KR20200051011A - 변형된 폐쇄-종결된 dna(cedna) - Google Patents

변형된 폐쇄-종결된 dna(cedna) Download PDF

Info

Publication number
KR20200051011A
KR20200051011A KR1020207009737A KR20207009737A KR20200051011A KR 20200051011 A KR20200051011 A KR 20200051011A KR 1020207009737 A KR1020207009737 A KR 1020207009737A KR 20207009737 A KR20207009737 A KR 20207009737A KR 20200051011 A KR20200051011 A KR 20200051011A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
itr
cedna
cedna vector
vector
sequence
Prior art date
Application number
KR1020207009737A
Other languages
English (en)
Inventor
로버트 마이클 코틴
오잔 알칸
애널리즈 존스
더글라스 앤소니 커
아라 칼 말라키안
매튜 존 시몬스
테레사 엘. 라이트
Original Assignee
제너레이션 바이오 컴퍼니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제너레이션 바이오 컴퍼니 filed Critical 제너레이션 바이오 컴퍼니
Publication of KR20200051011A publication Critical patent/KR20200051011A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/60—Vectors comprising a special translation-regulating system from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

선형 및 연속 구조를 갖는 CeDNA 벡터는 고수율로 생산될 수 있고, 이식유전자의 효과적인 전달 및 발현에 사용될 수 있다. ceDNA 벡터는 발현 카세트, 및 AAV 게놈으로부터 유래된 2개의 상이한 ITR 서열을 특정 순서로 포함한다. 본원에 제공된 일부 ceDNA 벡터는 시스-조절 인자를 추가로 포함하고, 높은 유전자 발현 효율을 제공한다. 선형, 연속적 및 캡시드-비함유 DNA 벡터의 신뢰할 수 있고 효율적인 생산을 위한 방법 및 세포주가 본원에 추가로 제공된다.

Description

변형된 폐쇄-종결된 DNA(CEDNA)
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 각각 2017년 9월 8일에 출원된 미국 가출원 번호: 제62/556,319호; 제62/556,324호; 제62/556,329호; 제62/556,331호; 제62/556,281호 및 제62/556,335호의 35 U.S.C.§ 119(e) 하의 이점을 청구하며, 이들은 각각 전문이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자제출된 서열목록을 포함하며, 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 2018년 9월 7일에 작성된 ASCII 사본의 명칭은 080170-090580WOPT_SL.txt이며, 크기는 205,991 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 외인성 DNA 서열을 표적 세포, 조직, 장기 또는 유기체에 전달하는 것을 포함하는 유전자 요법 분야에 관한 것이다.
유전자 요법은 유전자 돌연변이, 또는 유전자 발현 프로파일의 이상에 의해 야기된 후천성 질환을 앓고 있는 환자의 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 유전자 요법에는 장애, 질병, 악성종양 등을 초래할 수 있는, 결함있는 유전자 또는 비정상적인 조절 또는 발현, 예를 들어, 저발현 또는 과발현으로 인한 의료 병태의 치료 또는 예방이 포함된다. 예를 들어, 결함있는 유전자로 인한 질환 또는 장애는 변형적 유전 물질을 환자에게 전달하여, 환자내에서 유전 물질의 치료적 발현을 초래함으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있다. 유전자 요법의 기초는, 예를 들어, 양성 기능획득 효과, 음성 기능상실 효과 또는 또 다른 결과, 예컨대 예를 들어 종양용해 효과를 초래할 수 있는 활성 유전자 산물(때로는 이식유전자로 지칭됨)을 전사 카세트에 공급하는 것이다. 유전자 요법은 또한, 다른 인자들에 의해 야기된 질환 또는 악성종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 인간 단일유전자 장애는 표적 세포에 정상 유전자의 전달 및 발현에 의해 치료될 수 있다. 환자의 표적 세포에서 변형적 유전자의 전달 및 발현은 조작된 바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터의 사용을 포함하여, 수많은 방법을 통해 수행될 수 있다. 이용 가능한 많은 바이러스-유래 벡터(예를 들어, 재조합 레트로바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 등) 중에서, 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV)가 유전자 요법의 다용도 벡터로서 인기를 얻고 있다.
아데노-연관된 바이러스(AAV)는 파보비리다에 계열에 속하고, 더 구체적으로 디펜도파보바이러스 속을 구성한다. AAV 게놈은 대략 4.7 킬로베이스(kb)를 함유하고 비-구조 Rep(복제) 및 구조 Cap(캡시드) 단백질을 암호화하는 2개의 주요 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된 선형 단일-가닥 DNA 분자로 구성된다. 어셈블리-활성화 단백질(AAP)을 암호화하는 cap 유전자 내의 제2 ORF가 확인되었다. AAV 암호화 영역에 측접하는 DNA는 대략 145개의 뉴클레오타이드 길이의 2개의 시스-작용 역전된 말단 반복(ITR) 서열이며, DNA 복제의 프라이머로서 기능하는 에너지적으로-안정한 헤어핀 구조로 접힐 수 있는 차단된 회문성 서열을 갖는다. DNA 복제에서의 그들의 역할에 더하여, ITR 서열은 세포 게놈으로의 바이러스 DNA 통합, 숙주 게놈 또는 플라스미드로부터의 구조, 및 바이러스 핵산의 성숙한 비리온으로의 캡시드화에 관여하는 것으로 밝혀졌다(Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129).
AAV로부터 유래된 벡터(즉, 재조합 AAV(rAVV) 또는 AAV 벡터)는 (i) 근세포 및 뉴런을 포함하는 다양한 비-분열 및 분열 세포 유형을 감염(전이)시킬 수 있고; (ii) 바이러스 구조 유전자가 결여되어 바이러스 감염에 대한 숙주세포 반응, 예를 들어 인터페론-매개 반응을 감소시키며; (iii) 야생형 바이러스가 인간에서 비-병리적으로 간주되며; (iv) 숙주세포 게놈으로 통합될 수 있는 야생형 AAV와 대조적으로, 복제-결핍 AAV 벡터는 rep 유전자가 결여되고 일반적으로 에피솜으로서 지속되므로, 삽입 돌연변이유발 또는 유전독성의 위험을 제한하며; 및 (v) 다른 벡터 시스템과 비교하여, AAV 벡터가 일반적으로 상대적으로 불량한 면역원으로 간주되고, 따라서 상당한 면역 반응을 유발하지 않으며(ii 참조), 따라서 벡터 DNA의 지속성 및 잠재적으로 치료적 이식유전자의 장기간 발현을 얻기 때문에 유전 물질을 전달하는데 매력적이다. AAV 벡터는 또한 고역가로 생산 및 제형화될 수 있으며, 동맥내, 정맥내 또는 복막내 주사를 통해 전달되어 설치류(Goyenvalle 등, 2004; Fougerousse 등, 2007; Koppanati 등, 2010; Wang 등, 2009) 및 개의 단일 주사를 통해 벡터를 분포시키고, 유전자가 중요한 근육 영역으로 전달되도록 한다. 척수 근이영양증 유형 1을 치료하기 위한 임상 연구에서, AAV 벡터는 뇌를 표적으로 할 의도로 전신으로 전달되어, 명백한 임상 개선을 초래하였다.
그러나, 유전자 전달 벡터로서 AAV 입자를 사용하는 데에는 몇 가지 주요 결함이 있다. rAAV와 연관된 하나의 주요 단점은 약 4.5 kb의 이종 DNA의 제한된 바이러스 패키징 용량이다(Dong 등, 1996; Athanasopoulos 등, 2004; Lai 등, 2010). 그 결과, AAV 벡터의 사용은 150,000 Da 미만 단백질 암호화 용량으로 제한되었다. 두 번째 단점은 집단에서 야생형 AAV 감염의 유병률의 결과로 rAAV 유전자 요법 후보가 환자로부터 벡터를 제거하는 중화 항체의 존재에 대해 선별되어야 한다는 것이다. 세 번째 단점은 초기 치료에서 배제되지 않은 환자에게 재-투여를 방지하는 캡시드 면역원성과 관련이 있다. 환자의 면역계는 향후 치료를 배제하는 고역가 항-AAV 항체를 생산하는 면역계를 자극하기 위해 "부스터" 샷으로서 효과적으로 작용하는 벡터에 반응할 수 있다. 일부 최근 보고서는 고용량 상황에서 면역원성에 대한 우려를 나타낸다. 또 다른 주목할 만한 단점은 단일-가닥 AAV DNA가 이종성 유전자 발현 전에 이중-가닥 DNA로 전환되어야 하기 때문에 AAV-매개 유전자 발현의 개시가 비교적 느리다는 것이다. 이중-가닥 DNA 벡터를 구축함으로써 이 사안을 회피하려는 시도가 있었지만, 이 전략은 AAV 벡터에 통합될 수 있는 이식유전자 발현 카세트의 크기를 추가로 제한한다(McCarty, 2008; Varenika 등, 2009; Foust 등, 2009).
또한, 캡시드를 갖는 종래의 AAV 비리온은 AAV 게놈, rep 유전자 및 cap 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입함으로써 생산된다(Grimm 등, 1998). 트랜스에 이들 헬퍼 플라스미드의 도입시, AAV 게놈은 숙주 게놈으로부터 "구조화"되고(즉, 방출 및 후속으로 증폭됨), 추가로 캡시드화되어(바이러스 캡시드) 생물학적 활성 AAV 벡터를 생산한다. 그러나, 이러한 캡시드화된 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 유형을 비효율적으로 형질도입시키는 것으로 밝혀졌다. 캡시드는 또한 면역 반응을 유도한다.
따라서, 유전자 요법을 위한 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터의 사용은 환자에의 단일 투여(환자 면역 반응으로 인해), 느린 AAV-매개 유전자 발현뿐만 아니라 연관된 AAV 캡시드의 최소 바이러스 패키징 용량(약 4.5 kb)으로 인해 AAV 벡터에서의 전달에 적합한 이식유전자 유전 물질의 제한된 범위로 인해 제한된다. rAAV 임상 유전자 요법에 대한 적용은 동계 마우스 모델 또는 다른 모델 종에서의 용량 반응에 의해 예상되지 않은 환자-환자 가변성에 의해 더욱 악화된다.
재조합 캡시드-비함유 AAV 벡터는 Rep 결합 및 말단 분할 부위를 포함하는 2개의 야생형 AAV 역전 말단 반복 서열(ITR)에 의해 측접된 발현성 이식유전자 및 프로모터 영역을 포함하는 분리된 선형 핵산 분자로서 수득될 수 있다. 이들 재조합 AAV 벡터는 AAV 캡시드 단백질 암호화 서열이 결여되어 있고, 2개의 야생형 ITR 회문 서열을 통해 공유결합된 하나 또는 양쪽 말단을 갖는 단일-가닥, 이중-가닥 또는 듀플렉스일 수 있다(예를 들어, WO2012/123430, 미국 특허 9,598,703). 그들은 이식유전자 용량이 훨씬 높고, 이식유전자 발현 개시가 신속하며, 환자 면역계가 DNA 분자를 제거할 바이러스로 인식한다는 점에서 AAV-매개 유전자 요법의 많은 문제를 피한다. 그러나, 이식유전자의 일정한 발현이 모든 경우에 바람직하지는 않을 수 있고, AAV 표준 야생형 ITR은 ceDNA 기능에 대해 최적화되지 않을 수 있다. 따라서, 개선된 생산 및/또는 발현 특성을 갖는 제어가능한 재조합 DNA 벡터에 대한 중요한 충족되지 않은 요구가 남아 있다.
발명의 간단한 설명
본 명세서에 기재된 본 발명은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(본 명세서에서 "폐쇄-종결된 DNA 벡터" 또는 "ceDNA 벡터"로 지칭됨)이다. 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터는 5' 역전된 말단 반복(ITR) 서열 및 서로에 대해 상이하거나 비대칭인 3' ITR 서열을 포함하는, 공유적으로-폐쇄된 말단(선형, 연속적 및 비-캡시드화된 구조)을 갖는 상보성 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드-비함유 선형 이중나선 DNA 분자이다.
본 명세서에 기재된 기술은 적어도 하나의 변형된 AAV 역전된 말단 반복 서열(ITR) 및 발현성 이식유전자를 함유하는 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터는 진핵 세포에서 생산될 수 있으며, 따라서 곤충 세포에서 원핵 DNA 변형 및 박테리아 내독소 오염이 없다.
일 양태에서, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터는 바람직하게는 선형 듀플렉스 분자이고, 2개의 상이한 역전된 말단 반복 서열(ITR)(예를 들어, AAV ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하는 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 얻을 수 있으며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 말단 분할 부위 및 복제 단백질 결합 부위(RPS)(때로는 복제 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 포함하고, 및 ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 즉, ITR 중 하나는 다른 ITR에 비해 비대칭이다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR, 예를 들어 야생형 AAV ITR 또는 변형된 AAV ITR이다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 다른 ITR에 비해 변형된 ITR이다 - 즉, ceDNA는 서로 비대칭인 ITR을 포함한다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 비-기능성 ITR이다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 하기를 포함하며: (1) 시스-조절 인자, 프로모터 및 적어도 하나의 이식유전자를 포함하는 발현 카세트; 또는 (2) 적어도 하나의 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 (3) 상기 발현 카세트에 측접하는 2개의 자가-상보성 서열, 예를 들어, ITR, 여기서, ceDNA 벡터는 캡시드 단백질과 연관되지 않는다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 AAV 게놈에서 발견된 2개의 자가-상보성 서열을 포함하고, 여기서 적어도 하나는 작동성 Rep-결합 요소(RBE)(또한 본원에서 "RBS"로 지칭됨) 및 AAV의 말단 분할 부위(trs) 또는 RBE의 기능적 변이체, 및 이식유전자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 시스-조절 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 성분, 예를 들어 조절 스위치를 포함하며, 이는 이식유전자의 발현을 제어 및 조절하기 위한 "조절 스위치" 섹션에서 본원에 기재되어 있으며, 조절 스위치, 예를 들어, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 자가-상보성 서열은 임의의 알려진 파보바이러스, 예를 들어 데펜도바이러스, 예컨대 AAV(예를 들어, AAV1-AAV12)로부터의 ITR 서열일 수 있다. 헤어핀 이차 구조 형성을 허용하는 가변성 회문성 서열에 더하여 Rep-결합 부위(RBS), 예컨대 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호: 531) 및 말단 분할 부위(trs)를 보유하는, 변형된 AAV2 ITR 서열을 비제한적으로 포함하는 임의의 AAV 혈청형이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 헤어핀 이차 구조 형성을 허용하는 가변성 회문성 서열에 더하여 기능성 Rep-결합 부위(RBS), 예컨대 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호: 531) 및 말단 분할 부위(TRS)를 보유하는 합성 ITR 서열이다. 일부 예에서, 변형된 ITR 서열은 RBS, trs의 서열 및 야생형 AAV2 ITR의 상응하는 서열로부터의 ITR 헤어핀 이차 구조 중 하나의 말단 루프부를 형성하는 Rep 결합 요소의 구조 및 위치를 유지한다.
ceDNA 벡터에 사용하기 위한 예시적인 ITR 서열은 하기에 개시되어 있다: 표 2-10A 및 10B, 또는 도 26a~26b에 도시된 서열번호: 2, 52, 101~499 및 545~547 또는 부분적인 ITR 중 임의의 하나 이상. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 500~529로부터 선택된 임의의 서열을 포함하는 ITR을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A 및 10B 중 임의의 하나 이상에 나타낸 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열의 임의의 변형에 상응하는 ITR에서의 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있다.
예시적인 예로서, 본 발명은 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 폐쇄-종결된 DNA 벡터를 제공하며, 여기서 ceDNA는 캡시드 단백질이 없고, (a) 헤어핀 이차 배치형태에서 서열번호: 2와 동일한 수의 분자내 이중화 염기쌍을 갖는 돌연변이된 우측 AAV2 ITR 또는 서열번호: 51과 동일한 수의 분자내 이중화 염기쌍을 갖는 돌연변이된 좌측 AAV2 ITR을 암호화하는 ceDNA-플라스미드(예를 들어, 실시예 1-2 및/또는 도 1a~b 참조)로부터 생산되고(바람직하게는 이들 참조 서열과 비교되는 이러한 배치형태에서 임의의 AAA 또는 TTT 말단 루프의 결실은 배제함)이고, (b) 실시예 1의 고유 겔 및 변성 조건 하에 아가로스 겔 전기영동에 의한 ceDNA의 확인을 위한 분석법을 사용하여 ceDNA로 확인된다. 이러한 변형된 ITR 서열의 예는 본원의 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A 및 10B에 제공된다.
본 명세서에 기재된 기술은 또한 표적 세포에서 하나 이상의 이식유전자를 전달 및 암호화할 수 있는 ceDNA 벡터에 관한 것이며, 예를 들어, ceDNA 벡터는 멀티시스트론성 서열을 포함하거나, 이식유전자 및 그의 고유 게놈 문맥(예를 들어, 이식유전자, 인트론 및 내인성 미번역된 영역)이 함께 ceDNA 벡터에 통합된다. 이식유전자는 단백질 암호화 전사체, 비-암호화 전사체 또는 둘 다일 수 있다. ceDNA 벡터는 다수의 암호화 서열, 및 단백질 암호화 전사체, 비-암호화 전사체, 또는 둘 모두를 발현하기 위한 비-표준 번역 개시 부위 또는 하나 초과의 프로모터를 포함할 수 있다. 이식유전자는 하나 초과의 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있거나, 비-암호화 전사체의 서열일 수 있다. 발현 카세트는 예를 들어 4000개 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000개 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 뉴클레오타이드, 또는 약 4000~10,000개 뉴클레오타이드 또는 10,000~50,000개 초과의 뉴클레오타이드, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드의 임의의 범위를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한을 갖지 않으므로, 이식유전자의 효율적인 발현을 제공하기 위해 대형 발현 카세트의 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있다.
발현 카세트는 또한 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 인자는 프로모터, 리보스위치, 절연체, 미르-조절가능 요소, 전사후 조절 인자, 조직- 및 세포 유형-특이적 프로모터 및 향상제를 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 이식유전자의 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가 성분을 포함한다. 예를 들어, 추가의 조절 성분은 필요에 따라 ceDNA 감염 세포, 및 다른 유도성 및/또는 억제성 요소를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 비제한적으로 포함하는, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조절인자 스위치일 수 있다.
본 명세서에 기재된 기술은 ceDNA 벡터를 사용하여 하나 이상의 이식유전자를 전달하고 효율적으로 및 선택적으로 발현시키는 신규한 방법을 추가로 제공한다. ceDNA 벡터는 AAV 캡시드가 없는 경우 핵으로 수송될뿐만 아니라 숙주세포로 용해시킬 수 있는 능력을 갖는다. 또한, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터는 캡시드가 결여되어, 캡시드-함유 벡터에 대한 반응으로 발생할 수 있는 면역 반응을 피한다.
본 발명의 양태는 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 구현예는 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 일 구현예에서, 캡시드 비함유 비-바이러스 DNA 벡터(ceDNA 벡터)는 다음의 순서로 포함되는 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형을 포함하는 플라스미드(본 명세서에서 "ceDNA-플라스미드"로 지칭됨)로부터 수득된다: 제1 5' 역전된 말단 반복(예를 들어, AAV ITR); 발현 카세트; 및 5' 및 3' ITR 중 적어도 하나가 변형된 ITR이거나, 5' 및 3' ITR이 모두 변형될 때, 서로 상이한 변형을 갖는 3' ITR(예를 들어 AAV ITR)이 동일한 서열이 아니다.
본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터는 숙련가가 본 개시내용을 읽은 후 알려져 있는 다수의 수단에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ceDNA 벡터를 생산하기 위해 사용된 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형은 ceDNA-플라스미드(예를 들어, 표 12 또는 도 10b 참고), ceDNA-백미드 및/또는 ceDNA-배큘로바이러스일 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 ITR 사이에 작동가능하게 배치된 제한 클로닝 부위(예를 들어, 서열번호: 7)를 포함하며, 여기서 발현 카세트는 예를 들어 이식유전자, 예를 들어 리포터 유전자 및/또는 치료 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터)를 삽입할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 상응하는 측접하는 AAV3 ITR 또는 야생형 AAV2 ITR 서열과 비교하여 변형된 ITR을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드, ceDNA-배큘로바이러스)으로부터 생산되며, 여기서 변형은 결실, 삽입 및/또는 치환 중 임의의 하나 이상이다.
허용된 숙주세포에서, 예를 들어 Rep의 존재하에, 적어도 하나의 변형된 ITR을 갖는 폴리뉴클레오타이드 주형은 복제하여, ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 두 단계; 첫째, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어 ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드, ceDNA-배큘로바이러스 게놈 등)으로부터 주형의 절개("구조") 및 두 번째, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개된 복제. 다양한 AAV 혈청형의 Rep 단백질 및 Rep 결합 부위는 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 숙련가는 적어도 하나의 기능성 ITR에 기초하여 핵산 서열에 결합하고 이를 복제하는 혈청형으로부터 Rep 단백질을 선택하는 것을 이해한다. 예를 들어, 복제 적격 ITR이 AAV 혈청형 2에서 유래한 경우, 상응하는 Rep는 AAV2 또는 AAV4 Rep와 함께 AAV2 ITR과 같은 혈청형과 작동하고, 작동하지 않는, AAV5 Rep가 아닌 AAV 혈청형으로부터 유래할 것이다. 복제시, 공유-폐쇄 종결된 ceDNA 벡터는 허용가능 세포내에 축적하며, ceDNA 벡터는 바람직하게는 예를 들어 표준 복제 조건 하에서 Rep 단백질의 존재하에 시간에 걸쳐 충분히 안정하여, 예를 들어 적어도 1 pg/세포, 바람직하게는 적어도 2 pg/세포, 바람직하게는 적어도 3 pg/세포, 더 바람직하게는 적어도 4 pg/세포, 더욱 더 바람직하게는 적어도 5 pg/세포의 양으로 계속 축적된다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 a) 숙주세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에, 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있고, 숙주세포가 바이러스 캡시드 암호화 서열을 포함하지 않는, 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드 및/또는 ceDNA-배큘로바이러스)을 보유하는 숙주세포(예를 들어 곤충 세포)의 모집단을 인큐베이팅하는 단계; 및 b) 숙주세포로부터 ceDNA 벡터를 수확하고 단리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. Rep 단백질의 존재는 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 생산하기 위해 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도한다. 그러나, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않다. 따라서, 비리온-강제 크기 제한은 없다.
숙주세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 존재는 숙주세포로부터 단리된 DNA를 ceDNA 벡터상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 변성 및 비-변성 겔에 대해 소화된 DNA 물질을 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원은 하기 단락 중 임의의 단락에서 정의될 수 있다:
1. 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, 상기 ceDNA 벡터는 비대칭 역전된 말단 반복 서열(비대칭 ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 비대칭 ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는, ceDNA 벡터.
2. 단락 1에 있어서, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화되고 천연 및 변성 겔 전기영동 둘다에 의해 분석될 때 ceDNA 벡터는 선형 및 비-연속적 DNA 대조군과 비교하여, 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드를 나타내는, ceDNA 벡터.
3. 단락 1 또는 2에 있어서, 비대칭 ITR 서열 중 하나 이상이 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래된, ceDNA 벡터.
4. 단락 3에 있어서, 비대칭 ITR이 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래된, ceDNA 벡터.
5. 단락 4에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 이상이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래된, ceDNA 벡터.
6. 단락 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 이상이 합성인, ceDNA 벡터.
7. 단락 1 내지 3 및 6 중 어느 하나에 있어서, ITR 중 하나 이상이 야생형 ITR이 아닌, ceDNA 벡터.
8. 단락 1 내지 단락 7 중 어느 하나에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'로부터 선택된 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된, ceDNA 벡터. 일부 구현예에서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 표 1에 기재된 바와 같은 B, B', C 또는 C' 영역의 임의의 조합에서 결실, 삽입 및/또는 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 영역, 및/또는 B' 영역, 및/또는 C 영역, 및/또는 C' 영역에서 결실, 삽입 및/또는 치환을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 A 영역 및/또는 A' 영역, 및/또는 B 영역, 및/또는 B' 영역, 및/또는 C 영역, 및/또는 C' 영역, 및/또는 D 영역 및/또는 D' 영역에서 하나 이상의 결실, 삽입 및/또는 치환을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 모든 특정 아암, 예를 들어 A-A' 아암의 전부 또는 일부, 또는 B-B' 아암의 전부 또는 일부, 또는 C-C' 아암의 전부 또는 일부의 제거 또는 결실을 가질 수 있으며, 또는 대안적으로, 최종 루프 캡핑 동안 루프 스템을 형성하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 가질 수 있어, 스템(예를 들어, 단일 아암)이 여전히 존재한다(예를 들어, ITR-6 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기 쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거 및 B-B' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 염기 쌍의 제거의 임의의 조합이 구상된다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암이 결여되어 있다.
9. 단락 8에 있어서, 결실, 삽입 및/또는 치환은 A, A', B, B' C, 또는 C' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시킨 ceDNA 벡터. 예를 들어, 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 상보성 염기쌍이 C-C' 아암의 C 부분 및 C' 부분 각각으로부터 제거되어, C-C' 아암이 절단되고/되거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 상보성 염기쌍이 B-B' 아암의 B 부분 및 B' 부분 각각으로부터 제거되어, C-C' 아암 및/또는 B'-B 아암이 절단된다. 대안적인 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 C-C' 아암의 C 부분으로부터 제거되어, 아암의 C' 부분 만이 남게 된다. 대안적인 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 C-C' 아암의 C' 부분으로부터 제거되어, 아암의 C 부분 만이 남게 된다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 B-B' 아암의 B 부분으로부터 제거되어, 아암의 B' 부분 만이 남게 된다. 대안적인 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 B-B' 아암의 B' 부분으로부터 제거되어, 아암의 B 부분 만이 남게 된다. 일부 구현예에서, C 영역, C' 영역, B 영역 또는 B' 영역에서의 임의의 결실은 여전히 스템-루프의 말단 루프를 보존한다. 일부 구현예에서, 말단 루프는 적어도 3개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, C-C' 아암 및/또는 B-B' 아암의 말단 루프는 적어도 3개의 순차적인 TTT 또는 3개의 순차적인 AAA를 갖는다.
10. 단락 8 또는 단락 9에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, B 및 B' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, ceDNA 벡터.
11. 단락 8 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, C 및 C' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, ceDNA 벡터.
12. 단락 10 또는 단락 11에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, B 및 B' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 C 및 C' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부를 결실시키는, ceDNA 벡터.
13. 단락 1 내지 단락 12 중 어느 하나에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에서 단일 스템-루프 구조를 포함하는, ceDNA 벡터.
14. 단락 13에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에서 단일 스템 및 2개의 루프를 포함하는, ceDNA 벡터.
15. 단락 13 또는 단락 14에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에서 단일 스템 및 단일 루프를 포함하는, ceDNA 벡터
16. 단락 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비대칭 ITR은 하기로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 AAV2 ITR인, ceDNA 벡터: 도 26a 또는 26b, 서열번호: 101~499 또는 545~547의 ITR, 도 26a 또는 26b의 ITR에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 ITR, 및 서열번호: 101~499 및 545~547에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 ITR.
17. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 비대칭 ITR이 서열번호: 2, 52, 63 또는 64의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호: 2, 52, 63 또는 64에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 AAV2 ITR인, ceDNA 벡터.
18. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 5' ITR은 야생형 AAV ITR이고, 3' ITR은 서열번호: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 469~483 및 546으로부터 선택된 서열, 및 도 26a에 도시된 ITR 서열, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
19. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 3' ITR은 야생형 AAV ITR이고, 5' ITR은 서열번호: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484~499, 545 및 547로부터 선택된 서열, 및 도 26b에 도시된 ITR 서열, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
20. 단락 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 5' ITR이 서열번호: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484~499, 545 및 547로부터 선택된 서열, 및 도 26b에 도시된 ITR 서열, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 3' ITR은 서열번호: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,130, 132, 134, 469~483 및 546으로부터 선택된 서열 및 도 26a에 도시된 ITR 서열, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
21. 단락 1에 있어서, (a) 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및 (b) 서열번호: 2 및 서열번호: 51로부터 선택된 적어도 2개의 비대칭 ITR을 포함하는, ceDNA 벡터.
22. 단락 1에 있어서, (a) 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및 (b) 서열번호: 2 및 서열번호: 51로부터 선택된 한 쌍의 비대칭 ITR을 포함하는, ceDNA 벡터.
23. 단락 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두 서열번호: 2, 52, 63 64, 113, 114, 및 557 이외의 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
24. 단락 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 이종성 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부가 적어도 하나의 조절 스위치의 제어하에 있는, ceDNA 벡터.
25. 단락 24에 있어서, 적어도 하나의 조절 스위치는 표 11, 또는 본원의 "조절 스위치" 섹션에서 열거된 조절 스위치의 임의의 또는 한 조합으로부터 선택되는, ceDNA 벡터. 단지 예로서, 조절 스위치는 이종성 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 이식유전자의 발현을 미세 조정하는 역할을 하며, 일부 구현예에서 ceDNA 벡터의 생체내 기능으로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 "온/오프(ON/OFF)" 스위치이다. 이론에 제한되지 않고, "온/오프" 스위치는 통제가능하고 조절가능한 방식으로 ceDNA 벡터로부터 발현된 이종성 뉴클레오타이드 서열 또는 이식유전자의 발현을 시작 또는 중지(즉, 셧다운)하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 스위치가 활성화되면 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포 프로그래밍된 사멸을 겪도록 지시할 수 있는 "킬(kill) 스위치"이다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 2원 스위치(예를 들어, 유도성 프로모터, 보조인자 또는 외인성 물질이 전사를 억제하지 않음), 소분자 조절 스위치(예를 들어, 약물-유도 또는 전구-약물이 전사를 활성화시키거나 중지시킴), 또는 "암호" 조절 스위치(예를 들어, 이식유전자 발현 및/또는 억제가 발생하기 위해 조건의 조합이 존재해야 함), 핵산 기반 조절 스위치(예를 들어, 발현 및/또는 억제를 제어하기 위한 핵산 기반 기전), 번역후 및/또는 전사후 조절 스위치(예를 들어, 번역후 변형이 발생할 때까지 시날(sihnal) 반응 인자(SRE) 또는 기능성 이식유전자를 방지하는 불안정화 도메인(DD)으로 발현된 이식유전자) 또는 킬 스위치(예를 들어, 대상체 시스템으로부터 도입된 ceDNA 벡터를 영구적으로 제거하는 수단으로서 프로그래밍된 세포사멸을 유도하기 위한 스위치)로부터 선택된다.
26. 단락 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 벡터가 나노담체 내에 있는, ceDNA 벡터.
27. 단락 26에 있어서, 나노담체는 지질 나노입자(LNP)를 포함하는, ceDNA 벡터.
28. 단락 1 내지 25 중 어느 하나의 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, ceDNA 벡터는 a) 적어도 하나의 Rep 단백질의 존재하에, ceDNA 발현 작제물을 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 ceDNA 발현 작제물이 곤충세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 ceDNA 벡터를 암호화하는 단계; 및 b) 곤충세포로부터 ceDNA 벡터를 단리하는 단계를 포함하는 방법으로부터 수득되는, ceDNA 벡터.
29. 단락 28에 있어서, ceDNA 발현 작제물은 ceDNA 플라스미드, ceDNA 백미드 및 ceDNA 배큘로바이러스로부터 선택되는, ceDNA 벡터.
30. 단락 28 또는 29에 있어서, 곤충 세포가 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, ceDNA 벡터.
31. 단락 30에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질은 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, ceDNA 벡터.
32. 단락 31에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, ceDNA 벡터.
33. 단락 1 내지 25 중 어느 하나의 ceDNA 벡터를 암호화하는 ceDNA 발현 작제물.
34. 단락 33에 있어서, ceDNA 플라스미드, ceDNA 백미드 또는 ceDNA 배큘로바이러스인, ceDNA 발현 작제물.
35. 단락 33 또는 단락 34의 ceDNA 발현 작제물을 포함하는 숙주세포.
36. 단락 35에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, 숙주세포.
37. 단락 36에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, 숙주세포.
38. 단락 37에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 숙주세포.
39. 단락 35 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 곤충 세포인 숙주세포.
40. 단락 39에 있어서, Sf9 세포인, 숙주세포.
41. (a) ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건하에 및 충분한 시간 동안 단락 35 내지 40 중 어느 하나의 숙주세포를 인큐베이팅하는 단계; 및 (b) 숙주세포로부터 ceDNA를 단리하는 단계를 포함하는, ceDNA 벡터의 제조 방법.
42. 대상체에서 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 모니터링 또는 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 단락 1 내지 25 중 어느 하나의 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 진단 또는 모니터링하기 위해 선택되는, 방법.
43. 단락 42에 있어서, 전사 또는 번역될 때 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 대상체에서 비정상적인 양의 내인성 단백질을 교정하는 방법.
44. 단락 42에 있어서, 전사 또는 번역될 때 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 대상체에서 내인성 단백질의 활성 또는 경로의 비정상 기능을 교정하는, 방법.
45. 단락 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 RNAi, siRNA, miRNA, lncRNA, 및 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드로부터 선택된 뉴클레오타이드 분자를 암호화하거나 포함하는, 방법.
46. 단락 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 단백질을 암호화하는, 방법.
47. 단락 42에 있어서, 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 마커 단백질(예를 들어, 리포터 단백질)을 암호화하는, 방법.
48. 단락 42 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 상기 질환 또는 장애와 연관된 내인성 단백질 또는 경로의 효능제 또는 길항제를 암호화하는, 방법.
49. 단락 42 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 항체를 암호화하는, 방법.
50. 단락 42 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 대사 질환 또는 장애, CNS 질환 또는 장애, 안구 질환 또는 장애, 혈액 질환 또는 장애, 간 질환 또는 장애, 면역 질환 또는 장애, 감염성 질환, 근육 질환 또는 장애, 암, 및 유전자 산물의 비정상 수준 및/또는 기능에 기초한 질환 또는 장애로부터 선택되는, 방법.
51. 단락 50에 있어서, 상기 대사 질환 또는 장애는 당뇨병, 리소좀 축적 장애, 점액다당류 장애, 요소 대사 질환 또는 장애 및 글리코겐 축적 질환 또는 장애로부터 선택되는, 방법.
52. 단락 51에 있어서, 리소좀 저장 장애는 고오셔 질환, 폼페병, 이염성 백질이상증(MLD), 페닐케톤뇨증(PKU), 및 파브리병으로부터 선택되는, 방법.
53. 단락 51에 있어서, 요소 대사 질환 또는 장애가 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 결핍인, 방법.
54. 단락 51에 있어서, 점액다당류 장애는 슬라이 증후군, 헐러 증후군, 쉬에 증후군, 헐러-쉬에 증후군, 헌터 증후군, 산필립포 증후군, 모르키오 증후군, 및 마로토-라미 증후군으로부터 선택되는, 방법.
55. 단락 50에 있어서, CNS 질환 또는 장애는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 카나반병, 레이(Leigh) 병, 레프섬(Refsum) 질환, 투렛 증후군, 일차 측삭 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 진행성 근육 위축증, 피크(Pick)병, 근이영양증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 빈스완거(Binswanger)병, 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이색스(Tay Sachs) 질환, 레쉬-니안(Lesch-Nyan) 질환, 간질, 뇌 경색, 정신과 장애, 정신분열증, 약물 의존성, 신경증, 정신병, 치매, 편집증, 주의력 결핍 장애, 수면 장애, 통증 장애, 섭식 또는 체중 장애, 및 CNS의 암 및 종양으로부터 선택되는, 방법.
56. 단락 50에 있어서, 안구 질환 또는 장애는 망막, 후관 및/또는 시신경을 포함하는 안과 장애로부터 선택되는, 방법.
57. 단락 55에 있어서, 망막, 후관 및/또는 시신경을 포함하는 안과 장애는 당뇨병성 망막병증, 연령 관련 황반 변성을 포함하는 황반 변성, 지리적 위축증 및 혈관 또는 "습식" 황반 변성, 녹내장, 포도막염, 색소성 망막염, 스타가르트, 레베르(Leber) 선천성 흑내장(LCA), 어셔 증후군, 탄력섬유성가황색종(PXE), x-연관 망막염 색소성 망막염(XLRP), x-연관 망막층간분리증(XLRS), 맥락막결손, 레베르(Leber) 선천성 시신경병증(LHON)), 전색맹(Archomatopsia), 추체간체 이영양증, 푹스(Fuchs) 각막 내피 이상증, 당뇨병성 황반 부종 및 안구 암 및 종양로부터 선택되는, 방법.
58. 단락 50에 있어서, 혈액 질환 또는 장애는 A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해 빈혈, 빈혈 및 혈액 암으로부터 선택되는, 방법.
59. 단락 50에 있어서, 간 질환 또는 장애는 진행성 계열성 간내 담즙정체증(PFIC) 및 간암 및 종양으로부터 선택되는, 방법.
60. 단락 42에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 낭포성 섬유증인, 방법.
61. 단락 42 내지 60 중 어느 하나에 있어서, ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 투여되는, 방법.
62. 단락 1 내지 25 중 어느 하나의 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료적 단백질을 대상체에게 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 치료적 단백질을 암호화하는, 방법.
63. 단락 62에 있어서, 치료적 단백질이 치료적 항체인, 방법.
64. 단락 62에 있어서, 치료적 단백질이 효소, 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 초과산화물 디스무타제, 글로빈, 렙틴, 카탈라제, 티로신 하이드록실라제, 사이토카인, 낭포성 섬유증 막관통 전도성 조절인자(CFTR), 펩타이드 성장 인자, 및 호르몬으로부터 선택되는, 방법.
65. 단락 1 내지 25 중 어느 하나의 ceDNA 벡터, 및 패킷 삽입물을 갖는 컨테이너에 포장된 나노담체를 포함하는 키트.
66. ceDNA 벡터를 생산하기 위한 키트로서, 이 키트는 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 위한 적어도 하나의 제한 부위, 또는 조절 스위치, 또는 둘 모두를 포함하는 발현 작제물을 포함하며, 적어도 하나의 제한 부위는 비대칭 역전된 말단 반복 서열(비대칭 ITR)사이에 작동가능하게 배치되며, 비대칭 ITR 중 적어도 하나가 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는, 키트.
67. 단락 66에 있어서, 단락 1 내지 25 중 어느 하나의 ceDNA 벡터를 생산하는데 적합한, 키트.
68. 단락 66 또는 단락 67에 있어서, 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여된 곤충 세포의 모집단을 추가로 포함하고, Rep 단백질의 존재 하에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도할 수 있는, 키트.
69. 단락 66 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 추가로 포함하며, 상기 벡터는 곤충 세포에서 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현시키는데 적합한, 키트.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 기술의 일 양태는 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드 비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)에 관한 것이며, 여기서 ceDNA 벡터는 비대칭 역전된 말단 반복 서열(비대칭 ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서, 비대칭 ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, 선택적으로 이종성 핵산 서열은 이식유전자를 암호화하고, 벡터는 바이러스 캡시드에 있지 않다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 하기에 더욱 상세하게 기재된다.
도 1a는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이 구현예에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 루시퍼라제 이식유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위(R3/R4)에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 역전된 말단 반복부(ITR), 즉 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 야생형 AAV2 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR에 의해 측접되며, 따라서 발현 카세트에 측접하는 2개의 ITR은 서로에 대해 비대칭이다.
도 1b는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 갖는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 루시퍼라제 이식유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트는 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 야생형 ITR인, 2개의 역전된 말단 반복(ITR)에 의해 측접된다.
도 1c는 향상제/프로모터를 포함하는 발현 카세트, 이식유전자의 삽입을 위한 오픈 리딩 프레임(ORF), 전사후 요소(WPRE) 및 폴리A 신호를 갖는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 이식유전자의 삽입을 허용한다. 발현 카세트는 서로에 대해 비대칭인 2개의 역전된 말단 반복부(ITR)에 의해 측접되고; 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR 및 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR을 포함하며, 5' ITR 및 3' ITR은 모두 변형된 ITR이지만 상이한 변형을 갖는다(즉, 동일한 변형을 갖지 않음).
도 2a는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE')의 확인과 함께 AAV2의 야생형 좌측 ITR(서열번호: 538)의 T-형상화된 스템-루프 구조를 제공하며, 말단 분할 부위(trs)도 나타낸다. RBE는 Rep 78 또는 Rep 68과 상호작용하는 것으로 여겨지는 일련의 4개의 듀플렉스 사량체를 함유한다. 또한, RBE'는 또한 작제물내 야생형 ITR 또는 돌연변이된 ITR 상에 조립된 Rep 복합체와 상호작용하는 것으로 여겨진다. D 및 D' 영역은 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 함유한다. 도 2b는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE')의 확인과 함께 AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T-형상화된 스템-루프 구조를 포함하는, 야생형 좌측 ITR(서열번호: 539)에서의 제안된 Rep-촉매접촉된 닉킹 및 결찰 활성을 도시하며, 말단 분할 부위(trs), 여러 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 포함하는 D 및 D' 영역도 나타낸다.
도 3a는 의 RBE-함유 부분의 야생형 좌측 AAV2 ITR(서열번호: 540)의 A-A' 아암, C-C' 및 B-B' 아암의 일차 구조(폴리뉴클레오타이드 서열)(좌측) 및 이차 구조(우측)를 제공한다. 도 3b는 좌측 ITR에 대한 예시적인 돌연변이된 ITR(또한 변형된 ITR이라고도 함) 서열을 나타낸다. 예시적인 돌연변이된 좌측 ITR(ITR-1, 좌측)(서열번호: 113)의 A-A' 아암, C 아암 및 B-B' 아암의 RBE 부분의 일차 구조(좌측) 및 예상된 이차 구조(우측)가 도시되어 있다. 도 3c는 A-A' 루프의 RBE-함유 부분의 일차 구조(좌측) 및 이차 구조(우측), 및 야생형 우측 AAV2 ITR(서열번호: 541)의 B-B' 및 C-C' 아암을 나타낸다. 도 3d는 예시적인 우측 변형된 ITR을 나타낸다. 예시적인 돌연변이체 우측 ITR(ITR-1, 우측)(서열번호: 114)의 A-A' 아암, B-B' 및 C 아암의 RBE 함유 부분의 일차 구조(좌측) 및 예상된 이차 구조(우측)가 도시되어 있다. 좌측 ITR이 비대칭이거나 우측 ITR과 상이한 경우, 좌측 및 우측 ITR(예를 들어, AAV2 ITR 또는 다른 바이러스 혈청형 또는 합성 ITR)의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 각각의 도 3a~3d 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같이 ceDNA를 생산하는데 사용된 플라스미드 또는 백미드/배큘로바이러스 게놈에 사용된 서열을 지칭한다. 또한, 플라스미드 또는 백미드/배큘로바이러스 게놈의 ceDNA 벡터 배치형태 및 예상된 깁스 자유 에너지 값으로부터 추론된 상응하는 ceDNA 이차 구조가 각각의 도 3a~3d에 포함된다.
도 4a는 도 4b의 개략도에 기술된 공정에서 ceDNA의 생산에 유용한 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 제조하기 위한 업스트림 공정을 도시한 개략도이다. 도 4b는 ceDNA 생산의 예시적인 방법의 개략도이며, 도 4c는 ceDNA 벡터 생산을 확인하기 위한 생화학적 방법 및 공정을 설명한다. 도 4d 및 도 4e는 도 4b의 ceDNA 생산 공정 동안 수득된 세포 펠릿으로부터 수확된 DNA에서 ceDNA의 존재를 확인하기 위한 공정을 설명하는 개략도이다. 도 4e는 비-연속적 구조를 갖는 DNA를 도시한다. ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 및 변성 조건 모두에서 상이한 크기(1kb 및 2kb)를 갖는 2개의 DNA 단편을 생산한다. 도 4e는 또한 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA를 나타낸다. ceDNA 벡터는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 조건에서 1kb 및 2kb로 이동하는 2개의 DNA 단편을 생산하지만, 변성 조건에서 스탠드는 연결된 상태로 유지되고 2kb 및 4kb로 이동하는 단일 가닥을 생산한다. 도 4d는 제한 엔도뉴클레아제로 절단 또는 소화되지 않은채, 천연 겔 또는 변성 겔상에서 전기영동된 예시적인 ceDNA에 대한 개략적인 예상 밴드를 나타낸다. 가장 좌측의 도식은 천연 겔이며, 듀플렉스 및 절단되지 않은 형태로 ceDNA가 적어도 단량체 및 이합체 상태로 존재하며, 더 빠르게 이동하는 더 작은 단량체 및 더 느리게 이동하는 이량체로 단량체의 두 배 크기임을 시사하는 다중 밴드를 나타낸다. 좌측에서 두 번째인 도식은 ceDNA가 제한 엔도뉴클레아제로 절단될 때, 원래 밴드가 사라지고 절단 후 남은 예상 단편 크기에 해당하는 더 빠르게 이동하는(예를 들어, 더 작은) 밴드가 나타나는 것을 보여준다. 변성 조건 하에서, 원래의 이중나선 DNA는 단일-가닥이고, 상보성 가닥이 공유결합되어 있기 때문에 천연 겔에서 관측된 것보다 2배 큰 종으로 이동한다. 따라서 우측에서 두 번째 도식에서, 소화된 ceDNA는 천연 겔에서 관측된 것과 유사한 밴딩 분포를 나타내지만, 밴드는 천연 겔 대응물의 크기의 두 배 크기의 단편으로 이동한다. 가장 우측 회로도는 변성 조건 하에서 절단되지 않은 ceDNA가 단일-가닥 개방된 원으로서 이동하므로 관측된 밴드는 원이 개방되지 않은 기본 조건 하에서 관측된 것보다 두 배 크기라는 것을 보여준다. 이 도면에서, "kb"는 문맥에 따라, 뉴클레오타이드 사슬 길이(예를 들어, 변성 조건에서 관측된 단일가닥 분자의 경우) 또는 염기쌍의 수(예를 들어, 기본 조건에서 관측된 이중-가닥 분자의 경우)에 기초하여 뉴클레오타이드 분자의 상대 크기를 나타내는데 사용된다.
도 5는 엔도뉴클레아제(ceDNA 작제물 1 및 2에 대한 EcoRI; ceDNA 작제물 3 및 4에 대한 BamH1; ceDNA 작제물 5 및 6에 대한 SpeI; 및 ceDNA 작제물 7 및 8에 대한 XhoI)에 의해 (+)소화된, 또는 (-)소화되지 않은 ceDNA 벡터의 변성 겔 실행 예의 예시적 사진이다. 별표로 강조 표시된 밴드의 크기를 결정하고 사진의 하단에 제공했다.
도 6a는 x-축상에서 확인된 작제물(작제물-1, 작제물-3, 작제물-5, 작제물-7)(표 12)의 400 ng(흑색), 200 ng(회색) 또는 100 ng(백색)의 형질감염 후 48시간에 HEK293 세포에서 루시퍼라제 활성(y-축, RQ(Luc))을 측정하는 시험관내 단백질 발현 검정의 결과를 나타낸다. 도 6b는 x-축상에서 확인된 작제물(작제물-2, 작제물-4, 작제물-6, 작제물-8)(표 12)의 400 ng(흑색), 200 ng(회색) 또는 100 ng(백색)의 형질감염 후 48시간에 HEK293 세포에서 측정된 루시퍼라제 활성(y-축, RQ(Luc))을 나타낸다. 임의의 플라스미드없이 "푸진(Fugene)"으로 처리된 HEK293 세포에서, 또는 미처리 HEK293 세포("처리되지 않음")에서 측정된 루시퍼라제 활성이 또한 제공된다.
도 7a는 x-축상에서 확인된 작제물(작제물-1, 작제물-3, 작제물-5, 작제물-7)의 400 ng(흑색), 200 ng(회색) 또는 100 ng(백색)의 형질감염 후 48시간에 HEK293 세포의 생존율(y-축)을 나타낸다. 도 7b는 x-축상에서 확인된 작제물(작제물-2, 작제물-4, 작제물-6, 작제물-8)의 400 ng(흑색), 200 ng(회색) 또는 100 ng(백색)의 형질감염 후 48시간에 HEK293 세포의 생존율(y-축)을 나타낸다.
도 8a는 Rep 단백질 Rep52 및 Rep78에 대한 핵산 서열을 포함하는 pFBDLSR 플라스미드에서의 예시적인 Rep-백미드이다. 이 예시적인 Rep-백미드는 하기를 포함한다: IE1 프로모터 단편(서열번호: 66); 코작(Kozak) 서열(서열번호: 67)을 포함하는 Rep78 뉴클레오타이드 서열, Rep52에 대한 다면체 프로모터 서열(서열번호: 68) 및 코작 서열 gccgccacc로 시작하는 Rep58 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 69). 도 8b는 wt-L ITR, CAG 프로모터, 루시퍼라제 이식유전자, WPRE 및 폴리아데닐화 서열, 및 mod-R ITR을 갖는 예시적인 ceDNA-플라스미드-1의 개략도이다.
도 9a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-2(좌측)" 서열번호: 101)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 9b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-2(우측)" 서열번호: 102)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. 그들은 단일 아암(C-C') 및 단일 비쌍 루프를 갖는 구조를 형성할 것으로 예상된다. 그들의 깁스(Gibbs) 자유 전개 에너지는 -72.6 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 10a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-3(좌측)" 서열번호: 103)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 10b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-3(우측)" 서열번호: 104)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. 그들은 단일 아암(B-B') 및 단일 비쌍 루프를 갖는 구조를 형성할 것으로 예상된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -74.8 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 11a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-4(좌측)" 서열번호: 105)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 11b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-4(우측)" 서열번호: 106)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. 그들은 단일 아암(C-C') 및 단일 비쌍 루프를 갖는 구조를 형성할 것으로 예상된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -76.9 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 12a는 C-B' 및 C'-B 부분("ITR-10(좌측)" 서열번호: 107)의 상보성 염기쌍을 나타내는, 예시적인 변형된 좌측 ITR의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 C-C' 및 B-B' 부분의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 12b는 B-C' 및 B'-C 부분("ITR-10(우측)" 서열번호: 108)의 상보성 염기쌍을 나타내는, 예시적인 변형된 좌측 ITR의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 B-B' 및 C-C' 부분의 예상된 최저 에너지 구조를 도시한다. 그들은 단일 아암(C'-B 및 C-B'의 일부 또는 B'-C 및 B-C'의 일부) 및 단일 비쌍 루프를 갖는 구조를 형성할 것으로 예상된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -83.7 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 13a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-17(좌측)" 서열번호: 109)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 C-C' 및 B-B' 부분의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 13b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-17(우측)" 서열번호: 110)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 C-C' 및 B-B' 부분의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-17(좌측)과 ITR-17(우측)은 모두 단일 아암(B-B') 및 단일 비쌍 루프를 갖는 구조를 형성할 것으로 예상된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -73.3 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 14a는 예시적인 변형된 ITR("ITR-6(좌측)" 서열번호: 111)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 14b는 예시적인 변형된 ITR("ITR-6(우측)" 서열번호: 112)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-6(좌측)과 ITR-6(우측)은 모두 단일 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -54.4 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 15a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-1(좌측)" 서열번호: 113)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 C 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 15b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-1(우측)" 서열번호: 114)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-1(좌측)과 ITR-1(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -74.7 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 16a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-5(좌측)" 서열번호: 545)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 16b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-5(우측)" 서열번호: 116)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분 및 B-B' 아암 및 C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-5(좌측)와 ITR-5(우측) 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나는(예를 들어 C' 아암) 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -73.4 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 17a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-7(좌측)" 서열번호: 117)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 17b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-7(우측)" 서열번호: 118)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-17(좌측) 및 ITR-17(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나는(예를 들어 B-B' 아암) 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -89.6 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 18a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-8(좌측)" 서열번호: 119)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 18b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-8(우측)" 서열번호: 120)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-8(좌측) 및 ITR-8(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -86.9 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 19a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-9(좌측)" 서열번호: 121)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 19b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-9(우측)" 서열번호: 122)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-9(좌측)와 ITR-9(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -85.0 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 20a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-11(좌측)" 서열번호: 123)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 20b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-11(우측)" 서열번호: 124)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-11(좌측)와 ITR-11(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -89.5 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 21a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-12(좌측)" 서열번호: 125)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 21b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-12(우측)" 서열번호: 126)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-12(좌측)와 ITR-12(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -86.2 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 22a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-13(좌측)" 서열번호: 127)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 22b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-13(우측)" 서열번호: 128)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-13(좌측)와 ITR-13(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나(예를 들어, C-C' 아암)는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -82.9 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 23a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-14(좌측)" 서열번호: 129)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 23b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-14(우측)" 서열번호: 130)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-14(좌측)와 ITR-14(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나(예를 들어, C-C' 아암)는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -80.5 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 24a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-15(좌측)" 서열번호: 131)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 24b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-15(우측)" 서열번호: 132)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-15(좌측)와 ITR-15(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나(예를 들어, C-C' 아암)는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -77.2 kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 25a는 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-16(좌측)" 서열번호: 133)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 C-C' 아암 및 B-B' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타내고, 도 25b는 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-16(우측)" 서열번호: 134)의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 예상된 최저 에너지 구조를 나타낸다. ITR-16(좌측)와 ITR-16(우측)은 모두 2개의 아암을 갖는 구조를 형성할 것으로 예상되는데, 그 중 하나(예를 들어, C-C' 아암)는 절단된다. 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 -73.9kcal/mol일 것으로 예상된다.
도 26a는 표 10A에 열거된 예시적인 변형된 우측 ITR의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 변형된 B-B' 아암 및/또는 변형된 C-C' 아암의 예상된 구조를 나타낸다. 도 26b는 표 10B에 열거된 예시적인 변형된 좌측 ITR의 A-A' 아암의 RBE-함유 부분 및 변형된 C-C' 아암 및/또는 변형된 B-B' 아암의 예상된 구조를 나타낸다. 도시된 구조는 예상된 최저 자유 에너지 구조이다. 색상 코드: 적색 = >99% 확률; 오렌지색 = 99%~95% 확률; 베이지색 = 95~90% 확률; 진한 녹색 90%~80%; 밝은 녹색 = 80%~70%; 하늘색 = 70%~60%; 암청색 60%~50% 및 분홍색 = <50%.
도 27은 표 10A 및 10B로부터의 선택된 비대칭 ITR 돌연변이 변이체로 형질감염된 Sf9 글리코박(GlycoBac) 곤충 세포의 루시퍼라제 활성을 나타낸다. ceDNA 벡터는 wt ITR 및 표 10A 또는 10B로부터 선택된 변형된 비대칭 ITR에 측접된 루시퍼라제 유전자를 가졌다. "ITR-50 R no rep"은 Rep 함유 배큘로바이러스를 공-감염시키지 않은 공지된 구조가능한 돌연변이체이다. "모의" 조건은 공여체 DNA가 없는, 형질감염 시약 단독이다.
도 28은 표 10A에 개시된 다양한 돌연변이체 우측 ITR로부터 선택된 다른 ITR과 함께 좌측 wt-ITR을 포함하는 ceDNA-플라스미드로 형질감염된 Sf9 곤충 세포 배양물로부터의 대표적 미정제 ceDNA 추출물의 천연 아가로스 겔(1% 아가로스, 1x TAE 완충액)을 나타낸다. 레인 당 2 ug의 총 추출물이 장입되었다. 좌측에서 우측으로: 레인 1) 1 kb + 사다리, 레인 2) ITR-18 우측, 레인 3) ITR-49 우측, 레인 4) ITR-19 우측, 레인 5) ITR-20 우측, 레인 6) ITR-21 우측, 레인 7) ITR-22 우측, 레인 8) ITR-23 우측, 레인 9) ITR-24 우측, 레인 10) ITR-25 우측, 레인 11) ITR-26 우측, 레인 12) ITR-27 우측, 레인 13) ITR-28 우측, 레인 14) ITR-50 우측, 레인 15) 1 kb + 사다리.
도 29는 ITR 돌연변이체 라이브러리로부터의 대표적인 작제물의 변성 겔(0.8% 알칼리성 아가로스)을 나타낸다. ceDNA 벡터는 표 10A에 개시된 다양한 돌연변이체 우측 ITR로부터 선택된 다른 ITR과 함께 좌측 wt-ITR을 포함하는 플라스미드 작제물로부터 생산된다. 좌측에서 우측으로, 레인 1) 1 kb + DNA 사다리, 레인 2) ITR-18 우측 비-절단, 레인 3) ITR-18 우측 제한 소화, 레인 4) ITR-19 우측 비-절단, 레인 5) ITR-19 우측 제한 소화, 레인 6) ITR-21 우측 비-절단, 레인 7) ITR-21 우측 제한 소화, 레인 8) ITR-25 우측 비-절단, 레인 9) ITR-25 우측 제한 소화. 추출물을 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제로 처리하였다. 각각의 돌연변이체 ceDNA는 단일 EcoRI 인식 부위를 가질 것으로 예상되며, 약 2,000 bp 및 약 3,000 bp의 2개의 특징적인 단편을 생산하며, 이는 변성 조건 하에서 각각 약 4,000 및 약 6,000 bp에서 실행될 것이다. 처리되지 않은 ceDNA 추출물은 약 5,000 bp이며, 변성 조건 하에서 약 11,000 bp로 이동될 것으로 예상된다.
도 30은 ITR 돌연변이체 ITR-18 우측, ITR-19 우측, ITR-21 우측 및 ITR-25 우측, 및 ITR-49의 HEK293 세포에서 시험관내 루시퍼라제 활성을 나타내며, 여기서 ceDNA 벡터의 좌측 ITR은 WT ITR이다. "모의" 조건은 공여체 DNA가 없는 형질감염 시약 단독이며, 미처리는 음성 대조군이다.
I. 정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적으로 사용된 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정의된다. 면역학 및 분자 생물학에서 공통 용어들의 정의는 하기에서 찾아볼 수 있으며, 이들의 전문은 본원에 참고로 포함된다: 진단 및 요법의 Merck 매뉴얼, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6th Edition, published by Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), 분자 세포 생물학 및 분자 의학의 백과사전, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); and Robert A. Meyers (ed.), 분자 생물학 및 생명공학: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); 면역학 by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); 루인의 유전자(Lewin's Genes) XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, 분자 클로닝: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., 분자 생물학에서 기본적인 방법, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); 효소학에서 실험실 방법: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); 분자 생물학에서 현 프로토콜 (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), 단백질 과학에서 현 프로토콜 (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 면역학에서 현 프로토콜 (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이종성 뉴클레오타이드 서열" 및 "이식유전자"는 상호교환적으로 사용되며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 의해 편입되어, 전달 및 발현될 수 있는 관심 핵산(캡시드 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 이외)을 지칭한다. 관심의 이식유전자는 폴리펩타이드, 바람직하게는 치료적(예를 들어, 의료, 진단 또는 수의적 용도를 위한) 또는 면역원성 폴리펩타이드(예를 들어, 백신을 위한)를 암호화하는 핵산을 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 핵산은 치료적 RNA로 전사되는 핵산을 포함한다. 본 발명의 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 이식유전자는 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 압타머, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAis, miRNA, lncRNA, 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 발현 또는 암호화하는 것들을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어들 "발현 카세트" 및 "전사 카세트"는 상호교환적으로 사용되며, 이식유전자의 직접적인 전사에 충분한 하나 이상의 프로모터 또는 다른 조절 서열에 작동가능하게 연결된 이식유전자를 포함하지만, 캡시드-암호화 서열, 다른 벡터 서열 또는 역전된 말단 반복 영역을 포함하지 않는 선형 스트레치 핵산을 지칭한다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스-작용 서열(예를 들어, 프로모터, 향상제 또는 억제인자), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사후 조절 인자를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "말단 반복" 또는 "TR"은 적어도 하나의 필요한 최소 복제 기점 및 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는 임의의 바이러스 말단 반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열("RBS")(RBE(Rep-결합 요소)로도 지칭됨) 및 말단 분할 부위("TRS")는 함께 "최소 요구된 복제 기점"을 구성하므로, TR은 적어도 하나의 RBS 및 하나 이상의 TRS를 포함한다. 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열의 스트레치 내에서 서로의 역 보체인 TR은 전형적으로 각각 "역전된 말단 반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스와 연관하여, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 구출을 중재한다. 본 발명에서 예상외로 발견된 바와 같이, 전장에 걸쳐 역 보체가 아닌 TR은 여전히 ITR의 전통적인 기능을 수행할 수 있으므로, ITR이라는 용어는 본원에서 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는, ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터내 TR을 지칭하기 위해 사용된다. 복잡한 ceDNA 벡터 구성에서 2개 이상의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있음을 당해 분야의 숙련가는 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비-AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비-AAV ITR로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 갯과 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보비리다에(Parvoviridae) 계열로부터 유래될 수 있으며, 또는 SV40 복제의 기점으로서 제공하는 SV40 헤어핀은 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있는 ITR로 사용될 수 있다. 파보비리다에 계열 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파보비리내(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소비리내(Densovirinae)의 2개의 아과로 구성된다. 데펜도파보바이러스는 인간, 영장류, 소과, 갯과, 말 및 양 종을 비제한적으로 포함하는 척추동물 숙주에서 복제할 수 있는 아데노-연관된 바이러스(AAV)의 바이러스 계열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "비대칭 ITR"은 전장에 걸쳐 역 상보적이지 않은 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 ITR을 지칭한다. 2개의 ITR 사이의 서열 차이는 뉴클레오타이드 첨가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이에 기인할 수 있다. 일 구현예에서, 쌍의 하나의 ITR은 야생형 AAV 서열일 수 있고 다른 하나는 비-야생형 또는 합성 서열일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 쌍의 ITR은 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 서로 순서가 상이하다. 본원의 편의상, ceDNA 벡터에서 5' 내지 발현 카세트(의 업스트림)에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터에서 3' 내지 발현 카세트(의 다운스트림)에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA 게놈"은 적어도 하나의 역전된 말단 반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 지칭한다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 듀플렉스 폴리뉴클레오타이드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 통합된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA 스페이서 영역"은 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 게놈에서 기능적 요소를 분리하는 개재 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 최적의 기능성을 위해 2개의 기능성 요소를 원하는 거리로 유지한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 예를 들어 플라스미드 또는 배큘로바이러스 내에서 ceDNA 게놈의 유전자 안정성을 제공하거나 추가한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 클로닝 부위 등을 위한 편리한 위치를 제공함으로써 ceDNA 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 "폴리링커", 또는 공지된 단백질(예를 들어, 전사 인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비-오픈 리딩 프레임 서열은 ceDNA 게놈에 위치하여 시스-작용 인자를 단리하여, 예를 들어, 말단 분할 부위와 업스트림 전사 조절 인자 사이에 6mer, 12mer, 18mer, 24mer, 48mer, 86mer, 176mer 등을 삽입할 수 있다. 유사하게, 스페이서는 폴리아데닐화 신호 서열과 3'-말단 분할 부위 사이에 통합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "Rep 결합 부위, "Rep 결합 요소, "RBE" 및 "RBS"는 상호교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의한 결합시, Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 그의 부위-특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있게 하는, Rep 단백질(예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 지칭한다. RBS 서열 및 그의 역 보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당해 기술에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2에서 확인된 RBS 서열인 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호: 531)을 포함한다. 다른 알려진 AAV RBS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 RBS 서열을 포함하여, 임의의 공지된 RBS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다. 이론에 의한 구속됨 없이, Rep 단백질의 뉴클레아제 도메인은 듀플렉스 뉴클레오타이드 서열 GCTC에 결합하고, 따라서 2개의 공지된 AAV Rep 단백질은 듀플렉스 올리고뉴클레오타이드, 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(서열번호: 531)에 직접 결합하고 안정적으로 조립된다고 생각된다. 또한, 가용성 응집된 이형태체(즉, 정의되지 않은 수의 상호-연관된 Rep 단백질)는 해리되어, Rep 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드에 결합한다. 각각의 Rep 단백질은 각각의 가닥에서 질소 염기 및 포스포디에스테르 백본 둘 다와 상호작용한다. 질소 염기와의 상호작용은 서열 특이성을 제공하는 반면, 포스포디에스테르 백본과의 상호작용은 서열 특이적이지 않거나 약간 서열 특이적이며, 단백질-DNA 복합체를 안정화시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "말단 분할 부위" 및 "TRS"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, Rep가 5' 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하는 영역을 지칭하며, 세포 DNA 중합 효소, 예를 들어 DNA 폴 델타 또는 DNA 폴 엡실론을 통한 DNA 연장을 위한 기질의 역할을 하는 3' OH를 생산한다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 배위된 결찰 반응에 참여할 수 있다. 일부 구현예에서, TRS는 비-염기 쌍을 이루는 티미딘을 최소로 포괄한다. 일부 구현예에서, TRS의 닉킹 효율은 RBS로부터의 동일한 분자 내에서의 거리에 의해 적어도 부분적으로 제어될 수 있다. 수용체 기질이 상보성 ITR인 경우, 수득된 생산물은 분자내 듀플렉스이다. TRS 서열은 당해 기술에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2에서 확인된 헥사 뉴클레오타이드 서열인 5'-GGTTGA-3'(서열번호: 45)을 포함한다. 다른 공지된 AAV TRS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 TRS 서열, 예컨대 AGTT(서열번호: 46), GGTTGG(서열번호: 47), AGTTGG(서열번호: 48), AGTTGA(서열번호: 49), 및 다른 모티프 예컨대 RRTTRR(서열번호: 50)을 포함하는 임의의 공지된 TRS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA-플라스미드"는 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 플라스미드를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA-백미드"는 E. 콜리에서 플라스미드로서 전파될 수 있어서, 따라서 배큘로바이러스를 위한 셔틀 벡터로서 작동할 수 있는 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 배큘로바이러스 게놈을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA-배큘로바이러스"는 배큘로바이러스 게놈 내의 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 배큘로바이러스를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "ceDNA-배큘로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-배큘로바이러스에 감염된 무척추동물 숙주세포(곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포)를 비제한적으로 포함)를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폐쇄-종결된 DNA 벡터", "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"는 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(즉, 분자내 듀플렉스)를 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA는 2개의 공유적으로-폐쇄된 말단을 포함한다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, "리포터"는 해독가능한 판독을 제공하기 위해 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 리포터는 일반적으로 형광, 색상 또는 발광과 같은 측정가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 암호화 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 쉽게 관측되는 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 일으키고, 루시퍼라제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉매하게 하며, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 기질을 유색 생산물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩타이드는 β-락타마제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타제(AP), 티미딘 키나제(TK), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 다른 형광 단백질, 클로르암페니콜 아세틸전달효소(CAT), 루시퍼라제 및 기타 당 업계에 잘 알려진 것들을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "효과기 단백질"은 예를 들어 리포터 폴리펩타이드로서 또는 보다 적절하게는 세포를 사멸시키는 폴리펩타이드, 예를 들어 세포를 사멸시키는 폴리펩타이드, 예를 들어 독소, 또는 선택된 제제로 세포를 사멸에 민감해지거나 또는 그의 결핍으로 만드는 제제로서 검출가능한 판독을 제공하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 효과기 단백질은 숙주세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적화하거나 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 효과기 단백질은 (게놈 또는 염색체외 요소에 관계없이) 숙주세포 DNA 서열을 표적화하는 제한 엔도뉴클레아제, 세포 생존에 필요한 폴리펩타이드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이라제 억제제 및 리보뉴클레아제-타입 독소를 비제한적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 효과기 단백질의 발현은 다른 합성 생물학적 회로의 인자로서 참여하여 그에 의해 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.
전사 조절인자는 관심 유전자의 전사를 활성화 또는 억제하는 전사 활성제 및 억제제를 지칭한다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성제는 전형적으로 전사 프로모터에 결합하고 전사를 직접 개시하기 위해 RNA 중합효소를 동원한다. 억제제는 전사 프로모터에 결합하고, RNA 중합효소에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절인자는 이들이 결합하는 위치 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성제 또는 억제제로서 작용할 수 있다. 전사 조절인자 부류의 비-제한적인 예는 호메오도메인 단백질, 아연-핑거 단백질, 윙-헬릭스(포크헤드) 단백질 및 류신-지퍼 단백질을 비제한적으로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "억제인자 단백질" 또는 "유발제 단백질"은 조절 서열 요소에 결합하고 조절 서열 요소에 작동가능하게 연결된 서열의 전사를 각각 억제하거나 활성화시키는 단백질이다. 본 명세서에 기재된 바람직한 억제인자 및 유발제 단백질은 적어도 하나의 투입 제제 또는 환경 투입의 존재 또는 부재에 민감하다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은 예를 들어 분리가능한 DNA-결합 및 투입 제제-결합 또는 반응 인자 또는 도메인을 포함하는 모듈 형태이다.
본원에 사용된 바와 같이, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅물, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 잘 알려져있다. 보충의 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 어구 "약제학적으로-허용가능한"은 숙주에 투여될 때 독성, 알러지성 또는 유사한 유해한 반응을 일으키지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "투입 제제 반응성 도메인"은 연결된 DNA 결합 융합 도메인이 조건 또는 투입의 존재에 반응하도록 하는 방식으로 상태 또는 투입 제제에 결합하거나 달리 반응하는 전사 인자의 도메인이다. 일 구현예에서, 조건 또는 투입의 존재는 전사 인자의 전사-조절 활성을 변형시키는 투입 제제 반응성 도메인 또는 융합된 단백질에서 구조적 변화를 초래한다.
용어 "생체내"는 유기체, 예컨대 다세포 동물에서 또는 내에서 발생하는 분석 또는 과정을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 일부 양태에서, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때 방법 또는 용도가 "생체내"에서 발생한다고 말할 수 있다. 용어 "생체외"는 다세포 동물 또는 식물의 본체 외부에 온전한 막을 갖는 살아있는 세포, 예를 들어, 외식편, 일차 세포 및 세포주를 포함하는 배양 세포, 형질전환된 세포주, 및 추출된 조직 또는 혈구를 포함하는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 용도를 지칭한다. 용어 "시험관내"는 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 분석 및 방법을 지칭하고, 비-세포 시스템, 예컨대 세포 또는 세포 시스템, 예컨대 세포 추출물을 포함하지 않는 배지에서 프로그래밍가능한 합성 생물학적 회로의 도입을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 단백질 또는 RNA를 암호화하는 이종성 표적 유전자일 수 있는 핵산 서열의 전사를 유도함으로써 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직-특이적, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 개시 및 전사 속도가 제어되는 핵산 서열의 조절 영역이다. 프로모터는 또한 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 인자, 예컨대 RNA 중합효소 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 본 명세서에 기재된 양태의 일부 구현예에서, 프로모터는 프로모터 자체의 발현을 조절하는 전사 인자 또는 본 명세서에 기재된 합성 생물학적 회로의 다른 모듈 성분에 사용되는 다른 프로모터의 발현을 유도할 수 있다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위뿐만 아니라 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵 프로모터는 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 포함하지만, 항상 그런 것은 아니다. 유도성 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터를 사용하여 본원에 개시된 ceDNA 벡터에서 이식유전자의 발현을 유도할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "향상제"는 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질(예를 들어, 활성제 단백질 또는 전사 인자)에 결합하는 시스-작용 조절 서열(예를 들어, 50~1,500개의 염기 쌍)을 지칭한다. 향상제는 유전자 개시 부위의 업스트림 또는 이들이 조절하는 유전자 개시 부위의 다운스트림에서 최대 1,000,000개의 염기 파스에 배치될 수 있다. 향상제는 인트론 영역 또는 관련없는 유전자의 엑손 영역 내에 배치될 수 있다.
프로모터는 그것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다고 말할 수 있다. "작동가능하게 연결된", "작동가능하게 배치된", "작동가능하게 연결된", "제어 중" 및 "전사 제어 중"이라는 어구는 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하도록 조절하는, 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 배향에 있음을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "역전된 프로모터"는 핵산 서열이 역방향으로 있어, 암호화 가닥이 이제 비-암호화 가닥이 되고, 그 반대인 프로모터를 지칭한다. 역전된 프로모터 서열은 스위치의 상태를 조절하기 위해 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 또한, 다양한 구현예에서, 프로모터는 향상제와 함께 사용될 수 있다.
프로모터는 암호화 세그먼트의 업스트림에 위치한 5' 비-암호화 서열 및/또는 주어진 유전자 또는 서열의 엑손을 분리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관되는 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 향상제는 그 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 연관되는 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 암호화 핵산 세그먼트는 "재조합 프로모터" 또는 "이종성 프로모터"의 제어하에 배치되며, 둘 모두는 그의 천연 환경과 작동가능하게 연결된 암호화된 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종성 향상제는 그의 천연 환경에서 주어진 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 향상제를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 향상제는 다른 유전자의 프로모터 또는 향상제; 임의의 다른 원핵, 바이러스 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 향상제; 및 "자연 발생"하지 않는 합성 프로모터 또는 향상제, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당해 기술에 공지된 유전공학 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 프로모터 및 향상제의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본 명세서에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, PCR을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호 참조, 각각 본 명세서에 참고로 포함됨). 게다가, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 조절 서열도 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "유도성 프로모터"는 유발제 또는 유도제의 존재, 영향을 받거나 이에 의해 접촉될 때 전사 활성을 개시 또는 향상시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, "유발제" 또는 "유도제"는 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는데 활동적인 방식으로 투여되는 내인성, 또는 정상적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 유발제 또는 유도제, 즉 화학 물질, 화합물 또는 단백질 자체는 핵산 서열의 전사 또는 발현의 결과일 수 있어서(즉, 유발제가 다른 성분 또는 모듈에 의해 발현된 유발제 단백질일 수 있어서) 그 자체가 제어 또는 유도성 프로모터하에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 특정 제제, 예를 들어 억제인자의 부재하에 유도된다. 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린, 메탈로티오닌, 엑디손, 포유동물 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유선 종양 바이러스 긴 말단 반복(MMTV-LTR)) 및 다른 스테로이드-반응성 프로모터, 라파마이신 반응성 프로모터 등을 비제한적으로 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 예방적 치료를 포함하여 본 발명에 따른 ceDNA 벡터에 의한 치료가 제공되는 인간 또는 동물을 지칭한다. 일반적으로 동물은 비제한적으로 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥대상 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰구스 원숭이, 거미 원숭이 및 마카크, 예를 들어 레수스를 비제한적으로 포함한다. 설치류는 마우스, 랫트, 우드처크, 흰담비, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가정용 및 사냥대상 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예를 들어, 가정용 고양이, 갯과 종, 예를 들어, 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어, 닭, 에뮤, 타조, 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어를 비제한적으로 포함한다. 본 명세서에 기재된 양태의 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류 또는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상체는 영아 또는 아동일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 신생아 또는 태어나지 않은 대상체일 수 있으며, 예를 들어 대상체는 자궁 내에 있다. 바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예에 제한되지는 않는다. 인간 이외의 포유동물이 질환 및 장애의 동물 모델을 대표하는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 사육된 동물 및/또는 애완동물을 위해 사용될 수 있다. 인간 대상체는 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족 그룹, 예를 들어, 백인(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카인 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 임상 환경에서 환자 또는 다른 대상체일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 이미 치료 중이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는한, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 비제한적으로 포함하는 다양한 항체 구조를 포함한다. "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 동일한 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 면역글로불린 사슬 또는 항체 단편 및 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함한다. 항체 또는 이의 단편의 예는 Fv, scFv, Fab 단편, Fab', F(ab')2, Fab'-SH, 단일 도메인 항체(dAb), 중쇄, 경쇄, 중쇄 및 경쇄, 완전 항체(예를 들어, 각각의 Fc, Fab, 중쇄, 경쇄, 가변 영역 등을 포함), 이중특이적 항체, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 인트라바디, 단클론성 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 다량체 항체를 비제한적으로 포함한다. 항체 또는 이의 단편은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 비제한적으로 포함하는 임의의 부류 및 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 비제한적으로 포함하는 임의의 서브클래스일 수 있다. 또한, 항체는 임의의 포유동물, 예를 들어 영장류, 인간, 랫트, 마우스, 말, 염소 등으로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 변형된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체의 성분은 단백질 성분의 발현 후 항체가 자기-조립하도록 개별적으로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 인간에서 면역원성 반응을 감소시키기 위해 "인간화"된다. 일부 구현예에서, 항체는 질환 또는 질환의 증상을 치료할 목적으로 원하는 기능, 예를 들어 원하는 단백질의 상호작용 및 억제를 갖는다. 일 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 프레임워크 영역 또는 Fc 영역을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 항체 분자의 용어 "항원-결합 도메인"은 항원 결합에 참여하는 항체 분자, 예를 들어 면역글로불린(Ig) 분자의 일부를 지칭한다. 구현예에서, 항원 결합 부위는 중쇄(H) 및 경쇄(L)의 가변(V) 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 초가변 영역으로 지칭되는, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내에서 3개의 고도로 분기되는 스트레치는 "프레임워크 영역"(FR)으로 불리는 보다 보존된 측접 스트레치 사이에 배치된다. FR은 면역글로불린에서 초가변성 영역 사이에서 그리고 그에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열이다. 구현예에서, 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변성 영역 및 중쇄의 3개의 초가변성 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원-결합 표면을 형성하고, 이는 결합된 항원의 3차원 표면에 대해 상보성이다. 각각의 중쇄 및 경쇄의 3개의 초가변성 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 프레임워크 영역 및 CDR은 예를 들어 Kabat, E. A., et al.(1991) 면역학적 관심 단백질의 서열, 제5판, 미국 보건복지부, NIH 공개 번호 91-3242 및 Chothia, C. et al.(1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917에 정의 및 기재되어 있다. 각각의 가변성 사슬(예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄)은 전형적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 아미노산 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "전장 항체"는 예를 들어 자연적으로 발생하고 정상적인 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성된 면역글로불린(Ig) 분자(예를 들어, IgG 항체)를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 항체 단편"은 온전한(예를 들어, 전장) 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원에 결합하는 단편을 지칭한다. 용어 "항체 단편" 또는 "기능적 단편"은 또한 가변 영역으로 구성된 단리된 단편, 예를 들어 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv"단편 또는 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커("scFv 단백질")에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩타이드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 항원 결합 활성이 없는 항체의 일부, 예컨대 Fc 단편 또는 단일 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "면역글로불린 가변 도메인 서열"은 면역글로불린 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 서열은 자연 발생 가변 도메인의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열은 하나, 둘 또는 그 이상의 N- 또는 C-말단 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있거나, 단백질 구조의 형성에 적합한 다른 변경을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는 방법 또는 조성물에 필수적이지만 아직 불특정된 요소의 포함에 개방된 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)과 관련하여, 필수 여부에 관계없이사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "본질적으로 구성되는"은 주어진 구현예에 필요한 요소들을 지칭한다. 이 용어는 그 구현예의 기본 및 신규한 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다.
용어 "구성되는"은 구현예의 설명에서 인용되지 않은 임의의 요소를 배제한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성 요소를 지칭한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명확하게 명시되지 않는한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본 명세서에 기재되고/되거나 본 개시내용 등을 읽을 때 당해 분야의 숙련가에게 명백할 하나 이상의 방법 및/또는 단계의 단계를 포함한다. 유사하게, 용어 "또는"은 문맥상 달리 명확하게 나타내지 않는한 "및"을 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 기재되어 있다. 약어 "예를 들어"는 라틴어 예시적 Gratia로부터 유래되고, 비-제한적인 예를 나타내기 위해 본 명세서에 사용된다. 따라서 약어 "예를 들어"는 "예를 들면"과 동의어이다.
작동 예 이외에, 또는 달리 나타내는 경우에, 본원에 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 연관하여 사용될 때 용어 "약"은 평균 ±1%를 의미할 수 있다. 이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위가 이것에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정해진다.
II. ceDNA 벡터
공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 신규한 비-바이러스성, 캡시드-비함유 ceDNA 분자(ceDNA)가 본원에 제공된다. 이들 비-바이러스성 캡시드 비함유 ceDNA 분자는 2개의 상이한 역전된 말단 반복(ITR) 서열 사이에 배치된 이종성 유전자(이식유전자)를 함유하는 발현 작제물(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드, ceDNA-배큘로바이러스 또는 통합된 세포주)로부터 허용된 숙주세포에서 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR 중 하나는 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되고; ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위(trs) 및 Rep 결합 부위를 포함한다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 걸쳐 듀플렉스, 예를 들어 자가-상보적이다(예를 들어, ceDNA는 이중가닥 원형 분자가 아니다). ceDNA 벡터는 공유적으로 폐쇄된 말단을 가지며, 따라서, 예를 들어 37℃에서 1시간 동안 엑소뉴클레아제 소화(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 내성이 있다.
본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내의 제한 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물-생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 생존가능한 진핵적으로-생산된 대안을 나타낸다. 이는 조절 요소, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 이식유전자, 다중 이식유전자 등의 삽입을 허용한다.
일 양태에서, ceDNA 벡터는 5'에서 3' 방향으로: 제1 아데노-연관된 바이러스(AAV) 역전된 말단 반복(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본 명세서에 기재된 발현 카세트) 및 제1 ITR 및 제2 ITR이 서로에 대해 비대칭인, 즉 서로 상이한 제2 AAV ITR을 포함한다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR일 수 있고 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 모두 변형되었지만 상이한 서열이거나, 또는 상이한 변형을 갖거나, 동일한 변형된 ITR이 아니다. 달리 말하면, ITR은 한 ITR의 임의의 변화가 다른 ITR에 반영되지 않는다는 점에서 비대칭적이거나; 또는 대안적으로, ITR이 서로 상이하다. ceDNA 벡터에서 및 ceDNA-플라스미드를 생산하기 위해 사용하기 위한 예시적인 ITR은 "ITR"이라는 제목의 섹션에서 하기에 논의된다.
본원에 제공된 야생형 또는 돌연변이 또는 달리 변형된 ITR 서열은 ceDNA 벡터의 생산을 위한 발현 작제물(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ce-DNA 백미드, ceDNA-배큘로바이러스)에 포함된 DNA 서열을 나타낸다. 따라서, ceDNA-플라스미드 또는 다른 발현 작제물로부터 생산된 ceDNA 벡터에 실제로 함유된 ITR 서열은 생산 공정 동안 자연적으로 발생하는 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로서 본원에 제공된 ITR 서열과 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어 조절 서열, 핵산을 암호화하는 서열(예를 들어, miR 또는 안티센스 서열), 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 예컨대 이식유전자)를 암호화하는 서열일 수 있는 이식유전자를 갖는 발현 카세트를 포함하는 ceDNA 벡터가 본 명세서에 기재되어 있다. 일 구현예에서, 이식유전자는 이식유전자의 발현을 허용하거나 제어하는 하나 이상의 조절 서열(들)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 ITR 서열 및 제2 ITR 서열을 포함하고, 여기서 관심 뉴클레오타이드 서열은 제1 및 제2 ITR 서열에 의해 측접되고, 제1 및 제2 ITR 서열은 서로 비대칭이다.
이들 각각의 양태에서 일 구현예에서, 발현 카세트는 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터, 전사후 조절 인자, 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 중 하나 이상을 갖는 하기 순서로 구성된 2개의 ITR 사이에 위치된다. 일 구현예에서, 프로모터는 조절가능-유도성 또는 억제성이다. 프로모터는 이식유전자의 전사를 촉진하는 임의의 서열일 수 있다. 일 구현예에서 프로모터는 CAG 프로모터(예를 들어, 서열번호: 03) 또는 그의 변이체이다. 전사후 조절 인자는 이식유전자의 발현을 조절하는 서열, 비-제한적인 예로서 이식유전자의 발현을 향상시키는 3차 구조를 생산하는 임의의 서열이다.
일 구현예에서, 전사후 조절 인자는 WPRE(예를 들어, 서열번호: 08)를 포함한다. 일 구현예에서, 폴리아데닐화 및 종결 신호는 BGH폴리A(예를 들어, 서열번호: 09)를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 시스-조절 인자, 또는 이들의 조합, 예를 들어 SV40 후기 폴리A 신호 업스트림 향상제 서열(USE) 또는 단순 포진 바이러스 또는 B형 간염 바이러스(HBV)의 티미딘 키나제 유전자를 비제한적으로 포함하는 다른 전사후 처리 요소가 추가로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 5'에서 3'방향으로의 발현 카세트 길이는 AAV 비리온에 캡시드화되는 것으로 알려진 최대 길이보다 크다. 일 구현예에서, 길이는 4.6 kb 이상, 5 kb 이상, 6 kb 이상, 또는 7 kb 이상이다. 다양한 발현 카세트가 본원에 예시된다.
발현 카세트는 4000개 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000개 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드, 또는 약 4000~10,000개 뉴클레오타이드 또는 10,000~50,000개 뉴클레오타이드, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드의 임의의 범위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 50,000개 뉴클레오타이드 길이 범위의 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 75,000개 뉴클레오타이드 길이 범위의 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 10,000개 뉴클레오타이드 길이 범위인 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 1000 내지 10,000개 뉴클레오타이드 길이 범위인 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 5,000개 뉴클레오타이드 길이 범위인 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한을 갖지 않으므로, 이식유전자의 효율적인 발현을 제공하기 위해 대형 발현 카세트의 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 원핵 생물-특이적 메틸화가 결여되어 있다.
발현 카세트는 또한 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 인자는 프로모터, 리보스위치, 절연체, 미르-조절가능 요소, 전사후 조절 인자, 조직- 및 세포 유형-특이적 프로모터 및 향상제를 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 이식유전자의 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가 성분, 예를 들어 조절 스위치를 포함하고, 이는 이식유전자의 발현을 제어 및 조절하기 위한 "조절 스위치" 섹션에 본원에 기재되어 있고, 요망하는 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포사를 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.
도 1a~1c는 비-제한적, 예시적인 ceDNA 벡터 또는 상응하는 ceDNA 플라스미드 서열의 개략도를 나타낸다. ceDNA 벡터는 캡시드가 비함유되어 있고, 하기 순서로 플라스미드 암호화으로부터 수득될 수 있다: 제1 ITR, 발현성 이식유전자 카세트 및 제2 ITR, 여기서, 제1 및/또는 제2 ITR 서열 중 적어도 하나는 상응하는 야생형 AAV2 ITR 서열에 대해 돌연변이된다. 발현성 이식유전자 카세트는 바람직하게는 향상제/프로모터, ORF 리포터(이식유전자), 전사후 조절 인자(예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH 폴리A) 중 하나 이상을 포함한다.
발현 카세트는 임의의 관심 이식유전자를 포함할 수 있다. 관심의 이식유전자는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 비-암호화 핵산(예를 들어, RNAi, miR 등), 바람직하게는 치료적(예를 들어, 의료, 진단 또는 수의적 용도) 또는 면역원성(예를 들어, 백신용) 폴리펩타이드를 비제한적으로 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트의 이식유전자는 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAis, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 치료 유전자 또는 마커 단백질이다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 효능제 또는 길항제이다. 일부 구현예에서, 길항제는 모방체 또는 항체, 또는 항체 단편 또는 그의 항원-결합 단편, 예를 들어 중화 항체 또는 항체 단편 등이다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 항체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다.
특히, 이식유전자는 예를 들어 단백질(들), 폴리펩타이드(들), 펩타이드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편 뿐만 아니라 질환, 기능 이상, 손상 및/또는 장애 중 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 이의 변이체 및/또는 그의 활성 단편을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 치료제(들)를 암호화할 수 있다. 예시적인 이식유전자는 본원에서 "치료 방법" 섹션에 기재되어 있다.
플라스미드-기반 발현 벡터와 상이한 ceDNA 벡터의 많은 구조적 특징이 존재한다. ceDNA 벡터는 하기 특징들 중 하나 이상을 가질 수 있다: 최초(즉, 삽입되지 않은) 박테리아 DNA의 부족, 원핵 복제 기원의 부족, 자가-함유, 즉 이들은 Rep 결합 및 말단 분할 부위(RBS 및 TRS)를 포함하는 2개의 ITR 이외의 임의의 서열, 및 ITR 사이의 외인성 서열을 요구하지 않음, 진핵 기원(즉, 진핵 세포에서 생산됨)의, 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재, 및 박테리아-유형 DNA 메틸화의 부재 또는 실제로 포유동물 숙주에 의해 비정상적인 것으로 간주되는 임의의 다른 메틸화. 일반적으로, 본 벡터는 임의의 원핵 DNA를 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 일부 원핵 DNA는 프로모터 또는 향상제 영역에서 비-제한적인 예로서 외인성 서열로서 삽입될 수 있는 것으로 고려된다. 플라스미드 발현 벡터로부터 ceDNA 벡터를 구별하는 또 다른 중요한 특징은 ceDNA 벡터가 폐쇄 말단을 갖는 단일-가닥 선형 DNA인 반면, 플라스미드는 항상 이중-가닥 DNA라는 것이다.
본원에 제공된 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 바람직하게는 제한 효소 소화 검정에 의해 결정된 바와 같이 비-연속적 구조보다는 선형 및 연속적 구조를 갖는다(도 4d). 선형 및 연속적 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터보다 안정할뿐만 아니라 재조합될 가능성이 적고 돌연변이유발을 야기하는 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속적 구조에서 ceDNA 벡터가 바람직한 구현예이다. 연속적인 선형의 단일 가닥 분자내 듀플렉스 ceDNA 벡터는 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 서열없이 공유결합된 말단을 가질 수 있다. 이들 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 듀플렉스 핵산 분자인, 플라스미드(본 명세서에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 상보적인 플라스미드 가닥은 변성 후에 분리되어 2개의 핵산 분자를 생산할 수 있는 반면, 대조적으로, 상보적인 가닥을 가지면서 ceDNA 벡터는 단일 DNA 분자이고 따라서 변성되더라도 단일 분자로 유지된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 플라스미드와 달리 원핵 유형의 DNA 염기 메틸화없이 생산될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터 및 ceDNA-플라스미드는 구조(특히 선형 대 원형) 및 이들 상이한 목표물을 생산 및 정제하는데 사용된 방법(아래 참조)의 관점 및, 또한 ceDNA-플라스미드에 대한 원핵 유형 및 ceDNA 벡터에 대한 진핵 유형의 DNA 메틸화의 관점에서 상이하다.
플라스미드-기반 발현 벡터에 비해 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터의 몇개의 이점은: 1) 플라스미드가 박테리아 DNA 서열을 함유하고 원핵-특이적 메틸화, 예를 들어 6-메틸 아데노신 및 5-메틸 시토신 메틸화를 거치는 반면, 캡시드-비함유 AAV 벡터 서열은 진핵 기원이고 원핵-특이적 메틸화를 거치지 않아; 결과적으로, 캡시드-비함유 AAV 벡터는 플라스미드에 비해 염증 및 면역 반응을 유발할 가능성이 적은 점; 2) 플라스미드는 생산 공정 동안 저항 유전자의 존재를 요구하지만, ceDNA 벡터는 그렇지 않은 점; 3) 원형 플라스미드가 세포 내로 도입될 때 핵으로 전달되지 않고 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 우회하기 위해 과부하가 필요하지만, ceDNA 벡터는 바이러스성 시스-요소, 즉 ITR을 함유하며, 이는 뉴클레아제에 대한 내성을 부여하고 표적화되어 핵으로 전달되도록 설계될 수 있다는 점이다. ITR 기능에 필수적인 최소 정의 요소는 Rep-결합 부위(RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호: 531)) 및 말단 분할 부위(TRS; AAV2의 경우 5'-AGTTGG-3'(서열번호: 48)) 플러스 헤어핀 형성을 허용하는 가변성 회문성 서열로 가정한다; 및 4) ceDNA 벡터는 T 세포-매개 면역 반응을 유발하는 톨(Toll)-유사 수용체 계열의 구성원에 결합하는 것으로 보고된 원핵생물-유래된 플라스미드에서 종종 발견되는 CpG 디뉴클레오타이드의 과-발현을 갖지 않는다는 점이다. 대조적으로, 본 명세서에 개시된 캡시드-비함유 AAV 벡터에 의한 형질도입은 다양한 전달 시약을 사용하여 종래의 AAV 비리온으로 형질도입하기 어려운 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.
III. ITR
본 명세서에 개시된 바와 같이, ceDNA 벡터는 서로에 대해 상이한(즉, 비대칭 ITR인) 2개의 역전된 말단 반복(ITR) 서열 사이에 배치된 이종성 유전자를 함유한다. 일부 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되고; ITR 중 적어도 하나는 기능성 Rep 결합 부위(RBS; 예를 들어, AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열번호: 531) 및 기능적 말단 분할 부위(TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3', 서열번호: 46)를 포함한다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 비-기능성 ITR이다. 일 구현예에서, 상이한 ITR은 상이한 혈청형으로부터의 각각의 야생형 ITR이 아니다.
본원의 명세서 및 실시예에서 예시된 ITR은 AAV2 ITR이지만, 당해 분야의 숙련가는 상기 언급된 바와 같이 임의의 공지된 파보바이러스, 예를 들어 데펜도바이러스로부터의 ITR, 예컨대 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ, 및 AAV-DJ8 게놈. 예를 들어, NCBI: NC　002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), 키메라 ITR, 또는 임의의 합성 AAV로부터의 ITR을 사용할 수 있음을 인식하고 있다. 일부 구현예에서, AAV는 온혈 동물, 예를 들어 조류(AAAV), 소(BAAV), 갯과, 말 및 양 아데노-연관된 바이러스를 감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 B19 파보비리스(GenBank 수탁 번호: NC 000883), 마우스로부터의 미세 바이러스(MVM)(GenBank 수탁 번호 NC 001510); 거위 파보바이러스(GenBank 수탁 번호 NC 001701); 뱀 파보바이러스 1(GenBank 수탁 번호 NC 006148)로부터 유래된다.
일부 구현예에서, ITR 서열은 2개의 아과를 포함하는 파보비리다에 계열의 바이러스로부터 유래될 수 있다: 척추동물을 감염시키는 파보비리나에(Parvovirinae) 및 곤충을 감염시키는 덴소비리나에(Densovirinae). 파보비리나에 서브패밀리(파보바이러스라고 칭함)에는 데펜도바이러스 속이 포함되어 있으며, 대부분의 조건에서 이의 구성원은 생산적인 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스에 의한 동시 감염이 필요하다. 데펜도바이러스 속에는 일반적으로 사람(예를 들어, 혈청형 2, 3A, 3B, 5 및 6) 또는 영장류(예를 들어, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 아데노-연관된 바이러스(AAV) 및 다른 온혈 동물(예를 들어, 소과, 갯과, 말 및 양 아데노-연관된 바이러스)을 감염시키는 관련된 바이러스가 포함된다. 파보바이러스 및 파보비리다에 계열의 다른 구성원은 일반적으로 Kenneth I. Berns, "파보비리다에: 바이러스 및 그들의 복제", FIELDS VIROLOGY(3d Ed. 1996)의 Chapter 69에 기재되어 있다.
당업자는 ITR 서열이 이중-가닥 홀리데이 접합부의 공통 구조를 가지며, 이는 전형적으로 T-형상화된 또는 Y-형상화된 헤어핀 구조이고(예를 들어, 도 2a 및 도 3a 참조), 인 것을 알고 있다. 여기서 각각의 ITR은 더 큰 회문성 아암(A-A')에 포매된 2개의 회문성 아암 또는 루프(B-B' 및 C-C')와 단일가닥 D 서열에 의해 형성되고, (이러한 회문성 서열의 순서는 ITR의 플립 또는 플롭 배향을 정의함), 본원에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열에 기초하여 ceDNA 벡터 또는 ceDNA-플라스미드에 사용하기 위한 임의의 AAV 혈청형으로부터 상응하는 변형된 ITR 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14]에 기재된 상이한 AAV 혈청형(AAV1-AAV6)으로부터의 ITR의 구조 분석 및 서열 비교를 참고한다.
ITR에서의 특이적 변형 및 돌연변이는 본원에 상세하게 기술되어 있지만, ITR과 관련하여, "변경된" 또는 "돌연변이된"은 뉴클레오타이드가 야생형, 참조, 또는 원래의 ITR 서열에 대해 삽입, 결실 및/또는 치환된 것을 나타내고, 2개의 측접하는 ITR을 갖는 ceDNA 벡터에서 다른 측접하는 ITR에 비해 변경될 수 있다. 변경 또는 돌연변이된 ITR은 조작된 ITR일 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "조작된"은 인간의 손에 의해 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 하나 이상의 양태, 예를 들어 이의 서열이 인간의 손으로 조작되어, 자연에 존재하는 양태와 상이한 경우 폴리펩타이드는 "조작된" 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, ITR은 합성일 수 있다. 일 구현예에서, 합성 ITR은 하나 초과의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 서열에 기초한다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV-기반 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV-소싱 서열의 일부만을 가지거나 아예 갖지 않지만 상기 기재된 ITR 구조를 보존한다. 일부 양태에서, 합성 ITR은 야생형 Rep 또는 특정 혈청형의 Rep와 우선적으로 상호작용할 수 있거나, 일부 경우 야생형 Rep에 의해 인식되지 않고 돌연변이된 Rep에 의해서만 인식될 것이다.
ITR 서열은 이중-가닥 홀리데이 접합부의 공통 구조를 가지며, 이는 전형적으로 T-형상화된 또는 Y-형상화된 헤어핀 구조(예를 들어,도 2a 및 도 3a 참조)이며, 여기서 각각의 ITR은 더 큰 회문성 아암(A-A')에 내장된 두개의 회문성 아암 또는 루프(B-B' 및 C-C'), 및 단일가닥 D 서열(이러한 회문성 서열의 순서는 ITR의 '플립' 또는 '플롭' 배향을 정의함)에 의해 형성된다. 당해 분야의 숙련가는 본원에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열에 기초하여 ceDNA 벡터 또는 ceDNA-플라스미드에 사용하기 위한 임의의 AAV 혈청형으로부터 ITR 서열 또는 변형된 ITR 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439에 기재된 상이한 AAV 혈청형(AAV1-AAV6, 및 조류 AAV(AAAV) 및 소과 AAV(BAAV))으로부터의 ITR의 서열 비교를 참고하며; AAV-3(86%), AAV-4(79%), AAV-5(58%)와 같은 AAV2의 좌측 ITR과 다른 혈청형으로부터의 좌측 ITR의 % 동일성을 보여준다: AAV-1(84%), AAV-3(86%), AAV-4(79%), AAV-5(58%), AAV-6(좌측 ITR)(100%) 및 AAV-6(우측 ITR)(82%).
따라서, AAV2 ITR은 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터에서 예시적인 ITR로서 사용되지만, 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터는 예를 들어 AAV 혈청형 1(AAV1), AAV 혈청형 2(AAV2), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11), 또는 AAV 혈청형 12(AAV12)을 포함하는 임의의 공지된 AAV 혈청형의 ITR에 의해 제조되거나, 이에 기초할 수 있다. 숙련가는 공지된 수단에 의해 다른 혈청형에서 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 변경이 A, A', B, B', C, C' 또는 D 영역에 있는지 결정하고, 또 다른 혈청형에서 상응하는 영역을 결정한다. BLAST®(기본 국소 정렬 검색 툴, Basic Local Alignment Search Tool) 또는 다른 상동성 정렬 프로그램을 디폴트 상태로 사용하여 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 본 발명은 추가로 상이한 AAV 혈청형의 조합으로부터의 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 모집단 및 복수를 제공하는데, 즉 하나의 ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고 다른 ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 일 구현예에서 하나의 ITR은 AAV2 ITR 서열로부터 유래하거나 이를 기초로 할 수 있고, ceDNA 벡터의 다른 ITR은 AAV 혈청형 1(AAV1), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11), 또는 AAV 혈청형 12(AAV12) 중 임의의 하나 이상의 ITR 서열로부터 유래되거나, 이를 기초로 할 수 있다.
임의의 파보바이러스 ITR은 변형을 위한 ITR 또는 기본 ITR로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파보바이러스는 데펜도바이러스이다. 더 바람직하게는 AAV이다. 선택된 혈청형은 혈청형의 조직 굴성에 기초할 수 있다. AAV2는 광범위한 조직 굴성을 가지며, AAV1은 우선적으로 뉴런 및 골격근을 표적으로 하고, AAV5는 뉴런, 망막 색소 상피 및 광수용체를 우선적으로 표적으로 한다. AAV6은 우선적으로 골격근 및 폐를 표적으로 한다. AAV8은 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 우선적으로 표적으로 한다. AAV9는 간, 골격 및 폐 조직을 우선적으로 표적으로 한다. 일 구현예에서, 변형된 ITR은 AAV2 ITR에 기초한다. 예를 들어, 서열번호: 2 및 서열번호: 52로 구성된 그룹에서 선택된다. 이들 양태 각각의 일 구현예에서, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및 서열번호: 2 및 서열번호: 51로 구성된 군으로부터 선택되는 한 쌍의 ITR을 포함한다. 이들 양태 각각의 일 구현예에서, 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드 또는 비-바이러스성 캡시드-비함유 DNA 벡터는 서열번호: 101 및 서열번호: 102; 서열번호: 103, 및 서열번호: 104, 서열번호: 105, 및 서열번호: 106; 서열번호: 107, 및 서열번호: 108; 서열번호: 109, 및 서열번호: 110; 서열번호: 111, 및 서열번호: 112; 서열번호: 113 및 서열번호: 114; 및 서열번호: 115 및 서열번호: 116으로 구성된 군으로부터 선택되는 한 쌍의 상이한 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 서열번호: 2, 52, 63, 64, 101~499 또는 545~547의 ITR 또는 부분 ITR 서열 중 임의의 하나로부터 선택된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원의 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A 및 10B 중 임의의 하나 이상에 나타낸 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열, 또는 도 26a 또는 26b에 도시된 서열의 임의의 변형에 상응하는 ITR에서의 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA는 분자내 듀플렉스 이차 구조를 형성할 수 있다. 제1 ITR 및 비대칭 제2 ITR의 이차 구조는 야생형 ITR(예를 들어, 도 2a, 3a, 3c 참고) 및 변형된 ITR 구조(예를 들어,도 2b 및 도 3b, 3d 참고)의 맥락에서 예시된다. 이차 구조는 ceDNA 벡터를 생산하는데 사용된 플라스미드의 ITR 서열에 기초하여 추론되거나 예상된다. 스템-루프 구조의 일부가 결실된, 변형된 ITR의 예시적인 이차 구조가 도 9a~25b 및 도 26a~26b에 도시되어 있으며, 또한 표 10A 및 10B에 도시되어 있다. 단일 스템 및 2개의 루프를 포함하는 변형된 ITR의 예시적인 이차 구조가 도 9a~13b에 도시되어 있다. 단일 스템 및 단일 루프를 갖는 변형된 ITR의 예시적인 이차 구조가 도 14에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 이차 구조는 폴딩 자유 에너지 변화에 의해 정량화된 구조의 안정성을 예상하는 최근접한 이웃 규칙에 기초한 열역학적 방법을 사용하여 본 명세서에 나타낸 바와 같이 추론될 수 있다. 예를 들어, 최저 자유 에너지 구조를 찾아서 구조를 예상할 수 있다. 일부 구현예에서, 문헌 [Reuter, J. S., & Mathews, D. H. (2010) RNAstructure: RNA 이차 구조 예상 및 분석을 위한 소프트웨어에 개시된 알고리즘. BMC 생물정보학. 11,129]에 개시되고, RNAstructure 소프트웨어(세계 웹 주소: "rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html"에서 이용가능)에서 시행되어 ITR 구조의 예상에 사용될 수 있다. 알고리즘은 또한 임의의 온도에서 형태 안정성을 예상할 수 있도록 37℃에서 자유 에너지 변화 파라미터 및 실험 문헌으로부터 유도된 엔탈피 변화 파라미터를 모두 포함할 수 있다. RNA 구조 소프트웨어를 사용하여, 변형된 ITR 구조의 일부는 도 3a~3d에 도시된 생리적 조건 하에서 전개되는 깁스 자유 에너지(ΔG)가 추정되는 변형된 T-형상화된 스템-루프 구조로서 예상될 수 있다. RNAstructure 소프트웨어를 사용하여, 3가지 유형의 변형된 ITR은 AAV2의 야생형 ITR(-92.9 kcal/mol)보다 더 높은 깁스 자유 전개 에너지를 가질 것으로 예상되며 하기와 같다: (a) 본원에 제공된 단일-아암/단일-비쌍-루프 구조를 갖는 변형된 ITR은 -85 내지 -70 kcal/mol 범위의 깁스 자유 전개 에너지를 갖는 것으로 예상된다. (b) 본원에 제공된 단일-헤어핀 구조를 갖는 변형된 ITR은 -70 내지 -40 kcal/mol 범위의 깁스 자유 전개 에너지를 갖는 것으로 예상된다. (c) 본원에 제공된 2-아암 구조를 갖는 변형된 ITR은 -90 내지 -70 kcal/mol 범위의 깁스 자유 전개 에너지를 갖는 것으로 예상된다. 이론에 의해 제한되지 않고, 더 높은 깁스 자유 에너지를 갖는 구조는 Rep 68 또는 Rep 78 복제 단백질에 의한 복제를 위해 보다 쉽게 전개된다. 따라서, 더 높은 깁스 자유 전개 에너지를 갖는 변형된 ITR, 예를 들어, 단일-아암/단일-비쌍-루프 구조, 단일-헤어핀 구조, 절단된 구조는 야생형 ITR보다 더 효율적으로 복제되는 경향이 있다.
일 구현예에서, ceDNA 벡터의 좌측 ITR은 야생형(wt) AAV ITR 구조에 대해 변형되거나 돌연변이되며, 우측 ITR은 야생형 AAV ITR이다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터의 우측 ITR은 야생형 AAV ITR 구조에 대해 변형되고, 좌측 ITR은 야생형 AAV ITR이다. 이러한 구현예에서, ITR의 변형(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 AAV 게놈으로부터 유래된 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 생산될 수 있다.
본원에 사용된 ITR은 분해가능하고 분해가능하지 않을 수 있으며, ceDNA 벡터에서 사용하기 위해 선택되는 것은 AAV 서열이며, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9가 바람직하다. 분해가능한 AAV ITR은 말단 반복이 원하는 기능, 예를 들어, 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구출 등을 매개하는한 야생형 ITR 서열을 필요로 하지 않는다(예를 들어, 내인성 또는 야생형 AAV ITR 서열은 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있다). 전형적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래되며, 예를 들어 ceDNA 벡터의 ITR 서열 둘다는 AAV2로부터 유래된다. ITR은 Samulski 등의 미국 특허 번호 제5,478,745호에 기재된 "이중-D 서열"과 같은 AAV 역전된 말단 반복으로서 기능하는 합성 서열일 수 있다. 필요하지는 않지만, ITR은 동일한 파보바이러스로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 두 ITR 서열 모두 AAV2로부터 유래된다.
일 구현예에서, ceDNA는 본 명세서에 개시된 야생형 ITR 중 하나에 대해 돌연변이된 ITR 구조를 포함할 수 있지만, 돌연변이체 또는 변형된 ITR은 여전히 동작가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE') 및 말단 분할 부위(trs)를 보유한다. 일 구현예에서, 돌연변이체 ceDNA ITR은 기능성 복제 단백질 부위(RPS-1)를 포함하고, RPS-1 부위에 결합하는 복제 가능 단백질이 생산에 사용된다.
일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 Rep 결합 및/또는 Rep 닉킹에 대한 결함있는 ITR이다. 일 구현예에서, 결함은 야생형 감소 ITR에 비해 적어도 30%이고, 다른 구현예에서는 적어도 35%..., 50%..., 65%..., 75%..., 85%..., 90%..., 95%..., 98%..., 또는 기능 또는 그 사이의 지점이 완전히 부족하다. 숙주세포는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않으며, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형에는 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있다. 일 구현예에서, AAV 캡시드 유전자가 결여되어 있는 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형 및 숙주세포 및 수득한 단백질은 다른 바이러스의 캡시드 유전자를 암호화하거나 발현하지 않는다. 또한, 특정 구현예에서, 핵산 분자는 또한 AAV Rep 단백질 암호화 서열이 결여되어 있다.
일부 구현예에서, ITR의 구조 요소는 큰 Rep 단백질(예를 들어, Rep 78 또는 Rep 68)과 ITR의 기능적 상호작용에 관여하는 임의의 구조 요소일 수 있다. 특정 구현예에서, 구조 요소는 큰 Rep 단백질과 ITR의 상호작용에 대한 선택성을 제공하고, 즉, Rep 단백질이 ITR과 기능적으로 상호작용하는 것을 적어도 부분적으로 결정한다. 다른 구현예에서, Rep 단백질이 ITR에 결합될 때 구조 요소는 큰 Rep 단백질과 물리적으로 상호작용한다. 각각의 구조 요소는, 예를 들어 ITR의 이차 구조, ITR의 뉴클레오타이드 서열, 2개 이상의 요소 사이의 간격, 또는 이들 중 임의의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 구조 요소는 A 및 A' 아암, B 및 B' 아암, C 및 C' 아암, D 아암, Rep 결합 부위(RBE) 및 RBE'(즉, 유능한 RBE 서열) 및 말단 분할 부위(trs)로 구성된 군으로부터 선택된다.
보다 구체적으로, 구조 요소가 특정한 큰 Rep 단백질과 기능적으로 상호작용하는 능력은 구조 요소를 변형시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열은 ITR의 야생형 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 일 구현예에서, ITR의 구조 요소(예를 들어, A 아암, A' 아암, B 아암, B' 아암, C 아암, C' 아암, D 아암, RBE, RBE' 및 trs)가 제거되고, 상이한 파보바이러스로부터의 야생형 구조 요소로 대체될 수 있다. 예를 들어, 대체 구조는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파보바이러스(예를 들어, 로얄 파이톤 파보바이러스), 소과 파보바이러스, 염소 파보바이러스, 조류 파보바이러스, 갯과 파보바이러스, 말 파보바이러스, 새우 파보바이러스, 돼지 파보바이러스 또는 곤충 AAV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, ITR은 AAV2 ITR일 수 있으며, A 또는 A' 아암 또는 RBE는 AAV5의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, ITR은 AAV5 ITR일 수 있고, C 또는 C' 아암, RBE 및 trs는 AAV2의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, AAV ITR은 B 및 B' 아암이 AAV2 ITR B 및 B' 아암으로 대체된 AAV5 ITR일 수 있다.
단지 예로서, 표 1은 변형된 ITR 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 예시적인 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타내고, 여기서 X는 해당 야생형 ITR에 대한 해당 섹션에서 적어도 하나의 핵산의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타낸다. 일부 구현예에서, C 및/또는 C' 및/또는 B 및/또는 B'의 임의의 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에서 3개의 순차적인 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 예를 들어, 변형 결과 단일 아암 ITR(예를 들어, 단일 C-C' 아암 또는 단일 B-B' 아암), 또는 변형된 C-B' 아암 또는 C'-B 아암 중 하나가 발생하는 경우, 또는 적어도 하나의 절단된 아암(예를 들어, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암), 적어도 하나의 단일 아암, 또는 2개의 아암 ITR의 아암 중 적어도 하나를 갖는 2개의 아암 ITR(하나의 아암이 절단될 수 있는 경우)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적인 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 일부 구현예에서, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암은 말단 루프에 3개의 순차적인 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 갖는다.
Figure pct00001
일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 1에 나타낸 변형, 및 또한 A'와 C 사이, C와 C' 사이, C'와 B 사이, B와 B' 사이 및 B'와 A 사이로부터 선택된 임의의 하나 이상의 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C 또는 C' 또는 B 또는 B' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 여전히 스템-루프의 말단 루프를 유지한다. 일부 구현예에서, C 및 C' 및/또는 B 및 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적인 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 대안적인 구현예에서, C 및 C' 및/또는 B 및 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적인 A 뉴클레오타이드(즉, AAA)를 보유한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 1에 나타낸 변형, 및 또한 A', A 및/또는 D로부터 선택된 영역 중 임의의 하나 이상에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 1에 나타낸 변형, 및 또한 A 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 1에 나타낸 변형 및 A' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 1에 나타낸 변형, 및 A 및/또는 A' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 1에 나타낸 변형 및 D 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 뉴클레오타이드 또는 그 안의 임의의 범위를 변형시킴으로써) 변형되어, 변형된 구조 요소를 생산할 수 있다. 일 구현예에서, ITR에 대한 특이적 변형이 본원에서 예시된다(예를 들어, 서열번호: 2, 52, 63, 64, 101~499, 또는 545~547). 일부 구현예에서, ITR은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 뉴클레오타이드 또는 그 안의 임의의 범위를 변형시킴으로써) 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, ITR은 서열번호: 469~499 또는 545~547의 변형된 ITR 중 하나, 또는 서열번호: 101~134 또는 545~547의 A-A' 아암의 RBE-함유 섹션 및 C-C' 및 B-B' 아암과의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과 서열 동일성을 가질 수 있다..
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 예를 들어 모든 특정 아암, 예를 들어 A-A' 아암의 전부 또는 일부, 또는 B-B' 아암의 전부 또는 일부, C-C' 아암의 전부 또는 일부의 제거 또는 결실, 또는 대안적으로, 루프의 스템을 형성하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있으며, 최종 루프 캡핑하는 만큼 스템 캡핑(예를 들어, 단일 아암)이 여전히 존재한다(예를 들어, ITR-6 참고). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기 쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거 및 B-B' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 예를 들어, C-C' 아암에서 6개의 염기 쌍이 제거되고 B-B' 아암에서 2개의 염기 쌍이 제거될 수 있다. 예시로서, 도 13a~13b는 각각의 C 부분 및 C' 부분으로부터 결실된 적어도 7개의 염기쌍, C 및 C' 영역 사이의 루프에서 뉴클레오타이드의 치환, 및 적어도 하나의 아암(예를 들어, C-C')이 절단되는 경우, 변형된 ITR이 2개의 아암을 포함하도록 각각의 B 영역 및 B' 영역으로부터의 적어도 하나의 염기쌍 결실에 의한 예시적인 변형된 ITR을 나타낸다. 이 실시예에서, 변형된 ITR은 각각의 B 영역 및 B' 영역으로부터 적어도 하나의 염기쌍 결실을 포함하므로, 아암 B-B'도 WT ITR에 대해 절단된다.
일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 상보성 염기쌍이 C-C' 아암의 C 부분 및 C' 부분 각각으로부터 제거되어, C-C' 아암이 절단된다. 즉, C-C' 아암의 C 부분에서 염기가 제거되면, C' 부분의 상보성 염기쌍이 제거되어 그에 의해 C-C' 아암이 절단된다. 이러한 구현예에서, 2, 4, 6, 8개 이상의 염기쌍이 C-C' 아암으로부터 제거되어 C-C' 아암이 절단된다. 대안적인 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 C-C' 아암의 C 부분으로부터 제거되어, 아암의 C' 부분 만이 남게 된다. 대안적인 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 C-C' 아암의 C' 부분으로부터 제거되어, 아암의 C 부분 만이 남게 된다.
일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 상보성 염기쌍이 B-B' 아암의 B 부분 및 B' 부분 각각으로부터 제거되어, B-B' 아암이 절단된다. 즉, B-B' 아암의 B 부분에서 염기가 제거되면, B' 부분의 상보성 염기쌍이 제거되어, B-B' 아암이 절단된다. 이러한 구현예에서, 2, 4, 6, 8개 이상의 염기쌍이 B-B' 아암으로부터 제거되어, B-B' 아암이 절단된다. 대안적인 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 B-B' 아암의 B 부분으로부터 제거되어 아암의 B' 부분 만이 남게 된다. 대안적인 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 B-B' 아암의 B' 부분으로부터 제거되어, 아암의 B 부분 만이 남게 된다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 대한 1 내지 50개(예를 들어, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50) 뉴클레오타이드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 WT ITR 서열에 대해 1 내지 30개의 뉴클레오타이드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 비해 2 내지 20개의 뉴클레오타이드 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 2개의 대향하는, 길이 비대칭 스템-루프를 형성하고, 예를 들어 C-C'루프는 B-B'루프와 상이한 길이이다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR의 대향하는 길이 비대칭 스템-루프 중 하나는 길이가 8 내지 10개의 염기쌍 범위의 C-C' 및/또는 B-B' 스템 부분 및 2 내지 5개의 비쌍 데옥시리보뉴클레오타이드를 갖는 루프부(예를 들어, C-C' 또는 B-B')을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR의 하나의 길이 비대칭 스템-루프는 8 미만 또는 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1개 미만의 염기쌍 길이의 C-C' 및/또는 B-B' 스템 부분 및 0 내지 5개의 뉴클레오타이드를 갖는 루프부(예를 들어, C-C' 또는 B-B' 사이)를 갖는다. 일부 구현예에서, 길이 비대칭 스템-루프를 갖는 변형된 ITR은 길이가 3개의 염기쌍 미만의 C-C' 및/또는 B-B' 스템 부분을 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 A 또는 A' 영역의 RBE-함유 부분에서 임의의 뉴클레오타이드 결실을 함유하지 않아서, DNA 복제를 방해하지 않는다(예를 들어, Rep 단백질에 의한 RBE에의 결합 또는 말단 분할 부위에서의 닉킹(nicking)). 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위해 포괄된 변형된 ITR은 본 명세서에 기재된 바와 같이 B, B', C 및/또는 C 영역에서 하나 이상의 결실을 갖는다. 변형된 ITRS의 몇몇 비-제한적인 예가 도 9a~26b에 도시되어 있다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암의 결실을 포함할 수 있으므로, C-C' 아암은 예를 들어 도 9a~9b에 도시된 예시적인 ITR-2(좌측) 및 ITR-2(우측) 및 ITR-4(좌측) 및 ITR-4(우측)(도 11a~11b)를 유지한다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암의 결실을 포함하여, B-B' 아암이 유지되도록 할 수 있으며, 예를 들어, 도 10a~10b에 도시된 예시적인 ITR-3(좌측) 및 ITR-3(우측)을 참고한다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암 및 C-C' 아암의 결실을 포함하여 단일 스템-루프가 유지될 수 있으며, 예를 들어 도 14a~14b에 도시된 예시적인 ITR-6(좌측) 및 ITR-6(우측 참조) 및 ITR-21 및 ITR-37을 참고한다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C' 영역의 결실을 포함하여, 절단된 C-루프 및 B-B' 아암이 유지될 수 있으며, 예를 들어, 도 15a~15b에 도시된 예시된 ITR-1(좌측) 및 ITR-1(우측)을 참고한다. 유사하게, 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C 영역의 결실을 포함하여, 절단된 C'-루프 및 B-B' 아암이 유지될 수 있으며, 예를 들어 도 16a~16b에 도시된 예시적인 ITR-5(좌측) 및 ITR-5(우측)를 참고한다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C 부분, C' 부분, B 부분 또는 B' 부분 중 임의의 하나 이상에서 염기쌍의 결실을 포함하여, 따라서 상보성 염기 쌍이 C-B' 부분 및 C'-B 부분에서 일어나서 단일 아암을 생산할 수 있으며, 예를 들어, ITR-10(우측) 및 ITR-10(좌측)(도 12a~12b)을 참고한다.
일부 구현예에서, C, C', B 및/또는 B' 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드에서의 변형에 추가하여, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 변형(예를 들어, 결실, 치환 또는 첨가)을 포함할 수 있다) : A'와 C 사이, C와 C'사이, C'와 B 사이, B와 B'사이 및 B'와 A 사이에서 선택된 임의의 하나 이상의 영역에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 치환 또는 첨가)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 우측 ITR에서 B'와 C 사이의 뉴클레오타이드는 nA에서 G, C 또는 A로 치환되거나 결실되거나 하나 이상의 뉴클레오타이드가 첨가될 수 있으며; 변형된 좌측 ITR에서 C'와 B 사이의 뉴클레오타이드는 T에서 G, C 또는 A로 변경되거나 결실되거나 하나 이상의 뉴클레오타이드가 첨가될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 550~557 중 임의의 하나로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 구성된 변형된 ITR을 갖지 않는다. 본 발명의 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 550~557 중 임의의 하나로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 ITR을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본 명세서에 개시된 바와 같은 조절 스위치 및 서열번호: 550~557로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 선택된 변형된 ITR을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 구조 요소의 구조는 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소는 스템의 높이 및/또는 루프의 뉴클레오타이드 수의 변화이다. 예를 들어, 스템의 높이는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 뉴클레오타이드 이상 또는 임의의 범위일 수 있다. 일 구현예에서, 스템 높이는 약 5개의 뉴클레오타이드 내지 약 9개의 뉴클레오타이드일 수 있고, Rep와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 스템 높이는 약 7개의 뉴클레오타이드일 수 있고, Rep와 기능적으로 상호작용할 수 있다. 또 다른 예에서, 루프는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상의 임의의 범위를 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, RBE 또는 연장된 RBE 내의 GAGY 결합 부위 또는 GAGY-관련된 결합 부위의 수는 증가 또는 감소될 수 있다. 일 예에서, RBE 또는 연장된 RBE는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 GAGY 결합 부위 또는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 서열이 Rep 단백질에 결합하기에 충분하다면, 각 GAGY 결합 부위는 독립적으로 정확한 GAGY 서열 또는 GAGY와 유사한 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에서, (예를 들어, RBE 및 헤어핀으로 제한되지는 않음) 두 요소 사이의 간격은 큰 Rep 단백질과의 기능적 상호작용을 변경하기 위해 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)될 수 있다. 예를 들어, 간격은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 뉴클레오타이드 또는 그 이상의 임의의 범위일 수 있다.
본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터는 본 명세서에 개시된 야생형 AAV2 ITR 구조와 연관하여 변형되지만 여전히 작동가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분을 보유하는 ITR 구조를 포함할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는 ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 기전을 도시한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위(RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호: 531)) 및 말단 분할 부위(TRS; 5'-AGTT(서열번호: 46))를 포함하는 하나 이상의 기능성 ITR 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR(wt 또는 변형된 ITR)은 기능적이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서로 상이하거나 비대칭인 2개의 변형된 ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 변형된 ITR은 기능적이고 적어도 하나의 변형된 ITR은 비-기능적이다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원에 제공된 바와 같이 서열번호: 500~529로 구성되거나 본질적으로 구성된 임의의 서열로부터 선택된 변형된 ITR을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호: 500~529로부터 선택된 임의의 서열로부터 선택된 ITR을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터의 변형된 ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에 변형을 갖는다. 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 표 2에 열거되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터의 변형된 ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 루프 아암 및 절단된 아암 내에 변형을 갖는다. 루프 아암 및 절단된 아암 내에 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 표 3에 열거되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터의 변형된 ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 루프 아암 및 스페이서 내에 변형을 갖는다. 루프 아암 및 스페이서 내에 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 표 4에 열거되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터의 변형된 ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 절단된 아암 및 스페이서 내에 변형을 갖는다. 절단된 아암 및 스페이서 내에 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 표 5에 열거되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터의 변형된 ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 루프 아암, 절단된 아암 및 스페이서 내에 변형을 갖는다. 루프 아암, 절단된 아암 및 스페이서 내에 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 표 6에 열거되어 있다.
일부 구현예에서, ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 최저 전개 에너지("낮은 에너지 구조")를 포함하도록 변형된다. 에너지가 적으면 야생형 ITR에 비해 깁스 자유 에너지가 감소된다. 전개의 낮은(즉, 감소된) 전개 에너지로 변형된 ITR의 예시적인 서열은 본원에서 표 7~9에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 표 2~9, 10A 또는 10B에 나타낸 것들 중 임의의 것 또는 조합으로부터 선택된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
본 명세서에 개시된 바와 같이, 변형된 ITR은 AAV 게놈으로부터 유래된 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하도록 생산될 수 있다. 변형된 ITR은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)의 플라스미드에서 증식하는 동안, 또는 스포도프테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 배큘로바이러스, 또는 다른 생물학적 방법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 또는 화학적 합성을 사용하는 시험관내에서 유전자 변형에 의해 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 AAV2의 야생형 ITR(좌측)(서열번호: 51) 또는 AAV2의 야생형 ITR(우측)(서열번호: 1)로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 뉴클레오타이드가 T-형상화된 스템-루프 구조의 B-C' 또는 C-C'로부터 결실, 삽입 또는 치환된다. 게다가, 변형된 ITR은 AAV2의 야생형 ITR의 Rep-결합 요소(RBE) 및 말단 분할 부위(trs)내에 변형을 포함하지 않지만, RBE'(TTT)는 주형이 한 번의 복제 라운드를 겪어서 AAA 삼중항을 상보성 RBE'-TTT로 변환하는지 여부에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
3가지 유형의 변형된 ITR이 예시된다: (1) 단일 아암 및 단일 비쌍 루프를 포함하는 최저 에너지 구조("단일 아암/단일 비쌍-루프 구조")를 갖는 변형된 ITR; (2) 단일 헤어핀을 갖는 최저 에너지 구조("단일 헤어핀 구조")를 갖는 변형된 ITR; 및 (3) 2개의 아암을 가지며, 이들 중 하나는 절단된 최저 에너지 구조("절단된 구조")를 갖는 변형된 ITR.
단일-아암/단일-비쌍-루프 구조를 갖는 변형된 ITR
야생형 ITR은 단일 아암 및 단일 비쌍 루프를 포함하는 이차 구조(즉, "단일 아암/단일-비쌍-루프 구조")를 형성하도록 변형될 수 있다. 구조의 깁스 자유 전개 에너지(ΔG)는 -85 kcal/mol 내지 -70 kcal/mol의 범위일 수 있다. 변형된 ITR의 예시적인 구조가 제공된다.
단일-아암/단일-비쌍 루프 구조를 형성하는 것으로 예상된 변형된 ITR은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형된 ITR은 유전자 변형 또는 생물학적 및/또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
예를 들어, 도 9a~9b에 제공된 ITR-2, 좌측 및 우측(서열번호: 101 및 102)d은 AAV2의 야생형 ITR에서 C-C' 아암으로부터 2개의 뉴클레오타이드가 결실되고 B-B' 아암으로부터 16개의 뉴클레오타이드가 결실되도록 생산된다. 변형된 ITR의 B-B' 아암에 남아있는 3개의 뉴클레오타이드는 상보성 쌍을 이루지 못한다. 따라서, ITR-2 좌측 및 우측은 단일 C-C' 아암과 단일 비쌍 루프로 최저 에너지 구조를 갖는다. 구조의 깁스 자유 전개 에너지는 약 -72.6 kcal/mol인 것으로 예상된다.
도 10a 및 10b에 제공된 ITR-3 좌측 및 우측(서열번호: 103 및 104)은 AAV2의 야생형 ITR로부터 C-C' 아암에 19개의 뉴클레오타이드 결실을 포함하도록 생산된다. 변형된 ITR의 B-B' 아암에 남아있는 3개의 뉴클레오타이드는 상보성 쌍을 이루지 못한다. 따라서, ITR-3 좌측 및 우측은 단일 B-B' 아암과 단일 비쌍 루프로 최저 에너지 구조를 갖는다. 구조의 깁스 자유 전개 에너지는 약 -74.8 kcal/mol인 것으로 예상된다.
도 11a 및 11b에 제공된 ITR-4 좌측 및 우측(서열번호: 105 및 106)은 AAV2의 야생형 ITR로부터 B-B' 아암에 19개의 뉴클레오타이드 결실을 포함하도록 생산된다. 변형된 ITR의 B-B' 아암에 남아있는 3개의 뉴클레오타이드는 상보성 쌍을 이루지 못한다. 따라서, ITR-4 좌측 및 우측은 단일 C-C' 아암과 단일 비쌍 루프로 최저 에너지 구조를 갖는다. 구조의 깁스 자유 전개 에너지는 약 -76.9 kcal/mol인 것으로 예상된다.
도 12a 및 12b에 제공된 ITR-10 좌측 및 우측(서열번호: 107 및 108)은 AAV2의 야생형 ITR로부터 B-B' 아암에 8개의 뉴클레오타이드 결실을 포함하도록 생산된다. B-B' 및 C-C' 아암에 남아있는 뉴클레오타이드는 B와 C' 모티프(ITR-10 좌측) 또는 C와 B' 모티프(ITR-10 우측) 사이에 새로운 상보성 결합을 형성한다. 따라서, ITR-10 좌측 및 우측은 단일 B-C' 또는 C-B' 아암과 단일 비쌍 루프로 최저 에너지 구조를 갖는다. 구조의 깁스 자유 전개 에너지는 약 -83.7 kcal/mol인 것으로 예상된다.
도 13a 및 13b에 제공된 ITR-17 좌측 및 우측(서열번호: 109 및 110)은 AAV2의 야생형 ITR로부터 C-C' 아암에 14개의 뉴클레오타이드 결실을 포함하도록 생산된다. C-C' 아암에 남아있는 8개의 뉴클레오타이드는 상보성 결합을 형성하지 않는다. 그 결과, ITR-17 좌측 및 우측은 단일 B-B' 아암과 단일 비쌍 루프로 최저 에너지 구조를 갖는다. 구조의 깁스 자유 전개 에너지는 약 -73.3 kcal/mol인 것으로 예상된다.
야생형 ITR 좌측 또는 우측(상단부), 및 단일-아암/단일-비쌍 루프 구조를 형성할 것으로 예상되는 다양한 변형된 ITR 좌측 또는 우측(하단부)의 서열이 정렬되고, 하기 표 7에 제공된다.
Figure pct00016
Figure pct00017
단일-헤어핀 구조를 갖는 변형된 ITR
야생형 ITR은 단일-헤어핀 구조를 포함하는 최저 에너지 구조를 갖도록 변형될 수 있다. 구조의 전개의 깁스 자유 전개 에너지(ΔG)는 -70 kcal/mol 내지 -40 kcal/mol의 범위일 수 있다. 변형된 ITR의 예시적인 구조는 도 14a 및 14b에 제공된다.
단일 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예상되는 변형된 ITR은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형된 ITR은 유전자 변형 또는 생물학적 및/또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
예를 들어, ITR-6 좌측 및 우측은 도 14a 및 14b(서열번호: 111 및 112)에 제공되며, AAV2의 야생형 ITR로부터 B-B' 및 C-C' 아암에 40개의 뉴클레오타이드 결실을 포함한다. 변형된 ITR에 남아있는 뉴클레오타이드는 단일 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예상된다. 구조의 깁스 자유 전개 에너지는 약 -54.4 kcal/mol이다.
야생형 ITR 및 ITR-6(좌측 및 우측 모두)의 서열이 정렬되고, 하기 표 8에 제공된다.
Figure pct00018
절단된 구조를 갖는 변형된 ITR
야생형 ITR은 2개의 아암을 포함하는 최저 에너지 구조를 갖도록 변형될 수 있으며, 이들 중 하나는 절단된다. 이의 깁스 자유 전개 에너지(ΔG)는 -90 내지 -70 kcal/mol 범위이다. 따라서, 그들의 깁스 자유 전개 에너지는 AAV2의 야생형 ITR보다 낮다.
변형된 ITR은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 예를 들어, 스템의 말단에 최종 루프가 여전히 존재하는한 루프의 스템을 형성하는 모든 특정 루프, 예를 들어 A-A' 루프, B-B' 루프 또는 C-C' 루프의 제거, 또는 대안적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 변형된 ITR은 유전자 변형 또는 생물학적 및/또는 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
절단된 구조를 갖는 변형된 ITR의 예시적인 구조가 도 15a~15b에 제공되어 있다.
절단된 구조를 형성할 것으로 예상되는 다양한 변형된 ITR의 서열은 야생형 ITR의 서열과 함께 정렬되고, 하기 표 9에 제공된다.
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
본원에 사용하기 위한 상기 부류 각각에서 추가의 예시적인 변형된 ITR이 표 10A 및 10B에 제공되어 있다. 표 10A에서 우측 변형된 ITR의 예상된 이차 구조는 도 26a에 도시되어 있으며, 표 10B에서 좌측 변형된 ITR의 예상된 이차 구조가 도 26b에 도시되어 있다.
표 10A 및 표 10B는 예시적인 우측 및 좌측 변형된 ITR을 나타낸다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
본 발명의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터는 서열번호: 550, 551, 552, 553, 553, 554, 555, 556, 557의 그룹 중 어느 하나로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 변형된 ITR을 갖지 않는다.
ceDNA 벡터가 본원의 청구범위 중 임의의 하나 이상에, 또는 장차 본원에서 제출될 수 있는 보정된 청구범위 또는 이로부터 유래되는 임의의 특허에 정의되는 임의의 발명내에서 서열번호: 550~557에 기재된 바와 같은 B, B', C 또는 C' 영역에서의 변형 중 하나를 갖는 변형된 ITR을 갖는 한, 및 이러한 청구가 적용되는 임의의 관련 국가 또는 그 국가의 법률이 적용되는 한, 본 출원 또는 그로부터 유래된 임의의 특허의 무효화를 방지하기 위해 필요한 정도로 본 출원 또는 그로부터 유래된 임의의 특허의 청구범위로부터 상기 내용들을 부인할 권리를 보유한다.
예를 들어, 그리고 비제한적으로, 우리는 현재 또는 미래에 보정된 본 출원의 임의의 청구범위, 또는 그로부터 유래된 특허로부터 하기 주제 중 임의의 하나를 부인할 권리를 보유한다.
A. 조절 스위치없이 ceDNA 벡터에 사용되는 서열번호: 2, 52, 63 64, 113, 114, 550, 551; 552, 553, 553, 554, 555, 556, 557로 구성된 군으로부터 선택된 변형된 ITR
B. 조절 서열 없이, 및 ceDNA 벡터에서, 및 이종성 핵산이 ABCA4, USA2A var1, VEGFR, CEP290, BDD 인자 VIII(FVIII), 인자 VIII, vWF_His, vWF, 레시트킨 콜레스테롤 아세틸 전달효소, PAH, G6PC, 또는 CFTR을 암호화하는 경우, A에서의 상기-명시된 변형된 ITR
비제한적으로, 우리는 상기 면책의 권리의 유보는 본 출원의 청구항 1 내지 57 및 [0027] 및 [00397]에 기재된 단락을 비제한적으로 포함하는 모든 단락에 대해 적어도 적용된다고 진술한다.
IV. 조절 인자.
ceDNA 벡터는 시스-조절 인자의 특이적 조합을 추가로 포함하는 발현 작제물로부터 생산될 수 있다. 시스-조절 인자는 프로모터, 리보스위치, 절연체, 미르-조절가능 요소, 전사후 조절 인자, 조직- 및 세포 유형-특이적 프로모터 및 향상제를 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 이식유전자에 대한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 성분, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 조절 스위치, 또는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 킬 스위치를 포함한다.
ceDNA 벡터는 시스-조절 인자, 예컨대 WHP 전사후 조절 인자(WPRE)(예를 들어, 서열번호: 8) 및 BGH 폴리A(서열번호: 9)의 특이적 조합을 추가로 포함하는 발현 작제물로부터 생산될 수 있다. 발현 작제물에 사용하기에 적합한 발현 카세트는 바이러스 캡시드에 의해 부과된 패키징 제약에 의해 제한되지 않는다. 본 발명의 발현 카세트는 세포-특이성뿐만 아니라 전체 발현 수준에 영향을 줄 수 있는 프로모터를 포함한다. 이식유전자 발현을 위해, 이들은 고활성 바이러스-유래된 즉각적인 초기 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 조직-특이적 진핵 프로모터를 함유하여 이식유전자 발현을 특정 세포 유형으로 제한하고 조절되지 않은 이소성 발현으로 인한 독성 효과 및 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발현 카세트는 합성 조절 인자, 예컨대 CAG 프로모터(서열번호: 3)를 함유할 수 있다. CAG 프로모터는 (i) 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 향상제 요소, (ii) 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함한다. 대안적으로, 발현 카세트는 알파-1-항 트립신(AAT) 프로모터(서열번호: 4 또는 서열번호: 74), 간 특이적(LP1) 프로모터(서열번호: 5 또는 서열번호: 16), 또는 인간 신장 인자-1 알파(EF1a) 프로모터(예를 들어, 서열번호: 6 또는 서열번호: 15)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 하나 이상의 항시성 프로모터, 예를 들어 레트로바이러스 루 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 향상제 포함) 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉각적인 초기 프로모터(선택적으로 CMV 향상제, 예를 들어 서열번호: 22 포함)를 포함한다. 대안적으로, 유도성 프로모터, 이식유전자에 대한 천연 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 당 업계에 공지된 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.
상기 기재된 것들을 포함하여 적합한 프로모터는 바이러스로부터 유래될 수 있으며, 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵 또는 진핵 유기체를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 적합한 프로모터를 사용하여 임의의 RNA 중합효소(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도할 수 있다. 예시적인 프로모터는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 긴 말단 반복(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 포진 바이러스(HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉각적인 초기 프로모터 영역(CMVIE), 루 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 소형 핵 프로모터(U6, 예를 들어, 서열번호: 18)(Miyagishi 등, Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), 향상된 U6 프로모터(예를 들어, Xia 등, Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)), 인간 H1 프로모터(H1)(예를 들어, 서열번호: 19), CAG 프로모터, 인간 알파 1-안티팁신(HAAT) 프로모터(예를 들어, 서열번호: 21) 등을 비제한적으로 포함한다. 구현예에서, 이들 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 다운스트림 인트론 함유 말단에서 변경된다. 구현예에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)를 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 이질적이다.
프로모터는 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함하여 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경시킬 수 있다. 프로모터는 또한 원위 향상제 또는 억제인자 요소를 포함할 수 있으며, 전사 개시 부위로부터 수천개 정도의 염기쌍에 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 발생하는 세포, 조직 또는 장기에 대하여, 또는 발현이 발생하는 발달 단계에 대하여, 또는 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여, 유전자 성분의 발현을 구성적으로 또는 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예로는 박테리오파아지 T7 프로모터, 박테리오파아지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터, 뿐만 아니라 하기에 열거된 프로모터가 포함된다. 이러한 프로모터 및/또는 향상제는 임의의 관심 유전자, 예를 들어 유전자 편집 분자, 공여체 서열, 치료적 단백질 등의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 치료적 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 치료적 단백질 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 시미안 바이러스 40(SV40)로부터의 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예컨대 소과 면역결핍 바이러스(BIV) 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스(ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉각적인 초기 프로모터, 엡슈타인 바르 바이러스(EBV) 프로모터 또는 루(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유전자, 예컨대 인간 유비퀴틴 C(hUbC), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인으로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 조직 특이적 프로모터, 예컨대 간 특이적 프로모터, 예컨대 인간 알파 1-안티팁신(HAAT), 천연 또는 합성일 수 있다. 일 구현예에서, 간으로의 전달은 간세포 표면에 존재하는 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체를 통해 간세포에 대한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 내인성 ApoE 특이적 표적화를 사용하여 달성될 수 있다.
일 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료적 단백질을 암호화하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료적 단백질을 암호화하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 공지되어 있고, 특성규명되어 있다. 사용되는 프로모터 영역은 하나 이상의 추가의 조절 서열(예를 들어, 천연), 예를 들어 향상제(예를 들어, 서열번호: 22 및 서열번호: 23)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 프로모터의 비-제한적인 예는 예를 들어(서열번호: 3)의 CAG 프로모터, HAAT 프로모터(서열번호: 21), 인간 EF1-α CAG 프로모터(서열번호: 6), 또는 EF1a 프로모터(서열번호: 15), IE2 프로모터(예를 들어, 서열번호: 20) 및 래트 EF1-α 프로모터(서열번호: 24)의 단편을 포함한다.
폴리아데닐화 서열: 폴리아데닐화 서열을 암호화하는 서열은 ceDNA 벡터에 포함되어 ceDNA 벡터로부터 발현된 mRNA를 안정화시키고 핵 방출 및 번역을 보조할 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 벡터는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50개 또는 그 초과의 아데닌 디뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 약 43개 뉴클레오타이드, 약 40~50개 뉴클레오타이드, 약 40~55개 뉴클레오타이드, 약 45~50개 뉴클레오타이드, 약 35~50개 뉴클레오타이드, 또는 이들 사이의 임의의 범위를 포함한다.
발현 카세트는 당 업계에 공지된 폴리-아데닐화 서열 또는 이의 변형, 예컨대 소과 BGHpA(예를 들어, 서열번호: 74) 또는 바이러스 SV40pA(예를 들어, 서열번호: 10), 또는 합성 서열(예를 들어, 서열번호: 27)로부터 단리된 자연 발생 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 폴리A 신호 업스트림 향상제(USE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, USE는 SV40pA 또는 이종성 폴리-A 신호와 함께 사용될 수 있다.
발현 카세트는 또한 이식유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사후 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우드 처크 간염 바이러스(WHP) 전사후 조절 인자(WPRE)(예를 들어, 서열번호: 8)는 이식유전자의 발현을 증가시키는 데 사용된다. 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 유전자로부터의 전사후 요소 또는 B형 간염 바이러스(HBV)와 같은 다른 전사후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비성 서열은 이식유전자, 예를 들어 VH-02 및 VK-A26 서열, 예를 들어 서열번호: 25 및 서열번호: 26에 연결될 수 있다.
V. 조절 스위치
분자 조절 스위치는 신호에 응답하여 측정가능한 상태 변화를 생산하는 스위치이다. 이러한 조절 스위치는 ceDNA 벡터의 출력을 제어하기 위해 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터와 유용하게 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 미세 조정하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 이는 ceDNA 벡터의 생체내 기능으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 스위치는 제어가능하고 조절가능한 방식으로 ceDNA에서 관심 유전자의 발현을 시작 또는 중지(즉, 셧다운)하도록 설계된 "온/오프" 스위치이다. 일부 구현예에서, 스위치는 스위치가 활성화되면 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포 프로그래밍된 사멸을 겪도록 지시할 수 있는 "킬 스위치"를 포함할 수 있다.
A. 이원 조절 스위치
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 제어가능하게 조절하는 역할을 할 수 있는 조절 스위치를 포함한다. 이러한 구현예에서, ceDNA 벡터의 ITR 사이에 위치한 발현 카세트는 조절 영역, 예를 들어 프로모터, 시스-요소, 억제인자, 향상제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 관심 유전자에 작동가능하게 연결되며, 여기서 조절 영역은 하나 이상의 보조 인자 또는 외인성 제제에 의해 조절된다. 따라서, 일 구현예에서, 하나 이상의 보조 인자(들) 또는 외인성 제제가 세포에 존재할 때만 ceDNA 벡터로부터 관심 유전자의 전사 및 발현이 일어날 것이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보조 인자(들) 또는 외인성 제제는 관심 유전자의 전사 및 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 핵산 조절 영역은 조절 스위치를 포함하도록 설계된 ceDNA 벡터에 사용될 수 있다. 단지 예로서, 조절 영역은 소분자 스위치 또는 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터의 비-제한적인 예는 호르몬-유도성 또는 금속-유도성 프로모터이다. 다른 예시적인 유도성 프로모터/향상제 요소는 RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 비제한적으로 포함한다. 하기에 개시된 것들을 포함하는, 고전적 테트라사이클린-기반 또는 다른 항생제-기반 스위치가 사용하기 위해 포괄된다(Fussenegger 등, Nature Biotechnol. 18: 1203-1208 (2000)).
B. 소분자 조절 스위치
다양한 당 업계에 공지된 소분자 기초 조절 스위치가 당해 기술에 공지되어 있고, 조절-스위치 제어된 ceDNA 벡터를 형성하기 위해 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 작동가능하게 연결된 이식유전자, 예컨대 Taylor, et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15에 개시된 것들의 발현을 조절하는 인공 프로모터와 함께, 직교 리간드/핵 수용체 쌍, 예를 들어 레티노이드 수용체 변이체/LG335 및 GRQCIMFI; 조작된 스테로이드 수용체, 예를 들어, 프로게스테론에 결합할 수 없지만 RU486(미페프리스톤)에 결합하는 C-말단 절단을 갖는 변형된 프로게스테론 수용체(미국 특허 번호 제5,364,791호); 드로소필라로부터의 엑디손 수용체 및 그들의 엑디스테로이드 리간드(Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517; 또는 Sando R 3rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8에 개시된 항생제 트리메토프림(TMP)에 의해 제어되는 스위치 중 임의의 하나 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
당업자에 의해 공지된 다른 소분자 기초 조절 스위치는 ceDNA의 이식유전자 발현을 제어하는 데 사용하기 위해 구상되며, Buskirk et al., Cell; Chem and Biol., 2005; 12(2); 151-161에 개시된 것들; 압시스 산 민감성 온(ON)-스위치; 예컨대 Liang, F.-S., et al., (2011) Science Signaling, 4(164)에 개시된 것들; 외인성 L-아르기닌 민감성 온-스위치, 예컨대 Hartenbach, et al.Nucleic Acids Research, 35(20), 2007에 개시된 것들, 합성 담즙산 민감성 온-스위치 예컨대
Figure pct00026
et al., Metab Eng. 2014,21: 81-90에 개시된 것들; 바이오틴 민감한 온-스위치, 예컨대 Weber et al., Metab. Eng. 2009 Mar; 11(2): 117-124에 개시된 것들; 이중 주입 식품 첨가물 벤조에이트/바닐린 민감성 조절 스위치, 예컨대 Xie et al., Nucleic Acids Research, 2014; 42(14);e116에 개시된 것들; 4-하이드록시타목시펜 민감성 스위치 예컨대 Giuseppe et al., Molecular Therapy, 6(5), 653 - 663에 개시된 것들; 및 플라비노이드(플로레틴) 민감성 조절 스위치, 예컨대 Gitzinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009 Jun 30; 106(26): 10638-10643에 개시된 것들을 비제한적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 이식유전자를 제어하거나 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 조절 스위치는 미국 특허 제8,771,679호 및 제6,339,070호에 개시된 것과 같은 전구약물 활성화 스위치이다.
ceDNA 벡터에 사용하기 위한 예시적인 조절 스위치는 표 11의 스위치를 비제한적으로 포함한다.
C. "패스코드" 조절 스위치
일부 구현예에서, 조절 스위치는 "패스코드 스위치" 또는 "패스코드 회로"일 수 있다. 패스코드 스위치를 사용하면 특정 조건이 발생할 때 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현 제어를 미세 조정할 수 있으며, 즉, 발생할 이식유전자 발현 및/또는 억제를 위해서는 조건의 조합이 있어야 한다. 예를 들어, 이식유전자의 발현이 발생하기 위해서는 적어도 조건 A 및 B가 발생해야 한다. 패스코드 조절 스위치는 발생할 이식유전자 발현을 위해 존재하는 임의의 수의 조건, 예를 들어 적어도 2, 또는 적어도 3, 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7, 또는 그 초과의 조건일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 조건(예를 들어, A, B 조건)이 발생해야 하고, 일부 구현예에서, 적어도 3개의 조건(예를 들어, A, B 및 C, 또는 A, B 및 D)이 발생해야 한다. 단지 예로서, 패스코드 "ABC" 조절 스위치를 갖는, ceDNA로부터의 유전자 발현이 발생하기 위해서는 조건 A, B 및 C가 존재해야 한다. 조건 A, B 및 C는 하기와 같다: 조건 A는 병태 또는 질병의 존재이고, 병태 B는 호르몬 반응이고, 병태 C는 이식유전자 발현에 대한 반응이다. 단지 예로서, 이식유전자가 인슐린인 경우, 대상체가 당뇨병을 앓고 있는 경우 조건 A가 발생하고, 조건 B는 혈액내 당 수준이 높은 경우이며, 조건 C는 요구되는 양으로 발현되지 않는 내인성 인슐린의 수준이다. 당 수준이 감소하거나 원하는 수준의 인슐린에 도달하면, 이식유전자(예를 들어, 인슐린)가 3가지 조건이 발생할 때까지 다시 꺼지고 다시 켜진다. 또 다른 예시적인 예에서, 이식유전자가 EPO인 경우, 조건 A는 만성 신장 질환(CKD)의 존재이며, 조건 B는 상기 대상체가 신장에서 저산소 병태를 갖는 경우 발생하고, 조건 C는 신장내 에리트로포이에틴-생산 세포(EPC) 동원이이 손상된 것이며; 또는 대안적으로, HIF-2 활성화가 손상된 것이다. 산소 수준이 증가하거나 원하는 수준의 EPO에 도달하면, 3가지 조건이 발생할 때까지 이식유전자(예를 들어, EPO)가 다시 꺼지고 다시 켜진다.
패스코드 조절 스위치는 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현을 미세 조정하는데 유용하다. 예를 들어, 패스코드 조절 스위치는 다중 스위치, 예를 들어 특정 수준의 대사물의 존재 하에서만 켜지는 조직 특이적, 유도성 프로모터를 포함한다는 점에서 모듈식일 수 있다. 이러한 구현예에서, ceDNA 벡터로부터의 이식유전자 발현이 발생하기 위해서는, 유도성 제제가 원하는 세포 유형(조건 B)으로 존재하고(조건 A), 대사물이 특정 역치 이상이거나 또는 그 미만이다(조건 C). 대안적인 구현예에서, 패스코드 조절 스위치는 조건 A 및 B가 존재할 때 이식유전자 발현이 켜지고 조건 C가 존재할 때는 꺼지도록 설계될 수 있다. 이러한 구현예는 조건 C가 발현된 이식유전자의 직접적인 결과로서 발생하는 경우에 유용하며, 즉, 조건 C는 이식유전자가 충분한 양의 원하는 치료효과를 가졌을 때 ceDNA 벡터로부터 이식유전자 발현을 끄도록 루프에 대한 양성 피드백의 역할을 한다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포괄된 패스코드 조절 스위치는 WO2017/059245에 개시되어 있으며, 이는 하이브리드 전사 인자(TF)를 사용하여 세포 생존을 위한 복잡한 환경 요건을 구성하는 합성 생물학적 회로인, "패스코드 스위치" 또는 "패스코드 회로" 또는 "패스코드 킬 스위치"로 지칭되는 스위치를 기술한다. WO2017/059245에 기재된 패스코드 조절 스위치는 ceDNA 벡터에서, 회로 활성화를 제어하는 환경 조건 및 세포 운명을 제어하는 출력 모듈의 관점에서 모듈화 및 커스터마이즈가 가능하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 패스코드 회로는 ceDNA 벡터에 사용되는 특정 유용성을 가지고 있는데, 적합한 "패스코드" 분자가 없으면 필요한 사전결정된 조건의 존재 하에서만 이식유전자 발현을 허용할 것이기 때문이다. 세포에 어떤 문제가 발생하거나 어떤 이유로 더 이상의 이식유전자 발현이 필요하지 않은 경우, 관련 킬 스위치(즉, 데드맨(deadman) 스위치)가 유발될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포괄된 패스코드 조절 스위치 또는 "패스코드 회로"는 생체내포 조건을 정의하는데 사용되는 환경 신호의 범위 및 복잡성을 확장시키기 위해 하이브리드 전사 인자(TF)를 포함한다. 사전결정된 조건의 존재 하에서 세포 사멸을 유발하는 데드맨 스위치와는 대조적으로, "패스코드 회로"는 특정 "패스코드"의 존재 하에서 세포 생존 또는 이식유전자 발현을 허용하고, 사전결정된 환경 조건 또는 패스코드가 존재하는 경우에만 이식유전자 발현 및/또는 세포 생존을 허용하도록 쉽게 재프로그래밍될 수 있다.
일 양태에서, 적어도 2개의 선택된 제제의 사전결정된 세트의 존재로 세포 성장을 제한하는 "패스코드" 시스템은, i) 숙주세포에 독성이 있는, 독소를 암호화하는 독소 발현 모듈로서, 제1 하이브리드 억제인자 단백질 hRP1의 결합에 의해 억제되는 프로모터 P1에 작동가능하게 연결된 독서 발현 모듈; ii) 제1 하이브리드 억제인자 단백질 hRP1을 암호화하는 제1 하이브리드 억제인자 단백질 발현 모듈로서, 여기서 hRP1의 발현이 2개의 하이브리드 전사 인자 hTF1 및 hTF2에 의해 형성된 AND 게이트에 의해 제어되며, 이의 결합 또는 활성은 제제 A1 및 A2에 반응하여, A1 및 A2 둘 다 hRP1의 발현에 필요하며, 여기서 A1 또는 A2의 부재하에 hRP1 발현이 독소 프로모터 모듈 P1 및 독소 생산을 억제하기에 불충분하여 숙주세포가 사멸되는, 제1 하이브리드 억제인자 단백질 발현 모듈을 포함하는 하나 이상의 핵산 작제물 암호화 발현 모듈을 포함한다. 이 시스템에서, 하이브리드 인자 hTF1, hTF2 및 hRP1은 각각 하나의 전사 인자로부터의 환경 감지 모듈 및 상이한 전사 인자로부터의 DNA 인식 모듈을 포함하여, 각각의 서브 유닛이 전형적으로 본질적으로 결합하는 것과 상이한 환경 물질, A1 또는 A2의 존재에 패스코드 조절 스위치의 결합이 민감하게 한다.
따라서, ceDNA 벡터는 출력 모듈을 활성화시키기 위해 특정 분자의 존재 및/또는 부재를 요구하는 "패스코드 조절 회로"를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 독소를 암호화하는 유전자가 출력 모듈에 배치되는 경우, 이 패스코드 조절 회로는 이식유전자 발현을 조절하는 데 사용될뿐만 아니라 세포가 원하지 않는 방식으로 동작하는 경우 회로가 세포를 사멸시키는 킬 스위치 기전을 생성하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 센서 도메인에 의해 정의된 특정 환경을 떠나거나 상이한 세포 유형으로 분화함). 비-제한적인 일례에서, 하이브리드 전사 인자, 회로 구조 및 출력 모듈의 모듈성은 당 업계에 이해되는 바와 같이, 다른 환경 신호를 감지하고 다른 방식으로 환경 신호에 반응하고, 유도된 세포 사멸에 추가하여 세포내 다른 기능을 제어하도록 회로를 재구성할 수 있게 한다.
본 명세서에 개시된 임의의 조절 스위치 및 이들의 모든 조합, 예를 들어, 소분자 스위치, 핵산-기반 스위치, 소분자-핵산 하이브리드 스위치, 전사후 이식유전자 조절 스위치, 번역후 조절, 방사선-제어 스위치, 저산소증-매개 스위치, 및 본 명세서에 개시된 바와 같이 당해 분야의 숙련가에 의해 알려진 다른 조절 스위치는 본 명세서에 개시된 바와 같은 패스코드 조절 스위치에 사용될 수 있다. 사용을 위해 포괄된 조절 스위치는 Kis et al., J R Soc Interface 12: 20141000(2015) 검토 논문에 논의되고, Kis의 표 1에 요약되어 있다. 일부 구현예에서, 패스코드 시스템에 사용하기 위한 조절 스위치는 표 11의 스위치 중 임의의 것 또는 조합으로부터 선택될 수 있다.
D. 이식유전자 발현을 제어하기 위한 핵산-기반 조절 스위치
일부 구현예에서, ceDNA에 의해 발현된 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 핵산 기반 제어 기전에 기초한다. 예시적인 핵산 제어 기전은 당해 기술에 공지되어 있으며, 사용을 위해 구상된다. 예를 들어, 이러한 기전은 리보스위치, 예컨대 US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, 미국 특허 제9,222,093호 및 EP 출원 EP288071에 개시된 것, 및 Villa JK 등, Microbiol Spectr. 2018 May;6(3)에 의한 검토에 개시된 것을 포함한다. 또한, WO2018/075486 및 WO2017/147585에 개시된 것들과 같은 대사물-반응성 전사 바이오센서가 포함된다. 사용을 위해 구상된 다른 공지된 기전은 siRNA 또는 RNAi 분자(예를 들어, miR, shRNA)에 의한 이식유전자의 침묵화를 포함한다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자에 상보적인 RNAi 분자를 암호화하는 조절 스위치를 포함할 수 있다. 이식유전자가 ceDNA 벡터에 의해 발현되더라도 이러한 RNAi가 발현될 때, 상보성 RNAi 분자에 의해 침묵화될 것이고, 이식유전자가 ceDNA 벡터에 의해 발현될 때 RNAi가 발현되지 않을 경우 이식유전자는 RNAi에 의해 침묵화되지 않는다. 유전자 발현을 제어하는, 또는 조절 스위치로서 RNAi 분자의 이러한 예는 US2017/0183664에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현을 차단하는 억제인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 온/오프 스위치는 예를 들어 Chappell J. et al., Nat Chem Biol. 2015 Mar;11(3):214-20; and Chappell et al., Microbiol Spectr. 2018 May;6(3)에 개시된 것과 같은 소형 전사 활성화 RNA(STAR)-기반 스위치이다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 US2009/0191546, US2016/0076083, WO2017/087530, US2017/0204477, WO2017/075486 및 Green et al, Cell, 2014; 159(4); 925-939에 개시된 것과 같은 토홀드(toehold) 스위치이다.
일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2002/0022018에 개시된 바와 같은 조직-특이적 자가-활성화 조절 스위치이며, 이에 의해 조절 스위치는 이식유전자 발현이 달리 불리한 부위에서 이식유전자 발현을 고의적으로 스위치 오프시킨다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 예를 들어 US2014/0127162 및 미국 특허 제8,324,436호에 개시된 바와 같은 재조합효소 가역적 유전자 발현 시스템이다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 관심 유전자 또는 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 핵산-기반 제어 기전 및 소분자 조절 시스템의 하이브리드이다. 이러한 시스템은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 사용되도록 구상된다. 이러한 조절 스위치의 예는 LTRi 시스템 또는 "Lac-Tet-RNAi" 시스템, 예를 들어 US2010/0175141 및 Deans T. et al., Cell., 2007, 130(2); 363-372, WO2008/051854 및 미국 특허 제9,388,425호에 개시된 것들을 비제한적으로 포함한다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 관심 유전자 또는 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 미국 특허 제8,338,138호에 개시된 바와 같이 순환 치환을 포함한다. 이러한 구현예에서, 분자 스위치는 다중 안정성, 즉 적어도 2개의 상태 사이에서 전환될 수 있거나, 대안적으로 쌍 안정성, 즉 상태가 "온(ON)" 또는 "오프(OFF)"이고, 예를 들어, 광을 방출할 수 있거나 그렇지 않을 수 있으며, 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있으며, 촉매화할 수 있거나 그렇지 않을 수 있으며, 전자를 전달할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 또 다른 양태에서, 분자 스위치는 융합 분자를 사용하므로, 스위치는 2개 이상의 상태 사이를 전환할 수 있다. 예를 들어, 삽입 서열 또는 수용체 서열에 의해 나타나는 특정 역치 상태에 반응하여, 융합의 각각의 다른 서열은 상태 범위(예를 들어, 결합 활성 범위, 효소 촉매작용 범위 등)를 나타낼 수 있다. 따라서, "온" 또는 "오프"로부터 전환하는 대신에, 융합 분자는 자극에 대해 단계적인 반응을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 기반 조절 스위치는 표 11의 스위치 중 임의의 것 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
E. 전사후 및 번역후 조절 스위치.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 관심 유전자 또는 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 전사후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이러한 조절 스위치는 US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, EP 특허 2707487 및 Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534; Zhong 등, Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858에 개시된 바와 같이 테트라사이클린 또는 테오필린에 민감한 앱타자임 리보스위치일 수 있다. 일부 구현예에서, 당해 분야의 숙련가는 리간드 민감성(오프-스위치) 압타머를 함유하는 이식유전자 및 억제성 siRNA 둘 다를 암호화할 수 있으며, 그 결과는 리간드 민감성 온-스위치이다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 관심 유전자 또는 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 번역후 변형 시스템이다. 대안적인 구현예에서, 관심 유전자 또는 단백질은 전-단백질 또는 전-프로단백질로 발현되거나, 또는 발현된 단백질에 부착된 신호 반응 인자(SRE) 또는 불안정화 도메인(DD)을 가지므로, 번역후 변형이 발생할 때까지 교정 단백질 폴딩 및/또는 활성을 방지한다. 불안정화 도메인(DD) 또는 SRE의 경우, 불안정화 도메인은 외인성 제제 또는 소분자의 존재하에 번역후 절단된다. 당해 분야의 숙련가는 미국 특허 제8,173,792호 및 PCT 출원 WO2017180587에 개시된 바와 같은 제어 방법을 이용할 수 있다. 기능성 이식유전자 활성을 제어하기 위해 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 구상된 다른 전사후 제어 스위치는 Rakhit et al., Chem Biol. 2014;21(9):1238-52 및 Navarro et al., ACS Chem Biol. 2016; 19; 11(8): 2101-2104A에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 관심 유전자 또는 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 리간드 민감성 인테인스를 이식유전자 암호화 서열에 통합시켜 이식유전자 또는 발현된 단백질이 스플라이싱 전에 억제되도록 하는 번역후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이는 4-하이드록시타목시펜 및 갑상선 호르몬 둘 다를 사용하여 실증되었다(예를 들어, 미국 특허 제7,541,450호, 제9,200,045호; 제7,192,739호, Buskirk, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jul 20; 101(29): 10505-10510; ACS Synth Biol. 2016 Dec 16; 5(12): 1475-1484; and 2005 Feb; 14(2): 523-532 참고). 일부 구현예에서, 전사후 기반 조절 스위치는 표 11의 임의의 스위치 또는 스위치 조합으로부터 선택될 수 있다.
F. 다른 예시적인 조절 스위치
환경 변화에 의해 유발된 것들을 포함하여 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자의 유전자 발현을 제어하기 위해 임의의 공지된 조절 스위치가 ceDNA 벡터에서 사용될 수 있다. 추가의 예는; Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018)의 BOC 방법; 유전자 코드 확장 및 비-생리적 아미노산; 방사선-제어 또는 초음파 제어 온/오프 스위치(예를 들어, Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul;7(13):1121-5; 미국 특허 제5,612,318호; 제5,571,797호; 제5,770,581호; 제5,817,636호; 및 WO1999/025385A1 참조)를 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 예를 들어 미국 특허 제7,840,263호; US2007/0190028A1에 개시된 바와 같이 이식가능한 시스템에 의해 제어되며, 여기서 유전자 발현은 전자기 에너지를 포함하여 하나 이상의 형태의 에너지에 의해 제어되어 ceDNA 벡터의 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 사용하기 위해 구상된 조절 스위치는 저산소증-매개 또는 스트레스-활성화 스위치, 예를 들어 예컨대 WO1999060142A2, 미국 특허 제5,834,306호; 제6,218,179호; 제6,709,858호; US2015/0322410; Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368, 뿐만 아니라 예를 들어, 미국 특허 제9,394,526호에 개시된 바와 같은, FROG, TOAD 및 NRSE 요소 및 저산소증 반응 인자(HRE), 염증성 반응 인자(IRE) 및 전단-스트레스 활성화 요소(SSAE)를 포함한 조건부로 유도가능한 침묵 요소이다. 이러한 구현예는 허혈 후 ceDNA 벡터로부터 또는 허혈 조직 및/또는 종양에서 이식유전자의 발현을 켜는데 유용하다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 사용하기 위해 구상된 조절 스위치는 예를 들어 Polesskaya et al., BMC Neurosci. 2018; 19(Suppl 1): 12에서 검토된 스위치 중 하나와 같은 광전자 조절(예를 들어, 광 제어) 조절 스위치이며, 또한 본 명세서에서 사용되도록 구상된다. 이러한 구현예에서, ceDNA 벡터는 감광성인 유전 인자를 포함할 수 있고, 가시 파장(예를 들어, 청색, 근적외선)에 반응하여 이식유전자 발현을 조절할 수 있다. 광 유전자 조절 스위치를 포함하는 ceDNA 벡터는 이러한 광원, 예를 들어 피부, 눈, 근육 등을 수용할 수 있는 신체 위치에서 이식유전자를 발현할 때 유용하고, ceDNA 벡터가 내부 장기 및 조직에서 이식유전자를 발현할 때 사용될 수 있으며, 이 경우 광 신호는 적합한 수단(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 이식가능한 디바이스)에 의해 제공될 수 있다. 이러한 광전자 조절 스위치는 광 반응성 요소, 또는 광-유도성 전사 효과기(LITE)(예를 들어, 2014/0287938에 개시됨), 광-온 시스템(예를 들어, Wang et al., Nat Methods. 2012 Feb 12;9(3):266-9에 개시됨)의 사용을 포함하며; 이는 인슐린 이식유전자, Cry2/CIB1 시스템(예를 들어, Kennedy et al., Nature Methods; 7, 973-975 (2010)에 개시됨) 및 FKF1/GIGANTEA 시스템(예를 들어, Yazawa et al., Nat Biotechnol. 2009 Oct;27(10):941-5에 개시됨)의 발현의 생체내 제어를 가능하게 하는 것으로 보고되었다.
G. 킬 스위치
본 발명의 다른 구현예는 킬 스위치를 포함하는 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 킬 스위치는 도입된 ceDNA 벡터를 대상체 시스템으로부터 영구적으로 제거하기 위한 수단으로서 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 사멸되거나 프로그래밍된 세포사를 겪을 수 있게 한다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 ceDNA 벡터에서 킬 스위치의 사용은 전형적으로 대상체가 수용가능하게 상실될 수 있는 제한된 수의 세포 또는 세포자멸사가 바람직한 세포유형(예를 들어, 암 세포)에 대한 ceDNA 벡터의 표적화와 결합될 수 있음을 이해할 것이다. 모든 양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 "킬 스위치"는 투입 생존 신호 또는 다른 명시된 조건의 부재하에 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 신속하고 강력한 세포 사멸을 제공하도록 설계된다. 달리 말하면, 본 명세서에서 ceDNA 벡터에 의해 암호화된 킬 스위치는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 세포 생존을 특정 투입 신호에 의해 정의된 환경으로 제한할 수 있다. 이러한 킬 스위치는 대상체로부터 ceDNA 벡터를 제거하거나 그것이 암호화된 이식유전자를 발현하지 않도록 보장해야 하는 경우 생물학적 생화학적봉쇄 역할을 한다. 따라서, 킬 스위치는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 조건부 생존과 환경 신호를 결합시키는 ceDNA 벡터의 합성 생물학적 회로이다. 일부 구현예에서, 상이한 ceDNA 벡터는 상이한 킬 스위치를 갖도록 설계될 수 있다. 이는 ceDNA 벡터의 칵테일이 사용되는 경우 어느 이식유전자 발현 세포가 사멸되는지를 제어할 수 있게 한다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 모듈식 생물학적봉쇄 회로인 킬 스위치를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포괄된 킬 스위치가 WO2017/059245에 개시되어 있고, 이는 적어도 2개의 억제성 서열의 상호 억제 배열을 포함하여, 환경 신호가 작제물에서 제2 분자의 활성을 억제하도록 하는(예를 들어, 소분자-결합 전사 인자가 독소 생산의 억제로 인한 '생존' 상태를 생성하는데 사용됨) "데드만 킬 스위치"로 지칭되는 스위치를 기술한다. 데드맨 킬 스위치를 포함하는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포에서, 환경 신호가 손실되면, 회로는 영구적으로 '사망' 상태로 전환되며, 여기서 독소는 감압되어 독소 생산이 일어나 세포를 사멸시킨다. 또 다른 구현예에서, 하이브리드 전사 인자(TF)를 사용하여 세포 생존을 위한 복잡한 환경 요건을 구성하는 "패스코드 회로" 또는 "패스코드 킬 스위치"로 지칭되는 합성 생물학적 회로가 제공된다. WO2017/059245에 기재된 데드맨 및 패스코드 킬 스위치는 회로 활성화를 제어하는 환경 조건 및 셀 운명을 제어하는 출력 모듈의 관점에서 모듈화 및 사용자 정의가 가능하기 때문에 ceDNA 벡터에서 사용하는데 특히 유용한다. 엔도뉴클레아제, 예를 들어, EcoRI를 비제한적으로 포함하는 독소의 적합한 선택으로, ceDNA 벡터에 존재하는 패스코드 회로는 ceDNA 벡터를 포함하는 숙주세포를 사멸시킬뿐만 아니라 그의 게놈 및 동반 플라스미드를 분해하는데 사용될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 알려진 다른 킬 스위치는 예를 들어 Jusiak et al, Reviews in Cell Biology and molecular Medicine; 2014; 1-56; Kobayashi et al., PNAS, 2004; 101; 8419-9; Marchisio et al., Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310-319; and in Reinshagen et al., Science Translational Medicine, 2018, 11에 개시된 킬 스위치뿐만 아니라 UUS2010/0175141; US2013/0009799; US2011/0172826; US2013/0109568에 개시된 바와 같이 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포괄된다.
따라서, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 효과기 독소 또는 리포터 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 킬 스위치 핵산 작제물을 포함할 수 있으며, 여기서 효과기 독소(예를 들어, 사멸 단백질) 또는 리포터 단백질의 발현은 사전결정된 조건에 의해 제어된다. 예를 들어, 사전결정된 조건은 세포가 효과기 독소(예를 들어, 사멸 단백질)의 발현을 디폴트로 하지 않고 사멸되는 환경 물질, 예컨대 외인성 제제의 존재일 수 있다. 대안적인 구현예에서, 사전결정된 조건은 둘 이상의 환경 제제의 존재이며, 예를 들어, 세포는 둘 이상의 필요한 외인성 제제가 공급될 때에만 생존할 것이며, 둘 중 어느 것도 없이 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 사멸된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 파괴하기 위해 킬-스위치를 포함하도록 변형되어 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 이식유전자의 생체내 발현을 효과적으로 종결시킨다(예를 들어, 치료 유전자, 단백질 또는 펩타이드 등). 구체적으로, ceDNA 벡터는 정상 생리적 조건 하에서 포유동물 세포에서 기능하지 않는 스위치-단백질을 발현하도록 추가로 유전자 조작된다. 이 스위치-단백질을 특이적으로 표적화하는 약물 또는 환경 조건의 투여시에만, 스위치-단백질을 발현하는 세포가 파괴되어 치료적 단백질 또는 펩타이드의 발현이 종결될 것이다. 예를 들어, HSV-티미딘 키나제를 발현하는 세포는 강시클로비르 및 시토신 데아미나제와 같은 약물의 투여시 사멸될 수 있는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 유전자 요법의 표적에서, Dey and Evans, 단순 포진 바이러스-1 티미딘 키나제(HSV-TK)에 의한 자살 유전자 요법은 You (2011); and Beltinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8699-8704 (1999)에 의해 편집된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 DISE(생존 유전자 제거에 의한 사멸)(Murmann et al., Oncotarget. 2017; 8:84643-84658. 생체내 난소암 세포에서의 DISE 유도)로 지칭되는 siRNA 킬 스위치를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 데드맨 킬 스위치는 세포 성장 환경에서 제제, 예를 들어 외인성 제제의 부재와 같은 사전결정된 조건에 민감하게 세포 반응을 일으키는 생물학적 회로 또는 시스템이다. 이러한 회로 또는 시스템은 사전결정된 조건에 민감한 데드맨 조절 회로를 형성하는 발현 모듈을 포함하는 핵산 작제물을 포함할 수 있으며, 상기 작제물은 조절 회로를 형성하는 발현 모듈을 포함하며, 상기 작제물은 하기를 포함한다:
i) 제1 억제인자 단백질 발현 모듈로서, 제1 억제인자 단백질은 제1 억제인자 단백질 핵산 결합 요소에 결합하고 제1 억제인자 단백질 결합 요소를 포함하는 암호화 서열로부터의 전사를 억제하고, 여기서 제1 억제인자 단백질의 억제 활성은 제1 외인성 제제에 의한 억제에 민감하고, 제1 외인성 제제의 존재 또는 부재가 사전결정된 조건을 확립하는, 제1 억제인자 단백질 발현 모듈;
ii) 제2 억제인자 단백질 발현 모듈로서, 제2 억제인자 단백질은 제2 억제인자 단백질 핵산 결합 요소에 결합하고 제2 억제인자 단백질 결합 요소를 포함하는 암호화 서열로부터의 전사를 억제하고, 여기서 제2 억제인자 단백질은 제1 억제인자 단백질과 상이한 제2 억제인자 단백질 발현 모듈; 및
iii) 제2 억제인자 단백질에 대한 결합 요소를 포함하는 유전 인자에 작동가능하게 연결되어, 제2 억제인자 단백질의 발현이 효과기 발현 모듈로부터의 효과기 발현의 억제를 야기하도록 하는 효과기 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 효과기 발현 모듈로서, 제2 발현 모듈은 상기 요소가 제1 억제인자 단백질에 의해 결합될 때 제2 억제인자 단백질의 전사를 억제하는 제1 억제인자 단백질 핵산 결합 요소를 포함하고, 각각의 모듈은 제1 외인성 제제의 부재하에 제1 억제인자 단백질이 제1 억제인자 단백질 발현 모듈로부터 생산되고 제2 억제인자 단백질 발현 모듈로부터의 전사를 억제하여, 제2 억제인자 단백질에 의한 효과기 발현의 억제가 완화되어 효과기 단백질의 발현을 초래하지만 제1 외인성 제제의 존재하에, 제1 억제제 단백질의 활성이 억제되어, 제2 억제인자 단백질의 발현을 허용하도록 하며, 이는 "오프" 상태에서 효과기 단백질 발현의 발현을 유지하여, "오프" 상태에서 효과기 단백질 발현을 유지하고, 효과기 단백질의 발현을 기본으로 하는 제1 외인성 제제의 제거 또는 부재를 유지하기 위해 회로에 의해 제1 외인성 제제가 요구되도록 한다.
일부 구현예에서, 효과기는 세포 사멸 프로그램을 유도하는 독소 또는 단백질이다. 숙주세포에 독성이 있는 임의의 단백질이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 독소는 그것이 발현되는 세포만을 사멸시킨다. 다른 구현예에서, 독소는 동일한 숙주 유기체의 다른 세포를 사멸시킨다. 세포 사멸을 초래할 다수의 생성물은 데드맨 킬 스위치에 이용될 수 있다. DNA 복제, 단백질 번역 또는 다른 공정을 억제하거나, 또는 예를 들어 숙주세포의 핵산을 분해하는 제제는 특히 유용하다. 회로 활성화시 숙주세포를 사멸시키는 효율적인 기전을 확인하기 위해, 숙주세포의 DNA 또는 RNA를 직접 손상시키는 몇몇 독소 유전자가 시험되었다. 엔도뉴클레아제 ecoRI 21, DNA 자이라제 억제제 ccdB 22 및 리보뉴클레아제-유형 독소 mazF 23은 이들이 잘 특성규명되고, 이. 콜라이에 고유하며, 다양한 사멸 기전을 제공하기 때문에 시험되었다. 회로의 강건성을 증가시키고 회로-의존적 세포 사멸의 독립적인 방법을 제공하기 위해, 시스템은 예를 들어 사멸 유전자를 "오프(off)"상태로 유지하는 억제인자를 추가로 방해하는 표적화된 프로테아제 또는 뉴클레아제를 발현하도록 추가로 적응될 수 있다. 생존 신호의 손실 또는 회수시, 사멸 유전자 억제는 예를 들어 억제인자 단백질 또는 그의 메신저의 활성 분해에 의해 더욱 더 효율적으로 제거된다. 비-제한적인 예로서, mf-Lon 프로테아제가 사용되어, LacI를 분해할뿐만 아니라 분해를 위해 필수 단백질을 표적화하였다. mf-Lon 분해 태그 pdt#1은 단백질 생성물이 mf-Lon 분해에 특히 민감한 5가지 필수 유전자의 3' 말단에 부착될 수 있으며20, ATc 제거 후 세포 생존율을 측정하였다. 시험된 필수 유전자 표적 중, 펩티도글리칸 생합성 유전자 murC는 가장 강력하고 가장 빠른 세포사 표현형을 제공하였다(6시간 내에 생존율 <1 x 10-4).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "사전결정된 투입"은 공지된 방식으로 전사 인자 폴리펩타이드의 활성에 영향을 미치는 제제 또는 상태를 지칭한다. 일반적으로, 이러한 제제는 전사 인자 폴리펩타이드에 결합 및/또는 그의 형태를 변화하여 전사 인자 폴리펩타이드의 활성을 변형시킬 수 있다. 사전결정된 투입의 예는 주어진 숙주 유기체의 생존에 필요하지 않는 (즉, 본 명세서에 기재된 합성 생물학적 회로가 없는 경우) 환경 투입제를 비제한적으로 포함한다. 사전결정된 투입을 제공할 수 있는 조건은 예를 들어 온도, 예를 들어 하나 이상의 인자의 활성이 온도에 민감한 경우, 주어진 파장의 스펙트럼 광을 포함하는 광의 존재 또는 부재, 및 가스, 염, 금속 또는 미네랄의 농도를 포함한다. 환경 투입제는, 예를 들어, 소분자, 생물 제제, 예컨대 페로몬, 호르몬, 성장 인자, 대사물, 영양소 등 및 그의 유사체; 화학물질, 환경 부산물, 금속 이온 및 다른 이러한 분자 또는 제제의 농도; 광 수준; 온도; 기계적 스트레스 또는 압력; 또는 전류 및 전압과 같은 전기 신호를 포함한다.
일부 구현예에서, 리포터는 본 발명의 모듈 또는 프로그래밍가능한 합성 생물학적 회로에 의해 수신된 신호의 강도 또는 활성을 정량화하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 리포터는 단백질이 세포 또는 유기체에서 어디에 위치하는지를 식별하기 위해 다른 단백질 암호화 서열에 인프레임 융합될 수 있다. 루시퍼라제는 본 명세서에 기재된 다양한 구현예, 예를 들어, 저수준의 유전자 발현을 측정하는 데 있어서 효과기 단백질로서 사용될 수 있는데, 이는 루시퍼라제가 부재한 경우 세포가 배경 발광을 거의 또는 전혀 갖지 않는 경향이 있기 때문이다. 다른 구현예에서, 착색된 기질을 생산하는 효소는 분광측정기, 또는 플레이트 판독기를 포함하는, 흡광도 측정을 수행할 수 있는 다른기구를 사용하여 정량화될 수 있다. 루시퍼라제와 같이, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 낮은 신호를 증폭시키는 경향이 있기 때문에 저수준의 유전자 발현을 측정하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 효과기 단백질은 주어진 독소를 분해하거나 달리 파괴할 수 있는 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 효과기 단백질은 기질을 탈취제 생산물로 전환시키는 탈취제 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 효과기 단백질은 소분자 또는 다른 단백질을 인산화 또는 탈인산화하는 효소, 또는, 다른 단백질 또는 DNA를 메틸화 또는 탈메틸화하는 효소일 수 있다.
일부 구현예에서, 효과기 단백질은 수용체, 리간드 또는 용해성 단백질일 수 있다. 수용체는 3가지 도메인을 갖는 경향이 있다: 단백질, 펩타이드 또는 소분자와 같은 리간드 결합을 위한 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 인산화와 같은 신호 형질도입 이벤트의 일부에 빈번하게 참여할 수 있는 세포내 또는 세포질 도메인. 일부 구현예에서, 수송체, 채널 또는 펌프 유전자 서열이 효과기 단백질로서 사용된다. 본 명세서에 기재된 킬 스위치와 함께 사용하기 위한 효과기 단백질의 비-제한적인 예 및 서열은 월드 와이드 웹(parts.igem.org)의 표준 생물학적 부분의 등록부에서 찾을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "조절 단백질"은 표적 핵산 서열로부터의 발현을 조절하는 단백질이다. 조절 단백질은, 예를 들어, 특히 전사 활성제 및 억제인자를 포함하는 전사 인자, 및 전사 인자에 결합하거나 변형하여 그의 활성에 영향을 미치는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조절 단백질은 예를 들어 표적 핵산 서열로부터 발현 조절에 관여하는 단백질 인자를 분해하는 프로테아제를 포함한다. 바람직한 조절 단백질은, 예를 들어, DNA-결합 및 투입제-결합 또는 반응성 요소 또는 도메인이 분리가능하고 이동가능한 모듈식 단백질을 포함하며, 예를 들어 제1 조절 단백질의 DNA 결합 도메인의 제2의 투입제-반응성 도메인에 대한 융합체는 제1 단백질에 의해 인식되는 DNA 서열에 결합하지만 제2 단백질이 정상적으로 반응하는 투입제에 민감한 신규한 단백질을 생산한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "조절제 폴리펩타이드" 및 보다 특이적인 "억제인자 폴리펩타이드"는 명시된 폴리펩타이드 이외에, 예를 들어 "LacI(억제제) 폴리펩타이드", 변이체, 또는 상이한 또는 변이체 투입제에 반응하는 이러한 폴리펩타이드의 유도체를 포함한다. 따라서, LacI 폴리펩타이드의 경우, 락토스 또는 IPTG 이외의 제제에 결합하는 LacI 돌연변이체 또는 변이체가 포함된다. 광범위한 이러한 작용제가 당해 기술에 공지되어 있다.
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
VI. ceDNA 벡터의 상세한 생산 방법
A. 일반적인 생산
본 명세서에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터는 a) 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드 및/또는 ceDNA-배큘로바이러스)을 보유하는 숙주세포(예를 들어 곤충 세포)의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 숙주세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건하에 및 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재 하에서 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있고, 여기서 숙주세포는 바이러스 캡시드 암호화 서열을 포함하지 않는, 단계; 및 b) 숙주세포로부터 ceDNA 벡터를 수확하고 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다. Rep 단백질의 존재는 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 생산하기 위해 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도한다. 그러나, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, AAV 또는 다른 바이러스-기반 벡터에 자연적으로 부과되는 것과 같은 크기 제한은 없다.
숙주세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 존재는 숙주세포로부터 단리된 DNA를 ceDNA 벡터상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 비-변성 겔상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 주형(ceDNA 주형)을 예를 들어, Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879에 기재된 바와 같이, 비-바이러스 DNA 벡터의 생산시 그들 자신의 게놈에 안정적으로 통합시킨 숙주세포주의 사용을 제공한다. 바람직하게는, Rep는 약 3의 MOI에서 숙주세포에 첨가된다. 숙주세포주가 포유동물 세포주, 예를 들어 HEK293 세포인 경우, 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스 바이러스와 같은 제2 벡터가 Rep 단백질을 세포 내로 도입하여 Rep 및 헬퍼 바이러스의 존재 하에서 ceDNA의 절개 및 증폭을 허용하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터를 제조하는데 사용되는 숙주세포는 곤충 세포이고, 예를 들어 도 4a~4c 및 실시예 1에 기재된 바와 같이 배큘로바이러스는 Rep 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 ceDNA에 대한 비-바이러스 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형을 둘다 전달하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 숙주세포는 Rep 단백질을 발현하도록 조작된다.
이어서 ceDNA 벡터가 수확되고 숙주세포로부터 단리된다. 세포로부터 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터를 수확 및 수집하는 시간은 ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하도록 선택되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수확 시간은 세포 생존율, 세포 형태, 세포 성장 등을 고려하여 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 ceDNA 벡터를 생산하기 위한 배큘로바이러스 감염 후, 그러나 배큘로바이러스 독성으로 인해 대다수의 세포가 죽기 시작하기 전에 충분한 조건 하에서 성장하고, 충분한 시간에 수확한다. Qiagen 엔도-프리 플라스미드 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 DNA 벡터가 단리될 수 있다. 플라스미드 분리를 위해 개발된 다른 방법들도 DNA 벡터에 적합할 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
DNA 벡터는 DNA의 정제를 위해 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로서 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 극미립자로서 정제된다.
ceDNA 벡터의 존재는 DNA 벡터상에서 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 세포로부터 단리된 벡터 DNA를 소화시키고, 겔 전기영동을 사용하여 소화 및 소화되지 않은 DNA 물질 둘 다를 분석하여 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있다. 도 4c 및 4e는 본원의 방법에 의해 생산된 폐쇄된 말단 ceDNA 벡터의 존재를 확인하기 위한 일 구현예를 도시한다. 예를 들어, 도 5는 실시예에 기재된 바와 같은 이들 벡터를 생산하기 위한 일 구현예를 사용하여 다중 플라스미드 작제물로부터 ceDNA의 생산을 확인하는 겔이다.
B. ceDNA 플라스미드
ceDNA-플라스미드는 나중에 ceDNA 벡터의 생산에 사용되는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 전사 방향으로 작동가능하게 연결된 성분으로서 적어도 하기를 제공하기 위해 공지된 기술을 사용하여 구축될 수 있다: (1) 5' ITR 서열; (2) 시스-조절 인자, 예를 들어 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 향상제 등을 함유하는 발현 카세트; 및 (3) 3' ITR 서열로서, 여기서 3' ITR 서열이 5' ITR 서열에 대해 비대칭인 서열. 일부 구현예에서, ITR에 의해 측접된 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 발현 카세트는 AAV 게놈의 rep 및 캡 암호화 영역을 대체한다.
일 양태에서, ceDNA 벡터는 본 명세서에서 제1 아데노-연관된 바이러스(AAV) 역전된 말단 반복(ITR), 이식유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 돌연변이된 또는 변형된 AAV ITR 순서로 암호화하는 "ceDNA-플라스미드"로 지칭되는 플라스미드로부터 수득되며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드는 AAV 캡시드 단백질 암호화 서열이 결여되어 있다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형된 또는 돌연변이된 AAV ITR, 이식유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 야생-형 AAVITR의 순서로 암호화하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 암호화 서열이 결여되어 있고, 5' 및 3' ITR은 서로에 대해서 비대칭이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형된 또는 돌연변이된 AAV ITR, 이식유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 돌연변이된 또는 변형된 AAV ITR의 순서로 암호화하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 암호화 서열이 결여되어 있고, 5' 및 3' 변형된 ITR은 상이하고, 동일한 변형을 갖지 않는다.
추가의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 시스템에는 바이러스 캡시드 단백질 암호화 서열이 결여되어 있다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐만 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 결여되어 있다). 또한, 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 또한 AAV Rep 단백질 암호화 서열이 결여되어 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 기능성 AAV 캡 및 AAV2에 대한 AAV rep 유전자 GG-3' 및 가변성 회문 서열이 결여되어 있고 헤어핀 형성이 가능하다.
본 발명의 ceDNA-플라스미드는 당해 분야에서 잘 알려진 임의의 AAV 혈청형의 게놈의 천연 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 생산될 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ, 및 AAV-DJ8 게놈으로부터 유래된다. 예를 들어, NCBI: NC　002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin 및 Smith, The Springer Index of Viruses, Springer에 의해 유지되는 URL(www 웹 어드레스: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)에서 이용가능함(참고 - URL에 대한 참고문헌 또는 데이터베이스는 본 출원의 유효 출원일로서 URL 또는 데이터베이스의 내용을 지칭함) 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV2 게놈으로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 이들 AAV 게놈 중 하나로부터 유래된 5' 및 3' ITR에 포함하도록 유전자 조작된 합성 백본이다.
ceDNA-플라스미드는 ceDNA 벡터-생산 세포주의 확립에 사용하기 위한 선택가능한 또는 선택 마커를 선택적으로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 선택 마커는 3' ITR 서열의 다운스트림(즉, 3')에 삽입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선택 마커는 5' ITR 서열의 업스트림(즉, 5')에 삽입될 수 있다. 적합한 선택 마커는 예를 들어 약물 내성을 부여하는 마커를 포함한다. 선택 마커는 예를 들어 블라스티사이딘 S-저항 유전자, 카나마이신, 게네티신 등일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약물 선택 마커는 블라스티사이딘 S-저항 유전자이다.
예시적인 ceDNA(예를 들어, rAAV0)는 rAAV 플라스미드로부터 생산된다. rAAV 벡터의 생산 방법은 하기를 포함할 수 있다: (a) 상기 기재된 바와 같은 rAAV 플라스미드를 숙주세포에 제공하는 단계로서, 상기 숙주세포 및 상기 플라스미드는 캡시드 단백질 암호화 유전자가 결여된, 단계, (b) ceDNA 게놈의 생산을 허용하는 조건하에서 숙주세포를 배양하는 단계, 및 (c) 세포를 수확하고, 상기 세포로부터 생산된 AAV 게놈을 단리하는 단계.
C. ceDNA 플라스미드로부터 ceDNA 벡터를 제조하는 예시적인 방법
캡시드-없는 ceDNA 벡터를 제조하는 방법, 특히 생체내 실험에 충분한 벡터를 제공하기에 충분히 높은 수율을 갖는 방법이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 생산 방법은 (1) 발현 카세트 및 2개의 비대칭 ITR 서열을 포함하는 핵산 작제물을 숙주세포(예를 들어, Sf9 세포) 내로 도입하는 단계, (2) 선택적으로, 예를 들어, 플라스미드 상에 존재하는 선택 마커를 사용하여 클론 세포주를 확립하는 단계, (3) Rep 암호화 유전자를 (상기 유전자를 운반하는 배큘로바이러스에 의한 형질감염 또는 감염에 의해) 상기 곤충 세포에 도입하는 단계; 및 (4) 세포를 수확하고 ceDNA 벡터를 정제하는 단계. 캡시드-비함유 AAV 벡터의 생산을 위해 상기 기재된 발현 카세트 및 2개의 ITR 서열을 포함하는 핵산 작제물은 cfAAV-플라스미드, 또는 하기 기재된 바와 같이 cfAAV-플라스미드로 생산된 백미드 또는 배큘로바이러스의 형태일 수 있다. 핵산 작제물은 형질감염, 바이러스 형질도입, 안정적인 통합 또는 당해 분야에 알려진 다른 방법에 의해 숙주세포로 도입될 수 있다.
D. 세포주:
ceDNA 벡터의 생산에 사용되는 숙주세포주는 스포도프테라 프루지페르다, 예컨대 Sf9 Sf21, 또는 트리코플러시아 ni 세포 또는 다른 무척추동물, 척추동물 또는 포유동물 세포를 포함하는 다른 진핵 세포주로부터 유래된 곤충 세포주를 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 세포주, 예컨대 HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, 단핵구, 및 성숙한 및 미성숙한 수지상 세포가 또한 사용될 수 있다. 숙주세포주는 고수율 ceDNA 벡터 생산을 위한 ceDBA-플라스미드의 안정한 발현을 위해 형질감염될 수 있다.
ceDNA-플라스미드는 당 업계에 공지된 시약(예를 들어, 리포좀, 인산칼슘) 또는 물리적 수단(예를 들어, 전기천공)을 사용한 일시적 형질감염에 의해 Sf9 세포로 도입될 수 있다. 대안적으로, ceDNA-플라스미드를 게놈에 안정적으로 통합시킨 안정한 Sf9 세포주가 확립될 수 있다. 이러한 안정한 세포주는 상기 기재된 바와 같이 선택 마커를 ceDNA-플라스미드에 포함시킴으로써 확립될 수 있다. 세포주를 형질감염시키기 위해 사용된 ceDNA-플라스미드가 항생제와 같은 선택 마커를 포함하는 경우, ceDNA-플라스미드로 형질감염되고 ceDNA-플라스미드 DNA를 그의 게놈에 통합시킨 세포는 세포 성장 배지에 항생제를 첨가시킴으로써 선택될 수 있다. 이어서, 세포의 저항성 클론을 단일-세포 희석 또는 콜로니 전달 기술에 의해 단리하고, 증식시킬 수 있다.
E. ceDNA 벡터 단리 및 정제:
ceDNA 벡터를 수득하고 단리하는 방법의 예는 도 4a 내지 4e 및 아래의 특정 예에 기재되어 있다. 본 명세서에 개시된 ceDNA-벡터는 ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드 또는 ceDNA-배큘로바이러스로 추가로 형질전환된 AAV Rep 단백질(들)을 발현하는 생산자 세포로부터 수득될 수 있다. ceDNA 벡터의 생산에 유용한 플라스미드는 도 8a(Rep BIIC 생산에 유용), 도 8b(ceDNA 벡터를 얻기 위해 사용된 플라스미드)에 도시된 플라스미드를 포함한다.
일 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드(Rep-플라스미드), 백미드(Rep-백미드), 또는 배큘로바이러스(Rep-배큘로바이러스)에서 생산자 세포로 전달된 AAV Rep 단백질(Rep 78 또는 68)을 암호화한다. Rep-플라스미드, Rep-백미드 및 Rep-배큘로바이러스는 상기 기재된 방법으로 생산할 수 있다.
예시적인 ceDNA 벡터인 ceDNA-벡터를 생산하는 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명의 ceDNA 벡터를 생산하기 위해 사용된 발현 작제물은 플라스미드(예를 들어, ceDNA-플라스미드), 백미드(예를 들어, ceDNA-백미드) 및/또는 배큘로바이러스(예를 들어, ceDNA-배큘로바이러스)일 수 있다. 단지 예로서, ceDNA-벡터는 ceDNA-배큘로바이러스 및 Rep-배큘로바이러스로 공동-감염된 세포로부터 생산될 수 있다. Rep-배큘로바이러스로부터 생산된 Rep 단백질은 ceDNA-배큘로바이러스를 복제하여 ceDNA-벡터를 생산할 수 있다. 대안적으로, ceDNA 벡터는 Rep-플라스미드, Rep-백미드 또는 Rep-배큘로바이러스에 전달된 AAV Rep 단백질(Rep78/52)을 암호화하는 서열을 포함하는 작제물로 안정적으로 형질도입된 세포로부터 생산될 수 있다. ceDNA-배큘로바이러스는 세포에 일시적으로 형질감염될 수 있고, Rep 단백질에 의해 복제되고, ceDNA 벡터를 생산할 수 있다.
백미드(예를 들어, ceDNA-백미드)는 허용된 곤충 세포 예컨대 Sf9, Sf21, Tni(트리코플러시아 ni) 세포, 하이 파이브(High Five) 세포로 형질감염될 수 있고, 비대칭 ITR 및 발현 카세트를 포함하는 서열을 포함하는 재조합 배큘로바이러스인 ceDNA-배큘로바이러스를 생산할 수 있다. ceDNA-배큘로바이러스는 곤충 세포 내로 다시 감염되어 차세대 재조합 배큘로바이러스를 수득할 수 있다. 선택적으로, 단계는 재조합 배큘로바이러스를 대량으로 생산하기 위해 한 번 또는 여러 번 반복될 수 있다.
세포로부터 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터를 수확하고 수집하는 시간은 ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하도록 선택되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수확 시간은 세포 생존율, 세포 형태, 세포 성장 등을 고려하여 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포는 배큘로바이러스 감염 후 충분한 시간 후에 수확되어, ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터)를 생산하지만, 바이러스 독성 때문에 다수의 세포가 전에 죽기 시작한다. ceDNA-벡터는 Qiagen ENDO-FREE PLASMID® 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 Sf9 세포로부터 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법은 ceDNA 벡터에도 적용할 수 있다. 일반적으로, 상업적으로 입수가능한 DNA 추출 키트뿐만 아니라 임의의 공지된 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
대안적으로, 정제는 세포 펠릿을 알칼리 용해 공정에 적용하여, 생성된 용해물을 원심분리하고 크로마토그래피 분리를 수행함으로써 실시될 수 있다. 하나의 비-제한적인 예로서, 상기 공정은 핵산을 보유하는 이온 교환 컬럼(예를 들어 SARTOBIND Q®)에 상청액을 장입한 후 (예를 들어 1.2M NaCl 용액으로) 용리시키고, 추가로 겔 여과 컬럼(예를 들어, 6 패스트 플로우 GE) 상에서 크로마토그래피 정제를 수행함으로써 수행될 수 있다. 이어서, 캡시드-비함유 AAV 벡터는 예를 들어 침전에 의해 회수된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 또한 엑소좀 또는 극미립자 형태로 정제될 수 있다. 다수의 세포 유형이 막 미세소포 쉐딩을 통해 가용성 단백질뿐만 아니라 복합 단백질/핵산 전달대상물을 방출한다는 것이 당 업계에 공지되어 있다(Cocucci et al, 2009; EP 10306226.1). 상기 소포는 미세소포(또한, 극미립자로도 지칭됨) 및 엑소좀(나노소포로도 지칭됨)을 포함하며, 이 둘 모두는 단백질 및 RNA를 전달대상물로서 포함한다. 미세소포는 원형질막의 직접적인 발아로부터 생성되고, 다중소포 엔도좀과 원형질막의 융합시 엑소좀이 세포외 환경으로 방출된다. 따라서, ceDNA 벡터-함유 미세소포 및/또는 엑소좀은 ceDNA-플라스미드 또는 ceDNA-플라스미드로 생산된 백미드 또는 배큘로바이러스로 형질도입된 세포로부터 단리될 수 있다.
배양 배지를 20,000 x g에서 여과 또는 초원심분리하고, 엑소좀을 100,000 x g에서 처리함으로써 미세소포가 단리될 수 있다. 초원심분리의 최적 기간은 실험적으로 결정될 수 있으며, 소포가 단리되는 특정 세포 유형에 의존할 것이다. 바람직하게는, 배양 배지가 먼저 저속 원심분리(예를 들어, 2000 x g에서 5~20분 동안)로 제거되고, 예를 들어 AMICON® 스핀 칼럼(밀리포어, 왓포드, 영국)을 사용하여 스핀 농도에 적용한다. 미세소포 및 엑소좀은 미세소포 및 엑소좀에 존재하는 특정 표면 항원을 인식하는 특정 항체를 사용함으로써 FACS 또는 MACS를 통해 추가로 정제될 수 있다. 다른 미세소포 및 엑소좀 정제 방법은 면역침강, 친화성 크로마토그래피, 여과 및 특정 항체 또는 압타머로 코팅된 자성 비드를 비제한적으로 포함한다. 정제시, 소포는 예를 들어 포스페이트-완충 식염수로 세정된다. ceDNA-함유 소포를 전달하기 위해 미세소포 또는 엑소좀을 사용하는 것의 하나의 이점은 이들 소포가 각각의 세포 유형 상의 특정 수용체에 의해 인식되는 막 단백질을 포함함으로써 다양한 세포 유형을 표적으로 할 수 있다는 점이다.(또한, EP 10306226 참고)
본 발명의 또 다른 양태는 ceDNA 작제물을 그들 자신의 게놈에 안정적으로 통합한 숙주세포주로부터 ceDNA 벡터를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로서 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 극미립자로서 정제된다.
도 5는 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 ceDNA-플라스미드 작제물로부터 ceDNA의 생산을 확인하는 겔을 보여준다. ceDNA는 실시예에서의 도 4d와 관련하여 논의된 바와 같이 겔에서 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다. ceDNA 생산 공정 및 중간체의 다른 특성은 도 6a 및 6b 및 실시예에 기재된 바와 같이 도 7a 및 7b에 요약되어 있다.
VII. 약제학적 조성물
또 다른 양태에서, 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
본 명세서에 개시된 DNA-벡터는 대상체의 세포, 조직 또는 장기에 생체내 전달을 위해 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA-벡터 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터는 원하는 치료적 투여 경로(예를 들어, 비경구 투여)에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포내질 주사를 통한 수동적인 조직 형질도입이 또한 고려된다. 치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산물, 리포좀 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주입가능 용액은 필요에 따라 ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적합한 완충액에 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다.
ceDNA 벡터를 포함하는 약제학적 활성 조성물은 핵산내 이식유전자를 수령체의 세포로 전달하여 그 안에 이식유전자의 치료적 발현을 생성하도록 제형화될 수 있다. 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 국소, 전신, 양막내, 척추강내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 장기, 조직내(예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 척추강내, 방광내, 결막(예를 들어, 궤도 외, 안와내, 안구뒤, 망막내, 망막하, 맥락막, 하위-맥락막, 기질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내, 및 점막(예를 들어, 경구, 직장, 비강) 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포내질 주사를 통한 수동적인 조직 형질도입이 또한 고려된다.
치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 본 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산물, 리포좀 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주입가능 용액은 필요에 따라 ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적합한 완충액에 혼입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다.
핵산을 세포로 전달하기 위한 다양한 기술 및 방법이 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, ceDNA와 같은 핵산은 지질 나노입자(LNP), 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 리포플렉스 또는 코어-쉘 나노입자로 제형화될 수 있다. 전형적으로, LNP는 핵산(예를 들어, ceDNA) 분자, 하나 이상의 이온화가능한 또는 양이온성 지질(또는 이의 염), 하나 이상의 비-이온성 또는 중성 지질(예를 들어, 인지질), 응집을 방지하는 분자(예를 들어, PEG 또는 PEG-지질 콘주게이트), 및 선택적으로 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)로 제형화될 수 있다.
ceDNA와 같은 핵산을 세포로 전달하는 또 다른 방법은 세포에 의해 내재화된 리간드와 핵산을 콘주게이팅시키는 것이다. 예를 들어, 리간드는 세포 표면상의 수용체에 결합하고, 세포내이입을 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산에서 뉴클레오타이드에 공유결합될 수 있다. 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 예시적인 콘주게이트는 예를 들어 WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 및 WO2017/177326에 기재되어 있다.
ceDNA와 같은 핵산은 또한 형질감염에 의해 세포로 전달될 수 있다. 유용한 형질감염 방법은 지질-매개된 형질감염, 양이온성 중합체-매개된 형질감염 또는 인산칼슘 침전을 비제한적으로 포함한다. 형질감염 시약은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, TurboFect 형질감염 시약(Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject 시약(Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P 단백질 형질감염 시약(New England Biolabs), CHARIOT™ 단백질 전달 시약(Active Motif), PROTEOJUICE™ 단백질 형질감염 시약(EMD Millipore), 293fectin, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™(Roche, Basel, Switzerland), FUGENE™ HD(Roche), TRANSFECTAM™(Transfectam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™(Promega), TFX-20™(Promega), TFX-50™(Promega), TRANSFECTIN™(BioRad, Hercules, Calif.), SILENTFECT™(Bio-Rad), Effectene™(Qiagen, Valencia, Calif.), DC-chol(Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™(Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.), DHARMAFECT 1™(Dharmacon, Lafayette, Colo.), DHARMAFECT 2™(Dharmacon), DHARMAFECT 3™(Dharmacon), DHARMAFECT 4™(Dharmacon), ESCORT™ III(Sigma, St. Louis, Mo.), 및 ESCORT™ IV(Sigma Chemical Co.)을 비제한적으로 포함한다. ceDNA와 같은 핵산은 또한 당해 분야의 숙련가에게 공지된 미세유체공학 방법을 통해 세포로 전달될 수 있다.
생체내 또는 생체외에서 핵산의 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션(미국 특허 번호 제5,049,386호; 제4,946,787호 및 상업적으로 입수가능한 시약, 예컨대 Transfectam™ 및 Lipofectin™ 참조), 미세주입, 바이오리스틱, 바이로좀, 리포좀을 포함한다. 리포좀(예를 들어, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 번호 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 및 제4,946,787호 참고), 면역리포좀, 다중양이온 또는 지질:핵산 콘주게이트, 네이키드 DNA, 및 DNA의 제제-향상된 흡수를 포함한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용한 초음파천공도 핵산의 전달에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 또한 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 비제한적으로 포함하는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉시키기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 이용가능하고, 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 보다 즉각적이고 또 다른 경로보다 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산 벡터 ceDNA 벡터의 도입 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,928,638호에 기재된 방법에 의해 조혈 줄기 세포로 전달될 수 있다.
본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 대상체에서 세포 또는 표적 장기로 전달하기 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포이다. 리포좀은 약제학적 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 그들은 세포막과 융합하고 그의 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약제학적 성분(API)을 전달함으로써 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 면역원성/항원성을 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 작용기를 갖는 하나 이상의 화합물(소위 "페길화(PEG-ylated) 화합물")을 포함하고, 화합물(들)에 대한 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시키는 리포좀 제형을 제공한다. 또는 리포좀 제형은 단순히 추가 성분으로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함한다. 이러한 양태에서, PEG 또는 PEG 작용기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 수 시간 내지 수 주에 걸쳐 연장 방출 또는 조절 방출 프로파일을 갖는 API를 전달할 리포좀 제형을 제공한다. 일부 관련된 양태에서, 리포좀 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련된 양태에서, 리포좀 제형은 고온에서 물리적 전이를 겪는 성분으로 API를 캡시드화하여 수 시간 내지 수주에 걸쳐 API를 방출한다.
일부 양태에서, 리포좀 제형은 스핑고미엘린 및 본 명세서에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 옵티좀을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질, HSPC(수소첨가된 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(에그 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(dierucoyl포스파티딜콜린); DOPE(디오레올리-sn-글리세로-포스포에탄올아민). 콜레스테릴 설페이트(CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), DOPC(디오레올리-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 콜레스테롤 및 페길화 지질을 56:38:5의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형의 전체 지질 함량은 2~16 mg/mL이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및 페길화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및 페길화 지질을 각각 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 콜레스테롤 및 페길화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 페길화 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 콘주게이트 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 하나 이상의 지질 및 에탄올아민 작용기를 함유하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의: 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 DOPC/DEPC; 및 DOPE를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약제학적 부형제, 예를 들어 수크로스 및/또는 글리신을 추가로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 구조상 단일 라멜라 또는 다중층이 있는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다중-소포성 입자 및/또는 발포체-기반 입자를 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 일반적인 나노입자에 비해 크기가 크고 약 150 내지 250 nm인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 외부에 단리된 ceDNA를 갖는 혼합물에 약염기를 첨가함으로써 본원에 개시되거나 기재된 ceDNA 벡터로 제조되고 장입된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포좀 외부의 pH를 약 7.3으로 증가시키고 API를 리포좀으로 유도한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 내부에서 산성인 pH를 갖는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우, 리포좀 내부는 pH 4~6.9, 더욱 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 리포좀내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 중합체성 또는 비-중합체성 고전하 음이온 및 리포좀내 포착제, 예를 들어 폴리포스페이트 또는 수크로스 옥타설페이트가 이용된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
리포좀, 나노캡슐, 극미립자, 마이크로구형체, 지질 입자, 소포 등과 같은 전달 시약은 본 개시내용의 조성물을 적합한 숙주세포로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 핵산은 지질 입자, 리포좀, 소포, 나노구형체, 나노입자, 금 입자 등으로 캡슐화되어 전달되도록 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 본 명세서에 개시된 핵산의 약제학적으로 허용가능한 제형의 도입에 바람직할 수 있다.
당해 분야에 공지된 다양한 전달 방법 또는 이의 변형을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 표적화된 세포로의 DNA 진입이 촉진되도록 기계적, 전기, 초음파, 유체역학적 또는 레이저-기반 에너지에 의해 세포막에 일시적 침투를 함으로써 전달된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 크기-제한 채널을 통해 또는 당 업계에 공지된 다른 수단을 통해 세포를 압착함으로써 일시적으로 세포막을 파괴함으로써 전달될 수 있다. 일부 경우에, ceDNA 벡터 단독이 피부, 흉선, 심장 근육, 골격근 또는 간 세포에 네이키드 DNA로서 직접 주입된다.
일부 경우에, ceDNA 벡터는 유전자 건에 의해 전달된다. 캡시드-비함유 AAV 벡터로 코팅된 금 또는 텅스텐 구형 입자(1~3 μm 직경)는 가압된 가스를 통해 표적 조직 세포로 침투함으로써 고속으로 가속화될 수 있다.
일부 구현예에서, 전기천공은 ceDNA 벡터를 전달하는데 사용된다. 전기천공은 한 쌍의 전극을 조직 내로 삽입함으로써 세포막 표적 세포 조직의 일시적인 불안정화를 야기하여 불안정화 막의 주변 배지 내의 DNA 분자가 세포의 세포질 및 핵형질 내로 침투할 수 있게 한다. 전기천공은 피부, 폐 및 근육과 같은 많은 유형의 조직에 생체내에서 사용되어왔다.
일부 경우에, ceDNA 벡터는 유체역학적 주사에 의해 전달되는데, 이는 임의의 수용성 화합물 및 입자를 사지 전체의 내부 장기 및 골격근으로 세포내로 직접 전달하기 위한 간단하고 매우 효율적인 방법이다.
일부 경우에, ceDNA 벡터는 내부 장기 또는 종양의 세포 내로 DNA 입자의 세포내 전달을 촉진하기 위해 막에 나노범위 기공을 만들어 초음파에 의해 전달되므로, 플라스미드 DNA의 크기 및 농도는 시스템의 효율에서 큰 역할을 한다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 핵산을 함유하는 입자를 표적 세포 내로 농축시키기 위해 자기장을 사용하여 자기감염에 의해 전달된다.
일부 경우에, 화학적 전달 시스템은 예를 들어 양이온성 리포좀/미셀 또는 양이온성 중합체에 속하는 다중양이온성 나노머 입자에 의한 음으로 하전된 핵산의 압축을 포함하는 나노머 복합체를 사용함으로써 사용될 수 있다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질은 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아니딘 함유 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체(예를 들어, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-라이신, 프로타민, 기타 양이온성 중합체), 및 지질-폴리머 하이브리드를 비제한적으로 포함한다.
A. 엑소좀:
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 엑소좀에 패키지되어 전달된다. 엑소좀은 다중소포체와 원형질막의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 세포내이입 기원의 작은 막 소포이다. 그들의 표면은 공여체 세포의 세포막으로부터의 지질 이중층으로 구성되며, 이들은 엑소좀을 생산한 세포로부터의 사이토졸을 함유하고, 표면상의 친계 세포로부터 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 상피 세포, B 및 T 림프구, 비만 세포(MC) 및 수지상 세포(DC)를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생산된다. 일부 구현예에서, 직경이 10 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 30 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 100 nm인 엑소좀이 사용되는 것으로 구상된다. 공여체 세포를 사용하거나 특정 핵산을 세포에 도입함으로써 표적 세포로의 전달을 위해 엑소좀이 단리될 수 있다. 당 업계에 공지된 다양한 접근법을 사용하여 본 발명의 캡시드-비함유 AAV 벡터를 함유하는 엑소좀을 생성할 수 있다.
B. 극미립자/나노입자:
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 지질 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507에 개시된 바와 같이, 지질 나노입자는 이온화가능한 아미노 지질(예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질(폴리에틸렌 글리콜-디미리스톨글리세롤, PEG-DMG)을 포함한다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 1000 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 300 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 300 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 200 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 25 내지 약 200 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제제(예를 들어, 복수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는 평균 크기(예를 들어, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 더욱 전형적으로 평균 크기가 약 100 nm 이하인 크기 분포를 갖는다.
당 업계에 공지된 다양한 지질 나노입자를 사용하여 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자를 사용하는 다양한 전달 방법은 미국 특허 번호 제9,404,127호, 제9,006,417호 및 제9,518,272호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터는 금 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 핵산은 예를 들어 Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083에 기재된 바와 같이 금 나노입자에 공유결합되거나 금 나노입자에 비-공유결합될 수 있다(예를 들어, 전하-전하 상호작용에 의해 결합됨). 일부 구현예에서, 금 나노입자-핵산 콘주게이트는 예를 들어 미국 특허 번호 제6,812,334호에 기재된 방법을 사용하여 생산된다.
C. 리포좀
리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 리포좀은 개선된 혈청 안정성 및 순환 절반-배로 개발되었다(미국 특허 번호 제5,741,516호). 또한, 잠재적 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다(미국 특허 번호 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호).
리포좀은 다른 절차에 의해 형질감염에 정상적으로 저항성인 수많은 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되어왔다. 또한, 리포좀은 바이러스-기반 전달 시스템의 전형적인 DNA 길이 제한이 없다. 리포좀은 유전자, 약물, 방사선요법 제제, 바이러스, 전사 인자 및 알로스테릭 효과기를 다양한 배양 세포주 및 동물에 도입하는데 효과적으로 사용되어왔다. 또한, 리포좀-매개된 약물 전달의 효과를 검사하는 몇 가지 성공적인 임상 시험이 완료되었다.
리포좀은 수성 매질에 분산되어 자발적으로 다중층 동심성 이중층 소포(일명 다중층 소포(MLV)라고도 함)를 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 μm의 직경을 갖는다. MLV의 초음파처리에 의해, 코어에 수용액을 함유하는 200 내지 500 ANG 범위의 직경을 갖는 작은 단층 소포(SUV)가 형성된다.
일부 구현예에서, 리포좀은 양이온성 지질을 포함한다. 용어 "양이온성 지질"은 극성 및 무극성 도메인 둘 다를 갖고 생리적 pH에서 또는 그 근처에서 양으로 하전될 수 있고, 핵산과 같은 다중음이온에 결합하고, 핵산의 세포로의 전달을 촉진하는 지질 및 합성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 포화된 및 불포화된 알킬 및 지환족 에테르 및 아민, 아미드 또는 이의 유도체의 에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 직쇄, 분지형 알킬, 알케닐 기 또는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 1 내지 약 25개의 탄소 원자(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 탄소 원자)를 함유한다 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 25개 초과의 탄소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알켄 기는 6개 이상의 탄소 원자를 갖는다. 양이온성 지질은 또한 일부 구현예에서 하나 이상의 지환족 기를 포함할 수 있다. 지환족 기의 비-제한적인 예는 콜레스테롤 및 다른 스테로이드기를 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 하나 이상의 반대이온으로 제조된다. 반대이온(음이온)은 Cl-, Br-, I-, F-, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 설페이트, 아질산염, 및 니트레이트를 비제한적으로 포함한다.
양이온성 지질의 비-제한적인 예는 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민(PAMAM) 스타버스트 덴드리머, 리포펙틴(DOTMA 및 DOPE의 조합), 리포펙타제, 리포펙타민™(예를 들어, 리포펙타민™ 2000), DOPE, 사이토펙틴(Gilead Sciences, Foster City, Calif.), 및 유펙틴(Eufectins)(JBL, San Luis Obispo, Calif.)을 포함한다. 예시적인 양이온성 리포좀은 N-[1-(2,3-디올레올 옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸염화암모늄(DOTMA), N-[1-(2,3-디올레올 옥시)-프로필]N,N,N-트리메틸암모늄 메틸설페이트(DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 2,3,-디올레일옥시-N-[2(스페르민카복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB)로부터 제조될 수 있다. 핵산(예를 들어, CELiD)은 또한 예를 들어 폴리(L-라이신) 또는 아비딘과 착화될 수 있고 지질은 이 혼합물, 예를 들어 스테릴-폴리(L-라이신)에 포함될 수 있거나 포함되지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 미국 특허 번호 제8,158,601호에 기재된 양이온성 지질, 또는 미국 특허 번호 제8,034,376호에 기재된 바와 같은 폴리아민 화합물 또는 지질을 사용하여 전달된다.
D. 콘주게이트
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 접합된다(예를 들어, 세포 흡수를 증가시키는 제제에 공유결합된다. "세포 흡수를 증가시키는 제제"는 지질 막을 통한 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친유성 화합물(예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 침투 펩타이드(CPP)(예를 들어, 페네트라틴, TAT, Syn1B 등) 및 폴리아민(예를 들어, 스페르민)에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 제제의 추가 예는 예를 들어 Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 중합체(예를 들어, 중합체 분자) 또는 폴레이트 분자(예를 들어, 엽산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 중합체에 접합된 핵산의 전달은 예를 들어 WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재된 바와 같이 당 업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 예를 들어 미국 특허 번호 제8,987,377호에 기재된 바와 같은 폴리(아미드) 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 핵산은 미국 특허 번호 제8,507,455호에 기재된 바와 같은 엽산 분자에 접합된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 예를 들어 미국 특허 번호 제8,450,467호에 기재된 바와 같이 탄수화물에 접합된다.
E. 나노캡슐
대안적으로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 물질을 안정적이고 재현가능한 방식으로 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자(약 0.1 ㎛ 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이들 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용될 것으로 고려된다.
VIII. ceDNA 벡터를 전달하는 방법
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 다양한 적합한 방법에 의해 시험관내 또는 생체내 표적 세포로 전달될 수 있다. ceDNA 벡터만 적용하거나 주입할 수 있다. CeDNA 벡터는 형질감염 시약 또는 다른 물리적 수단의 도움없이 세포로 전달될 수 있다. 대안적으로, ceDNA 벡터는 세포로의 DNA의 진입을 촉진하는 임의의 공지된 형질감염 시약 또는 다른 공지된 물리적 수단, 예를 들어 리포좀, 알코올, 폴리라이신-풍부 화합물, 아르기닌-풍부 화합물, 인산 칼슘, 미세소포, 미세주입, 전기천공 등을 사용하여 전달될 수 있다.
대조적으로, 본 명세서에 개시된 캡시드-비함유 AAV 벡터를 사용한 형질도입은 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온으로 형질도입하기 어려운 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.
또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 CNS(예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여된다. ceDNA 벡터는 척수, 뇌간(연수, 뇌교), 중뇌(성 상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체샘, 흑질, 송과선), 소뇌, 종뇌(선상체, 후두를 포함하는 대뇌, 후두부, 두정 및 전두엽, 피질, 기저핵, 해마 및 편도문(portaamygdala)), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구에 도입될 수 있다. ceDNA 벡터는 또한 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 다른 영역에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터는 (예를 들어, 요추 천자에 의해) 뇌척수액으로 전달될 수 있다. 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 ceDNA 벡터가 혈관 내로 CNS에 추가로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 척추강내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내(예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에서), 비강 내, 귀내, 안구내(예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위(예를 들어, 테논 하부의 영역) 전달뿐만 아니라 운동 뉴런으로의 역행 전달을 통한 근육내 전달을 비-제한적으로 포함하여 당 업계에 공지된 임의의 경로에 의해 CNS의 원하는 영역(들)에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 CNS의 원하는 영역 또는 구획에 직접 주사(예를 들어, 뇌정위적 주사)에 의해 액체 제형으로 투여된다. 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 원하는 영역에 국소 적용하거나 에어로졸 제형의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 액적의 국소 적용에 의해 될 수 있다. 추가의 대안으로서, ceDNA 벡터는 고체 서방형 제제로서 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호 참고). 또 다른 추가의 구현예에서, ceDNA 벡터는 운동 뉴런(예를 들어, 근위축성 측삭 경화증(ALS); 척추 근육 위축증(SMA) 등)을 포함하는 질환 및 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직으로 전달될 수 있다.
VIII. ceDNA 벡터의 추가 사용
본원에 제공된 조성물 및 ceDNA 벡터는 다양한 목적으로 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 연구 목적, 예를 들어 이식유전자를 보유한 체세포성 형질전환 동물 모델을 생산하기 위해, 예를 들어 이식유전자 산물의 기능을 연구하기 위해 사용되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생산하기 위해 사용되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화한다. 이식유전자는 발현 감소, 발현 부족 또는 유전자 기능 이상화 연관된 질환을 치료하는데 충분한 양으로 대상체에게 전달될 수 있다(예를 들어, 발현된다). 일부 구현예에서, 이식유전자는 발현 증가, 유전자 산물의 활성, 또는 이식유전자가 억제하거나 달리 발현을 감소시키는 유전자의 부적합한 상향 조절과 연관된 질환을 치료하는데 충분한 양으로 대상체에게 전달될 수 있다(예를 들어, 발현된다).
IX. 사용 방법
본 발명의 ceDNA 벡터는 또한 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 표적 세포로 전달하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 치료적 관심 유전자를 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에 전달하기 위한 방법일 수 있다. 본 발명은 치료 수준의 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드가 발현되도록 대상체에서 세포내 치료적 외인성 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 생체내 발현을 허용한다. 이들 결과는 ceDNA 벡터 전달의 생체내 및 시험관내 방식 둘 다에서 볼 수 있다.
대상체의 세포에서 관심있는 핵산의 전달 방법은 상기 관심있는 핵산을 포함하는 본 발명의 ceDNA 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 관심 핵산을 포함하는 본 발명의 ceDNA 벡터의 다중 투여를 포함하여, 치료를 필요로 하는 대상체의 세포에 관심 핵산을 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명의 ceDNA 벡터는 면역 반응을 유도하지 않기 때문에, 이러한 다중 투여 전략은 캡시드화된 벡터에서 관측되는 것과 반대로 본 발명의 ceDNA 벡터에 대한 숙주 면역계 반응에 의해 손상되지 않을 것이다.
ceDNA 벡터 핵산(들)은 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 역효과없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하는데 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용가능한 투여 경로는 정맥내(예를 들어, 리포좀 제형으로), 선택된 장기로의 직접 전달(예를 들어, 간으로의 문내 전달), 근육내 및 다른 친계 투여 경로를 비제한적으로 포함한다. 원하는 경우, 투여 경로가 조합될 수 있다.
CeDNA 벡터 전달은 한 종의 ceDNA 벡터로 제한되지 않는다. 이와 같이, 다른 양태에서, 상이한 외인성 DNA 서열을 포함하는 다수의 ceDNA 벡터는 표적 세포, 조직, 장기 또는 대상체에 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 따라서, 이 전략은 여러 유전자의 발현을 허용할 수 있다. 바이러스성 캡시드의 부재로 인한 항-캡시드 숙주 면역 반응의 부족을 고려하여, 후속적으로 증가하거나 감소하는 용량으로 임상 환경에서 유전자 요법에 대해 전달이 여러 번, 중요하게는 수행될 수 있다. 캡시드가 없으므로 항-캡시드 반응이 일어나지 않을 것으로 예상된다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 상기 대상체의 필요로 하는 표적 세포(특히, 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. ceDNA 벡터는 담체의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는데 유용한 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는 대상체에 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 암호화된 원하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 전사를 지시할 수 있는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 및 본원의 다른 곳에 투여될 수 있다.
X. 치료 방법
본 명세서에 기재된 기술은 또한 예를 들어, 현장외, 시험관내 및 생체내 적용, 방법론, 진단 절차 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 개시된 ceDNA 벡터를 사용하는 방법뿐만 아니라 제조하는 방법을 입증한다.
치료적 유효량의 ceDNA 벡터를 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 상기 대상체의 치료를 필요로 하는 표적 세포(예를 들어, 근육 세포 또는 조직 또는 다른 영향을 받는 세포 유형)에 도입하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. ceDNA 벡터는 담체의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는데 유용한 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는 대상체에 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 암호화된 원하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 전사를 지시할 수 있는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 및 본원의 다른 곳에 투여될 수 있다.
임의의 이식유전자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 의해 전달될 수 있다. 관심의 이식유전자는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 비-암호화 핵산(예를 들어, RNAi, miR 등), 바람직하게는 치료적(예를 들어, 의료, 진단 또는 수의적 용도를 위한) 또는 면역원성(예를 들어, 백신을 위한) 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 이식유전자는 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAis, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 발현 또는 암호화할 것이다.
특히, 이식유전자는 예를 들어 질병, 기능이상, 손상 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 단백질(들), 폴리펩타이드(들), 펩타이드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편뿐만 아니라 이의 변이체 및/또는 이의 활성 단편, 효능제, 길항제, 모방체를 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 치료제(들)를 암호화할 수 있다. 일 양태에서, 질환, 기능이상, 트라우마, 손상 및/또는 장애는 인간 질환, 기능이상, 트라우마, 손상 및/또는 장애이다.
본원에 언급된 바와 같이, 이식유전자는 하나 이상의 작용제, 길항제, 항-세포자멸사 인자, 억제제, 수용체, 사이토카인, 세포독소, 적혈구생성 제제, 당단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 신경 성장 인자, 신경활성 펩타이드, 신경활성 펩타이드 수용체, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 탈탄산효소, 단백질 키나제, 단백질 키나제 억제제, 효소, 수용체 결합 단백질, 수송 단백질 또는 이의 하나 이상의 억제제, 세로토닌 수용체, 또는 이의 하나 이상의 흡수 억제제, 세르핀, 세르핀 수용체, 종양 억제인자, 진단 분자, 화학치료제, 세포독소, 또는 이들의 임의의 조합을 비제한적으로 포함하는 치료적 단백질 또는 펩타이드, 또는 치료 핵산 서열 또는 치료제를 암호화할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 발현 카세트, 발현 작제물 또는 ceDNA 벡터의 이식유전자는 숙주세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 천연 서열(예를 들어, 원핵 서열)의 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당수의 코돈을 대체함으로써 관심 척추동물, 예를 들어 마우스 또는 인간(예를 들어, 인간화된)의 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 최초 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어 Aptagen의 Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc.) 또는 또 다른 공개적으로 이용가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상체 숙주세포에서 이식유전자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 숙주세포는 간 (즉, 간) 세포, 폐 세포, 심장 세포, 췌장 세포, 창자 세포, 횡격막 세포, 신장 (즉, 신장) 세포, 신경 세포, 혈구, 골수 세포, 또는 유전자 요법이 고려되는 대상체의 임의의 하나 이상의 선택된 조직을 비제한적으로 포함하는, 혈구, 줄기 세포, 조혈 세포, CD34+ 세포, 간 세포, 암 세포, 혈관 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 안구 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상 세포, 섬유모세포, 또는 포유동물 기원의 임의의 다른 세포를 포함하는 인간 숙주세포이다. 일 양태에서, 본 발명의 숙주세포는 인간 숙주세포이다.
본원에는 하나 이상의 본 발명의 ceDNA 벡터 중 하나 이상을 약제학적으로 허용가능한 완충제, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 ceDNA 벡터 조성물 및 제형이 개시된다. 이러한 조성물은 질환, 손상, 장애, 트라우마 또는 기능이상의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기 위한 하나 이상의 진단 또는 치료 키트에 포함될 수 있다. 일 양태에서, 질환, 손상, 장애, 트라우마 또는 기능이상은 인간 질환, 손상, 장애, 트라우마 또는 기능이상이다.
본 명세서에 기재된 기술의 또 다른 양태는 진단적 또는 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를 치료를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직 또는 장기에 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 양을; 및 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현을 가능하게 하는데 효과적인 시간 동안 제공하여, ceDNA 벡터에 의해 발현된 진단적 또는 치료적 유효량의 단백질, 펩타이드, 핵산을 상기 대상체에게 제공하는 단계를 포함한다. 추가 양태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에 기재된 기술의 또 다른 양태는 대상체에서 질환, 장애, 기능이상, 손상, 비정상 상태 또는 트라우마의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 전체적이고 일반적인 의미에서, 상기 방법은 대상체에서 질환, 장애, 기능이상, 손상, 비정상 상태 또는 트라우마의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로, 및 시간 동안 하나 이상의 개시된 ceDNA 벡터를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 추가 양태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태는 질환 또는 질환 상태의 하나 이상의 증상을 치료 또는 감소시키기 위한 도구로서 ceDNA 벡터의 용도이다. 결함이 있는 유전자가 알려져 있고, 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 효소의 결핍 상태와 조절 또는 구조 단백질을 포함할 수 있는 불균형 상태의 두 가지 등급으로 분류되고, 전형적으로 항상 우세한 방식으로 유전되는 것은 아닌 선천적 질환이 많이 있다. 결핍 상태 질환의 경우, ceDNA 벡터를 이용하여 이식유전자를 전달하여 대체 요법을 위해 정상 유전자를 감염된 조직으로 가져오고, 일부 구현예에서, 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생산할 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, ceDNA 벡터를 사용하여 모델 시스템에서 질환 상태를 생설한 다음, 질환 상태에 대응하기 위한 노력에 사용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터 및 방법은 유전자 질환의 치료를 허용한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 질환 상태는 질환을 유발하거나 더 심각하게 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 치료함으로써 치료된다.
일반적으로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 연관된 증상을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 임의의 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태는 낭포성 섬유증(및 폐의 다른 질환), A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해빈혈, 빈혈 및 다른 혈액 장애, AIDS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 간질 및 기타 신경계 장애, 암, 진성 당뇨병, 근육 이영양증(예를 들어, 뒤센(Duchenne), 베커(Becker)), 헐러 질환(Hurler's disease), 아데노신 데아미나제 결핍, 대사 결함, 망막 퇴행성 질환(및 눈의 다른 질환), 미토콘드리아 병증(예를 들어, 레버 선천성 시신경병증(LHON), 레이 증후군 및 아급성 경화성 뇌병증), 근병증(예를 들어, 근위저하 근병증(FSHD) 및 심근병증), 고형 장기 질환(예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장) 등을 비제한적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 대사 장애(예를 들어, 오미틴 트랜스카바밀라제 결핍증)를 갖는 개체의 치료에 유익하게 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터는 유전자 또는 유전자 산물에서의 돌연변이에 의해 야기된 질환 또는 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터로 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애는 대사 질환 또는 장애(예를 들어, 파브리병, 고셔병, 페닐케톤뇨증(PKU), 글리코겐 축적 질환); 요소 대사 질환 또는 장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC) 결핍); 리소좀 축적 질환 또는 장애(예를 들어, 이염성 백질이상증(MLD), 점액다당류증 유형 II(MPSII; 헌터 증후군)); 간 질환 또는 장애(예를 들어, 진행성 가족성 간내 답증정체증(PFIC); 혈액 질환 또는 장애(예를 들어, (A형 및 B형) 혈우병, 지중해빈혈, 및 빈혈); 암 및 종양, 및 유전 질환 또는 장애(예를 들어, 낭포성 섬유증)를 비제한적으로 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 이식유전자(예를 들어, 호르몬 또는 성장 인자를 암호화하는 이식유전자) 발현 수준을 조절하는 것이 바람직한 상황에서 이종성 뉴클레오타이드 서열을 전달하는데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터는 질환 또는 장애를 초래하는 유전자 산물의 비정상 수준 및/또는 기능(예를 들어, 단백질의 부재 또는 결함)을 교정하는데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터는 기능성 단백질을 생산하고/하거나 단백질의 수준을 변형시켜 단백질의 부재 또는 결함에 의해 야기되는 특정 질환 또는 장애로 인한 증상을 완화 또는 감소시키고 이점을 부여할 수 있다. 예를 들어, OTC 결핍의 치료는 기능성 OTC 효소를 생산함으로써 달성될 수 있으며; A형 및 B형 혈우병의 치료는 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X의 수준을 변형시킴으로써 달성될 수 있으며; PKU의 처리는 페닐알라닌 하이드록실라제 효소의 수준을 변형시킴으로써 달성될 수 있으며; 파브리 또는 고셔병의 치료는 각각 기능성 알파 갈락토시다아제 또는 베타 글루코세레브로시다제를 생산함으로써 달성될 수 있으며; MLD 또는 MPSII의 처리는 각각 기능성 아릴설파타제 A 또는 이듀로네이트-2-설파타제를 생산함으로써 달성될 수 있으며; 낭포성 섬유증의 치료는 기능성 낭포성 섬유증 막관통 전도성 조절인자를 생산함으로써 달성될 수 있으며; 글리코겐 축적 질환의 치료는 기능성 G6Pase 효소 기능을 회복시킴으로써 달성될 수 있으며; PFIC의 치료는 기능성 ATP8B1, ABCB11, ABCB4, 또는 TJP2 유전자를 생산함으로써 달성될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 안티센스 핵산을 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이식유전자가 RNAi 분자인 경우, 표적 세포에서 안티센스 핵산 또는 RNAi의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, RNAi 분자 또는 안티센스 핵산인 이식유전자는 치료를 필요로 하는 대상체에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관내 세포에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 암호화된 예시적인 이식유전자는 X, 리소좀 효소(예를 들어, 테이-삭스 질환과 연관된 헥소사미니다제 A, 또는 헌터 증후군/MPS II와 연관된 이듀로네이트 설파타제), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 초과산화물 디스무타제, 글로빈, 렙틴, 카탈라제, 티로신 하이드록실라제, 뿐만 아니라 사이토카인(예를 들어, 인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨 12, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 림프독 등), 펩타이드 성장 인자 및 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래된 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 신경 성장 인자(NGF), 신경친화성 인자-3 및 4, 뇌-유래된 신경친화성 인자(BDNF), 신경교 유래된 성장 인자(GDNF), 형질전환 성장 인자-α 및 -β, 등), 수용체(예를 들어, 종양 괴사 인자 수용체)를 비제한적으로 포함한다. 일부 예시적인 구현예에서, 이식유전자는 하나 이상의 원하는 표적에 특이적인 단클론성 항체를 암호화한다. 일부 예시적인 구현예에서, 하나 초과의 이식유전자는 ceDNA 벡터에 의해 암호화된다. 일부 예시적인 구현예에서, 이식유전자는 관심있는 2개의 상이한 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 암호화한다. 일부 구현예에서, 항체는 본 명세서에 정의된 바와 같은 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다. 다른 예시적인 이식유전자 서열은 자살 유전자 산물(티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 사이토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나제 및 종양 괴사 인자), 암 요법에 사용되는 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질, 및 종양 억제인자 유전자 산물을 암호화한다.
대표적인 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자는 치료를 필요로 하는 대상체에서 근육 이영양증의 치료에 사용될 수 있으며, 상기 방법은: 본 명세서에 기재된 치료-, 개선- 또는 예방-유효량의 ceDNA 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 ceDNA 벡터는 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 마이오스타틴 프로펩타이드, 폴리스타틴, 액티빈 유형 II 가용성 수용체, IGF-1, 항-염증성 폴리펩타이드, 예컨대 Ikappa B 우세한 돌연변이체, 사르코스판, 우트로핀, 마이크로-디스트로핀, 라미닌-α2, α-사르코글리칸, β-사르코글리칸, γ-사르코글리칸, δ-사르코글리칸, IGF-1, 마이오스타틴 또는 마이오스타틴 프로펩타이드에 대한 항체 또는 항체 단편, 및/또는 마이오스타틴에 대한 RNAi를 암호화하는 이종성 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 혈액 내에서 정상적으로 순환하는 폴리펩타이드(예를 들어, 효소) 또는 기능성 RNA(예를 들어, RNAi, 마이크로RNA, 안티센스RNA)의 생산을 위해, 또는 장애(예를 들어, 대사 장애, 예컨대 당뇨병(예를 들어, 인슐린), 혈우병(예를 들어, VIII), 점액다당류 장애(예를 들어, 슬라이 증후군, 헐러 증후군, 쉬에 증후군, 헐러-쉬에 증후군, 헌터 증후군, 산필립포 증후군 A, B, C, D, 모르키오 증후군, 마로토-라미 증후군, 등) 또는 리소좀 축적 장애(예컨대 고셔병[글루코세레브로시다제], 폼페병[리소좀 산 α-글루코시다제] 또는 파브리병[α-갈락토시다아제 A]) 또는 글리코겐 축적 장애(예컨대 폼페병[리소좀 산 글루코시다제])를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 다른 조직으로 전신 전달하기 위해, 골격, 심장 또는 횡격막 근육에 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 대사 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는데 적합한 다른 단백질은 상기 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 치료를 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로 이식유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 대사 장애 및 이식유전자가 본 명세서에 기재되어 있다. 선택적으로, 폴리펩타이드(예를 들어, 천연 상태의 분비된 폴리펩타이드이거나, 예를 들어 당 업계에 공지된 분비-신호 서열과의 동작가능한 회합에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩타이드)가 분비된다.
본 발명의 또 다른 양태는 치료를 필요로 하는 대상체에서 선천성 심부전 또는 패드(PAD)의 치료, 개선 및/또는 예방 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 포유동물 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 ceDNA 벡터는, 예를 들어, 혈관질 내배엽 Ca2+-ATPase(SERCA2a), 혈관 신생 인자, 포스파타제 억제제 I(I-1), 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 억제성 또는 우세한-음성 분자 예컨대 포스포람반 S16E, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, β2-아드레날린 수용체, β2-아드레날린 수용체 키나제(BARK), PI3 키나제, 칼사르칸, β-아드레날린 수용체 키나제 억제제(βARKct), 단백질 포스파타제 1의 억제제 1, S100A1, 파브알부민, 아데닐릴 사이클라제 유형 6, G-단백질 커플링된 수용체 키나제 2형 녹다운에 영향을 미치는 분자, 예컨대 절단된 구성적으로 활성인 βARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, 칼리크레인, HIF, 티모신-β4, mir-1, mir-133, mir-206 및/또는 mir-208을 암호화하는 이식유전자를 포함한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 임의의 적합한 수단에 의해, 선택적으로, 대상체가 흡입하는 ceDNA 벡터를 포함하는 호흡가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함으로써 대상체의 폐에 투여될 수 있다. 호흡가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 알려진 바와 같이, ceDNA 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 임의의 적합한 수단, 예컨대 압력-구동식 에어로졸 분무기 또는 초음파 분무기를 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,501,729호를 참고한다. ceDNA 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 약제학적 분야에 공지된 기술에 의해 임의의 고체 미립자 약제 에어로졸 발생제로 생산될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 CNS의 조직(예를 들어, 뇌, 눈)에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 유전자 장애, 신경퇴행성 장애, 정신과 장애 및 종양을 포함하는 CNS의 질환을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. CNS의 예시적인 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 카나반병, 레이(Leigh) 병, 레프섬 질환, 투렛 증후군, 일차 측삭 경화증, 근위축 측삭 경화증, 진행성 근육 위축증, 피크병, 근육 이영양증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 빈스완거병, 척수 또는 두부 손상으로 인한 트라우마, 테이 삭스 병, 레쉬-니안병(Lesch-Nyan disease), 간질, 뇌 경색, 기분 장애(예를 들어, 우울증, 양극성 정서적 장애, 지속적인 정서적 장애, 이차 기분 장애)를 포함하는 정신과 장애, 정신분열증, 약물 의존(예를 들어, 알코올중독 및 다른 물질 의존), 신경증(예를 들어, 불안, 강박 장애, 체성 장애, 해리성 장애, 슬픔, 산후 우울증), 정신병(예를 들어, 환각 및 망상), 치매, 편집증, 주의력 결핍 장애, 정신성 장애, 수면 장애, 통증 장애, 섭식 또는 체중 장애(예를 들어, 비만, 악액질, 신경성 식욕부진, 및 신경성 빈혈) 및 CNS의 암 및 종양(예를 들어, 뇌하수체 종양)을 비제한적으로 포함한다.
본 발명의 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 안구 장애에는 망막, 후관 및 시신경을 포함하는 안과 장애(예를 들어, 색소성 망막염, 당뇨 망막병증 및 다른 망막 퇴행성 질환, 포도막염, 연령 관련 황반 변성, 녹내장)가 포함된다. 많은 안과 질환 및 장애는 3가지 유형의 징후 중 하나 이상과 관련이 있다: (1) 혈관 신생, (2) 염증 및 (3) 퇴행. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 항-혈관신생 인자; 항-염증성 인자; 세포 퇴행을 지연시키거나, 세포 스페어링을 촉진시키거나, 또는 세포 성장을 촉진하는 인자 및 상기의 조합을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 당뇨 망막병증은 혈관신생을 특징으로 한다. 당뇨 망막병증은 안구내로(예를 들어, 유리체에서) 또는 눈주위로(예를 들어, 테논 이하의 영역에서) 하나 이상의 항-혈관신생 인자를 전달함으로써 치료될 수 있다. 하나 이상의 신경친화성 인자는 또한 안구내로(예를 들어, 유리체내로) 또는 눈주위로 공동 전달될 수 있다. 본 발명의 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 추가의 안구 질환은 지리적 위축증, 혈관 또는 "습식" 황반 변성, 스타가르트 질환, 레버 선천성 흑내장(LCA), 어셔 증후군, 탄력섬유 가황색종(PXE), x-연관 색소성 망막염(XLRP), x-연관 망막층간분리(XLRS), 맥락막결손, 레버(Leber) 선천성 시신경병증(LHON), 고혈압증, 추상체-간상체 이영양증, 후치스(Fuchs) 내피성 각막 이영양증, 당뇨병성 황반 부종 및 안암 및 종양을 포함한다.
일부 구현예에서, 염증성 안구 질환 또는 장애(예를 들어, 포도막염)는 본 발명의 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 항-염증성 인자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 안구내(예를 들어, 유리체 또는 전방 챔버) 투여에 의해 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 망막 변성을 특징으로 하는 안구 질환 또는 장애(예를 들어, 색소성 망막염)는 본 발명의 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 신경 영양 인자를 암호화하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 안구내(예를 들어, 유리체 투여)는 이러한 망막 변성-기반 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈관신생 및 망막 변성(예를 들어, 연령 관련 황반 변성) 둘 다를 수반하는 질환 또는 장애는 본 발명의 ceDNA 벡터로 치료될 수 있다. 연령 관련 황반 변성은 안구 내(예를 들어, 유리체) 및/또는 하나 이상의 항-혈관신생 인자를 안구내로 또는 눈주위로(예를 들어, 테논 이하의 영역에서) 암호화하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 투여함으로써 치료될 수 있다. 녹내장은 안압 증가 및 망막 신경절 세포의 손실을 특징으로 한다. 녹내장의 치료는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 세포를 흥분독성 손상으로부터 보호하는 하나 이상의 신경 보호제의 투여를 포함한다. 따라서, 이러한 제제는 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 길항제, 사이토카인 및 신경 영양 인자를 포함하며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 안구내로, 선택적으로 유리체내로 전달될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 발작을 치료하기 위해, 예를 들어 발작의 개시, 발병률 또는 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 발작에 대한 치료적 처치의 효능은 행동(예를 들어, 떨림, 눈 또는 입의 틱) 및/또는 전자 촬영 수단(대부분의 발작에 특징적인 전자기적 이상이 있음)에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 또한 간질을 치료하는데 사용될 수 있으며, 이는 시간이 지남에 따라 다수의 발작으로 표시된다. 하나의 대표적인 구현예에서, 뇌하수체 종양을 치료하기 위해 소마토스타틴(또는 이의 활성 단편)이 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터를 사용하여 뇌에 투여된다. 이 구현예에 따르면, 소마토스타틴(또는 이의 활성 단편)을 암호화하는 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 뇌하수체로의 미세주입에 의해 투여된다. 마찬가지로, 이러한 치료는 말단비대증(뇌하수체에서 비정상적인 성장 호르몬 분비)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 소마토스타틴의 핵산(예를 들어, GenBank 수탁 번호 J00306) 및 아미노산(예를 들어, GenBank 수탁 번호 P01166; 가공된 활성 펩타이드 소마토스타틴-28 및 소마토스타틴-14 함유) 서열이 당해 기술에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 미국 특허 제7,071,172호에 기재된 분비-신호를 포함하는 이식유전자를 암호화할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 생체내에서 대상체에게 전신 전달하기 위한 안티센스 RNA, RNAi 또는 다른 기능성 RNA(예를 들어, 리보자임)를 생산하기 위한 본 명세서에 기재된 ceDNA 벡터의 용도에 관한 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 안티센스 핵산, 리보자임(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,877,022호에 기재된 바와 같음), 스플라이세오좀-매개된 트랜스-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA(Puttaraju 등, (1999) Nature Biotech. 17:246; 미국 특허 번호 제6,013,487호; 미국 특허 번호 제6,083,702호 참고), 유전자 침묵을 매개하는 간섭 RNA(RNAi)(Sharp et al., (2000) Science 287: 2431 참고) 또는 다른 "번역되지 않은" RNA, 예컨대 "가이드" RNA(Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; Yuan et al.의 미국 특허 번호 제5,869,248호) 등을 암호화하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 리포터 폴리펩타이드(예를 들어, 효소, 예컨대 녹색 형광 단백질 또는 알칼리성 포스파타제)를 암호화하는 이식유전자를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 실험 또는 진단 목적에 유용한 리포터 단백질을 암호화하는 이식유전자는 β-락타마제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로르암페니콜 아세틸전달효소(CAT), 루시퍼라제 및 당해 분야에 잘 알려진 다른 것들 중 어느 하나로부터 선택된다. 일부 양태에서, 리포터 폴리펩타이드를 암호화하는 이식유전자를 포함하는 ceDNA 벡터는 진단 목적으로, 또는 이들이 투여되는 대상체에서 ceDNA 벡터의 활성의 마커로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 숙주 염색체상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 유전자좌와 재조합하는 이식유전자 또는 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이 접근법은 숙주세포에서 유전적 결손을 교정하는데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 예를 들어 백신 접종을 위해 대상체에서 면역원성 폴리펩타이드를 발현시키는 데 사용될 수 있는 이식유전자를 포함할 수 있다. 이식유전자는 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등으로부터의 면역원을 비제한적으로 포함하는 당 업계에 공지된 임의의 관심 면역원을 암호화할 수 있다.
XI. 투여
특정 구현예에서, 다양한 간격, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 하나 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 이상의 투여)가 이용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터의 예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 척추강내, 안구내, 경피, 내피, 자궁내(또는 난내), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 진피내, 두개내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에의 투여 포함], 늑막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 피부 및 점막 표면 모두, 기도 표면, 및 경피 투여를 포함), 림프내 등, 및 직접적인 조직 또는 장기 주사(예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌로 주사)를 포함한다.
ceDNA 벡터의 투여는 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부 및 눈으로 구성된 군으로부터 선택된 부위를 비제한적으로 포함는 대상체의 임의의 부위에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터의 투여는 또한 종양(예를 들어, 종양 또는 림프절내 또는 근처)에 있을 수 있다. 임의의 경우에 가장 적합한 경로는 치료, 개선 및/또는 예방되는 상태의 성질 및 중증도 및 사용중인 특정 ceDNA 벡터의 성질에 따라 달라질 것이다. 또한, ceDNA는 단일 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 칵테일)에서 하나 초과의 이식유전자를 투여할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 골격근에 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터를 투여하는 것은 사지(예를 들어, 상완, 하완, 상지 및/또는 하지)의 골격근, 등, 목, 두부(예를 들어, 혀), 흉부, 복부, 골반/회음부 및/또는 손(발)가락에의 투여를 비제한적으로 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류(선택적으로 다리 및/또는 팔의 고립된 사지 관류; 예를 들어 Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464 참고), 및/또는 직접적인 근육내 주사에 의해 골격 근육에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 사지 관류, 임의로 단리된 사지 관류(예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여)에 의해 대상체(예를 들어, DMD와 같은 근육 이영양증을 갖는 대상체)의 사지(팔 및/또는 다리)에 투여된다. 구현예들에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 "유체역학적" 기술을 사용하지 않고 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 심장 근육으로의 투여는 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 격막에의 투여를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 예컨대 대동맥내 투여, 직접적인 심장 주사(예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실) 및/또는 관상동맥 관류에 의해 심장 근육으로 전달될 수 있다. 횡격막 근육으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 투여는 평활근에 존재하거나, 부근 및/또는 평활근 상에 존재하는 내피 세포에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 (예를 들어, 근이영양증 또는 심장병(예를 들어, PAD 또는 울혈성 심장기능상실)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해) 골격근, 횡격막 근육 및/또는 심장 근육에 투여된다.
A. 생체외 치료
일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 제거되고, ceDNA 벡터가 그 안에 도입되고, 이어서 세포가 대상체로 다시 대체된다. 생체외 치료를 위해 대상체로부터 세포를 제거하고 이어서 대상체로 다시 도입하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,399,346호 참고; 그의 개시내용은 그 전문이 본 명세서에 포함됨). 대안적으로, ceDNA 벡터는 또 다른 대상체의 세포, 배양된 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원의 세포로 도입되고, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
ceDNA 벡터로 형질도입된 세포는 바람직하게는 약제학적 담체와 함께 "치료적-유효량"으로 상기 대상체에게 투여된다. 당해 분야의 숙련가는 치료 효과가 대상체에게 일부 이점이 제공되는한 완전하거나 치유적일 필요는 없음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에서 바람직하게 생산되는 임의의 폴리펩타이드인 이식유전자(이종성 뉴클레오타이드 서열이라고도 함)를 암호화할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 논의된 바와 같은 치료 방법에서 ceDNA 벡터의 사용과 대조적으로, 일부 구현예에서 ceDNA 벡터는 예를 들어 항원 또는 백신의 생산을 위해 배양된 세포, 및 이로부터 단리된 발현된 유전자 산물에 도입될 수 있다.
ceDNA 벡터는 수의과 및 의료 용도 모두에 사용될 수 있다. 상기 기재된 생체외 유전자 전달 방법에 적합한 대상체는 조류(예를 들어, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유동물(예를 들어, 인간, 소과, 양, 염소, 말, 고양이,갯과 및 토끼목)을 포함하며, 포유동물이 바람직하다. 인간 대상체가 가장 바람직하다. 인간 대상체에는 신생아, 영아, 청소년 및 성인이 포함된다.
본 명세서에 기재된 기술의 일 양태는 이식유전자를 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 시험관내 방법의 경우, ceDNA 벡터는 본 명세서에 개시된 방법뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에 개시된 ceDNA 벡터는 바람직하게는 생물학적 유효량으로 세포에 투여된다. ceDNA 벡터가 생체내 세포(예를 들어, 대상체)에 투여되는 경우, 생물학적 유효량의 ceDNA 벡터는 표적 세포에서 이식유전자의 형질도입 및 발현을 야기하기에 충분한 양이다.
B. 용량 범위
생체내 및/또는 시험관내 검정은 선택적으로 사용하기 위한 최적의 투여량 범위를 확인하는데 도움이 될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 상태의 중증도에 따라 달라질 것이며, 숙련가의 판단 및 각각의 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 효과적인 용량이 외삽될 수 있다.
ceDNA 벡터는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용가능한 투여 경로는 상기 "투여" 섹션에서 상기한 것, 예컨대 선택된 장기로의 직접 전달(예를 들어, 간으로의 문내 전달), 경구, 흡입(비강내 및 장기내 전달 포함), 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 종양내 및 기타 친계 투여 경로를 비제한적으로 포함한다. 원하는 경우 투여 경로가 조합될 수 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하기 위해 요구되는 ceDNA 벡터의 양의 용량은 핵산 투여 경로, 치료 효과를 달성하는데 요구되는 유전자 수준 또는 RNA 발현 수준, 치료되는 특정 질환 또는 장애, 및 유전자(들), RNA 생산물(들) 또는 생산된 발현 단백질(들)의 안정성을 비제한적으로 포함하는 몇몇 인자에 기초하여 변할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 상기 언급된 인자 및 당 업계에 잘 알려진 다른 인자에 기초하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 ceDNA 벡터 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 반복적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 몇개의 용량이 매일 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 용량이 비례하여 감소될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 올리고뉴클레오타이드가 세포 또는 대상체에게 투여되는지 여부에 관계없이 대상체의 올리고뉴클레오타이드의 적합한 투여 용량 및 투여 스케줄을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
"치료적으로 효과적인 용량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이고, 특정 적용에 의존할 것이다(신경 세포는 매우 소량을 필요로 하는 반면, 전신 주사는 다량을 필요로 한다). 예를 들어, 인간 대상체의 골격 또는 심장 근육으로의 생체내 직접 주사의 경우, 치료적으로 효과적인 용량은 약 1 μg 내지 100 g의 ceDNA 벡터일 것이다. 엑소좀 또는 극미립자가 ceDNA 벡터를 전달하기 위해 사용되는 경우, 치료적으로 효과적인 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 1 μg 내지 약 100 g의 벡터를 전달할 것으로 기대된다.
약제학적으로 허용가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 다양한 치료 요법에서 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
시험관내 형질감염의 경우, 세포(lx106 세포)로 전달되는 유효량의 ceDNA 벡터는 0.1 내지 100 μg ceDNA 벡터, 바람직하게는 1 내지 20 μg, 더욱 바람직하게는 1 내지 15 μg 또는 8 내지 10 μg일 것이다. 더 큰 ceDNA 벡터는 더 높은 용량을 요구할 것이다. 엑소좀 또는 극미립자가 사용되는 경우, 효과적인 시험관내 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만 일반적으로 동일한 양의 ceDNA 벡터를 전달하도록 의도될 것이다.
치료는 단일 용량 또는 다중 용량의 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 이상의 용량이 대상체에게 투여될 수 있고; 실제로, 바이러스 캡시드의 부재로 인해 항-캡시드 숙주 면역 반응을 ceDNA 벡터가 유발하지 않기 때문에, 필요에 따라 다중 용량이 투여될 수 있다. 이와 같이, 당해 분야의 숙련가는 적합한 수의 용량을 쉽게 결정할 수 있다. 투여되는 용량의 수는 예를 들어 1 내지 100, 바람직하게는 2 내지 20 용량일 수 있다.
임의의 특정 이론에 구속되고자 하지 않으면서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 투여에 의해 유발되는 전형적인 항-바이러스 면역 반응의 부재(즉, 캡시드 성분의 부재)는 ceDNA 벡터가 여러 차례 숙주에게 투여될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 이종성 핵산이 대상체에게 전달되는 경우의 수는 2 내지 10회(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회)의 범위이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 10회 초과로 대상체에게 전달된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 캘린더 1일당 1회 이하(예를 들어, 24-시간 기간) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 캘린더 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 1회 이하 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 캘린더 1주일(예를 들어, 7일)에 1회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 2주 이하(예를 들어, 캘린더 2주일에 1회) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 1개월에 1회 이하(예를 들어, 캘린더 30일에 1회) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 캘린더 6개월마다 1회 이하 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 ceDNA 벡터는 캘린더 1년마다(예를 들어, 365일 또는 윤년에 366일) 1회 이하 대상체에게 투여된다.
C. 단위 투여 형태
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약제학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 적합할 것이다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 증발기에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 척추강내 또는 뇌심실내 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다.
XII. 다양한 적용
본원에 제공된 조성물 및 ceDNA 벡터는 상기 기재된 바와 같은 다양한 목적을 위해 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 연구 목적, 예를 들어 이식유전자를 보유한 체세포 형질전환 동물 모델을 생산하기 위해, 예를 들어 이식유전자 산물의 기능을 연구하기 위해 사용되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생산하기 위해 사용되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다.
일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화한다. 이식유전자는 발현 감소, 발현 부족 또는 유전자 기능이상과 연관된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 전달될 수 있다(예를 들어, 발현된다).
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 진단 및 스크리닝 방법에 사용하기 위해 구상되며, 이로써 이식유전자가 세포 배양 시스템, 또는 대안적으로 형질전환 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현된다.
본 명세서에 기재된 기술의 또 다른 양태는 포유동물 세포 모집단을 형질도입시키는 방법을 제공한다. 전체적이고 일반적인 의미에서, 상기 방법은 모집단의 하나 이상의 세포에, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 ceDNA의 유효량을 포함하는 조성물을 도입하는 단계를 적어도 포함한다.
추가로, 본 발명은 하나 이상의 추가의 성분으로 제형화되거나 이의 용도를 위한 하나 이상의 지침으로 제조된 하나 이상의 개시된 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 조성물을 포함하는 조성물 및 치료적 및/또는 진단 키트를 제공한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터가 투여될 세포는 신경 세포(말초 및 중추 신경계 세포, 특히 뇌 세포를 포함), 폐 세포, 망막 세포, 상피 세포(예를 들어, 소화관 및 호흡기 상피 세포), 근육 세포, 수지상 세포, 췌장 세포(소도세포 포함), 간 세포, 심근 세포, 뼈 세포(예를 들어, 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 각질형성 세포, 섬유모세포, 내피 세포, 전립선 세포, 생식 세포 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 유형일 수 있다. 대안적으로, 세포는 임의의 선조 세포일 수 있다. 다른 대안으로서, 세포는 줄기 세포(예를 들어, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포)일 수 있다. 또 다른 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 또한, 세포는 상기 나타낸 바와 같이 기원의 임의의 종으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원은 하기 단락 중 임의의 단락에서 정의될 수 있다:
1A. 시스-조절 인자를 포함하는 발현 카세트로서, 시스-조절 인자는 전사후 조절 인자 및 BGH 폴리-A 신호로 구성된 군으로부터 선택되는 발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단)상의 야생형 ITR로서, 야생형 ITR이 서열번호: 51의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 야생형 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단)상의 변형된 ITR로서, 서열번호: 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 변형된 ITR,
을 포함하는 ceDNA 벡터로서,
상기 DNA 벡터는 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있고, AAV 캡시드 단백질에 캡시드화되지 않는, DNA 벡터.
2A. 단락 1A에 있어서, DNA 벡터는 선형 및 연속적 구조를 갖는, DNA 벡터.
3A. 단락 1A 또는 2A에 있어서, 전사후 조절 인자가 WHP 전사후 조절 인자(WPRE)를 포함하는, DNA 벡터.
4A. 단락 1A 내지 3A 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 클로닝 부위를 추가로 포함하는, DNA 벡터.
5A. 단락 1A 내지 4A 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는, DNA 벡터.
6A. 단락 1A에 있어서, 발현 카세트가 서열번호: 3, 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 벡터.
7A. 단락 1A 내지 6A 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 클로닝 부위 및 클로닝 부위에 삽입된 외인성 서열을 추가로 포함하는, DNA 벡터.
8A. 단락 7A에 있어서, 외인성 서열이 적어도 2000개 뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 벡터.
9A. 단락 7A에 있어서, 외인성 서열이 단백질을 암호화하는, DNA 벡터.
10A. 단락 7A에 있어서, 외인성 서열이 리포터 단백질을 암호화하는, DNA 벡터.
11A. 단락 1A 내지 10A 중 어느 하나의 DNA 벡터를 포함하는 세포.
12A. 단락 11A에 있어서, AAV Rep 78, AAV Rep 68, AAV Rep52 및 AAV Rep 40으로 구성된 군으로부터 선택된 복제 단백질을 추가로 포함하는, 세포.
13A. 단락 12A에 있어서, 상기 복제 단백질이 헬퍼 바이러스에 의해 암호화되는, 세포.
14A. 단락 11A 내지 13A 중 어느 하나에 있어서, 세포는 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자가 결여되어 있는, 세포.
15A. 단락 1A 내지 10A 중 어느 하나의 DNA 벡터, 및 선택적으로 부형제를 포함하는 약리학적 활성 성분.
16A. 단락 1A 내지 10A 중 어느 하나의 DNA 벡터를 상기 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 외인성 서열을 세포에 전달하는 방법.
17A. 단락 16A에 있어서, 상기 DNA 벡터를 도입하는 단계는 유체역학적 주사를 포함하는, 방법.
18A. 하기 단계를 포함하는 DNA 벡터의 제조 방법:
하기를 포함하는 핵산 작제물 또는 바이러스를 세포에 도입하는 단계:
시스-조절 인자를 포함하는 발현 카세트로서, 시스-조절 인자가 전사후 조절 인자 및 BGH 폴리-A 신호로 구성된 군으로부터 선택되는 발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단) 상의 야생형 ITR로서, 야생형 ITR이 서열번호: 51의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 야생형 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단) 상의 변형된 ITR로서, 변형된 ITR이 서열번호: 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 ITR,
상기 세포에는 AAV 캡시드 단백질이 결여되어 있는, 단계; 및
상기 핵산 작제물 또는 상기 바이러스로부터 생산된 상기 DNA 벡터를 수집하는 단계로서,
상기 DNA 벡터에 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있는, 단계.
19A. 단락 18A에 있어서, DNA 벡터가 선형 및 연속적 구조를 갖는, 방법.
20A. 단락 18A 또는 19A에 있어서, 전사후 조절 인자가 WHP 전사후 조절 인자(WPRE)를 포함하는, 방법.
21A. 단락 18A 내지 20A 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
22A. 단락 18에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호: 3, 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
23A. 단락 18A 내지 22A 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 카세트가 외인성 서열을 추가로 포함하는, 방법.
24A. 단락 23A에 있어서, 외인성 서열이 적어도 2000개 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
25A. 단락 23A에 있어서, 외인성 서열이 단백질을 암호화하는, 방법.
26A. 단락 23A에 있어서, 외인성 서열이 리포터 단백질을 암호화하는, 방법.
27A. 단락 18A 내지 26A 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 곤충 세포인, 방법.
28A. 단락 18 내지 27 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 DNA 벡터.
29A. 하기를 포함하는 DNA 벡터를 생산하기 위한 세포:
하기를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드:
시스-조절 인자를 포함하는 발현 카세트로서, 시스-조절 인자가 전사후 조절 인자 및 BGH 폴리-A 신호로 구성된 군으로부터 선택된, 발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단) 상의 야생형 ITR로서, 야생형 ITR이 서열번호: 51의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 야생형 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단) 상의 변형된 ITR로서, 변형된 ITR이 서열번호: 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 ITR; 및
AAV78, AAV52, AAV Rep68 및 AAV Rep 40으로 구성된 군으로부터 선택된 복제 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드;
상기 세포에는 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자가 결여되어 있는, 방법.
30A. 단락 29A에 있어서, 전사후 조절 인자는 WHP 전사후 조절 인자(WPRE)를 포함하는, 세포.
31A. 단락 29A 또는 30A에 있어서, 상기 세포는 곤충 세포인, 세포.
32A. 상기 제1 폴리뉴클레오타이드의 복제에 의해, 단락 29A 내지 31A 중 어느 하나의 세포로부터 생산된 DNA 벡터.
33A. 하기를 포함하는 DNA 벡터를 생산하기 위한 폴리뉴클레오타이드:
시스-조절 인자를 포함하는 발현 카세트로서, 시스-조절 인자가 전사후 조절 인자 및 BGH 폴리-A 신호로 구성된 군으로부터 선택된, 발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단) 상의 야생형 ITR로서, 야생형 ITR이 서열번호: 51의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 야생형 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단) 상의 변형된 ITR로서, 변형된 ITR이 서열번호: 2의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 ITR.
34A. 단락 33A에 있어서, 전사후 조절 인자가 WHP 전사후 조절 인자(WPRE)를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
35A. 단락 33A 또는 34A에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 플라스미드, 백미드 또는 배큘로바이러스에 있는, 폴리뉴클레오타이드.
36A. 단락 33A 내지 35A 중 어느 하나에 있어서, 외인성 서열을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
37A. 단락 36A에 있어서, 외인성 서열이 적어도 2000개 뉴클레오타이드를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
38A. 단락 36A에 있어서, 외인성 서열이 단백질을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
39A. 단락 36A에 있어서, 외인성 서열이 리포터를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드
40A. AAV78, AAV52, AAV Rep68 및 AAV Rep 40으로 구성된 군으로부터 선택된 복제 단백질에 의한 단락 33A 내지 39A 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드의 복제에 의해 생산된 DNA 벡터로서, DNA 벡터가 선형 및 연속 구조를 가지고, 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있고, AAV 캡시드 단백질에 캡시드화되지 않는, DNA 벡터.
41A. 발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단) 상의 변형된 ITR로서, 변형된 ITR이 서열번호: 52의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단) 상의 야생형 ITR로서, 야생형 ITR이 서열번호: 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 야생형 ITR
를 포함하는 DNA 벡터로서,
상기 DNA 벡터는 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있고, AAV 캡시드 단백질에 캡시드화되지 않는, DNA 벡터.
42A. 단락 41A에 있어서, 발현 카세트가 시스-조절 인자를 포함하고, 시스-조절 인자가 전사후 반응 인자 및 폴리-A 신호로 구성된 군으로부터 선택된, DNA 벡터.
43A. 단락 42A에 있어서, 전사후 반응 인자가 WHP 전사후 반응 인자(WPRE)를 포함하는, DNA 벡터.
44A. 단락 42A 또는 43A에 있어서, 폴리-A 신호가 BGH 폴리-A 신호를 포함하는, DNA 벡터.
45A. 단락 41A 내지 44A 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는, DNA 벡터.
46A. 단락 41A에 있어서, 발현 카세트가 서열번호: 3, 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 벡터.
47A. 단락 41A 내지 46A 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 외인성 서열을 포함하는, DNA 벡터.
48A. 단락 47A에 있어서, 외인성 서열이 적어도 2000개 뉴클레오타이드를 포함하는, DNA 벡터.
49A. 단락 47A에 있어서, 외인성 서열이 단백질을 암호화하는, DNA 벡터.
50A. 단락 47A에 있어서, 외인성 서열이 리포터 단백질을 암호화하는, DNA 벡터.
51A. 단락 41A 내지 50A 중 어느 하나의 DNA 벡터를 포함하는 세포.
52A. 단락 52A에 있어서, AAV Rep 78, AAV Rep 68, AAV Rep52 및 AAV Rep 40으로 구성된 군으로부터 선택된 복제 단백질을 추가로 포함하는, 세포.
53A. 단락 51A에 있어서, 상기 복제 단백질은 헬퍼 바이러스에 의해 암호화되는, 세포.
54A. 단락 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 세포에 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자가 결여되어 있는, 세포.
55A. 단락 1A 내지 10A 중 어느 하나의 DNA 벡터; 및 선택적으로, 부형제를 포함하는 약리적 활성 성분.
56A. 단락 1A 내지 10A 중 어느 하나의 상기 비-캡시드화된 DNA 벡터를 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 외인성 서열을 세포에 전달하는 방법.
57A. 단락 16A에 있어서, 상기 DNA 벡터를 도입하는 단계는 유체역학적 주사를 포함하는, 방법.
58A. 하기 단계를 포함하는 DNA 벡터의 제조 방법:
하기를 포함하는 핵산 작제물 또는 바이러스를 세포에 도입하는 단계:
발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단) 상의 변형된 ITR로서, 변형된 ITR이 서열번호: 52의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단) 상의 야생형 ITR로서, 야생형 ITR이 서열번호: 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 야생형 ITR,
상기 세포에는 AAV 캡시드 단백질이 결여되어 있는, 단계; 및
상기 핵산 작제물 또는 상기 바이러스로부터 생산된 상기 DNA 벡터를 수집하는 단계로서,
상기 DNA 벡터에 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있고, AAV 캡시드 단백질에서 캡시드화되지 않는, 단계.
59A. 단락 18A에 있어서, 발현 카세트가 시스-조절 인자를 포함하고, 시스-조절 인자는 전사후 반응 인자 및 폴리-A 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
60A. 단락 59A에 있어서, 전사후 반응 인자는 WHP 전사후 반응 인자(WPRE)를 포함하는, 방법.
61A. 단락 59A 또는 60A에 있어서, 상기 폴리-A 신호는 BGH 폴리-A 신호를 포함하는, 방법.
62A. 단락 18A 내지 61A 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는, 방법.
63A. 단락 18A에 있어서, 상기 발현 카세트가 서열번호: 3, 서열번호: 7, 서열번호: 8 및 서열번호: 9의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
64A. 단락 18A 내지 63A 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 외인성 서열을 추가로 포함하는, 방법.
65A. 단락 23A에 있어서, 외인성 서열이 적어도 2000개 뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
66A. 단락 23A에 있어서, 외인성 서열이 단백질을 암호화하는, 방법.
67A. 단락 23A에 있어서, 외인성 서열이 리포터 단백질을 암호화하는, 방법.
68A. 단락 18A 내지 26A 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 곤충 세포인, 방법.
69A. 단락 18A 내지 27A 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 DNA 벡터.
70A. 단락 69A에 있어서, DNA 벡터가 선형 및 연속적 구조를 갖는, DNA 벡터.
71A. 하기를 포함하는 DNA 벡터를 생산하기 위한 세포:
하기를 포함하는 제1 폴리뉴클레오타이드:
발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단) 상의 변형된 ITR로서, 변형된 ITR이 서열번호: 52의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단) 상의 야생형 ITR로서, 야생형 ITR이 서열번호: 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 야생형 ITR; 및
AAV78, AAV52, AAV Rep68 및 AAV Rep 40으로 구성된 군으로부터 선택된 복제 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드;
상기 세포에는 AAV 캡시드 단백질을 암호화하는 유전자가 결여되어 있는, 방법.
72A. 단락 71A에 있어서, 상기 세포는 곤충 세포인, 세포.
73A. 제1 폴리뉴클레오타이드의 복제에 의한, 단락 29A 내지 50A 중 어느 하나의 세포로부터 생산된 DNA 벡터.
74A. 하기를 포함하는 DNA 벡터를 생산하기 위한 폴리뉴클레오타이드:
발현 카세트;
발현 카세트의 업스트림(5'-말단) 상의 변형된 ITR로서, 변형된 ITR이 서열번호: 52의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 ITR; 및
발현 카세트의 다운스트림(3'-말단) 상의 야생형 ITR로서, 야생형 ITR이 서열번호: 1의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 야생형 ITR.
75A. 단락 74A에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드, 백미드 또는 배큘로바이러스에 있는, 폴리뉴클레오타이드.
76A. 단락 74A 또는 75A에 있어서, 외인성 서열을 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
77A. 단락 74A에 있어서, 외인성 서열이 적어도 2000개 뉴클레오타이드를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
78A. 단락 74A에 있어서, 외인성 서열이 단백질을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
79A. 단락 74A에 있어서, 외인성 서열이 리포터를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
80A. AAV78, AAV52, AAV Rep68 및 AAV Rep 40으로 구성된 군으로부터 선택된 복제 단백질에 의한 단락 33 내지 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드의 복제에 의해 생산된 DNA 벡터로서, 상기 DNA 벡터는 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있고, AAV 캡시드 단백질에 캡시드화되지 않는, DNA 벡터.
81A. 단락 80A에 있어서, DNA 벡터는 곤충 세포에서 생산되는, DNA 벡터.
82A. 표 2~6 또는 표 7~10A 또는 10B 중 어느 하나의 돌연변이된 AAV ITR 서열을 포함하는 플라스미드로부터 수득된 ceDNA 벡터.
일부 구현예에서, 본 출원은 하기 단락 중 어느 하나에 정의될 수 있다:
1B. 하기를 포함하는 공정에 의해 수득된 DNA 벡터:
(a) 제1 DNA 플라스미드 작제물을 배큘로바이러스 발현 벡터로 형질도입함으로써 수득된 제1 재조합 백미드로 곤충 세포의 제1 모집단을 형질감염시킨 다음, 그로부터 제1 배큘로-주입된 곤충 세포(BIIC-1)의 제1 모집단으로부터 수확하는 단계로서, 상기 제1 DNA 플라스미드 작제물은 단일 방향으로 하기 순서로 순차적으로 진행되는 단계: 제1 복제 단백질 부위(RPS-1), ORF 리포터 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 번역후 및 종결 신호, 및 RPS-1 및 RPS-2가 독립적으로 분자내 이중화되고 공유결합되고, RPS-1이 RPS-2에 비해 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 염기쌍 결실, 치환 또는 절단을 갖는 제2 복제 단백질 부위(RPS-2);
(b) 제2 DNA 플라스미드 작제물을 제2 배큘로바이러스 발현 벡터로 형질도입함으로써 수득된 제2 재조합 백미드로 곤충 세포의 제2 집단을 형질감염시킨 다음, 배큘로-주입된 곤충 세포(BIICs-2)의 제2 모집단으로부터 수확하는 단계로서, 상기 제2 DNA 플라스미드 작제물이 RPS-1 및 RPS-2 중 적어도 하나에 결합하는 단백질을 암호화하는 단계;
(c) 실질적으로 동일한 감염 다중도(MOI)를 제공하는 상대적인 양으로 곤충 세포의 제3 모집단과 BIIC-1 및 BIIC-2를 배합한 다음, 제2 DNA 플라스미드 작제물에 의해 암호화된 단백질이 RPS-1 및/또는 RPS-2 부위와 반응하여 약 15~20 마이크로미터 및 약 50~80%의 세포 생존율이 관측될 때까지 제1 DNA 플라스미드에 의해 암호화된 DNA 벡터의 복제를 유도하는 세포 성장 조건 하에서 곤충 세포의 제3 모집단, BIIC-1 및 BIIC-2를 인큐베이팅한 후, 원심분리에 의해 곤충 세포 펠릿으로부터 DNA를 수확하는 단계;
(d) 곤충 세포 펠릿으로부터 DNA를 추출하여 곤충 세포 펠릿으로부터 생산된 DNA를 수득하는 단계;
(e) 일차 밴드의 중량의 대략 2배인 물질을 나타내는 제2 밴드를 나타내는 서로에 대해 일차 밴드 및 이차 밴드 둘 다의 천연 겔상에서 곤충 세포 펠릿으로부터 수득된 DNA를 확인하는 단계;
(f) DNA의 제한 엔도뉴클레아제 소화 후 일차 및 이차 밴드 둘 다에서 겔의 저중량 영역을 향하여 상향 이동함으로써, 변성된 겔상에서 곤충 세포 펠릿으로부터 수득된 DNA에서 DNA 벡터를 확인하는 단계; 및
(g) 곤충 세포 펠릿으로부터 수득된 나머지 DNA 벡터를 단리하여, 높은 안정성 DNA 벡터를 수득하는 단계.
2B. 단락 1B에 있어서, RPS-1 및 RPS-2가 상이하고, 하기 서열 번호의 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열 쌍으로부터 독립적으로 선택되는, DNA 벡터:
서열번호: 1 및 서열번호: 52; 또는 서열번호: 2 및 서열번호: 51; 또는 서열번호: 101 및 서열번호: 102; 또는 서열번호: 103 및 서열번호: 104; 또는 서열번호: 105 및 서열번호: 106; 또는 서열번호: 107 및 서열번호: 108; 또는 서열번호: 109 및 서열번호: 110; 또는 서열번호: 111 및 서열번호: 112; 또는 서열번호: 113 또는 서열번호: 114; 및 서열번호: 115 또는 서열번호: 116.
일부 구현예에서, 본 출원은 하기 단락 중 어느 하나에 정의될 수 있다:
1C. 하기를 포함하는 캡시드 비함유 AAV(cfAAV) 벡터:
시스-조절 인자, 프로모터 및 외인성 서열을 포함하는 발현 카세트; 및
상기 발현 카세트에 측접하는 2개의 자기-상보성 서열,
여기서 cfAAV 벡터는 캡시드 단백질과 연관되어 있지 않고, 원핵생물-특이적 메틸화가 결여되어 있는, cfAAV 벡터.
2C. 단락 1C에 있어서, 시스-조절 인자가 리보스위치, 절연체, 미르-조절가능 요소 및 전사후 조절 인자로 구성된 군으로부터 선택되는, cfAAV 벡터.
3C. DNA 벡터가 CELiD인 단락 1C-2C 중 어느 하나의 cfAAV 벡터.
4C. 단락 1C 내지 3C 중 어느 하나에 있어서, 2개의 자기-상보성 서열이 AAV2의 ITR 서열인, cfAAV 벡터.
5C. 단락 1C 내지 4C 중 어느 하나에 있어서, 외인성 서열이 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 및 2A 요소를 포함하는, cfAAV 벡터.
6C. 단락 5C에 있어서, 발현 카세트는 하나 초과의 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는, cfAAV 벡터.
7C. 단락 1C 내지 6C 중 어느 하나에 있어서, 발현 카세트가 4000개 초과의 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드를 포함하는, cfAAV 벡터.
8C. 단락 1C 내지 7C 중 어느 하나의 cfAAV 벡터를 포함하는 약리적 조성물.
9C. 하기를 포함하는 발현 작제물로서:
시스-조절 인자, 프로모터 및 외인성 서열을 포함하는 발현 카세트; 및 상기 발현 카세트에 측접하는 2개의 역전된 말단 반복(ITR) 서열,
상기 발현 작제물은 캡시드 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임이 결여되어 있는, 발현 작제물.
10C. 단락 9C에 있어서, 시스-조절 인자가 리보스위치, 절연체, 미르-조절 가능 요소 및 전사후 조절 인자로 구성된 군으로부터 선택되는, 발현 작제물.
11C. 단락 9C 또는 10C에 있어서, 외인성 서열이 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 및 2A 요소를 포함하는, 발현 카세트.
12C. 단락 11에 있어서, 발현 카세트는 하나 초과의 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는, 발현 카세트.
13C. 단락 9C 내지 12C 중 어느 하나에 있어서, 발현 작제물은 플라스미드, 백미드 또는 배큘로바이러스에 있는, 발현 작제물.
14C. 하기를 포함하는 cfAAV 벡터를 생산하는 방법으로서:
단락 9C 내지 13C 중 어느 하나의 발현 작제물을 세포에 도입하는 단계; 및
발현 작제물의 복제에 의해 생산된 cfAAV 벡터를 수집하는 단계.
15C. 단락 14C에 있어서, 발현 작제물을 세포에 도입하기 전에 발현 작제물을 여러 번 복제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
16C. 단락 15C에 있어서, 발현 작제물은 플라스미드에 있고, 복제 단계는 이. 콜라이에서 수행되는, 방법.
17C. 단락 16C에 있어서, 발현 작제물을 세포에 도입하기 전에 발현 작제물을 플라스미드로부터 백미드로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
18C. 단락 17C에 있어서, 발현 작제물을 세포에 도입하기 전에 상기 발현 작제물을 백미드로부터 배큘로바이러스로 전달하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
19C. 단락 14C 내지 18C 중 어느 하나에 있어서, Rep 단백질을 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
20C. 단락 14C 내지 19C 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 곤충 세포인, 방법.
21C. 단락 14C 내지 20C 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 cfAAV 벡터.
22C. 단락 21C에 있어서, DNA 벡터가 CELiD인, cfAAV 벡터.
일부 구현예에서, 본 출원은 하기 단락 중 어느 하나의 단락에서 정의될 수 있다:
1D. 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터로서, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1 또는 서열번호: 51의 상응하는 AAV2 야생형 ITR에 대해 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 결실, 삽입 또는 치환을 갖는 적어도 하나의 ITR과 함께 제1 및 제2 AAV2 역전된 말단 반복 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하여, Rep 단백질의 존재하에 곤충 세포에서 DNA 벡터의 복제를 유도하고, DNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 공정으로부터 수득가능하며:
a. Rep 단백질의 존재 하에서 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여된 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 곤충 세포내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 생산을 유도하는데 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 곤충 세포가 바이러스 캡시드 암호화 서열을 포함하지 않는 단계; 및
b. 곤충 세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA를 수확하고 단리하는 단계;
곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비-함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하여, 확인될 수 있는, 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터.
2D. 단락 1에 있어서, 돌연변이된 ITR은 서열번호: 2 및 서열번호: 52로 구성된 군으로부터 선택되는, 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터.
3D. 단락 1에 있어서, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및 서열번호: 2 및 서열번호: 51로 구성된 군으로부터 선택된 한 쌍의 ITR을 포함하는, 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터.
4D. 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터로서, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 2개의 상이한 역전된 말단 반복 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하고, ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는 기능성 ITR이고, ITR 중 하나는 기능성 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고; Rep 단백질의 존재는 곤충 세포에서 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제 및 DNA 벡터의 생산을 유도하고, DNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 공정으로부터 수득가능하며:
a. Rep 단백질의 존재 하에서 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여된 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 곤충 세포내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터의 생산을 유도하는데 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 곤충 세포가 곤충 세포내에 캡시드-비-함유, 비-바이러스 DNA를 포함하지 않는 단계; 및
b. 곤충 세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA를 수확하고 단리하는 단계;
곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하여, 확인될 수 있는, 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터.
일부 구현예에서, 본 출원은 하기 단락 중 어느 하나의 단락에서 정의될 수 있다:
1E. (i) 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 포함하고, 여기서 ceDNA 벡터는 2개의 상이한 AAV 역전된 말단 반복 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이식유전자를 암호화하는 이종성 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능성 AAV 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 다른 하나는 다른 ITR(변형된 ITR)에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고, 벡터가 바이러스 캡시드에 있지 않은, ceDNA 벡터.
2E. 단락 1에 있어서, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 ceDNA 벡터가 비-변성 겔 상에서 분석될 때 선형 및 비-연속적 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 갖는, ceDNA 벡터.
3E. 단락 1E에 있어서, 변형된 ITR이 상이한 혈청형으로부터 유래되는, ceDNA 벡터.
4E. 단락 3E에 있어서, 변형된 ITR이 야생형 ITR이 아닌, ceDNA 벡터.
5E. 단락 1E에 있어서, 결실, 삽입 또는 치환이 A, A', B, B', C, C' 및 D로 구성된 군으로부터 선택된 ITR 영역 중 적어도 하나에 있는, ceDNA 벡터.
6E. 단락 5E에 있어서, 결실, 삽입 또는 치환이 A, A', B, B', C 또는 C' 영역에 의해 형성된 루프 중 하나를 결실시키는, ceDNA 벡터.
7E. 단락 1E에 있어서, 변형은 서열번호: 101~498 및 499 또는 545~547로 구성된 군으로부터 선택된 AAV2 변형된 ITR에서의 변형에 상응하는, ceDNA 벡터.
8E. 단락 1E에 있어서, 변형은 서열번호: 2, 52, 63 및 64로 구성된 군으로부터 선택된 AAV2 변형된 ITR에서의 변경에 상응하는, ceDNA 벡터.
9E. 단락 1E 내지 8E 중 어느 하나에 있어서, 벡터는 나노담체 내에 있는, ceDNA 벡터.
10E. 단락 9E에 있어서, 나노담체가 지질 나노입자(LNP)를 포함하는, ceDNA 벡터.
11E. 하기를 포함하는 방법:
벡터 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA(ceDNA)를 생산하는 단계로서, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 2개의 상이한 역전된 말단 반복 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 핵산을 암호화하며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 확인 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR의 다른 하나는 다른 ITR에 비해 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고; Rep 단백질의 존재는 곤충 세포에서 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제 및 DNA 벡터의 생산을 유도하고, DNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 공정으로부터 수득가능하고:
a. 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에, 및 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있고, 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 곤충 세포는 곤충 세포 내에 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 생산을 포함하지 않으며; 및
b. 곤충 세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA를 수확하고 단리하는 단계;
곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하여, 확인될 수 있는, 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터.
12E. 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터로서, 벡터는 제1 및 제2 AAV2 역전된 말단 반복 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 유전자를 암호화하며, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 서열번호: 1 또는 서열번호: 51의 상응하는 AAV2 야생형 ITR에 대하여 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 결실, 삽입 또는 치환을 가져서 Rep 단백질의 존재 하에 곤충 세포에서 DNA 벡터의 복제를 유도하고, DNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 공정으로부터 수득가능하고:
(a) 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에, 및 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있고, 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 곤충 세포는 바이러스 캡시드 암호화 서열을 포함하지 않으며; 및
(b) 곤충 세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA를 수확하고 단리하는 단계;
곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하여, 확인될 수 있는, 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터.
13E. 단락 12E에 있어서, 변형된 ITR은 서열번호: 2 및 서열번호: 52로 구성된 군으로부터 선택되는, 캡시드-비-함유, 비-바이러스 DNA 벡터.
14E. 단락 12E에 있어서, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 서열번호: 2 및 서열번호: 51로 구성된 군으로부터 선택된 한 쌍의 ITR을 포함하는, 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터.
15E. 벡터 폴리뉴클레오타이드로부터 수득된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터로서, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 2개의 상이한 역전된 말단 반복 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이종성 유전자를 암호화하고, ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고; ITR 중 하나는 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고, Rep 단백질의 존재는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제 및 곤충 세포에서 DNA 벡터의 생산을 유도하며, DNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 공정으로부터 수득가능하고:
(a) 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에, 및 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여되어 있고, 벡터 폴리뉴클레오타이드를 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 곤충 세포는 곤충 세포 내에 생산 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 포함하지 않으며; 및
(b) 곤충 세포로부터 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA를 수확하고 단리하는 단계;
곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 곤충 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 소화된 DNA 물질을 비-변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비-연속적 DNA와 비교하여 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하여, 확인될 수 있는, 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터.
17E. 단락 15E에 있어서, 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR인, 캡시드-비함유 비-바이러스 DNA 벡터.
18E. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은:
(i) 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)를 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함하며, ceDNA 벡터는 2개의 상이한 AAV 역전된 말단 반복 서열(ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 이식유전자를 암호화하는 이종성 핵산 서열을 포함하며, ITR 중 하나는 기능성 AAV 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 비해 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는, 방법.
19E. 단락 17E에 있어서, ceDNA 벡터가 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 투여되는, 방법.
20E. 대상체에게 치료제를 전달하는 방법으로서,
단락 1E 내지 10E 및 12E 내지 16E의 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시예
하기 실시예는 비제한적인 예시로서 제공된다.
실시예 1: ceDNA 벡터의 구축
폴리뉴클레오타이드 작제물 주형을 사용한 ceDNA 벡터의 생산이 기재된다. 예를 들어, 본 발명의 ceDNA 벡터를 생산하는데 사용된 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드 및/또는 ceDNA-배큘로바이러스일 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 허용된 숙주세포에서, 예를 들어 Rep의 존재하에, 2개의 ITR 및 ITR 중 적어도 하나가 변형되는 발현 작제물을 갖는 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형이 복제되어 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 두 단계: 첫째, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어 ceDNA-플라스미드, ceDNA-백미드, ceDNA-배큘로바이러스 게놈 등)으로부터 주형의 절개("구제") 및 둘째, 절단된 ceDNA 벡터의 Rep 매개된 복제를 겪는다.
ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ceDNA-플라스미드로부터의 것이다. 도 1a 및 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형은 ITR 서열 사이에 하기를 갖는 좌측 ITR 및 우측 돌연변이된 ITR 둘 다를 포함한다: (i) 향상제/프로모터; (ii) 이식유전자에 대한 클로닝 부위; (iii) 전사후 반응 인자(예를 들어, 우드처크 간염 바이러스 전사후 조절 인자(WPRE)); 및 (iv) 폴리-아데닐화 신호(예를 들어, 소과 성장 호르몬 유전자(BGHpA)로부터 유래). 독특한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(R1-R6)(도 1a 및 1b에 도시됨)가 또한 각각의 성분 사이에 도입되어, 작제물내 특정 부위로의 신규한 유전적 성분의 도입을 촉진하였다. R3(PmeI) GTTTAAAC(서열번호: 7) 및 R4(PacI) TTAATTAA(서열번호: 542) 효소 부위는 클로닝 부위로 조작되어, 이식유전자의 오픈 리딩 프레임을 도입한다. 이들 서열을 ThermoFisher Scientific으로부터 입수한 pFastBac HT B 플라스미드에 클로닝하였다.
간단히 말해서, 일련의 ceDNA 벡터는 도 4a 내지 4c에 도시된 과정을 사용하여 표 12에 도시된 ceDNA-플라스미드 작제물로부터 수득되었다. 표 12는 이식유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터의 한쪽 말단에서 복제 단백질 부위(RPS)(예를 들어, Rep 결합 부위)로서 활성인 서열을 포함하는, 각각의 성분에 대한 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 수를 나타낸다. 표 12의 숫자는 각각의 성분의 서열에 해당하는 이 문서의 서열번호를 지칭한다.
Figure pct00032
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 제조하기 위한 작제물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조절 스위치인 프로모터, 예를 들어 유도성 프로모터를 포함한다. 루시퍼라제 이식유전자에 작동가능하게 연결된 MND 또는 HLCR 프로모터를 포함하는 ceDNA 벡터, 예를 들어, 작제물 10, 작제물 11, 작제물 12 및 작제물 13(예를 들어, 표 14A 참고)을 제조하기 위해 다른 작제물을 사용하였다.
ceDNA-백미드의 생산:
도 4a와 관련하여, DH10Bac 반응능 세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ 반응능 세포, Thermo Fisher)를 제조사 지침에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 배큘로바이러스 셔틀 벡터 간의 재조합을 유도하여 재조합 ceDNA-백미드를 생산시켰다. 형질전환체에 대한 선택 및 백미드 및 전위효소 플라스미드의 유지를 위해, X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트에서 이. 콜라이(Φ80dlacZΔM15 마커는 백미드 벡터로부터 β-갈락토시다아제 유전자의 α-보체를 제공함)에서 청색-백색 스크리닝에 기초한 양성 선택을 스크리닝함으로써 재조합 백미드를 선택하였다. β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 콜로니를 선별하여 10 mL의 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-백미드를 이. 콜라이로부터 단리하고 FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 형질감염시켜 감염성 배큘로바이러스를 생산시켰다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크에서 50 ml의 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지(PO 바이러스를 함유함)를 세포로부터 제거하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 감염성 배큘로바이러스 입자를 세포 또는 세포 잔해로부터 분리하였다.
선택적으로, 제1 세대의 배큘로바이러스(P0)는 50 내지 500 mL의 배지에서 미접촉 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시킴으로써 증폭되었다. 세포가 직경 18~19 nm(미접촉 직경 14~15 nm), 및 ~ 4.0E + 6 세포/mL의 밀도에 도달할 때까지 세포 직경 및 생존율을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 회전식 진탕기 인큐베이터에서의 현탁 배양에서 세포를 유지시켰다. 감염 후 3 내지 8일 사이에, 배지에서 P1 배큘로바이러스 입자를 원심분리하여 세포 및 잔해물을 제거한 다음 0.45 μm 필터를 통해 여과한 후 수집하였다.
시험 작제물을 포함하는 ceDNA-배큘로바이러스를 수집하고, 배큘로바이러스의 감염성 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 2.5E + 6 세포/ml에서 4 x 20 ml Sf9 세포 배양물을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000 희석에서 P1 배큘로바이러스로 처리하고, 25~27℃에서 인큐베이팅하였다. 감염성은 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 4 내지 5일 동안 매일 세포 생존율의 변화에 의해 결정되었다.
도 4a와 관련하여, 도 8a에 따른 "Rep-플라스미드"는 Rep78(서열번호: 13) 또는 Rep68(서열번호: 12) 및 Rep52(서열번호: 14) 또는 Rep40(서열번호: 11)을 모두 포함하는 pFASTBACTM-이중 발현 벡터(ThermoFisher)에서 생산하였다.
Rep-플라스미드를 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac™ 반응능 세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ 반응능 세포(Thermo Fisher))로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 배큘로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합이 유도되어, 재조합 백미드("Rep-백미드")를 생산하였다. 재조합 백미드는 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트상에서, 이. 콜라이에서 청백색 스크리닝을 포함하는 양성 선택에 의해 선택되었다(Φ80dlacZΔM15 마커는 백미드 벡터로부터 β-갈락토시다아제 유전자의 α-보체를 제공한다). 단리된 백색 콜로니를 10 ml의 선별 배지(LB 액체 배지 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라사이클린)에 골라 접종하였다. 재조합 백미드(Rep-백미드)를 이. 콜라이로부터 분리하고, Rep-백미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 형질감염하여 감염성 배큘로바이러스를 생산했다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 ml의 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 배큘로바이러스("Rep-배큘로바이러스")를 배양물로부터 단리하였다. 선택적으로, 제1 세대의 렙-배큘로바이러스(P0)는 미접촉 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 증폭시키고, 50 내지 500 ml의 배지에서 배양하였다. 감염 후 3 내지 8일 사이에, 배지에서 P1 배큘로바이러스 입자를 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 공정에 의해 세포를 분리함으로써 수집하였다. Rep-배큘로바이러스를 수집하고 배큘로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 2.5x106 세포/mL에서 4 x 20 mL Sf9 세포 배양물을 하기 희석, 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000에서 P1 배큘로바이러스로 처리하고 인큐베이팅하였다. 감염률은 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 4 내지 5일 동안 매일 세포 생존율의 변화에 의해 결정되었다.
ceDNA 벡터 생산 및 특성규명
도 4b와 관련하여, (1) ceDNA-백미드 또는 ceDNA-배큘로바이러스를 함유하는 샘플, 및 (2) 상기 기재된 Rep-배큘로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를 Sf9 세포의 신선한 배양물에 각각 1:1000 및 1:10,000의 비율로 첨가하였다(2.5E + 6 세포/ml, 20ml). 이어서 세포를 130 rpm에서 25℃에서 배양하였다. 공동-감염 후 4~5일 후에, 세포 직경 및 생존율이 검출된다. 세포 직경이 약 70~80%의 생존율로 18~20nm에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿을 먼저 물 또는 완충제 중 적합한 부피의 수성 매질에 재현탁된다. ceDNA 벡터는 Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜(Qiagen, 컬럼 당 0.2mg의 세포 펠릿 덩어리 처리)을 사용하여 세포로부터 단리 및 정제하였다.
Sf9 곤충 세포로부터 생산되고 정제된 ceDNA 벡터의 수득량은 260 nm에서의 UV 흡광도에 기초하여 초기에 결정하였다. UV 흡광도에 기초하여 결정된 다양한 ceDNA 벡터의 수득량은 하기 표 13에 제공된다.
Figure pct00033
ceDNA 벡터는 도 4d에 도시된 바와 같이 고유 또는 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인함으로써 평가될 수 있으며, (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 변성 겔 대 천연 겔에서 크기가 두 배로 이동하는 특징적인 밴드의 존재 및 (b) 비절단된 물질에 대한 변성 겔에서 단량체 및 이량체(2x) 밴드의 존재 ceDNA 벡터의 존재의 특징이다.
단리된 ceDNA 벡터의 구조는 a) ceDNA 벡터 내에 단일 절단 부위만 존재하고, b) 0.8% 변성 아가로스 겔(> 800 bp)에서 분별될 때 명확하게 볼 수 있을 정도로 큰 생산된 단편을 위해 선택된 제한 엔도뉴클레아제로 공-감염된 Sf9 세포(본 명세서에 기재된 바와 같이)로부터 수득된 DNA를 소화시킴으로써 추가로 분석하였다. 도 4e에 도시된 바와 같이, 비-연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터 및 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 반응 생성물의 크기에 의해 구별될 수 있다 - 예를 들어, 비-연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1kb 및 2kb 단편을 생산할 것으로 기대되는 반면, 연속 구조를 갖는 비-캡시드화된 벡터는 2kb 및 4kb 단편을 생산할 것으로 기대된다.
따라서, 정의에 의해 요구되는 바와 같이 단리된 ceDNA 벡터가 공유적으로 폐쇄-종결되는 것을 정성적 방식으로 입증하기 위해, 샘플은 단일 제한 부위를 갖는 것으로 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화되어, 바람직하게는 동일하지 않은 크기(예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)의 2개의 절단 생성물이 생성된다. 변성 겔(2개의 상보성 DNA 가닥을 분리하는)에서 소화 및 전기영동 후, 선형의 비-공유적으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp 크기로 분해되는 반면, 공유적으로-폐쇄된 DNA(즉, ceDNA 벡터)는 2개의 DNA 가닥이 연결되어 펼쳐지고 길이가 2배(단일 가닥이지만)이므로, 2배 크기(2000 bp 및 4000 bp)로 유지될 것이다. 게다가, DNA 벡터의 단량체성, 이량체성 및 n량체성 형태의 소화는 다량체 DNA 벡터의 말단간 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 모두 분해될 것이다(도 4d 참조).
도 5는 하기와 같이 ceDNA 벡터를 갖는 변성 겔의 예시적인 사진을 제공한다: 엔도뉴클레아제에 의한 소화를 갖는(+) 또는 소화없는(-) 작제물-1, 작제물-2, 작제물-3, 작제물-4, 작제물-5, 작제물-6, 작제물-7 및 작제물-8(모두 상기 표 12에 기재됨). 작제물-1로부터 작제물-8까지의 각각의 ceDNA 벡터는 엔도뉴클레아제 반응 후 2개의 밴드(*)를 생성하였다. 크기 마커를 기준으로 결정된 두개의 밴드 크기는 사진 하단에 제공된다. 밴드 크기는 작제물-1 내지 작제물-8을 포함하는 플라스미드로부터 생산된 각각의 ceDNA 벡터가 연속 구조를 가짐을 확인시켜 준다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "천연 겔 및 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 확인을 위한 검정"은 제한 엔도뉴클레아제 소화를 수행한 후 소화 생성물의 전기영동 평가를 수행함으로써 ceDNA의 근접성을 평가하기 위한 검정을 지칭한다. 하나의 이러한 예시적인 검정이 이어지지만, 당해 분야의 숙련가는 본 실시예에서 많은 공지된 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 약 1/3x 및 2/3x의 생성물을 생산할 관심있는 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소로 선택된다. 이것은 천연 겔과 변성 겔 둘다의 밴드를 분해한다. 변성 전에 샘플에서 완충액을 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR 정리 키트 또는 탈염 "스핀 컬럼"(예를 들어, GE HEALTHCARE ILUSTRATM MICROSPINTM G-25 컬럼은 엔도뉴클레아제 분해를 위한 공지된 옵션이다. 검정은 예를 들어, i) 적합한 제한 엔도뉴클레아제(들)로 DNA를 소화시키고, 2) 예를 들어 Qiagen PCR 세정 키트에 적용하고, 증류수로 용리하고, iii) 10x 변성 용액(10x = 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA)을 첨가하고, 10X 염료를 첨가하고, 완충하지 않고, 1 mM EDTA 및 200 mM NaOH와 함께 이전에 인큐베이팅한 0.8~1.0% 겔 상에서 4배속에 10X 변성 용액을 첨가하여 준비한 DNA 래더와 함께 분석하여, NaOH 농도가 겔 및 겔 박스에서 균일하도록 하고, 1x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)의 존재하에 겔을 진행시키는 것을 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 크기 및 원하는 결과 타이밍에 기초하여 전기영동을 진행시키기 위해 어떤 전압을 사용할지 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수시키고 1x TBE 또는 TAE에서 중화시키고, 1x SYBR 금을 사용하여 증류수 또는 1x TBE/TAE로 옮긴다. 그런 다음 예를 들어, Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain(DMSO 중 10,000X 농축물) 및 형광등(파란색) 또는 UV(312nm)를 사용하여 밴드를 시각화할 수 있다.
생산된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 하나의 예시적이고 비-제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교함으로써 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도를 기준으로 4μg의 ceDNA 벡터가 젤에 장입되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1μg인 것으로 알려진 2 kb 밴드에 해당하는 경우 1μg의 ceDNA 벡터가 있으며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수물질의 25%이다. 그런 다음 겔의 밴드 강도는 밴드가 나타내는 계산된 투입에 대해 플로팅되는데, 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8 kb이고 절단된 비교 밴드가 2 kb인 경우 밴드 강도는 총 투입의 25%로 플롯되고, 이 경우 1.0 μg 투입의 경우 0.25 μg이다. ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 작성하면 회귀선 방정식을 사용하여 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산할 수 있으며, 이를 사용하여 ceDNA 벡터 또는 퍼센트 순도에 의해 제시된 총 투입의 퍼센트를 결정할 수 있다.
실시예 2: ceDNA 세포에서 바이러스 DNA 생산
ceDNA 벡터는 또한 표 14A에 나타낸 작제물 11, 12, 13 및 14로부터 생산되었다. 작제물 11~14를 포함하는 ceDNA-플라스미드는 당 업계에 잘 알려진 분자 클로닝 방법에 의해 생산되었다. 표 14A의 플라스미드는 서열번호: 8을 포함하는 WPRE, 이어서 이식유전자 및 우측 ITR 사이의 3' 비-번역 영역에서 서열번호: 9를 포함하는 BGHpA로 구성되었다.
Figure pct00034
작제물 11~14의 경우 작제물에 대한 백본 벡터는 하기와 같다:(i) pFB-HTb 내 asymITR-MND-루시퍼라제-wPRE-BGH-폴리A-ITR(작제물 11), (ii) pFB-HTb 내 ITR-MND-루시퍼라제-wPRE-BGH-폴리A-asymITR(작제물 12), (iii) pFB-HTb 내 asymITR-HLCR-AAT-luc-wPRE(O)-BGH-폴리A-ITR(작제물 13); 및 pFB-HTb 내 ITR-HLCR-AAT-luc-wPRE(O)-BGH-폴리A-asymITR(작제물 14), 각각의 작제물은 서로에 대해 적어도 하나의 비대칭 ITR을 갖는다. 이들 작제물은 또한 wPRE0(서열번호: 72) 및 BGH-폴리A 서열(서열번호: 73), 또는 이와 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열 중 하나 이상을 포함한다.
다음으로, ceDNA 벡터 생산을 도 4a~4c의 절차에 따라 수행하였으며, 예를 들어 (a) 재조합 ceDNA-백미드 DNA의 생산 및 재조합 ceDNA-백미드 DNA에 의한 곤충 세포의 형질감염; (b) P1 스톡(낮은 역가), P2 스톡(높은 역가)의 생산 및 정량적-PCR에 의한 바이러스 역가의 결정으로 5 ml, > 1E + 7 플라크 형성 또는 감염성 단위 "pfu"/ml BV 스톡, BV 스톡 COA를 수득하였다. 하기 쌍의 감염에 대해 BV 스톡으로 50 ml 곤충 세포를 공동 감염시켜, ceDNA 벡터 단리를 수행하였다: 본 명세서에 개시된 바와 같은 Rep-백미드 및 작제물 11, 작제물 12, 작제물 13 및 작제물 14 중 적어도 하나. QIAGEN 플라스미드 Midi 키트를 사용하여 ceDNA 벡터 단리를 수행하여, 추가 분석을 위해 정제된 DNA 물질을 얻었다. 표 14B 및 표 14C는 작제물 11~14로부터 생산된 ceDNA 벡터의 수율(OD 검출에 의해 검출됨)을 보여준다.
Figure pct00035
Figure pct00036
표 14C는 표 14C로부터 작제물 12 및 14를 사용하여 수득된(OD 검출에 의해 검출된) DNA 물질의 양을 나타낸다. 상기 실시예 1(표 13)의 공정으로부터 약 3 mg/L의 DNA 물질의 전형적인 수득량과 비교하여, 총 DNA 물질의 수득량이 허용가능하였다.
실시예 3: ceDNA 벡터는 시험관내에서 루시퍼라제 이식유전자를 발현한다
루시퍼라제 리포터 유전자를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 ceDNA-플라스미드 작제물의 클로닝 부위에 도입함으로써 작제물을 생산하였다: 작제물-1, 작제물-3, 작제물-5 및 작제물-7. 루시퍼라제 암호화 서열을 포함하는 ceDNA-플라스미드(표 12에서 상기 참고)는 각각 플라스미드 작제물 1-Luc, c 플라스미드 작제물-3-Luc, 플라스미드 작제물-5-Luc 및 플라스미드 작제물 7-Luc로 명명된다.
HEK293 세포를 형질감염 제제로서 FUGENE®(Promega Corp.)를 사용하여 100 ng, 200 ng 또는 400 ng의 플라스미드 작제물 1, 3, 5 및 7로 배양하고 형질감염시켰다. 각각의 플라스미드로부터 루시퍼라제의 발현은 각각의 세포 배양에서 루시퍼라제 활성에 기초하여 결정되었고, 결과는 도 6a에 제공된다. 루시퍼라제 활성은 미처리 대조군 세포("미처리") 또는 Fugene 단독으로 처리된 세포("Fugene")로부터 검출되지 않아, 루시퍼라제 활성이 플라스미드로부터의 유전자 발현으로부터 초래되었음을 확인하였다. 도 6a 및 도 6b에 도시된 바와 같이, 루시퍼라제의 강력한 발현이 작제물 1 및 7로부터 검출되었다. 작제물 7로부터의 발현은 루시퍼라제 활성의 용량-의존적 증가가 검출되는 루시퍼라제를 발현하였다.
각각의 플라스미드로 형질감염된 세포의 성장 및 생존율을 또한 측정하여. 도 7a 및 도 7b에 제시하였다. 형질감염된 세포의 세포 성장 및 생존율은 상이한 작제물로 처리된 상이한 군의 세포간에 유의미하게 상이하지 않았다.
따라서, 각각의 그룹에서 측정되고 세포 성장 및 생존율에 기초하여 표준화된 루시퍼라제 활성은 표준화없이 루시퍼라제 활성과 상이하지 않았다. 작제물 1-Luc를 갖는 ceDNA-플라스미드는 정규화의 유무에 관계없이 루시퍼라제의 가장 강력한 발현을 나타냈다.
따라서, 도 6a, 6b, 7a 및 7b에 제시된 데이터는 5' 내지 3'-WT-ITR(서열번호: 51), CAG 프로모터(서열번호: 3), R3/R4 클로닝 부위(서열번호: 7), WPRE(서열번호: 8), BGHpA(서열번호: 9) 및 변형된 ITR(서열번호: 2)을 포함하는 작제물 1이 ceDNA 벡터 내에서 이식유전자의 단백질을 발현할 수 있는 ceDNA 벡터를 생산하는데 효과적임을 입증한다.
실시예 4: ceDNA 벡터로부터 루시퍼라제 이식유전자의 생체내 단백질 발현.
상기 기재된 작제물 1~8로부터 생산된 ceDNA 벡터로부터의 이식유전자의 생체내 단백질 발현을 마우스에서 평가한다. ceDNA-플라스미드 작제물 1(표 12에 기재됨)로부터 수득된 ceDNA 벡터를 시험하고, 리포좀, 리포좀없이 ceDNA 작제물의 유체역학적 주사, 재투여(redose)(28일) 및 외인성 개똥벌레 루시퍼라제 ceDNA의 내구성(42일까지) 후 마우스 모델에서 지속되고 내구성있는 루시퍼라제 이식유전자 발현을 입증하였다. 상이한 실험에서, 선택된 ceDNA 벡터의 루시퍼라제 발현은 생체내에서 평가되며, 여기서 ceDNA 벡터는 루시퍼라제 이식유전자 및 표 10A~10B에 나타낸 임의의 하나로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 ITR, 또는 도 26a~26b에 나타낸 적어도 하나의 서열을 포함하는 ITR을 포함한다.
생체내 루시퍼라제 발현: 5~7주 수컷 CD-1 IGS 마우스(Charles River Laboratories)에 루시퍼라제를 발현하는 0.35 mg/kg의 ceDNA 벡터를 1.2 mL 부피로 정맥 내를 통해 0일째에 꼬리 정맥에 유체역학적 투여하였다. 루시퍼라제 발현은 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35 및 42일에 IVIS 이미지형성에 의해 평가한다. 간단히, 마우스에 150 mg/kg의 루시페린 기질을 복강내 주사한 다음, 전신 발광을 IVIS® 이미지형성을 통해 평가하였다.
IVIS 이미지형성은 3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일, 31일, 35일 및 42일에 수행하고, 수집된 장기는 42일째에 희생시킨 후에 생체외에서 이미지화한다.
연구 과정 동안, 동물의 체중을 측정하고, 일반적인 건강 및 복지에 대해 매일 모니터링하였다. 희생시, 혈액은 말단 심장 스틱에 의해 각각의 동물로부터 수집되고, 두 부분으로 분할되어 1) 혈장 및 2) 혈청으로 처리하며, 혈장 스냅-냉동 및 혈청은 간 효소 패널에 사용되며, 이어서 스냅 냉동한다. 또한, 간, 비장, 신장 및 서혜 림프절(LN)을 수집하고, IVIS에 의해 생체외에서 이미지화한다.
루시퍼라제 발현은 MAXDISCOVERY® 루시퍼라제 ELISA 검정(BIOO Scientific/PerkinElmer), 간 샘플의 루시퍼라제에 대한 qPCR, 간 샘플의 조직병리 및/또는 혈청 간 효소 패널(VetScanVS2; Abaxis Preventive Care Profile Plus)에 의해 간에서 평가한다.
실시예 5: ITR 워크(Walk) 돌연변이체 스크리닝
ITR 구조와 ceDNA 형성의 관계에 대한 추가 분석을 수행하였다. ceDNA 형성에 대한 특정 구조 변화의 영향 및 ceDNA-암호화된 이식유전자를 발현하는 능력을 질의하기 위해 일련의 돌연변이체를 구축하였다. 인간 세포 배양에서 돌연변이체 작제, ceDNA 형성의 검정 및 ceDNA 이식유전자 발현의 평가는 하기에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
A. 돌연변이체 ITR 구축
독특한 비대칭 AAV II형 ITR 돌연변이 카세트를 갖는 31개 플라스미드의 라이브러리를 인실리코 설계하고, 이어서 Sf9 곤충 세포 및 인간 배아 신장 세포(HEK293)에서 평가하였다. 각각의 ITR 카세트는 곤충 세포에서의 발현을 위한 p10 프로모터 서열에 의해 유도되는 루시퍼라제(LUC) 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터 유전자, 및 포유동물 세포에서의 발현을 위한 CAG 프로모터 서열을 함유하였다. ITR 서열에 대한 돌연변이는 우측 또는 좌측 ITR 영역에서 생산되었다. 라이브러리는 표 10A 및 10B 및 본원의 도 26a 및 26b에 개시된 15개의 우측(RS) 및 16개의 좌측(LS) 돌연변이체를 함유하였다.
Sf9 현탁 배양물을 통기된 200 mL 조직 배양 플라스크에서 Sf900 III 배지(Gibco)에 유지시켰다. 배양물을 48시간마다 계대하였고, ViCell Counter(Beckman Coulter)를 사용하여 각 계대 전에 세포 수 및 성장 메트릭을 측정하였다. 배양물을 27℃에서 진탕 조건(1" 궤도, 130 rpm)하에 유지시켰다. HEK293 세포의 부착 배양물을 5% CO2와 함께 37℃에서 250 mL 배양 플라스크에서 1% 우태 혈청 및 0.1% 펜 스트렙과 함께 GlutiMax DMEM(둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium), Gibco)에서 유지시켰다. 배양물을 트립신 처리하고 96시간마다 계대시켰다. 90~100% 융합 플라스크의 1:10 희석을 사용하여 각 계대를 시딩하였다.
ceDNA 벡터를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 생산 및 구축하였다. 간단히 말해서, 도 4b를 참조하여, 플라스미드 작제물로 형질도입된 Sf9 세포를 27℃에서 정지 조건 하에 24시간 동안 부착성 성장시켰다. 24시간 후, 형질감염된 Sf9 세포를 배큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 통해 Rep 벡터로 감염시켰다. BIIC는 감염성을 특성화하기 위해 이전에 분석되었고 1:2000의 최종 희석에서 사용하였다. Sf900 곤충 세포 배지에서 1:100으로 희석된 BIIC를 각각의 이전에 형질감염된 세포 웰에 첨가하였다. 비-Rep 벡터 BIIC를 음성 대조군으로서 웰의 서브셋에 첨가하였다. 플레이트를 2분 동안 플레이트 로커에서 약하게 흔들면서 혼합하였다. 이어서, 세포를 정지 조건하에 27℃에서 추가로 48시간 동안 성장시켰다. 모든 실험 작제물 및 대조군을 3회 분석하였다.
48시간 후, 96-웰 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고, 실온으로 간단히 평형화시키고, 루시퍼라제 발현에 대해 분석하였다(OneGlo 루시퍼라제 검정(Promega Corporation)). SpectraMax M 시리즈 마이크로플레이트 리더를 사용하여 전체 발광을 측정하였다. 복제물은 평균화하였다. 결과는 도 27에 도시되어 있다. 예상한 바와 같이, 3개의 음성 대조군(매질 단독, 공여체 DNA가 없는 모의 형질감염 및 Rep-함유 배큘로바이러스 세포없이 처리된 샘플)은 현저한 루시퍼라제 발현을 나타내지 않았다. 각각의 돌연변이체 샘플에서 강력한 루시퍼라제 발현이 관측되었으며, 이는 각각의 샘플에 대해 ceDNA-암호화된 이식유전자가 돌연변이에 관계없이 성공적으로 형질감염되고 발현되었음을 나타낸다.
B. ceDNA 형성의 분석
이전의 연구에서 생산된 ceDNA가 예상되는 폐쇄적인-말단 구조임을 보장하기 위해, 적합한 구조에 대해 시험될 수 있는 충분한 양의 각각의 ceDNA를 생산하기 위한 실험을 수행하였다. 간단히, Sf9 현탁 배양물을 라이브러리로부터 단일 ITR 돌연변이체 플라스미드에 속하는 DNA로 형질감염시켰다. 가스 교환이 제한된 에를렌메이어 배양 플라스크에서 배양물을 1.25x106 세포/mL로 시딩하였다. DNA:지질 형질감염 복합체는 제조사의 지침에 따라 fuGene 형질감염 시약을 사용하여 제조하였다. 루시퍼라제 플레이트 검정에 대해 이전에 기재한 바와 동일한 방식으로 복합체 혼합물을 제조하고 인큐베이팅하였으며, 형질감염되는 세포의 수에 비례하여 부피를 증가시켰다. 리포터 유전자 검정에서와 같이, 4.5:1(용적 시약/질량 DNA)의 비가 사용되었다. 실험 배양물과 병행하여 모의(형질감염 시약 단독) 및 처리되지 않은 성장 대조군을 제조하였다. 형질감염 시약을 첨가한 후, 부드럽게 소용돌이하면서 실온에서 10~15분 동안 배양물을 회복시키고나서, 27℃ 진탕 인큐베이터로 옮겼다. 진탕 조건 하에서 24시간 인큐베이팅한 후, 모든 플라스크(실험 및 대조군)에 대한 세포 계수 및 성장 메트릭스를 ViCell 카운터(Beckman Coulter)를 사용하여 측정하였다. 모든 플라스크(성장 조절 제외)는 1:5,000의 최종 희석으로 Rep-벡터 함유 BIIC로 감염시켰다. ceDNA 생산을 위해 확립된 BIIC 이중 감염 절차를 사용한 양성 대조군도 준비하였다. 이중 감염 배양물은 모든 실험 배양물의 평균 생존가능 세포 수와 동일한 세포 수로 시딩하였다. 이중 감염 대조군을 각각의 작제물에 대해 각각 1:5,000의 최종 희석으로 Rep 및 리포터 유전자 BIIC로 감염시켰다. 감염 후, 배양물을 상기 기재한 진탕 조건하에 인큐베이터에 다시 넣었다. 감염후 3일 동안 모든 플라스크에 대해 매일 세포 수, 성장 및 생존율 메트릭스를 측정하였다. 진탕 인큐베이션 조건 하에서 새로 감염된 배양물을 약 2시간 동안 회복시킨 후 T=0 시점 측정을 수행하였다. 3일 후, 세포를 15분 동안 원심분리하여 수확하였다. 상청액을 버리고, 펠릿의 질량을 기록하고, DNA 추출까지 펠릿을 -80℃로 동결시켰다.
제조자 "고수율" 프로토콜에 따라 Qiagen Plasmid Plus Midi 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 모든 플라스크(실험 및 대조군)로부터 추정 미정제 ceDNA를 추출하였다. NanoDrop OneC(ThermoFisher)로부터 얻은 광학 밀도 측정을 사용하여 용리액을 정량화하였다. 생산된 ceDNA 추출물을 4℃에서 저장하였다.
상기 ceDNA 추출물을 TrackIt 1kb Plus DNA 래더와 함께 1:10,000의 SYBR 안전 겔 스테인(ThermoFisher Scientific) 희석액으로 제조된 천연 아가로스(1% 아가로스, 1x TAE 완충제) 겔에서 작동시켰다. 겔은 UV/청색 조명 하에서 Gbox Mini Imager를 사용하여 시각화하였다. 상기 기재된 바와 같이, 천연 겔상에서 실행되는 ceDNA 샘플에서 2개의 일차 밴드가 예상된다: 단량체성 종을 나타내는 약 5,500 bp 밴드 및 이량체 종에 해당하는 약 11,000 bp 밴드. 모든 돌연변이체 샘플을 시험하고, 천연 아가로스 겔에서 예상되는 단량체 및 이량체 밴드를 나타냈다. 돌연변이체의 대표적인 샘플에 대한 결과는 도 28에 도시되어 있다. 소규모 생산의 추정 미정제 ITR-돌연변이체 ceDNA 및 대조군 추출물을 커플링된 제한 소화 및 변성 아가로스 겔을 사용하여 추가로 분석하여, ceDNA의 이중가닥 DNA 구조 진단을 확인하였다. 각각의 돌연변이체 ceDNA는 단일 EcoR1 제한 부위를 가질 것이고, 따라서 적절히 형성된다면 EcoR1 소화시 2개의 특징적인 단편을 생산할 것으로 예상된다. 고-충실도 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI(New England Biolabs)를 사용하여 추정 ceDNA 추출물을 제조업체의 지침에 따라 소화시켰다. 천연 아가로스 겔 분석뿐만 아니라 NanoDrop(ThermoFisher)을 사용한 분광광도법적 정량화는 용리액에서 ceDNA/플라스미드와 같은 생산물이 검출되지 않았기 때문에 모의 및 성장 대조군으로부터의 추출물은 분석되지 않았다. 제조업체의 지시에 따라 Qiagen PCR Clean-up 키트(Qiagen)를 사용하여 소화된 물질을 정제하였으며, 단 정제된 소화된 물질은 Qiagen 용출 완충액 대신 뉴클레아제 유리수에서 용출하였다. 알칼리성 아가로스 겔(8% 알칼리성 아가로스)을 평형 완충액(1 mM EDTA, 200 mM NaOH)에서 4℃에서 밤새 평형화시켰다. 10x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)을 정제된 ceDNA 소화물의 샘플에 첨가하고, 상응하는 소화되지 않은 ceDNA(총 1ug) 및 샘플을 65℃에서 10분 동안 가열하였다. 10x 장입 염료(브로모페놀 블루, 50% 글리세롤)를 각각의 변성 샘플에 첨가하고, 혼합하였다. TrackIt 1kb Plus DNA 래더(ThermoFisher Scientific)도 참조용으로 겔에 장입하였다. 겔을 4℃ 및 정전압(25V)에서 약 18시간 동안 작동시킨 후, 탈이온화된 H2O로 세정하고 1xTAE(트리스-아세테이트, EDTA) 완충액, pH 7.6에서 20분 동안 온화하게 진탕하면서 중화시켰다. 이어서, 겔을 온화하게 진탕하면서 약 1시간 동안 1x TAE/1x SYBR 금 용액으로 옮겼다. 겔은 UV/청색 조명 하에서 Gbox Mini Imager(Syngene)를 사용하여 시각화하였다. 비-절단 변성 샘플은 약 11,000 bp에서 이동하고 EcoRI 처리된 샘플이 약 4,000 bp에서 1개 및 약 6,000 bp에서 1개인, 2개의 밴드를 가질 것으로 예상되었다.
모든 돌연변이체 샘플은 이 실험에서 유사한 결과를 초래하였다. 예상된 약 11,000 bp 크기로 이동하는, 소화되지 않은 돌연변이체 샘플과는 대조적으로, 예상되는 크기로 변성 겔상에서 이동하는 EcoR1-처리된 샘플의 각 샘플 레인에서 2개의 유의한 밴드가 보였다. 도 27은 대표적 돌연변이체 샘플에 대한 결과를 도시하며, 여기서 소화되지 않은 돌연변이체 샘플에서 보이는 단일 밴드와 비교하여 배경 위의 2개의 밴드가 각각의 소화된 돌연변이체 샘플에 대해 보여진다. 따라서, 돌연변이체 샘플은 ceDNA를 정확하게 형성하는 것으로 보였다.
C. 인간 세포 배양에서의 기능적 발현
소규모 생산 공정에 의해 생산된 돌연변이체 ITR ceDNA의 기능성을 평가하기 위해, HEK293 세포를 일부 대표적인 돌연변이체 ceDNA 샘플로 형질감염시켰다. 활동적으로 분열하는 HEK293 세포를 웰당 3x106 세포(80% 밀집도)로 96-웰 미세적정 플레이트에 분주하고, 부착성 HEK293 배양을 위해 이전에 기재된 조건에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 24시간 후, 리포펙타민(Invitrogen, TheromoFisher Scientific)을 사용하여 총 200 ng의 미정제 소규모 ceDNA를 형질감염시켰다. 형질감염 복합체는 제조사 지침에 따라 제조되었고, 총 부피 10 uL 형질감염 복합체를 사용하여 이전에 분주된 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 모든 실험 작제물 및 대조군을 3회 분석하였다. 형질감염된 세포를 상기 기재된 조건에서 72시간 동안 인큐베이팅하였다. 72시간 후, 96-웰 플레이트를 인큐베이터로부터 제거하고 실온으로 간단히 평형화시켰다. OneGlo 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 회전식 진탕기에서 10분 후, SpectraMax M 시리즈 마이크로플레이트 리더를 사용하여 총 발광을 측정하였다. 복제물은 평균화되었다. 결과는 도 30에 도시되어 있다. 시험된 각각의 돌연변이체 샘플은 인간 세포 배양에서 루시퍼라제를 발현하였으며, 이는 ceDNA가 인간 세포와 연관하여 각각의 샘플에 대해 정확하게 형성되고 발현되었음을 나타낸다.
참고문헌
특허, 특허 출원, 국제 특허 출원 및 공보를 포함하여 명세서 및 실시예에 열거되고 개시된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
<110> GENERATION BIO INC. <120> MODIFIED CLOSED-ENDED DNA (CEDNA) <130> 080170-090580WOPT <150> 62/556,335 <151> 2017-09-08 <150> 62/556,281 <151> 2017-09-08 <150> 62/556,319 <151> 2017-09-08 <150> 62/556,324 <151> 2017-09-08 <150> 62/556,329 <151> 2017-09-08 <150> 62/556,331 <151> 2017-09-08 <160> 557 <170> KoPatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 2 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120 tgcctgcagg 130 <210> 3 <211> 1923 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg 540 cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 600 attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg 660 gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg 720 cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg 780 aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg 840 ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc 900 gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt 960 ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc 1020 ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc 1080 ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg 1140 aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag 1200 gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc 1260 tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg 1320 gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg 1380 ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc 1440 ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1500 taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1560 gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1620 aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1680 cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1740 ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tttagccttc 1800 ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcatttgtcg 1860 acagaattcc tcgaagatcc gaaggggttc aagcttggca ttccggtact gttggtaaag 1920 cca 1923 <210> 4 <211> 1272 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag 360 taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa 420 gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg 480 ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc 540 tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt 600 gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag 660 cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt 720 ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtaccggat 780 cttgctacca gtggaacagc cactaaggat tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt 840 ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg ccaccccctc caccttggac acaggacgct 900 gtggtttctg agccaggtac aatgactcct ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg 960 cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag 1020 cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc 1080 ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag 1140 cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatccggac tctaaggtaa atataaaatt 1200 tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tctctctttt agattccaac 1260 ctttggaact ga 1272 <210> 5 <211> 547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540 gaactga 547 <210> 6 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 6 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840 acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900 tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960 tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020 gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080 ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140 gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179 <210> 7 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 gtttaaac 8 <210> 8 <211> 581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 8 gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60 ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120 actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240 aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300 attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360 ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581 <210> 9 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 9 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180 ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225 <210> 10 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 10 taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60 tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120 ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 180 tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta 213 <210> 11 <211> 1260 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 11 atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60 gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120 gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180 gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240 aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300 ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360 gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420 cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480 aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540 tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600 tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660 atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720 gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780 tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840 cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900 aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960 tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020 cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080 aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140 actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt 1200 taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga 1260 1260 <210> 12 <211> 1932 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 12 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 13 <211> 1876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840 taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900 gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960 gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020 taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080 aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140 ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200 caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260 cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1320 ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1380 ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1440 ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1500 cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1560 gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1620 cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680 aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740 tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1800 gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1860 catctttgaa caataa 1876 <210> 14 <211> 1194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60 gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120 gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180 gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240 aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300 ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360 gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420 cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480 aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540 tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600 tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660 atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720 gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780 tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840 cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900 aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960 tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020 cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080 aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140 actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa 1194 <210> 15 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60 cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120 tgcggcgcgc gcagcacctt t 141 <210> 16 <211> 556 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180 agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240 aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300 ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360 ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacactcg agggccctgt ctcctcagct 420 tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atccggacat cgattctaag gtaaatataa 480 aatttttaag tgtataattt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc ttttagattc 540 caacctttgg aactga 556 <210> 17 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 18 <211> 241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60 ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120 aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180 atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240 c 241 <210> 19 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215 <210> 20 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc 60 gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct 120 gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct 150 <210> 21 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540 gaactg 546 <210> 22 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300 gcctaggctt ttgcaaa 317 <210> 23 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540 gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576 <210> 24 <211> 1313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60 ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc 120 atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg 180 gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg 240 tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt 300 agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg 360 gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc 420 gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg 480 ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc 540 tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct 600 gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta 660 aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc 720 gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg 780 aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc 840 tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca 900 ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg 960 gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct 1020 tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc 1080 gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt 1140 tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg 1200 aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt 1260 attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <400> 38 000 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <400> 40 000 <210> 41 <400> 41 000 <210> 42 <400> 42 000 <210> 43 <400> 43 000 <210> 44 <400> 44 000 <210> 45 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ggttga 6 <210> 46 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 agtt 4 <210> 47 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 ggttgg 6 <210> 48 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 agttgg 6 <210> 49 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 agttga 6 <210> 50 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 rrttrr 6 <210> 51 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 51 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 52 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 53 <211> 3123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc 60 cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg 120 gttcctgaac agagaaacag gagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 180 ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc 240 tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc 300 ccgccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa 360 atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc 420 ttctgctccc cgagctctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 480 gacgccatcc acgctgtttt gacttccata gaaggccgcc accatggaag acgccaaaaa 540 cataaagaaa ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat ggaaccgctg gagagcaact 600 gcataaggct atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta cagatgcaca 660 tatcgaggtg gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg tccgttcggt tggcagaagc 720 tatgaaacga tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg aaaactctct 780 tcaattcttt atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg cgcccgcgaa 840 cgacatttat aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc atttcgcagc ctaccgtggt 900 gttcgtttcc aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaagc tcccaatcat 960 ccaaaaaatt attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt cgatgtacac 1020 gttcgtcaca tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtgc cagagtcctt 1080 cgatagggac aagacaattg cactgatcat gaactcctct ggatctactg gtctgcctaa 1140 aggtgtcgct ctgcctcata gaactgcctg cgtgagattc tcgcatgcca gagatcctat 1200 ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat tccatcacgg 1260 ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg tcttaatgta 1320 tagatttgaa gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat tacaagattc aaagtgcgct 1380 gctggtgcca accctattct ccttcttcgc caaaagcact ctgattgaca aatacgattt 1440 atctaattta cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc tctaaggaag tcggggaagc 1500 ggttgccaag aggttccatc tgccaggtat caggcaagga tatgggctca ctgagactac 1560 atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg gtaaagttgt 1620 tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg gcgttaatca 1680 aagaggcgaa ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc ggttatgtaa acaatccgga 1740 agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca tagcttactg 1800 ggacgaagac gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag tctctgatta agtacaaagg 1860 ctatcaggtg gctcccgctg aattggaatc catcttgctc caacacccca acatcttcga 1920 cgcaggtgtc gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg ccgttgttgt 1980 tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg gattacgtcg ccagtcaagt 2040 aacaaccgcg aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg gacgaagtac cgaaaggtct 2100 taccggaaaa ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc ataaaggcca agaagggcgg 2160 aaagatcgcc gtgtaagagc atcttaccgc catttattcc catatttgtt ctgtttttct 2220 tgatttgggt atacatttaa atgttaataa aacaaaatgg tggggcaatc atttacattt 2280 ttagggatat gtaattacta gttcaggtgt attgccacaa gacaaacatg ttaagaaact 2340 ttcccgttat ttacgctctg ttcctgttaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag 2400 attgactgat attcttaact atgttgctcc ttttacgctg tgtggatatg ctgctttata 2460 gcctctgtat ctagctattg cttcccgtac ggctttcgtt ttctcctcct tgtataaatc 2520 ctggttgctg tctcttttag aggagttgtg gcccgttgtc cgtcaacgtg gcgtggtgtg 2580 ctctgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ctggggcatt gccaccacct gtcaactcct 2640 ttctgggact ttcgctttcc ccctcccgat cgccacggca gaactcatcg ccgcctgcct 2700 tgcccgctgc tggacagggg ctaggttgct gggcactgat aattccgtgg tgttgtctgt 2760 gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 2820 aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 2880 taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 2940 agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcaggaaccc ctagtgatgg 3000 agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg 3060 cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc 3120 agg 3123 <210> 54 <211> 3117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc 180 tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gttggaacag cagaatatgg 240 gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg 300 tccccagatg cggtcccgcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt ttccagggtg 360 ccccaaggac ctgaaatgac cctgtgcctt atttgaacta accaatcagt tcgcttctcg 420 cttctgttcg cgcgcttctg ctccccgagc tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 480 gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgactt ccatagaagg ccgccaccat 540 ggaagacgcc aaaaacataa agaaaggccc ggcgccattc tatccgctgg aagatggaac 600 cgctggagag caactgcata aggctatgaa gagatacgcc ctggttcctg gaacaattgc 660 ttttacagat gcacatatcg aggtggacat cacttacgct gagtacttcg aaatgtccgt 720 tcggttggca gaagctatga aacgatatgg gctgaataca aatcacagaa tcgtcgtatg 780 cagtgaaaac tctcttcaat tctttatgcc ggtgttgggc gcgttattta tcggagttgc 840 agttgcgccc gcgaacgaca tttataatga acgtgaattg ctcaacagta tgggcatttc 900 gcagcctacc gtggtgttcg tttccaaaaa ggggttgcaa aaaattttga acgtgcaaaa 960 aaagctccca atcatccaaa aaattattat catggattct aaaacggatt accagggatt 1020 tcagtcgatg tacacgttcg tcacatctca tctacctccc ggttttaatg aatacgattt 1080 tgtgccagag tccttcgata gggacaagac aattgcactg atcatgaact cctctggatc 1140 tactggtctg cctaaaggtg tcgctctgcc tcatagaact gcctgcgtga gattctcgca 1200 tgccagagat cctatttttg gcaatcaaat cattccggat actgcgattt taagtgttgt 1260 tccattccat cacggttttg gaatgtttac tacactcgga tatttgatat gtggatttcg 1320 agtcgtctta atgtatagat ttgaagaaga gctgtttctg aggagccttc aggattacaa 1380 gattcaaagt gcgctgctgg tgccaaccct attctccttc ttcgccaaaa gcactctgat 1440 tgacaaatac gatttatcta atttacacga aattgcttct ggtggcgctc ccctctctaa 1500 ggaagtcggg gaagcggttg ccaagaggtt ccatctgcca ggtatcaggc aaggatatgg 1560 gctcactgag actacatcag ctattctgat tacacccgag ggggatgata aaccgggcgc 1620 ggtcggtaaa gttgttccat tttttgaagc gaaggttgtg gatctggata ccgggaaaac 1680 gctgggcgtt aatcaaagag gcgaactgtg tgtgagaggt cctatgatta tgtccggtta 1740 tgtaaacaat ccggaagcga ccaacgcctt gattgacaag gatggatggc tacattctgg 1800 agacatagct tactgggacg aagacgaaca cttcttcatc gttgaccgcc tgaagtctct 1860 gattaagtac aaaggctatc aggtggctcc cgctgaattg gaatccatct tgctccaaca 1920 ccccaacatc ttcgacgcag gtgtcgcagg tcttcccgac gatgacgccg gtgaacttcc 1980 cgccgccgtt gttgttttgg agcacggaaa gacgatgacg gaaaaagaga tcgtggatta 2040 cgtcgccagt caagtaacaa ccgcgaaaaa gttgcgcgga ggagttgtgt ttgtggacga 2100 agtaccgaaa ggtcttaccg gaaaactcga cgcaagaaaa atcagagaga tcctcataaa 2160 ggccaagaag ggcggaaaga tcgccgtgta agagcatctt accgccattt attcccatat 2220 ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg 2280 caatcattta catttttagg gatatgtaat tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa 2340 acatgttaag aaactttccc gttatttacg ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta 2400 caaaatttgt gaaagattga ctgatattct taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg 2460 atatgctgct ttatagcctc tgtatctagc tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc 2520 ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct tttagaggag ttgtggcccg ttgtccgtca 2580 acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg gcattgccac 2640 cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact 2700 catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctagg ttgctgggca ctgataattc 2760 cgtggtgttg tctgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 2820 ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 2880 atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 2940 gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcagg 3000 aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 3060 cccgggaaac ccgggcgtgc gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcagg 3117 <210> 55 <400> 55 000 <210> 56 <400> 56 000 <210> 57 <211> 3912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 57 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc 60 cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg 120 gttcctggct cagaggctca gaggcacaca ggagtttctg ggctcaccct gcccccttcc 180 aacccctcag ttcccatcct ccagcagctg tttgtgtgct gcctctgaag tccacactga 240 acaaacttca gcctactcat gtccctaaaa tgggcaaaca ttgcaagcag caaacagcaa 300 acacacagcc ctccctgcct gctgaccttg gagctggggc agaggtcaga gacctctctg 360 ggcccatgcc acctccaaca tccactcgac cccttggaat ttcggtggag aggagcagag 420 gttgtcctgg cgtggtttag gtagtgtgag agggtccggg ttcaaaacca cttgctgggt 480 ggggagtcgt cagtaagtgg ctatgccccg accccgaagc ctgtttcccc atctgtacaa 540 tggaaatgat aaagacgccc atctgatagg gtttttgtgg caaataaaca tttggttttt 600 ttgttttgtt ttgttttgtt ttttgagatg gaggtttgct ctgtcgccca ggctggagtg 660 cagtgacaca atctcatctc accacaacct tcccctgcct cagcctccca agtagctggg 720 attacaagca tgtgccacca cacctggcta attttctatt tttagtagag acgggtttct 780 ccatgttggt cagcctcagc ctcccaagta actgggatta caggcctgtg ccaccacacc 840 cggctaattt tttctatttt tgacagggac ggggtttcac catgttggtc aggctggtct 900 agaggtaccg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga 960 gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg 1020 gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg 1080 aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag 1140 ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca 1200 ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc 1260 cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgccgcca ccatggaaga 1320 cgccaaaaac ataaagaaag gcccggcgcc attctatccg ctggaagatg gaaccgctgg 1380 agagcaactg cataaggcta tgaagagata cgccctggtt cctggaacaa ttgcttttac 1440 agatgcacat atcgaggtgg acatcactta cgctgagtac ttcgaaatgt ccgttcggtt 1500 ggcagaagct atgaaacgat atgggctgaa tacaaatcac agaatcgtcg tatgcagtga 1560 aaactctctt caattcttta tgccggtgtt gggcgcgtta tttatcggag ttgcagttgc 1620 gcccgcgaac gacatttata atgaacgtga attgctcaac agtatgggca tttcgcagcc 1680 taccgtggtg ttcgtttcca aaaaggggtt gcaaaaaatt ttgaacgtgc aaaaaaagct 1740 cccaatcatc caaaaaatta ttatcatgga ttctaaaacg gattaccagg gatttcagtc 1800 gatgtacacg ttcgtcacat ctcatctacc tcccggtttt aatgaatacg attttgtgcc 1860 agagtccttc gatagggaca agacaattgc actgatcatg aactcctctg gatctactgg 1920 tctgcctaaa ggtgtcgctc tgcctcatag aactgcctgc gtgagattct cgcatgccag 1980 agatcctatt tttggcaatc aaatcattcc ggatactgcg attttaagtg ttgttccatt 2040 ccatcacggt tttggaatgt ttactacact cggatatttg atatgtggat ttcgagtcgt 2100 cttaatgtat agatttgaag aagagctgtt tctgaggagc cttcaggatt acaagattca 2160 aagtgcgctg ctggtgccaa ccctattctc cttcttcgcc aaaagcactc tgattgacaa 2220 atacgattta tctaatttac acgaaattgc ttctggtggc gctcccctct ctaaggaagt 2280 cggggaagcg gttgccaaga ggttccatct gccaggtatc aggcaaggat atgggctcac 2340 tgagactaca tcagctattc tgattacacc cgagggggat gataaaccgg gcgcggtcgg 2400 taaagttgtt ccattttttg aagcgaaggt tgtggatctg gataccggga aaacgctggg 2460 cgttaatcaa agaggcgaac tgtgtgtgag aggtcctatg attatgtccg gttatgtaaa 2520 caatccggaa gcgaccaacg ccttgattga caaggatgga tggctacatt ctggagacat 2580 agcttactgg gacgaagacg aacacttctt catcgttgac cgcctgaagt ctctgattaa 2640 gtacaaaggc tatcaggtgg ctcccgctga attggaatcc atcttgctcc aacaccccaa 2700 catcttcgac gcaggtgtcg caggtcttcc cgacgatgac gccggtgaac ttcccgccgc 2760 cgttgttgtt ttggagcacg gaaagacgat gacggaaaaa gagatcgtgg attacgtcgc 2820 cagtcaagta acaaccgcga aaaagttgcg cggaggagtt gtgtttgtgg acgaagtacc 2880 gaaaggtctt accggaaaac tcgacgcaag aaaaatcaga gagatcctca taaaggccaa 2940 gaagggcgga aagatcgccg tgtaagagca tcttaccgcc atttattccc atatttgttc 3000 tgtttttctt gatttgggta tacatttaaa tgttaataaa acaaaatggt ggggcaatca 3060 tttacatttt tagggatatg taattactag ttcaggtgta ttgccacaag acaaacatgt 3120 taagaaactt tcccgttatt tacgctctgt tcctgttaat caacctctgg attacaaaat 3180 ttgtgaaaga ttgactgata ttcttaacta tgttgctcct tttacgctgt gtggatatgc 3240 tgctttatag cctctgtatc tagctattgc ttcccgtacg gctttcgttt tctcctcctt 3300 gtataaatcc tggttgctgt ctcttttaga ggagttgtgg cccgttgtcc gtcaacgtgg 3360 cgtggtgtgc tctgtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcattg ccaccacctg 3420 tcaactcctt tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc 3480 cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgata attccgtggt 3540 gttgtctgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 3600 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 3660 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 3720 ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg caggaacccc 3780 tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 3840 caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 3900 gctgcctgca gg 3912 <210> 58 <211> 3906 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 58 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tggctcagag gctcagaggc acacaggagt ttctgggctc 180 accctgcccc cttccaaccc ctcagttccc atcctccagc agctgtttgt gtgctgcctc 240 tgaagtccac actgaacaaa cttcagccta ctcatgtccc taaaatgggc aaacattgca 300 agcagcaaac agcaaacaca cagccctccc tgcctgctga ccttggagct ggggcagagg 360 tcagagacct ctctgggccc atgccacctc caacatccac tcgacccctt ggaatttcgg 420 tggagaggag cagaggttgt cctggcgtgg tttaggtagt gtgagagggt ccgggttcaa 480 aaccacttgc tgggtgggga gtcgtcagta agtggctatg ccccgacccc gaagcctgtt 540 tccccatctg tacaatggaa atgataaaga cgcccatctg atagggtttt tgtggcaaat 600 aaacatttgg tttttttgtt ttgttttgtt ttgttttttg agatggaggt ttgctctgtc 660 gcccaggctg gagtgcagtg acacaatctc atctcaccac aaccttcccc tgcctcagcc 720 tcccaagtag ctgggattac aagcatgtgc caccacacct ggctaatttt ctatttttag 780 tagagacggg tttctccatg ttggtcagcc tcagcctccc aagtaactgg gattacaggc 840 ctgtgccacc acacccggct aattttttct atttttgaca gggacggggt ttcaccatgt 900 tggtcaggct ggtctagagg taccggatct tgctaccagt ggaacagcca ctaaggattc 960 tgcagtgaga gcagagggcc agctaagtgg tactctccca gagactgtct gactcacgcc 1020 accccctcca ccttggacac aggacgctgt ggtttctgag ccaggtacaa tgactccttt 1080 cggtaagtgc agtggaagct gtacactgcc caggcaaagc gtccgggcag cgtaggcggg 1140 cgactcagat cccagccagt ggacttagcc cctgtttgct cctccgataa ctggggtgac 1200 cttggttaat attcaccagc agcctccccc gttgcccctc tggatccact gcttaaatac 1260 ggacgaggac agggccctgt ctcctcagct tcaggcacca ccactgacct gggacagtgc 1320 cgccaccatg gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atccgctgga 1380 agatggaacc gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg 1440 aacaattgct tttacagatg cacatatcga ggtggacatc acttacgctg agtacttcga 1500 aatgtccgtt cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat 1560 cgtcgtatgc agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg cgttatttat 1620 cggagttgca gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa cgtgaattgc tcaacagtat 1680 gggcatttcg cagcctaccg tggtgttcgt ttccaaaaag gggttgcaaa aaattttgaa 1740 cgtgcaaaaa aagctcccaa tcatccaaaa aattattatc atggattcta aaacggatta 1800 ccagggattt cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat ctacctcccg gttttaatga 1860 atacgatttt gtgccagagt ccttcgatag ggacaagaca attgcactga tcatgaactc 1920 ctctggatct actggtctgc ctaaaggtgt cgctctgcct catagaactg cctgcgtgag 1980 attctcgcat gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc attccggata ctgcgatttt 2040 aagtgttgtt ccattccatc acggttttgg aatgtttact acactcggat atttgatatg 2100 tggatttcga gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag ctgtttctga ggagccttca 2160 ggattacaag attcaaagtg cgctgctggt gccaacccta ttctccttct tcgccaaaag 2220 cactctgatt gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa attgcttctg gtggcgctcc 2280 cctctctaag gaagtcgggg aagcggttgc caagaggttc catctgccag gtatcaggca 2340 aggatatggg ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt acacccgagg gggatgataa 2400 accgggcgcg gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg aaggttgtgg atctggatac 2460 cgggaaaacg ctgggcgtta atcaaagagg cgaactgtgt gtgagaggtc ctatgattat 2520 gtccggttat gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg attgacaagg atggatggct 2580 acattctgga gacatagctt actgggacga agacgaacac ttcttcatcg ttgaccgcct 2640 gaagtctctg attaagtaca aaggctatca ggtggctccc gctgaattgg aatccatctt 2700 gctccaacac cccaacatct tcgacgcagg tgtcgcaggt cttcccgacg atgacgccgg 2760 tgaacttccc gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag acgatgacgg aaaaagagat 2820 cgtggattac gtcgccagtc aagtaacaac cgcgaaaaag ttgcgcggag gagttgtgtt 2880 tgtggacgaa gtaccgaaag gtcttaccgg aaaactcgac gcaagaaaaa tcagagagat 2940 cctcataaag gccaagaagg gcggaaagat cgccgtgtaa gagcatctta ccgccattta 3000 ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat ttaaatgtta ataaaacaaa 3060 atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt actagttcag gtgtattgcc 3120 acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc tctgttcctg ttaatcaacc 3180 tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt aactatgttg ctccttttac 3240 gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct attgcttccc gtacggcttt 3300 cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt ttagaggagt tgtggcccgt 3360 tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac gcaaccccca ctggctgggg 3420 cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct ttccccctcc cgatcgccac 3480 ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctaggt tgctgggcac 3540 tgataattcc gtggtgttgt ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 3600 ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 3660 ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 3720 ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 3780 tatggcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 3840 ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgcc 3900 tgcagg 3906 <210> 59 <400> 59 000 <210> 60 <400> 60 000 <210> 61 <400> 61 000 <210> 62 <400> 62 000 <210> 63 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 63 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc 60 cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg 120 gttcct 126 <210> 64 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccggga aacccgggcg tgcgcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 120 120 <210> 65 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 66 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60 cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120 tgcggcgcgc gcagcacctt t 141 <210> 67 <211> 1876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840 taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900 gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960 gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020 taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080 aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140 ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200 caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260 cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1320 ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1380 ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1440 ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1500 cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1560 gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1620 cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680 aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740 tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1800 gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1860 catctttgaa caataa 1876 <210> 68 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 68 atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 60 gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca 120 tcgggcgcg 129 <210> 69 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 69 gccgccacca tggagttggt gggctggctc gtggacaaag gcattacttc ggaaaagcag 60 tggattcagg aggatcaggc atcttacatc tcattcaacg ctgccagtaa ctcgaggtcc 120 cagatcaagg cagcgctgga caacgcggga aagattatga gtctgaccaa aactgctcca 180 gactacctcg ttggtcagca accggtggaa gatatctcca gcaacaggat ctacaagatt 240 ctggagctca acggctacga ccctcaatac gctgcctcag tgttcttggg ttgggccacc 300 aagaaattcg gcaagagaaa cactatctgg ctgttcggcc ccgctaccac tggaaagaca 360 aacatcgcag aagcgattgc tcacacggtg ccattctacg gctgcgtcaa ctggacaaac 420 gagaacttcc cgttcaacga ctgtgtcgat aagatggtta tctggtggga ggaaggaaag 480 atgacggcca aagtggtcga aagcgccaag gcaattctgg gtggctctaa agtgcgcgtc 540 gaccagaagt gcaaatcttc agctcaaatc gatcctaccc ccgttattgt gacatcaaac 600 acgaacatgt gtgccgtgat cgacggaaac agtacaacgt tcgaacacca gcaacctctc 660 caggatcgta tgttcaagtt cgagctcacc cgccgtttgg accatgattt cggcaaggtc 720 actaaacaag aggttaagga cttcttccgc tgggctaaag atcacgttgt ggaggttgaa 780 catgagttct acgtcaagaa aggaggtgct aagaaacgtc cagccccgtc ggacgcagat 840 atctccgaac ctaagagggt gagagagtcg gtcgcacagc caagcacttc tgacgcagaa 900 gcttccatta actacgcaga taggtaccaa aacaagtgca gcagacacgt gggtatgaac 960 ttgatgctgt tcccatgccg ccagtgtgag cgtatgaacc aaaactctaa catctgtttc 1020 acacatggcc agaaggactg cctcgaatgt ttccctgtgt cagagagtca gcccgtctca 1080 gtcgttaaga aagcttacca aaagttgtgc tacatccacc atattatggg taaagtccct 1140 gatgcctgta ccgcttgtga tctggtcaac gtggatttgg acgactgtat tttcgagcaa 1200 taa 1203 <210> 70 <211> 388 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 70 gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 60 cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt 120 aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc 180 tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc 240 ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc 300 tccccgagct ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc 360 atccacgctg ttttgacttc catagaag 388 <210> 71 <211> 1662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 71 gccgccacca tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg 60 gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct 120 ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc 180 gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga 240 atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt 300 atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt 360 atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg 420 aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta tcatggattc taaaacggat 480 taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat 540 gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga caattgcact gatcatgaac 600 tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg 660 agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt 720 ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata 780 tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt 840 caggattaca agattcaaag tgcgctgctg gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa 900 agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct 960 cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg 1020 caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat 1080 aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat 1140 accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt 1200 atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg 1260 ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat cgttgaccgc 1320 ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat caggtggctc ccgctgaatt ggaatccatc 1380 ttgctccaac accccaacat cttcgacgca ggtgtcgcag gtcttcccga cgatgacgcc 1440 ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag 1500 atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg 1560 tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag 1620 atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag atcgccgtgt aa 1662 <210> 72 <211> 581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60 ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120 actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240 aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300 attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360 ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581 <210> 73 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 73 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180 ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225 <210> 74 <211> 1177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 74 ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60 tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac 120 ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac 180 agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca 240 tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc 300 ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag 360 tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa 420 tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt 480 tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga 540 cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca 600 agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt 660 tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta 720 attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt 780 accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca 840 gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca 900 ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 960 tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 1020 gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 1080 gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 1140 tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177 <210> 75 <400> 75 000 <210> 76 <400> 76 000 <210> 77 <400> 77 000 <210> 78 <400> 78 000 <210> 79 <400> 79 000 <210> 80 <400> 80 000 <210> 81 <400> 81 000 <210> 82 <400> 82 000 <210> 83 <400> 83 000 <210> 84 <400> 84 000 <210> 85 <400> 85 000 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <400> 87 000 <210> 88 <400> 88 000 <210> 89 <400> 89 000 <210> 90 <400> 90 000 <210> 91 <400> 91 000 <210> 92 <400> 92 000 <210> 93 <400> 93 000 <210> 94 <400> 94 000 <210> 95 <400> 95 000 <210> 96 <400> 96 000 <210> 97 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 98 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 99 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 99 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 100 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 100 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120 tgcctgcagg 130 <210> 101 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 102 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 103 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 104 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 105 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 106 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 107 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 108 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 109 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60 tgagcgagcg agcgcgc 77 <210> 110 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag 60 tgagcgagcg agcgcgc 77 <210> 111 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 112 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 113 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 114 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 115 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgc 77 <210> 116 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 117 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgactttgtc 60 gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 118 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaagtcgc ccgacgcccg ggctttgccc 60 gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 119 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgattttcgc 60 ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 120 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaatcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 60 gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 121 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgtttcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 122 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaacgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 123 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtcgggcg acctttggtc 60 gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 124 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggtttccc 60 gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 125 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg gaaaccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc 60 ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 126 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg 60 gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 127 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 128 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgtttcgggc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 129 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccca aagggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 130 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc ctttgggcgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 131 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccaa aggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc 60 tcagtgagcg agcgagcgcg c 81 <210> 132 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc tttggcggcc 60 tcagtgagcg agcgagcgcg c 81 <210> 133 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcaaa gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 134 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgct ttgcggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 135 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagcc cgggctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 136 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 137 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac cggtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 138 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgca cgtgcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 139 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 140 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagac cggtctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 141 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaca cgtgtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 142 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 143 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca cgtgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 144 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaacc cgggttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 145 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagcc atggctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 146 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaac cggttggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 147 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 147 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc atggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 148 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 149 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgca attgcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 150 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaac cggtttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 151 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagaa cgttctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 152 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 153 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaaa cgtttggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 154 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa atttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 155 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 156 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaacc atggttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 157 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaac atgttggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 158 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagac atgtctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 159 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaca attgtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 160 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaaa cgttttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 161 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaac atgtttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 162 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaca attgttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 163 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagaa atttctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 164 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaaa attttggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 165 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaaa atttttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 166 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 gcgcgctcgc tcgctcgctg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 167 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 gcgcgctcgc tcgctcaatg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 168 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 gcgcgctcgc tcgctcaccg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cggtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 169 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 170 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 gcgcgctcgc tcgctcactg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 171 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 gcgcgctcgc tcgctcactg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 172 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 gcgcgctcgc tcgctcactg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 173 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 gcgcgctcgc tcgctcgatg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 174 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 gcgcgctcgc tcgctcgcgg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 175 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 gcgcgctcgc tcgctcgcta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 176 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 gcgcgctcgc tcgctcgctg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 cagcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 177 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 gcgcgctcgc tcgctcgctg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 cagcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 178 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 gcgcgctcgc tcgctcgctg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct 60 cagcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 179 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 gcgcgctcgc tcgctcgagg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 180 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 gcgcgctcgc tcgctcgata aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tatcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 181 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 182 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 gcgcgctcgc tcgctcgatg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 183 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 gcgcgctcgc tcgctcgatg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 184 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 gcgcgctcgc tcgctcgaga aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 185 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 gcgcgctcgc tcgctcgagg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 186 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 gcgcgctcgc tcgctcgagg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 187 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 gcgcgctcgc tcgctcgagg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 188 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 gcgcgctcgc tcgctcgagg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 189 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 gcgcgctcgc tcgctcgagg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 190 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 gcgcgctcgc tcgctcgaga gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 191 <400> 191 000 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <400> 193 000 <210> 194 <400> 194 000 <210> 195 <400> 195 000 <210> 196 <400> 196 000 <210> 197 <400> 197 000 <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <400> 199 000 <210> 200 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 gcgcgctcgc tcgctcgaga aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 201 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 gcgcgctcgc tcgctcgaga agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 202 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 gcgcgctcgc tcgctcgaga gagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 203 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 gcgcgctcgc tcgctcgaga ggaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtcc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 204 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 205 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 gcgcgctcgc tcgctcaaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tcttgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 206 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 gcgcgctcgc tcgctcacga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tcgtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 207 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 gcgcgctcgc tcgctcacta gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 208 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 gcgcgctcgc tcgctcactg gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 209 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 gcgcgctcgc tcgctcactg aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttt 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 210 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 211 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 212 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 213 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgagcg accaaaggtc gctcgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 214 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccggacg accaaaggtc gtccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 215 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggag accaaaggtc tcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 216 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca accaaaggtt gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 217 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 218 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aacaaagttc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 219 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 220 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaagcg accaaaggtc gcttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 221 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaacg accaaaggtc gtttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 222 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 223 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa accaaaggtt ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 224 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gccaaaggct ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 225 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gacaaagtct ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 226 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gaaaaattct ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 227 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 228 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaaa aaaaaatttt tttcgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 229 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccggaaa gaaaaattct ttccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 230 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggaa gaaaaattct tcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 231 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 232 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gaaaaattcc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 233 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaaaatttc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 234 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 235 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 236 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 237 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 238 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 239 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 240 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 241 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 242 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 243 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 243 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 244 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 244 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 245 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 245 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 246 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 246 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 247 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 247 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 248 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 249 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 250 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 251 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 251 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 252 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 253 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 253 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 254 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 254 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 255 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 255 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 256 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 256 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 257 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 257 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 258 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 258 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 259 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 260 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 261 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 262 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 262 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 263 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 263 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 264 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 264 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 265 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 265 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 266 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 266 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 267 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 267 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 268 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 268 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 269 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 270 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 271 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 272 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 273 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 274 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 274 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 275 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 275 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 276 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 276 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 277 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 277 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 278 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 278 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 279 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 279 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 280 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 281 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 281 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 282 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 282 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 283 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 283 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 284 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 285 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 285 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 286 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 286 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 287 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 287 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 288 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 288 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 289 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 289 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 290 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 290 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 291 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 291 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 292 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 292 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 293 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 293 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 294 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 294 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 295 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 295 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 296 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 296 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 297 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 297 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 298 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 298 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 299 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 299 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 300 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 300 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 301 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 301 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 302 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 302 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 303 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 304 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 304 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 305 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 305 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 306 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 306 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 307 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 307 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 308 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 308 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 309 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 309 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 310 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 310 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 311 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 311 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 312 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 312 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 313 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 314 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 314 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 315 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 316 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 317 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 318 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 319 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 319 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 320 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 321 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 322 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 323 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 324 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 325 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 325 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 326 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 327 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 327 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 328 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 328 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 329 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 330 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 331 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 332 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 333 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 334 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 334 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 335 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 335 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 336 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 336 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 337 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 337 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 338 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 338 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 339 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 339 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 340 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 340 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 341 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 341 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 342 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 342 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 343 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 344 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 344 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 345 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 345 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 346 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 346 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 347 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 347 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 348 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 348 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 349 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 349 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 350 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 350 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 351 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 351 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 352 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 353 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 353 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 354 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 354 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 355 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 355 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 356 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 356 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 357 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 357 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 358 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 359 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 360 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 361 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 362 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 362 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 363 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 364 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 364 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 365 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 365 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 366 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 366 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 367 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 367 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 368 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 368 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 369 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 370 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 371 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 372 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 373 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 374 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 375 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 376 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 377 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 378 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 379 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 380 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 380 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 381 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 381 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 382 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 382 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 383 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 383 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 384 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 384 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 385 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 385 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 386 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 386 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 387 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 387 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 388 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 388 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 389 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 390 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 391 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 392 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 392 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 393 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 393 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 394 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 394 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 395 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 395 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 396 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 396 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 397 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 397 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 398 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 398 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 399 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 399 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 400 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 400 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 401 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 401 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 402 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 402 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 403 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 403 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 404 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 404 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 405 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 405 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 406 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 406 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 407 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 407 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 408 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 408 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 409 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 409 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 410 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 410 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 411 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 411 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 412 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 412 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 413 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 413 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 414 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 414 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 415 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 415 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 416 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 416 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 417 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 417 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 418 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 418 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 419 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 420 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 420 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 421 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 421 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 422 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 422 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 423 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 423 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 424 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 424 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 425 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 425 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 426 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 426 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 427 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 427 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 428 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 428 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 429 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 429 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 430 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 430 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 431 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 431 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 432 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 432 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 433 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 433 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 434 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 434 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 435 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 435 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 436 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 436 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 437 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 437 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 438 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 438 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 439 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 439 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 440 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 440 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 441 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 441 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 442 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 443 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 444 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 445 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 445 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 446 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 446 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 447 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 447 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 448 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 448 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 449 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 449 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 450 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 450 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 451 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 451 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 452 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 453 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 454 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 455 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 455 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 456 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 456 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 457 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 457 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 458 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 458 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaag accaaaggtc ttttgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 459 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 459 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 460 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 460 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 461 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 461 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 462 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 462 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 463 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 463 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 464 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 464 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 465 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 465 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 466 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 466 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 467 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 467 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 468 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 468 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 469 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 469 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 cgcacgcccg ggtttcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 120 120 <210> 470 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 470 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 471 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 471 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120 gcctgcagg 129 <210> 472 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 472 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g 101 <210> 473 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 473 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaca aagtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120 gcgcgcagct gcctgcagg 139 <210> 474 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 474 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaaa atcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120 gcgcagctgc ctgcagg 137 <210> 475 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 475 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaaa cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120 gcagctgcct gcagg 135 <210> 476 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 476 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120 agctgcctgc agg 133 <210> 477 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 477 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120 gcgcgcagct gcctgcagg 139 <210> 478 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 478 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120 gcgcagctgc ctgcagg 137 <210> 479 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 479 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120 gcagctgcct gcagg 135 <210> 480 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 480 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120 agctgcctgc agg 133 <210> 481 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 481 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 120 ctgcctgcag g 131 <210> 482 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 482 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120 gcctgcagg 129 <210> 483 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 483 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgtttcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 120 ctgcagg 127 <210> 484 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 484 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 120 120 <210> 485 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 485 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120 ct 122 <210> 486 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 486 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120 ct 122 <210> 487 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 487 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 488 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 488 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc 60 gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t 101 <210> 489 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 489 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120 tccatcacta ggggttcct 139 <210> 490 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 490 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgatttt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 491 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 491 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 492 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 492 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 493 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 493 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg 60 gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120 tccatcacta ggggttcct 139 <210> 494 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 494 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc 60 gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 495 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 495 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga 60 cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 496 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 496 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 497 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 497 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc t 131 <210> 498 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 498 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 499 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 499 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120 ggttcct 127 <210> 500 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 500 gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgc 43 <210> 501 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 501 cgggcccgtg cgggcccaaa gggcccgc 28 <210> 502 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 502 gcccgggcac gcccgggttt cccgggcg 28 <210> 503 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 503 cgtgcgggcc caaagggccc gc 22 <210> 504 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 504 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 505 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 505 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 506 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 506 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc 42 <210> 507 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 507 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 508 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 508 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 509 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 509 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggc 34 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 510 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 511 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 511 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 512 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 512 cggggcccga cgcccgggct ttgcccgggc 30 <210> 513 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 513 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 514 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 514 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 515 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 515 cgggcccgac gcccgggctt tgcccgggc 29 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 516 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 517 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 517 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 518 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 518 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 519 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 520 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 520 gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42 <210> 521 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 521 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 522 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 522 gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g 31 <210> 523 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 523 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 524 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 525 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 525 gccgcccggg cgacgggcga cctttggtcg cccg 34 <210> 526 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 526 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 527 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 528 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 528 gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g 31 <210> 529 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 529 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 530 <211> 1653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 530 atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60 tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120 ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180 tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240 caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300 cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360 cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420 atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480 tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540 aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600 agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660 ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720 ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780 cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840 atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900 tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960 cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020 gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080 ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140 ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200 gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260 cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320 cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380 attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440 agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500 gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560 gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620 ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1653 <210> 531 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 531 gcgcgctcgc tcgctc 16 <210> 532 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 532 actgaggc 8 <210> 533 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 533 cgggcgacca aaggtcgccc ga 22 <210> 534 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 534 cgcccgggcg 10 <210> 535 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 535 gcctcagt 8 <210> 536 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 536 gagcgagcga gcgcgc 16 <210> 537 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 537 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 538 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 538 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165 <210> 539 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 539 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc 60 cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg 120 cgcagagaga tcactagggg 140 <210> 540 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 540 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 541 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 541 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60 ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 542 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 542 ttaattaa 8 <210> 543 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 543 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 544 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 544 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcctttgc ctcagtgagc gagcgagcgc gc 52 <210> 545 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 545 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 546 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 546 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg tttcggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgca g 81 <210> 547 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 547 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgaa acgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgca g 81 <210> 548 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 548 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc 42 <210> 549 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 549 gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42 <210> 550 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 550 aggaacccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60 cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg 120 agcgcgcaga gagggagtgg ccaa 144 <210> 551 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 551 gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgc 43 <210> 552 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 552 cgggcccgtg cgggcccaaa gggcccgc 28 <210> 553 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 553 gcccgggcac gcccgggttt cccgggcg 28 <210> 554 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 554 cgtgcgggcc caaagggccc gc 22 <210> 555 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 555 gcgggccgga aacgggcccg ctgcccgctg gtttccagcg ggc 43 <210> 556 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 556 cgcccgggaa acccgggcgt gcccgggc 28 <210> 557 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 557 gggccgcccg ggaaacccgg gcgtgccc 28

Claims (57)

  1. 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, 상기 ceDNA 벡터는 비대칭 역전된 말단 반복 서열(비대칭 ITR) 사이에 작동가능하게 배치된 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 비대칭 ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는, ceDNA 벡터.
  2. 청구항 1에 있어서, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화되고 천연 및 변성 겔 전기영동 둘다에 의해 분석될 때 상기 ceDNA 벡터는 선형 및 비-연속적 DNA 대조군과 비교하여, 선형 및 연속적 DNA의 특징적인 밴드를 나타내는, ceDNA 벡터.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 비대칭 ITR 서열 중 하나 이상이 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래된, ceDNA 벡터.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 비대칭 ITR이 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래된, ceDNA 벡터.
  5. 청구항 4에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 이상이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래된, ceDNA 벡터.
  6. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 이상이 합성인, ceDNA 벡터.
  7. 청구항 1 내지 3 및 6 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 이상이 야생형 ITR이 아닌, ceDNA 벡터.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'로부터 선택된 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된, ceDNA 벡터.
  9. 청구항 8에 있어서, 결실, 삽입 및/또는 치환은 A, A', B, B' C, 또는 C' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, ceDNA 벡터.
  10. 청구항 8 또는 9에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, B 및 B' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, ceDNA 벡터.
  11. 청구항 8 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, C 및 C' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, ceDNA 벡터.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두가 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되어, B 및 B' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 C 및 C' 영역에 의해 정상적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부를 결실시키는, ceDNA 벡터.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에 단일 스템-루프 구조를 포함하는, ceDNA 벡터.
  14. 청구항 13에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에 단일 스템 및 2개의 루프를 포함하는, ceDNA 벡터.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 정상적으로 포함하는 영역에 단일 스템 및 단일 루프를 포함하는, ceDNA 벡터.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비대칭 ITR은 하기로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 AAV2 ITR인, ceDNA 벡터: 도 26a 또는 26b, 서열번호: 101~499 또는 545~547의 ITR, 도 26a 또는 26b의 ITR에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 ITR, 및 서열번호: 101~499 및 545~547에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 ITR.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 비대칭 ITR이 서열번호: 2, 52, 63 또는 64의 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호: 2, 52, 63 또는 64에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 AAV2 ITR인, ceDNA 벡터.
  18. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR은 야생형 AAV ITR이고, 3' ITR은 서열번호: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 469~483 및 546으로부터 선택된 서열, 및 도 26a에 도시된 ITR 서열, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  19. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 3' ITR은 야생형 AAV ITR이고, 5' ITR은 서열번호: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484~499, 545 및 547로부터 선택된 서열, 및 도 26b에 도시된 ITR 서열, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  20. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 5' ITR이 서열번호: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484~499, 545 및 547로부터 선택된 서열, 및 도 26b에 도시된 ITR 서열, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고; 3' ITR은 서열번호: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,130, 132, 134, 469~483 및 546으로부터 선택된 서열 및 도 26a에 도시된 ITR 서열, 및 상기 서열 중 임의의 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  21. 청구항 1에 있어서, 하기로부터 선택된 적어도 2개의 비대칭 ITR을 포함하는, ceDNA 벡터:
    a. 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및
    b. 서열번호: 2 및 서열번호: 51.
  22. 청구항 1에 있어서, 하기로부터 선택된 한 쌍의 비대칭 ITR을 포함하는, ceDNA 벡터:
    a. 서열번호: 1 및 서열번호: 52; 및
    b. 서열번호: 2 및 서열번호: 51.
  23. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 비대칭 ITR 중 하나 또는 둘 모두 서열번호: 2, 52, 63 64, 113, 114, 및 557 이외의 서열을 포함하는, ceDNA 벡터.
  24. 청구항 1 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부가 적어도 하나의 조절 스위치의 제어하에 있는, ceDNA 벡터.
  25. 청구항 24에 있어서, 적어도 하나의 조절 스위치는 표 11의 조절 스위치로부터 선택되는, ceDNA 벡터.
  26. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 나노담체 내에 있는, ceDNA 벡터.
  27. 청구항 26에 있어서, 나노담체는 지질 나노입자(LNP)를 포함하는, ceDNA 벡터.
  28. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, ceDNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 방법으로부터 수득되는, ceDNA 벡터:
    a. 적어도 하나의 Rep 단백질의 존재하에, ceDNA 발현 작제물을 보유하는 곤충 세포의 모집단을 인큐베이팅하는 단계로서, 상기 ceDNA 발현 작제물이 곤충세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 ceDNA 벡터를 암호화하는 단계; 및
    b. 곤충세포로부터 ceDNA 벡터를 단리하는 단계.
  29. 청구항 28에 있어서, ceDNA 발현 작제물은 ceDNA 플라스미드, ceDNA 백미드 및 ceDNA 배큘로바이러스로부터 선택되는, ceDNA 벡터.
  30. 청구항 28 또는 29에 있어서, 곤충 세포가 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, ceDNA 벡터.
  31. 청구항 30에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질은 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, ceDNA 벡터.
  32. 청구항 31에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, ceDNA 벡터.
  33. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 암호화하는 ceDNA 발현 작제물.
  34. 청구항 33에 있어서, ceDNA 플라스미드, ceDNA 백미드 또는 ceDNA 배큘로바이러스인, ceDNA 발현 작제물.
  35. 청구항 33 또는 34의 ceDNA 발현 작제물을 포함하는 숙주세포.
  36. 청구항 35에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, 숙주세포.
  37. 청구항 36에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 파보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)로부터 선택된 바이러스로부터 유래되는, 숙주세포.
  38. 청구항 37에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 숙주세포.
  39. 청구항 35 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포인 숙주세포.
  40. 청구항 39에 있어서, Sf9 세포인, 숙주세포.
  41. 하기를 포함하는, ceDNA 벡터의 제조 방법:
    a. ceDNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건 하에 및 충분한 시간 동안 청구항 35 내지 40 중 어느 한 항의 숙주세포를 인큐베이팅하는 단계; 및
    b. 숙주세포로부터 ceDNA를 단리하는 단계.
  42. 대상체에서 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 모니터링 또는 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 진단 또는 모니터링하기 위해 선택되는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 전사 또는 번역될 때 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 대상체에서 비정상적인 양의 내인성 단백질을 교정하는 방법.
  44. 청구항 42에 있어서, 전사 또는 번역될 때 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 대상체에서 내인성 단백질의 활성 또는 경로의 비정상 기능을 교정하는, 방법.
  45. 청구항 42 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 RNAi, siRNA, miRNA, lncRNA, 및 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드로부터 선택된 뉴클레오타이드 분자를 암호화하거나 포함하는, 방법.
  46. 청구항 42 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 단백질을 암호화하는, 방법.
  47. 청구항 42에 있어서, 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 마커 단백질을 암호화하는, 방법.
  48. 청구항 42 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 상기 질환 또는 장애와 연관된 내인성 단백질 또는 경로의 효능제 또는 길항제를 암호화하는, 방법.
  49. 청구항 42 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열은 항체를 암호화하는, 방법.
  50. 청구항 42 내지 49 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 투여되는, 방법.
  51. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료적 단백질을 대상체에게 전달하는 방법으로서, 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열이 치료적 단백질을 암호화하는, 방법.
  52. 청구항 51에 있어서, 치료적 단백질이 치료적 항체인, 방법.
  53. 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터, 및 패킷 삽입물을 갖는 컨테이너에 포장된 나노담체를 포함하는 키트.
  54. ceDNA 벡터를 생산하기 위한 키트로서, 하기를 포함하며:
    a. 적어도 하나의 이종성 뉴클레오타이드 서열의 삽입을 위한 적어도 하나의 제한 부위, 또는 조절 스위치, 또는 둘 모두를 포함하는 발현 작제물,
    적어도 하나의 제한 부위는 비대칭 역전된 말단 반복 서열(비대칭 ITR)사이에 작동가능하게 배치되며, 비대칭 ITR 중 적어도 하나가 기능성 말단 분할 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는, 키트.
  55. 청구항 54에 있어서, 청구항 1 내지 25 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 생산하는데 적합한, 키트.
  56. 청구항 54 또는 55에 있어서, 바이러스 캡시드 암호화 서열이 결여된 곤충 세포의 모집단을 추가로 포함하고, Rep 단백질의 존재 하에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도할 수 있는, 키트.
  57. 청구항 54 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 추가로 포함하며, 상기 벡터는 곤충 세포에서 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현시키는데 적합한, 키트.
KR1020207009737A 2017-09-08 2018-09-07 변형된 폐쇄-종결된 dna(cedna) KR20200051011A (ko)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762556335P 2017-09-08 2017-09-08
US201762556324P 2017-09-08 2017-09-08
US201762556281P 2017-09-08 2017-09-08
US201762556331P 2017-09-08 2017-09-08
US201762556319P 2017-09-08 2017-09-08
US201762556329P 2017-09-08 2017-09-08
US62/556,329 2017-09-08
US62/556,331 2017-09-08
US62/556,324 2017-09-08
US62/556,281 2017-09-08
US62/556,335 2017-09-08
US62/556,319 2017-09-08
PCT/US2018/049996 WO2019051255A1 (en) 2017-09-08 2018-09-07 CLOSED-ENDED DNA (CEDNA) MODIFIED

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200051011A true KR20200051011A (ko) 2020-05-12

Family

ID=65635235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207009737A KR20200051011A (ko) 2017-09-08 2018-09-07 변형된 폐쇄-종결된 dna(cedna)

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20200283794A1 (ko)
EP (1) EP3678710A4 (ko)
JP (2) JP2020532981A (ko)
KR (1) KR20200051011A (ko)
CN (1) CN111132699A (ko)
AU (1) AU2018327348A1 (ko)
BR (1) BR112020004151A2 (ko)
CA (1) CA3075168A1 (ko)
IL (1) IL272797A (ko)
MA (1) MA50100A (ko)
MX (1) MX2020002500A (ko)
PH (1) PH12020500465A1 (ko)
SG (1) SG11202000698SA (ko)
WO (1) WO2019051255A1 (ko)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
EP3092049A1 (en) 2014-01-08 2016-11-16 Flodesign Sonics Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
MX2020005808A (es) * 2017-12-06 2020-10-28 Generation Bio Co Edición de genes mediante el uso de un adn modificado de extremo cerrado (ceadn).
KR20220066413A (ko) 2017-12-14 2022-05-24 프로디자인 소닉스, 인크. 음향 트랜스듀서 구동기 및 제어기
US20220042035A1 (en) * 2018-02-14 2022-02-10 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for antibody and fusion protein production
GB201905651D0 (en) 2019-04-24 2019-06-05 Lightbio Ltd Nucleic acid constructs and methods for their manufacture
WO2021011840A1 (en) * 2019-07-17 2021-01-21 Generation Bio Co. Compositions and production of nicked closed-ended dna vectors
EP3999122A4 (en) * 2019-07-17 2023-08-30 Generation Bio Co. SYNTHETIC MANUFACTURE OF SINGLE STRANDED ADENO-ASSOCIATED VIRAL DNA VECTORS
US20220280427A1 (en) * 2019-09-06 2022-09-08 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended dna and cleavable lipids and methods of use thereof
CA3151464A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Bruce C. SCHNEPP Synthetic dna vectors and methods of use
WO2021072031A1 (en) * 2019-10-11 2021-04-15 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions for the manufacture and use of circular dna encoded therapeutics for genetic disorders and other diseases
WO2021169167A1 (en) * 2020-02-29 2021-09-02 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Method for treating coronavirus infections
MX2023001109A (es) 2020-07-27 2023-04-24 Anjarium Biosciences Ag Composiciones de moleculas de adn, metodos para elaborar las mismas, y metodos de usos de las mismas.
JP2023538666A (ja) 2020-08-23 2023-09-08 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の改善された製造のための改変バキュロウイルス系
US20240026374A1 (en) * 2020-09-16 2024-01-25 Generation Bio Co. Closed-ended dna vectors and uses thereof for expressing phenylalanine hydroxylase (pah)
GB202014751D0 (en) * 2020-09-18 2020-11-04 Lightbio Ltd Targeting vector
WO2022232029A2 (en) * 2021-04-26 2022-11-03 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Synthetic aav vectors for repeated delivery of therapeutic genes
EP4329884A1 (en) * 2021-04-27 2024-03-06 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
IL308404A (en) * 2021-04-27 2024-01-01 Generation Bio Co Non-viral DNA vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
KR20240005903A (ko) * 2021-05-07 2024-01-12 제너레이션 바이오 컴퍼니 백신 전달을 위한 비바이러스성 dna 벡터
WO2022236016A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Generation Bio Co. Lyophilized non-viral dna vector compositions and uses thereof
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
CN117802161A (zh) * 2022-06-30 2024-04-02 苏州吉恒基因科技有限公司 精准重组腺相关病毒载体及其用途
WO2024040222A1 (en) * 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
US11993783B1 (en) 2023-03-27 2024-05-28 Genecraft Inc. Nucleic acid molecule comprising asymmetrically modified ITR for improving expression rate of inserted gene, and use thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050019824A1 (en) * 1994-03-08 2005-01-27 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast Growth Factor-10
US20050026838A1 (en) * 1995-06-05 2005-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast Growth Factor-13
DE10066104A1 (de) * 2000-09-08 2003-01-09 Medigene Ag Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung
US20060166363A1 (en) * 2004-01-27 2006-07-27 Sergei Zolotukhin Modified baculovirus expression system for production of pseudotyped rAAV vector
WO2008016391A2 (en) * 2006-01-31 2008-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same
EP2500434A1 (en) * 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
CA2876293C (en) * 2012-06-27 2023-10-10 Arthrogen B.V. Combination for treating an inflammatory disorder
CN104087613B (zh) * 2014-06-30 2017-08-29 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 基于aav‑itr的基因表达微载体及其构建方法和应用
JP7260898B2 (ja) * 2016-01-15 2023-04-19 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド ガンマデルタｔ細胞の活性化のための方法および組成物
JP6994140B2 (ja) * 2016-03-03 2022-02-03 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ 非ウイルス的遺伝子導入のための閉鎖型直鎖状二重鎖ｄｎａ

Also Published As

Publication number Publication date
PH12020500465A1 (en) 2021-01-25
CA3075168A1 (en) 2019-03-14
IL272797A (en) 2020-04-30
BR112020004151A2 (pt) 2020-09-08
WO2019051255A1 (en) 2019-03-14
US20200283794A1 (en) 2020-09-10
RU2020109904A (ru) 2021-10-08
JP2020532981A (ja) 2020-11-19
CN111132699A (zh) 2020-05-08
AU2018327348A1 (en) 2020-02-20
EP3678710A1 (en) 2020-07-15
JP2022190081A (ja) 2022-12-22
MA50100A (fr) 2020-07-15
SG11202000698SA (en) 2020-03-30
EP3678710A4 (en) 2021-06-09
MX2020002500A (es) 2020-09-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200051011A (ko) 변형된 폐쇄-종결된 dna(cedna)
KR20200051708A (ko) 비-바이러스성 캡시드-비함유 dna 벡터의 지질 나노입자 제형
US20210071197A1 (en) Closed-ended dna vectors obtainable from cell-free synthesis and process for obtaining cedna vectors
KR20210090619A (ko) 대칭인 변형된 역말단반복을 포함하는 변형된 폐쇄형 DNA(ceDNA)
US20220119840A1 (en) Closed-ended dna (cedna) and use in methods of reducing gene or nucleic acid therapy related immune response
KR20200120649A (ko) 비-바이러스 dna 벡터 및 항체 및 융합 단백질 생산을 위한 이의 용도
US20220127625A1 (en) Modulation of rep protein activity in closed-ended dna (cedna) production
KR20200124250A (ko) 폐쇄-말단 dna (cedna) 벡터를 사용한 이식유전자의 제어된 발현
US20240181085A1 (en) Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing pfic therapeutics
CA3172572A1 (en) Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing factor ix therapeutics
RU2800026C2 (ru) МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)
RU2816963C2 (ru) МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК), СОДЕРЖАЩАЯ СИММЕТРИЧНЫЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ИНВЕРТИРОВАННЫЕ КОНЦЕВЫЕ ПОВТОРЫ
KR20230003478A (ko) 비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도
RU2812850C2 (ru) Модуляция активности rep белка при получении днк с замкнутыми концами (зкднк)
JP2024083567A (ja) 閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の産生におけるＲＥＰタンパク質活性の調節
CN117836420A (zh) 重组tert编码病毒基因组和运载体

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal