BR112020004151A2 - dna modificado de extremidade fechada (cedna) - Google Patents

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Annaliese Jones
Douglas Anthony Kerr
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Abstract

Os vetores de ceDNA com estrutura linear e contínua podem ser produzidos com altos rendimentos e usados para transferência e expressão eficazes de um transgene. Os vetores de ceDNA compreendem um cassete de expressão e duas sequências de ITR diferentes derivadas de genomas de AAV em uma ordem especificada. Alguns vetores de ceDNA aqui fornecidos compreendem ainda elementos de regulação cis e fornecem alta eficiência de expressão gênica. São ainda aqui fornecidos métodos e linhas celulares para produção confiável e eficiente dos vetores de DNA linear, contínuo e sem capsídeo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DNA MODIFICADO DE EXTREMIDADE FECHADA (CEDNA)".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica benefício sob 35 USC § 119 (e) dos Números de Pedido Provisórios dos EUA: 62/556.319; 62/556.324; 62/556.329; 62/556.331; 62/556.281 e 62/556.335, cada um dos quais foi depositado em 8 de setembro de 2017, o conteúdo de cada é in- corporado aqui a título de referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada a título de referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 7 de setembro de 2018, é denominada 080170-090580WOPT_SL.txt e tem 205.991 bytes de tamanho.
CAMPO TÉCNICO
[003] A presente invenção refere-se ao campo de terapia gênica, incluindo a entrega de sequências de DNA exógenas para um alvo ce- lular, tecido, órgão ou organismo.
ANTECEDENTES
[004] A terapia gênica visa melhorar os resultados clínicos de pa- cientes que sofrem de mutações genéticas ou doenças adquiridas causadas por uma aberração no perfil de expressão gênica. A terapia gênica inclui o tratamento ou prevenção de condições médicas resul- tantes de genes defeituosos ou regulação ou expressão anormal, por exemplo, subexpressão ou superexpressão, que podem resultar em um distúrbio, doença, malignidade, etc. Por exemplo, uma doença ou distúrbio ocasionado por um gene defeituoso pode ser tratado, preve- nido ou melhorado pela entrega de um material genético corretivo a um paciente, resultando na expressão terapêutica do material genético dentro do paciente. A base da terapia gênica é fornecer um cassete de transcrição com um produto genético ativo (às vezes chamado de transgene), por exemplo, que pode resultar em um efeito positivo de ganho de função, um efeito negativo de perda de função ou outro re- sultado, como, por exemplo, um efeito oncolítico. A terapia gênica também pode ser usada para tratar uma doença ou malignidade cau- sada por outros fatores. Os distúrbios monogênicos humanos podem ser tratados pela entrega e expressão de um gene normal nas células- alvo. A entrega e expressão de um gene corretivo nas células-alvo do paciente podem ser realizadas por vários métodos, incluindo o uso de vírus manipulados e vetores de entrega de genes virais. Entre os mui- tos vetores derivados de vírus disponíveis (por exemplo, retrovírus re- combinante, lentivírus recombinante, adenovírus recombinante e simi- lares), o vírus adenoassociado recombinante (rAAV) está ganhando popularidade como um vetor versátil na terapia gênica.
[005] Os vírus adenoassociados (AAV) pertencem à família par- voviridae e, mais especificamente, constituem o gênero dependopar- vovírus. O genoma do AAV é composto por uma molécula de DNA li- near de fita simples que contém aproximadamente 4,7 quilobases (kb) e consiste em dois grandes quadros de leitura aberta (ORFs) que codi- ficam as proteínas Rep (replicação) e Cap (capsídeo) não estruturais. Foi identificada um segundo ORF dentro do gene cap que codifica a proteína de ativação do conjunto (AAP). Os DNAs que flanqueiam as regiões codificadoras do AAV são duas sequências de repetição ter- minal invertida (ITR) de ação cis, com aproximadamente 145 nucleotí- deos de comprimento, com sequências palindrômicas interrompidas que podem ser dobradas em estruturas em grampo de cabelo energe- ticamente estáveis que funcionam como iniciadores de replicação de DNA. Além de seu papel na replicação do DNA, as sequências de ITR demonstraram estar envolvidas na integração do DNA viral no genoma celular, no resgate do genoma ou plasmídeo hospedeiro e na encapsi-
dação do ácido nucleico viral nos virions maduros (Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 97-129).
[006] Os vetores derivados do AAV (ou seja, vetores de AAV re- combinantes (rAVV) ou AAV) são atraentes para a entrega de material genético devido ao fato de que (i) têm capacidade de infectar (transdu- zir) uma ampla variedade de tipos de células que não se dividem e se dividem, incluindo miócitos e neurônios; (ii) são desprovidos dos genes estruturais do vírus, diminuindo assim as respostas das células hospe- deiras à infecção pelo vírus, por exemplo, respostas mediadas por in- terferon; (iii) vírus do tipo selvagem são considerados não patológicos em humanos; (iv) em contraste com o AAV do tipo selvagem, com a capacidade de integrar-se no genoma da célula hospedeira, os vetores de AAV com deficiência de replicação não têm o gene rep e geralmen- te persistem como epissomas, limitando assim o risco de mutagênese de inserção ou genotoxicidade; e (v) em comparação com outros sis- temas vetoriais, os vetores de AAV são geralmente considerados imunógenos relativamente pobres e, portanto, não desencadeiam uma resposta imune significativa (consulte ii), ganhando assim a persistên- cia do DNA do vetor e potencialmente a expressão a longo prazo dos transgenes terapêuticos. Os vetores de AAV também podem ser pro- duzidos e formulados com alto título e administrados por meio de inje- ções intra-arteriais, intravenosas ou intraperitoneais, permitindo a dis- tribuição do vetor e a transferência de genes para regiões musculares significativas por meio de uma única injeção em roedores (Goyenvalle et al., 2004; Fougerousse et al., 2007; Koppanati et al., 2010; Wang et al., 2009) e cães. Em um estudo clínico para tratar a distrofia muscular espinhal tipo 1, os vetores de AAV foram administrados sistemicamen- te com a intenção de atingir o cérebro, resultando em aparentes apri- moramentos clínicos.
[007] No entanto, existem várias deficiências importantes no uso de partículas de AAV como vetor de entrega de genes. Uma grande desvantagem associada ao rAAV é sua capacidade limitada de empa- cotamento viral de cerca de 4,5kb de DNA heterólogo (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010). Como resultado, o uso de vetores de AAV foi limitado a menos de 150.000 Da de capaci- dade de codificação da proteína. A segunda desvantagem é que, co- mo resultado da prevalência de infecção por AAV do tipo selvagem na população, os candidatos à terapia genética com rAAV devem ser ras- treados quanto à presença de anticorpos neutralizantes que eliminam o vetor do paciente. Uma terceira desvantagem está relacionada à imunogenicidade do capsídeo que impede a readministração em paci- entes que não foram excluídos de um tratamento inicial. O sistema imune do paciente pode responder ao vetor, que atua efetivamente como uma injeção de "reforço" para estimular o sistema imune, geran- do anticorpos antiaAV de alta titulação que impedem tratamentos futu- ros. Alguns relatórios recentes indicam preocupações com a imunoge- nicidade em situações de altas doses. Outra desvantagem notável é que o início da expressão gênica mediada por AAV é relativamente lento, dado que o DNA de AAV de fita simples deve ser convertido em DNA de fita dupla antes da expressão gênica heteróloga. Embora te- nham sido feitas tentativas para contornar esse problema através da construção de vetores de DNA de fita dupla, essa estratégia limita ain- da mais o tamanho do cassete de expressão de transgene que pode ser integrado ao vetor AAV (McCarty, 2008; Varenika et al., 2009; Foust et al., 2009).
[008] Além disso, os virions convencionais de AAV com capsí- deos são produzidos através da introdução de um plasmídeo ou plas- mídeos contendo o genoma de AAV, os genes rep e os genes caps (Grimm et al., 1998). Após a introdução desses plasmídeos auxiliares em trans, o genoma do AAV é "resgatado" (ou seja, liberado e posteri-
ormente amplificado) do genoma do hospedeiro e é encapsidado (cap- sídeos virais) para produzir vetores de AAV biologicamente ativos. No entanto, verificou-se que tais vetores de vírus AAV encapsidados transduzem ineficientemente certos tipos de células e tecidos. Os cap- sídeos também induzem uma resposta imune.
[009] Consequentemente, o uso de vetores de vírus adenoasso- ciado (AAV) para terapia genética é limitado devido à administração única a pacientes (devido à resposta imune do paciente), a gama limi- tada de material genético transgênico adequado para entrega em veto- res de AAV devido à capacidade mínima de empacotamento viral (cer- ca de 4,5kb) do capsídeo do AAV associado, bem como a expressão gênica lenta mediada pelo AAV. Os pedidos de terapias gênicas clíni- cas para rAAV são ainda mais onerados pela variabilidade de paciente para paciente não prevista pela resposta à dose em modelos de ca- mundongos singênicos ou em outras espécies de modelos.
[0010] Os vetores de AAV recombinantes sem capsídeo podem ser obtidos como uma molécula linear isolada de ácido nucleico que compreende regiões transgênicas e promotoras expressáveis, flan- queadas por duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV do tipo selvagem, incluindo os sítios de ligação e resolução ter- minal. Esses vetores de AAV recombinantes são desprovidos de se- quências codificadoras de proteínas do capsídeo do AAV e podem ser de fita simples, fita dupla ou dúplex com uma ou ambas as extremida- des ligadas covalentemente através das duas sequências de palín- dromo ITR do tipo selvagem (por exemplo, WO2012/123430, Patente no US 9.598.703). Os mesmos evitam muitos dos problemas da terapia gênica mediada por AAV, pois a capacidade do transgene é muito maior, o início da expressão do transgene é rápido e o sistema imune do paciente reconhece as moléculas de DNA como um vírus a ser eli- minado. No entanto, a expressão constante de um transgene pode não ser desejável em todos os casos, e as ITRs canônicas do tipo selva- gem do AAV podem não ser otimizadas para a função ceDNA. Portan- to, permanece uma importante necessidade não atendida de vetores de DNA recombinante controláveis com melhores propriedades de produção e/ou expressão.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0011] A invenção aqui descrita é um vetor de DNA não viral sem capsídeo com extremidades fechadas covalentemente (referido aqui como "vetor de DNA com extremidade fechada" ou "vetor de ceDNA"). Os vetores de ceDNA aqui descritos são moléculas de DNA dúplex linear e sem capsídeo, formadas a partir de uma cadeia contínua de DNA complementar com extremidades fechadas covalentemente (es- trutura linear, contínua e não encapsidada), que compreendem uma sequência de 5’ repetição terminal invertida (ITR) e uma sequência de 3’ ITR que é diferente ou assimétrica entre si.
[0012] A tecnologia aqui descrita se refere a um vetor de ceDNA contendo pelo menos uma sequência de repetição terminal invertida por AAV (ITR) modificada e um transgene expressável. Os vetores de ceDNA aqui descritos podem ser produzidos em células eucarióticas, desprovidas de modificações no DNA procariótico e contaminação bacteriana por endotoxina em células de insetos.
[0013] Em um aspecto, vetores de DNA não virais sem capsídeo com extremidades fechadas covalentemente são de preferência molé- culas dúplex lineares e são obtidos a partir de um vetor de polinucleo- tídeo que codifica um ácido nucleico heterólogo operativamente posi- cionado entre duas sequências de repetição terminal invertidas dife- rentes (ITRs) (por exemplo, IAVs de AAV), em que pelo menos uma das ITRs compreende um sítio de resolução de terminal e um sítio de ligação à proteína de replicação (RPS) (às vezes chamado de sítio de ligação à proteína replicativa), por exemplo, um sítio de ligação à pro-
teína replicativa), por exemplo, um sítio de ligação ao Rep e uma das ITRs compreende uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR. Ou seja, uma das ITRs é assimétrica em relação à outra ITR. Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR de AAV, por exemplo, uma ITR de AAV do tipo selvagem ou ITR de AAV modificada. Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR modificada em relação à outra ITR - ou seja, o ceDNA compreen- de ITRs que são assimétricas entre si. Em uma modalidade, pelo me- nos uma das ITRs é uma ITR não funcional.
[0014] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende: (1) um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis, um promotor e pelo menos um transgene; ou (2) um promotor ope- racionalmente ligado a pelo menos um transgene e (3) duas sequên- cias autocomplementares, por exemplo, ITRs, flanqueando o dito cas- sete de expressão, em que o vetor de ceDNA não está associado a uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, o vetor de ceD- NA compreende duas sequências autocomplementares encontradas em um genoma de AAV, em que pelo menos uma compreende um elemento de ligação a Rep (RBE) operacional (também algumas vezes referido aqui como "RBS") e um sítio de resolução de terminal (trs) do AAV ou uma variante funcional do RBE e um ou mais elementos regu- ladores cis operacionalmente ligados a um transgene. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para regular a expressão do transgene, por exemplo, comutadores re- guladores, descritas aqui na seção intitulada "Chaves reguladoras" pa- ra controlar e regular a expressão do transgene, e pode incluir um co- mutador regulador, por exemplo, um comutador de extermínio para permitir a morte celular controlada de uma célula que compreende um vetor de ceDNA.
[0015] Em algumas modalidades, as duas sequências autocom-
plementares podem ser sequências de ITR de qualquer parvovírus co- nhecido, por exemplo, um dependovírus como o AAV (por exemplo, AAV1-AAV12). Qualquer sorotipo AAV pode ser usado, incluindo, en- tre outros, uma sequência ITR de AAV2 modificada, que retém um sí- tio de ligação a Rep (RBS), como 5´-GCGCGCTCGCTCGCTC-3´ (SEQ ID NO: 531) e um sítio de resolução de terminal (trs) além de uma sequência palindrômica variável que permite a formação de estru- tura secundária em grampo de cabelo. Em algumas modalidades, a ITR é uma sequência sintética de ITR que retém um sítio de ligação a Rep (RBS) funcional como 5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 531) e um sítio de resolução de terminal (TRS), além de uma se- quência palindrômica variável, permitindo a formação de estrutura se- cundária em grampo de cabelo. Em alguns exemplos, uma sequência ITR modificada retém a sequência do RBS, trs e a estrutura e posição de um elemento de ligação a Rep que forma a porção de alça terminal de uma das estruturas secundárias em grampo de cabelo de ITR da sequência correspondente do ITR de AAV2 do tipo selvagem.
[0016] Sequências de ITR exemplificadoras para uso nos vetores de ceDNA são reveladas em qualquer uma ou mais das Tabelas 2-10A e 10B, ou SEQ ID NO: 2, 52, 101-499 e 545-547 ou nas sequências de ITR parciais mostradas na Figura 26A-26B. Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA não têm uma ITR que compreende qualquer se- quência selecionada de SEQ ID NO: 500-529.
[0017] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA pode com- preender uma ITR com uma modificação na ITR correspondente a qualquer uma das modificações nas sequências de ITR ou sequências parciais ITR mostradas em qualquer uma ou mais das Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A e 10B no presente documento.
[0018] Como um exemplo de exemplo, a presente descrição for- nece um vetor de DNA de extremidade fechada que compreende um promotor operacionalmente ligado a um transgene, em que o ceDNA é desprovido de proteínas do capsídeo e é: (a) produzido a partir de um plasmídeo de ceDNA (por exemplo, consulte os Exemplos 1-2 e/ou as Figuras 1A-B) que codifica uma ITR de AAV2 do lado direito mutado com o mesmo número de pares de bases dúplex intramolecularmente duplos que a SEQ ID NO: 2 ou um IAV de AAV2 do lado esquerdo mu- tado com o mesmo número de intramolecularmente pares de bases dúplex como SEQ ID NO: 51 em sua configuração secundária em grampo de cabelo (preferencialmente excluindo a deleção de qualquer alça terminal AAA ou TTT nessa configuração em comparação com essas sequências de referência) e (b) é identificado como ceDNA usando o ensaio para a identificação de ceDNA por eletroforese em gel de agarose sob condições de desnaturação e gel nativas no Exemplo 1. Exemplos dessas sequências de ITR modificadas são for- necidos nas Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A e 10B.
[0019] A tecnologia aqui descrita refere-se ainda a um vetor de ceDNA que pode entregar e codificar um ou mais transgenes em uma célula alvo, por exemplo, em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência multicistrônica ou onde o transgene e seu contexto genômi- co nativo (por exemplo, transgene, íntrons e regiões não traduzidas endógenas) são incorporados juntos no vetor de ceDNA. Os transge- nes podem ser transcritos codificadores de proteínas, transcritos não codificadores ou ambos. O vetor de ceDNA pode compreender várias sequências de codificação e um sítio de início de tradução não canôni- co ou mais de um promotor para expressar transcritos de codificação de proteínas, transcritos não codificadores ou ambos. O transgene po- de compreender uma sequência que codifica mais de uma proteína ou pode ser uma sequência de um transcrito não codificante. O cassete de expressão pode compreender, por exemplo, mais de 4.000 nucleo- tídeos, 5.000 nucleotídeos, 10.000 nucleotídeos ou 20.000 nucleotí-
deos, ou 30.000 nucleotídeos, ou 40.000 nucleotídeos ou 50.000 nu- cleotídeos, ou qualquer intervalo entre cerca de 4.000 a 10.000 nu- cleotídeos ou 10.000 a 50.000 nucleotídeos, ou mais de 50.000 nucle- otídeos. Os vetores de ceDNA não têm as limitações de tamanho dos vetores de AAV encapsidados, permitindo assim a entrega de um cas- sete de expressão de tamanho grande para fornecer expressão efici- ente de transgenes. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é desprovido de metilação específica de procariota.
[0020] O cassete de expressão também pode compreender um sítio de entrada interno no ribossomo (IRES) e/ou um elemento 2A. Os elementos reguladores cis incluem, sem limitação, um promotor, um comutador de ribossomos, um isolador, um elemento regulável por mir, um elemento regulador pós-transcricional, um promotor específico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor do transgene. Em algumas modali- dades, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para regular a expressão do transgene. Por exemplo, o componente regu- lador adicional pode ser um comutador regulador, conforme descrito no presente documento, incluindo, entre outros, um comutador de ex- termínio, que pode matar a célula infectada com ceDNA, se necessá- rio, e outros elementos induzíveis e/ou repressíveis.
[0021] A tecnologia descrita no presente documento fornece ainda novos métodos de entrega e expressão eficiente e seletiva de um ou mais transgenes usando os vetores de ceDNA. Um vetor de ceDNA tem capacidade para ser absorvido pelas células hospedeiras, bem como transportado para o núcleo na ausência do capsídeo do AAV. Além disso, os vetores de ceDNA aqui descritos não têm um capsídeo e, portanto, evitam a resposta imune que pode surgir em resposta a vetores contendo o capsídeo.
[0022] Aspectos da invenção referem-se a métodos para produzir os vetores de ceDNA aqui descritos. Outras modalidades se referem a um vetor de ceDNA produzido pelo método aqui fornecido. Em uma modalidade, o vetor de DNA não viral sem capsídeo (vetor de ceDNA) é obtido a partir de um plasmídeo (referido no presente documento como "plasmídeo de ceDNA") que compreende um modelo de constru- to de expressão de polinucleotídeo que compreende nessa ordem: uma primeira repetição de terminal invertido em 5’ (por exemplo, ITR de AAV); um cassete de expressão; e uma 3’ ITR (por exemplo, ITR de AAV), em que pelo menos uma dentre 5’ e 3’ ITR é uma ITR modi- ficada ou quando as 5’ e 3’ ITRs são modificadas, as mesmas têm modificações diferentes entre si e não são a mesma sequência.
[0023] O vetor de ceDNA descrito no presente documento é obtido por vários meios que seriam conhecidos pelo técnico no assunto de- pois de ler esta descrição. Por exemplo, um modelo de construto de expressão de polinucleotídeo usado para gerar os vetores de ceDNA da presente invenção pode ser um plasmídeo de ceDNA (por exemplo, consulte a Tabela 12 ou a Figura 10B), um ceDNA-bacmídeo e/ou um ceDNA-baculovírus. Em uma modalidade, o plasmídeo de ceDNA compreende um sítio de clonagem de restrição (por exemplo, SEQ ID NO: 7) operacionalmente posicionado entre as ITRs onde um cassete de expressão que compreende, por exemplo, um promotor operacio- nalmente ligado a um transgene, por exemplo, um gene repórter e/ou um gene terapêutico pode ser inserido. Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA são produzidos a partir de um modelo de polinucle- otídeo (por exemplo, plasmídeo de ceDNA, ceDNA-bacmídeo, ceDNA- baculovírus) contendo uma ITR modificada em comparação com a se- quência de ITR de AAV3 ou ITR de AAV2 de flanqueamento corres- pondente, em que a modificação é qualquer um ou mais dentre dele- ção, inserção e/ou substituição.
[0024] Em uma célula hospedeira permissiva, na presença de, por exemplo, Rep, o modelo polinucleotídico que tem pelo menos uma ITR modificada replica para produzir vetores de ceDNA. A produção do ve- tor de ceDNA passa por duas etapas: primeiro, excisão ("resgate") do modelo da estrutura principal modelo (por exemplo, plasmídeo de ce- DNA, ceDNA-bacmídeo, genoma ceDNA-baculovírus etc.) por meio de proteínas Rep e segunda replicação mediada por Rep vetor de ceDNA excisado. As proteínas Rep e os sítios de ligação a Rep dos vários so- rotipos de AAV são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Um téc- nico no assunto entende escolher uma proteína Rep a partir de um so- rotipo que se liga e replica a sequência de ácidos nucleicos com base em pelo menos uma ITR funcional. Por exemplo, se a ITR competente para replicação for do sorotipo 2 do AAV, o representante correspon- dente seria de um sorotipo do AAV que funcione com esse sorotipo, como a ITR de AAV2 com o AAV2 ou o AAV4 Rep, mas não o AAV5 Rep, o que não acontece. Após a replicação, o vetor de ceDNA cova- lentemente fechado continua a acumular-se nas células permissivas e o vetor de ceDNA é, de preferência, suficientemente estável ao longo do tempo na presença da proteína Rep sob condições padrão de repli- cação, por exemplo, para acumular em uma quantidade que é pelo menos 1 pg/célula, preferencialmente pelo menos 2 pg/célula, prefe- rencialmente pelo menos 3 pg/célula, mais preferencialmente pelo menos 4 pg/célula, ainda mais preferencialmente pelo menos 5 pg/célula.
[0025] Por conseguinte, um aspecto da invenção se refere a um processo que compreende as etapas de: a) incubar uma população de células hospedeiras (por exemplo, células de insetos) que abrigam o modelo de construto de expressão de polinucleotídeo (por exemplo, um plasmídeo de ceDNA, um ceDNA-bacmídeo, e/ou um ceDNA- baculovírus), que é desprovido de sequências codificantes do capsí- deo viral, na presença de uma proteína Rep em condições eficazes e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células hospedeiras e em que o hospedeiro as células não com- preendem sequências codificantes do capsídeo viral; e b) colher e iso- lar o vetor de ceDNA das células hospedeiras. A presença da proteína Rep induz a replicação do polinucleotídeo do vetor com uma ITR modi- ficada para produzir o vetor de ceDNA em uma célula hospedeira. No entanto, não são expressas partículas virais (por exemplo, viriões AAV). Assim, não há limitação de tamanho forçada por virião.
[0026] A presença do vetor de ceDNA isolado das células hospe- deiras pode ser confirmada digerindo o DNA isolado da célula hospe- deira com uma enzima de restrição com um único sítio de reconheci- mento no vetor de ceDNA e analisando o material do DNA digerido na desnaturação e não desnaturação géis para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[0027] Em algumas modalidades, o presente pedido pode ser defi- nido em qualquer um dos seguintes parágrafos:
1. Um vetor de DNA sem capsídeo não viral com extremi- dades fechadas covalentemente (vetor de ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos hete- róloga posicionada operacionalmente entre sequências repetitivas terminais invertidas assimétricas (ITRs assimétricas), em que em pelo menos uma das ITRs assimétricas compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação a Rep.
2. O vetor de ceDNA do parágrafo 1, em que o vetor de ce- DNA quando digerido com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisado por eletrofore- se em gel nativa e desnaturante exibe bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com controles lineares e não contí- nuos de DNA.
3. O vetor de ceDNA dos parágrafos 1 ou 2, em que uma ou mais das sequências de ITR assimétricas são de um vírus selecio- nado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoasso- ciado (AAV).
4. O vetor de ceDNA do parágrafo 3, em que as ITRs assi- métricas são de diferentes sorotipos virais.
5. O vetor de ceDNA do parágrafo 4, em que os uma ou mais ITRs assimétricas são de um sorotipo AAV selecionado entre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.
6. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que uma ou mais das sequências de ITR assimétricas são sintéti- cas.
7. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 3 e 6, em que uma ou mais das ITRs não é uma ITR do tipo selvagem.
8. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 7, em que um ou mais dos dois ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição em pelo menos uma das regi- ões de ITR selecionadas de A, A’, B, B’, C, C’, D e D’. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs assimétricas podem ter uma de- leção, inserção e/ou substituição em qualquer combinação de regiões B, B’, C ou C’, conforme descrito na Tabela 1. Em algumas modalida- des, uma ou ambas as ITRs assimétricas podem ter uma deleção, in- serção e/ou substituição na região B e/ou região B’ e/ou região C e/ou região C’. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs assimé- tricas podem ter uma ou mais deleções, inserções e/ou substituições na região A e/ou região A’ e/ou região B e/ou região B’ e/ou região C e/ou região C’ e/ou região D e/ou região D’. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ITR modificada pode ter a remoção ou deleção de todo um braço específico, por exemplo, todo ou parte do braço A-A’,
ou todo ou parte do braço B-B’ ou todo ou parte do C-C’ ou, alternati- vamente, a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases que formam a haste da alça, desde que a alça final que cobre a haste (por exemplo, braço único) ainda esteja presente (por exemplo, con- sulte ITR-6). Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço B-B’. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço C-C’. Em algumas modalidades, uma ITR modifica- da pode compreender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pa- res de bases do braço C-C’ e a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço do B-B’. Está prevista qualquer combi- nação de remoção de pares de bases. Em algumas modalidades, uma ITR modificada não tem um braço B-B’. Em algumas modalidades, uma ITR modificada não tem o braço C-C’.
9. O vetor de ceDNA do parágrafo 8, em que a deleção, in- serção e/ou substituição resulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pelas regiões A, A’, B, B’ C ou C’. Por exemplo, em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases complementares são removidos de cada parte C e parte C’ do braço C-C’ de modo que o braço C-C’ seja truncado e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases complementares sejam removidos de cada parte B e parte B’ do braço B-B’, de modo que o braço C-C’ e/ou braço B’-B seja truncado. Em modalidades al- ternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removi- dos da porção C do braço C-C’, de modo que apenas a parte C’ do braço permaneça. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da porção C’ do braço C-C’, de modo que apenas a porção C do braço permaneça. Em algumas mo- dalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removi-
dos da porção B do braço B-B’, de modo que apenas a porção B’ do braço permaneça. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da porção B’ do braço B-B’, de modo que apenas a porção B do braço permaneça. Em algumas mo- dalidades, qualquer deleção na região C, região C’, região B ou região B’ ainda preserva a alça terminal da alça de haste. Em algumas moda- lidades, a alça terminal é de pelo menos três aminoácidos. Em algu- mas modalidades, a alça terminal de um braço C-C’ e/ou B-B’ tem pelo menos três TTTs sequenciais ou três AAAs sequenciais.
10. O vetor de ceDNA do parágrafo 8 ou 9, em que uma ou ambas as ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, inser- ção e/ou substituição que resulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formado pelas regiões B e B’.
11. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 8 a 10, em que uma ou ambas as ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que resulta na deleção de to- do ou parte de um tronco estrutura de alça normalmente formada pe- las regiões C e C’.
12. O vetor de ceDNA do parágrafo 10 ou 11, em que uma ou ambas as ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, in- serção e/ou substituição que resulta na deleção de parte de uma estru- tura de haste-alça normalmente formada pelas regiões B e B’ e/ou par- te de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pelas regiões C e C’.
13. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 12, em que uma ou ambas as ITRs assimétricas compreendem uma única estrutura de haste-alça na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regiões B e B’ e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regiões C e C’.
14. O vetor de ceDNA do parágrafo 13, em que uma ou ambas as ITRs assimétricas compreendem uma haste única e duas alças na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regiões B e B’ e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regiões C e C’.
15. O vetor de ceDNA do parágrafo 13 ou parágrafo 14, em que uma ou ambas as ITRs assimétricas compreendem uma haste única e uma alça única na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regiões B e B’ e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regiões C e C’.
16. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 15, em que pelo menos uma ITR assimétrica é uma IAV de AAV2 mo- dificada que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre: as ITRs nas Figuras 26A ou 26B, SEQ ID NO: 101-499 ou 545- 547, uma ITR com pelo menos 95% de identidade de sequência com uma ITR nas Figuras 26A ou 26B e uma ITR com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 101 -499 e 545-547.
17. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 16, em que pelo menos uma ITR assimétrica é uma IAV de AAV2 mo- dificada que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, 52, 63 ou 64, ou uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 52, 63 ou 64.
18. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 16, em que a 5’ ITR é um IAV de AAV do tipo selvagem e a 3’ ITR compreende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,130, 132, 134, 469-483 e 546 e sequências de ITR mostradas na Figura 26A e sequências que têm pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências anteriores.
19. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a
16, em que a 3’ ITR é uma ITR de AAV do tipo selvagem e a 5’ ITR compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484-499, 545 e 547 e sequências de ITR mostradas na Figu- ra 26B e sequências que têm pelo menos 95% de identidade de se- quência com qualquer uma das sequências anteriores.
20. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 16, em que a 5’ ITR compreende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484-499, 545 e 547 e sequências de ITR mostradas na Figura 26B e sequências que têm pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências anteriores; e a 3’ ITR compreende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,130, 132, 134, 469-483 e 546, e sequências de ITR mostradas na Figura 26A e sequências que têm pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências anterio- res.
21. O vetor de ceDNA do parágrafo 1, que compreende pe- lo menos duas ITRs assimétricas selecionadas dentre: (a) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 52; e (b) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 51.
22. O vetor de ceDNA do parágrafo 1, que compreende um par de ITRs assimétricas selecionadas dentre: (a) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 52; e (b) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 51.
23. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, em que uma ou ambas as ITRs assimétricas compreendem uma sequência diferente da SEQ ID NO: 2, 52, 63 64, 113, 114 e 557.
24. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 24, em que toda ou parte da sequência de nucleotídeos heteróloga está sob o controle de pelo menos um comutador regulador.
25. O vetor de ceDNA do parágrafo 24, em que pelo menos um comutador regulador é selecionado de qualquer um ou uma com- binação de comutadores reguladores listados na Tabela 11 ou na se- ção denominada "Comutadores Reguladores" no presente documento.
Apenas a título de exemplo, um comutador regulador serve para ajus- tar a expressão da sequência de nucleotídeos heteróloga, por exem- plo, um transgene, e pode servir, em algumas modalidades, como uma função de biocontenção do vetor de ceDNA.
Em algumas modalida- des, um comutador regulador é um comutador "LIGA/DESLIGA". Sem desejar limitar-se à teoria, um comutador "LIGA/DESLIGA" é projetado para iniciar ou parar (ou seja, desligar) a expressão da sequência de nucleotídeos heteróloga ou transgene expressa a partir do vetor de ceDNA de uma maneira controlável e regulável.
Em algumas modali- dades, o comutador regulador é um "comutador de extermínio" que pode instruir a célula que compreende o vetor de ceDNA a sofrer mor- te programada por célula uma vez que o comutador é ativado.
Em al- gumas modalidades, o comutador regulador é selecionado de qualquer uma das seguintes opções: um comutador binário (por exemplo, pro- motores induzíveis, cofatores ou agentes exógenos reprimem a trans- crição), um comutador regulador de molécula pequena (por exemplo, induzida por fármacos ou ativada por pró-fármacos ou interromper a transcrição), um comutador regulador de "código de acesso" (por exemplo, uma combinação de condições precisa estar presente para que a expressão e/ou repressão do transgene ocorra), um comutador regulador baseado em ácido nucleico (por exemplo, um mecanismo baseado em ácido nucleico para controle expressão e/ou repressão), um comutador regulador pós-tradução e/ou pós-transcricional (por exemplo, transgenes expressos com elementos de resposta de sinal (SRE) ou domínios desestabilizadores (DD) que impedem transgenes funcionais até que ocorra a modificação pós-tradução) ou uma comu-
tador de extermínio (por exemplo, um comutador para induzir a morte celular programada como um meio de remover permanentemente um vetor de ceDNA introduzido do sistema do sujeito).
26. O vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 25, em que o vetor está em um nanocarreador.
27. O vetor de ceDNA do parágrafo 26, em que o nanocar- reador compreende uma nanopartícula lipídica (LNP).
28. Um vetor de DNA sem capsídeo não viral com extremi- dades fechadas covalentemente (vetor de ceDNA) de qualquer um dos parágrafos 1 a 25, em que o vetor de ceDNA é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: (a) incubar uma população de células de inseto que abrigam um construto de expressão de ceD- NA na presença de pelo menos uma proteína Rep, em que o construto de expressão de ceDNA codifica o vetor de ceDNA, sob condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células de inseto; e (b) isolar o vetor de ceDNA das células de inseto.
29. O vetor de ceDNA do parágrafo 28, em que o construto de expressão de ceDNA é selecionado dentre um plasmídeo de ceD- NA, um bacmídeo ceDNA e um baculovírus ceDNA.
30. O vetor de ceDNA do parágrafo 28 ou do parágrafo 29, em que a célula de inseto expressa pelo menos uma proteína Rep.
31. O vetor de ceDNA do parágrafo 30, em que pelo menos uma proteína Rep é de um vírus selecionado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV).
32. O vetor de ceDNA do parágrafo 31, em que pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.
33. Um construto de expressão de ceDNA que codifica o vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 25.
34. O construto de expressão de ceDNA do parágrafo 33, que é um plasmídeo de ceDNA, bacmídeo ceDNA ou baculovírus ce- DNA.
35. Célula hospedeira que compreende o construto de ex- pressão de ceDNA do parágrafo 33 ou 34.
36. A célula hospedeira do parágrafo 35, que expressa pelo menos uma proteína Rep.
37. A célula hospedeira do parágrafo 36, em que pelo me- nos uma proteína Rep é de um vírus selecionado dentre um parvoví- rus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV).
38. A célula hospedeira do parágrafo 37, em que pelo me- nos uma proteína Rep é de um sorotipo AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.
39. A célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 35 a 38, que é uma célula de inseto.
40. A célula hospedeira do parágrafo 39, que é uma célula Sf9.
41. Método para produzir um vetor de ceDNA que compre- ende: (a) incubar a célula hospedeira de qualquer um dos parágrafos 35 a 40 sob condições efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA; e (b) isolar o ceDNA das células hospe- deiras.
42. Método para tratar, prevenir, melhorar, monitorar ou di- agnosticar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, em que o méto- do compreende: administrar a um indivíduo em necessidade do mes- mo, uma composição que compreende o vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 25, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga é selecionada para tratar, prevenir, melhorar,
diagnosticar ou monitorar a doença ou distúrbio.
43. O método do parágrafo 42, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga, quando transcrita ou traduzida, corrige uma quantidade anormal de uma proteína endógena no indiví- duo.
44. O método do parágrafo 42, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga, quando transcrita ou traduzida, corrige uma função ou atividade anormal de uma proteína ou via en- dógena no indivíduo.
45. O método de qualquer um dos parágrafos 42 a 44, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica ou compreende uma molécula nucleotídica selecionada dentre um RNAi, um siRNA, um miRNA, um lncRNA e um oligo- ou polinucleotí- deo antissenso.
46. O método de qualquer um dos parágrafos 42 a 44, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica uma proteína.
47. O método do parágrafo 42, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica uma proteína marcado- ra (por exemplo, uma proteína repórter).
48. O método de qualquer um dos parágrafos 42 a 46, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica um agonista ou um antagonista de uma proteína ou via endógena as- sociada à doença ou distúrbio.
49. O método de qualquer um dos parágrafos 42 a 46, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica um anticorpo.
50. O método de qualquer um dos parágrafos 42 a 49, em que a doença ou distúrbio é selecionado dentre: uma doença ou dis- túrbio metabólico, uma doença ou distúrbio do SNC, uma doença ou distúrbio ocular, uma doença ou distúrbio ocular, uma doença ou dis- túrbio sanguíneo, uma doença ou distúrbio hepático, doença ou distúr- bio imune, doença infecciosa, doença ou distúrbio muscular, câncer e doença ou distúrbio com base em um nível anormal e/ou na função de um produto genético.
51. O método do parágrafo 50, em que a doença ou distúr- bio metabólico é selecionado dentre diabetes, um distúrbio de arma- zenamento lisossômico, um distúrbio de mucopolissacarídeo, uma do- ença ou distúrbio do ciclo da ureia e uma doença ou distúrbio de ar- mazenamento de glicogênio.
52. O método do parágrafo 51, em que o distúrbio de arma- zenamento lisossômico é selecionado dentre doença de Gaucher, do- ença de Pompe, leucodistrofia metacromática (MLD), fenilcetonúria (PKU) e doença de Fabry.
53. O método do parágrafo 51, em que a doença ou distúr- bio do ciclo da ureia é uma deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC).
54. O método do parágrafo 51, em que o distúrbio dos mu- copolissacarídeos é selecionado dentre síndrome de Sly, síndrome de Hurler, síndrome de Scheie, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo, síndrome de Morquio e síndrome de Maroteaux-Lamy.
55. O método do parágrafo 50, em que a doença ou distúr- bio do SNC é selecionado dentre doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Canavan, doença de Leigh, doença de Refsum, síndrome de Tourette, esclerose lateral pri- mária, esclerose lateral amiotrófica, progressiva atrofia muscular, do- ença de Pick, distrofia muscular, esclerose múltipla, miastenia grave, doença de Binswanger, trauma devido à lesão na medula espinhal ou na cabeça, doença de Tay Sachs, doença de Lesch-Nyan, epilepsia,
infartos cerebrais, distúrbios psiquiátricos, esquizofrenia, dependência de fármacos, neuroses, psicose, demência, paranóia, distúrbio de défi- cit de atenção, distúrbios do sono, distúrbios da dor, distúrbios alimen- tares ou de peso e câncer e tumores do SNC.
56. O método do parágrafo 50, em que a doença ou distúr- bio ocular é selecionado dentre distúrbios oftálmicos que envolvem a retina, trato posterior e/ou nervo óptico.
57. O método do parágrafo 55, em que o distúrbio oftálmico que envolve a retina, trato posterior e/ou nervo óptico é selecionado de retinopatia diabética, degeneração macular, incluindo degeneração macular relacionada à idade, atrofia geográfica e lesões vasculares ou degeneração macular "úmida", glaucoma, uveíte, retinite pigmentosa, Stargardt, amaurose congênita de Leber (LCA), síndrome de Usher, pseudoxantoma elástico (PXE), retinite pigmentosa ligada ao x (XLRP), retinosquise ligada ao x (XLRS), choroiderticia, opacidade he- reditária de Leber neuropatia (LHON), arquomatopsia, distrofia de co- ne-haste, distrofia endotelial da córnea de Fuchs, edema macular dia- bético e câncer e tumores oculares.
58. O método do parágrafo 50, em que a doença ou distúr- bio sanguíneo é selecionado dentre hemofilia A, hemofilia B, talasse- mia, anemia e câncer de sangue.
59. O método do parágrafo 50, em que a doença ou distúr- bio hepático é selecionado dentre colestase intra-hepática familiar pro- gressiva (PFIC) e câncer e tumores no fígado.
60. O método do parágrafo 42, em que a doença ou distúr- bio é fibrose cística.
61. O método dos parágrafos 42 a 60, em que o vetor de ceDNA é administrado em combinação com um veículo farmaceutica- mente aceitável.
62. Método para entregar uma proteína terapêutica a um indivíduo, em que o método compreende administrar a um indivíduo uma composição que compreende o vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 25, em que pelo menos uma sequência de nucleo- tídeos heteróloga codifica uma proteína terapêutica.
63. O método do parágrafo 62, em que a proteína terapêu- tica é um anticorpo terapêutico.
64. O método do parágrafo 62, em que a proteína terapêu- tica é selecionada dentre uma enzima, eritropoietina, angiostatina, en- dostatina, superóxido dismutase, globina, leptina, catalase, tirosina hi- droxilase, citocina, regulador de condutância transmembrana da fibro- se cística (CFTR), um fator de crescimento de peptídeos e um hormô- nio.
65. Um kit que compreende um vetor de ceDNA de qual- quer um dos parágrafos 1 a 25, e um nanocarreador, embalado em um recipiente com um folheto informativo.
66. Um kit para a produção de um vetor de ceDNA, o kit que compreende um construto de expressão que compreende pelo menos um sítio de restrição para inserção de pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga, ou comutador regulador, ou am- bos, o pelo menos um sítio de restrição posicionado operativamente entre sequências de repetição terminal invertidas assimétricas (ITRs assimétricas), em que pelo menos uma das ITRs assimétricas com- preende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de liga- ção a Rep.
67. O kit do parágrafo 66, que é adequado para produzir o vetor de ceDNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 25.
68. O kit do parágrafo 66 ou parágrafo 67, que compreende ainda uma população de células de inseto que é desprovida de se- quências de codificação do capsídeo viral, que na presença da proteí- na Rep podem induzir a produção do vetor de ceDNA.
69. O kit de qualquer um dos parágrafos 66-68, que com- preende ainda um vetor que compreende uma sequência polinucleotí- dica que codifica pelo menos uma proteína Rep, em que o vetor é adequado para expressar a pelo menos uma proteína Rep em uma célula de inseto.
[0028] Em algumas modalidades, um aspecto da tecnologia des- crita no presente documento diz respeito a um vetor de DNA não viral sem capsídeo com extremidades covalentemente fechadas (vetor de ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga, operativamente posicionada entre sequências de repetição terminal invertidas assimétricas (ITRs assimé- tricas), em que pelo menos uma das ITRs assimétricas compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação de Rep, e opcionalmente a sequência de ácidos nucleicos heteróloga co- difica para um transgene, e em que o vetor não é em um capsídeo vi- ral.
[0029] Esses e outros aspectos da invenção são descritos em mais detalhes abaixo.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0030] A Figura 1A ilustra uma estrutura exemplificadora de um vetor de ceDNA. Nessa modalidade, o vetor de ceDNA exemplificador compreende um cassete de expressão contendo o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberta (ORF) que codifica um transgene de luciferase é inserido no sítio de clonagem (R3/R4) entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITRs) - a ATR do tipo selvagem AAV2 a montante (5’-extremidade) e a ITR modificada a jusante (3’- extremidade) do cassete de expressão; portanto, as duas as ITRs que flanqueiam o cassete de expressão são assimétricas entre si.
[0031] A Figura 1B ilustra uma estrutura exemplificadora de um vetor de ceDNA com um cassete de expressão contendo o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberta (ORF) que codifi- ca o transgene de Luciferase é inserido no sítio de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITRs) - uma ITR modificada a montante (5’-extremidade) e uma ITR do tipo selvagem a jusante (3’- extremidade) do cassete de expressão.
[0032] A Figura 1C ilustra uma estrutura exemplificadora de um vetor de ceDNA com um cassete de expressão contendo um intensifi- cador/promotor, um quadro de leitura aberto (ORF) para inserção de um transgene, um elemento pós-transcricional (WPRE) e um sinal polyA. Um quadro de leitura aberta (ORF) permite a inserção de um transgene no sítio de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais in- vertidas (ITRs) que são assimétricas entre si; uma ITR modificada a montante (5’-extremidade) e uma ITR modificada a jusante (3’ extre- midade) do cassete de expressão, em que a 5’ ITR e a 3’ ITR são am- bas ITRs modificadas, mas têm modificações diferentes (isto é, as mesmas não têm as mesmas modificações).
[0033] A Figura 2A fornece à estrutura de haste-alça em forma de T de uma ITR esquerda do tipo selvagem de AAV2 (SEQ ID NO: 538) a identificação de braço A-A’, braço B-B’, braço C-C’, dois sítios de li- gação a Rep (RBE e RBE’) e também mostra o sítio de resolução de terminal (trs). O RBE contém uma série de 4 tetrâmeros dúplex que, acredita-se, interagem com o Rep 78 ou o Rep 68. Além disso, tam- bém se acredita que o RBE’ interaja com o complexo Rep montado no ITR do tipo selvagem ou ITR mutado na construção. As regiões D e D’ contêm sítios de ligação ao fator de transcrição e outra estrutura con- servada. A Figura 2B mostra atividades de corte e ligação catalisadas por Rep propostas em uma ITR esquerda do tipo selvagem (SEQ ID
NO: 539), incluindo a estrutura de alça-haste em forma de T do ITR esquerda do tipo selvagem do AAV2 com identificação do braço A-A’, braço B-B’, braço C-C’, dois sítios de ligação a Rep (RBE e RBE’) e também mostra o sítio de resolução de terminal (trs) e a região D e D’ que compreende vários sítios de ligação ao fator de transcrição e outra estrutura conservada.
[0034] A Figura 3A fornece a estrutura primária (sequência polinu- cleotídica) (esquerda) e a estrutura secundária (direita) das porções contendo RBE do braço A-A’ e o braço C-C’ e B-B’ do tipo selvagem esquerdo ITR de AAV2 (SEQ ID NO: 540). A Figura 3B mostra uma sequência de ITR mutada exemplificadora (também referida como uma ITR modificada) para a ITR esquerda. É mostrada a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária prevista (direita) da porção RBE do braço A-A’, do braço C e do braço B-B’ de uma ITR esquerda mu- tada exemplificadora (ITR-1, esquerda) (SEQ ID NO: 113). A Figura 3C mostra a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária (direita) da porção que contém RBE da alça A-A’ e os braços B-B’ e C- C’ da ITR de AAV2 direita do tipo selvagem (SEQ ID NO: 541). A Figu- ra 3D mostra uma ITR modificada à direita exemplificadora. É mostra- da a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária prevista (direita) da porção RBE do braço A-A’, do B-B’ e do braço C de um exemplo de ITR direita mutante exemplificadora (ITR-1, direita) (SEQ ID NO: 114). Qualquer combinação de ITR esquerda e direita (por exemplo, ITRs de AAV2 ou outro sorotipo viral ou ITR sintética) pode ser usada, desde que a ITR esquerda seja assimétrica ou diferente da ITR direita. Cada uma das Figuras 3A-3D mostra sequências de poli- nucleotídeos que se referem à sequência usada no genoma do plas- mídeo ou bacmídeo/baculovírus usado para produzir o ceDNA como aqui descrito. Também incluídas em cada uma das Figuras 3A-3D são estruturas secundárias de ceDNA correspondentes inferidas a partir das configurações do vetor de ceDNA no genoma do plasmídeo ou bacmídeo/baculovírus e os valores previstos de energia livre de Gibbs.
[0035] A Figura 4A é um esquema que ilustra um processo a mon- tante para produzir células de inseto infectadas com baculovírus (BIICs) que são úteis na produção de ceDNA no processo descrito no esquema na Figura 4B. A Figura 4B é um esquema de um método exemplificador de produção de ceDNA e a Figura 4C ilustra um méto- do e processo bioquímico para confirmar a produção do vetor de ceD- NA. As Figuras 4D e 4E são ilustrações esquemáticas que descrevem um processo para identificar a presença de ceDNA no DNA colhido de péletes de células obtidas durante os processos de produção de ceD- NA na Figura 4B. A Figura 4E mostra DNA que tem uma estrutura não contínua. O ceDNA pode ser cortado por uma endonuclease de restri- ção, que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de ceDNA, e gerar dois fragmentos de DNA com tamanhos diferentes (1kb e 2kb) em condições neutras e desnaturantes. A Figura 4E também mostra um ceDNA que tem uma estrutura linear e contínua. O vetor de ceDNA pode ser cortado pela endonuclease de restrição e gerar dois fragmen- tos de DNA que migram como 1kb e 2kb em condições neutras, mas em condições desnaturantes, os suportes permanecem conectados e produzem fitas únicas que migram como 2kb e 4kb. A Figura 4D mos- tra bandas esquemáticas esperadas para um ceDNA exemplificador deixado sem cortes ou digerido com uma endonuclease de restrição e, em seguida, submetido à eletroforese em um gel nativo ou em um gel desnaturante. O esquema mais à esquerda é um gel nativo e mostra várias bandas sugerindo que, em sua forma dúplex e sem cortes, o ceDNA existe em pelo menos estados monoméricos e diméricos, visí- veis como um monômero menor de migração mais rápida e um dímero de migração mais lenta com o dobro do tamanho do monômero. O se- gundo esquema da esquerda mostra que, quando o ceDNA é cortado com uma endonuclease de restrição, as bandas originais desapare- cem e as bandas de migração mais rápida (por exemplo, menores) aparecem, correspondendo aos tamanhos de fragmento esperados após a clivagem. Sob condições desnaturantes, o DNA dúplex original é de fita simples e migra como espécie duas vezes maior que o obser- vado no gel nativo, devido ao fato de que as fitas complementares es- tão ligadas covalentemente. Assim, no segundo esquema da direita, o ceDNA digerido mostra uma distribuição de bandas semelhante à ob- servada no gel nativo, mas as bandas migram como fragmentos duas vezes o tamanho de seus equivalentes de gel nativos. O esquema mais à direita mostra que o ceDNA sem cortes em condições de des- naturação migra como um círculo aberto de fita simples e, portanto, as bandas observadas têm o dobro do tamanho daquelas observadas em condições nativas em que o círculo não está aberto. Nessa figura, "kb" é usado para indicar o tamanho relativo das moléculas de nucleotídeo com base, dependendo do contexto, no comprimento da cadeia de nu- cleotídeos (por exemplo, para as moléculas de fita simples observadas em condições de desnaturação) ou no número de pares de bases (por exemplo, para as moléculas de fitas duplas retidas observadas em condições nativas).
[0036] A Figura 5 é uma imagem exemplificativa de um gel desna- turante executando exemplos de vetores de ceDNA com (+) ou sem (-) digestão com endonucleases (EcoRI para construtos de ceDNA 1 e 2; BamH1 para construtos de ceDNA 3 e 4; SpeI para construtos de ce- DNA 5 e 6 e XhoI para construção de ceDNA 7 e 8). Os tamanhos das bandas destacadas com um asterisco foram determinados e forneci- dos na parte inferior da imagem.
[0037] A Figura 6A mostra resultados de um ensaio de expressão proteica in vitro medindo a atividade da luciferase (eixo y, RQ (Luc)) em células HEK293 48 horas após a transfecção de 400 ng (preto),
200 ng (cinza) ou 100 ng (branco) dos construtos identificados no eixo x (construto-1, construto-3, construto-5, construto-7). (Tabela 12.) A Figura 6B mostra a atividade da luciferase (eixo y, RQ (Luc)) medida nas células HEK293 48 horas após a transfecção de 400 ng (preto), 200 ng (cinza) ou 100 ng (branco) dos construtos identificados no eixo x (construto-2, construto-4, construto-6, construto-8) (Tabela 12). Também são fornecidas atividades de luciferase medidas em células HEK293 tratadas com Fugene sem plasmídeos ("Fugene") ou em célu- las HEK293 não tratadas ("Não tratadas").
[0038] A Figura 7A mostra a viabilidade de células HEK293 (eixo y) 48 horas após a transfecção de 400 ng (preto), 200 ng (cinza), ou 100 ng (branco) dos construtos identificados no eixo x (construto-1, construto-3, construto-5, construto-7). A Figura 7B mostra a viabilidade de células HEK293 (eixo y) 48 horas após a transfecção de 400 ng (preto), 200 ng (cinza), ou 100 ng (branco) dos construtos identificados no eixo x (construto-2, construto-4, construto-6, construto-8).
[0039] A Figura 8A é um Rep-bacmídeo exemplificador no plasmí- deo pFBDLSR que compreende as sequências de ácido nucleico para as proteínas Rep Rep52 e Rep78. Esse exemplo de Rep-bacmídeo compreende: fragmento de promotor IE1 (SEQ ID NO: 66); sequência de nucleotídeos Rep78, incluindo a sequência Kozak (SEQ ID NO: 67), sequência promotora de poliedro para a sequência de nucleotídeos Rep52 (SEQ ID NO: 68) e Rep58, começando com a sequência Kozak gccgccacc) (SEQ ID NO: 69). A Figura 8B é um esquema de um exemplo de plasmídeo de ceDNA-1, com o promotor ITR wt-L, CAG, transgene luciferase, WPRE e sequência de poliadenilação e ITR mod- R.
[0040] A Figura 9A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ de uma ITR esquerda modificada exemplificadora ("ITR-2 (esquerda)" SEQ ID NO:
101) e a Figura 9B mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ de um exem- plo de ITR direita modificada ("ITR-2 (direita)" SEQ ID NO: 102). Pre- vê-se que formem uma estrutura com um único braço (C-C’) e uma única alça não emparelhada. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam de -72,6 kcal/mol.
[0041] A Figura 10A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ de uma ITR esquerda modificada exemplificadora ("ITR-3 (esquerda)" SEQ ID NO: 103) e a Figura 10B mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-3 (direita)" SEQ ID NO: 104). Prevê-se que formem uma estrutura com um único braço (B-B’) e uma única alça não emparelhada. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -74,8 kcal/mol.
[0042] A Figura 11A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ de uma ITR esquerda modificada exemplificadora ("ITR-4 (esquerda)" SEQ ID NO: 105) e a Figura 11B mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-4 (direita)" SEQ ID NO: 106). Prevê-se que formem uma estrutura com um único braço (C-C’) e uma única alça não emparelhada. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -76,9 kcal/mol.
[0043] A Figura 12A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e as porções C-C’ e B-B’ de uma ITR esquerda modificada exemplificadora, mostrando empare- lhamento de bases complementares das porções C-B’ e C’-B ("ITR- 10 (esquerda) "SEQ ID NO: 107) e a Figura 12B mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e as porções B-B’ e C-C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora, mostrando o pareamento de base complementar das porções B-C’ e B’-C ("ITR- 10 (direita) "SEQ ID NO: 108). Prevê-se que formem uma estrutura com um único braço (uma porção C’-B e C-B’ ou uma porção B’-C e B-C’) e uma única alça não emparelhada. Prevê se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -83,7 kcal/mol.
[0044] A Figura 13A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e as porções C-C’ e B-B’ de uma ITR esquerda modificada exemplificadora ("ITR-17 (esquerda)" SEQ ID NO: 109) e a Figura 13B mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e as porções C-C’ e B-B’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-17 (direita)" SEQ ID NO: 110). Prevê-se que a ITR-17 (esquerda) e a ITR-17 (direi- ta) formem uma estrutura com um único braço (B-B’) e uma única alça não emparelhada. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de des- dobramento sejam -73,3 kcal/mol.
[0045] A Figura 14A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ de uma ITR modificada exem- plificadora ("ITR-6 (esquerda)" SEQ ID NO: 111) e a Figura 14B mos- tra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ de uma ITR modificada exemplificadora ("ITR-6 (direita)" SEQ ID NO: 112). Prevê-se que a ITR-6 (esquerda) e a ITR-6 (direita) formam uma estrutura com um único braço. Prevê-se que suas ener- gias livres de Gibbs de desdobramento sejam de -54,4 kcal/mol.
[0046] A Figura 15A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C e B-B’ de um exemplo de ITR esquerda modificada ("ITR-1 (esquerda)" SEQ ID NO: 113) e a Figura 15B mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C e B-B’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-1 (direita)" SEQ ID NO: 114).
Prevê-se que a ITR-1 (esquerda) e a ITR-1 (direita) formem uma estru- tura com dois braços, um dos quais é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -74,7 kcal/mol.
[0047] A Figura 16A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C’ e B-B’ de uma ITR modificada esquerda exemplificadora ("ITR-5 (esquerda)" SEQ ID NO: 545) e a Figura 16B mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-5 (direita)" SEQ ID NO: 116). Prevê-se que a ITR-5 (esquerda) e a ITR-5 (direita) formem uma estrutura com dois braços, um dos quais (por exemplo, o braço C’) é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -73,4 kcal/mol.
[0048] A Figura 17A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e B-B’ de uma ITR modificada esquerda exemplificadora ("ITR-7 (esquerda)" SEQ ID NO: 117) e a Figura 17B mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-7 (direita)" SEQ ID NO: 118). Prevê-se que a ITR-17 (esquerda) e a ITR-17 (direi- ta) formem uma estrutura com dois braços, um dos quais (por exem- plo, braço B-B’) é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam de -89,6 kcal/mol.
[0049] A Figura 18A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e B-B’ de uma ITR modificada esquerda exemplificadora ("ITR-8 (esquerda)" SEQ ID NO: 119) e a Figura 18B mostra a estrutura de menor energia prevista da porção que contém RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-8 (direita)" SEQ ID NO: 120). Prevê-se que a ITR-8 (esquerda) e a ITR-8 (direita)
formem uma estrutura com dois braços, um dos quais é truncado. Pre- vê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam - 86,9 kcal/mol.
[0050] A Figura 19A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e B-B’ de uma ITR modificada esquerda exemplificadora ("ITR-9 (esquerda)" SEQ ID NO: 121) e a Figura 19B mostra a estrutura de menor energia prevista da porção que contém RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de uma ITR modificada exemplificadora ("ITR-9 (direita)" SEQ ID NO: 122). Prevê-se que a ITR-9 (esquerda) e a ITR-9 (direita) formem uma estrutura com dois braços, um dos quais é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -85,0 kcal/mol.
[0051] A Figura 20A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e B-B’ de uma ITR esquerda modificada exemplificadora ("ITR-11 (esquerda)" SEQ ID NO: 123) e a Figura 20B mostra a estrutura de menor energia prevista da porção que contém RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-11 (direita)" SEQ ID NO: 124). Prevê-se que a ITR-11 (esquerda) e a ITR-11 (direita) for- mem uma estrutura com dois braços, um dos quais é truncado. Prevê- se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam de - 89,5 kcal/mol.
[0052] A Figura 21A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção que contém RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e braço B- B’ de uma ITR modificada esquerda exemplificadora ("ITR-12 (esquer- da)" SEQ ID NO: 125) e a Figura 21B mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção que contém RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de uma ITR modificada exemplificadora ("ITR-12 (di- reita)" SEQ ID NO: 126). Tanto a ITR-12 (esquerda) quanto a ITR-12
(direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -86,2 kcal/mol.
[0053] A Figura 22A mostra a estrutura de menor energia prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e do braço B- B’ de uma ITR modificada esquerda exemplificadora ("ITR-13 (esquer- da)" SEQ ID NO: 127) e a Figura 22B mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-13 (direita)" SEQ ID NO: 128). Prevê-se que a ITR-13 (esquerda) e a ITR- 13 (direita) formam uma estrutura com dois braços, um dos quais (por exemplo, braço C-C’) é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -82,9 kcal/mol.
[0054] A Figura 23A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e B-B’ de uma ITR esquerda modificada exemplificadora ("ITR-14 (esquerda)" SEQ ID NO: 129) e a Figura 23B mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR-14 (direi- ta)" SEQ ID NO: 130). Prevê-se que a ITR-14 (esquerda) e a ITR-14 (direita) formem uma estrutura com dois braços, um dos quais (por exemplo, braço C-C’) é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -80,5 kcal/mol.
[0055] A Figura 24A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e braço B-C’ de uma ITR modificada esquerda exemplificadora ("ITR-15 (es- querda)" SEQ ID NO: 131) e a Figura 24B mostra a estrutura de ener- gia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de uma ITR direita modificada exemplificadora ("ITR- 15 (direita)" SEQ ID NO: 132). Prevê-se que a ITR-15 (esquerda) e a
ITR-15 (direita) formem uma estrutura com dois braços, um dos quais (por exemplo, o braço C-C’) é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam de -77,2 kcal/mol.
[0056] A Figura 25A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A’ e do braço C-C’ e braço B-C’ de uma ITR modificada esquerda exemplificadora ("ITR-16 (es- querda) SEQ ID NO: 133) e a Figura 25B mostra a estrutura de menor energia prevista da porção que contém RBE do braço A-A’ e do braço B-B’ e C-C’ de um exemplo de ITR direita modificada ("ITR-16 (direita)" SEQ ID NO: 134). Prevê-se que a ITR-16 (esquerda) e a ITR-16 (direi- ta) formem uma estrutura com dois braços, um dos quais (por exem- plo, braço C-C’) é truncado. Prevê-se que suas energias livres de Gibbs de desdobramento sejam -73,9 kcal/mol.
[0057] A Figura 26A mostra estruturas previstas da porção con- tendo RBE do braço A-A’ e braço B-B’ modificado e/ou braço C-C’ mo- dificado de ITRs modificadas exemplificadoras listadas na Tabela 10A. A Figura 26B mostra estruturas previstas da porção contendo RBE do braço A-A’ e braço C-C’ modificado e/ou braço B-B’ modificado de ITRs esquerdas modificadas exemplificadoras listadas na Tabela 10B. As estruturas mostradas são a menor estrutura prevista de energia li- vre. Código de cores: vermelho => 99% de probabilidade; laranja = 99%-95% de probabilidade; bege = 95-90% de probabilidade; verde escuro 90%-80%; verde brilhante = 80%-70%; azul claro = 70%-60%; azul escuro 60%-50% e rosa = <50%.
[0058] A Figura 27 mostra a atividade da luciferase de células de inseto Sf9 GlycoBac transfectadas com variantes mutantes de ITR as- simétrica selecionada das Tabelas 10A e 10B. O vetor de ceDNA tinha um gene da luciferase flanqueado por uma ITR WT e uma ITR assimé- trica modificada selecionada na Tabela 10A ou 10B. "ITR-50 R sem rep" é o mutante resgatável conhecido sem coinfecção de Rep con-
tendo baculovírus. As condições de "simulação" são apenas reagentes para transfecção, sem DNA do doador.
[0059] A Figura 28 mostra um gel de agarose nativa (1% de aga- rose, 1x tampão TAE) de extratos representativos de ceDNA bruto de culturas de células de inseto Sf9 transfectadas com plasmídeos de ceDNA que compreendem uma ITR wt esquerdo com a outra ITR se- lecionado dentre vários ITRs direitos mutantes descritos na Tabela 10A. 2 ug do extrato total foram carregados por faixa. Da esquerda pa- ra a direita: Faixa 1) 1kb mais ladder, Faixa 2) ITR-18 direita, Faixa 3) ITR-49 Faixa direita 4) ITR-19 direita, Faixa 5) ITR-20 direita, Faixa 6) ITR-21 direita, Faixa 7) ITR-22 direita, Faixa 8) ITR-23 direita, Faixa 9) ITR-24 direita, Faixa 10) ITR-25 direita, Faixa 11) ITR-26 direita, Faixa 12) ITR-27 direita, Faixa 13) ITR-28 direita, Faixa 14) ITR-50 direita, faixa 15) 1kb mais ladder.
[0060] A Figura 29 mostra um gel desnaturante (agarose alcalina a 0,8%) de construtos representativos da biblioteca de mutantes ITR. O vetor de ceDNA é produzido a partir de plasmídeos constituídos que compreendem uma ITR esquerda WT com a outra ITR selecionada de várias ITRs mutantes direitas reveladas na Tabela 10A. Da esquerda para a direita, Faixa 1) 1kb Plus DNA Ladder, Faixa 2) ITR-18 direita sem corte, Faixa 3) ITR-18 Digestão de restrição direita, Faixa 4) ITR- 19 direita sem corte, Faixa 5) ITR- 19 Digestão de restrição direita, Faixa 6) ITR-21 direita não cortada, Faixa 7) ITR-21 Digestão de res- trição direita, Faixa 8) ITR-25 direita sem corte, Faixa 9) ITR-25 Diges- tão de restrição direita. Os extratos foram tratados com endonuclease de restrição EcoRI. Espera-se que cada ceDNA mutante tenha um único sítio de reconhecimento de EcoRI, produzindo dois fragmentos característicos, ~2.000 pb e ~3.000 pb, que serão executados em ~4.000 e ~6.000 pb, respectivamente, sob condições de desnaturação. Extratos de ceDNA não tratados são ~5.000 pb e espera-se que mi-
grem a ~11.000 pb em condições desnaturantes.
[0061] A Figura 30 mostra a atividade da luciferase in vitro nas cé- lulas HEK293 dos mutantes ITR ITR-18 direita, ITR-19 direita, ITR-21 direita e ITR-25 direita e ITR-49, em que a ITR esquerda no vetor de ceDNA é ITR WT. As condições "simuladas" são apenas reagentes para transfecção, sem DNA doador, e não tratado é o controle negati- vo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições
[0062] A menos que definido de outra forma no presente docu- mento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com o presente pedido terão os significados que são comumente entendidos pelos técnicos no assunto a que essa descrição pertence. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protoco- los e reagentes específicos, etc., descritos no presente documento e, como tal, podem variar. A terminologia usada no presente documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações. As definições de termos comuns em imunologia e biologia molecular podem ser encontradas em The Merck Manual of Diagnoses and Therapy, 19ª edição, publicado pela Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6a Edition, publicado por Lippincott Williams & amp; Wilkins, Philadelphia, PA, EUA (2013), Knipe, DM e Howley, PM (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Mo- lecular Medicine, publicado pela Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006; Janeway´s Immunobi-
ology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin´s Genes XI, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN- 1449659055); Michael Richard Green e Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Methods Basic in Molecular Biology, Elsevier Science Publish- ing, Inc., Nova York, EUA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Os protocolos atuais em biologia molecular (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley e Sons, Inc., 2005; e Cur- rent Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), cujos conteúdos estão incorporados a título de refe- rência aqui na sua totalidade.
[0063] Como usado neste documento, os termos "sequência nu- cleotídica heteróloga" e "transgene" são usados de forma intercambiá- vel e se referem a um ácido nucleico de interesse (que não seja um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de capsídeo) que é incor- porado e pode ser entregue e expresso por um vetor de ceDNA como aqui descrito. Transgenes de interesse incluem, sem limitação, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos, preferencialmente terapêuticos (por exemplo, para uso médico, diagnóstico ou veterinário) ou polipep- tídeos imunogênicos (por exemplo, para vacinas). Em algumas moda- lidades, ácidos nucleicos de interesse incluem ácidos nucleicos que são transcritos no RNA terapêutico. Os transgenes incluídos para uso nos vetores de ceDNA da invenção incluem, sem limitação, aqueles que expressam ou codificam um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ri- bozimas, aptâmeros, ácidos nucleicos peptídicos, siRNAs, RNAis, miRNAs, lncRNAs, oligo-antissenso ou polinucleotídeos, anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno ou qualquer combinação dos mes- mos.
[0064] Como usado neste documento, os termos "cassete de ex- pressão" e "cassete de transcrição" são usados de forma intercambiá- vel e se referem a um trecho linear de ácidos nucleicos que inclui um transgene que está operacionalmente ligado a um ou mais promotores ou outras sequências reguladoras suficientes para direcionar transcri- ção do transgene, mas que não compreende sequências que codifi- cam o capsídeo, outras sequências de vetores ou regiões de repetição terminal invertidas. Um cassete de expressão pode adicionalmente compreender uma ou mais sequências que atuam em cis (por exem- plo, promotores, intensificadores ou repressores), um ou mais íntrons e um ou mais elementos reguladores pós-transcricionais.
[0065] Como usado neste documento, o termo "repetição terminal" ou "TR" inclui qualquer repetição terminal viral ou sequência sintética que compreende pelo menos uma origem mínima necessária de repli- cação e uma região que compreende uma estrutura em gancho de ca- belo palíndromo. Uma sequência de ligação a Rep ("RBS") (também referida como RBE (elemento de ligação a Rep)) e um sítio de resolu- ção de terminal ("TRS") juntos constituem uma "origem mínima de re- plicação necessária" e, portanto, o TR compreende pelo menos uma RBS e pelo menos um TRS. TRs que são o complemento inverso um do outro dentro de um determinado trecho de sequência polinucleotídi- ca são tipicamente referidos como "repetição terminal invertida" ou "ITR". No contexto de um vírus, as ITRs mediam replicação, empaco- tamento de vírus, integração e resgate de provírus. Como foi inespe- radamente encontrado na invenção, as TRs que não são complemen-
tos inversos em todo o seu comprimento ainda podem desempenhar as funções tradicionais das ITRs e, portanto, o termo ITR é usado nes- te documento para se referir a uma TR em um genoma ceDNA ou ve- tor de ceDNA que tem a capacidade de mediar a replicação do vetor de ceDNA. Será entendido por um técnico no assunto que em configu- rações complexas de vetor de ceDNA podem estar presentes mais de duas ITRs ou pares de ITR assimétricos. A ITR pode ser uma ITR de AAV ou um ITR de não AAV ou pode ser derivada de uma ITR de AAV ou um ITR de não AAV. Por exemplo, a ITR pode ser derivada da fa- mília Parvoviridae, que inclui parvovírus e dependovírus (por exemplo, parvovírus canino, parvovírus bovino, parvovírus de camundongo, par- vovírus suíno, parvovírus suíno, parvovírus humano B-19) ou o gram- po SV40 que serve como origem. A replicação do SV40 pode ser usa- da como uma ITR, que pode ser modificado ainda mais por trunca- mento, substituição, exclusão, inserção e/ou adição. Os vírus da famí- lia Parvoviridae consistem em duas subfamílias: Parvovirinae, que in- fecta vertebrados, e Densovirinae, que infecta invertebrados. Os de- pendoparvovírus incluem a família viral dos vírus adenoassociados (AAV) que têm a capacidade de replicação em hospedeiros vertebra- dos, incluindo, sem limitação, espécies humanas, primatas, bovinas, caninas, equinas e ovinas.
[0066] Como usado neste documento, o termo "ITRs assimétricas" refere-se a um par de ITRs dentro de um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que não são complementos inversos em todo o seu comprimento. A diferença na sequência entre as duas ITRs pode ser devida à adição, deleção, truncamento ou mutação pontual de nucleo- tídeos. Em uma modalidade, uma ITR do par pode ser uma sequência AAV do tipo selvagem e a outra uma sequência sintética ou não do tipo selvagem. Em outra modalidade, nenhuma ITR do par é uma se- quência de AAV do tipo selvagem e as duas ITRs diferem em sequên-
cia uma da outra. Por conveniência aqui, uma ITR localizado 5’ para (a montante) de um cassete de expressão em um vetor ceDNA é referido como uma "ITR 5’" ou uma "ITR esquerda", e uma ITR localizada a 3’ para (a jusante de) um cassete de expressão em um vetor de ceDNA é referido como "ITR 3’" ou "ITR direita".
[0067] Como usado neste documento, o termo "genoma de ceD- NA" refere-se a um cassete de expressão que incorpora ainda pelo menos uma região de repetição terminal invertida. Um genoma de ce- DNA pode ainda compreender uma ou mais regiões espaçadoras. Em algumas modalidades, o genoma de ceDNA é incorporado como um polinucleotídeo duplex intermolecular de DNA em um plasmídeo ou genoma viral.
[0068] Como usado neste documento, o termo "região espaçadora de ceDNA" refere-se a uma sequência intermediária que separa ele- mentos funcionais no vetor de ceDNA ou no genoma ceDNA. Em al- gumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA mantêm dois elementos funcionais a uma distância desejada para a funcionalidade ideal. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA fornecem ou aumentam a estabilidade genética do genoma de ceDNA dentro, por exemplo, de um plasmídeo ou baculovírus. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA facilitam a manipula- ção genética pronta do genoma de ceDNA, fornecendo uma localiza- ção conveniente para locais de clonagem e similares. Por exemplo, em certos aspectos, um oligonucleotídeo "poliligante" contendo vários sí- tios de endonuclease de restrição ou uma sequência de quadro de lei- tura não aberta projetada para não ter nenhum sítio de ligação conhe- cido à proteína (por exemplo, fator de transcrição) pode ser posiciona- do no genoma do ceDNA para separar os fatores de ação cis, por exemplo, inserção de 6mer, 12mer, 18mer, 24mer, 48mer, 86mer, 176mer, etc. entre o sítio de resolução de terminal e o elemento regu-
lador da transcrição a montante. Do mesmo modo, o espaçador pode ser incorporado entre a sequência do sinal de poliadenilação e o sítio de resolução 3’-terminal.
[0069] Conforme usado neste documento, os termos "sítio de li- gação Rep", elemento de ligação Rep, "RBE" e "RBS" são usados de forma intercambiável e se referem a um sítio de ligação para a proteí- na Rep (por exemplo, AAV Rep 78 ou AAV Rep 68) que por ligação de uma proteína Rep permite que a proteína Rep realize sua atividade de endonuclease sítio-específica na sequência que incorpora o RBS. Uma sequência RBS e seu complemento inverso juntos formam um único RBS. As sequências RBS são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, 5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 531), uma sequência RBS identificada no AAV2. Qualquer sequência RBS co- nhecida pode ser utilizada nas modalidades da invenção, incluindo ou- tras sequências conhecidas de AAV RBS e outras sequências natu- ralmente conhecidas ou sintéticas de RBS. Sem estar limitado pela teoria, pensa-se que o domínio da nuclease de uma proteína Rep se liga à sequência nucleotídica duplex GCTC e, portanto, as duas prote- ínas Rep AAV conhecidas se ligam diretamente e se montam de forma estável no oligonucleotídeo duplex, 5’-(GCGC) (GCTC) (GCTC) (GCTC)-3’ (SEQ ID NO: 531). Além disso, os conformes agregados solúveis (isto é, número indefinido de proteínas Rep interassociadas) se dissociam e se ligam a oligonucleotídeos que contêm sítios de liga- ção a Rep. Cada proteína Rep interage com as bases nitrogenadas e a estrutura principal do fosfodiéster em cada fita. As interações com as bases nitrogenadas fornecem especificidade de sequência, enquanto as interações com o esqueleto de fosfodiéster são não ou menos es- pecíficas da sequência e estabilizam o complexo proteína-DNA.
[0070] Conforme usado neste documento, os termos "sítio de reso- lução de terminal" e "TRS" são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a uma região na qual Rep forma uma ligação tirosina-fosfodiéster com a 5’ timidina gerando um 3’ OH que serve como um substrato para extensão de DNA através de uma polimerase de DNA celular, por exemplo, DNA pol delta ou DNA pol epsilon. Alter- nativamente, o complexo Rep-timidina pode participar de uma reação de ligação coordenada. Em algumas modalidades, um TRS abrange minimamente uma timidina não emparelhada com base. Em algumas modalidades, a eficiência de corte do TRS pode ser controlada pelo menos em parte por sua distância dentro da mesma molécula do RBS. Quando o substrato aceitador é a ITR complementar, o produto resul- tante é um duplex intramolecular. As sequências TRS são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, 5’-GGTTGA-3’ (SEQ ID NO: 45), a sequência hexanucleotídica identificada no AAV2. Qualquer sequência TRS conhecida pode ser usada nas modalidades da invenção, incluin- do outras sequências TRS de AAV conhecidas e outras sequências TRS naturalmente conhecidas ou sintéticas, como AGTT (SEQ ID NO: 46), GGTTGG (SEQ ID NO: 47), AGTTGG (SEQ ID NO: 48), AGTTGA (SEQ ID NO: 49) e outros motivos como RRTTRR (SEQ ID NO: 50).
[0071] Como usado neste documento, o termo "plasmídeo ceDNA" refere-se a um plasmídeo que compreende um genoma de ceDNA como um duplex intermolecular.
[0072] Como usado neste documento, o termo "ceDNA-bacmídeo" refere-se a um genoma de baculovírus infeccioso que compreende um genoma de ceDNA como um duplex intermolecular que tem a capaci- dade de se propagar em E. coli como um plasmídeo e, portanto, pode operar como um vetor de vaivém para baculovírus.
[0073] Como usado neste documento, o termo "ceDNA- baculovírus" refere-se a um baculovírus que compreende um genoma de ceDNA como um duplex intermolecular dentro do genoma de bacu- lovírus.
[0074] Como usado neste documento, os termos "célula de inseto infectada por ceDNA-baculovírus" e "ceDNA-BIIC" são usados de for- ma intercambiável e se referem a uma célula hospedeira de inverte- brado (incluindo, sem limitação uma célula de inseto (por exemplo, uma célula Sf9)) infectados com um ceDNA-baculovírus.
[0075] Conforme usado neste documento, os termos "vetor de DNA fechado", "vetor de ceDNA" e "ceDNA" são usados de forma in- tercambiável e se referem a um vetor de DNA sem capsídeos sem ví- rus com pelo menos uma extremidade covalentemente fechada (ou seja, um duplex intramolecular). Em algumas modalidades, o ceDNA compreende duas extremidades fechadas covalentemente.
[0076] Conforme definido neste documento, "repórteres" referem- se a proteínas que podem ser usadas para fornecer leituras detectá- veis. Os repórteres geralmente produzem um sinal mensurável, como fluorescência, cor ou luminescência. As sequências codificadoras de proteínas repórter codificam proteínas cuja presença na célula ou or- ganismo é facilmente observada. Por exemplo, proteínas fluorescentes fazem com que uma célula fluorescente quando excitada com luz de um comprimento de onda específico, as luciferases fazem com que uma célula catalise uma reação que produz luz, e enzimas como a β- galactosidase convertem um substrato em um produto colorido. Poli- peptídeos repórter exemplares úteis para fins experimentais ou de di- agnóstico incluem, sem limitação β-lactamase, β-galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina (AP), timidina quinase (TK), proteína verde fluores- cente (GFP) e outras proteínas fluorescentes, cloranfenicol acetiltrans- ferase (CAT), luciferase e outras bem conhecidas na técnica.
[0077] Como usado neste documento, o termo "proteína efetora" refere-se a um polipeptídeo que fornece uma leitura detectável, como, por exemplo, um polipeptídeo repórter, ou mais apropriadamente, co- mo um polipeptídeo que mata uma célula, por exemplo, uma toxina ou um agente que torne uma célula suscetível de matar com um agente escolhido ou a falta dele. Proteínas efetoras incluem qualquer proteína ou peptídeo que direciona diretamente ou dano do DNA e/ou RNA da célula hospedeira. Por exemplo, proteínas efetoras podem incluir, sem limitação, uma endonuclease de restrição que tem como alvo uma se- quência de DNA da célula hospedeira (seja genômica ou em um ele- mento extracromossômico), uma protease que degrada um alvo poli- peptídico necessário para a sobrevivência celular, um inibidor da DNA girase e uma toxina do tipo ribonuclease. Em algumas modalidades, a expressão de uma proteína efetora controlado por um circuito biológico sintético, como descrito no presente documento pode participar como um fator no outro circuito biológico sintético para expandir a gama e, assim, a complexidade de uma responsividade do sistema de circuito biológica.
[0078] Reguladores da transcrição referem-se a ativadores e re- pressores da transcrição que ativam ou reprimem a transcrição de um gene de interesse. Promotores são regiões de ácido nucleico que ini- ciam a transcrição de um gene específico. Os ativadores da transcri- ção tipicamente se ligam próximo a promotores da transcrição e recru- tam a RNA polimerase para iniciar diretamente a transcrição. Os re- pressores se ligam aos promotores da transcrição e dificultam estereo- tipadamente a iniciação da transcrição pela RNA polimerase. Outros reguladores da transcrição podem servir como ativadores ou represso- res, dependendo de onde eles se ligam e das condições celulares e ambientais. Exemplos não limitativos de classes reguladoras da trans- crição incluem, sem limitação proteínas de domínio doméstico, proteí- nas de dedos de zinco, proteínas de hélice alada (cabeça de forquilha) e proteínas de zíper de leucina.
[0079] Como usado neste documento, uma "proteína repressora" ou "proteína indutora" é uma proteína que se liga a um elemento de sequência reguladora e reprime ou ativa, respectivamente, a transcri- ção de sequências operacionalmente ligadas ao elemento de sequên- cia reguladora. As proteínas repressoras e indutoras preferenciais, como aqui descritas, são sensíveis à presença ou ausência de pelo menos um agente de entrada ou entrada ambiental. As proteínas pre- ferenciais como aqui descritas são de forma modular, que compreen- dem, por exemplo, elementos ou domínios de ligação separáveis para ligação ao DNA e ligação ao agente de entrada ou responsivos.
[0080] Como usado neste documento, "veículo" inclui todo e qual- quer solvente, meio de dispersão, carreadores, revestimentos, diluen- tes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, tampões, soluções de suporte, suspen- sões, coloides e similares. O uso de tais meios e agentes para subs- tâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Os in- gredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. A expressão "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação indesejável tóxica, alérgica ou similar quando administradas a um hos- pedeiro.
[0081] Como usado neste documento, um "domínio responsivo ao agente de entrada" é um domínio de um fator de transcrição que se liga ou responde a uma condição ou agente de entrada de uma manei- ra que torna um domínio de fusão de ligação a DNA ligado responsivo à presença dessa condição ou entrada. Em uma modalidade, a pre- sença da condição ou entrada resulta em uma alteração conformacio- nal no domínio responsivo do agente de entrada ou em uma proteína à qual ele é fundido, que modifica a atividade de modulação da transcri- ção do fator de transcrição.
[0082] O termo "in vivo" refere-se a ensaios ou processos que ocorrem em ou dentro de um organismo, como um animal multicelular.
Em alguns dos aspectos aqui descritos, pode-se dizer que um método ou uso ocorre "in vivo" quando um organismo unicelular, como uma bactéria, é usado. O termo "ex vivo" refere-se a métodos e usos que são realizados usando uma célula viva com uma membrana intacta que está fora do corpo de um animal ou planta multicelular, por exem- plo, explantes, células cultivadas, incluindo células primárias e linhas celulares, transformadas linhas celulares e tecido ou células extraídos, incluindo células sanguíneas, entre outros. O termo "in vitro" refere-se a ensaios e métodos que não requerem a presença de uma célula com uma membrana intacta, como extratos celulares, e podem se referir à introdução de um circuito biológico sintético programável em um sis- tema não celular, como um meio que não compreende células ou sis- temas celulares, como extratos celulares.
[0083] O termo "promotor" como usado neste documento, refere- se a qualquer sequência de ácido nucleico que regula a expressão de outra sequência de ácido nucleico dirigindo a transcrição da sequência de ácido nucleico, que pode ser um gene alvo heterólogo que codifica uma proteína ou um RNA. Os promotores podem ser constitutivos, in- duzíveis, repressíveis, específicos de tecido ou qualquer combinação dos mesmos. Um promotor é uma região de controle de uma sequên- cia de ácido nucleico na qual são controladas a iniciação e a taxa de transcrição do restante de uma sequência de ácido nucleico. Um pro- motor também pode conter elementos genéticos nos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, um promotor pode dirigir a expressão de um fator de trans- crição que regula a expressão do próprio promotor ou de outro promo- tor usado em outro componente modular dos circuitos biológicos sinté- ticos aqui descritos. Dentro da sequência do promotor, será encontra- do um local de iniciação da transcrição, bem como os domínios de li-
gação às proteínas responsáveis pela ligação da RNA polimerase. Promotores eucarióticos, muitas vezes, mas nem sempre, contêm "TATA" boxes e "CAT" boxes. Vários promotores, incluindo promotores induzíveis, podem ser usados para dirigir a expressão de transgenes nos vetores de ceDNA descritos neste documento.
[0084] O termo "intensificador", conforme usado neste documento, refere-se a uma sequência reguladora de ação cis (por exemplo, 50-
1.500 pares de bases) que liga uma ou mais proteínas (por exemplo, proteínas ativadoras ou fator de transcrição) para aumentar a ativação transcricional de um núcleo sequência ácida. Os intensificadores po- dem ser posicionados em até 1.000.000 pares de bases a montante do local inicial do gene ou a jusante do local inicial do gene que eles regu- lam. Um intensificador pode ser posicionado dentro de uma região in- trônica ou na região exônica de um gene não relacionado.
[0085] Pode-se dizer que um promotor direciona a expressão ou direciona a transcrição da sequência de ácidos nucleicos que ele regu- la. As expressões "operativamente ligado", "operativamente posiciona- do", "operativamente ligado", "sob o controle" e "sob o controle trans- cricional" indicam que um promotor está na zona funcional correto e/ou da orientação em relação a uma sequência de ácido nucleico que re- gula para controlar a iniciação da transcrição e/ou expressão dessa sequência. Um "promotor invertido", como usado neste documento, refere-se a um promotor, em que a sequência de ácido nucleico está na orientação inversa, de modo que o que foi a cadeia codificadora é agora a cadeia não codificante, e vice-versa. Sequências promotoras invertidas podem ser usadas em várias modalidades para regular o estado de um comutador. Além disso, em várias modalidades, um promotor pode ser usado em conjunto com um intensificador.
[0086] Um promotor pode ser um naturalmente associado a um gene ou sequência, como pode ser obtido isolando as sequências não codificadoras 5’ localizadas a montante do segmento codificador e/ou éxon de um determinado gene ou sequência. Esse promotor pode ser referido como "endógeno". Do mesmo modo, em algumas modalida- des, um intensificador pode ser uma naturalmente associada com uma sequência de ácido nucleico, localizados a jusante ou a montante da dita sequência.
[0087] Em algumas modalidades, um segmento de ácido nucleico codificador é posicionado sob o controle de um "promotor recombinan- te" ou "promotor heterólogo", ambos os quais referem-se a um promo- tor que normalmente não está associado à sequência de ácido nuclei- co codificada, é operacionalmente ligado ao seu ambiente natural. Um intensificador recombinante ou heterólogo refere-se a um intensificador que normalmente não está associado a uma dada sequência de ácido nucleico no seu ambiente natural. Tais promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes; promo- tores ou intensificadores isolados de qualquer outra célula procariótica, viral ou eucariótica; e promotores sintéticos ou intensificadores que não são "de ocorrência natural", ou seja, compreender diversos ele- mentos de diferentes regiões reguladoras da transcrição e/ou muta- ções que alteram a expressão por meio de métodos de manipulação genética que são conhecidos na técnica. Além de produzir sequências de ácido nucleico de promotores e intensificadores sinteticamente, as sequências de promotor podem ser produzidas usando a tecnologia de clonagem recombinante e/ou de amplificação de ácido nucleico, inclu- indo PCR, em conexão com os circuitos e módulos biológicos sintéti- cos descritos neste documento (ver, por exemplo, US 4.683.202, US
5.928.906, cada uma aqui incorporada a título de referência). Além disso, é contemplado que sequências de controle que direcionam a transcrição e/ou expressão de sequências dentro de organelas não nucleares, como mitocôndrias, cloroplastos e similares, também po-
dem ser utilizadas.
[0088] Como descrito neste documento, um "promotor induzível" é aquele que é caracterizado por iniciar ou aprimorar a atividade trans- cricional quando na presença de, influenciado por ou contactado por um indutor ou agente indutor. Um "indutor" ou "agente indutor" como é aqui definido, pode ser endógeno, ou um composto normalmente exó- geno ou proteína que é administrado de modo um como para ser ativo na indução de atividade de transcrição a partir do promotor induzível. Em algumas modalidades, o indutor ou agente indutor, ou seja, um produto químico, um composto ou uma proteína, pode ser o resultado da transcrição ou expressão de uma sequência de ácido nucleico (ou seja, um indutor pode ser uma proteína indutora expressa por outro componente ou módulo), que por si só pode estar sob o controle ou um promotor induzível. Em algumas modalidades, um promotor indu- zível é induzido na ausência de certos agentes, como um repressor. Exemplos de promotores induzíveis incluem, entre outros, tetraciclina, metalotionina, ecdisona, vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio dos adenovírus; e repetição terminal longa do vírus do tumor mamário do mouse (MMTV-LTR)) e outros promotores responsivos aos esteroides, rapamicina promotores responsivos e afins.
[0089] O termo "indivíduo", como usado neste documento, refere- se a um ser humano ou animal, a quem é fornecido tratamento, inclu- indo tratamento profilático, com o vetor de ceDNA de acordo com a presente invenção. Normalmente, o animal é um vertebrado como, sem limitação, primata, roedor, animal doméstico ou animal de caça. Os primatas incluem sem limitação chimpanzés, macacos cinomólo- gos, macacos-aranha e macacos, por exemplo, Rhesus. Os roedores incluem ratos, ratos, marmotas, furões, coelhos e hamsters. Os ani- mais domésticos e de caça incluem, entre outros, vacas, cavalos, por- cos, veados, bisontes, búfalos, espécies felinas, por exemplo, gato doméstico, espécies caninas, por exemplo, cachorro, raposa, lobo, es- pécies aviárias, por exemplo, frango, emu, avestruz e peixe, por exemplo, truta, peixe-gato e salmão. Em certas modalidades dos as- pectos aqui descritos, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um primata ou um humano. Um sujeito pode ser homem ou mulher. Além disso, um indivíduo pode ser um bebê ou uma criança. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um recém-nascido ou não nascido, por exemplo, o indivíduo está no útero. De preferência, o indivíduo é um mamífero. O mamífero pode ser um primata humano, não humano, camundongo, rato, cachorro, gato, cavalo ou vaca, mas não está limi- tado a esses exemplos. Outros mamíferos que não humanos podem ser usados com vantagem como indivíduos que representam modelos animais de doenças e distúrbios. Além disso, os métodos e composi- ções aqui descritos podem ser usados para animais domesticados e/ou animais de estimação. Um indivíduo humano pode ser de qual- quer idade, sexo, raça ou grupo étnico, por exemplo, caucasiano (branco), asiático, africano, preto, afro-americano, europeu africano, hispânico, médio-oriental etc. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um paciente ou outro indivíduo em um ambiente clínico. Em algumas modalidades, o indivíduo já está em tratamento.
[0090] Como usado neste documento, o termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, in- cluindo, entre outros, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibem a atividade de liga- ção ao antígeno desejada. Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o mesmo antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmen- to de anticorpo compreende uma cadeia de imunoglobulina ou um fra-
gmento de anticorpo e pelo menos uma sequência de domínio variável de imunoglobulina. Exemplos de anticorpos ou fragmentos dos mes- mos incluem, sem limitação, um Fv, um scFv, um fragmento Fab, um Fab’, um F’(ab’)2, um Fab’-SH, um anticorpo de domínio único (dAb), uma cadeia pesada, uma cadeia leve, uma cadeia pesada e leve, um anticorpo completo (por exemplo, inclui cada um dos Fc, Fab, cadeias pesadas, cadeias leves, regiões variáveis etc.), um anticorpo biespecí- fico, um diabody, um anticorpo linear, um anticorpo de cadeia única, um intracorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico ou um anticorpo multimérico. Um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser de qualquer classe, incluindo, sem limitação IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e de qualquer subclasse do mesmo, incluindo sem limitação IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Além disso, um anticorpo pode ser derivado de qualquer mamífero, por exemplo, primatas, humanos, ratos, camundongos, cavalos, cabras etc. Em uma modalidade, o anticorpo é humano ou humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo modificado. Em al- gumas modalidades, os componentes de um anticorpo podem ser ex- pressos separadamente, de modo que o anticorpo se automonte após a expressão dos componentes da proteína. Em algumas modalidades, o anticorpo é "humanizado" para reduzir reações imunogênicas em um ser humano. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma função desejada, por exemplo, interação e inibição de uma proteína desejada com a finalidade de tratar uma doença ou um sintoma de uma doença. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compre- ende uma região estrutural ou uma região Fc.
[0091] Como usado neste documento, o termo "domínio de ligação ao antígeno" de uma molécula de anticorpo refere-se à parte de uma molécula de anticorpo, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina (Ig), que participa da ligação ao antígeno. Em modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regi- ões variáveis (V) das cadeias pesada (H) e leve (L). Três trechos alta- mente divergentes nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve, denominadas regiões hipervariáveis, são dispostos entre trechos de flanqueamento mais conservados, denominados "regiões de arcabou- ço" (FRs). FRs são sequências de aminoácidos que são naturalmente encontradas entre e adjacentes a regiões hipervariáveis nas imuno- globulinas. Nas modalidades, em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariá- veis de uma cadeia pesada são dispostas uma em relação à outra no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antí- geno, que é complementar à tri- superfície dimensional de um antíge- no ligado. As três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pe- sada e leve são denominadas "regiões determinantes da complemen- taridade" ou "CDRs". A região de estrutura e CDRs foram definidos e descritos, por exemplo, em Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Pro- teins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saú- de e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH no 91-3242, e Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. Cada cadeia variá- vel (por exemplo, cadeia pesada variável e cadeia leve variável) é tipi- camente composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carboxi na ordem de aminoácidos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.
[0092] Como usado neste documento, o termo "anticorpo de com- primento total" refere-se a uma molécula de imunoglobulina (Ig) (por exemplo, um anticorpo IgG), por exemplo, que ocorre naturalmente e formada por processos recombinatórios normais de fragmentos de ge- nes de imunoglobulina.
[0093] Como usado neste documento, o termo "fragmento de anti- corpo funcional" refere-se a um fragmento que se liga ao mesmo antí-
geno que o reconhecido pelo anticorpo intacto (por exemplo, compri- mento total). Os termos "fragmento de anticorpo" ou "fragmento funci- onal", também incluem fragmentos isolados que consistem em regiões variáveis, como os "Fv " fragmentos que consistem em regiões variá- veis das cadeias pesada e leve ou polipeptídeo de fita simples recom- binantes de moléculas na qual a luz e pesada regiões variáveis são conectadas por um ligante peptídico ("proteínas scFv"). Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo não inclui porções de anti- corpos sem atividade de ligação ao antígeno, como fragmentos Fc ou resíduos de aminoácidos únicos.
[0094] Como usado neste documento, uma "sequência de domínio variável de imunoglobulina" refere-se a uma sequência de aminoáci- dos que pode formar a estrutura de um domínio variável de imunoglo- bulina. Por exemplo, a sequência pode incluir toda ou parte da se- quência de aminoácidos de um domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a sequência pode ou não incluir um, dois ou mais ami- noácidos N ou C-terminais ou pode incluir outras alterações compatí- veis com a formação da estrutura da proteína
[0095] Como usado neste documento, o termo "compreendendo" ou "compreende" é usado em referência a composições, métodos e respectivos componentes, que são essenciais para o método ou com- posição, mas abertos à inclusão de elementos não especificados, es- sencial ou não.
[0096] Como usado neste documento, o termo "que consiste es- sencialmente em" refere-se aos elementos necessários para uma de- terminada modalidade. O termo permite a presença de elementos que não afetam materialmente a característica (ou características) básica e inovadora daquela modalidade.
[0097] O termo "que consiste em" refere-se a composições, méto- dos e respectivos componentes, como descrito no presente documen-
to, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado nessa des- crição da modalidade.
[0098] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica- ções anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem refe- rências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrá- rio. Assim, por exemplo, as referências ao "método" incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito aqui e/ou que se tornarão aparentes para as pessoas versadas na técnica ao ler esta descrição e assim por diante. Da mesma forma, a palavra "ou" pretende incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Embora méto- dos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos pos- sam ser usados na prática ou no teste desta descrição, métodos e ma- teriais adequados são descritos abaixo. A abreviação, "e.g" é derivada do exemplo latino gratia e é usada aqui para indicar um exemplo não limitativo. Assim, a abreviação "e.g" é sinônimo do termo "por exem- plo".
[0099] Além dos exemplos operacionais, ou onde indicado de ou- tra forma, todos os números que expressam quantidades de ingredien- tes ou condições de reação usado nestes documentos devem ser en- tendidos como modificados em todas as instâncias pelo termo "cerca de". O termo "cerca de" quando usado em conexão com porcentagens pode significar ± 1%. A presente invenção é ainda explicada em deta- lhes pelos exemplos a seguir, mas o escopo da invenção não deve ser limitado a isso.
[00100] Deve ser entendido que esta invenção não se limita à me- todologia, protocolos e reagentes específicos, etc., aqui descritos e, como tal, podem variar. A terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se des- tina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações.
II. Vetor de ceDNA
[00101] São fornecidas no presente documento novas moléculas de ceDNA, não virais e livres de capsídeo, com extremidades fechadas covalentemente (ceDNA). Essas moléculas de ceDNA não virais sem capsídeo podem ser produzidas em células hospedeiras permissivas a partir de um construto de expressão (por exemplo, um plasmídeo de ceDNA, um ceDNA-bacmídeo, um ceDNA-baculovírus ou uma linha celular integrada) contendo um gene heterólogo (transgene) posicio- nado entre duas sequências diferentes de repetição terminal invertida (ITR), em que as ITRs são diferentes entre si. Em algumas modalida- des, uma das ITRs é modificada por deleção, inserção e/ou substitui- ção em comparação com uma sequência de ITR do tipo selvagem (por exemplo, ITR de AAV); e pelo menos uma das ITRs compreende um sítio de resolução de terminal funcional (trs) e um sítio de ligação a Rep. O vetor de ceDNA é, de preferência, duplex, por exemplo, auto- complementar, sobre pelo menos uma porção da molécula, como o cassete de expressão (por exemplo, ceDNA não é uma molécula circu- lar de fita dupla). O vetor de ceDNA tem extremidades fechadas cova- lentemente e, portanto, é resistente à digestão com exonucleases (por exemplo, exonuclease I ou exonuclease III), por exemplo, por mais de uma hora a 37°C.
[00102] Os vetores de ceDNA descritos no presente documento não têm nenhuma restrição de acondicionamento imposta pela limitação de espaço dentro do capsídeo viral. Os vetores de ceDNA representam uma alternativa viável produzida por eucariotas aos vetores de DNA de plasmídeo produzidos em procariotas, em oposição aos genomas de AAV encapsulados. Isso permite a inserção de elementos de controle, por exemplo, comutadores reguladores, conforme descrito no presente documento, grandes transgenes, múltiplos transgenes etc.
[00103] Em um aspecto, um vetor de ceDNA compreende, na dire-
ção 5’ a 3’: uma primeira repetição de terminal invertida (ITR) de vírus adenoassociado (AAV), uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um cassete de expressão como descrito aqui) e uma segunda ITR de AAV, em que a primeira ITR e a segunda ITR são as- simétricas entre si – isto é, são diferentes uma da outra. Como uma modalidade exemplificadora, a primeira ITR pode ser uma ITR do tipo selvagem e a segunda ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada. Em algumas modalidades, a primeira ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada e a segunda ITR, uma ITR do tipo selvagem. Em outra modalidade, a primeira ITR e a segunda ITR são ambas modificadas, mas são sequências diferentes, ou têm modificações diferentes, ou não são ITRs modificadas idênticas. Dito de forma diferente, as ITRs são assimétricas em que quaisquer alterações em uma ITR são não refletidas na outra ITR; ou, alternativamente, em que as ITRs são dife- rentes entre si. Exemplos de ITRs no vetor de ceDNA e para uso para gerar uma ceDNA-plasmídeo são discutidos abaixo na seção intitulada "ITRs".
[00104] As sequências de ITR do tipo selvagem ou mutada ou de outro modo modificada fornecidas no presente documento aqui repre- sentam sequências de DNA incluídas no construto de expressão (por exemplo, ceDNA-plasmídeo, ceDNA-bacmídeo, ceDNA-baculovírus) para a produção do vetor de ceDNA. Assim, as sequências de ITR efe- tivamente contidas no vetor de ceDNA produzidos a partir do ceDNA- plasmídeo ou outro construto de expressão podem ou não ser idênti- cas às sequências de ITR fornecidas no presente documento como um resultado das mudanças de ocorrência natural que ocorrem durante o processo de produção (por exemplo, erro de replicação)
[00105] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA descrito no presente documento, que compreende a expressão de cassetes com um transgene, que pode ser, por exemplo, uma sequência reguladora,
uma sequência que codifica um ácido nucleico (por exemplo, como uma miR ou uma sequência antissenso), ou uma sequência que codi- fica um polipeptídeo (por exemplo, como um transgene). Em uma mo- dalidade, o transgene pode ser operativamente ligado a uma ou mais sequências reguladoras que permitem ou controlam de expressão do transgene. Em uma modalidade, o polinucleotídeo compreende uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, em que a sequência de nucleotídeos de interesse é flanqueada pela primeira e segunda sequências de ITR, e a primeira e segunda sequências de ITR são assimétricas entre si.
[00106] Em uma modalidade em cada um desses aspectos, um cassete de expressão está localizado entre duas ITRs compreendidas na seguinte ordem com um ou mais dentre: um promotor operativa- mente ligado a um transgene, um elemento regulador pós- transcricional, e um sinal de poliadenilação e terminação. Em uma modalidade, o promotor é regulável - induzível ou repressível. O pro- motor pode ser qualquer sequência que facilita a transcrição do trans- gene. Em uma modalidade, o promotor é um promotor CAG (por exemplo, SEQ ID NO: 03), ou variações do mesmo. O elemento regu- lador pós-transcricional é uma sequência que modula a expressão do transgene, como um exemplo não limitativo, qualquer sequência que cria uma estrutura terciária que melhora a expressão do transgene.
[00107] Em uma modalidade, o elemento regulador pós- transcricional compreende WPRE (por exemplo, SEQ ID NO: 08). Em uma modalidade, o sinal de poliadenilação e terminação compreende BGHpolyA (por exemplo, SEQ ID NO: 09). Qualquer elemento cis re- gulador conhecido na técnica, ou combinação dos mesmos, pode ser adicionalmente usado, por exemplo, sequência intensificadora a mon- tante (USE) de sinal polyA tardio de SV40, ou outros elementos de processamento pós-transcricional, incluindo, sem limitação, a timidina quinase do gene do vírus da herpes simplex, ou vírus da hepatite B (HBV). Em uma modalidade, o comprimento de cassete de expressão na direção 5’ a 3’ é maior do que o comprimento máximo conhecido para ser encapsidado em um virião de AAV. Em uma modalidade, o comprimento é maior do que 4,6kb, ou maior do que 5kb, ou maior do que 6kb, ou maior do que 7kb. Vários cassetes de expressão são exemplificados no presente documento.
[00108] O cassete de expressão pode compreender mais do que
4.000 nucleotídeos, 5.000 nucleotídeos, 10.000 nucleotídeos ou
20.000 nucleotídeos, ou 30.000 nucleotídeos, ou 40.000 nucleotídeos ou 50.000 nucleotídeos, ou qualquer faixa entre cerca de 4.000 a
10.000 nucleotídeos ou 10.000 a 50.000 nucleotídeos, ou mais de
50.000 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o cassete de expres- são pode incluir um transgene ou ácido nucleico na faixa de 500 a
50.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode incluir um transgene ou ácido nucleico na faixa de 500 a 75.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas mo- dalidades, o cassete de expressão pode incluir um transgene ou ácido nucleico é na faixa de 500 a 10.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode incluir um trans- gene ou ácido nucleico na faixa de 1.000 a 10.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode incluir um transgene ou ácido nucleico é na faixa de 500 a 5.000 nu- cleotídeos de comprimento. Os vetores de ceDNA que têm as limita- ções de tamanho de vetores de AAV encapsidados, assim, permitem a entrega de um cassete de expressão de tamanho grande para forne- cer eficiente expressão de transgenes. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é desprovido de metilação específica de procariota.
[00109] O cassete de expressão pode também incluir um sítio de entrada de ribossoma interno (IRES) e/ou um elemento2A. Os elemen-
tos cis-reguladores incluem, sem limitação, um promotor, um riboco- mutador, um isolador, um elemento mir-regulável, um elemento regu- lador pós-transcricional, um promotor do tipo específico de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor para o transgene. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para regular a ex- pressão do transgene, por exemplo, comutadores reguladores, que são descritos no presente documento na seção intitulada "Comutado- res Reguladores" para o controle e regulação da expressão do trans- gene, e podem incluir, se desejado, um comutador regulador que é um comutador de extermínio para permitir extermínio controlado de célula de uma célula que compreende um vetor de ceDNA.
[00110] As Figuras 1A-1C mostram esquemas de vetores de ceD- NA exemplificadores não limitativos ou a sequência correspondente de plasmídeos de ceDNA. Os vetores de ceDNA são livres de capsídeo e podem ser obtidos a partir de um plasmídeo que codifica nessa ordem: uma primeira ITR, cassete de transgene expressável e uma segunda ITR, em que pelo menos um dentre a primeira e/ou a segunda se- quência de ITR está mutada em relação à sequência de ITR de AAV2 do tipo selvagem correspondente. O cassete de transgene expressável preferencialmente inclui, no presente pedido, um ou mais dentre: um intensificador/promotor, um repórter de ORF (transgene), um elemento regulador pós-transcricional (por exemplo, WPRE), e um sinal de poli- adenilação e terminação (por exemplo, BGH polyA)
[00111] O cassete de expressão pode compreender qualquer trans- gene de interesse. Os transgenes de interesse incluem, sem limitação, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos, ou ácidos nucleicos não codificantes (por exemplo, RNAi, MIRs etc.) de preferência polipeptí- deos terapêuticos (por exemplo, para usos medicinais, de diagnóstico ou veterinário) ou imunogênico (por exemplo, para vacinas). Em certas modalidades, os transgenes no cassete de expressão codifica um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, ácidos nucleicos peptídicos, siRNAs, RNAs, oligonucleotídeos antissenso, polinucleotídeos antis- senso, anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o transgene é um gene terapêutico ou uma proteína marcadora. Em algumas moda- lidades, o transgene é um agonista ou antagonista. Em algumas mo- dalidades, o antagonista é um mimético ou anticorpo, ou fragmento de anticorpo, ou fragmentos de ligação a antígeno do mesmo, por exem- plo, um anticorpo neutralizador ou fragmento de anticorpo e similares. Em algumas modalidades, o transgene codifica um anticorpo, incluindo um anticorpo completo ou fragmento de anticorpo, conforme aqui defi- nido. Em algumas modalidades, o anticorpo é um domínio de ligação ao antígeno ou uma sequência de domínio variável de imunoglobulina, assim como é definido no presente documento.
[00112] Em particular, o transgene pode codificar um ou mais agen- tes terapêuticos, incluindo, sem limitação, por exemplo, proteína (ou proteínas), polipeptídeo (ou polipeptídeos), peptídeo (peptídeos), en- zima (enzimas), anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, como bem como as variantes, e/ou fragmentos ativos dos mesmos, para uso no tratamento, profilaxia, e/ou melhora de um ou mais sintomas de uma doença, disfunção, lesão, e/ou distúrbio. Exemplos de transgenes são descritos no presente documento na seção intitulada "Método de Tratamento".
[00113] Existem muitas características estruturais de vetores de ceDNA que diferem de vetores de expressão à base de plasmídeos. Os vetores de ceDNA podem ter uma ou mais das seguintes caracte- rísticas: a falta de DNA bacteriano original (isto é, não inserido), a falta de uma origem procariótica de replicação, sendo autocontendo, isto é, os mesmos não requerem quaisquer sequências além das duas ITRs,
incluindo sítios de ligação a Rep e de resolução de terminal (RBS e TRS), e uma sequência exógena entre as ITRs, a presença das se- quências de ITR que formam grampos de cabelo, da origem eucarióti- ca (isto é, são produzidos em células eucariotas), e a ausência de me- tilação de DNA do tipo bacteriano ou de fato qualquer outra metilação considerada anormal por um mamífero hospedeiro. Em geral, isso é preferencial para os presentes vetores não para conter qualquer DNA procariota, mas que está contemplado que alguns DNA procariotas podem ser inseridos como uma sequência exógena, como um exem- plo não limitativo, em uma região promotora ou intensificadora. Outra característica importante que distingue vetores de ceDNA de vetores de expressão de plasmídeo é que vetores de ceDNA são de DNA de fita simples linear que tem extremidades fechadas, ao passo que os plasmídeos são sempre de DNA de fita dupla.
[00114] Os vetores de ceDNA produzidos pelos métodos fornecidos no presente documento de um modo preferencial tem uma estrutura linear e contínua, em vez de uma estrutura não contínua, como deter- minado por ensaio de digestão de enzima de restrição (Figura 4D). Acredita-se que a estrutura linear e contínua é mais estável contra o ataque por endonucleases celulares, bem como menos provável de ser recombinada e ocasionar mutagênese. Assim, um vetor de ceDNA na estrutura linear e contínua é uma modalidade preferencial. O vetor de ceDNA dúplex intramolecular de fita simples, linear e contínua, po- de ter extremidades terminais ligadas covalentemente, sem sequên- cias que codificam proteínas do capsídeo AAV. Esses vetores de ce- DNA são estruturalmente distintos de plasmídeos (incluindo ceDNA plasmídicos descritos no presente documento), que são moléculas de ácido nucleico dúplex circulares de origem bacteriana. As fitas com- plementares de plasmídeos podem ser separadas após a desnatura- ção para produzir duas moléculas de ácido nucleico, enquanto, por outro lado, os vetores de ceDNA, embora tenham cadeias complemen- tares, são uma única molécula de DNA e, portanto, mesmo se desna- turados, permanecem uma molécula única. Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA como aqui descritos podem ser produzidos sem a metilação da base de DNA do tipo procariótico, diferentemente dos plasmídeos. Portanto, os vetores de ceDNA e ceDNA plasmídicos são diferentes tanto em termo de estrutura (em particular, linear contra cir- cular) e também em vista dos métodos usados para produzir e purificar esses diferentes objetos (consulte abaixo), e também em vista da sua metilação do DNA, que é do tipo procariótico para ceDNA-plasmídeos e do tipo eucariótico para o vetor de ceDNA.
[00115] Várias vantagens de um vetor de ceDNA descrito no pre- sente documento em relação a vetores de expressão baseados em plasmídeo incluem, sem limitação: 1) plasmídeos contêm sequências de DNA bacteriano e são submetidos a - metilação específica procarió- tica, por exemplo, metilação de 6-metil adenosina e 5-metil citosina, enquanto que sequências de vetor de AAV sem capsídeo são de ori- gem eucariota e não são submetidas à metilação específica procarióti- ca; como um resultado, vetores de AAV sem capsídeo são menos pro- pensos a induzir respostas inflamatórias e imunes em comparação com os plasmídeos; 2) enquanto plasmídeos requerem a presença de um genes de resistência durante o processo de produção, vetores de ceDNA não o fazem; 3) enquanto um plasmídeo circular não é entre- gue para o núcleo mediante a introdução em uma célula e requer a sobrecarga para desvio de degradação por nucleases celulares, os vetores de ceDNA contêm cis-elementos virais, ou seja, ITRs, que conferem resistência a nucleases em pode ser concebidos para ser alvo e entregues para o núcleo. Hipotetiza-se que os elementos de de- finição mínima indispensáveis para função de ITR são um sítio de liga- ção a Rep (RBS; 5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 531)
para AAV2) e um sítio de resolução de terminal (TRS; 5’-AGTTGG-3’ (SEQ ID NO: 48) para AAV2) mais uma sequência palindrômica variá- vel que permite a formação de grampo de cabelo; e 4) vetores de ce- DNA que não têm a sobre-representação de dinucleotídeos de CpG frequentemente encontrados em plasmídeos derivados de procariotas que declaradamente se liga a um membro da família de receptores Toll-like, provocando uma resposta imune mediada por células T. Em contrapartida, as transduções com vetores de AAV sem capsídeo aqui descritos podem direcionar eficientemente tipos de células e tecidos que são difíceis de transduzir com viriões de AAV convencionais usando vários reagentes de entrega. III - ITRs
[00116] Como descrito no presente documento, vetores de ceDNA contêm um gene heterólogo posicionado entre duas sequências de repetição de terminal invertido (ITR), que diferem entre si (isto é, são ITRs assimétricas). Em algumas modalidades, no mínimo uma das ITRs é modificada por deleção, inserção, e/ou substituição, como comparado a uma sequência de ITR do tipo selvagem (por exemplo, a ITR de AAV); e pelo menos uma das ITRs compreende um sítio de li- gação a Rep funcional (RBS; por exemplo, 5’- GCGCGCTCGCTCGCTC-3’ para AAV2, SEQ ID NO: 531) e uma sítio de resolução de terminal funcional (TRS; por exemplo, 5’-AGTT-3’, SEQ ID NO: 46). Em uma modalidade, no mínimo uma das ITRs é uma ITR não funcional. Em uma modalidade, as diferentes ITRs não são, cada uma, ITR do tipo selvagem de diferentes sorotipos.
[00117] Embora as ITRs exemplificadas no relatório descritivo e exemplos aqui sejam ITR de AAV2, um técnico no assunto está ciente que pode como indicado acima usar ITRs de qualquer parvovírus co- nhecido, por exemplo um dependovírus como AAV (por exemplo, ge- noma AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9,
AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ, e AAV-DJ8. Por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITRs quiméricos ou ITRs de qualquer AAV sintético. Em algumas modalidades, o AAV pode infec- tar animais de sangue quente, por exemplo, vírus adenoassociado de aves (AAAV), bovinos (BAAV), caninos, equinos e ovinos. Em algumas modalidades, a ITR é de B19 parvoviris (no de acesso ao GenBank: NC 000883), Vírus Minute de Camundongo (MVM) (no de acesso ao GenBank: NC 001510); parvovírus de ganso (no de acesso ao Gen- Bank: NC 001701); parvovírus de cobra 1 (no de acesso ao Ganbank: NC006148).
[00118] Em algumas modalidades, a sequência de ITR pode ser de vírus da família Parvoviridae, que inclui duas subfamílias: Parvovirinae, que infectam vertebrados, e Densovirinae, que infectam insetos. A subfamília Parvovirinae (referida como os parvovírus) inclui o gênero Dependovírus, os membros que, sob a maioria das condições, reque- rem a coinfecção com um vírus ajudante, como adenovírus ou vírus de herpes para infecção produtiva. O gênero Dependovírus inclui vírus adenoassociado (AAV), que normalmente infecta seres humanos (por exemplo, os sorotipos 2, 3A, 3B, 5, e 6) ou primatas (por exemplo, os sorotipos 1 e 4), e vírus relacionados que infectam outros animais de sangue quente (por exemplo, vírus adenoassociados de bovinos, cani- nos, equinos e ovinos). Os parvovírus e outros membros da família Parvoviridae são geralmente descritos em Kenneth I. Berns, "Parvo- viridae: The Viruses and Their Replication," Capítulo 69 em VIRO- LOGY FIELD (3a Ed. 1996).
[00119] Um técnico no assunto está ciente que sequências de ITR têm uma estrutura comum de uma junção Holliday de fita dupla, que tipicamente tem uma estrutura de grampo de cabelo em forma de T ou forma de Y (consulte, por exemplo, as Figuras 2A e 3A), em que cada
ITR é formada por dois braços ou alças palindrômicas (B-B’ e C-C’) incorporadas em um maior braço palindrômico (A-A’), e uma sequên- cia D de fita simples, (onde a ordem dessas sequências palindrômicas define a orientação flip ou flop da ITR), pode-se facilmente determinar sequências de ITR modificadas correspondente a partir de qualquer sorotipo de AAV para uso em um vetor de ceDNA ou ceDNA- plasmídeo baseado nas sequências de ITR de AAV2 exemplificadoras fornecidas no presente documento. Consulte, por exemplo, análise es- trutural e comparação de sequências de ITRs de diferentes sorotipos de AAV (AAV1-AAV6) e descritas em Grimm et al., J. Virology, 2006; 80 (1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Vi- rology 1999; 261; 8-14.
[00120] Alterações e mutações específicas nas ITRs são descritas em detalhe aqui, mas no contexto de ITRs, "alteradas" ou "mutantes" indica que os nucleotídeos foram inseridos, deletados e/ou substituí- dos em relação à sequência de ITR do tipo selvagem, de referência ou original, e podem ser alterados em relação entre si flanqueando ITR em um vetor de ceDNA que tem duas ITRs flanqueadoras. A ITR alte- rada ou mutada pode ser uma ITR manipulada. Como usado no pre- sente documento, "manipulado" refere-se ao aspecto de ter sido mani- pulado pela mão do homem. Por exemplo, um polipeptídeo é conside- rado "manipulado", quando em pelo menos um aspecto do polipeptí- deo, por exemplo, a sua sequência, foi manipulado pela mão do ho- mem para diferir do aspecto como o mesmo existe na natureza.
[00121] Em algumas modalidades, uma ITR pode ser sintética. Em uma modalidade, uma ITR sintética está baseada nas sequências de ITR de mais de um sorotipo de AAV. Em outra modalidade, uma ITR sintética não inclui sequência baseada em AAV. Em ainda outra moda- lidade, uma ITR sintética preserva a estrutura da ITR descrita acima, embora tenha apenas alguma ou nenhuma sequência originada por
AAV. Em alguns aspectos, uma ITR sintética pode interagir preferenci- almente com uma Rep do tipo selvagem ou uma Rep de um sorotipo específico ou, em alguns casos, não será reconhecido por uma Rep do tipo selvagem e será reconhecido apenas por uma Rep mutada.
[00122] As sequências de ITR têm uma estrutura comum de uma junção de Holliday de fita dupla, que normalmente é uma estrutura em grampo de cabelo em forma de T ou Y (consulte, por exemplo, as Fi- guras 2A e 3A), em que cada ITR é formada por dois braços ou alças palindrômicas (B-B’ e C-C’) incorporadas em um maior braço palin- drômico (A-A’), e uma sequência D de fita simples, (onde a ordem dessas sequências palindrômicas define a orientação ‘flip’ ou ‘flop’ da ITR). Um técnico no assunto pode prontamente determinar sequências de ITR ou sequências de ITR modificada a partir de qualquer sorotipo de AAV para uso em um vetor de ceDNA ou ceDNA-plasmídeo basea- do nas sequências de ITR de AAV2 exemplificadoras fornecidas no presente documento. Consulte, por exemplo, a comparação de se- quências de ITRs de diferentes sorotipos de AAV (AAV1-AAV6 e AAV aviário (AAAV) e AAV bovino (BAAV)) descritos em Grimm et al., J. Virology, 2006; 80 (1); 426-439; que mostram o percentual de identi- dade da ITR esquerda de AAV2 com a ITR esquerda de outros soroti- pos: AAV-1 (84%), AAV-3 (86%), AAV-4 (79%), AAV-5 (58%), AAV-6 (ITR esquerda) (100%) e AAV-6 (ITR direita) (82%).
[00123] Por conseguinte, enquanto as ITR de AAV2 são usadas como exemplos de ITRs nos vetores de ceDNA descritos no presente documento, um vetor de ceDNA descrito no presente documento pode ser preparado com ou baseado em ITRs de qualquer sorotipo de AAV conhecido, incluindo, por exemplo, o sorotipo de AAV 1 (AAV1), soro- tipo de AAV 2 (AAV2), sorotipo de AVV 4 (AAV4), sorotipo de AAV 5 (AAV5), sorotipo de AAV 6 (AAV6), sorotipo de AAV 7 (AAV7), sorotipo de AAV 8 (AAV8), sorotipo de AAV 9 (AAV9), sorotipo de AAV 10
(AAV10), sorotipo de AAV 11 (AAV11), ou de sorotipo de AAV 12 (AAV12). O técnico no assunto pode determinar a sequência corres- pondente em outros sorotipos por meios conhecidos. Por exemplo, a determinação se a mudança é na região A, A’ B, B’, C, C’ ou D e de- terminar a região correspondente no outro sorotipo. Pode-se usar BLAST® (Basic local Alinhamento Pesquisa Tool) ou outros programas de alinhamento de homologia em situação padrão para determinar a sequência correspondente. A invenção fornece ainda populações e pluralidades de vetores de ceDNA que compreendem ITRs de uma combinação de diferentes sorotipos de AAV - isto é, uma ITR pode ser de um sorotipo de AAV e a outra ITR pode ser de um sorotipo diferen- te. Se desejar ater-se a nenhuma teoria, em uma modalidade, uma ITR pode ser de ou baseada em uma sequência de ITR de AAV2 e a outra ITR do vetor de ceDNA pode ser de, ou ser baseada em qual- quer uma ou mais sequências de ITR de sorotipo de AAV 1 (AAV1), sorotipo de AAV 4 (AAV4), sorotipo de AAV 5 (AAV5), sorotipo de AAV 6 (AAV6), sorotipo de AAV 7 (AAV7), sorotipo de AAV 8 (AAV8), soro- tipo de AAV 9 (AAV9), sorotipo de AAV 10 (AAV10), sorotipo de AAV 11 (AAV11), ou de sorotipo de AAV 12 (AAV12).
[00124] Qualquer ITR de parvovírus pode ser usada como uma ITR ou como uma ITR básica para modificação. De preferência, o parvoví- rus é um dependovírus. Mais preferencialmente, AAV. O sorotipo es- colhido pode ser baseado no tropismo de tecido do sorotipo. AAV2 tem um amplo tropismo de tecido, AAV1 preferencialmente direciona mús- culo neuronal e esquelético, e AAV5 preferencialmente direciona epité- lio pigmentado retinal neuronal, e fotorreceptores. O AAV6 direciona preferencialmente músculo esquelético e pulmão. O AAV8 direciona preferencialmente tecidos hepáticos, musculares esqueléticos, cardía- cos e pancreáticos. O AAV9 direciona preferencialmente tecido hepáti- co, esquelético e pulmonar. Em uma modalidade, a ITR modificada está baseada em uma ITR de AAV2. Por exemplo, é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 52. Em uma mo- dalidade de cada um desses aspectos, o vetor de polinucleotídeo compreende um par de ITRs, selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 52; e SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 51. Em uma modalidade de cada um desses aspectos, o vetor de polinu- cleotídeo ou os vetores de DNA não viral sem capsídeo com extremi- dades covalentemente fechadas compreendem um par de ITRs dife- rentes selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109 e SEQ ID NO: 110; SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 113 e SEQ ID NO: 114; e SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 116. Em algumas modalidades, uma ITR modificada é selecionada de qualquer uma das ITRs, ou sequências de ITR parciais de SEQ ID NO: 2, 52, 63, 64, 101-499 ou 545-547.
[00125] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA pode com- preender uma ITR com uma modificação na ITR correspondente a qualquer uma das modificações nas sequências de ITR ou sequências de ITR parciais mostradas em qualquer uma ou mais das Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A e 10B no presente documento, ou as sequências mostradas na Figura 26A ou 26B.
[00126] Em algumas modalidades, o ceDNA pode formar uma es- trutura secundária dúplex intramolecular. A estrutura secundária da primeira ITR e da segunda ITR assimétrica é exemplificada no contex- to de ITRs do tipo selvagem (consulte, por exemplo, as Figuras 2A, 3A, 3C) e estruturas de ITR modificada (consulte, por exemplo, as Fi- guras 2B e 3B, 3D). As estruturas secundárias são inferidas ou previs- tas com base nas sequências de ITR do plasmídeo usado para produ- zir o vetor de ceDNA. As secundárias estruturas exemplificadoras das
ITRs modificadas em que parte da estrutura de haste-alça é suprimida são mostradas nas Figuras 9A-25B e 26A-26B, e também mostradas nas Tabelas 10A e 10B.
As secundárias estruturas exemplificadoras das ITRs modificadas que compreendem uma única haste e duas al- ças são mostradas nas Figuras 9A-13B.
A estrutura secundária exem- plificadora de uma ITR modificada com uma única haste e única alça é mostrada na Figura 14. Em algumas modalidades, a estrutura secun- dária pode ser inferida como mostrado no presente documento usando métodos de termodinâmica com base em regras de vizinho mais pró- ximo que preveem a estabilidade de uma estrutura como quantificado por mudança de energia livre de dobragem.
Por exemplo, a estrutura pode ser prevista encontrando a estrutura de menor energia livre.
Em algumas modalidades, um algoritmo descrito em Reuter, J.
S., & Ma- thews, D.
H. (2010) RNAstructure: software for RNA secondary structu- re prediction and analysis.
BMC Bioinformatics. 11,129 e implantado no software RNAstructure (disponível no endereço: "rna.urmc.roches- ter.edu/RNAstructureWeb/index.htmL") pode ser usado para previsão da estrutura de ITR.
O algoritmo pode também incluir parâmetros de mudança de energia livre a 37°C e parâmetros de mudanças de ental- pia derivados a partir literatura experimental para permitir a previsão da estabilidade de conformação a uma temperatura arbitrária.
Usando a software de estrutura de RNA, algumas das estruturas de ITR modi- ficadas podem ser previstas como estruturas de haste-alça em forma de T modificadas com energia livre de Gibbs estimada (ΔG) de desdo- bramento sob condições fisiológicas mostradas na Figura 3A-3D.
Usando o software RNAstructure, é previsto que os três tipos de ITRs modificadas têm uma energia livre de Gibbs de desdobramento maior do que uma ITR do tipo selvagem de AAV2 (-92,9 kcal/mol) e são co- mo se segue: (a) As ITRs modificadas com uma estrutura de braço único/alça não emparelhada aqui fornecidas são previstas como tendo uma energia livre de Gibbs de desdobramento que varia entre -85 e - 70 kcal/mol. (b) Prevê-se que as ITRs modificadas com uma estrutura em gancho de cabelo aqui fornecidas tenham uma energia livre de Gibbs de desdobramento que varia entre -70 e -40 kcal/mol. (c) As ITRs modificadas com uma estrutura de dois braços aqui fornecidas são previstas como tendo uma energia livre de Gibbs que se desdobra que varia entre -90 e -70 kcal/mol. Sem desejar se vincular a uma teo- ria, as estruturas com maior Gibbs é fácil desdobrar energia livre para replicação pelas proteínas de replicação Rep 68 ou Rep 78. Assim, as ITRs modificadas com maior energia livre de Gibbs de desdobramento - por exemplo, uma estrutura de braço único/loop não emparelhado, uma estrutura de gancho único, uma estrutura truncada - tendem a ser replicadas com mais eficiência do que as ITRs do tipo selvagem.
[00127] Em uma modalidade, a ITR esquerda do vetor de ceDNA é modificada ou mutada em relação a uma estrutura de ITR de AAV do tipo selvagem (wt) e a ITR direita é uma ITR de AAV do tipo selvagem. Em uma modalidade, a ITR direita do vetor de ceDNA é modificada em relação a uma estrutura de ITR de AAV do tipo selvagem, e a ITR es- querda é uma ITR de AAV do tipo selvagem. Em tal modalidade, uma modificação da ITR (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) pode ser gerada por uma deleção, inserção ou substituição de um ou mais nu- cleotídeos da ITR do tipo selvagem derivada do genoma de AAV.
[00128] As ITRs aqui usadas podem ser resolvíveis e não resolví- veis, e selecionadas para uso nos vetores de ceDNA são preferenci- almente sequências de AAV, sendo preferenciais os sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9. As ITRs de AAV resolvíveis não requerem uma se- quência de ITR do tipo selvagem (por exemplo, a sequência de ITR de AAV endógena ou do tipo selvagem pode ser alterada por inserção, deleção, truncamento e/ou mutações antissenso), desde que a repeti- ção do terminal medeie as funções desejadas, por exemplo, replica-
ção, empacotamento de vírus, integração e/ou resgate de vírus, e simi- lares. Tipicamente, mas não necessariamente, as ITRs são do mesmo sorotipo de AAV, por exemplo, ambas as sequências de ITR do vetor de ceDNA são de AAV2. As ITRs podem ser sequências sintéticas que funcionam como repetições terminais invertidas de AAV, como a "se- quência D dupla" como descrito na Patente US No. 5.478.745 de Sa- mulski et al. Embora não seja necessário, as ITRs podem ser do mesmo parvovírus, por exemplo, ambas as sequências ITR são do AAV2.
[00129] Em uma modalidade, o ceDNA pode incluir uma estrutura de ITR que é mutada em relação a uma das ITRs do tipo selvagem reveladas aqui, mas em que a ITR mutante ou modificada ainda retém um sítio de ligação a Rep operável (RBE ou RBE’) e um sítio de reso- lução de terminal (trs). Em uma modalidade, a ITR de ceDNA mutante inclui um sítio de proteína de replicação funcional (RPS-1) e uma pro- teína competente para replicação que se liga ao sítio de RPS-1 é usa- da na produção.
[00130] Em uma modalidade, no mínimo uma das ITRs é um ITR defeituosa com respeito à ligação a Rep e/ou nicking de Rep. Em uma modalidade, o defeito é de pelo menos 30% em relação a uma ITR de redução do tipo selvagem; em outras modalidades, é de pelo menos 35%..., 50%..., 65%..., 75%..., 75%..., 85%..., 90%..., 95%..., 98%..., ou completamente falta na função ou qualquer ponto no meio. As célu- las hospedeiras não expressam proteínas do capsídeo viral e o mode- lo de vetor polinucleotídico é desprovido de qualquer sequência de co- dificação do capsídeo viral. Em uma modalidade, os modelos de veto- res polinucleotídicos e células hospedeiras que são desprovidos de genes da cápside de AAV e a proteína resultante também não codifi- cam ou expressam genes da cápside de outros vírus. Além disso, em uma modalidade específica, a molécula de ácido nucleico também é desprovida de sequências de codificação da proteína AAV Rep.
[00131] Em algumas modalidades, o elemento estrutural da ITR po- de ser qualquer elemento estrutural que esteja envolvido na interação funcional da ITR com uma grande proteína Rep (por exemplo, Rep 78 ou Rep 68). Em certas modalidades, o elemento estrutural fornece se- letividade para a interação de uma ITR com uma proteína Rep grande, isto é, determina pelo menos em parte qual proteína Rep interage fun- cionalmente com a ITR. Em outras modalidades, o elemento estrutural interage fisicamente com uma proteína Rep grande quando a proteína Rep está ligada à ITR. Cada elemento estrutural pode ser, por exem- plo, uma estrutura secundária da ITR, uma sequência nucleotídica da ITR, um espaçamento entre dois ou mais elementos ou uma combina- ção de qualquer uma das alternativas acima. Em uma modalidade, os elementos estruturais são selecionados a partir do grupo que consiste em um braço A e A’, um braço B e um B’, um braço C e C’, um braço D, um sítio de ligação a Rep (RBE) e um RBE’ (isto é, sequência RBE complementar) e um reprodutor de resolução terminal (trs).
[00132] Mais especificamente, a capacidade de um elemento estru- tural interagir funcionalmente com uma determinada proteína Rep grande pode ser alterada modificando o elemento estrutural. Por exemplo, a sequência nucleotídica do elemento estrutural pode ser modificada em comparação com a sequência do tipo selvagem da ITR. Em uma modalidade, o elemento estrutural (por exemplo, braço A, braço A’, braço B, braço B’, braço C, braço C’, braço D, RBE, RBE’ e trs) de uma ITR pode ser removido e substituído por um elemento es- trutural do tipo selvagem de um parvovírus diferente. Por exemplo, a estrutura de substituição pode ser de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, parvovírus de cobra (por exemplo, parvovírus de píton real), parvovírus bovino, parvovírus de cabra , parvovírus aviário, parvovírus canino,
parvovírus equino, parvovírus de camarão, parvovírus suíno ou AAV de inseto. Por exemplo, a ITR pode ser uma ITR de AAV2 e o braço A ou A’ ou RBE pode ser substituído por um elemento estrutural do AAV5. Em outro exemplo, a ITR pode ser uma ITR de AAV5 e os bra- ços C ou C’, o RBE e os trs podem ser substituídos por um elemento estrutural do AAV2. Em outro exemplo, a ITR de AAV pode ser uma ITR de AAV5 com os braços B e B’ substituídos pelos braços B e B’ de ITR de AAV2.
[00133] Apenas a título de exemplo, a Tabela 1 indica modificações exemplares de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma exclu- são, inserção e/ou substituição) em regiões de ITRs modificadas, em que X é indicativo de uma modificação de pelo menos um ácido nu- cleico (por exemplo, uma exclusão, inserção e/ou substituição) nessa seção em relação ao correspondente ITR de tipo selvagem. Em algu- mas modalidades, qualquer modificação de pelo menos um nucleotí- deo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) em qual- quer uma das regiões de C e/ou C 'e/ou B e/ou B’ retém três nucleotí- deos T sequenciais (ou seja, TTT) em pelo menos um loop de termi- nal. Por exemplo, se a modificação resultar em: um ITR de braço único (por exemplo, um braço C-C ‘único ou um único braço B-B’) ou um braço C-B ‘modificado ou um braço C’-B, ou um ITR de dois braços com pelo menos um braço truncado (por exemplo, um braço C-C ‘trun- cado e/ou braço B-B’ truncado), pelo menos o braço único ou pelo menos um dos braços de um ITR de dois braços (onde um braço pode ser truncado) retém três nucleotídeos T sequenciais (ou seja, TTT) em pelo menos uma alça terminal. Em algumas modalidades, um braço C- C’ truncado e/ou um braço B-B’ truncado tem três nucleotídeos T se- quenciais (isto é, TTT) na alça terminal.
[00134] Tabela 1: Combinações exemplificadores de modificações de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) em diferentes regiões B-B’ e C-C’ ou braços de ITRs (X indica uma modificação de nucleotídeo, por exemplo, adição, dele- ção ou substituição de pelo menos um nucleotídeo na região). Região B Região B’ Região C Região C’
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
[00135] Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode incluir qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 1, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo em qualquer uma ou mais das regiões se- lecionadas a partir de: entre A’ e C, entre C e C’, entre C’ e B, entre B e B’ e entre B’ e A. Em algumas modalidades, qualquer modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) nas regiões C ou C’ ou B ou B’, ainda preserva o terminal de circuito da haste-ansa. Em algumas modalidades, qualquer modifi- cação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, in- serção e/ou substituição) entre C e C’ e/ou B e B’ retém três nucleotí- deos T sequenciais (ou seja, TTT) em pelo menos um terminal ciclo.
Em modalidades alternativas, qualquer modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) entre C e C’ e/ou B e B’ retém três nucleotídeos A sequenciais (ou se- ja, AAA) em pelo menos uma alça terminal. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode incluir qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 1, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) em qualquer um ou mais das regiões selecionadas a partir de: A’, A e/ou D. por exemplo, em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode incluir qualquer uma das combinações de modifica- ções mostradas na Tabela 1, e também uma modificação de pelo me- nos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substi- tuição) em uma região. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode incluir qualquer uma das com- binações de modificações mostradas na Tabela 1, e também uma mo- dificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) na região A’. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode incluir qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 1, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) em A e/ou A’. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente do- cumento pode incluir qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 1, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) da região D.
[00136] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos do ele- mento estrutural pode ser modificada (por exemplo, por modificação de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos ou qualquer faixa no meio) para produzir um elemento estrutural modificado. Em uma modalidade, as modificações específicas para as ITRs são exemplificadas no presente documento (por exemplo, SEQ ID NO: 2, 52, 63, 64, 101-499, ou 545-547). Em algumas modalidades, uma ITR pode ser modificada (por exemplo, por modificação de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos ou qualquer faixa no meio). Em ou- tras modalidades, a ITR pode ter pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de identidade de se- quência com uma das ITRs modificadas de SEQ ID NO: 469-499 ou 545-547, ou a seção contendo RBE do braço A-A’ e dos braços C-C’ e B-B’ de SEQ ID NO: 101-134 ou 545-547.
[00137] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode por exemplo, compreender a remoção ou deleção de todo um braço parti- cular, por exemplo, todo ou parte do braço A-A’, ou todo ou parte do braço B B-’ ou todo ou parte do braço C-C’, ou, alternativamente, a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases que formam a haste da alça desde que a alça final que tampa a haste (por exem- plo, braço único) ainda esteja presente (por exemplo, consulte ITR-6). Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de base de o B-B’ braço. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compre- ender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de base a partir do braço C-C’. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de base a partir do braço C-C’ e a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de base do braço B-B’. Qualquer combinação de remo- ção do par de bases está prevista, por exemplo, 6 pares de base po- dem ser removidos do braço C-C’ e 2 pares de base do braço B-B’.
Como um exemplo ilustrativo, as Figuras 13A-13B mostram uma ITR modificada exemplificadora com pelo menos 7 pares de base excluí- dos de cada porção C e porção C’, uma substituição de um nucleotí- deo na alça entre a região C e C’, e pelo menos uma deleção de par de bases de cada uma das regiões B-B’ de modo que a ITR modifica- da compreenda dois braços, em que pelo menos um braço (por exem- plo, C-C’) é truncado. Observar, no presente exemplo, como a ITR modificada compreende pelo menos uma deleção de par de bases de cada um dentre a região B e regiões B’, em que o braço B-B’ é tam- bém truncado em relação à ITR WT.
[00138] Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases complementares são removidos de cada uma dentre a porção C e a porção C’ da alça C-C’ de modo que o braço C-C’ seja truncado. Isto é, se uma base é removida na porção C de um braço C- C’, o par de bases complementar na porção C’ é removido, desse mo- do, truncando o braço C-C’. Em tais modalidades, 2, 4, 6, 8 ou mais pares de bases são removidos do braço C-C’ de modo que o braço C- C’ seja truncado. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da porção C de um braço C-C’ de modo que unicamente a porção C’ dos braços permaneça. Em mo- dalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da porção C’ de um braço C-C’ de modo que unica- mente a porção C dos braços permaneça.
[00139] Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases complementares são removidos de cada uma dentre a porção B e a porção B’ do braço B-B’ de modo que o braço do BB está truncado. Isso é, se uma base de for removido em a B porção de o B- B’ braço, o complementar par de bases em a B’ porção é removido, desse modo, truncando o B-B’ braço. Em tais modalidades, 2, 4, 6, 8 ou mais pares de bases são removidos a partir do B-B’ armar de modo que o B-B’ braço está truncado. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da porção B do braço B-B’ de modo que a única porção B’ dos braços permaneça. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de ba- ses são removidos da porção B’ do braço B-B’ de modo que a única porção B dos braços permaneça.
[00140] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode ter entre 1 e 50 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50) de- leções de nucleotídeos em relação a uma sequência ITR do tipo sel- vagem de comprimento total. Em algumas modalidades, uma ITR mo- dificada pode ter entre 1 e 30 deleções de nucleotídeos em relação a uma sequência de ITR WT de comprimento total. Em algumas modali- dades, uma ITR modificada tem entre 2 e 20 deleções de nucleotídeos em relação a uma sequência de ITR do tipo selvagem de comprimento total.
[00141] Em algumas modalidades, uma ITR modificada forma duas haste-alças opostas, de comprimento assimétrico, por exemplo, alça C-C’ tem um comprimento diferente para a alça B-B’. Em algumas mo- dalidades, uma das hastes-alça opostas longitudinalmente-assimé- tricas de uma ITR modificada tem uma porção de haste C-C’ e/ou B-B’ na faixa de 8 a 10 pares de bases de comprimento e uma porção de alça (por exemplo, entre C-C’ ou entre B-B’) com 2 a 5 desoxirribonu- cleotídeos não emparelhados. Em algumas modalidades, uma haste- alça de comprimento assimétrico de uma ITR modificada tem uma porção da haste C-C’ e/ou B-B’ menor que 8, ou menor que 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 de pares de base de comprimento e uma porção de alça (por exemplo, entre C-C’ ou entre B-B’) tendo entre 0 a 5 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma ITR modificada com uma estrutura haste-
alça de comprimento assimétrico tem uma porção de haste C-C’ e/ou B-B’ menor que 3 pares de bases de comprimento.
[00142] Em algumas modalidades, uma ITR modificada não contém quaisquer deleções de nucleotídeos na porção contendo RBE das re- giões A ou A’, de modo a não interferir na replicação de DNA (por exemplo, ligação a um RBE por proteína Rep, ou nicking em um sítio de resolução de terminal). Em algumas modalidades, uma ITR modifi- cada abrangida para uso no presente documento tem uma ou mais deleções nas regiões B, B’, C e/ou C, conforme descrito no presente documento. Vários exemplos não limitativos de ITRS modificado são mostrados nas Figuras 9A-26B.
[00143] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode com- preender uma deleção de o B-B’ do braço, de modo que o braço C-C’ permaneça, por exemplo, consulte o exemplo de ITR-2 (esquerda) e ITR-2 (para a direita) mostrado nas Figuras 9A-9B e ITR-4 (esquerda) e ITR-4 (direita) (Figuras, 11A-11B). Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender uma deleção de do braço C-C’ de modo que o B-B’ de braço permaneça, por exemplo, consulte o exem- plo de ITR-3 (esquerda) e ITR-3 (direita) mostrado na Figura 10A-10B. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender uma deleção do braço B-B’ e do braço C-C’ de modo que uma única haste-laço permaneça, por exemplo, consulte o exemplo de ITR-6 (es- querda) e ITR-6 (direita) mostrado na Figura 14A-14B e ITR-21 e ITR-
37. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender uma deleção da região C’ de modo que uma alça C truncada e braço B-B’ permaneça, por exemplo, consulte o exemplo de ITR-1 (esquer- da) e ITR-1 (direita) mostrado na Figura 15A-15B. Do mesmo modo, em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender uma deleção da região C de modo que uma alça C’ truncada e braço B-B’ permaneça, por exemplo, consulte o exemplo de ITR-5 (esquer-
da) e ITR-5 (direita) mostrado na Figura 16A-16B.
[00144] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode com- preender uma deleção de pares de base, em qualquer um ou mais dentre: porção C, a porção C’, a porção B ou a porção B’, de modo que emparelhamento de base complementar ocorra entre as porções C-B’ e as porções C’-B para produzir um único braço, por exemplo, consulte ITR-10 (direita) e ITR-10 (esquerda) (Figura 12A-12B).
[00145] Em algumas modalidades, além de uma modificação em um ou mais nucleotídeos nas regiões C, C’, B e/ou B’, uma ITR modifi- cada para uso no presente documento pode compreender uma modifi- cação (por exemplo, deleção, substituição ou adição) de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 nucleotídeos em qualquer um ou mais das regiões seleci- onadas dentre: entre A’ e C, entre C e C’, entre C’ e B, entre B e B’ e entre B’ e A. Por exemplo, o nucleotídeo entre B’ e C em uma ITR di- reita modificada pode ser substituído de um nA para um G, C ou A ou excluído ou um ou mais nucleotídeos adicionados; um nucleotídeo en- tre C’ e B em uma ITR esquerda modificada pode ser alterado de um T para um G, C ou A ou excluído ou um ou mais nucleotídeos adiciona- dos.
[00146] Em certas modalidades da presente invenção, o vetor de ceDNA que não tem uma ITR modificada consiste na sequência de nucleotídeos selecionada de qualquer uma de: SEQ ID NO: 550-557. Em certas modalidades da presente invenção, o vetor de ceDNA que não tem uma ITR modificada compreende a sequência de nucleotí- deos selecionada de uma qualquer de: SEQ ID NO: 550-557.
[00147] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um comutador regulador como descrito no presente documento e uma ITR modificada selecionada que tem a sequência de nucleotídeos se- lecionada de qualquer uma do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 550-557.
[00148] Em uma outra modalidade, a estrutura do elemento estrutu- ral pode ser modificada. Por exemplo, o elemento estrutural altera a altura da haste e/ou o número de nucleotídeos na alça. Por exemplo, a altura da haste pode ser de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 nucleotí- deos ou mais ou qualquer faixa nisso. Em uma modalidade, a altura do caule pode ser de cerca de 5 nucleotídeos a cerca de 9 nucleotídeos e interage funcionalmente com Rep. Em outra modalidade, a altura da haste pode ser de cerca de 7 nucleotídeos e interage funcionalmente com Rep. Em outro exemplo, a alça pode ter 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa nisso.
[00149] Em outra modalidade, o número de sítios de ligação a GAGY ou sítios de ligação relacionados a GAGY no RBE ou no RBE estendido pode ser aumentado ou diminuído. Em um exemplo, o RBE ou RBE estendido pode compreender 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais sítios de ligação a GAGY ou qualquer intervalo nele. Cada sítio de ligação a GAGY pode ser independentemente uma sequência exata de GAGY ou uma sequência semelhante ao GAGY, desde que a sequência seja suficiente para ligar uma proteína Rep.
[00150] Em outra modalidade, o espaçamento entre dois elementos (como, sem limitação, o RBE e um grampo de cabelo) pode ser altera- do (por exemplo, aumentado ou diminuído) para alterar a interação funcional com uma grande proteína Rep. Por exemplo, o espaçamento pode ser de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa nisso.
[00151] O vetor de ceDNA aqui descrito pode incluir uma estrutura ITR que é modificada em relação à estrutura ITR AAV2 de tipo selva- gem revelada aqui, mas ainda mantém uma porção operacional de RBE, trs e RBE. As Figuras 2A e 2B mostram um mecanismo possível para a operação de um sítio de trs dentro de uma porção da estrutura ITR do tipo selvagem de um vetor de ceDNA. Em algumas modalida-
des, o vetor de ceDNA contém uma ou mais sequências polinucleotídi- cas de ITR funcionais que compreendem um sítio de ligação Rep (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3’(SEQ ID NO: 531) para AAV2) e um sítio de resolução de terminal (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 46)). Em algumas modalidades, pelo menos uma ITR (ITR WT ou modifica- da) é funcional. Em modalidades alternativas, em que um vetor de ce- DNA compreende duas ITRs modificadas que são diferentes ou assi- métricas entre si, pelo menos uma ITR modificada é funcional e pelo menos uma ITR modificada não é funcional.
[00152] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA que não tem uma ITR modificada selecionada de qualquer sequência que consiste em, ou que consiste essencialmente em: SEQ ID NO: 500-529, como fornecido no presente documento. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA que não tem uma ITR é selecionado de qualquer sequência selecionada de SEQ ID NO: 500-529.
[00153] Em algumas modalidades, a ITR modificada (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) do vetor de ceDNA aqui descrito tem modi- ficações no braço de alça, no braço truncado ou no espaçador. Se- quências exemplares de ITRs com modificações no braço da alça, no braço truncado ou no espaçador estão listadas na Tabela 2.
[00154] Em algumas modalidades, a ITR modificada (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) do vetor de ceDNA aqui descrito tem modi- ficações dentro do braço de alça e do braço truncado. Sequências exemplificativas de ITRs com modificações no braço da alça e no bra- ço truncado estão listadas na Tabela 3.
[00155] Em algumas modalidades, a ITR modificada (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) do vetor de ceDNA aqui descrito tem modi- ficações dentro do braço da alça e do espaçador. Sequências exempli- ficativas de ITRs com modificações no braço da alça e no espaçador estão listadas na Tabela 4.
[00156] Em algumas modalidades, a ITR modificada (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) do vetor de ceDNA aqui descrito tem modi- ficações no braço truncado e no espaçador. Sequências exemplares de ITRs com modificações no braço truncado e no espaçador estão listadas na Tabela 5.
[00157] Em algumas modalidades, a ITR modificada (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) do vetor de ceDNA aqui descrito tem modi- ficações no braço de alça, no braço truncado e no espaçador. Se- quências exemplificativas de ITRs com modificações no braço do laço, no braço truncado e no espaçador estão listadas na Tabela 6.
[00158] Em algumas modalidades, a ITR (por exemplo, a ITR es- querda ou direita) é modificada de modo que compreenda a menor energia de desdobramento ("estrutura de baixa energia"). Uma baixa energia terá energia livre de Gibbs reduzida em relação a uma ITR do tipo selvagem. Sequências exemplificadoras de ITRs que são modifi- cadas para energia baixa (isto é, reduzida) de desdobramento são apresentadas aqui nas Tabelas 7 a 9.
[00159] Em algumas modalidades, a ITR modificada é selecionada de qualquer uma ou uma combinação daquelas mostradas nas Tabe- las 2-9, 10A ou 10B.
[00160] Tabela 2: Sequências de ITR com modificações no braço de alça, braço truncado ou espaçador. Isso inclui a sequência RBS GCGCGCTCGCTCGCTC (SEQ ID NO: 531) na extremidade 5’ e a sequência RBE complementar GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 536) na extremidade mais a 3’. Tabela 2 SEQ Região modifi- Sequência ΔG Nº Es- ID cada trutura 135 Braço truncado GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGT -73,6 1
CGCCCGAAGCCCGGGCTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGC
GC 136 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGT -73,7 3
CGCCCGACACCCGGGTGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCG
CGC 137 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGG -74,2 1
TCGCCCGACGACCGGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGC GCGC
138 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -75,7 2 CAAAGGTCGCCCGACGCACGTGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 139 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -75,2 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCATGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 140 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAGACCGGTCTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 141 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -74,2 1 CAAAGGTCGCCCGACACACGTGTGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 142 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,3 2 CAAAGGTCGCCCGACGACATGTCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 143 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -74,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAGCACGTGCTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 144 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAACCCGGGTTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 145 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,6 1 CAAAGGTCGCCCGAAGCCATGGCTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 146 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,0 1 CAAAGGTCGCCCGACAACCGGTTGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 147 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,7 1 CAAAGGTCGCCCGACACCATGGTGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 148 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,7 1 CAAAGGTCGCCCGACGAACGTTCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 149 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -75,7 1 CAAAGGTCGCCCGACGCAATTGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 150 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAAACCGGTTTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 151 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAGAACGTTCTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 152 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -74,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAGCAATTGCTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 153 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,0 1 CAAAGGTCGCCCGACAAACGTTTGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 154 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,7 2 CAAAGGTCGCCCGACGAAATTTCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 155 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -74,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAGCAATTGCTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 156 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAACCATGGTTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 157 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,0 1 CAAAGGTCGCCCGACAACATGTTGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 158 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 2 CAAAGGTCGCCCGAAGACATGTCTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 159 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -74,2 1 CAAAGGTCGCCCGACACAATTGTGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 160 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAAAACGTTTTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 161 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 2 CAAAGGTCGCCCGAAAACATGTTTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 162 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAACAATTGTTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 163 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAGAAATTTCTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 164 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -73,0 1 CAAAGGTCGCCCGACAAAATTTTGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 165 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAAAAAATTTTTGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 166 Espaçador GCGCGCTCGCTCGCTCGCTGAGGCCGGGCGAC- -76,7 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCAGCGAGCGAGCGAGCGCGC 167 GCGCGCTCGCTCGCTCAATGAGGCCGGGCGAC- -72,9 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCATT-
GAGCGAGCGAGCGCGC 168 GCGCGCTCGCTCGCTCACCGAGGCCGGGCGAC- -76,7 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCGGTGAGCGAGCGAGCGCGC 169 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGAC- -72,9 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 170 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGGGGCCGGGCGAC- -77,3 2 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCCCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 171 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAAGCCGGGCGAC- -72,8 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCTTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 172 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGACCGGGCGAC- -73,1 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGTCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 173 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGAGGCCGGGCGAC- -74,7 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 174 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGAGGCCGGGCGAC- -78,2 2 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 175 GCGCGCTCGCTCGCTCGCTAAGGCCGGGCGAC- -72,5 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 176 GCGCGCTCGCTCGCTCGCTGGGGCCGGGCGAC- -78,8 2 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCCCAGCGAGCGAGCGAGCGCGC 177 GCGCGCTCGCTCGCTCGCTGAAGCCGGGCGAC- -74,3 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCTTCAGCGAGCGAGCGAGCGCGC 178 GCGCGCTCGCTCGCTCGCTGAGACCGGGCGAC- -74,6 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGTCTCAGCGAGCGAGCGAGCGCGC 179 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGGAGGCCGGGCGAC- -76,9 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 180 GCGCGCTCGCTCGCTCGATAAGGCCGGGCGAC- -72,4 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTTATCGAGCGAGCGAGCGCGC 181 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGAC- -73,8 2 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 182 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGAAGCCGGGCGAC- -72,3 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCTTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 183 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGAGACCGGGCGAC- -72,6 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGTCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 184 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAAGGCCGGGCGAC- -74,5 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 185 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGGGGGCCGGGCGAC- -79 2 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCCCCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 186 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGGAAGCCGGGCGAC- -74,5 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCTTCCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 189 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGGAGACCGGGCGAC- -74,8 1
CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGTCTCCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 187 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGGGGGCCGGGCGAC- -79 2 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCCCCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 188 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGGAAGCCGGGCGAC- -74,5 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCTTCCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 189 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGGAGACCGGGCGAC- -74,8 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGTCTCCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 190 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGGGCCGGGCGAC- -76,9 2 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 200 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAAAGCCGGGCGAC- -72,1 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCTTTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 201 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAAGACCGGGCGAC- -69,1 2 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 202 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAGCCGGGCGAC- -74,8 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 203 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGGACCGGGCGAC- -74,8 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGTCCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 204 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCGAC- -72,4 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 205 GCGCGCTCGCTCGCTCAAGAGAACCGGGCGAC- -70,6 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGTTCTCTT-
GAGCGAGCGAGCGCGC 206 GCGCGCTCGCTCGCTCACGAGAACCGGGCGAC- -72,2 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGTTCTCGTGAGCGAGCGAGCGCGC 207 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAGAACCGGGCGAC- -70,8 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGTTCTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 208 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGGAACCGGGCGAC- -72,8 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGTTCCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 209 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAAACCGGGCGAC- -70,4 1 CAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGTTTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 210 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGAC- -80,3 2 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 211 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCGAC- -65,8 1 CAAAGGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 212 Braço de Alça GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAGGCGAC- -73,7 1 CAAAGGTCGCCTGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 213 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAGCGAC- -73,1 1 CAAAGGTCGCTCGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 214 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGACGAC- -73,1 2 CAAAGGTCGTCCGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 215 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGAGAC- -73,9 1 CAAAGGTCTCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 216 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAC- -73,4 1 CAAAGGTTGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 217 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -77,3 2 TGAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 218 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -72,8 2 TGAGGCCGGGCGAACAAAGTTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 219 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -73,5 1 TGAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC
220 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAGCGAC- -71,3 1 CAAAGGTCGCTTGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 221 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAACGAC- -68,9 1 CAAAGGTCGTTTGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 222 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAGAC- -67,3 2 CAAAGGTCTTTTGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 223 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAAAC- -64,6 2 CAAAGGTTTTTTGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 224 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAA- -67 2 GCCAAAGGCTTTTTGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 225 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAAGA- -64,9 1 CAAAGTCTTTTTGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 226 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAA- -63,1 1 GAAAAATTCTTTTTGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 227 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -60,4 1 TGAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC-
GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 228 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -62,2 1 TGAGGCCGAAAAAAAAAATTTTTTTCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 229 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGAAA- -67,3 1 GAAAAATTCTTTCCGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 230 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGAA- -69,7 2 GAAAAATTCTTCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 231 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG- -71,9 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 232 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCG- -73,4 2 GAAAAATTCCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 233 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -71,0 2 TGAGGCCGGGCGAAAAAATTTCGCCCGAC-
GCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC
[00161] A Tabela 3: Sequências de ITR modificadas com modifica- ções em Braço de Alça e Braço Truncado Tabela 3 SEQ Nº Es- Região modificada Sequência ΔG ID trutura 234 Braço de Alça & GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAGGCGAC- -72,2 Braço Truncado CAAAGGTCGCCTGACACCCGGGTGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 2 235 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAGGCGAC- -73,7 CAAAGGTCGCCTGACGCCATGGCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 236 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAGGCGAC- -71,8 CAAAGGTCGCCTGACGACATGTCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 237 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAGGCGAC- -72,2 CAAAGGTCGCCTGACGAACGTTCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 238 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAGGCGAC- -72,6 CAAAGGTCGCCTGAAGCAATTGCTGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 239 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -75,8
TGAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGACACCCGGG TGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 2 240 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -77,3 TGAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAC- 1
GCCATGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 241 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -75,4 TGAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAC- GACATGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 1 242 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -75,8 TGAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGACGAAC- GTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 1 243 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -76,2 TGAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAAGCAATT- GCTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 1 244 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -72
TGAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGACACCCGGG TGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 1 245 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -73,5 TGAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC- GCCATGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 1 246 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -71,6 TGAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC- GACATGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 2 247 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -72 TGAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGACGAAC- GTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 2 248 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -72,4 TGAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGAAGCAATT- GCTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 1 249 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAGAC- -65,8 CAAAGGTCTTTTGACACCCGGGTGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 3 250 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAGAC- -67,3 CAAAGGTCTTTTGACGCCATGGCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 2 251 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAGAC- -65,4 CAAAGGTCTTTTGACGACATGTCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 2 252 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAGAC- -65,8 CAAAGGTCTTTTGACGAACGTTCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 2 253 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCAAAAGAC- -66,2 CAAAGGTCTTTTGAAGCAATTGCTGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 254 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -59,6 TGAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTT- GACACCCGGGTGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 2 255 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -60,4 TGAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC- GCCATGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 1 256 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -59,8 TGAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC- GACATGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 1 257 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -58,9 TGAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGACGAAC- GTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 2 258 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -59,3 TGAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAAGCAATT- GCTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 2 259 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG- -70,4 CAGAAAAATTCTGCCCGACACCCGGGTGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 260 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG- -71,9 CAGAAAAATTCTGCCCGACGCCATGGCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 261 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG- -70 CAGAAAAATTCTGCCCGACGACATGTCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 262 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG- -70,4 CAGAAAAATTCTGCCCGACGAACGTTCGGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1 263 GCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG- -70,8 CAGAAAAATTCTGCCCGAAGCAATTGCTGCCTCAG- TGAGCGAGCGAGCGCGC 1
[00162] Tabela 4: Sequências de ITR com modificações no Braço de Alça e Espaçador Tabela 4 SEQ Região Modi- Sequência ΔG Nº Es- ID ficada trutura 264 Braço de Alça GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAGGCGACCAAAGGTCGCCTG -71,4 1 & Espaçador ACGCCCGGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 265 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCC -75 2
CGACGCCCGGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 266 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGACAAAATGTCG -71,2 1
CCCGACGCCCGGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 267 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAAAAGACCAAAGGTCTTTT- -65 2
GACGCCCGGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 268 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTT- -58,1 1
GACGCCCGGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 269 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCAGAAAAATTCTG -69,6 1
CCCGACGCCCGGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 270 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAGGCGACCAAAGGTCGCCTG -72,3 2
ACGCCCGGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 271 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCG -75,9 3
ACGCCCGGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 272 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCG -72,1 2
ACGCCCGGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 273 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAGACCAAAGGTCTTTT- -65,9 3
GACGCCCGGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 274 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTT- -59 2
GACGCCCGGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 275 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCAGAAAAATTCTG -70,5 2
CCCGACGCCCGGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 276 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAGGCGACCAAAGGTCGCCT -70,9 1
GACGCCCGGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 277 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCGGCCAAAGGCCGCC -74,5 1
CGACGCCCGGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 278 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCGACAAAATGTCG -70,7 1
CCCGACGCCCGGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 279 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAAAAGACCAAAGGTCTTTT- -64,5 2
GACGCCCGGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 280 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAAAAAAAAAAATTTTTTTT- -57,6 1
GACGCCCGGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 281 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCAGAAAAATTCTGCCC -69,1 1
GACGCCCGGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 282 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAGGCGACCAAAGGTCGC -78,8 2
CTGACGCCCGGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 283 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCG -82,4 3
ACGCCCGGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 284 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCG -78,6 2
ACGCCCGGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 285 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAGACCAAAGGTCTTTT- -72,4 3
GACGCCCGGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 286 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTT- -65,5 1
GACGCCCGGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 287 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCAGAAAAATTC -77 2
TGCCCGACGCCCGGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 288 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAGGCGACCAAAGGTCGCC -64,3 1
TGACGCCCGGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 289 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCGGCCAAAGGCC -67,9 1
GCCCGACGCCCGGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 290 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCGACAAAATGTC -64,1 1
GCCCGACGCCCGGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 291 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAAAAGACCAAAGGTCTTTT- -57,9 2
GACGCCCGGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 292 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAAAAAAAAAAATTTTTTTT- -51 1
GACGCCCGGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 293 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCAGAAAAATTCTGCC -62,5 1
CGACGCCCGGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC
[00163] Tabela 5: Sequências de ITR com modificações no Braço Truncado e Espaçador Tabela 5
SEQ ID Região Modificada Sequência ΔG Nº Es- trutura 294 Braço Truncado & GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGACCAAAG -71,4 1 espaçador GTCGCCCGACACCCGGGTGGCCTTAGTGAGCGAGC
GAGCGCGC 295 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGACCAAA -72,9 1
GGTCGCCCGACGCCATGGCGGCCTTAGTGAGCGAG
CGAGCGCGC 296 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGAC- -71 1 CAAAGGTCGCCCGACGACATGTCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 297 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGAC- -71,4 1 CAAAGGTCGCCCGACGAACGTTCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 298 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGAC- -71,8 1 CAAAGGTCGCCCGAAGCAATTGCTGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 299 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGAC- -72,3 2
CAAAGGTCGCCCGACACCCGGGTGGCCTCATCGAGCG
AGCGAGCGCGC 300 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACCAAA -73,8 1
GGTCGCCCGACGCCATGGCGGCCTCATCGAGCGA
GCGAGCGCGC 301 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACCAAA -71,9 1
GGTCGCCCGACGACATGTCGGCCTCATCG
AGCGAGCGAGCGCGC 302 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACCAAA -72,3 1
GGTCGCCCGACGAACGTTCGGCCTCATCGAGCGA
GCGAGCGCGC 303 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACCAAAG -72,7 1
GTCGCCCGAAGCAATTGCTGCCTCATCGAGCG
AGCGAGCGCGC 304 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCGACCAAA -70,9 1
GGTCGCCCGACACCCGGGTGGTTCTCTCGAGCGAGCG
AGCGCGC 305 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCGACCAAAG -72,4 1
GTCGCCCGACGCCATGGCGGTTCTCTCGAGCGAG
CGAGCGCGC 306 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCGACCAAAG -70,5 1 GTCGCCCGAC-
GACATGTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 307 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCGACCAAAG -70,9 1
GTCGCCCGACGAACGTTCGGTTCTCTCGAGCGAGC
GAGCGCGC 308 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGGCGACCAAAG -71,3 1
GTCGCCCGAAGCAATTGCTGTTCTCTCGAGCGAGC
GAGCGCGC 309 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACCAAAG -78,8 1
GTCGCCCGACACCCGGGTGGCCCCCGCGAGCGAGCGA
GCGCGC 310 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACCAAAG -80,3 1
GTCGCCCGACGCCATGGCGGCCCCCGCGAGCGA
GCGAGCGCGC 311 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACCAAAG -78,4 1
GTCGCCCGACGACATGTCGGCCCCCGCGAGCGAGCG
AGCGCGC 312 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACCAAAG -78,8 1
GTCGCCCGACGAACGTTCGGCCCCCGCGAGCGAGCG
AGCGCGC 313 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACCAAAG -79,2 1
GTCGCCCGAAGCAATTGCTGCCCCCGCGAGCGAGCGA
GCGCGC 314 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCGACCAAAG -64,3 1
GTCGCCCGACACCCGGGTGGTTTTATTGAGCGAGCGA
GCGCGC 315 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCGACCAAAG -65,8 1
GTCGCCCGACGCCATGGCGGTTTTATTGAGCGA
GCGAGCGCGC 316 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCGACCAAAG -63,9 1
GTCGCCCGACGACATGTCGGTTTTATTGAGCGAGC
GAGCGCGC 317 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCGACCAAAG -64,3 1
GTCGCCCGACGAACGTTCGGTTTTATTGAGCGAGCGA GCGCGC
318 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGGCGACCAAAG -64,7 1
GTCGCCCGAAGCAATTGCTGTTTTATTGAGCGAGC GAGCGCGC
[00164] Tabela 6: Sequências ITR com modificações no braço de alça, braço truncado e espaçador Tabela 6 SEQ Região Modificada Sequência ΔG Nº Es- ID trutura 319 Braço de Alça, GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAGGCGACCAAAG -69,9 2 Braço Truncado & GTCGCCTGACACCCGGGTGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGC espaçador GCGC 320 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAGGCGACCAAAG -71,4 1
GTCGCCTGACGCCATGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAG
CGCGC 321 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAGGCGACCAAAG -69,5 1
GTCGCCTGACGACATGTCGGCCTTAGTGAGCGAG
CGAGCGCGC 322 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAGGCGACCAAAG -69,9 1
GTCGCCTGACGAACGTTCGGCCTTAGTGAGCGAGCGA
GCGCGC 323 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAGGCGACCAAAG -70,3 1
GTCGCCTGAAGCAATTGCTGCCTTAGTGAGCGAGCGA
GCGCGC 324 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGGCCAAAG -73,5 2
GCCGCCCGACACCCGGGTGGCCTTAGTGAGCGAGC
GAGCGCGC 325 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGGCCAAA -75 1
GGCCGCCCGACGCCATGGCGGCCTTAGTGAGCGAG
CGAGCGCGC 326 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGGCGGC -73,1 1 CAAAGGCCGCCCGACGACATGTCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 327 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -73,5 1 TAAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGACGAAC-
GTTCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 328 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -73,9 1 TAAGGCCGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAAGCAATT-
GCTGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 329 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -69,7 1
TAAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGACACCCGGGTGG
CCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 330 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -71,2 1 TAAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC-
GCCATGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 331 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -69,3 2 TAAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC-
GACATGTCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 332 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -69,7 2 TAAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGACGAAC-
GTTCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 333 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -70,1 1 TAAGGCCGGGCGACAAAATGTCGCCCGAAGCAATT-
GCTGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 334 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAAAAGAC- -63,5 2 CAAAGGTCTTTTGACACCCGGGTGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 335 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAAAAGAC- -65 2 CAAAGGTCTTTTGACGCCATGGCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 336 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAAAAGAC- -63,1 2 CAAAGGTCTTTTGACGACATGTCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 337 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAAAAGAC- -63,5 2 CAAAGGTCTTTTGACGAACGTTCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 338 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCAAAAGAC- -63,9 1 CAAAGGTCTTTTGAAGCAATTGCTGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 339 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -57,3 2
TAAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTT-
GACACCCGGGTGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 340 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -58,1 1 TAAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC-
GCCATGGCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 341 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -57,5 1 TAAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC-
GACATGTCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 342 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -56,6 2 TAAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGACGAAC-
GTTCGGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 343 GCGCGCTCGCTCGCTCAC- -57 2 TAAGGCCAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAAGCAATT-
GCTGCCTTAGTGAGCGAGCGAGCGCGC 344 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGG- -68,1 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACACCCGGGTGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 345 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGG- -69,6 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACGCCATGGCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 346 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGG- -67,7 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACGACATGTCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 347 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGG- -68,1 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACGAACGTTCGGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 348 GCGCGCTCGCTCGCTCACTAAGGCCGGG- -68,5 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAAGCAATTGCTGCCTTAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGC 349 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAGGCGAC- -70,8 3
CAAAGGTCGCCTGACACCCGGGTGGCCTCATCGAGCGAG
CGAGCGCGC 350 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAGGCGAC- -72,3 1 CAAAGGTCGCCTGAC-
GCCATGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 351 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAGGCGAC- -70,4 1 CAAAGGTCGCCTGAC-
GACATGTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 352 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAGGCGAC- -70,8 1 CAAAGGTCGCCTGACGAAC-
GTTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 353 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAGGCGAC- -71,2 1 CAAAGGTCGCCTGAAGCAATT-
GCTGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 354 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -74,4 3
CGCCCGACACCCGGGTGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGC
GC 355 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -75,9 1 CGCCCGAC-
GCCATGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 356 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -74 1 CGCCCGAC-
GACATGTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 357 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -74,4 1 CGCCCGACGAAC-
GTTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 358 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -74,8 1 CGCCCGAAGCAATT-
GCTGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 359 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACAAAATGT -70,6 2
CGCCCGACACCCGGGTGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGC
GC 360 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACAAAATGT -72,1 1 CGCCCGAC-
GCCATGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 361 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACAAAATGT -70,2 2 CGCCCGAC-
GACATGTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 362 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACAAAATGT -70,6 2 CGCCCGACGAAC-
GTTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 363 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGGCGACAAAATGT -71 1 CGCCCGAAGCAATT-
GCTGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC
364 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAGAC- -64,4 3 CAAAGGTCTTTT-
GACACCCGGGTGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 365 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAGAC- -65,9 2 CAAAGGTCTTTTGAC-
GCCATGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 366 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAGAC- -64 2 CAAAGGTCTTTTGAC-
GACATGTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 367 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAGAC- -64,4 2 CAAAGGTCTTTTGACGAAC-
GTTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 368 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAGAC- -64,8 1 CAAAGGTCTTTTGAAGCAATT-
GCTGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 369 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -58,2 2* TTTTT-
GACACCCGGGTGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 370 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -59 1 TTTTTGAC-
GCCATGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 371 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -58,4 1 TTTTTGAC-
GACATGTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 372 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -57,5 2 TTTTTGACGAAC-
GTTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 373 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -57,9 2 TTTTTGAAGCAATT-
GCTGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 374 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGG- -69 2
CAGAAAAATTCTGCCCGACACCCGGGTGGCCTCATCGAG
CGAGCGAGCGCGC 375 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGG- -70,5 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAC-
GCCATGGCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 376 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGG- -68,6 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAC-
GACATGTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 377 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGG- -69 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACGAAC-
GTTCGGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 378 GCGCGCTCGCTCGCTCGATGGGGCCGGG- -69,4 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAAGCAATT-
GCTGCCTCATCGAGCGAGCGAGCGCGC 379 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAGGCGAC- -69,4 2
CAAAGGTCGCCTGACACCCGGGTGGTTCTCTCGAGCGAG
CGAGCGCGC 380 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAGGCGAC- -70,9 1 CAAAGGTCGCCTGAC-
GCCATGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 381 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAGGCGAC- -69 1 CAAAGGTCGCCTGAC-
GACATGTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 382 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAGGCGAC- -69,4 1 CAAAGGTCGCCTGACGAAC-
GTTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 383 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAGGCGAC- -69,8 1 CAAAGGTCGCCTGAAGCAATT-
GCTGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 384 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -73 1
CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGACACCCGGGTGGTTCTCT
CGAGCGAGCGAGCGCGC 385 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -74,5 1 CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAC-
GCCATGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 386 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -72,6 1 CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAC-
GACATGTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 387 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -73 1 CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGACGAAC-
GTTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 388 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -73,4 1 CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAAGCAATT-
GCTGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 389 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -69,2 1
CGGGCGACAAAATGTCGCCCGACACCCGGGTGGTTCTCT
CGAGCGAGCGAGCGCGC 390 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -70,7 1 CGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC-
GCCATGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 391 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -69,8 2 CGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC-
GACATGTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 392 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -69,2 2 CGGGCGACAAAATGTCGCCCGACGAAC-
GTTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 393 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -69,6 1 CGGGCGACAAAATGTCGCCCGAAGCAATT-
GCTGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 394 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAAAAGAC- -63 2 CAAAGGTCTTTT-
GACACCCGGGTGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 395 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAAAAGAC- -64,5 2 CAAAGGTCTTTTGAC-
GCCATGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 396 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAAAAGAC- -62,6 2 CAAAGGTCTTTTGAC-
GACATGTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 397 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAAAAGAC- -63 2 CAAAGGTCTTTTGACGAAC-
GTTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 398 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCAAAAGAC- -63,4 1 CAAAGGTCTTTTGAAGCAATT-
GCTGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 399 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -56,8 2 CAAAAAAAAAAATTTTTTTT-
GACACCCGGGTGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 400 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -57,6 1 CAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC-
GCCATGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 401 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -57 1 CAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC-
GACATGTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 402 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -56,1 2 CAAAAAAAAAAATTTTTTTTGACGAAC-
GTTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 403 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAAC- -56,5 2 CAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAAGCAATT-
GCTGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 404 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGG- -67,6 1
CAGAAAAATTCTGCCCGACACCCGGGTGGTTCTCTCGAG
CGAGCGAGCGCGC 405 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGG- -69,1 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAC-
GCCATGGCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 406 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGG- -67,2 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAC-
GACATGTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 407 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGG- -67,6 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACGAAC-
GTTCGGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 408 GCGCGCTCGCTCGCTCGAGAGAACCGGG- -68 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAAGCAATT-
GCTGTTCTCTCGAGCGAGCGAGCGCGC 409 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAGGCGAC- -77,3 2
CAAAGGTCGCCTGACACCCGGGTGGCCCCCGCGAGCGAG
CGAGCGCGC 410 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAGGCGAC- -78,8 1 CAAAGGTCGCCTGAC-
GCCATGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 411 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAGGCGAC- -76,9 1 CAAAGGTCGCCTGAC-
GACATGTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 412 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAGGCGAC- -77,3 1 CAAAGGTCGCCTGACGAAC-
GTTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 413 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAGGCGAC- -77,7 1
CAAAGGTCGCCTGAAGCAATT-
GCTGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 414 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -80,9 2
CGCCCGACACCCGGGTGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGC
GC 415 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -82,4 1 CGCCCGAC-
GCCATGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 416 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -80,5 1 CGCCCGAC-
GACATGTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 417 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -80,9 1 CGCCCGACGAAC-
GTTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 418 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGGCCAAAGGC -81,3 1 CGCCCGAAGCAATT-
GCTGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 419 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACAAAATGT -77,1 1
CGCCCGACACCCGGGTGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGC
GC 420 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACAAAATGT -78,6 1 CGCCCGAC-
GCCATGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 421 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACAAAATGT -76,7 2 CGCCCGAC-
GACATGTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 422 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACAAAATGT -77,1 2 CGCCCGACGAAC-
GTTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 423 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGGCGACAAAATGT -77,5 1 CGCCCGAAGCAATT-
GCTGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 424 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAGAC- -70,9 3 CAAAGGTCTTTT-
GACACCCGGGTGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 425 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAGAC- -72,4 2 CAAAGGTCTTTTGAC-
GCCATGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 426 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAGAC- -70,5 2 CAAAGGTCTTTTGAC-
GACATGTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 427 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAGAC- -70,9 2 CAAAGGTCTTTTGACGAAC-
GTTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 428 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAGAC- -71,3 1 CAAAGGTCTTTTGAAGCAATT-
GCTGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 429 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -64,7 2 TTTTT-
GACACCCGGGTGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 430 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -65,5 1 TTTTTGAC-
GCCATGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 431 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -64,9 1 TTTTTGAC-
GACATGTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 432 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -64 2 TTTTTGACGAAC-
GTTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 433 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCAAAAAAAAAAATTT -64,4 2 TTTTTGAAGCAATT-
GCTGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 434 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGG- -75,5 1
CAGAAAAATTCTGCCCGACACCCGGGTGGCCCCCGCGAG
CGAGCGAGCGCGC 435 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGG- -77 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAC-
GCCATGGCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 436 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGG- -75,1 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAC-
GACATGTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 437 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGG- -75,5 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACGAAC-
GTTCGGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC
438 GCGCGCTCGCTCGCTCGCGGGGGCCGGG- -75,9 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAAGCAATT-
GCTGCCCCCGCGAGCGAGCGAGCGCGC 439 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAGGCGAC- -62,8 2
CAAAGGTCGCCTGACACCCGGGTGGTTTTATTGAGCGAG
CGAGCGCGC 440 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAGGCGAC- -64,3 1 CAAAGGTCGCCTGAC-
GCCATGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 441 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAGGCGAC- -62,4 1 CAAAGGTCGCCTGAC-
GACATGTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 442 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAGGCGAC- -62,8 1 CAAAGGTCGCCTGACGAAC-
GTTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 443 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAGGCGAC- -63,2 1 CAAAGGTCGCCTGAAGCAATT-
GCTGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 444 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -66,4 1
CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGACACCCGGGTGGTTTTAT
TGAGCGAGCGAGCGCGC 445 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -67,9 1 CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAC-
GCCATGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 446 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -66 1 CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAC-
GACATGTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 447 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -66,4 1 CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGACGAAC-
GTTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 448 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -66,8 1 CGGGCGGCCAAAGGCCGCCCGAAGCAATT-
GCTGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 449 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -62,6 1
CGGGCGACAAAATGTCGCCCGACACCCGGGTGGTTTTAT
TGAGCGAGCGAGCGCGC 450 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -64,1 1 CGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC-
GCCATGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 451 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -62,2 2 CGGGCGACAAAATGTCGCCCGAC-
GACATGTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 452 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -62,6 2 CGGGCGACAAAATGTCGCCCGACGAAC-
GTTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 453 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -63 1 CGGGCGACAAAATGTCGCCCGAAGCAATT-
GCTGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 454 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAAAAGAC- -56,4 2 CAAAGGTCTTTT-
GACACCCGGGTGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 455 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAAAAGAC- -57,9 2 CAAAGGTCTTTTGAC-
GCCATGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 456 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAAAAGAC- -56 2 CAAAGGTCTTTTGAC-
GACATGTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 457 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAAAAGAC- -56,4 2 CAAAGGTCTTTTGACGAAC-
GTTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 458 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCAAAAGAC- -56,8 1 CAAAGGTCTTTTGAAGCAATT-
GCTGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 459 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -50,2 2 CAAAAAAAAAAATTTTTTTT-
GACACCCGGGTGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 460 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -51 1 CAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC-
GCCATGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 461 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -50,4 1 CAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAC-
GACATGTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 462 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -49,5 2 CAAAAAAAAAAATTTTTTTTGACGAAC-
GTTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 463 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAAC- -49,9 1 CAAAAAAAAAAATTTTTTTTGAAGCAATT-
GCTGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 464 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGG- -61 1
CAGAAAAATTCTGCCCGACACCCGGGTGGTTTTATTGAG
CGAGCGAGCGCGC 465 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGG- -62,5 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAC-
GCCATGGCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 466 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGG- -60,6 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAC-
GACATGTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 467 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGG- -61 1 CAGAAAAATTCTGCCCGACGAAC-
GTTCGGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC 468 GCGCGCTCGCTCGCTCAATAAAACCGGG- -61,4 1 CAGAAAAATTCTGCCCGAAGCAATT-
GCTGTTTTATTGAGCGAGCGAGCGCGC
[00165] Como descrito no presente documento, a ITR modificada pode ser gerada para incluir deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da ITR do tipo selvagem derivada do genoma de AAV. A ITR modificada pode ser gerada por modificação genética du- rante a propagação em um plasmídeo em Escherichia coli ou como um genoma de baculovírus em células de Spodoptera frugiperda, ou ou- tros métodos biológicos, por exemplo, in vitro, usando reação em ca- deia da polimerase ou síntese química.
[00166] Em algumas modalidades, a ITR modificada inclui deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da ITR do tipo selvagem de AAV2 (esquerda) (SEQ ID NO: 51) ou da ITR do tipo sel- vagem de AAV2 (direita) (SEQ ID NO: 1). Especificamente, um ou mais nucleotídeos são excluídos, inseridos ou substituídos a partir de B-C’ ou C-C’ da estrutura de alça-haste em forma de T. Além disso, a ITR modificada não inclui modificação nos elementos de ligação a Rep (RBE) e no sítio de resolução de terminal (trs) da ITR do tipo selvagem de AAV2, embora a RBE’(TTT) possa estar ou não presente, depen- dendo da se o modelo passou por uma rodada de replicação, conver- tendo, assim, o tripleto AAA em RBE’-TTT complementar.
[00167] Três tipos de ITRs modificadas são exemplificados - (1) uma ITR modificada com uma estrutura de menor energia que com- preende um único braço e uma única alça não emparelhada ("estrutura de braço único/alça única emparelhada"); (2) uma ITR modificada com uma estrutura de energia mais baixa com um grampo de cabelo único ("estrutura de grampo de cabelo único"); e (3) uma ITR modificada com uma estrutura de energia mais baixa com dois braços, um dos quais é truncado ("estrutura truncada").
[00168] ITR modificada com uma estrutura de braço único/alça não emparelhada
[00169] A ITR do tipo selvagem pode ser modificada para formar uma estrutura secundária que compreende um único braço e uma úni- ca alça não emparelhada (ou seja, "estrutura de braço único/alça única emparelhada"). A energia livre de Gibbs (ΔG) do desdobramento da estrutura pode variar entre -85 kcal/mol e -70 kcal/mol. Exemplos de estruturas das ITRs modificadas são fornecidos.
[00170] As ITRs modificadas previstas para formar a estrutura de braço único/alça não emparelhada podem incluir deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da ITR do tipo selvagem nas sequências que formam o braço B e B’ e/ou braço C e C’. A ITR modi- ficada pode ser gerada por modificação genética ou síntese biológica e/ou química.
[00171] Por exemplo, ITR-2, esquerda e direita fornecidas nas Figu- ras 9A-9B (SEQ ID NO: 101 e 102), são geradas para ter deleção de dois nucleotídeos do braço C-C’ e deleção de 16 nucleotídeos do bra- ço B-B’ na ITR do tipo selvagem de AAV2. Três nucleotídeos restantes no braço B-B’ da ITR modificada não fazem um emparelhamento com- plementar. Assim, a ITR-2 esquerda e direita têm a menor estrutura de energia com um único braço C-C’ e uma única alça não emparelhada. Prevê-se que a energia livre de Gibbs no desdobramento da estrutura seja de cerca de -72,6 kcal/mol.
[00172] ITR-3 esquerda e direita fornecidas nas Figuras 10A e 10B (SEQ ID NO: 103 e 104), são geradas para incluir 19 deleções de nu-
cleotídeos no braço C-C’ da ITR do tipo selvagem de AAV2. Três nu- cleotídeos restantes no braço B-B’ da ITR modificada não fazem um emparelhamento complementar. Assim, ITR-3 esquerda e direita têm a menor estrutura de energia com um único braço B-B’ e uma única alça não emparelhada. Prevê-se que a energia livre de Gibbs no desdo- bramento da estrutura seja de cerca de -74,8 kcal/mol.
[00173] ITR-4 esquerda e direita fornecidas nas Figuras 11A e 11B (SEQ ID NO: 105 e 106), são geradas para incluir 19 deleções de nu- cleotídeos no braço B-B’ da ITR do tipo selvagem de AAV2. Três nu- cleotídeos restantes no braço B-B’ da ITR modificada não fazem um emparelhamento complementar. Assim, a ITR-4 esquerda e direita têm a menor estrutura de energia com um único braço C-C’ e uma única alça não emparelhada. Prevê-se que a energia livre de Gibbs no des- dobramento da estrutura seja de cerca de -76,9 kcal/mol.
[00174] ITR-10 esquerda e direita fornecidas nas Figuras 12A e 12B (SEQ ID NO: 107 e 108), são geradas para incluir 8 deleções de nu- cleotídeos no braço B-B’ da ITR do tipo selvagem de AAV2. Os nu- cleotídeos que permanecem nos braços B-B’ e C-C’ fazem novas liga- ções complementares entre os motivos B e C’ (ITR-10 à esquerda) ou entre os motivos C e B’ (ITR-10 à direita). Assim, a ITR-10 esquerda e direita têm a menor estrutura de energia com um único braço B-C’ ou C-B’ e uma única alça não emparelhada. Prevê-se que a energia livre de Gibbs no desdobramento da estrutura seja de cerca de -83,7 kcal/mol.
[00175] ITR-17 esquerda e direita fornecidas nas Figuras 13A e 13B (SEQ ID NO: 109 e 110), são gerados para incluir 14 deleções de nu- cleotídeos no braço C-C’ da ITR do tipo selvagem de AAV2. Oito nu- cleotídeos restantes no braço C-C’ não fazem ligações complementa- res. Como resultado, a ITR-17 esquerda e direita têm a menor estrutu- ra de energia com um único braço B-B’ e uma única alça não empare-
lhada. Prevê-se que a energia livre de Gibbs no desdobramento da estrutura seja de cerca de -73,3 kcal/mol.
[00176] As sequências de ITR do tipo selvagem esquerda ou direita (em cima) e várias ITRs modificadas em esquerda ou direita (em bai- xo) previstas para formar a estrutura de braço único/alça não empare- lhada são alinhadas e fornecidas abaixo na Tabela 7.
[00177] Tabela 7: Alinhamento de ITR WT e ITRs modificadas (ITR- 2, ITR-3, ITR-4, ITR-10 e ITR-17) com uma estrutura de braço úni- co/alça não emparelhada. TABELA 7 Alinhamento de sequência de ITRs do tipo selvagem; ITR WT-L (SEQ ID ITR Modificada NO: 540) ou ITR WT-R (SEQ ID NO: 17) (sequência de topo) v. sequências ΔG (kcal/ (SEQ ID NO) de ITR modificadas (SEQ ID NO: 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, mol) 110) (sequências de fundo)) ITR-2 Esquerda -72,6 (SEQ:101) ITR-2 Direita -72,6 (SEQ:102) ITR-3 Esquerda -74,8 (SEQ:103) ITR-3 Direita -74,8 (SEQ:104)
TABELA 7 Alinhamento de sequência de ITRs do tipo selvagem; ITR WT-L (SEQ ID ITR Modificada NO: 540) ou ITR WT-R (SEQ ID NO: 17) (sequência de topo) v. sequências ΔG (kcal/ (SEQ ID NO) de ITR modificadas (SEQ ID NO: 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, mol) 110) (sequências de fundo))
ITR-4 Esquerda -76,9 (SEQ:105)
ITR-4 Direita -76,9 (SEQ:106)
ITR-10 Esquerda -83,7 (SEQ:107)
ITR-10 Direita -83,7 (SEQ:108)
ITR-17 Esquerda -73,3 (SEQ:109)
ITR-17 Direita -73,3 (SEQ:110)
ITR modificada com uma estrutura em gancho único
[00178] A ITR do tipo selvagem pode ser modificada para ter a me- nor estrutura de energia que compreende uma estrutura de gancho único. A energia livre de Gibbs (ΔG) do desdobramento da estrutura pode variar entre -70 kcal/mol e -40 kcal/mol. Estruturas exemplificado- ras das ITRs modificadas são fornecidas nas Figuras 14A e 14B.
[00179] As ITRs modificadas previstas para formar a única estrutura em grampo de cabelo podem incluir a deleção, inserção ou substitui- ção de um ou mais nucleotídeos da ITR do tipo selvagem nas sequên- cias que formam o braço B e B’ e/ou o braço C e C’. A ITR modificada pode ser gerada por modificação genética ou síntese biológica e/ou química.
[00180] Por exemplo, ITR-6 esquerda e direita fornecidas nas Figu- ras 14A e 14B (SEQ ID NO: 111 e 112), incluem 40 deleções de nu- cleotídeos nos braços B-B’ e C-C’ da ITR do tipo selvagem de AAV2. Prevê-se que os nucleotídeos restantes na ITR modificada formem uma única estrutura em grampo de cabelo. A energia livre de Gibbs do desdobramento da estrutura é de cerca de -54,4 kcal/mol.
[00181] As sequências de ITR do tipo selvagem e ITR-6 (esquerda e direita) estão alinhadas e são fornecidas abaixo na Tabela 8.
[00182] Tabela 8: Alinhamento de ITR WT e ITR-6 modificada com uma estrutura de gancho único. TABELA 8 Alinhamento de sequência de ITRs do tipo selvagem; ITR WT-L ITR Modificada (SEQ ID NO: 540) ou ITR WT-R (SEQ ID NO: 17) (sequência de ΔG (kcal/ (SEQ ID NO) topo)) v. ITR-6 modificada (SEQ ID NO: 111; ITR-6, esquerda) (SEQ mol) ID NO: 112, ITR-6 direita) (sequência de fundo) ITR-6 Esquerda -54,4 (SEQ:111)
TABELA 8 Alinhamento de sequência de ITRs do tipo selvagem; ITR WT-L ITR Modificada (SEQ ID NO: 540) ou ITR WT-R (SEQ ID NO: 17) (sequência de ΔG (kcal/ (SEQ ID NO) topo)) v. ITR-6 modificada (SEQ ID NO: 111; ITR-6, esquerda) (SEQ mol) ID NO: 112, ITR-6 direita) (sequência de fundo) ITR-6 Direita -54,4 (SEQ:112) ITR modificada com uma estrutura truncada
[00183] A ITR do tipo selvagem pode ser modificada para ter a me- nor estrutura de energia que compreende dois braços, um dos quais é truncado. A energia livre de Gibbs (Δ G) do desdobramento varia entre -90 e -70 kcal/mol. Assim, suas energias livres de Gibbs de desdobra- mento são inferiores à ITR do tipo selvagem do AAV2.
[00184] As ITRs modificadas podem incluir deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da ITR do tipo selvagem nas sequências que formam o braço B e B’ e/ou o braço C e C’. Em algu- mas modalidades, uma ITR modificada pode, por exemplo, compreen- der a remoção de toda uma alça em particular, por exemplo, alça A-A’, alça B-B’ ou alça C-C’ ou, alternativamente, a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases que formam a haste da alça, desde que a alça final no final da haste ainda esteja presente. A ITR modifi- cada pode ser gerada por modificação genética ou síntese biológica e/ou química.
[00185] Estruturas exemplificadores das ITRs modificadas com uma estrutura truncada são fornecidas nas Figuras 15A-15B.
[00186] As sequências de várias ITRs modificadas previstas para formar uma estrutura truncada são alinhadas com uma sequência de ITR do tipo selvagem e fornecidas abaixo na Tabela 9.
[00187] Tabela 9: Alinhamento de ITR WT e ITRs modificadas (ITR-
5, ITR-7, ITR-8, ITR-9, ITR-11, ITR-12, ITR-13, ITR-14, ITR-1 e ITR- 16) com uma estrutura truncada.
TABELA 9
Alinhamento de sequência: ITRs do tipo selvagem; ITR WT-L (SEQ ITR Modificada ΔG (kcal/ ID NO: 540) ou ITR WT-R (SEQ ID NO: 17) (sequência de topo) v. (SEQ ID NO) mol) ITRs modificadas) (SEQ ID NO: 115-134) (sequências de fundo)
ITR-5 Esquerda -73,4 (SEQ:115)
ITR-5 Direita -73,4 (SEQ:116)
ITR-7 Esquerda -89,6 (SEQ:117)
ITR-7 Direita -89,6 (SEQ:118)
ITR-8 Esquerda -86,9 (SEQ:119)
TABELA 9
Alinhamento de sequência: ITRs do tipo selvagem; ITR WT-L (SEQ ITR Modificada ΔG (kcal/ ID NO: 540) ou ITR WT-R (SEQ ID NO: 17) (sequência de topo) v. (SEQ ID NO) mol) ITRs modificadas) (SEQ ID NO: 115-134) (sequências de fundo)
ITR-8 Direita -86,9 (SEQ:120)
ITR-9 Esquerda -85,0 (SEQ:121)
ITR-9 Direita -85,0 (SEQ:122)
ITR-11 Esquerda -89,5 (SEQ:123)
ITR-11 Direita -89,5 (SEQ:124)
TABELA 9
Alinhamento de sequência: ITRs do tipo selvagem; ITR WT-L (SEQ ITR Modificada ΔG (kcal/ ID NO: 540) ou ITR WT-R (SEQ ID NO: 17) (sequência de topo) v. (SEQ ID NO) mol) ITRs modificadas) (SEQ ID NO: 115-134) (sequências de fundo)
ITR-12 Esquerda -86,2 (SEQ:125)
ITR-12 Direita -86,2 (SEQ:126)
ITR-13 Esquerda -82,9 (SEQ:127)
ITR-13 Direita -82,9 (SEQ:128)
ITR-14 Esquerda -80,5 (SEQ:129)
TABELA 9 Alinhamento de sequência: ITRs do tipo selvagem; ITR WT-L (SEQ ITR Modificada ΔG (kcal/ ID NO: 540) ou ITR WT-R (SEQ ID NO: 17) (sequência de topo) v. (SEQ ID NO) mol) ITRs modificadas) (SEQ ID NO: 115-134) (sequências de fundo) ITR-14 Direita -80,5 (SEQ:130) ITR-15 Esquerda -77,2 (SEQ:131) ITR-15 Direita -77,2 (SEQ:132) ITR-16 Esquerda -73,9 (SEQ:133) ITR-16 Direita -73,9 (SEQ:134)
[00188] ITRs modificadas exemplificadoras adicionais em cada uma das classes acima para uso no presente documento são fornecidas nas Tabelas 10A e 10B. A estrutura secundária prevista das ITRs mo- dificadas à direita na Tabela 10A é mostrada na Figura 26A, e a estru-
tura secundária prevista das ITRs modificadas à esquerda na Tabela 10B são mostradas na Figura 26B.
[00189] As Tabelas 10A e 10B mostram ITRs modificadas à direita e à esquerda exemplificadoras.
[00190] Tabela 10A: ITRs modificadas exemplificadoras. Essas ITRs modificadas exemplificadoras podem compreender o RBE de GCGCGCTCGCTCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 531), espaçador de AC- TGAGGC (SEQ ID NO: 532), o complemento de espaçador GCCT- CAGT (SEQ ID NO: 535) e RBE’ (ou seja, complemento para RBE) de GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 536). Tabela 10A: ITRs modificadas Direitas Exemplificadoras Construto Sequência SEQ ID de ITR NO: ITR-18 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 469 Direita CTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-19 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 470 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-20 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 471 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGG-
CGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-21 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 472 Direita CTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTG-
CCTGCAGG ITR-22 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 473 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGG- CTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTG-
CAGG ITR-23 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 474 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTG-
CCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-24 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 475 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTG-
CCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-25 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 476 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTG-
CCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-26 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 477 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGG- TTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTG-
CAGG ITR-27 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 478 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTT-
CCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-28 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 479 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTT-
Tabela 10A: ITRs modificadas Direitas Exemplificadoras Construto Sequência SEQ ID de ITR NO:
CGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-29 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 480 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACG- CCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTG-
CAGG ITR-30 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 481 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGG-
CGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-31 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 482 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGG-
CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-32 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 483 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGG-
CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-49 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 99 Direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAG-
TGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-50 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCG- 100 direita CTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGG-
CGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
[00191] TABELA 10B: ITRs modificadas à esquerda exemplificati- vos. Essas ITRs modificadas à esquerda modificados podem compre- ender o RBE de GCGCGCTCGCTCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 531), espa- çador de ACTGAGGC (SEQ ID NO: 532), o complemento de espaça- dor GCCTCAGT (SEQ ID NO: 535) e o complemento de RBE (RBE’) de GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 536). Tabela 10B: ITRs esquerdas modificadas exemplificadoras CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGA- ITR-33 AACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA- Esquerda GTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 484 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGG- ITR-34 CGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA- Esquerda GAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 485 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG- ITR-35 CAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA- Esquerda GAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 486 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCG- ITR-36 TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG- Esquerda CAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 487 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAG- ITR-37 TGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCAC- Esquerda TAGGGGTTCCT 488 ITR-38 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG- Esquerda CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAG- 489
Tabela 10B: ITRs esquerdas modificadas exemplificadoras CGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTT-
CCT CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG- ITR-39 CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAG- Esquerda CGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 490 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG- ITR-40 CAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAG- Esquerda CGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 491 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGG- ITR-41 CAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAG- Esquerda CGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 492 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGA- ITR-42 AACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAG- Esquerda CGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTT- CCT 493 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGA- ITR-43 AACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAG- Esquerda CGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 494 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCG- ITR-44 CCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAG- Esquerda CGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTT- CCT 495 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCG- ITR-45 CCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAG- Esquerda CGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTT- CCT 496 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGG- ITR-46 CGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCG- Esquerda CGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 497 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCG- ITR-47 TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG- Esquerda CAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 498 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACG- ITR-48 TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG- Esquerda CAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 499
[00192] Nas modalidades da presente invenção, o vetor de ceDNA descrito no presente documento não tem ITRs modificadas com a se- quência de nucleotídeos selecionada de qualquer um dos grupos das SEQ ID NO: 550, 551, 552, 553, 553, 554, 555, 556, 557.
[00193] Na medida em que o vetor de ceDNA tem uma ITR modifi- cada que tem uma das modificações na região B, B’, C ou C’, confor- me descrito na SEQ ID NO: 550-557, conforme definido em qualquer um ou mais das reivindicações deste pedido ou dentro de qualquer invenção a ser definida em reivindicações emendadas que possam no futuro ser depositadas neste pedido ou em qualquer patente derivada do mesmo, e na medida em que as leis de qualquer país ou países relevantes aos quais esse ou se essas reivindicações se aplicarem, nos reservamos o direito de recusar a dita descrição das reivindica- ções do presente pedido ou de qualquer patente derivada da mesma, na medida necessária para impedir a invalidação do presente pedido ou de qualquer patente dele derivada.
[00194] Por exemplo, e sem limitação, nos reservamos o direito de recusar qualquer uma das seguintes matérias de qualquer reivindica- ção do presente pedido, agora ou conforme alterada no futuro, ou qualquer patente dele derivada:
[00195] A. uma ITR modificada selecionada de qualquer grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2, 52, 63 64, 113, 114, 550, 551; 552, 553, 553, 554, 555, 556, 557 usado em um vetor de ceDNA sem um comu- tador regulador
[00196] B. as ITRs modificadas acima especificadas em A., em um vetor de ceDNA sem sequência reguladora e em que o ácido nucleico heterólogo codifica ABCA4, USA2A var1, VEGFR, CEP290, fator VIII BDD (FVIII), fator VIII, vWF_His, vWF, lecitina colesterol acetil transfe- rase, PAH, G6PC ou CFTR
[00197] Sem limitação, afirmamos que a reserva acima de um direi- to de exoneração de responsabilidade se aplica pelo menos às reivin- dicações 1 a 57 desta solicitação e a todos os parágrafos, incluindo, sem limitações parágrafos estabelecidos em [0027] e [00397]. IV Elementos reguladores.
[00198] Os vetores de ceDNA podem ser produzidos a partir de construtos de expressão que compreendem ainda uma combinação específica de elementos reguladores cis. Os elementos reguladores cis incluem, sem limitação, um promotor, um comutador de ribosso- mos, um isolador, um elemento regulável por mir, um elemento regu- lador pós-transcricional, um promotor específico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor do transgene. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para regular a expressão do transgene, por exemplo, comutadores reguladores, como descrito no presente documento, para regular a expressão do transgene, ou um comutador de extermínio, que pode matar uma célula que compre- ende o vetor de ceDNA.
[00199] Os vetores de ceDNA podem ser produzidos a partir de construtos de expressão que compreendem ainda uma combinação específica de elementos reguladores cis, como o elemento regulador pós-transcricional WHP (WPRE) (por exemplo, SEQ ID NO: 8) e BGH polyA (SEQ ID NO: 9) Cassetes de expressão adequadas para uso em construtos de expressão não são limitadas pela restrição de embala- gem imposta pelo capsídeo viral. Os cassetes de expressão da pre- sente invenção incluem um promotor, que pode influenciar os níveis gerais de expressão, bem como a especificidade celular. Para a ex- pressão do transgene, eles podem incluir um promotor precoce ime- diato derivado de um vírus altamente ativo. Os cassetes de expressão podem conter promotores eucarióticos específicos de tecido para limi- tar a expressão do transgene a tipos celulares específicos e reduzir efeitos tóxicos e respostas imunes resultantes de expressão ectópica não regulamentada. Em modalidades preferencias, um cassete de ex- pressão pode conter um elemento regulador sintético, como um pro- motor CAG (SEQ ID NO: 3). O promotor CAG compreende (i) o ele- mento potencializador precoce do citomegalovírus (CMV), (ii) o promo- tor, o primeiro exon e o primeiro íntron do gene da beta-actina de fran- go e (iii) o aceitador de emenda do gene da beta-globina de coelho. Alternativamente, um cassete de expressão pode conter um promotor de alfa-1-antitripsina (AAT) (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 74), um promotor específico do fígado (LP1) (SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:
16) ou um promotor de fator de alongamento-1 humano alfa (EF1a) (por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 15). Em algumas modali- dades, o cassete de expressão inclui um ou mais promotores constitu- tivos, por exemplo, um promotor LTR retroviral do vírus do sarcoma Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV) ou um pro- motor precoce imediato de citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV, por exemplo, SEQ ID NO: 22). Alternativa- mente, pode ser usado um promotor induzível, um promotor nativo pa- ra um transgene, um promotor específico de tecido ou vários promoto- res conhecidos na técnica.
[00200] Promotores adequados, incluindo os descritos acima, po- dem ser derivados de vírus e, portanto, podem ser referidos como promotores virais, ou podem ser derivados de qualquer organismo, incluindo organismos procarióticos ou eucarióticos. Promotores ade- quados podem ser usados para direcionar a expressão por qualquer RNA polimerase (por exemplo, pol I, pol II, pol III). Promotores exem- plificadores incluem, sem limitação promotor inicial SV40, promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus do tumor mamário de camun- dongo; principal promotor tardio de adenovírus (Ad MLP); um promotor do vírus herpes simplex (HSV), um promotor do citomegalovírus (CMV), como a região do promotor imediato do CMV (CMVIE), um promotor do vírus do sarcoma rous (RSV), um pequeno promotor nu- clear U6 humano (U6, por exemplo, SEQ ID NO: 18) (Miyagishi et al., Nature Biotechnolog y 20, 497-500 (2002)), um promotor U6 aprimora- do (por exemplo, Xia et al., Nucleic Acids Res. Res. 2003 1 de setem- bro de 2003; 31 (17)), um promotor H1 humano (H1) (por exemplo, SEQ ID NO: 19), um promotor CAG, um promotor humano alfa 1- antitipsina (HAAT) (por exemplo, SEQ ID NO: 21) e similares. Nas mo- dalidades, esses promotores são alterados no final contendo íntron a jusante para incluir um ou mais sítios de clivagem de nuclease. Em modalidades, o DNA contendo o sítio (ou sítios) de clivagem da nu- clease é estranho ao DNA do promotor.
[00201] Um promotor pode compreender uma ou mais sequências reguladoras transcricionais específicas para aprimorar ainda mais a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal da mesma. Um promotor também pode compreender elementos inten- sificadores ou repressores distais, que podem estar localizados até vários milhares de pares de bases a partir do local inicial da transcri- ção. Um promotor pode ser derivado de fontes incluindo vírus, bacté- rias, fungos, plantas, insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente do gene de forma constitutiva ou dife- rencial em relação à célula, tecido ou órgão em que a expressão ocor- re ou, em relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta a estímulos externos, como estresses fisiológi- cos, patógenos, íons metálicos ou agentes indutores. Exemplos repre- sentativos de promotores incluem o promotor bacteriófago T7, promo- tor bacteriófago T3, promotor SP6, operador lac, promotor tac, promo- tor final SV40, promotor inicial SV40, promotor inicial SV40, promotor RSV-LTR, promotor CMV IE, promotor inicial SV40 ou promotor final SV40 e o promotor CMV IE, bem como os promotores listados abaixo. Tais promotores e/ou intensificadores podem ser usados para a ex- pressão de qualquer gene de interesse, por exemplo, as moléculas de edição de genes, sequência doadora, proteínas terapêuticas etc.). Por exemplo, o vetor pode compreender um promotor que está operacio- nalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica uma prote- ína terapêutica. O promotor operacionalmente ligado à sequência de codificação da proteína terapêutica pode ser um promotor do vírus sí- mio 40 (SV40), um promotor do vírus do tumor mamário do mouse (MMTV), um promotor do vírus da imunodeficiência humana (HIV), como o vírus da imunodeficiência bovina (BIV) promotor de repetição terminal (LTR), um promotor do vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor do citomegalovírus (CMV), co- mo o promotor imediato do CMV, o promotor do vírus Epstein Barr (EBV) ou um vírus do sarcoma Rous (RSV)) promotor. O promotor também pode ser um promotor de um gene humano, como a ubiquitina C humana (hUbC), actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou metalotioneína humana. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, como um promotor específico de fígado, como alfa 1-antitipsina humana (HAAT), natural ou sintética. Em uma modalidade, a entrega ao fígado pode ser alcançada usando o direcionamento específico de ApoE en- dógeno da composição que compreende um vetor de ceDNA para he- patócitos através do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) presente na superfície do hepatócito.
[00202] Em uma modalidade, o promotor usado é o promotor nativo do gene que codifica a proteína terapêutica. Os promotores e outras sequências reguladoras para os respectivos genes que codificam as proteínas terapêuticas são conhecidos e foram caracterizados. A regi- ão promotora usada pode ainda incluir uma ou mais sequências regu- ladoras adicionais (por exemplo, nativas), por exemplo, intensificado- res (por exemplo, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23).
[00203] Exemplos não limitativos de promotores adequados para uso de acordo com a presente invenção incluem o promotor CAG de, por exemplo (SEQ ID NO: 3), o promotor HAAT (SEQ ID NO: 21), o EF1- α humano promotor (SEQ ID NO: 6) ou um fragmento do promo- tor EF1a (SEQ ID NO: 15), promotor IE2 (por exemplo, SEQ ID NO: 20) e o promotor EF1- α de rato (SEQ ID NO: 24).
[00204] Sequências de poliadenilação: uma sequência que codifica uma sequência de poliadenilação pode ser incluída no vetor de ceDNA para estabilizar o mRNA expresso a partir do vetor de ceDNA e para ajudar na exportação e tradução nuclear. Em uma modalidade, o vetor de ceDNA não inclui uma sequência de poliadenilação. Em outras mo- dalidades, o vetor inclui pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo me- nos 20, pelo menos 25, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50 ou mais dinucleotídeos de adenina. Em algumas modalidades, a sequência de poliadenilação compreende cerca de 43 nucleotídeos, cerca de 40-50 nucleotídeos, cerca de 40-55 nucleotídeos, cerca de 45-50 nucleotídeos, cerca de 35-50 nucleotí- deos ou qualquer intervalo entre isso.
[00205] Os cassetes de expressão podem incluir uma sequência de poliadenilação conhecida na técnica ou uma variação da mesma, co- mo uma sequência de ocorrência natural isolada de BGHpA bovino (por exemplo, SEQ ID NO: 74) ou um vírus SV40pA (por exemplo, SEQ ID NO: 10) ou uma sequência sintética (por exemplo, SEQ ID NO: 27). Alguns cassetes de expressão também podem incluir a se- quência aprimoradora do sinal tardio polyA SV40 (USE). Em algumas modalidades, o USE pode ser usado em combinação com SV40pA ou sinal poli-A heterólogo.
[00206] Os cassetes de expressão também podem incluir um ele- mento pós-transcricional para aumentar a expressão de um transgene. Em algumas modalidades, o elemento regulador pós-transcricional (WPRE) do vírus da hepatite da marmota (WHP) (por exemplo, SEQ ID NO: 8) é usado para aumentar a expressão de um transgene. Po- dem ser usados outros elementos de processamento pós- transcricionais, como o elemento pós-transcricional do gene da timidi- na-quinase do vírus do herpes simplex ou o vírus da hepatite B (HBV). Sequências secretoras podem ser ligadas aos transgenes, por exem- plo, sequências VH-02 e VK-A26, por exemplo, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.
V. Comutadores reguladores
[00207] Um comutador regulador molecular é aquele que gera uma mudança mensurável de estado em resposta a um sinal. Tais comuta- dores reguladores podem ser utilmente combinados com os vetores de ceDNA aqui descritos para controlar a saída do vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um comutador regulador que serve para ajustar a expressão do transgene. Por exemplo, pode servir como uma função de biocontenção do vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o comutador é um comutador "LI- GA/DESLIGA" projetado para iniciar ou parar (isto é, desligar) a ex- pressão do gene de interesse no ceDNA de uma maneira controlável e regulável. Em algumas modalidades, o comutador pode incluir um "comutador de extermínio" que pode instruir a célula que compreende o vetor de ceDNA a sofrer morte programada por célula uma vez que o comutador é ativado. A. Comutadores reguladores binários
[00208] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um comutador regulador que pode servir para modular controlativa- mente a expressão do transgene. Em tal modalidade, o cassete de ex- pressão localizada entre as ITRs do vetor de ceDNA pode adicional- mente compreender uma região reguladora, por exemplo, um promo- tor, elemento cis, repressor, intensificador etc., que está operacional- mente ligado ao gene de interesse, em que a região reguladora é re- gulada por um ou mais cofatores ou agentes exógenos. Por conse- guinte, em uma modalidade, somente quando o um ou mais cofatores ou agentes exógenos estiverem presentes na célula ocorrerão a trans- crição e expressão do gene de interesse do vetor de ceDNA. Em outra modalidade, um ou mais cofatores ou agentes exógenos podem ser usados para reprimir a transcrição e expressão do gene de interesse.
[00209] Qualquer região reguladora de ácido nucleico conhecida por um técnico no assunto pode ser empregada em um vetor de ceD- NA projetado para incluir um comutador regulador. Apenas a título de exemplo, as regiões reguladoras podem ser moduladas por comutado- res de pequenas moléculas ou promotores induzíveis ou repressíveis. Exemplos não limitativos de promotores induzíveis são promotores in- duzíveis a hormônios ou induzíveis a metais. Outros elementos promo- tores/intensificadores induzíveis exemplificativos incluem, sem limita- ção, um promotor induzível por RU486, um promotor induzível por ecdisona, um promotor induzível por rapamicina e um promotor de me- talotioneína. Os switches clássicos baseados em tetraciclina ou outros baseados em antibióticos são abrangidos para uso, incluindo aqueles descritos em (Fussenegger et al., Nature Biotechnol. 18: 1203-1208 (2000)). B. Comutadores reguladores de moléculas pequenas
[00210] Uma variedade de comutadores reguladores baseados em moléculas pequenas conhecidas na técnica é conhecida na técnica e pode ser combinada com os vetores de ceDNA aqui descritos para formar um vetor de ceDNA controlado por comutador regulador. Em algumas modalidades, o comutador regulador pode ser selecionado de qualquer um ou uma combinação de: um par ligante ortogonal/receptor nuclear, por exemplo, variante de receptor retinoide/lG335 e GRQCIMFI, juntamente com um promotor artificial que controla a ex- pressão do transgene operacionalmente ligado, como o descrito em Taylor et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15; receptores de esteroi- des manipulados, por exemplo, receptor de progesterona modificado com um truncamento C-terminal que não pode se ligar à progesterona, mas se liga ao RU486 (mifepristona) (Patente no US 5.364.791); um receptor de ecdisona de Drosophila e os seus ligantes de ecdiesteroi- de (Saez, et al, PNAS, 97 (26) (2000), 14512-14517;. ou um comuta- dor controlado pelo antibiótico trimetoprim (TMP), como descrito em
Sando R 3ª; Nat Methods.2013, 10 (11): 1085-8.
[00211] Outros comutadores reguladores baseados em moléculas pequenas, conhecidos por um técnico no assunto, também são previs- tos para uso no controle da expressão transgênica do ceDNA e inclu- em, mas não se limitam aos descritos em Buskirk et al., Cell; Chem e Biol., 2005; 12 (2); 151-161; um comutador LIGA sensível ao ácido abscísico; como o descrito em Liang, F.-S., et al., (2011) Science Sig- naling, 4 (164); comutadores LIGA sensíveis à L-arginina exógenos, como os descritos em Hartenbach, et al. Nucleic Acids Research, 35 (20), 2007, comutadores LIGA sintéticos sensíveis aos ácidos biliares, como os descritos em Rössger et al., Metab Eng. 2014, 21: 81–90; comutadores LIGA sensíveis à biotina, como os descritos em Weber et al., Metab. Eng. Mar de 2009; 11 (2): 117-124; comutadores regulado- res sensíveis ao benzoato/vanilina de aditivo alimentar de dupla entra- da, como os descritos em Xie et al., Nucleic Acids Research, 2014; 42 (14); e116; Comutadores sensíveis ao 4-hidroxitamoxifeno, como os descritos em Giuseppe et al., Molecular Therapy, 6(5), 653-663; e co- mutadores reguladores sensíveis a flavinoides (floretina), como os descritos em Gitzinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009 Jun 30; 106 (26): 10638-10643.
[00212] Em algumas modalidades, o comutador regulador para con- trolar o transgene ou expressa pelo vetor de ceDNA é uma comutador de ativação pró-droga, como a revelada nas patentes US 8.771.679 e
6.339.070.
[00213] Os comutadores reguladores exemplificadores para uso nos vetores de ceDNA incluem, sem limitações da Tabela 11. C. Comutadores reguladores de "código de acesso"
[00214] Em algumas modalidades, o comutador regulador pode ser um "comutador de código de acesso" ou "circuito de código de aces- so". Os comutadores de código de acesso permitem o ajuste fino do controle da expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA quan- do ocorrem condições específicas - isto é, uma combinação de condi- ções precisa estar presente para a expressão e/ou repressão do transgene.
Por exemplo, para a expressão de um transgene ocorrer pelo menos as condições A e B devem ocorrer.
Um comutador regula- dor de código de acesso pode ser qualquer número de condições, por exemplo, pelo menos 2, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6 ou pelo menos 7 ou mais condições pre- sentes na expressão do transgene para ocorrer.
Em algumas modali- dades, pelo menos 2 condições (por exemplo, condições A, B) preci- sam ocorrer e em algumas modalidades, pelo menos 3 condições pre- cisam ocorrer (por exemplo, A, B e C, ou A, B e D). Apenas a título de exemplo, para que ocorra a expressão gênica de um ceDNA que tenha um comutador regulador "ABC" de código de acesso, as condições A, B e C devem estar presentes.
As condições A, B e C podem ser as seguintes; a condição A é a presença de uma condição ou doença, a condição B é uma resposta hormonal e a condição C é uma resposta à expressão do transgene.
Como exemplo apenas de exemplo, se o transgene for insulina, a Condição A ocorrerá se o indivíduo tiver dia- betes, a Condição B será se o nível de açúcar no sangue estiver alto e a Condição C for o nível de insulina endógena que não está sendo ex- pressa nas quantidades necessárias.
Quando o nível de açúcar dimi- nui ou o nível desejado de insulina é atingido, o transgene (por exem- plo, insulina) desliga novamente até que as três condições ocorram, ligando-o novamente.
Em outro exemplo exemplar, se o transgene for EPO, a Condição A é a presença de Doença Renal Crônica (DRC), a Condição B ocorre se o indivíduo tiver condições hipóxicas no rim, a Condição C é o recrutamento de células produtoras de eritropoietina (EPC) em o rim está comprometido; ou, alternativamente, a ativação do HIF-2 é prejudicada.
Quando os níveis de oxigênio aumentam ou o nível desejado de EPO é alcançado, o transgene (por exemplo, EPO) desliga novamente até que ocorram 3 condições, ligando-o novamen- te.
[00215] Os comutadores reguladores de código de acesso são úteis para ajustar a expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA. Por exemplo, o comutador regulador de código de acesso pode ser modu- lar na medida em que compreende múltiplos comutadores, por exem- plo, um promotor induzível específico de tecido que é ativado apenas na presença de um determinado nível de um metabólito. Em tal moda- lidade, para que a expressão do transgene do vetor de ceDNA ocorra, o agente induzível deve estar presente (condição A), no tipo de célula desejado (condição B) e o metabolito está no, ou acima ou abaixo de um certo limiar (Condição C). Em modalidades alternativas, o comuta- dor regulador de código de acesso pode ser manipulado de modo que a expressão do transgene esteja ativada quando as condições A e B estiverem presentes, mas será desativada quando a condição C esti- ver presente. Tal modalidade é útil quando a Condição C ocorre como resultado direto do transgene expresso - ou seja, a Condição C serve como uma resposta positiva à alça para desativar a expressão do transgene do vetor de ceDNA quando o transgene teve uma quantida- de suficiente da terapêutica desejada efeito.
[00216] Em algumas modalidades, um comutador regulador de có- digo de acesso abrangido para uso no vetor de ceDNA é descrito no documento WO2017/059245, que descreve um comutador denomina- do "comutador de código de acesso" ou "circuito de código de acesso" ou "comutador de extermínio de código de acesso" que é um circuito biológico sintético que usa fatores de transcrição híbridos (TFs) para construir requisitos ambientais complexos para a sobrevivência celular. Os comutadores reguladores de código de acesso descritos no docu- mento WO2017/059245 são particularmente úteis para uso nos veto-
res de ceDNA, pois são modulares e personalizáveis, tanto em termos das condições ambientais que controlam a ativação do circuito quanto nos módulos de saída que controlam o destino da célula. Além disso, o circuito de código de acesso tem utilidade particular para ser usado em vetores de ceDNA, uma vez que, sem as moléculas apropriadas de "código de acesso", permitirá a expressão do transgene somente na presença das condições predeterminadas necessárias. Se algo der errado com uma célula ou nenhuma expressão transgene adicional for desejada por qualquer motivo, o comutador de extermínio relacionado (por exemplo, comutador deadman) pode ser acionado.
[00217] Em algumas modalidades, um comutador regulador de có- digo de acesso ou "circuito de código de acesso" abrangido para uso no vetor de ceDNA compreende fatores de transcrição híbridos (TFs) para expandir o alcance e a complexidade dos sinais ambientais usa- dos para definir condições de biocontenção. Ao contrário do comuta- dor deadman que aciona a morte celular na presença de uma condi- ção predeterminada, o "circuito de código de acesso" permite a sobre- vivência da célula ou expressão de transgene na presença de um "có- digo de acesso" específico e pode ser facilmente reprogramado para permitir a expressão de transgene e/ou sobrevivência de células ape- nas quando a condição ambiental pré-determinada ou código de aces- so estiver presente.
[00218] Em um aspecto, um sistema de "código de acesso" que restringe o crescimento celular à presença de um conjunto predetermi- nado de pelo menos dois agentes selecionados, inclui uma ou mais construtos de ácido nucleico que codificam módulos de expressão que compreende: i) um módulo de expressão de toxina que codifica uma toxina que é tóxica para uma célula hospedeira, em que a sequência que codifica a toxina está operacionalmente ligada a um promotor P1 que é reprimido pela ligação de uma primeira proteína repressora hí-
brida hRP1; ii) um primeiro módulo de expressão de proteína represso- ra híbrida que codifica a primeira proteína repressora híbrida hRP1, em que a expressão de hRP1 é controlada por uma porta AND forma- da por dois fatores de transcrição híbridos hTF1 e hTF2, cuja ligação ou atividade é responsiva aos agentes A1 e A2, respectivamente, de modo que ambos os agentes A1 e A2 sejam necessários para a ex- pressão de hRP1, em que na ausência de A1 ou A2, a expressão de hRP1 é insuficiente para reprimir o módulo promotor de toxinas P1 e a produção de toxinas, de modo que a célula hospedeira seja morta. Nesse sistema, os fatores híbridos hTF1, hTF2 e hRP1 compreendem um módulo de detecção ambiental de um fator de transcrição e um módulo de reconhecimento de DNA de um fator de transcrição diferen- te que torna a ligação do respectivo comutador regulador de código de acesso sensível à presença de um agente ambiental, A1 ou A2, que é diferente daquele que as subunidades respectivas normalmente se ligariam por natureza.
[00219] Consequentemente, um vetor de ceDNA pode compreender um ‘circuito regulador de código de acesso’ que requer a presença e/ou ausência de moléculas específicas para ativar o módulo de saída. Em algumas modalidades, em que os genes que codificam toxinas ce- lulares são colocados no módulo de saída, esse circuito regulador de código de acesso de código de acesso não pode ser usado apenas para regular a expressão do transgene, mas também pode ser usado para criar um mecanismo de interrupção na qual o circuito mata a célu- la se a célula se comportar de maneira indesejada (por exemplo, ela deixa o ambiente específico definido pelos domínios do sensor ou se diferencia em um tipo de célula diferente). Em um exemplo não limita- tivo, a modularidade dos fatores de transcrição híbrida, a arquitetura do circuito e o módulo de saída permitem que o circuito seja reconfigu- rado para detectar outros sinais ambientais, reagir aos sinais ambien-
tais de outras maneiras e controlar outras funções na célula além da morte celular induzida, como é entendido na técnica.
[00220] Toda e qualquer combinação de comutadores reguladores descritos no presente documento, por exemplo, comutadores de pe- quenas moléculas, comutadores baseados em ácido nucleico, comu- tadores híbridos de pequenas moléculas-ácido nucleico, comutadores de regulação de transgene pós-transcricionais, regulação pós-tradu- cional, comutadores controlados por radiação, comutadores mediados por hipóxia e outros comutadores reguladores conhecidos por pessoas técnicos no assunto como descritos no presente documento podem ser usados em um comutador regulador de código de acesso, confor- me descrito no presente documento. Comutadores reguladores abran- gidos para uso também são discutidos no artigo de revisão Kis et al., JR Soc Interface. 12: 20141000 (2015) e resumidos na Tabela 1 de Kis. Em algumas modalidades, um comutador regulador para uso em um sistema de código de acesso pode ser selecionado de qualquer uma ou uma combinação dos comutadores na Tabela 11. D. Comutadores reguladores à base de ácido nucleico para con- trolar a expressão de transgene
[00221] Em algumas modalidades, o comutador regulador para con- trolar o transgene expresso pelo ceDNA é baseado em um mecanismo de controle baseado em ácido nucleico. Mecanismos de controle de ácido nucleico exemplificadores são conhecidos na técnica e estão previstos para uso. Por exemplo, esses mecanismos incluem riboswi- ches, como aqueles descritos nos documentos, por exemplo, US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, patente US 9.222.093 e pedido de EP EP288071, e também descritos na revisão por Villa JK et al. Microbiol Spectr. maio de 2018; 6 (3). Também estão incluídos os biossensores de transcri- ção responsivos ao metabolito, como os descritos nos documentos
WO2018/075486 e WO2017/147585. Outros mecanismos conhecidos na técnica previstos para uso incluem o silenciamento do transgene com uma molécula de siRNA ou RNAi (por exemplo, miR, shRNA). Por exemplo, o vetor de ceDNA pode compreender um comutador regula- dor que codifica uma molécula de RNAi que é complementar ao trans- gene expresso pelo vetor de ceDNA. Quando esse RNAi é expresso mesmo que o transgene seja expresso pelo vetor de ceDNA, o mesmo será silenciado pela molécula de RNAi complementar e quando o RNAi não for expresso quando o transgene for expresso pelo vetor de ceDNA, o transgene não será silenciado pelo RNAi. Um exemplo de molécula de RNAi que controla a expressão gênica ou como um comu- tador regulador é descrito no documento US2017/0183664. Em algu- mas modalidades, o comutador regulador compreende um repressor que bloqueia a expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o comutador liga/desliga é uma transcrição de RNA pequeno de ativação (estrela) comutador com base, por exemplo, como o descrito em Chappell J. et al., Nat Chem Biol. Mar 2015; 11 (3): 214-20; e Chappell et al., Microbiol Spectr. Maio de 2018; 6 (3. Em algumas modalidades, o comutador regulador é um comuta- dor toehold, como descrito nos documentos US2009/0191546, US2016/0076083, WO2017/087530, US2017/0204477, WO2017/075486 e em Green et al., Cell, 2014; 159 (4); 925-939.
[00222] Em algumas modalidades, o comutador regulador é um comutador regulador autoinativador específico de tecido, por exemplo, conforme descrito no documento US2002/0022018, em que o comuta- dor regulador desativa deliberadamente a expressão de transgene em um sítio onde a expressão de transgene pode ser desvantajosa. Em algumas modalidades, o comutador regulador é um sistema de ex- pressão gênica reversível por recombinase, por exemplo, como des- crito em nos documentos US2014/0127162 e Patente no US
8.324.436.
[00223] Em algumas modalidades, o comutador regulador para con- trolar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA é um híbrido de um mecanismo de controle baseado em ácido nuclei- co e um sistema regulador de pequenas moléculas. Tais sistemas são bem conhecidos dos técnicos no assunto e estão previstos para uso no presente documento. Exemplos de tais comutadores reguladores incluem, entre outros, um sistema LTRi ou "Lac-Tet-RNAi", por exem- plo, conforme descrito no documento US2010/0175141 e em Deans T. et al., Cell., 2007, 130 (2); 363-372, WO2008/051854 e patente no US
9.388.425.
[00224] Em algumas modalidades, o comutador regulador para con- trolar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA envolve permutação circular, conforme descrito na patente no US
8.338.138. Em tal modalidade, o comutador molecular é multiestável, ou seja, com a capacidade de alternar entre pelo menos dois estados ou, alternativamente, biestável, ou seja, um estado é "LIGADO" ou "DESLIGADO", por exemplo, com a capacidade de emitir luz ou não, com a capacidade de se ligar ou não, com a capacidade de catalisar ou não, com a capacidade de transferir elétrons ou não, e assim por diante. Em outro aspecto, o comutador molecular usa uma molécula de fusão, portanto, o comutador tem a capacidade de alternar entre mais de dois estados. Por exemplo, em resposta a um estado limite específico exibido por uma sequência de inserção ou sequência acei- tadora, a outra sequência da fusão pode exibir uma faixa de estados (por exemplo, uma faixa de atividade de ligação, uma faixa de catálise enzimática, etc.). Assim, em vez de mudar de "LIGADO" ou "DESLI- GADO", a molécula de fusão pode exibir uma resposta graduada a um estímulo.
[00225] Em algumas modalidades, um comutador regulador basea-
do em ácido nucleico pode ser selecionado de qualquer um ou uma combinação dos comutadores na Tabela 11. E. Comutadores reguladores pós-transcricionais e pós-tradu- cionais.
[00226] Em algumas modalidades, o comutador regulador para con- trolar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA é um sistema de modificação pós-transcricional. Por exemplo, esse comutador regulador pode ser um ribocomutador de aptazima que é sensível à tetraciclina ou teofilina, como descrito nos documentos US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, patente EP 2707487 e Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534; Zhong et al., Elife. 2016 2 de novembro; 5. pii: e18858. Em algumas modalidades, é previsto que um indivíduo técnico no assunto possa codificar o transgene e um siRNA inibidor que contém um aptâmero sensível ao ligante (comutador OFF), o resultado líquido sendo um comutador LIGA sensível ao ligante.
[00227] Em algumas modalidades, o comutador regulador para con- trolar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA é um sistema de modificação pós-tradução. Em modalidades alternati- vas, o gene de interesse ou proteína é expresso como pró-proteína ou pré-pró-proteína, ou tem um elemento de resposta a sinal (SRE) ou um domínio desestabilizador (DD) anexado à proteína expressa, evi- tando assim o dobramento correto de proteínas e/ou atividade até que a modificação pós-tradução tenha ocorrido. No caso de um domínio desestabilizador (DD) ou SRE, o domínio de desestabilização é clivado pós-traducionalmente na presença de um agente exógeno ou molécula pequena. Um técnico no assunto pode utilizar os métodos de controle descritos na patente US 8,173,792 e no pedido PCT WO2017180587. Outros comutadores de controle pós-transcricionais previstos para uso no vetor de ceDNA para controlar a atividade transgênica funcional são descritos em Rakhit et al., Chem Biol. 2014; 21 (9): 1238-52 e Na- varro et al., ACS Chem Biol. 2016; 19; 11 (8): 2101-2104A.
[00228] Em algumas modalidades, um comutador regulador para controlar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ce- DNA é um sistema de modificação pós-tradução que incorpora inteiras sensíveis ao ligante na sequência de codificação do transgene, de modo que o transgene ou a proteína expressa sejam inibidos antes da emenda. Por exemplo, isso foi demonstrado usando o 4- hidroxitamoxifeno e o hormônio tireoidiano (consulte, por exemplo, pa- tentes no US 7.541.450, 9.200.045; 7.192.739, Buskirk et al., Proc Natl Acad Sci USA. 20 de jul de 2004; 101 (29): 10505–10510; ACS Synth Biol. 16 dez 2016; 5(12): 1475-1484; e fevereiro de 2005; 14(2): 523-
532. Em algumas modalidades, um comutador regulador pós- transcricional pode ser selecionado dentre qualquer um ou uma com- binação dos comutadores na Tabela 11. F. Outros comutadores reguladores exemplificadores
[00229] Qualquer comutador regulador conhecido pode ser usado no vetor de ceDNA para controlar a expressão gênica do transgene expressa pelo vetor de ceDNA, incluindo aqueles desencadeados por mudanças ambientais. Exemplos adicionais incluem, sem limitação; o método BOC de Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018); ex- pansão do código genético e um aminoácido não fisiológico; comuta- dores de ligar/desligar controlados por radiação ou ultrassom (consul- te, por exemplo, Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul; 7 (13): 1121-5; patentes no US 5.612.318; 5.571.797; 5.770.581; 5.817.636; e WO1999/025385A1. Em algumas modalidades, o comutador regulador é controlado por um sistema implantável, por exemplo, conforme des- crito na patente US 7.840.263; US2007/0190028A1 em que a expres- são gênica é controlada por uma ou mais formas de energia, incluindo energia eletromagnética, que ativa promotores operativamente ligado ao transgene no vetor de ceDNA.
[00230] Em algumas modalidades, um comutador regulador previs- to para uso no vetor de ceDNA é um comutador mediado por hipóxia ou ativado por estresse, por exemplo, como os descritos no documen- to WO1999060142A2, patente no US 5.834.306; 6.218.179; 6.709.858; US2015/0322410; Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368, bem como elementos FROG, TOAD e NRSE e elementos de silêncio condicionalmente induzíveis, incluindo elementos de resposta à hipóxia (HREs), elementos de resposta inflamatória (IREs) e elemen- tos ativados por estresse de cisalhamento (SSAEs), por exemplo, co- mo descrito na Patente US 9.394.526. Uma tal modalidade é útil para ativar a expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA após is- quemia ou em tecidos isquêmicos e/ou tumores.
[00231] Em algumas modalidades, um comutador regulador previs- to para uso no vetor de ceDNA é um comutador regulador optogenéti- co (por exemplo, controlado por luz), por exemplo, como um dos co- mutadores revisados em Polesskaya et al., BMC Neurosci. 2018; 19 (Supl 1):12, e também estão previstos para uso no presente documen- to. Em tais modalidades, um vetor de ceDNA pode compreender ele- mentos genéticos sensíveis à luz e pode regular a expressão do trans- gene em resposta a comprimentos de onda visíveis (por exemplo, azul, próximo ao IR). Os vetores de ceDNA que compreende comuta- dores reguladores optogenéticos são úteis ao expressar o transgene em locais do corpo que podem receber essas fontes de luz, por exem- plo, pele, olho, músculo etc., e também podem ser usados quando ve- tores de ceDNA expressam transgenes em órgãos internos e tecidos, em que o sinal de luz pode ser fornecido por um meio adequado (por exemplo, dispositivo implantável, como descrito no presente documen- to). Tais comutadores reguladores optogenéticos incluem o uso de elementos responsivos à luz ou efetor transcricional induzível à luz
(LITE) (por exemplo, descrito em 2014/0287938), um sistema Light-On (por exemplo, descrito em Wang et al., Nat Methods. 2012 12 de feve- reiro; 9 (3): 266-9; que relatou permitir o controle in vivo da expressão de um transgene de insulina, o sistema Cry2/CIB1 (por exemplo, des- crito em Kennedy et al., Nature Methods; 7, 973-975 (2010) e o siste- ma FKF1/GIGANTEA (por exemplo, descrito em Yazawa et al., Nat Biotechnol. Outubro de 2009; 27 (10): 941-5). G. Comutadores de Extermínio
[00232] Outras modalidades da invenção referem-se a um vetor de ceDNA que compreende um comutador de extermínio. Um comutador de extermínio, como descrito no presente documento, permite que uma célula que compreende o vetor de ceDNA seja morta ou sofra morte celular programada como um meio para remover permanente- mente um vetor de ceDNA introduzido do sistema do indivíduo. Será entendido por um técnico no assunto que o uso de comutadores de extermínio nos vetores de ceDNA da invenção seria tipicamente aco- plado ao direcionamento do vetor de ceDNA a um número limitado de células que o indivíduo pode perder de maneira aceitável ou para uma célula tipo em que a apoptose é desejável (por exemplo, células can- cerígenas). Em todos os aspectos, um "comutador de extermínio", co- mo descrito no presente documento, é projetado para fornecer morte celular rápida e robusta da célula que compreende o vetor de ceDNA na ausência de um sinal de sobrevivência de entrada ou outra condi- ção especificada. Dito de outra maneira, um comutador de extermínio codificado por um vetor de ceDNA aqui pode restringir a sobrevivência celular de uma célula que compreende um vetor de ceDNA a um am- biente definido por sinais de entrada específicos. Tais comutadores de extermínio servem como uma função de biocontenção biológica, caso seja desejável remover o vetor de ceDNA de um indivíduo ou garantir que não expresse o transgene codificado. Por conseguinte, os comu-
tadores de extermínio são circuitos biológicos sintéticos no vetor de ceDNA que acoplam sinais ambientais com sobrevivência condicional da célula que compreende o vetor de ceDNA. Em algumas modalida- des, diferentes vetores de ceDNA podem ser projetados para ter dife- rentes comutadores de extermínio. Isso permite que se consiga contro- lar quais células que expressam transgene são mortas se forem usa- dos coquetéis de vetores de ceDNA.
[00233] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA pode com- preender um comutador de extermínio que é um circuito modular de contenção biológica. Em algumas modalidades, um comutador de ex- termínio abrangido para uso no vetor de ceDNA é descrito no docu- mento WO2017/059245, que descreve um comutador referido como um "comutador de extermínio Deadman" que compreende um arranjo mutuamente inibidor de pelo menos duas sequências repressíveis, de modo que um O sinal ambiental reprime a atividade de uma segunda molécula na construção (por exemplo, um pequeno fator de transcri- ção de ligação à molécula é usado para produzir um estado de ‘sobre- vivência’ devido à repressão da produção de toxinas). Nas células que compreendem um vetor de ceDNA que compreende um comutador de extermínio morto, após a perda do sinal ambiental, o circuito muda permanentemente para o estado de ‘morte’, em que a toxina é agora despressurizada, resultando na produção de toxinas que matam a cé- lula. Em outra modalidade, é fornecido um circuito biológico sintético referido como "circuito de código de acesso" ou "comutador de exter- mínio de código de acesso" que usa fatores de transcrição híbridos (TFs) para construir requisitos ambientais complexos para a sobrevi- vência das células. Os comutadores deadman e Passcode kill descri- tos no documento WO2017/059245 são particularmente úteis para uso em vetores de ceDNA, pois são modulares e personalizáveis, tanto em termos das condições ambientais que controlam a ativação do circuito quanto nos módulos de saída que controlam o destino da célula. Com a escolha adequada de toxinas, incluindo, sem limitação, uma endo- nuclease, por exemplo, um EcoRI, os circuitos de código de acesso de código de acesso presentes no vetor de ceDNA podem ser usados não apenas para matar a célula hospedeira que compreende o vetor de ceDNA, mas também para degradar seu genoma e plasmídeos acompanhantes.
[00234] Outros comutadores de extermínio conhecidos por um téc- nico no assunto são abrangidos para uso no vetor de ceDNA como descrito no presente documento, por exemplo, como descrito nos do- cumentos US2010/0175141; US2013/0009799; US2011/0172826; US2013/0109568, bem como comutadores de extermínio descritos em Jusiak et al., Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine; 2014; 1- 56; Kobayashi et al., PNAS, 2004; 101; 8419-9; Marchisio et al., Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310-319; e em Reinsha- gen et al., Science Translational Medicine, 2018, 11.
[00235] Por conseguinte, em algumas modalidades, o vetor de ce- DNA pode compreender um construto de ácido nucleico de comutador de extermínio, que compreende o ácido nucleico que codifica uma to- xina efetora ou proteína repórter, em que a expressão da toxina efeto- ra (por exemplo, uma proteína mortal) ou repórter a proteína é contro- lada por uma condição predeterminada. Por exemplo, uma condição predeterminada pode ser a presença de um agente ambiental, como, por exemplo, um agente exógeno, sem o qual a célula se tornará pa- drão para a expressão da toxina efetora (por exemplo, uma proteína da morte) e será morta. Em modalidades alternativas, uma condição predeterminada é a presença de dois ou mais agentes ambientais, por exemplo, a célula sobreviverá apenas quando dois ou mais agentes exógenos necessários forem fornecidos, e sem nenhum dos quais, a célula que compreende o vetor de ceDNA é morta.
[00236] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é modificado para incorporar um comutador de extermínio para destruir as células que compreendem o vetor de ceDNA para finalizar efetivamente a ex- pressão in vivo do transgene sendo expressa pelo vetor de ceDNA (por exemplo, gene terapêutico, proteína ou peptídeo etc). Especifica- mente, o vetor de ceDNA é geneticamente modificado para expressar uma proteína de troca que não é funcional em células de mamíferos sob condições fisiológicas normais. Somente após a administração de uma droga ou condição ambiente modo que atinja especificamente essa proteína de troca, as células que expressam a proteína de troca serão destruídas, terminando assim a expressão da proteína ou peptí- deo terapêutico. Por exemplo, foi relatado que as células que expres- sam HSV-timidina-quinase podem ser mortas após a administração de fármacos, como ganciclovir e citosina-desaminase. Consulte, por exemplo, Dey e Evans, Suicide Gene Therapy, do Herpes Simplex Vi- rus-1 Timidine Kinase (HSV-TK), em Targets in Gene Therapy, editado por You (2011); e Beltinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8699-8704 (1999). Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode compreender um comutador de extermínio de siRNA referido como DISE (Morte Induzida por Eliminação de Genes de Sobrevivência) (Murmann et al., Oncotarget. 2017; 8: 84643-84658. Indução de DISE em células cancerígenas do ovário in vivo).
[00237] Em alguns aspectos, um comutador de extermínio dead- man é um circuito ou sistema biológico que torna uma resposta celular sensível a uma condição predeterminada, como a falta de um agente no ambiente de crescimento celular, por exemplo, um agente exógeno. Tal circuito ou sistema pode compreender um construto de ácido nu- cleico que compreende módulos de expressão que formam um circuito regulador deadman sensível à condição predeterminada, a construção que compreende módulos de expressão que formam um circuito regu-
lador, a construção incluindo: i) um primeiro módulo de expressão de proteína repressora, em que a primeira proteína repressora se liga a um primeiro elemento de ligação a ácido nucleico de proteína repressora e reprime a transcrição de uma sequência de codificação que compreende o primeiro elemento de ligação à proteína repressora e em que a atividade de repressão da primeira proteína repressora é sensível à inibição por um primeiro agente exógeno, a presença ou ausência do primeiro agente exógeno estabelecendo uma condição predeterminada; ii) um segundo módulo de expressão da proteína repressora, em que a segunda proteína repressora se liga a um segundo elemento de liga- ção ao ácido nucleico da proteína repressora e reprime a transcrição de uma sequência de codificação que compreende o segundo elemen- to de ligação à proteína repressora, em que a segunda proteína re- pressora é diferente da primeira proteína repressora; e iii) um módulo de expressão efetor, que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína efetora, operacionalmente ligada a um elemento genético que compreende um elemento de liga- ção para a segunda proteína repressora, de modo que a expressão da segunda proteína repressora cause repressão da expressão efetiva de o módulo de expressão efetor, em que o segundo módulo de expres- são compreende um primeiro elemento de ligação ao ácido nucleico da proteína repressora que permite a repressão da transcrição da se- gunda proteína repressora quando o elemento é ligado pela primeira proteína repressora, os respectivos módulos formando um circuito re- gulador de modo que na ausência do primeiro agente exógeno, a pri- meira proteína repressora seja produzida a partir do primeiro módulo de expressão da proteína repressora e reprima a transcrição do se- gundo módulo de expressão da proteína repressora, de modo que a repressão da expressão efetiva pela segunda proteína repressora é aliviada, resultando na expressão da proteína efetora, mas na ausên- cia do primeiro agente exógeno, a atividade da primeira proteína re- pressora é inibida, permitindo a expressão da segunda proteína re- pressora, que mantém a expressão da expressão efetiva da proteína no estado "desligado", de modo que o primeiro agente exógeno seja requerido pelo circuito para manter a expressão da proteína efetor no estado "desligado" e a remoção ou ausência do primeiro agente exó- geno é padronizada para a expressão da proteína efetor.
[00238] Em algumas modalidades, o efetor é uma toxina ou uma proteína que induz um programa de morte celular. Qualquer proteína que seja tóxica para a célula hospedeira pode ser usada. Em algumas modalidades, a toxina mata apenas as células nas quais é expressa. Em outras modalidades, a toxina mata outras células do mesmo orga- nismo hospedeiro. Qualquer um de um grande número de produtos que levará à morte celular pode ser empregado em um comutador de extermínio deadman. Os agentes que inibem a replicação do DNA, a tradução de proteínas ou outros processos ou, por exemplo, que de- gradam o ácido nucleico da célula hospedeira, são de particular utili- dade. Para identificar um mecanismo eficiente para matar as células hospedeiras após a ativação do circuito, foram testados vários genes de toxinas que danificam diretamente o DNA ou o RNA da célula hos- pedeira. A endonuclease EcoRI 21, a girase de DNA inibidor ccdB 22 e o 23 tipo de ribonuclease toxina mazF foram testadas devido ao fato de que os mesmos são bem caracterizados, são nativas para E. coli, e fornecer uma variedade de mecanismos de matar. Para aumentar a robustez do circuito e fornecer um método independente de morte ce- lular dependente do circuito, o sistema pode ser ainda mais adaptado para expressar, por exemplo, uma protease ou nuclease direcionada que interfere ainda mais com o repressor que mantém o gene da mor- te no estado "desligado". Com a perda ou retirada do sinal de sobrevi-
vência, a repressão do gene da morte é ainda mais eficientemente re- movida por, por exemplo, degradação ativa da proteína repressora ou sua mensagem. Como exemplos não limitativos, a protease mf-Lon foi usada não apenas para degradar o LacI, mas também para direcionar proteínas essenciais para a degradação. O tag de degradação mf-Lon pdt no 1 pode ser anexado à extremidade 3’ de cinco genes essenciais cujos produtos proteicos são particularmente sensíveis à degradação mf-Lon 2º, e a viabilidade celular foi medida após a remoção de ATc. Entre os alvos genéticos essenciais testados, o gene da biossíntese peptidoglicana murC forneceu o fenótipo de morte celular mais forte e mais rápido (razão de sobrevivência <1 x 10-4 dentro de 6 horas).
[00239] Como aqui usado, o termo "entrada predeterminada" refere- se a um agente ou condição que influencia a atividade de um polipep- tídeo de fator de transcrição de uma maneira conhecida. Geralmente, esses agentes podem se ligar e/ou alterar a conformação do polipeptí- deo do fator de transcrição para modificar assim a atividade do poli- peptídeo do fator de transcrição. Exemplos de entradas predetermina- das incluem, sem limitação, agentes de entrada ambientais que não são necessários para a sobrevivência de um determinado organismo hospedeiro (isto é, na ausência de um circuito biológico sintético, como descrito no presente documento). As condições que podem fornecer uma entrada predeterminada incluem, por exemplo, temperatura, por exemplo, em que a atividade de um ou mais fatores é sensível à tem- peratura, a presença ou ausência de luz, incluindo a luz de um deter- minado espectro de comprimentos de onda, e a concentração de um gás, sal, metal ou mineral. Os agentes de entrada ambiental incluem, por exemplo, uma molécula pequena, agentes biológicos como fe- romônios, hormônios, fatores de crescimento, metabólitos, nutrientes e similares e seus análogos; concentrações de produtos químicos, sub- produtos ambientais, íons metálicos e outras moléculas ou agentes;
níveis de luz; temperatura; estresse mecânico ou pressão; ou sinais elétricos, como correntes e tensões.
[00240] Em algumas modalidades, os repórteres são usados para quantificar a intensidade ou a atividade do sinal recebido pelos módu- los ou circuitos biológicos sintéticos programáveis da invenção. Em algumas modalidades, os repórteres podem ser fundidos in-frame com outras sequências de codificação de proteínas para identificar onde uma proteína está localizada em uma célula ou organismo. As lucife- rases podem ser usadas como proteínas efetoras para várias modali- dades descritas aqui, por exemplo, medindo baixos níveis de expres- são gênica, devido ao fato de que as células tendem a ter pouca ou nenhuma luminescência de fundo na ausência de uma luciferase. Em outras modalidades, as enzimas que produzem substratos coloridos podem ser quantificadas usando espectrofotômetros ou outros instru- mentos que podem realizar medições de absorvância, incluindo leito- res de placas. Assim como as luciferases, enzimas como a β- galactosidase podem ser usadas para medir baixos níveis de expres- são gênica devido ao fato de que tendem a amplificar sinais baixos. Em algumas modalidades, uma proteína efetora pode ser uma enzima que pode degradar ou destruir uma dada toxina. Em algumas modali- dades, uma proteína efetora pode ser uma enzima odorante que con- verte um substrato em um produto odorante. Em algumas modalida- des, uma proteína efetora pode ser uma enzima que fosforila ou des- fosforila pequenas moléculas ou outras proteínas, ou uma enzima que metila ou desmetila outras proteínas ou DNA.
[00241] Em algumas modalidades, uma proteína efetora pode ser um receptor, ligante ou proteína lítica. Os receptores tendem a ter três domínios: um domínio extracelular para ligação de ligantes, como pro- teínas, peptídeos ou moléculas pequenas, um domínio transmembra- nar e um domínio intracelular ou citoplasmático que frequentemente pode participar de algum tipo de evento de transdução de sinal, como a fosforilação. Em algumas modalidades, sequências de genes trans- portadoras, de canal ou de bomba são usadas como proteínas efeto- ras. Exemplos e sequências não limitantes de proteínas efetoras para uso com os comutadores de extermínio descritos no presente docu- mento podem ser encontrados no Registro de Partes Biológicas Pa- drão na Internet em parts.igem.org.
[00242] Como aqui usado, uma "proteína moduladora" é uma prote- ína que modula a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. As proteínas moduladoras incluem, por exemplo, fatores de transcri- ção, incluindo ativadores e repressores da transcrição, entre outros, e proteínas que se ligam a ou modificam um fator de transcrição e influ- enciam sua atividade. Em algumas modalidades, uma proteína modu- ladora inclui, por exemplo, uma protease que degrada um fator de pro- teína envolvido na regulação da expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. As proteínas moduladoras preferencias incluem proteí- nas modulares nas quais, por exemplo, elementos ou domínios de li- gação ao DNA e de ligação ao agente de entrada ou responsivos são separáveis e transferíveis, de modo que, por exemplo, a fusão do do- mínio de ligação ao DNA de uma primeira proteína moduladora com o domínio responsivo ao agente de entrada de um segundo resulta em uma nova proteína que liga a sequência de DNA reconhecida pela primeira proteína, mas é sensível ao agente de entrada ao qual a se- gunda proteína normalmente responde. Por conseguinte, como usado no presente documento, o termo "polipeptídeo modulador" e o "poli- peptídeo repressor" mais específico incluem, além dos polipeptídeos especificados, por exemplo, "um polipeptídeo LacI (repressor)", varian- tes ou derivados desses polipeptídeos que respondem para um agente de entrada diferente ou variante. Assim, para um polipeptídeo LacI, estão incluídos mutantes ou variantes LacI que se ligam a outros agentes além da lactose ou IPTG. Uma vasta gama de tais agentes é conhecida na técnica.
[00243] Tabela 11. Comutadores reguladores exemplificadores. b comutabilidade LIGA por um efetor; diferente de remover o efetor que confere o estado DESLIGADO. cComutabilidade DESLIGA por um efe- tor; diferente de remover o efetor que confere o estado LIGADO. dUm ligante ou outro estímulo físico (por exemplo, temperatura, radiação eletromagnética, eletricidade) que estabiliza a comutador no estado e LIGADO ou DESLIGADO. refere-se ao número de referência citado em Kis et al., JR Soc Interface. 12: 20141000 (2015), em que o artigo e as referências citadas no mesmo são aqui incorporados a título de referência. Comutador Comutador referên- no nome origem efetord Ligab DESLIGAc ciase Comutadores Transcricionais Arabidopsis thaliana, 1 ABA sim não ácido absísico [19] levedura 2 AIR sim não Aspergillus nidulans Acetaldeído [20] Chlamydia pneumoni- 3 ART sim não l-arginina [21] ae BEARON, BEA- 4 sim sim Campylobacter jejuni Ácido biliar [22]
ROFF 5 BirA-tTA não sim Escherichia coli biotina (vitamina H) [23] 6 BIT sim não Escherichia coli biotina (vitamina H) [24] Arabidopsis thaliana, 7 Cry2-CIB1 sim não Luz azul [25] levedura Comamonas testoste- Aditivos alimentícios (ben- 8 CTA, CTS sim sim [26] roni, Homo sapiens zoato, vanilato) 9 cTA, rcTA sim sim Pseudomonas putida Cumato [27] Homo sapiens, Dro- 10 Ecdysone sim não Ecdisona [28] sophila melanogaster Homo sapiens, Locus- 11 EcR:RXR sim não Ecdisona [29] ta migratoria 12 electro-genetic sim não Aspergillus nidulans eletricidade, acetaldeído [30] Homo sapiens, leve- 13 ER-p65-ZF sim não 4,4′-di-idroxibenzil [31] dura 14 E.REX sim sim Escherichia coli Eritromicina [32] Mycobacterium tuber- 15 EthR não sim 2-feniletil-butirato [33] culosis levedura, Homo oestrogênio, 4- 16 GAL4-ER sim sim [34] sapiens hidroxitamoxifen levedura, Homo 17 GAL4-hPR sim sim mifepristone [35,36] sapiens levedura, Homo rapamicina e derivados de 18 GAL4-Raps sim sim [37] sapiens rapamicina levedura, Homo 19 GAL4-TR sim não Hormônio da tiroide [38] sapiens 20 GyrB sim sim Escherichia coli coumermicina, novobiocina [39]
Comutador Comutador referên- no nome origem efetord Ligab DESLIGAc ciase 21 HEA-3 sim não Homo sapiens 4-hidroxitamoxifen [40] aptâmeros derivados 22 Intramer não sim Teofilina [41] de SELEX sintético 23 LacI sim não Escherichia coli IPTG [42–46] Arabidopsis thaliana, 24 LAD sim não luz azul [47] levedura Neurospora crassa, 25 LightOn sim não luz azul [48] levedura Arthrobacter nicotino- 26 NICE sim sim 6-hidroxinicotina [49] vorans 27 PPAR* sim não Homo sapiens Rosiglitazona [50] flavonoides (por exemplo, 28 PEACE não sim Pseudomonas putida [51] floretina) Streptomyces coelico- pristinamicina I, virginiamici- 29 PIT sim sim [12] lor na Streptomyces coelico- 30 REDOX não sim NADH [52] lor Streptomyces coelico- butirolactonas (por exemplo, 31 QuoRex sim sim lor, Streptomyces [53] SCB1) pristinaespiralis Streptomyces coelico- 32 ST-TA sim sim lor, Escherichia coli, γ-butirolactona, tetraciclina [54] Herpes simplex 33 TIGR não sim Streptomyces albus Temperatura [55] Agrobacterium tume- N-(3-oxo- 34 TraR sim não [56] faciens octanoil)homoserina lactona TET-OFF, TET- Escherichia coli, 35 sim sim tetraciclina, doxiciclina [11,57] ON Herpes simplex Chlamydia trachoma- 36 TRT sim não l-triptofano [58] tis Deinococcus radiodu- 37 UREX sim não Ácido úrico [59] rans Caulobacter crescen- 38 VAC sim sim Ácido vanílico [60] tus Mus musculus, Homo ZF-ER, ZF- 4-hidroxitamoxifen, ponaste- 39 sim sim sapiens, Drosophila [61] RXR/EcR rona-A melanogaster 40 ZF-Raps sim não Homo sapiens Rapamicina [62] Mus musculus, Homo 4-hidroxitamoxifen, mifepris- 41 ZF switches sim não sapiens, Drosophila [63] tone melanogaster Xenopus laevis, Homo etil-4-hidroxibenzoato, 42 ZF(TF)s sim não [64] sapiens propil-4-hidroxibenzoato
Comutadores pós-transcricionais aptâmero derivado de 1 aptâmero RNAi sim não teofilina [65] SELEX sintético aptâmero derivado de 2 aptâmero RNAi não sim teofilina [66] SELEX sintético aptâmero RNAi aptâmero derivado de teofilina, tetraciclina, 3 sim não [67] miRNA SELEX sintético hypoxanthine Homo sapiens, MS2 4 aptâmero Splicing sim sim MS2, p65, p50, b-catenin [68] bateriófago aptâmero derivado de 5 aptazyme não sim SELEX sintético, teofilina [69] Schistosoma mansoni 6 replicon CytTS sim não Sindbis virus temperatura [70] Escherichia coli, TET-OFF-shRNA, 7 sim sim Herpes simplex, Homo doxiciclina [71] TET-ON-shRNA sapiens 8 theo aptâmero não sim aptâmero derivado de teofilina [72]
Comutador Comutador referên- no nome origem efetord Ligab DESLIGAc ciase SELEX sintético aptâmero derivado de 9 3′ UTR aptazyme sim não SELEX sintéticos, teofilina, tetraciclina [73] vírus anular do tabaco aptâmero derivado de 10 5′ UTR aptazyme não sim SELEX sintético, teofilina [74] Schistosoma mansoni Comutadores translacionais Hoechst aptâme- sequência de RNA 1 não sim Corantes Hoechst [75] ro sintético Archaeoglobus fulgi- 2 H23 aptâmero não sim L7Ae, L7KK [76] dus Archaeoglobus fulgi- 3 L7Ae aptâmero sim sim L7Ae [77] dus 4 MS2 aptâmero não sim MS2 bateriófago MS2 [78] Comutadores pós-translacionais Arabidopsis thaliana, 1 AID não sim Oryza sativa, Gos- auxinas (por exemplo, IAA) [79] sypium hirsutum 2 ER DD não sim Homo sapiens CMP8, 4-hidroxitamoxifen [80] 3 FM sim não Homo sapiens AP21998 [81] Rhodococcus sp. 4 HaloTag não sim HyT13 [82,83] RHA1 5 HDV-aptazyme não sim vírus hepatite delta teofilina, guanina [84] proteólise direcionada a 6 PROTAC não sim Homo sapiens moléculas quiméricas [85] (PROTACS) 7 shield DD sim não Homo sapiens shields (por exemplo, Shld1) [86] 8 shield LID não sim Homo sapiens shields (por exemplo, Shld1) [87] 9 TMP DD sim não Escherichia coli trimethoprim (TMP) [88] VI Método detalhado de produção de um vetor de ceDNA A. Produção em geral
[00244] Como descrito no presente documento, o vetor de ceDNA pode ser obtido pelo processo que compreende as etapas de: a) incu- bar uma população de células hospedeiras (por exemplo, células de insetos) que abrigam o modelo de construto de expressão de polinu- cleotídeo (por exemplo, um plasmídeo de ceDNA, um ceDNA- Bacmídeo e/ou um ceDNA-baculovírus), que é desprovido de sequên- cias codificantes do capsídeo viral, na presença de uma proteína Rep sob condições eficazes e por um tempo suficiente para induzir a pro- dução do vetor de ceDNA nas células hospedeiras, e em que as célu- las hospedeiras não compreendem sequências codificantes do capsí- deo viral; e b) colher e isolar o vetor de ceDNA das células hospedei-
ras. A presença da proteína Rep induz a replicação do polinucleotídeo do vetor com uma ITR modificada para produzir o vetor de ceDNA em uma célula hospedeira. No entanto, não são expressas partículas vi- rais (por exemplo, viriões AAV). Assim, não há limitação de tamanho como a imposta naturalmente no AAV ou em outros vetores baseados em vírus.
[00245] A presença do vetor de ceDNA isolado das células hospe- deiras pode ser confirmada digerindo o DNA isolado da célula hospe- deira com uma enzima de restrição com um único sítio de reconheci- mento no vetor de ceDNA e analisando o material do DNA digerido em um gel não desnaturante confirmar a presença de bandas característi- cas de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[00246] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece o uso de linhas de células hospedeiras que integraram estavelmente o modelo de ex- pressão de polinucleotídeo do vetor de DNA (modelo ceDNA) em seu próprio genoma na produção do vetor de DNA não viral, por exemplo, como descrito em Lee L. et al. (2013) Plos One 8 (8): e69879. De pre- ferência, Rep é adicionada às células hospedeiras em um MOI de cer- ca de 3. Quando a linha de células hospedeiras é uma linha celular de mamífero, por exemplo, células HEK293, as linhas celulares podem ter um modelo de vetor polinucleotídico integrado de forma estável e um segundo vetor, como o vírus do herpes pode ser usado para introduzir a proteína Rep nas células, permitindo a excisão e amplificação do ceDNA na presença de Rep e do vírus auxiliar.
[00247] Em uma modalidade, as células hospedeiras usadas para produzir os vetores de ceDNA aqui descritos são células de inseto, e o baculovírus é usado para entregar o polinucleotídeo que codifica a pro- teína Rep e o modelo de construto de expressão de polinucleotídeo de vetor de DNA não viral para ceDNA, por exemplo, como descrito nas
Figuras 4A-4C e Exemplo 1. Em algumas modalidades, a célula hos- pedeira é manipulada para expressar a proteína Rep.
[00248] O vetor de ceDNA é então colhido e isolado das células hospedeiras. O tempo para colher e coletar vetores de ceDNA aqui descritos a partir das células pode ser selecionado e otimizado para alcançar uma produção de alto rendimento dos vetores de ceDNA. Por exemplo, o tempo de colheita pode ser selecionado em vista da viabili- dade celular, morfologia celular, crescimento celular, etc. Em uma mo- dalidade, as células são cultivadas em condições suficientes e colhi- das um tempo suficiente após a infecção baculoviral para produzir ve- tores de ceDNA, mas antes da maioria dos casos as células começam a morrer por causa da toxicidade baculoviral. Os vetores de DNA po- dem ser isolados usando kits de purificação de plasmídeo, como kits de plasmídeo Qiagen Endo-Free Plasmid. Outros métodos desenvolvi- dos para o isolamento de plasmídeo também podem ser adaptados para vetores de DNA. Geralmente, qualquer método de purificação de ácido nucleico pode ser adotado.
[00249] Os vetores de DNA podem ser purificados por qualquer meio conhecido dos técnicos no assunto para purificação de DNA. Em uma modalidade, os vetores de ceDNA são purificados como molécu- las de DNA. Em outra modalidade, os vetores de ceDNA são purifica- dos como exossomos ou micropartículas.
[00250] A presença do vetor de ceDNA pode ser confirmada dige- rindo o DNA do vetor isolado das células com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o material de DNA digerido e não digerido usando eletroforese em gel para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo. As Figu- ras 4C e 4E ilustram uma modalidade para identificar a presença dos vetores de ceDNA de extremidade fechada produzidos pelos proces-
sos aqui descritos. Por exemplo, a Figura 5 é um gel que confirma a produção de ceDNA a partir de múltiplos construtos de plasmídeos usando uma modalidade para a produção desses vetores como des- crito nos Exemplos. B. Plasmídeo de ceDNA
[00251] Um plasmídeo de ceDNA é um plasmídeo usado para a produção posterior de um vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, um plasmídeo de ceDNA pode ser construído usando técnicas conhe- cidas para fornecer pelo menos o seguinte como componentes opera- cionalmente ligados na direção da transcrição: (1) uma sequência 5’ ITR; (2) um cassete de expressão contendo um elemento regulador cis, por exemplo, um promotor, promotor induzível, comutador regula- dor, intensificadores e similares; e (3) uma sequência 3’ ITR, em que a sequência 3’ ITR é assimétrica em relação à sequência 5’ ITR . Em algumas modalidades, o cassete de expressão flanqueada pelas ITRs compreende um sítio de clonagem para a introdução de uma sequên- cia exógena. O cassete de expressão substitui as regiões de codifica- ção rep e cap dos genomas de AAV.
[00252] Em um aspecto, um vetor de ceDNA é obtido a partir de um plasmídeo, aqui referido como um "plasmídeo de ceDNA", codificando nesta ordem: uma primeira repetição terminal invertida (ITR) do vírus adenoassociado (AAV), um cassete de expressão que compreende um transgene e uma ITR de AAV mutado ou modificado, em que o dito plasmídeo de ceDNA é desprovido de sequências codificadoras da proteína do capsídeo AAV. Em modalidades alternativas, o plasmídeo de ceDNA codifica nesta ordem: uma primeira ITR de AAV modificada ou mutada, um cassete de expressão que compreende um transgene e uma segunda (ou 3’) ITR de AAV do tipo selvagem, em que o dito ceDNA O plasmídeo é desprovido de sequências de codificação da proteína do capsídeo AAV e em que as ITRs 5’ e 3’ são assimétricas entre si. Em modalidades alternativas, o plasmídeo de ceDNA codifica nesta ordem: uma primeira ITR de AAV modificada ou mutada, um cassete de expressão que compreende um transgene e uma segunda (ou 3’) ITR de AAV mutada ou modificada, em que o dito ceDNA O plasmídeo é desprovido de sequências de codificação da proteína do capsídeo AAV e em que as ITRs modificadas em 5’ e 3’ são diferentes e não têm as mesmas modificações.
[00253] Em uma modalidade adicional, o sistema de plasmídeo de ceDNA é desprovido de sequências codificantes da proteína do capsí- deo viral (isto é, desprovido de genes da capsídeo do AAV, mas tam- bém de genes da capsídeo de outros vírus). Além disso, em uma mo- dalidade específica, o plasmídeo de ceDNA também é desprovido de sequências de codificação da proteína AAV Rep. Por conseguinte, em uma modalidade preferencial, o plasmídeo de ceDNA é desprovido dos genes funcionais de AAV cap e de rep de AAV GG-3’ para AAV2) mais uma sequência palindrômica variável que permite a formação de grampo de cabelo.
[00254] Um plasmídeo de ceDNA da presente invenção pode ser gerado usando sequências nucleotídicas naturais dos genomas de quaisquer sorotipos AAV bem conhecidos na técnica. Em uma modali- dade, a estrutura principal do plasmídeo de ceDNA é derivada dos ge- nomas AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ e AAV- DJ8. Por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin e Smith, The Springer Index of Virus, disponível na URL mantida pela Springer (no endereço web: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(note -referências para um URL ou banco de dados refere-se ao conteúdo da URL ou banco de dados a partir da data efetiva de depósito deste pedido). Em uma modalidade específica, a estrutura principal do plas-
mídeo de ceDNA é derivada do genoma do AAV2. Em outra modalida- de particular, a estrutura principal de plasmídeo de ceDNA é uma es- trutura principal sintética geneticamente modificada para incluir em su- as ITRs 5’ e 3’ derivadas de um desses genomas de AAV.
[00255] Um plasmídeo de ceDNA pode opcionalmente incluir um marcador selecionável ou de seleção para uso no estabelecimento de uma linha celular produtora de vetor de ceDNA. Em uma modalidade, o marcador de seleção pode ser inserido a jusante (isto é, 3’) da se- quência 3’ ITR. Em outra modalidade, o marcador de seleção pode ser inserido a montante (isto é, 5’) da sequência 5’ ITR. Marcadores de seleção apropriados incluem, por exemplo, aqueles que conferem re- sistência ao medicamento. Os marcadores de seleção podem ser, por exemplo, um gene de resistência a blasticidina S, canamicina, geneti- cina e similares. Em uma modalidade preferencial, o marcador de se- leção de fármacos é um gene de resistência à blasticidina S.
[00256] Um ceDNA exemplificador (por exemplo, rAAV0) é produzi- do a partir de um plasmídeo rAAV. Um método para a produção de um vetor rAAV pode compreender: (a) fornecer uma célula hospedeira com um plasmídeo rAAV como descrito acima, em que tanto a célula hospedeira quanto o plasmídeo são desprovidos de genes que codifi- cam a proteína do capsídeo, (b) cultivam o hospedeiro célula sob con- dições que permitem a produção de um genoma de ceDNA, e (c) co- lher as células e isolar o genoma de AAV produzido a partir das referi- das células. C. Método exemplificador de produção de vetores de ceDNA a partir de plasmídeos de ceDNA
[00257] Os métodos para produzir vetores de ceDNA sem capsídeo também são aqui fornecidos, notadamente um método com um rendi- mento suficientemente alto para fornecer vetor suficiente para experi- mentos in vivo.
[00258] Em algumas modalidades, um método para a produção de um vetor de ceDNA compreende as etapas de: (1) introduzir o constru- to de ácido nucleico que compreende um cassete de expressão e duas sequências de ITR assimétricas em uma célula hospedeira (por exem- plo, células Sf9), (2) opcionalmente, estabelecer uma linha celular clo- nal, por exemplo, usando um marcador de seleção presente no plas- mídeo, (3) introduzir um gene de codificação Rep (por transfecção ou infecção com um baculovírus carregando o dito gene) na referida célu- la de inseto, e (4) colher a célula e purificar o vetor de ceDNA. O cons- truto de ácido nucleico que compreende um cassete de expressão e duas sequências de ITR descritas acima para a produção do vetor AAV sem capsídeo pode estar na forma de um plasmídeo cfAAV, ou Bacmídeo ou Baculovírus gerado com o plasmídeo cfAAV como des- crito abaixo. O construto de ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira por transfecção, transdução viral, integração estável ou outros métodos conhecidos na técnica. D. Linhas celulares:
[00259] As linhas celulares hospedeiras usadas na produção de um vetor de ceDNA podem incluir linhas celulares de insetos derivadas de Spodoptera frugiperda, como Sf9 Sf21, ou Trichoplusia ni cell, ou ou- tras linhas celulares invertebradas, vertebradas ou outras linhas celula- res eucarióticas, incluindo células de mamíferos. Também podem ser usadas outras linhas celulares conhecidas por um técnico no assunto, como HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, monócitos e dendríticos maduros e imaturos células. As linhas celulares hospedeiras podem ser transfectadas para expressão estável do plasmídeo ceDBA para produção de vetor de ceDNA de alto rendimento.
[00260] ceDNA plasmídicos podem ser introduzidos em células Sf9 por transientes de transfecção utilizando reagentes (por exemplo, li-
possomas, fosfato de cálcio) ou meios físicos (por exemplo, eletropo- ração) conhecidos na técnica. Alternativamente, linhas celulares Sf9 estáveis que têm estavelmente integrado o ceDNA-plasmídeo nos seus genomas podem ser estabelecidas. Tais linhas celulares estáveis podem ser estabelecidas pela incorporação de um marcador de sele- ção para a ceDNA-plasmídeo como descrito acima. Se o plasmídeo de ceDNA usado para transfectar a linha celular incluir um marcador de seleção, como um antibiótico, as células que foram transfectadas com o plasmídeo de ceDNA e integraram o DNA do plasmídeo de ceDNA em seu genoma podem ser selecionadas por adição do antibiótico pa- ra o meio de crescimento celular. Os clones resistentes das células podem então ser isolados por diluição de célula única ou por técnicas de transferência de colônias e propagados. E. Isolamento e purificação de vetores de ceDNA:
[00261] Exemplos do processo para obter e isolar vetores de ceD- NA são descritos nas Figuras 4A-4E e os exemplos específicos abai- xo. Os vetores de ceDNA aqui descritos podem ser obtidos a partir de uma célula produtora que expressa a proteína (ou proteínas) Rep de AAV, posteriormente transformada com um plasmídeo de ceDNA, ce- DNA-bacmídeo ou ceDNA-baculovírus. Os plasmídeos úteis para a produção de vetores de ceDNA incluem plasmídeos mostrados na Fi- gura 8A (útil para produção de Rep BIICs), na Figura 8B (plasmídeo usado para obter um vetor de ceDNA).
[00262] Em um aspecto, um polinucleotídeo codifica a proteína Rep de AAV (Rep 78 ou 68) entregue a uma célula produtora em um plas- mídeo (Rep-plasmídeo), um bacmídeo (Rep-bacmídeo) ou um baculo- vírus (Rep-baculovírus). O Rep-plasmídeo, Rep-bacmídeo e Rep- baculovírus podem ser gerados pelos métodos descritos acima.
[00263] Os métodos para produzir um vetor de ceDNA, que é um vetor de ceDNA exemplar, são descritos no presente documento. Os construtos de expressão usados para gerar vetores de ceDNA da pre- sente invenção podem ser um plasmídeo (por exemplo, plasmídeos de ceDNA), um Bacmídeo (por exemplo, ceDNA-bacmídeo) e/ou um ba- culovírus (por exemplo, ceDNA-baculovírus). Apenas a título de exem- plo, um vetor de ceDNA pode ser gerado a partir das células coinfec- tadas com ceDNA-baculovírus e Rep-baculovírus. As proteínas Rep produzidas a partir do Rep-baculovírus podem replicar o ceDNA- baculovírus para gerar vetores de ceDNA. Alternativamente, os veto- res ceDNA podem ser gerados a partir de células transfectadas de forma estável com um construto que compreende uma sequência que codifica a proteína Rep de AAV (Rep78/52) entregue em Rep- plasmídeos, Rep-bacmídeos ou Rep-baculovírus. O ceDNA- Baculovírus pode ser transfectado transitoriamente para as células, ser replicado pela proteína Rep e produzir vetores de ceDNA.
[00264] O bacmídeo (por exemplo, ceDNA-bacmídeo) pode ser transfectado para células de inseto permissivas, como a célula Sf9, Sf21, Tni (Trichoplusia ni), célula High Five, e gerar ceDNA- baculovírus, que é um baculovírus recombinante, incluindo as sequên- cias que compreende as ITRs assimétricas e o cassete de expressão. O ceDNA-baculovírus pode ser novamente infectado nas células de insetos para obter uma próxima geração do baculovírus recombinante. Opcionalmente, a etapa pode ser repetida uma ou várias vezes para produzir o baculovírus recombinante em uma quantidade maior.
[00265] O tempo para colher e coletar vetores de ceDNA aqui des- critos a partir das células pode ser selecionado e otimizado para al- cançar uma produção de alto rendimento dos vetores de ceDNA. Por exemplo, o tempo de colheita pode ser selecionado em vista da viabili- dade celular, morfologia celular, crescimento celular, etc. Normalmen- te, as células podem ser colhidas após tempo suficiente após a infec- ção baculoviral para produzir vetores de ceDNA (por exemplo, vetores de ceDNA), mas antes de a maioria das células começar a morrer por causa da toxicidade viral. Os vetores de ceDNA podem ser isolados das células Sf9 usando kits de purificação de plasmídeos, como os kits Qiagen ENDO-FREE PLASMID®. Outros métodos desenvolvidos para o isolamento de plasmídeo também podem ser adaptados para veto- res de ceDNA. Geralmente, qualquer método de purificação de ácido nucleico conhecido na técnica pode ser adotado, bem como kits de extração de DNA disponíveis comercialmente.
[00266] Alternativamente, a purificação pode ser implantada subme- tendo um sedimento celular a um processo de lise alcalina, centrifu- gando o lisado resultante e realizando a separação cromatográfica. Como um exemplo não limitativo, o processo pode ser realizado carre- gando o sobrenadante em uma coluna de troca iônica (por exemplo, SARTOBIND Q®) que retém ácidos nucleicos e eluindo (por exemplo, com uma solução de NaCl 1,2 M) e realizando uma purificação croma- tográfica adicional em uma coluna de filtração em gel (por exemplo, 6 GE de fluxo rápido). O vetor AAV sem capsídeo é então recuperado por, por exemplo, precipitação.
[00267] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA também podem ser purificados na forma de exossomos ou micropartículas. Sa- be-se na técnica que muitos tipos de células liberam não apenas pro- teínas solúveis, mas também cargas complexas de proteínas/ácidos nucleicos via desprendimento de microvesículas de membrana (Co- cucci et al, 2009; EP 10306226.1). Essas vesículas incluem microvesí- culas (também conhecidas como micropartículas) e exossomos (tam- bém chamados de nanovesículas), que compreendem proteínas e RNA como carga. As microvesículas são geradas a partir da brotação direta da membrana plasmática, e os exossomos são liberados no ambiente extracelular mediante a fusão dos endossomos multivesicu- lares com a membrana plasmática. Assim, microvesículas e/ou exos-
somos contendo vetores de ceDNA podem ser isolados de células que foram transduzidas com o plasmídeo de ceDNA ou com um bacmídeo ou baculovírus gerado com o plasmídeo de ceDNA.
[00268] As microvesículas podem ser isoladas submetendo o meio de cultura à filtração ou ultracentrifugação a 20.000 xg e exossomos a
100.000 x g. A duração ideal da ultracentrifugação pode ser determi- nada experimentalmente e dependerá do tipo de célula específico do qual as vesículas são isoladas. De preferência, o meio de cultura é limpo primeiro por centrifugação a baixa velocidade (por exemplo, a
2.000 xg por 5 a 20 minutos) e submetido à concentração de centrifu- gação usando, por exemplo, uma coluna de centrifugação AMICON® (Millipore, Watford, Reino Unido). Microvesículas e exossomos podem ser ainda mais purificados via FACS ou MACS usando anticorpos es- pecíficos que reconhecem antígenos de superfície específicos presen- tes nas microvesículas e exossomos. Outros métodos de purificação de microvesículas e exossomos incluem, sem limitação, imunoprecipi- tação, cromatografia de afinidade, filtração e esferas magnéticas re- vestidas com anticorpos ou aptâmeros específicos. Após a purificação, as vesículas são lavadas com, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato. Uma vantagem do uso de microvesículas ou exossomos para fornecer vesículas contendo ceDNA é que essas vesículas po- dem ser direcionadas a vários tipos de células, incluindo em suas membranas proteínas reconhecidas por receptores específicos nos respectivos tipos de células (consulte também o documento EP 10306226).
[00269] Outro aspecto da invenção aqui relacionado refere-se a mé- todos de purificação de vetores de ceDNA de linhas celulares hospe- deiras que integraram estavelmente uma construção de ceDNA em seu próprio genoma. Em uma modalidade, os vetores de ceDNA são purificados como moléculas de DNA. Em outra modalidade, os vetores de ceDNA são purificados como exossomos ou micropartículas.
[00270] A Figura 5 mostra um gel confirmando a produção de ceD- NA a partir de múltiplos construtos de plasmídeo de ceDNA usando o método descrito nos Exemplos. O ceDNA é confirmado por um padrão característico de banda no gel, como discutido em relação à Figura 4D nos exemplos. Outras características do processo de produção de ce- DNA e intermediários estão resumidas nas Figuras 6A e 6B, e Figuras 7A e 7B, como descrito nos Exemplos. VII. Composições farmacêuticas
[00271] Em outro aspecto, composições farmacêuticas são forneci- das. A composição farmacêutica compreende um vetor de ceDNA co- mo descrito no presente documento e um veículo ou diluente farma- ceuticamente aceitável.
[00272] Os vetores de DNA aqui descritos podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo para entrega in vivo a células, tecidos ou órgãos do indiví- duo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um vetor de ceDNA como descrito no presente documento e um veículo farma- ceuticamente aceitável. Por exemplo, os vetores de ceDNA aqui des- critos podem ser incorporados em uma composição farmacêutica ade- quada para uma via desejada de administração terapêutica (por exemplo, administração parentérica). Transdução passiva de tecido por infusão intravenosa ou intra-arterial de alta pressão, bem como injeção intracelular, como microinjeção intranuclear ou injeção intraci- toplasmática, também são contempladas. As composições farmacêuti- cas para fins terapêuticos podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. As soluções in- jetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto do vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, con- forme necessário, seguido de esterilização filtrada.
[00273] As composições farmaceuticamente ativas que compreen- de um vetor de ceDNA podem ser formuladas para entregar um trans- gene no ácido nucleico às células de um receptor, resultando na ex- pressão terapêutica do transgene no mesmo. A composição também pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00274] Um vetor de ceDNA como descrito no presente documento pode ser incorporado a uma composição farmacêutica adequada para uso tópico, sistêmico, intra-amniótico, intratecal, intracraniano, intra- arterial, intravenoso, intralinfático, intraperitoneal, subcutâneo, tra- queal, intratecido (por exemplo, intramuscular, intracardíaca, intra- hepática, intrarrenal, intracerebral), intratecal, intravesical, conjuntival (por exemplo, extraorbital, intraorbital, retro orbital, intraretinal, sub- retiniana, coroidal, sub-coroidal, intrastromal, intracameral e intraví- trea), intracoclear e oral (mucosa) administração retal, nasal). Trans- dução passiva de tecido por infusão intravenosa ou intra-arterial de alta pressão, bem como injeção intracelular, como microinjeção in- tranuclear ou injeção intracitoplasmática, também são contempladas.
[00275] As composições farmacêuticas para fins terapêuticos ge- ralmente devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solu- ção, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. As soluções in- jetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto do vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, con- forme necessário, seguido de esterilização filtrada.
[00276] Várias técnicas e métodos são conhecidos na técnica para fornecer ácidos nucleicos às células. Por exemplo, ácidos nucleicos,
como ceDNA podem ser formulados em nanopartículas lipídicas (LNPs), lipidoides, lipossomas, nanopartículas lipídicas, lipoplexes ou nanopartículas com casca de núcleo. Normalmente, os LNPs são compostos de moléculas de ácido nucleico (por exemplo, ceDNA), um ou mais lipídios ionizáveis ou catiônicos (ou seus sais), um ou mais lipídios não iônicos ou neutros (por exemplo, um fosfolipídio), uma mo- lécula que impede a agregação (por exemplo, PEG ou um conjugado de lipídio PEG) e, opcionalmente, um esterol (por exemplo, colesterol).
[00277] Outro método para fornecer ácidos nucleicos, como ceDNA a uma célula, é conjugando o ácido nucleico com um ligante que é in- ternalizado pela célula. Por exemplo, o ligante pode se ligar a um re- ceptor na superfície celular e internalizado via endocitose. O ligando pode ser covalentemente ligado a um nucleotídeo no ácido nucleico. Conjugados exemplificadores para a entrega de ácidos nucleicos em uma célula são descritos, por exemplo, nos documentos WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 e WO2017/177326.
[00278] Os ácidos nucleicos, como o ceDNA, também podem ser entregues a uma célula por transfecção. Os métodos úteis de trans- fecção incluem, sem limitação, transfecção mediada por lipídios, trans- fecção catiônica mediada por polímero ou precipitação com fosfato de cálcio. Os reagentes de transfecção são bem conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, Reagente de Transfecção TurboFect (Thermo Fisher Scientific), Reagente Pro-Ject (Thermo Fisher Scientific), Rea- gente de Transfecção de Proteína TRANSPASS™ P (New England Biolabs), Reagente CHARIOT™ para administração de proteínas (mo- tivo ativo), Reagente de transfecção de proteínas PROTEOJUICE™ (EMD Millipore), 293fectina, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTA-
MINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), DMRIE - C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™ (Roche, Ba- sileia, Suíça), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFECTAM™ (Transfec- tam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™ (Promega), TFX-20™ (Pro- mega), TFX-50™ (Promega), TRANSFECTIN™ (BioRad, Hercules, Califórnia), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Valencia, Califórnia), DC-chol (lipídios polares avanti), GENEPORTER™ (Gene Therapy Systems, San Diego, Califórnia), DHARMAFECT 1™ (Dhar- macon, Lafayette, Colorado), DHARMAFECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMAFECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, St. Louis, Mo.) e ESCORT™ IV (Sigma Chemi- cal Co.). Os ácidos nucleicos, como ceDNA, também podem ser en- tregues a uma célula através de métodos microfluídicos conhecidos dos técnicos no assunto.
[00279] Métodos de entrega não viral de ácidos nucleicos in vivo ou ex vivo incluem eletroporação, lipofecção (consulte Patente US
5.049.386; 4.946.787 e reagentes disponíveis comercialmente, como Transfectam™ e Lipofectin™), microinjeção, biolística, virossomas li- possomas (consulte, por exemplo, Crystal, Science 270: 404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4817-4820 (1992); Patentes no US
4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728,
4.774.085, 4.837.028 e 4.946.787), imunolipossomas, policátions ou lipídios: conjugados de ácidos nucleicos, DNA nu e captação de DNA melhorada por agente. A sonoporação usando, por exemplo, o sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) também pode ser usado para a entrega de ácidos nucleicos.
[00280] Os vetores de ceDNA como aqui descritos também podem ser administrados diretamente a um organismo para transdução de células in vivo. A administração é realizada por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma molécula no contato final com células sanguíneas ou teciduais, incluindo, entre outras, injeção, infusão, aplicação tópica e eletroporação. Os métodos adequados pa- ra administrar esses ácidos nucleicos estão disponíveis e são bem co- nhecidos dos técnicos no assunto e, embora mais de uma rota possa ser usada para administrar uma composição específica, uma rota es- pecífica pode frequentemente fornecer uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra rota.
[00281] Métodos para introdução de um vetor de ceDNA de vetor de ácido nucleico, como descrito no presente documento, podem ser entregues em células-tronco hematopoiéticas, por exemplo, pelos mé- todos descritos, por exemplo, na Patente no US 5.928.638.
[00282] Os vetores de ceDNA de acordo com a presente invenção podem ser adicionados aos lipossomas para entrega a uma célula ou órgão-alvo em um indivíduo. Lipossomas são vesículas que possuem pelo menos uma bicamada lipídica. Os lipossomas são tipicamente usados como transportadores para entrega de medicamen- tos/terapêuticos no contexto do desenvolvimento farmacêutico. Eles trabalham fundindo-se com uma membrana celular e reposicionando sua estrutura lipídica para fornecer um medicamento ou ingrediente farmacêutico ativo (API). As composições de lipossomas para essa distribuição são compostas por fosfolipídios, especialmente compostos com um grupo fosfatidilcolina, no entanto, essas composições também podem incluir outros lipídios.
[00283] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomas que inclui um ou mais compostos com um grupo funci-
onal de polietilenoglicol (PEG) (os chamados "compostos PEGuila- dos") que podem reduzir a imunogenicidade/antigenicidade de forne- cer hidrofilicidade e hidrofobicidade para o composto (ou compostos) e reduzir a frequência de dosagem. Ou a formulação de lipossomas simplesmente inclui polímero de polietileno glicol (PEG) como um componente adicional. Em tais aspectos, o peso molecular do grupo funcional PEG ou PEG pode ser de 62 Da a cerca de 5.000 Da.
[00284] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomas que fornecerá uma API com perfil de liberação prolon- gada ou liberação controlada durante um período de horas a semanas. Em alguns aspectos relacionados, a formulação de lipossomas pode compreender câmaras aquosas que são ligadas por bicamadas lipídi- cas. Em outros aspectos relacionados, a formulação de lipossomas encapsula uma API com componentes que passam por uma transição física a temperatura elevada que libera a API durante um período de horas a semanas.
[00285] Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compre- ende esfingomielina e um ou mais lipídios aqui descritos. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende optissomas.
[00286] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossoma que inclui um ou mais lipídios selecionados de: N- (carbonil-metoxipolietileno glicol 2000) sal de -1,2-distearoil-sn-glicero- 3-fosfoetanolamina sódio, (lipídio conjugado com distearoil-sn- glicerofosfoetanolamina), MPEG (metoxi polietilenoglicol), HSPC (HSPC (fosfatidilcolina de soja hidrogenada); PEG (polietileno glicol); DSPE (distearoil-sn-glicerofosfoetanolamina); DSPC (distearoilfosfati- dilcolina); DOPC (dioleoilfosfatidilcolina); DPPG (dipalmitoilfosfatidilgli- cerol); EPC (fosfatidilcolina de ovo); DOPS (dioleoilfosfatidilserina); POPC (palmitoiloleoilfosfatidilcolina); SM (esfingomielina); MPEG (me- toxi polietileno glicol); DMPC (dimiristoil fosfatidilcolina); DMPG (dimi-
ristoilfosfatidilglicerol); DSPG (distearoilfosfatidilglicerol); DEPC (dieru- coilfosfatidilcolina); DOPE (dioleol-sn-glicerofosfoetanolamina). sulfato de colesteril (CS), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), DOPC (dioleol- sn-glicerofosfatidilcolina) ou qualquer combinação dos mesmos.
[00287] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que compreende fosfolipídio, colesterol e um lipídio PE- Guilado em uma razão molar de 56:38:5. Em alguns aspectos, o con- teúdo lipídico geral da formulação lipossômica é de 2 a 16 mg/mL. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcoli- na, um lipídio contendo um grupo funcional etanolamina e um lipídio PEGuilado. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, um lipídio contendo um grupo funcional etanolamina e um lipídio PEGuilado em uma razão molar de 3:0,015:2, respectiva- mente. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, colesterol e um lipídio PEGuilado. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina e colesterol. Em alguns aspectos, o lipídio PEGuilado é PEG-2000-DSPE. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que com- preende DPPG, PC de soja, conjugado lipídico MPEG-DSPE e coles- terol.
[00288] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que compreende um ou mais lipídios contendo um grupo funcional fosfatidilcolina e um ou mais lipídios contendo um grupo fun- cional etanolamina. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que compreende um ou mais: lipídios con- tendo um grupo funcional fosfatidilcolina, lipídios contendo um grupo funcional etanolamina e esteróis, por exemplo, colesterol. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende DOPC/DEPC; e DOPE.
[00289] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que compreende ainda um ou mais excipientes farma- cêuticos, por exemplo, sacarose e/ou glicina.
[00290] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomas que é murcha na estrutura unilamelar ou multilamelar. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de liposso- mas que compreende partículas multivesiculares e/ou partículas à ba- se de espuma. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formula- ção de lipossomas que são maiores em tamanho relativo às nanopar- tículas comuns e cerca de 150 a 250 nm em tamanho. Em alguns as- pectos, a formulação de lipossomas é um pó liofilizado.
[00291] Em alguns aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo que é feita e carregada com vetores de ceDNA descritos ou descritos no presente documento, adicionando uma base fraca a uma mistura com o ceDNA isolado fora do lipossomo. Essa adição aumenta o pH fora dos lipossomos para aproximadamente 7,3 e leva a API ao lipossomo. Em alguns aspectos, a descrição fornece uma for- mulação de lipossomo com um pH ácido no interior do lipossomo. Nesses casos, o interior do lipossoma pode estar em pH 4 a 6,9 e, mais preferencialmente, em pH 6,5. Em outros aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomo feita usando a tecnologia de estabilização de fármacos intralipossômica. Nesses casos, são usados ânions poliméricos ou não poliméricos de alta carga e agentes de cap- tura intralipossômicos, por exemplo, polifosfato ou octasulfato de saca- rose.
[00292] Em outros aspectos, a descrição fornece uma formulação de lipossomas que compreende fosfolipídios, lecitina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina.
[00293] Reagentes de entrega, como lipossomos, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas e simila- res, podem ser usados para a introdução das composições da presen- te descrição em células hospedeiras adequadas. Em particular, os áci- dos nucleicos podem ser formulados para entrega encapsulados em uma partícula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma nanosfera, uma nanopartícula, uma partícula de ouro ou semelhante. Tais formu- lações podem ser preferencias para a introdução de formulações far- maceuticamente aceitáveis dos ácidos nucleicos aqui descritos.
[00294] Vários entrega métodos conhecidos na técnica ou modifica- ção dos mesmos pode ser usado para entregar vetores de ceDNA in vitro ou in vivo. Por exemplo, em algumas modalidades, vetores de ceDNA são entregues fazendo penetração transiente na membrana celular por mecânica, eléctrica, ultrassons, hidrodinâmico, ou à base de laser de energia de modo que o DNA de entrada para as segmen- tadas células é facilitado. Por exemplo, um vetor de ceDNA pode ser entregue por transitoriamente perturbar célula de membrana por aper- tando a célula através de uma restrição de tamanho de canal ou por outros meios conhecidos na técnica. Em alguns casos, um vetor de ceDNA sozinho é injetado diretamente como DNA nu na pele, timo, músculo cardíaco, músculo esquelético ou células hepáticas.
[00295] Em alguns casos, um vetor de ceDNA é entregue por pisto- la de gene. Partículas esféricas de ouro ou tungstênio (1–3 μm de di- âmetro) revestidas com vetores de AAV sem capsídeo podem ser ace- leradas em alta velocidade por gás pressurizado para penetrar nas cé- lulas alvo do tecido.
[00296] Em algumas modalidades, a eletroporação é usada para fornecer os vetores de ceDNA. A eletroporação causa desestabiliza- ção temporária do tecido da célula alvo da membrana celular através da inserção de um par de eletrodos no tecido, de modo que as molé- culas de DNA no meio circundante da membrana desestabilizada pos- sam penetrar no citoplasma e no nucleoplasma da célula. A eletropo- ração tem sido usada in vivo para muitos tipos de tecidos, como pele, pulmão e músculo.
[00297] Em alguns casos, um vetor de ceDNA é entregue por inje- ção hidrodinâmica, que é um método simples e altamente eficiente pa- ra a entrega intracelular direta de quaisquer compostos e partículas solúveis em água em órgãos internos e músculo esquelético em um membro inteiro.
[00298] Em alguns casos, os vetores de ceDNA são entregues por ultrassom, produzindo poros nanoscópicos na membrana para facilitar a entrega intracelular de partículas de DNA nas células de órgãos ou tumores internos, de modo que o tamanho e a concentração do DNA do plasmídeo têm um grande papel na eficiência do sistema. Em al- guns casos, os vetores de ceDNA são entregues por magnetofecção usando campos magnéticos para concentrar partículas contendo ácido nucleico nas células alvo.
[00299] Em alguns casos, os sistemas de entrega de produtos quí- micos podem ser usados, por exemplo, usando complexos nanoméri- cos, que incluem a compactação de ácido nucleico com carga negativa por partículas nanoméricas policatiônicas, pertencentes a lipossomos catiônicos/micelas ou polímeros catiônicos. Os lipídios catiônicos usa- dos para o método de entrega incluem, entre outros, lipídios catiônicos monovalentes, lipídios catiônicos polivalentes, compostos contendo guanidina, compostos derivados de colesterol, polímeros catiônicos (por exemplo, poli (etilenimina), poli-L-lisina, protamina, outros catiôni- cos polímeros) e híbrido lipídio-polímero. A. Exossomos:
[00300] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como des-
crito no presente documento é entregue por ser empacotado em um exossomo. Os exossomos são pequenas vesículas de membrana de origem endocítica que são liberadas no ambiente extracelular após a fusão de corpos multivesiculares com a membrana plasmática. Sua superfície consiste em uma bicamada lipídica da membrana celular da célula doadora, eles contêm citosol da célula que produziu o exosso- mo e exibem proteínas da membrana da célula parental na superfície. Os exossomos são produzidos por vários tipos de células, incluindo células epiteliais, linfócitos B e T, mastócitos (MC) e células dendríti- cas (DC). Algumas modalidades, exossomos com um diâmetro entre 10 nm e 1 μm, entre 20 nm e 500 nm, entre 30 nm e 250 nm, entre 50 nm e 100 nm, estão previstos para uso. Os exossomos podem ser iso- lados para uma entrega às células-alvo usando suas células doadoras ou introduzindo ácidos nucleicos específicos nelas. Várias abordagens conhecidas na técnica podem ser usadas para produzir exossomos contendo vetores de AAV sem capsídeo da presente invenção. B. Micropartículas/nanopartículas:
[00301] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA conforme descrito no presente documento é entregue por uma nanopartícula li- pídica. Geralmente, as nanopartículas lipídicas compreendem um ami- no lipídio ionizável (por exemplo, 4-(dimetilamino)butanoato de hepta- triaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ila, DLin-MC3-DMA, uma fosfatidilcolina (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DSPC), colesterol e um reves- timento lipídico (polietileno glicol-dimiristolglicerol, PEG-DMG), por exemplo como descrito por Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nano- particles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507.
[00302] Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro médio entre cerca de 10 e cerca de 1.000 nm. Em algu- mas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro inferior a 300 nm. Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro entre cerca de 10 e cerca de 300 nm. Em algumas moda- lidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro inferior a 200 nm. Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro entre cerca de 25 e cerca de 200 nm. Em algumas modalidades, uma preparação de nanopartículas lipídicas (por exemplo, composição que compreende uma pluralidade de nanopartículas lipídicas) tem uma dis- tribuição de tamanho na qual o tamanho médio (por exemplo, diâme- tro) é de cerca de 70 nm a cerca de 200 nm e, mais tipicamente, o ta- manho médio é de cerca de 100 nm ou menos.
[00303] Várias nanopartículas lipídicas conhecidas na técnica po- dem ser usadas para fornecer o vetor de ceDNA descrito no presente documento. Por exemplo, vários métodos de administração com o uso de nanopartículas lipídicas são descritos nas patentes no US
9.404.127, 9.006.417 e 9.518.272.
[00304] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA aqui des- crito é entregue por uma nanopartícula de ouro. Geralmente, um ácido nucleico pode ser ligado covalentemente a uma nanopartícula de ouro ou não covalentemente a uma nanopartícula de ouro (por exemplo, ligado por uma interação carga-carga), por exemplo, como descrito por Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22 (6); 1075-1083. Em algumas modalidades, os conjugados de nanopartículas de ácido nucleico de ouro são produzidos usando mé- todos descritos, por exemplo, na Patente no US 6.812.334. C. Lipossomas
[00305] A formação e uso de lipossomas é geralmente conhecida pelos técnicos no assunto. Os lipossomas foram desenvolvidos com melhor estabilidade do soro e circulação por meio tempo (Patente dos EUA No. 5.741.516). Além disso, foram descritos vários métodos de preparações lipossômicas e similares a lipossomas como potenciais transportadores de fármacos (Patentes no US 5.567.434; 5.552.157;
5.565.213; 5.565.213; 5.738.868 e 5.795.587).
[00306] Os lipossomas foram usados com sucesso com vários tipos de células que normalmente são resistentes à transfecção por outros procedimentos. Além disso, os lipossomos estão livres das restrições de comprimento do DNA, típicas dos sistemas de entrega com base em vírus. Os lipossomas foram usados eficazmente para introduzir ge- nes, fármacos, agentes radioterapêuticos, vírus, fatores de transcrição e efetores alostéricos em uma variedade de linhas celulares e animais cultivados. Além disso, vários ensaios clínicos bem-sucedidos que examinam a eficácia da administração de medicamentos mediada por lipossomas foram concluídos.
[00307] Os lipossomas são formados a partir de fosfolipídios dis- persos em meio aquoso e formam espontaneamente vesículas concili- ares multicamadas concêntricas multilamelares (também denominadas vesículas multilamelares (MLVs). As MLVs geralmente têm diâmetros de 25 nm a 4 µm. A sonicação dos MLVs resulta na formação de pe- quenas vesículas unilamelares (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 ANG., contendo uma solução aquosa no núcleo.
[00308] Em algumas modalidades, um lipossomo compreende lipí- dios catiônicos. O termo "lipídio catiônico" inclui lipídios e lipídios sinté- ticos com domínios polares e não polares e que têm capacidade de serem carregados positivamente no pH fisiológico ou próximo aos mesmos e que se ligam a poliânions, como ácidos nucleicos, e facili- tam a entrega de ácidos nucleicos em células. Em algumas modalida- des, lipídios catiônicos incluem éteres alquílicos e alicíclicos saturados e insaturados e ésteres de aminas, amidas ou derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, os lipídios catiônicos compreendem grupos alquila de cadeia linear, alquila ramificados, alquenila ou qualquer combinação dos anteriores. Em algumas modalidades, os lipídios ca- tiônicos contêm de 1 a cerca de 25 átomos de carbono (por exemplo,
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 átomos de carbono. Em algumas modalidades, lipídios catiônicos contêm mais de 25 átomos de carbono. Em algumas moda- lidades, os grupos alquila ou alceno de cadeia linear ou ramificada têm seis ou mais átomos de carbono átomos. Um lipídio catiônico também pode compreender, em algumas modalidades, um ou mais grupos ali- cíclicos. Exemplos não limitativos de grupos alicíclicos incluem coles- terol e outros grupos de esteroides. Em algumas modalidades, os lipí- dios catiônicos são preparados com um ou mais contraíons. Exemplos dos contraíons (ânions) incluem, sem limitação, Cl-, Br-, I-, F-, acetato, trifluoroacetato, sulfato, nitrito e nitrato.
[00309] Exemplos não limitativos de lipídios catiônicos incluem poli- etilenimina, dendrímeros de explosão de estrela em poliamidoamina (PAMAM), Lipofectina (uma combinação de DOTMA e DOPE), Lipo- fectase, LIPOFECTAMINE™ (por exemplo, LIPOFECTAMINE™ 2000), DOPE, citofectina (Gilead Sciences, Gilead Sciences City, Cali- fórnia), e Eufectins (JBL, San Luis Obispo, Califórnia). Lipossomas ca- tiônicos exemplificativos podem ser produzidos a partir de cloreto de N-[1-(2,3-dioleoloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), N-[1-(2,3- dioleoloxi)-propil] metilsulfato de -N,N,N-trimetilamônio (DOTAP), 3β- [N-(N′,N′-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), 2,3,- diioliloxi-N-[2(esperminecarboxamido) trifluoroacetato de etil], -N,N- dimetil-1-propanamina (DOSPA), brometo de 1,2-dimiriloxipropil-3- dimetil-hidroxietil amônio; e brometo de dimetildioctadecilamônio (DDAB). Os ácidos nucleicos (por exemplo, CELiD) também podem ser complexos com, por exemplo, poli(L-lisina) ou avidina e lipídios podem ou não ser incluídos nessa mistura, por exemplo, esteril-poli(L- lisina).
[00310] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como des- crito no presente documento é entregue usando um lipídio catiônico descrito na Patente no US 8.158.601, ou um composto ou lipídio de poliamina como descrito na Patente no US 8.034.376. D. Conjugados
[00311] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA conforme aqui descrito é conjugado (por exemplo, ligado covalentemente a um agente que aumenta a captação celular. Um "agente que aumenta a captação celular" é uma molécula que facilita o transporte de um ácido nucleico através de uma membrana lipídica. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser conjugado com um composto lipofílico (por exemplo, colesterol, tocoferol, etc.), um peptídeo penetrante na célula (CPP) (por exemplo, penetratina, TAT, Syn1B, etc), e poli-aminas (por exem- plo, espermina). Outros exemplos de agentes que aumentam a absor- ção celular estão descritos, por exemplo, em Winkler (2013). Oligonu- cleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4 (7); 791-
809.
[00312] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como des- crito no presente documento é conjugado com um polímero (por exemplo, uma molécula polimérica) ou uma molécula de folato (por exemplo, molécula de ácido fólico). Geralmente, a entrega de ácidos nucleicos conjugados a polímeros é conhecida na técnica, por exem- plo, como descrito nos documentos WO2000/34343 e WO2008/022309. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA co- mo descrito no presente documento é conjugado com um polímero de poli (amida), por exemplo, como descrito pela Patente no US
8.987.377. Em algumas modalidades, um ácido nucleico descrito pela descrição é conjugado com uma molécula de ácido fólico como des- crito na Patente no US 8.507.455.
[00313] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como des- crito no presente documento é conjugado com um carboidrato, por exemplo, como descrito na Patente no US 8.450.467.
E. Nanocápsula
[00314] Alternativamente, as formulações de nanocápsulas de um vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documento, podem ser usadas. As nanocápsulas geralmente podem aprisionar substân- cias de maneira estável e reproduzível. Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga polimérica intracelular, essas partículas ultrafinas (dimensionadas em torno de 0,1 µm) devem ser manipuladas usando polímeros com a capacidade de serem degradados in vivo. Nanopartí- culas de polialquil-cianoacrilato biodegradáveis que atendem a esses requisitos são contempladas para uso. VIII. Métodos de entrega de vetores de ceDNA
[00315] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA pode ser entregue a uma célula alvo in vitro ou in vivo por vários métodos ade- quados. vetores de ceDNA sozinhos podem ser aplicados ou injeta- dos. Os vetores de ceDNA podem ser entregues a uma célula sem a ajuda de um reagente de transfecção ou outros meios físicos. Como alternativa, os vetores de ceDNA podem ser entregues usando qual- quer reagente de transfecção conhecido na técnica ou outro meio físi- co conhecido na técnica que facilite a entrada de DNA em uma célula, por exemplo, lipossomas, álcoois, compostos ricos em polilisina, com- postos ricos em arginina, fosfato de cálcio, microvesículas, microinje- ção, eletroporação e similares.
[00316] Em contrapartida, as transduções com vetores de AAV sem capsídeo aqui descritos podem direcionar eficientemente tipos de célu- las e tecidos que são difíceis de transduzir com viriões de AAV con- vencionais usando vários reagentes de entrega.
[00317] Em outra modalidade, um vetor de ceDNA é administrado ao CNS (por exemplo, ao cérebro ou ao olho). O vetor de ceDNA pode ser introduzido na medula espinhal, tronco cerebral (medula oblonga- da, ponte), mesencéfalo (hipotálamo, tálamo, epitálamo, glândula pitui-
tária, substância negra, glândula pineal), cerebelo, telencéfalo (corpo estriado, cérebro incluindo occipital, temporal). lobos parietais e fron- tais, córtex, gânglios da base, hipocampo e porta-amígdala), sistema límbico, neocórtex, corpo estriado, cérebro e colículo inferior. O vetor de ceDNA também pode ser administrado em diferentes regiões do olho, como retina, córnea e/ou nervo óptico. O vetor de ceDNA pode ser entregue no líquido cefalorraquidiano (por exemplo, por punção lombar). O vetor de ceDNA pode ainda ser administrado por via intra- vascular ao SNC em situações em que a barreira hematoencefálica foi perturbada (por exemplo, tumor cerebral ou infarto cerebral).
[00318] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode ser ad- ministrado à região desejada (ou regiões) do CNS por qualquer via co- nhecida na técnica, incluindo, sem limitação, intratecal, intraointraocu- lar, intracerebral, intraventricular, intravenosa (por exemplo, na pre- sença de açúcar como manitol), entrega intranasal, intra-aural, intra- ointraocular (por exemplo, intravítrea, sub-retiniana, câmara anterior) e periocular (por exemplo, região do sub-Tenon) como entrega intra- muscular com entrega retrógrada para neurônios motores.
[00319] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é administra- do em uma formulação líquida por injeção direta (por exemplo, injeção estereotática) na região ou compartimento desejado no CNS. Em ou- tras modalidades, o vetor de ceDNA pode ser fornecido por aplicação tópica na região desejada ou por administração intranasal de uma for- mulação de aerossol. A administração ocular pode ser por aplicação tópica de gotículas de líquido. Como alternativa adicional, o vetor de ceDNA pode ser administrado como uma formulação sólida de libera- ção lenta (consulte, por exemplo, Patente no US 7.201.898). Em moda- lidades ainda adicionais, o vetor de ceDNA pode ser usado para trans- porte retrógrado para tratar, melhorar e/ou prevenir doenças e distúr- bios envolvendo neurônios motores (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica (ALS); atrofia muscular espinhal (SMA), etc.). Por exemplo, o vetor de ceDNA pode ser entregue ao tecido muscular do qual pode migrar para os neurônios. VIII. Usos adicionais dos vetores ceDNA
[00320] As composições e vetores de ceDNA aqui fornecidos po- dem ser usados para entregar um transgene para vários propósitos. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para fins de pesquisa, por exem- plo, para criar um modelo animal transgênico somático que abriga o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgene. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcio- nal que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doen- ça. Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptí- deos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tratamento, prevenção ou melhora de estados ou distúrbios de doenças em um mamífero. O transgene pode ser transferido (por exemplo, expresso em) para um indivíduo em quantidade suficiente para tratar uma doen- ça associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene. Em algumas modalidades, o transgene pode ser transferido para (por exemplo, expresso em) um indivíduo em quantidade suficien- te para tratar uma doença associada ao aumento da expressão, ativi- dade do produto genético ou regulação positiva inadequada de um ge- ne que o transgene suprime ou causa a expressão da qual deve ser reduzida. IX. Métodos de uso
[00321] O vetor de ceDNA da invenção também pode ser usado em um método para a entrega de uma sequência de nucleotídeos de inte- resse a uma célula alvo. O método pode, em particular, ser um método para a entrega de um gene terapêutico de interesse a uma célula de um indivíduo que dele necessite. A invenção permite a expressão in vivo de um polipeptídeo, proteína ou oligonucleotídeo codificado por uma sequência de DNA exógena terapêutica em células de um indiví- duo de modo que os níveis terapêuticos do polipeptídeo, proteína ou oligonucleotídeo sejam expressos. Esses resultados são vistos com os modos in vivo e in vitro da entrega do vetor de ceDNA.
[00322] Um método para a entrega de um ácido nucleico de inte- resse em uma célula de um indivíduo pode compreender a administra- ção ao dito indivíduo de um vetor de ceDNA da invenção que compre- ende o dito ácido nucleico de interesse. Além disso, a invenção forne- ce um método para a entrega de um ácido nucleico de interesse em uma célula de um indivíduo em necessidade, que compreende múlti- plas administrações do vetor de ceDNA da invenção que compreende o dito ácido nucleico de interesse. Uma vez que o vetor de ceDNA da invenção não induz uma resposta imune, tal estratégia de administra- ção múltipla não será prejudicada pela resposta do sistema imune do hospedeiro contra o vetor de ceDNA da invenção, ao contrário do que é observado com vetores encapsidados.
[00323] Os ácidos nucleicos do vetor de ceDNA são administrados em quantidades suficientes para transfectar as células de um tecido desejado e fornecer níveis suficientes de transferência e expressão de genes sem efeitos adversos indevidos. As vias de administração con- vencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação, intravenosa (por exemplo, em uma formulação de lipossomas), entre- ga direta ao órgão selecionado (por exemplo, entrega intraportal ao fígado), intramuscular e outras vias de administração parentais. As vi- as de administração podem ser combinadas, se desejado.
[00324] A entrega do vetor de ceDNA não é limitada à uma espécie de vetor de ceDNA. Como tal, em outro aspecto, vários vetores de ce- DNA que compreende diferentes sequências de DNA exógenas po- dem ser entregues simultânea ou sequencialmente à célula, tecido,
órgão ou sujeito alvo. Portanto, essa estratégia pode permitir a ex- pressão de múltiplos genes. O parto também pode ser realizado várias vezes e, principalmente para terapia gênica no cenário clínico, em do- ses subsequentes crescentes ou decrescentes, dada a falta de uma resposta imune do hospedeiro anticapsídeo devido à ausência de um capsídeo viral. Prevê-se que não ocorra resposta anticapsídeo, pois não há capsídeo.
[00325] A invenção também fornece um método de tratamento de uma doença em um indivíduo, que compreende a introdução em uma célula alvo em necessidade (em particular uma célula muscular ou te- cido) do indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ve- tor de ceDNA, opcionalmente com um veículo farmaceuticamente acei- tável. Embora o vetor de ceDNA possa ser introduzido na presença de um transportador, esse veículo não é necessário. O vetor de ceDNA implantado compreende uma sequência de nucleotídeos de interesse útil no tratamento da doença. Em particular, o vetor de ceDNA pode compreender uma sequência de DNA exógena desejada operacional- mente ligada a elementos de controle com a capacidade de direcionar a transcrição do polipeptídeo, proteína ou oligonucleotídeo desejado codificado pela sequência de DNA exógena quando introduzido no in- divíduo. O vetor de ceDNA pode ser administrado por qualquer via adequada, como fornecido acima, e em outras partes deste documen- to. X. Métodos de tratamento
[00326] A tecnologia descrita aqui também demonstra métodos pa- ra fabricar, como bem como métodos de uso dos vetores de ceDNA descritos em uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, aplica- ções ex situ, in vitro e in vivo, metodologias de diagnóstico procedi- mentos, e/ou regimes de terapia genética.
[00327] É fornecido no presente documento um método de trata-
mento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, que compreende a introdução em uma célula alvo em necessidade (por exemplo, uma célula ou tecido muscular ou outro tipo de célula afetada) do indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de ceDNA, opci- onalmente com um veículo farmaceuticamente aceitável. Embora o vetor de ceDNA possa ser introduzido na presença de um veículo, es- se veículo não é necessário. O vetor de ceDNA implantado compreen- de uma sequência de nucleotídeos de interesse útil no tratamento da doença. Em particular, o vetor de ceDNA pode compreender uma se- quência de DNA exógena desejada operacionalmente ligada a ele- mentos de controle com a capacidade de direcionar a transcrição do polipeptídeo, proteína ou oligonucleotídeo desejado codificado pela sequência de DNA exógena quando introduzido no indivíduo. O vetor de ceDNA pode ser administrado por qualquer via adequada, como fornecido acima, e em outras partes deste documento.
[00328] Qualquer transgene, pode ser entregue pelos vetores de ceDNA, conforme descrito no presente documento. Os transgenes de interesse incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ou áci- dos nucleicos não codificadores (por exemplo, RNAi, miRs etc.), de preferência terapêuticos (por exemplo, para uso médico, diagnóstico ou veterinário) ou polipeptídeos imunogênicos (por exemplo, para va- cinas).
[00329] Em certas modalidades, os transgenes a serem expressos pelos vetores de ceDNA descritos no presente documento irão expres- sar ou codificar um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, áci- dos nucleicos peptídicos, siRNAs, RNAs, oligonucleotídeos antissen- so, polinucleotídeos antissenso, anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00330] Em particular, o transgene pode codificar um ou mais agen- tes terapêuticos, incluindo, sem limitação, por exemplo, proteína (ou proteínas), polipeptídeo (ou polipeptídeos), peptídeo (ou peptídeos), enzima (ou enzimas), anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, como bem como as variantes, e/ou fragmentos ativos dos mesmos, agonistas, antagonistas, miméticos para uso no tratamento, profilaxia, e/ou melhora de um ou mais sintomas de uma doença, disfunção, le- são, e/ou distúrbio. Em um aspecto, a doença, disfunção, trauma, le- são e/ou distúrbio é uma doença, disfunção, trauma, lesão, e/ou dis- túrbio humano.
[00331] Tal como notado aqui, o transgene pode codificar uma te- rapêutica proteína ou peptídeo, ou terapêutico sequência de ácidos nucleicos ou terapêutico do agente, incluindo, sem limitação um ou mais agonistas, antagonistas, fatores antiapoptose, inibidores, recepto- res, citocinas, citotoxinas, agentes eritropoiéticos, glicoproteínas, fato- res de crescimento, fator de crescimento de receptores, hormônios, hormônio de receptores, interferons, interleucinas, receptores de inter- leucina, fatores crescimento neurais, peptídeos neuroativos, recepto- res peptídicos neuroativos, proteases, protease, inibidores de proteína descarboxilases, proteína quinases, inibidores de proteína quinase, enzimas, receptores de ligação de proteínas, transporte de proteínas ou de um ou mais inibidores dos mesmos, serotonina receptores, ou uma ou mais absorção de inibidores do mesmo, as serpinas, recepto- res de serpina, eliminadores tumorais, moléculas de diagnóstico, qui- mioterapêuticos, agentes, citotoxinas, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00332] Em algumas modalidades, um transgene no cassete de ex- pressão, construto de expressão ou vetor de ceDNA aqui descrito po- de ser otimizado por códon para a célula hospedeira. Conforme usado no presente documento, o termo "otimização de códon" ou "otimização de códon" refere-se ao processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão aprimorada nas células do vertebrado de interesse, por exemplo, camundongo ou ser humano (por exemplo, humanizado), substituindo pelo menos um, mais de um ou um número significativo de códons da sequência nativa (por exemplo, uma se- quência procariótica) com códons que são mais frequentemente ou mais frequentemente usados nos genes desse vertebrado. Várias es- pécies exibem viés particular para certos códons de um aminoácido particular. Tipicamente, a otimização do códon não altera a sequência de aminoácidos da proteína traduzida original. Os códons otimizados podem ser determinados usando, por exemplo, a plataforma de otimi- zação de códons Gene Forge® da Aptagen e síntese genética perso- nalizada (Aptagen, Inc.) ou outro banco de dados disponível publica- mente.
[00333] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA expressa o transgene em uma célula hospedeira em questão. Em algumas moda- lidades, a célula hospedeira em questão é uma célula hospedeira hu- mana, incluindo, por exemplo, células sanguíneas, células-tronco, cé- lulas hematopoiéticas, células CD34+, células hepáticas, células cance- rígenas, células vasculares, células musculares, células pancreáticas, células neurais, oculares ou células da retina, células epiteliais ou en- doteliais, células dendríticas, fibroblastos ou qualquer outra célula de origem mamífera, incluindo, sem limitação, células hepáticas (isto é, fígado), células pulmonares, células cardíacas, células pancreáticas, células intestinais, células diafragmáticas, renal (ou seja, rim) células, neurais células, sangue células, células da medula óssea , ou qualquer um ou mais tecidos selecionados de um indivíduo para o qual gene terapia é contemplada. Em um aspecto, o indivíduo hospedeiro celular é um humano hospedeiro celular.
[00334] No presente documento são descritos vetor de ceDNA composições e formulações que incluem um ou mais dos vetores de ceDNA da presente invenção em conjunto com um ou mais tampões,
diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composi- ções podem ser incluídas em um ou mais kits de diagnóstico ou tera- pêuticos, para diagnosticar, prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas de uma doença, lesão, distúrbio, trauma ou disfunção. Em um aspecto da doença, ferimento, distúrbio, trauma ou disfunção é uma doença humana, ferimento, distúrbio, trauma ou disfunção.
[00335] Um outro aspecto da tecnologia descrita no presente do- cumento fornece um método para fornecimento a um indivíduo em ne- cessidade disso uma quantidade diagnóstica ou terapeuticamente efi- caz de um vetor de ceDNA, em que o método que compreende forne- cer a uma célula, tecido ou órgão de um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade do vetor de ceDNA como descrito no presen- te documento; e por um tempo eficaz para permitir a expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA assim fornecendo ao indivíduo uma quantidade diagnóstica ou um terapeuticamente eficaz da proteí- na, peptídeo, ácido nucleicos expressa pelo vetor de ceDNA. Em um aspecto anterior, o indivíduo é um ser humano.
[00336] Um outro aspecto da tecnologia descrita no presente do- cumento fornece um método para diagnosticar, prevenir, tratar, ou me- lhorar pelo menos um ou mais sintomas de uma doença, um distúrbio, uma disfunção, uma lesão, uma condição anormal, ou trauma, em um indivíduo. Em um sentido global e geral, o método inclui pelo menos a etapa de administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo um ou mais dos vetores de ceDNA descritos, em uma quantidade e durante um tempo suficiente para diagnosticar, prevenir, tratar ou melhorar o um ou mais sintomas da doença, distúrbio, disfunção, lesão, condição anormal, ou traumatismo no o assunto. Em um aspecto anterior, o in- divíduo é um ser humano.
[00337] Outro aspecto é o uso do vetor de ceDNA como uma ferra- menta para tratar ou reduzir um ou mais sintomas de uma doença ou estados de doença. Existem várias doenças hereditárias nas quais os genes defeituosos são conhecidos e geralmente se enquadram em duas classes: estados de deficiência, geralmente de enzimas, geral- mente herdadas de maneira recessiva, e estados desequilibrados, que podem envolver proteínas reguladoras ou estruturais, e que são tipi- camente, mas nem sempre, herdados de maneira dominante. Para doenças do estado de deficiência, os vetores de ceDNA podem ser usados para entregar transgenes para trazer um gene normal aos te- cidos afetados para terapia de substituição, bem como, em algumas modalidades, para criar modelos animais para a doença usando muta- ções antisssenso. Para estados de doença desequilibrados, os vetores de ceDNA podem ser usados para criar um estado de doença em um sistema modelo, que pode ser usado em esforços para combater o es- tado de doença. Assim, os vetores e métodos de ceDNA aqui descritos permitem o tratamento de doenças genéticas. Como aqui usado, um estado de doença é tratado por remediar parcial ou totalmente a defi- ciência ou desequilíbrio que causa a doença ou a torna mais grave.
[00338] Em geral, o vetor de ceDNA conforme aqui descrito pode ser usado para entregar qualquer transgene para tratar, prevenir ou melhorar os sintomas associados a qualquer distúrbio relacionado à expressão gênica. Os estados ilustrativos de doenças incluem, entre outros: fibrose cística (e outras doenças pulmonares), hemofilia A, he- mofilia B, talassemia, anemia e outras doenças do sangue, AIDS, do- ença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, late- ral amiotrófica esclerose, epilepsia e outros distúrbios neurológicos, câncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por exemplo, Du- chenne, Becker), doença de Hurler, deficiência de adenosina desami- nase, defeitos metabólicos, doenças degenerativas da retina (e outras doenças oculares), mitocondriopatias (por exemplo, Neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON), síndrome de Leigh e encefalopatia escle-
rosante subaguda), miopatias (por exemplo, miopatia facioescapulo- umeral (FSHD) e cardiomiopatias), doenças de órgãos sólidos (por exemplo, cérebro, fígado, rim, coração) e similares. Em algumas mo- dalidades, os vetores de ceDNA como descrito no presente documen- tos podem ser usados com vantagem no tratamento de indivíduos com distúrbios metabólicos (por exemplo, deficiência de omitina transcar- bamilase).
[00339] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA aqui descrito pode ser usado para tratar, melhorar e/ou prevenir uma doença ou dis- túrbio ocasionado por mutação em um gene ou produto genético. Do- enças ou distúrbios exemplificadores que podem ser tratados com ve- tores de ceDNA incluem, sem limitação, doenças ou distúrbios meta- bólicos (por exemplo, doença de Fabry, doença de Gaucher, fenilceto- núria (PKU), doença de armazenamento de glicogênio); doenças ou distúrbios do ciclo da ureia (por exemplo, deficiência de ornitina trans- carbamilase (OTC)); doenças ou distúrbios do armazenamento lisos- sômico (por exemplo, leucodistrofia metacromática (DLM), mucopolis- sacaridose tipo II (MPSII; síndrome de Hunter)); doenças ou distúrbios hepáticos (por exemplo, colestase intra-hepática familiar progressiva (PFIC); doenças ou distúrbios no sangue (por exemplo, hemofília (A e B), talassemia e anemia); cânceres e tumores e doenças ou distúrbios genéticos (por exemplo, fibrose cística).
[00340] Ainda como um outro aspecto, um vetor de ceDNA confor- me aqui descrito pode ser empregado para fornecer uma sequência de nucleotídeos heteróloga em situações nas quais é desejável regular o nível de expressão do transgene (por exemplo, transgenes que codifi- cam hormônios ou fatores de crescimento, como descrito no presente documento).
[00341] Por conseguinte, em algumas modalidades, o vetor de ce- DNA aqui descrito pode ser usado para corrigir um nível e/ou função anormais de um produto genético (por exemplo, uma ausência ou de- feito em uma proteína) que resulta na doença ou distúrbio. O vetor de ceDNA pode produzir uma proteína funcional e/ou modificar os níveis da proteína para aliviar ou reduzir os sintomas resultantes de ou confe- rir benefícios a uma doença ou distúrbio específico ocasionado pela ausência ou defeito na proteína. Por exemplo, o tratamento da defici- ência de OTC pode ser alcançado através da produção de enzima OTC funcional; o tratamento da hemofilia A e B pode ser alcançado modificando os níveis do fator VIII, fator IX e fator X; o tratamento de PKU pode ser conseguido modificando os níveis da enzima fenilalani- na hidroxilase; o tratamento da doença de Fabry ou Gaucher pode ser alcançado através da produção de alfa galactosidase funcional ou beta glucocerebrosidase, respectivamente; o tratamento de MLD ou MPSII pode ser alcançado produzindo arilsulfatase A funcional ou iduronato- 2-sulfatase, respectivamente; o tratamento da fibrose cística pode ser conseguido através da produção de um regulador de condutância transmembrana funcional da fibrose cística; o tratamento da doença de armazenamento de glicogênio pode ser alcançado restaurando a fun- ção funcional da enzima G6Pase; e o tratamento de PFIC pode ser alcançado através da produção dos genes funcionais ATP8B1, ABCB11, ABCB4 ou TJP2.
[00342] Em modalidades alternativas, os vetores de ceDNA como descrito no presente documentos podem ser usados para fornecer um ácido nucleico antissenso a uma célula in vitro ou in vivo. Por exemplo, em que o transgene é uma molécula de RNAi, a expressão do ácido nucleico antissenso ou RNAi na célula alvo diminui a expressão de uma proteína específica pela célula. Por conseguinte, os transgenes que são moléculas de RNAi ou ácidos nucleicos antissenso podem ser administrados para diminuir a expressão de uma proteína específica em um indivíduo em necessidade. Os ácidos nucleicos antissenso também podem ser administrados às células in vitro para regular a fi- siologia celular, por exemplo, para otimizar os sistemas de cultura de células ou tecidos.
[00343] Em algumas modalidades, transgenes exemplificadores co- dificados pelo vetor de ceDNA incluem, sem limitação: X, enzimas li- sossômicas (por exemplo, hexosaminidase A, associada à doença de Tay-Sachs ou iduronato de sulfatase, associada à síndrome de Hun- ter/MPS II), eritropoietina, angiostatina, endostatina, superóxido dismu- tase, globina, a leptina, a catalase, a tirosina hidroxilase, bem como citocinas (por exemplo, um interferon, interferon-β, interferon-γ, inter- leucina-2, interleucina-4, interleucina 12, fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos, linfotoxina e similares), fatores de cres- cimento de peptídeos e hormônios (por exemplo, somatotropina, insu- lina, fatores de crescimento semelhantes à insulina 1 e 2, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epi- dérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento de nervos (NGF), fator neurotrófico 3 e 4, fator neurotrófi- co derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento derivado da glia (GDNF), fator de crescimento transformador α e β e similares), recep- tores (por exemplo, receptores do fator de necrose tumoral). Em algu- mas modalidades exemplificadores, o transgene codifica um anticorpo monoclonal específico para um ou mais alvos desejados. Em algumas modalidades exemplificadores, mais de um transgene é codificado pe- lo vetor de ceDNA. Em algumas modalidades exemplificadores, o transgene codifica uma proteína de fusão que compreende dois poli- peptídeos diferentes de interesse. Em algumas modalidades, o trans- gene codifica um anticorpo, incluindo um anticorpo completo ou frag- mento de anticorpo, conforme aqui definido. Em algumas modalidades, o anticorpo é um domínio de ligação ao antígeno ou uma sequência de domínio variável da imunoglobulina, conforme definido no presente documento. Outras sequências de transgene ilustrativas codificam produtos gênicos suicidas (timdina-quinase, citosina desaminase, toxi- na da difteria, citocromo P450, desoxicitidina quinase e fator de necro- se tumoral), proteínas que conferem resistência a um fármaco usado na terapia do câncer e produtos gênicos supressores de tumores.
[00344] Em uma modalidade representativa, o transgene expresso pelo vetor de ceDNA pode ser usado para o tratamento de distrofia muscular em um indivíduo em necessidade, em que o método com- preende: administrar uma quantidade eficaz de tratamento, melhora ou prevenção do vetor de ceDNA aqui descrito, em que o vetor de ceDNA compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica distrofina, uma mini-distrofina, uma micro-distrofina, propeptídeo de miostatina, folista- tina, receptor solúvel de ativina tipo II, IGF-1, polipeptídeos anti- inflamatórios como o mutante Ikappa B dominante, sarcospan, utrofi- na, uma micro-distrofina, laminina-α2, α-sarcoglicano, β-sarcoglicano, γ-sarcoglicano, δ-sarcoglicano, IGF-1, um anticorpo ou fragmento de anticorpo contra miostatina ou propostídeo de miostatina e/ou RNAi contra miostatina. Em modalidades particulares, o vetor de ceDNA po- de ser administrado ao músculo esquelético, diafragma e/ou cardíaco, como descrito em outro local no presente documento.
[00345] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode ser usa- do para entregar um transgene ao músculo esquelético, cardíaco ou diafragma, para produção de um polipeptídeo (por exemplo, uma en- zima) ou RNA funcional (por exemplo, RNAi, microRNA, RNA antis- senso) que normalmente circula no sangue ou para entrega sistêmica a outros tecidos para tratar, melhorar e/ou prevenir um distúrbio (por exemplo, um distúrbio metabólico, como diabetes (por exemplo, insuli- na), hemofilia (por exemplo, VIII), um distúrbio de mucopolissacarídeo (por exemplo, síndrome de Sly, síndrome de Hurler, síndrome de Scheie, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de
Sanfilippo A, B, C, D, síndrome de Morquio, síndrome de Maroteaux- Lamy, etc.) ou um distúrbio de armazenamento lisossômico (como a doença de Gaucher) [glucocerebrosidase], doença de Pompe [ácido lisossômico a-glucosidase] ou doença de Fabry [a-galactosidase A]) ou um distúrbio de armazenamento de glicogênio (como doença de Pom- pe [ácido lisossômico a glucosidase]). Outras proteínas adequadas para o tratamento, melhorar e/ou prevenir distúrbios metabólicos são descritos acima.
[00346] Em outras modalidades, o vetor de ceDNA conforme des- crito no presente documento pode ser usado para entregar um trans- gene em um método de tratamento, melhora e/ou prevenção de um distúrbio metabólico em um indivíduo em necessidade. Distúrbios me- tabólicos ilustrativos e transgenes que codificam polipeptídeos são descritos no presente documento. Opcionalmente, o polipeptídeo é secretado (por exemplo, um polipeptídeo que é um polipeptídeo secre- tado em seu estado nativo ou que foi manipulado para ser secretado, por exemplo, por associação operável com uma sequência de sinal secretora, como é conhecido na técnica).
[00347] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de tra- tamento, melhora e/ou prevenção de insuficiência cardíaca congênita ou DAP em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o méto- do compreende a administração de um vetor de ceDNA conforme des- crito no presente documento a um indivíduo mamífero, em que o vetor de ceDNA compreende um transgene que codifica, por exemplo, um endoreticulum sarcoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA2a), um fator angiogênico, inibidor da fosfatase I (I-1), RNAi contra fosfolamban; uma molécula inibidora de fosfolamban ou dominante negativa, como fosfolamban S16E, uma proteína digital de zinco que regula o gene de fosfolamban, receptor β2-adrenérgico, receptor beta.2-adrenérgico quinase (BARK), PI3 quinase, calsarcan, a. inibidor de receptor qui-
nase adrenérgico (β ARKct), inibidor 1 da proteína fosfatase 1, S100A1, parvalbumina, adenilil ciclase tipo 6, uma molécula que afeta o knockdown do receptor quinase tipo 2 acoplado à proteína G, como um β ARKct acoplado constitutivamente ativo de proteína G, Pim-1, PGC-1 α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, calicreína, HIF, timosina-β4, mir-1, mir-133, mir-206 e/ou mir-208.
[00348] Os vetores de ceDNA conforme aqui descritos podem ser administrados aos pulmões de um indivíduo por qualquer meio ade- quado, opcionalmente administrando uma suspensão em aerossol de partículas respiráveis que compreendem os vetores de ceDNA, que o indivíduo inalou. As partículas respiráveis podem ser líquidas ou sóli- das. Os aerossóis de partículas líquidas que compreende os vetores de ceDNA podem ser produzidos por qualquer meio adequado, como com um nebulizador de aerossol acionado por pressão ou um nebuli- zador ultrassônico, como é conhecido pelos técnicos no assunto. Con- sulte, por exemplo, a Patente no 4.501.729. Aerossóis de partículas sólidas que compreende os vetores de ceDNA também podem ser produzidos com qualquer gerador de aerossóis de medicamentos em partículas sólidas, por técnicas conhecidas na técnica farmacêutica.
[00349] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA podem ser administrados aos tecidos do SNC (por exemplo, cérebro, olho). Em modalidades particulares, os vetores de ceDNA aqui descritos podem ser administrados para tratar, melhorar ou prevenir doenças do SNC, incluindo distúrbios genéticos, distúrbios neurodegenerativos, distúr- bios psiquiátricos e tumores. As doenças ilustrativas do SNC incluem, entre outras, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Canavan, doença de Leigh, doença de Refsum, síndrome de Tourette, esclerose lateral primária, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular progressiva, doença de Pick, distrofia muscular, esclerose múltipla, miastenia grave, doença de Binswanger,
traumatismo por lesão medular ou na cabeça, doença de Tay Sachs, doença de Lesch-Nyan, epilepsia, infartos cerebrais, distúrbios psi- quiátricos, incluindo distúrbios de humor (por exemplo, depressão, dis- túrbio afetivo bipolar, distúrbio afetivo persistente), distúrbio de humor secundário), esquizofrenia, dependência de fármacos (por exemplo, alcoolismo e outras dependências de substâncias), neuroses (por exemplo, ansiedade, distúrbio obsessivo, distúrbio somatoforme, dis- túrbio dissociativo, luto, depressão pós-parto), psicose (por exemplo, alucinações e delírios), demência, paranóia, distúrbio de déficit de atenção, distúrbios psicossexuais, distúrbios do sono, distúrbios da dor, e distúrbios alimentares ou de peso (por exemplo, obesidade, ca- quexia, anorexia nervosa e bulemia) e cânceres e tumores (por exem- plo, tumores da hipófise) do SNC.
[00350] Os distúrbios oculares que podem ser tratados, melhorados ou prevenidos com os vetores de ceDNA da invenção incluem distúr- bios oftálmicos que envolvem a retina, trato posterior e nervo óptico (por exemplo, retinite pigmentosa, retinopatia diabética e outras doen- ças degenerativas da retina, uveíte, degeneração macular relacionada à idade, glaucoma). Muitas doenças e distúrbios oftálmicos estão as- sociados a um ou mais dos três tipos de indicações: (1) angiogênese, (2) inflamação e (3) degeneração. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA como descrito no presente documento pode ser empregado para fornecer fatores antiangiogênicos; fatores anti-inflamatórios; fato- res que retardam a degeneração celular, promovem a economia de células ou promovem o crescimento e combinações das células ante- riores. A retinopatia diabética, por exemplo, é caracterizada pela an- giogênese. A retinopatia diabética pode ser tratada pela administração de um ou mais fatores antiangiogênicos, intraocularmente (por exem- plo, no vítreo) ou periocularmente (por exemplo, na região do sub- Tenon). Um ou mais fatores neurotróficos também podem ser coentre-
gues, intraointraocularmente (por exemplo, intravítrea) ou periocular- mente. As doenças oculares adicionais que podem ser tratadas, me- lhoradas ou prevenidas com os vetores de ceDNA da invenção inclu- em atrofia geográfica, degeneração macular vascular ou "úmida", do- ença de Stargardt, Amaurose congênita de Leber (LCA), síndrome de Usher, pseudoxantoma elástico (PXE), retinite pigmentar ligada ao x (XLRP), retinosquise ligada ao x (XLRS), choroideremia, neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON), arquomatopsia, distrofia de cone- haste, distrofia da córnea endotelial de Fuchs, distrofia endotelial da córnea de Fuchs, edema macular diabético e câncer ocular e tumores.
[00351] Em algumas modalidades, doenças ou distúrbios oculares inflamatórios (por exemplo, uveíte) podem ser tratados, melhorados ou prevenidos pelos vetores de ceDNA da invenção. Um ou mais fatores anti-inflamatórios podem ser expressos pela administração intraointra- ocular (por exemplo, vítreo ou câmara anterior) do vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documento. Em outras modalidades, doenças ou distúrbios oculares caracterizados por degeneração da retina (por exemplo, retinite pigmentosa) podem ser tratados, melhora- dos ou prevenidos pelos vetores de ceDNA da invenção. intraocular (por exemplo, administração vitreal) do vetor de ceDNA, como descrito no presente documento, que codifica um ou mais fatores neurotróficos, pode ser usado para tratar essas doenças baseadas em degeneração da retina. Em algumas modalidades, doenças ou distúrbios que envol- vem angiogênese e degeneração da retina (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade) podem ser tratados com os vetores de ceDNA da invenção. A degeneração macular relacionada à idade pode ser tratada pela administração do vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documento, que codifica um ou mais fatores neurotróficos intraocularmente (por exemplo, vítreo) e/ou um ou mais fatores antian- giogênicos intraocularmente ou periocularmente (por exemplo, na re-
gião do sub Tenon) O glaucoma é caracterizado por aumento da pres- são ocular e perda de células ganglionares da retina. Os tratamentos para o glaucoma incluem a administração de um ou mais agentes neu- roprotetores que protegem as células contra danos excitotóxicos usando o vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documento. Por conseguinte, esses agentes incluem antagonistas de N-metil-D- aspartato (NMDA), citocinas e fatores neurotróficos, podem ser entre- gues intraointraocularmente, opcionalmente intravítrea usando o vetor de ceDNA, como descrito no presente documento.
[00352] Em outras modalidades, o vetor de ceDNA conforme des- crito no presente documento pode ser usado para tratar convulsões, por exemplo, para reduzir o início, a incidência ou a gravidade das convulsões. A eficácia de um tratamento terapêutico para convulsões pode ser avaliada por meios comportamentais (por exemplo, tremores, carrapatos dos olhos ou da boca) e/ou eletrográficos (a maioria das convulsões tem anormalidades eletrográficas marcadas). Assim, o ve- tor de ceDNA como descrito no presente documento também pode ser usado para tratar epilepsia, que é marcada por múltiplas convulsões ao longo do tempo. Em uma modalidade representativa, a somatosta- tina (ou um fragmento ativo do mesmo) é administrada ao cérebro usando o vetor de ceDNA como descrito no presente documento para tratar um tumor da hipófise. De acordo com esta modalidade, o vetor de ceDNA como descrito no presente documento codificando somatos- tatina (ou um fragmento ativo do mesmo) é administrado por microin- fusão na hipófise. Da mesma forma, esse tratamento pode ser usado para tratar a acromegalia (secreção anormal do hormônio do cresci- mento da hipófise). O ácido nucleico (por exemplo, no de acesso Gen- bank J00306) e o aminoácido (por exemplo, no de acesso Genbank P01166) contêm peptídeos ativos processados somatostatina-28 e somatostatina-14) sequências de somatostatinas, como são conheci-
das na técnica. Em modalidades particulares, o vetor de ceDNA pode codificar um transgene que compreende um sinal secretório como descrito na Patente no US 7.071.172.
[00353] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso de um vetor de ceDNA como aqui descrito para produzir RNA antissenso, RNAi ou outro RNA funcional (por exemplo, uma ribozima) para entrega sistê- mica a um indivíduo in vivo. Por conseguinte, em algumas modalida- des, o vetor de ceDNA pode compreender um transgene que codifica um ácido nucleico antissenso, uma ribozima (por exemplo, como des- crito na Patente no US 5.877.022), RNAs que afetam a transplicação mediada por spliceossomo (consulte Puttaraju et al., (1999) Nature Bi- otech. 17: 246; US 6,013,487; US 6,083,702), RNAs interferentes (RNAi) que mediam o silenciamento de genes (consulte Sharp et al., (2000) Science 287:2431) ou outros RNAs não traduzidos, como RNAs "guia" (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 4929; Pa- tente no US 5.869.248 de Yuan et al.), e similares.
[00354] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA também pode compreender um transgene que codifica um polipeptídeo repórter (por exemplo, uma enzima como a Green Fluorescent Protein, ou fosfatase alcalina). Em algumas modalidades, um transgene que codifica uma proteína repórter útil para fins experimentais ou de diagnóstico é sele- cionado dentre qualquer uma das seguintes opções: β-lactamase, β- galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina, timidina quinase, proteína flu- orescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), lucifera- se e outros bem conhecidos na técnica. Em alguns aspectos, os veto- res de ceDNA que compreendem um transgene que codifica um poli- peptídeo repórter pode ser usados para fins de diagnóstico ou como marcadores da atividade do vetor de ceDNA no indivíduo ao qual são administrados.
[00355] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode compre-
ender um transgene ou uma sequência de nucleotídeos heteróloga que compartilha a homologia e se recombina com um lócus no cro- mossomo hospedeiro. Essa abordagem pode ser usada para corrigir um defeito genético na célula hospedeira.
[00356] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode compre- ender um transgene que pode ser usado para expressar um polipeptí- deo imunogênico em um indivíduo, por exemplo, para vacinação. O transgene pode codificar qualquer imunógeno de interesse conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, imunógenos do vírus da imunode- ficiência humana, vírus da influenza, proteínas gag, antígenos tumo- rais, antígenos de câncer, antígenos bacterianos, antígenos virais e similares. XI. Administração
[00357] Em modalidades particulares, mais de uma administração (por exemplo, duas, três, quatro ou mais administrações) pode ser empregada para atingir o nível desejado de expressão gênica durante um período de vários intervalos, por exemplo, diariamente, semanal- mente, mensalmente, anualmente etc.
[00358] Os modos de administração exemplificativos do vetor de ceDNA descritos no presente documento incluem oral, retal, transmu- cosa, intranasal, inalação (por exemplo, via aerossol), bucal (por exemplo, sublingual), vaginal, intratecal, intraocular, transdérmica, in- traendotelial, no útero (ou no ovo), parenteral (por exemplo, intraveno- sa, subcutânea, intradérmica, intracraniana, intramuscular [incluindo administração ao músculo esquelético, diafragma e/ou cardíaco], in- trapleural, intracerebral e intraarticular), tópico (por exemplo, tanto na pele quanto na mucosa superfícies, incluindo superfícies das vias aé- reas e administração transdérmica), intralinfática e similares, bem co- mo injeção direta de tecidos ou órgãos (por exemplo, fígado, olho, músculo esquelético, músculo cardíaco, músculo diafragma ou cére-
bro).
[00359] A administração do vetor de ceDNA pode ser em qualquer sítio de um indivíduo, incluindo, sem limitação, um local selecionado do grupo que consiste no cérebro, um músculo esquelético, um mús- culo liso, o coração, o diafragma, o epitélio das vias aéreas, fígado, rim, baço, pâncreas, pele e olhos. A administração do vetor de ceDNA também pode ser em um tumor (por exemplo, em um tumor ou em um linfonodo ou próximo a ele). A via mais adequada em qualquer caso dependerá da natureza e gravidade da condição a ser tratada, melho- rada e/ou impedida e da natureza do vetor de ceDNA específico que está sendo usado. Além disso, o ceDNA permite administrar mais de um transgene em um único vetor ou vários vetores de ceDNA (por exemplo, um coquetel de ceDNA).
[00360] A administração do vetor de ceDNA aqui revelada ao mús- culo esquelético de acordo com a presente invenção inclui, mas não está limitada à administração no músculo esquelético nos membros (por exemplo, braço superior, braço inferior, perna inferior e/ou perna superior), costas, pescoço, cabeça (por exemplo, língua), tórax, abdô- men, pelve/períneo e/ou dígitos. O ceDNA conforme descrito neste vetor pode ser entregue ao músculo esquelético por administração in- travenosa, administração intra-arterial, administração intraperitoneal, perfusão de membro ((opcionalmente, perfusão de membro isolada de uma perna e/ou braço; consulte, por exemplo, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464) e/ou injeção intramuscular direta. Em modali- dades particulares, o vetor de ceDNA conforme descrito no presente documento é administrado a um membro (braço e/ou perna) de um indivíduo (por exemplo, um sujeito com distrofia muscular como DMD) por perfusão de membro, perfusão de membro opcionalmente isolada (por exemplo, por via intravenosa ou administração intra-articular. Em modalidades, o vetor de ceDNA como descrito no presente documento pode ser administrado sem o emprego de técnicas "hidrodinâmicas".
[00361] A administração do vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documento ao músculo cardíaco, inclui administração no átrio esquerdo, átrio direito, ventrículo esquerdo, ventrículo direito e/ou sep- to. O vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documento, pode ser entregue ao músculo cardíaco por administração intravenosa, ad- ministração intra-arterial como administração intra-aórtica, injeção car- díaca direta (por exemplo, no átrio esquerdo, átrio direito, ventrículo esquerdo, ventrículo direito) e/ou perfusão da artéria coronária. A ad- ministração ao músculo diafragma pode ser por qualquer método ade- quado, incluindo administração intravenosa, administração intra- arterial e/ou administração intraperitoneal. A administração ao músculo liso pode ser por qualquer método adequado, incluindo administração intravenosa, administração intra-arterial e/ou administração intraperito- neal. Em uma modalidade, a administração pode ser em células endo- teliais presentes no músculo próximo, e/ou no músculo liso.
[00362] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA de acordo com a presente invenção é administrado ao músculo esquelético, músculo diafragma e/ou músculo cardíaco (por exemplo, para tratar, melhorar e/ou prevenir distrofia muscular ou doença cardíaca (por exemplo, DAP ou doença congestiva) insuficiência cardíaca). A. Tratamento ex vivo
[00363] Em algumas modalidades, as células são removidas de um indivíduo, um vetor de ceDNA é introduzido no mesmo e as células são então substituídas novamente no indivíduo. Os métodos de remo- ção de células do sujeito para tratamento ex vivo, seguidos de introdu- ção ao indivíduo, são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Patente no US 5.399.346; cuja descrição é aqui incorporada na sua totalidade). Alternativamente, um vetor de ceDNA é introduzido em cé- lulas de outro indivíduo, em células cultivadas ou em células de qual-
quer outra fonte adequada, e as células são administradas a um indi- víduo em necessidade.
[00364] As células transduzidas com um vetor de ceDNA são prefe- rencialmente administradas ao indivíduo em uma "quantidade terapeu- ticamente eficaz" em combinação com um veículo farmacêutico. Os técnicos no assunto compreenderão que os efeitos terapêuticos não precisam ser completos ou curativos, desde que seja fornecido algum benefício ao indivíduo.
[00365] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode codificar um transgene (às vezes chamado de sequência de nucleotídeos hete- róloga) que é qualquer polipeptídeo que é desejavelmente produzido em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, em contraste com o uso dos vetores de ceDNA em um método de tratamento discu- tido aqui, em algumas modalidades os vetores de ceDNA podem ser introduzidos em células cultivadas e o produto genético expresso iso- lado a partir deles, por exemplo, para a produção de antígenos ou va- cinas.
[00366] Os vetores de ceDNA podem ser usados em aplicações veterinárias e médicas. Assuntos adequados para métodos de entrega de genes ex vivo, conforme descrito acima, incluem aves (por exem- plo, galinhas, patos, gansos, codornas, perus e faisões) e mamíferos (por exemplo, seres humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, feli- nos, caninos e lagomorfos), sendo preferidos os mamíferos. Os seres humanos são os preferidos. Os seres humanos incluem recém- nascidos, bebês, jovens e adultos.
[00367] Um aspecto da tecnologia descrita no presente documento refere-se a um método de entrega de um transgene a uma célula. Tipi- camente, para métodos in vitro, o vetor de ceDNA pode ser introduzido na célula usando os métodos como descrito no presente documentos, bem como outros métodos conhecidos na técnica. Os vetores de ceD-
NA aqui descritos são preferencialmente administrados à célula em uma quantidade biologicamente eficaz. Se o vetor de ceDNA for admi- nistrado a uma célula in vivo (por exemplo, a um indivíduo), uma quan- tidade biologicamente eficaz do vetor de ceDNA é uma quantidade que é suficiente para resultar na transdução e expressão do transgene em uma célula alvo. B. Faixas de doses
[00368] Ensaios in vivo e/ou in vitro podem opcionalmente ser em- pregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais para uso. A dose precisa ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da condição, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do indivíduo técnico no assunto e nas cir- cunstâncias de cada sujeito. As doses efetivas podem ser extrapola- das a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.
[00369] Um vetor de ceDNA é administrado em quantidades sufici- entes para transfectar as células de um tecido desejado e fornecer ní- veis suficientes de transferência e expressão de genes sem efeitos adversos indevidos. As vias de administração convencionais e farma- ceuticamente aceitáveis incluem, entre outras, as descritas acima na seção "Administração", como entrega direta ao órgão selecionado (por exemplo, entrega intraportal ao fígado), oral, inalação (incluindo intra- nasal e administração intratraqueal), intraocular, intravenosa, intra- muscular, subcutânea, intradérmica, intratumoral e outras vias de ad- ministração parentais. As rotas de administração podem ser combina- das, se desejado.
[00370] A dose da quantidade de um vetor de ceDNA necessária para obter um "efeito terapêutico" específico variará com base em vá- rios fatores, incluindo, entre outros: a via de administração de ácido nucleico, o nível de expressão de gene ou RNA necessário para al-
cançar um efeito terapêutico, a doença ou distúrbio específico a ser tratado e a estabilidade do gene (ou genes), produto (ou produtos) de RNA ou proteína (proteínas) expressa resultante. Um técnico no as- sunto pode determinar facilmente uma faixa de dose do vetor de ceD- NA para tratar um paciente com uma doença ou distúrbio específico com base nos fatores mencionados acima, bem como em outros fato- res que são bem conhecidos na técnica.
[00371] O regime de dosagem pode ser ajustado para fornecer a resposta terapêutica ideal. Por exemplo, o oligonucleotídeo pode ser administrado repetidamente, por exemplo, várias doses podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser proporcionalmente re- duzida conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Um técnico no assunto será com a capacidade de determinar pronta- mente doses e esquemas de administração apropriados dos oligonu- cleotídeos em questão, se os oligonucleotídeos devem ser administra- dos às células ou aos indivíduos.
[00372] Uma "dose terapeuticamente eficaz" cairá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de ensaios clí- nicos e dependerá da aplicação específica (as células neurais exigirão quantidades muito pequenas, enquanto a injeção sistêmica exigiria grandes quantidades). Por exemplo, para injeção direta in vivo no músculo esquelético ou cardíaco de um indivíduo humano, uma dose terapeuticamente eficaz será da ordem de desde cerca de 1 μg a 100 g do vetor de ceDNA. Se exossomas ou micropartículas são usadas para distribuir o vetor de ceDNA, em seguida, uma dose terapeutica- mente eficaz pode ser determinada experimentalmente, mas é espe- rado para entregar a partir de 1 μg a cerca de 100 g de vetor.
[00373] A formulação de excipientes e soluções transportadoras farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida dos técnicos no as- sunto, como é o desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamen-
to adequados para usar as composições particulares descritas aqui em uma variedade de regimes de tratamento.
[00374] Para transfecção in vitro, uma quantidade eficaz de um ve- tor de ceDNA para ser entregue às células (1X106 células) será da or- dem de 0,1 a 100 μg vetor de ceDNA, preferencialmente 1 a 20 μg, e com mais preferência 1 a 15 μg ou 8 a 10 μg. Vetores maiores de ce- DNA exigirão doses mais altas. Se forem usados exossomos ou mi- cropartículas, uma dose eficaz in vitro pode ser determinada experi- mentalmente, mas se destinaria a fornecer geralmente a mesma quan- tidade do vetor de ceDNA.
[00375] O tratamento pode envolver a administração de uma dose única ou várias doses. Em algumas modalidades, mais de uma dose pode ser administrada a um indivíduo; de fato, doses múltiplas podem ser administradas conforme necessário, devido ao fato de que o vetor de ceDNA desencadeia não provoca uma resposta imune do hospe- deiro anticapsídeo devido à ausência de um capsídeo viral. Como tal, um técnico no assunto pode determinar rapidamente um número apro- priado de doses. O número de doses administradas pode, por exem- plo, ser da ordem de 1 a 100, de preferência 2 a 20 doses.
[00376] Sem desejar ater-se a nenhuma teoria específica, a falta de resposta imune antiviral típica provocada pela administração de um vetor de ceDNA, conforme descrito na descrição (isto é, a ausência de componentes do capsídeo), permite que o vetor de ceDNA seja admi- nistrado para um host em várias ocasiões. Em algumas modalidades, o número de ocasiões em que um ácido nucleico heterólogo é entre- gue a um indivíduo varia de 2 a 10 vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes). Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA é entregue a um indivíduo mais de 10 vezes.
[00377] Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceD- NA é administrada a um indivíduo não mais do que uma vez por dia do calendário (por exemplo, um período de 24 horas). Em algumas moda- lidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indiví- duo não mais que uma vez a cada 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias corridos. Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administra- da a um indivíduo não mais que uma vez por semana civil (por exem- plo, 7 dias corridos). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que duas vezes por semana (por exemplo, uma vez em um período de duas semanas ci- vis). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por mês civil (por exemplo, uma vez em 30 dias corridos). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez a cada seis meses. Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por ano civil (por exemplo, 365 dias ou 366 dias em um ano bissexto). C. Formas farmacêuticas unitárias
[00378] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem uni- tária. Uma forma de dosagem unitária será tipicamente adaptada a uma ou mais vias de administração específicas da composição farma- cêutica. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por inalação. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um vaporizador. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um nebulizador. Em algumas moda- lidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um aerossolizador. Em algumas modalidades, a forma de dosa- gem unitária é adaptada para administração oral, para administração bucal ou para administração sublingual. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração intraveno- sa, intramuscular ou subcutânea. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração intratecal ou intra- cerebroventricular. Em algumas modalidades, a composição farmacêu- tica é formulada para administração tópica. A quantidade de ingredien- te ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. XII. Várias aplicações
[00379] As composições e vetores de ceDNA aqui fornecidos po- dem ser usados para fornecer um transgene para vários propósitos, como descrito acima. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para fins de pesquisa, por exemplo, para criar um modelo animal transgênico somático que abriga o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgene. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doença.
[00380] Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tratamen- to, melhora ou prevenção de estados de doença em um mamífero. O transgene pode ser transferido (por exemplo, expresso em) para um paciente em quantidade suficiente para tratar uma doença associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene.
[00381] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA são previs- tos para uso em métodos de diagnóstico e triagem, em que um trans- gene é expresso de forma transitória ou estável em um sistema de cul- tura de células ou, alternativamente, em um modelo animal transgêni- co.
[00382] Outro aspecto da tecnologia descrita no presente documen-
to fornece um método de transdução de uma população de células de mamíferos. Em um sentido geral e geral, o método inclui pelo menos a etapa de introdução em uma ou mais células da população, uma com- posição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais dos ceDNA aqui descritos.
[00383] Além disso, a presente invenção fornece composições, bem como kits terapêuticos e/ou de diagnóstico que incluem um ou mais vetores de ceDNA descritos ou composições de ceDNA, formulados com um ou mais ingredientes adicionais ou preparados com uma ou mais instruções para seu uso.
[00384] Uma célula a ser administrada ao vetor de ceDNA, confor- me revelada no presente documento, pode ser de qualquer tipo, inclu- indo, sem limitação, células neurais (incluindo células dos sistemas nervoso central e periférico, em particular, células cerebrais), células pulmonares, células da retina, células epiteliais (por exemplo, células epiteliais respiratórias e do intestino), células musculares, células den- dríticas, células pancreáticas (incluindo células de ilhotas), células he- páticas, células do miocárdio, células ósseas (por exemplo, células- tronco da medula óssea), células-tronco hematopoiéticas, células do baço, queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais, células da prós- tata, células germinativas e similares. Alternativamente, a célula pode ser qualquer célula progenitora. Como alternativa adicional, a célula pode ser uma célula-tronco (por exemplo, célula-tronco neural, célula- tronco hepática). Ainda como alternativa adicional, a célula pode ser uma célula de câncer ou tumor. Além disso, as células podem ser de qualquer espécie de origem, como indicado acima.
[00385] Em algumas modalidades, o presente pedido pode ser defi- nido em qualquer um dos seguintes parágrafos:
[00386] 1A. Um vetor de ceDNA que compreende: um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis,
em que o elemento regulador cis é selecionado do grupo que consiste em um elemento regulador pós-transcricional e um sinal BGH poli-A; uma ITR do tipo selvagem a montante (5’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucle- otídeo da SEQ ID NO: 51; e uma ITR modificada a jusante (3’-extremidade) do cassete de expres- são, em que a ITR modificada compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 2, em que o dito vetor de DNA tem é desprovido de uma metilação espe- cífica de procariota e não é encapsidado em uma proteína do capsídeo AAV.
[00387] 2A. O vetor de DNA do parágrafo 1A, em que o vetor de DNA tem uma estrutura linear e contínua.
[00388] 3A. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1A-2A, em que o elemento regulador pós-transcricional compreende um ele- mento regulador pós-transcricional WHP (WPRE).
[00389] 4A. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1A-3A, em que o cassete de expressão compreende ainda um sítio de clona- gem.
[00390] 5A. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1A a 4A, em que o cassete de expressão compreende um promotor seleci- onado do grupo que consiste em promotor CAG, promotor AAT, pro- motor LP1 e promotor EF1a.
[00391] 6A. O vetor de DNA do parágrafo 1A, em que o cassete de expressão compreende polinucleotídeos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.
[00392] 7A. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1A-6A, em que o cassete de expressão compreende ainda um sítio de clona- gem e uma sequência exógena inserida no sítio de clonagem.
[00393] 8A. O vetor de DNA do parágrafo 7A, em que a sequência exógena compreende pelo menos 2.000 nucleotídeos.
[00394] 9A. O vetor de DNA do parágrafo 7A, em que a sequência exógena codifica uma proteína.
[00395] 10A. O vetor de DNA do parágrafo 7A, em que a sequência exógena codifica uma proteína repórter.
[00396] 11A. Célula que compreende o vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1A-10A.
[00397] 12A. A célula do parágrafo 11A, que compreende ainda uma proteína de replicação selecionada do grupo que consiste em: AAV Rep 78, AAV Rep 68, AAV Rep52 e AAV Rep 40.
[00398] 13A. A célula do parágrafo 12A, em que a dita proteína de replicação é codificada por um vírus auxiliar.
[00399] 14A. A célula de qualquer um dos parágrafos 11A-13A, em que a célula é desprovida de um gene que codifica uma proteína do capsídeo AAV.
[00400] 15A. Um ingrediente farmacologicamente ativo que com- preende o vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1A-10A e, op- cionalmente, um excipiente.
[00401] 16A. Método para entregar uma sequência exógena a uma célula, que compreende a etapa de: introdução do dito vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1A-10A à referida célula.
[00402] 17A. O método do parágrafo 16A, em que a dita etapa de introdução do vetor de DNA compreende injeção hidrodinâmica.
[00403] 18A. Método para preparar um vetor de DNA que compre- ende as etapas de: introduzir em uma célula um construto de ácido nucleico ou um vírus que compreende: um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis, em que o elemento regulador cis é selecionado do grupo que consiste em um elemento regulador pós-transcricional e um sinal
BGH poli-A; uma ITR do tipo selvagem a montante (5’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 51; e uma ITR modificada a jusante (3’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR modificada compreende um polinucleotí- deo da SEQ ID NO: 2, em que a dita célula é desprovida de uma proteína do cap- sídeo AAV; e a coleta do dito vetor de DNA produzido a partir do dito construto de ácido nucleico ou do dito vírus, em que o dito vetor de DNA é desprovido de uma metilação específica de procariota.
[00404] 19A. O método do parágrafo 18A, em que o vetor de DNA tem uma estrutura linear e contínua.
[00405] 20A. O método de qualquer um dos parágrafos 18A-19A, em que o elemento regulador pós-transcricional compreende um ele- mento regulador pós-transcricional WHP (WPRE).
[00406] 21A. O método de qualquer um dos parágrafos 18A-20A, em que o cassete de expressão compreende ainda um promotor sele- cionado do grupo que consiste no promotor CAG, promotor AAT, pro- motor LP1 e promotor EF1a.
[00407] 22A. O método do parágrafo 18, em que o dito cassete de expressão compreende polinucleotídeos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.
[00408] 23A. O método de qualquer um dos parágrafos 18A-22A, em que o dito cassete de expressão compreende ainda uma sequên- cia exógena.
[00409] 24A. O método do parágrafo 23A, em que a sequência exógena compreende pelo menos 2.000 nucleotídeos.
[00410] 25A. O método do parágrafo 23A, em que a sequência exógena codifica uma proteína.
[00411] 26A. O método do parágrafo 23A, em que a sequência exógena codifica uma proteína repórter.
[00412] 27A. O método de qualquer um dos parágrafos 18A-26A, em que a dita célula é uma célula de inseto.
[00413] 28A. Um vetor de DNA gerado pelo método de qualquer um dos parágrafos 18 a 27.
[00414] 29A. Célula para produzir um vetor de DNA que compreen- de: um primeiro polinucleotídeo que compreende: um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis, em que o elemento regulador cis é selecionado do grupo que consiste em um elemento regulador pós-transcricional e um sinal BGH poli-A; uma ITR do tipo selvagem a montante (5’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 51; e uma ITR modificada a jusante (3’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR modificada compreende um polinucleotí- deo da SEQ ID NO: 2; e um segundo polinucleotídeo que codifica uma proteína de replicação selecionada do grupo que consiste em AAV78, AAV52, AAV Rep68 e AAV Rep 40, em que a dita célula é desprovida de um gene que codifica uma proteína do capsídeo AAV.
[00415] 30A. A célula do parágrafo 29A, em que o elemento regula- dor pós-transcricional compreende um elemento regulador pós- transcricional WHP (WPRE).
[00416] 31A. A célula de qualquer um dos parágrafos 29A-30A, em que a dita célula é uma célula de inseto.
[00417] 32A. Um vetor de DNA produzido a partir da célula de qual- quer um dos parágrafos 29A-31A, por replicação do dito primeiro poli- nucleotídeo.
[00418] 33A. Polinucleotídeo para gerar um vetor de DNA que com- preende: um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis, em que o elemento regulador cis é selecionado do grupo que consiste em um elemento regulador pós-transcricional e um sinal BGH poli-A; uma ITR do tipo selvagem a montante (5’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 51; e uma ITR modificada a jusante (3’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR modificada compreende um polinucleotí- deo da SEQ ID NO: 2.
[00419] 34A. O polinucleotídeo do parágrafo 33A, em que o ele- mento regulador pós-transcricional compreende um elemento regula- dor pós-transcricional WHP (WPRE).
[00420] 35A. O polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 33A- 34A, em que o polinucleotídeo está em um plasmídeo, em um bacmí- deo ou em um baculovírus.
[00421] 36A. O polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 33A- 35A, que compreende ainda uma sequência exógena.
[00422] 37A. O polinucleotídeo do parágrafo 36A, em que a se- quência exógena compreende pelo menos 2.000 nucleotídeos.
[00423] 38A. O polinucleotídeo do parágrafo 36A, em que a se- quência exógena codifica uma proteína.
[00424] 39A. O polinucleotídeo do parágrafo 36A, em que a se- quência exógena codifica um repórter
[00425] 40A. Um vetor de DNA produzido por replicação do polinu- cleotídeo de qualquer um dos parágrafos 33A-39A por uma proteína de replicação selecionada do grupo que consiste em AAV78, AAV52, AAV Rep68 e AAV Rep 40, em que o vetor de DNA tem uma estrutura linear e contínua, é desprovido de uma metilação específica de proca- riota e não é encapsidado em uma proteína do capsídeo AAV.
[00426] 41A. Um vetor de DNA que compreende: um cassete de expressão; uma ITR modificada a montante (5’-extremidade) do casse- te de expressão, em que a ITR modificada compreende um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 52; e uma ITR do tipo selvagem a jusante (3’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1, em que o vetor de DNA é desprovido de uma metilação es- pecífica de procariota e não é encapsidado em uma proteína do capsí- deo AAV.
[00427] 42A. O vetor de DNA do parágrafo 41A, em que o cassete de expressão compreende um elemento de regulação cis, em que o elemento de regulação cis é selecionado do grupo que consiste em um elemento de resposta pós-transcricional e um sinal poli-A.
[00428] 43A. O vetor de DNA do parágrafo 42A, em que o elemento de resposta pós-transcricional compreende um elemento de resposta pós-transcricional WHP (WPRE).
[00429] 44A. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 42A- 43A, em que o sinal poli-A compreende um sinal BGH poli-A.
[00430] 45A. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 41A- 44A, em que o cassete de expressão compreende um promotor sele- cionado do grupo que consiste em promotor CAG, promotor AAT, promotor LP1 e promotor EF1a.
[00431] 46A. O vetor de DNA do parágrafo 41A, em que o cassete de expressão compreende polinucleotídeos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.
[00432] 47A. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 41A- 46A, em que o cassete de expressão compreende uma sequência exógena.
[00433] 48A. O vetor de DNA do parágrafo 47A, em que a sequên- cia exógena compreende pelo menos 2.000 nucleotídeos.
[00434] 49A. O vetor de DNA do parágrafo 47A, em que a sequên- cia exógena codifica uma proteína.
[00435] 50A. O vetor de DNA do parágrafo 47A, em que a sequên- cia exógena codifica uma proteína repórter.
[00436] 51A. Uma célula que compreende o vetor de DNA de qual- quer um dos parágrafos 41A-50A.
[00437] 52A. A célula do parágrafo 52A que compreende ainda uma proteína de replicação selecionada do grupo que consiste em: AAV Rep 78, AAV Rep 68, AAV Rep52 e AAV Rep 40.
[00438] 53A. A célula do parágrafo 51A, em que a dita proteína de replicação é codificada por um vírus auxiliar.
[00439] 54A. A célula de qualquer um dos parágrafos 51-53, em que a célula é desprovida de um gene que codifica uma proteína do capsídeo AAV.
[00440] 55A. Ingrediente farmacologicamente ativo que compreen- de: o vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1A-10A; e opcio- nalmente, um excipiente.
[00441] 56A. Método para entregar uma sequência exógena a uma célula que compreende a etapa de: introduzir o dito vetor de DNA não encapsidado de qualquer um dos parágrafos 1A a 10A na referida cé- lula.
[00442] 57A. O método do parágrafo 16A, em que a dita etapa de introdução do vetor de DNA compreende injeção hidrodinâmica.
[00443] 58A. Método para preparar um vetor de DNA que compre- ende as etapas de: introduzir em uma célula um construto de ácido nucleico ou um vírus que compreende: um cassete de expressão; uma ITR modificada a montante (5’-extremidade) do casse- te de expressão, em que a ITR modificada compreende um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 52; e uma ITR do tipo selvagem a jusante (3’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1, em que a dita célula é desprovida de uma proteína do cap- sídeo AAV; e a coleta do dito vetor de DNA produzido a partir do dito construto de ácido nucleico ou do dito vírus, em que o dito vetor de DNA é desprovido de uma metilação específica de procariota e não é encapsidado em uma proteína do capsídeo AAV.
[00444] 59A. O método do parágrafo 18A, em que o cassete de ex- pressão compreende um elemento regulador cis, em que o elemento regulador cis é selecionado do grupo que consiste em um elemento de resposta pós-transcricional e um sinal poli-A.
[00445] 60A. O método do parágrafo 59A, em que o elemento de resposta pós-transcricional compreende um elemento de resposta pós- transcricional WHP (WPRE).
[00446] 61A. O método de qualquer um dos parágrafos 59A-60A, em que o sinal poli-A compreende um sinal BGH poli-A.
[00447] 62A. O método de qualquer um dos parágrafos 18A-61A, em que o cassete de expressão compreende um promotor selecionado do grupo que consiste em promotor CAG, promotor AAT, promotor
LP1 e promotor EF1a.
[00448] 63A. O método do parágrafo 18A, em que o dito cassete de expressão compreende polinucleotídeos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9.
[00449] 64A. O método de qualquer um dos parágrafos 18A-63A, em que o cassete de expressão compreende ainda uma sequência exógena.
[00450] 65A. O método do parágrafo 23A, em que a sequência exógena compreende pelo menos 2.000 nucleotídeos.
[00451] 66A. O método do parágrafo 23A, em que a sequência exógena codifica uma proteína.
[00452] 67A. O método do parágrafo 23A, em que a sequência exógena codifica uma proteína repórter.
[00453] 68A. O método de qualquer um dos parágrafos 18A- 26A, em que a dita célula é uma célula de inseto.
[00454] 69A. Um vetor de DNA gerado por meio do método de qualquer um dos parágrafos 18A-27A.
[00455] 70A. O vetor de DNA do parágrafo 69A, em que o vetor de DNA tem uma estrutura linear e contínua.
[00456] 71A. Uma célula para produzir um vetor de DNA que com- preende: um primeiro polinucleotídeo que compreende: um cassete de expressão; uma ITR modificada a montante (5’-extremidade) do casse- te de expressão, em que a ITR modificada compreende um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 52; e uma ITR do tipo selvagem a jusante (3’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1; e um segundo polinucleotídeo que codifica uma proteína de replicação selecionada do grupo que consiste em AAV78, AAV52, AAV Rep68 e AAV Rep 40, em que a dita célula é desprovida de um gene que codifica uma proteína do capsídeo AAV.
[00457] 72A. A célula do parágrafo 71A, em que a dita célula é uma célula de inseto.
[00458] 73A. Um vetor de DNA produzido a partir da célula de qual- quer um dos parágrafos 29A-50A, por replicação do dito primeiro poli- nucleotídeo.
[00459] 74A. Um polinucleotídeo para gerar um vetor de DNA que compreende: um cassete de expressão; uma ITR modificada a montante (5’-extremidade) do casse- te de expressão, em que a ITR modificada compreende um polinucleo- tídeo da SEQ ID NO: 52; e uma ITR do tipo selvagem a jusante (3’-extremidade) do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucleotídeo da SEQ ID NO: 1.
[00460] 75A. O polinucleotídeo do parágrafo 74A, em que o polinu- cleotídeo está em um plasmídeo, em um bacmídeo ou em um baculo- vírus.
[00461] 76A. O polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 74A- 75A que compreende ainda uma sequência exógena.
[00462] 77A. O polinucleotídeo do parágrafo 74A, em que a se- quência exógena compreende pelo menos 2.000 nucleotídeos.
[00463] 78A. O polinucleotídeo do parágrafo 74A, em que a se- quência exógena codifica uma proteína.
[00464] 79A. O polinucleotídeo do parágrafo 74A, em que a se- quência exógena codifica um repórter
[00465] 80A. Um vetor de DNA produzido por replicação do polinu-
cleotídeo de qualquer um dos parágrafos 33-39 por uma proteína de replicação selecionada do grupo que consiste em AAV78, AAV52, AAV Rep68 e AAV Rep 40, em que o vetor de DNA é desprovido de uma metilação específica de procariota e não é encapsidado em uma prote- ína do capsídeo AAV.
[00466] 81A. O vetor de DNA do parágrafo 80A, em que o vetor de DNA é produzido em uma célula de inseto.
[00467] 82A. Um vetor de ceDNA obtido a partir de um plasmídeo que compreende uma sequência ITR de AAV mutada em qualquer uma das Tabelas 2-6 ou Tabelas 7-10A ou 10B.
[00468] Em algumas modalidades, o presente pedido pode ser defi- nido em qualquer um dos seguintes parágrafos:
[00469] 1B. Um vetor de DNA obtido por um processo que compre- ende: (a) transfectar uma primeira população de células de inseto com um primeiro bacmídeo recombinante, obtido pela transposição de uma primeira construção de plasmídeo de DNA em um vetor de ex- pressão de baculovírus, a primeira construção de plasmídeo de DNA prosseguindo sequencialmente na seguinte ordem em uma única dire- ção: a primeiro sítio de proteína replicativa (RPS-1), um promotor ope- racionalmente ligado a uma sequência de polinucleotídeo repórter de ORF, um sinal pós-traducional e de terminação e um segundo sítio de proteína replicativa (RPS-2), em que RPS-1 e RPS-2 são duplamente intramolecularmente dúplex e covalentemente unidos, e o RPS-1 tem uma ou mais deleções, substituições ou truncamentos de pares de ba- ses polinucleotídicos em relação ao RPS-2 e, em seguida, colher uma primeira população de células de inseto injetadas em báculo (BIICs-1); (b) transfectar uma segunda população de células de inseto com um segundo bacmídeo recombinante, obtido pela transposição de uma segunda construção de plasmídeo de DNA para um segundo ve-
tor de expressão de baculovírus, a segunda construção de plasmídeo de DNA que codifica uma proteína que se liga a pelo menos um dos RPS -1 e RPS-2 e, em seguida, colher uma segunda população de células de inseto injetadas em báculo (BIICs-2); (c) combinar o BIICs-1 e o BIICs-2 com uma terceira popu- lação de células de inseto em quantidades relativas, proporcionando uma multiplicidade de infecção (MOI) substancialmente igual e incubar a terceira população de células de inseto, BIICs-1 e BIICs-2 em condi- ções de crescimento celular em que a proteína codificada pelo segun- do construto plasmídeo de DNA reage com os locais RPS-1 e/ou RPS- 2 para induzir a replicação de um vetor de DNA codificado pelo primei- ro plasmídeo de DNA, até a observação de uma célula de inseto diâ- metro de cerca de 15-20 micrômetros e uma viabilidade celular de cer- ca de 50-80% e, em seguida, colher DNA dos grânulos de células de inseto por centrifugação; (d) extrair o DNA dos péletes de células de insetos para ob- ter DNA produzido a partir dos péletes de células de inseto; (e) identificar o DNA obtido a partir dos grânulos de células de inseto em um gel nativo, tanto na banda primária quanto na secun- dária, a uma distância relativa uma da outra, que é indicativa da se- gunda banda que representa material com aproximadamente o dobro do peso de a banda principal; (f) confirmar o vetor de DNA no DNA obtido dos grânulos de células de insetos em um gel desnaturado por uma mudança tanto na banda primária quanto na secundária para cima em direção à área de menor peso do gel após a digestão com restrição de endonucleases do DNA; e (g) isolar o vetor de DNA restante obtido a partir dos péletes de células de inseto para obter o vetor de DNA de alta estabilidade.
[00470] 2B. O vetor de DNA do parágrafo 1B, em que o RPS-1 e
RPS-2 são diferentes e são selecionados independentemente dos pa- res de sequências de polinucleotídeos de DNA das SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 52; ou SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 51; ou SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 102; ou SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 104; ou SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 106; ou SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 108; ou SEQ ID NO: 109 e SEQ ID NO: 110; ou SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 112; ou SEQ ID NO: 113 ou SEQ ID NO: 114; e SEQ ID NO: 115 ou SEQ ID NO: 116.
[00471] Em algumas modalidades, o presente pedido pode ser defi- nido em qualquer um dos seguintes parágrafos:
[00472] 1C. Um vetor AAV sem capsídeo (cfAAV) que compreende: um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis, um promotor e uma sequência exógena; e duas sequências autocomplementares que flanqueiam o di- to cassete de expressão, em que o vetor cfAAV não está associado a uma proteína do capsídeo e é desprovido de metilação específica de procariota.
[00473] 2C. O vetor cfAAV do parágrafo 1C, em que os elementos de regulação cis são selecionados do grupo que consiste em um ri- bocomutador, um isolador, um elemento regulável por mir e um ele- mento regulador pós-transcricional.
[00474] 3C. O vetor cfAAV de qualquer um dos parágrafos 1C-2C, em que o vetor de DNA é CELiD.
[00475] 4C. O vetor cfAAV de qualquer um dos parágrafos 1C-3C, em que as duas sequências autocomplementares são sequências de ITR de AAV2.
[00476] 5C. O vetor cfAAV de qualquer um dos parágrafos 1C-4C, em que a sequência exógena compreende um sítio de entrada interno do ribossomo (IRES) e um elemento 2A.
[00477] 6C. O vetor cfAAV do parágrafo 5C, em que o cassete de expressão compreende uma sequência que codifica mais de uma pro- teína.
[00478] 7C. O vetor cfAAV de qualquer um dos parágrafos 1C-6C, em que o cassete de expressão compreende mais de 4,000 nucleotí- deos, 5.000 nucleotídeos, 10.000 nucleotídeos ou 20.000 nucleotí- deos.
[00479] 8C. Uma composição farmacológica que compreende o ve- tor cfAAV de qualquer um dos parágrafos 1C-7C.
[00480] 9C. Um construto de expressão que compreende: um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis, um promotor e uma sequência exógena; e duas sequên- cias de repetição terminal invertida (ITR) que flanqueiam o dito cassete de expressão, em que o construto de expressão é desprovido de um qua- dro de leitura aberto que codifica uma proteína do capsídeo.
[00481] 10C. O construto de expressão do parágrafo 9C, em que os elementos de regulação cis são selecionados do grupo que consiste em um ribocomutador, um isolador, um elemento regulável por mir e um elemento regulador pós-transcricional.
[00482] 11C. O cassete de expressão de qualquer um dos parágra- fos 9C-10C, em que a sequência exógena compreende um sítio de entrada interno do ribossomo (IRES) e um elemento 2A.
[00483] 12C. O cassete de expressão do parágrafo 11, em que o cassete de expressão compreende uma sequência que codifica mais de uma proteína.
[00484] 13C. O construto de expressão de qualquer um dos pará- grafos 9C-12C, em que o construto de expressão está em um plasmí- deo, um Bacmídeo ou um baculovírus.
[00485] 14C. Um método para gerar um vetor cfAAV que compre- ende:
introduzir o construto de expressão de qualquer um dos pa- rágrafos 9C-13C em uma célula; e coletar o vetor cfAAV gerado pela replicação do construto de expres- são.
[00486] 15C. O método do parágrafo 14C que compreende ainda a etapa de replicar o construto de expressão várias vezes antes de in- troduzir o construto de expressão na célula.
[00487] 16C. O método do parágrafo 15C, em que o construto de expressão está em um plasmídeo e a etapa de replicação é realizada em uma E. coli.
[00488] 17C. O método do parágrafo 16C que compreende ainda a etapa de transferir o construto de expressão do plasmídeo para um Bacmídeo antes de introduzir o construto de expressão na célula.
[00489] 18C. O método do parágrafo 17C que compreende ainda a etapa de transferir o construto de expressão do Bacmídeo para um baculovírus antes de introduzir o construto de expressão na célula.
[00490] 19C. O método de qualquer um dos parágrafos 14C- 18C que compreende ainda a etapa de introdução de uma proteína Rep na célula.
[00491] 20C. O método de qualquer um dos parágrafos 14C-19C, em que a célula é uma célula de inseto.
[00492] 21C. O vetor cfAAV produzido pelo método de qualquer um dos parágrafos 14C-20C.
[00493] 22C. O vetor cfAAV do parágrafo 21C, em que o vetor de DNA é CELiD.
[00494] Em algumas modalidades, o presente pedido pode ser defi- nido em qualquer um dos seguintes parágrafos:
[00495] 1D. Vetor de DNA não viral sem capsídeo, obtido a partir de um vetor de polinucleotídeo, em que o vetor de polinucleotídeo codifica um ácido nucleico heterólogo posicionado operativamente entre uma primeira e uma segunda sequência polinucleotídica de DNA de repeti- ção terminal invertida AAV2 (ITRs), em que pelo menos uma das ITRs tem pelo menos uma deleção, inserção ou substituição de polinucleo- tídeo em relação à ITR do tipo selvagem AAV2 correspondente da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 51 para induzir a replicação do vetor de DNA em uma célula de inseto na presença da proteína Rep, em que o vetor de DNA é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codifi- cação do capsídeo viral, na presença da proteína Rep, sob condições eficazes e por um tempo suficiente para induzir a produção do DNA não viral sem capsídeo dentro das células de inseto, em que as célu- las de inseto não compreendem sequências codificantes do capsídeo viral; e b. colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células de insetos; em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo o DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o DNA digerido ma- terial em um gel não desnaturante para confirmar a presença de ban- das características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[00496] 2D. O vetor de DNA não viral sem capsídeo, do parágrafo 1, em que a ITR mutada é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 52.
[00497] 3D. O vetor de DNA não viral sem capsídeo, do parágrafo 1, em que o polinucleotídeo do vetor compreende um par de ITRs se- lecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:
52; e SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 51.
[00498] 4D. Um vetor de DNA não viral sem capsídeo, obtido a par- tir de um vetor de polinucleotídeo, em que o vetor de polinucleotídeo codifica um ácido nucleico heterólogo posicionado operacionalmente entre duas sequências repetidas terminais invertidas (ITRs) diferentes, em que pelo menos uma das ITRs é uma ITR funcional que compre- ende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação a Rep, e em que uma das ITRs compreende uma deleção, inserção ou substituição, em relação à ITR funcional; a presença de proteína Rep induzindo a replicação do vetor de polinucleotídeo e produção do vetor DNA em uma célula de inseto, em que o vetor DNA é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codifi- cação do capsídeo viral na presença da proteína Rep sob condições efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral não capsídico dentro das células do inseto, em que as células de inseto não compreendem DNA não viral de produção sem capsídeo dentro das células de inseto; e b. colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células de insetos; em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o DNA digerido materi- al em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[00499] Em algumas modalidades, o presente pedido pode ser defi- nido em qualquer um dos seguintes parágrafos:
[00500] 1E. Um vetor que compreende (i) um vetor de DNA sem capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (vetor de ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica o transgene operacionalmente posicionado entre duas sequências diferentes de repetição terminal invertida por AAV (ITRs), uma das ITRs que compreende um sítio de resolução de terminal AAV funcional e um sítio de ligação a Rep, uma das ITRs que compreende uma deleção, inserção ou substituição em relação ao outra ITR (ITR modificado), em que o vetor não está em um capsídeo viral.
[00501] 2E. O vetor de ceDNA do parágrafo 1, em que o vetor de ceDNA quando digerido com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de ceDNA tem a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
[00502] 3E. O vetor de ceDNA do parágrafo 1E, em que a ITR mo- dificada é de um sorotipo diferente.
[00503] 4E. O vetor de ceDNA do parágrafo 3E, em que a ITR mo- dificada não é uma ITR do tipo selvagem.
[00504] 5E. O vetor de ceDNA do parágrafo 1E, em que a deleção, inserção ou substituição está em pelo menos uma das regiões de ITR selecionadas do grupo que consiste em A, A’, B, B’, C, C’ e D.
[00505] 6E. O vetor de ceDNA do parágrafo 5E, em que a deleção, inserção ou subestação resulta na deleção de uma das alças formadas pelas regiões A, A’, B, B’ C ou C’.
[00506] 7E. O vetor de ceDNA do parágrafo 1E, em que a modifica- ção corresponde à alteração em uma ITR modificada por AAV2 seleci- onada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 101-498 e 499 ou 545-
547.
[00507] 8E. O vetor de ceDNA do parágrafo 1E, em que a modifica- ção corresponde à alteração em uma ITR modificada por AAV2 seleci- onada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 52, 63 e 64.
[00508] 9E. O vetor de ceDNA dos parágrafos 1E-8E, em que o ve- tor está em um nanocarreador.
[00509] 10E. O vetor de ceDNA do parágrafo 9E, em que o nano- carreador compreende uma nanopartícula lipídica (LNP).
[00510] 11E. Um método que compreende: produzir um DNA não viral do capsídeo sem extremidades fechadas covalentemente (ceDNA) usando um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólogo opera- tivamente posicionado entre duas sequências de repetição terminal invertidas diferentes (ITRs), em que em pelo menos uma das ITRs que compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação a Rep e uma das ITRs que compreende uma deleção, inserção ou substituição, em relação à outra ITR; a presença de proteína Rep induzindo a replicação do vetor de polinucleotídeo e produção do vetor DNA em uma célula de inseto, sendo o vetor DNA obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codifi- cação do capsídeo viral na presença da proteína Rep sob condições efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral não capsídico dentro das células do inseto, em que as células de inseto não compreendem DNA não viral de produção sem capsídeo dentro das células de inseto; e b. colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células de insetos; em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o DNA digerido ma- terial em um gel não desnaturante para confirmar a presença de ban- das características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[00511] 12E. Vetor de DNA não viral sem capsídeo obtido a partir de um vetor de polinucleotídeo, em que o vetor codifica um gene hete- rólogo posicionado operacionalmente entre uma primeira e uma se- gunda sequência polinucleotídica de DNA de repetição terminal inver- tida AAV2 (ITRs), com pelo menos uma das ITRs tendo pelo menos pelo menos uma deleção, inserção ou substituição de polinucleotídeo em relação à ITR do tipo selvagem correspondente AAV2 da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 51 para induzir a replicação do vetor de DNA em uma célula de inseto na presença de proteína Rep, o DNA vetor sendo obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: (a) incubando uma população de células de inseto que abrigam o vetor de polinucleotídeo, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral, na presença da proteína Rep, em condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do DNA não viral dentro das células de inseto, em que as células de inseto não compreendem sequências codificantes do capsídeo viral; e (b) colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das célu- las de inseto; em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o DNA digerido materi- al em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[00512] 13E. O vetor de DNA não viral sem capsídeo, do parágrafo 12E, em que a ITR modificada é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 52.
[00513] 14E. O vetor de DNA não viral sem capsídeo, do parágrafo 12E, em que o polinucleotídeo do vetor compreende um par de ITRs selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 51.
[00514] 15E. Um vetor de DNA não viral sem capsídeo obtido a par- tir de um vetor de polinucleotídeo, em que o vetor de polinucleotídeo codifica um gene heterólogo posicionado operacionalmente entre duas sequências repetidas terminais invertidas diferentes (ITRs), pelo me- nos uma das ITRs que compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação ao Rep e uma das ITRs que compreen- de uma deleção, inserção ou substituição, a presença da proteína Rep induzindo a replicação do polinucleotídeo do vetor e a produção do vetor de DNA em uma célula de inseto, em que o vetor de DNA é obti- do a partir de um processo que compreende as etapas de: (a) incubar uma população de células de inseto que abri- gam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral na presença da proteína Rep sob condi- ções efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral sem capsídeo dentro das células de inseto, em que as células de inseto não compreendem DNA não viral de produção de capsídeo, dentro das células de inseto; e (b) colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das célu- las de inseto; em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o DNA digerido materi-
al em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[00515] 17E. Um vetor de DNA não viral sem capsídeo do parágrafo 15E, em que uma ITR é uma ITR de AAV do tipo selvagem.
[00516] 18E. Um método para tratamento de doença em um indiví- duo, em que o método compreende: coadministrar a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma composição que compreende (i) um vetor de DNA sem capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (vetor de ceD- NA), em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência heterólo- ga de ácido nucleico que codifica um transgene posicionado operacio- nalmente entre duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRs) de AAV diferentes, uma das ITRs que compreende um sítio de resolução de terminal de AAV funcional e um sítio de ligação a Rep, uma das ITRs que compreende uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR.
[00517] 19E. O método do parágrafo 17E, em que o vetor de ceD- NA é administrado em combinação com um veículo farmaceuticamen- te aceitável.
[00518] 20E. Um método para administrar uma terapêutica a um indivíduo, em que o método compreende:
[00519] administrar a um indivíduo, uma composição que compre- ende o vetor de ceDNA dos parágrafos 1E-10E e 12E-16E.
EXEMPLOS
[00520] Os exemplos a seguir são fornecidos a título de ilustração, não como limitação. Exemplo 1: Construindo vetores de ceDNA
[00521] A produção dos vetores de ceDNA usando um modelo de construto de polinucleotídeo é descrita. Por exemplo, um modelo de construto de polinucleotídeo usado para gerar os vetores de ceDNA da presente invenção pode ser um plasmídeo de ceDNA, um ceDNA- Bacmídeo e/ou um ceDNA-baculovírus. Sem se limitar à teoria, em uma célula hospedeira permissiva, na presença de, por exemplo, Rep, o modelo de construto de polinucleotídeo com duas ITRs e um cons- truto de expressão, em que pelo menos uma das ITRs é modificada, replica para produzir vetores de ceDNA. A produção do vetor de ceD- NA passa por duas etapas: primeiro, excisão ("resgate") do modelo do modelo de estrutura principal (por exemplo, plasmídeo de ceDNA, ce- DNA-bacmídeo, genoma ceDNA-baculovírus etc.) por meio de proteí- nas Rep e segunda replicação mediada por Rep do vetor de ceDNA excisado.
[00522] Um método exemplificador para produzir vetores de ceDNA é de um plasmídeo de ceDNA, como descrito no presente documento. Com referência às Figuras 1A e 1B, o modelo de construto de polinu- cleotídeo de cada um dos plasmídeos ceDNA inclui uma ITR esquerda e uma ITR mutada direita com o seguinte entre as sequências de ITR: (i) um intensificador/promotor; (ii) um sítio de clonagem para um trans- gene; (iii) um elemento de resposta pós-transcricional (por exemplo, o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite por marmo- ta) (WPRE); e (iv) um sinal de poliadenilação (por exemplo, do gene do hormônio do crescimento bovino (BGHpA)). Sítios únicos de reco- nhecimento de endonucleases de restrição (R1-R6) (mostrados nas Figuras 1A e 1B) também foram introduzidos entre cada componente para facilitar a introdução de novos componentes genéticos nos sítios específicos do construto R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 7) e R4 (PacI). Os sítios das enzimas TTAATTAA (SEQ ID NO: 542) são proje- tados no sítio de clonagem para introduzir um quadro de leitura aberto de um transgene. Essas sequências foram clonadas em um plasmídeo pFastBac HT B obtido junto à ThermoFisher Scientific.
[00523] Em resumo, uma série de vetores de ceDNA foi obtida a partir dos construtos de plasmídeo de ceDNA mostrados na Tabela 12, usando o processo mostrado nas Figuras 4A-4C. A Tabela 12 indica o número da sequência polinucleotídica correspondente para cada componente, incluindo sequências ativas como sítio da proteína de replicação (RPS) (por exemplo, sítio de ligação a Rep) em cada ex- tremidade de um promotor operacionalmente ligado a um transgene. Os números na Tabela 12 referem-se às SEQ ID NO no presente do- cumento, correspondentes às sequências de cada componente. Tabela 12: Construtos exemplificadores de ceDNA. Plasmídeo ITR-L Promotor Transgene ITR-R Construto-1 51 3 Luciferase 2 Construto-2 52 3 Luciferase 1 Construto-3 51 4 s/SV40 intr Luciferase 2 Construto-4 52 4 s/SV40 intr Luciferase 1 Construto-5 51 5 s/SV40 intr Luciferase 2 Construto-6 52 5 s/SV40 intr Luciferase 1 Construto-7 51 6 Luciferase 2 Construto-8 52 6 Luciferase 1
[00524] Em algumas modalidades, um construto para fazer vetores de ceDNA compreende um promotor que é um comutador regulador como aqui descrito, por exemplo, um promotor induzível. Outros cons- trutos foram usados para fazer vetores de ceDNA, por exemplo, cons- trutos 10, construtos 11, construtos 12 e construção 13 (consulte, por exemplo, a Tabela 14A) que compreendem um promotor MND ou HLCR operacionalmente ligado a um transgene de luciferase. Produção de ceDNA-bacmídeos:
[00525] Com referência à Figura 4A, as células competentes DH10Bac (células competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) foram transformadas com plasmídeos de teste ou con- trole, seguindo um protocolo de acordo com as instruções do fabrican-
te. A recombinação entre o plasmídeo e um vetor shuttle de baculoví- rus nas células DH10Bac foi induzida para gerar ceDNA-bacmídeos recombinantes. Os bacmídeos recombinantes foram selecionados por triagem de uma seleção positiva com base em triagem azul-branca em E. coli (marcador Φ 80dlacZ Δ M15 fornece um complemento α do ge- ne da β-galactosidase do vetor bacmídeo) em uma placa de ágar bac- teriana contendo X-gal e IPTG com antibióticos para selecionar trans- formantes e manutenção dos plasmídeos bacmídeo e transposase. Colônias brancas causadas por transposição que rompe o gene indi- cador de b-galactosídeo foram colhidas e cultivadas em 10 mL de meio.
[00526] Os ceDNA-bacmídeos recombinantes foram isolados da E. coli e transfectados para células de inseto Sf9 ou Sf21 usando Fuge- neHD para produzir baculovírus infeccioso. As células de inseto ade- rentes Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 mL de meio em balões T25 a 25°C. Quatro dias depois, o meio de cultura (contendo o vírus P0) foi removido das células, filtrado através de um filtro de 0,45 µm, sepa- rando as partículas infecciosas de baculovírus das células ou detritos celulares.
[00527] Opcionalmente, a primeira geração do baculovírus (P0) foi amplificada através da infecção de células de inseto Sf9 ou Sf21 ingê- nuas em 50 a 500 mL de meio. As células foram mantidas em culturas em suspensão em uma incubadora orbital de agitador a 130 rpm a 25°C, monitorando o diâmetro e a viabilidade das células, até as célu- las atingirem um diâmetro de 18 a 19 nm (a partir de um diâmetro in- gênuo de 14 a 15 nm) e uma densidade de ~ 4,0E + 6 células/mL. En- tre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculovírus P1 no meio foram coletadas após centrifugação para remover células e detritos e filtração através de um filtro de 0,45 µm.
[00528] Os ceDNA-baculovírus que compreendem os produtos de teste foram coletados e a atividade infecciosa, ou título, do baculovírus foram determinados. Especificamente, quatro culturas de células Sf9 x 20 mL a 2,5E + 6 células/mL foram tratadas com baculovírus P1 nas seguintes diluições: 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incuba- das a 25 a 27°C. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celular e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.
[00529] Com referência à Figura 4A, um "Rep-plasmídeo" de acor- do com a Figura 8A foi produzido em um vetor de expressão pFAS- TBACTM-Dual (ThermoFisher) que compreende Rep78 (SEQ ID NO: 13) ou Rep68 (SEQ ID NO: 12) e Rep52 (SEQ ID NO: 14) ou Rep40 (SEQ ID NO: 11).
[00530] O Rep-plasmídeo foi transformado em células competentes DH10Bac (células competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ (Thermo Fisher), seguindo um protocolo fornecido pelo fabricante. A recombinação entre o Rep-plasmídeo e um vetor shuttle de baculoví- rus nas células DH10Bac foi induzida a gerar bacmídeos recombinan- tes ("Rep-bacmídeos"). Os bacmídeos recombinantes foram selecio- nados por uma seleção positiva que incluía triagem azul-branca em E. coli (marcador Φ 80dlacZ Δ M15 fornece um complemento α do gene da β-galactosidase do vetor de bacmídeo) em uma placa de ágar bac- teriano contendo X-gal e IPTG. Colônias brancas isoladas foram colhi- das e inoculadas em 10 mL de meio de seleção (canamicina, gentami- cina, tetraciclina em caldo LB). Os bacmídeos recombinantes (Rep- bacmídeos) foram isolados de E. coli e os rep-bacmídeos foram trans- fectados em células de inseto Sf9 ou Sf21 para produzir baculovírus infeccioso.
[00531] As células de inseto Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 mL de meio por 4 dias e os baculovírus recombinantes infecciosos ("Rep- baculovírus") foram isolados da cultura. Opcionalmente, a Rep-
baculovírus de primeira geração (P0) foi amplificada através da infec- ção de células de inseto Sf9 ou Sf21 ingênuas e cultivada em 50 a 500 mL de meio. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculo- vírus P1 no meio foram coletadas por separação de células por centri- fugação ou filtração ou outro processo de fracionamento. Os Rep- baculovírus foram coletados e a atividade infecciosa do baculovírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 mL de culturas de células Sf9 a 2,5x106 células/mL foram tratadas com baculovírus PI nas se- guintes diluições, 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incubadas. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celu- lar e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias. Geração e caracterização do vetor de ceDNA
[00532] Com referência à Figura 4B, meios de cultura de células de inseto Sf9 contendo (1) uma amostra contendo um ceDNA-bacmídeo ou um ceDNA-baculovírus e (2) rep-baculovírus descritos acima foram então adicionados a uma nova cultura de células Sf9 (2,5E + 6 célu- las/mL, 20 mL) na proporção de 1:1.000 e 1:10.000, respectivamente. As células foram então cultivadas a 130 rpm a 25°C. 4 a 5 dias após a coinfecção, o diâmetro e a viabilidade celular são detectados. Quando os diâmetros celulares atingiram 18 a 20 nm com uma viabilidade de ~70-80%, as culturas celulares foram centrifugadas, o meio foi removi- do e os péletes celulares foram coletados. Os sedimentos celulares são primeiro ressuspensos em um volume adequado de meio aquoso, água ou tampão. O vetor de ceDNA foi isolado e purificado das células usando o protocolo de purificação Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, 0,2 mg de massa de grânulos de células processadas por coluna).
[00533] Os rendimentos dos vetores de ceDNA produzidos e purifi- cados a partir das células de inseto Sf9 foram inicialmente determina- dos com base na absorvância de UV a 260 nm. Os rendimentos de vários vetores de ceDNA determinados com base na absorvância UV são fornecidos abaixo na Tabela 13. Tabela 13: Rendimento de vetores de ceDNA de construtos exemplifi- cadores. Construto Volume Parâmetros de cultura Rendimento Rendimento esti- da cultura (Diâmetro em micrômetros) (mg/l) mado (pg/célula) construto-1 2x1L Total: 6,02 x10e6 15,8 5,23 Viabilidade: 53,3% Diâmetro: 18,4
[00534] os vetores de ceDNA podem ser avaliados por identificados por eletroforese em gel de agarose em condições nativas ou desnatu- rantes, como ilustrado na Figura 4D, em que (a) a presença de bandas características migrando com o dobro do tamanho em géis desnatu- rantes versus géis nativos após clivagem por endonuclease de restri- ção e análise eletroforética em gel e (b) a presença de bandas de mo- nômero e dímero (2x) em géis desnaturantes para material não clivado é característica da presença do vetor de ceDNA.
[00535] As estruturas dos vetores de ceDNA isolados foram anali- sadas posteriormente pela digestão do DNA obtido das células Sf9 co- infectadas (como descrito no presente documento) com endonuclea- ses de restrição selecionadas para a) a presença de apenas um único sítio de corte nos vetores de ceDNA e b) fragmentos resultantes que eram grandes o suficiente para serem vistos claramente quando fraci- onados em um gel de agarose desnaturante a 0,8% (> 800 pb). Como ilustrado na Figura 4E, os vetores lineares de DNA com uma estrutura não contínua e o vetor de ceDNA com a estrutura linear e contínua podem ser distinguidos pelos tamanhos de seus produtos de reação - por exemplo, espera-se que um vetor de DNA com uma estrutura não contínua produza fragmentos de 1kb e 2kb, enquanto um vetor não encapsidado com a estrutura contínua deve produzir fragmentos de 2kb e 4kb.
[00536] Portanto, para demonstrar de maneira qualitativa que os vetores de ceDNA isolados são covalentemente fechados, conforme exigido por definição, as amostras foram digeridas com uma endonu- clease de restrição identificada no contexto da sequência específica do vetor de DNA como tendo um único sítio de restrição., de preferência resultando em dois produtos de clivagem de tamanho desigual (por exemplo, 1.000 pb e 2.000 pb). Após digestão e eletroforese em um gel desnaturante (que separa as duas cadeias complementares de DNA), um DNA linear e não covalentemente fechado será resolvido nos tamanhos de 1.000 bp e 2.000 bp, enquanto um DNA covalente- mente fechado (ou seja, um vetor de ceDNA) será resolvido em tama- nhos 2x (2.000 pb e 4.000 pb), à medida que as duas cadeias de DNA estão ligadas e agora se desdobram e têm o dobro do comprimento (embora de fita simples). Além disso, a digestão das formas monomé- ricas, diméricas e n-méricas dos vetores de DNA será resolvida como fragmentos do mesmo tamanho devido à ligação de ponta a ponta dos vetores de DNA multiméricos (consulte a Figura 4D).
[00537] A Figura 5 fornece uma imagem exemplificadora de um gel desnaturante com vetores de ceDNA da seguinte forma: construto-1, construto-2, construto-3, construto-4, construto-5, construto-6, constru- to-7 e construto-8 (todos descritos em Tabela 12 acima), com (+) ou sem digestão (-) pela endonuclease. Cada vetor de ceDNA dos cons- trutos-1 ao construto-8 produziu duas bandas (*) após a reação de en- donuclease. Seus dois tamanhos de banda determinados com base no marcador de tamanho são fornecidos na parte inferior da imagem. Os tamanhos das bandas confirmam que cada um dos vetores de ceDNA produzidos a partir de plasmídeos que compreende a construção 1 a construção 8 tem uma estrutura contínua.
[00538] Como aqui usada, a expressão "Ensaio para identificação de vetores de DNA por eletroforese em gel de agarose sob condições nativas de gel e desnaturação" refere-se a um ensaio para avaliar a proximidade do ceDNA, realizando digestão com endonucleases de restrição seguida de avaliação eletroforética dos produtos digeridos.
Um desses ensaios exemplificadores a seguir, embora um técnico no assunto compreenda que muitas variações conhecidas na técnica nesse exemplo são possíveis.
A endonuclease de restrição é selecio- nada para ser uma enzima de corte único para o vetor de ceDNA de interesse que irá gerar produtos com aproximadamente 1/3x e 2/3x do comprimento do vetor de DNA.
Isso resolve as bandas em géis nativos e desnaturantes.
Antes da desnaturação, é importante remover o tam- pão da amostra.
O kit de limpeza Qiagen PCR ou a dessalinização de "colunas giratórias", por exemplo, colunas GE HEALTHCARE ILUS- TRA, MICROSPIN e G-25, são algumas opções conhecidas na técnica para a digestão de endonucleases.
O ensaio inclui, por exemplo, i) di- gerir DNA com endonuclease (ou endonucleases) de restrição apropri- ada, 2) aplicar a, por exemplo, um kit de limpeza Qiagen PCR, eluir com água destilada, iii) adicionar 10x solução desnaturante (10x = NaOH,5 M, EDTA 10 mM), adicionar 10X de corante, sem tampona- mento e analise, juntamente com as ladders de DNA preparadas adi- cionando solução de desnaturação 10X a 4x, em um gel de 0,8 a 1,0% previamente incubado com EDTA 1 mM e NaOH 200 mM para garantir que a concentração de NaOH seja uniforme na caixa de gel e gel e executando o gel na presença de solução desnaturante 1x (NaOH 50 mM, EDTA 1 mM). Um técnico no assunto apreciará qual voltagem usar para executar a eletroforese com base no tamanho e no tempo desejado dos resultados.
Após a eletroforese, os géis são drenados e neutralizados em 1x TBE ou TAE e transferidos para água destilada ou 1x TBE/TAE com 1x SYBR Gold.
As bandas podem então ser visuali- zadas com, por exemplo, Thermo Fisher, mancha de gel de ácido nu- cleico SYBR® Gold (10.000X concentrado em DMSO) e luz epifluores- cente (azul) ou UV (312nm).
[00539] A pureza do vetor de ceDNA gerado pode ser avaliada por meio do qualquer método conhecido na técnica. Como um método exemplificador e não limitativo, a contribuição do plasmídeo de ceDNA para a absorvância total de UV de uma amostra pode ser estimada comparando a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA com um padrão. Por exemplo, se com base na absorvância UV, 4 µg do vetor de ceDNA foram carregados no gel, e a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA é equivalente a uma banda de 2kb que é conhecida por 1 µg, então há 1 µg de vetor de ceDNA e o vetor de ceDNA é 25% do total de material absorvente de UV. A intensidade da banda no gel é plotada contra a entrada calculada que a banda representa - por exemplo, se o vetor de ceDNA total for 8kb e a banda comparativa ex- cisada for 2kb, a intensidade da banda será plotada como 25% da en- trada total, que neste caso seria 0,25 µg para 1,0 µg de entrada. Usando a titulação do plasmídeo do vetor de ceDNA para plotar uma curva padrão, uma equação de linha de regressão é então usada para calcular a quantidade da banda do vetor de ceDNA, que pode ser usa- da para determinar a porcentagem da entrada total representada pelo vetor de ceDNA, ou porcentagem de pureza. Exemplo 2: Produção de DNA viral em células de ceDNA
[00540] Os vetores de ceDNA também foram gerados a partir dos construtos 11, 12, 13 e 14 mostradas na Tabela 14A. Os plasmídeos de ceDNA que compreende os construtos 11-14 foram gerados por métodos de clonagem molecular bem conhecidos na técnica. Os plasmídeos da Tabela 14A foram construídos com o WPRE que com- preende SEQ ID NO: 8 seguido por BGHpA que compreende SEQ ID NO: 9 na região não traduzida 3’ entre o transgene e a ITR direita.
Tabela 14A Plasmídeo ITR-L Promotor Transgene ITR-R Construto 11 (SEQ ID NO: 63) (SEQ ID NO: 70) Luciferase (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 1) Construto 12 (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 70) Luciferase (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 64) Construto 13 (SEQ ID NO: 63) (SEQ ID NO: 74) Luciferase (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 1) Construto 14 (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 74) Luciferase (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 64)
[00541] O vetor Backbone para construtos dos construtos 11-14 é o seguinte: (i) asymITR-MND-gluciferase -wPRE-BGH-polyA-ITR em pFB-HTb (construção 11), (ii) ITR-MND-luciferase–WPRE-BGH-polyA– assimITR em pFB-HTb (contrato 12), (iii) asymITR–HLCR-AAT-luc- wPRE (O) -BGH-polyA-ITR em pFB-HTb (construto 13); e ITR-HLCR- AAT-luc-wPRE (O)-BGH-polyA-asymITR em pFB-HTb (construto 14), em que cada construto tem pelo menos uma ITR assimétrica entre si. Esses construtos também compreendem uma ou mais das seguintes sequências: wPRE0 (SEQ ID NO: 72) e sequência BGH-PolyA (SEQ ID NO: 73) ou sequências pelo menos 85%, ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência.
[00542] A seguir, a produção do vetor de ceDNA foi realizada de acordo com o procedimento na Figura 4A-4C, por exemplo, (a) Gera- ção de DNA ceDNA-Bacmídeo recombinante e Transfecção de células de insetos com DNA ceDNA-Bacmídeo recombinante; (b) geração de material P1 (título baixo), material P2 (título alto) e determinação do título de vírus por PCR Quantitativa, para obter um produto de 5 mL,> 1E + 7 formador de placa ou unidades infecciosas "pfu" por mL BV Stock, BV Stock COA. O isolamento do vetor de ceDNA foi realizado por coinfecção de 50 mL de células de inseto com estoque de BV para os seguintes pares de infecções: Rep-bacmídeo, conforme descrito no presente documento e pelo menos uma das seguintes construtos: construto 11, construto 12, construto 13 e construto 14 O isolamento do vetor de ceDNA foi realizado usando o kit QIAGEN Plasmid Midi para obter material de DNA purificado para análise posterior. As Tabe-
las 14B e 14C mostram o rendimento (como detectado pela detecção de OD) do vetor de ceDNA produzido a partir dos produtos 11-14. Tabela 14B: Rendimento (como detectado pela detecção de OD) de vetores de ceDNA exemplificadores produzidos a partir dos construtos 11-14. No de Construto Concentração de DNA Razão 260/280 quantidade total de Rendimento total de OD260 e coeficiente DNA [ug] de infec- DNA [mg] por 1 litro padrão 50 ção de 50 mL (vo- (estimativa) lume de produção de ceDNA) Construto 11 342,7 ng/µl 1,79 8,57 0,171 Construto 12 197,5 ng/μl 1,9 4,54 0,090 Construto 13 145 ng/ul 1,9 3,62 0,072 Construto 14 443,1 ng/ul 1,79 11,08 0,221 Tabela 14C: Rendimento (detectado pela detecção de OD) do vetor de ceDNA produzido a partir do construto No de Cons- A230 260/230 260/280 DNA Conc. Rendimento Rendimento total de truto OD260 e coefi- de 0,2 g de pé- DNA [mg] por 1 litro ciente padrão 50 lete de células (estimativa) 14 0,038 2,789 1,860 265 ng/ul 53,0 2,6 12 0,017 6,176 1,842 263 ng/ul 52,6 2,6
[00543] A Tabela 14C mostra a quantidade de material de DNA ob- tido (como detectado pela detecção de OD) usando os construtos 12 e 14 da Tabela 14C. O rendimento do material total de DNA foi aceitável, comparado com rendimentos típicos de cerca de 3 mg/l de material de DNA do processo no Exemplo 1 (Tabela 13) acima. Exemplo 3: Vetores de ceDNA expressam o transgene da lucifera- se in vitro
[00544] Os construtos foram gerados pela introdução de um quadro de leitura aberto que codifica o gene repórter da Luciferase no sítio de clonagem dos construtos do plasmídeo de ceDNA: construto-1, cons- truto-3, construto-5 e construto-7. Os ceDNA-plasmídeos (consulte acima na Tabela 12) incluindo a sequência de codificação da Lucifera- se são denominados construto plasmídeo 1-Luc, construto plasmídeo-
3-Luc, construto plasmídeo-5-Luc e construto plasmídeo 7-Luc, res- pectivamente.
[00545] As células HEK293 foram cultivadas e transfectadas com 100 ng, 200 ng ou 400 ng dos construtos plasmídeo 1, 3, 5 e 7, usan- do FUGENE® (Promega Corp.) como agente de transfecção. A ex- pressão de luciferase de cada um dos plasmídeos foi determinada com base na atividade da luciferase em cada cultura de células e os resultados são fornecidos na Figura 6A A atividade da luciferase não foi detectada a partir das células de controle não tratadas ("não trata- das") ou das células tratadas apenas com Fugene ("Fugene"), confir- mando que a atividade da Luciferase resultou da expressão gênica dos plasmídeos. Como ilustrado nas Figuras 6A e 6B, a expressão ro- busta de Luciferase foi detectada nos construtos 1 e 7. A expressão do construto-7 expressou Luciferase com um aumento dependente da dose da atividade da Luciferase sendo detectada.
[00546] O crescimento e a viabilidade das células transfectadas com cada um dos plasmídeos também foram determinados e apresen- tados nas Figuras 7A e 7B. O crescimento celular e a viabilidade das células transfectadas não foram significativamente diferentes entre os diferentes grupos de células tratadas com diferentes construtos.
[00547] Consequentemente, a atividade da luciferase medida em cada grupo e normalizada com base no crescimento e viabilidade celu- lar não foi diferente da atividade da luciferase sem a normalização. O plasmídeo de ceDNA com o construto 1-Luc mostrou a expressão mais robusta da luciferase com ou sem normalização.
[00548] Assim, os dados apresentados nas Figuras 6A, 6B, 7A e 7B demonstram que o construto 1, que compreende de 5’ a 3’– WT- ITR (SEQ ID NO: 51), promotor CAG (SEQ ID NO: 3), sítio de clona- gem R3/R4 (SEQ ID NO: 7), WPRE (SEQ ID NO: 8), BGHpA (SEQ ID NO: 9) e uma ITR modificada (SEQ ID NO: 2) são eficazes na produ-
ção de um vetor de ceDNA que pode expressar uma proteína de um transgene dentro do vetor de ceDNA. Exemplo 4: expressão proteica in vivo do transgene de luciferase a partir de vetores de cedna.
[00549] A expressão proteica in vivo de um transgene a partir de vetores de ceDNA produzidos a partir dos construtos 1-8 descritas acima é avaliada em camundongos. O vetor de ceDNA obtido do cons- truto plasmídeo de ceDNA 1 (conforme descrito na Tabela 12) foi tes- tado e demonstrou expressão do transgene de luciferase sustentada e durável em um modelo de camundongo após injeção hidrodinâmica da construção ceDNA sem lipossomo, redose (no dia 28) e durabilidade (até o dia 42) do ceDNA de luciferase firefly exógeno. Em diferentes experiências, a expressão de luciferase de vetores de ceDNA selecio- nados é avaliada in vivo, em que os vetores de ceDNA compreendem o transgene de luciferase e pelo menos uma ITR modificada selecio- nada dentre as mostradas nas Tabelas 10A-10B, ou uma ITR que compreende pelo menos uma sequência mostrada nas Figuras 26A- 26B
[00550] Expressão in vivo de luciferase: camundongos IGS CD-1 machos de 5 a 7 semanas (Charles River Laboratories) recebem 0,35 mg/kg de vetor de ceDNA expressando luciferase em volume de 1,2 mL via administração hidrodinâmica iv na veia da cauda no dia 0. A expressão da luciferase é avaliada por imagem IVIS nos dias 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35 e 42. Resumidamente, os camundongos são injeta- dos intraperitonealmente com 150 mg/kg de substrato de luciferina e a luminescência do corpo inteiro foi avaliada via Imagem IVIS®.
[00551] O imageamento IVIS é realizado no dia 3, dia 4, dia 7, dia 14, dia 21, dia 28, dia 31, dia 35 e dia 42, e os órgãos coletados são fotografados ex vivo após o sacrifício no dia 42.
[00552] Durante o curso do estudo, os animais são pesados e moni-
torados diariamente quanto à saúde e bem-estar geral. No sacrifício, o sangue é coletado de cada animal pelo bastão cardíaco terminal e di- vidido em duas porções e processado em 1) plasma e 2) soro, com plasma congelado rapidamente e soro usado no painel de enzimas hepáticas e subsequentemente congelado. Além disso, fígados, baços, rins e linfonodos inguinais (LNs) são coletados e gerados por imagem ex vivo pelo IVIS.
[00553] A expressão da luciferase é avaliada em fígado pelo ensaio MAXDISCOVERY® Luciferase ELISA (BIOO Scientific/PerkinElmer), qPCR para luciferase de amostras de fígado, histopatologia de amos- tras de fígado e/ou painel de enzimas hepáticas séricas (VetScanVS2; Abaxis Preventative Care Profile Plus). Exemplo 5: Triagem mutante de itr walk
[00554] Análises adicionais da relação da estrutura ITR com a for- mação de ceDNA foram realizadas. Uma série de mutantes foi cons- truída para questionar o impacto de alterações estruturais específicas na formação de ceDNA e na capacidade de expressar o transgene co- dificado em ceDNA. A construção de mutantes, o ensaio da formação de ceDNA e a avaliação da expressão do transgene de ceDNA em cul- tura de células humanas são descritos em mais detalhes abaixo. A. Construto de ITR mutante
[00555] Uma biblioteca de 31 plasmídeos com cassetes mutantes ITR AAV tipo II assimétricas únicas foi manipulada in silico e subse- quentemente avaliada em células de inseto Sf9 e células renais embri- onárias humanas (HEK293). Cada cassete ITR continha um gene re- pórter da luciferase (LUC) ou proteína fluorescente verde (GFP), acio- nado por uma sequência promotora p10 para expressão em células de inseto e uma sequência promotora CAG para expressão em células de mamíferos. Mutações na sequência ITR foram criadas na região ITR direita ou esquerda. A biblioteca continha 15 mutantes do lado direito
(RS) e 16 do lado esquerdo (LS), descritos na Tabela 10A e 10B e nas Figuras 26A e 26B deste documento.
[00556] As culturas de suspensão de Sf9 foram mantidas em meio Sf900 III (Gibco) em balões de cultura de tecidos de 200 mL ventila- dos. As culturas foram passadas a cada 48 horas e as contagens de células e métricas de crescimento foram medidas antes de cada pas- sagem usando um ViCell Counter (Beckman Coulter). As culturas fo- ram mantidas sob condições de agitação (órbita de 1’’, 130 rpm) a 27°C. As culturas aderentes das células HEK293 foram mantidas em GlutiMax DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco, Gibco) com soro bovino fetal a 1% e PenStrep a 1% em 250 frascos de cultura mL a 37°C com 5% de CO2. As culturas foram tripsinizadas e passadas a cada 96 horas. Uma diluição de 1:10 de um frasco confluente de 90- 100% foi usada para semear cada passagem.
[00557] Os vetores de ceDNA foram gerados e construídos como descrito no Exemplo 1 acima. Em resumo, referindo-se à Figura 4B, as células Sf9 transduzidas com construtos plasmídicos foram deixadas crescer aderentemente por 24 horas em condições estacionárias a 27°C. Após 24 horas, as células Sf9 transfectadas foram infectadas com o vetor Rep via células de inseto infectadas com baculovírus (BIICs). As BIICs foram previamente testadas para caracterizar a infec- tividade e foram usados na diluição final de 1:2.000. BIICs diluídas 1:100 em meio de célula de inseto Sf900 foram adicionadas a cada poço de célula previamente transfectado. BIICs de vetor não Rep fo- ram adicionadas a um subconjunto de poços como controle negativo. As placas foram misturadas balançando suavemente em um agitador de placas por 2 minutos. As células foram então cultivadas por mais 48 horas a 27°C em condições estacionárias. Todos os construtos e con- troles experimentais foram testados em triplicado.
[00558] Após 48 horas, a placa de 96 poços foi removida da incu-
badora, equilibrada brevemente à temperatura ambiente e testada quanto à expressão de luciferase (OneGlo Luciferase Assay (Promega Corporation)). A luminescência total foi medida usando um leitor de microplacas SpectraMax M Series. As réplicas foram calculadas como média. Os resultados são mostrados na Figura 27. Como esperado, os três controles negativos (apenas meio, transfecção simulada sem DNA do doador e amostra processada na ausência de células de baculoví- rus contendo Rep) não mostraram expressão significativa de lucifera- se. Foi observada expressão robusta de luciferase em cada uma das amostras mutantes, indicando que para cada amostra o transgene co- dificado por ceDNA foi transfectado com sucesso e expresso indepen- dentemente da mutação. B. Ensaio de formação de ceDNA
[00559] Para garantir que o ceDNA gerado no estudo anterior fosse da estrutura esperada final, foram realizados experimentos para pro- duzir quantidades suficientes de cada ceDNA que pudessem ser pos- teriormente testadas quanto à estrutura adequada. Resumidamente, as culturas de suspensão de Sf9 foram transfectadas com DNA per- tencente a um único plasmídeo mutante de ITR da biblioteca. As cultu- ras foram semeadas a 1,25x106 células/mL em frascos de cultura Er- lenmeyer com troca gasosa limitada. Os complexos de transfecção de DNA:lipídio foram preparados usando reagente de transfecção fuGene de acordo com as instruções do fabricante. As misturas complexas fo- ram preparadas e incubadas da mesma maneira descrita anteriormen- te para o ensaio da placa de luciferase, com volumes aumentados proporcionais ao número de células sendo transfectadas. Como no ensaio do gene repórter, foi usada uma razão de 4,5:1 (volume de re- agente/DNA de massa). A simulação (apenas os reagentes de trans- fecção) e os controles de crescimento não tratados foram preparados em paralelo com as culturas experimentais. Após a adição de reagen-
tes de transfecção, as culturas foram recuperadas por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave antes de serem transferi- das para uma incubadora com agitação a 27°C. Após 24 horas de in- cubação sob condições de agitação, as contagens de células e métri- cas de crescimento para todos os frascos (experimental e controle) foram medidas com o uso de um contador ViCell (Beckman Coulter). Todos os frascos (exceto controle de crescimento) foram infectados com BIICs contendo vetor Rep a uma diluição final de 1:5.000. Um controle positivo com o uso do procedimento de infecção dupla BIIC estabelecido para a produção de ceDNA também foi preparado. A cul- tura de infecção dupla foi semeada com o número de células igual à contagem de células viável média de todas as culturas experimentais. O controle duplo da infecção foi infectado com BIICs do gene Rep e repórter a uma diluição final de 1:5.000 para cada construto, respecti- vamente. Após a infecção, as culturas foram colocadas de volta na in- cubadora sob condições de agitação descritas anteriormente. As con- tagens de células, métricas de crescimento e viabilidade foram medi- das diariamente para todos os frascos durante 3 dias após a infecção. Medições de ponto no tempo T = 0 foram tomadas após culturas re- cém-infectadas terem sido recuperadas por ~2 horas sob condições de incubação com agitação. Após 3 dias, as células foram colhidas por centrifugação por 15 minutos. O sobrenadante foi descartado, a massa de péletes foi registrada e os péletes foram congelados a -80°C até a extração do DNA.
[00560] O ceDNA bruto putativo foi extraído de todos os frascos (experimental e controle) usando o kit Qiagen Plasmid Plus Midi Purifi- cation (Qiagen) de acordo com o protocolo de "alto rendimento" dos fabricantes. Os eluatos foram quantificados usando medições de den- sidade óptica obtidas de um NanoDrop OneC (ThermoFisher). Os ex- tratos de ceDNA resultantes foram armazenados a 4°C.
[00561] Os extratos de ceDNA anteriores foram executados em um gel de agarose nativa (1% agarose, 1x tampão TAE) preparado com diluição 1:10.000 de SYBR Safe Gel Stain (ThermoFisher Scientific), ao lado da ladder de DNA TrackIt 1kb Plus.
O gel foi subsequentemen- te visualizado usando um Gbox Mini Imager sob iluminação UV/azul.
Como descrito anteriormente, são esperadas duas bandas primárias em amostras de ceDNA executadas em géis nativos: uma banda de ~5.500 pb representando uma espécie monomérica e uma banda de ~11.000 pb correspondente a uma espécie dimérica.
Todas as amos- tras mutantes foram testadas e exibiram as bandas esperadas de mo- nômero e dímero em géis de agarose nativos.
Os resultados para uma amostra representativa dos mutantes são mostrados na Figura 28. O ceDNA bruto de ITR-mutante putativo e os extratos de controle da produção em pequena escala foram posteriormente analisados com o uso de uma digestão de restrição acoplada e gel de agarose desnatu- rante para confirmar um diagnóstico de estrutura de DNA de fita dupla do ceDNA.
Espera-se que cada ceDNA mutante tenha um único sítio de restrição de EcoR1 e, se formado adequadamente, produza dois fragmentos característicos após a digestão com EcoR1. A endonu- clease de restrição de alta fidelidade EcoRI (New England Biolabs) foi usada para digerir o extrato putativo de ceDNA de acordo com as ins- truções do fabricante.
Extratos de controles simulados e de crescimen- to não foram analisados devido ao fato de que a quantificação espec- trofotométrica usando o NanoDrop (ThermoFisher), bem como a análi- se de gel de agarose nativa, revelou que não havia produto detectável do tipo ceDNA/plasmídeo nos eluatos.
O material digerido foi purifica- do usando o Kit Qiagen PCR Clean-up (Qiagen) de acordo com as ins- truções do fabricante, com a exceção de que o material digerido purifi- cado foi eluído em água livre de nuclease em vez de tampão de elui- ção Qiagen.
Um gel de agarose alcalina (agarose alcalina a 0,8%) foi equilibrado em Tampão de Equilibração (EDTA 1 mM, NaOH 200 mM) durante a noite a 4°C. Solução de desnaturação 10x (NaOH 50 mM, EDTA 1 mM) foi adicionada às amostras do ceDNA purificado as di- gestões e o ceDNA não digerido correspondente (1 ug total) e as amostras foram aquecidas a 65°C por 10 minutos. Adicionou-se 10x corante de carga (azul de bromofenol, glicerol a 50%) a cada amostra desnaturada e misturou-se. A ladder de DNA TrackIt 1kb Plus (Ther- moFisher Scientific) também foi carregada no gel como referência. O gel foi corrido, durante ~ 18 horas a 4°C e de tensão constante (25 V), seguido de enxágue com H2O desionizada e neutralização em 1xTAE (Tris-acetato, EDTA), pH 7,6, durante 20 minutos com suave agitação. O gel foi então transferido para solução 1x TAE/1x SYBR Gold por ~1 hora sob agitação suave. O gel foi então visualizado com o uso de um Gbox Mini Imager (Syngene) sob iluminação UV/azul. Esperava-se que as amostras desnaturadas não cortadas migrassem a ~11.000 pb e as amostras tratadas com EcoRI deveriam ter duas bandas, uma a ~4.000 pb e uma a ~6.000 pb.
[00562] Todas as amostras mutantes tiveram resultados semelhan- tes neste experimento. Duas faixas significativas foram visíveis em ca- da faixa de amostra nas amostras tratadas com EcoR1, migrando no gel desnaturante nos tamanhos esperados, em nítido contraste com as amostras mutantes não digeridas, que migraram no tamanho esperado de ~11.000 pb. A Figura 27 mostra os resultados para uma amostra representativa de mutantes, em que duas bandas acima do fundo são vistas para cada amostra de mutante digerida, em comparação com a banda única visível nas amostras de mutantes não digeridas. Assim, as amostras mutantes pareciam formar corretamente ceDNA. C. Expressão funcional na cultura de células humanas
[00563] Para avaliar a funcionalidade do ceDNA ITR mutante pro- duzido pelo processo de produção em pequena escala, as células
HEK293 foram transfectadas com algumas amostras representativas de ceDNA mutante. Ativamente células HEK293 que dividem foram plaqueadas em placas de 96 poços de microtitulação a 3x106 células por poço (80% de confluência) e incubou-se durante 24 horas a condi- ções previamente descritas para culturas aderentes HEK293. Após 24 horas, 200 ng total de ceDNA em pequena escala foi transfectado com o uso de Lipofectamine (Invitrogen, TheromoFisher Scientific). Os complexos de transfecção foram preparados de acordo com as instru- ções do fabricante e um volume total de 10 ul de complexo de trans- fecção foi usado para transfectar células HEK293 previamente plaque- adas. Todos os construtos e controles experimentais foram testados em triplicado. As células transfectadas foram incubadas nas condições descritas anteriormente por 72 horas. Após 72 horas, a placa de 96 poços foi removida da incubadora e deixada equilibrar brevemente à temperatura ambiente. O ensaio OneGlo Luciferase foi realizado. Após 10 minutos no agitador orbital, a luminescência total foi medida com o uso de um leitor de microplacas SpectraMax M Series. As réplicas fo- ram calculadas como média. Os resultados são mostrados na Figura
30. Cada uma das amostras mutantes testadas expressou luciferase em cultura de células humanas, indicando que o ceDNA foi correta- mente formado e expresso para cada amostra no contexto de células humanas.
REFERÊNCIAS
[00564] Todas as referências listadas e reveladas no relatório des- critivo e nos Exemplos, incluindo patentes, pedidos de patente, pedi- dos de patente internacionais e publicações, são incorporadas aqui na sua totalidade a título de referência.

Claims (57)

REIVINDICAÇÕES
1. Vetor de DNA não viral sem capsídeo com extremidades fechadas covalentemente (vetor de ceDNA), caracterizado pelo fato de que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma sequência de nu- cleotídeos heteróloga posicionada operacionalmente entre sequências repetitivas terminais invertidas assimétricas (ITRs assimétricas), em que pelo menos uma das ITRs assimétricas compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação de Rep.
2. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que o vetor de ceDNA quando digerido com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no ve- tor de ceDNA e analisado por eletroforese em gel nativa e desnaturan- te exibe bandas características de DNA linear e contínuo em compara- ção com linear e controles de DNA não contínuos.
3. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das sequências de ITR assimétricas são de um vírus selecionado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV).
4. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 3, carac- terizado pelo fato de que as ITRs assimétricas são de diferentes soro- tipos virais.
5. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 4, carac- terizado pelo fato de que a uma ou mais ITRs assimétricas são de um sorotipo AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.
6. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das se- quências de ITR assimétricas são sintéticas.
7. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3 e 6, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das
ITRs não são uma ITR do tipo selvagem.
8. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que uma ou mais das ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição em pelo menos uma das regiões de ITR selecionadas de A, A’, B, B’, C, C’, D e D’.
9. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 8, carac- terizado pelo fato de que a deleção, inserção e/ou substituição resulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça normal- mente formada por regiões A, A’, B, B’ C ou C.
10. Vetor ceDNA, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, ca- racterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que resulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça normal- mente formada por regiões B e B’.
11. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que resulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pelas regiões C e C’.
12. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que re- sulta na deleção de parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pelas regiões B e B’ e/ou parte de uma estrutura haste-alça normalmente formada pelas regiões C e C’.
13. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs assimétricas compreendem uma única estrutura de haste-alça na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-
alça formada pelas regiões B e B’ e uma segunda estrutura de haste- alça formada pelas regiões C e C’.
14. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 13, ca- racterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs assimétricas com- preendem uma haste única e duas alças na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regi- ões B e B’ e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regi- ões C e C’.
15. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs assimétricas compreendem uma haste única e uma alça única na região que nor- malmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regiões B e B’ e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regiões C e C’.
16. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ITR assimétrica é uma ITR de AAV2 modificada que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada dentre: as ITRs nas Figuras 26A ou 26B, SEQ ID NO: 101-499 ou 545 a 547, uma ITR com pelo menos 95% de identidade de sequência com uma ITR nas Figuras 26A ou 26B e uma ITR com pelo menos 95% de identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 101 a 499 e 545 a 547.
17. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ITR assimétrica é uma ITR de AAV2 modificada que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2, 52, 63 ou 64, ou uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, 52, 63 ou 64.
18. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a 5’ ITR é uma ITR de AAV do tipo selvagem e a 3’ ITR compreende uma sequência sele- cionada dentre SEQ ID NO: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,130, 132, 134, 469 a 483 e 546, e sequências de ITR mostradas na Figura 26A e sequências que têm pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências anteriores.
19. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a 3’ ITR é uma ITR de AAV do tipo selvagem e a 5’ ITR compreende uma sequência sele- cionada dentre SEQ ID NO: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484 a 499, 545 e 547, e sequências de ITR mostradas na Figura 26B e sequências que têm pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências anteriores.
20. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a 5’ ITR compreen- de uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO: 52, 63, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 484 a 499, 545 e 547 e sequências de ITR mostradas na Figura 26B e sequências que têm pelo menos 95% de identidade de sequên- cia com qualquer uma das sequências anteriores; e a 3’ ITR compre- ende uma sequência selecionada dentre SEQ ID NO: 2, 64, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128,130, 132, 134, 469 a 483 e 546, e sequências de ITR mostradas na Figura 26A e sequências que têm pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências anteriores.
21. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que compreende pelo menos duas ITRs assi- métricas selecionadas dentre: a. SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 52; e b. SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 51.
22. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que compreende um par de ITRs assimétricas selecionadas dentre: a. SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 52; e b. SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 51.
23. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs assimétricas compreendem uma sequência diferente da SEQ ID NO: 2, 52, 63, 64, 113, 114 e 557.
24. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que toda ou parte da sequência de nucleotídeos heteróloga está sob o controle de pelo me- nos um comutador regulador.
25. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 24, ca- racterizado pelo fato de que pelo menos um comutador regulador é selecionado dos comutadores reguladores da Tabela 11.
26. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o vetor está em um nanocarreador.
27. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 26, ca- racterizado pelo fato de que o nanocarreador compreende uma nano- partícula lipídica (LNP).
28. Vetor de DNA não viral sem capsídeo com extremida- des fechadas covalentemente (vetor de ceDNA), de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o vetor de ceDNA sendo obtido a partir de um processo que compreen- de as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abrigam um construto de expressão de ceDNA na presença de pelo menos uma proteína Rep, em que o construto de expressão de ceDNA codifi- ca o vetor de ceDNA, sob condições efetivas e por um tempo suficien- te para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células de inseto; e b. isolar o vetor de ceDNA das células de insetos.
29. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 28, ca- racterizado pelo fato de que o construto de expressão de ceDNA é se- lecionado dentre um plasmídeo de ceDNA, um bacmídeo ceDNA e um baculovírus ceDNA.
30. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a célula de inseto expressa pelo menos uma proteína Rep.
31. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 30, ca- racterizado pelo fato de que pelo menos uma proteína Rep é de um vírus selecionado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV).
32. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 31, ca- racterizado pelo fato de que pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.
33. Construto de expressão de ceDNA, caracterizado pelo fato de que codifica o vetor de ceDNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.
34. Construto de expressão de ceDNA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que é um plasmídeo de ceDNA, bacmídeo ceDNA ou baculovírus ceDNA.
35. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o construto de expressão de ceDNA, como definido na reivin- dicação 33 ou 34.
36. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que expressa pelo menos uma proteína
Rep.
37. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína Rep é de um vírus selecionado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV).
38. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.
39. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizada pelo fato de que é uma célula de inseto.
40. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que é uma célula Sf9.
41. Método para produzir um vetor de ceDNA, caracteriza- do pelo fato de que compreende: a. incubar a célula hospedeira, como definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 40, em condições efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA; e b. isolar o ceDNA das células hospedeiras.
42. Método para tratar, prevenir, melhorar, monitorar ou di- agnosticar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma composição que compreende o vetor de ceDNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, em que pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga é selecio- nada para tratar, prevenir, melhorar, diagnosticar ou monitorar a doen- ça ou distúrbio.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos he-
teróloga, quando transcrita ou traduzida, corrige uma quantidade anormal de uma proteína endógena no indivíduo.
44. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos he- teróloga, quando transcrita ou traduzida, corrige uma função ou ativi- dade anormal de uma proteína ou via endógena no indivíduo.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 44, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga codifica ou compreende uma mo- lécula nucleotídica selecionada dentre um RNAi, um siRNA, um miR- NA, um lncRNA e um oligo ou polinucleotídeo antissenso.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 44, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga codifica uma proteína.
47. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos he- teróloga codifica uma proteína marcadora.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 46, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga codifica um agonista ou um anta- gonista de uma proteína ou via endógena associada à doença ou dis- túrbio.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 46, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga codifica um anticorpo.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 42 a 49, caracterizado pelo fato de que o vetor de ceDNA é ad- ministrado em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitá- vel.
51. Método para entregar uma proteína terapêutica a um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende: administrar a um indivíduo uma composição que compre- ende o vetor de ceDNA, como definido em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 25, em que pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica uma proteína terapêutica.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracteriza- do pelo fato de que a proteína terapêutica é um anticorpo terapêutico.
53. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um ve- tor de ceDNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, e um nanocarreador, embalado em um recipiente com um folheto informativo.
54. Kit para produzir um vetor de ceDNA, caracterizado pe- lo fato de que o kit compreende: a. um construto de expressão que compreende pelo menos um sítio de restrição para inserção de pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga, ou comutador regulador, ou ambos, pelo me- nos um sítio de restrição posicionado operacionalmente entre sequên- cias de repetição terminal invertidas assimétricas (ITRs assimétricas), em que pelo menos uma das ITRs assimétricas compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação de Rep.
55. Kit, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pe- lo fato de que é adequado para a produção do vetor de ceDNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.
56. Kit, de acordo com a reivindicação 54 ou 55, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda uma população de células de inseto que é desprovida de sequências de codificação do capsídeo viral, que na presença da proteína Rep podem induzir a produção do vetor de ceDNA.
57. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 56, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um vetor que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica pelo menos uma proteína Rep, em que o vetor é adequado para expressar a pelo menos uma proteína Rep em uma célula de inseto.
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