KR0148782B1 - 유전자 발현에 영향을 주는 다수의 표적반응요소를 가진 벡터 - Google Patents

유전자 발현에 영향을 주는 다수의 표적반응요소를 가진 벡터

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Abstract

본 발명은 다수의 표적반응요소를 포함하는 DNA 서열에 의한 바이러스저해, 특별하게는 HIV저해에 관한 것이다.
유전자 치료용도를 위한 구조체가 생물학적 조절의 컨트롤 하에 있는 것은 이것이 처음이다. 만약 세포가 감염되고 바이러스성 단백질이 만들어지면 보호유전자 생성물만이 발현될것이다.
본 발명의 DNA구조체는 그 요서가 탠덤하게 전사되도록 적어도 하나의 표적 반응요소에 작동적으로 연결되는 프로모터 및 벡터로 이루어진다.
그 DNA 구조체는 HIV감염된 환자로 부터 세포를 얻고 그 세포를 구조체로 형질전환시킨다음 그 형질전환된 세포를 환자에 투여함으로써 바이러스감염 특히 HIV 관련질병의 치료에 이용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
유전자 발현에 영향을 주는 다수의 표적반응요소를 가진 벡터
[발명의 배경]
본 발명은 1990년 1월 18일 Lisziewic가 출원한 출원번호 제07/467,407호의 일부 계속출원이며 상기 출원의 전체 내용은 인용예로 여기에 포함되어 있다.
[발명의 분야]
본 발명은 다수의 표적반응요소를 코드하는 DNA 서열로 바이러스를 저해시키는 방법 및 거기에 사용하기에 적합한 구조체에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)를 저해하는 방법에 관한 것이다.
[배경정보]
HIV의 tat 단백질은 바이러스 유전자 발현을 전이 활성화시키며 바이러스 생산에 필수적이다[Arya et al, Science 229: 69-73(1985) ; Sodroski et al, Science 229 : 74-77(1985) ; Dayton et al, Cell 44 : 941-947 (1986); Fisher et al, Nature 320 : 367-371(1986)].
tat활성화 반응요소(TAR로 지칭됨)는 전사개시부위의 하류 처음 44 뉴클레오티드의 영역이내에 위치한다[Chen, C., 및 Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 7:2745(1987) ; Rosen et al, Cell 41 : 813-823(1985) ; Tong-Starksen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84 : 6845-6849(1987) ; Hauber et al, J. Virol. 63 : 673-679(1988)]. 모든 HIV-1 전사체로 존재하는 이 영역은 비상히 안정한 줄기고리구조(Stem loop structure)를 형성하고 [Okamoto, T., 및 Wong-Staal, F. Cell 47 : 29-35 (1986)], 몇가지 계통의 증거는 tat의 전사효과가 바이러스 RNA의 TAR 영역과의 상호작용을 통해 중개됨을 암시한다[Sharp et al, Cell 59 : 229-230(1989) ; Viscidi et al, Science 246: 1606-1608(1989) ; Berkhout et al, Cell 59 : 273-282(1989) ; Garcia et al, EMBO J. 8 : 765-778(1989) ; Feng, S. 및 Holland, E. C. Nature 334 : 165-167(1988); Southgate et al, Nature 345 : 640-642(1990)].
TAR RNA 서열에의 tat가 결합한다는 발표가 있지만[Rappaport, J. et al, Cold Spring Harbor, New York(1989b) ; Dingwall et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86 : 6925-6929 (1989)], tat결합을 위한 서열요건은 전이활성화에 필요한 서열 및 구조적 조건을 설명하기에는 불충분하다.
세포인자도, tat매개 전이활성화에 있어 역할을 하여 추가적으로 특이성을 주는 것 같다[Marciniak et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 87 : 3624-3628 (1990)]. tat는 비영장동물세포에서는 제대로 작용하지 못하는 것 같으며 종간잡종을 이용한 연구는 전이활성화 능력은 인간 염색체12의 존재와 관련이 있음을 암시하고 있다 [Hart et al, Science 246 : 488-491].
수종의 세포성 TAR RNA 및 TAR DNA 결합 단백질이 확인되었다[Gaynor, R. B. EMBO J. 8:765-778(1989) ; Gatignol et al, Proc. Natl Acad. Sci USA 86 : 7828-7832(1989) ; Wu et al, EMBO J. 7 : 2117-2129(1989) ; Jones et al, Science 232 : 755-758(1986) ; Garcia et al, EMBO J. 8 : 765-778(1989) ; Marciniak et al, Proc. Natl Acad. Sci. 87 : 3624-3628(1990)].
그러나 tat 매개 전이활성화에 있어 이들 단백질의 역할은 아직 분명하지 않다.
시험관내에 있어, tat 단백질이 방출되어 세포에 흡수될수 있으며[Frankel, A.D., 및 Pabo, C. O. Cell 55 : 1189-1193 (1988)], HIV 프로모터를 활성화시키는데 역할을 하고 더하여 세포증식의 조절에 대해 생물학적 효력을 나타낸다.
최근의 연구결과 tat는 항원 유기 임파구 번식을 저해하며[Viscidi et al, Science 246 : 1606-1608(1989)] AIDS환자의 카포시 육종 병변으로부터 유도된 세포에 대해 성장 촉진 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다[Ensoli et al, Nature 340 :84-86(1990)].
그와는 대조적으로 tat는 미토겐에 반응하여 임파구 번식을 크게 감소시키지는 않는다.
HIV 관련 질병을 일으키는데 HIV-I tat 가 관여하는 것이 알려졌으므로 tat 기능을 저해하는것(방해하는것)이 치료적으로 의미가 있을 것이다.
HIV 단백질에 대한 전이지배 돌연변이가 보고되었다[Malim et al, Cell 58 : 205-214 (1989) ; Trono et al, Cell 59 : 113-120 (1989) ; Marcinial et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 87 : 3624-3628 (1990)].
강력한 프로모터로 부터 기본적으로 생산되는 이들 단백질은 HIV-I의 성장을 길항할 수 있고 따라서 바이러스 감염에 면역된세포주를 만드는데 사용될 수 있다.
TAR RNA는 직접 tat 단백질과 결합하던지 [Southgate et al, Nature 345 : 640-642 (1990)] 또는 세포인자와의 합성활성을 통하여 [Marciniak et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 3624-3628 (1990)] tat 단백질과 작용하듯이 하므로, 본출원인은 대량으로 생산된 TAR RNA는 tat 기능에 대한 경쟁력 있는 저해제 역할을 할 수 있을 것이라고 가설을 세웠다.
다음에 나오는 실시예에 주어진 결과들은 TAR RNA의 과도 생산은 사용량에 따라 tat 매개 전이 활성화를 저해할 수 있음을 보여준다.
바이러스형 또는 세포형 전이활성체를 차단하기 위해 고수준의 표적 RNA 요소의 발현을 생물학적으로 조절하는 방법은 신규한 종류의 항 바이러스 약제의 제조에 범용성을 가질 것이다.
본 명세서에 예시된 폴리-TAR 의 유도성 전사체를 전이지배 돌연변이체를 코딩하는 서열과 결합시키면 세포내 면역화에 대한 상승 작용을 발휘할 수 있을 것이다.
[발명의 요약]
HIV-1 LTR 관련 유전자발현을 저해시키는 수단을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
tat작용(기능)에 대한 경쟁적인 저해제를 제공하는 것이 본 발명의 다른 목적이다.
세포내 면역화에 대한 일종의 항 바이러스약제를 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
여러 다른 목적 및 이점들은 발명의 상세한 설명 및 도면으로부터 명백해 질 것이다.
한 구체예에 있어, 본 발명은 탠덤하게 전사될 수 있도록 최소한 두개의 반응 요소에 작동적으로 연결된 프로모터와 백터로 구성되는 DNA 구조체에 관한 것이다. 구성체는 그위에 바이러스 DNA 에 특이적인 리보짐을 코드하는 DNA부분 또는 바이러스 단백질의 전이지배 네가티브 돌연변이체를 코드하는 DNA 부분을 포함한다.
다른 구체예에 있어서는 본 발명은 바이러스 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 바이러스 감염환자로부터 세포를 얻는단계 및 본 발명의 구조체를 이용하여 그 세포를 형질 전환하는 단계를 포함한다.
그런뒤 그 세포를 환자에게 다시 도입한다.
또다른 구체예에 있어, 본 발명은 바이러스에 감염된 세포내에 본 발명의 구조체를 도입하는 바이러스 복제를 저해하는 방법에 관한 것이다.
바이러스로부터의 생산물이 구성체의 요소의 전사를 조절하여 저해가 달성되게 한다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 HIV-LTR에 의한 다수의 TAR 요소를 이용하여 HIV 유전자 발현을 세포내에서 저해하는 것에 관한 작동가설을 나타낸다.
이 모델에 의하면, 바이러스 LTR 로부터 발현된 tat가 LTR에 의한 다수의 TAR요소의 전사를 활성화한다.
다수의 TAR RNA는 경쟁력으로 tat와 결합을 한다.
따라서 바이러스 유전자 발현은 tat 발현과 함께, 구성체내 TAR 요소의 수에 좌우되어 평형에 도달할 때까지 감소한다.
제2a도는 다수의 TAR 요소의 구성 및 전사체의 예상되는 이차 구조를 나타낸다.
이 도면은 DraI과 SmaI의 반 회문구조 서열을 가지고 어닐링시킨 완전 야생형 TAR 요소를 함유하고 있는 올리고 뉴클레오티드를 나타낸다.
화살표는 전사의 방향을 나타낸다.
다수의 TAR RNA의 예상 이차 구조도 또한 표시되어 있다.
B. 플라스미드의 일반 구조를 나타낸다.
이 실험에 사용되는 플라스미드는 야생형 HIV-1-LTR로부터 네가티브 조절요서(NRE)를 삭제하므로써, 얻어지는 CD7-LTR를 함유한다.
모든 구조체는 박테이라 CAT 유전자의 C- 말단부(NcoI 부위로 부터 하류) 및 SV-40 스프라이스 및 폴리아데닐화 시그날을 함유하고 있다.
제3도는 다수의 TAR 요소의 전사가 전이 활성체를 저해하는 것을 보여준다.
A 및 B. 플라스미드, 1㎍ RSV-루시페라제, 2.2 ㎍ LTR-CAT 및 0.48 ㎍ LTR-tat(패널A) 또는 0.48㎍ pSVL- tat (패널B) 플라스미드(표시되어 있는대로)를 함유하는 4.4㎍의 상이한 폴리-TAR를 사용하여 COS세포를 코트랜스펙숀(cotransfection)했다. + 및 -는 각각 코트랜스펙숀 분석에 있어 특정 플라스미드의 존재 및 부존재를 나타낸다.
트랜스펙숀 48시간후 CAT 발현 및 루시페라제 활성을 알아보기 위해 세포용해물을 분석했다.
C. 도면에 표시된 여러 플라스미드로 트랜스펙숀한 COS 세포로부터 총 RNA를 제조했다.(13).
+ 및 - 는 코트랜스펙숀 분석에서 특정 플라스미드의 존재 및 부존재를 나타낸다. 노던 블로트 혼성화법으로 10㎍RNA를 분석했다.
제2도가 나타내는 것처럼, 코트랜스펙숀에 사용된 구조체는 CAT 유전자의 짧은 C-말단부를 갖고 있다.
틈해독된 CAT 단편(Pharmacia)을32P-표지된 프로브로 사용했다.
D. COS 세포는 발현 플라스미드 1㎍ RSV- 루시페라제, 2.2 ㎍ HTLV-I-LTR-CAT, 0.48 ㎍ HRLV-I-LTR-TAX(13), 0.48㎍LTR-tat를 표시한 바와 같이 함유하는 표시된 여러 폴리-TAR 4.4㎍과 함께 트랜스펙숀시켰다.
+ 및 - 는 코트랜스펙숀 분석에 있어 각 특정 플라스미드의 존재 및 부존재를 표시한다. 트랜스펙숀 48시간후 CAT 발현 및 후시페라제 활성에 관해 세포추출물을 분석했다.
제4도는 전이활성화의 저해는 TAR RNA 전사체의 양에 의존하는 것을 보여 준다.
A. COS 세포를 LTR-5STAR의 양을 증가시키면서 LTR-CAT 2.2㎍과 LTR-tat 0.48㎍으로 공형질전환시켰다.
프로모터의 농도를 일정하게 유지하기 위해 lTR-OTAR(X는 0.22㎍을 가리킨다)의 양을 감소시키면서 사용하였다.
코트랜스펙숀 분석에서 +는 특정플라스미스가 존재함을 , -는 존재하지 않음을 나타낸다. 형질전환 48시간후에 CAT 발현을 알아보기위해 세포 용해물을 분석하였다.
BC. 전체 RNA 는 도면에 제시된 여러 플라스미드로 트랜스펙숀된 COS 세포로부터 얻었다. RNA 10㎍을 틈번역된32P-표지 CAT DNA 절편을 이용하여 노던 블로트 혼성법으로 분석하였다(패널 B). CAT 소식자는 제1도에 예시된 모든 구조체와 결합하였다.32P-표지 tat DNA 프로브는 다른 조건하에서 발현되는 tat mRNA를 정량하는데 사용되었다.(패널C).
제5도에서 TAR RNA 전사체에 전사활성을 저해하는 양이 다양함을 알 수 있다. OTAR에서 50TAR 인자를 포함하는 구조체에 의한 저해를 비교하였다.
제6도에서 바이러스 복제의 저해에 대한 리보짐- 폴리- TAR구조체의 예를 알 수 있다.
제7도에서 HIV복제를 저해하는 △GAC-폴리-TAR 구조체의 예를 알수 있다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명을 하게된 본 연구의 특별한 목적은 tat 단백질의 작용으로 활성화되고, 동시에 tat 활성을 저해할수 있는 유도벡터 시스템을 확립하는데 있다. 본 발명의 방법은 tat 활성반응(TAR) 요소의 과량생산을 통해 tat 기능을 저해하는 것이다. 제1도에서 본 방법에 대해 알 수 있다. 보호된 세포는 적어도 본 발명의 구조체중 하나의 복제물을 포함하고, 감염후에는 통합된 프로바이러스의 하나의 복제물을 포함한다.
만일 HIV-LTR이 활성화되면, tat단백질이 프로바이러스 게놈에서 초기 유전자산물로서 만들어진다. 이들 tat 단백질의 일부는 바이러스의 유전자 발현을 활성화시키고, 일부는 구조체에서 중복된 TAR 인자의 전사를 활성화 시킨다. 다수의 TAR RNA 가 tat 결합과 경쟁함에 따라 유전자 발현는 감소한다. tat는 본질적으로 tat 존재에 의존하여 발현하는바, tat 발현은 복수체의 TAR 인자수에 의존하여 일정한 평형에 도달할때까지 모든 LTR 관련유전자 발현과 함께 감소한다.
이는 유전자 치료법으로 제안된 구조체가 생물학적 조절의 통제하에 존재하는 첫번째 경우이다. 보호된 유전자 산물을 세포가 감염되어 tat가 만들어지는 경우에만 발현된다. 만약 그렇지 않으며 구조체는 게놈에서 비활성 상태로 존재한다.
다수의 TAR 인자를 이용한 바이러스 복제의 저해는 기능적 저해이므로 모든 HIV분리체에 대해 효과적이다.
대부분의 HIV 백신이 직면하는 문제는 바이러스의 높은 돌연변이율이다. 본 구조체는 레트로바이러스의 돌연변이에 대해 제한적이지 않다. 따라서 본 발명은 TAR 인자의 적어도 하나의 복제물, 바람직하게는 5~50복제물, 가장 바람직하게는 20복제물 이상을 코딩하는 DNA 구조체에 관한 것이다.
본 발명과 관련된 구조체는 TAR 요소등과 같은 다수의 표적 반응요소, LTR-HIV 같은 프로모터 및 pCD7 같은 벡터를 지니는 DNA 절편을 포함한다. 다수의 활성 반응요소는 탠덤하게 존재해야하며, 또는 분리되어 있어도 이들의 전사는 분리시키는 서열에 의해 방해받지 말아야 한다.
본 발명자는 TAR RNA 가, TAR 요소가 증가해도 저해를 증가시키지 않는 한계점인 25개의 TAR 를 포함한때까지 TAR 요소가 증가함에 따라 HIV 저해가 증가함을 발견하였다. 측정실험은 임시 발현분석을 통해 실시한 바, 안정하게 통합된 경우에는 TAR 를 부가시키면 저해가 증가되었다.
본 발명의 구조체에서 프로모터가 TAR RAN의 생산량을 조절할 수 있도록 다수의 TAR DNA 절편에 연결된다. 하기예에서는 HIV-LTR 프로모터가 사용되지만 다수의 TAR 요소 여러 다른 프로모티에서 전사될 수 있다. 예컨대, tat 단백질에 의해 활성화 되어질 수 있는 프로모터가 사용될 수 있다. 다른 프로모티들(CMV, SV40 또는 tRNA 프로모터)도 사용될 수 있으나, 이들 프로모터들은 유전자 산물의 본질적 발현을 일으킨다. HIV-LTR 등의 프로모터를 이용하는 장점은 바이러스에 의해 유도된다는 점이다. 이것은 다른 어느 프로모터보다도 특이적이다. 게다가 조직- 특이적 프로모터가 이들 구조체에 유용하다.
본 발명의 구조체에 사용된 벡터 예를 들어 레트로 바이러스 벡터는 생체외에서 표적세포에 대해 높은 효율로 유전자 전달을 보장해야 한다. 본 발명에 사용된 적절한 벡터는 원핵세포에서 증식할 수 있는 복제 기원과 선별표지를 지니는 벡터를 포함한다. 벡터는 하나이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 더욱이, 본 구조체의 벡터는 세포기능을 파괴시키지 않고 구조물의 특정부위를 염색체로 통합시킬 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 또한 벡터는 표적세포로 구조체를 전달시키고 계속 감염시켜서 벡터증식을 촉진시키는 조력자 바이러스 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 구조체를 이용하여, 본 발명자는 HIV-1 유전자 발현수준이 낮게 조절되는 것은 구조체의 TAR 인자의 수에 의존함을 규명하였다. 이는 몇가지 과다한 표적 뉴클레오티드 서열의 사용이 희망하지 않는 유전자 활성을 낮게 조절할 수 있음을 시시한다. 바이러스 발현을 저해하거나 바이러스 단백질의 파괴적 효과에 반대로 작용하는 보호단백질을 유도하는 다른 요소들을 TAR 요소에 탠덤하게 결합시키는 것도 가능하다. 예컨대 본 발명의 방법으로 만든 제6 및 제7도의 구조체는 희망하지 않는 유전자 활성을 낮게 조절하는데 이용할 수 있다. 구조체로 통합되는 적당한 요소의 예에는 전이지배 조절 단백질, 안티센스, 시열, 인터페론 같은 항바이러스 인자 또는 면역계 자극 인자등을 코딩하는 서열이 있다. 구조체에는 또한 다른 활성 또는 저해 반응요소가 포함될 수도 있다.
상기와 같은 본 발명의 구조체의 저해 활성은 바이러스 단백질의 전이지배 네가티브 돌연변이체, 예컨대 돌연변이체 GAG, 또는 HIV mRNA에 대한 리보짐-관련물질, 예컨대 GAGNAM등을 구조체에 포함시키므로서 증가시킬 수 있다. 구조체는 rev- 반응인자(RRE)도 포함한다. 구조체의 RRE인자는 구조체에서 만들어진 RNA를 핵에서 세포질로 수송하는 기능을 한다.
하나의 구조체내에서 바이러스 mRNA에 대한 TARs와 리보짐의 결합은 두가지 타입의 저해를 제공한다. TARs가 tat를 격리시켜 HIV-1 관련 유전자 발현을 저해하는 반면에 리보짐은 표적 RNA 와 히브리드를 이루어 절단하므로서 단백질 합성을 저해한다. 이 두저해 기작의 결합이 전체 저해가능성을 증가시킨다. 하기예에 사용된 리보짐인 GAGNAM은 미국인의 HIV- 분리체에서 보존되어 있어 특별히 좋은 표적인, GAG mRNA에 작용한다. TARs, GAG와 같은 HIV 단백질의 전이지배 돌연변이체를 포함하는 구조체는 HIV 유전자 발현과 바이러스의 조립을 저해한다. TARs와 돌연변이체 GAG의 결합은 바이러스가 돌연변이를 통해 극복할 수 없는 순수한 기능적 저해를 제공한다.
본 발명의 구조체는 문헌에서 알려진 적당한 방법을 통해 만들 수 있다. 실험자는 서열의 직렬상 첨가와 다수의 표적반응서열을 제공하기 위해 한 방식으로 연결된 정제된 반응서열을 이용하여 다수의 표적 반응서열을 제조할 수 있다. 주의할 점은 다수의 활성 반응서열을 포함하는 구조체가 예증되는 반면, 구조체는 다수의 저해 반응 서울도 포함할 수 있다는 점이다. 다수의 저해 서열을 이용함으로서 실험자는 희망하는 프로모터의 활성을 촉진시킬수 있으리라 예상된다.
이러한 다수의 저해 반응 서열을 직렬상으로 포함하는 구조체는 예컨대 희망하는 단백질의 발현과 관련있는 프로모터를 자극하여 희망하는 생산물의 생산을 증가시키기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 구조체는 공지된 방법을 통해 유전자 치료에 이용할 수 있다. 세포내 면역이라 알려진 David Baltimore(Nature 335 : 395-396(1988))에 의해 언급된 방법을 이용할 수 있다. 예컨대 본 발명의 구조체를 모든 조혈 간(幹) 세포를 포함하여 골수세포로 삽입시킬수 있다. 혈구 세포는 혼성집단이나 임파세포와 같은 동질 집단으로 존재할 수 있다. 예증된 구조체를 이용하여, HIV 감염자의 세포를 사용할 수 있다. 유전자의 삽입후에 세포를 환자한테 역(逆) 주사할 수 있다. 이식된 세포의 생장 공간을 만들기 위해 광선요법을 통해 부분적으로 맑게 하거나 또는 변형된 세포를 주사하기 전에 약물치료를 해야한다.
또한 환자의 혈구 세포에 본 발명의 벡터를 삽입시킬 수 있다. 구조체를 지닌 세포를 환자에게 재삽입시킬수 있다. HIV 감염을 치료하는데 있어, 구조체를 CD4+ 세포로 삽입시켜야 한다. 이들 세포의 교체가 상대적으로 빠르기 때문에, 보호된 세포의 재- 삽입은 바이러스의 감염이 존재하는 한 필요하다. 그러한 세포의 반복된 도입이 요구될 것이다. 다수의 TAR 구조체 및/또는 본발명의 TAR + 리보짐 구조체는 유전자 치료 전략에서 중요할 수 있는 단백질 생성물이 아닌 저해 RNA 만 생산하는 것으로 믿어진다.
본 발명의 다수의 TAR 요소 구조체를 이용하는 것이 매우 유리하다. 예를 들면, 그 구조체는 HIV-1으로 향한 유전자 발현의 특이 저해를 제공한다. 보호 유전자 생성물의 발현은 생물학적으로 조절되는데 그것은 생체내 정상 세포 과정에서 TAR- 함유 전사의 구성적 발현이 유독할 수 있기 때문에 현저하게 유리하다. 구조체의 유용성은 서로 다른 HIV 분리물 사이의 다양성에 의해 제한되지 않는다. 더욱이, 리보짐 또는 HIV 단백질의 트랜스 우세 돌연변이와 같은 서열을 아래 쪽으로 삽입하므로써 구조체의 이용을 확장할 수 있다.
[실시예]
이하의 비 제한적인 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고 있다. 본 발명은 HIV 시스템과 TAR 요소를 사용하여 예시되고 있으나 본 기술분야의 당업자라면 본 발명의 방법을 이용해서 다른 바이러스의 저해가 이행될 수 있다는 것을 예상할 수 있을 것이다.
[플라스미스 제조]
HIV-LTR의 조절하에서 서로 다른수의 일정방향성 TAR 요소를 함유하는 플라스미드를 제조한다(제2도 참조).
다중결합된 TAR 서열이 네가티브 조절요소(NRE)가 결핍되고 야생형 HIV-1-LTR과 비교해서 높은 수준의 발현을 가지는 5'HIV-1-LTR 결실 돌연변이 CD7의 확실한 TAR 서열 아래방향으로 크론된다[Siekevitz 등의 Science 238: 1575-1578(1987)]. HIV-1 LTR 부분 (-278-+63)을 가지는 플라스미드 PCD7( 스테펜 조셉에 의해 제공됨)을 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키고 다수의 텐덤 TAR 요소를 연결시킨다. LTR-1TAR, LTR-4TAR 및 LTR-5TAR은 각각 1,4 및 5카피의 TAR 요소를 포함한다.
플라스미드 LTR-5TAR 및 LTR-4TAR를 제조하기 위해서 Dra I 및 SmaI 제한 엔도 뉴클레아제 인식 위치에 대한 회문(回文) 서열의 반에 의해 접해져 있는 HIV-1의 전체 TAR 요소(+1내지 +63)에 대한 서열을 포함하는 2개의 올리고 뉴클레오티드가 합성된다. 그 올리고 뉴클레오티드를 정제하고 인산화하고 안닐링 시킨다.
안닐링된 DNA(TAR)은 TAR 요소의 오직 텐덤 (방향을 맞춘) 결합만하게 하는 Dra I 및 Sma I의 존재하에서 연결된다. HIV-I-LTR의 부분(-278 내지 +63)을 가지는 플라스미드 CD7-CAT [Siekevitz 등의 Science 238 : 1575-1578(1987)]을 제한 엔도뉴클레아제 Hind III 및 NcoI로 소화시키고 말단은 다수의 텐덤 TAR요소로 채우고 연결시킨다. 한번 시험한 여러 E. coli 균주중에서 Bj 5183 : F, rec BC, endo I, gal, met, str, thi, bio, hsd. (F. Lacroute에 의해 공급받음)가 재배열 없이 이들 플라스미드를 유지할 능력이 있었다. LTR-1-TAR은 CD7-CAT를 Hind III 및 NcoⅠ로 소화시켜서 제조하고 말단을 채우고 재연결 시킨다. 2그룹의 컨트롤 플라스미드가 생성된다. 즉, 상류프로모터 서열의 결실을 가진 5TAR (TAR 서열은 존재하나 전사되지 않는다)과 TAR 서열을 가지지 않으나 상류 프로모터 서열을 포함하는 LTR-0TAR(제2도)가 생성된다.
LTR-0-TAR은 CD7-CAT 플라스미드[Siekevitz 등의 Science 238 :1575-1578(1987)]을 PvuII 및 NcoⅠ로 소화시켜서 제조하고 평체말단화하고 재연결시킨다. 5TAR 플라스미드는 Xba I 및 PvuII로 소화시켜서 플라스미드 LTR-5TAR로부터 HIV-LTR의 5'부분을 결실시켜서 제조하고, 말단을 채우고 재연결시킨다. LTR-tat는 SalⅠ 및 BamHI로 pSVL- tat [Rapaport 등의 The NEW Biologist 1 : 101-110(1989a)]를 소화시켜서 제조하고; 350 Bp tat 함유 단편을 분리하고, 평체말단연결은 HindIII와 NcoⅠ 위치 사이에서 벡터 CD7-CAT로 행한다.
모든 구조체는 제한지도 및 서열화에 의해 확인된다. 전화된 복사물은 연결하는 동안 SmaI와 DraI 효소에 의해서 절단하기 때문에 그 클로닝 전략은 직접적이나 전화되지 않은 TAR요소의 복사물을 형성하게 된다. 각 요소의 정확한 방위 및 2차적 구조는 원하는 효과를 위해서 중요하다고 여겨지는데 왜냐하면 TAR은 위치의존 방식에서만 전이 활성화하기 때문이다[Peterlin 등의 Proc, Natl. Acad. Sci. USA 83 : 9734-9738(1986)].
[전이활성화의 하향조절은 TAR 요소의 전사에 의해 좌우된다.]
HIV-LTR유전자 발현에 대한 다수의 TAR요소의 효과를 측정하기 위해서 TAR 발현 플라스미드를 COS 세포에서 LTR-CAT [Siekevitz 등의 Science 238 : 1575-1578(1987)] 와 LTR-tat 또는 pSVL-tat [Rappaport 등의 The NEW Biologist 1:101-110 (1989a)] 와 코트랜스펙숀시킨다. COS-1 세포를 10% 소태아 혈청이 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 생장시켰다 2×105세포를 트랜스펙숀 하루전에 6개의 웰이 있는 조직 배양 플레이트에 있는 배지3㎖에 넣었다.
전체 플라스미드의 25㎍을 3개의 웰에 사용하였다. 다른 플라스미드의 양을 도면에 나타냈다. pBR 322 플라스미드를 운반체 DNA로 사용하였다. 트랜스펙숀은 인산칼슘방법[Chen, C., 및 Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7 : 27-45(1987)]으로 시행하였다. 트랜스펙숀 48시간후에 세포를 수집하여 (SIGMA 세포제거 시약) PBS에서 조세포 추출물을 만들었다. 트랜스펙숀 효율을 측정하기 위해 RSV 플라스미드-루시페라제를 내부 조절체로 포함시켰다. CAT 단백질 양과 루시페라제 활성의 상대적 수준을 트랜스펙숀된 세포의 추출물로부터 결정하였다.
CAT 단백질은 5 PRIME 3 PRIME ELISA 장치를 써서 제조사의 지시에 따라 분석 하였다: 투시페라제 활성은 P. E. Stanley 및 S. G. Williams [Stanley, P. E. 및 Williams, S. G. Anal. Biochem 29:381 (1969) ]에 따라 측정하였고 활성도를 임의 단위(ARU) 로 표현하였다.
제3a도에서 알수있듯이, HIV-LTR 에서 전사된 다수의 TAR 인자가 tat 의 존재하에서 HIV-LTR 관련 유전자 발현을 저해하고, 관찰된 조절 감소는 구조체중의 TAR 인자수에 비례한다.
LTR-4TAR 및 LTR-5TAR 은 각 평균 70% 및 80% 전이활성을 저해하였다.
또한 LTR-1TAR 은 40% 조절감소의 측정가능한 효과를 지닌다.
이러한 감소는 CAT및 tat 발현 저해의 축적효과를 나타내는바, 두 유전자 산물은 HIV-I-LTR 조절하에 있기 때문이다.
다수의 TAR 인자의 tat 가 SV40 후기 프로모터에서 본질적으로 발현될때 전이 활성을 저해하여 감소된 수준을 나타낸다(제3b도).
제2a와 제2b도에 제시된 결과는 본질적으로 발현되는 tat 에서 관찰된 50% 감소에 비해, tat 가 HIV-1 LTR 에서 발현될때는 CAT 발현이 82% 감소함을 예시한다. 멀티머형 TAR 서열의 전사는 효과적인 조절감소에 필요하고 일정상태에 있는 경쟁 RNA 의 축적은 tat 의 존재하에서만 일어난다( 제3c도 참조).
TAR 인자의 윗부분 서열로 본 관찰된 효과를 설명할수 없다.
TAR 서열을 포함하지 않는 LTR-OTAR 플라스미드 또는 프로모터의 윗부분 서열이 제거된 5TAR 플라스미드는 HIV-1 LTR 관련 유전자 발현에 특별한 효과를 나타내지 않는다( 제3a, 제3b, 제3c도 참조).
멀티머형 TAR RAN 효과의 특이성을 결정하기 위해 다른 사람 레트로바이러스 LTR 로 코트랜스펙숀을 수행하였다.
HTLV-1-LTR-CAT(M. Mereberg 가 제공함)를 리포터 유전자로 사용하고 HTLV-1 LTR 의 전이활성제로 HTLV-1-LTR-TAR 플라스미드를 포함시켰다.[Sodroski et al, Science 225 : 381-385(1984); Felber et al, Science 229 :675-679(1985)]. 또한 LTR-tat 를 멀티머형 TAR 인자의 전사에 공급하였다.
제3d도에 제시된 결과에서 다수 TAR RNA 인자의 발현은 HTLV-1 프로모터 활성에 영향을 끼치지 않는데, 이는 유전자 발현의 조절감소가 HIV-LTR에 특이함을 시사한다. 다수의 TAR RNA 요소가 HIV 유전자 발현의 전이활성을 특이적으로 저해시킬 수 있다는 것이 제3도에서 증명되며, 여기서 RSV 프로모터는 루시페라제 리포터 유전자와 커플되어 있다. 구조체를 사용하여 다수의 TRA RNA 요소의 특이성은 이질적 프로모터의 사용을 초래하지 않는다는 것을 증명하였다. TAR RNA 또는 DNA 요소를 사용하여 RSV 프로모터 활성의 큰 차이점은 발견할 수 없었다. 이것은 CAT 및 루시페라제 발현 부분으로서 RSV 프로모터에 대한 HIV-LTR 의 상대적 프로모터 활성을 의미한다.
[전이 활성의 저해는 TAR 전사체의 량과 평행한다.]
전이 활성에 대한 TAR 전사체의 량에 따라 달라지는 결과를 측정하기 위해 LTR-5TAR의 량을 증가시키면서 LTR-CAT 및 LTR-tat를 코트랜스펙숀시켰다. CINNA/BIOTECX RNA 20ℓ 시약을 회사의 공정방법에 따라 사용하여 RNA 를 분리 하였다. 노던 분석을 하기 위하여, RNA를 1% 포름알데히드/ 아가로오스겔로 전기영동하였다. RNA를 니트로셀루로오스 종이로 옮겨서, 틈번역된32P-표지 프로브를 사용하여 전술한 바와 같이 혼성화하였다[Maniatis 등, Cold Spring Harbor, 뉴욕 : Cold Spring Harbor, 뉴욕 : Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]. LTR-5TAR 플라스미드량을 증가시키면, CAT 발현이 부분적으로 감소한다(97%까지).
본 실험에서는 트랜스펙숀된 LTR 상류서열의 량을 일정하게 유지하기 때문에 저해원인이 HIV-I-LTR과 연관되 전사인자를 경쟁적으로 제한하기 때문일수는 없다. 트랜스펙숀된 LTR-5TAR 플라스미등의 량을 증가시키면 LTR-5TAR 전사체가 유사하게 증가한다. (제4b도 참조).
이 실험에서, HIV-1 LTR에 의한 유전자 발현의 하향 조절은 세포내로 도입된 발현 플라스미드 DNA의 상대량과 또한 발현 플라스미드에 포함된 전사된 TAR 의 수에 좌우된다는 결론이 나왔다. 노던블로트를 하여 보면 tat 및 CAT 발현은 다중의 TAR RNA (제4c도)에 의해 평행하게 감소하며; 이것은 둘다 HIV-LTR 에 의하기 때문에 예상되어지는 것이다,
제4도의 자료는 유전자 발현의 하향조절은 전사된 표적활성화 뉴클레오티드 서열의 수에 좌우된다는 사실을 지지해 준다. 자료는, tat에 의한 HIV-1 전이활성은 텐덤하게 연결된 5TAR RNA 요소를 사용하여 97%까지 하향조절되며, 하향조절은 TAR RNA 전사량의 작용이라는 것을 나타낸다. 자료는 5개 이상의 TAR 요소를 함유하면 하향조절 효과가 더 좋다는 것을 나타낸다.
[5개 이상의 TAR 요소를 함유하는 구조체]
다수의 TAR 구조체를 확장시키고 50개까지의 TAR를 포함하는 플라스미드를 만들어 시험하였다(제5도 참조).
15내지 45개 사이의 TAR를 포함하는 pST 18-폴리 TAR 구조체는 XbaⅠ로 pST18 벡터(Pharmacia)를 잘라서 만든다.
말단은 클레노우(Klenow) 효소로 단면말단을 만들고 탈인산화 시켰다. PvuⅡ 및 ScaⅠ로 pLTR-5TAR을 잘라서 단편(455Bp)을 함유하는 5TAR을 분리시켜 삽입부를 제조하였다. 상기 벡터와 삽입부를 같이 연결시켜 대장균을 형질전환시키는데 사용하였다.
당해 기술분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 커다란 삽입부를 포함하도록, 단일 콜로니에서 플라스미드 DNA를 만들고 클론을 선택하였다.
삽입부의 위치는 SspⅠ 및 HindⅢ+SspⅠ를 사용하여 제한효소분해 방법으로 조사하였다.
다음에 LTR-5TAR-CAT를 클론하였다. LTR-CAT벡터를 XbaⅠ+HindⅢ으로 잘라서 큰단편을 분리하였다. 중합효소연쇄반응에 의해 제조되는 LTR-5TAR 단편 삽입부는 PCR단편을 XbaⅠ+HindⅢ으로 잘라서 제조하였다. 벡터와 삽입부를 같이 연결하고 대장균을 형질전환시키는데 사용하였다. 단일 콜로니가 조사되었다.
상기와 같이 제조된 sSPT 45TAR은 HindⅢ+BamHⅠ로 잘라서 45TAR을 포함하는 큰 단편을 분리시켰다. 분리된 분획을 하나로 연결시켜, 이 연결된 산물로 대장균을 형질전환시켰다.
LTR-25 TAR 및 LTR-50TAR을 제조하였다. SaℓⅠ+BamHⅠ로 벡터 LTR-5TAR-CAT를 잘라서, LTR-5TAR-pBR322를 포함하는 분획을 분리하였다. SaℓⅠ+BamHⅡ로 pSPT-20TAR 또는 pSPT-45TAR을 잘라서 20TAR 또는 45TAR을 함유하는 단편을 분리하였다.
그리고 벡터와 삽입부를 연결시키고, 이 연결된 산물을 가지고 대장균를 형질전환시켰다. 제5도에 도시된 결과는 유전자를 발현시키는 HⅣ-1-LTR을 저해시키면 25TAR가 사용될때까지 구조물에서 TAR의 수가 증가한다. 25이상으로 TAR의 수가 증가하면 더 이상 저해되지 않는다. 이와같이 이 시점에서 단백질이 포화되는 것으로 믿어진다. 저해가 증가되는 것을 검출할 수 있을 만큼 시험이 민감하지 않을 가능성도 있다.
LTR-50TAR을 DC-벡터[Hantzopaulos 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 3519(1989)] 같은 레트로 바이러스 벡터로 넣는다.
XbaⅠ로 LTR-50TAR을 자르고 Klenow 효소로 체우고 고효율의 유전자 전이용 DC벡터의 Sna BⅠ 부위로 삽입한다. 고효율 유전자 전이를 하는 다른 벡터들도 본 발명에서 사용할 수 있다.
[리보짐-폴리-TAR의 구성]
RRE(T7프로모터의 조절하에 역-반응부분)을 포함하는 벡터 pRRE [Daefler 등, Proc, Natl, Sci. USA 98:4571-4575(1990)]을 BamHⅠ로 자르고 탈포스포릴화 시킨후 정제하였다. BamHⅠ부위에 인접한 65BP의 리보짐 PCR 단편[Chang et al., Clinical Biotechnology 2:23-31(1990)]을 BamHⅠ로 자르고 정제했다. 이 리보짐은 HⅣ-1 GAG mRNA에 반작용을 하는 것으로 Sarver 등에 의해 Science 247:1222(1990)에 나와 있다. 벡터와 삽입부를 연결하여 연결혼합물 일정량씩을 가지고 E. coli를 형질 전환시켰다. 개개의 형질전환체에서 플라스미드를 제조하여, 제한효소분해로 시험하였다. 8개의 클론이 삽입부를 포함하는 것으로 나타났다.
이 클론들을 시험관에서 생물학적 활성을 시험한 결과 8개중 3개가 합성기질(J. Rossi가 기증)을 자를 수 있는 능력을 가졌다는 것이 밝혀졌다. LTR-poly TAR-RRE- 리보짐(제6도 참조)을 구성하기 위해서, LTR-46TAR 벡터를 Saℓ로 자르고, 말단을 Klenow로 채우고 다시 HindⅢ으로 자른다.
그리고 DNA를 정제한다. 삽입부를 제조하기 위하여, pRRE-리보짐을 HindⅢ 및 SmaⅠ로 자른다. 314Bp 단편을 겔 전기영동으로 분리시켰다. 벡터와 삽입부를 연결시키고 E. coli를 형질전환시키는데 사용하였다. 콜로니를 하나하나 시험하였다.
LTR-poly TAR-PRE- 리보짐을 XbaⅠ로 잘라서 DC- 벡터[Hantzopaulos 등, Proc. Acad. Sci. USA 86:3519(1989)]와 같은 역바이러스 벡터로 전이시켰다. 커다란 XabⅠ 단편을 Klenow 효소로 채우고 DC벡터의 SnaBⅠ 부위에 삽입시켰다. 역바이러스벡터에 구조물을 넣는 것을 고효율의 유전자 전이를 위해서 필요한 것으로, DC벡터가 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 고효율 유전자 전이를 하는 벡터는 어느것이라도 적당하다.
[△GAG-Poly-TAR의 구성]
pRRE 벡터를 BamHⅠ로 자르고, 말단을 탈포스포릴화 시키고, 벡터를 정제하였다. 변이 바이러스 DNA HT4(Ⅵ-△E-dhfr) 중 코드된 △GAG 단백질은 HⅣ-1의 복제를 우세하게 방해할 수 있다[Trono et al., Cell 59:113-120(1989)]. 플라스미드 DNA HT4(Ⅵ-△E-dhfr)을 BglⅡ로 자르고 △GAG를 함유하는 1429Bp 분획을 1% 아가로스 겔에서 분리하였다.
벡터와 삽입부를 연결하고, 연결혼합물 일정량을 사용하여 E. coli를 형질 전환시켰다. 개개의 형질전환체에서 플라스미드를 만들고 제한효소, EcoRⅠ+SphⅠ, 분해로 시험하였다.
LTR-Poly TAR-PRE-△GAG 구성을 위하여(제7도 참조), LTR-46TAR 벡터를 SaℓⅠ로 자르고, 말단을 Klenow 효소로 채운다. 그리고 DNA를 정제한다. 삽입부의 제조를 위하여, pRRE-△GAG를 EcoRV 및 SmaⅠ로 잘랐다. 1.6KB 단편을 겔 전기영동으로 분리하였다. 벡터와 삽입부를 연결시키고, 그것을 사용하여 E. coli를 형질전환시켰다. 클로니 하나하나를 시험하였다. 구조물을 상기한 바와같이 DC-벡터에 삽입시켰다. LTR 5TAR(5TAR를 포함)이라고 명명된 플라스미드를 1990년 1월 17일에 메어리랜드주 베데스다에 있는 아메리칸 타입 칼춰 컬렉션에 수탁번호 68203으로 E. coli로 기탁하였다. 더욱, LTR-50 TAR플라스미드를 1990년 10월 12일에 메어리랜드주 베데스타에 있는 아메리칸 타입 컬춰 컬렉션에 수탁번호 68446으로 E. coli로 기탁하였다. 플라스미드를 부다페스트 조약하에 기탁하였다. 상기한 모든 출판물은 여기에 인용자료로 포함되어 있다. 상기한 발명은 명확성과 이해를 위해 자세하게 기술하지만, 당해기술 분야에서의 전문가가 개시된 내용을 읽으면 본 발명의 진정한 범위를 벗어나지 않는 여러가지 변화가 가능하다는 것을 알게 될 것이다.

Claims (20)

  1. TAR 요소가 탠덤하게 전사되도록, 적어도 2개의 인간면역결핍바이러스(HIV) tat 활성화 반응(TAR) 요소에 작동적으로 연결된 HIV 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터 및 벡터로 이루어지는 DNA구조체.
  2. 제1항에 있어서, 5개이상의 TAR 요소를 가지는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  3. 제2항에 있어서, 25개의 TAR 요소를 가지는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 바이러스의 발현 생성물에 의해 조절 가능한 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프로모터가 HIV-1 LTR인 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 벡터가 CD7인 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  7. 제1항에 있어서, 상기의 벡터는 레트로바이러스 벡터인 DNA구조체.
  8. TAR 요소가 함께 전사되도록 적어도 HIV TAR 반응요소에 작동적으로 연결된 HIV 긴말단 반복부(LTR) 프로모터와 벡터를 함유하고, 더욱이 HIV 복제를 저해하고 동일한 전사체에서 상기 TAR 요소와 함께 전사되는 분자를 코오드화하는 추가의 요소로서 상기 TAR 요소와 작동적으로 연결된 것을 함유하는 DNA구조체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 분자가 RNA 분자인 DNA 구조체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 RNA분자가 리보짐인 DNA구조체.
  11. 제8항에 있어서, 상기의 분자가 단백질인 DNA구조체.
  12. 제11항에 있어서, 상기의 단백질은 전이지배 네가티브 돌연변이 바이러스성 단백질인 DNA구조체.
  13. 제12항에 있어서, 상기의 바이러스성 돌연변이 단백질은 전이지배 gag 돌연변이 단백질인 DNA구조체.
  14. 제10항에 있어서, 상기의 리보짐은 HIV RNA에 특이적인 DNA구조체.
  15. 바이러스에 감염된 환자로부터 얻은 혈액세포에 제1항에 의한 DNA구조체를 도입시킨 바이러스성 감염치료에 이용하기 위한 DNA구조체 함유세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 바이러스가 인간면역결핍 바이러스(HIV)인 DNA구조체 함유세포.
  17. 제1항에 있어서, 상기의 TAR 요소의 전사는 HIV tat 단백질에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  18. 제1항에 있어서, 상기 프로모터에 작동적으로 연결되고 바이러스 RNA에 특이적인 리보짐을 코오드화하는 DNA절편을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  19. 제1항에 있어서, 전이지배 네가티브 돌연변이 바이러스성 단백질을 코오드화하는 DNA절편을 추가로 함유하고, 상기 프로모터는 이 DNA절편에 작동적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 단백질은 바이러스 방출을 억제하는 gag 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 DNA구조체.
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