KR20230019402A - 프로그래뉼린 연관 신경변성 질환 또는 장애의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 (aav) 시스템 - Google Patents

프로그래뉼린 연관 신경변성 질환 또는 장애의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 (aav) 시스템 Download PDF

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KR20230019402A
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주안 리
타나즈 파리바르
사비트리 만다파디
스티븐 페녹
마크 셔먼
주디스 뉴마크
아드리안 티멀스
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어플라이드 제네틱스 테크놀로지스 코퍼레이션
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Abstract

본 개시내용은, 부분적으로, 가족성 전두측두엽 치매 (FTD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL), 또는 알츠하이머병 (AD)을 포함한, 인지 장애, 행동 장애, 및 리소좀 축적 결핍을 특징으로 하는 신경변성 장애에 대한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 기반 유전자 요법에 사용하기 위한 최적으로 변형된 프로그래뉼린 (PGRN) cDNA 및 연관 유전 요소를 제공한다.

Description

프로그래뉼린 연관 신경변성 질환 또는 장애의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 (AAV) 시스템
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/924,340을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 대상체 또는 세포에서 단리된 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 AAV 벡터를 포함한 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함한 핵산 구축물, 프로모터, 벡터, 및 숙주 세포 뿐만 아니라 표적 세포, 조직, 장기 또는 유기체에 외인성 DNA 서열을 전달하는 방법, 및 프로그래뉼린 연관 신경변성 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 사용하는 방법에 관한 것이다.
유전자 요법은 유전자 발현 프로필에서의 이상에 의해 유발된 유전자 돌연변이 또는 후천성 질환으로 인해 고통받는 환자에 대한 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 유전자 요법은 장애, 질환, 악성 종양 등을 초래할 수 있는, 결함성 유전자 또는 비정상적인 조절 또는 발현, 예를 들어 과소발현 또는 과다발현으로 인한 의학적 병태의 치료 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 결함성 유전자에 의해 야기되는 질환 또는 장애는 환자에게 교정된 유전 물질을 전달함으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있거나, 또는 결함성 유전자를 변경 또는 침묵시킴으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있으며, 예를 들어 환자에게 교정된 유전 물질을 전달함으로써 환자 내에서 유전 물질의 치료적 발현을 초래할 수 있다.
유전자 요법의 기본은 전사 카세트에 활성 유전자 산물 (때로는 트랜스진 또는 치료 핵산으로서 지칭됨)을 공급하여, 예를 들어, 긍정적인 기능 획득 효과, 부정적인 기능 상실 효과 또는 또 다른 결과를 초래할 수 있도록 하는 것이다. 이러한 결과는 치료 단백질, 예컨대 항체, 기능적 효소 또는 융합 단백질의 발현에 기인할 수 있다. 유전자 요법은 또한 다른 요인에 의해 야기되는 질환 또는 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 인간 단일유전인자 장애는 정상 유전자를 표적 세포에 전달하고 발현함으로써 치료될 수 있다. 환자의 표적 세포에서 교정 유전자의 전달과 발현은 조작된 바이러스와 바이러스 유전자 전달 벡터의 사용을 포함한 많은 방법을 통해 수행될 수 있다.
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 파보비리다에(Parvoviridae) 과에 속하며, 보다 구체적으로 데펜도파보바이러스 속을 구성한다. AAV로부터 유래된 벡터 (즉, 재조합 AAV (rAAV) 또는 AAV 벡터)는 유전 물질을 전달하는 데 매력적인데, 이는 (i) 이들이 근세포와 뉴런을 포함한 매우 다양한 비-분열 세포와 분열 세포 유형을 감염 (형질도입)시킬 수 있으며; (ii) 바이러스 구조 유전자가 없으며, 이로써 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 반응, 예를 들어 인터페론 매개 반응이 감소되며; (iii) 야생형 바이러스는 인간에게서 비-병리적인 것으로 간주되며; (iv) 숙주 세포 게놈에 통합할 수 있는 야생형 AAV와 반대로, 복제 결핍성 AAV 벡터는 rep 유전자가 결여되고 일반적으로 에피솜으로서 지속되므로, 삽입 돌연변이 유발 또는 유전독성의 위험을 제한하며; (v) 다른 벡터 시스템과 비교하여, AAV 벡터는 일반적으로 상대적으로 약한 면역원인 것으로 간주되므로, 유의미한 면역 반응을 촉발하지 않으므로 (ii 참조), 벡터 DNA의 지속성과 잠재적으로 치료 트랜스진의 장기적 발현을 확보하기 때문이다.
프로그래뉼린 (PGRN)은 뉴런 세포를 포함한 많은 세포 유형에 대한 영양 인자로서 작용하고, 염증을 조정하며, 상처 복구를 용이하게 하는 널리 발현되고 분비되는 당단백질이다. PGRN은 뉴런 세포의 발달, 상처 치유, 혈관신생, 성장 및 유지, 및 염증을 포함한 여러 프로세스의 조절에 관여한다. PGRN은 뉴런과 미세아교세포에서 발현되며 (문헌 [Petkau et al., Neurol. 2010. 518, 3931-3947]), 염증 (문헌 [Yin et al., J. Exp. Med. 2010. 207, 117-12; Tang et al., Science. 2010; 332, 478-484]), 상처 복구 (문헌 [He et al., Nat. Med. 2003. 9, 225-229]) 및 신경돌기 성장 (문헌 [Van Damme et al., J. Cell Biol. 181, 37-41])과 관련이 있다. 미세아교세포에서, 프로그래뉼린은 구성적으로 발현되고 분비된다. 뉴런에서의 프로그래뉼린은 리소좀 효소, 예컨대 β-글루코세레브로시다제 및 카텝신 D의 적당한 트래피킹과 기능을 위해 중요하다.
소르틸린은 PGRN과 결합하고 리소좀 분해를 위해 PGRN을 표적화하므로, PGRN의 세포외 수준을 부정적으로 조절한다 (Hu, F et al. 2010. Neuron 68, 654-667). 이와 관련하여, 소르틸린의 결핍은 생체내 마우스 모델과 인간 세포 둘 다에서 혈장 PGRN 수준을 유의미하게 증가시킨다 (Carrasquillo. M. M et al., 2010. Am J Hum Genet 87, 890-897; Lee, W. C et al., 2010. 23, 1467-1478). 소르틸린의 다형성은 인간에서의 PGRN 혈청 부하와 강하게 연관되는 것으로 나타났다 (Carrasquillo M. et al., 2010. Am J Hum Genet. 10; 87(6):890-7). Tanaka et al., Hum Mol Genet. 2017 Mar 1;26(5):969-988; Paushter et al., Acta Neuropathol. 2018 Jul;136(1):1-1; Hu et al., Neuron. 2010 Nov 18;68(4):654-67; Zheng et al., PLoS One. 2011. 6(6):e21023; Nicholson et al., Nat Commun. 2016 Jun 30;7:11992; Zhou et al., J Neurochem. 2017 Oct;143(2):236-243).
PGRN 발현 변경은 여러 신경변성 장애에서 나타났으며, 최근 신경변성 질환의 유전적 병인에 대한 연구 결과, PGRN 유전자에서의 유전적인 돌연변이가 뉴런 생존의 감소로 인해 성인 발병 신경변성 장애의 발생으로 이어질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 완전한 PGRN 결핍 (즉, 동형접합성 PGRN 돌연변이체) 및 기능 상실 돌연변이는 가족성 전두측두엽 치매 (FTD)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경변성 질환 또는 장애; 및 뉴런 세로이드 리포푸신증 11 (CLN11)을 포함한 신경변성 리소좀 축적 장애 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL)을 초래한다. 전두측두엽 치매 (FTD)는 인지 및 행동 장애를 특징으로 하는 신경변성 장애 군을 포괄한다. 프로그래뉼린 (PGRN)에서의 이형접합성 돌연변이는 가족성 FTD를 유발하고 PGRN 발현을 감소시키는 반면, 동형접합성 돌연변이는 PGRN 발현의 완전한 상실을 초래하고 NCL을 유발한다. 성인 발병 CLN이라고도 하는 CLN11은 FTD와 일부 임상 특징, 예컨대 인지 저하 및 최종 사망을 공유하지만, 또한 망막 이영양증으로 인한 점진적인 시력 상실, 발작, 소뇌 운동실조 및 소뇌 위축을 특징으로 한다. 낮은 PGRN은 신경 염증을 촉진하고 말초 염증 병태, 예컨대 관절염 및 죽상 동맥경화증을 증진시키며, 따라서 신경 염증이나 말초 염증을 특징으로 하는 임의의 장애는 PGRN에 대한 잠재적 표적이 될 수 있다. 특히, 낮은 PGRN은 정신분열증, 양극성 및 정신 장애에 대한 위험 인자이다 (Chitramuthu et al., Brain. 2017 Dec 1;140(12):3081-3104).
FTD는 60세 미만의 사람에게 치매의 흔한 원인인 치명적인 변성 뇌 질환이다. 종종 전성기의 사람에 발병하는 FTD는 언어와 행동을 담당하는 영역인 뇌의 전두엽 부분이 점진적으로 변성하는 것을 특징으로 한다. FTD 환자는 질환의 진행 과정에서 적절한 행동, 판단, 의사소통 및 일상 활동을 수행할 수 있는 능력을 상실할 수 있다. 전두측두엽 변성 (FTLD)은 FTD 증후군을 유발할 수 있는 병리학적 진단의 집합체를 지칭한다. 프로그래뉼린 보충제는 신경변성 질환, 예컨대 알츠하이머병 (AD), 파킨슨병 (PD) 및 파킨슨병-유사 질환 (문헌 [Capell et al., 2011; Cenik et al., 2011; Van Kampen et al., 2014; Minami et al., 2015]), 급성 뇌손상 (문헌 [Tao et al., 2012; Egashira et al., 2013; Jackman et al., 2013; Kanazawa et al., 2015; Zhao and Bateman, 2015; Altmann et al., 2016b; Xie et al., 2016])을 포함한 여러 질환 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 프로그래뉼린은 많은 말초 병태, 특히 중요한 염증 성분이 있는 병태에 대한 치료 표적으로서 시사되어 왔다 (He et al., 2003; Sfikakis and Tsokos, 2011; Guo et al., 2012; Jian et al., 2013; Choi et al., 2014; Huang et al., 2015; Zhou et al., 2015a). 반수체 기능 부전으로 이어지는 PGRN에서의 이형접합성 돌연변이는 가족성 FTD의 대략 20%를 차지한다 (The Association for Frontotemporal Degeneration website (2019); Petkau & Leavitt Trends in Neurosci. 2014 37(7): 388-98).
신경변성 장애는 고령화 사회에서 상당한 사회적 및 경제적 문제를 나타낸다. 현재 FTD는 치매 스펙트럼의 유병률과 발병률 관점에서 알츠하이머 다음으로 높긴 하지만, FTD에 대한 승인된 치료법이나 치유법이 없다. 현재 신경변성 장애의 치료는 일반적으로 증상의 진행을 늦추고 환자를 더 편안하게 만들기 위한 의사의 노력을 수반하며, 대부분의 치료는 신경학적 퇴행의 진행을 감추는 것 뿐이다. 현재로서는, 신경변성 질환 또는 장애에 대한 임상 개발중인 프로그래뉼린 유전자 요법은 없다. 따라서, 신경변성 질환 또는 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물에 대한 필요성이 여전히 요망된다.
본 개시내용은 프로그래뉼린 (PGRN) 돌연변이와 연관된 신경변성 장애를 앓고 있는 환자에게 CNS-표적화된 전달을 위해 프로그래뉼린 발현 카세트를 패키징할 수 있는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터에 관한 것이다.
한 측면에 따르면, 본 개시내용은 프로그래뉼린을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 비-자연 발생 서열이다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 포유류 프로그래뉼린을 코딩한다. 일부 실시양태에 따르면, 포유류 프로그래뉼린은 인간 프로그래뉼린이다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호(SEQ ID NO): 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6으로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10으로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 96% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 97% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 98% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13으로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 포유류 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 cDNA 서열이다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 작동가능하게 연결된 기능적으로 최적화된 N-말단 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 작동가능하게 연결된 헤마글루티닌 C-말단 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 작동가능하게 연결된 소르틸린 결합 억제 (SBI) 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 작동가능하게 연결된 뉴런-특이적 인간 시냅신-1 프로모터 (hSYN1)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 작동가능하게 연결된 편재적 활성 CBA 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 마우스 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 래트 튜뷸린 알파 1 (Ta1) 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 래트 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 인간 혈소판 유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 EF1알파 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 본원의 측면 및 실시양태에 기재된 프로모터 중 임의의 것은 프로모터 서열의 5' (상류)에 위치하는 부가의 CAG/CMV 인핸서 요소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 높은 프로그래뉼린 발현을 구동하도록 최적화된다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는 작동가능하게 연결된 3'UTR 조절 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시양태에 따르면, 폴리아데닐화 신호는 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시양태에 따르면, 폴리뉴클레오티드는 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는 3'UTR 조절 영역에 작동가능하게 연결된, 부가의 5' CAG/CMV 인핸서 요소를 추가로 포함하는, 뉴런-특이적 인간 시냅신-1 프로모터, 마우스 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터, 래트 튜뷸린 알파 1 (Ta1) 프로모터, 래트 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터, 인간 혈소판 유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터, 또는 편재적 활성 CBA 프로모터, 편재적 활성 EF1알파 프로모터, 또는 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 제시된 프로모터 중 임의의 것에 작동가능하게 연결된, 헤마글루티닌 C-말단 태그 또는 소르틸린 결합 억제 (SBI) 도메인을 임의로 포함하는, 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 포유류 세포이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스 (rHSV)를 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 및 최소 조절 요소를 포함하는 트랜스진 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 청구항 24의 발현 카세트를 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 트랜스진 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열의 혈청형 및 상기 AAV 벡터의 ITR의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터, 및 AAV 게놈 카세트를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, AAV 게놈 카세트는 2개의 서열-조정된 역위 말단 반복부에 의해 플랭킹된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는 3'UTR 조절 영역에 작동가능하게 연결된, 부가의 5' CAG/CMV 인핸서 요소를 추가로 포함하는, 뉴런-특이적 인간 시냅신-1 프로모터 (hSYN), 마우스 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터, 래트 튜뷸린 알파 1 (Ta1) 프로모터, 래트 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터, 인간 혈소판 유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터, 또는 편재적 활성 CBA 프로모터, 편재적 활성 EF1알파 프로모터, 또는 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 제시된 프로모터 중 임의의 것에 작동가능하게 연결된, 헤마글루티닌 C-말단 태그 또는 소르틸린 결합 억제 (SBI) 도메인을 임의로 포함하는, N-말단 신호 서열에 작동가능하게 연결된, 본원의 측면 및 실시양태 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터를 제공하며, 여기서 2개의 서열 조정된 역위 말단 반복부 (ITR)는 AAV 게놈 카세트를 플랭킹하고, 단백질 캡시드 변이체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 폴리아데닐화 신호는 SV40 또는 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 높은 프로그래뉼린 발현을 구동하도록 최적화된다. 일부 실시양태에 따르면, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, rhAAV10 (AAVrh10이라고도 함), AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형이다. 일부 실시양태에 따르면, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, rh-AAV10, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 변이체 또는 혼성체이다. 일부 실시양태에 따르면, rAAV는 AAV 비리온 내에 포함된다.
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 AAVrh10-hSYN-PGRNwt를 포함하는 발현 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 발현 벡터를 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스 (rHSV)를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 숙주 세포는 포유류 세포이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 및 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드 및 최소 조절 요소를 포함하는 트랜스진 발현 카세트를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 발현 카세트를 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 재조합 단순 헤르페스 바이러스 (rHSV)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 트랜스진 발현 카세트를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 발현 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 조성물은 제약 조성물이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 신경변성 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 트랜스진 발현 카세트를 신경변성 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 발현 벡터를 신경변성 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터를 신경변성 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 신경변성 장애의 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 트랜스진 발현 카세트를 신경변성 장애의 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 발현 벡터를 신경변성 장애의 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터를 신경변성 장애의 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 (rAAV) 바이러스 입자를 신경변성 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 (rAAV) 바이러스 입자를 신경변성 장애의 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 신경변성 장애는 인지 장애, 행동 장애, 리소좀 축적 결핍, 또는 그의 조합을 특징으로 한다. 일부 실시양태에 따르면, 신경변성 장애는 프로그래뉼린-연관 신경변성 장애이다. 일부 실시양태에 따르면, 신경변성 장애는 가족성 전두측두엽 치매 (FTD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL), 또는 알츠하이머병 (AD)이다. 일부 실시양태에 따르면, 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL)은 뉴런 세로이드 리포푸신증-11 (CLN11)이다. 일부 실시양태에 따르면, 투여는 중추 신경계에 대한 것이다. 일부 실시양태에 따르면, 투여는 정맥내, 뇌실내, 척수강내, 또는 그의 조합이다.
한 측면에 따르면, 본 개시내용은: 각각 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV cap 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 재조합 헤르페스바이러스; 및 프로그래뉼린 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 재조합 헤르페스바이러스로 현탁 세포를 공동 감염시키는 단계; 및 세포가 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하도록 하며, 이로써 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함하는, 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, cap 유전자는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, rh-AAV-10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 AAV로부터 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 제1 헤르페스바이러스 및 제2 헤르페스바이러스는 시토메갈로바이러스 (CMV), 단순 헤르페스 (HSV), 및 바리셀라 조스터 (VZV), 및 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스이다. 일부 실시양태에 따르면, 헤르페스바이러스는 복제 결함성이다. 일부 실시양태에 따르면, 공동 감염은 동시 감염이다.
도 1은 각각의 말단에 있는 역위 말단 반복부 (ITR), 인간 시냅신 1 (hSYN1) 또는 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터, C-말단 HA 태그 또는 C-말단에서의 3-16개 핵산의 결실을 임의로 포함하는 PGRN, 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사후 조절 요소 (WPRE), SV40 초기 폴리아데닐화 신호 (SV40pA) 및 임의로 스터퍼 DNA를 포함하는 PGRN 구축물의 대략도를 보여준다. 하단 패널은 자기-상보적 AAV 게놈의 도식을 보여준다.
도 2는 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 1)을 나타낸다.
도 3은 인간 시냅신 1 (hSYN1) 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 2)을 나타낸다.
도 4는 단일 가닥 (ss) 및 자기-상보적 (sc) AAV 게놈에 대한 5'-3' 역위 말단 반복부 (ITR) (서열식별번호: 3)를 나타낸다.
도 5a는 단일 가닥 (ss) AAV 게놈 단독에 대한 3'-5' ITR (서열식별번호: 4)을 나타낸다. 도 5b는 자기-상보적 (sc) AAV 게놈 단독에 대한 3'-5' TRS (서열식별번호: 26)를 나타낸다. TRS는 단축된 ITR을 지칭한다.
도 6은 야생형 인간 프로그래뉼린 (hPGRNwt)의 핵산 서열 (서열식별번호: 5)을 나타낸다.
도 7은 야생형 마우스 프로그래뉼린 (mPGRNwt)의 핵산 서열 (서열식별번호: 6)을 나타낸다. mPGRNwt는 hPGRN과 78% 유사하다.
도 8은 마카크 [마카카 물라타(Macaca mulatta)]의 핵산 서열 (서열식별번호: 7)을 나타낸다. 마카크 PGRN은 hPGRN과 96% 유사하다.
도 9는 hPGRNcoA의 핵산 서열 (서열식별번호: 8)을 나타낸다.
도 10은 hPGRNcoB의 핵산 서열 (서열식별번호: 9)을 나타낸다.
도 11은 hPGRNcoC의 핵산 서열 (서열식별번호: 10)을 나타낸다.
도 12는 hPGRNcoD의 핵산 서열 (서열식별번호: 11)을 나타낸다.
도 13은 hPGRNcoE의 핵산 서열 (서열식별번호: 12)을 나타낸다.
도 14는 hPGRNcoF의 핵산 서열 (서열식별번호: 13)을 나타낸다.
도 15는 hPGRN 소르틸린-결합 결핍 변이체의 핵산 서열 (서열식별번호: 14)을 나타낸다.
도 16은 헤마글루티닌 (HA) 태그의 핵산 서열 (서열식별번호: 15)을 나타낸다.
도 17은 WPRE의 핵산 서열 (서열식별번호: 16)을 나타낸다.
도 18은 SV40 pA의 핵산 서열 (서열식별번호: 17)을 나타낸다.
도 19는 진뱅크 AJ222796, nuc 7625-7988로부터의 서열에 상응하는 CaMKII 프로모터 (364 bp) 의 핵산 서열 (서열식별번호: 18)을 나타낸다.
도 20은 래트 튜뷸린 알파 1 (Ta1) 프로모터 (1034 bp)의 핵산 서열 (서열식별번호: 19)을 나타낸다.
도 21은 래트 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터 (1801 bp)의 핵산 서열 (서열식별번호: 20)을 나타낸다.
도 22는 인간 혈소판 유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF-B) 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 21 (PDGFB_1), 서열식별번호: 24 (PDG-B_2) 및 서열식별번호: 25 (PDGFB_3))을 나타낸다. 인간 게놈에는 3가지 규정된 PDGF-B 프로모터가 있으며, 염색체 NC_000022.11의 [-] 가닥 상의 위치 39244982 - 39244621에 걸쳐 있다. PDGF-B 프로모터에 대한 서열은 제공된 3개의 코어 프로모터 서열 중 최소 1개 또는 그의 임의의 독특한 조합을 포함한다. 산재된 서열은 서열을 전혀 포함하지 않는, 임의의 비-코딩, 비-조절 기능적 서열일 수 있다.
도 23은 EF1알파 프로모터 (806 bp)의 핵산 서열 (서열식별번호: 22)을 나타낸다.
도 24는 CAG/CMV 인핸서의 핵산 서열 (서열식별번호: 23)을 나타낸다.
도 25는 척수강내 주사 후 비-인간 영장류에서 GFP 리포터의 발현을 시험한 rAAVrh10, AAV9, ΔHSmax 및 AAV2tyf 캡시드의 결과를 요약한 것이다. 뇌의 다양한 영역에서의 GFP 양성 세포 퍼센트와 GFP 강도가 제시된다.
도 26은 소뇌숨뇌수조 (ICM) 내로의 주사에 의한 비-인간 영장류에서의 rAAVrh10 생체내 분포의 결과를 요약한 것이다.
도 27은 HEK293 및 SH-SY5Y 세포에서 GFP 발현에 대한 CBA 또는 hSYN 프로모터의 효과를 시험한 실험 결과를 도시한 그래프를 나타낸다.
도 28은 AD5 벡터 존재 및 부재의 경우에, HEK293 및 SHSY-5Y 세포에서 rAAVRh10-CBA-hGFP 형질도입 후의 GFP 발현을 도시한 그래프를 나타낸다.
도 29는 야생형과 비교하여 6개의 PGRN 코돈 최적화된 변이체 (coA-coF로 명명됨)의 단백질 발현을 결정하기 위한 ELISA 실험의 결과를 나타낸다.
도 30은 야생형과 비교하여 6개의 PGRN 코돈 최적화된 변이체 (coA-coF로 명명됨)의 단백질 발현을 결정하기 위한 웨스턴 블롯 실험의 결과를 나타낸다.
도 31은 HEK 293 세포에서 프로그래뉼린 발현에 대한 hSYN 프로모터의 제어 하에 코돈 최적화된 변이체 coE (PGRNcoE) 및 coF (PGRNcoF)의 효과를 시험한 결과를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 32는 프로그래뉼린 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯 실험 결과를 나타낸다.
도 33은 야생형과 비교하여 6개의 PGRN 코돈 최적화된 변이체 (coA-coF로 명명됨)의 단백질 발현을 결정하기 위한 ELISA 실험의 결과를 나타낸다.
도 34는 rAAVRh10-hSYN-PGRNwt를 사용한 NHP에서의 생체내 연구에서 8주 및 10주 후에 결정된 프로그래뉼린 발현을 나타낸다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 통상의 기술자에게 제공한다: 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (Eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)]. 본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 달리 명시되지 않는 한 하기에 제시된 의미를 가진다.
단수 형태는 본원에서 하나 또는 하나 초과 (즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
용어 "포함한"은 본원에서 "포함하나 이에 제한되지는 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 사용되고, 이러한 문구와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 본원에서 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는 한 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되며, 이와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "예컨대"는 본원에서 "예컨대 ~이나 이에 제한되지는 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 사용되고, 이러한 문구와 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "투여하다", "투여하는 것", "투여" 등은 생물학적 작용의 원하는 부위에 치료제 또는 제약 조성물을 전달할 수 있게 하는 데 사용되는 방법을 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "AAV 비리온"은 AAV 캡시드 단백질에 패키징된 단일 가닥 게놈 DNA를 포함하는 완전한 바이러스 입자, 예컨대 예를 들어 야생형 AAV 비리온 입자를 광범위하게 지칭하는 것을 의미한다. 단일 가닥 핵산 분자는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 중 하나이며, 이는 두 가닥 모두 동등하게 전염성이 있기 때문이다. 용어 "rAAV 바이러스 입자"는 재조합 AAV 바이러스 입자, 즉 감염성이지만 복제 결함성인 입자를 지칭한다. rAAV 바이러스 입자는 AAV 캡시드 단백질에 패키징된 단일 가닥 게놈 DNA를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "생물반응기"는 세포 배양 목적으로 사용될 수 있는 임의의 장치를 광범위하게 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함하는 것을 의미한다. 제약상 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 문구 "제약상 허용되는"은 숙주에게 투여했을 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 일으키지 않는 분자적 실체 및 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "플랭킹"은 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적인 위치를 지칭한다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B는 A와 C에 의해 플랭킹된다. 배열 AxBxC에 대해서도 마찬가지이다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열의 앞 또는 뒤에 위치하지만, 플랭킹된 서열과 연속되거나 이에 바로 인접할 필요는 없다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자 전달"은 유전자 요법의 적용을 위해 외래 DNA가 숙주 세포로 전달되는 프로세스를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유전자" 또는 "코딩 서열"은 단백질을 코딩하는 DNA 영역 (전사된 영역)을 광범위하게 지칭하는 것을 의미한다. 코딩 서열은 적절한 조절 영역, 예컨대 프로모터의 제어 하에 놓일 때 전사되고 (DNA) 폴리펩티드로 번역된다 (RNA). 유전자는 폴리아데닐화 부위를 포함하는 작동가능하게 연결된 여러 단편, 예컨대 프로모터, 5'-리더 서열, 코딩 서열 및 3'-비번역 서열을 포함할 수 있다. "유전자의 발현"이라는 문구는 유전자가 RNA로 전사되고/되거나 활성 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "관심 유전자 (GOI)"는 AAV 발현 벡터 내로 도입된 이종 서열을 광범위하게 지칭하며, 전형적으로 인간 또는 동물에서 치료적 용도의 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "헤르페스바이러스" 또는 "헤르페스비리다에 과"는 상대적으로 큰 게놈을 가진 외피보유 이중 가닥 DNA 바이러스의 일반적인 과를 광범위하게 지칭하는 것을 의미한다. 이러한 과는 광범위한 척추동물 및 무척추동물 숙주, 바람직한 실시양태에서 포유류 숙주, 예를 들어 인간, 말, 소, 마우스 및 돼지의 핵에서 복제된다. 헤르페스비리다에 과의 예시적인 구성원은 시토메갈로바이러스 (CMV), 단순 헤르페스 바이러스 유형 1 및 2 (HSV1 및 HSV2) 및 바리셀라 조스터 (VZV) 및 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "이종"은 비교되거나 또는 도입 또는 혼입되는 실체의 나머지 부분과 유전자형으로 뚜렷이 구별되는 실체로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전자 조작 기술에 의해 상이한 세포 유형 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종 폴리뉴클레오티드이다 (또한 발현될 때, 이종 폴리펩티드를 코딩할 수 있다). 유사하게, 바이러스 벡터 내로 혼입되는 세포 서열 (예를 들어, 유전자 또는 그의 일부분)은 벡터에 대한 이종 뉴클레오티드 서열이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "증가", "증강", "상승" (및 유사 용어)은 일반적으로 자연적, 예상된 또는 평균과 비교하여, 또는 대조군 조건과 비교하여, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 행동을 직접 또는 간접적으로 증가시키는 행위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "감염"은 바이러스에 의한 이종 DNA의 세포 내로의 전달을 광범위하게 지칭하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "공동 감염"은 2가지 이상의 바이러스에 의한 "동시 감염", "이중 감염", "다중 감염" 또는 "연속 감염"을 의미한다. 2가지 (또는 그 초과) 바이러스에 의한 생산자 세포의 감염이 "공동 감염"으로서 지칭될 것이다. 용어 "형질감염"은 전기천공, 인산칼슘 침전, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 기타 방법에 의해 세포 내로 전달되는 물리적 또는 화학적 방법, 예컨대 플라스미드 DNA에 의해 이종 DNA를 세포에 전달하는 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, "역위 말단 반복부" 또는 "ITR" 서열은 반대 배향에 있는 바이러스 게놈의 말단에서 발견되는 비교적 짧은 서열을 지칭하는 것을 의미한다. 관련 기술분야에 널리 공지된 용어 "AAV 역위 말단 반복부 (ITR)" 서열은 천연 단일 가닥 AAV 게놈의 양쪽 말단에 존재하는 대략 145개의 뉴클레오티드 서열이다. ITR의 가장 바깥쪽 뉴클레오티드는 2가지 대체 방향 중 하나로 존재할 수 있으며, 이는 상이한 AAV 게놈 간의 이질성과 단일 AAV 게놈의 두 말단 간에 이질성을 초래한다.
"야생형 ITR", "WT-ITR" 또는 "ITR"은 AAV 또는 기타 데펜도바이러스에서 자연 발생 ITR 서열의 서열을 지칭하며, 예를 들어 Rep 결합 활성 및 Rep 닉킹 능력을 보유하고 있다. 임의의 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR의 뉴클레오티드 서열은 유전 코드의 축중성 또는 드리프트로 인해 정규 자연 발생 서열과 약간 다를 수 있으며, 따라서 본원에서 사용하기 위해 포괄된 WT-ITR 서열은 생산 프로세스 동안 일어나는 자연 발생 변화 (예를 들어, 복제 오류)의 결과로 생성된 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 적어도 하나의 적어도 요구된 복제 기점과 팔린드롬 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는 임의의 바이러스 말단 반복부 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열 ("RBS") (RBE (Rep-결합 요소)로서 지칭되기도 함)과 말단 분해능 부위 ("TRS")는 함께 "최소 요구된 복제 기점"을 구성하므로, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 주어진 연장물 내에서 서로 역 보체인 TR은 전형적으로 각각 "역위 말단 반복부" 또는 "ITR"로서 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 구제를 매개한다.
용어 "생체내"는 유기체, 예컨대 다세포 동물 내 또는 내부에서 발생하는 검정 또는 프로세스를 지칭한다. 본원에 기재된 측면 중 일부에서, 방법 또는 사용은 단세포 유기체, 예컨대 박테리움이 사용될 때 "생체내"에서 발생한다고 할 수 있다. 용어 "생체외"는 다세포 동물 또는 식물의 체 외부에 있는 무손상 막을 가진 살아있는 세포, 예를 들어, 체외 이식편, 1차 세포와 세포주를 포함한 배양 세포, 형질전환된 세포주, 및 특히 혈액 세포를 포함한 추출된 조직 또는 세포를 이용하여 수행되는 방법 및 사용을 지칭한다. 용어 "시험관내"는 무손상 막을 가진 세포, 예컨대 세포 추출물의 존재를 요구하지 않는 검정 및 방법을 지칭하며, 비-세포 시스템, 예컨대 세포 또는 세포 시스템, 예컨대 세포 추출물을 포함하지 않는 매질에서 프로그램가능한 합성 생물학적 회로를 도입하는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "단리된" 분자 (예를 들어, 단리된 핵산 또는 단백질 또는 세포)는 그의 자연 환경의 구성 요소로부터 확인 및 분리 및/또는 회수되었다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "최소 조절 요소"는 표적 세포에서 유전자의 효과적인 발현에 필요한 조절 요소를 지칭하므로, 트랜스진 발현 카세트에 포함되어야 한다. 이러한 서열은, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열, 플라스미드 벡터 내에 DNA 단편의 삽입을 용이하게 하는 폴리링커 서열, 및 mRNA 전사체의 인트론 스플라이싱 및 폴리아데닐화를 담당하는 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "최소화", "저하", "감소" 및/또는 "억제" (및 이와 유사한 용어)는 일반적으로 자연적, 예상된 또는 평균과 비교하여, 또는 대조군 조건과 비교하여 농도, 수준, 기능, 활성 또는 행동을 직접 또는 간접적으로 감소시키는 행위를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "신경계"는 중추 신경계와 말초 신경계 둘 다를 포함한다. 용어 "중추 신경계" 또는 "CNS"는 척추동물의 뇌 및 척수의 모든 세포 및 조직을 포함한다. 용어 "말초 신경계"는 뇌 및 척수 외부의 신경계 부분의 모든 세포 및 조직을 지칭한다. 따라서, 용어 "신경계"는 뉴런 세포, 신경교 세포, 성상세포, 뇌척수액 (CSF) 내의 세포, 간질 공간 내의 세포, 척수의 보호 덮개 내의 세포, 경막외 세포 (즉, 경막 외부의 세포), 신경 조직에 인접하거나 신경 조직과 접촉하거나 신경 조직의 지배를 받는 비-신경 조직 내의 세포; 신경상막, 신경주막, 신경내막, 섬유단, 섬유다발 내의 세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "비-자연 발생"은 자연에서 발생하지 않는 단백질, 핵산, 리보핵산 또는 바이러스를 광범위하게 지칭하는 것을 의미한다. 예를 들어, 이것은 유전적으로 변형된 변이체, 예를 들어 cDNA 또는 코돈-최적화된 핵산일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단량체 뉴클레오티드의 쇄로 구성된 분자, 예컨대 예를 들어 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)를 지칭하는 것을 의미한다. 핵산은, 예를 들어 프로모터, PGRN 유전자 또는 그의 일부분, 또는 조절 요소를 코딩할 수 있다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. "PGRN 핵산"은 PGRN 유전자 또는 그의 일부분, 또는 PGRN 유전자 또는 그의 일부분의 기능적 변이체를 포함하는 핵산을 지칭한다. 유전자의 기능적 변이체는 사소한 변이, 예컨대 예를 들어, 침묵 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성, 미스센스 돌연변이, 및 유전자 기능을 유의미하게 변경시키지 않는 기타 돌연변이 또는 결실을 가진 유전자의 변이체를 포함한다.
DNA와 RNA 가닥의 비대칭 말단은 5' (5 프라임) 및 3' (3 프라임) 말단으로 지칭되고, 5' 말단은 말단 포스페이트 기를 가지며, 3' 말단은 말단 히드록실 기를 가진다. 5 프라임 (5') 말단은 그의 말단에서 디옥시리보스 또는 리보스의 당-고리 내에 제5 탄소를 가지고 있다. 새로운 가닥을 어셈블리하는 데 사용되는 폴리머라제가 포스포디에스테르 결합을 통해 각각의 새로운 뉴클레오티드를 3'-히드록실 (-OH) 기에 부착시키기 때문에, 핵산은 생체 내에서 5'-방향에서 3'-방향으로 합성된다.
본원에 사용된 바와 같은, "핵산 구축물"은 자연 발생 유전자로부터 단리되거나 또는 자연에 달리 존재하지 않는 방식으로 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형되거나 또는 합성인 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 지칭한다. 용어 핵산 구축물은 이러한 핵산 구축물이 본 개시내용의 코딩 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 함유할 때 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.
특정한 PGRN 단백질 (그의 단편 및 일부분 포함)을 "코딩하는" DNA 서열은 특정한 RNA 및/또는 단백질로 전사되는 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되는 RNA (mRNA)를 코딩할 수 있거나, 또는 DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되지 않는 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA, 또는 DNA 표적화 RNA; "비-코딩" RNA 또는 "ncRNA"라고도 함)를 코딩할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된" 또는 "커플링된"은 유전 요소의 병치를 지칭할 수 있으며, 여기서 요소는 예상되는 방식으로 작동할 수 있도록 하는 관계에 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사를 시작하는 데 도움을 주는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 영역에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 코딩 영역 사이에 개재 잔기가 있을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열에 대한 "서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열을 정렬하고 필요에 따라 갭을 도입하여 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 참조 폴리펩티드 또는 핵산 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의된다. 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것, 및 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 정렬 프로그램의 예는 ALIGN 플러스 [사이언티픽 앤드 에듀케이셔날 소프트웨어 (Scientific and Educational Software; 미국 펜실베이니아주)]이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교 중인 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대항한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (이는 주어진 아미노산 서열 B에 대한, 서열 B와의, 또는 서열 B에 대항한 특정의 아미노산 서열 동일성 %을 가지거나 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 대안적으로 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다: 분수 X/Y의 100배로, 여기서 X는 A와 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매칭물로서 점수가 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %는 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않는 것으로 인지될 것이다. 본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에 대한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대항한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 % (이는 주어진 핵산 서열 D에 대한, 서열 D와의, 또는 서열 D에 대항한 특정의 핵산 서열 동일성 %을 가지거나 이를 포함하는 주어진 핵산 서열 C로서 대안적으로 표현될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다: 분수 W/Z의 100배로, 여기서 W는 C와 D의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램에 의해 동일한 매칭물로서 점수가 매겨진 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서의 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 %는 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않는 것으로 인지될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제약 조성물" 또는 "조성물"은 예컨대 담체, 안정제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 부형제 등이나 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 제약상 허용되는 화학 성분과 임의로 혼합된, 본원에 기재된 조성물 또는 작용제 (예를 들어, 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터)를 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용되며, 적어도 길이로 제한되지는 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 자연 또는 비-자연 아미노산 잔기를 함유할 수 있으며, 펩티드, 올리고펩티드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체 및 다량체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 전장 단백질과 그의 단편 둘 다는 본 정의에 의해 포괄된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 발현 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 더욱이, 본 개시의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 변형, 예컨대 결실, 부가 및 치환 (일반적으로 자연적으로 보존적임)을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위 지향 돌연변이 유발을 통한 의도적인 것일 수 있거나, 또는 PCR 증폭으로 인한 단백질 또는 오류를 생산하는 숙주의 돌연변이를 통한 우발적인 것일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어, "프로그래뉼린", "PGRN", "그래눌린-에피텔린 전구체", "GEP", "PC-세포 유래 성장 인자", "PCDGF", "프로에피텔린", "아크로그라닌" 및 "GP80"은 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "프로그래뉼린 (PGRN)" 또는 "프로그래뉼린 (PGRN) 핵산"은 서열식별번호: 5를 포함하는 핵산, 서열식별번호: 5와 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 5로 이루어진 핵산; 서열식별번호: 6을 포함하는 핵산, 서열식별번호: 6과 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 6으로 이루어진 핵산; 서열식별번호: 7을 포함하는 핵산, 서열식별번호: 7과 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 7로 이루어진 핵산; 서열식별번호: 8을 포함하는 핵산, 서열식별번호: 8과 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 8로 이루어진 핵산; 서열식별번호: 9를 포함하는 핵산, 서열식별번호: 9와 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 9로 이루어진 핵산; 서열식별번호: 10을 포함하는 핵산, 서열식별번호: 10과 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 10으로 이루어진 핵산; 서열식별번호: 11을 포함하는 핵산, 서열식별번호: 11과 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 11로 이루어진 핵산; 서열식별번호: 12를 포함하는 핵산, 서열식별번호: 12와 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 12로 이루어진 핵산; 서열식별번호: 13을 포함하는 핵산, 서열식별번호: 13과 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 13으로 이루어진 핵산; 또는 서열식별번호: 14를 포함하는 핵산, 서열식별번호: 14와 약 95% 상동성, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 상동성을 갖는 핵산, 서열식별번호: 14로 이루어진 핵산으로부터 선택된 핵산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "프로모터"는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 지칭하는 것을 의미하며, 여기서 조절 서열은 RNA 폴리머라제와 결합할 수 있고 하류 (3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다. 전사 프로세스의 일부로서, RNA 폴리머라제로서 공지된 RNA를 합성하는 효소가 유전자 근처의 DNA에 부착된다. 프로모터는 RNA 폴리머라제와 RNA 폴리머라제를 모집하는 전사 인자에 대한 초기 결합 부위를 제공하는 특이적 DNA 서열 및 반응 요소를 함유한다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 CNS의 세포에서의 트랜스진 발현에 고도로 특이적이다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 뉴런-특이적 트랜스진 발현에 고도로 특이적이다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 내인성 PGRN 프로모터이다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터이다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 인간 시냅신-1 유전자 프로모터 (hSyn1) 프로모터이다. 도 3은 인간 시냅신 1 (hSYN1) 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 2)을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, hSYN1 프로모터는 서열식별번호: 2를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, hSYN1 프로모터는 서열식별번호: 2로 이루어진다. CBA 프로모터는 닭 베타-액틴 유전자 (예를 들어, 진뱅크 엔트레즈 유전자 ID 396526으로써 나타낸 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 베타-액틴)로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 도 2는 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 1)을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, CBA 프로모터는 서열식별번호: 1을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, CBA 프로모터는 서열식별번호: 1로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 마우스 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터이다. 마우스 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II 프로모터는 중간 강도의 뉴런-특이적 프로모터이다. 도 19는 CaMKII 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 18)을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, CaMKII 프로모터는 서열식별번호: 18을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, CaMKII 프로모터는 서열식별번호: 18로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 래트 튜뷸린 알파 1 (Ta1) 프로모터이다. 래트 튜뷸린 알파 1 프로모터는 형태학적 성장의 기능으로서 뉴런 유전자 발현을 조절하는 것을 담당하는 중간 강도의 프로모터이다. 래트 Ta1 프로모터는 문헌 [Gloster et al. 1994 J of Neuroscience] (그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 도 20은 래트 튜뷸린 알파 1 (Ta1) 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 19)을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, Ta1 프로모터는 서열식별번호: 19를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, Ta1 프로모터는 서열식별번호: 19로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 래트 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터이다. 래트 뉴런-특이적 에놀라제 프로모터는 중간 강도의 발달적으로 조절된 프로모터이다. 도 21은 래트 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 20)을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, NSE 프로모터는 서열식별번호: 20을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, NSE 프로모터는 서열식별번호: 20으로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 인간 혈소판 유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터이다. 인간 혈소판 유래 성장 인자 베타 쇄 프로모터는 뉴런 및 (뉴런-연관) 신경교 세포에 특이적인 중간 강도의 프로모터이다. 인간 게놈에는 3가지 규정된 프로모터가 있으며, 염색체 NC_000022.11의 [-] 가닥 상의 위치 39244982 - 39244621에 걸쳐 있다 (362개 뉴클레오티드에 걸쳐 있음). 도 22는 인간 혈소판 유래 성장 인자-베타 쇄 (PDGF) 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 21, 서열식별번호: 24 및 서열식별번호: 25)을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, PDGF-베타 쇄 프로모터는 서열식별번호: 21을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, PDGF-베타 쇄 프로모터는 서열식별번호: 21로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 프로모터는 편재적 활성 EF1알파 프로모터이다. EF1a 프로모터는 포유류 기원의 강력한 편재적 프로모터이며, CNS의 세포를 포함하여 대부분의 세포 유형에서 발현된다. 도 23은 EF1알파 프로모터의 핵산 서열 (서열식별번호: 22)을 나타낸다. 일부 실시양태에 따르면, EF1알파 프로모터는 서열식별번호: 22를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, EF1알파 프로모터는 서열식별번호: 22로 이루어진다. 일부 실시양태에 따르면, 본원의 측면 및 실시양태에 제시된 프로모터 중 임의의 것은 부가의 5' CAG/CMV 인핸서 요소를 추가로 포함한다. CAG/CMV 인핸서는 둘 다 통상적으로 코어 프로모터의 전사 활성을 증진시키기 위해 이용되는 강한 편재적 CAG 프로모터와 그의 CMV 모 프로모터에 영향을 미치는 인핸서로부터 유래된 강한 인핸서 요소이다. 도 24는 CAG/CMV 인핸서의 핵산 서열 (서열식별번호: 23)을 나타낸다.
프로모터는 자신이 조절하는 핵산 서열의 발현을 구동하거나 또는 전사를 구동한다고 할 수 있다. 문구 "작동가능하게 연결된", "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어하에" 및 "전사 제어하에"는 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 조절되는 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 방향에 있음을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은, "역위 프로모터"는 핵산 서열이 역방향으로 있으므로, 코딩 가닥이었던 것이 이제 비-코딩 가닥이 되고, 그 반대도 마찬가지인 프로모터를 지칭한다. 역위 프로모터 서열은 스위치의 상태를 조절하기 위해 다양한 실시양태에서 사용될 수 있다. 또한, 다양한 실시양태에서, 프로모터는 인핸서와 연계해서 사용될 수 있다.
프로모터는 코딩 세그먼트의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열 및/또는 주어진 유전자 또는 서열의 엑손을 단리함으로써 수득될 수 있는 것과 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 실시양태에서, 인핸서는 핵산 서열의 하류 또는 상류에 위치한, 그 핵산 서열과 자연적으로 연합된 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 코딩 핵산 세그먼트는 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 제어 하에 위치하며, 둘 다 자연 환경에서 작동가능하게 연결된 코딩된 핵산 서열과 정상적으로 연합되지 않는 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종 인핸서는 자연 환경에서 주어진 핵산 서열과 정상적으로 연합되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵, 바이러스 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "자연 발생"이 아닌, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 관련 기술분야에 공지된 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인핸서"는 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 활성인자 단백질 또는 전사 인자)과 결합하는 시스 작용성 조절 서열 (예를 들어, 50-1,500개 염기쌍)을 지칭한다. 인핸서는 그것이 조절하는 유전자 시작 부위의 상류 또는 유전자 시작 부위의 하류에서 최대 1,000,000개 염기쌍에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합"은 (1) 자연 발생 환경으로부터 제거되었거나, (2) 유전자가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 연합되지 않거나, (3) 자연적으로 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는 생체 분자, 예를 들어 유전자 또는 단백질을 지칭할 수 있다. 용어 "재조합"은 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성되는 폴리뉴클레오티드 유사체 뿐만 아니라 그러한 핵산에 의해 코딩된 단백질 및/또는 mRNA와 관련하여 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합 HSV", "rHSV" 및 "rHSV 벡터"는 바이러스 게놈에 혼입된 이종 유전자를 함유하는, 단리되고 유전적으로 변형된 형태의 단순 헤르페스 바이러스 유형 1 (HSV)을 광범위하게 지칭하는 것을 의미한다. 용어 "rHSV-rep2cap2" 또는 "rHSV-rep2cap1"은 AAV 혈청형 1 또는 2로부터의 AAV rep 및 cap 유전자가 rHSV 게놈에 혼입되는 rHSV를 의미하며, 특정 실시양태에서, 관심 치료 유전자를 코딩하는 DNA 서열이 바이러스 게놈에 혼입되었다.
본원에 사용된 바와 같은, 본 발명의 방법에 의해 치료되는 "대상체" 또는 "환자" 또는 "개체"는 인간 또는 비-인간 동물을 지칭하는 것을 의미한다. "비-인간 동물"은 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체를 포함한다. 인간 대상체는 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족, 예를 들어 코카서스계 (백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉, 중동인 등일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 환자 또는 임상 환경의 다른 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이미 치료를 받고 있다. 일부 실시양태에서 대상체는 신생아, 유아, 어린이, 청소년 또는 성인이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치료 효과"는 그 결과가 바람직하고 유익하다고 판단되는 치료의 결과를 지칭한다. 치료 효과는 질환 징후를 직접 또는 간접적으로 저지, 감소 또는 제거하는 것을 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한 질환 징후의 진행을 직접 또는 간접적으로 저지, 감소 또는 제거하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 치료제에 대한 치료상 유효량은 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델로부터 초기에 결정될 수 있다. 치료상 유효한 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용된 용량은 투여된 화합물의 상대적 생체 이용률과 효력에 근거하여 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 기타 널리 공지된 방법에 근거하여 최대의 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은 통상의 기술자의 능력 범위 내에 있다. 치료 유효성을 결정하기 위한 일반적인 원칙은 문헌 [Chapter 1 of Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)] (본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있으며, 하기에 요약되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "치환 돌연변이 프로필"은 5개의 엘라스타제 절단 부위 및/또는 2개의 다른 단백질 분해 절단 부위 중 하나 이상을 제거하는 프로그래뉼린의 도메인간 영역에 있는 보존적 아미노산 치환 패널을 지칭하는 것을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Cenik et al., JBC 2012; Zhu et al., Cell 2002] 참조; 둘 다 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에 따르면, 치환 돌연변이는 PGRN이 그래눌린으로 프로세싱되는 것을 감소시키거나 방지시킬 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "트랜스진"은 세포 내로 도입되고 RNA로 전사될 수 있으며, 적절한 조건하에 임의로 번역 및/또는 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 것을 의미한다. 측면에서, 트랜스진은 그것이 도입된 세포에 원하는 특성을 부여하거나, 그렇지 않는 경우 원하는 치료 또는 진단 결과를 초래한다.
본원에 사용된 바와 같은, "트랜스진 발현 카세트" 또는 "발현 카세트"는 상호 교환적으로 사용되며, 트랜스진의 전사를 지시하기에 충분한 하나 이상의 프로모터 또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함하는 핵산의 선형 연장물을 지칭하지만, 캡시드 코딩 서열, 기타 벡터 서열 또는 역위 말단 반복부 영역을 포함하지 않는다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스 작용성 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 억제인자), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사후 조절 요소를 부가적으로 포함할 수 있다. 트랜스진 발현 카세트는 핵산 벡터가 표적 세포에 전달하는 유전자 서열을 포함한다. 이러한 서열은 관심 유전자 (예를 들어, PGRN 핵산 또는 그의 변이체), 하나 이상의 프로모터, 및 최소 조절 요소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 질환 또는 장애를 "치료" 또는 "치료하는 것"은 검출가능한지 검출가능하지 않든지 간에, 이러한 질환 또는 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상의 완화, 질환 또는 장애의 정도 감소, 질환 또는 장애의 안정화된 (예를 들어, 악화되지 않은) 상태, 질환 또는 장애의 확산 방지, 질환 또는 장애 진행의 지연 또는 둔화, 질환 또는 장애 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 관해 (부분적 또는 전체적)를 지칭하는 것을 의미한다. 예를 들어, PGRN은 유효량 (또는 투여량)으로 표현될 때, 비정상적인 생리학적 반응을 예방, 교정 및/또는 정상화하기에 충분하며, 예를 들어, 질환 또는 장애의 임상적으로 유의미한 특징을 적어도 약 30퍼센트, 보다 바람직하게 적어도 50퍼센트, 가장 바람직하게 적어도 90퍼센트만큼 감소시키기에 충분한 치료 효과이다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교 시 생존을 연장하는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포로 전달될 핵산을 포함하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스를 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 종종 세포와 이종이지만, 반드시 그렇지는 않다. 발현 벡터는 부가의 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있으며, 따라서 두 유기체, 예를 들어 발현을 위한 인간 세포와 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지될 수 있다. 용어 "발현"은 RNA와 단백질, 및 적절한 분비 단백질을 생산하는 데 관여하는 세포성 프로세스를 지칭하며, 이는 적용가능한 경우, 예를 들어, 전사, 전사체 프로세싱, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 프로세싱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "발현 산물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결될 때 시험관 내 또는 생체 내에서 RNA로 전사되는 (DNA) 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역의 앞과 뒤의 영역, 예를 들어, 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3'UTR 또는 "트레일러" 서열 뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 (엑손) 사이의 개재 서열 (인트론)을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종 서열 (즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭하는 것을 의미한다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산은 적어도 하나의 역위 말단 반복 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에 따르면, 재조합 핵산은 2개의 ITR에 의해 플랭킹된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "재조합 AAV 벡터 (rAAV 벡터)"는 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복 서열 (ITR)에 의해 플랭킹된 하나 이상의 이종 서열 (즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭하는 것을 의미한다. 이러한 rAAV 벡터는 적합한 헬퍼 바이러스에 감염되고 (또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하고) AAV rep 및 cap 유전자 산물 (즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하는 숙주 세포에 존재할 때 복제되고 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 염색체 또는 또 다른 벡터, 예컨대 클로닝 또는 형질감염을 위해 사용되는 플라스미드)에 혼입될 때, rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재하에 복제 및 캡슐화에 의해 "구제"될 수 있는 "프로-벡터"로서 지칭될 수 있다. rAAV 벡터는 플라스미드, 선형 인공 염색체, 지질과의 복합체 형성, 리포좀 내에서의 캡슐화, 및 바이러스 입자, 예를 들어 AAV 입자 내에서의 캡슐화를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 형태 중 임의의 것일 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드 내로 패키징되어 "재조합 아데노-연관 바이러스 입자 (rAAV 입자)"를 생성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "rAAV 바이러스" 또는 "rAAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질과 캡슐화된 rAAV 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "리포터"는 검출가능한 판독값을 제공하는 데 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 리포터는 일반적으로 측정가능한 신호, 예컨대 형광, 색상 또는 발광을 생산한다. 리포터 단백질 코딩 서열은, 세포 또는 유기체에서의 그의 존재가 쉽게 관찰되는 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정한 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 내게 하고, 루시페라제는 세포가 빛을 생산하는 반응을 촉매하게 하며, 효소 예컨대 β-갈락토시다제는 기질을 유색 산물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적으로 유용한 예시적인 리포터 폴리펩티드는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제 (AP), 티미딘 키나제 (TK), 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 기타 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시페라제, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
전사 조절인자는 관심 유전자, 예컨대 PGRN의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 활성인자 및 억제인자를 지칭한다. 프로모터는 특정한 유전자의 전사를 시작하는 핵산의 영역이다. 전사 활성인자는 전형적으로 전사 프로모터와 근처에서 결합하고 RNA 폴리머라제를 동원하여 전사를 직접 시작한다. 억제인자는 전사 프로모터와 결합하고 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절인자는 결합 위치와 세포성 및 환경적 조건에 따라 활성인자 또는 억제인자로서 제공될 수 있다. 전사 조절인자 클래스의 비-제한적인 예는 호메오도메인 단백질, 징크 핑거 단백질, 날개 달린 나선 (포크헤드) 단백질, 및 류신-지퍼 단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "억제인자 단백질" 또는 "유도인자 단백질"은 조절 서열 요소와 결합하고 조절 서열 요소에 작동적으로 연결된 서열의 전사를 각각 억제하거나 활성화하는 단백질이다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 억제인자 및 유도인자 단백질은 적어도 하나의 입력제 또는 환경 입력의 존재 또는 부재에 대해 감수성이다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은, 예를 들어 분리가능한 DNA-결합 및 입력제-결합 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 모듈 형태이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 방법 또는 조성물에 필수적이지만, 필수적이든 아니든 불특정 요소의 포함에 개방적인 조성물, 방법, 및 그의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "로 본질적으로 이루어지는"은 주어진 실시양태에 필요한 요소를 지칭한다. 이러한 용어는 그 실시양태의 기본적 및 신규 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. "포함하는"의 사용은 제한이 아니라 포함을 나타낸다.
용어 "로 이루어지는"은 실시양태의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 제외한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 그의 각각의 성분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "로 본질적으로 이루어지는"은 주어진 실시양태에 필요한 요소를 지칭한다. 이러한 용어는 본 발명의 그 실시양태의 기본적 및 신규 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 부가의 요소의 존재를 허용한다.
용어 "포함한"은 본원에서 "포함하나 이에 제한되지는 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 사용되고, 이러한 문구와 상호 교환적으로 사용된다.
용어 "예컨대"는 본원에서 "예컨대 ~이나 이에 제한되지는 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 사용되고, 이러한 문구와 상호 교환적으로 사용된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수의 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재되고/되거나 본 개시내용의 판독 시 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것인 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 약어 "예를 들어"는 라틴어 예시어로부터 유래된 것이며, 본원에서 비-제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어"는 용어 "예를 들어"와 동의어이다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 실시양태의 군 분류는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 군 구성원은 개별적으로 또는 군의 다른 구성원 또는 본원에서 발견되는 다른 요소와의 임의의 조합으로 참조되고 청구될 수 있다. 특정 군의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 인해 특정 군에 포함되거나 그로부터 결실될 수 있다. 이러한 임의의 포함 또는 결실이 발생하는 경우, 본 명세서는 변형된 바와 같은 군을 함유하는 것으로 간주되며, 따라서 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬 군의 서면 설명을 충족한다.
측면 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 개시내용은 인간을 클로닝하는 프로세스, 인간의 생식 계통 유전적 정체성을 변형시키는 프로세스, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용 또는 인간 또는 동물에게 임의의 실질적인 의학적 혜택 없이 고통을 주는 것으로 예상되는 동물의 유전적 정체성을 변형시키는 프로세스, 및 그러한 프로세스로부터 비롯된 동물과 연관되지 않는다.
기타 용어는 본 발명의 다양한 측면에 대한 설명 내에서 본원에 정의된다.
참조 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류 중인 특허 출원을 포함한 모든 특허 및 기타 간행물; 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 것은, 예를 들어, 본원에 기재된 기술과 연계해서 사용될 수 있는 그러한 간행물에 기재된 방법론을 기재하고 개시할 목적으로 본원에 참조로 명시적으로 포함된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시를 위한 목적으로만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해서 또는 임의의 다른 이유로 인해 상기 개시내용에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이들 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 본 출원인이 활용할 수 있는 정보에 기초하며, 이들 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 인정도 구성하지 않는다.
본 개시내용의 실시양태에 대한 설명은 완전한 것으로 의도되지 않거나 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하도록 의도되지 않는다. 본 개시내용의 구체적인 실시양태 및 예가 본원에서 예시의 목적으로 기재되어 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 본 개시의 범위 내에서 다양한 등가 변형이 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되지만, 대안적 실시양태는 상이한 순서로 기능을 수행하거나, 또는 기능이 실질적으로 공동으로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 다른 절차 또는 방법에도 적절히 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시양태을 조합하여 추가의 실시양태를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 측면은 필요한 경우, 상기 참고문헌 및 적용의 조성, 기능 및 개념을 이용하도록 변형되어 본 개시내용의 또 다른 실시양태를 제공할 수 있다. 더욱이, 생물학적 기능적 동등성 고려사항 때문에, 종류 또는 양에 있어서 생물학적 또는 화학적 작용에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조 내에서 일부 변화가 이루어질 수 있다. 이들 및 다른 변화가 상세한 설명에 비추어 본 개시내용에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
전술한 실시양태 중 임의의 것의 구체적인 요소를 조합하거나 또는 이를 다른 실시양태에서의 요소로 대체할 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 특정 실시양태와 관련된 장점이 이들 실시양태들의 맥락에서 기재되었지만, 다른 실시양태가 또한 이러한 장점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시양태가 본 개시의 범위 내에 포함되기 위하여 이러한 장점을 반드시 나타내어야 하는 것은 아니다.
본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 본 발명이 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 및 시약 등에 제한되는 것은 아니며, 다양할 수 있음을 이해하여야 한다. 본원에 사용된 전문 용어는 특정한 실시양태만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 이는 청구범위에 의해서만 규정된다.
II. 핵산
잠재적 치료적 사용을 위한 핵산 분자의 특징규명 및 개발이 본원에 제공된다. 본 개시내용은 신경변성 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있는 프로모터, 발현 카세트, 벡터, 키트 및 방법을 제공한다. 본 개시내용의 특정 측면은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에게 이종 핵산을 전달하는 것에 관한 것이다. 일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 본원에 기재된 rAAV 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에 전달하는 것을 포함하는, 신경변성 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 rAAV 벡터는 이종 핵산 (예를 들어, PGRN을 코딩하는 핵산)을 포함한다. 본 개시의 목적은 PGRN을 코딩하는 핵산을 중추 신경계 (CNS)에 전달하고, CNS 내에서의 성공적인 발현 및 신경변성 질환을 치료하는 것이다.
일부 실시양태에 따르면, 발현된 PGRN 단백질은 신경변성 질환 또는 장애의 치료에 기능적이다. 일부 실시양태에서, 발현된 PGRN 단백질은 면역 체계 반응을 유발하지 않는다.
PGRN은 신경영양, 항염증성, 및 리소좀 조절 특성을 포함한 여러 세포성 기능을 가진 GRN/Grn 유전자에 의해 코딩된 당단백질이다. GRN 유전자에서의 돌연변이는 치매의 원인인 전두측두엽 변성 (FTD)과 리소좀 축적 질환인 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL)을 초래할 수 있다. 두 질환 모두 PGRN 기능의 상실과 연관되며, 그 결과 다른 특징 중에서도 특히 미세아교세포 신경염증 및 리소좀 기능장애가 증가한다. PGRN은 또한 알츠하이머병 (AD)과도 관련이 있다 (Mendsaikhan et al. Cells. 2019 8(3): 230).
일부 실시양태에 따르면, 관심 유전자 (예를 들어, PGRN)는 야생형 PGRN보다 발현 (및/또는 기능)이 우수하도록 최적화되어 있으며, 추가로 야생형 PGRN과 (DNA/RNA 수준에서) 구별할 수 있는 능력을 가지고 있다.
일부 실시양태에 따르면, 관심 유전자 (예를 들어, PGRN)는 소르틸린에 대한 결합을 억제하도록 최적화된다. PGRN C-말단 모티프인 PGRN (589-593) LRQLL이 SORT1 매개 세포내 이입에 필수적이라는 것이 이전에 입증되었다 (Zheng et al., PLoS One. 2011;6(6):e21023).
일부 실시양태에 따르면, 관심 유전자 (예를 들어, PGRN)는 더 적은 그래눌린 산물을 생성하도록 최적화된다.
"PGRN 핵산"은 PGRN 유전자 또는 그의 일부분, 또는 PGRN 유전자 또는 그의 일부분의 기능적 변이체를 포함하는 핵산을 지칭한다. 유전자의 기능적 변이체는 사소한 변이, 예컨대 예를 들어, 침묵 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형성, 미스센스 돌연변이, 및 유전자 기능을 유의미하게 변경시키지 않는 기타 돌연변이 또는 결실을 가진 유전자의 변이체를 포함한다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1779 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5와 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 5로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1767 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6과 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 6으로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1779 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7과 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 7로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1779 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8과 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 8로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1779 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9와 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 9로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1779 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10과 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 10으로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1779 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11과 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 11로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1779 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12와 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 12로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 1779 bp 길이이다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13을 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 85% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 90% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 95% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 96% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 97% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 98% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13과 적어도 99% 동일하다. 한 실시양태에 따르면, 핵산은 서열식별번호: 13으로 이루어진다.
한 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 C-말단으로부터 3-16개 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개)의 아미노산이 결실된다. 일부 실시양태에 따르면, PGRN의 C-말단에서의 결실은 PGRN 소르틸린 결합의 억제와 개별 그래눌린으로의 후속 프로세싱을 초래한다. 일부 실시양태에 따르면, PGRN 단백질을 코딩하는 핵산은 C-말단으로부터 3-16개 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개)의 아미노산이 결실된 서열식별번호: 1로 이루어진다.
코돈-최적화
부위 지향 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심 표적 DNA를 함유하는 세포 내 발현을 위해 관련 기술분야에서 표준화된 방법에 따라 코돈-최적화될 수 있다. 예를 들어, 의도된 표적 핵산이 인간 세포 내에 있는 경우, PGRN을 코딩하는 인간 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드를 본원에 기재된 구축물에 사용하도록 고려된다.
일부 실시양태에 따르면, 핵산 서열은 포유류 발현을 위해 코돈 최적화된다.
III. 신경변성 질환에 대한 PGRN 유전자 요법
본 개시내용은 일반적으로 PGRN 유전자 구축물을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV) 바이러스 입자를 생산하는 방법 및 신경변성 질환, 특히 부분적 또는 완전한 PGRN 결핍을 특징으로 하는 신경변성 질환, 예를 들어, 전두측두엽 치매 (FTD)에 대한 유전자 요법의 방법에 있어서의 그의 용도를 제공한다. 본원에 기재된 바와 같은 AAV 벡터는 핵산 (예를 들어, PGRN 유전자 구축물)을 CNS의 세포, 특히 뉴런 세포로 전달하는 데 특히 효율적이다. 발현 및 후속 분비를 위해 PGRN을 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 치료 벡터를 생성, 평가 및 활용하는 방법이 본원에 기재되어 있다. FTD의 치료 및/또는 예방을 포함하여, 신경변성 질환에 대한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 기반 유전자 요법에 사용하기 위해 최적으로 변형된 PGRN cDNA 및 연관 유전 요소가 본원에 기재되어 있다.
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 벡터는 PGRN 표적 유전자와 연관 유전 요소 둘 다를 효율적으로 수용할 수 있다. 더욱이, 이러한 벡터는 CNS의 치료상 관련된 세포에서 PGRN을 특이적으로 발현하도록 설계될 수 있다. 본 개시내용은 기능적 PGRN 유전자를 환자에게 효율적으로 전달할 수 있는 rAAV 치료 벡터를 생성, 평가 및 활용하는 방법을 설명한다.
PGRN 유전자 구축물은 (1) 인간, 마우스 또는 마카크로부터 유래된 1.8 킬로염기 (kb)의 비-자연 발생 코돈-최적화된 PGRN cDNA 서열이며, 이러한 서열은 (a) 치환 돌연변이 프로필에 의해, 또는 27개 뉴클레오티드 헤마글루티닌 C-말단 태그를 수반하거나 수반하지 않는, 3-16개의 C-말단 아미노산 결실 (소르틸린 결합과 개별 그래눌린으로의 후속 프로세싱을 억제하기 위함)에 의해 그래눌린으로의 단백질 분해적 절단에 대한 내성을 보유할 수 있는 것; (2) 0.5 kb의 비-자연 발생 뉴런-특이적 인간 시냅신-1 프로모터 (hSYN1) 또는 0.364 kb의 마우스 칼슘/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II (CaMKII) 프로모터, 또는 1.034 kb의 래트 튜불린 알파 1 (Ta1) 프로모터, 또는 1.81 kb의 래트 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터, 또는 1.47 kb의 인간 혈소판 유래 성장 인자 베타 쇄 (PDGF) 프로모터, 또는 편재적 활성 1.7 kb의 CBA 프로모터, 또는 편재적 활성 0.81 kb의 EF1알파 프로모터, 또는 본원의 측면 또는 실시양태 중 임의의 것에 따른 프로모터 중 임의의 것이며, 여기서 프로모터는 부가의 0.35 kb 5' CAG/CMV 인핸서 요소를 추가로 포함하며, 모두 높은 PGRN 발현을 구동하도록 최적화된 것; (3) 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)에 이어 SV40 또는 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호를 포함하는 0.9 kb의 비-자연 발생 3'-UTR 조절 영역; (4) AAV 게놈 카세트를 플랭킹하는 2개의 자연 발생 141개 염기 서열-조정된 역위 말단 반복부 (ITR); 및 (5) 표적화된 CNS 전달에 최적으로 적합한 AAV 캡시드 변이체 (자연적으로 또는 비-자연적으로 발생)를 포함할 수 있다.
자기-상보적 AAV 게놈
다수의 전임상 연구는 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 유전자 전달 벡터의 효능을 입증했으며, 최근 임상 시험은 유망한 결과를 보여주었다. 그러나, 형질도입에 필요한 게놈 함유 입자의 수의 관점에서, 이러한 벡터의 효율은 발현 전에 단일 가닥 DNA (ssDNA) 게놈을 이중 가닥 DNA (dsDNA)로 전환시켜야 하는 필요성 때문에 방해받는다. 이러한 단계는 DNA 합성 또는 다수의 벡터 게놈 간의 염기쌍 형성을 필요로 하지 않으면서 dsDNA로 폴딩될 수 있는 역위 반복 게놈을 패키징하는 자기-상보적 벡터를 사용하여 완전히 우회할 수 있다. 이러한 효율성에 대한 중요한 트레이드 오프는, 작은 단백질 코딩 유전자 (최대 55 kd)와 현재 이용가능한 임의의 RNA 기반 요법이 수용될 수 있지만, 벡터의 코딩 용량의 절반의 손실이다.
아데노 -연관 바이러스 ( AAV )
아데노-연관 바이러스 (AAV)는 비-병원성의 단일 가닥 DNA 파보바이러스이다. AAV는 약 20 nm의 캡시드 직경을 갖는다. 단일 가닥 DNA 게놈의 각각의 말단은 게놈 복제 및 패키징에 필요한 유일한 시스 작용성 요소인 역위 말단 반복부 (ITR)를 함유한다. AAV 게놈은 2가지 바이러스 유전자: rep 및 cap를 보유한다. 바이러스는 복제에 필요한 4가지 단백질 (Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40)을 생성하기 위해 2개의 프로모터와 대체 스플라이싱을 활용한다. 세 번째 프로모터는 교대 스플라이싱 및 교대 번역 출발 코돈의 조합을 통해, 3개의 구조 바이러스 캡시드 단백질 1, 2 및 3 (VP1, VP2 및 VP3)에 대한 전사체를 생성한다 (Berns & Linden Bioessays 1995; 17:237-45). 3개의 캡시드 단백질은 동일한 C-말단 533개의 아미노산을 공유하는 반면, VP2와 VP1은 각각 65개와 202개 아미노산의 부가의 N-말단 서열을 함유한다. AAV 비리온은 T-1 정이십면체 대칭으로 배열된, 총 60개의 VP1, VP2 및 VP3 카피를 1:1:20 비율로 함유한다 (Rose et al. J Virol . 1971; 8:766-70). AAV는 용해성 수명 주기를 완료하기 위해 헬퍼 바이러스로서 아데노바이러스 (Ad), 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 또는 기타 바이러스를 필요로 한다 (Atchison et al. Science, 1965; 149:754-6; Hoggan et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1966; 55:1467-74). 헬퍼 바이러스의 부재하에, 야생형 AAV는 ITR과 염색체의 상호작용을 통해 Rep 단백질의 보조로 통합함으로써 잠복기를 설정한다 (Berns & Linden (1995)).
AAV 혈청형
수많은 상이한 AAV 혈청형이 존재하며, 이는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV2.레트로 및 그의 변이체 또는 혼성체 (예를 들어, HSPG 돌연변이를 가진 AAV2 변이체, AAV 1+9 혼성체)를 포함한다. 생체내 연구에 따르면, 다양한 AAV 혈청형은 상이한 조직 또는 세포 지향성을 나타낸다. 예를 들어, AAV1과 AAV6는 골격근의 형질도입에 효율적인 2가지 혈청형이다 (Gao, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:11854-11859; Xiao, et al. J Virol. 1999; 73:3994-4003; Chao, et al. Mol Ther. 2000; 2:619-623). AAV-3은 거대핵세포의 형질도입에 뛰어난 것으로 나타났다 (Handa, et al. J Gen Virol. 2000; 81:2077-2084). AAV5와 AAV6는 말초 기도 세포를 효율적으로 감염시킨다 (Zabner, et al. J Virol. 2000; 74:3852-3858; Halbert, et al. J Virol. 2001; 75:6615-6624). AAV2, AAV4, 및 AAV5는 중추 신경계에서 상이한 유형의 세포를 형질도입시킨다 (Davidson, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97:3428-3432). AAV8과 AAV5는 AAV-2보다 간 세포를 더 잘 형질도입할 수 있다. AAV-5 기반 벡터는 AAV2보다 더 높은 효율로 특정 세포 유형 (배양된 기도 상피 세포, 배양된 횡문 근육 세포 및 배양된 인간 제대 정맥 내피 세포)을 형질도입하였으나, AAV2와 AAV5 둘 다가 NIH 3T3, skbr3 및 t-47D 세포주에 대해 낮은 형질도입 효율을 보였다 (Gao, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99:11854-11859; Mingozzi, et al. J Virol. 2002; 76:10497-10502. WO 99/61601). AAV4는 래트 망막을 가장 효율적으로 형질도입하고, AAV5와 AAV1이 그 뒤를 이은 것으로 밝혀졌다 (Rabinowitz, et al. J Virol. 2002; 76:791-801; Weber, et al. Mol Ther. 2003; 7:774-781). 요약하면, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 및 AAV9는 CNS 조직에 대한 지향성을 나타낸다. AAV1, AAV8 및 AAV9는 심장 조직에 대한 지향성을 나타낸다. AAV2는 신장 조직에 대해 지향성을 나타낸다. AAV7, AAV8 및 AAV9는 간 조직에 대해 지향성을 나타낸다. AAV4, AAV5, AAV6, 및 AAV9는 폐 조직에 대해 지향성을 나타낸다. AAV8은 췌장 세포에 대해 지향성을 나타낸다. AAV3, AAV5, 및 AAV8은 광수용체 세포에 대해 지향성을 나타낸다. AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, 및 AAV8은 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 대해 지향성을 나타낸다. AAV1, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9는 골격근에 대한 지향성을 나타낸다. AAV2 캡시드 상의 여러 티로신 잔기를 돌연변이시키면 줄무늬체 및 해마에서 뉴런 변환이 유의미하게 증진되며, 헤파린 술페이트 (HS) 결합의 절제 또한 벡터의 체적 확산을 증가시키는 것으로 나타났다 (Kanaan et al., Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Sep 15; 8: 184-19). 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 (HSPG) 돌연변이를 가진 AAV2 변이체 (AAV2-HBKO, AAVT-TT, AAV44-9)는 신경 및 뇌 변환을 증진시킨 것으로 나타났다.
바이러스에 대한 추가 변형은, 예를 들어 각각의 혈청형의 지향성을 개선시킴으로써 유전자 전달의 효율성을 증진시키기 위해 수행될 수 있다. 한 가지 접근 방식은 하나의 혈청형 캡시드에서 또 다른 혈청형 캡시드로 도메인을 교환하여 각각의 부모로부터 원하는 품질을 가진 혼성체 벡터를 생성하는 것이다. 바이러스 캡시드는 세포 수용체 결합을 담당하므로, 결합에 중요한 바이러스 캡시드 도메인(들)에 대한 이해가 중요하다. 결정 구조가 이용가능하기 전에 수행된 바이러스 캡시드 (주로 AAV2에 대함)에 대한 돌연변이 연구는 대부분 외인성 모이어티의 흡착, 무작위 위치에서의 펩티드의 삽입, 또는 아미노산 수준에서 포괄적인 돌연변이 유발에 의한 캡시드 표면 기능화에 기초하였다. 문헌 [Choi, et al. Curr Gene Ther. 2005 June; 5(3): 299-310]에는 혼성체 혈청형에 대한 상이한 접근 방식과 고려사항이 기재되어 있다.
다른 AAV 혈청형으로부터의 캡시드는 AAV2 캡시드에 기반한 rAAV 벡터보다 특정 생체내 적용에서 이점을 제공한다. 첫째, 특정한 혈청형을 가진 rAAV 벡터의 적절한 사용은 AAV2 기반 벡터에 의해 잘 감염되지 않았거나 전혀 감염되지 않은 특정 표적 세포에 대한 생체내 유전자 전달의 효율성을 증가시킬 수 있다. 둘째, rAAV 벡터의 재투여가 임상적으로 필요한 경우, 다른 AAV 혈청형에 기초한 rAAV 벡터를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 동일한 캡시드를 가진 동일한 rAAV 벡터의 재투여가 비효과적일 수 있으며, 이는 벡터에 대해 생성된 중화 항체의 생성 때문일 수 있음이 입증되었다 (Xiao, et al. 1999; Halbert, et al. 1997). 이러한 문제는 캡시드가 첫 번째 rAAV 벡터에 대한 중화 항체의 존재에 영향을 받지 않는 상이한 AAV 혈청형으로부터의 단백질로 구성되는 rAAV 입자를 투여함으로써 피할 수 있다 (Xiao, et al. 1999). 상기 이유로, AAV2를 포함하고 이에 더하여 혈청형으로부터의 cap 유전자를 사용하여 구축된 재조합 AAV 벡터가 바람직하다. rHSV와 유사하지만 다른 AAV 혈청형, 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV5 내지 AAV9로부터의 cap 유전자를 코딩하는 재조합 HSV 벡터의 구축은 rHSV를 생산하기 위해 본원에 기재된 방법을 사용하여 달성할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 특정의 바람직한 실시양태에서, 상이한 AAV로부터의 cap 유전자를 사용하여 구축된 재조합 AAV 벡터가 바람직하다. 이러한 부가의 rHSV 벡터의 구축의 중요한 장점은 rAAV의 대규모 생산에 사용되는 대체 방법과 비교하여 쉽고 시간이 절약된다는 것이다. 특히, 각각의 상이한 캡시드 혈청형에 대해 새로운 rep 및 cap 유도성 세포주를 구축하는 어려운 프로세스를 피할 수 있다.
IV. 재조합 AAV ( rAAV ) 벡터 제조
본 발명의 rAAV 벡터의 생산, 정제 및 특징규명은 관련 기술분야에 공지된 많은 방법 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 실험실 규모의 생산 방법에 대한 검토는, 예를 들어, 문헌 [Clark RK, Recent advances in recombinant adeno-associated virus vector production. Kidney Int. 61s:9-15 (2002); Choi VW et al., Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use. Current Protocols in Molecular Biology 16.25.1-16.25.24 (2007) (이하 Choi et al.); Grieger JC & Samulski RJ, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production, and clinical applications. Adv Biochem Engin/Biotechnol 99:119-145 (2005) (이하 Grieger & Samulski); Heilbronn R & Weger S, Viral Vectors for Gene Transfer: Current Status of Gene Therapeutics, in M. Schaefer-Korting (ed.), Drug Delivery, Handbook of Experimental Pharmacology, 197: 143-170 (2010) (이하 Heilbronn); Howarth JL et al., Using viral vectors as gene transfer tools. Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010) (이하 Howarth)]을 참조한다. 하기에 기재되는 생산 방법은 비-제한적인 예로서 의도된 것이다.
AAV 벡터 생산은 패키징 플라스미드의 공동 형질감염에 의해 수행될 수 있다 (Heilbronn). 세포주는 결실된 AAV 유전자 rep 및 cap 및 필요한 헬퍼 바이러스 기능을 제공한다. 아데노바이러스 헬퍼 유전자, VA-RNA, E2A 및 E4는 2개의 별도의 플라스미드 상에 또는 단일 헬퍼 구축물 상에, AAV rep 및 cap 유전자와 함께 형질감염된다. AAV 캡시드 유전자가 ITR로 분류된 트랜스진 발현 카세트 (관심 유전자, 예를 들어 PGRN 핵산; 프로모터; 및 최소 조절 요소를 포함함)로 대체되는 재조합 AAV 벡터 플라스미드가 또한 형질감염된다. 이러한 패키징 플라스미드는 전형적으로 나머지 필요한 Ad 헬퍼 유전자인 E1A 및 E1B를 구성적으로 발현하는 인간 세포주인 293 세포로 형질감염된다. 이는 관심 유전자를 운반하는 AAV 벡터의 증폭 및 패키징으로 이어진다.
현재 12개의 인간 혈청형 및 100개 초과의 비-인간 영장류 혈청형을 포함한 AAV의 다수의 혈청형이 확인되었다 (Howarth et al. Cell Biol Toxicol 26:1-10 (2010)). 본 발명의 AAV 벡터는 임의의 공지된 혈청형의 AAV로부터 유래된 캡시드 서열을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "공지된 혈청형"은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있는 캡시드 돌연변이체를 포괄한다. 이러한 방법은, 예를 들어, 바이러스 캡시드 서열의 유전자 조작, 상이한 혈청형의 캡시드 영역의 노출된 표면의 도메인 교환, 및 마커 구제와 같은 기술을 사용한 AAV 키메라의 생성을 포함한다. 문헌 [Bowles et al. Marker rescue of adeno-associated virus (AAV) capsid mutants: A novel approach for chimeric AAV production. Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003)] 뿐만 아니라 그 문헌에 인용된 참고문헌을 참조한다. 더욱이, 본 발명의 AAV 벡터는 임의의 공지된 혈청형의 AAV로부터 유래된 ITR을 포함할 수 있다. 우선적으로, ITR은 인간 혈청형 AAV1-AAV12 중 하나로부터 유래된다. 본 발명의 일부 실시양태에 따르면, 하나의 ITR 혈청형의 게놈이 상이한 혈청형 캡시드로 패키징되는 위형화 접근 방식이 이용된다.
일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열은 인간 혈청형 AAV1-AAV12 중 하나로부터 유래된다. 일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV2.레트로, 및 그의 변이체 또는 혼성체 (예를 들어, HSPG 돌연변이를 가진 AAV2 변이체 (AAV2-HBKO, AAVT-TT, AAV44.9), AAV 1+9 혼성체)로부터 유래된다. 일부 실시양태에 따르면, 특정한 캡시드 서열은 증진된 신경 및 뇌 변환을 부여한다. 일부 실시양태에 따르면, 캡시드 서열은 CNS의 세포 (예를 들어, 뉴런 세포, 성상세포)를 표적화하기 위해 높은 지향성을 갖는 AAV2 변이체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 따르면, AAV는 AAV9이다. 일부 실시양태에 따르면, AAV는 AAVrh10이다.
AAV 지향성은 별개의 바이러스 캡시드 단백질과 그의 동족 세포 수용체 간의 특이적 상호작용에 의해 결정된다. 따라서, 표적화되는 조직에 적절한 캡시드를 갖는 rAAV가 선택될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 재조합 AAV 벡터는 특히 AAV 3차원 구조의 루프 아웃 영역에서의 바이러스 캡시드 서열의 유전자 조작에 의해, 또는 상이한 혈청형의 캡시드 영역의 노출된 표면의 도메인 스와핑에 의해, 또는 마커 구제와 같은 기술을 사용한 AAV 키메라의 생성에 의해 직접적으로 표적화될 수 있다. 문헌 [Bowles et al. Marker rescue of adeno-associated virus (AAV) capsid mutants: A novel approach for chimeric AAV production. Journal of Virology, 77(1): 423-432 (2003)] 뿐만 아니라 이에 인용된 참고문헌을 참조한다.
재조합 AAV (rAAV) 벡터의 생산, 정제 및 특징규명을 위한 가능한 한 가지 프로토콜은 문헌 [Choi et al.]에 제공된다. 일반적으로, 하기 단계가 포함된다: 트랜스진 발현 카세트의 설계, 특이적 수용체를 표적화하기 위한 캡시드 서열의 설계, 아데노바이러스가 없는 rAAV 벡터의 생성, 정제 및 역가. 이들 단계는 하기에 요약되어 있으며 문헌 [Choi et al.]에 자세히 기재되어 있다.
트랜스진 발현 카세트는 단일 가닥 AAV (ssAAV) 벡터 또는 유사 이중 가닥 트랜스진으로서 패키징되는 "이량체" 또는 자기-상보적 AAV (scAAV) 벡터일 수 있다 (Choi et al.; Howarth et al.). 전통적인 ssAAV 벡터를 사용하면, 일반적으로 단일 가닥 AAV DNA를 이중 가닥 DNA로 전환시켜야 하기 때문에 유전자 발현이 느리게 시작된다 (트랜스진 발현의 안정기에 도달할 때까지 수일 내지 수주가 소요된다). 대조적으로, scAAV 벡터는 수시간 이내에 유전자 발현의 시작을 보여주며, 이는 정지 세포의 형질도입 후 수일 이내에 안정기에 도달한다 (Heilbronn). 일부 실시양태에 따르면, scAAV가 사용되며, 여기서 scAAV는 단일 가닥 AAV와 비교하여 빠른 형질도입 개시 및 증가된 안정성을 갖는다. 대안적으로, 트랜스진 발현 카세트는 두 AAV 벡터 사이에서 분할되어, 더 긴 구축물의 전달을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Daya S. and Berns, K.I., Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clinical Microbiology Reviews, 21(4): 583-593 (2008) (이하 Daya et al.)]을 참조한다. ssAAV 벡터는 제한 엔도뉴클레아제로 적절한 플라스미드 (예컨대 예를 들어, PGRN 유전자를 함유하는 플라스미드)를 소화하여 rep 및 cap 단편을 제거하고, AAVwt-ITR을 함유하는 플라스미드 백본을 겔 정제함으로써 구축될 수 있다 (Choi et al.). 연속해서, 원하는 트랜스진 발현 카세트를 적절한 제한 부위 사이에 삽입하여 단일 가닥 rAAV 벡터 플라스미드를 구축할 수 있다. scAAV 벡터는 문헌 [Choi et al.]에 기재된 바와 같이 구축될 수 있다.
이어서, rAAV 벡터와 적합한 AAV 헬퍼 플라스미드 및 pXX6 Ad 헬퍼 플라스미드의 대규모 플라스미드 제제 (적어도 1 mg)는 이중 CsCl 구배 분별에 의해 정제될 수 있다 (Choi et al.). 적합한 AAV 헬퍼 플라스미드는 각각 AAV2 ITR 게놈을 AAV 혈청형 1 내지 5의 캡시드로 교차 패키징할 수 있는 pXR 시리즈, pXR1-pXR5로부터 선택될 수 있다. 적절한 캡시드는 관심 세포에 대한 캡시드의 표적화의 효율성에 기초하여 선택될 수 있다. 특이적 세포 유형 (예를 들어, 망막 원추 세포)으로의 유전자 전달 및/또는 발현을 개선시키기 위해, 게놈 (즉, 트랜스진 발현 카세트) 길이와 AAV 캡시드를 변화시키는 공지된 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Yang GS, Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: Effects of viral capsid and genome size. Journal of Virology, 76(15): 7651-7660]을 참조한다.
그 다음, 293 세포를 pXX6 헬퍼 플라스미드, rAAV 벡터 플라스미드, 및 AAV 헬퍼 플라스미드로 형질감염시킨다 (Choi et al.). 연속해서, 분별된 세포 용해물은 rAAV 정제의 다단계 프로세스를 거친 다음, CsCl 구배 정제 또는 헤파린 세파로스 컬럼 정제 프로세스를 거친다. rAAV 비리온의 생산 및 정량화는 도트-블롯 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 세포 배양에서 rAAV의 시험관내 형질도입은 바이러스의 감염성과 발현 카세트의 기능성을 검증하는 데 사용될 수 있다.
문헌 [Choi et al.]에 기재된 방법에 더하여, AAV의 생산을 위한 다양한 다른 형질감염 방법이 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 인산칼슘 침전 프로토콜에 의존하는 방법을 포함한 일시적 형질감염 방법이 이용가능하다.
rAAV 벡터를 생산하기 위한 실험실 규모의 방법에 더하여, 본 발명은 AAV 벡터의 생물반응기 규모의 제조를 위해, 예를 들어 문헌 [Heilbronn; Clement, N. et al.]을 포함한 관련 기술분야에 공지된 기술을 활용할 수 있다. 헤르페스바이러스 기반 시스템을 사용한 대규모 아데노-연관 바이러스 벡터 생산은 임상 연구를 위한 제조를 가능하게 한다 (Human Gene Therapy, 20: 796-606).
대량의 임상 등급 rAAV 벡터를 산출할 수 있는 확장가능한 생산 시스템의 원하는 목표를 달성하기 위한 발전은 세포에서 rAAV 생산에 필요한 유전 요소를 전달하는 수단으로서 형질감염을 활용하는 생산 시스템에서 주로 이루어졌다. 예를 들어, 오염된 아데노바이러스 헬퍼의 제거는 세 번째 플라스미드가 아데노바이러스 헬퍼 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 3-플라스미드 형질감염 시스템에서 아데노바이러스 감염을 플라스미드 형질감염으로 대체함으로써 회피되었다 (Xiao, et al. 1998). 2-플라스미드 형질감염 시스템에서의 개선 또한 생산 프로세스를 단순화하고 rAAV 벡터 생산 효율을 증가시켰다 (Grimm, et al. 1998).
배양된 포유류 세포로부터 rAAV의 수율을 개선시키기 위한 몇 가지 전략은 유전 공학에 의해 생성된 전문화된 생산자 세포의 개발을 기반으로 한다. 한 가지 접근 방식에서, rAAV의 대규모 생산은 삽입된 AAV 게놈이 세포를 헬퍼 아데노바이러스 또는 HSV에 감염시킴으로써 "구제"될 수 있는 유전적으로 조작된 "프로바이러스" 세포주를 사용함으로써 달성되었다. 프로바이러스 세포주는 단순한 아데노바이러스 감염에 의해 구제될 수 있으며, 이는 형질감염 프로토콜에 비해 효율성을 높일 수 있다.
세포로부터 rAAV의 수율을 개선시키기 위한 두 번째 세포 기반 접근 방식은 AAV rep 및 cap 유전자, 또는 rep-cap와 관심 ITR-유전자 둘 다를 자신의 게놈에 보유하는 유전적으로 조작된 "패키징" 세포주의 사용을 포함한다 (Qiao, et al. 2002). 전자의 접근 방식에서, rAAV를 생산하기 위해, 패키징 세포주는 헬퍼 기능 및 AAV ITR-GOI 요소로 감염되거나 형질감염된다. 후자의 접근 방식은 헬퍼 기능만을 가진 세포의 감염 또는 형질감염을 수반한다. 전형적으로, 패키징 세포주를 이용한 rAAV 생산은 세포를 야생형 아데노바이러스 또는 재조합 아데노바이러스에 감염시킴으로써 시작된다. 패키징 세포는 rep 및 cap 유전자를 포함하기 때문에, 이들 요소는 외인적으로 공급할 필요가 없다.
패키징 세포주로부터의 rAAV 수율은 프로바이러스 세포주 구제 또는 형질감염 프로토콜에 의해 수득된 수율보다 더 높은 것으로 나타났다.
rAAV의 수율 개선은 재조합 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 앰플리콘 시스템을 사용하는 HSV로부터의 헬퍼 기능 전달을 기반으로 한 접근 방식을 사용하여 이루어졌다. 세포당 150-500 바이러스 게놈 (vg)의 보통 수준의 rAAV 벡터 수율이 초기에 보고되었으나 (문헌 [Conway, et al. 1997]), rHSV 앰플리콘 기반 시스템에서의 보다 최근의 개선은 세포당 rAAV v.g.와 감염성 입자 (ip)의 수율을 실질적으로 더 높였다 (Feudner, et al. 2002). 앰플리콘 시스템은 본질적으로 복제 결핍성이지만; "완전히 파괴된" 벡터, 복제 적격 (rcHSV) 또는 복제 결핍 rHSV의 사용은 여전히 면역원성 HSV 성분을 rAAV 생산 시스템 내로 도입시킨다. 따라서, 이러한 성분에 대한 적절한 검정과 그의 제거를 위한 상응하는 정제 프로토콜이 시행되어야만 한다.
이들 방법 외에도, 포유류 세포에서 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 이러한 방법은 현탁액 내에서 성장할 수 있는 포유류 세포를, 각각 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV cap 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 재조합 헤르페스바이러스, 및 PGRN 유전자, 및 관심 유전자의 패키징을 용이하게 하기 위해 AAV 역위 말단 반복부에 의해 플랭킹된, 상기 PGRN 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 재조합 헤르페스바이러스로 공동 감염시키는 단계; 및 상기 바이러스가 포유류 세포를 감염시키도록 하며, 이로써 포유류 세포에서 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함한다.
헤르페스바이러스의 복제를 지원할 수 있는 임의의 유형의 포유류 세포는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 사용하기에 적합하다. 따라서, 포유류 세포는 본원의 방법에 기재된 바와 같이 헤르페스바이러스의 복제를 위한 숙주 세포로 간주될 수 있다. 숙주 세포가 헤르페스바이러스의 복제를 지원할 수 있는 한, 이러한 숙주 세포로서 사용하기 위한 임의의 세포 유형이 본 발명에 의해 고려된다. 유전적으로 변형되지 않은 적합한 포유류 세포의 예는 세포주, 예컨대 HEK-293 (293), Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 다양한 실시양태에서 사용되는 숙주 세포는, 예를 들어, 포유류 세포, 예컨대 인간 배아 신장 세포 또는 영장류 세포로부터 유래될 수 있다. 다른 세포 유형은 BHK 세포, Vero 세포, CHO 세포, 또는 세포가 헤르페스바이러스를 허용하는 한 조직 배양 기술이 확립된 임의의 진핵 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "헤르페스바이러스 허용"은 헤르페스바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터가 세포 환경 내에서 세포내 바이러스 수명 주기 전체를 완료할 수 있는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 기재된 바와 같은 방법은 현탁액에서 성장하는 포유류 세포주 BHK에서 발생한다. 숙주 세포는 기존 세포주, 예를 들어 BHK 세포주로부터 유래되거나, 또는 새로 발생될 수 있다.
본원에 기재된 rAAV 유전자 구축물을 생산하는 방법은 또한 현탁액 내에서 성장할 수 있는 포유류 세포를, 각각 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV cap 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 재조합 헤르페스바이러스, 및 PGRN, 및 상기 PGRN 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 재조합 헤르페스바이러스로 공동 감염시키는 단계; 및 상기 바이러스가 포유류 세포를 감염시키도록 하며, 이로써 포유류 세포에서 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 포유류 세포에서 생산된 재조합 AAV 바이러스 입자를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 헤르페스바이러스는 시토메갈로바이러스 (CMV), 단순 헤르페스 (HSV), 및 바리셀라 조스터 (VZV) 및 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스이다. 재조합 헤르페스바이러스는 복제 결함성이다. 일부 실시양태에 따르면, AAV cap 유전자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV2.레트로, 및 그의 변이체 또는 혼성체 (예를 들어, HSPG 돌연변이를 가진 AAV2 변이체, (AAV2-HBKO, AAVT-TT, AAV44.9), AAV 1+9 혼성체)로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는다. 일부 실시양태에 따르면, 특정한 캡시드 서열은 증진된 신경 및 뇌 변환을 부여한다. 일부 실시양태에 따르면, AAV는 AAV9이다. 일부 실시양태에 따르면, AAV는 AAVrh10이다.
미국 특허 출원 공개 번호 2007/0202587 (그 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨)에는 rAAV 생산 시스템의 필수 요소가 기재되어 있다. 재조합 AAV는 생산자 세포로서 공지된 세포 내로 유전자 구축물을 도입함으로써 시험관 내에서 생산된다. rAAV의 생산을 위한 공지된 시스템은 3가지 기본 요소를 이용한다: (1) 관심 유전자를 함유하는 유전자 카세트, (2) AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 유전자 카세트, 및 (3) "헬퍼" 바이러스 단백질의 공급원.
제1 유전자 카세트는 AAV로부터의 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된 관심 유전자로 구축된다. ITR은 관심 유전자를 숙주 세포 게놈으로 직접 통합하는 기능을 하며, 재조합 게놈의 캡슐화에 필수적이다 (Hermonat and Muzyczka, 1984; Samulski et al. 1983). 제2 유전자 카세트는 rAAV의 복제 및 패키징에 필요한 단백질을 코딩하는 AAV 유전자 rep 및 cap를 함유한다. rep 유전자는 DNA 복제에 필요한 4가지 단백질 (Rep 78, 68, 52 및 40)을 코딩한다. cap 유전자는 바이러스 캡시드를 구성하는 3가지 구조 단백질 (VP1, VP2, 및 VP3)을 코딩한다 (Muzyczka and Berns, 2001).
AAV는 자체적으로 복제되지 않기 때문에 제3 요소가 필요하다. 헬퍼 기능은 rAAV의 효율적인 복제 및 패키징에 도움이 되는 세포 환경을 만드는 헬퍼 DNA 바이러스로부터의 단백질 산물이다. 전통적으로, 아데노바이러스 (Ad)가 rAAV에 대한 헬퍼 기능을 제공하기 위해 사용되었지만, 헤르페스바이러스가 또한 본원에서 논의된 바와 같이 이러한 기능을 제공할 수 있다.
유전자 요법를 위한 rAAV 벡터의 생산은 적합한 생산자 세포주, 예컨대 현탁액에서 성장시킨 BHK 세포를 사용하여 시험관 내에서 수행된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 세포주는 HEK-293 (293), Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5를 포함한다.
세포가 헤르페스바이러스의 복제를 지원할 수 있는 한, 임의의 세포 유형이 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 숙주 세포로부터 헤르페스바이러스의 생산에 사용될 수 있는 광범위한 숙주 세포에 익숙할 것이다. 예를 들어, 유전적으로 변형되지 않은 적합한 포유류 숙주 세포의 예는 세포주, 예컨대 HEK-293 (293), Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
숙주 세포는 현탁 배양에서의 성장을 위해 적응될 수 있다. 숙주 세포는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포일 수 있다. 현탁액에서 성장한 BHK 세포주는 부착 BHK 세포주의 적응으로부터 유래된다. 두 세포주 모두 상업적으로 이용가능하다.
rAAV 생산에 필요한 모든 요소를 전달하기 위한 한 가지 전략은 2개의 플라스미드와 헬퍼 바이러스를 활용하는 것이다. 이러한 방법은 필요한 유전자 산물을 코딩하는 유전자 카세트를 함유하는 플라스미드로 생산자 세포를 형질감염시키는 것 뿐만 아니라 헬퍼 기능을 제공하기 위해 Ad로 세포를 감염시키는 것에 의존한다. 이러한 시스템은 2개의 상이한 유전자 카세트를 가진 플라스미드를 이용한다. 첫 번째는 rAAV로서 패키징될 재조합 DNA를 코딩하는 프로바이러스 플라스미드이다. 두 번째는 rep 및 cap 유전자를 코딩하는 플라스미드이다. 이러한 다양한 요소들을 세포 내로 도입하기 위해, 세포는 Ad에 감염될 뿐만 아니라 2개의 플라스미드로 형질감염된다. Ad에 의해 제공되는 유전자 산물은 유전자 E1a, E1b, E2a, E4orf6, 및 Va에 의해 코딩된다 (Samulski et al. 1998: Hauswirth et al. 2000; Muzyczka and Burns, 2001). 대안적으로, 보다 최근의 프로토콜에서, Ad 감염 단계는 VA, E2A, 및 E4 유전자를 함유하는 아데노바이러스 "헬퍼 플라스미드"로의 형질감염으로 대체될 수 있다 (Xiao et al. 1998; Matsushita, et al. 1998).
rAAV 생산을 위한 헬퍼 바이러스로서 Ad가 통상적으로 사용되었지만, 다른 DNA 바이러스, 예컨대 단순 헤르페스 바이러스 유형 1 (HSV-1)이 또한 사용될 수 있다. AAV2 복제 및 패키징에 필요한 최소 HSV-1 유전자 세트가 확인되었으며, 이는 초기 유전자 UL5, UL8, UL52 및 UL29를 포함한다 (Muzyczka and Burns, 2001). 이들 유전자는 HSV-1 핵심 복제 기구의 구성 요소, 즉 헬리카제, 프리마제, 프리마제 부속 단백질 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질을 코딩한다 (Knipe, 1989; Weller, 1991). HSV-1의 이러한 rAAV 헬퍼 특성은 rAAV 생산에 필요한 헬퍼 바이러스 유전자 산물을 제공할 수 있는 재조합 헤르페스바이러스 벡터의 설계 및 구축에 활용되었다 (Conway et al. 1999).
유전자 요법를 위한 rAAV 벡터의 생산은 적합한 생산자 세포주, 예컨대 현탁액에서 성장시킨 BHK 세포를 사용하여 시험관 내에서 수행된다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 세포주는 HEK-293 (293), Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5를 포함한다.
세포가 헤르페스바이러스의 복제를 지원할 수 있는 한, 임의의 세포 유형이 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 숙주 세포로부터 헤르페스바이러스의 생산에 사용될 수 있는 광범위한 숙주 세포에 익숙할 것이다. 예를 들어, 유전적으로 변형되지 않은 적합한 포유류 숙주 세포의 예는 세포주, 예컨대 HEK-293 (293), Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
숙주 세포는 현탁 배양에서의 성장을 위해 적응될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포일 수 있다. 현탁액에서 성장한 BHK 세포주는 부착 BHK 세포주의 적응으로부터 유래된다. 두 세포주 모두 상업적으로 이용가능하다.
rHSV 기반 rAAV 제조 프로세스
현탁액에서 성장하는 세포에서의 재조합 AAV 바이러스 입자의 생산 방법이 본원에 기재되어 있다. 지속적으로 확립된 세포주로부터의 현탁 또는 비-고정 의존적 배양은 세포와 세포 산물의 대규모 생산을 위해 가장 널리 사용되는 수단이다. 발효 기술을 기반으로 한 대규모 현탁 배양은 포유류 세포 산물의 제조에 분명한 이점이 있다. 생물반응기에 균일한 조건을 제공함으로써 온도, 용존 산소 및 pH를 정밀하게 모니터링하고 제어할 수 있으며, 배양의 대표적인 샘플을 채취할 수 있다. 사용된 rHSV 벡터는 조직 배양 플라스크와 생물반응기 둘 다에서 허용되는 세포주 상에서 높은 역가로 쉽게 전파되며, 임상 및 시장 생산에 필요한 바이러스 생산 수준에 맞게 확대할 수 있는 생산 프로토콜을 제공하였다.
교반 탱크 생물반응기에서의 세포 배양은 매우 높은 용적당 배양 표면적을 제공하며 바이러스 백신 생산에 사용되어 왔다 (Griffiths, 1986). 더욱이, 교반 탱크 생물반응기는 산업적으로 확장가능한 것으로 입증되었다. 한 가지 예는 다중 플레이트 CELL CUBE 세포 배양 시스템이다. 감염성 바이러스 벡터를 생산할 수 있는 능력은 제약 산업, 특히 유전자 요법의 맥락에서 점점 중요도가 증가하고 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 세포를 성장시키는 것은 본 발명의 헤르페스 벡터에 의해 감염될 수 있는 완전히 생물학적으로 활성인 세포를 대량 생산할 수 있는 생물반응기에서 수행될 수 있다. 생물반응기는 현탁액과 고정 의존성 동물 세포 배양액 둘 다로부터 생물학적 산물을 생산하는 데 널리 사용되어 왔다. 대부분의 대규모 현탁 배양은 운영 및 규모 확장이 가장 간단한 배치 또는 유가 프로세스로서 운영된다. 그러나, 케모스태트 또는 관류 원리에 기초한 연속 프로세스가 이용가능하다. 생물반응기 시스템은 배지 교환을 허용하는 시스템을 포함하도록 설정될 수 있다. 예를 들어, 필터가 생물반응기 시스템에 혼입됨으로써 사용된 배지로부터 세포를 분리하여 배지 교환을 용이하게 할 수 있다. 헤르페스바이러스를 생산하기 위한 본 발명의 방법의 일부 실시양태에 따르면, 배지 교환 및 관류는 세포 성장의 특정 날에 시작하여 시행된다. 예를 들어, 배지 교환 및 관류는 세포 성장 제3일부터 시작될 수 있다. 필터는 생물반응기 외부에 있거나 생물반응기 내부에 있을 수 있다.
재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 방법은 현탁 세포를, 각각 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV cap 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 재조합 헤르페스바이러스; 및 PGRN 유전자 구축물, 및 상기 관심 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 재조합 헤르페스바이러스로 공동 감염시키는 단계; 및 상기 세포가 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산할 수 있도록 하며, 이로써 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 세포는 HEK-293 (293), Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5일 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, cap 유전자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV2.레트로, 및 그의 변이체 또는 혼성체 (예를 들어, HSPG 돌연변이를 가진 AAV2 변이체, (AAV2-HBKO, AAVT-TT, AAV44.9), AAV 1+9 혼성체)로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 AAV로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 특정한 캡시드 서열은 증진된 신경 및 뇌 변환을 부여한다. 일부 실시양태에 따르면, AAV는 AAV9이다. 일부 실시양태에 따르면, AAV는 AAVrh10이다. 세포는 3 내지 14의 복합 감염 다중도 (MOI)로 감염될 수 있다. 제1 헤르페스바이러스 및 제2 헤르페스바이러스는 시토메갈로바이러스 (CMV), 단순 헤르페스 (HSV) 및 바리셀라 조스터 (VZV) 및 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스일 수 있다. 헤르페스바이러스는 복제 결함성일 수 있다. 공동 감염은 동시 감염일 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 재조합 AAV 바이러스 입자는 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 추가로 포함한다.
포유류 세포에서 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 방법은 현탁 세포를, 각각 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV cap 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 재조합 헤르페스바이러스; 및 PGRN 유전자 구축물, 및 상기 PGRN 유전자 구축물에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 재조합 헤르페스바이러스로 공동 감염시키는 단계; 및 상기 세포가 번식할 수 있도록 하며, 이로써 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하며, 이로써 생산된 바이러스 입자의 수가 부착 조건 하의 동일한 수의 세포에서 성장한 바이러스 입자의 수와 같거나 그 초과인 것인 단계를 포함할 수 있다. 세포는 HEK-293 (293), Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5일 수 있다. cap 유전자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV2.레트로, 및 그의 변이체 또는 혼성체 (예를 들어, HSPG 돌연변이를 가진 AAV2 변이체, (AAV2-HBKO, AAVT-TT, AAV44.9), AAV 1+9 혼성체)로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 AAV로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, AAV는 AAVrh10이다. 일부 실시양태에 따르면, AAV는 AAV9이다. 일부 실시양태에 따르면, 특정한 캡시드 서열은 증진된 신경 및 뇌 변환을 부여한다. 세포는 3 내지 14의 복합 감염 다중도 (MOI)로 감염될 수 있다. 제1 헤르페스바이러스 및 제2 헤르페스바이러스는 시토메갈로바이러스 (CMV), 단순 헤르페스 (HSV) 및 바리셀라 조스터 (VZV) 및 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스일 수 있다. 헤르페스바이러스는 복제 결함성일 수 있다. 공동 감염은 동시 감염일 수 있다.
치료 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 현탁 세포에 전달하는 방법은 BHK 세포를, 각각 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV cap 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 재조합 헤르페스바이러스; 및 PGRN 유전자 구축물 (여기서 관심 유전자는 치료 단백질 코딩 서열을 포함함), 및 상기 PGRN 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 헤르페스바이러스로 공동 감염시키는 단계이며, 여기서 상기 세포는 3 내지 14의 복합 감염 다중도 (MOI)로 감염되는 것; 및 상기 바이러스가 세포를 감염시키고 치료 단백질을 발현할 수 있도록 하며, 이로써 치료 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 세포에 전달하는 단계를 포함한다. 세포는 HEK-293 (293), Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 9,783,826을 참조한다.
V. 치료 방법
AAV 및 유전자 요법
유전자 요법은 질환의 원인이 되는 유전자를 대체, 변경 또는 보충함으로써 유전되거나 후천적인 질환을 치료하는 것을 지칭한다. 이는 일반적으로 비히클 또는 벡터를 통해 교정된 유전자 또는 유전자들을 숙주 세포 내로 도입함으로써 달성된다. rAAV를 이용한 유전자 요법은 수많은 질환의 치료에 대한 큰 가능성을 가지고 있다. 신경변성 질환의 치료를 지원하기 위해 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)를 생산하는 방법, 특히 다량의 재조합 AAV를 생산하는 방법이 본원에 기재되어 있다.
현재까지 세계적으로 500가지 초과의 유전자 요법 임상 시험이 시행되었다. rAAV를 유전자 요법에 대한 비히클로서 사용하려는 노력은 인간 질환에 대한 치료로서 그것의 적용가능성에 대한 가능성을 약속한다. 이미, 뇌, 간, 골격근 및 폐의 임상적으로 중요한 비-분열 세포를 포함한 동물 세포 내로 도입된 유전자의 전달 및 장기간 발현을 위해 재조합 AAV (rAAV)를 사용하여 임상 전 일부 성공을 달성하였다. 일부 조직에서, AAV 벡터가 표적 세포의 게놈에 통합되는 것으로 나타났다 (Hirata, et al. 2000, J. of Virology 74:4612-4620).
rAAV의 부가의 장점은 간 세포, 뉴런 및 골격 근세포를 포함한 비-분열 세포 유형에서 이러한 기능을 수행할 수 있는 능력이다. rAAV는 마우스의 골격근에서 에리스로포이에틴 (문헌 [Kessler, et al. 1996]), 파킨슨병의 원숭이 모델의 CNS에서의 티로신 히드록실라제 및 방향족 아미노산 데카르복실라제 (문헌 [Kaplitt, et al. 1994]) 및 혈우병의 동물 모델에서 골격근과 간에서의 인자 IX의 발현을 가능하게 하는 유전자 요법 비히클로서 성공적으로 사용되어 왔다. 임상 수준에서, rAAV 벡터는 낭포성 섬유증 환자에게 CFTR 유전자를 전달하고, 혈우병 환자에게 인자 IX 유전자를 전달하기 위해 인간 임상 시험에서 사용되었다 (Flotte, et al. 1998; Wagner, et al. 1998). 추가로, AAV는 인간 또는 포유류에서의 질환과 연관되지 않는 헬퍼 의존성 DNA 파보바이러스이다 (Berns and Bohensky, 1987, Advances in Virus Research, Academic Press Inc, 32:243-307). 따라서, AAV 벡터의 가장 중요한 속성 중 하나는 I상 임상 시험에서의 안전성 프로필이다.
AAV 유전자 요법은 다양한 질환 및 장애를 치료하기 위해 다수의 상이한 병리학적 환경에서 수행되었다. 예를 들어, 임상 I상 연구에서, 8명의 혈우병 B 대상체의 골격근에 AAV2-FIX 벡터를 투여하는 것은 안전한 것으로 입증되었고 벡터 주입 후 적어도 10개월 동안 국소 유전자 전달과 인자 IX 발현을 달성했으며 (문헌 [Jiang, et al. Mol Ther . 14(3):452-5 2006]), AAT 결핍 성인에 대한 재조합 아데노-연관 바이러스 알파 1-항트립신 (rAAV2-CB-hAAT) 유전자 벡터의 근육내 주입에 대한 I상 시험은 이전에 설명되었으며 (문헌 [Flotte, et al. Hum Gene Ther . 2004 15(1):93-128]), 또 다른 임상 시험에서 시상하부 핵의 AAV-GAD 유전자 요법은 진행성 파킨슨병 환자에게 안전하고 내약성이 우수한 것으로 나타났다 (Kaplitt et al. Lancet. 200723; 369(9579):2097-105).
프로그래뉼린 및 신경변성 질환
본원에는 대상체에서의 신경변성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에 따르면, 신경변성 질환은 대상체에서의 유전성 돌연변이에 의해 매개된다. 일부 실시양태에 따르면, 신경변성 질환은 대상체에 대한 환경적 손상 요인에 의해 매개된다. 본원에 사용된 바와 같은, 환자에 대한 환경적 손상 요인에 의해 매개되는 신경변성 질환은 환경적 손상 요인에 의해 유발되며, 프로그래뉼린 발현을 변형시키는 프로그래뉼린 유전자의 유전성 돌연변이에 의해 유발되지 않는 질환을 의미한다. 유전성 돌연변이는 환자의 자손에게 전달될 수 있는 환자 DNA의 영구적인 돌연변이이다. 본원에 기재된 핵산 중 하나 이상을 CNS 세포, 특히 뉴런 세포로 전달하는 것은 신경변성 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 가족성 전두측두엽 치매 (FTD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 뉴런 세로이드 리포푸신증-11 (CLN11) 및 배턴병을 포함한 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL), 및 알츠하이머병 (AD)을 포함하나 이에 제한되지는 않은 프로그래뉼린-연관 신경변성 질환을 치료하기 위해 PGRN AAV 기반 유전자 요법을 이용하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에 따르면, 가족성 전두측두엽 치매 (FTD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 뉴런 세로이드 리포푸신증-11 (CLN11) 및 배턴병을 포함한 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL), 및 알츠하이머병 (AD)을 포함하나 이에 제한되지는 않은 프로그래뉼린-연관 신경변성 장애를 예방하기 위해 PGRN AAV 기반 유전자 요법을 이용하는 방법이 본원에 제공된다.
현탁액에서 성장할 수 있는 포유류 세포를, 가족성 전두측두엽 치매 (FTD) 및 뉴런 세로이드 리포푸신증-11 (CLN11)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 프로그래뉼린-연관 신경변성 장애의 치료에 치료적 가치를 갖는 프로그래뉼린 유전자 구축물을 포함하는 제2 재조합 헤르페스바이러스 및 제1 재조합 헤르페스바이러스로 공동 감염시키는 것을 포함하는 본원에 기재된 방법은 포유류 세포에서 재조합 AAV 바이러스 입자의 생산을 가능하게 한다.
본원에 기재된 유전자 요법 구축물은 프로그래뉼린-연관 신경변성 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 프로그래뉼린-연관 신경변성 장애는 가족성 전두측두엽성 치매 (FTD)의 발병률의 20% 및 뉴런 세로이드 리포푸신증-11 (CLN11)의 모든 경우를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 신경변성 장애는 가족성 전두측두엽성 치매 (FTD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 뉴런 세로이드 리포푸신증-11 (CLN11) 및 배턴병을 포함한 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL), 및 알츠하이머병 (AD)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
분비된 당단백질인 프로그래뉼린은 단일 GRN 유전자에 의해 인간에서 코딩된다. 프로그래뉼린 (PGRN)은 주로 뇌의 미세아교세포에 의해 발현된다. 프로그래뉼린 (PGRN)은 고도로 보존되어 있으며 진핵생물에서 인간에 이르는 광범위한 종에서 발견되는 분비된 593개 아미노산의 다기능 단백질이다. PGRN은 CNS 전체에 널리 분포되어 있으며 주로 뉴런과 미세아교세포에서 발견되지만 훨씬 더 낮은 수준에서는 성상세포와 희소돌기아교세포에서도 검출되었다. 프로그래뉼린은 12개의 시스테인 그래눌린 모티프의 동일하지 않은 7개 반의 탠덤 반복된 카피로 이루어진다. 많은 세포성 프로세스와 질환은 배아 발생, 종양 발생, 염증, 상처 회복, 신경변성 및 리소좀 기능을 포함하나 이에 제한되지는 않은 이러한 독특한 다면발현 인자와 연관된다. GRN 유전자 내의 상염색체 우성 돌연변이에 의해 야기되는 반수체 기능 부전은 환자에게 전두측두엽 치매로서 제시되는 진행성 신경 위축인 전두측두엽 변성으로 이어진다. 전두측두엽 치매는 알츠하이머병과 구별되는 조기 발병 형태의 치매이다. 전두측두엽 치매의 GRN 관련 형태는 유비퀴틴화 및 단편화된 TDP-43 (TARDBP에 의해 코딩됨)을 함유하는 뉴런 봉입체의 출현을 특징으로 하는 단백질병증이다 (Chitramuthu et al. Brain 2017 140(12): 3081-3104; Suarez-Calvet et al. EMBO Molecular Medicine 2018 e9712).
본원에 기재된 프로그래뉼린 (PGRN) AAV 구축물은 가족성 전두측두엽 치매 (FTD)의 전체 발병률의 20% 및 뉴런 세로이드 리포푸신증-11 (CLN11)의 모든 경우를 포함하여 PGRN-연관 신경변성 장애의 치료를 위한 유전자 요법 비히클을 제공한다. 본원에 기재된 PGRN AAV 유전자 요법 구축물 및 사용 방법은 PGRN-연관 신경변성 장애를 앓고 있는 환자에게 이용가능한 유전자 요법 기반 치료가 없기 때문에 오랫동안 충족되지 않은 요구인 PGRN-연관 신경변성 장애에 대한 요법을 제공한다.
일부 실시양태에 따르면, PGRN AAV 유전자 요법은 대상체에게 신경변성 질환이 발병하기 전에 투여된다. 일부 실시양태에 따르면, 대상체는 PGRN 돌연변이를 확인하기 위한 분자 유전자 시험에 의해 신경변성 질환이 있는 것으로 진단된다. 일부 실시양태에 따르면, 대상체는 신경변성 질환이 있는 가족 구성원을 갖는다.
본원에 기재된 rAAV 구축물은 기존의 AAV 벡터보다 더 큰 효율로 CNS 세포, 특히 뉴런 세포를 형질도입한다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 핵산을 CNS 세포, 특히 뉴런 세포로 매우 효율적으로 전달할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 내부 유모 세포의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)에서 트랜스진으로의 전달 및 트랜스진의 발현, 또는 뉴런 세포의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)로의 전달 및 발현을 가능하게 한다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 내부 유모 세포의 적어도 70% (예를 들어, 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)에서 트랜스진으로의 전달 및 트랜스진의 발현, 또는 뉴런 세포의 적어도 70% (예를 들어, 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)로의 전달 및 발현을 가능하게 한다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 내부 유모 세포의 적어도 80% (예를 들어, 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)에서 트랜스진으로의 전달 및 트랜스진의 발현, 또는 뉴런 세포의 적어도 80% (예를 들어, 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%)로의 전달 및 발현을 가능하게 한다.
일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 핵산 서열은 세포 내로 직접 도입되며, 여기서 핵산 서열은 그 결과로 생성되는 재조합 세포의 생체내 투여 전에, 코딩된 산물을 생산하도록 발현한다. 이것은 관련 기술분야에 공지된 수많은 방법 중 임의의 것, 예를 들어 전기천공, 리포펙션, 인산칼슘 매개 형질감염과 같은 방법에 의해 달성될 수 있다.
VI. 제약 조성물
일부 측면에 따르면, 본 개시내용은 임의로 제약상 허용되는 부형제 중의, 본원에 기재된 벡터 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같이, 제악상 허용되는 부형제는 약리학적으로 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 불활성인 물질이며, 액체 용액 또는 현탁액으로서, 에멀션으로서, 또는 사용 전에 액체에서 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태로서 공급될 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 일관성을 제공하거나 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정제, 습윤 및 유화제, 다양한 삼투압을 위한 염, 캡슐화제, pH 완충 물질, 및 완충제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 부형제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 귀 (예를 들어, 내이 또는 중이)로의 직접 전달에 적합한 임의의 의약품을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 소르비톨, 다양한 TWEEN 화합물 중 임의의 것, 및 액상물, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염은 그 내부에, 예를 들어, 무기산 염, 예컨대 염산염, 브로민화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제에 대한 철저한 논의는 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용가능하다.
일부 실시양태에 따르면, rAAV 조성물은 특히 높은 rAAV 농도가 존재하는 조성물 내의 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제형화된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 계면활성제의 부가, pH 조정, 염 농도 조정 등을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178] 참조; 그 내용은 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에 따르면, 제약 조성물은 BSST, PBS 또는 BSS 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 제약 조성물은 히스티딘 완충제를 추가로 포함한다.
필수는 아니지만, 상기 조성물은 임의로, 정확한 양의 투여에 적합한 단위 투여 형태로 공급될 수 있다.
VII. 투여 방법
일반적으로, 본원에 기재된 조성물은 CNS에 투여하기 위해 제형화된다. 일부 실시양태에 따르면, 조성물은 뉴런 세포에 투여하기 위해 제형화된다.
일부 실시양태에 따르면, 투여는 뇌내 (예를 들어, 소뇌숨뇌수조내 (ICM)), 척수강내 (IT), 카테터 유무, 정맥내 (IV), 또는 IV와 IT의 조합이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "척수강내 투여"는 작용제, 예를 들어, rAAV를 포함하는 조성물을 척추관에 투여하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 척수강내 투여는 척추관의 경부 영역, 척추관의 흉부 영역, 또는 척추관의 요추 영역 내의 주사를 포함할 수 있다. 전형적으로, 척수강내 투여는 척추관의 지주막과 연질막 사이의 영역인, 척추관의 지주막하 강 (지주막하 공간)에 작용제, 예를 들어 rAAV를 포함하는 조성물을 주사함으로써 수행된다. 지주막하 공간은 섬유주 (지주막으로부터 연장되어 연질막으로 블렌딩되는 섬세한 결합 조직 필라멘트)와 뇌척수액이 함유된 상호 통신 채널로 이루어진 해면 조직이 차지하고 있다. 일부 실시양태에 따르면, 척수강내 투여는 척추 혈관계로의 투여가 아니다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "뇌내 투여"는 뇌 내부 및/또는 뇌 주위에 작용제를 투여하는 것을 지칭한다. 뇌내 투여는 작용제를 대뇌, 연수, 뇌교, 소뇌, 두개내 강, 및 뇌를 둘러싼 수막에 투여하는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 뇌내 투여는 뇌의 경막, 지주막, 및 연질막에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뇌내 투여는 작용제를 소뇌숨뇌수조 (CM) 내로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뇌내 투여는 작용제를 뇌를 둘러싼 지주막하 공간의 뇌척수액 (CSF) 내로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뇌내 투여는 작용제를 뇌의 뇌실, 예를 들어 우측 뇌실, 좌측 뇌실, 제3 뇌실, 제4 뇌실 내로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 뇌내 투여는 뇌 혈관계로의 투여가 아니다.
뇌내 투여는 뇌 내부 및/또는 뇌 주변에 직접 주사하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 뇌내 투여는 뇌정위 고정 절차를 사용한 주사를 포함한다. 뇌정위 고정 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 전형적으로 특정한 뇌내 영역, 예를 들어, 뇌실 영역으로 주사를 가이드하기 위해 함께 사용되는 3차원 스캐닝 장치 및 컴퓨터의 사용을 포함한다. 미량주사 펌프 [예를 들어, 월드 프리시전 인스트루먼츠(World Precision Instruments)]가 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, rAAV를 포함하는 조성물을 전달하기 위해 미량주사 펌프가 사용된다.
일부 실시양태에 따르면, 조성물의 주입 속도는 1 mL/분 이하이다. 일부 실시양태에 따르면, 조성물의 주입 속도는 약 10 μl/분 내지 약 1000 μl/분이다. 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, 주입 속도는, 예를 들어 대상체의 종, 대상체의 연령, 대상체의 체중/크기, AAV의 혈청형, 필요한 투여량, 표적화된 뇌내 영역 등을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 따라서, 통상의 기술자는 특정 상황에서 다른 주입 속도를 적절한 것으로 간주할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 rAAV를 포함하는 조성물은 삼투압 펌프 또는 주입 펌프를 사용하여 투여된다. 삼투압 펌프와 주입 펌프는 모두 다양한 공급업체, 예를 들어 알제트 코포레이션(Alzet Corporation), 해밀턴 코포레이션(Hamilton Corporation), 알자, 인크.(Alza, Inc.) (미국 캘리포니아주 팔로 알토)로부터 상업적으로 입수가능하다.
본원에 기재된 바와 같이 안전하고 효과적으로 CNS 세포를 형질도입함으로써, 본 발명의 방법은 개체, 예를 들어 인간을 치료하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 형질도입된 세포는 신경변성 질환을 치료하거나 예방하기에 충분한 양의 PGRN을 생산한다.
본 발명의 치료 방법에 따르면, 전달된 벡터의 용적은 치료를 받는 대상체의 특징, 예컨대 대상체의 연령, 및 벡터가 전달될 부위의 용적에 근거하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 주입되는 조성물의 용적은 약 10 μl 내지 약 1000 μl, 또는 100 μl 내지 약 1000 μl, 또는 약 100 μl 내지 약 500 μl, 또는 약 500 μl 내지 약 1000 μl이다. 일부 실시양태에 따르면, 주입되는 조성물의 용적은 약 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl, 5 μl, 6 μl, 7 μl, 8 μl, 9 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 50 μl, 75 μl, 100 μl, 200 μl, 300 μl, 400 μl, 500 μl, 600 μl, 700 μl, 800 μl, 900 μl, 또는 1 mL 중 어느 하나 초과, 또는 이들 사이의 임의의 값이다.
본 개시내용의 치료 방법에 따르면, 투여되는 벡터의 농도는 생산 방법에 따라 달라질 수 있으며, 특정한 투여 경로에 대해 치료상 유효한 것으로 결정된 농도에 근거하여 선택 또는 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 밀리리터당 벡터 게놈의 농도 (vg/ml)는 약 108 vg/ml, 약 109 vg/ml, 약 1010 vg/ml, 약 1011 vg/ml, 약 1012 vg/ml, 약 1013 vg/ml, 및 약 1014 vg/ml로 이루어진 군로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 농도는 약 0.1 mL, 약 0.2 mL, 약 0.4 mL, 약 0.6 mL, 약 0.8 mL, 및 약 1.0 mL의 용적 중의 1011 vg/ml 내지 1014 vg/ml의 범위이다.
본원에 기재된 조성물의 유효성은 여러 기준에 의해 모니터링될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 조성물의 유효성은 PGRN rAAV로 치료받은 대상체에서의 개선을 모니터링함으로써 결정된다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물의 유효성은 생체내 마우스 모델에서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, PGRN-/-KO 마우스 모델에서, 혈액, CSF 및 뇌 조직에서의 PGRN 단백질 수준 증가; 혈액 및 CSF에서의 뉴로필라멘트-1 (Nfl-1)의 수준 감소; 뇌 조직으로부터의 리포푸신 및 세포내 TDP43의 수준 감소는 조성물의 유효성을 나타내는 지표가 될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물의 유효성은 인간 질환 대상체에서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 혈액 및 CSF에서의 PGRN 단백질 수준 증가, 혈액 및 CSF에서의 Nfl-1의 수준 감소, 및 행동 및 인지 개선은 조성물의 유효성을 나타내는 지표로서 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태는 이제 하기 실시예와 관련하여 기재될 것이다. 본원에 함유된 실시예는 어떠한 방식의 제한이 아니라 예시 방식으로 제공된다.
실시예
실시예 1. 방법
본 발명은 하기 방법을 사용하여 수행되나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 바와 같은 방법은 고 역가 재조합 AAV 생산이란 발명의 명칭으로 2002년 9월 23일에 출원된 미국 출원 번호 10/252,182 (2006년 8월 15일에 허여된 미국 특허 번호 7,091,029)의 부분 연속 출원인, 포유류 세포에서의 재조합 AAV 생산이란 발명의 명칭으로 2007년 8월 14일에 출원된 미국 출원 번호 11/503,775를 우선권 청구하는, 포유류 세포에서의 재조합 AAV 생산이란 발명의 명칭으로 2007년 8월 8일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2007/017645에 제시되어 있다. 전술한 모든 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
rHSV 공동 감염 방법
재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV) 생산을 위한 rHSV 공동 감염 방법은 2개의 ICP27 결핍 재조합 단순 헤르페스 바이러스 유형 1 (rHSV-1) 벡터를 사용하며, 하나는 AAV rep 및 cap 유전자 (rHSV-rep2capX, "capX는 AAV 혈청형 중 임의의 것을 지칭함)를 보유하고 있으며, 다른 하나는 AAV 역위 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된 관심 유전자 (GOI) 카세트를 보유하고 있다. AAV 혈청형 2 rep, cap, 및 ITR 뿐만 아니라 인간화된 녹색 형광 단백질 유전자 (GFP)를 트랜스진으로서 사용하여 시스템을 개발하였지만, 상이한 트랜스진과 혈청형/위형 요소로 시스템을 이용할 수 있다.
포유류 세포는 rHSV 벡터에 감염되어, 모든 시스 및 트랜스 작용성 rAAV 성분 뿐만 아니라 증식성 rAAV 감염에 필요한 헬퍼 기능을 제공한다. 세포는 rHSV-rep2capX와 rHSV-GOI의 혼합물에 감염된다. 세포는 rAAV-GOI를 방출하기 위해 채취 및 용해되며, 그 결과로 생성된 벡터 스톡은 하기에 기재된 다양한 방법에 의해 적정된다.
DOC 용해
채취할 때, 세포와 배지는 원심분리에 의해 분리된다. 배지는 세포 펠릿을 2 내지 3회 동결-해동 사이클을 사용하여, 0.5% (w/v) 데옥시콜레이트 (DOC)를 함유하는 용해 완충액 (20 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl)으로 추출하는 동안 따로 두며, 이는 세포-연관 rAAV를 추출한다. 일부 경우에, 배지와 세포-연관 rAAV 용해물이 재조합된다.
계내 용해
rAAV를 채취하는 대안적인 방법은 계내 용해이다. 채취시, MgCl2는 1 mM의 최종 농도에 부가되고, 10% (v/v) 트리톤 X-100은 1% (v/v)의 최종 농도에 부가되며, 벤조나제는 50 단위/mL의 최종 농도에 부가된다. 이러한 혼합물은 37℃에서 2시간 동안 진탕하거나 교반한다.
DRP 수율을 결정하기 위한 정량적 실시간 PCR
DNAse 내성 입자 (DRP) 검정은 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR) 기술을 사용하여 증폭된 DNA 서열의 검출 및 정량화를 위해 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 이중 표지된 혼성화 프로브를 사용한다. 표적 서열은 DNA와 혼성화되고 카피 의존적 형광을 방출하는 형광발생 프로브의 존재 하에 증폭된다. DRP 역가 (DRP/mL)는 동일한 DNA 서열을 갖는 공지된 플라스미드 희석액으로부터 생성된 형광 신호에 대한 시험 물품의 상대적 형광 단위 (RFU)를 직접 비교함으로써 계산된다. 이러한 검정으로부터 생성된 데이터는 패키징된 바이러스 DNA 서열의 수량을 반영하며, 서열 무결성 또는 입자 감염성을 나타내지 않는다.
감염성 입자 수율을 결정하기 위한 그린-세포 감염성 검정 ( rAAV - GFP 단독)
감염성 입자 (ip) 적정은 그린 세포 검정을 사용하여 rAAV-GFP의 스톡에서 수행된다. C12 세포 (AAV2 Rep 및 Cap 유전자를 발현한 HeLa 유래 세포주 - 하기 참고문헌 참조)는 rAAV-GFP의 연속 희석액 플러스 포화 농도의 아데노바이러스 (AAV 복제를 위한 헬퍼 기능을 제공하기 위함)에 감염된다. 2일 내지 3일 인큐베이션한 후, 형광 그린 세포 (각각의 세포는 하나의 감염 사건을 나타냄)의 수를 측정하고 바이러스 샘플의 ip/mL 역가를 계산하는 데 사용한다.
문헌 [Clark KR et al.]에는 문헌 [Hum. Gene Ther. 1995. 6:1329-1341] 및 [Gene Ther. 1996. 3:1124-1132]에서의 재조합 아데노바이러스 생산이 기재되었으며, 이들 두 문헌 모두 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
rAAV 감염성을 결정하는 TCID 50
관심 유전자를 정착시킨 rAAV 입자 (rAAV-GOI)의 감염성은 50% (TCID50) 검정에서 조직 배양 감염 용량을 사용하여 결정되었다. 8개의 rAAV 복제물은 인간 아데노바이러스 유형 5의 존재하에 연속적으로 희석되어 96-웰 플레이트에서 HeLaRC32 세포 (AAV2 rep 및 cap을 발현하는 HeLa 유래 세포주; ATCC로부터 구입함)를 감염시키는 데 사용되었다. 감염 후 3일에, 용해 완충액 (최종 농도 1 mM 트리스-HC1 pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.25% (w/v) 데옥시콜레이트, 0.45% (v/v) 트윈-20, 0.1% (w/v) 소듐 도데실 술페이트, 0.3 mg/mL 프로테이나제 K)을 각각의 웰에 부가한 후 37℃에서 1시간, 55℃에서 2시간 및 95℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰로부터의 용해물 (2.5 μL 분취액)은 상기 기재된 DRP qPCR 검정에서 검정되었다. Ct 값이 표준 곡선의 플라스미드 최소량 값보다 더 낮은 웰은 양성으로서 점수가 매겨졌다. mL당 TCID50 감염성 (TCID50/mL)은 10배 연속 희석에서 양성 웰의 비율을 사용하여 카르버(Karber) 방정식에 기초하여 계산되었다.
세포주 및 바이러스
유전자 요법을 위한 rAAV 벡터의 생산은 적합한 생산자 세포주, 예컨대 HEK293 세포 (293)를 사용하여 시험관 내에서 수행된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 세포주는 Vero, RD, BHK-21, HT-1080, A549, Cos-7, ARPE-19, 및 MRC-5를 포함한다.
포유류 세포주는 달리 명시되지 않는 한 2 - 10% (v/v) 소 태아 혈청 [FBS; 하이클론(Hyclone)]을 함유하는 둘벡코의 변형 이글 배지 (DMEM, 하이클론)에서 유지되었다. 세포 배양과 바이러스 증식은 지시된 간격 동안 37℃, 5% CO2에서 수행되었다.
감염 세포 밀도
세포는 적어도 약, 최대 약, 또는 약 1 x 106개 내지 4 x 106개 세포/mL를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 농도로 성장될 수 있다. 이후 세포는 미리 결정된 MOI에서 재조합 헤르페스바이러스에 감염될 수 있다.
실시예 2. PGRN 발현 구축물의 클로닝
신경변성 장애에 대한 성공적인 AAV-프로그래뉼린 요법은 벡터 성분에 크게 의존적이다. 최적의 벡터는 뇌를 효과적으로 표적화하는 효율적인 캡시드, 중간 정도이지만 세포-특이적인 프로모터 및 인간 프로그래뉼린 단백질을 발현하는 안정화된 트랜스진을 제공한다.
모든 구축물은 하기의 변이체 반복이다:
pTR *- CBA */ hSYN1 *-h/ m(wt/co1,2,3,4,5,6,7)(ss*)PGRN(nothing/HA/SBI) - wpre -(SV/hGH)pA
* (잠재적으로) 최적화된 및/또는 서열 조정된 요소
도 1은 각각의 말단에 있는 역위 말단 반복부 (ITR), 인간 시냅신 1 (hSYN1) 또는 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터, C-말단 HA 태그 또는 C-말단에서의 3-16개 핵산의 결실을 임의로 포함하는 PGRN, 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사후 조절 요소 (WPRE), SV40 초기 폴리아데닐화 신호 (SV40pA) 및 임의로 스터퍼 DNA를 포함하는 PGRN 구축물의 개략도를 보여준다. 도 1a의 하단 패널은 자기-상보적 AAV 게놈을 나타낸다.
pTR-CBA-PGRN-WPRE의 설계 및 클로닝: 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE) 부위가 플라스미드 백본에 삽입되었다.
pTR-CBA-hGFP-WPRE의 설계 및 클로닝: CBA 프로모터가 있는 대조군 hGFP 플라스미드를 구축하고, 이와 동시에 플라스미드 백본에서 GFP와 WPRE 사이에 다중 클로닝 부위를 삽입하였다.
pTR-hSyn-hGFP-WPRE의 설계 및 클로닝: hSyn 프로모터를 플라스미드 백본에 삽입하고 hSyn 프로모터가 있는 대조군 hGFP 플라스미드를 구축하였다.
pTR-CBA-hPGRNwt-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 CBA 프로모터가 있는 PGRN 야생형 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-CBA-hPGRNwt-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그가 없고 CBA 프로모터가 있는 PGRN 야생형 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-CBA-hPGRNco1-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 CBA 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN (ATUM, hPGRN_opt1_CpG 감소) 발현 플라스미드를 구축한다.
pTR-CBA-hPGRNco2-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 CBA 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN (ATUM, hPGRN_opt2_CpG 감소) 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-hSyn-hPGRNwt-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 hSyn 프로모터가 있는 PGRN 야생형 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-hSyn-hPGRNwt-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그가 없고 hSyn 프로모터가 있는 PGRN 야생형 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-hSyn-hPGRNco1-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 hSyn 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN (ATUM, hPGRN_opt1_CpG 감소) 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-hSyn-hPGRNco2-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 hSyn 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN (ATUM, hPGRN_opt2_CpG 감소) 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-CBA-hPGRNcoE-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 CBA 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN (ATUM, hPGRN_opt1_CpG 감소) 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-CBA-hPGRNcoF-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 CBA 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN (ATUM, hPGRN_opt2_CpG 감소) 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-hSyn-hPGRNcoE-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 hSyn 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN(ATUM, hPGRN_opt1_CpG 감소) 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-hSyn-hPGRNcoF-HA-WPRE의 설계 및 클로닝: HA 태그 및 hSyn 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN (ATUM, hPGRN_opt2_CpG 감소) 발현 플라스미드를 구축하였다.
pTR-hSyn-hPGRNcoEd5-WPRE 및 pTR-hSyn-hPGRNcoFd5-WPRE의 설계 및 클로닝: C-말단 5개-아미노산 말단절단의 변형을 수반한 hSyn 프로모터가 있는 코돈-최적화된 PGRN (coEd5 및 coFd5) 발현 플라스미드를 구축하였다.
구축물 성분의 예시적인 핵산 서열은 하기에 제시된다:
Figure pct00001
프로모터 벡터 설계 및 합성:
강력한 편재적 프로모터 (CBA) 대 뉴런 특이적 프로모터 (인간 시냅신)의 시험관내 비교에 대한 연구가 이들의 특이성과 획득된 트랜스진 발현 수준을 비교하기 위해 수행되었다. CBA 프로모터는 pAAV 플라스미드 (pTR-CBA-PGRNwt-WPRE-pA)에서 수득되었다. PGRNwt의 서열은 NEBuilder® HiFi DNA 어셈블리 키트 [뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)]를 사용하여 hGFP를 함유하는 서열과 다중 클로닝 부위로 대체되어 플라스미드 pTR-CBA-hGFP-WPRE-pA를 생성하였다. 인간 시냅신 프로모터 서열은 상업적으로 합성되었고 [젠스크립트(Genscript)], 이어서 사내 PCR 증폭 및 추출이 행해졌으며, 이로써 암피실린 선택 카세트, AAV ITR 세그먼트, hGFP 리포터 유전자, WPRE 및 SV40 폴리 A를 함유하는 독특한 바이러스 패키징 벡터 (pTR-hSyn-hGFP-WPRE-pA)에 삽입하기 위한 호환되는 제한 부위 세그먼트를 가진 프로모터 세그먼트가 생성되었다.
구축물은 증폭을 위해 고 효율 이. 콜라이(E. coli) 세포 (SURE2)로 형질전환되었고, 검증을 위해 클론을 선택하였다. 프로모터 플라스미드를 검증하기 위해 생어 시퀀싱 [진위즈(Genewiz)] 및 제한 소화 (프로모터 삽입 및 ITR 무결성을 검사하기 위한 적절한 제한 부위 (SmaI 및 XmaI)를 사용함)를 수행하였다. 후속 실험을 위해 각각의 구축물에 대한 양성 클론이 선택되었다. 독특한 프로모터 구축물은 HEK-293 (대조군) 또는 SHSY-5Y 세포의 시험관내 형질감염을 통해 hGFP 발현 구동의 효능에 대해 시험되었다. 시험관내 데이터는 CBA와 인간 시냅신 프로모터가 시험된 양쪽 세포 모두에서 작동하며 CBA는 양쪽 세포 모두에서 시냅신 프로모터보다 항상 더 강력하다는 결과를 나타냈다.
캡시드 선택
다수의 면역조직학적 분석은 AAV9와 AAVrh10 둘 다가 요법에 유리한 광범위한 뉴런 지향성을 가지고 있음을 나타낸다. 중추 신경계에서 AAV9 및 AAVrh10 발현 및 효능을 비교하는 연구를 기반으로 하여 AAVrh10이 AAV9을 제치고 선택되었다. AAVrh10은 AAV9보다 훨씬 더 잘 형질도입되는 것으로 밝혀졌다. 또한, AAV9 및 rh10은 인간 집단에서 유사하게 낮은 중화 Ab 혈청 유병률을 갖는다 (각각 18% 및 21%; 문헌 [Thwaite R et al. 2014]).
한 세트의 실험은 척수강내 투약을 통해 비-인간 영장류 (NHP)에서 캡시드 선택을 조사하였다. AAVrh10, AAV9, ΔHSmax 및 AAV2tyf 캡시드를 포함하는 GFP 구축물은 척수 및 뇌에서의 GFP 발현에 대해 시험되었다. 도 25는 척수강내 주사 후 뇌의 다양한 영역에서 GFP 양성 세포 퍼센트 및 GFP 강도에 대해 시험된 각각의 캡시드에 대한 결과를 요약한 것이다. 이러한 연구로부터, AAVrh10이 가장 많은 GFP 발현을 나타내었고, AAV9가 그 뒤를 이었다. 벡터 모두는 내약성이 우수하였다.
다음으로, 소뇌숨뇌수조 (ICM)에 투약함으로써 NHP에서의 AAVrh10 생체내 분포를 수행하였다. 1.2E13 vg의 AAVRh10은 ICM 투약 후 전두엽에서부터 등측 NHP 뇌로의 우수한 생체내 분포를 보이는 것으로 밝혀졌다. 스코어링은 도 26에 제시되어 있다.
실시예 3. 프로모터 선택
프로그래뉼린 벡터에 사용하기 위한 프로모터를 시험하기 위한 실험이 수행되었다. 이용된 프로모터는 hSyn 프로모터 (SYNP1이라고도 함, 뉴런 특이적) 및 키메라 CMV-닭 ß-액틴 프로모터 (CBA) 프로모터 (편재적)였다. 첫 번째 실험 세트는 시험관 내에서 수행되었다. 도 27에 나타난 바와 같이, CBA 프로모터는 인간 배아 신장 293 세포 (HEK293)와 SH-SY5Y 세포 모두에서 SYNP1보다 더 강한 발현을 구동시켰다 (상이한 2개의 형질감염 시약을 사용하여 확인됨). SH-SY5Y는 SK-N-SH 신경모세포종 세포주로부터 유래된 세포주이며, 신경변성 장애에 대한 모델로서 자주 제공된다. 도 28은 HEK293 및 SHSY-5Y 세포에서 rAAVRh10-CBA-hGFP 형질도입 후 AD5 벡터의 유무에 따른 GFP 발현을 나타낸다. 도 28에 나타난 바와 같이, AAVRh10-CBA 구축물로 형질도입된 SH-SY5Y 세포에서는 AD5의 유무에 관계없이 GFP가 검출되지 않았다. 도 27에 나타난 결과는 HEK 및 SH-SY5Y 세포 모두가 CBA 또는 hSYN 프로모터로부터 구동된 WPRE 증진 발현을 나타내는 데 사용될 수 있다는 것을 입증해준다. 그러나, hSYN 구동된 발현 수준은 두 세포 유형 모두에서 CBA 구동된 발현보다 상당히 더 낮다. 도 28에 나타난 결과는 AAV 혈청형 (AAV2tYF 또는 AAVrh10)이 HEK 세포에서 벡터의 형질도입을 보여주는 데 사용될 수 있으나 (Ad5에 의해 추가로 증진됨), AAV2tYF 만이 SH-SY5Y 세포에서 (Ad5 부가에 관계없이) 형질도입을 보여주는 데 사용될 수 있다는 것을 입증해준다.
이러한 결과는 세포 검정에서 AAVrh10 벡터의 후속 시험을 위해 HEK293 세포를 사용할 수 있거나, 또는 뉴런/뉴런-유사 세포 모델을 사용할 경우, SH-SY5Y 이외의 세포 유형을 사용할 필요가 있을 수 있거나 또는 SH-SY5Y 세포에서의 조건을 추가로 최적화해야 할 필요가 있을 수 있음을 시사한다.
종합하면, 프로모터 선택 작업으로부터의 결과는 그의 세포 특이성 때문에 SYNP1 프로모터를 선택하게 되는데, 이는 과다발현을 제한하고 따라서 가능한 독성을 제한하기에 바람직하다. 더욱이, SYNP1 프로모터는 CSF에서의 PGRN만을 증가시키고 혈장에서는 그렇지 않은 것으로 나타났는데, 이는 본 발명의 구축물의 추가의 바람직한 특징이다.
실시예 4. 코돈 최적화된 프로그래뉼린 벡터 설계 및 합성
프로그래뉼린 트랜스진 최적화는 단백질 발현, 안정성 및 기능을 증진시키기 위한 노력으로 이루어진다. 프로그래뉼린 (PGRN)의 코돈 최적화된 변이체를 합성하고, 야생형과 비교한 단백질 발현 상의 변화에 대해 평가하였다. 27 bp C-말단 HA 태그의 유무와 무관하게, 6개의 코돈 최적화된 변이체가 생성되었다. HA 태그부착된 변이체는 단백질 발현을 위한 대체 방안인 내인성 PGRN 단백질을 구별하기 위한 수단을 제공하며, 또한 PGRN-소르틸린 결합을 억제하는 데 대한 임의의 치료상의 혜택을 평가할 수 있게 한다.
각각의 코돈 최적화 변이체는 독특한 최적화 (즉, 코돈 사용량, GC 함량, 5' mRNA 구조의 안정성, RNA 불안정성 서열의 제거 등)를 함유함으로써, DNA 서열은 다양하지만 아미노산 서열은 보존하는 변이체를 초래한다. 이들 변이체는 3가지 상이한 최적화 알고리즘 (또는 그의 조합) 중 하나로부터 생성되었다.
PCR 증폭 및 추출을 수행하였으며, 이로써 암피실린 선택 카세트 및 AAV ITR 세그먼트를 함유하는 독특한 바이러스 패키징 벡터에 삽입하기 위해 호환되는 제한 부위 (NotI, NheI)를 가진 PGRN 트랜스진 세그먼트가 생성되었다. 완전 합성에 이어, 코돈 최적화된 구축물이 증폭을 위한 고 효율 이. 콜라이 세포 (SURE2)로 형질전환되었고, 검증을 위한 클론이 선택되었다. 코돈 최적화된 PGRN 및 PGRNwt 플라스미드를 검증하기 위해 생어 시퀀싱 (진위즈) 및 제한 소화 (트랜스진 삽입 및 ITR 무결성을 검사하기 위한 적절한 제한 부위를 사용함)가 수행되었다. 후속 실험을 위해 각각의 코돈 최적화된 구축물에 대한 양성 클론이 선택되었다.
PGRNwt와 비교하여 6개의 코돈 최적화된 변이체 (coA-F (예를 들어, PGRNcoA, PGRNcoB, PGRNcoC, PGRNcoD, PGRNcoE, PGRNcoF)로 지정됨)가 PGRN을 어떻게 발현하는지 결정하기 위해, 상청액 및 세포 용해물 ELISA 및 웨스턴 블롯팅을 통해 트랜스진 발현 실험을 수행하고 분석하였다. ELISA와 웨스턴의 결과 모두는, 인간 프로그래뉼린 콴티카인(Quantikine) ELISA 키트 [R&D 시스템즈(R&D Systems)]로 검정한 경우 및 항-인간 프로그래뉼린 항체 [시그마(Sigma)] 및 항-HA 모노클로날 항체 [써모피셔(ThermoFisher)]로 프로빙한 경우에 coE와 coF 변이체가 WT와 거의 동등한 수준의 단백질 발현을 나타냈지만, 다른 모든 공동-변이체는 열등한 발현을 나타냈다 (도 29 및 도 30). 따라서, coE 및 coF가 선택 트랜스진에 대한 좋은 후보로서 선택되었다. 도 30에 나타난 바와 같이, coE 및 coF 둘 다는 SDS-PAGE 상에 ~80 kD의 예상 분자량 (즉, PGRNwt와 동일함)으로 이동한다.
다음으로, hSYn 프로모터의 제어 하에 코돈 최적화된 변이체 coE (PGRNcoE)와 coF (PGRNcoF)를 HEK 293 세포에 형질감염시키고 상청액 ELISA를 통해 분비된 트랜스진 유전자 발현을 분석하였다 (도 31). 도 31에 나타난 바와 같이, coE는 HEK293 세포에서 WT와 거의 동등한 수준의 분비된 프로그래뉼린 발현 (ng/ml)을 보였으며, coF보다 더 높은 분비된 프로그래뉼린 발현 (ng/ml)을 보였다. 발현은 또한 제5일 (d5)에 측정되었으며, 여기서 변이체 coE에서는 약간의 감소가 관찰되었고, 변이체 coF에서는 더 큰 감소가 관찰되었다. 웨스턴 블롯 결과 (도 32)는 이러한 결과를 확인시켜 주었다.
SH-SY5Y 세포에서도 유사한 실험이 수행되었다. 그 결과는 도 33에 나타나 있다. hSYn 프로모터의 제어 하에 코돈 최적화된 변이체 coE (PGRNcoE) 및 coF (PGRNcoF)를 SH-SY5Y 세포에 형질감염시키고 상청액 ELISA를 통해 분비된 트랜스진 발현을 분석하였다. 도 33에 나타난 바와 같이, HEK293 세포에서 coE는 WT와 거의 동등한 수준의 분비된 프로그래뉼린 발현 (ng/ml)을 보였으며, coF보다 더 높은 분비된 프로그래뉼린 발현 (ng/ml)을 보였다. 발현은 또한 제5일 (d5)에 측정되었으며, 여기서 변이체 coE에서는 분비된 프로그래뉼린 발현이 약간 감소하는 반면, 변이체 coF에서는 증가가 관찰되었다.
최적화를 향한 발현과 안정성을 증진시키는 것 외에도, PGRN의 그래눌린으로의 분해 및/또는 세포에 의한 PGRN 흡수를 회피하는 것은 PGRN 가용성을 증가시킬 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있다. 접근 방식 중 하나는 PGRN이 그의 주요 수용체인 소르틸린과 결합하는 것을 표적화하는 것이다. 따라서, 선택된 후보들의 vC 말단 변형된 PGRN은 소르틸린 결합에 중요한 5개의 아미노산을 결실시킴으로써 생성되었다.
주요 수용체인 소르틸린에 대한 결합을 회피함으로써 PGRN 발현이 증진될 수 있는지 알아보기 위해 실험이 수행될 것이다.
실시예 5. rAAV -X 벡터의 생산
rAAV-X 벡터가 생산되었으며, 여기서 "X"는 하기 혈청형/변이체 중 하나이다: AAV-rh10, 선택된 상위 게놈 변이체를 함유하는 AAV-9. 이러한 벡터의 연구 등급 준비는 다양한 방법으로 진행될 것이다. (1) 첫 번째 방법에서, 벡터는 확립된 방법에 따라 HEK293 세포의 플라스미드 형질감염에 의해 패키징되고 아이오딕사놀 밀도 구배에 의해 바이러스 정제된다 (이러한 방법에 대한 참조는 문헌 [Zolotukhin et al., 2002 Methods]에서 찾을 수 있음). (2) 두 번째 방법에서, 벡터는 현탁 배양된 새끼 햄스터 신장 (sBHK) 세포에서 AGTC의 독점적 재조합 HSV 상보성을 사용하여 생산된다 (Kang et al., Gene Ther 2009; Thomas et al., Hum Gene Ther 2009). 모든 전임상 작업을 위한 벡터를 만들기 위해 삼중 형질감염 방법이 사용되었다. 삼중 형질감염은 또한 GLP 독소 연구를 위한 벡터를 제조하는 데 사용될 것이다. 벡터 생산은 HAVE (HSV-연관) 방법을 사용하여 최적화되고 있으며, 이러한 방법은 임상 시험 재료의 준비와 같은 후기 단계의 작업에서의 생산에 사용될 것으로 기대된다. 2가지 방법 모두에 의해 만들어진 벡터의 비교가능성을 입증하기 위한 연구가 수행될 것이다.
일부 실시양태에 따르면, rAAVr10-SYN-PGRNwt를 포함하는 벡터 구축물은 ITR-SYN-PGRNwt-wpre-pA-ITR 카세트가 삽입된 pUC 기반 "pTR" 플라스미드를 포함하는 삼중 형질감염으로 제조되었다. ITR-SYN-PGRNwt-wpre-pA-ITR 카세트의 핵산 서열 (도 1)은 도 4 또는 도 5a 및 5b (ITR 서열) 또는 도 5ab (두 ITR 모두의 경우), 도 3 (hSYN), 도 6 (hPGRNwt), 도 17 (WPRE의 경우) 및 도 18 (SV40pA의 경우)에 제공된 개별 서열로부터 유래될 수 있다.
실시예 6. 생체내 연구: 비-인간 영장류에서의 프로그래뉼린 발현
시노몰구스 원숭이에서 유전자 요법 (rAAVr10-SYN-PGRNwt 사용)의 단일 수조내 주사 후 전신 유전자 발현을 평가하기 위한 연구가 시행되었다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 2마리의 수컷 시노몰구스 원숭이를 연구로 이동시켰으며, 그 중 1마리는 CSF 샘플 수집을 위해 척수강내 요추 카테터를 이전에 체내 이식하였다 (동물 002A). 하기 연구 설계에 따라 동물에게 소뇌숨뇌수조 천자를 통해 시험 물품 1.5 mL를 단일 용량으로 투여하였다.
Figure pct00002
용량 투여: 2마리 동물 모두에게 척수강내 소뇌숨뇌수조 (CM) 천자를 통해 용량 투여하기 위해 진정제를 투여하였다. 각각의 동물에게 덱스메데토미딘 염산염 IM (0.04 mg/kg)이 제공되었다. 적어도 10분 후, 케타민 염산염 (2.5 mg/kg)을 IM 주사하여 진정을 유도하였다. 일단 진정제를 투여하면, 동물에게 삽관술을 하고 척추 천자를 위해 소뇌숨뇌수조 부위가 준비되었다. 동물은 NBR SOP에 따라 옆으로 누운 자세가 취해졌다. 척추 바늘을 소뇌숨뇌수조에 도입하기 전에 20 게이지 바늘을 사용하여 피부에 미세 절개를 하였다. 척추 천자는 게르티 마르크스(Gertie Marx®) 22 게이지 바늘을 활용하여 수행되었다. CM으로의 접근은 바늘로부터의 CSF의 흐름에 의해 확인되었다. 일단 척추 바늘의 허브에서 CSF가 관찰되면, 1.5 mL 용량을 수동 볼루스를 통해 대략 1-2분 동안 투여하였다. 바늘을 제거한 후에는 주사 부위에 직접 압력을 가한 다음 국소 무균 연고를 바른다. 동물은 마취 역전에 앞서 용량 투여 후 10분 동안 트렌델렌부르크(Trendelenburg) 자세를 취하였다. 역전제인 아티파메졸 염산염은 0.2 mg/kg IM의 용량으로 제공되었고, 시간을 기록하고 동물을 우리로 돌려보냈다.
실생활에서의 관찰과 측정은 본 보고서의 다른 부분에 기재된 바와 같은 임상 관찰, 체중 및 임상 병리학 평가를 포함하였다. 분석을 위해 혈액과 CSF를 수집하였다. 제57일에 샘플을 수집한 후, 두 동물 모두 NBR 영장류 가축 군락지로 돌려보냈다.
연구 과정 전반에 걸쳐 체중에 있어서의 시험 물품 관련 변화 및 비정상적인 임상 징후는 없었다.
사전 연구와 비교하여 평가된 시간 간격 (제57일)에서 혈액학 또는 혈청 화학 파라미터에서의 유의미한 변화는 없었다.
시험 물품을 투약한 후, 모든 시험 샘플에서 항-AAV 중화 항체의 역가가 증가하였다. 결과는 도 34에 나타나 있다. 8주 또는 10주의 과정 동안 뇌척수액 (CSF) 및 혈장에서의 프로그래뉼린 발현 상의 배수 변화가 결정되었다. 도 34에 나타난 바와 같이, 시간 경과에 따라 CSF에서는 프로그래뉼린 발현이 증가하였으나, 혈장에서의 발현은 증가하지 않았다. 동물 001A는 동물 002A와 비교하여 특히 CSF에서 더 빠른/높은 반응을 보였다. CSF 프로그래뉼린 수준의 감소를 확인하기 위해 제10주 시점이 부가되었다.
본 발명은 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 예를 통해 어느 정도 상세히 기재되었지만, 첨부된 청구범위의 범위 내에서 특정 변화 및 변형이 실시될 수 있음을 이해하여야 한다. 유전자 요법, 분자 생물학 및/또는 관련 분야에서의 통상의 기술자에 대하여 전술한 개시 관점에서 이해될 수 있거나, 또는 본 발명의 일상적인 실시 또는 이행과 함께 명백해질 수 있는, 본 발명을 수행하기 위한 전술한 양식의 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 (예를 들어, 비-특허 문헌), 특허, 특허 출원 공보 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자의 기술 수준을 나타낸다. 이러한 모든 간행물 (예를 들어, 비-특허 문헌), 특허, 특허 출원 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함되도록 구체적 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
전술한 발명은 이러한 바람직한 실시양태와 연계해서 기재되었지만, 이에 의해 제한되는 것이 아니라, 후술하는 청구범위의 범위에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> APPLIED GENETIC TECHNOLOGIES CORPORATION <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) SYSTEMS FOR TREATMENT OF PROGRANULIN ASSOCIATED NEURODEGENERATIVE DISEASES OR DISORDERS <130> 119561-01820 <140> PCT/US2020/056860 <141> 2020-10-22 <150> 62/924,340 <151> 2019-10-22 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1680 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 1 ctcagatctg aattcggtac ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca 60 tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 120 gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 180 agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 240 acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 300 cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 360 cgtattagtc atcgctatta ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc 420 catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc 480 agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg 540 gcggggcggg gcgaggcgga gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa 600 gtttcctttt atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 660 ggcgggagtc gctgcgcgct gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg 720 cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc 780 tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctt gtttcttttc tgtggctgcg 840 tgaaagcctt gaggggctcc gggagggccc tttgtgcggg gggagcggct cggggggtgc 900 gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga 960 gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc 1020 cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg 1080 tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcgtcg gtcgggctgc aaccccccct 1140 gcacccccct ccccgagttg ctgagcacgg cccggcttcg ggtgcggggc tccgtacggg 1200 gcgtggcgcg gggctcgccg tgccgggcgg ggggtggcgg caggtggggg tgccgggcgg 1260 ggcggggccg cctcgggccg gggagggctc gggggagggg cgcggcggcc cccggagcgc 1320 cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag 1380 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Adeno-associated virus <400> 3 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttc 143 <210> 4 <211> 143 <212> DNA <213> Adeno-associated virus <400> 4 aaccggtgag ggagagacgc gcgagcgagc gagtgactcc ggcccgctgg tttccagcgg 60 gctgcgggcc cgaaacgggc ccgccggagt cactcgctcg ctcgcgcgtc tctccctcac 120 cggttgaggt agtgatcccc aag 143 <210> 5 <211> 1779 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgtggaccc tggtgagctg ggtggcctta acagcagggc tggtggctgg aacgcggtgc 60 ccagatggtc agttctgccc tgtggcctgc tgcctggacc ccggaggagc cagctacagc 120 tgctgccgtc cccttctgga caaatggccc acaacactga gcaggcatct gggtggcccc 180 tgccaggttg atgcccactg ctctgccggc cactcctgca tctttaccgt ctcagggact 240 tccagttgct gccccttccc agaggccgtg gcatgcgggg atggccatca ctgctgccca 300 cggggcttcc actgcagtgc agacgggcga tcctgcttcc aaagatcagg taacaactcc 360 gtgggtgcca tccagtgccc tgatagtcag ttcgaatgcc cggacttctc cacgtgctgt 420 gttatggtcg atggctcctg 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gggctgttgt cctatgccac aggcctcatg ctgtgaggat 480 cgagtacatt gctgccccca tggagccttc tgtgatttgg ttcacaccag atgcattaca 540 cctacaggaa cccaccctct ggcaaaaaaa ctgccagctc agcggaccaa tagggctgtg 600 gccttgagta gctcagtgat gtgtcctgac gctaggagca ggtgtcctga tggctcaacg 660 tgctgcgaac tccccagtgg aaagtatgga tgctgcccaa tgccaaatgc tacctgttgt 720 agtgatcacc tccattgctg cccccaagac actgtgtgcg acctcatcca gtctaagtgc 780 ctcagcaaag aaaacgccac caccgatctg ctcacaaagt tgcccgctca cacagtcggt 840 gatgtcaaat gtgacatgga ggtctcttgc ccagatgggt atacttgctg caggctccag 900 agcggtgcct ggggatgttg ccctttcact caagcggtct gctgtgagga ccacatccat 960 tgttgcccag ccggattcac ctgcgacaca caaaaaggta cttgcgagca gggccctcat 1020 caagtgccat ggatggaaaa agcccccgcc catcttagcc tgccagaccc tcaggcactt 1080 aagagagacg ttccttgcga taatgtctcc agttgtcctt cctccgacac gtgctgtcag 1140 ctcactagcg gcgaatgggg gtgctgcccc atacctgagg ctgtttgttg ttctgaccac 1200 cagcactgct gcccccaggg ctatacatgc gttgcagaag gccagtgtca gcgcggatca 1260 gagatcgtgg ctggactgga aaagatgccc gctagacgcg ccagcctcag ccacccacga 1320 gacatagggt gcgatcaaca cacatcctgc cctgtgggcc agacctgttg ccctagcctg 1380 ggagggtcat gggcctgctg ccagctgcct catgcagtgt gctgtgaaga tagacagcac 1440 tgttgtcccg ccggctatac atgtaacgtg aaagcccgat cctgcgagaa agaagtcgtc 1500 tcagcacagc ctgctacatt tctcgccagg tctcctcatg tgggtgtgaa ggatgtcgaa 1560 tgtggggaag gccacttttg ccacgataat cagacctgtt gccgcgataa ccgccagggg 1620 tgggcgtgtt gcccctatag acagggagtg tgttgtgctg atcgaagaca ctgctgcccc 1680 gccggattcc gatgcgctgc aagaggaacg aaatgcctgc gacgagaagc acccagatgg 1740 gacgcccctc tcagagatcc cgccctgcgc cagctcctc 1779 <210> 11 <211> 1779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 11 atgtggactt tggtgtcttg ggttgccctg accgcagggc ttgtcgctgg gaccaggtgc 60 cctgacggac agttttgccc cgtagcttgc tgtcttgatc ctggtggggc atcttatagc 120 tgttgcaggc ccctgttgga taaatggcct actaccctct ctaggcacct gggcgggcca 180 tgccaggttg atgcacactg ttctgccggg cattcctgta tattcactgt tagtggaact 240 tcatcctgtt gtccttttcc tgaagccgtg gcctgtggcg atggccatca ctgttgcccc 300 agaggattcc attgttccgc cgacggaagg agctgctttc aaaggtcagg gaacaacagc 360 gtaggggcca tccagtgtcc tgactcccaa tttgagtgtc ccgacttttc aacatgctgt 420 gtcatggtgg acggtagctg gggctgttgt cctatgcctc aggcgagctg ttgcgaggac 480 cgagtgcact gctgccccca tggagcattt tgtgatcttg tacacaccag atgcattacc 540 cccacaggca cacacccatt ggcgaaaaaa ttgcccgccc agcggaccaa tagggctgtg 600 gccctttcaa gctcagtgat gtgccctgac gctaggagtc ggtgtcccga tggcagcaca 660 tgctgtgagc tgccttccgg gaagtatggt tgctgtccga tgccaaacgc tacctgctgc 720 tccgatcatc tccattgctg tcctcaagat acagtgtgcg atctcattca gagcaagtgc 780 ttgtctaagg aaaacgcaac tactgatctc cttactaagt tgccagccca taccgtcgga 840 gatgtgaagt gcgatatgga ggtttcttgc ccagatgggt acacttgctg cagactccag 900 agtggtgcct ggggctgctg tccgtttacc caagctgtgt gttgtgaaga ccatatccac 960 tgctgcccag ctggcttcac atgtgacaca cagaaaggca cttgcgagca gggcccacac 1020 caggtgccat ggatggaaaa ggcgcctgct caccttagcc tgccagatcc gcaggcactt 1080 aagagggatg ttccctgtga caatgtttcc agttgtccct cctctgatac atgttgtcag 1140 ctgacaagcg gcgagtgggg gtgttgcccc attccagagg cggtgtgttg ctccgaccac 1200 cagcattgtt gcccccaggg ctacacatgc gtggcagagg gccagtgtca gcgcgggtct 1260 gagattgtag ccgggctgga aaagatgccc gccagacgag cttccctgtc tcacccaagg 1320 gatattgggt gtgatcaaca cacgtcctgc ccggtgggcc agacctgttg tccaagtttg 1380 ggggggtctt gggcttgctg ccaactccca catgcagtgt gctgtgaaga ccggcagcac 1440 tgttgtccgg ccgggtatac ttgcaacgtg aaagctaggt cctgtgaaaa ggaagtagtg 1500 tcagcccagc cagcgacttt cctcgctcga agcccacacg ttggtgtgaa agatgtggag 1560 tgtggggagg gccacttctg tcatgataat cagacctgtt gtcgcgataa ccgccaaggg 1620 tgggcgtgtt gcccctatcg acagggagtg tgctgtgccg accgacgcca ttgttgcccc 1680 gcgggttttc gctgcgctgc acggggaacc aagtgcctgc ggagggaagc ccccagatgg 1740 gacgcccctc tccgcgatcc cgccctgcgc cagctgctg 1779 <210> 12 <211> 1779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 atgtggactc ttgtgtcgtg ggtcgctttg actgctggac ttgttgctgg aacccgatgc 60 ccggatggcc agttctgccc ggtggcctgc tgtctggacc cgggtggagc ctcctactcc 120 tgctgccggc ccctgcttga caagtggccc accaccctgt cccggcactt gggtggaccg 180 tgccaggtgg acgcacactg ctcagcgggc cacagctgca tcttcactgt gtcggggacc 240 tcctcatgct gcccattccc tgaggcagtg gcctgtgggg acggccacca ctgctgcccc 300 cggggcttcc actgctcggc cgatggcaga agctgcttcc agcggtcggg aaacaactca 360 gtgggagcca ttcagtgccc tgactcccaa tttgaatgcc cggacttcag cacttgctgc 420 gtcatggtgg acggttcctg gggttgctgt cccatgcccc aagcctcctg ttgcgaggac 480 agagtccact gctgtcctca cggagccttc tgtgacttgg tccacaccag atgcatcact 540 cccactggga cccaccccct ggccaagaaa ctgccagccc agcgcaccaa cagggcggtg 600 gccctgagca gctcagtgat gtgccctgac gcaagatcca gatgccccga tggttccacg 660 tgctgcgagc tccccagcgg aaaatatggc tgctgtccta tgcccaatgc cacctgttgt 720 tcggaccatc tgcactgttg cccgcaagac accgtgtgtg acctgatcca gtccaagtgc 780 ctcagcaagg agaacgccac cactgatctg ctgaccaagc tgcctgcaca cactgtggga 840 gatgtgaagt gtgacatgga agtgtcctgc cctgatggtt acacttgctg ccggctccag 900 tctggagcgt gggggtgctg tccattcacc caagcagtgt gctgtgaaga tcatatccat 960 tgctgccctg ctggctttac ttgtgacacc cagaagggaa cctgtgaaca gggcccgcac 1020 caagtccctt ggatggaaaa ggccccggcc cacctgtccc tcccggaccc acaggccctc 1080 aagagggatg tcccctgtga caatgtcagc tcctgccctt cctcggatac ctgttgccaa 1140 ctgacctcgg gggaatgggg ctgctgcccg atccctgaag ctgtgtgctg cagtgatcac 1200 cagcattgtt gcccccaagg ctacacctgt gtggcggaag ggcagtgcca gaggggctca 1260 gagattgtgg cgggcctgga gaagatgcct gccaggagag ccagcctctc tcatccccgg 1320 gacattggtt gtgatcaaca cacctcctgc cctgtgggac agacctgttg cccctcactg 1380 ggaggttcct gggcctgttg ccagctgccc catgccgtgt gctgcgagga ccgccagcac 1440 tgttgtcctg cggggtacac ctgtaacgtc aaggcccgca gctgcgaaaa ggaagtggtg 1500 tcagcacagc cagccacctt cctggcccgg tccccccacg tgggagtcaa ggatgtggag 1560 tgcggagagg gccatttctg ccatgacaac cagacttgct gcagggacaa ccgccagggc 1620 tgggcctgct gcccgtaccg ccagggagtg tgctgcgcgg acagacgcca ttgctgtccg 1680 gctggattcc gctgtgctgc ccgggggaca aagtgcctgc ggcgggaagc ccctagatgg 1740 gatgccccac tgagggaccc tgccctgcgc cagctcctc 1779 <210> 13 <211> 1779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 atgtggacct tggtatcctg ggtcgccctg actgctggac ttgtcgctgg taccagatgc 60 ccagatggcc agttctgtcc tgtggcatgc tgcctggacc cgggaggggc ctcctactcc 120 tgctgccgcc ccttgctgga caagtggccc accaccctgt cccggcatct gggaggaccg 180 tgccaagtgg atgcccactg tagcgctggt cacagctgca tcttcactgt gtcgggcact 240 agctcgtgct gcccgttccc cgaagcggtg gcctgtggag atggacacca ctgttgtccc 300 cggggattcc actgctccgc tgatgggcgc tcatgcttcc aaagatcagg aaacaactct 360 gtgggggcca tccagtgccc ggactcacag ttcgaatgcc ctgacttctc cacgtgctgt 420 gtgatggtgg atgggagctg gggctgctgc cctatgcccc aagcctcctg ctgtgaagat 480 cgggtgcact gttgccccca tggtgcattt tgtgacctgg tgcacacccg gtgcatcacc 540 cctactggaa cccacccact ggccaagaag ctcccggccc aaagaaccaa cagggctgtg 600 gccctgtcct cctccgtcat gtgcccggat gcccggagca gatgccctga tggcagcaca 660 tgctgcgaac tgccttcggg aaaatacggt tgttgtccca tgccgaacgc cacttgctgc 720 agcgaccacc tccattgctg tccacaagac actgtgtgcg acctcatcca gtccaagtgc 780 ctgtccaagg aaaatgccac cacagatctg cttaccaagc tgccggccca cactgtgggg 840 gatgtgaaat gcgacatgga ggtgtcctgc ccggatggct acacctgttg ccggctgcag 900 tcgggagcct ggggctgttg cccattcact caagcggtct gctgcgagga ccacattcat 960 tgttgccctg ccggattcac ctgtgacacc caaaagggca cttgcgagca gggaccccat 1020 caggtgccct ggatggagaa ggcccctgcc cacctgagct tgccagaccc tcaagccctg 1080 aagagggatg tcccctgcga caacgtgtcc tcatgcccgt ccagcgacac ctgttgtcag 1140 ctcacctccg gagaatgggg gtgctgcccc atccctgagg ccgtctgctg ctcggaccat 1200 cagcactgct gcccccaagg ctacacttgc gtggcagagg gccagtgtca gcggggatcg 1260 gaaattgtgg cggggctgga gaagatgcca gcgcgcaggg cctcactgag ccaccctagg 1320 gacattggat gtgaccagca cacctcatgc cctgtgggcc agacctgttg cccttccctg 1380 ggtggttcct gggcgtgctg ccagctccct catgctgtgt gttgcgagga cagacagcat 1440 tgctgccccg ccggttacac ttgcaatgtg aaggctcgat cctgtgaaaa ggaggttgtc 1500 agtgcccagc ctgccacctt cctggcccgc tcccctcatg tgggcgtgaa ggatgtggaa 1560 tgcggggaag gccacttttg ccacgacaac cagacttgct gccgggacaa ccgccaggga 1620 tgggcctgct gcccgtaccg ccagggggtc tgctgtgcgg acaggcgcca ctgctgtccg 1680 gcgggcttta gatgcgcagc acggggcacc aagtgcctcc ggagagaggc cccccgctgg 1740 gatgcacccc tgagggaccc ggccctgaga cagcttctc 1779 <210> 14 <211> 1770 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 atgtggaccc tggtgagctg ggtggcctta acagcagggc tggtggctgg aacgcggtgc 60 ccagatggtc agttctgccc tgtggcctgc tgcctggacc ccggaggagc cagctacagc 120 tgctgccgtc cccttctgga caaatggccc acaacactga gcaggcatct gggtggcccc 180 tgccaggttg atgcccactg ctctgccggc cactcctgca tctttaccgt ctcagggact 240 tccagttgct gccccttccc agaggccgtg gcatgcgggg atggccatca ctgctgccca 300 cggggcttcc actgcagtgc agacgggcga tcctgcttcc aaagatcagg taacaactcc 360 gtgggtgcca tccagtgccc tgatagtcag ttcgaatgcc cggacttctc cacgtgctgt 420 gttatggtcg atggctcctg ggggtgctgc cccatgcccc aggcttcctg ctgtgaagac 480 agggtgcact gctgtccgca cggtgccttc tgcgacctgg ttcacacccg ctgcatcaca 540 cccacgggca cccaccccct ggcaaagaag ctccctgccc agaggactaa cagggcagtg 600 gccttgtcca gctcggtcat gtgtccggac gcacggtccc ggtgccctga tggttctacc 660 tgctgtgagc tgcccagtgg gaagtatggc tgctgcccaa tgcccaacgc cacctgctgc 720 tccgatcacc tgcactgctg cccccaagac actgtgtgtg acctgatcca gagtaagtgc 780 ctctccaagg agaacgctac cacggacctc ctcactaagc tgcctgcgca cacagtgggg 840 gatgtgaaat gtgacatgga ggtgagctgc ccagatggct atacctgctg ccgtctacag 900 tcgggggcct ggggctgctg cccttttacc caggctgtgt gctgtgagga ccacatacac 960 tgctgtcccg cggggtttac gtgtgacacg cagaagggta cctgtgaaca ggggccccac 1020 caggtgccct ggatggagaa ggccccagct cacctcagcc tgccagaccc acaagccttg 1080 aagagagatg tcccctgtga taatgtcagc agctgtccct cctccgatac ctgctgccaa 1140 ctcacgtctg gggagtgggg ctgctgtcca atcccagagg ctgtctgctg ctcggaccac 1200 cagcactgct gcccccaggg ctacacgtgt gtagctgagg ggcagtgtca gcgaggaagc 1260 gagatcgtgg ctggactgga gaagatgcct gcccgccggg cttccttatc ccaccccaga 1320 gacatcggct gtgaccagca caccagctgc ccggtggggc agacctgctg cccgagcctg 1380 ggtgggagct gggcctgctg ccagttgccc catgctgtgt gctgcgagga tcgccagcac 1440 tgctgcccgg ctggctacac ctgcaacgtg aaggctcgat cctgcgagaa ggaagtggtc 1500 tctgcccagc ctgccacctt cctggcccgt agccctcacg tgggtgtgaa ggacgtggag 1560 tgtggggaag gacacttctg ccatgataac cagacctgct gccgagacaa ccgacagggc 1620 tgggcctgct gtccctaccg ccagggcgtc tgttgtgctg atcggcgcca ctgctgtcct 1680 gctggcttcc gctgcgcagc caggggtacc aagtgtttgc gcagggaggc cccgcgctgg 1740 gacgcccctt tgagggaccc agccttgaga 1770 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Influenza virus <400> 15 tacccatatg acgtgccgga ctacgcc 27 <210> 16 <211> 592 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 16 taatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 60 tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 120 tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 180 gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 240 tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 300 tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 360 gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 420 cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 480 caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 540 tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ct 592 <210> 17 <211> 233 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 17 ttcgagcaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt 60 gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa 120 gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg 180 agatgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaaa atc 233 <210> 18 <211> 364 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 acttgtggac taagtttgtt cgcatcccct tctccaaccc cctcagtaca tcaccctggg 60 ggaacagggt ccacttgctc ctgggcccac acagtcctgc agtattgtgt atataaggcc 120 agggcaaaga ggagcaggtt ttaaagtgaa aggcaggcag gtgttgggga ggcagttacc 180 ggggcaacgg gaacagggcg tttcggaggt ggttgccatg gggacctgga tgctgacgaa 240 ggctcgcgag gctgtgagca gccacagtgc cctgctcaga agccccaagc tcgtcagtca 300 agccggttct ccgtttgcac tcaggagcac gggcaggcga gtggccccta gttctggggg 360 cagc 364 <210> 19 <211> 1140 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 19 gtatccagac tcactccttt ctccttacag tttctgaatt ccgtattaga agggatggct 60 catttctagg gacaaaataa cacaggctct ggggtgaggt agggtcgggt aagggggcga 120 gcggggaggg gtgatggaag agcactaccg cataaagaaa gcaagctctc tagtaaagcg 180 ttaagtacta ctttgtatat tgtttctctt ttttcctttc tctctctctc tctctttgtt 240 tgtttttggt ttttgagaca gaatatcaca ctatatatcc aggccgggta caaaataacc 300 gcagtcctcc gcttcccaat gctgggattt acaggcataa accactaagg gcggttatga 360 tgaccttgag ctgcaagtct tcctgcctct gcctcccagg tgctgttgag ggtcataggc 420 gtggtctatt catactgagc ttctgaattt gctcaaatat taataataat agtaataata 480 ataataacca caataataca actgtaaaac taaacattta cccacgcctt tttgaccatc 540 attcccatag ctcttgctac tttatttaaa gcgaacagag atgttgaatc ctgacggaac 600 gtatttaaat ttagtgtagt ataaatgaaa agctggaatt taccataaag aatctcaaca 660 caaattctgt gattaagtgt tggggaaaac cttaaattat cctaactaca gtttaaggtt 720 taagctccgt ataatcaccc aacccccgtt ttctttcttc cctctctacc cctccccagc 780 tccaccccat aatggatgct cggctagttg cttttgcgag gcctttgtct gaaggatgca 840 aaatctacgg atgctagcga gggggggaag gggggagaga ttacctcata ccatgtcgct 900 tgcaccaatc accactcctg tcgcggcttc tctgggcaga cggaggggtc tggaccaaca 960 ggaaaaggcc ttggcccatc cccatggtga ccgagctgta tataaggagg cgcatccgcc 1020 caagtgccgg caggttctct tacatcgacc gcttaagagt cgcgctgtaa gaagcaacac 1080 ctcctcctcg cctccgccat ccacccggca gccgcgaagc agcaaccatg gtgagcaaac 1140 <210> 20 <211> 1801 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 20 tccttccaac cccctatggt ggtatggctg acacagaaaa tgtctgctcc tgtatgggac 60 atttgcccct cttctccaaa tataagacag gatgaggcct agcttttgct gctccaaagt 120 tttaaaagaa cacattgcac ggcatttagg gactctaaag ggtggaggag gaatgaggga 180 attgcatcat gccaaggctg gtcctcatcc atcactgctt ccagggccca gagtggcttc 240 caggaggtat tcttacaaag gaagcccgat ctgtagctaa cactcagagc ccattttcct 300 gcgttaaccc ctcccgacct catatacagg agtaacatga tcagtgacct gggggagctg 360 gccaaactgc gggacctgcc caagctgagg gccttggtgc tgctggacaa cccctgtgcc 420 gatgagactg actaccgcca ggaggccctg gtgcagatgg cacacctaga gcgcctagac 480 aaagagtact atgaggacga ggaccgggca gaagctgagg agatccgaca gaggctgaag 540 gaggaacagg agcaagaact cgacccggac caagacatgg aaccgtacct cccgccaact 600 tagtggcacc tctagcctgc agggacagta aaggtgatgg caggaaggca gcccccggag 660 gtcaaaggct gggcacgcgg gaggagaggc cagagtcaga ggctgcgggt atctcagata 720 tgaaggaaag atgagagagg ctcaggaaga ggtaagaaaa gacacaagag accagagaag 780 ggagaagaat tagagaggga ggcagaggac cgctgtctct acagacatag ctggtagaga 840 ctgggaggaa gggatgaacc ctgagcgcat gaagggaagg aggtggctgg tggtatatgg 900 aggatgtagc tgggccaggg aaaagatcct gcactaaaaa tctgaagcta aaaataacag 960 gacacggggt ggagaggcga aaggagggca gagtgaggca gagagactga gaggcctggg 1020 gatgtgggca ttccggtagg gcacacagtt cacttgtctt ctctttttcc aggaggccaa 1080 agatgctgac ctcaagaact cataataccc cagtggggac caccgcattc atagccctgt 1140 tacaagaagt gggagatgtt cctttttgtc ccagactgga aatccgttac atcccgaggc 1200 tcaggttctg tggtggtcat ctctgtgtgg cttgttctgt gggcctacct aaagtcctaa 1260 gcacagctct caagcagatc cgaggcgact aagatgctag taggggttgt ctggagagaa 1320 gagccgagga ggtgggctgt gatggatcag ttcagctttc aaataaaaag gcgtttttat 1380 attctgtgtc gagttcgtga acccctgtgg tgggcttctc catctgtctg ggttagtacc 1440 tgccactata ctggaataag gggacgcctg cttccctcga gttggctgga caaggttatg 1500 agcatccgtg tacttatggg gttgccagct tggtcctgga tcgcccgggc ccttccccca 1560 cccgttcggt tccccaccac cacccgcgct cgtacgtgcg tctccgcctg cagctcttga 1620 ctcatcgggg ccccccgggt cacatgcgct cgctcggctc tataggcgcc gccccctgcc 1680 caccccccgc ccgcgctggg agccgcagcc gccgccactc ctgctctctc tgcgccgccg 1740 ccgtcaccac cgccaccgcc accggctgag tctgcagtcc tcgaggtgag gcccgtatcg 1800 g 1801 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 aaaaaaaaaa aaaaagccca ccctccagcc tcgctgcaaa gagaaaaccg gagcagccgc 60 <210> 22 <211> 806 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 gagtcaatgg gaaaaaccca ttggagccaa gtacactgac tcaataggga ctttccattg 60 ggttttgccc agtacataag gtcaataggg ggtgagtcaa caggaaagtc ccattggagc 120 caagtacatt gagtcaatag ggactttcca atgggttttg cccagtacat aaggtcaatg 180 ggaggtaagc caatgggttt ttcccattac tgacatgtat actgagtcat tagggacttt 240 ccaatgggtt ttgcccagta cataaggtca ataggggtga atcaacagga aagtcccatt 300 ggagccaagt acactgagtc aatagggact ttccattggg ttttgcccag tacaaaaggt 360 caataggggg tgagtcaatg ggtttttccc attattggca catacataag gtcaataggg 420 gtgactagtg gagaagagca tgcttgaggg ctgagtgccc ctcagtgggc agagagcaca 480 tggcccacag tccctgagaa gttgggggga ggggtgggca attgaactgg tgcctagaga 540 aggtggggct tgggtaaact gggaaagtga tgtggtgtac tggctccacc tttttcccca 600 gggtggggga gaaccatata taagtgcagt agtctctgtg aacattcaag cttctgcctt 660 ctccctcctg tgagtttggt aagtcactga ctgtctatgc ctgggaaagg gtgggcagga 720 ggtggggcag tgcaggaaaa gtggcactgt gaaccctgca gccctagaca attgtactaa 780 ccttcttctc tttcctctcc tgacag 806 <210> 23 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120 gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180 atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240 aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300 catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tc 352 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tctcgcactc tcccttctcc tttataaagg ccggaacagc tgaaagggtg gcaacttctc 60 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gccgcgtcca cctgtcggcc gggcccagcc gagcgcgcag cgggcacgcc gcgcgcgcgg 60 <210> 26 <211> 106 <212> DNA <213> Adeno-associated virus <400> 26 gacgcgcgag cgagcgagtg actccggcgg gcccgtttcg ggcccgcagc ccgctggaaa 60 ccagcgggcc ggagtcactc gctcgctcgc gcgtctctcc ctcacc 106 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: PGRN C-terminal motif sequence <400> 27 Leu Arg Gln Leu Leu 1 5

Claims (66)

  1. 프로그래뉼린을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 비-자연 발생 서열인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 서열이 포유류 프로그래뉼린을 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 포유류 프로그래뉼린이 인간 프로그래뉼린인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 14로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 포유류 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 핵산 서열이 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 cDNA 서열인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 기능적으로 최적화된 N-말단 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 헤마글루티닌 C-말단 태그를 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 소르틸린 결합 억제 (SBI) 도메인을 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 뉴런-특이적 인간 시냅신-1 프로모터 (hSYN1)를 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 편재적 활성 CBA 프로모터를 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 프로모터가 높은 프로그래뉼린 발현을 구동하도록 최적화된 것인 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는 작동가능하게 연결된 3'UTR 조절 영역을 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 SV40 폴리아데닐화 신호인 폴리뉴클레오티드.
  19. 제17항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호인 폴리뉴클레오티드.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는 3'UTR 조절 영역에 작동가능하게 연결된, 뉴런-특이적 인간 시냅신-1 프로모터 또는 편재적 활성 CBA 프로모터에 작동가능하게 연결된, 헤마글루티닌 C-말단 태그 또는 소르틸린 결합 억제 (SBI) 도메인을 임의로 포함하는, 작동가능하게 연결된 N-말단 신호 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 숙주 세포가 포유류 세포인 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스 (rHSV).
  24. 하기를 포함하는 트랜스진 발현 카세트:
    (a) 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) 최소 조절 요소.
  25. 제24항의 발현 카세트를 포함하는 핵산 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
  27. 제24항의 트랜스진 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 캡시드 서열의 혈청형 및 상기 AAV 벡터의 ITR의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인 벡터.
  31. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및 AAV 게놈 카세트를 포함하는 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터.
  32. 제31항에 있어서, AAV 게놈 카세트가 2개의 서열-조정된 역위 말단 반복부에 의해 플랭킹되는 것인 발현 벡터.
  33. 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결된 우드척 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는 3'UTR 조절 영역에 작동가능하게 연결된, 뉴런-특이적 인간 시냅신-1 프로모터 또는 편재적 활성 CBA 프로모터에 작동가능하게 연결된, 헤마글루티닌 C-말단 태그 또는 소르틸린 결합 억제 (SBI) 도메인을 임의로 포함하는, N-말단 신호 서열에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터로서,
    여기서 2개의 서열 조정된 역위 말단 반복부 (ITR)는 AAV 게놈 카세트를 플랭킹하고, 단백질 캡시드 변이체를 추가로 포함하는 것인 발현 벡터.
  34. 제33항에 있어서, 폴리아데닐화 신호가 SV40 또는 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호인 발현 벡터.
  35. 제33항에 있어서, 프로모터가 높은 프로그래뉼린 발현을 구동하도록 최적화된 것인 발현 벡터.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, rh-AAV-10, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형인 발현 벡터.
  37. 제36항에 있어서, rAAV가 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, rh-AAV-10, AAV10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 변이체 또는 혼성체인 발현 벡터.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV가 AAV 비리온 내에 포함되는 것인 발현 벡터.
  39. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 단순 헤르페스 바이러스 (rHSV).
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  41. 제40항에 있어서, 숙주 세포가 포유류 세포인 숙주 세포.
  42. 하기를 포함하는 트랜스진 발현 카세트:
    (a) 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) 최소 조절 요소.
  43. 제42항의 발현 카세트를 포함하는 핵산 벡터.
  44. 제43항에 있어서, 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
  45. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  46. 제21항의 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  47. 제23항의 재조합 단순 헤르페스 바이러스 (rHSV)를 포함하는 조성물.
  48. 제24항의 트랜스진 발현 카세트를 포함하는 조성물.
  49. 제25항 또는 제26항의 발현 벡터를 포함하는 조성물.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 제약 조성물인 조성물.
  51. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 신경변성 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  52. 제24항의 트랜스진 발현 카세트를 신경변성 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  53. 제25항 또는 제26항의 발현 벡터를 신경변성 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  54. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항의 재조합 아데노-연관 (rAAV) 발현 벡터를 신경변성 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  55. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 아데노-연관 (rAAV) 바이러스 입자를 신경변성 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경변성 장애를 치료 또는 예방하는 방법.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 신경변성 장애가 인지 장애, 행동 장애, 리소좀 축적 결핍, 또는 그의 조합을 특징으로 하는 것인 방법.
  57. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 신경변성 장애가 프로그래뉼린-연관 신경변성 장애인 방법.
  58. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 신경변성 장애가 가족성 전두측두엽 치매 (FTD), 전두측두엽 변성 (FTLD), 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL), 또는 알츠하이머병 (AD)인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 뉴런 세로이드 리포푸신증 (NCL)이 뉴런 세로이드 리포푸신증-11 (CLN11)인 방법.
  60. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 중추 신경계에 대한 것인 방법.
  61. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 정맥내, 뇌실내, 척수강내, 또는 그의 조합인 방법.
  62. 각각 프로모터에 작동가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV cap 유전자를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 재조합 헤르페스바이러스; 및 프로그래뉼린 유전자 및 상기 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 재조합 헤르페스바이러스로 현탁 세포를 공동 감염시키는 단계; 및 세포가 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하도록 하며, 이로써 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 단계를 포함하는, 재조합 AAV 바이러스 입자를 생산하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, cap 유전자가 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, rh-AAV-10, AAV11, 및 AAV12로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형을 갖는 AAV으로부터 선택되는 것인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 제1 헤르페스바이러스 및 제2 헤르페스바이러스가 시토메갈로바이러스 (CMV), 단순 헤르페스 (HSV) 및 바리셀라 조스터 (VZV) 및 엡스타인 바르 바이러스 (EBV)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스인 방법.
  65. 제62항에 있어서, 헤르페스바이러스가 복제 결함성인 것인 방법.
  66. 제62항에 있어서, 공동 감염이 동시 감염인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024035649A1 (en) * 2022-08-08 2024-02-15 Shape Therapeutics Inc. Compositions for progranulin expression and methods of use thereof
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3421603T3 (pl) * 2009-05-02 2022-02-14 Genzyme Corporation Terapia genowa zaburzeń neurodegeneracyjnych
WO2013151667A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides
WO2016125330A1 (ja) * 2015-02-02 2016-08-11 原　英彰 網膜再生促進薬
WO2017151884A1 (en) * 2016-03-02 2017-09-08 The Children's Hospital Of Philadelphia Therapy for frontotemporal dementia
WO2018136680A1 (en) * 2017-01-19 2018-07-26 New York University Progranulin and progranulin derivatives in treating impaired fracture healing
AU2018346104B2 (en) * 2017-10-03 2023-07-27 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
KR20220015500A (ko) * 2017-10-03 2022-02-08 프리베일 테라퓨틱스, 인크. 리소좀 장애를 위한 유전자 요법
EP3917539A4 (en) * 2019-02-01 2022-11-23 Avrobio, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING NEUROCOGNITIVE DISORDERS
PE20211819A1 (es) * 2019-02-22 2021-09-14 Univ Pennsylvania Virus adenoasociado recombinante para el tratamiento de la neurodegeneracion de inicio en adultos asociada a grn

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