JPH05504255A - 遺伝子発現に影響を与える多重標的応答因子をもつベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子発現に影響を与える多重標的応答因子をもつベクター 技術分野 本発明は、複数の標的応答因子をコードするＤＮＡ配列によってウィルスの阻害 を引き起こす方法およびこの方法における使用に適する構成物に関するものであ る。

特に本発明は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶウィルス）を阻害する方法に関す るものである。

従来の技術 ＨＩＶのｔｘｔタンパクは、ウィルスの遺伝子発現をトランス作用的に活性化さ せ、ウィルスの産生に必須のものである［Ａｒｙａ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２２９：８９−７３（１９８５）；５ｏｄｒｏａｋｉ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２２９ニア４−７７（１９８５）；Ｄａｙｔｏｎ　ｅｔａｌ、ｃｅｌ ｌ　４４：９４１−９４７（１９１ｉ６）；　Ｆｉｓｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａ ｔｕｒｅ　３２０：３８７−３７１（１９８Ｂ）］　ｏ　ｔ　ａ　を活性応答因 子（いわゆるＴＡＲ）は、転写開始部位の下流側の最初の４４ヌクレオチドの領 域中に位置していた［Ｃｈｅｎ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ。

Ｈ，、！４ｏ１．　Ｃｅ１１．Ｂｌｏｌ、　７：２７４５（１９８７）；　Ｒｏ ｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１１４１：１ｌ１３−８２３（１９８５）：　Ｔｏｎ ｇ−ｓｔａｒｋｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、　ＵＳＡ　１１４：６８４５−６８４９（ １９８７）；　Ｈａｕｂｅｒｅｔ　ａｌ、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２：６７３− ６７９（１９８８）］。

この領域は、すべてのＨＩＶ−１転写物に存在し、異常に安定したスラムルーブ 構造を形成し［０ｋａｉｏｔｏ、　Ｔ、。

ａｎｄＷｏｎｇ−Ｓｔａａｌ、　Ｆ、　Ｃｅ１ｌ　４７：２９−３５（１９８Ｂ ）］　、いくつかの証拠は、ｔａｔの転写効果がウィルスＲＮＡのＴＡＲ領域と の相互作用を通して媒介される、ということを示唆している［：５ｈａｒｐ　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ　５９：２２９−２３０（１９８９）；Ｖｉｓｃｉｄｉ　 ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１６０Ｇ−１６０８（１９８９）；Ｂｅ ｒｋｈｏｕｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１１５９：２７３−２１１２（１９１１１９） ；Ｇａｒｃｉａ　ａｔ　ａｔ。

ＥＭＢＯＪ、ｌｌニア８５−７７８＜１９１！９）：　Ｆｅｎｇ、　Ｓ、　ａｎ ｄ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｅ。

Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ　３３４：１６５−１６７（ＩＨＩＩ）；　Ｓｏｕｔｈｇａｔ ｅ　ｅｔ　ａｔ。

Ｎａｔｕｒｅ　３４５：６４０−６４２（１９９０）］。

ＴＡＲＲＮＡ配列への結合が証明されたが［Ｒａｐｐａｐｏｒｔ、Ｊ、ｅｔ　ａ ｔ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９ｂ） ；　Ｄｊｎｇｖａｌｌ　ａｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ　ＵＳＡ８８：８９２５−８９２９（１９８９）］、ｔａｔが結合するために 要求される配列は、トランス活性化に必要な配列および構造的な要求を説明する のには十分でない。細胞的な要因は、また、さらなる特異性を与えるｔａｔを介 したトランス活性化において、役割を演じているように思われる［Ｍａｒｃｉｎ ｉａｋ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　８７：３６ ２４−３６２１１１（１９９０）］。ｔａｔは非霊長類細胞においてはほとんど 機能しないようであり、相互特異的なハイブリッドを用いた研究は、トランス活 性化の能力がヒト染色体の１２番目の存在と関連していることを示唆している［ Ｈａｒｔ　ｅｒａｔ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４８：４８８−４９１］。ＴＡＲＤＮ Ａ結合タンパク質だけでなくいくつかの細胞性ＴＡＲＲＮＡが特定されたが［Ｇ ａｙｎｏｒ、　Ｒ，Ｂ、　ＥＭＢＯＪ、　８ニア６５−７７８（１９８９）；Ｇ ａｔｉｇｎｏｌ　ｅｔ　ａｔ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　Ｈニア８２８−７８３２（１９Ｈ）；　ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、ＥＭＢＯ Ｊ、　７：２１１７−２１２９（１９Ｈ）；Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｔ、　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３２ニア５５−７５８（１９８Ｂ）：　Ｇａｒｃｉａ　ｅｔａｌ、 　ＥＭＢＯＪ、　８ニア６５−７７８（１９Ｈ）：　Ｍａｒｃｉｎｉａｋ　ｅｔ 　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　８７：３Ｂ２４−３６２８（ １９９０）］　、Ｌかしながらｔｘｔを介したトランスからの活性化におけるこ れらのタンパク質の役割は、いまだにはっきりしていない。

インビトロでは、ｔａｔタンパク質は細胞によって放出され取り込まれることが でき［Ｆｒａｎｋｅｌ、　Ａ、　Ｄ、、ａｎｄＰａｂｏ、　Ｃ，Ｏ，Ｃｅ１ｌ　 ５５：１１８９−１１９３（１９８１１）］　、ＨＩ　Ｖプロモーター活性化に おける役割に加えて、細胞の増殖の制御に対する生物的な効果を有する。最近の 研究は、ｔａｔが、リンパ球の増殖を誘発する抗原を阻害し［Ｖｉｓｃｉｄｉ　 ｅｔａｔ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４８：１６０Ｂ−１８０８（１９８９）］、エ イズ患者のカポージ肉腫病変由来の細胞の成長促進活性を有する［Ｅｎｓｏｌｌ 　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　３４０：８４−８８（１９９０）］　、というこ とを示している。反対に、ｔａｔはマイトジェンに反応してリンパ球の増殖の著 しい低下を引き起こさない。疾患と関連したＨＩＶの原因とＨＩ　Ｖ　−１ｔａ ｔとが関係しているならば、ｔａｔの機能を妨害することは治療上重要であるだ ろう。　ＨＩＶタンパク質に対するトランス優勢なミュータントが報告されたＣ Ｍａｌｌｍ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１ｌ　５ｇ：２０５−２１４（１９８９）；　Ｔ ｏｒｎｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１ｌ　５９：１１３−１２０（１９８９）；Ｍａｒ ｃｉｎｊａｋ　ｅｔ　ａｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、 ８７：３６２４−３ｆｉ２１１１（１９９０）　］。これらのタンパク質は、強 力なプロモーターから構造的に産生され、ＨＩ　Ｖ−Ｉの成長を止めることがで き、従って、ウィルスの感染に対して“免疫された”細胞系統を作り出すことに 用いることができる。

ＴＡＲＲＮＡはｗｔｔ　ｔａｔタンパク質と直接［Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ　ｅｔ　 ａｔ、　Ｎａｔｕｒｅ　３４５＋６４０−６４２（１９９０）］または細胞的要 因の合わされた活性化を通して［Ｍａｒｏｎｉａｋ　ｅｔａｔ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　ｇ７：３Ｂ２４−３［１２８（１９９０）コ 相互作用すると思われ、出願人は、大量に産生されるＴＡＲＲＮＡがｔａｔ機能 の競争阻害剤として働いていると仮定した。後述する実施例の結果は、ＴＡＲＲ ＮＡの過剰生産が投与量に依存して、ｔａｔを介したトランス活性化を低く抑え る、ということを示している。ウィルス性または細胞性のトランス活性物を隔絶 する高レベルの標的ＲＮＡ因子の発現を生物学的に制御する試みは、抗ウイルス 性試薬の新しい種類の生成において一般的な応用性を有している。ここで例示す るｐｏｌｙ−Ｔ　Ａ　Ｒの誘導転写物は、トランス優勢なシュータントが細胞内 免疫に対して相互異存的な効果が与えるコード配列と結合することができる。

発明の概要 本発明の目的は、遺伝子の発現を指令するＨＩＶ−ＩＬＴＲをダウンレギュレー トする方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、ｔａｔ機能の競争阻害剤を提供することである。

本発明のさらなる目的は、細胞内免疫として抗ウイルス試薬の一種を提供するこ とである。

多様な他の目的および利益は、本発明の詳細な説明および図面から明らかになる 。

１つの実施、態様において、本発明は、タンデムに転写されるよう連結された少 なくとも２つの標的応答因子に、作動可能に連結されたベクターおよびプロモー ターからなるＤＮＡ構成物に関するもの、である。その構成物は、さらに、ウィ ルスＤＮＡに特異的なりボザイムをコードするＤＮＡセグメントまたはウィルス タンパク質のトランス優勢なネガティブミュータントをコードするＤＮＡセグメ ントを含んでいてもよい。

もう１つの実施、態様において、本発明は、ウィルス感染を治療する方法に関す るものである。この方法は、ウィルス感染患者から細胞を得て、そして本発明に よる構成物を用いてその細胞を形質転換することを含む。この細胞は、次いで、 患者に再び導入される。

さらなる実施態様において、本発明は、ウィルスに感染した細胞に本発明の構成 物を導入することからなる、ウィルスの復製を阻害する方法に関するものである 。ウィルスの産生物は、阻害が効果的であるように、構成物の因子の転写産物を 調節する。

図面の簡単な説明 図１は、ＨＩ　Ｖ−ＬＴＲ−駆動多重ＴＡＲ因子を用いたＨＩＶ遺伝子発現の細 胞内阻害に対する作用仮説について示したものである。

このモデルによると、ウィルスＬＴＲから発現されたｔａｔは、多重ＴＡＲ因子 のＬＴＲ駆動転写を活性化する。

多重ＴＡＲＲＮＡはｔａｔの結合と競合する。従って、ウィルス遺伝子の発現は 、構成物中のＴＡＲ因子の数に依存した平衡に到達するまで、ｔａｔの発現とと もに減少する。

図２Ａは多重ＴＡＲ因子の構成および転写物の予想される二次構造を示したもの である。

この図は、Ｄｒａ　ＩおよびＳｅａ　Ｉのハーフパリンドローム配列をもつ完全 な野生型のＴＡＲ因子を含む、アニーリングされたオリゴヌクレオチドを示した ものである。

矢印は、転写の方向を表わす。多重ＴＡＲＲＮＡ因子の予想される二次構造も示 されている。

Ｂは、プラスミドの一般的構造を示したものである。

この実験で用いたプラスミドはＣＤ７−ＬＴＲを含んでおり、このＣＤ７−ＬＴ Ｒは負の調節因子（ＮＲＥ）の欠失によって、野生型のＨＩＶ−１−ＬＴＲから 得られている。すべての構成物は、バクテリアのＣＡＴ遺伝子のＣ末端部分（Ｎ ｅｏ　１部位の下流側）およびＳ　Ｖ−４０のスプライシングおよびポリアデニ ル化の信号を含む。

図３は、多重ＴＡＲ因子がトランス活性化をダウンレギュレートすることを示し たものである。

ＡおよびＢ：コス細胞は、ブニスミドを含んだ４．４μｇの異なったｐｏｌｙ− ＴＡＲ，１ｕ　ｇ　ＲＳ　Ｖ−ルシフェラーゼ、２．２μｇ　ＬＴＲ−ＣＡＴお よび示したような０．４８ｕｇ　ＬＴＲ−ｔａｔ　（パネルＡ）または０．４８ ｕｇ　ｐＳＶＬ−ｔａｔ　（パネルＢ）のプラスミドを用いて同時トランスフェ クションされた。＋および−は、同時トランスフェクション分析において、特定 のプラスミドがそれぞれ存在するか存在しないかを表わしている。トランスフェ クションから４８時間後、細胞の溶菌液をＣＡＴの発現およびルシフェラーゼ活 性について分析した。

Ｃ：全ＲＮＡは、図に示された異なるプラスミドでトランスフェクションされた コス細胞から調製された（１３）。十および−は、同時トランスフェクション分 析において、特定のプラスミドがそれぞれ存在するか存在しないかを表わしてい る。１０μｇ　ＲＮＡは、ノーザンブロット　ハイブリダイゼーションによって 分析された。図２が示すように、同時トランスフェクションに用いられる構成物 は、ＣＡＴ遺伝子の短いＣ末端部分を含む。ニックトランスレーションされたＣ ＡＴフラグメント（ファルマシア社）は、Ｐ標識プローブとして用いられた。

Ｄ０コス細胞は、発現プラスミドを含む示された異なるｐｏｌｙ−ＴＡＲ４，４ ｕｇ、Ｉμｇ　Ｒ３Ｖ−ルシフェラーゼ、２．２ｕｇ　ＨＴＬＶ−１−ＬＴＲ− ＣＡＴ。

０．４８μｇ　ＨＴＬＶ−Ｉ−ＬＴＲ−ＴＡＸ　（１３）、示したような０．４ ８μｇ　Ｌ　Ｔ　Ｒ−ｔａｔで同時トランスフェクションされた。トランスフェ クションから４８時間後に、細胞の溶菌液をＣＡＴ発現およびルシフェラーゼ活 性について分析した。

図４は、トランス活性化の阻害がＴＡＲＲＮＡ転写産物の量に依存することを示 したものである。

Ａ０コス細胞は、２．２μｇ　ＬＴＲ−ＣＡＴ。

０．４８μｇ　ＬＴＲｔａｔおよび増量したＬＴＲ−５５ＴＡＲで同時トランス フェクションされた。減量したＬＴＲ−ＯＴＡＲ（Ｘは０．２２μｇを示す）は 、プロモーターの濃度を一定に保つことに用いられた。＋および−は、同時トラ ンスフェクション分析におけるおのおのの特定のプラスミドが存在するか存在し ないかを表わしている。トランスフェクションから４８時間後、細胞の溶菌液を ＣＡＴの発現について分析した。

ＢおよびＣ０全ＲＮＡは、図に示されたような異なるプラスミドでトランスフェ クションされたコス細胞から調製された。１０μｇ　ＲＮＡは、ニックトランス レージョンされた　ＰＩ１２ＣＡＴ　ＤＮＡフラグメントを用いて、ノーザンブ ロット　ハイブリダイゼーションによって分析された（パネルＢ）。ＣＡＴのプ ローブは、図１に表わされたすべての構成物に対してアニーリングする。　Ｐ標 識されたｔａｔＤＮＡプローブは、異なる条件下で発現されたｔａｔｇＲＮＡの 量を決定することに用いられた（パネルＣ）。

図５は、ＴＡＲＲＮＡ転写産物の量に依存したトランス活性化の阻害量の変化を 示したものである。０ＴＡＲから５０ＴＡＲ因子を含む構成物によって生ずる阻 害を比較する。

図６は、ウィルスの複製の阻害に対するリボザイムーｐｏｌｙ−Ｔ　Ａ　Ｒ構成 物の例を示したものである。

図７は、ＨＩＶの複製の阻害に対するΔＧＡＧ−ｐｏｌｙ−ＴＡＲ構成物の例を 示したものである。

発明の詳細な説明 本発明を導く研究の特殊な目的は、ｔａｔタンパク質の活動によって活性化され 、ｔｘｔ活性を同時に阻害することができる導入ベクター系を確立することであ った。本発明者の試みは、ｔｘｔ活性応答（ＴＡＲ）因子の過剰生産により、ｔ ａｔの機能を阻害することであった。図１は、この試みを描いたものである。保 護された細胞は、本発明による構成物の少なくとも１コピーを含んでおり、感染 後は、組み込まれたプロウィルスの１コピーを含んでいる。もし、ＨＩ　Ｖ−Ｌ ＴＲが活性化されるなら、ｔａｔタンパク質は最初の遺伝子産物として、プロウ ィルスのゲノムから作られる。このｔａｔタンパク質のいくつかはウィルス遺伝 子の発現を活性化し、またいくつかは構成物由来の多重化されたＴＡＲ因子の転 写産物を活性化する。多重ＴＡＲＲＮＡはｔａｔの結合と競合するので、ウィル ス遺伝子の発現は減少する。発現それ自身はｔａｔの存在に依存するので、その 発現は、マルチマーにおけるＴＡＲ因子の数に依存したある平衡に到達するまで 、すべてのＬＴＲ指令遺伝子発現とともに減少する。これは、遺伝子治療用に提 案された構成物が、生物的な調節の制御下におかれた最初の特例である。もし細 胞が感染状態になり、ｔｘｔが作られるならば、防御遺伝子（Ｐｒｏｔｅｃｔｉ ｖｅ　ｇｅｎｅ　）産物だけが発現されるであろう。

にもかかわらず、構成物は、ゲノム中では不活性である。

多重ＴＡＲ因子を用いたウィルス複製の阻害は、すべての単ＭＨＩ　Ｖに対して 効果的であり、というのはそれが機能的な阻害であるからである。たいていのＨ ＩＶワクチンが遭遇する問題は、ウィルスの高い突然変異率である。本発明の構 成物は、レトロウィルスの突然変異に限定されない。

従って、本発明は、ＴＡＲ因子を少なくとも１コピー、好ましくは５〜５０コピ ー、最も好ましくは２０コピ一以上コードするＤＮＡ構成物に関する。本発明に よる構成物は、ＴＡＲ因子のような多重標的応答因子、ＬＴＲ−ＨＩＶのような プロモーターおよびｐＣＤ７のようなベクターを含んでなる、ＤＮＡセグメント を含んでなるものである。多重活性化応答因子は、タンデムでなければならず、 または、もし離されているのならは、それらの転写は離れた配列によって妨げら れてはならない。本発明は、ＴＡＲ因子の数のさらなる増加が阻害を増加させな いような点である２５ＴＡＲを、ＴＡＲＲＮＡが含むまで、ＨＩＶの阻害はＴＡ Ｒ因子の増加ととともに増加する、ということを見い出した。決定試験は、過渡 的な発現分析で行われ、安定な組み込みの場合には、追加されたＴＡＲがさらな る阻害の増加を与えた。

本発明の構成物において、プロモーターは、作り出されたＴＡＲＲＮＡの量を制 御するように、多重ＴＡＲＤＮＡセグメントに作動可能に連結される。後述する 実施例ではＨＩ　Ｖ−ＬＴＲのプロモーターを用いるが、多重ＴＡＲ因子は、種 々の他のプロモーターによって転写されうる。例えば、ｔａｔタンパク質によっ て活性化されうるプロモーターが用いられる。他のプロモーター（ＣＭＶ、ＳＶ ４０！たｉ！ｔＲＮＡ７’ロモ−９−）　を用いることができるが、これらのプ ロモーターは遺伝子産物の構造的な発現を生み出す。ＨＩ　Ｖ−ＬＴＲのような プロモーターを用いる利点は、それらがウィルスによって誘導される、というこ とである。このことは、どのプロモーターよりも特異的である。さらにまた、組 織特異的なプロモーターがこれらの構成物に有用である。

本発明の構成物に用いられたベクターは、インビボの標的細胞への高い効率での 遺伝子導入を保障するものでなければならない（例えばレトロウィルスベクター ）。

本発明における使用に適したベクターには、複製起点および原核細胞の増殖に対 する選択マーカーを含んでなるベクターが包含される。ベクターは、１以上のプ ロモーターを含んでもよい。さらに、本発明の構成物のベクターは、細胞機能を みだすことなく染色体中への構成物の部位特異的な組み込みを許容する配列を含 むことができる。ベクターは、また、標的細胞への構成物の遺伝子を許容し、さ らなる感染によってベクターの増殖を促進する“ヘルパーウィルス“配列を含む ことができる。

本発明の構成物を用いた際、本発明者らは、ＨＩＶ−１遺伝子の発現のダウンレ ギュレーションの程度が構成物中のＴＡＲ因子の数に依存する、ということを示 した。

このことは、いくつかの過剰な標的ヌクレオチド配列の使用が、望まざる遺伝子 の活性化をダウンレギュレートすることに用いられうる、ということを示してい る。

ＴＡＲ因子を、ウィルス発現を阻害し、またはウィルスのタンパク質の破壊的効 果に対して作用する保護タンパク質を誘導することによって作用する他の因子と 、タンデムに結合させることが可能である。例えば、本発明の方法によって作ら れた図６および７の構成物は、望まざる遺伝子の活性をダウンレギュレートする ことに用いることができる。構成物への混入に適当な因子の例として、トランス 優性調節タンパク質、アンチセンス配列、インターフェロンまたは免疫系を刺激 する因子のような抗ウイルス因子のコード配列が挙げられる。構成物は、また、 異なる活性または阻害の応答因子を含むことができる。

上記したような本発明の構成物の阻害活性は、その構成物中にウィルスタンパク 質のトランス優性なネガティブミュータント（例えばミニータントＧＡＧ、また は、例えばＧＡＧＮＡＭのようなＨＩＶ　ｍＲＮＡに対するリボザイム指令）を 含めることによって強めることができる。この構成物は、また、ｒｅｖ応答因子 （ＲＲＥ）を含むことができる。構成物のＲＲＥ因子は、核から細胞質へと構成 物から作られたＲＮＡを輸送するために機能する。

単一の構成物中における、ウィルスのｍＲＮＡに対スるリボザイムとＴＡＲとの 組み合わせは、２つの異なった種類の阻害を与える。ＴＡＲはｔａｔを隔絶する ことによってＨＩＶ−１が指令する遺伝子の発現を阻害するが、リボザイムは標 的ＲＮＡにハイブリダイズしそれを開裂させることによってタンパク質の翻訳を 阻害することかできる。これらの２つ阻害機能の結びつきが、全体の阻害の可能 性を増加させる。後述する例で用いられたりボザイム、すなわちＧＡＧＮＡＭは 、ＧＡＧＩＩＲＮＡすなわち特によい標的に対して指令され、というのはそれが アメリカ人のＨＩＶ隔離者に保存されているからである。

ＴＡＲおよびＧＡＧのようなＨＩＶタンパク質のトランス優勢なミュータントを 含む構成物は、ＨＩＶ遺伝子発現およびウィルスの構築の両方を阻害する。ＴＡ ＲおよびミュータントＧＡＧの組み合わせはウィルスが突然変異によって打ち勝 つことのできない純粋な機能阻害を与える。

本発明の構成物は、技術分野において知られた適当な方法によって作ることがで きる。多重標的応答配列を与えるよう、配列をタンデムに加える方法によって連 結され得る精製された応答配列を用いて、多重標的応答配列を調製することがで きる。多重活性化応答配列を含む構成物が例示されたが、構成物は、また、多重 阻害応答配列を含むことができる、ということが認識されるべきである。

多重阻害配列の使用は、希望するプロモーターの活性を刺激することを当業者に 予想あらしめると期待される。

タンデムの多重阻害応答配列を含むそのような構成物は、例えば、希望するタン パク質の発現の要因となるプロモーターを刺激することによって、希望する産物 の産生を増加することに用いることができる。

本発明の構成物は、公知の方法によって遺伝子治療に用いることができる。　Ｄ ａｖｉｄ　Ｂａ１ｔｊｓｏｒｅ（Ｎａｔｕｒｅ　３３５：３９５−３９６（１９ ８ｇ））によって表わされ、“細胞内免疫”として知られる方法を、用いること ができる。例えば、本発明の構成物を、すべての造血幹細胞を含む骨髄細胞へと 導入することができる。血液細胞は、混合した集団がリンパ球のような均一な集 団のいずれかであることができる。

例示した構成物を用いて、ＨＩＶ惑染個体の細胞が使用される。遺伝子を導入し たあと、その細胞は患者に再び注入される。移植された細胞の成長の空間を作る ために、修飾された細胞が注入される前に、照射法によってまたは薬物療法で、 骨髄は部分的に除かれるであろう。

また、患者からの血液細胞へ本発明のベクターを導入することができる。構成物 を保存した細胞は患者に再び導入される。ＨＩＶ感染者の治療において、構成物 は、ＣＤ４＋細胞へと導入されなければならない。これらの細胞の交替は比較的 早いので、保護細胞の再導入はウィルスの感染が存在するかぎり必要である。そ のような細胞の繰り返しの導入は必要であろう。

本発明による多重ＴＡＲ構成物および／またはＴＡＲ＋リボザイム構成物は、遺 伝子治療の戦略において重要であるタンパク質産物ではなく阻害ＲＮＡだけを作 り出すと信じられている。

本発明の多重ＴＡＲ因子構成物の使用は、大変有利である。例えば、この構成物 は、ＨＩＶが指令する遺伝子発現の特異的な阻害を準備する。防御遺伝子産物の 発現は生物学的に制御され、インビボでの普通の細胞の方法でのＴＡＲを含む転 写産物の構造的な発現が有害であるので、際立って有利である。構成物の有用性 は、異なる隔＃ＨＩＶの間の多様性によって限定されるものではない。さらに、 構成物の使用は、リボザイムまたはＨＩＶタンパク質のトランス優勢なミュータ ントのいずれかのような配列の下流への挿入によって広げることができる。

例 次の限定を伴わない例は、本発明をさらに説明するために与えられる。本発明は 、ＨＩＶ系およびＴＡＲ因子を用いて例示されるが、本発明の方法を用いること で他のウィルスの阻害がもたらされることを期待できるということを当業者は、 認識するであろう。

プラスミド構成物 異なった数の単一の方向性を持つＴＡＲ因子をＨＩＶ−ＬＴＲの制御下で含むプ ラスミドが、構成された（図２７照）。“多重化された゛ＴＡＲ配列は、５’Ｉ （ＩＶ−１−ＬＴＲ欠失ミュータントＣＤ７　（すなわち負の調節因子（ＮＲＥ ）を欠き、野生型ＨＩＶ−１−ＬＴＲと比較するとより高レベルの発現を冑する もの）の真正なＴＡＲ配列の下流側にクローン化された［５ｊｅｋｅｖｉｔｚ　 ｅｔａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１５７５−１５７８（ＬＨ７）］、　Ｈ Ｉ　Ｖ　−Ｉ　Ｌ　Ｔ　Ｒ（−２７８−＋６３）の一部を含むプラスミドｐＣＤ 　７　（５ｔｅｐｅｎＪｏｓｅｐｈｓの好意により提供された）を制限酵素で消 化し、多重タンデムＴＡＲ因子に連結された。ＬＴＲ−ＩＴＡＲ，ＬＴＲ−４Ｔ ＡＲおよびＬＴＲ−５ＴＡＲは、それぞ、１つ、４つ、５つのＴＡＲ因子のコピ ーを含んでいた。

プラスミドＬＴＲ−５ＴＡＲおよびＬＴＲ−４ＴＡＲを構成するために、Ｄｒａ 　ＩおよびＳｍａ　Ｉ制限酸素認識部位に対するパリンドローム配列の半分の隣 に置かれたＨＩＶ−Ｉの完全なＴＡＲ因子（＋１から＋６３）の配列を含んでな る２つのオリゴヌクレオチドが合成された。オリゴヌクレオチドは精製され、リ ン酸化され、連結された。連結されたＤＮＡ　（ＴＡＲ）は、Ｄｒａ　Ｉおよび Ｓｍａ　Ｉの存在下で連結され、ＴＡＲ因子のタンデム（方向が決められた）連 結のみを許容する。ＨＩＶ−１−ＬＴＲの一部（−２７８から＋６３）を含むプ ラスミ　ド　ＣＤ　７　−　ＣＡ　Ｔ　［５ｉｅｋｅｖｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、５ ｃｉｅｎｃｅ　２３８：１５７５−１５７８（１９８７）］は、制限酵素旧ｎｄ ｍおよびＮ　ｃｏ　Ｉによって消化され、末端は多重タンデムＴＡＲ因子で満た され連結された。試験されたいくつかの大腸菌株のうち、唯一の株、すなわちＢ ｊ　５１８３：Ｆ　−、ｒｅｃＢＣ，ｅｎｄｏ　Ｉ、ｇａｌ。

ｓｅｔ、　ｓｔｒ、　ｔｈｉ、　ｂｌｏ、　ｈｓｄ　（Ｆ、Ｌａｃｒｏｕｔｅか ら好意的に提供された）が、転移せずにこれらのプラスミドを維持することがで きた。

ＬＴＲ−１−ＴＡＲは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｅｏ　ＩでＣＤ７−ＣＡＴを消 化することにより構成され、末端は満たされ再び連結された。

２種類の制御プラスミドか作られた。上流のプロモーター配列（ＴＡＲ配列が存 在するが転写されない）を欠失する５ＴＡＲおよびＴＡＲ配列をもたないが上流 のプロモーター配列を含むＬＴＲ−ＯＴＡＲ（図２）。ＬＴＲ−０−ＴＡＲは、 Ｐｖｕ　ＩＩおよびＮｅｏ　Ｉを用いてＣＤ７−ＣＡＴプラスミド［５ｉｅｋｅ ｖｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２３ｇ＋１５７５−１５７８（１９８ ７）］を消化し平滑末端を作り連結することによって作られた。

５ＴＡＲプラスミドは、ＸｂａＩおよびＰＶＵ　ＩＩで消化することによってプ ラスミドＬＴＲ−５ＴＡＲからＨＩＶ−ＬＴＲの５′部分を欠失させることによ り構成することができ、その末端は満たされて連結された。ＬＴＲ−ｔａｔは、 Ｓａｌ　ＩおよびＢａＩＩＨＩでｐｓＶ　Ｌ−ｔａｔ［：Ｒａｐｐａｐｏｒｔｅ ｔ　ａｌ、ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ　１：１０１−１１０（１９８ ９ａ）コを消化することにより構成された：フラグメントを含む３５０ＢＰｔａ ｔが単離され、平滑末端連結が旧ｎｄＩＩＩおよびＮｃｏ　１部位の間にベクタ ーＣＤ７−ＣＡＴで行われた。

すべての構成物は、制限地図および配列によって確実なものにされた。

クローニングの戦略は方向性の形成を許容するが、ＴＡＲ因子の逆方向の繰り返 しは許容しない。その理由は、逆方向の繰り返しが連結中に５ＩＩａ１およびＤ ｒａｌ酵素によって開裂されるからである。各々の因子の正しい方向および二次 構造は望ましい効果のためにはおそらく重要であり、というのは、ＴＡＲは位置 に依存した方法においてのみトランス活性化に機能するからである。［Ｐｅｔｅ ｒｌｉｎｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８３：９７３４−９７３８（１９８６）］　トランス活性化のダウンレギュレ ーション、ＴＡＲ因子の転写に依存する。

ＨＩ　Ｖ−ＬＴＲの指令を受けた遺伝子発現における多重ＴＡＲ因子の効果を決 定するために、ＴＡＲ発現ブラスミ　ドがＬ　Ｔ　Ｒ−ＣＡ　Ｔ　［５ｉｅｋｅ ｖｌｔｚ　ｅｔ　ａｔ；、　５ｃｉｅｎｃｅ２３８：１５７５−１５７８（１９ ８７）］およびコス細胞におけるＬＴＲ−ｔａｔまたはｐｓＶＬ−ｔａｔ［Ｒａ ｐｐａｐｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、Ｔｈｅ　Ｎｅ’ｄＢｉｏｌｏｇｉｓｔｌ　：１０ １−１１０（１９８９ａ）コで同時トランスフェクションされた。

コスー１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社）を補ったダルベツコ修飾 イーグル培地（ＤＭＥＭ）に成育させた。２Ｘ１０５の細胞が、トランスフェク ションの１日前に６穴組織培養培地中の３１１の培地に移植された。全プラスミ ド２５μｇが３穴に用いられた。異なったプラスミドの量は、図に示される通り である。プラスミドｐＢＲ３２２は、ＤＮＡのキャリアーとして用いられた。

トランスフェクションは、リン酸カルシウム法によって行われた［Ｃｈｅｎ、Ｃ ，、ａｎｄ　Ｏｋａｙａｗａ、に、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．７：２７−４５（１ ９８７）コ。トランスフェクションから４８時間後、細胞が集められ（Ｓ　Ｉ　 ＧＭＡ細胞除去試薬）、粗細胞抽出液がＰＢＳ中に作られた。

プラスミドＲ３Ｖ−ルシフェラーゼは、トランスフェクションの効率を検出する ため内部制御として含められた。ＣＡＴタンパク質の量およびルシフェラーゼ活 性の相対レベルは、感染細胞の抽出液から決定された。ＣＡＴタンパク質は、製 品の指示に従い５プライム３プライムイライザキツトを用いて分析された；ルシ フェラーゼの活性は、Ｐ、Ｅ、　５ｔａｎｌｅｙおよびＳ、Ｇ、　Ｗｉｌｌｉａ ＩＩｓ［５ｔａｎｌｅｙ。

Ｐ、Ｅ、　ａｎｄ　ｗｌｌｌａｓｓ、　Ｓ、Ｇ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ 　２９：３１！１（１９８９）］に従って測定され、活性は任意の単位（Ａ　Ｒ Ｕ）で表わされた。

図３Ａに示されるように、ＨＩＶ−ＬＴＲから転写された多重ＴＡＲ因子は、ｔ ａｔの存在下でＨＩ　Ｖ−ＬＴＲ指令遺伝子発現を阻害し、観察されるダウンレ ギュレーションは構成物中のＴＡＲ因子の数に比例する。ＬＴＲ−４ＴＡＲおよ びＬＴＲ−５ＴＡＲは、トランス活性化を平均で７０％、８０％それぞれ阻害し た。ＬＴＲ−ＩＴＡＲは、また、４０％までのダウンレギュレーションを生ずる 重要な効果を有する。この減少は、ＣＡＴおよびｔａｔの発現の両方の阻害の累 積的効果を表わす。なぜならば両方の遺伝子産物がこの実験ではＨＩ　Ｖ−Ｉ− ＬＴＲの制御下にあるからである。多重ＴＡＲ因子は、ｔａｔが減少レベルにも かかわらずＳＶ４０の後期プロモーターから構造的に発現される場合に（図３） 、トランス活性化を抑制することができる。図２ＡおよびＢは、ｔａｔがＨＩＶ −ＩＬＴＲから発現された場合、構造的に発現されたｔａｔで観察された５０％ の減少と比較してＣＡＴの発現が８２％に減少する、ということを表している。

多重化されたＴＡＲ配列の転写は、効率的なダウンレギュレーションを要求し、 安定状態の競合ＲＮＡの累積は、ｔａｔの存在下でのみ起こる（図３Ｃ参照）。

ＴＡＲ配列を含まないＬＴＲ−ＯＴＡＲプラスミドまたは上流のプロモーター配 列の欠失を有する５ＴＡＲプラスミドは、ＨＩ　Ｖ−ＬＴＲ指令遺伝子発現への 重要な効果を生み出さない（図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ参照）。

同時トランスフェクションは多重化されたＴＡＲＲＮＡの効果の特異性を決定す るために他のヒトレトロウィルスＬＴＲで行われた。ＨＴＬＶ−１−ＬＴＲＣＡ Ｔ（Ｍ、Ｎｅｒｅｎｂｅｒｇの好意により提供された）は、レポーター遺伝子と して用いられ、ＨＴＬＶ−１−ＬＴＲ−ＴＡＲプラスミドは、ＨＴＬＶ−Ｉ　Ｌ ＴＲのトランス活性剤として含まれていた［５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｔ、　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：３８１−３８５（１９８４）；　Ｆｅ１ｂｅｒ　ｅｔ 　ａｔ、　５ｃｉｅｎｃｅ２２９：８７５−６７９（１９８５）］　、　Ｌ　Ｔ 　Ｒ−ｔａｔは、また、多重化されたＴＡＲ因子の転写に利用された。図３Ｄに 表わされた結果は、多重ＴＡＲＲＮＡ因子の発現がＨＴＬＶ−１プロモーター活 性に影響を与えないことを示し、遺伝子発現のダウンレギュレーションがＨＩＶ −ＬＴＨに特異的であることを示唆している。

多重ＴＡＲＲＮＡ因子がＨＩＶ遺伝子発現のトランス活性化を特異的に阻害する ことができる、ということが、また、図３に証明されており、ここでＲ５Ｖプロ モーターはルシフェラーゼレポーター遺伝子と結合されていた。この構成物を用 いて、多重ＴＡＲＲＮＡ因子の特異性は異質のプロモーターの使用に影響を与え ないことが証明された。Ｒ３Ｖプロモーター活性の重要な違いは、ＴＡＲＲＮＡ またはＤＮＡ因子を用いて検出されてなかった。このことは、ＨＩ　Ｖ−ＬＴＲ 対Ｒ５Ｖプロモーターのプロモーターの比活性をＣＡＴおよびルシフェラーゼの 発現の比率として示す。トランス活性化の阻害は、ＴＡＲ転写産物の量と同等で ある。

ＬＴＲ−ＣＡＴおよびＬＴＲ−ｔａｔは、増量したＬＴＲ−５ＴＡＲプラスミド で同時トランスフェクションされ、トランス活性化へのＡＲ転写物の異なった量 の効果が決定された。ＲＮＡは、製造者のプロトコールに従い、ＣＩＮＮＡ／Ｂ ＩＯＴＥＣＸ　ＲＮＡｚｏｌ試薬を用いて単離した。ノーザンブロソト分析のた めに、ＲＮＡを１％ホルムアルデヒド／アガロース　ゲルで電気泳動した。ＲＮ Ａはニトロセルロース紙に転写され、先述したようにニックトランスレーション された　Ｐ標識プローブでハイブリダイズした［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ 、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９ｇ２）コ　。

図４Ａは、ＬＴＲ−５ＴＡＲプラスミドの量の増加が、ＣＡＴ発現において比例 した減少（９７％まで）を生ずる、ということを示している。阻害は、感染させ られたＬＴＲの上流配列の量がこの実験では一定に保たれていたので、ＨＩ　Ｖ −Ｉ−ＬＴＲに関わる転写要因を限定する競合によるものではない。感染させら れたＬＴＲ−５ＴＡＲプラスミドの増量は、ＬＴＲ−５ＴＡＲ転写物の同様な増 加を生ずる（図４Ｂ参照）。これらの実験から、ＨＩ　Ｖ−Ｉ　ＬＴＲ指令の遺 伝子発現のダウンレギュレーションが発現プラスミドに含まれる転写されたＴＡ Ｒ因子の数に加え、細胞に導入されたプラスミドＤＮＡの発現の相対的な量に依 存するということが結論される。

ノーザンプロットは、ｔａｔおよびＣＡＴの発現が多重化されたＴＡＲＲＮＡに よって平行して減少することを示しく図４０）、それはそれらが両方ともＨＩＶ −ＬＴＲによって駆動されるために予想される。

図４のデータは、遺伝子発現のダウンレギュレータ５ンが転写された標的アクチ ベーターヌクレオチド配列の数に依存するという教示を支持する。その証拠は、 ｔａｔによるＨＩＶ−１トランス活性化が７ＴＡＲＲＮＡ因子をタンデムに用い て９７％までダウンレギュレートされ、ダウンレギュレーションがＴＡＲＲＮＡ 転写産物の量の関数であるということを示している。データは、７ＴＡＲ因子以 上を含む構成物が、より効果的なダウンレギュレーション効果を与えるというこ とを示多重ＴＡＲ構成物は、拡大され、５０までのＴＡＲを含むプラスミドが構 成され試験された（図５参照）。

１５から４５の間のＴＡＲを含むｐＳＰ１１８−ｐｏｌｙＴＡＲ構成物は、ｐＳ ＰＴ１８ベクター（ファルマシア社）をＸｂａｌで切断することによって構成さ れた。末端は、次いで、フレノウ酵素によって平滑末端にされ、脱リン酸化され た、挿入物は、ＰｖｕｌＩおよびＳＣａ　ＩでｐＬＴＲ−５ＴＡＲを切断し、５ ＴＡＲを含むフラグメント（４５５Ｂｐ）を単離することにより調整された。

上記のベクターおよび挿入物は、次いて、共に連結され、大腸菌を形質転換する ことに用いた。プラスミドＤＮＡは単一のコロニーから調製され、クローンは当 業者に周知の方法を用いて大きい挿入物を含むように選択された。挿入物の方向 は、５ｓｐＩおよびＨｉ　ｎ　ｄＩＩＩ＋５ｓｐｌを用いて制限酵素の消化で確 認された。

次のＬＴＲ−５ＴＡＲ−ＣＡＴがクローン化された。

ＬＴＲ−ＣＡＴベクターがＸｂａｌ＋Ｈｉｎｄｍで切断され、より大きいフラグ メントが単離された。ポリメラーゼ鎖反応によって調製された挿入物、ＬＴＲ− ５ＴＡＲフラグメントは、ＰＣＲフラグメントをＸｂａＩ＋Ｈｉｎｄｍで切断す ることによってｊＩ製した。

ベクターおよび挿入物は共に連結され、大腸菌を形質転換することに用いられた 。単一のコロニーが調べられた。

ＬＴＲ−４６ＴＡＲは、ＬＴＲ−ＣＡＴをＨｉｎｄｍ＋ＢａｍＨＩで切断し、Ｌ ＴＲ−ＩＴＡＲ＋ｐＢＲ３２２を含む大きいフラグメントを単離することにより 調製された。上記したように調製されたｐＳＰＴ４５ＴＡＲはＨｉｎｄＩＩＩ＋ ＢａｍＨＩで切断され、４５ＴＡＲを含む大きいフラグメントが単離された。単 離されたフラグメントは、共に連結され、大腸菌はこの連結された産物で形質転 換された。

ＬＴＲ−２５ＴＡＲおよびＬＴＲ−５０ＴＡＲが、また、調製された。ベクター Ｌ　Ｔ　Ｒ−５Ｔ　Ａ　Ｒ−ＣＡ　Ｔ　ハＳａ　ｌ　Ｉ＋ＢａｍＨＩで切断され 、ＬＴＲ−５ＴＡＲ＋ｐＢＲ３２２を含むフラグメントが単離された。ｐＳＰＴ −２０ＴＡＲまたはｌ）Ｓ　ＰＴ−４５ＴＡＲは、５ａ１１＋ＢａｍＨＩで切断 され、２０ＴＡＲまたは４５ＴＡＲを含むフラグメントか単離された。ベクター および挿入物は、次いで共に連結され、大腸菌はこの連結された産物で形質転換 された。

図５で取り上げた結果は、ＨＩ　Ｖ−１−ＬＴＲ指令遺伝子発現の阻害が２５Ｔ ＡＲが用いられるまで、構成物中のＴＡＲの数とともに増加するということを示 している。ＴＡＲの数を２５以上に増加することは、阻害を増加させない。従っ て、ｔａｔタンパク質はこの点で飽和すると考えられる。この試験は、阻害のさ らなる増加を検出する感度が十分でない、ということも、また、可能性としては ある。

ＬＴＲ−５０ＴＡＲ，ＤＣベクター［Ｈａｎｔｚｏｐａｕｌｏｓｅｔ　ａｌ、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８６：３５１９　（１９８９） ］のようなレトロウィルスベクターに導入する二とができる。

ＬＴＲ−５０ＴＡＲはＸｂａｌで切断され、フレノウ酵素で満たされ、高い効率 の遺伝子導入用のＤＣベクターの５ｎａＢ１部位に挿入される。高い効率の遺伝 子導入を確実にする他のベクターを本発明で用いることもできる。

リボザイム−Ｐｏｌｙ−ＴＡＲの構成 ｐＲＲＥ−リボザイムの構成のために、ＲＲＥ　（Ｔ７プロモーターの制御下の ｒｅｖ一対応因子）含むベクター　ｐ　ＲＲＥ　［Ｄａｅｆｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ　、　Ｓｃ　ｉ　、　ＵＳＡ８７：４５７１− ４５７５（１９９０）］がＢａｍＨＩで切断され、脱リン酸化され、精製された 。挿入物として、ＢａｍＨＩ部位の隣に位置した６５Ｂｐの長いりボザイムＰＣ Ｒフラグメント［Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｔ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　２＋２３−３１（１９９０）］をＢａｍＨＩにより切断し精製し た。このリボザイムは、ＨＩ　Ｖ−Ｉ　ＧＡＧｍＲＮＡに対して指令され、Ｎａ ｔｕｒｅ２４７：　１２２２　（１９９０）にＮ。

Ｓａ　ｒｖｅ　ｒらによって開示された。

ベクターおよび挿入物は連結され、連給混合物の一部で大腸菌を形質転換した。

プラスミドは独立した形質転換体から調製され、制限酵素の消化によって試験さ れた。

８クローンが挿入物を含んでいるとして見い出された。

これらのクローンは生物活性をインビトロで試験され、８つのクローンのうち３ つが合成基質（Ｊ、Ｒｏｓｓｉの提供基質）を切断する能力を有していることが わかった。

ＬＲＴ−ｐ　ｏ　１　ｙＴＡＲ−ＲＲＥ−リボザイム（図６参照）の構成のため に、ベクターＬＴＲ−４６ＴＡＲが５ａｌＩで切断され、その末端がフレノウ酵 素で満たされ、次いで再びＨｉｎｄｍで切断される。そのＤＮＡが次いで精製さ れる。挿入物の調製のために、ｐＲＲＥ−リボザイムがＨｉｎｄＩｎおよびＳｍ ａ　Ｉで切断される。

３１４Ｂｐフラグメントがゲル電気泳動によって単離される。ベクターおよび挿 入物は次いで連結され、大腸菌を形質転換することに用いられた。各々のコロニ ーが調べられる。

ＬＴＲ−ｐ　ｏ　１　ｙＴＡＲ−ＲＲＥ−リボザイムは、ＤＣベクター［Ｈａｎ ｔｚｏｐａｕｌｏｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃ１．ＵＳＡ　Ｈ：３５１９（１９８９）　］のようなレトロウィルスベクタ ーに、Ｘｂａｌで切断することによって導入される。

大きいＸａｂＩフラグメントは、フレノウ酵素によって満たされ、ＤＣベクター の５ｎａＢ　Ｉに挿入される。レトロウィルスベクターに構成物を置くことは、 高い効率の遺伝子導入に必要であり、ＤＣベクターが好ましい。

しかし、高い効率の遺伝子導入を確実にするどのベクターも適する。

△ＧＡＧ−Ｐｏ　Ｉ　ｙ−ＴＡＲの構成ｐＲＲＥ−ΔＧＡＣはｐＲＲＥベクター をＢａｍＨＩで切断し、末端を脱リン酸化し、ベクターを精製することによって 構成された。ミュータントウィルスＤＮＡＨＴ４（Ｖｌ−△Ｅ　−ｄ　ｈ　ｆ　 ｒ　）　［Ｔｏｒｎｏ　ａｔ　ａｌ、Ｃｅ１１５９：１１３−１２０（１９８９ ）　］中にコードされたΔＧＡＧタンパク質は、ＨＩＶ−１の複製を優勢に防げ ることができる。

プラスミドＤＮＡ　ＨＴ４　（ＶＩ−ΔＥ−ｄｈｆｒ）は、ＢｇｌＩＩで切断さ れ、ΔＧＡＧを含む１４２９Ｂｐフラグメントは、１％アガロースゲルから単離 された。ベクターおよび挿入物は、連絡され、連絡混合物の一部が大腸菌を形質 転換させるのに用いられた。プラスミドは個々の形質転換体から調製され、制限 酵素による消化、ＥｃｏＲＩ＋５ｐｈＩ、によって試験された。

ＬＲＴ−ｐ　ｏ　１　ｙＴＡＲ−ＲＲＥ−ΔＧＡＧ　（図７参照）の構成のため に、ベクターＬＴＲ−４６ＴＡＲが５ａｌＩで切断され、その末端がフレノウ酵 素で満たされる。ＤＮＡが次いで精製される。挿入物の調製のために、ｐＲＲＥ −ΔＧＡＧがＥｃｏＲＶおよびＳｍａ　Ｉで切断される。１．６ＫＢフラグメン トがゲル電気泳動によって単離される。ベクターおよび挿入物は次いで連結され 、大腸菌を形質転換するのに用いられる。個々のコロニーが調べられる。構成物 は、上記したＤＣベクターに挿入される。

ＬＴＲ−７ＴＡＲとされたプラスミドは、メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅ ｓｄａ）の＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ に、大腸菌に入れられ、１９９０年１月１７日に受託番号６８２０３で寄託され た。さらに、ＬＴＲ−５０ＴＡＲプラスミドは、メリーランド州ベセスダ（Ｂｅ ｔｈｅｓｄａ）のＡｓｅｒ４ｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎに、大腸菌に入れられ、１９９０年１０月１２日に受託番号６８４４６ で寄託された。プラスミドは、ブタペスト条約の下寄託された。

上述した全ての刊行物は、本明細書の開示の一部とされる。

前記発明が、明示と理解のために詳細に記述されているが、この開示を読むこと により、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や些細な点において様々な変 形が可能であることが当業者によって認識されるであろう。

ＦＩＧ、　１ ｌ≦ゴ之りわＧ１二 ＤＮＡ　５’−ＧＧＧ、、、、、ｎ１ＧＧＧ、、、、ＪＴＴＧＧＧ、、、、ｍＧ ＧＧ、、、、、η■３’−ＣＣＣ，、、、、ＡＡＡＣＣＣ，、、、、ＡＡＡＣＣ Ｃ，、、、ＡＡＡＣＣＣ，、、、、八＾ＡＦＩＧ、　２ａ Ｃ’Ｊ ｒつ ＬＴＲ−ＣＡＴ　＋　＋　＋　＋　＋　＋　＋ＬＴＲ−ＴＡＴ　−−＋　＋　＋ 　＋　＋「０ ＦＩＧ、　４ａ ＬＴＲ−５ＴＡＲ−１０ｘ　２５ｘ　４０ｘ　５０ｘＬＴＲ−ＯＴＡＲ５０ｘ　 ４０ｘ　２５ｘ　１０ｘ　−ＬＴＲ−５ＴＡＲ−１５ｘ　３５ｘ　５０ｘＬＴＲ −ＯＴＡＲ５０ｘ　３５ｘ　１５ｘ　−ＦＩＧ、　−５予４り一２ やり 要　約 本発明は多重標的応答配列を含んでなるＤＮＡ配列によるウィルスの阻害、特に ＨＩＶの阻害、に関するものである。これは、遺伝子治療用に提案された構成物 が、生物的な調節の制御下におかれた最初の例である。防御遺伝子産物のみが発 現される。本発明によるＤＮＡ構成物は、ベクターと、少なくとも一つの標的応 答因子と作動可能に連結されたプロモータとからなり、その結果それらの因子が タンデムに転写される。このＤＮＡ構成物はウィルス感染、特にＨＩＶ関連疾患 、の治療に用いることができ、それはＨＩＶに感染した患者から細胞を取りだし 、前記構成物でその細胞を形質転換し、患者にその形質転換細胞を与えることか らなる。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　４　年　７　月　２０日 謬

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．ベクターと、少なくとも二つの標的応答因子に作動可能に連結されたプロモ ータとからなり、その結果それらがタンデムに転写される、ＤＮＡ構成物。
2. ２．５〜５０個の標的応答因子を有する、請求項１記載のＤＮＡ構成物。
3. ３．２５個の標的応答因子を有する、請求項２記載のＤＮＡ構成物。
4. ４．前記応答因子が活性化応答因子である、請求項１記載のＤＮＡ構成物。
5. ５．前記因子がｔａｔ活性化応答因子である、請求項４記載のＤＮＡ構成物。
6. ６．前記プロモータがウイルス産生物によって調節され得る、請求項１記載のＤ ＮＡ構成物。
7. ７．前記プロモータがＨＩＶ−１ＬＴＲである、請求項６記載のＤＮＡ構成物。
8. ８．前記ベクターがｐＣＤ７である、請求項１記載のＤＮＡ構成物。
9. ９．ウイルスＲＮＡに特異的なリボザイムをコードするＤＮＡセグメントを更に 含んでなる、請求項１記載のＤＮＡ構成物。
10. １０．トランス優勢ネガティブミュータントをコードする、ＤＮＡセグメントを 更に含んでなる、請求項１記載のＤＮＡ構成物。
11. １１．前記プロモータがＧＡＧである、請求項１０記載のＤＮＡ構成物。
12. １２．ベクターと、一つの標的応答因子に作動可能に結合されたプロモータとか ら本質的になる、ＤＮＡ構成物。
13. １３．下記の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含んでなる、ウイルス感染の治療法。 （ｉ）ウイルスに感染した患者から細胞を得る工程。 （ｉｉ）請求項１または請求項１０に記載の構成物を前記細胞に導入する工程。 （ｉｉｉ）前記治療が達成されるような条件の下で、前記工程（ｉｉ）で得た前 記細胞を前記患者に再び導入する工程。
14. １４．前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項１３記載 の方法。
15. １５．前記細胞が骨髄細胞または血液細胞である、請求項１３記載の方法。
16. １６．ＨＩＶ−１の複製を阻害する方法であって、請求項１または請求項１２に 記載の構成物をウイルス感染細胞に導入することを含んでなる方法。
17. １７．前記ウイルスがＨＩＶである、請求項１６記載の方法。
18. １８．請求項１記載の構成物をウイルスに感染した細胞に導入することからなり 、前記ウイルスの産生物が前記因子の転写を制御し、その結果阻害が達成される 、ウイルスの複製を阻害する方法。