CN117295530A - 非病毒dna载体及其用于表达pfic治疗剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了用于递送和表达转基因的具有线性和连续结构的ceDNA载体。ceDNA载体包含侧接两个ITR序列的表达盒，其中该表达盒编码例如选自表1的转基因，该转基因编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)。一些ceDNA载体还包含顺式调节元件，包括调节开关。本文还提供了用于使用该ceDNA载体在体外、离体和体内可靠基因表达PFIC治疗蛋白的方法和细胞系。本文提供了包含可用于在细胞、组织或受试者中表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的方法和组合物以及用表达PFIC治疗蛋白的该ceDNA载体治疗疾病的方法。此类PFIC治疗蛋白可表达用于治疗患有进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的受试者。

Description

非病毒DNA载体及其用于表达PFIC治疗剂的用途
相关申请
本申请要求于2021年3月19日提交的美国临时申请号63/163,280的优先权，该美国临时专利申请的全部内容通过引用特别并入本文。
序列表
本申请含有本文的序列表和表1至表12中的序列，各自均通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及基因疗法领域，该基因疗法包括用于在受试者或细胞中表达转基因或经分离多核苷酸的非病毒载体。本公开还涉及包括多核苷酸的核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。例如，本公开提供了使用非病毒ceDNA载体从细胞表达PFIC治疗蛋白(例如，表达用于治疗患有进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)疾病的受试者的PFIC治疗蛋白)的方法。该方法和组合物可应用于例如通过在有需要的受试者的细胞或组织中表达PFIC治疗蛋白来治疗疾病的目的。
背景技术
基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结果。基因疗法包括治疗或预防由缺陷基因或者异常调节或表达(例如，可能导致病患、疾病、恶性病等的表达不足或过表达)造成的医学病症。例如，由缺陷基因引起的疾病或病患可以通过向患者递送矫正性遗传物质来进行治疗、预防或改善，或者可以通过例如对患者用矫正性遗传物质改变或沉默缺陷基因，从而引起遗传物质在患者体内治疗性表达来进行治疗、预防或改善。
基因疗法的基础是向转录盒供应活性基因产物(有时称为转基因)。基因疗法可用于治疗疾病或恶性病。人类单基因病患可以通过将正常基因递送给目标细胞并表达来治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以经由多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如，重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus；rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且更具体地说，组成依赖病毒属。来源于AAV的载体(即，重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)各种各样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，因此减少宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒在人类中被认为是非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV不同，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因并且通常持续作为附加体，因此限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其他载体系统相比，AAV载体通常被认为免疫原性较低，从而获得载体DNA的持久性和治疗性转基因的潜在长期表达。
然而，使用AAV粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其病毒包装容量有限，为约4.5kb的异源DNA(Dong等人，1996；Athanasopoulos等人，2004；Lai等人，2010)，因此，AAV载体的用途被限制到小于150kDa的蛋白编码容量。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以rAAV基因疗法候选者需要筛查从患者候选者体内消除该载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，该免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的该载体作出反应，以刺激免疫系统生成高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
另外，通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人，1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫应答。
相应地，由于单次施用于患者(因患者免疫应答)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒包装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢，因此基因疗法使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)是一类慢性胆汁淤积病患，PFIC1、PFIC2、PFIC3和PFIC4，它们各自在婴儿期开始，并且通常在生命的前十年内发展成肝硬化。PFIC在没有治疗的儿童中是致命的。PFIC 1型和2型是罕见的，估计发病率为1:50,000至1∶100,000新生儿。PFIC3甚至更罕见。PFIC4仅在最近才通过调查不具有已知遗传组分的胆汁淤积病的研究来表征，并且也预计是非常罕见的。
PFIC的每个亚型与展现常染色体隐性遗传的特定遗传缺陷相关。PFIC1(也称为拜勒病(Byler disease))和PFIC2的特征在于低γ-谷氨酰肽酶(GGT)水平。两者都是由小管输出和胆汁形成所需的基因产物的缺乏引起的，导致缺陷性胆汁盐排泄。胆汁盐是胆汁的组分，其用于消化脂肪。胆汁盐由肝细胞产生，并且然后转运出细胞以制备胆汁。胆汁盐从肝细胞的释放对于胆汁的正常分泌是至关重要的。
PFIC1由ATP8B1基因(ATP酶磷脂转运8B1)中的突变引起。ATP8B1基因位于染色体18q21-22上，并且编码FIC1蛋白(在本文中也已知并称为ATP8B1蛋白)。它在肝脏和几个其它器官中表达。ATP8B1蛋白是负责维持肝细胞内膜中高浓度磷脂的P-型ATP酶。ATP8B1活性的丧失导致缺陷性胆汁盐排泄。认为该蛋白的突变引起磷脂膜不稳定，导致胆汁酸转运蛋白的功能降低。ATP8B1功能的丧失也引起听觉丧失，与耳蜗毛细胞的进行性退化相关。ATP8B1基因的突变也引起较不严重形式的胆汁淤积，称为良性复发1型肝内胆汁淤积(BRIC1)。BRIC1的特征在于阵发性黄疸和瘙痒，其消退而没有进展成肝脏衰竭。
PFIC2由ABCB11(ATP结合盒亚家族B成员11)基因的突变引起。ABCB11基因位于染色体2q24上并编码胆汁盐输出泵(BSEP)。其仅在肝脏中表达。BSEP是位于肝细胞顶膜中的ATP结合盒(ABC)-转运蛋白，并且是主要的小管胆汁酸泵。BSEP将结合的胆汁酸从细胞腔易位到胆小管中，驱动胆汁盐依赖性胆汁流动。ABCB11突变也与良性胆汁淤积病BRIC2相关。
PFIC3由染色体7q21上的基因ABCB4(ATP结合盒亚家族B成员4)的突变引起，编码蛋白MDR3(在本文中也已知并称为ABCB4蛋白)，该蛋白是转运磷脂穿过小管膜进入胆汁内所必需的脂质易位体。在PFIC3中，患者缺乏肝细胞磷脂输出，这产生对胆管具有毒性作用的不稳定胶束，导致胆管堵塞和胆道阻塞。磷脂通过缓冲胆固醇和胆汁盐来帮助保护胆道系统。胆中缺乏磷脂可导致胆囊结石、肝硬变和黄疸。ABCB4蛋白的唯一已知的生理功能是磷脂酰胆碱(PC)穿过肝细胞质膜易位到胆小管中(Trauner等人，Semin.Liver Dis.，27:77-98，2007)。ABCB4在肝细胞的小管膜上表达，在那里它将PC从肝细胞易位到胆管小管腔中(Dean等人，Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.，6:123-142，2005)。ABCB4的适当功能对于维持肝胆稳态是至关重要的。许多疾病是由ABCB4多态性引起的，这些多态性导致完全或部分蛋白功能障碍。
PFIC4是由染色体9q12上的TJP2(紧密连结蛋白2)基因(也称为封闭带2(ZO-2))的纯合突变引起的。这种与PFIC病的关联最近通过寻找新的胆汁淤积基因而被鉴定出来(Sambrotta等人，Nat Genet.46(4):326-328(2014))。TJP2蛋白是在大多数(如果不是全部)上皮细胞中表达的细胞-细胞连结复合物的细胞质组分。与其它蛋白结合，其在跨膜紧密连结蛋白和肌动蛋白细胞骨架之间产生联系。其在肝脏中的缺失导致胆汁组分通过细胞旁空间渗漏到肝实质中。TJP2还可参与易位到细胞核后的细胞周期复制。
因此，本领域强烈需要允许治疗性PFIC治疗蛋白在细胞、组织或受试者中表达以治疗进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的技术。
发明内容
本文所述的技术涉及通过从具有共价封闭端的无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(在本文中称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”)表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)来治疗进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的方法和组合物，其中ceDNA载体包含编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)或其密码子优化型式的核酸序列。这些ceDNA载体可用于产生用于治疗、监测和/或诊断的PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)。将表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体应用于受试者以治疗进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)可用于：(i)提供PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的疾病改善水平，在递送中侵入性最小，可重复且剂量有效，具有快速起效的治疗效果，导致矫正性PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4和TJP2)在肝中持续表达，以达到缺陷性酶的适当药理学水平。
在一个方面，本文公开了具有共价封闭端的无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(在本文中称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”)，该DNA载体包含编码PFIC治疗蛋白的异源基因，以允许PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)在细胞中表达。根据一些实施方案，本公开提供ceDNA载体，该ceDNA载体包含操作性地位于两个侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个异源核苷酸序列，其中该异源核苷酸序列编码如本文所述的一种或多种PFIC治疗蛋白。
如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)产生的ceDNA载体为由具有共价封闭端的互补DNA的连续链形成的无衣壳线性双链体DNA分子(线性、连续和非衣壳化结构)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列和3'ITR序列，其中5'ITR和3'ITR可以具有相同的相对于彼此的对称三维组织(即，对称或基本上对称的)，或另选地，5'ITR和3'ITR可以具有不同的相对于彼此的三维组织(即，不对称ITR)。另外，ITR能够来自相同或不同的血清型。在一些实施方案中，ceDNA载体能够包含ITR序列，该ITR序列具有对称的三维空间组织，以便其结构在几何空间中呈相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环(即，它们是相同的或相对于彼此呈镜像)。在一些实施方案中，一个ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个ITR可以来自不同的AAV血清型。
因此，本文所述的技术的一些方面涉及用于改善上述PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的蛋白表达和/或产生的ceDNA载体，其中该ceDNA包含侧接异源核酸序列的ITR序列，该异源核酸序列包含编码在表1中公开的PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的核苷酸序列，该ITR序列选自以下任一种：(i)至少一种WTITR和至少一种修饰的AAV反向末端重复(ITR)(例如，不对称的经修饰ITR)；(ii)两个经修饰ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如，不对称的经修饰ITR)，或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织，或者(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织。本文公开的ceDNA载体可以在真核细胞中产生，因此在昆虫细胞中没有原核DNA修饰和细菌内毒素污染。
本文所述的方法和组合物部分地涉及发现具有共价封闭端的非病毒无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其能够用于从细胞(包括但不限于肝细胞)中表达至少一种PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)，或超过一种PFIC治疗蛋白。
因此，在一个方面中，本文提供了DNA载体(例如，ceDNA载体)，该DNA载体包含编码至少一种转基因的至少一种异源核酸序列，该转基因编码其PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)，该至少一种异源核酸序列操作性地连接至位于两个不同AAV反向末端重复序列(ITR)之间的启动子，ITR中的一个ITR包含功能性AAV末端解链位点和Rep结合位点，并且ITR中的一个ITR包含相对于另一ITR的缺失、插入或取代；其中该转基因编码PFIC治疗蛋白；并且其中DNA当用DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化时，当在非变性凝胶上分析时，相较于线性和非连续DNA对照，存在线性和连续DNA的特征色带。其它方面包括通过由如本文所述的ceDNA载体对PFIC治疗蛋白进行体内表达来递送PFIC治疗蛋白，并且进一步包括使用编码FIX治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体治疗PFIC。本文还预期包含如本文所述的编码PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的细胞。
根据一些实施方案，本公开提供了可以递送和编码目标细胞中的一种或多种转基因的ceDNA载体，例如其中ceDNA载体包含多顺反子序列，或其中转基因和其天然基因组背景(例如转基因、内含子和内源性未翻译区)一起并入ceDNA载体中。转基因可以是蛋白编码转录物、非编码转录物或这两种。ceDNA载体可以包含多个编码序列，和非典型翻译起始位点或超过一个启动子以表达蛋白编码转录物、非编码转录物或这两种。转基因可以包括编码超过一种蛋白的序列，或可以是非编码转录物的序列。表达盒可以包括例如超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸或30,000个核苷酸或40,000个核苷酸或50,000个核苷酸或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围或超过50,000个核苷酸。ceDNA载体不具有衣壳化AAV载体的大小限制，因此能够递送大尺寸的表达盒来提供有效的转基因表达。在一些实施方案中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
根据一些实施方案，表达盒还可以包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施方案中，ITR可以充当转基因的启动子。在一些实施方案中，ceDNA载体包括调控转基因表达的另外的组分。例如，另外的调控组分可以是如本文所公开的调控开关，包含但不限于在必要时可以杀灭ceDNA感染的细胞的杀灭开关，以及其它诱导型和/或抑制型元件。
本公开还提供了使用ceDNA载体递送并且有效和选择性地表达一种或多种本文所述的转基因的方法。ceDNA载体能够被吸收到宿主细胞中，以及在缺乏AAV衣壳下被转运到细胞核中。另外，本文所描述的ceDNA载体没有衣壳，因此避免了可能对含衣壳的载体作出响应而产生的免疫应答。
本公开的方面涉及用于产生如本文所述的可用于使PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)在细胞中进行PFIC治疗蛋白表达的ceDNA载体的方法。其它实施方案涉及通过本文所提供的方法产生的ceDNA载体。在一个实施方案中，用于PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)生产的无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(ceDNA载体)获自包含多核苷酸表达构建体模版的质粒(在本文中称为“ceDNA质粒”)，该多核苷酸表达构建体模版按此次序包含：第一5'反向末端重复(例如，AAV ITR)；异源核酸序列；3'ITR(例如，AAV ITR)，其中5'ITR和3'ITR可相对于彼此不对称，或如本文所定义对称(例如，WT-ITR或修饰的对称ITR)。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体通过普通熟练技术人员在阅读本公开之后已知的多种方式可获得。例如，用于生成本公开的ceDNA载体的多核苷酸表达构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。在一个实施方案中，ceDNA质粒包含操作性地位于ITR之间的限制克隆位点(例如，SEQ ID NO:123和/或124)，在该ITR中可以插入包含例如操作性地连接到转基因、例如编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4和TJP2)的核酸的启动子的表达盒。在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4和TJP2)的ceDNA载体由含有对称或不对称的ITR(经修饰或WT ITR)的多核苷酸模板(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒、ceDNA杆状病毒)产生。
在准许的宿主细胞中，在存在例如Rep下，具有至少两个ITR的多核苷酸模板复制以产生表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4和TJP2)的ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：首先，经由Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒、ceDNA杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；和其次，Rep介导所切除的ceDNA载体的复制。各种AAV血清型的Rep蛋白和Rep结合位点是所属领域的普通技术人员熟知的。普通技术人员了解基于至少一种功能性ITR从血清型中选择结合并复制核酸序列的Rep蛋白。例如，如果有复制能力的ITR来自AAV血清型2，那么对应的Rep将来自与该血清型一起工作的AAV血清型，例如AAV2 ITR与AAV2或AAV4 Rep一起，但不是AAV5Rep，它不行。复制后，共价封闭端ceDNA载体继续在准许细胞中累积，并且ceDNA载体在Rep蛋白存在下在标准复制条件下优选随时间足够稳定，例如，累积达至少1pg/细胞、优选至少2pg/细胞、优选至少3pg/细胞、更优选至少4pg/细胞、甚至更优选至少5pg/细胞的量。
因此，本公开的一个方面涉及一种产生用于表达这种PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的方法，该方法包括以下步骤：a)在有效诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并持续足以诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的时间，在Rep蛋白的存在下温育具有不含病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如昆虫细胞)群体，并且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰ITR的载体多核苷酸的复制以产生用于在宿主细胞中表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体。然而，没有表达病毒颗粒(例如，AAV病毒粒子)。因此，没有病毒粒子所施加的大小限制。
从宿主细胞中分离的可用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的存在可以通过以下来证实：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从宿主细胞中分离的DNA，并在变性和非变性凝胶上分析所消化的DNA物质以证实与线性和非连续DNA相比线性和连续DNA的特征带的存在。
本文还提供了在细胞或受试者中使用ceDNA载体表达具有治疗用途的PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的方法。这种PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)可用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)。因此，本文提供了用于治疗进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的方法，该方法包括将编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4和TJP2)的ceDNA载体施用给有需要的受试者。
在一些实施方案中，本文所述的技术的一个方面涉及一种具有共价封闭端的非病毒无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其中ceDNA载体包含至少一个操作性地定位于两个反向末端重复序列之间的异源核苷酸序列，其中ITR序列可以是不对称的或对称的或基本上对称的，这些术语如本文所定义，其中ITR中的至少一个ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点，并且任选地，异源核酸序列编码转基因(例如PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)PFIC治疗蛋白)且其中载体不存在于病毒衣壳中。
本公开的这些和其他方面在下文中更详细地描述。
附图说明
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其它等效的实施方案。
图1A示出了如本文所公开的包含不对称的ITR的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的示例性结构。在此实施方案中，示例性ceDNA载体包括含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的开放阅读框(ORF)可插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点(R3/R4)中。表达盒侧接在两个反向末端重复序列(ITR)-表达盒上游(5'端)的野生型AAV2 ITR和下游(3'端)的经修饰ITR，因此侧接表达盒的两个ITR彼此不对称。
图1B示出了如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含不对称ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码PFIC转基因的开放阅读框(ORF)可以插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。该表达盒侧接两个反向末端重复序列(ITR)-该表达盒上游(5'端)的经修饰ITR和下游(3'端)的野生型ITR。
图1C示出了如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含不对称ITR以及含有增强子/启动子、PFIC转基因、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许将PFIC转基因插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个彼此不对称的反向末端重复(ITR)；表达盒上游(5'端)的经修饰ITR和下游(3'端)的经修饰ITR，其中5'ITR和3'ITR都是经修饰ITR，但是具有不同的修饰(即，它们不具有相同的修饰)。
图1D示出了如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码PFIC转基因的开放阅读框(ORF)被插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个修饰的反向末端重复序列(ITR)，其中5'经修饰ITR和3'经修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1E示出了如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许将转基因(例如PFIC)插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个修饰的反向末端重复序列(ITR)，其中5'经修饰ITR和3'经修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1F示出了如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含如本文所定义的对称WT-ITR或基本上对称WT-ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因(例如PFIC)的开放阅读框(ORF)插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图1G示出了如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有增强子/启动子、转基因(例如编码PFIC治疗蛋白的转基因)、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许将转基因(例如PFIC治疗蛋白)插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图2A提供了AAV2的野生型左ITR(SEQ ID NO:52)的T形茎-环结构，以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解链位点(trs)。RBE含有一连串4个双链体四聚体，它们被认为与Rep 78或Rep 68相互作用。另外，RBE'也被认为与在该构建体中的野生型ITR或突变的ITR上装配的Rep复合物相互作用。D和D'区含有转录因子结合位点和其它保守结构。图2B显示了所提出的Rep催化的在野生型左ITR(SEQID NO:53)中产生的切割和接合活性，该野生型左ITR包括AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解链位点(trs)以及包含若干转录因子结合位点和另一保守结构的D和D'区域。
图3A提供了野生型左AAV2 ITR(SEQ ID NO:54)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'臂的一级结构(多核苷酸序列)(左)和二级结构(右)。图3B显示了左ITR的示例性突变ITR(也称为经修饰ITR)序列。显示的是示例性突变左ITR(ITR-1，左)(SEQ ID NO:113)的A-A'臂的RBE部分、C臂和B-B'臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。图3C显示了野生型右AAV2 ITR(SEQ ID NO:55)的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图3D显示了示例性经修饰右ITR。显示的是示例性突变右ITR(ITR-1，右)(SEQID NO:114)的A-A'臂的含RBE部分、B-B'和C臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。可以如本文所教示，使用左ITR和右ITR的任何组合(例如AAV2 ITR或其它病毒血清型ITR或合成ITR)。图3A-图3D的多核苷酸序列中的每一个多核苷酸序列是指在用于产生如本文所述的ceDNA的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。图3A-图3D每一个中还包含从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中的ceDNA载体构型推断出的相应ceDNA二级结构以及预测的吉布斯自由能(Gibbs free energy)值。
图4A是示出了用于制备杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的上游过程的示意图，该杆状病毒感染的昆虫细胞可用于在图4B的示意图中所描述的过程中产生如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体。图4B是ceDNA产生的一种示例性方法的示意图，并且图4C示出了证实ceDNA载体产生的一种生化方法和过程。图4D和图4E是描述了用于鉴定从在图4B的ceDNA产生过程期间获得的细胞团粒采集的DNA中ceDNA的存在的过程的示意性展示。图4D显示了未切割或用限制性核酸内切酶消化并然后在天然凝胶或变性凝胶上进行电泳的示例性ceDNA的示意性预期色带。最左边的示意图是天然凝胶，并显示多个色带，表明以其双链体和未切割形式的ceDNA以至少单体和二聚体状态存在，可看到呈迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体，二聚体的大小是单体的两倍。左起第二个示意图显示，当用限制性核酸内切酶切割ceDNA时，原始色带消失并出现了迁移较快(例如较小)的色带，与切割后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下，原始双链体DNA是单链的，并且因为互补链是共价连接的，所以作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此，在右起第二个示意图中，经过消化的ceDNA显示了与在天然凝胶上观察到的相似的带分布，但该带作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图显示，在变性条件下未切割的ceDNA作为单链开环进行迁移，因此观察到的色带是在不开环的天然条件下观察到的色带大小的两倍。在此图中，“kb”用于指示核苷酸分子的相对大小，取决于背景，其基于核苷酸链长(例如，对于在变性条件下观察到的单链分子)或碱基对数量(例如，对于在天然条件下观察到的双链分子)。图4E显示了具有不连续结构的DNA。ceDNA可以通过在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制性核酸内切酶切割，并在中性和变性两种条件下生成两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图4E还示出了具有线性和连续结构的ceDNA。该ceDNA载体可被限制性核酸内切酶切割，并生成两个DNA片段，该片段在中性条件下以1kb和2kb迁移，但在变性条件下，链保持连接并产生以2kb和4kb迁移的单链。
图5是在用(+)或不用(-)核酸内切酶(对于ceDNA构建体1和2，为EcoRI；对于ceDNA构建体3和4，为BamH1；对于ceDNA构建体5和6，为SpeI；并且对于ceDNA构建体7和8，为XhoI)消化的情况下ceDNA载体的变性凝胶运行示例的示例性图片。构建体1-8描述于国际申请PCT PCT/US18/49996(以全文引用的方式并入本文)的实施例1中。确定了用星号突出显示的色带的大小，并提供在图片的底部。
图6描绘了实施例7中所述的实验结果且特别地显示IVIS图像，该图像获自经LNP-聚C对照治疗的小鼠(距左侧最远的小鼠)和经LNP-ceDNA荧光素酶治疗的四个小鼠(除距离左侧最远的小鼠之外的所有小鼠)。经ceDNA治疗的四只小鼠在小鼠的含肝脏区域中显示明显的荧光。
图7描绘了实施例8中所述的实验结果。暗斑点表示由被表达的ceDNA转基因产生的蛋白存在且证实所施用的LNP-ceDNA与肝细胞结合。
图8A-8B描绘了实施例9中所阐述的眼部研究的结果。图8A显示了注射-ceDNA荧光素酶的大鼠眼睛(左上方)相对于相同大鼠的未注射眼睛(右上方)或注射质粒-荧光素酶DNA的大鼠眼睛(左下方)与相同大鼠的未注射眼睛(右下方)的代表性IVIS图像。图8B显示了每个治疗组的经治疗眼睛或相应未治疗眼睛中观察到的平均辐射度图。ceDNA治疗的大鼠在99天期间展现长时间的明显荧光(和因此荧光素酶转基因表达)，与之形成鲜明对比的是经质粒-荧光素酶治疗的大鼠，其中观察到的相对荧光(和因此荧光素酶转基因表达)最小。
图9A和图9B描绘了实施例10中描述的Rag2小鼠的ceDNA持久性和重复给药研究的结果。图9A显示了在LNP-ceDNA-Luc治疗的野生型c57bl/6小鼠或Rag2小鼠中随时间观察到的总通量的图形。图9B提供的图形显示了重新给药对Rag2小鼠中的荧光素酶转基因表达水平的影响，重新给药之后，随之观察到增加的稳定表达(箭头表示重新给药施用的时间)。
图10提供了实施例11中所述的经治疗小鼠的ceDNA荧光素酶表达研究的数据，显示了每组小鼠在研究期间的总通量。高水平的未甲基化CpG与小鼠中随时间所观察到的较低总通量相关，而肝脏特异性启动子的使用与ceDNA载体在至少77天期间对转基因的持久稳定表达相关。
图11A、图11B、图11C和图11D显示了用于克隆到ceDNA载体中以生成编码本文所述的PFIC治疗蛋白的质粒的示例性插入片段。图11A显示了两个示例性插入片段，该插入片段各自可用作模块化组分以插入期望的治疗性(TTX)载体(例如，TTX-1)中以生成用于编码PFIC1治疗蛋白ATP8B1的ceDNA的质粒。在该实施方案中，用于生成质粒TTX-A的插入片段(显示在顶部)具有CAG启动子并且用于组成型表达。用于生成质粒TTX-B的插入片段(显示在底部)具有HAAT启动子并且用于肝脏特异性表达。图11B显示了两个示例性插入片段，该插入片段各自可用作模块化组分以插入到期望的TTX载体(例如，TTX-1)中以生成用于编码PFIC2治疗蛋白ABCB11的ceDNA的质粒。用于生成质粒TTX-C的插入片段(显示在顶部)具有CAG启动子并且用于组成型表达。用于生成质粒TTX-D的插入片段(显示在底部)具有HAAT启动子并且用于肝脏特异性表达。图11C显示了两个示例性插入片段，该插入片段各自可用作模块化组分以插入期望的TTX载体(例如，TTX-1)中以生成用于编码PFIC3治疗蛋白ABCB4的ceDNA的质粒。顶部显示的插入片段具有CAG启动子并且用于组成型表达。底部显示的插入片段具有HAAT启动子并且用于肝脏特异性表达。图11D显示了两个示例性插入片段，该插入片段各自可用作模块化组分以插入期望的TTX载体(例如，TTX-1)中以生成用于编码PFIC4治疗蛋白TJP2的ceDNA的质粒。顶部显示的插入片段具有CAG启动子并且用于组成型表达。底部显示的插入片段具有HAAT启动子并且用于肝脏特异性表达。出于示例性目的，图8A-图8D和实施例中显示5'WT AAV2 ITR和3'突变体(或经修饰)ITR，并且是不对称ITR对的示例。在另选的实施方案中，右边的ITR(5'ITR)和左边的ITR(3'ITR)可以是任何ITR，包括来自任何AAV，并且可以是不对称的、对称的或基本上对称的，如这些术语在本文中所定义的。
图12提供了编码ABCB4作为所关注的基因并具有所指示不同启动子区域的三个ceDNA载体盒的示意图。出于示例性目的，图9显示了5'WT AAV2 ITR和3'突变体(或经修饰)ITR，并且是不对称ITR对的示例。在另选的实施方案中，右边的ITR(5'ITR)和左边的ITR(3'ITR)可以是任何ITR，包括来自任何AAV，并且可以是不对称的、对称的或基本上对称的，如这些术语在本文中所定义的。
图13A-图13G显示了实施例8中描述的HepG2细胞中的免疫细胞化学实验的结果，作为一系列免疫荧光显微镜图像。红色荧光指示细胞中ABCB4蛋白的存在；蓝色荧光指示DAPI染色的DNA，并且绿色荧光指示GFP的存在(仅某些对照)。图13A-13C中的每个图显示表达的ABCB4的存在(红色)。来自相关对照样品的图像显示在图13D-图13G中。图13D-图13E中的图像是从与图13A-图13C中所示相同的实验收集的。图13F和图13G是在类似的条件下分开制备。
图14A、图14B和图14C描绘了用流体动力学注射的对照缓冲液(图14A)；5μgceDNA:hAAT-ABCB4(图14B)和50μg ceDNA:hAAT-ABCB4(图14C)处理的ABCB4-/-小鼠的肝细胞的显微图像并且通过ABCB4蛋白的免疫组织化学可视化。图14A显示了未处理的ABCB4-/-小鼠的肝细胞(10X)。图14B描绘了用流体动力学施用的5μg ceDNA处理的ABCB4-/-小鼠的肝细胞的免疫直方图(10X)；ceDNA具有驱动密码子优化的人类ABCB4的表达的hAAT启动子。图14C描绘了用流体动力学施用的50μgceDNA处理的ABCB4-/-小鼠的肝细胞的免疫直方图(10X)；ceDNA具有驱动密码子优化的人类ABCB4的表达的hAAT启动子。
图15描绘了显示与用PBS缓冲液处理的ABCB4-/-小鼠的胆磷脂水平相比，用5μghAAT-ABCB4 ceDNA或50μg hAAT-ABCB4 ceDNA处理的ABCB4-/-小鼠的胆磷脂水平(μM磷脂)的图表。
具体实施方式
特别在罕见疾病中，治疗剂开发中的最大障碍中的一个障碍是大量的个别病症。地球上约有3.5亿人患有罕见病患，根据美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)的定义为诊断患有疾病或病症的人数不到200,000人。这些罕见病患中的约80％是基因起源的，并且其中约95％没有经过FDA批准的治疗。
本文所描述的ceDNA载体的优点中在于提供一种可以快速适应多种疾病，并且尤其适应罕见单基因疾病的方法，该方法可以针对基因病症或疾病中的一些疾病有意义地改变当前治疗状态。此外，本文所描述的ceDNA载体包含调控开关，因此允许在递送之后可控制的基因表达。
本文提供ceDNA载体，该ceDNA载体包含编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)或其片段(例如，功能片段)的一种或多种异源核酸。该载体可用于生成用于鉴定和研究治疗药物的疾病模型系统，并且还可用于通过递送PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的编码序列和通过来自载体的胞内表达使PFIC治疗蛋白表达来治疗PFIC疾病。
本文提供了使用ceDNA载体治疗PFIC疾病的方法，该ceDNA载体包含一种或多种编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)或其片段的核酸。本文还提供了用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体，该ceDNA载体包含来自表1的编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的一种或多种异源核酸。在一些实施方案中，PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的表达可以包括治疗蛋白从表达它的细胞中分泌出来，或另选地，在一些实施方案中，表达的PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)可以在表达它的细胞内起作用或发挥作用。在一些实施方案中，ceDNA载体在受试者的肝脏、肌肉(例如，骨骼肌)或其他身体部位中表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)，其可以充当PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)产生和分泌到许多全身性隔室的储槽。
I.定义
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义。应理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，由Merck Sharp&Dohme Corp.出版(2011)(ISBN 978-0-911910-19-3)；RobertS.Porter等人(编辑),Fields Virology，第6版，由Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA出版(2013)；Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编辑),The Encyclopediaof Molecular Cell Biology and Molecular Medicine，由Blackwell Science Ltd.出版(1999-2012)(ISBN 9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biologyand Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版(1995)(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann，由Elsevier出版(2006)；Janeway’s Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑),Taylor&Francis Limited,2014(ISBN 0815345305、9780815345305)；Lewin’s Genes XI，由Jones&Bartlett Publishers出版(2014)(ISBN-1449659055)；Michael Richard Greenand Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版，Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch(编辑),Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols inMolecular Biology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编辑),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X、9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(编辑),John Wiley and Sons,Inc.,2005；以及Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan MShevach,Warren Strobe(编辑)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735、9780471142737)，这些文献的内容均以全文引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“异源核苷酸序列”和“转基因”可互换使用，并且是指并入如本文公开的ceDNA载体中并可以由其递送和表达的所关注的核酸(除编码衣壳多肽的核酸外)。
如本文所用，术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用，并且是指一段线性核酸，其包括与一个或多个启动子或足以引导转基因转录的其它调节序列操作性地连接的转基因，但是不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区域。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏子)、一个或多个内含子和一个或多个转录后调节元件。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，这个术语包含单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交物、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“oligo”，并且可以从基因中分离出来，或通过所属领域已知的方法化学合成。应了解术语“多核苷酸”和“核酸”包含单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸(如果所描述的实施方案适用的话)。
如本文所使用的，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其是从天然基因中分离的，或者以自然界中不另外存在或合成的方式进行修饰以含有核酸的节段。当核酸构建体包含表达本公开的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。“表达盒”包含操作性地连接至启动子的DNA编码序列。
“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如RNA)包括使其能够在体外和/或体内适当的温度和溶液离子强度的条件下，以序列特异性的反向平行方式(即，核酸特异性地结合于互补核酸)与另一核酸序列非共价结合，即形成沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)和/或G/U碱基对、“退火”或“杂交”的核苷酸序列。如所属领域已知的，标准的沃森-克里克碱基对包含：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。另外，在所属领域中还已知对于两个RNA分子(例如dsRNA)之间的杂交，鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如，在与mRNA中的密码子进行tRNA反密码子碱基配对的情况下，G/U碱基配对部分负责遗传密码的简并性(即，冗余)。在本公开的上下文中，靶向主题DNA的RNA分子的蛋白结合节段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补，反之亦然。这样，当可以在靶向主题DNA的RNA分子的蛋白结合节段(dsRNA双链体)的给定核苷酸位置形成G/U碱基对时，该位置不被认为是非互补的，而是被认为是互补的。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包含编码和非编码的氨基酸、经过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。
“编码”特定PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的DNA序列为转录到特定RNA和/或蛋白中的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可编码被翻译成蛋白的RNA(mRNA)，或者DNA多核苷酸可编码未被翻译成蛋白的RNA(例如，tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；也称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。
如本文所用，如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白的蛋白域的多肽。例如，融合蛋白可包含(i)PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)或其片段和(ii)至少一种非GOI蛋白。本文涵盖的融合蛋白包括但不限于抗体或者与PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)融合的抗体的Fc或抗原结合片段，例如受体、配体、酶或肽的细胞外结构域。作为融合蛋白的一部分的PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)或其片段可以为单特异性抗体或双特异性抗体或多特异性抗体。
如本文所用，术语“基因组安全港基因”或“安全港基因”是指可以插入核酸序列以使得该序列可以以可预测的方式整合和起作用(例如表达所关注的蛋白)且对内源基因活性没有明显的负面影响或不促进癌症的基因或基因座。在一些实施方案中，安全港基因也是可有效地表达所插入的核酸序列并且表达水平比非安全港位点高的基因座或基因。
如本文所用，术语“基因递送”意指将外来DNA转移到宿主细胞中以施加基因疗法的过程。
如本文所用，术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)(也称为RBE(Rep结合元件))和末端解链位点(“TRS”)共同构成“最低需要的复制起点”，并且因此TR包括至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和原病毒拯救。正如在本文的公开内容中意外发现的，在全长上不是反向互补序列的TR仍然可以执行ITR的传统功能，因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。所属领域的普通技术人员将了解，在复杂的ceDNA载体构型中，可以存在超过两个ITR或不对称的ITR对。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR，或可以来源于AAVITR或非AAV ITR。例如，ITR可以源自于细小病毒科，其涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)，或可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截断、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科。依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，该宿主包含但不限于人、灵长类、牛、犬、马和羊物种。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV或其它依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核苷酸序列可能与典型的天然存在的序列略有不同，因此，本文涵盖使用的WT-ITR序列包括由于在产生过程中发生的天然存在的变化(例如，复制误差)而产生的WT-ITR序列。
如本文所用，术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对WT-ITR，它们都是在整个长度上具有反向互补序列的野生型ITR。例如，ITR即使具有一个或多个偏离典型的天然存在的序列的核苷酸，只要变化并不影响该序列的特性和整体三维结构，该ITR也可以被认为是野生型序列。在一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性示例，序列与典型序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(例如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与另一个WT-ITR具有对称的三维空间组织，以使它们的3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定基本上对称的WT-ITR具有与适当的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解链位点(trs)，可以在功能上将其确认为WT。可以选择测试其它功能，包含在许可条件下的转基因表达。
如本文所使用的，短语“经修饰ITR(modified ITR/mod-ITR)”或“突变ITR”在本文中可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。突变可能导致ITR中A、C、C'、B、B'区中的一个或多个发生变化，并且可能导致三维空间组织(即，其几何空间中的3D结构)与相同血清型的WT-ITR的3D空间组织相比发生变化。
如本文所使用的，术语“不对称ITR”也称为“不对称ITR对”，是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内在全长上不反向互补的一对ITR。作为一个非限制性示例，不对称的ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组织，使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说，不对称的ITR对具有不同的整体几何结构，即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组织(例如，一个ITR与同源ITR相比可能具有短的CC'臂和/或短的BB'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截短或点突变引起的。在一个实施方案中，不对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列，另一个ITR是如本文定义的经修饰ITR(例如非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施方案中，不对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列，并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰ITR(即，不同的整体几何结构)。在一些实施方案中，不对称ITR对中的一个经修饰ITR可能具有短的C-C'臂，而另一个ITR可能具有不同的修饰(例如单臂或短的B-B'臂等)，使得它们与同源不对称经修饰ITR相比具有不同的三维空间组织。
如本文所用，术语“对称ITR”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对ITR，其相对于野生型依赖病毒ITR序列发生突变或修饰并且在其全长上反向互补。这两个ITR都不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是经修饰ITR，也称为突变ITR)，并且由于核苷酸的添加、缺失、取代、截断或点突变，而在序列上与野生型ITR不同。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。
如本文所使用的，术语“基本上对称的经修饰ITR”或“基本上对称的mod-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对经修饰ITR，它们在其全长上具有反向互补序列。例如，即使经修饰ITR具有一些偏离反向互补序列的核苷酸序列，只要这些变化不影响性质和整体形状，其也可以认为是基本上对称的。作为一个非限制性示例，序列与典型序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与其同源经修饰ITR具有对称的三维空间组织，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。换句话说，基本上对称的经修饰ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。在一些实施方案中，来自经修饰ITR对的ITR可具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组织，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。例如，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同血清型，然而，两者均能够具有相同的相应突变(例如，如果5'ITR在C区域中具有缺失，则来自不同血清型的经修饰的同源3'ITR在C'区域中的相应位置具有缺失)，使得经修饰ITR对具有相同的对称三维空间组织。在此类实施方案中，经修饰ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如，AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，诸如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰反映在来自不同血清型的同源ITR中的对应位置中。在一个实施方案中，基本上对称的经修饰ITR对是指一对经修饰ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有基本上相同的形状即可。作为非限制性示例，诸如通过本领域中公知的标准方法，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与典型mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且还具有对称的三维空间组织，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的经修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源经修饰ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B'环的类似3D结构。
术语“侧接”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B的两侧是A和C。这同样适用于布置AxBxC。因此，侧接序列在所侧接的序列之前或之后，但不必与所侧接的序列相邻或紧邻。在一个实施方案中，术语“侧接”是指在线性双链体ceDNA载体的每个末端处的末端重复序列。
如本文所使用的，术语“ceDNA基因组”是指还并入了至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。在一些实施方案中，该ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所使用的，术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的间插序列。在一些实施方案中，ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最优功能性来说所期望的距离上。在一些实施方案中，ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传稳定性。在一些实施方案中，ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置，促进ceDNA基因组的就绪遗传操纵。例如，在某些方面中，含有若干限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多酶切点接头”或设计成不具有已知蛋白(例如转录因子)结合位点的非开放阅读框序列能够定位于ceDNA基因组中以分离顺式作用因子，例如将6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等插入末端解链位点与上游转录调节元件之间。类似地，可以在多聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解链位点之间并入间隔区。
如本文所用，术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋白(例如AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点，其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了该RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列在本领域中是已知的，并且包括例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)，一种在AAV2中鉴定的RBS序列。可以使用任何已知的RBS序列，包括其它已知的AAV RBS序列和其它天然已知的或合成的RBS序列。不受理论的束缚，据信Rep蛋白的核酸酶结构域与双螺旋核苷酸序列GCTC结合，因此该两个已知的AAV Rep蛋白直接结合并稳定地组装在双螺旋寡核苷酸5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(SEQ ID NO:60)上。另外，可溶性聚集性构象异构体(即，数目未定的相互缔合的Rep蛋白)解离并结合到含有Rep结合位点的寡核苷酸。每个Rep蛋白都与每个链上的含氮碱基和磷酸二酯骨架相互作用。与含氮碱基的相互作用提供序列特异性，而与磷酸二酯主链的相互作用是非序列特异性的或较少序列特异性的，并稳定了蛋白-DNA复合物。
如本文所使用，术语“末端解链位点”和“TRS”在本文可互换使用，并且是指一个区域，在此Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键，生成3'OH，充当经由细胞的DNA聚合酶、例如DNA polδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。另选地，Rep-胸苷复合物可以参与配位接合反应。在一些实施方案中，TRS最低限度地涵盖非碱基配对的胸苷。在一些实施方案中，TRS的切口产生效率可以至少部分地由其在同一分子内距RBS的距离来控制。当受体底物是互补ITR时，所产生的产物是分子内双螺旋。TRS序列在所属领域中已知，并且包括例如5'-GGTTGA-3'(SEQ ID NO:61)，AAV2中所鉴定的六核苷酸序列。可以使用任何已知的TRS序列，包括其他已知的AAV TRS序列和其他天然已知的或合成的TRS序列，诸如AGTT(SEQ ID NO:62)、GGTTGG(SEQ ID NO:63)、AGTTGG(SEQ ID NO:64)、AGTTGA(SEQ ID NO:65)和其他基序如RRTTRR(SEQ ID NO:66)。
如本文所用，术语“ceDNA-质粒”是指一种包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的质粒。
如本文所使用的，术语“ceDNA-杆粒”是指一种包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种在杆状病毒基因组内包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，是指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。
如本文所用，术语“封闭端DNA载体”是指具有至少一个共价封闭端的无衣壳DNA载体，其中该载体的至少一部分具有分子内双链体结构。
如本文所用，术语“ceDNA”意指用于非病毒基因转移、合成或其它形式的无衣壳封闭端的线性双链(ds)双链体DNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中，该申请的全部内容以引用的方式明确地并入本文中。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实施例1中，该申请中的每一个申请以全文引用的方式并入本文中。用于产生包括各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，该国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中。根据一些实施方案，该ceDNA为封闭端的线性双链体(CELiD)CELiD DNA。根据一些实施方案，该ceDNA为基于DNA的小环。根据一些实施方案，该ceDNA为最低免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体。根据一些实施方案，该ceDNA为辅助DNA。根据一些实施方案，该ceDNA为哑铃形线性双链体封闭端DNA，包括表达盒的5'和3'端中ITR的两个发夹结构。根据一些实施方案，该ceDNA为狗骨TMDNA。
如本文所使用，术语“封闭端DNA载体”、“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包括至少一个末端回文结构的末端封闭式DNA载体。在一些实施方案中，ceDNA包含两个共价封闭端。
如本文所用，术语“合成AAV载体”和“AAV载体的合成产生”意指在完全无细胞环境中的AAV载体和其合成产生方法。
如本文中所定义，“报告体”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白。报告体通常产生可测量的信号，诸如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白。例如，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及诸如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它在所属领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“效应蛋白”是指一种提供可检测的读出数的多肽，例如作为报告多肽，或更适当地，作为杀伤细胞的多肽，例如毒素，或致使细胞易用所选药剂或因缺乏所选药剂而被杀伤的药剂。效应蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞的DNA和/或RNA的任何蛋白或肽。例如，效应蛋白可以包含但不限于：靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制性核酸内切酶；降解细胞存活所必需的多肽目标的蛋白酶；DNA旋转酶抑制剂；以及核糖核酸酶型毒素。在一些实施方案中，由如本文所描述的合成生物回路控制的效应蛋白表达可作为一个因子参与另一个合成生物回路，从而扩大了生物回路系统反应性的范围和复杂度。
转录调节子是指活化或抑制所关注的基因转录的转录活化子和阻遏子，诸如PFIC治疗蛋白。启动子是启动特定基因转录的核酸区域。转录活化子通常在附近与转录启动子结合并募集RNA聚合酶来直接启动转录。阻遏子与转录启动子结合，并在空间上阻碍RNA聚合酶启动转录。其它转录调节子可取决于它们的结合位置以及细胞和环境条件来充当活化子或阻遏子。转录调节子类别的非限制性实施例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
如本文所使用的，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调节序列元件结合并分别阻遏或活化与调节序列元件操作性连接的序列的转录的蛋白。如本文所描述的优选阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存在或不存在敏感。如本文所描述的优选蛋白是模块的形式，包括例如可分离的DNA结合和输入剂结合或反应元件或结构域。
如本文所使用的，“载剂(carrier)”包含任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所使用的，“输入剂反应结构域”是转录因子的一个结构域，其以致使连接的DNA结合融合结构域对条件或输入剂的存在作出反应的方式与该条件或输入剂结合或以其它方式作出反应。在一个实施方案中，条件或输入剂的存在导致输入剂反应结构域或其融合的蛋白发生构象变化，从而改变转录因子的转录调制活性。
术语“体内”是指在生物体，诸如多细胞动物中或内部进行的分析或过程。在本文描述的一些方面中，当使用单细胞生物例如，细菌时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用具有完整膜的活细胞进行的方法和用途，该活细胞在多细胞动物或植物体之外，例如外植体、培养细胞，包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系，以及提取的组织或细胞，包括血细胞，等等。术语“体外”是指不需要存在具有完整膜的细胞的分析和方法，诸如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统，诸如不包含细胞或细胞系统的介质，诸如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。
如本文所使用的，术语“启动子”是指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列，其可以是编码蛋白或RNA的异源目标基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在该核酸序列的其余部分的引发和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件，诸如，RNA聚合酶和其他转录因子。在本文所述的方面的一些实施方案中，启动子可以驱动调节启动子本身的表达的转录因子的表达。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子，包括诱导型启动子，可用于驱动本文公开的ceDNA载体中转基因的表达。启动子序列可以在其3'末端以转录起始位点为界并且向上游延伸(5'方向)以包括为了在高于背景的可检测水平上引发转录所必需的最少数目个碱基或元件。
如本文所用，术语“增强子”是指结合一种或多种蛋白(例如，活化蛋白或转录因子)以增加核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列(例如，50-1,500个碱基对)。增强子可以位于其所调节的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以位于内含子区域内，或无关基因的外显子区中。
启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“操作性地连接”、“操作性地定位”、“操作性地连接”，“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所使用的，“反向启动子”是指核酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链的启动子，并且反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施方案中用于调节开关的状态。另外，在各种实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于编码节段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子所获得。此类启动子可以称为“内源性的”。类似地，在一些实施方案中，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于该序列的下游或上游。
在一些实施方案中，编码核酸节段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，该启动子均指在其天然环境中通常不与其操作性地连接的编码核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子是指在天然环境中正常不与给定核酸序列关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子；从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”(即包含不同转录调节区域的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法改变表达的突变)的合成启动子或增强子。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以结合本文公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR，来产生启动子序列(参见例如美国专利第4,683,202号、美国专利第5,928,906号，各自以引用的方式并入本文)。此外，预期也可以采用指导序列在例如，线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。
如本文所描述的，“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时，启动或增强转录活性的启动子。如本文所定义的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的，或是以能够从诱寻型启动子诱导转录活性的方式施用的通常外源性的化合物或蛋白。在一些实施方案中，诱导物或诱导剂，即化学物质、化合物或蛋白，本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即诱导物可以是由另一组分或模块表达的诱导蛋白)，转录或表达本身可以处于诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，诱导型启动子是在不存在某些药剂，诸如阻遏子的情况下被诱导的。诱导型启动子的示例包括但不限于四环素、金属硫蛋白、蜕皮素、哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其他类固醇反应性启动子、雷帕霉素反应性启动子等。
本文可互换使用的术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”是指提供和/或调节非编码序列(例如靶向DNA的RNA)或编码序列(例如定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节所编码多肽的转译的转录和转译控制序列，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等。
“操作性地连接”是指一种并置，其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么该启动子操作性地连接到所述编码序列。“表达盒”包括异源DNA序列，其操作性地连接到启动子或足以引导转基因在ceDNA载体中转录的其他调控序列。合适的启动子包括例如，组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。
如本文所使用，术语“受试者”是指向其提供用本公开的ceDNA载体进行的治疗，包括预防性治疗的人类或动物。通常，动物是脊椎动物，例如，但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或野生动物。灵长类动物包括但不限于黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养和野生动物包括但不限于：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种如家猫、犬科物种如狗、狐狸、狼、禽类物种如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在本文所述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物或人。受试者可以是雄性或雌性。另外，受试者可以是婴儿或儿童。在一些实施方案中，受试者可以是新生儿或未出生的受试者，例如，受试者还在子宫内。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些示例。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病患的动物模型的受试者。另外，本文所描述的方法和组合物可以用于家养动物和/或宠物。人类受试者可以是任何年龄、性别、种族或人种群组，例如，高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其它受试者。在一些实施方案中，受试者已进行治疗。在一些实施方案中，受试者是胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施方案中，受试者是人类胎儿、人类新生儿、人类婴儿、人类儿童、人类青少年或人类成人。在一些实施方案中，受试者是动物胚胎，或非人类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。在一些实施方案中，受试者是人胚胎。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括易于被本公开的核酸构建体或ceDNA表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性示例，宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如HepG2细胞)中的任何一种。可替代地，宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。
术语“外源”是指存在于细胞中而非其天然来源的物质。当在本文中使用时，术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入诸如细胞或生物体的生物系统中的核酸(例如，编码多肽的核酸)或多肽，通常在该细胞或生物体中未发现该核酸或多肽，并且希望将该核酸或多肽引入此类细胞或生物体中。可替代地，“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸或多肽，在该细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低，并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量，例如，以产生异位表达或水平。相比之下，术语“内源”是指生物系统或细胞天然存在的物质。
术语“序列同一性”是指两个核苷酸序列之间的相关性。出于本公开的目的，使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，同上)，优选版本3.0.0或更高版本中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，并按以下方式计算：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸、优选为至少25个核苷酸、更优选为至少50个核苷酸并且最优选为至少100个核苷酸。
如本文所用，术语“同源性”或“同源”被定义为，在比对序列且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，与靶染色体上的相应序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。出于确定核苷酸序列同源性百分比的比对可以用所属技术领域中内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，当同源臂的例如核酸序列(例如DNA序列)与宿主细胞的对应原生或未经编辑的核酸序列(例如基因组序列)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多同一性时，该序列被视为“同源”。
如本文所用，术语“异源”意指分别在天然核酸或蛋白中未发现的核苷酸或多肽序列。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变异体)连接(例如通过基因工程)以生成编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如，通过基因工程)以生成编码融合变异多肽的核苷酸序列。
如本文所用，术语“异源核苷酸序列”和“转基因”可互换使用，并且是指并入如本文公开的ceDNA载体中并可以由其递送和表达的所关注的核酸(除编码衣壳多肽的核酸外)。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变体)连接(例如，通过基因工程)以生成编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如，通过基因工程)以生成编码融合变异多肽的核苷酸序列。所关注的转基因包含(但不限于)编码多肽的核酸，该多肽优选为治疗性(例如用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽(例如用于疫苗)。在一些实施方案中，所关注的核酸包含转录成治疗性RNA的核酸。为了在本公开的ceDNA载体中使用而包括的转基因包括(但不限于)表达或编码以下中的一种或多种的转基因：多肽、肽、核酶、适体、肽核酸、siRNA、RNAi、miRNA、lncRNA、反义寡核苷酸或多核苷酸、抗体、抗原结合片段或其任何组合。
“载体”或“表达载体”为可以与另一DNA节段，即“插入片段”附接以便使所附接的节段在细胞中复制的复制子，诸如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒粒子或粘质体。载体可以是设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体在起源和/或最终形式上可以是病毒或非病毒的，但是出于本公开的目的，“载体”通常是指ceDNA载体，如本文所用。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。在一些实施方案中，载体可以是表达载体或重组载体。
如本文所用，术语“表达载体”是指引导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包括其它元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如，在人类细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白以及适当时分泌蛋白的细胞过程，在适用时包括但不限于例如转录、转录物加工、转译和蛋白折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过转译从基因转录的mRNA所获得的多肽。术语“基因”是指当操作性地连接至适当的调控序列时，在体外或体内转录(DNA)为RNA的核酸序列。基因可以包括或可以不包括编码区前后的区域，例如5'非转译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾区”序列，以及单个编码节段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应了解，在一些实施方案中，本文所述的载体可以与其它合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中，载体是游离型的。合适的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持受试者中的所关注的核苷酸，从而消除染色体整合的潜在影响的方式。
如本文所用的短语“遗传性疾病”是指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病，尤其是从出生起出现的病症。异常可以是突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调节序列。遗传疾病可以是(但不限于)DMD、血友病、囊肿性纤维化、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington’s chorea)、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏疾病(Wilson's disease)、先天性肝卟啉症(hepatic porphyria)、遗传性肝代谢病症、勒什尼汗综合征(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞贫血、地中海贫血、着色性干皮病、范克尼氏贫血(Fanconi's anemia)、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁氏综合征(Bloom's syndrome)、视网膜母细胞瘤和泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs disease)。
如本文所用，术语“治疗”包括减轻、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床症状，或者基本上预防病症的临床症状的出现、获得有益或期望的临床结果。治疗还指完成以下一项或多项：(a)降低病患的严重程度；(b)限制被治疗病患的特征性症状的发展；(c)限制被治疗病患的特征性症状的恶化；(d)限制障碍在先前患有该病患的患者中的复发；以及(e)限制先前对病患无症状的患者的症状复发。
有益或所需的临床结果，诸如药理学和/或生理学作用，包括(但不限于)：预防可能易患有疾病、病患或病症但尚未经历或展现疾病的症状的受试者出现该疾病、病患或病症(防治性治疗)；缓解该疾病、病患或病症的症状；减轻该疾病、病患或病症的程度；稳定该疾病、病患或病症(即，不恶化)；预防该疾病、病患或病症的扩散；延迟或减缓该疾病、病患或病症进展；改善或缓和该疾病、病患或病症；以及其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。根据一些实施方案，疾病是PFIC。
如本文所使用的，术语活性剂(例如，如本文所描述的ceDNA脂质颗粒)的“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”或“药学上有效量”可互换地使用以指代足以提供治疗的预期益处的量。然而，剂量水平是基于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病症、病症的严重程度、施用途径和所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以在很大范围内变化，但可以由医师使用标准方法常规地确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学有效量”包括组合物的防治或预防量。在防治或预防应用中，以足以消除或降低疾病、病患或病症(包括疾病、病患或病症的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症和在疾病、病患或病症的发展期间呈现的中间病理学表型)的风险、减轻它们的严重程度或者延迟它们的发作的量向易患有疾病、病患或病症或者以其他方式处于它们的风险中的患者施用药物组合物或药剂。通常优选使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量(dose/dosage)”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现(例如PFIC)的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。
对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其他熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可以在Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill(纽约)(2001)的第1章中找到，该文献以引用的方式并入本文中。
药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。
如本文所使用的，术语“包括(comprising/comprises)”在提及组合物、方法以及对该方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。
如本文所使用的，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。该术语允许存在不实质影响该实施方案的一个或多个基本和新颖或功能性特征的要素。“包含”的使用表示包含而不是限制。
术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，其排除在该实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本说明书和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”包含多个提及物。因此，例如，提到“方法”包含本文所描述的和/或在阅读本公开等之后对于所属领域技术人员而言将变得显而易见的类型的一个或多个方法和/或步骤。类似地，除非上下文另有明确规定，否则单词“或”旨在包含“和”。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开，但在下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁文exempli gratia，并且在本文中用以指示非限制性示例。因此，缩写“例如(e.g)”与术语“例如(for example)”同义。
除了在操作示例中或在另外指示的情况下，本文所使用的表示成分或反应条件的量的所有数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。术语“约”在结合百分比使用时，可以意指±1％。以下实施例进一步详细解释本公开，但本公开的范围不应限于此。
本文所公开的本公开的替代性要素或实施方案的分组不解释为限制。每个组成员可以单独提及和要求，或呈与该组的其它成员或此处找到的其它要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时，在本文中认为说明书含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
在任何方面的一些实施方案中，本文描述的公开内容不涉及克隆人的方法、用于修饰人的种系遗传身份的方法、用于工业或商业目的的人胚胎的使用、或用于修饰动物的基因身份，可能导致其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法，以及由这类方法产生的动物。
其它术语在本文中限定于本公开的各个方面的描述内。
本申请全文中引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，以描述和公开例如在此类出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其它原因而提前所述公开。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的次序呈现，但是另选的实施方案可以以不同的次序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，这些实施例决不应解释为进一步限制。应理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。
II.由ceDNA载体表达进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)治疗蛋白
本文提供了具有共价封闭端的非病毒无衣壳ceDNA分子(ceDNA)。本文所公开的ceDNA载体不存在由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装约束。与经囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体代表原核生物产生的质粒DNA载体的可行的真核生物产生的替代物。这允许插入控制元件，例如如本文所公开的调控开关、较大转基因、多个转基因等，并且必要时并入转基因的天然基因调控元件。根据本公开的方面，具有共价封闭端的非病毒无衣壳ceDNA分子(ceDNA)包含编码一种或多种PFIC治疗蛋白的核苷酸序列。编码PFIC治疗蛋白的示例性核苷酸序列显示在表1中。
ceDNA载体有许多不同于基于质粒的表达载体的结构特征。ceDNA载体可能具有以下一个或多个特征：缺少原始(即没有插入)的细菌DNA；缺少原核复制起点；是自给的，即其不需要除两个ITR以外的任何序列，包含Rep结合位点和末端解链位点(RBS和TRS)以及ITR之间的外源序列；存在具有真核来源(即其在真核细胞中产生)的形成发夹的ITR序列；以及不存在细菌型DNA甲基化或实际上被哺乳动物宿主认为异常的任何其它甲基化。一般来说，本公开的载体优选不含有任何原核DNA，但作为非限制性示例，预期可以将一些原核DNA作为外源序列插入启动子或增强子区中。区分ceDNA载体与质粒表达载体的另一个重要特点是，ceDNA载体是具有封闭端的单链线性DNA，而质粒始终是双链DNA。
使用如本文所描述的ceDNA载体存在优于基于质粒的表达载体的若干优点。此类优点包括但不限于：1)质粒含有细菌DNA序列且经受原核特异性甲基化，例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化，而无衣壳AAV载体序列是真核来源的且不经历原核特异性甲基化；因此，与质粒相比，无衣壳AAV载体不太可能诱导炎性和免疫应答；2)质粒在生产过程中需要抗性基因的存在，而ceDNA载体则不需要；3)环状质粒在引入细胞中时不被递送到细胞核并且需要过载才能绕过细胞核酸酶的降解，而ceDNA载体含有赋予对核酸酶的抗性并且可以被设计为被靶向并被递送到细胞核的病毒顺式元件，即经修饰ITR。假设对于ITR功能必不可少的最小限定元件是Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ IDNO:531))和末端解链位点(TRS；对于AAV2，5'-AGTTGG-3'(SEQ ID NO:48))加上允许发夹形成的可变回文序列。相比之下，用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
如通过限制酶消化分析和电泳分析所确定，ceDNA载体优选地具有线性和连续结构而非非连续结构。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所描述的ceDNA质粒)，该质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而相比之下，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也仍保持是单个分子。在一些实施方案中，与质粒不同，如本文所描述的ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性相对于环状)以及还考虑用于产生和纯化这些不同物体(参见下文)的方法方面，并且还考虑其DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
本文所述的技术大体上涉及由非病毒DNA载体(例如本文所述的ceDNA载体)在细胞中表达和/或产生PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)。用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体描述于本文中的标题为“通用ceDNA载体”的章节中。具体地说，用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的ceDNA载体包含一对ITR(例如，如本文所述的对称或不对称的ITR)和在ITR对之间的选自编码如本文所述的PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)PFIC治疗蛋白的表1中任一种的核酸，该核酸操作性地连接至启动子或调节序列。与传统AAV载体甚至慢病毒载体相比，ceDNA载体用于PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)表达的一个独特优势是编码期望蛋白PFIC治疗蛋白的异源核酸序列没有大小约束。因此，本文所述的ceDNA载体能够用于在有需要的受试者(例如，患有PFIC的受试者)中表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)。PFIC的体征和症状通常开始于婴儿期，并且与胆汁积累和肝病有关。因此，在一些实施方案中，受试者是婴儿。
如人们将了解，本文所述的ceDNA载体技术可以适于任何复杂程度或可以模块化方式使用，其中可以独立方式控制PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的不同组分的表达。例如，特别预期本文中所设计的ceDNA载体技术能够与使用单个ceDNA载体表达单一异源基因序列(例如，单一PFIC治疗蛋白)一样简单，或能够与使用多个ceDNA载体一样复杂，其中每个载体表达各自由不同启动子独立地控制的多种PFIC治疗蛋白(例如，一种或多种由表1中的序列编码的蛋白，或一种或多种ATP8B1、ABCB11、ABCB4和TJP2蛋白)PFIC治疗蛋白或相关联辅因子或辅助蛋白。本文特别预期以下实施方案且所属领域的技术人员能够按需要对其进行调适。
在一个实施方案中，单个ceDNA载体可以用于表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的单个组分。另选地，单个ceDNA载体可以用于在单个启动子(例如，强启动子)的控制下任选地使用IRES序列表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的多个组分(例如，至少2个)，以确保这些组分中的每一个组分(例如，辅因子或辅助蛋白)适当地表达。
在另一个实施方案中，本文还预期包含至少两个插入片段(例如表达重链或轻链)的单个ceDNA载体，其中每个插入片段的表达是在其自身启动子的控制下进行。启动子可以包括相同启动子的多个拷贝、多个不同启动子或其任意组合。正如本领域技术人员将了解的那样，常常期望以不同的表达水平表达PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的组分，从而控制所表达的单个组分的化学计量以确保PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)在细胞中有效折叠和组合。
所属领域的技术人员能够设想ceDNA载体技术的其它变化形式或能够使用常规载体通过蛋白产生方法对其进行调适。
A.进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)
在一些实施方案中，编码PFIC治疗蛋白(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)的转基因还可以编码分泌序列以使得PFIC治疗蛋白被引导到高尔基体(Golgi)设备和内质网，由此PFIC治疗蛋白将在其穿过ER并且离开细胞时通过伴护分子折叠成正确构象。示例性分泌序列包括但不限于VH-02(SEQ ID NO:88)和VK-A26(SEQ ID NO:89)和IgK信号序列(SEQID NO:126)，以及允许标记的蛋白从胞溶质中分泌出来的Gluc分泌信号(SEQ ID NO:188)、将标记的蛋白引导到高尔基体的TMD-ST分泌序列(SEQ ID NO:189)。
调节开关还可以用于微调PFIC治疗蛋白的表达以使得如所期望表达PFIC治疗蛋白，包括但不限于在所期望的表达水平或量下表达PFIC治疗蛋白，或另选地，当存在或不存在特定信号时，包括细胞信号传导事件。例如，如本文所述，当出现特定病症时，可以开启或关闭ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达，如本文中的标题为“调节开关”的章节中所描述。
例如并且仅出于说明的目的，PFIC治疗蛋白可以用于关闭非所期望的反应，诸如PFIC治疗蛋白的过高的产生水平。PFIC基因可以含有用于将PFIC治疗蛋白带到期望细胞的信号肽标志物。然而，在任一种情况下，都可能期望调节PFIC治疗蛋白的表达。ceDNA载体容易适应调节开关的使用。
ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码PFIC治疗蛋白的异源核酸序列不存在大小约束。因此，甚至全长PFIC治疗蛋白以及任选的任何辅因子或辅助蛋白可以由单个ceDNA载体表达。另外，取决于必要的立体化学，人们可以表达同一PFIC治疗蛋白的多个节段，并且可以使用相同或不同启动子，并且还可以使用调节开关来微调每个区域的表达。例如，如实施例中所示，可以使用包含双启动子系统的ceDNA载体，使得不同启动子用于PFIC治疗蛋白的每个结构域。使用ceDNA质粒产生PFIC治疗蛋白可以包括用于表达PFIC治疗蛋白结构域的启动子的独特组合，这引起适当比率的每个结构域用于形成功能性PFIC治疗蛋白。因此，在一些实施方案中，ceDNA载体可以单独地(例如，在不同启动子的控制下)用于表达PFIC治疗蛋白的不同区域。
在另一个实施方案中，由ceDNA载体表达的PFIC治疗蛋白进一步包含额外功能性，诸如荧光、酶活性、分泌信号或免疫细胞活化子。
在一些实施方案中，编码PFIC治疗蛋白的ceDNA可以进一步包含例如接头结构域。如本文所使用，“接头结构域”是指长度为约2个到100个氨基酸的寡肽或多肽区，其使如本文所述的PFIC治疗蛋白的任一个结构域/区域连接在一起。在一些实施方案中，接头能够包含或由柔性残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)构成，使得相邻蛋白域相对于彼此自由地移动。当希望确保两个相邻结构域在空间上彼此无干扰时，可以使用较长接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的示例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等效物以及其组合。接头可以是来源于明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)的T2A的接头区域。
所属领域的技术人员能够充分采用例如PFIC治疗蛋白等的已知和/或公开可用的蛋白序列并且反向工程改造cDNA序列以编码此类蛋白。然后可以对cDNA进行密码子优化以与预定的宿主细胞匹配，并且插入如本文所述的ceDNA载体中。
B.表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体
具有一个或多个编码期望PFIC治疗蛋白的序列的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以包含调节序列，诸如启动子、分泌信号、聚A区和增强子。在最低限度，ceDNA载体包含编码PFIC治疗蛋白的一个或多个异源序列。
为了实现高效且精确的PFIC治疗蛋白装配，在一些实施方案中，特别预期PFIC治疗蛋白包含内质网ER前导序列以将其引导到ER，在该ER中发生蛋白折叠。例如，序列将所表达的蛋白引导到ER进行折叠。
在一些实施方案中，细胞或细胞外定位信号(例如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号等)包含于ceDNA载体中以引导PFIC治疗蛋白的分泌或期望亚细胞定位，使得PFIC治疗蛋白可以结合到细胞内靶标(例如胞内抗体)或细胞外靶标。
在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体准许以模块化方式装配和表达任何期望PFIC治疗蛋白。如本文所用，术语“模块化”是指能够轻松地从构建体中去除的ceDNA表达质粒中的元件。例如，生成ceDNA的质粒中的模块化元件包含与构建体内的每个元件侧接的独特限制位点对，从而能够排它性地操纵个别元件(参见例如图1A-图1G)。因此，ceDNA载体平台可以准许表达和装配任何期望PFIC治疗蛋白构型。本文在各个实施方案中提供可以减少和/或最小化用于装配编码PFIC治疗蛋白的期望ceDNA载体所必需的操纵量的ceDNA质粒载体。
C.由ceDNA载体表达的示例性PFIC治疗蛋白
具体地说，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体能够编码例如(但不限于)用于治疗、防治和/或改善进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的一种或多种症状的PFIC治疗蛋白以及其变体和/或活性片段。在一个方面，PFIC疾病是人类进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)。
(i)PFIC治疗蛋白及其片段
基本上任何型式的PFIC治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)都可以由如本文所述的ceDNA载体编码并在该载体中由其表达。所属领域的技术人员将理解PFIC治疗蛋白包括PFIC治疗蛋白的所有剪接变体和直系同源物。PFIC治疗蛋白包括完整分子以及其片段(例如，功能片段)。
ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码所期望蛋白的异源核酸序列不存在大小约束。因此，多个全长PFIC治疗蛋白可以由单个ceDNA载体表达。
由ceDNA载体表达PFIC治疗蛋白或其片段可以使用一个或多个如所属领域中已知或本文所述的可诱导或可抑制型启动子，包括如本文所述的调节开关在空间上和时间上实现。
在一个实施方案中，PFIC治疗蛋白为“治疗蛋白变异体”，其是指与其对应的天然PFIC治疗蛋白相比具有改变的氨基酸序列、组成或结构的PFIC治疗蛋白。在一个实施方案中，PFIC为功能性型式(例如野生型)。表达PFIC治疗蛋白的突变型式(诸如导致进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的点突变或缺失突变)也可能有用，例如用于疾病的动物模型和/或用于评估进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的药物。可以将突变或经修饰PFIC治疗蛋白递送到细胞或动物模型系统以便生成疾病模型。这种细胞或动物模型可用于研究和/或药物筛选。由ceDNA载体表达的PFIC治疗蛋白可以进一步包含赋予额外功能性，诸如荧光、酶活性或分泌信号的序列/部分。在一个实施方案中，PFIC治疗蛋白变异体包含用于标识的非天然标签序列(例如免疫标签)以允许其与接受者宿主细胞中的内源性PFIC治疗蛋白区分开来。
所属领域的技术人员能够充分采用例如PFIC治疗蛋白的已知和/或公开可用的蛋白序列并且反向工程改造cDNA序列以编码此类蛋白。然后可以对cDNA进行密码子优化以与预定的宿主细胞匹配，并且插入如本文所述的ceDNA载体中。
在一个实施方案中，PFIC治疗蛋白编码序列可以衍生自现有的宿主细胞或细胞系，例如通过反向转录从宿主获得的mRNA并使用PCR扩增该序列。
(ii)表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体
具有一个或多个编码期望PFIC治疗蛋白的序列的ceDNA载体可以包含调节序列，诸如启动子(例如参见表7)、分泌信号、聚A区(例如参见表10)和增强子(例如参见表8A-8C)。至少，ceDNA载体包含一个或多个编码PFIC治疗蛋白或其功能片段的异源序列。用于生成编码PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的示例性盒插入片段描绘于图1A-图1G中。在一个实施方案中，ceDNA载体包含本文表1中所列的PFIC序列。
表1：用于治疗PFIC疾病(例如PFIC1、PFIC2、PFIC3或PFIC4)的PFIC治疗蛋白(例如 ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)表达的示例性PFIC序列。
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(iii)PFIC治疗蛋白及其用于治疗PFIC的用途
一种向受试者递送治疗蛋白的方法，该方法包括向该受试者施用包含本文所述的ceDNA载体的组合物，其中至少一个异源核苷酸序列编码PFIC治疗蛋白。
本文所述的ceDNA载体可以用于递送治疗性PFIC治疗蛋白以治疗与PFIC治疗蛋白的不当表达和/或PFIC治疗蛋白内的突变相关的PFIC疾病。
如本文所述的ceDNA载体可以用于表达任何期望PFIC治疗蛋白。示例性治疗性PFIC治疗蛋白包括但不限于由如本文表1中所阐述的序列表达的任何PFIC治疗蛋白。
在一个实施方案中，表达的PFIC治疗蛋白具有治疗进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的功能。在一些实施方案中，PFIC治疗蛋白不引起免疫系统反应。
在另一个实施方案中，编码PFIC治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)的ceDNA载体可以用于生成嵌合蛋白。因此，本文特别预期可以将表达嵌合蛋白的ceDNA载体施用于例如选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺。在一些实施方案中，当将表达PFIC的ceDNA载体施用于婴儿或施用于子宫内的受试者时，人们可以将表达PFIC的ceDNA载体施用于选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾上腺、心脏、肠、肺和胃，或其肝干细胞前体，以用于体内或离体治疗进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)。
该方法包括向受试者施用有效量的包含如本文所述的编码PFIC治疗蛋白或其片段(例如功能片段)的ceDNA载体的组合物。如熟练的从业者将了解，术语“有效量”是指ceDNA组合物的施用量，引起蛋白以治疗疾病或病患的“治疗有效量”表达。
包含编码PFIC治疗蛋白或其片段(例如，功能片段)的ceDNA载体的组合物的剂量范围取决于效力(例如，启动子的效率)，并且包括足以产生期望效果(例如表达期望的PFIC治疗蛋白)的量以治疗进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)。剂量不应大到引起不可接受的副作用。通常，剂量将随ceDNA载体的特定特征、表达效率以及随患者的年龄、病症和性别而变化。剂量可以由所属领域的技术人员确定，并且与传统的AAV载体不同，在任何并发症的情况下，也可以由个别医师来调节，因为ceDNA载体不包含阻止重复给药的免疫活化衣壳蛋白。
可以在有限的时间段内重复施用本文所述的ceDNA组合物。在一些实施方案中，定期或通过脉冲施用给予剂量。在一个优选实施方案中，上述剂量被施用数月。治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的反应而定。预期随着时间的推移加强治疗。此外，表达水平可以随着受试者的成长而滴定。
PFIC治疗蛋白可以在受试者中表达至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长时间。通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够达成长期表达。
如本文所用，术语“治疗有效量”是所表达的PFIC治疗蛋白或其功能片段足以产生疾病生物标志物的表达的统计学上显著的可测量变化或给定疾病症状的减轻的量(参见下文的“功效测量”)。指定的ceDNA组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
需要施用的ceDNA载体的精确量取决于从业者的判断并且因个体而异。合适的施用方案也是可变的，但以初始施用为代表，随后通过后续注射或其他施用以一个或多个间隔重复给药。另选地，预期持续静脉内输注足以将血液中的浓度维持在体内治疗规定的范围内，特别是用于治疗急性疾病/病患。
可用于本文所述的方法和组合物的药剂可通过体表、静脉内(通过团注或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、通过吸入、腹膜内、肌内、皮下、腔内施用，并且必要时可通过蠕动方式或通过所属领域的技术人员已知的其他方式递送。如果如此期望，那么可以全身施用该药剂。其也可以在子宫内施用。
对于PFIC疾病(例如PFIC1、PFIC2、PFIC3和PFIC4)的给定治疗的功效，可以由熟练的临床医生确定。然而，在本文使用“有效治疗”时，如果在用编码ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2或其功能片段的ceDNA载体治疗之后疾病或病患的任一种或所有体征或症状以有益方式改变、或疾病的其它临床上接受的症状或标志物改良或改善例如至少10％，那么认为治疗是“有效治疗”。示例性标志物和症状在实施例8中进行论述。还可以根据个体未发生恶化来测量功效，如通过疾病的稳定或对医疗干预的需求(即，疾病的进展停止或至少减缓)所评估。测量这些指标的方法是所属领域的技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括对个体或动物(一些非限制性示例包括人或哺乳动物)的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制(例如遏制)或减缓疾病或病患进展；或者(2)缓解疾病，例如引起症状消退；以及(3)防止该疾病发展或减小该疾病发展的可能性，或者预防与该疾病相关的继发性疾病/病患。用于治疗疾病的有效量意指当施用于有需要的哺乳动物时足以对该疾病产生如本文所定义术语的有效治疗的量。
药剂功效能够通过评估指定疾病所特有的身体指标来测定。分析疾病指标的标准方法是本领域已知的。例如，PFIC的物理指标包括但不限于肝炎、胆管损伤、肝细胞损伤和胆汁淤积。作为非限制性示例，胆汁淤积的血清标志物包括碱性磷酸酯酶(AP)和胆汁酸(BA)。血清胆红素、血清三酸甘油酯值水平和血清胆固醇水平也指示例如由PFIC引起的肝损伤。血清丙氨酸转氨酶(ALT)是肝细胞损伤的一种标志物。例如，可以通过测量TNF-α、Mcp-1和Vcam-1的mRNA表达以及诸如Col1a1和Col1a2的胆纤维化标志物的表达来分析肝炎和导管周纤维化。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体还可以编码辅因子或其他多肽、有义或反义寡核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、微小RNA和它们的反义对应物(例如，antagoMiR))，它们可以与从ceDNA表达的PFIC治疗蛋白结合使用。另外，包含编码PFIC治疗蛋白的序列的表达盒还可以包括外源序列，该外源序列编码待用于实验或诊断目的的报告蛋白，诸如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其它蛋白。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含用于表达对治疗PFIC疾病具有功能的PFIC治疗蛋白的核酸序列。在一个优选实施方案中，治疗性PFIC治疗蛋白不引起免疫系统反应，除非期望如此。
III.一般用于产生PFIC治疗蛋白的ceDNA载体
本公开的实施方案基于包含可以表达PFIC转基因的封闭端线性双链(ceDNA)载体的方法和组合物。在一些实施方案中，转基因是编码PFIC治疗蛋白的序列。如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体不受大小限制，从而准许例如表达由单个载体表达转基因所需的所有组分。用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体优选地为双链体，例如在分子的至少一部分上为自互补的，诸如表达盒(例如，ceDNA不为双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭端，并且因此抵抗核酸外切酶消化(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)，例如在37℃处维持超过一小时。
一般而言，用于表达本文公开的PFIC治疗蛋白的ceDNA载体在5'到3'方向上包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下中的任一种：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的经修饰ITR)；(ii)两个经修饰ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如，不对称的经修饰ITR)，或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织，或者(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织。
本文涵盖包含用于产生PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的方法和组合物，其可以进一步包括递送系统，诸如但不限于脂质体纳米粒子递送系统。本文公开了涵盖使用的非限制示例性脂质体纳米粒子系统。在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如，2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开了脂质纳米粒子配制物，该配制物经制备并且装载通过所述方法获得的ceDNA载体，该国际申请并入本文中。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体不具有由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装约束。与经囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体代表原核生物产生的质粒DNA载体的可行的真核生物产生的替代物。这允许插入控制元件，例如本文公开的调节开关、大的转基因、多个转基因等。
图1A-图1E显示了用于表达PFIC治疗蛋白的非限制性示例性ceDNA载体或ceDNA质粒的对应序列的示意图。用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体为无衣壳的并且可以获自质粒，该质粒按照此次序编码：第一ITR、包含转基因的表达盒和第二ITR。表达盒可以包括一种或多种允许且/或控制转基因表达的调节序列，例如其中表达盒能够按照此次序包含以下中的一个或多个：增强子/启动子、ORF报告基因(转基因)、转录后调节元件(例如WPRE)，以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A)。
表达盒还可包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施方案中，ITR可以充当转基因(例如，PFIC治疗蛋白)的启动子。在一些实施方案中，ceDNA载体包含用于调节转基因的表达的额外组分，例如调节开关，其在本文中标题为用于控制和调节PFIC治疗蛋白表达的“调节开关”的章节中描述，并且如果期望，可以包括作为使包含ceDNA载体的细胞能够控制细胞的细胞死亡的杀伤开关的调节开关。
表达盒能够包含超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000个-10,000个核苷酸或10,000个-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在500个至50,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在500个至75,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在500个至10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在1000个至10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒可以包含长度在500个至5,000个核苷酸范围内的转基因。ceDNA载体不存在衣壳化AAV载体的大小限制，从而能够递送大大小表达盒以提供有效的转基因表达。在一些实施方案中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
ceDNA表达盒能够包括例如编码在接受的受试者中不存在、无活性或活性不充分的蛋白的可表达的外源序列(例如开放阅读框)或转基因，或编码具有所期望的生物或治疗作用的蛋白的基因。转基因能够编码能够用以校正缺陷基因或转录物表达的基因产物。原则上，表达盒可包括编码因突变而减少或不存在或在本公开的范围内认为过度表达时会展现治疗益处的蛋白、多肽或RNA的任何基因。
表达盒可以包含任何转基因(例如编码PFIC治疗蛋白的转基因)，例如可用于治疗受试者的PFIC疾病的PFIC治疗蛋白，即治疗性PFIC治疗蛋白。ceDNA载体能够单独或与编码多肽的核酸或非编码核酸(例如RNAi、miRs等)以及外源基因和核苷酸序列(包括受试者基因组中的病毒序列，例如HIV病毒序列等等)组合，以递送和表达受试者中的所关注的任何PFIC治疗蛋白。优选地，本文所公开的ceDNA载体用于治疗目的(例如用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽。在某些实施方案中，ceDNA载体可用于在受试者中表达所关注的任何基因，包括一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、微RNA和它们的反义对应物(例如，antagomiR))、抗体、融合蛋白或它们的任何组合。
表达盒还可以编码多肽、有义或反义寡核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、微小RNA和它们的反义对应物(例如，antagoMiR))。表达盒可包括编码用于实验或诊断目的的报告蛋白的外源序列，该报告蛋白例如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它所属领域众所周知的报告蛋白。
在表达盒，即本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的表达构建体中提供的序列可以针对靶宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人等所关注的脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在该脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白的氨基酸序列。能够使用例如Aptagen的Gene密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司，2190Fox MillRd.Suite 300,Herndon,Va.20171)或其它公共数据库确定优化密码子。在一些实施方案中，如所属领域中已知，编码PFIC治疗蛋白的核酸经优化用于人类表达，和/或为人类PFIC治疗蛋白或其功能片段。
由如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体表达的转基因编码PFIC治疗蛋白。用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体存在许多不同于基于质粒的表达载体的结构特点。ceDNA载体可以具有以下特点中的一个或多个：缺乏原始(即，非插入)细菌DNA；缺乏原核复制起点；为自给自足的，即，其不需要除该两个ITR之外的任何序列，包括Rep结合和末端解链位点(RBS和TRS)和在该ITR之间的外源序列；存在形成发夹的ITR序列和不存在细菌型DNA甲基化或实际上被哺乳动物宿主视为异常的任何其它甲基化。一般来说，本公开的载体优选不含有任何原核DNA，但作为非限制性示例，预期可以将一些原核DNA作为外源序列插入启动子或增强子区中。将ceDNA载体与质粒表达载体区分开来的另一个重要特征是，ceDNA载体是具有封闭端的单链线性DNA，而质粒始终是双链DNA。
通过本文所提供的方法产生的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体优选地具有线性和连续结构而非非连续结构，如限制酶消化分析所测定(图4D)。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所描述的ceDNA质粒)，该质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而相比之下，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也仍保持是单个分子。在一些实施方案中，与质粒不同，如本文所描述的ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和纯化这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
如本文所述使用ceDNA载体来表达PFIC治疗蛋白相对于基于质粒的表达载体有几个优点，此类优点包括但不限于：1)质粒含有细菌DNA序列且经受原核特异性甲基化，例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化，而无衣壳AAV载体序列是真核来源的且不经历原核特异性甲基化；因此，与质粒相比，无衣壳AAV载体不太可能诱导炎性和免疫应答；2)质粒在生产过程中需要抗性基因的存在，而ceDNA载体则不需要；3)环状质粒在引入细胞中时不被递送到细胞核并且需要过载才能绕过细胞核酸酶的降解，而ceDNA载体含有赋予对核酸酶的抗性并且可以被设计为被靶向并被递送到细胞核的病毒顺式元件，即ITR。假设对于ITR功能必不可少的最小限定元件是Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQID NO:60))和末端解链位点(TRS；对于AAV2，5'-AGTTGG-3'(SEQ ID NO:64))加上允许发夹形成的可变回文序列；以及4)ceDNA载体不具有通常在原核生物来源的质粒中发现的CpG二核苷酸的过度呈现，据报道，CpG二核苷酸会结合Toll样受体家族的成员，从而引发T细胞介导的免疫应答。相比之下，用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
IV.ITR
如本文所公开，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体含有位于两个反向末端重复(ITR)序列之间的转基因或异源核酸序列，其中ITR序列可以是不对称ITR对或对称或基本上对称的ITR对，这些术语如本文所定义。如本文所公开的ceDNA载体可以包含选自以下中的任一种的ITR序列：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的修饰ITR)；(ii)两个经修饰ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如，不对称的经修饰ITR)，或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织，或者(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织，其中本公开的方法还可包括递送系统，诸如但不限于脂质体纳米粒子递送系统。
在一些实施方案中，ITR序列可以来自细小病毒科的病毒，细小病毒科包括两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科，和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(称为细小病毒)包括依赖病毒属，其成员在大多数情况下需要与诸如腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒共同感染才能进行生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(例如血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)，以及感染其它温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和羊的腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其它成员大体描述于Kenneth I.Berns,FIELDS VIROLOGY(第3版，1996)中第69章“Parvoviridae:The Virusesand Their Replication”1996)。
尽管在说明书和本文的实施例中举例说明的ITR是AAV2 WT-ITR，但是所属领域的普通技术人员知道如上所述，可以使用来自任何已知的细小病毒，例如依赖病毒，诸如AAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如，NCBI：NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)、嵌合ITR或来自任何合成AAV的ITR。在一些实施方案中，AAV可以感染温血动物，例如禽类(AAAV)、牛(BAAV)、犬、马和绵羊腺相关病毒。在一些实施方案中，ITR来自B19细小病毒(GenBank登录号：NC 000883)、来自小鼠的微小病毒(MVM)(GenBank登录号：NC 001510)；鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇毒细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。在一些实施方案中，5'WT-ITR可以来自一种血清型，而3'WT-ITR来自不同血清型，如本文所讨论。
普通技术人员知道，ITR序列具有双链霍利迪连结体(Holliday junction)的共同结构，该结构通常是T形或Y形发夹结构(参见例如图2A和图3A)，其中每个WT-ITR由两个回文臂或环(B-B'和C-C')嵌入较大的回文臂(A-A')中与单链D序列形成(其中这些回文序列的次序限定了ITR的翻转或翻动取向)。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)并且描述于以下文献中的ITR的结构分析和序列比较：Grimm等人，J.Virology,2006；80(1)；426-439；Yan等人，J.Virology,2005；364-379；Duan等人，Virology 1999；261；8-14。所属领域的技术人员基于本文提供的示例性AAV2 ITR序列，可以容易地确定用于ceDNA载体或ceDNA质粒的来自任何AAV血清型的WT-ITR序列。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6和禽类AAV(AAAV)和牛AAV(BAAV))并且描述于以下文献中的ITR的序列比较：Grimm等人，J.Virology,2006；80(1)；426-439；其显示了AAV2的左ITR与来自以下其他血清型的左ITR的同一性％：AAV-1(84％)、AAV-3(86％)、AAV-4(79％)、AAV-5(58％)、AAV-6(左ITR)(100％)和AAV-6(右ITR)(82％)。
A.对称ITR对
在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体按照5'到3'方向包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此是对称的或基本上对称的，也就是说，ceDNA载体能够包含具有对称三维空间组织的ITR序列，使得其结构在几何空间中具有相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。在这样的实施方案中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是不是野生型ITR的经修饰ITR(例如，mod-ITR)。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在另选的实施方案中，经修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的，也就是说，经修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有对应或相同的对称的三维形状。
(i)野生型ITR
在一些实施方案中，对称的ITR或基本上对称的ITR是如本文所描述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。也就是说，在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组织。
因此，如本文所公开，ceDNA载体含有位于两个侧接野生型反向末端重复(WT-ITR)序列之间的转基因或异源核酸序列，该两个野生型反向末端重复序列彼此反向互补(逆向)，或另选地，相对于彼此基本对称，即，WT-ITR对具有对称的三维空间组织。在一些实施方案中，野生型ITR序列(例如AAV WT-ITR)包含功能Rep结合位点(RBS；例如，对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:60)和功能末端解链位点(TRS；例如，5′-AGTT-3'，SEQID NO:62)。
在一方面，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可从编码异源核酸的载体多核苷酸获得，该异源核酸操作性地位于两个WT反向末端重复序列(WT-ITR)(例如AAV WT-ITR)之间。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。也就是说，在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组织。在一些实施方案中，5'WT-ITR来自一种AAV血清型，而3'WT-ITR来自相同或不同的AAV血清型。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR是彼此的镜像，即它们是对称的。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR来自相同的AAV血清型。
WT ITR是众所周知的。在一个实施方案中，两个ITR来自相同的AAV2血清型。在某些实施方案中，可以使用来自其它血清型的WT。存在许多同源血清型，例如AAV2、AAV4、AAV6、AAV8。在一个实施方案中，可以使用紧密同源的ITR(例如具有类似环结构的ITR)。在另一个实施方案中，能够使用较多样化的AAV WT ITR，例如AAV2和AAV5，并且在仍另一个实施方案中，能够使用基本上呈WT的ITR，也就是说，其不仅具有WT的基本环结构，而且具有不改变或不影响该特性的一些保守核苷酸变化。当使用来自相同病毒血清型的WT-ITR时，可以进一步使用一种或多种调节序列。在某些实施方案中，调节序列是准许调节ceDNA的活性(例如，所编码的PFIC治疗蛋白的表达)的调节开关。
在一些实施方案中，本文所述技术的一个方面涉及一种用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体，其中ceDNA载体包含至少一个操作性地位于两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间的异源核苷酸序列，其中WT-ITR能够来自相同血清型、不同血清型或相对于彼此是基本上对称的(即，具有对称的三维空间组织，使得其结构在几何空间中具有相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环)。在一些实施方案中，对称的WT-ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。在一些实施方案中，异源核酸序列编码转基因，并且其中载体不在病毒衣壳中。
在一些实施方案中，WT-ITR是相同的，但是彼此反向互补。例如，5'ITR中的序列AACG可以是3'ITR中相应位点处的CGTT(即，反向互补)。在一个示例中，5'WT-ITR有义链包含ATCGATCG的序列，而相应的3'WT-ITR有义链包含CGATCGAT(即与ATCGATCG反向互补)。在一些实施方案中，WT-ITR ceDNA还包含末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点)，例如Rep结合位点。
在本文的表3中显示了用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中的示例性WT-ITR序列，该载体包含WT-ITR，其显示成对的WT-ITR(5'WT-ITR和3'WT-ITR)。
作为一个示例性示例，本公开提供了包含操作性地连接到转基因(例如异源核酸序列)的启动子、具有或不具有调节开关的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体，其中ceDNA不含衣壳蛋白，并且：(a)由编码WT-ITR的ceDNA质粒(例如参见图1F-图1G)产生，其中每个WT-ITR的发夹二级构型具有相同数目个分子内双链碱基对(相较于这些参考序列，优选地排除这种构型中的任何AAA或TTT末端环的缺失)；和(b)使用用于标识ceDNA的分析通过在实施例1中的天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳标识为ceDNA。
在一些实施方案中，位于两侧的WT-ITR彼此基本上对称。在该实施方案中，5'WT-ITR可以来自AAV的一种血清型，而3'WT-ITR可以来自AAV的另一种血清型，使得WT-ITR不是相同的反向互补序列。例如，5'WT-ITR可以来自AAV2，并且3'WT-ITR来自不同血清型(例如，AAV1、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)。在一些实施方案中，WT-ITR可以选自从以下中的任一种中选择的两种不同的细小病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。在一些实施方案中，WT ITR的这种组合是来自AAV2和AAV6的WT-ITR的组合。在一个实施方案中，当一个相对于另一个ITR反向时，基本上对称的WT-ITR具有至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％…97％…98％…99％....99.5％以及其间的所有点的同一性，并具有相同的对称三维空间组织。在一些实施方案中，由于WT-ITR对具有对称的三维空间组织，例如具有A、C-C'、B-B'和D臂的相同3D组织，因此WT-ITR对是基本对称的。在一个实施方案中，基本上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此具有至少95％、至少96％…97％…98％…99％....99.5％同一性和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)。在一些实施方案中，基本上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此具有至少95％、至少96％…97％…98％…99％....99.5％同一性和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)，此外保留允许发夹二级结构形成的可变回文序列。同源性可以通过所属领域熟知的标准方法来确定，诸如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)、BLASTN。
在一些实施方案中，ITR的结构元件可以是参与ITR与大的Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施方案中，结构元件为ITR与大的Rep蛋白的相互作用提供了选择性，即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其它实施方案中，当Rep蛋白与ITR结合时，结构元件与大的Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以是例如ITR的二级结构、ITR的核苷酸序列、两个或更多个元件之间的间距元件，或上述任一个的组合。在一个实施方案中，结构元件选自由A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(trs)组成的组。
仅举例而言，表2指示WT-ITR的示例性组合。
表2：来自相同血清型或不同血清型或不同细小病毒的WT-ITR的示例性组合。显示的次序并不表示ITR位置，例如，“AAV1，AAV2”表明ceDNA可以在5'位置包含WT-AAV1 ITR，而在3'位置包含WT-AAV2 ITR，反之亦然，WT-AAV2 ITR位于5'位置，WT-AAV1 ITR位于3'位置。缩写：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(AAV3)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)；AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组(例如，NCBI:NC 002077、NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)、来自温血动物的ITR(禽类AAV(AAAV)、牛AAV(BAAV)、犬、马和绵羊AAV)、来自B19细小病毒的ITR(GenBank登录号：NC 000883)、小鼠微小病毒(MVM)(GenBank登录号NC 001510)；鹅：鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇：蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。
表2：
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仅举例而言，表3显示来自一些不同AAV血清型的示例性WT-ITR的序列。
表3
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在一些实施方案中，可以修饰WT-ITR序列的核苷酸序列(例如，通过修饰1、2、3、4或5个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，其中该修饰是替代互补核苷酸，例如，G替代C，反之亦然，T替代A，反之亦然。
在某些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体不具有由选自以下中的任一个的核苷酸序列组成的WT-ITR：SEQ ID NO:1、2、5-14。在本发明的另选的实施方案中，如果ceDNA载体具有包含选自以下中的任一个的核苷酸序列的WT-ITR：SEQ ID NO:1、2、5-14，那么侧接ITR也是WT并且ceDNA载体包含调控开关，例如如本文和国际申请PCT/US18/49996所公开(例如参见PCT/US18/49996的表11)。在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含如本文所公开的调控开关和所选择的WT-ITR，该WT-ITR具有选自由SEQID NO:1、2、5-14组成的组中的任一种的核苷酸序列。
如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以包括保留可操作的RBE、trs和RBE'部分的WT-ITR结构。出于示例性目的使用野生型ITR，图2A和图2B示出了关于ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点操作的一种可能机制。在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体含有一个或多个功能WT-ITR多核苷酸序列，这些多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60))和末端解链位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:62))。在一些实施方案中，至少一个WT-ITR是功能性的。在另选的实施方案中，其中用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含彼此基本上对称的两个WT-ITR，至少一个WT-ITR具有功能并且至少一个WT-ITR不具有功能。
B.通常用于包含不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的经修饰ITR(mod-ITR)
如本文所讨论，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以包含对称ITR对或不对称ITR对。在两个例子中，ITR中的一个或两个可以是经修饰ITR，差异在于，在第一个例子(即，对称的mod-ITR)中，mod-ITR具有相同的三维空间组织(即，具有相同的A-A'、C-C'和B-B'臂构形)，而在第二个例子(即，不对称的mod-ITR)中，mod-ITR具有不同的三维空间组织(即，具有A-A'、C-C'和B-B'臂的不同构形)。
在一些实施方案中，相较于野生型ITR序列(例如AAV ITR)，经修饰ITR为通过缺失、插入和/或取代进行修饰的ITR。在一些实施方案中，ceDNA载体中的ITR中的至少一个包含功能性Rep结合位点(RBS；例如，对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:60)和功能末端解链位点(TRS；例如，5′-AGTT-3'，SEQ ID NO:62。)在一个实施方案中，ITR中的至少一个是非功能ITR。在一个实施方案中，不同的或经修饰ITR不是各自来自不同血清型的野生型ITR。
在本文中详细描述了ITR中的特定改变和突变，但是在ITR的情况下，“改变”或“突变”或“修饰”表明相对于野生型、参考或原始ITR序列，插入、缺失和/或取代核苷酸。改变或突变的ITR可以是工程化ITR。如本文所用，“工程化”是指通过人的手进行操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面，例如其序列，通过人的手进行操纵而不同于自然存在的方面时，则认为该多肽是“工程化”的。
在一些实施方案中，经修饰ITR可以是合成的。在一个实施方案中，合成的ITR是基于来自一种以上AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方案中，合成ITR不包括基于AAV的序列。在又一个实施方案中，合成的ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列，但是保留了上述的ITR结构。在一些方面，合成的ITR可以优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或者在某些情况下，野生型Rep将不识别其，而仅突变的Rep可识别其。
技术人员可以通过已知手段确定其它血清型的对应序列。例如，确定改变是否在A、A'、B、B'、C、C'或D区域中，并确定另一种血清型中的对应区域。能够在默认状态下使用(基本局部比对搜索工具)或其它同源性比对程序测定对应序列。本公开进一步提供了包含来自不同AAV血清型的组合的mod-ITR的ceDNA载体群体和多个该ceDNA载体-也就是说，一个mod-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个mod-ITR可以来自不同血清型。不希望受理论的束缚，在一个实施方案中，一个ITR可以来自或基于AAV2 ITR序列，而ceDNA载体的另一个ITR可以来自或基于以下中的任一种或多种ITR序列：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。
任何细小病毒ITR都可以用作ITR或用于修饰的基础ITR。优选地，细小病毒是依赖病毒。更优选是AAV。选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和光感受器。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。在一个实施方案中，经修饰ITR是基于AAV2 ITR。
更具体地说，可以通过修饰结构元件来改变结构元件与特定的大Rep蛋白功能性相互作用的能力。例如，可以与ITR的野生型序列相比较来修饰结构元件的核苷酸序列。在一个实施方案中，可以去除ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和trs)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。例如，替代结构可以来自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。例如，ITR可以是AAV2 ITR，并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。又如，ITR可以是AAV5 ITR，并且C或C'臂、RBE和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个实施方案中，AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITR B和B'臂替代的AAV5 ITR。
仅作为示例，表4显示了经修饰ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如，缺失、插入和/或取代)，其中X指示该区段中的至少一个核酸相对于对应野生型ITR的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。例如，如果修饰引起以下任一种：单臂ITR(例如，单个C-C'臂或单个B-B'臂)或经修饰C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截短臂(例如截短的C-C'臂和/或截短的B-B'臂)的两臂ITR，那么至少该单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截短的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在一些实施方案中，截短的C-C'臂和/或截短的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。
表4：ITR的不同B-B'和C-C'区域或臂的至少一个核苷酸的修饰的示例性组合(例 如，缺失、插入和/或取代)(X指示核苷酸修饰，例如该区域中的至少一个核苷酸的添加、缺 失或取代)。
B区 B'区 C区 C'区
X
X
X X
X
X
X X
X X
X X
X X
X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X X
在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中的mod-ITR包含如本文所公开的不对称的ITR对或对称的mod-ITR对，可以包含表4中所示的任一种修饰组合，以及选自以下的任一个或多个区域中的至少一种核苷酸的修饰：在A'与C之间、在C与C'之间、在C'与B之间、在B与B'之间以及在B'与A之间。在一些实施方案中，在C或C'区或B或B'区中的至少一种核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)仍然保留了茎-环的末端环。在一些实施方案中，在C和C'和/或B和B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在替代实施方案中，C与C'之间和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续A核苷酸(即，AAA)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰ITR能够包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)：A'、A和/或D。例如，在一些实施方案中，本文中使用的经修饰ITR能够包含表4中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰ITR可以包含表4中所示的修饰的组合中的任一个，并且还包含A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰ITR可以包括表4中所示出的修饰组合中的任一个，并且还包括A和/或A’区中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰ITR可以包括表4中所示出的修饰组合中的任一个，并且还包括D区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。
在一个实施方案中，可以修饰结构元件的核酸序列(例如通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或者其中的任何范围)，以产生经修饰结构元件。在一个实施方案中，本文中举例说明了ITR的特定修饰(例如SEQ IDNO:3、4、15-47、101-116或165-187，或2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A-图7B中所示(例如PCT/US2018/064242中的SEQ ID No 97-98、101-103、105-108、111-112、117-134、545-54)。在一些实施方案中，能够修饰ITR(例如通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)。在其他实施方案中，ITR与SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的经修饰ITR之一或SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的A-A'臂和C-C'和B-B'臂的含RBE区段或国际专利申请PCT/US18/49996的表2-表9中所示(即，SEQ ID NO:110-112、115-190、200-468)可具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性，该国际专利申请全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，经修饰ITR可以例如包含特定臂的全部，例如A-A'臂的全部或一部分、或B-B'臂的全部或一部分、或C-C'臂的全部或一部分的去除或缺失，或另选地，形成环的茎的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对的去除，只要对茎(例如单臂)进行加帽的最终环仍然存在即可(例如参见2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A中的ITR-21)。在一些实施方案中，经修饰ITR可以包括从B-B'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对。在一些实施方案中，经修饰ITR能够包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对从C-C'臂中的去除(参见例如2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图3B中的ITR-1或图7A中的ITR-45)。在一些实施方案中，经修饰ITR可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对从C-C'臂的去除和1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对从B-B'臂的去除。设想去除碱基对的任何组合，例如可以在C-C'臂中去除6个碱基对以及在B-B'臂中去除2个碱基对。作为说明性示例，图3B显示了示例性经修饰ITR，其中从C部分和C'部分各缺失至少7个碱基对，C和C'区域之间的环中的核苷酸被取代，以及从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得经修饰ITR包含至少一个臂(例如C-C')截短的两个臂。在一些实施方案中，经修饰ITR还包含从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得臂B-B'相对于WTITR也截短。
在一些实施方案中，相对于全长野生型ITR序列，经修饰ITR可具有1个至50个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个)核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长WT ITR序列，经修饰ITR可以具有1个与30个之间的核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长野生型ITR序列，经修饰ITR可以具有2个与20个之间的核苷酸缺失。
在一些实施方案中，经修饰ITR在A或A'区域的含RBE部分中不含任何核苷酸缺失，以便不干扰DNA复制(例如，通过Rep蛋白结合到RBE，或在末端解链位点切割)。在一些实施方案中，本文涵盖使用的经修饰ITR在如本文所述的B、B'、C和/或C区域中具有一个或多个缺失。
在一些实施方案中，包含对称ITR对或不对称ITR对的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含如本文所公开的调节开关和至少一个经选择具有选自由SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187组成的组中的任一者的核苷酸序列的经修饰ITR。
在另一个实施方案中，结构元件的结构可以为经修饰的。例如，结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数量。例如，茎高可以是约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个或更多个核苷酸或其中的任何范围。在一个实施方案中，茎高度可以为约5个核苷酸至约9个核苷酸，并且在功能上与Rep相互作用。在另一个实施方案中，茎高度可以为约7个核苷酸，并且在功能上与Rep相互作用。在另一个示例中，环可以具有3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
在另一个实施方案中，RBE或扩展RBE内GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数量可以增加或减少。在一个实施方案中，RBE或扩展RBE可以包括1、2、3、4、5或6个或更多个GAGY结合位点或其中的任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列，只要该序列足以结合Rep蛋白即可。
在另一个实施方案中，能够改变(例如增加或减少)两个元件(诸如(但不限于)RBE和发夹)之间的间距，以改变与大Rep蛋白的功能相互作用。例如，间距可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以包括ITR结构，该ITR结构相对于本文所公开的野生型AAV2 ITR结构经修饰，但仍然保留可操作的RBE、trs和RBE'部分。图2A和图2B显示了用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点的一种可能的操作机制。在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体含有一个或多个功能ITR多核苷酸序列，这些多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60))和末端解链位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:62))。在一些实施方案中，至少一个ITR(wt或经修饰ITR)是功能性的。在另选的实施方案中，其中用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含彼此不同或不对称的两个经修饰ITR，至少一个经修饰ITR具有功能并且至少一个经修饰ITR不具有功能。
在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的经修饰ITR(例如，左ITR或右ITR)在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰。在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰的ITR的示例性序列列于国际申请PCT/US18/49996(其以全文引用的方式并入本文)的下表中：表2(即，SEQ ID NO:135-190、200-233)；表3(例如，SEQ ID No:234-263)；表4(例如，SEQ ID NO:264-293)；表5(例如，本文的SEQ IDNo:294-318)；表6(例如，SEQ ID NO:319-468)；以及表7-表9(例如，SEQ ID No:101-110、111-112、115-134)或者表10A或10B(例如，SEQ ID No:9、100、469-483、484-499)。
在一些实施方案中，包含不对称ITR对或对称mod-ITR对的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中使用的经修饰ITR选自国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9和10A-10B中所示的那些修饰中的任一个或组合，该国际申请以全文引用的方式并入本文中。
用于以上类别中的每一者中的包含不对称的ITR对或对称的mod-ITR对的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中的额外示例性经修饰ITR提供于表5A和表5B中。表5A中的经修饰右ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A中，并且表5B中的经修饰左ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7B中，该国际申请全文以引用方式并入本文。
表5A和表5B显示了示例性经修饰右ITR和左ITR。
表5A：示例性经修饰右ITR。经修饰的这些示例性右ITR能够包含 GCGCGCTCGCTCGCTC-3′(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子 补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE'(即，RBE的补 体)。
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表5B：示例性经修饰左ITR。经修饰的这些示例性左ITR能够包含 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子 补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE补体(RBE')。
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在一个实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体按照5'到3'方向包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的非核苷酸序列(例如如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此是不对称的，也就是说，它们具有彼此不同的3D空间构型。作为示例性实施方案，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是突变或修饰ITR，或反过来，其中第一ITR可以是突变或经修饰ITR，第二ITR可以是野生型ITR。在一些实施方案中，第一ITR和第二ITR均是mod-ITR，但具有不同序列或具有不同修饰，因此不是相同的经修饰ITR，并且具有不同的3D空间构型。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体包含这样的ITR：其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化不反映在另一个ITR中；或另选地，其中具有经修饰的不对称ITR对的不对称ITR可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。用于表达PFIC治疗蛋白并且用于生成ceDNA质粒的ceDNA载体中的示例性不对称的ITR在表5A和表5B中示出。
在一个另选的实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含两个对称的mod-ITR-也就是说，两个ITR都具有相同序列，但为彼此的反向互补序列(反向)。在一些实施方案中，相对于来自相同AAV血清型的野生型ITR序列，对称的经修饰ITR对包含缺失、插入或取代中的至少一种或任何组合。对称ITR中的添加、缺失或取代是相同的，但彼此反向互补。例如，在5'ITR的C区中插入3个核苷酸将反映为在3'ITR的C'区中对应部分中插入3个反向互补核苷酸。仅出于说明目的，如果在5'ITR中添加AACG，那么在3'ITR中对应位点处添加CGTT。例如，如果5'ITR有义链是ATCGATCG，在G与A之间添加AACG以产生序列ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)，则对应的3'ITR有义链是CGATCGAT(ATCGATCG的反向补体)，在T与C之间添加CGTT(即AACG的反向补体)以产生序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(ATCGAACGATCG的反向补体)(SEQ ID NO:51)。
在另选的实施方案中，经修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的-也就是说，经修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有对应或相同的对称的三维形状。例如，一个经修饰ITR能够来自一种血清型，而另一个经修饰ITR能够来自不同血清型，但它们在相同区域中具有相同突变(例如核苷酸插入、缺失或取代)。换句话说，仅出于说明目的，5'mod-ITR可以来自AAV2并在C区域有一个缺失，而3'mod-ITR可以来自AAV5并在C'区域中有相应的缺失，并且如果5'mod-ITR和3'mod-ITR具有相同或对称的三维空间组织，那么其作为经修饰ITR对涵盖用于在本文中。
在一些实施方案中，基本上对称的经修饰ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的经修饰ITR对中的修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源经修饰ITR相应缺失C-C'环，并且在其同源经修饰ITR的几何空间呈相同形状下，剩余A和B-B'环具有相似3D结构。仅作为示例，基本上对称的ITR可以具有对称的空间组织，使得它们的结构在几何空间中是相同的形状。例如，当G-C对被修饰为例如C-G对(反之亦然)或者A-T对被修饰为T-A对(反之亦然)时，可能会发生这种情况。因此，使用经修饰5'ITR的上述示例性示例作为ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)和经修饰3'ITR的上述示例性示例作为CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(即ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)的反向补体)，如果例如5'ITR具有序列ATCGAACCATCG(SEQ ID NO:50)，其中添加的G被修饰为C，并且基本上对称的3'ITR具有序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)，除了a外没有T的对应修饰，则这些经修饰ITR仍将是对称的。在一些实施方案中，这种经修饰ITR对基本上是对称的，因为经修饰ITR对具有对称的立体化学。
表6显示了用于用以表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中的示例性对称的经修饰ITR对(即，经修饰左ITR和对称的经修饰右ITR)。序列的黑体(红色)部分标识了部分ITR序列(即A-A'、C-C'和B-B'环的序列)，也在图31A-图46B中示出。经修饰的这些示例性ITR能够包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE'(即，RBE的补体)。
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在一些实施方案中，包含不对称ITR对的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体能够包含具有修饰的ITR，该修饰对应于以下序列中的任一修饰：本文表9A-表9B中的任一个或多个中所示的ITR序列或ITR部分序列；或2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A-图7B中所示的序列，该国际申请全文并入本文中；或2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9或表10A-表10B中所公开的序列，该国际申请以全文引用的方式并入本文中。
V.示例性ceDNA载体
如上文所描述，本公开涉及重组ceDNA表达载体和编码PFIC治疗蛋白的ceDNA载体，该ceDNA载体包含以下中的任一者：如上文所描述的不对称的ITR对、对称的ITR对或基本上对称的ITR对。在某些实施方案中，本公开涉及用于表达PFIC治疗蛋白的重组ceDNA载体，该重组ceDNA载体具有侧接的ITR序列和转基因，其中如本文所定义，ITR序列相对于彼此是不对称的、对称的或基本上对称的，并且ceDNA进一步包含位于侧接的ITR之间的所关注的核苷酸序列(例如包含转基因的核酸的表达盒)，其中该核酸分子缺乏病毒衣壳蛋白编码序列。
重组用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA表达载体可以是任何ceDNA载体，该ceDNA载体可以方便地进行包括如本文所述的核苷酸序列的重组DNA程序，条件是改变至少一个ITR。本公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体与其中将引入ceDNA载体的宿主细胞相容。在某些实施方案中，ceDNA载体可以是线性的。在某些实施方案中，ceDNA载体可以作为染色体外实体存在。在某些实施方案中，本公开的ceDNA载体可以含有容许供体序列整合到宿主细胞基因组中的元件。如本文所用，“转基因”与“异源核苷酸序列”同义，并且编码PFIC治疗蛋白，如本文所述。
现参看图1A-图1G，显示了可用于制造用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的两种非限制性质粒的功能性组分的示意图。图1A、图1B、图1D、图1F显示了ceDNA载体的构建体或用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA质粒的对应序列。ceDNA载体是无衣壳的并且能够获自质粒，该质粒按照此次序编码：第一ITR、可表达的转基因盒，和第二ITR，其中如本文所定义，第一ITR序列与第二ITR序列相对于彼此是不对称的、对称的或基本上对称的。ceDNA载体是无衣壳的并且能够获自质粒，该质粒按照此次序编码：第一ITR、可表达的转基因(蛋白或核酸)，和第二ITR，其中如本文所定义，第一ITR序列与第二ITR序列相对于彼此是不对称的、对称的或基本上对称的。在一些实施方案中，可表达的转基因盒根据需要包括：增强子/启动子、一个或多个同源臂、供体序列、转录后调节元件(例如WPRE，例如SEQ ID NO:67))以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A，例如SEQ ID NO:68)。
图5是使用实施例中所述的方法证实从多个质粒构建体产生ceDNA的凝胶。如以上关于图4A和实施例中所论述，ceDNA由凝胶中的特征色带图案证实。
A.调节元件。
包含如本文所定义的不对称的ITR对或对称的ITR对的如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以进一步包含顺式调节元件的特定组合。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。示例性启动子列于表7中。示例性增强子列于表8A-表8C中。在一些实施方案中，ITR可以充当转基因(例如，PFIC治疗蛋白)的启动子。在一些实施方案中，如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含用于调节转基因表达的额外组分，例如本文所述的用于调节转基因表达的调节开关或可以杀伤包含编码其PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的细胞的杀伤开关。可以用于本公开中的调节元件(包括调节开关)在国际申请PCT/US18/49996(其以全文引用的方式并入本文)中更充分地讨论。
在实施方案中，第二核苷酸序列包括调控序列和编码核酸酶的核苷酸序列。在某些实施方案中，基因调控序列与编码核酸酶的核苷酸序列操作性地连接。在某些实施方案中，调节序列适合于控制核酸酶在宿主细胞中的表达。在某些实施方案中，调控序列包括适合的启动子序列，其能够引导操作性地连接到启动子序列的基因转录，诸如编码本公开的核酸酶的核苷酸序列。在某些实施方案中，第二核苷酸序列包括连接到编码核酸酶的核苷酸序列的5'末端的内含子序列。在某些实施方案中，在启动子的上游提供增强子序列以提高启动子的功效。在某些实施方案中，调控序列包括增强子和启动子，其中第二核苷酸序列包括在编码核酸酶的核苷酸序列上游的内含子序列，其中内含子包括一个或多个核酸酶裂解位点，并且其中启动子与编码核酸酶的核苷酸序列操作性地连接。
以合成方式(参见PCT/US2019/014122，其内容以全文引用的方式并入本文)或使用如本文在实施例中所描述的基于细胞的产生方法产生的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以进一步包含顺式调节元件的特定组合，诸如WHP转录后调节元件(WPRE)(例如SEQID NO:67)和BGH聚A(SEQ ID NO:68)。适用于表达构建体中的表达盒不受病毒衣壳强加的包装约束的限制。
(i).启动子：
一般技术人员应了解，适当时，应该根据其启动的特定序列来定制如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中所使用的启动子。可用于ceDNA载体中的操作性地连接到转基因(例如PFIC治疗蛋白)的示例性启动子公开于本文表7中。
表7：
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用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的表达盒可以包括可以影响整体表达水平以及细胞特异性的启动子，例如选自表7的启动子中的任一者。对于转基因表达，例如PFIC治疗蛋白表达，其可以包括高活性病毒衍生的即刻早期启动子。表达盒可以含有组织特异性的真核启动子，以将转基因表达限制在特定细胞类型，并减少由不受调节的异常表达引起的毒性效应和免疫应答。在一些实施方案中，表达盒能够含有启动子或合成调节元件，例如CAG启动子(SEQ ID NO:72)。CAG启动子包括(i)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(ii)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及(iii)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。另选地，表达盒能够含有α-1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子(SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74)、肝脏特异性(LP1)启动子(SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76)，或人延伸因子-1α(EF1a)启动子(例如SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78)。在一些实施方案中，表达盒包括一个或多个组成型启动子，例如逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)，或细胞巨大病毒(CMV)即刻早期启动子(任选地具有CMV增强子，例如SEQID NO:79)。另选地，可以使用诱导型启动子、转基因的天然启动子、组织特异性启动子或所属领域已知的各种启动子。
适合的启动子，包括表7和上文所描述的启动子，可以衍生自病毒并因此可以称为病毒启动子，或其可以衍生自任何生物体，包括原核或真核生物体。适合的启动子可以用于通过任何RNA聚合酶(例如，pol I、pol II、pol III)来驱动表达。示例性启动子包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV即刻早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人类U6小核启动子(U6，例如，SEQ ID NO:80)(Miyagishi等人，Nature Biotechnology 20,497-500(2002))、增强的U6启动子(例如，Xia等人，Nucleic Acids Res.2003年9月1日；31(17))、人类H1启动子(H1)(例如，SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:155)、CAG启动子、人类α1-抗胰蛋白酶(HAAT)启动子(例如，SEQ ID NO:82)等。在某些实施方案中，这些启动子在其下游含内含子的末端处被改变以包括一个或多个核酸酶裂解位点。在某些实施方案中，含有核酸酶裂解位点的DNA与启动子DNA是无关的。
在一个实施方案中，使用的启动子是编码治疗性蛋白的基因的天然启动子。编码治疗性蛋白的相应基因的启动子和其他调节序列是已知的并且已被表征。所用启动子区域可以进一步包括一种或多种额外的调节序列(例如原生序列)，例如增强子(例如SEQ IDNO:79和SEQ ID NO:83)，包括SV40增强子(SEQ ID NO:126)。
在一些实施方案中，启动子还可以是来自人基因的启动子，例如人泛素C(hUbC)、人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，诸如肝脏特异性启动子，诸如天然或合成的人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)。在一个实施方案中，使用内源性ApoE经由存在于肝细胞表面上的低密度脂蛋白(LDL)受体将包括ceDNA载体的组合物特异性靶向肝细胞能够实现向肝脏的递送。
根据本公开使用的适合的启动子的非限制性实施例包括表7中列出的任一个启动子或以下中的任一个：例如CAG启动子(SEQ ID NO:72)、HAAT启动子(SEQ ID NO:82)、人类EF1-α启动子(SEQ ID NO:77)或EF1a启动子片段(SEQ ID NO:78)、IE2启动子(例如SEQ IDNO:84)以及大鼠EF1-α启动子(SEQ ID NO:85)、mEF1启动子(SEQ ID NO:59)或1E1启动子片段(SEQ ID NO:125)。
(ii)增强子
在一些实施方案中，表达PFIC治疗蛋白的ceDNA包含一个或多个增强子。在一些实施方案中，增强子序列位于启动子序列的5'。在一些实施方案中，增强子序列位于启动子序列的3'。在本文表8A-表8C中列出了示例性增强子。
表8：示例性增强子序列
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表8B：SERPINA1增强子变体
表8C：SERPINA1增强子变体(多个重复序列)
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(iii)5'UTR序列和内含子序列
在一些实施方案中，ceDNA载体包含5'UTR序列和/或位于5'ITR序列的3'的内含子序列。在一些实施方案中，5'UTR位于转基因(例如，编码PFIC治疗蛋白的序列)的5'。表9A中列出了示例性5'UTR序列。
表9A：示例性5'UTR序列和内含子序列
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(iv)3'UTR序列
在一些实施方案中，ceDNA载体包含位于3'ITR序列的5'的3'UTR序列。在一些实施方案中，3'UTR位于转基因(例如，编码PFIC治疗蛋白的序列)的3'。表9B中列出了示例性3'UTR序列。
表9B：示例性3'UTR序列和内含子序列
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(v).聚腺苷酸化序列：
编码聚腺苷酸化序列的序列可以包括于用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中以使由ceDNA载体表达的mRNA稳定并且有助于核输出和转译。在一个实施方案中，ceDNA载体不包括多聚腺苷酸化序列。在其它实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，多聚腺苷酸化序列包括约43个核苷酸、约40个-50个核苷酸、约40个-55个核苷酸、约45个-50个核苷酸、约35个-50个核苷酸或它们之间的任何范围。
表达盒可以包含所属领域已知的任何聚腺苷酸化序列或其变体。在一些实施方案中，聚腺苷酸化(聚A)序列选自表10中列出的任一个序列。也可以使用本领域公知的其他polyA序列，例如，包括但不限于从牛BGHpA(例如，SEQ ID NO:68)或病毒SV40pA(例如，SEQID NO:86)中分离的天然存在的序列或者合成序列(例如，SEQ ID NO:87)。一些表达盒还可以包括SV40晚期多聚腺苷酸化信号上游增强子(USE)序列。在一些实施方案中，USE序列可以与SV40pA或异源聚A信号组合使用。聚A序列位于编码PFIC治疗蛋白的转基因的3'。
表达盒还可以包含转录后元件以增加转基因的表达。在一些实施方案中，使用土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:67)增强转基因表达。可以使用其它转录后处理元件，诸如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。分泌序列能够连接到转基因，例如VH-02和VK-A26序列，例如SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89。
表10：示例性聚A序列
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(vi).核定位序列
在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含一个或多个核定位序列(NLS)，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，一个或多个NLS位于氨基末端处或附近、羧基末端处或附近、或这些位置的组合(例如氨基末端的一个或多个NLS和/或羧基末端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，可以彼此独立地选择，使得单个NLS可以多于一个拷贝存在并且/或者与以一个或多个拷贝存在的一个或多个其他NLS组合存在。NLS的非限制性实施例显示于表11中。
表11：核定位信号
B.ceDNA载体的额外组分
本公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以含有编码用于基因表达的其它组分的核苷酸。例如，为了选择特定的基因靶向事件，可以将保护性shRNA嵌入微型RNA中，然后插入被设计成位点特异性地整合至高活性基因座(诸如白蛋白基因座)中的重组ceDNA载体中。这样的实施方案可以提供用于在任何遗传背景下体内选择和扩增基因修饰的肝细胞的系统，诸如在Nygaard等人的A universal system to select gene-modifiedhepatocytes in vivo，Gene Therapy,2016年6月8日中所述。本公开的ceDNA载体可以含有一种或多种选择性标志物，其允许选择转化、转染、转导等的细胞。选择性标志物是产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原营养、NeoR等的基因。在某些实施方案中，将正向选择标志物并入供体序列中，诸如NeoR。可以将负向选择标志物并入供体序列的下游，例如可以将编码负向选择标志物的核酸序列HSV-tk并入供体序列下游的核酸构建体中。
C.调节开关
分子调节开关是一种响应信号而生成可测量的状态变化的开关。该调节开关可以有效地与如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体组合以控制ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达的输出。在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含用于微调PFIC治疗蛋白表达的调节开关。例如，其可以发挥ceDNA载体的生物封存功能。在一些实施方案中，开关为被设计成以可控制和可调节的方式启动或停止(即，关闭)ceDNA载体中PFIC治疗蛋白的表达的“ON/OFF”型开关。在一些实施方案中，开关可以包含“杀伤开关”，一旦该开关被激活，其就可以指令包括ceDNA载体的细胞经历细胞程序性死亡。所涵盖的用于用以表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中的示例性调节开关可以用于调节转基因表达，并更全面地论述于全文以引用方式并入本文中的国际申请PCT/US18/49996中。
(i)二元调节开关
在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包含可以用于可控制地调节PFIC治疗蛋白表达的调节开关。例如，位于ceDNA载体的ITR之间的表达盒可以另外包含操作性地连接到编码PFIC治疗蛋白的核酸序列的调节区，例如启动子、顺式元件、阻遏子、增强子等，其中调节区由一种或多种辅因子或外源因子调节。仅举例来说，调节区可以通过小分子开关或诱导型或阻遏型启动子进行调节。诱导型启动子的非限制性示例是激素诱导型或金属诱导型启动子。其它示例性的诱导型启动子/增强子元件包括但不限于RU486诱导型启动子、蜕皮素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
(ii)小分子调节开关
多种所属领域已知的基于小分子的调节开关为所属领域中已知的，并且可以与如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体组合以形成调节开关控制的ceDNA载体。在一些实施方案中，调节开关可选自以下中的任何一种或组合：正交配体/核受体对，例如类视黄醇受体变体/LG335和GRQCIMFI，以及控制操作性地连接的转基因的表达的人工启动子，诸如Taylor等人，BMC Biotechnology 10(2010):15中所公开；经工程改造的类固醇受体，例如C末端被截短的不能结合孕酮但结合RU486(米非司酮)的经修饰孕酮受体(美国专利号5,364,791)；来自果蝇的蜕皮素及其蜕皮类固醇配体(Saez等人，PNAS,97(26)(2000),14512–14517)；或者由抗生素甲氧苄氨嘧啶(TMP)控制的开关，如Sando R 3rd；NatMethods.2013,10(11):1085-8中公开的。在一些实施方案中，控制转基因或由ceDNA载体表达的调节开关是前药活化开关，诸如美国专利8,771,679和6,339,070中公开的活化开关。
(iii)“密码”调节开关
在一些实施方案中，调节开关可以是“密码开关”或“密码回路”。在发生特定条件时，也就是说，需要存在条件的组合才能发生转基因表达和/或阻遏时，密码开关允许微调对转基因从ceDNA载体的表达的控制。例如，为了发生转基因的表达，至少必须发生条件A和B。密码调节开关可以是任何数量的条件，例如，要存在至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个或更多个条件方能发生转基因表达。在一些实施方案中，需要发生至少2个条件(例如A、B条件)，并且在某些实施方案中，需要发生至少3个条件(例如A、B和C，或A、B和D)。仅举例来说，为了从具有密码“ABC”调节开关的ceDNA发生基因表达，必须存在条件A、B和C。条件A、B和C可以如下：条件A是存在病症或疾病，条件B是激素响应，并且条件C是对转基因表达的响应。例如，如果转基因编辑缺陷性EPO基因，那么条件A是存在慢性肾病(CKD)，如果受试者的肾脏中有低氧状况，那么发生条件B，条件C是肾脏中促红细胞生成素生成细胞(EPC)的募集受损；或另选地，HIF-2活化受损。一旦氧水平升高或达到期望的EPO水平，转基因就会关闭，直到再次发生3个条件，它重新打开。
在一些实施方案中，涵盖用于ceDNA载体中的密码调节开关或“密码回路”包含杂合转录因子(TF)以扩大用于界定生物封存条件的环境信号的范围和复杂度。与在预定条件存在下触发细胞死亡的致命开关相反，“密码回路”允许在特定“密码”存在下细胞存活或转基因表达，并且只有当存在预定环境条件或密码时，才可以容易地重新编程以允许转基因表达和/或细胞存活。
本文公开的调节开关，例如小分子开关、基于核酸的开关、小分子-核酸杂合开关、转录后转基因调节开关、转译后调节、辐射控制开关、低氧介导的开关和如本文公开的所属领域中普通技术人员已知的其它调节开关中的任何和所有组合均可以用于如本文公开的密码调节开关中。预期使用的调节开关也在综述文章Kis等人，J R Soc Interface.12:20141000(2015)中论述，并总结在Kis的表1中。在一些实施方案中，用于密码系统中的调节开关能够选自国际专利申请PCT/US18/49996的表11中所公开的任何开关或开关组合，该专利申请以全文引用的方式并入本文中。
(iv).控制转基因表达的基于核酸的调节开关
在一些实施方案中，用于控制ceDNA对PFIC治疗蛋白的表达的调节开关是以基于核酸的控制机制为基础。示例性核酸控制机构是所属领域中已知的并且是设想使用的。例如，此类机制包括核糖开关，诸如以下文献中所公开的核糖开关：例如US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018026762A1、美国专利9,222,093和EP申请EP288071；以及Villa JK等人的评论中所公开的核糖开关，Microbiol Spectr.2018年5月；6(3)中公开的。还包括代谢物响应性转录生物传感器，诸如WO2018/075486和WO2017/147585中公开的那些。设想使用的其它所属领域已知的机制包括用siRNA或RNAi分子(例如miR、shRNA)使转基因沉默。例如，ceDNA载体能够包含编码RNAi分子的调节开关，该RNAi分子与ceDNA载体所表达的转基因的一部分互补。当这种RNAi表达时，即使转基因(例如，PFIC治疗蛋白)由ceDNA载体表达，它将被互补的RNAi分子沉默，并且当RNAi不表达时，当转基因由ceDNA载体表达时，转基因(例如，PFIC治疗蛋白)不被RNAi沉默。
在一些实施方案中，调节开关是组织特异性自失活调节开关，例如如US2002/0022018中所公开，由此调节开关在转基因表达原本可能不利的位点有意地将转基因(例如，PFIC治疗蛋白)关闭。在一些实施方案中，调节开关是重组酶可逆基因表达系统，例如US2014/0127162和美国专利8,324,436中所公开。
(v).转录后和转译后调节开关
在一些实施方案中，用于控制ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达的调节开关为转录后修饰系统。例如，这样的调节开关可以是对四环素或茶碱敏感的适体酶(aptazyme)核糖开关，如以下中所公开：US2018/0119156、GB201107768、WO2001/064956A3、欧洲专利2707487和Beilstein等人，ACS Synth.Biol.Biol.,2015,4(5)，第526–534页；Zhong等人，Elife.2016年11月2日；5.pii:e18858。在一些实施方案中，设想所属领域普通技术人员可以编码转基因和含有配体敏感性(OFF-开关)适体的抑制性siRNA二者，净结果是配体敏感性ON-开关。
(vi).其它示例性调节开关
任何已知的调节开关都可以用于ceDNA载体中以控制ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达，包括环境变化所触发的表达。另外的示例包括但不限于：Suzuki等人，ScientificReports 8；10051(2018)的BOC方法；遗传密码扩展和非生理性氨基酸；辐射控制或超声控制的开/关开关(参见例如Scott S等人，Gene Ther.2000年7月；7(13):1121-5；美国专利5,612,318、5,571,797、5,770,581、5,817,636、和WO1999/025385A1。在一些实施方案中，调节开关由可植入系统控制，例如如美国专利7,840,263、US2007/0190028A1中所公开，其中基因表达由一种或多种形式的能量来控制，包括电磁能，该能量活化与ceDNA载体中的转基因操作性地连接的启动子。
在一些实施方案中，设想用于ceDNA载体中的调节开关是低氧介导的或胁迫活化的开关，例如诸如以下文献中公开的那些开关：WO1999060142A2、美国专利5,834,306、6,218,179、6,709,858、US2015/0322410、Greco等人，(2004)Targeted Cancer Therapies 9,S368，以及FROG、TOAD和NRSE元件和条件诱导型沉默元件，包括低氧应答元件(HRE)、炎型应答元件(IRE)和剪切应力活化元件(SSAE)，例如如美国专利9,394,526中所公开的。此类实施方案可用于在缺血后或在缺血组织和/或肿瘤中打开转基因从ceDNA载体的表达。
(iv).杀伤开关
本文所述的其它实施方案涉及如本文所述的包含杀伤开关的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体。如本文公开的杀伤开关能够使包括ceDNA载体的细胞被杀伤或经历程序性细胞死亡，作为从受试者的系统中永久去除引入的ceDNA载体的手段。所属领域的普通技术人员将了解，杀伤开关在用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中的使用通常联合ceDNA载体靶向受试者可以接受地损失的有限数目个细胞或靶向期望细胞凋亡时的细胞类型(例如癌细胞)。在所有方面，如本文公开的“杀伤开关”被设计成在缺乏输入的存活信号或其它指定条件下提供对包括ceDNA载体的细胞的快速而稳固的细胞杀伤。换句话说，由如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体编码的杀伤开关可以使包含ceDNA载体的细胞的细胞存活受特定输入信号所限定的环境限制。如果期望从受试者中去除ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达或确保其不表达所编码的PFIC治疗蛋白，则这种杀伤开关发挥生物学生物封存功能。
本领域普通技术人员已知的其他杀伤开关被涵盖用于如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体中，例如如以下文献中所公开的：US2010/0175141、US2013/0009799、US2011/0172826、US2013/0109568，以及以下文献中所公开的杀伤开关：Jusia等人，Reviews in Cell Biology and molecular Medicine；2014；1-56；Kobayashi等人，PNAS,2004；101；8419-9；Marchisio等人，Int.Journal of Biochem and Cell Biol.,2011；43；310-319；以及Reinshagen等人，Science Translational Medicine,2018,11。
因此，在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以含有包含编码效应毒素或报告蛋白的核酸的杀伤开关核酸构建体，其中效应毒素(例如死亡蛋白)或报告蛋白的表达受预定条件控制。例如，预定条件可以是存在环境试剂，例如外源药剂，在没有该环境要剂的情况下，细胞将默认表达效应毒素(例如死亡蛋白)并且被杀伤。在另选的实施方案中，预定条件是存在两种或更多种环境剂，例如细胞将仅在提供两种或更多种必需的外源剂时存活，而在其中的任一种不存在的情况下，包含ceDNA载体的细胞被杀伤。
在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体经修饰以并入杀伤开关，从而破坏包含ceDNA载体的细胞，以有效地终止ceDNA载体所表达的转基因的体内表达(例如PFIC治疗蛋白的表达)。具体地说，进一步对ceDNA载体进行基因工程改造以表达在哺乳动物细胞中、在正常生理学条件下不具功能性的开关蛋白。仅在药物施用后或在特异性靶向这种开关蛋白的环境条件下，表达开关蛋白的细胞被破坏，从而终止治疗蛋白或肽的表达。例如，据报告，表达HSV-胸苷激酶的细胞在药物(诸如苷昔洛韦(ganciclovir)和胞嘧啶脱氨酶)施用后可以被杀伤。参见例如Dey和Evans,Suicide Gene Therapy by HerpesSimplex Virus-1 Thymidine Kinase(HSV-TK),You编辑的Targets in Gene Therapy(2011)；以及Beltinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15):8699-8704(1999)。在一些实施方案中，ceDNA载体能够包含siRNA杀伤开关，称为DISE(存活基因排除所诱导的死亡)(Murmann等人，(Oncotarget.2017；8:84643-84658.Induction of DISE in ovariancancer cells in vivo)。
VI.产生ceDNA载体的详细方法
A.一般产生
用于产生如本文所定义的包含不对称的ITR对或对称的ITR对的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的章节IV中，该申请的全文以引用方式并入本文中。在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以如本文所述使用昆虫细胞产生。在另选的实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以以合成方式产生，并且在一些实施方案中，以游离方法产生，如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122所公开，该申请的全文以引用方式并入本文中。
如本文所述，在一个实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以例如通过包括以下步骤的方法获得：a)在有效诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并持续足以诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的时间，在Rep蛋白的存在下温育具有不含病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如昆虫细胞)群体，并且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。然而，没有表达病毒粒子(例如，AAV病毒粒子)。因此，没有大小限制，诸如在AAV或其它基于病毒的载体中天然强加的大小限制。
可以通过以下来确认从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从宿主细胞分离的DNA，并在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。
在又另一个方面中，本公开提供了将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合到其自身基因组中的宿主细胞系用于产生非病毒DNA载体的用途，例如Lee,L.等人(2013)Plos One 8(8):e69879中所描述。优选地，Rep以约3的MOI加入宿主细胞中。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系、例如HEK293细胞时，该细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体、诸如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中，使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。
在一个实施方案中，用于制造如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的宿主细胞为昆虫细胞，并使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板，例如如图4A至图4C和实施例1中所描述。在一些实施方案中，宿主细胞经工程改造以表达Rep蛋白。
然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞采集和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。在一个实施方案中，细胞在足以产生ceDNA载体的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体但在大多数细胞开始因杆状病毒毒性而死亡之前的时间采集。可以使用质粒纯化试剂盒，诸如，Qiagen Endo-Free Plasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸纯化方法。
DNA载体可以通过所属领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。在一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的存在可以通过以下来证实：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离的载体DNA，并使用凝胶电泳分析被消化和未被消化的DNA物质，以证实与线性和非连续DNA相比线性和连续DNA的特征带的存在。图4C和图4D示出了用于鉴定通过本文的方法产生的封闭端ceDNA载体的存在的一个实施方案。
B.ceDNA质粒
ceDNA质粒为用于后续产生用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的质粒。在一些实施方案中，ceDNA质粒可以使用已知的技术来构建，以在转录方向上提供至少以下项作为操作性地连接的组分：(1)经修饰5'ITR序列；(2)含有顺式调节元件(例如，启动子、诱导型启动子、调节开关、增强子等)的表达盒；以及(3)经修饰3'ITR序列，其中3'ITR序列相对于5'ITR序列对称。在一些实施方案中，侧接ITR的表达盒包含用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。
在一个方面中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是从质粒获得，该质粒在本文中称为“ceDNA质粒”，其按照此次序编码：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、包含转基因的表达盒和经突变或经修饰AAV ITR，其中该ceDNA质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列。在另选的实施方案中，ceDNA-质粒按次序编码：第一(或5')经修饰或经突变AAV ITR、包括转基因的表达盒、以及第二(或3')经修饰AAV ITR，其中该ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR彼此对称。在另选的实施方案中，ceDNA质粒按次序编码：第一(或5')经修饰或经突变AAV ITR、包含转基因的表达盒、以及第二(或3')经突变或经修饰AAV ITR，其中该ceDNA质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'修饰ITR具有相同的修饰(即彼此反向互补或对称)。
在另一个实施方案中，ceDNA质粒系统不含病毒衣壳蛋白编码序列(即，其不含AAV衣壳基因，并且还不含其它病毒的衣壳基因)。另外，在具体实施方案中，ceDNA-质粒还不含AAV Rep蛋白编码序列。因此，在一个优选实施方案中，ceDNA质粒缺乏AAV2的功能性AAVcap和AAV rep基因GG-3'加上允许发夹形成的可变回文序列。
本公开的ceDNA质粒可以使用所属领域中熟知的任何AAV血清型的基因组的天然核苷酸序列来生成。在一个实施方案中，ceDNA-质粒主链衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如，NCBI：NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC006261；Kotin and Smith,The Springer Index of Viruses，可在Springer维护的URL上获得(www网址：oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp？virID＝42.04.)(注意：对URL或数据库的引用是指截至本申请生效提交日为止的URL或数据库的内容)。在一个具体实施方案中，ceDNA-质粒主链衍生自AAV2基因组。在另一个具体实施方案中，ceDNA-质粒主链是合成的主链，其经过基因工程改造以在它的5'和3'ITR处包含衍生自这些AAV基因组之一。
ceDNA-质粒可以任选地包括选择性或选择标志物，用于建立产生ceDNA载体的细胞系。在一个实施方案中，选择标志物能够插入3'ITR序列的下游(即，3')。在另一个实施方案中，选择标志物能够插入5'ITR序列的上游(即，5')。适当的选择标志物包含例如赋予耐药性的那些标志物。选择标志物可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。在优选实施方案中，药物选择标志物是杀稻瘟菌素S抗性基因。
用于表达PFIC治疗蛋白的示例性ceDNA(例如rAAV0)载体由rAAV质粒产生。一种用于产生rAAV载体的方法可以包括：(a)为宿主细胞提供如上文所描述的rAAV质粒，其中宿主细胞和质粒均不含衣壳蛋白编码基因，(b)在允许产生ceDNA基因组的条件下培养宿主细胞；以及(c)收获细胞并分离从该细胞产生的AAV基因组。
C.从ceDNA质粒制备ceDNA载体的示例性方法
本文还提供了用于制造用于表达PFIC治疗蛋白的无衣壳ceDNA载体的方法，特别是具有足够高的产量以提供足够的载体用于体内实验的方法。
在一些实施方案中，用于产生用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的方法包括以下步骤：(1)将包含表达盒和两个对称的ITR序列的核酸构建体引入宿主细胞(例如Sf9细胞)中；(2)任选地，例如通过使用质粒上存在的选择标志物建立克隆细胞系；(3)将Rep编码基因引入(通过用携带该基因的杆状病毒转染或感染)该昆虫细胞中；以及(4)收取细胞并纯化ceDNA载体。上述用于产生ceDNA载体的包括表达盒和两个ITR序列的核酸构建体可以呈ceDNA质粒的形式，或如下所述用ceDNA质粒生成的杆粒或杆状病毒的形式。可以通过转染、病毒转导、稳定整合或所属领域中已知的其它方法将核酸构建体引入宿主细胞中。
D.细胞系：
用于产生用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的宿主细胞系可以包括衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的昆虫细胞系，诸如Sf9 Sf21，或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，或其它无脊椎动物、脊椎动物或其它真核细胞系，包括哺乳动物细胞。也可以使用普通技术人员已知的其它细胞系，诸如HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1 180、单核细胞、以及成熟和不成熟的树突状细胞。可以转染宿主细胞系以稳定表达ceDNA质粒，从而高产率地产生ceDNA载体。
可以使用所属领域已知的试剂(例如脂质体、磷酸钙)或物理手段(例如电穿孔)，通过瞬时转染将ceDNA质粒引入Sf9细胞中。另选地，可以建立将ceDNA质粒稳定整合至基因组中的稳定Sf9细胞系。此类稳定细胞系可以通过如上文所描述将选择标志物并入ceDNA-质粒中来建立。如果用于转染细胞系的ceDNA-质粒包含选择标志物，诸如抗生素，那么可以通过向细胞生长培养基中加入抗生素来选择已用ceDNA-质粒转染并将ceDNA-质粒DNA整合到基因组中的细胞。然后可以通过单细胞稀释或集落转移技术来分离细胞的抗性克隆并增殖。
E.分离并纯化ceDNA载体：
用于获得和分离ceDNA载体的方法的示例描述于图4A-图4E和下文的具体实施例中。本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以从表达AAV Rep蛋白的生产细胞获得，进一步用ceDNA质粒、ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒转化。可用于产生ceDNA载体的质粒包括编码PFIC治疗蛋白的质粒或编码一种或多种REP蛋白的质粒。
在一个方面中，多核苷酸编码在质粒(Rep-质粒)、杆粒(Rep-杆粒)或杆状病毒(Rep-杆状病毒)中递送到生产细胞的AAV Rep蛋白(Rep 78或68)。Rep-质粒、Rep-杆粒和Rep-杆状病毒可以通过上文所描述的方法生成。
用于产生用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的方法描述于本文中。用于生成如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的表达构建体可以为质粒(例如ceDNA质粒)、杆粒(例如ceDNA杆粒)和/或杆状病毒(例如ceDNA杆状病毒)。仅举例来说，ceDNA-载体可以由用ceDNA-杆状病毒和Rep-杆状病毒共同感染的细胞生成。由Rep-杆状病毒产生的Rep蛋白可以复制ceDNA-杆状病毒以生成ceDNA-载体。另选地，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以由经构建体稳定转染的细胞生成，该构建体包含编码AAV Rep蛋白(Rep78/52)的序列，该AAV Rep蛋白是在Rep质粒、Rep杆粒或Rep杆状病毒中递送。CeDNA-杆状病毒可以瞬时转染到细胞中，通过Rep蛋白复制并产生ceDNA载体。
杆粒(例如ceDNA-杆粒)能够转染到允许的昆虫细胞中，诸如Sf9、Sf21、Tni(粉纹夜蛾)细胞、High Five细胞，并且生成ceDNA-杆状病毒，该杆状病毒是重组杆状病毒，其包括包含对称ITR的序列和表达盒。ceDNA-杆状病毒能够再次感染到昆虫细胞中以获得下一代重组杆状病毒。任选地，该步骤可以重复一次或多次以产生更大量的重组杆状病毒。
从细胞收取和收集如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化以实现ceDNA载体的高产量生产。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择收获时间。通常，可以在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体(例如，ceDNA载体)的时间后但在大多数细胞开始因病毒毒性死亡之前收获细胞。使用质粒纯化试剂盒，诸如Qiagen ENDO-FREE试剂盒，能够从Sf9细胞中分离出ceDNA载体。为了分离质粒而开发的其它方法也可以适合于ceDNA载体。一般而言，可以采用所属领域中已知的任何核酸纯化方法，以及可商购的DNA提取试剂盒。
另选地，可以通过对细胞团块进行碱溶解法、离心所得溶解液并进行色谱分离来实施纯化。作为一个非限制性实施例，该方法可以如下进行：将上清液装载于保留核酸的离子交换柱(例如SARTOBIND)上，然后洗脱(例如使用1.2M NaCl溶液)并且在凝胶过滤柱(例如6个快速流动GE)上进一步进行色谱纯化。然后通过例如沉淀来回收无衣壳AAV载体。
在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体还可以以外泌体或微米粒子形式纯化。本领域已知许多细胞类型不仅释放出可溶性蛋白，而且经由膜微囊泡脱落释放出复杂的蛋白/核酸货物(Cocucci等人，2009；EP 10306226.1)。此类囊泡包含微囊泡(也称为微粒)和外泌体(也称为纳米囊泡)，两者均包括蛋白和RNA作为货物。微囊泡由质膜的直接出芽生成，而外泌体在多囊泡内体与质膜融合后释放到细胞外的环境中。因此，可以从已经用ceDNA-质粒转导的细胞或用ceDNA-质粒生成的杆粒或杆状病毒中分离出含有ceDNA载体的微囊泡和/或外泌体。
微囊泡可以通过对培养基进行过滤或以20,000xg超速离心来分离，并且外泌体可以通过以100,000xg超速离心来分离。超速离心的最佳持续时间可以通过实验确定，并且将取决于从中分离囊泡的特定细胞类型。优选地，首先利用低速离心(例如在2000×g下进行5分钟-20分钟)清除培养基并且使用例如离心柱(Millipore,Watford,UK)进行离心浓缩。微囊泡和外泌体可以通过使用识别存在于微囊泡和外泌体上的特定表面抗原的特异性抗体，经由FACS或MACS进一步纯化。其它微囊泡和外泌体纯化方法包括但不限于免疫沉淀、亲和色谱、过滤和涂有特异性抗体或适体的磁珠。纯化后，用例如磷酸盐缓冲盐水洗涤囊泡。使用米囊泡或外泌体递送含ceDNA的囊泡的一个优点是，这些囊泡可通过在它们的膜上包括被相应细胞类型上的特异性受体识别的蛋白而靶向各种细胞类型。(也参见EP10306226)
本文的本公开的另一个方面涉及从已经将ceDNA构建体稳定整合到其自身基因组中的宿主细胞系中纯化ceDNA载体的方法。在一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
国际申请PCT/US18/49996的图5显示了凝胶证实ceDNA的产生，该ceDNA使用实施例中所述的方法由多种ceDNA-质粒构建体产生。如实施例中关于图4D所论述，ceDNA通过凝胶中的特征色带图案来证实。
VII.药物组合物
在另一方面，提供了药物组合物。药物组合物包含如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以并入适于施用于受试者的药物组合物中以体内递送到受试者的细胞、组织或器官。通常，药物组合物包括如本文公开的ceDNA-载体和药学上可接受的载剂。例如，如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以并入适于期望的治疗性施用途径(例如肠胃外施用)的药物组合物中。还预期经由高压静脉内或动脉内输注以及诸如核内显微注射或胞浆内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的缓冲液中、然后进行过滤灭菌来制备。可以配制包括ceDNA载体，以将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，使得转基因或供体序列在其中治疗性表达。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。
包含用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的药学活性组合物可以被配制成将用于不同目的的转基因递送到细胞，例如受试者的细胞。
用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以并入适于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴管内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、眼房内和玻璃体内)、耳蜗内和经粘膜(例如经口、经直肠、经鼻)施用的药物组合物中。还预期经由高压静脉内或动脉内输注以及诸如核内显微注射或胞质内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。
在一些方面中，本文所提供的方法包括将一种或多种如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体递送到宿主细胞。本文还提供了通过这类方法产生的细胞，以及包含这类细胞或由这类细胞产生的生物体(诸如动物、植物或真菌)。核酸的递送方法可包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA和药剂增强的DNA吸收。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355)并且脂质体转染试剂有市售(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。递送可以到细胞(例如，体外或离体施用)或靶组织(例如，体内施用)。
将核酸递送到细胞的各种技术和方法是所属领域中已知的。例如，核酸诸如用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA可以被配制到脂质纳米粒子(LNP)、类脂质(lipidoid)、脂质体、脂质纳米粒子、脂质体复合物(lipoplex)或核壳纳米粒子中。通常，LNP由核酸(例如ceDNA)分子、一种或多种可电离或阳离子脂质(或其盐)、一种或多种非离子或中性脂质(例如磷脂)、防止聚集的分子(例如PEG或PEG-脂质缀合物)以及任选的固醇(例如胆固醇)构成。
另一种用于将核酸诸如用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA递送到细胞的方法为使核酸与被细胞内化的配体缀合。例如，配体可以结合细胞表面上的受体并经由胞吞而被内化。配体可以与核酸中的核苷酸共价连接。用于将核酸递送到细胞中的示例性缀合物描述于例如WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515和WO2017/177326中。
核酸诸如用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体还可以通过转染递送到细胞。有用的转染方法包含(但不限于)：脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。转染试剂在本领域中是熟知的并且包括但不限于：TurboFect转染试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技)、TRANSPASSTM P蛋白转染试剂(新英格兰生物实验室(New England/>))、CHARIOTTM蛋白递送试剂(艾跃生物公司(Active/>))、PROTEOJUICETM蛋白转染试剂(EMD密理博(EMD/>))、293fectin、LIPOFECTAMINETM 2000、LIPOFECTAMINETM 3000(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTINTM(赛默飞世尔科技)、DMRIE-C、CELLFECTINTM(赛默飞世尔科技)、OLIGOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTACETM、FUGENETM(瑞士巴塞尔的罗氏(/>Basel,Switzerland))、FUGENETM HD(罗氏)、TRANSFECTAMTM(转染胺(Transfectam)，威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(/>Madison,Wis.))、TFX-10TM(普洛麦格公司/>)、TFX-20TM(普洛麦格公司)、TFX-50TM(普洛麦格公司)、TRANSFECTINTM(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(/>Hercules,Calif.))、SILENTFECTTM(伯乐公司/>)、EffecteneTM(加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(/>Valencia,Calif.))、DC-chol(阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))、GENEPORTERTM(加利福尼亚州圣地亚哥的基因疗法系统(GeneTherapy/>San Diego,Calif.))、DHARMAFECT 1TM(科罗拉多州拉斐特的达尔马肯(Lafayette,Colo.))、DHARMAFECT 2TM(达尔马肯/>)、DHARMAFECT 3TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 4TM(达尔马肯)、ESCORTTM III(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(/>St.Louis,Mo.))和ESCORTTM IV(西格玛化学品公司(SigmaChemical Co.))。核酸，诸如ceDNA，也可以经由所属领域的技术人员已知的微流体方法递送到细胞。
如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体还可以直接施用于生物体以在体内转导细胞。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包含(但不限于)：注射、输注、局部施用和电穿孔。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。
用于引入如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的核酸载体ceDNA载体的方法可以例如通过如例如在美国专利号5,928,638中所描述的方法来递送到造血干细胞中。
本公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了示例性脂质体和脂质体配制物，包括(但不限于)含有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物，参见例如标题为“药物配制物”的章节。
所属领域已知的各种递送方法或其改良方法可用于在体外或体内递送ceDNA载体。例如，在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是通过机械能、电能、超声波能、流体动力能或基于激光的能量使得短暂渗透细胞膜以使得便于DNA进入靶向细胞中来递送。例如，可以通过经过大小限制的通道挤压细胞或通过所属领域中已知的其它手段来瞬时破坏细胞膜来递送ceDNA载体。在一些情况下，单独的ceDNA载体作为裸DNA直接注射到以下任一组织中：选自以下的任何一种或多种组织：肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃、皮肤、胸腺，心肌或骨骼肌。在一些情况下，通过基因枪递送ceDNA载体。涂覆有无衣壳AAV载体的金或钨球形粒子(直径1μm-3μm)可以通过加压气体加速到高速而渗透到目标靶细胞中。
本文特别预期包含用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施方案中，ceDNA载体与脂质递送系统，例如本文所述的脂质体一起配制。在一些实施方案中，这类组合物通过熟练从业人员期望的任何途径来施用。可以通过不同途径，包括经口、肠胃外、舌下、经皮直肠、经粘膜、局部、经由吸入、经由颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内鞘内和关节内或其组合，向受试者施用组合物。对于兽医用途，可根据正常兽医实践将组合物作为适当可接受的配制物施用。兽医可以很容易地确定最适合具体动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法(诸如电穿孔(“EP”)、流体动力学方法或超声波)施用组合物。
在一些情况下，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是通过流体动力学注射来递送，该流体动力学注射为将任何水溶性化合物和粒子直接细胞内递送到内脏和整个肢体的骨骼肌中的简单且高效的方法。
在一些情况下，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是通过超声波，通过在膜中制造纳米级孔以便于将DNA粒子细胞内递送到内脏或肿瘤的细胞中来递送，因此质粒DNA的大小和浓度在系统的效率中起重要作用。在一些情况下，通过使用磁场的磁转染来递送ceDNA载体，以将含有核酸的粒子集中到靶细胞中。
在一些情况下，可以使用化学递送系统，例如通过使用纳米复合物，其包含用属于阳离子脂质体/胶束或阳离子聚合物的聚阳离子纳米粒子来压紧带负电核酸。用于递送方法的阳离子脂质包含但不限于单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍化合物、胆固醇衍生化合物、阳离子聚合物、(例如聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、其它阳离子聚合物)和脂质-聚合物杂化物。
A.外泌体：
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是通过包装于外泌体中来递送。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡，其在多囊泡体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。其表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，其含有来自产生外泌体的细胞的胞溶质并且在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。外泌体由包含上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)以及树突状细胞(DC)在内的各种细胞类型产生。一些实施方案设想使用直径在10nm与1μm之间、20nm与500nm之间、30nm与250nm之间、50nm与100nm之间的外泌体。使用外泌体的供体细胞或通过将特定核酸引入外泌体中，可以分离外泌体以递送到靶细胞中。所属领域中已知的各种方法可以用于产生含有本公开的无衣壳AAV载体的外泌体。
B.微米颗粒/纳米颗粒：
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体通过脂质纳米粒子递送。通常，脂质纳米粒子包含可电离的氨基脂质(例如4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPC)、胆固醇和外被脂质(聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油，PEG-DMG)，例如Tam等人(2013).Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery.Pharmaceuticals5(3):498-507所公开的。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约10nm与约1000nm之间的平均直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有小于300nm的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约10nm与约300nm之间的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有小于200nm的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子具有介于约25nm与约200nm之间的直径。在一些实施方案中，脂质纳米粒子制剂(例如，包含多个脂质纳米粒子的组合物)具有一定的大小分布，其中平均大小(例如，直径)为约70nm至约200nm，并且更通常，平均大小为约100nm或更小。
所属领域中已知的多种脂质纳米粒子可以用于递送如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体。例如，在美国专利号9,404,127、9,006,417和9,518,272中描述了使用脂质纳米粒子的各种递送方法。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是通过金纳米粒子来递送。通常，核酸可以与金纳米粒子共价结合或与金纳米粒子非共价结合(例如通过电荷-电荷相互作用结合)，例如Ding等人(2014).Gold Nanoparticles forNucleic Acid Delivery.Mol.Ther.22(6)；1075-1083。在一些实施方案中，使用例如美国专利号6,812,334中描述的方法产生金纳米粒子-核酸缀合物。
C.偶联物
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体与增强细胞吸收的试剂缀合(例如共价结合)。“增加细胞吸收的药剂”是促进核酸跨脂质膜运输的分子。例如，核酸能够与亲脂性化合物(例如胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如穿膜肽、TAT、Syn1B等)和多胺(例如精胺)缀合。增强细胞吸收的药剂的其他示例公开于例如Winkler(2013).Oligonucleotide conjugates for therapeuticapplications.Ther.Deliv.4(7)；791-809。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体与聚合物(例如聚合分子)或叶酸(folate)分子(例如叶酸(folic acid)分子)缀合。通常，与聚合物缀合的核酸的递送是所属领域中已知的，例如WO2000/34343和WO2008/022309中所描述。在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体与聚(酰胺)聚合物缀合，例如美国专利号8,987,377所描述。在一些实施方案中，将本公开所描述的核酸与叶酸分子缀合，如美国专利号8,507,455中所描述。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体与碳水化合物缀合，例如美国专利号8,450,467中所描述。
D.纳米胶囊
另选地，可以使用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的纳米胶囊配制物。纳米胶囊通常可以呈稳定并且可再现的方式截留物质。为了避免由于细胞内聚合物过载所致的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细粒子(大小约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米粒子是预期使用的。
E.脂质体
本公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。已经研发了血清稳定性和循环半衰期有所改善的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载剂的各种方法(美国专利号5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587)。
F.示例性脂质体和脂质纳米颗粒(LNP)组合物
本公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到细胞，例如需要表达转基因的细胞。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
包含ceDNA载体的脂质纳米粒子(LNP)公开于全文并入本文中的2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中，并且设想用于针对如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的方法和组合物中。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，该聚乙二醇官能团可以降低一种或多种该化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低剂量频率。另选地，脂质体配制物仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此类方面，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da至约5,000Da。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其将在数小时至数周的时间内以延长释放或受控释放曲线来递送API。在一些相关的方面，脂质体配制物可以包括以脂质双层结合的水性腔。在其它相关方面，脂质体配制物将API与组分一起囊封起来，该组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时到数周的时段内释放API。
在一些方面，脂质体配制物包括鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。在一些方面，脂质体配制物包括光敏体。
在一些方面，本公开提供了脂质体配制物，其包括选自以下项的一种或多种脂质：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)；DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)；EPC(卵磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)；POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DSPG(二硬脂酰基磷脂酰甘油)；DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、胆固醇硫酸酯(CS)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或它们的任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。在一些方面，脂质体配制物的总脂质含量为2mg/mL-16mg/mL。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，摩尔比分别为3:0.015:2。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面，PEG化脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质缀合物和胆固醇。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括以下中的一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇，例如胆固醇。在一些方面，脂质体配制物包括DOPC/DEPC；和DOPE。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体调配物，该脂质体配制物进一步包括一种或多种药物赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。
在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。在一些方面中，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或泡沫基粒子的脂质体配制物。在一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对大小更大并且大小为约150nm至250nm的脂质体配制物。在一些方面，脂质体配制物是冻干粉末。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱，用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载该ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大致7.3，并驱动API进入脂质体中。在一些方面，本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体配制物。在此类情况下，脂质体的内部可以处于pH 4-6.9下，并且更优选pH 6.5。在其它方面，本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体配制物。在这样的情况下，利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内俘获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。
在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如，通过如2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开的方法获得的ceDNA制备并负载ceDNA的脂质纳米粒子配制物，该申请并入本文中。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合，使可电离脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和粒子成核提供有利的能量来实现。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定粒子。能够将颗粒浓缩至所需水平。
通常，以约10:1至30:1的总脂质与ceDNA(质量或重量)比率制备脂质粒子。在一些实施方案中，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。能够调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/mL至约30mg/mL的范围内。
可电离脂质通常用于在低pH值下浓缩核酸货物(例如ceDNA)并驱动膜缔合和融合。通常，可电离脂质是包含至少一个氨基的脂质，该氨基在酸性条件下(例如在pH 6.5或更低的条件下)带正电或质子化。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。
示例性可电离脂质描述于国际PCT专利公开WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354；以及美国专利公开US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人，Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012),51(34):8529-8533，其内容以全文引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/074085中所述的脂质ATX-002，其内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2012/040184中所述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/199952中所述的化合物6或化合物22，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
没有限制，可电离脂质可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的20％-90％(mol)。例如，可电离脂质摩尔含量可以为脂质纳米粒子中存在的总脂质的20％-70％(mol)、30％-60％(mol)或40％-50％(mol)。在一些实施方案中，可电离的脂质占脂质纳米粒子中存在的总脂质的约50mol％至约90mol％。
在一些方面中，脂质纳米粒子可以进一步包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。
设想用于如本文所公开的方法和组合物中的示例性非阳离子脂质描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242中，该国际申请全文并入本文中。示例性非阳离子脂质描述于国际申请公开WO2017/099823和美国专利公开US2018/0028664中，两者的内容以全文引用的方式并入本文中。
非阳离子脂质能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0％-30％(mol)。例如，非阳离子脂质含量为脂质纳米粒子中存在的总脂质的5％-20％(mol)或10％-15％(mol)。在各种实施方案中，可电离的脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子不包含任何磷脂。在一些方面中，脂质纳米粒子能够进一步包含诸如固醇等组分，以提供膜完整性。
能够用于脂质纳米粒子的一种示例性固醇是胆固醇和其衍生物。示例性胆固醇衍生物描述于国际申请WO2009/127060和美国专利公开US2010/0130588中，该文献以全文引用的方式并入本文。
提供膜完整性的组分(诸如固醇)能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0％-50％(mol)。在一些实施方案中，此类组分占脂质纳米粒子的总脂质含量的20％-50％(mol)、30％-40％(mol)。
在一些方面，脂质纳米粒子可以进一步包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米粒子的聚集和/或提供空间稳定。示例性缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物以及其混合物。在一些实施方案中，缀合的脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质。示例性PEG-脂质缀合物包括(但不限于)：PEG-二酰基甘油(DAG)(如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，所有这些文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，PEG-脂质是如US2018/0028664中定义的化合物，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，US20150376115或US2016/0376224中公开了PEG-脂质，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰氨基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些示例中，PEG-脂质可以选自由以下项组成的组：PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
还能够使用与除PEG之外的分子缀合的脂质替代PEG-脂质。例如，代替PEG-脂质或除PEG-脂质以外，还可以使用聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物。示例性的缀合脂质(即，PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质)描述于WO1996/010392、WO1998/051278、WO2002/087541、WO2005/026372、WO2008/147438、WO2009/086558、WO2012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、WO2017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282；美国专利申请公开US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453；和US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，可以根据治疗目的和所需的生物学作用选择治疗剂。例如，如果LNP内的ceDNA可用于治疗PFIC疾病，那么额外化合物可以为抗PFIC疾病剂(例如化学治疗剂或其它PFIC疾病疗法(包括但不限于小分子或抗体))。例如，如果LNP内的ceDNA可用于治疗血友病A，那么另外的化合物可以是抗微生物剂(例如抗生素或抗病毒化合物)。在又一个实方案中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病症，那么额外化合物可以是调节免疫应答的化合物(例如免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调节一种或多种特异性免疫途径的化合物)。在一些实施方案中，含有不同化合物诸如编码不同蛋白的ceDNA或不同化合物诸如治疗剂的不同脂质纳米粒子的不同混合液可以用于本公开的组合物和方法中。
在一些实施方案中，额外的化合物是免疫调节剂。例如，另外的化合物是免疫抑配制物。在一些实施方案中，额外的化合物是免疫刺激剂。本文还提供了包含所产生的经脂质纳米粒子囊封的昆虫细胞或如本文所述的以合成方式产生的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体以及药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
在一些方面，本公开提供了一种脂质纳米粒子配制物，该脂质纳米粒子配制物进一步包含一种或多种药物赋形剂。在一些实施方案中，脂质纳米粒子配制物还包含蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
ceDNA载体能够与粒子的脂质部分复合或囊封于脂质纳米粒子的脂质位置。在一些实施方案中，可以将ceDNA完全囊封在脂质纳米粒子的脂质位置中，从而保护其免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。在一些实施方案中，脂质纳米粒子中的ceDNA在37℃处脂质纳米粒子暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上不降解。在一些实施方案中，在将血清中的粒子在37℃处温育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后，脂质纳米粒子中的ceDNA基本上不降解。
在某些实施方案中，脂质纳米粒子对受试者，例如对哺乳动物，诸如人基本上是无毒的。在一些方面，脂质纳米粒子配制物是冻干粉末。
在一些实施方案中，脂质纳米粒子是具有至少一个脂质双层的固体芯粒子。在其它实施方案中，脂质纳米粒子具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制，非双层形态能够包括例如三维管、棒、对称立方体等。例如，使用例如Cryo-TEM分析，能够轻松地评估且表征脂质纳米粒子的形态(片层对非片层)，例如如US2010/0130588中所述，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些其它实施方案中，具有非层状形态的脂质纳米粒子是电子致密的。在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质纳米粒子。在一些方面，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或基于泡沫的粒子的脂质纳米粒子配制物。
通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质缀合物从脂质粒子中交换出来的速率，进而可以控制脂质纳米粒子融合的速率。另外，包括例如pH、温度或离子强度的其它变量可以用于改变和/或控制脂质纳米粒子融合的速率。基于本公开，所属领域的普通技术人员将清楚可以用于控制脂质纳米粒子融合的速率的其它方法。同样显而易见，通过控制该脂质缀合物的组合物和浓度，可以控制脂质颗粒的大小。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的效力相关(参见Jayaraman等人，Angewandte Chemie,International Edition(2012),51(34),8529-8533；Semple等人，Nature Biotechnology 28,172-176(20l 0)，这两篇文献都以全文引用的方式并入)。pKa的优选范围是约5到约7。使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的测定法测定脂质纳米粒子中阳离子脂质的pKa。
VIII.使用方法
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体还可以用于将所关注的核苷酸序列(例如编码PFIC治疗蛋白)递送到靶细胞(例如宿主细胞)的方法中。该方法尤其可以为将PFIC治疗蛋白递送到有需要的受试者的细胞并治疗PFIC疾病的方法。本公开允许在ceDNA载体中经编码的PFIC治疗蛋白在受试者的细胞中进行体内表达以使得出现PFIC治疗蛋白表达的治疗效果。在ceDNA载体的体内和体外递送模式中均可以看到这些结果。
另外，本公开提供了在有需要的受试者的细胞中递送PFIC治疗蛋白的方法，该方法包括多次施用编码该PFIC治疗蛋白的本公开的ceDNA载体。由于本公开的ceDNA载体不像对囊封病毒载体通常所观察到那样诱导免疫应答，所以该多次施用策略将可能在基于ceDNA的系统中取得更大的成功。ceDNA载体是以足以转染期望组织细胞和提供足够的基因转移和PFIC治疗蛋白表达水平而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于视网膜施用(例如视网膜下注射，脉络膜上注射或玻璃体内注射)、静脉内施用(例如在脂质体配制物中)、直接递送至所选器官(例如选自肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃中的任何一种或多种组织)、肌肉内施用和其他肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
如本文所述的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的递送不限于所表达的PFIC治疗蛋白的递送。例如，常规产生(例如使用基于细胞的产生方法(例如昆虫细胞产生方法))或合成产生的如本文所述的ceDNA载体可与为了提供基因疗法的一部分而提供的其他递送系统一起使用。可与根据本公开的ceDNA载体组合的系统的一个非限制性示例包括单独递送一种或多种辅因子或免疫抑制剂以使表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体进行有效基因表达的系统。
本公开还提供了治疗受试者的PFIC疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的ceDNA载体和任选地药学上可接受的载剂引入受试者的有需要的靶细胞(尤其肌肉细胞或组织)中。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所选的ceDNA载体包含编码可用于治疗PFIC疾病的PFIC治疗蛋白的核苷酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包含操作性地连接到控制元件的期望PFIC治疗蛋白序列，该控制元件在引入受试者中时能够引导由外源DNA序列编码的期望PFIC治疗蛋白的转录。ceDNA载体可以经由如上文和本文其它地方提供的任何适合的途径施用。
本文所提供的组合物和载体可以用于递送PFIC治疗蛋白以用于各种目的。在一些实施方案中，转基因编码旨在用于研究目的，例如创建具有转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究PFIC治疗蛋白产物的功能的PFIC治疗蛋白。在另一个示例中，转基因编码旨在用于创建PFIC疾病动物模型的PFIC治疗蛋白。在一些实施方案中，经编码PFIC治疗蛋白可用于治疗或预防哺乳动物受试者的PFIC疾病状态。PFIC治疗蛋白可以足以治疗与基因的表达减少、缺乏表达或功能异常相关的PFIC疾病的量转移到患者(例如于患者中表达)。
原则上，表达盒可以包括编码PFIC治疗蛋白的核酸或任何转基因，该蛋白因突变而减少或不存在或者在本公开的范围内被认为是过表达时会赋予治疗益处。优选地，本文提供的ceDNA组合物中不存在未插入的细菌DNA，并且优选地不存在细菌DNA。
ceDNA载体不限于ceDNA载体的一种。因而，在另一个方面中，表达不同蛋白或相同PFIC治疗蛋白、但操作性地连接到不同启动子或顺式调节元件的多种ceDNA载体可以同时或依序递送到靶细胞、组织、器官或受试者。因此，这种策略能够允许多个蛋白同时进行基因疗法或基因递送。将PFIC治疗蛋白的不同部分分离成可以同时或在不同时间施用并且可以单独调节的单独ceDNA载体(例如，PFIC治疗蛋白的功能性所需的不同结构域和/或辅因子)，由此添加额外水平的对PFIC治疗蛋白表达的控制也是可能的。考虑到由于缺乏病毒衣壳而缺乏抗衣壳宿主免疫应答，递送也可以进行多次，并且对于临床环境中的基因疗法来说，重要的是随后增加或减少剂量。可以预期，由于没有衣壳，因此不会发生抗衣壳应答。
本公开还提供了治疗受试者的PFIC疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的如本文所公开的ceDNA载体和任选地药学上可接受的载剂引入受试者的有需要的靶细胞(尤其肌肉细胞或组织)中。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所建构的ceDNA载体包括可用于治疗PFIC疾病的所关注的核苷酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包括与控制元件操作性地连接的期望的外源DNA序列，当引入受试者中时，该控制元件能够指导由外源DNA序列编码的期望的多肽、蛋白或寡核苷酸的转录。ceDNA载体可以经由如上文和本文其它地方提供的任何适合的途径施用。
IX.递送用于PFIC治疗蛋白产生的ceDNA载体的方法
在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以通过各种适合的方法体外或体内递送到靶细胞。可以施用或注射单独的ceDNA载体。CeDNA载体可以在不借助于转染试剂或其他物理方式的情况下递送到细胞。另选地，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以使用任何所属领域已知的转染试剂或其他所属领域已知的便于DNA进入细胞中的物理手段，例如脂质体、醇类、富含聚赖氨酸的化合物、富含精氨酸的化合物、磷酸钙、微囊泡、显微注射、电穿孔等等来递送。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以有效地靶向通常难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
本文所述的技术的一个方面涉及将PFIC治疗蛋白递送到细胞的方法。通常，对于体内和体外方法，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以使用如本文所公开的方法以及所属领域中已知的其它方法引入细胞中。如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体优选地以生物学有效量施用于细胞。如果将ceDNA载体在体内施用于细胞(例如施用于受试者)，那么ceDNA载体的生物学有效量是足以使PFIC治疗蛋白在靶细胞中转导和表达的量。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的示例性施用模式包括经口、经直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，经由气雾剂)、经颊(例如，舌下)、经阴道、鞘内、眼内、透皮、内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内[包括施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌]、胸膜内、脑内和关节内)。施用可以全身或直接递送到肝脏或其他地方(例如，任何肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、肺和胃)。
施用可以是局部(例如，皮肤和粘膜表面，包括气道表面和透皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如但不限于肝脏，但也可用于眼睛、肌肉，包括骨骼肌、心肌、膈肌或大脑)。
可以向受试者的任何部位施用ceDNA载体，包括(但不限于)选自由以下组成的组的部位：肝脏和/或眼睛、脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肾脏、脾脏、胰腺、皮肤。
在任何给定情况下最适合的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病症的性质和严重程度，以及所使用的特定ceDNA载体的性质。另外，ceDNA准许人们施用在单个载体或多个ceDNA载体(例如ceDNA混合液)中的超过一种PFIC治疗蛋白。
A.ceDNA载体的肌肉内施用
在一些实施方案中，治疗受试者的疾病的方法包含将治疗有效量的编码PFIC治疗蛋白的ceDNA载体和任选地药学上可接受的载剂引入受试者的有需要的靶细胞(尤其肌肉细胞或组织)中。在一些实施方案中，将用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体施用于受试者的肌肉组织。
在一些实施方案中，ceDNA载体能够施用于受试者的任何部位，包括但不限于选自由骨骼肌、平滑肌、心脏、隔膜或眼肌组成的组的部位。
向本公开的骨骼肌施用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包括但不限于向肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌施用。如本文所公开的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda等人，(2005)Blood 105:3458-3464)和/或直接肌肉内注射而递送到骨骼肌。在具体实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体通过肢体灌注、任选地隔离肢体灌注(例如静脉内或关节内施用)来施用于受试者(例如患有如DMD的肌营养不良症的受试者)的肝脏、眼睛、肢体(臂和/或腿)。在实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体可以在不使用“流体动力学”技术的情况下施用。
例如，常规病毒载体的组织递送(例如递送到肌肉)通常利用流体动力学技术增强(例如大体积的静脉内/静脉内施用)，其增强血管压力并且促进病毒载体穿越内皮细胞屏障的能力。在具体实施方案中，本文所述的ceDNA载体能够在流体动力学技术缺乏的情况下施用，例如大体积输注和/或升高的血管内压力(例如大于正常收缩压，例如小于或等于血管内压力相对于正常收缩压的5％、10％、15％、20％、25％增幅)。这样的方法可以减少或避免与流体动力学技术相关的副作用，例如水肿、神经损伤和/或隔室综合征。
此外，包含施用于骨骼肌的如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的组合物可以施用于肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌片)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌。适合的骨骼肌包括但不限于外展小指肌(abductordigiti minimi)(在手中)、外展小趾肌(abductor digiti minimi)(在脚中)、拇展肌(abductor hallucis)、第五趾(指)展肌(abductor ossis metatarsi quinti)、拇短展肌(abductor pollicis brevis)、拇长展肌(abductor pollicis longus)、内收短肌(adductor brevis)、拇收肌(adductor hallucis)、内收长肌(adductor longus)、内收大肌(adductor magnus)、拇收肌(adductor pollicis)、肘肌(anconeus)、前斜角肌(anterior scalene)、膝关节肌(articularis genus)、肱二头肌(biceps brachii)、股二头肌(biceps femoris)、肱肌(brachialis)、肱挠肌(brachioradialis)、颊肌(buccinator)、喙肱肌(coracobrachialis)、皱眉肌(corrugator supercilii)、三角肌(deltoid)、降口角肌(depressor anguli oris)、降下唇肌(depressor labiiinferioris)、二腹肌(digastric)、骨间背侧肌(dorsal interossei)(在手中)、骨间背侧肌(在脚中)、桡侧腕短伸肌(extensor carpi radialis brevis)、桡侧腕长伸肌(extensorcarpi radialis longus)、尺侧伸腕肌(extensor carpi ulnaris)、伸小指肌(extensordigiti minimi)、伸趾肌(extensor digitorum)、伸趾短肌(extensor digitorumbrevis)、伸趾长肌(extensor digitorum longus)、伸拇短肌(extensor hallucisbrevis)、伸拇长肌(extensor hallucis longus)、伸食指肌(extensor indicis)、伸拇短肌(extensor pollicis brevis)、伸拇长肌(extensor pollicis longus)、桡侧腕屈肌(flexor carpi radialis)、尺侧屈腕肌(flexor carpi ulnaris)、小指短屈肌(flexordigiti minimi brevis)(在手中)、小趾短屈肌(flexor digiti minimi brevis)(在脚中)、趾短屈肌(flexor digitorum brevis)、趾长屈肌(flexor digitorum longus)、指深屈肌(flexor digitorum profundus)、指浅屈肌(flexor digitorum superficialis)、拇短屈肌(flexor hallucis brevis)、拇长屈肌(flexor hallucis longus)、拇短屈肌(flexor pollicis brevis)、拇长屈肌(flexor pollicis longus)、额肌(frontalis)、腓肠肌(gastrocnemius)、颏舌骨肌(geniohyoid)、臀大肌(gluteus maximus)、臀中肌(gluteus medius)、臀小肌(gluteus minimus)、股薄肌(gracilis)、颈髂肋肌(iliocostalis cervicis)、腰髂肋肌(iliocostalis lumborum)、胸髂肋肌(iliocostalisthoracis)、髂肌(illiacus)、下孖肌(inferior gemellus)、下斜肌(inferior oblique)、下直肌(inferior rectus)、冈下肌(infraspinatus)、棘间肌(interspinalis)、横突间肌(intertransversi)、翼外肌(lateral pterygoid)、外直肌(lateral rectus)、背阔肌(latissimus dorsi)、提口角肌(levator anguli oris)、提上唇肌(levator labiisuperioris)、提上唇鼻翼肌(levator labii superioris alaeque nasi)、提上睑肌(levator palpebrae superioris)、肩胛提肌(levator scapulae)、长回旋肌(longrotators)、头最长肌(longissimus capitis)、颈最长肌(longissimus cervicis)、胸最长肌(longissimus thoracis)、头长肌(longus capitis)、颈长肌(longus colli)、蚓状肌(lumbricals)(在手中)、蚓状肌(lumbricals)(在脚中)、咬肌(masseter)、翼内肌(medialpterygoid)、内直肌(medial rectus)、中斜角肌(middle scalene)、多裂肌(multifidus)、下颌舌骨肌(mylohyoid)、头下斜肌(obliquus capitis inferior)、头上斜肌(obliquuscapitis superior)、闭孔外肌(obturator externus)、闭孔内肌(obturator internus)、枕肌(occipitalis)、肩胛舌骨肌(omohyoid)、小指对掌肌(opponens digiti minimi)、拇对掌肌(opponens pollicis)、眼轮匝肌(orbicularis oculi)、口轮匝肌(orbicularisoris)、骨间掌侧肌(palmar interossei)、掌短肌(palmaris brevis)、掌长肌(palmarislongus)、耻骨肌(pectineus)、胸大肌(pectoralis major)、胸小肌(pectoralis minor)、腓短肌(peroneus brevis)、腓长肌(peroneus longus)、第三腓骨肌(peroneus tertius)、梨状肌(piriformis)、跖侧骨间肌(plantar interossei)、跖肌(plantaris)、颈阔肌(platysma)、腘肌(popliteus)、后斜角肌(posterior scalene)、旋前方肌(pronatorquadratus)、旋前圆肌(pronator teres)、腰大肌(psoas major)、股方肌(quadratusfemoris)、跖方肌(quadratus plantae)、头直前肌(rectus capitis anterior)、头侧直肌(rectus capitis lateralis)、头后大直肌(rectus capitis posterior major)、头后小直肌(rectus capitis posterior minor)、股直肌(rectus femoris)、大菱形肌(rhomboidmajor)、小菱形肌(rhomboid minor)、笑肌(risorius)、缝匠肌(sartorius)、小斜角肌(scalenus minimus)、半膜肌(semimembranosus)、头半棘肌(semispinalis capitis)、颈半棘肌(semispinalis cervicis)、胸半棘肌(semispinalis thoracis)、半腱肌(semitendinosus)、前锯肌(serratus anterior)、短回旋肌(short rotators)、比目鱼肌(soleus)、头棘肌(spinalis capitis)、颈棘肌(spinalis cervicis)、胸棘肌(spinalisthoracis)、头夹肌(splenius capitis)、颈夹肌(splenius cervicis)、胸锁乳突肌(sternocleidomastoid)、胸舌骨肌(sternohyoid)、胸骨甲状肌(sternothyroid)、茎突舌骨肌(stylohyoid)、锁骨下肌(subclavius)、锁骨下肌(subscapularis)、上孖肌(superiorgemellus)、上斜肌(superior oblique)、上直肌(superior rectus)、旋后肌(supinator)、冈上肌(supraspinatus)、颞肌(temporalis)、阔筋膜张肌(tensor fascia lata)、大圆肌(teres major)、小圆肌(teres minor)、胸肌(thoracis)、甲状舌骨肌(thyrohyoid)、胫前肌(tibialis anterior)、胫骨后肌(tibialis posterior)、斜方肌(trapezius)、肱三头肌(triceps brachii)、股中间肌(vastus intermedius)、股外侧肌(vastus lateralis)、股内侧肌(vastus medialis)、颧大肌(zygomaticus major)和颧小肌(zygomaticus minor)、以及所属领域中已知的任何其它适合的骨骼肌。
向隔膜肌施用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用来进行。在一些实施方案中，从ceDNA载体表达的转基因递送到靶组织还能够通过递送包含ceDNA载体的合成储槽来实现，其中将包含ceDNA载体的储槽植入骨骼肌、平滑肌、心肌和/或隔膜肌组织，或能够使肌肉组织与包含如本文所述的ceDNA载体的膜或其它基质接触。此类可植入基质或底物描述于美国专利号7,201,898中。
向心肌施用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体包括向左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜(septum)施用。如本文所述的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、例如主动脉内施用、直接心脏注射(例如注入左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注而递送到心肌。
向平滑肌施用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用来进行。在一个实施方案中，可以施用存在于平滑肌内、附近和/或平滑肌上的内皮细胞。平滑肌的非限制示例包括眼虹膜、肺细支气管、喉肌(声带)、胃肠道的胃、食道、小肠和大肠肌肉层、膀胱的输尿管、逼尿肌肌肉、子宫的子宫肌层、阴茎或前列腺腺体。
在一些实施方案中，将如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌。在代表性实施方案中，本公开的ceDNA载体用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或隔膜肌病患。
具体地说，预期包含如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的组合物可以被递送到眼睛的一种或多种肌肉(例如外直肌(Lateral rectus)、内直肌(Medialrectus)、上直肌(Superior rectus)、下直肌(Inferior rectus)、上斜肌(Superioroblique)、下斜肌(Inferior oblique))、面部肌肉(例如枕额肌(Occipitofrontalismuscle)、颞下颌肌(Temporoparietalis muscle)、降眉间肌(Procerus muscle)、鼻肌(Nasalis muscle)、降鼻中隔肌(Depressor septi nasi muscle)、眼轮匝肌(Orbicularisoculi muscle)、皱眉肌(Corrugator supercilii muscle)、降眉肌(Depressorsupercilii muscle)、耳廓肌(Auricular muscles)、口轮匝肌(Orbicularis orismuscle)、降口角肌(Depressor anguli oris muscle)、笑肌(Risorius)、颧大肌(Zygomaticus major muscle)、颧小肌(Zygomaticus minor muscle)、提上唇肌(Levatorlabii superioris)、提上唇鼻翼肌(Levator labii superioris alaeque nasi muscle)、降下唇肌(Depressor labii inferioris muscle)、提口角肌(Levator anguli oris)、颊肌(Buccinator muscle)、颏肌(Mentalis))或舌肌(例如颏舌肌(genioglossus)、舌骨舌肌(hyoglossus)、小角舌肌(chondroglossus)、茎舌肌(styloglossus)、腭舌肌(palatoglossus)、舌上纵肌(superior longitudinal muscle)、舌下纵肌(inferiorlongitudinal muscle)、舌直肌(vertical muscle)和舌横肌(transverse muscle))。
(i)肌内注射：在一些实施方案中，使用针能够将包含如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的组合物注射到受试者的指定肌肉的一个或多个部位，例如骨骼肌(例如三角肌、股外侧肌、背外侧肌的侧臀肌，或婴儿的前外侧股)。包含ceDNA的组合物能够引入肌肉细胞的其它亚型中。肌肉细胞亚型的非限制性示例包括骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或隔膜肌细胞。
肌肉内注射的方法是所属领域技术人员已知的，因此本文中不再详细描述。然而，当执行肌肉内注射时，应该基于患者的年龄和体型、组合物的粘度以及注射部位来确定适当的针尺寸。表12提供了示例性注射部位和相应针尺寸的指南：
表12：人类患者肌内注射指南
在某些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是以小体积(例如，如针对给定受试者在表12中概述的示例性体积)配制。在一些实施方案中，必要时，受试者在注射之前，能够施用全身或局部麻醉剂。如果需要多次注射，或如果注射更深的肌肉，而非上文提及的常见注射部位，这是特别期望的。
在一些实施方案中，能够将肌肉内注射与以下组合：电穿孔、递送压力或使用转染试剂增强ceDNA载体的细胞吸收。
(ii)转染试剂：在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体被配制成包含一种或多种转染试剂的组合物，以促进载体吸收到肌管或肌肉组织中。因此，在一个实施方案中，使用本文中别处所述的方法、通过转染将本文所述的核酸施用于肌肉细胞、肌管或肌肉组织。
(iii)电穿孔：在某些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体在缺乏载剂的情况下施用以促进ceDNA进入细胞中，或在生理学上呈惰性的药学上可接受的载剂中(即，不改进或不增强无衣壳非病毒载体吸收到肌管中的任何载剂)施用。在此类实施方案中，通过对细胞或组织进行电穿孔能够促进无衣壳非病毒载体的吸收。
细胞膜天然地抵抗从细胞外传递到细胞的细胞质中。一种用于暂时减小这种抵抗力的方法是“电穿孔”，其中使用电场在细胞中产生孔隙而对细胞不引起持久性损伤。这些孔隙大足以允许DNA载体、药物、DNA和其它极性化合物触及细胞内部。细胞膜中的孔隙封闭并且细胞再次变得不可通透。
电穿孔能够用于体外和体内应用中以将例如外源DNA引入活细胞中。体外应用通常是将活细胞样品与包含例如DNA的组合物混合。然后将细胞放在电极(诸如平行板)之间并且向细胞/组合物混合物施加电场。
有许多用于体内电穿孔的方法；电极可以以多种配置提供，诸如夹持表皮的测径规上覆于待治疗的细胞区域上。另选地，可以将针形电极插入组织中，从而更深地触及所定位的细胞。在任一情况下，将包含例如核酸的组合物注射到治疗区域之后，电极向该区域施加电场。在一些电穿孔应用中，这个电场包含约10ms到60ms持续时间的约100V/cm到500V/cm的单一方波脉冲。此类脉冲可以通过例如Genetronics有限公司的分公司BTX制造的Electro Square Porator T820的已知应用生成。
通常，仅当肌肉在施用组合物(例如注射到肌肉中)之后立即或不久加以电刺激时才成功地发生例如核酸的吸收。
在某些实施方案中，使用电场脉冲或使用低电压/长脉冲治疗方案(例如使用方波脉冲电穿孔系统)达成电穿孔。能够生成脉冲电场的示例性脉冲发生器包括例如可以产生指数波形的ECM600以及可以生成方波形的ElectroSquarePorator(T820)，两者均可从BTX(Inc.(San Diego,Calif.)的分公司)获得。方波电穿孔系统递送可控的电脉冲，其快速地升高到设定电压，在那个水平保持设定的时间长度(脉冲长度)，然而快速地降到零。
在一些实施方案中，施用局部麻醉剂，例如通过在治疗部位注射以减少疼痛，该疼痛可能与组织在包含如本文所述的无衣壳非病毒载体的组合物存在下电穿孔有关。另外，所属领域的技术人员将了解，应该选择最小化且/或防止过度组织损伤、以致肌肉发生纤维化、坏死或发炎的组合物剂量。
(iv)递送压力：在一些实施方案中，将如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体递送到肌肉组织通过递送压力来促进，该递送压力使用大体积和快速注射到供应肢体的动脉(例如，髂动脉)中的组合。这种施用模式能够通过多种方法达成，包括将包含ceDNA载体的组合物输注到肢体血管中，通常同时使用血管钳压脉带将肌肉与全身循环分隔。在一种方法中，组合物通过肢体血管循环以准许外渗到细胞中。在另一方法中，提高血管内流体动力学压力以扩展血管床且增强ceDNA载体吸收到肌肉细胞或组织中。在一个实施方案中，将ceDNA组合物施用于动脉。
(v)脂质纳米粒子组合物：在一些实施方案中，将用于肌内递送的如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体配制在包含如本文别处所述的脂质体的组合物中。
(vi)靶向肌肉组织的ceDNA载体的全身施用：在一些实施方案中，将如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体配制成经由间接递送施用靶向肌肉，其中与肝脏相反，将ceDNA输送到肌肉。因此，本文所述的技术涵盖向肌肉组织间接施用包含如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的组合物，例如通过全身施用。此类组合物能够通过体表、静脉内(通过集团或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、通过吸入、腹膜内、皮下、腔内施用，并且在必要时能够通过蠕动方式或通过所属领域的技术人员已知的其它手段递送。药剂能够全身性施用，例如通过静脉内输注(如果希望如此)。
在一些实施方案中，通过使用优先地将载体引导到肌肉组织的靶向剂或部分来增加如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体到肌肉细胞/组织中的吸收。因此，在一些实施方案中，相较于无衣壳ceDNA载体存在于身体的其它细胞或组织中的量，无衣壳ceDNA载体能够在肌肉组织中浓缩。
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的组合物进一步包含到肌肉细胞的靶向部分。在其它实施方案中，所表达的基因产物包含对期望产生作用的组织具有特异性的靶向部分。靶向部分能包括能够靶向细胞或组织的细胞内、细胞表面或细胞外生物标志物、与其相互作用、与其偶合且/或结合至其的任何分子或分子复合物。生物标志物能包括例如细胞蛋白酶、激酶、蛋白、细胞表面受体、脂质和/或脂肪酸。靶向部分能靶向、相互作用、偶合和/或结合到的生物标志物的其它实施例包括与特定疾病有关的分子。例如，生物标志物能够包括涉及癌症发展的细胞表面受体，例如表皮生长因子受体和运铁蛋白受体。靶向部分能够包括(但不限于)结合到靶肌肉组织中所表达的分子的合成化合物、天然化合物或产物、巨分子实体、生物工程化分子(例如多肽、脂质、多核苷酸、抗体、抗体片段)以及小实体(例如小分子、神经传递素、底物、配体、激素和元素化合物)。
在某些实施方案中，靶向部分可以进一步包含受体分子，包括例如天然地识别靶细胞中的特定期望分子的受体。此类受体分子包括已经修饰以增强其与靶分子相互作用的特异性的受体、已经修饰以与受体天然不识别的所期望靶分子相互作用的受体，以及此类受体的片段(参见例如Skerra，2000，J.Molecular Recognition，13:167-187)。优选的受体是趋化因子受体。示例性趋化因子受体已经描述于例如Lapidot等人，2002，Exp Hematol,30:973-81和Onuffer等人，2002,Trends Pharmacol Sci,23:459-67。
在其它实施方案中，另外的靶向部分可以包含配体分子，包括例如天然地识别靶细胞的特定期望受体的配体，诸如运铁蛋白(Tf)配体。此类配体分子包括已经修饰以增强其与靶受体相互作用的特异性的配体、已经修饰以与配体天然不识别的期望受体相互作用的配体，和此类配体的片段。
在仍其它实施方案中，靶向部分可以包含适体。适体是经选择可特异性结合到靶细胞的期望分子结构的寡核苷酸。适体通常是类似于噬菌体呈现亲和力选择(又称为体外分子进化)的亲和力选择方法的产物。该方法涉及执行亲和力分离的若干次串联迭代，例如使用致病免疫原所结合的固体载体执行；随后执行聚合酶链反应(PCR)以扩增结合到免疫原的核酸。每一轮亲和力分离由此从核酸群体中富集成功地结合期望免疫原的分子。以这种方式，可以“培育”随机核酸池，从而产生特异性结合靶分子的适体。适体通常是RNA，但可以是DNA或其类似物或衍生物，例如(不限于)肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯核酸。
在一些实施方案中，靶向部分能够包含光可降解配体(即，‘笼状’配体)，该配体通过例如聚焦光束释放，从而使无衣壳非病毒载体或基因产物靶向特定组织。
本文还预期组合物递送到受试者的一种或多种肌肉的多个部位。也就是说，能够在至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个注射部位中进行注射。此类部位相对于单一肌肉的区域能够扩展或能够在多种肌肉之间分布。
B.将用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体施用于非肌肉位置
在另一个实施方案中，向肝脏施用用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体。可以将ceDNA载体施用于眼睛的不同区域，诸如角膜和/或视神经。还可以将ceDNA载体引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体腺、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体；包括枕骨、颞叶、顶叶和额叶的大脑；皮质；基底神经节；海马和杏仁核(portaamygdala))、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。ceDNA载体可以被递送到脑脊髓液中(例如通过腰椎穿刺)。可以在血脑屏障已经被扰动(例如脑瘤或大脑梗塞)的情况下进一步将用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体血管内施用于CNS。
在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以通过所属领域已知的任何途径施用于眼睛的(多个)期望区域，该途径包括但不限于鞘内、眼内、大脑内、脑室内、静脉内(例如在存在糖例如甘露糖醇下)、鼻内、耳内、眼内(例如玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如眼球筋膜囊下区(sub-Tenon's region))递送以及肌肉内递送和逆行递送到运动神经元。
在一些实施方案中，用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是在液体配制物中通过直接注射(例如立体定向注射)施用于CNS中的期望区域或隔室中。在其它实施方案中，可以通过局部施加到期望区域或通过鼻内施用气雾剂配制物来提供ceDNA载体。可以通过局部施加液滴来施用眼睛。作为另一替代方案，ceDNA载体能够作为固体、缓释型配制物施用(参见例如美国专利号7,201,898)。在另外的实施方案中，ceDNA载体可以用于逆行转运，以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和障碍(例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例如，可以将ceDNA载体递送到肌肉组织，其可以从肌肉组织迁移到神经元中。
C.离体治疗
在一些实施方案中，从受试者去除细胞，将如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体引入其中，并且然后将细胞替换回到受试者中。从受试者取出细胞进行离体处理、然后再引回到受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346；其公开内容全文并入本文)。另选地，将ceDNA载体引入另一个受试者的细胞，引入培养细胞中，或引入任何其它适合来源的细胞中，并将细胞施用于有需要的受试者。
经如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体转导的细胞优选地以“治疗有效量”与药物载剂组合施用于受试者。所属领域的技术人员将了解，治疗效果不必是完全的或治愈的，只要给受试者提供了一些益处即可。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以编码如本文所述的PFIC治疗蛋白(有时称为转基因或异源核苷酸序列)，该PFIC治疗蛋白将在体外、离体或体内细胞中产生。例如，与本文所述的ceDNA载体在如本文所讨论的治疗方法中的使用形成相比，在一些实施方案中，可以将用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体引入经培养细胞中并从细胞分离所表达的PFIC治疗蛋白，例如用于产生抗体和融合蛋白。在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的培养细胞可以用于商业上生产抗体或融合蛋白，例如充当小规模或大规模生物制造抗体或融合蛋白的细胞源。在另选的实施方案中，将如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体引入宿主非人类受试者的细胞中，用于体内生产抗体或融合蛋白，包括小规模生产以及商业大规模PFIC治疗蛋白生产。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以用于兽医学与医学应用中。如上所述的离体基因递送方法的合适受试者包括禽类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔)，以哺乳动物为优选。人类受试者是最优选的。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。
D.剂量范围
本文提供了治疗方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含如本文所述的编码PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的组合物。如熟练的从业者将了解，术语“有效量”是指ceDNA组合物的施用量，该量引起PFIC治疗蛋白以“治疗有效量”表达以用于治疗PFIC疾病。
可以任选地采用体内和/或体外分析来帮助鉴定使用的最优剂量范围。配制物中准备采用的精确剂量还将取决于施用途径和病状严重度，并应根据所属领域的普通技术人员的判断和每个受试者的情况来决定。有效剂量可从衍生自例如体外或动物模型试验系统的剂量-应答曲线推断。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体是以足以转染期望组织的细胞和足以提供足够水平的基因转移和表达而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于上文在“施用”部分中所述的那些途径，例如直接递送至选定的器官(例如门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、肿瘤内和其它肠胃外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。
实现特定“治疗效果”所需的本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的剂量将基于若干因素而变化，该因素包括但不限于：核酸施用途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病患以及基因、RNA产物或所产生的所表达的蛋白的稳定性。所属领域的技术人员可以基于前述的因素以及所属领域中熟知的其它因素容易地确定治疗患有特定疾病或病患的患者的ceDNA载体剂量范围。
剂量方案可以调整，以提供最优的治疗应答。例如，可以重复施用寡核苷酸，例如可以每天施用若干剂，或者可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少剂量。所属领域的普通技术人员将能够容易地确定主题寡核苷酸的适当剂量和施用计划，无论所述寡核苷酸是将施用于细胞还是受试者。
“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内，该范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(神经细胞将需要很少的量，而全身性注射将需要大量)。例如，对于体内直接注射到人类受试者的骨骼肌或心肌中，治疗有效剂量将为约1μg至100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体，那么可以通过实验确定治疗有效剂量，但预计递送1μg至约100g的载体。此外，治疗有效剂量是表达足量的转基因、从而对受试者起作用的ceDNA载体的量，其使得疾病的一种或多种症状减少，但不产生显著的脱靶或显著的不良副作用。在一个实施方案中，“治疗有效量”为所表达的PFIC治疗蛋白足以产生PFIC疾病生物标志物的表达的统计学上显著的可测量变化或既定疾病症状的减轻的量。指定的ceDNA载体组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的配制物是所属领域的技术人员熟知的，开发在多种治疗方案中使用本文所描述的特定组合物的适合的剂量和治疗方案也是所属领域技术人员熟知的。
对于体外转染，递送到细胞(1×106个细胞)的如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的有效量将为约0.1μg到100μg、优选地1μg到20μg并且更优选地1μg到15μg或8到10μg ceDNA载体。ceDNA载体越大，需要的剂量越高。如果使用外泌体或微粒，那么可以通过实验确定有效的体外剂量，但意图递送大致相同量的ceDNA载体。
对于PFIC治疗，如本文所公开的表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的适当剂量将取决于待治疗的疾病的特定类型、PFIC治疗蛋白类型、PFIC的严重程度和病程、先前疗法、患者的临床史和对抗体的应答以及主治医师的判断。编码PFIC治疗蛋白的ceDNA载体适当地一次或在一系列治疗内施用于患者。本文预期各种给药方案，包括(但不限于)单次施用或在不同时间点上的多次施用、集团施用和脉冲输注。
取决于疾病的类型和严重性，通过一次或多次单独施用或通过连续输注以使得经编码PFIC治疗蛋白以约0.3mg/kg到100mg/kg(例如15mg/kg-100mg/kg或该范围内的任何剂量)表达的量来施用ceDNA载体。ceDNA载体的一种典型日剂量足以引起在约15mg/kg到100mg/kg或更大范围内的经编码PFIC治疗蛋白表达，此取决于上文提及的因素。ceDNA载体的一种示例性剂量为足以引起在约10mg/kg到约50mg/kg范围内的如本文所公开的经编码PFIC治疗蛋白表达的量。因此，可以向患者施用呈足以引起约0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、3mg/kg、4.0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg(或其任何组合)的经编码PFIC治疗蛋白表达的量的一次或多次剂量的ceDNA载体。在一些实施方案中，ceDNA载体为足以引起在50mg到2500mg范围内的总剂量的经编码PFIC治疗蛋白表达的量。ceDNA载体的示例性剂量为足以引起约50mg、约100mg、200mg、300mg、400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约720mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2050mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg或约2500mg(或其任何组合)的经编码PFIC治疗蛋白的总表达的量。由于ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达可以由本文中的调节开关小心地控制，或另选地，向受试者施用多次剂量的ceDNA载体，ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达可以使得可以间歇地，例如每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个月、每三个月或每六个月从ceDNA载体施用所表达的PFIC治疗蛋白的剂量的方式进行控制。通过常规技术和分析能够监测此疗法的进展。
在某些实施方案中，ceDNA载体是以足以引起呈15mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg或均一剂量例如300mg、500mg、700mg、800mg或更高的剂量的经编码PFIC治疗蛋白表达的量施用。在一些实施方案中，ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达受到控制以使得PFIC治疗蛋白在一段时间内每天、每隔一天、每周、每2周或每4周进行表达。在一些实施方案中，ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达受到控制以使得PFIC治疗蛋白在一段时间内每2周或每4周进行表达。在某些实施方案中，时间段是6个月、一年、十八个月、两年、五年、十年、15年、20年或患者一生。
治疗可以涉及施用单次剂量或多次剂量。在一些实施方案中，可以向受试者施用超过一个剂量；实际上，可以根据需要施用多个剂量，因为ceDNA载体由于没有病毒衣壳而不会引发抗衣壳的宿主免疫应答。因此，所属领域的技术人员可以容易地确定适当剂量次数。施用的剂数可以例如1剂-100剂，优选地2剂-20剂的量级。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下，缺乏通过施用如本公开所描述的ceDNA载体引发的典型抗病毒免疫应答(即，不存在衣壳组分)允许用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体在多种场合施用于宿主。在一些实施方案中，将异源核酸递送至受试者的次数在2次至10次的范围内(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次)。在一些实施方案中，向受试者递送ceDNA载体超过10次。
在一些实施方案中，每个日历天(例如24小时时间段)向受试者施用一剂量的如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日向受试者施用一剂量ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，每个日历周(例如7个日历天)向受试者施用一剂量的如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，每周向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次(例如两个日历周时间段为一次)。在一些实施方案中，每日历月向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次(例如30个日历日为一次)。在一些实施方案中，每六个日历月向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次。在一些实施方案中，每个日历年(例如365天或闰年366天)向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次。
在具体实施方案中，超过一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以用于在不同间隔期内，例如每天、每周、每月、每年等实现所期望的基因表达水平。
在一些实施方案中，由如本文所公开的ceDNA载体编码的治疗性PFIC治疗蛋白可以通过调节开关、可诱导或可抑制型启动子进行调节以使得其在受试者中表达至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长时间。在一个实施方案中，通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够实现表达。另选地，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以进一步包含基因编辑系统的组分(例如CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸内切酶等)以准许插入一个或多个编码PFIC治疗蛋白的核酸序列以获得疾病的基本上永久的治疗或“治愈”。包含基因编辑组分的该ceDNA载体公开于国际申请PCT/US18/64242中，并且可以包括5'和3'同源臂(例如SEQ ID NO:151-154或与其具有至少40％、50％、60％、70％或80％同源性的序列)以将编码PFIC治疗蛋白的核酸，例如但不包括白蛋白基因或CCR5基因插入安全港区中。作为示例，表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以包含至少一个基因组安全港(GSH)特异性同源臂以用于将PFIC转基因插入基因组安全港中，如2019年3月1日提交的国际专利申请PCT/US2019/020225(其以全文引用的方式并入本文)中所公开的。
治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的反应而定。初始较高治疗剂量之后，预期为连续的相对较低维持剂量。
E.单位剂型
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的药物组合物可以便利地以单位剂型呈现。单位剂量通常将适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。在一些实施方案中，单位剂型适合于直接施用于眼睛的液滴。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过吸入施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过汽化器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过喷雾器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于通过气雾器施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实施方案中，单位剂量适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。在一些实施方案中，单位剂型适合于视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
在一些实施方案中，单位剂量适合于鞘内或脑室内施用。在一些实施方案中，配制药物组合物以供局部施用。可以与载剂材料组合以产生单个剂量的活性成分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。
X.治疗方法
本文所述的技术还展示了用于制备所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的方法以及以多种方式(包括例如离体、非原位/体外和体内应用、方法、诊断程序和/或基因疗法方案)使用所公开的载体的方法。
在一个实施方案中，由如本文所公开的ceDNA载体表达的所表达的治疗性PFIC治疗蛋白具有治疗疾病的功能。在一个优选实施方案中，治疗性PFIC治疗蛋白不引起免疫系统反应，除非期望如此。
本文提供了治疗受试者的PFIC疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体和任选地药学上可接受的载剂引入受试者的有需要的靶细胞(例如肌肉细胞或组织或其它受影响的细胞类型)中。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所建构的ceDNA载体包含编码如本文所述的适用于治疗疾病的PFIC治疗蛋白的核苷酸序列。具体地说，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以包含操作性地连接到控制元件的期望PFIC治疗蛋白DNA序列，该控制元件能够在由外源性DNA序列编码的期望PFIC治疗蛋白引入受试者中时引导其转录。如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以经由如上文和本文其它地方所提供的任何适合的途径施用。
本文公开了如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体组合物和配制物，其包括本公开的一种或多种ceDNA载体以及一种或多种药学上可接受的缓冲剂、稀释剂或赋形剂。该组合物可以包括于一种或多种诊断或治疗试剂盒中，以用于诊断、预防、治疗或改善PFIC疾病的一种或多种症状。一方面，该疾病、损伤、病患、创伤或功能障碍是人疾病、损伤、病患、创伤或功能障碍。
本文所述的技术的另一个方面提供了一种用于向有需要的受试者提供诊断或治疗有效量的如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的方法，该方法包括向有需要的受试者的细胞、组织或器官提供一定量的如本文所公开的ceDNA载体；并且持续有效实现由ceDNA载体表达PFIC治疗蛋白的时间，由此向受试者提供诊断或治疗有效量的由ceDNA载体表达的PFIC治疗蛋白。在另一方面，受试者为人。
本文所述的技术的另一个方面提供了用于诊断、预防、治疗或改善受试者的PFIC疾病、病患、功能障碍、损伤、异常病症或创伤的至少一种或多种症状的方法。在整体和一般意义上，该方法至少包括以足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病况或创伤的一种或多种症状的量并持续足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病患、功能障碍、损伤、异常病症或创伤的一种或多种症状的时间向有需要的受试者施用一种或多种所公开的用于产生PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的步骤。在此类实施方案中，可以评估受试者的PFIC治疗蛋白的功效，或另选地，检测受试者的PFIC治疗蛋白或PFIC治疗蛋白的组织位置(包括细胞和亚细胞位置)。因此，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以用作体内诊断工具，例如用于检测癌症或其他适应症。在另一方面，受试者为人。
另一个方面为使用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体作为用于治疗或减轻PFIC疾病或疾病状态的一种或多种症状的工具。有许多遗传疾病中的缺陷基因是已知的，并且通常分为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可以涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常但不总是以显性方式遗传。对于不平衡的疾病状态，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以用于在模型系统中创建PFIC疾病状态，然后可以使用该模型系统尝试抵消该疾病状态。因此，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体准许治疗遗传疾病。如本文所使用，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡来治疗PFIC疾病状态。
A.宿主细胞：
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体将PFIC治疗蛋白转基因递送到受试者宿主细胞中。在一些实施方案中，细胞是感光细胞。在一些实施方案中，细胞是RPE细胞。在一些实施方案中，受试者的宿主细胞是人宿主细胞，包括例如血细胞、干细胞、造血细胞、CD34+细胞、肝细胞、癌细胞、血管细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、神经细胞、视觉或视网膜细胞、上皮或内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞或任何其它哺乳动物来源的细胞，包括但不限于肝(即肝)细胞、肺细胞、心脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、隔膜细胞、肾(即肾)细胞、神经细胞、血细胞、骨髓细胞或预期进行基因治疗的受试者的任何一种或多种所选的组织。在一方面，受试者的宿主细胞是人类宿主细胞。
本公开还涉及如上文所提及的重组宿主细胞，包括如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体。因此，对于技术人员而言显而易见的是，可以根据目的使用多种宿主细胞。将包括供体序列的如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的构建体或ceDNA载体引入宿主细胞中以使得供体序列维持为染色体整合体，如早先所描述。术语宿主细胞涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于供体序列和其来源。
宿主细胞也可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是人细胞(例如原代细胞、干细胞或永生化细胞系)。在一些实施方案中，可以向宿主细胞离体施用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体，并且然后在基因疗法事件之后将其递送到受试者。宿主细胞可以是任何细胞类型，例如体细胞或干细胞、诱导型多能干细胞或血细胞，例如T细胞或B细胞，或骨髓细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是同种异体细胞。例如，T细胞基因组工程可用于癌症免疫疗法、诸如HIV疗法的疾病调节(例如受体敲除，如CXCR4和CCR5)和免疫缺陷疗法。可靶向B细胞上的MHC受体进行免疫治疗。在一些实施方案中，能够将基因经修饰的宿主细胞(例如骨髓干细胞，例如CD34+细胞，或诱导多能干细胞)移植回到患者中用于表达治疗蛋白。
B.基因疗法所针对的额外疾病：
一般来说，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以用于递送上文说明书的任何PFIC治疗蛋白以治疗、预防或改善与受试者的异常蛋白表达或基因表达有关的PFIC疾病相关症状。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以用于将PFIC治疗蛋白递送到骨骼肌、心肌或隔膜肌，以产生用于在血液中分泌和循环的PFIC治疗蛋白或用于全身递送到其它组织，从而治疗、改善和/或预防进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)疾病。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以通过任何适合的手段，任选地通过施用受试者所吸入的包含ceDNA载体的可吸入粒子的气雾剂悬浮液来施用于受试者的肺。可吸入粒子可以是液体或固体。包含ceDNA载体的液体粒子的气雾剂可以通过任何合适的手段产生，例如用压力驱动的气雾剂喷雾器或超声喷雾器，如所属领域的技术人员所知。参见例如美国专利号4,501,729。包含ceDNA载体的固体粒子的气雾剂也可以通过制药领域已知的技术，用任何固体粒子药物气雾剂发生器产生。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以施用于CNS组织(例如，大脑、眼睛、脑脊髓液等)。
可以用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体治疗、改善或预防的眼病包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科病症(例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变和其它视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关黄斑变性、青光眼)。许多眼科疾病和病患与以下三种类型适应症中的一种或多种有关：(1)血管产生、(2)炎症和(3)变性。在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体可以用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞变性、促进细胞保留或促进细胞生长的因子以及上述因子的组合。例如，糖尿病性视网膜病的特征是血管生成。通过眼内(例如玻璃体内)或眼周(例如眼球筋膜囊下区域)递送一种或多种抗血管生成抗体或融合蛋白能够治疗糖尿病性视网膜病变。可以用本公开的ceDNA载体治疗、改善或预防的额外眼病包括：地图样萎缩、血管性或“湿性”黄斑变性、PKU、雷伯氏先天性黑蒙(LCA)、尤塞氏综合征(Usher syndrome)、弹力纤维性假黄瘤(PXE)、x连锁色素性视网膜炎(XLRP)、x连锁视网膜劈裂症(XLRS)、无脉络膜症、雷伯氏遗传性视神经病变(LHON)、色盲、视锥-视杆营养不良、富克斯角膜内皮营养不良(Fuchs endothelialcorneal dystrophy)、糖尿病性黄斑水肿以及眼癌和肿瘤。
在一些实施方案中，发炎眼部疾病或病患(例如葡萄膜炎)可以通过如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体治疗、改善或预防。通过眼内(例如玻璃体或前房)施用如本文所公开的ceDNA载体能够表达一种或多种消炎抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以编码与编码报告多肽(例如酶，例如绿色荧光蛋白或碱性磷酸酶)的转基因相关的PFIC治疗蛋白。在一些实施方案中，编码可用于实验或诊断目的的报告蛋白的转基因选自下列中的任何一种：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其它转基因。在一些方面中，连接到报告多肽的表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以用于诊断目的，以及用于测定ceDNA载体在其所施用的受试者中的功效或用作ceDNA载体在该受试者中的活性的标志物。
C.使用ceDNA载体测试成功的基因表达
所属领域中熟知的分析可以用于测试ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的基因递送的效率，该测试可以在体外和体内模型中执行。所属领域的技术人员可以通过测量PFIC治疗蛋白的mRNA和蛋白含量(例如逆转录PCR、蛋白印迹分析和酶联免疫吸附分析(ELISA))来评估ceDNA对PFIC治疗蛋白的表达水平。在一个实施方案中，ceDNA包含报告蛋白，该报告蛋白可以用于评估PFIC治疗蛋白的表达，例如通过利用荧光显微术或发光读盘器检查报告蛋白的表达。对于体内应用，蛋白功能分析可以用于测试既定PFIC治疗蛋白的功能性以确定基因表达是否成功进行。熟练的技术人员能够确定用于测量由ceDNA载体体外或体内表达的PFIC治疗蛋白的功能性的最佳测试。
本文预期在细胞或受试者中ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的基因表达的效应可以持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少四个月、至少5个月、至少六个月、至少10个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年，或可以永久。
在一些实施方案中，本文所述的表达盒、表达构建体或ceDNA载体中的PFIC治疗蛋白可以针对宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人(例如人源化)等所关注的脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在该脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白的氨基酸序列。使用例如Aptagen的Gene密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司)或其它公共数据库可以确定优化密码子。
D.通过评估ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达来测定功效
所属领域中已知的用于测定蛋白表达的基本上任何方法都可以用于分析ceDNA载体对PFIC治疗蛋白的表达。此类方法/分析的非限制性实施例包括酶联免疫分析(ELISA)、亲和力ELISA、ELISPOT、连续稀释、流式细胞术、表面等离子体共振分析、动力学排除分析、质谱学、蛋白印迹、免疫沉淀和PCR。
为了评估体内PFIC治疗蛋白表达表达，可以从受试者获得生物样品用于分析。示例性生物样品包括生物流体样品、体液样品、血液(包括全血)、血清、血浆、尿液、唾液、切片和/或组织样品等。生物样品或组织样品还可以指从个体中分离出的组织或流体样品，包括(但不限于)肿瘤切片、粪便、脊髓液、胸膜液、乳头抽出物、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、泪液、唾液、母乳、细胞(包括(但不限于)血细胞)、肿瘤、器官，以及体外细胞培养液成分的样品。术语还包括上述样品的混合物。术语“样品”还包括未治疗或预治疗(或预处理)的生物样品。在一些实施方案中，用于本文描述的分析和方法的样品包含从待测受试者收集的血清样品。
E.通过临床参数测定所表达的PFIC治疗蛋白的功效
由ceDNA载体表达的既定PFIC治疗蛋白对PFIC疾病的功效(即功能性表达)可以由熟练的临床医师测定。然而，在本文使用“有效治疗”时，如果在用如本文所述的编码治疗性PFIC治疗蛋白的ceDNA载体治疗之后PFIC的任一种或所有体征或症状以有益方式改变、或疾病的其他临床上接受的症状或标志物改良或改善例如至少10％，那么认为治疗是“有效治疗”。还可以根据个体未发生恶化来测量功效，如根据PFIC疾病的稳定或对医疗干预的需求所评估(即，疾病的发展停止或至少减缓)。测量这些指标的方法是所属领域的技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括个体或动物(一些非限制性示例包括人或哺乳动物)中的疾病的任何治疗，并且包括：(1)抑制PFIC，例如阻止或减缓PFIC的进展；或(2)缓解PFIC疾病的症状，例如使PFIC疾病症状消退；以及(3)预防或降低PFIC疾病发展的可能性，或预防与PFIC疾病相关的继发性疾病/病患。当本文定义有效治疗时，治疗疾病的有效量意味着当施用于有需要的哺乳动物时足以对该疾病产生有效治疗的量。药剂功效能够通过评估PFIC疾病所特有的身体指标来测定。
如本文所公开的表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的功效可通过评估对给定PFIC疾病特定的物理指标来确定。分析疾病指标的标准方法是本领域已知的。例如，PFIC的物理指标包括但不限于肝炎、胆管损伤、肝细胞损伤和胆汁淤积。作为非限制性示例，胆汁淤积的血清标志物包括碱性磷酸酯酶(AP)和胆汁酸(BA)。血清胆红素、血清三酸甘油酯值水平和血清胆固醇水平也指示例如由PFIC引起的肝损伤。血清丙氨酸转氨酶(ALT)是肝细胞损伤的一种标志物。例如，可以通过测量TNF-α、Mcp-1和Vcam-1的mRNA表达以及诸如Col1a1和Col1a2的胆纤维化标志物的表达来分析肝炎和导管周纤维化。
XI.表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体的各种应用
如本文所公开，如本文所述的组合物和用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以出于一系列目的用于表达PFIC治疗蛋白。在一个实施方案中，表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体能够用于建立具有转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究PFIC的功能和疾病进展。在一些实施方案中，表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可用于治疗、预防或改善哺乳动物受试者的PFIC状态或病患。
在一些实施方案中，PFIC治疗蛋白在受试者中可以以足以治疗与基因产物的表达增强、活性提高或基因的不当上调有关的疾病的量从ceDNA载体表达。
在一些实施方案中，PFIC治疗蛋白在受试者中能够以足以治疗与蛋白的表达减少、表达缺乏或功能异常有关的疾病的量从ceDNA载体中表达。
本领域普通技术人员应当理解，转基因可以不是待转录基因本身的开放阅读框；相反，它可以是靶基因的启动子区域或阻遏子区域，并且ceDNA载体可修饰这样的区域，从而调节PFIC基因的表达。
如本文所公开的组合物和用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体可以出于如上文所描述的各种目的用于递送PFIC治疗蛋白。
在一些实施方案中，转基因编码一种或多种PFIC治疗蛋白，该PFIC治疗蛋白可用于治疗、改善或预防哺乳动物受试者的PFIC疾病状态。向患者施用呈足以治疗与异常基因序列相关的PFIC疾病的量的由ceDNA载体表达的PFIC治疗蛋白，这可以产生以下中的任一者或多者：蛋白表达增强、优先于蛋白活性、靶基因或蛋白的表达减少、缺乏表达或功能异常。
在一些实施方案中，设想本文公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体用于诊断和筛选方法中，其中使PFIC治疗蛋白瞬时或稳定表达于细胞培养系统中，或另选地，表达于转基因动物模型中。
本文所述的技术的另一个方面提供了用如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体转导哺乳动物细胞群体的方法。在整体和一般意义上，该方法至少包括将包含有效量的一种或多种如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的组合物引入群体的一个或多个细胞中的步骤。
另外，本公开提供了包含一种或多种如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的所公开ceDNA载体的组合物以及治疗和/或诊断试剂盒、或用一种或多种额外成分配制或根据其一个或多个使用指令制备的ceDNA组合物。
如本文所公开的用于表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体所施用的细胞可以为任何类型，包括但不限于神经细胞(包括末梢和中枢神经系统的细胞，特别是大脑细胞)、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞、树突状细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质细胞、纤维母细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等等。另选地，细胞可以是任何祖细胞。作为另一个替代方案，细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为又一个替代方案，细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。此外，如上文指出，细胞可以来自任何物种来源。
A.表达PFIC治疗蛋白的ceDNA载体的产生和纯化
本文所公开的ceDNA载体将用于体外或体内产生PFIC治疗蛋白。以这种方式产生的PFIC治疗蛋白可以分离出来，针对期望功能加以测试，并且经过纯化以便进一步用于研究中或用作治疗性治疗。每种蛋白产生系统具有其自身的优点/缺点。虽然体外产生的蛋白能够轻松地纯化且能够在短时间内产生蛋白，但体内产生的蛋白能够具有转译后修饰，诸如糖基化。
可以使用所属领域的技术人员已知的任何方法，例如离子交换色谱、亲和色谱、沉淀或电泳纯化使用ceDNA载体产生的PFIC治疗蛋白。
通过本文所述的方法和组合物产生的PFIC治疗蛋白可以针对与期望靶蛋白的结合加以测试。
实施例
通过说明而非限制的方式提供了以下实施例。所属领域的普通技术人员将了解，可以从本文所述的任何野生型或修饰ITR中构建ceDNA载体，并且以下示例性方法可以用于构建和评估这类ceDNA载体的活性。虽然这些方法以某些ceDNA载体为例，但它们适用于符合描述的任何ceDNA载体。
实施例1：使用基于昆虫细胞的方法构建ceDNA载体
使用多核苷酸构建体模板生产ceDNA载体描述于PCT/US18/49996的实施例1中，其通过引用整体并入本文。例如，用于生成本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论的限制，在许可宿主细胞中，在存在例如Rep的情况下，具有两个对称ITR和表达构建体的多核苷酸构建体模板进行复制以产生ceDNA载体，其中该ITR中的至少一个ITR相对于野生型ITR序列被修饰。ceDNA载体产生经历两个步骤：首先，经由Rep蛋白从模板主链(例如，ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及其次，切除的ceDNA载体的Rep介导的复制。
产生ceDNA载体的一种示例性方法是从如本文所描述的ceDNA-质粒产生。参照图1A和图1B，每个ceDNA质粒的多核苷酸构建体包括经修饰左ITR和经修饰右ITR，在ITR序列之间有以下序列：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后应答元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))；以及(iv)多腺苷酰化信号(例如来自牛生长激素基因(BGhPa))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框。将这些序列克隆到从ThermoFisher获得的pFastBacHT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试质粒或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞，Thermo/>)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以生成重组ceDNA-杆粒。通过以下方法来选择重组杆粒：在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上利用抗生素基于大肠杆菌中的蓝白筛选来筛选阳性选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)，以选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒。挑选出由破坏β-半乳糖苷指示基因的易位所造成的白色菌落，并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃处在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50ml到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡温育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃处维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18nm-19nm直径(从14nm-15nm的原初直径)和约4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理四个20ml的2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并在25℃-27℃处温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及持续4天到5天的每天的细胞活力的变化来测定感染性。
如PCT/US18/49996的图8A中所公开的“Rep质粒”(该文献以全文引用的方式并入本文中)在pFASTBACTM-Dual表达载体中产生，该表达载体包含Rep78(SEQ ID NO:131或133)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep40(SEQID NO:129)。遵循制造商提供的方案，将Rep质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞(Thermo/>))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以生成重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过阳性选择来选择重组杆粒，该阳性选择包括在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上在大肠杆菌中进行蓝白筛选(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、庆大霉素(gentamicin)、四环素的LB培养液)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染原生Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗四个20mL的2.5x106个细胞/mL的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及持续4天到5天的每天的细胞活力的变化来测定感染性。
ceDNA载体产生和表征
参考图4B，然后将含有以下项中任一种的Sf9昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率添加到新鲜的Sf9细胞培养物(2.5E+6个细胞/ml，20ml)中：(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上述Rep杆状病毒。然后将细胞在25℃处以130rpm培养。共同感染4天到5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18nm-20nm并且活力为约70％-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用Qiagen MIDI PLUSTM纯化方案(每个柱处理0.2mg细胞团粒块)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所述)获得的DNA，进一步分析分离的ceDNA载体的结构，该限制性核酸内切酶是针对以下条件选择的：a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得到的片段足够大，以便在0.8％变性琼脂糖凝胶上进行分级分离时被清楚看到(>800bp)。如图4D和图4E所示，具有非连续结构的线性DNA载体以及具有线性和连续结构的ceDNA载体可以通过它们反应产物的大小来区分-例如，预计具有非连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的非衣壳化载体预计产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000、bp和2000、bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000、bp和4000、bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4D)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管所属领域的普通技术人员将了解，对这个实施例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将生成DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR纯化试剂盒或脱盐“离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRATM MICROSPINTM G-25柱，是用于内切核酸酶消化的一些本领域已知的选项。该分析包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)加入10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mM EDTA)，加入10X染料，不进行缓冲，并与通过添加入10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1、mM EDTA和200、mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8％-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。所属领域的普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和，并转移到蒸馏水或含1x SYBR金的1x TBE/TAE中。然后，可以用例如Thermo的/>金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和辐射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。
生成的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。例如，如果基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，那么存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入绘制，例如，如果总ceDNA载体为8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于10μg输入，将为0.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
出于比较的目的，实施例1描述了使用基于昆虫细胞的方法和多核苷酸构建体模板生产ceDNA载体，并且还描述在PCT/US18/49996的实施例1中，其通过引用整体并入本文。例如，用于根据实施例1生成本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论的限制，在许可宿主细胞中，在存在例如Rep存在下，具有两个对称ITR和表达构建体的多核苷酸构建体模板进行复制以产生ceDNA载体，其中该ITR中的至少一个ITR相对于野生型ITR序列被修饰。ceDNA载体产生经历两个步骤：首先，经由Rep蛋白从模板主链(例如，ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及其次，切除的ceDNA载体的Rep介导的复制。
在使用昆虫细胞的方法中产生ceDNA载体的示例性方法是通过如本文所述的ceDNA-质粒。参照图1A和1B，每个ceDNA质粒的多核苷酸构建体包括经修饰左ITR和经修饰右ITR，在ITR序列之间有以下序列：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后应答元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))；以及(iv)多腺苷酰化信号(例如来自牛生长激素基因(BGhPa))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框。将这些序列克隆到从ThermoFisher Scientific获得的pFastBac HT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试质粒或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞，Thermo/>)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以生成重组ceDNA-杆粒。通过以下方法来选择重组杆粒：在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上利用抗生素基于大肠杆菌中的蓝白筛选来筛选阳性选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)，以选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒。挑选出由破坏β-半乳糖苷指示基因的易位所造成的白色菌落，并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃处在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50ml到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡温育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃处维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18nm-19nm直径(从14nm-15nm的原初直径)和约4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理四个20ml的2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并在25℃-27℃处温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及持续4天到5天的每天的细胞活力的变化来测定感染性。
使“Rep质粒”在pFASTBACTM-Dual表达载体中产生，该表达载体包含Rep78(SEQ ID NO:131或133)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep40(SEQ ID NO:129)。遵循制造商提供的方案，将Rep质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAX/>DH10BacTM感受态细胞(Thermo/>))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以生成重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过阳性选择来选择重组杆粒，该阳性选择包括在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上在大肠杆菌中进行蓝白筛选(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、庆大霉素(gentamicin)、四环素的LB培养液)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染原生Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗四个20mL的2.5x106个细胞/mL的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4天到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体产生和表征
然后将Sf9昆虫细胞培养基分别按照1:1000和1:10,000的比率添加到新制的Sf9细胞培养基(2.5E+6个细胞/毫升，20ml)中，该昆虫细胞培养基含有：(1)含有ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒的样品；和(2)上述Rep杆状病毒。然后将细胞在25℃处以130rpm培养。共同感染4天到5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18nm-20nm并且活力为约70％-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用Qiagen MIDI PLUSTM纯化方案(每个柱处理0.2mg细胞团粒块)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。使用实施例5中所述的电泳方法能够评估所纯化的ceDNA载体的正确封闭端构型。
实施例2：经由从双链DNA分子中切除来产生合成ceDNA
ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实施例2-实施例6中，该国际申请通过引用整体并入本文。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简而言之，可以使用双链DNA构建体生成ceDNA载体，例如，参见PCT/US19/14122的图7A-图8E。在一些实施方案中，双链DNA构建体是ceDNA质粒，例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。
在一些实施方案中，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所述的调节开关。
出于说明的目的，实施例2描述了ceDNA载体的产生，该ceDNA载体是使用此方法生成的示例性封闭端DNA载体。然而，虽然这个实施例中以ceDNA载体为例来说明生成闭合端DNA载体的体外合成产生方法，其通过切除包含ITR和表达盒(例如异源核酸序列)的双链多核苷酸、随后如本文所述将自由的3'和5'端接合来实现，但所属领域的普通技术人员了解，能够如上所说明修饰双链DNA多核苷酸分子，以便生成任何所期望的闭合端DNA载体，包括(但不限于)狗骨状DNA、哑铃状DNA等等。能够利用实施例2中所述的合成产生方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA载体论述于标题为“III.通用ceDNA载体”的章节中。由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白描述于标题为“IIC.由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白”的章节中。
该方法包括(i)从双链DNA构建体中切除编码表达盒的序列和(ii)在一个或多个ITR处形成发夹和(iii)通过接合(例如通过T4 DNA连接酶)将自由的5'与3'端连接。
双链DNA构建体按5'到3'的次序包含：第一限制性核酸内切酶位点；上游ITR；表达盒；下游ITR；和第二限制性核酸内切酶位点。然后使双链DNA构建体与一种或多种限制性核酸内切酶接触以在两个限制性核酸内切酶位点处生成双链断裂。一种核酸内切酶可以靶向两个位点，或者每个位点可以被不同的核酸内切酶靶向，只要限制性位点不存在于ceDNA载体模板中。这从双链DNA构建体的其余部分切除了限制性核酸内切酶位点之间的序列(参见PCT/US19/14122的图9)。接合后，形成封闭端DNA载体。
该方法中使用的一个或两个ITR可以是野生型ITR。也可以使用经修饰ITR，其中该修饰能够包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代(参见例如PCT/US19/14122的图6-图8、图10和图11B)，并且可以具有两个或更多个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图6-图8和图11B)或单个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图10A-图10B和图11B)。通过对现有寡核苷酸进行基因修饰或通过重新生物学和/或化学合成能够生成发夹环经修饰ITR。
在一个非限制性实施例中，左和右ITR-6(SEQ ID NO:111和112)在B-B'和C-C'臂中包括来自AAV2的野生型ITR的40个核苷酸的缺失。经修饰ITR中剩余的核苷酸预测可形成单个发夹结构。展开结构的吉布斯自由能(Gibbs free energy)是约-54.4千卡/摩尔。还可以对ITR产生其它修饰，包括功能Rep结合位点或Trs位点的任选缺失。
实施例3：经由寡核苷酸构建来产生ceDNA
使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实施例3中，其中ceDNA载体是通过合成5'寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122的图11B显示了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。
如本文所公开，ITR寡核苷酸能够包含WT-ITR(参见例如图3A、图3C)，或经修饰ITR(参见例如图3B和图3D)。(还参见例如PCT/US19/14122的图6A、图6B、图7A和图7B，该文献全文并入本文中)。示例性ITR寡核苷酸包括但不限于SEQ ID NOS:134-145(例如，参见PCT/US19/14122的表7)。经修饰ITR可以包含形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中相对于野生型ITR的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。用于无细胞合成的包括如本文所述的WT-ITR或mod-ITR的ITR寡核苷酸可通过遗传修饰或生物学和/或化学合成生成。如本文所讨论的，实施例2和实施例3中的ITR寡核苷酸可以包括如本文所讨论的对称或非对称构型的WT-ITR或经修饰ITR(mod-ITR)。
实施例4：经由单链DNA分子产生ceDNA
PCT/US19/14122的实施例4中提供了使用合成方法产生ceDNA载体的另一个示例性方法，该方法使用包括两个有义ITR的单链线性DNA，该有义ITR侧接于有义表达盒序列并共价连接到两个反义ITR，该反义ITR侧接于反义表达盒，然后将其单链线性DNA的末端接合，以形成封闭端单链分子。一个非限制性实施例包含合成和/或产生单链DNA分子、使该分子的各部分退火以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子，然后使自由的5'与3'端彼此接合以形成封闭的单链分子。
用于产生ceDNA载体的示例性单链DNA分子从5'到3'包含：第一有义ITR；有义表达盒序列；第二有义ITR；第二反义ITR；反义表达盒序列；以及第一反义ITR。
用于实施例4的示例性方法的单链DNA分子可以通过本文所描述的任何DNA合成方法形成，例如体外DNA合成，或通过用核酸酶使DNA构建体(例如质粒)裂解并将所得的dsDNA片段解链以提供ssDNA片段来提供。
通过将温度降低到低于有义和反义序列对的所计算的解链温度可以实现退火。解链温度取决于特定核苷酸碱基含量和所用溶液的特征，例如盐浓度。任何给定序列的解链温度和溶液组合容易由所属领域的普通技术人员计算出。
退火分子的游离5'和3'端可以彼此接合，或接合到发夹分子上以形成ceDNA载体。适合的示例性接合方法和发夹分子描述于实施例2和实施例3中。
实施例5：ceDNA的纯化和/或产生证实
通过本文所述方法(例如，包括实施例1中所述的基于昆虫细胞的产生方法或者实施例2-实施例4中所述的合成产生方法)产生的任何DNA载体产物可以使用技术人员通常已知的方法加以纯化，例如以去除杂质、未使用的组分或副产物；并且/或者可以加以分析，以确认所产生的DNA载体(在这种情况下是ceDNA载体)是期望的分子。用于纯化DNA载体(例如ceDNA)的示例性方法使用Qiagen Midi PlusTM纯化方案和/或凝胶纯化。
以下是用于确认ceDNA载体身份的示例性方法。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
分离出的ceDNA载体的结构进一步如下分析：用根据以下所选的限制核酸内切酶消化经纯化的DNA：a)ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得片段当在0.8％变性琼脂糖凝胶上分级分离时大得足以清晰可见(>800bp)。如图4C和4D中所说明，具有非连续结构的线性DNA载体和具有线性和连续结构的ceDNA载体能够根据其反应产物的大小区分，例如，具有非连续结构的DNA载体预期产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的ceDNA载体预期产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4E)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管所属领域的普通技术人员将了解，对这个实施例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将生成DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR纯化试剂盒或脱盐“离心柱”(例如，GE HEALTHCARE ILUSTRATM MICROSPINTM G-25柱)是用于内切核酸酶消化的一些本领域已知的选项。该分析包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；(ii)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；(iii)加入10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mM EDTA)，(iv)加入10X染料，不进行缓冲，并与通过添加入10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起温育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8％-1.0％凝胶上进行分析，以及(v)在1x变性溶液(50mMNaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。所属领域的普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和，并转移到蒸馏水或含1x SYBR金的1x TBE/TAE中。然后，可以用例如Thermo的金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和辐射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。前述基于凝胶的方法通过从凝胶色带中分离出ceDNA载体且允许其复性而能够根据纯化目的调整。
生成的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。例如，如果基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，那么存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入绘制-例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为0.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
实施例6：ceDNA的可控转基因表达：重新给药施用能够维持和/或增加体内ceDNA 载体的转基因表达
根据以上实施例1中所描述的方法，使用包含CAG启动子(SEQ ID NO:72)和侧接于不对称的ITR(例如5'WT-ITR(SEQ ID NO:2)与3'mod-ITR(SEQ ID NO:3)之间的用作示例性PFIC基因的荧光素酶转基因(SEQ ID NO:56)的ceDNA质粒产生ceDNA载体，并且在不同的体内治疗程序中进行评估。实施例6到实施例10所述的所有后续实验中都使用这种ceDNA载体。在本实施例中，纯化ceDNA载体且配制成脂质纳米粒子(LNP ceDNA)且注射到每只IGS小鼠的尾静脉中。脂质体是用适合的脂质掺混物配制而成，该脂质掺混物包含四种组分以形成脂质纳米粒子(LNP)脂质体，包括可电离的脂质(例如，阳离子脂质)、辅助脂质、胆固醇和PEG-脂质。
为了评估ceDNA载体在体内在长时间段内对转基因的持续表达，通过尾静脉的静脉内注射将存在于无菌PBS中的LNP-ceDNA施用于大约5周到7周龄的IGS小鼠。评估三个不同剂量组：0.1mg/kg、0.5mg/kg和1.0mg/kg，每组十只小鼠(除1.0mg/kg之外，每组15只小鼠)。第0天施用注射液。每组五只小鼠在第28天另外注射相同剂量。静脉内施用于 IGS小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)；野生型小鼠)之后，通过IVIS成像来测量荧光素酶表达。在第3天、4天、7天、14天、21天、28天、31天、35天和42天，以及在第42天至第110天之间常规地(例如每周、每两周，或每10天或每2周)腹膜内注射150mg/kg荧光素底物之后，通过IVIS成像来评估荧光素酶表达。如通过在3种不同的施用方案后进行IVIS成像持续至少132天所测量，荧光素酶转基因作为示例性PFIC进行表达(数据未示出)。
为了研究重新给药(例如再施用)的表达荧光素酶的LNP-ceDNA对经LNP-ceDNA治疗的受试者的效果，进行了扩展研究。具体地说，评估其以确定一次或多次额外施用ceDNA载体是否能够增加表达水平。
在此研究中，在第0天和第28天初始静脉内施用1.0mg/kg(即，预激给药)之后，通过IVIS评估ceDNA载体的荧光素酶表达在IVIS inIGS小鼠中的生物分布(A组)。ceDNA载体的第二次施用是在第84天，经由尾静脉注射3mg/kg(B组)或10mg/kg(C组)，以1.2mL施用于尾静脉。在该研究中，在组A、组B和组C中的每一个组中使用五(5)只/> 小鼠。如上文所述，在第49天、第56天、第63天和第70天额外给药之前，且在第84天和第91天、第98天、第105天、第112天和第132天重复剂量后，对小鼠中的荧光素酶表达进行IVIS成像。评估且检测到所有三个组A、B和C的荧光素酶表达直到至少110天(所评估的最长时间段)。
显示LNP-ceDNA-Luc重新给药(即，ceDNA组合物再施用)使荧光素酶表达水平增加，如通过在荧光素存在下评估荧光素酶活性所测定。如通过在3种不同的施用方案后进行IVIS成像持续至少110天所测量，荧光素酶转基因作为示例性PFIC进行表达(A组、B组和C组)。在研究期间，对于尚未给予任何额外重新给药(1mg/kg预激给药(即，A组))治疗的小鼠观察到稳定的荧光素酶表达。重新给药3mg/kg ceDNA载体的B组的小鼠所观察到的辐射相对于C组的小鼠增加大约7倍。令人惊讶地，重新给予10mg/kg ceDNA载体的小鼠所观察到的荧光素酶辐射比未接受任何再给药的小鼠(A组)增加17倍。
在第0和28天静脉内施用1mg/kg ceDNA载体于尾静脉之后，A组的IGS小鼠显示荧光素酶表达。B组和C组显示在第一时间点(第0天)施用1mg/kg ceDNA载体并且在第二时间点第84天重新给药施用ceDNA载体的/>IGS小鼠的荧光素酶表达。ceDNA载体的第二次施用(即，重新给药)使表达增加至少7倍、甚至高达17倍。
B组重新给药施用的ceDNA载体的剂量(即，量)的3倍增加(即，重新给药施用3mg/kg)引起荧光素酶表达增加7倍。还意外的是，C组重新给药施用ceDNA载体的量的10倍增加(即，重新给药施用10mg/kg)引起荧光素酶表达增加17倍。因此，ceDNA的第二次施用(即，重新给药)使表达增加至少7倍、甚至高达17倍。这表明，重新给药引起的转基因表达增加大于预期且依赖于ceDNA载体在重新给药施用时的剂量或量，且似乎与第0天的初始预激施用引起的初始转基因表达协同作用。也就是说，转基因表达的剂量依赖性增加不具有相加作用；相反，转基因表达水平具有剂量依赖性且大于在每个时间点所施用的ceDNA载体的量的总和。
相较于未在第二时间点给予ceDNA载体的对照小鼠(A组)，B组和C组均显示荧光素酶表达有明显的剂量依赖性增加。综合而言，这些数据表明ceDNA载体对转基因的表达能够通过在至少第二时间点重复给药(即，再施用)ceDNA载体、以剂量依赖性方式增加。
综合而言，这些数据表明，转基因的表达水平，例如ceDNA载体对PFIC的表达水平可以维持在持续水平下至少84天并且可以在重新给药至少在第二时间点施用的ceDNA载体之后体内提高。
实施例7：LNP配制的ceDNA载体在体内的持续转基因表达
评估具有不同脂质纳米粒子的实施例6的结果在体内、在小鼠中的再现性。小鼠在第0天给予包含由CAG启动子驱动的荧光素酶转基因的ceDNA载体，该ceDNA载体囊封于与实施例6中所用不同的LNP中或包含聚C、但缺乏ceDNA或荧光素酶基因的相同LNP中。具体地说，大约4周龄的雄性小鼠在第0天通过单次注射0.5mg/kg LNP-TTX-荧光素酶或对照LNP-聚C(经由外侧尾静脉静脉内施用)来治疗。第14天，动物经由腹膜内注射2.5mL/kg全身性给予150mg/kg荧光素。在荧光素施用之后的大致15分钟，使用体内成像系统(“IVIS”)对每只动物进行成像。
如图6中所示，观察到所有四只经ceDNA治疗的小鼠的肝脏中存在明显荧光，并且除注射部位之外，在动物中观察到的其它荧光极少，这表明LNP介导ceDNA构建体发生肝脏特异性递送并且所递送的ceDNA载体在施用之后能够控制其转基因的持续表达持续至少两周。
实施例8：体内施用ceDNA载体引起的转基因在肝脏中的持续表达
在单独实验中，评估LNP递送的ceDNA在经治疗动物的肝脏内的定位。将包含所关注的功能转基因的ceDNA载体囊封于实施例7所用的相同LNP中且以0.5mg/kg的剂量水平、通过体内静脉内注射施用于小鼠。6小时之后，终结小鼠且取肝脏样品，用福尔马林固定且使用标准方案进行石蜡包埋。进行原位杂交分析，以使用对ceDNA转基因具特异性的探针使组织内的ceDNA载体可视化且利用显色反应和苏木精染色(Advanced Cell)进行检测。图7显示了结果，该结果表明ceDNA存在于肝细胞中。技术人员将理解，可将荧光素酶在ceDNA载体中替换为选自表1的任何核酸序列。
实施例9：ceDNA在体内的持续眼部转基因表达
评估ceDNA载体转基因表达在除肝脏之外的组织中的可持续性，以测定在眼部施用之后，ceDNA载体在体内的耐受性和表达。尽管荧光素酶在实施例9中被用作示例性转基因，但是本领域普通技术人员可容易地用来自表1中列出那些的PFIC序列代替荧光素酶转基因。
第0天，向大约9周龄的雄性史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rats)视网膜下注射使用转染试剂(Polyplus)配制的5μL包含荧光素酶转基因的ceDNA载体或使用配制的编码荧光素酶的质粒DNA，两者浓度均为0.25μg/μL。每组测试四只大鼠。给动物服镇静剂且使用33号针在右眼视网膜下注射测试制品。每只动物的左眼不治疗。注射之后立即利用光学相干断层扫描或眼底成像来检查眼睛以便确认视网膜下水泡的存在。大鼠根据标准程序用丁基原啡因(buprenorphine)和体表抗生素软膏治疗。
在第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，给两组动物经由腹膜内注射全身给予150mg/kg新鲜制备的荧光素。以2.5mL/kg在施用荧光素后5分钟-15分钟时，在异氟烷麻醉下使用IVIS对所有动物成像。在5分钟暴露期间，获得包含眼睛的所关注的区域内的总通量[p/s]和平均通量(p/s/sr/cm2)。在ceDNA载体治疗的眼睛中容易检测到明显荧光，但在质粒治疗的眼睛中则弱得多(图8A)。结果作为每个治疗组的经治疗眼睛(“注射”)的平均辐射度相对于每个治疗组的未治疗眼睛(“未注射”)的平均辐射度的图形表示(图8B)。35天之后，将质粒注射的大鼠终结，同时继续研究ceDNA治疗的大鼠，在第42天、第49天、第56天、第63天、第70天和第99天进行荧光素注射和IVIS成像(图8B)。结果表明，通过单次注射引入大鼠眼睛中的ceDNA载体介导体内转基因表达，且该表达在高水平持续到注射之后的至少99天(图8B)。
实施例10：Rag2小鼠中ceDNA载体的持续给药和重新给药。
在ceDNA载体的基因表达盒中编码的一个或多个转基因表达于宿主环境(例如细胞或受试者)的情形中，在所表达的蛋白被识别为外来蛋白的情况下，宿主将可能产生适应性免疫应答，这可能使表达产物发生非期望的耗竭，从而会潜在地与表达的缺乏发生混淆。在一些情况下，与正常宿主环境异源的报告分子可能会发生这种情况。因此，在Rag2小鼠模型中评估体内的ceDNA载体转基因表达，该模型缺乏B细胞和T细胞并且因此未建立针对非原生鼠蛋白诸如荧光素酶的适应性免疫应答。简单来说，c57bl/6和Rag2基因敲除小鼠在第0天，经由尾静脉注射，静脉内给予0.5mg/kg的经LNP囊封的表达荧光素酶的ceDNA载体或聚C对照，且在第21天，某些小鼠重复给药相同剂量水平的相同的经LNP囊封的ceDNA载体。所有测试组各自由4只小鼠组成。如实施例9中所述，每周按时间间隔注射荧光素之后，进行IVIS成像。
与从IVIS分析中观察到的总通量相比，在给予LNP-ceDNA载体-Luc的野生型小鼠中观察到的荧光(所表达的荧光素酶的存在的间接测量)在第21天之后逐渐减少，而施用相同治疗的Rag2小鼠在第42天实验期间显示相对恒定持续的荧光素酶表达(图9A)。在野生型小鼠中观察到减少的大约第21天时间点对应于预期可能会产生适应性免疫应答的时间范围。LNP-ceDNA载体再施用于Rag2小鼠引起表达明显增加，在此研究中追踪其的至少21天期间，该表达的明显增加被维持(图9B)。结果表明，当ceDNA载体在宿主中表达非原生蛋白时，适应性免疫可以起作用，并且在从初始施用的20+天时间范围内观察到的表达的减少可以使混杂的适应性免疫应答而非表达的衰减(或除其之外)信号传导到所表达的分子。值得注意的是，当原生蛋白在宿主中表达时，这个应答预期较低，其中预期宿主将所表达的分子正确地识别为自身的且将不产生此类免疫应答。
实施例11：肝脏特异性表达和CpG调节对持续表达的影响
如实施例10中所述，非期望的宿主免疫应答在一些情况下可能会人为地抑制原本是一个或多个期望转基因从所引入的ceDNA载体中的持续表达。采取两种方法来评估避免和/或抑制潜在宿主免疫应答对来自ceDNA载体的持续表达的影响。首先，由于前述实施例中所用的ceDNA-Luc载体处于组成型CAG启动子的控制下，因此使用肝脏特异性启动子(hAAT)或不同组成型启动子(hEF-1)制备类似构建体，以了解避免长时间暴露于骨髓细胞或非肝脏组织是否减少所观察到的任何免疫效应。其次，对某些ceDNA荧光素酶构建体进行工程改造以使CpG含量减小(一种已知的用于宿主免疫应答的触发事件)。将此类工程化和启动子开关的ceDNA载体施用于小鼠后，测量ceDNA编码的荧光素酶基因表达。
使用三种不同ceDNA载体，每种编码作为转基因的荧光素酶。第一种ceDNA载体具有大量未甲基化的CpG(约350个)并包含组成型CAG启动子(“ceDNA CAG”)；第二种具有中等数量的未甲基化的CpG(约60个)并包含肝脏特异性hAAT启动子(“ceDNA hAAT低CpG”)；第三种是第二种的甲基化形式，使得它不含未甲基化的CpG并且还包含hAAT启动子(“ceDNAhAAT无CpG”)。ceDNA载体原本是相同的。如上文所述制备载体。
四组大约4周龄的四只雄性小鼠用囊封于LNP中的ceDNA载体之一或聚C对照治疗。第0天，每只小鼠施用0.5mg/kg ceDNA载体的单次静脉内尾静脉注射液，体积为5mL/kg。在第-1天、第0天、第1天、第2天、第3天、第7天和随后每周记录体重，直到小鼠终结为止。在第0天、1天和35天，获取全血和血清样品。第7天、14天、21天、28天和35天和随后每周使用体内成像系统(IVIS)执行一生成像(in-life imaging)。为了成像，每只小鼠经由腹膜内注射2.5mL/kg来注射150mg/kg荧光素。15分钟之后，将每只小鼠麻醉并且对其成像。第93天终结小鼠且收集末端组织，包括肝脏和脾脏。第0天给药之后的6小时进行细胞因子测量。
虽然所有经ceDNA治疗的小鼠在第7天和第14天显示明显的荧光，但是ceDNA CAG小鼠中的荧光在第14天之后快速减少且在研究的其余时间内逐渐减少。相比之下，ceDNAhAAT低CpG和无CpG治疗的小鼠的总通量保持在稳定的高水平下(图10)。这表明，将ceDNA载体递送特异性引向肝脏使得载体的转基因表达在单次注射之后的至少77天期间持续、持久。CpG最小化或完全缺乏CpG含量的构建体具有相似的持久、持续表达特征，而高CpG组成型启动子构建体的表达随时间展现衰减，表明ceDNA载体引入引起的宿主免疫活化可以起到减少此类载体在受试者中的所观察到的任何表达的作用。这些结果提供了按照所期望水平定制应答持续时间的替代方法，这是通过在观察到宿主免疫应答(一种潜在的转基因特异性应答)的情况下选择组织限制性启动子和/或改变ceDNA载体的CpG含量来实现。
实施例12：PFIC治疗蛋白的体内表达(例如，ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)
在体外受体细胞中证实了合适的蛋白表达和功能后，将如实施例1中所述产生的具有编码PFIC治疗蛋白的序列的ceDNA载体与脂质纳米粒子一起配制，并且在不同时间点(子宫内、新生儿、4周龄和8周龄)施用于各自蛋白产生的功能性表达缺陷的小鼠，用于验证体内表达和蛋白作用。将编码ATP8B1的ceDNA载体施用于先前开发的ATP8B1无效小鼠(ShahS、Sanford UR、Vargas JC、Xu H、Groen、A等人，(2010)PLOS ONE 5(2):e8984)。将编码ABCB11的ceDNA载体施用于先前开发的ABCB11-/-无效小鼠(Zhang等人，The Journal ofBiological Chemistry 287，24784-24794)。将编码ABCB4的ceDNA载体施用于先前开发的ABCB4-/-无效小鼠(Baghdasaryan等人，Liver Int.2008年8月；28(7):948-58；Baghdasaryan等人，Journal of Hepatology 2016；64:674-681)。将编码TJP2的ceDNA施用于TJP2-/-无效小鼠胚胎(Jackson Labs)(在子宫内)并评估表达和蛋白功能。
LNP-ceDNA载体以1.2mL的体积、以0.3mg/kg与5mg/kg之间的剂量施用于相应小鼠。每次剂量经由静脉内流体动力施用方式施用，或通过例如腹膜内注射来施用。正常小鼠施用充当对照并且还能够用于检测治疗蛋白的存在和数量。
在急性给药(例如单剂量的LNP-ceDNA)后，将在不同时间点(例如在第10天、第20天、第30天、第40天、第50天、第1000天和第200天或更长时间等)确定接受者小鼠肝脏组织中的表达。具体地，将获得小鼠肝脏和胆管的样品，以使用组织切片的免疫染色分析蛋白的存在。将定量评估蛋白存在，并还将评估在组织和其中的细胞内的适当定位。将评估肝脏中的细胞(例如，肝细胞和上皮细胞)和胆管中的细胞(例如，胆管细胞)的蛋白表达。
实施例13：治疗性施用PFIC治疗蛋白(例如ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2)
在证实外源性治疗蛋白表达后，如实施例12所讨论，通过标准方法评估接受者无效小鼠的胆汁淤积病状的治疗改善。评估将在施用后约2周、4周和8周进行。
根据Baghdasaryan等人(Journal of Hepatology 2016，第64卷：674-681)的方法，将接受者小鼠与对照小鼠比较肝脏组织学(胆管损伤分析)。将评估血清丙氨酸转氨酶(ALT)，一种肝细胞损伤的标志物(RocheMannheim，Germany)。分析胆汁淤积的血清标志物(碱性磷酸酯酶(AP)(Roche/>Mannheim，Germany)和胆汁酸(BA))(来自DiaSys Diagnostic Systems GmbH，Holzheim，Germany的胆汁酸试剂盒Ecoline S+)，其中显著降低指示胆汁淤积病症的有效治疗。还将监测血清胆红素、血清三酸甘油酯值水平、血清胆固醇水平与治疗蛋白表达相关的改善。还将评估肝重量和脾重量，其中肝:体重和脾:体重比率的降低指示有效治疗。还通过CK19 IHC染色以及mRNA表达水平的定量和分析来监测胆管增殖。
通过分析参与肝损伤发病机理的主要促炎细胞因子，将ceDNA接受者小鼠与对照小鼠在肝炎症和导管周纤维化方面进行比较。将评估TNF-α、Mcp-1和Vcam-1的mRNA表达，以及胆汁纤维化标志物诸如Col1a1和Col1a2的表达(Wagner等人，Gastroenterology 2003:125:825-838)。进行天狼星红染色以检测纤维化。肝炎症和导管周纤维化的减少将指示有效的治疗。
还将检查胆汁稳态和肝细胞胆汁酸负荷。将评估胆汁酸合成的肠调节子Fgf15的基因表达，其中降低指示有效治疗(Inagaki等人，Cell Metab2005:2:217-225)。胆汁酸合成限速酶(Cyp7a1)的增加和胆汁酸解毒酶Cyp3a11、Ugt1a1和Ugt2b5以及窦状隙输出转运蛋白Mrp3的基因表达降低也指示有效治疗。
根据Baghdasaryan等人(Journal of Hepatology 2016，第64卷：674-681)的方法检查胆汁酸的输出和胆汁酸的组成。胆汁流量和胆汁BA浓度的降低将指示有效治疗。还将检查胆囊生理学，其中胆囊大小的减小指示有效治疗。
实施例14：并入PFIC治疗蛋白内源启动子
制备一系列不同的ceDNA载体以询问不同启动子区在从ceDNA表达PFIC治疗蛋白中的活性。构建体示意性地显示在图11A-图11D和图12中。
评估每种ceDNA载体在培养基中表达编码的治疗性PFIC基因的能力。如实施例1所述制备包含上述ceDNA载体的质粒，并用于培养的HepG2细胞的瞬时转染。简言之，培养的细胞在烧瓶中在具有100％FBS 37℃和5％CO2的DMEM GlutaMAX培养基中生长。转染前一天，将细胞接种到预先包被有适当密度的聚-L-赖氨酸的盖玻片上，并在类似条件下在新鲜平板中生长。在转染的当天，将每个ceDNA样品与转染试剂Lipofectamine3000以2μgDNA:3.75μL Lipofectamine比率混合，并加入到细胞中。使细胞生长72小时。从每个培养物中收集细胞并通过免疫细胞化学分析。
免疫细胞化学分析如下进行。从细胞中除去培养基，并将它们在PBS中简单冲洗。然后将盖玻片用甲醇/丙酮4:1在-20℃固定3分钟，并用冰冷的1x PBS/0.05％ TWEEN pH7.4洗涤10分钟。然后将盖玻片用冰冷的PBS洗涤三次。
然后阻断细胞并进行免疫染色。将盖玻片固定的细胞与含有22.52mg/mL甘氨酸和0.1％ Tween 20的PBS中的1％BSA一起温育1小时以阻断抗体的非特异性结合，随后将细胞在以1:50稀释度加入了小鼠抗ABCB4一级抗体的相同溶液中于4℃在加湿容器中温育过夜。倾出溶液，随后用PBS洗涤三次5分钟。然后将细胞与PBS中的1％BSA中的荧光二级抗体(Alexa Fluor/>特异性识别小鼠IgG，/>)在室温在黑暗中温育1小时。倾出温育溶液，并再次将细胞在黑暗中在PBS中洗涤三次，每次5分钟)。将盖玻片用包括DAPI/>的封片溶液封片，并使用标准技术密封，并在-20℃在黑暗中储存直至成像。
在荧光评估下潜在地可见三种不同颜色：红色指示由于Alexa Fluor二级抗体染色而存在表达的ABCB4蛋白；蓝色指示由于DAPI染色而存在DNA并鉴定细胞核，并且绿色指示存在GFP(对于GFP表达对照)。如图13所示，在用ceDNA载体质粒转导的HepG2细胞中，在所有三个启动子背景中观察到ABCB4蛋白表达-天然启动子(图13A)、hAAT启动子(图13B)；以及CAG启动子(图13C)。
实施例15：PFIC在ABCB4-/-小鼠中的表达
为了评估携带操作性地连接至hAAT启动子的人类ABCB4构建体的ceDNA是否可以在缺乏ABCB4(ABCB4-/-)的小鼠中体内表达并且提供功效，将5μg或50μg的ceDNA:hAAT-ABCB4流体动力学地施用于ABCB4-/-小鼠。
该研究在两个单独的第0天日期开始，组1-组3在群组A中，组4-组7在群组B中。将组8和组9分配到群组B中，对于首次用于实验的对照组织收集没有开始日期。动物维持标准小鼠饮食(即，Lab Diet 5058)。
胆汁收集(非存活手术)。在第7天，用可注射的麻醉剂将动物麻醉到麻醉的手术平面以收集胆汁。对于组1-组3，在剑状突起和耻骨联合部之间的腹腔上进行正中切开以打开腹腔并到达腹膜后空间；不损害隔膜或主血管。暴露胆管并用结扎线(不可吸收的丝4-0缝线或等效物)封闭，并插入胆囊插管(具有PE-10管或等效物的30g针)。用温的无菌盐水润湿腹腔。将胆汁收集到冷冻管中并每30分钟单独冷冻60分钟(每只动物总共2个单独收集管)。如果在第一个30分钟内收集的胆汁的量小于20μL，则在剩余的30分钟内使用相同的冷冻管继续收集胆汁。
对于组4-组9，在剑状突起和耻骨联合部之间的腹腔上进行正中切开以打开腹腔并到达腹膜后空间；不损害隔膜或主血管。检查胆囊。如果存在胆汁，则完整收集胆囊。通过将全部胆囊悬浮在按扣管的帽中并以8,000g离心10秒-30秒来收集胆汁。将整个管放入LN2中，并将样品储存在标称-80℃处。如果胆囊不存在可见的胆汁，则如上文针对组1-组3所述进行胆管插管。如果在10分钟内没有收集到胆汁，则终止收集。
在小鼠的肝脏样品中，使用抗ABCB4抗体进行免疫组织化学。ABCB4染色揭示了从阴性对照组(图14A)、5μg ceDNA:hAAT-ABCB4组(图14B)到50μg ceDNA:hAAT-ABCB4组(图14C)，其中观察到最高水平的表达。虽然ceDNA:hAAT-ABCB4在处理的动物中显示ABCB4的散发的(<5％)中心周围表达(图14B和图14C)，但其表达在肝细胞中是明显的。
使用基于平板的比色测定，使用胆汁的1:50稀释液(MAK122)测量胆磷脂水平。与野生型小鼠相比，ABCB4-/-小鼠显示低于预期的可检测水平的最小胆磷脂水平(图15)。然而，与未经处理的ABCB4-/-相比，用ceDNA:hAAT-ABCB4处理的ABCB4-/-动物显示胆磷脂的升高。值得注意的是，50μg ceDNA:hAAT-ABCB4的流体动力递送导致ABCB4-/-小鼠中的胆磷脂水平升高，大约为WT水平的11％，这显著大于在用PBS缓冲液处理的ABCB4-/-小鼠中观察到的水平，表明由ABCB4中的缺陷引起的胆磷脂缺乏可以通过ceDNA:hAAT-ABCB4处理来校正。
参考文献
在本说明书和本文的实施例中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，都以全文引用的方式并入本文中，如同每个单独的出版物或参考文献被明确且单独地指出像充分阐述一样，以引用的方式并入本文中一般。本申请要求优先权的任何专利申请也以上述针对出版物和参考文献的方式以引用方式并入本文中。

Claims (58)

1.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，所述ceDNA载体包含：
位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一种异源核苷酸序列，其中所述至少一种异源核苷酸序列编码至少一种进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)治疗蛋白。
2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中编码至少一种PFIC治疗蛋白的所述至少一种异源核苷酸序列选自表1中的任一个序列。
3.根据权利要求1或2所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含选自表7中的任一个启动子的启动子，所述启动子操作性地连接到编码至少一种PFIC治疗蛋白的所述至少一种异源核苷酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含选自表8A-表8C中的任一个增强子的增强子。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含选自表9A中的任一个5'UTR和/或内含子序列的5'UTR和/或内含子序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含选自表9B中的任一个3'UTR的3'UTR。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个选自表10中的任一个聚A序列的聚A序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个操作性地连接到至少一种异源核苷酸序列的启动子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体以合成方式产生。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR来自选自以下的病毒：细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称的或不对称的。
13.根据权利要求12所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称的或基本上对称的。
14.根据权利要求12所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是不对称的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR是野生型的，或者其中所述ITR中的两个ITR都是野生型的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自表2中所示的病毒血清型对。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR包含选自表3中的序列的序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的至少一个ITR由于影响所述ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而相对于野生型AAV ITR序列改变。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR来源于选自以下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR是合成的。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR不是野生型ITR，或者其中所述ITR中的两个ITR都不是野生型的。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的ITR区域中的至少一个ITR区域的缺失、插入和/或取代而被修饰。
24.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
27.根据权利要求1至24中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的ceDNA载体，其中两个ITR以使得当所述ITR相对于彼此反转时产生整体三维对称性的方式改变。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR包含选自表3、表5A、表5B和表6中的序列的序列。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列处于至少一个调控开关的控制下。
34.根据权利要求33所述的ceDNA载体，其中至少一个调节开关选自二元调节开关、小分子调节开关、密码调节开关、基于核酸的调节开关、转录后调节开关、辐射控制或超声波控制的调节开关、低氧介导的调节开关、炎症应答调节开关、剪切活化的调节开关和杀伤开关。
35.一种在细胞中表达PFIC治疗蛋白的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体接触足以表达所述PFIC治疗蛋白的时间量。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞是感光细胞或视网膜色素上皮(RPE)细胞。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述细胞在体外或体内。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体包含至少一种异源核苷酸序列，所述异源核苷酸序列为了在真核细胞中表达而进行密码子优化。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述至少一种异源核苷酸序列选自表1中的任一种。
40.一种治疗患有进行性家族性肝内胆汁淤积(PFIC)的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一种编码至少一种PFIC治疗蛋白的异源核苷酸序列。
41.根据权利要求40所述的方法，其中编码至少一种PFIC治疗蛋白的所述至少一种异源核苷酸序列选自表1中的任一个序列。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中将所述ceDNA载体施用于感光细胞或RPE细胞或两者。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体在感光细胞或RPE细胞或两者中表达所述PFIC治疗蛋白。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中通过以下任何一种或多种方式施用所述ceDNA载体：视网膜下注射、脉络膜上注射或玻璃体内注射。
45.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体。
46.一种细胞，所述细胞含有根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体。
47.根据权利要求46所述的细胞，其中所述细胞是感光细胞或RPE细胞或两者。
48.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体以及脂质。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述脂质是脂质纳米粒子(LNP)。
50.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体、或根据权利要求48或49所述的组合物、或根据权利要求46所述的细胞。
51.根据前述权利要求中任一项所述的ceDNA载体，所述ceDNA载体是由包括以下步骤的方法获得：(a)在至少一种Rep蛋白存在的情况下温育携带ceDNA表达构建体的昆虫细胞群体，其中所述ceDNA表达构建体在有效诱导所述ceDNA载体在所述昆虫细胞内产生并且持续足以诱导所述ceDNA载体在所述昆虫细胞内产生的时间的条件下编码所述ceDNA载体；以及(b)从所述昆虫细胞中分离所述ceDNA载体。
52.根据权利要求51所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA表达构建体选自ceDNA质粒、ceDNA杆粒和ceDNA杆状病毒。
53.根据权利要求51或权利要求52所述的ceDNA载体，其中所述昆虫细胞表达至少一种Rep蛋白。
54.根据权利要求53所述的ceDNA载体，其中所述至少一种Rep蛋白来自选自以下的病毒：细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。
55.根据权利要求54所述的ceDNA载体，其中所述至少一种Rep蛋白来自选自以下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
56.一种ceDNA表达构建体，所述ceDNA表达构建体编码根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体。
57.根据权利要求56所述的ceDNA表达构建体，所述ceDNA表达构建体为ceDNA质粒、ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒。
58.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求56或权利要求57所述的ceDNA表达构建体。
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