JP2004522401A - ワクチンおよび治療薬としてのcd4非依存性のhivエンベロープタンパク質 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規のCD4非依存性のHIVエンベロープタンパク質およびそのための用途に関する。
Description
(関連出願の交差引用)
本出願は、1999年5月24日に出願された米国特許出願第09/317,556号の一部継続出願である。
【0001】
(連邦の後援に関する声明)
本発明は、米国政府からの資金(国立保健研究所(National Institute of Health)助成金第AI44308号および助成金第AI40880号)により部分的に援助され、そして米国政府は従って本発明においてある種の権利を有することができる。
【0002】
(発明の背景)
本発明は、HIVのCD4非依存性の変異体、それらのタンパク質およびそのための用途に関する。
【0003】
HIVの進入は、CD4および細胞のケモカイン受容体とのウイルスエンベロープ糖タンパク質(Env)の相互作用を必要とすることが既知である。HIVのEnvタンパク質は前駆体(gp160)として産生され、これはその後2部分、すなわちCD4およびケモカイン受容体を結合するgp120、ならびにウイルス膜中に固定されそして膜融合を媒介するgp41に切断される。HIVおよびSIVによるケモカイン受容体の示差的な使用は、多様な単離物の間の向性の差異を主に説明している(Berger、1997、AIDS 11:S3−S16;HoffmanとDoms、1998、AIDS 12:S17−S26)。多数のケモカイン受容体がHIVもしくはSIVにより利用されることができる(Dengら、1997、Nature 388:296−300;Choeら,1996、Cell 85、1135−1148;Ruckerら、1997、J.Virol.71:8999−9007;Edingerら、1997、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:14742−14747;Liaoら、1997、J.Exp.Med.185:2015−2023;Farzanら、1997、J.Exp.Med.186:405−411)一方、CCR5およびCXCR4はHIV−1の主要な補助受容体であるようである(Zhangら、1998、J Virol.72:9337−9344;Zhangら、1998、J.Virol.72:9337−9344)。感染を最初に確立するHIVの単離物は、CCR5を使用して血液のリンパ球およびマクロファージに標的を定める(Alkhatibら、1996、Science 272:1955−1958;Dengら、1996、Nature 381:661−666;Dragicら、1996、Nature 381:667−673;Doranzら、1996、Cell 85:1149−1158)一方、AIDSへの進行に一般に関連しかつインビトロでT細胞系を感染させることができるウイルスはCXCR4を使用する(Choeら、1996、Cell 85:1135−1148;Fengら、1996、Science 272:872−876;Connorら、1997、J.Exp.Med.185:621−628)。
【0004】
CD4へのEnvの結合は、gp120がケモカイン受容体に結合することを可能にしそしてウイルスおよび細胞膜の融合につながる、不十分に理解されたコンホメーション変化を開始させる(Jonesら、1998、J.Biol Chem.273:404−409;Mooreら、1994、J.Virol.68:469−484;Wyatt、1992、J.Virol.66:6997−7004;Wuら、1996、Nature 384:179−183)。免疫学的および突然変異誘発のアプローチは、これらの変化が、gp120上のV1/V2およびV3超可変ループの動きを必要とすることを示し(Mooreら、1994、J.Virol.68:469−484;Wyattら、1992、J.Virol.66:6997−7004;Wuら、1996、Nature 384:179−183)、これは、ケモカイン受容体の利用の特異性において決定的に重要な役割を演じている(Choeら、1996、Cell 85:1135−1148;Cocchiら、1996、Nature Med 2:1244−1247;Choら、1998、J.Virol.72:2509−2515;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139;Rossら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7682−7686;Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365)。CD4に結合されたgp120コアの構造の最近の結晶学的解像は、ケモカイン受容体の付加的な接触部位として作用することができる、gp120の内側ドメインと外側ドメインとの間の介入するβシート(「架橋シート」)を示した(WyattとSodroski、1998、Science 280:1884−1888;Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。
【0005】
CD4は、一般に、gp120がケモカイン受容体と会合するのに必要とされるが、HIV−1、HIV−2、およびSIVのCD4非依存性の単離物の同定は、ケモカイン受容体との機能的相互作用がCD4の相互作用の非存在下で発生する可能性があることを立証した(Edingerら、1997、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:14742−14747;ReevesとSchulz、1996、J.Virol.71:1453−1465;Endresら、1996、Cell 87:745−756;Dumonceauxら、1998、J.Virol.72:512−519)。CD4非依存性の表現型の決定子はウイルスのenv遺伝子に位置づけられているが、しかし、この表現型の根底にある機構は未知である。env中の突然変異はgp120上のケモカイン受容体結合部位の露出および/もしくは親和性を増大させることができ、かようにCD4に対する必要性を回避することが提案されている(Endresら、1996、Cell 87:745−756)。
【0006】
生化学的アッセイは、突然変異されたもしくは脱グリコシル化された組換えgp120がケモカイン受容体に直接結合することができることもまた示しており、通常はCD4により活性化されるドメインを人工的に露出させることができることを示唆している(Hesselgesserら、1997、Curr.Biol.7:112−121;Martinら、1997、Science 278:1470−1473;Bandresら、1998、J.Virol.72:2500−2504;Misseら、1998、J.Virol.72:7280−7288)。CD4非依存性の原因である決定子のより大きな理解は、ケモカイン受容体とのEnvの相互作用を媒介かつ調節し、そして最終的にウイルスの進入を支配するEnvドメインへの洞察を提供するはずである。
【0007】
今日まで、免疫系をのがれるHIV−1の能力は、この重要なヒトの病原体に対する効果的なワクチンの開発を妨げてきた。従って、ヒトにおけるHIV−1感染症のための有効なワクチンおよび治療様式の開発に対する、長いあいだ痛切に感じられかつ満たされていない必要性が存在する。本発明はそれらの必要性にかなう。
【0008】
(発明の簡単な要約)
本発明は、CD4非依存性のヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)のenv、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を包含する。一局面において、単離された核酸は、配列番号4のヌクレオチド配列を有する核酸と最低約98%の相同性を共有する。
【0009】
別の局面おいて、核酸は、HIV−1/IIIBx envおよびHIV−1/IIIBx 8x(8x)envより成る群から選択される。
【0010】
なお別の局面において、核酸はHIV−1/IIIBx 8x envである。
【0011】
本発明は、配列番号4のヌクレオチド配列を有するCD4非依存性のHIV envをコードする単離された核酸もまた包含する。
【0012】
本発明は、最低1個のHIV−1 envクローンにCD4非依存性を賦与するHIV−1 env遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を包含する。
【0013】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸をさらに包含し、第一部分はHIV−1/IIIBx 8x envコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は8x envでないHIV−1 envコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【0014】
一局面において、第二部分は、S10 env、HXB2 env、BaL envおよびIIIB envより成る群から選択されるenvコーディング配列である。
【0015】
別の局面において、第二部分は、CXCR4ケモカイン受容体結合部位およびCCR5ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【0016】
なお別の局面において、第二部分は、CXCR4ケモカイン受容体結合部位のV3ループおよびCCR5ケモカイン受容体結合部位のV3ループより成る群から選択されるV3ループのコーディング配列を含んで成る。
【0017】
本発明は、安定に露出されるケモカイン補助受容体結合部位を含んで成る単離されたHIV−1 gp120ポリペプチドを包含する。
【0018】
本発明は、HIV−1/IIIBx 8x Envを含んで成る単離されたポリペプチドもまた包含する。一局面において、該ポリペプチドは配列番号3と最低約98%の相同性を共有する。
【0019】
別の局面において、単離されたポリペプチドは配列番号3のアミノ酸配列を含んで成る。
【0020】
本発明は、gp120ポリペプチドを含んで成るキメラのHIV−1 Envポリペプチドを包含し、ここで、キメラポリペプチドは、HIV−1/IIIBx 8x gp120を含んで成る第一部分を含んで成り、該キメラポリペプチドは、HIV−1/IIIBx 8x以外のHIV−1からのgp120を含んで成る第二部分をさらに含んで成る。
【0021】
本発明は、ポリペプチドがCD4非依存性であり、また、さらに、ポリペプチドがCXCR4ケモカイン受容体結合部位およびCCR5ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、キメラのHIV−1 Envポリペプチドをさらに包含する。
【0022】
一局面において、第二部分は、HXB V3ループ、8x V3ループ、BaL V3ループ、YU−2 V3ループおよび89.6 V3ループより成る群から選択されるV3ループを含んで成る。
【0023】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成るgp120ポリペプチドを含んで成るCD4非依存性のHIV−1 Envを含んで成る組成物を包含し、ここで、HIV−1は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のHIV−1よりも抗体中和に対しより感受性である。
【0024】
本発明は、CD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を含んで成る製薬学的組成物もまた包含し、ここで、HIV−1 Envはケモカイン補助受容体結合部位を安定に露出させる最低1個の突然変異を含んで成る。
【0025】
一局面において、HIV−1 EnvはHIV−1/IIIBx 8xである。
【0026】
本発明は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envを含んで成るワクチンを包含する。
【0027】
一局面において、HIV−1 Envは、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 Envを発現する細胞より成る群から選択される。
【0028】
本発明は、CD4非依存性のヒトHIV−1 env、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を含んで成るベクターを包含する。
【0029】
本発明は、最低1個のHIV−1 envクローンにCD4非依存性を賦与するHIV−1 env遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を含んで成るベクターもまた包含する。
【0030】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸を含んで成るベクターを包含し、第一部分はHIV−1/IIIBx 8x envコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は8x envでないHIV−1 envコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【0031】
本発明は、CD非依存性のヒトHIV−1 env、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を含んで成る細胞を包含する。
【0032】
本発明は、最低1個のHIV−1 envクローンにCD4非依存性を賦与するHIV−1 env遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を含んで成る細胞もまた包含する。
【0033】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸を含んで成る細胞をさらに包含し、第一部分はHIV−1/IIIBx 8x envコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は8x envでないHIV−1 envコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【0034】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る単離されたHIV−1 gp120ポリペプチドを含んで成る細胞を包含する。
【0035】
本発明は、HIV−1/IIIBx 8x Envを含んで成る単離されたポリペプチドを含んで成る細胞もまた包含する。
【0036】
本発明は、gp120ポリペプチドを含んで成るキメラのHIV−1 Envポリペプチドを含んで成る細胞を包含し、キメラポリペプチドはHIV−1/IIIBx 8x gp120を含んで成る第一部分を含んで成り、該キメラポリペプチドは、HIV−1/IIIBx 8x以外のHIV−1からのgp120を含んで成る第二部分をさらに含んで成る。
【0037】
本発明は、ポリペプチドがCD4非依存性であり、また、さらに、ポリペプチドがCXCR4ケモカイン受容体結合部位およびCCR5ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、キメラのHIV−1 Envポリペプチドを含んで成る細胞もまた包含する。
【0038】
一局面において、第二部分は、HXB V3ループ、8x V3ループ、BaL V3ループ、YU−2 V3ループおよび89.6 V3ループより成る群から選択されるV3ループを含んで成る。
【0039】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成るgp120ポリペプチドを含んで成るCD4非依存性のHIV−1 Envを含んで成る組成物を含んで成る細胞を包含し、ここで、HIV−1は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のHIV−1より抗体中和に対しより感受性である。
【0040】
本発明は、CD4非依存性に関与するHIV−1 Envタンパク質のアミノ酸残基の同定方法を包含する。該方法は、CD4非依存性であるEnvクローンから完全長のenvコーディング配列を得ること、および前記envコーディング配列の少なくとも一部分を、CD4依存性であるEnvクローンからのコーディング配列で置き換えてキメラを形成させ、ここで、キメラがCD4依存性である場合、それは、envコーディング配列の該部分がCD4非依存性に関与することの表示であり、それによりCD4非依存性に関与するアミノ酸残基を同定することを含んで成る。
【0041】
本発明は、哺乳動物におけるHIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出す方法もまた包含する。該方法は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を哺乳動物に投与し、ここで、該タンパク質は安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成り、それにより哺乳動物におけるHIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出すことを含んで成る。
【0042】
本発明は、HIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法もまた包含する。該方法は、可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を該gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、該化合物と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および化合物と接触された細胞に結合された標識の量を、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、化合物と接触された細胞に結合されたより多いもしくは少ない量の標識は、化合物がHIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼすことの表示である。
【0043】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する小分子の同定方法を包含する。該方法は、可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に分子と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および分子と接触された細胞に結合された標識の量を、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、分子と接触された細胞に結合されたより少ない量の標識は、該分子が、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することの表示である。
【0044】
本発明は、可変性のケモカイン受容体結合部位を含んで成るCD4非依存性のキメラHIV−1 Envクローンの製造方法を包含する。該方法は、CD4非依存性のEnvクローンの超可変V3ループを別のHIV−1のV3ループで置き換えることを含んで成り、ここで、別のHIV−1のV3ループは、CD4非依存性のEnvクローンのものと異なるケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【0045】
一局面において、CD4非依存性クローンは、HIV−1/IIIBxおよびHIV−1/IIIBx 8xより成る群から選択される。
【0046】
別の局面において、別のHIV−1からのV3ループは、HIV−1/BaLからのV3ループ、HIV−1/YU−2からのV3ループ、HIV−1/ADAからのV3ループおよびHIV−1/89.6からのV3ループより成る群から選択される。
【0047】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合の阻害方法もまた包含する。該方法は、HIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法[該方法は、可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を該gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、化合物と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および化合物と接触された細胞に結合された標識の量を、化合物と接触されない、それ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、化合物と接触された細胞に結合されたより多いもしくは少ない量の標識は、該化合物がHIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼすことの表示である]により同定された小分子と前記gp120を接触させ、それによりそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することを含んで成る。
【0048】
本発明は、細胞のHIV−1感染の阻害方法を包含する。該方法は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する小分子と細胞を接触させ[ここで、小分子は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する小分子の同定方法を使用して同定され、該方法は、可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、分子と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および分子と接触された細胞に結合された標識の量を、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、分子と接触された細胞に結合されたより少ない量の標識は、該分子が、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することの表示である]、それにより細胞のHIV−1感染を阻害することを含んで成る。
【0049】
本発明は、製薬学的に適する担体中に、CD4非依存性のHIV−1 Env、およびHIV感染症を治療するのに使用される最低1種の化合物を含んで成る組成物を包含する。
【0050】
一局面において、HIV−1 Envは、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 envを発現する細胞より成る群から選択される。
【0051】
別の局面において、HIV感染症を治療するのに使用される化合物は、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインより成る群から選択される。
【0052】
本発明は、ヒトにおけるHIV−1感染症の治療方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 EnvをHIV−1に感染したヒトに投与し、それによりヒトにおけるHIV−1感染症を治療することを含んで成る。
【0053】
一局面において、HIV−1 Envは、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 envを発現する細胞より成る群から選択される。
【0054】
別の局面において、該方法は、HIV感染症を治療するのに使用される化合物を投与することをさらに含んで成る。
【0055】
なお別の局面において、HIV感染症を治療するのに使用される化合物は、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインより成る群から選択される。
【0056】
さらなる一局面において、該化合物は、前記CD4非依存性HIV−1 Envの投与前、投与の間もしくは投与後に前記ヒトに投与される。
【0057】
(発明の詳細な説明)
本発明は、HIV−1/IIIBx(IIIBx)と呼称されるHIV−1/IIIBのCD非依存性の変異体、および、細胞受容体タンパク質を必要とする宿主細胞のウイルス感染の機構の研究を可能にするHIV−1/IIIBx.8(8x)と命名されるそれからの機能的な完全長のenvクローンの発見に基づく。さらに、本発明は、別のHIV−1ウイルスからのenvの一部分をコードする最低1種の核酸に共有結合された8x envをコードする核酸の部分を含んで成るキメラの構築に関する。従って、該キメラは、8x HIV−1 env配列のどの部分(1種もしくは複数)がCD4非依存性に関与しているかのさらなる発見につながる、他のビリオンのenvコーディング配列の部分と、8x envコーディング配列の部分を組み合わせることにより生じられる。
【0058】
CD4非依存性は、それが、gp120のケモカイン結合部位がウイルスエンベロープ上に安定に露出されかつCD4へのgp120の前もっての結合なしに細胞のケモカイン受容体結合タンパク質に結合することが可能であることの指標であるため、重要である。典型的には、ケモカイン結合部位は、CD4へのこうした結合が、該部位を露出させかつ宿主細胞上のケモカイン受容体タンパク質に結合することが可能な「誘導された(triggered)」コンホメーションをもたらすコンホメーション変化を引き起こすまで、隠されている。従って、CD4非依存性のgp120は、とりわけケモカイン受容体タンパク質へのgp120の結合に関与するタンパク質の決定子を同定するため、gp120のケモカイン受容体結合部位を認識することが可能な中和抗体を産生させるため、およびgp120とケモカイン受容体の結合を封鎖することができる小分子の阻害剤を同定するために使用することができる、安定な中間の配置を代表する。
【0059】
従って、Envのどの部分が細胞タンパク質へのウイルス結合に関与しているかを理解すること、およびそれにより宿主細胞受容体へのHIV−1ウイルスの結合に関与するタンパク質の決定子をマッピングすることは、ウイルス感染に決定的に重要なウイルスタンパク質ドメインに対する有効な抗ウイルスワクチンの開発で重要である。こうしたドメインは、高度に保存されるが、しかし保護免疫応答がこうしたタンパク質ドメインに対し装備されないように免疫系からいくぶん「カムフラージュされる」と考えられている。従って、これらのタンパク質ドメインの同定、および免疫応答がHIV−1に対し生じられるように免疫系にそれらを提示する能力は、この重要なヒトの病原体に対するワクチン開発の重要な一最終目標である。
【0060】
さらに、キメラの産生は、CD4依存性の特質およびケモカイン受容体の選択が機能的に分離できる特質であるという発見につながった。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、こうしたキメラはenvをコードする核酸およびそれによりコードされるEnvタンパク質の多様な構造的および機能的要素のマッピングに有用であることの真価をみとめるとみられる。従って、多様な特性(例えば、CD4依存性もしくは非依存性、および/または多様なケモカイン受容体に対する多様な親和性)を有する多様なウイルスの多様な部分を組み合わせることにより、Envタンパク質の多様な機能的要素を検査かつ同定することができる。
【0061】
一態様において、CD4の非存在下でCXCR4ケモカイン受容体を結合する8x gp120のV3ループ部分を、CD4依存性でありかつCCR5ケモカイン補助受容体を結合するウイルス株であるHIV−1/BaLのV3ループで置き換えることは、キメラのgp120 8x/V3−BaLをCD4非依存性のままであるCCR5結合タンパク質に転化する。これはさらに、CD4非依存性が、gp120によるCD4結合の先行する段階がケモカイン受容体の選択に関係なくもはや必要とされないように、ケモカイン受容体結合ドメインを露出させることを立証する。これらのデータは、ケモカイン受容体結合部位が遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体(すなわちCXCR4およびCCR5)と相互作用することが可能であるgp120上に存在し、そしてこの部位が機能的でありかつCD4非依存性のウイルス上に露出されていることがありそうであることもまた示唆する。
【0062】
加えて、本発明は、CD4非依存性のgp120タンパク質が安定な部分的に「誘導された」状態で存在することを教示し、ここで、ケモカイン補助受容体結合部位は、HIV−1 gp120分子のCD4依存性のコンホメーションにおいてよりもCD4非依存性のgp120タンパク質においてより露出されている。これは、CD4非依存性のウイルスを、マウス、ヒトおよびウサギからの抗HIV−1抗体による中和に対しより影響を受けやすくするという効果を有する。従って、本発明はHIV−1の治療薬の開発に重要な意味を有する。なぜなら、免疫検出を逃れるようそれ以外はカムフラージュされることができる安定に露出された高度に保存されたケモカイン受容体結合部位の利用可能性が、体液性および/もしくは細胞性免疫応答の発生、ならびにこのウイルス−宿主タンパク質相互作用を封鎖しそれによりHIV−1感染を予防する小分子阻害剤の開発を助長するはずであるからである。
【0063】
本発明は、2つの成分すなわちgp120をコードする部分およびgp41をコードする部分より構成されるCD4非依存性のHIV envコーディング配列をコードする単離された核酸を包含する。一態様において、CD4非依存性のHIV−1/IIIBxの完全長のenvクローン(すなわち8x)が単離されている(配列番号3および配列番号4;図3ならびにそれぞれ14Aおよび14Bを参照されたい)。さらに、8xクローン中の突然変異をHXBc2の既知のenvコーディング配列(ジェンバンク(GenBank)受託番号第AF038399号)(配列番号11)に関し同定し、そして図4に開示する。しかしながら、本発明は、CD4非依存性のHIV−1/IIIBx変異体の完全長のenvクローンに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は部分的envクローンを包含すると解釈されるべきである。事実、本明細書に開示されるデータは、8xの完全なenvコーディング配列がCD4非依存性に必要とされないことを立証する。従って、8x envコーディング配列中に存在する最低1個の突然変異が8xにCD4非依存性を賦与するが、しかし、クローン中の全部の突然変異が本発明の目的上必要とされるわけでない。さらに、gp120の完全に別個の突然変異もまたCD4非依存性を賦与する可能性がある。
【0064】
下の実施例に開示される実験は、逆転写酵素活性アッセイ(図1A)により立証されるとおり、CD4+ SupT1細胞およびSupT1変異体、CD4− BC7細胞の双方を感染させることが可能であった本発明のCD4非依存性株(HIV−1/IIIBx)の単離を開示する。しかしながら、本発明は、HIV−1によるBC7もしくはSupT1細胞の感染にのみ限定されない。むしろ、本発明の「CD4非依存性」は、CD4を発現しないいかなる細胞型のHIV−1による感染も包含する。さらに、本明細書で既に論考されたとおり、CD4非依存性のHIV−1株はCD4+である細胞も感染させることができるが、とは言えCD4とgp120の相互作用はCD4非依存性のHIV−1によるこれらの細胞の感染に必要とされない。さらに、CD4非依存性のHIV−1株はすべてのCD4−細胞型を感染させる必要はない。むしろ、HIV−1株は、最低1種のCD4−細胞型を感染させることが可能であることのみが必要である一方、それからクローンを得たそのそれ以外は同一の親株は、その細胞型を感染させることができない。
【0065】
加えて、本発明の目的上、HIV−1株の変異体は、それが培養物中の影響を受けやすい細胞の最低約5%を感染させることが可能である場合にCD4非依存性と考えられるか、もしくは、感染のレベルはバックグラウンドのレベルに比較して約2ないし3倍である。
【0066】
HIV−1株のCD4非依存性の単離物は、最初にCD4+細胞中で成長されたCD4依存性のHIV−1遊走群を、CD4−である細胞上で継代することにより得ることができることが、本明細書で提供される開示に基づき、当業者により真価をみとめられるであろう。本明細書の実施例1に記述される実験で開示されるとおり、HIV−1/IIIBxは、CD4+ SupT1細胞中でウイルスを継代すること、次いでCD4−のほかそれ以外は同一のBC7細胞上でウイルスを継代することにより得た。しかしながら、本発明はこれらの特定の細胞型に限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、限定されるものでないが293、Cf2TH、CCC+L−およびQT6細胞を挙げることができる多様なCD4+およびCD4−細胞、ならびにCD4の存在もしくは非存在下で組換えケモカイン受容体を発現する安定にトランスフェクションされた細胞(U87、HeLa、HOS)を包含する。
【0067】
他の関係する局面において、本発明は、HIV−1 envの最低一部分を含んで成るこうした単離された核酸(そしてその単離された核酸は好ましくは該核酸によりコードされるタンパク質の発現を指図することが可能である)を含有するベクター;ならびにこうしたベクターを含有するビリオン、プロウイルスおよび/もしくは細胞を包含する。
【0068】
本実験的実施例が立証するとおり、Envタンパク質をコードする核酸は多様なプラスミドベクター中にクローン化することができる。しかしながら、本発明は、これらのプラスミドもしくはいかなる特定のベクターにも限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、容易に入手可能かつ/もしくは当該技術分野で公知である夥しい量のベクターを包含すると解釈されるべきである。従って、一態様において完全長のenvコーディング領域をPCRにより増幅しかつプラスミドpCDNA3にクローン化し、そして挿入物をその後pNL4−3の3’半ゲノム(hemigenome)にサブクローニングしたが、本発明はこれらもしくはいずれかの他の特定のベクターに限定されると解釈されるべきでない。
【0069】
本発明の単離された核酸は、本発明のEnvタンパク質をコードするRNAもしくはDNA配列、およびそれが細胞を含まない場合もしくはそれが細胞を伴う場合に該ヌクレオチド配列をより安定にするDNAもしくはRNAの化学修飾を包含するそれらのいずれかの改変された形態を包含すると解釈されるべきである。ヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオチド配列が細胞により取り込まれる効率もしくはそれが細胞中で発現される効率を高めるのにもまた使用することができる。ヌクレオチド配列の修飾のいずれかのおよび全部の組み合わせを本発明で企図する。
【0070】
本発明は、HIV−1/IIIBx 8xのアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドもまた包含する。
【0071】
本発明は、本明細書に開示されるようなgp120タンパク質を含んで成るタンパク質もしくはペプチドの類似物もまた提供する。類似物は、保存的アミノ酸配列の差異、もしくは配列に影響を及ぼさない修飾、または双方により、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドと異なることができる。例えば、それらが該タンパク質もしくはペプチドの一次配列を変えるが通常はその機能を変えない保存的アミノ酸変化を作成することができる。保存的アミノ酸置換は、以下の群、すなわち
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リシン、アルギニン;
フェニルアラニン、チロシン
内での置換を典型的に包含する。(通常は一次配列を変えない)修飾は、ポリペプチドのインビボもしくはインビトロの化学的誘導体化(例えば、アセチル化、カルボキシル化もしくはビオチニル化)を包含する。グリコシル化(例えば、その合成およびプロセシングの間にポリペプチドのグリコシル化パターンを改変させることにより、またはさらなるプロセシング段階において;例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素(例えば哺乳動物のグリコシル化もしくは脱グリコシル化酵素)にポリペプチドを曝露させることによりなされるもの)の修飾もまた包含する。リン酸化されたアミノ酸残基(例えばホスホチロシン、ホスホセリンもしくはホスホトレオニン)を有する配列もまた包含する。
【0072】
タンパク質分解性の分解に対するそれらの抵抗性を向上させる、もしくは溶解性の特性を至適化する、もしくはそれらを治療薬としてより適するようにするように、通常の分子生物学の技術を使用して改変されたポリペプチドもまた包含する。こうしたポリペプチドの類似物は、天然に存在するL−アミノ酸以外の残基(例えばD−アミノ酸もしくは天然に存在しない合成アミノ酸)を含有するものを包含する。本発明のペプチドは、本明細書に列挙される特定の例示的方法のいずれかの産物に限定されない。
【0073】
さらに、本発明は、HIV−1/IIIBx 8x env配列の天然に存在する変異体もしくは組換え的に生じられた突然変異体を包含すると解釈されるべきであり、これらの変異体もしくは突然変異体は、それによりコードされるタンパク質を、本発明の完全長の8x envクローンより大きく、より小さく、もしくはそれと正に同じくらいのいずれか、生物学的に活性にする。
【0074】
加えて、本発明は、変えられたケモカイン受容体結合部位を含んで成る8x gp120の突然変異体もしくは変異体を包含する。本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、gp120タンパク質は多様な細胞のケモカイン受容体タンパク質へのgp120の結合を媒介するケモカイン受容体結合ドメインを含んで成り、この結合は、典型的にはCD4へのgp120の結合後に発生する。この節に続く実験の結果にて開示されるとおり、8x gp120はCXCR4ケモカイン受容体に結合し、そしてそうする前にCD4への結合を必要としない。さらに、本明細書の別の場所に開示されるデータは、8x gp120のコーディング配列へのHIV−1/BaL gp120の一部分をコードする核酸の一部分の導入が、もはやCXCR4に結合しないキメラタンパク質を生じさせることを立証する。代わりに該キメラgp120は今やCCR5を結合する。こうした突然変異体は、HIV−1ウイルス感染におけるgp120とケモカイン受容体タンパク質の相互作用の役割の研究のため、本発明の方法で有用である。本発明は、8x gp120をコードする核酸の一部分がBaL gp120をコードする核酸の一部分を置き換えたキメラgp120に単に限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、8x gp120をコードする核酸のいずれかの部分(1種もしくは複数)を、いずれかの他のHIV−1株、好ましくはCCR5を補助受容体として使用するHIV(もしくはSIV)の株からのgp120をコードする核酸の最低1部分により置き換えることができる、他のキメラを包含すると解釈されるべきである。さらに、こうした部分は、gp120のいずれかの特定のドメインに限定されると解釈されるべきでなく、しかし、むしろ、置換されたgp120の部分は、該タンパク質をコードする配列のいずれかの部分からであることができる。従って、生じるキメラ核酸およびそれから発現されるタンパク質は、可能ないずれかの組み合わせの、数種のHIV−1株からの多様なgp120より構成されるキメラであることができる。
【0075】
本明細書の別の場所でより具体的に示されるとおり、それにより推定のケモカイン受容体結合部位のもしくはその近くのアミノ酸が変えられる、またはそれによりEnvの短縮された細胞質の尾が生じられる、挿入、欠失もしくは置換を含んで成るgp120タンパク質をコードする突然変異体のgp120遺伝子が、宿主細胞のケモカイン受容体タンパク質とのgp120の会合の研究で有用である。事実、下述される実験で開示されるとおり、いくつかのこうした突然変異体が本明細書で発見された(表1および図3を参照されたい)。しかしながら、本発明は、これらの突然変異体のみに限定されると解釈されるべきでなく;むしろ、本発明は、野性型gp120に比較してケモカイン受容体タンパク質への変えられた結合を立証しかつその突然変異体がCD4非依存性を立証する、欠失、置換および点突然変異を含んで成る他の突然変異体を包含する。
【0076】
本発明はまた、生物学的活性を保持してももしくはしなくてもよいHIV−1 Envの変異体をコードするDNAを包含すると解釈されるべきである。こうした変異体(すなわちgp120、gp41(TMともまた称される)のタンパク質もしくはポリペプチドの類似物)は、該タンパク質もしくはポリペプチドが、本明細書に記述される方法での使用に対するその適合性を高める付加的な特性(例えば、限定されるものでないが露出されたケモカイン受容体結合部位の高められた安定性、CD4、CXCR4、CCR5などへの高められた特異的結合を賦与する変異体)を所有するような組換えDNA技術を使用して改変されているかもしくは改変することができるタンパク質もしくはポリペプチドを包含する。
【0077】
本発明は8x Envタンパク質の類似物を包含する。類似物は、保存的アミノ酸配列の差異もしくは配列に影響を及ぼさない修飾、またはその双方により、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドと異なることができる。例えば、それらがタンパク質もしくはペプチドの一次配列を変えるが通常はその機能を変えない、保存的アミノ酸変化を作成することができる。
【0078】
好ましくは、8x Env類似物のアミノ酸配列は、本明細書に図4に開示される8x envのアミノ酸配列(配列番号3)に約70%相同、より好ましくは約80%相同、なおより好ましくは約90%相同、より好ましくは約95%相同、そして最も好ましくは最低約99%相同である。
【0079】
本発明は、本明細書に開示されるDNAおよびアミノ酸配列にのみ限定されると解釈されるべきでない。本発明で武装されれば、本明細書に開示されるCD4非依存性のEnvをコードする8x env核酸(配列番号4)の単離についての実験の詳細の節で本明細書に記述される手順に従うことにより、HIV−1の他のCD4非依存性のenvクローンを得ることができることが当業者に容易に明らかである。
【0080】
本発明は、従って、いずれかのおよび全部の、HIV−1/IIIBx 8x Envをコードする核酸配列、ならびに、本明細書に開示される8x envをコードする核酸(配列番号4)に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列および図4に示されるアミノ酸配列(配列番号3)を包含すると解釈されるべきである。好ましくは、実質的に相同であるDNAは、本明細書に開示される8x env配列(配列番号4)に約50%相同、より好ましくは約70%相同、なおより好ましくは約80%相同、そして最も好ましくは約90%相同である。好ましくは、実質的に相同であるアミノ酸配列は、図4に示される8x Envのアミノ酸配列(配列番号3)に約50%相同、より好ましくは約70%相同、なおより好ましくは約80%相同、そして最も好ましくは約90%相同である。
【0081】
いずれかの数の手順を8x envの突然変異体もしくは変異体の形態の生成に使用することができる。例えば、CD4非依存性でない8xの突然変異体の形態の生成は、例えばSambrookら(1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク)およびAusubelら(1997、Current Protocols in Molecular Biology、グリーン アンド ワイリー(Green & Wiley)、ニューヨーク)に記述されるような当該技術分野で公知の組換えDNAの方法論を使用して、CD依存性であったウイルスからのenvをコードする核酸の部分を導入することにより、本明細書で達成した。そのように生成された突然変異体のEnvを発現させ、そして生じるタンパク質を、本明細書に記述されるもののような実時間バイオセンサーアッセイでCD4を結合するその能力について評価する。その後、CD4非依存性の様式でケモカイン受容体タンパク質を結合する突然変異体タンパク質を、RT、融合活性、実時間結合/解離の動力学および他のこうしたアッセイにより検査した。
【0082】
ポリペプチドをコードするDNA配列を変えることによるタンパク質もしくはポリペプチド中のアミノ酸変化の導入のための手順は当該技術分野で公知であり、かつ、Sambrookら(1989、上記);Ausubelら(1997、上記)にもまた記述される。
【0083】
本発明は、HIV−1 Envをコードする核酸(配列番号4)の一部分もしくは全部に対し相補的である核酸配列を有する単離された核酸もまた包含する。
【0084】
本明細書で使用されるところの、核酸に適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常長さが最低約100ヌクレオチド、典型的には最低約200ヌクレオチド、より典型的には約300から約600ヌクレオチドまで、典型的には最低約700ないし約1000ヌクレオチド、好ましくは最低約1000ないし約1400ヌクレオチド、なおより好ましくは最低約1600ヌクレオチドないし約2000ヌクレオチドであることができ、そして最も好ましくは、核酸フラグメントは長さが約2400ヌクレオチドより大きいことができる。
【0085】
本発明は目的の核酸を含んで成る細胞をさらに包含する。該核酸は、細胞ゲノム中に組み込まれることも必要でなく、また、それらは細胞中で発現されることも必要としない。さらに、細胞は原核生物もしくは真核生物細胞であることができ、そして本発明はいずれかの特定の細胞系もしくは型に限定されると解釈されるべきでない。
【0086】
本発明はgp120もしくはその一部分のケモカイン受容体結合部位に特異的な抗体もまた包含し、この抗体はモノクローナル抗体を含んで成る。
【0087】
一態様において、抗体は、そのエピトープがケモカイン受容体結合部位と重なり合うgp120に対するマウスモノクローナル抗体(17b)、ならびに48dと称されるgp120に対するマウスモノクローナル抗体(Thaliら、1993、J.Virol.67:3978−3988)である。しかしながら、本発明はこれらの抗体にのみ限定されると解釈されるべきでないが、しかしむしろ、Envもしくはその部分に対する他の抗体(その用語が本明細書で定義されるところの)を包含すると解釈されるべきであり、この抗体は、とりわけ該抗体がgp120ケモカイン受容体結合部位に結合するため、本明細書に記述されるものに実質的に類似の様式で機能し、そしてそれらはRT活性および細胞融合活性により測定されるとおりHIV−1感染を阻害することが可能である。
【0088】
本発明は8x Envタンパク質のアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド、ならびにその突然変異体、変異体およびフラグメントもまた含んで成る。
【0089】
本発明のペプチドは実質的に純粋であることができる。実質的に純粋なペプチドはタンパク質精製のための既知の手順に従うことにより精製され、ここで、該手順の各段階で純度をモニターするのに免疫学的、酵素的もしくは他のアッセイを使用する。タンパク質精製法は当該技術分野で公知であり、そして例えばDeutscherら(1990、Guide to Protein Purification、ハーコート ブレース ジョヴァノヴィッチ(Harcourt Brace Jovanovich)中、サンディエゴ)に記述される。
【0090】
従って、本発明は、所望のタンパク質をコードする核酸および所望のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントを包含すると解釈されるべきである。
【0091】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラタンパク質をコードする単離された核酸を包含する。一態様において、キメラ核酸は、8x envをコードする第一部分、およびS10、IIIBもしくはHXB2からのenvをコードする第二部分を含んで成る。これらのキメラは、8xのどの領域がCD4非依存性に必要とされるかのマッピングで有用であったが、本発明はこれらのキメラに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、8xのいかなる部分、およびいかなるHIV−1ウイルス株もしくはその変異体も含んで構築することができるenvコーディング領域中のいかなるキメラも包含すると解釈されるべきである。
【0092】
さらに、別の態様において、キメラは、8x envコーディング領域の一部分、およびCCR5向性のHIV−1株BaLのenvコーディング領域の一部分を含んだ。より具体的には、該態様は、BaLのV3ループをコードする核酸部分を伴う8x envクローンを含んで成る。しかしながら、本発明は、envコーディング領域のこの特定の部分もしくはHIV−1のこの特定の株に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、本発明は、最低1種の他のHIV−1株もしくは変異体のenvコーディング配列の一部分での、8x envコーディング配列のいずれかの部分の置換、およびそのいずれかの可能な並べ換えを包含する。従って、核酸およびそれから発現されるアミノ酸の双方のキメラは、2種もしくはそれ以上の目的のHIV−1 envコーディング領域からの組み合わせを包含する。従って、本明細書に提供される開示で武装されれば、本明細書で開示される予測される効果をもつキメラのほとんど無限の組み合わせの産生が当業者に明らかであろう。
【0093】
本発明は、CD4非依存性に関与するHIV−1 Envタンパク質のアミノ酸残基の同定方法もまた包含する。該方法は、CD4非依存性のEnvクローンからの最低1部分および少なくともCD4依存性のEnvクローンからの第二の部分を含んで成るキメラタンパク質を産生させることを含んで成る。その後、生じるキメラを検査して、本明細書の別の場所に開示されるような多様なアッセイにより、CD4非依存性の感染を媒介するキメラタンパク質の能力を決定する。本明細書で既に論考されたとおり、8x envコーディング配列の部分を数種のCD4依存性のHIV−1株(例えばS10およびHXBc2)のenvコーディング配列の多様な部分と組み合わせた、好ましい一態様が開示される。また本明細書で既に示されたとおり、本発明はこれらの特定の組み合わせもしくはこれらの特定の株に限定されない。むしろ、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、CD4依存性および非依存性のenvコーディング配列のいかなる組み合わせも検査して、CD4非依存性の決定子をマッピングすることができることの真価をみとめるであろう。さらに、CD4非依存性は、また本明細書の別の場所で既に記述されたような多様な哺乳動物細胞系で多様なアッセイを使用して検査することができる。
【0094】
本発明は、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含んで成る単離されたgp120タンパク質もまた包含する。一態様において、バイオセンサー実験において多様なタンパク質の実時間結合動力学を、また、抗HIV抗体によるウイルスの高められた中和を測定することにより、ならびに結晶学的分析により、ケモカイン受容体結合部位の増大された露出が決定された。しかしながら、本発明はこれらの特定のアッセイに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、当該技術分野で公知の、もしくはタンパク質−タンパク質相互作用の研究のため開発されるべき他のアッセイを使用して、目的のgp120もしくはEnvタンパク質のケモカイン受容体結合部位の露出を測定することができる。
【0095】
本発明は、HIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出す方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を哺乳動物に投与することを含んで成り、ここで該タンパク質は安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【0096】
加えて、該核酸がベクター(例えばプラスミドもしくはウイルス)中にある場合、または該核酸がいずれかの他の核酸と会合しない裸の(naked)核酸を含んで成る場合の、免疫応答を生じさせるための精製された核酸の使用は、当該技術分野で公知である。例えば、核酸ワクチンの構築方法は、Burgerら(1991、J.Gen.Virol.72:359−367)に記述され、そして当該技術分野で公知である。Sambrookら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク;Ausubelら、1997、Current Protocols in Molecular Biology、グリーン アンド ワイリー(Green & Wiley)、ニューヨークもまた参照されたい。
【0097】
さらに、選択すべきHIV−1 Envタンパク質を発現する細胞を使用して、HIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を生じさせることもまたできる。
【0098】
Env免疫原に対する免疫応答は、ELISAもしくはウェスタンブロッティングのような標準的免疫学的技術、および当該技術分野で公知もしくは今後開発されるべき他のこうした技術により測定する。多様なイムノアッセイの形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択することができる。例えば、特異的免疫反応性を決定するのに使用することができるイムノアッセイの形式および条件の記述については、HarlowとLane(1988、Antibodies,A Laboratory Manual、コールド スプリング ハーバー パブリケーションズ(Cold Spring Harbor Publications)、ニューヨーク)を参照されたい。
【0099】
本発明のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質は、ヒトもしくは家畜の患者への該タンパク質の投与に適する製薬学的組成物に処方することができる。正確な処方および投薬量は、限定されるものでないが治療されるべき疾患の型および重症度、投与経路、個体の齢および全体的健康状態、Envタンパク質の性質などを挙げることができるいずれかの数に因子に依存して変動することができることが真価をみとめられるであろう。しかしながら、適切なpH、等張性、安定性および他の特徴を有する製薬学的に許容できる組成物の製造は、当該技術の熟練内である。製薬学的組成物は、当該技術分野で、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences(1985、Genaro編、マック パブリッシング カンパニー(Mack Publishing Co.)、フィラデルフィア州イーストン)に記述される。
【0100】
投与されるCD4非依存性のEnvの量は、それがタンパク質として投与されようと、もしくは核酸として投与されようと、もしくはHIV envを発現する細胞として投与されようと、HIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出すのに十分である。本発明の実施に有用な製薬学的組成物は、患者の体重1kgあたり約1ngと約100mgとの間の用量を送達するように投与することができる。投与に適するCD4非依存性のEnvタンパク質の量は、付随する副作用を伴わずに所望の効果を有するのに十分多い用量を包含する。CD4非依存性のEnvがタンパク質もしくはペプチドである場合、好ましい投薬量範囲は、患者の体重1kgあたり約10から約1000μgまでのタンパク質もしくはペプチドである。CD4非依存性のEnvを、組換えウイルスベクター内に含有されるそれをコードするDNAの形態で投与する場合、患者の体重1kgあたり約102と約1011プラーク形成単位との間のウイルスの投薬量を使用することができる。CD4非依存性のEnvをコードする裸のDNAを製薬学的組成物として投与するべきである場合、患者の体重1kgあたり約10μgないし約数mgの間のDNAの投薬量を使用することができる。
【0101】
本発明の方法の実務において、CD4非依存性のEnvタンパク質を含有する組成物は、該個体におけるHIV−1感染症を治療、予防もしくは緩和するのに十分な量で患者に投与する。
【0102】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、Envタンパク質/Envをコードする核酸を患者に投与して、ウイルスのケモカイン受容体結合部位を使用する適切なケモカイン受容体へのウイルスの結合を妨害し、そしてそれにより感染を予防することにより、HIV感染症を予防することができることの真価をみとめるであろう。さらに、Envタンパク質/envをコードする核酸はまた、人における免疫応答を増大させることにより既に感染した個体の病状を治療もしくは緩和することもでき、それは、順に、抗レトロウイルスの薬理学的治療への添加物(adjunct)として有益である可能性がある。すなわち、免疫原はウイルスのケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を増大させ、それにより、ウイルスのケモカイン受容体結合部位と標的細胞のケモカイン受容体との間の必須の相互作用を封鎖する抗体を生じさせることができる。
【0103】
患者へのCD4非依存性のEnvタンパク質の投与の頻度は、限定されるものでないが治療されるべきウイルス感染症の型および重症度、投与経路、個体の齢および全体的健康状態、Envタンパク質の性質などを挙げることができるいくつかの因子に依存してもまた変動することができる。患者へのEnvタンパク質の投与の頻度は数ヶ月ごとに約1回から、1ヶ月に約1回、1週間に約1回、1日あたり約1回、1日に約数回まで変動することができることが企図される。
【0104】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、非経口の、経口の固体および液体製剤、眼の、坐剤、エアゾル、局所のもしくは他の類似の製剤で全身に投与することができる。適切なEnvタンパク質もしくはそれをコードする核酸に加え、これらの製薬学的組成物は、製薬学的に許容できる担体、および薬物投与を高めかつ助長することが既知の他の成分を含有することができる。従って、こうした組成物は、場合によっては、アジュバント(例えば水酸化アルミニウムおよびマグネシウムの水性懸濁液)のような他の成分、ならびに/もしくは生理的食塩水のような他の製薬学的に許容できる担体を含有することができる。ナノ粒子、リポソーム、再封止赤血球(resealed erythrocyte)および免疫学的に基づく系のような他の可能な製剤もまた、本発明の方法に従って適切なEnvタンパク質もしくはそれをコードする核酸を患者に投与するのに使用することができる。
【0105】
好ましくは、本発明の組成物は非経口もしくは静脈内の経路によりヒトに投与する。
【0106】
Envタンパク質および/もしくはEnvをコードする核酸は、HIV感染症を治療するのに使用する他の化合物とともに投与することができる。こうした化合物は、限定されるものでないがプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤(ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド類似物)、AZT、インターフェロン、インターロイキン−2、他のサイトカインなどを挙げることができる。投与する付加的化合物の選択は、Envタンパク質もしくはそれをコードする核酸の投薬量および投与頻度の選択を支配するいずれかの数の同一の型の因子に依存して変動することができる。本発明の方法の実施のための、Envタンパク質とともにの使用のためのこれらの型の化合物の選択は、当業者の熟練内に十分にある。
【0107】
本発明は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を含んで成るワクチンもまた包含する。本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、ウイルスのケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答の生成は、宿主のケモカイン受容体リガンドへのこのウイルス部位の相互作用を封鎖し、それによりHIV感染に必要とされる必須のウイルス/宿主細胞の相互作用を妨害および/もしくは阻害するはずである。
【0108】
加えて、本発明は、gp120タンパク質のケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法を包含する。該方法は、細胞を化合物と接触させること、および細胞に特異的に結合された標識されたgp120の量を、該化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識されたケモカインの量と比較することを含んで成る。一態様において、目的のgp120を125I標識し、そして可溶性CD4の存在もしくは非存在下に多様なケモカイン受容体を発現する細胞に結合した。しかしながら、本発明は、放射ヨウ素化、もしくはいずれかの特定のgp120、もしくはこれらのケモカイン受容体のみの発現に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、目的のgp120の結合を定量することができるような多様なタンパク質標識を包含すると解釈されるべきである。こうした方法は当該技術分野で公知であり、そして限定されるものでないがビオチニル化、ならびに35S−cysおよび35S−metを挙げることができる。
【0109】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するHIV−1 gp120によるケモカイン受容体の結合を阻害する小分子の同定方法もまた包含する。該方法は、可溶性のCD4とのgp120の前インキュベーションを伴いもしくは伴わずに、標識されたgp120と細胞を接触させる前もしくはそれと同時発生的に、細胞を小分子と接触させることを含んで成る。その後、細胞に結合された標識の量を測定し、それにより細胞に結合された標識されたgp120の量を検出する。小分子と接触された細胞に結合された、結合されたgp120の量を、小分子と接触されない細胞に結合されたgp120の量と比較する。小分子と接触されなかった細胞に結合されたgp120の量に比較して、より少ない量のgp120が小分子と接触された細胞に結合される場合は、これは、小分子と細胞を接触させることがそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することの表示である。
【0110】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、こうした小分子は標的細胞のウイルス感染に必要な必須のHIV−1 gp120とケモカイン受容体の相互作用を阻害するとみられるため、こうした小分子は細胞のHIV−1感染を阻害する有用な治療薬であることの真価をみとめるであろう。さらに、従来技術は、ケモカイン受容体に特異的に結合しかつケモカイン受容体へのgp120の結合を封鎖する抗体およびケモカインが、しばしばHIV感染もまた封鎖することを教示する(Leeら、1999、J.Biol.Chem.、印刷中;Olsonら、1999、J.Virol.、印刷中;Wuら、1997、J.Exp.Med.)。従って、本発明の方法を使用して同定される、ケモカイン受容体へのgp120の結合の小分子阻害剤は、HIV感染の有用な阻害剤である。
【0111】
さらに、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明の方法を使用して同定される、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのgp120の結合の小分子阻害剤は、その受容体へのケモカインの結合およびその受容体の活性化の有用な阻害剤であることの真価をみとめるであろう。すなわち、小分子阻害剤は、HIV感染におけるケモカイン受容体の役割に関係しないケモカイン受容体の本来の機能を阻害するのに有用であることができる。従って、本明細書で同定される小分子阻害剤は、とりわけいかなるHIVに感染していないヒトにおける免疫系の治療、炎症、および発症のための潜在的用途を有する有用な治療薬である。
【0112】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合の阻害方法を包含する。該方法は、ケモカイン受容体へのgp120の結合がウイルスのgp120タンパク質のケモカイン受容体結合部位により媒介される場合にこうした結合を阻害する小分子とgp120を接触させることを含んで成る。小分子は本明細書の別の場所に既に開示されたとおり同定する。小分子の結合阻害剤とgp120を接触させることは、細胞のケモカイン受容体とのgp120の結合を阻害する。
【0113】
本発明は細胞のHIV−1感染の阻害方法もまた包含する。該方法は、本明細書の別の場所に既に記述されたとおり同定された小分子と細胞を接触させることを含んで成る。そのように同定された小分子は、ウイルスのgp120のケモカイン受容体結合部位により媒介される、細胞のケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する。小分子は、必須のgp120とケモカイン受容体との相互作用(1種もしくは複数)を妨害することにより、それにより細胞のHIV−1感染を阻害する。事実、ケモカイン受容体へのgp120の結合を封鎖する抗体およびケモカインがしばしばHIV感染もまた封鎖することが既に立証されている(Leeら、1999、J.Biol.Chem.、印刷中;Olsonら、1999、J.Virol.、印刷中;Wuら、1997、J.Exp、Med.)。従って、本発明は、gp120のケモカイン受容体結合部位を使用する細胞のケモカイン受容体へのgp120の結合の小分子阻害剤を使用する、標的細胞のHIV−1感染に必要とされる受容体とリガンドの相互作用を妨害することによる、HIV−1感染の阻害方法を包含する。
【0114】
本発明は、製薬学的に適する担体中にCD4非依存性のHIV−1 EnvおよびHIV感染症を治療するのに使用される最低1種の化合物を含んで成る組成物もまた包含する。本明細書の別の場所に記述されるとおり、HIV−1 Envは、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸、および/もしくはHIV−1 envを発現する細胞であることができる。さらに、本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、本発明は、例えば限定されるものでないがプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、逆転写構造阻害剤類(ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド双方の類似物を包含する)、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインのような、HIV感染症を治療するのに使用される化合物を包含すると解釈されるべきである。
【0115】
本発明はヒトにおけるHIV−1感染症の治療方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 EnvをHIV−1に感染したヒトに投与することを含んで成る。こうしたCD4非依存性のHIV−1 Envの投与は、gp120の安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対する抗体の産生を誘導する。従って、CD4非依存性のHIV−1 Envの投与は、宿主細胞のHIV−1感染に必要とされるgp120とケモカイン受容体の相互作用(1種もしくは複数)を封鎖する潜在的中和抗体の産生を引き起こす。これは、本明細書の別の場所に開示される、CD4非依存性のgp120は、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のCD4依存性のgp120よりも、中和抗体に対しより感受性であるという事実により示唆される。さらに、Envとケモカイン受容体の相互作用を封鎖する抗体はHIV−1を中和することができる(Wuら、1996、Nature 384:179−183;Trkolaら、1996、Nature 384:184−187)。従って、ケモカイン受容体結合部位の増大された露出はこの保存された領域に対する抗体の産生を高めることができ、この抗体は必須のgp120とケモカイン受容体の相互作用を阻害する。従って、CD4非依存性のEnvでヒトを免疫化することは、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対する抗体の産生を引き起こし、この抗体は感染に必要とされる必須のEnvとケモカイン受容体の相互作用を封鎖して、それによりヒトにおけるHIV−1感染症を治療する。
【0116】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envが、HIV−1ウイルスへの曝露の前および後双方のヒトにおけるHIV−1感染を治療および/もしくは緩和するのに有用な治療薬であることができることの真価をみとめるであろう。すなわち、免疫原性の用量は、HIV−1によるヒトの感染の前、その間もしくは後に投与することができる。それがいつ投与されるかに関係なく、免疫原は、とりわけgp120の安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対するヒトにおける応答を導き出し、それによりケモカイン受容体へのウイルスのgp120の結合を阻害する応答を誘導する。この阻害は既に感染した個体ならびに未感染の人の双方で生じられる。HIV−1に既に感染した個体において、免疫原は該個体中に既に存在するいずれかの免疫応答に加えて免疫応答を生じさせ、そして従ってその個体におけるウイルス負荷の低下を媒介する。従って、CD4非依存性のHIV−1 Envは、HIV−1ウイルスにより既に感染したヒトにおける治療的ワクチンとして有用である。
【0117】
本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envはタンパク質、核酸(ベクターもしくは裸のDNAを含んで成る)および/またはCD4非依存性のenvをコードする核酸を発現する細胞として投与することができることの真価をみとめるであろう。
【0118】
別の局面において、ヒトにおけるHIV−1感染症の治療方法は、HIV感染症を治療するために使用される化合物をさらに投与することを含んで成る。本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、こうした化合物は、限定されるものでないが、プロテアーゼ阻害剤、1種の逆転写酵素阻害剤、1種の逆転写酵素阻害剤(ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド双方の類似物を包含する)、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインを挙げることができる。化合物は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envの投与前、その間もしくは後に投与することができる。
【0119】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envに関する化合物の時間的調節が、HIV−1 EnvおよびEnv免疫原とともに投与される特定の化合物(1種もしくは複数)、ならびに患者の健康および齢ならびに疾患過程の重症度および段階に関する免疫感作レジメンに依存することができることの真価をみとめるであろう。
【0120】
HIV−1 Env免疫原(1種もしくは複数)および/または本明細書に記述される方法のいずれかを使用して同定される化合物は、今や記述されるとおりに処方しかつHIV感染症の治療および/もしくは予防のため哺乳動物に投与することができる。
【0121】
本発明は、有効成分としてHIV感染症の治療に有用な化合物を含んで成る製薬学的組成物の製造法および使用を包含する。こうした製薬学的組成物は、被験体への投与に適する形態の、最低1種の有効成分の組み合わせ剤(例えば、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envおよびインターロイキン−2のようなHIV感染症を治療するのに使用される化合物)として有効成分単独より成ることができるか、あるいは、製薬学的組成物は、有効成分、および1種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体、1種もしくはそれ以上の付加的成分、またはこれらの数種の組み合わせを含むことができる。有効成分は、当該技術分野で公知であるように、生理学的に許容できる陽イオンもしくは陰イオンとの組み合わせでのような生理学的に許容できるエステルもしくは塩の形態で製薬学的組成物中に存在することができる。
【0122】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、それと有効成分を組み合わせることができかつ被験体に有効成分を投与するのに組み合わせの後に使用することができる化学的組成物を意味する。
【0123】
本明細書で使用されるところの「生理学的に許容できる」エステルもしくは塩という用語は、エステルもしくは塩の形態の有効成分を意味し、これは製薬学的組成物のいかなる他の成分とも適合性であり、それは該組成物を投与すべきである被験体に対し有害でない。
【0124】
本明細書に記述される製薬学的組成物の製剤は、既知のもしくは薬理学の技術分野で将来開発されるいずれかの方法により製造することができる。一般に、こうした予備的(preparatory)方法は、有効成分を担体または1種もしくはそれ以上の他の補助成分と連合させること、およびその後、必要もしくは所望の場合は、生成物を所望の単一もしくは複数用量の単位に造形もしくは包装することの段階を包含する。
【0125】
本明細書に提供される製薬学的組成物の記述は、主としてヒトへの倫理的投与に適する製薬学的組成物に向けられるとは言え、こうした組成物は一般に全部の種類の動物への投与に適することが当業者により理解されるであろう。製薬学的組成物を多様な動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適する該組成物の改変は十分に理解されており、そして通常の熟練を積んだ家畜の薬理学者は、単に通常の(あれば)実験を用いてこうした改変を設計かつ実施することができる。本発明の製薬学的組成物の投与が企図される被験体は、限定されるものでないがヒトおよび他の霊長類、非ヒトの霊長類、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連のある哺乳動物を包含する哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウのような商業的に関連のある鳥を包含する鳥類、養殖された(farm−raised)魚および養魚池の魚を包含する魚、ならびに養殖された貝のような甲殻類を挙げることができる。
【0126】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、口腔内、眼、もしくは別の投与経路に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。他の企図される製剤は、射出されたナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球、および免疫学的に基づく製剤を包含する。
【0127】
本発明の製薬学的組成物は、単一単位用量としてもしくは複数の単一単位用量として、バルクで製造、包装もしくは販売することができる。本明細書で使用されるところの「単位用量」は、予め決められた量の有効成分を含んで成る製薬学的組成物の別個の量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与されることができる有効成分の投薬量、または例えばこうした投薬量の半分もしくは1/3のようなこうした投薬量の便宜的な画分に等しい。
【0128】
本発明の製薬学的組成物中の有効成分、製薬学的に許容できる担体およびいずれかの付加的成分の相対量は、治療される被験体の正体(identity)、大きさおよび病状に依存して、またさらに組成物が投与されるはずである経路に依存して、変動することができる。例として、組成物は0.1%と100%(w/w)との間の有効成分を含むことができる。
【0129】
本発明の製薬学的組成物は、有効成分に加え、1種もしくはそれ以上の付加的な製薬学的有効成分をさらに含むことができる。とりわけ企図される付加的成分は、抗吐薬、ならびにシアニドおよびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャー、ならびにAZT、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターロイキン−2、インターフェロン、サイトカインなどを包含する。
【0130】
本発明の製薬学的組成物の制御もしくは持続性放出製剤は、慣習的技術を使用して作成することができる。
【0131】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の製剤は、限定されるものでないが錠剤、硬もしくは軟カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤または舐剤を挙げることができる別個の固体の用量単位の形態で製造、包装もしくは販売することができ、それぞれは予め決められた量の有効成分を含有する。経口投与に適する他の製剤は、限定されるものでないが粉末状もしくは顆粒状製剤、水性もしくは油性の懸濁剤、水性もしくは油性の溶液、または乳剤を挙げることができる。
【0132】
本明細書で使用されるところの「油性」の液体は、炭素を含有する液体分子を含んで成りかつ水より小さい極性の特徴を表すものである。
【0133】
有効成分を含んで成る錠剤は、例えば、場合によっては1種もしくはそれ以上の付加的成分とともに、有効成分を圧縮もしくは成形することにより作成することができる。圧縮錠剤は、場合によっては結合剤、滑沢剤、賦形剤、界面活性剤および分散助剤の1種もしくはそれ以上と混合された粉末状もしくは顆粒状の調製物のような、自由に流動する形態の有効成分を適する装置中で圧縮することにより製造することができる。成形錠剤は、有効成分、製薬学的に許容できる担体、および混合物を湿らせるのに少なくとも十分な液体の混合物を、適する装置中で成形することにより作成することができる。錠剤の製造で使用される製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないが不活性希釈剤、顆粒化および崩壊剤、結合剤、ならびに滑沢剤を挙げることができる。既知の分散助剤は、限定されるものでないがバレイショデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムを挙げることができる。既知の界面活性剤は、限定されるものでないがラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。既知の希釈剤は、限定されるものでないが炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを挙げることができる。既知の顆粒化および崩壊剤は、限定されるものでないがトウモロコシデンプンおよびアルギン酸を挙げることができる。既知の結合剤は、限定されるものでないがゼラチン、アラビアゴム、前ゼラチン化された(pre−gelatinized)トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを挙げることができる。既知の滑沢剤は、限定されるものでないがステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを挙げることができる。
【0134】
錠剤は、コーティングされなくてよいか、もしくは、それらは被験体の消化管における遅延した崩壊を達成するために既知の方法を使用してコーティングすることができ、それにより有効成分の持続性の放出および吸収を提供する。例として、グリセリルモノステアレートもしくはグリセリルジステアレートのような素材を、錠剤をコーティングするのに使用することができる。さらなる例として、錠剤は、浸透圧で制御される放出錠剤を形成するために、米国特許第4,256,108号;同第4,160,452号;および同第4,265,874号明細書に記述される方法を使用してコーティングすることができる。錠剤は、製薬学的に上質のかつ味のよい製剤を提供するために、甘味料、香味料、着色料、保存剤もしくはこれらの数種の組み合わせをさらに含むことができる。
【0135】
有効成分を含んで成る硬カプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。こうした硬カプセル剤は有効成分を含んで成り、また、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンのような不活性の固体の希釈剤を包含する付加的成分をさらに含むことができる。
【0136】
有効成分を含んで成る軟ゼラチンカプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。こうした軟カプセル剤は、水、またはラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような油媒体と混合することができる有効成分を含んで成る。
【0137】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体の形態で、または使用前に水もしくは別の適するベヒクルを用いる再構成に意図される乾燥生成物の形態のいずれかで製造、包装および販売することができる。
【0138】
液体の懸濁剤は、水性もしくは油性のベヒクル中の有効成分の懸濁剤を達成する慣習的方法を使用して製造することができる。水性ベヒクルは、例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性ベヒクルは、例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油のような植物油、分別された(fractionated)植物油、および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。液体の懸濁剤は、限定されるものでないが、懸濁化剤、分散もしくは湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、香味料、着色料および甘味料を挙げることができる1種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。油性の懸濁剤は増粘剤をさらに含むことができる。既知の懸濁化剤は、限定されるものでないがソルビトールシロップ、水素化可食脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を挙げることができる。既知の分散もしくは湿潤剤は、限定されるものでないが、レシチンのような天然に存在するホスファチド、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分的エステル、もしくは脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分的エステルとのアルキレンオキシドの縮合生成物(例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)を挙げることができる。既知の乳化剤は限定されるものでないがレシチンおよびアラビアゴムを挙げることができる。既知の保存剤は、限定されるものでないが、パラヒドロキシ安息香酸メチル、エチルもしくはn−プロピル、アスコルビン酸およびソルビン酸を挙げることができる。既知の甘味料は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ショ糖およびサッカリンを包含する。油性懸濁剤のための既知の増粘剤は、例えばミツロウ、硬質パラフィンおよびセチルアルコールを包含する。
【0139】
水性もしくは油性の溶媒中の有効成分の液体の溶液は、液体の懸濁剤と実質的に同一の様式で製造することができ、主な差異は、有効成分を溶媒中に懸濁するよりはむしろ溶解することである。本発明の製薬学的組成物の液体の溶液は、液体の懸濁剤に関して記述された成分のそれぞれを含むことができ、懸濁化剤は溶媒中の有効成分の溶解を必ずしも補助しないことができることが理解される。水性溶媒は、例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性の溶媒は、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油のような植物油、分別された植物油、および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。
【0140】
本発明の製薬学的製剤の粉末状および顆粒状の製剤は既知の方法を使用して製造することができる。こうした製剤は、被験体に直接投与することができ、例えば錠剤を形成する、カプセルを充填する、またはそれへの水性もしくは油性のベヒクルの添加により水性もしくは油性の懸濁剤もしくは溶液を製造するのに使用することができる。これらの製剤のそれぞれは、分散もしくは湿潤剤、懸濁化剤および保存剤の1種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。増量剤および甘味料、香味料もしくは着色料のような付加的な賦形剤もまたこれらの製剤中に包含することができる。
【0141】
本発明の製薬学的組成物は、水中油乳剤もしくは油中水乳剤の形態で製造、包装もしくは販売することもまたできる。油相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油のような植物油、流動パラフィンのような鉱物油、またはこれらの組み合わせであることができる。こうした組成物は、アラビアゴムもしくはトラガカントガムのような天然に存在するガム、ダイズもしくはレシチンのホスファチドのような天然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレエートのような脂肪酸およびヘキシトール無水物の組み合わせ由来のエステルもしくは部分的エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキシドとのこうした部分的エステルの縮合生成物のような1種もしくはそれ以上の乳化剤をさらに含むことができる。これらの乳剤は、例えば甘味料もしくは香味料を包含する付加的成分もまた含有することができる。
【0142】
本発明の製薬学的組成物は、直腸投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした組成物は例えば坐剤、保持浣腸製剤、および直腸もしくは結腸の灌注のための溶液の形態であることができる。
【0143】
坐剤製剤は、通常の室温(すなわち約20℃)で固体でありかつ被験体の直腸温(すなわち健康なヒトで約37℃)で液体である非刺激性の製薬学的に許容できる賦形剤と有効成分を組み合わせることにより作成することができる。適する製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないがカカオバター、ポリエチレングリコールおよび多様なグリセリドを挙げることができる。坐剤製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【0144】
保持浣腸製剤、または直腸もしくは結腸の灌注のための溶液は、有効成分を製薬学的に許容できる液体の担体と組み合わせることにより作成することができる。当該技術分野で公知であるとおり、浣腸製剤は、被験体の直腸の解剖学的構造に適合された送達装置を使用して投与することができ、かつ、それ内に包装することができる。浣腸製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【0145】
本発明の製薬学的組成物は、膣投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした組成物は、例えば坐剤、タンポンのような含浸もしくは被覆された膣に挿入可能な素材、ビデ製剤、またはゲルもしくはクリーム、または膣灌注のための溶液の形態にあることができる。
【0146】
化学的組成物で素材を含浸もしくはコーティングするための方法は当該技術分野で既知であり、そして、限定されるものでないが表面上に化学的組成物を沈殿もしくは結合する方法、化学的組成物を素材の合成(すなわち生理学的に分解可能な素材を用いるような)の間に素材の構造中に組み込む方法、およびその後の乾燥を伴いもしくは伴わずに吸収体素材に水性もしくは油性の溶液もしくは懸濁剤を吸収させる方法を挙げることができる。
【0147】
膣灌注のためのビデ製剤もしくは溶液は、有効成分を製薬学的に許容できる液体の担体と組み合わせることにより作成することができる。当該技術分野で公知であるとおり、ビデ製剤は、被験体の膣の解剖学的構造に適合された送達装置を使用して投与することができ、かつ、それ内に包装することができる。ビデ製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【0148】
本明細書で使用されるところの、製薬学的組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的破壊を特徴とするいずれかの投与経路、および組織中の破壊による製薬学的組成物の投与を包含する。従って、非経口投与は、限定されるものでないが、組成物の注入、外科的切開による組成物の適用、組織を浸透する非外科的創傷による組成物の適用などによる製薬学的組成物の投与を挙げることができる。とりわけ、非経口投与は、限定されるものでないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎透析注入技術を挙げることができることが企図される。
【0149】
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水もしくは滅菌の等張の生理学的食塩水のような製薬学的に許容できる担体と組み合わせられた有効成分を含んで成る。こうした製剤は、ボーラス投与もしくは連続的投与に適する形態で製造、包装もしくは販売することができる。注入可能な製剤は、アンプル、もしくは保存剤を含有する複数用量の容器中のような単位投与剤形で製造、包装もしくは販売することができる。非経口投与のための製剤は、限定されるものでないが、油性もしくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液、乳剤、パスタ剤および埋込可能な持続性放出もしくは生物分解可能な製剤を挙げることができる。こうした製剤は、限定されるものでないが、懸濁化剤、安定剤もしくは分散助剤を挙げることができる1種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。非経口投与のための製剤の一態様において、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与に先立ち適するベヒクル(例えば、滅菌の発熱性物質を含まない水)での再構成のための乾燥した(すなわち粉末もしくは顆粒の)形態で提供される。
【0150】
製薬学的組成物は、滅菌の注入可能な水性もしくは油性の懸濁剤もしくは溶液の形態で製造、包装もしくは販売することができる。この懸濁剤もしくは溶液は、既知技術に従って製造することができ、そして、有効成分に加えて、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤もしくは懸濁化剤のような付加的成分を含むことができる。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水もしくは1,3−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤もしくは溶媒を使用して製造することができる。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないがリンゲル溶液、等張の塩化ナトリウム溶液、および合成のモノもしくはジグリセリドのような固定油を挙げることができる。有用である他の非経口で投与可能な製剤は、微晶質の形態で、リポソーム製剤中に、もしくは生物分解可能なポリマー系の成分として有効成分を含んで成るものを包含する。持続性の放出もしくは埋込のための組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、わずかに可溶性のポリマーもしくはわずかに可溶性の塩のような製薬学的に許容できるポリマー性もしくは疎水性の素材を含むことができる。
【0151】
局所投与に適する製剤は、限定されるものでないが、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤もしくはパスタ剤のような水中油もしくは油中水乳剤、および溶液もしくは懸濁剤のような液体もしくは半液体の製剤を挙げることができる。局所で投与可能な製剤は、例えば約1%から約10%(w/w)までの有効成分を含んで成ることができるとは言え、有効成分の濃度は溶媒中での有効成分の溶解性の限界と同じくらい高いことができる。局所投与のための製剤は、本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【0152】
本発明の製薬学的組成物は、口腔を介する肺投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、有効成分を含んで成りかつ約0.5から約7ナノメートルまで、および好ましくは約1から約6ナノメートルまでの範囲の直径を有する乾燥粒子を含むことができる。こうした組成物は、便宜的に、粉末を分散するよう噴射剤の流れをそれに向けることができる乾燥粉末溜めを含んで成る装置を使用する、または、封止された容器中の低沸点噴射剤中に溶解もしくは懸濁された有効成分を含んで成る装置のような自己噴射溶媒/粉末分注容器を使用する投与のための乾燥粉末の形態にある。好ましくは、こうした粉末は、重量で粒子の最低98%が0.5ナノメートルより大きい直径を有しかつ数で粒子の最低95%が7ナノメートル未満の直径を有する粒子を含んで成る。より好ましくは、重量で粒子の最低95%が1ナノメートルより大きい直径を有し、かつ、数で粒子の最低90%が6ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは、糖のような固体の微細な粉末希釈剤を包含し、また、便宜的には単位投与剤形で提供される。
【0153】
低沸点噴射剤は、一般に、大気圧で65°Fより下の沸点を有する液体噴射剤を包含する。一般に、噴射剤は組成物の50ないし99.9%(w/w)を構成することができ、そして有効成分は組成物の0.1ないし20%(w/w)を構成することができる。噴射剤は、液体の非イオン性もしくは固体の陰イオン性界面活性剤、または固体の希釈剤(好ましくは、有効成分を含んで成る粒子と同一の桁の粒子径を有する)のような付加的成分をさらに含むことができる。
【0154】
肺送達のため処方される本発明の製薬学的組成物は、有効成分を溶液もしくは懸濁剤の小滴の形態でもまた提供することができる。こうした製剤は、場合によっては滅菌の、有効成分を含んで成る水性もしくは希アルコール性の溶液もしくは懸濁剤として製造、包装もしくは販売することができ、かつ、便宜的には、いずれかの噴霧(nebulization)もしくは噴霧(atomization)装置を使用して投与することができる。こうした製剤は、限定されるものでないが、サッカリンナトリウムのような香味料、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、もしくはヒドロキシ安息香酸メチルのような保存剤を挙げることができる1種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。この投与経路により提供される小滴は、好ましくは、約0.1から約200ナノメートルまでの範囲の平均直径を有する。
【0155】
肺送達に有用であるとして本明細書に記述される製剤は、本発明の製薬学的組成物の鼻内送達にもまた有用である。
【0156】
鼻内投与に適する別の製剤は、有効成分を含んで成りかつ約0.2から500マイクロメートルまでの平均粒子を有する粗い粉末である。こうした製剤は、嗅剤が摂取される様式で、すなわち鼻孔近くに保持される粉末の容器からの鼻の通過による迅速吸入により投与する。
【0157】
鼻投与に適する製剤は、例えば、0.1%(w/w)と同じくらいから、そして100%(w/w)と同じくらいの有効成分を含んで成り、そして本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【0158】
本発明の製薬学的組成物は、口腔内投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、例えば慣習的方法を使用して作成された錠剤もしくは舐剤の形態であることができ、そして、例えば、0.1ないし20%(w/w)の有効成分であることができ、均衡は、経口で溶解可能もしくは分解可能な組成物および場合によっては本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上を含んで成る。あるいは、口腔内投与に適する製剤は、有効成分を含んで成る散剤またはエアゾル化もしくは噴霧される溶液もしくは懸濁剤を含むことができる。こうした粉末状、エアゾル化もしくはエアゾル化された製剤は、分散される場合に、好ましくは約0.1から約200ナノメートルまでの範囲の平均粒子もしくは小滴径を有し、また、本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【0159】
本発明の製薬学的組成物は、眼投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、例えば、例えば水性もしくは油性の液体担体中に0.1〜1.0%(w/w)の有効成分の溶液もしくは懸濁液を包含する点眼薬の形態であることができる。こうした点眼薬は、緩衝剤、塩、または本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上の他者をさらに含むことができる。有用である他の眼に(ophthalmalmically)投与可能な製剤は、微晶質の形態でもしくはリポソーム製剤中に有効成分を含んで成るものを包含する。
【0160】
本明細書で使用されるところの「付加的成分」は、限定されるものでないが以下すなわち賦形剤;界面活性剤;分散助剤;不活性希釈剤;顆粒化および崩壊剤;結合剤;滑沢剤;甘味料;香味料;着色料;保存剤;ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物;水性のベヒクルおよび溶媒;油性のベヒクルおよび溶媒;懸濁化剤;分散もしくは湿潤剤;乳化剤、粘滑剤;緩衝剤;塩;増粘剤;増量剤;乳化剤;抗酸化剤;抗生物質;抗真菌剤;安定剤;ならびに製薬学的に許容できるポリマー性もしくは疎水性物質の1種もしくはそれ以上を挙げることができる。本発明の製薬学的組成物に包含することができる他の「付加的成分」は当該技術分野で既知であり、そして例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences(1985、Genaro編、マック パブリッシング カンパニー(Mack Publishing Co.)、フィラデルフィア州イーストン)(引用により本明細書に組み込まれる)に記述される。
【0161】
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与することができる本発明の化合物の投薬量は、動物の体重1キログラムあたり1μgから約100gまでの量の範囲にわたる。一方、投与される正確な投薬量は、限定されるものでないが動物の型および治療されている疾患状態の型、動物の齢および投与経路を挙げることができるいずれかの数の因子に依存して変動することができる。好ましくは、化合物の投薬量は、動物の体重1キログラムあたり約1mgから約10gまで変動することができる。より好ましくは、投薬量は動物の体重1キログラムあたり約10mgから約1gまで変動することができる。
【0162】
化合物は1日に数回と同じくらい頻繁に動物に投与することができるか、あるいは、それは、1日1回、週1回、2週間ごとに1回、月1回のような、より少なく頻繁に、あるいは数ヶ月ごとに1回または年1回もしくはより少なくさえのような、なおより少なく頻繁に投与することができる。投与の頻度は当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが治療されている疾患の型および重症度、動物の型および齢などのようないずれかの数の因子に依存することができる。
【0163】
HIV感染症を治療するのに使用される化合物は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envと共投与することができる。あるいは、化合物(1種もしくは複数)を、免疫原性の用量(1個もしくは複数)のHIV−1 Envに先だって1時間、1日、1週間、1ヶ月もしくはなおより以上、またはそのいずれかの順序変更(permutation)で投与することができる。さらに、化合物(1種もしくは複数)は、免疫原性の用量(1個もしくは複数)のHIV−1 Envの後1時間、1日、1週間もしくはなおより以上、またはそのいずれかの順序変更で投与することができる。頻度および投与レジメンは当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが治療されている疾患の型および重症度、動物の齢および健康状態、投与されている化合物もしくは化合物類の正体、多様な化合物およびHIV−1 Envの投与経路などのようないずれかの数の因子に依存することができる。
【0164】
本発明は、以下の実験的実施例への引用により詳細にさらに記述する。これらの実施例は具体的説明のみの目的上提供され、そして別の方法で明記されない限り制限であることを意図していない。従って、本発明は、以下の実施例に制限されると決して解釈されるべきでないが、しかしむしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるいずれかのおよび全部の変形物を包含すると解釈されるべきである。
定義
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、本節でそれに関連した意味を有する。
【0165】
冠詞「a」および「an」(ひとつの)は、該冠詞の文法上の目的語の1つもしくは1つ以上(すなわち最低1つ)を指すために本明細書で使用する。例として、「1つの要素(an element)」は1個の要素もしくは1個以上の要素を意味する。
【0166】
本明細書で使用されるところの、HIV−1感染症を「緩和する」ことは、該疾患もしくは障害の症状の重症度を低下させることを意味する。
【0167】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源から、もしくは組換えの供給源から生じられた無傷の免疫グロブリンであることができ、また、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)2、ならびに一本鎖抗体および人化抗体を包含する多様な形態で存在することができる(Harlowら、1988、Antibodies:A Laboratory Manual、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中;Houstonら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;Birdら、1988、Science 242:423−426)。
【0168】
本明細書で使用されるところの「合成抗体」という用語により、例えば本明細書に記述されるようなバクテリオファージにより発現される抗体のような、組換えDNA技術を使用して生じられる抗体を意味する。該用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成により生じられた抗体を意味すると解釈されるべきであり、そしてこのDNA分子は抗体タンパク質もしくは抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでDNAもしくはアミノ酸配列は、利用可能かつ当該技術分野で公知である合成DNAもしくはアミノ酸配列の技術を使用して得られている。
【0169】
該用語が本明細書で使用されるところの「生物学的活性」により、タンパク質がその会合されたタンパク質(1種もしくは複数)と相互作用しかつ細胞内でおよび/もしくはHIV−1感染に関してその正常の機能(1種もしくは複数)を実施する能力を有することを意味する。一態様において、8x gp120は、該タンパク質がCXCR4ケモカイン受容体タンパク質に結合するためおよび宿主細胞膜とのウイルスエンベロープの融合を媒介するためにCD4との相互作用を必要としないため、その生物学的活性を保持する。さらに、それがEnvのいずれかの形態もしくはフラグメントを指すところの生物学的活性は、該ポリペプチドが、それがCD4にもまた結合するという要件なしにケモカイン受容体タンパク質に結合する能力を有することを意味する。
【0170】
該用語が本明細書で使用されるところの「ケモカイン受容体結合部位」により、限定されるものでないがCXCR4もしくはCCR5のようなヒトケモカイン受容体タンパク質を特異的に結合するウイルスのgp120の部分を意味する。従って、CXCR4ケモカイン受容体結合部位は、CXCR4ケモカイン受容体に特異的に結合するがしかしCCR5のような別のケモカイン受容体に実質的に結合しないHIV−1 gp120分子の一部分を意味する。同様に、CCR5ケモカイン受容体結合部位は、CCR5に特異的に結合するがしかしCXCR4などのような別のケモカイン受容体を包含するいずれかの他の分子に有意に結合しないHIV−1 gp120分子の一部分を意味する。
【0171】
該用語が本明細書で使用されるところの「CD4非依存性」という用語により、HIV−1株が、CD4タンパク質を発現しない細胞を感染させることが可能であり、かつ/もしくはCD4に誘導されるコンホメーション変化(1種もしくは複数)の非存在下でそのgp120が補助受容体に結合することができることを意味する。しかしながら、CD4非依存性のHIV−1はCD4および適切なケモカイン受容体(これは必要とされないが)を発現する細胞もまた感染させることができる。
【0172】
本明細書で使用されるところの「キメラ」という用語により、異なるHIV−1株からのenvの一部分をコードする最低1種の核酸に共有結合されたenvの少なくとも一部分をコードする8x核酸の一部分を含んで成る、envをコードする核酸を意味する。
【0173】
その用語が本明細書で使用されるところの「Envクローン」という用語により、gp120およびgp41を含んで成るEnvタンパク質gp160をコードするenv核酸を意味する。完全長のEnvクローンは完全なEnvタンパク質gp160をコードする一方、部分的クローンは、8xに特異的である突然変異を含むことができる8x Envのより小さい部分を構築するのに使用することができる完全長のクローンのフラグメント(1種もしくは複数)を包含する。
【0174】
本明細書で使用されるところの「相補性」は、2種の核酸(例えば2個のDNA分子)の間のサブユニット配列の相補性の広範な概念を指す。分子の双方のあるヌクレオチド位置が相互と塩基対形成することが通常は可能なヌクレオチドにより占有される場合には、該核酸はこの位置で相互に対し相補性であると考えられる。従って、分子のそれぞれの実質的な数(最低50%)の対応する位置が通常相互と塩基対形成する(例えばA:TおよびG:Cヌクレオチド対)ヌクレオチドにより占有される場合に、2種の核酸は相互に対し相補性である。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の配列に対し相補性である。アンチセンス配列がDNA分子のコーディング鎖のコーディング部分に対してのみ相補性であることは必要ではない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA分子のコーディング鎖上で明記された調節配列に対し相補性であることができ、この調節配列はコーディング配列の発現を制御する。
【0175】
「をコードする(encoding)核酸」もしくは「をコードする(coding)核酸」という用語の使用は、所望のタンパク質、および実際のコーディング配列に付随するいかなる必要な5’もしくは3’非翻訳領域もコードするRNAもしくはDNA配列を包含すると解釈されるべきである。
【0176】
これらの用語が本明細書で使用されるところの「コードする(encoding)」および「コードする(coding)」という用語により、核酸のヌクレオチド配列が目的の特定のポリペプチドを特定することが可能であることを意味する。すなわち、該核酸が転写および/もしくは翻訳されてポリペプチドを産生することができる。従って、例えば、HIV−1 Envをコードする核酸は、転写および/もしくは翻訳されてHIV−1エンベロープタンパク質を産生することが可能である。
【0177】
本明細書で使用されるところの、ポリペプチドに適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常、最低約7個の連続するアミノ酸、典型的には最低約15個の連続するアミノ酸、より典型的には最低約30個の連続するアミノ酸、典型的には最低約40個の連続するアミノ酸、好ましくは最低約50個のアミノ酸、なおより好ましくは最低約60個のアミノ酸であることができ、そして最も好ましくは、ペプチドフラグメントは長さが約60より長い連続するアミノ酸であることができる。
【0178】
本明細書で使用されるところの「相同な」は、2種のポリマー分子の間(例えば2種の核酸分子(例えば2種のDNA分子もしくは2種のRNA分子)の間、または2種のポリペプチド分子の間)のサブユニット配列の類似性を指す。2種の分子の双方のあるサブユニット位置が同一の単量体サブユニットにより占有される場合(例えば2種のDNA分子のそれぞれのある位置がアデニンにより占有される場合)には、それらはその位置で相同である。2種の配列の間の相同性は、適合するもしくは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、2種の化合物の配列の位置の半分(例えば長さが10サブユニットのポリマーの5個の位置)が相同である場合には、該2配列は50%相同であり、位置の90%(例えば10個のうち9個)が合致しているもしくは相同である場合は、該2配列は90%の相同性を共有する。例として、DNA配列3’ATTGCC5’および3’TATGCG5’は50%の相同性を共有する。
【0179】
さらに、目的の2種の核酸もしくは2種のタンパク質の間の相同性パーセントを計算するのにアルゴリズムを使用することができ、そしてこれらは当該技術分野で公知である。
【0180】
該用語が本明細書で使用されるところの「免疫原性の用量」という用語により、タンパク質(それがタンパク質として投与されようと核酸として投与されようと)が投与されないそれ以外は同一の哺乳動物の免疫応答に比較して、該タンパク質に対する検出可能な体液性および/もしくは細胞性免疫応答を生じさせるタンパク質の量を意味する。一局面において、該用量はEnvタンパク質もしくはそのフラグメントとして投与する。別の局面において、該用量は核酸として投与する。
【0181】
本明細書で使用されるところの「単離された核酸」という用語により、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離されている核酸配列もしくはそのフラグメント(例えば、該フラグメントに通常隣接する配列(例えばそれが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに隣接する配列)から取り出されているDNAフラグメント)を意味する。該用語は、細胞中でそれに天然に付随する、核酸(例えばRNAもしくはDNA)またはタンパク質に天然に付随する他の成分から実質的に精製されている核酸にもまた当てはまる。従って、該用語は、例えば、ベクター中;自律性に複製するプラスミドもしくはウイルス中;または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組込まれる;あるいは他の配列に依存せず別個の分子として(例えばcDNA、またはPCRもしくは制限酵素消化により生じられるゲノムもしくはcDNAのフラグメントとして)存在する組換えDNAを包含する。それは、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAもまた包含する。
【0182】
本明細書で使用されるところの「単離されたペプチド」、「単離されたポリペプチド」もしくは「単離されたタンパク質」という用語により、細胞中で該タンパク質もしくはペプチドに天然に付随する成分(例えば、DNA、RNA、他のタンパク質およびペプチド、炭水化物ならびに脂質)から実質的に分離されているペプチドもしくはタンパク質を意味する。単離されたペプチドおよびタンパク質という用語は、単離された核酸を含んで成る細胞から発現および/もしくは分泌されるペプチドもしくはタンパク質を包含すると解釈することができる。
【0183】
本発明のペプチド(もしくはそれをコードするDNA)の「突然変異体」、「誘導体」および「変異体」は、該ペプチド(もしくはDNA)が本明細書に再引用される配列に同一でないように1個もしくはそれ以上のアミノ酸(または1個もしくはそれ以上の塩基対)で変えることができるが、しかし該ペプチドがCD4非依存性の様式でケモカイン受容体タンパク質に結合するという特性を有するため本明細書に開示されるペプチドと同一の特性を有するペプチドである。
【0184】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、適切なEnvタンパク質をそれと組み合わせることができかつ組み合わせ後に患者に該タンパク質を投与するのに使用することができる化学的組成物を意味する。
【0185】
本明細書で使用されるところの「特異的に結合する」という用語により、例えばCXCR4ポリペプチドを認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子を実質的に認識もしくは結合しないケモカイン受容体結合部位を意味する。同様に、ケモカイン受容体結合部位は、該結合部位がサンプル中のCXCR4を認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子(例えばCCR5)を実質的に認識もしくは結合しない場合に「CXCR4を特異的に結合する」。同様に、ケモカイン受容体結合部位はCCR5を特異的に結合することができ、そして従ってCXCR4のような他の分子を結合しないとみられる。
【0186】
遊走群は、感染した細胞からのHIVのクローン化されないストックを指す。こうしたストックは、創始体(founder)もしくは親のウイルスの多くの遺伝子的に別個の変異体を含有することが既知であり、これゆえに「遊走群」という用語である。
【0187】
本明細書で使用されるところの「安定に露出されたケモカイン受容体結合部位」という用語は、典型的にケモカイン受容体タンパク質のgp120結合に前もって必要であるCD4とのgp120の相互作用に対する必要性なしに、ケモカイン受容体タンパク質に結合するのにgp120ケモカイン受容体結合部位が利用可能であることを意味する。本明細書に開示されるデータにより立証されるとおり、gp120のケモカイン受容体結合部位は、CD4の結合前のそれ以外は同一のCD4依存性のgp120よりも抗体中和に対しより感受性である、安定な露出された配置で存在することができる。安定に露出された形態のケモカイン結合部位は、最低約3ヶ月の期間の間および/もしくは無期限に溶液中で存在することができる。
【0188】
本明細書で使用されるところの「実質的に純粋な」という用語は、天然にそれに不随する成分から分離されている化合物(例えば核酸、タンパク質もしくはポリペプチド)を記述する。典型的には、サンプル中の総物質の最低約10%、好ましくは最低約20%、より好ましくは最低約50%、さらにより好ましくは最低約75%、なおより好ましくは最低約90%、そして最も好ましくは最低約99%(容積で、湿もしくは乾燥重量で、またはモルパーセントもしくはモル画分で)が目的の化合物である場合に、化合物は実質的に純粋である。純度は、いずれかの適切な方法により、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動もしくはHPLC分析により測定することができる。
【0189】
化合物(例えば核酸、タンパク質もしくはポリペプチド)は、それが天然に関連する成分を本質的に含まない場合、もしくはそれがその天然の状態でそれに付随する天然の汚染物質から分離されている場合にもまた「実質的に精製されて」いる。従って、本明細書で使用されるところの、核酸の「実質的に純粋な」調製物は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されている核酸配列(例えばそれが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに通常隣接する配列から取り出されているDNAフラグメント)を指す。
【0190】
同様に、本明細書で使用されるところの、タンパク質もしくはポリペプチドの「実質的に純粋な」調製物は、その天然に存在する状態でそれが通常伴う成分から精製されているタンパク質もしくはポリペプチドを指す。
【0191】
本明細書で使用されるところの「治療する」ことは、HIV−1感染症の症状が患者により経験される頻度を低下させることを意味する。
【0192】
該用語が本明細書で使用されるところの「誘導された」により、HIV−1 Envタンパク質は、gp120がCXCR4もしくはCCR5のようなケモカイン受容体タンパク質に結合することができる前にCD4に結合することを必要としないことを意味する。好ましくは、誘導されたEnvは、CD4への結合の非存在下でケモカイン受容体を結合することができるコンホメーションにあるgp120を含んで成る。
【0193】
本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語により、外因性の核酸をコードするいかなるプラスミドもしくはウイルスも意味する。該用語は、例えばポリリシン化合物などのような、ビリオンもしくは細胞中への核酸の移入を助長する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含するようにもまた解釈されるべきである。ベクターは、患者へのHIV−1 Envタンパク質もしくはHIV−1 envをコードする核酸の送達のための送達ベヒクルとして適するウイルスベクターであることができるか、または、ベクターは、同一の目的上適する非ウイルスベクターであることができる。細胞および組織へのDNAの送達のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当該技術分野で公知であり、そして例えばMaら(1997、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12744−12746)に記述される。ウイルスベクターの例は、限定されるものでないが組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えトリポックスウイルスなどを挙げることができる(Cranageら、1986、EMBO J.5:3057−3063;国際特許出願第WO94/17810号明細書(1994年8月18日公開);国際特許出願第WO94/23744号明細書(1994年10月27日公開))。非ウイルスベクターの例は、限定されるものでないがリポソーム、DNAのポリアミン誘導体などを挙げることができる。
【0194】
該用語が本明細書で使用されるところの「ワクチン」という用語により、ヒトもしくは家畜の患者に投与される場合に、HIV−1もしくはその成分(1種もしくは複数)に対する体液性および/もしくは細胞性の検出可能な免疫応答を誘導する化合物を意味する。
実施例1:HIV−1のCD4非依存性の決定子は、補助受容体特異性に必要とされる外側領域に位置する
本実施例に提示される実験は、以下のとおり要約することができる。
【0195】
HIVによる感染は、典型的にはウイルスエンベロープ糖タンパク質(Env)、CD4およびケモカイン受容体の間の相互作用を必要とするが、HIVおよびSIVのCD4非依存性の単離物が本明細書で発見された。本発明は、CD4の非存在下でCXCR4を利用する能力を表す、HIV−1/IIIBxと命名されたHIV−1/IIIBの変異体の派生を開示する。このウイルスでCD4陰性のTおよびB細胞を感染させ、そしてヒトCXCR4単独を発現するマウス3T3細胞と融合した。
【0196】
機能的なHIV−1/IIIBx envクローンは、5個のグリコシル化部位の目立った喪失を包含するいくつかの突然変異を表した。本明細書に開示されるデータはCD4依存性のenvをもつキメラの構築を立証する。該データは、CD4非依存性の決定子が、ケモカイン受容体特異性を決定するV1/V2およびV3超可変ループの外側、ならびに少なくとも部分的に、保存されたケモカイン受容体結合部位の形成に関係しているgp120コア上の一領域内に位置することを開示する。さらに、本明細書に開示されるデータは、CCR5向性のEnvのV3ループをHIV−1/IIIBx Env中に置換した場合、生じるキメラはCCR5を利用したがしかしCD4非依存性のままであったことを立証する。従って、開示されたデータは、ケモカイン受容体特異性のEnv決定子は、細胞融合へのその受容体の使用を媒介するものと異なることを初めて立証する。これらの知見は、HIV−1/IIIBx中の突然変異はCD4の非存在下でCXCR4もしくはCCR5のいずれかと相互作用することができる保存されたケモカイン受容体部位を露出させ、そしてワクチン開発のための露出されたケモカイン受容体結合部位をもつEnvの設計に重要な意味を有することができるという証拠を提供する。
【0197】
本明細書に提示されるデータは、CD4の非存在下でCXCR4を利用する能力を獲得した、HIV−1/IIIBxと命名されたHIV−1/IIIBの変異体の派生および分子の特徴づけを開示する。機能的HIV−1/IIIBx envクローン(8x)を使用して、緊密に関係するがしかしCD4依存性のenvを含むキメラを構築し、そしてCD4非依存性の決定子が、部分的に、保存されたケモカイン受容体結合部位、および可変ループの外側に位置することが示された。顕著なことに、8xがCCR5向性のEnvのV3ループを含有した場合、それはCCR5を利用したが、しかしCD4非依存性を維持した。これらの知見は、CD4結合は、遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体と相互作用することができるgp120コア上のドメインを露出させることがありそうであるという証拠を提供する。この研究は、新規生化学的および免疫原性の特性を表すことができる露出されたケモカイン受容体接触部位をもつHIV−1 Envタンパク質の設計で重要な意味を有することができる。
【0198】
本実施例に提示される実験で使用された材料および方法を今や記述する。
【0199】
細胞、ウイルスおよび感染力アッセイ。
【0200】
Hut−78およびSupT1は不死化されたCD4+ T細胞系である。BC7はSupT1由来のCD4陰性の系統である(Endresら、1996、Cell 87:745−756)。クローン化されないHIV−1/IIIBは、Popovicら(1984、Science 224:497−500)に記述されるとおり慢性に感染したHut−78細胞中で得た。この感染したHut−78細胞培養物からの上清のウイルスをSupT1細胞上で連続的に継代し、これからBC7上でのその後の継代によりHIV−1/IIIBxを単離した。IIIB/Supウイルスは、SupT1中での早期継代HIV−1/IIIBから生じさせた。トランスフェクションされない、およびヒトCXCR4で安定にトランスフェクションされたNIH−3T3細胞は、(Dengら、1996、Nature 381:661−666)に記述された。逆転写酵素(RT)アッセイは、Endresら(1997、Science 278:1462−1464)に記述されるとおり培養物上清で実施した。中和アッセイのためには、BC7細胞を、変動する濃度の抗CXCR4 MAbもしくは12G5(Endresら、1997、上記)とともに37℃で30分間前インキュベートし、細胞にその後HIV−1/IIIBx(10 TCID50)を接種し、そして細胞をRT活性についてモニターした。
【0201】
PCR、クローニング、ウイルス産生およびキメラ構築。
【0202】
完全長のenvコーディング領域は、センスプライマー5’−CGCAACCTATACCAATAGTAGCAA−3’[配列番号1]およびアンチセンスプライマー5’−CAGTAAGCCATCCAATCACACTAC−3’[配列番号2]を使用して、バイオサイクラー(BioCycler)(エリコンプ(Ericomp)、カリフォルニア州サンディエゴ)中で、慢性に感染した細胞のゲノムDNAからPCRにより増幅した。PCR産物をpCDNA3.1(インヴィトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州サンディエゴ)にTAクローン化し、そしてレポーター遺伝子融合アッセイで試験した。自動化シークェンサーを使用して、HIV−1/IIIBx(8x)およびIIIB/Sup(S10)の機能的クローンを配列決定した。クローンはまた、Asp718およびBamHIを使用して、HXBc2 envを含有したpSP73(プロメガ コープ(Promega Corp.)、ウィスコンシン州マディソン)中にもサブクローニングした(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365)。
【0203】
機能的envクローンを、env中の唯一のNdeIおよびBamHI制限部位を使用してpNL4−3の3’半ゲノム(EcoRI部位から)にサブクローニングし、これはHIV−1/IIIBxおよびIIIB/Sup中の突然変異を包含する。5’pNL4−3 Δvpr半ゲノム(EcoRI部位まで)(Gibbsら、1994、AIDS Res.Hum.Retroviruses.10:343−350)および多様な3’半ゲノム構築物の各20μgをEcoRIで消化すること、フェノール抽出すること、ならびに電気穿孔法によるBC7およびSupT1へのトランスフェクション前に共沈殿させることにより、ウイルスを生成させた。細胞をシンシチウム形成についてモニターし、そして上清のウイルスを収穫してウイルスストックを生成させた。HIV−1/IIIBウイルスストックは、1mlのアリコート中、−70℃で凍結した。HIV−1/IIIBxおよび8xのウイルスストックは、5%ショ糖中−140℃で凍結して感染力を保存した。8xとS10もしくはHXBc2との間のキメラ(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365)は、TM(すなわちEnvの膜貫通部分であるEnvのgp41部分)からSU(すなわちEnvの表面部分であるEnvのgp120部分)の変化を単離するためのBsaBI部位(nt7673)、ならびにV1−V2、V3およびV4/C4領域を単離するためのそれぞれDraIII(nt6714)、StuI(nt6948)およびBsu36I(nt7430)を使用して構築した。R5ウイルスのV3ループを含有するクローンは、BaLのV3ループをもつHXBのプロウイルスクローン(Hwangら、1991、Science 253:71−74)からのAsp718−BamHIフラグメントをpSP73−HXBc2(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365)にサブクローニングすることにより構築した。BaLのV3ループを含有する8xのバージョンは、このプロウイルスのStuI−Bsu36IフラグメントをpSP73−8x中に挿入することにより類似の様式で作成した。
【0204】
細胞−細胞融合アッセイ。
【0205】
細胞−細胞融合を媒介するenv遺伝子の能力は、ルシフェラーゼに基づく遺伝子レポーターアッセイ(Ruckerら、1997、Methods Enzymol.288:118−133)を使用して評価した。簡潔には、ウズラQT6細胞を、CaPO4によりHIV envを含有するプラスミドとコトランスフェクションし、そしてT7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス(Alexanderら、1992、1992、J.Virol.66:2934−2942)に感染させた。これらの細胞を、ヒトCD4およびT7プロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を伴いもしくは伴わずに、ヒトCXCR4もしくはCCR5を一過性に発現するウズラQT6細胞と混合した。細胞を組み合わせた7〜8時間後に細胞を溶解すること、および発光計(luminometer)でルシフェラーゼ発現を測定することにより、融合を定量した。
【0206】
逆転写酵素アッセイ。
【0207】
細胞の生産性感染を、既に記述された(Hoxieら、1985、Science 229:1400−1402)ような培養物上清中の逆転写酵素(RT)活性の検出により報告した。簡潔には、1mlの澄明にされた培養物上清からのウイルスを、100,000×gで4℃で30分間ペレットにし、そしてウイルスを100μlの可溶化緩衝液(0.15Mトリス pH8.0、0.4M NaCl、0.25%トリトン(Triton)X−100、10%グリセロール、0.5mM D.T.)中で可溶化した。二重の20μlのアリコートを85μlのRTカクテル(0.05単位のポリr(A)および12.5μCiの3H−dTTPを含有する67.5mMトリス pH7.5、1.3mM D.T.、1mM ATP、13.5mM MgCl2)と混合し、そして37℃で1時間インキュベートした。チューブを氷上に置き、225μgのtRNAを各チューブに添加し、そしてRNAを冷10%TCAで沈殿させた。沈殿されたRNAをガラス繊維フィルター上で捕捉し、そしてRNAをTCAおよびEtOHで洗浄した。フィルターを乾燥し、そして各フィルター上に存在する放射活性(1分あたりのカウント、cpmで)をシンチレーションカウンター(LKB/ワラック(Wallac)、フィンランド・テュルク)中で測定した。
【0208】
突然変異誘発。
【0209】
製造元の仕様書に従ってクイックチェンジ[Quickchange](商標)部位特異的突然変異誘発キット(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラホヤ)を使用して、pSP73中のEnv構築物中に点突然変異を工作した。以下のプライマー対、すなわちD368R−順、5’CCTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAACGC−3’(配列番号5);D368R−逆、5’GCGTTACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG−3’(配列番号6)が、CD4結合を除去したD368R突然変異を生じた。2組のオリゴヌクレオチド、すなわち8x−G431E−順 5’−GGCAGGAAGTAGAAAAAGCAATGTATGCCCC−3’(配列番号7)および8X−G431E−逆 5’GGGGCATACATTGCTTTTTCTACTTCCTGCC−3’(配列番号8);ならびにS10−E431G−順 5’−GGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCC−3’(配列番号9)およびS10−E431G−逆 5’−GGGGCATACATTGCTTTTCCTACTTCCTGCC−3’(配列番号10)を使用して、8xおよびS10中の位置431の残基の相互交換を達成した。
【0210】
ウェスタンブロット。
【0211】
感染した細胞培養物の上清から単離されたウイルスを、100,000×gで4℃で90分間ペレットにし、そしてウイルスペレットを氷上の溶解緩衝液(20mMトリス pH8.0、120mM NaCl、0.2%デオキシコール酸ナトリウム、0.5% NP−40、0.2mM EGTA、0.2mM NaF、1μMペプスタチン、5μg/mlロイペプチン、5μg/mlアプロチニン)に再懸濁した。等容積のライセートおよび2×サンプル緩衝液(50mMトリス、pH6.8、2% SDS、30%グリセロール、10% β−メルカプトエタノール、0.2%パイロニンY)を7分間沸騰させ、氷上で7分間冷やし、そしてその後サンプルを12% SDS−PAGEゲル上で泳動した。
【0212】
マルチフォア(Multiphor)IIセミドライ電気転写装置(ファルマシア−LKB バイオテクノロジー インク(Pharmacia−LKB Biotechnology Inc.)、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を使用して、タンパク質をゲルからニトロセルロース(バイオラッド ラボラトリーズ(BioRad Laboratories)、カリフォルニア州リッチモンド)に転写した。Earlら(1997、J.Virol.71:2674−2684)に記述されるようなD12マウスモノクローナル抗体、次いで、ビオチニル化ヒツジ抗マウスIG(重鎖および軽鎖)(ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、フィラデルフィア州ウェストグローヴ)、ワサビペルオキシダーゼに結合されたストレプトアビジン(ストレプトアビジン−HRP、アマーシャム(Amersham)、イリノイ州アーリントンハイツ)および化学発光基質(ピアース ケミカル カンパニー(Pierce Chemical Co.)、イリノイ州ロックフォード)を使用して、HIV−1膜貫通タンパク質の存在をブロット上で検出した。
【0213】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【0214】
HIV−1/IIIBのCD4非依存性変異体の派生。
【0215】
HIV−1/IIIBのCD4非依存性変異体を、SupT1中のHIV−1/IIIBのクローン化されないストックの連続的継代、およびその後BC7(SupT1のCD4陰性系統)(Endresら、1996、Cell 87:745−756)を接種することにより派生させた。1実験においては、免疫蛍光アッセイ(IFA)により、およそ5%のBC7細胞がウイルスのp24gagについて陽性であった。この培養物からのウイルスを、感染していないBC7細胞上で2回継代し、そして慢性に感染した系統を樹立した。HIV−1/IIIBxと命名されたこの系統からのウイルスを、IIIB/SupT1と呼称される、SupT1細胞中のHIV−1/IIIBのより早期の継代と比較した。図1Aに示されるとおり、HIV−1/IIIBxのみがBC7を感染させることができた一方、双方のウイルスがSupT1を感染させることが可能であった。HIV−1/IIIBxは、Raji細胞(CD4陰性のBリンパ芽球様細胞系)もまた感染させることが可能であった。BC7の感染は、抗CXCR4 MAb、12G5により完全に阻害することができ(図1B)、この感染がCXCR4により媒介されることがありそうであったことを示した。さらに、HIV−1/IIIBxに感染したBC7細胞は、ヒトCXCR4を安定に発現したマウス3T3線維芽細胞と共培養された場合にシンシチウムを誘導した一方、トランスフェクションされない3T3細胞上では融合が誘導されなかった(図1C)。加えて、HIV−1/IIIBに感染したHUT−78細胞をCXCR4を発現する3T3細胞と共培養した場合には、融合が観察されなかった。一緒にすると、これらのデータは、HIV−1/IIIBx変異体が、TおよびBリンパ球様細胞系ならびにマウス線維芽細胞上で、CD4の非存在下に主受容体としてCXCR4を利用することができることを示す。
【0216】
機能的HIV−1/IIIBx envのクローニングおよび特徴づけ。
【0217】
HIV−1/IIIBx(8xと呼称される)の完全長のenvクローン(配列番号4)を、感染したBC7細胞からPCRにより増幅し、pSP73にクローン化し、そして細胞融合アッセイで原型のCD4依存性のIIIBクローン(HXBc2)と比較した。8xおよびHXBc2の双方が、CD4およびCXCR4の双方を発現するウズラQT6細胞上での融合を媒介することが可能であったが、しかし、8xのみが、CXCR4単独を発現した細胞と融合することができた(図2)。注目すべきことに、CD4およびCXCR4が共発現された場合に8xの融合が高められ、8x EnvはなおCD4と相互作用することが可能であることがありそうであったことを示した。加えて、pNL4−3プロウイルスにクローン化された8x envは、複製能力のあるウイルスを生じさせ、これはSupT1ならびにBC7細胞を感染させ(図3A)、8x EnvがCD4の非存在下でCXCR4を利用することが可能であった、および、8xクローンがクローン化されない親IIIBxウイルスを代表したという、さらなる証拠を提供した。
【0218】
8xのCD4非依存性を、gp120のアミノ酸位置368のAspからArgへの置換を導入することにより、さらに評価した。このAspは全部のHIV−1単離物のあいだで高度に保存され、そしてCD4のCDR2ループ中のArg−59と塩橋を形成することによりCD4結合の決定的に重要な決定子である(Kwongら、1998、Nature 393:648−659)。この位置での突然変異はCD4結合を除去することが示されている(Olshevskyら、1990、J.Virol.64:5701−5705)。図2に示されるとおり、D368R(すなわちアミノ酸368でのAspからArg)突然変異は、CD4およびCXCR4を共発現した細胞上のHXBc2による融合を排除したとは言え、この突然変異は、CXCR4のみを発現する標的細胞上での8xに媒介される融合に影響を及ぼさなかった。8x−D368Rの融合は、8xクローンと異なり、CD4がCXCR4と共発現された場合に高められず、8x−D368R EnvがCD4と相互作用することが不可能であったことを確認した。従って、8x Envは、CD4の非存在下でCXCR4を利用することが可能であったのみならず、gp120上のCD4結合部位を破壊した突然変異を耐えることもできた。
【0219】
envクローンの配列分析。
【0220】
8x(配列番号3)およびS10(配列番号12)の配列を、HXBc2の発表された配列(配列番号11)と比較した(図4)。8x中の突然変異の数は多い(gp120中に16個およびTM中に7個)一方、gp120中の突然変異の6個およびTM中の2個は、HIV−1/IIIB由来の他のenvクローン中で観察されており、そして従ってCD4非依存性の表現型に関与していることがありそうでない。gp120において、11個の独特の突然変異のうち8個は、超可変ループ、V1/V2(S143G、I165K、G167S、Q170KおよびT188P)、V3(R298K、Q310HおよびI320V)ならびにV4(N386K)中であった。3個の突然変異はgp120コア中にあった(D62E、N339S、I423V)。興味深いことに、gp120中の5個の突然変異は潜在的なNに結合されるグリコシル化部位の喪失をもたらし、そしてこれらのうち4個(S143G、T188P、N339SおよびN386K)は8xに独特であった。TMの外的ドメイン中の4個の8xに特異的な突然変異は、コイルドコイルを形成する2領域内に配置された(T536A、L544S、N651IおよびK655M)。顕著なことに、8xはTMの膜にわたるドメイン中に単一のヌクレオチド欠失もまた含有し、これは位置706にフレームシフトを導入し、わずか30アミノ酸の規準から外れた細胞質の尾を生成させた。短縮された細胞質の尾をもつHIV−1ウイルスは、典型的に減弱されているかもしくは非感染性である(Shimizuら、1992、Virology 189:534−546;Dubayら、1992、J.Virol.66:6616−6625;Chenら、1996、Virology 226:260−268)ため、この特徴は驚くべきである。にもかかわらず、上に示されたとおり、8x Envは、SupT1ならびにBC7細胞を感染させることができた複製能力のあるウイルスを生成することが可能であった(図3A)。さらに、クローン化されないHIV−1/IIIBxならびに8x envを含有するNL4−3からのウイルスライセートのウェスタンブロットは、親HIV−1/IIIBの41kDに比較して、およそ35kDのTMを立証した(図3B)。
【0221】
キメラEnvタンパク質を使用するCD4非依存性のマッピング。
【0222】
CD4非依存性の決定子を同定するため、8xとHXBc2との間で一組の相互キメラを生成させた。TM中の突然変異からgp120中のものを単離しそしてV1/V2、V3およびV4/C4サブドメイン中の突然変異の効果を定義するため、独特の制限部位を選んだ(図5)。キメラをpSP73にクローン化し、そしてCXCR4を単独でもしくはCD4とともに発現する標的細胞上で、本明細書に記述されるような融合アッセイで分析した。各キメラの結果は、CXCR4およびCD4双方を発現した標的細胞でのHXBc2 Env融合活性の融合活性のパーセントとして表す。CXCR4およびCD4が標的細胞上で共発現された場合に全部のキメラが機能的であったとは言え、HXBc2のものの約50%から約500%までの範囲にわたる融合活性を伴うかなりの量的差異が検出された(図6)。gp120全体およびTMを交換した相互キメラはCD4依存性であったが、とは言えHXBc2 TMをもつ8x gp120[8x(gp120)]の評価は、このEnvの乏しい全体的融合活性によりいくぶん限定された。注目すべきことに、8x TMを含有したキメラは、HXBc2、もしくはHXBc2 TMを含有したキメラより融合原性(fusogenic)であり、8xの外部ドメインもしくは未熟に短縮された細胞質の尾中の決定子がこれらのクローンの増大された融合原性に寄与していたことを示唆した。にもかかわらず、これらの知見は、CD4非依存性の決定子がgp120もしくはTMに完全に制限されなかったことを示唆した。
【0223】
8xの背景にHXBc2のgp120サブドメインを導入したキメラのなかで、個々にもしくは組み合わせでのいずれかでのV1/V2およびV3ループの置換は、CD4非依存性を除外することに失敗した(図6;キメラHX(V1/V2)、HX(V3)、HX(V1−V3)を参照されたい)。ケモカイン受容体特異性の決定子としてのこれらのループの重要性(Choら、1998、J.Virol.72:2509−2515;Choeら、1996、Cell 85:1135−1148;Cocchiら、1996、Nature Med.2:1244−1247;Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:11360−11365;RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7682−7686;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139)を考えるとこの知見は興味深かった。これらのキメラについては、8xに関する融合活性はCD陰性および陽性双方の細胞で低下した(80%)とは言え、CD4依存性の融合はHXBc2でみられるものよりなおより大きかった。対照的に、HXBc2 V4/C4を含有したHX(v4/C4)の融合活性はCD4陰性細胞で低下したが、しかしCD4+細胞で不変であった。興味深いことに、8xのV3およびV4/C4双方のドメインをHXBc2のもので置き換えた[HX(V3−C4)]場合、CD4非依存性の融合は完全に排除された一方、CD4の存在下での融合は影響を及ぼされなかった。
【0224】
8xのドメインをHXBc2の背景上に置いたキメラについて、gp120のどの単一の領域もHXBc2にCD4非依存性を賦与することが可能でなく、gp120およびTM双方中の決定子が必要とされるという上で示された証拠と矛盾しなかった(図6)。しかしながら、8xからのV4/C4およびTM双方のドメインを含有したHXBc2キメラ[8x(V4−TM)]は、CD依存性および非依存性双方の融合に対し高度に能力があった。8xおよびHXBc2に基づくキメラを用いたこれらの知見は、集合的に、8x gp120 V3、およびとりわけV4/C4ドメイン中の決定子が8xのCD4非依存性の表現型に寄与するが、しかし8x TMと会合される場合のみであることを示す。
【0225】
IIIBxに感染した細胞からのCD4依存性クローンの評価。
【0226】
CD4依存性のEnvを、IIIBxに感染したSupT1細胞からもまた生じさせた。S10と命名されたこのクローンは、CXCR4およびCD4を共発現したQT6細胞上での融合を媒介することが可能であったが、しかしCD4の非存在下で融合することが不可能であった(図7)。配列分析は、S10がHXBc2に関して8xと数個の突然変異を共有したことを立証した(gp120中で8個およびgp41中で3個)(図4)。加えて、S10は数個の独特の突然変異、すなわち、gp120中でC4中のG431EおよびV5中のS461N、ならびにTM中で、位置611および674の予測されたNに結合されるグリコシル化部位の喪失を包含する、外部ドメインおよび膜にわたるドメイン中の6個の付加的なアミノ酸変化を含有した(図4)。S10は、TMの細胞質の尾中に55ntの欠失もまた含有し、これは、8xに類似に、フレームシフト突然変異および未熟に短縮された細胞質の尾を生じさせる。この欠失はまた、N末端で核局在化シグナルを除外しかつRRE結合部位の前でタンパク質を短縮するフレームシフト突然変異を導入することにより、revの読取り枠も混乱させる(PollardとMalim、1998、Annu.Rev.Microbiol.52:491−532)。最後に、S10は、8x gp120(S143G、G167S、Q310HおよびI423V)ならびにTM(N651I)中に存在した数個の変化を欠いていた。S10がCD4+/CXCR4+標的細胞での融合アッセイで機能的であったとしても、このenvは、その非機能的Revタンパク質の結果としてありそうであるが、NL4−3にクローン化された場合に感染性のウイルスを生成させることが不可能であった。
【0227】
S10 Envは8xと数個の突然変異を共有したがしかし完全にCD4依存性であったため、この変化の決定子を同定するために8xとS10との間の一組のキメラを作成した。図7に示されるとおり、S10の背景上に8x V3およびV4/C4[8x(V3−C4)]もしくはV4/C4単独[8x(V4/C4)]を含有したキメラは若干のCD4非依存性を表した一方、8xの背景上の相互キメラ、[S10(V3−C4)]および[S10(V4/C4)]は、完全にCD4依存性であった。S10 V4/C4ドメインは唯一のG431E突然変異を含有したため、この変化がCD4非依存性に対する負の影響を有することができた可能性が考えられた。事実、GlyをS10のこの位置で回復させた場合(S10−E431G)、このクローンはCXCR4を発現する標的細胞上で限定された程度のCD4非依存性を表した。さらに、G431E突然変異を8xに導入した場合(8x−G431E)、このクローンは融合能力のあるままであったが、しかし完全にCD4依存性となった(図7)。従って、C4ドメイン内での電荷の変化は8xのCD4非依存性を排除するのに十分であり、そして、これらのデータは、CD4非依存性の表現型に決定的に重要であるとしてこの領域を巻き込んだ、上述された8x/HXBc2キメラを使用して得られたマッピングのデータをさらに支持する。
【0228】
CCR5向性のV3ループはケモカイン受容体の特異性を変えるが、しかしCD4非依存性を変えない。
【0229】
ケモカイン受容体の特異性の決定におけるV3ループの重要性、およびCD4非依存性の決定子がこのドメインの外側に配置されたという証拠を考え、8xの向性およびCD4非依存性を分離することができる程度を検査した。マクロファージ/CCR5向性の単離物HIV−1/BaLからのV3ループを含有したHXB2 gp120(HXB2−V3BaL)(Hwangら、1991、Science 253:71−74)を使用して、8xにBaL V3ループを導入した。生じるキメラ(8x−V3BaL)を、CD4の存在もしくは非存在下で、CXCR4もしくはCCR5を発現した標的細胞での融合アッセイにおいて、8x、HXBc2およびHXB2−V3BaLと比較した(図8)。本明細書に開示されるデータが立証するとおり、HXBc2およびHXB2−V3BaLは、それぞれCXCR4もしくはCCR5を発現する細胞上で融合を表し、そしてそれらの活性は厳格にCD4依存性であった。対照的に、8x−V3BaLキメラはCCR5向性およびCD4非依存性の双方であった。従って、8xのCD4非依存性の決定子は、ケモカイン受容体の向性を媒介するものと機能的に別個である。
【0230】
本明細書に開示されるデータは、CD4の非存在下でCXCR4を利用することができる、HIV−1/IIIBxと命名されたHIV−1/IIIBのCD4非依存性の変異体の派生および特徴づけを立証する。IIIBxの8x envクローンは、HIV−1プロウイルス中にクローン化される場合に、複製能力のあるCD4非依存性のウイルスを生成させることが可能であり、また、CD4の非存在下でCXCR4を発現するウズラ細胞での融合を媒介することができた。このクローンはまた、gp120の位置368(DE4結合部位の形成に決定的に重要であることが既に示された残基)(Kwongら、1998、Nature 393:648−659;Olshevskyら、1990、J.Virol.64:5701−5705)のAspの代わりにArgを用いた場合にも完全に機能的であった。8xの配列分析は、他のHIV−11/IIIBプロウイルスクローンにおいて記述されていない17個の突然変異、およびgp120上の5個のグリコシル化部位の顕著な正味の喪失を示した。8xと、関係するCD4依存性クローンHXBc2との間の相互キメラは、CD4非依存性の決定子が超可変V1/V2およびV3ループの外側に位置したことを示した。8xのV4/C4およびTM双方のドメインを含有したHXBc2キメラはCD4非依存性であった一方、いずれかのドメイン単独を含有したキメラはCD4依存性であった。加えて、gp120のC4ドメイン中に唯一のG431E突然変異を含有した、IIIBx遊走群からのCD4依存性クローンS10は、この突然変異を修正した場合にCD4非依存性となった。8xへのG431E突然変異の導入はこのEnvを完全にCD4依存性とし、この位置での電荷の変化がCXCR4のCD4非依存性(しかしCD4依存性でない)の利用を混乱させるのに十分であったことを示した。これらの知見は、集合的に、ケモカイン受容体結合部位がgp120コア上に存在すること、および、この領域中の突然変異は、TM中の変化と共同してHIV−1 EnvをCD4の非存在下で完全に機能的にすることができることを示す。
【0231】
HIV−1のV3ループは、CD4結合後のCCR5もしくはCXCR4のケモカイン受容体の特異性の主要な決定子であることが示されている(Choら、J.Virol.72:2509−2515;Choeら、1996、Cell 85:1135−1148;Cocchiら、1996、Nature Med.2:1244−1247;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139;Trkolaら、1998、J.Virol.72:1876−1885;Wuら、1996、Nature 384:179−183)。より最近、V1/V2領域もまた、適切なV3の情況において、CCR3、CCR2b、STRL33およびAPJを包含する付加的なケモカイン受容体の使用を媒介することが示され(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:11360−11365;RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7682−7686)、V1/V2とV3との間の協同的相互作用がケモカイン受容体の認識に関与していることを示唆する。これらのループは、CD4結合後にコンホメーション変化を受けることが知られており(Jonesら、1998、J.Biol.Chem.273:404−409;Mooreら、1994、J.Virol.68:469−484;Wuら、1996、Nature 384:179−183;Wyattら、1992、J.Virol.66:6997−7004)、これは特定のケモカイン受容体との相互作用を助長することができる(Jonesら、1998、J.Biol.Chem.273:404−409;Wuら、1996、Nature 384:179−183;Wyattら、1992、J.Virol.66:6997−7004)。しかしながら、これらの知見は、V3それ自身がケモカイン受容体結合部位を含有することができることを示唆した一方、CCR5もしくはCXCR4向性のウイルスの間でのV3ループの顕著な遺伝子の多様性は、これらのループが共通の構造要素を含有すること、もしくはEnv上の他の領域もまたケモカイン受容体の利用に寄与することのいずれかを示す。最近、CCR5向性のHIV−1 gp120の突然変異誘発が、gp120コアの内側および外側のドメインを連結する架橋シートにより形成されるEnv上のまず確実なCCR5結合部位を同定した。この領域はV1/V2ループの基部とV3ループの基部との間に配置され、そしてCD4結合後に細胞膜に向けられると予測される(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。CCR5およびCXCR4向性のEnvの間でのこの領域中のアミノ酸の顕著な保存は、この部位が、複数のケモカイン受容体と相互作用することが可能な包括的なケモカイン受容体結合ドメインを表すことができることを示唆した。これらの知見は、特定のケモカイン受容体との最初の相互作用を助長しかつ融合が起こるためにその後必要とされるこの保存された結合部位を露出する、V1/V2およびV3ループの動きをCD4が誘導するというモデルと矛盾しない(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953;WyattとSodroski、1998、Science 280:1884−1888)。
【0232】
8xクローンのCD4非依存性の決定子はケモカイン受容体の特異性に必要とされる外側領域に位置したため、異なるV3が、そのCD4非依存性に影響を及ぼすことなく8xのケモカイン受容体の向性を変えることができるという可能性を検討した。顕著なことに、本明細書に開示されるデータは、CCR5向性のEnv(HIV−1BaL)からのV3ループを8x中に挿入した場合に、生じるキメラがCCR5を発現する細胞上でのCD4非依存性の融合を媒介することが可能であったことを立証する。CD4を伴うもしくは伴わない、CXCR4を発現する細胞上での融合は、このキメラで観察されなかった。対照的に、HXBc2の背景上でHIV−1/BaL V3ループを含有するキメラはCCR5を利用したが、しかし完全にCD4依存性であった。これらのデータは、ケモカイン受容体の特異性、および融合のためのその受容体の利用が、gp120の別個の領域により媒介されることを明瞭に示す。さらに、本明細書に開示されるデータは、V3上の特異性決定子がなお必要とされるとは言え、CD4非依存性のウイルス上で機能的にされるgp120コア上の一領域が、遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体を使用する融合を媒介することが可能であるという直接の証拠もまた提供する。
【0233】
上に示されたgp120上の架橋シートは、主としてC4ドメインおよびV1/V2の幹(stem)からのアミノ酸から構成される(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。この領域はまた、CD4結合により誘導されるgp120のエピトープの形成に寄与することも示されている(Kwongら、1998、Nature 393:648−659;Thaliら、1993、J.Virol.67:3978−3988)。興味深いことに、8x V4/C4ドメイン中の2個の突然変異(N386KおよびI423V)ならびにV3ループの基部近くの第三の突然変異(R298K)は、この領域にすぐに隣接する位置に位置する(図9A)。本明細書に開示されるデータが立証するとおり、HXBc2からの対応するV3およびV4/C4ドメインを包含しかつこれらの突然変異を欠いた8xキメラは、融合に対し高度に能力があったが、しかし完全にCD4依存性であった(図6)。理論により拘束されることを願わないが、推定のケモカイン受容体結合ドメインへのR298K、N386KおよびI423Vの顕著な近接は、これらの突然変異がこの部位を露出させ、そして/もしくはそれをウイルス結合の間にケモカイン受容体に提示するのを助けることを強く示唆する。さらに、本明細書の別の場所に開示されるデータ(実施例2、下)は、組換え8x gp120がCXCR4を発現する細胞にCD4に独立に結合することが可能であること、および、gp120のケモカイン受容体ドメイン内に部分的に含有されるCD4に誘導されるエピトープが、CD4結合の非存在下で安定に露出されることを立証する。加えて、S10および8x上のCD4非依存性を排除するのに十分であった、C4中のG431E突然変異は、gp120コアの結晶構造により、ケモカイン受容体結合部位に寄与するV1/V2の幹の基部の残基に並置されることが示されている(図9B)。理論により拘束されることを願わないが、この残基での負の電荷の獲得は、V1/V2ループの向きを変えかつ/もしくはgp120上のケモカイン受容体結合部位のコンホメーションに影響を及ぼすことができる。機構に関係なく、このケモカイン受容体結合部位中もしくはその周囲の突然変異は、CD4なしで機能する8x Envの能力に対し正もしくは負に影響する可能性があり、そしてCD4結合がケモカイン受容体の利用の全体的な効率および/もしくは親和力を向上させるという見方と矛盾しないことが明らかである。
【0234】
V4/C4ドメインはIIBxのCD4非依存性に明瞭に関連する一方、Envの他の領域もまたこの表現型に寄与することが明らかである。HXBc2の背景上に8x V4/C4含有したキメラは、それが8x TMもまた含有した場合にのみCD4非依存性であった。CD4非依存性のHIV−2/ROD−BのReevesらによる以前の研究(1996、J.Virol.71:1453−1465)は、gp120およびTMの双方における突然変異がこの表現型に対する最小の要件であった(すなわち、HIV−1の類似のV4ループにすぐ近接するLeuからPheへの突然変異、およびTMの外部ドメインの最初の7個の基の反復中の2個の突然変異)ことを立証した。この効果の根底にある機構は不明であるが、HIV−1 TMの領域が、CD4および/もしくはケモカイン受容体へのその結合に影響を及ぼすことができるgp120との多数の協同的相互作用に関係している(Caoら、1993、J.Virol.67:2747−2755;Chanら、1997、Cell 89:263−273;Matthewsら、1994、Immunol.Rev.140:93−104)。注目すべきことに、上述されたgp120のケモカイン受容体結合部位は、TMとの相互作用が生じることがありそうである、集成されたEnvオリゴマーの予測される三量体の軸近くに配置される(Haigwoodら、1992、J.Med.Primatol.21:82−90)。最近の実験で得られたデータは、ならびに8x V4/C4およびTM中の8xのフレームシフトのみを含有するHXBc2キメラが、8xのもののおよそ10%のレベルまでCD4非依存性の融合を媒介することが可能であったことを立証する。この小さなしかし再現可能な効果がトランスフェクションされた細胞上のEnvの表面発現の増大によるのかどうか(LaBrancheら、1995、J.Virol.69:5217−5227;Mulliganら、1992、J.Virol.66:3971−3975)、またはこの効果がTMの外部ドメイン(Ritterら、1993、Virology 197:255−264;Spiesら、1994、J.Virol.68:585−591)および/またはgp120(Caoら、1993、J.Virol.67:2747−2755;Chanら、1997、Cell 89:263−273;Matthewsら、1994、Immunol.Rev.140:93−104)中の構造の変化によるのかどうかは、決定されるべきままである。
【0235】
さらに、8xは、本明細書の別の場所で既に示されたようなN386Kを包含するgp120中の5個のグリコシル化部位を除外すると予測される突然変異を含有し、この突然変異は推定のケモカイン受容体結合部位に隣接して存する。最近、炭水化物が、SIV gp120の免疫原性の改変および中和エピトープの遮蔽に関係している(Reitterら、1998、Nature Med.4:679−684)。理論により束縛されることを願わないが、1個もしくはそれ以上のグリコシル化部位の喪失はケモカイン受容体結合部位の露出にもまた関与することができることが可能である。
【0236】
本明細書に開示されるデータは、CD4非依存性の決定子としてのIIIBx V4/C4およびTM中の突然変異を巻き込んだとは言え、gp120の多様な領域中の突然変異が他のHIV−1単離物のCD4非依存性と関連していることが注目されるべきである。C2、C3およびV3ドメイン中の突然変異の組み合わせによって、CXCR4を使用してHeLa細胞を感染させることができたHIV−1/NDKのCD4非依存性の変異体が記述されている(Dumonceauxら、1998、J.Virol.72:512−519)。Sodroskiらによる最近の知見は、HIV−1/ADAのCD4非依存性のCCR5向性の変異体の決定子が、V1/V2の幹の遠位領域中の点突然変異に位置したことを立証した。これらの遺伝子の差異にもかかわらず、CD4非依存性のウイルスは、この表現型の類似の構造的基礎を有することができた。この点に関して、CD4非依存性のHIV−1/NDKおよびHIV−1/ADA中の変化の少なくともいくつかはIIIBxに類似であり、それらがケモカイン受容体へのこの領域の提示に影響を及ぼすことができるgp120の架橋シート近くに配置されている。
【0237】
HIVは、活発な宿主免疫応答にもかかわらずウイルス複製を継続することを可能にする戦略を進化させている(Weiら、1995、Nature 373:117−122;Perelsonら、1996、Science 271:1582−1586)。抗体の中和は、典型的には、あったとしても感染の経過の後期に生じ、そして頻繁にgp120上の群特異的(group−specific)決定子よりはむしろ型特異的(type−specific)決定子に向けられる(WyattとSodroski、1998、Science 280:1884−1888;MooreとHo、1995、AIDS 9:S117−S136)。gp120コアの推定される結晶構造は、CD4結合ドメインおよびケモカイン受容体結合部位が乏しく接近可能であり、そして/もしくはEnvオリゴマー内に隠されることを示唆した(WyattとSodroski、1998、Science 280:1884−1888;Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。対照的に、gp120の露出された表面は、体液性免疫応答のための免疫学的おとりとして作用することができる超可変ドメインおよび炭水化物を含有する(StamatatosとCheng−Mayer、1998、J.Virol.72:7840−7845;Reitterら、1998、Nature Med.4:679−684;Caoら、1997、J.Virol.71:9808−9812)。これらの保存されかつ機能的に決定的に重要なドメインを露出させるためのアプローチは、質的に異なりかつおそらくより有効な免疫応答が生成されることを可能にすることができる。LaCasseらによる最近の研究(1999、Science 283:357−362)は、gp120およびgp41上の保存された中和エピトープが明らかに安定化された、融合で活性化された形態のEnvが、マウスにおいて強力かつ広範に交差中和する抗体応答を生じさせることが可能であったことを立証した。この点に関して、派生されるもしくは設計されるCD4非依存性のEnvは、生物学的に関係した情況でこれらのドメインを提示するための手段を提供することができる。本明細書の別の場所で開示されるデータは、8x gp120が、CD4に誘導されるエピトープの増大された露出(実施例2を参照されたい)およびCD4の非存在下でCXCR4に結合する能力を包含する、多数の新規の免疫学的および生化学的特性を表すことを立証する。HIV−1/IIIBxおよび付加的なCD4非依存性の単離物の今後の研究は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の構造および機能に探りを入れ(probe)かつ治療の様式としての変えられた免疫原性の特徴をもつgp120分子の理にかなった設計につながる効果的なツールを提供するはずである。
実施例2:CD4非依存性のHIV−1エンベロープタンパク質中の補助受容体結合部位の安定な露出
本実施例に提示される実験は、以下のとおり要約することができる。
【0238】
実施例1に既に提示されたデータは、ケモカイン受容体CXCR4と直接相互作用してCD4の非存在下で細胞を感染させる、CD4非依存性のHIV−1ウイルス、HIV−1/IIIBxを開示する。本明細書に提示されるデータは、実施例1で既に開示された、8xと命名された、HIV−1/IIIBx遊走群からの新規のクローン化されたEnvを使用することにより、CD4非依存性の根底にある機構を開示する。8x Envクローンを使用して可溶性gp120を生じさせた。本明細書に開示されるデータは、8x gp120がCXCR4のみを発現する細胞に直接結合した一方、IIIB gp120の結合は可溶性CD4もまた必要としたことを立証する。さらに、光学的バイオセンサーを使用して、本明細書に開示されるデータは、モノクローナル抗体(MAb)17bおよび48dにより認識される、CD4に誘導される(CD4i)エピトープが、IIIB gp120上でよりも8x上でより露出されたことを立証する。CD4の非存在下での、CXCR4に直接結合しかつMAb 17bおよび48dと反応する8x gp120の能力は、17bエピトープと重なり合うgp120中の保存された補助受容体結合部位が露出される、部分的に誘導されたしかし安定な状態で8x gp120が存在することを示す。
【0239】
CCR5向性のHIV−1/BaL株からのV3ループでの、8xのCXCR4特異的V3ループの置換は、CD4非依存性のCCR5依存性のウイルス感染を媒介したEnvクローンをもたらした。従って、V3ループの置換はCD4の非存在下でCCR5に結合したgp120キメラ(8x−BaL)を生じさせた。かように、本明細書に開示されるデータは、部分的に誘導されたEnvタンパク質において、V3ループが補助受容体の使用の特異性を変えることができるが、しかしCD4非依存性を変えないことを立証する。さらに、本明細書に開示されるデータは、CD4非依存性およびケモカイン補助受容体結合が分離可能であることを示す。さらに、HIV−1/IIIBxは、CD4依存性のIIIB株がそうであったよりも、HIV陽性のヒト血清、多様な抗IIIB gp120ウサギ抗血清、およびCD4i MAbによる中和に対し、はるかにより感受性であった。抗体により中和に対する、HIV−1/IIIBxウイルスの増大された感受性、およびgp120の高度に保存された領域の安定な露出は、この機能上重要なドメインに対する抗体および小分子阻害剤の開発のための新規戦略を示唆する。
【0240】
本実施例に提示される実験で使用された材料および方法を今や記述する。
【0241】
プラスミド
ヒトCCR5、CXCR4およびCD4はpCDNA3ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して発現した。ルシフェラーゼ遺伝子は、pGEM2ベクター(プロメガ コープ(Promega Corp.)、ウィスコンシン州マディソン)中で、T7プロモーターの制御下に発現した。IIIBのHXBc2クローンからのEnvおよび8xは、双方ともpSP73ベクター(プロメガ コープ(Promega Corp.)、ウィスコンシン州マディソン)中で発現した。R5 HIV−1株BaLのV3ループを含有するEnv構築物を生成させるために、完全長のプロウイルスクローンpIIIB−V3BaLからのenv中のKpnI−BamHIフラグメントをpSP73−IIIBにクローン化した。BaLのV3ループを含有する8xの1バージョンを生じさせるため、pIIIB−V3BaLのStuI−Bsu361 envフラグメントをpSP73−8xにクローン化した。クイックチェンジ[Quickchange](商標)部位特異的突然変異誘発キット(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラホヤ)を使用して、gp120/gp41接合部で各envプラスミドに終止コドンを挿入して、gp120産生のための構築物を作成した。全部の突然変異体およびクローンの正体をDNA配列決定により確認した。
【0242】
細胞−細胞融合アッセイ
このアッセイは別の場所でより詳細に記述されている。簡潔には、T25フラスコ中のエフェクターQT6細胞を、T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス(vTF1.1)に感染させ、そして30μgのenv構築物でトランスフェクションし、ここで発現はT7プロモーターにより駆動された。標的QT6細胞を24穴プレート中でプレート培養し、そして、細胞の各ウェルを、CMVプロモーターの制御下の0.5μgのCD4プラスミドおよび1.0μgの補助受容体プラスミド、ならびにT7プロモーターの制御下の1.5μgのルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクションした。一夜発現の後、エフェクター細胞を標的細胞に添加し、そして、混合後7.5時間の細胞ライセート中でルシフェラーゼ活性を定量した。
【0243】
タンパク質の産生および精製
293T細胞を、T225フラスコ中でvTF1.1に感染させ、そして、細胞をその後、200μgのgp120プラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション後4時間に、細胞をリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)で洗浄し、そして血清を含まない培地中に24時間置いた。培地を収集し、0.1% TX−100の添加に先立ち遠心分離および0.2μm濾過により澄明にした。上清中のタンパク質を、ガランティス ナヴァリス(Galanthis Navalis)カラム(ベクター ラボラトリーズ(Vector Laboratories)、カリフォルニア州バーリンゲーム)に結合させ、メチル−α−D−マンノピラノシド(MES)緩衝液(20mM MES、pH7.0、0.13M NaCl、10mM CaCl2)で洗浄し、そして0.5Mα−メチルマンノシドを含有するMES緩衝液中に溶出した。溶出物を、付加的精製、洗浄、および50kDのタンパク質分子量カットオフを用いるアミコン(Amicon)限外濾過系を使用する濃縮にかけた。HPLC分析は、この様式で調製されたEnvが高度に純粋であったことを決定し、そして正確なタンパク質濃度をアミノ酸分析およびBCAアッセイにより測定した。
【0244】
細胞表面結合アッセイ
補助受容体へのgp120の結合は、Doranzら(1999、J.Virol.、73:2752−2761)により記述されたとおり測定した。簡潔には、およそ5μgの各gp120を、IIIB、8x、IIIB−V3BaLおよび8x−V3BaLについてそれぞれ12.3μCi/μg、7.15μCi/μg、47.3μCi/μgおよび22.0μCi/μgの比活性までヨードゲン(Iodogen)(ピアース(Pierce))を使用してヨウ素化した。1分あたり100,000カウント(CPM)を、総量で100μlの結合緩衝液(50mM Hepes pH7.4、5mM MgCl2、1mM CaCl2、5% BSA)中の14μgのDNAで前日にトランスフェクションされていた約0.5ないし約1.0×106個の293T細胞に添加した。示された場合に可溶性CD4(sCD4)を100nMで添加した。細胞を25℃で1時間インキュベートした。
【0245】
0.3%ポリエチレンイミン中に前浸積されたワットマン(Whatman)GF/Cフィルターを通して細胞を濾過すること、および4mlの洗浄緩衝液(50mM Hepes pH7.4、5mM MgCl2、1mM CaCl2、500mM NaCl)で2回洗浄することにより、結合されない放射活性を除去した。細胞の非存在下でフィルターに非特異的に結合した放射活性の量を、全部のデータ点から差し引いた。
【0246】
バイオセンサー実験
全部の実験は、25℃でバイアコア(BIACORE)2000(スウェーデン・ウプサラ)光学的バイオセンサーを使用して実施した。およそ200RUのsCD4、ならびに完全長のヒトMAb 17bおよび48dを、アミンカップリングにより研究等級のCM5チップに結合した。抗体もしくはsCD4を伴わない裸の(naked)センサー表面が、各結合相互作用の陰性対照として作用した。連続的に希釈していたEnvを、PBS+0.005%トゥイーン(Tween)20の運転緩衝液(running buffer)中の6種の異なる濃度(gp120について11nMないし585nM、gp120+sCD4について5nMないし91nM)で各センサー表面を横切って運転した(run)。可溶性CD4は、結合を測定する少なくとも30分前に8倍モル過剰でEnvに添加し、そしてセンサー表面に結合されたCD4へのEnvの結合を完全に除外した。結合および解離を、流れに依存しない結合のオン速度(on−rate)を与えた30μl/分の流速で、それぞれ300秒間測定した。センサー表面は、100μl/分で15秒間の10mM HClの2回の洗浄を使用することにより各結合反応の間に再生し、これは固定された表面の結合能力を低下させることなくシグナルを完全に基礎まで戻すことが見出された。陰性対照フローセルから得られたシグナルの減法により、各結合曲線を非特異的結合について補正した。会合および解離の動力学的定数を、最低5濃度の被検体の輸出された結合データの線形変換から生じさせた。得られた動力学的パラメータは、BIA Evaluation 3.1ソフトウェアを使用してデータを単純1:1ラングミュアー相互作用モデルに適合させることにより推定されたものと比較した。
【0247】
中和アッセイ
抗血清もしくはMAbによるウイルスの中和は、既に記述されたMAGIアッセイ(Chakerianら、1997、J.Virol.71:3932−3939)の改変物、もしくはConnorら(1995、Virology 206:935−944)により記述されたルシフェラーゼレポーターウイルス系を使用して実施した。簡潔には、1.25×105個のMAGI細胞を48穴プレート中でプレート培養し、そして細胞を接着させた。抗体の連続的希釈物と37℃で1時間前インキュベートしていたウイルスで細胞を感染させた。使用されたウイルスの量は、400〜800感染単位を含有するようにMAGIアッセイで既に決定された量であった。感染の24時間後にDP178阻害ペプチドを5μg/mlの最終濃度で添加してシンシチウムの形成を予防した。細胞培養物を別の48時間インキュベートし、固定しそして細胞をX−galで染色した。アルファイメージャー(AlphaImager)2000(アルファイノテック コーポレーション(AlphaInnotech Corporation)、カリフォルニア州サンリアンドロ)を使用して、青色の核を定量した。ルシフェラーゼレポーターウイルスの感染のためには、相対的光単位(RLU)により判断されるような等量のウイルスもまた、抗体の連続的希釈物とともに37℃で1時間インキュベートした。ウイルスを、96穴プレート中でGHOST−CCR5細胞に添加し、そして感染2日後に、細胞ライセートをルシフェラーゼ活性について測定した。
【0248】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【0249】
CXCR4への8x gp120の直接結合
HIV−1 EnvへのCD4の結合は、その後のEnvと補助受容体の相互作用に必要とされるコンホメーション変化を誘導する。これらの変化は、補助受容体結合に関係しているgp120中の例外的に良好に保存されたドメインの増大された露出を包含することがありそうである(図12)。多くのSIVおよびHIV−2株は、CD4非依存性の様式でウイルス進入に補助受容体を利用することにより、この正常な進入過程を省くことができるが、とは言えそれらの効率はCD4が存在する場合に典型的に高められる。実施例1に既に提示されたデータは、CD4陰性、CXCR4陽性の細胞上でのHIV−1 IIIBの反復された継代によるCD4非依存性のHIV−1株の産生を開示する(実施例1、上記)。生じるウイルス株(HIV−1/IIIBx)は、広範な細胞型を感染させるのに、CD4の非存在下でCXCR4を利用することができる(実施例1、上記)。8xと命名された、HIV−1/IIIBxに慢性に感染した細胞由来のEnvクローンはこの表現型を維持する。従って、8x Envを発現する細胞は、CD4陰性、CXCR4陽性の細胞との融合を媒介した。CD4の存在下で、融合の効率はおよそ3倍高められた(図10Aおよび10B)。8xにより媒介される融合はCXCR4に厳格に依存し、そして他の補助受容体が発現される場合に観察されない(図10Aおよび10B)。CD4は、それが補助受容体と相互作用することを可能にするEnvのコンホメーション変化を誘導することが既知であるため、また、8x EnvはCD4の非存在下でCXCR4依存性の融合を媒介することができるため、8x Envタンパク質が部分的に誘導された状態で存在してそれによりそれがCD4非依存性の様式でCXCR4を結合することを可能にするかどうかを決定するための実験を実施した。
【0250】
8x gp120のコンホメーションの差異を評価するために、CXCR4に直接に結合する精製された8x gp120の能力を検査した。この点に関して、Doranzら(1999、J.Virol.73:2752−2761)により記述されかつ本明細書に示されるような細胞表面結合アッセイを使用し、ここで、可溶性CD4(sCD4)との前インキュベーションを伴うもしくは伴わない、放射ヨウ素化されたgp120を、所望の補助受容体を発現する細胞に添加した。細胞を洗浄し、そして結合された放射標識されたgp120の量を測定した。本明細書に開示されるデータは、sCD4と複合体形成されたIIIB gp120がCXCR4を発現する細胞に結合したが、しかし他の補助受容体を発現する細胞に結合しなかったことを立証する(図11)。対照的に、8x gp120は、sCD4の存在もしくは非存在下で同等に良好に、CXCR4を発現する細胞に結合した(図11)。ベクター単独もしくはCCR5を発現する細胞への結合は観察されなかった。これらの結果は、親IIIB Envと異なり、8x gp120は、それがCD4の非存在下でCXCR4と直接相互作用することを可能にする安定なコンホメーションで存在することを立証する。
【0251】
補助受容体結合部位の露出
理論により拘束されることを願わないが、CXCR4に結合する8x gp120の能力は、CXCR4と相互作用するgp120上の部位の増大された露出の結果であることができる。これらの部位の増大された露出が存在したかどうかを決定するために、CD4i MAb 17bおよび48dと相互作用するIIIBおよび8x gp120の能力を検査した。17bのFabフラグメントをgp120およびsCD4と共結晶化し(Kwongら、1998、Nature 393:648−659)、そして開示されるデータは、17bとgp120の相互作用に関与する接触残基の多くが補助受容体結合にもまた重要であることを立証する(図12)。従って、17bを、Rizzutoら(1998、Science 280:1949−1953)により定義される保存された補助受容体結合部位の露出を測定するための免疫学的代理物として使用することができる。
【0252】
sCD4との前インキュベートを伴うもしくは伴わない、IIIBおよび8x gp120のCD4i MAb 17bおよび48dへの結合を、本明細書の別の場所に記述されるような光学的バイオセンサーアッセイ法を使用して測定した(実施例2の材料および方法を参照されたい)。このアプローチは、タンパク質−タンパク質相互作用を実時間で測定することを可能にし、そしてオン速度およびオフ速度、ならびに親和性定数を生じさせるのに使用することができる。所望のMAbをセンサー表面に共有結合し、その後gp120もしくはgp120−sCD4複合体を適用した。典型的なセンサー図(sensorgram)を図13に示す。期待されたとおり、HIV−1/IIIB gp120がMAb 17bに結合した速度は、sCD4とEnvの前インキュベーションにより顕著に増大した。17bに結合されれば、IIIB gp120およびgp120−sCD4複合体の双方が、無視できるオフ速度を表した。IIIB gp120に対照的に、8x gp120はsCD4なしで17bに効率的に結合し、IIIB gp120のものより大きな桁であったオン速度を表した。sCD4の添加はこのオン速度を2倍高めた。sCD4と複合体形成された場合に、8xおよびIIIB双方のgp120は同一のオン速度を表した(表1)。興味深いことに、17bに結合されれば、8x gp120はIIIB gp120が表したより大きなオフ速度を表した。この効果は、アミノ酸位置423(17bの接触部位であることが既に示されている残基(Kwongら、上記))での8x gp120中のIleからValへの突然変異によることができる(図12)。
【0253】
【表1】
【0254】
表1に開示されるデータは、本明細書の別の場所に既に記述されたとおり実施されたバイオセンサー実験で、CD4i抗体へのgp120の結合から生じられる見かけの動力学的定数および平衡定数を立証する。簡潔には、CD4i抗体17bおよび48dをバイオセンサー表面に結合し、そして8xおよびHXB gp120の連続的希釈物の結合および解離の双方を測定した。飽和量のsCD4と前混合していた双方のEnvの連続的希釈物の結合もまた測定した。全部の結合は25℃で実施し、そしてサンプルのセンサー図を図13に示す。データの直線化されたプロットの傾きの最も適合された値(r2≧0.98)を報告する。単純1:1ラングミュアー相互作用モデルを適合させることにより推定されたパラメータは、包括的に、報告された値の15%内であった。斜体の値は、それらがバイオセンサーの検出限界にあったくらい遅かった解離速度を表し、これらの値から生じられる親和性定数をより少なく正確にする。
【0255】
異なるCD4i MAb、48dの分析は、17bに類似であった結果を生じた(表1)。最後に、IIIBおよび8x gp120分子は、同一の様式で、センサー表面に結合されたCD4と相互作用した。従って、それをCD4非依存性にする8x中の突然変異はCD4結合にはっきりと感知できる程度まで影響を及ぼさなかったが、しかし17bエピトープのより大きな露出(保存された補助受容体結合部位と重なり合う)をもたらした。
【0256】
補助受容体の選択およびCD4非依存性の分離
gp120の保存された補助受容体結合部位ならびにV1/V2およびV3ループの双方が、Envと補助受容体の相互作用で重要な役割を担っている。入手可能な証拠は、V3ループ、およびより少ない程度までV1/V2領域が、与えられたEnvにより使用される補助受容体の数および型を支配することを示す(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365;RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7682−7686;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139;Cocchiら、1996、Nature Med.2:1244−1247;Choら、1998、J.Virol.72:2509−2515;Choeら、1996、Cell 85:1135−1148)。対照的に、保存された補助受容体結合部位中の突然変異はEnvと補助受容体の結合に影響を及ぼすことができる(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)が、しかし、この領域が補助受容体の特異性においてもまたある役割を担っているかどうかは明らかでない。CXCR4と直接相互作用する8x gp120の能力は、補助受容体の選択、および補助受容体結合部位を露出させるEnv中の変化が分離可能であるかどうかを決定する機会を提供した。以前の研究は、HIV−1 IIIB背景へのR5 V3ループ(HIV−1 BaLから)の導入が、ウイルス感染にCCR5を使用した(しかしCXCR4でない)Envタンパク質(IIIB−BaL)をもたらしたことを立証した(RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7682−7686;Rossら、1997、J.Virol.72:1918−1924)。実施例1で本明細書に既に開示されたデータは、細胞−細胞融合アッセイを使用して、R5 Env(BaL)からのV3ループでの8x Envのものの置換は、CCR5陽性、CD4陰性の細胞との融合を媒介することが可能であったタンパク質(8x−BaL)を生じさせたことを立証する。8x−BaLがCD4非依存性のウイルス感染もまた媒介することができたかどうかを決定するため、IIIB−V3BaLもしくは8x−V3BaLいずれかのEnvタンパク質を担持するConnorら(1995、Virology 206:935−944)に記述されたようなルシフェラーゼレポーターウイルスを生じさせた。8x−V3BaL Envを担持するビリオンは、CD4非依存性、CCR5依存性のウイルス感染を媒介した(図10B)。融合アッセイにおいて8x Envで観察されたとおり、CD4の存在はウイルス進入の効率を増大させた。CD4の存在もしくは非存在下で、IIIB−BaLもしくは8x−BaLのいずれもCXCR4を使用しなかった。また、IIIB−BaLおよび8x−BaL gp120分子が産生され、そして、本明細書で開示されるデータは、IIIB−BaL gp120がCD4依存性の様式でCCR5に結合した一方、8x−BaLはCD4に依存せずにCCR5に結合したことを立証する。いずれのタンパク質も、検査されたいかなる条件下でもCXCR4に結合しなかった。従って、V3ループ中の変化はどの補助受容体が使用されたかに影響を及ぼしたが、しかしCD4非依存性に影響しなかった。
【0257】
HIV−1/IIIBxの中和
Envと補助受容体の相互作用を封鎖する抗体はHIV−1を中和することができる(Wuら、1996、Nature 384:179−183;Trkolaら、1996、Nature 384:184−187)。HIV−1/IIIBx gp120中の補助受容体結合部位の露出された性質は、従って、このウイルスを抗体に媒介される中和に対しより感受性にすると期待することができる。V1/V2領域中の改変を伴う数種のSIVおよびHIV−1株が、おそらく保存された決定子の増大された露出により、中和感受性であることが示されている(StamatatosとCheng−Mayer、1998、J.Virol.72:7840−7845;Reitterら、1998、Nature Med.4:679−684)。従って、HIV陽性のヒト血清による中和、およびIIIBもしくは8xいずれかのgp120で免疫化されたウサギからの血清に対するHIV−1/IIIBおよびHIV−1/IIIBxの相対的感受性を比較し、そして結果を表2に示す。
【0258】
【表2】
【0259】
表2に開示されるデータは、sMAGI細胞を同等量のHIV−1/IIIBおよびHIV−1/IIIBxに感染させることにより得た。感染は、Chackerianら(1997、J.Virol.71:3932−3939)により既に記述されたとおり感染後72時間に決定した。MAb 17bおよび48dについて、IIIB−BaLもしくは8x−BaL Envを担持する同等量のルシフェラーゼレポーターウイルスを使用してGHOST−CCR5細胞を感染させ、これを感染48時間後に溶解した。全部の感染について、ウイルス、ならびにMAb、ヒト血清およびウサギ血清の連続的希釈物を、標的細胞への添加前に1時間混合した。入力ウイルス(input virus)の50%および90%を中和するのに必要とされる血清もしくは抗体の濃度を示す。MAb 48dは試験されたいかなる条件下でもIIIB−BaLを中和せず、そして8x−BaLの88%の中和のみが200ng/ml(*により示されるような)の濃度でこのMAbにより達成された。MAb 50.1はWhite−Scharfら(1993、Virology 192:197−206)により記述されるようなBaL V3ループに対し向けられる。
【0260】
本明細書に開示されるデータは、HIV−1/IIIBxが、多くの場合で1対数もしくはそれ以上、親HIV−1/IIIBよりも中和に対し均一により感受性であったことを立証する(表2)。HIV−1陽性のヒト血清、IIIB gp120に対し生じられたウサギ血清、および8x gp120に対し生じられたウサギ血清は、全部、HIV−1/IIIBよりはるかにより効率的にHIV−1/IIIBxを中和した。加えて、本明細書に開示されるデータは、8x−BaL Envを含有するビリオンが、IIIB−BaL Envを含有するものよりも、CD4i MAb 17bおよび48dによる中和に対しずっとより感受性であったが、しかし8x−BaL EnvビリオンはこれらのウイルスのV3ループを認識する抗体による中和に対し増大された感受性を立証しなかったことを立証する(表2)。従って、理論により拘束されることを願わないが、本明細書に開示されるデータは、補助受容体結合部位の増大された露出、ならびにCD4iエピトープの増大された露出が、抗体に誘導される中和に対するHIV−1/IIIBxの増大された感受性の原因であることがありそうであることを立証する。
【0261】
従来技術は、受容体結合が、その膜融合の潜在能力を活性化するEnvのコンホメーション変化を誘導することを教示する。CD4への結合は、Envが適切な補助受容体(通常はCCR5もしくはCXCR4)と相互作用することを可能にし(Wuら、1996、Nature 384:179−183;Trkolaら、1996、Nature 384:184−187;Laphamら、1996、Science 274:602−605;Hillら、1997、J.Virol.71:6296−6304)、これは最終的に膜融合およびウイルス進入につながるEnvの付加的なコンホメーション変化をもたらすと考えられる。融合はウイルス感染で決定的に重要な一段階であり、そしてこの過程につながるEnvの構造の中間体を理解することは、新規の抗ウイルス戦略の開発を示唆することができる。事実、膜融合反応のペプチド阻害剤での早期の臨床試験は、ウイルス負荷のかなりの低下を示している(Kilbyら、1998、Nature Med.4:1302−1307)。
【0262】
ウイルス補助受容体の発見、およびgp120コアフラグメントの最近解明された結晶構造は、ウイルス進入過程のより大きな理解を提供し、また、薬理学的もしくは免疫学的介入のための新たな潜在的標的を同定した(Kwongら、1998、Nature 393:648−659;Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953;Wyattら、1998、Nature 393:705−710)。Envの場合には、gp120中の例外的に良好に保存された領域がCCR5結合に関係している(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。gp120の内側ドメインと外側ドメインとの間の架橋シート中に配置されるこの領域は、V3ループの基部とV1/V2領域との間に存する(図12)。これらの可変領域の位置を変えることが知られている(Wyattら、1995、J.Virol.69:5723−5733)CD4への結合は、この高度に保存された部位の露出および/もしくは形成につながることができる。17bのような中和抗体は、この領域と重なり合うエピトープに結合し(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953;Wyattら、1998、Nature 393:705−710)、こうしてこのドメインの露出のための免疫学的代理物として作用し、かつ、適正に提示される場合はこの領域が広範に交差反応性の中和抗体を導き出すことができることを示唆する。しかしながら、本発明の前には、gp120の補助受容体結合領域に対する免疫応答を生じさせるような方法で、この領域を免疫系に提示する方法が存在しなかった。
【0263】
CCR5もしくはCXCR4と直接相互作用して細胞を感染させることにより正常なウイルス進入過程を迂回する、多数のHIV−1、HIV−2およびSIVウイルス株が記述されている(実施例1;Edingerら、1997、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:14742−14747;Endresら、1996、Cell 87:745−756)。CD4非依存性のウイルスはウイルスの向性および病因に影響することができる一方、それらはまたウイルス進入経路を詳細に分析するための有用なツールとしても作用する。本明細書に開示されるデータは、本明細書で開示されるCD4非依存性のHIV−1 Envは安定な部分的に誘導された状態で存在し、ここでは保存された補助受容体結合部位が十分に露出されていることを示す、2方向の証拠を立証する。第一に、8x gp120はCXCR4に直接結合した一方、親IIIB gp120はCD4依存性の様式でCXCR4を結合した。第二に、8x gp120は、親のCD4依存性のタンパク質が結合したよりもずっとより迅速に2種のCD4i MAbに結合した。しかしながら、より迅速なオフ速度の結果として、CD4i MAbに対する8x gp120の全体的な親和性はHIV−1 IIIB gp120のものに類似であり、タンパク質−タンパク質相互作用における重要な差異が、光学的バイオセンサーの使用により提供される実時間分析によりどのように示されることができるかの目立つ例を提供した。IIIBに関して8xにより表されるより迅速なオフ速度は、I423V(17bの接触部位として作用する残基)を包含する補助受容体結合部位の近傍の8xタンパク質中の多数のアミノ酸変化によることができる(Kwongら、1998、Nature 393:648−659)。
【0264】
HIV−1の向性は、大部分で、補助受容体の選択により支配される。CCR5、CXCR4もしくは双方を利用するウイルスの能力は、それが進入することができるCD4陽性の細胞の型を主に命令する。gp120中のV3ループは補助受容体の選択で決定的に重要な役割を担っており、V1/V2領域はより従属的な役割を演じている(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365;RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7682−7686;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139;Cocchiら、1996、Nature Med.2:1244−1247;Choら、1998、J.Virol.72:2509−2515;Choeら、1996、Cell 85:1135−1148)。本明細書に開示されるデータは、8x Envの補助受容体の選択およびCD4非依存性の根底にある決定子が分離可能であることを立証する。従って、R5 EnvからのV3ループを含有する8x EnvはそのCD4非依存性の表現型を維持するが、しかし、今や、細胞−細胞融合およびウイルス感染にCXCR4よりはむしろCCR5を使用する。さらに、本明細書に開示されるデータは、8x−BaL gp120がCD4の非存在下でCCR5を発現する細胞に結合することが可能であることを立証する。これらのデータは、補助受容体の選択およびケモカイン受容体のCD4非依存性の使用が分離可能であることを初めて明瞭に立証する。これらのデータは、理論により拘束されることを願わず、補助受容体結合領域が、会合されたV3ループの性質に依存して、CXCR4およびCCR5の双方と相互作用することができることを示唆する(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1053)。従って、本明細書に開示されるHIV−1変異体の情況において、V3ループは部分的に誘導されたEnvでの補助受容体の選択に同様に影響を及ぼすことができる。本発明の開示は、補助受容体の相互作用において可変領域および保存された結合部位が担うそれぞれの役割の解明、ならびにそれぞれが相互作用するCCR5およびCXCR4中のドメインの同定を助長することができる。
【0265】
HIV−1/IIIBx遊走群および8x分子クローンのとりわけ目立つ特徴は、抗体による中和に対するそれらの感受性であった。HIV−1/IIIBxは、HIV陽性のヒト血清による中和、ならびにIIIB gp120もしくは8x gp120のいずれかに対して生じられたウサギ血清に対しおよそ10倍より感受性であった。理論により拘束されることを願わないが、抗体に媒介される中和に対するHIV−1/IIIBxの増大された感受性は、この部分的に誘導されたEnv中の1種もしくはそれ以上の中和決定子が、親のCD4依存性のEnvにおけるよりも抗体により一般的に接近可能であることを示唆する。保存された補助受容体結合部位は、8x Envに直接結合しかつ8x−BaL Envに偽型分類される(pseudotyped)ビリオンを効率的に中和するCD4i MAbの能力により示されるとおり、この表現型の原因であることができる標的でありそうである。加えて、本明細書の実施例1で開示されたデータにより立証されるとおり、8x Envは親IIIBに関して5個のグリコシル化部位の顕著な喪失もまた表し、炭水化物の喪失がこの領域の露出である役割を担うことができるという可能性を生じる。CD4i MAbによる8x−BaLの増大された中和にもかかわらず、補助受容体結合部位の増大された露出は、V3ループに対し向けられたMAbに対する8x−BaLの増大された感受性につながらなかった(表2)。V1/V2領域中のグリコシル化部位を欠くSIVmac239、ならびにV1中に1個の欠失を含有するHIV−1 SF162株を包含する、数種の他の中和感受性のウイルスが最近、記述されている(StamatatosとCheng−Mayer、1998、J.Virol.72:7840−7845)。本発明は、V1/V2の幹に隣接する補助受容体結合部位がこれらのウイルスで同様に露出されるかどうかを決定するための研究を助長することができる。
【0266】
組換えgp120での免疫感作は広範に交差反応性の中和抗体を生じさせることに典型的に失敗することを、多数の研究が示しているが、それでもなお、こうした抗体がウイルス感染の結果として若干の個体で生じられることが明らかである(BurtonとMotefiori、1997、AIDS 11(Supp.A):S87−S98)。理論により拘束されることを願わないが、株特異的中和のみがgp120による免疫感作後に観察されたかもしれない。なぜなら、Envの保存された領域は、CD4結合の前にCD4依存性のgp120中に隠されているからである。本明細書に開示されるデータは、gp120がケモカイン受容体タンパク質に結合することができる前にCD4への最初の結合をもはや必要としない、部分的に誘導された形態のgp120からCD4非依存性が生じる場合には、高度に保存されたケモカイン受容体結合部位の露出がウイルスを中和に対しより感受性にすることを示唆する。より重要なことに、本明細書に開示されるデータは、部分的に誘導され従ってそれ以外は隠されたケモカイン受容体結合部位を安定に露出させるEnvでの免疫感作は、この領域に対し向けられる広範に交差反応性の中和抗体のより効率的な生成をもたらすことができることを示唆する示す。これが起こるためには、おそらく、この領域への接近が高められる誘導されたコンホメーションをCD4結合が誘導した後に、本来のCD4依存性のEnvタンパク質中の補助受容体結合部位に接近することができる抗体が生じられなければならない。EnvをCD4非依存性にしかつこの領域の露出に影響する決定子の同定は、中和抗体を導き出すこの部位の潜在能力を系統的に取り扱うことを可能にすることができる。補助受容体結合部位の露出はCD4非依存性のEnvの重要な一成分であることができる一方、Env中の他の変化もまたCD4非依存性の様式で細胞を感染させる能力に影響することがありそうであることに注目することが重要である(実施例1)。
【0267】
加えて、分子レベルでケモカイン受容体結合部位の決定子(1個もしくは複数)を検査しかつ位置づける能力は、gp120/ケモカイン受容体結合の小分子阻害剤の開発を助長することができる。
【0268】
該用語が本明細書で使用されるところの「小分子」は、ケモカイン受容体タンパク質へのgp120の結合を阻害することが可能でありかつ大きさが約1kDa未満である、限定されるものでないがペプチド模倣物およびALX40−4C(Doranzら、1997、J.Exp.med.186:1395−1400)のような核酸およびポリペプチドを包含する化合物(合成であろうと天然に存在しようと)を意味する。
【0269】
従って、本明細書に開示されるデータは、限定されるものでないが抗体に基づく様式を挙げることができる有効な抗ウイルス治療薬の開発において重要な意味を有する。従って、本発明は、gp120とケモカイン受容体タンパク質の相互作用の阻害剤のような化合物の広範な一分類の開発を包含すると解釈されるべきである。
【0270】
さらに、補助受容体結合部位を安定に露出させることができることは、ウイルスの進入に対する意味を有することができる。理論により拘束されることを願わないが、CD4結合後の補助受容体結合部位の露出および/もしくは形成は、比較的不安定であるEnvのコンホメーションをもたらす可能性があり、短い時間の期間内に補助受容体との相互作用を必要とすることが想像できる。例えば、酸性のpHによるセムリキ森林ウイルスのスパイクの糖タンパク質のコンホメーション変化の誘導は、それが数分以内にその脂質補助受容体と相互作用することができない限り、該タンパク質の膜融合の潜在能力の迅速な不活性化につながる(Kielian、1995、Advances in Virus Res.45:113−151)。しかしながら、部分的に誘導されたしかし安定な状態で存在する8x Envタンパク質は、補助受容体結合部位の露出が寿命の長い誘導されたEnvのコンホメーションと適合性であることを示唆する。従って、補助受容体結合は、この事象を可能にするCD4により誘導されるコンホメーション変化のずっと後に発生する可能性があり、おそらく十分なレベルのCD4が存在する場合に非常に低レベルの補助受容体を発現する細胞を感染させるHIV−1の能力の原因である(Plattら、1998、J.Virol.72:2855−2864;Kozakら、1997、J.Virol.71:873−882)。この発見は、HIV−1とケモカイン受容体の相互作用の阻害に基づく抗ウイルス治療薬の開発における本発明の潜在能力をさらに強調する。なぜなら、誘導されたコンホメーションは、潜在的に、必要な決定子を封鎖する化合物が宿主細胞の受容体へのウイルス結合の阻害を達成するのに十分長く存在することができるからである。
【0271】
結論として、本明細書に開示されるデータは、8x Envタンパク質のCD4非依存性の表現型が補助受容体結合部位の安定な露出と関連していることを立証する。従って、このタンパク質は、通常の融合過程の構造の中間体を表すことがありそうであり、そして、膜融合につながるコンホメーション変化に影響する構造パラメータを検討するのに使用することができる。重要なことに、この安定に露出されたドメインの高度に保存された性質、および中和抗体をそれに対して向けることができるという事実は、適正に提示される場合にHIV−1に対する広範に交差反応性の中和抗体を導き出すのにこのドメインを使用することができるという可能性を生じる。
【0272】
本明細書で引用されるそれぞれのおよびすべての特許、特許出願ならびに刊行物の開示は、これによりそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
【0273】
本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形物を、本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により工夫することができることが明らかである。付属として付けられる請求の範囲は、全部のこうした態様および同等の変形物を包含するよう解釈されるよう意図している。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
発明にかかる、HIV−1/IIIBもしくはHIV−1/IIIBxによるCD4陽性およびCD4陰性のT細胞におけるウイルス複製を描く、2図を含んで成るグラフである。CD4陰性のBC7細胞(上図)およびSupT1 CD4陽性細胞(下図)に、等量のHIV−1/IIIB(白菱形)もしくはHIV−1/IIIBx(黒丸)を接種し、そしてウイルス複製を培養物上清中の逆転写酵素(RT)活性により測定した。
【図1B】
発明にかかる、抗CXCR4抗体(12G5)によるHIV−1/IIIBx複製の阻害を描くグラフである。CD4陰性のBC7細胞に、抗CXCR4抗体12G5の非存在(白棒)または存在(5μg/ml(斜線をつけられた棒)もしくは20μg/ml(黒棒))下にHIV−1/IIIBxを接種し、そして逆転写酵素(RT)活性を示された時点で測定した。
【図1C】
発明にかかる、CXCR4を発現するマウス細胞でHIV−1/IIIBxにより誘導される細胞融合を描く、2図を含んで成る像である。HIV−1/IIIBxに感染したBC7細胞を、CXCR4を発現しないマウス3T3細胞(3T3、左図)もしくはヒトCXCR4を発現する3T3細胞(3T3/CXCR4、右図)と24時間共培養し、そしてその後、Endresら(1996、Cell 87:745−756)に記述されるとおりシンシチウム形成について細胞を染色した。
【図2】
発明にかかる、IIIBx env遺伝子の相対的光単位(RLU)で表される融合活性を描くグラフである。示されたenv遺伝子をpSP73にクローン化し、QT6細胞にトランスフェクションし、そして、Ruckerら(1997、Methods Enzymol.288:118−133)に記述されるとおりかつ本明細書の別の場所に記述されるとおり、CD4およびCXCR4、CXCR4単独、もしくはCD4単独を発現するQT6細胞上での融合アッセイで遺伝子を評価した。結果は、CXCR4+/CD4+細胞上での8xの活性に対して正規化されたRLUの平均+SEMとして表す。Olshevskyら(1990、J.Virol.64:5701−5705)に記述されるような、CD4結合部位を除去するD368R突然変異を含有する8xおよびHXBc2 Envの融合活性もまた示す。
【図3A】
発明にかかる、HIV−1/IIIBx env遺伝子の融合活性を立証するグラフである。8x envをpNL4−3に挿入し、そしてBC7細胞のトランスフェクション後にウイルスストックを生成させた。等量の生じるウイルス(NL43/8xと呼称される)およびHIV−1/IIIBをSupT1およびBC7細胞に接種し、そして時間にわたってRTレベルをモニターした。
【図3B】
発明にかかる、多様なウイルスのTMポリペプチドの大きさの評価を描くウェスタンブロットの像である。HIV−1/IIIBに感染したSupT1細胞(レーン1)、IIIBxに感染したBC7細胞(レーン2)およびNL43/8xに感染したBC7細胞からのウイルスライセートを、抗TMマウスモノクローナル抗体D12を使用するウェスタンブロットにより評価した。配列分析(図4)と矛盾せず、IIIBxおよびNL43/8x双方が短縮されたTMタンパク質を表した。
【図4】
発明にかかる、IIIBx envクローンのアミノ酸配列分析を描く図である。IIIBx envクローン8x(配列番号3)およびS10(配列番号12)の配列分析を、HXBc2(配列番号11)のものと比較する。影を付けられた領域は、HIV−1/IIIBからの他のクローン中でもまた見出される突然変異を示す。予測されるNに結合されるグリコシル化部位は、アミノ酸位置(アミノ酸は一文字記号を使用して呼称する)の直接上に、影を付けられた灰色の丸の記号により示す。可変ループ、gp120/gp41切断部位およびTMの膜にわたるドメイン(msd)の位置もまたHXBc2のアミノ酸配列の上に示す。8xの配列はアミノ酸位置706にフレームシフト突然変異を含有し、これはHXBc2に比較して未熟に短縮された細胞質の尾をもたらす。S10は50ヌクレオチドの欠失を含有し、これもまたフレームシフトおよび未熟に短縮された細胞質の尾につながる。図4において、破線はHXBc2の対応するアミノ酸残基に同一であるアミノ酸残基を示す。
【図5】
発明にかかる、融合アッセイにおけるキメラEnvタンパク質の評価を描く図である。図は、8x、S10、HXBc2、および図の上に示される示された制限部位を使用して構築されたキメラからのenv遺伝子を描く。8x中に存在する突然変異は上図の上に示す。キメラをpSP73にクローン化し、そして下の図6に記述されるような細胞融合アッセイで評価した。
【図6】
発明にかかる、融合アッセイにおけるキメラEnvタンパク質の評価を描くグラフである。上の図5に示される、HXBc2と8xとの間で構築されたキメラEnvタンパク質を、CXCR4単独、CXCR4およびCD4、もしくはCD4単独を発現するQT6標的細胞での融合アッセイで評価した。結果は、CXCR4+/CD4+細胞上でのHXBc2のものに関するルシフェラーゼ活性(すなわち相対的ルシフェラーゼ単位、RLU)として表す。棒は3回の実験の平均のRLU+SEMを示す。
【図7】
発明にかかる、IIIBxのCD4依存性クローンの決定子のマッピングを描くグラフである。IIIBxのCD4依存性S10クローン、および上の図5で示されるようなS10/8xキメラの融合活性を示す。加えて、C4ドメイン中のG431E突然変異を修正した(S10−E431G)S10 Env、およびこの突然変異を含有した8x Env(8x−G431E)の活性を示す。結果は、CXCR4およびCD4を共発現した標的細胞上での8xルシフェラーゼ活性のパーセントとして表す。
【図8】
発明にかかる、CCR5向性のEnv、HIV−1/BaLからのV3ループを含有するEnvタンパク質のCCR5向性を描くグラフである。CD4依存性であるHXB2(IIIB遊走群由来の分子クローン)のEnv、およびHIV−1/BaLからのV3ループを含有する8x Envタンパク質を構築し、そしてそれらの融合活性を、CCR5もしくはCXCR4±CD4を発現した標的細胞上で親HBXc2 Envもしくは8x Envと比較した。融合活性は、CXCR4およびCD4双方を発現した標的細胞上でのHXBc2のルシフェラーゼ活性のパーセントとして表す。棒は平均+SEMを示す。
【図9A】
発明にかかる、HIV−1/HXB2のgp120コア結晶構造を描きかつgp120結晶構造上でのHIV−1/IIIBx突然変異の位置を立証する空間実体模型の像である。コア結晶構造は、CD4のリボン図(Kwongら、1998、Nature 393:648−659)(像の下右四分円中に示される)とともに白色で描く。突然変異がCCR5へのgp120の結合の50%の減少もしくは増大を生じさせたアミノ酸部位(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)を赤色で示す。理論により拘束されることを願わないが、gp120のコア上にマッピングすることができた8x中の6個の突然変異のうち、3個(淡青色で示される)がこの推定のケモカイン受容体結合部位にすぐ隣接して配置されている。
【図9B】
発明にかかる、G431E突然変異の位置を示すために上の図9Aに示されたものとわずかに異なる向きで描かれた、gp120/CD4複合体のリボン図の像である。これは、8xクローンのCD4非依存性の融合を排除するのに十分であったが、しかしCD4依存性の融合はそうでなかった。
【図10A】
発明にかかる、HXBもしくは8xのEnvクローンによるCD4非依存性の細胞−細胞融合を描くグラフである。示されるとおりHXB Envもしくは8x Env、ならびにT7ポリメラーゼを発現するQT6エフェクター細胞を、T7プロモーターの制御下にケモカイン受容体CXCR4(斜交平行線の陰影をつけられた棒)、CD4(白棒)もしくはCXCR4/CD4(黒棒)およびルシフェラーゼ遺伝子を発現するQT6標的細胞と混合した。HIV−1/IIIBはクローン化されていないウイルスであり、これからHXBc2(「HXB」)およびIIIBx(「8x」)のような数種の分子クローンが生じている。本明細書に開示されるデータはこれら2種のEnv分子クローンを比較する。ルシフェラーゼは、本アッセイにおいて、Envがエフェクター細胞と標的細胞との間の融合を媒介する場合にのみ産生される。各Envについての結果はRLUで表し、そしてIIIB EnvエフェクターおよびCXCR4/CD4標的細胞で得られた融合の量に対し正規化する。典型的な一実験の結果を示す。
【図10B】
発明にかかる、HXB−V3BaLもしくは8x−V3BaLのEnvクローンによるCD4非依存性の細胞−細胞融合を描くグラフである。示されるような、HXB−V3BaLもしくは8x−V3BaLのEnvタンパク質を担持するルシフェラーゼレポーターウイルスを使用して、T7プロモーターの制御下にCCR5(斜交平行線の陰影を付けられた棒)、CD4(白棒)もしくはCCR5/CD4(灰色棒)およびルシフェラーゼ遺伝子を発現する293T細胞を感染させた。感染3日後にルシフェラーゼ活性の量を測定した。各Envについての結果はRLUで表し、そしてIIIB−BaL Envを担持するビリオンおよびCCR5/CD4標的細胞を用いて得られた結果に対し正規化する。典型的な一実験の結果を示す。
【図11】
発明にかかる、CD4、CXCR4もしくはCCR5を発現する細胞における多様なgp120の細胞表面結合を描くグラフである。放射ヨウ素化されたgp120を、補助受容体もしくはCD4のプラスミドで一過性にトランスフェクションされた293T細胞とともにインキュベートした。可溶性のCD4(sCD4)を、示されたとおり結合反応に添加した。細胞に結合される比放射活性の量を提示し、そしてCD4への結合が100%になるように、示される各gp120について正規化する。各値は3回以上の独立の実験の平均を表し、そして誤差の棒(error bar)はSEMを表す。以下の組み合わせを示す。すなわち、空ベクターpCDNA3を発現する細胞(白棒)、CD4を発現する細胞(黒棒)、CXCR4を発現する細胞(濃灰色棒)、sCD4が添加された、CXCR4を発現する細胞(濃い斜交平行線の棒)、CCR5を発現する細胞(淡灰色棒)、sCD4が添加された、CCR5を発現する細胞(薄い斜交平行線の棒)。
【図12】
発明にかかる、CCR5補助受容体結合部位とMAb 17bエピトープとの間の重なり合いを描く、CD4に結合されたgp120の空間実体模型の像である。突然変異される場合にCCR5結合を50%以上減少させる一方CD4結合を50%未満減少させる、Rizzutoら(1998、Science 280:1949−1953)により示されるアミノ酸残基を赤色で示す。MAb 17bの接触残基を淡青色で示し、また、CCR5および17b双方の結合に関与する残基を薄紫色で示す。実施例1に既に開示されたような補助受容体結合部位の近傍で8xとIIIBとの間で異なりかつCD4非依存性に影響することができる3個の残基を緑色で示す。これらの残基の1個(423)はMAb 17bの接触部位でもまたある。超可変V1/V2およびV3ループの幹を橙色で示す。
【図13】
発明にかかる、CD4i MAb 17bへのgp120の結合のセンサー図を描くグラフである。MAb 17bをセンサー表面に結合し、その後、示されるような飽和するレベルのsCD4との前インキュベーションを伴うもしくは伴わない、示された(等濃度の)gp120分子を、フローセルに適用した。300秒会合させ、次いで、追加の300秒間、運転緩衝液で洗浄し、その間に解離を測定した。データの線形変換から得られた動力学的定数を、本明細書の別の場所の表1に提示する。
【図14(図14Aおよび14Bを含んで成る)】
発明にかかる、クローン8xから得られるenvのヌクレオチド配列を列挙する。
本出願は、1999年5月24日に出願された米国特許出願第09/317,556号の一部継続出願である。
【0001】
(連邦の後援に関する声明)
本発明は、米国政府からの資金(国立保健研究所(National Institute of Health)助成金第AI44308号および助成金第AI40880号)により部分的に援助され、そして米国政府は従って本発明においてある種の権利を有することができる。
【0002】
(発明の背景)
本発明は、HIVのCD4非依存性の変異体、それらのタンパク質およびそのための用途に関する。
【0003】
HIVの進入は、CD4および細胞のケモカイン受容体とのウイルスエンベロープ糖タンパク質(Env)の相互作用を必要とすることが既知である。HIVのEnvタンパク質は前駆体(gp160)として産生され、これはその後2部分、すなわちCD4およびケモカイン受容体を結合するgp120、ならびにウイルス膜中に固定されそして膜融合を媒介するgp41に切断される。HIVおよびSIVによるケモカイン受容体の示差的な使用は、多様な単離物の間の向性の差異を主に説明している(Berger、1997、AIDS 11:S3−S16;HoffmanとDoms、1998、AIDS 12:S17−S26)。多数のケモカイン受容体がHIVもしくはSIVにより利用されることができる(Dengら、1997、Nature 388:296−300;Choeら,1996、Cell 85、1135−1148;Ruckerら、1997、J.Virol.71:8999−9007;Edingerら、1997、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:14742−14747;Liaoら、1997、J.Exp.Med.185:2015−2023;Farzanら、1997、J.Exp.Med.186:405−411)一方、CCR5およびCXCR4はHIV−1の主要な補助受容体であるようである(Zhangら、1998、J Virol.72:9337−9344;Zhangら、1998、J.Virol.72:9337−9344)。感染を最初に確立するHIVの単離物は、CCR5を使用して血液のリンパ球およびマクロファージに標的を定める(Alkhatibら、1996、Science 272:1955−1958;Dengら、1996、Nature 381:661−666;Dragicら、1996、Nature 381:667−673;Doranzら、1996、Cell 85:1149−1158)一方、AIDSへの進行に一般に関連しかつインビトロでT細胞系を感染させることができるウイルスはCXCR4を使用する(Choeら、1996、Cell 85:1135−1148;Fengら、1996、Science 272:872−876;Connorら、1997、J.Exp.Med.185:621−628)。
【0004】
CD4へのEnvの結合は、gp120がケモカイン受容体に結合することを可能にしそしてウイルスおよび細胞膜の融合につながる、不十分に理解されたコンホメーション変化を開始させる(Jonesら、1998、J.Biol Chem.273:404−409;Mooreら、1994、J.Virol.68:469−484;Wyatt、1992、J.Virol.66:6997−7004;Wuら、1996、Nature 384:179−183)。免疫学的および突然変異誘発のアプローチは、これらの変化が、gp120上のV1/V2およびV3超可変ループの動きを必要とすることを示し(Mooreら、1994、J.Virol.68:469−484;Wyattら、1992、J.Virol.66:6997−7004;Wuら、1996、Nature 384:179−183)、これは、ケモカイン受容体の利用の特異性において決定的に重要な役割を演じている(Choeら、1996、Cell 85:1135−1148;Cocchiら、1996、Nature Med 2:1244−1247;Choら、1998、J.Virol.72:2509−2515;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139;Rossら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7682−7686;Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365)。CD4に結合されたgp120コアの構造の最近の結晶学的解像は、ケモカイン受容体の付加的な接触部位として作用することができる、gp120の内側ドメインと外側ドメインとの間の介入するβシート(「架橋シート」)を示した(WyattとSodroski、1998、Science 280:1884−1888;Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。
【0005】
CD4は、一般に、gp120がケモカイン受容体と会合するのに必要とされるが、HIV−1、HIV−2、およびSIVのCD4非依存性の単離物の同定は、ケモカイン受容体との機能的相互作用がCD4の相互作用の非存在下で発生する可能性があることを立証した(Edingerら、1997、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:14742−14747;ReevesとSchulz、1996、J.Virol.71:1453−1465;Endresら、1996、Cell 87:745−756;Dumonceauxら、1998、J.Virol.72:512−519)。CD4非依存性の表現型の決定子はウイルスのenv遺伝子に位置づけられているが、しかし、この表現型の根底にある機構は未知である。env中の突然変異はgp120上のケモカイン受容体結合部位の露出および/もしくは親和性を増大させることができ、かようにCD4に対する必要性を回避することが提案されている(Endresら、1996、Cell 87:745−756)。
【0006】
生化学的アッセイは、突然変異されたもしくは脱グリコシル化された組換えgp120がケモカイン受容体に直接結合することができることもまた示しており、通常はCD4により活性化されるドメインを人工的に露出させることができることを示唆している(Hesselgesserら、1997、Curr.Biol.7:112−121;Martinら、1997、Science 278:1470−1473;Bandresら、1998、J.Virol.72:2500−2504;Misseら、1998、J.Virol.72:7280−7288)。CD4非依存性の原因である決定子のより大きな理解は、ケモカイン受容体とのEnvの相互作用を媒介かつ調節し、そして最終的にウイルスの進入を支配するEnvドメインへの洞察を提供するはずである。
【0007】
今日まで、免疫系をのがれるHIV−1の能力は、この重要なヒトの病原体に対する効果的なワクチンの開発を妨げてきた。従って、ヒトにおけるHIV−1感染症のための有効なワクチンおよび治療様式の開発に対する、長いあいだ痛切に感じられかつ満たされていない必要性が存在する。本発明はそれらの必要性にかなう。
【0008】
(発明の簡単な要約)
本発明は、CD4非依存性のヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)のenv、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を包含する。一局面において、単離された核酸は、配列番号4のヌクレオチド配列を有する核酸と最低約98%の相同性を共有する。
【0009】
別の局面おいて、核酸は、HIV−1/IIIBx envおよびHIV−1/IIIBx 8x(8x)envより成る群から選択される。
【0010】
なお別の局面において、核酸はHIV−1/IIIBx 8x envである。
【0011】
本発明は、配列番号4のヌクレオチド配列を有するCD4非依存性のHIV envをコードする単離された核酸もまた包含する。
【0012】
本発明は、最低1個のHIV−1 envクローンにCD4非依存性を賦与するHIV−1 env遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を包含する。
【0013】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸をさらに包含し、第一部分はHIV−1/IIIBx 8x envコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は8x envでないHIV−1 envコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【0014】
一局面において、第二部分は、S10 env、HXB2 env、BaL envおよびIIIB envより成る群から選択されるenvコーディング配列である。
【0015】
別の局面において、第二部分は、CXCR4ケモカイン受容体結合部位およびCCR5ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【0016】
なお別の局面において、第二部分は、CXCR4ケモカイン受容体結合部位のV3ループおよびCCR5ケモカイン受容体結合部位のV3ループより成る群から選択されるV3ループのコーディング配列を含んで成る。
【0017】
本発明は、安定に露出されるケモカイン補助受容体結合部位を含んで成る単離されたHIV−1 gp120ポリペプチドを包含する。
【0018】
本発明は、HIV−1/IIIBx 8x Envを含んで成る単離されたポリペプチドもまた包含する。一局面において、該ポリペプチドは配列番号3と最低約98%の相同性を共有する。
【0019】
別の局面において、単離されたポリペプチドは配列番号3のアミノ酸配列を含んで成る。
【0020】
本発明は、gp120ポリペプチドを含んで成るキメラのHIV−1 Envポリペプチドを包含し、ここで、キメラポリペプチドは、HIV−1/IIIBx 8x gp120を含んで成る第一部分を含んで成り、該キメラポリペプチドは、HIV−1/IIIBx 8x以外のHIV−1からのgp120を含んで成る第二部分をさらに含んで成る。
【0021】
本発明は、ポリペプチドがCD4非依存性であり、また、さらに、ポリペプチドがCXCR4ケモカイン受容体結合部位およびCCR5ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、キメラのHIV−1 Envポリペプチドをさらに包含する。
【0022】
一局面において、第二部分は、HXB V3ループ、8x V3ループ、BaL V3ループ、YU−2 V3ループおよび89.6 V3ループより成る群から選択されるV3ループを含んで成る。
【0023】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成るgp120ポリペプチドを含んで成るCD4非依存性のHIV−1 Envを含んで成る組成物を包含し、ここで、HIV−1は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のHIV−1よりも抗体中和に対しより感受性である。
【0024】
本発明は、CD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を含んで成る製薬学的組成物もまた包含し、ここで、HIV−1 Envはケモカイン補助受容体結合部位を安定に露出させる最低1個の突然変異を含んで成る。
【0025】
一局面において、HIV−1 EnvはHIV−1/IIIBx 8xである。
【0026】
本発明は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envを含んで成るワクチンを包含する。
【0027】
一局面において、HIV−1 Envは、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 Envを発現する細胞より成る群から選択される。
【0028】
本発明は、CD4非依存性のヒトHIV−1 env、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を含んで成るベクターを包含する。
【0029】
本発明は、最低1個のHIV−1 envクローンにCD4非依存性を賦与するHIV−1 env遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を含んで成るベクターもまた包含する。
【0030】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸を含んで成るベクターを包含し、第一部分はHIV−1/IIIBx 8x envコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は8x envでないHIV−1 envコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【0031】
本発明は、CD非依存性のヒトHIV−1 env、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸を含んで成る細胞を包含する。
【0032】
本発明は、最低1個のHIV−1 envクローンにCD4非依存性を賦与するHIV−1 env遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸を含んで成る細胞もまた包含する。
【0033】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラ核酸を含んで成る細胞をさらに包含し、第一部分はHIV−1/IIIBx 8x envコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、第二部分は8x envでないHIV−1 envコーディング配列の少なくとも一部分をコードする。
【0034】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る単離されたHIV−1 gp120ポリペプチドを含んで成る細胞を包含する。
【0035】
本発明は、HIV−1/IIIBx 8x Envを含んで成る単離されたポリペプチドを含んで成る細胞もまた包含する。
【0036】
本発明は、gp120ポリペプチドを含んで成るキメラのHIV−1 Envポリペプチドを含んで成る細胞を包含し、キメラポリペプチドはHIV−1/IIIBx 8x gp120を含んで成る第一部分を含んで成り、該キメラポリペプチドは、HIV−1/IIIBx 8x以外のHIV−1からのgp120を含んで成る第二部分をさらに含んで成る。
【0037】
本発明は、ポリペプチドがCD4非依存性であり、また、さらに、ポリペプチドがCXCR4ケモカイン受容体結合部位およびCCR5ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、キメラのHIV−1 Envポリペプチドを含んで成る細胞もまた包含する。
【0038】
一局面において、第二部分は、HXB V3ループ、8x V3ループ、BaL V3ループ、YU−2 V3ループおよび89.6 V3ループより成る群から選択されるV3ループを含んで成る。
【0039】
本発明は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成るgp120ポリペプチドを含んで成るCD4非依存性のHIV−1 Envを含んで成る組成物を含んで成る細胞を包含し、ここで、HIV−1は、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のHIV−1より抗体中和に対しより感受性である。
【0040】
本発明は、CD4非依存性に関与するHIV−1 Envタンパク質のアミノ酸残基の同定方法を包含する。該方法は、CD4非依存性であるEnvクローンから完全長のenvコーディング配列を得ること、および前記envコーディング配列の少なくとも一部分を、CD4依存性であるEnvクローンからのコーディング配列で置き換えてキメラを形成させ、ここで、キメラがCD4依存性である場合、それは、envコーディング配列の該部分がCD4非依存性に関与することの表示であり、それによりCD4非依存性に関与するアミノ酸残基を同定することを含んで成る。
【0041】
本発明は、哺乳動物におけるHIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出す方法もまた包含する。該方法は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を哺乳動物に投与し、ここで、該タンパク質は安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成り、それにより哺乳動物におけるHIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出すことを含んで成る。
【0042】
本発明は、HIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法もまた包含する。該方法は、可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を該gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、該化合物と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および化合物と接触された細胞に結合された標識の量を、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、化合物と接触された細胞に結合されたより多いもしくは少ない量の標識は、化合物がHIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼすことの表示である。
【0043】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する小分子の同定方法を包含する。該方法は、可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に分子と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および分子と接触された細胞に結合された標識の量を、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、分子と接触された細胞に結合されたより少ない量の標識は、該分子が、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することの表示である。
【0044】
本発明は、可変性のケモカイン受容体結合部位を含んで成るCD4非依存性のキメラHIV−1 Envクローンの製造方法を包含する。該方法は、CD4非依存性のEnvクローンの超可変V3ループを別のHIV−1のV3ループで置き換えることを含んで成り、ここで、別のHIV−1のV3ループは、CD4非依存性のEnvクローンのものと異なるケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【0045】
一局面において、CD4非依存性クローンは、HIV−1/IIIBxおよびHIV−1/IIIBx 8xより成る群から選択される。
【0046】
別の局面において、別のHIV−1からのV3ループは、HIV−1/BaLからのV3ループ、HIV−1/YU−2からのV3ループ、HIV−1/ADAからのV3ループおよびHIV−1/89.6からのV3ループより成る群から選択される。
【0047】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合の阻害方法もまた包含する。該方法は、HIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法[該方法は、可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を該gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、化合物と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および化合物と接触された細胞に結合された標識の量を、化合物と接触されない、それ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、化合物と接触された細胞に結合されたより多いもしくは少ない量の標識は、該化合物がHIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼすことの表示である]により同定された小分子と前記gp120を接触させ、それによりそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することを含んで成る。
【0048】
本発明は、細胞のHIV−1感染の阻害方法を包含する。該方法は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する小分子と細胞を接触させ[ここで、小分子は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する小分子の同定方法を使用して同定され、該方法は、可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、分子と細胞を接触させること、細胞に結合された標識の量を測定すること、および分子と接触された細胞に結合された標識の量を、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、分子と接触された細胞に結合されたより少ない量の標識は、該分子が、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することの表示である]、それにより細胞のHIV−1感染を阻害することを含んで成る。
【0049】
本発明は、製薬学的に適する担体中に、CD4非依存性のHIV−1 Env、およびHIV感染症を治療するのに使用される最低1種の化合物を含んで成る組成物を包含する。
【0050】
一局面において、HIV−1 Envは、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 envを発現する細胞より成る群から選択される。
【0051】
別の局面において、HIV感染症を治療するのに使用される化合物は、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインより成る群から選択される。
【0052】
本発明は、ヒトにおけるHIV−1感染症の治療方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 EnvをHIV−1に感染したヒトに投与し、それによりヒトにおけるHIV−1感染症を治療することを含んで成る。
【0053】
一局面において、HIV−1 Envは、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 envを発現する細胞より成る群から選択される。
【0054】
別の局面において、該方法は、HIV感染症を治療するのに使用される化合物を投与することをさらに含んで成る。
【0055】
なお別の局面において、HIV感染症を治療するのに使用される化合物は、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインより成る群から選択される。
【0056】
さらなる一局面において、該化合物は、前記CD4非依存性HIV−1 Envの投与前、投与の間もしくは投与後に前記ヒトに投与される。
【0057】
(発明の詳細な説明)
本発明は、HIV−1/IIIBx(IIIBx)と呼称されるHIV−1/IIIBのCD非依存性の変異体、および、細胞受容体タンパク質を必要とする宿主細胞のウイルス感染の機構の研究を可能にするHIV−1/IIIBx.8(8x)と命名されるそれからの機能的な完全長のenvクローンの発見に基づく。さらに、本発明は、別のHIV−1ウイルスからのenvの一部分をコードする最低1種の核酸に共有結合された8x envをコードする核酸の部分を含んで成るキメラの構築に関する。従って、該キメラは、8x HIV−1 env配列のどの部分(1種もしくは複数)がCD4非依存性に関与しているかのさらなる発見につながる、他のビリオンのenvコーディング配列の部分と、8x envコーディング配列の部分を組み合わせることにより生じられる。
【0058】
CD4非依存性は、それが、gp120のケモカイン結合部位がウイルスエンベロープ上に安定に露出されかつCD4へのgp120の前もっての結合なしに細胞のケモカイン受容体結合タンパク質に結合することが可能であることの指標であるため、重要である。典型的には、ケモカイン結合部位は、CD4へのこうした結合が、該部位を露出させかつ宿主細胞上のケモカイン受容体タンパク質に結合することが可能な「誘導された(triggered)」コンホメーションをもたらすコンホメーション変化を引き起こすまで、隠されている。従って、CD4非依存性のgp120は、とりわけケモカイン受容体タンパク質へのgp120の結合に関与するタンパク質の決定子を同定するため、gp120のケモカイン受容体結合部位を認識することが可能な中和抗体を産生させるため、およびgp120とケモカイン受容体の結合を封鎖することができる小分子の阻害剤を同定するために使用することができる、安定な中間の配置を代表する。
【0059】
従って、Envのどの部分が細胞タンパク質へのウイルス結合に関与しているかを理解すること、およびそれにより宿主細胞受容体へのHIV−1ウイルスの結合に関与するタンパク質の決定子をマッピングすることは、ウイルス感染に決定的に重要なウイルスタンパク質ドメインに対する有効な抗ウイルスワクチンの開発で重要である。こうしたドメインは、高度に保存されるが、しかし保護免疫応答がこうしたタンパク質ドメインに対し装備されないように免疫系からいくぶん「カムフラージュされる」と考えられている。従って、これらのタンパク質ドメインの同定、および免疫応答がHIV−1に対し生じられるように免疫系にそれらを提示する能力は、この重要なヒトの病原体に対するワクチン開発の重要な一最終目標である。
【0060】
さらに、キメラの産生は、CD4依存性の特質およびケモカイン受容体の選択が機能的に分離できる特質であるという発見につながった。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、こうしたキメラはenvをコードする核酸およびそれによりコードされるEnvタンパク質の多様な構造的および機能的要素のマッピングに有用であることの真価をみとめるとみられる。従って、多様な特性(例えば、CD4依存性もしくは非依存性、および/または多様なケモカイン受容体に対する多様な親和性)を有する多様なウイルスの多様な部分を組み合わせることにより、Envタンパク質の多様な機能的要素を検査かつ同定することができる。
【0061】
一態様において、CD4の非存在下でCXCR4ケモカイン受容体を結合する8x gp120のV3ループ部分を、CD4依存性でありかつCCR5ケモカイン補助受容体を結合するウイルス株であるHIV−1/BaLのV3ループで置き換えることは、キメラのgp120 8x/V3−BaLをCD4非依存性のままであるCCR5結合タンパク質に転化する。これはさらに、CD4非依存性が、gp120によるCD4結合の先行する段階がケモカイン受容体の選択に関係なくもはや必要とされないように、ケモカイン受容体結合ドメインを露出させることを立証する。これらのデータは、ケモカイン受容体結合部位が遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体(すなわちCXCR4およびCCR5)と相互作用することが可能であるgp120上に存在し、そしてこの部位が機能的でありかつCD4非依存性のウイルス上に露出されていることがありそうであることもまた示唆する。
【0062】
加えて、本発明は、CD4非依存性のgp120タンパク質が安定な部分的に「誘導された」状態で存在することを教示し、ここで、ケモカイン補助受容体結合部位は、HIV−1 gp120分子のCD4依存性のコンホメーションにおいてよりもCD4非依存性のgp120タンパク質においてより露出されている。これは、CD4非依存性のウイルスを、マウス、ヒトおよびウサギからの抗HIV−1抗体による中和に対しより影響を受けやすくするという効果を有する。従って、本発明はHIV−1の治療薬の開発に重要な意味を有する。なぜなら、免疫検出を逃れるようそれ以外はカムフラージュされることができる安定に露出された高度に保存されたケモカイン受容体結合部位の利用可能性が、体液性および/もしくは細胞性免疫応答の発生、ならびにこのウイルス−宿主タンパク質相互作用を封鎖しそれによりHIV−1感染を予防する小分子阻害剤の開発を助長するはずであるからである。
【0063】
本発明は、2つの成分すなわちgp120をコードする部分およびgp41をコードする部分より構成されるCD4非依存性のHIV envコーディング配列をコードする単離された核酸を包含する。一態様において、CD4非依存性のHIV−1/IIIBxの完全長のenvクローン(すなわち8x)が単離されている(配列番号3および配列番号4;図3ならびにそれぞれ14Aおよび14Bを参照されたい)。さらに、8xクローン中の突然変異をHXBc2の既知のenvコーディング配列(ジェンバンク(GenBank)受託番号第AF038399号)(配列番号11)に関し同定し、そして図4に開示する。しかしながら、本発明は、CD4非依存性のHIV−1/IIIBx変異体の完全長のenvクローンに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は部分的envクローンを包含すると解釈されるべきである。事実、本明細書に開示されるデータは、8xの完全なenvコーディング配列がCD4非依存性に必要とされないことを立証する。従って、8x envコーディング配列中に存在する最低1個の突然変異が8xにCD4非依存性を賦与するが、しかし、クローン中の全部の突然変異が本発明の目的上必要とされるわけでない。さらに、gp120の完全に別個の突然変異もまたCD4非依存性を賦与する可能性がある。
【0064】
下の実施例に開示される実験は、逆転写酵素活性アッセイ(図1A)により立証されるとおり、CD4+ SupT1細胞およびSupT1変異体、CD4− BC7細胞の双方を感染させることが可能であった本発明のCD4非依存性株(HIV−1/IIIBx)の単離を開示する。しかしながら、本発明は、HIV−1によるBC7もしくはSupT1細胞の感染にのみ限定されない。むしろ、本発明の「CD4非依存性」は、CD4を発現しないいかなる細胞型のHIV−1による感染も包含する。さらに、本明細書で既に論考されたとおり、CD4非依存性のHIV−1株はCD4+である細胞も感染させることができるが、とは言えCD4とgp120の相互作用はCD4非依存性のHIV−1によるこれらの細胞の感染に必要とされない。さらに、CD4非依存性のHIV−1株はすべてのCD4−細胞型を感染させる必要はない。むしろ、HIV−1株は、最低1種のCD4−細胞型を感染させることが可能であることのみが必要である一方、それからクローンを得たそのそれ以外は同一の親株は、その細胞型を感染させることができない。
【0065】
加えて、本発明の目的上、HIV−1株の変異体は、それが培養物中の影響を受けやすい細胞の最低約5%を感染させることが可能である場合にCD4非依存性と考えられるか、もしくは、感染のレベルはバックグラウンドのレベルに比較して約2ないし3倍である。
【0066】
HIV−1株のCD4非依存性の単離物は、最初にCD4+細胞中で成長されたCD4依存性のHIV−1遊走群を、CD4−である細胞上で継代することにより得ることができることが、本明細書で提供される開示に基づき、当業者により真価をみとめられるであろう。本明細書の実施例1に記述される実験で開示されるとおり、HIV−1/IIIBxは、CD4+ SupT1細胞中でウイルスを継代すること、次いでCD4−のほかそれ以外は同一のBC7細胞上でウイルスを継代することにより得た。しかしながら、本発明はこれらの特定の細胞型に限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、限定されるものでないが293、Cf2TH、CCC+L−およびQT6細胞を挙げることができる多様なCD4+およびCD4−細胞、ならびにCD4の存在もしくは非存在下で組換えケモカイン受容体を発現する安定にトランスフェクションされた細胞(U87、HeLa、HOS)を包含する。
【0067】
他の関係する局面において、本発明は、HIV−1 envの最低一部分を含んで成るこうした単離された核酸(そしてその単離された核酸は好ましくは該核酸によりコードされるタンパク質の発現を指図することが可能である)を含有するベクター;ならびにこうしたベクターを含有するビリオン、プロウイルスおよび/もしくは細胞を包含する。
【0068】
本実験的実施例が立証するとおり、Envタンパク質をコードする核酸は多様なプラスミドベクター中にクローン化することができる。しかしながら、本発明は、これらのプラスミドもしくはいかなる特定のベクターにも限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、容易に入手可能かつ/もしくは当該技術分野で公知である夥しい量のベクターを包含すると解釈されるべきである。従って、一態様において完全長のenvコーディング領域をPCRにより増幅しかつプラスミドpCDNA3にクローン化し、そして挿入物をその後pNL4−3の3’半ゲノム(hemigenome)にサブクローニングしたが、本発明はこれらもしくはいずれかの他の特定のベクターに限定されると解釈されるべきでない。
【0069】
本発明の単離された核酸は、本発明のEnvタンパク質をコードするRNAもしくはDNA配列、およびそれが細胞を含まない場合もしくはそれが細胞を伴う場合に該ヌクレオチド配列をより安定にするDNAもしくはRNAの化学修飾を包含するそれらのいずれかの改変された形態を包含すると解釈されるべきである。ヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオチド配列が細胞により取り込まれる効率もしくはそれが細胞中で発現される効率を高めるのにもまた使用することができる。ヌクレオチド配列の修飾のいずれかのおよび全部の組み合わせを本発明で企図する。
【0070】
本発明は、HIV−1/IIIBx 8xのアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチドもまた包含する。
【0071】
本発明は、本明細書に開示されるようなgp120タンパク質を含んで成るタンパク質もしくはペプチドの類似物もまた提供する。類似物は、保存的アミノ酸配列の差異、もしくは配列に影響を及ぼさない修飾、または双方により、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドと異なることができる。例えば、それらが該タンパク質もしくはペプチドの一次配列を変えるが通常はその機能を変えない保存的アミノ酸変化を作成することができる。保存的アミノ酸置換は、以下の群、すなわち
グリシン、アラニン;
バリン、イソロイシン、ロイシン;
アスパラギン酸、グルタミン酸;
アスパラギン、グルタミン;
セリン、トレオニン;
リシン、アルギニン;
フェニルアラニン、チロシン
内での置換を典型的に包含する。(通常は一次配列を変えない)修飾は、ポリペプチドのインビボもしくはインビトロの化学的誘導体化(例えば、アセチル化、カルボキシル化もしくはビオチニル化)を包含する。グリコシル化(例えば、その合成およびプロセシングの間にポリペプチドのグリコシル化パターンを改変させることにより、またはさらなるプロセシング段階において;例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素(例えば哺乳動物のグリコシル化もしくは脱グリコシル化酵素)にポリペプチドを曝露させることによりなされるもの)の修飾もまた包含する。リン酸化されたアミノ酸残基(例えばホスホチロシン、ホスホセリンもしくはホスホトレオニン)を有する配列もまた包含する。
【0072】
タンパク質分解性の分解に対するそれらの抵抗性を向上させる、もしくは溶解性の特性を至適化する、もしくはそれらを治療薬としてより適するようにするように、通常の分子生物学の技術を使用して改変されたポリペプチドもまた包含する。こうしたポリペプチドの類似物は、天然に存在するL−アミノ酸以外の残基(例えばD−アミノ酸もしくは天然に存在しない合成アミノ酸)を含有するものを包含する。本発明のペプチドは、本明細書に列挙される特定の例示的方法のいずれかの産物に限定されない。
【0073】
さらに、本発明は、HIV−1/IIIBx 8x env配列の天然に存在する変異体もしくは組換え的に生じられた突然変異体を包含すると解釈されるべきであり、これらの変異体もしくは突然変異体は、それによりコードされるタンパク質を、本発明の完全長の8x envクローンより大きく、より小さく、もしくはそれと正に同じくらいのいずれか、生物学的に活性にする。
【0074】
加えて、本発明は、変えられたケモカイン受容体結合部位を含んで成る8x gp120の突然変異体もしくは変異体を包含する。本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、gp120タンパク質は多様な細胞のケモカイン受容体タンパク質へのgp120の結合を媒介するケモカイン受容体結合ドメインを含んで成り、この結合は、典型的にはCD4へのgp120の結合後に発生する。この節に続く実験の結果にて開示されるとおり、8x gp120はCXCR4ケモカイン受容体に結合し、そしてそうする前にCD4への結合を必要としない。さらに、本明細書の別の場所に開示されるデータは、8x gp120のコーディング配列へのHIV−1/BaL gp120の一部分をコードする核酸の一部分の導入が、もはやCXCR4に結合しないキメラタンパク質を生じさせることを立証する。代わりに該キメラgp120は今やCCR5を結合する。こうした突然変異体は、HIV−1ウイルス感染におけるgp120とケモカイン受容体タンパク質の相互作用の役割の研究のため、本発明の方法で有用である。本発明は、8x gp120をコードする核酸の一部分がBaL gp120をコードする核酸の一部分を置き換えたキメラgp120に単に限定されると解釈されるべきでない。代わりに、本発明は、8x gp120をコードする核酸のいずれかの部分(1種もしくは複数)を、いずれかの他のHIV−1株、好ましくはCCR5を補助受容体として使用するHIV(もしくはSIV)の株からのgp120をコードする核酸の最低1部分により置き換えることができる、他のキメラを包含すると解釈されるべきである。さらに、こうした部分は、gp120のいずれかの特定のドメインに限定されると解釈されるべきでなく、しかし、むしろ、置換されたgp120の部分は、該タンパク質をコードする配列のいずれかの部分からであることができる。従って、生じるキメラ核酸およびそれから発現されるタンパク質は、可能ないずれかの組み合わせの、数種のHIV−1株からの多様なgp120より構成されるキメラであることができる。
【0075】
本明細書の別の場所でより具体的に示されるとおり、それにより推定のケモカイン受容体結合部位のもしくはその近くのアミノ酸が変えられる、またはそれによりEnvの短縮された細胞質の尾が生じられる、挿入、欠失もしくは置換を含んで成るgp120タンパク質をコードする突然変異体のgp120遺伝子が、宿主細胞のケモカイン受容体タンパク質とのgp120の会合の研究で有用である。事実、下述される実験で開示されるとおり、いくつかのこうした突然変異体が本明細書で発見された(表1および図3を参照されたい)。しかしながら、本発明は、これらの突然変異体のみに限定されると解釈されるべきでなく;むしろ、本発明は、野性型gp120に比較してケモカイン受容体タンパク質への変えられた結合を立証しかつその突然変異体がCD4非依存性を立証する、欠失、置換および点突然変異を含んで成る他の突然変異体を包含する。
【0076】
本発明はまた、生物学的活性を保持してももしくはしなくてもよいHIV−1 Envの変異体をコードするDNAを包含すると解釈されるべきである。こうした変異体(すなわちgp120、gp41(TMともまた称される)のタンパク質もしくはポリペプチドの類似物)は、該タンパク質もしくはポリペプチドが、本明細書に記述される方法での使用に対するその適合性を高める付加的な特性(例えば、限定されるものでないが露出されたケモカイン受容体結合部位の高められた安定性、CD4、CXCR4、CCR5などへの高められた特異的結合を賦与する変異体)を所有するような組換えDNA技術を使用して改変されているかもしくは改変することができるタンパク質もしくはポリペプチドを包含する。
【0077】
本発明は8x Envタンパク質の類似物を包含する。類似物は、保存的アミノ酸配列の差異もしくは配列に影響を及ぼさない修飾、またはその双方により、天然に存在するタンパク質もしくはペプチドと異なることができる。例えば、それらがタンパク質もしくはペプチドの一次配列を変えるが通常はその機能を変えない、保存的アミノ酸変化を作成することができる。
【0078】
好ましくは、8x Env類似物のアミノ酸配列は、本明細書に図4に開示される8x envのアミノ酸配列(配列番号3)に約70%相同、より好ましくは約80%相同、なおより好ましくは約90%相同、より好ましくは約95%相同、そして最も好ましくは最低約99%相同である。
【0079】
本発明は、本明細書に開示されるDNAおよびアミノ酸配列にのみ限定されると解釈されるべきでない。本発明で武装されれば、本明細書に開示されるCD4非依存性のEnvをコードする8x env核酸(配列番号4)の単離についての実験の詳細の節で本明細書に記述される手順に従うことにより、HIV−1の他のCD4非依存性のenvクローンを得ることができることが当業者に容易に明らかである。
【0080】
本発明は、従って、いずれかのおよび全部の、HIV−1/IIIBx 8x Envをコードする核酸配列、ならびに、本明細書に開示される8x envをコードする核酸(配列番号4)に対する実質的な相同性を有するアミノ酸配列および図4に示されるアミノ酸配列(配列番号3)を包含すると解釈されるべきである。好ましくは、実質的に相同であるDNAは、本明細書に開示される8x env配列(配列番号4)に約50%相同、より好ましくは約70%相同、なおより好ましくは約80%相同、そして最も好ましくは約90%相同である。好ましくは、実質的に相同であるアミノ酸配列は、図4に示される8x Envのアミノ酸配列(配列番号3)に約50%相同、より好ましくは約70%相同、なおより好ましくは約80%相同、そして最も好ましくは約90%相同である。
【0081】
いずれかの数の手順を8x envの突然変異体もしくは変異体の形態の生成に使用することができる。例えば、CD4非依存性でない8xの突然変異体の形態の生成は、例えばSambrookら(1989、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク)およびAusubelら(1997、Current Protocols in Molecular Biology、グリーン アンド ワイリー(Green & Wiley)、ニューヨーク)に記述されるような当該技術分野で公知の組換えDNAの方法論を使用して、CD依存性であったウイルスからのenvをコードする核酸の部分を導入することにより、本明細書で達成した。そのように生成された突然変異体のEnvを発現させ、そして生じるタンパク質を、本明細書に記述されるもののような実時間バイオセンサーアッセイでCD4を結合するその能力について評価する。その後、CD4非依存性の様式でケモカイン受容体タンパク質を結合する突然変異体タンパク質を、RT、融合活性、実時間結合/解離の動力学および他のこうしたアッセイにより検査した。
【0082】
ポリペプチドをコードするDNA配列を変えることによるタンパク質もしくはポリペプチド中のアミノ酸変化の導入のための手順は当該技術分野で公知であり、かつ、Sambrookら(1989、上記);Ausubelら(1997、上記)にもまた記述される。
【0083】
本発明は、HIV−1 Envをコードする核酸(配列番号4)の一部分もしくは全部に対し相補的である核酸配列を有する単離された核酸もまた包含する。
【0084】
本明細書で使用されるところの、核酸に適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常長さが最低約100ヌクレオチド、典型的には最低約200ヌクレオチド、より典型的には約300から約600ヌクレオチドまで、典型的には最低約700ないし約1000ヌクレオチド、好ましくは最低約1000ないし約1400ヌクレオチド、なおより好ましくは最低約1600ヌクレオチドないし約2000ヌクレオチドであることができ、そして最も好ましくは、核酸フラグメントは長さが約2400ヌクレオチドより大きいことができる。
【0085】
本発明は目的の核酸を含んで成る細胞をさらに包含する。該核酸は、細胞ゲノム中に組み込まれることも必要でなく、また、それらは細胞中で発現されることも必要としない。さらに、細胞は原核生物もしくは真核生物細胞であることができ、そして本発明はいずれかの特定の細胞系もしくは型に限定されると解釈されるべきでない。
【0086】
本発明はgp120もしくはその一部分のケモカイン受容体結合部位に特異的な抗体もまた包含し、この抗体はモノクローナル抗体を含んで成る。
【0087】
一態様において、抗体は、そのエピトープがケモカイン受容体結合部位と重なり合うgp120に対するマウスモノクローナル抗体(17b)、ならびに48dと称されるgp120に対するマウスモノクローナル抗体(Thaliら、1993、J.Virol.67:3978−3988)である。しかしながら、本発明はこれらの抗体にのみ限定されると解釈されるべきでないが、しかしむしろ、Envもしくはその部分に対する他の抗体(その用語が本明細書で定義されるところの)を包含すると解釈されるべきであり、この抗体は、とりわけ該抗体がgp120ケモカイン受容体結合部位に結合するため、本明細書に記述されるものに実質的に類似の様式で機能し、そしてそれらはRT活性および細胞融合活性により測定されるとおりHIV−1感染を阻害することが可能である。
【0088】
本発明は8x Envタンパク質のアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド、ならびにその突然変異体、変異体およびフラグメントもまた含んで成る。
【0089】
本発明のペプチドは実質的に純粋であることができる。実質的に純粋なペプチドはタンパク質精製のための既知の手順に従うことにより精製され、ここで、該手順の各段階で純度をモニターするのに免疫学的、酵素的もしくは他のアッセイを使用する。タンパク質精製法は当該技術分野で公知であり、そして例えばDeutscherら(1990、Guide to Protein Purification、ハーコート ブレース ジョヴァノヴィッチ(Harcourt Brace Jovanovich)中、サンディエゴ)に記述される。
【0090】
従って、本発明は、所望のタンパク質をコードする核酸および所望のポリペプチドをコードする核酸のフラグメントを包含すると解釈されるべきである。
【0091】
本発明は、第一部分および第二部分を含んで成るキメラタンパク質をコードする単離された核酸を包含する。一態様において、キメラ核酸は、8x envをコードする第一部分、およびS10、IIIBもしくはHXB2からのenvをコードする第二部分を含んで成る。これらのキメラは、8xのどの領域がCD4非依存性に必要とされるかのマッピングで有用であったが、本発明はこれらのキメラに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、8xのいかなる部分、およびいかなるHIV−1ウイルス株もしくはその変異体も含んで構築することができるenvコーディング領域中のいかなるキメラも包含すると解釈されるべきである。
【0092】
さらに、別の態様において、キメラは、8x envコーディング領域の一部分、およびCCR5向性のHIV−1株BaLのenvコーディング領域の一部分を含んだ。より具体的には、該態様は、BaLのV3ループをコードする核酸部分を伴う8x envクローンを含んで成る。しかしながら、本発明は、envコーディング領域のこの特定の部分もしくはHIV−1のこの特定の株に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、本発明は、最低1種の他のHIV−1株もしくは変異体のenvコーディング配列の一部分での、8x envコーディング配列のいずれかの部分の置換、およびそのいずれかの可能な並べ換えを包含する。従って、核酸およびそれから発現されるアミノ酸の双方のキメラは、2種もしくはそれ以上の目的のHIV−1 envコーディング領域からの組み合わせを包含する。従って、本明細書に提供される開示で武装されれば、本明細書で開示される予測される効果をもつキメラのほとんど無限の組み合わせの産生が当業者に明らかであろう。
【0093】
本発明は、CD4非依存性に関与するHIV−1 Envタンパク質のアミノ酸残基の同定方法もまた包含する。該方法は、CD4非依存性のEnvクローンからの最低1部分および少なくともCD4依存性のEnvクローンからの第二の部分を含んで成るキメラタンパク質を産生させることを含んで成る。その後、生じるキメラを検査して、本明細書の別の場所に開示されるような多様なアッセイにより、CD4非依存性の感染を媒介するキメラタンパク質の能力を決定する。本明細書で既に論考されたとおり、8x envコーディング配列の部分を数種のCD4依存性のHIV−1株(例えばS10およびHXBc2)のenvコーディング配列の多様な部分と組み合わせた、好ましい一態様が開示される。また本明細書で既に示されたとおり、本発明はこれらの特定の組み合わせもしくはこれらの特定の株に限定されない。むしろ、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、CD4依存性および非依存性のenvコーディング配列のいかなる組み合わせも検査して、CD4非依存性の決定子をマッピングすることができることの真価をみとめるであろう。さらに、CD4非依存性は、また本明細書の別の場所で既に記述されたような多様な哺乳動物細胞系で多様なアッセイを使用して検査することができる。
【0094】
本発明は、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含んで成る単離されたgp120タンパク質もまた包含する。一態様において、バイオセンサー実験において多様なタンパク質の実時間結合動力学を、また、抗HIV抗体によるウイルスの高められた中和を測定することにより、ならびに結晶学的分析により、ケモカイン受容体結合部位の増大された露出が決定された。しかしながら、本発明はこれらの特定のアッセイに限定されると解釈されるべきでない。むしろ、当該技術分野で公知の、もしくはタンパク質−タンパク質相互作用の研究のため開発されるべき他のアッセイを使用して、目的のgp120もしくはEnvタンパク質のケモカイン受容体結合部位の露出を測定することができる。
【0095】
本発明は、HIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出す方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を哺乳動物に投与することを含んで成り、ここで該タンパク質は安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含んで成る。
【0096】
加えて、該核酸がベクター(例えばプラスミドもしくはウイルス)中にある場合、または該核酸がいずれかの他の核酸と会合しない裸の(naked)核酸を含んで成る場合の、免疫応答を生じさせるための精製された核酸の使用は、当該技術分野で公知である。例えば、核酸ワクチンの構築方法は、Burgerら(1991、J.Gen.Virol.72:359−367)に記述され、そして当該技術分野で公知である。Sambrookら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク;Ausubelら、1997、Current Protocols in Molecular Biology、グリーン アンド ワイリー(Green & Wiley)、ニューヨークもまた参照されたい。
【0097】
さらに、選択すべきHIV−1 Envタンパク質を発現する細胞を使用して、HIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を生じさせることもまたできる。
【0098】
Env免疫原に対する免疫応答は、ELISAもしくはウェスタンブロッティングのような標準的免疫学的技術、および当該技術分野で公知もしくは今後開発されるべき他のこうした技術により測定する。多様なイムノアッセイの形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択することができる。例えば、特異的免疫反応性を決定するのに使用することができるイムノアッセイの形式および条件の記述については、HarlowとLane(1988、Antibodies,A Laboratory Manual、コールド スプリング ハーバー パブリケーションズ(Cold Spring Harbor Publications)、ニューヨーク)を参照されたい。
【0099】
本発明のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質は、ヒトもしくは家畜の患者への該タンパク質の投与に適する製薬学的組成物に処方することができる。正確な処方および投薬量は、限定されるものでないが治療されるべき疾患の型および重症度、投与経路、個体の齢および全体的健康状態、Envタンパク質の性質などを挙げることができるいずれかの数に因子に依存して変動することができることが真価をみとめられるであろう。しかしながら、適切なpH、等張性、安定性および他の特徴を有する製薬学的に許容できる組成物の製造は、当該技術の熟練内である。製薬学的組成物は、当該技術分野で、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences(1985、Genaro編、マック パブリッシング カンパニー(Mack Publishing Co.)、フィラデルフィア州イーストン)に記述される。
【0100】
投与されるCD4非依存性のEnvの量は、それがタンパク質として投与されようと、もしくは核酸として投与されようと、もしくはHIV envを発現する細胞として投与されようと、HIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出すのに十分である。本発明の実施に有用な製薬学的組成物は、患者の体重1kgあたり約1ngと約100mgとの間の用量を送達するように投与することができる。投与に適するCD4非依存性のEnvタンパク質の量は、付随する副作用を伴わずに所望の効果を有するのに十分多い用量を包含する。CD4非依存性のEnvがタンパク質もしくはペプチドである場合、好ましい投薬量範囲は、患者の体重1kgあたり約10から約1000μgまでのタンパク質もしくはペプチドである。CD4非依存性のEnvを、組換えウイルスベクター内に含有されるそれをコードするDNAの形態で投与する場合、患者の体重1kgあたり約102と約1011プラーク形成単位との間のウイルスの投薬量を使用することができる。CD4非依存性のEnvをコードする裸のDNAを製薬学的組成物として投与するべきである場合、患者の体重1kgあたり約10μgないし約数mgの間のDNAの投薬量を使用することができる。
【0101】
本発明の方法の実務において、CD4非依存性のEnvタンパク質を含有する組成物は、該個体におけるHIV−1感染症を治療、予防もしくは緩和するのに十分な量で患者に投与する。
【0102】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、Envタンパク質/Envをコードする核酸を患者に投与して、ウイルスのケモカイン受容体結合部位を使用する適切なケモカイン受容体へのウイルスの結合を妨害し、そしてそれにより感染を予防することにより、HIV感染症を予防することができることの真価をみとめるであろう。さらに、Envタンパク質/envをコードする核酸はまた、人における免疫応答を増大させることにより既に感染した個体の病状を治療もしくは緩和することもでき、それは、順に、抗レトロウイルスの薬理学的治療への添加物(adjunct)として有益である可能性がある。すなわち、免疫原はウイルスのケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を増大させ、それにより、ウイルスのケモカイン受容体結合部位と標的細胞のケモカイン受容体との間の必須の相互作用を封鎖する抗体を生じさせることができる。
【0103】
患者へのCD4非依存性のEnvタンパク質の投与の頻度は、限定されるものでないが治療されるべきウイルス感染症の型および重症度、投与経路、個体の齢および全体的健康状態、Envタンパク質の性質などを挙げることができるいくつかの因子に依存してもまた変動することができる。患者へのEnvタンパク質の投与の頻度は数ヶ月ごとに約1回から、1ヶ月に約1回、1週間に約1回、1日あたり約1回、1日に約数回まで変動することができることが企図される。
【0104】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、非経口の、経口の固体および液体製剤、眼の、坐剤、エアゾル、局所のもしくは他の類似の製剤で全身に投与することができる。適切なEnvタンパク質もしくはそれをコードする核酸に加え、これらの製薬学的組成物は、製薬学的に許容できる担体、および薬物投与を高めかつ助長することが既知の他の成分を含有することができる。従って、こうした組成物は、場合によっては、アジュバント(例えば水酸化アルミニウムおよびマグネシウムの水性懸濁液)のような他の成分、ならびに/もしくは生理的食塩水のような他の製薬学的に許容できる担体を含有することができる。ナノ粒子、リポソーム、再封止赤血球(resealed erythrocyte)および免疫学的に基づく系のような他の可能な製剤もまた、本発明の方法に従って適切なEnvタンパク質もしくはそれをコードする核酸を患者に投与するのに使用することができる。
【0105】
好ましくは、本発明の組成物は非経口もしくは静脈内の経路によりヒトに投与する。
【0106】
Envタンパク質および/もしくはEnvをコードする核酸は、HIV感染症を治療するのに使用する他の化合物とともに投与することができる。こうした化合物は、限定されるものでないがプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤(ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド類似物)、AZT、インターフェロン、インターロイキン−2、他のサイトカインなどを挙げることができる。投与する付加的化合物の選択は、Envタンパク質もしくはそれをコードする核酸の投薬量および投与頻度の選択を支配するいずれかの数の同一の型の因子に依存して変動することができる。本発明の方法の実施のための、Envタンパク質とともにの使用のためのこれらの型の化合物の選択は、当業者の熟練内に十分にある。
【0107】
本発明は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を含んで成るワクチンもまた包含する。本明細書の別の場所で既に論考されたとおり、ウイルスのケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答の生成は、宿主のケモカイン受容体リガンドへのこのウイルス部位の相互作用を封鎖し、それによりHIV感染に必要とされる必須のウイルス/宿主細胞の相互作用を妨害および/もしくは阻害するはずである。
【0108】
加えて、本発明は、gp120タンパク質のケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法を包含する。該方法は、細胞を化合物と接触させること、および細胞に特異的に結合された標識されたgp120の量を、該化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識されたケモカインの量と比較することを含んで成る。一態様において、目的のgp120を125I標識し、そして可溶性CD4の存在もしくは非存在下に多様なケモカイン受容体を発現する細胞に結合した。しかしながら、本発明は、放射ヨウ素化、もしくはいずれかの特定のgp120、もしくはこれらのケモカイン受容体のみの発現に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、本発明は、目的のgp120の結合を定量することができるような多様なタンパク質標識を包含すると解釈されるべきである。こうした方法は当該技術分野で公知であり、そして限定されるものでないがビオチニル化、ならびに35S−cysおよび35S−metを挙げることができる。
【0109】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するHIV−1 gp120によるケモカイン受容体の結合を阻害する小分子の同定方法もまた包含する。該方法は、可溶性のCD4とのgp120の前インキュベーションを伴いもしくは伴わずに、標識されたgp120と細胞を接触させる前もしくはそれと同時発生的に、細胞を小分子と接触させることを含んで成る。その後、細胞に結合された標識の量を測定し、それにより細胞に結合された標識されたgp120の量を検出する。小分子と接触された細胞に結合された、結合されたgp120の量を、小分子と接触されない細胞に結合されたgp120の量と比較する。小分子と接触されなかった細胞に結合されたgp120の量に比較して、より少ない量のgp120が小分子と接触された細胞に結合される場合は、これは、小分子と細胞を接触させることがそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することの表示である。
【0110】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、こうした小分子は標的細胞のウイルス感染に必要な必須のHIV−1 gp120とケモカイン受容体の相互作用を阻害するとみられるため、こうした小分子は細胞のHIV−1感染を阻害する有用な治療薬であることの真価をみとめるであろう。さらに、従来技術は、ケモカイン受容体に特異的に結合しかつケモカイン受容体へのgp120の結合を封鎖する抗体およびケモカインが、しばしばHIV感染もまた封鎖することを教示する(Leeら、1999、J.Biol.Chem.、印刷中;Olsonら、1999、J.Virol.、印刷中;Wuら、1997、J.Exp.Med.)。従って、本発明の方法を使用して同定される、ケモカイン受容体へのgp120の結合の小分子阻害剤は、HIV感染の有用な阻害剤である。
【0111】
さらに、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明の方法を使用して同定される、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのgp120の結合の小分子阻害剤は、その受容体へのケモカインの結合およびその受容体の活性化の有用な阻害剤であることの真価をみとめるであろう。すなわち、小分子阻害剤は、HIV感染におけるケモカイン受容体の役割に関係しないケモカイン受容体の本来の機能を阻害するのに有用であることができる。従って、本明細書で同定される小分子阻害剤は、とりわけいかなるHIVに感染していないヒトにおける免疫系の治療、炎症、および発症のための潜在的用途を有する有用な治療薬である。
【0112】
本発明は、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合の阻害方法を包含する。該方法は、ケモカイン受容体へのgp120の結合がウイルスのgp120タンパク質のケモカイン受容体結合部位により媒介される場合にこうした結合を阻害する小分子とgp120を接触させることを含んで成る。小分子は本明細書の別の場所に既に開示されたとおり同定する。小分子の結合阻害剤とgp120を接触させることは、細胞のケモカイン受容体とのgp120の結合を阻害する。
【0113】
本発明は細胞のHIV−1感染の阻害方法もまた包含する。該方法は、本明細書の別の場所に既に記述されたとおり同定された小分子と細胞を接触させることを含んで成る。そのように同定された小分子は、ウイルスのgp120のケモカイン受容体結合部位により媒介される、細胞のケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する。小分子は、必須のgp120とケモカイン受容体との相互作用(1種もしくは複数)を妨害することにより、それにより細胞のHIV−1感染を阻害する。事実、ケモカイン受容体へのgp120の結合を封鎖する抗体およびケモカインがしばしばHIV感染もまた封鎖することが既に立証されている(Leeら、1999、J.Biol.Chem.、印刷中;Olsonら、1999、J.Virol.、印刷中;Wuら、1997、J.Exp、Med.)。従って、本発明は、gp120のケモカイン受容体結合部位を使用する細胞のケモカイン受容体へのgp120の結合の小分子阻害剤を使用する、標的細胞のHIV−1感染に必要とされる受容体とリガンドの相互作用を妨害することによる、HIV−1感染の阻害方法を包含する。
【0114】
本発明は、製薬学的に適する担体中にCD4非依存性のHIV−1 EnvおよびHIV感染症を治療するのに使用される最低1種の化合物を含んで成る組成物もまた包含する。本明細書の別の場所に記述されるとおり、HIV−1 Envは、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸、および/もしくはHIV−1 envを発現する細胞であることができる。さらに、本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、本発明は、例えば限定されるものでないがプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、逆転写構造阻害剤類(ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド双方の類似物を包含する)、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインのような、HIV感染症を治療するのに使用される化合物を包含すると解釈されるべきである。
【0115】
本発明はヒトにおけるHIV−1感染症の治療方法を包含する。該方法は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 EnvをHIV−1に感染したヒトに投与することを含んで成る。こうしたCD4非依存性のHIV−1 Envの投与は、gp120の安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対する抗体の産生を誘導する。従って、CD4非依存性のHIV−1 Envの投与は、宿主細胞のHIV−1感染に必要とされるgp120とケモカイン受容体の相互作用(1種もしくは複数)を封鎖する潜在的中和抗体の産生を引き起こす。これは、本明細書の別の場所に開示される、CD4非依存性のgp120は、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のCD4依存性のgp120よりも、中和抗体に対しより感受性であるという事実により示唆される。さらに、Envとケモカイン受容体の相互作用を封鎖する抗体はHIV−1を中和することができる(Wuら、1996、Nature 384:179−183;Trkolaら、1996、Nature 384:184−187)。従って、ケモカイン受容体結合部位の増大された露出はこの保存された領域に対する抗体の産生を高めることができ、この抗体は必須のgp120とケモカイン受容体の相互作用を阻害する。従って、CD4非依存性のEnvでヒトを免疫化することは、安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対する抗体の産生を引き起こし、この抗体は感染に必要とされる必須のEnvとケモカイン受容体の相互作用を封鎖して、それによりヒトにおけるHIV−1感染症を治療する。
【0116】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envが、HIV−1ウイルスへの曝露の前および後双方のヒトにおけるHIV−1感染を治療および/もしくは緩和するのに有用な治療薬であることができることの真価をみとめるであろう。すなわち、免疫原性の用量は、HIV−1によるヒトの感染の前、その間もしくは後に投与することができる。それがいつ投与されるかに関係なく、免疫原は、とりわけgp120の安定に露出されたケモカイン受容体結合部位に対するヒトにおける応答を導き出し、それによりケモカイン受容体へのウイルスのgp120の結合を阻害する応答を誘導する。この阻害は既に感染した個体ならびに未感染の人の双方で生じられる。HIV−1に既に感染した個体において、免疫原は該個体中に既に存在するいずれかの免疫応答に加えて免疫応答を生じさせ、そして従ってその個体におけるウイルス負荷の低下を媒介する。従って、CD4非依存性のHIV−1 Envは、HIV−1ウイルスにより既に感染したヒトにおける治療的ワクチンとして有用である。
【0117】
本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envはタンパク質、核酸(ベクターもしくは裸のDNAを含んで成る)および/またはCD4非依存性のenvをコードする核酸を発現する細胞として投与することができることの真価をみとめるであろう。
【0118】
別の局面において、ヒトにおけるHIV−1感染症の治療方法は、HIV感染症を治療するために使用される化合物をさらに投与することを含んで成る。本明細書の別の場所に既に開示されたとおり、こうした化合物は、限定されるものでないが、プロテアーゼ阻害剤、1種の逆転写酵素阻害剤、1種の逆転写酵素阻害剤(ヌクレオシドおよび非ヌクレオシド双方の類似物を包含する)、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインを挙げることができる。化合物は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envの投与前、その間もしくは後に投与することができる。
【0119】
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envに関する化合物の時間的調節が、HIV−1 EnvおよびEnv免疫原とともに投与される特定の化合物(1種もしくは複数)、ならびに患者の健康および齢ならびに疾患過程の重症度および段階に関する免疫感作レジメンに依存することができることの真価をみとめるであろう。
【0120】
HIV−1 Env免疫原(1種もしくは複数)および/または本明細書に記述される方法のいずれかを使用して同定される化合物は、今や記述されるとおりに処方しかつHIV感染症の治療および/もしくは予防のため哺乳動物に投与することができる。
【0121】
本発明は、有効成分としてHIV感染症の治療に有用な化合物を含んで成る製薬学的組成物の製造法および使用を包含する。こうした製薬学的組成物は、被験体への投与に適する形態の、最低1種の有効成分の組み合わせ剤(例えば、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envおよびインターロイキン−2のようなHIV感染症を治療するのに使用される化合物)として有効成分単独より成ることができるか、あるいは、製薬学的組成物は、有効成分、および1種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体、1種もしくはそれ以上の付加的成分、またはこれらの数種の組み合わせを含むことができる。有効成分は、当該技術分野で公知であるように、生理学的に許容できる陽イオンもしくは陰イオンとの組み合わせでのような生理学的に許容できるエステルもしくは塩の形態で製薬学的組成物中に存在することができる。
【0122】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、それと有効成分を組み合わせることができかつ被験体に有効成分を投与するのに組み合わせの後に使用することができる化学的組成物を意味する。
【0123】
本明細書で使用されるところの「生理学的に許容できる」エステルもしくは塩という用語は、エステルもしくは塩の形態の有効成分を意味し、これは製薬学的組成物のいかなる他の成分とも適合性であり、それは該組成物を投与すべきである被験体に対し有害でない。
【0124】
本明細書に記述される製薬学的組成物の製剤は、既知のもしくは薬理学の技術分野で将来開発されるいずれかの方法により製造することができる。一般に、こうした予備的(preparatory)方法は、有効成分を担体または1種もしくはそれ以上の他の補助成分と連合させること、およびその後、必要もしくは所望の場合は、生成物を所望の単一もしくは複数用量の単位に造形もしくは包装することの段階を包含する。
【0125】
本明細書に提供される製薬学的組成物の記述は、主としてヒトへの倫理的投与に適する製薬学的組成物に向けられるとは言え、こうした組成物は一般に全部の種類の動物への投与に適することが当業者により理解されるであろう。製薬学的組成物を多様な動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適する該組成物の改変は十分に理解されており、そして通常の熟練を積んだ家畜の薬理学者は、単に通常の(あれば)実験を用いてこうした改変を設計かつ実施することができる。本発明の製薬学的組成物の投与が企図される被験体は、限定されるものでないがヒトおよび他の霊長類、非ヒトの霊長類、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連のある哺乳動物を包含する哺乳動物、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウのような商業的に関連のある鳥を包含する鳥類、養殖された(farm−raised)魚および養魚池の魚を包含する魚、ならびに養殖された貝のような甲殻類を挙げることができる。
【0126】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、口腔内、眼、もしくは別の投与経路に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。他の企図される製剤は、射出されたナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球、および免疫学的に基づく製剤を包含する。
【0127】
本発明の製薬学的組成物は、単一単位用量としてもしくは複数の単一単位用量として、バルクで製造、包装もしくは販売することができる。本明細書で使用されるところの「単位用量」は、予め決められた量の有効成分を含んで成る製薬学的組成物の別個の量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与されることができる有効成分の投薬量、または例えばこうした投薬量の半分もしくは1/3のようなこうした投薬量の便宜的な画分に等しい。
【0128】
本発明の製薬学的組成物中の有効成分、製薬学的に許容できる担体およびいずれかの付加的成分の相対量は、治療される被験体の正体(identity)、大きさおよび病状に依存して、またさらに組成物が投与されるはずである経路に依存して、変動することができる。例として、組成物は0.1%と100%(w/w)との間の有効成分を含むことができる。
【0129】
本発明の製薬学的組成物は、有効成分に加え、1種もしくはそれ以上の付加的な製薬学的有効成分をさらに含むことができる。とりわけ企図される付加的成分は、抗吐薬、ならびにシアニドおよびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャー、ならびにAZT、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、インターロイキン−2、インターフェロン、サイトカインなどを包含する。
【0130】
本発明の製薬学的組成物の制御もしくは持続性放出製剤は、慣習的技術を使用して作成することができる。
【0131】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の製剤は、限定されるものでないが錠剤、硬もしくは軟カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤または舐剤を挙げることができる別個の固体の用量単位の形態で製造、包装もしくは販売することができ、それぞれは予め決められた量の有効成分を含有する。経口投与に適する他の製剤は、限定されるものでないが粉末状もしくは顆粒状製剤、水性もしくは油性の懸濁剤、水性もしくは油性の溶液、または乳剤を挙げることができる。
【0132】
本明細書で使用されるところの「油性」の液体は、炭素を含有する液体分子を含んで成りかつ水より小さい極性の特徴を表すものである。
【0133】
有効成分を含んで成る錠剤は、例えば、場合によっては1種もしくはそれ以上の付加的成分とともに、有効成分を圧縮もしくは成形することにより作成することができる。圧縮錠剤は、場合によっては結合剤、滑沢剤、賦形剤、界面活性剤および分散助剤の1種もしくはそれ以上と混合された粉末状もしくは顆粒状の調製物のような、自由に流動する形態の有効成分を適する装置中で圧縮することにより製造することができる。成形錠剤は、有効成分、製薬学的に許容できる担体、および混合物を湿らせるのに少なくとも十分な液体の混合物を、適する装置中で成形することにより作成することができる。錠剤の製造で使用される製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないが不活性希釈剤、顆粒化および崩壊剤、結合剤、ならびに滑沢剤を挙げることができる。既知の分散助剤は、限定されるものでないがバレイショデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムを挙げることができる。既知の界面活性剤は、限定されるものでないがラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。既知の希釈剤は、限定されるものでないが炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを挙げることができる。既知の顆粒化および崩壊剤は、限定されるものでないがトウモロコシデンプンおよびアルギン酸を挙げることができる。既知の結合剤は、限定されるものでないがゼラチン、アラビアゴム、前ゼラチン化された(pre−gelatinized)トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを挙げることができる。既知の滑沢剤は、限定されるものでないがステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを挙げることができる。
【0134】
錠剤は、コーティングされなくてよいか、もしくは、それらは被験体の消化管における遅延した崩壊を達成するために既知の方法を使用してコーティングすることができ、それにより有効成分の持続性の放出および吸収を提供する。例として、グリセリルモノステアレートもしくはグリセリルジステアレートのような素材を、錠剤をコーティングするのに使用することができる。さらなる例として、錠剤は、浸透圧で制御される放出錠剤を形成するために、米国特許第4,256,108号;同第4,160,452号;および同第4,265,874号明細書に記述される方法を使用してコーティングすることができる。錠剤は、製薬学的に上質のかつ味のよい製剤を提供するために、甘味料、香味料、着色料、保存剤もしくはこれらの数種の組み合わせをさらに含むことができる。
【0135】
有効成分を含んで成る硬カプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。こうした硬カプセル剤は有効成分を含んで成り、また、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンのような不活性の固体の希釈剤を包含する付加的成分をさらに含むことができる。
【0136】
有効成分を含んで成る軟ゼラチンカプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。こうした軟カプセル剤は、水、またはラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような油媒体と混合することができる有効成分を含んで成る。
【0137】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体の形態で、または使用前に水もしくは別の適するベヒクルを用いる再構成に意図される乾燥生成物の形態のいずれかで製造、包装および販売することができる。
【0138】
液体の懸濁剤は、水性もしくは油性のベヒクル中の有効成分の懸濁剤を達成する慣習的方法を使用して製造することができる。水性ベヒクルは、例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性ベヒクルは、例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油のような植物油、分別された(fractionated)植物油、および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。液体の懸濁剤は、限定されるものでないが、懸濁化剤、分散もしくは湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、香味料、着色料および甘味料を挙げることができる1種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。油性の懸濁剤は増粘剤をさらに含むことができる。既知の懸濁化剤は、限定されるものでないがソルビトールシロップ、水素化可食脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を挙げることができる。既知の分散もしくは湿潤剤は、限定されるものでないが、レシチンのような天然に存在するホスファチド、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分的エステル、もしくは脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分的エステルとのアルキレンオキシドの縮合生成物(例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)を挙げることができる。既知の乳化剤は限定されるものでないがレシチンおよびアラビアゴムを挙げることができる。既知の保存剤は、限定されるものでないが、パラヒドロキシ安息香酸メチル、エチルもしくはn−プロピル、アスコルビン酸およびソルビン酸を挙げることができる。既知の甘味料は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ショ糖およびサッカリンを包含する。油性懸濁剤のための既知の増粘剤は、例えばミツロウ、硬質パラフィンおよびセチルアルコールを包含する。
【0139】
水性もしくは油性の溶媒中の有効成分の液体の溶液は、液体の懸濁剤と実質的に同一の様式で製造することができ、主な差異は、有効成分を溶媒中に懸濁するよりはむしろ溶解することである。本発明の製薬学的組成物の液体の溶液は、液体の懸濁剤に関して記述された成分のそれぞれを含むことができ、懸濁化剤は溶媒中の有効成分の溶解を必ずしも補助しないことができることが理解される。水性溶媒は、例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性の溶媒は、例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油のような植物油、分別された植物油、および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。
【0140】
本発明の製薬学的製剤の粉末状および顆粒状の製剤は既知の方法を使用して製造することができる。こうした製剤は、被験体に直接投与することができ、例えば錠剤を形成する、カプセルを充填する、またはそれへの水性もしくは油性のベヒクルの添加により水性もしくは油性の懸濁剤もしくは溶液を製造するのに使用することができる。これらの製剤のそれぞれは、分散もしくは湿潤剤、懸濁化剤および保存剤の1種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。増量剤および甘味料、香味料もしくは着色料のような付加的な賦形剤もまたこれらの製剤中に包含することができる。
【0141】
本発明の製薬学的組成物は、水中油乳剤もしくは油中水乳剤の形態で製造、包装もしくは販売することもまたできる。油相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油のような植物油、流動パラフィンのような鉱物油、またはこれらの組み合わせであることができる。こうした組成物は、アラビアゴムもしくはトラガカントガムのような天然に存在するガム、ダイズもしくはレシチンのホスファチドのような天然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレエートのような脂肪酸およびヘキシトール無水物の組み合わせ由来のエステルもしくは部分的エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキシドとのこうした部分的エステルの縮合生成物のような1種もしくはそれ以上の乳化剤をさらに含むことができる。これらの乳剤は、例えば甘味料もしくは香味料を包含する付加的成分もまた含有することができる。
【0142】
本発明の製薬学的組成物は、直腸投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした組成物は例えば坐剤、保持浣腸製剤、および直腸もしくは結腸の灌注のための溶液の形態であることができる。
【0143】
坐剤製剤は、通常の室温(すなわち約20℃)で固体でありかつ被験体の直腸温(すなわち健康なヒトで約37℃)で液体である非刺激性の製薬学的に許容できる賦形剤と有効成分を組み合わせることにより作成することができる。適する製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないがカカオバター、ポリエチレングリコールおよび多様なグリセリドを挙げることができる。坐剤製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【0144】
保持浣腸製剤、または直腸もしくは結腸の灌注のための溶液は、有効成分を製薬学的に許容できる液体の担体と組み合わせることにより作成することができる。当該技術分野で公知であるとおり、浣腸製剤は、被験体の直腸の解剖学的構造に適合された送達装置を使用して投与することができ、かつ、それ内に包装することができる。浣腸製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【0145】
本発明の製薬学的組成物は、膣投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした組成物は、例えば坐剤、タンポンのような含浸もしくは被覆された膣に挿入可能な素材、ビデ製剤、またはゲルもしくはクリーム、または膣灌注のための溶液の形態にあることができる。
【0146】
化学的組成物で素材を含浸もしくはコーティングするための方法は当該技術分野で既知であり、そして、限定されるものでないが表面上に化学的組成物を沈殿もしくは結合する方法、化学的組成物を素材の合成(すなわち生理学的に分解可能な素材を用いるような)の間に素材の構造中に組み込む方法、およびその後の乾燥を伴いもしくは伴わずに吸収体素材に水性もしくは油性の溶液もしくは懸濁剤を吸収させる方法を挙げることができる。
【0147】
膣灌注のためのビデ製剤もしくは溶液は、有効成分を製薬学的に許容できる液体の担体と組み合わせることにより作成することができる。当該技術分野で公知であるとおり、ビデ製剤は、被験体の膣の解剖学的構造に適合された送達装置を使用して投与することができ、かつ、それ内に包装することができる。ビデ製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含むことができる。
【0148】
本明細書で使用されるところの、製薬学的組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的破壊を特徴とするいずれかの投与経路、および組織中の破壊による製薬学的組成物の投与を包含する。従って、非経口投与は、限定されるものでないが、組成物の注入、外科的切開による組成物の適用、組織を浸透する非外科的創傷による組成物の適用などによる製薬学的組成物の投与を挙げることができる。とりわけ、非経口投与は、限定されるものでないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎透析注入技術を挙げることができることが企図される。
【0149】
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水もしくは滅菌の等張の生理学的食塩水のような製薬学的に許容できる担体と組み合わせられた有効成分を含んで成る。こうした製剤は、ボーラス投与もしくは連続的投与に適する形態で製造、包装もしくは販売することができる。注入可能な製剤は、アンプル、もしくは保存剤を含有する複数用量の容器中のような単位投与剤形で製造、包装もしくは販売することができる。非経口投与のための製剤は、限定されるものでないが、油性もしくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液、乳剤、パスタ剤および埋込可能な持続性放出もしくは生物分解可能な製剤を挙げることができる。こうした製剤は、限定されるものでないが、懸濁化剤、安定剤もしくは分散助剤を挙げることができる1種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。非経口投与のための製剤の一態様において、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与に先立ち適するベヒクル(例えば、滅菌の発熱性物質を含まない水)での再構成のための乾燥した(すなわち粉末もしくは顆粒の)形態で提供される。
【0150】
製薬学的組成物は、滅菌の注入可能な水性もしくは油性の懸濁剤もしくは溶液の形態で製造、包装もしくは販売することができる。この懸濁剤もしくは溶液は、既知技術に従って製造することができ、そして、有効成分に加えて、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤もしくは懸濁化剤のような付加的成分を含むことができる。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水もしくは1,3−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤もしくは溶媒を使用して製造することができる。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないがリンゲル溶液、等張の塩化ナトリウム溶液、および合成のモノもしくはジグリセリドのような固定油を挙げることができる。有用である他の非経口で投与可能な製剤は、微晶質の形態で、リポソーム製剤中に、もしくは生物分解可能なポリマー系の成分として有効成分を含んで成るものを包含する。持続性の放出もしくは埋込のための組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、わずかに可溶性のポリマーもしくはわずかに可溶性の塩のような製薬学的に許容できるポリマー性もしくは疎水性の素材を含むことができる。
【0151】
局所投与に適する製剤は、限定されるものでないが、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤もしくはパスタ剤のような水中油もしくは油中水乳剤、および溶液もしくは懸濁剤のような液体もしくは半液体の製剤を挙げることができる。局所で投与可能な製剤は、例えば約1%から約10%(w/w)までの有効成分を含んで成ることができるとは言え、有効成分の濃度は溶媒中での有効成分の溶解性の限界と同じくらい高いことができる。局所投与のための製剤は、本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【0152】
本発明の製薬学的組成物は、口腔を介する肺投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、有効成分を含んで成りかつ約0.5から約7ナノメートルまで、および好ましくは約1から約6ナノメートルまでの範囲の直径を有する乾燥粒子を含むことができる。こうした組成物は、便宜的に、粉末を分散するよう噴射剤の流れをそれに向けることができる乾燥粉末溜めを含んで成る装置を使用する、または、封止された容器中の低沸点噴射剤中に溶解もしくは懸濁された有効成分を含んで成る装置のような自己噴射溶媒/粉末分注容器を使用する投与のための乾燥粉末の形態にある。好ましくは、こうした粉末は、重量で粒子の最低98%が0.5ナノメートルより大きい直径を有しかつ数で粒子の最低95%が7ナノメートル未満の直径を有する粒子を含んで成る。より好ましくは、重量で粒子の最低95%が1ナノメートルより大きい直径を有し、かつ、数で粒子の最低90%が6ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは、糖のような固体の微細な粉末希釈剤を包含し、また、便宜的には単位投与剤形で提供される。
【0153】
低沸点噴射剤は、一般に、大気圧で65°Fより下の沸点を有する液体噴射剤を包含する。一般に、噴射剤は組成物の50ないし99.9%(w/w)を構成することができ、そして有効成分は組成物の0.1ないし20%(w/w)を構成することができる。噴射剤は、液体の非イオン性もしくは固体の陰イオン性界面活性剤、または固体の希釈剤(好ましくは、有効成分を含んで成る粒子と同一の桁の粒子径を有する)のような付加的成分をさらに含むことができる。
【0154】
肺送達のため処方される本発明の製薬学的組成物は、有効成分を溶液もしくは懸濁剤の小滴の形態でもまた提供することができる。こうした製剤は、場合によっては滅菌の、有効成分を含んで成る水性もしくは希アルコール性の溶液もしくは懸濁剤として製造、包装もしくは販売することができ、かつ、便宜的には、いずれかの噴霧(nebulization)もしくは噴霧(atomization)装置を使用して投与することができる。こうした製剤は、限定されるものでないが、サッカリンナトリウムのような香味料、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、もしくはヒドロキシ安息香酸メチルのような保存剤を挙げることができる1種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含むことができる。この投与経路により提供される小滴は、好ましくは、約0.1から約200ナノメートルまでの範囲の平均直径を有する。
【0155】
肺送達に有用であるとして本明細書に記述される製剤は、本発明の製薬学的組成物の鼻内送達にもまた有用である。
【0156】
鼻内投与に適する別の製剤は、有効成分を含んで成りかつ約0.2から500マイクロメートルまでの平均粒子を有する粗い粉末である。こうした製剤は、嗅剤が摂取される様式で、すなわち鼻孔近くに保持される粉末の容器からの鼻の通過による迅速吸入により投与する。
【0157】
鼻投与に適する製剤は、例えば、0.1%(w/w)と同じくらいから、そして100%(w/w)と同じくらいの有効成分を含んで成り、そして本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【0158】
本発明の製薬学的組成物は、口腔内投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、例えば慣習的方法を使用して作成された錠剤もしくは舐剤の形態であることができ、そして、例えば、0.1ないし20%(w/w)の有効成分であることができ、均衡は、経口で溶解可能もしくは分解可能な組成物および場合によっては本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上を含んで成る。あるいは、口腔内投与に適する製剤は、有効成分を含んで成る散剤またはエアゾル化もしくは噴霧される溶液もしくは懸濁剤を含むことができる。こうした粉末状、エアゾル化もしくはエアゾル化された製剤は、分散される場合に、好ましくは約0.1から約200ナノメートルまでの範囲の平均粒子もしくは小滴径を有し、また、本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上をさらに含むことができる。
【0159】
本発明の製薬学的組成物は、眼投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売することができる。こうした製剤は、例えば、例えば水性もしくは油性の液体担体中に0.1〜1.0%(w/w)の有効成分の溶液もしくは懸濁液を包含する点眼薬の形態であることができる。こうした点眼薬は、緩衝剤、塩、または本明細書に記述される付加的成分の1種もしくはそれ以上の他者をさらに含むことができる。有用である他の眼に(ophthalmalmically)投与可能な製剤は、微晶質の形態でもしくはリポソーム製剤中に有効成分を含んで成るものを包含する。
【0160】
本明細書で使用されるところの「付加的成分」は、限定されるものでないが以下すなわち賦形剤;界面活性剤;分散助剤;不活性希釈剤;顆粒化および崩壊剤;結合剤;滑沢剤;甘味料;香味料;着色料;保存剤;ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物;水性のベヒクルおよび溶媒;油性のベヒクルおよび溶媒;懸濁化剤;分散もしくは湿潤剤;乳化剤、粘滑剤;緩衝剤;塩;増粘剤;増量剤;乳化剤;抗酸化剤;抗生物質;抗真菌剤;安定剤;ならびに製薬学的に許容できるポリマー性もしくは疎水性物質の1種もしくはそれ以上を挙げることができる。本発明の製薬学的組成物に包含することができる他の「付加的成分」は当該技術分野で既知であり、そして例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences(1985、Genaro編、マック パブリッシング カンパニー(Mack Publishing Co.)、フィラデルフィア州イーストン)(引用により本明細書に組み込まれる)に記述される。
【0161】
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与することができる本発明の化合物の投薬量は、動物の体重1キログラムあたり1μgから約100gまでの量の範囲にわたる。一方、投与される正確な投薬量は、限定されるものでないが動物の型および治療されている疾患状態の型、動物の齢および投与経路を挙げることができるいずれかの数の因子に依存して変動することができる。好ましくは、化合物の投薬量は、動物の体重1キログラムあたり約1mgから約10gまで変動することができる。より好ましくは、投薬量は動物の体重1キログラムあたり約10mgから約1gまで変動することができる。
【0162】
化合物は1日に数回と同じくらい頻繁に動物に投与することができるか、あるいは、それは、1日1回、週1回、2週間ごとに1回、月1回のような、より少なく頻繁に、あるいは数ヶ月ごとに1回または年1回もしくはより少なくさえのような、なおより少なく頻繁に投与することができる。投与の頻度は当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが治療されている疾患の型および重症度、動物の型および齢などのようないずれかの数の因子に依存することができる。
【0163】
HIV感染症を治療するのに使用される化合物は、免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envと共投与することができる。あるいは、化合物(1種もしくは複数)を、免疫原性の用量(1個もしくは複数)のHIV−1 Envに先だって1時間、1日、1週間、1ヶ月もしくはなおより以上、またはそのいずれかの順序変更(permutation)で投与することができる。さらに、化合物(1種もしくは複数)は、免疫原性の用量(1個もしくは複数)のHIV−1 Envの後1時間、1日、1週間もしくはなおより以上、またはそのいずれかの順序変更で投与することができる。頻度および投与レジメンは当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが治療されている疾患の型および重症度、動物の齢および健康状態、投与されている化合物もしくは化合物類の正体、多様な化合物およびHIV−1 Envの投与経路などのようないずれかの数の因子に依存することができる。
【0164】
本発明は、以下の実験的実施例への引用により詳細にさらに記述する。これらの実施例は具体的説明のみの目的上提供され、そして別の方法で明記されない限り制限であることを意図していない。従って、本発明は、以下の実施例に制限されると決して解釈されるべきでないが、しかしむしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるいずれかのおよび全部の変形物を包含すると解釈されるべきである。
定義
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは、本節でそれに関連した意味を有する。
【0165】
冠詞「a」および「an」(ひとつの)は、該冠詞の文法上の目的語の1つもしくは1つ以上(すなわち最低1つ)を指すために本明細書で使用する。例として、「1つの要素(an element)」は1個の要素もしくは1個以上の要素を意味する。
【0166】
本明細書で使用されるところの、HIV−1感染症を「緩和する」ことは、該疾患もしくは障害の症状の重症度を低下させることを意味する。
【0167】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することが可能である免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源から、もしくは組換えの供給源から生じられた無傷の免疫グロブリンであることができ、また、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であることができる。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)2、ならびに一本鎖抗体および人化抗体を包含する多様な形態で存在することができる(Harlowら、1988、Antibodies:A Laboratory Manual、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー中;Houstonら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;Birdら、1988、Science 242:423−426)。
【0168】
本明細書で使用されるところの「合成抗体」という用語により、例えば本明細書に記述されるようなバクテリオファージにより発現される抗体のような、組換えDNA技術を使用して生じられる抗体を意味する。該用語はまた、抗体をコードするDNA分子の合成により生じられた抗体を意味すると解釈されるべきであり、そしてこのDNA分子は抗体タンパク質もしくは抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、ここでDNAもしくはアミノ酸配列は、利用可能かつ当該技術分野で公知である合成DNAもしくはアミノ酸配列の技術を使用して得られている。
【0169】
該用語が本明細書で使用されるところの「生物学的活性」により、タンパク質がその会合されたタンパク質(1種もしくは複数)と相互作用しかつ細胞内でおよび/もしくはHIV−1感染に関してその正常の機能(1種もしくは複数)を実施する能力を有することを意味する。一態様において、8x gp120は、該タンパク質がCXCR4ケモカイン受容体タンパク質に結合するためおよび宿主細胞膜とのウイルスエンベロープの融合を媒介するためにCD4との相互作用を必要としないため、その生物学的活性を保持する。さらに、それがEnvのいずれかの形態もしくはフラグメントを指すところの生物学的活性は、該ポリペプチドが、それがCD4にもまた結合するという要件なしにケモカイン受容体タンパク質に結合する能力を有することを意味する。
【0170】
該用語が本明細書で使用されるところの「ケモカイン受容体結合部位」により、限定されるものでないがCXCR4もしくはCCR5のようなヒトケモカイン受容体タンパク質を特異的に結合するウイルスのgp120の部分を意味する。従って、CXCR4ケモカイン受容体結合部位は、CXCR4ケモカイン受容体に特異的に結合するがしかしCCR5のような別のケモカイン受容体に実質的に結合しないHIV−1 gp120分子の一部分を意味する。同様に、CCR5ケモカイン受容体結合部位は、CCR5に特異的に結合するがしかしCXCR4などのような別のケモカイン受容体を包含するいずれかの他の分子に有意に結合しないHIV−1 gp120分子の一部分を意味する。
【0171】
該用語が本明細書で使用されるところの「CD4非依存性」という用語により、HIV−1株が、CD4タンパク質を発現しない細胞を感染させることが可能であり、かつ/もしくはCD4に誘導されるコンホメーション変化(1種もしくは複数)の非存在下でそのgp120が補助受容体に結合することができることを意味する。しかしながら、CD4非依存性のHIV−1はCD4および適切なケモカイン受容体(これは必要とされないが)を発現する細胞もまた感染させることができる。
【0172】
本明細書で使用されるところの「キメラ」という用語により、異なるHIV−1株からのenvの一部分をコードする最低1種の核酸に共有結合されたenvの少なくとも一部分をコードする8x核酸の一部分を含んで成る、envをコードする核酸を意味する。
【0173】
その用語が本明細書で使用されるところの「Envクローン」という用語により、gp120およびgp41を含んで成るEnvタンパク質gp160をコードするenv核酸を意味する。完全長のEnvクローンは完全なEnvタンパク質gp160をコードする一方、部分的クローンは、8xに特異的である突然変異を含むことができる8x Envのより小さい部分を構築するのに使用することができる完全長のクローンのフラグメント(1種もしくは複数)を包含する。
【0174】
本明細書で使用されるところの「相補性」は、2種の核酸(例えば2個のDNA分子)の間のサブユニット配列の相補性の広範な概念を指す。分子の双方のあるヌクレオチド位置が相互と塩基対形成することが通常は可能なヌクレオチドにより占有される場合には、該核酸はこの位置で相互に対し相補性であると考えられる。従って、分子のそれぞれの実質的な数(最低50%)の対応する位置が通常相互と塩基対形成する(例えばA:TおよびG:Cヌクレオチド対)ヌクレオチドにより占有される場合に、2種の核酸は相互に対し相補性である。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の配列に対し相補性である。アンチセンス配列がDNA分子のコーディング鎖のコーディング部分に対してのみ相補性であることは必要ではない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするDNA分子のコーディング鎖上で明記された調節配列に対し相補性であることができ、この調節配列はコーディング配列の発現を制御する。
【0175】
「をコードする(encoding)核酸」もしくは「をコードする(coding)核酸」という用語の使用は、所望のタンパク質、および実際のコーディング配列に付随するいかなる必要な5’もしくは3’非翻訳領域もコードするRNAもしくはDNA配列を包含すると解釈されるべきである。
【0176】
これらの用語が本明細書で使用されるところの「コードする(encoding)」および「コードする(coding)」という用語により、核酸のヌクレオチド配列が目的の特定のポリペプチドを特定することが可能であることを意味する。すなわち、該核酸が転写および/もしくは翻訳されてポリペプチドを産生することができる。従って、例えば、HIV−1 Envをコードする核酸は、転写および/もしくは翻訳されてHIV−1エンベロープタンパク質を産生することが可能である。
【0177】
本明細書で使用されるところの、ポリペプチドに適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常、最低約7個の連続するアミノ酸、典型的には最低約15個の連続するアミノ酸、より典型的には最低約30個の連続するアミノ酸、典型的には最低約40個の連続するアミノ酸、好ましくは最低約50個のアミノ酸、なおより好ましくは最低約60個のアミノ酸であることができ、そして最も好ましくは、ペプチドフラグメントは長さが約60より長い連続するアミノ酸であることができる。
【0178】
本明細書で使用されるところの「相同な」は、2種のポリマー分子の間(例えば2種の核酸分子(例えば2種のDNA分子もしくは2種のRNA分子)の間、または2種のポリペプチド分子の間)のサブユニット配列の類似性を指す。2種の分子の双方のあるサブユニット位置が同一の単量体サブユニットにより占有される場合(例えば2種のDNA分子のそれぞれのある位置がアデニンにより占有される場合)には、それらはその位置で相同である。2種の配列の間の相同性は、適合するもしくは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば、2種の化合物の配列の位置の半分(例えば長さが10サブユニットのポリマーの5個の位置)が相同である場合には、該2配列は50%相同であり、位置の90%(例えば10個のうち9個)が合致しているもしくは相同である場合は、該2配列は90%の相同性を共有する。例として、DNA配列3’ATTGCC5’および3’TATGCG5’は50%の相同性を共有する。
【0179】
さらに、目的の2種の核酸もしくは2種のタンパク質の間の相同性パーセントを計算するのにアルゴリズムを使用することができ、そしてこれらは当該技術分野で公知である。
【0180】
該用語が本明細書で使用されるところの「免疫原性の用量」という用語により、タンパク質(それがタンパク質として投与されようと核酸として投与されようと)が投与されないそれ以外は同一の哺乳動物の免疫応答に比較して、該タンパク質に対する検出可能な体液性および/もしくは細胞性免疫応答を生じさせるタンパク質の量を意味する。一局面において、該用量はEnvタンパク質もしくはそのフラグメントとして投与する。別の局面において、該用量は核酸として投与する。
【0181】
本明細書で使用されるところの「単離された核酸」という用語により、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離されている核酸配列もしくはそのフラグメント(例えば、該フラグメントに通常隣接する配列(例えばそれが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに隣接する配列)から取り出されているDNAフラグメント)を意味する。該用語は、細胞中でそれに天然に付随する、核酸(例えばRNAもしくはDNA)またはタンパク質に天然に付随する他の成分から実質的に精製されている核酸にもまた当てはまる。従って、該用語は、例えば、ベクター中;自律性に複製するプラスミドもしくはウイルス中;または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組込まれる;あるいは他の配列に依存せず別個の分子として(例えばcDNA、またはPCRもしくは制限酵素消化により生じられるゲノムもしくはcDNAのフラグメントとして)存在する組換えDNAを包含する。それは、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAもまた包含する。
【0182】
本明細書で使用されるところの「単離されたペプチド」、「単離されたポリペプチド」もしくは「単離されたタンパク質」という用語により、細胞中で該タンパク質もしくはペプチドに天然に付随する成分(例えば、DNA、RNA、他のタンパク質およびペプチド、炭水化物ならびに脂質)から実質的に分離されているペプチドもしくはタンパク質を意味する。単離されたペプチドおよびタンパク質という用語は、単離された核酸を含んで成る細胞から発現および/もしくは分泌されるペプチドもしくはタンパク質を包含すると解釈することができる。
【0183】
本発明のペプチド(もしくはそれをコードするDNA)の「突然変異体」、「誘導体」および「変異体」は、該ペプチド(もしくはDNA)が本明細書に再引用される配列に同一でないように1個もしくはそれ以上のアミノ酸(または1個もしくはそれ以上の塩基対)で変えることができるが、しかし該ペプチドがCD4非依存性の様式でケモカイン受容体タンパク質に結合するという特性を有するため本明細書に開示されるペプチドと同一の特性を有するペプチドである。
【0184】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、適切なEnvタンパク質をそれと組み合わせることができかつ組み合わせ後に患者に該タンパク質を投与するのに使用することができる化学的組成物を意味する。
【0185】
本明細書で使用されるところの「特異的に結合する」という用語により、例えばCXCR4ポリペプチドを認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子を実質的に認識もしくは結合しないケモカイン受容体結合部位を意味する。同様に、ケモカイン受容体結合部位は、該結合部位がサンプル中のCXCR4を認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子(例えばCCR5)を実質的に認識もしくは結合しない場合に「CXCR4を特異的に結合する」。同様に、ケモカイン受容体結合部位はCCR5を特異的に結合することができ、そして従ってCXCR4のような他の分子を結合しないとみられる。
【0186】
遊走群は、感染した細胞からのHIVのクローン化されないストックを指す。こうしたストックは、創始体(founder)もしくは親のウイルスの多くの遺伝子的に別個の変異体を含有することが既知であり、これゆえに「遊走群」という用語である。
【0187】
本明細書で使用されるところの「安定に露出されたケモカイン受容体結合部位」という用語は、典型的にケモカイン受容体タンパク質のgp120結合に前もって必要であるCD4とのgp120の相互作用に対する必要性なしに、ケモカイン受容体タンパク質に結合するのにgp120ケモカイン受容体結合部位が利用可能であることを意味する。本明細書に開示されるデータにより立証されるとおり、gp120のケモカイン受容体結合部位は、CD4の結合前のそれ以外は同一のCD4依存性のgp120よりも抗体中和に対しより感受性である、安定な露出された配置で存在することができる。安定に露出された形態のケモカイン結合部位は、最低約3ヶ月の期間の間および/もしくは無期限に溶液中で存在することができる。
【0188】
本明細書で使用されるところの「実質的に純粋な」という用語は、天然にそれに不随する成分から分離されている化合物(例えば核酸、タンパク質もしくはポリペプチド)を記述する。典型的には、サンプル中の総物質の最低約10%、好ましくは最低約20%、より好ましくは最低約50%、さらにより好ましくは最低約75%、なおより好ましくは最低約90%、そして最も好ましくは最低約99%(容積で、湿もしくは乾燥重量で、またはモルパーセントもしくはモル画分で)が目的の化合物である場合に、化合物は実質的に純粋である。純度は、いずれかの適切な方法により、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動もしくはHPLC分析により測定することができる。
【0189】
化合物(例えば核酸、タンパク質もしくはポリペプチド)は、それが天然に関連する成分を本質的に含まない場合、もしくはそれがその天然の状態でそれに付随する天然の汚染物質から分離されている場合にもまた「実質的に精製されて」いる。従って、本明細書で使用されるところの、核酸の「実質的に純粋な」調製物は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されている核酸配列(例えばそれが天然に存在するゲノム中で該フラグメントに通常隣接する配列から取り出されているDNAフラグメント)を指す。
【0190】
同様に、本明細書で使用されるところの、タンパク質もしくはポリペプチドの「実質的に純粋な」調製物は、その天然に存在する状態でそれが通常伴う成分から精製されているタンパク質もしくはポリペプチドを指す。
【0191】
本明細書で使用されるところの「治療する」ことは、HIV−1感染症の症状が患者により経験される頻度を低下させることを意味する。
【0192】
該用語が本明細書で使用されるところの「誘導された」により、HIV−1 Envタンパク質は、gp120がCXCR4もしくはCCR5のようなケモカイン受容体タンパク質に結合することができる前にCD4に結合することを必要としないことを意味する。好ましくは、誘導されたEnvは、CD4への結合の非存在下でケモカイン受容体を結合することができるコンホメーションにあるgp120を含んで成る。
【0193】
本明細書で使用されるところの「ベクター」という用語により、外因性の核酸をコードするいかなるプラスミドもしくはウイルスも意味する。該用語は、例えばポリリシン化合物などのような、ビリオンもしくは細胞中への核酸の移入を助長する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含するようにもまた解釈されるべきである。ベクターは、患者へのHIV−1 Envタンパク質もしくはHIV−1 envをコードする核酸の送達のための送達ベヒクルとして適するウイルスベクターであることができるか、または、ベクターは、同一の目的上適する非ウイルスベクターであることができる。細胞および組織へのDNAの送達のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当該技術分野で公知であり、そして例えばMaら(1997、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12744−12746)に記述される。ウイルスベクターの例は、限定されるものでないが組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えトリポックスウイルスなどを挙げることができる(Cranageら、1986、EMBO J.5:3057−3063;国際特許出願第WO94/17810号明細書(1994年8月18日公開);国際特許出願第WO94/23744号明細書(1994年10月27日公開))。非ウイルスベクターの例は、限定されるものでないがリポソーム、DNAのポリアミン誘導体などを挙げることができる。
【0194】
該用語が本明細書で使用されるところの「ワクチン」という用語により、ヒトもしくは家畜の患者に投与される場合に、HIV−1もしくはその成分(1種もしくは複数)に対する体液性および/もしくは細胞性の検出可能な免疫応答を誘導する化合物を意味する。
実施例1:HIV−1のCD4非依存性の決定子は、補助受容体特異性に必要とされる外側領域に位置する
本実施例に提示される実験は、以下のとおり要約することができる。
【0195】
HIVによる感染は、典型的にはウイルスエンベロープ糖タンパク質(Env)、CD4およびケモカイン受容体の間の相互作用を必要とするが、HIVおよびSIVのCD4非依存性の単離物が本明細書で発見された。本発明は、CD4の非存在下でCXCR4を利用する能力を表す、HIV−1/IIIBxと命名されたHIV−1/IIIBの変異体の派生を開示する。このウイルスでCD4陰性のTおよびB細胞を感染させ、そしてヒトCXCR4単独を発現するマウス3T3細胞と融合した。
【0196】
機能的なHIV−1/IIIBx envクローンは、5個のグリコシル化部位の目立った喪失を包含するいくつかの突然変異を表した。本明細書に開示されるデータはCD4依存性のenvをもつキメラの構築を立証する。該データは、CD4非依存性の決定子が、ケモカイン受容体特異性を決定するV1/V2およびV3超可変ループの外側、ならびに少なくとも部分的に、保存されたケモカイン受容体結合部位の形成に関係しているgp120コア上の一領域内に位置することを開示する。さらに、本明細書に開示されるデータは、CCR5向性のEnvのV3ループをHIV−1/IIIBx Env中に置換した場合、生じるキメラはCCR5を利用したがしかしCD4非依存性のままであったことを立証する。従って、開示されたデータは、ケモカイン受容体特異性のEnv決定子は、細胞融合へのその受容体の使用を媒介するものと異なることを初めて立証する。これらの知見は、HIV−1/IIIBx中の突然変異はCD4の非存在下でCXCR4もしくはCCR5のいずれかと相互作用することができる保存されたケモカイン受容体部位を露出させ、そしてワクチン開発のための露出されたケモカイン受容体結合部位をもつEnvの設計に重要な意味を有することができるという証拠を提供する。
【0197】
本明細書に提示されるデータは、CD4の非存在下でCXCR4を利用する能力を獲得した、HIV−1/IIIBxと命名されたHIV−1/IIIBの変異体の派生および分子の特徴づけを開示する。機能的HIV−1/IIIBx envクローン(8x)を使用して、緊密に関係するがしかしCD4依存性のenvを含むキメラを構築し、そしてCD4非依存性の決定子が、部分的に、保存されたケモカイン受容体結合部位、および可変ループの外側に位置することが示された。顕著なことに、8xがCCR5向性のEnvのV3ループを含有した場合、それはCCR5を利用したが、しかしCD4非依存性を維持した。これらの知見は、CD4結合は、遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体と相互作用することができるgp120コア上のドメインを露出させることがありそうであるという証拠を提供する。この研究は、新規生化学的および免疫原性の特性を表すことができる露出されたケモカイン受容体接触部位をもつHIV−1 Envタンパク質の設計で重要な意味を有することができる。
【0198】
本実施例に提示される実験で使用された材料および方法を今や記述する。
【0199】
細胞、ウイルスおよび感染力アッセイ。
【0200】
Hut−78およびSupT1は不死化されたCD4+ T細胞系である。BC7はSupT1由来のCD4陰性の系統である(Endresら、1996、Cell 87:745−756)。クローン化されないHIV−1/IIIBは、Popovicら(1984、Science 224:497−500)に記述されるとおり慢性に感染したHut−78細胞中で得た。この感染したHut−78細胞培養物からの上清のウイルスをSupT1細胞上で連続的に継代し、これからBC7上でのその後の継代によりHIV−1/IIIBxを単離した。IIIB/Supウイルスは、SupT1中での早期継代HIV−1/IIIBから生じさせた。トランスフェクションされない、およびヒトCXCR4で安定にトランスフェクションされたNIH−3T3細胞は、(Dengら、1996、Nature 381:661−666)に記述された。逆転写酵素(RT)アッセイは、Endresら(1997、Science 278:1462−1464)に記述されるとおり培養物上清で実施した。中和アッセイのためには、BC7細胞を、変動する濃度の抗CXCR4 MAbもしくは12G5(Endresら、1997、上記)とともに37℃で30分間前インキュベートし、細胞にその後HIV−1/IIIBx(10 TCID50)を接種し、そして細胞をRT活性についてモニターした。
【0201】
PCR、クローニング、ウイルス産生およびキメラ構築。
【0202】
完全長のenvコーディング領域は、センスプライマー5’−CGCAACCTATACCAATAGTAGCAA−3’[配列番号1]およびアンチセンスプライマー5’−CAGTAAGCCATCCAATCACACTAC−3’[配列番号2]を使用して、バイオサイクラー(BioCycler)(エリコンプ(Ericomp)、カリフォルニア州サンディエゴ)中で、慢性に感染した細胞のゲノムDNAからPCRにより増幅した。PCR産物をpCDNA3.1(インヴィトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州サンディエゴ)にTAクローン化し、そしてレポーター遺伝子融合アッセイで試験した。自動化シークェンサーを使用して、HIV−1/IIIBx(8x)およびIIIB/Sup(S10)の機能的クローンを配列決定した。クローンはまた、Asp718およびBamHIを使用して、HXBc2 envを含有したpSP73(プロメガ コープ(Promega Corp.)、ウィスコンシン州マディソン)中にもサブクローニングした(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365)。
【0203】
機能的envクローンを、env中の唯一のNdeIおよびBamHI制限部位を使用してpNL4−3の3’半ゲノム(EcoRI部位から)にサブクローニングし、これはHIV−1/IIIBxおよびIIIB/Sup中の突然変異を包含する。5’pNL4−3 Δvpr半ゲノム(EcoRI部位まで)(Gibbsら、1994、AIDS Res.Hum.Retroviruses.10:343−350)および多様な3’半ゲノム構築物の各20μgをEcoRIで消化すること、フェノール抽出すること、ならびに電気穿孔法によるBC7およびSupT1へのトランスフェクション前に共沈殿させることにより、ウイルスを生成させた。細胞をシンシチウム形成についてモニターし、そして上清のウイルスを収穫してウイルスストックを生成させた。HIV−1/IIIBウイルスストックは、1mlのアリコート中、−70℃で凍結した。HIV−1/IIIBxおよび8xのウイルスストックは、5%ショ糖中−140℃で凍結して感染力を保存した。8xとS10もしくはHXBc2との間のキメラ(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365)は、TM(すなわちEnvの膜貫通部分であるEnvのgp41部分)からSU(すなわちEnvの表面部分であるEnvのgp120部分)の変化を単離するためのBsaBI部位(nt7673)、ならびにV1−V2、V3およびV4/C4領域を単離するためのそれぞれDraIII(nt6714)、StuI(nt6948)およびBsu36I(nt7430)を使用して構築した。R5ウイルスのV3ループを含有するクローンは、BaLのV3ループをもつHXBのプロウイルスクローン(Hwangら、1991、Science 253:71−74)からのAsp718−BamHIフラグメントをpSP73−HXBc2(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365)にサブクローニングすることにより構築した。BaLのV3ループを含有する8xのバージョンは、このプロウイルスのStuI−Bsu36IフラグメントをpSP73−8x中に挿入することにより類似の様式で作成した。
【0204】
細胞−細胞融合アッセイ。
【0205】
細胞−細胞融合を媒介するenv遺伝子の能力は、ルシフェラーゼに基づく遺伝子レポーターアッセイ(Ruckerら、1997、Methods Enzymol.288:118−133)を使用して評価した。簡潔には、ウズラQT6細胞を、CaPO4によりHIV envを含有するプラスミドとコトランスフェクションし、そしてT7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス(Alexanderら、1992、1992、J.Virol.66:2934−2942)に感染させた。これらの細胞を、ヒトCD4およびT7プロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子を伴いもしくは伴わずに、ヒトCXCR4もしくはCCR5を一過性に発現するウズラQT6細胞と混合した。細胞を組み合わせた7〜8時間後に細胞を溶解すること、および発光計(luminometer)でルシフェラーゼ発現を測定することにより、融合を定量した。
【0206】
逆転写酵素アッセイ。
【0207】
細胞の生産性感染を、既に記述された(Hoxieら、1985、Science 229:1400−1402)ような培養物上清中の逆転写酵素(RT)活性の検出により報告した。簡潔には、1mlの澄明にされた培養物上清からのウイルスを、100,000×gで4℃で30分間ペレットにし、そしてウイルスを100μlの可溶化緩衝液(0.15Mトリス pH8.0、0.4M NaCl、0.25%トリトン(Triton)X−100、10%グリセロール、0.5mM D.T.)中で可溶化した。二重の20μlのアリコートを85μlのRTカクテル(0.05単位のポリr(A)および12.5μCiの3H−dTTPを含有する67.5mMトリス pH7.5、1.3mM D.T.、1mM ATP、13.5mM MgCl2)と混合し、そして37℃で1時間インキュベートした。チューブを氷上に置き、225μgのtRNAを各チューブに添加し、そしてRNAを冷10%TCAで沈殿させた。沈殿されたRNAをガラス繊維フィルター上で捕捉し、そしてRNAをTCAおよびEtOHで洗浄した。フィルターを乾燥し、そして各フィルター上に存在する放射活性(1分あたりのカウント、cpmで)をシンチレーションカウンター(LKB/ワラック(Wallac)、フィンランド・テュルク)中で測定した。
【0208】
突然変異誘発。
【0209】
製造元の仕様書に従ってクイックチェンジ[Quickchange](商標)部位特異的突然変異誘発キット(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラホヤ)を使用して、pSP73中のEnv構築物中に点突然変異を工作した。以下のプライマー対、すなわちD368R−順、5’CCTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAACGC−3’(配列番号5);D368R−逆、5’GCGTTACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG−3’(配列番号6)が、CD4結合を除去したD368R突然変異を生じた。2組のオリゴヌクレオチド、すなわち8x−G431E−順 5’−GGCAGGAAGTAGAAAAAGCAATGTATGCCCC−3’(配列番号7)および8X−G431E−逆 5’GGGGCATACATTGCTTTTTCTACTTCCTGCC−3’(配列番号8);ならびにS10−E431G−順 5’−GGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCC−3’(配列番号9)およびS10−E431G−逆 5’−GGGGCATACATTGCTTTTCCTACTTCCTGCC−3’(配列番号10)を使用して、8xおよびS10中の位置431の残基の相互交換を達成した。
【0210】
ウェスタンブロット。
【0211】
感染した細胞培養物の上清から単離されたウイルスを、100,000×gで4℃で90分間ペレットにし、そしてウイルスペレットを氷上の溶解緩衝液(20mMトリス pH8.0、120mM NaCl、0.2%デオキシコール酸ナトリウム、0.5% NP−40、0.2mM EGTA、0.2mM NaF、1μMペプスタチン、5μg/mlロイペプチン、5μg/mlアプロチニン)に再懸濁した。等容積のライセートおよび2×サンプル緩衝液(50mMトリス、pH6.8、2% SDS、30%グリセロール、10% β−メルカプトエタノール、0.2%パイロニンY)を7分間沸騰させ、氷上で7分間冷やし、そしてその後サンプルを12% SDS−PAGEゲル上で泳動した。
【0212】
マルチフォア(Multiphor)IIセミドライ電気転写装置(ファルマシア−LKB バイオテクノロジー インク(Pharmacia−LKB Biotechnology Inc.)、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を使用して、タンパク質をゲルからニトロセルロース(バイオラッド ラボラトリーズ(BioRad Laboratories)、カリフォルニア州リッチモンド)に転写した。Earlら(1997、J.Virol.71:2674−2684)に記述されるようなD12マウスモノクローナル抗体、次いで、ビオチニル化ヒツジ抗マウスIG(重鎖および軽鎖)(ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ(Jackson ImmunoResearch Laboratories)、フィラデルフィア州ウェストグローヴ)、ワサビペルオキシダーゼに結合されたストレプトアビジン(ストレプトアビジン−HRP、アマーシャム(Amersham)、イリノイ州アーリントンハイツ)および化学発光基質(ピアース ケミカル カンパニー(Pierce Chemical Co.)、イリノイ州ロックフォード)を使用して、HIV−1膜貫通タンパク質の存在をブロット上で検出した。
【0213】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【0214】
HIV−1/IIIBのCD4非依存性変異体の派生。
【0215】
HIV−1/IIIBのCD4非依存性変異体を、SupT1中のHIV−1/IIIBのクローン化されないストックの連続的継代、およびその後BC7(SupT1のCD4陰性系統)(Endresら、1996、Cell 87:745−756)を接種することにより派生させた。1実験においては、免疫蛍光アッセイ(IFA)により、およそ5%のBC7細胞がウイルスのp24gagについて陽性であった。この培養物からのウイルスを、感染していないBC7細胞上で2回継代し、そして慢性に感染した系統を樹立した。HIV−1/IIIBxと命名されたこの系統からのウイルスを、IIIB/SupT1と呼称される、SupT1細胞中のHIV−1/IIIBのより早期の継代と比較した。図1Aに示されるとおり、HIV−1/IIIBxのみがBC7を感染させることができた一方、双方のウイルスがSupT1を感染させることが可能であった。HIV−1/IIIBxは、Raji細胞(CD4陰性のBリンパ芽球様細胞系)もまた感染させることが可能であった。BC7の感染は、抗CXCR4 MAb、12G5により完全に阻害することができ(図1B)、この感染がCXCR4により媒介されることがありそうであったことを示した。さらに、HIV−1/IIIBxに感染したBC7細胞は、ヒトCXCR4を安定に発現したマウス3T3線維芽細胞と共培養された場合にシンシチウムを誘導した一方、トランスフェクションされない3T3細胞上では融合が誘導されなかった(図1C)。加えて、HIV−1/IIIBに感染したHUT−78細胞をCXCR4を発現する3T3細胞と共培養した場合には、融合が観察されなかった。一緒にすると、これらのデータは、HIV−1/IIIBx変異体が、TおよびBリンパ球様細胞系ならびにマウス線維芽細胞上で、CD4の非存在下に主受容体としてCXCR4を利用することができることを示す。
【0216】
機能的HIV−1/IIIBx envのクローニングおよび特徴づけ。
【0217】
HIV−1/IIIBx(8xと呼称される)の完全長のenvクローン(配列番号4)を、感染したBC7細胞からPCRにより増幅し、pSP73にクローン化し、そして細胞融合アッセイで原型のCD4依存性のIIIBクローン(HXBc2)と比較した。8xおよびHXBc2の双方が、CD4およびCXCR4の双方を発現するウズラQT6細胞上での融合を媒介することが可能であったが、しかし、8xのみが、CXCR4単独を発現した細胞と融合することができた(図2)。注目すべきことに、CD4およびCXCR4が共発現された場合に8xの融合が高められ、8x EnvはなおCD4と相互作用することが可能であることがありそうであったことを示した。加えて、pNL4−3プロウイルスにクローン化された8x envは、複製能力のあるウイルスを生じさせ、これはSupT1ならびにBC7細胞を感染させ(図3A)、8x EnvがCD4の非存在下でCXCR4を利用することが可能であった、および、8xクローンがクローン化されない親IIIBxウイルスを代表したという、さらなる証拠を提供した。
【0218】
8xのCD4非依存性を、gp120のアミノ酸位置368のAspからArgへの置換を導入することにより、さらに評価した。このAspは全部のHIV−1単離物のあいだで高度に保存され、そしてCD4のCDR2ループ中のArg−59と塩橋を形成することによりCD4結合の決定的に重要な決定子である(Kwongら、1998、Nature 393:648−659)。この位置での突然変異はCD4結合を除去することが示されている(Olshevskyら、1990、J.Virol.64:5701−5705)。図2に示されるとおり、D368R(すなわちアミノ酸368でのAspからArg)突然変異は、CD4およびCXCR4を共発現した細胞上のHXBc2による融合を排除したとは言え、この突然変異は、CXCR4のみを発現する標的細胞上での8xに媒介される融合に影響を及ぼさなかった。8x−D368Rの融合は、8xクローンと異なり、CD4がCXCR4と共発現された場合に高められず、8x−D368R EnvがCD4と相互作用することが不可能であったことを確認した。従って、8x Envは、CD4の非存在下でCXCR4を利用することが可能であったのみならず、gp120上のCD4結合部位を破壊した突然変異を耐えることもできた。
【0219】
envクローンの配列分析。
【0220】
8x(配列番号3)およびS10(配列番号12)の配列を、HXBc2の発表された配列(配列番号11)と比較した(図4)。8x中の突然変異の数は多い(gp120中に16個およびTM中に7個)一方、gp120中の突然変異の6個およびTM中の2個は、HIV−1/IIIB由来の他のenvクローン中で観察されており、そして従ってCD4非依存性の表現型に関与していることがありそうでない。gp120において、11個の独特の突然変異のうち8個は、超可変ループ、V1/V2(S143G、I165K、G167S、Q170KおよびT188P)、V3(R298K、Q310HおよびI320V)ならびにV4(N386K)中であった。3個の突然変異はgp120コア中にあった(D62E、N339S、I423V)。興味深いことに、gp120中の5個の突然変異は潜在的なNに結合されるグリコシル化部位の喪失をもたらし、そしてこれらのうち4個(S143G、T188P、N339SおよびN386K)は8xに独特であった。TMの外的ドメイン中の4個の8xに特異的な突然変異は、コイルドコイルを形成する2領域内に配置された(T536A、L544S、N651IおよびK655M)。顕著なことに、8xはTMの膜にわたるドメイン中に単一のヌクレオチド欠失もまた含有し、これは位置706にフレームシフトを導入し、わずか30アミノ酸の規準から外れた細胞質の尾を生成させた。短縮された細胞質の尾をもつHIV−1ウイルスは、典型的に減弱されているかもしくは非感染性である(Shimizuら、1992、Virology 189:534−546;Dubayら、1992、J.Virol.66:6616−6625;Chenら、1996、Virology 226:260−268)ため、この特徴は驚くべきである。にもかかわらず、上に示されたとおり、8x Envは、SupT1ならびにBC7細胞を感染させることができた複製能力のあるウイルスを生成することが可能であった(図3A)。さらに、クローン化されないHIV−1/IIIBxならびに8x envを含有するNL4−3からのウイルスライセートのウェスタンブロットは、親HIV−1/IIIBの41kDに比較して、およそ35kDのTMを立証した(図3B)。
【0221】
キメラEnvタンパク質を使用するCD4非依存性のマッピング。
【0222】
CD4非依存性の決定子を同定するため、8xとHXBc2との間で一組の相互キメラを生成させた。TM中の突然変異からgp120中のものを単離しそしてV1/V2、V3およびV4/C4サブドメイン中の突然変異の効果を定義するため、独特の制限部位を選んだ(図5)。キメラをpSP73にクローン化し、そしてCXCR4を単独でもしくはCD4とともに発現する標的細胞上で、本明細書に記述されるような融合アッセイで分析した。各キメラの結果は、CXCR4およびCD4双方を発現した標的細胞でのHXBc2 Env融合活性の融合活性のパーセントとして表す。CXCR4およびCD4が標的細胞上で共発現された場合に全部のキメラが機能的であったとは言え、HXBc2のものの約50%から約500%までの範囲にわたる融合活性を伴うかなりの量的差異が検出された(図6)。gp120全体およびTMを交換した相互キメラはCD4依存性であったが、とは言えHXBc2 TMをもつ8x gp120[8x(gp120)]の評価は、このEnvの乏しい全体的融合活性によりいくぶん限定された。注目すべきことに、8x TMを含有したキメラは、HXBc2、もしくはHXBc2 TMを含有したキメラより融合原性(fusogenic)であり、8xの外部ドメインもしくは未熟に短縮された細胞質の尾中の決定子がこれらのクローンの増大された融合原性に寄与していたことを示唆した。にもかかわらず、これらの知見は、CD4非依存性の決定子がgp120もしくはTMに完全に制限されなかったことを示唆した。
【0223】
8xの背景にHXBc2のgp120サブドメインを導入したキメラのなかで、個々にもしくは組み合わせでのいずれかでのV1/V2およびV3ループの置換は、CD4非依存性を除外することに失敗した(図6;キメラHX(V1/V2)、HX(V3)、HX(V1−V3)を参照されたい)。ケモカイン受容体特異性の決定子としてのこれらのループの重要性(Choら、1998、J.Virol.72:2509−2515;Choeら、1996、Cell 85:1135−1148;Cocchiら、1996、Nature Med.2:1244−1247;Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:11360−11365;RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7682−7686;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139)を考えるとこの知見は興味深かった。これらのキメラについては、8xに関する融合活性はCD陰性および陽性双方の細胞で低下した(80%)とは言え、CD4依存性の融合はHXBc2でみられるものよりなおより大きかった。対照的に、HXBc2 V4/C4を含有したHX(v4/C4)の融合活性はCD4陰性細胞で低下したが、しかしCD4+細胞で不変であった。興味深いことに、8xのV3およびV4/C4双方のドメインをHXBc2のもので置き換えた[HX(V3−C4)]場合、CD4非依存性の融合は完全に排除された一方、CD4の存在下での融合は影響を及ぼされなかった。
【0224】
8xのドメインをHXBc2の背景上に置いたキメラについて、gp120のどの単一の領域もHXBc2にCD4非依存性を賦与することが可能でなく、gp120およびTM双方中の決定子が必要とされるという上で示された証拠と矛盾しなかった(図6)。しかしながら、8xからのV4/C4およびTM双方のドメインを含有したHXBc2キメラ[8x(V4−TM)]は、CD依存性および非依存性双方の融合に対し高度に能力があった。8xおよびHXBc2に基づくキメラを用いたこれらの知見は、集合的に、8x gp120 V3、およびとりわけV4/C4ドメイン中の決定子が8xのCD4非依存性の表現型に寄与するが、しかし8x TMと会合される場合のみであることを示す。
【0225】
IIIBxに感染した細胞からのCD4依存性クローンの評価。
【0226】
CD4依存性のEnvを、IIIBxに感染したSupT1細胞からもまた生じさせた。S10と命名されたこのクローンは、CXCR4およびCD4を共発現したQT6細胞上での融合を媒介することが可能であったが、しかしCD4の非存在下で融合することが不可能であった(図7)。配列分析は、S10がHXBc2に関して8xと数個の突然変異を共有したことを立証した(gp120中で8個およびgp41中で3個)(図4)。加えて、S10は数個の独特の突然変異、すなわち、gp120中でC4中のG431EおよびV5中のS461N、ならびにTM中で、位置611および674の予測されたNに結合されるグリコシル化部位の喪失を包含する、外部ドメインおよび膜にわたるドメイン中の6個の付加的なアミノ酸変化を含有した(図4)。S10は、TMの細胞質の尾中に55ntの欠失もまた含有し、これは、8xに類似に、フレームシフト突然変異および未熟に短縮された細胞質の尾を生じさせる。この欠失はまた、N末端で核局在化シグナルを除外しかつRRE結合部位の前でタンパク質を短縮するフレームシフト突然変異を導入することにより、revの読取り枠も混乱させる(PollardとMalim、1998、Annu.Rev.Microbiol.52:491−532)。最後に、S10は、8x gp120(S143G、G167S、Q310HおよびI423V)ならびにTM(N651I)中に存在した数個の変化を欠いていた。S10がCD4+/CXCR4+標的細胞での融合アッセイで機能的であったとしても、このenvは、その非機能的Revタンパク質の結果としてありそうであるが、NL4−3にクローン化された場合に感染性のウイルスを生成させることが不可能であった。
【0227】
S10 Envは8xと数個の突然変異を共有したがしかし完全にCD4依存性であったため、この変化の決定子を同定するために8xとS10との間の一組のキメラを作成した。図7に示されるとおり、S10の背景上に8x V3およびV4/C4[8x(V3−C4)]もしくはV4/C4単独[8x(V4/C4)]を含有したキメラは若干のCD4非依存性を表した一方、8xの背景上の相互キメラ、[S10(V3−C4)]および[S10(V4/C4)]は、完全にCD4依存性であった。S10 V4/C4ドメインは唯一のG431E突然変異を含有したため、この変化がCD4非依存性に対する負の影響を有することができた可能性が考えられた。事実、GlyをS10のこの位置で回復させた場合(S10−E431G)、このクローンはCXCR4を発現する標的細胞上で限定された程度のCD4非依存性を表した。さらに、G431E突然変異を8xに導入した場合(8x−G431E)、このクローンは融合能力のあるままであったが、しかし完全にCD4依存性となった(図7)。従って、C4ドメイン内での電荷の変化は8xのCD4非依存性を排除するのに十分であり、そして、これらのデータは、CD4非依存性の表現型に決定的に重要であるとしてこの領域を巻き込んだ、上述された8x/HXBc2キメラを使用して得られたマッピングのデータをさらに支持する。
【0228】
CCR5向性のV3ループはケモカイン受容体の特異性を変えるが、しかしCD4非依存性を変えない。
【0229】
ケモカイン受容体の特異性の決定におけるV3ループの重要性、およびCD4非依存性の決定子がこのドメインの外側に配置されたという証拠を考え、8xの向性およびCD4非依存性を分離することができる程度を検査した。マクロファージ/CCR5向性の単離物HIV−1/BaLからのV3ループを含有したHXB2 gp120(HXB2−V3BaL)(Hwangら、1991、Science 253:71−74)を使用して、8xにBaL V3ループを導入した。生じるキメラ(8x−V3BaL)を、CD4の存在もしくは非存在下で、CXCR4もしくはCCR5を発現した標的細胞での融合アッセイにおいて、8x、HXBc2およびHXB2−V3BaLと比較した(図8)。本明細書に開示されるデータが立証するとおり、HXBc2およびHXB2−V3BaLは、それぞれCXCR4もしくはCCR5を発現する細胞上で融合を表し、そしてそれらの活性は厳格にCD4依存性であった。対照的に、8x−V3BaLキメラはCCR5向性およびCD4非依存性の双方であった。従って、8xのCD4非依存性の決定子は、ケモカイン受容体の向性を媒介するものと機能的に別個である。
【0230】
本明細書に開示されるデータは、CD4の非存在下でCXCR4を利用することができる、HIV−1/IIIBxと命名されたHIV−1/IIIBのCD4非依存性の変異体の派生および特徴づけを立証する。IIIBxの8x envクローンは、HIV−1プロウイルス中にクローン化される場合に、複製能力のあるCD4非依存性のウイルスを生成させることが可能であり、また、CD4の非存在下でCXCR4を発現するウズラ細胞での融合を媒介することができた。このクローンはまた、gp120の位置368(DE4結合部位の形成に決定的に重要であることが既に示された残基)(Kwongら、1998、Nature 393:648−659;Olshevskyら、1990、J.Virol.64:5701−5705)のAspの代わりにArgを用いた場合にも完全に機能的であった。8xの配列分析は、他のHIV−11/IIIBプロウイルスクローンにおいて記述されていない17個の突然変異、およびgp120上の5個のグリコシル化部位の顕著な正味の喪失を示した。8xと、関係するCD4依存性クローンHXBc2との間の相互キメラは、CD4非依存性の決定子が超可変V1/V2およびV3ループの外側に位置したことを示した。8xのV4/C4およびTM双方のドメインを含有したHXBc2キメラはCD4非依存性であった一方、いずれかのドメイン単独を含有したキメラはCD4依存性であった。加えて、gp120のC4ドメイン中に唯一のG431E突然変異を含有した、IIIBx遊走群からのCD4依存性クローンS10は、この突然変異を修正した場合にCD4非依存性となった。8xへのG431E突然変異の導入はこのEnvを完全にCD4依存性とし、この位置での電荷の変化がCXCR4のCD4非依存性(しかしCD4依存性でない)の利用を混乱させるのに十分であったことを示した。これらの知見は、集合的に、ケモカイン受容体結合部位がgp120コア上に存在すること、および、この領域中の突然変異は、TM中の変化と共同してHIV−1 EnvをCD4の非存在下で完全に機能的にすることができることを示す。
【0231】
HIV−1のV3ループは、CD4結合後のCCR5もしくはCXCR4のケモカイン受容体の特異性の主要な決定子であることが示されている(Choら、J.Virol.72:2509−2515;Choeら、1996、Cell 85:1135−1148;Cocchiら、1996、Nature Med.2:1244−1247;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139;Trkolaら、1998、J.Virol.72:1876−1885;Wuら、1996、Nature 384:179−183)。より最近、V1/V2領域もまた、適切なV3の情況において、CCR3、CCR2b、STRL33およびAPJを包含する付加的なケモカイン受容体の使用を媒介することが示され(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:11360−11365;RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:7682−7686)、V1/V2とV3との間の協同的相互作用がケモカイン受容体の認識に関与していることを示唆する。これらのループは、CD4結合後にコンホメーション変化を受けることが知られており(Jonesら、1998、J.Biol.Chem.273:404−409;Mooreら、1994、J.Virol.68:469−484;Wuら、1996、Nature 384:179−183;Wyattら、1992、J.Virol.66:6997−7004)、これは特定のケモカイン受容体との相互作用を助長することができる(Jonesら、1998、J.Biol.Chem.273:404−409;Wuら、1996、Nature 384:179−183;Wyattら、1992、J.Virol.66:6997−7004)。しかしながら、これらの知見は、V3それ自身がケモカイン受容体結合部位を含有することができることを示唆した一方、CCR5もしくはCXCR4向性のウイルスの間でのV3ループの顕著な遺伝子の多様性は、これらのループが共通の構造要素を含有すること、もしくはEnv上の他の領域もまたケモカイン受容体の利用に寄与することのいずれかを示す。最近、CCR5向性のHIV−1 gp120の突然変異誘発が、gp120コアの内側および外側のドメインを連結する架橋シートにより形成されるEnv上のまず確実なCCR5結合部位を同定した。この領域はV1/V2ループの基部とV3ループの基部との間に配置され、そしてCD4結合後に細胞膜に向けられると予測される(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。CCR5およびCXCR4向性のEnvの間でのこの領域中のアミノ酸の顕著な保存は、この部位が、複数のケモカイン受容体と相互作用することが可能な包括的なケモカイン受容体結合ドメインを表すことができることを示唆した。これらの知見は、特定のケモカイン受容体との最初の相互作用を助長しかつ融合が起こるためにその後必要とされるこの保存された結合部位を露出する、V1/V2およびV3ループの動きをCD4が誘導するというモデルと矛盾しない(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953;WyattとSodroski、1998、Science 280:1884−1888)。
【0232】
8xクローンのCD4非依存性の決定子はケモカイン受容体の特異性に必要とされる外側領域に位置したため、異なるV3が、そのCD4非依存性に影響を及ぼすことなく8xのケモカイン受容体の向性を変えることができるという可能性を検討した。顕著なことに、本明細書に開示されるデータは、CCR5向性のEnv(HIV−1BaL)からのV3ループを8x中に挿入した場合に、生じるキメラがCCR5を発現する細胞上でのCD4非依存性の融合を媒介することが可能であったことを立証する。CD4を伴うもしくは伴わない、CXCR4を発現する細胞上での融合は、このキメラで観察されなかった。対照的に、HXBc2の背景上でHIV−1/BaL V3ループを含有するキメラはCCR5を利用したが、しかし完全にCD4依存性であった。これらのデータは、ケモカイン受容体の特異性、および融合のためのその受容体の利用が、gp120の別個の領域により媒介されることを明瞭に示す。さらに、本明細書に開示されるデータは、V3上の特異性決定子がなお必要とされるとは言え、CD4非依存性のウイルス上で機能的にされるgp120コア上の一領域が、遺伝子的に互いに異なるケモカイン受容体を使用する融合を媒介することが可能であるという直接の証拠もまた提供する。
【0233】
上に示されたgp120上の架橋シートは、主としてC4ドメインおよびV1/V2の幹(stem)からのアミノ酸から構成される(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。この領域はまた、CD4結合により誘導されるgp120のエピトープの形成に寄与することも示されている(Kwongら、1998、Nature 393:648−659;Thaliら、1993、J.Virol.67:3978−3988)。興味深いことに、8x V4/C4ドメイン中の2個の突然変異(N386KおよびI423V)ならびにV3ループの基部近くの第三の突然変異(R298K)は、この領域にすぐに隣接する位置に位置する(図9A)。本明細書に開示されるデータが立証するとおり、HXBc2からの対応するV3およびV4/C4ドメインを包含しかつこれらの突然変異を欠いた8xキメラは、融合に対し高度に能力があったが、しかし完全にCD4依存性であった(図6)。理論により拘束されることを願わないが、推定のケモカイン受容体結合ドメインへのR298K、N386KおよびI423Vの顕著な近接は、これらの突然変異がこの部位を露出させ、そして/もしくはそれをウイルス結合の間にケモカイン受容体に提示するのを助けることを強く示唆する。さらに、本明細書の別の場所に開示されるデータ(実施例2、下)は、組換え8x gp120がCXCR4を発現する細胞にCD4に独立に結合することが可能であること、および、gp120のケモカイン受容体ドメイン内に部分的に含有されるCD4に誘導されるエピトープが、CD4結合の非存在下で安定に露出されることを立証する。加えて、S10および8x上のCD4非依存性を排除するのに十分であった、C4中のG431E突然変異は、gp120コアの結晶構造により、ケモカイン受容体結合部位に寄与するV1/V2の幹の基部の残基に並置されることが示されている(図9B)。理論により拘束されることを願わないが、この残基での負の電荷の獲得は、V1/V2ループの向きを変えかつ/もしくはgp120上のケモカイン受容体結合部位のコンホメーションに影響を及ぼすことができる。機構に関係なく、このケモカイン受容体結合部位中もしくはその周囲の突然変異は、CD4なしで機能する8x Envの能力に対し正もしくは負に影響する可能性があり、そしてCD4結合がケモカイン受容体の利用の全体的な効率および/もしくは親和力を向上させるという見方と矛盾しないことが明らかである。
【0234】
V4/C4ドメインはIIBxのCD4非依存性に明瞭に関連する一方、Envの他の領域もまたこの表現型に寄与することが明らかである。HXBc2の背景上に8x V4/C4含有したキメラは、それが8x TMもまた含有した場合にのみCD4非依存性であった。CD4非依存性のHIV−2/ROD−BのReevesらによる以前の研究(1996、J.Virol.71:1453−1465)は、gp120およびTMの双方における突然変異がこの表現型に対する最小の要件であった(すなわち、HIV−1の類似のV4ループにすぐ近接するLeuからPheへの突然変異、およびTMの外部ドメインの最初の7個の基の反復中の2個の突然変異)ことを立証した。この効果の根底にある機構は不明であるが、HIV−1 TMの領域が、CD4および/もしくはケモカイン受容体へのその結合に影響を及ぼすことができるgp120との多数の協同的相互作用に関係している(Caoら、1993、J.Virol.67:2747−2755;Chanら、1997、Cell 89:263−273;Matthewsら、1994、Immunol.Rev.140:93−104)。注目すべきことに、上述されたgp120のケモカイン受容体結合部位は、TMとの相互作用が生じることがありそうである、集成されたEnvオリゴマーの予測される三量体の軸近くに配置される(Haigwoodら、1992、J.Med.Primatol.21:82−90)。最近の実験で得られたデータは、ならびに8x V4/C4およびTM中の8xのフレームシフトのみを含有するHXBc2キメラが、8xのもののおよそ10%のレベルまでCD4非依存性の融合を媒介することが可能であったことを立証する。この小さなしかし再現可能な効果がトランスフェクションされた細胞上のEnvの表面発現の増大によるのかどうか(LaBrancheら、1995、J.Virol.69:5217−5227;Mulliganら、1992、J.Virol.66:3971−3975)、またはこの効果がTMの外部ドメイン(Ritterら、1993、Virology 197:255−264;Spiesら、1994、J.Virol.68:585−591)および/またはgp120(Caoら、1993、J.Virol.67:2747−2755;Chanら、1997、Cell 89:263−273;Matthewsら、1994、Immunol.Rev.140:93−104)中の構造の変化によるのかどうかは、決定されるべきままである。
【0235】
さらに、8xは、本明細書の別の場所で既に示されたようなN386Kを包含するgp120中の5個のグリコシル化部位を除外すると予測される突然変異を含有し、この突然変異は推定のケモカイン受容体結合部位に隣接して存する。最近、炭水化物が、SIV gp120の免疫原性の改変および中和エピトープの遮蔽に関係している(Reitterら、1998、Nature Med.4:679−684)。理論により束縛されることを願わないが、1個もしくはそれ以上のグリコシル化部位の喪失はケモカイン受容体結合部位の露出にもまた関与することができることが可能である。
【0236】
本明細書に開示されるデータは、CD4非依存性の決定子としてのIIIBx V4/C4およびTM中の突然変異を巻き込んだとは言え、gp120の多様な領域中の突然変異が他のHIV−1単離物のCD4非依存性と関連していることが注目されるべきである。C2、C3およびV3ドメイン中の突然変異の組み合わせによって、CXCR4を使用してHeLa細胞を感染させることができたHIV−1/NDKのCD4非依存性の変異体が記述されている(Dumonceauxら、1998、J.Virol.72:512−519)。Sodroskiらによる最近の知見は、HIV−1/ADAのCD4非依存性のCCR5向性の変異体の決定子が、V1/V2の幹の遠位領域中の点突然変異に位置したことを立証した。これらの遺伝子の差異にもかかわらず、CD4非依存性のウイルスは、この表現型の類似の構造的基礎を有することができた。この点に関して、CD4非依存性のHIV−1/NDKおよびHIV−1/ADA中の変化の少なくともいくつかはIIIBxに類似であり、それらがケモカイン受容体へのこの領域の提示に影響を及ぼすことができるgp120の架橋シート近くに配置されている。
【0237】
HIVは、活発な宿主免疫応答にもかかわらずウイルス複製を継続することを可能にする戦略を進化させている(Weiら、1995、Nature 373:117−122;Perelsonら、1996、Science 271:1582−1586)。抗体の中和は、典型的には、あったとしても感染の経過の後期に生じ、そして頻繁にgp120上の群特異的(group−specific)決定子よりはむしろ型特異的(type−specific)決定子に向けられる(WyattとSodroski、1998、Science 280:1884−1888;MooreとHo、1995、AIDS 9:S117−S136)。gp120コアの推定される結晶構造は、CD4結合ドメインおよびケモカイン受容体結合部位が乏しく接近可能であり、そして/もしくはEnvオリゴマー内に隠されることを示唆した(WyattとSodroski、1998、Science 280:1884−1888;Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。対照的に、gp120の露出された表面は、体液性免疫応答のための免疫学的おとりとして作用することができる超可変ドメインおよび炭水化物を含有する(StamatatosとCheng−Mayer、1998、J.Virol.72:7840−7845;Reitterら、1998、Nature Med.4:679−684;Caoら、1997、J.Virol.71:9808−9812)。これらの保存されかつ機能的に決定的に重要なドメインを露出させるためのアプローチは、質的に異なりかつおそらくより有効な免疫応答が生成されることを可能にすることができる。LaCasseらによる最近の研究(1999、Science 283:357−362)は、gp120およびgp41上の保存された中和エピトープが明らかに安定化された、融合で活性化された形態のEnvが、マウスにおいて強力かつ広範に交差中和する抗体応答を生じさせることが可能であったことを立証した。この点に関して、派生されるもしくは設計されるCD4非依存性のEnvは、生物学的に関係した情況でこれらのドメインを提示するための手段を提供することができる。本明細書の別の場所で開示されるデータは、8x gp120が、CD4に誘導されるエピトープの増大された露出(実施例2を参照されたい)およびCD4の非存在下でCXCR4に結合する能力を包含する、多数の新規の免疫学的および生化学的特性を表すことを立証する。HIV−1/IIIBxおよび付加的なCD4非依存性の単離物の今後の研究は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質の構造および機能に探りを入れ(probe)かつ治療の様式としての変えられた免疫原性の特徴をもつgp120分子の理にかなった設計につながる効果的なツールを提供するはずである。
実施例2:CD4非依存性のHIV−1エンベロープタンパク質中の補助受容体結合部位の安定な露出
本実施例に提示される実験は、以下のとおり要約することができる。
【0238】
実施例1に既に提示されたデータは、ケモカイン受容体CXCR4と直接相互作用してCD4の非存在下で細胞を感染させる、CD4非依存性のHIV−1ウイルス、HIV−1/IIIBxを開示する。本明細書に提示されるデータは、実施例1で既に開示された、8xと命名された、HIV−1/IIIBx遊走群からの新規のクローン化されたEnvを使用することにより、CD4非依存性の根底にある機構を開示する。8x Envクローンを使用して可溶性gp120を生じさせた。本明細書に開示されるデータは、8x gp120がCXCR4のみを発現する細胞に直接結合した一方、IIIB gp120の結合は可溶性CD4もまた必要としたことを立証する。さらに、光学的バイオセンサーを使用して、本明細書に開示されるデータは、モノクローナル抗体(MAb)17bおよび48dにより認識される、CD4に誘導される(CD4i)エピトープが、IIIB gp120上でよりも8x上でより露出されたことを立証する。CD4の非存在下での、CXCR4に直接結合しかつMAb 17bおよび48dと反応する8x gp120の能力は、17bエピトープと重なり合うgp120中の保存された補助受容体結合部位が露出される、部分的に誘導されたしかし安定な状態で8x gp120が存在することを示す。
【0239】
CCR5向性のHIV−1/BaL株からのV3ループでの、8xのCXCR4特異的V3ループの置換は、CD4非依存性のCCR5依存性のウイルス感染を媒介したEnvクローンをもたらした。従って、V3ループの置換はCD4の非存在下でCCR5に結合したgp120キメラ(8x−BaL)を生じさせた。かように、本明細書に開示されるデータは、部分的に誘導されたEnvタンパク質において、V3ループが補助受容体の使用の特異性を変えることができるが、しかしCD4非依存性を変えないことを立証する。さらに、本明細書に開示されるデータは、CD4非依存性およびケモカイン補助受容体結合が分離可能であることを示す。さらに、HIV−1/IIIBxは、CD4依存性のIIIB株がそうであったよりも、HIV陽性のヒト血清、多様な抗IIIB gp120ウサギ抗血清、およびCD4i MAbによる中和に対し、はるかにより感受性であった。抗体により中和に対する、HIV−1/IIIBxウイルスの増大された感受性、およびgp120の高度に保存された領域の安定な露出は、この機能上重要なドメインに対する抗体および小分子阻害剤の開発のための新規戦略を示唆する。
【0240】
本実施例に提示される実験で使用された材料および方法を今や記述する。
【0241】
プラスミド
ヒトCCR5、CXCR4およびCD4はpCDNA3ベクター(インヴィトロジェン(Invitrogen)、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して発現した。ルシフェラーゼ遺伝子は、pGEM2ベクター(プロメガ コープ(Promega Corp.)、ウィスコンシン州マディソン)中で、T7プロモーターの制御下に発現した。IIIBのHXBc2クローンからのEnvおよび8xは、双方ともpSP73ベクター(プロメガ コープ(Promega Corp.)、ウィスコンシン州マディソン)中で発現した。R5 HIV−1株BaLのV3ループを含有するEnv構築物を生成させるために、完全長のプロウイルスクローンpIIIB−V3BaLからのenv中のKpnI−BamHIフラグメントをpSP73−IIIBにクローン化した。BaLのV3ループを含有する8xの1バージョンを生じさせるため、pIIIB−V3BaLのStuI−Bsu361 envフラグメントをpSP73−8xにクローン化した。クイックチェンジ[Quickchange](商標)部位特異的突然変異誘発キット(ストラタジーン(Stratagene)、カリフォルニア州ラホヤ)を使用して、gp120/gp41接合部で各envプラスミドに終止コドンを挿入して、gp120産生のための構築物を作成した。全部の突然変異体およびクローンの正体をDNA配列決定により確認した。
【0242】
細胞−細胞融合アッセイ
このアッセイは別の場所でより詳細に記述されている。簡潔には、T25フラスコ中のエフェクターQT6細胞を、T7ポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルス(vTF1.1)に感染させ、そして30μgのenv構築物でトランスフェクションし、ここで発現はT7プロモーターにより駆動された。標的QT6細胞を24穴プレート中でプレート培養し、そして、細胞の各ウェルを、CMVプロモーターの制御下の0.5μgのCD4プラスミドおよび1.0μgの補助受容体プラスミド、ならびにT7プロモーターの制御下の1.5μgのルシフェラーゼレポータープラスミドでトランスフェクションした。一夜発現の後、エフェクター細胞を標的細胞に添加し、そして、混合後7.5時間の細胞ライセート中でルシフェラーゼ活性を定量した。
【0243】
タンパク質の産生および精製
293T細胞を、T225フラスコ中でvTF1.1に感染させ、そして、細胞をその後、200μgのgp120プラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクション後4時間に、細胞をリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)で洗浄し、そして血清を含まない培地中に24時間置いた。培地を収集し、0.1% TX−100の添加に先立ち遠心分離および0.2μm濾過により澄明にした。上清中のタンパク質を、ガランティス ナヴァリス(Galanthis Navalis)カラム(ベクター ラボラトリーズ(Vector Laboratories)、カリフォルニア州バーリンゲーム)に結合させ、メチル−α−D−マンノピラノシド(MES)緩衝液(20mM MES、pH7.0、0.13M NaCl、10mM CaCl2)で洗浄し、そして0.5Mα−メチルマンノシドを含有するMES緩衝液中に溶出した。溶出物を、付加的精製、洗浄、および50kDのタンパク質分子量カットオフを用いるアミコン(Amicon)限外濾過系を使用する濃縮にかけた。HPLC分析は、この様式で調製されたEnvが高度に純粋であったことを決定し、そして正確なタンパク質濃度をアミノ酸分析およびBCAアッセイにより測定した。
【0244】
細胞表面結合アッセイ
補助受容体へのgp120の結合は、Doranzら(1999、J.Virol.、73:2752−2761)により記述されたとおり測定した。簡潔には、およそ5μgの各gp120を、IIIB、8x、IIIB−V3BaLおよび8x−V3BaLについてそれぞれ12.3μCi/μg、7.15μCi/μg、47.3μCi/μgおよび22.0μCi/μgの比活性までヨードゲン(Iodogen)(ピアース(Pierce))を使用してヨウ素化した。1分あたり100,000カウント(CPM)を、総量で100μlの結合緩衝液(50mM Hepes pH7.4、5mM MgCl2、1mM CaCl2、5% BSA)中の14μgのDNAで前日にトランスフェクションされていた約0.5ないし約1.0×106個の293T細胞に添加した。示された場合に可溶性CD4(sCD4)を100nMで添加した。細胞を25℃で1時間インキュベートした。
【0245】
0.3%ポリエチレンイミン中に前浸積されたワットマン(Whatman)GF/Cフィルターを通して細胞を濾過すること、および4mlの洗浄緩衝液(50mM Hepes pH7.4、5mM MgCl2、1mM CaCl2、500mM NaCl)で2回洗浄することにより、結合されない放射活性を除去した。細胞の非存在下でフィルターに非特異的に結合した放射活性の量を、全部のデータ点から差し引いた。
【0246】
バイオセンサー実験
全部の実験は、25℃でバイアコア(BIACORE)2000(スウェーデン・ウプサラ)光学的バイオセンサーを使用して実施した。およそ200RUのsCD4、ならびに完全長のヒトMAb 17bおよび48dを、アミンカップリングにより研究等級のCM5チップに結合した。抗体もしくはsCD4を伴わない裸の(naked)センサー表面が、各結合相互作用の陰性対照として作用した。連続的に希釈していたEnvを、PBS+0.005%トゥイーン(Tween)20の運転緩衝液(running buffer)中の6種の異なる濃度(gp120について11nMないし585nM、gp120+sCD4について5nMないし91nM)で各センサー表面を横切って運転した(run)。可溶性CD4は、結合を測定する少なくとも30分前に8倍モル過剰でEnvに添加し、そしてセンサー表面に結合されたCD4へのEnvの結合を完全に除外した。結合および解離を、流れに依存しない結合のオン速度(on−rate)を与えた30μl/分の流速で、それぞれ300秒間測定した。センサー表面は、100μl/分で15秒間の10mM HClの2回の洗浄を使用することにより各結合反応の間に再生し、これは固定された表面の結合能力を低下させることなくシグナルを完全に基礎まで戻すことが見出された。陰性対照フローセルから得られたシグナルの減法により、各結合曲線を非特異的結合について補正した。会合および解離の動力学的定数を、最低5濃度の被検体の輸出された結合データの線形変換から生じさせた。得られた動力学的パラメータは、BIA Evaluation 3.1ソフトウェアを使用してデータを単純1:1ラングミュアー相互作用モデルに適合させることにより推定されたものと比較した。
【0247】
中和アッセイ
抗血清もしくはMAbによるウイルスの中和は、既に記述されたMAGIアッセイ(Chakerianら、1997、J.Virol.71:3932−3939)の改変物、もしくはConnorら(1995、Virology 206:935−944)により記述されたルシフェラーゼレポーターウイルス系を使用して実施した。簡潔には、1.25×105個のMAGI細胞を48穴プレート中でプレート培養し、そして細胞を接着させた。抗体の連続的希釈物と37℃で1時間前インキュベートしていたウイルスで細胞を感染させた。使用されたウイルスの量は、400〜800感染単位を含有するようにMAGIアッセイで既に決定された量であった。感染の24時間後にDP178阻害ペプチドを5μg/mlの最終濃度で添加してシンシチウムの形成を予防した。細胞培養物を別の48時間インキュベートし、固定しそして細胞をX−galで染色した。アルファイメージャー(AlphaImager)2000(アルファイノテック コーポレーション(AlphaInnotech Corporation)、カリフォルニア州サンリアンドロ)を使用して、青色の核を定量した。ルシフェラーゼレポーターウイルスの感染のためには、相対的光単位(RLU)により判断されるような等量のウイルスもまた、抗体の連続的希釈物とともに37℃で1時間インキュベートした。ウイルスを、96穴プレート中でGHOST−CCR5細胞に添加し、そして感染2日後に、細胞ライセートをルシフェラーゼ活性について測定した。
【0248】
本実施例に提示される実験の結果を今や記述する。
【0249】
CXCR4への8x gp120の直接結合
HIV−1 EnvへのCD4の結合は、その後のEnvと補助受容体の相互作用に必要とされるコンホメーション変化を誘導する。これらの変化は、補助受容体結合に関係しているgp120中の例外的に良好に保存されたドメインの増大された露出を包含することがありそうである(図12)。多くのSIVおよびHIV−2株は、CD4非依存性の様式でウイルス進入に補助受容体を利用することにより、この正常な進入過程を省くことができるが、とは言えそれらの効率はCD4が存在する場合に典型的に高められる。実施例1に既に提示されたデータは、CD4陰性、CXCR4陽性の細胞上でのHIV−1 IIIBの反復された継代によるCD4非依存性のHIV−1株の産生を開示する(実施例1、上記)。生じるウイルス株(HIV−1/IIIBx)は、広範な細胞型を感染させるのに、CD4の非存在下でCXCR4を利用することができる(実施例1、上記)。8xと命名された、HIV−1/IIIBxに慢性に感染した細胞由来のEnvクローンはこの表現型を維持する。従って、8x Envを発現する細胞は、CD4陰性、CXCR4陽性の細胞との融合を媒介した。CD4の存在下で、融合の効率はおよそ3倍高められた(図10Aおよび10B)。8xにより媒介される融合はCXCR4に厳格に依存し、そして他の補助受容体が発現される場合に観察されない(図10Aおよび10B)。CD4は、それが補助受容体と相互作用することを可能にするEnvのコンホメーション変化を誘導することが既知であるため、また、8x EnvはCD4の非存在下でCXCR4依存性の融合を媒介することができるため、8x Envタンパク質が部分的に誘導された状態で存在してそれによりそれがCD4非依存性の様式でCXCR4を結合することを可能にするかどうかを決定するための実験を実施した。
【0250】
8x gp120のコンホメーションの差異を評価するために、CXCR4に直接に結合する精製された8x gp120の能力を検査した。この点に関して、Doranzら(1999、J.Virol.73:2752−2761)により記述されかつ本明細書に示されるような細胞表面結合アッセイを使用し、ここで、可溶性CD4(sCD4)との前インキュベーションを伴うもしくは伴わない、放射ヨウ素化されたgp120を、所望の補助受容体を発現する細胞に添加した。細胞を洗浄し、そして結合された放射標識されたgp120の量を測定した。本明細書に開示されるデータは、sCD4と複合体形成されたIIIB gp120がCXCR4を発現する細胞に結合したが、しかし他の補助受容体を発現する細胞に結合しなかったことを立証する(図11)。対照的に、8x gp120は、sCD4の存在もしくは非存在下で同等に良好に、CXCR4を発現する細胞に結合した(図11)。ベクター単独もしくはCCR5を発現する細胞への結合は観察されなかった。これらの結果は、親IIIB Envと異なり、8x gp120は、それがCD4の非存在下でCXCR4と直接相互作用することを可能にする安定なコンホメーションで存在することを立証する。
【0251】
補助受容体結合部位の露出
理論により拘束されることを願わないが、CXCR4に結合する8x gp120の能力は、CXCR4と相互作用するgp120上の部位の増大された露出の結果であることができる。これらの部位の増大された露出が存在したかどうかを決定するために、CD4i MAb 17bおよび48dと相互作用するIIIBおよび8x gp120の能力を検査した。17bのFabフラグメントをgp120およびsCD4と共結晶化し(Kwongら、1998、Nature 393:648−659)、そして開示されるデータは、17bとgp120の相互作用に関与する接触残基の多くが補助受容体結合にもまた重要であることを立証する(図12)。従って、17bを、Rizzutoら(1998、Science 280:1949−1953)により定義される保存された補助受容体結合部位の露出を測定するための免疫学的代理物として使用することができる。
【0252】
sCD4との前インキュベートを伴うもしくは伴わない、IIIBおよび8x gp120のCD4i MAb 17bおよび48dへの結合を、本明細書の別の場所に記述されるような光学的バイオセンサーアッセイ法を使用して測定した(実施例2の材料および方法を参照されたい)。このアプローチは、タンパク質−タンパク質相互作用を実時間で測定することを可能にし、そしてオン速度およびオフ速度、ならびに親和性定数を生じさせるのに使用することができる。所望のMAbをセンサー表面に共有結合し、その後gp120もしくはgp120−sCD4複合体を適用した。典型的なセンサー図(sensorgram)を図13に示す。期待されたとおり、HIV−1/IIIB gp120がMAb 17bに結合した速度は、sCD4とEnvの前インキュベーションにより顕著に増大した。17bに結合されれば、IIIB gp120およびgp120−sCD4複合体の双方が、無視できるオフ速度を表した。IIIB gp120に対照的に、8x gp120はsCD4なしで17bに効率的に結合し、IIIB gp120のものより大きな桁であったオン速度を表した。sCD4の添加はこのオン速度を2倍高めた。sCD4と複合体形成された場合に、8xおよびIIIB双方のgp120は同一のオン速度を表した(表1)。興味深いことに、17bに結合されれば、8x gp120はIIIB gp120が表したより大きなオフ速度を表した。この効果は、アミノ酸位置423(17bの接触部位であることが既に示されている残基(Kwongら、上記))での8x gp120中のIleからValへの突然変異によることができる(図12)。
【0253】
【表1】
【0254】
表1に開示されるデータは、本明細書の別の場所に既に記述されたとおり実施されたバイオセンサー実験で、CD4i抗体へのgp120の結合から生じられる見かけの動力学的定数および平衡定数を立証する。簡潔には、CD4i抗体17bおよび48dをバイオセンサー表面に結合し、そして8xおよびHXB gp120の連続的希釈物の結合および解離の双方を測定した。飽和量のsCD4と前混合していた双方のEnvの連続的希釈物の結合もまた測定した。全部の結合は25℃で実施し、そしてサンプルのセンサー図を図13に示す。データの直線化されたプロットの傾きの最も適合された値(r2≧0.98)を報告する。単純1:1ラングミュアー相互作用モデルを適合させることにより推定されたパラメータは、包括的に、報告された値の15%内であった。斜体の値は、それらがバイオセンサーの検出限界にあったくらい遅かった解離速度を表し、これらの値から生じられる親和性定数をより少なく正確にする。
【0255】
異なるCD4i MAb、48dの分析は、17bに類似であった結果を生じた(表1)。最後に、IIIBおよび8x gp120分子は、同一の様式で、センサー表面に結合されたCD4と相互作用した。従って、それをCD4非依存性にする8x中の突然変異はCD4結合にはっきりと感知できる程度まで影響を及ぼさなかったが、しかし17bエピトープのより大きな露出(保存された補助受容体結合部位と重なり合う)をもたらした。
【0256】
補助受容体の選択およびCD4非依存性の分離
gp120の保存された補助受容体結合部位ならびにV1/V2およびV3ループの双方が、Envと補助受容体の相互作用で重要な役割を担っている。入手可能な証拠は、V3ループ、およびより少ない程度までV1/V2領域が、与えられたEnvにより使用される補助受容体の数および型を支配することを示す(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365;RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7682−7686;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139;Cocchiら、1996、Nature Med.2:1244−1247;Choら、1998、J.Virol.72:2509−2515;Choeら、1996、Cell 85:1135−1148)。対照的に、保存された補助受容体結合部位中の突然変異はEnvと補助受容体の結合に影響を及ぼすことができる(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)が、しかし、この領域が補助受容体の特異性においてもまたある役割を担っているかどうかは明らかでない。CXCR4と直接相互作用する8x gp120の能力は、補助受容体の選択、および補助受容体結合部位を露出させるEnv中の変化が分離可能であるかどうかを決定する機会を提供した。以前の研究は、HIV−1 IIIB背景へのR5 V3ループ(HIV−1 BaLから)の導入が、ウイルス感染にCCR5を使用した(しかしCXCR4でない)Envタンパク質(IIIB−BaL)をもたらしたことを立証した(RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7682−7686;Rossら、1997、J.Virol.72:1918−1924)。実施例1で本明細書に既に開示されたデータは、細胞−細胞融合アッセイを使用して、R5 Env(BaL)からのV3ループでの8x Envのものの置換は、CCR5陽性、CD4陰性の細胞との融合を媒介することが可能であったタンパク質(8x−BaL)を生じさせたことを立証する。8x−BaLがCD4非依存性のウイルス感染もまた媒介することができたかどうかを決定するため、IIIB−V3BaLもしくは8x−V3BaLいずれかのEnvタンパク質を担持するConnorら(1995、Virology 206:935−944)に記述されたようなルシフェラーゼレポーターウイルスを生じさせた。8x−V3BaL Envを担持するビリオンは、CD4非依存性、CCR5依存性のウイルス感染を媒介した(図10B)。融合アッセイにおいて8x Envで観察されたとおり、CD4の存在はウイルス進入の効率を増大させた。CD4の存在もしくは非存在下で、IIIB−BaLもしくは8x−BaLのいずれもCXCR4を使用しなかった。また、IIIB−BaLおよび8x−BaL gp120分子が産生され、そして、本明細書で開示されるデータは、IIIB−BaL gp120がCD4依存性の様式でCCR5に結合した一方、8x−BaLはCD4に依存せずにCCR5に結合したことを立証する。いずれのタンパク質も、検査されたいかなる条件下でもCXCR4に結合しなかった。従って、V3ループ中の変化はどの補助受容体が使用されたかに影響を及ぼしたが、しかしCD4非依存性に影響しなかった。
【0257】
HIV−1/IIIBxの中和
Envと補助受容体の相互作用を封鎖する抗体はHIV−1を中和することができる(Wuら、1996、Nature 384:179−183;Trkolaら、1996、Nature 384:184−187)。HIV−1/IIIBx gp120中の補助受容体結合部位の露出された性質は、従って、このウイルスを抗体に媒介される中和に対しより感受性にすると期待することができる。V1/V2領域中の改変を伴う数種のSIVおよびHIV−1株が、おそらく保存された決定子の増大された露出により、中和感受性であることが示されている(StamatatosとCheng−Mayer、1998、J.Virol.72:7840−7845;Reitterら、1998、Nature Med.4:679−684)。従って、HIV陽性のヒト血清による中和、およびIIIBもしくは8xいずれかのgp120で免疫化されたウサギからの血清に対するHIV−1/IIIBおよびHIV−1/IIIBxの相対的感受性を比較し、そして結果を表2に示す。
【0258】
【表2】
【0259】
表2に開示されるデータは、sMAGI細胞を同等量のHIV−1/IIIBおよびHIV−1/IIIBxに感染させることにより得た。感染は、Chackerianら(1997、J.Virol.71:3932−3939)により既に記述されたとおり感染後72時間に決定した。MAb 17bおよび48dについて、IIIB−BaLもしくは8x−BaL Envを担持する同等量のルシフェラーゼレポーターウイルスを使用してGHOST−CCR5細胞を感染させ、これを感染48時間後に溶解した。全部の感染について、ウイルス、ならびにMAb、ヒト血清およびウサギ血清の連続的希釈物を、標的細胞への添加前に1時間混合した。入力ウイルス(input virus)の50%および90%を中和するのに必要とされる血清もしくは抗体の濃度を示す。MAb 48dは試験されたいかなる条件下でもIIIB−BaLを中和せず、そして8x−BaLの88%の中和のみが200ng/ml(*により示されるような)の濃度でこのMAbにより達成された。MAb 50.1はWhite−Scharfら(1993、Virology 192:197−206)により記述されるようなBaL V3ループに対し向けられる。
【0260】
本明細書に開示されるデータは、HIV−1/IIIBxが、多くの場合で1対数もしくはそれ以上、親HIV−1/IIIBよりも中和に対し均一により感受性であったことを立証する(表2)。HIV−1陽性のヒト血清、IIIB gp120に対し生じられたウサギ血清、および8x gp120に対し生じられたウサギ血清は、全部、HIV−1/IIIBよりはるかにより効率的にHIV−1/IIIBxを中和した。加えて、本明細書に開示されるデータは、8x−BaL Envを含有するビリオンが、IIIB−BaL Envを含有するものよりも、CD4i MAb 17bおよび48dによる中和に対しずっとより感受性であったが、しかし8x−BaL EnvビリオンはこれらのウイルスのV3ループを認識する抗体による中和に対し増大された感受性を立証しなかったことを立証する(表2)。従って、理論により拘束されることを願わないが、本明細書に開示されるデータは、補助受容体結合部位の増大された露出、ならびにCD4iエピトープの増大された露出が、抗体に誘導される中和に対するHIV−1/IIIBxの増大された感受性の原因であることがありそうであることを立証する。
【0261】
従来技術は、受容体結合が、その膜融合の潜在能力を活性化するEnvのコンホメーション変化を誘導することを教示する。CD4への結合は、Envが適切な補助受容体(通常はCCR5もしくはCXCR4)と相互作用することを可能にし(Wuら、1996、Nature 384:179−183;Trkolaら、1996、Nature 384:184−187;Laphamら、1996、Science 274:602−605;Hillら、1997、J.Virol.71:6296−6304)、これは最終的に膜融合およびウイルス進入につながるEnvの付加的なコンホメーション変化をもたらすと考えられる。融合はウイルス感染で決定的に重要な一段階であり、そしてこの過程につながるEnvの構造の中間体を理解することは、新規の抗ウイルス戦略の開発を示唆することができる。事実、膜融合反応のペプチド阻害剤での早期の臨床試験は、ウイルス負荷のかなりの低下を示している(Kilbyら、1998、Nature Med.4:1302−1307)。
【0262】
ウイルス補助受容体の発見、およびgp120コアフラグメントの最近解明された結晶構造は、ウイルス進入過程のより大きな理解を提供し、また、薬理学的もしくは免疫学的介入のための新たな潜在的標的を同定した(Kwongら、1998、Nature 393:648−659;Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953;Wyattら、1998、Nature 393:705−710)。Envの場合には、gp120中の例外的に良好に保存された領域がCCR5結合に関係している(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)。gp120の内側ドメインと外側ドメインとの間の架橋シート中に配置されるこの領域は、V3ループの基部とV1/V2領域との間に存する(図12)。これらの可変領域の位置を変えることが知られている(Wyattら、1995、J.Virol.69:5723−5733)CD4への結合は、この高度に保存された部位の露出および/もしくは形成につながることができる。17bのような中和抗体は、この領域と重なり合うエピトープに結合し(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953;Wyattら、1998、Nature 393:705−710)、こうしてこのドメインの露出のための免疫学的代理物として作用し、かつ、適正に提示される場合はこの領域が広範に交差反応性の中和抗体を導き出すことができることを示唆する。しかしながら、本発明の前には、gp120の補助受容体結合領域に対する免疫応答を生じさせるような方法で、この領域を免疫系に提示する方法が存在しなかった。
【0263】
CCR5もしくはCXCR4と直接相互作用して細胞を感染させることにより正常なウイルス進入過程を迂回する、多数のHIV−1、HIV−2およびSIVウイルス株が記述されている(実施例1;Edingerら、1997、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:14742−14747;Endresら、1996、Cell 87:745−756)。CD4非依存性のウイルスはウイルスの向性および病因に影響することができる一方、それらはまたウイルス進入経路を詳細に分析するための有用なツールとしても作用する。本明細書に開示されるデータは、本明細書で開示されるCD4非依存性のHIV−1 Envは安定な部分的に誘導された状態で存在し、ここでは保存された補助受容体結合部位が十分に露出されていることを示す、2方向の証拠を立証する。第一に、8x gp120はCXCR4に直接結合した一方、親IIIB gp120はCD4依存性の様式でCXCR4を結合した。第二に、8x gp120は、親のCD4依存性のタンパク質が結合したよりもずっとより迅速に2種のCD4i MAbに結合した。しかしながら、より迅速なオフ速度の結果として、CD4i MAbに対する8x gp120の全体的な親和性はHIV−1 IIIB gp120のものに類似であり、タンパク質−タンパク質相互作用における重要な差異が、光学的バイオセンサーの使用により提供される実時間分析によりどのように示されることができるかの目立つ例を提供した。IIIBに関して8xにより表されるより迅速なオフ速度は、I423V(17bの接触部位として作用する残基)を包含する補助受容体結合部位の近傍の8xタンパク質中の多数のアミノ酸変化によることができる(Kwongら、1998、Nature 393:648−659)。
【0264】
HIV−1の向性は、大部分で、補助受容体の選択により支配される。CCR5、CXCR4もしくは双方を利用するウイルスの能力は、それが進入することができるCD4陽性の細胞の型を主に命令する。gp120中のV3ループは補助受容体の選択で決定的に重要な役割を担っており、V1/V2領域はより従属的な役割を演じている(Hoffmanら、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:11360−11365;RossとCullen、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7682−7686;Speckら、1997、J.Virol.71:7136−7139;Cocchiら、1996、Nature Med.2:1244−1247;Choら、1998、J.Virol.72:2509−2515;Choeら、1996、Cell 85:1135−1148)。本明細書に開示されるデータは、8x Envの補助受容体の選択およびCD4非依存性の根底にある決定子が分離可能であることを立証する。従って、R5 EnvからのV3ループを含有する8x EnvはそのCD4非依存性の表現型を維持するが、しかし、今や、細胞−細胞融合およびウイルス感染にCXCR4よりはむしろCCR5を使用する。さらに、本明細書に開示されるデータは、8x−BaL gp120がCD4の非存在下でCCR5を発現する細胞に結合することが可能であることを立証する。これらのデータは、補助受容体の選択およびケモカイン受容体のCD4非依存性の使用が分離可能であることを初めて明瞭に立証する。これらのデータは、理論により拘束されることを願わず、補助受容体結合領域が、会合されたV3ループの性質に依存して、CXCR4およびCCR5の双方と相互作用することができることを示唆する(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1053)。従って、本明細書に開示されるHIV−1変異体の情況において、V3ループは部分的に誘導されたEnvでの補助受容体の選択に同様に影響を及ぼすことができる。本発明の開示は、補助受容体の相互作用において可変領域および保存された結合部位が担うそれぞれの役割の解明、ならびにそれぞれが相互作用するCCR5およびCXCR4中のドメインの同定を助長することができる。
【0265】
HIV−1/IIIBx遊走群および8x分子クローンのとりわけ目立つ特徴は、抗体による中和に対するそれらの感受性であった。HIV−1/IIIBxは、HIV陽性のヒト血清による中和、ならびにIIIB gp120もしくは8x gp120のいずれかに対して生じられたウサギ血清に対しおよそ10倍より感受性であった。理論により拘束されることを願わないが、抗体に媒介される中和に対するHIV−1/IIIBxの増大された感受性は、この部分的に誘導されたEnv中の1種もしくはそれ以上の中和決定子が、親のCD4依存性のEnvにおけるよりも抗体により一般的に接近可能であることを示唆する。保存された補助受容体結合部位は、8x Envに直接結合しかつ8x−BaL Envに偽型分類される(pseudotyped)ビリオンを効率的に中和するCD4i MAbの能力により示されるとおり、この表現型の原因であることができる標的でありそうである。加えて、本明細書の実施例1で開示されたデータにより立証されるとおり、8x Envは親IIIBに関して5個のグリコシル化部位の顕著な喪失もまた表し、炭水化物の喪失がこの領域の露出である役割を担うことができるという可能性を生じる。CD4i MAbによる8x−BaLの増大された中和にもかかわらず、補助受容体結合部位の増大された露出は、V3ループに対し向けられたMAbに対する8x−BaLの増大された感受性につながらなかった(表2)。V1/V2領域中のグリコシル化部位を欠くSIVmac239、ならびにV1中に1個の欠失を含有するHIV−1 SF162株を包含する、数種の他の中和感受性のウイルスが最近、記述されている(StamatatosとCheng−Mayer、1998、J.Virol.72:7840−7845)。本発明は、V1/V2の幹に隣接する補助受容体結合部位がこれらのウイルスで同様に露出されるかどうかを決定するための研究を助長することができる。
【0266】
組換えgp120での免疫感作は広範に交差反応性の中和抗体を生じさせることに典型的に失敗することを、多数の研究が示しているが、それでもなお、こうした抗体がウイルス感染の結果として若干の個体で生じられることが明らかである(BurtonとMotefiori、1997、AIDS 11(Supp.A):S87−S98)。理論により拘束されることを願わないが、株特異的中和のみがgp120による免疫感作後に観察されたかもしれない。なぜなら、Envの保存された領域は、CD4結合の前にCD4依存性のgp120中に隠されているからである。本明細書に開示されるデータは、gp120がケモカイン受容体タンパク質に結合することができる前にCD4への最初の結合をもはや必要としない、部分的に誘導された形態のgp120からCD4非依存性が生じる場合には、高度に保存されたケモカイン受容体結合部位の露出がウイルスを中和に対しより感受性にすることを示唆する。より重要なことに、本明細書に開示されるデータは、部分的に誘導され従ってそれ以外は隠されたケモカイン受容体結合部位を安定に露出させるEnvでの免疫感作は、この領域に対し向けられる広範に交差反応性の中和抗体のより効率的な生成をもたらすことができることを示唆する示す。これが起こるためには、おそらく、この領域への接近が高められる誘導されたコンホメーションをCD4結合が誘導した後に、本来のCD4依存性のEnvタンパク質中の補助受容体結合部位に接近することができる抗体が生じられなければならない。EnvをCD4非依存性にしかつこの領域の露出に影響する決定子の同定は、中和抗体を導き出すこの部位の潜在能力を系統的に取り扱うことを可能にすることができる。補助受容体結合部位の露出はCD4非依存性のEnvの重要な一成分であることができる一方、Env中の他の変化もまたCD4非依存性の様式で細胞を感染させる能力に影響することがありそうであることに注目することが重要である(実施例1)。
【0267】
加えて、分子レベルでケモカイン受容体結合部位の決定子(1個もしくは複数)を検査しかつ位置づける能力は、gp120/ケモカイン受容体結合の小分子阻害剤の開発を助長することができる。
【0268】
該用語が本明細書で使用されるところの「小分子」は、ケモカイン受容体タンパク質へのgp120の結合を阻害することが可能でありかつ大きさが約1kDa未満である、限定されるものでないがペプチド模倣物およびALX40−4C(Doranzら、1997、J.Exp.med.186:1395−1400)のような核酸およびポリペプチドを包含する化合物(合成であろうと天然に存在しようと)を意味する。
【0269】
従って、本明細書に開示されるデータは、限定されるものでないが抗体に基づく様式を挙げることができる有効な抗ウイルス治療薬の開発において重要な意味を有する。従って、本発明は、gp120とケモカイン受容体タンパク質の相互作用の阻害剤のような化合物の広範な一分類の開発を包含すると解釈されるべきである。
【0270】
さらに、補助受容体結合部位を安定に露出させることができることは、ウイルスの進入に対する意味を有することができる。理論により拘束されることを願わないが、CD4結合後の補助受容体結合部位の露出および/もしくは形成は、比較的不安定であるEnvのコンホメーションをもたらす可能性があり、短い時間の期間内に補助受容体との相互作用を必要とすることが想像できる。例えば、酸性のpHによるセムリキ森林ウイルスのスパイクの糖タンパク質のコンホメーション変化の誘導は、それが数分以内にその脂質補助受容体と相互作用することができない限り、該タンパク質の膜融合の潜在能力の迅速な不活性化につながる(Kielian、1995、Advances in Virus Res.45:113−151)。しかしながら、部分的に誘導されたしかし安定な状態で存在する8x Envタンパク質は、補助受容体結合部位の露出が寿命の長い誘導されたEnvのコンホメーションと適合性であることを示唆する。従って、補助受容体結合は、この事象を可能にするCD4により誘導されるコンホメーション変化のずっと後に発生する可能性があり、おそらく十分なレベルのCD4が存在する場合に非常に低レベルの補助受容体を発現する細胞を感染させるHIV−1の能力の原因である(Plattら、1998、J.Virol.72:2855−2864;Kozakら、1997、J.Virol.71:873−882)。この発見は、HIV−1とケモカイン受容体の相互作用の阻害に基づく抗ウイルス治療薬の開発における本発明の潜在能力をさらに強調する。なぜなら、誘導されたコンホメーションは、潜在的に、必要な決定子を封鎖する化合物が宿主細胞の受容体へのウイルス結合の阻害を達成するのに十分長く存在することができるからである。
【0271】
結論として、本明細書に開示されるデータは、8x Envタンパク質のCD4非依存性の表現型が補助受容体結合部位の安定な露出と関連していることを立証する。従って、このタンパク質は、通常の融合過程の構造の中間体を表すことがありそうであり、そして、膜融合につながるコンホメーション変化に影響する構造パラメータを検討するのに使用することができる。重要なことに、この安定に露出されたドメインの高度に保存された性質、および中和抗体をそれに対して向けることができるという事実は、適正に提示される場合にHIV−1に対する広範に交差反応性の中和抗体を導き出すのにこのドメインを使用することができるという可能性を生じる。
【0272】
本明細書で引用されるそれぞれのおよびすべての特許、特許出願ならびに刊行物の開示は、これによりそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。
【0273】
本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形物を、本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により工夫することができることが明らかである。付属として付けられる請求の範囲は、全部のこうした態様および同等の変形物を包含するよう解釈されるよう意図している。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
発明にかかる、HIV−1/IIIBもしくはHIV−1/IIIBxによるCD4陽性およびCD4陰性のT細胞におけるウイルス複製を描く、2図を含んで成るグラフである。CD4陰性のBC7細胞(上図)およびSupT1 CD4陽性細胞(下図)に、等量のHIV−1/IIIB(白菱形)もしくはHIV−1/IIIBx(黒丸)を接種し、そしてウイルス複製を培養物上清中の逆転写酵素(RT)活性により測定した。
【図1B】
発明にかかる、抗CXCR4抗体(12G5)によるHIV−1/IIIBx複製の阻害を描くグラフである。CD4陰性のBC7細胞に、抗CXCR4抗体12G5の非存在(白棒)または存在(5μg/ml(斜線をつけられた棒)もしくは20μg/ml(黒棒))下にHIV−1/IIIBxを接種し、そして逆転写酵素(RT)活性を示された時点で測定した。
【図1C】
発明にかかる、CXCR4を発現するマウス細胞でHIV−1/IIIBxにより誘導される細胞融合を描く、2図を含んで成る像である。HIV−1/IIIBxに感染したBC7細胞を、CXCR4を発現しないマウス3T3細胞(3T3、左図)もしくはヒトCXCR4を発現する3T3細胞(3T3/CXCR4、右図)と24時間共培養し、そしてその後、Endresら(1996、Cell 87:745−756)に記述されるとおりシンシチウム形成について細胞を染色した。
【図2】
発明にかかる、IIIBx env遺伝子の相対的光単位(RLU)で表される融合活性を描くグラフである。示されたenv遺伝子をpSP73にクローン化し、QT6細胞にトランスフェクションし、そして、Ruckerら(1997、Methods Enzymol.288:118−133)に記述されるとおりかつ本明細書の別の場所に記述されるとおり、CD4およびCXCR4、CXCR4単独、もしくはCD4単独を発現するQT6細胞上での融合アッセイで遺伝子を評価した。結果は、CXCR4+/CD4+細胞上での8xの活性に対して正規化されたRLUの平均+SEMとして表す。Olshevskyら(1990、J.Virol.64:5701−5705)に記述されるような、CD4結合部位を除去するD368R突然変異を含有する8xおよびHXBc2 Envの融合活性もまた示す。
【図3A】
発明にかかる、HIV−1/IIIBx env遺伝子の融合活性を立証するグラフである。8x envをpNL4−3に挿入し、そしてBC7細胞のトランスフェクション後にウイルスストックを生成させた。等量の生じるウイルス(NL43/8xと呼称される)およびHIV−1/IIIBをSupT1およびBC7細胞に接種し、そして時間にわたってRTレベルをモニターした。
【図3B】
発明にかかる、多様なウイルスのTMポリペプチドの大きさの評価を描くウェスタンブロットの像である。HIV−1/IIIBに感染したSupT1細胞(レーン1)、IIIBxに感染したBC7細胞(レーン2)およびNL43/8xに感染したBC7細胞からのウイルスライセートを、抗TMマウスモノクローナル抗体D12を使用するウェスタンブロットにより評価した。配列分析(図4)と矛盾せず、IIIBxおよびNL43/8x双方が短縮されたTMタンパク質を表した。
【図4】
発明にかかる、IIIBx envクローンのアミノ酸配列分析を描く図である。IIIBx envクローン8x(配列番号3)およびS10(配列番号12)の配列分析を、HXBc2(配列番号11)のものと比較する。影を付けられた領域は、HIV−1/IIIBからの他のクローン中でもまた見出される突然変異を示す。予測されるNに結合されるグリコシル化部位は、アミノ酸位置(アミノ酸は一文字記号を使用して呼称する)の直接上に、影を付けられた灰色の丸の記号により示す。可変ループ、gp120/gp41切断部位およびTMの膜にわたるドメイン(msd)の位置もまたHXBc2のアミノ酸配列の上に示す。8xの配列はアミノ酸位置706にフレームシフト突然変異を含有し、これはHXBc2に比較して未熟に短縮された細胞質の尾をもたらす。S10は50ヌクレオチドの欠失を含有し、これもまたフレームシフトおよび未熟に短縮された細胞質の尾につながる。図4において、破線はHXBc2の対応するアミノ酸残基に同一であるアミノ酸残基を示す。
【図5】
発明にかかる、融合アッセイにおけるキメラEnvタンパク質の評価を描く図である。図は、8x、S10、HXBc2、および図の上に示される示された制限部位を使用して構築されたキメラからのenv遺伝子を描く。8x中に存在する突然変異は上図の上に示す。キメラをpSP73にクローン化し、そして下の図6に記述されるような細胞融合アッセイで評価した。
【図6】
発明にかかる、融合アッセイにおけるキメラEnvタンパク質の評価を描くグラフである。上の図5に示される、HXBc2と8xとの間で構築されたキメラEnvタンパク質を、CXCR4単独、CXCR4およびCD4、もしくはCD4単独を発現するQT6標的細胞での融合アッセイで評価した。結果は、CXCR4+/CD4+細胞上でのHXBc2のものに関するルシフェラーゼ活性(すなわち相対的ルシフェラーゼ単位、RLU)として表す。棒は3回の実験の平均のRLU+SEMを示す。
【図7】
発明にかかる、IIIBxのCD4依存性クローンの決定子のマッピングを描くグラフである。IIIBxのCD4依存性S10クローン、および上の図5で示されるようなS10/8xキメラの融合活性を示す。加えて、C4ドメイン中のG431E突然変異を修正した(S10−E431G)S10 Env、およびこの突然変異を含有した8x Env(8x−G431E)の活性を示す。結果は、CXCR4およびCD4を共発現した標的細胞上での8xルシフェラーゼ活性のパーセントとして表す。
【図8】
発明にかかる、CCR5向性のEnv、HIV−1/BaLからのV3ループを含有するEnvタンパク質のCCR5向性を描くグラフである。CD4依存性であるHXB2(IIIB遊走群由来の分子クローン)のEnv、およびHIV−1/BaLからのV3ループを含有する8x Envタンパク質を構築し、そしてそれらの融合活性を、CCR5もしくはCXCR4±CD4を発現した標的細胞上で親HBXc2 Envもしくは8x Envと比較した。融合活性は、CXCR4およびCD4双方を発現した標的細胞上でのHXBc2のルシフェラーゼ活性のパーセントとして表す。棒は平均+SEMを示す。
【図9A】
発明にかかる、HIV−1/HXB2のgp120コア結晶構造を描きかつgp120結晶構造上でのHIV−1/IIIBx突然変異の位置を立証する空間実体模型の像である。コア結晶構造は、CD4のリボン図(Kwongら、1998、Nature 393:648−659)(像の下右四分円中に示される)とともに白色で描く。突然変異がCCR5へのgp120の結合の50%の減少もしくは増大を生じさせたアミノ酸部位(Rizzutoら、1998、Science 280:1949−1953)を赤色で示す。理論により拘束されることを願わないが、gp120のコア上にマッピングすることができた8x中の6個の突然変異のうち、3個(淡青色で示される)がこの推定のケモカイン受容体結合部位にすぐ隣接して配置されている。
【図9B】
発明にかかる、G431E突然変異の位置を示すために上の図9Aに示されたものとわずかに異なる向きで描かれた、gp120/CD4複合体のリボン図の像である。これは、8xクローンのCD4非依存性の融合を排除するのに十分であったが、しかしCD4依存性の融合はそうでなかった。
【図10A】
発明にかかる、HXBもしくは8xのEnvクローンによるCD4非依存性の細胞−細胞融合を描くグラフである。示されるとおりHXB Envもしくは8x Env、ならびにT7ポリメラーゼを発現するQT6エフェクター細胞を、T7プロモーターの制御下にケモカイン受容体CXCR4(斜交平行線の陰影をつけられた棒)、CD4(白棒)もしくはCXCR4/CD4(黒棒)およびルシフェラーゼ遺伝子を発現するQT6標的細胞と混合した。HIV−1/IIIBはクローン化されていないウイルスであり、これからHXBc2(「HXB」)およびIIIBx(「8x」)のような数種の分子クローンが生じている。本明細書に開示されるデータはこれら2種のEnv分子クローンを比較する。ルシフェラーゼは、本アッセイにおいて、Envがエフェクター細胞と標的細胞との間の融合を媒介する場合にのみ産生される。各Envについての結果はRLUで表し、そしてIIIB EnvエフェクターおよびCXCR4/CD4標的細胞で得られた融合の量に対し正規化する。典型的な一実験の結果を示す。
【図10B】
発明にかかる、HXB−V3BaLもしくは8x−V3BaLのEnvクローンによるCD4非依存性の細胞−細胞融合を描くグラフである。示されるような、HXB−V3BaLもしくは8x−V3BaLのEnvタンパク質を担持するルシフェラーゼレポーターウイルスを使用して、T7プロモーターの制御下にCCR5(斜交平行線の陰影を付けられた棒)、CD4(白棒)もしくはCCR5/CD4(灰色棒)およびルシフェラーゼ遺伝子を発現する293T細胞を感染させた。感染3日後にルシフェラーゼ活性の量を測定した。各Envについての結果はRLUで表し、そしてIIIB−BaL Envを担持するビリオンおよびCCR5/CD4標的細胞を用いて得られた結果に対し正規化する。典型的な一実験の結果を示す。
【図11】
発明にかかる、CD4、CXCR4もしくはCCR5を発現する細胞における多様なgp120の細胞表面結合を描くグラフである。放射ヨウ素化されたgp120を、補助受容体もしくはCD4のプラスミドで一過性にトランスフェクションされた293T細胞とともにインキュベートした。可溶性のCD4(sCD4)を、示されたとおり結合反応に添加した。細胞に結合される比放射活性の量を提示し、そしてCD4への結合が100%になるように、示される各gp120について正規化する。各値は3回以上の独立の実験の平均を表し、そして誤差の棒(error bar)はSEMを表す。以下の組み合わせを示す。すなわち、空ベクターpCDNA3を発現する細胞(白棒)、CD4を発現する細胞(黒棒)、CXCR4を発現する細胞(濃灰色棒)、sCD4が添加された、CXCR4を発現する細胞(濃い斜交平行線の棒)、CCR5を発現する細胞(淡灰色棒)、sCD4が添加された、CCR5を発現する細胞(薄い斜交平行線の棒)。
【図12】
発明にかかる、CCR5補助受容体結合部位とMAb 17bエピトープとの間の重なり合いを描く、CD4に結合されたgp120の空間実体模型の像である。突然変異される場合にCCR5結合を50%以上減少させる一方CD4結合を50%未満減少させる、Rizzutoら(1998、Science 280:1949−1953)により示されるアミノ酸残基を赤色で示す。MAb 17bの接触残基を淡青色で示し、また、CCR5および17b双方の結合に関与する残基を薄紫色で示す。実施例1に既に開示されたような補助受容体結合部位の近傍で8xとIIIBとの間で異なりかつCD4非依存性に影響することができる3個の残基を緑色で示す。これらの残基の1個(423)はMAb 17bの接触部位でもまたある。超可変V1/V2およびV3ループの幹を橙色で示す。
【図13】
発明にかかる、CD4i MAb 17bへのgp120の結合のセンサー図を描くグラフである。MAb 17bをセンサー表面に結合し、その後、示されるような飽和するレベルのsCD4との前インキュベーションを伴うもしくは伴わない、示された(等濃度の)gp120分子を、フローセルに適用した。300秒会合させ、次いで、追加の300秒間、運転緩衝液で洗浄し、その間に解離を測定した。データの線形変換から得られた動力学的定数を、本明細書の別の場所の表1に提示する。
【図14(図14Aおよび14Bを含んで成る)】
発明にかかる、クローン8xから得られるenvのヌクレオチド配列を列挙する。
Claims (51)
- CD4非依存性のヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)のenv、またはその突然変異体、誘導体もしくはフラグメントをコードする単離された核酸。
- 前記核酸が、配列番号4のヌクレオチド配列を有する核酸と最低約98%の相同性を共有する、請求項1記載の単離された核酸。
- 前記核酸が、HIV−1/IIIBx envおよびHIV−1/IIIBx 8x(8x)envより成る群から選択される、請求項2記載の単離された核酸。
- 前記核酸がHIV−1/IIIBx 8x envである、請求項3記載の単離された核酸。
- 配列番号4のヌクレオチド配列を有するCD4非依存性のHIV envをコードする単離された核酸。
- 最低1個のHIV−1 envクローンにCD4非依存性を賦与するHIV−1 env遺伝子の一部分を含んで成る単離された核酸。
- 第一部分および第二部分を含んで成り、前記第一部分はHIV−1/IIIBx 8x envコーディング配列の少なくとも一部分をコードし、また、前記第二部分が8x envでないHIV−1 envのコーディング配列の少なくとも一部分をコードする、キメラ核酸。
- 前記第二部分が、S10 env、HXB2 env、BaL envおよびIIIB envより成る群から選択されるenvコーディング配列である、請求項7記載のキメラ核酸。
- 前記第二部分が、CXCR4ケモカイン受容体結合部位およびCCR5ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、請求項7記載のキメラ核酸。
- 前記第二部分が、CXCR4ケモカイン受容体結合部位のV3ループおよびCCR5ケモカイン受容体結合部位のV3ループより成る群から選択されるV3ループコーディング配列を含んで成る、請求項9記載のキメラ核酸。
- 安定に露出されるケモカイン補助受容体結合部位を含んで成る、単離されたHIV−1 gp120ポリペプチド。
- HIV−1/IIIBx 8x Envを含んで成る単離されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが配列番号3と最低約98%の相同性を共有する、請求項12記載の単離されたポリペプチド。
- 配列番号3のアミノ酸配列を含んで成る、請求項13記載の単離されたポリペプチド。
- キメラポリペプチドがHIV−1/IIIBx 8x gp120を含んで成る第一部分を含んで成り、前記キメラポリペプチドが、HIV−1/IIIBx 8x以外にHIV−1からのgp120を含んで成る第二部分をさらに含んで成る、gp120ポリペプチドを含んで成る前記キメラHIV−1 Envポリペプチド。
- キメラHIV−1 EnvポリペプチドがCD4非依存性であり、また、さらに、前記ポリペプチドが、CXCR4ケモカイン受容体結合部位およびCCR5ケモカイン受容体結合部位より成る群から選択されるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、前記キメラHIV−1 Envポリペプチド。
- 前記第二部分が、HXB V3ループ、8x V3ループ、BaL V3ループ、YU−2 V3ループおよび89.6 V3ループより成る群から選択されるV3ループを含んで成る、請求項16記載のキメラポリペプチド。
- HIV−1が、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含まないそれ以外は同一のHIV−1より抗体中和に対しより感受性である、安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成るgp120ポリペプチドを含んで成るCD4非依存性の前記HIV−1のEnvを含んで成る組成物。
- HIV−1 Envタンパク質がケモカイン補助受容体結合部位を安定に露出させる最低1個の突然変異を含んで成る、CD4非依存性の前記HIV−1 Envを含んで成る製薬学的組成物。
- 前記HIV−1 EnvがHIV−1/IIIBx 8xである、請求項21記載の組成物。
- 免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envを含んで成るワクチン。
- 前記HIV−1 Envが、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 Envを発現する細胞より成る群から選択される、請求項21記載のワクチン。
- 請求項1記載の単離された核酸を含んで成るベクター。
- 請求項6記載の単離された核酸を含んで成るベクター。
- 請求項7記載の単離された核酸を含んで成るベクター。
- 請求項1記載の単離された核酸を含んで成る細胞。
- 請求項6記載の単離された核酸を含んで成る細胞。
- 請求項7記載の単離された核酸を含んで成る細胞。
- 請求項11記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
- 請求項12記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
- 請求項15記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
- 請求項16記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
- 請求項17記載の単離されたポリペプチドを含んで成る細胞。
- 請求項18記載の組成物を含んで成る細胞。
- CD4非依存性であるEnvクローンから完全長のenvコーディング配列を得ること、および、前記envコーディング配列の少なくとも一部分をCD4依存性であるEnvクローンからのコーディング配列で置き換えてキメラを形成させ、ここで、前記キメラがCD4依存性である場合、それは前記envコーディング配列の前記部分がCD4非依存性に関与することの表示であり、それによりCD4非依存性に関与するアミノ酸残基を同定することを含んで成る、CD4非依存性に関与するHIV−1 Envタンパク質のアミノ酸残基の同定方法。
- 哺乳動物に免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 Envタンパク質を投与し、ここで、前記タンパク質は安定に露出されるケモカイン受容体結合部位を含んで成り、それにより前記哺乳動物におけるHIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出すことを含んで成る、哺乳動物におけるHIV−1ケモカイン受容体結合部位に対する免疫応答を導き出す方法。
- 可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、化合物と前記細胞を接触させること、前記細胞に結合された標識の量を測定すること、および前記化合物と接触された前記細胞に結合された標識の量を、前記化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、前記化合物と接触されない、前記それ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、前記化合物と接触された前記細胞に結合されたより多いもしくは少ない量の標識は、前記化合物がHIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼすことの表示である、前記HIV−1 gp120ケモカイン受容体結合部位の露出に影響を及ぼす化合物の同定方法。
- 可溶性のCD4との標識されたgp120の前インキュベーションを伴うかもしくは伴わずに、細胞を前記gp120と接触させるのに先立ちもしくはそれと同時発生的に、小分子と前記細胞を接触させること、前記細胞に結合された標識の量を測定すること、および前記分子と接触された前記細胞に結合された標識の量を、前記分子と接触されないそれ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較することを含んで成り、ここで、前記分子と接触されない、前記それ以外は同一の細胞に結合された標識の量と比較した、前記分子と接触された前記細胞に結合されたより少ない量の標識は、前記分子がそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することの表示である、前記そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する小分子の同定方法。
- CD4非依存性のEnvクローンの超可変V3ループを別のHIV−1のV3ループで置き換えることを含んで成り、ここで、別のHIV−1の前記V3ループは、前記CD4非依存性のEnvクローンのものと異なるケモカイン受容体結合部位を含んで成る、可変性のケモカイン受容体結合部位を含んで成るCD4非依存性のキメラHIV−1 Envクローンの製造方法。
- 前記CD4非依存性クローンが、HIV−1/IIIBxおよびHIV−1/IIIBx 8xより成る群から選択される、請求項39記載の方法。
- 別のHIV−1からの前記V3ループが、HIV−1/BalからのV3ループ、HIV−1/YU−2からのV3ループ、HIV−1/ADAからのV3ループおよびHIV−1/89.6からのV3ループより成る群から選択される、請求項40記載の方法。
- 請求項37の方法を使用して同定された小分子とHIV−1 gp120を接触させ、それによりそのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害することを含んで成る、そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体への前記gp120の結合の阻害方法。
- そのケモカイン受容体結合部位を使用するケモカイン受容体へのHIV−1 gp120の結合を阻害する小分子と細胞を接触させ、ここで、前記小分子は請求項38の方法を使用して同定され、それにより細胞のHIV−1感染を阻害することを含んで成る、前記細胞のHIV−1感染の阻害方法。
- 製薬学的に適する担体中に、CD4非依存性のHIV−1 Env、およびHIV感染症を治療するのに使用される最低1種の化合物を含んで成る組成物。
- 前記HIV−1 Envが、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 envを発現する細胞より成る群から選択される、請求項44記載の組成物。
- HIV感染症を治療するのに使用される前記化合物が、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインより成る群から選択される、請求項44記載の組成物。
- 免疫原性の用量のCD4非依存性のHIV−1 EnvをHIV−1に感染したヒトに投与し、それにより前記ヒトにおけるHIV−1感染症を治療することを含んで成る、ヒトにおけるHIV−1感染症の治療方法。
- 前記HIV−1 Envが、HIV−1 Envポリペプチド、HIV−1 Envをコードする核酸およびHIV−1 envを発現する細胞より成る群から選択される、請求項47記載の方法。
- HIV感染症を治療するのに使用される化合物を投与することをさらに含んで成る、請求項48記載の方法。
- HIV感染症を治療するのに使用される前記化合物が、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素ヌクレオシド類似物阻害剤、逆転写酵素非ヌクレオシド類似物阻害剤、インターフェロン、AZT、インターロイキン−2およびサイトカインより成る群から選択される、請求項49記載の方法。
- 前記化合物が、前記CD4非依存性のHIV−1 Envの投与前、投与の間もしくは投与後に前記ヒトに投与される、請求項50記載の方法。
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