CN116529369A - 非病毒dna载体及其用于表达fviii治疗剂的用途 - Google Patents

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CN116529369A CN202180076751.XA CN202180076751A CN116529369A CN 116529369 A CN116529369 A CN 116529369A CN 202180076751 A CN202180076751 A CN 202180076751A CN 116529369 A CN116529369 A CN 116529369A
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Abstract

本申请描述了一种用于递送和表达转基因的具有线性和连续结构的ceDNA载体。ceDNA载体包含两侧是两个ITR序列的表达盒，其中所述表达盒编码转基因，所述转基因编码FVIII蛋白。一些ceDNA载体还包含顺式调节元件，所述顺式调节元件包括调节开关。本文还提供了用于使用所述ceDNA载体在体外、离体和体内可靠基因表达FVIII蛋白的方法和细胞系。本文提供了包含可用于在细胞、组织或受试者中表达FVIII蛋白的ceDNA载体的方法和组合物以及用表达FVIII蛋白的所述ceDNA载体治疗疾病的方法。可以表达这种FVIII蛋白以用于治疗疾病，例如血友病A。

Description

非病毒DNA载体及其用于表达FVIII治疗剂的用途
相关申请
本申请要求2020年9月16日提交的美国临时申请号63/079,349以及2020年12月31日提交的美国临时申请号63/132,838的优先权，这些临时申请中的每一项的内容特此以全文引用的方式并入。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交并且特此以全文引用的方式并入。创建于2021年9月16目的所述ASCII副本命名为131698-08220_SL.txt，并且大小为1,915,851字节。
技术领域
本公开涉及基因疗法领域，所述基因疗法包括用于在受试者或细胞中表达转基因或经分离多核苷酸的非病毒载体。本公开还涉及核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，包括多核苷酸以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。例如，本公开提供了使用非病毒ceDNA载体从细胞表达FVIII(例如，表达FVIII治疗蛋白质)以治疗患有血友病A的受试者的方法。可以使用所述方法和组合物例如来通过在有需要的受试者的细胞或组织中表达FVIII来治疗疾病。
背景技术
基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结果。基因疗法包括治疗或预防由缺陷基因或者异常调节或表达(例如，可能导致障碍、疾病、恶性病等的表达不足或过表达)造成的医学病症。例如，由缺陷基因引起的疾病或障碍可以通过向患者递送矫正性遗传物质来进行治疗、预防或改善，或者可以通过例如对患者用矫正性遗传物质改变或沉默缺陷基因、从而引起遗传物质在患者体内治疗性表达来进行治疗、预防或改善。
基因疗法的基础是向转录盒提供例如可以产生正向功能获得效应、负向功能丧失效应或另一结果的活性基因产物(转基因)。此类结果可归因于治疗蛋白(例如抗体、功能性酶或融合蛋白)的表达。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性疾病。人类单基因病症可以通过将正常基因递送给目标细胞并表达来治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如，重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus；rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且更具体地说，组成依赖病毒属。来源于AAV的载体(即，重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)各种各样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，因此减少宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒在人类中被认为是非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因并且通常作为附加体持续存在，从而限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其他载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较差的免疫原，因此不会触发显著的免疫应答(参见ii)，从而获得载体DNA的持久性和治疗性转基因的潜在长期表达。
然而，使用AAV粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其病毒包装容量有限，为约4.5kb的异源DNA(Dong等人,1996；Athanasopoulos等人,2004；Lai等人,2010)，因此，AAV载体的用途被限制在小于150,000Da的蛋白质编码容量。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，所述免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的所述载体作出反应，以刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
另外，通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人，1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫反应。
相应地，由于单次施用于患者(因患者免疫反应)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒包装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢，因此基因疗法使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
对血友病A的疾病修饰疗法存在大量未满足的需求。目前的疗法繁琐并且需要例如缓慢滴注静脉内(IV)施用。首先，这些因子VIII可注射剂不提供持续的因子递送，其中低谷水平允许出血事件。其次，没有对血友病A的基因疗法获得批准，并且由于预先存在的抗体，25％至40％的患者不能使用基于AAV的疗法。AAV只能施用一次，并且所产生的因子VIII水平可能达不到临床意义，或者可能超常，因为无法滴定剂量水平。第三，由于针对这些外源性人工凝血因子的中和抗体的发展，许多血友病A患者无法使用这些疗法。
因此，本领域需要一种允许治疗性FVIII蛋白在细胞、组织或受试者中表达以治疗血友病A的技术。
发明内容
本文所述的技术涉及通过从具有共价封闭端的无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(本文称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”)表达因子VIII(FVIII)蛋白来治疗血友病A的方法和组合物，其中ceDNA载体包含FVIII核酸序列或其密码子优化型式。这些ceDNA载体可以用于产生FVIII蛋白以进行治疗、监测和诊断。将表达FVIII的ceDNA载体应用于受试者来治疗血友病A可用于：(i)提供疾病修饰水平的FVIII酶，(ii)在递送中具有微创性，(iii)可重复且剂量有效，(iv)具有快速起效的治疗效果，(v)引起矫正性FVIII酶在肝脏中持续表达，(vi)恢复尿素循环功能，和/或(vii)可滴定以获得适当药理学水平的缺陷酶。
在实施方案中，表达FVIII的ceDNA载体任选地存在于脂质体纳米粒子制剂(LNP)中以治疗血友病A。本文所述的ceDNA载体可以提供一种或多种益处，包括但不限于提供疾病修饰水平的FVIII、在递送中具有微创性、可重复且剂量有效、例如在一些实施方案中在治疗干预几天内提供快速起效的治疗效果、在循环中提供矫正性因子VIII水平的持续表达、可滴定以获得适当药理学水平的缺陷凝血因子和/或为其他类型的血友病(包括但不限于因子VIII缺乏症(血友病A)或因子IX缺乏症(血友病B)或因子XI缺乏症(血友病C))提供治疗。
因此，本文所述的公开内容涉及一种具有共价封闭端的无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(本文称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”)，该载体包含编码FVIII的异源基因，以允许FVIII治疗蛋白在细胞(例如，患有血友病A的人类患者的肝细胞)中表达。
根据一个方面，本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，该ceDNA载体包含在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列，例如异源核苷酸序列，其中至少一个异源核酸序列编码至少一种FVIII蛋白，其中编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自表1A中的任何序列(SEQ ID NO:71-183、556和626-633)。
在第一方面，本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，该ceDNA载体包含在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列，其中至少一个核酸序列编码至少一种FVIII蛋白，其中编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自与表1A中的任何序列(SEQ ID NO:71-183、556和626-633)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列与SEQ ID NO:556至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列由SEQ ID NO:556组成。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸包含SEQ ID NO:556，其中SEQ ID NO:556还包含一个或多个修饰。根据一些实施方案，包含还包含一个或多个修饰的SEQ ID NO:556的至少一个核酸包含SEQ ID NO:627或由SEQID NO:627组成。根据一些实施方案，包含还包含一个或多个修饰的SEQ ID NO:556的至少一个核酸包含SEQ ID NO:628或由SEQ ID NO:628组成。根据一些实施方案，包含还包含一个或多个修饰的SEQ ID NO:556的至少一个核酸包含SEQ ID NO:628或由SEQ ID NO:628组成。根据一些实施方案，包含还包含一个或多个修饰的SEQ ID NO:556的至少一个核酸包含SEQ ID NO:630或由SEQ ID NO:630组成。根据一些实施方案，包含还包含一个或多个修饰的SEQ ID NO:556的至少一个核酸包含SEQ ID NO:631或由SEQ ID NO:631组成。根据一些实施方案，包含还包含一个或多个修饰的SEQ ID NO:556的至少一个核酸包含SEQ ID NO:632或由SEQ ID NO:632组成。根据一些实施方案，包含还包含一个或多个修饰的SEQ IDNO:556的至少一个核酸包含SEQ ID NO:633或由SEQ ID NO:633组成。
在一些实施方案中，ceDNA载体包含与编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核苷酸序列可操作地连接的启动子或启动子组。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自表1A中的任何序列(SEQ ID NO:71-183、556和626-633)。在一些实施方案中，ceDNA载体包含选自由人a1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、最小运甲状腺素蛋白启动子(TTRm)、hAAT_core_C06、hAAT_core_C07、hAAT_core_08、hAAT_core_C09、hAAT_core_C10和hAAT_core_truncated组成的组的启动子。在一些实施方案中，ceDNA载体包含选自与SEQID NO:210-217中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的启动子。在一些实施方案中，启动子组包含包括增强子和核心启动子而没有5pUTR的合成肝特异性启动子组。在一些实施方案中，启动子组选自与SEQ ID NO:184-197、400、401、484和617-624中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自表1A中的任何序列(SEQ ID NO:71-183、556和626-633)，并且启动子组选自与SEQ ID NO:184-197、400、401、484和617-624中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自与SEQ ID NO:556或626-633中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且启动子组选自与SEQ ID NO:184-197、400、401、484和617-624中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，ceDNA载体包含增强子。在一些实施方案中，增强子选自由丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)增强子(SerpEnh)、运甲状腺素蛋白(TTRe)基因增强子(TTRe)、肝核因子1结合位点(HNF1)、肝核因子4结合位点(HNF4)、人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子(ApoE_Enh)、来自前白蛋白基因的增强子区(ProEnh)、ApoE_Enh的CpG最小化型式(人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子)(ApoE_Enh_C03、ApoE_Enh_C04、ApoE_Enh_C09和ApoE_Enh_C10)和嵌入GE-856中的肝核因子增强子阵列(Embedded_enhancer_HNF_array)组成的组。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含与SEQ ID NO:198至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，增强子选自表7中所示的核酸序列(SEQ ID NO:198-209、485和557-616)。在一些实施方案中，增强子选自与表7中的任何序列(SEQ ID NO:198-209、485和557-616)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自表1A中的任何序列(SEQ ID NO:71-183、556和626-633)，并且增强子选自与SEQ ID NO:198-209、485和557-616中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自与SEQ ID NO:556或626-633中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列，并且增强子选自与SEQ ID NO:557-616中的任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，ceDNA载体包含5'UTR序列。在一些实施方案中，5'UTR序列选自与表10中的任何序列具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，ceDNA载体包含内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列选自与表11中的任何序列具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，ceDNA载体包含外显子序列。在一些实施方案中，外显子序列选自与表12中的任何序列具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，ceDNA载体包含3'UTR序列。在一些实施方案中，外显子序列选自与表13中的任何序列具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，ceDNA载体包含至少一个poly A序列。在一些实施方案中，ceDNA载体包含一个或多个DNA核靶向序列(DTS)。在一些实施方案中，DTS选自与表14中的任何序列具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，ceDNA载体包含以下项中的一种或多种：遍在染色质开放元件(UCOE)、Kozak序列、间隔子序列或前导序列。
在实施方案的任何前述方面的一个实施方案中，至少一个核酸序列是cDNA。
在实施方案的任何前述方面的一个实施方案中，至少一个ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。
在实施方案的任何前述方面的一个实施方案中，ITR中的一个或两个来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。在一些实施方案中，侧接ITR是对称的或不对称的。在一些实施方案中，侧接ITR是对称的或基本上对称的。在一些实施方案中，侧接ITR是不对称的。在一些实施方案中，ITR中的一个或两个是野生型的，或者其中ITR中的两个都是野生型的。在一些实施方案中，侧接ITR来自不同病毒血清型。在一些实施方案中，侧接ITR来自相同病毒血清型。在一些实施方案中，侧接ITR来自国际公开号WO/2019/161059(以全文引用的方式并入)的表6中所示的一对病毒血清型。在一些实施方案中，ITR中的一个或两个包含选自表2、表4A、表4B或表5中的序列的序列。在一些实施方案中，ITR中的至少一个由于影响ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而相对于野生型AAV ITR序列改变。在一些实施方案中，ITR中的一个或两个来源于选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。在一些实施方案中，ITR中的一个或两个是合成的。在一些实施方案中，ITR中的一个或两个不是野生型ITR，或者其中ITR中的两个都不是野生型的。根据一些实施方案，ITR中的一个或两个通过选自A、A’、B、B’、C、C’、D和D’的ITR区中的至少一个中的缺失、插入和/或取代而被修饰。在一些实施方案中，缺失、插入和/或取代使得通常由A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。在一些实施方案中，所述ITR中的一个或两个通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。在一些实施方案中，所述ITR中的一个或两个通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。在一些实施方案中，所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。在一些实施方案中，所述ITR中的一个或两个在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。在一些实施方案中，所述ITR中的一个或两个在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。在一些实施方案中，所述ITR中的一个或两个在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。在一些实施方案中，两个ITR以使得当ITR相对于彼此反转时产生整体三维对称性的方式改变。在一些实施方案中，ITR中的一个或两个包含选自表2、表4A、表4B和表5中的序列的核酸序列。
在任何上述方面或实施方案的一些实施方案中，ceDNA载体包含选自与表18中的序列(例如，SEQ ID NO:1-70、442-483或642-646中的任一个)具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的序列的核酸序列。
在另一个方面，本公开提供了一种在细胞中表达FVIII蛋白的方法，该方法包括使细胞与本文的任一个方面和实施方案的ceDNA载体接触。在一些实施方案中，细胞是感光或RPE细胞。在一些实施方案中，细胞在体外或体内。在任何上述方面或实施方案的一些实施方案中，至少一个核酸序列经密码子优化以在真核细胞中表达。在任何上述方面或实施方案的一些实施方案中，至少一个核酸序列是与表1A中所示的任何序列(例如，SEQ ID NO:71-183、556和626-633中的任一个)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗患有血友病A的受试者的方法，该方法包括向受试者施用本文的任一个方面和实施方案的ceDNA载体，其中至少一个核酸序列编码至少一种FVIII蛋白。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗患有血友病A的受试者的方法，该方法包括向受试者施用选自与表18中的序列(例如，SEQ ID NO:1-70、442-483或642-646中的任一个)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的核酸序列。根据一个实施方案，核酸序列与SEQ ID NO:5至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。在一个实施方案中，核酸序列包含SEQ ID NO:5。在另一个实施方案中，核酸序列由SEQ ID NO:5组成。在任何上述方面或实施方案的一些实施方案中，ceDNA载体包含选自与SEQ ID NO:42具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的核酸序列。在一些实施方案中，ceDNA包含由SEQ ID NO:42组成的核酸序列。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗患有血友病B的受试者的方法，该方法包括向受试者施用选自与表18中的序列(例如，SEQ ID NO:1-70、442-483或642-646中的任一个)具有至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性的序列的核酸序列。
在任何上述方面或实施方案的一些实施方案中，与对照相比，受试者的血清中的FVIII水平在施用ceDNA载体的受试者体内增加。在一些实施方案中，与对照相比，FVIII水平的增加大于约40％。在一些实施方案中，至少一个核酸序列是与表1A中所示的任何序列(例如，SEQ ID NO:71-183、556和626-633中的任一个)或表18中所示的任何序列(例如，SEQID NO:1-70、442-483或642-646中的任一个)具有至少85％同一性、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。根据一个实施方案，核酸序列与SEQID NO:5至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同。根据一个实施方案，核酸序列包含SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成。
在前述方面或实施方案的一些实施方案中，受试者的血浆中的FVIII水平在施用后在受试者体内增加。在一些实施方案中，受试者的血浆中的FVIII水平在施用后增加至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、9倍、14倍、19倍、24倍、29倍、39倍、49倍、59倍、69倍、79倍、89倍或99倍。在一些实施方案中，与对照相比，受试者的血清中的FVIII水平在施用ceDNA载体的受试者体内增加。在一些实施方案中，与对照相比，受试者的血清中的FVIII水平的增加大于约40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、9倍、14倍、19倍、24倍、29倍、39倍、49倍、59倍、69倍、79倍、89倍或99倍。在一些实施方案中，对照是施用前受试者的血清中的FVIII水平，或者其中对照是未接受施用的患有血友病A的受试者的血清中的FVIII水平。
在一些实施方案中，以约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg至约20mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg至约15mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.1mg/kg至约0.5mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.5mg/kg至约20mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.5mg/kg至约15mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.5mg/kg至约5mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约1mg/kg至约20mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约1mg/kg至约15mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约1mg/kg至约10mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约1mg/kg至约5mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约5mg/kg至约20mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约5mg/kg至约15mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约10mg/kg至约20mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约10mg/kg至约15mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约15mg/kg至约20mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg或5mg/kg的剂量施用ceDNA载体。在一些实施方案中，以约0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg或5mg/kg的剂量施用ceDNA载体。
在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约10％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约15％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约20％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约25％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约30％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约35％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约40％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约45％的FVIII血浆水平。在一些实施方案中，施用恢复未受血友病A影响的正常个体的至少约50％的FVIII血浆水平。
在任何上述方面或实施方案的一些实施方案中，将ceDNA载体施用于感光细胞或RPE细胞或两者。
在任何上述方面或实施方案的一些实施方案中，ceDNA载体在感光细胞或RPE细胞或两者中表达FVIII蛋白。
在任何上述方面或实施方案的一些实施方案中，通过视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射中的任何一种或多种施用ceDNA载体。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文的任一个方面或实施方案的ceDNA载体。
在另一个方面，本公开提供了一种细胞，该细胞含有本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体。在一些实施方案中，细胞是感光细胞或RPE细胞或两者。
在另一个方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体和脂质。在一些实施方案中，脂质是脂质纳米粒子(LNP)。在另一个方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含ceDNA载体和脂质，其中ceDNA载体包含与SEQ IDNO:5至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的核苷酸序列，包含SEQ ID NO:5，或由SEQ ID NO:5组成。在另一个方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含ceDNA载体和脂质，其中ceDNA载体包含与SEQ ID NO:42至少85％相同、至少90％相同、至少91％相同、至少92％相同、至少93％相同、至少94％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同或至少99％相同的核苷酸序列，包含SEQ ID NO:42，或由SEQ ID NO:42组成。在一些实施方案中，脂质是LNP。
在另一个方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体、本文的任何方面或实施方案的药物组合物、本文的任何方面或实施方案的细胞或者本文的任何方面或实施方案的组合物。
在另一个方面，本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，该ceDNA载体包含在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列，其中至少一个核苷酸序列编码至少一种蛋白，其中ceDNA载体包含与编码至少一种蛋白的至少一个核苷酸序列可操作地连接的启动子或启动子组，并且其中启动子选自由人a1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、最小运甲状腺素蛋白启动子(TTRm)、hAAT_core_C06、hAAT_core_C07、hAAT_core_08、hAAT_core_C09、hAAT_core_C10和hAAT_core_truncated组成的组。在一些实施方案中，启动子选自与SEQ ID NO:210-217中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子组包含包括增强子和核心启动子而没有5pUTR的合成肝特异性启动子组。在一些实施方案中，启动子组选自与SEQ ID NO:184-197、400、401、484和617-624中的任何一个具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％同一性的核酸序列，包含SEQ ID NO:184-197、400、401、484和617-624中的任何一个或由SEQ ID NO:184-197、400、401、484和617-624中的任何一个组成。
在本文的任何方面或实施方案的一些实施方案，ceDNA载体包含增强子。在一些实施方案中，增强子选自由丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(SerpEnh)、运甲状腺素蛋白(TTRe)基因增强子(TTRe)、肝核因子1结合位点(HNF1)、肝核因子4结合位点(HNF4)、人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子(ApoE_Enh)、来自前白蛋白基因的增强子区(ProEnh)、ApoE_Enh的CpG最小化型式(人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子)(ApoE_Enh_C03、ApoE_Enh_C04、ApoE_Enh_C09和ApoE_Enh_C10)和嵌入GE-856中的肝核因子增强子阵列(Embedded_enhancer_HNF_array)组成的组。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含与SEQ ID NO:198至少约85％相同的核酸序列。在一些实施方案中，增强子选自与SEQ ID NO:198-209、485和557-616中的任何一个具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％同一性的核酸序列，包含SEQ ID NO:198-209、485和557-616中的任何一个或由SEQ ID NO:198-209、485和557-616中的任何一个组成。
在另一个方面，本公开提供了一种在细胞中表达蛋白质的方法，该方法包括使细胞与本文的任何方面和实施方案的ceDNA载体接触。在一些实施方案中，细胞是感光或RPE细胞。在一些实施方案中，细胞在体外或体内。在本文的任何方面或实施方案的一些实施方案中，至少一个核酸序列经密码子优化以在真核细胞中表达。
在本文的任何方面或实施方案的一些实施方案中，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自与SEQ ID NO:556和626-633中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列，并且其中ceDNA载体包含增强子，其中增强子选自与SEQ ID NO:557-616中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
在另一个方面，本公开提供了包含与SEQ ID NO:71-183、556和626-633至少85％相同的核酸序列的DNA载体。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:198-209、485、557-616中的任一个具有至少95％同一性的增强子序列。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:198和557-616中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:557-616中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:557-568中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:569和570中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
在一些实施方案中，其中DNA载体包含与SEQ ID NO:571中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:572中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:611中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:603中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
在本文的方面和实施方案的一些实施方案中，DNA载体包含TTRe序列。在一些实施方案中，TTRe序列在SEQ ID NO:199中示出或是与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，DNA载体包含TTR启动子。在一些实施方案中，TTR启动子在SEQ ID NO:211中示出或是与其具有95％同一性的序列。在一些实施方案中，DNA载体包含选自由以下项组成的组的5'非翻译区(5'UTR)序列：SEQ ID NO:411、SEQ ID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:419、SEQID NO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428、SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:430、SEQID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435和SEQ ID NO:436。在一些实施方案中，DNA载体包含选自由以下项组成的组的内含子序列：SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247和SEQ ID NO:248。在一些实施方案中，DNA载体还包含与SEQ ID NO:235具有至少95％同一性的内含子序列。在一些实施方案中，DNA载体包含3'UTR序列。在一些实施方案中，3'UTR序列包含WPRE元件和/或bGH poly A信号序列或与SEQ ID NO:283-291和634中的任一个具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，DNA载体包含SEQ ID NO:543中所示的微小RNA(mir)序列或与其具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，DNA载体包含选自与表15中所示的任何序列(SEQ ID NO:318-332和635-641)具有至少85％同一性的序列的间隔子序列。在一些实施方案中，DNA载体包含与SEQ ID NO:556至少95％相同的核酸序列的5'和/或3'末端侧接的至少一个ITR。在一些实施方案中，与5'和/或3'侧接的至少一个ITR是野生型AAV ITR。在一些实施方案中，DNA载体是封闭端DNA(ceDNA)。在一些实施方案中，DNA载体是质粒。在一些实施方案中，DNA载体包含编码单链(SC)FVIII的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列在SEQ ID NO:556中示出或是与其具有至少99％同一性的序列。
在另一个方面，本公开提供了一种ceDNA载体，该载体包含SEQ ID NO:42的核酸序列或与SEQ ID NO:42至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在另一个方面，本公开提供了一种ceDNA载体，该载体包含SEQ ID NO:642的核酸序列或与SEQ ID NO:642至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在另一个方面，本公开提供了一种ceDNA载体，该载体包含SEQ ID NO:643的核酸序列或与SEQ ID NO:643至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在另一个方面，本公开提供了一种ceDNA载体，该载体包含SEQ ID NO：644的核酸序列或与SEQ ID NO：644至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在另一个方面，本公开提供了一种ceDNA载体，该载体包含SEQ ID NO：645的核酸序列或与SEQ ID NO：645至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
在另一个方面，本公开提供了一种ceDNA载体，该载体包含SEQ ID NO：646的核酸序列或与SEQ ID NO：646至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
本公开的这些和其他方面在下文中更详细地描述。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一个彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由办公室提供。
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施例。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其它等效的实施方案。
图1A提供了AAV2的野生型左ITR(SEQ ID NO：52)的T形茎-环结构，以及A-A′臂、B-B′臂、C-C′臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE′)的标识，并且还显示了末端解链位点(TRS)。RBE含有一连串4个双链体四聚体，它们被认为与Rep 78或Rep 68相互作用。另外，RBE′也被认为与在所述构建体中的野生型ITR或突变的ITR上装配的Rep复合物相互作用。D和D′区含有转录因子结合位点和其它保守结构。图1A公开了SEQ ID NO：544。图1B显示了所提出的Rep催化的在野生型左ITR中产生的切割和接合活性，所述野生型左ITR包括AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构，并鉴定了A-A′臂、B-B′臂、C-C′臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE′)，并且还显示了末端解链位点(TRS)以及包含若干转录因子结合位点和另一保守结构的D和D′区域。图1B公开了SEQ ID NO：545。
图2A提供了野生型左AAV2 ITR的A-A′臂的含RBE部分以及C-C′和B-B′臂的一级结构(多核苷酸序列)(左)(SEQ ID NO：547)和二级结构(右)(SEQ ID NO:547)。图2B显示了左ITR的示例性突变ITR(也称为修饰ITR)序列。显示的是示例性突变左ITR(ITR-1，左)的A-A'臂的RBE部分、C臂和B-B'臂的一级结构(左)(SEQ ID NO:549)和预测的二级结构(右)(SEQID NO:549)。图2C显示了野生型右AAV2 ITR的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)(SEQ ID NO:550)和二级结构(右)(SEQ ID NO:550)。图2D显示了示例性右修饰ITR。显示的是示例性突变右ITR(ITR-1，右)的A-A'臂的含RBE部分、B-B'和C臂的一级结构(左)(SEQ ID NO:551)和预测的二级结构(右)(SEQ ID NO:551)。可以如本文所教示，使用左ITR和右ITR的任何组合(例如AAV2 ITR或其它病毒血清型ITR或合成ITR)。图2A-2D的多核苷酸序列中的每一个是指在用于产生如本文所述的ceDNA的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。图2A-2D每一个中还包含从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中的ceDNA载体构型推断出的相应ceDNA二级结构以及预测的吉布斯自由能(Gibbs free energy)值。
图3A是说明用于制备杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的上游过程的示意图，所述细胞可用于在图4B的示意图中所描述的过程中产生如本文所公开的用于表达FVIII的ceDNA载体。图3B是ceDNA产生的一种示例性方法的示意图，图3C示出了证实ceDNA载体产生的一种生化方法和过程。图3D和图3E是描述了用于鉴定从在图3B的ceDNA产生过程期间获得的细胞集结粒收获的DNA中ceDNA的存在的过程的示意图。图3D显示未切割或用限制性核酸内切酶消化并然后在天然凝胶或变性凝胶上进行电泳的示例性ceDNA的示意性预期色带。最左边的示意图是天然凝胶，并显示多个色带，表明以其双链体和未切割形式的ceDNA以至少单体和二聚体状态存在，可看到呈迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体，二聚体的大小是单体的两倍。左起第二个示意图显示，当用限制性核酸内切酶切割ceDNA时，原始色带消失并出现了迁移较快(例如较小)的色带，与切割后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下，原始双链体DNA是单链的，并且因为互补链是共价连接的，所以作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此，在右起第二个示意图中，经过消化的ceDNA展示出与在天然凝胶上观察到的相似的带分布，但所述带作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图显示，在变性条件下未切割的ceDNA作为单链开环进行迁移，因此观察到的色带是在不开环的天然条件下观察到的色带大小的两倍。在这个图中，“kb”用于指示核苷酸分子的相对大小，取决于上下文，其基于核苷酸链长(例如，对于在变性条件下观察到的单链分子)或碱基对数目(例如，对于在天然条件下观察到的双链分子)。图3E显示了具有不连续结构的DNA。ceDNA可以通过在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制性核酸内切酶切割，并在中性和变性两种条件下产生两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图3E还示出了具有线性且连续结构的ceDNA。所述ceDNA载体可被限制性核酸内切酶切割，并生成两个DNA片段，所述片段在中性条件下以1kb和2kb迁移，但在变性条件下，链保持连接并产生以2kb和4kb迁移的单链。
图4是在用(+)或不用(-)核酸内切酶(对于ceDNA构建体1和2，为EcoRI；对于ceDNA构建体3和4，为BamH1；对于ceDNA构建体5和6，为SpeI；并且对于ceDNA构建体7和8，为XhoI)消化的情况下ceDNA载体的变性凝胶运行示例的示例性图片。构建体1-8描述于国际申请PCT PCT/US18/49996(全文以引用的方式并入本文)的实施例1中。确定了用星号突出显示的色带的大小，并提供在图片的底部。
图5是ceDNA1368构建体(6007bp)的注释示意图。图5按出现顺序分别公开了SEQID NO:8和552。
图6是ceDNA1652构建体(6250bp)的注释示意图。图6按出现顺序分别公开了SEQID NO:43和552。
图7是ceDNA1923构建体(5996bp)的注释示意图。图7公开了SEQ ID NO:68。
图8是ceDNA1373的注释示意图，其在外显子1与外显子2之间具有内含子(即，GE-857“miniF8_500/500”，其为小因子VIII内含子1嵌合体，距内含子的5'端500个核苷酸，距内含子的3'端500个核苷酸)并且在启动子(TTRm)与ATG起始位点之间具有位于5'-UTR的另一个内含子(即，GE-023“MVM_intron”)。图8公开了SEQ ID NO:51。
图9显示了如被加工成活性FVIIIa的FVIII及其结构域的示意图。
图10A和图10B是详述将内含子(miniF8_50/100intron)插入ceDNA1367的FVIIIORF中的示意图。图10A描绘了将具有功能性剪接供体和受体位点的嵌合FVIII内含子在内含子1的天然位置处插入密码子优化的FVIII ORF中。图10B描绘了用来源于FVIII Wt cDNA序列的内含子侧接区(33bp)取代FVIII CDS中的密码子优化序列。图10B公开了SEQ ID NO:553。
图11A和图11B是详述将内含子插入FVIII ORF中的示意图。图11A描绘了将具有功能性剪接供体和受体位点的嵌合FVIII内含子(miniF8_200_5p和miniF8_200_3p)在内含子1的天然位置处插入密码子优化的FVIII ORF中。图11B描绘了将增强子元件(Embedded_enhancer_HNF_array)插入嵌合内含子的5p与3p区之间。图11B公开了SEQ ID NO:554。
图12是详述用异源分泌信号序列(N末端序列)取代天然FVIII信号序列的示意图。用天然FVIII信号序列取代来自胰凝乳蛋白酶原(CHY-SSv1)ORF的信号序列。FVIII成熟肽在顶部显示。FVIII N末端信号序列和成熟肽切割位点的序列在底部显示。图12按出现顺序分别公开了SEQ ID NOS:487-490。
图13显示了本文所述的构建体的B结构域选择的示意图，范围有完全B结构域缺失(通常称为BDD-SQ)；仅具有V3肽的B结构域(称为BDD V3；McIntosh等人,2013,Blood,121:3335-3344)；含有6个N连接的糖基化位点的具有226个氨基酸的B结构域(266BD；226a/N6；参见Miao等人,Blood(2004)；以及单链(SC)中的完全B结构域缺失，其中A2结构域连接到在天然A3的N末端具有轻微缺失(“EITR”(SEQ ID NO:486)的4个氨基酸)的A3结构域，称为“Afstyla”试样(BDD-SC)。图13按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:491和491。
图14是显示显色活性测定与验证测定FVIII活性的测定方法的ELISA之间的比较的图。利用显色测定测试各种构建体的FVIII活性，并使用ELISA测试FVIII蛋白量。所测试的构建体是ceDNA692(BBD-SQ)、ceDNA704(BDD-V3)、ceDNA1270(226/F309S)、ceDNA1368(SC)和ceDNA1373(SC/F309S)。
图15描绘了体外ceDNA(ceDNA692(BBD-SQ)、ceDNA693(BBD-SQ)、ceDNA694(BBD-SQ)、ceDNA1391(226/F309S)、ceDNA1270(226/F309S)、ceDNA1367(SC/F309S)、ceDNA1373(SC/F309S)、ceDNA1368(SC)和ceDNA1374(SC))以及第3天体内流体动力学注射研究1和研究2(ceDNA692(BBD-SQ)、ceDNA694(BBD-SQ)、ceDNA933(226BD/F309S)、ceDNA1265、ceDNA1270(226/F309S)、ceDNA1270重复序列(rep)、ceDNA1367(SC/F309S)、ceDNA1373(SC/F309S)、ceDNA1368(SC)和ceDNA1374(SC))的FVIII活性。
图16描绘了使用在LNP中配制的构建体ceDNA933(226BD/F309S)、ceDNA1270(226/F309S)、ceDNA1367(SC/F309S)和ceDNA1368(SC)的体内研究在第11天对FVIII活性的结果。
图17显示了密码子优化对FVIII活性的结果。使用FVIII SC密码子优化的FVIII序列的各种ceDNA(ceDNA1362、ceDNA1368、ceDNA1374、ceDNA1838、ceDNA1840、ceDNA1918、ceDNA1919、ceDNA1920、ceDNA1921、ceDNA1922和ceDNA1923)从体内和体外研究测量FVIII活性。流体动力学(HD)
图18显示了没有F309S突变的密码子优化的构建体：即ceDNA1368及其变体，诸如ceDNA1923、ceDNA1823、ceDNA1840，它们显示出血浆FVIII浓度(IU/ml)改善。流体动力学(HD)
图19描绘了3'非翻译区(UTR)的优化及其对FVIII活性和血浆FVIII的影响。
图20描绘了不同启动子和增强子对FVIII活性的影响。
图21描绘了显示不同内含子对ceDNA FVIII表达的影响的体外研究的结果，如通过显色FVIII活性所测量的。
图22显示了体内施用在LNP中配制的ceDNAFVIII后11天的血浆FVIII显色活性(IU/mL)，如通过FVIII活性的显色测定所测量的(参见实施例12)。
图23描绘了不同DNA核靶向序列(DTS)对体外和体内FVIII活性的影响。
图24描绘了前导序列对体外和体内FVIII活性的影响。
图25显示了在小鼠和非人灵长类动物(NHP)中使用各种ceDNA载体来表达FVIII蛋白的体内研究的结果，如实施例10、15和16中所描述的。结果显示了血浆FVIII浓度(IU/ml)。小鼠媒剂：实施例10，PBS，第5天，n＝5；小鼠DP#1：实施例10，ceDNA1270的LNP制剂1(可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG-GalNAc4(47.5:10.0:39.2:3.3)，1mpk，第5天，n＝4；小鼠DP#2：实施例10，ceDNA1270的LNP制剂2(可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG2000-GalNAc4(47.3:10.0:40.5:2.3)，2mpk，第5天，n＝5；NHP媒剂：实施例14，盐水，第5天，n＝2；NHP DP#1：实施例14，ceDNA1270的LNP制剂1(可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG-GalNAc4(47.5:10.0:39.2:3.3)，1mpk，第5天，n＝2；NHP DP#2：实施例15，ceDNA 1270的LNP制剂2(可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG2000-GalNAc4(47.3:10.0:40.5:2.3)，2mpk，第5天，n＝2。
图26显示了在FVIII敲除小鼠中进行体内研究的结果，如实施例11中所述。结果显示了第10天的血浆FVIII浓度(IU/ml)。以所指示的剂量(mg/kg)测试以下ceDNA构建体ceDNA1270、ceDNA1368、ceDNA1923、ceDNA1651。如图26所示，10天后，以所有测试剂量施用这些ceDNA构建体的小鼠显示出血浆FVIII浓度增加。总之，FVIII血浆浓度的增加是剂量依赖性的。ceDNA1270显示出从0.5mg/kg剂量到2.0mg/kg剂量血浆FVIII浓度明显增加。
图27描绘了显示使用3x hSerpEnh的各种间隔子变体(2-mer和11-mer)和丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子序列变体(例如，婴猴丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子、树鼩丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子)的FVIII表达结果的图表。在第0天将一个剂量的50ng含有FVIII ceDNA序列的质粒流体动力学注射到Rag2小鼠的尾静脉中，在第3天(给药后约72小时)进行单次血液收集以用于FVIII活性。
图28描绘了显示来自体内研究的结果的图表，其中用FVIII-ceDNA流体动力学注射C57BL/6J小鼠，并且在第3天从经处理的小鼠的血清中测量FVIII活性。ceDNA构建体是：(1)ceDNA构建体10(野生型左ITR:左ITR间隔子:3x hSerpEnh VD启动子组:小鼠TTR 5'UTR:MVM内含子:hFVIII-F309S_BD226seq124-BDD-F309 ORF，其与ceDNA 1651的ORF序列相同):WPRE_3pUTR:bGH:右ITR间隔子:野生型右ITR；(2)ceDNA构建体60，其具有与ceDNA构建体10相同的序列，除了它含有3x_hSerpEnh-2mer spacer v17外；(3)ceDNA构建体61，其具有与ceDNA构建体10相同的序列，除了它含有3x_SerpEnh_11-mer_spacers_v3外；(4)ceDNA构建体62，其具有与ceDNA构建体10相同的序列，除了它具有腺嘌呤(A)间隔子(“Aspacer”)位于TTR启动子的5′上游的3x_Bushbaby SerpEnh外；(5)ceDNA构建体39，其具有与ceDNA构建体10相似的序列，除了它含有截短的右ITR外。
具体实施方式
本文提供了一种使用包含一个或多个编码FVIII治疗蛋白或其片段的核酸的ceDNA载体来治疗血友病A的方法。本文还提供了如本文所述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体，所述载体包含一个或多个编码FVIII蛋白的核酸，例如异源核酸。在一些实施方案中，FVIII蛋白的表达可以包括将治疗蛋白分泌到表达该蛋白的细胞之外。另选地，在一些实施方案中，所表达的FVIII蛋白可以在表达该蛋白的细胞内起作用或发挥功能(例如，发挥其效应)。在一些实施方案中，ceDNA载体在受试者的肝脏、肌肉(例如，骨骼肌)或可以充当用于产生FVIII治疗蛋白并将其分泌到许多全身性腔室中的贮库的其他身体部位中表达FVIII蛋白。
I.定义
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义。应理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不打算限制仅由权利要求书定义的本公开的范围。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，由MerckSharp&Dohme Corp.出版(2011)(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编辑)，Fields Virology，第6版，由Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA，USA出版(2013)；Knipe，D.M.和Howley，P.M.(编辑)，The Encyclopedia of Molecular CellBiology and Molecular Medicine，由Blackwell Science Ltd.出版(1999-2012)(ISBN9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版(1995)(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann，由Elsevier出版(2006)；Janeway′sImmunobiology，Kenneth Murphy，Allan Mowat,Casey Weaver(编辑),Taylor&FrancisLimited,2014(ISBN 0815345305、9780815345305)；Lewin's Genes XI，由Jones&BartlettPublishers出版(2014)(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and JosephSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,NewYork,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,JonLorsch(编辑),Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols in MolecularBiology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编辑),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X、9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(编辑),John Wiley and Sons,Inc.,2005；以及Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan MShevach,Warren Strobe(编辑)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735、9780471142737)，这些文献的内容均全文以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“施用”及其变型是指将组合物或药剂(例如，如本文所述的治疗核酸或免疫抑制剂)引入受试者体内并且包括同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。“施用”可以指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。将组合物或药剂引入受试者中是通过任何适合的途径，包括经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。通过电穿孔将组合物或药剂引入受试者中。施用包括自我施用和由另一个人施用。可以通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径使得组合物或药剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入受试者的静脉中来施用组合物。
如本文所用，短语“核酸治疗性”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用，并且是指使用核酸作为治疗疾病或病症的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所用，这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性实例包含mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性示例包括小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、封闭端线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、狗骨(dbDNATM)DNA载体、简约免疫学定义的基因表达(MIDGE)载体、非病毒小线DNA载体(线性-共价封闭DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。
如本文所用，治疗剂(诸如FVIII治疗蛋白或其片段)的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生期望效果(例如，治疗或预防血友病A)的量。用于测量靶基因或靶序列的表达的适合的测定包括例如使用本领域技术人员已知的技术(诸如斑点印迹、northern印迹、原位杂合、ELISA、免疫沉淀、酶功能以及本领域技术人员已知的表型测定)来检查蛋白质或RNA水平。然而，剂量水平是基于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病状、病状的严重程度、施用途径和所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以在很大范围内变化，但可以由医生使用标准方法常规地确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学有效量”包括所描述的公开内容的组合物的防治或预防量。在所描述的公开内容的防治或预防应用中，以足以消除或降低疾病、障碍或病症(包括疾病、障碍或病症的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病、障碍或病症的发展期间呈现的中间病理学表型)的风险、减轻它们的严重程度或者延迟它们的发作的量向易患有疾病、障碍或病症或者以其他方式处于它们的风险中的患者施用药物组合物或药剂。通常优选使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。根据一些实施方案，疾病、障碍或病症是血友病A。术语“剂”和“剂量”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。
对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其他熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可以在《古德曼和吉尔曼的治疗学的药理学基础(Goodman and Gilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics)》,第10版,麦格劳-希尔专业出版公司(McGraw-Hill)(纽约)(2001)的第1章中找到，所述文献以引用的方式并入本文中。
药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。
如本文所使用，术语“异源核酸序列”和“转基因”可互换使用并且指并入如本文所公开的ceDNA载体中并可以由所述ceDNA载体递送和表达的感兴趣的核酸(除编码衣壳多肽的核酸之外)。在一个实施方案中，核酸序列可以是异源核酸序列。根据一些实施方案，术语“异源核酸”打算指不存在于其所接触的细胞或受试者中、由其所接触的细胞或受试者表达或衍生自其所接触的细胞或受试者的核酸(或转基因)。
如本文所用，术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用，并且是指一段线性核酸，其包括与一个或多个启动子或足以引导转基因转录的其它调节序列可操作地连接的转基因，但是不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区域。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏子)、一个或多个内含子和一个或多个转录后调节元件。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，这个术语包含单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交物、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“oligo”，并且可以从基因中分离出来，或通过所属领域已知的方法化学合成。应了解术语“多核苷酸”和“核酸”包含单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸(如果所描述的实施方案适用的话)。DNA可呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、辅助DNA(线性共价封闭DNA载体)、封闭端线性双链体DNA(CELiD或ceDNA)、doggybone(dbDNATM)DNA、哑铃形DNA、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、病毒载体或非病毒载体的形式。RNA可以呈小干扰RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)和其组合的形式。核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合特性。所述类似物和/或经修饰残基的实例包含(但不限于)：硫代磷酸酯、磷酰二胺吗啉代寡聚体(吗啉代)、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNATM)和肽核酸(PNA)。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。
如本文所使用的，“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。
“碱基”包括嘌呤和嘧啶，所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于放置新的反应性基团(诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物)的修饰。
如本文所使用的，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其是从天然基因中分离的，或者以自然界中不另外存在或合成的方式进行修饰以含有核酸的节段。当核酸构建体包含表达本公开的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。“表达盒”包含可操作地连接至启动子的DNA编码序列。
“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如RNA)包括使其能够与另一核酸序列在体外和/或体内适当的温度和溶液离子强度的条件下非共价结合，即形成沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)和/或G/U碱基对、“退火”或“杂交”以序列特异性的反向平行方式(即，核酸特异性地结合于互补核酸)的核苷酸序列。如所属领域已知的，标准的沃森-克里克碱基对包含：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。另外，在所属领域中还已知对于两个RNA分子(例如dsRNA)之间的杂交，鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如，在与mRNA中的密码子进行tRNA反密码子碱基配对的情况下，G/U碱基配对部分负责遗传密码的简并性(即，冗余)。在本公开的上下文中，靶向主题DNA的RNA分子的蛋白质结合区段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补，反之亦然。这样，当可以在靶向主题DNA的RNA分子的蛋白质结合节段(dsRNA双链体)的给定核苷酸位置形成G/U碱基对时，所述位置不被认为是非互补的，而是被认为是互补的。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包含编码和非编码的氨基酸、经过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。
“编码”特定FVIII蛋白的DNA序列为转录到特定RNA和/或蛋白质中的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可编码被翻译成蛋白质的RNA(mRNA)，或者DNA多核苷酸可编码未被翻译成蛋白质的RNA(例如，tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；也称为“非编码”RNA或ncRNA)。
如本文所用，如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质域的多肽。例如，融合蛋白可包含(i)FVIII或其片段和(ii)至少一种非GOI蛋白。本文涵盖的融合蛋白包括但不限于抗体或者与FVIII蛋白融合的抗体的Fc或抗原结合片段，例如受体、配体、酶或肽的细胞外结构域。作为融合蛋白的一部分的FVIII蛋白或其片段可以为单特异性抗体或双特异性抗体或多特异性抗体。
如本文所用，术语“基因组安全港基因”或“安全港基因”是指可以插入核酸序列以使得所述序列可以以可预测的方式整合和起作用(例如表达所关注蛋白质)且对内源基因活性没有明显的负面影响或不促进癌症的基因或基因座。在一些实施方案中，安全港基因也是可有效地表达所插入的核酸序列并且表达水平比非安全港位点高的基因座或基因。
如本文所用，术语“基因递送”意指将外来DNA转移到宿主细胞中以施加基因疗法的过程。
如本文所用，术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)(也称为RBE(Rep结合元件))和末端解链位点(“TRS”)共同构成“最低需要的复制起点”，并且因此TR包括至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和原病毒拯救。正如在本文的公开内容中意外发现的，在全长上不是反向互补序列的TR仍然可以执行ITR的传统功能，因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。所属领域的普通技术人员将了解，在复杂的ceDNA载体构型中，可以存在超过两个ITR或不对称的ITR对。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR，或可以来源于AAVITR或非AAV ITR。例如，ITR可以来源于细小病毒科，其涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)，或可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截短、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科。依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，所述宿主包含但不限于人、灵长类、牛、犬、马和羊物种。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV或其它依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口能力。由于遗传密码简并或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核酸序列可能与典型的天然存在的序列略有不同，并且因此，本文涵盖的使用的WT-ITR序列包括归因于在产生过程中发生的天然存在的变化(例如复制误差)的WT-ITR序列。
如本文所用，术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对WT-ITR，它们都是在整个长度上具有反向互补序列的野生型ITR。举例来说，ITR即使具有一个或多个偏离典型的天然存在的序列的核苷酸，只要变化并不影响所述序列的特性和整体三维结构，所述ITR也可以被认为是野生型序列。在一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性示例，序列与典范序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(例如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与另一个WT-ITR具有对称的三维空间组织，以使它们的3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定具有与合适的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解离位点(TRS)，可以在功能上将基本上对称的WT-ITR确认为WT。可以选择测试其它功能，包含在许可条件下的转基因表达。
如本文所使用的，短语“经修饰ITR(modified ITR/mod-ITR)”或“突变ITR”在本文中可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。所述突变可以引起ITR中的A、C、C'、B、B'区中的一个或多个发生变化，并且可以使得三维空间组构(即，其几何空间中的3D结构)相较于相同血清型的WT-ITR的3D空间组构发生变化。
如本文所使用的，术语“不对称ITR”也称为“不对称ITR对”，是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内在全长上不反向互补的一对ITR。作为一个非限制性示例，不对称的ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组织，使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说，不对称的ITR对具有不同的整体几何结构，即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组织(例如，一个ITR与同源ITR相比可能具有短的CC'臂和/或短的BB'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截短或点突变引起的。在一个实施方案中，不对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列，另一个ITR是如本文定义的修饰ITR(例如非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施方案中，不对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列，并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰的ITR(即，不同的整体几何结构)。在一些实施方案中，不对称ITR对中的一个经修饰ITR可能具有短的C-C'臂，而另一个ITR可能具有不同的修饰(例如单臂或短的B-B'臂等)，使得它们与同源不对称经修饰ITR相比具有不同的三维空间组织。
如本文所用，术语“对称ITR”是指在单个ceDNA基因组或ceDNA载体内是野生型或突变型(例如，相对于野生型被修饰)依赖病毒ITR序列并且在其全长上反向互补的一对ITR。在一个非限制性示例中，两个ITR都是来自AAV2的野生型ITR序列。在另一个示例中，两个ITR都不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是经修饰的ITR，也被称为突变ITR)，并且由于核苷酸添加、缺失、取代、截短或点突变而可能在序列上与野生型ITR不同。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
如本文所使用的，术语“基本上对称的修饰ITR”或“基本上对称的经修饰ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对修饰ITR，它们在其全长上具有反向互补序列。例如，经修饰的ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核酸序列，但也可以认为其是基本上对称的，只要变化不影响性质和整体形状。作为一个非限制性实例，序列与典型序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与其同源经修饰的ITR具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。换句话说，基本上对称的经修饰的ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。在一些实施方案中，来自mod-ITR对的ITR可具有不同的反向互补核酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组构，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。举例来说，经修饰ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同血清型，然而，两者均能够具有相同的相应突变(例如，如果5'ITR在C区域中具有缺失，则来自不同血清型的经修饰的同源3'ITR在C'区域中的相应位置具有缺失)，使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组织。在此类实施方案中，经修饰的ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如，AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，诸如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰反映在来自不同血清型的同源ITR中的对应位置中。在一个实施方案中，基本上对称的经修饰的ITR对是指一对经修饰的ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核酸序列的差异不影响特性或整体形状并且它们在3D空间中具有基本上相同的形状。作为非限制性实例，如通过本领域中公知的标准方法，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与典型的mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且还具有对称的三维空间组构，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。基本上对称的经修饰ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的经修饰ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源经修饰ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源经修饰ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B’环的类似3D结构。
术语“侧接”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B的两侧是A和C。这同样适用于布置AxBxC。因此，侧接序列在所侧接的序列之前或之后，但不必与所侧接的序列相邻或紧邻。在一个实施方案中，术语“侧接”是指在线性双链体ceDNA载体的每个末端处的末端重复序列。
如本文所用，术语“治疗”包括减轻、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床症状，或者基本上预防病症的临床症状的出现、获得有益或期望的临床结果。根据一些实施方案，病症是血友病A。治疗还指完成以下项中的一种或多种：(a)降低障碍的严重程度；(b)限制被治疗障碍的特征性症状的发展；(c)限制被治疗障碍的特征性症状的恶化；(d)限制障碍在先前患有所述障碍的患者中的复发；以及(e)限制先前对障碍无症状的患者的症状复发。有益或所需的临床结果，如药理学和/或生理学作用，包括(但不限于)：预防可能易患有疾病、病症或病状但尚未经历或展现疾病的症状的受试者出现所述疾病、病症或病状(防治性治疗)；缓解所述疾病、病症或病状的症状；减轻所述疾病、病症或病状的程度；稳定所述疾病、病症或病状(即，不恶化)；预防所述疾病、病症或病状的扩散；延迟或减缓所述疾病、病症或病状进展；改善或缓和所述疾病、病症或病状；以及其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。
如本文所用，术语“增加”、“增强”、“提高”(以及类似术语)通常是指相对于自然条件、预期条件或平均条件、或者相对于对照条件直接地或间接地增加浓度、水平、功能、活性或行为的作用。
如本文所用，术语“最小化”、“减少”、“降低”和/或“抑制”(以及类似术语)通常是指直接或间接地降低相对于自然条件、预期条件或平均条件，或相对于对照条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。
如本文所使用的，术语“ceDNA基因组”是指还并入了至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。在一些实施方案中，所述ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所使用的，术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的间插序列。在一些实施方案中，ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最优功能性来说所期望的距离上。在一些实施方案中，ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传稳定性。在一些实施方案中，ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置，促进ceDNA基因组的就绪遗传操作。举例来说，在某些方面中，含有若干限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多酶切点接头”或设计成不具有已知蛋白质(例如转录因子)结合位点的非开放阅读框架序列能够定位于ceDNA基因组中以分离顺式作用因子，例如将6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等插入末端解链位点与上游转录调节元件之间。类似地，可以在多聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解链位点之间并入间隔区。
如本文所用，术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋白(例如AAV Rep 78或AAV Rep68)的结合位点，其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了所述RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列在本领域中是已知的，并且包括例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:437)，即在AAV2中标识的RBS序列。在本公开的实施方案中可以使用任何已知的RBS序列，包括其它已知的AAV RBS序列和其它天然已知的或合成的RBS序列。不受理论束缚，认为Rep蛋白的核酸酶结构域结合到双链体核酸序列GCTC，因此两种已知的AAV Rep蛋白直接结合到双链体寡核苷酸5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(SEQ ID NO:437)并稳定地装配在其上。另外，可溶性聚集性构象异构体(即，数目未定的相互缔合的Rep蛋白)解离并结合到含有Rep结合位点的寡核苷酸。每个Rep蛋白都与每个链上的含氮碱基和磷酸二酯骨架相互作用。与含氮碱基的相互作用提供序列特异性，而与磷酸二酯主链的相互作用是非或较少序列特异性的，并稳定了蛋白质-DNA复合物。
如本文所使用，术语“末端解链位点”和“TRS”在本文中可互换使用并且指一个区域，在所述区域Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键，从而产生3'OH，其充当用于通过细胞DNA聚合酶，例如DNA polδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。可替代地，Rep-胸苷复合物可以参与配位接合反应。在一些实施方案中，TRS最低限度地涵盖非碱基配对的胸苷。在一些实施方案中，TRS的切口产生效率可以至少部分地由其在同一分子内距RBS的距离来控制。当受体底物是互补ITR时，所产生的产物是分子内双螺旋。TRS序列是本领域已知的，并包含例如5'-GGTTGA-3'，其是在AAV2中鉴定的六核苷酸序列。本公开的实施方案中可使用任何已知的TRS序列，包括其他已知的AAV TRS序列和其他天然已知的或合成的TRS序列，诸如AGTT(SEQ ID NO:438)、GGTTGG、AGTTGG、AGTTGA和其他基序(诸如RRTTRR)。
如本文所用，术语“ceDNA-质粒”是指一种包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的质粒。
如本文所使用的，术语“ceDNA-杆粒”是指一种包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种在杆状病毒基因组内包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，是指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。
如本文所用，术语“ceDNA”是指用于非病毒基因转移、合成或其他目的的无衣壳封闭端线性双链(ds)双螺旋DNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中，所述申请的全部内容以引用的方式明确地并入本文中。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实施例1中，所述申请中的每一个全文以引用的方式并入本文中。用于产生包含各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，该国际申请的全部内容以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“封闭端DNA载体”是指具有至少一个共价封闭端的无衣壳DNA载体，其中所述载体的至少一部分具有分子内双链体结构。
如本文所使用的，术语“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包括至少一个末端回文结构的末端封闭式DNA载体。在一些实施方案中，ceDNA包含两个共价封闭端。
如本文所用，术语“neDNA”或“带切口的ceDNA”是指在开放阅读框(例如，待表达的启动子和转基因)上游的茎区或间隔区5'中具有1-100个碱基对的切口或间隙的封闭端DNA。
如本文所用，术语“间隙”是指本公开的合成DNA载体的不连续部分，在原本双链的ceDNA中产生一段单链DNA部分。在双链体DNA的一个链中，间隙的长度可以是1个碱基对到100个碱基对。由本文所描述的方法以及由所述方法产生的合成载体设计和产生的典型间隙的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60bp。本公开中的示例性间隙的长度可以是1bp到10bp、1bp到20bp、1bp到30bp。
如本文中所定义，“报告体”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白质。报告体通常产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白质。例如，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它在所属领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“有义”和“反义”是指多核苷酸上结构元件的取向。元件的有义和反义型式彼此反向互补。
如本文所用，术语“合成AAV载体”和“AAV载体的合成产生”是指在完全无细胞环境中的AAV载体和其合成产生方法。
如本文所用，“报告子”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白质。报告体通常产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白质。例如，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它在所属领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“效应蛋白”是指一种提供可检测的读出数的多肽，例如作为报告多肽，或更适当地，作为杀伤细胞的多肽，例如毒素，或致使细胞易用所选作用剂或因缺乏所选作用剂而被杀伤的作用剂。效应蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞的DNA和/或RNA的任何蛋白质或肽。例如，效应子蛋白可以包含但不限于：靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制性核酸内切酶；降解细胞存活所必需的多肽目标的蛋白酶；DNA旋转酶抑制剂；以及核糖核酸酶型毒素。在一些实施方案中，由如本文所描述的合成生物回路控制的效应子蛋白表达可作为一个因子参与另一个合成生物回路，从而扩大了生物回路系统反应性的范围和复杂度。
转录调节因子是指活化或抑制感兴趣的基因转录的转录活化子和抑制因子，例如FVIII。启动子为引发特定基因转录的核酸区域。转录活化子通常结合至转录启动子附近并且募集RNA聚合酶以直接引发转录。阻遏子与转录启动子结合，并在空间上阻碍RNA聚合酶启动转录。其它转录调节子可取决于它们的结合位置以及细胞和环境条件来充当活化子或阻遏子。转录调节子类别的非限制性示例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
如本文所使用的，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调节序列元件结合并分别阻遏或活化与调节序列元件操作性连接的序列的转录的蛋白质。如本文所描述的优选阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存在或不存在敏感。如本文所描述的优选蛋白质是模块的形式，包括例如可分离的DNA结合和输入剂结合或反应元件或结构域。
如本文所使用的，“载剂(carrier)”包含任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性组分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所使用的，“输入剂反应结构域”是转录因子的一个结构域，其以致使连接的DNA结合融合结构域对条件或输入剂的存在作出反应的方式与所述条件或输入剂结合或以其它方式作出反应。在一个实施方案中，条件或输入剂的存在导致输入剂反应结构域或其融合的蛋白质发生构象变化，从而改变转录因子的转录调制活性。
术语“体内”是指在生物体，如多细胞动物中或内部进行的分析或过程。在本文描述的一些方面中，当使用单细胞生物例如，细菌时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用在多细胞动物体或植物体之外的具有完整膜的活细胞进行的方法和用途，所述活细胞例如外植体、培养细胞(包括原代细胞和细胞系)、转化的细胞系、以及提取的组织或细胞(包括血细胞)等等。术语“体外”是指不需要存在具有完整膜的细胞的分析和方法，如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统，如不包含细胞或细胞系统的介质，如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。
如本文所用，术语“启动子”是指通过驱动核酸序列(其可以是靶基因，例如编码蛋白质或RNA的异源靶基因)的转录来调节另一核酸序列的表达的任何核酸序列。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在所述核酸序列的其余部分的引发和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件，例如，RNA聚合酶和其他转录因子。在本文所述的方面的一些实施方案中，启动子可以驱动调节启动子本身的表达的转录因子的表达。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子，包括诱导型启动子，可用于驱动本文公开的ceDNA载体中转基因的表达。启动子序列可以在其3’末端以转录起始位点为界并且向上游延伸(5’方向)以包括为了在高于背景的可检测水平上引发转录所必需的最少数目个碱基或元件。
如本文所用，术语“增强子”是指结合一种或多种蛋白质(例如，活化蛋白或转录因子)以增加核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列(例如，50-1,500个碱基对)。增强子可以位于其所调节的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以位于内含子区域内，或无关基因的外显子区中。增强子可以是与启动子、基因或序列天然相关的增强子。
启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“操作性地连接”、“操作性定位”、“操作性连接”，“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所使用的，“反向启动子”是指核酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链的启动子，并且反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施方案中用于调节开关的状态。另外，在各种实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于编码区段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子来获得。此类启动子可以称为“内源性的”。类似地，在一些实施方案中，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于所述序列的下游或上游。
在一些实施方案中，编码核酸区段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，所述启动子均指在其天然环境中通常不与其可操作地连接的编码核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子是指在天然环境中正常不与给定核酸序列关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子；从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”(即包含不同转录调节区域的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法改变表达的突变)的合成启动子或增强子。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以结合本文公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR，来产生启动子序列(参见例如美国专利第4,683,202号、美国专利第5,928,906号，各自以引用的方式并入本文)。此外，经考虑也可以采用指导序列在例如，线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。
如本文所描述的，“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时，启动或增强转录活性的启动子。如本文所定义的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的，或是以能够从诱寻型启动子诱导转录活性的方式施用的通常外源性的化合物或蛋白质。在一些实施方案中，诱导物或诱导剂，即化学物质、化合物或蛋白质，本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即诱导物可以是由另一组分或模块表达的诱导蛋白)，转录或表达本身可以处于诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，诱导型启动子是在不存在某些药剂，如阻遏子的情况下被诱导的。诱导型启动子的示例包括但不限于四环素、金属硫蛋白、蜕皮素、哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其他类固醇反应性启动子、雷帕霉素反应性启动子等。
本文可互换使用的术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”是指提供和/或调节非编码序列(例如靶向DNA的RNA)或编码序列(例如定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节所编码多肽的转译的转录和转译控制序列，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等。
“可操作地连接”是指一种并置，其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子可操作地连接到所述编码序列。“表达盒”包括与启动子或足以指导转基因在ceDNA载体中转录的其他调节序列可操作地连接的DNA序列，例如异源DNA序列。合适的启动子包括例如组织特异性启动子或AAV来源的启动子。
如本文所使用，术语“受试者”是指向其提供用本公开的ceDNA载体进行的治疗，包括预防性治疗的人类或动物。通常，动物为脊椎动物，例如但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或猎获的动物。灵长类动物包括但不限于黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养和野生动物包括但不限于：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种如家猫、犬科物种如狗、狐狸、狼、禽类物种如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在本文所述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物或人。受试者可以是雄性或雌性。另外，受试者可以是婴儿或儿童。在一些实施方案中，受试者可以是新生儿或未出生的受试者，例如，受试者还在子宫内。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些示例。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病症的动物模型的受试者。另外，本文所描述的方法和组合物可以用于家养动物和/或宠物。人类受试者可以是任何年龄、性别、种族或人种群组，例如，高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其它受试者。在一些实施方案中，受试者已进行治疗。在一些实施方案中，受试者是胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施方案中，受试者是人类胎儿、人类新生儿、人类婴儿、人类儿童、人类青少年或人类成人。在一些实施方案中，受试者是动物胚胎，或非人类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。在一些实施方案中，受试者是人胚胎。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括易于被本公开的核酸构建体或ceDNA表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性示例，宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如HepG2细胞)中的任何一种。可替代地，宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。
术语“外源”是指存在于细胞中而非其天然来源的物质。当在本文中使用时，术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸(例如，编码多肽的核酸)或多肽，通常在所述细胞或生物体中未发现所述核酸或多肽，并且希望将核酸或多肽引入此类细胞或生物体中。可替代地，“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸或多肽，在所述细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低，并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量，例如，以产生异位表达或水平。相比之下，术语“内源”是指生物系统或细胞天然存在的物质。
术语“序列同一性”是指两个核酸序列之间的相关性。出于本公开的目的，使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件,Rice等人,2000,同上)，优选版本3.0.0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长一致性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作一致性百分比，并按以下计算：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸、优选为至少25个核苷酸、更优选为至少50个核苷酸并且最优选为至少100个核苷酸。
如本文所用，术语“同源性”或“同源”被定义为，在比对序列且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，与靶染色体上的相应序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。出于确定核苷酸序列同源性百分比的比对可以用所属技术领域中内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，当同源臂的例如核酸序列(例如DNA序列)与宿主细胞的相应原生或未经编辑的核酸序列(例如基因组序列)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多同一性时，所述序列被视为“同源”。
如本文所用，术语“异源”意指分别在天然核酸或蛋白质中未发现的核苷酸或多肽序列。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变异体)连接(例如通过基因工程)以产生编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如，通过基因工程)以产生编码融合变异多肽的核苷酸序列。
“载体”或“表达载体”为可以与另一DNA区段，即“插入片段”附接以便使所附接的区段在细胞中复制的复制子，例如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒粒子或粘质体。载体可以是设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体在起源和/或最终形式上可以是病毒或非病毒的，但是出于本公开的目的，“载体”通常是指ceDNA载体，如本文所用。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。在一些实施方案中，载体可以是表达载体或重组载体。
如本文所用，术语“表达载体”是指引导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包括其它元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如，在人类细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时包括但不限于例如转录、转录物加工、转译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过转译从基因转录的mRNA所获得的多肽。术语“基因”是指当可操作地连接至适当的调控序列时，在体外或体内转录(DNA)为RNA的核酸序列。基因可以包括或可以不包括编码区前后的区域，例如5'非转译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾区”序列，以及单个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“重组载体”意指包括能够在体内表达的核酸序列(例如，异源核酸序列)或“转基因”的载体。应了解，在一些实施方案中，本文所述的载体可以与其它合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中，载体是游离型的。合适的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持受试者中的所关注核苷酸，从而消除染色体整合的潜在影响的方式。
如本文所用的短语“遗传性疾病”是指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病，尤其是从出生起出现的病状。异常可以是突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调节序列。遗传疾病可以是(但不限于)DMD、血友病、囊肿性纤维化、亨廷顿氏舞蹈病、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏疾病(Wilson's disease)、先天性肝卟啉症(hepatic porphyria)、遗传性肝代谢病症、勒什尼汗综合症(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞贫血、地中海贫血、着色性干皮病、范克尼氏贫血(Fanconi's anemia)、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁氏综合症、视网膜母细胞瘤，和泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs disease)。
如本文所使用的，术语“包括(comprising/comprises)”在提及组合物、方法以及对所述方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。
如本文所使用的，术语“基本上由…组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。所述术语允许存在不实质影响所述实施方案的一个或多个基本和新颖或功能性特征的要素。“包含”的使用表示包含而不是限制。
术语“由…组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，其排除在所述实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本文所使用的，术语“基本上由…组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。该术语允许存在不实质影响本发明的那个实施方案的一种或多种基本和新颖或功能特征的另外要素。
如本说明书和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”包含多个提及物。因此，举例来说，提到“方法”包含本文所描述的和/或在阅读本公开等之后对于所属领域技术人员而言将变得显而易见的类型的一个或多个方法和/或步骤。类似地，除非上下文另有明确规定，否则单词“或”旨在包含“和”。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开，但在下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
本文所公开的本公开的替代性要素或实施方案的分组不解释为限制。每个组成员可以单独提及和要求，或呈与所述组的其它成员或此处找到的其它要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时，在本文中认为说明书含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
在任何方面的一些实施方案中，本文描述的公开内容不涉及克隆人的方法、用于修饰人的种系遗传身份的方法、用于工业或商业目的的人胚胎的使用、或用于修饰动物的基因身份，可能导致其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法，以及由这类方法产生的动物。
其它术语在本文中限定于本公开的各个方面的描述内。
本申请全文中引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，以描述和公开例如在此类出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其它原因而提前所述公开。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是替代实施方案可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
II.由ceDNA载体表达FVIII蛋白
本文所述的技术大体上涉及由非病毒DNA载体(例如，如本文所述的ceDNA载体)在细胞中表达和/或产生FVIII蛋白。用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体描述于标题为“通用ceDNA载体”的章节中。具体地，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含一对ITR(例如，如本文所述的对称的或不对称的)，并且在该ITR对之间包含与启动子或调节序列可操作地连接的编码FVIII蛋白的核酸。用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体相对于传统AAV载体甚至慢病毒载体的独特优势在于，对核酸序列(例如，编码期望蛋白质的异源核酸序列)没有大小限制。甚至全长6.8kb的FVIII蛋白也可以由单个ceDNA载体表达。因此，本文所述的ceDNA载体可以用于在有需要的受试者(例如，患有血友病A的受试者)中表达治疗性FVIII蛋白。
正如人们将了解的那样，ceDNA载体技术可以适于任何复杂程度或可以以模块化方式使用，其中可以以独立的方式控制FVIII蛋白的不同组分的表达。例如，特别考虑了此处描述的ceDNA载体技术可以像使用单个ceDNA载体表达单个基因序列(例如，FVIII蛋白)一样简单，或可以像使用多个ceDNA载体一样复杂，其中每个载体表达各自独立地由不同启动子控制的多个FVIII蛋白或相关辅因子或辅助蛋白。特别考虑了以下实施方案，并且本领域的技术人员可以根据需要对这些实施方案进行调整。
在一个实施方案中，单个ceDNA载体可以用于表达FVIII蛋白的单个组分。另选地，单个ceDNA载体可以用于在单个启动子(例如，强启动子)的控制下任选地使用IRES序列表达FVIII蛋白的多个组分(例如，至少2个)，以确保这些组分中的每一个(例如，辅因子或辅助蛋白)适当地表达。
正如本领域技术人员将了解的那样，常常期望以不同的表达水平表达FVIII蛋白的组分，从而控制所表达的单个组分的化学计量以确保FVIII蛋白在细胞中有效折叠和组合。所属领域的技术人员能够设想ceDNA载体技术的其它变化形式或能够使用常规载体通过蛋白质产生方法对其进行调适。
A.核酸
本文提供了用于潜在治疗用途的核酸分子的表征和开发。根据一些实施方案，用于治疗用途的核酸编码FVIII蛋白。在一些实施方案中，在适当情况下描述了出于改变和改善的体内性质(递送、稳定性、寿命、折叠、靶标特异性)以及其与治疗应用直接相关的生物学功能和机制的目的对寡核苷酸进行化学修饰。
本文所述的治疗性核苷酸是封闭端双链DNA，例如ceDNA。用于表达治疗性蛋白的ceDNA载体相对于传统AAV载体甚至慢病毒载体的独特优势在于，对核酸序列(例如，编码期望蛋白质的异源核酸序列)没有大小限制。因此，ceDNA载体可以用于在有需要的受试者中表达FVIII蛋白。
一般来说，如本文所公开的用于表达FVIII的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺病毒相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下项中的任一种：(i)至少一个WT ITR和至少一个修饰的AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的修饰的ITR)；(ii)两个修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如，不对称的修饰的ITR)，或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构，或者(iv)对称或基本上对称的修饰的ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构。
在一些实施方案中，编码FVIII蛋白的转基因还可以编码分泌序列，使得FVIII蛋白被引导到高尔基氏体和内质网，在那里，FVIII蛋白在穿过ER并离开细胞时被伴侣分子折叠成正确的构象。示例性分泌序列包括但不限于VH-02(SEQ ID NO:88)和VK-A26(SEQ IDNO:89)和IgK Kβ信号序列(SEQ ID NO:548)，以及允许标记的蛋白质从细胞溶质中分泌出来的Gluc分泌信号、将标记的蛋白质引导到高尔基体的TMD-ST分泌序列。
调节开关还可以用于微调FVIII蛋白的表达，使得根据需要表达FVII蛋白，包括但不限于以期望的表达水平或量表达FVIII蛋白，或另选地，当存在或不存在特定信号时，包括细胞信号传导事件。举例来说，如本文所描述，当出现特定病况时，可以开启或关闭ceDNA载体对FVIII蛋白的表达，如本文中的标题为调节开关的章节中所描述。
举例来说并且仅出于说明的目的，FVIII蛋白可以用于关闭非所期望的反应，例如FVIII蛋白的过高的产生水平。FVIII基因可以含有用于将FVIII蛋白带到期望细胞的信号肽标记物。然而，在任一种情况下，都可能期望调节FVIII蛋白的表达。ceDNA载体容易适应调节开关的使用。
ceDNA载体相对于传统AAV载体甚至慢病毒载体的独特优势在于，对编码FVIII蛋白的核酸序列没有大小限制。因此，甚至全长FVIII以及任选的任何辅因子或辅助蛋白可以由单个ceDNA载体表达。另外，取决于必要的立体化学，人们可以表达同一FVIII蛋白的多个区段，并且可以使用相同或不同启动子，并且还可以使用调节开关来微调每个区域的表达。例如，可以使用包含双启动子系统的ceDNA载体，使得不同启动子用于FVIII蛋白的每个结构域。使用ceDNA质粒产生FVIII蛋白可以包括用于表达FVIII蛋白结构域的启动子的独特组合，这引起适当比率的每个结构域用于形成功能性FVIII蛋白。因此，在一些实施方案中，ceDNA载体可以单独地(例如，在不同启动子的控制下)用于表达FVIII蛋白的不同区域。
在另一个实施方案中，由ceDNA载体表达的FVIII蛋白进一步包含额外功能，例如荧光、酶活性、分泌信号或免疫细胞活化子。
在一些实施方案中，编码FVIII蛋白的ceDNA可以进一步包含例如接头结构域。如本文所使用，“接头结构域”是指长度为约2到100个氨基酸的寡肽或多肽区，其使如本文所描述的FVIII蛋白的任一个结构域/区域连接在一起。在一些实施方案中，接头能够包括或由柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)构成，使得相邻蛋白质域相对于彼此自由地移动。当希望确保两个相邻结构域在空间上彼此无干扰时，可以使用较长接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的示例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等效物以及其组合。接头可以是来源于明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)的T2A的接头区域。
在一些实施方案中，编码FVIII蛋白的转基因还可以包括信号序列。在一些实施方案中，编码FVIII蛋白的转基因可以具有
本领域技术人员完全能够采用FVIII的已知和/或公开可用的蛋白质序列并且反向工程改造cDNA序列以编码这种蛋白质。然后可以对cDNA进行密码子优化以与预定的宿主细胞匹配，并且插入如本文所述的ceDNA载体中。
B.表达FVIII蛋白的ceDNA载体
具有一个或多个编码期望FVIII的序列的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以包含调节序列，例如启动子、分泌信号、聚A区和增强子。至少，ceDNA载体包含一个或多个编码FVIII蛋白的核酸序列，例如异源核酸序列。
为了实现高效且精确的FVIII蛋白装配，在一些实施方案中，特别预期FVIII蛋白包含内质网ER前导序列以将其引导到ER，在所述ER中发生蛋白质折叠。例如，序列将所表达的蛋白质引导到ER进行折叠。
在一些实施方案中，细胞或细胞外定位信号(例如，分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号等)包含在ceDNA载体中以指导FVIII的分泌或期望亚细胞定位，使得FVIII蛋白可以结合到细胞内标靶(例如，胞内抗体)或细胞外标靶。在一些实施方案中，FVIII序列可含有增强FVIII分泌出ER的突变。例如，FVIII分泌需要高水平的细胞内ATP，这与BiP的ATP依赖性释放一致。将位置309处的Phe突变为Ser或Ala(F309S)增强了功能性FVIII的分泌并降低了其ATP依赖性。(Swaroop等人,J.Biol.Chem(1997)272:27428-34)。
在一些实施方案中，如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体准许以模块化方式装配和表达任何期望FVIII蛋白。如本文所用，术语“模块化”是指能够轻松地从构建体中去除的ceDNA表达质粒中的元件。例如，产生ceDNA的质粒中的模块化元件包含侧接构建体内的每个元件的独特限制位点对，从而能够排他性地操控单个元件。因此，ceDNA载体平台可以允许任何期望的FVIII ORF表达并与任何期望的顺式作用元件(诸如增强子、启动子、内含子、5'-UTR、3'-UTR、poly-A等)装配。在各种实施方案中，本文提供了可以减少和/或最小化装配编码FVIII蛋白的期望ceDNA载体所需的操纵量的ceDNA质粒载体。
C.由ceDNA载体表达的示例性FVIII蛋白
具体地，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以编码例如但不限于用于治疗、预防和/或改善血友病A的一种或多种症状的FVIII蛋白以及其变异体和/或活性片段。在一个方面，血友病A是人血友病A。
(i)FVIII治疗蛋白及其片段
基本上任何型式的FVIII治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)都可以由如本文所述的ceDNA载体编码并在该载体中由其表达。本领域技术人员将理解FVIII治疗蛋白包括FVIII蛋白的所有剪接变体和直向同源物。FVIII治疗蛋白包括完整分子以及其片段(例如，功能性片段)。根据本公开的实施方案，编码特定FVIII蛋白的核酸在表1A中示出。
因子VIII
因子VIII是激活的凝结因子IX(FIXa)的非酶促辅因子，当其被蛋白水解激活时，会与FIXa相互作用形成紧密的非共价复合物，该复合物结合并激活因子X(FX)。
因子VIII基因或蛋白质也可被称为F8、凝血因子VIII、促凝血成分、抗血友病因子、F8C、AHF、DXS1253E、FVIII、HEMA或F8B。因子VIII基因的表达是组织特异性的，主要在肝细胞中观察到。已经在肝窦状隙细胞中检测到最高水平的mRNA和因子VIII蛋白；大量的因子VIII也存在于肝细胞和Kupffer细胞(肝窦状隙的驻留巨噬细胞)中。在血清和血浆中可检测到中等水平的因子VIII蛋白。在胎儿脑、视网膜、肾和睾丸中表达低至中等水平的因子VIII蛋白。
因子VIII mRNA在身体的许多组织中表达，包括骨髓、全血、白细胞、淋巴结、胸腺、大脑、大脑皮层、小脑、视网膜、脊髓、胫神经、心脏、动脉、平滑肌、骨骼肌、小肠、结肠、脂肪细胞、肾、肝、肺、脾、胃、食道、膀胱、胰腺、甲状腺、唾液腺、肾上腺、脑垂体、乳房、皮肤、卵巢、子宫、胎盘、前列腺和睾丸。位于X染色体长臂上的FVIII基因占据大约186kbp长的区域，并由26个外显子(69-3,106bp)和内含子(从207bp到32.4kbp)组成。该基因的编码序列的总长度为9kbp。
成熟因子VIII多肽包含A1–A2–B–A3–C1-C2结构域。三个酸性子域，表示为a1–a3–A1(a1)–A2(a2)–B–(a3)A3–C1–C2，位于A域的边界，在FVIII和其他蛋白质(特别是凝血酶)之间的相互作用中发挥重要作用。这些亚结构域中的突变降低了凝血酶激活因子VIII的水平(对于FVIII加工步骤，参见图9)。
因子VIII蛋白(凝血因子VIII同种型)是一种前蛋白原[智人]；登录号：NP_000123.1(2351aa)并且具有如SEQ ID NO:492中所示的序列。
根据一些实施方案，本文考虑的FVIII蛋白可以是修饰的FVIII蛋白。根据另外的实施方案，FVIII蛋白可以具有缺失的B结构域并且包含SEQ ID NO:555中所示的氨基酸序列。
根据一些实施方案，由本文公开的一些FVIII-ceDNA载体表达的FVIII是；重组单链凝血因子VIII(rVIII单链)；罗诺凝血素α；CAS登记号：1388129-63-2。
是一种单链重组因子VIII(FVIII)，其大部分B结构域存在于野生型全长FVIII中，并且相邻酸性A3结构域的4个氨基酸被去除(例如，全长FVIII的氨基酸765至1652)。
应当理解，作为野生型变体，上述SEQ ID NO:555中位置56处的氨基酸D(天冬氨酸)可以自由地被V(缬氨酸)取代，并且本文针对FVIII-ceDNA ORF所公开的任何核苷酸序列包括位置56处缬氨酸变体的相应核酸序列。
由ceDNA载体表达FVIII治疗蛋白或其片段可以使用如本领域已知或本文所述的一种或多种诱导型或阻抑型启动子或者组织特异性启动子(例如，合成肝特异性启动子，如本文所述的TTR启动子(TTRm)、CpG最小化的hAAT启动子)(包括如本文所述的调节开关)在空间上和时间上实现。
在一个实施方案中，FVIII治疗蛋白可以是“治疗蛋白变体”，其是指与其对应的天然FVIII治疗蛋白相比具有改变的氨基酸序列、组成或结构的FVIII治疗蛋白。在一个实施方案中，FVIII是功能性型式(例如，上述D56V变体的野生型FVIII蛋白)。表达FVIII蛋白的突变型式(诸如点突变(F309突变)或缺失突变(例如，B结构域缺失和/或单链重组FVIII))也可能是有用的，如本文许多实施例中所述。由ceDNA载体表达的FVIII治疗蛋白可以进一步包含赋予额外功能性例如荧光、酶活性或分泌信号的序列/部分。在一个实施方案中，FVIII治疗蛋白变体包含用于标识的非天然标签序列(例如，免疫标签)以允许其与接受宿主细胞中的内源性FVIII治疗蛋白区分开来。
根据一些实施方案，本文公开的FVIII ceDNA载体的开放读框(ORF)是密码子优化的。
根据一些其他实施方案，FVIII ceDNA载体是CpG最小化的。例如，FVIII ceDNA载体中的增强子、启动子、5'UTR、间隔子、内含子、3'UTR和WPRE序列可以被修饰以具有最小化的CpG水平，从而确保载体的稳健表达。
在一个实施方案中，FVIII治疗蛋白编码序列可以衍生自现有的宿主细胞或细胞系，例如通过反向转录从宿主获得的mRNA并使用PCR扩增该序列。
(ii)表达FVIII治疗蛋白的ceDNA载体
具有一个或多个编码期望FVIII治疗蛋白的序列的ceDNA载体可以包含调节序列，诸如启动子、分泌信号、内含子、polyA区域和增强子，以在递送到期望的细胞或组织时最大化FVIII治疗蛋白的表达。至少，ceDNA载体包含一个或多个编码FVIII治疗蛋白或其功能片段的核酸序列。在一个实施方案中，ceDNA载体包含SEQ ID NO:71-183、556和626-633中的任一个中所示的FVIII序列。
根据一些方面，本公开提供了一种ceDNA载体，该ceDNA载体包含在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列，其中至少一个核酸序列编码至少一种FVIII蛋白，其中编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列选自与表1A中的任何序列(SEQ IDNO:71-183、556和626-633)具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列与SEQ ID NO:556至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸序列由SEQ IDNO:556组成。根据一些实施方案，编码至少一种FVIII蛋白的至少一个核酸包含SEQ ID NO:556，其中SEQ ID NO:556还包含一个或多个修饰。根据一些实施方案，包含还包含一个或多个修饰的SEQ ID NO:556的至少一个核酸包含选自SEQ ID NO:627-633中的任一个的序列或由该序列组成。
表1A提供了序列标识、密码子优化的FVIII ORF的描述和本文使用的名称。表1B提供了本文针对FVIII ORF的名称所用的相应GE编号。
表1A：本文所用的示例性密码子优化的FVIII ORF序列的描述、序列标识和名称
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表1B.通用元件编号
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*两个名称hFVIII-F309S-BD226seq124-Afstyla-BDD-F309和hFVIII-F309S-BD226seq124-BDD-F309是指相同的序列GE-715(SEQ ID NO:76和556)。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:71至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:71-183或由SEQ ID NO:71-183组成。在一些实施方案中，具有编码FVIII的核酸序列(例如，表1A)的ceDNA载体在SEQ ID NO:492的氨基酸位置75处编码Val(V)而不是Asp(D)。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:71至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:71或由SEQ ID NO:71组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:72至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:72或由SEQ ID NO:72组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:73至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:73或由SEQ ID NO:73组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:74至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:74或由SEQ ID NO:74组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:75至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:75或由SEQ ID NO:75组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:76至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:76或由SEQ ID NO:76组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:77至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:77或由SEQ ID NO:77组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:78至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:78或由SEQ ID NO:78组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:79至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:79或由SEQ ID NO:79组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:80至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:80或由SEQ ID NO:80组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:81至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:81或由SEQ ID NO:81组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:82至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:82或由SEQ ID NO:82组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:83至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:83或由SEQ ID NO:83组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:84至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:84或由SEQ ID NO:84组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:85至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:85或由SEQ ID NO:85组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:86至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:86或由SEQ ID NO:86组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:87至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:87或由SEQ ID NO:87组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:88至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:88或由SEQ ID NO:88组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:89至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:89或由SEQ ID NO:89组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:90至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:90或由SEQ ID NO:90组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:91至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:91或由SEQ ID NO:91组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:92至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:92或由SEQ ID NO:92组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:93至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:93或由SEQ ID NO:93组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:94至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:94或由SEQ ID NO:94组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:95至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:95或由SEQ ID NO:95组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:96至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:96或由SEQ ID NO:96组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:97至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子由SEQ IDNO:97组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:98至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:98或由SEQ ID NO:98组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:99至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:99或由SEQ IDNO:99组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:100至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:100或由SEQ ID NO:100组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:101至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:101或由SEQ ID NO:101组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:102至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:102或由SEQ ID NO:102组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:103至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:103或由SEQ ID NO:103组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:104至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:104或由SEQ ID NO:104组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:105至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:105或由SEQ ID NO:105组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:106至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:106或由SEQ ID NO:106组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:107至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:107或由SEQ ID NO:107组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:108至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:108或由SEQ ID NO:108组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:109至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:109或由SEQ ID NO:109组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:110至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:110或由SEQ ID NO:110组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:111至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:111或由SEQ ID NO:111组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:112至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:112或由SEQ ID NO:112组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:113至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:113或由SEQ ID NO:113组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:114至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:114或由SEQ ID NO:114组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:115至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:115或由SEQ ID NO:115组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:116至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:116或由SEQ ID NO:116组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:117至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:117或由SEQ ID NO:117组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:118至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:118或由SEQ ID NO:118组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:119至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:119或由SEQ ID NO:119组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:120至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:120或由SEQ ID NO:120组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:121至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:121或由SEQ ID NO:121组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:122至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:122或由SEQ ID NO:122组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:123至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:123或由SEQ ID NO:123组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:124至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:124或由SEQ ID NO:124组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:125至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:125或由SEQ ID NO:125组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:126至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:126或由SEQ ID NO:126组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:127至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:127或由SEQ ID NO:127组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:128至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:128或由SEQ ID NO:128组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:129至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:129或由SEQ ID NO:129组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:130至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:130或由SEQ ID NO:130组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:131至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:131或由SEQ ID NO:131组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:132至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:132或由SEQ ID NO:132组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:133至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:133或由SEQ ID NO:133组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:134至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:134或由SEQ ID NO:134组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:135至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:135或由SEQ ID NO:135组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:136至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:136或由SEQ ID NO:136组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:137至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:137或由SEQ IDNO:137组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:138至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:138或由SEQ ID NO:138组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:139至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:139或由SEQ ID NO:139组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:140至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:140或由SEQ ID NO:140组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:141至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:141或由SEQ ID NO:141组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:142至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:142或由SEQ ID NO:142组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:143至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:143或由SEQ ID NO:143组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:144至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:144或由SEQ ID NO:144组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:145至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:145或由SEQ ID NO:145组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:146至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:146或由SEQ ID NO:146组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:147至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:147或由SEQ ID NO:147组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:148至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:148或由SEQ ID NO:148组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:149至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:149或由SEQ ID NO:149组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:150至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:150或由SEQ ID NO:150组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:151至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:151或由SEQ ID NO:151组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:152至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:152或由SEQ ID NO:152组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:153至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:153或由SEQ ID NO:153组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:154至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:154或由SEQ ID NO:154组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:155至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:155或由SEQ ID NO:155组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:156至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:156或由SEQ ID NO:156组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:157至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:157或由SEQ ID NO:157组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:158至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:158或由SEQ ID NO:158组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:159至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:159或由SEQ ID NO:159组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:160至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:160或由SEQ ID NO:160组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:161至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:161或由SEQ ID NO:161组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:162至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:162或由SEQ ID NO:162组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:163至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:163或由SEQ ID NO:163组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:164至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:164或由SEQ ID NO:164组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:165至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:165或由SEQ ID NO:165组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:166至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:166或由SEQID NO:166组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:167至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:167或由SEQ ID NO:167组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:168至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:168或由SEQ ID NO:168组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:169至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:169或由SEQ ID NO:169组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:170至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:170或由SEQ ID NO:170组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:171至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:171或由SEQ ID NO:171组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:172至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:172或由SEQ ID NO:172组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:173至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:173或由SEQ ID NO:173组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:174至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:174或由SEQ ID NO:174组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:175至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:175或由SEQ ID NO:175组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:176至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:176或由SEQ ID NO:176组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:177至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:177或由SEQ ID NO:177组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:178至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:178或由SEQ ID NO:178组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:179至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQID NO:179或由SEQ ID NO:179组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:180至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:180或由SEQ ID NO:180组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:181至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:181或由SEQ ID NO:181组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:182至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:182或由SEQ ID NO:182组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:183至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:183或由SEQ ID NO:183组成。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:556至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:556至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:556至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:556至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQID NO:556至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:556至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:556或由SEQ ID NO:556组成。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:626至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:626至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:626至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:626至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:626至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:626至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:626或由SEQID NO:626组成。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:627至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:627至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:627至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:627至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:627至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:627至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:627或由SEQID NO:627组成。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:628至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:628至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:628至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:628至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:628至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:628至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:628或由SEQID NO:628组成。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:629至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:629至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:629至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:629至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:629至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:629至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:629或由SEQID NO:629组成。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:630至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:630至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:630至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:630至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ IDNO:630至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:630至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:630或由SEQID NO:630组成。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:631至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:631至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:631至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:631至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:631至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:631至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:631或由SEQID NO:631组成。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:632至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:632至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:632至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:632至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:632至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:632至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:632或由SEQID NO:632组成。
根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:633至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:633至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:633至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:633至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:633至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含与SEQ ID NO:633至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，编码FVIII蛋白的核酸序列包含SEQ ID NO:633或由SEQID NO:633组成。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA933，并且在侧接反向末端重复序列(ITR)之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:71。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1265，并且在侧接反向末端重复序列(ITR)之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:72。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1270，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:73。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1368，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:74。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1367，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:75。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1374，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:76。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1373，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:77。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1918，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:78。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1919，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:79。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1920，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:80。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1921，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:81。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1922，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:82。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1923，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:83。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1927，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:84。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1928，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:85。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1929，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:86。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1930，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:87。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1931，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:88。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1932，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:89。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1933，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:90。
根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1651，并且在侧接ITR之间包含至少一个核苷酸序列，其中至少一个核苷酸序列包含SEQ ID NO:556。根据一些实施方案，ceDNA构建体是ceDNA1651，并且包含SEQ ID NO:42或基本上由SEQ ID NO:42组成。
在任何上述实施方案中，至少一个核酸序列可以是异源核酸序列。
(iii)FVIII治疗蛋白及其用于治疗血友病A的用途
本文所述的ceDNA载体可以用于递送治疗FVIII蛋白以治疗与FVIII蛋白的不当表达和/或FVIII蛋白内的突变相关的血友病A。
如本文所述的ceDNA载体可以用于表达任何期望FVIII治疗蛋白。示例性治疗FVIII治疗蛋白包括但不限于由本文在表1A和表1B中所示的序列(例如，SEQ ID NO:71-183、556和626-633中的任一个)表达的任何FVIII蛋白或其部分。
在一个实施方案中，表达的FVIII治疗蛋白对于治疗血友病A是有功能的。在一些实施方案中，FVIII治疗蛋白不引起免疫系统反应。
在另一个实施方案中，编码FVIII治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)的ceDNA载体可以用于产生嵌合蛋白。因此，本文特别考虑了可以将表达嵌合蛋白的ceDNA载体施用于例如选自以下项的任何一种或多种组织：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺。在一些实施方案中，当将经工程改造以表达FVIII的ceDNA载体施用于婴儿或施用于子宫中的受试者时，可以将该ceDNA载体施用于选自以下项的任何一种或多种组织：肝脏、肾上腺、心脏、肠、肺和胃，或施用于其肝脏干细胞前体，以体内或体外治疗血友病A。
血友病
血友病A是凝结因子VIII的遗传缺陷，会导致出血增加，通常影响男性。在大多数情况下，它是作为X连锁隐性性状遗传的，但也有一些情况是由自发突变引起的。就血友病A的症状而言，有内部或外部出血事件。血友病更严重的个体会出现更严重和更频繁的出血，而其他轻度血友病患者通常会出现更轻微的症状，除非在手术或严重创伤后。中度血友病患者有不同的症状，表现在严重和轻度之间的范围内。
目前预防患有血友病A的人出血的治疗涉及因子VIII药物治疗。大多数患有严重血友病的个体需要定期补充静脉内重组或血浆浓缩因子VIII。重组液血因子VIII是工业制造中最复杂的蛋白质之一，因为其基因转录效率低、翻译后加工过程中其前蛋白在细胞内大量丢失以及分泌蛋白的不稳定性。轻度血友病患者可以使用去氨加压素来控制其病情，去氨加压素是一种从血管壁释放储存的因子VIII的药物。
关于血友病A的治疗有许多并发症。在儿童中，可以插入一个容易进入的静脉注射端口，以减少频繁的创伤性静脉插管。然而，这些端口与高感染率和在导管尖端形成凝块的风险相关，使其无用。病毒感染在血友病患者中可能很常见，因为频繁输血使患者处于获得血液传播感染(诸如HIV、乙型肝炎和丙型肝炎)的风险中。朊病毒感染也可能通过输血传播。血友病A的另一个治疗并发症是由于频繁输注而产生针对因子VIII的抑制剂抗体。这些随着身体将输注的因子VIII识别为外来物而发展，因为身体不会产生自己的副本。在这些个体中，活化的因子VII(凝血级联中因子VIII的前体)可作为用于治疗血友病个体的出血和针对替代因子VIII的抗体输注。
凝血级联
凝血(coagulation/clotting)为血液从液体变成凝胶，形成血凝块的过程。其可能引起止血，即停止受损血管的失血，接着进行修复。凝血机制涉及血小板的活化、粘附和聚集以及纤维蛋白的沉积和成熟。凝血障碍为可能导致出血(失血或擦伤)或阻塞性凝血(血栓形成)的疾病状态。
在血管的损伤损坏血管内衬的内皮后，凝血几乎立即开始。血液暴露于内皮下空间引发两个过程：血小板的变化，以及内皮下组织因子暴露于血浆因子VII，最终导致纤维蛋白形成。血小板立即在受伤部位形成栓塞；这称为初级止血。继发性止血同时发生：除因子VII(包括因子VIII)之外的另外凝血因子或凝结因子以复杂的级联反应形成纤维蛋白链，从而加强了血小板栓塞。
二次止血的凝血级联有两条导致纤维蛋白形成的初始途径。这些是接触激活途径(也称为内源性途径)和组织因子途径(也称为外源性途径)，它们都导致产生纤维蛋白的相同基本反应。启动凝血的主要途径是组织因子(外源性)途径。所述途径是一系列反应，其中丝氨酸蛋白酶的酶原(无活性酶前体)及其糖蛋白辅因子被激活成为活性成分，然后所述活性成分催化级联中的下一个反应，最终产生交联的纤维蛋白。凝血因子通常用罗马数字表示，附加小写字母a表示活性形式。
凝血因子通常是丝氨酸蛋白酶(酶)，它通过切割下游蛋白质起作用。例外是组织因子、FV、FVIII、FXIII。组织因子、FV和FVIII是糖蛋白，而因子XIII是转谷氨酰胺酶。凝血因子作为无活性的酶原循环。因此，凝血级联通常分为三个途径。组织因子和接触激活途径都激活因子X、凝血酶和纤维蛋白的“最终共同途径”。
组织因子(外源性)途径的主要作用是产生“凝血酶爆发”，通过所述过程，凝血酶(就其反馈激活作用而言是凝血级联的最重要组成)被非常迅速地释放。FVIIa的循环量高于任何其它活化凝血因子。所述过程包括以下步骤：
步骤1：在血管受损之后，FVII离开循环并且与在携带组织因子的细胞(基质成纤维细胞和白细胞)上表达的组织因子(TF)接触，从而形成活化复合物(TF-FVIIa)。
步骤2：TF-FVIIa活化FIX和FX。
步骤3：FVII自身被凝血酶、FXIa、FXII和FXa活化。
步骤4：由TF-FVIIa活化FX(以形成FXa)几乎立即受到组织因子路径抑制剂(TFPI)抑制。
步骤5：FXa和其辅因子FVa形成凝血酶原酶复合物，所述凝血酶原酶复合物将凝血酶原活化为凝血酶。
步骤6：凝血酶接着活化凝血级联的其它组分，包括FV和FVIII(其与FIX形成复合物)，并且活化和释放FVIII，使其免于结合到血管性血友病因子(von Willebrand factor；vWF)。
步骤7：FVIIIa是FIXa的辅因子，它们一起形成活化FX的“液化酶”复合物；因此循环继续。
接触激活(内源性)途径始于通过高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶和FXII(哈格曼因子)在胶原蛋白上形成初级复合物。前激肽释放酶转化为激肽释放酶，FXII变为FXIIa。FXIIa将FXI转化为FXIa。因子XIa激活FIX，FIX与其辅因子FVIIIa形成tenase复合物，将FX激活为FXa。FXII、HMWK和前激肽释放酶严重缺乏的患者没有出血性疾病，这一事实可以说明接触激活途径在启动凝块形成方面的次要作用。相反，接触激活系统更多地参与炎症和先天免疫。
内源性和外源性凝血途径共有的最终共同途径涉及凝血酶原转化为凝血酶和纤维蛋白原转化为纤维蛋白。凝血酶具有多种功能，不仅将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，而且是止血栓子的构成要素。此外，它是最重要的血小板激活剂，除此之外，它还激活因子VIII和V及其抑制蛋白C(在血栓调节蛋白存在的情况下)，并激活因子XIII，因子XIII形成交联纤维蛋白聚合物的共价键，纤维蛋白聚合物由活化单体形成。
在接触因子或组织因子途径激活后，凝血级联通过FVIII和FIX的持续激活而维持在促血栓形成状态，以形成tenase复合物，直到它通过抗凝剂路径下调。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体还可以编码辅因子或其他多肽、有义或反义寡核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、微小RNA和它们的反义对应物(例如，antagoMiR))，它们可以与从ceDNA表达的FVIII蛋白结合使用。另外，包含编码FVIII蛋白的序列的表达盒还可以包括外源序列，所述外源序列编码待用于实验或诊断目的的报告蛋白，例如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其它蛋白质。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含表达FVIII蛋白的核酸序列，所述FVIII蛋白对血友病A的治疗起作用。在优选实施方案中，治疗性FVIII蛋白不引起免疫系统反应，除非如此需要。
III.一般用于产生FVIII治疗蛋白的ceDNA载体
本公开的实施方案基于包含可以表达FVIII转基因的封闭端线性双链(ceDNA)载体的方法和组合物。在一些实施方案中，转基因为编码FVIII蛋白的序列。根据一些实施方案，转基因是如表1A中所示的核酸序列(例如，SEQ ID NO:71-183、556和626-633中的任一个)。如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体不受大小限制，从而准许例如表达由单个载体表达转基因所需的所有组分。用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体优选地是双链体，例如在分子的至少一部分诸如表达盒上是自互补的(例如，ceDNA不是双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭端，因此对核酸外切酶(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)消化具有抗性，例如在37℃下超过一个小时。
一般来说，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺病毒相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)(野生型或修饰)、感兴趣的核酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR(野生型或修饰)。根据一些实施方案，ITR序列选自以下项中的任一种：(i)至少一个WT ITR和至少一个修饰的AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的修饰的ITR)；(ii)两个修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如，不对称的修饰的ITR)，或者(iii)对称或基本上对称的WT-WTITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构，或者(iv)对称或基本上对称的修饰的ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构。
本文涵盖包含用于产生FVIII蛋白的ceDNA载体的方法和组合物，其可以进一步包括递送系统，例如但不限于脂质体纳米粒子递送系统。本文公开了预期使用的非限制示例性脂质体纳米粒子系统。在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。举例来说，2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开了脂质纳米粒子制剂，所述制剂经制备并且装载通过所述方法获得的ceDNA载体，所述国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体不具有由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装约束。与经囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体代表原核生物产生的质粒DNA载体的活的真核生物产生的替代物。这允许插入控制元件，例如本文公开的调节开关、大的转基因、多个转基因等。
用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是无衣壳的，并且可以从按顺序编码以下项的质粒中获得：第一ITR、包含转基因的表达盒和第二ITR。表达盒可包括允许和/或控制转基因的表达的一个或多个调节序列，例如其中表达盒可以按顺序包含以下项中的一个或多个：增强子/启动子组、ORF(报告基因，例如FVIII)、转录后调节元件(例如，WPRE 3'UTR)以及聚腺苷酸化和终止信号(例如，BGH polyA)。
表达盒还可包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施方案中，ITR可以充当转基因(例如，FVIII蛋白)的启动子。在一些实施方案中，ceDNA载体包含用于调节转基因的表达的额外组分，例如调节开关，其在本文中标题为用于控制和调节FVIII蛋白表达的“调节开关”的章节中描述，并且如果期望，可以包括作为使包含ceDNA载体的细胞能够控制细胞的细胞死亡的杀伤开关的调节开关。
表达盒能够包含超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在500至50,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在500至75,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在500至10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在1000至10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在500至5,000个核苷酸范围内的转基因。ceDNA载体不存在衣壳化AAV载体的尺寸限制，从而能够递送大尺寸表达盒以提供有效的转基因表达。在一些实施方案中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
ceDNA表达盒可以包括例如编码在接受受试者中不存在、无活性或活性不足的蛋白质(例如，FVIII)的可表达外源序列(例如，开放阅读框架)或转基因或者编码具有期望的生物或治疗效果的蛋白质的基因。转基因能够编码能够用以校正缺陷基因或转录物表达的基因产物。原则上，表达盒可包括编码因突变而减少或不存在或在本公开的范围内认为过度表达时会展现治疗益处的蛋白质、多肽或RNA的任何基因。
表达盒可包含任何转基因(例如，编码FVIII蛋白)，例如用于治疗受试者的血友病A的FVIII蛋白，即治疗性FVIII蛋白。ceDNA载体可以用于单独或与编码多肽的核酸或非编码核酸(例如RNAi、miRs等)以及外源基因和核酸序列(包括受试者基因组中的病毒序列，例如HIV病毒序列等等)组合来在受试者中递送和表达任何感兴趣的FVIII蛋白。优选地，本文所公开的ceDNA载体用于治疗目的(例如用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽。在某些实施方案中，ceDNA载体可用于在受试者中表达感兴趣的任何基因，包括一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、引导RNA(gRNA)、微小RNA和它们的反义对应物(例如，antagoMiR))、抗体、融合蛋白或它们的任何组合。
表达盒还可以编码多肽、有义或反义寡核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、微小RNA和它们的反义对应物(例如，antagoMiR))。表达盒可包括编码用于实验或诊断目的的报告蛋白的外源序列，所述报告蛋白例如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它所属领域众所周知的报告蛋白。
在表达盒，即本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的表达构建体中提供的序列可以针对靶宿主细胞进行密码子优化。根据一些实施方案，在表达盒中提供的序列是来自表1A的经密码子修饰的序列(例如，选自SEQ ID NO:71-183、556和626-633中的一个或多个的序列)。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人等所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。优化的密码子可以使用例如Aptagen的密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen,Inc.，2190Fox Mill Rd.Suite300,Herndon,Va.20171)或另一公开可用的数据库来测定。在一些实施方案中，如所属领域中已知，编码FVIII蛋白的核酸经优化用于人类表达，和/或为人类FVIII或其功能片段。
由如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体表达的转基因编码FVIII蛋白。用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体存在许多不同于基于质粒的表达载体的结构特点。ceDNA载体可以具有以下特点中的一个或多个：缺乏原始(即，非插入)细菌DNA；缺乏原核复制起点；为自给式的，即，其不需要除所述两个ITR之外的任何序列，包括Rep结合和末端解链位点(RBS和TRS)和在所述ITR之间的外源序列；存在形成发夹的ITR序列和不存在细菌型DNA甲基化或实际上被哺乳动物宿主视为异常的任何其它甲基化。一般来说，本公开的载体优选不含有任何原核DNA，但作为非限制性示例，预期可以将一些原核DNA作为外源序列插入启动子或增强子区中。将ceDNA载体与质粒表达载体区分开来的另一个重要特征是，ceDNA载体是具有封闭端的单链线性DNA，而质粒始终是双链DNA。
通过本文所提供的方法产生的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体优选地具有线性且连续结构，而非非连续结构，如限制酶消化分析所测定(图3D)。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所描述的ceDNA质粒)，所述质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而相比之下，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也仍保持是单个分子。在一些实施方案中，与质粒不同，如本文所描述的ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和纯化这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
与相比，如本文所述使用ceDNA载体来表达FVIII蛋白相对于基于质粒的表达载体有几个优点，此类优点包括但不限于：1)质粒含有细菌DNA序列且经受原核特异性甲基化，例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化，而无衣壳的AAV载体序列是真核来源的且不经历原核特异性甲基化；因此，与质粒相比，无衣壳的AAV载体不太可能诱导炎性和免疫应答；2)质粒在生产过程中需要抗性基因的存在，而ceDNA载体则不需要；3)环状质粒在引入细胞中时不被递送到细胞核并且需要过载才能绕过细胞核酸酶的降解，而ceDNA载体含有赋予对核酸酶的抗性并且可以被设计为被靶向并被递送到细胞核的病毒顺式元件，即ITR。假设对于ITR功能必不可少的最小限定元件是Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:437))和末端解链位点(TRS；对于AAV2，5'-AGTTGG-3')加上允许发夹形成的可变回文序列；以及4)ceDNA载体不具有通常在原核生物来源的质粒中发现的CpG二核苷酸的过度呈现，据报道，CpG二核苷酸会结合Toll样受体家族的成员，从而引发T细胞介导的免疫应答。相比之下，用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
IV.反向末端重复序列(ITR)
如本文所公开，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体含有位于两个反向末端重复(ITR)序列之间的转基因或核酸序列，例如异源核酸序列，其中ITR序列可以是不对称的ITR对或者对称或基本上对称的ITR对，这些术语如本文所定义。如本文所公开的ceDNA载体可以包含选自以下项中的任一种的ITR序列：(i)至少一个WT ITR和至少一个修饰的AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的修饰的ITR)；(ii)两个修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如，不对称的修饰的ITR)，或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构，或者(iv)对称或基本上对称的修饰的ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构，其中本公开的方法还可包括递送系统，诸如但不限于脂质体纳米粒子递送系统。
在一些实施方案中，ITR序列可以来自细小病毒科的病毒，细小病毒科包括两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(称为细小病毒)包含依赖病毒属，所述依赖病毒属的成员在大多数情况下需要与辅助病毒例如腺病毒或疱疹病毒共同感染以用于生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(例如，血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类动物(例如，血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)以及感染其它温血动物的相关病毒(例如，牛科动物、犬科动物、马科动物和绵羊科动物腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其他成员一般描述于Kenneth I.Berns,“Parvoviridae:The Viruses andTheir Replication,”FIELDS VIROLOGY中的第69章(第3版，1996)。
尽管在说明书和本文的实例中举例说明的ITR是AAV2 WT-ITR，但是所属领域的普通技术人员知道如上所述，可以使用来自任何已知的细小病毒，例如依赖病毒，例如AAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如，NCBI：NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)、嵌合ITR或来自任何合成AAV的ITR。在一些实施方案中，AAV可以感染温血动物，例如禽类(AAAV)、牛(BAAV)、犬、马和绵羊腺相关病毒。在一些实施方案中，ITR来自B19细小病毒(GenBank登录号：NC 000883)、来自小鼠的微小病毒(MVM)(GenBank登录号：NC 001510)；鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇毒细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。在一些实施方案中，5'WT-ITR可以来自一种血清型，而3'WT-ITR来自不同血清型，如本文所讨论。
普通技术人员知道，ITR序列具有双链霍利迪连结体的共同结构，该结构通常是T形或Y形发夹结构，其中每个WT-ITR由嵌入较大的回文臂(A-A')中的两个回文臂或环(B-B'和C-C')和单链D序列形成(其中这些回文序列的顺序限定ITR的翻转或翻动取向)。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)并且描述于以下文献中的ITR的结构分析和序列比较：Grimm等人,J.Virology,2006；80(1)；426-439；Yan等人,J.Virology,2005；364-379；Duan等人,Virology 1999；261；8-14。所属领域的技术人员基于本文提供的示例性AAV2 ITR序列，可以容易地确定用于ceDNA载体或ceDNA质粒的来自任何AAV血清型的WT-ITR序列。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6和鸟AAV(AAAV)和牛AAV(BAAV))并且描述于以下文献中的ITR的序列比较：Grimm等人,J.Virology,2006；80(1)；426-439；其显示了AAV2的左ITR与来自以下其他血清型的左ITR的同一性％：AAV-1(84％)、AAV-3(86％)、AAV-4(79％)、AAV-5(58％)、AAV-6(左ITR)(100％)和AAV-6(右ITR)(82％)。
A.对称的ITR对
在一些实施方案中，如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此对称或基本上对称-也就是说，ceDNA载体可以包含具有对称三维空间组织以使得其结构在几何空间中为相同形状或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环的ITR序列。在这样的实施方案中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是不是野生型ITR的经修饰ITR(modified ITR/mod-ITR)。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在另选的实施方案中，修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的，也就是说，修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有对应或相同的对称的三维形状。
(i)野生型ITR
在一些实施方案中，对称的ITR或基本上对称的ITR是如本文所述的野生型(WT-ITR)。在一些实施方案中，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自相同AAV血清型的WT-ITR。在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，例如它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组织。
因此，如本文所公开，ceDNA载体含有位于两个侧接野生型反向末端重复(WT-ITR)序列之间的转基因或核酸序列，例如异源核酸序列，两个侧接野生型反向末端重复序列彼此反向互补(逆向)，或另选地，相对于彼此基本上对称，例如WT-ITR对具有对称的三维空间组构。在一些实施方案中，野生型ITR序列(例如，AAV WT-ITR)包含功能Rep结合位点(RBS；例如，对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:437)和功能末端解链位点(TRS；例如，5'-AGTT-3'，SEQ ID NO:438)。
在一个方面，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可从编码可操作地位于两个WT反向末端重复序列(WT-ITR)(例如，AAV WT-ITR)之间的核酸序列(例如，异源核酸序列)的载体多核苷酸获得。在一些实施方案中，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自相同AAV血清型的WT-ITR。在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组织。在一些实施方案中，5'WT-ITR来自一种AAV血清型，而3'WT-ITR来自相同或不同的AAV血清型。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR是彼此的镜像，即它们是对称的。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR来自相同的AAV血清型。
WT ITR是众所周知的。在一个实施方案中，两个ITR来自相同的AAV2血清型。在某些实施方案中，可以使用来自其它血清型的WT。存在许多同源血清型，例如AAV2、AAV4、AAV6、AAV8。在一个实施方案中，可以使用密切同源的ITR(例如，具有相似环结构的ITR)。在另一个实施方案中，能够使用较多样化的AAV WT ITR，例如AAV2和AAV5，并且在仍另一个实施方案中，能够使用基本上呈WT的ITR，也就是说，其不仅具有WT的基本环结构，而且具有不改变或不影响所述特性的一些保守核苷酸变化。当使用来自相同病毒血清型的WT-ITR时，可以进一步使用一种或多种调节序列。在某些实施方案中，调节序列是准许调节ceDNA的活性(例如，所编码的FVIII蛋白的表达)的调节开关。
在一些实施方案中，本文所述的技术的一个方面涉及一种用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体，其中该ceDNA载体包含可操作地位于两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间的至少一个编码FVIII蛋白的核酸序列(例如，异源核酸序列)，其中WT-ITR可以来自相同血清型、不同血清型或相对于彼此基本上对称(即，具有对称的三维空间组织，使得它们的结构在几何空间中是相同的形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环)。在一些实施方案中，对称的WT-ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。在一些实施方案中，核酸序列(例如，异源核酸序列)编码转基因，并且载体不在病毒衣壳中。
在一些实施方案中，WT-ITR是相同的，但是彼此反向互补。例如，5'ITR中的序列AACG可以是3'ITR中相应位点处的CGTT(即，反向互补)。在一个实施方案中，5'WT-ITR有义链包含ATCGATCG的序列，而相应的3'WT-ITR有义链包含CGATCGAT(即与ATCGATCG反向互补)。在一些实施方案中，WT-ITR ceDNA还包含末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点)，例如Rep结合位点。
在用于表达FVIII蛋白且包含WT-ITR的ceDNA载体中使用的示例性WT-ITR序列在本文的表2中示出，该表示出了成对的WT-ITR(5'WT-ITR和3'WT-ITR)。
作为一个示例性示例，本公开提供了一种用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体，该载体包含与转基因(例如，异源核酸序列)可操作地连接的启动子，具有或不具有调节开关，其中ceDNA缺乏衣壳蛋白并且：(a)由编码WT-ITR的ceDNA质粒产生，其中每个WT-ITR在其发夹二级构型中具有相同数量的分子内双链碱基对(与这些参考序列相比，优选地在这种构型中排除任何AAA或TTT末端环的缺失)；以及(b)使用通过琼脂糖凝胶电泳在实施例1中的天然凝胶和变性条件下鉴定ceDNA的测定鉴定为ceDNA。
在一些实施方案中，位于两侧的WT-ITR彼此基本上对称。在该实施方案中，5'WT-ITR可以来自AAV的一种血清型，而3'WT-ITR可以来自AAV的另一种血清型，使得WT-ITR不是相同的反向互补序列。例如，5'WT-ITR可以来自AAV2，并且3'WT-ITR来自不同血清型(例如，AAV1、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)。在一些实施方案中，WT-ITR可以选自从以下中的任一种中选择的两种不同的细小病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。在一些实施方案中，WT ITR的这种组合是来自AAV2和AAV6的WT-ITR的组合。在一个实施方案中，当一个ITR相对于另一个ITR反向时，基本上对称的WT-ITR为至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同以及它们之间的所有点，并且具有相同的对称三维空间组构。在一些实施方案中，WT-ITR对由于其具有对称的三维空间组构，例如具有A、C-C’、B-B’和D臂的相同三维组构。在一个实施方案中，基本上对称的WT-ITR对相对于另一个反向，并且彼此至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同以及它们之间的所有点，并且一个WT-ITR保留Rep结合位点(RBS)5'-GCGCGCTCGCTCGCTC3'(SEQ ID NO:437)和末端解链位点(TRS)。在一些实施方案中，基本上对称的WT-ITR对相对于彼此反向，并且彼此至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或至少99.5％相同以及它们之间的所有点，并且除了允许发夹二级结构形成的可变回文序列外，一个WT-ITR还保留Rep结合位点(RBS)5'-GCGCGCTCGCTCGCTC3'(SEQ ID NO:437)和末端解链位点(TRS)。同源性可以通过所属领域熟知的标准方法来确定，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)、BLASTN。
在一些实施方案中，ITR的结构元件可以是参与ITR与大的Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施方案中，结构元件为ITR与大的Rep蛋白的相互作用提供了选择性，即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其它实施方案中，当Rep蛋白与ITR结合时，结构元件与大的Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以为例如ITR的二级结构、ITR的核酸序列、在两个或更多个元件之间的间距或以上中的任一者的组合。在一个实施方案中，结构元件选自由A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(TRS)组成的组。
仅作为示例，国际公开号WO/2019/161059(全文以引用的方式并入本文)的表6指示了WT-ITR的示例性组合。
仅作为示例，表2示出了来自一些不同AAV血清型的示例性WT-ITR的序列的相应SEQ ID NO。
表2
在一些实施方案中，WT-ITR序列的核酸序列可以被修饰(例如，通过修饰1、2、3、4或5个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，由此该修饰是取代互补核苷酸，例如G取代C(反之亦然)和T取代A(反之亦然)。
本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以包括保留了可操作的RBE、TRS和RBE'部分的WT-ITR结构。出于示例性目的使用野生型ITR，图1A和图1B示出了ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的TRS位点操作的一种可能机制。在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体含有一个或多个功能WT-ITR多核苷酸序列，这些多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:437))和末端解链位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:438))。在一些实施方案中，至少一个WT-ITR是功能性的。在另选的实施方案中，其中用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含彼此基本上对称的两个WT-ITR，至少一个WT-ITR具有功能并且至少一个WT-ITR不具有功能。
B.通常对于包含不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的经修饰ITR(mod-ITR)
如本文所讨论，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以包含对称的ITR对或不对称的ITR对。在两个例子中，ITR中的一个或两个可以是经修饰的ITR，差异在于，在第一个例子(即，对称的经修饰ITR)中，经修饰ITR具有相同的三维空间组织(即，具有相同的A-A'、C-C'和B-B'臂构形)，而在第二个例子(即，不对称的经修饰ITR)中，经修饰ITR具有不同的三维空间组织(即，具有A-A'、C-C'和B-B'臂的不同构形)。
在一些实施方案中，与野生型ITR序列(例如，AAV ITR)相比，经修饰的ITR是通过缺失、插入和/或取代进行修饰的ITR。在一些实施方案中，ceDNA载体中的ITR中的至少一个包含功能Rep结合位点(RBS；例如，对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:437)和功能末端解链位点(TRS；例如，5'-AGTT-3'，SEQ ID NO:438)。在一个实施方案中，ITR中的至少一个是非功能ITR。在一个实施方案中，不同的或经修饰的ITR并不都是来自不同血清型的野生型ITR。
在本文中详细描述了ITR中的特定改变和突变，但是在ITR的情况下，“改变”或“突变”或“修饰”表明相对于野生型、参考或原始ITR序列，插入、缺失和/或取代核苷酸。改变或突变的ITR可以是工程化ITR。如本文所使用的，“工程化”是指通过人手进行操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面，例如其序列，通过人的手进行操纵而不同于自然存在的方面时，则认为所述多肽是“工程化”的。
在一些实施方案中，经修饰ITR可以是合成的。在一个实施方案中，合成的ITR是基于来自一种以上AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方案中，合成ITR不包括基于AAV的序列。在又一个实施方案中，合成的ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列，但是保留了上述的ITR结构。在一些方面，合成的ITR可优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或者在一些情况下，将不被野生型Rep识别而仅被突变Rep识别
技术人员可以通过已知手段确定其它血清型的相应序列。例如，确定改变是否在A、A'、B、B'、C、C'或D区域中，并确定另一种血清型中的相应区域。能够在默认状态下使用(基本局部比对搜索工具)或其它同源性比对程序测定相应序列。本公开进一步提供了包含来自不同AAV血清型的组合的经修饰ITR的ceDNA载体群体和多个所述ceDNA载体-也就是说，一个经修饰ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个经修饰ITR可以来自不同血清型。不希望受理论的束缚，在一个实施方案中，一个ITR可以来自或基于AAV2 ITR序列，而ceDNA载体的另一个ITR可以来自或基于以下中的任一种或多种ITR序列：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。
任何细小病毒ITR都可以用作ITR或用于修饰的基础ITR。优选地，细小病毒是依赖病毒。更优选是AAV。选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和光感受器。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。在一个实施方案中，修饰ITR是基于AAV2ITR。
更具体地说，可以通过修饰结构元件来改变结构元件与特定的大Rep蛋白功能性相互作用的能力。举例来说，与ITR的野生型序列相比，结构元件的核酸序列可以经修饰。在一个实施方案中，可以除去ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和TRS)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。例如，替代结构可以来自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。例如，ITR可以是AAV2 ITR，并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。在另一个实施方案中，ITR可以是AAV5 ITR，并且C或C'臂、RBE和TRS可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个实施方案中，AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITR B和B'臂替代的AAV5 ITR。
仅作为示例，表3显示了经修饰的ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如，缺失、插入和/或取代)，其中X表示该区段中的至少一个核酸相对于相应野生型ITR的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。例如，如果修饰引起以下任一种：单臂ITR(例如，单个C-C'臂或单个B-B'臂)或修饰的C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截短臂(例如截短的C-C'臂和/或截短的B-B'臂)的两臂ITR，那么至少所述单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截短的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在一些实施方案中，截短的C-C'臂和/或截短的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。
表3：ITR的不同B-B'和C-C'区域或臂的至少一个核苷酸的修饰的示例性组合(例如，缺失、插入和/或取代)(X指示核苷酸修饰，例如该区域中的至少一个核苷酸的添加、缺失或取代)。
B区 B'区 C区 C'区
X
X
X X
X
X
X X
X X
X X
X X
X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X X
在一些实施方案中，用于如本文所公开的包含不对称的ITR对或对称的经修饰ITR对的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体中的经修饰ITR可以包含表3中所示的任一种修饰组合，以及选自以下的任一个或多个区域中的至少一种核苷酸的修饰：在A'与C之间、在C与C'之间、在C'与B之间、在B与B'之间以及在B'与A之间。在一些实施方案中，在C或C'区或B或B'区中的至少一种核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)仍然保留了茎-环的末端环。在一些实施方案中，在C和C'和/或B和B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在另选的实施方案中，C与C'之间和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)使至少一个末端环中保留三个连续A核苷酸(即，AAA)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表3中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)：A'、A和/或D。举例来说，在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表3中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可以包含表3中所示的修饰的组合中的任一个，并且还包含A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可以包括表3中所示出的修饰组合中的任一个，并且还包括A和/或A’区中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR可以包括表3中所示出的修饰组合中的任一个，并且还包括D区中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。
在一个实施方案中，可以修饰结构元件的核酸序列(例如修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，以产生经修饰的结构元件。在一个实施方案中，对ITR的特定修饰在本文中举例说明(例如，在2018年12月6日提交并且全文以引用的方式并入本文的PCT/US2018/064242的图7A-7B中显示，例如，PCT/US2018/064242中的SEQ ID NO:97-98、101-103、105-108、111-112、117-134、545-54)。在一些实施方案中，能够修饰ITR(例如通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)。在其他实施方案中，ITR可以与经修饰的ITR中的一个或者SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的A-A'臂和C-C'和B-B'臂的含RBE区段或者国际申请PCT/US18/49996(全文以引用的方式并入本文)的表2-9中所示(即，SEQ ID NO:110-112、115-190、200-468)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性。
在一些实施方案中，经修饰的ITR可以例如包含所有特定臂(例如，A-A'臂的全部或一部分，或B-B'臂的全部或一部分，或C-C'臂的全部或一部分)的去除或缺失，或另选地，形成环茎的1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个碱基对的去除，只要对茎(例如，单臂)进行封端的最终环仍然存在(例如，参见2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A中的ITR-21，该文献全文以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，经修饰的ITR可以包括从B-B'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对。在一些实施方案中，经修饰的ITR能够包含从C-C'臂中去除1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个碱基对(参见例如2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图3B中的ITR-1或图7A中的ITR-45，该文献全文以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，修饰ITR可以包含从C-C'臂除去1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对和从B-B'臂除去1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对。设想去除碱基对的任何组合，例如可以在C-C'臂中去除6个碱基对以及在B-B'臂中去除2个碱基对。作为说明性示例，图2B显示了示例性经修饰的ITR，其从C部分和C'部分各缺失至少7个碱基对，C和C'区域之间的环中的核苷酸被取代，以及从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得修饰ITR包含至少一个臂(例如C-C')截短的两个臂。在一些实施方案中，经修饰的ITR还包含从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得臂B-B'相对于WTITR也截短。
在一些实施方案中，经修饰的ITR相对于全长野生型ITR序列可以具有在1个与50个之间(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个)的核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长WT ITR序列，经修饰的ITR可以具有1与30个之间的核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长野生型ITR序列，经修饰的ITR可以具有2与20个之间的核苷酸缺失。
在一些实施方案中，经修饰的ITR在A或A'区的含RBE部分中不含任何核苷酸缺失以免干扰DNA复制(例如，Rep蛋白对RBE的结合，或在末端解链位点处的切口)。在一些实施方案中，预期用于本文中的经修饰ITR在如本文所述的B、B'、C和/或C区域中具有一个或多个缺失。
在另一个实施方案中，结构元件的结构可以为经修饰的。例如，结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数量。例如，茎高可以是约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个或更多个核苷酸或其中的任何范围。在一个实施方案中，茎高度可以为约5个核苷酸至约9个核苷酸，并且在功能上与Rep相互作用。在另一个实施方案中，茎高度可以为约7个核苷酸，并且在功能上与Rep相互作用。在另一个示例中，环可以具有3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
在另一个实施方案中，RBE或扩展RBE内GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数量可以增加或减少。在一个实施方案中，RBE或扩展RBE可以包括1、2、3、4、5或6个或更多个GAGY结合位点或其中的任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列，只要所述序列足以结合Rep蛋白即可。
在另一个实施方案中，能够改变(例如增加或减少)两个元件(例如(但不限于)RBE和发夹)之间的间距，以改变与大Rep蛋白的功能相互作用。例如，间距可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
本文所述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体能够包括相对于本文公开的野生型AAV2 ITR结构经修饰，但仍保留可操作的RBE、TRS和RBE'部分的ITR结构。图1A和图1B显示了用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的TRS位点的一种可能的操作机制。在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体含有一个或多个功能ITR多核苷酸序列，这些多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:437))和末端解链位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:438))。在一些实施方案中，至少一个ITR(wt或修饰ITR)是功能性的。在另选的实施方案中，其中用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含彼此不同或不对称的两个经修饰ITR，至少一个经修饰ITR具有功能并且至少一个经修饰ITR不具有功能。
在一些实施方案中，如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的经修饰ITR(例如，左或右ITR)在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰。在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰的ITR的示例性序列列于国际申请PCT/US18/49996(其全文以引用的方式并入本文)的下表中：表2(即，SEQ ID NO:135-190、200-233)；表3(例如，SEQ ID No:234-263)；表4(例如，SEQ ID NO:264-293)；表5(例如，本文的SEQ IDNo:294-318)；表6(例如，SEQ ID NO:319-468)；以及表7-9(例如，SEQ ID No:101-110、111-112、115-134)或者表10A或10B(例如，SEQ ID No:9、100、469-483、484-499)。
在一些实施方案中，包含不对称ITR对或对称mod-ITR对的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体中使用的经修饰的ITR选自国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9和10A-10B中所示的那些修饰中的任一个或组合，所述国际申请全文以引用的方式并入本文中。
用于以上类别中的每一者中的包含不对称的ITR对或对称的经修饰ITR对的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体中的额外示例性经修饰ITR提供于表4A和4B中。表4A中的经修饰的右ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A中，并且表4B中的经修饰的左ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7B中，这些文献中的每一篇全文以引用的方式并入本文。
表4A和表4B显示了示例性经修饰的右和左ITR。
表4A：示例性经修饰的右ITR。这示例性些经修饰的右ITR还可以包含 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:437)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:439)的间隔子、间隔 子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:440)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:441)的RBE'(即，RBE的 补体)。
ITR构建体 SEQ ID NO: ITR构建体 SEQ ID NO:
ITR-18右 505 ITR-27右 514
ITR-19右 506 ITR-28右 515
ITR-20右 507 ITR-29右 516
ITR-21右 508 ITR-30右 517
ITR-22右 509 ITR-31右 518
ITR-23右 510 ITR-32右 519
ITR-24右 511 ITR-49右 520
ITR-25右 512 ITR-50右 521
ITR-26右 513
表4B：示例性经修饰的左ITR。这些示例性经修饰的左ITR还可以包含 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:437)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO: 439)的间隔子、间隔 子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:440)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:441)的RBE补体 (RBE')。
ITR构建体 SEQ ID NO: ITR构建体 SEQ ID NO:
ITR-33左 522 ITR-42左 531
ITR-34左 523 ITR-43左 532
ITR-35左 524 ITR-44左 533
ITR-36左 525 ITR-45左 534
ITR-37左 526 ITR-46左 535
ITR-38左 527 ITR-47左 536
ITR-39左 528 ITR-48左 537
ITR-40左 529 ITR-41左 530
在一个实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此不对称-也就是说，其具有彼此不同的3D空间构型。作为示施性实施方案，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是突变或修饰ITR，或反过来，其中第一ITR可以是突变或修饰ITR，第二ITR可以是野生型ITR。在一些实施方案中，第一ITR和第二ITR均是经修饰ITR，但具有不同序列或具有不同修饰，因此不是相同的经修饰的ITR，并且具有不同的3D空间构型。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体包含这样的ITR：其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化不反映在另一个ITR中；或另选地，其中具有经修饰的不对称ITR对的不对称ITR可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。用于表达FVIII蛋白并且用于产生ceDNA质粒的ceDNA载体中的示例性不对称的ITR在表4A和4B中示出。
在一个另选的实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含两个对称的经修饰ITR-也就是说，两个ITR都具有相同序列，但为彼此的反向互补序列(反向)。在一些实施方案中，相对于来自相同AAV血清型的野生型ITR序列，对称mod-ITR对包含缺失、插入或取代中的至少一种或任何组合。对称ITR中的添加、缺失或取代是相同的，但彼此反向互补。举例来说，在5’ITR的C区中插入3个核苷酸将反映为在3’ITR的C'区中相应部分中插入3个反向互补核苷酸。仅出于说明目的，如果在5'ITR中添加AACG，那么在3'ITR中相应位点处添加CGTT。例如，如果5'ITR有义链是ATCGATCG，在G与A之间添加AACG以产生序列ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:538)，则相应的3'ITR有义链是CGATCGAT(ATCGATCG的反向补体)，在T与C之间添加CGTT(即AACG的反向补体)以产生序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:539)(ATCGAACGATCG的反向补体)(SEQ ID NO:538)。
在另选的实施方案中，修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的-也就是说，修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有对应或相同的对称的三维形状。举例来说，一个经修饰的ITR能够来自一种血清型，而另一个经修饰的ITR能够来自不同血清型，但它们在相同区域中具有相同突变(例如核苷酸插入、缺失或取代)。换句话说，仅出于说明目的，5'经修饰ITR可以来自AAV2并在C区域有一个缺失，而3'经修饰ITR可以来自AAV5并在C'区域中有相应的缺失，并且如果5'经修饰ITR和3'经修饰ITR具有相同或对称的三维空间组织，那么其作为修饰ITR对涵盖用于在本文中。
在一些实施方案中，基本上对称的经修饰ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的经修饰ITR对中的修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源经修饰ITR相应缺失C-C'环，并且在其同源经修饰ITR的几何空间呈相同形状下，剩余A和B-B'环具有相似3D结构。仅作为示例，基本上对称的ITR可以具有对称的空间组织，使得它们的结构在几何空间中是相同的形状。例如，当G-C对被修饰为例如C-G对(反之亦然)或者A-T对被修饰为T-A对(反之亦然)时，可能会发生这种情况。因此，使用经修饰的5'ITR的上述示例性示例作为ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:538)和经修饰的3'ITR的上述示例性示例作为CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:539)(即ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:538)的反向补体)，如果例如5'ITR具有序列ATCGAACCATCG(SEQ ID NO:540)，其中添加的G被修饰为C，并且基本上对称的3'ITR具有序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:539)，除了a外没有T的相应修饰，则这些经修饰的ITR仍将是对称的。在一些实施方案中，这种经修饰的ITR对基本上是对称的，因为经修饰的ITR对具有对称的立体化学。
表5显示对称修饰的示例性ITR对(即，经修饰的左ITR和经修饰的对称右ITR)，其用在用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体中。序列的黑体(红色)部分标识了部分ITR序列(即A-A'、C-C'和B-B'环的序列)，也在图31A-46B中示出。这些示例性经修饰的ITR可以包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:437)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:439)的间隔子、间隔子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:440)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:441)的RBE'(即，RBE的补体)。
在一些实施方案中，包含不对称ITR对的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体能够包含具有修饰的ITR，所述修饰对应于以下序列中的任一修饰：本文表4A-4B中的任一个或多个中所示的ITR序列或ITR部分序列；或2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A-7B中所示的序列，所述国际申请全文并入本文中；或2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B中所公开的序列，所述国际申请全文以引用的方式并入本文中。
V.示例性ceDNA载体
如上文所描述，本公开涉及重组ceDNA表达载体和编码FVIII蛋白的ceDNA载体，其包含以下中的任一者：如上文所描述的不对称的ITR对、对称的ITR对或基本上对称的ITR对。在某些实施方案中，本公开涉及具有侧接ITR序列和转基因的用于表达FVIII蛋白的重组ceDNA载体，其中如本文所定义，ITR序列相对于彼此不对称、对称或基本上对称，并且ceDNA进一步包含位于侧接ITR之间的感兴趣的核酸序列(例如包含转基因的核酸的表达盒)，其中所述核酸分子不含病毒衣壳蛋白编码序列。
用于表达FVIII蛋白的ceDNA表达载体可以为包括如本文所描述的(多个)核酸序列的可以便利地进行重组DNA程序的任何ceDNA载体，前提是改变至少一个ITR。本公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体与其中将引入ceDNA载体的宿主细胞相容。在某些实施方案中，ceDNA载体可以是线性的。在某些实施方案中，ceDNA载体可以作为染色体外实体存在。在某些实施方案中，本公开的ceDNA载体可以含有容许供体序列整合到宿主细胞基因组中的元件。如本文所用，“转基因”和“异源核酸序列”同义，并且可编码FVIII蛋白，如本文所述。
ceDNA载体是无衣壳的并且可以从按顺序编码以下项的质粒中获得：第一ITR、可表达转基因盒和第二ITR，其中如本文所定义，第一和第二ITR序列相对于彼此是不对称的、对称的或基本上对称的。用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是无衣壳的并且可以从按顺序编码以下项的质粒中获得：第一ITR、可表达转基因(蛋白质或核酸)和第二ITR，其中如本文所定义，第一和第二ITR序列相对于彼此是不对称的、对称的或基本上对称的。在一些实施方案中，可表达的转基因盒根据需要包括：增强子/启动子、一个或多个同源臂、供体序列、转录后调节元件(例如WPRE，例如SEQ ID NO:67))以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A，例如SEQ ID NO:68)。
A.调节元件
包含如本文所定义的不对称的ITR对或对称的ITR对的如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以进一步包含顺式调节元件的特定组合。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施方案中，ITR可以充当转基因(例如，FVIII蛋白)的启动子。在一些实施方案中，如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含用于调节转基因表达的额外组分，例如本文所描述的用于调节转基因表达的调节开关或可以杀伤包含编码其FVIII蛋白的ceDNA载体的细胞的杀伤开关。可以用于本公开中的调节元件(包括调节开关)在国际申请PCT/US18/49996(全文以引用的方式并入本文)中更充分地讨论。
本文描述了包含密码子优化的FVII核苷酸序列并且与特定顺式元件(例如，启动子、增强子、特异性启动子和增强子组合)组合的ceDNA载体。根据一些实施方案，与相同密码子优化的FVIII核酸序列与另一个启动子序列和/或特异性增强子序列组合相比，特定密码子优化的FVIII核酸序列在与一个或多个特异性启动子序列和/或特异性增强子序列组合时表现得更好。
(i)启动子：
本领域普通技术人员将会理解，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体中所用的启动子是根据它们所促进的特定序列而定制的。
用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的表达盒可以含有组织特异性真核启动子，以将转基因表达限制在特定细胞类型并减少由未调节的异常表达引起的毒性作用和免疫应答。所使用的启动子区域还可包括一个或多个另外的调节序列(例如，天然的)，例如增强子。
在一些实施方案中，启动子还可以是来自人类基因的启动子。启动子还可以是组织特异性启动子，诸如肝特异性启动子，诸如人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)。根据一些实施方案，启动子可以是合成的。
根据本公开使用的合适启动子的非限制性示例包括本文所述的任何启动子或以下项中的任一种：
根据一些实施方案，启动子是hAAT核心、人a1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(来自人A1AT基因的核心启动子序列)。根据一些实施方案，hAAT启动子包含如SEQ ID NO:210所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:210至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:210至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:210至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:210至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:210至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:210至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:210至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:210的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子是最小运甲状腺素蛋白启动子(TTRm)。根据一些实施方案，TTRm启动子包含如SEQ ID NO:211所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:211至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:211至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:211至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:211至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:211至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:211至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:211至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:211的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子是hAAT_core_C06，hAAT核心启动子(A1AT基因启动子)的CpG最小化型式。根据一些实施方案，hAAT启动子包含如SEQ ID NO:212所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:212至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:212至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:212至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:212至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:212至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:212至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:212至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:212的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子是hAAT_core_C07，hAAT核心启动子(A1AT基因启动子)的CpG最小化型式。根据一些实施方案，hAAT启动子包含如SEQ ID NO:213所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:213至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:213至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:213至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:213至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:213至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:213至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:213至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:213的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子是hAAT_core_C08，hAAT核心启动子(A1AT基因启动子)的CpG最小化型式。根据一些实施方案，hAAT启动子包含如SEQ ID NO:214所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:214至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:214至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:214至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:214至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:214至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:214至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:214至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:214的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子是hAAT_core_C09，hAAT核心启动子(A1AT基因启动子)的CpG最小化型式。根据一些实施方案，hAAT启动子包含如SEQ ID NO:215所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:215至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:215至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:215至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:215至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:215至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:215至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:215至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:215的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子是hAAT_core_C10，hAAT核心启动子(A1AT基因启动子)的CpG最小化型式。根据一些实施方案，hAAT启动子包含如SEQ ID NO:216所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:216至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:216至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:216至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:216至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:216至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:216至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:216至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:216的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子是hAAT_core_truncated，衍生自hAAT_core(SEQ IDNO:210)的5p截短的hAAT核心启动子。根据一些实施方案，hAAT启动子包含如SEQ ID NO:217所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:217至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:217至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:217至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:217至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:217至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:217至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:217至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:217的核酸序列组成。
表6列出了可以在本文所述的ceDNA FVIII治疗剂中实施的核心启动子序列及其相应的SEQ ID NO。
表6.核心启动子
根据具体的实施方案，启动子选自由以下项组成的组：VandenDriessche(称为“VD”或“VanD”)启动子、人α1-抗胰蛋白酶(hAAT)启动子(包括CpG最小化的hAAT(979)启动子(CpGmin hAAT_core_C10)和其他CpGmin_hAAT启动子如hAAT_core_C06；hAAT_core_C07；hAAT_core_C08；和hAAT_core_C09)和运甲状腺素蛋白(TTR)肝特异性启动子。
在一些实施方案中，VD启动子包含微小病毒小鼠(MVM)内含子、最小运甲状腺素蛋白启动子(TTRm)、丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(72bp)和TTRm 5'UTR。根据一些实施方案，TTRm包含SEQ ID NO:211。根据一些实施方案，丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含SEQ ID NO:19。根据一些实施方案，TTRm 5'UTR包含SEQ ID NO:426。
根据另外的实施方案，VD启动子包含SEQ ID NO:541。
根据一些实施方案，CpGmin_hAAT启动子包含选自SEQ ID NO:212、213、214、215或216中任一个的序列。
(ii)增强子
在一些实施方案中，表达FVIII的ceDNA包含一个或多个增强子。在一些实施方案中，增强子序列位于启动子序列的5'。在一些实施方案中，增强子序列位于启动子序列的3'。根据一些实施方案，增强子是如Chuah,M.等人描述的丝氨酸蛋白酶抑制剂1基因(SerpEnh)的增强子区((2014).Liver-Specific Transcriptional Modules Identifiedby Genome-Wide In Silico Analysis Enable Efficient Gene Therapy in Mice andNon-Human Primates Molecular Therapy,22(9),1605-1613，该文献全文以引用的方式并入本文)。
根据一些实施方案，丝氨酸蛋白酶抑制蛋白增强子(SerpEnh)的序列如SEQ IDNO:198所示。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:198至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。
根据一些实施方案，增强子是运甲状腺素蛋白(TTRe)基因(TTRe)的增强子区。根据一些实施方案，运甲状腺素蛋白(TTRe)基因(TTRe)的增强子区的序列在SEQ ID NO:199中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:199至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子由SEQ ID NO:199组成。根据一些实施方案，增强子是肝核因子1结合位点(HNF1)。根据一些实施方案，肝核因子1结合位点(HNF1)的序列在SEQ ID NO:200中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:200至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子由SEQ ID NO:200组成。
根据一些实施方案，增强子是肝核因子4结合位点(HNF4)。根据一些实施方案，肝核因子4结合位点(HNF4)的序列在SEQ ID NO:201中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:201至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子由SEQ ID NO:201组成。
根据一些实施方案，增强子是人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子(ApoE_Enh)。根据一些实施方案，人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子(ApoE_Enh)的序列在SEQ ID NO:202中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:202至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子由SEQ ID NO:202组成。
根据一些实施方案，增强子是来自前白蛋白基因(ProEnh)的增强子区。根据一些实施方案，来自前白蛋白基因(ProEnh)的增强子区的序列在SEQ ID NO:203示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:203至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子由SEQ ID NO:203组成。
根据一些实施方案，增强子是ApoE_Enh的CpG最小化型式(人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子)(ApoE_Enh_C03、ApoE_Enh_C04、ApoE_Enh_C09和ApoE_Enh_C10)。根据一些实施方案，ApoE_Enh_C03、ApoE_Enh_C04、ApoE_Enh_C09和ApoE_Enh_C10的序列在SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206和SEQ ID NO:207中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:204至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:204或由SEQID NO:204组成。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:205至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:205或由SEQID NO:205组成。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:206至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:206或由SEQID NO:206组成。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:207至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:207或由SEQID NO:207组成。
根据一些实施方案，增强子是嵌入GE-856中的HCR1 footprint123(Embedded_HCR1_footprint123)。根据一些实施方案，嵌入GE-856中的HCR1 footprint123的序列在SEQ ID NO:208中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:208至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:208或由SEQID NO:208组成。
根据一些实施方案，增强子是嵌入GE-856中的肝核因子增强子阵列(Embedded_enhancer_HNF_array)。根据一些实施方案，嵌入GE-856中的肝核因子增强子阵列的序列在SEQ ID NO:209中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:209至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:209或由SEQID NO:209组成。
根据一些实施方案，增强子是人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子的衍生物(ApoE_enhancer_v2)。根据一些实施方案，ApoE_enhancer_v2的序列在SEQ ID NO:485中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:485至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:485或由SEQID NO:485组成。
根据一些实施方案，所述增强剂是来自婴猴的丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子的衍生物(Bushbaby SerpEnh)。根据一些实施方案，婴猴丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子序列在下面显示为SEQ ID NO:557：GGGGGAAGCTACTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCAGTTATCAGGGAGCAAACAGGAGCTAAGTCCAT并且在SEQ ID NO:557中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:557至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:557或由SEQID NO:557组成。根据一些其他实施方案，婴猴丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍和多达10倍的包含SEQ ID NO:557的核酸序列的重复序列，在序列的每次迭代之间具有或不具有间隔子序列。
根据一些实施方案，增强子是来自树鼩的丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子的衍生物(树鼩SerpEnh)。根据一些实施方案，树鼩丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子序列如下：GGAGGCTGTTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCTCAGTTATCGGAGG AGCAAACAAGGGCTAAGTCCAC并且在SEQ IDNO:617中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:617至少约95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:617或由SEQ ID NO:617组成。根据一些其他实施方案，婴猴丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍和多达10倍的包含SEQ ID NO:617的核酸序列的重复序列，在每次迭代之间具有或不具有间隔子序列。
根据一些实施方案，增强子是来自人SERPINA1增强子的丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子的衍生物，其具有FOXA和HNF4共有位点并且去除内部CpG(HNF4_FOXA_v1)。根据一些实施方案，HNF4_FOXA_v1丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子序列如下：
GGGGGAGGCTGCTGGTAAACATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCAGAGGAGCAAACAGGGGCAAAGTCCAC并且在SEQ ID NO:625中示出。
根据一些实施方案，增强子包含与SEQ ID NO:625至少约95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，增强子包含SEQ ID NO:625或由SEQ ID NO:625组成。根据一些其他实施方案，HNF4_FOXA_v1丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍和多达10倍的包含SEQ ID NO:625的核酸序列的重复序列，在每次迭代之间具有或不具有间隔子序列。
可以用于ceDNA FVIII构建体中的这些增强子的概述在表7中列出。
表7.增强子
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在一些其他实施方案中，可以串联使用增强子。
启动子组
根据一些实施方案，启动子包含包括增强子和核心启动子而没有5pUTR(称为启动子组)的合成肝特异性启动子组。
根据一些实施方案，与TTR启动子融合的3xHNF1-4_ProEnh增强子(前白蛋白增强子)包含SEQ ID NO:184中所示的序列。
根据一些实施方案，与3x VanD-TTRe和TTR启动子融合的3xHNF1-4_ProEnh增强子(前白蛋白增强子)包含SEQ ID NO:185中所示的序列。
根据一些实施方案，与TTR启动子融合的5xHNF1_ProEnh增强包含SEQ ID NO:186中所示的序列。根据一些实施方案，与3x SerpEnh VD-TTRe和TTR启动子融合的5xHNF1_ProEnh增强包含SEQ ID NO:187中所示的序列。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1471)包含如SEQ ID NO:184所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:184至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:184至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:184至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:184至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:184至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:184至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:184至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:184的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1472)包含如SEQ ID NO:185所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:185至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:185至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:185至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:185至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:185至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:185至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:185至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:185的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1473)包含如SEQ ID NO:186所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:186至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:186至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:186至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:186至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:186至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:186至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:186至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:186的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1474)包含如SEQ ID NO:187所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:187至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:187至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:187至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:187至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:187至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:187至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:187至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:187的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1475)包含如SEQ ID NO:484所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:484至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:484至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:484至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:484至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:484至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:484至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:484至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:484的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1476)包含如SEQ ID NO:189所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:189至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:189至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:189至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:189至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:189至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:189至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:189至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:189的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1477)包含如SEQ ID NO:190所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:190至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:190至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:190至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:190至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:190至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:190至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:190至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:190的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1478)包含如SEQ ID NO:191所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:191至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:191的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1479)包含如SEQ ID NO:192所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:192至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:192至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:192至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:192至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:192至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:192至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:192至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:192的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1480)包含如SEQ ID NO:193所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:193至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:193至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:193至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:193至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:193至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:193至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:193至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:193的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1368)包含如SEQ ID NO:194所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:194至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:194至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:194至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:194至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:194至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:194至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:194至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:194的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1648)包含如SEQ ID NO:195所示的序列)。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:195至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:195至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:195至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:195至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:195至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:195至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:195至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:195的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1657)包含如SEQ ID NO:196所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:196至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:196至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:196至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:196至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:196至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:196至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:196至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:196的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1622)包含如SEQ ID NO:197所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:197至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:197至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:197至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:197至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:197至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:197至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:197至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:197的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组1664)包含如SEQ ID NO:400所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:400至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:400至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:400至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:400至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:400至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:400至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:400至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子由SEQ ID NO:400的核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组979)包含如SEQ ID NO:401所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:401至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:401至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:401至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:401至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:401至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:401至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:401至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:401的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组2558)包含如SEQ ID NO:617所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:617的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组2559)包含如SEQ ID NO:618所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:618的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组2560)包含如SEQ ID NO:619所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:619的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组2580)包含如SEQ ID NO:620所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:620的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组2583)包含如SEQ ID NO:621所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:621的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组2584)包含如SEQ ID NO:622所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:622的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组2588)包含如SEQ ID NO:623所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:623的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子组(启动子组2589)包含如SEQ ID NO:624所示的序列。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:624的核酸序列或由该核酸序列组成。
可以用于ceDNA FVIII构建体中的启动子组的概述在表8和表9中示出。
表8：启动子组
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表9.启动子组：hAAT CpG最小化的增强子与核心启动子CpG最小化的hAAT core_C10(hAAT_979)或hAAT_core_C06的组合；HNF4/FOXA-TTRe与TTR启动子的组合；婴猴变体增强子重复序列与TTRe和TTR启动子的组合；树鼩增强子重复序列与TTRe和TTR启动子的组合。
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根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:402至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:402至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:402至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:402至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:402至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:402至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:402至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:402的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:403至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:403至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:403至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:403至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:403至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:403至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:403至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:403的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:404至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:404至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:404至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:404至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:404至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:404至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:404至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:404的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:405至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:405至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:405至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:405至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:405至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:405至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:405至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:405的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:406至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:406至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:406至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:406至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:406至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:406至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:406至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:406的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:407至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:407至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:407至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:407至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:407至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:407至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:407至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:407的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:408至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:408至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:408至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:408至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:408至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:408至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:408至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:408的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:409至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:409至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:409至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:409至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:409至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:409至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:409至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:409的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:410至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:410至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:410至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:410至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:410至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:410至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:410至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:410的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:617至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:617的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:618至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:618的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:619至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:619的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:620至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:620的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:621至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:621的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:622至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:622的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:623至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:623的核酸序列或由该核酸序列组成。
根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含与SEQ ID NO:624至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，启动子包含SEQ ID NO:624的核酸序列或由该核酸序列组成。
(iii)5'UTR序列和内含子序列
在一些实施方案中，ceDNA载体包含5'UTR序列和/或位于5'ITR序列的3'的内含子序列。在一些实施方案中，5'UTR位于转基因(例如，编码FVIII蛋白的序列)的5’。根据一些实施方案，5'UTR序列选自下表10和国际申请号PCT/US2020/021328(全文以引用的方式并入本文)中(例如，表9A中)列出的那些。
表10.5'UTR
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根据一些实施方案，5'-UTR序列包含与如SEQ ID NO:411-436中所示的序列中的任一个至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含这些序列中的任一个或由这些序列中的任一个组成。
根据一些实施方案，ceDNA载体包含位于5'ITR序列的3'的内含子序列。根据一些实施方案，ceDNA载体包含位于FVIII的ORF内、两个外显子之间的内含子序列。根据一些实施方案，内含子序列选自下表11中列出的那些序列，下表提供了序列标识和内含子的描述。
表11.内含子
根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:235至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:235或由SEQ ID NO:235组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:236至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:236或由SEQ ID NO:236组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQID NO:237至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:237或由SEQ ID NO:237组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:238至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:238或由SEQ ID NO:238组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:239至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:239或由SEQ ID NO:239组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:240至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:240或由SEQ ID NO:240组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:241至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:241或由SEQ ID NO:241组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQID NO:242至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:242或由SEQ ID NO:242组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:243至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:243或由SEQ ID NO:243组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:244至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:244或由SEQ ID NO:244组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:245至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:245或由SEQ ID NO:245组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:246至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:246或由SEQ ID NO:246组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQID NO:247至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:247或由SEQ ID NO:247组成。根据一些实施方案，内含子序列包含与SEQ ID NO:248至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，内含子序列包含SEQ ID NO:248或由SEQ ID NO:248组成。
(iv)外显子序列
根据一些实施方案，ceDNA载体包含外显子序列。根据一些实施方案，外显子序列选自下表12中列出的那些序列，下表提供了序列标识和外显子的描述。
表12.
根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQ ID NO:293至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:293或由SEQ ID NO:293组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQ ID NO:294至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:294或由SEQ ID NO:294组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQID NO:295至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:295或由SEQ ID NO:295组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQ ID NO:296至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:296或由SEQ ID NO:296组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQ ID NO:297至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:297或由SEQ ID NO:297组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQ ID NO:298至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:298或由SEQ ID NO:298组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQ ID NO:299至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:299或由SEQ ID NO:299组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQID NO:300至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:300或由SEQ ID NO:300组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQ ID NO:301至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:301或由SEQ ID NO:301组成。根据一些实施方案，外显子序列包含与SEQ ID NO:302至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，外显子序列包含SEQ ID NO:302或由SEQ ID NO:302组成。
(v)3'UTR序列
在一些实施方案中，ceDNA载体包含位于3'ITR序列的5'的3'UTR序列。在一些实施方案中，3'UTR位于转基因(例如，编码FVIII蛋白的序列)的3’。根据一些实施方案，3'UTR序列选自下表13中列出的那些序列，下表提供了序列标识和3'UTR的描述。
表13.
WPRE_3pUTR_v3-ATG
根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ ID NO:283至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:283或由SEQ ID NO:283组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ ID NO:284至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:284或由SEQ ID NO:284组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ IDNO:285至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:285或由SEQ ID NO:285组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ ID NO:286至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:286或由SEQ ID NO:286组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ ID NO:287至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:287或由SEQ ID NO:287组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ ID NO:288至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:288或由SEQ IDNO:288组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ ID NO:289至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:289或由SEQ ID NO:289组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ ID NO:290至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:290或由SEQ ID NO:290组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ IDNO:291至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:291或由SEQ ID NO:291组成。根据一些实施方案，3'UTR序列包含与SEQ ID NO:634至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，3'UTR序列包含SEQ ID NO:634或由SEQ ID NO:634组成。
(v)多聚腺苷酸化序列：
编码聚腺苷酸化序列的序列可以包括于用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体中以使由ceDNA载体表达的mRNA稳定并且有助于核输出和转译。在一个实施方案中，ceDNA载体不包括多聚腺苷酸化序列。在其它实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，多聚腺苷酸化序列包括约43个核苷酸、约40-50个核苷酸、约40-55个核苷酸、约45-50个核苷酸、约35-50个核苷酸或它们之间的任何范围。
表达盒可以包含所属领域已知的任何聚腺苷酸化序列或其变体。在一些实施方案中，聚腺苷酸化(polyA)序列选自国际申请号PCT/US2020/021328中列出的任何那些，例如在表10中，所述国际申请全文以引用的方式并入本文中。也可以使用本领域公知的其他polyA序列，例如，包括但不限于从牛BGHpA(例如，SEQ ID NO:68)或病毒SV40pA(例如，SEQID NO:86)中分离的天然存在的序列或者合成序列(例如，SEQ ID NO:87)。一些表达盒还可以包括SV40晚期多聚腺苷酸化信号上游增强子(USE)序列。在一些实施方案中，USE序列可以与SV40pA或异源聚A信号组合使用。聚A序列位于编码FVIII蛋白的转基因的3'。表达盒还可以包含转录后元件以增加转基因的表达。在一些实施方案中，使用土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:67)增强转基因表达。可以使用其它转录后处理元件，如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。分泌序列能够连接到转基因，例如VH-02和VK-A26序列，例如SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89。
(vi)DNA核靶向序列(DTS)
在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含一个或多个DNA核靶向序列(DTS)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个DTS。在一些实施方案中，一个或多个DTS位于氨基末端处或附近、羧基末端处或附近，或这些位置的组合(例如，一个或多个NLS在氨基末端处和/或一个或多个NLS在羧基末端处)。当存在超过一个DTS时，每一个可以彼此独立地选择，使得单个DTS存在于超过一个拷贝中和/或与存在于一个或多个拷贝中的一个或多个其他DTS组合存在。根据一些实施方案，DTS选自下表14中列出的那些，下表提供了序列标识、DTS的描述和名称。
表14.
B.ceDNA载体的额外组分
本公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以含有编码用于基因表达的其它组分的核苷酸。
(i)遍在染色质开放元件(UCOE)
根据一些实施方案，ceDNA载体还可包含遍在染色质开放元件(UCOE)，其在结构上由包含单个或两个差异转录的看家基因启动子的无甲基化的CpG岛组成，并且由它们持续赋予稳定的、不依赖整合位点的与拷贝数成比例的转基因表达的能力来定义(Neville等人,第35卷,第5期,2017年9月,第557-56页)。
根据一些实施方案，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含源自CBX3基因间区的最小UCOE，其包含消除CBX3内含子区中的剪接位点的突变(CBX3(674mut1))。根据一些实施方案，最小UCOE包含SEQ ID NO:292或由SEQ ID NO:292组成。
根据一些实施方案，UCOE包含与SEQ ID NO:292至少约85％相同的核酸序列。根据一些实施方案，UCOE包含与SEQ ID NO:292至少约90％相同的核酸序列。根据一些实施方案，UCOE包含与SEQ ID NO:292至少约95％相同的核酸序列。根据一些实施方案，UCOE包含与SEQ ID NO:292至少约96％相同的核酸序列。根据一些实施方案，UCOE包含与SEQ ID NO:292至少约97％相同的核酸序列。根据一些实施方案，UCOE包含与SEQ ID NO:292至少约98％相同的核酸序列。根据一些实施方案，UCOE包含与SEQ ID NO:292至少约99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，UCOE包含SEQ ID NO:292的核酸序列或由该核酸序列组成。
(ii)Kozak序列
根据一些实施方案，ceDNA载体还可包含一个或多个Kozak序列。根据一些实施方案，Kozak序列是共有Kozak序列。根据一些实施方案，Kozak序列是修饰Kozak序列。根据一些实施方案，Kozak序列是最小Kozak序列。
根据一些实施方案，共有Kozak序列(Consensus_Kozak)包含GCCGCCACC(SEQ IDNO:314)。根据一些实施方案，经修饰的共有Kozak序列(Mod_Minimum_Consensus_Kozak_v1)包含AGCCACC(SEQ ID NO:315)。根据一些实施方案，经修饰的共有Kozak序列(Mod_Minimum_Consensus_Kozak_v2)包含CGCAGCCACC(SEQ ID NO:316)。根据一些实施方案，最小的共有Kozak序列(536_Kozak)包含ACC(SEQ ID NO:317)。
(iii)间隔子序列
根据一些实施方案，ceDNA载体还可包含一个或多个间隔子序列。根据一些实施方案，间隔子序列选自下表15中列出的那些序列中的一个或多个，下表提供了序列标识、间隔子序列的描述和名称。
表15.间隔子
根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:318至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:318或由SEQ ID NO:318组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:319至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:319或由SEQ ID NO:319组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:320至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:320或由SEQ ID NO:320组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:321至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:321或由SEQ ID NO:321组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ IDNO:322至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:322或由SEQ ID NO:322组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:323至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:323或由SEQ IDNO:323组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:324至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:324或由SEQ ID NO:324组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:325至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:325或由SEQ ID NO:325组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:326至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:326或由SEQ ID NO:326组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:327至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:327或由SEQ ID NO:327组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:328至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQID NO:328或由SEQ ID NO:328组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:329至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:329或由SEQ ID NO:329组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:330至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:330或由SEQ ID NO:330组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:331至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:331或由SEQ ID NO:331组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:332至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:332或由SEQ ID NO:332组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:634至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:634或由SEQ ID NO:634组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:635至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:635或由SEQ ID NO:635组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ IDNO:636至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:636或由SEQ ID NO:636组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:637至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:637或由SEQ IDNO:637组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:638至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:638或由SEQ ID NO:638组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:639至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:639或由SEQ ID NO:639组成。根据一些实施方案，间隔子序列包含与SEQ ID NO:640至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:640或由SEQ ID NO:640组成。
(iv)前导序列
根据一些实施方案，ceDNA载体还可包含一个或多个前导序列。根据一些实施方案，前导序列选自下表16中列出的那些序列中的一个或多个，下表提供了序列标识、前导序列的描述和名称。
表16.前导序列
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根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:249至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:249或由SEQ ID NO:249组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:250至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:250或由SEQ ID NO:250组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:251至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:251或由SEQ ID NO:251组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQID NO:252至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ IDNO:252或由SEQ ID NO:252组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:253至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:253或由SEQID NO:253组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:254至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:254或由SEQ ID NO:254组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:255至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:255或由SEQ ID NO:255组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:256至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:256或由SEQ ID NO:256组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:257至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:257或由SEQ ID NO:257组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ IDNO:258至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:258或由SEQ ID NO:258组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:259至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:259或由SEQ IDNO:259组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:260至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:260或由SEQ ID NO:260组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:261至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:261或由SEQ ID NO:261组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:262至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:262或由SEQ ID NO:262组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQID NO:263至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ IDNO:263或由SEQ ID NO:263组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:264至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:264或由SEQID NO:264组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:265至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:265或由SEQ ID NO:265组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:266至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:266或由SEQ ID NO:266组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:267至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:267或由SEQ ID NO:267组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:268至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:268或由SEQ ID NO:268组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ IDNO:269至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:269或由SEQ ID NO:269组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:270至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:270或由SEQ IDNO:270组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:271至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:271或由SEQ ID NO:271组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:272至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:272或由SEQ ID NO:272组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:273至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:273或由SEQ ID NO:273组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQID NO:274至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ IDNO:274或由SEQ ID NO:274组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:275至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:275或由SEQID NO:275组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:276至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:276或由SEQ ID NO:276组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:277至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:277或由SEQ ID NO:277组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:278至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:278或由SEQ ID NO:278组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:279至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:279或由SEQ ID NO:279组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ IDNO:280至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:280或由SEQ ID NO:280组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:281至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:281或由SEQ IDNO:281组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:282至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:282或由SEQ ID NO:282组成。根据一些实施方案，前导序列包含与SEQ ID NO:283至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:283或由SEQ ID NO:283组成。
在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可包含一个或多个参与免疫应答或肝稳态的微小RNA(MIR)序列，如以下表17所示。
表17.MIR序列
根据一些实施方案，为了选择特定的基因靶向事件，可将保护性shRNA嵌入微小RNA中，然后插入被设计成位点特异性地整合到高活性基因座(诸如白蛋白基因座)中的重组ceDNA载体中。这样的实施方案可以提供用于在任何遗传背景下体内选择和扩增基因修饰的肝细胞的系统，例如在Nygaard等人的《体内选择基因修饰的肝细胞的通用系统(Auniversal system to select gene-modified hepatocytes in vivo)》《基因疗法(GeneTherapy)》,2016年6月8日)中所述。本公开的ceDNA载体可以含有一种或多种选择性标志物，其允许选择转化、转染、转导等的细胞。选择性标志物是产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原营养、NeoR等的基因。在某些实施方案中，将正向选择标志物并入供体序列中，例如NeoR。可以将负向选择标志物并入供体序列的下游，例如可以将编码负向选择标志物的核酸序列HSV-tk并入供体序列下游的核酸构建体中。
C.调节开关
分子调节开关是一种响应信号而产生可测量的状态变化的开关。所述调节开关可以有效地与如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体组合以控制ceDNA载体对FVIII蛋白的表达的输出。在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含用于微调FVIII蛋白表达的调节开关。例如，其可以发挥ceDNA载体的生物封存功能。在一些实施方案中，开关为被设计成以可控制和可调节的方式启动或停止(即，关闭)ceDNA载体中FVIII蛋白的表达的“ON/OFF”型开关。在一些实施方案中，开关可以包含“杀伤开关”，一旦所述开关被激活，其就可以指令包括ceDNA载体的细胞经历细胞程序性死亡。所涵盖的用于用以表达FVIII蛋白的ceDNA载体中的示例性调节开关可以用于调节转基因表达，并更全面地论述于全文以引用方式并入本文中的国际申请PCT/US18/49996中。
(i)二元调节开关
在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包含可以用于可控制地调节FVIII蛋白表达的调节开关。举例来说，位于ceDNA载体的ITR之间的表达盒可以另外包含可操作地连接到编码FVIII蛋白的核酸序列的调节区，例如启动子、顺式元件、抑制因子、增强子等，其中调节区由一种或多种辅因子或外源因子调节。仅举例来说，调节区可以通过小分子开关或诱导型或阻遏型启动子进行调节。诱导型启动子的非限制性示例是激素诱导型或金属诱导型启动子。其它示例性的诱导型启动子/增强子元件包括但不限于RU486诱导型启动子、蜕皮素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
(ii)小分子调节开关
多种所属领域已知的基于小分子的调节开关为所属领域中已知的，并且可以与如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体组合以形成调节开关控制的ceDNA载体。在一些实施方案中，调节开关可以选自以下项中的任一种或组合：正交配体/核受体对，例如类视黄醇受体变体/LG335和GRQCIMFI，以及控制操作性连接的转基因的表达的人工启动子，诸如Taylo等人，BMC Biotechnology 10(2010):15中所公开的人工启动子；经工程改造的类固醇受体，例如C末端被截短的不能结合孕酮但结合RU486(米非司酮)的经修饰的孕酮受体(美国专利号5,364,791)；来自果蝇的蜕皮素及其蜕皮类固醇配体(Saez等人,PNAS,97(26)(2000),14512–14517)；或者由抗生素甲氧苄氨嘧啶(TMP)控制的开关，如Sando R 3rd；Nat Methods.2013,10(11):1085-8中公开的。在一些实施方案中，控制转基因或由ceDNA载体表达的调节开关是前药活化开关，诸如美国专利8,771,679和6,339,070(所有这些文献的内容全文以引用的方式并入本文)中公开的前药活化开关。
(iii)“密码”调节开关
在一些实施方案中，调节开关可以是“密码开关”或“密码回路”。在发生特定条件时，也就是说，需要存在条件的组合才能发生转基因表达和/或阻遏时，密码开关允许微调对转基因从ceDNA载体的表达的控制。例如，为了发生转基因的表达，至少必须发生条件A和B。密码调节开关可以是任何数量的条件，例如，要存在至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个或更多个条件方能发生转基因表达。在一些实施方案中，需要发生至少2个条件(例如A、B条件)，并且在某些实施方案中，需要发生至少3个条件(例如A、B和C，或A、B和D)。仅举例来说，为了从具有密码“ABC”调节开关的ceDNA发生基因表达，必须存在条件A、B和C。条件A、B和C可以如下：条件A是存在病症或疾病，条件B是激素响应，并且条件C是对转基因表达的响应。例如，如果转基因编辑缺陷性EPO基因，则条件A是存在慢性肾病(CKD)，如果受试者的肾脏中有低氧状况，则发生条件B，条件C是肾脏中促红细胞生成素生成细胞(EPC)的募集受损；或另选地，HIF-2活化受损。一旦氧水平升高或达到期望的EPO水平，转基因就会关闭，直到再次发生3个条件，它重新打开。
在一些实施方案中，涵盖用于ceDNA载体中的密码调节开关或“密码回路”包含杂合转录因子(TF)以扩大用于界定生物封存条件的环境信号的范围和复杂度。与在预定条件存在下触发细胞死亡的致命开关相反，“密码回路”允许在特定“密码”存在下细胞存活或转基因表达，并且只有当存在预定环境条件或密码时，才可以容易地重新编程以允许转基因表达和/或细胞存活。
本文公开的调节开关，例如小分子开关、基于核酸的开关、小分子-核酸杂合开关、转录后转基因调节开关、转译后调节、辐射控制开关、低氧介导的开关和如本文公开的所属领域中普通技术人员已知的其它调节开关中的任何和所有组合均可以用于如本文公开的密码调节开关中。涵盖使用的调节开关也在综述文章Kis等人,J R Soc Interface.12:20141000(2015)中讨论，并且在Kis的表1中总结，该文献全文以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，用于密码系统中的调控开关能够选自国际专利申请PCT/US18/49996的表11中所公开的任何开关或开关组合，所述专利申请全文以引用的方式并入本文中。
(iv)控制转基因表达的基于核酸的调节开关
在一些实施方案中，控制由ceDNA进行的FVIII蛋白表达的调控开关是建立在基于核酸的控制机理的基础上。示例性核酸控制机构是所属领域中已知的并且是设想使用的。例如，此类机理包括核糖开关，诸如以下文献中所公开的核糖开关：例如US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018026762A1、美国专利9,222,093和EP申请EP288071；以及Villa JK等人,Microbiol Spectr.2018年5月；6(3)中公开的。还包括代谢物响应性转录生物传感器，例如WO2018/075486和WO2017/147585中公开的那些。设想使用的其它所属领域已知的机制包括用siRNA或RNAi分子(例如miR、shRNA)使转基因沉默。例如，ceDNA载体可以包含编码与ceDNA载体所表达的转基因的两部分互补的RNAi分子的调控开关。当这种RNAi表达时，即使转基因(例如，FVIII蛋白)由ceDNA载体表达，它将被互补的RNAi分子沉默，并且当RNAi不表达时，当转基因由ceDNA载体表达时，转基因(例如，FVIII蛋白)不被RNAi沉默。
在一些实施方案中，调节开关是组织特异性自失活调节开关，例如如US2002/0022018中所公开，由此调节开关在转基因表达原本可能不利的位点有意地将转基因(例如，FVIII蛋白)关闭。在一些实施方案中，调节开关是重组酶可逆基因表达系统，例如US2014/0127162和美国专利8,324,436中所公开。
(v)转录后和翻译后调节开关
在一些实施方案中，用于控制ceDNA载体对FVIII蛋白的表达的调节开关为转录后修饰系统。例如，此类调节开关可以是对四环素或茶碱敏感的适体酶(aptazyme)核糖开关，如在以下文献中公开：US2018/0119156、GB201107768、WO2001/064956A3、欧洲专利2707487和Beilstein等人,ACS Synth.Biol.,2015,4(5),第526–534页；Zhong等人,Elife.2016年11月2日；5.pii:e18858。在一些实施方案中，设想所属领域普通技术人员可以编码转基因和含有配体敏感性(OFF-开关)适体的抑制性siRNA二者，净结果是配体敏感性ON-开关。
(vi)其他示例性调节开关
任何已知的调节开关都可以用于ceDNA载体中以控制ceDNA载体对FVIII蛋白的表达，包括环境变化所触发的表达。另外的示例包括但不限于：Suzuki等人,ScientificReports 8；10051(2018)的BOC方法；遗传密码扩展和非生理性氨基酸；辐射控制或超声控制的开/关开关(参见例如Scott S等人,Gene Ther.2000年7月；7(13):1121-5；美国专利5,612,318、5,571,797、5,770,581、5,817,636和WO1999/025385A1，这些文献中的每一篇的内容全文以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，调节开关由可植入系统控制，例如如美国专利7,840,263、US2007/0190028A1中所公开，其中基因表达由一种或多种形式的能量来控制，包括电磁能，该能量活化与ceDNA载体中的转基因可操作地连接的启动子。
在一些实施方案中，设想用于ceDNA载体中的调节开关是低氧介导的或胁迫活化的开关，例如如以下文献中公开的那些开关：WO1999060142A2、美国专利5,834,306、6,218,179、6,709,858、US2015/0322410；Greco等人,(2004)Targeted Cancer Therapies 9,S368，以及FROG、TOAD和NRSE元件和条件诱导型沉默元件，包括低氧应答元件(HRE)、炎型应答元件(IRE)和剪切应力活化元件(SSAE)，例如如美国专利9,394,526中所公开的。此类实施例可用于在缺血后或在缺血组织和/或肿瘤中打开转基因从ceDNA载体的表达。
(vii)杀伤开关
本文所描述的其它实施例涉及如本文所描述的包含杀伤开关的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体。如本文公开的杀伤开关能够使包括ceDNA载体的细胞被杀伤或经历程序性细胞死亡，作为从受试者的系统中永久去除引入的ceDNA载体的手段。所属领域的普通技术人员将了解，杀伤开关在用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体中的使用通常联合ceDNA载体靶向受试者可以接受地损失的有限数目个细胞或靶向期望细胞凋亡时的细胞类型(例如癌细胞)。在所有方面，如本文公开的“杀伤开关”被设计成在缺乏输入的存活信号或其它指定条件下提供对包括ceDNA载体的细胞的快速而稳固的细胞杀伤。换句话说，由如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体编码的杀伤开关可以使包含ceDNA载体的细胞的细胞存活受特定输入信号所限定的环境限制。如果期望从受试者中去除ceDNA载体对FVIII蛋白的表达或确保其不表达所编码的FVIII蛋白，则所述杀伤开关发挥生物学生物封存功能。
本领域普通技术人员已知的其他杀伤开关包括在内用于如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体中，例如如以下文献中所公开的：US2010/0175141、US2013/0009799、US2011/0172826、US2013/0109568，以及以下文献中所公开的杀伤开关：Jusia等人,Reviews in Cell Biology and molecular Medicine；2014；1-56；Kobayashi等人,PNAS,2004；101；8419-9；Marchisio等人,Int.Journal of Biochem and Cell Biol.,2011；43；310-319；以及Reinshagen等人,Science Translational Medicine,2018,11。
因此，在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以含有包含编码效应毒素或报告蛋白的核酸的杀伤开关核酸构建体，其中效应毒素(例如死亡蛋白)或报告蛋白的表达受预定条件控制。举例来说，预定条件可以是存在环境试剂，例如外源试剂，在没有所述环境试剂的情况下，细胞将默认表达效应毒素(例如死亡蛋白质)并且被杀伤。在另选的实施方案中，预定条件是存在两种或更多种环境试剂，例如细胞将仅在提供两种或更多种必需的外源试剂时存活，而在其中的任一种不存在的情况下，包含ceDNA载体的细胞被杀伤。
在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体经修饰以并入杀伤开关，从而破坏包含ceDNA载体的细胞，以有效地终止ceDNA载体所表达的转基因的体内表达(例如FVIII蛋白的表达)。具体地说，进一步对ceDNA载体进行基因工程改造以表达在哺乳动物细胞中、在正常生理学条件下不具功能性的开关蛋白。仅在药物施用后或在特异性靶向这种开关蛋白的环境条件下，表达开关蛋白的细胞被破坏，从而终止治疗蛋白或肽的表达。举例来说，据报告，表达HSV-胸苷激酶的细胞在药物(例如苷昔洛韦(ganciclovir)和胞嘧啶脱氨酶)施用后可以被杀伤。参见例如Dey和Evans,Suicide Gene Therapy by HerpesSimplex Virus-1 Thymidine Kinase(HSV-TK),You编辑的Targets in Gene Therapy(2011)；以及Beltinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15):8699-8704(1999)。在一些实施方案中，ceDNA载体可以包含siRNA杀伤开关，称为DISE(生存基因消除诱导的死亡)(Murmann等人,Oncotarget.2017；8:84643-84658.Induction of DISE in ovariancancer cells in vivo)。
D.构建体
本文提供了FVIII ceDNA构建体，所述构建体包含如表1中所示的核酸序列，以及启动子序列、增强子序列、5'UTR序列、内含子序列、前导序列、3'UTR序列、UCOE序列、外显子序列、DNA核靶向序列(DTS)、Kozak序列和/或间隔子序列中的一种或多种。根据一些实施方案，FVIII ceDNA构建体包含如下表18中所示的序列。
表18.ceDNA FVIII构建体
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根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:1至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:1或由SEQ ID NO:1组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:2至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:3至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:3或由SEQ ID NO:3组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:4至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:5至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:6至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:6或由SEQ ID NO:6组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:7至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:8至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:9至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ IDNO:9或由SEQ ID NO:9组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:10至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:10或由SEQ ID NO:10组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ IDNO:11至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:11或由SEQ ID NO:11组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:12至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:12或由SEQ ID NO:12组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:13至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:13或由SEQ ID NO:13组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:14至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:14或由SEQID NO:14组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:15至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ IDNO:15或由SEQ ID NO:15组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:16至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:16或由SEQ ID NO:16组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQID NO:17至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:17或由SEQ ID NO:17组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:18至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:18或由SEQ ID NO:18组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:19至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:19或由SEQ ID NO:19组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:20至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:20或由SEQID NO:20组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:21至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ IDNO:21或由SEQ ID NO:21组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:22至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:22或由SEQ ID NO:22组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQID NO:23至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:23或由SEQ ID NO:23组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:24至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:24或由SEQ ID NO:24组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:25至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:25或由SEQ ID NO:25组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:26至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ ID NO:26或由SEQID NO:26组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:27至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含SEQ IDNO:7或由SEQ ID NO:7组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:28至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:28或由SEQ IDNO:28组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:28组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:29至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:29或由SEQ ID NO:29组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQID NO:29组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:30至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:30或由SEQ ID NO:30组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:30组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:31至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:31或由SEQ ID NO:31组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:31组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:32至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:32或由SEQ ID NO:32组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:32组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ IDNO:33至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:33或由SEQ ID NO:33组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:33组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:34至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:34或由SEQ ID NO:34组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:34组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:35至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:35组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:36至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:36或由SEQ ID NO:36组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:36组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:37至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:37或由SEQ IDNO:37组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:37组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:38至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:38或由SEQ ID NO:38组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQID NO:38组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:39至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:39或由SEQ ID NO:39组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:39组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:40至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:40或由SEQ ID NO:40组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:40组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:41至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:41组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ IDNO:42至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:42或由SEQ ID NO:42组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:42组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:43至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:43或由SEQ ID NO:43组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:43组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:44至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:44或由SEQ ID NO:44组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:44组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:45至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:45或由SEQ ID NO:45组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:45组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:46至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:46或由SEQ IDNO:46组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:46组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:47至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:47或由SEQ ID NO:47组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQID NO:47组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:48至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:48或由SEQ ID NO:48组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:48组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:49至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:49或由SEQ ID NO:49组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:49组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:50至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:50或由SEQ ID NO:50组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:50组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ IDNO:51至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:51或由SEQ ID NO:51组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:51组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:52至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:52或由SEQ ID NO:52组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:52组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:53至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:53或由SEQ ID NO:53组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:53组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:54至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:54或由SEQ ID NO:54组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:54组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:55至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:55或由SEQ IDNO:55组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:55组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:56至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:56或由SEQ ID NO:56组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQID NO:56组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:57至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:57或由SEQ ID NO:57组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:57组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:58至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:58或由SEQ ID NO:58组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:58组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:59至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列、包含SEQ ID NO:59或由SEQ ID NO:59组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:59组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ IDNO:60至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:60。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:60组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:61至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:61。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:61组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:62至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:62。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:62组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:63至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:63。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:63组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:64至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:64。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:64组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:65至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:65。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:65组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:66至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQID NO:66。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:66组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:67至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:67。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:67组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:68至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:68。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQID NO:68组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:69至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:69。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:69组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:70至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:70。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:70组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:442至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQID NO:442。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:442组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:443至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:443。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:443组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:444至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:444。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:444组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:445至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:445。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:445组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQID NO:446至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ IDNO:446。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:446组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:447至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:447。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:447组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:448至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:448。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ IDNO:448组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:449至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:449。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:449组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:450至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:450。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:450组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:451至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:451。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:451组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:452至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:452。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:452组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:453至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:453。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:453组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:454至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:454。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:454组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQID NO:455至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ IDNO:455。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:455组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:456至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:456。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:456组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:457至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:457。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ IDNO:457组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:458至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:458。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:458组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:459至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:459。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:459组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:460至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:460。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:460组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:461至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:461。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:461组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:462至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:462。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:462组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:463至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:463。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:463组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQID NO:464至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ IDNO:464。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:464组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:465至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:465。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:465组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:466至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:466。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ IDNO:466组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:467至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:467。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:467组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:468至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:468。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:468组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:469至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:469。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:469组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:470至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:470。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:470组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:471至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:471。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:471组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID NO:472至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:472。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:472组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQID NO:473至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ IDNO:473。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:473组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与SEQ ID 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NO:482至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ IDNO:482。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:482组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与，SEQ ID NO:483至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:483。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:483组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与，SEQ ID NO:642至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:642。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQID NO:642组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与，SEQ ID NO:643至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:643。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:643组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与，SEQ IDNO:644至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:644。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:644组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与，SEQ ID NO:645至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:645。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQ ID NO:645组成。根据一些实施方案，ceDNA构建体包含与，SEQ ID NO:646至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％相同的核酸序列或包含SEQ ID NO:646。根据一些实施方案，ceDNA构建体由SEQID NO:646组成。
VI.产生ceDNA载体的详细方法
A.一般产生
用于产生如本文所定义的包含不对称的ITR对或对称的ITR对的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的章节IV中，所述申请的全文以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以如本文所描述使用昆虫细胞产生。在另选的实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以以合成方式产生，并且在一些实施方案中，以游离方法产生，如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122所公开，所述申请的全文以引用方式并入本文中。
如本文所述，在一个实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以例如通过包括以下步骤的方法获得：a)在有效诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并持续足以诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的时间在存在Rep蛋白下孵育具有不含病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如，ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如，昆虫细胞)群体，并且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。然而，没有表达病毒颗粒(例如，AAV病毒粒子)。因此，没有大小限制，如在AAV或其它基于病毒的载体中天然强加的大小限制。
可以通过以下来确认从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从宿主细胞分离的DNA，并在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。
在又一个方面，本公开提供了将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合到其自身基因组中的宿主细胞系在产生非病毒DNA载体中的用途，例如如Lee,L.等人,(2013)Plos One 8(8):e69879所述。优选地，Rep以约3的MOI加入宿主细胞中。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系、例如HEK293细胞时，所述细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体、例如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中，使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。
在一个实施方案中，用于制造如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的宿主细胞为昆虫细胞，并使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板，例如图4A-4C和实例1中所描述。在一些实施方案中，宿主细胞经工程改造以表达Rep蛋白。
然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞采集和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。举例来说，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。在一个实施方案中，细胞在足以产生ceDNA载体的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体但在大多数细胞开始因杆状病毒毒性而死亡之前的时间采集。可以使用质粒纯化试剂盒，例如，Qiagen Endo-FreePlasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸纯化方法。
DNA载体可以通过所属领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。在一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的存在可以通过以下来证实：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离的载体DNA，并使用凝胶电泳分析被消化和未被消化的DNA物质，以证实与线性且非连续的DNA相比线性且连续的DNA的特征带的存在。图4C和图4D示出了用于鉴定通过本文的方法产生的封闭端ceDNA载体的存在的一个实施例。
B.ceDNA质粒
ceDNA质粒为用于后续产生用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的质粒。在一些实施方案中，ceDNA质粒可以使用已知的技术来构建，以在转录方向上提供至少以下项作为可操作地连接的组分：(1)经修饰的5'ITR序列；(2)含有顺式调节元件(例如，启动子、诱导型启动子、调节开关、增强子等)的表达盒；以及(3)经修饰的3'ITR序列，其中3'ITR序列相对于5'ITR序列对称。在一些实施方案中，侧接ITR的表达盒包含用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。
在一个方面中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是从质粒获得，所述质粒在本文中称为“ceDNA质粒”，其按照此次序编码：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、包含转基因的表达盒和经突变或修饰AAV ITR，其中所述ceDNA质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列。在另选的实施方案中，ceDNA-质粒按顺序编码：第一(或5')经修饰的或突变的AAVITR、包括转基因的表达盒、以及第二(或3')经修饰的AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR彼此对称。在替代实施方案中，ceDNA质粒依次编码：第一(或5’)修饰或突变AAV ITR、包含转基因的表达盒、以及第二(或3’)突变或修饰AAV ITR，其中所述ceDNA质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5’和3’修饰ITR具有相同的修饰(即彼此反向互补或对称)。
在另一个实施方案中，ceDNA质粒系统不含病毒衣壳蛋白编码序列(即，其不含AAV衣壳基因，也没有其它病毒的衣壳基因)。另外，在特定实施例中，ceDNA-质粒还不含AAVRep蛋白编码序列。因此，在一个优选实施例中，ceDNA质粒缺乏AAV2的功能性AAV cap和AAVrep基因GG-3'加上允许发夹形成的可变回文序列。
本公开的ceDNA质粒可以使用所属领域中熟知的任何AAV血清型的基因组的天然核苷酸序列来产生。在一个实施方案中，ceDNA-质粒主链衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如，NCBI：NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC006261；Kotin and Smith,The Springer Index of Viruses，可在Springer维护的URL上获得(www网址：oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp？virID＝42.04.)(注意：对URL或数据库的引用是指截至本申请生效提交日为止的URL或数据库的内容)。在一个具体实施方案中，ceDNA-质粒主链衍生自AAV2基因组。在另一个特定实施例中，ceDNA-质粒主链是合成的主链，其经过基因工程以在它的5'和3'ITR处包含衍生自这些AAV基因组之一。
ceDNA-质粒可以任选地包括选择性或选择标志物，用于建立产生ceDNA载体的细胞系。在一个实施方案中，选择标志物能够插入3'ITR序列的下游(即，3')。在另一个实施方案中，选择标志物能够插入5'ITR序列的上游(即，5')。适当的选择标志物包含例如赋予耐药性的那些标志物。选择标志物可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。在优选的实施方案中，药物选择标志物是杀稻瘟菌素S抗性基因。
用于表达FVIII蛋白的示例性ceDNA(例如rAAV0)载体由rAAV质粒产生。一种用于产生rAAV载体的方法可以包括：(a)为宿主细胞提供如上文所描述的rAAV质粒，其中宿主细胞和质粒均不含衣壳蛋白编码基因，(b)在允许产生ceDNA基因组的条件下培养宿主细胞；以及(c)收获细胞并分离从所述细胞产生的AAV基因组。
C.从ceDNA质粒制备ceDNA载体的示例性方法
本文还提供了用于制造用于表达FVIII蛋白的无衣壳ceDNA载体的方法，特别是具有足够高的产量以提供足够的载体用于体内实验的方法。
在一些实施方案中，用于产生用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的方法包含以下步骤：(1)将包含表达盒和两个对称的ITR序列的核酸构建体引入宿主细胞(例如Sf9细胞)中；(2)任选地，例如通过使用质粒上存在的选择标记物建立克隆细胞系；(3)将Rep编码基因引入(通过用携带所述基因的杆状病毒转染或感染)所述昆虫细胞中；以及(4)收取细胞并纯化ceDNA载体。上述用于产生ceDNA载体的包括表达盒和两个ITR序列的核酸构建体可以呈ceDNA-质粒的形式，或如下所述用ceDNA-质粒产生的杆粒或杆状病毒的形式。可以通过转染、病毒转导、稳定整合或所属领域中已知的其它方法将核酸构建体引入宿主细胞中。
D.细胞系
用于产生用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的宿主细胞系可以包括衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的昆虫细胞系，例如Sf9 Sf21，或粉纹夜蛾(Trichoplusiani)细胞，或其它无脊椎动物、脊椎动物或其它真核细胞系，包括哺乳动物细胞。也可以使用普通技术人员已知的其它细胞系，如HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1 180、单核细胞、以及成熟和不成熟的树突状细胞。可以转染宿主细胞系以稳定表达ceDNA质粒，从而高产率地产生ceDNA载体。
可以使用所属领域已知的试剂(例如脂质体、磷酸钙)或物理手段(例如电穿孔)，通过瞬时转染将ceDNA质粒引入Sf9细胞中。可替代地，可以建立将ceDNA质粒稳定整合至基因组中的稳定Sf9细胞系。此类稳定细胞系可以通过如上文所描述将选择标志物并入ceDNA-质粒中来建立。如果用于转染细胞系的ceDNA-质粒包含选择标志物，如抗生素，那么可以通过向细胞生长培养基中加入抗生素来选择已用ceDNA-质粒转染并将ceDNA-质粒DNA整合到基因组中的细胞。然后可以通过单细胞稀释或集落转移技术来分离细胞的抗性克隆并增殖。
E.分离并纯化ceDNA载体：
用于获得和分离ceDNA载体的方法的示例描述于图4A-4E和下文的具体实施例中。本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以从表达AAV Rep蛋白的生产细胞获得，进一步用ceDNA质粒、ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒转化。可用于生产ceDNA载体的质粒包括编码FVIII蛋白的质粒或编码一种或多种REP蛋白的质粒。
在一个方面中，多核苷酸编码在质粒(Rep-质粒)、杆粒(Rep-杆粒)或杆状病毒(Rep-杆状病毒)中递送到生产细胞的AAV Rep蛋白(Rep 78或68)。Rep-质粒、Rep-杆粒和Rep-杆状病毒可以通过上文所描述的方法产生。
用于产生用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的方法描述于本文中。用于产生如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的表达构建体可以为质粒(例如ceDNA质粒)、杆粒(例如ceDNA杆粒)和/或杆状病毒(例如ceDNA杆状病毒)。仅举例来说，ceDNA-载体可以由用ceDNA-杆状病毒和Rep-杆状病毒共同感染的细胞产生。由Rep-杆状病毒产生的Rep蛋白可以复制ceDNA-杆状病毒以产生ceDNA-载体。或者，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以由经构建体稳定转染的细胞产生，所述构建体包含编码AAV Rep蛋白(Rep78/52)的序列，所述AAV Rep蛋白是在Rep质粒、Rep杆粒或Rep杆状病毒中递送。CeDNA-杆状病毒可以瞬时转染到细胞中，通过Rep蛋白复制并产生ceDNA载体。
杆粒(例如ceDNA-杆粒)能够转染到允许的昆虫细胞中，例如Sf9、Sf21、Tni(粉纹夜蛾)细胞、High Five细胞，并且产生ceDNA-杆状病毒，所述杆状病毒是重组杆状病毒，其包括包含对称ITR的序列和表达盒。ceDNA-杆状病毒能够再次感染到昆虫细胞中以获得下一代重组杆状病毒。任选地，所述步骤可以重复一次或多次以产生更大量的重组杆状病毒。
从细胞收取和收集如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化以实现ceDNA载体的高产量生产。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择收获时间。通常，可以在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体(例如，ceDNA载体)的时间后但在大多数细胞开始因病毒毒性死亡之前收获细胞。使用质粒纯化试剂盒，例如Qiagen ENDO-FREE试剂盒，能够从Sf9细胞中分离出ceDNA载体。为了分离质粒而开发的其它方法也可以适合于ceDNA载体。一般而言，可以采用所属领域中已知的任何核酸纯化方法，以及可商购的DNA提取试剂盒。
可替代地，可以通过对细胞团块进行碱溶解法、离心所得溶解液并进行色谱分离来实施纯化。作为一个非限制性示例，该方法可以如下进行：将上清液装载到保留核酸的离子交换柱(例如，SARTOBIND)上，然后洗脱(例如，用1.2M NaCl溶液)，并在凝胶过滤柱(例如，6个快速流动GE)上进行进一步色谱纯化。然后通过例如沉淀来回收无衣壳的AAV载体。
在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体还可以以外泌体或微米粒子形式纯化。本领域已知许多细胞类型不仅释放出可溶性蛋白质，而且通过膜微囊泡脱落释放出复杂的蛋白质/核酸货物(Cocucci等人,2009；EP 10306226.1)。此类囊泡包括微囊泡(也称为微粒)和外泌体(也称为纳米囊泡)，两者均包含蛋白质和RNA作为货物。微囊泡由质膜的直接出芽产生，而外泌体在多囊泡内体与质膜融合后释放到细胞外的环境中。因此，可以从已经用ceDNA-质粒转导的细胞或用ceDNA-质粒产生的杆粒或杆状病毒中分离出含有ceDNA载体的微囊泡和/或外泌体。
微囊泡可以通过对培养基进行过滤或以20,000xg超速离心来分离，并且外泌体可以通过以100,000xg超速离心来分离。超速离心的最佳持续时间可以通过实验确定，并且将取决于从中分离囊泡的特定细胞类型。优选地，首先利用低速离心(例如在2000×g下进行5-20分钟)清除培养基并且使用例如离心柱(密理博(Millipore)，英国赫特福德郡(Watford,UK))进行离心浓缩。微米囊泡和外泌体可以通过使用识别存在于微米囊泡和外泌体上的特定表面抗原的特异性抗体，通过FACS或MACS进一步纯化。其它微米囊泡和外泌体纯化方法包括但不限于免疫沉淀、亲和色谱、过滤和涂有特异性抗体或适体的磁珠。纯化后，用例如磷酸盐缓冲盐水洗涤囊泡。使用微囊泡或外泌体递送含ceDNA的囊泡的一个优点是，这些囊泡可以通过在其膜蛋白上包括被相应细胞类型上的特异性受体识别的蛋白质而靶向各种细胞类型。(也参见EP 10306226)本文的本公开的另一个方面涉及从已经将ceDNA构建体稳定整合到其自身基因组中的宿主细胞系中纯化ceDNA载体的方法。在一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
国际申请PCT/US18/49996的图5显示了凝胶证实ceDNA的产生，所述ceDNA使用实例中所述的方法由多种ceDNA-质粒构建体产生。如实例中关于图4D所论述，ceDNA通过凝胶中的特征色带图案来证实。
VII.药物组合物
在另一方面，提供了药物组合物。药物组合物包含如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以并入适于施用于受试者的药物组合物中以体内递送到受试者的细胞、组织或器官。通常，药物组合物包括如本文公开的ceDNA-载体和药学上可接受的载剂。举例来说，如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以并入适于期望的治疗性施用途径(例如肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及例如核内显微注射或胞浆内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的缓冲液中、然后进行过滤灭菌来制备。可以配制包括ceDNA载体，以将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，使得转基因或供体序列在其中治疗性表达。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。
包含用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的药学活性组合物可以被配制成将用于不同目的的转基因递送到细胞，例如受试者的细胞。
用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的组分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以并入适于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴管内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、眼房内和玻璃体内)、耳蜗内和经粘膜(例如经口、经直肠、经鼻)施用的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。
在一些方面中，本文所提供的方法包含将一种或多种如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体递送到宿主细胞。本文还提供了通过这类方法产生的细胞，以及包含这类细胞或由这类细胞产生的生物体(例如动物、植物或真菌)。核酸的递送方法可包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA和试剂增强的DNA吸收。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355(这些文献中的每一篇的内容全文以引用的方式并入本文)，并且脂转染试剂是商业销售的(例如，TRANSFECTAMTM和LIPFECTINTM)。递送可以到细胞(例如，体外或离体施用)或靶组织(例如，体内施用)。
将核酸递送到细胞的各种技术和方法是所属领域中已知的。举例来说，核酸例如用于表达FVIII蛋白的ceDNA可以被配制到脂质纳米粒子(LNP)、类脂质(lipidoid)、脂质体、脂质纳米粒子、脂质体复合物(lipoplex)或核壳纳米粒子中。通常，LNP由核酸(例如ceDNA)分子、一种或多种可电离或阳离子脂质(或其盐)、一种或多种非离子或中性脂质(例如磷脂)、防止聚集的分子(例如PEG或PEG-脂质缀合物)以及任选的固醇(例如胆固醇)构成。
另一种用于将核酸例如用于表达FVIII蛋白的ceDNA递送到细胞的方法为使核酸与被细胞内化的配体缀合。例如，配体可以结合细胞表面上的受体并通过胞吞而被内化。配体可以与核酸中的核苷酸共价连接。用于将核酸递送到细胞中的示例性缀合物描述于例如WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515和WO2017/177326，这些文献中的每一篇的内容全文以引用的方式并入本文。
核酸例如用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体还可以通过转染递送到细胞。有用的转染方法包含(但不限于)：脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。转染试剂在所属领域中是熟知的并且包含(但不限于)：TurboFect转染试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技)、TRANSPASSTM P蛋白转染试剂(新英格兰生物实验室)、CHARIOTTM蛋白递送试剂(Active Motif)、PROTEOJUICETM蛋白转染试剂(EMD密理博)、293fectin、LIPOFECTAMINETM 2000、LIPOFECTAMINETM 3000(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTINTM(赛默飞世尔科技)、DMRIE-C、CELLFECTINTM(赛默飞世尔科技)、OLIGOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTACETM、FUGENETM(瑞士巴塞尔的罗氏(Roche,Basel,Switzerland))、FUGENETM HD(罗氏)、TRANSFECTAMTM(转染胺，威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.))、TFX-10TM(普洛麦格公司)、TFX-20TM(普洛麦格公司)、TFX-50TM(普洛麦格公司)、TRANSFECTINTM(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BioRad,Hercules,Calif.))、SILENTFECTTM(伯乐公司)、EffecteneTM(加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,Calif.))、DC-chol(阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))、GENEPORTERTM(加利福尼亚圣地亚哥的基因疗法系统(Gene Therapy Systems,San Diego,Calif.))、DHARMAFECT 1TM(科罗拉多州拉斐特的达尔马肯(Dharmacon,Lafayette,Colo.))、DHARMAFECT 2TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 3TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 4TM(达尔马肯)、ESCORTTMIII(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,Mo.))和ESCORTTM IV(西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.))。核酸，如ceDNA，也可以通过所属领域的技术人员已知的微流体方法递送到细胞。
如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体还可以直接施用于生物体以在体内转导细胞。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包含(但不限于)：注射、输注、局部施用和电穿孔。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。
用于引入如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的核酸载体ceDNA载体的方法可以例如通过如例如美国专利号5,928,638(其内容全文以引用的方式并入本文)中所述的方法来递送到造血干细胞中。
本公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了示例性脂质体和脂质体配制物，包括(但不限于)含有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物，参见例如标题为“药物配制物”的章节。
所属领域已知的各种递送方法或其改良方法可用于在体外或体内递送ceDNA载体。举例来说，在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是通过机械能、电能、超声波能、流体动力能或基于激光的能量使得短暂渗透细胞膜以使得便于DNA进入靶向细胞中来递送。例如，可以通过经过大小限制的通道挤压细胞或通过所属领域中已知的其它手段来瞬时破坏细胞膜来递送ceDNA载体。在一些情况下，单独的ceDNA载体作为裸DNA直接注射到以下任一组织中：任何一种或多种组织选自：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃、皮肤、胸腺，心肌或骨骼肌。在一些情况下，通过基因枪递送ceDNA载体。涂覆有无衣壳的AAV载体的金或钨球形粒子(直径1-3μm)可以通过加压气体加速到高速而渗透到目标组织细胞中。
本文特别涵盖包含用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施方案中，ceDNA载体与脂质递送系统，例如本文所述的脂质体一起配制。在一些实施方案中，这类组合物通过熟练从业人员期望的任何途径来施用。可以通过不同途径，包括经口、肠胃外、舌下、经皮直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内鞘内和关节内或其组合，向受试者施用组合物。对于兽医用途，可根据正常兽医实践将组合物作为适当可接受的配制物施用。兽医可以很容易地确定最适合具体动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法(例如电穿孔(“EP”)、流体动力学方法或超声波)施用组合物。
在一些情况下，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是通过流体动力学注射来递送，所述流体动力学注射为将任何水溶性化合物和粒子直接细胞内递送到内脏和整个肢体的骨骼肌中的简单且高效的方法。
在一些情况下，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是通过超声波，通过在膜中制造纳米级孔以便于将DNA粒子细胞内递送到内脏或肿瘤的细胞中来递送，因此质粒DNA的大小和浓度在系统的效率中起重要作用。在一些情况下，通过使用磁场的磁转染来递送ceDNA载体，以将含有核酸的粒子集中到目标细胞中。
在一些情况下，可以使用化学递送系统，例如通过使用纳米复合物，其包含用属于阳离子脂质体/胶束或阳离子聚合物的聚阳离子纳米粒子来压紧带负电核酸。用于递送方法的阳离子脂质包含但不限于单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍化合物、胆固醇衍生化合物、阳离子聚合物、(例如聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、其它阳离子聚合物)和脂质-聚合物杂化物。
A.外泌体
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是通过包装于外泌体中来递送。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡，其在多囊泡体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。其表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，其含有来自产生外泌体的细胞的胞溶质并且在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。外泌体由包含上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)以及树突状细胞(DC)在内的各种细胞类型产生。一些实施例设想使用直径在10nm与1μm之间、20nm与500nm之间、30nm与250nm之间、50nm与100nm之间的外泌体。使用外泌体的供体细胞或通过将特定核酸引入外泌体中，可以分离外泌体以递送到目标细胞中。所属领域中已知的各种方法可以用于产生含有本公开的无衣壳AAV载体的外泌体。
B.微粒/纳米粒子
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体通过脂质纳米粒子递送。通常，脂质纳米粒子包括可电离氨基脂质(例如，4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPC)、胆固醇和外被脂质(聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油，PEG-DMG)，例如如Tam等人,(2013).Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery.Pharmaceuticals5(3):498-507所公开的。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约10nm与约1000nm之间的平均直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有小于300nm的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约10nm与约300nm之间的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有小于200nm的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约25nm与约200nm之间的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂(例如，包含多个脂质纳米粒子的组合物)具有一定的尺寸分布，其中平均尺寸(例如，直径)为约70nm至约200nm，并且更通常，平均尺寸为约100nm或更小。
所属领域中已知的多种脂质纳米粒子可以用于递送如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体。例如，在美国专利第9,404,127号、第9,006,417号和第9,518,272号中描述了使用脂质纳米粒子的各种递送方法。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是通过金纳米粒子来递送。通常，核酸可以与金纳米粒子共价结合或与金纳米粒子非共价结合(例如通过电荷-电荷相互作用结合)，例如如Ding等人(2014).Gold Nanoparticles for NucleicAcid Delivery.Mol.Ther.22(6)；1075-1083所述。在一些实施方案中，使用例如美国专利第6,812,334号中描述的方法产生金纳米粒子-核酸缀合物。
C.偶联物
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体与增强细胞吸收的试剂缀合(例如共价结合)。“增加细胞吸收的药剂”是促进核酸跨脂质膜运输的分子。例如，核酸能够与亲脂性化合物(例如胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如穿膜肽、TAT、Syn1B等)和多胺(例如精胺)缀合。增强细胞吸收的试剂的其他示例公开于例如Winkler(2013).Oligonucleotide conjugates for therapeuticapplications.Ther.Deliv.4(7)；791-809。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体与聚合物(例如聚合分子)或叶酸(folate)分子(例如叶酸(folic acid)分子)缀合。通常，与聚合物缀合的核酸的递送是所属领域中已知的，例如WO2000/34343和WO2008/022309中所描述。在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体与聚(酰胺)聚合物缀合，例如美国专利第8,987,377号所描述。在一些实施方案中，如美国专利第8,507,455号中所描述，将本公开所描述的核酸与叶酸分子缀合。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体与碳水化合物缀合，例如美国专利第8,450,467号中所描述。
D.纳米胶囊
或者，可以使用如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的纳米胶囊配制物。纳米胶囊通常可以呈稳定并且可再现的方式截留物质。为了避免由于细胞内聚合物过载所致的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细粒子(尺寸约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米粒子是预期使用的。
E.脂质体
本公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。已经研发了血清稳定性和循环半衰期有所改善的脂质体(美国专利第5,741,516号)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载剂的各种方法(美国专利号5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587)。
F.示例性脂质体和脂质纳米粒子(LNP)组合物
本公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到细胞，例如需要表达转基因的细胞。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
包含ceDNA载体的脂质纳米粒子(LNP)公开于全文并入本文中的2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中，并且设想用于针对如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的方法和组合物中。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，所述聚乙二醇官能团可以降低一种或多种所述化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低剂量频率。或者，脂质体配制物仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此类方面，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da至约5,000Da。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其将在数小时至数周的时间内以延长释放或受控释放曲线来递送API。在一些相关的方面，脂质体配制物可以包括以脂质双层结合的水性腔。在其它相关方面，脂质体配制物将API与组分一起包封起来，所述组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时到数周的时段内释放API。
在一些方面，脂质体配制物包括鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。在一些方面，脂质体配制物包括光敏体。
在一些方面，本公开提供了脂质体配制物，其包括选自以下项的一种或多种脂质：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)；DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)；EPC(卵磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)；POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DSPG(二硬脂酰基磷脂酰甘油)；DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；硫酸胆甾醇酯(CS)；二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)；DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或它们的任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。在一些方面，脂质体配制物的总脂质含量为2-16mg/mL。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，摩尔比分别为3:0.015:2。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面，PEG化脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质缀合物和胆固醇。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括以下中的一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇，例如胆固醇。在一些方面，脂质体配制物包括DOPC/DEPC；和DOPE。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其进一步包括一种或多种药物赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。
在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。在一些方面中，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或泡沫基粒子的脂质体配制物。在一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对尺寸更大并且尺寸为约150至250nm的脂质体配制物。在一些方面，脂质体配制物是冻干粉末。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱，用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载所述ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大致7.3，并驱动API进入脂质体中。在一些方面，本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体配制物。在此类情况下，脂质体的内部可以处于pH 4-6.9下，并且更优选pH 6.5。在其它方面，本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体配制物。在这样的情况下，利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内俘获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。
在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。举例来说，通过如2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开的方法获得的ceDNA制备并负载ceDNA的脂质纳米粒子配制物，所述申请并入本文中。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合，使可电离脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和粒子成核提供有利的能量来实现。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定粒子。能够将颗粒浓缩至所需水平。
通常，以约10:1至30:1的总脂质与ceDNA(质量或重量)比率制备脂质粒子。在一些实施方案中，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。能够调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/mL至约30mg/mL的范围内。
可电离的脂质通常用于在低pH值下浓缩核酸货物(例如ceDNA)并驱动膜缔合和融合。通常，可电离的脂质是包含至少一个氨基的脂质，所述氨基在酸性条件下(例如在pH6.5或更低的条件下)带正电或质子化。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。
示例性可电离脂质描述于国际PCT专利公开WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354；以及美国专利公开US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920，所有这些文献的内容全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012),51(34):8529-8533，其内容全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/074085中所述的脂质ATX-002，其内容全文以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2012/040184(其内容全文以引用的方式并入本文)中所述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/199952(其内容全文以引用的方式并入本文)中所述的化合物6或化合物22。
没有限制，可电离的脂质可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的20-90％(mol)。例如，可电离的脂质摩尔含量可以为脂质纳米粒子中存在的总脂质的20-70％(mol)、30-60％(mol)或40-50％(mol)。在一些实施方案中，可电离的脂质占脂质纳米粒子中存在的总脂质的约50mol％至约90mol％。
在一些方面中，脂质纳米粒子可以进一步包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。
设想用于如本文所公开的方法和组合物中的示例性非阳离子脂质描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242中，所述国际申请全文并入本文中。示例性非阳离子脂质描述于国际申请公开WO2017/099823和美国专利公开US2018/0028664中，两者的内容全文以引用的方式并入本文中。
非阳离子脂质能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0-30％(mol)。例如，非阳离子脂质含量为脂质纳米粒子中存在的总脂质的5-20％(mol)或10-15％(mol)。在各种实施例中，可电离的脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子不包含任何磷脂。在一些方面中，脂质纳米粒子能够进一步包含例如固醇等组分，以提供膜完整性。
能够用于脂质纳米粒子的一种示例性固醇是胆固醇和其衍生物。示例性胆固醇衍生物描述于国际申请WO2009/127060和美国专利公开US2010/0130588中，这两篇文献的内容全文以引用的方式并入本文。
提供膜完整性的组分(例如固醇)能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0-50％(mol)。在一些实施方案中，此类组分占脂质纳米粒子的总脂质含量的20％-50％(mol)、30％-40％(mol)。
在一些方面，脂质纳米粒子可以还包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米粒子的聚集和/或提供空间稳定。示例性的缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物以及其混合物。在一些实施方案中，缀合的脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质。示例性PEG-脂质缀合物包括(但不限于)：PEG-二酰基甘油(DAG)(如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，所有这些文献的内容全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，PEG-脂质是如US2018/0028664中定义的化合物，该文献的内容全文以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，US20150376115或US2016/0376224中公开了PEG-脂质，所述文献的内容全文以引用的方式并入本文中。
PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰氨基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些示例中，PEG-脂质可以选自由以下项组成的组：PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
还能够使用与除PEG之外的分子缀合的脂质替代PEG-脂质。举例来说，代替PEG-脂质或除PEG-脂质以外，还可以使用聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物。示例性缀合脂质(即，PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质)描述于WO1996/010392、WO1998/051278、WO2002/087541、WO2005/026372、WO2008/147438、WO2009/086558、WO2012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、WO2017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282；美国专利申请公开US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453；以及US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559，所有这些文献的内容全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，可以根据治疗目的和所需的生物学作用选择治疗剂。举例来说，如果LNP内的ceDNA可用于治疗血友病A，则另外的化合物可以是抗血友病A剂(例如化学治疗剂、其他血友病A疗法(包括(但不限于)小分子或抗体)。举例来说，如果LNP内的ceDNA可用于治疗血友病A，则另外的化合物可以是抗微生物剂(例如抗生素或抗病毒化合物)。在又一个实施方案中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病症，那么另外的化合物可以是调节免疫反应的化合物(例如免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调节一种或多种特异性免疫途径的化合物)。在一些实施方案中，含有不同化合物例如编码不同蛋白质的ceDNA或不同化合物例如治疗剂的不同脂质纳米粒子的不同混合液可以用于本公开的组合物和方法中。
在一些实施方案中，额外的化合物是免疫调节剂。例如，另外的化合物是免疫抑配制物。在一些实施方案中，额外的化合物是免疫刺激剂。本文还提供了包含所产生的经脂质纳米粒子封装的昆虫细胞或如本文所描述的以合成方式产生的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体以及药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
在一些方面，本公开提供了一种脂质纳米粒子配制物，其还包含一种或多种药物赋形剂。在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物还包含蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
ceDNA载体能够与粒子的脂质部分复合或囊封于脂质纳米粒子的脂质位置。在一些实施方案中，可以将ceDNA完全囊封在脂质纳米粒子的脂质位置中，从而保护其免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。在一些实施方案中，脂质纳米粒子中的ceDNA在37℃下脂质纳米粒子暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上不降解。在一些实施方案中，脂质纳米粒子中的ceDNA在颗粒在血清中在37℃下培育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后基本上不降解。
在某些实施方案中，脂质纳米粒子对受试者，例如对哺乳动物，例如人基本上是无毒的。在一些方面，脂质纳米粒子配制物是冻干粉末。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子是具有至少一个脂质双层的固体芯粒子。在其它实施方案中，脂质纳米粒子具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制，非双层形态能够包括例如三维管、棒、对称立方体等。举例来说，使用例如Cryo-TEM分析，能够轻松地评估且表征脂质纳米粒子的形态(片层对非片层)，如US2010/0130588中所述，所述文献的内容全文以引用的方式并入本文中。
在一些其它实施例中，具有非层状形态的脂质纳米粒子是电子致密的。在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质纳米粒子。在一些方面，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或基于泡沫的粒子的脂质纳米粒子配制物。
通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质缀合物从脂质粒子中交换出来的速率，进而可以控制脂质纳米粒子融合的速率。另外，包括例如pH、温度或离子强度的其它变量可以用于改变和/或控制脂质纳米粒子融合的速率。基于本公开，所属领域的普通技术人员将清楚可以用于控制脂质纳米粒子融合的速率的其它方法。同样显而易见，通过控制所述脂质缀合物的组合物和浓度，可以控制脂质颗粒的尺寸。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的效力相关(参见Jayaraman等人,Angewandte Chemie,International Edition(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,Nature Biotechnology 28,172-176(20l 0)，两篇文献都以全文引用的方式并入)。pKa的优选范围是约5到约7。使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的测定法测定脂质纳米粒子中阳离子脂质的pKa。
VIII.使用方法
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体还可以用于将感兴趣的核酸序列(例如编码FVIII蛋白)递送到靶细胞(例如宿主细胞)的方法中。在一些实施方案中，该方法包括用于将FVIII蛋白递送到有需要的受试者的细胞并治疗血友病A的方法。本公开允许在受试者的细胞中体内表达在ceDNA载体中编码的FVIII蛋白，使得发生FVIII蛋白表达的治疗作用。在ceDNA载体的体内和体外递送模式中均可以看到这些结果。
另外，本公开提供了在有需要的受试者的细胞中递送FVIII蛋白的方法，其包含多次施用编码所述FVIII蛋白的本公开的ceDNA载体。由于本公开的ceDNA载体不像对包封病毒载体通常所观察到那样诱导免疫反应，所以所述多次施用策略将可能在基于ceDNA的系统中取得更大的成功。ceDNA载体是以足以转染期望组织细胞和提供足够的基因转移和FVIII蛋白表达水平而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于视网膜施用(例如视网膜下注射，脉络膜上注射或玻璃体内注射)、静脉内施用(例如在脂质体配制物中)、直接递送至所选器官(例如选自肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃中的任何一种或多种组织)、肌肉内施用和其他肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
如本文所描述的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的递送不限于所表达的FVIII蛋白的递送。例如，常规产生(例如使用基于细胞的产生方法(例如昆虫细胞产生方法))或合成产生的如本文所述的ceDNA载体可与为了提供基因疗法的一部分而提供的其他递送系统一起使用。可与根据本公开的ceDNA载体组合的系统的一个非限制性示例包括单独递送一种或多种辅因子或免疫抑制剂以使表达FVIII蛋白的ceDNA载体进行有效基因表达的系统。
本公开还提供了一种治疗受试者的血友病A的方法，该方法包括向受试者的有需要的靶细胞(特别是肌肉细胞或组织)中引入治疗有效量的ceDNA载体和任选的药学上可接受的载剂。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所选择的ceDNA载体包含可用于治疗血友病A的编码FVIII蛋白的核酸序列。具体地，ceDNA载体可包含可操作地连接到控制元件的期望FVIII蛋白序列，所述控制元件能够在将外源DNA序列引入受试者中时指导由其编码的期望FVIII蛋白的转录。ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方提供的任何适合的途径施用。
本文所提供的组合物和载体可以用于递送FVIII蛋白以用于各种目的。在一些实施方案中，转基因编码旨在用于研究目的，例如创建具有转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究FVIII蛋白产物的功能的FVIII蛋白。在另一个实施方案中，转基因编码旨在用于建立血友病A动物模型的FVIII蛋白。在一些实施方案中，编码的FVIII蛋白可用于治疗或预防哺乳动物受试者的血友病A状态。可以将FVIII蛋白以足量转移到患者(例如在其中表达)，以治疗与基因表达降低、缺乏表达或功能障碍有关的血友病A。
原则上，表达盒可以包括编码FVIII蛋白的核酸或任何转基因，该蛋白因突变而减少或不存在或者在本公开的范围内被认为是过表达时会赋予治疗益处。优选地，本文提供的ceDNA组合物中不存在未插入的细菌DNA，并且优选地不存在细菌DNA。
ceDNA载体不限于ceDNA载体的一种。因而，在另一个方面中，表达不同蛋白或相同FVIII蛋白、但可操作地连接到不同启动子或顺式调节元件的多种ceDNA载体可以同时或依序递送到靶细胞、组织、器官或受试者。因此，这种策略能够允许多个蛋白质同时进行基因疗法或基因递送。将FVIII蛋白的不同部分分离成可以同时或在不同时间施用并且可以单独调节的单独ceDNA载体(例如，FVIII蛋白的功能所需的不同结构域和/或辅因子)，由此添加额外水平的对FVIII蛋白表达的控制也是可能的。考虑到由于缺乏病毒衣壳而缺乏抗衣壳宿主免疫反应，递送也可以进行多次，并且对于临床环境中的基因疗法来说，重要的是随后增加或减少剂量。可以预期，由于没有衣壳，因此不会发生抗衣壳反应。
本公开还提供了一种治疗受试者的血友病A的方法，该方法包括向受试者的有需要的靶细胞(尤其肌肉细胞或组织)中引入治疗有效量的如本文所公开的ceDNA载体和任选的药学上可接受的载剂。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所实施的ceDNA载体包含可用于治疗血友病A的感兴趣的核酸序列。具体地，ceDNA载体可包含可操作地连接到控制元件的期望外源性DNA序列，所述控制元件能够在引入受试者中时引导由外源性DNA序列编码的期望多肽、蛋白质或寡核苷酸的转录。ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方提供的任何适合的途径施用。
IX.递送用于FVIII蛋白产生的ceDNA载体的方法
在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以通过各种适合的方法体外或体内递送到靶细胞。可以施用或注射单独的ceDNA载体。根据实施方案，可以在不借助于转染试剂或其他物理方式的情况下将ceDNA载体递送到细胞。另选地，根据其他实施方案，可以使用任何所属领域已知的转染试剂或其她所属领域已知的便于DNA进入细胞中的物理方式(例如，脂质体、醇类、富含聚赖氨酸的化合物、富含精氨酸的化合物、磷酸钙、微囊泡、显微注射、电穿孔等)来递送用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以有效地靶向通常难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
本文所描述的技术的一个方面涉及将FVIII蛋白递送到细胞的方法。通常，对于体内和体外方法，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以使用如本文所公开的方法以及所属领域中已知的其它方法引入细胞中。如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体优选以生物学有效量施用于细胞。如果将ceDNA载体在体内施用于细胞(例如施用于受试者)，那么ceDNA载体的生物学有效量是足以使FVIII蛋白在靶细胞中转导和表达的量。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的示例性施用模式包括经口、经直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、经颊(例如，舌下)、经阴道、鞘内、眼内、透皮、内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内[包括施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌]、胸膜内、脑内和关节内)。施用可以全身或直接递送到肝脏或其他地方(例如，任何肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃)。
施用可以是局部(例如，皮肤和粘膜表面，包括气道表面和透皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如但不限于肝脏，但也可用于眼睛、肌肉，包括骨骼肌、心肌、膈肌或大脑)。
可以向受试者的任何部位施用ceDNA载体，包括(但不限于)选自由以下组成的组的部位：肝脏和/或眼睛、脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肾脏、脾脏、胰腺。
在任何给定情况下最适合的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病状的性质和严重程度，以及所使用的特定ceDNA载体的性质。另外，ceDNA准许人们施用在单个载体或多个ceDNA载体(例如ceDNA混合液)中的超过一种FVIII蛋白。
A.ceDNA载体的肌内施用
在一些实施方案中，治疗受试者的疾病的方法包含将治疗有效量的编码FVIII蛋白的ceDNA载体和任选的药学上可接受的载剂引入受试者的有需要的靶细胞(尤其肌肉细胞或组织)中。在一些实施方案中，将用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体施用于受试者的肌肉组织。
在一些实施方案中，ceDNA载体能够施用于受试者的任何部位，包括但不限于选自由骨骼肌、平滑肌、心脏、隔膜或眼肌组成的组的部位。
向本公开的骨骼肌施用如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包括但不限于向肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌施用。如本文所公开的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda等人,(2005)Blood 105:3458-3464)和/或直接肌内注射来递送到骨骼肌。在特定实施例中，如本文所公开的ceDNA载体通过肢体灌注、任选地隔离肢体灌注(例如静脉内或关节内施用)来施用于受试者(例如患有如DMD的肌营养不良症的受试者)的肢体(臂和/或腿)。在实施例中，如本文所公开的ceDNA载体可以在不使用“流体动力学”技术的情况下施用。
举例来说，常规病毒载体的组织递送(例如递送到肌肉)通常利用流体动力学技术增强(例如大体积的静脉内/静脉内施用)，其增强血管压力并且促进病毒载体穿越内皮细胞屏障的能力。在特定实施例中，本文所述的ceDNA载体能够在流体动力学技术缺乏的情况下施用，例如大体积输注和/或升高的血管内压力(例如大于正常收缩压，例如小于或等于血管内压力相对于正常收缩压的5％、10％、15％、20％、25％增幅)。这样的方法可以减少或避免与流体动力学技术相关的副作用，例如水肿、神经损伤和/或隔室综合征。
此外，包含施用于骨骼肌的如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的组合物可以施用于肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌片)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌。适合的骨骼肌包括但不限于外展小指肌(abductor digitiminimi)(在手中)、外展小趾肌(abductor digiti minimi)(在脚中)、拇展肌(abductorhallucis)、第五趾(指)展肌(abductor ossis metatarsi quinti)、拇短展肌(abductorpollicis brevis)、拇长展肌(abductor pollicis longus)、内收短肌(adductorbrevis)、拇收肌(adductor hallucis)、内收长肌(adductor longus)、內收大肌(adductormagnus)、拇收肌(adductor pollicis)、肘肌(anconeus)、前斜角肌(anterior scalene)、膝关节肌(articularis genus)、肱二头肌(biceps brachii)、股二头肌(bicepsfemoris)、肱肌(brachialis)、肱挠肌(brachioradialis)、颊肌(buccinator)、喙肱肌(coracobrachialis)、皱眉肌(corrugator supercilii)、三角肌(deltoid)、降口角肌(depressor anguli oris)、降下唇肌(depressor labii inferioris)、二腹肌(digastric)、骨间背侧肌(dorsal interossei)(在手中)、骨间背侧肌(在脚中)、桡侧腕短伸肌(extensor carpi radialis brevis)、桡侧腕长伸肌(extensor carpi radialislongus)、尺侧伸腕肌(extensor carpi ulnaris)、伸小指肌(extensor digiti minimi)、伸趾肌(extensor digitorum)、伸趾短肌(extensor digitorum brevis)、伸趾长肌(extensor digitorum longus)、伸拇短肌(extensor hallucis brevis)、伸拇长肌(extensor hallucis longus)、伸食指肌(extensor indicis)、伸拇短肌(extensorpollicis brevis)、伸拇长肌(extensor pollicis longus)、桡侧腕屈肌(flexor carpiradialis)、尺侧屈腕肌(flexor carpi ulnaris)、小指短屈肌(flexor digiti minimibrevis)(在手中)、小趾短屈肌(flexor digiti minimi brevis)(在脚中)、趾短屈肌(flexor digitorum brevis)、趾长屈肌(flexor digitorum longus)、指深屈肌(flexordigitorum profundus)、指浅屈肌(flexor digitorum superficialis)、拇短屈肌(flexorhallucis brevis)、拇长屈肌(flexor hallucis longus)、拇短屈肌(flexor pollicisbrevis)、拇长屈肌(flexor pollicis longus)、额肌(frontalis)、腓肠肌(gastrocnemius)、颏舌骨肌(geniohyoid)、臀大肌(gluteus maximus)、臀中肌(gluteusmedius)、臀小肌(gluteus minimus)、股薄肌(gracilis)、颈髂肋肌(iliocostaliscervicis)、腰髂肋肌(iliocostalis lumborum)、胸髂肋肌(iliocostalis thoracis)、髂肌(illiacus)、下孖肌(inferior gemellus)、下斜肌(inferior oblique)、下直肌(inferior rectus)、冈下肌(infraspinatus)、棘间肌(interspinalis)、横突间肌(intertransversi)、翼外肌(lateral pterygoid)、外直肌(lateral rectus)、背阔肌(latissimus dorsi)、提口角肌(levator anguli oris)、提上唇肌(levator labiisuperioris)、提上唇鼻翼肌(levator labii superioris alaeque nasi)、提上睑肌(levator palpebrae superioris)、肩胛提肌(levator scapulae)、长回旋肌(longrotators)、头最长肌(longissimus capitis)、颈最长肌(longissimus cervicis)、胸最长肌(longissimus thoracis)、头长肌(longus capitis)、颈长肌(longus colli)、蚓状肌(lumbricals)(在手中)、蚓状肌(lumbricals)(在脚中)、咬肌(masseter)、翼内肌(medialpterygoid)、内直肌(medial rectus)、中斜角肌(middle scalene)、多裂肌(multifidus)、下颌舌骨肌(mylohyoid)、头下斜肌(obliquus capitis inferior)、头上斜肌(obliquuscapitis superior)、闭孔外肌(obturator externus)、闭孔内肌(obturator internus)、枕肌(occipitalis)、肩胛舌骨肌(omohyoid)、小指对掌肌(opponens digiti minimi)、拇对掌肌(opponens pollicis)、眼轮匝肌(orbicularis oculi)、口轮匝肌(orbicularisoris)、骨间掌侧肌(palmar interossei)、掌短肌(palmaris brevis)、掌长肌(palmarislongus)、耻骨肌(pectineus)、胸大肌(pectoralis major)、胸小肌(pectoralis minor)、腓短肌(peroneus brevis)、腓长肌(peroneus longus)、第三腓骨肌(peroneus tertius)、梨状肌(piriformis)、跖侧骨间肌(plantar interossei)、跖肌(plantaris)、颈阔肌(platysma)、腘肌(popliteus)、后斜角肌(posterior scalene)、旋前方肌(pronatorquadratus)、旋前圆肌(pronator teres)、腰大肌(psoas major)、股方肌(quadratusfemoris)、跖方肌(quadratus plantae)、头直前肌(rectus capitis anterior)、头侧直肌(rectus capitis lateralis)、头后大直肌(rectus capitis posterior major)、头后小直肌(rectus capitis posterior minor)、股直肌(rectus femoris)、大菱形肌(rhomboidmajor)、小菱形肌(rhomboid minor)、笑肌(risorius)、缝匠肌(sartorius)、小斜角肌(scalenus minimus)、半膜肌(semimembranosus)、头半棘肌(semispinalis capitis)、颈半棘肌(semispinalis cervicis)、胸半棘肌(semispinalis thoracis)、半腱肌(semitendinosus)、前锯肌(serratus anterior)、短回旋肌(short rotators)、比目鱼肌(soleus)、头棘肌(spinalis capitis)、颈棘肌(spinalis cervicis)、胸棘肌(spinalisthoracis)、头夹肌(splenius capitis)、颈夹肌(splenius cervicis)、胸锁乳突肌(sternocleidomastoid)、胸舌骨肌(sternohyoid)、胸骨甲状肌(sternothyroid)、茎突舌骨肌(stylohyoid)、锁骨下肌(subclavius)、锁骨下肌(subscapularis)、上孖肌(superiorgemellus)、上斜肌(superior oblique)、上直肌(superior rectus)、旋后肌(supinator)、冈上肌(supraspinatus)、颞肌(temporalis)、阔筋膜张肌(tensor fascia lata)、大圆肌(teres major)、小圆肌(teres minor)、胸肌(thoracis)、甲状舌骨肌(thyrohyoid)、胫前肌(tibialis anterior)、胫骨后肌(tibialis posterior)、斜方肌(trapezius)、肱三头肌(triceps brachii)、股中间肌(vastus intermedius)、股外侧肌(vastus lateralis)、股内侧肌(vastus medialis)、颧大肌(zygomaticus major)和颧小肌(zygomaticus minor)、以及所属领域中已知的任何其它适合的骨骼肌。
向隔膜肌施用如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用来进行。在一些实施方案中，从ceDNA载体表达的转基因递送到靶组织还能够通过递送包含ceDNA载体的合成储槽来实现，其中将包含ceDNA载体的储槽植入骨骼肌、平滑肌、心肌和/或隔膜肌组织，或能够使肌肉组织与包含如本文所述的ceDNA载体的膜或其它基质接触。此类可植入基质或底物描述于美国专利第7,201,898号中。
向心肌施用如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体包括向左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜(septum)施用。如本文所述的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、例如主动脉内施用、直接心脏注射(例如注入左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注而递送到心肌。
向平滑肌施用如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用来进行。在一个实施方案中，可以施用存在于平滑肌内、附近和/或平滑肌上的内皮细胞。平滑肌的非限制示例包括眼虹膜、肺细支气管、喉肌(声带)、胃肠道的胃、食道、小肠和大肠肌肉层、膀胱的输尿管、逼尿肌肌肉、子宫的子宫肌层、阴茎或前列腺腺体。
在一些实施方案中，将如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌。在代表性实施例中，本公开的ceDNA载体用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或隔膜肌病症。
具体地说，预期包含如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的组合物可以被递送到眼睛的一种或多种肌肉(例如外直肌(Lateral rectus)、内直肌(Medialrectus)、上直肌(Superior rectus)、下直肌(Inferior rectus)、上斜肌(Superioroblique)、下斜肌(Inferior oblique))、面部肌肉(例如枕额肌(Occipitofrontalismuscle)、颞下颌肌(Temporoparietalis muscle)、降眉间肌(Procerus muscle)、鼻肌(Nasalis muscle)、降鼻中隔肌(Depressor septi nasi muscle)、眼轮匝肌(Orbicularisoculi muscle)、皱眉肌(Corrugator supercilii muscle)、降眉肌(Depressorsupercilii muscle)、耳廓肌(Auricular muscles)、口轮匝肌(Orbicularis orismuscle)、降口角肌(Depressor anguli oris muscle)、笑肌(Risorius)、颧大肌(Zygomaticus major muscle)、颧小肌(Zygomaticus minor muscle)、提上唇肌(Levatorlabii superioris)、提上唇鼻翼肌(Levator labii superioris alaeque nasi muscle)、降下唇肌(Depressor labii inferioris muscle)、提口角肌(Levator anguli oris)、颊肌(Buccinator muscle)、颏肌(Mentalis))或舌肌(例如颏舌肌(genioglossus)、舌骨舌肌(hyoglossus)、小角舌肌(chondroglossus)、茎舌肌(styloglossus)、腭舌肌(palatoglossus)、舌上纵肌(superior longitudinal muscle)、舌下纵肌(inferiorlongitudinal muscle)、舌直肌(vertical muscle)和舌横肌(transverse muscle))。
(i)肌内注射：在一些实施方案中，使用针能够将包含如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的组合物注射到受试者的指定肌肉的一个或多个部位，例如骨骼肌(例如三角肌、股外侧肌、背外侧肌的侧臀肌，或婴儿的前外侧股)。包含ceDNA的组合物能够引入肌肉细胞的其它亚型中。肌肉细胞亚型的非限制性示例包括骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或隔膜肌细胞。
肌肉内注射的方法是所属领域技术人员已知的，因此本文中不再详细描述。然而，当执行肌肉内注射时，应该基于患者的年龄和体型、组合物的粘度以及注射部位来确定适当的针尺寸。表19提供了示例性注射部位和相应针尺寸的指南：
表19：人类患者肌内注射指南
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在某些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是以小体积(例如，如针对给定受试者在表8中概述的示例性体积)配制。在一些实施方案中，必要时，受试者在注射之前，能够施用全身或局部麻醉剂。如果需要多次注射，或如果注射更深的肌肉，而非上文提及的常见注射部位，这是特别期望的。
在一些实施方案中，能够将肌肉内注射与以下组合：电穿孔、递送压力或使用转染试剂增强ceDNA载体的细胞吸收。
(ii)转染试剂：在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体被配制成包含一种或多种转染试剂的组合物，以促进载体吸收到肌管或肌肉组织中。因此，在一个实施方案中，使用本文中别处所述的方法、通过转染将本文所述的核酸施用于肌肉细胞、肌管或肌肉组织。
(iii)电穿孔：在某些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体在缺乏载剂的情况下施用以促进ceDNA进入细胞中，或在生理学上呈惰性的药学上可接受的载剂中(即，不改进或不增强无衣壳非病毒载体吸收到肌管中的任何载剂)施用。在此类实施例中，通过对细胞或组织进行电穿孔能够促进无衣壳非病毒载体的吸收。
细胞膜天然地抵抗从细胞外传递到细胞的细胞质中。一种用于暂时减小这种抵抗力的方法是“电穿孔”，其中使用电场在细胞中产生孔隙而对细胞不引起持久性损伤。这些孔隙大足以允许DNA载体、药物、DNA和其它极性化合物触及细胞内部。细胞膜中的孔隙封闭并且细胞再次变得不可通透。
电穿孔能够用于体外和体内应用中以将例如外源DNA引入活细胞中。体外应用典型地是将活细胞样品与包含例如DNA的组合物混合。然后将细胞放在电极(例如平行板)之间并且向细胞/组合物混合物施加电场。
有许多用于体内电穿孔的方法；电极可以以多种配置提供，诸如夹持表皮的测径规上覆于待治疗的细胞区域上。替代地，可以将针形电极插入组织中，从而更深地触及所定位的细胞。在任一情况下，将包含例如核酸的组合物注射到治疗区域之后，电极向所述区域施加电场。在一些电穿孔应用中，这个电场包含约10到60ms持续时间的约100到500V/cm的单一方波脉冲。此类脉冲可以通过例如Genetronics有限公司的分公司BTX制造的ElectroSquare Porator T820的已知应用产生。
典型地，仅当肌肉在施用组合物(例如注射到肌肉中)之后立即或不久加以电刺激时才成功地发生例如核酸的吸收。
在某些实施方案中，使用电场脉冲或使用低电压/长脉冲治疗方案(例如使用方波脉冲电穿孔系统)达成电穿孔。能够产生脉冲电场的示例性脉冲发生器包括例如可以产生指数波形的ECM600以及可以产生方波形的ElectroSquarePorator(T820)，两者均可从BTX(Genetronics,Inc.(San Diego,Calif.)的分公司)获得。方波电穿孔系统递送可控的电脉冲，其快速地升高到设定电压，在那个水平保持设定的时间长度(脉冲长度)，然而快速地降到零。
在一些实施方案中，施用局部麻醉剂，例如通过在治疗部位注射以减少疼痛，所述疼痛可能与组织在包含如本文所述的无衣壳非病毒载体的组合物存在下电穿孔有关。另外，所属领域的技术人员将了解，应该选择最小化且/或防止过度组织损伤、以致肌肉发生纤维化、坏死或发炎的组合物剂量。
(iv)递送压力：在一些实施方案中，将如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体递送到肌肉组织通过递送压力来促进，该递送压力使用大体积和快速注射到供应肢体的动脉(例如，髂动脉)中的组合。这种施用模式能够通过多种方法达成，包括将包含ceDNA载体的组合物输注到肢体血管中，典型地同时使用血管钳压脉带将肌肉与全身循环分隔。在一种方法中，组合物通过肢体血管循环以准许外渗到细胞中。在另一方法中，提高血管内流体动力学压力以扩展血管床且增强ceDNA载体吸收到肌肉细胞或组织中。在一个实施方案中，将ceDNA组合物施用于动脉。
(v)脂质纳米粒子组合物：在一些实施方案中，将用于肌内递送用的如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体配制在包含如本文别处所述的脂质体的组合物。
(vi)靶向肌肉组织的ceDNA载体的全身施用：在一些实施方案中，将如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体配制成通过间接递送施用靶向肌肉，其中与肝脏相反，将ceDNA输送到肌肉。因此，本文所描述的技术涵盖向肌肉组织间接施用包含如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的组合物，例如通过全身施用。此类组合物能够通过体表、静脉内(通过集团或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、通过吸入、腹膜内、皮下、腔内施用，并且在必要时能够通过蠕动方式或通过所属领域的技术人员已知的其它方式递送。药剂能够全身性施用，例如通过静脉内输注(如果希望如此)。
在一些实施方案中，通过使用优先地将载体引导到肌肉组织的靶向剂或部分来增加如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体到肌肉细胞/组织中的吸收。因此，在一些实施方案中，相较于无衣壳ceDNA载体存在于身体的其它细胞或组织中的量，无衣壳ceDNA载体能够在肌肉组织中浓缩。
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的组合物进一步包含到肌肉细胞的靶向部分。在其它实施方案中，所表达的基因产物包含对期望产生作用的组织具有特异性的靶向部分。靶向部分能包括能够靶向细胞或组织的细胞内、细胞表面或细胞外生物标志物、与其相互作用、与其偶合且/或结合至其的任何分子或分子复合物。生物标志物能包括例如细胞蛋白酶、激酶、蛋白质、细胞表面受体、脂质和/或脂肪酸。靶向部分能靶向、相互作用、偶合和/或结合到的生物标志物的其它示例包括与特定疾病有关的分子。举例来说，生物标志物能够包括涉及癌症发展的细胞表面受体，例如表皮生长因子受体和运铁蛋白受体。靶向部分能够包括(但不限于)结合到靶肌肉组织中所表达的分子的合成化合物、天然化合物或产物、巨分子实体、生物工程化分子(例如多肽、脂质、多核苷酸、抗体、抗体片段)以及小实体(例如小分子、神经传递素、底物、配体、激素和元素化合物)。
在某些实施方案中，靶向部分可以进一步包含受体分子，包括例如天然地识别靶细胞中的特定期望分子的受体。此类受体分子包括已经修饰以增强其与靶分子相互作用的特异性的受体、已经修饰以与受体天然不识别的所期望靶分子相互作用的受体，以及此类受体的片段(参见例如Skerra，2000，《分子识别杂志(J.Molecular Recognition)》，13:167-187)。优选的受体是趋化因子受体。示例性趋化因子受体已经描述于例如Lapidot等人，2002，《实验血液学(Exp Hematol)》，30:973-81和Onuffer等人，2002，《制药学趋势(Trends Pharmacol Sci)》，23:459-67。
在其它实施方案中，另外的靶向部分可以包含配体分子，包括例如天然地识别靶细胞的特定期望受体的配体，例如运铁蛋白(Tf)配体。此类配体分子包括已经修饰以增强其与靶受体相互作用的特异性的配体、已经修饰以与配体天然不识别的期望受体相互作用的配体，和此类配体的片段。
在仍其它实施例中，靶向部分可以包含适体。适体是经选择可特异性结合到靶细胞的期望分子结构的寡核苷酸。适体典型地是类似于噬菌体呈现亲和力选择(又称为体外分子进化)的亲和力选择方法的产物。所述方法涉及执行亲和力分离的若干次串联迭代，例如使用致病免疫原所结合的固体载体执行；随后执行聚合酶链反应(PCR)以扩增结合到免疫原的核酸。每一轮亲和力分离由此从核酸群体中富集成功地结合期望免疫原的分子。以这种方式，可以“培育”随机核酸池，从而产生特异性结合靶分子的适体。适体典型地是RNA，但可以是DNA或其类似物或衍生物，例如(不限于)肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯核酸。
在一些实施方案中，靶向部分能够包含光可降解配体(即，‘笼状’配体)，所述配体通过例如聚焦光束释放，从而使无衣壳非病毒载体或基因产物靶向特定组织。
本文还预期组合物递送到受试者的一种或多种肌肉的多个部位。也就是说，能够在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个注射部位中进行注射。此类部位相对于单一肌肉的区域能够扩展或能够在多种肌肉之间分布。
B.将用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体施用于非肌肉位置
在另一个实施方案中，向肝脏施用用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体。可以将ceDNA载体施用于眼睛的不同区域，例如角膜和/或视神经。还可以将ceDNA载体引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体腺、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体；包括枕骨、颞叶、顶叶和额叶的大脑；皮质；基底神经节；海马和杏仁核(portaamygdala))、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。ceDNA载体可以被递送到脑脊髓液中(例如通过腰椎穿刺)。可以在血脑屏障已经被扰动(例如脑瘤或大脑梗塞)的情况下进一步将用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体血管内施用于CNS。
在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以通过所属领域已知的任何途径施用于眼睛的(多个)期望区域，所述途径包括但不限于鞘内、眼内、大脑内、脑室内、静脉内(例如在存在糖例如甘露糖醇下)、鼻内、耳内、眼内(例如玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如眼球筋膜囊下区(sub-Tenon's region))递送以及肌肉内递送和逆行递送到运动神经元。
在一些实施方案中，用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是在液体配制物中通过直接注射(例如立体定向注射)施用于CNS中的期望区域或腔室中。在其它实施方案中，可以通过局部施加到期望区域或通过鼻内施用气雾剂配制物来提供ceDNA载体。可以通过局部施加液滴来施用眼睛。作为另一替代方案，ceDNA载体能够作为固体、缓释型配制物施用(参见例如美国专利第7,201,898号)。在另外的实施方案中，ceDNA载体可以用于逆行转运，以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和障碍(例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。举例来说，可以将ceDNA载体递送到肌肉组织，其可以从肌肉组织迁移到神经元中。
C.离体治疗
在一些实施方案中，从受试者去除细胞，将如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体引入其中，并且然后将细胞替换回到受试者中。从受试者取出细胞进行离体处理、然后再引回到受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346；其公开内容全文并入本文)。可替代地，将ceDNA载体引入另一个受试者的细胞，引入培养细胞中，或引入任何其它适合来源的细胞中，并将细胞施用于有需要的受试者。
经如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体转导的细胞优选地以“治疗有效量”与药物载剂组合施用于受试者。所属领域的技术人员将了解，治疗效果不必是完全的或治愈的，只要给受试者提供了一些益处即可。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以编码将在细胞中体外、离体或体内产生的如本文所述的FVIII蛋白(有时称为转基因或异源核酸序列)。举例来说，与本文所描述的ceDNA载体在如本文所讨论的治疗方法中的使用形成相比，在一些实施方案中，可以将用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体引入经培养细胞中并从细胞分离所表达的FVIII蛋白，例如用于产生抗体和融合蛋白。在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的培养细胞可以用于商业上生产抗体或融合蛋白，例如充当小规模或大规模生物制造抗体或融合蛋白的细胞源。在另选的实施方案中，将如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体引入宿主非人类受试者的细胞中，用于体内生产抗体或融合蛋白，包括小规模生产以及商业大规模FVIII蛋白生产。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以用于兽医学与医学应用中。如上所述的离体基因递送方法的合适受试者包括禽类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔)，以哺乳动物为优选。人类受试者是最优选的。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。
D.剂量范围
本文提供了治疗方法，其包含向受试者施用有效量的包含如本文所描述的编码FVIII蛋白的ceDNA载体的组合物。如熟练的从业者将了解，术语“有效量”是指ceDNA组合物的施用量，引起FVIII蛋白以治疗血友病A的“治疗有效量”表达。
可以任选地采用体内和/或体外分析来帮助鉴定使用的最优剂量范围。制剂中准备采用的精确剂量还将取决于施用途径和病状严重度，并应根据所属领域的普通技术人员的判断和每个受试者的情况来决定。有效剂量可以从源自于体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推断。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体是以足以转染期望组织的细胞和足以提供足够水平的基因转移和表达而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于上文在“施用”部分中所述的那些途径，例如直接递送至选定的器官(例如门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、肿瘤内和其它肠胃外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。
实现特定“治疗作用”所需的本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的剂量将基于若干因素而变化，所述因素包括但不限于：核酸施用途径、实现治疗作用所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症以及(多种)基因、(多种)RNA产物或(多种)所产生的所表达的蛋白质的稳定性。所属领域的技术人员可以基于前述的因素以及所属领域中熟知的其它因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的ceDNA载体剂量范围。
剂量方案可以调整，以提供最优的治疗反应。例如，可以重复施用寡核苷酸，例如可以每天施用若干剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少剂量。所属领域的普通技术人员将能够容易地确定主题寡核苷酸的适当剂量和施用计划，无论所述寡核苷酸是将施用于细胞还是受试者。
“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内，所述范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(神经细胞将需要很少的量，而全身性注射将需要大量)。例如，对于体内直接注射到人类受试者的骨骼肌或心肌中，治疗有效剂量将为约1μg至100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体，那么可以通过实验确定治疗有效剂量，但预计递送1μg至约100g的载体。此外，治疗有效剂量是表达足量的转基因、从而对受试者起作用的ceDNA载体的量，其使得疾病的一种或多种症状减少，但不产生显著的脱靶或显著的不良副作用。在一个实施方案中，“治疗有效量”是所表达的FVIII蛋白的量，所述量足以使血友病A生物标志物的表达产生统计显著的可测量变化或使指定疾病症状产生统计显著的可测量减轻。指定的ceDNA载体组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的调配物是所属领域的技术人员熟知的，开发在多种治疗方案中使用本文所描述的特定组合物的适合的剂量和治疗方案也是所属领域技术人员熟知的。
对于体外转染，递送到细胞(1×106个细胞)的如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的有效量将为约0.1到100μg、优选1到20μg并且更优选1到15μg或8到10μgceDNA载体。ceDNA载体越大，需要的剂量越高。如果使用外泌体或微粒，那么可以通过实验确定有效的体外剂量，但意图递送大致相同量的ceDNA载体。
对于血友病A的治疗，如本文所公开的表达FVIII蛋白的ceDNA载体的适当剂量将取决于待治疗的疾病的特定类型、FVIII蛋白的类型、血友病A疾病的严重度和病程、先前疗法、患者的临床史和对抗体的应答以及主治医师的判断。编码FVIII蛋白的ceDNA载体适当地一次或在一系列治疗内施用于患者。本文涵盖了各种给药方案，包括(但不限于)单次施用或在不同时间点上的多次施用、集团施用和脉冲输注。
取决于疾病的类型和严重性，通过一次或多次单独施用或通过连续输注以使得经编码FVIII蛋白以约0.3mg/kg到100mg/kg(例如15mg/kg-100mg/kg或所述范围内的任何剂量)表达的量来施用ceDNA载体。ceDNA载体的一种典型日剂量足以引起在约15mg/kg到100mg/kg或更大范围内的经编码FVIII蛋白表达，此取决于上文提及的因素。ceDNA载体的一种示例性剂量是足以引起如本文所公开的经编码的FVIII蛋白在约10mg/kg至约50mg/kg范围内表达的量。因此，可以向患者施用呈足以引起约0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、3mg/kg、4.0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg(或其任何组合)的经编码FVIII蛋白表达的量的一次或多次剂量的ceDNA载体。在一些实施方案中，ceDNA载体为足以引起在50mg到2500mg范围内的总剂量的经编码FVIII蛋白表达的量。ceDNA载体的示例性剂量为足以引起约50mg、约100mg、200mg、300mg、400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约720mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2050mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg或约2500mg(或其任何组合)的经编码FVIII蛋白的总表达的量。由于ceDNA载体对FVIII蛋白的表达可以由本文中的调节开关小心地控制，或者，向受试者施用多次剂量的ceDNA载体，ceDNA载体对FVIII蛋白的表达可以使得可以间歇地，例如每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每三个月或每六个月从ceDNA载体施用所表达的FVIII蛋白的剂量的方式进行控制。通过常规技术和分析能够监测此疗法的进展。
在某些实施方案中，ceDNA载体是以足以引起呈15mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg或均一剂量例如300mg、500mg、700mg、800mg或更高的剂量的经编码FVIII蛋白表达的量施用。在一些实施方案中，ceDNA载体对FVIII蛋白的表达受到控制以使得FVIII蛋白在一段时间内每天、每隔一天、每周、每2周或每4周进行表达。在一些实施方案中，ceDNA载体对FVIII蛋白的表达受到控制以使得FVIII蛋白在一段时间内每2周或每4周进行表达。在某些实施方案中，时间段是6个月、一年、十八个月、两年、五年、十年、15年、20年或患者一生。
治疗可以涉及施用单次剂量或多次剂量。在一些实施方案中，可以向受试者施用超过一个剂量；实际上，可以根据需要施用多个剂量，因为ceDNA载体由于没有病毒衣壳而不会引发抗衣壳的宿主免疫应答。因此，所属领域的技术人员可以容易地确定适当剂量次数。施用的剂数可以例如1-100剂，优选地2-20剂的量级。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下，缺乏通过施用如本公开所描述的ceDNA载体引发的典型抗病毒免疫反应(即，不存在衣壳组分)允许用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体在多种场合施用于宿主。在一些实施方案中，将核酸递送到受试者的场合数在2到10次范围内(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。在一些实施方案中，向受试者递送ceDNA载体超过10次。
在一些实施方案中，每个日历天(例如24小时时间段)向受试者施用一种剂量的如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日向受试者施用一剂ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，每个日历周(例如7个日历天)向受试者施用一种剂量的如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每两周不超过一次(例如两个日历周时间段为一次)。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历月不超过一次(例如30个日历日为一次)。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每六个日历月不超过一次。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历年(例如365天或闰年366天)不超过一次。在特定实施例中，超过一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以用于在不同间隔期内，例如每天、每周、每月、每年等实现所期望的基因表达水平。
可以在有限的时间段内重复施用本文所述的ceDNA组合物。在一些实施方案中，定期或通过脉冲施用进行给药。在一个优选的实施例中，上述剂量被施用数月。治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的反应而定。预期随着时间的推移加强治疗。此外，表达水平可以随着受试者的成长而滴定。
FVIII治疗蛋白可以在受试者中表达至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长时间。通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够达成长期表达。
在一些实施方案中，由如本文所公开的ceDNA载体编码的治疗性FVIII蛋白可以通过调节开关、可诱导或可抑制型启动子进行调节以使得其在受试者中表达至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长时间。在一个实施方案中，通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够达成表达。替代地，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体能够进一步包含基因编辑系统的组分(例如CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸内切酶等)以容许一种或多种核酸序列插入，所述一种或多种核酸序列编码用于基本上持久治疗或“治愈”疾病的FVIII蛋白。包含基因编辑组分的此类ceDNA载体公开于国际申请PCT/US18/64242，并且可以包括5’和3’同源臂(例如，SEQ ID NO:151-154或与其具有至少40％、50％、60％、70％或80％同源性的序列)以将编码FVIII蛋白的核酸(诸如但不包括白蛋白基因或CCR5基因)插入安全港区中。作为示例，表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以包含至少一个基因组安全港(GSH)特异性同源臂以用于将FVIII转基因插入基因组安全港中，如2019年3月1日提交的国际专利申请PCT/US2019/020225(全文以引用的方式并入本文)中所公开的。
治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的反应而定。初始较高治疗剂量之后，预期为连续的相对较低维持剂量。
E.单位剂型
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的药物组合物可以便利地以单位剂型呈现。单位剂量通常将适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。在一些实施方案中，单位剂型适合于直接施用于眼睛的液滴。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过吸入施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过汽化器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过喷雾器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过气雾器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。在一些实施方案中，单位剂型适合于视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
在一些实施方案中，单位剂量适合于鞘内或脑室内施用。在一些实施方案中，配制药物组合物以供局部施用。可以与载剂材料组合以产生单个剂量的活性组分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。
X.治疗方法
本文所述的技术还展示了用于制备所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的方法以及以多种方式(包括例如离体、非原位、体外和体内应用、方法、诊断程序和/或基因疗法方案)使用所公开的载体的方法。
在一个实施方案中，由如本文所公开的ceDNA载体表达的所表达的治疗性FVIII蛋白具有治疗疾病的功能。在一个优选实施例中，治疗性FVIII蛋白不引起免疫系统反应，除非期望如此。
本文提供了一种治疗受试者的血友病A的方法，包含将治疗有效量的如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体、任选地与药学上可接受的载剂一起引入有需要的靶细胞(例如肌肉细胞或组织，或其它受影响的细胞类型)。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所建构的ceDNA载体包含可用于治疗疾病的如本文所描述的编码FVIII蛋白的核酸序列。确切地说，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以包含可操作地连接到控制元件的期望FVIII蛋白DNA序列，所述控制元件能够在由外源性DNA序列编码的期望FVIII蛋白引入受试者中时引导其转录。如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方所提供的任何适合的途径施用。
本文公开了如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体组合物和配制物，其包括本公开的一种或多种ceDNA载体以及一种或多种药学上可接受的缓冲剂、稀释剂或赋形剂。此类组合物可包括在一种或多种诊断或治疗试剂盒中以用于诊断、预防、治疗或改善血友病A的一种或多种症状。在一个方面，疾病、损伤、障碍、创伤或功能障碍是人类疾病、损伤、障碍、创伤或功能障碍。
本文所述的技术的另一个方面提供了一种用于向有需要的受试者提供诊断或治疗有效量的如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的方法，该方法包括向有需要的受试者的细胞、组织或器官提供一定量的如本文所公开的ceDNA载体；并且持续有效实现由ceDNA载体表达FVIII蛋白的时间，由此向受试者提供诊断或治疗有效量的由ceDNA载体表达的FVIII蛋白。在另一方面，受试者为人。
本文描述的技术的另一方面提供了一种用于诊断、预防、治疗或改善受试者的血友病A、病症、功能障碍、损伤、异常病状或创伤的至少一种或多种症状的方法。在整体和一般意义上，所述方法至少包括以足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病况或创伤的一种或多种症状的量并持续足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病况或创伤的一种或多种症状的时间向有需要的受试者施用一种或多种所公开的用于产生FVIII蛋白的ceDNA载体的步骤。在此类实施例中，可以评估受试者的FVIII蛋白的功效，或者，检测受试者的FVIII蛋白或FVIII蛋白的组织位置(包括细胞和亚细胞位置)。因此，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以用作体内诊断工具，例如用于检测癌症或其他适应症。在另一方面，受试者为人。
另一方面是如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体用作治疗或减轻血友病A或疾病状态的一种或多种症状的工具的用途。有许多遗传疾病中的缺陷基因是已知的，并且通常分为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可以涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常但不总是以显性方式遗传。就不均衡的疾病状态而言，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体能够用于在模型系统中建立血友病A状态，然后能够利用所述模型系统尝试抵消疾病状态。因此，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体准许治疗遗传疾病。如本文所使用的，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡，可以治疗血友病A状态。
如本文所使用，术语“治疗有效量”为所表达的FVIII治疗蛋白或其功能片段足以产生疾病生物标记物的表达的统计学上显著的可测量变化或既定疾病症状的减轻的量(参见下文的“功效测量”)。指定的ceDNA组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
对血友病A的给定治疗的功效可由熟练的临床医生确定。然而，在本文使用“有效治疗”时，如果在用编码FVIII或其功能片段的ceDNA载体治疗之后疾病或病症的任一种或所有征象或症状以有益方式改变、或疾病的其它临床上接受的症状或标记物改良或改善例如至少10％，那么认为治疗是“有效治疗”。还可以根据个体未发生恶化来测量功效，如通过疾病的稳定或对医疗干预的需求(即，疾病的进展停止或至少减缓)所评估。测量这些指标的方法是所属领域的技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括对个体或动物(一些非限制性示例包括人或哺乳动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制(例如遏制)或减缓疾病或障碍进展；或者(2)缓解疾病，例如引起症状消退；以及(3)防止疾病发展或降低疾病发展的可能性，或者预防与疾病相关的继发性疾病/障碍，诸如肝或肾衰竭。当本文定义有效治疗时，治疗疾病的有效量意味着当施用于有需要的哺乳动物时足以对所述疾病产生有效治疗的量。
可以通过评估血友病A特有的物理指标来确定药剂的功效。分析血友病A指标的标准方法是本领域已知的。
A.宿主细胞
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体将FVIII蛋白转基因递送到受试者宿主细胞中。在一些实施方案中，细胞是感光细胞。在一些实施方案中，细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，受试者的宿主细胞是人宿主细胞，包括例如血细胞、干细胞、造血细胞、CD34+细胞、肝细胞、癌细胞、血管细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、神经细胞、视觉或视网膜细胞、上皮或内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞或任何其它哺乳动物来源的细胞，包括但不限于肝(即肝)细胞、肺细胞、心脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、隔膜细胞、肾(即肾)细胞、神经细胞、血细胞、骨髓细胞或预期进行基因治疗的受试者的任何一种或多种选定的组织。在一方面，受试者的宿主细胞是人类宿主细胞。
本公开还涉及如上文所提及的重组宿主细胞，其包括如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体。因此，对于技术人员而言显而易见的是，可以根据目的使用多种宿主细胞。将包括供体序列的如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的构建体或ceDNA载体引入宿主细胞中以使得供体序列维持为染色体整合体，如早先所描述。术语宿主细胞涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于供体序列和其来源。
宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是人细胞(例如原代细胞、干细胞或永生化细胞系)。在一些实施方案中，可以向宿主细胞离体施用如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体，并且然后在基因疗法事件之后将其递送到受试者。宿主细胞可以是任何细胞类型，例如体细胞或干细胞、诱导型多能干细胞或血细胞，例如T细胞或B细胞，或骨髓细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是同种异体细胞。例如，T细胞基因组工程可用于癌症免疫疗法、如HIV疗法的疾病调节(例如受体敲除，如CXCR4和CCR5)和免疫缺陷疗法。可靶向B细胞上的MHC受体进行免疫治疗。在一些实施方案中，能够将基因经修饰的宿主细胞(例如骨髓干细胞，例如CD34+细胞，或诱导多能干细胞)移植回到患者中用于表达治疗蛋白。
B.基因疗法的额外疾病：
一般来说，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体能够用于递送根据上述说明的任何FVIII蛋白以治疗、预防或改善与血友病A有关的症状，所述病症与受试者的异常蛋白质表达或基因表达有关。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可用于将FVIII蛋白递送至骨骼肌、心肌或隔膜肌，以产生用于在血液中分泌和循环的FVIII蛋白或用于全身递送至其他组织以治疗、改善和/或预防血友病A。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的方式，任选地通过施用受试者所吸入的包含ceDNA载体的可吸入粒子的气雾剂悬浮液来施用受试者的肺。可吸入粒子可以是液体或固体。包含ceDNA载体的液体粒子的气雾剂可以通过任何合适的手段产生，例如用压力驱动的气雾剂喷雾器或超声喷雾器，如所属领域的技术人员所知。参见例如美国专利第4,501,729号。包含ceDNA载体的固体粒子的气雾剂也可以通过制药领域已知的技术，用任何固体粒子药物气雾剂发生器产生。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以施用于CNS组织(例如大脑、眼睛)。
可以用如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体治疗、改善或预防的眼病包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科病症(例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变和其它视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关黄斑变性、青光眼)。许多眼科疾病和病症与以下三种类型适应症中的一种或多种有关：(1)血管产生、(2)炎症和(3)变性。在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体可以用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞变性、促进细胞保留或促进细胞生长的因子以及上述因子的组合。例如，糖尿病性视网膜病的特征是血管产生。通过眼内(例如玻璃体内)或眼周(例如眼球筋膜囊下区域)递送一种或多种抗血管产生抗体或融合蛋白能够治疗糖尿病性视网膜病变。可以用本公开的ceDNA载体治疗、改善或预防的额外眼病包括：地图样萎缩、血管性或“湿性”黄斑变性、PKU、雷伯氏先天性黑蒙(LCA)、尤塞氏综合征(Usher syndrome)、弹力纤维性假黄瘤(PXE)、x连锁色素性视网膜炎(XLRP)、x连锁视网膜劈裂症(XLRS)、无脉络膜症、雷伯氏遗传性视神经病变(LHON)、色盲、视锥-视杆营养不良、富克斯角膜内皮营养不良(Fuchs endothelial cornealdystrophy)、糖尿病性黄斑水肿以及眼癌和肿瘤。
在一些实施方案中，发炎眼部疾病或病症(例如葡萄膜炎)可以通过如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体治疗、改善或预防。通过眼内(例如玻璃体或前房)施用如本文所公开的ceDNA载体能够表达一种或多种消炎抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以编码与编码报告多肽(例如酶，例如绿色荧光蛋白或碱性磷酸酶)的转基因相关的FVIII蛋白。在一些实施方案中，编码可用于实验或诊断目的的报告蛋白的转基因选自下列中的任何一种：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其它转基因。在一些方面中，表达连接到报告子多肽的FVIII蛋白的ceDNA载体可以用于诊断目的，以及测定ceDNA载体在其所施用到的受试者中的功效或用作ceDNA载体在所述受试者中的活性的标志物。
C.使用ceDNA载体测试成功的基因表达
所属领域中熟知的分析可以用于测试ceDNA载体对FVIII蛋白的基因递送的效率，所述测试可以在体外和体内模型中执行。所属领域的技术人员可以通过测量FVIII蛋白的mRNA和蛋白质含量(例如逆转录PCR、蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附分析(ELISA))来评估ceDNA对FVIII蛋白的表达水平。在一个实施方案中，ceDNA包含报告蛋白，所述报告蛋白可以用于评估FVIII蛋白的表达，例如通过利用荧光显微术或发光读盘器检查报告蛋白的表达。对于体内应用，蛋白质功能分析可以用于测试既定FVIII蛋白的功能以确定基因表达是否成功进行。熟练的技术人员能够确定用于测量由ceDNA载体体外或体内表达的FVIII蛋白的功能的最佳测试。
本文预期在细胞或受试者中ceDNA载体对FVIII蛋白的基因表达的效应可以持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少四个月、至少5个月、至少六个月、至少10个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年，或可以永久。
在一些实施方案中，本文所描述的表达盒、表达构建体或ceDNA载体中的FVIII蛋白可以针对宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人(例如人源化)等所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。使用例如Aptagen的Gene密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司)或其它公共数据库可以确定优化密码子。
D.通过评估ceDNA载体的FVIII蛋白表达来测定功效
所属领域中已知的用于测定蛋白质表达的基本上任何方法都可以用于分析ceDNA载体对FVIII蛋白的表达。此类方法/分析的非限制性示例包括酶联免疫分析(ELISA)、亲和力ELISA、ELISPOT、连续稀释、流式细胞术、表面等离子体共振分析、动力学排除分析、质谱学、蛋白质印迹、免疫沉淀和PCR。
为了评估体内FVIII蛋白表达，可以从受试者获得生物样品进行分析。示例性生物样品包括生物流体样品、体液样品、血液(包括全血)、血清、血浆、尿液、唾液、切片和/或组织样品等。生物样品或组织样品还可以指从个体中分离出的组织或流体样品，包括(但不限于)肿瘤切片、粪便、脊髓液、胸膜液、乳头抽出物、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、泪液、唾液、母乳、细胞(包括(但不限于)血细胞)、肿瘤、器官，以及体外细胞培养液成分的样品。术语还包括上述样品的混合物。术语“样品”还包括未治疗或预治疗(或预处理)的生物样品。在一些实施方案中，用于本文描述的分析和方法的样品包含从待测受试者收集的血清样品。
E.通过临床参数测定所表达的FVIII蛋白的功效
由ceDNA载体表达的给定FVIII蛋白对血友病A(即功能性表达)的功效可由熟练的临床医生确定。然而，在如本文所述的编码治疗性FVIII蛋白的ceDNA载体治疗之后，如果血友病A的任一种或所有征象或症状以有益方式改变或临床上接受的其它症状或疾病标志物改良或改善例如至少10％，则治疗在所述术语在本文使用时被视为“有效治疗”。还可以根据个体未发生恶化来测量功效，如通过血友病A的稳定或对医疗干预的需求(即，疾病的进展停止或至少减缓)所评估。测量这些指标的方法是所属领域的技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括对个体或动物(一些非限制性示例包括人或哺乳动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制血友病A，例如遏制或减缓血友病A进展；或者(2)缓解血友病A，例如引起血友病A症状消退；以及(3)防止血友病A发展或减小血友病A发展的可能性，或者预防与血友病A相关的继发性疾病/障碍。用于治疗疾病的有效量意指当施用于有需要的哺乳动物时足以对该疾病产生如本文所定义术语的有效治疗的量。药剂功效能够通过评估血友病A疾病所特有的身体指标来测定。医师可以评估血友病A的任何一种或多种临床症状，包括：由于切口或伤口或者在手术或牙科工作后原因不明和过度的出血；许多大的或深的瘀伤；疫苗接种后异常出血；关节疼痛、肿胀或紧绷；尿液或粪便中带血；不明原因的流鼻血；在婴儿中，原因不明的烦躁。
XI.表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体的各种应用
如本文所公开，如本文所描述的组合物和用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以出于一系列目的用于表达FVIII蛋白。在一个实施方案中，表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以用于创建携带转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究血友病A的功能或疾病进展。在一些实施方案中，表达FVIII蛋白的ceDNA载体可用于治疗、预防或改善哺乳动物受试者的血友病A状态或障碍。
在一些实施方案中，FVIII蛋白在受试者中可以以足以治疗与基因产物的表达增强、活性提高或基因的不当上调有关的疾病的量由ceDNA载体表达。
在一些实施方案中，FVIII蛋白在受试者中能够以足以治疗与蛋白质的表达减少、表达缺乏或功能异常有关的血友病A的量从ceDNA载体中表达。
本领域普通技术人员应当理解，转基因可以不是待转录基因本身的开放读框；相反，它可以是靶基因的启动子区域或阻遏子区域，并且ceDNA载体可修饰这样的区域，从而调节FVIII基因的表达。
如本文所公开的组合物和用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体可以出于如上文所描述的各种目的用于递送FVIII蛋白。
在一些实施方案中，转基因编码一种或多种可用于治疗、改善或预防哺乳动物受试者的血友病A状态的FVIII蛋白。ceDNA载体所表达的FVIII蛋白以足以治疗与异常基因序列有关的血友病A的量施用于患者，从而能够产生以下中的任何一种或多种：增强的蛋白质表达、蛋白质的过度活性、靶基因或蛋白质的表达减少、表达缺乏或功能异常。
在一些实施方案中，设想本文公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体用于诊断和筛选方法中，其中使转基因瞬时或稳定表达于细胞培养系统中，或可替代地，表达于转基因动物模型中。
本文所描述的技术的另一个方面提供了用如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体转导哺乳动物细胞群体的方法。在整体和一般意义上，所述方法至少包括将包含有效量的一种或多种如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体的组合物引入群体的一个或多个细胞中的步骤。
另外，本公开提供了包括一种或多种如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的所公开ceDNA载体的组合物以及治疗和/或诊断试剂盒、或用一种或多种额外成分配制或根据其一个或多个使用指令制备的ceDNA组合物。
如本文所公开的用于表达FVIII蛋白的ceDNA载体所施用的细胞可以为任何类型，包括但不限于神经细胞(包括末梢和中枢神经系统的细胞，尤其大脑细胞)、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞、树突状细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质细胞、纤维母细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等等。可替代地，细胞可以是任何祖细胞。作为另一个替代方案，细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为又一个替代方案，细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。此外，如上文指出，细胞可以来自任何物种来源。
A.表达FVIII的ceDNA载体的产生和纯化
本文所公开的ceDNA载体将用于体外或体内产生FVIII蛋白。以这种方式产生的FVIII蛋白可以分离出来，针对期望功能加以测试，并且经过纯化以便进一步用于研究中或用作治疗性治疗。每种蛋白质产生系统具有其自身的优点/缺点。虽然体外产生的蛋白能够轻松地纯化且能够在短时间内产生蛋白，但体内产生的蛋白能够具有转译后修饰，例如糖基化。
可以使用所属领域的技术人员已知的任何方法，例如离子交换色谱、亲和色谱、沉淀或电泳纯化使用ceDNA载体产生的FVIII治疗蛋白。
通过本文所描述的方法和组合物产生的FVIII治疗蛋白可以针对与期望靶蛋白的结合加以测试。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，这些实施例决不应解释为进一步限制。应理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不打算限制仅由权利要求书定义的本公开的范围。
实施例
通过说明而非限制的方式提供了以下实施例。所属领域的普通技术人员将了解，可以从本文所述的任何野生型或修饰ITR中构建ceDNA载体，并且以下示例性方法可以用于构建和评估这类ceDNA载体的活性。虽然这些方法以某些ceDNA载体为例，但它们适用于符合描述的任何ceDNA载体。
实施例1：使用基于昆虫细胞的方法构建ceDNA载体
使用多核苷酸构建体模板生产ceDNA载体描述于PCT/US18/49996的实例1中，其通过引用整体并入本文。举例来说，用于产生本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论束缚，在准许的宿主细胞中，在例如Rep存在下，具有两个对称ITR(其中至少一个ITR相对于野生型ITR序列经修饰)和表达构建体的多核苷酸构建体模板复制而产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，通过Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞，赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以产生重组ceDNA-杆粒。通过以下方法来选择重组杆粒：在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上利用抗生素基于大肠杆菌中的蓝白筛选来筛选阳性选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)，以选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒。挑选出由破坏β-半乳糖苷指示基因的易位所造成的白色菌落，并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃下在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡温育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃下维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18-19nm直径(从14-15nm的原初直径)和～4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗4×20ml 2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并且在25℃-27℃下温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
如PCT/US18/49996(全文以引用的方式并入本文)的图8A中公开的“Rep-质粒”是在pFASTBACTM-Dual表达载体(ThermoFisher)中产生的，该表达载体包含Rep78和Rep52或Rep68和Rep40。依循制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以产生重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过阳性选择来选择重组杆粒，该阳性选择包括在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上在大肠杆菌中进行蓝白筛选(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、庆大霉素(gentamicin)、四环素的LB培养液)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染原生Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗四个20mL的2.5×106个细胞/mL的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体产生和表征
参考图3B，然后将含有以下项中任一种的Sf9昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率添加到新鲜的Sf9细胞培养物(2.5E+6个细胞/ml，20ml)中：(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上述Rep杆状病毒。然后将细胞在25℃下以130rpm培养。共同感染4-5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18nm-20nm并且活力为约70％-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用凯杰(Qiagen)MIDI PLUSTM纯化方案(凯杰，每个柱处理0.2mg细胞团粒质量)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。
可以通过如图3D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所述)获得的DNA，进一步分析分离的ceDNA载体的结构，所述限制性核酸内切酶是针对以下条件选择的：a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得到的片段足够大，以便在0.8％变性琼脂糖凝胶上进行分级分离时被清楚看到(>800bp)。如图3D和图3E所示，具有非连续结构的线性DNA载体以及具有线性且连续结构的ceDNA载体可以通过它们反应产物的大小来区分-例如，预计具有非连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的非衣壳化载体预计产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图3D)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管所属领域的普通技术人员将了解，对这个实例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR纯化试剂盒或脱盐“离心柱”(例如，GE HEALTHCARE ILUSTRATM MICROSPINTMG-25柱)是用于内切核酸酶消化的一些本领域已知的选择。所述分析包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)加入10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mM EDTA)，加入10X染料，不进行缓冲，并与通过添加入10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。所属领域的普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和，并转移到蒸馏水或含1xSYBR金的1x TBE/TAE中。然后，可以用例如Thermo Fisher的金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和辐射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。举例来说，若基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，则存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
出于比较目的，实施例1描述了使用基于昆虫细胞的方法和多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体，并且还描述于PCT/US18/49996的实施例1中，所述文献全文以引用的方式并入本文中。举例来说，用于根据实例1产生本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论束缚，在准许的宿主细胞中，在例如Rep存在下，具有两个对称ITR(其中至少一个ITR相对于野生型ITR序列经修饰)和表达构建体的多核苷酸构建体模板复制而产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，通过Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。
在使用昆虫细胞的方法中产生ceDNA载体的示例性方法是通过如本文所述的ceDNA-质粒。
实施例2：通过从双链DNA分子中切除来产生合成ceDNA
ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实例2-6中，所述国际申请通过引用整体并入本文。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简而言之，可以使用双链DNA构建体产生ceDNA载体，例如，参见PCT/US19/14122的图7A-8E。在一些实施方案中，双链DNA构建体是ceDNA质粒，例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。
在一些实施方案中，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所述的调节开关。
出于说明的目的，实施例2描述了ceDNA载体的产生，所述ceDNA载体是使用此方法产生的示例性封闭端DNA载体。然而，虽然在本实施例中例示了ceDNA载体以说明通过切除包含ITR和表达盒(例如核酸序列，例如异源核酸序列)的双链多核苷酸、随后如本文所述连接自由的3'和5'端来产生封闭端DNA载体的体外合成产生方法，但本领域普通技术人员知道可以如上所示修饰双链DNA多核苷酸分子，使得产生任何期望的封闭端DNA载体，包括但不限于狗骨DNA、哑铃DNA等。能够利用实施例2中所述的合成产生方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA载体论述于标题为“III.通用ceDNA载体”的章节中。由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白描述于标题为“IIC.由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白”的章节中。
所述方法包括(i)从双链DNA构建体中切除编码表达盒的序列和(ii)在一个或多个ITR处形成发夹和(iii)通过接合(例如通过T4 DNA连接酶)将自由的5'与3'端连接。
双链DNA构建体按5'到3'的顺序包含：第一限制性核酸内切酶位点；上游ITR；表达盒；下游ITR；第二限制性核酸内切酶位点。然后使双链DNA构建体与一种或多种限制性核酸内切酶接触以在两个限制性核酸内切酶位点处产生双链断裂。一种核酸内切酶可以靶向两个位点，或者每个位点可以被不同的核酸内切酶靶向，只要限制性位点不存在于ceDNA载体模板中。这从双链DNA构建体的其余部分切除了限制性核酸内切酶位点之间的序列(参见PCT/US19/14122的图9)。接合后，形成封闭端DNA载体。
所述方法中使用的一个或两个ITR可以是野生型ITR。也可以使用经修饰的ITR，其中所述修饰能够包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代(参见例如PCT/US19/14122的图6-8和10；图11B)，并且可以具有两个或更多个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图6-8；图11B)或单个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图10A-10B、图11B)。通过对现有寡核苷酸进行基因修饰或通过重新生物学和/或化学合成能够产生发夹环经修饰的ITR。
在一个非限制性示例中，左和右ITR-6(SEQ ID NO:111和112)在B-B'和C-C'臂中包括来自AAV2的野生型ITR的40个核苷酸的缺失。经修饰的ITR中剩余的核苷酸预测可形成单个发夹结构。展开结构的吉布斯自由能(Gibbs free energy)是约-54.4千卡/摩尔。还可以对ITR产生其它修饰，包括功能Rep结合位点或Trs位点的任选缺失。
实施例3：通过寡核苷酸构建来产生ceDNA
使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实例3中，其中ceDNA载体是通过合成5'寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122的图11B显示了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。
如本文所公开，ITR寡核苷酸能够包含WT-ITR(参见例如图2A、图2C)，或经修饰的ITR(参见例如图2B和图2D)。(还可参见例如PCT/US19/14122(全文并入本文)的图6A、图6B、图7A和图7B)。示例性ITR寡核苷酸包括但不限于SEQ ID NOS:134-145(例如，参见PCT/US19/14122的表7)。经修饰的ITR可以包含形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中相对于野生型ITR的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。用于无细胞合成的包括如本文所述的WT-ITR或经修饰ITR的ITR寡核苷酸可通过遗传修饰或生物学和/或化学合成产生。如本文所讨论的，实例2和3中的ITR寡核苷酸可以包括如本文所讨论的对称或非对称构型的WT-ITR或经修饰ITR(modified ITR/mod-ITR)。
实施例4：通过单链DNA分子产生ceDNA
PCT/US19/14122的实例4中提供了使用合成方法产生ceDNA载体的另一个示例性方法，所述方法使用包括两个有义ITR的单链线性DNA，所述有义ITR侧接于有义表达盒序列并共价连接到两个反义ITR，所述反义ITR侧接于反义表达盒，然后将其单链线性DNA的末端接合，以形成封闭端单链分子。一个非限制性示例包括合成和/或产生单链DNA分子、使所述分子的各部分粘接以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子，然后使自由的5’与3’端彼此接合以形成封闭的单链分子。
用于产生ceDNA载体的示例性单链DNA分子从5'到3'包含：第一有义ITR；有义表达盒序列；第二有义ITR；第二反义ITR；反义表达盒序列；以及第一反义ITR。
用于实施例4的示例性方法的单链DNA分子可以通过本文所描述的任何DNA合成方法形成，例如体外DNA合成，或通过用核酸酶使DNA构建体(例如质粒)裂解并将所得的dsDNA片段解链以提供ssDNA片段来提供。
通过将温度降低到低于有义和反义序列对的所计算的解链温度可以实现粘接。解链温度取决于特定核苷酸碱基含量和所用溶液的特征，例如盐浓度。任何给定序列的解链温度和溶液组合容易由所属领域的普通技术人员计算出。
退火分子的游离5'和3'端可以彼此接合，或接合到发夹分子上以形成ceDNA载体。适合的示例性接合方法和发夹分子描述于实例2和3中。
实施例5：ceDNA的纯化和/或产生确认
通过本文所述方法(例如，包括实施例1中所述的基于昆虫细胞的产生方法或者实施例2-4中所述的合成产生方法)产生的任何DNA载体产物可以使用技术人员通常已知的方法加以纯化，例如以去除杂质、未使用的组分或副产物；并且/或者可以加以分析，以确认所产生的DNA载体(在这种情况下是ceDNA载体)是期望的分子。用于纯化DNA载体(例如，ceDNA)的示例性方法是使用Qiagen Midi Plus纯化方案(Qiagen)和/或凝胶纯化。
以下是用于确认ceDNA载体身份的示例性方法。
可以通过如图3D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
分离出的ceDNA载体的结构进一步如下分析：用根据以下所选的限制核酸内切酶消化经纯化的DNA：a)ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得片段当在0.8％变性琼脂糖凝胶上分级分离时大得足以清晰可见(>800bp)。如图3C和3D中所说明，具有非连续结构的线性DNA载体和具有线性连续结构的ceDNA载体能够根据其反应产物的尺寸区分，举例来说，具有非连续结构的DNA载体预期产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的ceDNA载体预期产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图3E)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管所属领域的普通技术人员将了解，对这个实例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR纯化试剂盒或脱盐“离心柱”(例如，GE HEALTHCARE ILUSTRATM MICROSPINTM G-25柱)是用于内切核酸酶消化的一些本领域已知的选择。所述分析包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)加入10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mM EDTA)，加入10X染料，不进行缓冲，并与通过添加入10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。所属领域的普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和，并转移到蒸馏水或含1xSYBR金的1x TBE/TAE中。然后，可以用例如Thermo Fisher的金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和辐射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。前述基于凝胶的方法通过从凝胶色带中分离出ceDNA载体且允许其复性而能够根据纯化目的调整。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。举例来说，若基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，则存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
实施例6：ceDNA FVIII构建体和方法
全长未修饰的FVIII在其在基因疗法应用中具有许多挑战。FVIII在异源系统中表现不佳，并且与类似大小的蛋白质相比显示出较差的表达。已经表明，FVIII的低效分泌会导致细胞应激，FVIII的非活性和活性形式都具有较短的半衰期，并且FVIII在循环中表现不佳。此外，已经表明FVIII具有高度免疫原性。如通过活性FVIIIa处理的FVIII结构域的示意图在图9中示出。
以下实施例描述了在流体动力学和脂质纳米粒子施用后显示表达和活性的ceDNAFVIII构建体的制备和测试。
图5是ceDNA 1638构建体的注释示意图。图6是ceDNA 1652构建体的注释示意图。图7是ceDNA 1923构建体的注释示意图。图8是ceDNA 1373内含子的注释示意图。
在实施例7-实施例16中描述的研究中使用以下ceDNA FVIII构建体。
表20：ceDNA构建体概述
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图10是详述将内含子插入FVIII ORF中的方法的示意图。将具有功能性剪接供体和受体位点的嵌合FVIII内含子在内含子1的天然位置处插入密码子优化的FVIII ORF中。用来源于FVIII Wt cDNA序列的内含子侧接区(33bp)取代FVIII CDS中的密码子优化序列。
图11是详述将内含子插入FVIII ORF ceDNA 1373中的方法的示意图。将具有功能性剪接供体和受体位点的嵌合FVIII内含子在内含子1的天然位置处插入密码子优化的FVIII ORF中。将增强子元件插入嵌合内含子的5p与3p区域之间。
图12A-图12B是详述用异源分泌信号序列取代天然FVIII信号序列的方法的示意图。图12A显示了用天然FVIII信号序列取代来自胰凝乳蛋白酶原(CHY-SSv1)ORF的信号序列。显示了FVIII成熟肽。图12B显示了FVIII N末端的序列，显示了信号序列和成熟肽切割位点。
使用以下测定进行筛选以确定FVIII活性：
体外筛选测定：
使用Lipofectamine p3000(Thermofisher目录号：L3000001)，转染前24小时：将HepG2细胞以20,000个细胞/孔的密度(每个孔中100uL＝200,000个细胞/mL)铺在96孔胶原包被的板中。在转染的当天，更换所有含细胞的孔中的培养基。
如下制备Lipofectamine稀释液：0.3uL lipofectamine3000试剂+10uL Opti-MEM(每孔)
如下制备P3000稀释液：10uL Opti-MEM+0.4uL p3000(每孔)将800ng DNA铺在96孔制备板的单个孔中。
将21uL L3000稀释液和21uL P3000稀释液添加到每个含DNA的孔中，并轻轻混合，随后在室温(RT)下孵育15分钟。将10uL/孔的L3000和P3000混合物一式三份地添加到细胞中，随后在37℃、5％CO2、潮湿空气中孵育72小时。
转染后72小时，将上清液培养基收集到2X 96W储存板的等体积等分试样中，并立即冷冻或用于Chromogenix FVIII活性测定。
Chromogenix FVIII活性测定：
如下进行测定FVIII活性得显色测定：在使用前使试剂盒组分从4℃适应至室温。用无菌水重构冻干的试剂盒组分：3mL/因子试剂(绿盖)和6mL/S-2765+I-2581试剂(白盖)。用1mL无菌水重构Technoclone凝血参考品，并在使用前在摇床上缓慢混合15分钟。如下稀释样品：在96W块中，5uL样品+400uL缓冲液。
如“延伸曲线”选项卡所示，在96W块中制备标准品(凝血参考品)。使用125uLVoyager移液管将样品和标准品铺在384W板上：各10uL。将来自试剂盒的重构的因子试剂(绿盖)和S-2765+I-2581(白盖)在37℃下预热。将板在37℃下孵育4分钟。
接下来，使用50uL移液管将10uL因子试剂添加到每个孔中，在行添加之间留出10秒以维持孵育时间。将板在37℃下孵育4分钟。使用50uL移液管将10uL S-2765+I-2581添加到每个孔中，在行添加之间留出10秒以维持孵育时间。将板在37℃下孵育10分钟。使用50uL移液管将10uL乙酸(20％)作为终止溶液添加到每个孔中，在行添加之间留出10秒以维持孵育时间。在M3上在405nm下读取板吸光度。
如下进行分析：在M3上读取后，将数据输出到Excel进行处理。将所有原始吸光度值归一化为0IU/mL标准孔(计算2个孔的平均值，然后从每个其他孔值中减去平均值)。将归一化值插入GraphPad Prism XY表格式中。将FVIII标准品的IU/mL值与它们的归一化吸光度值相加。添加未知物-样品名称和归一化吸光度值。
如下处理数据：“转化浓度(x)”à转化为log(log(10))；XY分析“非线性回归(曲线拟合)”à“不对称5参数，X是log(浓度)；转到“内插X平均值”选项卡à分析à转换à标准函数和“使用：Y＝10^Y转换Y值”并勾选“创建新的结果图”；这给出了未知物(样本品)的处理和内插的IU/mL值。
实施例7：在雄性FVIII敲除小鼠中确定流体动力学ceDNA递送后的FVIII表达的研 究
将核酸引入啮齿动物中的肝脏的熟知的方法是通过流体动力学尾静脉注射。在此系统中，大量未囊封核酸的加压注射导致细胞通透性的瞬时增加，并直接递送到组织和细胞中。这提供了绕过许多宿主免疫系统(诸如巨噬细胞递送)的实验机制，提供了在没有这种活性的情况下观察递送和表达的机会。
使用流体动力学递送系统来测试表达FVIII的各种ceDNA载体对血清FVIII水平的影响，其中在血清中检测到FVIII表明ceDNA载体能够在注射后表达FVIII。
采用如实施例6中所述的ceDNA载体。ceDNA构建体的SEQ ID NO在表18中示出，并且构建体的描述在表20中提供。用于每个研究的测试材料在下表21-23中示出。
表21：研究1
表22：研究2
表23：研究3
测试制品以浓缩原液供应，并储存在标称4℃下。制剂不涡旋或离心。各个组通过手术室中通风架上的接触垫料安置在透明的聚碳酸酯笼中。随意向动物提供用1N HCl酸化至目标pH 2.5-3.0的食物和过滤自来水。如下表24-26中所示在中期和终末时间点收集血液。
表24：研究1和2中期和终末收集
/>
表25：研究3血液收集(中期)：组1-10中的所有动物在第1天、测试材料给药后24小 时(±5％)进行中期血液收集
表26：研究3终末收集
MOV＝最大可获得体积。
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：来自Jackson Laboratories的FVIII KO(B6；129S-F8<tm1Kaz>/J)小鼠(N＝40+4只备用，雄性，到达时为约4周龄)。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5-6小时和约24小时进行临床观察。
体重：在第0、3和7天记录所有动物的体重，包括在安乐死之前。
剂量配方：测试制品以浓缩原液形式供应。原液在使用前立即用PBS稀释。如果不立即进行给药，则将制备好的材料储存在～4℃(或湿冰上)。
剂量施用：测试材料在第0天通过流体动力学IV施用经由侧尾静脉(在5秒内给药)给药，每只动物的设定体积为90-100ml/kg(取决于组中最轻的动物)。每次采集后，动物皮下注射0.5–1.0mL乳酸林格氏液。对于血浆收集，按照设施SOPS在麻醉下通过眼眶窦穿刺将全血收集到未包被的Eppendorf式样管中。立即取出120μL并放入含有13.33μL 3.2％柠檬酸钠的试管中。轻轻混合血液并保持室温直至处理为止。全血样品在环境条件(20-25℃)下以2,000g离心15分钟。血浆样品被取出，避免细胞堆积。制备一(1)个等分试样，并注意全血样品中的任何凝结或血浆中的溶血。将样品储存在标称-70℃下直至分析。
麻醉恢复：在麻醉状态下、恢复期间和直到移动时，连续监测动物。
安乐死和终末血液采集：在第7天，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。通过心脏穿刺收集最大可获得的血量并处理成血浆。没有收集其他组织。
对于血浆收集，通过注射器收集全血，并立即将600μL放入含有66.66μL 3.2％柠檬酸钠的试管中。轻轻混合血液并保持室温直至处理为止。全血样品在环境条件(20-25℃)下以2,000g离心15分钟。取出血浆样品，避免细胞堆积，并制备三(3)个等分试样。注意全血样品中的任何凝结或血浆中的溶血。将所有血浆样品储存在标称-70℃下，直至装运以进行分析。
结果：图13显示了本文所述的构建体的B结构域选择的示意图。简言之，优先在临床使用中选择FVIII蛋白序列，以最小化免疫原性风险。通过ELISA和显色测定分析(数据未显示)，发现FVIII-SC是一种有利的FVIII蛋白序列。在FVIII-SC中，重链和轻链共价连接，并且该构建体显示出对von Willbrand因子(VFW)的亲和力增加，从而减少与抗原呈递细胞(APC)结合，从而提高体外稳定性和免疫原性。
在ELISA测定方法与显色测定之间进行了比较，以确定一种方法在确定FVIII活性方面是否产生比另一种方法更可靠的结果。具体地，发现用于测量WT小鼠中血浆人FVIII的ELISA低估了具有短的或缺失的B结构域的构建体的FVIII活性(SQ和SC-1373[SC/F309S])。然而，在ELISA与仅具有活性的v226构建体之间发现了良好的一致性(1270[v226/F309S])。因此，得出的结论是，在使用ELISA测定的研究(CD-1或C57bl/6小鼠中的流体动力学研究)中只能在具有相同B结构域的构建体之间进行比较，但是在具有不同类型B结构域或不同优化序列的构建体之间进行比较。显色测定似乎提供了更一致的结果。示例性结果在图14中示出。
实施例8：在雄性CD-1和FVIII KO小鼠中确定流体动力学ceDNA递送后的FVIII表 达的研究
使用流体动力学递送系统来测试表达FVIII的各种ceDNA载体对血清FVIII水平的影响，其中在血清中检测到FVIII表明ceDNA载体能够在注射后表达FVIII。
采用如实施例6中所述的ceDNA载体。ceDNA构建体的SEQ ID NO在表18中示出，并且构建体的描述在表20中提供。用于研究的测试材料在下表27中示出。
表27：研究4
No.＝数目；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；min＝分钟；hr＝小时
测试制品以浓缩原液供应，并储存在标称4℃下。制剂不涡旋或离心。各个组通过手术室中通风架上的接触垫料安置在透明的聚碳酸酯笼中。随意向动物提供用1N HCl酸化至目标pH 2.5-3.0的食物和过滤自来水。如下表28中所示在中期和终末时间点收集血液。
表28：研究4终末收集
/>
MOV＝最大可获得体积
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：来自Jackson Laboratories的FVIII KO(B6；129S-F8<tm1Kaz>/J)小鼠(N＝40+4只备用，雄性，到达时为约4周龄)。CD-1，22加1只备用。到达时为4周龄。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
剂量配方：测试制品以浓缩原液形式供应。原液在使用前立即用PBS稀释。如果不立即进行给药，则将制备好的材料储存在～4℃(或湿冰上)。
剂量施用：测试材料在第0天通过流体动力学IV施用经由侧尾静脉(在5秒内给药)给药，每只动物的设定体积为90-100ml/kg(取决于组中最轻的动物)。
通过注射器仅收集组1-14的全血，并立即将600μL放入含有66.66μL3.2％柠檬酸钠的试管中。轻轻混合血液并保持室温直至处理为止。全血样品在环境条件(20-25℃)下以2,000g离心15分钟。取出血浆样品，避免细胞堆积，并制备三(3)个等分试样。注意全血样品中的任何凝结或血浆中的溶血。
将所有血浆样品储存在标称-70℃下，直至分析。
灌注：放血后，所有动物(包括组15)都接受生理盐水心脏灌注。简而言之，通过将连接到含有盐水的10mL注射器的23/21号针头插入左心室腔进行灌注来进行全身心内灌注。切开右心房，为灌注液提供引流口。在将针头定位在心脏后，对柱塞施加温和而稳定的压力以灌注动物。确保冲洗液充分的流动，直到流出的灌注液流动清澈(没有可见的血液)，表明冲洗液已经浸透了身体并且该程序完成。
组织收集：在安乐死、放血和灌注后，收获肝脏并记录整个器官重量。组15不需要整个器官重量。
组1-14组织规格-来自从肝脏：收集4个约20-30mg切片(≤30mg)并称重。丢弃任何剩余的肝脏。将称重的切片单独快速冷冻，储存在标称-70℃下，直至装运。
组15组织规格：将整个肝脏放入冷PBS中。将样品储存在湿冰上。
使用上面所示的方案进行并重复类似的实验。测试制品缺失B结构域(SQ)，如692、693、694；或者v226/F309S，如1270和1391；单链F309S，如1367和1373；单链FVIII，如1368和1374，如表18和表20中所述。
结果：测试了FVIII ceDNA构建体的各种B结构域和分泌突变体组合表达功能性FVIII蛋白的能力。如图15所示，具有SC和任选F309S的FVIII构建体在体外和体内显示出一致的高表达(参见例如ceDNA1368、ceDNA1373和ceDNA1374)。
实施例9：在雄性CD-1小鼠中确定流体动力学ceDNA递送后的FVIII表达的研究
使用流体动力学递送系统来确定使用具有各种元件的FVIII ceDNA构建体进行ceDNA递送后的FVIII表达(例如，测试不同的3'UTR、启动子-增强子组合、内含子对FVIII表达的影响)。采用如实施例6所述的ceDNA载体。ceDNA构建体的SEQ ID NO在表18中示出，并且构建体的描述在表20中提供。用于研究的测试材料在下表29-30中示出。
表29：研究5
表30：研究6
物种(数量、性别、年龄)：CD-1，40加4只备用。到达时为4周龄。
其余研究详情类似于上述实施例8和9中提供的那些。进行并重复类似的实验以测试启动子-增强子组的各种组合、内含子、3'-UTR对FVIII蛋白表达的影响。所测试的元件如下：
图20显示了具有以下启动子组的ceDNA的FVIII表达结果：
1x hSerpEnh_VD_PromoterSet(1x SerpEnh)
SC：1362、1368、1374、1918、1919、1920、1921、1922、1923、1593、1602
SC/前导序列：1579、1582、1585、1598、1611、1612、1615、1616
SC/F309S：1367、1373、1700、1701、1708、1712、1725、1930、1931、1710
v226/F309S：1270、1391、1740、1741、1742、1743、1744
3x hSerpEnh_VD_PromoterSet
SC：1655
v226/F309S：1375、1381
3x hSerpEnh_VD_PromoterSet(5’UTR变体)
SC：1652
SC/F309S：1657
3x hSerpEnh_VD_TTRe_PromoterSet
SC：1649、1651、1838、1840、1841
SC/F309S：1648
v226/F309S：1647
3x hSerpEnh_VD_TTRe_PromoterSet_v2
SC：1668
SC/F309S：1886
3x SerpEnh_VD_TTRe_PromoterSet_v2*
SC/F309S：1664
CpGmin_hAAT_Promoter_Set
SC/F309S：1632、1637、1638、1645、1646、1620、1622、1627、1636、1628
3xSerpEnh-TTRm
v226/F309S：1377、1378
hAAT(979)_PromoterSet
v226/F309S：1387
TTR_liver_specific_Promoter
SC/F309S：1695、1696
hFIX_Promoter
SC/F309S：1574
CpGfree20mer_1、5xHNF1_ProEnh_10mer、3xhSerpEnh_VD_TTRe_PromoterSet_v2
SC/F309S：1572
图21显示了具有以下内含子的ceDNA的FVIII表达结果：
miniF8_50/100：1700、1725
miniF8_200/200：1701、1712
miniF8_500/500：1708
HBB_intron1：1695
图19显示了具有以下3'UTR的ceDNA的FVIII表达结果：
WPRE_3pUTR,bGH：所有测试的构建体
HBBv3_3pUTR,SV40_polyA：
CpGmin_hAAT,SC/F309S：1632(1622)、1636(1627)、1637(1627)、1638(1628)
hAAT(979),v226/F309S：1387(无)
SV40_polyA：
CpGmin_hAAT,SC/F309S：1645(1622)
HBBv3_3pUTR：
CpGmin_hAAT,SC/F309S：1646(1622)
3xSerpEnh-TTRm_MVM_intron,v226/F309S：1377(无)
bGH：
3x hSerpEnh_VD,v226/F309S：1375(1381)
HBBv2_3pUTR,bGH：
3xSerpEnh-TTRm_MVM_intron,v226/F309S：1378
图24显示了具有以下前导序列(及其位置)的ceDNA的FVIII表达结果：
白蛋白：1611、1579
Gaussia：1598、1582
Secrecon：1616、1585
胰凝乳蛋白酶原：1612
Lonza：1615、1602
CD33：1593
DTS
5'DTS_primer_pad||5x_kB_mesika_DTS||3'DTS_primer_pad：
3pUTR后：1740
启动子前：1742
CpGfree20mer_1||SV40DNA_DTS_72bpTandemRepeat||CpGfree20mer_2||SV40DNA_DTS_72bpTandemRepeat||CpGfree20mer_3||SV40DNA_DTS_72bpTandemRepeat||CpGfree20mer_4||SV40DNA_DTS_72bpTandemRepeat||CpGfree20mer_5||SV40DNA_DTS_72bpTandemRepeat：
3pUTR后：1741
启动子前：1743
CpGfree20mer_1,CBX3(674mut1)||20mer_16
3pUTR后：1744(也具有5pUTR–1738是比较物)
结果：图19显示了在1622、1632、1645、1646、1627、1636、1637、1628、1638、1382、1375、1377、1378和1387中具有各种3pUTR的ceDNA的FVIII表达结果以及对血浆FVIII浓度(IU/ml)的影响。还进行了上述研究，部分是为了测试各种启动子和增强子组合以及它们对血浆FVIII浓度的影响。图20描述了所采用和测试的各种启动子和启动子/增强子组合。图21显示了体外和体内1367、1700、1701、1695、1373、1708、1725、1712中的内含子组合的结果。图23显示了具有DNA核靶向序列(DTS)的ceDNA的FVIII表达及其对FVIII表达的影响的结果。图24显示了具有前导序列变异对FVIII表达的影响的结果。
实施例10：在雄性C57Bl/6小鼠中评价通过IV递送的ceDNA制剂的研究
进行以下研究以确定IV注射LNP配制的ceDNA后的蛋白表达。将ceDNA1270配制在两种不同的LNP组合物中(LNP制剂1：可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG-GalNAc4(47.5:10.0:39.2:3.3)(命名为“DP#1”)；以及LNP制剂2：可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG2000-GalNAc4(47.3:10.0:40.5:2.3)(命名为“DP#2”)。在第0天通过静脉内给药将一定剂量的测试材料施用到外侧尾静脉中。剂量以5mL/kg的剂量体积施用。将剂量四舍五入到最接近的0.01mL。用于研究的测试材料在下表31和表32中示出。表达因子IX的ceDNA(ceDNA-FIX)用作独立对照。
表31
表32
物种(数量、性别、年龄)：C57Bl，6.30加3只备用。到达时为6周龄。其余研究详情类似于上述实施例8和9中提供的那些。
在第0天(给药后60-120分钟和工作日结束时(给药后3-6小时))和第1天(第0天测试材料给药后22-26小时)进行临床观察。每个例外都进行了额外的观察。
结果：向小鼠施用1mg/kg ceDNA1270的LNP制剂1(可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG-GalNAc4(47.5:10.0:39.2:3.3)(DP#1)或2mg/kg ceDNA 1270的LNP制剂2(可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG2000-GalNAc4(47.3:10.0:40.5:2.3)(DP#2)。图25显示了与用媒剂处理的小鼠相比，用ceDNA1270 LNP制剂处理的小鼠表现出增加的血浆FVIII，表明ceDNA LNP成功地靶向肝脏并整合到细胞中，引起FVIII蛋白的成功表达。
实施例11：在雄性FVIII KO小鼠中评价通过IV流体动力学递送的ceDNA制剂的研 究
进行以下研究以确定IV注射裸ceDNA构建体后的蛋白表达。ceDNA构建体的SEQ IDNO在表18中示出，并且构建体的描述在表20中提供。在第0天通过静脉内给药将一定剂量的测试材料施用到外侧尾静脉中。剂量以5mL/kg的剂量体积施用。将剂量四舍五入到最接近的0.01mL。用于研究的测试材料在下表33和表34中示出。
表33
No.＝数目；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；min＝分钟；hr＝小时
物种(数量、性别、年龄)：FVIII KO(B6；129S-F8<tm1Kaz>/J)，62加3只备用。到达时为4-8周龄。其余研究详情类似于上述实施例8和9中提供的那些。
在第0天(给药后60-120分钟和工作日结束时(给药后3-6小时))和第1天(第0天测试材料给药后22-26小时)进行临床观察。
结果：如图26所示，10天后，以所有测试剂量施用ceDNA1270、ceDNA1368、ceDNA1923或ceDNA1651构建体的小鼠显示出增加的血浆FVIII浓度。总之，增加的FVIII血浆浓度是剂量依赖性的。这些ceDNA构建体显示出血浆FVIII浓度从0.5mg/kg显著增加到2.0mg/kg。
实施例12：在雄性CD-1和FVIII KO小鼠中确定IV LNP:ceDNA递送后的FVIII转基 因表达的研究
本研究的目的是确定IV施用配制的ceDNA后的转基因表达。ceDNA构建体的SEQ IDNO在表18中示出，并且构建体的描述在表20中提供。用于研究的测试材料在下表34-37中示出。
表34：激酶抑制剂施用
表35：测试材料施用
No.＝数目；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；min＝分钟；hr＝小时
表36：血液收集(中期)：
表37：血液收集(终末)
MOV＝最大可获得体积
研究详情如下：
物种(数量、性别、年龄)：来自Jackson Laboratories的FVIII KO(B6；129S-F8<tm1Kaz>/J)小鼠(N＝16+2只备用，雄性，到达时为约4周龄)。CD1。16+2只备用，雄性。到达时为4周龄。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5-6小时和约24小时进行临床观察，适用于其余组。
体重：在第0、1、2、4、7和14天记录所有动物的体重。将重量四舍五入到最接近0.1g。按要求记录额外的重量。
剂量配方：测试制品(ceDNA)以浓缩原液形式以1.0mg/mL供应。将原液温热至室温并在使用前即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则可将制备好的材料储存在约4℃下。
抑制剂以每日准备给药等分试样的形式供应；在0.5％甲基纤维素中配制。在施用前混合(移液)和/或超声处理制剂以分布口服灌胃悬浮液的颗粒。
剂量施用：按照上述表1在第0天通过PO施用(口服灌胃)以10mL/kg给药抑制剂。在第0天ceDNA施用前30分钟(±5分钟)和给药后5小时(±10分钟)给药抑制剂。在第0天通过静脉内给药将测试材料的剂量施用到侧尾静脉中。剂量以5mL/kg的剂量体积施用。将剂量四舍五入到最接近的0.01mL。
血液收集：组1-8中的所有动物具有在第4、7和10天收集的中期血液。
对于血浆收集，按照设施SOPS在麻醉下通过眼眶窦穿刺将全血收集到未包被的Eppendorf式样管中。立即取出120μL并放入含有13.33μL3.2％柠檬酸钠的试管中。轻轻混合血液并保持室温直至处理为止。全血样品在环境条件(20-25℃)下以2,000g离心15分钟。血浆样品被取出，避免细胞堆积。制备两(2)个等分试样，并注意全血样品中的任何凝结或血浆中的溶血。
麻醉恢复：在麻醉状态下、恢复期间和直到移动时，连续监测动物。
安乐死和终末血液采集：在第14天，通过CO2窒息对动物实施安乐死，然后进行开胸手术和放血。
通过注射器收集全血，并立即将600μL放入含有66.66μL 3.2％柠檬酸钠的试管中。轻轻混合血液并保持室温直至处理为止。全血样品在环境条件(20-25℃)下以2,000g离心15分钟。取出血浆样品，避免细胞堆积，并制备三(3)个等分试样。注意全血样品中的任何凝结或血浆中的溶血。
将所有血浆样品储存在标称-70℃下用于分析。
结果：图16和图22显示了施用LNP:ceDNAFVIII-载体测试制品后11天的血浆FVIII浓度(IU/mL)，如图所示。如图所示，与第一代载体993相比，在来自用LNP:ceDNAFVIII-载体1270、1367、1368测试制品处理的小鼠的血浆样品中检测到高得多的FVIII。在仅用媒剂处理的小鼠中未观察到FVIII(未显示)。
实施例13：在雄性FVIII KO小鼠中确定流体动力学ceDNA递送后的FVIII表达的研 究
使用流体动力学递送系统来测定流体动力学注射ceDNA后的FVIII表达和活性。采用如实施例6中所述的ceDNA载体。ceDNA构建体的SEQ ID NO在表18中示出，并且构建体的描述在表20中提供。用于研究的测试材料在下表35中示出。
表38
No.＝数目；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；min＝分钟；hr＝小时
物种(数量、性别、年龄)：FVIII KO(B6；129S-F8<tm1Kaz>/J)。到达时为4-8周龄。
其余研究详情类似于上述实施例7和8中提供的那些。
结果：图17和图18显示了没有F309S突变的密码子优化的构建体(即1368及其变体诸如1923、1823、1840)提供了单链型式的FVIII(“SC”)蛋白表达的改善。在这些构建体中，1923显示出比其他密码子优化的SC FVIII ceDNA构建体始终更高的表达。
实施例14：在非人灵长类动物耐受性研究中评价LNP
本研究的目的是评价70分钟静脉内输注LNP配制的ceDNA对雄性猕猴的耐受性。ceDNA构建体的SEQ ID NO在表18中示出，并且构建体的描述在表20中提供。用于研究的测试材料在下表39中示出。含有因子IX表达盒的ceDNA用作独立对照。
表39
提供了以下研究详情：
动物：物种：食蟹猴；品系：猕猴；雄性数目：12；年龄：成年；研究状态：非原生；体重：约2-5kg；来源：Testing Facility群落。
剂量施用
预处理：在给药开始前30分钟(±3分钟)，向组1-8中的所有动物施用苯海拉明(5mg/kg，IV或IM)和地塞米松(1mg/kg，IV或IM)。
测试制品施用：在大约70分钟的时间内通过IV输注将测试材料施用于组1-8中受约束的动物。使用临时IV导管通过大隐静脉或头静脉施用剂量。在给药结束时用0.5mL盐水冲洗导管。根据最近的体重计算剂量体积，并四舍五入到最接近的0.1mL。IV施用的结束时间用于确定血液样品和尸体剖检收集时间点的目标时间。将注射位点、给药开始和结束时间记录在原始数据中。用不可擦除的墨水标记注射部位。
生活中的观察和测量
动物健康检查：每天进行至少两次动物健康检查，其中检查所有动物的一般健康状况。
临床观察：在给药前(第-1或1天)进行至少一次临床观察，此后在研究期间每天进行至少一次临床观察。
体重：在给药前第-1天和此后每周记录体重。将体重四舍五入到最接近的0.1kg。
体温：在给药前以及在给药后1、2、4和6小时记录所有动物的体温。
样品收集：从适当的外周静脉(不是用于给药的静脉)收集血液样品，如下表40所示。
表40
用于FVIII表达的血液收集
通过直接针刺入柠檬酸钠管中从外周静脉收集全血样品。轻轻混合血液并保持室温直至处理为止。在环境条件(20-25℃)下，尽快以2,000g离心全血样本15分钟。血浆样品被取出，避免细胞堆积。注意全血样品中的任何凝结或血浆中的溶血。将血浆样品储存在标称-80℃下，直至装运到申办方进行分析。
用于FIX表达的血液收集
通过直接针刺入柠檬酸钠管中从外周静脉收集全血样品。轻轻混合血液并保持室温直至处理为止。在环境条件(20-25℃)下，尽快以2,000g离心全血样本15分钟。血浆样品被取出，避免细胞堆积。
注意全血样品中的任何凝结或血浆中的溶血。将血浆样品储存在标称-80℃下，直至装运用于分析。
细胞因子分析
通过直接针刺入SST管中从外周静脉收集全血样品，并根据Testing FacilitySOP进行处理以获得血清。将血清样品储存在-80℃下，直至装运用于分析。
补体分析
通过直接针刺入K2EDTA管中从外周静脉收集全血样品，并根据Testing FacilitySOP进行处理以获得血浆。将血浆样品储存在-80℃下，直至装运用于分析。
肝酶分析
通过直接针刺入SST管中从外周静脉收集全血样品，并根据Testing FacilitySOP进行处理以获得血清。由Testing Facility实验室使用Alfa Wassermann Ace Axcel分析血清样品的肝酶ALT、AST和CK。
凝血分析
通过直接针刺入柠檬酸钠管中从外周静脉收集全血样品，并根据TestingFacility SOP进行处理以获得血浆。如果在同一天装运，则将样品转移到湿冰上，或者将样品储存在-80℃下，直至转移到IDEXX Corp用于PTT、aPTT和纤维蛋白原的分析。
用于qPCR的全血
通过直接针刺入K2EDTA管中从外周静脉收集全血样品，并将其储存在4℃下，直至装运到LakePharma。收集第14天的样品，但不处理，除非修正案指示。
尸体解剖和组织收集
qPCR：
从所有动物收集以下组织的两组六个样品(每个组织共12个样品)用于qPCR(收集部位如下概述)。仅评价24小时样品的qPCR，收集第14天的样品，但不处理。
每个样品的重量至少为25mg(优选50mg，记录重量)，并将其在液氮中快速冷冻并储存在标称-80℃下，直至分析。
心脏：从左心室收集样品。
肾脏：右肾和左肾均一分为二，一半用于组织学，另一半快速冷冻用于qPCR样品。
肝脏：从动物的一致区域收集样品。
肺：处理左叶用于组织学，快速冷冻右叶用于qPCR样品。
脾脏：从动物的一致区域收集样品。
ISH
对于所有动物，收集剩余的肝脏和脾并放入单独标记的盒(大小适合盒)中，然后放入10％NBF中。仅评价24小时样品的ISH，收集第14天的样品，但不处理。
组织病理学组织处理
对于仅在第14天实施安乐死的动物，将剩余的肝脏和脾脏处理至载玻片阶段以进行石蜡包埋、H&E染色。处理载玻片，然后装运用于ISH染色和显微镜评价。
实施例15：猕猴中脂质纳米粒子制剂的14天单次剂量静脉内输注毒性研究
本研究的目的是测定在向雄性猕猴IV施用LNP配制的ceDNA后单次IV剂量的脂质纳米粒子ceDNA转基因表达的毒性作用。ceDNA构建体的SEQ ID NO在表18中示出，并且构建体的描述在表20中提供。用于研究的测试材料在下表41中示出。通过静脉内输注(70分钟±10分钟)向隐静脉(如果必要，使用头静脉或尾静脉)给药，以0.42mL/kg/hr给药15分钟，然后递增到4.59mL/kg/hr，持续55分钟。延长输注和递增给药速率设计对于预防/减轻输注反应是必要的。将给药的第一天称为第1天。在第1天执行给药一次并且进行15天。
在输注开始之前，用大致2mL无菌盐水冲洗导管。接下来，以0.42毫升/千克/小时施用给药配制物，持续前15分钟(靶时间)。停止输注泵，重新编程以输注剩余剂量持续4.59毫升/千克/小时的输注速率，持续输注的剩余的55分钟(靶时间)。在剂量施用之后通过导管施用大致1.0mL无菌盐水冲洗液。
表41.
a基于最近的体重测量结果。给药的第一天基于第1天体重。
b为了缓解潜在输注反应，在输注开始之前大致30±5分钟用苯海拉明(diphenhydramine)和地塞米松(dexamethasone)预治疗所有动物。另外，所有动物在输注后大致4小时±10分钟接受第二剂量的苯海拉明和地塞米松。苯海拉明以0.1ml/kg的剂量体积以肌肉内注射的形式施用以实现5mg/kg/剂量的剂量水平。地塞米松以0.25ml/kg的剂量体积以肌肉内注射的形式施用以实现1mg/kg/剂量的剂量水平。
图25显示了在小鼠和非人灵长类动物(NHP)中使用本文公开的各种ceDNA载体来表达FVIII蛋白的体内研究的结果，如实施例10、15和16中所描述的。向非人灵长类动物(NHP)施用1mg/kg ceDNA 1270的LNP制剂1(可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG-GalNAc4(47.5:10.0:39.2:3.3)(DP#1)或2mg/kg ceDNA 1270的LNP制剂2(可电离脂质:DSPC:胆固醇:PEG-脂质+DSPE-PEG2000-GalNAc4(47.3:10.0:40.5:2.3)(DP#2)。如图25所示，观察到与对照(媒剂)相比，在实施例14(对于DP#1)和15(对于DP#2)中所述的研究中，血浆FVIII浓度(IU/ml)在NHP中增加，表明本文公开的LNP配制的FVIII ceDNA构建体可以被有效地递送和表达以增加血浆FVIII蛋白水平，甚至在可能表现出针对人FVIII的中和抗体反应水平升高的非人灵长类动物中。
图27描绘了显示与ceDNA构建体1651中的3x人丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(其FVIII表达由3x VD启动子组驱动)相比使用3x hSerpEnh的各种间隔子变体(2-mer和11-mer)和丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子序列变体(例如，婴猴丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子和树鼩丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子)的FVIII表达水平的图表。这些构建体是相同的，除了hSerpEnh的间隔子(间隔子变体)或SerpEnh序列(来自婴猴和树鼩的SerpEnh变体)。在第0天将一个剂量的50ng含有FVIII ceDNA序列的质粒流体动力学注射到Rag2小鼠的尾静脉中，在第3天(给药后约72小时)进行单次血液收集，随后进行FVIII活性测量。如图27所示，与具有3x VD启动子组和单个核苷酸间隔子的对照构建体相比，具有3x h丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子和放置在每个hSerpEnh之间的两个核苷酸的间隔子(“2mer”间隔子)的FVIII构建体显示出更高的FVIII表达水平。令人惊奇的是，与1个核苷酸间隔子或5个核苷酸间隔子相比，具有11个核苷酸间隔子(3xhSerpEnh_11mer_spacers_v3)的构建体表现出增加水平的FVIII表达(数据未显示)。此外，与3x人丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(即，3x VD启动子组)相比，婴猴丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子序列以及树鼩丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子序列的三个重复序列驱动更高水平的FVIII表达，表明这些保守的同源增强子序列可能对肝脏中的FVIII转录具有积极影响。
图28描绘了显示来自体内研究的结果的图表，其中用合成制备的FVIII-ceDNA分子流体动力学注射C57BL/6J小鼠，并且在第3天在经处理的小鼠的血清中测量FVIII活性。ceDNA构建体是：(1)ceDNA构建体10(野生型左ITR:左ITR间隔子:3x hSerpEnh VD启动子组:小鼠TTR 5'UTR:MVM内含子:hFVIII-F309S_BD226seq124-BDD-F309 ORF，其与ceDNA1651的ORF序列相同):WPRE_3pUTR:bGH:右ITR间隔子:野生型右ITR；(2)ceDNA构建体60，其与ceDNA构建体10基本上相同，除了它含有3x_hSerpEnh-2mer spacer v17外；(3)ceDNA构建体61，其与ceDNA构建体10基本上相同，除了它含有3x_SerpEnh_11-mer_spacers_v3外；(4)ceDNA构建体62，其与ceDNA构建体10基本上相同，除了它具有3x_Bushbaby SerpEnh和腺嘌呤(A)间隔基(“Aspacers”)外；以及(5)ceDNA构建体39，其与ceDNA构建体10基本上相同，除了它含有截短的右ITR外。与图27中的观察结果一致，与驱动FVIII表达的3x VD相比，具有含11mer间隔子的3x人丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(3xhSerpEnh_11mer_spacers_v3)和3x婴猴丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(3xBushbaby_Aspacers)的ceDNA构建体在ceDNA平台中表现出等效或更优的表达谱(参见图27)。
ceDNA构建体10含有野生型左ITR:左ITR间隔子:3x hSerpEnh VD启动子组:小鼠TTR5'UTR:MVM内含子:hFVIII-F309S_BD226seq124-BDD-F309 ORF(与ceDNA 1651的ORF序列相同)：
(1)WPRE_3pUTR:bGH:右ITR间隔子:野生型右ITR如下所示：
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(SEQ ID NO:642)
(2)ceDNA构建体60含有3x_hSerpEnh-2mer spacer v17
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(3)ceDNA构建体61含有3x_SerpEnh_11-mer_spacers_v3
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(4)ceDNA构建体62含有具有腺嘌呤(A)间隔子的3x_Bushbaby SerpEnh (“3xBushbaby_Aspacers”)。
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(5)ceDNA构建体39具有与ceDNA构建体10基本相同的序列，除了含有截短的右ITR 外。
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参考文献
在本说明书和本文的实施例中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，都全文以引用的方式并入本文中，如同每个单独的出版物或参考文献被明确且单独地指出像充分阐述一样，以引用的方式并入本文中一般。本申请要求优先权的任何专利申请也以上述针对出版物和参考文献的方式以引用方式并入本文中。

Claims (117)

1.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，所述ceDNA载体包含：
在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列，其中至少一个核酸序列编码至少一种FVIII蛋白，其中编码至少一种FVIII蛋白的所述至少一个核酸序列选自与表1A中所示的任何核酸序列(SEQ ID NO:71-183、556和626-633)具有至少85％同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含与编码至少一种FVIII蛋白的所述至少一个核酸序列可操作地连接的启动子或启动子组。
3.根据权利要求2所述的ceDNA载体，其中所述启动子选自由以下项组成的组：人a1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、最小运甲状腺素蛋白启动子(TTRm)、hAAT_core_C06、hAAT_core_C07、hAAT_core_08、hAAT_core_C09、hAAT_core_C10和hAAT_core_truncated。
4.根据权利要求2所述的ceDNA载体，其中所述启动子选自与SEQ ID NO:210-217中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
5.根据权利要求2所述的ceDNA载体，其中所述启动子组包含包括增强子和核心启动子而没有5pUTR的合成肝特异性启动子组。
6.根据权利要求2所述的ceDNA载体，其中所述启动子组选自与SEQID NO:184-197、400、401和484中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含增强子。
8.根据权利要求7所述的ceDNA载体，其中所述增强子选自由以下项组成的组：丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(SerpEnh)、运甲状腺素蛋白(TTRe)基因增强子(TTRe)、肝核因子1结合位点(HNF1)、肝核因子4结合位点(HNF4)、人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子(ApoE_Enh)、来自前白蛋白基因的增强子区(ProEnh)、ApoE_Enh的CpG最小化型式(人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子)(ApoE_Enh_C03、ApoE_Enh_C04、ApoE_Enh_C09和ApoE_Enh_C10)和嵌入GE-856中的肝核因子增强子阵列(Embedded_enhancer_HNF_array)。
9.根据权利要求8所述的ceDNA载体，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含与SEQID NO:198至少85％相同的核酸序列。
10.根据权利要求7所述的ceDNA载体，其中所述增强子选自与SEQ ID NO:198-209、485和557-616中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
11.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含5'UTR序列。
12.根据权利要求11所述的ceDNA载体，其中所述5'UTR序列选自与表10中的任何序列具有至少85％同一性的序列。
13.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含内含子序列。
14.根据权利要求13所述的ceDNA载体，其中所述内含子序列选自与表11中的任何序列具有至少85％同一性的序列。
15.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含外显子序列。
16.根据权利要求15所述的ceDNA载体，其中所述外显子序列选自与表12中的任何序列具有至少85％同一性的序列。
17.根据权利要求1中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含3'UTR序列。
18.根据权利要求17所述的ceDNA载体，其中所述外显子序列选自与表13中的任何序列具有至少85％同一性的序列。
19.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个poly A序列。
20.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含一个或多个DNA核靶向序列(DTS)。
21.根据权利要求20所述的ceDNA载体，其中所述DTS选自与表14中的任何序列具有至少85％同一性的序列。
22.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含以下项中的一种或多种：遍在染色质开放元件(UCOE)、Kozak序列、间隔子序列或前导序列。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个核酸序列是cDNA。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。
26.根据权利要求1-22中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称的或不对称的。
27.根据权利要求26所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称的或基本上对称的。
28.根据权利要求26所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是不对称的。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是野生型的，或者其中所述ITR中的两个都是野生型的。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。
31.根据权利要求1-29中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自相同病毒血清型。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个包含选自表2、表4A、表4B或表5中的序列的序列。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的至少一个由于影响所述ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而相对于野生型AAV ITR序列改变。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来源于选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是合成的。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个不是野生型ITR，或者其中所述ITR中的两个都不是野生型的。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个通过选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的ITR区中的至少一个中的缺失、插入和/或取代而被修饰。
38.根据权利要求37所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
39.根据权利要求1-37中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个通过使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的全部或部分发生缺失的缺失、插入和/或取代而被修饰。
40.根据权利要求1-37中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个通过使得通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的全部或部分发生缺失的缺失、插入和/或取代而被修饰。
41.根据权利要求1-37中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个通过使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的部分发生缺失的缺失、插入和/或取代而被修饰。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的ceDNA载体，其中两个ITR以使得当所述ITR相对于彼此反转时产生整体三维对称性的方式改变。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个包含选自表2、表4A、表4B或表5中的序列的序列。
47.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含选自与表18中的序列具有至少85％同一性的序列的核酸序列。
48.一种在细胞中表达FVIII蛋白的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-47或72-79中任一项所述的ceDNA载体接触。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述细胞是感光细胞或RPE细胞。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述细胞在体外或体内。
51.根据权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述至少一个核酸序列经密码子优化以在真核细胞中表达。
52.根据权利要求48-51中任一项所述的方法，其中所述至少一个核酸序列是与表1A中所示的任一个序列(SEQ ID NO:71-183、556和626-633)具有至少85％同一性的序列。
53.一种治疗患有血友病A的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-47或72-79中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个核酸序列编码至少一种FVIII蛋白。
54.一种治疗患有血友病A的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用选自与表18中的序列具有至少85％同一性的序列的核酸序列。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述受试者的血浆中的FVIII水平在施用后在所述受试者体内增加。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述受试者的血浆中的FVIII水平在施用后增加至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、9倍、14倍、19倍、24倍、29倍、39倍、49倍、59倍、69倍、79倍、89倍、99倍、199倍、299倍、399倍、499倍、599倍、699倍、799倍、899倍或999倍。
57.根据权利要求53或54所述的方法，其中与对照相比，所述受试者的血清中的FVIII水平在施用所述ceDNA载体的所述受试者体内增加。
58.根据权利要求57所述的方法，其中与所述对照相比，所述受试者的血清中的FVIII水平的增加大于约40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、9倍、14倍、19倍、24倍、29倍、39倍、49倍、59倍、69倍、79倍、89倍、99倍、199倍、299倍、399倍、499倍、599倍、699倍、799倍、899倍或999倍。
59.根据权利要求57-58中任一项所述的方法，其中所述对照是施用前所述受试者的血清中的FVIII水平，其中所述对照是未接受所述施用的患有血友病A的受试者的血清中的FVIII水平，或者其中所述对照是未患有血友病A的受试者体内的FVIII水平。
60.根据权利要求53-59中任一项所述的方法，其中所述施用将所述受试者体内的血浆FVIII水平恢复至未受血友病A影响的健康个体的血浆FVIII水平的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
61.根据权利要求53-60中任一项所述的方法，其中以约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg的剂量施用所述ceDNA载体。
62.根据权利要求54所述的方法，其中所述至少一个核酸序列是与表1A中所示的任何序列(SEQ ID NO:71-183、556和626-633)具有至少85％同一性的序列。
63.根据权利要求54-62中任一项所述的方法，其中将所述ceDNA载体施用于感光细胞或RPE细胞或两者。
64.根据权利要求54-63中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体在感光细胞或RPE细胞或两者中表达所述FVIII蛋白。
65.根据权利要求54-64中任一项所述的方法，其中通过以下任何一种或多种方式施用所述ceDNA载体：视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
66.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-47中任一项所述的ceDNA载体。
67.一种细胞，所述细胞含有根据权利要求1-47或72-79中任一项所述的ceDNA载体。
68.根据权利要求67所述的细胞，其中所述细胞是感光细胞或RPE细胞或两者。
69.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-47中任一项所述的ceDNA载体以及脂质。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述脂质是脂质纳米粒子(LNP)。
71.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-47或72-79中任一项所述的ceDNA载体、根据权利要求66所述的药物组合物、根据权利要求67或权利要求68所述的细胞或者根据权利要求69或权利要求70所述的组合物。
72.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，所述ceDNA载体包含：
在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列，其中至少一个核酸序列编码至少一种蛋白质，
其中所述ceDNA载体包含与编码所述至少一种蛋白质的所述至少一个核酸序列可操作地连接的启动子或启动子组，并且其中所述启动子选自由以下项组成的组：人a1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、最小运甲状腺素蛋白启动子(TTRm)、hAAT_core_C06、hAAT_core_C07、hAAT_core_08、hAAT_core_C09、hAAT_core_C10和hAAT_core_truncated。
73.根据权利要求72所述的ceDNA载体，其中所述启动子选自与SEQ ID NO:210-217中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
74.根据权利要求72所述的ceDNA载体，其中所述启动子组包含包括增强子和核心启动子而没有5pUTR的合成肝特异性启动子组。
75.根据权利要求72所述的ceDNA载体，其中所述启动子组选自与SEQID NO:184-197、400、401和484中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
76.根据权利要求72-75中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含增强子。
77.根据权利要求76所述的ceDNA载体，其中所述增强子选自由以下项组成的组：丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子(SerpEnh)、运甲状腺素蛋白(TTRe)基因增强子(TTRe)、肝核因子1结合位点(HNF1)、肝核因子4结合位点(HNF4)、人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子(ApoE_Enh)、来自前白蛋白基因的增强子区(ProEnh)、ApoE_Enh的CpG最小化型式(人载脂蛋白E/C-I肝特异性增强子)(ApoE_Enh_C03、ApoE_Enh_C04、ApoE_Enh_C09和ApoE_Enh_C10)和嵌入GE-856中的肝核因子增强子阵列(Embedded_enhancer_HNF_array)。
78.根据权利要求77所述的ceDNA载体，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子包含与SEQ ID NO:198至少85％相同的核酸序列。
79.根据权利要求76所述的ceDNA载体，其中所述增强子选自与SEQ ID NO:198-209、485和557-616中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
80.一种在细胞中表达蛋白质的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求72-79中任一项所述的ceDNA载体接触。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述细胞是感光细胞或RPE细胞。
82.根据权利要求80或81所述的方法，其中所述细胞在体外或体内。
83.根据权利要求80-82中任一项所述的方法，其中所述至少一个核酸序列经密码子优化以在真核细胞中表达。
84.根据权利要求1-46中任一项所述的ceDNA载体，其中编码至少一种FVIII蛋白的所述至少一个核酸序列选自与SEQ ID NO:556和626-633中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列，并且其中所述ceDNA载体包含增强子，其中所述增强子选自与SEQ ID NO:557-616中的任一个具有至少85％同一性的核酸序列。
85.一种DNA载体，所述载体包含与SEQ ID NO:71-183、556和626-633至少85％相同的核酸序列。
86.根据权利要求85所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:198-209、485、557-616中的任一个具有至少95％同一性的增强子序列。
87.根据权利要求86所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:198和557-616中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
88.根据权利要求87所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:557-616中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
89.根据权利要求88所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:557-568中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
90.根据权利要求88所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:569和570中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
91.根据权利要求88所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:571中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
92.根据权利要求88所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:572中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
93.根据权利要求88所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:611中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
94.根据权利要求88所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:603中的任一个具有至少95％同一性的SerpEnh序列。
95.根据权利要求85-94中任一项所述的ceDNA载体，其中所述DNA载体包含TTRe序列。
96.根据权利要求95所述的DNA载体，其中所述TTRe序列在SEQ ID NO:199中示出或是与其具有至少95％同一性的序列。
97.根据权利要求95所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含TTR启动子。
98.根据权利要求95所述的DNA载体，其中所述TTR启动子在SEQ ID NO:211中示出或是与其具有95％同一性的序列。
99.根据权利要求97所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含选自由以下项组成的组的5'非翻译区(5'UTR)序列：SEQ ID NO:411、SEQID NO:412、SEQ ID NO:413、SEQ ID NO:414、SEQ ID NO:415、SEQ ID NO:416、SEQ ID NO:417、SEQ ID NO:418、SEQ ID NO:419、SEQ IDNO:420、SEQ ID NO:421、SEQ ID NO:422、SEQ ID NO:423、SEQ ID NO:424、SEQ ID NO:425、SEQ ID NO:426、SEQ ID NO:427、SEQ ID NO:428、SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:430、SEQ IDNO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435和SEQ ID NO:436。
100.根据权利要求97所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含选自由以下项组成的组的内含子序列：SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:245、SEQID NO:246、SEQ ID NO:247和SEQ ID NO:248。
101.根据权利要求97所述的DNA载体，其中所述DNA载体还包含与SEQ ID NO:235具有至少95％同一性的内含子序列。
102.根据权利要求97所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含3'UTR序列。
103.根据权利要求102所述的DNA载体，其中所述3'UTR序列包含WPRE元件和/或bGHpoly A信号序列或与SEQ ID NO:283-291和634中的任一个具有至少95％同一性的序列。
104.根据权利要求102所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含SEQ ID NO:543中所示的微小RNA(mir)序列或与其具有至少95％同一性的序列。
105.根据权利要求97所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含选自与表15中所示的任何序列(SEQ ID NO:318-332和635-641)具有至少85％同一性的序列的间隔子序列。
106.根据权利要求85所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含与SEQID NO:556至少95％相同的核酸序列的5'和/或3'末端侧接的至少一个ITR。
107.根据权利要求106所述的DNA载体，其中与5'和/或3'侧接的所述至少一个ITR是野生型AAV ITR。
108.根据权利要求85所述的DNA载体，其中所述DNA载体是封闭端DNA(ceDNA)。
109.根据权利要求85所述的DNA载体，其中所述DNA载体是质粒。
110.根据权利要求85所述的DNA载体，其中所述DNA载体包含编码单链(SC)FVIII的核酸序列。
111.根据权利要求110所述的DNA载体，其中所述核酸序列在SEQ ID NO:556中示出或是与其具有至少99％同一性的序列。
112.一种ceDNA载体，所述载体包含SEQ ID NO:42的核酸序列或与SEQID NO:42至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
113.一种ceDNA载体，所述载体包含SEQ ID NO:642的核酸序列或与SEQ ID NO:642至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
114.一种ceDNA载体，所述载体包含SEQ ID NO:643的核酸序列或与SEQ ID NO:643至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
115.一种ceDNA载体，所述载体包含SEQ ID NO:644的核酸序列或与SEQ ID NO:644至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
116.一种ceDNA载体，所述载体包含SEQ ID NO:645的核酸序列或与SEQ ID NO:645至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
117.一种ceDNA载体，所述载体包含SEQ ID NO:646的核酸序列或与SEQ ID NO:646至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列。
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