CN101782570A

CN101782570A - 一种生物分子竞争分析方法及其应用

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Publication number: CN101782570A
Application number: CN200910224150A
Authority: CN
Inventors: 吴淑庆; 弓景波; 杨在明
Original assignee: China National Academy Nanotechnology & Engineering
Current assignee: China National Academy Nanotechnology & Engineering
Priority date: 2008-12-25
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2010-07-21

Abstract

一种生物分子竞争分析方法，其特征在于它为利用核酸适体作为亲和配体，与标记的靶标一起建立的竞争分析方法，包括以下步骤：(1)靶标核酸适体包被；(2)与标记的靶标分子孵育结合；(3)加入靶标样品竞争分析；(4)洗涤后，加入底物进行分析。该方法尤其适用于小分子抗原或半抗原的测定。本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生物分子竞争分析方法的应用，可广泛用于致病物质在体内体外的检测分析、体液生物分子实验研究、食品安全监测、生物防恐监测、环境监测等领域。

Description

一种生物分子竞争分析方法及其应用

(一)技术领域：

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种生物分子竞争分析方法及其应用。

(二)背景技术：

1971年用酶代替同位素制备了酶标记试剂，建立了酶联免疫分析方法(ELISA)。该方法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于实现自动化操作等特点，现已广泛应用于临床诊断、生化分析、食品安全、环境监测等各生物检测领域，原则上适用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可直接定量测定体液中的可溶性抗原。其基本模式是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将固相上的抗原-抗体合物与液相中的游离成分分开。

ELISA常用的方法主要包括双抗体夹心法、间接法、竞争法：(1)双抗体夹心法，是检测抗原最常用的方法，利用两种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性，检测灵敏度可提高到pg级的水平，适用于测定2价或2价以上的大分子抗原，但不适用于测定不能形成两位点夹心的半抗原及小分子单价抗原。(2)间接法，是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体，这种方法操作简单，只要变换包被抗原就可利用同一酶标二抗建立检测相应抗体的方法，其成功的关键在于抗原的纯度以及正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体，因此常因高背景而特异性较差，目前已逐渐被夹心法取代。(3)竞争法，可用于测定抗原，也可用于测定抗体；当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体，其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原的结合，如抗原为高纯度的，可直接包被于固相，如抗原中有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原，洗涤除去抗原中的杂质，然后再加入标本和酶标抗体进行竞争结合反应；小分子抗原或半抗原因缺乏可用于夹心法的两个以上的位点而不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式，其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。用抗原包被来与液相抗原间接竞争的方法是一种低灵敏度的方法，而包被抗体，目标抗原与标记抗原竞争的方法能显著提高灵敏度。

对于小分子抗原来说，由于其抗体是联接载体蛋白免疫得到的，产生的抗体除了针对抗原的，还有针对载体蛋白与抗原-载体联接部位的，即便是针对抗原，也有可能因为载体蛋白的导向作用使其对偶联蛋白比游离小分子具有更高的亲和力。在进行检测时，一般会使用偶联蛋白进行包被或小分子标记HRP，所以会有抗体对固相抗原或标记抗原的亲和力强，而加入抗原后的抑制作用弱。如果检测系统使用的偶联物的偶联位点改变一下，就会出现效价下降的现象。所以需要筛选合适的，对偶联物及小分子亲和力一致的单抗用于检测，并需要从抗体质量及抗原抗体比例等多方面进行探索，可见小分子抗原的ELISA方法建立并不容易实现。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种生物分子竞争分析方法及其应用，其检测方法建立周期短、灵敏度高、特异性强，适用于生物检测中靶标的分析，尤其适用于小分子抗原或半抗原的测定。

本发明的技术方案：一种生物分子竞争分析方法，其特征在于它为利用核酸适体作为亲和配体，与标记的靶标一起建立的竞争分析方法，包括以下步骤：

(1)靶标核酸适体包被；

(2)与标记的靶标分子孵育结合；

(3)加入靶标样品竞争分析；

(4)洗涤后，加入底物进行分析。

上述所说的步骤(1)中的核酸适体包被是由核酸适体通过直接或间接的方式以共价键或非共价键形式包被在固相基质上。

上述所说的步骤(1)中的核酸适体既能与标记的靶标结合，也能与靶标结合，但其与靶标结合的能力高于与标记靶标结合的能力，靶标可竞争标记靶标结合核酸适体。

上述所说的核酸适体为单链DNA即ssDNA或RNA。

上述所说的核酸适体是通过指数富集配体进化系统即SELEX技术体外筛选获得的与靶标有特异结合的核酸序列。

上述所说的核酸适体的筛选包括以下步骤：

①合成制备ssDNA或RNA文库；

②以标记的靶标作为筛选分子，富集与其特异亲和的核酸序列；

③用靶标竞争洗脱，获得靶标特异的多克隆核酸适体，制备次级文库；

④筛选数轮，克隆测序，获得靶标的单克隆核酸适体。

上述所说的靶标是生物检测中靶标，包括生物大分子或生物小分子。

上述所说的靶标分子的标记方法采用放射性同位素标记法、荧光素标记法、生物素标记法、纳米材料标记法、用于ELISA检测或电化学分析的酶类标记法或电化学活性物质标记法；其中用于ELISA检测或电化学分析的酶类标记法中的酶类包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或葡萄糖6磷酸脱氢酶。

上述所说的步骤(4)中进行分析的方法为比色法、放射性同位素分析法、荧光分析法、化学发光分析法或电化学检测法。

一种生物分子竞争分析方法可以应用于致病物质在体内体外的检测分析、体液生物分子实验研究、食品安全监测、生物防恐监测、环境监测领域。

本发明的有益效果分析：适体(aptamer)是与靶分子高特异性、高亲和力结合的寡核苷酸配基，系通过SELEX(systematic evlution of ligandby exponential enrichment)技术从人工合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中筛选并富集而得。文库中的寡核苷酸单链存在随机序列，通过WatsonCrick碱基配对原则和分子内交互作用，每一条核苷酸单链均可有不同的三维结构，如发夹(haipin)、假结(pseudoknot)、凸环(bulge)、G四聚体(G tetramer)等。由于筛选文库的容量可达10¹⁵左右，因此理论上应用SELEX技术能筛选到自然界几乎所有靶分子的适体。适体的作用有如抗体，但它在敏感性、特异性等很多方面往往优于抗体。适体系体外筛选，可克服免疫原性弱的抗原所受的限制，靶分子范围广，蛋白、糖、脂类等生物大分子以及毒素、抗生素、农药、兽药、染料、离子等生物小分子均可筛选得到核酸适体；适体的标记更容易实现，可以精确、定点、随意连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和同位素、荧光素、生物素、纳米材料、用于ELISA检测或电化学分析的酶类(包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或葡萄糖6磷酸脱氢酶)、电化学活性物质等，因此可以实现的检测方法包括比色法、放射性同位素分析法、荧光分析法、化学发光分析法或电化学检测法等；适体能够分辨出靶分子结构上细微的差别，如一个取代基的有或无，因此适体能够区别靶分子标记与否。另外，核酸适体性质更稳定，筛选更快速，制备更简单，无批间差异，因此具有良好的应用价值。

本发明的技术效果：1、上述生物分子竞争分析方法，其检测方法建立周期短、灵敏度高、特异性强，用于生物检测中靶标的分析，尤其适用于小分子抗原或半抗原的测定；2、该方法可广泛应用于致病物质在体内体外的检测分析、体液生物分子实验研究、食品安全监测、生物防恐监测、环境监测等领域。

(四)具体实施方式：

实施例1：一种生物分子竞争分析方法，即以核酸适体为亲和配体的氯霉素竞争分析方法

文库的合成及扩增：

ssDNA文库通过化学合成法制备，其两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N35)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT3’，库容量10¹⁴以上；引物1：5’CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT 3’，引物2：5’ATCCGCCTGATTAGCGATACT 3’。

用以上合成的ssDNA文库为模板，以引物1、引物2不对称扩增ssDNA文库，即采用不对称PCR，引物1/引物2浓度比100∶1，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，65℃退火45s，循环35次，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。将获得的产物主要为ssDNA，于95℃作用3min，于冰中2min，室温放置10min，即为ssDNA文库。

氯霉素核酸适体的筛选：

购买偶联有羧基的磁珠，与标记了FITC的氯霉素之羟基反应，将其固定于磁珠，加入以上扩增的ssDNA文库，一同孵育后洗涤，然后用未经FITC标记的氯霉素竞争洗脱并收集ssDNA，作为次级文库参与下一轮筛选。筛选15轮后，将PCR产物克隆测序，采用SPR进行亲和力分析。选择亲和力高于0.5nmol的核酸序列，用于氯霉素的竞争分析。

氯霉素的竞争分析：

合成上述高亲和力核酸适体，并将3’端用氨基修饰；购买偶联有氨基的酶标板，通过PDITC溶液的介导，将3’-NH2-ssDNA核酸适体固定于酶标板，封闭过剩的活性位点；加入FITC标记的氯霉素，与适体孵育，洗涤，干燥后备用；向处理好的酶标板中加入稀释好的靶标氯霉素(浓度可低至0.5nmol/L)，孵育10-30分钟，洗涤后，检测荧光信号，即可指示待测样品中氯霉素的浓度。

实施例2：一种生物分子竞争分析方法，即以核酸适体为亲和配体的人CRP竞争分析方法

采用组合化学法合成含30个随机序列的单链DNA文库：5’-GTCACTGTCTTCATAGGTTG-N30-GAATCAGT GAGACATCCC 3’，经8％变性聚丙烯酰胺胶纯化后，通过引物1(5’-GTCACTGTCTTCATAGGTTG-3’)和引物2(5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGGATGTCTCACTGATTC-3’)扩增；用T7体外转录试剂盒转录合成RNA，DNA模板用无RNA酶的DNA酶消化，酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀RNA，溶解后用8％变性聚丙烯酰胺胶纯化，即为初级RNA文库。

按蛋白∶胶体金＝30μg∶1ml的量用胶体金标记人CRP，离心去除未结合部分，洗涤并重悬后将胶体金标记的人CRP包被于96孔板，与以上制备的初级RNA文库作用，洗去未结合的部分，然后用未经胶体金标记的人CRP竞争洗脱，收集RNA，作为次级文库参与下一轮筛选。筛选15轮后，将PCR产物克隆测序，采用SPR进行亲和力分析。选择亲和力高于0.5nmol的核酸序列，用于人CRP的竞争分析。

合成上述高亲和力核酸适体，以其包被经紫外线照射处理(30W紫外灯，75cm照射12小时)的聚苯乙烯板，封闭后，加入胶体金标记的人CRP作用适当时间，洗涤，干燥后备用；向处理好的酶标板中加入含人CRP的待测样品，孵育10-30分钟，洗涤后，用银增强法显色；采用比色分析即可指示待测样品中人CRP的浓度。

实施例3：一种生物分子竞争分析方法，即以核酸适体为亲和配体的双酚A竞争分析方法

文库的合成及扩增：

双酚A核酸适体的筛选：

将亚甲兰标记的双酚A固定于羧基磁珠，加入以上扩增的ssDNA文库，一同孵育后洗涤，然后用未标记的双酚A竞争洗脱并收集ssDNA，作为次级文库参与下一轮筛选。筛选15轮后，将PCR产物克隆测序，采用SPR进行亲和力分析。选择亲和力高于0.5nmol的核酸序列，用于双酚A的竞争分析。

双酚A的竞争分析：

合成上述高亲和力核酸适体，并将3’端用巯基修饰；以金电极为基体电极，采用自组装法将3’-SH-ssDNA核酸适体固定于电极，封闭过剩的活性位点；加入亚甲兰标记的双酚A，与适体孵育，适体构象发生改变，使得电化学活性标记物亚甲兰更接近电极表面，有利于电子在活性物与电极之间的转移，电化学信号增强；加入含双酚A的待测样品，使亚甲兰标记的双酚A竞争解离，电化学信号减弱；电化学信号的变化量即可指示待测样品中双酚A的浓度。

实施例4：一种生物分子竞争分析方法，即以核酸适体为亲和配体的黄曲霉毒素B1竞争分析方法

文库的合成及扩增：

黄曲霉毒素B1核酸适体的筛选：

将标记了辣根过氧化物酶的黄曲霉毒素B1固定于酶标板，加入以上扩增的ssDNA文库，一同孵育后洗涤，然后用未经辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1竞争洗脱并收集ssDNA，作为次级文库参与下一轮筛选。筛选15轮后，将PCR产物克隆测序，采用SPR进行亲和力分析。选择亲和力高于0.5nmol的核酸序列，用于黄曲霉毒素B1的竞争分析。

黄曲霉毒素B1的竞争分析：

合成上述高亲和力核酸适体，并将3’端用生物素标记；酶标板用链霉亲和素包被后，通过链霉亲和素与生物素间的相互作用，将3’-Bio-ssDNA核酸适体固定于酶标板，封闭过剩的活性位点；加入辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1，与适体孵育，洗涤，干燥后备用；向处理好的酶标板中加入含黄曲霉毒素B1的待测样品，孵育10-30分钟，洗涤后，再加入发光底物鲁米诺、H₂O₂检测化学发光信号，即可指示待测样品中黄曲霉毒素B1的浓度。

Claims

1.一种生物分子竞争分析方法，其特征在于它为利用核酸适体作为亲和配体，与标记的靶标一起建立的竞争分析方法，包括以下步骤：

(1)靶标核酸适体包被；

(2)与标记的靶标分子孵育结合；

(3)加入靶标样品竞争分析；

(4)洗涤后，加入底物进行分析。

2.根据权利要求1所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于所说的步骤(1)中的核酸适体包被是由核酸适体通过直接或间接的方式以共价键或非共价键形式包被在固相基质上。

3.根据权利要求1所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于所说的步骤(1)中的核酸适体既能与标记的靶标结合，也能与靶标结合，但其与靶标结合的能力高于与标记靶标结合的能力，靶标可竞争标记靶标结合核酸适体。

4.根据权利要求1所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于所说的核酸适体为单链DNA即ssDNA或RNA。

5.根据权利要求1所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于所说的核酸适体是通过指数富集配体进化系统即SELEX技术体外筛选获得的与靶标有特异结合的核酸序列。

6.根据权利要求5所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于所说的核酸适体的筛选包括以下步骤：

①合成制备ssDNA或RNA文库；

④筛选数轮，克隆测序，获得靶标的单克隆核酸适体。

7.根据权利要求1、3、5或6所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于所说的靶标是生物检测中靶标，包括生物大分子或生物小分子。

8.根据权利要求1或6所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于所说的靶标分子的标记方法采用放射性同位素标记法、荧光素标记法、生物素标记法、纳米材料标记法、用于ELISA检测或电化学分析的酶类标记法或电化学活性物质标记法；其中用于ELISA检测或电化学分析的酶类标记法中的酶类包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或葡萄糖6磷酸脱氢酶。

9.根据权利要求1所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于所说的步骤(4)中进行分析的方法为比色法、放射性同位素分析法、荧光分析法、化学发光分析法或电化学检测法。

10.根据权利要求1所说的一种生物分子竞争分析方法，其特征在于它可以用于致病物质在体内体外的检测分析、体液生物分子实验研究、食品安全监测、生物防恐监测、环境监测领域。