JPH03500245A - ヒト赤血球特異的転写エンハンサー - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒト赤血球特異的転写エンハンサ− 背景 サラセミア症候群および異常血色素症のための遺伝子治療において、導入された グロビン遺伝子は、組織特異性および転写の効能の両者においてその場の正常グ ロビン遺伝子の機能をまねることが要求される。参照、例えば、Ａｎｄｅ　ｒｓ ｏｎ、Ｗ、Ｆ、（１９８４）Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ１ス又６，４０１−４０９゜Ｄ ＮＡ仲介遺伝子転移の実験において、その隣接する５′および３′７ランキング 配列をもつヒトベーターグロビン遺伝子は、組織および発育の段階に対して特異 的である方法で、発現することができることが示された。Ｃｈａｇｅ、に、ｅｔ 　ａｌ、（１９８５）Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒｅ−，３１４，３７７−３８０；Ｔｏｗ ｎｅ　ｓ、Ｔ。

ａｔ　ａｌ、（１９８５）ＥＭＢｏ、４１７１５−１７２３；ＫＯＩＩｒ　ｅ　 ｓ％Ｔ−およびＮ１ｅｎｈｕｉｓＳＡ−（１９８７）Ｍｏｌ、　ａｎｄ　Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ−、ヱ、３９８−４０２；Ｃｏｎ５ｔａｎｔｉｎｉ、Ｆ、ｅｔ　ａ ｌ、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３，１１９２　１１９４；Ｍａｇｒａｒ ｎ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ１且上】、３３８−３４０．Ｌ かしながら、このような導入されたベーターグロビンの転写効率は一般に低い（ 上の参考文献を参照）。高いレベルの転写は、グロビン構造遺伝子およびその隣 接する７ランキング配列中に存在しない配列の要素、例えば、エンハンサ−配列 が発揮するｃｉｓ制御の他のレベルを要求することがある（上のＫｏ　ｌ　］　 ｉユｓ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、）。

トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）マウスに°おいて、例えば、ベー ターグロビン遺伝子の低いレベルであるが、組織特異的でありかつなお発育段階 特異的である発現は、わずかの５″であるが１゜５キロ塩基の３″　フランキン グ配列をマウスの接合体中に注入したとき、報告された。トランスジェニックマ ウスの赤血球中の導入されたベーターグロビン遺伝子のｗｐのレベルは、非常に 低く、内因性マウスベーターグロビン遺伝子のそれの数％より小さい。わずかの トランスジェニックマウスにおいて、しかしながら、注入したベーターグロビン 遺伝子から転写されたｍＲＮＡは内因性マウスベーターグロビンｍＲＮＡの５０ ％程度に高いことが報告された（参照、上のＴｏｗｎｅｓ、Ｔ、ｅｔａｌ、およ びＣｏｎ５ｔａｎｔｉｎｉ、Ｆ−ｅｔ　ａｌ、）ｅこのような場合において、注 入したベーターグロビン遺伝子の多数のコピー（２０〜５０コピー）は、宿主染 色体中に組み込まれることが発見された。

これらの組み込まれた遺伝子の転写体の高いレベルの蓄積は、活性化された宿主 染色体部位中に導入された遺伝子のコピーの組み込みの低い速度および機会で、 多くのこのような組み込まれた遺伝子の累積効果の結果であり得る。この位置の 効果、すなわち、組み込み部位の転写活性への発現レベルの依存性により、遺伝 子およびその隣接する７ランキング配列から遠くに位置するｃｉｓ転写制御のな お他のレベル、例えば、エンハンサ−要素により発揮されることがあるもの、は 導入されたベーターグロビン遺伝子の効率よい転写のために要求される。

ユンハンサー要素は、次のものにおいて同定された：ウイルスの５ｖ４０ゲノム （Ｂｅｒｎｏｌｓｔ、Ｃ，ｊ；よびＣｈａｍｂｏｎ、Ｐ、（１９８１）Ｎａｔｕ ｒｅ、２９旦、３０９−３１０）および赤血球免疫グロブリン遺伝子クラスター （参照、例えば、Ｇ１１ｌｉｅｓ、ｓ、ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｃｅｌｌ、３ ３．７２９　７４０；Ｍｅｒｃ。

ｌａ、Ｍ、ｅｔ　ａｔ、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２：２１，６６３　６６ ５；Ｑｅｅｎ、Ｃ，およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ　Ｄ、（１９８３）旦！ユニ、旦 １．７４１　７４８；ｐｉｃａｒｄ、Ｐ、および５ｃｈａｆｆｎｅｒ　Ｗ、（１ ９８３）Ｎａｔｕｒｅ、３０７．８０−８２；Ｇ１１ｌｉｅｓ、Ｓ、およびＴｏ ｎｅｇａｗａ、Ｓ、米国特許第４゜６７６３．２８１号）。それらは長い距離に わたってｃｉｓ連結遺伝子を転写的に活性化することができ、そしてそれらの作 用はエンハンサ−要素の向きおよび遺伝子に関するその位置に対して独立である 。広い型特異性を示す５Ｖ４Ｑウイルスのエンハンサ−Ｌ：比較して、１ｇエン ハンサ−および他の同定された真核生物のエンハンサ−要素は組織の特異性を表 す：工ｇエンハンサーはリンパ糸球において、インスリンエンハンサ−要素は膵 臓のベータ細胞において（Ｅｄｌｕｍ％Ｔ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）Ｓｃｉｅ ｎｃｅ、２３旦、９１２）そしてアルブミンエンハンサ−は肝臓細胞において（ Ｐｉｎｋｅｒ％Ｃ，ｅｔ　ａｌ。

８）最も活性であるように思われる。

トランスフェクションされたベーターグロビン遺伝子の高いレベルの転写は、事 実、ＳＶ４０エンハンサ−（参照、例えば、ＢａｎｅｒｊｉｘＪ、ｅｔ　ａｌ、 （１９８１）Ｃｅｌｌ、２７．２９９−３０８）または免疫グロブリン（Ｉｇ） 遺伝子エンハンサ−（Ｂａｎｅｒｊｉｌ　Ｊ。

ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｃｅｌｌ、３３，７２９−７４０）のｃｉＳにおいて 達成することができる。しかしながら、このようなエンハンサーーベーターグロ ビン遺伝子＊＊体の組織特異的発現は、ｃｉｓエンハンサーの宿主範囲により支 配され、こうしてＩｇエンハンサーにより推進されるベーターグロビン遺伝子は 赤血球中でなくリンパ系球中で最も効率よく発現される（Ｂａｎｅｒｊｉ％　Ｊ 、　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）Ｃｅ　ｌ　ｌ、３３．７２９−７４０）、これは トランスフェクションされたベーターグロビン遺伝子の高いレベルの発現がｃｉ ｓエン／１ンサーの存在を要求するばかりでなく、かつまたエンノーンサー中に 含有される組織特異的要素がプロモーターの組織特異性を取り消すことができる 赤白血痰を誘発するフレンド（Ｆｒｉｅｎｄ）白血痔ウィルスは、その長い末端 の反復（ＬＴＫ’　ｓ）中に赤血球特異的エンハンサ−要素を含有することが報 告された（Ｂｏｏａｅ、Ｚ、ｅｔ　ａｌ、（１９８６）ＥＭＢＯＳ５．１ａ１ｓ −１，５３２）、ウィルス配列の発癌性のｔ；めに、この赤血球特異的ウィルス のエンハンサ−要素の遺伝子治療への応用は制限されるように思われる。赤血球 特異的エン／Ｓフサ−の存在は過程されたが、哺乳動物細胞においてこのような エンハンサーは同定されてきていない。ファン（Ｔｕａｎ）らはヒト「ベーター グロビン様」遺伝子ドメインにおいて主要なりＮアーゼＩ−超感受性部位を検査 し、そしてエンハンサ−のある種の特性を有するＤＮＡ領域にそれらが位置する ことを示した。（参照、ＴｕａｎＳＤ、　ｅ　ｔ　ａ　１．（１９８５）Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ旦へ、８２，６３８４　６３８８；Ｔｕａ ｎ、Ｄ、およびＬｏｎｄｏｎｓ　１．Ｍ、（１９８５）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ旦Ａ、８土１２７１８−２７２２）。

子の導入の従来の方法よりすぐれた独特の利点を有する・なぜなら・それらを使 用して遺伝子の単一のコピーをほとんどの哺乳動物細胞の型中に非常に高い効率 で、時には１００％に到達する効率で導入することカミできるからである。（Ｗ ｅｉｓｓ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、（１９８５）ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ ｓ第２版、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニュ ーヨーク）、ウイルスユンハンサー配列をプロウィルスの両者のＬＴＲ３から欠 失されてし−る、ニンハンサーをもたないレトロウィルスのベクターの構成１ヨ 、転写的ｌ；不活性であるプロウィルスを産生じ、こうしてこのようなウィルス 中のゲノムのインサートからベクターの転写の潜在的作用を除去する（Ｃ。

ｎｅ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　旦土ｏ１．． ７．８７）。組み込まれたプロウィルスの両者ＬＴＲｓ４こおし１てユンハンサ ー配列の不存在は、また、細胞のプロト−腫瘍遺伝子を活性化する可能性を最小 とすることができ、こうしてヒト遺伝子治療においてより安全な代替法を提供す る。

（１）　完全ｔ、＋５’　ＬＴＲ（２）レトロウィルスのエン／・ンサー配列中 に欠失をもつ３’　ＬＴＲ（３）ヒトベーターグロビン遺伝子インサートおよび （４）選択可能なマーカー遺伝子、バクテリアのネオマイシンホスホトランスフ ェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ’）からなる、エンハンサーをもＩ；ないレトロウィル スのベクターは、構成された（上のＣｏｎｅ　ｅｔ　ａＬ）。転写エンハンサ− 要素の不存在下に、形質導入されｔ；ヒトベーターグロビン遺伝子は、宿主細胞 中へんレトロウィルスの感染により効率的に導入されたが、内因性ベーターグロ ビン遺伝子より約５００倍低いレベルで非効率的に発現される（上のＣｏｎｅ　 ｅｔ　ａｌ、）。エンハンサ−をもたないレトロウィルスのベクターの他の変異 型の構成体は、ｃｉｓ連結遺伝子上のＢ細胞特異的発現を与える、力・ンノク免 疫グロブリン遺伝子のエンハンサーープロモーターの組み合わせにカップリング された、Ｎｅｏ”遺伝子およびＣ−ｍｙｃ腫瘍遺伝子を含有する（Ｄｉｃｋ、Ｊ 、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）Ｃｅｌｌ、土又、７１）。

このベクター中のｃ−ｍｙｃ遺伝子は、この組み換えレトロウィルスで感染され たＢ細胞系中で転写される発見された（Ｈａｗ］　ｅ　ｙ１Ｒ’。

ｅｔ　ａｌ、（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ１ｄ、１旦ｉ、ＵＳＡ、８ ４．２４０５）。

組み換えレトロウィルスで感染した造血細胞は、照射しないか、あるいは照射さ れた宿主動物中に注射するとき、受容体動物の骨髄細胞の長期間の再構成を可能 とすることが発見された。上のＨａｗｌｅｙ、ｅｔａｌ、、ＬｅｍｉｓｋａＳ　 Ｔ、ｅｔ　ａｈ　（１９８６）Ｃｅｌｌ、４５．９１７゜ 及盟Ω！枚 本発明は、赤血球中の遺伝子の転写を増加する、ヒト転写エンハンサー要素に関 する。赤血球特異的エンハンサー要素は、ヒトニゲシロングロビンから約１０． ３〜１１゜１キロ塩基だけ上流におよびヒト赤血球中のベーターグロビン遺伝子 から約５３．０〜５３．８キロ塩基だけ上流に位置するエンハンサ−配列（約８ ００ヌクレオチド単位の長さをもつ）。この自然エンハンサ−のヌクレオチド配 列は第１図に示されている。本発明の好ましいエンハンサ−要素は、この配列の 少なくとも一部分に対して寅質的に相同性のＤＮＡセグメントからなる。

エンハンサ−要素は転写単位と組み合わせるすることができる。この転写単位は 、問題の１または２以上のタンパク質（またはその前駆体）をエンコードする１ または２以上の構造遺伝子およびこれらの遺伝子のだめの適当な調節配列（例え ば、プロモーター）からなる。エンハンサ−要素の存在は、赤血球宿主中の構造 遺伝子の転写効能を増加する（ｍＲＮＡの産生を増加する）。増加した転写効能 は、受容体宿主細胞中の遺伝子産生物の発現を増加することができる。転写単位 に結合したエンハンサ−要素は、普通の技術により赤血球中に導入することがで きる、ベクター、例えば、プラスミドまたはウィルス中に組み込むことができる 。生ずるトランスフェクションされた赤血球は、転写単位によりエンコードされ たタンパク質を高いレベルで発現する。

本発明のエンハンサ−要素は、赤血球由来の細胞のトランスフェクションのｔ； めの遺伝子の構成体を改良する。これらの構成体は、赤血球の疾患、例えば、サ ラセミアおよび異常血色素症の有効な遺伝子治療のため第１図は、赤血球特異的 エンハンサ−要素のヌクレオチド配列を示す。

第２図は、ＳＶ４０プロモーターにより推進されたクロランフエニフールアセチ ルトランス７エラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をもつＣＡＴプラスミドの構成を示す。

第３図、ＳＶ４０プロモーターにより推進されたＣＡＴ遺伝子を含有する組み換 えプラスミドのに５６２およびＨｅＬａ細胞のＣＡＴ活性のアッセイの結果を示 す。

第４図は、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞から分離したＲＮＡ中のＣ ＡＴ転写体の開始部位の５１ヌクレアーゼのマツピングを示第５図は、ニブシロ ン−クロビンプロモーターにより推進されたＣＡＴ遺伝子をもつＣＡＴプラスミ ドの構成を示す。

第６図は、ニブシロン−グロビンプロモーターにより推進されたＣＡＴ遺伝子を 含有する組み換えＣＡＴプラスミドのＣＡＴ活性を示す。

第７図は、造血細胞中に遺伝子を導入するための組み換えレトロウィルスのベク ターの構成を示す。

発明の詳細な説明 本発明のエンハンサ−要素は、ヒト赤血球中の遺伝子の転写を調節するｃｉｓ− 制御要素である。この要素は８００ｂｐのＤＮＡセグメントであり、ニブシロン グロビンから約１０．３〜１１．１キロ塩基だけ上流におよびベーターグロビン 遺伝子から約５３．０〜５３．８キロ塩基だけ上流に位置する。

自然８００ｂｐのエンハンサ−要素のＤＮＡ配列は第１図に示されている。（ニ ブシロン−グロビン遺伝子から２１Ｋｂだけ上流のヒトゲノムの領域は、Ｑｉｌ ｉａｎｇ　Ｌｉ　ｅｔ　ａ＋、（１９８５）去ユＢｉｏＬ、Ｃｈｅｍ、２６０． １４９０１により配列決定された。）好ましいエンハンサ−要素は、この配列の 少なくとも一部分に対して実質的に相同性であるＤＮＡ分子からなる。８００ｂ ｐのセグメントのより小さい部分は、また、ニンハンサー活性を有することがで きる。さらに、このエンハンサ−配列は欠失、付加および置換を包含する塩基の 突然変異により修飾することができる。したがって、本発明のエンハンサ−要素 は、自然エンハンサ−の５ｏｏｂｐの配列の領域に対して実質的に相同性である 活性ＤＮＡ配列からなる。

ニンハンサー要素を使用して、遺伝子を効率よく発現しかつ赤血球中でタンパク 質を産生ずるのｔ；めの、改良された遺伝子構成体を提供することができる。ト ランスジェニックマウスの赤血球宿主細胞、例えば、結合したニンハンサー配列 をもたない、単一のトランスフェクションされたベーターグロビン遺伝子は、内 因性ベーターグロビン遺伝子の転写効率の１／１００〜ｌ／１０００で、平均転 写されると計算される：平均２０〜５０）ピー／宿主細胞のレベルで存在する、 トランスフェクションされたグロビン遺伝子は、内因性ベーターグロビン遺伝子 のそれの２％〜５０％の範囲で蓄積される量のベーターグロビンｍＲＮＡを産生 ずると報告された。この計算した１００−１０００倍の転写の増加は、宿主赤血 球の内因性ベーターグロビン遺伝子と同程度の効率で、トランスフェクションさ れたベーターグロビン遺伝子が転写されることが要求されるように思われる。こ の程度の増強は、本発明の赤血球特異的エンハンサ−要素を使用して達成される 増強の範囲内である。

一般に、細胞のトランス７エクシａンのＤＮＡ構成体は、ａｓ　ｌまたは２以上 のタンパク質またはその前駆体をエンコードする転写単位からなるＤＮＡ、およ び ｂｌ　ヒト赤血球特異的転写エンハンサ−要素、からなる。

構成体のアセブリーのために、転写単位へ結合するためのエンハンサ−要素は、 自然源からか、あるいは合成により得ることができる。例えば、エンハンサ−要 素はヒトゲノムＤＮＡクローンから切除し、次いで転写単位からなるＤＮＡと結 合することができる。あるいは、エンハンサ−要素は第１図に与えられた配列に 従い、ＤＮＡ合成の普通の技術、例えば、ホスファイトトリエステル化学により 合成することができる（参照、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａｔｌ、米 国特許第４．４１一般に、エンハンサ−要素は転写単位に対して十分に近接させ て配置して、それが単位と機能的に活性であるようにする、すなわち、それが構 造遺伝子の転写効率を増強するようにする。ある場合において、エンハンサ−は 転写単位から離れて配置することができる。例えば、ある構成体において、エン ハンサ−はエンハンサ−の機能を低下させないで転写単位から少なくとも６塩基 だけ離すことができる。エンハンサ−の最適な位置は、特定のＤＮＡ構成体につ いて日常の実験により決定することができる。エンハンサ−要素の機能はその向 きに対して実質的に独立であり、こうしてニンハンサー要素は転写単位に関して ゲノムの向きまたは逆ゲノムの向きに配置することができる。一般に、エンハン サ−要素は転写単位から上流（５′）に配置する。しかしながら、ある構成体に おいて、それは転写単位から下流（３″）に配置する。

転写単位は、１または２以上の問題のタンパク質をエンコードするｌまたは２以 上の構造遺伝子およびｌまたは２以上のプロモーターおよび他の調節配列からな る。転写的に競合する転写単位は、普通の技術によりつくることができる。使用 する構造遺伝子は、一般に、赤血球のタンパク質をエンコードするが、構成体は 、また、外因性（非赤血球）のタンパク質のために設計することができる。遺伝 子治療において意味をもつ赤血球タンパク質の例は、次のものを包含する：ヒト 赤血球グロビン鎖（例えば、ベーターグロビン、ガンンマーグロビン、ニブシロ ン−グロビン、およびアルファーグロビン）、赤血球の酵素またはそのサブユニ ット（例えば、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびピルベー トキナーゼ）および赤血球の構造タンパク質。さらに、遺伝子はタンパク質の前 駆体をエンコードすることができ、前駆体は翻訳後細胞内で修飾される問題のタ ンパク質を産生ずる。

適当なプロモーターを構成体中に使用することができる。赤血球プロモーターは 赤血球タンパク質をエンコードする構造遺伝子との接合のために好ましいが、こ れは常に最適であるわけではない。問題のタンパク質をエンコードする構造遺伝 子と通常関連するプロモーターは、しばしば、望ましい。

問題のタンパク質をエンコードする転写単位へ結合されたエンハンサ−要素から なるＤＮＡ構成体は、普通の技術、例えば、トランス７エクシ慶ン、感染、マイ クロ注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、およびエレクトロボレイション（ ｅ　ｌｅｃ　ｔ　ｒｏｐｏ　ｒａ　ｔ　ｔｏｎ）により導入することができる。

転写単位に結合されたエンハンサ−要素からなるＤＮＡ構成体は、ベクター、例 えば、プラスミドまたはウィルス中に挿入するか、あるいはその内部に７セブリ ングすることができる。構成体は問題の宿主細胞中への組み込みのために適当な ベクター中にアセブリングするか、あるいはスプライシングすることができる。

ベクターは、バクテリア宿主中で増幅されうるように、複製のバクテリア起源を 含有することができる。ベクターは、まｔ；、トランスフェクションされた細胞 の選択のための選択可能なマーカーをエンコードする、発現可能な遺伝子を含有 することができる。構成体の導入のために好ましいベクターは、「エンハンサ− をもたない」　（すなわち、自然エンハンサ−要素を欠く）。

タンパク質をエンコードするＤＮＡを受容するｔ；めの開始部位に関して適当に 配置されたエンハンサ−要素を有するベクターを構成することができる。例えば 、 ａ１タンパク質またはその前駆体をエンコードするＤＮＡの挿入のための挿入領 域、および す、挿入領域に対して十分に隣接して位置して挿入されたＤＮＡの転写を増強す るヒト赤血球特異的転写エンハンサ−要素、からなるすることができる。挿入領 域は制限酵素の制限部位を含有することができる。ベクターは、また、構造遺伝 子を挿入するだめの挿入部位から上流にプロモーターを含有することができる。

不足または赤血球中の異常な構造遺伝子の発現により特徴づけられる、ヒト遺伝 病の遺伝子治療を改良する。これらの病気は、次のものを包含する：異常グロビ ンに関係する赤血球の疾、ｒ、（例えば、謙状赤血球の病気および異常値色素症 ）；酵素の欠乏により赤血球の破壊増大のため貧血（例えば、グルコース−６− ホスフェートデヒドロゲナーゼの欠乏およびピルベートキナーゼの欠乏）；およ び異常の形状の赤血球の破壊の増大のだめの貧血（例えば、遺伝的楕円赤血球症 ）。エンハンサ−要素は、赤血球中の正常赤血球タンパク質を高いレベルで発現 しそして赤血球の疾患の効果な遺伝子治療を生ずる手段を提供する。前述の構成 体は、異常赤血球中に導入して、異常なタンパク質または細胞中で不足または欠 乏するタンパク質の産生を補償することができる。

−１＆ｉ二、赤血球タンパク質の不足または異常の発現により特徴づけられる赤 血球の疾患の遺伝子治療は、次のようにして英施される。患者の骨髄を取り出す （例えば、無菌の条件下の吸引による）。次いで、骨髄細胞を正常赤血球タンパ ク質（またはその前駆体）をエンコードする転写単位および赤血球特異的転写エ ンハンサ−からなるそのＤＮＡ構成体をもつベクターとともに、そのＤＮＡ構成 体をもつベクターを細胞中に組み込ませる条件下に、インキュベーションする。

次いで、処理した骨髄細胞を患者に再注入する。この手順を数回反復して、正常 遺伝子が導入された骨髄の赤血球の合計の数を増加することができる。

ヘモグロビンの正常ベータ鎖のヒトヘモグロビン疾患（ここで正常ベーターグロ ビン鎖の合或は不足していあるか、あるいは異常鎖が合成されている）の遺伝子 治療において、ベーターグロビンをエンコードする転写単位および転写エンハン サ−を含有するベクター−ＤＮＡ構成体を骨髄細胞中に組み込む。骨髄細胞の処 理は、ベクター−ＤＮＡ構成体を赤血球前駆体および造血幹細胞中に組み込むで あろう。

遺伝子治療のｆ：めにとくに有用なベクターは、レトロウィルスのベクターであ る。組み換えレトロウィルスのベクターは、次の部分から成ることができる（参 照、第７図）： ｉ）　ＭＭＬＶ、不ズミ白血病レトロウィルス、からの完全な５′ＬＴＲ，引き 続くレトロウィルスのパッケージングシグナル配列を含有するＤＮＡ。

ｉｉ）　赤血球特異的エンハンサ−にカップリングされＩ：、置換遺伝子治療の ための赤血球中に導入された転写単位。

ｉ　ｉ　ｉ）　選択可能な遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼ遺伝子（Ｎｅｏりまたはメントレキセート抵抗性ジヒドロフオレートリダク ターゼ（ｄ　ｈ　ｆ　ｒ）遺伝子、隣接する５″プロモーターをもたない。変異 型の構成体は、パッケージング細胞系ならびに造血細胞において活性である、隣 接する５°プロモーター（例えば、マウスまたはヒトのメタロチオネインまたは ＳＶ４０プロモーター）をもつ選択可能な遺伝子を含有することができる。

ｉｖ）　ウィルスのニンハンサー領域に欠失を含有するか、あるいはウィルスの エンハンサ−およびプロモーターの両者の領域中に欠失を含有する３″ＬＴＲ。

組み換えレトロウィルスのベクターＤＮＡは、両栄養性パッケージング細胞＋− ＡＭ（Ｃｏｎｅ　Ｒ，およびＭｕｌ　］　ｉｇａｎ％　Ｒ，（１９８４）Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、見見Δ、ｌ１．６３４９）またはヘルパー不 合組み換えレトロウィルスの高い力価のストックを産生ずることができる他のパ ッケージング細胞系中にトランス７工クシ層ンすることができる。トランス７エ クシ却ン後、パッケージング細胞系は、増殖培地中の適当な濃度で存在する、薬 物Ｇ４１８に対する抵抗性について選択する。組み換えレトロウィルスのＤＮＡ を組み込んだ細胞のみは、選択培地中に生き残ることができる。なぜなら、組み 換えレトロウィルスのベクター中のｎｅｏＲ遺伝子は、５″ＬＴＲ中に存在する 完全なウイルスエンハンサー−プロモーター配列により、そして存在するとき隣 接する５′非ウイルスプロモーターにより、推進されるであろうからである。個 々のＧ４１ｇ抵抗性のクローンを取り上げ、そして膨張させて高いウィルス力価 を産生ずるクローンについて選択する。

骨髄細胞は、Ｇ４１８抵抗性ウイルス産生細胞系との同時培養によるか、あるい は普通の方法に従い精製したレトロウィルスにより感染することができる。ウィ ルスんゲノムからの逆転写により産生され、そして感染した造血細胞の染色体中 に組み込まれたプロウィルスは、５′または３′のいずれのＬＴＲ中にもウィル スのエンハンサ−配列を含有しないであろう。こうして、スプライシングした構 造遺伝子、すなわち、転写単位は、ウィルスのエンハンサ−配列による転写調節 を含まず、そして転写調節下にｃｉｓ結合赤血球特異的エンハンサ−により発現 されるであろう。造血細胞を選択可能なマーカーおよび隣接する５′非ウイルス プロモーターを含有するレトロウィルス構成体により感染したとき、これらの細 胞は選択培地中で増殖し、こうして患者へ再導入される細胞の１００％は組み換 えプロウィルスゲノムを含有するであろう。導入された遺伝子は、ｃｉｓ結合赤 血球特異的エンハンサ−により調節されるので、感染した赤血球中で活性的に転 写されるであろう。非赤血球造血細胞は、また、組み換えプロウィルスを組み込 むであろうが、ｃｉｓ結合エンハンサ−の赤血球特異性の結果、遺伝子非赤血球 中で有意に発現されないであろう。

本発明のエンハンサ−配列を含有するＤＮＡ構成体は、また、胚および胎児の段 階を包含する発育の種々の段階において一次細胞中に導入することができる。こ れを発育の早期の段階において実施して遺伝子治療を行うことができる。それは 、また、トランスジェニック動物を産生ずるために実施することができる。さら に、本発明の構成体は、生体外で問題のタンパク質を産生ずるために細胞系（例 えば、赤血球系）形質転換するために使用することができる。

次の英施例によって、本発明をさらに説明する・里工！ ニブシロン−グロビン遺伝子の−１０Ｋｂの５′に主要なりＮａ５ｅｌ超感受性 部位Ｈ３ＩＩを含有する１、９ＫｂのＤＮＡ断片はエン／ｈンサー活性を有する ことを示した。エンハンサー活性は、１．９Ｋｂの断片の５末端中の０．８Ｋｂ のＤＮＡの直接下に横たわるＨＳＩＩにに対してマツピングした。このエンハン サ−要素は、相同性のニブシロン−グロビンプロモーターと組み合わせたとき、 ＣＡＴ遺伝子の活性を約３００倍だけ増強する。それは赤血球特異性であると思 われ、そしてニブシロン−グロビンプロモーターから６Ｋｂ程度に遠くに配置す ることができ、そしてなおユンハンサー機能を保持するように忠われる。

ＳＶ４０プロモーターにカップリングした主要なりＮａ５ｅ　ｌ超感受性部位Ｈ ３ＴＩ−ニブシロン−グロビン遺伝子の一１０Ｋｂ５’　を含む１．．９Ｋｂの ＤＮＡ断片中にエンハンサ−活性は発見された。

ニブシロン−グロビン遺伝子の−６〜−２０Ｋｂの５７に、４つの明らかに赤血 球特異的なりＮａ５ｅｌ超感受性部位（ＨＳ　Ｉ−ＩＶ）の位置により案内され （Ｔｕａｎ、Ｄ、　ｅ　ｔ　ａ　］、（１９８５）ＰΣＡＳ　ＵＳＡ、６３８４ −８８）ニブシロン−グロビン遺伝子の−１０゜３〜−１１１Ｋｂの５″におい て、ＨＳＩＩの下に横たわるＤＮＡのセグメントはエンハンサ−機能を有するこ とが同定された。

第２ａ図は、ニブシロン−グロビン遺伝子に関する、赤血球特異的超感受性部位 の下に横たわる赤血球特異的エンハンサ−要素を含むＨｉｎ（１１１１（Ｈ）断 片の位置および赤血球特異的超感受性部位Ｈ３Ｉ、Ｈ３ＩＴおよびＨ３ＩＶを含 むが、赤血球特異的超感受性部位を含まない、他のＨｉｎ＋：ＩＩＩＴ断片の位 置を示す、Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ　（Ｂｇ）リンカ−の添加後、これらの断片はｐＡｌ 　０ＣＡＴ２プラスミドのＢｇｌｌｌ（Ｂｇ）またはＢａｍＨＩ　（Ｂａｍ）部 位中にスプライシングされた。　第２ｂ図は、対照のプラスミドｐＡ１０ｃＡＴ ２およびｐ３Ｖ２ｃＡＴ。

およびエンハンサ−要素を含む１．９ＫｂのＤＮＡ、まｌ；はこの１．９Ｋｂの 断片から誘導されｊ；下位断片を含有する種々のＣＡＴプラスミドの部分的線状 地図を示す。ハツチングしたボックスはＳＶ４０早期のプロモーターを表す。ｐ ＳＶ２ＣＡＴプラスミド中の充填したボックスはＳＶ４０赤血球特異的を表す； 他の構成体において、それはエンハンサ−活性について試験した種々のヒトゲノ ム断片を表す。垂直の矢印は、ニブシロン−グロビン遺伝子の一１０Ｋｂの５′ における、主要なりＮａ５ｅｌ超感受性部位Ｈ５ＩＩの位置を示す。水平の半分 の矢印は、スプライシングしたゲノム（→）または逆ゲノム（−）の向きを示す ｅｐＡＨ３Ｔ　Ｉ　（０，８）およびｐＡＨ３ＩＩ　（１，１）は、まずＢａｍ Ｈ１リンカード１．９Ｋｂの断片をＢｇｌＪＩ（参照、第５図）で消化し、次い で下位断片をＣＡＴ遺伝子のＢｇｌｌＩ部位５′中にスプライシングすることに よって得た。

ＨＳＩＩを含む１．９Ｋｂの断片中に含有されるエンハンサ−は、Ｓ１０の早期 のプロモーターにより推進された、バクテリアんＣＡＴ遺伝子の転写を、５０倍 以上増強する。同様な構成体において、ニブシロン−グロビン遺伝子の一６Ｋｂ の５′を含有するＤＮＡ断片は、ＣＡＴ活性を弱く、約２倍だけ増強する。それ ぞれＨＳ　ｌｌｌ８よびＨ３ＩＶを含むＤＮＡ断片、ならびに超感受性部位を含 まない隣接するＤＮＡ断片は、ＣＡＴ活性を認められ得るほどに増強しない、Ｓ Ｖ４０プロモーターにより推進されるＣＡＴグラスミドにおいて、ＨＳＩＩのエ ンハンサ−効果は、向きおよび位置の両者に対して依存性であり（第１図および 表１）モしてＣＡＴ遺伝子の５′を逆ゲノムの向きでスプライシングしたとき、 最も顕著であると忠われる。

さらに、それは厳格な赤血球特異性を示さず、このときＨｅＬＡ細胞中でＣＡＴ 遺伝子を活性化する（表１）が、単核細胞の白血病細胞系ＴＨＰ−１または前骨 髄細胞の白血病の細胞系ＨＬ６０において活性化しない、ＨＬ６０またはＴ）Ｉ Ｐ−１細胞のエンハンサ−活性の欠乏は、トランスフェクションするプラスミド ＤＮＡを吸収するこれらの細胞の能力の欠如のためでなく、また宿主細胞中の参 照プラスミドのコピーより多い、この断片を含有する組み換えプラスミドのコピ ーが偶発的に存在するために、に５６２およびＨｅＬａＭＪ胞においてエンハン サ−活性は観測されない（ＤＮＡのドツトプロットのデータは示されていない） 。

赤血球特異性ならびにエンハンサ−要素の転写増強活性を改良する試みにおいて 、１．９Ｋｂの断片を２つの下位断片に分割した：５′の半分の直ぐ下に横たわ るＨＳＩＩから誘導された０、８Ｋｂの断片、および赤血球特異的ＤＮａｓｅｌ 超感受性部位を含まない、３′半分からの１．ｌＫｂの下位断片（第２図）ａそ れぞれの断片をエンハンサ−をもｔ；ないｐＡｌ　０ＣＡＴ２　（Ｇｏ　ｒｍａ ｎ、Ｃ，ｅ　ｔ　ａ　１．（１９８２）ＭＯｌ、ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、 、２．１０４４−１０５１）中で両者の向きにスプライシングし、次いで赤血球 に５６２および非赤血球ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクションした。

第３図は、ＳＶ４０プロモーターにより推進されたＣＡＴ遺伝子を含有する、組 み換えプラスミドのに５６２およびＨｅＬａ細胞中のＣＡＴ活性のアッセイの結 果を示す。Ｋ５６２細胞は、トランスフェクションの前後における、２０μモル のヘミン（Ｈｅｍｉｎ）を含有する培地中で維持した。ＣＡＴのアッセイは次の ようにして寅施した：等しい数のトランスフェクションされた細胞からの細胞抽 出物を、まず６５℃に１０分間加熱して、Ｋ５６２細胞抽出物中のＣＡＴ酵素活 性を明らかに妨害する分子を不活性化し、次いで余分のアセチルＣｏＡを４５分 毎に添加して、１４Ｃ−クロランフェニコールおよびアセチルＣｏＡとともに３ ７℃において３時間インキュベーションした。アセチル化産生物（ａＳｂ）を未 反応のクロランフェニコール（Ｃ）から、薄層クロマトグラフィー　（ＴＬＣ） により分離しｔ；。平板をＸ線フィルムに２４〜４８時間露出した。各レーンは 、印をしたように、それぞれの組み換えプラスミドのＣＡＴ活性を表す。

第３図から理解することができるように、ＨＳＩＩを含む、０．８Ｋｂの断片は 、Ｋ５６２細胞（第３ａ図）および）（ｅＬａ細胞（第３ｂ図）の両者において 試験したとき、ニンハンサー活性を含有する。１゜ＩＫｂの下位断片は認められ 得るエンハンサ−機能を含有しない。Ｋ５６２細胞において、０．８Ｋｂの下位 断片は、逆ゲノム向きにおいて、１．９Ｋｂの親断片のように、ゲノム向き中の 同一下位断片より３〜５倍大きいエンハンサ−活性を示す（表１）、再び、それ は厳格な赤血球特異性を示さず、このときそれは、また、ＨｅＬａ細胞中でＣＡ Ｔ遺伝子の発現を増強する（第３ｂ図）。

顕著な向き依存性、すなわち、逆ゲノム向きにおける０、８Ｋｂの断片の非常に 高い転写増強活性は、この断片中に存在しうる、ニンハンサー配列よりむしろ、 向き依存性の方法で機能する、可能性をプロモーター配列に付与シタ。５’−３ ’方向ｒ：Ｈ３Ｉ　ｒ　（０，８）−５Ｖ４０の早期のプロモーター−ＣＡＴ遺 伝子を含有するＰＡ　Ｈ５ＩＩ　（０−８）（第２図）でトランスフェクション したＨｅＬａ細胞から分離したＲＮＡの、予備的Ｓｌヌクレアーゼのマフピング を第４図に示す。

第４図は、トランスフェクションしたＨｅＬａ細胞から分離したＲＮＡにおける ＣＡＴ転写開始部位のＳｌヌクレアーゼのマツピングを示す。

ＲＮＡはグアニジンイソチオシアネート方法により分離した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ 、Ｊ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、　（１９７９）Ｅｉｏｃｈｅｍ、、上Ｃ，（１９７９） Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　立見上、■、１１７５−１１９２）、プローブは次のよ うにして作った：ＣＡＴ遺伝子の非転写鋼内からの２０マーのオリゴヌクレオチ ドのプライマー（Ａ、　Ｂａ　ｌ　ｄｗ　ｉｎ博士から入手しＩ：）を、ポリヌ クレオチドキナーゼにより５″末端において標識した。キナーゼオリゴヌクレオ チドブライマーを変性したｐＡ１０ＣＡＴ２、鋳型、に対してハイブリダイゼー ションし、クレノー断片および４つの非榎識デオキシヌクレオチドの存在下に伸 長し、次いでＢｇｌＴｌで切断し、次いでアルカリ性ゲル電気泳動により５′末 端において標識したほぼ３００ｂｐの一本鎖のプローブを産生じ、これはＣＡＴ 転写体に対してハイブリダイゼーションするであろう。レーンＭ１およびＭ２： 分子の大きさのマーカー。レーン２および２：Ｓｌヌクレアーゼにより消化の前 後。ｐＳＶ２ＣＡＴ（レーン３）により、ｐＡ１０ＣＡＴ２（レーン４）により 、ｐＡｌ−１’ｓ　Ｉ　１　（０，８）　（レーン５）により、ｐＡＩＴｓＩ　 Ｉ　（０，８）（レーン６）により、およびｐＡｌｓ　’１１（＋）（レーン７ ）により、産生された、保護されたＣＡＴ転写体。

水平の矢印は、保護されたＣＡＴ転写体の主要な長さを示す。

結果が示すようｌ；、ｐＳＶ２ＣＡＴおよびｐＡｓＨＩ　１　（０，８）でトラ ンス７エクンヨンされた細胞から分離したＲＮＡｌｍ８けるＣＡＴの転写体は、 すべて、長さ約１３０ｂｐの保護された断片を産生じた（第４図におけるレーン ３．５および６）。こうして、ｐＡＦＳ　Ｉ　Ｉ　（０゜８）により産生された 保護された断片は、５’　−３Ｖ４０エンハンサー−５Ｖ４０ＣＡＴ遺伝子３′ を含有する、ｐｓＶ２ｃＡＴのｃＡＴ転写体によりそれと同一の長さを有する（ 第４図におけるレーン３）。ｐＡＨ５１１（０，８）においてゲノム向きまたは 逆ゲノム向きで０．８Ｋｂの断片内からのＳＶ４０早期グ早期グツモーター流で 開始されたより長いＣＡＴの転写は、検出されなかった（第４図におけるレーン ５８よび６）、これが示唆するように、明らかなプロモーター配列は０．８Ｋｂ の断片中に存在する。

こうして、逆ゲノム向きの０．８Ｋｂの断片の非常に高いニンハンサー活性は、 実際のエンハンサ−要素がこの０．８Ｋｂの断片の５″末端に向かって非常に小 さいＤＮＡ領域に位置することができ、モしてゲノムの向きにおけるように、エ ンハンサ−とプロモーターとの間に介在されるとき、この断片の３“部分がエン ハンサ−活性に対する阻害的であるすることができる可能性のためでありうる。

胚のニブシロン−グロビンプロモーターにより推進されるＣＡＴ遺伝子をもつ組 み換えＣＡＴプラスミド 厳格な赤血球特異性を示さない上のプラスミドは、すべて、広い組織特異性をも つＳＶ４０プロモーターを含有するＣＡＴプラスミド中で構成された。ＣＡＴ遺 伝子を推進する胚のニブシロン−グロビンプロモーターを使用して、他の組の組 み換えＣＡＴプラスミドを構成して、■。

９Ｋｂまたは切頭０−８Ｋｂの断片中に含有されるエンハンサ−配列がより厳格 な赤血球特異性を示すかどうかを決定した。なぜなら、グロビンプロモーターは 結合した遺伝子に赤血球特異的発現を与えることが示されたからである。

第５図は、ニブシロン−グロビンプロモーターにより推進されたＣＡＴ遺伝子を もつＣＡＴプラスミドの構成を示す。上の水平線は、組み換えプラスミドの構成 において使用したニブシロン−グロビン遺伝子の制限部位５°を示す。Ｈ：Ｈ４ ｎｄｌＩＩ％Ｂｇ：ＢｇｌＩＴＳＢｃ：Ｂｃａｌ、Ｂａ：ＢａｍＨＩ％ｐｖ：Ｐ ｖｕｌ　Ｌ次の水平線は、膨張した１、９ＫｂのＨｉｎｄｌｌｌ断片を示す。水 平線より下の数字は、それぞれのＤＮＡ断片のＫｂの大きさを表す。チェッカー のボックスはニブシロン−グロビンプロモーターを表す。ＣＡＴ遺伝子のニブシ ロン−グロビンプロモーター５″をもつエンハンサ−をもたないｐｐは、ニブシ ロン−グロビンプロモーターを含有する２００ｂｐのＢｓｔｌ−Ｐｖｕｌｌ断片 （Ｌｉ、（Ｌ　Ｌ、ｅｔ　ａｌ、（１９８５）去エ　旦土旦上、Ｃｈｅｍｏ、２ ６旦、１４９１−１４９１０）を、Ｂｇｌｌｌ−５ｔｕｌ二重消化によりＳＶ４ ０プラスミドを欠失しである、ｐＡ１０ＣＡＴ２プラスミド１：結合することに よって構成した。ｐｔｐＴＴｓＩＩまたはｐｔｐＴＴｓＩＩ（図示せず）は、エ ンハンサ−要素を含有するＢｓｔＴ結合１．９Ｋｂ断片、ニブシロン−グロビン プロモーターを含有する２００ｂｐのＢｓ　ｔ　Ｉ−Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ断片、およ びＰＡ１０ＣＡＴ２からのＣＡＴ遺伝子を含有する大きいＢｇｌ　Ｔ　ｌ−５ｔ ｕ　Ｉ断片の三重結合ｊコより構成した。ｐｔｐＷｓ　Ｉ　Ｉ　（０，８）Ｉｉ ｐｔｐＴＴＳＩ　Ｉ中の１゜９ＫｂのインサートをＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨＩ で消化し、ここでこれはＤＮａｓｅｌ超感受性部位を含有しない１〜９Ｋｂのイ ンサート中の３′の１．ＩＫｂの下位断片を欠失し、次いで残りの大きい断片の 再’４ｍニＪ：　’）　形成Ｌ　ｆ：。ｐ＋ｐＴＴｓ　Ｉ　Ｉ　（０，８）　− Ｔｒｓ　Ｉ　（６，３）　ＩＬ、上の線状の再循環しないＢｇ　ｌ　Ｉ　１−Ｂ ａｍＨＩの大きい断片を、ニブシロン−グロビン遺伝子の６．３ＫｂのＢｃ　Ｉ 　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片５゜に結合することによって構成した。

第６図は、ニブシロン−グロビンプロモーターにより推進されたＣＡＴ遺伝子を 含有する組み換えＣＡＴプラスミドのＣＡＴ活性を示す。同−ｔｃ２ｏμｇ）の 各組み換えプラスミドをトランス７エクンヨンのｔ；めに使用した。しかしなが ら、７Ｋｂの大きいインサートをもつ、ｐ１ｐ葺ｓ　Ｉ　Ｉ　（０，８）　−Ｔ ＴＳ　Ｉ　（６，３）　フ５：Ａミトハ他（７）７’う７．ミ）’の分子量の約 ２倍の分子量を存し、こうしてこのプラスミドについて、２０μｇのトランス７ 工クシ１ン分子の数は２０ｔｚｇの他のゲラスミトノ約半分ノミテアル。シタカ ッチ、ｐｔｐＭｓ　Ｉ　Ｉ　（０，８）−ＴＴＳ　ＩＣ６，３）中のアセチル化 スポットの強度は、トランスフエラ９２フ分子の数について補正後、はぼ２倍だ け増加されるであろう。パイロット実験において、アセチル化スポットの強度少 なくとも２０μｇ／１０ｃｍ皿のに５６２細胞において、トランス７エクシラン プラスミドの量に関して直線で増加することが示された。

これらの構成体において、１．９Ｋｂの断片は、いずれの向きにおいても、Ｈｅ Ｌａ細胞中でＣＡＴ遺伝子を活性化すると思われない（第６図）、シかもに５６ ２細胞において、１．９ｋｇの断片（ｐｏｐ葺Ｓ１１中）および０．８Ｋｂの断 片（ｐ＋ｐＴｒｓ　Ｉ　１　０．８中）は、ゲノムの向きにおいてさえ、ＣＡＴ 遺伝子の活性を約３００倍の同様なレベルに増強する。これが示唆するように、 相同性のニブシロン−グロビンプロモーターとの組み合わせにおいて、エンハン サ−要素ｌ）は異質のＳＶ４０プロモーターより活性であり；２）それはＨｅＬ ａ、ｔｌＢ胞中のＣＡＴ遺伝子を活性化しないので、より厳格な赤血球特異性を 示すように思われる；そして３）ニブシロン−グロビンプロモーターから少なく とも１．ｌＫｂだけ離れた配置することができ、そしてなお同一程度のエンハン サ−活性を保持する。なぜなら、それぞれ、ｐｇｐＭｓｌｌおよＵｐ　ｔｐｉｓ 　Ｉ　Ｔ　中ｆ）　１　、９　Ｋ　ｂオヨＵ　Ｏ−８Ｋ　ｂ（７）ｌｌ’ｒ片１ ：ｌ：類似ｔルカらである（表１）。

エンハンサ−要素がニブシロン−グロビンプロモーターからなおさらに離れて配 置することができるかどうかを決定するために、およびまた、それ自体多くのエ ンハンサ−機能を示さないが、Ｈ３ＩＴ中でエンハンサ−と縦に結合されている 場合、Ｈ３ＩＩの真下に横たわるＤＮＡがＨ３ｌｌのエンハンサ−機能を促進す ることができるかどうかを決定するために、他のプラスミド（ｐｏｐ甘ＳせＩ　 Ｉ　（０，８）−ｐｔｐ甘５せＩ（６，３））を構成した。このプラスミドにお いて、０．８Ｋｂの断片中に含有されるエンハンサ−要素をＨ３Ｉの真下に横！ ：わる接触させ、次いでゲノム中のＨ５Ｉとニブシロン−グロビンプロモーター との間に自然に存在する他の５．５ＫｂのＤＮＡと接触させる（第５図）・ＣＡ Ｔ遺伝子の活性を約５００倍だけ増強する、このプラスミドのＣＡＴ活性は、Ｃ −グロビンプロモーターの０．８Ｋｂの断片５′およびＣＡＴ遺伝子のみを含有 する、ｐｔｐＨ５Ｉ　１　（０，８）より４０％活性である。これが示唆するよ うに、１）ＨＳＩＩ中のエンハンサ−要素はニブシロン−グロビンプロモーター から６Ｋｂ程度に離れて配置することができ、そしてなおエンハンサ−活性を保 持することができ；そして２）Ｈ５Ｉ中のまたは５．５Ｋｂのより下流のＤＮＡ 中の配列要素はＨ５１１のエンハンサ−機能を促進することができる。

エンハンサ−配列は種特異的ではない。

ヒト赤血球特異的転写エンハンサ−配列は、適当なプロモーター配列にカップリ ングしたとき、ヒトばかりでなく、かつまたマウス（ＭＥＬ）赤血球において機 能的である（表１）。この観察が示唆するように、ヒト赤血球特異的転写エンハ ンサ−配列は種特異的ではない。

遺伝子を造血細胞中に導入するための組み換えベクターの構成第７図は、遺伝子 を造血細胞中に導入するだめの組み換えベクターの構成を示す。この図面は一定 の尺度で描かれていない。点描したボックスは選択可能なマーカー遺伝子を表す （Ｎｅｏ’は示されているが、他のものを使用することができる）。水平の矢印 は遺伝子転写の向きを示す。チェッカーのボックスは、必要に応じてスプライシ ングした選択可能なマーカー遺伝子であることができる、プロモーター配列（メ タロチオネイン、ＳＶ４０または他の適当なプロモーター）を表す。ハツチング したボックスは遺伝子始原のためにスプライシングすべき遺伝子を表し、この遺 伝子は５′および３′のウィルスのスプライシング部位（５’ｓｓおよび３’ｓ ｓ）の間の独特ＢａｍＨＩ　（Ｂａｍ）中に、選択可能なマーカー遺伝子および ウィルスの転写のそれと反対の転写向きにスプライシングすることができる。充 填したボックスは、置換遺伝子治療のために遺伝子のスプライシングされた５′ であるべき、赤血球特異的エンハンサ−要素を表す。赤血球特異的エンノ・ンサ ーは、また、遺伝子のスプライシングされｔ；３′であることができる。適当な 向きにおいて、エンハンサーー遺伝子のカセットを、また、レトロウィルスのベ クター中の他の制限部位中にスプライシングすることができるが、ただしこのよ うな挿入部位はカセット中の遺伝子の転写が赤血球特異的エンハンサ−により調 節されるようにさせ、そして他のベクター配列による望ましくない調節の影響を 存在させなくすることができる。

表１゜ＳＶ４０またはニブシロン−グロビンプロモーターにより推進すれたＣＡ Ｔプラスミドの相対的ＣＡＴ活性。試験プラスミドの相対的ＣＡＴ活性は、アセ チル化された形態に転化された合計の入力の＋３Ｃクロランフエニフールの百分 率（ＴＬＣ上のスポットａおよびｂ）／そのＣＡＴ活性を１として設定したユン ノ・ンサーをもたなｕ＝、Ａ１０ＣＡＴ２またはｐｔｐによる転化の百分率とし て定義される。カッコ内の数値は、改良された条件下に実施したＣＡＴアッセイ から得られた相対的ＣＡＴ活性である（第３図の凡例参照）。＊−他の小さいプ ラスミドと同一の数のトランスフェクションｐ＋ｐＨ３Ｉ　Ｉ　（０，８）−Ｈ ９Ｉ　（６，３）分子の補正したＣＡＴ活性（第５図の凡例参照）。＊＊ニアセ チル化した形ＢへのＩ′Ｃ−クロランフェニコールの転化百分率は、５Ｖ４０７ ’ロモーターを含有するプラスミドについてのそれらに比較して非常に低い。

したがって、この観察を例示するために、相対的ＣＡＴ値は参照としてｐＡ１０ ＣＡＴ２を使用して計算した。Ｎ、Ｄ−一寅施せず。

造血細胞中のカセット中の遺伝子の適切な調節のために、主要なりＮａ５ｅｌ超 感受性部位Ｈ５Ｉ％Ｈ３Ｉ　Ｉ　Ｌ　）（ＳＩＶ　（参照、第１図）まプこ１ま Ｈ３ＶＩ（Ｔｕａｎ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．６３８４）またはこれらの部位 の任意の組み合わせ下に横たわる、可能な補助調節機能をもつＤＮＡ配列を、ま た、赤血球特異的エンハンサ−の次に、あるいはカセットまたはベクター配列中 の他の適当な中にスプライシングすることができる。

同等の実施態様 当業者は日常の実験を越えない実験を使用して、ここに記載する本発明の特定の 実７Ｍ態様に対する多くの同等の実施態様を認識するであろう。

このような同等の実施態様は次の請求の範民内に包含される。

＋　−４、、−ツ Ｆ工Ｇ、２Ａ ｐＡ１０ｃＡＴ２　ＣＡＴ− Ｈ８■ ＳＩＩ ＳＩＩ Ｓｎ ｅＬａ ＦＩＧ、３Ｂ ５−３゛ ＨｅＬａ 補正婁の写しく翻へｔ）提出ＩＩ（特許法第１８４条の８）ｇｅｎｅ　ｅｎｎ　 ｐｒｏｍ 請求の範囲 】、ヒト赤血球特異的転写エンハンサ−要素から本質的に成る分離したポリペプ チド。

２、転写的に機能的なりＮＡ配列がらなり、前記配列はヒトニブシロングロビン から約１Ｏ１３〜１１．１キロ塩基だけ上流におよびヒト赤血球中のベーターグ ロビン遺伝子から約５３．ｏ〜５３，８キロ塩基だけ上流に位置するエンハンサ −配列と同一であるか、あるいはそれに対して実質的に相同性である、請求の範 囲第１項記載のポリペプチド。

３、第１図に示す配列の少なくとも転写的に機能的な部分に対して実質的に相同 性である、請求の範囲Ｍ１項記載のエンハンサ−要素。

４、ａ、タンパク質またはその前駆体をエンコードする構造遺伝子転写単位およ びＤＮＡ調節配列からなるＤＮＡ、およびす、ヒト赤血球特異的転写エンハンサ −要素またはその転写的に機能的な部分、 からなる、宿主細胞中に組み込みかつその中でタンパク質を発現するだめのＤＮ Ａ構成体。

５、転写エンハンサ−要素はエンハンサ−として転写的に機能的なであるべき請 求の範囲第１または２項記載の分離したポリペプチドと同一であるか、あるいは それに対して実質的に相同性であるＤＮＡ配列からなる、請求の範囲第４項記載 のＤＮＡ構成体。

６、エンハンサ−要素は第１図に示す配列の少なくとも転写的に機能的な部分か らなる、請求の範囲第５項記載のＤＮＡ構成体。

７、転写単位の調節配列がプロモーター配列を含む、請求の範囲第４項記載のＤ ＮＡ構成体。

８、転写単位はヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコードする、請求の範囲第４ 項記載のＤＮＡ構成体。

９、転写単位はヒトベーターグロビンをエンコードする、請求の範囲第８項記載 のＤＮＡ構成体。

ｌＯ１転写単位は酵素または酵素サブユニットをエンコードする、請求の範囲第 ４項記載のＤＮＡ構成体。

１１、酵素はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたはピルベート キナーゼである、請求の範囲第４０項記載のＤＮＡ′＃Ｉｔ成体。

１２、転写単位は赤血球構造タンパク質をエンコードする、請求の範囲第４項記 載のＤＮＡ構成体。

１３、ａ、　プロモーターおよびタンパク質またはその前駆体をエンコードする ｌまたは２以上の構造遺伝子からなる転写巣位、およびｂ１ヒト赤血球特異的転 写エンハンサ−要素またはその転写的に機能的な部分、 からなる、赤血球、その前駆体または造血幹細胞をトランスフェクションして、 問題のタンパク質を発現するトランスフェクションされた細胞を産生するｔ；め のベクター。

１４、転写エンハンサ−要素はエンハンサ−として転写的に機能的なであるべき 請求の範囲第１または２項記載の分離したポリペプチドと同一であるか、あるい はそれに対して実質的に相同性であるＤＮＡ配列からなる、請求の範囲第１３項 記載のベクター。

１５、エンハンサ−要素は第１図に示す配列の少なくとも転写的に機能的な部分 と同一であるか、あるいはそれに対して実質的に相同性である配列からなる、請 求の範囲第１４項記載のベクター。

１６、転写単位はヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコードする、請求の範囲第 １３項記載のベクター。

１７、転写単位はヒトベーターグロビンをエンコードする、請求の範囲第１６項 記載のベクター。

１８、転写単位は酵素または酵素サブユニットをエンコードする、請求の範囲第 １３項記載のベクター。

１９、酵素はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたはピルベート キナーゼである、請求の範囲第１８”Ｊ記載のベクター。

２０、転写単位は赤血球構造タンパク質をエンコードする、請求の範囲第１３項 記載のベクター。

２Ｌ選択可能なマーカーをエンコードする発現可能な遺伝子をさらにを含む、請 求の範囲第１３項記載のベクター。

２２、プラスミドまたはウィルスからなる、請求の範囲第１３項記載のベクター 。

２３、レトロウィルスからなる、請求の範囲第１５項記載のベクター。

２４、ａ、　レトロウィルスのバックボーン、ｂ１プロモーターおよび赤血球中 で合成することができるタンパク質をエンコードする構造遺伝子からなる転写単 位、Ｃ１転写単位に対して十分に隣接して位置してその転写を増強するヒト赤血 球特異的転写エンハンサ−要素、およびｄ、任意の選択可能なマーカー遺伝子お よびプロモーター、赤血球、その前駆体まｔ；は造血幹細胞中に組み込むための レトロウィルスのベクター。

２５、構造遺伝子は正常ヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコードする、請求の 範囲第２４項記載のレトロウィルスのベクター。

２６、構造遺伝子は正常ヒトベーターグロビンポリペプチドをエンコードする、 請求の範囲第２５記載のレトロウィルスのベクター。

２７、構造遺伝子は正常ベーターグロビンポリペプチド鎖である、請求の範囲第 ２４項記載のレトロウィルスのベクター。

２８、エンハンサ−は第１図に示す配列の少なくとも転写的に機能的な部分に対 して実質的に相同性である配列である、請求の範囲第２４項記載のレトロウィル スのベクター。

２９、ａ、タンパク質またはその前駆体をエンコードするＤＮＡの挿入のための 挿入領域、および ｂ１ヒト赤血球特異的転写ユンハンサー要素、からなる、タンパク質をエンコー ドするＤＮＡを受容しおよび赤血球をトランスフェクションして、問題のタンパ ク質を発現するトランスフェクションされた赤血球を産生ずるためのベクター。

３０、挿入領域は制限酵素のための認識部位をエンコードするＤＮＡ配列である 、請求の範囲第２９項記載のベクター。

３１、エンハンサ−要素は第１図に示す配列の少なくとも転写的に機能的な部分 と同一であるか、あるいはそれに対して実質的に相同性である配列からなる、請 求の範囲第２９項記載のベクター。

３２、エンハンサ−要素は第１図に示す配列の少なくとも転写的に機能的な部分 からなる、請求の範囲第２９項記載のベクター。

３３、挿入領域から上流に位置するプロモーターをさらにを含む、請求の範囲第 ２９項記載のベクター。

３４、ａ、タンパク質またはその前駆体をエンコードする転写単位からなるＤＮ Ａ、および ｂ１転写単位に対して十分に隣接して位置してその転写を増強するヒト赤血球特 異的転写エンハンサ−要素、からなるトランスフェクションされたＤＮＡを含有 する、タンパク質の発現のｔ：めの赤血球トランスフェクション体。

３５、転写単位はヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコードする、請求の範囲第 ３４項記載のベクター。　・３６、転写単位はベーターグロビンをエンコードす る、請求の範囲第３５項記載のベクター。

３７、工程： ａ１赤血球の疾患に悩まされる個体から骨髄細胞を取り出し、ｂ　ｓ　ｌ　ｓタ ンパク質またはその前駆体をエンコードする転写単位からなるＤＮＡ、および １１１転写単位に対して十分に隣接して位置してその転写を増強するヒト赤血球 特異的転写エンハンサ−要素、からなるＤＮＡで骨髄細胞をトランスフェクショ ンし、ｃ、トランスフェクションした骨髄細胞を個体にもどす、かもなる、正常 赤血球タンパク質の発現の不足によるか、あるいは構造的または機能的異常な赤 血球の生物合成により特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療方法。

３８、転写エンハンサ−は、第１図に示す配列の少なくとも一部分に対して実質 的に相同性である配列からなる、請求の範囲第３７項記載の方法。

３９、転写単位はベーターグロビンをエンコードする、請求の範囲第３７項記載 の方法。

４０、ＤＮＡはレトロウィルスのベクターからなる、請求の範囲第３７項記載の 方法。

４１、工程： ａ、疾患に悩まされる個体から骨髄細胞を取り出し、ｂｌ　】、ベーターグロビ ンまたはその前駆体をエンコードする転写単位からなるＤＮＡ、および ｊｊ、転写単位ｌ；対して十分に隣接して位置してその転写を増強するヒト赤血 球特異的転写エンハンサ−要素、からなるＤＮＡで骨髄細胞をトランスフェクシ ョンし、ｃ、トランスフェクションした骨髄細胞を個体にもどす、からなる、ベ ーターグロビンが不足するか、あるいは異常である、ヘモグロビンのベーターグ ロビン鎖のヒトヘモグロビン疾患の遺伝子治療方法。

４２、トランスフェクションするＤＮＡはレトロウィルスのベクターである、請 求の範囲第４１項記載の方法。

４３、転写エンハンサ−は、第１図に示す配列の少なくとも転写的に機能的な部 分と同一であるか、あるいはそれに対して実質的に相同性である配列からなる、 請求の範囲第４１項記載の方法。

４４、ヒト赤血球特異的転写エンハンサ−、プロモーターおよび正常タンパク質 またはその前駆体の構造遺伝子またはその成分からなる遺伝子構成体を、ヒトま たはヒト以外の胚細胞または胎児造血細胞中に導入することからなる、正常赤血 球タンパク質の発現の不足によるか、あるいは構造的または機能的異常な赤血球 の生物合成により特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療方法。

４５、遺伝子構成体は、トランスフェクション、感染、ミクロ注入マたはエレク トロポレイションにより導入する、請求の範囲第４４項記載の方法。

国際調食報告 ｍｍＭｌ　＾ｗａｅｍ＋；ａＩＩｌ＋ａ、Ｐｃ”／ＵＳ　８８／Ｑ？Ｍ９７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素。 ２、長さ約８００ヌクレオチドの配列からなり、前記配列はヒトエブシロングロ ビンから約１０．３〜１１．１キロ塩基だけ上流におよびヒト赤血球細胞中のベ ーターグロビン遺伝子から約５３，０〜５３，８キロ塩基だけ上流に位置するエ ンハンサー配列に対して実質的に相同性である、請求の範囲第１項記載のエンハ ンサー要素。 ３、第１図に示す配列の少なくとも一部分に対して奥質的に相同性である、請求 の範囲第１項記載のエンハンサー要素。 ４、ａ、タンパク質またはその前駆体をエンコードする転写単位からなるＤＮＡ 、および ｂ、ヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素、からなる、宿主細胞中に組み込み かつその中でタンパク質を発現するためのＤＮＡ構成体＞ ５、転写エンハンサー要素は長さ約８００ヌクレオチドの配列からなり、前記配 列はヒトエプシロングロビンから約１０．３〜１１．１キロ塩基だけ上流におよ びベーターグロビン遺伝子から約５３．０〜５３．８キロ塩基だけ上流に位置す るエンハンサー配列に対して実質的に相同性である、請求の範囲第４項記載のＤ ＮＡ構成体。 ６、エンハンサー要素は第１図に示す配列の少なくとも一部分からなる、請求の 範囲第５項記数のＤＮＡ構成体。 ７、転写単位がプロモーター配列を含むＤＮＡ構成体。 ８、転写単位はヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコードする、請求の範囲第４ 項記載のＤＮＡ構成体。 ９、転写単位はヒトベークーグロビンをエンコードする、請求の範囲第８項記載 のＤＮＡ構成体。 １０、転写単位は酵素または酵素サブユニットをエンコードする、請求の範囲第 ４項記載のＤＮＡ構成体。 ｌＩ、酵素はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたはビルベート キナーゼである、請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ構成体。 １２、転写単位は赤血球構造タンパク質をエンコードする、請求の範囲第４項記 載のＤＮＡ構成体。 １３、ａ、プロモーターおよびタンパク質またはその前駆体をエンコードする１ または２以上の構造遺伝子からなる転写単位、およびｂ、ヒト赤血球特異的転写 エンハンサー要素、からなる、赤血球、その前駆体または造血幹細胞をトランス フェクションして、問題のタンパク質を発現するトランスフェクションされた細 胞を産生するためのベクター。 １４、転写エンハンサー要素は長さ約８００ヌクレオチドの配列からなり、前記 配列はヒトエプシロングロビンから約１０．３〜１１．１キロ塩基だけ上流にお よびヒト赤血球中のベーターグロビン遺伝子から約５３．０〜５３．８キロ塩基 だけ上流に位置するエンハンサー配列に対して実質的に相同性である、請求の範 囲第１３項記載のベクター。 １５、エンハンサー要素は第１図に示す配列の少なくとも一部分に対して実質的 に相同性である配列からなる、請求の範囲第１４項記載のベクター。 １６、転写単位はヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコードする、請求の範囲第 １３項記載のベクター。 １７、転写単位はヒトベーターグロビンをエンコードする、請求の範囲第１６項 記載のベクター。 １８、転写単位は酵素または酵素サブユニットをエンコードする、請求の範囲第 １３項記載のベクター。 １９、酵素はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたはピルベート キナーゼである、請求の範囲第１８項記載のベクター。 ２０、転写単位は赤血球構造タンパク質をエンコードする、請求の範囲第１３項 記載のベクター。 ２１、選択可能なマーカーをエンコードする発現可能な遺伝子をさらに含む、請 求の範囲第１３項記載のベクター。 ２２、プラスミドまたはウイルスからなる、請求の範囲第１３項記載のベクター 。 ２３、レトロウイルスからなる、請求の範囲第１５項記載のベクター。 ２４、ａ、レトロウイルスのパックボーン、ｂ、プロモーターおよび赤血球中で 合成することができるタンパク質をエンコードする構造遺伝子からなる転写単位 、ｃ、転写単位に対して十分に隣接して位置してその転写を増強するヒト赤血球 特異的転写エンハンサー要素、およびｄ、任意の選択可能なマーカー遺伝子およ びプロモーター、赤血球、その前駆体または造血幹細胞中に組み込むためのレト ロウイルスのベクター。 ２５、構造遺伝子は正常ヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコードする、請求の 範囲第２４項記載のレトロウイルスのベクター。 ２６、構造遺伝子は正常ヒトベーターグロビンポリペプチドをエンコードする、 請求の範囲第２５記載のレトロウイルスのベクター。 ２７、構造遺伝子は正常ベーターグロビンポリペプチド鎖である、請求の範囲第 ２４項記載のレトロウイルスのベクター。 ２８、エンハンサーは第１図に示す配列の少なくとも一部分に対して実質的に相 同性である配列である、請求の範囲第２４項記載のレトロウイルスのベクター。 ２９、ａ、タンパク質またはその前駆体をエンコードするＤＮＡの挿入のための 挿入領域、および ｂ、ヒト赤血球特異的転写エンハンサー要素、からなる、タンパク質をエンコー ドするＤＮＡを受容しおよび赤血球をトランスフェクションして、問題のタンパ ク質を発現するトランスフェクションされた赤血球を産生するためのベクター。 ３０、挿入領域は制限酵素のための認識部位をエンコードするＤＮＡ配列である 、請求の範囲第２９項記載のベクター。 ３１、エンハンサー要素は長さ約８００ヌクレオチドの配列からなり、前記配列 はヒトエプシロングロビンから約１０．３〜ｌｌ．１キロ塩基だけ上流におよび ヒト赤血球中のベーターグロビン遺伝子から約５３．０〜５３．８キロ塩基だけ 上流に位置するエンハンサー配列に対して実質的に相同性である、請求の範囲第 ２９項記載のベクター。 ３２、エンハンサー要素は第１図に示す配列の少なくとも一部分からなる、請求 の範囲第２９項記数のベクター。 ３３、挿入領域から上流に位置するプロモーターをさらにを含む、請求の範囲第 ２９項記載のベクター。 ３４、ａ、タンパク質またはその前駆体をエンコードする転写単位からなるＤＮ Ａ、および ｂ、転写単位に対して十分に隣接して位置してその転写を増強するヒト赤血球特 異的転写エンハンサー要素、からなるトランスフェクションされたＤＮＡを含有 する、タンパク質の発現のための赤血球トランスフエクション体。 ３５、転写単位はヒトグロビンポリペプチド鎖をエンコードする、請求の範囲第 ３４項記載のベクター。 ３６、転写単位はベーターグロビンをエンコードする、請求の範囲第３５項記載 のベクター。 ３７、工程： ａ、赤血球の疾患に悩まされる個体から骨髄細胞を取り出し、ｂ、ｉ、タンパク 質またはその前駆体をエンコードする転写単位からなるＤＮＡ、および ｉｉ、転写単位に対して十分に隣接して位置してその転写を増強するヒト赤血球 特異的転写エンハンサー要素、からなるＤＮＡで骨髄細胞をトランスフェクショ ンし、ｃ、トランスフェクションした骨髄細胞を個体にもどす、からなる、正常 赤血球タンパク質の発現の不足によるか、あるいは構造的または機能的異常な赤 血球の生物合成により特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療方法。 ３８、転写エンハンサーは、第１図に示す配列の少なくとも一部分に対して実質 的に相同性である配列からなる、請求の範囲第３７項記載の方法。３９、転写単 位はベーターグロビンをエンコードする、請求の範囲第３７項記載の方法。 ４０、ＤＮＡはレトロウイルスのベクターからなる、請求の範囲第３７項記載の 方法。 ４１、工程： ａ、疾患に悩まされる個体から骨髄細胞を取り出し、ｂ、ｉ、ベーターグロビン またはその前駆体をエンコードする転写単位からなるＤＮＡ、および ｉｉ、転写単位に対して十分に隣接して位置してその転写を増強するヒト赤血球 特異的転写エンハンサー要素、からなるＤＮＡで骨髄細胞をトランスフェクショ ンし、ｃ、トランスフェクションした骨髄細胞を個体にもどす、からなる、ベー ターグロビンが不足するか、あるいは異常である、ヘモグロビンのベーターグロ ビン鎖のヒトヘモグロビン疾患の遺伝子治療方法。 ４２、トランスフェクションするＤＮＡはレトロウイルスのベクターである、請 求の範囲第４１項記載の方法。 ４３、転写エンハンサーは、第１図に示す配列の少なくとも一部分に対して実質 的に相同性である配列からなる、請求の範囲第４１項記載の方法。４４、ヒト赤 血球特異的転写エンハンサー、プロモーターおよび正常タンパク質またはその前 駆体の構造遺伝子またはその成分からなる遺伝子構成体を、ヒトまたはヒト以外 の胚細胞または胎児造血細胞中に導入することからなる、正常赤血球タンパク質 の発現の不足によるか、あるいは構造的または機能的異常な赤血球の生物合成に より特徴づけられる赤血球の疾患の遺伝子治療方法。 ４５、遺伝子構成体は、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクショ ンまたはエレクトロポレイションにより導入する、請求の範囲第４４項記載の方 法。