CN113874508A - 非病毒dna载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶(pah)治疗剂的用途 - Google Patents

非病毒dna载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶(pah)治疗剂的用途 Download PDF

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Abstract

本申请描述了一种用于递送和表达转基因的具有线性连续结构的ceDNA载体。所述ceDNA载体包含两侧是两个ITR序列的表达盒，其中所述表达盒编码转基因，所述转基因编码PAH蛋白。一些ceDNA载体进一步包含顺式调控元件，包括调控开关。本文进一步提供了使用所述ceDNA载体进行可靠的体外、离体和体内PAH蛋白的基因表达的方法和细胞系。本文提供了包含可用于在细胞、组织或受试者中表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法和组合物，以及用表达PAH蛋白的所述ceDNA载体治疗疾病的方法。这种PAH蛋白可以表达用于治疗疾病，例如苯丙酮尿症(PKU)。

Description

非病毒DNA载体及其用于表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)治疗剂的 用途
相关申请
本申请要求2019年3月13日提交的第62/817,771号美国临时申请以及2019年6月5日提交的第62/857,514号美国临时申请的优先权，所述临时申请中的每一个的内容特此以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式以及本文的表1-15中的序列电子提交并各自特此通过全文引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2020年3月10日，被命名为131698-05720_SL.txt并且大小为116,806字节。
技术领域
本发明涉及基因疗法领域，包括用于在受试者或细胞中表达转基因或经分离的多核苷酸的非病毒载体。本公开还涉及核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，包括多核苷酸以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。例如，本公开提供了使用非病毒ceDNA载体从细胞表达苯丙氨酸羟化酶(PAH)的方法，例如，表达用于治疗患有苯丙酮尿症(PKU)的受试者的PAH治疗蛋白。该方法和组合物可用于例如通过在有对其需要的受试者的细胞或组织中表达PAH来治疗疾病。
背景技术
基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结局。基因疗法包括治疗或预防因可能导致病症、疾病、恶性病等的缺陷基因或者异常调节或表达、例如表达不足或过表达所引起的医学病状。例如，可以通过向患者递送矫正性遗传物质来治疗、预防或改善由缺陷基因引起的疾病或病症，或可以通过例如对患者用矫正性遗传物质改变或沉默缺陷基因，使得该遗传物质在患者体内发生治疗性表达来治疗、预防或改善。
基因疗法的基础是向转录盒提供活性基因产物(有时称为转基因)，例如能够产生正向功能获得效应、负向功能丧失效应或另一结果的活性基因产物。此类结果可归因于治疗蛋白(例如抗体、功能性酶或融合蛋白)的表达。基因疗法也可以用于治疗由其他因素引起的疾病或恶性疾病。人类单基因病症可以通过将正常基因递送给目标细胞并表达来治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且更具体地说，组成依赖病毒属。源自于AAV的载体(即重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质具有吸引力，因为(i)它们能够感染(转导)多种多样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减弱了宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非致病性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因，并且通常作为附加体存留，从而限制了插入诱变或基因毒性的风险；以及(v)与其他载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较弱的免疫原，因此不会触发明显的免疫应答(参见ii)，从而获得了载体DNA的持久性以及治疗性转基因的潜在长期表达。
然而，使用AAV颗粒作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其对异源DNA的约4.5kb的病毒封装容量有限(Dong等人，1996；Athanasopoulos等人，2004；Lai等人，2010)，因此AAV载体的使用已限于小于150,000Da蛋白质编码容量。第二个缺点是，由于群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，所述免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的所述载体作出应答，以刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
另外，通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人，1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫应答。
相应地，由于单次施用于患者(因患者免疫应答)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒封装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢，因此基因疗法使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
苯丙酮尿症(PKU)是一种罕见的遗传性先天性代谢缺陷，由PAH基因突变引起。苯丙酮尿症(PKU)是一种先天性代谢缺陷，导致氨基酸苯丙氨酸的代谢降低。未经治疗，PKU可导致智力障碍、癫痫发作、行为问题和精神障碍。它还可能导致发霉的气味和较浅色的皮肤。PKU治疗不佳的母亲所生的婴儿可能有心脏问题、小头和低出生体重。PKA是由于PAH基因的突变引起的，突变导致苯丙氨酸羟化酶(PAH)水平低，即患有PKU的受试者的PAH发生突变，导致其酶活性不足。PKU是常染色体隐性遗传，这意味着该基因的两个拷贝都必须发生突变才能使病情发展。有两种主要类型，经典PKU和变异PKU，取决于是否保留任何酶功能。那些携带一个突变PAH基因拷贝的人通常没有症状。
PAH是一种酶，通常在肝脏中表达，是将膳食苯丙氨酸代谢为酪氨酸所必需的，酪氨酸是一种负责产生神经递质的氨基酸。PAH催化苯丙氨酸羟基化为酪氨酸。有缺陷的PAH酶会导致膳食苯丙氨酸积累到潜在的毒性水平。
PKU可由苯丙氨酸羟化酶(PAH)中的单基因缺陷引起，从而导致血清Phe水平升高。PAH在脊椎动物中将Phe转化为酪氨酸。在没有PAH的情况下，去除Phe的唯一其他机制是蛋白质合成和轻微的降解途径，涉及丙氨酸侧链的脱氨基和氧化脱羧，从而产生PKU患者尿液中所见的特征性苯乳酸和乙酸苯酯。不幸的是，典型的饮食中含有的Phe比在没有PAH的情况下可以消除的多。PKU患者体内Phe的累积导致许多症状，包括大脑发育异常和严重的智力低下。(Kaufman,Proc Nat'l Acad Sci USA(美国国家科学院学报)96:3160-3164,1999)。
目前的护理标准是严格限制饮食(限制苯丙氨酸(Phe))，但并不总是有效，因为这种饮食限制难以维持并且不能纠正潜在的缺陷。目前对PKU的治疗是减少含有苯丙氨酸和特殊补充剂的食物的饮食。严格的饮食必须在出生后尽快开始，并至少持续10年，如果不是终生的话。药物沙丙蝶呤二盐酸盐可用于某些PKU患者。如果不及时治疗，PKU会导致进行性和严重的神经功能障碍。据估计，PKU在美国影响了大约15,000人，并且没有解决PKU的遗传缺陷的可用治疗方法。
尽管在理解PKU的生物化学、分子生物学和遗传学方面取得了巨大进展，但在开发该病症的新治疗方法方面进展甚微。PKU对疾病改善疗法的需求有很大的未满足。首先，目前的疗法不能改变疾病，仅对一部分患者有效，并且仍然需要严格的饮食限制，不依从性会导致神经元损伤。其次，PKU尚无获批的基因疗法，而且由于预先存在的抗体，25％至40％的患者无法使用基于AAV的疗法。AAV只能给药一次，产生的PAH水平可能不够高而无法发挥作用，或者可能超出正常范围，剂量水平不能滴定。
因此，本领域需要允许治疗性PAH蛋白在细胞、组织或受试者中表达以治疗PKU的技术。
发明内容
本文所述的技术涉及通过从具有共价闭合端无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(本文称为“闭合端DNA载体”或“ceDNA载体”)表达苯丙氨酸羟化酶来治疗苯丙酮尿症(PKU)的方法和组合物，其中ceDNA载体包含PAH核酸序列或其密码子优化版本。这些ceDNA载体可用于生产用于治疗、监测和诊断的PAH蛋白。将表达PAH的ceDNA载体应用于受试者进行PKU的治疗可用于：(i)提供改善疾病水平的PAH酶，(ii)在递送过程中是微创性的，(iii)可重复且有效剂量，(iv)治疗效果起效快，(v)导致肝脏中纠正性PAH酶的持续表达，(vi)恢复尿素循环功能苯丙氨酸代谢，和/或(vii)可滴定以达到适当的药理学水平有缺陷的酶。
因此，本文所述的发明涉及具有共价闭合端无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(本文称为“闭合端DNA载体”或“ceDNA载体”)，其包含编码PAH的异质基因，以允许在细胞中表达PAH治疗蛋白。
一方面，本文公开了一种闭合端DNA(ceDNA)载体，其在侧翼反向末端重复序列(ITR)之间包含至少一个异源核苷酸序列，其中至少一个异源核苷酸序列编码至少一种PAH蛋白，其中至少一种编码至少一种PAH蛋白的异源核苷酸序列选自与表1中的任何序列具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，ceDNA载体是无casid的载体。在一个实施方案中，表1中的序列选自SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393和SEQ ID NO:394。
在一个实施方案中，异源核苷酸序列与SEQ ID NO:392具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个实施方案中，异源核苷酸序列与SEQ ID NO:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在一个实施方案中，异源核苷酸序列与SEQ ID NO:394具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
如本文所述的用于表达PAH蛋白生产的ceDNA载体是由具有共价闭合端的互补DNA的连续链形成的无衣壳线性双链体DNA分子(线性、连续和非衣壳化结构)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列和3'ITR序列，其中5'ITR和3'ITR相对于彼此能够具有相同的对称三维组构(即，对称或大体对称)，或替代地，5'ITR和3'ITR相对于彼此能够具有不同的三维组构(即，不对称ITR)。另外，ITR能够来自相同或不同的血清型。在一些实施方案中，ceDNA载体能够包含ITR序列，所述ITR序列具有对称的三维空间组构，以便其结构在几何空间中呈相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环(即，它们是相同的或相对于彼此呈镜像)。在一些实施方案中，一个ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个ITR可以来自不同的AAV血清型。
相应地，本文所述的技术的一些方面涉及一种用于改进蛋白表达和/或生产上述PAH蛋白的ceDNA载体，其包含两侧为包含表5中所公开的任意PAH核酸序列的异源核酸序列，该ITR序列选自以下中的任一种：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复(ITR)(例如不对称修饰的ITR)；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如不对称修饰的ITR)；或(iii)对称或基本对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构；或(iv)不对称修饰的或基本对称ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构。本文公开的ceDNA载体可以在真核细胞中产生，因此在昆虫细胞中没有原核DNA修饰和细菌内毒素污染。
本文所述的方法和组合物部分地涉及发现具有共价闭合端的非病毒无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其能够用于从细胞中表达至少一种PAH蛋白和/或超过一种来自细胞的PAH蛋白，包括但不限于肝脏的细胞。
相应地，本文在一个方面中提供DNA载体(例如ceDNA载体)，其包含：编码至少一种转基因的至少一种异源核酸序列，所述转基因编码PAH蛋白且可操作地连接到位于两个不同AAV反向末端重复序列(ITR)之间的启动子，ITR之一包含功能AAV末端解析位点和Rep结合位点，并且ITR之一相对于另一ITR包含缺失、插入或取代；其中所述转基因编码PAH蛋白；且其中在非变性凝胶上分析时，DNA当在DNA载体上用具有单一识别位点的限制酶消化时，相较于线性和非连续DNA对照组，存在线性和连续DNA的特征色带。其他方面包括通过从本文所述的ceDNA载体在体内表达PAH蛋白来递送PAH蛋白，此外，使用编码PAH的ceDNA载体治疗苯丙酮尿症(PKU)。本文还考虑包含如本文所述的编码PAH的ceDNA载体的细胞。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:192 85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:192 90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:192 95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ IDNO:192 96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:192 97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:192 98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:192 99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体由SEQ ID NO:192组成。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ IDNO:194 85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:194 90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:194 95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:194 96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:194 97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:194 98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含与SEQ ID NO:194 99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA载体由SEQ ID NO:194组成。
本发明的方面涉及产生ceDNA载体的方法，所述ceDNA载体可用于如本文所述的在细胞中表达PAH蛋白。其它实施方案涉及通过本文提供的方法产生的ceDNA载体。在一个实施方案中，用于PAH蛋白生产的无衣壳(例如非病毒)DNA载体(ceDNA载体)获自包含多核苷酸表达构建体模板的质粒(在本文中称为“ceDNA质粒”)，所述模板以此次序包含：第一5'反向末端重复(例如AAV ITR)；异源核酸序列；和3'ITR(例如AAV ITR)，其中如本文所定义，5'ITR和3'ITR相对于彼此可以是不对称或对称的(例如WT-ITR，或经修饰对称的ITR)。
本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可通过普通技术人员在阅读本公开之后将会知道的许多手段获得。举例来说，用于产生本发明的ceDNA载体的多核苷酸表达构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒，和/或ceDNA-杆状病毒。在一个实施方案中，ceDNA质粒包含可操作地定位于ITR之间的限制性克隆位点(例如SEQ ID NO:123和/或124)，其中能够插入包含例如启动子的表达盒，所述启动子操作性连接到转基因，例如编码PAH的核酸。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是由多核苷酸模板(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒、ceDNA杆状病毒)产生，所述多核苷酸模板含有对称或不对称的ITR(经修饰的ITR或WT ITR)。
在允许的宿主细胞中，具有至少两个ITR的多核苷酸模板在例如Rep存在下复制而产生表达PAH蛋白的ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，通过Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒、ceDNA杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；和第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。各种AAV血清型的Rep蛋白和Rep结合位点是所属领域的普通技术人员熟知的。普通技术人员了解基于至少一种功能性ITR从血清型中选择结合并复制核酸序列的Rep蛋白。例如，如果有复制能力的ITR来自AAV血清型2，那么对应的Rep将来自与该血清型一起工作的AAV血清型，例如AAV2 ITR与AAV2或AAV4 Rep一起，但不是AAV5Rep，它不行。复制后，共价闭合端ceDNA载体继续在容许细胞中累积，并且ceDNA载体在Rep蛋白存在下在标准复制条件下优选随时间足够稳定，例如，累积达至少1pg/细胞、优选至少2pg/细胞、优选至少3pg/细胞、更优选至少4pg/细胞、甚至更优选至少5pg/细胞的量。
因此，本发明的一个方面涉及一种产生用于表达此类PAH蛋白的ceDNA载体的方法，所述方法包含以下步骤：a)在Rep蛋白存在下，在有效诱导宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并历时足够诱导宿主细胞内产生ceDNA载体的时间来培育具有多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒)的宿主细胞(例如昆虫细胞)群体，所述模板缺乏病毒衣壳编码序列，并且其中所述宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；和b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生用于PAH蛋白表达的ceDNA载体。然而，没有表达病毒颗粒(例如，AAV病毒粒子)。因此，没有病毒粒子所施加的大小限制。
可以通过用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从宿主细胞分离的DNA，并在变性和非变性凝胶上分析消化的DNA物质，以与线性和非连续DNA相比较证实线性且连续DNA的特征色带的存在，从而证实从宿主细胞分离的可用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的存在。
本文还提供了在细胞或受试者中使用ceDNA载体表达具有治疗用途的PAH蛋白的方法。此类PAH蛋白可用于治疗苯丙酮尿症(PKU)。相应地，本文提供了用于治疗苯丙酮尿症(PKU)的方法，包含向对其有需要的受试者施用编码治疗PAH蛋白的ceDNA载体。根据一些实施方案，与施用前受试者的血清苯丙氨酸水平相比，受试者表现出血清苯丙氨酸水平至少降低约50％。根据一些实施方案，受试者表现出血清苯丙氨酸水平降低至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。根据一些实施方案，受试者在施用后的血清苯丙氨酸水平小于约1500uM。根据一些实施方案，施用后，受试者的血清苯丙氨酸水平低于1500、低于1250、低于1000、低于750、低于500、低于400、低于300、低于250、低于200、低于100，低于50mM。根据一些实施方案，与施用前的PAH活性水平相比，受试者表现出给药后的PAH活性增加至少约10％。根据一些实施方案，与施用前的PAH活性水平相比，所述受试者给表现出给药后的PAH活性增加至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％。
在一些实施方案中，本文所述技术的一个方面涉及一种具有共价闭合端的非病毒无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其中ceDNA载体包含至少一个可操作地定位于两个反向末端重复序列之间的异源核苷酸序列，其中ITR序列可以是不对称的或对称的或基本对称的，这些术语如本文所定义，其中所述ITR中的至少一个包含功能末端解析位点和Rep结合位点，并且任选地，所述异源核酸序列编码转基因(例如PAH蛋白)且其中所述载体不存在于病毒衣壳中。
下面进一步详细描述本发明的这些和其它方面。
附图说明
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其它等效的实施方案。
图1A示出了如本文所公开的用于PAH蛋白表达的ceDNA载体的示例性结构，其包含不对称ITR。在此实施方案中，示例性ceDNA载体包括含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码PAH转基因的开放阅读框(ORF)能够插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点(R3/R4)中。表达盒的两侧是在两个反向末端重复序列(ITR)-表达盒上游(5'端)的野生型AAV2 ITR和下游(3'端)的经修饰ITR，因此位于表达盒两侧的两个ITR彼此不对称。
图1B示出了如本文所公开的用于PAH表达的ceDNA载体的示例性结构，其包含不对称ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码PAH转基因的开放阅读框(ORF)能够插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是在两个反向末端重复(ITR)-表达盒上游(5'端)的经修饰的ITR和下游(3'端)的野生型ITR。
图1C示出了如本文所公开的用于PAH表达的ceDNA载体的示例性结构，其包含不对称ITR以及含有增强子/启动子、PAH转基因、转录后元件(WPRE)和聚腺苷酸化信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许PAH转基因插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个彼此不对称的反向末端重复序列(ITR)；表达盒上游(5'端)的修饰ITR和下游(3'端)的修饰ITR，其中5'ITR和3'ITR都是修饰ITR，但是具有不同的修饰(即，它们不具有相同的修饰)。
图1D示出了如本文所公开的用于PAH表达的ceDNA载体的示例性结构，其包含如本文所定义的对称修饰的ITR或基本对称修饰的ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。将编码PAH转基因的开放阅读框(ORF)插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个修饰的反向末端重复序列(ITR)，其中5'修饰ITR和3'修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1E示出了如本文所公开的用于PAH表达的ceDNA载体的示例性结构，其包含如本文所定义的对称修饰的ITR或基本对称修饰的ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚腺苷酸化信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许转基因(例如PAH)插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个修饰的反向末端重复序列(ITR)，其中5'修饰ITR和3'修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1F示出了如本文所公开的用于PAH表达的ceDNA载体的示例性结构，其包含如本文所定义的对称WT-ITR或基本对称WT-ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因(例如PAH)的开放阅读框(ORF)是插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图1G示出了如本文所公开的用于PAH表达的ceDNA载体的示例性结构，其包含如本文所定义的对称修饰的ITR或基本对称修饰的ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚腺苷酸化信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许转基因(例如PAH)插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图2A提供了AAV2的野生型左ITR(SEQ ID NO:52)的T形茎-环结构，以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解析位点(trs)。RBE含有一连串4个双螺旋四聚体，其被认为与Rep 78或Rep 68相互作用。另外，RBE'也被认为与在所述构建体中的野生型ITR或突变的ITR上装配的Rep复合物相互作用。D和D'区含有转录因子结合位点和其它保守结构。图2B显示了所提出的Rep催化的在野生型左ITR(SEQID NO:53)中产生的切割和接合活性，所述野生型左ITR包括AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解析位点(TRS)以及包含若干转录因子结合位点和另一保守结构的D和D'区域。
图3A提供了野生型左AAV2 ITR(SEQ ID NO:54)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'臂的一级结构(多核苷酸序列)(左)和二级结构(右)。图3B显示了左ITR的示例性突变ITR(也称为修饰ITR)序列。显示的是示例性突变左ITR(ITR-1，左)(SEQ ID NO:113)的A-A'臂的RBE部分、C臂和B-B'臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。图3C显示了野生型右AAV2 ITR(SEQ ID NO:55)的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图3D显示了示例性右修饰ITR。显示的是示例性突变右ITR(ITR-1，右)(SEQ IDNO:114)的A-A'臂的含RBE部分、B-B'和C臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。可以如本文所教示，使用左ITR和右ITR的任何组合(例如AAV2 ITR或其它病毒血清型ITR或合成ITR)。图3A-3D的多核苷酸序列中的每一个是指在用于产生如本文所述的ceDNA的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。图3A-3D每一个中还包含从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中的ceDNA载体构型推断出的相应ceDNA二级结构以及预测的吉布斯自由能(Gibbs freeenergy)值。
图4A是示意图，其示出了制备杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的上游方法，用于在图4B的示意图所述的方法中产生如本文所公开的用于PAH表达的ceDNA载体。图4B是ceDNA产生的一种示例性方法的示意图，图4C示出了证实ceDNA载体产生的一种生化方法和过程。图4D和图4E是描述了用于鉴定从在图4B的ceDNA产生过程期间获得的细胞集结粒收获的DNA中ceDNA的存在的过程的示意图。图4D显示未切割或用限制性核酸内切酶消化并然后在天然凝胶或变性凝胶上进行电泳的示例性ceDNA的示意性预期色带。最左边的示意图是天然凝胶，并显示多个色带，表明以其双链体和未切割形式的ceDNA以至少单体和二聚体状态存在，可看到呈迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体，二聚体的大小是单体的两倍。左起第二个示意图显示，当用限制性核酸内切酶切割ceDNA时，原始色带消失并出现了迁移较快(例如较小)的色带，与裂解后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下，原始双链体DNA是单链的，并且因为互补链是共价连接的，所以作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此，在右起第二个示意图中，经过消化的ceDNA展示出与在天然凝胶上观察到的相似的带分布，但所述带作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图展示，在变性条件下未经切割的ceDNA作为单链开环进行迁移，并且因此观察到的带是在不开环的天然条件下观察到的带大小的两倍。在此图中，“kb”用于指示核苷酸分子的相对大小，取决于背景，其基于核苷酸链长(例如，对于在变性条件下观察到的单链分子)或碱基对数量(例如，对于在天然条件下观察到的双链分子)。图4E显示了具有不连续结构的DNA。ceDNA可以通过在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制性核酸内切酶切割，并在中性和变性两种条件下产生两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图4E还显示了具有线性且连续结构的ceDNA。所述ceDNA载体可被限制性核酸内切酶切割，并产生两个DNA片段，所述片段在中性条件下以1kb和2kb迁移，但在变性条件下，链保持连接并产生以2kb和4kb迁移的单链。
图5是ceDNA载体实例跑变性凝胶的示例性图像，所述ceDNA载体用核酸内切酶消化(+)或不消化(-)(ceDNA构建体1和2使用EcoRI；ceDNA构建体3和4使用BamH1；ceDNA构建体5和6使用SpeI；且ceDNA构建体7和8使用XhoI)。构建体1-8描述于国际申请PCT PCT/US18/49996的实例1中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。确定了用星号突出显示的色带的大小，并提供在图片的底部。
图6描绘了实例7中所述的实验结果且特别地显示IVIS影像，所述影像获自经LNP-polyC对照物处理的小鼠(距左侧最远的小鼠)和经LNP-ceDNA荧光素酶处理的四个小鼠(除距离左侧最远的小鼠之外的所有小鼠)。经ceDNA处理的四只小鼠在小鼠的含肝脏区域中显示明显的荧光。
图7描绘了实例8中所述的实验结果。暗斑点(由箭头所示)表示由被表达的ceDNA转基因产生的蛋白质存在且证实所施用的LNP-ceDNA与肝细胞结合。
图8A-8B描绘了实例9中阐述的眼部研究结果。图8A显示了注射
Figure BDA0003352315200000111
-ceDNA荧光素酶的大鼠眼(左上方)相对于相同大鼠的未注射眼(右上方)或注射质粒-荧光素酶DNA的大鼠眼(左下方)与相同大鼠的未注射眼(右下方)的代表性IVIS影像。图8B显示了每个处理组的经处理眼或相应未处理眼中观察到的平均辐射度图。ceDNA处理的大鼠在99天期间展现长时间的明显荧光(和因此荧光素酶转基因表达)，与之形成鲜明对比的是经质粒-荧光素酶处理的大鼠，其中观察到的相对荧光(和因此荧光素酶转基因表达)最小。
图9A和图9B描绘了实例10中描述的Rag2小鼠的ceDNA持久性和重复给药研究的结果。图9A显示了在LNP-ceDNA-Luc处理的野生型c57bl/6小鼠或Rag2小鼠中随时间观察到的总通量的图形。图9B提供的图形显示了重复剂量对Rag2小鼠中的荧光素酶转基因表达水平的影响，重复剂量之后，随之观察到增加的稳定表达(箭头表示重复剂量施用的时间)。
图10提供了实例11中所述的经处理小鼠的ceDNA荧光素酶表达研究的数据，显示了每组小鼠在研究期间的总通量。高水平的未甲基化CpG与小鼠中随时间所观察到的较低总通量相关，而肝脏特异性启动子的使用与ceDNA载体在至少77天期间对转基因的持久稳定表达相关。
图11是描绘实例12所述的实验结果的图。在PAHenu2小鼠中通过流体动力学递送施用两种ceDNA PAH构建体(ceDNA#1、ceDNA#2)中的每一种，导致血清PHE水平相对于对照(PolyC)处理的小鼠中的血清PHE水平显着降低(降低约75％)。
图12是描述实例13中描述的实验结果的图。hPAH Codop2是指含有连接到VandenDriessche(VD)启动子的密码子优化版本2(codop_v2)人类PAH序列的ceDNA；hPAHCodop4是指包含VD_启动子的ceDNA，VD_启动子操作性连接到密码子优化和CpG最小化的人类PAH版本4(codop_CpGmin_v4)；ceDNA hPAH cDNA是指未经修饰的人类PAH cDNA，经测试对有PAH缺陷的PAHenu2小鼠中的PHE校正有影响。图12显示了血清PHE水平的时间过程(显示为相对于对照PAHenu2校正的％PHE)。施用含有hPAH Codop2和Codop4的ceDNA导致PHE血清水平降低，表明有足够的PAH活性来校正鼠PKU中的血液苯丙氨酸水平。在15天的实验过程中显示校正是稳定的。
图13是描述实例14中描述的实验结果的图。以低、中和高剂量施用含有hPAH密码子优化版本2(Codop2)的ceDNA。图13显示了血清PHE水平(PHEμM)的时间过程。以低剂量和中剂量施用ceDNA hPAH Codop2导致血清PHE以剂量依赖性方式降低。值得注意的是，以中等剂量施用ceDNA hPAH Codop2比以低剂量施用要高得多。在15天的实验过程中显示校正是稳定的。对照动物(媒介物KO)中的血清PHE浓度没有降低。
图14A是描绘实例15中描述的实验结果的图。检查了ceDNA Codop2在第3天和第7天对个体动物的影响。如图14A所示，到第3天，Codop2的施用导致血清PHE水平降低，表明早在第3天就有足够的PAH活性来校正鼠PKU中的血液苯丙氨酸水平。
图14B是描绘在注射含有VD-hPAH Codop2的ceDNA后第3天和第7天测量的人PAH酶活性和所得血清苯丙氨酸水平的图。椭圆形指的是在第7天收集的无反应者，并对应于图14A中缺少PHE校正。
具体实施方式
本文提供了使用包含一种或多种编码PAH治疗蛋白或其片段的核酸的ceDNA载体治疗苯丙酮尿症(PKU)的方法。本文还提供了本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，其包含一种或多种编码PAH蛋白的异源核酸。在一些实施方案中，PAH蛋白的表达可以包括治疗蛋白从表达它的细胞中分泌出来，或者在一些实施方案中，表达的PAH蛋白可以在表达它的细胞内起作用或发挥作用(例如发挥其作用)。在一些实施方案中，ceDNA载体在肝脏、受试者的肌肉(例如，骨骼肌)或其他身体部位中表达PAH蛋白，其可充当PAH治疗蛋白产生和分泌到许多系统性隔室的贮库。
I.定义
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义。应理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义能够在下列文献中找到：《默克诊疗手册(The Merck Manual of Diagnosis andTherapy)》第19版，默克夏普公司(Merck Sharp & Dohme Corp.)出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编辑)，《病毒学领域(Fields Virology)》第6版，Lippincott Williams & Wilkins出版，美国宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA,USA)(2013)；Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编辑)，《分子细胞生物学与分子医学百科全书(TheEncyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine)》，Blackwell科学有限公司出版，1999-2012(ISBN9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑)，《分子生物学与生物技术：综合案头参考(Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference)》，由VCH Publishers有限公司出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；WernerLuttmann的《免疫学(Immunology)》，由Elsevier出版，2006；《詹韦氏免疫生物学(Janeway's Immunobiology)》，Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑)，Taylor&Francis有限公司，2014(ISBN 0815345305、9780815345305)；《勒温基因XI(Lewin's GenesXI)》，由Jones & Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael RichardGreen和Joseph Sambrook，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》，第4版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，美国纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.,USA)(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人，《分子生物学的基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)》，Elsevier科学出版有限公司，美国纽约(2012)(ISBN 044460149X)；《酶学实验室方法：DNA(Laboratory Methodsin Enzymology:DNA)》,Jon Lorsch(编辑)Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；《分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology，CPMB)》，Frederick M.Ausubel(编辑)，John Wiley and Sons，2014(ISBN047150338X、9780471503385),《蛋白质科学现代方法(Current Protocols in Protein Science，CPPS)》，John E.Coligan(编辑)，JohnWiley and Sons,Inc.，2005；以及《免疫学现代方法(Current Protocols in Immunology，CPI)》(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,WarrenStrobe(编辑)John Wiley and Sons,Inc.，2003(ISBN 0471142735、9780471142737)，其内容以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“施用(administration/administering)”及其变化形式是指将组合物或药剂(例如，如本文所述的治疗性核酸或免疫抑制剂)引入受试者中并且包括同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。“施用”可以指例如治疗、药物动力学、诊断、研究、安慰剂以及实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。将组合物或药剂引入个体中是通过任何适合的途径，包括经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。通过电穿孔将组合物或药剂引入受试者中。施用包含自我施用和由另一个人施用。可以通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径使得组合物或药剂执行其预期功能。举例来说，如果所适合的途径是静脉内，那么通过将组合物或药剂引入个体的静脉来施用组合物。
如本文所用，短语“核酸治疗性”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用，并且是指使用核酸作为治疗疾病或病症的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所使用的，这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性实例包含mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性实例包含小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、闭合端线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggybone(dbDNATM)DNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒辅助DNA载体(线性-共价闭合的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。
如本文所用，治疗剂(例如PAH治疗蛋白或其片段)的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生所需效果的量，例如提供疾病改善水平的PAH酶，导致肝脏中纠正PAH酶的持续表达，恢复的尿素循环功能苯丙氨酸代谢，和/或达到缺陷酶的适当药理学水平。用于测量目标基因或目标序列的表达的适合的分析包括例如使用所属领域的技术人员已知的技术检查蛋白质或RNA水平，所述技术如斑点印迹、北方印迹法、原位杂合、ELISA、免疫沉淀、酶功能以及所属领域的技术人员已知的表型分析。然而，剂量水平是基于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病状、病状的严重程度、施用途径和所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以在很大范围内变化，但可以由医生使用标准方法常规地确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学上有效量”包括所描述的本发明的组合物的防治或预防量。在所描述的本发明的防治性或预防性应用中，以足以消除或降低疾病、病症或病状的风险、减轻严重程度或延迟发病的量向易患有疾病、病症或病状或以其他方式处于疾病、病症或病状风险下的患者施用药物组合物或药剂，所述疾病、病症或病状包括疾病、病症或病状的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病、病症或病状的发展期间呈现的中间病理学表型。通常优选使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。根据一些实施方案，疾病、障碍或病症是PKU。术语“剂量(dose/dosage)”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。
对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其他熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可以在《古德曼和吉尔曼的治疗学的药理学基础(Goodman and Gilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics)》,第10版,麦格劳-希尔专业出版公司(McGraw-Hill)(纽约)(2001)的第1章中找到，所述文献以引用的方式并入本文中。
药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。
如本文所用，术语“异源核苷酸序列”和“转基因”可互换使用，并且是指并入如本文公开的ceDNA载体中并可以由其递送和表达的所关注的核酸(除编码衣壳多肽的核酸外)。
如本文所用，术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用，并且是指一段线性核酸，其包括与一个或多个启动子或足以引导转基因转录的其他调控序列可操作地连接的转基因，但是不包含衣壳编码序列、其他载体序列或反向末端重复区域。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏子)、一个或多个内含子和一个或多个转录后调控元件。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，这个术语包含单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交物、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“寡聚物(oligo)”，并且可以从基因中分离出来，或通过本领域已知的方法化学合成。应了解术语“多核苷酸”和“核酸”包含单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸(如果所描述的实施方案适用的话)。DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、辅助DNA(线性共价闭合DNA载体)、闭合端线性双链体DNA(CELiD或ceDNA)、doggybone(dbDNATM)DNA、哑铃形DNA、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)载体、病毒载体或非病毒载体的形式。RNA可以呈小干扰RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)和其组合的形式。核酸包含含有已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键联的核酸，其是合成的、天然存在的以及非天然存在的，并且其具有与参考核酸类似的结合特性。此类类似物和/或经修饰的残基的实例包含(但不限于)：硫代磷酸酯、二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(吗啉基)、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNATM)和肽核酸(PNA)。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有与参考核酸具有类似结合特性的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外指出，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。
如本文所使用的，“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。
“碱基”包括嘌呤和嘧啶，所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于放置新的反应性基团(诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物)的修饰。
如本文所用，术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”包括当干扰RNA在与靶基因或序列相同的细胞中时能够减少或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过介导降解与干扰RNA序列互补的mRNA或抑制与干扰RNA序列互补的mRNA翻译)的单链RNA(例如，成熟的miRNA、ssRNAi寡核苷酸、ssDNAi寡核苷酸)、双链RNA(即，双螺旋RNA，诸如siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、shRNA、aiRNA或前-miRNA)、DNA-RNA杂交物(参见例如，PCT公开号WO 2004/078941)或DNA-DNA杂交物(参见例如，PCT公开号WO 2004/104199)。因此，干扰RNA是指与靶mRNA序列或与由两条互补链或由一条单一自身互补链形成的双链RNA互补的单链RNA。干扰RNA可能与靶基因或序列具有实质或完全同一性，或可能包含错配区域(即错配基序)。干扰RNA的序列可对应于全长靶基因或其子序列。优选地，干扰RNA分子是化学合成的。出于所有目的，将每个上述专利文件的公开内容以全文引用的方式并入本文。
干扰RNA包括“小干扰RNA”或“siRNA”，例如，长度为约15-60个、15-50个或15-40个(双螺旋)核苷酸，更通常长度为约15-30个、15-25个或19-25个(双螺旋)核苷酸的干扰RNA，并且优选地长度为约20-24个、21-22个或21-23个(双螺旋)核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列的长度为15-60个、15-50个、15-40个、15-30个、15-25个或19-25个核苷酸，优选长度为20-24个、21-22个或21-23个核苷酸，并且双链siRNA的长度为约15-60个、15-50个、15-40个、15-30个、15-25个或19-25个碱基对，优选长度为约18-22个、19-20个或19-21个碱基对)。siRNA双螺旋可包含约1个至约4个核苷酸或约2个至约3个核苷酸的3'突出端和5'磷酸末端。siRNA的实例包括但不限于由两条单独的链分子组装的双链多核苷酸分子，其中一条链是有义链，而另一条链是互补的反义链；由单链分子组装的双链多核苷酸分子，其中有义区和反义区通过基于核酸的接头或基于非核酸的接头连接；含有自身互补的有义区和反义区的具有发夹二级结构的双链多核苷酸分子；以及具有两个或更多个环结构和含有自身互补的有义区和反义区的茎的环状单链多核苷酸分子，其中所述环状多核苷酸可以在体内或在体外被加工以产生活性双链siRNA分子。如本文所用，术语“siRNA”包括RNA-RNA双螺旋以及DNA-RNA杂交物(参见，例如，PCT公开号WO 2004/078941，以全文引用的方式并入本文中)。
如本文所使用的，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其是从天然基因中分离的，或者以自然界中不另外存在或合成的方式进行修饰以含有核酸区段。当核酸构建体包含表达本公开的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。“表达盒”包括可操作地连接至启动子的DNA编码序列。
“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如，RNA)包含使其能够与另一核酸序列在体外和/或体内适当的温度和溶液离子强度的条件下非共价结合，即形成沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)和/或G/U碱基对、“退火”或“杂交”以序列特异性的反向平行方式(即，核酸特异性地结合于互补核酸)的核苷酸序列。如本领域已知的，标准的沃森-克里克碱基对包含：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。另外，在本领域中还已知对于两个RNA分子(例如dsRNA)之间的杂交，鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如，在与mRNA中的密码子进行tRNA反密码子碱基配对的情况下，G/U碱基配对部分负责遗传密码的简并性(即，冗余)。在本公开的上下文中，靶向主题DNA的RNA分子的蛋白质结合区段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补，反之亦然。这样，当可以在靶向主题DNA的RNA分子的蛋白质结合区段(dsRNA双链体)的给定核苷酸位置形成G/U碱基对时，该位置不被认为是非互补的，而是被认为是互补的。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包含编码和非编码的氨基酸、经过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。
“编码”特定PAH蛋白的DNA序列是转录成特定RNA和/或蛋白质的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可以编码被翻译成蛋白质的RNA(mRNA)，或者DNA多核苷酸可以编码未被翻译成蛋白质的RNA(例如tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；也称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。
如本文所用，如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质域的多肽。例如，融合蛋白可包含(i)PAH或其片段和(ii)至少一种非GOI蛋白。本文中涵盖的融合蛋白包括(但不限于)抗体，或与PAH蛋白融合的抗体的Fc或抗原结合片段(例如受体、配体、酶或肽的胞外域)。作为融合蛋白的一部分的PAH蛋白或其片段可以是单特异性抗体或双特异性或多特异性抗体。
如本文所用，术语“基因组安全港基因”或“安全港基因”是指可以插入核酸序列以使得该序列可以以可预测的方式整合和起作用(例如表达所关注蛋白质)且对内源基因活性没有明显的负面影响或不促进癌症的基因或基因座。在一些实施方案中，安全港基因也是可有效地表达所插入的核酸序列并且表达水平比非安全港位点高的基因座或基因。
如本文所用，术语“基因递送”意指将外来DNA转移到宿主细胞中以施加基因疗法的方法。
如本文所用，术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)(也称为RBE(Rep结合元件))和末端解链位点(“TRS”)共同构成“最低需要的复制起点”，并且因此TR包括至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和原病毒拯救。正如本文在本发明中意外发现的，在全长上不是反向互补序列的TR仍然可以执行ITR的传统功能，因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。本领域普通技术人员将了解，在复杂的ceDNA载体构型中，可以存在超过两个ITR或不对称的ITR对。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR，或可以源自于AAV ITR或非AAV ITR。例如，ITR可以源自于细小病毒科，其涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)，或可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截断、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科。依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，所述宿主包含但不限于人、灵长类、牛、犬、马和羊物种。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV或其他依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核苷酸序列可能与规范的天然存在的序列略有不同，因此，本文涵盖使用的WT-ITR序列包括由于在产生过程中发生的天然存在的变化(例如复制误差)而产生的WT-ITR序列。
如本文所用，术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对WT-ITR，它们都是在整个长度上具有反向互补序列的野生型ITR。举例来说，ITR即使具有一个或多个偏离典型的天然存在的序列的核苷酸，只要变化并不影响所述序列的特性和整体三维结构，所述ITR也可以被认为是野生型序列。在一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性实例，序列与典范序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(例如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与另一个WT-ITR具有对称的三维空间组织，以使它们的3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定具有与合适的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解离位点(TRS)，可以在功能上将基本上对称的WT-ITR确认为WT。可以任选地测试其他功能，包括在允许条件下的转基因表达。
如本文所使用的，短语“经修饰的ITR”或“mod-ITR”或“突变ITR”在本文中可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。所述突变可以引起ITR中的A、C、C'、B、B'区中的一个或多个发生变化，并且可以使得三维空间组构(即，其几何空间中的3D结构)相较于相同血清型的WT-ITR的3D空间组构发生变化。
如本文所使用的，术语“不对称ITR”也称为“不对称ITR对”，是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内在全长上不反向互补的一对ITR。作为一个非限制性实例，不对称的ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组织，使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说，不对称的ITR对具有不同的整体几何结构，即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组织(例如，一个ITR与同源ITR相比可能具有短的CC'臂和/或短的BB'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截断或点突变引起的。在一个实施方案中，不对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列，另一个ITR是如本文定义的修饰ITR(例如非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施方案中，不对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列，并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰的ITR(即，不同的整体几何结构)。在一些实施方案中，不对称ITR对中的一个mod-ITR可能具有短的C-C'臂，而另一个ITR可能具有不同的修饰(例如单臂或短的B-B'臂等)，使得它们与同源不对称mod-ITR相比具有不同的三维空间组织。
如本文所用，术语“对称ITR”是指在单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的、为野生型或突变型(例如相对于野生型被修饰的)依赖病毒ITR序列并且在其全长上反向互补的一对ITR。在一个非限制性实例中，两个ITR都是来自AAV2的野生型ITR序列。在另一个实例中，这两个ITR皆不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是经修饰的ITR，也称为突变型ITR)，并且由于核苷酸添加、缺失、取代、截短或点突变而在序列上与野生型ITR不同。本文中为方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5'(上游)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3'(下游)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。
如本文所使用的，术语“基本上对称的修饰ITR”或“基本上对称的mod-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对修饰ITR，它们在其全长上具有反向互补序列。例如，修饰ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核苷酸序列，只要变化不影响特性和整体形状，也可以认为是基本上对称的。作为一个非限制性实例，序列与典型序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与其同源经修饰的ITR具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。换句话说，大体上对称的经修饰的ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。在一些实施方案中，来自mod-ITR对的ITR可以具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组织，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。举例来说，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同血清型，然而，两者均能够具有相同的相应突变(例如如果5'ITR在C区域中具有缺失，则来自不同血清型的经修饰的同源3'ITR在C'区域中的相应位置具有缺失)，使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组织。在此类实施方案中，经修饰的ITR对中的每个ITR可来自不同血清型(例如AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，诸如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰在来自不同血清型的同源ITR的相应位置得到反映。在一个实施方案中，大体上对称的经修饰的ITR对是指一对经修饰的ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有大体上相同的形状即可。作为非限制性实例，如通过本领域公知的标准方法如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与规范的mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且还具有对称的三维空间组织，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B’环的类似3D结构。
术语“位于侧翼”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B的两侧是A和C。对于A×B×C排列，情况也是如此。因此，位于两侧的序列在被侧接的序列之前或之后，但不必与被侧接的序列相邻或紧邻。在一个实施方案中，术语位于两侧是指在线性双链体ceDNA载体的每个末端出的末端重复序列。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括减轻、大体上抑制、减缓或逆转病状的进展，大体上改善病状的临床症状或大体上预防病状的临床症状的出现、获得有益或所需的临床结果。根据一些实施方案，病症是PKU。治疗进一步指代实现以下中的一个或多个：(a)降低病症的严重程度；(b)限制所治疗的一种或多种病症的症状特征的发展；(c)限制所治疗的一种或多种病症的症状特征的恶化；(d)限制先前患有病症的患者中的一种或多种病症的复发；以及(e)限制先前对于一种或多种病症无症状的患者中的症状的复发。有益或所需的临床结果，如药理学和/或生理学作用，包括(但不限于)：预防可能易患有疾病、病症或病状但尚未经历或展现疾病的症状的个体出现所述疾病、病症或病状(防治性治疗)；缓解所述疾病、病症或病状的症状；减轻所述疾病、病症或病状的程度；稳定所述疾病、病症或病状(即，不恶化)；预防所述疾病、病症或病状的扩散；延迟或减缓所述疾病、病症或病状进展；改善或缓和所述疾病、病症或病状；以及其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。
如本文所用，术语“增加”、“增强”、“提高”(以及类似术语)通常是指相对于自然条件、预期条件或平均条件、或者相对于对照条件直接地或间接地增加浓度、水平、功能、活性或行为的作用。
如本文所用，术语“最小化”、“减少”、“降低”、和/或“抑制”(以及类似术语)通常是指直接或间接地减少相对于自然条件、预期条件或平均条件，或相对于对照条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。
如本文所使用的，术语“ceDNA基因组”是指还并入了至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。在一些实施方案中，ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所使用的，术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的间插序列。在一些实施方案中，ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最佳功能性来说所期望的距离上。在一些实施方案中，ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传稳定性。在一些实施方案中，ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置，促进ceDNA基因组的就绪遗传操作。举例来说，在某些方面中，含有若干限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多酶切点接头”或设计成不具有已知蛋白质(例如转录因子)结合位点的非开放阅读框架序列能够定位于ceDNA基因组中以分离顺式作用因子，例如将6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等插入末端解析位点与上游转录调控元件之间。类似地，可以在多聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解链位点之间并入间隔区。
如本文所用，术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋白(例如AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点，其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了所述RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列在所属领域中是已知的，并且包括例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)，AAV2中所鉴定的RBS序列。在本发明的实施方案中可以使用任何已知的RBS序列，包括其它已知的AAV RBS序列和其它天然已知的或合成的RBS序列。不受理论束缚，相信Rep蛋白的核酸酶域结合到双链体核苷酸序列GCTC，并且因此，两种已知的AAV Rep蛋白直接结合到双链体寡核苷酸5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(SEQ ID NO:60)并且在其上稳定组装。另外，可溶性聚集性构象异构体(即，数目未定的相互缔合的Rep蛋白)解离并结合到含有Rep结合位点的寡核苷酸。每个Rep蛋白都与每个链上的含氮碱基和磷酸二酯骨架相互作用。与含氮碱基的相互作用提供序列特异性，而与磷酸二酯主链的相互作用是非或较少序列特异性的，并稳定了蛋白质-DNA复合物。
如本文所使用，术语“末端解链位点”和“TRS”在本文可互换使用，并且是指一个区域，在此Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键，产生3'OH，充当通过细胞的DNA聚合酶、例如DNA polδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。可替代地，Rep-胸苷复合物可以参与配位接合反应。在一些实施方案中，TRS最低限度地涵盖非碱基配对的胸苷。在一些实施方案中，TRS的切口产生效率可以至少部分地由其在同一分子内距RBS的距离来控制。当受体底物是互补ITR时，所产生的产物是分子内双链体。TRS序列在所属领域中已知，并且包括例如5'-GGTTGA-3'(SEQ ID NO:61)，AAV2中所鉴定的六核苷酸序列。本发明的实施方案中可以使用任何已知的TRS序列，包括其它已知的AAV TRS序列和其它天然已知或合成的TRS序列，例如AGTT(SEQ ID NO:62)、GGTTGG(SEQ ID NO:63)、AGTTGG(SEQ ID NO:64)、AGTTGA(SEQ IDNO:65)和其它基序，例如RRTTRR(SEQ ID NO:66)。
如本文所使用的，术语“ceDNA-质粒”是指一种包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的质粒。
如本文所使用的，术语“ceDNA-杆粒”是指一种包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种在杆状病毒基因组内包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，是指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。
如本文所用，术语“ceDNA”是指用于非病毒基因转移、合成或其他目的的无衣壳闭合端线性双链(ds)双螺旋DNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中，所述申请的全部内容以引用的方式明确地并入本文中。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实例1中，所述申请中的每一个以全文引用的方式并入本文中。用于产生包括各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，所述国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
如本文所使用的，术语“闭合端DNA载体”是指具有至少一个共价闭合端的无衣壳DNA载体，其中所述载体的至少一部分具有分子内双链体结构。
如本文所使用的，术语“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包括至少一个末端回文结构的闭合端DNA载体。在一些实施方案中，ceDNA包括两个共价闭合端。
如本文所使用的，术语“neDNA”或“带切口的ceDNA”是指在开放阅读框(例如，待表达的启动子和转基因)上游的茎区或间隔区5'中具有1-100个碱基对的切口或间隙的闭合端DNA。
如本文所使用的，术语“间隙”和“切口”可互换地使用，并且意指本发明的合成DNA载体的中断部分，其在另外双链ceDNA中产生单链DNA部分的延伸。在双链体DNA的一个链中，间隙的长度可以是1个碱基对到100个碱基对。由本文所描述的方法以及由所述方法产生的合成载体设计和产生的典型间隙的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60bp。本公开中的示例性间隙的长度可以是1bp到10bp、1bp到20bp、1bp到30bp。
如本文中所定义，“报告子”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白质。报告子通常产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白质。举例来说，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包含但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它在本领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“有义”和“反义”是指多核苷酸上结构元件的取向。元件的有义和反义型式彼此反向互补。
如本文所用，术语“合成AAV载体”和“AAV载体的合成产生”是指在完全无细胞环境中的AAV载体和其合成产生方法。
如本文所用，“报告子”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白质。报告子通常产生可测量的信号，如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白质。举例来说，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其他荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其他在本领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“效应蛋白”是指一种提供可检测的读出数的多肽，例如作为报告多肽，或更适当地，作为杀死细胞的多肽，例如毒素，或致使细胞易用所选作用剂或因缺乏所选作用剂而被杀死的作用剂。效应蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞的DNA和/或RNA的任何蛋白质或肽。举例来说，效应子蛋白可以包含(但不限于)：靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制核酸内切酶、降解细胞存活所必需的多肽目标的蛋白酶；DNA旋转酶抑制剂；以及核糖核酸酶型毒素。在一些实施方案中，由如本文所描述的合成生物回路控制的效应蛋白表达可作为一个因子参与另一个合成生物回路，从而扩大了生物回路系统应答性的范围和复杂度。
转录调节子是指活化或阻遏所关注基因转录的转录活化因子和阻遏子，例如PAH。启动子是启动特定基因转录的核酸区域。转录活化因子通常在附近与转录启动子结合并募集RNA聚合酶来直接启动转录。阻遏子与转录启动子结合，并在空间上阻碍RNA聚合酶启动转录。其它转录调节子可取决于它们的结合位置以及细胞和环境条件来充当活化子或阻遏子。转录调节子类别的非限制性实例包含但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
如本文所使用的，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调控序列元件结合并分别阻遏或活化与调控序列元件操作性连接的序列的转录的蛋白质。如本文所描述的优选阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存在或不存在敏感。如本文所描述的优选蛋白质是模块的形式，包括例如可分离的DNA结合和输入剂结合或应答元件或结构域。
如本文所使用的，“载剂(carrier)”包含任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不会产生毒性的、过敏性的或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所使用的，“输入剂应答结构域”是转录因子的一个结构域，其以致使连接的DNA结合融合结构域对条件或输入剂的存在作出应答的方式与所述条件或输入剂结合或以其它方式作出应答。在一个实施方案中，条件或输入剂的存在导致输入剂应答结构域或其融合的蛋白质发生构象变化，从而改变转录因子的转录调制活性。
术语“体内”是指在生物体、例如多细胞动物中或内部进行的测定或过程。在本文描述的一些方面中，当使用单细胞生物例如细菌时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用具有完整膜的活细胞进行的方法和用途，所述活细胞在多细胞动物或植物体之外，例如外植体、培养细胞，包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系，以及提取的组织或细胞，包括血细胞，等等。术语“体外”是指不需要存在具有完整膜的细胞的测定和方法，例如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统、例如不包含细胞或细胞系统的介质、例如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。
如本文所用的术语“启动子”是指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列，其可以是编码蛋白质或RNA的异源靶基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在所述核酸序列的其余部分的引发和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件，例如RNA聚合酶和其他转录因子。在本文所述的方面的一些实施方案中，启动子可以驱动调节启动子本身的表达的转录因子的表达。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子，包括诱导型启动子，可用于驱动本文公开的ceDNA载体中转基因的表达。启动子序列可以在其3'末端以转录起始位点为界并且向上游延伸(5'方向)以包括为了在高于背景的可检测水平上引发转录所必需的最少数目个碱基或元件。
如本文所用，术语“增强子”是指顺式作用调控序列(例如50-1,500个碱基对)，其结合一种或多种蛋白质(例如活化剂蛋白质或转录因子)以增强核酸序列的转录活化。增强子可以位于其调节的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以位于内含子区域内，或无关基因的外显子区中。
启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“可操作地连接”、“操作性定位”、“操作性连接”，“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所使用的，“反向启动子”是指核酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链的启动子，并且反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施方案中用于调控开关的状态。另外，在各种实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于编码区段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子所获得。此类启动子可以称为“内源性的”。类似地，在一些实施方案中，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于所述序列的下游或上游。
在一些实施方案中，编码核酸区段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，所述启动子均指在其天然环境中通常不与其可操作地连接的编码核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子是指在天然环境中正常不与给定核酸序列关联的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子；从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，即包含不同转录调节区域的不同元件、和/或通过本领域已知的基因工程方法来改变表达的突变。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以结合本文公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR，来产生启动子序列(参见例如美国专利第4,683,202号、美国专利第5,928,906号，各自以引用的方式并入本文)。此外，预期也可以采用指导序列在例如线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。
如本文所描述的，“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时，启动或增强转录活性的启动子。如本文所定义的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的，或是以能够从诱寻型启动子诱导转录活性的方式施用的通常外源性的化合物或蛋白质。在一些实施方案中，诱导物或诱导剂，即化学物质、化合物或蛋白质，本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即诱导物可以是由另一组分或模块表达的诱导蛋白)，转录或表达本身可以处于诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，诱导型启动子是在不存在某些剂、例如阻遏蛋白的情况下被诱导的。诱导型启动子的实例包括但不限于：四环素、金属硫蛋白、蜕皮素、哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其它类固醇响应性启动子、雷帕霉素响应性启动子等。
本文可互换使用的术语“DNA调控序列”、“控制元件”和“调控元件”是指转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等，其提供和/或调节非编码序列(例如靶向DNA的RNA)或编码序列(例如定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节编码的多肽的翻译。
“可操作地连接”是指一种并置，其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么该启动子可操作地连接至编码序列。“表达盒”包括异源DNA序列，其可操作地连接到启动子或足以引导转基因在ceDNA载体中转录的其他调控序列。合适的启动子包括例如组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。
如本文所用的术语“受试者”是指向其提供用本发明的ceDNA载体的治疗、包括预防性治疗的人类或动物。通常，动物是脊椎动物，例如但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或野生动物。灵长类动物包括但不限于黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养和野生动物包括但不限于：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种如家猫、犬科物种如狗、狐狸、狼、禽类物种如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在本文所述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物或人。受试者可以是雄性或雌性。另外，受试者可以是婴儿或儿童。在一些实施方案中，受试者可以是新生儿或未出生的受试者，例如，受试者还在子宫内。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病症的动物模型的受试者。另外，本文所述的方法和组合物可用于家养动物和/或宠物。人类受试者可以是任何年龄、性别、种族或人种群组，例如，高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其他受试者。在一些实施方案中，受试者已在进行治疗。在一些实施方案中，受试者是胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施方案中，受试者是人类胎儿、人类新生儿、人类婴儿、人类儿童、人类青少年或人类成人。在一些实施方案中，受试者是动物胚胎，或非人类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。在一些实施方案中，受试者是人胚胎。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括易于被本公开的核酸构建体或ceDNA表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性实例，宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如HepG2细胞)中的任何一种。可替代地，宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。
术语“外源”是指存在于除天然来源外的细胞中的物质。当在本文中使用时，术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸(例如编码多肽的核酸)或多肽，通常在所述细胞或生物体中未发现所述核酸或多肽，并且希望将核酸或多肽引入此类细胞或生物体中。可替代地，“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸或多肽，在所述细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低，并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量，例如以产生异位表达或水平。与此相反，术语“内源”是指原产于所述生物系统或细胞的物质。
术语“序列一致性”是指两个核苷酸序列之间的相关性。出于本公开的目的，使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，同上)，优选版本3.0.0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长一致性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作一致性百分比，并按以下计算：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸、优选为至少25个核苷酸、更优选为至少50个核苷酸并且最优选为至少100个核苷酸。
如本文所用，术语“同源性”或“同源”被定义为，在比对序列且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，与靶染色体上的相应序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。出于确定核苷酸序列同源性百分比的比对可以用所属技术领域中内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，当同源臂的例如核酸序列(例如DNA序列)与宿主细胞的相应原生或未经编辑的核酸序列(例如基因组序列)至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多一致时，所述序列被视为“同源”。
如本文所用，术语“异源”意指分别在天然核酸或蛋白质中未发现的核苷酸或多肽序列。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变异体)连接(例如通过基因工程)以产生编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如通过基因工程)以产生编码融合变异多肽的核苷酸序列。
“载体”或“表达载体”是复制子，诸如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒体或粘粒，另一个DNA区段(即“插入物”)可与之连接以便实现所连接区段在细胞中的复制。载体可以是设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体在起源和/或最终形式上可以是病毒或非病毒的，但是出于本公开的目的，“载体”通常是指ceDNA载体，如本文所用。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。在一些实施方案中，载体可以是表达载体或重组载体。
如本文所用，术语“表达载体”是指指导RNA或多肽从与载体上的转录调控序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包含其它元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如在人类细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时包括但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过翻译从基因转录的mRNA所获得的多肽。术语“基因”意指当与适当的调控序列可操作地连接时在体外或在体内转录为RNA的核酸序列(DNA)。基因可以包括或可以不包括编码区前后的区域，例如5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾区”序列，以及单个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应了解，在一些实施方案中，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中，载体是游离型的。合适的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持受试者中的所关注核苷酸，从而消除染色体整合的潜在影响的方式。
如本文所用的短语“遗传性疾病”是指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病，尤其是从出生起出现的病状。异常可以是突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调控序列。遗传疾病可以是(但不限于)PKU、DMD、血友病、囊肿性纤维化、亨廷顿氏舞蹈病、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏疾病(Wilson's disease)、先天性肝卟啉症(hepatic porphyria)、遗传性肝代谢病症、勒什尼汗综合症(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞贫血、地中海贫血、着色性干皮病、范克尼氏贫血(Fanconi's anemia)、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁氏综合症、视网膜母细胞瘤，和泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs disease)。
如本文所用，“抑制性多核苷酸”是指减少或阻止第二(靶标)多核苷酸的表达(转录或翻译)的DNA或RNA分子。抑制性多核苷酸包括反义多核苷酸、核酶和外部指导序列。术语“抑制性多核苷酸”还包括DNA和RNA分子，例如编码实际抑制性物质的RNAi，诸如编码核酶的DNA分子。
如本文所用，关于RNAi分子(例如siRNA或miRNA)的活性的“基因沉默”或“基因沉默”是指细胞中用于靶基因的mRNA水平降低。
如本文所用，术语“RNAi”是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于siRNAi、shRNAi、内源性微小RNA和人工微小RNA。例如，其包括先前鉴定为siRNA的序列，而与RNA的下游加工机制无关(即，尽管据信siRNA具有导致mRNA切割的特定体内加工方法，但是可将此类序列并入在本文所述的侧翼序列的背景下的载体中)。术语“RNAi”可既包括基因沉默RNAi分子，又包括激活基因表达的RNAi效应子分子。仅举例来说，在一些实施方案中，用于抑制或基因沉默的RNAi试剂可用于本文公开的方法、试剂盒和组合物中，例如以抑制免疫应答(例如先天性免疫应答)。
如本文所用，术语“包含(comprising/comprises)”在提及组合物、方法以及对所述方法或组合物来说必不可少的一种或所种其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。
如本文所使用的，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。所述术语允许存在不实质影响所述实施方案的一个或多个基本和新颖或功能性特征的要素。“包含”的使用表示包含而不是限制。
术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，其排除在所述实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本文所使用的，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。该术语允许存在不实质上影响本发明的那个实施方案的基本和新颖或功能特征的额外元件。
如本说明书和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”包含多个提及物。因此，举例来说，提到“方法”包括本文所描述的和/或在阅读本公开等之后对于所属领域技术人员而言将变得显而易见的类型的一个或多个方法和/或步骤。类似地，除非上下文另有明确规定，否则单词“或”旨在包括“和”。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开，但在下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia，并且在本文中用以指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义的。
本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独提及和要求，或呈与该组的其他成员或此处找到的其他要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时，在本文中认为说明书含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
在任何方面的一些实施方案中，本文描述的公开内容不涉及克隆人的方法、用于修饰人的种系遗传身份的方法、用于工业或商业目的的人胚胎的使用、或用于修饰动物的基因身份，可能导致其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法，以及由这类方法产生的动物。
本文在本发明的各个方面的描述内定义了其它术语。
本申请全文中引用的所有专利和其它出版物，包括参考文献、授权专利、已发布的专利申请和共同待决的专利申请，以引用的方式明确地并入本文中，以描述和公开例如在这些出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者由于在先发明或任何其他原因而无权早于这种公开内容。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是替代实施方案可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实例进一步说明本文所述的技术，这些实例决不应解释为进一步限制。应理解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。
II.从闭合端DNA(ceDNA)载体表达PAH蛋白
本文所述的技术大体上涉及PAH蛋白通过非病毒DNA载体(例如如本文所述的ceDNA载体)在细胞中的表达和/或产生。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体描述于本文中的标题为“通用ceDNA载体”的章节中。具体地说，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含一对ITR(例如对称或不对称的，如本文所述)以及介于所述ITR对之间的如本文所述的编码抗体或融合蛋白的核酸，所述核酸可操作地连接到启动子或调控序列。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码所期望蛋白质的异源核酸序列不存在大小约束。因此，甚至可从单个ceDNA载体中表达全长为6.8kb的PAH蛋白。因此，本文所述的ceDNA载体能够用于在有需要的受试者中表达治疗性PAH蛋白。
正如将了解的那样，本文所述的ceDNA载体技术能够适合于任何复杂程度或能够以模块化方式使用，其中PAH蛋白的不同组分的表达能够以独立方式控制。举例来说，特别预期本文中所设计的ceDNA载体技术能够与使用单个ceDNA载体表达单一异源基因序列(例如PAH蛋白)一样简单，或能够与使用多个ceDNA载体一样复杂，其中每个载体表达各自由不同启动子独立地控制的多种PAH蛋白或相关联辅因子或辅助蛋白。本文特别涵盖以下实施方案且本领域的技术人员能够按需要对其进行改编辑。
在一个实施方案中，单个ceDNA载体可用于表达PAH蛋白的单个组分。或者，单个ceDNA载体能够用于在单个启动子(例如强启动子)的控制下表达PAH蛋白的多种组分(例如至少2种)，任选地使用一个或多个IRES序列确保每种组分的适当表达，例如辅因子或辅助蛋白。
在另一个实施方案中，本文还涵盖了包含至少两个插入片段(例如表达重链或轻链)的单个ceDNA载体，其中每个插入片段的表达是在其自身启动子的控制下进行。启动子可以包括相同启动子的多个拷贝、多个不同启动子或其任意组合。正如本领域技术人员将了解的那样，常常期望以不同的表达水平表达抗体的组分，从而控制所表达的个别组分的化学计量以确保在细胞中的有效PAH蛋白折叠和组合。
本领域的技术人员能够设想ceDNA载体技术的其他变化形式或能够使用常规载体通过蛋白质产生方法对其进行调适。
A.核酸
本文提供了用于潜在治疗用途的核酸分子的表征和发展。根据一些实施方案，用于治疗用途的核酸编码PAH蛋白。在一些实施方案中，在适当情况下描述了出于改变和改善的体内性质(递送、稳定性、寿命、折叠、靶标特异性)以及其与治疗应用直接相关的生物学功能和机制的目的对寡核苷酸进行化学修饰。
可具有免疫刺激作用并需要使用本文公开的免疫抑制剂的本公开的说明性治疗性核酸可包括但不限于：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(Msg)、核酶、闭合端双链DNA(例如，ceDNA、CELiD、线性共价闭合DNA(“辅助”)、狗骨头(dbDNATM)DNA、前端粒闭合端DNA或哑铃线性DNA)、切丁酶-底物RNA、双发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNS(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA和DNA病毒载体、病毒RNA载体以及其任何组合。
本发明还预期可以通过称作RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平的siRNA或miRNA为核酸治疗剂。在将siRNA或miRNA引入宿主细胞的胞质中之后，这些双链RNA构建体可以结合到称为RISC的蛋白质。siRNA或miRNA的有义链通过RISC复合物去除。RISC复合物当与互补mRNA组合时，裂解mRNA并且释放切割的链。RNAi是通过诱导mRNA的特异性破坏而导致相应蛋白质的下调。
抑制mRNA翻译到蛋白质中的反义寡核苷酸(ASO)和核酶可以是核酸治疗剂。对于反义构建体，这些单链脱氧核酸与目标蛋白mRNA的序列具有互补序列，并且沃森(Watson)能够通过克里克碱基配对(Crick base pairing)结合到mRNA。这一结合阻止目标mRNA的翻译，和/或触发mRNA转录物的RNaseH降解。因此，反义寡核苷酸具有增加的作用特异性(即，特定疾病相关蛋白的下调)。
在本文所提供的任何方法中，治疗性核酸可以是治疗性RNA。治疗性RNA可以是mRNA翻译的抑制剂、RNA干扰的药剂(RNAi)、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)或结合mRNA转录物的RNA(ASO)、蛋白质或其他分子配体(适体)。在本文所提供的方法中的任一种中，RNAi的药剂可以是双链RNA、单链RNA、微RNA、短干扰RNA、短发夹RNA或三链形成寡核苷酸。
根据一些实施方案，治疗性核酸是闭合端双链DNA，例如ceDNA。根据一些实施方案，治疗蛋白在细胞中的表达和/或产生来自非病毒DNA载体，例如ceDNA载体。用于表达治疗蛋白的ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码所期望蛋白质的异源核酸序列不存在大小约束。因此，甚至可从单个ceDNA载体中表达大的治疗蛋白。因此，ceDNA载体可用于在有需要的受试者中表达治疗蛋白。
一般来说，如本文所公开的用于表达治疗蛋白的ceDNA载体在5'至3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下中的任一者：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如不对称的修饰ITR)；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如不对称的修饰ITR)；或(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织；或(iv)对称或基本上对称的修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织。
在一些实施方案中，编码PAH蛋白的转基因还将编码分泌序列，使得PAH蛋白被引导到高尔基体和内质网，其中当抗体穿过ER且离开细胞时，PAH蛋白将通过伴随蛋白分子折叠成正确的构象。示例性分泌序列包括(但不限于)VH-02(SEQ ID NO:88)和VK-A26(SEQ IDNO:89)和Igκ信号序列(SEQ ID NO:126)，以及允许标记的蛋白质从胞溶质中分泌出来的Gluc分泌信号(SEQ ID NO:188)、将经标记的蛋白质引导到高尔基体的TMD-ST分泌序列(SEQ ID NO:189)。
调控开关还能够用于微调PAH蛋白的表达，以便按需表达PAH蛋白，包括(但不限于)在所期望的表达水平或量下表达PAH蛋白，或替代地，当存在或缺乏特定信号时，包括细胞信号传导事件。举例来说，如本文所述，当出现特定病状时，能够打开或关闭ceDNA载体对PAH蛋白的表达，如本文在标题为调控开关的章节中所述。
例如，仅出于说明目的，PAH蛋白可用于关闭不希望的反应，例如PAH蛋白的生产水平过高。PAH基因可以包含一个信号肽标记，将PAH蛋白带到期望的细胞。但是，在任一种情况下，都可能希望调控PAH蛋白的表达。ceDNA载体轻松地适应抗体对调控开关的使用。
ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码PAH蛋白的异源核酸序列不存在尺寸约束。因此，即使是全长PAH以及任选的任何辅因子或辅助蛋白也可以从单个ceDNA载体表达。另外，根据必需的化学计量，能够表达相同PAH蛋白的多个区段，并且能够使用相同或不同启动子，并且还能够使用调控开关微调每个区域的表达。举例来说，如实例所示，能够使用包含双重启动子系统的ceDNA载体，使得PAH蛋白的结构域各自使用不同的启动子。使用ceDNA质粒产生PAH蛋白可以包括用于表达PAH蛋白域的启动子的独特组合，这导致适当比例的每个结构域用于形成功能性PAH蛋白。因此，在一些实施方案中，ceDNA载体能够用于分别表达PAH蛋白的不同区域(例如在不同启动子的控制下)。
在另一个实施方案中，从ceDNA载体中表达的PAH蛋白进一步包含另外的功能，例如荧光、酶活性、分泌信号或免疫细胞活化因子。
在一些实施方案中，编码PAH蛋白的ceDNA能够进一步包含例如接头域。如本文所用，“接头域”是指长度为约2到100个氨基酸的寡核苷酸或多肽区域，其使如本文所述的PAH蛋白的任何结构域/区域连接在一起。在一些实施方案中，接头能够包括或由柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)构成，使得相邻蛋白质域相对于彼此自由地移动。当希望确保两个相邻结构域在空间上彼此无干扰时，可以使用较长接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的实例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等效物以及其组合。接头可以是来源于明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)的T2A的接头区域。
获取例如PAH等的已知和/或可公开获得的蛋白质序列以及对cDNA序列进行反向工程改造以编码此类蛋白质充分属于本领域的技术人员的能力范围内。然后能够对cDNA进行密码子优化以与预定的宿主细胞匹配，并且插入如本文所述的ceDNA载体中。
B.表达PAH蛋白的ceDNA载体
用于表达PAH蛋白的具有编码所期望PAH的一个或多个序列的ceDNA载体能够包含调控序列，例如启动子、分泌信号、polyA区域和增强子。在最低限度，ceDNA载体包含编码PAH蛋白的一个或多个异源序列。
为了实现高效且准确的PAH蛋白组装，在一些实施方案中特别预期PAH蛋白包含内质网ER前导序列以将其引导到ER，在ER中发生蛋白质折叠。举例来说，序列将所表达的蛋白质引导到ER进行折叠。
在一些实施方案中，ceDNA载体中包含细胞或细胞外定位信号(例如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号等)以引导PAH的分泌或所期望的亚细胞定位，使得PAH蛋白能够结合到细胞内靶标(例如胞内抗体)或细胞外靶标。
在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体允许以模块化方式组装和表达任何期望的PAH蛋白。如本文所用，术语“模块化”是指能够轻松地从构建体中去除的ceDNA表达质粒中的元件。举例来说，产生ceDNA的质粒中的模块化元件包含与构建体内的每个元件侧接的独特限制位点对，从而能够排它性地操控个别元件(参见例如图1A-1G)。因此，ceDNA载体平台能够容许所期望的任何PAH蛋白构形实现表达和组装。本文在多个实施方案中提供ceDNA质粒载体，其能够减少和/或最小化为了组装编码PAH蛋白的期望ceDNA载体所必需的操控量。
C.由ceDNA载体表达的示例性PAH蛋白
具体地说，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够编码例如(但不限于)用于治疗、预防和/或改善苯丙酮尿症(PKU)的一种或多种症状的PAH蛋白以及其变异体和/或活性片段。一方面，苯丙酮尿症(PKU)是人苯丙酮尿症(PKU)。
(i)PAH治疗蛋白及其片段
基本上任何形式的PAH治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)都可以由本文所述的ceDNA载体编码并在其中表达。本领域技术人员将理解PAH治疗蛋白包括PAH蛋白的所有剪接变体和直向同源物。PAH治疗蛋白包括完整的分子及其片段(例如，功能性的)。
ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码所期望蛋白质的异源核酸序列不存在尺寸约束。因此，可以从单个ceDNA载体表达多种全长PAH治疗蛋白。
PAH蛋白和基因：PAH基因位于12q22-q24.2条带中的12号染色体上。截至2000年，在PAH基因中发现了大约400个致病突变。苯丙氨酸羟化酶(PAH)也可称为苯丙氨酸4-单加氧酶、苯丙氨酸-4-羟化酶、Phe-4-单加氧酶、EC 1.14.16.1、EC 1.14.16、PKU1、PKU或PH。
PAH的蛋白质序列如下：Homo sapiens PAH酶转译(450个氨基酸)，入藏号NM_000277.3
MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPSRLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGAELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYMEEEKKTWGTVFKTLKSLYKTHACYEYNHIFPLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPEPDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSSFGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQRIEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQK(SEQ ID NO:195)
PAH主要在肝脏中表达，在肾脏和胆囊中适度表达。在前列腺、肾上腺中也可以检测到低水平的PAH表达。在胎儿发育过程中，PAH可在肾上腺、心脏、肠、肺和胃中表达。因此，可以将表达PAH的ceDNA载体施用于选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺。在一些实施方案中，当将表达PAH的ceDNA载体施用给婴儿或施用给子宫内的受试者时，可以将表达PAH的ceDNA载体施用给选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾上腺、心脏、肠、肺和胃。
使用一种或多种本领域已知的或本文所述的诱导型或抑制型启动子，包括本文所述的调控开关，可以在空间和时间上实现从ceDNA载体表达PAH治疗蛋白或其片段。
在一个实施方案中，PAH治疗蛋白是“治疗蛋白变体”，其指与其相应的天然PAH治疗蛋白相比具有改变的氨基酸序列、组成或结构的PAH治疗蛋白。在一个实施方案中，PAH是一种功能形式(例如，野生型)。表达PAH蛋白的突变形式例如导致苯丙酮尿症(PKU)的点突变或缺失突变也可能有用，例如用于疾病的动物模型和/或用于评估苯丙酮尿症(PKU)的药物。可以将突变的或修饰的PAH蛋白递送至细胞或动物模型系统以生成疾病模型。这种细胞或动物模型可用于研究和/或药物筛选。从ceDNA载体表达的PAH治疗蛋白可以进一步包含赋予额外功能性的序列/部分，例如荧光、酶活性或分泌信号。在一个实施方案中，PAH治疗蛋白变体包含用于鉴定的非天然标签序列(例如，免疫标签)以使其与受体宿主细胞中的内源性PAH治疗蛋白相区分。
获取例如PAH治疗蛋白的已知和/或可公开获得的蛋白质序列以及对cDNA序列进行反向工程改造以编码此类蛋白质充分属于本领域的技术人员的能力范围内。然后能够对cDNA进行密码子优化以与预定的宿主细胞匹配，并且插入如本文所述的ceDNA载体中。
在一个实施方案中，PAH治疗蛋白编码序列可以得自现有的宿主细胞或细胞系，例如，通过逆转录从宿主获得的mRNA并使用PCR扩增该序列。
(ii)表达ceDNA载体的PAH治疗蛋白
具有一个或多个编码期望PAH治疗蛋白的序列的ceDNA载体可包含调控序列，例如启动子(例如，参见表1)、分泌信号、polyA区域和增强子。至少，ceDNA载体包含一个或多个编码PAH治疗蛋白或其功能片段的异源序列。图1A-1G描述了用于产生编码PAH治疗蛋白的ceDNA载体的示例性盒插入物。在一个实施方案中，ceDNA载体包含本文表1中列出的PAH序列。
表1：用于治疗PKU的示例性PAH序列
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Figure BDA0003352315200000611
在一个实施方案中，ceDNA载体包含本文表1中列出的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少90％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少91％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少92％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少93％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少94％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少95％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少96％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少97％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少98％同一性的PAH序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含与表1中列出的PAH序列具有至少99％同一性的PAH序列。
在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ IDNO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少90％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少91％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ IDNO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少92％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少93％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少94％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ IDNO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少95％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少96％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少97％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ IDNO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少98％同一性。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少99％同一性。在一个实施方案中，PAH序列包含SEQ ID NO:380、SEQID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394。在一个实施方案中，PAH序列由SEQ ID NO:380、SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ ID NO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394组成。
在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382具有至少85％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQID NO:382具有至少97％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382具有至少99％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:382具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列具有包含SEQ ID NO:382的序列。在一个实施方案中，PAH序列具有由SEQ ID NO:382组成的序列。
在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:384具有至少85％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:384具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:384具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列具有与SEQ ID NO:384至少97％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:384具有至少99％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:384具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列具有包含SEQ ID NO:384的序列。在一个实施方案中，PAH序列具有由SEQ ID NO:384组成的序列。
在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:394具有至少85％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:394具有至少90％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:394具有至少95％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQID NO:394具有至少97％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:394具有至少99％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列与SEQ ID NO:394具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个实施方案中，PAH序列具有包含SEQ ID NO:394的序列。在一个实施方案中，PAH序列具有由SEQ ID NO:394组成的序列。
(iii)PAH治疗蛋白及其用于治疗PKU的用途
本文所述的ceDNA载体可用于递送治疗性PAH蛋白以治疗与PAH蛋白的不当表达和/或PAH蛋白内的突变相关的PKU。
如本文所述的ceDNA载体能够用于表达所期望的任何治疗PAH蛋白。示例性的治疗性PAH治疗蛋白包括但不限于由本文表1中列出的序列表达的任何PAH蛋白。
在一个实施方案中，表达的PAH治疗蛋白具有治疗苯丙酮尿症(PKU)的功能。在一些实施方案中，PAH治疗蛋白不引起免疫系统反应。
在另一个实施方案中，编码PAH治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)的ceDNA载体可用于产生嵌合蛋白。因此，本文特别考虑可将表达嵌合蛋白的ceDNA载体施用于例如任何一种或多种选自以下的组织：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺。在一些实施方案中，当将表达PAH的ceDNA载体施用于婴儿或施用于子宫内的受试者时，可以将表达PAH的ceDNA载体施用于选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾上腺、心脏、肠、肺和胃，或其肝干细胞前体，用于苯丙酮尿症(PKU)的体内或体外治疗。
PKU：PKU是一种罕见的遗传性先天性代谢缺陷，由PAH基因突变引起。PAH是一种酶，通常在肝脏中表达，是将膳食苯丙氨酸代谢为酪氨酸所必需的，酪氨酸是一种负责产生神经递质的氨基酸。PKU是由导致其酶活性不足的PAH突变引起的。因此，表达PAH蛋白的ceDNA载体可以在肝脏或其他组织中表达PAH，包括视网膜细胞，例如感光细胞和/或RPE细胞。在一些实施方案中，ceDNA载体在光感受器和RPE细胞中表达至少一种PAH蛋白。
PAH通常在PR和RPE细胞类型中内源性表达。据报道，正常视网膜功能也可能需要RPE中低水平的PAH表达。因此，有时可能需要通过ceDNA载体在PR以及任选的RPE细胞中低水平或高水平表达PAH蛋白以防止视网膜变性。这种表达水平可以通过本文所述的启动子和/或调控开关进行微调。
因此，在一些实施方案中，ceDNA载体用于从内源性启动子(约1kb)表达PAH蛋白(为6.8kb蛋白)，以恢复光感受器和RPE中的正常类视色素加工。在一些实施方案中，表达PAH蛋白的ceDNA载体通过脉络膜上或玻璃体内给药途径来治疗较大面积的视网膜。在一些实施方案中，ceDNA载体通过以下任何一种或多种施用：视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的编码PAH治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)的ceDNA载体。如熟练的从业者将了解，术语“有效量”是指ceDNA组合物的施用量，引起蛋白以治疗疾病的“治疗有效量”表达。
包含编码多环芳烃治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)的ceDNA载体的组合物的剂量范围取决于效力(例如，启动子的效率)，并且包括足以产生所需效果的量，例如，表达期望的PAH治疗蛋白，以用于治疗苯丙酮尿症(PKU)。剂量不应大到引起不可接受的副作用。通常，剂量将随ceDNA载体的特定特征、表达效率以及随患者的年龄、病状和性别而变化。剂量可以由本领域技术人员确定，并且与传统的AAV载体不同，在任何并发症的情况下，也可以由个别医师来调节，因为ceDNA载体不包含阻止重复给药的免疫活化衣壳蛋白。
可以在有限的时间段内重复施用本文所述的ceDNA组合物。在一些实施方案中，定期或通过脉冲施用给出剂量。在一个优选的实施方案中，在数月内以上述剂量给药。治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的应答而定。预期随着时间的推移加强治疗。此外，表达水平可以随着受试者的成长来调节。
PAH治疗蛋白可以在受试者中表达至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/1年、至少2年、至少至少5年，至少10年，至少15年，至少20年，至少30年，至少40年，至少50年或更长。通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够达成长期表达。
如本文所用，术语“治疗有效量”是足以在疾病生物标志物的表达中产生统计学显着的、可测量的变化或给定疾病症状的减少的表达的PAH治疗蛋白或其功能片段的量(请参见下面的“功效测量”)。指定的ceDNA组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
需要施用的ceDNA载体的精确量取决于从业者的判断并且因个体而异。合适的施用方案也是可变的，但以初始施用为代表，随后通过后续注射或其他施用以一个或多个间隔重复施用。或者，考虑持续静脉内输注足以将血液中的浓度维持在体内治疗规定的范围内，特别是用于治疗急性疾病/病症。
用于本文所述的方法和组合物的药剂能够通过体表、静脉内(通过推注或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、通过吸入、腹膜内、皮下、腔内施用，并且必要时能够通过蠕动方式或通过所属领域的技术人员已知的其它方式递送。如果需要，可以全身施用该药剂。它也可以在子宫内施用。
苯丙酮尿症(PKU)的给定治疗的功效可由熟练的临床医生确定。然而，在用编码PAH的ceDNA载体治疗之后，如果疾病或病症的任一种或所有征象或症状以有益方式改变或临床上接受的其它症状或疾病标志物改良或改善例如至少10％，则治疗在所述术语在本文使用时被视为“有效治疗”。还可以根据个体未发生恶化来测量功效，如通过疾病的稳定或对医疗干预的需求(即，疾病的进展停止或至少减缓)所评估。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制(例如遏制)疾病或减缓疾病或病症的进展；或(2)缓解疾病，例如引起症状消退；以及(3)阻止或减小疾病发展的可能性，或预防与疾病相关的继发疾病/病症(诸如肝脏或肾脏衰竭)。治疗疾病的有效量是指当施用给需要治疗的哺乳动物时，足以对该疾病产生如本文所定义术语的有效治疗的量。
药剂功效能够通过评估苯丙酮尿症(PKU)所特有的身体指标来测定。分析PKU指标的标准方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体还能够编码能够结合从ceDNA表达的PAH蛋白使用的辅因子或其它多肽、有义或反义寡核苷酸，或RNA(编码或非编码；例如siRNA、shRNA、微RNA，和其反义对应物(例如拮抗MiR))。另外，包含编码PAH蛋白的序列的表达盒还能够包括外源序列，所述外源序列编码用于实验或诊断目的的报告蛋白，例如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中众所周知的其它蛋白。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含核酸序列以表达具有PKU治疗功能的PAH蛋白。在一个优选实施方案中，治疗性PAH蛋白不引起免疫系统反应，除非期望如此。
III.通常用于产生PAH治疗蛋白的ceDNA载体
本发明的实施方案是基于包含闭合端线性双链(ceDNA)载体的方法和组合物，所述载体能够表达PAH转基因。在一些实施方案中，转基因是编码PAH蛋白的序列。本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体不受大小限制，从而允许例如表达从单个载体表达转基因所需的所有组分。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体优选地是双链体，例如相对于分子的至少一部分是自互补的，例如表达盒(例如，ceDNA不是双链环状分子)。ceDNA载体具有共价闭合端，因此抵抗核酸外切酶(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)消化，例如在37℃下超过一个小时。
一般来说，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在5'至3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下中的任一个：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复(mod-ITR)(例如经修饰的不对称ITR)；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如经修饰的不对称ITR)；或(iii)对称或基本对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构；或(iv)对称或基本对称修饰的ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构。
本文中涵盖了包含用于PAH蛋白产生的ceDNA载体的方法和组合物，其可以进一步包括递送系统，例如(但不限于)脂质体纳米颗粒递送系统。本文公开了预期使用的非限制示范性脂质体纳米颗粒系统。在一些方面，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。举例来说，2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开了脂质纳米颗粒配制物，所述配制物经制备并且装载通过所述方法获得的ceDNA载体，所述国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体不存在由病毒衣壳内的有限空间所强加的封装局限。与囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体是活真核生物产生的，代表原核生物产生的质粒DNA载体的替代方案。这允许插入控制元件，例如如本文公开的调控开关、大的转基因、多个转基因等。
图1A-1E显示了用于表达PAH蛋白的非限制性示例性ceDNA载体或ceDNA质粒的相应序列的示意图。ceDNA载体无衣壳，并且可从按以下顺序编码的质粒中获得：第一ITR、包含转基因的表达盒和第二ITR。表达盒可以包括一种或多种允许且/或控制转基因表达的调控序列，例如其中表达盒能够按照此次序包含以下中的一个或多个：增强子/启动子、ORF报告基因(转基因)、转录后调控元件(例如WPRE)，以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGHpolyA)。
表达盒还可包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调控元件包含但不限于：启动子、核糖开关、隔离子、mir可调控元件、转录后调控元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施方案中，ITR可以充当转基因(例如PAH蛋白)的启动子。在一些实施方案中，ceDNA载体包含调控转基因表达的额外组件，例如调控开关，其描述于本文中的标题为“调控开关”的章节中，用于控制和调控PAH蛋白的表达，并且必要时能够包括作为杀灭开关的调控开关，从而能够使包含ceDNA载体的细胞实现受控的细胞死亡。
表达盒能够包含超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在500到50,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在500到75,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在500到10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在1000到10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在500到5,000个核苷酸范围内的转基因。ceDNA载体不存在衣壳化AAV载体的尺寸限制，从而能够递送大尺寸表达盒以提供有效的转基因表达。在一些实施方案中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
ceDNA表达盒能够包括例如所编码的蛋白质在接受的受试者中不存在、无活性或活性不充分的可表达的外源序列(例如开放阅读框架)或转基因，或所编码的蛋白质具有所期望的生物或治疗作用的基因。转基因能够编码能够用以校正缺陷基因或转录物表达的基因产物。原则上，表达盒可包括编码因突变而减少或不存在或在本公开的范围内认为过度表达时会展现治疗益处的蛋白质、多肽或RNA的任何基因。
表达盒可包含任何转基因(例如，编码PAH蛋白)，例如可用于治疗受试者的PKU的PAH蛋白，即治疗性PAH蛋白。ceDNA载体能够单独或与编码多肽的核酸或非编码核酸(例如RNAi、miRs等)以及外源基因和核苷酸序列(包括受试者基因组中的病毒序列，例如HIV病毒序列等等)组合使用，以递送和表达受试者中的所关注的任何PAH蛋白。优选地，本文所公开的ceDNA载体用于治疗目的(例如用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽。在某些实施方案中，ceDNA载体适用于表达受试者中的所关注的任何基因，包括一种或多种多肽、肽、核糖核酸酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸，或RNA(编码或非编码；例如siRNA、shRNA、微RNA，和其反义对应物(例如拮抗MiR))、抗体、融合蛋白或其任何组合。
表达盒还能够编码多肽、有义或反义寡核苷酸，或RNA(编码或非编码；例如siRNA、shRNA、微RNA，和其反义对应物(例如拮抗MiR))。表达盒可包括编码用于实验或诊断目的的报道蛋白的外源序列，所述报道蛋白例如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它本领域众所周知的报道蛋白。
本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的表达盒、表达构建体中提供的序列能够针对靶宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人等所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。能够使用例如Aptagen的Gene
Figure BDA0003352315200000691
密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司，2190Fox Mill Rd.Suite 300,Herndon,Va.20171)或其它公共数据库确定优化密码子。在一些实施方案中，编码PAH蛋白的核酸针对人表达进行优化，且/或是所属领域中已知的人PAH或其功能片段。
由本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体表达的转基因编码PAH蛋白。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的许多结构特征不同于基于质粒的表达载体。ceDNA载体可以具有以下特征中的一个或多个：缺乏原始(即，非插入)细菌DNA、缺乏原核复制起点、是自给式，即，它们不需要除所述两个ITR之外的任何序列，包括Rep结合和末端解析位点(RBS和TRS)，和ITR之间的外源序列；存在形成发夹的ITR序列，以及缺乏细菌型DNA甲基化或实际上被哺乳动物宿主视为异常的任何其它甲基化。一般来说，本发明载体优选不含有任何原核DNA，但作为非限制性实例，预期可以将一些原核DNA作为外源序列插入启动子或增强子区中。将ceDNA载体与质粒表达载体区分开来的另一个重要特征是，ceDNA载体是具有闭合端的单链线性DNA，而质粒始终是双链DNA。
通过本文所提供的方法产生的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体优选具有线性连续结构，而非非连续结构，如限制酶消化分析所测定的(图4D)。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包含本文所描述的ceDNA质粒)，所述质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而与此相反，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也仍保持是单个分子。在一些实施方案中，与质粒不同，如本文所描述的ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和提纯这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
使用如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体相对于基于质粒的表达载体具有若干优势，此类优势包括(但不限于)：1)质粒含有细菌DNA序列并且经历原核特异性甲基化，例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化，而无衣壳AAV载体序列具有真核起源并且未经历原核特异性甲基化；因此，相较于质粒，无衣壳AAV载体不大可能诱导发炎和免疫应答；2)质粒在生产过程期间需要存在抗性基因，而ceDNA载体则不需要；3)环状质粒在引入细胞后不递送到细胞核并且需要过量装载以规避细胞核酸酶的降解作用，而ceDNA载体含有病毒顺式元件，即ITR，其赋予核酸酶抗性并且能够设计成靶向且递送到细胞核。假设：ITR功能必需的最小限定元件是Rep结合位点(RBS；对于AAV2，为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ IDNO:60))和末端解析位点(TRS；对于AAV2，为5'-AGTTGG-3'(SEQ ID NO:64))，加上允许发夹形成的可变回文序列；且4)ceDNA载体不具有通常在原核生物来源的质粒中发现的CpG二核苷酸过度表达，原核生物来源的质粒据报导结合铎样受体家族成员，诱发T细胞介导的免疫应答。相比之下，用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
IV.反向末端重复(ITR)
如本文所公开，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体含有位于两个反向末端重复(ITR)序列之间的转基因或异源核酸序列，其中ITR序列可以是不对称ITR对或对称或基本上对称的ITR对，这些术语如本文所定义。如本文所公开的ceDNA载体能够包含选自以下中的任一种的ITR序列：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复(mod-ITR)(例如不对称修饰的ITR)；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如不对称修饰的ITR)，或(iii)对称或基本对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构，或(iv)对称或基本对称修饰的ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构，其中本公开的方法可以进一步包括递送系统，例如(但不限于)脂质体纳米颗粒递送系统。
在一些实施方案中，ITR序列可以来自细小病毒科的病毒，细小病毒科包括两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科，和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(称为细小病毒)包括依赖病毒属，其成员在大多数情况下需要与例如腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒共同感染才能进行生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(例如血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)，以及感染其它温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和羊的腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其它成员大体描述于Kenneth I.Berns,《病毒学领域(FIELDS VIROLOGY)》(第3版，1996)中第69章“细小病毒科：病毒及其复制(Parvoviridae:The Viruses and Their Replication)”。
尽管在说明书和本文的实例中举例说明的ITR是AAV2 WT-ITR，但是本领域的普通技术人员知道如上所述，可以使用来自任何已知的细小病毒，例如如AAV的依赖病毒(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如NCBI:NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)的ITR、嵌合ITR或来自任何合成AAV的ITR。在一些实施方案中，AAV可以感染温血动物，例如禽类(AAAV)、牛(BAAV)、犬、马和绵羊腺相关病毒。在一些实施方案中，ITR来自B19细小病毒(GenBank登录号:NC000883)、来自小鼠的细小病毒(MVM)(GenBank登录号NC 001510)；鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。在一些实施方案中，如本文所论述，5'WT-ITR可以来自一种血清型，而3'WT-ITR来自不同血清型。
普通技术人员知道，ITR序列具有双链霍利迪连结体(Holliday junction)的共同结构，该结构典型是T形或Y形发夹结构(参见例如图2A和3A)，其中每个WT-ITR由两个回文臂或环(B-B'和C-C')嵌入较大的回文臂(A-A')中与单链D序列形成(其中这些回文序列的顺序限定了ITR的翻转或翻动取向)。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)的ITR的结构分析和序列比较，并描述于Grimm等人,《病毒学杂志(J.Virology)》,2006；80(1)；426-439；Yan等人,《病毒学杂志》,2005；364-379；Duan等人,《病毒学(Virology)》1999；261；8-14。本领域的技术人员基于本文提供的示例性AAV2 ITR序列，可以容易地确定用于ceDNA载体或ceDNA质粒的来自任何AAV血清型的WT-ITR序列。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6和禽类AAV(AAAV)和牛AAV(BAAV))的ITR的序列比较，其描述于Grimm等人,《病毒学杂志》,2006；80(1)；426-439；其示出了AAV2的左ITR与来自其它血清型的左ITR的同一性％：AAV-1(84％)、AAV-3(86％)、AAV-4(79％)、AAV-5(58％)、AAV-6(左ITR)(100％)和AAV-6(右ITR)(82％)。
A.对称的ITR对
在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体按照5'到3'方向包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此是对称的或基本对称的，也就是说，ceDNA载体能够包含具有对称三维空间组构的ITR序列，使得其结构在几何空间中具有相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。在这样的实施方案中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是不是野生型ITR的修饰ITR(例如mod-ITR)。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在替代实施方案中，修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有一致或相同的对称的三维形状。
(i)野生型ITR
在一些实施方案中，对称的ITR或大体上对称的ITR是如本文所描述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。也就是说，在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组构。
因此，如本文所公开，ceDNA载体含有位于两个侧接野生型反向末端重复(WT-ITR)序列之间的转基因或异源核酸序列，所述两个野生型反向末端重复序列彼此反向互补(逆向)，或替代地，相对于彼此基本对称，即，WT-ITR对具有对称的三维空间组构。在一些实施方案中，野生型ITR序列(例如AAV WT-ITR)包含功能Rep结合位点(RBS；例如AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:60)和功能末端解析位点(TRS；例如5'-AGTT-3'，SEQ IDNO:62)
在一方面，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可从编码异源核酸的载体多核苷酸获得，所述异源核酸操作性地位于两个WT反向末端重复序列(WT-ITR)(例如AAV WT-ITR)之间。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。也就是说，在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组构。在一些实施方案中，5'WT-ITR来自一种AAV血清型，而3'WT-ITR来自相同或不同的AAV血清型。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR是彼此的镜像，即它们是对称的。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR来自相同的AAV血清型。
WT ITR是众所周知的。在一个实施方案中，两个ITR来自相同的AAV2血清型。在某些实施方案中，可以使用来自其它血清型的WT。有许多同源的血清型，例如AAV2、AAV4、AAV6、AAV8。在一个实施方案中，可以使用紧密同源的ITR(例如具有相似环结构的ITR)。在另一个实施方案中，能够使用较多样化的AAV WT ITR，例如AAV2和AAV5，并且在仍另一个实施方案中，能够使用基本上呈WT的ITR，也就是说，其不仅具有WT的基本环结构，而且具有不改变或不影响所述特性的一些保守核苷酸变化。当使用来自相同病毒血清型的WT-ITR时，可以进一步使用一种或多种调控序列。在某些实施方案中，调控序列是容许调节ceDNA活性(例如所编码PAH蛋白的表达)的调控开关。
在一些实施方案中，本文所述技术的一个方面涉及一种用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，其中ceDNA载体包含至少一个可操作地位于两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间的异源核苷酸序列，其中WT-ITR能够来自相同血清型、不同血清型或相对于彼此是基本对称的(即，具有对称的三维空间组构，使得其结构在几何空间中具有相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环)。在一些实施方案中，对称的WT-ITR包含功能性末端解链位点和Rep结合位点。在一些实施方案中，异源核酸序列编码转基因，并且其中载体不在病毒衣壳中。
在一些实施方案中，WT-ITR是相同的，但是彼此反向互补。例如，5'ITR中的序列AACG可以是3'ITR中相应位点处的CGTT(即，反向互补)。在一个实例中，5'WT-ITR有义链包含ATCGATCG的序列，而相应的3'WT-ITR有义链包含CGATCGAT(即与ATCGATCG反向互补)。在一些实施方案中，WT-ITR ceDNA进一步包含末端解析位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制蛋白结合位点)，例如Rep结合位点。
在本文的表3中显示了用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中的示例性WT-ITR序列，所述载体包含WT-ITR，其显示成对的WT-ITR(5'WT-ITR和3'WT-ITR)。
作为一个示例性实例，本公开提供了一种用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，所述载体包含可操作地连接到转基因(例如异源核酸序列)的启动子，具有或不具有调控开关，其中ceDNA缺乏衣壳蛋白并且：(a)由编码WT-ITR的ceDNA质粒(参见例如图1F-1G)产生，其中每个WT-ITR的发夹二级构型具有相同数目个分子内双链体碱基对(相较于这些参考序列，优选排除这种构型中的任何AAA或TTT末端环的缺失)；和(b)使用分析鉴定为ceDNA，所述分析是通过琼脂糖凝胶电泳、在实例1中的天然凝胶和变性条件下鉴定ceDNA。
在一些实施方案中，位于两侧的WT-ITR彼此基本上对称。在所述实施方案中，5'WT-ITR可以来自AAV的一种血清型，而3'WT-ITR可以来自AAV的另一种血清型，使得WT-ITR不是相同的反向互补序列。举例来说，5'WT-ITR能够来自AAV2，并且3'WT-ITR来自不同血清型，例如AAV1、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施方案中，WT-ITR可以选自从以下中的任一种中选择的两种不同的细小病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。在一些实施方案中，WT ITR的这种组合是来自AAV2和AAV6的WT-ITR的组合。在一个实施方案中，当一个相对于另一个ITR反向时，基本上对称的WT-ITR是至少90％一致，至少95％一致，至少96％…97％…98％…99％......99.5％以及之间的所有点，并具有相同的对称三维空间组构。在一些实施方案中，WT-ITR对由于其具有对称的三维空间组构，例如具有A、C-C'、B-B'和D臂的相同3D组构，因此是基本对称的。在一个实施方案中，大体上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此至少95％一致、至少96％…97％…98％…99％…99.5％和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)。在一些实施方案中，基本对称的WT-ITR对相对于彼此呈逆向，并且彼此至少95％一致、至少96％…97％…98％…99％…99.5％和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)，此外保留允许发夹二级结构形成的可变回文序列。同源性可以通过本领域公知的标准方法来确定，例如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)、BLASTN。
在一些实施方案中，ITR的结构元件可以是参与ITR与大的Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施方案中，结构元件为ITR与大的Rep蛋白的相互作用提供了选择性，即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其它实施方案中，当Rep蛋白与ITR结合时，结构元件与大的Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以是例如ITR的二级结构、ITR的核苷酸序列、两个或更多个元件之间的间距元件，或上述任一个的组合。在一个实施方案中，结构元件选自由A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(trs)组成的组。
仅举例而言，表2指示WT-ITR的示例性组合。
表2：来自相同血清型或不同血清型或不同细小病毒的WT-ITR的示例性组合。显示的顺序并不表示ITR位置，例如，“AAV1，AAV2”表明ceDNA可以在5'位置包含WT-AAV1ITR，而在3'位置包含WT-AAV2 ITR，反之亦然，WT-AAV2 ITR位于5'位置，WT-AAV1 ITR位于3'位置。缩写：AAV血清型1(AAV1)，AAV血清型2(AAV2)，AAV血清型3(AAV3)，AAV血清型4(AAV4)，AAV血清型5(AAV5)，AAV血清型6(AAV6)，AAV血清型7(AAV7)，AAV血清型8(AAV8)，AAV血清型9(AAV9)，AAV血清型10(AAV10)，AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)；AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组(例如NCBI:NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC006261)，来自温血动物的ITR(禽AAV(AAAV)，牛AAV(BAAV)，犬、马和绵羊AAV)，来自B19细小病毒的ITR(GenBank登录号:NC 000883)，来自小鼠的细小病毒(MVM)(GenBank登录号NC 001510)；鹅：鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇：蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。
表2
Figure BDA0003352315200000751
Figure BDA0003352315200000761
Figure BDA0003352315200000771
Figure BDA0003352315200000781
Figure BDA0003352315200000791
仅举例而言，表3显示来自一些不同AAV血清型的示例性WT-ITR的序列。
表3
Figure BDA0003352315200000792
Figure BDA0003352315200000801
在一些实施方案中，可以修饰WT-ITR序列的核苷酸序列(例如，通过修饰1、2、3、4或5个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，其中所述修饰是替代互补核苷酸，例如，G替代C，反之亦然，T替代A，反之亦然。
在本发明的某些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体不具有由选自以下中的任一个的核苷酸序列组成的WT-ITR：SEQ ID NO:1、2、5-14。在本发明的替代实施方案中，如果ceDNA载体具有包含选自以下任一种的核苷酸序列的WT-ITR：SEQ ID NO:1、2、5-14，则侧接ITR也是WT并且ceDNA载体包含调控开关，例如如本文和国际申请PCT/US18/49996所公开(例如参见PCT/US18/49996的表11，所述国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含如本文所公开的调控开关和所选择的WT-ITR，所述WT-ITR具有选自由SEQ ID NO:1、2、5-14组成的群组中的任一种的核苷酸序列。
本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包括保留了可操作的RBE、trs和RBE'部分的WT-ITR结构。出于示例性目的使用野生型ITR，图2A和图2B示出了关于ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点操作的一种可能机制。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体含有一种或多种功能WT-ITR多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60))和末端解析位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:62))。在一些实施方案中，至少一个WT-ITR是功能性的。在替代实施方案中，在用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含彼此大体上对称的两个WT-ITR的情况下，至少一个WT-ITR是功能性的，并且至少一个WT-ITR是非功能性的。
B.通常对于包含不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的修饰ITR(mod-ITR)
如本文所述，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够包含对称的ITR对或不对称的ITR对。在两个例子中，ITR中的一个或两个可以是经修饰的ITR，差异在于，在第一个例子(即，对称mod-ITR)中，mod-ITR具有相同的三维空间组构(即，具有相同的A-A'、C-C'和B-B'臂构形)，而在第二个例子(即，不对称mod-ITR)中，mod-ITR具有不同的三维空间组构(即，具有A-A'、C-C'和B-B'臂的不同构形)。
在一些实施方案中，相较于野生型ITR序列(例如AAV ITR)，经修饰的ITR是通过缺失、插入和/或取代进行修饰的ITR。在一些实施方案中，ceDNA载体中的至少一个ITR包含功能Rep结合位点(RBS；对于AAV2为例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:60)和功能末端解析位点(TRS；例如5'-AGTT-3'，SEQ ID NO:62)。在一个实施方案中，ITR中的至少一个是非功能性ITR。在一个实施方案中，不同或修饰ITR不是来自不同血清型的每种野生型ITR。
在本文中详细描述了ITR中的特定改变和突变，但是在ITR的情况下，“改变”或“突变”或“修饰”表明相对于野生型、参考或原始ITR序列，插入、缺失和/或取代核苷酸。改变或突变的ITR可以是工程化ITR。如本文所用，“工程化”是指通过人的手进行操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面，例如其序列，通过人的手进行操纵而不同于自然存在的方面时，则认为该多肽是“工程化”的。
在一些实施方案中，mod-ITR可以是合成的。在一个实施方案中，合成的ITR是基于来自一种以上AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方案中，合成ITR不包含基于AAV的序列。在又一个实施方案中，合成的ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列，但是保留了上述的ITR结构。在一些方面，合成的ITR可以优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或者在某些情况下，野生型Rep将不识别其，而仅突变的Rep可识别其。
技术人员可以通过已知手段确定其它血清型的相应序列。例如，确定改变是否在A、A'、B、B'、C、C'或D区域中，并确定另一种血清型中的相应区域。能够在默认状态下使用
Figure BDA0003352315200000821
(基本局部比对搜索工具)或其它同源性比对程序测定相应序列。本发明进一步提供了包含来自不同AAV血清型的组合的mod-ITR的ceDNA载体群体和多种ceDNA载体，也就是说，一个mod-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个mod-ITR可以来自不同血清型。不希望受理论的束缚，在一个实施方案中，一个ITR可以来自或基于AAV2 ITR序列，而ceDNA载体的另一个ITR可以来自或基于以下中的任一种或多种ITR序列：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。
任何细小病毒ITR都可以用作ITR或用于修饰的基础ITR。优选地，细小病毒是依赖病毒。更优选是AAV。选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和光感受器。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。在一个实施方案中，修饰ITR是基于AAV2 ITR。
更具体地，可以通过修饰结构元件来改变结构元件与特定的大Rep蛋白功能性相互作用的能力。例如，可以与ITR的野生型序列相比较来修饰结构元件的核苷酸序列。在一个实施方案中，可以除去ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和trs)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。例如，替代结构可以来自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。例如，ITR可以是AAV2 ITR，并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。在另一个实例中，ITR可以是AAV5ITR，并且C或C'臂、RBE和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个实例中，AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITR B和B'臂替代的AAV5 ITR。
仅举例而言，表4显示经修饰的ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如缺失、插入和/或取代)，其中X表示那个区段中的至少一个核酸相对于相应野生型ITR的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。例如，如果修饰引起以下任一种：单臂ITR(例如，单个C-C'臂或单个B-B'臂)或修饰的C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截断臂(例如截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂)的两臂ITR，那么至少所述单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截断的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在一些实施方案中，截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。
表4：ITR的不同B-B'和C-C'区域或臂的至少一个核苷酸的修饰的示例性组合(例如，缺失、插入和/或取代)(X指示核苷酸修饰，例如所述区域中的至少一个核苷酸的添加、缺失或取代)。
B区 B'区 C区 C'区
X
X
X X
X
X
X X
X X
X X
X X
X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X X
在一些实施方案中，如本文公开的包含不对称ITR对或对称mod-ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中使用的mod-ITR能够包含表4中所示的任一种修饰组合，以及选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰：A'与C之间、C与C'之间、C'与B之间、B与B'之间以及B'与A之间。在一些实施方案中，在C或C'或者B或B'区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)仍然保留了茎环的末端环。在一些实施方案中，在C和C'和/或B和B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在替代实施方案中，C与C'之间和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)使至少一个末端环中保留三个连续A核苷酸(即，AAA)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)：A'、A和/或D。举例来说，在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可以包含表4中所示的修饰的组合中的任一个，并且还包含A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可以包括表4中所示出的修饰组合中的任一个，并且还包括A和/或A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可以包括表4中所示出的修饰组合中的任一个，并且还包括D区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。
在一个实施方案中，能够修饰结构元件的核苷酸序列(例如修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，以产生经修饰的结构元件。在一个实施方案中，本文中举例说明了ITR的特定修饰(例如SEQ IDNO:3、4、15-47、101-116或165-187，或2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A-7B中所示(例如PCT/US2018/064242中的SEQ ID No 97-98、101-103、105-108、111-112、117-134、545-54)。在一些实施方案中，能够修饰ITR(例如通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)。在其它实施方案中，ITR与SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的经修饰的ITR之一或SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的A-A'臂和C-C'和B-B'臂的含RBE区段或国际申请PCT/US18/49996的表2-9中所示(即，SEQ ID NO:110-112、115-190、200-468)能够具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列一致性，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，经修饰的ITR能够包含例如所有特定臂(例如A-A'臂的全部或一部分，或B-B'臂的全部或一部分，或C-C'臂的全部或一部分)的去除或缺失，或替代地，形成环茎的1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个碱基对的去除，只要对茎(例如单臂)进行封端的最终环仍然存在(参见例如2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A中的ITR-21，其全部内容用以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，经修饰的ITR可以包括从B-B'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对。在一些实施方案中，经修饰的ITR能够包含从C-C'臂中去除1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个碱基对(参见例如2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图3B中的ITR-1或图7A中的ITR-45，其全部内容以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，经修饰的ITR可以包括从C-C'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对以及从B-B'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对。设想去除碱基对的任何组合，例如可以在C-C'臂中去除6个碱基对以及在B-B'臂中去除2个碱基对。作为说明性实例，图3B展示了示例性的修饰ITR，其从C部分和C'部分各缺失至少7个碱基对，C和C'区域之间的环中的核苷酸被取代，以及从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得修饰ITR包含至少一个臂(例如C-C')截断的两个臂。在一些实施方案中，修饰ITR还包含从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得臂B-B'相对于WT ITR也截断。
在一些实施方案中，经修饰的ITR相对于全长野生型ITR序列可以具有1与50个之间(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)的核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长WT ITR序列，经修饰的ITR可以具有1与30个之间的核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长野生型ITR序列，经修饰的ITR可以具有2与20个之间的核苷酸缺失。
在一些实施方案中，经修饰的ITR在A或A'区域的含RBE部分中不含任何核苷酸缺失，以便不干扰DNA复制(例如，通过Rep蛋白结合到RBE，或在末端解链位点切割)。在一些实施方案中，预期用于本文中的经修饰的ITR在如本文所述的B、B'、C和/或C区域中具有一个或多个缺失。
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的包含对称ITR对或不对称ITR对的ceDNA载体包含如本文所公开的调控开关和至少一个经修饰的ITR，所述ITR具有选自由以下组成的任一群组的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187。
在另一个实施方案中，结构元件的结构可以为经修饰的。例如，结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数量。例如，茎高可以是约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个或更多个核苷酸或其中的任何范围。在一个实施方案中，茎高可以是约5个核苷酸至约9个核苷酸并与Rep功能性相互作用。在另一个实施方案中，茎高可以是约7个核苷酸并与Rep功能性相互作用。在另一个实例中，环可以具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
在另一个实施方案中，RBE或扩展RBE内GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数量可以增加或减少。在一个实例中，RBE或扩展RBE可以包括1、2、3、4、5或6个或更多个GAGY结合位点或其中的任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列，只要该序列足以结合Rep蛋白即可。
在另一个实施方案中，能够改变(例如增加或减少)两个元件(例如(但不限于)RBE和发夹)之间的间距，以改变与大Rep蛋白的功能相互作用。例如，间距可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够包括相对于本文公开的野生型AAV2ITR结构经修饰，但仍保留可操作的RBE、trs和RBE'部分的ITR结构。图2A和图2B示出了用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点的一种可能的操作机理。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体含有一种或多种功能ITR多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ IDNO:60))和末端解析位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:62))。在一些实施方案中，至少一个ITR(wt或修饰ITR)是功能性的。在其中用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包括彼此不同或不对称的两个经修饰的ITR的替代性实施方案中，至少一个经修饰的ITR是功能性的并且至少一个经修饰的ITR是非功能性的。
在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的经修饰的ITR(例如左或右ITR)在环臂、截断的臂或间隔子内具有修饰。环臂、截断的臂或间隔子内具有修饰的ITR的示例性序列列举于国际申请PCT/US18/49996的表2(即，SEQ ID NO:135-190、200-233)；表3(例如SEQ ID NO:234-263)；表4(例如SEQ ID NO:264-293)；表5(例如本文中的SEQ ID NO:294-318)；表6(例如SEQ ID NO:319-468；以及表7-9(例如SEQ ID NO:101-110、111-112、115-134)或表10A或10B(例如SEQ ID NO:9、100、469-483、484-499)中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，包含不对称ITR对或对称mod-ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中使用的经修饰的ITR选自国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9和10A-10B中所示的那些修饰中的任一个或组合，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
表5A和5B中提供了每一个以上类别中的包含不对称ITR对或对称mod-ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中使用的另外的示例性的修饰ITR。表5A中的经修饰的右ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A中，并且表5B中的经修饰的左ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7B中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
表5A和表5B展示了示例性的经修饰的右和左ITR。
表5A：示例性的经修饰的右ITR。经修饰的这些示例性右ITR能够包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3′(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE'(即，RBE的补体)。
Figure BDA0003352315200000871
Figure BDA0003352315200000881
Figure BDA0003352315200000891
表5B：示例性的经修饰的左ITR。经修饰的这些示例性左ITR能够包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE补体(RBE')。
Figure BDA0003352315200000892
Figure BDA0003352315200000901
Figure BDA0003352315200000911
在一个实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体按照5'到3'方向包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注非核苷酸序列(例如如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此是不对称的，也就是说，它们具有彼此不同的3D空间构型。作为示例性实施方案，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是突变或修饰ITR，或反过来，其中第一ITR可以是突变或修饰ITR，第二ITR可以是野生型ITR。在一些实施方案中，第一ITR和第二ITR均是mod-ITR，但具有不同序列或具有不同修饰，因此不是相同的经修饰的ITR，并且具有不同的3D空间构型。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体包含如下ITR：其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化均未反映于另一个ITR中；或可替代地，其中具有经修饰的不对称ITR对的不对称ITR可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中以及用于产生ceDNA质粒的示例性不对称ITR示于表5A和5B中。
在一个替代实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含两个对称mod-ITR，也就是说，两个ITR均具有相同序列，但彼此反向的补体(逆向)。在一些实施方案中，相对于来自相同AAV血清型的野生型ITR序列，对称的mod-ITR对包含缺失、插入或取代中的至少一种或任何组合。对称ITR中的添加、缺失或取代是相同的，但彼此反向互补。举例来说，在5’ITR的C区中插入3个核苷酸将反映为在3’ITR的C'区中相应部分中插入3个反向互补核苷酸。仅出于说明目的，如果在5'ITR中添加AACG，那么在3'ITR中相应位点处添加CGTT。举例来说，如果5'ITR有义链是ATCGATCG，则G与A之间添加AACG会产生序列ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)。相应的3'ITR有义链是CGATCGAT(ATCGATCG的反向补体)，其中T与C之间添加CGTT(即，AACG的反向补体)会产生序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(ATCGAACGATCG的反向补体)(SEQ ID NO:51)。
在替代实施方案中，修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有一致或相同的对称的三维形状。举例来说，一个经修饰的ITR能够来自一种血清型，而另一个经修饰的ITR能够来自不同血清型，但它们在相同区域中具有相同突变(例如核苷酸插入、缺失或取代)。换句话说，仅出于说明目的，5'mod-ITR可以来自AAV2并在C区域有一个缺失，而3'mod-ITR可以来自AAV5并在C'区域中有相应的缺失，并且如果5'mod-ITR和3'mod-ITR具有相同或对称的三维空间组构，那么其作为修饰ITR对涵盖用于在本文中。
在一些实施方案中，基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR相应缺失C-C'环，并且在其同源mod-ITR的几何空间呈相同形状下，剩余A和B-B'环具有相似3D结构。仅作为示例，基本上对称的ITR可以具有对称的空间组构，使得它们的结构在几何空间中是相同的形状。例如，当将GC对修饰为例如CG对，反之亦然，或者将AT对修饰为TA对，反之亦然时，可能会发生这种情况。因此，如果例如5'ITR具有序列ATCGAACCATCG(SEQ ID NO:50)(其中G另外修饰成C)，并且基本对称的3'ITR具有序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(除a之外，T不进行相应修饰)，那么使用上述示例性实例经修饰的5'ITR作为ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)和经修饰的3'ITR作为CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(即，ATCGAACGATCG的反向补体(SEQ ID NO:51))，这些经修饰的ITR仍然会是对称的。在一些实施方案中，此类经修饰的ITR对是基本对称的，原因是经修饰的ITR对具有对称立体化学构型。
表6显示对称修饰的示例性ITR对(即，经修饰的左ITR和经修饰的对称右ITR)，其用于供表达PAH蛋白用的ceDNA载体中。序列的黑体(红色)部分鉴定了部分ITR序列(即A-A'、C-C'和B-B'环的序列)。经修饰的这些示例性ITR能够包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE'(即，RBE的补体)。
Figure BDA0003352315200000931
Figure BDA0003352315200000941
Figure BDA0003352315200000951
Figure BDA0003352315200000961
Figure BDA0003352315200000971
在一些实施方案中，包含不对称ITR对的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够包含具有修饰的ITR，所述修饰对应于以下序列中的任一修饰：本文表5A-5B中的任一个或多个中所示的ITR序列或ITR部分序列；或2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A-7B中所示的序列，所述国际申请全文并入本文中；或2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B中所公开的序列，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
V.示例性ceDNA载体
如上所述，本公开涉及重组ceDNA表达载体和编码PAH蛋白的ceDNA载体，其包含以下中的任一种：如上所述的不对称的ITR对、对称的ITR对或基本上对称的ITR对。在某些实施方案中，本公开涉及用于表达PAH蛋白的重组ceDNA载体，其具有侧接的ITR序列和转基因，其中如本文所定义，ITR序列相对于彼此是不对称的、对称的或基本对称的，并且ceDNA进一步包含位于侧接的ITR之间的所关注核苷酸序列(例如包含转基因的核酸的表达盒)，其中所述核酸分子缺乏病毒衣壳蛋白编码序列。
用于表达PAH蛋白的ceDNA表达载体可以是任何ceDNA载体，其可以方便地进行包括如本文所述的核苷酸序列的重组DNA程序，条件是改变至少一个ITR。本公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与其中将要引入ceDNA载体的宿主细胞相容。在某些实施方案中，ceDNA载体可以是线性的。在某些实施方案中，ceDNA载体可以作为染色体外实体存在。在某些实施方案中，本公开的ceDNA载体可以含有容许供体序列整合到宿主细胞基因组中的元件。如本文所用，“转基因”与“异源核苷酸序列”同义，并且编码PAH蛋白，如本文所述。
现参考图1A-1G，显示了用于制备供表达PAH蛋白用的ceDNA载体的两个非限制性质粒的功能组分示意图。图1A、1B、1D、1F显示了ceDNA载体的构建体或用于表达PAH蛋白的ceDNA质粒的相应序列。ceDNA载体是无衣壳的并且能够获自质粒，所述质粒按照此次序编码：第一ITR、可表达的转基因盒，和第二ITR，其中如本文所定义，第一与第二ITR序列相对于彼此是不对称的、对称的或基本对称的。ceDNA载体是无衣壳的并且能够获自质粒，所述质粒按照此次序编码：第一ITR、可表达的转基因(蛋白质或核酸)，和第二ITR，其中如本文所定义，第一与第二ITR序列相对于彼此是不对称的、对称的或基本对称的。在一些实施方案中，可表达的转基因盒在需要时包括：增强子/启动子、一个或多个同源臂、供体序列、转录后调控元件(例如WPRE，例如SEQ ID NO:67)，以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGHpolyA，例如SEQ ID NO:68)。
图5是使用实施中所述的方法证实从多个质粒构建体产生ceDNA的凝胶。如以上关于图4A和实施中所论述，ceDNA由凝胶中的特征色带图案证实。
A.调控元件
包含如本文所定义的不对称ITR对或对称ITR对的如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够进一步包含顺式调控元件的特定组合。顺式调控元件包含但不限于：启动子、核糖开关、隔离子、mir可调控元件、转录后调控元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。示例性启动子列于国际申请号PCT/US2020/021328中，例如在表7中，所述国际申请的以全文引用的方式并入本文中。示例性增强剂列于国际申请号PCT/US2020/021328中，例如在表8中，所述国际申请的以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，ITR可以充当转基因(例如PAH蛋白)的启动子。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包括调控转基因表达的其它组分，例如如本文所描述的调控转基因表达的调控开关，或可以杀灭包含编码其PAH蛋白的ceDNA载体的细胞的杀灭开关。国际申请PCT/US18/49996中更充分地论述了本发明中能够使用的调控元件，包括调控开关，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
在实施方案中，第二核苷酸序列包括调控序列和编码核酸酶的核苷酸序列。在某些实施方案中，基因调控序列与编码核酸酶的核苷酸序列可操作地连接。在某些实施方案中，调控序列适合于控制核酸酶在宿主细胞中的表达。在某些实施方案中，调控序列包括适合的启动子序列，其能够引导可操作地连接到启动子序列的基因转录，例如编码本公开的核酸酶的核苷酸序列。在某些实施方案中，第二核苷酸序列包括连接到编码核酸酶的核苷酸序列的5'末端的内含子序列。在某些实施方案中，在启动子的上游提供增强子序列以增加启动子的功效。在某些实施方案中，调控序列包括增强子和启动子，其中第二核苷酸序列包括在编码核酸酶的核苷酸序列上游的内含子序列，其中内含子包括一个或多个核酸酶裂解位点，并且其中启动子与编码核酸酶的核苷酸序列可操作地连接。
以合成方式或使用如本文实例中所述的基于细胞的产生方法产生用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够进一步包含顺式调控元件的特定组合，例如WHP转录后调控元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:67)和BGH polyA(SEQ ID NO:68)。适用于表达构建体中的表达盒不受病毒衣壳强加的包装约束的限制。
(i)启动子：
所述领域普通技术人员将了解，适当时应该根据它们启动的特定序列来定制如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中所用的启动子。
用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的表达盒能够包括启动子，所述启动子能够影响整体表达水平以及细胞特异性。为了转基因表达，例如，PAH蛋白表达，它们可以包含高度活性的病毒源即刻早期启动子。表达盒可以含有组织特异性的真核启动子，以将转基因表达限制在特定细胞类型，并减少由不受调控的异常表达引起的毒性效应和免疫应答。在一些实施方案中，表达盒能够含有启动子或合成调控元件，例如CAG启动子(SEQ ID NO:72)。CAG启动子包括(i)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(ii)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及(iii)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。替代地，表达盒能够含有α-1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子(SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74)、肝脏特异性(LP1)启动子(SEQID NO:75或SEQ ID NO:76)，或人延伸因子-1α(EF1a)启动子(例如SEQ ID NO:77或SEQ IDNO:78)。在一些实施方案中，表达盒包括一个或多个组成型启动子，例如逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)，或细胞巨大病毒(CMV)即刻早期启动子(任选地具有CMV增强子，例如SEQ ID NO:79)。可替代地，可以使用诱导型启动子、转基因的天然启动子、组织特异性启动子或所属领域已知的各种启动子。根据一些实施方案，启动子是2020年3月6日提交的国际申请号PCT/US2020/021328中阐述的任何启动子或启动子序列，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案，启动子是VandenDriessche(VD)启动子。根据一些实施方案，VD启动子包含如下所示的SEQ ID NO:191：
CCGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTG(SEQ ID NO:191).根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQID NO:191至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:191的核酸序列组成。
适合的启动子可以来源于病毒并因此可以称为病毒启动子，或其可以来源于任何生物体，包含原核或真核生物体。适合的启动子可以用于通过任何RNA聚合酶(例如，pol I、pol II、pol III)来驱动表达。示例性启动子包括(但不限于)SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、细胞巨大病毒(CMV)启动子(例如CMV即刻早期启动子区域(CMVIE))、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、人U6小核启动子(U6，例如SEQ ID NO:80)(Miyagishi等人，《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》20，497-500(2002))、增强型U6启动子(例如Xia等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2003年9月1日；31(17))、人H1启动子(H1)(例如SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:155)、CAG启动子、人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)启动子(例如SEQ ID NO:82)等等。在某些实施方案中，这些启动子在其下游含内含子的末端处被改变以包括一个或多个核酸酶裂解位点。在某些实施方案中，含有核酸酶裂解位点的DNA与启动子DNA是无关的。
在一个实施方案中，使用的启动子是编码治疗蛋白的基因的天然启动子。编码治疗蛋白的相应基因的启动子和其它调控序列是已知的并且已被表征。所用启动子区域可以进一步包括一种或多种额外的调控序列(例如原生)，例如增强子(例如SEQ ID NO:79和SEQID NO:83)，包括SV40增强子(SEQ ID NO:126)。
在一些实施方案中，启动子还可以是来自人基因的启动子，例如人泛素C(hUbC)、人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，如肝脏特异性启动子，如天然或合成的人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)。在一个实施方案中，使用内源性ApoE、经由存在于肝细胞表面上的低密度脂蛋白(LDL)受体将包括ceDNA载体的组合物特异性靶向肝细胞能够实现向肝脏的递送。
根据本发明使用的适合启动子的非限制性实例包括以下例如CAG启动子(SEQ IDNO:72)、HAAT启动子(SEQ ID NO:82)、人EF1-α启动子(SEQ ID NO:77)，或EF1a启动子(SEQID NO:78)、IE2启动子(例如SEQ ID NO:84)和大鼠EF1-α启动子(SEQ ID NO:85)、mEF1启动子(SEQ ID NO:59)的片段，或1E1启动子片段(SEQ ID NO:125)中的任一种。
(ii)增强剂
在一些实施方案中，表达PAH的ceDNA包含一种或多种增强子。在一些实施方案中，增强子序列位于启动子序列的5'。在一些实施方案中，增强子序列位于启动子序列的3'。根据一些实施方案，增强子是2020年3月6日提交的国际申请号PCT/US2020/021328中阐述的任何增强子或增强子序列，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
(iii)5'UTR序列和内含子序列
在一些实施方案中，ceDNA载体包含5'UTR序列和/或位于5'ITR序列的3'的内含子序列。在一些实施方案中，5'UTR位于转基因的5'，例如编码PAH蛋白的序列。国际申请号PCT/US2020/021328中列出的示例性5'UTR序列，例如在表9A中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
(iv)3'UTR序列
在一些实施方案中，ceDNA载体包含位于3'ITR序列的5'的3'UTR序列。在一些实施方案中，3'UTR位于转基因的3'，例如编码PAH蛋白的序列。国际申请号PCT/US2020/021328中列出的示例性3'UTR序列，例如在表9B中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
(v)多聚腺苷酸化序列：
用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中可包括编码多聚腺苷酸化序列的序列，以稳定由ceDNA载体表达的mRNA，并有助于核输出和翻译。在一个实施方案中，ceDNA载体不包括聚腺苷酸化序列。在其他实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，聚腺苷酸化序列包括约43个核苷酸、约40-50个核苷酸、约40-55个核苷酸、约45-50个核苷酸、约35-50个核苷酸或它们之间的任何范围。
表达盒可以包含本领域已知的任何聚腺苷酸化序列或其变体。在一些实施方案中，聚腺苷酸化(polyA)序列选自国际申请号PCT/US2020/021328中列出的任何那些，例如在表10中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。也可以使用本领域公知的其他polyA序列，例如，包括但不限于从牛BGHpA(例如，SEQ ID NO:68)或病毒SV40pA(例如，SEQID NO:86)中分离的天然存在的序列、或合成序列(例如，SEQ ID NO:87)。一些表达盒还可以包含SV40晚期polyA信号上游增强子(USE)序列。在一些实施方案中，USE可以与SV40pA或异源聚A信号组合使用。PolyA序列位于编码PAH蛋白的转基因的3'。
表达盒还可以包含转录后元件以增加转基因的表达。在一些实施方案中，使用土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:67)增强转基因表达。可以使用其它转录后加工元件，例如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。分泌序列能够连接到转基因，例如VH-02和VK-A26序列，例如SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89。
(vi)核定位序列
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含一个或多个核定位序列(NLS)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，一个或多个NLS位于氨基端或附近、羧基端或附近，或这些位置的组合(例如氨基端的一个或多个NLS和/或羧基端的一个或多个NLS)。当存在超过一个NLS时，可以彼此独立地选择，使得单个NLS可以呈超过一个拷贝存在和/或与呈一个或多个拷贝存在的一个或多个其他NLS组合存在。NLS的非限制性实例如表7所示。
表7：核定位信号
Figure BDA0003352315200001021
Figure BDA0003352315200001031
B.ceDNA载体的其它组分
本公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以含有编码用于基因表达的其它组分的核苷酸。例如，为了选择特定的基因靶向事件，可以将保护性shRNA嵌入微型RNA中，然后插入被设计成位点特异性地整合至高活性基因座(如白蛋白基因座)中的重组ceDNA载体中。这样的实施方案可以提供用于在任何遗传背景下体内选择和扩增基因修饰的肝细胞的系统，例如在Nygaard等人的《体内选择基因修饰的肝细胞的通用系统(A universalsystem to select gene-modified hepatocytes in vivo)》《基因疗法(Gene Therapy)》,2016年6月8日)中所述。本公开的ceDNA载体可以含有一种或多种选择性标志物，其允许选择转化、转染、转导等的细胞。选择性标志物是产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原营养、NeoR等的基因。在某些实施方案中，将正向选择标志物并入供体序列中，例如NeoR。可以将负向选择标志物并入供体序列的下游，例如可以将编码负向选择标志物的核酸序列HSV-tk并入供体序列下游的核酸构建体中。
C.调控开关
分子调控开关是一种响应信号而产生可测量的状态变化的开关。此类调控开关能够与本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体组合使用以控制PAH蛋白从ceDNA载体中表达的输出。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包含用以微调PAH蛋白的表达的调控开关。例如，其可以发挥ceDNA载体的生物封存功能。在一些实施方案中，所述开关是“ON/OFF”开关，其设计成以可控和可调方式启动或终止(即，中断)PAH蛋白在ceDNA载体中的表达。在一些实施方案中，开关可以包含“杀灭开关”，一旦所述开关被激活，其就可以指令包括ceDNA载体的细胞经历细胞程序性死亡。涵盖用于表达PAH蛋白用ceDNA载体中的示例性调控开关可用于调节转基因的表达，并在国际申请PCT/US18/49996中更全面地论述，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
(i)二元调控开关
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体包括可以用来可控制地调节PAH蛋白的表达的调控开关。举例来说，位于ceDNA载体的ITR之间的表达盒可以另外包含与编码PAH蛋白的核酸操作性连接的调节区域，例如启动子、顺式元件、阻遏子、增强子等，其中调节区由一种或多种辅因子或外源作用剂调节。仅举例来说，调控区可以通过小分子开关或诱导型或阻遏型启动子进行调节。诱导型启动子的非限制性实例是激素诱导型或金属诱导型启动子。其他示例性诱导型启动子/增强子元件包括(但不限于)：RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
(ii)小分子调控开关
所属领域中已知的多种基于小分子的调控开关在所属领域中是已知的，并且可以与本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体组合以形成调控开关控制的ceDNA载体。在一些实施方案中，调控开关可以选自以下中的任何一种或组合：正交配体/核受体对，例如类视黄醇受体变体/LG335和GRQCIMFI，以及控制操作性连接的转基因的表达的人工启动子，如Taylor等人,《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》10(2010):15中公开的人工启动子；工程化的类固醇受体，例如C末端截断的经修饰的孕酮受体，其不能结合孕酮但结合RU486(米非司酮)(美国专利第5,364,791号)；来自果蝇(Drosophila)的蜕皮激素受体和其蜕皮类固醇配体(Saez等人，《美国国家科学院院刊(PNAS)》，97(26)(2000),14512-14517；或由抗生素甲氧苄啶(trimethoprim，TMP)控制的开关，如Sando R第3版；《自然方法(NatMethods)》。2013,10(11):1085-8中所公开。在一些实施方案中，控制转基因或由ceDNA载体表达的调控开关是前药活化开关，如美国专利8,771,679和6,339,070中公开的活化开关，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
(iii)“密码”调控开关
在一些实施方案中，调控开关可以是“密码开关”或“密码回路”。在发生特定条件时，也就是说，需要存在条件的组合才能发生转基因表达和/或阻遏时，密码开关允许微调对转基因从ceDNA载体的表达的控制。例如，为了发生转基因的表达，至少必须发生条件A和B。密码调控开关可以是任何数量的条件，例如，要存在至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个或更多个条件方能发生转基因表达。在一些实施方案中，需要发生至少2个条件(例如A、B条件)，并且在某些实施方案中，需要发生至少3个条件(例如A、B和C，或A、B和D)。仅举例来说，为了从具有密码“ABC”调控开关的ceDNA发生基因表达，必须存在条件A、B和C。条件A、B和C可以如下：条件A是存在病状或疾病，条件B是激素响应，并且条件C是对转基因表达的响应。举例来说，如果转基因编辑缺陷性EPO基因，那么条件A是存在慢性肾病(CKD)，如果受试者的肾脏中有低氧状况，那么发生条件B，条件C是肾脏中产生促红细胞产生素的细胞(EPC)的募集受损；或可替代地，HIF-2活化受损。一旦氧水平升高或达到期望的EPO水平，转基因就会关闭，直到再次发生3个条件，它重新打开。
在一些实施方案中，涵盖用于ceDNA载体中的密码调控开关或“密码回路”包含杂合转录因子(TF)以扩大用于界定生物封存条件的环境信号的范围和复杂度。与在预定条件存在下触发细胞死亡的致命开关相反，“密码回路”允许在特定“密码”存在下细胞存活或转基因表达，并且只有当存在预定环境条件或密码时，才可以容易地重新编程以允许转基因表达和/或细胞存活。
本文公开的调控开关，例如小分子开关、基于核酸的开关、小分子-核酸杂合开关、转录后转基因调控开关、翻译后调节、辐射控制开关、低氧介导的开关和如本文公开的本领域中普通技术人员已知的其他调控开关中的任何和所有组合均可以用于如本文公开的密码调控开关中。涵盖使用的调控开关也在综述文章Kis等人,《皇家学会界面杂志(J R SocInterface)》.12:20141000(2015)中论述，并总结在Kis的表1中。在一些实施方案中，用于密码系统中的调控开关能够选自国际专利申请PCT/US18/49996的表11中所公开的任何开关或开关组合，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。
(iv)控制转基因表达的基于核酸的调控开关
在一些实施方式中，控制由ceDNA进行的PAH蛋白表达的调控开关是建立在基于核酸的控制机理的基础上。示例性核酸控制机构是所属领域中已知的并且是设想使用的。举例来说，此类机理包括核糖开关，例如以下文献中所公开的核糖开关：例如US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018026762A1、美国专利9,222,093和EP申请EP288071；以及Villa JK等人的评论中所公开的核糖开关，《微生物学光谱(MicrobiolSpectr.)》。2018年5月；6(3)。还包括代谢物响应性转录生物传感器，例如WO2018/075486和WO2017/147585中公开的那些。设想使用的其它本领域已知的机制包括用siRNA或RNAi分子(例如miR、shRNA)使转基因沉默。举例来说，ceDNA载体能够包含编码RNAi分子的调控开关，所述RNAi分子与ceDNA载体所表达的转基因的一部分互补。当此类RNAi表达时，即使ceDNA载体表达转基因(例如PAH蛋白)，所述转基因也将因互补的RNAi分子而沉默，并且当ceDNA载体表达转基因时而所述RNAi未表达时，所述转基因不会因RNAi沉默。
在一些实施方式中，调控开关是组织特异性自失活调控开关，例如如US2002/0022018中所公开，其中调控开关在其中转基因表达原本可能不利的位点有意地将转基因(例如PAH蛋白)表达关闭。在一些实施方案中，调控开关是重组酶可逆基因表达系统，例如如US2014/0127162和美国专利8,324,436中所公开。
(v)转录后和翻译后调控开关
在一些实施方案中，控制ceDNA载体表达PAH蛋白的调控开关是转录后修饰系统。例如，此类调控开关可以是对四环素或茶碱敏感的适体酶(aptazyme)核糖开关，如以下中所公开：US2018/0119156、GB201107768、WO2001/064956A3、欧洲专利2707487和Beilstein等人,《ACS合成生物学(ACS Synth.Biol.)》,2015,4(5),第526-534页；Zhong等人,Elife.2016年11月2日；5.pii:e18858。在一些实施方案中，设想所属领域的普通技术人员可以编码转基因和含有配体敏感性(OFF-开关)适体的抑制性siRNA二者，净结果是配体敏感性ON-开关。
(vi)其他示例性调控开关
任何已知的调控开关可以用于ceDNA载体中以控制ceDNA载体进行的PAH蛋白表达，包含环境变化所触发的那些。另外的实例包含(但不限于)；以下中BOC方法：Suzuki等人,《科学报告8(Scientific Reports 8)》；10051(2018)；遗传密码扩展和非生理氨基酸；辐射控制或超声控制的on/off开关(参见例如Scott S等人,《基因疗法(Gene Ther.)》，2000年7月；7(13):1121-5；美国专利5,612,318；5,571,797；5,770,581；5,817,636；以及WO1999/025385A1。在一些实施方案中，调控开关是由可植入系统控制，例如如美国专利7,840,263；US2007 0190028A1中所公开，其中基因表达由一种或多种形式的能量控制，包括电磁能，所述能量将操作性地连接到ceDNA载体中的转基因的启动子活化。
在一些实施方案中，设想用于ceDNA载体中的调控开关是低氧介导或应激活化的开关，例如以下文献中所公开的那些：WO1999060142A2；美国专利5,834,306；6,218,179；6,709,858；US2015/0322410；Greco等人(2004)《靶向癌症疗法(Targeted CancerTherapies)》9；S368以及FROG、TOAD和NRSE元件，以及条件诱导型沉默元件，包含低氧应答元件(HRE)、发炎应答元件(IRE)和剪切应激活化元件(SSAE)，例如如美国专利9,394,526中所公开，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。此类实施方式可用于在缺血后或在缺血组织和/或肿瘤中打开转基因从ceDNA载体的表达。
(vii)杀灭开关
本文所述的其它实施方案涉及如本文所述用于表达PAH蛋白的包含杀灭开关的ceDNA载体。如本文公开的杀灭开关能够使包括ceDNA载体的细胞被杀灭或经历程序性细胞死亡，作为从受试者的系统中永久去除引入的ceDNA载体的手段。所属领域的普通技术人员将了解，杀灭开关在用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中的使用通常联接ceDNA载体靶向受试者可以接受地所能失去的有限数目个细胞或靶向希望细胞凋亡的细胞类型(例如癌细胞)。在所有方面，如本文公开的“杀灭开关”被设计成在缺乏输入的存活信号或其它指定条件下提供对包括ceDNA载体的细胞的快速而稳固的细胞杀灭。换句话说，由如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体编码的杀灭开关可以将包含ceDNA载体的细胞的细胞存活限制在特定输入信号所限定的环境。如果希望从受试者中去除用于表达PAH蛋白的ceDNA载体或确保其不表达所编码的转基因，那么此类杀灭开关发挥生物学的生物封存功能。
所属领域的普通技术人员已知的其它杀灭开关涵盖用于如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体中，所述杀灭开关例如如以下文献中所公开：US2010/0175141；US2013/0009799；US2011/0172826；US2013/0109568；以及以下文献中所公开的杀灭开关：Jusiak等人，《细胞生物学和分子医药评论(Reviews in Cell Biology and molecularMedicine)》；2014；1-56；Kobayashi等人，《美国国家科学院院刊(PNAS)》,2004；101；8419-9；Marchisio等人，《国际生物化学和细胞生物学杂志(Int.Journal of Biochem and CellBiol.)》,2011；43；310-319；以及Reinshagen等人，《科学转化医学(ScienceTranslational Medicine)》2018,11，所有这些文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
因此，在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包括杀灭开关核酸构建体，其包括编码效应子毒素或报告蛋白的核酸，其中效应子毒素(例如死亡蛋白)或报告蛋白的表达受预定条件控制。举例来说，预定条件可以是存在环境试剂，例如外源试剂，在没有所述环境试剂的情况下，细胞将默认表达效应毒素(例如死亡蛋白质)并且被杀灭。在替代性实施方案中，预定条件是存在两种或更多种环境试剂，例如细胞将仅在提供两种或更多种必需的外源试剂时存活，而在其中的任一种不存在的情况下，包含ceDNA载体的细胞被杀灭。
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体经修饰以并入杀灭开关，从而破坏包括ceDNA载体的细胞，以有效地终止ceDNA载体正在表达的转基因的体内表达(例如PAH蛋白的表达)。具体地说，进一步对ceDNA载体进行基因工程改造以表达在哺乳动物细胞中、在正常生理学条件下不具功能性的开关蛋白。仅在药物施用后或在特异性靶向这种开关蛋白的环境条件下，表达开关蛋白的细胞被破坏，从而终止治疗蛋白或肽的表达。举例来说，据报告，表达HSV-胸苷激酶的细胞在药物(例如苷昔洛韦(ganciclovir)和胞嘧啶脱氨酶)施用后可以被杀灭。参见例如Dey和Evans，《单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(HSV-TK)的自杀基因疗法(Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase(HSV-TK))》，于You编辑的《基因疗法中的靶标(Targets in Gene Therapy)》(2011)中；以及Beltinger等人，《美国国家科学院院刊》96(15):8699-8704(1999)。在一些实施方案中，ceDNA载体可以包括siRNA杀灭开关，称为DISE(存活基因排除所诱发的死亡)(Murmann等人，《肿瘤标靶(Oncotarget)》2017；8:84643-84658.DISE在体内卵巢癌细胞中的诱导(Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo))。
VI.产生ceDNA载体的详细方法
A.通用产生
用于产生ceDNA载体的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US1849996的章节IV中，所述ceDNA载体包含如本文所定义的不对称ITR对或对称ITR对，用于表达PAH蛋白，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，可以使用如本文所述的昆虫细胞来生产如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体。在替代性实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够以合成方式生产并且在一些实施方案中以无细胞方法生产，如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122所公开，所述国际申请以全文引用的方式并入本文。
如本文所述，在一个实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够通过例如包含以下步骤的方法获得：a)在诱导宿主细胞内产生ceDNA载体的有效条件和充足时间下，在Rep蛋白存在下，培育含有缺乏病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒，和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如昆虫细胞)群，且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；和b)从宿主细胞中收获且分离出ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。然而，没有表达病毒粒子(例如AAV病毒粒子)。因此，没有大小限制，如在AAV或其它基于病毒的载体中天然强加的大小限制。
可以通过以下来确认从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从宿主细胞分离的DNA，并在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。
在又另一方面，本发明提供了将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合至其自身基因组中的宿主细胞系的用途，所述细胞系用于产生非病毒DNA载体，例如如Lee,L.等人(2013)《公共科学图书馆综合(Plos One)》8(8):e69879中所描述的。优选地，Rep以约3的MOI加入宿主细胞中。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系、例如HEK293细胞时，所述细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体、例如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中，使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。
在一个实施方案中，用于制备本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的宿主细胞是昆虫细胞，并使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板，例如如图4A-4C和实例1中所描述。在一些实施方案中，宿主细胞经工程改造以表达Rep蛋白。
然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞采集和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。举例来说，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。在一个实施方案中，细胞在足以产生ceDNA载体的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体但在大多数细胞开始因杆状病毒毒性而死亡之前的时间采集。可以使用质粒纯化试剂盒，例如Qiagen Endo-FreePlasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸纯化方法。
DNA载体可以通过所属领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。在一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的存在可以如下证实：使用在DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离出的载体DNA，并且使用凝胶电泳术分析已消化和未消化的DNA材料，从而相较于线性和非连续DNA来证实线性和连续DNA的特征带的存在。图4C和图4D示出了用于鉴定通过本文的方法产生的闭合端ceDNA载体的存在的一个实施方案。
B.ceDNA质粒
ceDNA-质粒是用于后来产生用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的质粒。在一些实施方案中，ceDNA质粒可以使用已知的技术构建，以在转录方向上提供至少下列作为操作性连接的组分：(1)修饰5’ITR序列；(2)含有例如启动子、诱导型启动子、调控开关、增强子等顺式调控元件的表达盒；以及(3)修饰3’ITR序列，其中3’ITR序列相对于5’ITR序列是对称的。在一些实施方案中，侧接ITR的表达盒包含用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。
一方面，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是从质粒获得，该质粒在本文中称为“ceDNA-质粒”，其按以下顺序编码：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、包括转基因的表达盒、以及突变或修饰AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列。在替代实施方案中，ceDNA-质粒依次编码：第一(或5’)修饰或突变AAV ITR、包含转基因的表达盒、以及第二(或3’)修饰AAV ITR，其中所述ceDNA质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5’和3’ITR彼此对称。在替代实施方案中，ceDNA质粒依次编码：第一(或5’)修饰或突变AAV ITR、包含转基因的表达盒、以及第二(或3’)突变或修饰AAV ITR，其中所述ceDNA质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5’和3’修饰ITR具有相同的修饰(即彼此反向互补或对称)。
在另一个实施方案中，ceDNA-质粒系统不含病毒衣壳蛋白编码序列(即，其不含AAV衣壳基因，也没有其他病毒的衣壳基因)。另外，在特定实施方案中，ceDNA-质粒还不含AAV Rep蛋白编码序列。因此，在一个优选实施方案中，ceDNA-质粒缺乏AAV2的功能性AAVcap和AAV rep基因GG-3'加上允许发夹形成的可变回文序列。
本发明的ceDNA-质粒可以使用本领域公知的任何AAV血清型的基因组的天然核苷酸序列来产生。在一个实施方案中，ceDNA-质粒主链源自于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如NCBI:NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261；Kotin和Smith,《Springer病毒索引(The Springer Index of Viruses)》,在Springer维护的URL上可得(www网址：oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp？virID＝42.04.)(注意-对URL或数据库的引用是指截至本申请生效提交日为止的URL或数据库的内容)。在一个特定实施方案中，ceDNA-质粒主链源自于AAV2基因组。在另一个特定实施方案中，ceDNA-质粒主链是合成的主链，其经过基因工程以在它的5'和3'ITR处包含源自于这些AAV基因组之一。
ceDNA-质粒可以任选地包括选择性或选择标志物，用于建立产生ceDNA载体的细胞系。在一个实施方案中，选择标志物能够插入3'ITR序列的下游(即，3')。在另一个实施方案中，选择标志物能够插入5'ITR序列的上游(即，5')。适当的选择标志物包括例如赋予耐药性的标志物。选择标志物可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。在优选实施方案中，药物选择标志物是杀稻瘟菌素S抗性基因。
用于表达PAH蛋白的示例性ceDNA(例如，rAAV0)载体由rAAV质粒产生。一种用于产生rAAV载体的方法可以包括：(a)为宿主细胞提供如上文所描述的rAAV质粒，其中宿主细胞和质粒均不含衣壳蛋白编码基因，(b)在允许产生ceDNA基因组的条件下培养宿主细胞；以及(c)采集细胞并分离从所述细胞产生的AAV基因组。
C.从ceDNA质粒制备ceDNA载体的示例性方法
本文还提供了制备用于表达PAH蛋白的无衣壳的ceDNA载体的方法，特别是具有足够高的产率以提供足够的载体用于体内实验的方法。
在一些实施方案中，产生用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法包含以下步骤：(1)将包含表达盒和两个对称ITR序列的核酸构建体引入宿主细胞(例如Sf9细胞)中；(2)任选地，例如通过使用质粒上存在的选择标记建立克隆细胞系；(3)将Rep编码基因引入(通过用携带所述基因的杆状病毒转染或感染)所述昆虫细胞中；以及(4)采集细胞并纯化ceDNA载体。上述用于产生ceDNA载体的包含表达盒和两个ITR序列的核酸构建体可以呈ceDNA-质粒的形式，或如下所述用ceDNA-质粒产生的杆粒或杆状病毒的形式。可以通过转染、病毒转导、稳定整合或所属领域中已知的其它方法将核酸构建体引入宿主细胞中。
D.细胞系
用于产生用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的宿主细胞系可以包含来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的昆虫细胞系，如Sf9 Sf21，或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，或其它无脊椎动物、脊椎动物或其它真核细胞系，包含哺乳动物细胞。也可以使用普通技术人员已知的其他细胞系，如HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1 180、单核细胞、以及成熟和不成熟的树突状细胞。可以转染宿主细胞系以稳定表达ceDNA-质粒，从而高产率地产生ceDNA载体。
可以使用本领域已知的试剂(例如，脂质体、磷酸钙)或物理手段(例如，电穿孔)，通过瞬时转染将ceDNA-质粒引入Sf9细胞中。可替代地，可以建立将ceDNA-质粒稳定整合到基因组中的稳定Sf9细胞系。此类稳定细胞系可以通过如上文所描述将选择标志物并入ceDNA-质粒中来建立。如果用于转染细胞系的ceDNA-质粒包含选择标志物，如抗生素，那么可以通过向细胞生长培养基中加入抗生素来选择已用ceDNA-质粒转染并将ceDNA-质粒DNA整合到基因组中的细胞。然后可以通过单细胞稀释或集落转移技术来分离细胞的抗性克隆并增殖。
E.分离和提纯ceDNA载体：
图4A-4E和下面的特定实例中描述了用于获得和分离ceDNA载体的方法的实例。本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以从表达一种或多种AAV Rep蛋白的生产细胞获得，进一步用ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒转化。可用于生产ceDNA载体的质粒包括编码PAH蛋白的质粒或编码一种或多种REP蛋白的质粒。
在一个方面中，多核苷酸编码在质粒(Rep-质粒)、杆粒(Rep-杆粒)或杆状病毒(Rep-杆状病毒)中递送到生产细胞的AAV Rep蛋白(Rep 78或68)。Rep-质粒、Rep-杆粒和Rep-杆状病毒可以通过上文所描述的方法产生。
本文描述了产生用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法。用于产生如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的表达构建体可以是质粒(例如ceDNA-质粒)、杆粒(例如ceDNA-杆粒)和/或杆状病毒(例如ceDNA-杆状病毒)。仅举例来说，ceDNA-载体可以由用ceDNA-杆状病毒和Rep-杆状病毒共同感染的细胞产生。由Rep-杆状病毒产生的Rep蛋白可以复制ceDNA-杆状病毒以产生ceDNA-载体。可替代地，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以由经构建体稳定转染的细胞产生，所述构建体包含编码AAV Rep蛋白(Rep78/52)的序列，所述AAV Rep蛋白在Rep-质粒、Rep-杆粒或Rep-杆状病毒中递送。ceDNA-杆状病毒可以瞬时转染到细胞中，通过Rep蛋白复制并产生ceDNA载体。
杆粒(例如ceDNA-杆粒)能够转染到允许的昆虫细胞中，例如Sf9、Sf21、Tni(粉纹夜蛾)细胞、High Five细胞，并且产生ceDNA-杆状病毒，所述杆状病毒是重组杆状病毒，其包括包含对称ITR的序列和表达盒。ceDNA-杆状病毒能够再次感染到昆虫细胞中以获得下一代重组杆状病毒。任选地，所述步骤可以重复一次或多次以产生更大量的重组杆状病毒。
从细胞采集和收集本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。例如，可以根据细胞存活率、细胞形态、细胞生长等选择收获时间。通常，细胞可在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体(例如ceDNA载体)的时间后但在大多数细胞开始因病毒毒性而死亡之前收获。使用质粒提纯套组，例如Qiagen ENDO-FREE
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套组，能够从Sf9细胞中分离出ceDNA载体。为了分离质粒而开发的其它方法也可以适合于ceDNA载体。通常，可以采用所属领域中已知的任何核酸纯化方法，以及可商购的DNA提取试剂盒。
可替代地，可以通过对细胞团块进行碱溶解法、离心所得溶解液并进行色谱分离来实施纯化。作为一个非限制性实例，所述方法可以如下进行：将上清液装载于保留核酸的离子交换柱(例如SARTOBIND
Figure BDA0003352315200001122
)上，然后洗脱(例如使用1.2M NaCl溶液)并且在凝胶过滤柱(例如6个快速流动GE)上进一步进行色谱纯化。然后通过例如沉淀来回收无衣壳的AAV载体。
在一些实施方案中，用于PAH蛋白表达的ceDNA载体也可以外泌体或微粒形式纯化。所属领域中已知，许多细胞类型不仅释放出可溶性蛋白质，而且还通过膜微囊泡脱落释放出复杂的蛋白质/核酸货物(Cocucci等人,2009；EP 10306226.1，其以全文引用的方式并入本文中)。此类囊泡包括微囊泡(也称为微粒)和外泌体(也称为纳米囊泡)，二者均包含蛋白质和RNA作为货物。微囊泡由质膜的直接出芽产生，而外泌体在多囊泡内体与质膜融合后释放到细胞外的环境中。因此，可以从已经用ceDNA-质粒转导的细胞或用ceDNA-质粒产生的杆粒或杆状病毒中分离出含有ceDNA载体的微囊泡和/或外泌体。
微囊泡可以通过对培养基进行过滤或以20,000×g超速离心来分离，而对外泌体以100,000×g超速离心。超速离心的最佳持续时间可以通过实验确定，并将取决于从中分离出囊泡的特定细胞类型。优选地，首先利用低速离心(例如在2000×g下进行5-20分钟)清除培养基并且使用例如
Figure BDA0003352315200001131
离心柱(密理博(Millipore)，英国赫特福德郡(Watford,UK))进行离心浓缩。微米囊泡和外泌体可以通过使用识别存在于微米囊泡和外泌体上的特定表面抗原的特异性抗体，通过FACS或MACS进一步提纯。其他微米囊泡和外泌体提纯方法包括但不限于免疫沉淀、亲和色谱、过滤和涂有特异性抗体或适体的磁珠。提纯后，用例如磷酸盐缓冲盐水洗涤囊泡。使用微米囊泡或外泌体递送含ceDNA的囊泡的一个优点是，这些囊泡可通过在它们的膜上包括被相应细胞类型上的特异性受体识别的蛋白质而靶向各种细胞类型。(也参见EP 10306226)
本文发明的另一方面涉及从已将ceDNA构建体稳定整合到自身基因组中的宿主细胞系中纯化ceDNA载体的方法。在一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行提纯。
国际申请PCT/US18/49996的图5显示了凝胶证实ceDNA的产生，所述ceDNA使用实例中所述的方法由多种ceDNA-质粒构建体产生。如实例中关于图4D所论述，ceDNA通过凝胶中的特征色带图案来证实。
VII.药物组合物
在另一方面，提供了药物组合物。药物组合物包含如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够并入适于施用于受试者的药物组合物中以便体内递送到受试者的细胞、组织或器官。通常，药物组合物包括如本文公开的ceDNA-载体和药学上可接受的载剂。例如，可以将本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体并入适合于期望的治疗施用途径(例如肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及例如核内显微注射或胞浆内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的缓冲液中、然后进行过滤灭菌来制备。可以配制包括ceDNA载体，以将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，使得转基因或供体序列在其中治疗性表达。组合物还可以包含药学上可接受的载剂。
包含用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的医药活性组合物能够被配制成将用于不同目的的转基因递送到细胞，例如受试者的细胞。
用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可并入适合于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、前房内和玻璃体内)、耳蜗内和粘膜(例如口腔、直肠、鼻)施用的药物组合物。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。
在一些方面中，本文提供的方法包含将一种或多种如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体递送到宿主细胞。本文还提供了通过这类方法产生的细胞，以及包含这类细胞或由这类细胞产生的生物体(例如动物、植物或真菌)。核酸的递送方法可包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸偶联物、裸DNA和试剂增强的DNA吸收。脂质体转染描述于例如美国专利第5,049,386号、第4,946,787号和第4,897,355号，所述专利以全文引用的方式并入本文中)并且脂质体转染试剂有市售(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。能够递送到细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
将核酸递送到细胞的各种技术和方法是所属领域中已知的。举例来说，可以将核酸(如用于表达PAH蛋白的ceDNA)配制成脂质纳米粒子(LNP)、类脂(lipidoid)、脂质体、脂质纳米粒子、脂质体复合物(lipoplex)或核壳纳米粒子。通常，LNP由核酸(例如ceDNA)分子、一种或多种可电离或阳离子脂质(或其盐)、一种或多种非离子或中性脂质(例如磷脂)、防止聚集的分子(例如PEG或PEG-脂质偶联物)以及任选的固醇(例如胆固醇)构成。
将核酸(例如用于表达PAH蛋白的ceDNA)递送到细胞的另一种方法是将核酸与被所述细胞内化的配体偶联。例如，配体可以结合细胞表面上的受体并通过胞吞而被内化。配体可以与核酸中的核苷酸共价连接。用于将核酸递送到细胞中的示例性偶联物描述于例如WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515和WO2017/177326中，所有这些专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
核酸，如用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，也可以通过转染递送到细胞。有用的转染方法包含(但不限于)：脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。转染试剂在所属领域中是熟知的并且包含(但不限于)：TurboFect转染试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技)、TRANSPASSTMP蛋白转染试剂(新英格兰生物实验室)、CHARIOTTM蛋白递送试剂(Active Motif)、PROTEOJUICETM蛋白转染试剂(EMD密理博)、293fectin、LIPOFECTAMINETM2000、LIPOFECTAMINETM3000(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTINTM(赛默飞世尔科技)、DMRIE-C、CELLFECTINTM(赛默飞世尔科技)、OLIGOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTACETM、FUGENETM(瑞士巴塞尔的罗氏(Roche,Basel,Switzerland))、FUGENETMHD(罗氏)、TRANSFECTAMTM(转染胺，威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.))、TFX-10TM(普洛麦格公司)、TFX-20TM(普洛麦格公司)、TFX-50TM(普洛麦格公司)、TRANSFECTINTM(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BioRad,Hercules,Calif.))、SILENTFECTTM(伯乐公司)、EffecteneTM(加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,Calif.))、DC-chol(阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))、GENEPORTERTM(加利福尼亚圣地亚哥的基因疗法系统(Gene Therapy Systems,San Diego,Calif.))、DHARMAFECT 1TM(科罗拉多州拉斐特的达尔马肯(Dharmacon,Lafayette,Colo.))、DHARMAFECT 2TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 3TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 4TM(达尔马肯)、ESCORTTMIII(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,Mo.))和ESCORTTMIV(西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.))。核酸，如ceDNA，也可以通过所属领域的技术人员已知的微流体方法递送到细胞。
如本文所描述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体也可以直接施用生物体以在体内转导细胞。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包含(但不限于)：注射、输注、局部施用和电穿孔。适合的施用此类核酸的方法是可利用的并且是所属领域的技术人员熟知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径经常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。
引入如本文所公开的用于表达PAH蛋白的核酸载体ceDNA载体的方法可以例如通过如例如美国专利第5,928,638号中所描述的方法来递送到造血干细胞中，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
根据本发明的用于表达PAH蛋白的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或目标器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包含其它脂质。2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了示例性脂质体和脂质体配方，包括(但不限于)含有聚乙二醇(PEG)官能基的化合物，参见例如标题为“医药配方”的章节，每个国际申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
本领域已知的各种递送方法或其改良方法可用于在体外或体内递送ceDNA载体。例如，在一些实施方案中，通过机械、电力、超声波、流体动力或基于激光的能量让细胞膜瞬时渗透以便于DNA进入靶向细胞中来递送用于表达PAH蛋白的ceDNA载体。例如，可以通过经过大小限制的通道挤压细胞或通过所属领域中已知的其它手段来瞬时破坏细胞膜来递送ceDNA载体。在一些情况下，单独的ceDNA载体作为裸DNA直接注射到以下任一项中：任何一种或多种组织，选自：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃、皮肤、胸腺，心肌或骨骼肌。在一些情况下，通过基因枪递送ceDNA载体。涂覆有无衣壳的AAV载体的金或钨球形颗粒(直径1-3μm)可以通过加压气体加速到高速而渗透到目标组织细胞中。
本文特别涵盖包含用于表达PAH蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施方案中，ceDNA载体与脂质递送系统，例如本文所述的脂质体一起配制。在一些实施方案中，这类组合物通过熟练从业人员期望的任何途径来施用。可以通过不同途径，包括经口、肠胃外、舌下、经皮直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内鞘内和关节内或其组合，向受试者施用组合物。对于兽医用途，可根据正常兽医实践将组合物作为适当可接受的配制物施用。兽医可以很容易地确定最适合具体动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法(例如电穿孔(“EP”)、流体动力学方法或超声波)施用组合物。
在一些情况下，通过流体动力学注射来递送用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，这是一种将任何水溶性化合物和颗粒直接经细胞内递送到内脏器官和整个肢体的骨骼肌中的简单高效的方法。
在一些情况下，通过超声波在膜上制造纳米孔，以促进DNA颗粒在细胞内递送到内部器官或肿瘤的细胞中来递送用于表达PAH蛋白的ceDNA载体，因此质粒DNA的大小和浓度在所述系统的效率中起着重要作用。在一些情况下，通过使用磁场的磁转染来递送ceDNA载体，以将含有核酸的颗粒集中到目标细胞中。
在一些情况下，可以使用化学递送系统，例如通过使用纳米复合物，其包含用属于阳离子脂质体/胶束或阳离子聚合物的聚阳离子纳米颗粒来压紧带负电核酸。用于递送方法的阳离子脂质包含但不限于单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍化合物、胆固醇衍生化合物、阳离子聚合物、(例如聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、其它阳离子聚合物)和脂质-聚合物杂化物。
A.外泌体：
在一些实施方案中，如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体通过包装在外泌体中来递送。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡，其在多囊泡体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。其表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，其含有来自产生外泌体的细胞的胞溶质并且在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。外泌体由包含上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)以及树突状细胞(DC)在内的各种细胞类型产生。一些实施方案设想使用直径在10nm与1μm之间、20nm与500nm之间、30nm与250nm之间、50nm与100nm之间的外泌体。使用外泌体的供体细胞或通过将特定核酸引入外泌体中，可以分离外泌体以递送到目标细胞中。所属领域中已知的各种方法可以用于产生含有本发明的无衣壳AAV载体的外泌体。
A.微粒/纳米颗粒
在一些实施方案中，如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体通过脂质纳米颗粒来递送。通常，脂质纳米颗粒包含可电离的氨基脂质(例如4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPC)、胆固醇和外被脂质(聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油，PEG-DMG)，例如如Tam等人(2013)。《用于递送siRNA的脂质纳米颗粒的进展(Advances in Lipid Nanoparticlesfor siRNA delivery)》.《制药(Pharmaceuticals)》5(3):498-507所公开。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的平均直径在约10nm与约1000nm之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径小于300nm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径在约10nm与约300nm之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径小于200nm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径在约25nm与约200nm之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒制剂(例如包含多个脂质纳米颗粒的组合物)具有一定的尺寸分布，其中平均尺寸(例如直径)是约70nm至约200nm，且更典型地，平均尺寸是约100nm或更小。
本领域已知的各种脂质纳米颗粒可用于递送本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体。例如，在美国专利第9,404,127号、第9,006,417号和第9,518,272号中描述了使用脂质纳米颗粒的各种递送方法。
在一些实施方案中，通过金纳米颗粒递送本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体。通常，核酸可以与金纳米颗粒共价结合或与金纳米颗粒非共价结合(例如通过电荷-电荷相互作用结合)，例如如Ding等人(2014).《用于核酸递送的金纳米颗粒(GoldNanoparticles for Nucleic Acid Delivery)》.《分子疗法》22(6)；1075-1083所描述。在一些实施方案中，使用例如美国专利第6,812,334号中描述的方法产生金纳米颗粒-核酸偶联物。
B.共轭物
在一些实施方案中，将如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体偶联(例如与增加细胞吸收的药剂共价结合。“增加细胞吸收的药剂”是促进核酸跨脂质膜运输的分子。例如，核酸能够与亲脂性化合物(例如胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如穿膜肽、TAT、Syn1B等)和多胺(例如精胺)偶联。增强细胞吸收的试剂的其它实例公开于例如Winkler(2013)。《用于治疗应用的寡核苷酸偶联物(Oligonucleotide conjugates fortherapeutic applications.)》《治疗剂递送(Ther.Deliv.)》4(7)；791-809。
在一些实施方案中，如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与聚合物(例如聚合分子)或叶酸类分子(例如叶酸分子)偶联。通常，与聚合物偶联的核酸的递送是所属领域中已知的，例如如WO2000/34343和WO2008/022309中所描述。在一些实施方案中，例如如美国专利第8,987,377号中所描述，将如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与聚(酰胺)聚合物偶联。在一些实施方案中，如美国专利第8,507,455号中所描述，将本公开所描述的核酸与叶酸分子偶联。
在一些实施方案中，例如如美国专利第8,450,467号中所描述，将如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体与碳水化合物偶联。
C.纳米胶囊
可替代地，可以使用如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的纳米胶囊调配物。纳米胶囊通常可以呈稳定并且可再现的方式截留物质。为了避免由于细胞内聚合物过载所致的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细颗粒(尺寸约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒是预期使用的。
D.脂质体
根据本发明的用于表达PAH蛋白的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或目标器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
脂质体的形成和使用是所属领域的技术人员通常已知的。已经研发了血清稳定性和循环半衰期有所改善的脂质体(美国专利第5,741,516号)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载剂的各种方法(美国专利第5,567,434号；第5,552,157号；第5,565,213号；第5,738,868号和第5,795,587号，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中)。
E.示例性脂质体和脂质纳米颗粒(LNP)组合物
根据本发明的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够添加到脂质体中以便递送到细胞，例如需要表达转基因的细胞。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包含其它脂质。
2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了包含ceDNA载体的脂质纳米颗粒(LNP)，所述国际申请全文并入本文中并且设想用于如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法和组合物中。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，所述聚乙二醇官能团可以降低一种或多种所述化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低剂量频率。或者，脂质体调配物仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此类方面，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da至约5,000Da。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其将在数小时至数周的时间内以延长释放或受控释放曲线来递送API。在一些相关的方面，脂质体调配物可以包括以脂质双层结合的水性腔。在其它相关方面，脂质体调配物将API与组分一起包封起来，所述组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时到数周的时段内释放API。
在一些方面，脂质体调配物包括鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。在一些方面，脂质体调配物包括光敏体。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包含一种或多种选自以下的脂质：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)偶联的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)；DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)；EPC(绵羊磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)；POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DSPG(二硬脂酰基磷脂酰甘油)；DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、硫酸胆固醇酯(CS)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包括磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。在一些方面，脂质体调配物的总脂质含量为2-16mg/mL。在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，摩尔比分别为3:0.015:2。在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面，PEG化脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包括DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质偶联物和胆固醇。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包括一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其包括以下中的一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇，例如胆固醇。在一些方面，脂质体调配物包括DOPC/DEPC；和DOPE。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其还包含一种或多种药物赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。
在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。在一些方面中，本公开提供了一种包含多囊泡颗粒和/或泡沫基颗粒的脂质体配制物。在一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米颗粒的相对尺寸更大并且尺寸为约150至250nm的脂质体调配物。在一些方面，脂质体调配物是冻干粉末。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，其通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱，用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载所述ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大致7.3，并驱动API进入脂质体中。在一些方面，本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体调配物。在此类情况下，脂质体的内部可以处于pH 4-6.9下，并且更优选pH 6.5。在其它方面，本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体调配物。在这样的情况下，利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内俘获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。
在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米颗粒。举例来说，通过如2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开的方法获得的ceDNA制备并负载ceDNA的脂质纳米粒子配制物，所述申请并入本文中。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合，使可电离脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和粒子成核提供有利的能量来实现。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定粒子。能够将颗粒浓缩至所需水平。
通常，以约10:1至30:1的总脂质与ceDNA(质量或重量)比率制备脂质颗粒。在一些实施方案中，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1范围内。能够调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/ml至约30mg/mL的范围内。
可电离的脂质通常用于在低pH值下浓缩核酸货物(例如ceDNA)并驱动膜缔合和融合。通常，可电离的脂质是包含至少一个氨基的脂质，所述氨基在酸性条件下(例如在pH6.5或更低的条件下)带正电或质子化。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。
示例性可电离脂质描述于国际PCT专利公开WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354；以及美国专利公开US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920，所有文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
Figure BDA0003352315200001221
脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人，《英国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed Engl.)》(2012),51(34):8529-8533，其内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/074085中所述的脂质ATX-002，其内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2012/040184中所述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/199952中所述的化合物6或化合物22，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
没有限制，可电离的脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的20-90％(mol)。例如，可电离的脂质摩尔含量可以为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的20-70％(mol)、30-60％(mol)或40-50％(mol)。在一些实施方案中，可电离的脂质占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的约50mol％至约90mol％。
在一些方面中，脂质纳米颗粒可以进一步包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。
设想用于如本文所公开的方法和组合物中的示例性非阳离子脂质描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242中，所述国际申请全文并入本文中。示例性非阳离子脂质描述于国际申请公开WO2017/099823和美国专利公开US2018/0028664中，两者的内容以全文引用的方式并入本文中。
非阳离子脂质能够占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-30％(mol)。例如，非阳离子脂质含量为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5-20％(mol)或10-15％(mol)。在各种实施方案中，可电离的脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒不包含任何磷脂。在一些方面中，脂质纳米颗粒能够进一步包含例如固醇等组分，以提供膜完整性。
能够用于脂质纳米颗粒的一种示例性固醇是胆固醇和其衍生物。示例性胆固醇衍生物描述于国际申请WO2009/127060和美国专利公开US2010/0130588中，所述文献以全文引用的方式并入本文。
提供膜完整性的组分(例如固醇)能够占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-50％(mol)。在一些实施方案中，此类组分占脂质纳米粒子的总脂质含量的20％-50％(mol)、30％-40％(mol)。
在一些方面，脂质纳米粒子可以还包含聚乙二醇(PEG)或偶联的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米颗粒的聚集和/或提供空间稳定。示例性的偶联脂质包括但不限于PEG-脂质偶联物、聚噁唑啉(POZ)-脂质偶联物、聚酰胺-脂质偶联物(如ATTA-脂质偶联物)、阳离子聚合物脂质(CPL)偶联物以及其混合物。在一些实施方案中，偶联的脂质分子是PEG-脂质偶联物，例如(甲氧基聚乙二醇)偶联的脂质。示例性PEG-脂质偶联物包括(但不限于)PEG-二酰基甘油(DAG)(例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(例如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或其混合物。另外的示例性PEG-脂质偶联物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，所有这些文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，PEG-脂质是如US2018/0028664中定义的化合物，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，US20150376115或US2016/0376224中公开了PEG-脂质，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
PEG-DAA偶联物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实例中，PEG-脂质可以选自由以下组成的群组：PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
还能够使用与除PEG之外的分子偶联的脂质替代PEG-脂质。举例来说，代替PEG-脂质或除PEG-脂质以外，还可以使用聚噁唑啉(POZ)-脂质偶联物、聚酰胺-脂质偶联物(如ATTA-脂质偶联物)和阳离子聚合物脂质(CPL)偶联物。在以下中描述了示例性偶联的脂质，即PEG-脂质、(POZ)-脂质偶联物、ATTA-脂质偶联物和阳离子聚合物-脂质：国际专利申请公开案WO1996/010392、WO1998/051278、WO2002/087541、WO2005/026372、WO2008/147438、WO2009/086558、WO2012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、WO2017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282；美国专利申请公开案US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453；以及美国专利US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559，所有文献的内容以全文引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，可以根据治疗目的和所需的生物学作用选择治疗剂。举例来说，如果LNP内的ceDNA可用于治疗PKU，则另外的化合物可以是抗PKU剂(例如化学治疗剂、其他PKU疗法(包括(但不限于)小分子一种抗体)。在另一个实例中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗感染，那么另外的化合物可以是抗微生物剂(例如抗生素或抗病毒化合物)。在又一个实例中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病症，那么另外的化合物可以是调控免疫应答的化合物(例如免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调控一种或多种特异性免疫途径的化合物)。在一些实施方案中，含有例如编码不同蛋白质的ceDNA或例如治疗剂的不同化合物的不同化合物的不同脂质纳米颗粒的不同混合物可以用于本发明的组合物和方法中。
在一些实施方案中，另外的化合物是免疫调节剂。例如，另外的化合物是免疫抑制剂。在一些实施方案中，另外的化合物是免疫刺激剂。本文还提供了一种药物组合物，其包含所产生的经脂质纳米颗粒囊封的昆虫细胞，或如本文所述用于表达PAH蛋白的合成产生的ceDNA载体，和药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一些方面，本公开提供了一种脂质纳米粒子配制物，其还包含一种或多种药物赋形剂。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒配制物还包含蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
ceDNA载体能够与颗粒的脂质部分复合或囊封于脂质纳米颗粒的脂质位置。在一些实施方案中，可以将ceDNA完全囊封在脂质纳米颗粒的脂质位置中，从而保护其免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中的ceDNA在37℃下脂质纳米颗粒暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上不降解。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中的ceDNA在颗粒在血清中在37℃下培育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后基本上不降解。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒对受试者，例如对哺乳动物，例如人基本上是无毒的。在一些方面，脂质纳米颗粒配制物是冻干粉末。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是具有至少一个脂质双层的固体芯颗粒。在其它实施方案中，脂质纳米颗粒具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制，非双层形态能够包括例如三维管、棒、对称立方体等。举例来说，使用例如Cryo-TEM分析，能够轻松地评估且表征脂质纳米颗粒的形态(片层对非片层)，如US2010/0130588中所述，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些其它实施方案中，具有非片层形态的脂质纳米颗粒是电子致密的。在一些方面中，本公开提供了结构上为单层或多层的脂质纳米颗粒。在一些方面中，本公开提供了脂质纳米颗粒配制物，其包含多囊泡颗粒和/或基于泡沫的颗粒。
通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质偶联物从脂质颗粒中交换出来的速率，进而可以控制脂质纳米颗粒融合的速率。另外，包括例如pH、温度或离子强度的其他变量可以用于改变和/或控制脂质纳米粒子融合的速率。基于本公开，所属领域的普通技术人员将清楚可以用于控制脂质纳米粒子融合的速率的其他方法。同样显而易见，通过控制脂质偶联物的组成和浓度，可以控制脂质粒子的大小。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的效力相关(参见Jayaraman等人,《应用化学国际版》(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,《自然生物技术》28,172-176(20l0)，两个文献都以全文引用的方式并入本文中)。pKa的优选范围是约5到约7。使用基于2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的分析测定脂质纳米粒子中阳离子脂质的pKa。
VIII.使用方法
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体还能够用于递送所关注核苷酸序列(例如编码PAH蛋白)到靶细胞(例如宿主细胞)的方法。所述方法尤其可以是将PAH蛋白递送到有需要的受试者的细胞且治疗PKU的方法。本发明实现了ceDNA载体中编码的PAH蛋白在受试者细胞中的体内表达，使得PAH蛋白表达的治疗效应发生。在ceDNA载体的体内和体外递送模式中均可以看到这些结果。
另外，本发明提供了在有需要的受试者的细胞中递送PAH蛋白的方法，其包括多次施用编码所述PAH蛋白的本发明的ceDNA载体。由于本发明的ceDNA载体不像对包封病毒载体通常所观察到那样诱发免疫应答，所以这样的多次施用策略将可能在基于ceDNA的系统中取得更大的成功。ceDNA载体的施用量足以转染所需组织的细胞，并提供足够水平的基因转移和PAH蛋白的表达，而不会产生过度的不利影响。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于视网膜施用(例如视网膜下注射，脉络膜上注射或玻璃体内注射)、静脉内施用(例如在脂质体配制物中)、直接递送至所选器官(例如选自肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃中的任何一种或多种组织)、肌内施用和其他肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
如本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的递送不限于所表达的PAH蛋白的递送。举例来说，常规产生(例如使用基于细胞的产生方法(例如昆虫细胞产生方法))或合成产生的如本文所述的ceDNA载体可以联合为了提供基因疗法的一部分而提供的其他递送系统使用。可以与根据本公开的ceDNA载体组合的系统的一个非限制性实例包括为了使表达PAH蛋白的ceDNA载体实现有效的基因表达而单独递送一种或多种辅因子或免疫抑制剂的系统。
本发明还提供了一种治疗受试者的PKU的方法，所述方法包括将治疗有效量的ceDNA载体任选地与药学上可接受的载剂一起引入受试者的有需要的目标细胞(尤其是肌肉细胞或组织)中。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所选ceDNA载体包含编码可用于治疗疾病的PAH蛋白的核苷酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包含可操作地连接到控制元件的所期望PAH合蛋白序列，当引入受试者中时，所述控制元件能够引导由外源DNA序列编码的所期望PAH蛋白转录。ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方提供的任何适合的途径施用。
本文提供的组合物和载体可用于递送PAH蛋白以用于各种目的。在一些实施方案中，转基因编码旨在用于研究目的的PAH蛋白，例如建立具有转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究PAH蛋白产物的功能。在另一个实例中，转基因编码旨在用于建立动物疾病模型的PAH蛋白。在一些实施方案中，编码的PAH蛋白可用于治疗或预防哺乳动物受试者的PKU状态。可以将PAH蛋白以足量转移到患者(例如在其中表达)，以治疗与基因表达降低、缺乏表达或功能障碍有关的PKU。
原则上，表达盒能够包括被视为属于本发明范围内的核酸或任何转基因，其编码因突变而减少或缺乏或当过度表达时达成治疗益处的PAH蛋白。优选地，本文提供的ceDNA组合物中不存在未插入的细菌DNA，并且优选地不存在细菌DNA。
ceDNA载体不限于ceDNA载体的一种。因而，在另一个方面中，表达不同合蛋白或相同PAH蛋白、操作性地连接到不同启动子或顺式调控元件的多种ceDNA载体能够同时或依序递送到靶细胞、组织、器官或受试者。因此，这种策略能够允许多个基因同时进行基因疗法或基因递送。还能够将PAH蛋白的不同部分分离到单独的ceDNA载体中(例如PAH蛋白的功能所需的不同结构域和/或辅因子)，所述ceDNA载体能够同时或在不同时间施用，并且能够是分别可调控的，借此增添PAH蛋白的额外表达控制水平。考虑到由于缺乏病毒衣壳而缺乏抗衣壳宿主免疫应答，递送也可以进行多次，并且对于临床环境中的基因疗法来说，重要的是随后增加或减少剂量。可以预期，由于没有衣壳，因此不会发生抗衣壳应答。
本发明还提供了一种治疗受试者的PKU的方法，包含将治疗有效量的如本文所公开的ceDNA载体、任选地与药学上可接受的载剂一起引入受试者的有需要的靶细胞(具体地说，肌肉细胞或组织)。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所实施的ceDNA载体包括可用于治疗PKU的所关注的核苷酸序列。具体地，ceDNA载体可以包括与控制元件可操作地连接的期望的外源DNA序列，当引入受试者中时，所述控制元件能够指导由外源DNA序列编码的期望的多肽、蛋白质或寡核苷酸的转录。ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方提供的任何适合的途径施用。
IX.递送用于PAH蛋白生产的ceDNA载体的方法
在一些实施方案中，可以通过各种适合的方法将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体体外或体内递送到目标细胞。ceDNA载体可以单独施加或注射。CeDNA载体可以在不借助于转染试剂或其它物理方式的情况下递送到细胞。可替代地，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以使用所属领域已知的任何转染试剂或所属领域已知的促进DNA进入细胞的其它物理方式递送，例如脂质体、醇类、富含聚赖氨酸的化合物、富含精氨酸的化合物、磷酸钙、微囊泡、显微注射、电穿孔等等。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够有效地靶向使用各种递送试剂、使用常规AAV病毒粒子通常难以转导的细胞和组织类型。
本文所描述的技术的一个方面涉及一种将PAH蛋白递送到细胞的方法。典型地，在体内和体外方法中，可以使用如本文所公开的方法以及所属领域中已知的其它方法将如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体引入细胞中。如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体优选以生物学有效量施用于细胞。如果将ceDNA载体在体内施用到细胞(例如到受试者)，那么ceDNA载体的生物学有效量是足以使PAH蛋白在目标细胞中转导和表达的量。
如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的示例性施用模式包括口服、直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、口腔(例如，舌下)、阴道、鞘内、眼内、经皮、内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内[包括施用给骨骼肌、膈肌和/或心肌]、胸膜内、脑内和关节内)。施用可以全身或直接递送至肝脏或其他地方(例如，任何肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃)。
施用可以是局部(例如，皮肤和粘膜表面，包括气道表面和透皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如但不限于肝脏，但也可用于眼、肌肉，包括骨骼肌、心肌、膈肌或大脑)。
可以向受试者的任何部位施用ceDNA载体，包括(但不限于)选自由以下组成的组的部位：肝脏和/或眼睛、脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肾脏、脾脏、胰腺。
在任何给定情况下最适合的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病状的性质和严重程度，以及所使用的特定ceDNA载体的性质。另外，ceDNA允许通过单个载体或多个ceDNA载体(例如ceDNA混合物)施用超过一种PAH蛋白。
A.ceDNA载体的肌肉内施用
在一些实施方案中，治疗受试者的疾病的方法包括将治疗有效量的编码PAH蛋白的ceDNA载体、任选地与药学上可接受的载剂一起引入受试者的需要其的靶细胞(特别是肌肉细胞或组织)中。在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于受试者的肌肉组织。
在一些实施方案中，ceDNA载体能够施用于受试者的任何部位，包括但不限于选自骨骼肌、平滑肌、心脏、隔膜或眼肌的部位。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体向根据本发明的骨骼肌的施用包括(但不限于)施用于肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌。如本文所公开的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda等人，(2005)《血液(Blood)》105:3458-3464)和/或直接肌肉内注射而递送到骨骼肌。在特定实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体通过肢体灌注、任选地隔离肢体灌注(例如静脉内或关节内施用)来施用于受试者(例如患有如DMD的肌营养不良症的受试者)的肢体(臂和/或腿)。在实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体可以在不使用“流体动力学”技术的情况下施用。
举例来说，常规病毒载体的组织递送(例如递送到肌肉)通常利用流体动力学技术增强(例如大体积的静脉内/静脉内施用)，其增强血管压力并且促进病毒载体穿越内皮细胞屏障的能力。在特定实施方案中，本文所述的ceDNA载体能够在流体动力学技术缺乏的情况下施用，例如大体积输注和/或升高的血管内压力(例如大于正常收缩压，例如小于或等于血管内压力相对于正常收缩压的5％、10％、15％、20％、25％增幅)。这样的方法可以减少或避免与流体动力学技术相关的副作用，例如水肿、神经损伤和/或隔室综合征。
此外，包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的施用于骨骼肌的ceDNA载体的组合物能够施用于肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)的骨骼肌、背、颈、头(例如舌)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指。合适的骨骼肌包括(但不限于)外展小指肌(手)、外展小趾肌(足)、拇展肌(abductor hallucis)、第五趾(指)展肌(abductor ossis metatarsiquinti)、拇短展肌(abductor pollicis brevis)、拇长展肌(abductor pollicislongus)、内收短肌(adductor brevis)、拇收肌(adductor hallucis)、内收长肌(adductorlongus)、內收大肌(adductor magnus)、拇收肌(adductor pollicis)、肘肌(anconeus)、前斜角肌(anterior scalene)、膝关节肌(articularis genus)、肱二头肌(bicepsbrachii)、股二头肌(biceps femoris)、肱肌(brachialis)、肱挠肌(brachioradialis)、颊肌(buccinator)、喙肱肌(coracobrachialis)、皱眉肌(corrugator supercilii)、三角肌(deltoid)、降口角肌(depressor anguli oris)、降下唇肌(depressor labiiinferioris)、二腹肌(digastric)、骨间背侧肌(dorsal interossei)(手)、骨间背侧肌(足)、桡侧腕短伸肌(extensor carpi radialis brevis)、桡侧腕长伸肌(extensor carpiradialis longus)、尺侧伸腕肌(extensor carpi ulnaris)、伸小指肌(extensor digitiminimi)、伸趾肌(extensor digitorum)、伸趾短肌(extensor digitorum brevis)、伸趾长肌(extensor digitorum longus)、伸拇短肌(extensor hallucis brevis)、伸拇长肌(extensor hallucis longus)、伸食指肌(extensor indicis)、伸拇短肌(extensorpollicis brevis)、伸拇长肌(extensor pollicis longus)、桡侧腕屈肌(flexor carpiradialis)、尺侧屈腕肌(flexor carpi ulnaris)、小指短屈肌(flexor digiti minimibrevis)(手)、小趾短屈肌(足)、趾短屈肌(flexor digitorum brevis)、趾长屈肌(flexordigitorum longus)、指深屈肌(flexor digitorum profundus)、指浅屈肌(flexordigitorum superficialis)、拇短屈肌(flexor hallucis brevis)、拇长屈肌(flexorhallucis longus)、拇短屈肌(flexor pollicis brevis)、拇长屈肌(flexor pollicislongus)、额肌(frontalis)、腓肠肌(gastrocnemius)、颏舌骨肌(geniohyoid)、臀大肌(gluteus maximus)、臀中肌(gluteus medius)、臀小肌(gluteus minimus)、股薄肌(gracilis)、颈髂肋肌(iliocostalis cervicis)、腰髂肋肌(iliocostalis lumborum)、胸髂肋肌(iliocostalis thoracis)、髂肌(illiacus)、下孖肌(inferior gemellus)、下斜肌(inferior oblique)、下直肌(inferior rectus)、冈下肌(infraspinatus)、棘间肌(interspinalis)、横突间肌(intertransversi)、翼外肌(lateral pterygoid)、外直肌(lateral rectus)、背阔肌(latissimus dorsi)、提口角肌(levator anguli oris)、提上唇肌(levator labii superioris)、提上唇鼻翼肌(levator labii superioris alaequenasi)、提上睑肌(levator palpebrae superioris)、肩胛提肌(levator scapulae)、长回旋肌(long rotators)、头最长肌(longissimus capitis)、颈最长肌(longissimuscervicis)、胸最长肌(longissimus thoracis)、头长肌(longus capitis)、颈长肌(longuscolli)、蚓状肌(lumbricals)(手)、蚓状肌(足)、咬肌(masseter)、翼内肌(medialpterygoid)、内直肌(medial rectus)、中斜角肌(middle scalene)、多裂肌(multifidus)、下颌舌骨肌(mylohyoid)、头下斜肌(obliquus capitis inferior)、头上斜肌(obliquuscapitis superior)、闭孔外肌(obturator externus)、闭孔内肌(obturator internus)、枕肌(occipitalis)、肩胛舌骨肌(omohyoid)、小指对掌肌(opponens digiti minimi)、拇对掌肌(opponens pollicis)、眼轮匝肌(orbicularis oculi)、口轮匝肌(orbicularisoris)、骨间掌侧肌(palmar interossei)、掌短肌(palmaris brevis)、掌长肌(palmarislongus)、耻骨肌(pectineus)、胸大肌(pectoralis major)、胸小肌(pectoralis minor)、腓短肌(peroneus brevis)、腓长肌(peroneus longus)、第三腓骨肌(peroneus tertius)、梨状肌(piriformis)、跖侧骨间肌(plantar interossei)、跖肌(plantaris)、颈阔肌(platysma)、腘肌(popliteus)、后斜角肌(posterior scalene)、旋前方肌(pronatorquadratus)、旋前圆肌(pronator teres)、腰大肌(psoas major)、股方肌(quadratusfemoris)、跖方肌(quadratus plantae)、头直前肌(rectus capitis anterior)、头侧直肌(rectus capitis lateralis)、头后大直肌(rectus capitis posterior major)、头后小直肌(rectus capitis posterior minor)、股直肌(rectus femoris)、大菱形肌(rhomboidmajor)、小菱形肌(rhomboid minor)、笑肌(risorius)、缝匠肌(sartorius)、小斜角肌(scalenus minimus)、半膜肌(semimembranosus)、头半棘肌(semispinalis capitis)、颈半棘肌(semispinalis cervicis)、胸半棘肌(semispinalis thoracis)、半腱肌(semitendinosus)、前锯肌(serratus anterior)、短回旋肌(short rotators)、比目鱼肌(soleus)、头棘肌(spinalis capitis)、颈棘肌(spinalis cervicis)、胸棘肌(spinalisthoracis)、头夹肌(splenius capitis)、颈夹肌(splenius cervicis)、胸锁乳突肌(sternocleidomastoid)、胸舌骨肌(sternohyoid)、胸骨甲状肌(sternothyroid)、茎突舌骨肌(stylohyoid)、锁骨下肌(subclavius)、锁骨下肌(subscapularis)、上孖肌(superiorgemellus)、上斜肌(superior oblique)、上直肌(superior rectus)、旋后肌(supinator)、冈上肌(supraspinatus)、颞肌(temporalis)、阔筋膜张肌(tensor fascia lata)、大圆肌(teres major)、小圆肌(teres minor)、胸肌(thoracis)、甲状舌骨肌(thyrohyoid)、胫前肌(tibialis anterior)、胫骨后肌(tibialis posterior)、斜方肌(trapezius)、肱三头肌(triceps brachii)、股中间肌(vastus intermedius)、股外侧肌(vastus lateralis)、股内侧肌(vastus medialis)、颧大肌(zygomaticus major)和颧小肌(zygomaticus minor)，以及所属领域中已知的任何其它合适的骨骼肌。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够通过任何合适方法施用到隔膜肌，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一些实施方案中，从ceDNA载体表达的转基因递送到靶组织还能够通过递送包含ceDNA载体的合成储槽来实现，其中将包含ceDNA载体的储槽植入骨骼肌、平滑肌、心肌和/或隔膜肌组织，或能够使肌肉组织与包含如本文所述的ceDNA载体的膜或其它基质接触。此类可植入基质或底物描述于美国专利第7,201,898号中，所述美国专利以全文引用的方式并入本文中。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于心肌包括施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。如本文所述的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、例如主动脉内施用、直接心脏注射(例如注入左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注而递送到心肌。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于平滑肌能够通过任何合适方法实现，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一个实施方案中，可以施用存在于平滑肌内、附近和/或平滑肌上的内皮细胞。平滑肌的非限制实例包括眼虹膜、肺细支气管、喉肌(声带)、胃肠道的胃、食道、小肠和大肠肌肉层、膀胱的输尿管、逼尿肌肌肉、子宫的子宫肌层、阴茎或前列腺腺体。
在一些实施方案中，将如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌。在中代表性实施方案中，根据本发明的ceDNA载体是用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或隔膜肌的病症。
具体地说，预期包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物能够递送到眼部的一种或多种肌肉(例如外直肌(Lateral rectus)、内直肌(Medial rectus)、上直肌(Superior rectus)、下直肌(Inferior rectus)、上斜肌(Superior oblique)、下斜肌(Inferior oblique))、面部肌肉(例如枕额肌(Occipitofrontalis muscle)、颞下颌肌(Temporoparietalis muscle)、降眉间肌(Procerus muscle)、鼻肌(Nasalis muscle)、降鼻中隔肌(Depressor septi nasi muscle)、眼轮匝肌(Orbicularis oculi muscle)、皱眉肌(Corrugator supercilii muscle)、降眉肌(Depressor supercilii muscle)、耳廓肌(Auricular muscles)、口轮匝肌(Orbicularis oris muscle)、降口角肌(Depressoranguli oris muscle)、笑肌(Risorius)、颧大肌(Zygomaticus major muscle)、颧小肌(Zygomaticus minor muscle)、提上唇肌(Levator labii superioris)、提上唇鼻翼肌(Levator labii superioris alaeque nasi muscle)、降下唇肌(Depressor labiiinferioris muscle)、提口角肌(Levator anguli oris)、颊肌(Buccinator muscle)、颏肌(Mentalis))或舌肌(例如颏舌肌(genioglossus)、舌骨舌肌(hyoglossus)、小角舌肌(chondroglossus)、茎舌肌(styloglossus)、腭舌肌(palatoglossus)、舌上纵肌(superiorlongitudinal muscle)、舌下纵肌(inferior longitudinal muscle)、舌直肌(verticalmuscle)、舌横肌(transverse muscle))。
(i)肌肉内注射：
在一些实施方案中，使用针能够将包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物注射到受试者的指定肌肉的一个或多个部位，例如骨骼肌(例如三角肌、股外侧肌、背外侧肌的侧臀肌，或婴儿的前外侧股)。包含ceDNA的组合物能够引入肌肉细胞的其它亚型中。肌肉细胞亚型的非限制性实例包括骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或隔膜肌细胞。
肌内注射的方法是本领域技术人员已知的，因此本文中不再详细描述。然而，当执行肌肉内注射时，应该基于患者的年龄和体型、组合物的粘度以及注射部位来确定适当的针头尺寸。表8提供了示例性注射部位和相应针头尺寸的指南：
表8：人类患者肌内注射指南
Figure BDA0003352315200001331
在某些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体按照小体积(例如如表8中针对指定受试者概述的示例性体积)配制。在一些实施方案中，必要时，受试者在注射之前，能够施用全身或局部麻醉剂。如果需要多次注射，或如果注射更深的肌肉，而非上文提及的常见注射部位，这是特别期望的。
在一些实施方案中，能够将肌肉内注射与以下组合：电穿孔、递送压力或使用转染试剂增强ceDNA载体的细胞吸收。
(ii)转染试剂
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体被配制成包含一种或多种转染试剂的组合物，以促进载体吸收到肌管或肌肉组织中。因此，在一个实施方案中，使用本文中别处所述的方法、通过转染将本文所述的核酸施用于肌肉细胞、肌管或肌肉组织。
(iii)电穿孔
在某些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在缺乏载剂的情况下施用以促进ceDNA进入细胞中，或在生理学上呈惰性的药学上可接受的载剂中(即，不改进或不增强无衣壳非病毒载体吸收到肌管中的任何载剂)施用。在此类实施方案中，通过对细胞或组织进行电穿孔能够促进无衣壳非病毒载体的吸收。
细胞膜天然地抵抗从细胞外传递到细胞的细胞质中。一种用于暂时减小这种抵抗力的方法是“电穿孔”，其中使用电场在细胞中产生孔隙而对细胞不引起持久性损伤。这些孔隙大足以允许DNA载体、医药、DNA和其它极性化合物触及细胞内部。细胞膜中的孔隙闭合并且细胞再次变得不可通透。
电穿孔能够用于体外和体内应用中以将例如外源DNA引入活细胞中。体外应用典型地是将活细胞样品与包含例如DNA的组合物混合。然后将细胞放在电极(例如平行板)之间并且向细胞/组合物混合物施加电场。
体内电穿孔的方法有多种；电极能够以多种配置提供，例如夹持表皮的测径规上覆于待处理的细胞区域上。替代地，可以将针形电极插入组织中，从而更深地触及所定位的细胞。在任一情况下，将包含例如核酸的组合物注射到处理区域之后，电极向所述区域施加电场。在一些电穿孔应用中，这个电场包含约10到60ms持续时间的约100到500V/cm的单一方波脉冲。此类脉冲可以通过例如Genetronics有限公司的分公司BTX制造的ElectroSquare Porator T820的已知应用产生。
典型地，仅当肌肉在施用组合物(例如注射到肌肉中)之后立即或不久加以电刺激时才成功地发生例如核酸的吸收。
在某些实施方案中，使用电场脉冲或使用低电压/长脉冲处理方案(例如使用方波脉冲电穿孔系统)达成电穿孔。能够产生脉冲电场的示例性脉冲发生器包括例如能够产生指数波形的ECM600，和能够产生方波形的ElectroSquarePorator(T820)，两者均获自BTX，Genetronics有限公司的分公司(加利福尼亚州圣地亚哥)。方波电穿孔系统递送可控的电脉冲，其快速地升高到设定电压，在那个水平保持设定的时间长度(脉冲长度)，然而快速地降到零。
在一些实施方案中，施用局部麻醉剂，例如通过在处理部位注射以减少疼痛，所述疼痛可能与组织在包含如本文所述的无衣壳非病毒载体的组合物存在下电穿孔有关。另外，本领域的技术人员将了解，应该选择最小化且/或防止过度组织损伤、以致肌肉发生纤维化、坏死或发炎的组合物剂量。
(iv)递送压力：
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体递送到肌肉组织是通过递送压力促进，其将大体积与快速注射到供应肢体的动脉(例如髂动脉)组合使用。这种施用模式能够通过多种方法达成，包括将包含ceDNA载体的组合物输注到肢体血管中，典型地同时使用血管钳压脉带将肌肉与全身循环分隔。在一种方法中，组合物通过肢体血管循环以容许外渗到细胞中。在另一方法中，提高血管内流体动力学压力以扩展血管床且增强ceDNA载体吸收到肌肉细胞或组织中。在一个实施方案中，将ceDNA组合物施用于动脉。
(v)脂质纳米颗粒组合物
在一些实施方案中，将肌肉内递送用的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体配制成包含如在本文别处所述的脂质体的组合物。
(vi)靶向肌肉组织的ceDNA载体的全身施用
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体配制成通过间接递送施用靶向肌肉，其中与肝脏相反，将ceDNA输送到肌肉。相应地，本文所述的技术涵盖将包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物间接施用于肌肉组织，例如通过全身施药。此类组合物能够通过体表、静脉内(通过推注或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、通过吸入、腹膜内、皮下、腔内施用，并且在必要时能够通过蠕动方式或通过所属领域的技术人员已知的其它方式递送。药剂能够全身性施用，例如通过静脉内输注(如果希望如此)。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体吸收到肌肉细胞/组织内是通过使用优先引导载体到肌肉组织中的靶向药剂或部分来增加。因此，在一些实施方案中，相较于无衣壳ceDNA载体存在于身体的其它细胞或组织中的量，无衣壳ceDNA载体能够在肌肉组织中浓缩。
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物进一步包含肌肉细胞的靶向部分。在其它实施方案中，所表达的基因产物包含对期望产生作用的组织具有特异性的靶向部分。靶向部分能包括能够靶向细胞或组织的细胞内、细胞表面或细胞外生物标志物、与其相互作用、与其偶联且/或结合至其的任何分子或分子复合物。生物标志物能包括例如细胞蛋白酶、激酶、蛋白质、细胞表面受体、脂质和/或脂肪酸。靶向部分能靶向、相互作用、偶联和/或结合到的生物标志物的其它实例包括与特定疾病有关的分子。举例来说，生物标志物能够包括涉及癌症发展的细胞表面受体，例如表皮生长因子受体和运铁蛋白受体。靶向部分能够包括(但不限于)结合到靶肌肉组织中所表达的分子的合成化合物、天然化合物或产物、巨分子实体、生物工程化分子(例如多肽、脂质、多核苷酸、抗体、抗体片段)以及小实体(例如小分子、神经传递素、底物、配体、激素和元素化合物)。
在某些实施方案中，靶向部分可以进一步包含受体分子，包括例如天然地识别靶细胞中的特定期望分子的受体。此类受体分子包括已经修饰以增强其与靶分子相互作用的特异性的受体、已经修饰以与受体天然不识别的所期望靶分子相互作用的受体，以及此类受体的片段(参见例如Skerra，2000，《分子识别杂志(J.Molecular Recognition)》，13:167-187)。优选的受体是趋化因子受体。示例性趋化因子受体已经描述于例如Lapidot等人，2002，《实验血液学(Exp Hematol)》，30:973-81和Onuffer等人，2002，《制药学趋势(Trends Pharmacol Sci)》，23:459-67。
在其它实施方案中，另外的靶向部分可以包含配体分子，包括例如天然地识别靶细胞的特定期望受体的配体，例如运铁蛋白(Tf)配体。此类配体分子包括已经修饰以增强其与靶受体相互作用的特异性的配体、已经修饰以与配体天然不识别的期望受体相互作用的配体，和此类配体的片段。
在仍其它实施方案中，靶向部分可以包含适体。适体是经选择可特异性结合到靶细胞的期望分子结构的寡核苷酸。适体典型地是类似于噬菌体呈现亲和力选择(又称为体外分子进化)的亲和力选择方法的产物。所述方法涉及执行亲和力分离的若干次串联迭代，例如使用致病免疫原所结合的固体载体执行；随后执行聚合酶链反应(PCR)以扩增结合到免疫原的核酸。每一轮亲和力分离由此从核酸群体中富集成功地结合期望免疫原的分子。以这种方式，可以“培育”随机核酸池，从而产生特异性结合靶分子的适体。适体典型地是RNA，但可以是DNA或其类似物或衍生物，例如(不限于)肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯核酸。
在一些实施方案中，靶向部分能够包含光可降解配体(即，‘笼状’配体)，所述配体通过例如聚焦光束释放，从而使无衣壳非病毒载体或基因产物靶向特定组织。
本文还预期组合物递送到受试者的一种或多种肌肉的多个部位。也就是说，能够在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个注射部位中进行注射。此类部位相对于单一肌肉的区域能够扩展或能够在多种肌肉之间分布。
B.将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于非肌肉位置
在另一个实施方案中，将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体施用于肝脏。可以将ceDNA载体引入眼部的区域，例如角膜和/或视神经。还可以将ceDNA载体引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体腺、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体；包括枕骨、颞叶、顶叶和额叶的大脑；皮质；基底神经节；海马和杏仁核(portaamygdala))、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。ceDNA载体可以被递送到脑脊髓液中(例如通过腰椎穿刺)。可以在血脑屏障已被扰动的情况下(例如脑瘤或大脑梗塞)，进一步将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体通过血管内施用于CNS。
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以通过所属领域中已知的任何途径施用眼部的一个或多个所需区域，所述途径包括(但不限于)：鞘内、眼内、大脑内、脑室内、静脉内(例如在如甘露糖醇的糖的存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如眼球筋膜囊下区(sub-Tenon's region))递送，以及逆行递送到运动神经元的肌肉内递送。
在一些实施方案中，用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在液体配制物中通过直接注射(例如立体定向注射)施用于CNS中的所需区域或区室中。在其它实施方案中，可以通过局部施加到期望区域或通过鼻内施用气雾剂配制物来提供ceDNA载体。可以通过局部施加液滴来施用至眼睛。作为另一替代方案，ceDNA载体能够作为固体、缓释型配制物施用(参见例如美国专利第7,201,898号)。在另外的实施方案中，ceDNA载体可用于逆行转运，以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例如，可以将ceDNA载体递送至肌肉组织，它可以从肌肉组织迁移到神经元中。
C.离体治疗
在一些实施方案中，从受试者中去除细胞，将如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体引入其中，然后将细胞替换回到受试者中。从受试者取出细胞进行离体处理、然后再引回到受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利第5,399,346号；其公开内容整体并入本文中)。可替代地，将ceDNA载体引入另一个个体的细胞，引入培养细胞中，或引入任何其他适合来源的细胞中，并将细胞施用有需要的个体。
经如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体转导的细胞优选以“治疗有效量”与医药载剂组合施用于受试者。所属领域的技术人员将了解，治疗效果不必是完全的或治愈的，只要给个体提供了一些益处即可。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够编码如本文所述的PAH蛋白(有时称为转基因或异源核苷酸序列)，所述抗体或融合蛋白是体外、离体或体内细胞中产生。举例来说，与在如本文所论述的治疗方法中使用本文所述的ceDNA载体相比，在一些实施方案中，可以将用于表达PAH蛋白的ceDNA载体引入所培养细胞中并且从细胞中分离出所表达的PAH蛋白，例如产生抗体和融合蛋白。在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的所培养细胞能够用于商业上生产抗体或融合蛋白，例如充当小或大规模生物制造抗体或融合蛋白的细胞源。在替代性实施方案中，将如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体引入宿主非人类受试者的细胞中，用于体内产生抗体或融合蛋白，包括小规模生产以及商业上大规模生产PAH蛋白。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够用于兽医学与医学应用中。如上所述的离体基因递送方法的合适受试者包括禽类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔)，以哺乳动物为优选。人类受试者是最优选的。人类受试者包括新生儿、婴儿、少年和成人。
D.剂量范围
本文提供了治疗方法，包含向受试者施用有效量的包含如本文所述的编码PAH蛋白的ceDNA载体的组合物。如熟练的从业者将了解，术语“有效量”是指ceDNA组合物的施用量，引起PAH蛋白以治疗PKU的“治疗有效量”表达。
可以任选地采用体内和/或体外分析来帮助鉴定使用的最佳剂量范围。制剂中准备采用的精确剂量还将取决于施用途径和病状严重度，并应根据本领域普通技术人员的判断和每个受试者的情况来决定。有效剂量可从源自于例如体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推断。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体是以足转染所期望组织的细胞且提供足够的基因转移和表达水平而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于上文在“施用”部分中所述的那些途径，例如直接递送至选定的器官(例如门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、肿瘤内和其它胃肠外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。
实现特定“治疗效果”所需的本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体量的剂量将基于若干因素而变化，这些因素包含(但不限于)：核酸施用途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症以及一种或多种基因、一种或多种RNA产物或一种或多种所得表达的蛋白质的稳定性。所属领域的技术人员可以基于前述的因素以及所属领域中熟知的其它因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的ceDNA载体剂量范围。
剂量方案可以调整，以提供最佳的治疗反应。例如，可以重复施用寡核苷酸，例如可以每天施用若干剂，或者可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少剂量。本领域普通技术人员将能够容易地确定主题寡核苷酸的适当剂量和施用计划，无论所述寡核苷酸是将施用于细胞还是受试者。
“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内，该范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(神经细胞将需要很少的量，而全身性注射将需要大量)。例如，对于体内直接注射到人类受试者的骨骼肌或心肌中，治疗有效剂量将为约1μg至100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体，那么可以通过实验确定治疗有效剂量，但预计递送1μg至约100g的载体。此外，治疗有效剂量是表达足量的转基因、从而对受试者起作用的ceDNA载体的量，其使得疾病的一种或多种症状减少，但不产生显著的脱靶或显著的不良副作用。在一个实施方案中，“治疗有效量”是所表达的PAH蛋白的量，所述量足以使PKU生物标志物的表达产生统计显著的可测量变化或使指定疾病症状产生统计显著的可测量减轻。指定的ceDNA载体组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的调配物是所属领域的技术人员熟知的，开发在多种治疗方案中使用本文所描述的特定组合物的适合的剂量和治疗方案也是所属领域技术人员熟知的。
对于体外转染来说，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体递送到细胞(1x106个细胞)的有效量将是约0.1到100μg ceDNA载体，优选1到20μg且更优选1到15μg或8到10μg ceDNA载体。ceDNA载体越大，需要的剂量越高。如果使用外泌体或微粒，那么可以通过实验确定有效的体外剂量，但意图递送大致相同量的ceDNA载体。
治疗PKU时，如本文所公开的表达PAH蛋白的ceDNA载体的适当剂量将取决于待治疗的疾病的特定类型、PAH蛋白类型、PKU的严重度和病程、此前疗法、患者的临床史和对抗体的应答，以及主治医师的判断。一次或经过一系列治疗将编码PAH蛋白的ceDNA载体适当地施用于患者。本文涵盖了各种给药方案，包括(但不限于)单次施药或在不同时间点上的多次施药、推注施药和脉冲输注。
视疾病的类型和严重度而定，ceDNA载体通过一次或多次分开施用或通过连续输注来施用，施用的量使得所编码的PAH蛋白以约0.3mg/kg到100mg/kg(例如15mg/kg-100mg/kg，或所述范围内的任何剂量)表达。ceDNA载体的一种典型日剂量足以引起所编码的PAH蛋白在约15mg/kg到100mg/kg或更大值范围内表达，此视上文提及的因素而定。ceDNA载体的一种示例性剂量是足以引起如本文所公开的经编码的PAH蛋白在约10mg/kg至约50mg/kg范围内表达的量。因此，量足以引起所编码的PAH蛋白表达以约0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、3mg/kg、4.0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg(或其任何组合)的ceDNA载体的一种或多种剂量可以施用于患者。在一些实施方案中，ceDNA载体是足以引起所编码PAH蛋白按照50mg到2500mg范围内的总剂量表达的量。ceDNA载体的示例性剂量是足以引起所编码的PAH蛋白的总表达为50mg、约100mg,200mg,300mg,400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约720mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2050mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg或约2500mg(或其任何组合)的量。由于PAH蛋白从ceDNA载体中的表达能够小心地通过本文中的调控开关或替代地通过施用于受试者的ceDNA载体的多种剂量控制，因此PAH蛋白从ceDNA载体中的表达能够以使得所表达的PAH蛋白的剂量可以间歇性地(例如每周、每两周、每三周、每四周、每个月、每两个月、每三个月或每六个月)从ceDNA载体中施用的方式加以控制。通过常规技术和分析能够监测此疗法的进展。
在某些实施方案中，ceDNA载体的施用量足以引起所编码的PAH蛋白以15mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg或均一剂量(例如300mg、500mg、700mg、800mg或更高)的剂量表达。在一些实施方案中，PAH蛋白从ceDNA载体中的表达受到控制，以使得PAH蛋白在一段时间内每天、每隔一天、每周、每2周或每4周表达。在一些实施方案中，PAH蛋白从ceDNA载体中的表达受到控制，以使得PAH蛋白在一段时间内每2周或每4周表达。在某些实施方案中，时间段是6个月、一年、十八个月、两年、五年、十年、15年、20年或患者一生。
治疗可以涉及施用单次剂量或多次剂量。在一些实施方案中，能够向受试者施用超过一次剂量；实际上，在需要时能够施用多次剂量，原因是ceDNA载体因缺乏病毒衣壳而诱发/不诱发抗衣壳宿主免疫应答。因此，本领域技术人员可以容易地确定适当剂量次数。施用的剂数可以例如1-100剂，优选地2-20剂的量级。
不希望受任何特定理论束缚，缺乏通过施用如本公开所描述的ceDNA载体(即，缺乏衣壳组分)所诱发的典型抗病毒免疫应答允许用于表达PAH蛋白的ceDNA载体在多种场合下施用于宿主。在一些实施方案中，将异源核酸递送至受试者的次数在2至10次的范围内(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次)。在一些实施方案中，向受试者递送ceDNA载体超过10次。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的剂量施用于受试者每个日历日(例如24小时时间段)不超过一次。在一些实施方案中，每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日向受试者施用一剂ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历周(例如7个日历日)不超过一次。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每两周不超过一次(例如两个日历周时间段为一次)。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历月不超过一次(例如30个日历日为一次)。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每六个日历月不超过一次。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历年(例如365天或闰年366天)不超过一次。
在特定实施方案中，超过一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以用于在不同间隔期(例如每日、每周、每月、每年等)内实现所期望的基因表达水平。
在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体所编码的治疗性PAH蛋白能够通过调控开关、诱导型或可抑制型启动子调控，使得其在受试者中表达至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长。在一个实施方案中，通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够达成表达。替代地，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够进一步包含基因编辑系统的组分(例如CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸内切酶等)以容许一种或多种核酸序列插入，所述一或多种核酸序列编码用于基本上持久治疗或“治愈”疾病的抗体。包含基因编辑组分的此类ceDNA载体公开于国际申请PCT/US18/64242中，并且能够包括5'和3'同源臂(例如SEQID NO:151-154，或与其具有至少40％、50％、60％、70％或80％同源性的序列)以便将编码PAH蛋白的核酸插入安全港区域，例如但不包括白蛋白基因或CCR5基因。例如，于2019年3月1日提交的国际专利申请PCT/US2019/020225中公开了表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包含至少一个基因组安全港(GSH)特异性同源臂，用于将PAH转基因插入基因组安全港中，该专利于，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。
治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的应答而定。初始较高治疗剂量之后，预期为连续的相对较低维持剂量。
E.单位剂型
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的药物组合物能够方便地以单位剂型呈递。单位剂型通常将适于药用组合物的一种或多种特定施用途径。在一些实施方案中，单位剂型适用于直接施用于眼睛的液滴。在一些实施方案中，单位剂型适合于通过吸入施用。在一些实施方案中，单位剂型适合于通过汽化器施用。在一些实施方案中，单位剂型适合于通过喷雾器施用。在一些实施方案中，单位剂型适合于通过气雾器施用。在一些实施方案中，单位剂型适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实施方案中，单位剂型适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。在一些实施方案中，单位剂型适用于视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
在一些实施方案中，单位剂型适合于鞘内或脑室内施用。在一些实施方案中，配制药物组合物以供局部施用。可以与载剂材料组合以产生单个剂型的活性成分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。
X.治疗方法
本文所描述的技术还展示了通过多种方式制备所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法和其使用方法，包含例如离体、非原位、体外和体内施用、方法、诊断程序和/或基因治疗方案。
在一个实施方案中，从如本文所公开的ceDNA载体中表达的经表达的治疗性PAH蛋白具有治疗疾病的功能。在一个优选实施方案中，治疗性PAH蛋白不引起免疫系统反应，除非期望如此。
本文提供了一种治疗受试者的PKU或病症的方法，包含将治疗有效量的如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体、任选地与药学上可接受的载剂一起引入有需要的靶细胞(例如肌肉细胞或组织，或其它受影响的细胞类型)。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所建构的ceDNA载体包含编码如本文所述的适用于治疗疾病的PAH蛋白的核苷酸序列。具体地说，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以包含可操作地连接到控制元件的所期望PAH蛋白序列，当引入受试者中时，所述控制元件能够引导由外源DNA序列编码的所期望PAH蛋白转录。如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够经由如上文和本文中别处所提供的任何适合途径施用。
本文公开了如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体组合物和配制物，其包括本发明的一种或多种ceDNA载体以及药学上可接受的一种或多种缓冲液、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含在一种或多种诊断或治疗试剂盒中，以用于诊断、预防、治疗或改善PKU的一种或多种症状。一方面，所述疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍是人疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍。
本文所描述技术的另一方面提供了一种向有需要的受试者提供诊断或治疗有效量的本文所述的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的方法，所述方法包括向有需要的受试者的细胞、组织或器官提供如本文公开的ceDNA载体，提供的量和时间有效地使PAH蛋白从ceDNA载体表达，从而为受试者提供诊断或治疗有效量的由ceDNA载体表达的PAH蛋白。在另一方面，受试者为人。
本文描述的技术的另一方面提供了一种用于诊断、预防、治疗或改善受试者的PKU、病症、功能障碍、损伤、异常病状或创伤的至少一种或多种症状的方法。就整体和一般意义而言，所述方法至少包括以足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能异常、损伤、异常病状或创伤的一种或多种症状的量和时间向有需要的受试者施用一种或多种所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的步骤。在这样的实施方案中，可以评估受试者的PAH蛋白的功效，或者，检测PAH蛋白或PAH蛋白在受试者中的组织定位(包括细胞和亚细胞定位)。因而，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够用作体内诊断工具，例如用于检测癌症或其它适应症。在另一方面，受试者为人。
另一方面是如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体用作治疗或减轻PKU或疾病状态的一种或多种症状的工具的用途。有许多遗传性疾病中的缺陷基因是已知的，并且通常分为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可以涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常但不总是以显性方式遗传。就不均衡的疾病状态而言，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够用于在模型系统中建立疾病状态，然后能够利用所述模型系统尝试抵消疾病状态。因此，本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体允许治疗遗传疾病。如本文所使用的，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡，可以治疗疾病状态。
A.宿主细胞
在一些实施方案中，如本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体将PAH蛋白转基因递送到受试者宿主细胞中。在一些实施方案中，细胞是感光细胞。在一些实施方案中，细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，受试者的宿主细胞是人宿主细胞，包括例如血细胞、干细胞、造血细胞、CD34+细胞、肝细胞、癌细胞、血管细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、神经细胞、视觉或视网膜细胞、上皮或内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞或任何其它哺乳动物来源的细胞，包括但不限于肝(即肝)细胞、肺细胞、心脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、隔膜细胞、肾(即肾)细胞、神经细胞、血细胞、骨髓细胞或预期进行基因治疗的受试者的任何一种或多种选定的组织。在一方面，个体的宿主细胞是人类宿主细胞。
本公开还涉及如上文所提及的重组宿主细胞，其包括如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体。因此，对于技术人员而言显而易见的是，可以根据目的使用多种宿主细胞。将如本文所公开的包括供体序列的用于表达PAH蛋白的构建体或ceDNA载体引入宿主细胞中，使得供体序列作为染色体整合体维持，如早先所描述。术语宿主细胞涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于供体序列和其来源。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是人细胞(例如原代细胞、干细胞或永生化细胞系)。在一些实施方案中，能够将如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体离体施用于宿主细胞，然后在基因疗法事件之后，递送到受试者。宿主细胞可以是任何细胞类型，例如体细胞或干细胞、诱导型多能干细胞或血细胞，例如T细胞或B细胞，或骨髓细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是同种异体细胞。例如，T细胞基因组工程可用于癌症免疫疗法、如HIV疗法的疾病调节(例如受体敲除，如CXCR4和CCR5)和免疫缺陷疗法。可靶向B细胞上的MHC受体进行免疫治疗。在一些实施方案中，能够将基因经修饰的宿主细胞(例如骨髓干细胞，例如CD34+细胞，或诱导多能干细胞)移植回到患者中用于表达治疗蛋白。
B.基因疗法的其它疾病
一般来说，如本文所公开的用表达PAH蛋白的ceDNA载体能够用于递送根据上述说明的任何PAH蛋白以治疗、预防或改善与任何病症有关的症状，所述病症与受试者的异常蛋白质表达或基因表达有关。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可用于将PAH蛋白递送至骨骼肌、心肌或膈肌，以产生用于在血液中分泌和循环的PAH蛋白或用于全身递送至其他组织以治疗、改善和/或预防PKU。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够通过任何适合方式，任选地通过施用受试者所吸入的包含ceDNA载体的可吸入颗粒的气雾剂悬浮液施用于受试者的肺。可吸入粒子可以是液体或固体。包含ceDNA载体的液体颗粒的气雾剂可以通过任何合适的手段产生，例如用压力驱动的气雾剂喷雾器或超声喷雾器，如本领域技术人员所知。参见例如美国专利第4,501,729号。包含ceDNA载体的固体粒子的气雾剂也可以通过制药领域已知的技术，用任何固体粒子药物气雾剂发生器产生。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够施用于CNS组织(例如脑、眼)。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体可以治疗、改善或预防的眼病包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科病症(例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变和其它视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关黄斑变性、青光眼)。许多眼科疾病和病症与以下三种类型适应症中的一种或多种有关：(1)血管产生、(2)炎症和(3)变性。在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体可以用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞变性、促进细胞免毒或促进细胞生长的因子以及前述的组合。例如，糖尿病性视网膜病的特征是血管产生。通过眼内(例如玻璃体内)或眼周(例如眼球筋膜囊下区域)递送一种或多种抗血管产生抗体或融合蛋白能够治疗糖尿病性视网膜病变。可以用本发明的ceDNA载体治疗、改善或预防的其它眼病包括：地图样萎缩、血管性或“湿性”黄斑变性、PKU、雷伯氏先天性黑蒙(LCA)、尤塞氏综合征、弹力纤维性假黄瘤(PXE)、x-连锁视网膜色素变性(XLRP)、x-连锁视网膜劈裂症(XLRS)、无脉络膜症、雷伯氏遗传性视神经病变(LHON)、全色盲、视锥-视杆细胞营养不良、富克斯角膜内皮营养不良、糖尿病性黄斑水肿以及眼癌和肿瘤。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够治疗、改善或预防炎性眼疾病或病症(例如葡萄膜炎)。通过眼内(例如玻璃体或前房)施用如本文所公开的ceDNA载体能够表达一种或多种消炎抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体能够编码与转基因有关的PAH蛋白，所述转基因编码报告子多肽(例如酶，例如绿色荧光蛋白，或碱性磷酸酶)。在一些实施方案中，编码可用于实验或诊断目的的报告蛋白的转基因选自下列中的任何一种：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其它转基因。在一些方面中，表达连接到报告子多肽的PAH蛋白的ceDNA载体可以用于诊断目的，以及测定ceDNA载体在其所施用到的受试者中的功效或用作ceDNA载体在所述受试者中的活性的标志物。
C.使用ceDNA载体测试成功的基因表达
所属领域中众所周知的分析能够用于测试ceDNA载体对PAH蛋白的基因递送的效率，所述测试能够在体外和体内模型中进行。所属领域的技术人员通过测量PAH蛋白的mRNA和蛋白质水平(例如逆转录PCR、蛋白质印迹分析，和酶联免疫吸附分析(ELISA))能够评估ceDNA对PAH蛋白的表达水平。在一个实施方案中，ceDNA包含能够用于评估PAH蛋白表达的报道蛋白，例如通过荧光显微术或发光读盘器检查报道蛋白的表达。体内施用时，蛋白质功能测定能够用于测试给定PAH蛋白的功能，以确定基因表达是否已经成功地发生。熟练的技术人员将能够确定最佳的测试来体外或体内测量ceDNA载体所表达的PAH蛋白的功能。
本文中预期PAH蛋白通过ceDNA载体在细胞或受试者中的基因表达效应能够持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少10个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年，或能够持久存在。
在一些实施方案中，本文所描述的表达盒、表达构建体或ceDNA载体中的PAH蛋白可以针对宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人(例如人源化)等所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。使用例如Aptagen的Gene
Figure BDA0003352315200001461
密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司)或其它公共数据库可以确定优化密码子。
D.通过评估来自ceDNA载体的PAH蛋白表达来确定功效
所属领域中已知的用于测定蛋白表达的基本上任何方法能够用于分析PAH蛋白从ceDNA载体中的表达。此类方法/分析的非限制性实例包括酶联免疫分析(ELISA)、亲和力ELISA、ELISPOT、连续稀释、流式细胞术、表面等离子体共振分析、动力学排除分析、质谱学、蛋白质印迹、免疫沉淀和PCR。
为了评估体内PAH蛋白表达，可以从受试者获得生物样品进行分析。示例性生物样品包括生物流体样品、体液样品、血液(包括全血)、血清、血浆、尿液、唾液、切片和/或组织样品等。生物样品或组织样品还可以指从个体中分离出的组织或流体样品，包括(但不限于)肿瘤切片、粪便、脊髓液、胸膜液、乳头抽出物、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、泪液、唾液、母乳、细胞(包括(但不限于)血细胞)、肿瘤、器官，以及体外细胞培养液成分的样品。术语还包括上述样品的混合物。术语“样品”还包括未处理或预处理(或预处理)的生物样品。在一些实施方案中，用于本文描述的分析和方法的样品包含从待测受试者收集的血清样品。
E.通过临床参数确定表达的PAH蛋白的功效
由ceDNA载体表达的给定PAH蛋白对PKU的功效(即功能性表达)可由熟练的临床医生确定。然而，在如本文所述的编码治疗PAH蛋白的ceDNA载体治疗之后，如果PKU的任一种或所有征象或症状以有益方式改变或临床上接受的其它症状或疾病标志物改良或改善例如至少10％，则治疗在所述术语在本文使用时被视为“有效治疗”。还可以根据个体未发生恶化来测量功效，如通过PKU的稳定或对医疗干预的需求(即，疾病的进展停止或至少减缓)所评估。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制(例如遏制)PKU或减缓PKU的进展；或(2)缓解PKU，例如引起PKU症状消退；以及(3)阻止或减小PKU疾病发展的可能性，或预防与PKU相关的继发疾病/病症。治疗疾病的有效量是指当施用于有需要的哺乳动物时足以产生对该疾病有效治疗的量，所述术语如本文所定义。药剂功效能够通过评估PKU疾病所特有的身体指标来测定。医生可以评估PKU的任何一种或多种临床症状，包括：**(i)定期饮食时降低血清苯胺(Phe)水平。Phe的降低是PKU治疗开发中的关键生物标志物；(ii)在正常饮食中恢复Phe与酪氨酸的代谢比。该通路负责神经递质的产生；和/或(iii)评估降低的血清Phe水平。
XI.表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体的各种应用
如本文所公开，如本文所述用于表达PAH蛋白的组合物和ceDNA载体能够用于表达用于一系列目的的PAH蛋白。在一个实施方案中，表达PAH蛋白的ceDNA载体能够用于建立含有转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究PKU的功能和疾病进展。在一些实施方案中，表达PAH蛋白的ceDNA载体可用于治疗、预防或改善哺乳动物受试者的PKU状态或病症。
在一些实施方案中，PAH蛋白在受试者中能够以足以治疗与基因产物的表达增强、活性提高或基因的不当上调有关的疾病的量从ceDNA载体中表达。
在一些实施方案中，PAH蛋白在受试者中能够以足以治疗与蛋白质的表达减少、表达缺乏或功能异常有关的疾病的量从ceDNA载体中表达。
所属领域的普通技术人员应了解，转基因可以不是自身转录的基因的开放阅读框架，相反，其可以是靶基因的启动子区域或抑制子区域，并且ceDNA载体可以修饰此类区域，结果使如此调节PAH基因的表达。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的组合物和ceDNA载体可用于递送PAH蛋白以用于如上所述的各种目的。
在一些实施方案中，转基因编码一种或多种可用于治疗、改善或预防哺乳动物受试者的PKU状态的PAH蛋白。ceDNA载体所表达的PAH蛋白以足以治疗与异常基因序列有关的PKU的量施用于患者，从而能够产生以下中的任何一种或多种：增强的蛋白质表达、蛋白质的过度活性、靶基因或蛋白质的表达减少、表达缺乏或功能异常。
在一些实施方案中，设想本文公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体用于诊断和筛选方法中，其中使转基因瞬时或稳定表达于细胞培养系统中，或可替代地，表达于转基因动物模型中。
本文所述技术的另一方面提供了一种用如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体转导哺乳动物细胞群的方法。从总体和一般意义上讲，所述方法至少包含以下步骤：将包含有效量的一种或多种如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体的组合物引入所述群体的一个或多个细胞中。
另外，本发明提供了组合物以及治疗和/或诊断试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体或ceDNA组合物，所述ceDNA载体或ceDNA组合物与一种或多种另外的成分一起配制，或备有一个或多个关于其使用的说明书。
如本文所公开的用于表达PAH蛋白的ceDNA载体所施用的细胞可以是任何类型，包括(但不限于)神经细胞(包括末梢和中枢神经系统的细胞，具体地说，脑细胞)、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞、树突状细胞、胰脏细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质细胞、纤维母细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等等。可替代地，细胞可以是任何祖细胞。作为另一个替代方案，细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为又一个替代方案，细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。此外，如上文指出，细胞可以来自任何物种来源。
A.表达PAH的ceDNA载体的生产和纯化
本文公开的ceDNA载体将用于在体外或体内产生PAH蛋白。以这种方式产生的PAH蛋白能够分离出来，针对期望的功能加以测试，并且经过提纯以便进一步用于研究或治疗性治疗。每种蛋白产生系统具有其自身的优点/缺点。虽然体外产生的蛋白能够轻松地提纯且能够在短时间内产生蛋白，但体内产生的蛋白能够具有翻译后修饰，例如糖基化。
使用所属领域的技术人员已知的任何方法(例如离子交换色谱、亲和层析、沉淀或电泳)能够将使用ceDNA载体产生的PAH治疗蛋白提纯。
能够测试通过本文所述的方法和组合物产生的PAH治疗蛋白对所期望的靶蛋白的结合。
实例
以下实例是为了说明而非限制而提供。本领域普通技术人员将了解，可以从本文所述的任何野生型或修饰ITR中构建ceDNA载体，并且以下示例性方法可以用于构建和评估这类ceDNA载体的活性。尽管所述方法以某些ceDNA载体为例，但与描述一致，它们可应用于任何ceDNA载体。
实例1：使用基于昆虫细胞的方法构建ceDNA载体
PCT/US18/49996的实例1中描述了使用多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体，所述文献以全文引用的方式并入本文中。例如，用于生成本发明的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒。不受理论束缚，在容许的宿主细胞中，在例如Rep存在下，具有两个对称ITR(其中至少一个ITR相对于野生型ITR序列经修饰)和表达构建体的多核苷酸构建体模板复制而产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，通过Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。
产生ceDNA载体的一种示例性方法是从如本文所描述的ceDNA-质粒产生。参考图1A和1B，ceDNA-质粒中的每一种的多核苷酸构建体模板均包括左修饰ITR和右修饰ITR，在ITR序列之间具有以下：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后反应元件(例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))；以及(iv)聚腺苷酸化信号(例如，来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框架。将这些序列克隆到从ThermoFisher Scientific获得的pFastBac HT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAX
Figure BDA0003352315200001491
DH10BacTM感受态细胞，赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以产生重组ceDNA-杆粒。通过在含有X-gal和IPTG，利用抗生素选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒的细菌琼脂平板上大肠杆菌(E.coli)中基于蓝白筛选来筛选正向选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)来选择重组杆粒。挑选出由破坏-半乳糖苷指示基因的转座所造成的白色菌落，并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染至Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃下在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒颗粒。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡培育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃下维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18-19nm直径(从14-15nm的原初直径)和～4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒颗粒。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体地，用P1杆状病毒按下列稀释度处理4×20ml 2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并且在25℃-27℃下温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4至5天中每天细胞存活率的变化来测定感染性。
如PCT/US18/49996的图8A中所公开的“Rep-质粒”(所述文献以全文引用的方式并入本文中)在pFASTBACTM-Dual表达载体(赛默飞世尔)中产生，所述表达载体包含Rep78(SEQID NO:131或133)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep40(SEQ ID NO:129)。依循制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAX
Figure BDA0003352315200001501
DH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间重组，以产生重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上大肠杆菌中包含蓝白筛选的正向选择(Φ80dlacZΔM15标记提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)来选择重组杆粒。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、遗传霉素(gentamicin)、四环素的LB肉汤)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染未处理的原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒颗粒。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地，用P1杆状病毒按下列稀释度处理四个20mL的2.5×106个细胞/mL的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体产生和表征
参考图4B，然后将含有(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上述Rep杆状病毒二者之一的Sf9昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率加入到新鲜的Sf9细胞培养物(2.5E+6个细胞/毫升，20ml)中。然后将细胞在25℃下以130rpm培养。共同感染4-5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18nm-20nm并且活力为约70％-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用凯杰(Qiagen)MIDI PLUSTM纯化方案(凯杰，每个柱处理0.2mg细胞团粒质量)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和提纯的ceDNA载体的产量。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所述)获得的DNA，进一步分析分离的ceDNA载体的结构，所述限制性核酸内切酶是针对以下条件选择的：a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得到的片段足够大，以便在0.8％变性琼脂糖凝胶上进行分级分离时被清楚看到(>800bp)。如图4D和图4E所示，具有非连续结构的线性DNA载体以及具有线性且连续结构的ceDNA载体可以通过它们反应产物的大小来区分-例如，预计具有非连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的非衣壳化载体预计产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价闭合端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价闭合的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价闭合的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4D)。
如本文中所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下的琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA载体的分析法”是指通过进行限制性核酸内切酶消化、然后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA闭合端的分析法。后面是一种此类示例性分析，尽管所属领域的普通技术人员将了解，对这个实例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大致1/3×和2/3×的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRATMMICROSPINTMG-25柱，是核酸内切酶消化的一些本领域已知的选项。所述测定包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)加入10x变性溶液(10x＝0.5MNaOH、10mM EDTA)，加入10X染料，不进行缓冲，并与通过添加入10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。本领域普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1×TBE或TAE中中和，并转移到蒸馏水或含1×SYBR金的1×TBE/TAE中。然后使用例如赛默飞世尔
Figure BDA0003352315200001521
金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和落射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。举例来说，若基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，则存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可用于测定ceDNA载体所占的总输入的百分比或纯度百分比。
出于比较目的，实例1描述了使用基于昆虫细胞的方法和多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体，并且还描述于PCT/US18/49996的实例1中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。举例来说，根据实例1用于产生本发明的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒，和/或ceDNA-杆状病毒。不受理论束缚，在容许的宿主细胞中，在例如Rep存在下，具有两个对称ITR(其中至少一个ITR相对于野生型ITR序列经修饰)和表达构建体的多核苷酸构建体模板复制而产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，通过Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。
在使用昆虫细胞的方法中产生ceDNA载体的示例性方法是通过如本文所述的ceDNA-质粒。参考图1A和1B，ceDNA-质粒中的每一种的多核苷酸构建体模板均包括左修饰ITR和右修饰ITR，在ITR序列之间具有以下：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后反应元件(例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))；以及(iv)聚腺苷酸化信号(例如，来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框架。将这些序列克隆到从赛默飞世尔科技公司获得的pFastBac HT B质粒中。
实例2：通过切除从双链DNA分子产生合成的ceDNA
ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实例2-6中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简单来说，使用双链DNA构建体可以产生ceDNA载体，参见例如PCT/US19/14122的图7A-8E。在一些实施方案中，双链DNA构建体是ceDNA质粒，例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。
在一些实施方案中，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所述的调控开关。
出于说明的目的，实例2描述了ceDNA载体的产生，所述ceDNA载体是使用此方法产生的示例性闭合端DNA载体。然而，虽然这个实例中以ceDNA载体为例来说明产生闭合端DNA载体的体外合成产生方法，其通过切除包含ITR和表达盒(例如异源核酸序列)的双链多核苷酸、随后如本文所述将自由的3'和5'端接合来实现，但所属领域的普通技术人员了解，能够如上所说明修饰双链DNA多核苷酸分子，以便产生任何所期望的闭合端DNA载体，包括(但不限于)狗骨状DNA、哑铃状DNA等等。能够利用实例2中所述的合成产生方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA载体论述于标题为“III.通用ceDNA载体”的章节中。由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白描述于标题为“IIC.由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白”的章节中。
所述方法包括(i)从双链DNA构建体中切除编码表达盒的序列和(ii)在一个或多个ITR处形成发夹和(iii)通过接合(例如通过T4 DNA连接酶)将自由的5'与3'端连接。
双链DNA构建体按照5’到3’次序包含：第一限制性核酸内切酶位点；上游ITR；表达盒；下游ITR；以及第二限制性核酸内切酶位点。然后使双链DNA构建体与一种或多种限制核酸内切酶接触，以在两个限制性核酸内切酶位点处均产生双链断裂。一种核酸内切酶可以靶向两个位点，或每个位点可以被不同的限制性内切酶靶向，只要限制性位点不存在于ceDNA载体模板内即可。由此将限制性核酸内切酶位点之间的序列从双链DNA构建体的其余部分中切除(参见PCT/US19/14122的图9)。接合后，形成闭合端DNA载体。
所述方法中使用的一个或两个ITR可以是野生型ITR。也可以使用经修饰的ITR，其中所述修饰能够包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代(参见例如PCT/US19/14122的图6-8和10；图11B)，并且可以具有两个或更多个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图6-8；图11B)或单个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图10A-10B、图11B)。通过对现有寡核苷酸进行基因修饰或通过重新生物学和/或化学合成能够产生发夹环经修饰的ITR。
在一个非限制性实例中，左和右ITR-6(SEQ ID NO:111和112)在B-B'和C-C'臂中包括来自AAV2的野生型ITR的40个核苷酸的缺失。经修饰的ITR中剩余的核苷酸预测可形成单个发夹结构。展开结构的吉布斯自由能(Gibbs free energy)是约-54.4千卡/摩尔。还可以对ITR产生其它修饰，包括功能Rep结合位点或Trs位点的任选缺失。
实例3：经由寡核苷酸构建来产生ceDNA
使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实例3中，所述专利以全文引用的方式并入本文中，其中ceDNA载体是通过合成5’寡核苷酸和3’ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122的图11B展示了将5’ITR寡核苷酸和3’ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。
如本文所公开，ITR寡核苷酸能够包含WT-ITR(参见例如图3A、图3C)，或经修饰的ITR(参见例如图3B和图3D)。(还参见例如PCT/US19/14122的图6A、6B、7A和7B，所述文献全文并入本文中)。示例性ITR寡核苷酸包括(但不限于)SEQ ID NO:134-145(参见例如PCT/US19/14122的表7)。经修饰的ITR可以包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。可以通过基因修饰或生物和/或化学合成来生成用于无细胞合成的包含如本文所描述的WT-ITR或mod-ITR的ITR寡核苷酸。如本文所讨论，实例2和3中的ITR寡核苷酸可以包含WT-ITR，或呈对称或不对称构型的经修饰的ITR(mod-ITR)，如本文所讨论。
实例4：通过单链DNA分子产生ceDNA
使用合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实例4中，所述申请以全文引用的方式并入本文中，并且所述示例性方法使用包含两个有义ITR的单链线性DNA，所述两个有义ITR侧接有义表达盒序列并且共价附接到与反义表达盒侧接的两个反义ITR，然后将所述单链线性DNA的末端接合以形成闭合端单链分子。一个非限制性实例包含合成和/或产生单链DNA分子、使所述分子的各部分粘接以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子，然后使自由的5’与3’端彼此接合以形成闭合的单链分子。
用于产生ceDNA载体的示例性单链DNA分子从5’到3’包含：有义第一ITR；有义表达盒序列；有义第二ITR；反义第二ITR；反义表达盒序列；以及反义第一ITR。
用于实例4的示例性方法的单链DNA分子可以通过本文所描述的任何DNA合成方法形成，例如体外DNA合成，或通过用核酸酶使DNA构建体(例如质粒)裂解并将所得的dsDNA片段解链以提供ssDNA片段来提供。
通过将温度降低到低于有义和反义序列对的所计算的解链温度可以实现粘接。解链温度取决于特定核苷酸碱基含量和所用溶液的特征，例如盐浓度。任何给定序列的解链温度和溶液组合容易由所属领域的普通技术人员计算出。
所粘接分子的自由5’和3’端可以彼此接合，或与发夹分子接合而形成ceDNA载体。适合的示例性接合方法和发夹分子描述于实例2和3中。
实例5：ceDNA的提纯和/或产生确认
通过本文所述方法(包括例如实例1中所述的基于昆虫细胞的产生方法或实例2到4中所述的合成产生方法)产生的任一种DNA载体产物能够使用所属领域的技术人员通常已知的方法加以提纯，例如去除杂质、未使用的组分或副产物；且/或能够加以分析，从而确认所产生的DNA载体(在此情况下是ceDNA载体)是所期望的分子。用于提纯DNA载体(例如ceDNA)的示例性方法是使用Qiagen Midi Plus提纯方案(Qiagen)和/或凝胶提纯。
以下是用于确认ceDNA载体身份的示例性方法。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
分离出的ceDNA载体的结构进一步如下分析：用根据以下所选的限制核酸内切酶消化经提纯的DNA：a)ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得片段当在0.8％变性琼脂糖凝胶上分级分离时大得足以清晰可见(>800bp)。如图4C和4D中所说明，具有非连续结构的线性DNA载体和具有线性连续结构的ceDNA载体能够根据其反应产物的尺寸区分，举例来说，具有非连续结构的DNA载体预期产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的ceDNA载体预期产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价闭合端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价闭合的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价闭合的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。另外，由于多聚体DNA载体存在端对端连接，因此DNA载体的单体、二聚和n聚形式的消化都将解析为相同尺寸的片段(参见图4E)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA闭合端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管本领域普通技术人员将了解，对这个实例可以进行许多本领域已知的变化。选择限制核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大致1/3×和2/3×的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR提纯试剂盒或脱盐“离心柱”(例如GE HEALTHCARE ILUSTRA MICROSPIN G-25柱)是本领域中已知用于内切核酸酶消化的一些选项。分析包括例如：i)用适当限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR提纯试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)添加10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mMEDTA)，添加10X染料，不缓冲，且分析，且通过在预先用1mM EDTA和200mM NaOH培育的0.8-1.0％凝胶上添加10X变性溶液直至4x来制备DNA梯，以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均一；以及在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑凝胶。本领域普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1×TBE或TAE中中和，并转移到蒸馏水或含1×SYBR金的1×TBE/TAE中。然后使用例如赛默飞世尔
Figure BDA0003352315200001571
金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和落射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。前述基于凝胶的方法通过从凝胶色带中分离出ceDNA载体且允许其复性而能够根据提纯目的调整。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何本领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。举例来说，若基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，则存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可用于测定ceDNA载体所占的总输入的百分比或纯度百分比。
实例6：ceDNA的可控转基因表达：加打施用能够维持和/或增加体内ceDNA载体的转基因表达
使用包含CAG启动子(SEQ ID NO:72)和侧接于不对称ITR(例如5'WT-ITR(SEQ IDNO:2)与3'mod-ITR(SEQ ID NO:3)之间的荧光素酶转基因(SEQ ID NO:56)的ceDNA质粒作为示例性PAH，根据以上实例1所述的方法产生ceDNA载体，且在不同体内治疗方案中进行评估。实例6到10所述的所有后续实验中都使用这种ceDNA载体。在实例6中，提纯ceDNA载体且配制成脂质纳米颗粒(LNP ceDNA)且注射到每只
Figure BDA0003352315200001572
IGS小鼠的尾静脉中。脂质体是用适合的脂质掺混物配制而成，所述脂质掺混物包含四种组分以形成脂质纳米颗粒(LNP)脂质体，包括阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG-脂质。
为了评估ceDNA载体在体内在长时间段内对转基因的持续表达，通过尾静脉的静脉内注射将存在于无菌PBS中的LNP-ceDNA施用于大约5到7周龄的
Figure BDA0003352315200001573
IGS小鼠。评估三个不同剂量组：0.1mg/kg、0.5mg/kg和1.0mg/kg，每组十只小鼠(除1.0mg/kg之外，每组15只小鼠)。第0天施用注射液。每组五只小鼠在第28天另外注射相同剂量。静脉内施用于
Figure BDA0003352315200001574
IGS小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)；野生型小鼠)之后，通过IVIS成像来测量荧光素酶表达。在第3、4、7、14、21、28、31、35和42天，以及在第42天至第110天之间常规地(例如每周、每两周，或每10天或每2周)腹膜内注射150mg/kg荧光素底物之后，通过IVIS成像来评估荧光素酶表达。作为示例性PAH的荧光素酶转基因表达通过IVIS成像测量，持续3种不同施用方案之后的至少132天(数据未示出)。
为了研究重复剂量(例如再施用)的表达荧光素酶的LNP-ceDNA对经LNP-ceDNA治疗的受试者的效果，进行了扩展研究。具体地说，评估其以确定一次或多次额外施用ceDNA载体是否能够增加表达水平。
在此研究中，在第0天和第28天初始静脉内施用1.0mg/kg(即，预致敏剂量)之后，通过IVIS评估ceDNA载体的荧光素酶表达在
Figure BDA0003352315200001581
IGS小鼠中的生物分布(A组)。ceDNA载体的第二次施用是在第84天，经由尾静脉注射3mg/kg(B组)或10mg/kg(C组)，以1.2mL施用于尾静脉。在此研究中，A、B和C组各自使用五(5)只
Figure BDA0003352315200001582
小鼠。如上文所述，在第49、56、63和70天额外给药之前，且在第84天和第91、98、105、112和132天重复剂量后，对小鼠中的荧光素酶表达进行IVIS成像。评估且检测到所有三个组A、B和C的荧光素酶表达直到至少110天(所评估的最长时间段)。
显示LNP-ceDNA-Luc重复剂量(即，ceDNA组合物再施用)使荧光素酶表达水平增加，如通过在荧光素存在下评估荧光素酶活性所测定。作为示例性PAH的荧光素酶转基因表达通过IVIS成像测量，持续3种不同施用方案之后的至少110天(A、B和C组)。在研究期间，对于尚未给予任何额外重复剂量(1mg/kg预致敏剂量(即，A组))治疗的小鼠观察到稳定的荧光素酶表达。已施用3mg/kg ceDNA载体重复剂量的B组小鼠的辐射度观察值相对于C组小鼠增加大约七倍。惊人地，重复给药10mg/kg ceDNA载体的小鼠的荧光素酶辐射度观察值相对于未接受任何重复剂量的小鼠(A组)增加17倍。
在第0和28天静脉内施用1mg/kg ceDNA载体于尾静脉之后，A组的
Figure BDA0003352315200001583
IGS小鼠显示荧光素酶表达。B组和C组显示在第一时间点(第0天)施用1mg/kg ceDNA载体且在第二时间点第84天重复给药施用ceDNA载体的
Figure BDA0003352315200001584
IGS小鼠的荧光素酶表达。ceDNA载体的第二次施用(即，重复剂量)使表达增加至少7倍、甚至高达17倍。
B组重复剂量施用的ceDNA载体的剂量(即，量)的3倍增加(即，重复剂量施用3mg/kg)引起荧光素酶表达增加7倍。还意外的是，C组重复剂量施用ceDNA载体的量增加10倍(即，重复剂量施用10mg/kg)引起荧光素酶表达增加17倍。因此，ceDNA的第二次施用(即，重复剂量)使表达增加至少7倍、甚至高达17倍。这表明，重复剂量引起的转基因表达增加大于预期且依赖于ceDNA载体在重复剂量施用时的剂量或量，且似乎与第0天的初始预致敏施用引起的初始转基因表达协同作用。也就是说，转基因表达的剂量依赖性增加不具有相加作用；相反，转基因表达水平具有剂量依赖性且大于在每个时间点所施用的ceDNA载体的量的总和。
相较于未在第二时间点给予ceDNA载体的对照小鼠(A组)，B组和C组均显示荧光素酶表达有明显的剂量依赖性增加。综合而言，这些数据表明ceDNA载体对转基因的表达能够通过在至少第二时间点重复给药(即，再施用)ceDNA载体、以剂量依赖性方式增加。
综合而言，这些数据表明转基因(例如来自ceDNA载体的PAH)的表达水平能够在持续的水平保持至少84天且至少在第二时间点施用ceDNA载体重复剂量之后能够在体内增加。
实例7：LNP配制的ceDNA载体在体内的持续转基因表达
评估具有不同脂质纳米颗粒的实例6的结果在体内、在小鼠中的再现性。小鼠在第0天给予包含由CAG启动子驱动的荧光素酶转基因的ceDNA载体，所述ceDNA载体囊封于与实例6中所用不同的LNP中或包含polyC、但缺乏ceDNA或荧光素酶基因的相同LNP中。具体地说，大约4周龄的雄性
Figure BDA0003352315200001591
小鼠在第0天通过单次注射0.5mg/kg LNP-TTX-荧光素酶或对照LNP-polyC(静脉内经由侧向尾静脉施用)来处理。第14天，动物经由腹膜内注射2.5mL/kg全身性给予150mg/kg荧光素。荧光素施用之后的大约15分钟，使用体内成像系统(“IVIS”)对每只动物进行成像。
如图7中所示，观察到所有四只经ceDNA处理的小鼠的肝脏中存在明显荧光，并且除注射部位之外，在动物中观察到的其它荧光极少，表明LNP介导ceDNA构建体发生肝脏特异性递送且递送的ceDNA载体在施用之后至少两周能够控制其转基因的持续表达。
实例8：体内施用ceDNA载体引起的转基因在肝脏中的持续表达
在单独实验中，评估LNP递送的ceDNA在经处理动物的肝脏内的定位。将包含所关注的功能转基因的ceDNA载体囊封于实例7所用的相同LNP中且以0.5mg/kg的剂量水平、通过体内静脉内注射施用于小鼠。6小时之后，终结小鼠且取肝脏样品，用福尔马林固定且使用标准方案进行石蜡包埋。进行
Figure BDA0003352315200001592
原位杂交分析，以使用对ceDNA转基因具特异性的探针使组织内的ceDNA载体可视化且利用显色反应和苏木精染色(Advanced CellDiagnostics)进行检测。图8显示了结果，其表明ceDNA存在于肝细胞中。
实例9：ceDNA在体内发生的持续眼转基因表达
评估ceDNA载体转基因表达在除肝脏之外的组织中的可持续性，以测定在眼施用之后，ceDNA载体在体内的耐受性和表达。尽管荧光素酶在实例9中被用作示例性转基因，但是本领域普通技术人员可容易地用来自表5中列出那些的PAH序列代替荧光素酶转基因。
第0天，向大约9周龄的雄性史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rats)视网膜下注射使用
Figure BDA0003352315200001593
转染试剂(Polyplus)配制的5μL包含荧光素酶转基因的ceDNA载体或使用
Figure BDA0003352315200001594
配制的编码荧光素酶的质粒DNA，两者浓度均为0.25μg/μL。每组测试四只大鼠。给动物服镇静剂且使用33号针在右眼视网膜下注射测试制品。每只动物的左眼不处理。注射之后立即利用光学相干断层扫描或眼底成像来检查眼以便确认视网膜下水泡的存在。大鼠根据标准程序用丁基原啡因(buprenorphine)和体表抗生素软膏处理。
第7、14、21、28和35天，两组动物在荧光素施用后的5到15分钟，经由腹膜内注射(2.5mL/kg)全身性给予150mg/kg新制荧光素，所有动物均在异氟醚麻醉下的同时使用IVIS成像。在5分钟暴露期间，获得包含眼的所关注区域内的总通量[p/s]和平均通量(p/s/sr/cm2)。结果作为每个处理组的经处理的眼(“注射”)的平均辐射度相对于每个处理组的未处理眼(“未注射”)的平均辐射度的图形表示(图9B)。在ceDNA载体处理的眼中容易检测到明显的荧光，但在质粒处理的眼中则弱得多(图9A)。35天之后，将质粒注射的大鼠终结，同时继续研究ceDNA处理的大鼠，在第42、49、56、63、70和99天进行荧光素注射和IVIS成像。结果表明，通过单次注射引入大鼠眼中的ceDNA载体介导体内转基因表达，且所述表达在高水平持续到注射之后的至少99天。
实例10：ceDNA载体对Rag2小鼠的持续给予和加打。
在ceDNA载体的基因表达盒中编码的一个或多个转基因表达于宿主环境(例如细胞或受试者)的情形中，在所表达的蛋白质被识别为外来蛋白质的情况下，宿主将可能建立适应性免疫应答，这可能使表达产物发生非期望的耗竭，从而会潜在地与表达的缺乏发生混淆。在一些情况下，与正常宿主环境异源的报道分子可能会发生这种情况。相应地，评估Rag2小鼠模型体内的ceDNA载体转基因表达，所述小鼠模型缺乏B和T细胞且因此未建立针对非原生鼠蛋白质(例如荧光素酶)的适应性免疫应答。简单来说，c57bl/6和Rag2基因敲除小鼠在第0天，经由尾静脉注射，静脉内给予0.5mg/kg的经LNP囊封的表达荧光素酶的ceDNA载体或polyC对照物，且在第21天，某些小鼠重复给药相同剂量水平的相同的经LNP囊封的ceDNA载体。所有测试组各自由4只小鼠组成。如实例9中所述，每周按时间间隔注射荧光素之后，进行IVIS成像。
与从IVIS分析中观察到的总通量相比，在给予LNP-ceDNA载体-Luc的野生型小鼠中观察到的荧光(所表达的荧光素酶的存在的间接测量)在第21天之后逐渐减少，而施用相同治疗的Rag2小鼠在第42天实验期间显示相对恒定持续的荧光素酶表达(图9A)。在野生型小鼠中观察到减少的大约第21天时间点对应于预期可能会产生适应性免疫应答的时间范围。LNP-ceDNA载体再施用于Rag2小鼠引起表达明显增加，在此研究中追踪其的至少21天期间，所述表达的明显增加被维持(图9B)。结果表明，当ceDNA载体在宿主中表达非原生蛋白质时，适应性免疫可以起作用，并且在从初始施用的20+天时间范围内观察到的表达的减少可以使混杂的适应性免疫应答而非表达的衰减(或除其之外)信号传导到所表达的分子。值得注意的是，当原生蛋白质在宿主中表达时，这个应答预期较低，其中预期宿主将所表达的分子正确地识别为自身的且将不产生此类免疫应答。
实例11：肝脏特异性表达和CpG调节对持续表达的影响
如实例10中所述，非期望的宿主免疫应答在一些情况下可能会人为地抑制原本是一个或多个期望转基因从所引入的ceDNA载体中的持续表达。采取两种方法来评估避免和/或抑制潜在宿主免疫应答对来自ceDNA载体的持续表达的影响。首先，由于前述实例中所用的ceDNA-Luc载体处于组成型CAG启动子的控制下，因此使用肝脏特异性启动子(hAAT)或不同组成型启动子(hEF-1)制备类似构建体，以了解避免长时间暴露于骨髓细胞或非肝脏组织是否减少所观察到的任何免疫效应。其次，对某些ceDNA-荧光素酶构建体进行工程改造以使CpG含量减小(一种已知的用于宿主免疫反应的触发事件)。将此类工程化和启动子开关的ceDNA载体施用于小鼠后，测量ceDNA编码的荧光素酶基因表达。
使用三种不同ceDNA载体，每种编码作为转基因的荧光素酶。第一种ceDNA载体具有数目较多的未甲基化CpG(约350)且包含组成型CAG启动子(“ceDNA CAG”)；第二种具有中等数目个未甲基化CpG(约60)且包含肝脏特异性hAAT启动子(“ceDNA hAAT低CpG”)；并且第三种是第二种的甲基化形式，使得其不含有未甲基化CpG，并且也包含hAAT启动子(“ceDNAhAAT无CpG”)。ceDNA载体原本是相同的。如上文所述制备载体。
四组大约4周龄的四只雄性
Figure BDA0003352315200001611
小鼠用囊封于LNP中的ceDNA载体之一或polyC对照物处理。第0天，每只小鼠施用0.5mg/kg ceDNA载体的单次静脉内尾静脉注射液，体积为5mL/kg。在第-1、-、1、2、3、7天和随后每周记录体重，直到小鼠终结为止。在第0、1和35天，获取全血和血清样品。第7、14、21、28和35天和随后每周使用体内成像系统(IVIS)执行体内成像。为了成像，每只小鼠经由腹膜内注射2.5mL/kg来注射150mg/kg荧光素。15分钟之后，使每只小鼠麻醉并且成像。第93天终结小鼠且收集末端组织，包括肝脏和脾脏。第0天给药之后的6小时进行细胞因子测量。
虽然所有经ceDNA处理的小鼠在第7天和第14天显示明显的荧光，但是ceDNA CAG小鼠中的荧光在第14天之后快速减少且在研究的其余时间内逐渐减少。相比之下，ceDNAhAAT低CpG和无CpG处理的小鼠的总通量保持在稳定的高水平(图10)。这表明，将ceDNA载体递送特异性引向肝脏使得载体的转基因表达在单次注射之后的至少77天期间持续、持久。CpG最小化或完全缺乏CpG含量的构建体具有相似的持久、持续表达特征，而高CpG组成型启动子构建体的表达随时间展现衰减，表明ceDNA载体引入引起的宿主免疫活化可以起到减少此类载体在受试者中的所观察到的任何表达的作用。这些结果提供了按照所期望水平定制应答持续时间的替代方法，这是通过在观察到宿主免疫应答(一种潜在的转基因特异性应答)的情况下选择组织限制性启动子和/或改变ceDNA载体的CpG含量来实现。
实例12：表达PAH的ceDNA的流体动力学递送
将核酸引入啮齿动物中的肝脏的熟知的方法是通过流体动力学尾静脉注射。在此系统中，大量未囊封核酸的加压注射导致细胞通透性的瞬时增加，并直接递送到组织和细胞中。这提供了绕过许多宿主免疫系统(诸如巨噬细胞递送)的实验机制。
如上文实例1和5中所述制备和纯化两种不同的ceDNA载体，每种载体具有野生型左ITR和截短突变体右ITR并具有编码人PAH的转基因区。每个ceDNA PAH载体都受不同肝脏特异性启动子的控制。分析中还包括LNP封装的聚C对照。每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约4-6周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体经由外侧尾静脉、通过流体动力学静脉内注射、以≤100mL的体积、以每个动物(每组6个动物)5μg给药。在第-1、0、1、2、3、7和14天测量体重。在第-1、3、7和14天从每只接受治疗的动物中收集血液样本。接受治疗的动物血清样品中苯丙氨酸的量通过高通量质谱法来测量，并表示为在对照治疗动物中观察到的水平的百分比。
如图11所示，在对照治疗的动物的实验过程中，该突变小鼠模型中的苯丙氨酸水平始终保持高水平。在实验期间，施用任一ceDNA载体使小鼠的苯丙氨酸水平降低约75％(图11)。该实验表明，通过流体动力学注射施用的ceDNA载体表达了活性PAH，其能够系统地降低PKU小鼠模型中的苯丙氨酸水平。
实例13：通过流体动力学注射在PAHenu2小鼠中表达人PAH酶来评价苯丙氨酸水平的生化校正的药理学研究
PAH缺乏症小鼠模型的可用性，PAHenu2小鼠允许研究人PAH酶的表达对PAHenu2小鼠中苯丙氨酸水平的影响。PAH缺乏与苯丙氨酸清除受损和由此产生的高苯丙氨酸血症有关。
制备如实例12中所述的ceDNA载体。每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约4-6周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体经由外侧尾静脉、通过流体动力学静脉内注射、以≤100mL的体积、以每个动物(每组6个动物)5μg给药。在第-1、0、1、2、3、7和14天测量体重。在第-1、3、7和14天从每只接受治疗的动物中收集血液样本。接受治疗的动物血清样品中苯丙氨酸的量通过高通量质谱法测量，并表示为在对照治疗动物中观察到的水平的百分比(PAHenu2)。
研究设计如下表9和表10所示。
表9
Figure BDA0003352315200001631
表10
Figure BDA0003352315200001641
No.＝编号；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；WT＝野生型；KO＝基因敲除。
测试物品以浓缩库存形式提供，并在标称4℃下存储。制剂不涡旋或离心。各个组通过手术室中通风架上的接触垫料安置在透明的聚碳酸酯笼中。可以随意向动物提供用1NHCl酸化至目标pH值2.5-3.0的食物和过滤自来水。
分别在如下表11A和11B中的中间和终点时间点收集血液。
表11A
Figure BDA0003352315200001651
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
表11B
Figure BDA0003352315200001652
No.＝编号，NBF＝中性缓冲福尔马林
血液样品收集如下表12所示。
表12
Figure BDA0003352315200001661
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：对于第1-8组：36+2只备用PAHenu2小鼠(混合性别，～4-6周龄，年龄匹配)；10+1备用WT(同窝仔；年龄匹配)。对于第1-7组：30只PAHenu2小鼠(混合性别，～7-10周龄，年龄匹配)；10WT(同窝仔；年龄匹配)。
化合物类别：脂质纳米颗粒中的DNA。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在服药后～1、～6和～24小时进行临床观察。
体重：在第-4、0、1、2、3、7、14、21、28天，包括安乐死之前，记录所有动物的体重。
剂量配方：以浓缩原液形式提供的测试物品。在使用前立即用PBS稀释原液。如果不立即进行给药，则准备好的材料在～4℃下(或在湿冰上)存储。
剂量施用：第1-8组和第1-7组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药(在5秒内给药)。
采血和尸检前禁食：所有动物(所有组)在第-3天(～)给药前基线采血前以及第3、7、14、21和28天前(在终末收集之前)禁食最少4小时。
采血：每次收集后，动物皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液。根据以上采血表收集动物的血液。
禁食4小时后，在第-3(～)、3、7、14和21天，动物全血用于通过尾静脉切口、大隐静脉或眼眶窦(在吸入异氟醚的情况下根据设施SOP)收集血清。将制作两(2)份等分试样。所有样品均在名义上-70℃下存储直至发货。
麻醉恢复：在麻醉状态下、恢复期间和直到移动时，连续监测动物。
安乐死和终末采血：在第28天，禁食4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。通过心脏穿刺收集最大可获得的血量，并按照设施SOPS处理为血清，并存储在两(2)等分试样中。
灌注：放血后，所有动物都接受生理盐水心脏灌注。简而言之，全身心内灌注是通过将连接到含有生理盐水的10mL注射器的23/21号针头插入左心室腔进行灌注。切开右心房为灌注液提供引流口。将针头置于心脏中后，向柱塞施加温和而稳定的压力以灌注动物。确保冲洗液充分的流动，直到流出的灌注液流动清澈(没有可见的血液)，表明冲洗液已经浸透了身体并且该程序完成。
组织收集：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从发现死亡的动物身上收集和存储组织。
安乐死和灌注后，获得肝脏。从肝脏中，收集两(2)～50mg切片，但未称重并尽快速冻。然后收集三(3)～25-50mg切片(≤50mg)并称重。切片单独速冻，在名义上-70℃下存储直至发货。将左肝叶置于组织学盒中并固定在10％NBF中并冷藏(～4℃)。10％NBF中的组织保持冷藏(～4℃)，直到装在冰袋上的密封容器中发货。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果：如图12所示，在对照处理的动物的实验过程中，该突变小鼠模型中的苯丙氨酸水平(相对于对照的％PHE)始终保持高水平。在实验期间，施用任一ceDNA载体(Codop2或Codop4)都降低了小鼠中的苯丙氨酸水平(图12)。这些结果表明，通过流体动力学注射给药的ceDNA载体表达了活性PAH，其能够在PKU小鼠模型中全身性地降低苯丙氨酸水平。包含与人PAH密码子优化版本2(Codop2)连接的VD启动子的ceDNA在测试的三个ceDNA实验载体中发挥了最佳作用。这一结果表明，人类PAH密码子优化版本2(Codop2)的功能略好于人类PAH密码子优化版本4(Codop4)，这令人惊讶，至少部分是因为版本4是在CpG最小化的情况下构建的，这通常预期导致转基因表达增加，这将与本文描述的实验系统中PHE水平降低相关。然而，发现Codop2(没有CpG最小化)比Codop4(CpG最小化)降低了更多的PHE水平。
实例14：通过流体动力学IV-剂量响应在PAHenu2小鼠中表达人PAH酶来评价苯丙氨酸水平的生化校正的药理学研究
制备如实例12中所述的ceDNA载体。每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约4-6周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体经由外侧尾静脉、通过流体动力学静脉内注射、以≤100mL的体积、以每个动物(每组5个动物)0.5μg、每个动物5μg或每个动物50μg给药。在第-1、0、1、2、3、7和14天测量体重。在第-1、3、7和14天从每只接受治疗的动物中收集血液样本。通过高通量质谱法测量治疗动物血清样品中苯丙氨酸的含量。
研究设计如下表13所示。
表13
Figure BDA0003352315200001681
如实例13中所述进行血液收集。
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：35+1只备用PAH'小鼠(混合性别，＝6-9周龄，年龄匹配)；10+2备用WT(同窝仔；年龄匹配)。
化合物类别：脂质纳米颗粒中的DNA
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在测试材料(第0天)给药后-1、＝6和＝24小时进行临床观察。根据例外情况进行了额外的观察。
体重：在第-4、0、1、2、3、7、14、21、28天，包括安乐死之前，记录所有动物的体重。
剂量配方：以浓缩原液形式提供的测试物品。原液在使用前立即用tPBS稀释。
给药剂量：第1-9组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药(在5秒内给药)。
采血和尸检前禁食：所有动物(所有组)在第-4天(＝)给药前基线采血前以及第3、7、14和21天禁食至少4小时。
采血：每次收集后，动物皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液。根据血液收集表收集动物的血液。在第-4(--)、3、7、14和21天，动物全血用于空腹血清采集(见上表)。通过尾静脉切口、大隐静脉或眼眶窦(在吸入异氟醚的情况下根据设施SOP)收集全血血清。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中。制作一(1)等分试样。所有样品均在名义上-70℃下存储直至发货。
麻醉恢复：在麻醉状态下、恢复期间和直到移动时，连续监测动物。
安乐死和终末采血：在第28天，禁食4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。通过心脏穿刺收集最大可获得的血量，并处理为每个设施SOPS的血清，并存储在两(2)等分试样中。
灌注：放血后，所有动物都接受生理盐水心脏灌注。简而言之，全身心内灌注是通过将连接到含有生理盐水的10mL注射器的23/21号针头插入左心室腔进行灌注。切开右心房为灌注液提供引流口。将针头置于心脏中后，向柱塞施加温和而稳定的压力以灌注动物。确保冲洗液充分的流动，直到流出的灌注液流动清澈(没有可见的血液)，表明冲洗液已经浸透了身体并且程序完成。
组织收集：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从发现死亡的动物身上收集和存储组织。
安乐死和灌注后，获得肝脏。从肝脏中收集两(2)-50mg切片但未称重并尽快速冻。然后收集三(3)-25-50mg切片(<50mg)并称重。切片单独速冻，在名义上-70°下存储直至发货。丢弃所有剩余的肝脏。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果：如图13所示，在对照处理的动物的实验过程中，该突变小鼠模型中的苯丙氨酸水平始终保持高水平。在实验期间，施用含有VD-hPAH codop2的ceDNA载体以剂量依赖性方式降低了小鼠中的苯丙氨酸水平(图13)。该实验表明，通过流体动力学注射施用的ceDNA载体表达了活性PAH，其能够以剂量依赖性方式全身性降低PKU小鼠模型中的苯丙氨酸水平。
实例15：通过流体动力学注射在PAHenu2小鼠中表达人PAH酶来评价苯丙氨酸水平的生化校正的药理学研究-用于PHE的hPAH-codop2构建体与PAH酶活性的相关性
进行以下研究以确定人PAH酶的表达对PAHenu2小鼠的苯丙氨酸水平的影响，并将人PAH的表达与酶活性相关联。
制备如实例12中所述的ceDNA载体。每个ceDNA PAH载体(单独的，没有任何LNP封装)和对照被施用于大约4-6周龄的混合性别、年龄匹配的PAHenu2小鼠。裸ceDNA载体经由外侧尾静脉、通过流体动力学静脉内注射、以≤100mL的体积、以每个动物(每组6个动物)5μg施用。在第-1、0、1、2、3、7和14天测量体重。在第-1、3、7和14天从每只接受治疗的动物中收集血液样本。接受治疗的动物血清样品中苯丙氨酸的量通过高通量质谱法测量，并表示为在对照治疗动物中观察到的水平的百分比(PAHenu2)。
研究设计如下表14所示。
表14
Figure BDA0003352315200001711
No.＝编号；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；WT＝野生型；KO＝基因敲除。
分别在如下表15A和15B中的中间和终点时间点收集血液。
表15A
Figure BDA0003352315200001721
将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中；MOV＝最大可获得体积
表15B
Figure BDA0003352315200001722
No.＝编号，NBF＝中性缓冲福尔马林
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：55+2只备用PAHenu2小鼠(混合性别，～5-8周龄，年龄匹配)；5+1备用WT(混合性别，同窝仔；年龄匹配)。
化合物类别：脂质纳米颗粒中的DNA
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在服药后～1、～6和～24小时进行临床观察。将根据例外情况进行额外的观察。
体重：在第-2、0、1、2、3、7、14、21和28天(安乐死前)记录所有动物的体重(如适用)。
剂量配方：以浓缩原液形式提供测试物品。在使用前立即用Sponsor提供的PBS稀释原液。
剂量管理：第1-12组的测试材料在第0天经由外侧尾静脉、通过流体动力学IV施用，以每只动物90-100ml/kg的设定体积(取决于组中最轻的动物)给药(在5秒内给药)。
血液收集和尸检前禁食：所有动物(所有组)在所有血液收集和尸检(第-2、3、7、14、21和28天)前禁食至少4小时。
采血：每次收集后，动物皮下接受0.5–1.0mL乳酸林格氏液。在第-2、3、7、14和21天，动物的全血将用于空腹血清收集。制作了两(2)等分试样。所有样品均在名义上-70℃下存储直至发货。
麻醉恢复：在麻醉状态下、恢复期间和直到移动时，连续监测动物。
安乐死和终末采血：在第28天，禁食4小时后，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。通过心脏穿刺收集最大可获得的血量，并按照设施SOPS处理为血清，并存储在两(2)等分试样中。
灌注：放血后，所有动物都接受生理盐水心脏灌注。简而言之，全身心内灌注是通过将连接到含有生理盐水的10mL注射器的23/21号针头插入左心室腔进行灌注。切开右心房为灌注液提供引流口。将针头置于心脏中后，向柱塞施加温和而稳定的压力以灌注动物。确保冲洗液充分的流动，直到流出的灌注液流动清澈(没有可见的血液)，表明冲洗液已经浸透了身体并且程序完成。
组织收集：从在预定时间点之前被安乐死的垂死动物收集终末组织。如果可能，从发现死亡的动物身上收集和存储组织。
安乐死和灌注后，收获肝脏。从肝脏中收集两(2)～50mg切片，但未称重并尽快速冻。然后收集四(4)～25-50mg切片(≤50mg)并称重。切片单独速冻，在名义上-70℃下存储直至发货。
将左肝叶置于组织学盒中并固定在10％NBF中并冷藏(～4℃)。10％NBF中的组织保持冷藏(～4℃)，直到装在冰袋上的密封容器中发货。
所有剩余的肝脏将被丢弃。
苯丙氨酸(PHE)水平：通过Pure Honey分析血清样品的PHE水平。
活性水平：通过Pure Honey分析两(2)个冷冻肝脏样品的活性水平。
结果：如图14A-14B所示，到第3天，施用含有密码子优化的人PAH版本2(“Codop2”)的ceDNA导致血清PHE水平降低，表明早在第3天就有足够的PAH活性来校正鼠PKU中的血液苯丙氨酸水平。
核酸序列：
含有密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列如下所示。启动子以下划线显示(SEQ ID NO:191)，密码子优化的PAH版本2开放阅读框(ORF)以双下划线显示(SEQ ID NO:382)。
Figure BDA0003352315200001741
Figure BDA0003352315200001751
Figure BDA0003352315200001761
Figure BDA0003352315200001771
Figure BDA0003352315200001781
上面的ceDNA构建体包括left-ITR_v1：spacer_left-ITR_v2.1：VandenDriessche_Promoter Set：PmeI_site：Modified_Minimum_Consensus_Kozak：hPAH_codop_ORF_v2：PacI_site：WPRE_3pUTR：bGH/spacer-ITRv1v
根据一些实施方案，含有密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:192。根据一些实施方案，包含密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少85％相同。根据一些实施方案，含有密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:192至少90％相同。根据一些实施方案，含有密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAHCodop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少91％相同。根据一些实施方案，包含密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少92％相同。根据一些实施方案，包含密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少93％相同。根据一些实施方案，包含密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少94％相同。根据一些实施方案，包含密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少95％相同。根据一些实施方案，包含密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少96％相同。根据一些实施方案，含有密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:192至少97％相同。根据一些实施方案，含有密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAHCodop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少98％相同。根据一些实施方案，包含密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:192至少99％相同。根据一些实施方案，包含密码子优化的人PAH版本2(ceDNA“hPAH Codop2”)的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:192组成。
含有人PAH cDNA的ceDNA的核酸序列(ceDNA VD启动子与hPAH cDNA连接，没有密码子优化)如下所示。启动子以下划线显示(SEQ ID NO:191)，PAH开放阅读框(ORF)以双下划线显示(SEQ ID NO:394)。
Figure BDA0003352315200001791
Figure BDA0003352315200001801
Figure BDA0003352315200001811
Figure BDA0003352315200001821
上面的构建体提包括以下元素。Left-ITR_v1：spacer_left-ITR_v1：VandenDriessche_Promoter Set：PmeI_site：Consensus_Kozak：hPAH_cDNA_ORF_v3：PacI_site：WPRE_3pUTR：bGH：spacer_right-ITR_v1：right-ITR_v1。
根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:193。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少85％相同。根据一些实施方案，c含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少90％相同。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少91％相同。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少92％相同。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAHcDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少93％相同。根据一些实施方案，含有人PAHcDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:193至少94％相同。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少95％相同。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少96％相同。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少97％相同。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNA VD启动子连接到没有密码子优化的hPAHcDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:193至少98％相同。根据一些实施方案，含有人PAHcDNA(ceDNAVD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:193至少99％相同。根据一些实施方案，含有人PAH cDNA(ceDNAVD启动子连接到没有密码子优化的hPAH cDNA)的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:193组成。
含有密码子优化的hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列如下所示。启动子以下划线显示(SEQ ID NO:191)，密码子优化的hPAH版本4开放阅读框(ORF)以双下划线显示(SEQ ID NO:384)。
Figure BDA0003352315200001831
Figure BDA0003352315200001841
Figure BDA0003352315200001851
Figure BDA0003352315200001861
Figure BDA0003352315200001871
上面的构建体包括left-ITR_v1:separator_left-ITR_v1:VandenDriessche_Promoter Set:PmeI_site:Consensus_Kozak:hPAH_CpGmin-codop_ORF_v4:PacI_site:WPRE_3pUTR:bGH:right_ITR_ITR_right。
根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列包含SEQ ID NO:194。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少85％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少90％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少91％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少92％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ IDNO:194至少93％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少94％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少95％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少96％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少97％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少98％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列与SEQ ID NO:194至少99％相同。根据一些实施方案，含有hPAH版本4(CpG最小化和密码子优化的人PAH)的ceDNA的核酸序列由SEQ ID NO:194组成。
参考文献
在本说明书和本文的实例中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，都以全文引用的方式并入本文中，如同每个单独的出版物或参考文献被明确且单独地指出像充分阐述一样，以引用的方式并入本文中一般。本申请要求优先权的任何专利申请也以上述针对出版物和参考文献的方式通过引用并入本文中。
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Claims (55)

1.一种闭合端DNA(ceDNA)载体，其包含：
在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一种异源核苷酸序列，其中至少一种异源核苷酸序列编码至少一种PAH蛋白，其中编码至少一种PAH蛋白的所述至少一种异源核苷酸序列选自与表1中的任何序列具有至少90％同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含启动子，所述启动子操作性连接到编码至少一种PAH蛋白的至少一种异源核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的ceDNA载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO:191具有至少85％同一性的核酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含增强子。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含5'UTR和/或内含子序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含3'UTR。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个poly A序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个可操作地连接到至少一种异源核苷酸序列的启动子。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列是cDNA。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解析位点和Rep结合位点。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来自病毒，所述病毒选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或不对称的。
13.根据权利要求12所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或基本对称的。
14.根据权利要求12所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是不对称的。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是野生型，或其中所述ITR中的两个都是野生型。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自表2中所示的病毒血清型对。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个包含选自表3、表5A、表5B或表6中的序列的序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的至少一个是由野生型AAV ITR序列通过影响所述ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而变成。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来源于AAV血清型，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是合成的。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个不是野生型ITR，或其中所述ITR中的两个都不是野生型。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过在选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的至少一个ITR区域中进行缺失、插入和/或取代而经修饰。
24.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
26.根据权利要求1-24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
27.根据权利要求1-24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的ceDNA载体，其中两个ITR以使得当所述ITR相对于彼此呈反向时产生整体三维对称性的方式改变。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的ceDNA载体，其中所述至少一个异源核苷酸序列包含与SEQ ID NO:381、SEQ ID NO:382、SEQ ID NO:383、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:385、SEQ ID NO:386、SEQ ID NO:387、SEQ ID NO:388、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO:390、SEQ IDNO:391、SEQ ID NO:392、SEQ ID NO:393或SEQ ID NO:394具有至少90％同一性的核酸序列。
33.根据权利要求32所述的ceDNA载体，其中所述至少一个异源核苷酸序列包含与SEQID NO:382、SEQ ID NO:384、SEQ ID NO:394、SEQ ID NO:385或SEQ ID NO:386具有至少90％同一性的核酸序列。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与SEQ IDNO:192、SEQ ID NO:193或SEQ ID NO:194具有至少90％同一性的核酸序列。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列处于至少一个调控开关的控制下。
36.根据权利要求35所述的ceDNA载体，其中至少一个调控开关是选自二进制调控开关、小分子调控开关、密码调控开关、基于核酸的调控开关、转录后调控开关、辐射控制的或超声波控制的调控开关、低氧介导的调控开关、发炎应答调控开关、剪切活化调控开关，和杀灭开关。
37.一种使PAH蛋白在细胞中表达的方法，所述方法包含使所述细胞与根据权利要求1-36中任一项所述的ceDNA载体接触。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述细胞是感光细胞或RPE细胞。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述细胞在体外或体内。
40.根据权利要求36-39中任一项所述的方法，其中所述至少一个异源核苷酸序列为了在所述真核细胞中表达而进行密码子优化。
41.根据权利要求36-40中任一项所述的方法，其中所述至少一个异源核苷酸序列选自表1中所示的序列。
42.一种治疗苯丙酮尿症(PKU)受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-36中任一项所述的ceDNA载体。
43.根据权利要求42所述的方法，其中编码至少一种PAH蛋白的所述至少一种异源核苷酸序列选自与表1中列出的任何序列具有至少90％同一性的序列。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中将所述ceDNA载体施用于感光细胞或RPE细胞或两者。
45.根据权利要求20至44中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体在感光细胞或RPE细胞或两者中表达PAH蛋白。
46.根据权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体通过以下任何一种或多种方式施用：视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
47.根据权利要求42-46中任一项所述的方法，其中与施用前所述受试者的血清苯丙氨酸水平相比，所述受试者表现出至少约50％的血清苯丙氨酸水平降低。
48.根据权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用后具有小于约1500uM的血清苯丙氨酸水平。
49.根据权利要求42-48中任一项所述的方法，其中与施用前的PAH活性水平相比，所述受试者在施用后表现出至少约10％的PAH活性增加。
50.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-36中任一项所述的ceDNA载体。
51.一种细胞，其含有根据权利要求1-36中任一项所述的ceDNA载体。
52.根据权利要求51所述的细胞，其中所述细胞是感光细胞，或RPE细胞，或两者。
53.一种组合物，其包含根据权利要求1-36中任一项所述的ceDNA载体和脂质。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述脂质是脂质纳米颗粒(LNP)。
55.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-36中任一项所述的ceDNA载体，根据权利要求50所述的药物组合物，根据权利要求51或52所述的细胞或根据权利要求53或54所述的组合物。
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