DE69333216T2

DE69333216T2 - Vektor, enthält ein bei ARN-Polymerase-III transcriptes Virus-Gen

Info

Publication number: DE69333216T2
Application number: DE69333216T
Authority: DE
Inventors: Alain Doglio; Jean-Claude Lefèbvre; Laurence Cagnon
Original assignee: Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Current assignee: Universite de Nice Sophia Antipolis UNSA
Priority date: 1993-07-06
Filing date: 1993-07-06
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2013-07-07
Also published as: EP0647716A1; DE69333216D1; EP0647716B1; ATE250670T1

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante DNA-Vektoren, insbesondere vom Plasmid-Typ oder viralen Typ, welche eine Kassette für eine Transkription durch die RNA-Polymerase III umfassen, welche gebildet wird aus einem viralen Gen, welches natürlicherweise durch die RNA-Polymerase III transkribiert wird.
Die Erfindung betrifft auch eukaryotische Zellen, die durch erfindungsgemäße Vektoren transfiziert oder infiziert sind.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren zur intrazellulären Produktion eines RNA-Fragments in vitro oder in vivo durch Kultur von eukaryotischen Zellen, die durch die erfindungsgemäßen Vektoren transfiziert oder infiziert sind.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Verwendung von erfindungsgemäßen Vektoren als Arzneimittel.
Die Antisinn-Moleküle sind RNA-Sequenzen, die auf selektive Weise mit mRNAs, zu denen sie komplementär sind, hybridisieren und so die Expression des betreffenden Gens (Reifung der RNA, Translation) blockieren. Die seit Beginn der 80er Jahre des letzten Jahrhunderts ausgeführten Arbeiten bescheinigen die Wirksamkeit eines solchen Systems, um zahlreiche zelluläre oder virale Funktionen zu unterdrücken (1,2).
Die potentiellen Anwendungsperspektiven dieser Antisinn-Moleküle sind bei der Grundlagenforschung von Bedeutung. Die Verwendung der Antisinn-Moleküle, um die Expression von bestimmten "abnormalen" Phänotypen zu korrigieren oder um Viren wirksam zu bekämpfen, für die die klassischen Ansätze (Impfung, Chemotherapie...) sich als schwierig erweisen, wie dies bei dem Human Immunodeficieny-Virus (HIV) der Fall ist.
Eines der Probleme, die durch die Verwendung der Antisinn-Moleküle aufgeworfen werden, liegt in der Tatsache, dass diese Moleküle bei bedeutenden intrazellulären Konzentrationen, die jenen von deren Substrat sehr deutlich überlegen sind, wirksam sind. Da die intrazelluläre Konzentration von Antisinn-Molekülen das Ergebnis der Differenz zwischen der Synthese und dem Abbau ist, wurde gemäß der Erfindung nach Lösungen gesucht, welche die Synthese und die Stabilität der gebildeten Produkte begünstigen. Unter diesem Gesichtspunkt ist die Effizienz des Funktionierens des Antisinn-Moleküls gegenüber seinem Ziel ein wichtiger Parameter, denn je "wirkungsvoller" ein Molekül sein wird, umso weniger wird eine hohe Konzentration erforderlich sein, um eine maximale Wirkung zu erhalten.
Die RNA-Polymerase III ist bei den Eukaryoten das Enzym, das für die Synthese einer großen Vielzahl von kleinen zytoplasmatischen oder nukleären RNAs verantwortlich ist, wobei die Hauptrepräsentanten die Transfer-RNAs (tRNA) oder die ribosomalen RNAs vom Typ 5S sind (3).
Die RNA-Polymerase III ist in der Lage, in einem zellfreien System wirksam klonierte DNA-Fragmente zu transkribieren. Dies ist möglich unter der Bedingung, dass diese DNA-Fragmente die für die Transkription durch die Polymerase III spezifischen Promotorregionen enthalten. Diese Promotorregionen sind heute gut charakterisiert (4) und werden zuallererst durch intragenische Regionen gebildet, welche auf diskontinuierliche Weise verteilt sind. Im Falle der Gene vom Typ tRNA handelt es sich um zwei DNA-Regionen: die "A-Box" und die "B-Box", welche jeweils durch 11 Nukleotide (Consensus-Sequenz) gebildet werden und voneinander durch eine dazwischenliegende Region von variabler Größe beabstandet sind (4).
Die durch die Polymerase III transkribierten RNAs sind bemerkenswert durch ihre geringe Größe und vor allem durch ihre Konformation im Raum. Beispielsweise ist die kleeblattförmige Struktur der tRNA besonders gut bekannt. Diese Sekundärstruktur stellt bei den tRNAs wahrscheinlich Stabilität, aber insbesondere auch Funktionalität sicher. Die im Bereich der Schleifen vorhandenen Sequenzen (Anticodon) sind frei, um mit einer komplementären RNA zu hybridisieren. Cotton und Birnstiel haben 1989 vorgeschlagen (5), eine "Ribozym/Antisinn"-Sequenz in das tRNA^met-Gen von Xenopus zu insertieren. Das Oligonukleotid wurde in die zwischen Box A und Box B der Promotorregionen gelegene Zwischenregion derart insertiert, dass es im Bereich des Anticodons korrekt präsentiert wurde (ribtRNA^met, Referenz 2).
Bestimmte Viren (Adenovirus, Epstein-Barr-Virus, Herpes-Virus) sind mit Genen ausgestattet, die durch die RNA-Polymerase III transkribiert werden. Insbesondere sind die Adenoviren mit zwei Genen von ähnlicher Organisation ausgestattet, welche als VAI und VAII (VA: Virus Associated) bezeichnet werden, welche zwei unterschiedliche VA-RNAs, VA-RNAI und VA-RNAII, kodieren (6). Die VA-Gene sind im Genom der Adenoviren natürlicherweise kloniert und funktionsfähig. Man findet mehr als 10⁷ VA-RNA-Moleküle in einer durch ein Adenovirus infizierten Zelle. Diese kleinen RNAs, welche 150 Nukleotide umfassen, werden ausgehend von einem Promotor transkribiert, welcher zwei unterschiedliche Regionen (Box A und Box B) umfasst, welche sich in der Region L1 des Genoms des Adenovirus befinden (7). Die VA-RNAS üben eine Wirkung im Bereich der Translation aus: die Adenovirus-Mutanten, denen VA-RNAI fehlt, exprimieren ihre mRNRs normal, sind aber nicht in der Lage, diese wirksam zu translatieren. Die Erklärung für dieses Phänomen besteht darin, dass die durch Interferon induzierte Proteinkinase DAI durch die VA-RNAI inhibiert wird, was es deren Substrat eIF-2 erlaubt, der Phosphorylierung und folglich der Inaktivierung zu entgehen (9) (der Faktor eIF-2 ist für die Initiation der Translation erforderlich). Die Wechselwirkung zwischen der VA-RNAI und der Kinase ist gut dokumentiert worden (10,11). Es wurden zwei unterschiedliche Regionen der RNA beschrieben, wobei eine an der Bindung der RNA an das DAI-Protein (Nukleotide 93 bis 136) und die andere an der Hemmung der Kinaseaktivität (Nukleotide 54 bis 77) beteiligt ist.
Jennings und Molloy (12) haben gezeigt, dass es möglich ist, die Expression eines Replikons des SV40-Virus in COS1-Zellen dank eines anti-SV40-Antisinn-Moleküls von 163 by (T-Antigen), welches auf das 3'-Ende des VAI Gens aufgepfropft worden ist, zu unterdrücken. Nach einer Transfektion von COS1-Zellen durch verschiedene Konstrukte (Sinn, Antisinn) zeigen die Autoren mittels eines transitorischen Expressionssystems, dass das T-Antigen um 50% reprimiert wird.
Es wurde gemäß der Erfindung eine kurze Antisinn-Sequenz in das Innere des VA-Gens insertiert mit dem Ziel, eine funktionsfähige Gesamtheit zu erhalten, d. h. indem die partiell doppelsträngige Struktur des VA-Gens und seine schleifenförmige Struktur vom Haarnadeltyp, die mit der Proteinkinase wechselwirkt, bewahrt wird. Diese Bewahrung der strukturellen Konfiguration kommt zum Ausdruck durch eine größere intrazelluläre Stabilität einerseits und eine Bewahrung der Funktionalität des VA-Gens andererseits.
Man hat tatsächlich gemäß der Erfindung entdeckt, dass die bemerkenswerte Effizienz des Funktionierens dieser kleinen RNAs im Rahmen ihrer Rolle der Hemmung der Aktivität der Proteinkinase DAI eingesetzt werden kann, um diese von ihrer Hauptbestimmung abzulenken und um diese in Richtung eines anderen Ziels über den Umweg der Antisinn-Moleküle oder der Ribozyme zu dirigieren. Gemäß der Erfindung setzt man folglich diese VA-Gene als Shuttle-System insbesondere für die Entwicklung einer neuen Familie von Antisinn-RNA-Molekülen, die in Eukaryoten exprimiert werden und potentiell für ein breites Spektrum von Anwendungen einsetzbar sind, ein.
Es wurde gemäß der Erfindung ein Modell von Gen-"Kassetten" entwickelt, welche die vereinfachte Insertion von Antisinn-Oligonukleotiden oder von Ribozymen in das VA-Gen erlauben, ohne das Transkriptionsausmaß zu beeinträchtigen, und man konnte die relative Wirksamkeit dieser Konstrukte hinsichtlich der Hemmung der Replikation des HIV-Virus in Kultur messen. Die Erfindung beruht tatsächlich auf der Verwendung der RNA-Polymerase III, um klonierte Gene (VAI), welche Antisinn-Sequenzen oder Ribozyme tragen (in Form von exogenen DNA-Fragmenten von geringen Größen – 15 bis 25 Nukleotide – welche in das betreffende Gen insertiert werden), wirksam zu transkribieren.
Unter ihrem allgemeinsten Aspekt hat die Erfindung einen rekombinanten DNA-Vektor zum Gegenstand, welcher eine Kassette für eine Transkription durch die RNA-Polymerase III umfasst, welche gebildet wird aus dem Gen VAI von Adenovirus, das durch die RNA-Polymerase III transkribiert wird, in welches man ein Oligonukleotid, ein DNA-Fragment, in der Region, die von Nukleotid 10694 bis Nukleotid 10730 des in 1 dargestellten VRI-Gens von Adenovirus 2 geht, oder anstelle der Region von 10694 bis 10730, wobei diese deletiert ist, insertiert hat.
Das Transkriptionsausmaß der VA-Gene durch die Polymerase III ist sehr bedeutend. Dieses Enzym ist bei der Hauptzahl der Eukaryoten gut konserviert und aus diesem Grunde an zahlreiche Zell- oder Tiermodelle anpassbar; das ubiquitäre Vorhandensein dieses Enzyms in allen Geweben bedingt keine spezielle Gewebebeschränkung.
Die Verwendung dieser in großer Menge transkribierten, stabilen und funktionsfähigen viralen Gene liefert folglich besonders wirksame Systeme zur in situ-Produktion von RNA.
Die Organisation der durch dieses Enzym transkribierten Gene ist interessant aufgrund des Fehlens von regulatorischen DNA-Sequenzen in "extragenischer" Lage, was das Schema der Regulation der Transkription vereinfacht und eine Kompaktierung der genetischen Information sicherstellt. Die intragenische Lage der Promotoren vermeidet es, nicht-transkribierte Regionen manipulieren zu müssen, was es erlaubt, kleine Gene, die leicht zu klonieren sind, zu manipulieren. Schließlich bieten die viralen Gene gemäß der Erfindung, wie die VA, zahlreiche Möglichkeiten für eine Insertion von Oligonukleotiden, ohne deren Transkriptionsausmaß und die Sekundärstruktur der transkribierten RNA zu beeinträchtigen.
Bei einer geeigneten Ausführungsweise ist das virale Gen ein VAI-Gen eines Adenovirus.
Man kann insbesondere das VAI-Gen eines Adenovirus, insbesondere von Adenovirus 2 aufführen.
Das VAI-Gen der Adenoviren wurde als System für die Ausführung der Erfindung ausgewählt, denn es ist in der Literatur besonders gut beschrieben. Indessen kann die Gesamtheit der viralen Gene, die VAI ähneln und durch die RNA-Polymerase III transkribiert werden, in gleicher Weise geeignet sein.
Als geeigneten Vektor gemäß der Erfindung kann man einen plasmidischen oder episomalen, replikativen Vektor oder einen viralen Vektor aufführen.
Man wird insbesondere einen episomalen Vektor einsetzen, der den Replikationsstartpunkt des Eilstein-Barr-Virus (oriP) sowie die das Protein EBNA-1 kodierenden Sequenzen umfasst.
In Bezug auf die Wahl des Vektors ist es in der Tat vorzuziehen, so nah wie möglich an dem "natürlichen" System zu bleiben, indem dieses so wenig wie möglich gestört wird. Aus diesem Grund wird bevorzugt, einen Vektor einzusetzen, der sich auf autonome Weise repliziert (Episom). Der Rückgriff auf einen Vektor mit episomaler Replikation kann ein gutes Mittel sein, um Antisinn-Moleküle in eukaryotischen Zellen und insbesondere im T-Lymphozyten zu exprimieren. Die Klonierung der VA/Antisinn-Gene in Vektoren, die sich in eukaryotischen Systemen in episomaler Weise replizieren, ist besonders geeignet. Diese Vektoren tragen den Replikationsstartpunkt des Epstein-Barr-Virus (OriP) sowie Sequenzen, die das Protein Ebna1, welches für die Replikation des DNA-Moleküls, welches OriP umfasst, strikt erforderlich ist, kodieren.
Man stellt eine größere Effizienz des Funktionierens der Polymerase III an Episomen sowie eine Stimulation der transkriptionellen Aktivität in Gegenwart des E1a-Proteins fest. Diese Eigenschaften werden ausgenutzt, um das vorgeschlagene System zu verbessern.
Der erfindungsgemäße virale Vektor ist vorzugsweise ein DNA-Virus, kann aber gleichfalls ein retroviraler RNA-Vektor sein; er wird dann das RNA-Transkript der erfindungsgemäßen Transkriptionskassette umfassen. Berücksichtigt man die Tatsache, dass die Infektion einer Zelle durch ein Retrovirus die Produktion einer zirkularisierten proviralen DNA zur Folge hat, ist es diese provirale DNA, die ihrerseits durch die RNA-Polymerase III gemäß der Erfindung transkribiert werden wird, was das Funktionieren des eingesetzten Genkonstrukts nicht ausschließt, ist die retrovirale DNA einmal integriert.
Bei einer geeigneten Ausführungsweise gemäß der Erfindung wird das Oligonukleotid in die Region, welche von Nukleotid 10694 bis 10730 des Gens VAI geht, insertiert.
Für eine therapeutische Anwendung wird das VA-Gen vorzugsweise inaktiviert, was die Hemmung der Wirkung von Interferon angeht, durch Deletion oder Mutation der für die durch Interferon induzierte Inaktivierung der Proteinkinase DAI kritischen Sequenzelemente in dem VA-Gen.
Diese Inaktivierung kann durch direkte Insertion des Oligonukleotids in die Regionen, die für die Aktivität der Inhibition der Wirkung von Interferon verantwortlich sind, eine Region, hinsichtlich welcher beschrieben worden ist, dass sie sich in dem Gen VAI des Adenovirus 2 zwischen den Nukleotiden 10672 und 10745 einschließlich befindet, erfolgen. Durch diesen Umweg optimiert man gleichfalls die Affinität des Oligonukleotids für die Zielsequenz unter Berücksichtigung der schleifenförmigen räumlichen Konfiguration dieser Region.
Die Integrität der zentralen Region des VA-Gens der Nukleotide 10694 bis 10730 (Schleife IV) ist tatsächlich für die Aufrechterhaltung der inhibitorischen Aktivität der VA-RNA gegenüber der P68-Kinase kritisch. Diese Region befindet sich außerhalb der regulatorischen Zonen (Boxen A und B) und ihre Deletion beeinträchtigt die Transkription des VA-Gens nicht. Das Dokument EP 387775 , das die Integration von Oligonukleotiden in ein Gen erwähnt, liefert keinerlei Präzisierung hinsichtlich der für eine Integration auszuwählenden Regionen außer zwischen den Boxen A und B des durch die RNA-Polymerase III transkribierten Gens.
Gemäß einer ersten Ausführungsweise der Erfindung inaktiviert man die natürliche Aktivität des VAI-Gens des Adenovirus 2 durch die Insertion des Antisinn-Moleküls in die zentrale Region der Nukleotide 10694 bis 10730, insbesondere 10702 bis 10728, oder anstelle dieser Region, die deletiert worden ist.
Indessen konstruiert man, um chimäre VA-Antisinn-Gene, bei welchen die Antisinn-Sequenz außerhalb dieser Region eingeführt ist, konstruieren zu können, bei einer anderen Ausführungsweise ein VA-Gen, bei dem die zentrale Region (Nukleotide 10702 bis 10728) deletiert ist. In der Praxis erlaubt die "O-verlap"-PCR (7), diese Deletionen auszuführen, wenn die Oligonukleotide a' und b' in einem Abstand zu der zu deletierenden Region vorliegen. Außerdem kann eine neue Restriktionsstelle (EcoRV, GATATC) insbesondere durch die Anordnung der beiden die Deletion einrahmenden Enden (GAT und ACC) nebeneinander dank der Mutation des Nukleotids 10729 (ACC wird ersetzt durch ATC) erzeugt werden. Diese ergänzende Stelle kann später für die Klonierung von Antisinn-Sequenzen oder Ribozym-Sequenzen an dem Ort und anstelle der deletierten Schleife IV dienen. Dieses Gen wird als VA delta IV bezeichnet.
Bei einer besonderen Ausführungsweise wird das Oligonukleotid auf der Höhe des Nukleotids 10711 des VAI-Gens des Adenovirus 2, welches in 1 dargestellt ist, insertiert.
Das erfindungsgemäße Oligonukleotid umfasst vorzugsweise 15 bis 40, noch mehr bevorzugt 15 bis 25 Nukleotide.
Im Rahmen einer therapeutischen Anwendung könnte das Oligonukleotid einem Antisinn-RNA-Molekül oder einer ribozymalen RNA-Struktur entsprechen.
Mit dem Ziel, die Hybridisierungseffizienz zwischen dem Antisinn-RNA-Molekül und seinem Substrat zu erhöhen, richten sich zahlreiche Arbeiten gegenwärtig auf die Suche nach Zielsequen zen, welche in Hinblick auf Hybridisierungsparameter (Affinität, Zugänglichkeit) korrekt definiert sind.
Die ribozymalen Sequenzen (25) sind minimale Consensus-Sequenzen, die erforderlich sind, damit ein RNA-Molekül in der Lage ist, ein anderes RNA-Molekül gemäß einem katalytischen Modus zu hydrolysieren. Diese Ribonukleotide mit katalytischer Aktivität (Ribozyme) sind in der Lage, eine Ziel-RNA zu spalten, mit welcher sie auf spezifische Weise hybridisiert sind (dank zweier Sequenzen von 15 Nukleotiden, die zu der Ziel-RNA komplementär sind und auf der einen und der anderen Seite der katalytischen Sequenz angeordnet sind). Diese ribozymalen, mit "Superantisinn"-Sequenzen vergleichbaren Sequenzen können in unserem System mit Vorteil eingesetzt werden, indem die funktionale Effizienz der Gesamtheit erhöht wird.
Außerdem ist das VA-Gen von geringer Größe (160 Nukleotide für VAI des Adenovirus 2). Dies erlaubt gemäß der Erfindung, gleichzeitig mehrere VA-Antisinn-Gene, welche sich auf ein und demselben Genkonstrukt befinden, einzusetzen. Das angestrebte Ziel besteht darin, Antisinn-"Cocktails" zu definieren (beispielsweise im Falle von HIV die gleichzeitige Verwendung von drei unterschiedlichen Genen: anti-rev, anti-tat und anti-Verkapselungssignal). Diese eine Mehrzahl von Genen umfassenden Konstrukte weisen zwei bedeutende Vorteile auf:

– Additivität der Gene und folglich Erhöhung der intrazellulären Konzentration der Antisinn-RNAs.
– Multiplizität der Zielsequenzen und folglich bessere Effizienz des Funktionierens.

Außerdem erlaubt im Falle von Viren, die mit einer starken genetischen Variabilität ausgestattet sind und die sich an die eingesetzte Behandlung "anpassen", der Rückgriff auf die Verwendung einer Mehrzahl von Antisinn-Sequenzen, das Auftreten von genetischen Varianten zu vermeiden.
Die Erfindung hat folglich auch einen Vektor zum Gegenstand, welcher mehrere identische oder unterschiedliche virale Gene umfasst, die durch die RNA-Polymerase III transkribiert werden, in welchen man ein identisches oder unterschiedliches Oligonukleotid außerhalb der Boxen A und B von jedem der genannten viralen Gene insertiert hat.
Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zur intrazellulären Produktion eines RNA-Fragments in vitro zum Gegenstand, in welchem man eukaryotische Zellen, welche die RNA-Polymerase III enthalten, mit einem erfindungsgemäßen replikativen Vektor, welcher als Oligonukleotid ein DNA-Fragment, welches dem Umkehr- oder reversen Transkript der RNA entspricht, umfasst, transfiziert oder infiziert und dass man die so transfizierten oder infizierten eukaryotischen Zellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert.
Die Erfindung hat außerdem gleichfalls, wie man gesehen hat, die Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors, in welchem das Oligonukleotid in ein "Antisinn"-RNA-Molekül oder ein Ribozym-RNA-Molekül transkribiert wird, welche die Expression eines an einer Pathologie beteiligten Gens blockieren, indem sie mit dessen mRNA von zellulärem, viralem, bakteriellem oder parasitärem Ursprung hybridisieren und gegebenenfalls diese schneiden, als Arzneimittel zum Gegenstand.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann als antivirales Mittel, Antitumor-Mittel, antibiotisch oder antiparasitär wirksames Mittel oder bei einer jeglichen Pathologie, wo ein Gen entweder durch Mutation oder durch fehlerhafte Regulation in abnormaler Weise exprimiert wird, eingesetzt wersden.
Die Erfindung hat gleichfalls ein Verfahren zur Blockierung der Expression eines Gens ex vivo mit Hilfe eines erfindungs gemäßen Vektors, von dem das Oligonukleotid in ein Antisinn- oder Ribozym-RNA-Molekül transkribiert wird, welches mit der mRNA des Gens hybridisiert bzw. diese spaltet, zum Gegenstand.
Die Erfindung hat auch ein Verfahren zur Behandlung von Zellen ex vivo mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Vektors zum Gegenstand.
Bei dessen therapeutischen Anwendungen ex vivo setzt man in ganz und gar geeigneter Weise einen viralen oder retroviralen Vektor ein, der in die Zelle durch Transfektion oder Infektion eindringt. Insbesondere als Arzneimittel gemäß der Erfindung setzt man einen Vektor ein, welcher aus einem defekten viralen Vektor, wie einem Adenovirus, oder aus einem defekten retroviralen Vektor, wie einem Mäuse-Retrovirus, gebildet wird.
Tatsächlich kann der Vektor, welcher eingesetzt wird, um das erfindungsgemäße Genkonstrukt in Richtung seines theoretischen Ziels zu transportieren, ein retroviraler Vektor mit einem Transport des rekombinanten Konstrukts durch ein Leih-Capsid ("capside d'emprunt") und Insertion des genetischen Materials in die DNA der Wirtszelle sein.
Die Techniken, die darin bestehen, Vektoren, insbesondere virale Vektoren einzusetzen, um genetisches Material in Zielzellen zu transportieren und eindringen zu lassen und auf wirksame Weise genetische Modifikationen in verschiedene somatische Gewebe, wie den Muskel, die Leber, das Gehirn und die hämopoetischen Zellen, einzuführen, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Insbesondere weist das hämopoetische Gewebe (Leukozyten, Erythrozyten, Plättchen...) zwei essentielle Merkmale auf, die dieses Gewebe zu einem guten Kandidaten für Gentherapieansätze machen:

– die Blutzellen sind leicht ohne Trauma für den Patienten entnehmbar. Außerdem haben sich die Kulturbedingungen für diese Zellen (Verwendung von verschiedenen Zytokinen) verfeinert und erlauben eine Aufrechterhaltung ex vivo für variable Zeiträume (Einfrieren, Kultur).
– die Untersuchung der Differenzierung der verschiedenen Linien, die das hämopoetische System bilden, hat es erlaubt, zu zeigen, dass die Gesamtheit dieser Linien sich von einem gemeinsamen Vorläufer ableitet (Uchida, N., Fleming, W. H., Alpern, E. J., und Weissuran, I. L., 1993, Current Opinion in Immunology, 5, 177–184). Dies erlaubt, die gewünschte genetische Modifizierung in Stammzellen einzuführen, die nach Reimplantierung in der Lage sind, das hämopoetische Gewebe in seiner Gesamtheit erneut zu besiedeln.

Die Charakterisierung der Vorläuferzellen hat es erlaubt, zu ermitteln, dass das Vorhandensein eines Oberflächenproteins (CD34) es erlaubt, diese von anderen Zelltypen als CD34+-Zellen zu unterscheiden.
Die hämopoetischen Zellen proliferieren in allen Differenzierungsstadien. Aus diesem Grunde gebietet das Einführen von Fremdgenen in diese Zellen, dass diese im Verlauf der aufeinanderfolgenden Zellteilungen nicht "verdünnt" werden. Die Retroviren, die sich definitiv in das Genom der Empfängerzelle integrieren und für die der molekulare Replikationsmechanismus relativ gut bekannt ist, erweisen sich als gute Kandidaten für die Gentherapie an hämopoetischen Zellen.
Die Verwendung von retroviralen Vektoren, um genetisches Material zu transportieren, erfordert einerseits, die genetische Konstruktion des rekombinanten Retrovirus vorzunehmen, und andererseits, über ein zelluläres System zu verfügen, welches die Verkapselungsfunktion des zu transportierenden genetischen Materials sicherstellt:

– Zuerst erlauben die Techniken der Gentechnologie, das Genom eines Mäuse-Retrovirus, wie des Moloney-Virus (Mäuse- Retrovirus, welches zu der Gruppe der Mäuse-Leukämie-Viren gehört: Reddy, E. P., Smith, M. J., und Aaronson, S. A., 1981, Science 214, 445–450), zu modifizieren. Das retrovirale Genom wird in einen Plasmidvektor kloniert, dann wird die Gesamtheit der viralen Gene, die die Strukturproteine kodieren (Gene: Gag, Env), sowie die Sequenz, die die enzymatischen Aktivitäten kodiert (Gen: Pol), deletiert. Aus diesem Grunde bleiben nur die "in cis" für die Replikation, die Transkription und die Integration erforderlichen Sequenzen erhalten (Sequenzen, welche den beiden LTR-Regionen, dem Verkapselungssignal und dem Primeranheftungssignal entsprechen). Die deletierten genetischen Sequenzen können durch nicht-virale Gene, wie das Neomycinresistenzgen (zur Selektion dienendes Antibiotikum für eukaryotische Zellen), und durch das durch den retroviralen Vektor zu transportierende Gen ersetzt werden.
– Zum zweiten wird das so erhaltene Plasmidkonstrukt durch Transfektion in die Verkapselungszellen eingeführt. Diese Zellen exprimieren konstitutiv die viralen Proteine Gag, Pol und Env, aber der diese Proteine kodierenden RNA fehlen Signale, die für deren Verkapselung erforderlich sind. Aus diesem Grunde kann diese RNA nicht verkapselt werden und die Bildung von Viruspartikeln erlauben. Allein die rekombinante RNA, die von dem transfizierten retroviralen Konstrukt herstammt, ist mit dem Verkapselungssignal ausgestattet und wird verkapselt. Die durch dieses System erzeugten retroviralen Partikel enthalten die Gesamtheit der Elemente, die für die Infektion der Zielzellen (wie der CD34+-Zellen) und für die definitive Integration des Gens von Interesse in diese Zellen erforderlich sind. Das Fehlen der Gene Gag, Pol, Env hindert das System daran, fortzufahren, sich zu propagieren.

Gemäß der Erfindung haben die VA-Antisinn-Gene als Merkmal, dass sie durch die RNA-Polymerase III transkribiert werden. Diese Besonderheit hat dazu geführt, zwei Arten von retroviralen Konstrukten zu entwickeln, in denen die VA-anti-rev-Gene kloniert worden sind, wie in Beispiel 6 beschrieben.
Die DNA-Viren, wie die Adenoviren, können für diesen Ansatz gleichfalls geeignet sein, obgleich in diesem Falle die Aufrechterhaltung der DNA in episomalem Zustand in Form eines autonomen Replikons die wahrscheinlichste Situation ist.
Es versteht sich von selbst, dass die Verwendung eines viralen Vektors, welcher von einem Adenovirus stammt, besonders geeignet ist, wenn das virale Gen ein adenovirales Gen ist. Die Adenoviren weisen bestimmte interessante Eigenschaften auf.
Insbesondere haben sie ein ziemlich breites Wirtsspektrum, sind in der Lage, ruhende Zellen zu infizieren und integrieren sich nicht in das Genom der infizierten Zelle. Aus diesen Gründen sind die Adenoviren bereits für den Transfer von Genen in vivo eingesetzt worden. Zu diesem Zweck sind verschiedene von Adenoviren abgeleitete Vektoren hergestellt worden, in welchen verschiedene Gene (beta-gal, OTC, alpha-1At, Zytokine u. s. w.) enthalten waren. Um die Risiken einer Vermehrung und der Bildung von infektiösen Partikeln in vivo zu begrenzen, sind die eingesetzten Adenoviren im allgemeinen derart modifiziert, dass sie unfähig zu einer Replikation in der infizierten Zelle gemacht worden sind.
So sind in den eingesetzten Adenoviren im allgemeinen die Regionen E1 (E1a und/oder E1b) und gegebenenfalls E3 deletiert.
Die defekten rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung können durch eine jegliche Technik, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, hergestellt werden (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917).
Sie können insbesondere durch homologe Rekombination zwischen einem Adenovirus und einem Plasmid in einer geeigneten Zelllinie hergestellt werden. Die eingesetzte Zelllinie muss vorzugsweise (i) durch die Elemente transformierbar sein und (ii) die Sequenzen umfassen, welche in der Lage sind, den fehlenden oder defekten Teil des Genoms des Adenovirus zu ersetzen (zu komplementieren), vorzugsweise in integrierter Form, um Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel für eine Linie kann man die menschliche embryonale Nieren-Linie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die insbesondere integriert in ihr Genom den linken Teil des Genoms eines Ad5-Adenovirus (12%) enthält, erwähnen.
Dann werden die Adenoviren, die sich vermehrt haben, gemäß den klassischen Techniken der Molekularbiologie gewonnen und gereinigt.
Gemäß der Erfindung wird in das Genom des defekten rekombinanten Adenovirus im Bereich des VA-Gens eine exogene DNA-Sequenz, welche insbesondere eine Antisinn-RNA kodiert, insertiert.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche ein oder mehrere Vektor-Viren, wie rekombinante defekte Viren, wie zuvor beschrieben, umfassen, können in Hinblick auf eine Verabreichung auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem u. s. w Wege formuliert werden. Sie enthalten vorzugsweise für eine injizierbare Formulierung pharmazeutisch annehmbare Träger. Es kann sich insbesondere um sterile isotonische Salzlösungen (Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumchlorid u. s. w. oder Mischungen von solchen Salzen) oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen, die, je nach Fall, durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder von physiologischem Serum die Herstellung von injizierbaren Lösungen, insbesondere sterilen isotonischen Lösungen erlauben, oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen, die, je nach Fall, durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder von physiologischem Serum die Herstellung von injizierbaren Lösungen erlauben, handeln.
Die Dosen von defektem rekombinantem Virus, welche für die Injektion eingesetzt werden, können abhängig von verschiedenen Parametern und insbesondere abhängig von der eingesetzten Verabreichungsweise, der betreffenden Pathologie, dem zu exprimierenden Gen oder ferner der angestrebten Behandlungsdauer angepasst werden. Allgemein können die erfindungsgemäßen rekombinanten Viren in Form von Dosen zwischen 10 und 10 pfu/ml und vorzugsweise 10 bis 10 pfu/ml formuliert und verabreicht werden. Der Ausdruck pfu ("plaque forming unit", Plaquebildende Einheit) entspricht dem Infektionsvermögen einer Viruslösung und wird durch Infektion einer geeigneten Zellkultur und Messung, im allgemeinen nach 48 h, der Anzahl von Plaques von infizierten Zellen bestimmt. Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Titers einer Viruslösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
Die Verwendung von genetisch modifizierten Viren als Shuttle-System, um das modifizierte genetische Material zu transportieren, erlaubt nicht nur, das genetische Material in die Empfängerzelle durch den Umweg der Verwendung eines viralen Leih-Capsids ("capside d'emprunt") eindringen zu lassen, sondern erlaubt auch gleichzeitig und in einer kurzen Zeitspanne eine große Anzahl von Zellen zu behandeln; dies eröffnet den Weg für Heilansätze, welche sich in vitro an bereits durch das zu inhibierende Virus infizierte Zellen richten, erlaubt aber gleichfalls die therapeutische Behandlung, welche auf den gesamten Organismus angewendet wird.
Gemäß der Erfindung kann man virale Transaktivatoren einsetzen. Insbesondere stimuliert das Protein E1a von Adenovirus die transkriptionelle Aktivität der Polymerase III (23), insbesondere indem der begrenzende Faktor TFIIIC mobilisiert wird. Diese Verstärkungswirkung der Polymerase III wird vor allem beobachtet, wenn die DNA, die das VA-Gen trägt, in episomaler Form vorliegt (ein bei Adenoviren häufiger Fall). Man kann diese Eigenschaft des E1A-Proteins einsetzen, um die Effizienz des "VA-RNA-Polymerase III"-Systems insbesondere im Verlauf von transitorischen Expressionsexperimenten entweder mit dem in cis zu dem VA-RNA-Gen klonierten E1a-Gen oder in trans durch Cotransfektion zu stimulieren.
Gleichfalls könnte das Tat-Protein von HIV die transkriptionelle Aktivität der Polymerase III stimulieren.
Die mit der Vektorisierung des Antisinn-Moleküls gekoppelte Verwendung der Transaktivatoren kann gemäß der Erfindung in Hinblick auf die Wirkungspezifität gegenüber durch HIV (oder andere pathogene Viren) infizierten Zellen ausgenutzt werden. Es können zwei komplementäre Strategien angewandt werden:

– mit dem Ziel, für die HIV-Infektion permissiven Zellen (CD4+) eine "zelluläre Immunität" zu verleihen, erfolgt die Behandlung "ex vivo" durch die Entnahme von aus dem Knochenmark stammenden Stammzellen, deren Sortierung und deren genetische Modifizierung "ex vivo";
– eine "kurative" Strategie ist gleichfalls dank des Vorsehens einer Abhängigkeit der Replikation des Vektors von der Anwesenheit des Tat-Proteins von HIV möglich. Diese Abhängigkeit erlaubt es, den Vektor einzig in durch das Virus infizierten Zellen wirksam zu replizieren.

Die Herstellung und die Entwicklung von erfindungsgemäßen Antisinn-Kassetten, welche für zahlreiche Forschungsgebiete anpassbar sind, werden in überaus zahlreichen Gebieten, darunter insbesondere der molekularen Onkologie, dem zellulären Determinismus, ins Auge gefasst.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden im Lichte der detaillierten Beschreibung der folgenden Ausführungsweise ersichtlich.
Die 1 gibt die Nukleotidsequenz des VAI-Gens von Adenovirus 2 an.
LEGENDE der Fig. 1:
Die 2 gibt die Antisinn-Sequenzen und Zufallssequenzen ("Random") an, die bei dem Nukleotid 10711 des VAI-Gens insertiert worden sind.
Die 3 stellt die Analyse der Produkte einer zellfreien Transkription der PVV2/VAI/Antisinn-Konstrukte auf einem Acrylamid/Harnstoff-Gel dar.
Die 4 zeigt die Infektionskinetik von CEM, die durch ein Antisinn-Molekül transfiziert worden sind oder nicht, durch HIV.
Die 5 zeigt die quantitative Bestimmung der HIV-Antigene, die in den Überständen von durch Antisinn-Konstrukte transfizierten CEM-Zellen vorhanden sind.
Die quantitativen Bestimmungen von HIV-Antigenen erfolgten 5 h nach der Erneuerung des Kulturüberstands und 24 Tage nach dem Beginn der Infektion.
Sekundärstrukturen der VA-RNAs: die VA-RNAI-Struktur (A) und zwei mögliche Strukturen für die VA-RNAII-Moleküle (B und C) sind in der Referenz 13 beschrieben.
Die 6 gibt die Sekundärstruktur des VAI-Gens an.
Die 7 gibt das Insertionsschema eines Oligonukleotids durch die "overlap"-PCR-Methode an.
Die 8 zeigt die Expression des VA-Antisinn-Moleküls in der Population AS₁₀.
Bahn a: RNA von Zellen der Population AS₁₀
Bahn b: RNA von Zellen der Linie HepG₂, welche durch das Adenovirus vom Typ 2 infiziert ist.
Die 9 zeigt die Northern-Blot-Ergebnisse der ausgehend von einem Plasmid, welches die Gene VA-anti-rev und VA-anti-tat trägt, transkribierten RNAs, erhalten in Beispiel 5 mit dem Konstrukt, welches das Gen rev und das Gen tat trägt.
Die 10 stellt die Konstruktion der von dem Vektor pMV7 des Beispiels 6 abgeleiteten retroviralen Vektoren I und II dar.
Die 11 zeigt die transitorische Expression der modifizierten VAI-Gene des Beispiels 7 in 293-Zellen.
Beispiel 1: Klonierung des VAI-Gens
Das für die nachfolgend vorgeschlagenen Experimente ausgewählte Gen ist das Gen VA-RNAI des Adenovirus 2. Die Sequenz des Adenovirus ist in der folgenden Datenbank verfügbar: Genbank – Ref.: ADBVAI, von dem Nukleotid 10610 bis zum Nukleotid 10769 transkribierte Sequenzen (die 1 gibt die betreffenden Sequenzelemente an). Die Konformation der RNA in Lösung ist veröffentlicht und in der 6 angegeben (13, 14).
Die Klonierung des rekombinanten VAI-Gens erfolgt in einem Plasmidvektor vom Typ PW2 (15), welcher in cis das Geneticinresistenzgen (unter Abhängigkeit von dem TK-Promotor) trägt, oder in einem Vektor mit in einem eukaryotischen System autonomer Replikation vom Typ pCEP-4 (vertrieben von Invitrogen) oder ferner pHEBo (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von R. P. SEKALY, Laboratoire d'Immunologie, Montreal). Diese letzteren Vektoren enthalten die Regionen OriP und Ebna-1 und sie enthalten gleichfalls das Hygromycinresistenzgen (16, 17).
Das Gen VAI des Adenovirus 2 wurde nach einem PCR-Amplifizierungsschritt kloniert. Die Oligonukleotide, die zu dieser PCR dienten, wurden auf der 5'-Seite stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle des VAI-Gens und auf der 3'-Seite stromabwärts von der TTTT-Terminationsstelle gewählt (1). Die 5'-Enden von jedem Oligonukleotid sind mit der ClaI-Enzymschnittstelle, einer auf dem Plasmid pVV2 nur einmal vorkommenden Stelle, oder mit der HindIII-Stelle für die Klonierung in das Plasmid pHEBo ausgestattet. Die Transformation von Bakterien durch "pVV2-VAI"-Konstrukte hat erlaubt, mehrere rekombinante Klone zu erhalten.
Beispiel 2: Insertion und Klonierung der Antisinn-Sequenzen
Für HIV wurde die Sequenz der zu insertierenden Oligonukleotide zunächst gemäß den bereits von anderen Autoren veröffentlichten Antisinn-Sequenzen bestimmt: anti-rev (18) oder anti-tat (19) und eine zufällig ausgewählte Sequenz, welche als spezifische Kontrolle diente (siehe 2) (die Proteine tat und rev sind zwei virale Proteine, deren regulatorische Rolle für die Replikation des Virus kritisch ist).
Der Rückgriff auf Sequenzen vom Ribozym-Typ erfolgt zur Zeit mit Klonierung von Rekombinanten, welche Ribozym-Sequenzen tragen, welche von Goodchild & Kohli 1991 veröffentlicht worden sind (20).
Die Verwendung der "overlap"-PCR (siehe 7) hat es erlaubt, Oligonukleotide variabler Größe in das VAI-Gen zu insertieren. Die "anti-rev"-, "anti-tat" und "Zufalls" ("Random")-Antisinn-Moleküle wurden auf der Höhe des Nukleotids 10711 der Sequenz der VA-RNAI insertiert (2). Die so durch die Insertion der Antisinn-Sequenz modifizierten VAI-Gene werden in die ClaI-Stelle des Plasmids pVV2 kloniert, wie zuvor beschrieben.
Die erhaltenen Konstrukte wurden allesamt sequenziert (auf 200 Nukleotide), dann in einem zellfreien Transkriptionssystem getestet, um die Funktionalität sowie die relative Transkriptionseffizienz jedes Konstrukts sicherzustellen. Für die Ausführung der in vitro-Transkriptionen ist das verfolgte Protokoll jenes, das von Wu (21) und Weil (22) beschrieben worden ist. Kurz zusammengefasst, werden 3 μg zu testende DNA 90 min bei 29°C in Gegenwart von Zellextrakten, welche Polymerase III-Aktivität enthalten, und von Nukleotiden, darunter insbesondere alpha-P³²-dGTP, inkubiert. Nach der Synthese werden die Produkte der Reaktion auf einem Acrylamidgel analysiert (die Fi gur 3 präsentiert den Typ von erhaltenen Ergebnissen). Die beobachteten Größen entsprechen gut den für jedes Konstrukt erwarteten Größen, nämlich: native VA-RNAI 160 Nukleotide, VA-RNAI/anti-rev 188, VA-RNAI/anti-tat 190. Die anderen VA-RNAI/Ribozym-Konstrukte sind noch nicht analysiert worden.
Es ist gut verifiziert, dass die Insertion von exogenen Sequenzen in das VA-Gen dessen Transkriptionsausmaß durch die Polymerase III nicht beeinträchtigt.
Beispiel 3: Inhibition der Virusreplikation
Die Herstellung und die Entwicklung von Antisinn-Werkzeugen ("Tools") erfolgten im Falle von antiviralen Antisinn-Molekülen, an für die Replikation des untersuchten Virus permissiven Zelllinien. Beispielsweise werden für die anti-HIV-Antisinn-Moleküle die Lymphoblastenlinien CEM oder MOLT-4, die alle beide gute Virusproduzenten sind, ausgewählt.
Die Zellen der Linie CEM (befreit von Mycoplasmen) wurden mit den verschiedenen rekombinanten Plasmiden (pVV2/VAI/anti-rev, pVV2/VAI/anti-tat, pVV2/VAI- und pVV2-Vergleichsplasmide) transfiziert. Die eingesetzten Zelltransfektionstechniken hängen von dem untersuchten Zellmodell ab.
Für die in Suspension befindlichen Zellen wurde präferentiell die Elektroporation eingesetzt (Apparat vom Typ Gene Pulser^®, Biorad, die Elektroschocks werden mit 200 V und 960 μF erzeugt).
Nach der Transfektion werden die transduzierten Zellen in 96 unabhängige Kulturvertiefungen verteilt und durch die Wirkung der Antibiotika Geneticin, 1,5 mg/ml (Plasmid pVV2), oder Hygromycin, 400 μg/ml (Plasmid pHEBo), selektiert. Die Aufrechterhaltung des Selektionsdrucks bleibt während der gesam ten Experimente erforderlich. Diesmal wurde unter Einsatz der Elektroporation die CEM-Linie durch rekombinante Konstrukte des Plasmids pVV2/anti-rev, pVV2/anti-tat, pVV2/VRI und pVV2 transfiziert.
Nicht-klonale Zellpopulationen, welche gegen Geneticin resistent waren und aus unterschiedlichen Kulturvertiefungen stammten, werden auf der Grundlage einer guten Zellvermehrung mit einem geringen Mortalitätsgrad ausgewählt. Die Zellpopulationen, die aus der Transfektion mit "Antisinn"-Plasmiden hervorgehen, werden numeriert mit AS + Kennziffer X (AS: Antisinn, X: Nr. der Selektionsvertiefung).
Jede Population wird mit infektiösem Überstand, welcher von chronisch durch das HIV-Virus infizierten Zellen stammt (Partikel-reicher Überstand) infiziert, der eingesetzte Stamm zeigt keine zytopathische Wirkung auf die eingesetzten Zellen auf (Stamm LAV/BRU, JC Cherman, Marseille). Die Kinetik der Virusreplikation zeigt, dass unter den üblichen Bedingungen mehr als 95% der CEM 7 bis 8 Tage nach der Infektion Viruspartikel produzieren (4).
Das Ausmaß der Virusreplikation wird durch indirekte Immunfluoreszenz abgeschätzt. Kurz zusammengefasst, werden 5000 Zellen auf Glasobjektträgern fixiert und 30 min in Gegenwart eines 1/40 verdünnten anti-HIV-Serums, welches von einem seropositiven Patienten stammt, inkubiert. Die Sichtbarmachung erfolgt dank der Verwendung eines mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugierten zweiten Antikörpers, welcher für die menschlichen Immunglobuline spezifisch ist.
Die Virusreplikation kann gleichfalls durch die quantitative Bestimmung der Konzentration von HIV-1-Antigenen, die in dem Kulturüberstand vorhanden sind, gemessen werden (quantitative Bestimmung ausgeführt mit dem Kit HIVAG-1^® von ABBOTT). Die In fektionskinetiken werden gleichzeitig an durch die verschiedenen Plasmide transfizierten und aus der Selektion durch Geneticin hervorgehenden Zellen bestimmt.
Die 4 zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, indem auf vergleichende Weise die CEM-Linie, welche als Positivkontrolle dient, die gegen Geneticin resistente CEM-Linie (CEM.gen.r.), welche mit pVV2) transfiziert worden ist, 2 "anti-tat"-Populationen (AS1 und AS2) und 2 "anti-rev"-Populationen (AS3 und AS4) infiziert werden. Die Messung der Virusreplikation erfolgte durch die Beobachtung und die Zählung der Anzahl von HIV-positiven Zellen, welche durch indirekte Immunfluoreszenz an unterschiedlichen Tagen nach der Infektion detektiert wurden:
Das Übereinanderlegen der Kurven "CEM" und "CEM gen.r" zeigt, dass das Vorhandensein von Geneticin im Medium die Infektion der CEM-Zellen durch das HIV-Virus nicht beeinträchtigt. Es erweist sich, dass die 4 getesteten "Antisinn"-Populationen eine signifikante Verzögerung hinsichtlich des Beginns der Infektion zeigen, die Dauer der Eklipse ist für AS1 um 2 Tage und im Falle von AS3 um bis zu 6 Tage verlängert. Außerdem wird ein geringer Prozentsatz von Zellen bei bestimmten Linien (AS2, AS3, AS4) (25 bis 60%) erst spät nach der Infektion infiziert, was die Resistenz einer großen Anzahl von Zellen innerhalb von diesen nicht-klonierten Populationen gegenüber einer Virusinfektion zum Ausdruck bringt. Dies ist bei der Linie AS1 nicht der Fall, die 10 Tage nach dem Beginn der Infektion mehr als 95% positive Zellen aufweist.
Die 5 zeigt die während eines Experiments des gleichen Typs, welches aber mit einer größeren Gruppe von ASX-Populationen ausgeführt und durch die Messung der HIV-1-Antigene, welche in den Überständen an verschiedenen Tagen nach der Infektion durch HIV vorhanden sind, quantifiziert wurde, erhaltenen Ergebnisse. Es sind nur die am Tag 24 erhaltenen Ergebnisse aufgeführt (wobei jene für die an den anderen Tagen erhaltenen Ergebnisse repräsentativ sind). Um die Anhäufung der Viruspartikel und eine Verfälschung der vergleichenden Messungen zu vermeiden, werden die Oberstände 5 h nach dem Wechsel des vorangegangenen Mediums gesammelt.
Die Populationen "VAI/anti-tat" entsprechen den Bedingungen AS1, AS2, AS6, AS7 und AS8, und die Populationen "VAI/anti-rev" den Bedingungen AS3, AS4, AS9, AS10 und AS12.
Es erweist sich, dass der Hauptteil der "Antisinn"-Populationen bei 8 Linien von 10 (AS2, AS3, AS4, AS6, AS8, AS9, AS10 und AS12) eine signifikante Verringerung der in den Überständen gemessenen Menge von HIV-1-Antigenen zeigt, man misst weniger als 20% Produktion von viralen Antigenen verglichen mit der Kontrolle, 2 Populationen erreichen 70% des Kontrollniveaus (AS1 und AS7).
Die für die Populationen AS1, 2, 3 und AS4 gemäß 2 Messtechniken der Virusreplikation: Immunfluoreszenz (4) und Konzentrationen von Antigenen (5), erhaltenen Ergebnisse sind übereinstimmend. In den 4 und 5 sind die Populationen AS1, AS2, AS3 und AS4 identisch.
Beispiel 4: Messung des Expressionsausmaßes von VA-RNAI
Es ist möglich, die Expression der Antisinn-RNAs dank der Northern-Blot- oder auch Hybridisierungstechniken in flüssigem Milieu zu charakterisieren. Die RNAs werden gemäß dem folgenden Protokoll hergestellt: 25.10⁶ werden zweimal mit einem (Koch-)Salzpuffer gespült, die Zellen werden bei 4°C durch hypotonischen Schock (Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 10 mM, MgCl₂, 3 mM) und durch Einwirkung von 1% NP 40 lysiert; nach Zentrifugation (10000 Upm, 10 min) wird der die zytoplasmatischen RNAs enthaltende Überstand von den restlichen Proteinen durch 3 Ex traktionen mit Phenol-Chloroform befreit und die RNAs werden mit Ethanol aufkonzentriert. 10 μg RNA werden durch Northern-Blot analysiert und mit einer einzelsträngigen, für die 3'-Region des VA-Gens spezifischen Sonde hybridisiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 8 aufgeführt. Die hier aufgeführten Ergebnisse veranschaulichen die Tatsache, dass die getesteten Konstrukte (hier A5_10' "VA/anti-rev") in vivo exprimiert werden und dass das erhaltene Transkriptionsprodukt die erwartete Größe aufweist.
Beispiel 5: Gleichzeitige Verwendung von Chimären aus mehreren VA-Genen: "Antisinn-Cocktails"
Es wurde ein Genkonstrukt hergestellt, welches die Aufeinanderfolge der zwei Gene VA-anti-rev und VA-anti-tat, in die Cla1- bzw. HindIII-Stelle des Plasmids pVV2 kloniert, umfasst. Mit diesem Konstrukt ausgeführte zellfreie Transkriptionsexperimente haben gezeigt, dass jedes dieser Gene korrekt exprimiert wird:
Die aus der Transkription des die beiden Gene tragenden Plasmids in einem zellfreien System hervorgehenden RNAs wurden durch Northern-Blot analysiert und entweder mit einer für die rev-Sequenz spezifischen Sonde oder mit einer für die tat-Sequenz spezifischen Sonde sichtbar gemacht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 9 aufgeführt.

– Das Protokoll der zellfreien Transkription ist jenes, das bereits in Beispiel 2 und für die 3 eingesetzt worden ist (Ref. 21, WU et al., und 22, Weil et al.)
– Die Analyse der RNAs durch Northern-Blot erfolgt nach Reinigung der RNAs (Behandlung durch DNase I, dann Proteinase K und Extraktion mittels Phenol-Chloroform), Auftrennung auf einem Agarosegel in denaturierendem Milieu, Transfer auf eine

Membran und Sichtbarmachung entweder mit der rev-Sonde (Bahn a) oder mit der tat-Sonde (Bahn b).
Beispiel 6: Vektorisierung der VA-Antisinn-Gene durch modifizierte Mäuse-Retroviren – Transfer in Vorläuferzellen der hämopoetischen Zellen
1) Retroviraler Vektor vom Typ I:
Der Vektor, der eingesetzt wird, ist das Plasmid pMV7 (P. T. Kirschmeier, G. M. Housey, M. D. Johnson, A. S. Perkins und I. B. Weinstein, 1988, DNA, Band 7, 3, 219–225). Er wird einerseits aus den für die plasmidische Aufrechterhaltung erforderlichen Sequenzen und andererseits den beiden LTR des Moloney-Virus, welche das Neomycinresistenzgen (unter der Abhängigkeit des TK-Promotors) einrahmen, gebildet. Die HindIII-, ClaI- und EcoRI-Klonierungsstellen, die sich zwischen dem 5'-LTR und dem Neomycingen befinden, erlauben die Insertion von exogenen Sequenzen. Die Verkapselungszelle ist die DAMP-Zelle (R. Mann, R. C. Mulligan und D. Baltimore, 1983, Cell, 33, 143–159). Die Genkonstrukte wurden in die HindIII-Stelle von pMV7 kloniert und die DAMP-Zelle wurde mit den erhaltenen Plasmiden transfiziert. Die DAMP-Zellen, die gegen Neomycin resistent geworden waren, wurden subkloniert. Die Klone, die ein starkes Infektionsvermögen, nachgewiesen in den Kulturüberständen, aufwiesen, wurden selektiert. Diese Klone haben es erlaubt, Lymphozyten der Linie CEM (T4-Helfer-Lymphozyten) zu infizieren. Die Infektion erfolgt dank einer Cokultivierung für eine Nacht zwischen den DAMP und den Lymphozyten. Die Lymphozyten, die infiziert worden sind, sind ihrerseits gegen Neomycin resistent geworden und können so selektiert werden. Die aus diesen Lymphozyten stammenden RNAs sind analysiert worden und es wurde die Expression des VA-anti-rev-Gens (welches sich auf der integrierten proviralen Sequenz befindet), nachgewiesen.
Indessen könnte sich erweisen, dass die mögliche Interferenz zwischen der Aktivität der RNA-Polymerase II, die die Gesamtheit des viralen Genoms ausgehend von dem 5'-LTR transkribiert, und der Aktivität der RNA-Polymerase III in bestimmten Fällen ein für die Effizienz eines solchen Systems ungünstiges Element darstellt.
2) Retrovirale Vektoren vom Typ II:
Es wurden die in der U3-Region des 3'-LTR des Moloney-Virus, kloniert in pMV7, vorhandenen Enhancer-Signale deletiert und diese Signale wurden durch auf diesem Plasmid nur einmal vorkommende Klonierungsstellen ersetzt (wobei diese Modifizierungen dank der PCR-Technik ausgeführt wurden). Die Antisinn-Konstrukte werden in diese Stellen insertiert. Diese Modifizierung weist zwei Vorteile auf: sie erlaubt einerseits, das klonierte Gen dank des Einsatzes der Umkehrtranskription zu duplizieren (die in jedem der beiden LTR vorhandene U3-Region stammt ab von der U3-Region, die sich in dem 3'-LTR des vorangegangenen Provirus befindet), aber vor allem erlaubt diese der RNA-Polymerase II nicht mehr, das in die Empfängerzelle integrierte Provirus zu transkribieren. Dies vermeidet die Interferenz mit der RNA-Polymerase III und stellt eine Sicherheit des Funktionierens gegenüber der stets möglichen Aktivierung von angrenzenden Genen sicher.
Genauer wurde der Vektor II erhalten, wie die 10 veranschaulicht:

1) die einmalig vorkommende HindIII-Stelle wurde deletiert (Schnitt, Auffüllen mit DNA-Polymerase, Religation).
2) der vollständige Verdau von pMV7 durch ClaI setzt das Selektionsgen (Neomycin) frei, der resultierende Plasmidteil wird dann mit dem Enzym XhoI auf partielle Weise behandelt. Nur das Fragment, welches den 5'-LTR enthält, wird auf einem Agarosegel gereinigt (5064 bp). Aus diesem Grund geht der 3'-LTR verloren.
3) Der 3'-LTR wird dann durch einen modifizierten 3'-LTR, bei dem die in der U3-Region gelegenen Enhancer-Regionen beseitigt und durch eine HindIII-Stelle ersetzt worden sind (dies erfolgt dank der PCR-Technik), ersetzt.
4) Das Antisinn-Gen wurde in die neu erzeugte HindIII-Stelle kloniert.
5) Dieses neue retrovirale Konstrukt kann auf übliche Weise eingesetzt werden:
– Einschleusung durch Transfektion in Verkapselungszellen (CRIP-Zellen, Ref. Danos und R. C. Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, Band 85, 6460–6446).
– Gewinnung der Überstände mit Abschätzung des infektiösen Titers.
– diese rekombinanten retroviralen Partikel werden eingesetzt werden, um Zielzellen zu transduzieren.

Mit dem Ziel, die Gewinnung von durch Rekombination erhaltenen Wild-Partikeln des Moloney-Virus zu vermeiden, wird die DAMP-Verkapselungszelle zugunsten der CRIP-Zelle ausgetauscht (O. Danos und R. C. Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85, 6460–6446). Die CRIP-Zelle enthält zwei zusätzliche retrovirale Genome, bei denen das 3'-LTR-Ende, das Verkapselungssignal deletiert sind und von denen das eine in der Gag-Region und das andere in der env-Region mutiert ist.
Durch Komplementation wird die Produktion der Gag-, Pol- und Env-Gene sichergestellt, aber die Wahrscheinlichkeit, Wild-Genome, welche durch Rekombination erhalten werden, zu erhalten, wird auf Null reduziert. Die Gesamtheit der hier vorgeschlagenen und beschriebenen Verbesserungen erlaubt es, die Produktion von rekombinanten retroviralen Partikeln, welche ein oder mehrere VA/Antisinn-Gene (pMV/AS), welche durch die Polymerase III korrekt transkribiert werden, tragen, sicherzustellen. Dieser Vektor bietet gleichfalls eine optimale Funk tionssicherheit in Hinblick auf in Betracht gezogene therapeutische Anwendungen.
BEISPIEL 7: Transitorische Expression der VA-Antisinn-Gene
Mit der Perspektive einer kurzzeitigen lokalisierten Therapie wurde in einem Zellsystem die transitorische oder vorübergehende Expression der VA-Antisinn-Gene verifiziert. Bei einer transitorischen Expression wird das VA-Antisinn-Gen in das Genom der Wirtszelle nicht integriert und häuft sich im Kern, wo es transkribiert wird, bedeutend an.
Adhärente Zellen (Linie 293: menschliche embryonale Nierenzellen) wurden mit 20 g des pVA-anti-rev-Plasmids transfiziert. Die eingesetzte Technik ist die Calicumphosphat-Transfektion. Diese Technik besteht darin, die durch Calciumphosphat präzipitierte Plasmid-DNA und die Zellen 18 h miteinander in Kontakt zu bringen, wobei die Absorption der DNA an die Zellmembranen erhöht und die Wirkung der zellulären DNasen auf die eindringende DNA begrenzt wird. Die RNAs werden 48 h vor der Transfektion hergestellt oder präpariert, wie zuvor beschrieben, und durch Northern-Blot mit einer für die VA-anti-rev-RNAs spezifischen Sonde analysiert. Die 11 zeigt eine vorübergehende oder transitorische Expression der RNAs (Bande 293), die verglichen mit den RNAs, die in den Zellen, die die integrierte VA-RNA stabil exprimieren, produziert werden (Spur CEM), stärker ist.
REFERENZEN

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Claims

Rekombinanter DNA-Vektor, welcher eine Kassette für eine Transkription durch die RNA-Polymerase III umfasst, welche gebildet wird aus dem Gen VAI von Adenovirus, das durch die RNA-Polymerase III transkribiert wird, in welches man ein Oligonukleotid, ein DNA-Fragment, in der Region, die von Nukleotid 10694 bis Nukleotid 10730 des in 1 dargestellten VAI-Gens von Adenovirus 2 geht, oder anstelle der Region, die von Nukleotid 10694 bis Nukleotid 10730 geht, wobei diese deletiert ist, insertiert hat.
Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid in der Region, die von Nukleotid 10702 bis Nukleotid 10728 des in 1 dargestellten VAI-Gens von Adenovirus 2 geht, oder anstelle dieser Region, die von Nukleotid 10702 bis Nukleotid 10728 geht, wobei diese deletiert ist, insertiert ist, und wobei das Gen als VA delta IV bezeichnet wird.
Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid bei Nukleotid 10711 des in 1 dargestellten VA-1-Gens von Adenovirus 2 insertiert ist.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein plasmidischer, episomaler replikativer Vektor oder ein viraler Vektor ist.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein episomaler Vektor ist, der den Replikationsstartpunkt des Epstein Barr-Virus (oriP) sowie die das Protein EBNA 1 kodierenden Sequenzen umfasst.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er mehrere identische oder unterschiedliche virale Gene, die durch die RNA-Polymerase III transkribiert werden, umfasst, in welche man ein identisches oder unterschiedliches Oligonukleotid außerhalb der Boxen (Nukleotidsequenzabschnitte) A und B in jedem der genannten viralen Gene insertiert hat.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid 15 bis 40, vorzugsweise 15 bis 25 Nukleotide umfasst.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das virale Adenovirus-Gen ein Gen ist, welches durch Deletion oder Mutation hinsichtlich der Hemmung der Wirkung von Interferon inaktiviert worden ist.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid innerhalb der Region, die für die Aktivität der Hemmung der Wirkung von Interferon verantwortlich ist, insertiert ist.
Vektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein rekombinantes defektes oder rekombinationsdefektes Adenovirus handelt.
Retroviraler RNA-Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er das RNA-Transkript der Transkriptionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
Durch einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 infizierte oder transfizierte Zellen.
Verfahren zur intrazellulären Herstellung eines RNA-Fragments in vitro, bei welchem man eukaryotische Zellen, die RNA-Polymerase III enthalten, mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welcher als Oligonukleotide ein DNA-Fragment, welches dem Umkehr- oder reversen Transkript der RNA entspricht, umfasst, transfiziert oder infiziert, und dass man in einem geeigneten Kulturmedium die so transfizierten oder infizierten eukaryotischen Zellen kultiviert.
Verfahren zur Blockierung der Expression eines Gens ex vivo mit Hilfe eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11, von dem das Oligonukleotid in ein Antisinn- oder Ribozym-RNA-Molekül transkribiert wird, welches mit der mRNA des Gens hybridisiert und/oder diese spaltet.
Verfahren zur Behandlung von Zellen ex vivo mit Hilfe eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als Arzneimittel, welches insbesondere als antivirales Mittel, Antitumor-Mittel, antibiotisch oder antiparasitär wirksames Mittel oder bei einer jeglichen Pathologie, wo ein Gen entweder durch Mutation oder durch fehlerhafte Regulation in abnormaler Weise exprimiert wird, einsetzbar ist.
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11 als Arzneimittel nach Anspruch 16, bei welchem das Oligonukleotid in ein „Antisinn"-RNA-Molekül oder ein Ribozym-RNA-Molekül transkribiert wird, welche die Expression eines an einer Pathologie beteiligten Gens blockieren, indem sie mit dessen mRNA von zellulärem, viralem, bakteriellem oder parasitärem Ursprung hybridisieren und/oder diese schneiden.
Vektor, gebildet aus einem defekten viralen Vektor, wie einem Adenovirus, oder einem defekten retroviralen Vektor, wie einem Mäuse-Retrovirus, als Arzneimittel nach Anspruch 16 oder 17.
Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welcher als Oligonukleotide insbesondere anti-rev- oder anti-tat-Antisinn-Sequenzen umfasst, als Arzneimittel für die Behandlung von AIDS nach einem der Ansprüche 16 bis 18.