【発明の詳細な説明】
ＧＰ４１変異体及びＨＩＶ治療剤としてのそれらの使用
連邦政府後援の研究に関する供述
本発明は、合衆国政府により少なくとも一部資金提供されたものであり、した
がって政府は本発明に対し一定の権利を留保する。
発明の背景
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染の治療に関するもので
あり、ここでヒト免疫不全ウイルスというのは、ＨＴＬＶ−III、ＬＡＶ、ＡＲ
Ｖ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＬＡＶ−２のような用語により呼称されるさま
ざまなウイルス型及び系統の全てを含むものとする。
ＨＩＶは、後天性免疫不全症候群（エイズ）の病因学的作用因子である。ＨＩ
Ｖの一例（現在ＨＩＶ−１と呼ばれている）については、いくつかの論文、すな
わち、Barre-Sinoussi et al.，Science 220：868，1983；Gallo et al.，Scien ce
224：500，1984；Popovic et al.，Science 224：497，1984；及びLevy et a
1.，Science 225：840，1984に一般的に記述されているが、これらの論文は各々
本明細書に参照文献として含まれている。ＨＩＶ−１のさまざまな分離株が北米
、西欧及び中央アフリカから得られている。これらの分離株は、そのヌクレオチ
ド配列において幾分か異なっているが、それらがコードするタンパク質は一般に
抗原的交差反応性をもつ。
ＨＩＶ−１に関係する第２のウイルスが分離されＨＩＶ−２と名付けられた。
このウイルスは、各々本明細書に参照文献として含まれている、Guyader et al.
，Nature 326：662，1987；Brun-Vezinet et al.，The Lancet 1：128．1987；
及びClavel et al.， Science 233：343，1986によって報告されている。ＨＩＶ
−２の遺伝学的構成はＨＩＶ−１のものと類似している。
サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ又はＳＴＬＶ−III）と呼称される、サルから
分離した一群のウイルスは、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、特にＨＩＶ−２と関係
づけられている。各々本明細書に参照文献として含まれている、Daniel et al.
，S
cience 228： 1201-1204(1985)； Kanki et al.，Science 230： 951-954(1985)
； Chakrabarti et al.，Nature 328：543-547(1987)；及びOhta et al.，Int'1
．J．Cancer 41：115-222（1988）を参照されたい。このウイルス群のメンバー
は、そのゲノム配列においてわずかな差異を示し、その制限酵素地図の中にいく
つかの差異を有する。
その他のレンチウイルスの場合と同様に、ＨＩＶは、膜貫通（ＴＭ）タンパク
質及び細胞外タンパク質へとプロセッシングされる外被前駆体タンパク質をコー
ドする。ＴＭタンパク質は、膜貫通ドメインからさらに下流に延び（Gallaher，
W.R. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 5：431-440(1989)：Hunter及びSwa
nstrom，Current Topics in Microbiology and Immunology 157：187-253 (1990
)）、結果として１００を超えるアミノ酸から成る長い細胞質ドメインが形成さ
れる。例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＩＶＴＭタンパク質の細胞質ドメ
インは約１５０のアミノ酸から成る（Gallaher，W.R. et al., AIDS Res．Hum．
Retroviruses 5：431-440 (1989)；Hunter及びSwanstrom，Current Topics in M
icrobiology and Immunology 157：187-253 (1990)）。ＳＩＶ及びＨＩＶ−２に
ついては、いくつかの確立されたヒト細胞系統におけるウイルス複製にとって、
ＴＭタンパク質の細胞質ドメインの大部分が必須でないことが報告されている（
Chakrabariti et al.，Nature 328：543-547 (1987)；Fukasawa et al.，Nature
333：457-461 (1988)；Guyader et al., Nature 236：662-669 (1987)；Hirsch
etal., Cell 49：307-319 (1987)）。末端が切断された（truncated）ＴＭタン
パク質を有するいくつかの天然ＳＩＶ及びＨＩＶ−２分離株は、ある種の確立さ
れたヒト細胞系統において、全長ＴＭタンパク質を有するウイルスよりも良く増
殖する（Chakrabarti et al., J.Virol. 63：4395-4403, (1989)：Hirsch etal.
, Nature 341：573-574 (1989)；Kodama et al., J.Virol. 63：4709-4714(1989
)）。末端が切断された（truncated）ＴＭタンパク質が増大したフゾジェニック
（fusogenic）能を有するということも報告されている（（Earl et al., J.Viro
l. 65：31-41 (1991)；Kowalski et al., Science 237：1351-1355 (1987)；Mul
ligan. M.J. et al., J. Virol. 66：3971-3975 (1992)；Mulligan et al.,J. V
irol. 66：3971-3975 (1992)）。
ＳＩＶ及びＨＩＶ−２とは対照的に、今日までに配列決定された感染性ＨＩＶ
−１クローンは一般に全長ＴＭタンパク質（ｇｐ４１）を含んでいる。コンピュ
ータ分析によると、ｇｐ４１の細胞質ドメインは、二重膜との二次的会合を形成
することのできる２つの両親媒性αらせん構造（Venable et al., AIDS Res. Hu
m, Retroviruses 5：7-22 (1989)）を含んでいる（Haffar et al., Virology 18
0：439-441 (1991)）。ｇｐ４１の細胞質ドメイン内のαらせんの両方を欠失さ
せる大きな端部の欠失が、ウイルスＥｎｖタンパク質の生合成、プロセッシング
、輸送又は表面発現に多大な影響を与えることはないということが報告されてき
た（Earl et al., J. Virol. 65：31-41 (1991)）。変異体Ｅｎｖタンパク質の
オリゴマー化（Earl et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：648-652 (1990)
）及び合胞体（syncytium）形成（Earl et al., J. Virol. 65：31-41 (1991)；
Kowalski et al., Science 237：1351-1355 (1987)）も損なわれなかったと報告
されている。
ＨＩＶはすでに世界のかなりの部分の人が感染しており、これに感染した人々
の治療を開発することに向けて、多大な努力がなされてきた。合成薬の研究に加
えて、エイズ療法を考案するべくＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の変異株を利用する
ことに向けて研究努力が行なわれてきた。（Trono et al., Cell, 59：113-120,
(1989)）。
ｇａｇｐ２４コア遺伝子変異体又はキャプシド標的のＧａｇヌクレアーゼ融合
分子を用いた細胞内「免疫化」が、可能性ある抗レトロウイルス戦略として記述
されてきた（Trono et al., Cell 59：113-120 (1989)；Natsoulis et al., Nat
ure 352：632-635 (1991)）。
発明の要約
本発明は、患者の体内の感染性ＨＩＶレベルを低下させるのに有効な量のｇｐ
４１ポリペプチドの変異体を投与することにより、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）に感染した患者を治療する方法に関する。ｇｐ４１ポリペプチドは、以下で
記述するような、さまざまな粒子によって送り込むことができる。
変異ｇｐ４１ポリペプチドは、ポリペプチド自体として又は変異ｇｐ４１をコ
ードする核酸を含む発現可能に構成された遺伝子として投与することができる。
使用される核酸は、患者の細胞を形質転換することのできる核酸であってよく、
ウイルスベクターの一部として投与されうる。使用される核酸はさらに、ＣＤ４
−結合ポリペプチドをコードする配列、ｇｐ１２０−結合ポリペプチドをコード
する配列、又は標的細胞への治療用ペプチドの進入を可能にするそのフラグメン
トを含んでいてよい。このような薬物は、薬学的に許容可能な担体と共に投与さ
れる。
本発明の一部として同様に含まれるのは、患者の体外で細胞を形質転換させ、
形質転換した細胞を患者に戻すための方法である。好ましくは、細胞は核酸で形
質転換される前に患者から取り出され、患者の体に戻される。
または、核酸を患者に直接投与することもできるし、及び／又はヒト免疫不全
ウイルスＩ型の誘導体であるウイルスベクターの中に入れて送り込むこともでき
る。
本発明はさらに、感染細胞内でのＨＩＶのウイルス複製又はＥｎｖタンパク質
の集合を停止させるのに有効である、野生型ｇｐ４１の
−アミノ酸８４４〜８５６；
−アミノ酸８１４〜８５６；
−アミノ酸７９６〜８５６；
−アミノ酸７７６〜８５６；
−アミノ酸７５３〜８５６；又は
−アミノ酸７１０〜８５６；
なる領域のうちの少なくとも１つの領域の中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失
を有している変異体ｇｐ４１ポリペプチドを投与することにより、ＨＩＶ感染者
を治療する方法を含む。好ましくは、かかる欠失は、上述の欠失を４０〜６０パ
ーセント、より好ましくは６０〜８０％、そして最も好ましくは８０〜１００％
含むことになる。
本発明の一部として同様に含まれているのは、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（Ｈ
ＩＶ）に感染した患者に対し投与するよう適合された治療用組成物である。これ
らの組成物には、人間の患者の細胞を形質転換するための発現可能な遺伝子構築
物中の変異ｇｐ４１ポリペプチドをコードする核酸、又は薬学的に許容可能な担
体中の変異ｇｐ４１ポリペプチドが含まれる。
治療用組成物は、患者の細胞を形質転換することのできるウイルスベクターの
一部として核酸を含むことができる。核酸はさらに、ＣＤ４−結合ポリペプチド
をコードすることのできる配列、ｇｐ１２０−結合ポリペプチドをコードする配
列又はそのフラグメントを含んでいてよい。
変異ｇｐ４１とは、以下に記述する検定のうちの１つによって確認されるよう
に、ｇｐ４１をＨＩＶウイルス粒子の構築及び感染の阻害物質として有効なもの
にする欠失、挿入、置換又はその他の修飾を有するｇｐ４１のことである。
本発明に含まれる変異ｇｐ４１ポリペプチドは、その他のＨＩＶ系統由来の同
等の変異ｇｐ４１タンパク質であってもよい。変異部位を番号で呼称した場合、
当業者であれば、アミノ酸及び核酸の相同性に基づいて、図１とは異なる配列を
もつＨＩＶ及びタンパク質内の同等の変異を同定することが可能である。
Ｅｎｖタンパク質の取込み及び／又はウイルス複製を停止させ、かつＨＩＶ感
染者のための有用な療法であるような変異は、以下の方法において記述されてい
る技術を用いて、決定することのできるものである。特に有用であるのは、トラ
ンスフェクション、感染、ＲＴ検定、放射線免疫沈降法、イムノブロット法そし
てパルスチェイス分析操作である。具体的には、有用な変異体ｇｐ４１ポリペプ
チド及びポリペプチドをコードする核酸は、Ｅｎｖタンパク質の取込みを停止さ
せ、かつ、正常なｇａｇ及びｐｏｌタンパク質レベルを結果としてもたらすが、
粒子内のｇｐ１２０及びｇｐ４１タンパク質の低下をもたらすようなものである
。ウイルス複製を停止させる有用な変異体ｇｐ４１ポリペプチドは、共形質転換
検定において、野生型ウイルスに比べウイルス複製を減少させる、つまり好まし
くは１０％、最も好ましくは２０％以上減少させるものである。
本発明のその他の特徴及び利点は、本発明の好ましい態様についての以下の記
述及び請求の範囲から明らかになることだろう。
好ましい態様の説明
まず、図面の簡単な説明を行なう。
図面
図１は、ｇｐ４１ポリペプチドをコードするＤＮＡの配列及びｇｐ４１ポリペ
プチドの一次アミノ酸配列を示す。
図２は、ｇｐ４１変異体の構成を表す図である。ＨＩＶ−１Ｅｎｖ前駆体タン
パク質はＨＸＢ２Ｒ３内の８５６のアミノ酸を含んでいる。黒色の部域は親水性
領域を表わす。矢印はｇｐ１２０とｇｐ４１の間の切断部位を示す。各図形の終
りにある番号は、アミノ酸８１３の後に終結するＴＭ８１２を除いて、各構成体
によりｇｐ１６０内で合成されうる最後のアミノ酸を表わしている。
図３は、ウイルス感染力検定を表わす一連のグラフである。細胞を含まない野
生型及び変異体ウイルスを、トランスフェクションを受けたＣＯＳ−７細胞の上
清から調製し、ＳｕｐＴ１（図３Ａ）、ＭＴ−２（図３Ｃ）、Ｈ９（図３Ｂ）及
び新鮮なＰＢＭＣ（図３Ｄ）上で試験した。逆転写酵素（ＲＴ）値は、１分あた
りの計数（cpm）単位で測定した０．１mlの培養上清からの試料のものを表わし
ている。
図４は、イムノブロットによるウイルスタンパク質の分析を示す。（ａ）精製
及び分析したもの、（ｂ）他のＨＩＶ−１陽性ヒト血清でブロットされた、細胞
溶解物（cell）及びショ糖勾配精製されたウイルス粒子（virus）。
図５（ａ）は、放射線免疫沈降法によるウイルス蛋白質の分析を示す。〔35Ｓ
〕システイン代謝により標識されトランスフェクションを受けたＣＯＳ−７細胞
からの細胞溶解物（cell）および上清（sup）をＨＩＶ−１−陽性血清と反応さ
せた。
（ｂ）ｇｐ１２０に対するマウスモノクローナル抗体を用いた間接的免疫蛍光法
により検出されたＨＩＶ−１Ｅｎｖタンパク質の表面発現を示す：ａ及びｂは偽
トランスフェクションを受けた細胞である；ｃ及びｄは野生型でトランスフェク
ションを受けた細胞である；ｅ及びｆはＴＭ７４２でトランスフェクションを受
けた細胞である；ｇ及びｈはＴＭ７０９でトランスフェクションを受けた細胞で
ある。対応するノマルスキー（Nomarsky）写真（ａ、ｃ、ｅ及びｇ）は、蛍光写
真（ｂ、ｄ、ｆ及びｈ）に隣接している。
図６は、発現可能な位置においてｇｐ４１をコードする核酸を伴うウイルス構
成体を示す。Ｉ．抗ＨＩＶ治療薬として使用するためのｇｐ４１ポリペプチド
特定の作用メカニズムに束縛されたくはないが、変異体ｇｐ４１ポリペプチド
は、ＨＩＶ感染細胞内の感染性ウイルス粒子内へのウイルスｅｎｖタンパク質の
取込みを妨げることから、抗−ＨＩＶ治療薬として有用なものであると考えられ
る。以下の例が示すように、ｇｐ４１のカルボキシ末端ドメインを欠失させるか
又はその他の形で破壊する変異体は、この特性を有し、抗ＨＩＶ治療薬である。
かかる変異体でｅｎｖタンパク質合成が停止されることはないが、ウイルスＥｎ
ｖタンパク質の感染性粒子内への取込みは、著しく阻害される。このようにＥｎ
ｖタンパク質を適切に取込むことができない結果として、非感染性粒子が生み出
される。野生型ウイルスとの関係における変異体のこの優性として作用する性質
は「優性ネガティブ（dominant negative）」特性とも呼ばれる。
さらに、ｇｐ４１とＥｎｖタンパク質との間の相互作用を分断するカルボキシ
末端ドメインの外側の変異、特に膜貫通ドメイン内の変異は、効果的な療法を生
み出す可能性がある。
この目的のために有用ないくつかのｇｐ４１ポリペプチドには、カルボキシ末
端から１２より大であり１４７以下のアミノ酸を除去する欠失が含まれている。
ウイルスの集合の阻害にとって最も有用であるのは、カルボキシ末端細胞質ドメ
インの１０４から１４７までのアミノ酸を除去するような変異である。
当業者であれば、（天然に存在する（野生型）ｇｐ４１配列に対する欠失、置
換又は付加を含む）その他のｇｐ４１変異を本発明により使用することが可能で
あるということも理解できよう。多数の変異体候補を製造するための技術は、当
業者にとっては周知のものである。有用なさまざまな技術がCurrent Protocolsi n Molecular Biology
（編集：Ansebel et al., 1989, Green Publishing Assoc
iates, John Wiley & Sons，NY，pp8.1-8.4）に記述されている。その後、実施
例２、３及び４に記載され、以下で示される優性ネガティブ検定を用いた技術を
含むさまざまな技術により、取込みを阻害するその能力から、変異体候補プール
をスクリーニングすることができる。
同様に抗ＨＩＶ治療薬として有用であるのは、感染細胞における病原性ＨＩＶ
のウイルス複製を阻害するｇｐ４１変異である。ウイルス複製の阻害は、不適切
なウイルス形態形成をしたか又は全く形態形成ができなくなった結果と考えられ
る。機構の如何に関わらず、複製を妨げる能力は、本発明によるｇｐ４１変異体
の有用な特性である。この特性を有する変異体は、変異誘発（上述）とそれに続
く実施例２、３、４によるスクリーニング及び以下に示す優性ネガティブ変異体
検定によって同定することができる。この機構による治療薬にとって有用な変異
としては、細胞質ドメインの大部分のカルボキシ末端部分を破壊する変異が挙げ
られる。例えば、カルボキシ末端の最後の１２のアミノ酸を除去するｇｐ４１内
の変異がこの目的のために有用であることが確認されてきた。
ｇｐ４１由来の抗ＨＩＶ治療薬として有用な付加的なポリペプチドについては
、「その他の態様」の中で記述される。II．ｇｐ４１ポリペプチドの治療的投与
以下の実施例においてさらに詳細に記述するように、本発明によるｇｐ４１変
異体は、いわゆる「トランス優性」式に機能しうることから有効なＨＩＶ治療薬
である。特定的に言うと、ＭＡ変異体は、ＨＩＶ感染細胞内で、そのままでは病
原性の粒子成分と物理的に結びつけられた状態になると思われる。その結果、細
胞が製造する適切に集合した感染性粒子の割合は、細胞内の変異体ｇｐ４１レべ
ルに比例して減少する。変異体ｇｐ４１が充分余剰に細胞に送り込まれた時点で
、変異体ｇｐ４１を取込むことによる不活性なウイルス粒子の発生率は、野生型
ｇｐ４１の取込みの発生率よりもはるかに高いものとなる。
クローニングされた遺伝子が入手可能であることにより（Rekosh et al., Pro
c. Natl. Acad. Scl. USA 85：334 (1988)，Chanda et al., Vaccines：207 (19
89)、及びHammarskjold et al., Journal of Virology 63：1959 (1989)）、標
準的な技術を用いて（Scopes，R. Protein Purification：Principles and Prac
tice1982，Springer-Verlag，NY）、実質的に純粋なｇｐ４１ポリペプチド変異
体を産生させることが可能である。かくして、本発明の一態様は、許容可能な希
釈剤、担体又は賦形剤と一緒に、及び／又は単位用量形態でｇｐ４１ポリペプチ
ド変異体を含む薬剤である。ポリペプチドをＨＩＶ感染者に投与するための適当
な製剤又は組成物を提供するには、従来の薬学的方法を利用することができる。
ポリペプチドの実質的に純粋な調製物とは、細胞内に天然に存在するときに混
在しているタンパク質を実質的に含んでいない（例えば治療用組成物の形でｇｐ
４１変異体を処方するのに必要な程度に含んでいない）調製物のことである。
ｇｐ４１タンパク質変異体のフラグメント又は類似体も、本明細書に記述され
ている方法でＨＩＶ感染者に投与することができる。この目的にとって有用であ
るフラグメント又は類似体としては、先行する項目及び実施例の中で記述されＨ
ＩＶ感染者の治療のために有用なものであるｇｐ４１の変異体のフラグメント及
び類似体が含まれる。ＨＩＶ感染者の治療にとって有用となるフラグメント及び
類似体は、他のものの中から、以下の実施例で示されている検定を用いて決定さ
れる。
ｇｐ４１ポリペプチド変異体は同様に、Ｔ細胞のＣＤ４レセプターを結合する
のに充分なｇｐ１２０タンパク質又はそのフラグメントに対して融合させた、望
ましいｇｐ４１変異体ポリペプチドフラグメントから成る融合タンパク質の形で
ＨＩＶ感染者に対して投与することもできる。セイツ（sates）用途のためのｇ
ｐ１２０及びＣＤ４の両方の遺伝子の配列は、Rokosh et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci，USA 85：334 (1988),、Chanda et al., Vaccines：207 (1989)及びHamm
arskjold et al., Joaurnal of Virology 63：1959 (1989)から得ることができ
る。この融合タンパク質は、感染を受けていないＴ細胞、単球、マクロファージ
又はＨＩＶの感染を受けＣＤ４レセプタを発現するその他の型の細胞の中への、
ｇｐ４１ポリペプチド変異体の送り込みを可能にする。
ｇｐ４１ポリペプチドは同様に、ｇｐ１２０を結合するのに充分であるＣＤ４
タンパク質又はそのフラグメントに融合させた、ｇｐ４１ポリペプチド変異体又
は治療に有用なフラグメント又は誘導休から成る融合タンパク質の形で、ＨＩＶ
感染者に投与することもできる。この融合タンパク質は、その表面上でｇｐ１２
０を発現する感染したＴ細胞の中に、ｇｐ４１ポリペプチドを送り込むことを可
能にする。ｇｐ４１−ｇｐ１２０融合ポリペプチド又はｇｐ４１−ＣＤ４融合ポ
リペプチドは、適当なベクターにコードされた融合体を生成するための標準的な
分子生物学技術を用いて生成することができる（Sambrook et al., Molecular C loning：A Laboratory Manual
，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New Yo
rk (1989)）。
ｇｐ１２０フラグメント又はＣＤ４フラグメントのいずれかが、エンドサイト
−シスを通してのｇｐ４１ポリペプチド変異体の内在化を可能にすることができ
る。かかる遺伝子融合構成体の有用性は、とりわけ以下で実施例中に記述されて
いる方法を用いて決定することができる。本発明は、薬学的に許容可能な担体中
で単独に融合ポリペプチドを投与すること、又は許容可能な担体中で両方の融合
体を一緒に投与することを含んでいる。
したがって、本発明の製剤は、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、
筋内投与、頭蓋内投与、眼窩内投与、眼内投与、心室内投与、嚢内投与、脊髄内
投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾル又は経口投与によって適用
できる。
治療用製剤は、溶液又は懸濁液の形態であってもよい。経口投与のためには、
製剤は、錠剤又はカプセルの形態をしていてよく、鼻腔内製剤については、粉末
、鼻腔用滴剤又はエアゾルの形態であってよい。
製剤を作るための当該技術分野における周知の方法は、例えば、「Remington
の薬剤科学」の中に見い出される。非経口投与のための製剤は、例えば賦形剤、
無菌水又は食塩水、ポリエチレングリコールのようなポリアルキレングリコール
、植物油、又は水素添加ナフタレンを含んでいてもよい。当該因子の放出を制御
するのに、生物学的適合性と生分解性のあるラクチド重合体、ラクチド／グリコ
シド共重合体又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を使用す
ることができる。これらの因子のための可能性のあるその他の有用な非経口送り
出しシステムとしては、エチレン−酢酸ビニル共重合休粒子、浸透圧ポンプ、移
植可能な輸注システム、リポソームがある。吸入用の薬剤は、例えばラクトース
のような賦形剤を含んでいてもよいし、或いは例えばポリオキシエチレン−９−
ラウリルエーテル、グリココレート、デオキシコレートなどを含む水性溶液であ
ってもよいし、又は鼻腔用滴剤の形での投与のための油性溶液又は鼻腔内に塗布
するゲルであってもよい。IIＢ．変異ＭＡポリペプチドをコードすることを含むｇｐ４１の構成
特に好ましい態様は、上記のｇｐポリペプチドのいずれかをコードし、（患者
の細胞の形質転換の後）ｇｐ４１ポリペプチド変異体を発現することのできる遺
伝子構築物を患者に投与することを特徴とする。
好ましいウイルス粒子を例示している以下のＨＩＶの例に加えて、当業者であ
れば、本発明が、例えばＭＮ、ＨＸＢ２、ＬＡＩ、ＮＬ４３、ＭＦＡ、ＢＲＶＡ
及びＺ３２１のような、充分に性質が解明されている多くの他のＨＩＶ系統を使
用するこのとのできるものであるということを、容易に認識できることだろう。
さらに、宿主生体の細胞に進入し、進入が完了するとそこで発現されるように
活性化されうる又は活性化されたその他のウイルス粒子（すなわち核酸粒子）も
数多く存在する。IIＣ．ウイルスベクター内のｇｐ４１変異体の治療用投与
ＨＩＶ感染を受けた細胞に対する適切な親和性を有するレトロウイルスベクタ
ー又はその他のウイルスベクターを、ｇｐ４１ポリペプチド変異体のための遺伝
子運搬機構として使用することができる。この目的のために有用な数多くのベク
ターが一般に知られており、記述されている（Miller，Human Gene Therapy 15-
14 (1990)；Friedman，Science 244：1275-1281 (1989)；Eglitis及びAnderson
，Biotechniques 6：608-614 (1988)；Tolstoshev及びAnderson，Current Opini
on in Biotechnology 1：55-61 (1990)；Sharp，The Lancet 337：1277-1278 (1
991)；Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36：3
11-322 (1987)；Anderson，Science 226：401-409 (1984)；Moen，Blood Cells 17
：407-416 (1991)；及びMiller及びRosman，Biotechniques 7：980-990 (1989
)）。レトロウイルスベクターは特によく開発され、臨床的に使用されてきてい
る（Rosenberg et al．N．Engl．J．Med．323：370 (1990)）。
この目的のために役立つと考えられるレトロウイルス構成体、パッケージング
細胞株及び運搬機構としては、モロニーマウス白血病ウイルスベクター；自己不
活性化ベクター；２重コピーベクター；選択マーカーベクター；及び自殺機構ベ
クター、のうちの１つ又はその組合わせが含まれるが、これらに制限されるわけ
ではない。ｇｐ４１輸送のためのモロニーマウス白血病レトロウイルス機構は、
最終的にＴ細胞を発生させる造血細胞に対してｇｐ４１タンパク質の送り出しを
目的とすることから、特に有用である。ｇｐ４１ポリペプチドの送り出しはさら
に、ｇｐ１６０遺伝子からの発現を誘導するのにＨＩＶ−ＬＴＲが使用されてい
るレトロウイルス構成体を利用することによって、直接ＨＩＶの感染を受けてい
る細胞に制限することができる。かかる構成体からの適切な発現を達成するため
には、モロニーマウス白血病ベクターの３′ＬＴＲを欠失させなくてはならない
。ＨＩＶ−ＬＴＲにより誘導される、全ＨＸＢ２Ｒ３構成体又はｇｐ１６０ｅｎ
ｖ遺伝子のいずれかを含むように、ベクター構築の戦略をたてうる（図６参照）
。
ｇｐ４１ポリペプチドのフラグメント又は誘導体は同様に、レトロウイルス遺
伝子輸送治療法又はもう１つの適当なウイルスベクターシステムによって投与す
ることもできる。フラグメント又は誘導体は、上述の通りに定義づけされる。ｇ
ｐ４１の有用なフラグメント又は誘導体は、上述のとおり、遺伝子治療ベクター
における完全なｇｐ１６０遺伝子の代わりにこれらのフラグメント又は誘導体を
コードする核酸を挿入することによって投与することもできる。かかる構成体は
、上述のウイルス感染力に対するｇｐ４１の効果を試験するための方法を用いて
、他のもののなかで、試験を行ってもよい。
ｇｐ４１のレトロウイルスによる送り出しは、免疫不全の結果としてＢ細胞腫
瘍の共通の二次的外観を示すＨＩＶ−１感染個体において、特に適切である。こ
れらの個体は、Ｂ細胞腫瘍の治療のための慣例に従って、常套手段として、骨髄
摘出、処置及び再移植を受けることができる。この時点で、幹細胞をトランスフ
ェクションするのに、遺伝子治療ベクターの送り出しのための標準的技術を使用
することができる。このようなトランスフェクションの結果、患者の体内のＨＩ
Ｖの感染レベルを低下させるのに役立つｇｐ４１を合成するＴ細胞がもたらされ
る。IIＤ．ｇｐ４１をコードする核酸の治療用送り出しのためのウイルスを用いない 方法
患者のゲノムＤＮＡ内への挿入又は自己複製のために必要とされる適切な配列
を含み、ＨＩＶ−ＬＴＲの調節下にある、ｇｐ４１をコードする核酸又はそのフ
ラグメントを、以下の遺伝子移送技術を用いて患者に投与することができる：マ
イクロインジェクション法（Wolff et al., Science，47：1465 (1990)）；リン
酸カルシウムトランスファー法（Graham and Van der Eb．Virology 52：456(19
73)；Wigler et al., Cell 14：725 (1978)：Felgner et al., Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA 84：7413 (1987)）；リポフェクション法（Felgner et al., Proc
．Natl．Acad．Sci．USA 84：7413 (1987)；Ono et al., Neuroscience Lett 11
7：259 (1990)；Brigham et al., Am．J．Med．Sci．298：278 (1989)；Staubin
gerand Papahadjopoulos，Meth．Enz．101：512 (1983)）；アシアロロソヌコイ
ド（asialorosonucoid）−ポリリジン接合（Wu and Wu，J．Biol，Chem．263：1
4621 (1988)；Wu et al., J．Biol．Chem．264：16985 (1989)）；及び電気穿孔
法
（Neumann et al., EMBO J．7：841 (1980)）。これらの文献は、本明細書に参
照文献として含まれる。III．実験方法
１．ＤＮＡ構成体
ＨＸＢ２Ｒ３からの２．７５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（Ｔ
Ｍ７０９を生成するため）及び０．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメント
（ＴＭ７５２、ＴＭ７７５、ＴＭ７９５、ＴＭ８１２及びＴＭ８４４を生成する
ため）（Yu et al., J．Virol．66：4966-4971 (1992)）をｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋
）（Promega，Madison，Wis）へとサブクローニングした。一本鎖ウラシル含有
ＤＮＡを調製し、製造業者のプロトコル（Bio-Rad，Richmond，Calif．）に従っ
て部位特異的変異誘発のためにこれを用いた。変異誘発のために使用されたプラ
イマーの配列は以下の通りであった：TM709，5'-GAA TAG AGT TAG CTA GCG ATA
TTC ACC AT-3'；TM752，5'GTC CCA GAT AAG TGC CTA GGA TCC-3'；TM775，5'-GT
T ACA ATCTAG AGT AAG TC-3'；TM795，5'-TAG GAG ATT CCA CTA AAA TTT GAG GG
C TTC-3'；TM812，5'-GTG GCA TTG AGC TAG CTA ACA GCA C-3'；TM844，5'-GCC
CTG TCT TAT TCC TTA AGG TAT GTG GCG AA-3'。変異体を制限酵素切断及びＤＮ
Ａ配列決定によりスクリーニングした。ｇｐ４１変異を含んだ２．７ｋｂのＳａ
ｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び０．４ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメン
トをＨＸＢ２Ｒ３のベクター内にクローニングして戻した。
２．細胞及び血清
Ｌ−グルタミン及びＤ−グルコースそして１０％のウシ胎児血清を含むダルベ
ッコの修正イーグル培地の中に、ＣＯＳ−７細胞を維持した。ＲＰＭＩ１６４０
培地と１０％のウシ胎児血清の中にＳｕｐＴ１及びＨ９細胞を維持した。ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地と１５％のウシ胎児血清の中にＭＴ２細胞を維持した。ＰＢＭＣ
をＬＳＭ（Organon Teknica Corp., Durham，NC）上での密度勾配遠心分離によ
り分離し、ＲＰＭＩ１６４０と２０％ウシ胎児血清及び２０単位／mlのインター
ロイキン−２（Becton Dickinson Labware，Bedford，Mass）の中にこれを維持
した。感染検定のために使用する前に２日間、５μｇ／mlのフィトヘムアグルチ
ニンＰＨ
Ａ−Ｐ（Sigma，St．Louis，MO）でＰＢＭＣを処理した。ＨＩＶ陽性血清及びヒ
ツジ抗ｇｐ１２０血清については以前に記述されている（Yu et al., J．Virol
，66：4966-4971 (1992)）。ショ糖勾配精製された粒子を用いたイムノブロット
法のためには、もう１つのプールしたＨＩＶ陽性血清を用いた。マウスモノクロ
ーナル抗−ｇｐ１２０抗体は、Du Pont 社（Wilmington，DE）から入手した。
３．トランスフェクション、感染及び逆転写酵素（ＲＴ）の検定
トランスフェクション及びＲＴ検定は、以前に記述された通りに行なった（Yu
et al., J．Virol．66：4966-4971 (1992)）。簡単に言うと、以前に記述された
ＤＥＡＥ−デキストラン法（Yu et al., J．Vairol．66：4966-4971 (1992)）に
より、亜集密性ＣＯＳ−７細胞（５×１０6）をトリプシン処理し、２μｇの野
生型又は天然変異体プラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクションした。トラ
ンスフェクション又は感染を受けた細胞からの培養上清を用いて、ポリエチレン
グリコール法によりウイルスペレットを濃縮し、これを以前に記述された通り逆
転写酵素（ＲＴ）検定に付した（Yu et al., J．Virol．66：4966-4971 (1992)
）。
４．ウイルスタンパク質の放射線免疫沈降分析
トランスフェクションから６０時間後に、ＣＯＳ−７細胞を、１０％のウシ胎
児血清及び〔35Ｓ〕システイン（０．１mCi/ml；Du Pont，Mass）を含む、シス
テインを含まないＲＰＭＩ１６４０培地の中で１２時間インキュベートさせた。
次に細胞を細胞溶解緩衝液（０．１５MＮａＣｌ、０．０５Mトリス−ＨＣｌpH７
．２、１％ トライトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１
％ＳＤＳ）で溶解させ、４００００rpm（Beckman Ti70ローター）で１時間遠心
分離して細胞砕片を除去した。培養上清を１０００×ｇで３０分間予備清浄し、
４００００rpmで（Beckman Ti70ローター）１時間遠心分離させてウイルスペレ
ットを除去した。タンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Sigma，St.Louis，M
O）で予め吸収されたＨＩＶ陽性血清と、細胞溶解物及び培養上清を４℃で１２
時間反応させた。次に試料を、細胞溶解緩衝液（オキシコール酸ナトリウムを含
有しない）で３回、洗浄緩衝液（０．１５MＮａＣｌ、０．０５Mトリス−ＨＣｌ
pH７．２）で１回洗浄した。各々の試験管に６０μｌの試料緩衝液（０．０８M
トリス−ＨＣｌpH６．８、０．１MＤＴＴ、２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール
、０．２％のブロモフェノールブルー）を加えた。ロードの前に２分間、試料を
煮
沸し、１２％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分離させた。
５．粒子の精製及びイムノブロット法によるウイルスタンパク質の分析
トランスフェクションから７２時間後に、トランスフェクションを受けたＣＯ
Ｓ−７細胞からの培地を３０分間１０００×ｇで遠心分離した。０．２μｍのろ
過ユニット（Nalge Company，Rochester，NY）を通して上清をろ過し、２０００
０rpm （Beckman SW28ローター）で３mlの２０％シュークロースクッションを通
してこれを２時間遠心分離した。ウイルスを含まない上清を廃棄し、残留液を乾
燥した綿棒で遠心分離管から除去した。ウイルス沈殿物を試料緩衝液内で溶解さ
せ、１２％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分離させた。ショ糖勾配による粒子のさらなる精製のため、ウイルス沈殿物をＴ
ＮＥ緩衝液（０．０１Mトリス−ＨＣｌpH７．２、０．、１MＮａＣｌ、０．００
１MＥＤＴＡ）の中に溶解させ、ショ糖勾配の上に重畳させた。ショ糖勾配は、
２．５％の増分で６０％から２０％まで減少したＴＮＥ緩衝液内の２mlのショ糖
の段階的重畳によって調製された。試料を２００００rpm（Beckman SW28ロータ
ー）で２０時間遠心分離し、遠心分離管の底から１８の分画を滴下式に収集した
。最高のＲＴ活性を有する分画を用いて粒子を分離し、前述のようにこれらの分
画をイムノブロット法により分析した。
６．間接免疫蛍光検定
トランスフェクションから６０時間後に細胞をリン酸緩衝溶液で２回洗浄し、
ｇｐ１２０に対する１：１０希釈のマウスモノクローナル抗体（Du Pont 社，Wi
lmington，DE）を用いて室温で６０分間インキュベートした。次に細胞をリン酸
緩衝溶液で３回洗浄し、蛍光イソチオシアン酸塩接合ヤギ抗マウス抗体（Becton
Dickinson，San Jose，Calif）の１：２５希釈液を用いて室温で４５分間イン
キュベートした。細胞をリン酸緩衝溶液で３回洗浄し、蛍光顕微鏡下での検査の
前に１％のパラホルムアルデヒドで固定させた。
７．優性ネガティブ変異体検定
一定の与えられたｇｐ４１変異体によって付与された、優性ネガティブ表現型
が存在するか否かを決定するために、野生型又は野生型＋変異体ＤＮＡをＳｕｐ
Ｔ１細胞内にトランスフェクションする。トランスフェクションを受けた細胞の
上清中のＲＴ活性によって、ウイルス複製をモニターする。
ＳｕｐＴ１細胞（１０7）をリン酸緩衝食塩水で一度洗浄し、ＥＤＡＥ−デキ
ストラン６００μｇ及びＤＮＡ６μｇを含むＴＤ緩衝液３mlの中に再懸濁させる
。各々のＳｕｐＴ１トランスフェクションのために使用されるＤＮＡは、以下の
ようなものである：偽（mock）、ｐＵＣ１８（６μｇ）；野生型ＨＸＢ２Ｒ３（
１μｇ）及びｐＵＣ１８μｇ；野生型＋変異体ＨＸＢ２Ｒ３（１μｇ）、及び上
述の通りの適切なベクター中の変異体（約５μｇ）。
トランスフェクションは室温で２０分間行なう。トランスフェクションを受け
たＣＯＳ−７細胞の細胞を含まない上清を用いることにより、ＳｕｐＴ１細胞で
ウイルス感染力を試験する。逆転写酵素（ＲＴ）検定（上述のもの）において使
用される試料は、トランスフェクション又は感染を受けた細胞の上清からのポリ
エチレングリコール沈降させたウイルスペレットから調製される。この検定は、
以前に記述された通りに行なわれる（Yu et al., J．Virol．64：5688-5693，19
90）。IV．治療用ｇｐ４１の作用様式
本明細書に示されている結果は、ｇｐ４１の細胞質ドメインがＨＩＶ感染にお
いて重要な役割を果たすことを表わしている。ｇｐ４１の細胞質ドメインからの
４３（ＴＭ８１２）、６１（ＴＭ７９５）、８１（ＴＭ７７５）、１０４（ＴＭ
７５２）及び１４７（ＴＭ７０９）アミノ酸の切除は、非感染性粒子を生み出し
た（図３）。これらの変異体粒子の分析によると、野生型粒子と比較した場合に
その他のウイルス構造タンパク質が正常なレベルで存在していたにもかかわらず
、ウイルスＥｎｖタンパク質の取込みは著しく損なわれていた（図４）。ｇｐ４
１（ＴＭ８４４）からの最後の１２個のアミノ酸の切除では、ウイルスの集合及
び放出又はウイルスＥｎｖタンパク質の取込みが著しく減少させられることはな
かった（図４）。しかしながら、変異体ＴＭ８４４ウイルスの感染力は、野生型
ウイルスに比べ顕著に減少した（図３）。この事実は、ｇｐ４１の細胞質ドメイ
ンが集合以外のウイルス複製段階においても機能しうるということを示唆してい
る。ＴＭ８４４ウイルスの失活は、ＳｕｐＴ１及びＭＴ２細胞よりもＨ９細胞及
び新鮮なＰＢＭＣにおいてさらに顕著であったことから（図３）、細胞因子はウ
イル
ス複製におけるｇｐ４１細胞質ドメインの機能にも影響を及ぼし得たと思われる
。システインプロテアーゼとして作用しうるＶｉｆによってｇｐ４１の細胞質ド
メインが分割されるということが示唆されてきた（Guy et al., J．Virol．65：
1325-1331 (1987)）。推定切断部位は、変異体ＴＭ８４４の中に導入された停止
コドンにきわめて近い（Guy et al., J．Virol．65：1325-1331，(1987)）。野
生型ｇｐ４１がＴＭ８４４ｇｐ４１よりも遅く移動したという事実（図３）は、
少なくとも我々の研究における粒子精製段階においてはｇｐ４１の細胞質ドメイ
ンの分割が起こらなかったということを示唆している。
ｇｐ４１のＣ−末端からの１４７のアミノ酸の除去は、ＣＯＳ−７細胞内のウ
イルスＥｎｖタンパク質の定常状態レベルを顕著に低下させた（図５）。パルス
チェイス実験により示されているように、変異体Ｅｎｖタンパク質の合成は著し
く影響を受けなかった。したがって、ＴＭ７０９Ｅｎｖタンパク質の安定性は、
見かけ上野生型Ｅｎｖタンパク質に比べて減少した。最近になって、ｇｐ４１の
細胞質ドメイン内の変異が、変異Ｅｎｖタンパク質の安定性を低下し得るという
ことが報告された（Gabuzda et al., J．Virol．66：3306-3315 (1992)）。ＴＭ
７０９ｇｐ１２０は、野生型ｇｐ１２０よりもやや遅く移動し（図５）、このこ
とは、この変異体内でのこのｇｐ１２０のポリペプチド翻訳後の修飾が野生型ｇ
ｐ１２０のものと異なるものである可能性があるということを示唆していた。変
異体Ｅｎｖタンパク質の安定性の減少及び変異体ｇｐ１２０の異常な修飾は、ｇ
ｐ４１の細胞質ドメインがＥｎｖタンパク質の細胞内輸送を媒介するために重要
であるということを表わしている可能性がある。Ｖ．実施例
本発明を例示するために以下の実施例を示すが、本発明はそれらに限定されな
い。実施例１：ｇｐ４１変異体の構築
野生型プロウイルスクローンＨＸＢ２Ｒ３については、以前に記述されている
（Yu et al., J．Virol．66：4966-4971 (1992)）。ｇｐ４１コーディング領域
内の異なる位置で枠内停止コドンが生成された（図１、配列番号１及び図２）。
Ｔ
Ｍ７０９内の停止コドンは、推定上の膜貫通領域下流の２つのアミノ酸である。
恐らく停止トランスファーシグナルにとって重要であると思われる、７０７及び
７０９の位置にある２つの正に帯電したアルギニン残基は保存された。ＴＭ７５
２及びＴＭ７７５はそれぞれｇｐ４１細胞質ドメインの最初の４５個及び６８個
のアミノ酸を保持した。予想された両親媒性２−らせん（Venable et al., AIDS
Res．Hum．Retroviruses 5：7-22 (1989)）は、ＴＭ７５２及びＴＭ７７５ＴＭ
タンパク質の細胞質ドメインから欠失させられた。ＴＭ７９５及びＴＭ８１２内
の変異は、ｇｐ４１細胞質ドメインの最初の８８及び１０６個のアミノ酸を保存
し、予想された遠位両親媒性α−らせん（Venable et al., AIDS Res．Hum．Ret
roviruses 5：7-22 (1989)）を欠失させた。ＴＭ８４４における停止コドンは、
推定上のＶｉｆ分割部位（Guy et al., J．Virol．65：1325-1331 (1991)）のす
ぐ上流にあり、ｇｐ４１の最後の１２のアミノ酸が削除される。重複するｒｅｖ
読み取り枠のアミノ酸は、いずれの変異体においてもヌクレオチド置換により影
響されなかった。実施例２：ｇｐ４１変異体ウイルスの感染力
野生型及び変異体プラスミドＤＮＡでのトランスフェクションの後のＣＯＳ−
７細胞からウイルスが生成され（データは示さず）、このことは、ｇｐ４１の細
胞質ドメイン内の変異がウイルスの集合及び放出を遮断しないということを示唆
した。変異体ウイルスの感染力を、いくつかのＴ−リンパ球様細胞系統及びＰＢ
ＭＣで増殖する野生型ウイルスと比較した。以前に記述されたように（Yu et al
., J．Virol．66：4966-4971 (1992)）、細胞を含まない野生型及び変異体ウイ
ルスを調製し、感染力について分析した。変異体ＴＭ８４４を除いて、いずれの
変異体も、ＳｕｐＴ１、ＭＴ２、及びＨ９細胞又は新鮮なＰＢＭＣ内で生産的感
染を樹立しなかった（図３）。ＴＭ８４４の感染を受けたＭＴ−２及びＳｕｐＴ
１細胞においてはウイルス産生が検出されたが、これらの細胞内のＴＭ８４４複
製の速度は、野生型ウイルスのものに比べ非常に緩慢であった（図３）。ＴＭ８
４４ウイルスは、ＳｕｐＴ１細胞内で野生型ウイルスよりも少なくとも対数２の
規模で感染力が低かった（データは示さず）。ＴＭ８４４ウイルス複製は、Ｈ９
細胞及びＰＢＭＣ内でさらに一層顕著に阻害され、そのため変異体ウイルス産生
は、
３０日の追従期間中、野生型ウイルス産生レベルに達することはなかった（図３
）。実施例３：イムノブロットによる粒子タンパク質の分析
変異体ウイルスの欠損を研究するため、イムノブロット法により、野生型及び
変異体のトランスフェクションを受けたＣＯＳ−７細胞の培養上清から収穫した
粒子を分析した。野生型粒子についてそうであったように、ｇａｇ遺伝子でコー
ドされたタンパク質ｐ２４及びｐ１７、及びｐｏｌ遺伝子でコードされたタンパ
ク質ｐ６６、ｐ５１及びｐ３４は、プールしたＨＩＶ陽性ヒト血清を用いて、変
異体粒子のすべてにおいて容易に検出された（図４ａ）。しかしながら、野生型
粒子とは際だった対照を見せて、検出されたｅｎｖ遺伝子でコードされたタンパ
ク質（ｇｐ１２０）のレベルは、ヒツジ抗ｇｐ１２０血清（図４ａ上図）又はプ
ールされたＨＩＶ陽性血清（図４ａ下図）によって検出されるとおり、変異体粒
子ＴＭ７０９、ＴＭ７５２、ＴＭ７７５又はＴＭ７９５において顕著に低下した
。変異体ｇｐ４１は、ＨＩＶ陽性血清によってこれらの変異体粒子内に検出され
なかった（図４ａ、下図）。変異体ＴＭ８１２については、ＨＩＶ陽性血清によ
って、いかなるｇｐ４１も検出されず、野生型粒子に比べ少ない量のｇｐ１２０
が検出された（図３ａ、下図）。野生型及び変異体ＴＭ８４４粒子には、比較可
能な量のｇｐ１２０及びｇｐ４１が検出された（図３ａ）。ＴＭ８４４ｇｐ４１
は、野生型ｇｐ４１よりもわずかに速く移動した（図３ａ）。
野生型ＴＭ８４４及びＴＭ７５２粒子を同様にショ糖勾配により精製し、もう
１つのプールしたＨＩＶ陽性血清を用いてイムノブロットにより分析した。この
プールしたＨＩＶ陽性血清は、記述された検定条件下で上で用いられた上述のも
のに比べ、ｇｐ１２０に対しより良好に反応した。変異体ＴＭ８４４粒子内で検
出されたｇｐ１２０及びｇｐ４１の量は、ショ糖勾配による精製の後もなお、野
生型粒子の量に匹敵するものであった（図４ｂ）。これとは対照的に、変異体Ｔ
Ｍ７５２粒子内で検出されたｇｐ１２０の量は、野生型粒子内に見られるものよ
りも著しく少ないものであった（図４ｂ）。ＴＭ７５２粒子内で検出されたｇｐ
１２０の量は、野生型粒子試料の４倍希釈に比較した場合、野生型粒子内で検出
されたものの２０％未満であると推定された（図４ｂ）。ｇｐ４１は、変異体Ｔ
Ｍ７５２粒子の中では検出されなかった。（図４ｂ）。同じＨＩＶ陽性血清を用
いて細胞溶解物を分析した場合、野生型及びＴＭ７５２のトランスフェクション
を受けたＣＯＳ−７細胞の中で、比較可能な量のｇｐ１２０及び野生型及び末端
切除されたｇｐ４１が検出された（図４ｂ）。このことは、変異体ＴＭ７５２粒
子内のＥｎｖタンパク質の検出の減少が、ＨＩＶ陽性血清の免疫反応性低下を原
因とするものではないことを示唆している。実施例４：ウイルスＥｎｖタンパク質の合成、プロセッシング、輸送及び細胞表 面での発現の分析
変異体ＴＭ７０９及びＴＭ７５２粒子内のＥｎｖタンパク質の取込みの減少が
、トランスフェクションを受けた細胞内の変異体Ｅｎｖタンパク質の発現の低下
に起因するものであったか否かを調べるために、野生型及び変異体ＴＭ７０９、
ＴＭ７５２及びＴＭ８４４のトランスフェクションを受けたＣＯＳ−７細胞内の
ウイルスタンパク質の発現を、放射免疫沈降法により分析した。ＣＯＳ−７細胞
内でのトランスフェクションの後、野生型のトランスフェクションを受けた細胞
内でｇｐ１６０及びｇｐ１２０が検出された（図５ａ）。類似した量のＧａｇポ
リタンパク質（ｐ５５）に対し数値変換された場合、類似した量のｇｐ１６０及
びｇｐ１２０が同様に、ＴＭ８４４及びＴＭ７５２のトランスフェクションを受
けた細胞の中で検出された（図５ａ）。ＴＭ８４４及びＴＭ７５２のｇｐ１２０
の移動は、野生型ｇｐ１２０と同様であり（図５ａ）、このことは、ＴＭ８４４
及びＴＭ７５２内の変異体が変異体Ｅｎｖタンパク質の発現及び処理に影響を及
ぼさなかったということを示唆していた。ＴＭ８４４及びＴＭ７５２のトランス
フェクションを受けた細胞の上清中にはｇｐ１２０が検出できたことから、ＴＭ
８４４及びＴＭ７５２のＥｎｖタンパク質の輸送は著しい影響を受けていなかっ
た（図５ａ）。ＴＭ７０９のトランスフェクションを受けた細胞内で検出された
ｇｐ１６０及びｇｐ１２０の量は、野生型のトランスフェクションを受けた細胞
の中で検出されたものよりもはるかに少なかった（図５ａ）。さらにＴＭ７０９
のｇｐ１２０は、野生型のｇｐ１２０に比べてやや遅く移動した（図５ａ）。Ｔ
Ｍ７０９のｇｐ１２０が、ＴＭ７０９のトランスフェクションを受けたＣＯＳ−
７細胞の培養上清の中で検出された（図４ａ）。このことは、細胞表面へのＥｎ
ｖタンパク質の輸送がなおもＴＭ７０９のトランスフェクションを受けた細胞内
で
起こり得たことを示唆している。
野生型、ＴＭ７５２及びＴＭ７０９のトランスフェクションを受けたＣＯＳ−
７細胞内のｇｐ１２０の細胞表面発現も同様に、間接免疫蛍光染色法によって解
析した。マウスモノクローナル抗−ｇｐ１２０抗体により、野生型及びＴＭ７５
２のトランスフェクションを受けた細胞の表面上で比較可能なレベルのｇｐ１２
０が検出された（図４ｂ）。このことはすなわち、ｇｐ１２０の表面固定がＴＭ
７５２内の細胞質ドメインの切除によって影響されなかったことを表している。
この観察された事実は、（ＴＭ７５２と同じく）ｇｐ４１のＣ末端からの最後の
１０４個のアミノ酸の切除がウイルスＥｎｖタンパク質の表面発現に影響を及ぼ
さなかったという以前の報告（Earl et al., J．Virol．65：31-41 (1991)）と
一致している。ＴＭ７５２とは対照的に、細胞表面上でＥｎｖタンパク質を発現
する変異体ＴＭ７０９の能力は、ＴＭ７０９のトランスフェクションを受けたＣ
ＯＳ−７細胞の表面上でｇｐ１２０の免疫蛍光染色が欠如していたことによって
示されているように、大幅に低下した。VI．その他の実施態様
ｇｐ４１ポリペプチド
前述のとおり、本発明は、この出願の他の箇所で記述されている変異体ＨＩＶ
ｇｐ４１タンパク質又はかかる変異体に対して相同性を有するタンパク質（又は
タンパク質をコードする核酸）を用いた治療法を含んでいる。同様に、アレル変
異体；天然変異体；誘発変異体；高い緊縮性条件（例えば少なくとも４０ヌクレ
オチドのプローブ長で４０℃で２×ｓｓｃにて洗浄）の下で自然に発生するｇｐ
４１コーディング核酸に対しハイブリッド形成するＤＮＡ（高低緊縮性のその他
の定義については、本書に参考として含まれているCurrent Protocols in Molec
ular Biology，John Wiley & Sons，New York，1989，6.3.1-6.3.6を参照のこと
）によりコードされたタンパク質が、本発明に含まれる。この用語は同様に、関
係のない配列と共にｇｐ４１を含むキメラポリペプチドをも含んでいる。
また、本発明には、ｇｐ４１の生物学的に活性なあらゆるフラグメント又は類
似休が含まれる。「生物学的に活性な」というのは、図２及び図７に示され明細
書の第Ｉ節で記述された構成体がコードするｇｐ４１の特徴である、治療上有用
な抗ＨＩＶ活性を有することを意味している。ｇｐ４１フラグメント又はｇｐ４
１類似体の治療上有用な活性は、例えば優性ネガティブ変異体といったような、
本出願において記述されている検定などのさまざまな検定のうちの１つ（又は複
数）において決定することができる。優性ネガティブ検定において、１日〜１０
日の検定期間で、野生型に比べ最も好ましくは５分の１以上、好ましくは４分の
１以上の減少を有するか、または、抗ＨＩＶ活性についてのあらゆるin vivo又
はin vitroのｇｐ４１検定（記述されているもののような）において、抗原誘発
されていない野生型ＨＩＶでの対照感染に対する抗ＨＩＶ活性に比較して、少な
くとも２分の１の減少を有するｇｐ４１類似体が、生物学的に活性であり本発明
において有用であるとみなされる。
好ましい類似体には、例えば同じクラスのもう１つのアミノ酸による１つのア
ミノ酸の置換（例えばグリシンに対するバリン、リジンに対するアルギニンなど
）といった保存的なアミノ酸置換のみ、又はin vivo又はin vitroの系で（例え
ば上述の感染力及び優性ネガティブ検定を用いて）測定されるような、ポリペプ
チドの関連する抗ＨＩＶ活性を破壊しない単数又は複数の非保存的アミノ酸置換
、欠失又は挿入のみによって指示された、ｇｐ４１変異体配列と異なった配列を
有する変異体ｇｐ４１（又はその生物学的に活性なフラグメント）が含まれてい
る。好ましい類似体には同様に、ペプチドの安定性を増大させる目的で修飾され
たｇｐ４１（又はその活性フラグメント）も含まれる；かかる類似体は、例えば
、ペプチド配列内に単数又は複数の脱飽和ペプチド結合又はＤ−アミノ酸を含ん
でいるてもよい。
類似体は、アミノ酸配列の相違、配列に影響を及ぼさない修飾又はその両方に
よって、天然に存在するｇｐ４１と異なっていてもよい。本発明の類似体は一般
に、天然に存在するｇｐ４１の配列の全部又は一部分と、少なくとも６５％、よ
り好ましくは８０％、より一層好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％
、さらには９９％の相同性を示す。比較される配列の長さは一般に少なくとも約
１５個のアミノ酸残基、好ましくは４０個以上のアミノ酸残基となる。修飾には
、in vivo又はin vitroのペプチドの化学的誘導体合成、例えばアセチル化、グ
リコシル化又はカルボキシル化が含まれる。同様に本発明に包含されるのは、例
えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホトレオニンといった、ホスホリル
化ア
ミノ酸残基を有する同一の一次アミノ酸配列のものである。類似体は、その一次
配列の変更という点で、天然に存在するｇｐ４１と異なっている可能性がある。
これらには、天然の及び誘導された遺伝的変異体が含まれる。同様に本発明に含
まれているのは、天然には存在しないＬ−アミノ酸以外のアミノ酸、例えばＤ−
アミノ酸、天然には存在しないアミノ酸又は合成のアミノ酸、例えばβ又はγア
ミノ酸である。あるいは、ペプチド分子を環化することにより、増大した安定性
を付与することができる。
実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明には同様に、ポリペプチドの生
物学的に活性なフラグメントも含まれている。本書で使用されているように、ポ
リペプチドに適用される「フラグメント」とは、通常、長さが少なくとも約１０
の隣接するアミノ酸、典型的には少なくとも約２０の隣接アミノ酸、より典型的
には少なくとも約３０の隣接アミノ酸、普通は少なくとも約４０の隣接アミノ酸
、好ましくは少なくとも約５０の隣接アミノ酸、そしてさらに好ましくは少なく
とも約６０〜８０以上の隣接するアミノ酸である。ｇｐ４１のフラグメントは、
当業者にとって既知の方法により生成されうる。ｇｐ４１の生物学的活性を示す
候補であるフラグメントの能力は、以下に記述する方法によって評価可能である
。同様に含まれるのは、ポリペプチドの治療上の活性にとって必要とされない付
加的なアミノ酸を含むか、オールターナティブｍＲＮＡスプライシング又はオー
ルターナティブタンパク質プロセッシングの結果得られる付加的なアミノ酸を含
む、タンパク質のプロセッシングにおいて通常除去されるアミノ酸を含有するｇ
ｐ４１ポリペプチドである。
本発明は同様に、ｇｐ４１タンパク質に対して相同性を有するか又はｇｐ１６
０遺伝子に対して相同性を有し、かつＨＩＶ感染を受けた個体の治療にとって有
用であるポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）を含む。相同性を
有すると考えられる配列は、７０％相同な配列である。相同性というのは、２つ
のポリペプチド分子又は２つの核酸分子の間の配列類似性のことである。比較さ
れる２つの配列の双方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸の単量体サブユニ
ットによって占有されている場合、例えば２つのＤＮＡ分子の各々の中の１つの
位置がアデニンにより占有されている場合、分子はその位置において相同である
。２つの配列の間の相同性は、２つの配列により共有される、整合している位置
、
つまり相同な位置の数の関数である。例えば、２つの配列中の位置の１０のうち
６が一致しているか、又は相同である場合、２つの配列の相同性は６０％である
。一例を挙げると、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性
を共有している。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4Ｃ
Ｃ１２Ｎ 7/01
15/09
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ
// Ｃ０７Ｋ 14/155 8318−4Ｈ
特許法第30条第１項適用申請有り 1992年７月19日〜24
日に開催された、「ＶＩＩＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＡＩＤＳ」におい
て文書をもって発表
(72)発明者 リー チュン ホウ
アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ニ
ュートン ファリナ ロード 80