CN116754762A - 基于核酸适体的真菌毒素无毒定量分析试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸适体的真菌毒素无毒定量分析试剂盒及其应用。该试剂盒包括链霉亲和素磁微粒、生物素标记的真菌毒素核酸适体、碱性磷酸酶标记的互补DNA短链、样本稀释液、洗涤液、底物液。本发明试剂盒将化学发光、磁微粒分离和功能核酸技术汇聚在一起，可实现真菌毒素的快速、准确、全自动化检测。同时，与传统的免疫分析试剂盒不同，该试剂盒中不含真菌毒素抗原，对环境和实验人员没有危害，灵敏高、特异性好。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种基于核酸适体的真菌毒素无毒定量分析试剂盒及其应用。
背景技术
真菌毒素(Mycotoxins)是产毒真菌在一定环境条件下产生的次级代谢产物，广泛污染农产品、食品、中药材及饲料等植物源性产品。在农产品、食品和饲料中比较常见的真菌毒素有：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，又称呕吐毒素，DON)、黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、伏马毒素B1(fumonisin B1，FB1)、伏马毒素B2(FB1)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、T-2毒素(T-2toxin)、HT-2毒素(HT-2toxin)或黄曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM1)、展青霉素(patμLin)等。真菌毒素可以引起人类和动物的急性或慢性中毒，可损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等，对人类和动物健康可产生严重的影响。鉴于真菌毒素的危害，世界各国对其含量进行了严格的限定。开展真菌毒素残留污染研究，开发高灵敏、低成本、可靠的自动化检测技术对保证农产品、食品、中药和饲料等的质量和安全，打破国外的技术壁垒，保护我国在国际贸易中的经济利益，增加出口创汇具有重要意义。
目前真菌毒素的检测方法有薄层色谱法，高效液相色谱法、酶联免疫吸附法，毛细管电泳法、液质联用法等。其中薄层色谱法是最早使用的检测真菌毒素的方法，其优点是适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低、无需价格昂贵的仪器。但是，薄层色谱法的样品处理繁琐，实验过程复杂，所需检测周期较长，容易受到杂质的干扰。测定时用目测半定量，存在主观影响较大，灵敏度不高等缺点，已远远不能满足现代检测要求。高效液相色谱法和液质联用法等仪器分析方法具有准确度高、灵敏性强、可微量测定等优点，是目前常用的食品中真菌毒素检测的方法。但因其对样品纯度要求较高，需要经过一些前处理过程，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样品快速筛选的要求。免疫分析方法(酶联免疫法，ELISA；胶体金免疫层析法，LFIA)是对真菌毒素进行快速分析的主要手段，然而，由于真菌毒素因分子量小、抗原表位单一，难以利用经典的双抗体夹心法对其进行检测，其免疫学分析方法多为竞争型，需以真菌毒素标准品为原料化学合成人工抗原，面临制作成本高、操作毒害以及环境污染等多种挑战。
因此，发展无毒、无害的绿色定量检测技术是当前真菌毒素定量分析体系发展的必然趋势及现实需求，并已成为当前食品安全、免疫分析学交叉研究领域的主要挑战之一。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种真菌毒素无毒定量分析试剂盒，该试剂盒将化学发光、磁微粒分离和功能核酸技术汇聚在一起，无需添加真菌毒素抗原，建立了一种基于核酸适体的真菌毒素无毒、定量分析试剂盒，具有良好的准确性、灵敏度和重复性。
本发明的第二个目的在于提供上述试剂盒在检测真菌毒素中的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供一种真菌毒素无毒定量分析试剂盒，该试剂盒包括链霉亲和素磁微粒、生物素标记的真菌毒素核酸适体、碱性磷酸酶标记的互补DNA短链(ssDNA-AP)、样本稀释液、洗涤液、底物液。
本发明采用间接竞争的原理测定真菌毒素，在链霉亲和素磁微粒悬浮液中加入生物素标记的真菌毒素核酸适体工作液、ssDNA-AP和待测样本。样本中的真菌毒素与ssDNA-AP竞争数量有限的生物素标记的真菌毒素核酸适体，通过链霉亲和素和生物素的亲和反应以及核酸适体的特异性识别反应，分别形成磁微粒-链霉亲和素-生物素-核酸适体-ssDNA-AP复合物和磁微粒-链霉亲和素-生物素-核酸适体-真菌毒素复合物，磁微粒在外加磁微粒场中直接沉淀，用磁微粒场将复合物吸附在试剂管底部，清洗掉游离的成分，加入底物液，碱性磷酸酶催化底物的磷酸根水解后，立即发生分解反应释放出475nm的光子，于5min内测定各加样孔的发光值(RLU)。样本的RLU与样本中真菌毒素的浓度呈负相关。样本中的真菌毒素浓度依据由真菌毒素标准品浓度和对应的RLU建立的四参数数学模型进行定量，从而检测样本中的真菌毒素含量。
进一步的，本发明所述生物素标记的真菌毒素核酸适体为真菌毒素核酸适体的3’或5’端经生物素标记，其中，所述真毒毒素核酸适体的核苷酸序列可以是如以下中的任一种或多种：
黄曲霉毒素B1核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
玉米赤霉烯酮核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
T-2毒素核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
伏马毒素B1核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
赭曲霉毒素A核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步的，所述ssDNA-AP是以碱性磷酸酶(AP)作为生物发光的催化剂，将互补DNA短链与碱性磷酸酶进行共价偶联得到的。
进一步的，所述互补DNA短链与相应的真菌毒素核酸适体部分互补，所述互补DNA短链的核苷酸序列如以下中的任一种或多种：
黄曲霉毒素B1核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
玉米赤霉烯酮核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
T-2毒素核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
伏马毒素B1核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
赭曲霉毒素A核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
进一步的，所述的ssDNA-AP可以通过下述方法制备获得：
(1)互补DNA短链的复性：取1-5OD的3’或5’端氨基修饰的互补DNA短链溶解于200-1000μL Na2HPO4缓冲液中，于75-95℃复性3-5min，然后室温放置15-60min；
(2)互补DNA短链与碱性磷酸酶的共价偶联：将碱性磷酸酶先用异型双功能化学交联剂修饰制备巯基修饰的碱性磷酸酶，然后将氨基修饰的互补DNA短链溶液和巯基修饰的碱性磷酸酶溶液按照摩尔比1：1混合，4℃过夜反应得到碱性磷酸酶标记的互补DNA短链。
根据本申请的具体实施方式，依据要检测的毒素种类，选择相应的生物素标记的真菌毒素核酸适体和碱性磷酸酶标记的互补DNA短链。例如，当检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇时，本申请的试剂盒中，应包括生物素标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体和脱氧雪腐镰刀菌烯醇ssDNA-AP。
本发明将核酸适体代替抗体作为识别元件，核酸适体本质上是具有特定复杂三维结构并能特异性结合靶标的一段脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列(10～100个碱基)。单链的核酸序列可以形成二级结构，从而对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。通过构建单链随机寡核苷酸文库，利用指数富集配体系统进化技术(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)进行多次的富集和筛选，体外优选出能特异性与靶标高度亲和的核酸适配体，从而避免了体内免疫反应带来的困难。适配体作为一种在体外人工合成的、与抗体功能类似的新型分子，与主流的抗体技术相比，表现出一些有别于抗体的优势，如批间稳定性一致，易修饰，无免疫原性等。相比较传统的免疫分析技术，本技术具有如下优势：(1)稳定性好。核酸适体溶液无需添加保护蛋白等成分，可以有效降低背景干扰；可长期保存，运输要求低，无需冷藏。(2)无毒。由于真菌毒素因分子量小、抗原表位单一，难以利用经典的双抗体夹心法对其进行检测，其免疫学分析方法多为竞争型，需以真菌毒素标准品为原料化学合成人工抗原，面临制作成本高、操作毒害以及环境污染等多种挑战。本技术使用互补DNA短链克服了这一缺点，建立了无需添加真菌毒素抗原的无毒定量分析技术。(3)特异性好、灵敏度高。本发明提供的真菌毒素核酸适体具有良好的特异性；采用的链霉亲和素-生物素体系具有信号放大作用，基于核酸适体和链霉亲和素-生物素建立超敏的生物发光免疫分析试剂盒，用于检测粮油、食品、饲料和中草药等基质中真菌毒素的含量，具有良好的应用价值及前景。(4)批间差异小。核酸适体相较于传统抗体，在批间重复性、效价、修饰性等方面有较大优势，除本发明所示意的，其他所有核酸适体分子均可通过这种方式生产无毒定量分析试剂盒。
进一步的，本发明中所述磁微粒是以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基(-NH2)、甲苯磺酰基(Tosyl)、羧基(-COOH)或环氧基(-CH(O))基团，粒径为1-2μm。
进一步的，所述链霉亲和素磁微粒是将链霉亲和素与磁微粒偶联。
进一步的，所述底物液是浓度为0.5-2mmol/L的(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸盐溶液。
优选的，所述样本稀释液由0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％吐温20和0.5％牛血清白蛋白组成。
优选的，所述洗涤液由0.01MTris-HCl缓冲液和0.1％吐温20组成。
进一步的，所述试剂盒还包括反应管；优选的，所述反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
第二方面，本发明还要求保护上述试剂盒在真菌毒素检测中的应用，特别是在检测粮油、食品、饲料或中草药中真菌毒素的应用。
进一步的，所述食用油包括花生油、玉米油、大豆油、菜籽油、葵花籽油、油菜籽油、芝麻油、或橄榄油。
进一步的，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素中的一种或多种。
进一步，上述检测可以使用全自动化学发光免疫分析仪，从而实现真菌毒素全自动化检测。每个试剂盒互不干扰，可即时多样本同时检测，高度切合了真菌毒素现场快速检测的发展需求。此外，使用本发明试剂盒检测真菌毒素还具有以下优点：(1)检测速度快、稳定、无放射性污染，在没有磁微粒场存在的情况下，磁微粒悬浮在液体中，使得抗原-抗体反应类似于均相反应；磁微粒在外加磁微粒场的作用下可方便地分离、洗涤快速，可在20分钟内判断检测结果。(2)灵敏度高。(3)特异性强。(4)精密度良好。(5)链霉亲和素与生物素级联放大体系，链霉亲和素磁微粒，生物素标记的核酸适体，较磁微粒直接联真菌毒素抗原，大大提高了反应效率，操作简单。(6)成本低，与市场上同类产品比较，本试剂盒性能良好，成本低，具有实际应用价值。(7)食用油可直接加样检测，无需提取、离心等操作，大幅提高检测效率。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为基于核酸适体的真菌毒素无毒定量分析原理图。
图2为黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒测定糙米、大米、玉米、花生酱、小麦、和花生油样品中AFB1的回收率和重复性。
图3为脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒测定玉米、小麦和面粉中DON的回收率和重复性。
图4为玉米赤霉烯酮无毒定量分析试剂盒测定玉米、小麦、糙米和面粉中ZEN的回收率和重复性。
图5为T-2毒素无毒定量分析试剂盒检测玉米中T-2毒素的回收率和重复性。
图6为FB1毒素无毒定量分析试剂盒检测玉米中伏马毒素B1的回收率和重复性。
图7为赭曲霉毒素A无毒定量分析试剂盒测定玉米、小麦和糙米中OTA的回收率和重复性。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1制备黄曲霉毒素B1碱性磷酸酶标记的互补DNA短链
AFB1-ssDNA-AP是以碱性磷酸酶作为生物发光的催化剂，将黄曲霉毒素B1核酸适体的互补DNA短链(AFB1ssDNA)与碱性磷酸酶(AP)进行共价偶联得到的。
AFB1-ssDNA-AP是通过下述方法制备的：
(1)互补DNA短链的设计：根据碱基互补原则，互补DNA短链与相应的真菌毒素核酸适体部分互补，所述黄曲霉毒素B1核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
(2)互补DNA短链的复性：取1OD的3’或5’端氨基修饰的互补DNA短链溶解于200μLNa2HPO4缓冲液中，于95℃复性5min，然后室温放置30min；
(3)互补DNA短链与碱性磷酸酶的共价偶联：将碱性磷酸酶先用异型双功能化学交联剂SM(PEG)8(聚乙二醇化，长链SMCC交联剂)修饰制备巯基修饰的碱性磷酸酶，用30kD超滤管去盐3次后，用0.1M PBS(2mM EDTA，pH7.2)稀释至1mg/mL。将氨基修饰的互补DNA短链溶液和巯基修饰的碱性磷酸酶溶液按照摩尔比1：1混合，4℃过夜反应得到碱性磷酸酶修饰的互补DNA短链；
(4)AFB1-ssDNA-AP的纯化与表征：采用反相高效液相色谱仪进行交联效率分析和纯化。
通过上述方法，最终得到纯化后的AFB1-ssDNA-AP。AFB1-ssDNA-AP的活性分析：
活性测定：对硝基苯磷酸二钠法。在酶标板中，分别加入20μL稀释50，100，200，400，800，1000倍的AFB1-ssDNA-AP，再向孔中添加100μL PNPP试剂(2mg/mL，溶于含有2mMMgCl2的0.1M二乙醇胺缓冲液，pH9.8)，混匀后，置于37℃下孵育10min，最后加入50μL 4MNaOH溶液终止反应，利用微孔板酶标仪测定405nm处的吸光度，分别计算对硝基苯酚的浓度(mM)。酶活力(U/mL)＝对硝基苯酚浓度/反应时间*样品稀释倍数，酶的比活力(U/mg)＝酶活力(U/mL)/蛋白浓度(mg/mL)。通过比较AFB1-ssDNA-AP和AP的比活力大小，评估AFB1-ssDNA-AP的碱性磷酸酶活性。
采用本实施例的上述方法，还可以制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇碱性磷酸酶标记的互补DNA短链；玉米赤霉烯酮碱性磷酸酶标记的互补DNA短链；T-2毒素碱性磷酸酶标记的互补DNA短链；伏马毒素B1碱性磷酸酶标记的互补DNA短链；赭曲霉毒素A碱性磷酸酶标记的互补DNA短链。
实施例2制备黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒
1.链霉亲和素磁微粒制备：
(1)磁微粒的分散：将10mg磁微粒用10mL 0.1M 2-吗啉乙磺酸溶液(MES缓冲液)分散，使磁微粒的终浓度为1mg/mL；
(2)磁微粒的清洗：用3倍磁微粒溶液体积的MES缓冲液清洗磁微粒后，再用MES缓冲液重新分散，使磁微粒的终浓度为1mg/mL；
(3)磁微粒的活化与链接：将3mg链霉亲和素和3.5μL 10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液依次加入步骤(2)所得的磁微粒分散液中，室温下搅拌反应2小时；
(4)磁微粒的封闭：步骤(3)中将磁微粒与反应体系分离后，用MES缓冲液洗涤磁微粒2次，再用MES缓冲液重新分散磁微粒，磁微粒的终浓度为2-30mg/mL；然后加入2％甘氨酸封闭液，室温下搅拌反应2小时；
(5)磁微粒的清洗：将步骤(4)的磁微粒与反应体系分离，用pH7.4的磷酸盐缓冲液清洗磁微粒珠两次，获得链霉亲和素磁微粒；
(6)使用时，将链霉亲和素磁微粒配置成链霉亲和素磁微粒工作液：将步骤(5)中的链霉亲和素磁微粒分散于0.5g/mL酪蛋白、1g/mL PEG200、0.2％吐温20、0.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，pH值为7-8，磁微粒的终浓度为1mg/mL，即得。
2.生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体的制备：
(1)黄曲霉毒素B1核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
(2)利用现有技术的方法将上述核酸适体经生物素标记；
(3)使用时，将生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体用0.01MTris盐缓冲液和0.5％ MgCl2稀释得到0.1mmol/mL生物素标记的黄曲霉毒素B1核酸适体工作液。
3.碱性磷酸酶标记的互补DNA短链AFB1-ssDNA-AP工作液的制备
将实施例1制备的AFB1-ssDNA-AP用0.01M Tris盐缓冲液和0.5％ MgCl2溶液稀释得到0.075mmol/mL AFB1-ssDNA-AP工作液。
4.样品稀释液的配制：
样品稀释液由0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％吐温20和0.5％牛血清白蛋白组成。
5.洗涤液的配制：
洗涤液由0.01M Tris-HCl缓冲液和0.1％吐温20组成。
6.底物液的制备：
将(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸二钠盐用0.01M PBS稀释成1mmol/L得到底物液。
8.组装：将上述试剂组装成试剂盒，2-8℃储存。
基于核酸适体的AFB1无毒定量分析试剂盒工作原理图如图1所示。
实施例3黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒检测黄曲霉毒素B1的方法学考察
对实施例2制备的AFB1无毒定量分析试剂盒进行检测黄曲霉毒素B1的方法学考察试验。
(1)稳定性实验：将黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒37℃保存进行加速稳定性试验测试，连续监测12天，共12次，信号值的RSD小于5％，根据经验在37℃下保存1天相当于4℃保存2个月，即本试剂盒在4℃保存12个月，不影响使用。
(2)灵敏度分析
通过对20个独立的玉米阴性样品进行测定，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，结果为0.2μg/kg，定量限LOQ以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算，结果为0.6μg/kg。
(3)线性关系考察
①标准曲线的绘制：根据黄曲霉毒素B1标准品溶液的浓度发光值系列数值进行四参数拟合，获得基于的浓度发光值标准曲线。
②样本浓度的计算：在一定范围内发光值与黄曲霉毒素B1抗原浓度呈反比，根据拟合的黄曲霉毒素B1的浓度发光值标准曲线计算待测样本的黄曲霉毒素B1含量。
(4)黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒特异性考察
将黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒用于检测结构类似物(AFB1，AFB2，AFG1和AFG2)和其他常见真菌毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON；伏马毒素B1，FB1；；伏马毒素B1，FB2；伏马毒素B1，FB3；玉米赤霉烯酮，ZEN；T-2毒素，T-2；赭曲霉毒素A，OTA；3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3-ADON；15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，15-ADON；脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷，DON-3G；雪腐镰刀菌烯醇，NIV)，结果如表1所示，仅AFB2存在较为明显的交叉反应，交叉反应率为83.3％，与AFG1和AFG2的交叉反应率低于15％，其他毒素无交叉(交叉反应率小于1％)，表明黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒特异性良好。
表1.黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒特异性考察
| 编号 | 真菌毒素 | IC50 | 交叉反应率(％) |
| 1 | AFB1 | 0.5ppb | - |
| 2 | AFB2 | 0.6ppb | 83.3 |
| 3 | AFG1 | 3.6ppb | 13.9 |
| 4 | AFG2 | 4.5ppb | 11.1 |
| 5 | DON | >10ppm | <1％ |
| 6 | FB1 | >28.6ppm | <1％ |
| 7 | FB2 | >28.6ppm | <1％ |
| 8 | FB3 | >28.6ppm | <1％ |
| 9 | ZEN | >20ppm | <1％ |
| 10 | T-2 | >100ppm | <1％ |
| 11 | OTA | >1.9ppm | <1％ |
| 12 | 3-ADON | >100.1ppm | <1％ |
| 13 | 15-ADON | >100.4ppm | <1％ |
| 14 | DON-3G | >50ppm | <1％ |
| 15 | NIV | >100.4ppm | <1％ |
实施例4黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒的使用
(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，加入25.0mL甲醇/水(70：30)溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；
(2)黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒(实施例2制备)的使用步骤：
①物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。
②将试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；
③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或黄曲霉毒素B1标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μL生物素标记的AFB1核酸适体和50μL碱性磷酸酶标记的互补DNA短链，150μL底物以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。
(3)黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒的准确性和重复性
分别称取5g阴性糙米、大米、玉米、花生酱、小麦和花生油样品，并加入不同量的黄曲霉毒素B1标准品，7个平行，用黄曲霉毒素B1无毒定量分析试剂盒加标后的样品提取液进行测定，7个平行的回收率如图如图2所示，回收率在82.4％-115％之间，RSD小于9.5％。
实施例5脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法学考察
参考实施例2制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒并进行检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇的方法学考察。
(1)稳定性实验：采用先进的稳定剂(0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％牛血清白蛋白溶液、0.1％proclin300和1％海藻糖)处理，处理后37℃保存进行加速稳定性试验测试，连续监测12天，共12次，根据经验在37℃下保存1天相当于4℃保存2个月，即本试剂盒在4℃保存12个月，不影响使用。
(2)灵敏度分析
通过对20个独立的玉米阴性样品进行测定，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，结果为56.0μg/kg，定量限LOQ以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算，结果为189.6μg/kg。
(3)线性关系考察
①标准曲线的绘制：根据脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品溶液的浓度发光值系列数值进行四参数拟合，获得基于的浓度发光值标准曲线。
②样本浓度的计算：在一定范围内发光值与脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗原浓度呈反比，根据拟合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度发光值标准曲线计算待测样本的脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量。
(4)脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒特异性考察
将脱氧雪腐镰刀菌烯醇磁化学发光免疫分析试剂用于检测结构类似物(3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON)，15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON)和雪腐镰刀菌烯醇，NIV)和其他常见真菌毒素(黄曲霉毒素B1，DON玉米赤霉烯酮，ZEN；T-2毒素，T-2和赭曲霉毒素A，OTA)，结果如表2所示，与3-ADON和15-ADON及其他常见毒素均无交叉，表明脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒特异性良好。
表2.脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒的特异性
| 编号 | 真菌毒素 | IC50 | 交叉反应率(％) |
| 1 | DON | 2.4ppb | - |
| 2 | AFB1 | >2ppm | <1％ |
| 3 | T-2 | >100ppm | <1％ |
| 4 | OTA | >1.9ppm | <1％ |
| 5 | ZEN | >20ppm | <1％ |
| 6 | 3-ADON | 66.7ppb | 3.6％ |
| 7 | 15-ADON | 44.4ppb | 5.4％ |
| 8 | NIV | 610ppb | <1％ |
实施例6脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒的使用
(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，加入25.0mL水，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；
(2)脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒的使用步骤
①物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。
②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；
③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μL生物素标记的DON核酸适体和50μL碱性磷酸酶标记的互补DNA短链，150μL底物以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。
(3)脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒的准确性和重复性
分别称取5g阴性玉米、小麦和面粉样品，并加入不同量的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品，7个平行，用脱氧雪腐镰刀菌烯醇无毒定量分析试剂盒加标后的样品提取液进行测定，7个平行的回收率如图3所示，回收率在85％-118％之间，RSD小于8.5％。
实施例7玉米赤霉烯酮无毒定量分析试剂盒的使用
参考实施例2制备玉米赤霉烯酮无毒定量分析试剂盒。
(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的待测样品于50mL离心管中，加入25.0mL80％乙腈水溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；
(2)玉米赤霉烯酮无毒定量分析试剂盒的使用步骤
①物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。
②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；
③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或玉米赤霉烯酮标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μL生物素标记的ZEN核酸适体和50μL碱性磷酸酶标记的互补DNA短链，150μL底物以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。
(3)玉米赤霉烯酮无毒定量分析试剂盒的灵敏度分析
通过对20个独立的玉米阴性样品进行测定，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，结果为2.6μg/kg，定量限LOQ以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算，结果为8.7μg/kg。
(4)玉米赤霉烯酮无毒定量分析试剂盒的准确性和重复性
分别称取5g阴性玉米、小麦、糙米和面粉样品，并加入不同量的玉米赤霉烯酮标准品，7个平行，用玉米赤霉烯酮无毒定量分析试剂盒加标后的样品提取液进行测定，7个平行的回收率如图4所示，回收率在84％-117％之间，RSD小于8.2％。
实施例8T-2毒素无毒定量分析试剂盒的使用
参考实施例2制备T-2毒素无毒定量分析试剂盒。
(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的玉米阴性样品于50mL离心管中，分别加入不同量的T-2毒素标准品，最终加标水平分别为47.8μg/Kg和108μg/Kg，7个平行，加入25.0mL80％乙腈水溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；
(2)T-2毒素无毒定量分析试剂盒的使用步骤
①物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。
②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；
③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或T-2毒素标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μL生物素标记的T-2核酸适体和50μL碱性磷酸酶标记的互补DNA短链，150μL底物以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。
(3)T-2毒素无毒定量分析试剂盒的准确性和重复性
用T-2毒素无毒定量分析试剂盒对步骤(1)得到的待测样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如图5所示，回收率在82.6％-115.5％之间，RSD小于12％。
实施例9伏马毒素B1无毒定量分析试剂盒的使用
参考实施例2制备伏马毒素B1无毒定量分析试剂盒。
(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的玉米阴性样品于50mL离心管中，分别加入不同量的FB1标准品，最终加标水平分别为47.8μg/Kg和108μg/Kg，7个平行，加入25.0mL80％乙腈水溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；
(2)伏马毒素B1毒素无毒定量分析试剂盒的使用步骤
①物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。
②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；
③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或伏马毒素B1毒素标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μL生物素标记的FB1核酸适体和50μL碱性磷酸酶标记的互补DNA短链，150μL底物以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。
(3)FB1毒素无毒定量分析试剂盒的准确性和重复性
用FB1毒素无毒定量分析试剂盒对步骤(1)得到的待测样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如图6所示，回收率在83.0％-112.2％之间，RSD小于9％。
实施例10赭曲霉毒素A无毒定量分析试剂盒的使用
参考实施例2制备赭曲霉毒素A无毒定量分析试剂盒。
(1)待测样品前处理：称取5.0g粉碎后的样品于50mL离心管中，加入25.0mL80％乙腈水溶液，置于多管涡旋混匀仪上2500rpm涡旋5min(或使用高速均质器上11000rpm均质3min，或摇床上200rpm振荡40min)在检测管中加入20μL待测样品提取液，然后7000rpm离心5min，得到待测样品提取液；
(2)赭曲霉毒素A无毒定量分析试剂盒的使用步骤
①物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。
②将待测试剂盒在室温(2-8℃)下平衡30min；
③样本测定：将40-200μL待测样品提取液加入样本孔中，放置于全自动化学发光免疫分析仪中，点击运行后，仪器依据预先设置好的运行程序依次加入50μL待测样品提取液或赭曲霉毒素A标准品溶液，50μL链霉亲和素磁微粒工作液，50μL生物素标记的OTA核酸适体和50μL碱性磷酸酶标记的互补DNA短链，150μL底物以及400μL稀释液，混匀，37℃温育5min；依次洗涤3次后，测度发光值，并根据内置的四参数拟合曲线进行结果分析，可20min内完成8个样本的测定，并出具检测报告。
(3)赭曲霉毒素A无毒定量分析试剂盒的灵敏度
过对20个独立的小麦阴性样品进行测定，该方法检出限LOD以阴性样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算，结果为1.2μg/kg，定量限LOQ以阴性样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算，结果为4.0μg/kg。
(4)赭曲霉毒素A无毒定量分析试剂盒的准确性和重复性
分别称取5g阴性玉米、小麦和糙米样品，并加入低(2.5μg/kg)、中(5μg/kg)、高(10μg/kg)不同量的赭曲霉毒素A标准品，7个平行，用赭曲霉毒素A无毒定量分析试剂盒加标后的样品提取液进行测定，7个平行的回收率、均值及RSD如图7所示，回收率在92.2％-110.8％之间，RSD小于7.3％。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种真菌毒素无毒定量分析试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括链霉亲和素磁微粒、生物素标记的真菌毒素核酸适体、碱性磷酸酶标记的互补DNA短链、样本稀释液、洗涤液、底物液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的真菌毒素核酸适体为真菌毒素核酸适体的3’或5’端经生物素标记，其中，所述真毒毒素核酸适体的核苷酸序列如以下中的任一种或多种：
黄曲霉毒素B1核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
玉米赤霉烯酮核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
T-2毒素核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
伏马毒素B1核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
赭曲霉毒素A核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的互补DNA短链是以碱性磷酸酶作为生物发光的催化剂，将互补DNA短链与碱性磷酸酶进行共价偶联得到的。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述互补DNA短链与相应的真菌毒素核酸适体部分互补，所述互补DNA短链的核苷酸序列如以下中的任一种或多种：
黄曲霉毒素B1核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
脱氧雪腐镰刀菌烯醇核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
玉米赤霉烯酮核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
T-2毒素核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；
伏马毒素B1核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；
赭曲霉毒素A核酸适体的互补DNA短链的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记的互补DNA短链是通过下述方法制备的：
(1)互补DNA短链的复性：取1-5OD的3’或5’端氨基修饰的互补DNA短链溶解于200-1000μL Na2HPO4缓冲液中，于75-95℃复性3-5min，然后室温放置15-60min；
(2)互补DNA短链与碱性磷酸酶的共价偶联：将碱性磷酸酶先用异型双功能化学交联剂修饰制备巯基修饰的碱性磷酸酶，然后将氨基修饰的互补DNA短链溶液和巯基修饰的碱性磷酸酶溶液按照摩尔比1：1混合，4℃过夜反应得到碱性磷酸酶标记的互补DNA短链。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒是以四氧化三铁或三氧化二铁超顺磁性材料为内核，外围包覆聚苯乙烯或葡聚糖，通过物理或化学的方法活化使磁微粒表面产生氨基、甲苯磺酰基、羧基或环氧基基团，粒径为1-2μm。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁微粒是将链霉亲和素与磁微粒偶联。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物液是浓度为0.5-2mmol/L的(4-氯苯巯基)(10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基)磷酸盐溶液；
优选的，所述样本稀释液由0.01M磷酸盐缓冲液、0.1％吐温20和0.5％牛血清白蛋白组成；
优选的，所述洗涤液由0.01MTris-HCl缓冲液和0.1％吐温20组成。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应管；
优选的，所述反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。
10.权利要求1-9任一所述的试剂盒在检测真菌毒素中的应用；
优选的，所述试剂盒在检测食用油、食品、粮食、饲料或中草药中真菌毒素的应用；
优选地，所述食用油包括花生油、玉米油、大豆油、菜籽油、葵花籽油、油菜籽油、芝麻油或橄榄油；
优选的，使用真菌毒素全自动分析仪进行真菌毒素检测。
优选的，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素中的一种或多种。
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