JP2006523084A - リガンド - Google Patents
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Abstract
Description
ウイルスは好ましくはHIV、さらに好ましくはHIV−1である。好ましい一実施形態では、糖タンパク質はgp120である。
「エンベロープを有する」ウイルスという用語は、当業者に十分公知のウイルスであり、例えばレトロウイルスのように、エンベロープを保有するウイルスファミリーのことを呼ぶ。
アプタマーを当業者に十分公知の方法、例えば固相合成により調製できる。(Ogilvie, K.K.ら(1988)Proc、Natl、Acad.Sci.U.S.A 85(16)5764〜8頁;Scaringe、S.A(2000)Methods Enzymol 317 3〜18頁)又はin vitro転写(Heidenreich、0.、W.Peiken及びF.Eckstein(1993)Faseb J.7(1)90〜6頁)。
(i)HIV感染症の治療に使用するための薬物の製造に本発明の少なくとも1つの核酸分子を使用すること、及び
(ii)本発明の少なくとも1つの核酸分子の有効量を対象に投与することを含むHIV感染症の治療法
を提供する。
保有ウイルス
本研究に使用した総てのHIV−1株は、米国のベセスダにあるNIH、NIAIDにおけるAIDS研究及び基準試薬プログラムを通じて入手した。HIV−1Ba−Lは、S. Gartner,M Popovic及びR. Gallo(19)から、HIV−IADAはH. Gendelman(20)から、HIV−1111BはR. Gallo(21)から寄贈された。
抗gp120モノクローナル抗体17b(22)、48d(23)、2G12(24)及びIgG1 b12(25)、ならびにポリクローナルヒトHIV−Ig(26)は、NIH AIDS試薬プログラム(www.aidsreagent.org)から入手した。mAb 19bは、米国のコネチカット州06030、ファーミントンにあるコネチカット大学小児科のJames Robinsonから親切に分与された。抗gp120−CD4複合体モノクローナル抗体CG10(27)及び組換えCD4−Igは、AIDS試薬のためのNIBSC中央施設から入手した。抗FLAG M2と抗マウスIgG HRPのモノクローナル抗体はSigmaから入手した。
Spodoptera frugiperda Sf9細胞は、Ian Jones(レディング大学、イギリス)から親切に分与された。
ヒト白血球は、オックスフォード国立血液サービスを介してブリストル病院サービスにより供給されたバフィーコート画分から得た。
「ライブラリー」オリゴヌクレオチドは、以下の組成を有した。AATTAACCCTCACTAAAGGGAACTGTTGTGAGTCTCATGTCGAA (N)49TTGAGCGTCTAGTCTTGTCT
「5′プライマー」は、AATTAACCCTCACTAAAGGGAACTGTTGTGAGTCTCATGTCGAAで、
「3′プライマー」は、TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGACTAGACGCTCAAであった。
「Env6309+」プライマーは、AGCAGAAGACAGTGGCであった。
「Env8023−」プライマーは、TAGTGCTTCCTGCTGCTCCであった。
Sf9細胞は、SF900II昆虫用無血清培地(GibcoBRL)中、28℃で、1×106細胞/ml未満のサスペンションカルチャーで培養した。標準法に従って組換えウイルスを発生させるために、HIV−1Ba−LのSU糖タンパク質(gp120)をコードするp2BaC−gp120(28)と線状化pAcBAK6(Invitrogen)の混合物500ngでSf9細胞をトランスフェクトした(29)。細胞を5m.o.i.で感染させ、28℃で4日間培養すると、その時に培地へのgp120の分泌が最適であった。gp120は、抗FLAG M2(Sigma)アフィニティクロマトグラフィーを用いて、清澄な培養上清から精製され、画分は、SDS−PAGE及びウエスタンブロットにより評価した。タンパク質は、高次凝集物を除くために、Superdex200 HR10/30(Pharmacia)を用いたFPLCゲルろ過によってさらに精製し、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce、チェスター、イギリス)を用いて、製造業者の取扱説明書に従って定量した。
1mMの2′F UTP、1mMの2′F CTP(TriLink、米国)、1mMのGTP、1mMのATP(Amersham−Pharmacia)、40mMのTris−Cl(pH7.5)、6mMのMgCl2、5mMのDTT、1mMのスペルミジン及び1500ユニットのT7 RNA15ポリメラーゼ(New England BioLabs)を含む転写反応液に225pmolのDNAテンプレートを加えて終体積500μlとし、37℃で16時間インキュベートした。RNアーゼを含まないDNアーゼI(Sigma)を、用いたDNAテンプレート1ngあたり1ユニット添加することにより転写を終了させ、反応液を37℃で15〜30分間インキュベートし、引き続きフェノール/クロロホルム抽出を行った。RNAをエタノールで沈殿させ、水に再溶解させ、Sephadex−G50ニックスピンカラム(Pharmacia−Amersham)を用いて低分子量の混入物と分離し、A260の測定により定量した。RNAは、95℃で3分間、水中で加熱し、10分間室温まで冷却することにより再フォールディングさせ、その温度で1/5体積の5×HBS緩衝液を添加し(最終濃度:10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、2.7mM KCl)、室温での放置を5分間続けた。
BIAcore(Stevenage、イギリス)2000バイオセンサー装置を使用した。20000RUのHIV−1Ba−Lのgp120は、標準プロトコル(30)に従って、リシン残基を介したアミン結合を用いてCM5バイオセンサーチップ(研究用等級、BIAcore)のカルボキシメチル化デキストラン表面に直接結合させた。RNAは、上記のようにHBSに溶かして調製した。1回目の選択では、20μgのRNAプール(理論的な多様性は1014分子)が、gp120を固定化したフローセルに、37℃で1μl/minの流速で注入された。非特異的に結合したRNAは、100μlのHBS緩衝液を5μl/minの速度で注入することにより除いた。結合したRNAは、5μl/minの速度で、100μlの7Mの尿素を用いて溶離させ、フェノール/クロロホルム抽出により除タンパクした後、エタノールで沈殿させた。回収したRNAは、逆転写してcDNAにし、わずかな変異誘発条件下で、すでに記載した3′及び5′プライマーを用いてPCR増幅させた。RNA:タンパク質の比は、選択のストリンジェンシーを上げるために各回で約4まで上昇させた。総ての選択回で、RNAは対照としての機能する2つの未結合のセンサーチップフローセルを先に通過させ、これは、チップマトリックスに結合することによるアプタマーの偶発的な選択を避けるためでもあった。
親和性の測定は、37℃で行った。5000〜7500RUのHIV−1gp120は、上記のようにチップ上に共有結合的に固定化された。アプタマー又は対照核酸は、一連の濃度(5nMから3200nM)で調製され、5μl/minの速度で注入し(KININJECT法)、60分経過後に解離させた。可溶性CD4と結合するgp120の能力に影響を与えることなく、まだ結合している総てのRNAを解離させるために、新鮮調製した100mMのNaOH1〜5μlを注入してリガンドを再生させた。データは、BIAevaluation3.0(BIAcore)及びGraphPad Prism3.00(GraphPad software Inc.、米国)を用いて解析し、KDはkoff及びkonの比から計算した。
正常なHIV陰性ドナーのヘパリン処理バフィーコートからFicoll−Hypaque(Pharmacia−Amersham、イギリス)密度勾配遠心分離によりこれらの細胞を単離した。希釈した自己血漿は、貯蔵し、熱不活性化し、清澄化して、白血球培養用の自己血清(AS)の補充に供した。PBMCは、4℃のPBS(Sigma)で6回洗浄し、血小板及び顆粒球を本質的に含まないようにした。PBMCの培養は、マイトジェンによる活性化をすることなく、IL−2のような特異的増殖因子の添加をすることなく行い、2%のASを含有するX−VIVO−10(Bio−Whittaker)で維持した。この方法は、ゆっくりと増殖するリンパ球とマクロファージの混合培養を生成し、マイトジェンで処理されサイトカインを補充された培養よりも初代単離物の高レベルの複製を我々の手で補助するものである。
第7日目のPBMCに、100nMの抗gp120モノクローナルアプタマー又は対照アプタマーSA19(17)とインキュベートしたウイルスを段階希釈して感染させた。8個のレプリケートが、各10倍希釈して使われた。感染の16時間後、接種したウイルス及びアプタマーを含有する培地は、新鮮培地と交換した。培養を14日間維持してから、以前に記載された(31)ようにLTR−PCR用のDNAを調製した。
アプタマーB4ブレークスルー変異株を発生させるために、第7日目のヒトPBMC(107)に、アプタマーB4(1nM)と予めインキュベートしたHIV−1Ba−L(105IU)を感染させた。細胞変性作用が現れるまで、細胞上清試料を2日毎に集めた。最高の感染力価を有する試料が、アプタマーの非存在下で新たに分化したPBMCに感染するために使用され、これによりウイルスを約105IU/mlまで増幅させることができる。同じプロトコルに従って、選択と増幅をさらに4回繰り返し、各選択では使用するアプタマーB4の濃度を上げていった(すなわち 5、15、50及び100nM)。最終回の選択を行った後に、新鮮PBMC中で限界希釈することでウイルスをクローニングした。Env6309+及びEnv8023−プライマー対及び高フィデリティーPCRシステムキット(ロシュ、ドイツ)を用いて、ウイルス陽性のウェルからenv遺伝子をPCR増幅させた。起源となるHIV−1Ba−Lの種ウイルスのenv遺伝子についても同様に得た。
以前に記載された(32)ものを以下のように修正して、主として競合ELISAによりこれを行った。簡潔には、D7324抗gp120 COOHペプチド抗血清(Aalto Bioreagents Plc.)を用いて、Immulon II ELISAプレート(Dynatech Ltd)にgp120を捕捉した。洗浄後、結合したgp120は、HBS緩衝液又はHBS緩衝液で溶解した10μMの可溶性ヒトCD4溶液50μlと共に室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、HBS結合緩衝液で溶解したアプタマーB4溶液50μlを、一連の濃度で3回の反復として加え、1時間放置した。抗gp120mAbを、予め直線範囲であると決定した濃度で添加した。洗浄後、結合した抗体をABC Elite増幅キット(Vector)を用いて検出した。
HIV−1 Ba−L のgp120に対するアプタマーの選択
我々はR5株であるHIV−1Ba−Lのgp120に対する2′−フルオロピリミジン含有RNA(2′−F−RNA)アプタマーを選択した。標的タンパク質は、以前に記載されたように産生させ(28)、アプタマーの選択は、BIAcoreバイオセンサーチップ上に標的を固定化し、濃縮が標的からのアプタマーの解離速度が遅いことに基づいたSELEXプロトコルの変法(33,34)を使用して行った(図1A)。2′F−RNAアプタマーは、ヌクレアーゼに耐性であるばかりでなく、潜在的な四次コンホメーションのスペクトルを広げ(16)、未修飾RNA又はNH2置換RNAアプタマーと比べて高い親和性を有する、よりコンパクトで頑健なリガンドを生じることから、我々は2′F−RNAアプタマーを使用した(35)。
HIV−1による自然感染時に誘発された抗体は、一般に中和作用に乏しく、感染後期に発生する(36)。さらに、単離されたgp120の形で提示されるエピトープを認識するモノクローナル抗体(mAb)は、集合したビリオンとの関係では、通常同じエピトープと結合しない(37)。mAbによる中和に対するHIV−1の相対的な抵抗性はこれによるものであって、初代単離物では特にはっきりしている。従って、本研究では、HIV−1Ba−Lのgp120に対して単離されたアプタマーが標的細胞のHIV−1感染性を防止又は制限できるかどうかについて我々は尋ねた。終点希釈及びPCRに基づくTCID50アッセイ(31、38)を用いて、我々はアッセイされたアプタマークローン27個のうち25個がPBMC中のHIV−1Ba−Lホモログを中和することを示した(図2A及びB)。これらのアプタマーのほとんどが1000倍を超えてHIV−1Ba−Lを中和し、1つのアプタマー(B4)は5log10でウイルスを中和した。B4はヒトPBMC中で1nM未満の50%阻害濃度(IC50)の値でHIV−1Ba−Lの侵入を阻害した(図2C)。B4を含めてこれまでに試験されたHIV−1Ba−Lを中和するアプタマーは総て、別のR5株であるHIV−1ADAも交差中和した(図2D)。これらの2つの株のgp120は84%しか同一でなく、マクロファージ向性の程度が異なる(38)。従って、少なくとも2つのHIV−1株を中和するための少なくとも5つのアプタマーの能力は、それらが少なくともこのクレードBサブタイプのR5メンバーの間で保存されているgp120の機能的に重要な部位を認識する可能性があることを示唆している。
HIV−1は、淘汰圧に応じて、in vivoでの感染時に容易に突然変異し、これにより、免疫による認識をエスケープでき抗ウイルス薬に耐性になることができる変異体を増殖させる(39)。HIV−1の突然変異体は、代替補助受容体の使用に頼ることなく、CCR5拮抗薬の阻害作用に抵抗することができ(40)、類似のエスケープ変異体が病原性を増加させたかもしれないという可能性がそのような薬物の使用への関心を起こす(41)ことが最近示された。従って、我々はHIV−1Ba−Lが、突然変異してアプタマーB4による中和をエスケープできるかどうかを、方法の項に記載したように、アプタマーでチャレンジした後にヒトPBMC中で増殖できる変異体を選択することにより試験した。アプタマー濃度を段階的に上げた5回の選択を行った後で、ウイルスの4つのブレークスルークローンを単離した。env遺伝子のうちgp120をコードする部分を各クローンについて決定し、親ウイルスのその部分と比較した(図3A)。データベース上の他のいかなるHIV−1株の配列に比べて公式のBa−L配列とより密接に関係していたが、親配列がデータベースにおける配列と1.9%異なっていることを我々は観察した(分析を示さず)。4つのブレークスルークローンの総てが、V3ループの先端の推定上の中和エピトープ内を含めて、gp120にいくつかの追加のアミノ酸置換を有していた。次に、我々は、これらの突然変異がHIV−1Ba−L由来クローンを増殖させることによりアプタマーB4による中和抵抗性を付与したかどうかについて試験し、増殖したウイルスにアプタマーB4を再チャレンジさせ、ヒトPBMCに感染させた。アプタマーB4は総てのブレークスルークローンを105倍まで中和した(図3B及び3C)。このことは、突然変異がHIV−1Ba−Lに選択的な利点を何ら付与しなかったことを示している。これらの結果は、アプタマーB4がHIV−1Ba−Lの機能に重大なgp120の領域と結合し、従ってウイルスに対する有害作用を及ぼすことなしに突然変異できないことを示唆している。
アプタマーによる中和のメカニズムと思われるものは、ウイルス受容体の相互作用の阻害によるものである。しかしながら、SPRバイオセンサー分析を用いて、単量体の固定化したgp120に対するsCD4の結合を、B4が妨害しないことを発見した。我々は次に、gp120上のエピトープを以前にマッピングしたモノクローナル抗体の結合をB4が妨害するかどうかについて試験した。我々は、非中和エピトープよりもむしろ保存された中和エピトープ近くでB4が結合するようであると仮定したように、我々が選んだmAbは総て中和した。試験した10個のmAbのうちの1つ、17bだけがCD4の非存在下でアプタマーにより説得力をもって阻害された(図4A参照)。阻害レベルは有意であったが、最高濃度のアプタマーでも50%だけであり、このことは2つの分子の一方が空間的に関係しているが異なる面に結合したか、又はB4の結合が17bのエピトープにおけるわずかなアロステリック変化を引き起こし、抗体の結合を打ち消すことなくその結合レベルを減少させたことを示唆している。17bエピトープは、gp120のV1及びV2超可変ループによって、CD4結合の非存在下で抗体から部分的に隠され(23、42)、ウイルスの主要補助受容体CCR5及びCXCR4の結合部位と重複している(43)。17bのように「CD4i」エピトープに位置する2番目の抗体48dの結合は、CD4の非存在下で高濃度のアプタマーにより阻害されたが、CD4の存在下ではナノモル濃度で阻害された(図4b参照)。3番目のCD4i結合抗体であるCG10はアプタマーB4により全く阻害されなかった。
我々は、潜在的な治療剤によりターゲティングできるHIV−1の一次単離物のエンベロープの保存領域を同定するための新規な戦略を提示する。アプタマーのサイズが小さいこと及び生物物理学的性質により、我々はHIV−1のgp120の保存された部位をターゲティングすることができ、その部位への結合は感染性に対して高度に有効な中和をもたらした。補助受容体の利用が異なるHIV株由来のgp120複合体の構造についての研究は、gp120の表面ループが可変配列で可変トポロジーであるが、主要な受容体相互作用を行う表面を含むタンパク質のコアは、三次構造において顕著に保存されていることを示している(12)。gp120単量体の可変表面ループ間の四次相互作用は、ウイルスが抗体による中和をエスケープするように進化したものと思われるが、批判的に言えば、アプタマーのような比較的小さなリガンドによる妨害に対してgp120の保存されたコアを露出している。
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Claims (12)
- エンベロープを有するウイルスのエンベロープ糖タンパク質に結合でき、前記ウイルスを中和できる核酸分子。
- 前記ウイルスがHIVである、請求項1に記載の核酸分子。
- 前記ウイルスがHIV−1である、請求項1又は2に記載の核酸分子。
- 前記エンベロープ糖タンパク質がgp120である、請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が表1に示されるものから選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が修飾ヌクレオチドを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 前記修飾された塩基が以下の手段
(i)I、Br、Cl、CH3によるピリミジンの6もしくは8位、又はプリンの5位の修飾、
(ii)NH3によるピリミジンの2位の修飾、
(iii)ピリミジンの修飾O6−CH3、N6−CH3及びN2−CH3、
(iv)糖部2′位の修飾、
(v)3′位及び/又は5′位のキャッピング
の任意の1つ又は複数により修飾された、請求項6に記載の核酸分子。 - 請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸分子を利用した潜在的な治療ターゲットのスクリーニング法。
- 前記方法が競合阻害を伴う、請求項8に記載の方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸分子と、任意選択で1つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物。
- HIV感染症の治療に使用するための薬の製造における、請求項1から7のいずれか一項で記載された核酸分子の使用。
- HIV感染症の治療法であって、それを必要とする対象に請求項1から7のいずれか一項で記載された少なくとも1つの核酸分子の有効量を投与することを含む治療法。
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