CN116194154A - 使用aav载体的plakophilin-2(pkp2)基因疗法 - Google Patents

使用aav载体的plakophilin-2(pkp2)基因疗法 Download PDF

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Abstract

本文提供了例如使用腺相关病毒(AAV)载体对PKP2(Plakophilin‑2)的基因疗法。载体的启动子可以是MHCK7启动子或心肌肌钙蛋白T(HTNNT2)启动子。衣壳可以是AAV9或AAVrh74衣壳或其功能变体。可以使用其他启动子或衣壳。还提供了治疗方法，如通过rAAV载体的静脉内、冠状动脉内、颈动脉内或心内施用，以及其他组合物和方法。

Description

使用AAV载体的PLAKOPHILIN-2(PKP2)基因疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年8月7日提交的美国临时专利申请号63/063,032的优先权权益，该申请通过引用整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关联的序列表以文本格式提供，代替纸质副本，并在此通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件名称为ROPA_021_01WO_ST25.txt。该文本文件约为212KB，创建于2021年8月8日，经由EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
致心律失常性右心室心肌病(ARVC)是一种成人发作的心脏病，其影响着估计每1,000人中的1人至每1,250人中的1人。它表现为心脏肌壁(心肌)随着时间的破裂，这会导致异常心跳(心律失常)的风险增加以及当所累及的个体剧烈运动时猝死的风险增加。个体还可能感到胸部颤动或砰砰作响(心悸)、头晕目眩、昏晕(昏厥)、呼吸短促以及腿部或腹部异常肿胀。随着时间的推移，ARVC可导致心力衰竭。
ARVC中牵涉至少13个基因，其中许多涉及在桥粒的生物发生中，桥粒是提供细胞之间的强粘附的细胞内连接。当桥粒不能适当地形成时，心肌细胞可能彼此分离并死亡。特别是右心室可能会变得无力，而脂肪沉积物和疤痕组织可能会替代受损的心肌，从而导致右心室的扩张。这些改变最终会阻止有效的心脏泵送并扰乱控制心跳的电信号，从而导致心律失常。常染色体显性plakophilin-2(PKP2)心肌病是一种遗传性的ARVC，在其中检测到影响PKP2的突变。
因此，本领域对于包括ARVC在内的PKP2-相关疾病和病症的治疗仍然存在未满足的需求。本文公开的组合物和方法解决了这一需要。
发明内容
本发明大体上涉及使用表达PKP2或其功能变体的载体对疾病或病症例如心脏疾病或病症的基因疗法。
在一个方面，本公开提供了包含表达盒并且任选地侧接腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至启动子的编码Plakophilin-2(PKP2)或其功能变体的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，启动子为心脏特异性启动子。
在一些实施方案中，启动子为肌肉特异性启动子。
在一些实施方案中，启动子为心肌细胞特异性启动子。
在一些实施方案中，启动子为肌球蛋白重链肌酸激酶7(MHCK7)启动子。
在一些实施方案中，MHCK7启动子与SEQ ID NO:31具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，启动子为心肌肌钙蛋白T(hTNNT2)启动子。
在一些实施方案中，hTNNT2启动子与SEQ ID NO:32具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，表达盒包含心肌肌钙蛋白T(hTNNT2)基因的外显子1，其中任选地hTNNT2启动子和外显子1一起与SEQ ID NO:32具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，启动子为泛在启动子(ubiquitous promoter)，任选地CMV启动子或CAG启动子。
在一些实施方案中，表达盒包含polyA信号。
在一些实施方案中，polyA信号为人生长激素(hGH)polyA。
在一些实施方案中，表达盒包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，任选地WPRE(x)。
在一些实施方案中，Plakophilin-2(PKP2)或其功能变体为PKP2。
在一些实施方案中，PKP2为功能性PKP2。
在一些实施方案中，PKP2为人PKP2。
在一些实施方案中，PKP2为PKP2同种型A。
在一些实施方案中，PKP2同种型A与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，PKP2为PKP2同种型B。
在一些实施方案中，PKP2与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，编码PKP2的多核苷酸序列为人PKP2多核苷酸。
在一些实施方案中，编码PKP2的多核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，编码PKP2的多核苷酸序列与SEQ ID NO:4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，多核苷酸包含至少约4.0kb、至少约4.1kb、至少约4.2kb、至少约4.3kb、至少约4.4kb、或至少约4.5kb。
在一些实施方案中，多核苷酸包含至多约4.1kb、至多约4.2kb、至多约4.3kb、至多约4.4kb、至多约4.5kb、或至多约4.6kb。
在一些实施方案中，多核苷酸包含4.0kb至4.6kb、4.0kb至4.5kb、或4.0kb至4.4kb，或者其中多核苷酸包含4.0kb至4.3kb、4.0kb至4.2kb、或4.0kb至4.1kb。
在一些实施方案中，PKP2或其功能变体包含至少800个或至少830个氨基酸。
在一些实施方案中，多核苷酸与SEQ ID NO:8-15中的任何一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，表达盒侧接5′和3′反向末端重复序列(ITR)。
在一些实施方案中，ITR为AAV2 ITR并且/或者ITR与SEQ ID NO:20-26中的任何一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在另一个方面，本公开提供了一种包含前述实施方案中的任一项的多核苷酸的基因疗法载体。
在一些实施方案中，基因疗法载体为重组腺相关病毒(rAAV)载体。
在一些实施方案中，rAAV载体为AAV9或其功能变体。
在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO:77中的任何一个具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV载体为AAVrh10或其功能变体。
在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO:79中的任何一个具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV载体为AAV6或其功能变体。
在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO:78中的任何一个具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV载体为AAVrh74或其功能变体。
在一些实施方案中，rAAV载体包含与SEQ ID NO:80中的任何一个具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的衣壳蛋白。
在另一个方面，本公开提供了一种在有此需要的受试者中治疗和/或预防疾病或病症的方法，其包括向受试者施用前述实施方案中的任一项的载体。
在一些实施方案中，疾病或病症为心脏病症。
在一些实施方案中，疾病或病症为心肌病。
在一些实施方案中，心肌病为致心律失常性右心室心肌病(ARVC)。
在一些实施方案中，心肌病为肥厚型心肌病或扩张型心肌病。
在一些实施方案中，疾病或病症的特征在于心肌的纤维脂肪浸润。
在一些实施方案中，疾病或病症为心力衰竭。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。
在一些实施方案中，受试者为灵长类动物。
在一些实施方案中，受试者为人。
在一些实施方案中，受试者在PRP2基因中具有突变。
在一些实施方案中，载体通过静脉内注射、心内注射、心内输注和/或心导管插入术来施用。
在一些实施方案中，施用使PKP2表达增加至少约5％。
在一些实施方案中，施用使PKP2表达增加至少约30％。
在一些实施方案中，施用使PKP2表达增加至少约70％。
在一些实施方案中，施用使PKP2表达增加约5％至约10％。
在一些实施方案中，施用使PKP2表达增加约30％至约50％。
在一些实施方案中，施用使PKP2表达增加约50％至约70％。
在一些实施方案中，施用使PKP2表达增加约70％至约100％。
在一些实施方案中，所述方法治疗和/或预防所述疾病或病症。
在一些实施方案中，所述方法包括施用有效量的载体。
在一些实施方案中，疾病或病症与受试者中PKP2中的功能丧失相关或由其引起。
在一些实施方案中，疾病或病症与受试者中PKP2中的功能获得相关或由其引起。
在一些实施方案中，相对于编码具有SEQ ID NO:2的序列的人PKP2的人PKP2基因，受试者具有导致选自p.Arg490Trp、Asp26Asn、Thr50_Val51SerfsX60、Arg79X、Tyr86X、Gln133X、Val406SerfsX3、Tyr616X、Trp676X、Cys796Arg、Cys796E、Tyr807X、Glu62Lys、S688P、Trp848X、Y86X、V406X、Y616X、W848X和Y807X的氨基酸取代的突变。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包含有效量的载体的药物组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用载体的约1×1011个载体基因组至约1×1013个载体基因组，向受试者施用载体的约1×1012个载体基因组至约1×1014个载体基因组，或向受试者施用载体的约1×1013个载体基因组至约1×1015个载体基因组。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含前述实施方案中的任一项的载体。
在另一个方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含前述实施方案中的任一项的载体或前一实施方案的药物组合物和任选地使用说明书。
在另一个方面，本公开提供了前述实施方案中的任一项的载体用于任选地根据前述实施方案中的任一项的方法治疗疾病或病症的用途。
在另一个方面，本公开提供了一种根据前述实施方案中的任一项的载体，其用于任选地根据前述实施方案中的任一项的方法治疗疾病或病症。
在另一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:12-15和89-92中的任何一个或与SEQ ID NO:8-11和93-96中的任何一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，启动子为MHCK7启动子。
在一些实施方案中，MHCK7启动子与SEQ ID NO:31具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，PKP2为人PKP2。
在一些实施方案中，PKP2为PKP2同种型A。
在一些实施方案中，PKP2同种型A与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％、99％或100％的同一性。
在另一个方面，本公开提供了一种包含前述实施方案中的任一项的多核苷酸的基因疗法载体。
在一些实施方案中，基因疗法载体为重组腺相关病毒(rAAV)载体。
在一些实施方案中，rAAV载体为AAV9载体。
在一些实施方案中，rAAV载体为AAVrh74载体。
在另一个方面，本公开提供了一种在鉴定为在PRP2基因中具有突变的受试者中治疗和/或预防心脏病症的方法，其包括向受试者施用前述实施方案中的任一项的载体。
在一些实施方案中，心脏病症为心肌病，任选地致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、肥厚型心肌病或扩张型心肌病。
在一些实施方案中，心脏病症为心力衰竭。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。
在一些实施方案中，载体通过静脉内注射、心内注射、心内输注和/或心导管插入术来施用。
在一些实施方案中，与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少左心室射血分数百分比(LVEF％)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少左心室缩短分数百分比(FS％)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的增加相比，所述方法防止或减少以平方毫米为单位的右心室面积(RV面积(mm2)的增加，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少以毫米每秒为单位的右心室速度时间积分(RV VTI(mm/sec)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的增加相比，所述方法防止或减少左心室或右心室纤维化的增加，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
下面的详细描述中公开了各种其他方面和实施方案。本发明仅受附随的权利要求书的限制。
附图说明
图1示出了示意载体基因组的一个非限制性实例的图。该载体基因组的完整多核苷酸序列为SEQ ID NO:12。表达盒为SEQ ID NO:8。如本文所述，MHCK7启动子在图中标记为“增强子/MHCK7”。
图2示出了示意载体基因组的一个非限制性实例的图。该载体基因组的完整多核苷酸序列为SEQ ID NO:13。表达盒为SEQ ID NO:9。
图3示出了示意载体基因组的一个非限制性实例的图。该载体基因组的完整多核苷酸序列为SEQ ID NO:14。表达盒为SEQ ID NO:10。如本文所述，MHCK7启动子在图中标记为“增强子/MHCK7”。
图4示出了示意载体基因组的一个非限制性实例的图。该载体基因组的完整多核苷酸序列为SEQ ID NO:15。表达盒为SEQ ID NO:11。
图5A-5B示出了在转导的分化的AC16细胞中的PKP2蛋白表达。图5A示出了PKP2(上方小图)或上样对照GAPDH(下方小图)的蛋白质印迹法(WB)。图5B示出了蛋白质印迹法的条形图。标注了AAV载体血清型(AAV9或rh74)和启动子(MHCK7或hTnT)。对照包括GFP载体(CON-GFP)和无转导(无Tdxn)。
图6A-6D示出了正常小鼠(左条)、未经治疗的PKP2敲除小鼠(中条，cKO PKP2)或经治疗小鼠(右条)的左心室射血分数百分比(LVEF％)。图6A示出了用AAV9载体和MHCK7启动子(AAV9-MHCK7)的结果。图6B示出了用AAVrh.74载体和MHCK7启动子(AAVrh.74-MHCK7)的结果。图6C示出了用AAV9载体和hTnT启动子(AAV9-hTnT)的结果。图6D示出了用AAVrh.74载体和hTnT启动子(AAVrh.74-hTnT)的结果。
图7A-7D示出了正常小鼠(左条)、未经治疗的PKP2敲除小鼠(中条，cKO PKP2)或经治疗小鼠(右条)的左心室缩短分数百分比(FS％)。图7A示出了用AAV9载体和MHCK7启动子(AAV9-MHCK7)的结果。图7B示出了用AAVrh.74载体和MHCK7启动子(AAVrh.74-MHCK7)的结果。图7C示出了用AAV9载体和hTnT启动子(AAV9-hTnT)的结果。图7D示出了用AAVrh.74载体和hTnT启动子(AAVrh.74-hTnT)的结果。
图8A-8D示出了正常小鼠(左条)、未经治疗的PKP2敲除小鼠(中条，cKO PKP2)或经治疗小鼠(右条)以平方毫米为单位的右心室面积(RV面积(mm2))。图8A示出了用AAV9载体和MHCK7启动子(AAV9-MHCK7)的结果。图8B示出了用AAVrh.74载体和MHCK7启动子(AAVrh.74-MHCK7)的结果。图8C示出了用AAV9载体和hTnT启动子(AAV9-hTnT)的结果。图8D示出了用AAVrh.74载体和hTnT启动子(AAVrh.74-hTnT)的结果。
图9A-9D示出了正常小鼠(左条)、未经治疗的PKP2敲除小鼠(中条，cKO PKP2)或经治疗小鼠(右条)以毫米每秒为单位的右心室速度时间积分(RV VTI(mm/sec))。图9A示出了用AAV9载体和MHCK7启动子(AAV9-MHCK7)的结果。图9B示出了用AAVrh.74载体和MHCK7启动子(AAVrh.74-MHCK7)的结果。图9C示出了用AAV9载体和hTnT启动子(AAV9-hTnT)的结果。图9D示出了用AAVrh.74载体和hTnT启动子(AAVrh.74-hTnT)的结果。
图10A-10B示意了基于心脏的三色组织学染色后胶原百分比的定量的左心室和右心室中纤维化的程度。发现未进行条件性PKP2基因敲除的对照动物(Cre Neg组)具有非常少的胶原，而发现接受配制缓冲液的对照PKP2基因敲除动物(CKO FB组)在左心室和右心室中均具有大得多的胶原比例。在所有AAV注射组中，AAV介导的PKP2的过表达均导致了胶原在不同程度上的强劲衰减(对于所有组，n＝4；p-值反映来自单因素ANOVA和Bonferroni事后分析的结果)。图10A为左心室中胶原百分比的条形图。图10B为右心室中胶原百分比的条形图。
图11示出了示意载体基因组的一个非限制性实例的图。该载体基因组的完整多核苷酸序列为SEQ ID NO:89。表达盒为SEQ ID NO:93。如本文所述，MHCK7启动子在图中标记为“增强子/MHCK7”。
图12示出了示意载体基因组的一个非限制性实例的图。该载体基因组的完整多核苷酸序列为SEQ ID NO:90。表达盒为SEQ ID NO:94。
图13示出了示意载体基因组的一个非限制性实例的图。该载体基因组的完整多核苷酸序列为SEQ ID NO:91。表达盒为SEQ ID NO:95。如本文所述，MHCK7启动子在图中标记为“增强子/MHCK7”。
图14示出了示意载体基因组的一个非限制性实例的图。该载体基因组的完整多核苷酸序列为SEQ ID NO:92。表达盒为SEQ ID NO:96。
具体实施方式
本公开提供了用于递送编码PKP2多肽或其功能变体的多核苷酸的PKP2的基因疗法载体，以及使用方法，及其他组合物和方法。在特定的实施方案中，本公开涉及一种基因疗法载体，其包含可操作地连接至编码PKP2多肽或其功能变体的多核苷酸的启动子序列。在一些实施方案中，启动子为肌球蛋白重链肌酸激酶7(MHCK7)启动子。在一些实施方案中，AAV载体为AAV9载体。在一些实施方案中，启动子为MHCK7启动子并且AAV载体为AAV9载体。在一些实施方案中，启动子为hTNNT2启动子。在一些实施方案中，启动子为hTNNT2启动子并且AAV载体为AAV9载体。在一些实施方案中，PKP2为人PKP2a。在一些实施方案中，PKP2为人PKP2b。在一些实施方案中，AAV载体为rh74载体。在一些实施方案中，启动子为MHCK7启动子并且AAV载体为rh74载体。在一些实施方案中，启动子为hTNNT2启动子。在一些实施方案中，启动子为hTNNT2启动子并且AAV载体为rh74载体。在一些实施方案中，PKP2为人PKP2a。在一些实施方案中，PKP2为人PKP2b。
本公开还提供了通过向受试者施用本公开的基因疗法载体来治疗受试者的病症或病症的方法。在某个实施方案中，病症或病症为致心律失常性右心室心肌病(ARVC)。
在某些实施方案中，所治疗的受试者为在PKP2基因中具有一个或多个突变的ARVC患者。超过一半的ARVC患者在编码蛋白质Plakophilin-2(PKP2)的桥粒基因PKP2中携带突变。PKP2还与Brugada综合征(BrS)和特发性心室颤动相关联。它是犰狳重复序列和plakophilin蛋白家族的成员。该蛋白含有侧接N-末端和C-末端结构域的九个中心保守犰狳重复序列结构域。它的作用是将钙粘蛋白连接至细胞骨架中的中间丝。
Plakophilin 2定位于细胞桥粒和细胞核，并经由N-末端头部结构域结合斑珠蛋白、桥粒斑蛋白和桥粒钙粘蛋白。PKP2通过桥粒-中间丝组件提供横向稳定力，从而促进细胞-细胞接触。它还可以在细胞内信号传导调节、电生理和运输调节以及转录过程的控制中发挥作用。
在野生型小鼠的心脏中静脉注射编码PKP2a的C-末端缺失突变体(R735X)的AAV9载体在经治疗的小鼠经受运动训练时加速了ARVC的出现。Cruz等人,J Am CollCardiol.65(14):1438-50(2015)。突变型PKP2a会引起疾病表型；而表达非突变型PKP2a的对照AAV9载体在野生型小鼠中不会引起表型变化。野生型人PKP2a的异源表达不会诱发疾病或功能改变。这些研究证实，突变型PKP2a可引起疾病表型。它们未能证实PKP2的治疗作用，因为非突变型PKP2的异源表达在野生型小鼠中不会引起表型变化。
根据本发明，可使用编码PKP2或其功能变体的多核苷酸来生成基因疗法载体，其中PKP2或其功能变体包含至少800个或至少830个氨基酸(例如，在Arg-735处无C末端截短)。所得载体可以用于治疗疾病或病症，例如，PKP2-相关疾病或病症，例如，ARVC、Brugada综合征(BrS)、特发性心室颤动、扩张型心肌病(DCM)等。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。下文将描述合适的方法和材料，但在本发明的实践中可使用与本文描述的那些类似或等同的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献明确地通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，本文描述的材料、方法和实例仅是示意性的而不旨在限制。
本文中提到的所有出版物和专利在此通过引用整体并入，犹如每个个别出版物或专利被具体地和单独地指出通过引用并入。在发生冲突的情况下，以本申请(包括其中的任何定义)为准。然而，本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及均不是也不应被视为是承认或任何形式的暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。
在本说明书中，除非另有指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围均应理解为包括在所述及的范围内的任何整数的值，并在适当时包括其分数(例如，整数的十分之一和百分之一)。术语“约”，当紧接在数字或数值之前时，意指加或减10％的数字或数值范围。应理解，除非另有指明，否则如本文所用，术语“一种(a/an)”是指所列举的组分中的“一种或多种”。备选词(例如，“或”)的使用应理解为表示备选项中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应理解为意指备选项中的一个或两个。如本文所用，术语“包括”和“包含”同义地使用。
如本文所用，关于多肽或多核苷酸序列，术语“同一性”和“相同”是指在该“查询”序列与“主题”序列的比对中精确匹配残基的百分比，如由BLAST算法生成的比对。除非另有说明，否则在主题序列的全长上计算同一性。因此，如果在将查询序列与主题序列比对时，查询序列与主题序列“具有至少x％的同一性”，则主题序列中至少x％(向下四舍五入)的残基被比对为与查询序列中的对应残基精确匹配。在主题序列具有可变位置(例如，表示为X的残基)时，与查询序列中任何残基的比对被计为匹配。序列比对可以使用NCBI Blast服务(BLAST+版本2.12.0)进行。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指两个或更多个核酸(例如，DNA)区段之间的功能关系。通常，它是指转录调控序列与转录序列的功能关系。例如，如果启动子序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则启动子序列可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接至转录序列的启动子转录调控序列与转录序列是物理上邻接的，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调控序列，如增强子，不需要是物理上邻接的或位置上紧邻它们增强其转录的编码序列。
如本文所用，“AAV载体”或“rAAV载体”是指包含一种或多种侧接AAV反向末端重复序列(ITR)的目的多核苷酸(或转基因)的重组载体。当存在于已用编码和表达rep和cap基因产物的质粒转染的宿主细胞中时，此类AAV载体可被复制和包装成感染性病毒颗粒。或者，可使用已经稳定工程化以表达rep和cap基因的宿主细胞将AAV载体包装成感染性颗粒。
如本文所用，“AAV病毒体”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化多核苷酸AAV载体组成的病毒颗粒。如本文所用，如果颗粒包含异源多核苷酸(即，非野生型AAV基因组的多核苷酸，如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV载体颗粒的产生必然包括AAV载体的产生，因为这样的载体包含在AAV载体颗粒内。
如本文所用，“启动子”是指能够促进从真核细胞中的多核苷酸开始RNA转录的多核苷酸序列。
如本文所用，“载体基因组”是指由载体(例如，rAAV病毒体)包装的多核苷酸序列，包括侧接序列(在AAV中，反向末端重复序列)。术语“表达盒”和“多核苷酸盒”是指侧接ITR序列之间的载体基因组的部分。“表达盒”意指载体基因组包含至少一个编码基因产物的基因，该基因产物可操作地连接至驱动表达的元件(例如，启动子)。
如本文所用，术语“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指有患上适合于用本文公开的重组基因疗法载体或基因编辑系统治疗或改善的疾病、病症或病患的风险或者正罹患适合于用本文公开的重组基因疗法载体或基因编辑系统治疗或改善的疾病、病症或病患的患者或受试者。有需要的患者或受试者可以是例如被诊断患有与心脏相关联的病症的患者或受试者。受试者可能在PKP2基因中具有突变或具有PKP2基因或基因调控序列的全部或部分的缺失，这会引起PKP2蛋白的异常表达。“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。通过本文描述的方法治疗的受试者可以是成人或儿童。受试者的年龄可以不等。
如本文所用，术语“变体”是指与亲本蛋白质相比具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的蛋白质。如本文所用，术语“功能变体”是指与亲本蛋白质和保留亲本蛋白质的一种或多种所需活性的蛋白质相比具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的蛋白质。
如本文所用，“治疗”是指改善疾病或病症的一种或多种症状。术语“预防”是指延迟或中断疾病或病症的一种或多种症状的发作或者减慢PKP2-相关疾病或病症例如致心律失常性右心室心肌病(ARVC)的进展。
腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组的长度为约4.7kb，包括两个～145-核苷酸反向末端重复序列(ITR)。AAV有多种已知的变体，当按抗原表位分类时有时也称为血清型。AAV血清型的基因组的核苷酸序列是已知的。例如，AAV-1的完整基因组在GenBank登录号NC_002077中提供；AAV-2的完整基因组在GenBank登录号NC_001401和Srivastava等人,J.Virol.,45:555-564(1983)中提供；AAV-3的完整基因组在GenBank登录号NC_1829中提供；AAV-4的完整基因组在GenBank登录号NC_001829中提供；AAV-5基因组在GenBank登录号AF085716中提供；AAV-6的完整基因组在GenBank登录号NC_00 1862中提供；AAV-7和AAV-8基因组的至少一部分分别在GenBank登录号AX753246和AX753249中提供；AAV-9基因组在Gao等人,J.Virol.,78:6381-6388(2004)中提供；AAV-10基因组在Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)中提供；AAV-11基因组在Virology,330(2):375-383(2004)中提供。AAVrh.74基因组的序列在美国专利9,434,928中提供，该专利通过引用并入本文。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在AAV ITR中。三个AAV启动子(根据其相对图谱位置命名为p5、p19和p40)驱动编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个rep启动子(p5和p19)，与单个AAV内含子(在核苷酸2107和2227处)的差异剪接相结合，导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。Rep蛋白具有多重酶促性质，其最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。选择性剪接和非共有翻译起始位点负责三种相关衣壳蛋白的产生。单个共有多腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka,Current Topics in Microbiology andImmunology,158:97-129(1992)中有综述。
AAV具有独特的特征，这些特征使得其作为例如在基因疗法中向细胞递送外源DNA的载体具有吸引力。培养物中细胞的AAV感染是不致细胞病变的，而人和其他动物的自然感染是沉默且无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而有可能在体内靶向许多不同的组织。此外，AAV转导缓慢分裂和非分裂的细胞，并且可以作为转录活性核附加体(染色体外元件)基本上在这些细胞的整个生命周期内持续存在。AAV前病毒基因组作为克隆的DNA插入质粒中，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制和基因组衣壳化的信号包含在AAV基因组的ITR内，故内部大约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)中的一些或全部可被替换为外源DNA。为了生成AAV载体，可以以反式提供rep和cap蛋白。AAV的另一显著特征在于其是极其稳定且强大的病毒。它容易承受用于灭活腺病毒的条件(56℃至65℃持续数小时)，使得AAV的冷藏保存变得不那么重要。AAV甚至可以冻干。最后，AAV感染的细胞对重复感染没有抵抗力。
可用于本发明的实践中的基因递送病毒载体可利用分子生物学领域中公知的方法来构建。通常，携带转基因的病毒载体由编码转基因的多核苷酸、合适的调控元件和产生介导细胞转导的病毒蛋白所必需的元件组装。这样的重组病毒可以通过本领域已知的技术产生，例如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括但不限于HeLa细胞、SF9细胞(任选地具有杆状病毒辅助载体)、293细胞等。可使用基于疱疹病毒的系统来产生AAV载体，如US20170218395A1中所述。用于产生这样的复制缺陷型重组病毒的详细方案可见于例如W095/14785、W096/22378、美国专利号5,882,877、美国专利号6,013,516、美国专利号4,861,719、美国专利号5,278,056和W094/19478中，这些专利中的每一个的完整内容在此通过引用并入。
本公开涵盖与Plakophilin-2(PKP2)蛋白质或多肽有关的组合物和使用方法。已知PKP2中的各种突变与心肌病和心力衰竭相关联，包括疾病比如van Tintelen等人,Circulation 113:1650-58(2006)；Novelli Front.Cardiovasc.Med.(2008)中；和其他来源中描述的那些。因此，病毒载体介导的PKP2基因递送可以充当PKP2-相关人类疾病如心肌病和心力衰竭的可行治疗方法。
在患有致心律失常性右心室心肌病(ARVC)的人中已鉴定出PKP2基因中超过230个突变。(参见“PKP2 gene”,MedlinePlus)。这种病患最常影响右心室周围的心肌，右心室是心脏的两个下腔室中之一。ARVC会增加异常心跳(心律失常)和猝死的风险。一些PKP2基因突变会导致产生异常短的plakophilin 2版本。其他突变通过添加、删除或改变其蛋白质构建块(氨基酸)中的一个或多个来改变plakophilin 2的结构。研究表明，改变的蛋白质会损害桥粒的形成和功能。
在没有正常桥粒的情况下，心肌的细胞会彼此分离并死亡，特别是在心脏肌肉处于应激下时(如在剧烈运动期间)。受损的心肌逐渐被脂肪和疤痕组织所替代。随着这种异常组织的积累，右心室的壁会变得伸展，从而阻止心脏有效地泵血。这些变化还会扰乱控制心跳的电信号，从而可能导致心律失常。PKP2-相关疾病的描述可见于以下参考文献中：Bonne等人,Genomics 51:452-454(1998)[PubMed:9721216]；Bonne等人,Cytogenet.CellGenet.88:286-287(2000)[PubMed:10828611]；Dalal等人,Circulation 113:1641-1649(2006)[PubMed:16549640]；Gerull等人,Nature Genet.36:1162-1164(2004[PubMed:15489853]；Grossmann等人,J.Cell Biol.167:149-160(2004)[PubMed:15479741]；Marcus等人,Circulation 65:384-398(1982)[PubMed:7053899]；和Mertens等人,J.CellBiol.135:1009-1025(1996)[PubMed:8922383]。也参见OMIM.org条目602861(“PLAKOPHILIN 2；PKP2”)。
人PKP2a及其同种型PKP2b的天然序列在下面示出，其中Arg-735加有下划线：
PKP2a(SEQ ID NO:1)–837个氨基酸
Figure BDA0004113525680000131
/>
Figure BDA0004113525680000141
PKP2b(SEQ ID NO：2)-881个氨基酸
Figure BDA0004113525680000142
/>
Figure BDA0004113525680000151
PKP2-相关疾病的一个实验模型为R735X模型，如Cruz等人,J Am Coll Cardiol65:1438-50(2015)中所述。R735X根据PKP2b同种型进行编号。PKP2a的R735X突变体长度为690个氨基酸，这是由于在Arg-690处的C-末端截短(相对于PKP2b的Arg-735，SEQ ID NO:2)。
在一些实施方案中，PKP2蛋白包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中的任何一个至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多肽序列。在一些实施方案中，PKP2蛋白为野生型或天然PKP2蛋白，例如，人PKP2a或人PKP2b。
在一些实施方案中，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其包含衣壳和载体基因组，其中所述载体基因组包含可操作地连接至启动子的编码PKP2或其功能变体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本公开提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，其包含衣壳和载体基因组，其中所述载体基因组包含可操作地连接至启动子的编码PKP2的多核苷酸序列。编码PKP2a的多核苷酸可以包含与SEQ ID NO:3至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
编码PKP2b的多核苷酸可以包含与SEQ ID NO:4至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
任选地，编码载体基因组的多核苷酸序列可以包含Kozak序列，包括但不限于GCCACCATGG(SEQ ID NO:5)。Kozak序列可以与编码PKP2a蛋白或其功能变体的多核苷酸序列重叠。例如，载体基因组可以包含与SEQ ID NO:6至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列(前十个核苷酸构成Kozak序列)。
Kozak序列可以与编码PKP2b蛋白或其功能变体的多核苷酸序列重叠。例如，载体基因组可以包含与SEQ ID NO:7至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列(前十个核苷酸构成Kozak序列)。
在一些实施方案中，Kozak序列为包含以下中的任何一个或由以下中的任何一个组成的替代Kozak序列：
(gcc)gccRccAUGG(SEQ ID NO:16)；
AGNNAUGN；
ANNAUGG；
ANNAUGC；
ACCAUGG；和
GACACCAUGG(SEQ ID NO:18)。
在一些实施方案中，载体基因组不包含Kozak序列。
多核苷酸序列可以是密码子优化的。例如，载体基因组可以包含编码与SEQ IDNO:87具有至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的PKP2a的多核苷酸序列。
载体基因组可以包含编码与SEQ ID NO:88具有至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的PKP2b的多核苷酸序列。
本公开的AAV病毒体包含载体基因组。载体基因组可以包含表达盒(或用于不需要表达多核苷酸序列的基因编辑应用的多核苷酸盒)。可以使用任何合适的反向末端重复序列(ITR)。ITR可以是来自与AAV病毒体中存在的衣壳相同的血清型或与衣壳不同的血清型的AAV ITR(例如，可以与具有AAV9衣壳或AAVrh74衣壳的AAV病毒体一起使用AAV2 ITR)。在每种情况下，衣壳的血清型决定了应用于病毒体的名称。ITR通常是载体基因组的最5’和最3’的元件。按5’至3’的顺序，载体基因组通常还将含有启动子、转基因、3’非翻译区(UTR)序列(例如，WPRE元件)和多腺苷酸化序列。在变型中，载体基因组包括增强子元件(通常，启动子的5’)和/或外显子(通常，启动子的3’)。在变型中，本公开的载体基因组编码用作基因编辑系统中的修复模板的部分或完整转基因序列。在这样的变型中，载体基因组可以包含外源启动子，或者基因编辑系统可以将转基因插入到基因组中具有内源启动子如心脏或肌细胞特异性启动子的基因座中。
在一些实施方案中，5′ITR包含与SEQ ID NO:20至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，5′ITR包含与SEQ ID NO:21至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，5′ITR包含与SEQ ID NO:22)至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，5′ITR包含与SEQ ID NO:23至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，3′ITR包含与SEQ ID NO:24至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，3′ITR包含与SEQ ID NO:25至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，3′ITR包含与SEQ ID NO:26至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，载体基因组包含一个或多个填充序列，例如与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的填充序列。
在一些实施方案中，编码PKP2蛋白或其功能变体的多核苷酸序列可操作地连接至启动子。在某些实施方案中，启动子为MHCK7启动子。在某些实施方案中，启动子为TNNT2启动子。
本公开涵盖各种启动子的使用。可用于本公开的实施方案中的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子或由CMV增强子及鸡β-肌动蛋白启动子和兔β-球蛋白基因的部分组成的启动子序列(CAG)。在一些情况下，启动子可以是合成启动子。示例性的合成启动子由Schlabach等人,PNAS USA.107(6):2538–43(2010)提供。在一些实施方案中，启动子包含与SEQ ID NO:30至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码PKP2蛋白或其功能变体的多核苷酸序列可操作地连接至诱导型启动子。诱导型启动子可以配置为响应于试剂的添加或积累或者响应于试剂的去除、降解或稀释而使多核苷酸序列转录表达或不转录表达。试剂可以是药物。试剂可以是四环素或其衍生物之一，包括但不限于强力霉素。在一些情况下，诱导型启动子为tet-on启动子、tet-off启动子、化学调节的启动子、物理调节的启动子(即，响应于光的存在或不存在或响应于低温或高温的启动子)。诱导型启动子包括重金属离子诱导型启动子(如小鼠乳房肿瘤病毒(mMTV)启动子或各种生长激素启动子)，以及来自在T7 RNA聚合酶的存在下具有活性的T7噬菌体的启动子。该诱导型启动子列表是非限制性的。
在一些情况下，启动子为组织特异性启动子，如能够在心脏细胞中比在非心脏细胞中更大程度地驱动表达的启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子选自任何各种心脏细胞特异性启动子，包括但不限于肌间线蛋白(Des)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)、肌球蛋白轻链2(MLC-2)、心肌肌钙蛋白C(cTnC)、心肌肌钙蛋白T(hTNNT2)、肌肉肌酸激酶(CK)及其启动子/增强子区域的组合，如MHCK7。在一些情况下，启动子为泛在启动子。“泛在启动子”是指在实验或临床条件下不具有组织特异性的启动子。在一些情况下，泛在启动子为巨细胞病毒(CMV)、巨细胞病毒早期增强子元件鸡β-肌动蛋白基因内含子与兔β-球蛋白基因(CAG)的剪接受体、泛素C(UBC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、真核翻译伸长因子1α1(EF1-α)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、猿猴病毒40(SV40)、乙型肝炎病毒(HBV)、鸡β-肌动蛋白和人β-肌动蛋白启动子中的任何一种。
在一些实施方案中，启动子序列选自表3。在一些实施方案中，启动子包含与SEQID NO:31-51中的任何一个至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:31-51中的任何一个的多核苷酸序列的片段，例如，包含SEQ ID NO:31-51中的任何一个的至少25％、至少50％、至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的片段。
表3
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在某些实施方案中，载体基因组包含与SEQ ID NO:31至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在某些实施方案中，载体基因组包含与SEQ ID NO:32至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。在某些实施方案中，载体基因组包含与SEQ ID NO:33至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
启动子的其他示意性实例有来自猿猴病毒40的SV40后期启动子、杆状病毒多面体增强子/启动子元件、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV tk)、来自巨细胞病毒(CMV)的立即早期启动子和包括LTR元件的各种逆转录病毒启动子。多种其他启动子是本领域已知并通常可获得的，并且许多这样的启动子的序列可在序列数据库如GenBank数据库中获得。
在一些情况下，本公开的载体还包含一种或多种选自以下的调控元件：增强子、内含子、poly-A信号、2A肽编码序列、WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)和HPRE(乙型肝炎转录后调控元件)。
在一些实施方案中，载体包含CMV增强子。
在某些实施方案中，载体包含一种或多种增强子。在特定的实施方案中，增强子为CMV增强子序列、GAPDH增强子序列、β-肌动蛋白增强子序列或EF1-α增强子序列。前述序列是本领域已知的。例如，CMV立即早期(IE)增强子的序列为SEQ ID NO:50。
在某些实施方案中，载体包含一种或多种内含子。在特定的实施方案中，内含子为兔球蛋白内含子序列、鸡β-肌动蛋白内含子序列、合成内含子序列、SV40内含子或EF1-α内含子序列。
在某些实施方案中，载体包含polyA序列。在特定的实施方案中，polyA序列为兔球蛋白polyA序列、人生长激素polyA序列、牛生长激素polyA序列、PGK polyA序列、SV40polyA序列或TK polyA序列。在一些实施方案中，poly-A信号可以是牛生长激素多腺苷酸化信号(bGHpA)。
在某些实施方案中，载体包含一种或多种转录物稳定元件。在特定的实施方案中，转录物稳定元件为WPRE序列、HPRE序列、支架附着区、3'UTR或5'UTR。在特定的实施方案中，载体包含5'UTR和3'UTR两者。
在一些实施方案中，载体包含选自表4的5’非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，载体基因组包含与SEQ ID NO 51-61中的任何一个至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
表4
Figure BDA0004113525680000311
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在一些实施方案中，载体包含选自表5的3'非翻译区。在一些实施方案中，载体基因组包含与SEQ ID NO 62-70中的任何一个至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
表5
Figure BDA0004113525680000372
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Figure BDA0004113525680000421
在一些实施方案中，载体包含选自表6的多腺苷酸化(polyA)信号。在一些实施方案中，polyA信号包含与SEQ ID NO 71-75中的任何一个至少75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。
表6
Figure BDA0004113525680000422
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Figure BDA0004113525680000431
示意性的载体基因组在图1-4和11-14中描绘；并作为SEQ ID NO:12-15和89-92提供。每个序列的表达盒为SEQ ID NO:8-11或93-96。在一些实施方案中，载体基因组包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:12-15和89-92中的任何一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列，任选地具有或不具有ITR序列。在一些实施方案中，载体基因组包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:8-11和93-96中的任何一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；MHCK7启动子；PKPa转基因；WPRE(x)元件；pAGH-HS序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:3、6和87中的任何一个；SEQ ID NO:63；和SEQ ID NO:75；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2a转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；hTnnT2启动子；PKPa转基因；WPRE(x)元件；pAGH-HS序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:32或33；SEQ ID NO:3、6和87中的任何一个；SEQ ID NO:63；和SEQID NO:75；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2a转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；MHCK7启动子；PKPb转基因；WPRE(x)元件；pAGH-HS序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:4、7和88中的任何一个；SEQ ID NO:63；和SEQ ID NO:75；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2b转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；hTnnT2启动子；PKPb转基因；WPRE(x)元件；pAGH-HS序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:32或33；SEQ ID NO:4、7和88中的任何一个；SEQ ID NO:63；和SEQID NO:75；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2b转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；MHCK7启动子；PKPa转基因；任选地WPRE元件；多腺苷酸化序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:3、6和87中的任何一个；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2a转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；hTnnT2启动子；PKPa转基因；任选地WPRE元件；多腺苷酸化序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:32或33；SEQ ID NO:3、6和87中的任何一个；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2a转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；MHCK7启动子；PKPb转基因；任选地WPRE元件；多腺苷酸化序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:4、7和88中的任何一个；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2b转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；hTnnT2启动子；PKPb转基因；任选地WPRE元件；多腺苷酸化序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:32或33；SEQ ID NO:4、7和88中的任何一个；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2b转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；MHCK7启动子；SV40内含子；PKPa转基因；任选地WPRE元件；多腺苷酸化序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:53或61；SEQ ID NO:3、6和87中的任何一个；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2a转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；hTnnT2启动子；SV40内含子；PKPa转基因；任选地WPRE元件；多腺苷酸化序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:32或33；SEQ ID NO:53或61；SEQ ID NO:3、6和87中的任何一个；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2a转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；MHCK7启动子；SV40内含子；PKPb转基因；任选地WPRE元件；多腺苷酸化序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:53或61；SEQ ID NO:4、7和88中的任何一个；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2b转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在某个实施方案中，按5’至3’的顺序，载体基因组包含：5′ITR；hTnnT2启动子；SV40内含子；PKPb转基因；任选地WPRE元件；多腺苷酸化序列；和3′ITR。按5’至3’的顺序，载体基因组可以包含：多核苷酸序列SEQ ID NO:32或33；SEQ ID NO:53或61；SEQ ID NO:4、7和88中的任何一个；或与前述各者具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。在某些实施方案中，将该载体基因组包装在AAV9或AAVrh74载体中。本实施方案的PKP2b转基因为全长转基因，即编码至少800个或至少830个氨基酸的PKP的转基因。
在每种情况下，任选地WPRE元件可以存在或不存在。
腺相关病毒载体
可使用包括基于腺病毒和无辅助系统的各种系统将可用于本发明的实践中的AAV载体包装成AAV病毒体(病毒颗粒)。AAV生物学中的标准方法包括Kwon和Schaffer.PharmRes.(2008)25(3):489-99；Wu等人,Mol.Ther.(2006)14(3):316-27；Burger等人,Mol.Ther.(2004)10(2):302-17；Grimm等人,Curr Gene Ther.(2003)3(4):281-304；DeyleDR,Russell DW.Curr Opin Mol Ther.(2009)11(4):442-447；McCarty等人,Gene Ther.(2001)8(16):1248-54；和Duan等人,Mol Ther.(2001)4(4):383-91中描述的那些。无辅助系统包括US 6,004,797、US 7,588,772和US 7,094,604中描述的那些；
rAAV基因组中的AAV DNA可以来自可衍生出重组病毒的任何AAV变体或血清型，包括但不限于AAV变体或血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAVrh10。假型rAAV的生产在例如WO 01/83692中有公开。还涵盖其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic等人,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)。各种AAV血清型的基因组的核苷酸序列是本领域已知的。
在一些情况下，rAAV包含自互补基因组。如本文所定义，包含“自互补”或“双链”基因组的rAAV是指已经工程化使得rAAV的编码区配置为形成分子内双链DNA模板的rAAV，如McCarty等人,Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promoter efficient transduction independently of DNA synthesis.GeneTherapy.8(16):1248–54(2001)中所述。本公开涵盖在一些情况下使用包含自互补基因组的rAAV，因为在感染(如转导)时，scAAV的两个互补半部将缔合形成一个准备好立即复制和转录的双链DNA(dsDNA)单元，而不是等待rAAV基因组的第二链的细胞介导合成。应理解，与在rAAV中发现的完全编码容量(4.7-6kb)不同，包含自互补基因组的rAAV只能容纳该量的约一半(≈2.4kb)。
在其他情况下，rAAV载体包含单链基因组。如本文所定义，“单一标准”基因组是指不自互补的基因组。在大多数情况下，非重组AAV具有单链DNA基因组。已经有一些迹象表明，rAAV应当是scAAV以实现细胞的有效转导。然而，本公开涵盖可能具有单链基因组而不是自互补基因组的rAAV载体，应理解rAAV载体的其他遗传修饰可能有益于在靶细胞中获得最佳基因转录。在一些情况下，本公开涉及能够实现向小鼠眼前段的有效基因转移的单链rAAV载体。参见Wang等人,Single stranded adeno-associated virus achievesefficient gene transfer to anterior segment in the mouse eye.PLoS ONE 12(8):e0182473(2017)。
在一些情况下，rAAV载体具有血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVrh10或AAVrh74。假型rAAV的生产在例如WO 01/83692中有公开。还涵盖其他类型的rAAV变体，例如具有衣壳突变的rAAV。参见例如Marsic等人,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)。在一些情况下，rAAV载体具有血清型AAV9。在一些实施方案中，所述rAAV载体具有血清型AAV9并包含单链基因组。在一些实施方案中，所述rAAV载体具有血清型AAV9并包含自互补基因组。在一些实施方案中，rAAV载体包含AAV2的反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，rAAV载体包含AAV2基因组，使得rAAV载体为AAV-2/9载体、AAV-2/6载体或AAV-2/8载体。
大多数已知的AAV的衣壳基因的全长序列和序列在美国专利号8,524,446中提供，该专利整体并入本文。
AAV载体可以包含野生型AAV序列，或者它们可以包含对野生型AAV序列的一个或多个修饰。在某些实施方案中，AAV载体在衣壳蛋白任选地VP1、VP2和/或VP3内包含一个或多个氨基酸修饰，任选地取代、缺失或插入。在特定的实施方案中，在向受试者提供AAV载体时，修饰提供了降低的免疫原性。
可以修饰rAAV的衣壳蛋白使得rAAV靶向特定的目的靶组织如内皮细胞或更特别地内皮尖端细胞。在一些实施方案中，rAAV被直接注射到受试者的脑室内空间中。
在一些实施方案中，rAAV病毒体为AAV2 rAAV病毒体。衣壳可以是AAV2衣壳或其功能变体。在一些实施方案中，AAV2衣壳与参考AAV2衣壳例如SEQ ID NO:76具有至少98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，rAAV病毒体为AAV9 rAAV病毒体。衣壳可以是AAV9衣壳或其功能变体。在一些实施方案中，AAV9衣壳与参考AAV9衣壳例如SEQ ID NO:77具有至少98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，rAAV病毒体为AAV6 rAAV病毒体。衣壳可以是AAV9衣壳或其功能变体。在一些实施方案中，AAV6衣壳与参考AAV6衣壳例如SEQ ID NO:78具有至少98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，rAAV病毒体为AAVrh.10rAAV病毒体。衣壳可以是AAV9衣壳或其功能变体。在一些实施方案中，AAVrh.10衣壳与参考AAVrh.10衣壳例如SEQ ID NO:79具有至少98％、99％或100％的同一性。
在一些实施方案中，衣壳蛋白由在质粒上以反式供给到转移质粒的多核苷酸编码。野生型AAVrh74 cap的多核苷酸序列为如SEQ ID NO:80所提供。
本公开还提供了AAVrh74 VP1、VP2和VP3的蛋白质序列，包括SEQ ID NO:81-83，以及其同源物或功能变体。
在某些情况下，AAVrh74衣壳包含SEQ ID NO:81中阐述的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV载体包含多肽，所述多肽包含例如与SEQ ID NO:81中阐述的AAVrh74 VP1的氨基酸序列至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更通常90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多地相同的序列，或基本上由这样的序列组成，或还进一步由这样的序列组成。在一些实施方案中，rAAV载体包含多肽，所述多肽包含例如与SEQ ID NO:82中阐述的AAVrh74 VP2的氨基酸序列至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更通常90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多地相同的序列，或基本上由这样的序列组成，或还进一步由这样的序列组成。在一些实施方案中，rAAV载体包含多肽，所述多肽包含例如与SEQ ID NO:83中阐述的AAVrh74 VP3的氨基酸序列至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％、更通常90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多地相同的序列，或基本上由这样的序列组成，或还进一步由这样的序列组成。
在一些实施方案中，rAAV病毒体为AAV-PHP.B rAAV病毒体或其神经营养变体，如但不限于在国际专利公开号WO 2015/038958 A1和WO 2017/100671A1中公开的那些。例如，AAV衣壳可以包含来自序列TLAVPFK(SEQ ID NO:85)或KFPVALT(SEQ ID NO:86)的至少4个连续氨基酸，例如插入在编码AAV9的氨基酸588和589的序列之间。
衣壳可以是AAV-PHP.B衣壳或其功能变体。在一些实施方案中，AAV-PHP.B衣壳与参考AAV-PHP.B衣壳例如SEQ ID NO:84具有至少98％、99％或100％的同一性。
本公开的rAAV病毒体中使用的更多AAV衣壳包括在专利公开号WO 2009/012176A2和WO 2015/168666A2中公开的那些。
不受理论的束缚，本发明人已确定AAV9载体、AAVrh.74或AAVrh.10载体将在载体上赋予期望的心脏趋向性。不受理论的束缚，本发明人还已确定AAV9载体、AAVrh.74或AAVrh.10载体可以向心脏细胞提供所需的特异性。
在一个方面，本公开提供了包含本公开的rAAV病毒体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
就施用的目的而言，任选地通过注射，可以采用各种溶液，如无菌水溶液。如果需要，可对这样的水溶液进行缓冲，并且首先用盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。rAAV呈游离酸(DNA含有酸性磷酸酯基团)或药理学上可接受的盐的溶液可在与表面活性剂如泊洛沙姆188例如以0.001％或0.01％适当混合的水中制备。rAAV的分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备。在一般的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。就此而言，所采用的无菌水性介质均可通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。
适合于可注射使用的药物形式包括但不限于无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式都是无菌的并且必须是流体的至存在易于注射性的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油。适当的流动性可例如通过使用涂料如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液可以通过将rAAV以所需的量与上文列举的各种其他成分一起并入在适宜的溶剂中来制备，如果需要，随后进行过滤灭菌。通常，通过将灭菌的活性成分并入到无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基础的分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，某些制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分外加来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分的粉末。
在另一个方面，本公开包括试剂盒，所述试剂盒包括本公开的rAAV病毒体和使用说明书。
在一个方面，本公开提供了一种增加细胞中的PKP2活性的方法，其包括使细胞与本公开的rAAV接触。在另一个方面，本公开提供了一种增加受试者中的PKP2活性的方法，其包括向受试者施用本公开的rAAV。在一些实施方案中，细胞和/或受试者缺乏PKP2信使RNA或PKP2蛋白表达水平和/或活性和/或在PKP2中包含功能丧失突变。细胞可以是心脏细胞，例如心肌细胞。在一个特定的实施方案中，受试者为哺乳动物，例如人类。
在一些实施方案中，所述方法促进细胞培养物中和/或体内心脏细胞例如心肌细胞的存活。在一些实施方案中，所述方法促进和/或恢复心脏的功能。
在另一个方面，本公开提供了一种在有此需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开的rAAV病毒体。在一些实施方案中，疾病或病症为心脏疾病或病症。示意性的心脏病症包括心力衰竭、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、Brugada综合征(BrS)和特发性心室颤动。在某些实施方案中，受试者罹患致心律失常性右心室心肌病(ARVC)或处于其风险中。在特定的实施方案中，受试者为在PKP2基因中具有功能丧失突变的哺乳动物，例如人。在特定的方法中，用rAAV病毒体的治疗导致受试者中由rAAV病毒体编码的PKP2蛋白的表达，例如在受试者的心脏或心脏组织中。在某些实施方案中，用rAAV病毒体的治疗导致在受试者的心脏中可检测到至少两倍、至少五倍、至少十倍或更多倍的PKP2蛋白水平。
AAV介导的PKP2蛋白向心脏的递送可以延长寿命，预防或减弱心脏细胞变性、心力衰竭、瘢痕形成、射血分数降低、心律失常、心绞痛、运动不耐受、心绞痛(胸痛)、心脏性猝死、劳力性肌痛和痉挛。通过使用病理心电图、心脏MRI、心脏活检、阵发性室性心律失常的减少、心脏性猝死的减少和/或右心室心肌中纤维脂肪沉积的进一步发展的减少和/或缺乏检测到，AAV介导的PKP2蛋白向心脏的递送可以显示出从正常病程的改善或防止。本公开的方法可以防止右心室射血分数(RVEF)的减小、恢复和/或增大。
本文公开的方法可以在心脏中提供有效的生物分布。它们可能导致在所有或大部分心脏细胞例如心肌细胞中的持续表达。值得注意的是，本文公开的方法可以在受试者施用AAV载体后的整个寿命期间提供PKP2蛋白的持久表达。在一些实施方案中，响应于治疗的PKP2蛋白表达持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40年。
本发明还涵盖组合疗法。特别涵盖本发明的方法与标准医学治疗(例如，皮质类固醇或局部减压药物)的组合，以及与新型疗法的组合。在一些情况下，可以用类固醇和/或免疫抑制剂的组合来治疗受试者以防止或减少对施用本文所述rAAV的免疫反应。
在一些实施方案中，AAV载体以每千克(vg)受试者总体重约1×1012至5×1014个AAV载体的载体基因组(vg)或约1×1012至6×1014个vg的剂量(vg/kg)施用。在一些实施方案中，AAV载体以约1×1013至5×1014vg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，AAV载体以约5×1013至3×1014vg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，AAV载体以约5×1013至1×1014vg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，AAV载体以小于约1×1012vg/kg、小于约3×1012vg/kg、小于约5×1012vg/kg、小于约7×1012vg/kg、小于约1×1013vg/kg、小于约3×1013vg/kg、小于约5×1013vg/kg、小于约7×1013vg/kg、小于约1×1014vg/kg、小于约3×1014vg/kg、小于约5×1014vg/kg、小于约7×1014vg/kg、小于约1×1015vg/kg、小于约3×1015vg/kg、小于约5×1015vg/kg、或小于约7×1015vg/kg的剂量施用。在某些实施方案中，以这些剂量中的任何一个递送的AAV载体为AAV9载体或AAV rh74载体。在某些情况下，使用比AAV9载体的剂量高的剂量的AAV rh74载体可能是有利的。
在一些实施方案中，AAV载体以约1×1012vg/kg、约3×1012vg/kg、约5×1012vg/kg、约7×1012vg/kg、约1×1013vg/kg、约3×1013vg/kg、约5×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、约5×1014vg/kg、约7×1014vg/kg、约1×1015vg/kg、约3×1015vg/kg、约5×1015vg/kg、或约7×1015vg/kg的剂量施用。在某些实施方案中，以这些剂量中的任何一个递送的AAV载体为AAV9载体或AAV rh74载体。
在一些实施方案中，AAV载体以1×1012vg/kg、3×1012vg/kg、5×1012vg/kg、7×1012vg/kg、1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、5×1013vg/kg、7×1013vg/kg、1×1014vg/kg、3×1014vg/kg、5×1014vg/kg、7×1014vg/kg、1×1015vg/kg、3×1015vg/kg、5×1015vg/kg、或7×1015vg/kg的剂量施用。在某些实施方案中，以这些剂量中的任何一个递送的AAV载体为AAV9载体或AAV rh74载体。
在一些实施方案中，AAV载体以每千克(vg)受试者总体重约1×1012至5×1014个AAV载体的载体基因组(vg)的剂量(vg/kg)全身施用。在一些实施方案中，AAV载体以约1×1013至5×1014vg/kg的剂量全身施用。在一些实施方案中，AAV载体以约5×1013至3×1014vg/kg的剂量全身施用。在一些实施方案中，AAV载体以约5×1013至1×1014vg/kg的剂量全身施用。在一些实施方案中，AAV载体以小于约1×1012vg/kg、小于约3×1012vg/kg、小于约5×1012vg/kg、小于约7×1012vg/kg、小于约1×1013vg/kg、小于约3×1013vg/kg、小于约5×1013vg/kg、小于约7×1013vg/kg、小于约1×1014vg/kg、小于约3×1014vg/kg、小于约5×1014vg/kg、小于约7×1014vg/kg、小于约1×1015vg/kg、小于约3×1015vg/kg、小于约5×1015vg/kg、或小于约7×1015vg/kg的剂量全身施用。在某些实施方案中，以这些剂量中的任何一个递送的AAV载体为AAV9载体或AAV rh74载体。
在一些实施方案中，AAV载体以约1×1012vg/kg、约3×1012vg/kg、约5×1012vg/kg、约7×1012vg/kg、约1×1013vg/kg、约3×1013vg/kg、约5×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、约5×1014vg/kg、约7×1014vg/kg、约1×1015vg/kg、约3×1015vg/kg、约5×1015vg/kg、或约7×1015vg/kg的剂量全身施用。在某些实施方案中，以这些剂量中的任何一个递送的AAV载体为AAV9载体或AAV rh74载体。
在一些实施方案中，AAV载体以1×1012vg/kg、3×1012vg/kg、5×1012vg/kg、7×1012vg/kg、1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、5×1013vg/kg、7×1013vg/kg、1×1014vg/kg、3×1014vg/kg、5×1014vg/kg、7×1014vg/kg、1×1015vg/kg、3×1015vg/kg、5×1015vg/kg、或7×1015vg/kg的剂量全身施用。在某些实施方案中，以这些剂量中的任何一个递送的AAV载体为AAV9载体或AAV rh74载体。
在一些实施方案中，AAV载体以每千克(vg)受试者总体重约1×1012至5×1014个AAV载体的载体基因组(vg)的剂量(vg/kg)静脉内施用。在一些实施方案中，AAV载体以约1×1013至5×1014vg/kg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，AAV载体以约5×1013至3×1014vg/kg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，AAV载体以约5×1013至1×1014vg/kg的剂量静脉内施用。在一些实施方案中，AAV载体以小于约1×1012vg/kg、小于约3×1012vg/kg、小于约5×1012vg/kg、小于约7×1012vg/kg、小于约1×1013vg/kg、小于约3×1013vg/kg、小于约5×1013vg/kg、小于约7×1013vg/kg、小于约1×1014vg/kg、小于约3×1014vg/kg、小于约5×1014vg/kg、小于约7×1014vg/kg、小于约1×1015vg/kg、小于约3×1015vg/kg、小于约5×1015vg/kg、或小于约7×1015vg/kg的剂量静脉内施用。在某些实施方案中，以这些剂量中的任何一个递送的AAV载体为AAV9载体或AAV rh74载体。
在一些实施方案中，AAV载体以约1×1012vg/kg、约3×1012vg/kg、约5×1012vg/kg、约7×1012vg/kg、约1×1013vg/kg、约3×1013vg/kg、约5×1013vg/kg、约7×1013vg/kg、约1×1014vg/kg、约3×1014vg/kg、约5×1014vg/kg、约7×1014vg/kg、约1×1015vg/kg、约3×1015vg/kg、约5×1015vg/kg、或约7×1015vg/kg的剂量静脉内施用。
在一些实施方案中，AAV载体以1×1012vg/kg、3×1012vg/kg、5×1012vg/kg、7×1012vg/kg、1×1013vg/kg、3×1013vg/kg、5×1013vg/kg、7×1013vg/kg、1×1014vg/kg、3×1014vg/kg、5×1014vg/kg、7×1014vg/kg、1×1015vg/kg、3×1015vg/kg、5×1015vg/kg、或7×1015vg/kg的剂量静脉内施用。在某些实施方案中，以这些剂量中的任何一个递送的AAV载体为AAV9载体或AAV rh74载体。
纽约心脏协会功能分级(NYHA分级)的变化、病理心电图、心脏MRI、心脏活检、阵发性室性心律失常的减少、心脏性猝死的减少和/或右心室心肌中纤维脂肪沉积的进一步发展的减少和/或缺乏可能揭示患者功能改善、临床获益或疗效的证据。可以在通常与致心律失常性右心室心肌病相关联的心电图特征如T波倒置、S-波升支延长、局部QRS变宽和/或阵发性室性心动过速发作中观察到获益。
在一些实施方案中，与在患有与PKP2中的功能丧失相关或由所述功能丧失引起的疾病或病症或者处于其风险中的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少左心室射血分数百分比(LVEF％)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与在患有与PKP2中的功能丧失相关或由所述功能丧失引起的疾病或病症或者处于其风险下的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少左心室缩短分数百分比(FS％)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与在患有与PKP2中的功能丧失相关或由所述功能丧失引起的疾病或病症或者处于其风险下的未经治疗的受试者中观察到的增加相比，所述方法防止或减少以平方毫米为单位的右心室面积(RV面积(mm2)的增加，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与在患有与PKP2中的功能丧失相关或由所述功能丧失引起的疾病或病症或者处于其风险中的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少以毫米每秒为单位的右心室速度时间积分(RV VTI(mm/sec)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
在一些实施方案中，与在患有与PKP2中的功能丧失相关或由所述功能丧失引起的疾病或病症或者处于其风险下的未经治疗的受试者中观察到的增加相比，所述方法防止或减少左心室或右心室纤维化的增加，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
可以通过本领域的标准途径施用有效剂量的组合物，包括但不限于全身、局部、直接注射、静脉内、心内施用。在一些情况下，施用包括全身、局部、直接注射、静脉内、心内注射。施用可以通过心导管插入术进行。
在一些实施方案中，本公开提供了有效剂量的rAAV和本发明组合物的局部施用和全身施用。例如，全身施用可以是施用到循环系统中，从而影响整个身体。全身施用包括通过注射、输注或植入进行肠胃外施用。本文公开的组合物的施用途径包括静脉内(“IV”)施用、腹膜内(“IP”)施用、肌肉内(“IM”)施用、病灶内施用或皮下(“SC”)施用，或缓慢释放装置例如微型渗透泵、储库制剂等的植入。在一些实施方案中，本公开的方法包括通过静脉内、肌肉内、动脉内、肾内、尿道内、心内、冠状动脉内、心肌内、真皮内、硬膜外、皮下、腹膜内、心室内、离子电渗疗法或颅内施用来施用本公开的AAV载体或其药物组合物。
特别地，本发明的rAAV的施用可以通过使用将rAAV重组载体输送到动物靶组织中的任何物理方法来实现。施用包括但不限于注射到心脏中。
在一些实施方案中，本公开的方法包括心内递送。可以使用专用套管、导管、注射器/针头、使用输注泵进行输注。施用可以包括向心脏递送有效量的rAAV病毒体或包含rAAV病毒体的药物组合物。这些可以例如经由静脉内、肌肉内、动脉内、肾内、尿道内、心内、冠状动脉内、心肌内、真皮内、硬膜外、皮下、腹膜内、心室内、离子电渗疗法或颅内施用来实现。本公开的组合物还可以静脉内施用。
本文公开的治疗方法可以减少和/或预防一种或多种症状，包括但不限于心室肥大、室性心动过速、运动不耐受、心绞痛和RVEF的降低。
实施例
实施例1：临床前生物活性和功效
测试图1-4中示意的载体。使用培养的心肌细胞(例如，诱导的多能干细胞心肌细胞iPSC-CM)或适合于用这些构建体转染或转导的其他细胞在体外测试AAV载体或相应的表达盒。通过免疫荧光法和蛋白质印迹法来评估PKP2的表达。采用患者iPSC衍生的心肌细胞进行的基于细胞的研究将通过与增加的PKP2密度相关联的脂肪形成潜力的降低(例如，较少的脂质积累)、上调或异常过氧化物酶体增殖物-激活受体γ激活的减少，揭示PKP2转基因的过表达(在AAV载体转导和/或用载体质粒转染之后)的益处。
使用心肌病的突变小鼠模型(例如，PKP2-cKO等)在体内测试选定的载体。使用心肌细胞特异性、他莫昔芬激活的PKP2敲除鼠系(称为“PKP2-cKO”)可以揭示AAV介导的PKP2过表达的益处的证据。该小鼠模型允许控制PKP2表达缺失的发生，将PKP2的缺失限制于成体肌细胞，并引发导致致心律失常性心肌病的分子和功能事件的进展，其中右心室在该小鼠中占主导地位。还可以利用导致类似病理学过程的其他小鼠模型来揭示AAV介导的PKP2在心肌细胞中过表达的益处。AAV介导的PKP2过表达的益处将通过存活率的增加、在左心室和/或右心室的超声心动图上观察到的心肌病的正常进展的缓解(例如，与PKP cKO制剂缓冲液对照动物相比，更大的左心室射血分数、更大的左心室缩短分数和更大的右心室速度时间间隔)来证明。
AAV介导的PKP2蛋白递送的功能益处的电生理学证据通过受影响的心肌细胞中疾病相关的钙动力学紊乱的缓解来证实，最显著的是L-型钙电流、肌浆网钙渗漏、舒张期钙渗漏的测量值，以及受影响的(例如，PKP2缺陷)心肌细胞中钙瞬变的标准测量值，如达到峰值振幅的时间和弛豫时间常数。组织学分析将通过心脏的各个区域(包括心室)中疾病相关胶原沉积(例如，经由三色染色法)与cKO制剂缓冲液注射对照相比减少的出现，来揭示AAV介导的PKP2过表达的益处。还将通过评价钙信号传导通路中涉及的心肌细胞心室蛋白来揭示另外的益处，其通过相对于非AAV-PKP2治疗的PKP2-cKO患病对照而言Casq2、和/或Trdn、和/或Cav 1.2、和/或AnkB和/或RyR2增加的(即，标准化的)相对水平来度量。
实施例2：腺相关病毒载体的体外测试
制备本文描述的AAV载体(参见图11-12)并用于转导分化的AC16细胞，一种人心肌细胞细胞系。通过蛋白质印迹法评估PKP2(PKP2a同种型)的表达水平(图5A-5B)。令人惊奇的是，MHCK7启动子在心肌细胞中引起PKP2的强劲表达，而hTnnT2启动子(“hTnT”)在当前的测试条件下产生高于背景的边际PKP2水平。与AAV9血清型载体相比，AAVrh.74血清型诱导了较高的PKP2的表达。
基于这些结果，我们得出结论，AAV9载体或AAVrh74载体可有效地用于在心肌细胞中表达PKP2，并且当仅评价PKP2表达的相对水平时，MHCK7启动子优于hTnnT2启动子。
实施例3：腺相关病毒载体的体内功效
获得如Cerrone等人,Nat Comm.,2017中所述的PKP2-缺陷的“PKP2-cKO”小鼠模型。采用这种心肌细胞特异性、他莫昔芬激活的PKP2敲除鼠系(αMHC-Cre-ER(T2)/Pkp2 fl/fl；称为“PKP2-cKO”)来控制PKP2表达缺失的发生(参见Cerrone等人.,Nat Comm,2017)。该小鼠模型中PKP2表达的条件性缺失仅限于成体肌细胞并且已经确立了PKP2-cKO导致的分子、结构和功能事件的时间进展(Cerrone等人,Nat Comm,2017)。成体心室肌细胞中的PKP2缺陷足以引起以RV为主的致心律失常性心肌病，其包括与ARVC的疾病表型一致的“标志性”功能、分子和结构指标。
PKP2-Cko小鼠被注射他莫昔芬，导致PKP2的肌细胞特异性敲除。通过静脉内(尾静脉)注射以3×1013vg/kg向小鼠注射AAV载体(如下所述)。四个星期后，通过用他莫昔芬处理小鼠来诱导PKP2的肌细胞特异性敲除。所使用的载体基因组为：
5′ITR；MHCK7启动子(及其增强子元件)；SV40内含子；Kozak序列；PKPa转基因；WPRE(x)；hGH多腺苷酸化序列)；3′ITR–在图11中示出
5′ITR；hTnnT2启动子(及外显子1)；Kozak序列；PKPa转基因；WPRE(x)；hGH多腺苷酸化序列)；3′ITR–在图12中示出。
在AAV9血清型或AAVrh74血清型载体中测试每种载体基因组。
在他莫昔芬治疗后21天或28天，即在AAV治疗后25周或32周，基本上如Cerrone等人,Nat Comm,2017中所述或使用本领域已知的标准方法评价小鼠的各种生理学参数。通过左心室射血分数百分比(LVEF％)(图6A-6D)、左心室缩短分数百分比(FS％)(图7A-7D)、以平方毫米为单位的右心室面积(RV面积(mm2))(图8A-8D)、以毫米每秒为单位的右心室速度时间积分(RV VTI(mm/sec))(图9A-9D)和纤维化程度(图10A-10B)来评估治疗疾病的功效。这些测量值是评价心肌细胞中AAV介导的PKP2过表达的潜在功效的适宜功能和形态学指标，因为它们是指示人类疾病中ARVC的关键参数。一般来说，右心室通常具有略高的纤维化量(不分疾病)；在cKO模型中，由于缺乏PKP2，这种情况进一步加剧。在他莫昔芬注射后21天内观察到这些参数的进行性恶化，因为他莫昔芬注射导致PKP基因的肌细胞特异性敲除。
在AAV9-和AAVrh.74-介导的PKP表达后不同程度地观察到疾病表型的缓解的证据。使用处理前范式(他莫昔芬诱导的PKP cKO之前4周的AAV)，用迄今为止研究的剂量(3×1013vg/kg)，AAV9出人意料地对所有参数产生了最强劲的影响。然而，考虑到AAVrh74的心脏向性，并考虑到在该模型中观察到AAVrh.74-介导的PKP2过表达的生物学效应(例如，LVEF％、FS％和右心室面积)，优化AAVrh.74的剂量与适宜的启动子(即，MHCK7或hTnnT2)相结合可使得该载体具有强劲的治疗潜力。
这些结果证实，AAV9和AAVrh.74都可用于治疗PKP2-相关疾病，如致心律失常性右心室心肌病(ARVC)[也称为致心律失常性右心室发育不良(ARVD)或致心律失常性心肌病(ACM)]，对于这些疾病，PKP-cKO小鼠被认为是适宜的模型。另外，已经证实具有MHCK7启动子或hTnnT2启动子的载体可有效于治疗PKP2-相关疾病。
序列表
<110> 太空飞船七有限责任公司（Spacecraft Seven, LLC）
<120> 使用AAV载体的PLAKOPHILIN-2 (PKP2)基因疗法
<130> ROPA-021/01WO 329592-2263
<150> US 63/063,032
<151> 2020-08-07
<160> 96
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 837
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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cagcagaccc tcgcccggaa gggccgcagc tccgtgggca acggaaatct tcaccgaacc 240
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<220>
<223> Kozak序列基序
<400> 5
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<210> 6
<211> 2517
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Kozak序列的编码PKP2a的多核苷酸
<400> 6
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aagcttctgc agctcctaaa agttcagaat gaagacgttc agcgagctgt gtgtggggcc 1260
ttgagaaact tagtatttga agacaatgac aacaaattgg aggtggctga actaaatggg 1320
gtacctcggc tgctccaggt gctgaagcaa accagagact tggagactaa aaaacaaata 1380
acaggtttgc tgtggaattt gtcatctaat gacaaactca agaatctcat gataacagaa 1440
gcattgctta cgctgacgga gaatatcatc atcccctttt ctgggtggcc tgaaggagac 1500
tacccaaaag caaatggttt gctcgatttt gacatattct acaacgtcac tggatgccta 1560
agaaacatga gttctgctgg cgctgatggg agaaaagcga tgagaagatg tgacggactc 1620
attgactcac tggtccatta tgtcagagga accattgcag attaccagcc agatgacaag 1680
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ccagagaaat attcccagaa tatctatatt caaaaccgga atatccagac tgacaacaac 1800
aaaagtattg gatgttttgg cagtcgaagc aggaaagtaa aagagcaata ccaggacgtg 1860
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ataaggatgt atctgtcctt gatcgccaaa agtgtccgca actacacaca agaagcatcc 1980
ttaggagctc tgcagaacct cacggccgga agtggaccaa tgccgacatc agtggctcag 2040
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cagaatgaaa ttgccaaaga aactctccct gatttggttt ccatcattcc tgacacagtc 2220
ccgagtactg accttctcat tgaaactaca gcctctgcct gttacacatt gaacaacata 2280
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<211> 2649
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有Kozak序列的编码PKP2b的多核苷酸
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aaggctcagt ttaagaagac agattttgtc aacagccgga ctgccaaagc ctaccactcc 2640
cttaaagac 2649
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<211> 4081
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - MHCK7-PKP2a表达盒
<400> 8
acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc 60
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gcaaatggtt tgctcgattt tgacatattc tacaacgtca ctggatgcct aagaaacatg 2340
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ctggtccatt atgtcagagg aaccattgca gattaccagc cagatgacaa ggccacggag 2460
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c 4081
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<211> 3854
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - hTnT-PKP2a表达盒
<400> 9
ctcagtccat taggagccag tagcctggaa gatgtcttta cccccagcat cagttcaagt 60
ggagcagcac ataactcttg ccctctgcct tccaagattc tggtgctgag acttatggag 120
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ggccaggcgg ccgcaggggg aagtgggaat ctgctcactg agagaagcac tttcactgac 1800
tcccagctgg ggaatgcaga catggagatg actctggagc gagcagtgag tatgctcgag 1860
gcagaccaca tgctgccatc caggatttct gctgcagcta ctttcataca gcacgagtgc 1920
ttccagaaat ctgaagctcg gaagagggtt aaccagcttc gtggcatcct caagcttctg 1980
cagctcctaa aagttcagaa tgaagacgtt cagcgagctg tgtgtggggc cttgagaaac 2040
ttagtatttg aagacaatga caacaaattg gaggtggctg aactaaatgg ggtacctcgg 2100
ctgctccagg tgctgaagca aaccagagac ttggagacta aaaaacaaat aacagaccat 2160
acagtcaatt taagaagtag gaatggctgg ccgggcgcgg tggctcacgc ctgtaatccc 2220
agcactttgg gaggccaagg cgggcggatc acgaggtcag gagttcgaga ccagcctgac 2280
caacatggtt tgctgtggaa tttgtcatct aatgacaaac tcaagaatct catgataaca 2340
gaagcattgc ttacgctgac ggagaatatc atcatcccct tttctgggtg gcctgaagga 2400
gactacccaa aagcaaatgg tttgctcgat tttgacatat tctacaacgt cactggatgc 2460
ctaagaaaca tgagttctgc tggcgctgat gggagaaaag cgatgagaag atgtgacgga 2520
ctcattgact cactggtcca ttatgtcaga ggaaccattg cagattacca gccagatgac 2580
aaggccacgg agaattgtgt gtgcattctt cataacctct cctaccagct ggaggcagag 2640
ctcccagaga aatattccca gaatatctat attcaaaacc ggaatatcca gactgacaac 2700
aacaaaagta ttggatgttt tggcagtcga agcaggaaag taaaagagca ataccaggac 2760
gtgccgatgc cggaggaaaa gagcaacccc aagggcgtgg agtggctgtg gcattccatt 2820
gttataagga tgtatctgtc cttgatcgcc aaaagtgtcc gcaactacac acaagaagca 2880
tccttaggag ctctgcagaa cctcacggcc ggaagtggac caatgccgac atcagtggct 2940
cagacagttg tccagaagga aagtggcctg cagcacaccc gaaagatgct gcatgttggt 3000
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gtcccgagta ctgaccttct cattgaaact acagcctctg cctgttacac attgaacaac 3180
ataatccaaa acagttacca gaatgcacgc gaccttctaa acaccggggg catccagaaa 3240
attatggcca ttagtgcagg cgatgcctat gcctccaaca aagcaagtaa agctgcttcc 3300
gtccttctgt attctctgtg ggcacacacg gaactgcatc atgcctacaa gaaggctcag 3360
tttaagaaga cagattttgt caacagccgg actgccaaag cctaccactc ccttaaagac 3420
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tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 3600
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 3660
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 3720
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 3780
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 3840
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 3900
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 3960
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tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg 4080
cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc 4140
tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg ggcccaagtt gggaagaaac 4200
ctgtagggcc tgc 4213
<210> 11
<211> 3986
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - hTnT-PKP2b表达盒
<400> 11
ctcagtccat taggagccag tagcctggaa gatgtcttta cccccagcat cagttcaagt 60
ggagcagcac ataactcttg ccctctgcct tccaagattc tggtgctgag acttatggag 120
tgtcttggag gttgccttct gccccccaac cctgctccca gctggccctc ccaggcctgg 180
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tccatcctct gcctcaccca gtccccgctg agactgagca gacgcctcca ggatctgtcg 540
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gctgaagctg gcggggagca gcggccgcgg cggccagaca gtcaagagcc tgcggatcca 720
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tcaccgaacc agcagtgttc ctgagtatgt ctacaaccta cacttggttg aaaatgattt 840
tgttggaggc cgttcccctg ttcctaaaac ctatgacatg ctaaaggctg gcacaactgc 900
cacttatgaa ggtcgctggg gaagaggaac agcacagtac agctcccaga agtccgtgga 960
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ggccttgaga aacttagtat ttgaagacaa tgacaacaaa ttggaggtgg ctgaactaaa 1860
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cgcctgtaat cccagcactt tgggaggcca aggcgggcgg atcacgaggt caggagttcg 2040
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tctcatgata acagaagcat tgcttacgct gacggagaat atcatcatcc ccttttctgg 2160
gtggcctgaa ggagactacc caaaagcaaa tggtttgctc gattttgaca tattctacaa 2220
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gctggaggca gagctcccag agaaatattc ccagaatatc tatattcaaa accggaatat 2460
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gacatcagtg gctcagacag ttgtccagaa ggaaagtggc ctgcagcaca cccgaaagat 2760
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cacattgaac aacataatcc aaaacagtta ccagaatgca cgcgaccttc taaacaccgg 3000
gggcatccag aaaattatgg ccattagtgc aggcgatgcc tatgcctcca acaaagcaag 3060
taaagctgct tccgtccttc tgtattctct gtgggcacac acggaactgc atcatgccta 3120
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ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 3300
ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 3360
tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 3420
acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 3480
ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 3540
caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct 3600
ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 3660
tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 3720
ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 3780
cgcactgccc gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt 3840
tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga 3900
ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcccaa 3960
gttgggaaga aacctgtagg gcctgc 3986
<210> 12
<211> 4417
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体基因组的完整多核苷酸序列
<400> 12
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtaac ccttcagatt 180
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tctatctgcc catcggccct ttggggagga ggaatgtgcc caaggactaa aaaaaggcca 300
tggagccaga ggggcgaggg caacagacct ttcatgggca aaccttgggg ccctgctgtc 360
tagcatgccc cactacgggt ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc 420
gagatgcctg gttataatta acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct 480
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ggccatgggg ctgggcaagc tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac 780
gagctgaaag ctcatctgct ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt 840
cacaccctgt aggctcctct atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac 900
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cgcggcggcc agacagtcaa gagcctgcgg atccaggagc aggtgcagca gaccctcgcc 1140
cggaagggcc gcagctccgt gggcaacgga aatcttcacc gaaccagcag tgttcctgag 1200
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aaaacctatg acatgctaaa ggctggcaca actgccactt atgaaggtcg ctggggaaga 1320
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gccgccctcc tagtgccacc gagatatgct cgttccgaga tcgtgggggt cagccgtgct 1560
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ccagggacca gccgcagcat gggcaacctc ttggagaagg agaactacct gacggcaggg 1740
ctcactgtcg ggcaggtcag gccgctggtg cccctgcagc ccgtcactca gaacagggct 1800
tccaggtcct cctggcatca gagctccttc cacagcaccc gcacgctgag ggaagctggg 1860
cccagtgtcg ccgtggattc cagcgggagg agagcgcact tgactgtcgg ccaggcggcc 1920
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gaagctcgga agagggttaa ccagcttcgt ggcatcctca agcttctgca gctcctaaaa 2160
gttcagaatg aagacgttca gcgagctgtg tgtggggcct tgagaaactt agtatttgaa 2220
gacaatgaca acaaattgga ggtggctgaa ctaaatgggg tacctcggct gctccaggtg 2280
ctgaagcaaa ccagagactt ggagactaaa aaacaaataa caggtttgct gtggaatttg 2340
tcatctaatg acaaactcaa gaatctcatg ataacagaag cattgcttac gctgacggag 2400
aatatcatca tccccttttc tgggtggcct gaaggagact acccaaaagc aaatggtttg 2460
ctcgattttg acatattcta caacgtcact ggatgcctaa gaaacatgag ttctgctggc 2520
gctgatggga gaaaagcgat gagaagatgt gacggactca ttgactcact ggtccattat 2580
gtcagaggaa ccattgcaga ttaccagcca gatgacaagg ccacggagaa ttgtgtgtgc 2640
attcttcata acctctccta ccagctggag gcagagctcc cagagaaata ttcccagaat 2700
atctatattc aaaaccggaa tatccagact gacaacaaca aaagtattgg atgttttggc 2760
agtcgaagca ggaaagtaaa agagcaatac caggacgtgc cgatgccgga ggaaaagagc 2820
aaccccaagg gcgtggagtg gctgtggcat tccattgtta taaggatgta tctgtccttg 2880
atcgccaaaa gtgtccgcaa ctacacacaa gaagcatcct taggagctct gcagaacctc 2940
acggccggaa gtggaccaat gccgacatca gtggctcaga cagttgtcca gaaggaaagt 3000
ggcctgcagc acacccgaaa gatgctgcat gttggtgacc caagtgtgaa aaagacagcc 3060
atctcgctgc tgaggaatct gtcccggaat ctttctctgc agaatgaaat tgccaaagaa 3120
actctccctg atttggtttc catcattcct gacacagtcc cgagtactga ccttctcatt 3180
gaaactacag cctctgcctg ttacacattg aacaacataa tccaaaacag ttaccagaat 3240
gcacgcgacc ttctaaacac cgggggcatc cagaaaatta tggccattag tgcaggcgat 3300
gcctatgcct ccaacaaagc aagtaaagct gcttccgtcc ttctgtattc tctgtgggca 3360
cacacggaac tgcatcatgc ctacaagaag gctcagttta agaagacaga ttttgtcaac 3420
agccggactg ccaaagccta ccactccctt aaagactgat caacctctgg attacaaaat 3480
ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc 3540
tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt 3600
gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg 3660
cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg 3720
tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc 3780
cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt 3840
gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct 3900
gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg 3960
cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg 4020
gatctccctt tgggccgcct ccccgcactg cccgggtggc atccctgtga cccctcccca 4080
gtgcctctcc tggccctgga agttgccact ccagtgccca ccagccttgt cctaataaaa 4140
ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tccttctata atattatggg gtggaggggg 4200
gtggtatgga gcaaggggcc caagttggga agaaacctgt agggcctgct acgtagataa 4260
gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 4320
ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 4380
ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 4417
<210> 13
<211> 4190
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体基因组的完整多核苷酸序列
<400> 13
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtact cagtccatta 180
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tgctttatca ggattctcaa gagggacagc tggtttatgt tgcatgactg ttccctgcat 420
atctgctctg gttttaaata gcttatctga gcagctggag gaccacatgg gcttatatgg 480
cgtggggtac atgttcctgt agccttgtcc ctggcacctg ccaaaatagc agccaacacc 540
ccccaccccc accgccatcc ccctgcccca cccgtcccct gtcgcacatt cctccctccg 600
cagggctggc tcaccaggcc ccagcccaca tgcctgctta aagccctctc catcctctgc 660
ctcacccagt ccccgctgag actgagcaga cgcctccagg atctgtcggc aggccaccat 720
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cctgggacaa ctggacagct ccagcctggc gctgccctcc gaggccaagc tgaagctggc 840
ggggagcagc ggccgcggcg gccagacagt caagagcctg cggatccagg agcaggtgca 900
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ggtcagccgt gctggcacca caagcaggca gcgccacttt gacacatacc acagacagta 1380
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cacgtacccc aggccaggga ccagccgcag catgggcaac ctcttggaga aggagaacta 1500
cctgacggca gggctcactg tcgggcaggt caggccgctg gtgcccctgc agcccgtcac 1560
tcagaacagg gcttccaggt cctcctggca tcagagctcc ttccacagca cccgcacgct 1620
gagggaagct gggcccagtg tcgccgtgga ttccagcggg aggagagcgc acttgactgt 1680
cggccaggcg gccgcagggg gaagtgggaa tctgctcact gagagaagca ctttcactga 1740
ctcccagctg gggaatgcag acatggagat gactctggag cgagcagtga gtatgctcga 1800
ggcagaccac atgctgccat ccaggatttc tgctgcagct actttcatac agcacgagtg 1860
cttccagaaa tctgaagctc ggaagagggt taaccagctt cgtggcatcc tcaagcttct 1920
gcagctccta aaagttcaga atgaagacgt tcagcgagct gtgtgtgggg ccttgagaaa 1980
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gctgtggaat ttgtcatcta atgacaaact caagaatctc atgataacag aagcattgct 2160
tacgctgacg gagaatatca tcatcccctt ttctgggtgg cctgaaggag actacccaaa 2220
agcaaatggt ttgctcgatt ttgacatatt ctacaacgtc actggatgcc taagaaacat 2280
gagttctgct ggcgctgatg ggagaaaagc gatgagaaga tgtgacggac tcattgactc 2340
actggtccat tatgtcagag gaaccattgc agattaccag ccagatgaca aggccacgga 2400
gaattgtgtg tgcattcttc ataacctctc ctaccagctg gaggcagagc tcccagagaa 2460
atattcccag aatatctata ttcaaaaccg gaatatccag actgacaaca acaaaagtat 2520
tggatgtttt ggcagtcgaa gcaggaaagt aaaagagcaa taccaggacg tgccgatgcc 2580
ggaggaaaag agcaacccca agggcgtgga gtggctgtgg cattccattg ttataaggat 2640
gtatctgtcc ttgatcgcca aaagtgtccg caactacaca caagaagcat ccttaggagc 2700
tctgcagaac ctcacggccg gaagtggacc aatgccgaca tcagtggctc agacagttgt 2760
ccagaaggaa agtggcctgc agcacacccg aaagatgctg catgttggtg acccaagtgt 2820
gaaaaagaca gccatctcgc tgctgaggaa tctgtcccgg aatctttctc tgcagaatga 2880
aattgccaaa gaaactctcc ctgatttggt ttccatcatt cctgacacag tcccgagtac 2940
tgaccttctc attgaaacta cagcctctgc ctgttacaca ttgaacaaca taatccaaaa 3000
cagttaccag aatgcacgcg accttctaaa caccgggggc atccagaaaa ttatggccat 3060
tagtgcaggc gatgcctatg cctccaacaa agcaagtaaa gctgcttccg tccttctgta 3120
ttctctgtgg gcacacacgg aactgcatca tgcctacaag aaggctcagt ttaagaagac 3180
agattttgtc aacagccgga ctgccaaagc ctaccactcc cttaaagact gatcaacctc 3240
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 3300
tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca 3360
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 3420
tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca 3480
ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg 3540
cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg 3600
acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg 3660
ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg 3720
accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc 3780
ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca ctgcccgggt ggcatccctg 3840
tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct 3900
tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat 3960
ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcccaagttg ggaagaaacc tgtagggcct 4020
gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg 4080
agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg 4140
cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 4190
<210> 14
<211> 4549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体基因组的完整多核苷酸序列
<400> 14
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtaac ccttcagatt 180
aaaaataact gaggtaaggg cctgggtagg ggaggtggtg tgagacgctc ctgtctctcc 240
tctatctgcc catcggccct ttggggagga ggaatgtgcc caaggactaa aaaaaggcca 300
tggagccaga ggggcgaggg caacagacct ttcatgggca aaccttgggg ccctgctgtc 360
tagcatgccc cactacgggt ctaggctgcc catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc 420
gagatgcctg gttataatta acccagacat gtggctgccc cccccccccc aacacctgct 480
gcctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tcccctgcat gcgaagatct tcgaacaagg 540
ctgtggggga ctgagggcag gctgtaacag gcttgggggc cagggcttat acgtgcctgg 600
gactcccaaa gtattactgt tccatgttcc cggcgaaggg ccagctgtcc cccgccagct 660
agactcagca cttagtttag gaaccagtga gcaagtcagc ccttggggca gcccatacaa 720
ggccatgggg ctgggcaagc tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac 780
gagctgaaag ctcatctgct ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt 840
cacaccctgt aggctcctct atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac 900
cacctccaca gcacagacag acactcagga gccagccagg ccaccatggc agcccccggc 960
gccccagctg agtacggcta catccggacc gtcctgggcc agcagatcct gggacaactg 1020
gacagctcca gcctggcgct gccctccgag gccaagctga agctggcggg gagcagcggc 1080
cgcggcggcc agacagtcaa gagcctgcgg atccaggagc aggtgcagca gaccctcgcc 1140
cggaagggcc gcagctccgt gggcaacgga aatcttcacc gaaccagcag tgttcctgag 1200
tatgtctaca acctacactt ggttgaaaat gattttgttg gaggccgttc ccctgttcct 1260
aaaacctatg acatgctaaa ggctggcaca actgccactt atgaaggtcg ctggggaaga 1320
ggaacagcac agtacagctc ccagaagtcc gtggaagaaa ggtccttgag gcatcctctg 1380
aggagactgg agatttctcc tgacagcagc ccggagaggg ctcactacac gcacagcgat 1440
taccagtaca gccagagaag ccaggctggg cacaccctgc accaccaaga aagcaggcgg 1500
gccgccctcc tagtgccacc gagatatgct cgttccgaga tcgtgggggt cagccgtgct 1560
ggcaccacaa gcaggcagcg ccactttgac acataccaca gacagtacca gcatggctct 1620
gttagcgaca ccgtttttga cagcatccct gccaacccgg ccctgctcac gtaccccagg 1680
ccagggacca gccgcagcat gggcaacctc ttggagaagg agaactacct gacggcaggg 1740
ctcactgtcg ggcaggtcag gccgctggtg cccctgcagc ccgtcactca gaacagggct 1800
tccaggtcct cctggcatca gagctccttc cacagcaccc gcacgctgag ggaagctggg 1860
cccagtgtcg ccgtggattc cagcgggagg agagcgcact tgactgtcgg ccaggcggcc 1920
gcagggggaa gtgggaatct gctcactgag agaagcactt tcactgactc ccagctgggg 1980
aatgcagaca tggagatgac tctggagcga gcagtgagta tgctcgaggc agaccacatg 2040
ctgccatcca ggatttctgc tgcagctact ttcatacagc acgagtgctt ccagaaatct 2100
gaagctcgga agagggttaa ccagcttcgt ggcatcctca agcttctgca gctcctaaaa 2160
gttcagaatg aagacgttca gcgagctgtg tgtggggcct tgagaaactt agtatttgaa 2220
gacaatgaca acaaattgga ggtggctgaa ctaaatgggg tacctcggct gctccaggtg 2280
ctgaagcaaa ccagagactt ggagactaaa aaacaaataa cagaccatac agtcaattta 2340
agaagtagga atggctggcc gggcgcggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga 2400
ggccaaggcg ggcggatcac gaggtcagga gttcgagacc agcctgacca acatggtttg 2460
ctgtggaatt tgtcatctaa tgacaaactc aagaatctca tgataacaga agcattgctt 2520
acgctgacgg agaatatcat catccccttt tctgggtggc ctgaaggaga ctacccaaaa 2580
gcaaatggtt tgctcgattt tgacatattc tacaacgtca ctggatgcct aagaaacatg 2640
agttctgctg gcgctgatgg gagaaaagcg atgagaagat gtgacggact cattgactca 2700
ctggtccatt atgtcagagg aaccattgca gattaccagc cagatgacaa ggccacggag 2760
aattgtgtgt gcattcttca taacctctcc taccagctgg aggcagagct cccagagaaa 2820
tattcccaga atatctatat tcaaaaccgg aatatccaga ctgacaacaa caaaagtatt 2880
ggatgttttg gcagtcgaag caggaaagta aaagagcaat accaggacgt gccgatgccg 2940
gaggaaaaga gcaaccccaa gggcgtggag tggctgtggc attccattgt tataaggatg 3000
tatctgtcct tgatcgccaa aagtgtccgc aactacacac aagaagcatc cttaggagct 3060
ctgcagaacc tcacggccgg aagtggacca atgccgacat cagtggctca gacagttgtc 3120
cagaaggaaa gtggcctgca gcacacccga aagatgctgc atgttggtga cccaagtgtg 3180
aaaaagacag ccatctcgct gctgaggaat ctgtcccgga atctttctct gcagaatgaa 3240
attgccaaag aaactctccc tgatttggtt tccatcattc ctgacacagt cccgagtact 3300
gaccttctca ttgaaactac agcctctgcc tgttacacat tgaacaacat aatccaaaac 3360
agttaccaga atgcacgcga ccttctaaac accgggggca tccagaaaat tatggccatt 3420
agtgcaggcg atgcctatgc ctccaacaaa gcaagtaaag ctgcttccgt ccttctgtat 3480
tctctgtggg cacacacgga actgcatcat gcctacaaga aggctcagtt taagaagaca 3540
gattttgtca acagccggac tgccaaagcc taccactccc ttaaagactg atcaacctct 3600
ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct 3660
atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat 3720
tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt 3780
caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat 3840
tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc 3900
ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga 3960
caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc 4020
cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga 4080
ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc 4140
tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgcac tgcccgggtg gcatccctgt 4200
gacccctccc cagtgcctct cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt 4260
gtcctaataa aattaagttg catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg 4320
gggtggaggg gggtggtatg gagcaagggg cccaagttgg gaagaaacct gtagggcctg 4380
ctacgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc tagtgatgga 4440
gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc 4500
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 4549
<210> 15
<211> 4322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体基因组的完整多核苷酸序列
<400> 15
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtact cagtccatta 180
ggagccagta gcctggaaga tgtctttacc cccagcatca gttcaagtgg agcagcacat 240
aactcttgcc ctctgccttc caagattctg gtgctgagac ttatggagtg tcttggaggt 300
tgccttctgc cccccaaccc tgctcccagc tggccctccc aggcctgggt tgctggcctc 360
tgctttatca ggattctcaa gagggacagc tggtttatgt tgcatgactg ttccctgcat 420
atctgctctg gttttaaata gcttatctga gcagctggag gaccacatgg gcttatatgg 480
cgtggggtac atgttcctgt agccttgtcc ctggcacctg ccaaaatagc agccaacacc 540
ccccaccccc accgccatcc ccctgcccca cccgtcccct gtcgcacatt cctccctccg 600
cagggctggc tcaccaggcc ccagcccaca tgcctgctta aagccctctc catcctctgc 660
ctcacccagt ccccgctgag actgagcaga cgcctccagg atctgtcggc aggccaccat 720
ggcagccccc ggcgccccag ctgagtacgg ctacatccgg accgtcctgg gccagcagat 780
cctgggacaa ctggacagct ccagcctggc gctgccctcc gaggccaagc tgaagctggc 840
ggggagcagc ggccgcggcg gccagacagt caagagcctg cggatccagg agcaggtgca 900
gcagaccctc gcccggaagg gccgcagctc cgtgggcaac ggaaatcttc accgaaccag 960
cagtgttcct gagtatgtct acaacctaca cttggttgaa aatgattttg ttggaggccg 1020
ttcccctgtt cctaaaacct atgacatgct aaaggctggc acaactgcca cttatgaagg 1080
tcgctgggga agaggaacag cacagtacag ctcccagaag tccgtggaag aaaggtcctt 1140
gaggcatcct ctgaggagac tggagatttc tcctgacagc agcccggaga gggctcacta 1200
cacgcacagc gattaccagt acagccagag aagccaggct gggcacaccc tgcaccacca 1260
agaaagcagg cgggccgccc tcctagtgcc accgagatat gctcgttccg agatcgtggg 1320
ggtcagccgt gctggcacca caagcaggca gcgccacttt gacacatacc acagacagta 1380
ccagcatggc tctgttagcg acaccgtttt tgacagcatc cctgccaacc cggccctgct 1440
cacgtacccc aggccaggga ccagccgcag catgggcaac ctcttggaga aggagaacta 1500
cctgacggca gggctcactg tcgggcaggt caggccgctg gtgcccctgc agcccgtcac 1560
tcagaacagg gcttccaggt cctcctggca tcagagctcc ttccacagca cccgcacgct 1620
gagggaagct gggcccagtg tcgccgtgga ttccagcggg aggagagcgc acttgactgt 1680
cggccaggcg gccgcagggg gaagtgggaa tctgctcact gagagaagca ctttcactga 1740
ctcccagctg gggaatgcag acatggagat gactctggag cgagcagtga gtatgctcga 1800
ggcagaccac atgctgccat ccaggatttc tgctgcagct actttcatac agcacgagtg 1860
cttccagaaa tctgaagctc ggaagagggt taaccagctt cgtggcatcc tcaagcttct 1920
gcagctccta aaagttcaga atgaagacgt tcagcgagct gtgtgtgggg ccttgagaaa 1980
cttagtattt gaagacaatg acaacaaatt ggaggtggct gaactaaatg gggtacctcg 2040
gctgctccag gtgctgaagc aaaccagaga cttggagact aaaaaacaaa taacagacca 2100
tacagtcaat ttaagaagta ggaatggctg gccgggcgcg gtggctcacg cctgtaatcc 2160
cagcactttg ggaggccaag gcgggcggat cacgaggtca ggagttcgag accagcctga 2220
ccaacatggt ttgctgtgga atttgtcatc taatgacaaa ctcaagaatc tcatgataac 2280
agaagcattg cttacgctga cggagaatat catcatcccc ttttctgggt ggcctgaagg 2340
agactaccca aaagcaaatg gtttgctcga ttttgacata ttctacaacg tcactggatg 2400
cctaagaaac atgagttctg ctggcgctga tgggagaaaa gcgatgagaa gatgtgacgg 2460
actcattgac tcactggtcc attatgtcag aggaaccatt gcagattacc agccagatga 2520
caaggccacg gagaattgtg tgtgcattct tcataacctc tcctaccagc tggaggcaga 2580
gctcccagag aaatattccc agaatatcta tattcaaaac cggaatatcc agactgacaa 2640
caacaaaagt attggatgtt ttggcagtcg aagcaggaaa gtaaaagagc aataccagga 2700
cgtgccgatg ccggaggaaa agagcaaccc caagggcgtg gagtggctgt ggcattccat 2760
tgttataagg atgtatctgt ccttgatcgc caaaagtgtc cgcaactaca cacaagaagc 2820
atccttagga gctctgcaga acctcacggc cggaagtgga ccaatgccga catcagtggc 2880
tcagacagtt gtccagaagg aaagtggcct gcagcacacc cgaaagatgc tgcatgttgg 2940
tgacccaagt gtgaaaaaga cagccatctc gctgctgagg aatctgtccc ggaatctttc 3000
tctgcagaat gaaattgcca aagaaactct ccctgatttg gtttccatca ttcctgacac 3060
agtcccgagt actgaccttc tcattgaaac tacagcctct gcctgttaca cattgaacaa 3120
cataatccaa aacagttacc agaatgcacg cgaccttcta aacaccgggg gcatccagaa 3180
aattatggcc attagtgcag gcgatgccta tgcctccaac aaagcaagta aagctgcttc 3240
cgtccttctg tattctctgt gggcacacac ggaactgcat catgcctaca agaaggctca 3300
gtttaagaag acagattttg tcaacagccg gactgccaaa gcctaccact cccttaaaga 3360
ctgatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg 3420
ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc 3480
gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt 3540
tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca 3600
ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc 3660
ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc 3720
tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc 3780
tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc 3840
tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc 3900
ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cactgcccgg 3960
gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt 4020
gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt 4080
ctataatatt atggggtgga ggggggtggt atggagcaag gggcccaagt tgggaagaaa 4140
cctgtagggc ctgctacgta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac 4200
ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 4260
gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 4320
gc 4322
<210> 16
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak序列基序
<400> 16
gccgccrcca ugg 13
<210> 17
<400> 17
000
<210> 18
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Kozak序列基序
<400> 18
gacaccaugg 10
<210> 19
<400> 19
000
<210> 20
<211> 141
<212> DNA
<213> 腺相关病毒
<400> 20
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 21
<211> 168
<212> DNA
<213> 腺相关病毒2
<400> 21
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgta 168
<210> 22
<211> 170
<212> DNA
<213> 腺相关病毒
<400> 22
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta 170
<210> 23
<211> 145
<212> DNA
<213> 腺相关病毒
<400> 23
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60
cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 24
<211> 141
<212> DNA
<213> 腺相关病毒
<400> 24
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 25
<211> 168
<212> DNA
<213> 腺相关病毒2
<400> 25
tacgtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag 60
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 120
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgc 168
<210> 26
<211> 133
<212> DNA
<213> 腺相关病毒2
<400> 26
aggaacccct agtgatggag actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 60
gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120
gcagagaggg agt 133
<210> 27
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体填充序列
<400> 27
gcggcaattc agtcgataac tataacggtc ctaaggtagc gatttaaata cgcgctctct 60
taaggtagcc ccgggacgcg tcaattgact acaaaccgag tatctgcaga gggccctgcg 120
tatg 124
<210> 28
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体填充序列
<400> 28
cttctgaggc ggaaagaacc agatcctctc ttaaggtagc atcgagattt aaattaggga 60
taacagggta atggcgcggg ccgc 84
<210> 29
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体填充序列
<400> 29
gttacccagg ctggagtgca gtggcacatt tctgctcact gcaacctcct cctccctggg 60
ttc 63
<210> 30
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 部分人β疱疹病毒5中的CAG启动子
<400> 30
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg 420
cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg 480
cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc 540
ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgg 573
<210> 31
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - MHCK7启动子
<400> 31
acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc 60
tcctgtctct cctctatctg cccatcggcc ctttggggag gaggaatgtg cccaaggact 120
aaaaaaaggc catggagcca gaggggcgag ggcaacagac ctttcatggg caaaccttgg 180
ggccctgctg tctagcatgc cccactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc 240
ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taacccagac atgtggctgc cccccccccc 300
ccaacacctg ctgcctctaa aaataaccct gtccctggtg gatcccctgc atgcgaagat 360
cttcgaacaa ggctgtgggg gactgagggc aggctgtaac aggcttgggg gccagggctt 420
atacgtgcct gggactccca aagtattact gttccatgtt cccggcgaag ggccagctgt 480
cccccgccag ctagactcag cacttagttt aggaaccagt gagcaagtca gcccttgggg 540
cagcccatac aaggccatgg ggctgggcaa gctgcacgcc tgggtccggg gtgggcacgg 600
tgcccgggca acgagctgaa agctcatctg ctctcagggg cccctccctg gggacagccc 660
ctcctggcta gtcacaccct gtaggctcct ctatataacc caggggcaca ggggctgccc 720
tcattctacc accacctcca cagcacagac agacactcag gagccagcca g 771
<210> 32
<211> 544
<212> DNA
<213> 智人
<400> 32
ctcagtccat taggagccag tagcctggaa gatgtcttta cccccagcat cagttcaagt 60
ggagcagcac ataactcttg ccctctgcct tccaagattc tggtgctgag acttatggag 120
tgtcttggag gttgccttct gccccccaac cctgctccca gctggccctc ccaggcctgg 180
gttgctggcc tctgctttat caggattctc aagagggaca gctggtttat gttgcatgac 240
tgttccctgc atatctgctc tggttttaaa tagcttatct gagcagctgg aggaccacat 300
gggcttatat ggcgtggggt acatgttcct gtagccttgt ccctggcacc tgccaaaata 360
gcagccaaca ccccccaccc ccaccgccat ccccctgccc cacccgtccc ctgtcgcaca 420
ttcctccctc cgcagggctg gctcaccagg ccccagccca catgcctgct taaagccctc 480
tccatcctct gcctcaccca gtccccgctg agactgagca gacgcctcca ggatctgtcg 540
gcag 544
<210> 33
<211> 502
<212> DNA
<213> 智人
<400> 33
ctcagtccat taggagccag tagcctggaa gatgtcttta cccccagcat cagttcaagt 60
ggagcagcac ataactcttg ccctctgcct tccaagattc tggtgctgag acttatggag 120
tgtcttggag gttgccttct gccccccaac cctgctccca gctggccctc ccaggcctgg 180
gttgctggcc tctgctttat caggattctc aagagggaca gctggtttat gttgcatgac 240
tgttccctgc atatctgctc tggttttaaa tagcttatct gagcagctgg aggaccacat 300
gggcttatat ggcgtggggt acatgttcct gtagccttgt ccctggcacc tgccaaaata 360
gcagccaaca ccccccaccc ccaccgccat ccccctgccc cacccgtccc ctgtcgcaca 420
ttcctccctc cgcagggctg gctcaccagg ccccagccca catgcctgct taaagccctc 480
tccatcctct gcctcaccca gt 502
<210> 34
<211> 5464
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 34
ggtaccggat cctgcaaggt cacacaaggg tctccaccca ccaggtgccc tagtctcaat 60
ttcagtttcc atgccttgtt ctcacaatgc tggcctcccc agagctaatt tggactttgt 120
ttttatttca aaagggcctg aatgaggagt agatcttgtg ctacccagct ctaagggtgc 180
ccgtgaagcc ctcagacctg gagcctttgc aacagccctt taggtggaag cagaataaag 240
caattttcct taaagccaaa atcctgcctc tagactcttc ttctctgacc tcggtccctg 300
ggctctaggg tggggaggtg gggcttggaa gaagaaggtg gggaagtggc aaaagccgat 360
ccctagggcc ctgtgaagtt cggagccttc cctgtacagc actggctcat agatcctcct 420
ccagccaaac atagcaagaa gtgatacctc ctttgtgact tccccaggcc cagtacctgt 480
caggttgaaa caggatttag agaagcctct gaactcacct gaactctgaa gctcatccac 540
caagcaagca cctaggtgcc actgctagtt agtatcctac gctgataata tgcagagctg 600
ggccacagaa gtcctggggt gtaggaactg accagtgact tttcagtcgg caaaggtatg 660
accccctcag cagatgtagt aatgtcccct tagatcccat cccaggcagg tctctaagag 720
gacatgggat gagagatgta gtcatgtggc attccaaaca cagctatcca cagtgtccct 780
tgccccttcc acttagccag gaggacagta accttagcct atctttcttc ctccccatcc 840
tcccaggaca caccccctgg tctgcagtat tcatttcttc cttcacgtcc cctctgtgac 900
ttccatttgc aaggcttttg acctctgcag ctgctggaag atagagtttg gccctaggtg 960
tggcaagcca tctcaagaga aagcagacaa cagggggacc agattttgga aggatcagga 1020
actaaatcac tggcgggcct gggggtagaa aaaagagtga gtgagtccgc tccagctaag 1080
ccaagctagt ccccgagata ctctgccaca gctgggctgc tcggggtagc tttaggaatg 1140
tgggtctgaa agacaatggg attggaagac atctctttga gtctcccctc aaccccacct 1200
acagacacac tcgtgtgtgg ccagactcct gttcaacagc cctctgtgtt ctgaccactg 1260
agctaggcaa ccagagcatg ggccctgtgc tgaggatgaa gagttggtta ccaatagcaa 1320
aaacagcagg ggagggagaa cagagaacga aataaggaag gaagaaggaa aggccagtca 1380
atcagatgca gtcagaagag atgggaagcc aacacacagc ttgagcagag gaaacagaaa 1440
agggagagat tctgggcata aggaggccac agaaagaaga gcccaggccc cccaagtctc 1500
ctctttatac cctcatcccg tctcccaatt aagcccactc ttcttcctag atcagacctg 1560
agctgcagcg aagagacccg tagggaggat cacactggat gaaggagatg tgtggagaag 1620
tccagggaac ctaagagcca gagcctaaaa gagcaagaga taaaggtgct tcaaaggtgg 1680
ccaggctgtg cacacagagg gtcgaggact ggtggtagag cctcaagata aggatgatgc 1740
tcagaatggg cggggggggg gattctgggg gggggagaga gaaggtgaga aggagcctgg 1800
aacagagaat ctggaagcgc tggaaacgat accataaagg gaagaaccca ggctaccttt 1860
agatgtaaat catgaaagac agggagaagg gaagctggag agagtagaag gaccccgggg 1920
caagacattg aagcaaggac aagccaggtt gagcgctccg tgaaatcagc ctgctgaagg 1980
cagagccctg gtatgagcac cagaacagca gaggctaggg ttaatgtcga gacagggaac 2040
agaaggtaga cacaggaaca gacagagacg ggggagccag gtaacaaagg aatggtcctt 2100
ctcacctgtg gccagagcgt ccatctgtgt ccacatactc tagaatgttc atcagactgc 2160
agggctggct tgggaggcag ctggaaagag tatgtgagag ccaggggaga caagggggcc 2220
taggaaagga agaagagggc aaaccaggcc acacaagagg gcagagccca gaactgagtt 2280
aactccttcc ttgttgcatc ttccatagga ggcagtggga actctgtgac caccatcccc 2340
catgagcccc cactacccat accaagtttg gcctgagtgg cattctaggt tccctgagga 2400
cagagcctgg cctttgtctc ttggacctga cccaagctga cccaatgttc tcagtacctt 2460
atcatgccct caagagcttg agaaccaggc agtgacatat taggccatgg gctaaccctg 2520
gagcttgcac acaggagcct caagtgacct ccagggacac agctgcagac aggtggcctt 2580
tatccccaaa gagcaaccat ttggcatagg tggctgcaaa tgggaatgca aggttgaatc 2640
aggtcccttc aagaatactg catgcaagac ctaagacccc tggagagagg ggtatgctcc 2700
tgcccccacc caccataagg ggagtgaact atcctagggg gctggcgacc ttggggagac 2760
accacattac tgagagtgct gagcccagaa aaactgaccg ccctgtgtcc tgcccacctc 2820
cacactctag agctatattg agaggtgaca gtagataggg tgggagctgg tagcagggag 2880
agtgttcctg ggtgtgaggg tgtaggggaa agccagagca ggggagtctg gctttgtctc 2940
ctgaacacaa tgtctactta gttataacag gcatgacctg ctaaagaccc aacatctacg 3000
acctctgaaa agacagcagc cctggaggac aggggttgtc tctgagcctt gggtgcttga 3060
tggtgccaca aaggagggca tgagtgtgag tataaggccc caggagcgtt agagaagggc 3120
acttgggaag gggtcagtct gcagagcccc tatccatgga atctggagcc tggggccaac 3180
tggtgtaaat ctctgggcct gccaggcatt caaagcagca cctgcatcct ctggcagcct 3240
ggggaggcgg aagggagcaa ccccccactt ataccctttc tccctcagcc ccaggattaa 3300
cacctctggc cttccccctt cccacctccc atcaggagtg gagggttgca gagggagggt 3360
aaaaacctac atgtccaaac atcatggtgc acgatatatg gatcagtatg tgtagaggca 3420
agaaaggaaa tctgcaggct taactgggtt aatgtgtaaa gtctgtgtgc atgtgtgtgt 3480
gtctgactga aaacgggcat ggctgtgcag ctgttcagtt ctgtgcgtga ggttaccaga 3540
ctgcaggttt gtgtgtaaat tgcccaaggc aaagtgggtg aatcccttcc atggtttaaa 3600
gagattggat gatggcctgc atctcaagga ccatggaaaa tagaatggac actctatatg 3660
tgtctctaag ctaaggtagc aaggtctttg gaggacacct gtctagagat gtgggcaaca 3720
gagactacag acagtatctg tacagagtaa ggagagagag gagggggtgt agaattctct 3780
tactatcaaa gggaaactga gtcgtgcacc tgcaaagtgg atgctctccc tagacatcat 3840
gactttgtct ctggggagcc agcactgtgg aacttcaggt ctgagagagt aggaggctcc 3900
cctcagcctg aagctatgca gatagccagg gttgaaaggg ggaagggaga gcctgggatg 3960
ggagcttgtg tgttggaggc aggggacaga tattaagcct ggaagagaag gtgaccctta 4020
cccagttgtt caactcaccc ttcagattaa aaataactga ggtaagggcc tgggtagggg 4080
aggtggtgtg agacgctcct gtctctcctc tatctgccca tcggcccttt ggggaggagg 4140
aatgtgccca aggactaaaa aaaggccatg gagccagagg ggcgagggca acagaccttt 4200
catgggcaaa ccttggggcc ctgctgtcct cctgtcacct ccagagccaa gggatcaaag 4260
gaggaggagc caggacagga gggaagtggg agggagggtc ccagcagagg actccaaatt 4320
taggcagcag gcatatggga tgggatataa aggggctgga gcactgagag ctgtcagaga 4380
tttctccaac ccaggtaaga gggagtttcg ggtgggggct cttcacccac accagacctc 4440
tccccaccta gaaggaaact gcctttcctg gaagtggggt tcaggccggt cagagatctg 4500
acagggtggc cttccaccag cctgggaagt tctcagtggc aggaggtttc cacaagaaac 4560
actggatgcc ccttccctta cgctgtcttc tccatcttcc tcctggggat gctcctcccc 4620
gtcttggttt atcttggctc ttcgtcttca gcaagatttg ccctgtgctg tccactccat 4680
ctttctctac tgtctccgtg ccttgccttg ccttcttgcg tgtccttcct ttccacccat 4740
ttctcacttc accttttctc cccttctcat ttgtattcat ccttccttcc ttccttcctt 4800
ccttccttcc ttccttcctt ccttcctttc tcccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 4860
ccttccttcc ttcctgtgtc agagtgctga gaatcacacc tggggttccc acccttatgt 4920
aaacaatctt ccagtgagcc acagcttcag tgctgctggg tgctctctta ccttcctcac 4980
cccctggctt gtcctgttcc atcctggtca ggatctctag attggtctcc cagcctctgc 5040
tactcctctt cctgcctgtt cctctctctg tccagctgcg ccactgtggt gcctcgttcc 5100
agctgtggtc cacattcttc aggattctct gaaaagttaa ccaggtgaga atgtttcccc 5160
tgtagacagc agatcacgat tctcccggaa gtcaggcttc cagccctctc tttctctgcc 5220
cagctgcccg gcactcttag caaacctcag gcacccttac cccacataga cctctgacag 5280
agaagcaggc actttacatg gagtcctggt gggagagcca taggctacgg tgtaaaagag 5340
gcagggaagt ggtggtgtag gaaagtcagg acttcacata gaagcctagc ccacaccaga 5400
aatgacagac agatccctcc tatctccccc ataagagttt gagtcgaccc gcggccccga 5460
attg 5464
<210> 35
<211> 413
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 35
gggataaaag cagtctgggc tttcacatga cagcatctgg ggctgcggca gagggtcggg 60
tccgaagcgc tgccttatca gcgtccccag ccctgggagg tgacagctgg ctggcttgtg 120
tcagcccctc gggcactcac gtatctccgt ccgacgggtt taaaatagca aaactctgag 180
gccacacaat agcttgggct tatatgggct cctgtggggg aagggggagc acggaggggg 240
ccggggccgc tgctgccaaa atagcagctc acaagtgttg cattcctctc tgggcgccgg 300
gcacattcct gctggctctg cccgccccgg ggtgggcgcc ggggggacct taaagcctct 360
gccccccaag gagcccttcc cagacagccg ccggcaccca ccgctccgtg gga 413
<210> 36
<211> 1090
<212> DNA
<213> 智人
<400> 36
ctctcagccc tggaagtcct tgctcacagc cgaggcgccg agagcgcttg ctctgcccag 60
atctgcgcga gtctggcgcc cgcgctctga acggcgtcgc tgcccagccc ccttccccgg 120
gaggtgggag cggccaccca gggccccgtg gctgcccttg taaggaggcg aggcccgagg 180
acacccgaga cgcccggtta taattaacca ggacacgtgg cgaacccccc tccaacacct 240
gcccccgaac ccccccatac ccagcgcctc gggtctcggc ctttgcggca gaggagacag 300
caaagcgccc tctaaaaata actcctttcc cggcgaccga gaccctccct gtcccccgca 360
cagcggaaat ctcccagtgg caccgagggg gcgagggtta agtggggggg agggtgacca 420
ccgcctccca cccttgccct gagtttgaat ctctccaact cagccagcct cagtttcccc 480
tccactcagt ccctaggagg aaggggcgcc caagcgcggg tttctggggt tagactgccc 540
tccattgcaa ttggtccttc tcccggcctc tgcttcctcc agctcacagg gtatctgctc 600
ctcctggagc cacaccttgg ttccccgagg tgccgctggg actcgggtag gggtgagggc 660
ccagggggca cagggggagc cgagggccac aggaagggct ggtggctgaa ggagactcag 720
gggccagggg acggtggctt ctacgtgctt gggacgttcc cagccaccgt cccatgttcc 780
cggcgggggg ccagctgtcc ccaccgccag cccaactcag cacttggtca gggtatcagc 840
ttggtggggg ggcgtgagcc cagcccctgg ggcggctcag cccatacaag gccatggggc 900
tgggcgcaaa gcatgcctgg gttcagggtg ggtatggtgc gggagcaggg aggtgagagg 960
ctcagctgcc ctccagaact cctccctggg gacaacccct cccagccaat agcacagcct 1020
aggtccccct atataaggcc acggctgctg gcccttcctt tgggtcagtg tcacctccag 1080
gatacagaca 1090
<210> 37
<211> 253
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
gcccagcacc ccaaggcggc caacgccaaa actctccctc ctcctcttcc tcaatctcgc 60
tctcgctctt tttttttttc gcaaaaggag gggagagggg gtaaaaaaat gctgcactgt 120
gcggcgaagc cggtgagtga gcggcgcggg gccaatcagc gtgcgccgtt ccgaaagttg 180
ccttttatgg ctcgagcggc cgcggcggcg ccctataaaa cccagcggcg cgacgcgcca 240
ccaccgccga gtc 253
<210> 38
<211> 281
<212> DNA
<213> 原鸡
<400> 38
ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct ccccaccccc 60
aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg 120
ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg cggagaggtg 180
cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240
ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg a 281
<210> 39
<211> 220
<212> DNA
<213> 人β疱疹病毒5
<400> 39
tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 60
ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 120
actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 180
ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg 220
<210> 40
<211> 583
<212> DNA
<213> 人β疱疹病毒5
<400> 40
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgt 583
<210> 41
<211> 508
<212> DNA
<213> 人β疱疹病毒5
<400> 41
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagct 508
<210> 42
<211> 573
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 部分人β疱疹病毒5中的CAG启动子
<400> 42
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga 300
ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt 360
gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggcgcg 420
cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg 480
cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc 540
ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgg 573
<210> 43
<211> 580
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 部分人β疱疹病毒5中的CAG启动子
<400> 43
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catgtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc 360
ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg 420
ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg 480
tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg 540
gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 580
<210> 44
<211> 455
<212> DNA
<213> 智人
<400> 44
caacctttgg agctaagcca gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg 60
gcctccccgt caccaccccc cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa 120
aaggactcgc ccctgccttg gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag 180
aacccagaga tcgctgcgtt cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg 240
gagaatagca tgcgtgaggc tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag 300
tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaacggg tgcctagaga aggtggcgcg 360
gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag 420
aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgtt 455
<210> 45
<400> 45
000
<210> 46
<400> 46
000
<210> 47
<400> 47
000
<210> 48
<211> 281
<212> DNA
<213> 智人
<400> 48
acttgtggac aaagtttgct ctattccacc tcctccaggc cctccttggg tccatcaccc 60
caggggtgct gggtccatcc cacccccagg cccacacagg cttgcagtat tgtgtgcggt 120
atggtcaggg cgtccgagag caggtttcgc agtggaaggc aggcaggtgt tggggaggca 180
gttaccgggg caacgggaac agggcgtttt ggaggtggtt gccatgggga cctggatgct 240
gacgaaggct cgcgaggctg tgagcagcca cagtgccctg c 281
<210> 49
<400> 49
000
<210> 50
<211> 293
<212> DNA
<213> 人β疱疹病毒5
<400> 50
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 60
aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 120
gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 180
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 240
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta cca 293
<210> 51
<211> 953
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
cgcgtccgcc cgcgagcaca gagcctcgcc tttgccgatc cgccgcccgt ccacacccgc 60
cgccaggtaa gcccggccag ccgaccgggg catgcggccg cggcccttcg cccgtgcaga 120
gccgccgtct gggccgcagc ggggggcgca tggggcggaa ccggaccgcc gtggggggcg 180
cgggagaagc ccctgggcct ccggagatgg gggacacccc acgccagttc gcaggcgcga 240
ggccgcgctc gggcgggcgc gctccggggg tgccgctctc ggggcggggg caaccggcgg 300
ggtctttgtc tgagccgggc tcttgccaat ggggatcgca cggtgggcgc ggcgtagccc 360
ccgtcaggcc cggtgggggc tggggcgcca tgcgcgtgcg cgctggtcct ttgggcgcta 420
actgcgtgcg cgctgggaat tggcgctaat tgcgcgtgcg cgctgggact caatggcgct 480
aatcgcgcgt gcgttctggg gcccgggcgc ttgcgccact tcctgcccga gccgctggcg 540
cccgagggtg tggccgctgc gtgcgcgcgc gcgacccggt cgctgtttga accgggcgga 600
ggcggggctg gcgcccggtt gggagggggt tggggcctgg cttcctgccg cgcgccgcgg 660
ggacgcctcc gaccagtgtt tgccttttat ggtaataacg cggccggccc ggcttccttt 720
gtccccaatc tgggcgcgcg ccggcgcccc ctggcggcct aaggactcgg cgcgccggaa 780
gtggccaggg cggcagcggc tgctcttggc ggccccgagg tgactatagc cttcttttgt 840
gtcttgatag ttcgccagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc 900
tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttc 953
<210> 52
<211> 1068
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 鸡β-肌动蛋白外显子/内含子加兔球蛋白内含子
<400> 52
gtcgctgcgc gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60
cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120
ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 180
cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg 240
tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 300
gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc 360
ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc 420
gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc 480
cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc 540
gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg 600
ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc 660
tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag 720
ggacttcctt tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc 780
tctagcgggc gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc 840
cttcgtgcgt cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg 900
ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc 960
ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg 1020
ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattc 1068
<210> 53
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 嵌合体内含子序列
<400> 53
ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca 60
aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt acttctaggc ctgtacggaa gtgttacttc 120
tgctctaaaa gctgcggaat tgtacccgc 149
<210> 54
<211> 126
<212> DNA
<213> 智人
<400> 54
agtctgcggt gggcagcgga ggagtcgtgt cgtgcctgag agcgcagctg tgctcctggg 60
caccgcgcag tccgcccccg cggctcctgg ccagaccacc cctaggaccc cctgccccaa 120
gtcgca 126
<210> 55
<211> 121
<212> DNA
<213> 人β疱疹病毒5
<400> 55
tcagatcgcc tggagaggcc atccacgctg ttttgacctc catagtggac accgggaccg 60
atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg attccccgtg ccaagagtga 120
c 121
<210> 56
<211> 512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 腺病毒衍生增强子元件
<400> 56
ctcactctct tccgcatcgc tgtctgcgag ggccagctgt tgggctcgcg gttgaggaca 60
aactcttcgc ggtctttcca gtactcttgg atcggaaacc cgtcggcctc cgaacggtac 120
tccgccaccg agggacctga gcgagtccgc atcgaccgga tcggaaaacc tctcgagaaa 180
ggcgtctaac cagtcacagt cgcaaggtag gctgagcacc gtggcgggcg gcagcgggtg 240
gcggtcgggg ttgtttctgg cggaggtgct gctgatgatg taattaaagt aggcggtctt 300
gagacggcgg atggtcgagg tgaggtgtgg caggcttgag atccagctgt tggggtgagt 360
actccctctc aaaagcgggc attacttctg cgctaagatt gtcagtttcc aaaaacgagg 420
aggatttgat attcacctgg cccgatctgg ccatacactt gagtgacaat gacatccact 480
ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc ag 512
<210> 57
<211> 956
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg 60
cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac ctggctccag 120
tacgtgattc ttgatcccga gctggagcca ggggcgggcc ttgcgcttta ggagcccctt 180
cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt 240
ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat 300
gacgtgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caggatctgc 360
acactggtat ttcggttttt gggcccgcgg ccggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca 420
catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc 480
aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg 540
cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc 600
ctgctccagg gggctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac 660
ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt 720
accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctggagctt ttggagtacg tcgtctttag 780
gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag 840
ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tggccttttt gagtttggat 900
cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcag 956
<210> 58
<211> 939
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg 60
ccttgaatta cttccacctg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct tcgggttgga 120
agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg tgcttgagtt 180
gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct tcgcgcctgt 240
ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc tgcgacgctt 300
tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg tatttcggtt 360
tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc ggcgaggcgg 420
ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg ccggcctgct 480
ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag gctggcccgg 540
tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc agggagctca 600
aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca aaggaaaagg 660
gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc gccgtccagg 720
cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg ggaggggttt 780
tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc agcttggcac 840
ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt cattctcaag 900
cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcag 939
<210> 59
<211> 83
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
tcagaagccc cgggctcgtc agtcaaaccg gttctctgtt tgcactcggc agcacgggca 60
ggcaagtggt ccctaggttc ggg 83
<210> 60
<211> 476
<212> DNA
<213> 智人
<400> 60
gtgagtctat gggacccttg atgttttctt tccccttctt ttctatggtt aagttcatgt 60
cataggaagg ggagaagtaa cagggtacac atattgacca aatcagggta attttgcatt 120
tgtaatttta aaaaatgctt tcttctttta atatactttt ttgtttatct tatttctaat 180
actttcccta atctctttct ttcagggcaa taatgataca atgtatcatg cctctttgca 240
ccattctaaa gaataacagt gataatttct gggttaaggc aatagcaata tttctgcata 300
taaatatttc tgcatataaa ttgtaactga tgtaagaggt ttcatattgc taatagcagc 360
tacaatccag ctaccattct gcttttattt tatggttggg ataaggctgg attattctga 420
gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct tatcttcctc ccacag 476
<210> 61
<211> 196
<212> DNA
<213> 类人猿病毒40
<400> 61
tctagaggat ccggtactcg aggaactgaa aaaccagaaa gttaactggt aagtttagtc 60
tttttgtctt ttatttcagg tcccggatcc ggtggtggtg caaatcaaag aactgctcct 120
cagtggatgt tgcctttact tctaggcctg tacggaagtg ttacttctgc tctaaaagct 180
gcggaattgt acccgc 196
<210> 62
<211> 589
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 突变的土拨鼠肝炎调控元件
<400> 62
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 63
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 突变的土拨鼠肝炎调控元件
<400> 63
tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact atgttgctcc 60
ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg cttcccgtat 120
ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg 180
gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg 240
ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat 300
tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt 360
gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc 420
ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa 480
tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg 540
ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgca 588
<210> 64
<211> 755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 突变的土拨鼠肝炎调控元件
<400> 64
ttcctgttaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 60
atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg 120
cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg 180
aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa 240
cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc 300
ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg 360
ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccgc 420
ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt 480
cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc 540
cgcctcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgccca 600
tgtatctttt tcacctgtgc cttgtttttg cctgtgttcc gcgtcctact tttcaagcct 660
ccaagctgtg ccttgggcgg ctttggggca tggacataga tccctataaa gaatttggtt 720
catcttatca gttgttgaat tttcttcctt tggac 755
<210> 65
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAAX基序
<400> 65
tgtgtgataa tg 12
<210> 66
<211> 810
<212> DNA
<213> 智人
<400> 66
ctgttctcat cacatcatat caaggttata taccatcaat attgccacag atgttactta 60
gccttttaat atttctctaa tttagtgtat atgcaatgat agttctctga tttctgagat 120
tgagtttctc atgtgtaatg attatttaga gtttctcttt catctgttca aatttttgtc 180
tagttttatt ttttactgat ttgtaagact tctttttata atctgcatat tacaattctc 240
tttactgggg tgttgcaaat attttctgtc attctatggc ctgacttttc ttaatggttt 300
tttaatttta aaaataagtc ttaatattca tgcaatctaa ttaacaatct tttctttgtg 360
gttaggactt tgagtcataa gaaatttttc tctacactga agtcatgatg gcatgcttct 420
atattatttt ctaaaagatt taaagttttg ccttctccat ttagacttat aattcactgg 480
aatttttttg tgtgtatggt atgacatatg ggttcccttt tattttttac atataaatat 540
atttccctgt ttttctaaaa aagaaaaaga tcatcatttt cccattgtaa aatgccatat 600
ttttttcata ggtcacttac atatatcaat gggtctgttt ctgagctcta ctctatttta 660
tcagcctcac tgtctatccc cacacatctc atgctttgct ctaaatcttg atatttagtg 720
gaacattctt tcccattttg ttctacaaga atatttttgt tattgtcttt gggctttcta 780
tatacatttt gaaatgaggt tgacaagtta 810
<210> 67
<211> 726
<212> DNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 67
ataacaggcc tattgattgg aaagtttgtc aacgaattgt gggtcttttg gggtttgctg 60
ccccttttac gcaatgtgga tatcctgctt taatgccttt atatgcatgt atacaagcaa 120
aacaggcttt tactttctcg ccaacttaca aggcctttct cagtaaacag tatatgaccc 180
tttaccccgt tgctcggcaa cggcctggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca 240
ctggttgggg cttggccata ggccatcagc gcatgcgtgg aacctttgtg tctcctctgc 300
cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg cagcaggtct ggagcaaacc 360
tcatcgggac cgacaattct gtcgtactct cccgcaagta tacatcgttt ccatggctgc 420
taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcggcgc 480
tgaatcccgc ggacgacccc tcccggggcc gcttggggct ctaccgcccg cttctccgtc 540
tgccgtaccg tccgaccacg gggcgcacct ctctttacgc ggactccccg tctgtgcctt 600
ctcatctgcc ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca cgtcgcatgg aggccaccgt 660
gaacgcccac cggaacctgc ccaaggtctt gcataagagg actcttggac tttcagcaat 720
gtcatc 726
<210> 68
<211> 755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - HepB衍生增强子元件
<400> 68
ttcctgtaaa caggcctatt gattggaaag tttgtcaacg aattgtgggt cttttggggt 60
ttgctgcccc ttttacgcaa tgtggatatc ctgctttaat gcctttatat gcatgtatac 120
aagcaaaaca ggcttttact ttctcgccaa cttacaaggc ctttctcagt aaacagtata 180
tgacccttta ccccgttgct cggcaacggc ctggtctgtg ccaagtgttt gctgacgcaa 240
cccccactgg ttggggcttg gccataggcc atcagcgcat gcgtggaacc tttgtgtctc 300
ctctgccgat ccatactgcg gaactcctag ccgcttgttt tgctcgcagc tggactggag 360
caaacctcat cgggaccgac aattctgtcg tactctcccg caagcactca ccgtttccgc 420
ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt 480
cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc 540
cgcctcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgccca 600
tgtatctttt tcacctgtgc cttgtttttg cctgtgttcc gcgtcctact tttcaagcct 660
ccaagctgtg ccttgggcgg ctttggggca tggacataga tccctataaa gaatttggtt 720
catcttatca gttgttgaat tttcttcctt tggac 755
<210> 69
<211> 94
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
gctggagcct cggtagccgt tcctcctgcc cgctgggcct cccaacgggc cctcctcccc 60
tccttgcacc ggcccttcct ggtctttgaa taaa 94
<210> 70
<211> 596
<212> DNA
<213> 土拨鼠肝炎病毒
<400> 70
attcgagcat cttaccgcca tttattccca tatttgttct gtttttcttg atttgggtat 60
acatttaaat gttaataaaa caaaatggtg gggcaatcat ttacattttt agggatatgt 120
aattactagt tcaggtgtat tgccacaaga caaacatgtt aagaaacttt cccgttattt 180
acgctctgtt cctgttaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactgatat 240
tcttaactat gttgctcctt ttacgctgtg tggatatgct gctttaatgc ctctgtatca 300
tgctattgct tcccgtacgg ctttcgtttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 360
tctttatgag gagttgtggc ccgttgtccg tcaacgtggc gtggtgtgct ctgtgtttgc 420
tgacgcaacc cccactggct ggggcattgc caccacctgt caactccttt ctgggacttt 480
cgctttcccc ctcccgatcg ccacggcaga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 540
gacaggggct aggttgctgg gcactgataa ttccgtggtg ttgtcgggga agggcc 596
<210> 71
<211> 387
<212> DNA
<213> 穴兔
<400> 71
tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc 60
actcggaaga acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta 120
gagtttggca acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg 180
tcatcagtat atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac 240
ttgaggttag atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa 300
attttcctta catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat 360
agctgtccct cttctcttat ggagatc 387
<210> 72
<211> 251
<212> DNA
<213> 牛
<400> 72
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 60
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 120
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aatacaatag 180
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat gggtacccag gtgctgaaga attgacccgg 240
ttcctcctgg g 251
<210> 73
<211> 251
<212> DNA
<213> 牛
<400> 73
ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 60
tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 120
ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 180
caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat gggtacccag gtgctgaaga attgacccgg 240
ttcctcctgg g 251
<210> 74
<211> 225
<212> DNA
<213> 牛
<400> 74
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 75
<211> 202
<212> DNA
<213> 智人
<400> 75
ctgcccgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 60
actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 120
gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcccaagttg 180
ggaagaaacc tgtagggcct gc 202
<210> 76
<211> 735
<212> PRT
<213> 腺相关病毒2
<400> 76
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<213> 腺相关病毒9
<400> 77
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<213> 腺相关病毒6
<400> 78
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<400> 79
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<213> 非人灵长类动物腺相关病毒
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<210> 81
<211> 535
<212> PRT
<213> 非人灵长类动物腺相关病毒
<400> 81
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325 330 335
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340 345 350
Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr
355 360 365
Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln
370 375 380
Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala
385 390 395 400
Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro
405 410 415
Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro
420 425 430
Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile
435 440 445
Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala
450 455 460
Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val
465 470 475 480
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485 490 495
Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe
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Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr
515 520 525
Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
530 535
<210> 82
<211> 398
<212> PRT
<213> 非人灵长类动物腺相关病毒
<400> 82
Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Val
1 5 10 15
Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val
20 25 30
Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser Gln
35 40 45
Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln
50 55 60
Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp
65 70 75 80
Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu
85 90 95
Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr Gln
100 105 110
Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu Phe Ser Gln Ala
115 120 125
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130 135 140
Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn
145 150 155 160
Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg
165 170 175
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Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly
245 250 255
Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg
260 265 270
Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr
325 330 335
Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu
340 345 350
Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr
355 360 365
Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser
370 375 380
Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395
<210> 83
<211> 332
<212> PRT
<213> 非人灵长类动物腺相关病毒
<400> 83
Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr Asn Phe Glu Asp Val Pro
1 5 10 15
Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Cys Tyr
65 70 75 80
Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser Gln Asn Asn Asn Ser Asn
85 90 95
Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly Arg Asp Ser
100 105 110
Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His Lys Asp Asp Glu Glu
115 120 125
Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met Phe Gly Lys Gln Gly Ala
130 135 140
Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Glu Glu
145 150 155 160
Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr Gly Val Val
165 170 175
Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala Pro Ile Val Gly Ala Val
180 185 190
Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg Asp Val
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr
245 250 255
Thr Phe Asn Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr
260 265 270
Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser
275 280 285
Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser
290 295 300
Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Thr Tyr Ser Glu Pro
305 310 315 320
Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
325 330
<210> 84
<211> 743
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 - AAV9变体
<400> 84
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1 5 10 15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20 25 30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100 105 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115 120 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130 135 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165 170 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195 200 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210 215 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225 230 235 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245 250 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260 265 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275 280 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290 295 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305 310 315 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325 330 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355 360 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370 375 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385 390 395 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405 410 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420 425 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435 440 445
Arg Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450 455 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465 470 475 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485 490 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500 505 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515 520 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530 535 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545 550 555 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565 570 575
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Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile
645 650 655
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Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe
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Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽插入物
<400> 85
Thr Leu Ala Val Pro Phe Lys
1 5
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽插入物
<400> 86
Lys Phe Pro Val Ala Leu Thr
1 5
<210> 87
<211> 2514
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 密码子优化的PKP2a多核苷酸
<400> 87
atggctgcac ctggtgcgcc tgccgaatat ggttatataa ggacagtttt gggtcaacag 60
atacttggac aacttgattc ctcttctttg gcgctccctt cagaagcaaa gttgaaattg 120
gcaggttcat caggtagagg aggacaaact gtgaaatctc tgcggattca ggaacaagta 180
caacagactt tggctagaaa gggaagatct tccgttggca atggaaattt gcatagaacg 240
agcagcgtac ctgaatacgt atacaatctc catcttgttg aaaacgattt tgtaggaggt 300
cggtctccag ttccgaaaac atatgatatg cttaaagcag gtactacagc tacatacgaa 360
ggtagatggg gaagaggaac tgcacaatat tcatctcaaa aatctgttga agaaaggtca 420
ttgcgacatc ctctcagaag gctcgaaatt tccccggatt catcacctga aagggctcat 480
tatacacaca gtgattatca atatagccaa cgatctcaag caggtcatac acttcatcat 540
caggaaagta ggcgggcggc attgcttgta ccccctcgat atgccaggtc agaaattgta 600
ggagtttcca gagcaggtac tactagtcga caaagacact ttgacacata tcataggcaa 660
tatcaacacg gtagtgtctc agacactgtt tttgattcaa taccagcaaa tccggcattg 720
ctgacgtatc ctcgacctgg tacgtcaagg agcatgggaa atcttctgga gaaagaaaat 780
tatttgactg ctgggcttac agttggacag gtacggccat tggttcctct tcaaccagtt 840
actcagaatc gagcttccag aagctcttgg catcaatcaa gctttcattc cacaaggaca 900
ctgagagaag caggaccttc tgttgccgtt gattccagtg ggcggagagc ccaccttaca 960
gtaggtcaag cagctgccgg aggatcaggt aatttgctta cagaaaggag tacttttaca 1020
gatagccaac tcgggaatgc ggatatggaa atgacattgg agagagctgt atcaatgctg 1080
gaagcggatc atatgcttcc ttctagaatt tccgctgcgg caacttttat acagcacgaa 1140
tgttttcaaa aatccgaagc gcgaaagcgg gttaatcagc tgagaggtat tctgaaactg 1200
ttgcaacttt tgaaagtgca aaatgaagat gttcaaagag ctgtttgtgg agctcttaga 1260
aatcttgttt ttgaagataa tgataataaa ttggaagttg ctgaacttaa tggtgtacct 1320
agattgcttc aagttttgaa acaaacaaga gatttggaaa caaaaaaaca aataacagga 1380
cttttgtgga atctttcttc taatgataaa cttaaaaatt tgatgataac agaagctttg 1440
ttgacactta cagaaaatat tattatacct ttttctggat ggcctgaagg ggattatcca 1500
aaagctaatg ggttgctgga ttttgatatt ttttataatg tgacaggatg tttgaggaat 1560
atgtcctcag ctggtgctga cggtcggaaa gcaatgaggc gatgtgacgg tttgatcgat 1620
tcccttgttc attacgttag gggaacaata gctgattatc aaccagatga taaagcaaca 1680
gaaaattgtg tttgtattct tcataatctg tcttatcaat tggaagccga acttcctgaa 1740
aaatactctc aaaatatcta tattcagaat cggaacatac aaactgataa taacaaatct 1800
ataggatgtt ttggatcaag aagcagaaaa gttaaggaac aatatcaaga cgttcctatg 1860
cccgaagaaa aatcaaatcc aaagggtgta gaatggctgt ggcattctat tgttattaga 1920
atgtatttgt cactcatagc aaaatctgta cgaaattata cacaagaagc ttctttggga 1980
gcccttcaga atcttacagc aggaagtggt cctatgccta caagtgtagc gcaaacagtt 2040
gtacagaaag aatctggatt gcaacatact agaaagatgc tgcatgtagg agatccttct 2100
gttaaaaaga cagctataag cctcctgagg aacttgagtc gcaacttgtc tctccagaat 2160
gagattgcta aggaaacgct tcctgacctt gtatctatta tacctgacac ggtgccttcc 2220
acagatcttt tgattgaaac aactgcatct gcttgttata cattgaataa tatcattcaa 2280
aatagttatc agaacgcaag agatcttctg aatacaggag gtattcaaaa aataatggct 2340
atttcagcag gtgatgcata tgcttctaat aaagcgtcta aagctgcatc tgttcttttg 2400
tattctcttt gggcacatac agaacttcac catgcctaca agaaagctca attcaagaaa 2460
acagattttg ttaatagtcg cactgcaaaa gcgtatcatt cccttaagga ttaa 2514
<210> 88
<211> 2646
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 密码子优化的PKP2b多核苷酸
<400> 88
atggccgcac ctggagctcc agctgaatat ggatatatca ggactgtctt gggtcagcag 60
attctgggcc aactggattc ttcaagtctg gccctcccga gtgaggcaaa actgaaactc 120
gcaggatcta gtggaagggg cggacagaca gtgaagtcac tcaggattca ggagcaggtc 180
caacagacac tggcaagaaa agggaggtcc agcgtcggca atggtaactt gcatagaacc 240
tcttcagtgc ctgagtacgt gtacaacctg cacctggtgg aaaacgattt tgtgggcggc 300
agatccccgg tccctaaaac ttatgacatg ctgaaagctg gcacgacagc tacatatgaa 360
ggtagatggg gccggggcac cgcacaatat agttctcaga agtccgtgga agaaagatct 420
cttaggcacc cacttcggcg actggagata agtccagaca gcagccccga aagggcgcat 480
tatacacatt ctgactacca atacagccaa agatctcagg ctggccacac tctgcatcat 540
caggaaagta gaagggccgc ccttctcgtc cccccaagat acgcacggtc agaaatcgtg 600
ggagtgagca gagcaggtac cacctctcga cagaggcatt tcgacacata ccaccgacaa 660
taccaacatg gatcagtgtc agatactgtt tttgactcca taccagcaaa tccagcactc 720
ctgacatatc ctagaccggg gactagtcgc tccatgggga atctgctcga aaaagaaaac 780
tatctcaccg caggtctgac tgtggggcag gtaaggccgt tggtgcccct tcagcctgta 840
acgcagaata gggcttccag gtcatcctgg caccagagta gcttccactc cacaaggact 900
ctgagagagg caggccctag tgttgcagtt gatagttccg gtcgcagggc ccatcttaca 960
gttggtcaag ccgctgcagg gggtagcggt aatctgctga ccgaaagaag cacattcacg 1020
gattcccagc tcggaaatgc agacatggag atgacacttg aacgagccgt gagcatgctg 1080
gaagctgacc atatgctccc ttctagaatc tccgctgcgg ccactttcat ccagcacgag 1140
tgctttcaga aatccgaagc taggaaacgc gtgaaccagc tgaggggcat cctgaagctg 1200
ctgcagctgc ttaaggtgca gaatgaggat gtccaacgcg cagtgtgcgg tgctctgagg 1260
aacctcgtgt ttgaagataa cgataataag ttggaagtcg cagaacttaa cggggtacct 1320
cgactgctcc aggtgttgaa acagacacgg gacctggaaa cgaaaaaaca aattaccgac 1380
cacactgtga atctcagaag tcggaatggg tggcctgggg cagtagctca tgcctgtaac 1440
ccttctacat tgggtggcca aggcgggagg attaccagat caggggtacg ggatcaacct 1500
gatcagcacg ggctcctgtg gaacttgtcc tctaatgaca aactgaaaaa cctgatgata 1560
accgaggctc tgctgaccct gacagaaaac attatcatcc ccttctccgg atggccagaa 1620
ggagactatc ctaaagctaa cggcttgctg gacttcgata tcttttataa tgtcacaggg 1680
tgccttagaa atatgagtag cgccggtgcc gatggaagga aggcaatgcg ccggtgtgat 1740
ggtcttatcg attccctggt acattacgtg aggggcacca ttgccgacta ccaaccagac 1800
gataaagcaa ccgagaattg cgtgtgcatc ctgcacaatt tgagctacca actcgaagct 1860
gaactgcctg agaaatattc ccaaaatatt tatatccaga atcggaatat ccagaccgat 1920
aataacaaga gcataggatg ctttggttct agaagccgca aggtcaagga acagtaccag 1980
gatgtaccta tgccagagga aaaatcaaac cccaaaggag tggaatggct gtggcattcc 2040
atcgtgatca ggatgtacct gagtctgatt gctaagagcg tgaggaacta tacacaggag 2100
gcttcccttg gcgcactgca aaatctgacc gccggatctg ggccaatgcc aacaagcgtt 2160
gctcaaacag tagtgcaaaa ggaatctggc cttcagcaca ctaggaaaat gcttcatgtg 2220
ggagatcctt ctgtgaagaa gacggctatt agcctgctcc gcaacttgag cagaaacctt 2280
tctttgcaga atgagattgc gaaagagacg ctccctgacc tggtgtccat tataccagac 2340
acggtccctt ccacagatct tctgattgaa acgaccgctt ccgcatgtta caccctgaat 2400
aatattattc aaaactcata ccaaaatgct agagacctgc tgaacactgg ggggatccag 2460
aagattatgg caatttcagc cggcgatgcc tatgctagta ataaagcctc caaggccgcc 2520
agtgtattgc tgtatagtct gtgggcacat acagaactgc accacgcata taagaaggcc 2580
cagtttaaaa aaaccgattt cgtaaactct cggactgcaa aagcctacca ttcactgaaa 2640
gattga 2646
<210> 89
<211> 4650
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体基因组的多核苷酸序列
<400> 89
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtact ctggagacgc 180
gtacccttca gattaaaaat aactgaggta agggcctggg taggggaggt ggtgtgagac 240
gctcctgtct ctcctctatc tgcccatcgg ccctttgggg aggaggaatg tgcccaagga 300
ctaaaaaaag gccatggagc cagaggggcg agggcaacag acctttcatg ggcaaacctt 360
ggggccctgc tgtctagcat gccccactac gggtctaggc tgcccatgta aggaggcaag 420
gcctggggac acccgagatg cctggttata attaacccag acatgtggct gccccccccc 480
ccccaacacc tgctgcctct aaaaataacc ctgtccctgg tggatcccct gcatgcgaag 540
atcttcgaac aaggctgtgg gggactgagg gcaggctgta acaggcttgg gggccagggc 600
ttatacgtgc ctgggactcc caaagtatta ctgttccatg ttcccggcga agggccagct 660
gtcccccgcc agctagactc agcacttagt ttaggaacca gtgagcaagt cagcccttgg 720
ggcagcccat acaaggccat ggggctgggc aagctgcacg cctgggtccg gggtgggcac 780
ggtgcccggg caacgagctg aaagctcatc tgctctcagg ggcccctccc tggggacagc 840
ccctcctggc tagtcacacc ctgtaggctc ctctatataa cccaggggca caggggctgc 900
cctcattcta ccaccacctc cacagcacag acagacactc aggagccagc cagggtaagt 960
ttagtctttt tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact 1020
gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta 1080
aaagctgcgg aattgtaccc gcgccaccat ggcagccccc ggcgccccag ctgagtacgg 1140
ctacatccgg accgtcctgg gccagcagat cctgggacaa ctggacagct ccagcctggc 1200
gctgccctcc gaggccaagc tgaagctggc ggggagcagc ggccgcggcg gccagacagt 1260
caagagcctg cggatccagg agcaggtgca gcagaccctc gcccggaagg gccgcagctc 1320
cgtgggcaac ggaaatcttc accgaaccag cagtgttcct gagtatgtct acaacctaca 1380
cttggttgaa aatgattttg ttggaggccg ttcccctgtt cctaaaacct atgacatgct 1440
aaaggctggc acaactgcca cttatgaagg tcgctgggga agaggaacag cacagtacag 1500
ctcccagaag tccgtggaag aaaggtcctt gaggcatcct ctgaggagac tggagatttc 1560
tcctgacagc agcccggaga gggctcacta cacgcacagc gattaccagt acagccagag 1620
aagccaggct gggcacaccc tgcaccacca agaaagcagg cgggccgccc tcctagtgcc 1680
accgagatat gctcgttccg agatcgtggg ggtcagccgt gctggcacca caagcaggca 1740
gcgccacttt gacacatacc acagacagta ccagcatggc tctgttagcg acaccgtttt 1800
tgacagcatc cctgccaacc cggccctgct cacgtacccc aggccaggga ccagccgcag 1860
catgggcaac ctcttggaga aggagaacta cctgacggca gggctcactg tcgggcaggt 1920
caggccgctg gtgcccctgc agcccgtcac tcagaacagg gcttccaggt cctcctggca 1980
tcagagctcc ttccacagca cccgcacgct gagggaagct gggcccagtg tcgccgtgga 2040
ttccagcggg aggagagcgc acttgactgt cggccaggcg gccgcagggg gaagtgggaa 2100
tctgctcact gagagaagca ctttcactga ctcccagctg gggaatgcag acatggagat 2160
gactctggag cgagcagtga gtatgctcga ggcagaccac atgctgccat ccaggatttc 2220
tgctgcagct actttcatac agcacgagtg cttccagaaa tctgaagctc ggaagagggt 2280
taaccagctt cgtggcatcc tcaagcttct gcagctccta aaagttcaga atgaagacgt 2340
tcagcgagct gtgtgtgggg ccttgagaaa cttagtattt gaagacaatg acaacaaatt 2400
ggaggtggct gaactaaatg gggtacctcg gctgctccag gtgctgaagc aaaccagaga 2460
cttggagact aaaaaacaaa taacaggttt gctgtggaat ttgtcatcta atgacaaact 2520
caagaatctc atgataacag aagcattgct tacgctgacg gagaatatca tcatcccctt 2580
ttctgggtgg cctgaaggag actacccaaa agcaaatggt ttgctcgatt ttgacatatt 2640
ctacaacgtc actggatgcc taagaaacat gagttctgct ggcgctgatg ggagaaaagc 2700
gatgagaaga tgtgacggac tcattgactc actggtccat tatgtcagag gaaccattgc 2760
agattaccag ccagatgaca aggccacgga gaattgtgtg tgcattcttc ataacctctc 2820
ctaccagctg gaggcagagc tcccagagaa atattcccag aatatctata ttcaaaaccg 2880
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cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 4650
<210> 90
<211> 4274
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体基因组的多核苷酸序列
<400> 90
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
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ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga 3420
gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc 3480
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cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg 3780
tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcattg 3840
cctgcccggg tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc 3900
cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta 3960
ggtgtccttc tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg ggcccaagtt 4020
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gcgagcgagc gcgc 4274
<210> 91
<211> 4782
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体基因组的多核苷酸序列
<400> 91
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtact ctggagacgc 180
gtacccttca gattaaaaat aactgaggta agggcctggg taggggaggt ggtgtgagac 240
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gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta 1080
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gactctggag cgagcagtga gtatgctcga ggcagaccac atgctgccat ccaggatttc 2220
tgctgcagct actttcatac agcacgagtg cttccagaaa tctgaagctc ggaagagggt 2280
taaccagctt cgtggcatcc tcaagcttct gcagctccta aaagttcaga atgaagacgt 2340
tcagcgagct gtgtgtgggg ccttgagaaa cttagtattt gaagacaatg acaacaaatt 2400
ggaggtggct gaactaaatg gggtacctcg gctgctccag gtgctgaagc aaaccagaga 2460
cttggagact aaaaaacaaa taacagacca tacagtcaat ttaagaagta ggaatggctg 2520
gccgggcgcg gtggctcacg cctgtaatcc cagcactttg ggaggccaag gcgggcggat 2580
cacgaggtca ggagttcgag accagcctga ccaacatggt ttgctgtgga atttgtcatc 2640
taatgacaaa ctcaagaatc tcatgataac agaagcattg cttacgctga cggagaatat 2700
catcatcccc ttttctgggt ggcctgaagg agactaccca aaagcaaatg gtttgctcga 2760
ttttgacata ttctacaacg tcactggatg cctaagaaac atgagttctg ctggcgctga 2820
tgggagaaaa gcgatgagaa gatgtgacgg actcattgac tcactggtcc attatgtcag 2880
aggaaccatt gcagattacc agccagatga caaggccacg gagaattgtg tgtgcattct 2940
tcataacctc tcctaccagc tggaggcaga gctcccagag aaatattccc agaatatcta 3000
tattcaaaac cggaatatcc agactgacaa caacaaaagt attggatgtt ttggcagtcg 3060
aagcaggaaa gtaaaagagc aataccagga cgtgccgatg ccggaggaaa agagcaaccc 3120
caagggcgtg gagtggctgt ggcattccat tgttataagg atgtatctgt ccttgatcgc 3180
caaaagtgtc cgcaactaca cacaagaagc atccttagga gctctgcaga acctcacggc 3240
cggaagtgga ccaatgccga catcagtggc tcagacagtt gtccagaagg aaagtggcct 3300
gcagcacacc cgaaagatgc tgcatgttgg tgacccaagt gtgaaaaaga cagccatctc 3360
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ccctgatttg gtttccatca ttcctgacac agtcccgagt actgaccttc tcattgaaac 3480
tacagcctct gcctgttaca cattgaacaa cataatccaa aacagttacc agaatgcacg 3540
cgaccttcta aacaccgggg gcatccagaa aattatggcc attagtgcag gcgatgccta 3600
tgcctccaac aaagcaagta aagctgcttc cgtccttctg tattctctgt gggcacacac 3660
ggaactgcat catgcctaca agaaggctca gtttaagaag acagattttg tcaacagccg 3720
gactgccaaa gcctaccact cccttaaaga ctgatcaacc tctggattac aaaatttgtg 3780
aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt 3840
taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata 3900
aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg 3960
tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc 4020
tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct 4080
gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt 4140
cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg 4200
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ccctttgggc cgcctccccg catcattgcc tgcccgggtg gcatccctgt gacccctccc 4380
cagtgcctct cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcctaataa 4440
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<210> 92
<211> 4406
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 载体基因组的多核苷酸序列
<400> 92
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120
gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtact ctggagacgc 180
gtctcagtcc attaggagcc agtagcctgg aagatgtctt tacccccagc atcagttcaa 240
gtggagcagc acataactct tgccctctgc cttccaagat tctggtgctg agacttatgg 300
agtgtcttgg aggttgcctt ctgcccccca accctgctcc cagctggccc tcccaggcct 360
gggttgctgg cctctgcttt atcaggattc tcaagaggga cagctggttt atgttgcatg 420
actgttccct gcatatctgc tctggtttta aatagcttat ctgagcagct ggaggaccac 480
atgggcttat atggcgtggg gtacatgttc ctgtagcctt gtccctggca cctgccaaaa 540
tagcagccaa caccccccac ccccaccgcc atccccctgc cccacccgtc ccctgtcgca 600
cattcctccc tccgcagggc tggctcacca ggccccagcc cacatgcctg cttaaagccc 660
tctccatcct ctgcctcacc cagtccccgc tgagactgag cagacgcctc caggatctgt 720
cggcaggcca ccatggcagc ccccggcgcc ccagctgagt acggctacat ccggaccgtc 780
ctgggccagc agatcctggg acaactggac agctccagcc tggcgctgcc ctccgaggcc 840
aagctgaagc tggcggggag cagcggccgc ggcggccaga cagtcaagag cctgcggatc 900
caggagcagg tgcagcagac cctcgcccgg aagggccgca gctccgtggg caacggaaat 960
cttcaccgaa ccagcagtgt tcctgagtat gtctacaacc tacacttggt tgaaaatgat 1020
tttgttggag gccgttcccc tgttcctaaa acctatgaca tgctaaaggc tggcacaact 1080
gccacttatg aaggtcgctg gggaagagga acagcacagt acagctccca gaagtccgtg 1140
gaagaaaggt ccttgaggca tcctctgagg agactggaga tttctcctga cagcagcccg 1200
gagagggctc actacacgca cagcgattac cagtacagcc agagaagcca ggctgggcac 1260
accctgcacc accaagaaag caggcgggcc gccctcctag tgccaccgag atatgctcgt 1320
tccgagatcg tgggggtcag ccgtgctggc accacaagca ggcagcgcca ctttgacaca 1380
taccacagac agtaccagca tggctctgtt agcgacaccg tttttgacag catccctgcc 1440
aacccggccc tgctcacgta ccccaggcca gggaccagcc gcagcatggg caacctcttg 1500
gagaaggaga actacctgac ggcagggctc actgtcgggc aggtcaggcc gctggtgccc 1560
ctgcagcccg tcactcagaa cagggcttcc aggtcctcct ggcatcagag ctccttccac 1620
agcacccgca cgctgaggga agctgggccc agtgtcgccg tggattccag cgggaggaga 1680
gcgcacttga ctgtcggcca ggcggccgca gggggaagtg ggaatctgct cactgagaga 1740
agcactttca ctgactccca gctggggaat gcagacatgg agatgactct ggagcgagca 1800
gtgagtatgc tcgaggcaga ccacatgctg ccatccagga tttctgctgc agctactttc 1860
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 表达盒多核苷酸
<400> 93
acccttcaga ttaaaaataa ctgaggtaag ggcctgggta ggggaggtgg tgtgagacgc 60
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ctgccaaagc ctaccactcc cttaaagact gatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 3600
agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta 3660
atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 3720
tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg 3780
tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc 3840
ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc 3900
cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 3960
gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 4020
acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 4080
ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 4140
ctttgggccg cctccccgca tcattgcctg cccgggtggc atccctgtga cccctcccca 4200
gtgcctctcc tggccctgga agttgccact ccagtgccca ccagccttgt cctaataaaa 4260
ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tccttctata atattatggg gtggaggggg 4320
gtggtatgga gcaaggggcc caagttggga agaaacctgt agggcctgc 4369
<210> 96
<211> 3993
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实验室中制备 - 表达盒多核苷酸
<400> 96
ctcagtccat taggagccag tagcctggaa gatgtcttta cccccagcat cagttcaagt 60
ggagcagcac ataactcttg ccctctgcct tccaagattc tggtgctgag acttatggag 120
tgtcttggag gttgccttct gccccccaac cctgctccca gctggccctc ccaggcctgg 180
gttgctggcc tctgctttat caggattctc aagagggaca gctggtttat gttgcatgac 240
tgttccctgc atatctgctc tggttttaaa tagcttatct gagcagctgg aggaccacat 300
gggcttatat ggcgtggggt acatgttcct gtagccttgt ccctggcacc tgccaaaata 360
gcagccaaca ccccccaccc ccaccgccat ccccctgccc cacccgtccc ctgtcgcaca 420
ttcctccctc cgcagggctg gctcaccagg ccccagccca catgcctgct taaagccctc 480
tccatcctct gcctcaccca gtccccgctg agactgagca gacgcctcca ggatctgtcg 540
gcaggccacc atggcagccc ccggcgcccc agctgagtac ggctacatcc ggaccgtcct 600
gggccagcag atcctgggac aactggacag ctccagcctg gcgctgccct ccgaggccaa 660
gctgaagctg gcggggagca gcggccgcgg cggccagaca gtcaagagcc tgcggatcca 720
ggagcaggtg cagcagaccc tcgcccggaa gggccgcagc tccgtgggca acggaaatct 780
tcaccgaacc agcagtgttc ctgagtatgt ctacaaccta cacttggttg aaaatgattt 840
tgttggaggc cgttcccctg ttcctaaaac ctatgacatg ctaaaggctg gcacaactgc 900
cacttatgaa ggtcgctggg gaagaggaac agcacagtac agctcccaga agtccgtgga 960
agaaaggtcc ttgaggcatc ctctgaggag actggagatt tctcctgaca gcagcccgga 1020
gagggctcac tacacgcaca gcgattacca gtacagccag agaagccagg ctgggcacac 1080
cctgcaccac caagaaagca ggcgggccgc cctcctagtg ccaccgagat atgctcgttc 1140
cgagatcgtg ggggtcagcc gtgctggcac cacaagcagg cagcgccact ttgacacata 1200
ccacagacag taccagcatg gctctgttag cgacaccgtt tttgacagca tccctgccaa 1260
cccggccctg ctcacgtacc ccaggccagg gaccagccgc agcatgggca acctcttgga 1320
gaaggagaac tacctgacgg cagggctcac tgtcgggcag gtcaggccgc tggtgcccct 1380
gcagcccgtc actcagaaca gggcttccag gtcctcctgg catcagagct ccttccacag 1440
cacccgcacg ctgagggaag ctgggcccag tgtcgccgtg gattccagcg ggaggagagc 1500
gcacttgact gtcggccagg cggccgcagg gggaagtggg aatctgctca ctgagagaag 1560
cactttcact gactcccagc tggggaatgc agacatggag atgactctgg agcgagcagt 1620
gagtatgctc gaggcagacc acatgctgcc atccaggatt tctgctgcag ctactttcat 1680
acagcacgag tgcttccaga aatctgaagc tcggaagagg gttaaccagc ttcgtggcat 1740
cctcaagctt ctgcagctcc taaaagttca gaatgaagac gttcagcgag ctgtgtgtgg 1800
ggccttgaga aacttagtat ttgaagacaa tgacaacaaa ttggaggtgg ctgaactaaa 1860
tggggtacct cggctgctcc aggtgctgaa gcaaaccaga gacttggaga ctaaaaaaca 1920
aataacagac catacagtca atttaagaag taggaatggc tggccgggcg cggtggctca 1980
cgcctgtaat cccagcactt tgggaggcca aggcgggcgg atcacgaggt caggagttcg 2040
agaccagcct gaccaacatg gtttgctgtg gaatttgtca tctaatgaca aactcaagaa 2100
tctcatgata acagaagcat tgcttacgct gacggagaat atcatcatcc ccttttctgg 2160
gtggcctgaa ggagactacc caaaagcaaa tggtttgctc gattttgaca tattctacaa 2220
cgtcactgga tgcctaagaa acatgagttc tgctggcgct gatgggagaa aagcgatgag 2280
aagatgtgac ggactcattg actcactggt ccattatgtc agaggaacca ttgcagatta 2340
ccagccagat gacaaggcca cggagaattg tgtgtgcatt cttcataacc tctcctacca 2400
gctggaggca gagctcccag agaaatattc ccagaatatc tatattcaaa accggaatat 2460
ccagactgac aacaacaaaa gtattggatg ttttggcagt cgaagcagga aagtaaaaga 2520
gcaataccag gacgtgccga tgccggagga aaagagcaac cccaagggcg tggagtggct 2580
gtggcattcc attgttataa ggatgtatct gtccttgatc gccaaaagtg tccgcaacta 2640
cacacaagaa gcatccttag gagctctgca gaacctcacg gccggaagtg gaccaatgcc 2700
gacatcagtg gctcagacag ttgtccagaa ggaaagtggc ctgcagcaca cccgaaagat 2760
gctgcatgtt ggtgacccaa gtgtgaaaaa gacagccatc tcgctgctga ggaatctgtc 2820
ccggaatctt tctctgcaga atgaaattgc caaagaaact ctccctgatt tggtttccat 2880
cattcctgac acagtcccga gtactgacct tctcattgaa actacagcct ctgcctgtta 2940
cacattgaac aacataatcc aaaacagtta ccagaatgca cgcgaccttc taaacaccgg 3000
gggcatccag aaaattatgg ccattagtgc aggcgatgcc tatgcctcca acaaagcaag 3060
taaagctgct tccgtccttc tgtattctct gtgggcacac acggaactgc atcatgccta 3120
caagaaggct cagtttaaga agacagattt tgtcaacagc cggactgcca aagcctacca 3180
ctcccttaaa gactgatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 3240
ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 3300
ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 3360
tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 3420
acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 3480
ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 3540
caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct 3600
ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 3660
tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 3720
ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 3780
cgcatcattg cctgcccggg tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc 3840
tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt 3900
tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg 3960
ggcccaagtt gggaagaaac ctgtagggcc tgc 3993

Claims (90)

1.一种包含表达盒并且任选地侧接腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至启动子的编码Plakophilin-2(PKP2)或其功能变体的多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述启动子为心脏特异性启动子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中所述启动子为肌肉特异性启动子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子为心肌细胞特异性启动子。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子为肌球蛋白重链肌酸激酶7(MHCK7)启动子。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其中所述MHCK7启动子与SEQ ID NO:31具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子为心肌肌钙蛋白T(hTNNT2)启动子。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中所述hTNNT2启动子与SEQ ID NO:32具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述表达盒包含所述心肌肌钙蛋白T(hTNNT2)基因的外显子1，其中任选地所述hTNNT2启动子和外显子1一起与SEQ ID NO:32具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子为泛在启动子，任选地CMV启动子或CAG启动子。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多核苷酸，其中所述表达盒包含polyA信号。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所述polyA信号为人生长激素(hGH)polyA。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的多核苷酸，其中所述表达盒包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，任选地WPRE(x)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的多核苷酸，其中所述Plakophilin-2(PKP2)或其功能变体为PKP2。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中所述PKP2为功能性PKP2。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的多核苷酸，其中所述PKP2为人PKP2。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述PKP2为PKP2同种型A。
18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述PKP2同种型A与SEQ ID NO:1具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
19.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述PKP2为PKP2同种型B。
20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述PKP2与SEQ ID NO:2具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的多核苷酸，其中编码PKP2的所述多核苷酸序列为人PKP2多核苷酸。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的多核苷酸，其中编码PKP2的所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:3具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的多核苷酸，其中编码PKP2的所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:4具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少约4.0kb、至少约4.1kb、至少约4.2kb、至少约4.3kb、至少约4.4kb、或至少约4.5kb。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至多约4.1kb、至多约4.2kb、至多约4.3kb、至多约4.4kb、至多约4.5kb、或至多约4.6kb。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含4.0kb至4.6kb、4.0kb至4.5kb、或4.0kb至4.4kb，或者其中所述多核苷酸包含4.0kb至4.3kb、4.0kb至4.2kb、或4.0kb至4.1kb。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的多核苷酸，其中所述PKP2或其功能变体包含至少800个或至少830个氨基酸。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸与SEQ ID NO:8-15中的任何一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的多核苷酸，其中所述表达盒侧接5'和3'反向末端重复序列(ITR)。
30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中所述ITR为AAV2 ITR并且/或者所述ITR与SEQ ID NO:20-26中的任何一个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
31.一种基因疗法载体，所述基因疗法载体包含根据权利要求1至30中任一项所述的多核苷酸。
32.根据权利要求31所述的载体，其中所述基因疗法载体为重组腺相关病毒(rAAV)载体。
33.根据权利要求32所述的载体，其中所述rAAV载体为AAV9或其功能变体。
34.根据权利要求33所述的载体，其中所述rAAV载体包含与SEQ IDNO:77中的任何一个具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的衣壳蛋白。
35.根据权利要求32所述的载体，其中所述rAAV载体为AAVrh10或其功能变体。
36.根据权利要求35所述的载体，其中所述rAAV载体包含与SEQ IDNO:79中的任何一个具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的衣壳蛋白。
37.根据权利要求32所述的载体，其中所述rAAV载体为AAV6或其功能变体。
38.根据权利要求37所述的载体，其中所述rAAV载体包含与SEQ IDNO:78中的任何一个具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的衣壳蛋白。
39.根据权利要求38所述的载体，其中所述rAAV载体为AAVrh74或其功能变体。
40.根据权利要求39所述的载体，其中所述rAAV载体包含与SEQ IDNO:80中的任何一个具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的衣壳蛋白。
41.一种在有此需要的受试者中治疗和/或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求31至40中任一项所述的载体。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述疾病或病症为心脏病症。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述疾病或病症为心肌病。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述心肌病为致心律失常性右心室心肌病(ARVC)。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述心肌病为肥厚型心肌病或扩张型心肌病。
46.根据权利要求41所述的方法，其中所述疾病或病症的特征在于心肌的纤维脂肪浸润。
47.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述疾病或病症为心力衰竭。
48.根据权利要求41至57中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者为灵长类动物。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述受试者为人。
51.根据权利要求41至50中任一项所述的方法，其中所述受试者在PRP2基因中具有突变。
52.根据权利要求41至51中任一项所述的方法，其中所述载体通过静脉内注射、心内注射、心内输注和/或心导管插入术来施用。
53.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述施用使PKP2表达增加至少约5％。
54.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述施用使PKP2表达增加至少约30％。
55.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述施用使PKP2表达增加至少约70％。
56.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述施用使PKP2表达增加约5％至约10％。
57.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述施用使PKP2表达增加约30％至约50％。
58.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述施用使PKP2表达增加约50％至约70％。
59.根据权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述施用使PKP2表达增加约70％至约100％。
60.根据权利要求41至59中任一项所述的方法，其中所述方法治疗和/或预防所述疾病或病症。
61.根据权利要求41至60中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用有效量的所述载体。
62.根据权利要求41至61中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症与所述受试者中PKP2中的功能丧失相关或由其引起。
63.根据权利要求41至61中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症与所述受试者中PKP2中的功能获得相关或由其引起。
64.根据权利要求41至63中任一项所述的方法，其中相对于编码具有SEQ ID NO:2的序列的人PKP2的人PKP2基因，所述受试者具有导致选自p.Arg490Trp、Asp26Asn、Thr50_Val51SerfsX60、Arg79X、Tyr86X、Gln133X、Val406SerfsX3、Tyr616X、Trp676X、Cys796Arg、Cys796E、Tyr807X、Glu62Lys、S688P、Trp848X、Y86X、V406X、Y616X、W848X和Y807X的氨基酸取代的突变。
65.根据权利要求41至64中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用包含有效量的载体的药物组合物。
66.根据权利要求41至65中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用所述载体的约1×1011个载体基因组至约1×1013个载体基因组，向受试者施用载体的约1×1012个载体基因组至约1×1014个载体基因组，或向受试者施用载体的约1×1013个载体基因组至约1×1015个载体基因组。
67.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求31至40中任一项所述的载体。
68.一种试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求31至40中任一项所述的载体或根据权利要求68所述的药物组合物和任选地使用说明书。
69.根据权利要求31至40中任一项所述的载体用于任选地根据权利要求41至66中任一项所述的方法治疗疾病或病症的用途。
70.根据权利要求31至40中任一项所述的载体，其用于任选地根据权利要求41至66中任一项所述的方法治疗疾病或病症。
71.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:12-15和89-92中的任何一个或与SEQ ID NO:8-11和93-96中的任何一个具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的多核苷酸序列。
72.根据权利要求71所述的多核苷酸，其中所述启动子为MHCK7启动子。
73.根据权利要求72所述的多核苷酸，其中所述MHCK7启动子与SEQ ID NO:31具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
74.根据权利要求71所述的多核苷酸，其中所述PKP2为人PKP2。
75.根据权利要求74所述的多核苷酸，其中所述PKP2为PKP2同种型A。
76.根据权利要求75所述的多核苷酸，其中所述PKP2同种型A与SEQ ID NO:1具有至少80％、90％、95％、99％或100％的同一性。
77.一种基因疗法载体，所述基因疗法载体包含根据权利要求71至76中任一项所述的多核苷酸。
78.根据权利要求77所述的载体，其中所述基因疗法载体为重组腺相关病毒(rAAV)载体。
79.根据权利要求78所述的载体，其中所述rAAV载体为AAV9载体。
80.根据权利要求78所述的载体，其中所述rAAV载体为AAVrh74载体。
81.一种在鉴定为在PRP2基因中具有突变的受试者中治疗和/或预防心脏病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求77至80中任一项所述的载体。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述心脏病症为心肌病，任选地致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、肥厚型心肌病或扩张型心肌病。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述心脏病症为心力衰竭。
84.根据权利要求81至83中任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物。
85.根据权利要求81至84中任一项所述的方法，其中所述载体通过静脉内注射、心内注射、心内输注和/或心导管插入术来施用。
86.根据权利要求81至85中任一项所述的方法，其中与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少左心室射血分数百分比(LVEF％)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
87.根据权利要求81至86中任一项所述的方法，其中与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少左心室缩短分数百分比(FS％)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
88.根据权利要求81至87中任一项所述的方法，其中与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的增加相比，所述方法防止或减少以平方毫米为单位的右心室面积(RV面积(mm2)的增加，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
89.根据权利要求81至88中任一项所述的方法，其中与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的降低相比，所述方法防止或减少以毫米每秒为单位的右心室速度时间积分(RV VTI(mm/sec)的降低，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
90.根据权利要求81至89中任一项所述的方法，其中与在鉴定为在PRP2基因中具有突变的未经治疗的受试者中观察到的增加相比，所述方法防止或减少左心室或右心室纤维化的增加，任选地减少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％。
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