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Die vorliegende Erfindung betrifft
Proteinfragmente (Peptide) des humanen Immundefizienzirus (HIV) mit
antiviraler Funktion. Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäuren, die
für den
zytoplasmatischen Bereiches des HIV-Glykoproteins gp41 kodieren,
die durch diese Nukleinsäuren
kodierten Peptide, sowie die Verwendung dieser Peptide und Nukleinsäuren zur
gezielten Hemmung viraler Infektionen.
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Die weltweite Ausbreitung des humanen
Immundefizienzvirus (HIV) führte
bis heute zu 40 Millionen HIV-Infizierten (UNAIDS, 2001) mit täglich 15.000
Neu-Infektionen. Für
diese globale Infektion ist eine Vielzahl von bis heute nachgewiesenen
HIV-Varianten (HIV-1 Gruppen M, O und N sowie HIV-2) verantwortlich.
HIV-infizierte Patienten werden zur Zeit mittels anti-retroviraler
Wirkstoffe behandelt, die zu einer substantiellen Reduktion der
Virusreplikation im Patienten führt
und damit direkt dem Zusammenbruch des Immunsystems entgegenwirkt.
Es ist bereits bekannt, dass diese anti-retroviralen Medikamente
spezifisch virale Enzyme (Reverse Transkriptase-Inhibitoren, RTI
und NNRTI, Protease Inhibitoren, PI) inhibieren und dadurch eine
Reduktion von im Blut zirkulierenden Viruspartikel auf nicht nachweisbare
Mengen bewirken. Diese Reduktion ist jedoch nur möglich, wenn
eine Kombinationstherapie verschrieben und über einen längeren Zeitraum befolgt wird.
Daher ist diese sogenannte hoch-aktive anti-retrovirale Therapie
(HAART) nur in Ländern
durchführbar, die über ein
ausgebautes und funktionierendes Gesundheitssystem und die über die
nötigen
finanziellen Mittel zur Bereitstellung dieser Medikamente verfügen.
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Aufgrund der hohen Fehlerrate bei
der Replikation der Retroviren kommt es schnell zu Resistenzentwicklung,
wenn die Medikamente nicht in der vorgeschriebenen Dosis eingenommen
werden. Dies führte
zur Entwicklung von bisher über
20 anti-retroviralen Medikamenten, die in verschiedenen Kombinationen
zu einer langanhaltenden Suppression der Virusreplikation führen können. Eine
Eliminierung von HIV aufgrund dieser langanhaltenden Suppression
findet jedoch nicht statt, da das Virus in latenten Reservoirs überdauern
und auf sehr niedrigem Niveau weiter replizieren kann.
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Um die vorstehend geschilderten Nachteile
zu vermeiden, wurde im Zuge der Entwicklung einer effektiven HIV-Vakzine
nach HIV-Proteinfragmenten oder Peptiden gesucht, die in andere
(frühere)
Mechanismen als die Virusreplikation, wie zum Beispiel bereits beim
Eintritt des Virus in die Wirtszelle, eingreifen. Der gerichtete
Zelleintritt (Tropismus) des HIV erfolgt zum großen Teil mittels seines äußeren, glykosylierten
Hüllprotein gp120.
Dieses Protein wird als gp160-Vorstufe vom sogenannten env-Leserahmen
(envelope) des viralen Genoms kodiert. Nach der Translation wird
das gp160-Vorstufenprotein durch eine zelluläre Protease in gp120 und in
das Transmembranprotein gp41 gespalten. Beide Proteine sind für die Bindung
des Virus an den zellulären
Rezeptor und den anschließenden
Eintritt in die Zelle essentiell. Die Bindung an die entsprechenden Oberflächenrezeptoren
der infizierten Zelle (CD4-Rezeptor der T-Helferzellen und Makrophagen;
Chemokinrezeptoren) führt
zu konformationellen Umlagerungen und schließlich zur Fusion der viralen
Membran mit der Membran der Wirtszelle.
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Im Blickpunkt der vorliegenden Erfindung
stehen Peptide des Transmembranproteins gp41, das die Fusion des
HIV mit der Wirtszelle vermittelt. Gp41 besteht aus einer extrazellulären Domäne mit zwei
stark konservierten helikalen Bereichen (DP-107, DP-178), aus einem Transmembrananker
sowie einer 152 Aminosäuren
langen intrazellulären
Domäne.
Die Patentanmeldung WO 01/51673 beschreibt u.a. die Verwendung von
Peptiden der helikalen Bereiche DP-107 und DP-178 zur Hemmung der
Fusion zwischen HIV und der Wirtszelle und damit die Hemmung einer
weiteren Propagierung des Virus. DP-178, das dem Fachmann auch als
T-20 sowie als ,entry'-Inhibitor
bekannt ist, wird bereits mit vielversprechenden Ergebnissen in
ersten klinischen Studien eingesetzt (s. Kilby et al., Nature Med.
1998 Nov; 4(11): 1232-3).
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Neben der Entwicklung von Peptidinhibitoren
hat in den letzten Jahren auch die somatische Gentherapie als neues
Therapiekonzept an Bedeutung gewonnen. Mit Hilfe dieses Konzeptes
ist es möglich,
die Hauptzielzellen der HIV-Infektion gezielt zur Produktion intrazellulärer anti-retroviraler
Agenzien zu veranlassen, ohne auf die Einnahme von Therapeutika
angewiesen zu sein. Beispielsweise wird in
DE-A1 19957838 ein Nukleinsäurekonstrukt
offenbart, das für
eine membranständige
Form der extrazellulären
T-20-Region von gp41 kodiert. Die gentechnische Expression der offenbarten
Nukleinsäure
hemmt den durch die HIV-Hüllproteine
vermittelten Eintritt des Virus in die Zelle.
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Der intrazelluläre Bereich von gp41 ist zur
Zeit noch wenig untersucht. Es konnten Domänen bestimmt werden, die für den Transport
des gp41 zur Plasmamembran notwendig sind (YXXO-Motiv); zwei helikale
Bereiche, die für
die Bindung an intrazelluläre
Membranen notwendig sind (LLP1/LLP2), und ein Leuzin-Zipper Bereich,
der für
die Generation infektiöser
Partikel notwendig ist. Keine Studien wurden bisher publiziert,
die eine direkte Rolle des intrazellulären Bereiches von gp41 beim
Zelleintritt beschreiben.
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Es wurde nun gefunden, dass man eine
HIV-Ausbreitung in HIV-infizierten Zellen verhindern kann, wenn
man in den betroffenen Zellen Nukleinsäurekonstrukte, die für den intrazellulären Teil
von gp41 kodieren, exprimiert. Im Gegensatz zu der in
DE-A1 199 57 838 beschriebenen
Erfindung wird demnach eine Phase der Virusreplikation inhibiert,
die bereits im Innern der infizierten Zelle stattfindet, also zeitlich
später.
Es lassen sich somit gezielt verschiedene Stufen einer HIV-Infektion
ausschalten. Der unerwartete Effekt wurde unter anderem dadurch
erzielt, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäure zusätzlich für ein Peptid
kodiert, welches der Membranverankerung des gp41-Anteils dient.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist daher eine Nukleinsäuresequenz
der allgemeinen Formel
5'-(Marker)-MSD-intrazellulärer Bereich
gp41-3'
wobei
„5'" das 5'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet,
„ 3'" das 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz bezeichnet,
„(Marker)" eine optional vorhandene
DNA-Region, die für
ein extrazelluläres
Peptid zum Nachweis des Konstrukts kodiert, bezeichnet,
„MSD" die für eine „membrane
spanning domain" kodierende
DNA-Region, Fragmente oder Derivate davon, bezeichnet,
und
„intrazellulärer Bereich
gp41" eine DNA-Region,
für den
intrazellulär
exprimierten Bereich des gp41, eines Fragments oder Derivates davon,
von HIV kodiert, bezeichnet.
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Die Erfindung betrifft außerdem Nukleinsäuren der
allgemeinen Formel
5'-MSD-(Marker)-intrazellulärer Bereich
gp41-3'
sowie
5'-MSD-intrazellulärer Bereich
gp41-(Marker)-3'
sowie
Fragmente und Derivate besagter Nukleinsäuren.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
umfasst die Bezeichnung „HIV" sämtliche
Virus-Subtypen von
sowohl HIV-1 als auch HIV-2.
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Als „gp41" kommen für die vorliegende Erfindung
sämtliche
gp41-Varianten aller HIV-Subtypen
in Frage. Ein Beispiel für
eine für
den intrazellulären
Bereich eines geeigneten gp41 kodierende Nukleinsäure stellt die
Nukleinsäuresequenz
von Nukleinsäure
2089 bis 2580 der Genbank-Zugangsnummer U05352 dar. Die Erfindung
ist jedoch nicht darauf beschränkt.
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Im Sinne der vorliegenden Erfindung
bezieht sich die vorstehende Bezeichnung „Fragment und Derivat" auf DNA-Sequenzen,
die für
den intrazellulär
exprimierten Bereich von gp41 kodieren, bei denen mindestens ein
Nukleotid der in Frage kommenden Sequenzen durch mindestens ein
Nukleotid, das von dem ursprünglichen
verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf gp41-DNA-Sequenzen,
bei denen die ursprüngliche
Nukleotidsequenz entweder am 5'-,
am 3'- oder an beiden
Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder
an einem Ende verkürzt
und am anderen Ende verlängert
ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des
kodierten gp41-Bereichs erhalten bleibt. Ein Beispiel für eine verkürzte Form
des intrazellulär
exprimierten Bereichs von gp41 stellt die Nukleinsäuresequenz
von Nukleinsäure 2089
bis 2226 der Nukleinsäuresequenz
mit der Genbank-Zugangsnummer U05352 dar. Die Erfindung ist jedoch
nicht darauf beschränkt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der „intrazelluläre Bereich
gp41" die in SEQ
ID NO: 1 dargestellte Sequenz (FRES-A), Fragmente und Derivate davon.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst der „intrazelluläre Bereich
gp41" die in SEQ ID
NO: 3 dargestellte Sequenz (FRES-B), Fragmente und Derivate davon.
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Analog zu dem vorgenannten bezieht
sich „Fragmente
und Derivate" auf
DNA-Sequenzen die für
eine MSD kodieren, bei denen mindestens ein Nukleotid der ursprünglichen
Sequenz durch mindestens ein Nukleotid, das von dem ursprünglichen
Nukleotid verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf MSD-DNA-Sequenzen,
bei denen die ursprüngliche
Nukleotidsequenz entweder am 5'-,
am 3'- oder an beiden
Enden und/oder innerhalb der Sequenz entweder verlängert, verkürzt oder
an einem Ende verkürzt
und am anderen Ende verlängert
ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des
kodierten MSD-Bereichs erhalten bleibt.
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Die Erfindung schließt verschiedene
Möglichkeiten
zur Verankerung des von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierten
Peptids an der Membran ein. „MSD" kann daher für ein Peptid
kodieren, das ein Motiv zur intrazellulären Anhängung eines Membranankers birgt,
z.B. Myristoyl-, bzw. Prenyl oder CaaX-Motiv. Für die vorliegende Erfindung
ist es jedoch zweckmäßig, aber
nicht zwingend erforderlich, wenn „MSD" für
einen Transmembrananker eines Typ I – Transmembranproteins kodiert.
Unter einem Typ I – Transmembranprotein versteht
der Fachmann ein Transmembranprotein mit extrazellulärem Amino-
und intrazellulärem
Carboxyterminus.
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Geeignet für die Erfindung sind demnach
MSD aller dem Fachmann zugänglichen
Typ I-Transmembranproteine.
Bevorzugt sind MSD von Typ I-Transmembranproteinen, die ausgewählt sind
aus der nicht abschließenden
Liste von Beispielen wie Ribophorin I und II, MHC-Klasse I, HIV-1-Vpu,
Synaptotagmin II, Maus-CMV-gp48, Mensch-CMV-US11, Calnexin, PERK,
UDP-Glucuronosyltransferase, low affinity nerve growth factor receptor
(LNGFR) oder CD34. Besonders bevorzugt sind MSD von LNGFR oder CD34.
Ganz besonders bevorzugt ist die MSD, ein Fragment oder Derivat
davon, von LNGFR.
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Als „Marker" zum Nachweis der durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure kodierten
Peptide kommen verschiedene Peptide bzw. dafür kodierende DNA-Sequenzen
in Betracht. Generell schließt
die Erfindung alle extrazellulären
Domänen
ein, die sich für
einen Nachweis, beispielsweise für
einen immunologischen Nachweis, eignen. Für die vorliegende Erfindung
eignen sich besonders sogenannte Reportergene oder andere Gene,
die für
Proteine bzw. Peptide kodieren, deren Anwesenheit leicht zu bestimmen
ist. Marker, die sich zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung eignen, können ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend
sogenannte „epitope-tags" (c-Myc, Hämagglutinin, FLAG),
Biotin, Digoxygenin, Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase,
Green Fluorescent Protein (GFP) und Derivate davon mit veränderter
Fluoreszenz (EGFP, EYFP, EFCP), β-Galactosidase,
Luciferasen, β-Glucuronidase
und β-Lactamase.
Verfahren zum Nachweis der vorstehenden Marker sind dem Fachmann
bekannt.
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In einer weiteren Ausführungsform
kodiert der Marker für
eine inaktive T-20-Variante, welche nicht den vorher beschriebenen
Effekt, nämlich
eine fusionsinhibierende Wirkung, aufweist. In diesem Falle erfolgt
der Nachweis mittels dem Fachmann bekannter Methoden unter Verwendung
von T-20-spezifischen Antikörpern, z.B.
Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS), Western Blot, Immunpräzipitation,
Enzyme-linked Immunoadsorbent Assay (ELISA) oder Radioactive Immunoadsorbent
Assay (RIA). Vorteilhaft ist es, wenn der zum Nachweis verwendete
Antikörper
mit einem Molekül
gekoppelt ist, das den Nachweis ermöglicht oder dazu beiträgt. Geeignet
hierfür
sind beispielsweise Biotin, Meerrettichperoxidase, Alkalische Phosphatase,
Fluoreszein-Isothiocynat (FITC), Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat
(TRITC), Diamidinophenylindol (DAPI) und Phycoerythrin.
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Für
die vorliegende Erfindung kann es auch wünschenswert sein, wenn die
erfindungsgemäße Nukleinsäure keinen
für einen
Marker kodierenden Bereich enthält.
Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Nukleinsäure für (gen-)therapeutische
Zwecke eingesetzt wird. Dann ist es wichtig, wenn die Nukleinsäure für ein möglichst
kleines Peptid kodiert und das besagte Peptid möglichst frei von zusätzlichen,
für die
Wirkung abdingbaren Fremdanteilen ist, die sich möglicherweise
ungünstig
auf den physiologischen Zustand der Zielzelle auswirken.
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Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur
Expression des von ihr kodierten Peptids in Zellen, insbesondere
HIV-infizierten Zellen, eingesetzt.
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Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die
Wirts- bzw. Zielzelle (Transfektion bzw. Transformation) stehen
dem Fachmann zahlreiche Verfahren – abhängig von der gewählten Wirtszelle – zur Verfügung. Die
einfachste Methode für
den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe/Zielzellen.
Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen
Zelle durch die sogenannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den
Zellkern. Besonders günstig
ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, die Kalziumchlorid,
Rubidiumchlorid, Litiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische Lipide,
Liposomen, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation
und Elektroporation, sowie beliebige Kombinationen davon umfassen.
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Für
die Expression und für
das Einbringen der Nukleinsäure
in die Zielzelle ist es von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einem
sogenannten Expressionsvektor inseriert ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
daher auch eine rekombinante DNA und einen Expressionsvektor, welche
die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Expressionsvektor um einen eukaryontischen,
insbesondere menschlichen, bakteriellen oder einen retroviralen
Vektor, ein Plasmid, Bakteriophagen oder um andere in der Gentechnik übliche Vektoren,
die zur Expression von Proteinen bzw. Peptiden geeignet sind. Falls
gewünscht
oder erforderlich, kann die Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektor mit
regulatorischen Elementen, die Transkription und Synthese einer
translatierbaren mRNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten,
operativ verbunden sein. Derartige regulatorische Elemente sind
Promotoren, Enhancer oder Transkriptionsterminationssignale, können aber
auch Introns oder ähnliche
Elemente sein, wie Elemente, welche die Stabilität und Vermehrung des Vektors,
die Selektion und/oder die Integration in das Wirtsgenom ermöglichen
oder dazu beitragen.
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In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen
retroviralen Vektor inseriert. Retroviren sind sogenannte RNA-Viren,
deren Genom nach Infektion einer Zelle revers in DNA transkribiert
und in das Wirtszell-Genom integriert wird. Die Aufnahme in die
Zelle erfolgt hierbei über
rezeptorgesteuerte Endozytose. Bei manchen retroviralen Vektoren
wird die Expression des Vektors nach Aufnahme eines Virus ausgeschaltet,
so dass die Zelle nur einmal infiziert wird. Die Integration der
viralen DNA in das Genom wird durch ein viralkodiertes Protein,
Integrase, bewirkt, wobei der Integrationsort unspezifisch ist.
Vektoren auf retroviraler Basis sind aufgrund der vorstehend genannten
Eigenschaften insbesondere für die
Gentherapie geeignet, denn sie werden durch die rezeptorgesteuerte
Endozytose effizienter aufgenommen, und effizienter integriert,
da der Prozess enzymatisch erfolgt. Der Fachmann kennt diesen Vorgang
auch unter der Bezeichnung „retrovirale
Transduktion".
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Dem Fachmann ist bekannt, wie solche
Vektoren mittels sogenannter „Packaging
Cells", die sogenannte
Helferviren im Genom tragen, in die Zielzelle eingeschleust werden.
Die Erfindung umfasst alle retroviralen Vektoren, die sich beispielsweise
von Onko-, Lenti- oder
Spumaviren ableiten.
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Beispielhaft für die vorstehend genannten
retroviralen Vektoren handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Vektor
um M87m3 (M3) (siehe Hildinger et al., 2001, J. Virol., Vol 75,
Seiten 3038-3042), der zusätzlich den
kodierenden Bereich für
eine MSD und für
einen Marker (hier: inaktive T20-Variante) enthält. Diese Elemente sind für die Erfindung
jedoch nicht zwingend erforderlich, sondern können weggelassen oder gegen gleichartig
wirkende Elemente ausgetauscht werden. Für die Erfindung ist es vorteilhaft,
wenn die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gemäß SEQ ID
NO: 1 und SEQ ID NO: 3 unter Wahrung des Leserahmens unmittelbar
an das 3'-Ende der
für eine
MSD kodierende Nukleinsäuresequenz
inseriert werden.
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Die Erfindung umfasst außerdem ein
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, eines Fragments
oder Derivats davon, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert
wird. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Einbringen
eines erfindungsgemäßen Vektors,
der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, in eine geeignete
Wirtszelle mittels geeigneter Methoden, wobei die Wirtszelle pro-
oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten
Wirtszelle und (c) Isolierung des rekombinanten Proteins aus der
Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium.
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Falls gewünscht oder erforderlich können die
gemäß Schritt
(c) isolierten Proteine für
andere Zwecke weiter aufgereinigt werden. Der Fachmann kennt hierfür zahlreiche
Methoden, z.B. Salzfraktionierung, Größenausschlusschromatografie,
Ionenaustauschchromatografie, Reverse-Phase-Chromatografie, Affinitätschomatografie
und ähnliches.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist weiterhin ein von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiertes
Fusionspeptid der allgemeinen Formel
NH2-(Marker)-MSD-intrazellulärer Bereich
gp41-COOH
wobei
„NH2" das
aminoterminale Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„COOH" das carboxyterminale
Ende des Fusionspeptids bezeichnet,
„(Marker)" ein optional vorhandenes, extrazelluläres Peptid
zum Nachweis des Fusionspeptids bezeichnet,
„MSD" eine „membrane
spanning domain",
ein Fragment oder Derivat davon, bezeichnet,
und
„intrazellulärer Bereich
gp41" den intrazellulär exprimierten
Bereich des gp41, ein Fragment oder Derivat davon, bezeichnet.
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Die Erfindung betrifft außerdem Fusionspeptide
der allgemeinen Formeln
NH2-MSD-(Marker)-intrazellulärer Bereich
gp41-COOH
sowie
NH2-MSD-intrazellulärer Bereich
gp41-(Marker) COOH
sowie Fragmente und Derivate von besagten
Fusionspeptiden.
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Für
die vorliegende Erfindung kann es auch wünschenswert sein, wenn das
erfindungsgemäße Fusionspeptid
keinen Marker enthält.
Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das Fusionspeptid für therapeutische
Zwecke eingesetzt wird. Dann ist es wichtig, wenn das Fusionspeptid
möglichst
klein und möglichst
frei von zusätzlichen,
für die
Wirkung abdingbaren Fremdanteilen ist, die sich möglicherweise
ungünstig
auf den physiologischen Zustand der Zielzelle auswirken.
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In Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung bezieht sich die vorstehende Bezeichnung „Fragment
und Derivat" auf
Aminosäuresequenzen
des intrazellulär
exprimierten Bereiches von gp41, bei denen mindestens eine Aminosäure einer
geeigneten gp41-Sequenz durch mindestens eine Aminosäure, die
von der ursprünglichen
verschieden ist, ersetzt werden kann, oder auf gp41-Aminosäuresequenzen,
bei denen die ursprüngliche
Aminosäuresequenz
entweder am amino-, am carboxyterminalen oder an beiden Enden und/oder innerhalb
der Sequenz entweder verlängert,
verkürzt
oder an einem Ende verkürzt
und am anderen Ende verlängert
ist, vorausgesetzt, dass die Funktion und biologische Wirkung des
gp41-Bereiches erhalten bleibt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der „intrazelluläre Bereich
gp41" die in SEQ
D NO: 2 dargestellte Sequenz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst der „intrazelluläre Bereich gp41" die in SEQ ID NO:
4 dargestellte Sequenz.
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Hinsichtlich der Definitionen von „Macker", „HIV" und „MSD" gelten die vorstehend
für die
erfindungsgemäße Nukleinsäure gemachten
Angaben, wobei diese dann auf Proteinebene bezogen sind.
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In einem weiteren Aspekt führt die
Insertion der Nukleinsäuresequenz
in erfindungsgemäße, gentherapeutisch
anzuwendende Vektoren und das Einbringen der erfindungsgemäßen Vektoren
in HIV-infizierte Zellen zur Expression eines Fusionspeptides, wodurch
eine starke Hemmung der HIV-Replikation verursacht wird. Die Erfindung
betrifft daher auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors
für die
Behandlung von HIV-Infektionen.
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In diesem Zusammenhang betrifft die
Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der HIV-induzierten Zellfusion, wobei dieses
das Inkontaktbringen und die Transfektion/virale Transduktion der
HIV-infizierbaren Zelle mit dem erfindungsgemäßen Vektor umfasst. Günstig zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens ist
die Anwesenheit der vorgenannten Reagenzien bzw. der Einsatz der
vorstehend genannten Methoden, die dem Fachmann bekannt sind und
die eine Aufnahme der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die
Zelle ermöglichen
bzw. dazu beitragen.
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Als mögliche Zielzellen für eine Transfektion/virale
Transduktion mit einem erfindungsgemäßen Vektor sind alle Zellarten
denkbar. Besonders bevorzugt für
das vorstehend genannte Verfahren sind T-Lymphozyten und/oder hämatopoetische
Stammzellen. Ganz besonders bevorzugt sind T-Lymphozyten.
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Weiterhin betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Hemmung der HIV-induzierten Zellfusion, wobei
dieses das Inkontaktbringen der HIV-infizierbaren Zelle mit dem
erfindungsgemäßen Fusionspeptid
oder eines Fragments oder Derivats davon umfasst. Das Verfahren
kann in vitro in einer wässrigen
Lösung,
in vivo in einem geeigneten Zellkultur-Assay, oder in einem Lebewesen mittels
geeigneter Verabreichungsformen durchgeführt werden.
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Die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder der erfindungsgemäße Vektor
und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid
können
im Sinne der vorliegenden Erfindung als Arzneimittel, optional in
Kombination mit einem geeigneten Trägerstoff, verwendet werden.
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Dabei ist es unerheblich, ob die
erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder
der erfindungsgemäße Vektor
und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid
alleine oder in Kombination mit anderen aktiven Substanzen verabreicht
werden. Die Verabreichung der aktiven Substanzen kann gleichzeitig
oder nacheinander erfolgen. Die Dosis und/oder die Einwirkzeit des
Arzneimittels ist variabel und hängt
vom physiologischen Zustand der zu behandelnden Person ab. Dabei
können
Alter, Gewicht und Geschlecht des Patienten eine Rolle spielen.
Außerdem
kann es von Bedeutung sein, ob die Krankheit akut, chronisch oder
prophylaktisch behandelt werden muss.
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In einer weiteren Ausführungsform
werden die erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder
der erfindungsgemäße Vektor
und/oder das erfindungsgemäße Fusionspeptid
zur Herstellung eines Arzneimittels, optional in Verbindung mit
einem pharmazeutisch geeigneten Trägerstoff, für die Behandlung von HIV-infizierten Patienten
verwendet.
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Die Herstellung solcher Arzneimittel
sind dem Fachmann bekannt. Für
die Stabilität
und Wirksamkeit des Arzneimittels ist gegebenenfalls die Anwesenheit
von Stabilisatoren und Trägersubstanzen
wie Stärke, Laktose,
Stearinsäure,
Fette, Wachse, Alkohole oder physiologische Kochsalzlösungen oder
anderer Additiva wie Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Geschmacksstoffe
erforderlich. Arzneimittel in flüssiger
Form lassen sich, falls erforderlich, lyophilisieren.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
demnach auch ein Arzneimittel, das, optional in Kombination mit
weiteren, pharmazeutisch verträglichen
Substanzen und Trägerstoffen,
eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder
einen erfindungsgemäßen Vektor
und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionspeptid
enthält,
und das für
die Behandlung von HIV-infizierten
Patienten geeignet ist.
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Die Verabreichung des Arzneimittels
kann oral erfolgen, z.B. in Form von beschichteten oder unbeschichteten
Tabletten, Granulaten, harten und weichen Gelatinekapseln, oder
sie kann rektal in Form von Zäpfchen
erfolgen. Das Arzneimittel kann auch parenteral – unter Umgehung des Verdauungsapparates – z.B. subkutan,
intramuskulär
oder intravenös
in Form von Lösungen
für Infusionen
oder Injektionen verabreicht werden. Andere geeignete Darreichungsformen
betreffen direkte Applizierungen (z.B. auf die Haut) in Form von Salben,
Tinkturen, Sprays oder transdermalen therapeutischen Mitteln, oder
zu inhalierende Mittel in Form von Nasensprays, Aerosolen, oder
in Form von Mikrokapseln, Implantaten oder Stäbchen. Die geeignete Darreichungsform
hängt von
der Art und der Schwere der Krankheit ab.
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Schließlich betrifft die vorliegende
Erfindung ein Kit, das zur Behandlung von HIV-infizierten Patienten eingesetzt werden
kann, wobei das Kit mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder
einen erfindungsgemäßen Vektor
und/oder ein erfindungsgemäßes Fusionspeptid
umfasst.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Zeichnung 1: Schematische
Darstellung des Fusionspeptids zur Inhibition der HIV-Replikation
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- (A) bezeichnet den Ausgangsvektor M3, „LTR" steht für „Long Terminal
Repeat", „SP" steht für „Signalpeptid", M3(T20) bezeichnet
eine inaktive Variante des T20-Peptids, „hinge" bezeichnet ein Verbindungsstück, „MSD" steht für „Membrane
Spanning Domain" (Erläuterung
siehe Beschreibung), „IRES" steht für „Internal Ribosomal
Entry Site" und „neo" kennzeichnet einen
Selektionsmarker (Resistenz gegen Neomycin).
- (B) bezeichnet einen verkürzten
intrazellulären
Bereich von gp41 (der Pfeil markiert die Stelle des vorzeitigen
Stoppkodons) (FRES-A)
- (C) bezeichnet den vollständigen
intrazellulären
Bereich von gp41 (FRES-B).
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Zeichnung 2: Inhibition
der HIV-Infektion durch den zytoplasmatischen Bereich des gp41 (I)
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HeLa-Zellen wurden mit HIV-DNA und
inhibitorischen Konstrukten FRES-A und FRES- B kotransfiziert (2μg pNL4.3 und 10μg Vektor).
Der Nachweis der Virusproduktion erfolgte nach drei Tagen.
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Zeichnung 3: Inhibition
der HIV-Infektion durch den zytoplasmatischen Bereich des gp41 II
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Dargestellt ist die Replikationskinetik
von HIV-NL4.3 (moi = 0,001) nach Infektion stabil transduzierter PM-1
Zellen. Die Ziffern auf der Abszisse bezeichnen die Tage nach der
Transfektion.
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Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend
anhand von Beispielen näher
erläutert.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Kultivierung
der Zellen und Viren
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Hela-, 293T- und Phoenix-ampho-Zellen
wurden in Dulbecco's
Medium (Gibco, Invitrogen), das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, Sigma, Deisenhofen)
supplementiert war, kultiviert. PM-1, eine T-Zelllinie, wurde in
RPMI mit 10% FCS kultiviert. Replikationskompetente Viren wurden
entweder durch Passage auf PM-1 Zellen generiert (primäre HIV-Isolate)
oder nach Transfektion von 293T-Zellen mit dem viralen Klon pNL-4.3 und anschließender Passage
auf PM-1 Zellen gewonnen.
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Zur stabilen Transduktion von PM-1
Zellen wurden retrovirale Vektoren, die das Fusionspetid exprimieren
können,
mittels der Verpackungszelllinie Phoenix-ampho (Grigani et al.,
1998) verpackt.
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Beispiel 2: Klonierung
der retroviralen Vektoren zur Expression des Fusionspeptides
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Ausgehend von M3, einem retroviralen
Vektor, der eine nicht-inhibitorischen Mutante des membran-verankerten
T20-Peptides (Hildinger et al., 2001) kodiert, wurden durch Verlängerung
des bereits bestehenden Leserahmens die intrazellulären Bereiche
des HIV-2 Klones CBL23 (FRES-A und FRES-B) zusätzlich zur Expression gebracht.
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M3: Dieser retrovirale Vektor (basierend
auf MP1N, Hildinger et al, 1998) exprimiert ein Fusionspeptid bestehend
aus dem Signalpeptid (SP) des humanen low affinity nerve growth
factor receptor (LNGFR), gefolgt von einer T20-Variante, die keine
Fusionsinhibition bewirkt, gefolgt von einer Hinge-Region der schweren
Kette eines murinen IgG, gefolgt von der Transmembran-Domäne (MSD,
Membrananker) von LNGFR (siehe Zeichnung 1). (Hildinger et al, 2001).
Die extrazellulären
Bereiche dienten in der Erprobungsphase für den einfachen Nachweis der
Expression, während
der Membrananker hier nur exemplarisch für verschiedene Arten der Membranverankerung
verwendet wurde
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FRES-A: Die für den intrazellulären Bereich
des gp41 Proteins von HIV-2 (CBL23) kodierende Nukleinsäure-Sequenz
(SEQ ID NO: 1) wurde mittels PCR amplifiziert und in-frame an den Leserahmen
des Fusionspeptides aus dem M3-Vektor angehängt. Das so entstandene neue
Fusionspetid lokalisiert zur Plasmamembran (aufgrund des Membranankers)
und kann dort die inhibitorische Wirkung entfalten. Für die Konstruktion
des Vektors FRES-A wurde eine natürlich vorkommende Variante
des intrazellulären
Bereiches des gp41 gewählt,
die zur Expression eines kurzen intrazellulären Bereiches führt. (siehe
Zeichnung 1) FRES-B: Dieser Vektor wurde analog zu FRES-A kloniert,
jedoch ist hier in-frame die Nukleinsäure-Sequenz eines vollständigen intrazellulären Bereiches
des HIV-2 (CBL23) Klones im Fusionspeptid exprimiert. (SEQ ID NO:
3; siehe Zeichnung 1)
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Beispiel 3: Kotransfektionsexperimente
zum Nachweis der inhibitorischen Funktion des neuen Fusionspentides
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Durch die Kotransfektion eines HIV-kodierenden
Plasmides und den jeweiligen inhibitorischen Vektoren kann die Reduktion
der HIV-Infektion in einem schnellen HeLa-Assay aufgezeigt werden. Hierbei ist
wichtig, dass die Plasmid-DNA mit der vermeintlich inhibitorischen
Wirkung im Überschuss
vorhanden ist und sich die HIV-Infektion mit der Zeit in der Kultur
ausbreitet.
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Durch Transfektion mittels der Kalziumphophat-Methode
können
50-60% der Zellen zur Aufnahme der Plasmid-DNA veranlasst werden.
Die kodierenden Proteine (HIV und das Fusionspeptid FRES-A bzw FRES-B)
werden exprimiert. Im Falle einer Inhibition ist von einer Reduktion
des p24-Wertes (ein Marker für die
Ausbreitung von HIV in Zellkulturen) auszugehen. Wie in Zeichnung
2 gezeigt, führt
die Kotransfektion für beide
Fusionspeptide zu einer deutlichen Reduktion des p24-Wertes (minus
55% bzw. minus 77%) im Vergleich zur Kontrolle, die das Ausgangsplasmid
M3 erhalten hatte. (Zeichnung 2)
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Beispiel 4: Infektion
von stabil transduzierten PM-1 Zellen zum Nachweis der inhibitorischen
Funktion des neuen Fusionspeptides
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Mittels Verpackungszellinien lassen
sich stabil transduzierte PM-1 Zellen darstellen. Die retroviralen Vektoren
werden nach Transfektion der Verpackungzelllinie Phoenix-ampho zur
Transduktion der T-Zelllinie verwendet. Nach Selektion kann so eine
homogene Kultur an HIV-infizierbaren Zellen generiert werden, die entweder
das FRES-A Fusionspeptid oder das FRES-B Fusionspeptid stabil exprimiert.
Im Vergleich zur nicht-transduzierten, oder durch den Ausgangsvektor
M3 transduzierten PM-1 Linie sollte nach Infektion mit HIV eine
Reduktion des p24-Wertes im Verlauf des Versuches festzustellen
sein, falls die neuen Fusionspeptide eine inhibitorische Wirkung
zeigen. Dieser Versuchansatz ist dem tatsächlichen Geschehen in vivo
sehr nahe, da T-Zellen zur Infektion mit HIV genutzt werden.
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Wie in Zeichnung 3 dargestellt, ergibt
sich im Verlauf der Infektion eine Reduktion des p24-Wertes im Vergleich
zur Kontrolle um 90% bzw 99,9% (minus 3log für FRES-B). SEQUENCE
LISTING
