CN1738832A - 配体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了结合病毒包膜蛋白的适体，尤其是结合HIV包膜糖蛋白gp120的适体，以及这些适体在筛选潜在治疗靶点和治疗HIV感染中的用途。

Description

配体
技术领域
本发明涉及与病毒包膜蛋白结合的适体(aptamer)，更具体地涉及与HIV包膜糖蛋白gp120结合的适体。
背景技术
病毒能进化出抵抗目前抗病毒药物和体液和细胞适应性免疫选择压力的策略。例如使用CCR5共同受体以进入宿主并为HIV-1传播和AIDS发病机理中的主要病毒表型的HIV-1、R5株相对地抵抗抗体的中和作用。
虽然目前的抗病毒药物延长了许多HIV-1+个体的生活质量，但其未消除感染个体的病毒(1，2)。基于重组HIV-1表面包膜糖蛋白gp120的候选疫苗抗原不能引起中和HIV-1原代分离物(PIs)的抗体，并且药物抗性的HIV-1株迅速出现，这些促使人们继续努力寻找药征与目前所用不同的新抗逆转录病毒剂。一种方法就是靶向病毒感染宿主细胞的阶段。HIV-1进入靶细胞、其细胞向性和AIDS发病机理主要决定于病毒粒表面糖蛋白gp120，尤其决定于超变环序列(3-5)。例如，gp120序列10个外侧部分中的变异通过控制与趋化因子受体如CCR5和CXCR4的相互作用决定病毒的细胞向性(6)。依赖于前面共同受体的株，即R5株，优先从宿主到宿主传播(7)、支配感染的无症状阶段(8，9)并足以引起AIDS(10)。
存在两种主要HIV-1表型类别，即优先感染无限增殖的类淋巴母细胞系的HIV-1(T-向性)和优先感染原代巨噬细胞的HIV-1(M-向性)。M-向性株在体内感染的所有阶段都是主要的并尤其难于用抗体中和。
适体为包含一般20到120个核酸的配体并能用于确定蛋白质表面功能保守位点。如果结合位点是感染必需的，适体-病毒的结合效应可以是防止细胞感染。在HIV的情况下，市场上现在的药物都作用于胞内目标，如作用于反转录酶和蛋白酶以防止病毒复制。因此这些药物仅能用于治疗已感染的细胞。随着目前抗药性病毒的出现，使得鉴定出用于抗病毒治疗的新药变得越来越重要。防止细胞感染将是一种非常令人期望的治疗方法。这可以通过用适宜的适体靶向作用于病毒的包膜糖蛋白而达到。
本发明的示例性适体能够结合一系列HIV-1株的gp120糖蛋白，并多个数量级地中和它们的感染性。在只感染原代白细胞的临床相关株的情况下，与用抗体或其它任何特异性配体相比，我们观察到适体的中和程度是空前的。
以前描述过结合HIV gp-120分子的适体(Sayer等，(2002)BiochemBiophys Res Commun 293 924-31)。然而，这些适体是针对M-向性株的gp120而产生的并且不能够中和病毒。因此它们不可能有临床用途。本发明的适体结合M-向性gp120并且能够中和病毒。
发明内容
这样在第一方面本发明提供了能结合有包膜病毒的包膜糖蛋白并能中和所述病毒的核酸分子。
病毒优选地为HIV，更优选地为HIV-1。在一个优选的实施方案中糖蛋白为gp120。
在一个尤其优选的实施方案中适体选自表1所列的适体。
术语“有包膜”病毒是本领域技术人员熟知的病毒并指具有病毒包膜的病毒家族，如逆转录病毒。
术语“中和”在此指中和/降低所述有包膜病毒的感染性，优选地至少一个数量级，更优选地中和/降低所述有包膜病毒的感染性几个数量级。
第二方面本发明提供了利用本发明的适体筛选潜在治疗靶点的方法。由于适体-病毒结合的作用是防止细胞感染，所以可以鉴定出和适体竞争结合病毒的小分子。这些分子将结合病毒上的相同功能保守位点，由此抑制病毒感染，并因此对发展抗病毒疗法有用。在高通量筛选中应用适体已有描述(Green和Janjic(2001)Biotechniques 30 1094-6，1098，1100 passim.)。
本发明的适体自身就能用作治疗分子，这样第三方面本发明提供了包含至少一种本发明核酸分子及任选地一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
核酸分子可以为RNA或DNA，单链或双链。一般地核酸分子为20-120个核苷酸长度。形成核酸的核苷酸可进行化学修饰以增加分子的稳定性，提高其生物利用率或者赋予分子其他活性。例如，嘧啶碱基的第6或第8位和嘌呤碱基的第5位可以用CH3或卤素如I、Br或Cl修饰。嘧啶碱基的修饰也可包括在2位用NH3修饰、O6-CH3、N6-CH3及N2-CH3修饰。2’位修饰为糖修饰并一般包括NH2、F或者OCH3基团。修饰也可包括3’和5’修饰如加帽。
适体可通过本领域技术人员熟知的方法制备，例如固相合成(Ogilvie，K.K.，等(1988)Proc，Natl，Acad.Sci.U.S.A 85(16)p5764-8；Scaringe，S.A(2000)Methods Enzymol 317 p 3-18)或体外转录(Heidenreich，O.，W.Peiken和F.Eckstein(1993)Faseb J.7(1)p90-6.)。
本发明的组合物可以以每剂含有预定数量的每一活性成分的单位剂量形式提供。这样的单位可以适应于提供5-100毫克/天的化合物，优选地为或者5-15毫克/天、或者10-30毫克/天、或者25-50毫克/天、或者40-80毫克/天或者60-100毫克/天。对式I化合物来说，剂量以100-1000毫克/天提供，优选的为或者100-400毫克/天，或者300-600毫克/天或者500-1000毫克/天。此类剂量可以以单次或许多分次剂量的形式提供。最终的用量当然取决于待治疗的病症、施用途径和患者的年龄、体重、状况并由医生决定。
本发明的组合物可以适应于通过任何适当的途径施用，例如通过口(包括口腔或者舌下)、直肠、鼻、局部(包括口腔、舌下或者透皮)、阴道或者肠胃外(包括皮下、肌内、静脉、鞘内、眼内或者皮内)施用。此类制剂可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过使活性成分和载体或赋形剂联合来制备。
适于口服的药物制剂可以以离散单位形式提供，如胶囊或片剂，粉末或者颗粒，水性或非水性液体中的溶液或者悬浮液，可食用泡沫(foam或whip)，水包油液体乳剂或者油包水液体乳剂。
适于透皮施用的药物制剂可以以离散贴剂提供，其旨在保持与受体表皮长期的紧密接触。例如，可以通过一般在Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)中描述的离子电渗疗法(iontophoresis)从贴剂递送活性成分。
适于局部施用的药物制剂可制成软膏、乳膏、悬液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或者油。
为用于眼睛或者其他外部组织如口和皮肤，制剂优选地以局部软膏或乳膏形式应用。当配制成软膏形式时，活性成分可以与石蜡或水混溶的软膏基质一起使用。作为选择，活性成分可以与油包水基质或水包油基质配制成乳膏。
适于眼睛局部施用的药物制剂包括滴眼液，其中活性成分溶解或悬浮于适宜的载体中，尤其是水性溶剂中。
适于局部施用到口的药物制剂包括锭、软锭剂和漱口剂。
适于直肠施用的药物制剂可以以栓剂或者灌肠剂提供。
其中载体为固体并适于鼻施用的药物制剂包括颗粒大小为例如20-500微米并可通过鼻腔吸入方式给药的粗粉末，所述鼻腔吸入方式即从靠近鼻的盛有粉末的容器通过鼻通道迅速吸入。载体为液体的适于以鼻喷雾剂或滴鼻液施用的制剂包括活性成分的水溶液或油溶液。
适于吸入施用的药物制剂包括可以通过各种定量喷雾的气雾剂、喷雾器或吹入器产生的微细颗粒的粉尘或气雾。
适于阴道施用的药物制剂可以以阴道栓剂、卫生栓、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂提供。
适于肠胃外施用的药物制剂包括水性的或者非水性的无菌注射液，其中可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与目的受体的血液等渗的溶质；水性的或者非水性的无菌悬浮液，其中可以含有悬浮剂和增稠剂。制剂可以在单位剂量或多剂量容器中提供，如密封的安瓿或小瓶，并可在冻干(冷冻干燥)条件下保存，这样只需临用前加入无菌液体载体如注射用的水即可。现用现制型注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒和片剂制备。
优选的单位剂量制剂为含有上述日剂量或亚剂量或者其适当部分的活性成分的制剂。
应理解，除了以上特别提到的成分以外，制剂也可以包括与提到的制剂类型相关的其他本领域的常规药剂，例如适于口服的制剂可以包括调味剂。
另一方面本发明提供：
(i)至少一种本发明的核酸分子在制备用于治疗HIV感染的药物中的用途；
(ii)包括给对象施用有效量的至少一种本发明核酸分子的治疗HIV感染的方法。
参照下列实施例更详细的描述本发明，这些实施例不应理解为以任何方式限制本发明范围。
实施例涉及下列附图：
图1：分离结合R5向性HIV-1Ba-L的gp120的适体。(A)四轮筛选之后，2′F-RNA多克隆池(pool)表现出与HIV-1Ba-L gp120强烈和特异的结合，再一轮筛选富集结合作用。(B)适体B19结合来源于HIV-1Ba-L和HIV-1IIIB的gp120。所有实验中使用适体的浓度为100nM。
图2：单克隆适体对R5HIV-1株的中和。通过在100nM所示适体存在时在PBMC中进行有限稀释来滴定病毒。空心柱表明病毒感染性没有降低，阴影柱表明感染性降低10-100倍，阴影线柱表明感染性降低103-104倍，实心柱表明感染性降低＞104倍。A和B展示对HIV-1Ba-L的中和，其中适体自HIV-1Ba-L株起始产生。十七种适体以3-4log10IU/ml中和该病毒，两种适体B4和B84以高于4log10IU/ml抑制HIV-1Ba-L进入。(C)适体B4以浓度依赖性方式抑制HIV-1Ba-L的进入并且IC50值低于1nM。(D)至今检测了的适体中有5种也交叉中和另一R5株，HIV-1ADA。
图3：HIV-1Ba-L不能逃避适体B4的中和。(A)在适体B4存在下于PBMC中经过五轮筛选和传代HIV-1Ba-L之后，对四个突破性(break-through)病毒克隆的env扩增并测序，由此推导出gp120的预测序列。该序列与种子病毒(NIH510*)的序列和HIV-1Ba-L(M68893)的数据库序列比对。破折号指示未测序部分。“X”指示不确定的残基。点指示与数据库序列相同。(B)TCID50分析表明用100nM适体B4在人PBMC中完全中和克隆的HIV-1Ba-L来源的突破性原种(stock)。(C)图示表明用软件ID50统计学分析的TCID50数据，显示与对照适体相比，对HIV-1Ba-L突破性克隆的中和大于4log10IU/ml。结果代表所有克隆，因为所有4个突破性克隆同等地被中和。
图4：适体B4对mAb与gp120的结合的影响。用多克隆抗体在微量滴定板表面捕获重组Ba-L gp120。如果指明的话，结合的gp120然后被允许与可溶的CD4相互作用。然后结合的gp120或gp120/CD4复合物与不同浓度的适体B4一式三份孵育。然后gp120/适体或gp120/CD4/适体复合物与具有以前确定处于线性检测范围内的浓度的所示抗gp120mAb孵育。用抗-Ig-HRP系统检测结合的mAb。结果展示为与无适体的对照值相比下降的百分数±标准差。
实施例
材料和方法
病毒原种
本研究中所用HIV-1株均从AIDS Research and Reference ReagentProgram，NIAID，NIH，Bethesda，USA获得。HIV-1Ba-L由S.Gartner、MPopovic和R.Gallo(19)馈赠，HIV-1ADA由H.Gendelman(20)馈赠，HIV-1IIIB由R.Gallo(21)馈赠。
单克隆抗体
抗gp120单克隆抗体17b(22)，& 48d(23)2G12(24)IgG1 b12(25)以及多克隆人HIV-Ig抗体(26)从NIH AIDS Reagent Program(www.aidsreagent.org)获得。mAb 19b由美国康涅狄格大学(Farmington，Connecticut，06030)儿科系James Robinson友情提供。抗gp120-CD4复合体单克隆抗体CG10(27)以及重组CD4-Ig从NIBSC Centralised Facilityfor AIDS Reagents获得。抗FLAG M2和抗小鼠IgG HRD单克隆抗体购自Sigma。
细胞
草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞由Ian Jones(ReadingUniversity，UK)友情提供。
人白细胞从布里斯托尔医院服务部(Bristol Hospital Services)(通过牛津国家血液服务中心(the Oxford National Blood Services))提供的血沉棕黄层级分获得。
寡核苷酸(5’-3’列出)
“文库”寡核苷酸具有下列组成：AATTAACCCTCACTAAAGGGAACTGTTGTGAGTCTCATGTCGAA(N)49TTGAGCGTCTAGTCTTGTCT。
“5’引物”为：AATTAACCCTCACTAAAGGGAACTGTTGTGAGTCTCATGTCGAA
“3’引物”为：TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGACTAGACGCTCAA。
“Env6309+”引物为AGCAGAAGACAGTGGC。
“Env8023-”引物为TAGTGCTTCCTGCTGCTCC。
表达HIV-1Ba-Lgp120
Sf9细胞28℃下于SF 900II无血清昆虫培养基(GibcoBRL)中以低于1×106细胞/毫升悬浮培养。用500ng编码HIV-1Ba-LSU糖蛋白(gp120)的p2BaC-gp120(28)和线性化pAcBAK6(InVitrogen)的混合物根据标准方法(29)转染Sf9细胞以产生重组体病毒。细胞的感染复数为5，28℃孵育4天，这时gp120向培养基的分泌最佳。使用抗FLAG M2(Sigma)亲和层析从澄清培养物上清中纯化出gp120，级分通过SDS-PAGE和蛋白质印迹评价。蛋白质通过使用Superdex 200 HR10/30(Pharmacia)的FPLC凝胶过滤进一步纯化以去除高度聚集体，并用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce，Chester，UK)根据生产商说明进行定量。
体外转录
包含1mM 2′F UTP、1mM 2′F CTP(TriLink，USA)、1mM GTP、1mM ATP(Amersham-Pharmacia)、40mM Tris-Cl，pH7.5、6mMMgCl2、5mM DTT、1mM亚精胺和1500单位的T7 RNA 15聚合酶(New England BioLabs)的500μl终体积的转录体系中加入225pmol DNA模板并于37℃孵育16小时。每ng DNA模板加入1个单位无RNA酶的DNA酶I(Sigma)以终止转录，反应37℃孵育15-30分钟，随后用苯酚/氯仿进行抽提。RNA用乙醇沉淀，重新溶解于水中，通过Sephadex-G50nick旋转柱(Pharmacia-Amersham)分离出小分子量污染物并通过A260进行定量。水中加热至95℃3分钟然后冷却至室温10分钟使RNA重新折叠，在此温度下加入1/5体积的5×HBS缓冲液(终浓度：10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2，2.7mM KCl)，继续在室温下孵育5分钟。
体外筛选适体
使用BIAcore(Stevenage，UK)2000生物传感器。20000RU的HIV-1Ba-L gp120使用胺偶联通过赖氨酸残基根据标准方法(30)直接与CM5生物传感器芯片(研究级别；BIAcore)的羧甲基化的葡聚糖表面偶联。RNA如前所述预备在HBS中。进行第一轮筛选时，37℃下以1μl/min向固定有gp120的流动小室中注入20μg RNA池(理论多样性等于1014个分子)。5μl/min注入100μl HBS缓冲液去除非特异性结合的RNA。结合的RNA用5μl/min的100μl 7M尿素洗脱，用苯酚/氯仿抽提去蛋白，然后用乙醇沉淀。回收的RNA反转录成cDNA，在轻度致变条件下用所述3’和5’引物进行PCR扩增。每轮筛选，RNA和蛋白的比率增加大约4倍以增加选择的严紧性。每轮筛选时，都会用至少两个未偶联的传感器芯片流动小室对RNA进行预清除，以便作为对照并且也避免了无意中筛选到结合芯片基质的适体。
通过SPR生物传感器分析适体-gp120的相互作用
37℃下进行亲和测定。5000-7500RU的HIV-1 gp120如上所述共价固定到芯片上。适体或者对照核酸制备成一系列浓度(5nM-3 200nM)，以5μl/min注入(KININJECT方法)并允许解离60分钟。为了再生配体，注入1-5μl新鲜配制的100mM NaOH解离仍然结合的任何RNA(其不影响gp120结合可溶性CD4的能力)。数据用BIAevaluation 3.0(BIAcore)和GraphPad Prism 3.00(GraphPad software Inc.，USA)分析，从koff和kon的比率计算KD。
人外周血单个核细胞(PBMC)的培养
这些细胞通过Ficoll-Hypaque(Pharmacia-Amersham，UK)密度梯度离心来自正常的HIV阴性供体的肝素化血沉棕黄层而分离。保存稀释的自体血浆，加热灭活，澄清以提供用于白细胞培养的自体血清(AS)补充物。4℃下PBMC用PBS(Sigma)洗6次，基本上去除血小板和粒细胞。PBMC培养物在无有丝分裂原活化作用和不加入特异性生长因子如白介素-2的条件下培养，并保持在含2％AS的X-VIVO-10(Bio-Whittaker)中。此方法产生缓慢增殖的淋巴细胞和巨噬细胞的混合培养物，在我们的研究中此混合培养物比用有丝分裂原处理、添加细胞因子的培养物支持原代分离物的更高复制水平。
病毒感染性和中和试验
用已与100nM抗gp120的单克隆适体或对照适体SA19(17)孵育的连续稀释的病毒感染7天的PBMC。每稀释10倍用8个重复。感染16小时后包含病毒接种体和适体的培养基用新鲜培养基代替。维持培养物14天后制备用于LTR-PCR的DNA(如前所述(30))。
筛选适体逃逸突变体
为产生适体B4突破性变体，用预先与适体B4(1nM)孵育的HIV-1Ba-L(105IU)感染7天的人PBMC(107)。每隔一天收集细胞上清样品，直至出现致细胞病变效应。使用最高感染滴度的样品在无适体时感染新分化的PBMC以扩增病毒到约105IU/ml。根据同样的方法再进行四轮筛选和扩增，每一筛选使用增加浓度的B4适体(即5、15、50和100nM)。最后一轮筛选后，病毒通过在新鲜PBMC中有限稀释而克隆。使用Env6309+和Env8023-为引物和高保真PCR系统试剂盒(Roche，Germany)，从病毒阳性孔中PCR扩增env基因。原始种子HIV-1Ba-L病毒的env基因类似地获得。
通过抗体抑制而定位结合位点
通过主要如前述(32)但有如下改进的竞争性ELISA进行。简言之，在Immulon II ELISA板(Dynatech Ltd)上用D7324抗gp120 COOH多肽的抗血清(Aalto Bioreagents Plc)捕获gp120。洗过之后，结合的gp120与50μl HBS缓冲液或与含10μM可溶性人CD4的HBS缓冲液在室温下孵育1小时。洗涤ELISA板并一式三份加入50μl含一系列浓度的适体B4的HBS结合缓冲液1小时。以前面确定处于线性范围之内的浓度加入抗gp120 mAb。洗涤之后，用ABC Elite扩增试剂盒(Vector)检测结合的抗体。
结果
筛选针对HIV-1Ba-Lgp120
我们筛选了针对R5株HIV-1Ba-L gp120的含2’-氟嘧啶的RNA(2′-F-RNA)适体。靶蛋白如前述方法(28)产生，适体的筛选使用改进的SELEX方案(33，34)，其中靶蛋白固定在BIAcore生物传感器芯片上并且基于适体自靶蛋白的缓慢解离速率进行富集(图1A)。我们使用2′-F-RNA适体，因为这类适体不仅抗核酸酶，而且扩展了潜在的三级构象谱(16)，形成与未修饰的RNA或NH2-取代的RNA适体相比具更高亲合力的更紧密且刚性的配体(35)。
固定的gp120最初只能结合少于0.1％的所用RNA，但第二轮筛选时上升到1.5％，第三轮筛选时上升到16％，第四轮筛选时上升到60％，而第五轮筛选时上升到75％。TA克隆PCR扩增的第五轮筛选的DNA池。通过BIAcore分析对每一个克隆进行筛选，发现BIAcore分析确定的与gp120以高亲合力(Kd 5-100nM)结合的克隆属于至少25个不同的序列家族(表1)。虽然大多数单克隆的适体选择性地结合HIV-1Ba-Lgp120，但其中一些如B19显著结合HIV-1IIIB(一种X4病毒)来源的gp120(图1C)。总之，这些数据提示大量不同的序列能够折叠以产生结合gp120的适体，并且其中一些适体可能识别R5和X4株之间结构保守的gp120上的位点。
通过适体中和HIV-1
自然感染HIV-1过程中产生的抗体通常中和能力弱，并且在感染晚期产生(36)。此外，识别分离形式的gp120中出现的表位的单克隆抗体(mAb)通常不结合装配的病毒粒上相同的表位。这成为HIV-1对mAb中和作用具有相对抗性的基础，其尤其在原代分离物中显著。因此本研究中我们提出这样一个问题：针对HIV-1Ba-L gp120分离的适体能否防止或限制HIV-1感染靶细胞。使用终点稀释和基于PCR的TCID50鉴定法(31，38)，我们发现分析的27个适体克隆中有25个克隆在PBMC中中和同源HIV-1Ba-L(图2A和B)。大多数这些适体对HIV-1Ba-L的中和为1000倍以上，其中一种适体(B4)以约5log10中和病毒。在人PBMC中，B4抑制HIV-1Ba-L进入，50％抑制浓度(IC50)值小于1nM(图2C)。目前为止所有检测的中和HIV-1Ba-L的适体(包括B4)，也交叉中和另一R5株HIV-1ADA(图2D)。这两株的gp120只有84％相同，并且它们表现出不同程度的巨噬细胞向性(38)。因此，至少五种适体具有中和至少两种HIV-1株的能力，这表明它们可能识别gp120上至少在此B-亚型进化枝的R5成员之间保守的功能性重要位点。
HIV-1Ba-L不发生逃逸适体B4中和的突变
HIV-1在体内感染过程中响应选择压力容易发生突变，由此增殖能逃避免疫识别并对于抗病毒药物具有抗性的变体。最近研究表明HIV-1的突变体能够不依赖于使用替代共同受体而抵抗CCR5拮抗物的抑制作用(40)，并且类似逃逸变体可能具有增加的毒力的可能性也引起了对该药物使用的关注。因此如方法中所述，我们通过筛选用适体攻击后能在人PBMC中生长的突变体，检测了HIV-1Ba-L能否突变以逃避适体B4的中和作用。经过进行性增加适体浓度的五个循环筛选之后，分离了四个突破性病毒克隆。确定每一克隆中env基因的编码gp120的部分，25与亲代病毒的相应序列进行比较(图3A)。我们发现亲代序列与数据库中相应序列有1.9％的差异性，但是与数据库中任何其它HIV-1株相比，其与官方公布的Ba-L序列更接近地相关(分析未显示)。所有四个突破性克隆在gp120中都有几个额外氨基酸替代，包括在V3环顶端假定的中和作用表位中的替代。然后我们通过扩增HIV-1Ba-L-来源的克隆，然后再次用适体B4攻击扩增的病毒并感染人PBMC，检测了这些突变是否赋予了抗适体B4中和作用抗性。适体B4对所有突破性克隆的中和高达105倍(图3B和3C)，表明这些突变体没有赋予HIV-1Ba-L任何选择优势。这些数据表明适体B4可能结合在gp120中对HIV-1Ba-L的功能关键并因此不能发生对病毒无害的突变的区域。
适体B4结合gp120影响保守的CCR5结合表面
适体中和作用的一个可能机制是通过抑制病毒受体相互作用，然而使用SPR生物传感器分析，我们发现B4不干扰sCD4结合单体固定的gp120。接下来我们检测了B4是否干扰如下单克隆抗体的结合，其中该抗体的表位以前已在gp120上作图定位。我们选择的mAb都具中和作用，因为我们推测B4可能靠近保守的中和表位发生结合，而不靠近非中和表位。在检测的十个mAb中，只有一个mAb，即17b，确定地在无CD4时被适体抑制(见图4A)。抑制水平显著但在适体浓度最高时也只有50％，表明这两个分子与空间上相关但是截然不同的表面结合或者B4的结合导致17b的表位产生微妙的变构改变，从而在不彻底破坏结合的情况下降低了抗体的结合水平。在没有CD4结合在gp120的V1和V2超变环时，17b的表位部分地被遮掩而避开抗体的结合(23，42)，并且该表位和病毒主要的共同受体CCR5和CXCR4的结合位点有重叠(43)。第二抗体48d的结合象17b一样作图定位于“CD4i”表位处，在无CD4时被高浓度的适体抑制，而在CD4存在时被纳摩尔的适体抑制(见图4b)。第三结合CD4i的抗体CG10根本不受适体B4的抑制。
讨论
我们提出了一种新策略用于鉴定可作为潜在治疗剂靶点的原代HIV-1分离物包膜上的保守区域。适体的小尺寸和它的生物物理特性使我们可以靶定HIV-1 gp120上的保守位点，其结合产生了高效的感染性中和作用。对来源于利用不同共同受体的HIV株的gp120复合体进行结构研究，表明虽然gp120的表面环为序列可变和拓扑学可变的但是含有主要受体相互作用表面的蛋白质的核心在三级结构上非常保守(12)。gp120单体的可变表面环之间的四级相互作用似乎已经进化到使病毒能逃避抗体中和的程度，但关键地也使gp120的保守核心暴露于较小配体如适体的干扰作用。
适体的中和作用的两个特性值得特别提到：效力和抗逃逸性。与大多数有效抗体如IgG1-b12和2G12相比，适体像B4降低R5病毒感染性的能力非常显著。这些抗体在浓度约为300nM时，典型地只降低R5株的感染性一个数量级(44)，然而100nM时的适体B4能降低R5株的感染性4个以上数量级。甚至最高可行浓度下抗体对PI HIV-1的特异性中和也很少超过两个数量级。其次，在体内(45)和体外(46)病毒都可以通过进化而迅速克服抗体介导的中和作用。
其它设计来干扰HIV进入的治疗策略包括gp41破坏性肽类似物(47-49)和CCR5的小分子配体(40)。最有前景的，如C34(50)和T-20(51)，其IC50值几乎与在此描述的适体(～2nM)相当。然而已经在临床试验中鉴定出抵抗肽T-20抑制作用的病毒变体(52)。
我们的结果为适体中和作用的机制提供了一些线索。适体B4既不干扰CD4和gp120间的相互作用，也不会干扰其gp120上的表位包含V3环、V1V2环和“沉默”面(“silent”face)上的糖的抗体的结合。具有效中和作用的适体B4部分地抑制mAb 17b和48d的结合的能力表明，中和作用的机制可能是干扰gp120和其共同受体CCR5间的相互作用。当CD4不与gp120结合时，17b/48d的表位在单体gp120上部分被遮蔽，而在有功能的三聚体gp120上则完全被遮蔽，这确保了在感染过程中只非常短暂地暴露于体液免疫反应的抗病毒作用(如果有的话)。相反地，可能因为其较小的大小或其生物物理性质，适体B4在无CD4结合时仍结合其中和位点。CD4依赖性的抗体48d与gp120的结合在存在CD4时更有效地受到适体B4的抑制，这暗示在未形成复合体的gp120上适体B4向48d表位的接近可能部分受阻。引起兴趣的是，我们发现作图定位于“CD4i”区域的第三抗体CG10根本不受适体B4的抑制。这与其表位的位置最靠近V1V2环底部因而它在这三个表位中被封闭的程度最高(15，53)是相一致的。综合B4结合位点高度保守的事实，这表明，如我们所希望的，适体方法鉴定了gp120上比先前使用抗体所可能鉴定的靶点更受限制且功能上也更重要的中和作用靶点。
参考文献
1.Finzi，D.，Blankson，J.，Siliciano，J.D.，Margolick，J.B.，Chadwick，K.，Pierson，T.，Smith，K.，Lisziewicz，J.，Lori，F.，Flexner，C.，Quinn，T.C.，Chaisson，R.E.，Rosenberg，E.，Walker，B.，Gange，S.，Gallant，J.& Siliciano，R.F.(1999)Nat Med 5，512-7.
2.Piot，P.，Bartos，M.，Ghys，P.D.，Walker，N.& Schwartlander，B.(2001)Nature 410，968-73.
3.Chesebro，B.，Nishio，J.，Perryman，S.，Cann，A.，O′Brien，W.，Chen，I.S.&Wehrly，K.(1991)J Virol 65，5782-9.
4.Mondor，I.，Moulard，M.，Ugolini，S.，Klasse，P.J.，Hoxie，J.，Amara，A.，Delaunay，T.，Wyatt，R.，Sodroski，J.& Sattentau，Q.J.(1998)Virology 248，394-405.
5.Chavda，S.C.，Griffin，P.，Han-Liu，Z.，Keys，B.，Vekony，M.A.& Cann，A.J.(1994)J Gen Virol 75(Pt 11)，3249-53.
6.Berger，E.A.，Doms，R.W.，Fenyo，E.M.，Korber，B.T.，Littman，D.R.，Moore，J.P.，Sattentau，Q.J.，Schuitemaker，H.，Sodroski，J.& Weiss，R.A.(1998)Nature 391，240.
7.Samson，M.，Libert，F.，Doranz，B.J.，Rucker，J.，Liesnard，C.，Farber，C.M.，Saragosti，S.，Lapoumeroulie，C.，Cognaux，J.，Forceille，C.，Muyldermans，G.，Verhofstede，C.，Burtonboy，G.，Georges，M.，Imai，T.，Rana，S.，Yi，Y.，Smyth，R.J.，Collman，R.G.，Doms，R.W.，Vassart，G.& Parmentier，M.(1996)Nature 382，722-5.
8.Gendelman，H.E.，Orenstein，J.M.，Baca，L.M.，Weiser，B.，Burger，H.，Kalter，D.C.& Meltzer，M.S.(1989)Aids 3，475-95.
9.Ping，L.H.，Nelson，J.A.，Hoffman，I.F.，Schock，J.，Lamers，S.L.，Goodman，M.，Vernazza，P.，Kazembe，P.，Maida，M.，Zimba，D.，Goodenow，M.M.，Eron，J.J.，Jr.，Fiscus，S.A.，Cohen，M.S.& Swanstrom，R.(1999)JVirol 73，6271-81.
10.Mosier，D.& Sieburg，H.(1994)Immunol Today 15，332-9.
11.Kwong，P.D.，Wyatt，R.，Robinson，J.，Sweet，R.W.，Sodroski，J.&Hendrickson，W.A.(1998)Nature 393，648-59.25
12.Kwong，P.D.，Wyatt，R.，Majeed，S.，Robinson，J.，Sweet，R.W.，Sodroski，J.&Hendrickson，W.A.(2000)Structure Fold Des 8，1329-39.
13.Cordonnier，A.，Montagnier，L.& Emerman，M.(1989)Nature 340，571-4.
14.Kowalski，M.，Potz，J.，Basiripour，L.，Dorfman，T.，Goh，W.C.，Terwilliger，E.，Dayton，A.，Rosen，C.，Haseltine，W.& Sodroski，J.(1987)Science 237，1351-5.30
15.Rizzuto，C.D.，Wyatt，R.，Hernandez-Ramos，N.，Sun，Y.，Kwong，P.D.，Hendrickson，W.A.& Sodroski，J.(1998)Science 280，1949-53.
16.Kraus，E.，James，W.& Barclay，A.N.(1998)J Immunol 160，5209-12.
17.Tahiri-Alaoui，A.，Frigotto，L.，Manville，N.，Ibrahim，J.，Romby，P.&James，W.(2002)Nucleic Acids Research 30，1-9.35
18.Sayer，N.，Ibrahim，J.，Turner，K.，Tahiri-Alaoui，A.& James，W.(2002)Biochem Biophys Res Comm in press.
19.Gartner，S.，Markovits，P.，Markovitz，D.M.，Betts，R.F.& Popovic，M.(1986)Jama 256，2365-71.
20.Gendelman，H.E.，Orenstein，J.M.，Martin，M.A.，Ferrua，C.，Mitra，R.，Phipps，T.，Wahl，L.A.，Lane，H.C.，Fauci，A.S.，Burke，D.S.& et al.(1988)J Exp Med 167，1428-41.
21.Barre-Sinoussi，F.，Chermann，J.C.，Rey，F.，Nugeyre，M.T.，Chamaret，S.，Gruest，J.，Dauguet，C.，Axler-Blin，C.，Vezinet-Brun，F.，Rouzioux，C.，Rozenbaum，W.& Montagnier，L.(1983)Science 220，868-71.
22.Sullivan，N.，Sun，Y.，Sattentau，Q.，Thali，M.，Wu，D.，Denisova，G.，Gerahoni，J.，Robinson，J.，Moore，J.& Sodroski，J.(1998)J Virol 72，4694-703.
23.Thali，M.，Moore，J.P.，Furman，C.，Charles，M.，Ho，D.D.，Robinson，J.&Sodroski，J.(1993)J Virol 67，3978-88.
24.Buchacher，A.，Predl，R.，Strutzenberger，K.，Steinfellner，W.，Trkola，A.，Purtscher，M.，Gruber，G.，Tauer，C.，Steindl，F.，Jungbauer，A.& et al.(1994)AIDS Res Hum Retroviruses 10，359-69.
25.Burton，D.R.，Barbas，C.F.，3rd，Persson，M.A.，Koenig，S.，Chanock，R.M.& Lerner，R.A.(1991)Proc Natl Acad Sci U S A 88，10134-7.
26.Prince，A.M.，Reesink，H.，Pascual，D.，Horowitz，B.，Hewlett，I.，Murthy，K.K.，Cobb，K.E.& Eichberg，J.W.(1991)AIDS Res Hum Retroviruses 7，971-3.
27.Gershoni，J.M.，Denisova，G.，Raviv，D.，Smorodinsky，N.I.& Buyaner，D.(1993)Faseb J 7，1185-7.
28.Lin，C.L.，Sewell，A.K.，Gao，G.F.，Whelan，K.T.，Phillips，R.E.&Austyn，J.M.(2000)J Exp Med 192，587-94.
29.King，L.& Possee，R.(1992)The Baculovirus expression system：alaboratory guide(Chapman & Hall，London).
30.Karlsson，R.，Michaelsson，A.& Mattsson，L.(1991)J Immunol Methods145，229-40.
31.Collin，M.，Herbein，G.，Montaner，L.& Gordon，S.(1993)Res Virol 144，13-9.
32.Moore，J.P.，McKeating，J.A.，Jones，I.M.，Stephens，P.E.，Clements，G.，Thomson，S.& Weiss，R.A.(1990)Aids 4，307-15.
33.Ellington，A.D.& Szostak，J.W.(1990)Nature 346，818-22.
34.Fitzwater，T.& Polisky，B.(1996)Methods Enzymol 267，275-301.
35.Pagratis，N.C.，Bell，C.，Chang，Y.F.，Jennings，S.，Fitzwater，T.，Jellinek，
D.& Dang，C.(1997)Nat Biotechnol 15，68-73.
36.Pilgrim，A.K.，Pantaleo，G.，Cohen，O.J.，Fink，L.M.，Zhou，J.Y.，Zhou，J.T.，Bolognesi，D.P.，Fauci，A.S.& Montefiori，D.C.(1997)J Infect Dis 176，924-32.
37.Moore，J.P.& Ho，D.D.(1995)Aids 9，S117-36.
38.Collin，M.，Illei，P.，James，W.& Gordon，S.(1994)J Gen Virol 75，1597-1603.
39.Borrow，P.，Lewicki，H.，Wei，X.，Horwitz，M.S.，Peffer，N.，Meyers，H.，Nelson，J.A.，Gairin，J.E.，Hahn，B.H.，Oldstone，M.B.& Shaw，G.M.(1997)Nat Med 3，205-11.
40.Trkola，A.，Kuhmann，S.E.，Strizki，J.M.，Maxwell，E.，Ketas，T.，Morgan，T.，Pugach，P.，Xu，S.，Wojcik，L.，Tagat，J.，Palani，A.，Shapiro，S.，Clader，J.W.，McCombie，S.，Reyes，G.R.，Baroudy，B.M.& Moore，J.P.(2002)ProcNatl Acad Sci U S A 99，395-400.
41.Michael，N.L.& Moore，J.P.(1999)Nat Med 5，740-2.
42.Wyatt，R.，Moore，J.，Accola，M.，Desjardin，E.，Robinson，J.& Sodroski，J.(1995)J Virol 69，5723-33.
43.Wu，L.，Gerard，N.P.，Wyatt，R.，Choe，H.，Parolin，C.，Ruffing，N.，Borsetti，A.，Cardoso，A.A.，Desjardin，E.，Newman，W.，Gerard，C.&Sodroski，J.(1996)Nature 384，179-83.
44.Zwick，M.B.，Wang，M.，Poignard，P.，Stiegler，G.，Katinger，H.，Burton，D.R.& Parren，P.W.(2001)J Virol 75，12198-208.
45.McKeating，J.A.，Gow，J.，Goudsmit，J.，Pearl，L.H.，Mulder，C.& Weiss，R.A.(1989)Aids 3，777-84.
46.Arendrup，M.，Nielsen，C.，Hansen，J.E.，Pedersen，C.，Mathiesen，L.&Nielsen，J.O.(1992)J Acquir Immune Defic Syndr 5，303-7.
47.Kilby，J.M.，Hopkins，S.，Venetta，T.M.，DiMassimo，B.，Cloud，G.A.，Lee，J.Y.，Alldredge，L.，Hunter，E.，Lambert，D.，Bolognesi，D.，Matthews，T.，Johnson，M.R.，Nowak，M.A.，Shaw，G.M.& Saag，M.S.(1998)Nat Med 4，1302-7.
48.Ferrer，M.，Kapoor，T.M.，Strassmaier，T.，Weissenhorn，W.，Skehel，J.J.，Oprian，D.，Schreiber，S.L.，Wiley，D.C.& Harrison，S.C.(1999)Nat StructBiol 6，953-60.
49.Bewley，C.A.，Louis，J.M.，Ghirlando，R.& Clore，G.M.(2002)J.Biol.Chem.277，14238-14245.25
50.Chan，D.C.，Chutkowski，C.T.& Kim，P.S.(1998)Proc Natl Acad Sci US A 95，15613-7.
51.Kilby，J.M.，Hopkins，S.，Venetta，T.M.，DiMassimo，B.，Cloud，G.A.，Lee，J.Y.，Alldredge，L.，Hunter，E.，Lambert，D.，Bolognesi，D.，Matthews，T.，Johnson，M.R.，Nowak，M.A.，Shaw，G.M.& Saag，M.S.(1998)Nat Med 4，1302-7.
52.Zollner，B.，Feucht，H.H.，Schroter，M.，Schafer，P.，Plettenberg，A.，Stoehr，A.& Laufs，R.(2001)Aids 15，935-6.
53.Rizzuto，C.& Sodroski，J.(2000)AIDS Res Hum Retroviruses 16，741-9
表1
B1    CACCUACUAGACCACUUUUUGAGCCGGUUUUUUCGGGAACUUGCCAA
B3    GACCGGUGUGUCCUGAUCCAACUGCCACAAGUACCAUAUGCAGGUGACGU
B4    GAGCGGUUAAGGGAGAUUUAGGCAGCAGCUUGGACAGUGUAUCGGCUGAG
B5    GGGCGCUUAAUGUAUGCCGUAUGACCCUCAACAUCCGACUCAGUUAAGC
B9    CCUCUUGCACCGCCGAGAAUAUAAUUCAAGAGGUCCACAACUAAUUAG
B11   CCAAGGGCUAAGUCCGCAAAUAUCCUUCCUAAAGGACUCGUUACGUCGG
B19   AGACCUUAUACCUGAGAUUACACGCUCUUCGAGCACGUCGAC
B28   GCGAAAACUCCGAUUUUCCUCUGUAGUGAUGGGAUUUUCCCGCCUGAACC
B30   CACCUACCUAAUUAUUAAACUUUGGGCAGUAUCCCGCUUUGCUUCUUAUC
B31   GUUUAUAUAUACACAGGUUAAGCGUAACUUCGCUGGACAGCAAGAAUCCU
B33   CAUUGGCCAAUUCCUUGAAUCUCGACUGCUCGGUAGAAUAGACCUUACCA
B36   AGGAGAAUUAUGAGCGGGACAACUUCGUUCCGUGUUCGCGUACUGAGCGC
B38   CUUCUCCCUUGAGGGCCCCAUGACCUGACUGUAGAUAUCUGCCCUCGAG
B40   UGUGGGCCACGCCCGAUUUUACGCUUUUACCCGCACGCGAUUGGUUUGUU
B44   CAGUCGUCAUGGUUAUAGCUGCCACAACCUCGGUCCUGUCUUCAACGGCC
B45   GUCAAGUGCACACCCUUGCUCGUUUCUCGAUCGCCACAACCGAUUCCAAG
B55   CUUGCCGUAGACCCAUUUUCCAAUCACAAGUCACGCGUCUCAAGCUGUUA
B62   CCCGUACCACCACACCCUAUGCACAUCGUUGUUUGUCGUCUUUCCCGCAU
B81   AGUUUCAUCGUCCGAGCAAGAUCCUAAUGGCGUCCGGCGCGUUUAUGACU
B82     CCCCCAUGGCACGCCGAUCACGUUUUGCUGUCCGCCGGUCCAUAAAUACU
B84     AUGACGUACCCGCACAAGCCACCACAAGUCUUAAUCGCGCCACCCUUGC
B86     ACGUGCUCUCAUCUUUUAAUUCGUGGGCUCUGCGGCUGCCUCUUAGCUC
B114    CAUUACAGCGAAGUUACCAGCCAUACACGGUACAAAUGCGCCCGACUAGU
B116    GACGGCAACCCGUUAUAACCUCCCACUGGCUAUCCCGUUAAGCUUCCCUA
B132    UCACCUGUACACUACCUCUACCAUGCUUGAGCCUACGCCGCCGACACCC
B136    CGUAUUCAUCAGGUAGCGUAGAUCCGUGUGGCGGGCUGUUCCAUUUUA
B137    GCCAGGGUUCAUCAUUCACGGCCGAUUUCGAAGCUCCUAACUCGAGACAC

Claims (12)

1.核酸分子，其能结合有包膜病毒的包膜糖蛋白并中和所述病毒。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述病毒为HIV。
3.权利要求1或权利要求2的核酸分子，其中所述病毒是HIV-1。
4.权利要求1到3之任一项的核酸分子，其中包膜糖蛋白为gp120。
5.权利要求1到4之任一项的核酸分子，其中所述的核酸分子选自表1所列的核酸分子。
6.权利要求1到5之任一项的核酸分子，其中所述的核酸分子包含经修饰的核苷酸。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述的经修饰碱基是通过以下任一种或多种方式修饰的：
(i)用I、Br、Cl、CH3修饰嘧啶的6位或8位、或嘌呤的5位；；
(ii)用NH3修饰嘧啶的2位；
(iii)O6-CH3、N6-CH3和N2-CH3嘧啶修饰；
(iv)2’糖修饰；
(v)3’和/或5’加帽。
8.使用权利要求1至7之任一项的核酸分子筛选潜在治疗靶点的方法。
9.权利要求8的方法，其中所述方法涉及竞争性抑制。
10.药物组合物，其包含至少一种权利要求1至7之任一项的核酸分子，以及任选地一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
11.权利要求1-7之任一项的核酸分子在制备用于治疗HIV感染的药物中的用途。
12.治疗HIV感染的方法，其包括给需要该治疗的对象施用有效量的至少一种权利要求1-7之任一项的核酸分子。
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WO (1) WO2004043996A2 (zh)
ZA (1) ZA200504733B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101782570A (zh) * 2008-12-25 2010-07-21 国家纳米技术与工程研究院 一种生物分子竞争分析方法及其应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070166741A1 (en) 1998-12-14 2007-07-19 Somalogic, Incorporated Multiplexed analyses of test samples
GB0503145D0 (en) * 2005-02-15 2005-03-23 Isis Innovation Compounds
US20110136099A1 (en) 2007-01-16 2011-06-09 Somalogic, Inc. Multiplexed Analyses of Test Samples
US7947447B2 (en) 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US8975026B2 (en) 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
EP2336314A1 (en) * 2007-07-17 2011-06-22 Somalogic, Inc. Improved selex and photoselex
US8703416B2 (en) 2008-07-17 2014-04-22 Somalogic, Inc. Method for purification and identification of sperm cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756710A (en) * 1996-06-05 1998-05-26 The Trustees Of Columbia University In City Of New York Phosphorothioate oligonucleotides that bind to the V3-loop and uses thereof
US6506887B1 (en) * 1999-07-29 2003-01-14 Somalogic, Incorporated Conditional-selex
JP3463098B2 (ja) * 1999-10-08 2003-11-05 独立行政法人産業技術総合研究所 モジュレートアプタマー及びこれを用いた標的タンパク質の検出方法
US20040006035A1 (en) * 2001-05-29 2004-01-08 Dennis Macejak Nucleic acid mediated disruption of HIV fusogenic peptide interactions
WO2003102131A2 (en) * 2002-04-22 2003-12-11 Sirna Therapeutics Inc. Nucleic acid mediated disruption of hiv fusogenic peptide interactions
US6989442B2 (en) * 2002-07-12 2006-01-24 Sirna Therapeutics, Inc. Deprotection and purification of oligonucleotides and their derivatives
US9303262B2 (en) * 2002-09-17 2016-04-05 Archemix Llc Methods for identifying aptamer regulators

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101782570A (zh) * 2008-12-25 2010-07-21 国家纳米技术与工程研究院 一种生物分子竞争分析方法及其应用

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