BR112020017060A2 - Expressão controlada de transgenes usando vetores de dna de extremidade fechada (cedna) - Google Patents

Expressão controlada de transgenes usando vetores de dna de extremidade fechada (cedna) Download PDF

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Abstract

a presente invenção refere-se a métodos e construtos que compreendem dna de extremidade fechada (vetores de cedna) para manter ou sustentar um nível de expressão de transgene em um nível ou faixa predeterminado por um tempo predefinido ou aumentar o nível de expressão de transgene em uma célula ou um sujeito, em que o nível de expressão do transgene pode ser modulado (por exemplo, aumentado) com uma ou mais administrações subsequentes (por exemplo, uma administração de redose ou de reforço) após uma administração de preparação inicial. são fornecidos métodos para personalizar a terapia gênica ao longo da vida de um indivíduo para expressar um transgene em um nível que atenda às necessidades de um indivíduo, modulando-se os níveis de expressão de um transgene expresso pelo vetor de cedna de forma incremental, ou passo a passo, com uma ou mais administrações após uma administração de preparação inicial (por exemplo, no tempo 0), permitindo assim a titulação do nível de expressão do transgene para um nível de expressão predeterminado desejado ou para uma faixa de nível de expressão desejada.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EX-
PRESSÃO CONTROLADA DE TRANSGENES USANDO VETORES DE DNA DE EXTREMIDADE FECHADA (ceDNA)".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica benefício sob 35 USC § 119 (e) do Pedido Provisório n.os U.S. 62/633.882, depositado em 22 de fevereiro de 2018; 62/633.757, depositado em 22 de fevereiro de 2018; 62/633.795, depositado em 22 de fevereiro de 2018; e 62/746.762, de- positado em 17 de outubro de 2018, cujo conteúdo é incorporado no presente documento por referência em sua totalidade.
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente no formato ASCII e é incorporada a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 21 de fevereiro de 2019, é denominada 080170-091190-WOPT_SL.txt e tem 116.872 bytes de tamanho.
CAMPO TÉCNICO
[003] A presente invenção refere-se ao campo da terapia de ge- ne, incluindo vetores livres de capsídeo para expressão controlada de um transgene ou polinucleotídeos isolados em um sujeito ou célula. A tecnologia descrita no presente documento refere-se a métodos de expressão controlada de um transgene in vivo a partir de um vetor de DNA sem capsídeo com vetor de extremidade fechada (ceDNA), em que o nível de expressão pode ser mantido no nível desejado por um tempo predeterminado ou aumentado com uma ou mais subsequentes administrações (por exemplo, uma administração de reforço ou redo- se).
ANTECEDENTES
[004] A terapia de genes busca melhorar os resultados clínicos de pacientes que sofrem de mutações genéticas ou doenças adquiri- das causadas por uma aberração no perfil de expressão gênica. A te-
rapia de gene inclui o tratamento ou prevenção de condições médicas resultantes de genes defeituosos ou regulação ou expressão anormal, por exemplo, subexpressão ou superexpressão, que podem resultar em um distúrbio, doença, malignidade, etc. Por exemplo, uma doença ou distúrbio causado por um gene defeituoso pode ser tratado, preve- nido ou melhorado pela entrega de um material genético corretivo a um paciente, alterando ou silenciando um gene defeituoso ou entre- gando um anticorpo terapêutico, por exemplo, resultando na expres- são terapêutica do material genético dentro do paciente.
[005] A base da terapia de gene é fornecer um cassete de trans- crição com um produto de gene ativo (às vezes chamado de transge- ne), por exemplo, que pode resultar em um efeito positivo de ganho de função, um efeito negativo de perda de função ou outro resultado. A terapia de gene também pode ser usada para tratar uma doença ou malignidade causada por outros fatores. Os distúrbios monogênicos humanos podem ser tratados pela entrega e expressão de um gene normal nas células alvo. A entrega e expressão de um gene corretivo nas células alvo do paciente podem ser realizadas através de vários métodos, incluindo o uso de vírus geneticamente modificados e veto- res de entrega de genes virais. Entre os muitos vetores derivados de vírus disponíveis (por exemplo, retrovírus recombinante, lentivírus re- combinante, adenovírus recombinante e similares), o vírus adenoas- sociado recombinante (rAAV) está ganhando popularidade como um vetor versátil na terapia gênica.
[006] Os vírus adenoassociados (AAV) pertencem à família par- voviridae e constituem mais especificamente o gênero dependoparvo- vírus. Os vetores derivados do AAV (isto, é, vetores AAV recombinan- tes (rAVV) ou AAV) são atraentes para a entrega de material genético porque (i) têm capacidade de infectar (transduzir) uma ampla varieda- de de tipos de células que não se dividem e se dividem, incluindo mió-
citos e neurônios; (ii) são desprovidos dos genes estruturais do vírus, diminuindo, assim, as respostas das células hospedeiras à infecção pelo vírus, por exemplo, respostas mediadas por interferon; (iii) vírus do tipo selvagem são considerados não patológicos em humanos; (iv) em contraste com o AAV do tipo selvagem, com capacidade de se in- tegrar no genoma da célula hospedeira, os vetores de AAV com defici- ência de replicação não possuem o gene rep e geralmente persistem como epissomas, limitando, assim, o risco de mutagênese ou genoto- xicidade de inserção; e (v) em comparação com outros sistemas de vetores, os vetores de AAV são geralmente considerados como imunógenos relativamente ruins e, portanto, não desencadeiam uma resposta imune significativa (ver ii), ganhando, assim, a persistência do DNA do vetor e potencialmente a expressão a longo prazo dos transgenes terapêuticos.
[007] No entanto, existem várias deficiências importantes no uso de partículas de AAV como vetor de entrega de genes. Uma grande desvantagem associada ao rAAV é sua capacidade limitada de empa- cotamento viral de cerca de 4,5 kb de DNA heterólogo (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010) e, como resultado, o uso de AAV vetores foi limitado a menos de 150.000 capacidade de codificação da proteína Da. A segunda desvantagem é que, como re- sultado da prevalência de infecção por AAV do tipo selvagem na popu- lação, os candidatos à terapia genética com rAAV devem ser rastrea- dos quanto à presença de anticorpos neutralizantes que eliminam o vetor do paciente. Uma terceira desvantagem está relacionada à imu- nogenicidade do capsídeo que impede a readministração em pacien- tes que não foram excluídos de um tratamento inicial. O sistema imu- nológico do paciente pode responder ao vetor, que age efetivamente como uma injeção de "reforço" para estimular o sistema imunológico, gerando anticorpos anti-AAV de alta titulação que impedem tratamen-
tos futuros. Alguns relatórios recentes indicam preocupações com a imunogenicidade em situações de altas doses. Outra desvantagem notável é que o início da expressão gênica mediada por AAV é relati- vamente lento, dado que o DNA de AAV de fita simples deve ser con- vertido em DNA de cadeia dupla antes da expressão gênica heterólo- ga.
[008] Adicionalmente, os vírions de AAV convencionais com cap- sídeos são produzidos através da introdução de um plasmídeo ou plasmídeos contendo o genoma de AAV, os genes rep e os genes cap (Grimm et al., 1998). No entanto, verificou-se que tais vetores de vírus AAV encapsidados transduzem ineficientemente certos tipos de célu- las e tecidos e os capsídeos também induzem uma resposta imune.
[009] Além disso, os vetores tradicionais de terapia de gene para entrega de transgenes (por exemplo, vírus adenoassociado (AAV), adenovírus, vetores de lentivírus etc.) são tipicamente limitados a uma única administração do vetor aos pacientes, devido em parte à respos- ta imune do paciente a proteínas virais. Além disso, para a expressão sustentada a longo prazo do transgene, normalmente é necessário administrar um título alto na administração inicial, o que pode levar a efeitos colaterais deletérios. Como tal, os vetores virais tradicionais para terapia de gene carecem de utilidade devido à falta de expressão sustentada a longo prazo do transgene. Além disso, a faixa de material genético transgênico adequado para a entrega em tais vetores virais é limitada pela capacidade de empacotamento viral das proteínas do capsídeo viral (por exemplo, cerca de 4,5 kb para o AAV), excluindo assim a entrega de transgenes maiores para terapia. Consequente- mente, o uso de vetores de vírus adenoassociado (AAV) para terapia de gene é limitado devido à administração única a pacientes (devido à resposta imune do paciente), à faixa limitada de material genético transgênico adequado para a entrega em vetores AAV devido à capa-
cidade mínima de empacotamento viral (cerca de 4,5 kb) e à lenta ex- pressão de gene mediada por AAV.
[0010] Além disso, houve vários relatórios levantando preocupa- ções sobre o uso de uma dose muito alta de um vetor viral. A maioria dos vetores virais também sofre com as preocupações de imunogeni- cidade levantadas sobre o AAV.
[0011] Consequentemente, é necessário em campo uma tecnolo- gia que permita doses múltiplas de um vetor para terapia de gene. Além disso, existe uma necessidade na técnica de métodos de contro- le da expressão de gene de um vetor de terapia de gene com efeitos mínimos fora do alvo, e ainda existe uma necessidade importante não atendida de vetores de DNA recombinantes controláveis com proprie- dades aprimoradas de produção e/ou expressão. Além disso, como será apreciado por um médico experiente, é desejável a capacidade de titular a expressão/dose de um transgene para personalizar um tra- tamento de terapia gênica com base no conjunto particular de sinto- mas e/ou gravidade da doença de um sujeito e ainda para minimizar os efeitos colaterais ou toxicidade.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0012] A invenção descrita no presente documento é um vetor de DNA livre de capsídeo com extremidades fechadas covalentemente (denominado como "vetor de DNA de extremidade fechada" ou "vetor de ceDNA") para expressão controlada de um transgene em uma célu- la, por exemplo, para tratar uma doença. Em particular, a tecnologia no presente documento descrita refere-se a vetores livres de capsídeo de DNA de extremidade fechada (ceDNA) para expressão controlada de um transgene, incluindo, mas não se limitando a, expressão sustenta- da de um transgene, expressão controlada a longo prazo de um trans- gene, expressão dependente da dose e/ou titulável de um transgene e dosagem com repetição de um transgene usando os vetores no pre-
sente documento descritos. Por conseguinte, os métodos no presente documento descritos permitem personalizar a terapia de gene ao longo da vida de um indivíduo para expressar um transgene em um nível que atenda às necessidades do indivíduo, sustentando o nível de expres- são do transgene em um nível predeterminado por um tempo prede- terminado ou, alternativamente, aumentando a expressão do transge- ne de maneira dependente da dose, por uma ou mais administrações após a administração de preparação inicial, controlando desse modo o nível de expressão do transgene para um nível de expressão desejado ou faixa de nível de expressão desejada com base na concentração do vetor de ceDNA na administração de redose, permitindo um aumento controlado e específico na expressão do transgene na célula ou no sujeito.
[0013] Por conseguinte, em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como no presente documento descrito pode ser readministrado (também no presente documento referido como uma administração "redose" ou "de reforço") para continuar o nível de expressão do trans- gene em um nível predeterminado por um tempo predeterminado ou para aumentar o nível de expressão do transgene acima de um nível de expressão precedente que foi alcançado em uma primeira adminis- tração de vetor de ceDNA ou precedente, em que a segunda adminis- tração ou administração de reforço não gera uma reação imune que impede a expressão do transgene por não gerar uma resposta imune ao próprio vetor que afeta a expressão do transgene ou quando a rea- ção imune é menor em comparação com a readministração de um ve- tor viral compreendendo proteínas virais, incluindo, mas não se limi- tando a, um vetor viral compreendendo um capsídeo, como um parvo- vírus ou um lentivírus.
[0014] Sem querer limitar-se à teoria, a pesquisa mostra que a ex- pressão a longo prazo do transgene usando vetores virais convencio-
nais de AAV diminui com o tempo. Uma maneira de garantir a expres- são a longo prazo do transgene usando vetores de AAV convencionais tem sido tradicionalmente aumentar o título e a dose do vetor de AAV entregue na administração inicial. No entanto, sabe-se que um título ou dose muito alto do vetor de AAV pode resultar em uma variedade de efeitos colaterais. Além disso, como discutido acima, a readminis- tração de um vetor viral de AAV não é tradicionalmente possível devi- do a respostas imunes. As formas de contornar a causa de uma res- posta imune à readministração de vetores de AAV normalmente reque- rem a readministração de um vetor de AAV com uma configuração de capsídeo diferente em comparação com o vetor de AAV administrado em quaisquer administrações precedentes. Tais estratégias, no entan- to, ainda podem representar um risco significativo ao sujeito, induzindo uma resposta imune ao vetor de AAV e efeitos potencialmente deleté- rios.
[0015] No presente documento, a invenção fornece um método para expressão controlada de um transgene, incluindo expressão de longo prazo usando um vetor de DNA de extremidade fechada (ceD- NA). É no presente documento demonstrado que um vetor de ceDNA pode ser titulado para aumentar os níveis de expressão do transgene, por exemplo, repetição ou readministração do vetor de ceDNA. Além disso, o nível de expressão do transgene pode ser mantido a longo prazo e, se qualquer queda nos níveis de expressão for observada, uma administração de redose do vetor de ceDNA pode ser usada para manter o nível desejado ou mesmo para aumentar o nível de expres- são do transgene se desejável para o sujeito e/ou a doença ou distúr- bio a ser tratado.
[0016] Por conseguinte, são no presente documento fornecidos métodos de administração de vetores de ceDNA para sustentar e/ou aumentar o nível de expressão de um transgene a partir de um vetor de ceDNA em uma célula ou um sujeito, e onde o nível de expressão pode ser sustentado ou aumentado com uma ou mais administrações subsequentes (por exemplo, uma redose ou uma administração de re- forço). No caso em que a expressão do transgene entregue pelo ceD- NA diminua por qualquer motivo, a redose do vetor de ceDNA pode restabelecer ou manter a expressão desejada do transgene em um nível desejado. Também são fornecidos neste documento métodos para terapia genética personalizada, de modo que o nível de expres- são de um transgene expresso pelo vetor de ceDNA possa ser aumen- tado de forma incremental, ou de maneira passo a passo, com uma ou mais administrações após uma administração de preparação inicial (por exemplo, no tempo 0), ajustando assim (por exemplo, titulação) o nível de expressão do transgene para um nível de expressão desejado ou dentro de uma faixa de nível de expressão desejada, conforme ne- cessário pelo sujeito.
[0017] Por conseguinte, em algumas modalidades, os vetores e métodos de ceDNA no presente documento descritos podem ser usa- dos para titular ou efetuar um aumento no nível de expressão de um transgene por um vetor de ceDNA, e onde o nível de expressão do transgene pode ser titulado em uma maneira dependente de dose com uma ou mais administrações subsequentes (por exemplo, uma redose ou administração de reforço dependente da dose). Como tal, os méto- dos no presente documento descritos permitem personalizar a terapia gênica ao longo da vida de um indivíduo para expressar um transgene em um nível que atenda às necessidades do indivíduo, sustentando o nível de expressão do transgene em um nível predeterminado ou, al- ternativamente, aumentando a expressão do transgene de uma manei- ra dependente da dose, por uma ou mais administrações após a admi- nistração de preparação inicial (por exemplo, no tempo 0), controlando desse modo o nível de expressão do transgene para um nível de ex-
pressão desejado ou faixa de nível de expressão desejada com base na concentração do vetor de ceDNA na administração de redose, per- mitindo um aumento controlado e específico na expressão do transge- ne na célula ou no sujeito.
[0018] Por conseguinte, em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como no presente documento descrito pode ser readministrado (também no presente documento referido como uma administração "redose" ou "de reforço") para continuar o nível de expressão do trans- gene em um nível predeterminado por um tempo predeterminado ou para aumentar o nível de expressão do transgene acima de um nível de expressão precedente que foi alcançado em uma primeira ou pre- cedente administração do vetor de ceDNA.
[0019] Por conseguinte, um aspecto da tecnologia no presente do- cumento descrita refere-se ao uso do vetor de ceDNA em métodos pa- ra expressão controlada de transgene, por exemplo, em um método para modular os níveis de expressão de um transgene ou para um aumento controlado no nível de expressão de transgene ou para uma expressão dependente da dose de um nível de transgene em uma cé- lula ou um sujeito, em que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga (por exemplo, um transge- ne) operacionalmente ligada a um promotor e posicionada entre duas sequências de repetição terminal invertida, em que sequências ITR podem ser assimétricas, ou simétricas ou substancialmente simétricas, conforme estes termos são definidos no presente documento, em que pelo menos uma das ITRs compreende um local de resolução terminal funcional e um local de ligação a Rep e, opcionalmente, a sequência heteróloga de ácido nucleico codifica um transgene, e em que o vetor não está em um capsídeo viral.
[0020] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA, como des- crito no presente documento, são moléculas de DNA duplex lineares,
livres de capsídeos, formadas a partir de uma fita contínua de DNA complementar com extremidades fechadas covalentemente (estrutura linear, contínua e não encapsidada), que compreende duas repetições terminais invertidas (ITR) que flanqueiam um transgene que está ope- racionalmente ligado a um promotor ou outro interruptor regulador, como descrito no presente documento. A ITR 5' e a ITR 3' podem ter a mesma organização tridimensional simétrica em relação uma à outra (ou seja, simétrico ou substancialmente simétrico) ou, alternativamen- te, a ITR 5' e a ITR 3' podem ter diferentes organizações dimensionais em relação uma à outra (ou seja, ITRs assimétricas), conforme esses termos são definidos no presente documento. Além disso, as ITRs po- dem ser do mesmo ou de diferentes sorotipos. Em algumas modalida- des, um vetor de ceDNA pode compreender sequências ITR que têm uma organização espacial tridimensional simétrica, de modo que sua estrutura tenha a mesma forma no espaço geométrico ou possua as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D (ou seja, são iguais ou são imagens espelhadas uma em relação à outra). Em algumas modalida- des, uma ITR pode ser de um sorotipo de AAV e a outra ITR pode ser de um sorotipo de AAV diferente.
[0021] Por conseguinte, alguns aspectos da tecnologia no presen- te documento descrita referem-se a um vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgenes incluindo, mas não limitada a, expressão sustentada ou a longo prazo de um transgene, expressão dependente de dose ou titulável de um transgene, ou dosagem repetida de um transgene, em que o vetor de ceDNA compreende sequências de ITR selecionadas a partir de: (i) pelo menos uma WT ITR e pelo menos uma repetição terminal invertida (ITR) AAV modificada (por exemplo, ITRs assimétricas modificadas); (ii) duas ITRs modificadas, em que o par de mod-ITRs tem uma organização espacial tridimensional diferen- te uma da outra (por exemplo, ITRs modificadas assimétricas) ou (iii)
par WT-WT ITR simétrico ou substancialmente simétrico, em que cada WT-ITR tem a mesma organização espacial tridimensional, ou (iv) par de ITRs modificado simétrico ou substancialmente simétrico, em que cada mod-ITR tem a mesma organização espacial tridimensional. Os vetores de ceDNA no presente documento descritos podem ser produ- zidos em células eucarióticas, desse modo, desprovidas de modifica- ções no DNA procariótico e contaminação bacteriana por endotoxina em células de inseto.
[0022] Em algumas modalidades, os métodos e vetores de ceD- NA, conforme descrito no presente documento, permitem uma aborda- gem personalizada de medicina genética, isto é, titulando um aumento no nível da expressão do transgene por administrações de redose de maneira dependente da concentração. Prevê-se que aumentos na ex- pressão do transgene possam ser alcançados de maneira dependente da dose, passo a passo, utilizando administrações de redose, aumen- tando assim o nível de expressão do transgene em uma quantidade definida ou certa em cada administração de redose. Isso permite au- mentos controlados no nível da expressão do transgene de uma ma- neira dependente da dose e pode ser feito de forma incremental. Por conseguinte, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais de 6 redoses de uma quantida- de definida de ceDNA podem ser administradas para aumentar o nível de expressão do transgene em uma quantidade definida a cada vez, para atingir um nível desejado ou uma faixa de nível de expressão de- sejada, que é maior que o nível de expressão alcançado com a admi- nistração precedente ou antes dessa administração de redose.
[0023] Por conseguinte, em algumas modalidades, Um método para regular a expressão de um transgene em um hospedeiro com- preendendo: (i) administrar uma quantidade suficiente de um vetor de ceDNA conforme descrito neste documento que compreende um cas- sete de ácido nucleico que contém pelo menos um transgene operaci-
onalmente ligado a um promotor entre repetições terminais invertidas (ITRs) de flanqueamento, ao hospedeiro para expressar níveis mensu- ráveis do transgene, em que o transgene codifica uma proteína dese- jada; e (ii) administrar pelo menos uma segunda dose do vetor de ce- DNA compreendendo o pelo menos um transgene ou um transgene modificado entre ITRs de flanqueamento para (i) continuar a expres- são da proteína desejada em um nível predeterminado por um tempo predeterminado ou (ii) modular expressão da proteína desejada para um nível predeterminado, em que a segunda administração do vetor de ceDNA não gera uma reação imune que impede a expressão da proteína desejada.
[0024] Um aspecto da tecnologia no presente documento descrita refere-se ao uso de um vetor de ceDNA em um método para sustentar um nível desejado de expressão de um transgene em uma célula, mé- todo que compreende: (a) administrar a uma célula em um primeiro momento uma primeira dose de um vetor de ceDNA para obter a ex- pressão de um transgene a partir do vetor de ceDNA; e (b) administrar à célula em um segundo momento outra dose do mesmo ou de um vetor de ceDNA diferente para aumentar o nível de expressão do transgene para um nível desejado, ou para compensar qualquer dimi- nuição no nível de expressão do transgene após a administração inici- al do vetor de ceDNA. Será apreciado que tais aumentos incrementais na expressão do transgene permitem a titulação da dosagem em um sujeito até um nível desejado para esse sujeito. Em algumas modali- dades, o uso de um vetor de ceDNA em um método para sustentar o nível de expressão de um transgene em uma célula expressa o trans- gene em um nível de expressão desejado por pelo menos 42 dias. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA expressa o transgene em um nível de expressão desejado por pelo menos 84 dias. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA expressa o transgene em um nível de expressão desejado por pelo menos 132 dias.
[0025] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA usado nos métodos no presente documento descritos, por exemplo, em um mé- todo para sustentar a expressão de um transgene em uma célula e/ou para tratar um sujeito com uma doença, é administrado em combina- ção com um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou excipiente. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA é administrado em um segundo momento, é administrado por pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias ou entre 60 a 90 dias, ou entre 90 a 120 dias, ou entre cerca de 3 a 6 meses, ou entre 6 a 12 meses, ou entre 1 a 2 anos ou 2 a 3 anos após o primeiro momento.
[0026] Além da administração de redose de um vetor de ceDNA para simplesmente aumentar o nível de expressão do transgene se os níveis de expressão tiverem diminuído ao longo do tempo (por exem- plo, para continuar a expressão do transgene em um nível predetermi- nado desejado), em algumas modalidades, os métodos e composições de readministração de um vetor de ceDNA podem aumentar o nível de transgene de maneira dependente da dose - isto é, uma administração de redose de uma quantidade definida de um vetor de ceDNA pode afetar um aumento definido no nível de expressão de um transgene. Dito de forma diferente e usando unidades arbitrárias apenas para fins ilustrativos, uma dose de 1 unidade do ceDNA em uma administração de redose alcançará um aumento de 10% no nível de expressão do transgene em relação a um nível precedente e uma dose de 2 unida- des do vetor de cDNA atingirá um aumento de 20% no nível do trans- gene a partir de um nível precedente e uma dose unitária de 0,5 do ceDNA alcançará um aumento de 5% no nível de expressão do trans- gene a partir de um nível precedente.
[0027] Por conseguinte, em uma modalidade, um vetor de ceDNA como no presente documento descrito para expressão controlada de transgene pode ser usado para aumentar o nível de expressão de um transgene em uma célula ou um sujeito de uma maneira controlada. Por exemplo, o nível de expressão do transgene pode ser aumentado com uma ou mais administrações subsequentes (por exemplo, uma administração de redose ou de reforço) do vetor de ceDNA.
[0028] Outro aspecto da tecnologia no presente documento se re- laciona com um método para aumentar a expressão de um transgene em uma célula, por exemplo, para aumentar o nível de expressão de um transgene acima de um nível de expressão precedente que foi al- cançado com uma administração prévia de ceDNA, o método compre- endendo: (a) administrar a uma célula em um primeiro momento, uma dose de preparação de um vetor de ceDNA para obter a expressão de um transgene; e (b) administrar à célula em um segundo momento, uma dose de um vetor de ceDNA para aumentar o nível de expressão do transgene em comparação com o nível de expressão do transgene alcançado após a administração do vetor de ceDNA no primeiro mo- mento, ou para aumentar o nível de expressão do transgene para atin- gir um nível de expressão desejado.
[0029] Em todos os aspectos no presente documento descritos, um vetor de ceDNA é administrado a qualquer momento (por exemplo, um primeiro, segundo, terceiro momento etc.) é administrado em com- binação com um carreador farmaceuticamente aceitável e pode ser opcionalmente administrado com um carreador, por exemplo, uma par- tícula, lipossoma ou nanopartícula lipídica (LNP). Em todos os aspec- tos deste documento, um vetor de ceDNA administrado em qualquer um dos: o primeiro, o segundo ou qualquer momento subsequente, é administrado em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0030] Em todos os aspectos no presente documento descritos, um vetor de ceDNA usado nos métodos para expressão controlada de transgene, como descrito no presente documento, por exemplo, em um método para sustentar a expressão de um transgene, ou para um aumento controlado na expressão do transgene, ou para uma expres- são dependente de dose do transgene e/ou para tratar um sujeito com uma doença, o vetor de ceDNA administrado em qualquer um dos: o primeiro, o segundo ou qualquer momento subsequente, é administra- do em combinação com um carreador e/ou excipiente farmaceutica- mente aceitável.
[0031] Em algumas modalidades, onde mais de uma administra- ção do ceDNA é administrada (por exemplo, em um segundo ou qual- quer momento subsequente), o segundo momento ou qualquer mo- mento subsequente é de pelo menos 10 dias ou entre 10 a 30 dias, ou pelo menos 30 dias, ou entre 30 a 60 dias, pelo menos 60 dias, ou en- tre 60 a 90 dias, ou entre 90 a 120 dias, ou entre cerca de 3-6 meses, ou entre 6 a 12 meses, ou pelo menos um ano, após a administração do vetor de ceDNA no primeiro momento ou no momento precedente.
[0032] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA administra- do no primeiro, segundo ou em qualquer momento subsequente é o mesmo vetor de ceDNA compreendendo o mesmo transgene ou um transgene modificado e, em modalidades alternativas, um vetor de ce- DNA administrado no primeiro, segundo ou qualquer momento subse- quente é um vetor de ceDNA diferente compreendendo o mesmo transgene ou um transgene modificado, por exemplo, um vetor de ce- DNA diferente com um promotor diferente operacionalmente ligado ao mesmo transgene ou a um transgene modificado. Em algumas moda- lidades, o promotor é um promotor induzível ou repressível. O trans- gene também pode ser parte de uma chave reguladora, conforme des- crito neste documento.
[0033] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA usado nos métodos no presente documento descritos para expressão controlada de transgene, o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou em qualquer momento subsequente é o mesmo vetor de ceDNA com- preendendo o mesmo transgene ou um transgene modificado. Em modalidades alternativas, o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou em qualquer outro momento subsequente é um vetor de ceDNA diferente compreendendo o mesmo transgene ou um transge- ne modificado, por exemplo, mas não limitado a, onde o vetor de ceD- NA diferente tem um promotor diferente operacionalmente ligado ao mesmo transgene, ou a um transgene modificado, ou a um transgene diferente. Apenas para fins ilustrativos, um vetor de ceDNA adminis- trado no primeiro momento pode compreender um transgene e um primeiro promotor ou interruptor regulador, e um ceDNA administrado em um segundo momento ou subsequente pode compreender o mes- mo ou um transgene modificado e um segundo promotor ou interruptor regulador, onde o primeiro e o segundo promotores (ou chaves regu- ladoras) são promotores diferentes ou chaves reguladoras diferentes. Chaves reguladoras exemplares são definidas no presente documen- to.
[0034] Em algumas modalidades, o uso do vetor de ceDNA nos métodos para expressão controlada de transgene, conforme descrito no presente documento, por exemplo, em um método para sustentar a expressão de um transgene, ou para um aumento controlado na ex- pressão do transgene, ou para uma expressão dependente da dose do transgene e/ou para tratar um sujeito com uma doença, pode opcio- nalmente compreender uma etapa de administração à célula, em um ou mais momentos após o segundo momento, uma dose adicional do vetor de ceDNA para aumentar o nível de expressão do transgene em comparação com o nível de expressão do transgene alcançado após a administração do vetor de ceDNA no segundo momento ou momento precedente, ou para aumentar o nível de expressão do transgene para manter um nível de expressão sustentado desejado, em que a compo- sição administrada em um ou mais momentos após o segundo mo- mento compreende um vetor de ceDNA como no presente documento descrito.
[0035] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA útil nos méto- dos no presente documento descritos para a expressão controlada de transgene permite a expressão do transgene em uma quantidade tera- peuticamente eficaz.
[0036] Em algumas modalidades, o aumento da dose predetermi- nada do vetor de ceDNA administrado em um segundo momento, ou em qualquer momento subsequente, aumenta o nível de expressão do transgene na célula e/ou sujeito. Em algumas modalidades, uma dose predeterminada de um vetor de ceDNA administrada à célula ou sujei- to no segundo momento, ou momento subsequente, é determinada usando uma relação dependente da dose para o vetor de ceDNA para atingir o nível de expressão desejado do transgene na célula ou sujei- to.
[0037] Em algumas modalidades, uma dose predeterminada do vetor de ceDNA administrada no segundo ou em qualquer outro mo- mento, está em uma quantidade que está entre 2 e 10 vezes a dose do vetor de ceDNA administrada no primeiro momento. Em algumas modalidades, uma dose predeterminada do vetor de ceDNA adminis- trada no segundo ou em qualquer outro momento está em uma quan- tidade que aumenta a expressão do transgene em pelo menos 3 ve- zes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou entre 2 a 15 vezes ou entre 2 a 20 vezes, ou mais de 20 vezes em comparação com a expressão do transgene alcançada após a administração do ceDNA no primeiro momento ou no momento precedente. Em algumas modalidades, o nível de expressão desejado de transgene alcançado após a administração da composição em um ou mais momentos após o segundo momento é uma quantidade terapeuticamente eficaz do transgene.
[0038] Aspectos da invenção referem-se a métodos para produzir um vetor de ceDNA usado nos métodos para expressão controlada de transgene, como descrito no presente documento, por exemplo, em um método para sustentar a expressão de um transgene, ou para um aumento controlado na expressão do transgene, ou para uma expres- são dependente da dose do transgene e/ou para tratar um sujeito com uma doença. Em todos os aspectos, o vetor de DNA não viral sem capsídeo (vetor de ceDNA) para expressão controlada de transgene é obtido a partir de um plasmídeo (denominado neste documento "ceD- NA-plasmídeo") que compreende um modelo de construto de expres- são de polinucleotídeo que compreende, nessa ordem: uma primeira repetição terminal invertida 5' (por exemplo, ITR de AAV); uma se- quência heteróloga de ácido nucleico; e uma ITR 3' (por exemplo, ITR de AAV), em que a ITR 5' e a ITR 3' podem ser assimétricas entre si, ou simétricas (por exemplo, WT-ITRs ou ITRs simétricas modificadas), conforme no presente documento definido.
[0039] Um vetor de ceDNA útil nos métodos para expressão con- trolada de transgene como descrito no presente documento (por exemplo, em um método para sustentar os níveis de expressão de um transgene e/ou para um aumento controlado no nível de expressão de transgene ou para uma expressão de transgene dependente da dose) é obtida por um número de meios que seriam conhecidos do versado na técnica depois de ler esta invenção. Por exemplo, um modelo de construto de expressão de polinucleotídeo usado para gerar os vetores de ceDNA da presente invenção pode ser um ceDNA-plasmídeo (por exemplo, consulte a Figura 4B), um ceDNA-bacmídeo e/ou um ceD- NA-baculovírus. Em uma modalidade, o ceDNA-plasmídeo compreen- de um local de clonagem de restrição (por exemplo, SEQ ID NO: 123 e/ou 124 operacionalmente posicionado entre as ITRs onde um casse- te de expressão que compreende, por exemplo, um promotor operaci- onalmente ligado a um transgene, por exemplo, um gene repórter e/ou um gene terapêutico) pode ser inserido. Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA são produzidos a partir de um modelo de polinucle- otídeo (por exemplo, ceDNA-plasmídeo, ceDNA-bacmídeo, ceDNA- baculovírus) contendo ITRs simétricas ou assimétricas (ITRs modifica- das ou WT).
[0040] Em uma célula hospedeira permissiva, na presença de, por exemplo, Rep, o molde polinucleotídico que tem pelo menos duas ITRs se replica para produzir vetores de ceDNA. A produção do vetor de ceDNA passa por duas etapas: primeiro, excisão ("resgate") do modelo da cadeia principal de modelo (por exemplo, ceDNA- plasmídeo, ceDNA-bacmídeo, genoma de ceDNA-baculovírus etc.) por meio de proteínas Rep e, segundo, replicação mediada por Rep do vetor de ceDNA excisado. As proteínas Rep e os locais de ligação a Rep dos vários sorotipos de AAV são bem conhecidos dos versados na técnica. Um especialista na técnica entende que deve escolher uma proteína Rep a partir de um sorotipo que se liga e replica a sequência de ácidos nucleicos com base em pelo menos uma ITR funcional. Por exemplo, se a ITR competente para replicação for do sorotipo 2 do AAV, o representante correspondente seria de um sorotipo AAV que funcione com esse sorotipo, como o AAV2 ITR com AAV2 ou AAV4 Rep, mas não o AAV5 Rep, que não. Após a replicação, o vetor de ceDNA covalentemente fechado continua a se acumular nas células permissivas e o vetor de ceDNA é, de preferência, suficientemente es- tável ao longo do tempo na presença da proteína Rep sob condições padrão de replicação, por exemplo, para se acumular em uma quanti- dade que é pelo menos 1 pg/célula, preferencialmente, pelo menos 2 pg/célula, preferencialmente, pelo menos 3 pg/célula, mais preferenci-
almente, pelo menos 4 pg/célula, ainda mais preferencialmente, pelo menos 5 pg/célula.
[0041] Por conseguinte, um aspecto da invenção refere-se a um processo de produção de um vetor de ceDNA útil nos métodos para expressão controlada de transgene, como descrito no presente docu- mento, que compreende as etapas de: a) incubar uma população de células hospedeiras (por exemplo, células de insetos) que abrigam o modelo de construto de expressão de polinucleotídeo (por exemplo, um ceDNA-plasmídeo, um ceDNA-bacmídeo e/ou um ceDNA- baculovírus), desprovido de sequências codificantes do capsídeo viral, na presença de uma proteína Rep em condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas célu- las hospedeiras, e em que as células hospedeiras não compreendem sequências codificantes do capsídeo viral; e b) colher e isolar o vetor de ceDNA das células hospedeiras. A presença da proteína Rep induz a replicação do polinucleotídeo do vetor com uma ITR modificada para produzir o vetor de ceDNA em uma célula hospedeira. No entanto, não são expressas partículas virais (por exemplo, vírions AAV). Portanto, não há limitação de tamanho imposta por vírus.
[0042] A presença do vetor de ceDNA útil para expressão contro- lada do transgene como descrito no presente documento é isolada das células hospedeiras, podendo ser confirmada digerindo o DNA isolado da célula hospedeira com uma enzima de restrição que tem um único local de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisando o material de DNA digerido em géis de desnaturação e de não desnaturação para confirmar a presença de bandas de característica de DNA linear e con- tínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[0043] Em outra modalidade deste aspecto e de todos os outros aspectos no presente documento fornecidos, o transgene expresso de maneira controlada a partir do vetor de ceDNA é transgene terapêuti-
co, por exemplo, uma proteína de interesse, incluindo, mas não se li- mitando a, um receptor, uma toxina, um hormônio, uma enzima ou uma proteína da superfície celular. Em outra modalidade desse aspec- to e todos os outros aspectos no presente documento fornecidos, a proteína de interesse é um receptor. Em outra modalidade desse as- pecto e todos os outros aspectos no presente documento fornecidos, a proteína de interesse é uma enzima. Genes exemplares a serem dire- cionados e proteínas de interesse são descritos em detalhes nos mé- todos de uso e métodos das seções de tratamento deste documento.
[0044] Em algumas modalidades, o presente pedido pode ser defi- nido em qualquer um dos seguintes parágrafos:
[0045] Método para regular a expressão de um transgene em um sujeito que compreende: (a) administrar a um sujeito uma quantidade suficiente de um vetor de DNA (ceDNA) não viral e livre de capsídeo, compreendendo um cassete de ácido nucleico contendo pelo menos um transgene operacionalmente ligado a um promotor entre repetições terminais invertidas (ITRs) de flanqueamento, para expressar um nível mensurável do transgene, em que o transgene codifica uma proteína desejada para tratar uma doença; e (b) titular o vetor de ceDNA admi- nistrando ao sujeito pelo menos uma segunda dose do vetor de ceD- NA compreendendo o pelo menos um transgene entre ITRs de flan- queamento para obter a expressão do transgene da proteína desejada em um nível predeterminado por um tempo predeterminado ou a au- mentar a expressão do transgene da proteína desejada para um nível predeterminado.
[0046] Em algumas modalidades, o sujeito é avaliado em um tem- po predeterminado após a etapa (a), por exemplo, pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias, ou entre 60 a 90 dias ou mais de 90 dias após a etapa (a), para determinar a dose de titulação. Por exemplo, em al- gumas modalidades, o sujeito é avaliado para determinar o estado da doença no sujeito após a etapa (a) e/ou o nível de proteína desejada expresso pelo vetor de ceDNA no sujeito.
Em algumas modalidades, a avaliação do estado da doença é uma avaliação de pelo menos um sintoma da doença no sujeito.
Em algumas modalidades, se o estado da doença do sujeito permaneceu em estado estacionário ou não me- lhorou, ou onde o estado da doença declinou no sujeito, por exemplo, em comparação com o estado da doença no momento da primeira administração do vetor de ceDNA ou a qualquer momento antes da etapa (a), administra-se ao sujeito uma segunda dose do vetor de ce- DNA de acordo com a etapa (b). O estado da doença para qualquer doença pode ser determinado por um médico ou pessoa versada na técnica e inclui a avaliação de um ou mais sintomas clínicos e/ou bio- marcadores da doença, incluindo biomarcadores de proteínas, biomar- cadores de miRNA e mRNA e similares.
Em algumas modalidades, se o nível de expressão de transgene no sujeito tiver declinado de um ní- vel predeterminado ou tiver declinado de uma quantidade terapeutica- mente eficaz, o sujeito recebe uma segunda dose do vetor de ceDNA de acordo com a etapa (b). Em algumas modalidades, o nível da ex- pressão do transgene é determinado medindo o nível do transgene (por exemplo, medindo o nível de proteína ou os níveis de mRNA) ex- presso a partir do vetor de ceDNA em uma amostra biológica obtida do sujeito.
Em algumas modalidades, a amostra biológica é selecionada a partir de uma amostra de sangue, plasma, fluido sinovial, LCR, saliva ou amostra de biópsia de tecido.
Em algumas modalidades, onde o vetor de ceDNA expressa um transgene que codifica uma proteína ou gene terapêutico desejado e uma proteína repórter, o nível do trans- gene pode ser determinado medindo a proteína repórter desejada ex- pressa a partir do vetor de ceDNA in vivo, usando métodos comumen- te conhecidos por pessoas versadas na técnica.
Em algumas modali- dades, a titulação do vetor de ceDNA está determinando o nível de transgene expresso a partir do vetor de ceDNA e administrando uma segunda dose do vetor de ceDNA ao sujeito para ajustar ou modular a expressão do transgene para um nível desejado predeterminado.
[0047] Outro aspecto da tecnologia no presente documento descri- ta refere-se a um método de regular a expressão de um transgene em um sujeito que compreende: (a) administrar uma quantidade suficiente de um vetor de DNA (ceDNA) não viral sem capsídeo, que compreen- de um cassete de ácido nucleico contendo pelo menos um transgene operacionalmente ligado a um promotor entre repetições terminais in- vertidas (ITRs) de flanqueamento ao sujeito para expressar um nível mensurável do transgene, em que o transgene codifica uma proteína desejada; e (b) administrar ao sujeito pelo menos uma segunda dose do vetor de ceDNA que compreende o pelo menos um transgene, ou um transgene modificado, entre ITRs de flanqueamento para (i) conti- nuar a expressão da proteína desejada em um nível predeterminado por um tempo predeterminado ou (ii) modular a expressão da proteína desejada para um nível predeterminado.
[0048] Em todos os aspectos deste documento, a segunda admi- nistração do vetor de ceDNA ao sujeito não gera uma reação imune suficiente para impedir a obtenção do nível de expressão predetermi- nado da proteína desejada.
[0049] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é administra- do ao sujeito na primeira administração, ou uma segunda administra- ção ou qualquer administração subsequente em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0050] Em algumas modalidades, a segunda administração do ve- tor de ceDNA ocorre no momento em que o nível da expressão do transgene diminui de um nível predeterminado desejado, por exemplo, em algumas modalidades, a segunda administração é de pelo menos cerca de 30 dias, ou pelo menos pelo menos cerca de 60 dias ou pelo menos cerca de 90 dias após a primeira administração. Quando mais do que duas doses de vector ceDNA são administrados ao sujeito, ca- da redose (por exemplo, 3ª, 4ª, 5ª, 6ª e redoses subsequentes) são administrados em um momento em que o nível de expressão de trans- gene diminui ou reduz-se de um nível predeterminado desejado alcan- çado a partir da administração precedente, por exemplo, em algumas modalidades, cada readministração é pelo menos cerca de 30 dias, ou pelo menos cerca de 60 dias, ou pelo menos cerca de 90 dias após a administração precedente do vetor de ceDNA.
[0051] Em algumas modalidades, o método compreende adminis- trar pelo menos três ou mais administrações do vetor de ceDNA ao sujeito e, onde pelo menos três administrações do vetor de ceDNA são administradas, nenhuma das administrações gera uma resposta imune ao vetor de ceDNA que impede atingir o nível predeterminado de ex- pressão da proteína desejada.
[0052] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é administra- do ao sujeito em um cronograma periódico, por exemplo, a cada 2 me- ses, a cada 3 meses, a cada 6 meses, a cada 12 meses, a cada 18 meses e similares.
[0053] Em algumas modalidades, a segunda administração é para aumentar o nível de expressão da proteína desejada, por exemplo, prolongar a expressão da proteína desejada em um nível de expres- são predeterminado.
[0054] Em todos os aspectos deste documento, o transgene codi- fica uma proteína terapêutica e o nível de expressão desejado do transgene é uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína tera- pêutica. Em algumas modalidades, o transgene é um medicamento genético selecionado a partir de: um ácido nucleico, um inibidor, peptí- deo ou polipeptídeo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, proteína de fusão, antígeno, antagonista, agonista, molécula de RNAi, etc. Em al-
gumas modalidades, a proteína desejada ou proteína terapêutica é uma proteína inibidora, por exemplo, mas não limitada a, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ou uma proteína de fusão. Em al- gumas modalidades, a proteína ou proteína terapêutica desejada substitui uma proteína ou proteína defeituosa que não está sendo ex- pressa ou sendo expressa em níveis baixos. Em algumas modalida- des, o transgene está sob o controle de uma chave reguladora, con- forme no presente documento definido.
[0055] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um promotor que é um promotor induzível ou repressível.
[0056] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou qualquer momento subsequente é o mesmo tipo de vetor de ceDNA que compreende o mesmo transgene ou um transgene modificado. Por exemplo, dito de maneira diferente, o mes- mo vetor de ceDNA é administrado ao sujeito várias vezes e é compa- rável à administração do mesmo sorotipo do vetor viral a um sujeito várias vezes.
[0057] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA administra- do ao sujeito na segunda administração ou qualquer administração subsequente posteriormente (por exemplo, uma administração de re- dose) tem um promotor diferente operacionalmente ligado ao mesmo transgene ou um transgene modificado, em comparação com o promo- tor no vetor de ceDNA administrado em um momento ou administração precedente.
[0058] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA administra- do na primeira administração, ou segunda administração ou qualquer administração subsequente compreende duas sequências de repeti- ção terminal invertida (ITRs) que são ITRs de AAV e podem ser, por exemplo, AAV-2 ou qualquer ITR selecionada a partir de Tabela 1, ou AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV
11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ, e AAV-DJ8. Em algumas mo- dalidades, pelo menos uma ITR compreende um local de resolução terminal funcional e um local de ligação à Rep. Em algumas modalida- des, as ITRs de flanqueamento em um vetor de ceDNA administrado na primeira administração, ou segunda administração ou qualquer ad- ministração subsequente são simétricas ou substancialmente simétri- cas ou assimétricas, conforme no presente documento definido. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs são do tipo selvagem ou em que ambas as ITRs são do tipo selvagem. Em algumas modali- dades, as ITRs de flanqueamento são de diferentes sorotipos virais. Em algumas modalidades, onde as ITRs de flanqueamento são do tipo selvagem, elas podem ser selecionadas a partir de qualquer sorotipo de AAV, como mostrado na Tabela 1.
[0059] Em algumas modalidades, as ITRs de flanqueamento em um vetor de ceDNA administrado na primeira administração, ou se- gunda administração ou qualquer administração subsequente posteri- ormente podem compreender uma sequência selecionada a partir das sequências nas Tabelas 2, 4A, 4B ou 5 deste documento.
[0060] Em algumas modalidades, pelo menos uma das ITRs em um vetor de ceDNA administrado na primeira administração, ou se- gunda administração ou qualquer administração subsequente é altera- da de uma sequência de ITR de AAV de tipo selvagem por uma dele- ção, adição ou substituição que afeta a geral conformação tridimensio- nal do ITR. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs em um vetor de ceDNA administrado na primeira administração, ou segunda administração ou qualquer administração subsequente a partir de um sorotipo de AAV selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.
[0061] Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs em um vetor de ceDNA administrado na primeira administração, ou segunda administração ou qualquer administração subsequente são sintéticas. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs não são uma ITR do tipo selvagem ou em que as duas ITRs não são do tipo selvagem.
[0062] Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs em um vetor de ceDNA administrado na primeira administração, ou segunda administração ou qualquer administração subsequente posteriormente são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição em pelo menos uma das regiões ITR selecionadas a partir de A, A', B, B', C, C', D e D'. Em algumas modalidades, uma deleção, inserção e/ou substi- tuição resultam na deleção de toda ou parte de uma estrutura de has- te-laço normalmente formada pelas regiões A, A', B, B' C ou C'. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que resulta na deleção de to- da ou parte de uma estrutura de haste-laço normalmente formada pe- las regiões B e B'. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que re- sulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-laço nor- malmente formada pelas regiões C e C'. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que resulta na deleção de parte de uma estrutura de haste-laço normalmente formada pelas regiões B e B' e/ou parte de uma estrutura de haste-laço normalmente formada pelas regiões C e C'. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs compreendem uma única estrutura de haste-laço na região que normalmente com- preende uma primeira estrutura de haste-laço formada pelas regiões B e B' e uma segunda haste estrutura formada pelas regiões C e C'. Em algumas modalidades, uma ou ambas as ITRs compreendem uma haste única e dois laços na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-laço formada pelas regiões B e B' e uma segunda estrutura de haste-laço formada pelas regiões C e C'.
[0063] Em algumas modalidades, ambas as ITRs em um vetor de ceDNA administrado na primeira administração, ou segunda adminis- tração ou qualquer administração subsequente são alteradas de uma maneira que resulta em uma simetria tridimensional geral quando as ITRs são invertidas uma em relação à outra.
[0064] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA administrado na primeira administração ou segunda administração ou qualquer ad- ministração subsequente, portanto, compreende pelo menos uma se- quência heteróloga de nucleotídeo sob controle do pelo menos uma chave reguladora, por exemplo, pelo menos uma chave reguladora é selecionada a partir de uma chave reguladora binária, uma chave re- guladora de pequenas moléculas, uma chave reguladora de código de acesso, uma chave reguladora baseada em ácido nucleico, uma chave reguladora pós-transcricional, uma chave reguladora controlada por radiação ou controlada por ultrassom, uma chave reguladora mediada por hipóxia, uma chave reguladora de resposta inflamatória, uma cha- ve reguladora ativada por cisalhamento e uma chave de destruição. Chaves reguladoras são descritas no presente documento em mais detalhes abaixo.
[0065] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA administra- do na primeira administração, ou segunda administração ou qualquer administração subsequente a seguir é administrado a um sujeito que tem uma doença ou distúrbio selecionado dentre, por exemplo, câncer, doença autoimune, um distúrbio neurodegenerativo, hipercolesterole- mia, rejeição aguda a órgão, esclerose múltipla, osteoporose pós- menopausa, doenças da pele, asma ou hemofilia. Em algumas moda- lidades, um sujeito com câncer tem um tumor sólido, sarcoma de teci- dos moles, linfoma e leucemia. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma doença autoimune, por exemplo, selecionada a partir de artri- te reumatoide e doença de Crohn. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma condição de pele, por exemplo, é selecionada a partir de pso- ríase e dermatite atópica. Em algumas modalidades, o sujeito tem um distúrbio neurodegenerativo, por exemplo, doença de Alzheimer, ALS, doença de Parkinson, doença de Huntington.
[0066] Em algumas modalidades, o método no presente documen- to descrito compreende ainda administrar ao sujeito, em um ou mais momentos após o segundo momento, uma dose do vetor de ceDNA para aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de áci- dos nucleicos (por exemplo, o transgene) em comparação com o nível de expressão do transgene alcançado após a administração do vetor de ceDNA no segundo momento ou momento precedente, ou para aumentar o nível de expressão do transgene para atingir um nível de expressão desejado.
[0067] Em algumas modalidades, uma dose predeterminada do vetor de ceDNA administrada ao sujeito em um segundo ou qualquer momento subsequente, está em uma quantidade que está entre 2 ve- zes e 10 vezes a dose da composição do vetor de ceDNA administra- da no primeiro momento. Em algumas modalidades, uma dose prede- terminada da composição do vetor de ceDNA administrada no segun- do ou em qualquer outro momento, está em uma quantidade que au- menta a expressão do transgene em pelo menos 3 vezes, ou pelo me- nos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou entre 2 a 15 vezes ou 2 a 20 vezes em comparação com o nível de expressão do transgene após administração do vetor de ceDNA no primeiro momento ou administra- ção precedente. Em algumas modalidades, uma dose predeterminada do vetor de ceDNA administrada na segunda administração, ou se- gundo momento, é determinada usando uma relação dependente da dose para o vetor de ceDNA para atingir o nível de expressão deseja- do do transgene na célula.
[0068] Esses e outros aspectos da invenção são descritos em maiores detalhes abaixo.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0069] Modalidades da presente invenção, resumidas brevemente acima e discutidas em mais detalhes abaixo, podem ser entendidas por referência às modalidades ilustrativas da invenção representadas nos desenhos anexos. No entanto, os desenhos anexos ilustram ape- nas modalidades típicas da invenção e, portanto, não devem ser con- siderados limitantes do escopo, pois a invenção pode admitir outras modalidades igualmente eficazes.
[0070] A Figura 1A ilustra uma estrutura exemplar de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene conforme descrito no presente documento, compreendendo ITRs assimétricas. Nessa mo- dalidade, o vetor de ceDNA exemplificativo compreende um cassete de expressão contendo o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberta (ORF) que codifica um transgene pode ser inserido no local de clonagem (R3/R4) entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais in- vertidas (ITRs) - a ITR de AAV2 de tipo selvagem a montante (extre- midade 5') e a ITR modificada a jusante (extremidade 3') do cassete de expressão; portanto, as duas ITRs que flanqueiam o cassete de expressão são assimétricas entre si.
[0071] A Figura 1B ilustra uma estrutura exemplar de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, como no presente documento descrito, compreendendo ITRs assimétricas com um cas- sete de expressão que contém o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberta (ORF) que codifica um transgene pode ser inserido no local de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais in- vertidas (ITRs) - uma ITR modificada a montante (extremidade 5') e uma ITR de tipo selvagem a jusante (extremidade 3') do cassete de expressão.
[0072] A Figura 1C ilustra uma estrutura exemplar de um vetor de ceDNA para produção de anticorpos ou proteínas de fusão, como des- crito no presente documento, compreendendo ITRs assimétricas, com um cassete de expressão contendo um acentuador/promotor, um transgene, um elemento pós-transcricional (WPRE) e um sinal de po- liA. Um quadro de leitura aberta (ORF) permite a inserção de um transgene no local de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais in- vertidas (ITRs) que são assimétricas uma em relação à outra; uma ITR modificada a montante (extremidade 5') e uma ITR modificada a jusan- te (extremidade 3') do cassete de expressão, em que a ITR 5' e a ITR 3' são ambas ITRs modificadas, mas têm modificações diferentes (isto é, as mesmas não têm as mesmas modificações).
[0073] A Figura 1D ilustra uma estrutura exemplar de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, como descrito no presente documento, compreendendo ITRs modificadas simétricas ou ITRs modificadas substancialmente simétricas, conforme no presente documento definido, com um cassete de expressão contendo o promo- tor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberta (ORF) que co- difica o transgene é inserido no local de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repe- tições terminais invertidas modificadas (ITRs), em que a ITR modifica- da 5' e a ITR modificada 3' são simétricas ou substancialmente simé- tricas.
[0074] A Figura 1E ilustra uma estrutura exemplar de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, conforme descrito no presente documento, compreendendo ITRs modificadas simétricas ou ITRs modificadas substancialmente simétricas conforme no presente documento definidas, com um cassete de expressão contendo um acentuador/promotor, um transgene, um elemento pós-transcricional (WPRE) e um sinal poliA. Um quadro de leitura aberta (ORF) permite a inserção de um transgene no local de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas modificadas (ITRs), em que a ITR modificada 5' e a ITR modificada 3' são simétricas ou substancialmente simétricas.
[0075] A Figura 1F ilustra uma estrutura exemplar de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, conforme descrito no presente documento, compreendendo WT-ITRs simétricas ou WT- ITRs substancialmente simétricas, conforme no presente documento definido, com um cassete de expressão contendo o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberta (ORF) que codifica o transgene é inserido no local de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas do tipo selvagem (WT-ITRs), em que a WT-ITR 5' e a WT-ITR 3' são simétricas ou substancialmente simétricas.
[0076] A Figura 1G ilustra uma estrutura exemplar de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, conforme descrito no presente documento, compreendendo ITRs modificadas simétricas ou ITRs modificadas substancialmente simétricas conforme no presente documento definidas, com um cassete de expressão contendo um acentuador/promotor, um transgene, um elemento pós-transcricional (WPRE) e um sinal poliA. Um quadro de leitura aberta (ORF) permite a inserção de um transgene no local de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas do tipo selvagem (WT-ITRs), em que a WT-ITR 5' e a WT-ITR 3' são simétricas ou substancialmente simétricas.
[0077] A Figura 2A fornece a estrutura de alça de haste em forma de T de uma ITR esquerda do tipo selvagem de AAV2 (SEQ ID NO: 52) com a identificação de braço A-A', braço B-B', braço C-C', dois lo-
cais de ligação a Rep (RBE e RBE') e também mostra o local de reso- lução do terminal (trs). O RBE contém uma série de 4 tetrâmeros du- plex que, acredita-se, interagem com o Rep 78 ou o Rep 68. Além dis- so, acredita-se que o RBE' interaja com o complexo Rep montado na ITR de tipo selvagem ou ITR mutada no construto. As regiões D e D' contêm locais de ligação ao fator de transcrição e outra estrutura con- servada. A Figura 2B mostra atividades de corte e cruzamento catali- sadas por Rep propostas em uma ITR esquerda do tipo selvagem (SEQ ID NO: 53), incluindo a estrutura de alça de haste em forma de T da ITR esquerda do tipo selvagem da AAV2 com identificação do bra- ço A-A', o braço B-B', o braço C-C', dois locais de Ligação a Rep (RBE e RBE') e também mostra o local de resolução do terminal (trs) e a re- gião D e D' que compreende vários locais de ligação ao fator de trans- crição e outra estrutura conservada.
[0078] A Figura 3A fornece a estrutura primária (sequência poli- nucleotídica) (esquerda) e a estrutura secundária (direita) das porções contendo RBE do braço A-A' e o braço C-C' e B-B' do tipo selvagem esquerdo ITR AAV2 (SEQ ID NO: 54). A Figura 3B mostra uma se- quência de ITR mutada exemplificativa (também denominada uma ITR modificada) para a ITR esquerda. É mostrada a estrutura primária (es- querda) e a estrutura secundária prevista (direita) da porção RBE do braço A-A', o braço C e o braço B-B' de uma ITR esquerda mutada exemplificativa (ITR-1, esquerda) (SEQ ID NO: 113). A Figura 3C mostra a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária (direi- ta) da porção contendo RBE da alça A-A' e os braços B-B' e C-C' do tipo selvagem de AAV2 ITR direita (SEQ ID NO: 55). A Figura 3D mostra uma ITR modificada à direita exemplificativa. É mostrada a es- trutura primária (esquerda) e a estrutura secundária prevista (direita) da porção RBE do braço A-A', o braço B-B' e o braço C de uma ITR mutante exemplificativa direita (ITR-1, direita) (SEQ ID NO: 114).
Qualquer combinação de ITR esquerda e direita (por exemplo, ITRs de AAV2 ou outro sorotipo viral ou ITR sintético) pode ser usada como no presente documento ensinado. Cada uma das Figuras 3A-3D de se- quências de polinucleotídeos se referem à sequência usada no geno- ma do plasmídeo ou bacmídeo/baculovírus usado para produzir o ce- DNA como no presente documento descrito. Também incluídas em cada uma das Figuras 3A a 3D estão estruturas secundárias de ceD- NA correspondentes inferidas a partir das configurações do vetor de ceDNA no genoma do plasmídeo ou bacmídeo/baculovírus e os valo- res previstos de energia livre de Gibbs.
[0079] A Figura 4A é um esquema que ilustra um processo a montante para produzir células de inseto infectadas com baculovírus (BIICs) que são úteis na produção de um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene, como descrito no presente docu- mento, no processo descrito no esquema na Figura 4B. A Figura 4B é um esquema de um método exemplificativo de produção de ceDNA e a Figura 4C ilustra um método e processo bioquímico para confirmar a produção do vetor de ceDNA. A Figura 4D e a Figura 4E são ilustra- ções esquemáticas que descrevem um processo para identificar a pre- sença de ceDNA no DNA colhido de péletes de células obtidas durante os processos de produção de ceDNA na Figura 4B. A Figura 4D mos- tra bandas esquemáticas esperadas para um ceDNA exemplificativo, deixado sem cortes ou digerido com uma endonuclease de restrição e, em seguida, submetido a eletroforese em um gel nativo ou em um gel desnaturante. O esquema mais à esquerda é um gel nativo e mostra várias bandas sugerindo que, em sua forma duplex e sem cortes, o ceDNA existe em pelo menos estados monoméricos e diméricos, visí- veis como um monômero menor de migração mais rápida e um dímero de migração mais lenta com o dobro do tamanho de o monômero. O segundo esquema da esquerda mostra que quando o ceDNA é corta-
do com uma endonuclease de restrição, as bandas originais desapa- recem e as bandas de migração mais rápida (por exemplo, menores) aparecem, correspondendo aos tamanhos de fragmentos esperados após a clivagem. Sob condições desnaturantes, o DNA duplex original é de fita simples e migra como espécie duas vezes mais que o obser- vado no gel nativo porque as cadeias complementares estão ligadas covalentemente. Assim, no segundo esquema da direita, o ceDNA di- gerido mostra uma distribuição de bandas similar à observada no gel nativo, mas as bandas migram como fragmentos duas vezes o tama- nho de seus equivalentes de gel nativos. O esquema mais à direita mostra que o ceDNA sem cortes em condições de desnaturação migra como um círculo aberto de fita simples e, portanto, as bandas obser- vadas têm o dobro do tamanho daquelas observadas em condições nativas em que o círculo não está aberto. Nessa figura, "kb" é usado para indicar o tamanho relativo das moléculas de nucleotídeo com ba- se, dependendo do contexto, no comprimento da cadeia de nucleotí- deos (por exemplo, para as moléculas de fita simples observadas em condições de desnaturação) ou no número de pares de base (por exemplo, para as moléculas de cadeia dupla observadas em condi- ções nativas). A Figura 4E mostra DNA que tem uma estrutura não contínua. O ceDNA pode ser cortado por uma endonuclease de restri- ção, tendo um único local de reconhecimento no vetor de ceDNA, e gerar dois fragmentos de DNA com tamanhos diferentes (1kb e 2kb) em condições neutras e desnaturantes. A Figura 4E também mostra um ceDNA que tem uma estrutura linear e contínua. O vetor de ceDNA pode ser cortado pela endonuclease de restrição e gerar dois fragmen- tos de DNA que migram como 1kb e 2kb em condições neutras, mas em condições desnaturantes, as fitas permanecem conectadas e pro- duzem cadeias únicas que migram como 2kb e 4kb.
[0080] A Figura 5 é uma imagem exemplificativa de um gel desna-
turante executando exemplos de vetores de ceDNA com (+) ou sem (-) digestão com endonucleases (EcoRI para construto de ceDNA 1 e 2; BamH1 para construtos de ceDNA 3 e 4; SpeI para construtos de ce- DNA 5 e 6 e XhoI para construto de ceDNA 7 e 8). Os construtos 1 a 8 são descritos no Exemplo 1 do Pedido de Patente Internacional PCT PCT/US18/49996, que é incorporado neste documento em sua totali- dade por referência. Os tamanhos das bandas destacadas com um asterisco foram determinados e fornecidos na parte inferior da ima- gem.
[0081] A Figura 6 é um gráfico que mostra o efeito de uma redose (isto é, uma administração de reforço) para aumentar o nível de ex- pressão de um transgene a partir de um vetor de ceDNA que expressa a luciferase presente em uma composição compreendendo um lipos- somo. A expressão da luciferase foi medida após a administração de um vetor de ceDNA como descrito no Exemplo 6 e, em seguida, a re- administração de um vetor de ceDNA produzido a partir do vetor de ceDNA no dia 84 ou 87. A expressão da luciferase foi avaliada e de- tectada nos três grupos até pelo menos 132 dias (o período mais longo avaliado). A Figura 6 mostra que, no dia 80 ou por volta do dia 80, o nível de expressão do transgene em camundongos administrados com 1 mg/kg de vetor de ceDNA na presença de um lipossomo (LNPceD- NA) diminui ligeiramente. A readministração de um vetor de ceDNA na presença de um lipossoma no dia 84 ou no dia 87 pode ser usada para continuar a expressão do transgene a um nível predeterminado dese- jado (dados não mostrados) ou aumentar o nível de expressão do transgene do ceDNA para um nível acima do alcançado pela adminis- tração prévia do vetor de ceDNA. É mostrado no presente documento um aumento na expressão em 7 vezes acima do nível de expressão de transgene precedente, administrando-se 3 mg/kg de vetor LNPce- DNA, ou um aumento de 17 vezes no nível de expressão acima do ní-
vel precedente de expressão de transgene, administrando uma com- posição vetorial de LNPceDNA 10 mg/kg.
[0082] A Figura 7 representa os resultados das experiências des- critas no Exemplo 7 e mostra especificamente as imagens IVIS obtidas de camundongos tratados com controle LNP-poliC (camundongo mais à esquerda) e quatro camundongos tratados com LNP-ceDNA- Luciferase (todos, exceto o camundongo mais distante à esquerda). Os quatro camundongos tratados com ceDNA mostram fluorescência significativa na região que contém o fígado do camundongo.
[0083] A Figura 8 representa os resultados da experiência descrita no Exemplo 8. As manchas escuras indicam a presença da proteína resultante do transgene de ceDNA expresso e demonstram associa- ção do LNP-ceDNA administrado com hepatócitos.
[0084] As Figuras 9A a 9B representam os resultados dos estu- dos oculares estabelecidos no Exemplo 9. A Figura 9A mostra ima- gens IVIS representativas dos olhos de rato injetados com JetPEI®- ceDNA-Luciferase (canto superior esquerdo) versus olho não injetado no mesmo rato (canto superior direito) ou olho de rato injetado com DNA de Luciferase-plasmídeo (canto inferior esquerdo) e olho não in- jetado nesse mesmo rato (canto inferior direito). A Figura 9B mostra um gráfico da radiação média observada nos olhos tratados ou nos olhos não tratados correspondentes em cada um dos grupos de trata- mento. Os ratos tratados com ceDNA demonstraram fluorescência significativa (e, portanto, expressão do transgene de luciferase) pro- longada por 99 dias, em nítido contraste com ratos tratados com plas- mídeo-luciferase onde foi observada fluorescência relativa (e, portanto, expressão do transgene de luciferase) mínima.
[0085] As Figuras 10 e 10B representam os resultados do estudo de persistência e redução de ceDNA em camundongos Rag2 descritos no Exemplo 10. A Figura 10A mostra um gráfico do fluxo total ao lon-
go do tempo observado em camundongos c57bl/6 do tipo selvagem tratados com LNP-ceDNA-Luc ou camundongos Rag2. A Figura 10B fornece um gráfico que mostra o impacto da redose nos níveis de ex- pressão do transgene de luciferase em camundongos Rag2, com o aumento da expressão estável resultante observada após a redose (a seta indica o tempo de administração da redose).
[0086] A Figura 11 fornece dados do estudo de expressão de luci- ferase de ceDNA em camundongos tratados descritos no Exemplo 11, mostrando o fluxo total em cada grupo de camundongos durante a du- ração do estudo. Altos níveis de CpG não metilada correlacionaram-se com o fluxo total mais baixo observado nos camundongos ao longo do tempo, enquanto o uso de um promotor específico do fígado correlaci- onou-se com a expressão estável e durável do transgene do vetor de ceDNA por pelo menos 77 dias.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0087] São descritos no presente documento métodos e composi- ções que compreendem novos vetores de DNA sem capsídeo com ex- tremidades fechadas covalentemente (ceDNA) para expressão contro- lada de um transgene, por exemplo, para permitir a expressão susten- tada do transgene desejado em um tempo desejado e por um tempo predeterminado ou para modular expressão do nível de transgene (in- cluindo aumento do nível de expressão) em uma célula, in vivo ou in vitro, e onde o nível de expressão do transgene pode ser aumentado com pelo menos uma (ou seja, uma ou mais) administrações subse- quentes (por exemplo, uma administração de reforço ou redose).
[0088] Um vetor de ceDNA e métodos como no presente docu- mento descritos permitem sustentar o nível de expressão de um trans- gene in vitro e in vivo em uma célula ou indivíduo hospedeiro, ou seja, manter a expressão em um nível desejado ou interromper qualquer deterioração no nível de expressão por pelo menos uma readministra-
ção (no presente documento também referida como uma administra- ção de redose ou reforço) em um momento após a administração inici- al.
[0089] Um vetor de ceDNA e métodos como no presente docu- mento descritos permitem aumentar o nível de expressão de um transgene a partir de um nível precedente in vitro e in vivo, ou seja, aumentar a expressão para, ou acima de, um nível desejado, ou au- mentar o nível de expressão para dentro de uma faixa de expressão desejada, por pelo menos uma readministração (no presente docu- mento também referida como administração de "redose" ou "reforço") em um momento após a administração inicial.
[0090] Ou seja, a expressão do transgene expressa pelo ceDNA pode ser aumentada acima de um nível da administração precedente. Se a administração precedente era uma dose inicial (isto é, uma dose de preparação), então uma administração de redose em um segundo momento pode ser usada para aumentar o nível de expressão do transgene. Da mesma forma, se a administração precedente foi uma segunda administração (ou seja, uma administração de redose), então uma administração de redose adicional pode ser usada para aumentar o nível de expressão do transgene para um nível maior que ou para o nível ou faixa desejado de expressão, do que a administração de re- dose precedente. Portanto, a tecnologia, os métodos e o vetor de ce- DNA, conforme descrito neste documento, podem ser utilizados para aumentar de forma incremental, de maneira controlada, o nível de ex- pressão do transgene para um nível de expressão desejado. Tal au- mento gradual e incremental no nível de expressão do transgene é vantajoso para o tratamento de um sujeito, pois permite titular o nível de expressão do transgene para um indivíduo em particular, com base na necessidade e/ou eficácia do sujeito do vetor de ceDNA e/ou trans- gene expresso (por exemplo, medicina genética) no sujeito, sem o ris-
co de ter que administrar uma dose de preparação alta além do que é realmente necessário e/ou sem as complicações imunológicas associ- adas a outros vetores à base de AAV.
DEFINIÇÕES
[0091] A menos que no presente documento definido de outra for- ma, os termos científicos e técnicos usados em conexão com o pre- sente pedido devem ter os significados que são comumente entendi- dos pelos versados na técnica a que essa invenção pertence. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, pro- tocolos e reagentes específicos, etc., descritos no presente documento e, como tal, podem variar. A terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações. As definições de termos comuns em imunologia e biologia molecular podem ser encontradas no The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19aEdição, publicado por Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6a Edição, publicado por Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, EUA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medi- cine, publicado por Blackwell Science Ltd., 1999 a 2012 (ISBN 9783527600908); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Bio- technology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology de Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y., EUA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Ba- sic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, EUA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frede- rick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; and Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Stro- be, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), cujos conteúdos são incorporados em suas totalida- des a título de referência no presente documento em sua totalidade.
[0092] Como usado no presente documento, os termos "sequência de nucleotídeos heteróloga" e "transgene" são usados de forma inter- cambiável e se referem a um ácido nucleico de interesse (que não seja um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo do capsídeo) que é incorporado e pode ser entregue e expresso por um vetor de ceDNA como no presente documento descrito. Transgenes de interesse inclu- em, mas não estão limitados a, ácidos nucleicos que codificam poli- peptídeos, preferencialmente terapêuticos (por exemplo, para uso mé- dico, diagnóstico ou veterinário) ou polipeptídeos imunogênicos (por exemplo, para vacinas). Em algumas modalidades, ácidos nucleicos de interesse incluem ácidos nucleicos que são transcritos no RNA te- rapêutico. Os transgenes incluídos para uso nos vetores de ceDNA da invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles que expressam ou codificam um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, aptâme- ros, ácidos nucleicos peptídicos, siRNAs, RNAis, miRNAs, lncRNAs, oligo- ou polinucleotídeos antissenso, anticorpos, fragmentos de liga- ção a antígeno ou qualquer combinação dos mesmos. Um transgene pode ser um "medicamento genético" e abrange qualquer um dos se- guintes: inibidor, ácido nucleico, oligonucleotídeo, ácido nucleico silen- ciador, miRNA, RNAi, antagonista, agonista, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo ou fragmentos de anticorpo, proteínas de fusão ou variantes dos mesmos, epítopos, antígenos, aptâmeros, ribossomos e similares. Um transgene no presente documento utilizado no vetor de ceDNA não tem tamanho limitado.
[0093] O termo "medicamento genético", conforme descrito neste documento, refere-se a qualquer estrutura de DNA ou sequência de ácido nucleico que pode ser usada para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um sujeito.
[0094] Como no presente documento usado, os termos "cassete de expressão" e "cassete de transcrição" são usados de forma inter- cambiável e se referem a um trecho linear de ácidos nucleicos que in- clui um transgene que está operacionalmente ligado a um ou mais promotores ou outras sequências reguladoras suficientes para direcio- nar a transcrição do transgene, mas que não compreende sequências que codificam o capsídeo, outras sequências de vetores ou regiões de repetição terminal invertida. Um cassete de expressão pode adicio- nalmente compreender uma ou mais sequências de ação cis (por exemplo, promotores, intensificadores ou repressores), um ou mais íntrons e um ou mais elementos reguladores pós-transcricionais.
[0095] Como usado no presente documento, o termo "repetição terminal" ou "TR" inclui qualquer repetição terminal viral ou sequência sintética que compreende pelo menos uma origem mínima necessária de replicação e uma região que compreende uma estrutura em forma- to de grampo palíndroma. Uma sequência de ligação a Rep ("RBS") (também conhecida como RBE (elemento de ligação a Rep)) e um lo- cal de resolução terminal ("TRS") juntos constituem uma "origem mí- nima necessária de replicação" e, portanto, a TR compreende pelo menos um RBS e pelo menos um TRS. TRs que são o complemento inverso uma da outra dentro de um determinado trecho de sequência polinucleotídica são tipicamente ditos como "repetição terminal inverti- da" ou "ITR". No contexto de um vírus, as ITRs mediam replicação, empacotamento de vírus, integração e resgate de vírus. Como foi inesperadamente constatado na invenção deste documento, as TRs que não são complementos inversos em todo o seu comprimento que ainda podem desempenhar as funções tradicionais das ITRs e, portan- to, o termo ITR é usado no presente documento para se referir a uma TR em um genoma ceDNA ou vetor de ceDNA que tem capacidade de mediar a replicação do vetor de ceDNA. Será entendido por um versa- do na técnica que nas configurações complexas do vetor de ceDNA podem estar presentes mais de duas ITRs ou pares de ITR assimétri- cas. A ITR pode ser uma ITR AAV ou um ITR não AAV ou pode ser derivada de uma ITR AAV ou um ITR não AAV. Por exemplo, a ITR pode ser derivada da família Parvoviridae, que inclui parvovírus e de- pendovírus (por exemplo, parvovírus canino, parvovírus bovino, parvo- vírus de camundongo, parvovírus suíno, parvovírus suíno, parvovírus humano B-19) ou o SV40 em formato de grampo que serve como ori- gem do A replicação do SV40 pode ser usada como uma ITR, que po- de ser modificado ainda mais por truncamento, substituição, exclusão, inserção e/ou adição. Os vírus da família Parvoviridae consistem em duas subfamílias: Parvovirinae, que infectam vertebrados, e Densoviri- nae, que infectam invertebrados. Os dependoparvovírus incluem a fa- mília viral dos vírus adenoassociados (AAV) que têm capacidade de replicação em hospedeiros vertebrados, incluindo, mas não se limitan- do a, espécies humanas, primatas, bovinas, caninas, equinas e ovinas.
[0096] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico", no presente documento usados de forma intercambiável, referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja ribonucleo-
tídeo ou desoxirribonucleotídeo. Assim, este termo inclui DNA ou RNA de fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero que inclui bases de purina e pirimidina ou outras bases naturais, modificadas química ou bioquimicamente, não naturais ou bases nucleotídicas derivatizadas. "Oligonucleotídeo" ge- ralmente refere-se a polinucleotídeos entre cerca de 5 e cerca de 100 nucleotídeos de DNA de fita simples ou dupla. No entanto, para os fins desta invenção, não há limite superior para o comprimento de um oli- gonucleotídeo. Os oligonucleotídeos também são conhecidos como "oligômeros" ou "oligos" e podem ser isolados a partir de genes ou sin- tetizados quimicamente por métodos conhecidos na técnica. Os ter- mos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" devem ser entendidos como incluindo, conforme aplicável às modalidades descritas, polinucleotí- deos de fita simples (como senso ou antissenso) e de fita dupla.
[0097] O termo "construto de ácido nucleico", conforme no presen- te documento usado, refere-se a uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou que é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria, de outro modo, na natureza ou que é sintético. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo "cassete de expressão" quando o construto de ácido nucleico contém as sequências de controle necessárias para a expressão de uma se- quência de codificação da presente invenção. Um "cassete de expres- são" inclui uma sequência de codificação de DNA operacionalmente ligada a um promotor.
[0098] "Hibridizável" ou "complementar" ou "substancialmente complementar" significa que um ácido nucleico (por exemplo, RNA) inclui uma sequência de nucleotídeos que permite a ligação não cova- lente, ou seja, formar pares de bases Watson-Crick e/ou pares de ba- ses G/U, "recozimento" ou "hibridização" com outro ácido nucleico de maneira antiparalela específica de sequência (isto é, um ácido nuclei- co se liga especificamente a um ácido nucleico complementar) sob as condições apropriadas in vitro e/ou in vivo de temperatura e força iôni- ca da solução. Como é conhecido na técnica, o emparelhamento de base padrão Watson-Crick inclui: emparelhamento de adenina (A) com timidina (T), emparelhamento de adenina (A) com uracila (U) e empa- relhamento de guanina (G) com citosina (C). Além disso, também é conhecido na técnica que, para hibridação entre duas moléculas de RNA (por exemplo, dsRNA), pares de bases de guanina (G) com uraci- la (U). Por exemplo, o emparelhamento de bases G/U é parcialmente responsável pela degenerescência (isto é, redundância) do código ge- nético no contexto do emparelhamento de bases anticódon de tRNA com códons no mRNA. No contexto desta invenção, uma guanina (G) de um segmento de ligação a proteínas (dsRNA duplex) de uma molé- cula de RNA alvo de DNA do sujeito é considerada complementar a um uracila (U) e vice-versa. Dessa maneira, quando um par de bases G/U pode ser produzido, em uma determinada posição nucleotídica, um segmento de ligação a proteínas (dsRNA duplex) de uma molécula de RNA alvo do DNA do sujeito, a posição não é considerada não complementar, mas, em vez disso, é considerada complementar.
[0099] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usa- dos no presente documento de forma intercambiável e se referem a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, aminoácidos modificados ou derivados química ou bioquimicamente e polipeptídeos que têm estruturas principais peptídicas modificadas.
[00100] Uma sequência de DNA que "codifica" um determinado produto de gene de RNA ou proteína é uma sequência de ácido nu- cleico de DNA que é transcrita no RNA e/ou proteína em particular. Um polinucleotídeo de DNA pode codificar um RNA (mRNA) que é tra-
duzido em proteína, ou um polinucleotídeo de DNA pode codificar um RNA que não é traduzido em proteína (por exemplo, tRNA, rRNA ou um RNA direcionado a DNA; também chamado de RNA "não codifi- cante" ou "ncRNA").
[00101] Como usado no presente documento, o termo "gene de por- to seguro genômico" ou "gene de porto seguro" refere-se a um gene ou loci em que uma sequência de ácido nucleico pode ser inserida, de modo que a sequência possa se integrar e funcionar de maneira previ- sível (por exemplo, expressar uma proteína de interesse) sem conse- quências negativas significativas para a atividade gênica endógena ou para a promoção do câncer. Em algumas modalidades, um gene de porto seguro também é um loci ou gene em que uma sequência de ácido nucleico inserida pode ser expressada com eficiência e em ní- veis mais altos do que um local de porto não seguro.
[00102] Tal como usado no presente documento, o termo "entrega de genes" significa um processo pelo qual o DNA estranho é transferi- do para células hospedeiras para aplicações de terapia de gene.
[00103] Como usado no presente documento, o termo "repetição terminal" ou "TR" inclui qualquer repetição terminal viral ou sequência sintética que compreende pelo menos uma origem mínima necessária de replicação e uma região que compreende uma estrutura em forma- to de grampo palíndroma. Uma sequência de ligação a Rep ("RBS") (também conhecida como RBE (elemento de ligação a Rep)) e um lo- cal de resolução terminal ("TRS") juntos constituem uma "origem mí- nima necessária de replicação" e, portanto, a TR compreende pelo menos um RBS e pelo menos um TRS. TRs que são o complemento inverso uma da outra dentro de um determinado trecho de sequência polinucleotídica são tipicamente ditos como "repetição terminal inverti- da" ou "ITR". No contexto de um vírus, as ITRs mediam replicação, empacotamento de vírus, integração e resgate de vírus. Como foi inesperadamente constatado na invenção deste documento, as TRs que não são complementos inversos em todo o seu comprimento que ainda podem desempenhar as funções tradicionais das ITRs e, portan- to, o termo ITR é usado no presente documento para se referir a uma TR em um genoma ceDNA ou vetor de ceDNA que tem capacidade de mediar a replicação do vetor de ceDNA. Será entendido por um versa- do na técnica que nas configurações complexas do vetor de ceDNA podem estar presentes mais de duas ITRs ou pares de ITR assimétri- cas. A ITR pode ser uma ITR AAV ou um ITR não AAV ou pode ser derivada de uma ITR AAV ou um ITR não AAV. Por exemplo, a ITR pode ser derivada da família Parvoviridae, que inclui parvovírus e de- pendovírus (por exemplo, parvovírus canino, parvovírus bovino, parvo- vírus de camundongo, parvovírus suíno, parvovírus suíno, parvovírus humano B-19) ou o SV40 em formato de grampo que serve como ori- gem do A replicação do SV40 pode ser usada como uma ITR, que po- de ser modificado ainda mais por truncamento, substituição, exclusão, inserção e/ou adição. Os vírus da família Parvoviridae consistem em duas subfamílias: Parvovirinae, que infectam vertebrados, e Densoviri- nae, que infectam invertebrados. Os dependoparvovírus incluem a fa- mília viral dos vírus adenoassociados (AAV) que têm capacidade de replicação em hospedeiros vertebrados, incluindo, mas não se limitan- do a, espécies humanas, primatas, bovinas, caninas, equinas e ovinas. Por conveniência, neste documento, uma ITR localizada 5' (a montan- te) para uma cassete de expressão em um vetor de ceDNA é dita co- mo "ITR 5'" ou" ITR esquerda" e uma ITR localizada a 3' (a jusante) para um cassete de expressão em um vetor de ceDNA é dito como "ITR 3'" ou "ITR direita".
[00104] Uma "ITR de tipo selvagem" ou "WT-ITR" refere-se à se- quência de uma sequência de ITR de ocorrência natural em um AAV ou outro dependovírus que retém, por exemplo, atividade de ligação a
Rep e capacidade de repicagem. A sequência de nucleotídeos de um WT-ITR de qualquer sorotipo AAV pode variar ligeiramente da se- quência canônica de ocorrência natural devido à degeneração do có- digo genético ou à deriva, e, portanto, as sequências WT-ITR abrangi- das para uso no presente documento incluem sequências WT-ITR co- mo resultado de mudanças ocorridas durante o processo de produção (por exemplo, um erro de replicação).
[00105] Conforme usado no presente documento, o termo "WT- ITRs substancialmente simétricas" ou "par WT-ITR substancialmente simétrico" refere-se a um par de WT-ITRs em um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que são ambas ITRs de tipo selvagem que têm um complemento inverso sequência ao longo de todo o seu com- primento. Por exemplo, uma ITR pode ser considerada uma sequência do tipo selvagem, mesmo que tenha um ou mais nucleotídeos que se desviem da sequência canônica de ocorrência natural, desde que as alterações não afetem as propriedades e a estrutura tridimensional ge- ral de a sequência. Em alguns aspectos, os nucleotídeos divergentes representam alterações conservadoras da sequência. Como um exemplo não limitativo, uma sequência que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência canônica (conforme medido, por exemplo, usando BLAST nas configu- rações padrão) e também tem uma organização espacial tridimensio- nal simétrica para a outra WT-ITR, de modo que suas estruturas 3D tenham a mesma forma no espaço geométrico. A WT-ITR substanci- almente simétrica tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D. Uma WT-ITR substancialmente simétrica pode ser funcionalmente confirmada como WT, determinando que a mesma tem um local de ligação a Rep operacional (RBE ou RBE') e um local de resolução ter- minal (trs) que emparelha com a proteína Rep apropriada. Pode-se opcionalmente testar outras funções, incluindo a expressão do trans-
gene em condições permissivas.
[00106] Conforme usado neste documento, as expressões de "ITR modificada" ou "mod-ITR" ou "ITR mutante" são usadas de forma in- tercambiável e se referem a uma ITR que tem uma mutação em pelo menos um ou mais nucleotídeos em comparação com a WT-ITR do mesmo sorotipo. A mutação pode resultar em uma alteração em uma ou mais das regiões A, C, C', B, B' na ITR e pode resultar em uma al- teração na organização espacial tridimensional (ou seja, sua estrutura 3D no espaço geométrico) em comparação com a organização espa- cial 3D de uma WT-ITR do mesmo sorotipo.
[00107] Conforme usado no presente documento, o termo "ITRs assimétricas" também conhecido como "pares de ITRs assimétricas" refere-se a um par de ITRs em um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que não são complementos inversos em todo o seu com- primento. A diferença na sequência entre as duas ITRs pode ser devi- do a uma adição, deleção, truncamento ou mutação pontual de nucleo- tídeos. Em uma modalidade, uma ITR do par pode ser uma sequência de AAV do tipo selvagem e a outra uma sequência sintética ou não do tipo selvagem. Em outra modalidade, nenhuma ITR do par é uma se- quência de AAV do tipo selvagem e as duas ITRs diferem em sequên- cia uma da outra. Por conveniência, neste documento, uma ITR locali- zada 5' (a montante) para uma cassete de expressão em um vetor de ceDNA é dita como "ITR 5'" ou" ITR esquerda" e uma ITR localizada a 3' (a jusante) para um cassete de expressão em um vetor de ceDNA é dito como "ITR 3'" ou "ITR direita". Como um exemplo não limitativo, um par de ITRs assimétricas não tem uma organização espacial tridi- mensional simétrica à ITR cognata, de modo que suas estruturas 3D tenham formas diferentes no espaço geométrico. Dito de forma dife- rente, um par ITRs assimétricas tem a estrutura geométrica geral dife- rente, ou seja, as mesmas têm organização diferente de suas alças A,
C-C' e B-B' no espaço 3D (por exemplo, uma ITR pode ter um braço C-C' curto e/ou braço B-B' curto em comparação com a ITR cognata). A diferença na sequência entre as duas ITRs pode ser devido a um ou mais dentre adição, exclusão, truncamento ou mutação pontual de nu- cleotídeos. Em uma modalidade, uma ITR do par de ITR assimétrica pode ser uma sequência de ITR AAV de tipo selvagem e a outra ITR uma ITR modificada conforme no presente documento definido (por exemplo, uma sequência de ITR sintética ou de tipo não selvagem). Em outra modalidade, nem as ITRs do par de ITR assimétricas são uma sequência de AAV do tipo selvagem e as duas ITRs são ITRs modificadas que têm formas diferentes no espaço geométrico (isto é, uma estrutura geométrica geral diferente). Em algumas modalidades, uma mod-ITR de um par de ITRs assimétricas pode ter um braço C-C' curto e a outra ITR pode ter uma modificação diferente (por exemplo, um braço único ou um braço B-B' curto etc.), de modo que as mesmas tenham organização espacial tridimensional diferente em comparação com a mod-ITR cognata assimétrica.
[00108] Como usado no presente documento, o termo "ITRs simé- tricas" refere-se a um par de ITRs em um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que são mutados ou modificados em relação às se- quências de ITR dependovirais do tipo selvagem e são complementos inversos em todo o seu comprimento. Nem as ITRs são sequências ITR AAV2 do tipo selvagem (ou seja, são uma ITR modificada, tam- bém conhecida como ITR mutante) e podem ter uma diferença na se- quência da ITR do tipo selvagem devido à adição, exclusão, substitui- ção, truncamento ou nucleotídeo Mutação pontual. Por conveniência, neste documento, uma ITR localizada 5' (a montante) para uma casse- te de expressão em um vetor de ceDNA é dita como "ITR 5'" ou" ITR esquerda" e uma ITR localizada a 3' (a jusante) para um cassete de expressão em um vetor de ceDNA é dito como "ITR 3'" ou "ITR direi-
ta".
[00109] Conforme usado no presente documento, os termos "ITRs modificados substancialmente simétricas" ou "par de ITRs modificadas substancialmente simétricas" refere-se a um par de ITRs modificadas dentro de um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que têm uma sequência de complemento inversa em seu comprimento inteiro. Por exemplo, a ITR modificada pode ser considerada substancialmen- te simétrica, mesmo que tenha algumas sequências nucleotídicas que se desviam da sequência do complemento inverso, desde que as alte- rações não afetem as propriedades e a forma geral. Como um exem- plo não limitativo, uma sequência que tem pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência da sequên- cia canônica (conforme medida usando BLAST nas configurações pa- drão), e também tem uma organização espacial tridimensional simétri- ca à ITR modificada cognata, de modo que suas estruturas 3D tenham a mesma forma no espaço geométrico. Dito de forma diferente, um par ITRs modificadas substancialmente simétricas tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' organizadas no espaço 3D. Em algumas modalidades, as ITRs de um par mod-ITR podem ter diferentes sequências nucleotí- dicas de complemento reverso, mas ainda têm a mesma organização espacial tridimensional simétrica - ou seja, ambas as ITRs têm muta- ções que resultam na mesma forma 3D geral. Por exemplo, uma ITR (por exemplo, ITR 5') em um par mod-ITR pode ser de um sorotipo e a outra ITR (por exemplo, ITR 3') pode ser de um sorotipo diferente, no entanto, ambas podem ter a mesma mutação correspondente (por exemplo, se a ITR 5' tiver uma exclusão na região C, a ITR 3' modifi- cada cognata de um sorotipo diferente tem uma exclusão na posição correspondente na região C'), de modo que o par ITRs modificadas tenha a mesma organização espacial tridimensional simétrica. Em tais modalidades, cada ITR em um par de ITRs modificadas pode ser de diferentes sorotipos (por exemplo, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12), como a combinação de AAV2 e AAV6, com a modificação em uma ITR refletida na posição correspondente na ITR cognata de um sorotipo diferente. Em uma modalidade, um par de ITRs modificadas substancialmente simétricas refere-se a um par de ITRs modificadas (ITRs mod), desde que a diferença nas sequências de nucleotídeos entre as ITRs não afete as propriedades ou a forma geral e tenham substancialmente a mesma forma em 3D espaço. Como um exemplo não limitativo, uma mod-ITR que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a ITR modônica canôni- ca, conforme determinado por meios padrão bem conhecidos na técni- ca, como BLAST (Ferramenta Básica de Alinhamento Local) ou BLASTN nas configurações padrão e também tem uma organização espacial tridimensional simétrica, de modo que sua estrutura 3D tenha a mesma forma no espaço geométrico. Um par de mod-ITRs substan- cialmente simétricas tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D, por exemplo, se uma ITR modificada em um par mod-ITRs subs- tancialmente simétricas tiver uma exclusão de um braço C-C', então, a ITR tem a exclusão correspondente da alça C-C' e também tem uma estrutura 3D similar das demais alças A e B-B' da mesma forma no espaço geométrico do sua mod-ITR cognata.
[00110] O termo "flanqueamento" refere-se a uma posição relativa de uma sequência de ácido nucleico em relação a outra sequência de ácido nucleico. Geralmente, na sequência ABC, B é flanqueada por A e C. O mesmo vale para o arranjo AxBxC. Assim, uma sequência flan- queadora precede ou segue uma sequência flanqueada, mas não pre- cisa ser contígua ou imediatamente adjacente à sequência flanqueada. Em uma modalidade, o termo flanqueamento refere-se a repetições terminais em cada extremidade do vetor de ceDNA linear duplex.
[00111] Como usado no presente documento, o termo "genoma de ceDNA" refere-se a um cassete de expressão que incorpora ainda pelo menos uma região de repetição terminal invertida. Um genoma de ce- DNA pode ainda compreender uma ou mais regiões espaçadoras. Em algumas modalidades, o genoma de ceDNA é incorporado como um polinucleotídeo duplex intermolecular de DNA em um plasmídeo ou genoma viral.
[00112] Como usado no presente documento, o termo "região es- paçadora de ceDNA" refere-se a uma sequência intermediária que se- para elementos funcionais no vetor de ceDNA ou no genoma ceDNA. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA mantêm dois elementos funcionais a uma distância desejada para a funcionali- dade ideal. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ce- DNA fornecem ou aumentam a estabilidade genética do genoma de ceDNA dentro, por exemplo, de um plasmídeo ou baculovírus. Em al- gumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA facilitam a manipulação genética pronta do genoma de ceDNA, fornecendo uma localização conveniente para locais de clonagem e similares. Por exemplo, em certos aspectos, um oligonucleotídeo "poliligante" con- tendo vários locais de endonuclease de restrição ou uma sequência de armação de leitura não aberta projetada para não ter nenhum local de ligação conhecido à proteína (por exemplo, fator de transcrição) pode ser posicionado no genoma do ceDNA para separar o fatores de ação cis, por exemplo, inserção de 6 mer, 12 mer, 18 mer, 24 mer, 48 mer, 86 mer, 176 mer, etc. entre o local de resolução do terminal e o ele- mento regulador da transcrição a montante. Do mesmo modo, o espa- çador pode ser incorporado entre a sequência do sinal de poliadenila- ção e o local de resolução do terminal 3'.
[00113] Como usado no presente documento, os termos "local de ligação a Rep," elemento de ligação a Rep, "RBE" e "RBS" são usados de forma intercambiável e referem-se a um local de ligação para a pro-
teína Rep (por exemplo, AAV Rep 78 ou AAV Rep 68) que, após a li- gação por uma proteína Rep permite que a proteína Rep realize sua atividade de endonuclease específica do local na sequência que incor- pora o RBS. Uma sequência RBS e seu complemento inverso juntos formam um único RBS. As sequências RBS são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60), uma sequência RBS identificada no AAV2. Qualquer sequência RBS conhecida pode ser usada nas modalidades da invenção, incluin- do outras sequências conhecidas de AAV RBS e outras sequências naturalmente conhecidas ou sintéticas de RBS. Sem estar limitado pe- la teoria, pensa-se que o domínio da nuclease de uma proteína Rep se liga à sequência de nucleotídeos duplex GCTC e, portanto, as duas proteínas AAV Rep conhecidas se ligam diretamente e se montam de forma estável no oligonucleotídeo duplex, 5'- (GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3' (SEQ ID NO: 60). Além disso, os conformadores agregados solúveis (isto é, número indefinido de prote- ínas Rep interassociadas) se dissociam e se ligam a oligonucleotídeos que contêm locais de ligação a Rep. Cada proteína Rep interage com as bases nitrogenadas e a estrutura principal de fosfodiéster em cada fita. As interações com as bases nitrogenadas fornecem especificidade de sequência, enquanto as interações com a cadeia principal de fosfo- diéster apresentam especificidade de sequência menor ou nula e es- tabilizam o complexo proteína-DNA.
[00114] Como usado no presente documento, os termos "local de resolução terminal" e "TRS" são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a uma região na qual Rep forma uma ligação tirosina-fosfodiéster com a 5' timidina gerando um 3' OH que serve como substrato para o DNA extensão através de uma poli- merase de DNA celular, por exemplo, DNA pol delta ou DNA pol epsi- lon. Alternativamente, o complexo Rep-timidina pode participar de uma reação de ligação coordenada. Em algumas modalidades, uma TRS abrange minimamente uma timidina não emparelhada com base. Em algumas modalidades, a eficiência de cruzamento da TRS pode ser controlada pelo menos em parte por sua distância dentro da mesma molécula do RBS. Quando o substrato aceitador é a ITR complemen- tar, o produto resultante é um duplex intramolecular. As sequências TRS são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, 5'-GGTTGA- 3' (SEQ ID NO: 61), a sequência hexanucleotídica identificada no AAV2. Qualquer sequência TRS conhecida pode ser usada nas moda- lidades da invenção, incluindo outras sequências TRS de AAV conhe- cidas e outras sequências TRS naturalmente conhecidas ou sintéticas, como AGTT (SEQ ID NO: 62), GGTTGG (SEQ ID NO: 63), AGTTGG (SEQ ID NO: 64), AGTTGA (SEQ ID NO: 65) e outros motivos como RRTTRR (SEQ ID NO: 66).
[00115] Como usado no presente documento, o termo "ceDNA- plasmídeo" refere-se a um plasmídeo que compreende um genoma de ceDNA como um duplex intermolecular.
[00116] Como usado no presente documento, o termo "ceDNA- bacmídeo" refere-se a um genoma de baculovírus infeccioso que com- preende um genoma de ceDNA como um duplex intermolecular que tem capacidade de se propagar em E. coli como um plasmídeo e, por- tanto, pode operar como um vetor shuttle para baculovírus.
[00117] Como usado no presente documento, o termo "ceDNA- baculovírus" refere-se a um baculovírus que compreende um genoma de ceDNA como um duplex intermolecular dentro do genoma de bacu- lovírus.
[00118] Conforme usado no presente documento, os termos "célula de inseto infectada por ceDNA-baculovírus" e "ceDNA-BIIC" são usa- dos de forma intercambiável e se referem a uma célula hospedeira de invertebrado (incluindo, mas não se limitando a, uma célula de inseto
(por exemplo, uma célula Sf9)) com um ceDNA-baculovírus.
[00119] Como no presente documento utilizado, o termo "vetor de DNA com extremidade fechada" refere-se a um vetor de DNA sem capsídeo com pelo menos uma extremidade fechada covalentemente e onde pelo menos parte do vetor tem uma estrutura dúplex intramole- cular.
[00120] Conforme usado no presente documento, os termos "vetor de ceDNA" e "ceDNA" são usados de forma intercambiável e se refe- rem a um vetor de DNA de extremidade fechada que compreende pelo menos um palíndromo terminal. Em algumas modalidades, o ceDNA compreende duas extremidades fechadas covalentemente.
[00121] Conforme definido no presente documento, "repórteres" se referem a proteínas que podem ser usadas para fornecer leituras de- tectáveis. Os repórteres geralmente produzem um sinal mensurável, como fluorescência, cor ou luminescência. As sequências codificado- ras de proteínas repórter codificam proteínas cuja presença na célula ou organismo é facilmente observada. Por exemplo, proteínas fluores- centes fazem com que a célula fique fluorescente quando excitada com luz de um comprimento de onda específico, as luciferases fazem com que a célula catalise uma reação que produz luz, e enzimas como a β-galactosidase convertem um substrato em um produto colorido. Polipeptídeos repórter exemplificativos úteis para fins experimentais ou de diagnóstico incluem, mas não estão limitados a β-lactamase, β- galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina (AP), timidina-quinase (TK), proteína verde fluorescente (GFP) e outras proteínas fluorescentes, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), luciferase e outros bem conheci- dos na técnica.
[00122] Como usado no presente documento, o termo "proteína efe- tora" refere-se a um polipeptídeo que fornece uma leitura detectável, como, por exemplo, um polipeptídeo repórter ou, mais apropriadamen-
te, como um polipeptídeo que mata uma célula, por exemplo, uma to- xina ou um agente que torna uma célula suscetível de matar com um agente escolhido ou a falta do mesmo. As proteínas efetoras incluem qualquer proteína ou peptídeo que atinja ou danifique diretamente o DNA e/ou o RNA da célula hospedeira. Por exemplo, proteínas efeto- ras podem incluir, mas não estão limitadas a uma endonuclease de restrição que tem como alvo uma sequência de DNA da célula hospe- deira (seja genômica ou em um elemento extracromossômico), uma protease que degrada um alvo polipeptídico necessário para a sobre- vivência celular, um inibidor da DNA girase e uma toxina do tipo ribo- nuclease. Em algumas modalidades, a expressão de uma proteína efetora controlada por um circuito biológico sintético, como descrito neste documento, pode participar como um fator em outro circuito bio- lógico sintético, expandindo, assim, a faixa e a complexidade da capa- cidade de resposta de um sistema de circuitos biológicos.
[00123] Os reguladores da transcrição se referem a ativadores e repressores da transcrição que ativam ou reprimem a transcrição de um gene de interesse. Os promotores são regiões de ácido nucleico que iniciam a transcrição de um gene específico. Os ativadores de transcrição geralmente se ligam próximo a promotores de transcrição e recrutam a RNA polimerase para iniciar diretamente a transcrição. Os repressores se ligam aos promotores da transcrição e dificultam este- reotipadamente a iniciação da transcrição pela RNA polimerase. Ou- tros reguladores da transcrição podem servir como ativadores ou re- pressores, dependendo onde os mesmos se ligam e das condições celulares e ambientais. Exemplos não limitativos de classes regulado- ras da transcrição incluem, mas não estão limitados a proteínas de domínio doméstico, proteínas de dedos de zinco, proteínas de hélice alada (cabeça de forquilha) e proteínas de zíper de leucina.
[00124] Como no presente documento utilizado, uma "proteína re-
pressora" ou "proteína indutora" é uma proteína que se liga a um ele- mento de sequência reguladora e reprime ou ativa, respectivamente, a transcrição de sequências operacionalmente ligadas ao elemento de sequência reguladora. As proteínas repressoras e indutoras preferidas, como no presente documento descritas, são sensíveis à presença ou ausência de pelo menos um agente de entrada ou entrada ambiental. As proteínas preferidas como no presente documento descritas são de forma modular, que compreende, por exemplo, elementos ou domínios de ligação separáveis para ligação ao DNA e ligação ao agente de en- trada ou responsivos.
[00125] Como usado neste documento, "carreador" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, veículos, revestimentos, diluen- tes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retar- dadores de absorção, tampões, soluções carreadoras, suspensões, coloides e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composi- ções. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação indesejável tóxica, alérgica ou similar quando administradas a um hospedeiro.
[00126] Como usado no presente documento, um "domínio respon- sivo ao agente de entrada" é um domínio de um fator de transcrição que se liga ou responde a uma condição ou agente de entrada de uma maneira que processe um domínio de fusão de ligação a DNA vincula- do à presença dessa condição ou entrada. Em uma modalidade, a presença da condição ou entrada resulta em uma alteração conforma- cional no domínio responsivo do agente de entrada ou em uma proteí- na à qual o mesmo é fundido, que modifica a atividade de modulação da transcrição do fator de transcrição.
[00127] O termo "in vivo" refere-se a ensaios ou processos que ocorrem em ou dentro de um organismo, como um animal multicelular. Em alguns dos aspectos no presente documento descritos, pode-se dizer que um método ou uso pode ocorrer "in vivo " quando um orga- nismo unicelular, como uma bactéria, é usado. O termo "ex vivo" refe- re-se a métodos e usos que são realizados usando uma célula viva com uma membrana intacta que está fora do corpo de um animal ou planta multicelular, por exemplo, explantes, células cultivadas, incluin- do células primárias e linhas celulares, transformadas linhas celulares e tecido ou células extraídos, incluindo células sanguíneas, entre ou- tros. O termo "in vitro" refere-se a ensaios e métodos que não exigem a presença de uma célula com uma membrana intacta, como extratos celulares, e podem se referir à introdução de um circuito biológico sin- tético programável em um sistema não celular, como um meio que não compreende células ou sistemas celulares, como extratos celulares.
[00128] O termo "promotor", como usado no presente documento, refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico que regula a expres- são de outra sequência de ácido nucleico, conduzindo a transcrição da sequência de ácido nucleico, que pode ser um gene alvo heterólogo que codifica uma proteína ou um RNA. Os promotores podem ser constitutivos, indutíveis, repressíveis, específicos de tecido ou qual- quer combinação dos mesmos. Um promotor é uma região de controle de uma sequência de ácido nucleico na qual são controladas a inicia- ção e a taxa de transcrição do restante de uma sequência de ácido nucleico. Um promotor também pode conter elementos genéticos nos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. Em algumas modalidades dos aspectos no presente documento descritos, um promotor pode di- rigir a expressão de um fator de transcrição que regula a expressão do próprio promotor ou de outro promotor usado em outro componente modular dos circuitos biológicos sintéticos descritos no presente do-
cumento. Dentro da sequência do promotor, será encontrado um local de iniciação da transcrição, bem como os domínios de ligação às pro- teínas responsáveis pela ligação da RNA polimerase. Os promotores eucarióticos contêm frequentemente, mas nem sempre, caixas "TATA" e caixas "CAT". Vários promotores, incluindo promotores induzíveis, podem ser usados para acionar a expressão de transgenes nos veto- res de ceDNA no presente documento descritos. Uma sequência pro- motora pode ser limitada no seu terminal 3' pelo local de iniciação da transcrição e se estende a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do fundo.
[00129] O termo "intensificador", conforme usado no presente do- cumento, refere-se a uma sequência reguladora de ação cis (por exemplo, 50 a 1.500 pares de bases) que liga uma ou mais proteínas (por exemplo, proteínas ativadoras ou fator de transcrição) para au- mentar a ativação transcricional de uma sequência de ácido nucleico. Os intensificadores podem ser posicionados em até 1.000.000 pares de bases a montante do local inicial do gene ou a jusante do local ini- cial do gene que os mesmos regulam. Um intensificador pode ser po- sicionado dentro de uma região intrônica ou na região exônica de um gene não relacionado.
[00130] Pode-se dizer que um promotor direciona a expressão ou conduz a transcrição da sequência de ácido nucleico que o mesmo regula. As expressões "operacionalmente ligada", "operacionalmente posicionada", "operacionalmente ligada", "sob controle" e "sob controle transcricional" indicam que um promotor está em um local funcional correto e/ou orientação em relação a uma sequência de ácido nucleico que regula para controlar a iniciação da transcrição e/ou expressão dessa sequência. Um "promotor invertido", como usado no presente documento, refere-se a um promotor no qual a sequência de ácido nu-
cleico está na orientação reversa, de modo que o que era a cadeia de codificação agora é a fita não codificante e vice-versa. Sequências promotoras invertidas podem ser usadas em várias modalidades para regular o estado de uma chave. Além disso, em várias modalidades, um promotor pode ser usado em conjunto com um intensificador.
[00131] Um promotor pode ser um naturalmente associado a um gene ou sequência, como pode ser obtido isolando as sequências não codificadoras 5' localizadas a montante do segmento de codificação e/ou éxon de um determinado gene ou sequência. Esse promotor pode ser chamado de "endógeno". Da mesma forma, em algumas modali- dades, um intensificador pode ser um naturalmente associado a uma sequência de ácido nucleico, localizada a jusante ou a montante dessa sequência.
[00132] Em algumas modalidades, um segmento de ácido nucleico codificador é posicionado sob o controle de um "promotor recombinan- te" ou "promotor heterólogo", ambos os quais se referem a um promo- tor que normalmente não está associado à sequência de ácido nuclei- co codificada à qual está operacionalmente ligado em seu ambiente natural. Um intensificador recombinante ou heterólogo refere-se a um intensificador que normalmente não está associado a uma dada se- quência de ácido nucleico no seu ambiente natural. Tais promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes; promotores ou intensificadores isolados de qualquer ou- tra célula procariótica, viral ou eucariótica; e promotores ou intensifica- dores sintéticos de "ocorrência não natural", isto é, compreendem dife- rentes elementos de diferentes regiões reguladoras da transcrição e/ou mutações que alteram a expressão por métodos de engenharia genética conhecidos na técnica. Além de produzir sequências de ácido nucleico de promotores e intensificadores sinteticamente, as sequên- cias de promotor podem ser produzidas usando a clonagem recombi-
nante e/ou a tecnologia de amplificação de ácido nucleico, incluindo PCR, em conexão com os circuitos e módulos biológicos sintéticos no presente documento descritos (consulte, por exemplo, Pat. nº U.S.
4.683.202, Patente nº U.S. 5.928.906, cada uma incorporada ao pre- sente documento a título de referência). Além disso, é contemplado que sequências de controle que direcionam a transcrição e/ou expres- são de sequências dentro de organelas não nucleares, como mitocôn- drias, cloroplastos e similares, também podem ser usadas.
[00133] Como no presente documento descrito, um "promotor indu- zível" é aquele que é caracterizado por iniciar ou aprimorar a atividade transcricional quando na presença de, influenciado por ou contatado por um indutor ou agente indutor. Um "indutor" ou "agente indutor", como no presente documento definido, pode ser endógeno, ou um composto ou proteína normalmente exógeno que é administrado de modo a ser ativo na indução de atividade transcricional a partir do promotor indutível. Em algumas modalidades, o indutor ou agente in- dutor, ou seja, um produto químico, um composto ou uma proteína, pode ser o resultado da transcrição ou expressão de uma sequência de ácido nucleico (ou seja, um indutor pode ser uma proteína indutora expressa por outro componente ou módulo), que por si só pode estar sob o controle ou um promotor induzível. Em algumas modalidades, um promotor induzível é induzido na ausência de certos agentes, co- mo um repressor. Exemplos de promotores induzíveis incluem, entre outros, tetraciclina, metalotionina, ecdisona, vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio dos adenovírus; e repetição terminal longa do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV-LTR)) e outros promotores responsivos aos esteroides, promotores responsivos a ra- pamicina e afins.
[00134] Os termos "sequências reguladoras de DNA", "elementos de controle" e "elementos reguladores", usados de forma intercambiá-
vel neste documento, referem-se a sequências de controle transcricio- nais e translacionais, como promotores, intensificadores, sinais de po- liadenilação, terminadores, sinais de degradação de proteínas e simila- res, que fornecem e/ou regulam a transcrição de uma sequência não codificante (por exemplo, RNA alvo de DNA) ou uma sequência de co- dificação (por exemplo, polipeptídeo modificador direcionado ao local ou polipeptídeo Cas9/Csn1) e/ou regulam a tradução de um polipeptí- deo codificado.
[00135] O termo "operativamente ligado" refere-se a uma justaposi- ção em que os componentes descritos estão em um relacionamento que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codifica- ção se o promotor afeta sua transcrição ou expressão. Um "cassete de expressão" inclui uma sequência de DNA exógena que está operacio- nalmente ligada a um promotor ou outra sequência reguladora sufici- ente para direcionar a transcrição do transgene no vetor de ceDNA. Promotores adequados incluem, por exemplo, promotores específicos de tecido. Os promotores também podem ser de origem AAV.
[00136] O termo "sujeito", conforme no presente documento utiliza- do, refere-se a um ser humano ou animal, a quem é fornecido trata- mento, incluindo tratamento profilático, com o vetor de ceDNA de acordo com a presente invenção. Geralmente, o animal é um verte- brado como, mas não limitado a, primata, roedor, animal doméstico ou animal de caça. Os primatas incluem, mas não estão limitados a, chimpanzés, macacos cinomólogos, macacos-aranha e macacos, por exemplo, Rhesus. Os roedores incluem camundongos, ratos, marmo- tas, furões, coelhos e hamsters. Os animais domésticos e de caça in- cluem, entre outros, vacas, cavalos, porcos, veados, bisões, búfalos, espécies felinas, por exemplo, gato doméstico, espécies caninas, por exemplo, cachorro, raposa, lobo, espécies aviárias, por exemplo, fran-
go, ema, avestruz e peixe, por exemplo, truta, peixe-gato e salmão. Em certas modalidades dos aspectos no presente documento descri- tos, o sujeito é um mamífero, por exemplo, um primata ou ser um hu- mano. Um sujeito pode ser homem ou mulher. Além disso, um sujeito pode ser um bebê ou uma criança. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um recém-nascido ou não nascido, por exemplo, o sujeito está no útero. De preferência, o sujeito é um mamífero. O mamífero pode ser um primata humano, não humano, camundongo, rato, ca- chorro, gato, cavalo ou vaca, mas não está limitado a esses exemplos. Outros mamíferos que não humanos podem ser utilizados com vanta- gem como sujeitos que representam modelos animais de doenças e distúrbios. Além disso, os métodos e composições no presente docu- mento descritos podem ser utilizados para animais domesticados e/ou animais de estimação. Um sujeito humano pode ser de qualquer idade, sexo, raça ou grupo étnico, por exemplo, caucasiano (branco), asiáti- co, africano, preto, afro-americano, africano europeu, hispânico, do oriente médio, etc. Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um paciente ou outro sujeito em um ambiente clínico. Em algumas moda- lidades, o sujeito já está em tratamento. Em algumas modalidades, o sujeito é um embrião, um feto, um recém-nascido, uma criança, uma criança, um adolescente ou um adulto. Em algumas modalidades, o sujeito é um feto humano, um neonato humano, uma criança humana, uma criança humana, um adolescente humano ou um adulto humano. Em algumas modalidades, o sujeito é um embrião animal, ou embrião não humano ou embrião de primata não humano. Em algumas modali- dades, o sujeito é um embrião humano.
[00137] Como no presente documento utilizado, o termo "célula hospedeira" inclui qualquer tipo de célula suscetível à transformação, transfecção, transdução e afins com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão de ceDNA da presente invenção. Como exemplos não limitativos, uma célula hospedeira pode ser uma célula primária isolada, células-tronco pluripotentes, células CD34+), células-tronco pluripotentes induzidas ou qualquer uma de várias linhas celulares imortalizadas (por exemplo, células HepG2). Alternativamente, uma célula hospedeira pode ser uma célula in situ ou in vivo em um tecido, órgão ou organismo.
[00138] O termo "exógeno" refere-se a uma substância presente em uma célula que não seja a sua fonte nativa. O termo "exógeno", quan- do usado no presente documento, pode se referir a um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo) ou um polipeptídeo que foi introduzido por um processo que envolve a mão do homem em um sistema biológico, como uma célula ou organismo em que normalmente não é encontrado e se deseja introduzir o ácido nucleico ou polipeptídeo em uma célula ou organismo. Alternativamen- te, "exógeno" pode se referir a um ácido nucleico ou um polipeptídeo que foi introduzido por um processo que envolve a mão do homem em um sistema biológico, como uma célula ou organismo em que é encon- trado em quantidades relativamente baixas e se deseja aumentar a quantidade do ácido nucleico ou polipeptídeo na célula ou organismo, por exemplo, para criar expressão ou níveis ectópicos. Em contraste, o termo "endógeno" refere-se a uma substância que é nativo ao sistema biológico ou célula.
[00139] O termo "identidade de sequência" refere-se à relação entre duas sequências de nucleotídeos. Para os fins da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências desoxirribo- nucleotídicas é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), conforme implementado no pro- grama Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecu- lar Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferenci- almente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais utilizados são penalidade de abertura de folga de 10, penalidade de extensão de folga de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUC4.4). A saída da agulha denominada "identidade mais longa" (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada da seguinte forma: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de La- cunas no Alinhamento). O comprimento do alinhamento é preferenci- almente pelo menos 10 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 25 nucleotídeos mais preferidos pelo menos 50 nucleotídeos e mais preferencialmente pelo menos 100 nucleotídeos.
[00140] O termo "homologia" ou "homólogo", conforme usado no presente documento, é definido como a porcentagem de resíduos de nucleotídeos que são idênticos aos resíduos de nucleotídeos na se- quência correspondente no cromossomo alvo, depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcen- tagem máxima de identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de homologia de sequência de nu- cleotídeos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, usando software de computa- dor disponível publicamente, como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 ou Megalign (DNASTAR). Os versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para as sequências de ali- nhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Em algumas modalidades, uma sequência de áci- do nucleico (por exemplo, sequência de DNA), por exemplo, um braço de homologia, é considerada "homóloga" quando a sequência é de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me- nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais, idêntico à sequência de ácido nucleico nativa ou não editada correspondente (por exemplo, sequência genômica) da célula hospedeira.
[00141] O termo "heterólogo", como no presente documento utiliza- do, significa uma sequência nucleotídica ou polipeptídica que não é encontrada no ácido nucleico ou proteína nativa, respectivamente. Uma sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser ligada a uma sequência de ácido nucleico de ocorrência natural (ou uma variante da mesma) (por exemplo, por modificação genética) para gerar uma se- quência de nucleotídeo quimérica que codifica um polipeptídeo quimé- rico. Uma sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser ligada a um polipeptídeo variante (por exemplo, por modificação genética) para gerar uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo variante de fusão.
[00142] Um "vetor" ou "vetor de expressão" é um replicon, como plasmídeo, bacmídeo, fago, vírus, vírion ou cosmídeo, ao qual outro segmento de DNA, isto é, um "inserto", pode ser anexado para provo- car a replicação do segmento anexado em uma célula. Um vetor pode ser um construto de ácido nucleico projetado para entrega a uma célu- la hospedeira ou para transferência entre diferentes células hospedei- ras. Como usado no presente documento, um vetor pode ser viral ou não viral na origem e/ou na forma final; no entanto, para os fins da presente invenção, um "vetor" geralmente se refere a um vetor de ce- DNA, pois esse termo é usado no presente documento. O termo "ve- tor" abrange qualquer elemento genético que tenha capacidade de re- plicação quando associado aos elementos de controle adequados e que possa transferir sequências de genes para as células. Em algu- mas modalidades, um vetor pode ser um vetor de expressão ou vetor recombinante.
[00143] Como no presente documento utilizado, o termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor que direciona a expressão de um RNA ou polipeptídeo a partir de sequências ligadas a sequências regu- ladoras da transcrição no vetor. As sequências expressas serão fre- quentemente, mas não necessariamente, heterólogas para a célula. Um vetor de expressão pode compreender elementos adicionais, por exemplo, o vetor de expressão pode ter dois sistemas de replicação, permitindo que seja mantido em dois organismos, por exemplo, em células humanas para expressão e em um hospedeiro procariótico pa- ra clonagem e amplificação. O termo "expressão" refere-se aos pro- cessos celulares envolvidos na produção de RNA e proteínas e, quan- do apropriado, proteínas secretoras, incluindo onde aplicável, mas não limitado a, por exemplo, transcrição, processamento de transcrição, tradução e dobragem de proteínas, modificação e processamento. "Produtos de expressão" incluem RNA transcrito de um gene e poli- peptídeos obtidos por tradução de mRNA transcrito de um gene. O termo "gene" significa a sequência de ácido nucleico que é transcrita (DNA) para RNA in vitro ou in vivo quando ligada operacionalmente a sequências reguladoras apropriadas. O gene pode ou não incluir regi- ões que precedem e seguem a região de codificação, por exemplo, sequências 5' não traduzidas (UTR 5') ou "líder" e sequências UTR 3' ou "trailer", bem como sequências intermediárias (íntrons) entre indiví- duos segmentos de codificação (éxons).
[00144] Por "vetor recombinante" entende-se um vetor que inclui uma sequência de ácido nucleico heteróloga, ou "transgene" que tem capacidade de expressão in vivo. Deve ser entendido que os vetores no presente documento descritos podem, em algumas modalidades, ser combinados com outras composições e terapias adequadas. Em algumas modalidades, o vetor é epissomal. O uso de um vetor epis- somal adequado fornece um meio de manter o nucleotídeo de interes- se no sujeito em um DNA cromossômico extra com alto número de có-
pias, eliminando, desse modo, possíveis efeitos potenciais da integra- ção cromossômica.
[00145] A frase "doença genética", como no presente documento utilizada, refere-se a uma doença, parcial ou completamente, direta ou indiretamente, causada por uma ou mais anormalidades no genoma, especialmente uma condição presente desde o nascimento. A anorma- lidade pode ser uma mutação, uma inserção ou uma exclusão. A anormalidade pode afetar a sequência de codificação do gene ou sua sequência reguladora. A doença genética pode ser, sem limitação, DMD, hemofilia, fibrose cística, coreia de Huntington, hipercolestero- lemia familiar (defeito do receptor de LDL), hepatoblastoma, doença de Wilson, porfiria hepática congênita, distúrbios hereditários do metabo- lismo hepático, síndrome de Lesch Nyhan, anemia falciforme, talas- semias, xeroderma pigmentoso, anemia de Fanconi, retinite pigmento- sa, ataxia telangiectasia, síndrome de Bloom, retinoblastoma e doença de Tay-Sachs.
[00146] O termo "biomarcador", conforme no presente documento utilizado, significa qualquer característica ou composição testável que possa ser usada para identificar uma condição (por exemplo, uma do- ença) ou a situação de uma condição (por exemplo, estado da doença) do sujeito ou de uma amostra. Um biomarcador pode, em alguns exemplos no presente documento descritos, ser um gene cujas carac- terísticas de expressão podem ser usadas para identificar uma condi- ção ou situação de uma condição em um sujeito ou amostra. Em ou- tros exemplos, um biomarcador pode ser um produto genético. Em al- gumas modalidades, o termo "biomarcador" refere-se a um polipeptí- deo expresso endogenamente em um indivíduo ou encontrado ou reti- do em uma amostra biológica de um indivíduo.
[00147] Por "produto genético" entende-se uma transcrição (por exemplo, mRNA), ácido nucleico (por exemplo, miRNA) ou proteína.
Assim, no presente documento descritos são biomarcadores cuja pre- sença, ausência ou quantidade relativa pode ser usada para identificar uma condição ou situação de uma condição em um sujeito ou amostra.
Em um exemplo específico, um biomarcador pode ser um produto ge- nético cuja presença ou ausência em um sujeito é característica de um sujeito ter ou não ter uma doença neurodegenerativa específica, com um risco específico de desenvolver uma doença (por exemplo, uma doença neurodegenerativa), ou estar em um estágio específico da do- ença.
Ainda em outro exemplo, um biomarcador pode ser um produto genético cujo aumento ou diminuição indica um estado de doença es- pecífico, um risco específico para o desenvolvimento de uma doença ou um estágio específico da doença.
Em outro exemplo, um biomarca- dor pode ser um grupo de vários produtos genéticos, cuja presença ou ausência é indicativa de um sujeito ter ou não ter uma doença especí- fica, com um risco específico de desenvolver uma doença ou estar em um estágio específico de doença.
Em um exemplo adicional, um bio- marcador pode ser um grupo de produtos gênicos cujo padrão de ex- pressão crescente e decrescente caracteriza uma doença específica ou a falta dela.
Além disso, um biomarcador pode ser um produto ge- nético ou um grupo de produtos genéticos cujo padrão de expressão é característico da presença ou ausência de uma doença, ou um prog- nóstico ou resultado específico de uma doença.
Como usado no pre- sente documento, um biomarcador pode ser um substituto para outros testes clínicos.
Os biomarcadores no presente documento identifica- dos podem ser medidos para determinar níveis, expressão, atividade ou detectar variantes.
Como usado ao longo da detecção de níveis de expressão ou atividade, é entendido que isso pode refletir variantes de um determinado biomarcador.
As variantes incluem variantes de ami- noácidos ou ácidos nucleicos ou variantes pós-traducionais modifica- das.
[00148] O termo "amostra biológica", como no presente documento utilizado, refere-se a uma célula ou população de células ou a uma quantidade de tecido ou fluido de um sujeito.
Na maioria das vezes, a amostra foi removida de um sujeito, mas o termo "amostra biológica" também pode se referir a células ou tecidos analisados in vivo, ou se- ja, sem remoção do sujeito.
Frequentemente, uma "amostra biológica" conterá células do sujeito, mas o termo também pode se referir a ma- terial biológico não celular, como frações não celulares de sangue, sa- liva ou urina, que podem ser usadas para medir a expressão gênica ou níveis de expressão de proteínas.
As amostras biológicas incluem, en- tre outras, biópsias de tecidos, arranhões (por exemplo, arranhões bu- cais), sangue total, plasma, soro, urina, saliva, cultura celular ou líqui- do cefalorraquidiano.
As amostras biológicas também incluem biópsias de tecidos, cultura de células.
Uma amostra biológica ou amostra de tecido pode se referir a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um indivíduo, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, sangue, plasma, soro, biópsia de tumor, urina, fezes, escarro, fluido espinhal, líquido pleural, aspirados de mamilo, líquido linfático, seções externas da pele, vias respiratórias, intestinais e geniturinárias, lágrimas, saliva, leite, células (incluindo, mas não limitadas a células sanguíneas), tu- mores, órgãos e também amostras de cultura celular in vitro constituin- te.
Em algumas modalidades, a amostra é de uma ressecção, biópsia broncoscópica ou biópsia com agulha central de um tumor primário ou metastático ou um bloqueio celular do fluido pleural.
Além disso, são utilizadas amostras de aspirado com agulha fina.
As amostras podem ser tecido embebido em parafina ou tecido congelado.
A amostra pode ser obtida removendo uma amostra de células de um sujeito, mas também pode ser realizada usando células previamente isoladas (por exemplo, isoladas por outra pessoa) ou realizando análises do nível de expressão do transgene do vetor de ceDNA in vivo.
Amostra biológica também se refere a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um in- divíduo, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, sangue, plasma, soro, biópsia de tumor, urina, fezes, escarro, fluido espinhal, líquido pleural, aspirados de mamilo, líquido linfático, seções externas da pele, vias respiratórias, intestinais e geniturinárias, lágrimas, saliva, leite, células (incluindo, mas não limitadas a células sanguíneas), tu- mores, órgãos e também amostras de cultura celular in vitro constituin- te. Em algumas modalidades, as amostras biológicas podem ser pre- paradas, por exemplo, amostras biológicas podem ser frescas, fixadas, congeladas ou embebidas em parafina.
[00149] O termo "amostra de sangue" ou "sangue", conforme usado no presente documento, inclui, mas não está limitado a, sangue total, soro ou plasma. Em algumas modalidades, a amostra de sangue total é posteriormente processada em amostras de soro ou plasma. O ter- mo também inclui uma mistura das amostras acima mencionadas.
[00150] O termo "inibidor", conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer agente ou entidade que resulta na inibição de uma atividade biológica de proteínas. Uma "diminuição" ou "inibição" usada no contexto do nível de atividade de um gene refere-se a uma redução no nível de proteína ou ácido nucleico ou na atividade biológi- ca em uma célula, um extrato celular ou um sobrenadante celular. Por exemplo, essa inibição pode ser devida à diminuição da ligação do po- lipeptídeo ao seu ligante endógeno ou pela ligação não completa de um inibidor a um polipeptídeo para reduzir a atividade catalítica ou a afinidade pelo ligante alvo etc., ou alternativamente à estabilidade, transcrição ou tradução reduzida do RNA, maior degradação de prote- ínas ou interferência de RNA. Preferencialmente, uma diminuição é de pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80% ou mesmo pelo menos cerca de 90% da nível de expressão ou atividade sob condições de controle. O termo "inibição", conforme usado no presente documento, no que se refere à inibição da atividade da proteína topoisomerase I ou suas variantes, não signi- fica necessariamente inibição completa da expressão e/ou atividade. Em vez disso, a expressão ou atividade da proteína, polipeptídeo ou polinucleotídeo é inibida em uma extensão e/ou por um tempo sufici- ente para produzir o efeito desejado.
[00151] Os termos "inferior", "reduzido", "redução" ou "diminuição" ou "inibição" são todos no presente documento utilizados geralmente para significar uma diminuição em uma quantidade estatisticamente significativa. No entanto, para evitar dúvidas, "menor", "reduzido", "re- dução" ou "diminuição" ou "inibição" significa uma redução de pelo menos 10% em comparação com um nível de referência, por exemplo, uma redução de pelo menos cerca de 20 % ou pelo menos cerca de 30% ou pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo me- nos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou até e incluindo uma redução de 100% (ou seja, nível ausente em comparação com uma amostra de referência) ou qualquer diminuição entre 10 a 100% em comparação com um nível de referência.
[00152] Os termos "aumentado", "aumento" ou "aprimoramento" ou "superior" são todos usados no presente documento para geralmente significar um aumento em uma quantidade estatisticamente significati- va; para evitar qualquer dúvida, os termos "aumentado", "aumento" ou "aprimoramento" ou "superior" significam um aumento de pelo menos 10% em comparação com um nível de referência, por exemplo, um aumento de pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30% ou pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou mais para e incluindo um aumento de 100% ou qualquer aumento entre 10 a 100% em com- paração com um nível de referência, ou pelo menos cerca de 2 vezes, ou pelo menos cerca de 3 vezes, ou pelo menos cerca de 4 vezes, ou pelo menos um aumento de 5 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes ou qualquer aumento entre 2 e 10 vezes ou mais em comparação com um nível de referência.
[00153] Por "aumento" na expressão ou atividade de um gene ou proteína, entende-se uma mudança positiva no nível de proteína ou polipeptídeo ou ácido nucleico ou atividade em uma célula, extrato ce- lular ou sobrenadante celular. Por exemplo, esse aumento pode ser devido ao aumento da estabilidade, transcrição ou tradução do RNA ou diminuição da degradação de proteínas. De preferência, este au- mento é de pelo menos 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 200 % ou mesmo cerca de 500% ou mais acima do nível de expressão ou atividade sob condições de controle.
[00154] Como no presente documento utilizado, o termo "que com- preende" ou "compreende" é usado em referência a composições, mé- todos e respectivos componentes, que são essenciais para o método ou composição, mas abertos à inclusão de elementos não especifica- dos, essenciais ou não.
[00155] Como no presente documento utilizado, o termo "que con- siste essencialmente em" refere-se aos elementos necessários para uma determinada modalidade. O termo permite a presença de elemen- tos que não afetam materialmente as características básicas e novas ou funcionais dessa modalidade. O uso de "compreender" indica inclu- são e não limitação.
[00156] O termo "que consiste em" refere-se a composições, méto- dos e respectivos componentes, como no presente documento des-
crito, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado nessa descrição da modalidade.
[00157] Como no presente documento utilizado, o termo "que con- siste essencialmente em" refere-se aos elementos necessários para uma determinada modalidade. O termo permite a presença de elemen- tos adicionais que não afetam materialmente as características bási- cas e novas ou funcionais dessa modalidade da invenção.
[00158] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica- ções anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem refe- rências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrá- rio. Assim, por exemplo, as referências ao "método" incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito no presente documento e/ou que se tornarão evidentes para os especialistas na técnica ao ler esta invenção e assim por diante. Da mesma forma, a palavra "ou" de- ve incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos no presen- te documento descritos possam ser utilizados na prática ou no teste desta invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. A abreviatura "e.g." é derivada do exemplo latino gratia e é usada no presente documento para indicar um exemplo não limitativo. Assim, a abreviação "e.g." é sinônimo do termo "por exemplo".
[00159] Além dos exemplos operacionais, ou onde indicado de ou- tra forma, todos os números que expressam quantidades de ingredien- tes ou condições de reação no presente documento utilizados devem ser entendidos como modificados em todas as instâncias pelo termo "cerca de". O termo "cerca de" quando usado em conexão com por- centagens pode significar ± 1%. A presente invenção é ainda explica- da em detalhes pelos exemplos a seguir, mas o escopo da invenção não deve ser limitado a eles.
[00160] Os agrupamentos de elementos alternativos ou modalida-
des da invenção no presente documento descritos não devem ser in- terpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser dito e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos no presente documento en- contrados. Um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos ou excluídos de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabili- dade. Quando qualquer inclusão ou exclusão ocorre, considera-se no presente documento que a especificação contém o grupo modificado, cumprindo assim a descrição escrita de todos os grupos Markush usa- dos nas reivindicações anexas.
[00161] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a invenção no presente documento descrita não se refere a um processo de clonagem de seres humanos, processos para modificar a identida- de genética da linha germinativa de seres humanos, uso de embriões humanos para fins industriais ou comerciais ou processos para modifi- car a identidade genética de animais susceptíveis de os fazer sofrer sem qualquer benefício médico substancial para o homem ou animal, bem como animais resultantes de tais processos.
[00162] Outros termos são no presente documento definidos na descrição dos vários aspectos da invenção.
[00163] Todas as patentes e outras publicações; incluindo referên- cias de literatura, patentes emitidas, pedidos de patentes publicados e pedidos de patente pendentes; citadas ao longo deste pedido são ex- pressamente incorporadas no presente documento a título de referên- cia com o objetivo de descrever e divulgar, por exemplo, as metodolo- gias descritas em tais publicações que podem ser usadas em conexão com a tecnologia no presente documento descrita. Essas publicações são fornecidas apenas para sua invenção antes da data de apresenta- ção do presente pedido. Nada a esse respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm o direito de ante-
ceder essa invenção em virtude de invenção precedente ou por qual- quer outro motivo. Todas as declarações quanto à data ou representa- ção quanto ao conteúdo desses documentos são baseadas nas infor- mações disponíveis para os candidatos e não constituem nenhuma admissão quanto à exatidão das datas ou do conteúdo desses docu- mentos.
[00164] A descrição das modalidades da invenção não pretende ser exaustiva ou limitar a invenção à forma precisa descrita. Embora mo- dalidades específicas e exemplos para a invenção sejam no presente documento descritas para fins ilustrativos, várias modificações equiva- lentes são possíveis dentro do escopo da invenção, como reconhece- rão os especialistas na técnica. Por exemplo, enquanto as etapas ou funções do método são apresentadas em uma determinada ordem, modalidades alternativas podem executar funções em uma ordem dife- rente, ou funções podem ser executadas substancialmente simultane- amente. Os ensinamentos da invenção no presente documento forne- cidos podem ser aplicados a outros procedimentos ou métodos, con- forme apropriado. As várias modalidades descritas neste documento podem ser combinadas para fornecer outras modalidades. Aspectos da invenção podem ser modificados, se necessário, para usar as com- posições, funções e conceitos das referências e aplicação acima para fornecer ainda outras modalidades da invenção. Além disso, devido a considerações de equivalência funcional biológica, algumas alterações podem ser feitas na estrutura da proteína sem afetar a ação biológica ou química em espécie ou quantidade. Essas e outras alterações po- dem ser feitas na invenção à luz da descrição detalhada. Todas essas modificações devem ser incluídas no escopo das reivindicações ane- xas.
[00165] Elementos específicos de qualquer precedentesuma das modalidades precedentes pode ser combinados ou substituídos por elementos em outras modalidades. Além disso, embora as vantagens associadas a certas modalidades da invenção tenham sido descritas no contexto dessas modalidades, outras modalidades também podem exibir essas vantagens, e nem todas as modalidades precisam neces- sariamente exibir essas vantagens para se enquadrarem no escopo da invenção.
[00166] A tecnologia no presente documento descrita é ainda ilus- trada pelos exemplos a seguir, que de maneira alguma devem ser in- terpretados como limitantes adicionais. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes es- pecíficos, etc., descritos no presente documento e, como tal, podem variar. A terminologia usada neste documento tem o objetivo de des- crever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindica- ções. I. MÉTODO PARA EXPRESSÃO CONTROLADA DE UM TRANSGE- NE USANDO UM VETOR DE ceDNA
[00167] No presente documento são descritos métodos de adminis- tração de vetores de ceDNA in vivo ou in vitro, que permitem (i) a ex- pressão sustentada do nível de um transgene por um período de tem- po predeterminado (isto é, mantendo os níveis de expressão do trans- gene) ou (ii) para aumentar o nível de expressão do transgene de ma- neira dependente da dose, o método compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma ou mais) administrações subsequentes (por exem- plo, uma administração de "reforço" ou "redose") do vetor de ceDNA.
[00168] Por conseguinte, a tecnologia no presente documento des- crita relaciona a administração de um vetor de ceDNA in vivo, onde o nível de expressão do transgene é mantido em um nível desejado ou aumentado em nível com uma ou mais administrações subsequentes (por exemplo, uma administração de reforço ou redose). Os vetores de ceDNA no presente documento descritos permitem um aumento no nível de expressão do transgene a partir de um nível precedente in vi- tro e in vivo. O aumento no nível de transgene pode ser até, ou acima de, um nível desejado, ou aumentar o nível de expressão para dentro de uma faixa de expressão desejada, por pelo menos uma readminis- tração (no presente documento também referida como "redose") em qualquer momento após a administração inicial. Em alguns casos, o aumento desejado é corrigir uma diminuição natural nesses níveis, de modo que a dose final seja um retorno ao nível desejado precedente- mente, por exemplo, um nível de dose sustentada. É possível que es- sa administração de redose ou doses repetidas de um vetor de ceD- NA, conforme descrito no presente documento, possa aumentar o ní- vel de expressão do transgene, porque o vetor de ceDNA não possui capsídeo para provocar uma resposta imune do hospedeiro (por exemplo, o vetor possui propriedades não imunogênicas) e, portanto, oferece vantagens significativas sobre a tecnologia do vetor AAV exis- tente, em que não é possível redoses devido a respostas imunes ou imunidade ao AAV no hospedeiro devido a uma exposição prévia ao AAV ou, por exemplo, pela administração inicial do vetor AAV. Assim, para alcançar um alto nível de expressão usando vetores de rAAV, normalmente é necessária uma dose alta e as redoses não são possí- veis e/ou não são eficazes devido a problemas de resposta imune. Por outro lado, uma ou mais administrações de redose de um vetor de ce- DNA conforme descrito no presente documento podem ser administra- das para aumentar o nível de expressão de um transgene, por exem- plo, para aumentar o nível de expressão para um nível de expressão desejado ou acima de um nível limite desejado ou dentro de uma faixa de nível de expressão desejado.
[00169] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a métodos e vetores de ceDNA para expressão controlada de transgene para qualquer um dos seguintes: (i) manter ou sustentar o nível de expres- são de transgene em um nível desejado por um tempo predeterminado por readministração do vetor de ceDNA em um ou mais momentos (ii) aumento do nível de expressão do transgene pela readministração do vetor de ceDNA em um ou mais momentos ou (iii) expressão do trans- gene dependente da dose pela administração do vetor de ceDNA de maneira dependente da dose (isto é, expressão titulável do transgene). Como discutido no presente documento, os vetores de cDNA são úni- cos em comparação com outros vetores virais, pois o vetor de ceDNA pode ser administrado ao sujeito várias vezes, por exemplo, durante um curto período de tempo (por exemplo, vários meses) ou durante um longo período de tempo (por exemplo, ao longo de vários anos) para permitir que a expressão do transgene seja controlada, permitin- do assim personalizar ou adaptar a terapia genética às necessidades do sujeito. A. EXPRESSÃO CONTROLADA AUMENTADA OU DEPENDENTE
DA DOSE DO TRANSGENE (i) EXPRESSÃO CONTROLADA DO TRANSGENE: EXPRESSÃO
SUSTENTADA DO TRANSGENE PELA READMINISTRAÇÃO DO VETOR DE ceDNA
[00170] Um aspecto da tecnologia no presente documento descrita refere-se ao uso de um vetor de ceDNA conforme descrito no presente documento em um método para manter ou sustentar o nível de ex- pressão de um transgene em uma célula, o método compreendendo: (a) administração a uma célula em um primeiro momento, uma dose de preparação de um vetor de ceDNA para obter a expressão de um transgene e (b) administrar à célula em um segundo momento, uma dose de um vetor de ceDNA para compensar qualquer diminuição no nível de expressão do transgene após a administração de vetores de ceDNA no primeiro momento.
[00171] Como mostrado na Figura 6, o nível de expressão de um transgene expresso pelo ceDNA pode ser alcançado e sustentado (ou seja, mantido) por pelo menos 42 dias, ou pelo menos 60 dias ou pelo menos 80 dias, e pode ser aumentado para a expressão predetermi- nada necessária nível com uma administração de redose em um se- gundo ou mais momentos subsequentes após uma administração de preparação inicial (por exemplo, no tempo 0). A Figura 6 também de- monstra que o nível de expressão de um transgene expresso pelo ce- DNA pode ser alcançado e mantido por pelo menos 42 dias ou pelo menos 60 dias, e pode ser aumentado de maneira dependente da do- se com uma administração de redose compreendendo uma definição quantidade do vetor de ceDNA, em um segundo ou mais momentos subsequentes após uma administração de preparação inicial (por exemplo, no tempo 0).
[00172] A expressão do transgene ocorre tipicamente em cerca de 7 a 20 dias após a administração de redose e mantém esse nível de expressão (ou seja, é expressão sustentada) do transgene após a ad- ministração da redose por pelo menos cerca de 30 dias, ou cerca de 60 dias, ou cerca de 90 dias, ou cerca de 120 dias ou mais de 120 dias após a administração da segunda dose (isto é, a redose ou adminis- tração no segundo momento ou em momento subsequente).
[00173] Outro aspecto da tecnologia no presente documento descri- ta refere-se a um método para o tratamento de uma doença em um sujeito ou, alternativamente, a um método para expressão controlada de transgene em um sujeito, o método compreendendo: (a) administrar ao sujeito em um primeiro momento, uma dose de preparação de uma composição compreendendo um vetor de ceDNA como no presente documento descrito, para alcançar a expressão do transgene em um primeiro nível (ou primeira quantidade) e (b) administrar ao sujeito em um segundo momento, uma dose ou quantidade de um vetor de ceD-
NA para manter o nível de expressão do transgene em um nível de expressão sustentada desejado, em que o nível de expressão susten- tada é um nível de expressão mais alto em comparação com o nível de expressão de transgene alcançado apenas se administração inicial (isto é, de preparação) do vetor de ceDNA no primeiro momento tiver sido dada, tratando assim a doença no sujeito.
[00174] Por conseguinte, em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como no presente documento descrito pode ser readministrado (também referido no presente documento como "redosado") para man- ter um nível de expressão de transgene desejado, em que o vetor de ceDNA compreende duas sequências ITR (por exemplo, um par de ITR simétrico ou par de ITR assimétrico como no presente documento descrito) flanqueando uma sequência de polinucleotídeo transgene operacionalmente ligada a um promotor.
[00175] Em algumas modalidades, o uso de um vetor de ceDNA em um método para sustentar o nível de expressão de um transgene em uma célula expressa o transgene em um nível de expressão desejado por pelo menos 42 dias. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA expressa o transgene em um nível de expressão desejado por pelo menos 84 dias. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA expressa o transgene em um nível de expressão desejado por pelo menos 132 dias. Apenas para fins ilustrativos, um vetor de ceDNA produzido pelos métodos descritos no Exemplo 1 pode sustentar o nível de expressão de um transgene em um modelo murino de camundongos CD-1 IGS em um nível mais alto dos dias 7 a 28 após a administração em com- paração com similares vetores de DNA fechados produzidos por ou- tros métodos e testados no mesmo modelo de camundongo.
[00176] Em algumas modalidades, a expressão aumentada de transgene não é dependente da dose ou não depende totalmente da dose, mas é expressão sustentada, pois a expressão aumentada do transgene ocorre tipicamente dentro de 7 a 20 dias após a administra- ção de redose e mantém esse nível de expressão aumentada do transgene da redose por pelo menos cerca de 30 dias ou pelo menos cerca de 60 dias ou pelo menos cerca de 90 dias ou pelo menos cerca de 120 dias ou mais do que cerca de 120 dias após a administração da segundo dose (ou seja, a redose ou administração no segundo momento ou no tempo subsequente).
[00177] A relação de resposta à dose específica para um determi- nado vetor ou composição de ceDNA descrito neste documento pode ser determinada por meios bem conhecidos dos versados na técnica, incluindo, por exemplo, como descrito no Exemplo 6. O vetor de ceD- NA como no presente documento descrito pode ser titulado pela admi- nistração de doses adicionais do vetor de ceDNA uma ou mais vezes após a administração inicial, conforme necessário para atingir o nível de expressão desejado. Mais de uma, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais adminis- trações repetidas podem ser administradas para titular os níveis de expressão de um transgene em ou próximo de um nível desejado. Ti- picamente, cada administração repetida é administrada aproximada- mente 7 dias antes de se observar uma diminuição na expressão do transgene da administração precedente. Com efeito, as administra- ções repetidas servem para titular o nível de expressão do transgene para um nível desejado, ou declarado de outra maneira, as administra- ções repetidas permitem que o nível de expressão do transgene seja mantido dentro de uma faixa de nível de expressão desejada, por exemplo, em uma faixa desejada que é terapêutica para tratar uma doença ou distúrbio ou dentro da janela terapêutica da composição.
[00178] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA no presente documento descrito pode ser usado para adaptar o nível de expressão de transgene in vivo, onde o nível de expressão é aumentado de um nível precedente (onde o nível precedente é o nível após uma adminis-
tração prévia de preparação ou redose) a um nível de expressão dese- jado, ou dentro de uma faixa de nível de expressão desejada, ou aci- ma de um nível limite desejado in vivo, onde o nível de expressão au- mentado é sustentado ou mantido entre cerca de 30 a 60 dias ou entre cerca de 40 a 70 dias ou entre cerca de 50 a 80 dias, ou entre cerca de 60 a 90 dias, ou entre cerca de 70 a 100 dias ou entre cerca de 80 a 110 dias, ou entre cerca de 40 a 120 dias ou mais de 120 dias após a administração de redose do vetor de ceDNA.
[00179] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA usado nos métodos no presente documento descritos, por exemplo, em um mé- todo para sustentar a expressão de um transgene em uma célula e/ou para tratar um sujeito com uma doença, é administrado em combina- ção com um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou excipiente. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA é administrado em um segundo momento, é administrado por pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias ou entre 60 a 90 dias, ou entre 90 a 120 dias, ou entre cerca de 3 a 6 meses, ou entre 6 a 12 meses, ou entre 1 a 2 anos ou 2 a 3 anos após o primeiro momento. (ii) EXPRESSÃO CONTROLADA DO TRANSGENE: AUMENTO DA EXPRESSÃO DO TRANSGENE PELA READMINISTRAÇÃO DO VE- TOR DE ceDNA
[00180] Além da administração de redose de um vetor de ceDNA para simplesmente aumentar o nível de expressão do transgene se os níveis de expressão tiverem diminuído ao longo do tempo (por exem- plo, para continuar ou manter a expressão do transgene em um nível predeterminado desejado), em algumas modalidades, os métodos e composições de readministração de um vetor de ceDNA podem au- mentar o nível de transgene de maneira dependente da dose - isto é, uma administração de redose de uma quantidade definida de um vetor de ceDNA pode afetar um aumento definido no nível de expressão de um transgene. Dito de forma diferente e usando unidades arbitrárias apenas para fins ilustrativos, uma dose de 1 unidade do ceDNA em uma administração de redose alcançará um aumento de 10% no nível de expressão do transgene em relação a um nível precedente e uma dose de 2 unidades do vetor de cDNA irá atingir um aumento de 20% no nível do transgene a partir de um nível precedente e uma dose uni- tária de 0,5 do ceDNA alcançará um aumento de 5% no nível de ex- pressão do transgene a partir de um nível precedente.
[00181] Por conseguinte, em uma modalidade, um vetor de ceDNA como no presente documento descrito para expressão controlada de transgene pode ser usado para aumentar o nível de expressão de um transgene em uma célula ou um sujeito de uma maneira controlada. Por exemplo, o nível de expressão do transgene pode ser aumentado com uma ou mais administrações subsequentes (por exemplo, uma administração de redose ou de reforço) do vetor de ceDNA.
[00182] Os vetores de ceDNA, como no presente documento des- critos, permitem uma administração de redose dependente da dose ou concentração do ceDNA em um ou mais pontos após a administração de preparação inicial para aumentar o nível de expressão do transge- ne em uma quantidade definida in vivo. Em algumas modalidades, o aumento na expressão do transgene por uma quantidade definida po- de trazer o nível de expressão do transgene in vivo a, ou acima de um limite desejado (ou nível predeterminado) ou dentro de uma faixa de nível de expressão desejada, onde o limite desejado ou a faixa de ní- vel de expressão desejada está acima do nível de expressão do trans- gene da administração precedente (isto é, a administração de prepa- ração inicial ou uma administração de redose precedente).
[00183] A Figura 6 ilustra que é possível aumentar prontamente o nível de expressão do transgene após o indivíduo receber uma redose (isto é, uma nova administração ou reforço) do vetor de ceDNA in vivo.
Em particular, a Figura 6 mostra diferentes aumentos no nível de ex- pressão do transgene depois que o sujeito é administrado diferentes concentrações do vetor de ceDNA nas administrações de redose in vivo. Em particular, uma concentração de redose de 3 mg/ml de ceD- NA alcançou um aumento de 7 vezes na expressão do transgene, e uma concentração de redose de 10 mg/kg de ceDNA resultou em um aumento de 17 vezes na expressão do transgene em comparação com o nível de expressão sem a administração de redose dependente da dose. Por conseguinte, a tecnologia no presente documento descrita refere-se a pelo menos duas administrações de um ceDNA a um sujei- to in vivo, em que a segunda administração ou administrações subse- quentes resultam em um aumento dependente da dose no nível da expressão do transgene em uma quantidade desejada e, em algumas modalidades, para atingir uma faixa de nível de expressão desejada ou um nível de expressão desejado ou um nível de expressão limite, em comparação com o nível de expressão do transgene alcançado com a administração prévia do vetor de ceDNA ou sem a resposta de- pendente da dose administração de doses. Ou seja, é alcançado um aumento no nível de expressão do transgene por uma ou mais admi- nistrações de redose dependente da dose para aumentar o nível de expressão do transgene de maneira controlada, ou seja, para titular a expressão do transgene com base na dose (ou quantidade) de ceDNA na administração de redose.
[00184] Em outras palavras, a administração de redose dependente da dose descrita neste documento aumenta o nível de expressão do transgene. A expressão aumentada de transgene é dependente da dose e é uma expressão sustentável - ou seja, a expressão do trans- gene no nível mais alto (devido à administração de redose dependente da dose) é mantida por um período de tempo definido, ou não diminuir ou cair abaixo do nível de expressão observado sem a administração de redose.
[00185] Tipicamente, cada redose dependente da dose é adminis- trada aproximadamente 7 dias antes do aumento desejado na expres- são do transgene. Com efeito, as redoses dependentes da dose ser- vem para titular o nível de expressão do transgene para um nível de- sejado, ou faixa de nível de expressão desejada, ou declarado de ou- tra maneira, as redoses dependentes da dose permitem que o nível de expressão do transgene seja aumentado em uma quantidade definida acima do nível de expressão precedente, e que os aumentos possam estar em pelo menos uma administração de redose dependente da dose ou, alternativamente, em aumentos incrementais com mais de uma administração de redose dependente da dose, de modo que o transgene seja aumentado de uma maneira controlada e titulada para ser expresso em um nível que está dentro de uma faixa de nível de expressão desejada, por exemplo, em uma faixa desejada que é tera- pêutica para tratar uma doença ou distúrbio.
[00186] Em algumas modalidades, uma faixa desejada do nível de expressão ou faixa desejada do nível de expressão do transgene pode ser uma quantidade terapeuticamente eficaz de transgene para tratar ou reduzir efetivamente um sintoma de uma doença. Por conseguinte, em algumas modalidades, para alcançar uma quantidade terapeutica- mente eficaz de transgene, pode-se aumentar o nível de expressão do transgene usando uma ou mais administrações de redose, conforme descrito no presente documento, para aumentar gradualmente os ní- veis para a quantidade terapeuticamente eficaz da transgene. Portan- to, em algumas modalidades, um sujeito pode ser administrado uma dose de preparação do vetor de ceDNA que expressa o transgene em um nível de expressão baixo (isto é, uma quantidade subterapeutica- mente eficaz) e uma ou mais administrações de redose podem ser administradas ao sujeito durante um período de tempo para aumentar o nível de expressão até que um efeito terapêutico desejado seja al- cançado. Essa estratégia permite que o corpo do sujeito se ajuste ao nível do transgene expresso e efetivamente permite titulação ou ajuste (neste caso, aumento) do nível da expressão do transgene em incre- mentos para atingir um objetivo ou efeito terapêutico desejado e/ou prevenir excesso de medicação e/ou efeitos colaterais devido à super expressão do transgene. Alternativamente, em algumas modalidades, um sujeito pode ser administrado uma dose de preparação do vetor de ceDNA que expressa o transgene no nível de expressão desejado quando o sujeito é um bebê ou criança, tipicamente um nível de ex- pressão baixo e uma ou mais reações dependentes da dose. Adminis- trações de doses podem ser administradas ao sujeito durante um perí- odo de tempo, à medida que o indivíduo cresce para aumentar o nível de expressão, de modo que o efeito terapêutico seja mantido. B. MOMENTO E QUANTIDADE DO VETOR DE ceDNA NA READMI-
NISTRAÇÃO
[00187] O nível de expressão de um transgene a partir de um vetor de ceDNA, conforme descrito neste documento, pode ser aumentado a partir de um nível precedente (isto é, nível de expressão alcançado a partir de uma administração de preparação precedente no dia 0 ou uma redose precedente) por readministração (isto é, redose) do vetor de ceDNA uma ou mais vezes após a administração inicial. Tipicamen- te, a administração de redose para aumentar o nível de expressão pa- ra um nível desejado ou uma faixa de nível de expressão desejado é administrada cerca de 7 dias, ou mais de 7 dias antes de o aumento da expressão ser desejado. Como um exemplo ilustrativo, se um au- mento no nível de expressão do transgene for desejado cerca de 30 dias após a administração precedente (isto é, uma administração de preparação ou redose precedente), uma redose poderá ser dada aos 28 dias ou mais cedo. Da mesma forma, se um aumento na expressão do transgene for desejado em cerca de 90 dias (ou cerca de 3 meses) após uma administração precedente (ou seja, uma administração de preparação ou redose precedente), uma redose poderá ser adminis- trada cerca de no dia 83 ou 84 ou antes, a fim de aumentar o nível da expressão do transgene em ou em torno de 90 dias para um nível de- sejado ou dentro de uma faixa de nível de expressão desejada, em que o nível desejado ou a faixa de nível de expressão desejada esteja acima do nível de expressão de transgene alcançado com o adminis- tração prévia.
[00188] Como discutido no presente documento, como os métodos e os vetores de ceDNA no presente documento descritos permitem uma abordagem personalizada da medicina genética, ou seja, titular o nível da expressão do transgene de maneira passo a passo com as administrações de redose para aumentar os níveis de expressão de maneira incremental, é previsto que 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais de 6 re- doses podem ser administradas ao longo do tempo, a fim de aumentar o nível de expressão do transgene para um nível desejado ou para uma faixa de nível de expressão desejada, que é superior ao nível de expressão alcançado com a administração precedente ou antes desta administração de redose. Os aumentos incrementais no nível de ex- pressão do transgene por cada administração de redose podem ser os mesmos, ou seja, cada administração de redose pode aumentar o ní- vel de expressão do transgene em cerca de 10% do nível de expres- são precedente ou pode ser diferente, isto é, uma primeira administra- ção de redose pode aumentar a expressão em cerca de 10% a partir do nível de expressão precedente e uma segunda administração de redose pode aumentar a expressão em cerca de 20% a partir do nível de expressão precedente. Tipicamente, cada redose é administrada aproximadamente 7 dias antes do aumento desejado na expressão do transgene ser desejado. Com efeito, as redoses servem para titular o nível de expressão do transgene para um nível desejado ou faixa de nível de expressão desejada, ou declaradas de outra maneira, as re- doses permitem que o nível de expressão do transgene seja aumenta- do acima do nível de expressão precedente e que os aumentos podem ser incrementais com uma ou mais administrações de redose, de mo- do que o transgene seja expresso em um nível que esteja dentro de uma faixa de nível de expressão desejada, por exemplo, em uma faixa desejada que seja terapêutica para tratar uma doença ou distúrbio.
[00189] Em algumas modalidades, uma redose para aumentar o nível de expressão do transgene é de pelo menos cerca de 20 dias ou pelo menos cerca de 30 dias ou pelo menos cerca de 40 dias ou pelo menos cerca de 50 dias ou pelo menos cerca de 60 dias ou entre cer- ca de 60 a 90 dias, ou entre cerca de 90 a 120 dias, ou entre cerca de 120 a 150 dias após uma administração precedente (por exemplo, uma administração de preparação inicial no dia 0, ou uma administra- ção de redose precedente) da composição de ceDNA.
[00190] Em algumas modalidades, a tecnologia no presente docu- mento descrita refere-se a uma redose de ceDNA para aumentar a ex- pressão do transgene in vivo, onde a expressão do transgene pode ser aumentada em uma ou mais redoses (isto é, administrações de reforço ou readministração) da composição do ceDNA. Em algumas modali- dades, a dose (ou quantidade) do vetor de ceDNA na administração de redose em um segundo momento ou momento subsequente é a mes- ma ou uma quantidade diferente da dose (ou seja, quantidade) de ce- DNA na administração antes de, ou após, essa administração de redo- se (uma administração de preparação inicial no dia 0 ou uma adminis- tração de redose precedente). Como um exemplo, se a quantidade de ceDNA administrada no primeiro momento é de 1 mg/kg, a quantidade na administração de redose em um segundo momento ou momento subsequente pode ser de 1 mg/kg, ou menor que 1 mg/kg ou mais que
1 mg/kg. Em algumas modalidades, a redose pode estar em uma quantidade selecionada de qualquer um dos seguintes: cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, ou entre cerca de 2 a 5 mg/kg, ou entre 5 a 10 mg/kg, ou entre 10 a 15 mg/kg ou superior a 15 mg/kg.
[00191] Em algumas modalidades, para aumentar o nível de ex- pressão do transgene em uma ou mais administrações de redose (ou seja, administrações de redose sequencial para aumentar gradualmen- te o nível de expressão de transgene), cada administração de redose pode ser a mesma, ou seja, cada a administração de redose pode au- mentar o nível de expressão do transgene em cerca de 10% do nível de expressão precedente, ou pode ser diferente, ou seja, uma primeira administração de redose pode aumentar a expressão em cerca de 10% a partir do nível de expressão precedente e uma segunda admi- nistração de redose pode aumentar a expressão em cerca de 20% em relação ao nível de expressão precedente.
[00192] Em algumas modalidades, onde mais de uma redose é ad- ministrada, a quantidade de aumento no nível de expressão do trans- gene por cada administração de redose pode ser a mesma, ou seja, cada redose administrada pode aumentar o nível de expressão da transgene em cerca de 10% do nível de expressão precedente, ou po- de ser diferente, ou seja, uma primeira administração de redose pode aumentar a expressão em cerca de 10% do nível de expressão prece- dente, e uma segunda administração de redose pode aumentar a ex- pressão em cerca de 20% do nível de expressão precedente. Em al- gumas modalidades, onde mais de uma redose é administrada, a quantidade de aumento no nível de expressão do transgene por cada administração de redose pode ser a mesma, ou seja, cada redose ad- ministrada pode aumentar o nível de expressão da transgene em cer-
ca de 1 vez ou 2 vezes ou 3 vezes etc. do nível de expressão prece- dente, ou pode ser diferente, ou seja, uma primeira administração de redose pode aumentar a expressão em cerca de 2 vezes do nível de expressão precedente, e uma segunda administração de redose pode aumentar a expressão cerca de 6 vezes a partir do nível de expressão precedente ou cerca de 6 vezes a partir do nível de expressão alcan- çado a partir da administração de preparação inicial.
[00193] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é o mesmo vetor de ceDNA administrado na administração principal (isto é, primei- ra administração no tempo 0) que aquele administrado à célula ou su- jeito em uma segunda administração ou qualquer administração sub- sequente (por exemplo, administrações de redose). Em algumas mo- dalidades, o vetor de ceDNA pode ser o mesmo vetor de ceDNA. Ape- nas para fins ilustrativos, a readministração de vetores virais, por exemplo, vetores AAV, geralmente é um sorotipo diferente daquele administrado precedentemente. Por outro lado, um vetor de ceDNA em uma readministração é o mesmo que o vetor de ceDNA administrado precedentemente, ou seja, o vetor de ceDNA não mudou de forma que seja equivalente a administrar o mesmo sorotipo de AAV várias vezes.
[00194] Dito isto, embora seja equivalente ao mesmo sorotipo do vetor de ceDNA sendo readministrado, em algumas modalidades, o vetor de ceDNA administrado em uma segunda administração ou em qualquer administração subsequente (por exemplo, administrações de redose) após a administração de preparação inicial ser diferente, tais como, por exemplo, um par de ITR diferente, um promotor diferente operacionalmente ligado ao transgene, um transgene diferente ou transgene modificado ou similar. Em algumas modalidades, o gene do transgene é o mesmo ou pode ser um transgene modificado.
[00195] Em algumas modalidades, os intervalos entre a primeira administração (ou seja, administração de preparação) de um vetor de ceDNA e uma administração de redose (ou seja, em um segundo mo- mento ou qualquer momento subsequente depois disso, por exemplo, 3º, 4º, 5º, 6º, 7º, 8º, 9º, 10º, etc.) pode ter pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias ou pelo menos 80 dias ou entre 60 a 90 dias ou entre 90 e 120 dias ou entre cerca de 2 a 3 meses, ou entre cerca de 3 a 6 meses, ou entre cerca de 6 a 12 meses, ou cerca de 1 ano ou entre 1 a 2 anos, ou cerca de 2 anos ou entre 2 a 3 anos, ou cerca de 3 anos ou entre 3 a 4 anos, ou aproximadamente 5 anos ou entre 5 a 6 anos, ou entre 5 a 10 anos, ou entre 10 a 20 anos etc. após a administração precedente (isto é, a dose de preparação ou uma administração de redose precedente). Como discutido no presente documento, em uma modalidade, uma administração de redose para aumentar o nível de expressão de um transgene é administrada por cerca de 7 dias ou mais de 7 dias (por exemplo, entre 8 a 10 ou 14 dias) antes que um aumento na expressão seja desejado.
[00196] Apenas para fins ilustrativos, se a quantidade do vetor de ceDNA na administração inicial no dia 0 for definida em uma unidade arbitrária de 1, a quantidade do vetor de ceDNA na administração de redose, no segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto momento pode ser selecionada a partir de qualquer uma dentre 2 vezes, 3 vezes, 4 ve- zes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes ou entre 15 e 20 vezes ou en- tre 20 e 50 vezes maior (ou mais) do que a quantidade de vetor de ceDNA na administração inicial no dia 0.
[00197] Em algumas modalidades, se a quantidade do vetor de ce- DNA na administração inicial no dia 0 resultar em um nível de expres- são que recebe uma unidade arbitrária de 1 vez, então a quantidade de vetor de ceDNA em uma administração de redose, em um segundo, terceiro, quarto, quinto, sexto momento pode ser uma quantidade de um vetor de ceDNA que resulta em um aumento no nível de expressão do transgene em pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes ou entre 15 a 20 vezes ou entre 20 a 50 vezes maior (ou mais) em comparação com o nível de expressão do transgene da administração inicial do vetor de ceDNA no dia 0.
[00198] Em algumas modalidades, uma redose é administrada da mesma maneira ou mesma via de administração que a administração inicial do ceDNA no dia 0. Em algumas modalidades, uma redose é administrada de uma maneira diferente ou por uma via de administra- ção diferente da administração inicial do ceDNA no dia 0. Em algumas modalidades, quando a administração inicial (ou seja, administração principal no tempo 0) é seguida por uma ou mais redoses (ou seja, administrações de reforço), a administração pode ser por administra- ção intravenosa, administração intranasal ou intramuscular - ou qual- quer outra via de administração medicamente apropriada da composi- ção compreendendo o vetor de ceDNA.
[00199] Um vetor de ceDNA como no presente documento descrito pode ser administrado a um sujeito em um primeiro momento (por exemplo, a administração inicial, por exemplo, no dia 0) e em um mo- mento após o primeiro momento, se necessário ou desejado. Um vetor de ceDNA, conforme descrito neste documento, pode ser administrado em um segundo momento para titular os níveis do transgene em um nível desejado (por exemplo, acima de um valor limite para eficácia) ou dentro de uma faixa de nível de expressão desejada (por exemplo, dentro da janela terapêutica da composição). Prevê-se que mais de uma dose do vetor de ceDNA no presente documento descrita possa ser administrada ao sujeito, por exemplo, uma administração repetida pode ser administrada em qualquer um ou mais de: um segundo mo- mento, um terceiro momento, um quarto momento, etc. É abrangido que doses adicionais possam ser administradas para manter o nível desejado de expressão de transgene (isto é, para manter ou sustentar o mesmo nível de expressão de transgene). Os intervalos entre a pri- meira e a segunda ou quaisquer duas redoses sucessivas não preci- sam ser os mesmos. C. NÍVEIS DE EXPRESSÃO PREDETERMINADOS DO TRANSGENE
[00200] Em algumas modalidades, um nível predeterminado de ex- pressão do transgene (também referido como faixa desejada do nível de expressão ou faixa desejada do nível de expressão do transgene) pode ser uma quantidade terapeuticamente eficaz de transgene para tratar ou reduzir efetivamente um sintoma de uma doença. Por conse- guinte, em algumas modalidades, para alcançar uma quantidade tera- peuticamente eficaz de transgene, pode-se manter o nível de expres- são de transgene e/ou aumentar o nível de expressão do transgene, conforme descrito no presente documento, usando uma ou mais admi- nistrações de redose, conforme descrito no presente documento, para incrementalmente aumentar os níveis para a quantidade terapeutica- mente eficaz do transgene. Portanto, em algumas modalidades, um sujeito pode ser administrado uma dose de preparação do vetor de ceDNA que expressa o transgene a um nível de expressão desejado, tipicamente um baixo nível de expressão (ou seja, uma quantidade subterapeuticamente eficaz) e um ou mais dependentes da dose ad- ministrações de redose podem ser administradas ao sujeito durante um período de tempo para aumentar o nível de expressão até que um efeito terapêutico desejado seja alcançado. Essa estratégia permite que o corpo do sujeito se ajuste ao nível do transgene expresso e efe- tivamente permite titulação ou ajuste (neste caso, aumento) do nível de expressão do transgene em pelo menos uma administração de re- dose dependente da dose ou mais (isto é, em pelo menos dois ou mais incrementos) para atingir um objetivo ou efeito terapêutico dese- jado e/ou prevenir o excesso de medicação e/ou efeitos colaterais de-
vido à super expressão do transgene. Alternativamente, em algumas modalidades, um sujeito pode ser administrado uma dose de prepara- ção do vetor de ceDNA que expressa o transgene no nível de expres- são desejado quando o sujeito é um bebê ou criança, tipicamente um nível de expressão baixo e uma ou mais reações dependentes da do- se. Administrações de doses podem ser administradas ao sujeito du- rante um período de tempo, à medida que o indivíduo cresce para au- mentar o nível de expressão, de modo que o efeito terapêutico seja mantido. Da mesma forma, em algumas modalidades, um sujeito pode ser administrado uma dose de preparação do vetor de ceDNA que ex- pressa o transgene a um nível de expressão desejado no sujeito, e uma ou mais administrações de redose dependentes da dose podem ser administradas ao sujeito durante um período de tempo em que o sujeito ganha peso, etc., para aumentar o nível de expressão, de modo que o efeito terapêutico seja mantido.
[00201] Ou seja, um vetor de ceDNA como no presente documento descrito é administrado a um sujeito em um primeiro momento (por exemplo, a administração inicial, por exemplo, no dia 0) e, após o pri- meiro momento, um vetor de ceDNA como no presente documento descrito é administrado em um segundo momento para aumentar o nível de expressão do transgene para um nível de expressão de trans- gene predeterminado (por exemplo, para um nível desejado ou dentro de uma faixa de nível de expressão desejada), em que o nível de ex- pressão de transgene predeterminado está acima do nível da expres- são de transgene antes da administração de redose. Em algumas mo- dalidades, um nível de expressão de transgene predeterminado não é necessariamente a quantidade terapeuticamente eficaz do transgene, prevê-se que mais de uma redose dependente da dose de um vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documento, possa ser adminis- trada ao sujeito em qualquer um ou mais dentre: um segundo momen-
to, um terceiro momento, um quarto momento, etc. onde o transgene é aumentado para um nível de expressão de transgene predeterminado. É abrangido que redoses dependentes da dose possam ser adminis- tradas para aumentar o nível de expressão do transgene em uma quantidade definida que depende da dose do ceDNA na administração de redose e, em algumas modalidades, isso pode ser usado para au- mentar os níveis de expressão de maneira passo a passo para alcan- çar um nível de expressão que é uma quantidade terapeuticamente eficaz do transgene (por exemplo, é um nível que produz o efeito tera- pêutico desejado ou reduz um ou mais sintomas da doença ou distúr- bio).
[00202] Embora a administração de redose resulte em um aumento dependente da dose na expressão do transgene, em algumas modali- dades o efeito da administração de redose é sinérgico, ou seja, o au- mento na expressão do transgene é maior que a soma das administra- ções de dose única. Por exemplo, como demonstrado na Figura 6, um aumento de 3 vezes na quantidade de vetor de ceDNA em uma admi- nistração de redose resultou em um aumento na expressão de trans- gene maior que 3 vezes; e um aumento de 10 vezes na quantidade de vetor de ceDNA em uma administração de redose resultou em um au- mento maior que 10 vezes na expressão do transgene.
[00203] Em modalidades particulares descritas no presente docu- mento, pode ser desejável selecionar uma dose baixa na curva dose- resposta do ceDNA para a administração inicial (ou seja, no primeiro momento, ou seja, dia 0) e, opcionalmente, aumentar a dose (ou seja, nível de expressão do transgene) em incrementos com uma ou mais administrações de redose dependentes da dose em uma segunda, ter- ceira, quarta etc., administrações para induzir um efeito terapêutico, além de impedir o aparecimento de efeitos colaterais indesejáveis ou intolerância à composição. Em uma modalidade, a relação de resposta à dose para um determinado vetor de ceDNA é usada para determinar e/ou estimar uma dose ideal para o tratamento eficaz de uma dada doença que está bem dentro dos limites da janela terapêutica da com- posição. Ou seja, a titulação da dose de vetores de ceDNA, conforme descrito no presente documento, usando uma administração de prepa- ração inicial (por exemplo, no dia 0) e um aumento incremental depen- dente da dose nas administrações de redose em momentos subse- quentes, podem ser alcançados para maximizar o efeito terapêutico da expressão de transgene, além de minimizar os efeitos colaterais ou a toxicidade indesejada.
[00204] Ensaios in vivo e/ou in vitro podem opcionalmente ser usa- dos para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais do vetor de ce- DNA em readministrações para atingir um nível de expressão de transgene predeterminado. A dose precisa do vetor de ceDNA na ad- ministração de preparação inicial (por exemplo, no tempo 0) e em cada readministração subsequente também dependerá da via de adminis- tração e da gravidade da condição e deve ser decidida de acordo com o julgamento da pessoa versada na técnica e nas circunstâncias de cada sujeito. As doses efetivas podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.
[00205] Um vetor de ceDNA para expressão controlada de transge- ne é administrado em quantidades suficientes para transfectar as célu- las de um tecido desejado e fornecer níveis suficientes de expressão de transgene sem efeitos adversos indevidos. As vias de administra- ção convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre ou- tras, as descritas acima na seção "Administração", como entrega direta ao órgão selecionado (por exemplo, entrega intraportal ao fígado), oral, inalação (incluindo intranasal e administração intratraqueal), in- traocular, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intra-
tumoral e outras vias de administração parentais. As vias de adminis- tração podem ser combinadas, se desejado.
[00206] A dose da quantidade de um vetor de ceDNA na adminis- tração de preparação inicial (por exemplo, no tempo 0) e cada readmi- nistração subsequente para a expressão controlada de transgene ne- cessária para obter um "efeito terapêutico" específico variarão com base em vários fatores, incluindo, mas sem limitação a: a via de admi- nistração de ácido nucleico, o nível de expressão de gene ou RNA ne- cessário para obter um efeito terapêutico, a doença ou distúrbio espe- cífico que está sendo tratado e a estabilidade do gene (ou genes), produto (ou produtos) de RNA ou proteína (ou proteínas) expressa re- sultante. Um versado na técnica pode determinar prontamente uma faixa de dose do vetor de ceDNA para tratar um paciente com uma doença ou distúrbio específico com base nos fatores mencionados acima, bem como em outros fatores que são bem conhecidos na téc- nica.
[00207] O regime de dosagem pode ser ajustado para fornecer a resposta terapêutica ideal. Por exemplo, o oligonucleotídeo pode ser administrado repetidamente, por exemplo, várias doses podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser proporcionalmente re- duzida conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Um versado na técnica será capaz de determinar prontamente doses e esquemas de administração apropriados dos oligonucleotídeos sujei- tos, se os oligonucleotídeos devem ser administrados às células ou aos sujeitos.
[00208] Uma "dose terapeuticamente eficaz" será abrangida em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de ensaios clínicos e dependerá da aplicação específica (as células neu- rais exigirão quantidades muito pequenas, enquanto a injeção sistêmi- ca exigiria grandes quantidades). Por exemplo, para injeção direta in vivo no músculo esquelético ou cardíaco de um sujeito humano, uma dose terapeuticamente eficaz será da ordem de cerca de 1 µg a 100 g do vetor de ceDNA. Se exossomos ou micropartículas forem usadas para fornecer o vetor de ceDNA, então, uma dose terapeuticamente eficaz pode ser determinada experimentalmente, mas é esperado que entregue de 1 μg a cerca de 100 g de vetor. Além disso, uma dose te- rapeuticamente eficaz é uma quantidade de vetor de ceDNA que ex- pressa uma quantidade suficiente do transgene para ter um efeito no sujeito que resulta em uma redução em um ou mais sintomas da do- ença, mas não resulta em efeitos colaterais fora-de-alvo significativos ou efeitos adversos significativos.
[00209] A formulação de excipientes e soluções carreadoras farma- ceuticamente aceitáveis é bem conhecida dos versados na técnica, assim como o desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para usar as composições particulares descritas no pre- sente documento em uma variedade de regimes de tratamento.
[00210] Para transfecção in vitro, uma quantidade eficaz de um ve- tor de ceDNA a ser entregue às células (1x106 células) será da ordem de 0,1 a 100 μg de vetor de ceDNA, preferencialmente, de 1 a 20 μg e, mais preferencialmente, de 1 a 15 μg ou 8 a 10 μg. Vetores maiores de ceDNA exigirão doses mais altas. Se forem utilizados exossomos ou micropartículas, uma dose eficaz in vitro pode ser determinada expe- rimentalmente, mas se destinaria a fornecer geralmente a mesma quantidade do vetor de ceDNA.
[00211] Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria em particu- lar, a falta de resposta imune antiviral típica provocada pela adminis- tração de um vetor de ceDNA conforme descrito na invenção (isto é, a ausência de componentes do capsídeo) permite que o vetor de ceDNA seja administrado a um hospedeiro em várias ocasiões. Em algumas modalidades, o número de ocasiões em que um ácido nucleico heteró-
logo é entregue a um sujeito está na faixa de 2 a 10 vezes (por exem- plo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes). Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA é entregue a um sujeito mais de 10 vezes.
[00212] Em modalidades particulares, mais de uma administração (por exemplo, duas, três, quatro ou mais administrações) pode ser usada para atingir o nível desejado de expressão gênica durante um período de vários intervalos, por exemplo, diário, semanal, mensal, anual, etc.
[00213] Em algumas modalidades, um transgene codificado por um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, conforme descrito no presente documento, pode ser regulado por uma chave reguladora, promotor indutível ou repressível, de modo que seja ex- presso em um sujeito por pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, em pelo menos 5 horas, pelo menos 10 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 1 semana, pelo menos 2 semanas, em pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 12 meses/um ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 5 anos, pelo menos 10 anos, pelo menos 15 anos, pelo menos 20 anos, pelo menos 30 anos, pelo menos 40 anos, pelo me- nos 50 anos ou mais. Em uma modalidade, a expressão pode ser al- cançada por administração repetida dos vetores de ceDNA no presen- te documento descritos em intervalos predeterminados ou desejados. Alternativamente, a expressão controlada de um vetor de ceDNA con- forme descrito no presente documento pode ainda compreender com- ponentes de um sistema de edição de genes (por exemplo, CRISPR/Cas, TALENs, endonucleases de dedos de zinco etc.) para permitir a inserção de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam o transgene para tratamento substancialmente permanente ou "cura" da doença. Esses vetores de ceDNA compreendendo com-
ponentes de edição de genes são descritos no Pedido Internacional PCT/US18/64242 e podem incluir os braços de homologia 5' e 3' (por exemplo, SEQ ID NO: 151 a 154 ou sequências com pelo menos 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% de homologia) para inserção do ácido nuclei- co que codifica o transgene em regiões portuárias seguras, tais como, mas não incluindo o gene da albumina ou o gene CCR5.
[00214] A duração do tratamento depende do progresso clínico do paciente e da capacidade de resposta à terapia. Doses de manuten- ção contínuas e relativamente baixas são contempladas após uma do- se terapêutica inicial mais alta. II. TERAPIA GENÉTICA PERSONALIZADA
[00215] Como discutido no presente documento, os métodos e os vetores de ceDNA descritos no presente documento permitem uma abordagem personalizada da medicina genética, ou seja, titulação de- pendente da dose do nível da expressão do transgene usando redo- ses, por exemplo, de maneira passo a passo com uma ou mais admi- nistrações de redose, a fim de aumentar os níveis de expressão de transgene em uma certa quantidade com cada administração de redo- se. Como tal, as redoses podem ser usadas para titular o nível de ex- pressão do transgene em incrementos. Por conseguinte, em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais de 6 redoses dependentes da dose podem ser administradas para manter e/ou aumentar o nível de expressão do transgene em uma quantidade definida a cada vez (isto é, cada redose), para aumentar o nível de expressão para um nível desejado ou para uma faixa de nível de expressão desejada, que é maior que o nível de expressão alcançado com a administração pre- cedente ou antes dessa administração de redose.
[00216] A capacidade de um versado na técnica de titular a dose de uma composição que compreende vetores de ceDNA como no presen- te documento descrito com base na relação dose-resposta para o ve-
tor é benéfica para o tratamento da doença de várias maneiras. No mínimo, um versado na técnica pode aumentar a dose do vetor de ce- DNA quando se deseja um aumento no efeito (por exemplo, expressão de um transgene). Alternativamente, um versado na técnica pode se- lecionar uma dose que se sabe atingir um nível de expressão que é terapêutico com base no conhecimento prévio da relação dose- resposta para a composição de ceDNA. Em algumas modalidades, pode ser desejável selecionar uma dose relativamente alta na curva de dose-resposta, por exemplo, para acelerar o tratamento para um sujei- to com sintomas graves de uma dada doença. Em contraste, é geral- mente desejável selecionar uma dose baixa na curva de resposta à dose e, opcionalmente, aumentar a dose em incrementos para induzir um efeito terapêutico, além de impedir o aparecimento de efeitos cola- terais indesejáveis ou intolerância à composição. Em uma modalidade, a relação de resposta à dose para um determinado vetor de ceDNA é usada para determinar e/ou estimar uma dose ideal para o tratamento eficaz de uma dada doença que está bem dentro dos limites da janela terapêutica da composição. Ou seja, a titulação da dose de vetores de ceDNA, como no presente documento descrito, maximiza o efeito te- rapêutico do transgene expresso, ao mesmo tempo em que minimiza os efeitos colaterais ou a toxicidade indesejada.
[00217] Apenas como exemplo ilustrativo, os indivíduos com fibrose cística podem ter gravidade diferente da doença e/ou responder de maneira diferente ao mesmo nível de expressão transgênica do gene CFTR1 e/ou ter uma depuração de droga menor ou maior que o nor- mal e, portanto, aumentar a expressão do transgene CFTR1 de manei- ra passo a passo com uma ou mais administrações de redose de um vetor de ceDNA compreendendo um transgene CFTR1 permite que o nível de expressão do transgene CFTR1 seja aumentado em etapas incrementais, ou seja, a um nível de expressão que é eficaz na redu-
ção de um ou mais sintomas da doença de fibrose cística naquele in- divíduo em particular. Precedentemente, tal abordagem personalizada ou método de titulação para aumentar o nível de expressão de um transgene não era eficaz e/ou não era possível devido às respostas imunes associadas a outros vetores baseados em vírus, como os veto- res de AAV.
[00218] Em algumas modalidades, uma administração de redose dependente da dose permite um aumento controlado no nível de ex- pressão do transgene e, portanto, os métodos e composições como no presente documento descritos permitem uma abordagem de medicina personalizada para terapia genética. Apenas como exemplo ilustrativo, indivíduos com fibrose cística podem ter gravidade diferente da doen- ça e/ou responder de maneira diferente ao mesmo nível de expressão transgênica do gene CFTR1 e/ou ter uma depuração de droga menor ou maior que o normal e, portanto, um aumento controlado da expres- são do transgene CFTR1 em uma ou mais administrações de redose dependentes da dose de um vetor de ceDNA compreendendo um transgene CFTR1 permite que o nível de expressão do transgene CFTR1 seja aumentado de uma maneira controlada e, em algumas modalidades, o aumento controlado da expressão pode estar aumen- tado para um nível de expressão que seja eficaz na redução de um ou mais sintomas da doença de fibrose cística naquele indivíduo em par- ticular. Precedentemente, tal abordagem personalizada ou método de titulação para aumentar de forma dependente da dose o nível de ex- pressão de um transgene não era eficaz e/ou não era possível devido às respostas imunes associadas a outros vetores virais ou baseados em AAV.
[00219] Como discutido no presente documento, em algumas mo- dalidades, um sujeito é avaliado em um tempo predeterminado após uma primeira administração de um vetor de ceDNA, por exemplo, a qualquer momento, pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias, ou entre 60 a 90 dias ou mais do que 90 dias após a primeira administra- ção de um vetor de ceDNA para determinar a dose de titulação. Por exemplo, em algumas modalidades, o sujeito é avaliado para determi- nar o estado da doença do sujeito após uma primeira administração de um vetor de ceDNA e/ou o nível de transgene expresso pelo vetor de ceDNA no sujeito.
[00220] Em algumas modalidades, a avaliação do estado da doen- ça é uma avaliação de pelo menos um sintoma da doença no sujeito. O estado da doença para qualquer doença pode ser determinado por um médico ou versado na técnica e inclui a avaliação de um ou mais sintomas clínicos e/ou biomarcadores da doença, incluindo biomarca- dores de proteínas, biomarcadores de miRNA e mRNA e outros siste- mas de perfil molecular.
[00221] Em algumas modalidades, a avaliação do estado da doen- ça em um sujeito pode ser determinada usando o perfil molecular em combinação com a caracterização clínica de um paciente, como ob- servações feitas por um médico (como um código da Classificação In- ternacional de Doenças, por exemplo, e as datas em que esses códi- gos foram determinados), resultados de exames laboratoriais, radio- grafias, resultados de biópsias, declarações feitas pelo paciente e ou- tras informações médicas normalmente utilizadas por um médico para diagnosticar uma doença específica. Os métodos para determinar um estado de doença com base no perfil molecular de um sujeito são des- critos em Patentes e Pedidos de Patente dos EUA, 7.167.734,
9.372.193, 9.383.365, 2006/0224191, 2011/0172501, 2009/0104596, 2009/0023149 cada um no presente documento incorporado na sua totalidade.
[00222] Em algumas modalidades, os métodos no presente docu- mento descritos podem ser usados para titular o vetor de ceDNA ao sujeito para intervenção médica individualizada para um estado de do- ença específico.
[00223] Examinar as alterações de vários biomarcadores fornece informações sobre o status do sujeito do qual os biomarcadores são obtidos. Compreender como os biomarcadores mudam (por exemplo, aumentam, diminuem, não mudam) com a progressão da doença, de modo que a medição de uma única amostra biológica em um único momento permita a verificação (por exemplo, doença ou não), tipifica- ção e caracterização de uma doença estado (por exemplo, fase inicial ou de "início" versus fase tardia ou de "recuperação").
[00224] Em algumas modalidades, biomarcadores para avaliar o estado de progressão da doença, como início ou recuperação, com base no nível de cada um dos biomarcadores, bem como sua tendên- cia (aumento, diminuição ou constante) com o tempo pode ser avalia- da. A criação de perfil de biomarcadores para um estado de doença em questão também pode ser combinada com outras técnicas, como relações isotópicas estáveis que ocorrem naturalmente na respiração (por exemplo, US 5.912.178), para avaliar se um indivíduo é saudável ou está em um estado de doença. Os estados de doença são detecta- dos medindo-se mudanças nos níveis de biomarcadores e, particular- mente, uma pluralidade de biomarcadores interrelacionados dentro de uma via biológica associada ao estado da doença. Em algumas moda- lidades, um estado de doença específico pode ser caracterizado pela detecção e análise de sinais complexos dos espectros de RMN para determinar biomarcadores cujos níveis estão mudando à medida que a doença progride. Essa avaliação inicial do estado da doença permite "impressões digitais" das mudanças dinâmicas associadas à progres- são da doença e auxilia na avaliação do status atual da progressão e do processo da doença. Quando o estado da doença é identificado, a administração do vetor de ceDNA pode ser adaptada e/ou titulada ao indivíduo, de modo a reduzir o curso do tempo da doença.
[00225] Em algumas modalidades, pode-se avaliar um estado de doença avaliando o perfil de biomarcador dentro de uma amostra bio- lógica obtida de um sujeito. Os biomarcadores específicos que são medidos são determinados a partir de uma análise das principais vias bioquímicas subjacentes à doença e da resposta imune do hospedeiro associado. Em uma modalidade, um perfil padrão de biomarcador é obtido de um indivíduo saudável e de um indivíduo com a doença. A comparação do perfil de biomarcador da amostra biológica com o perfil padrão de biomarcador (saudável e doença) permite que um estado de doença seja identificado positivamente. Opcionalmente, uma segunda amostra biológica é isolada do paciente em um segundo momento ou no tempo de progressão da doença para obter uma tendência no perfil de biomarcadores (por exemplo, quais biomarcadores estão mudando entre a primeira e a segunda amostras), fornecendo informações adi- cionais sobre a situação da doença ou estado do paciente. Em algu- mas modalidades, um perfil padrão de biomarcador é avaliado em um ou mais dos seguintes tempos; antes da primeira administração do ve- tor de ceDNA, após pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias, ou entre 60 a 90 dias ou mais de 90 dias após a primeira administração de um vetor de ceDNA, ou após pelo menos 30 dias, ou pelo menos pelo menos 60 dias, ou entre 60 a 90 dias ou mais de 90 dias após a segunda administração (por exemplo, de redose) de um vetor de ceD- NA, ou após pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias, ou entre 60 a 90 dias ou mais 90 dias após quaisquer administrações subsequentes (por exemplo, administrações de redose) de um vetor de ceDNA.
[00226] Biomarcadores de proteínas foram identificados para diabe- tes, Doença de Alzheimer e câncer. (Ver, por exemplo, as Patentes US
7.125.663; 7.097.989; 7.074.576; e 6.925.389, que são no presente documento incorporadas na sua totalidade). Métodos para detecção de biomarcadores de proteínas, como espectrometria de massa e aglutinação específica a anticorpos, também podem ser utilizados. Mé- todos de análise de expressão de alto rendimento usando microarran- jos podem ser usados para biomarcadores de mRNA, bem como ar- ranjos focados e qPCR para vários genes relevantes para identificar genes relacionados ao estresse consulte, por exemplo, WO2007106685A2. Microarranjos de DNA têm sido utilizados para medir a expressão gênica em amostras de tumores de pacientes e pa- ra facilitar o diagnóstico. A expressão gênica pode revelar a presença de câncer em um paciente, seu tipo, estágio e origem e se estão en- volvidas mutações genéticas. A expressão gênica pode até ter um pa- pel na previsão da eficácia da quimioterapia. Nas últimas décadas, o Instituto Nacional do Câncer (NCI) testou compostos, incluindo agen- tes quimioterápicos, quanto ao seu efeito na limitação do crescimento de 60 linhas celulares de câncer humano. O NCI também mediu a ex- pressão de gene nessas 60 linhas celulares de câncer usando micro- arranjos de DNA. Vários estudos exploraram a relação entre expres- são de gene e efeito composto usando os conjuntos de dados NCI. O tempo crítico geralmente é perdido devido a uma abordagem de tenta- tiva e erro de encontrar uma quimioterapia eficaz para pacientes com câncer. Além disso, as células cancerígenas frequentemente desen- volvem resistência a uma terapia previamente eficaz. Em tais situa- ções, o resultado do paciente poderia ser muito melhorado pela detec- ção precoce dessa resistência.
[00227] Em algumas modalidades, o nível de expressão do biomar- cador de um estado de doença é determinado medindo o nível de mRNA transcrito do gene (ou genes), detectando o nível de um produ- to proteico do gene (ou genes) ou detectando o nível da atividade bio- lógica de um produto proteico do gene (ou genes). Em algumas moda- lidades, o nível de um biomarcador (incluindo biomarcadores de miR-
NA) de um estado de doença é medido usando uma reação quantitati- va em cadeia da polimerase por transcrição reversa (qRT-PCR). Tais métodos para medir produtos de expressão gênica, por exemplo, nível de proteína, incluem ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), western blot e imunoprecipitação, imunofluorescência usando reagen- tes de detecção, como um anticorpo ou agentes de ligação a proteí- nas. Alternativamente, um peptídeo pode ser detectado em um sujeito, introduzindo no sujeito um anticorpo antipeptídeo marcado e outros tipos de agente de detecção. Por exemplo, o anticorpo pode ser mar- cado com um marcador radioativo cuja presença e localização no su- jeito são detectadas por técnicas de imagem padrão.
[00228] Em certas modalidades, os produtos de expressão gênica podem ser determinados medindo o nível de expressão do RNA men- sageiro (mRNA) de um biomarcador de doença. Tais moléculas podem ser isoladas, derivadas ou amplificadas a partir de uma amostra bioló- gica, como sangue total ou plasma, por exemplo, plasma rico em pla- quetas. A detecção da expressão do mRNA é conhecida pelos versa- dos na técnica e compreende, por exemplo, mas não se limitando a, procedimentos de PCR, RT-PCR, análise de Northern blot, expressão diferencial de genes, teste de proteção de RNA, ensaio de microarran- jos, análise de microarranjos, métodos de hibridação etc. Em algumas modalidades, o nível dos mRNAs pode ser medido usando RT-PCR quantitativo. Em geral, o procedimento de PCR descreve um método de amplificação de genes que é composto por: (i) hibridação específica de sequência de iniciadores para genes ou sequências específicas dentro de uma amostra ou biblioteca de ácido nucleico; (ii) amplifica- ção subsequente envolvendo várias rodadas de anelamento, alonga- mento, e desnaturação usando uma polimerase de DNA termoestável e (iii) rastreio dos produtos de PCR para uma banda do tamanho cor- reto. Os iniciadores utilizados são oligonucleotídeos de comprimento suficiente e sequência apropriada para proporcionar o início da polime- rização, isto é, cada iniciador é especificamente projetado para ser complementar a uma fita do locus genômico a ser amplificado. Em uma modalidade alternativa, o nível de mRNA dos produtos de ex- pressão gênica no presente documento descritos pode ser determina- do por PCR de transcrição reversa (RT) e por métodos quantitativos de RT-PCR (QRT-PCR) ou PCR em tempo real. Os métodos de RT- PCR e QRT-PCR são bem conhecidos na técnica.
[00229] Em algumas modalidades, os métodos para medir um ou mais biomarcadores para um estado de doença ou o nível da expres- são do transgene do vetor de ceDNA podem ser um ensaio seleciona- do dentre qualquer uma das seguintes: análise imunoistoquímica (IHC) e/ou análise de microarranjo, um microarranjo de hibridação genômica comparativa (CGH), um arranjo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), uma hibridação in situ fluorescente (ISH), uma hibridação in situ (ISH) e um arranjo proteômico.
[00230] O termo "Microarranjo", conforme no presente documento utilizado, significa um dispositivo usado por qualquer método que quantifique um ou mais oligonucleotídeos em questão, por exemplo, DNA ou RNA, ou análogos dos mesmos, por vez. Uma classe exem- plar de microarranjos consiste em sondas de DNA ligadas a uma su- perfície de vidro ou quartzo. Muitos microarranjos, por exemplo, aque- les fabricados pela Affymetrix, usam várias sondas para determinar a expressão de um único gene. O microarranjo de DNA pode conter sondas oligonucleotídicas que podem ser, por exemplo, cDNAs de comprimento total complementares a um RNA ou fragmentos de cDNA que hibridizam com parte de um RNA. RNAs exemplares incluem mRNA, miRNA e precursores de miRNA. Exemplos de microarranjos também incluem um "microarranjo de ácido nucleico" com uma plurali- dade de ácidos nucleicos ligados ao substrato, sendo hibridada a cada uma da pluralidade de ácidos nucleicos ligados detectável separada- mente. O substrato pode ser sólido ou poroso, plano ou não plano, uni- tário ou distribuído. Exemplos de microarranjos de ácidos nucleicos incluem todos os dispositivos denominados em Schena (ed.), DNA Mi- croarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21 (1) (supl.): 1 a 60 (1999); e Schena (ed.), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publi- shing Company/BioTechniques Books Division (2000). Além disso, exemplos de microarranjos de ácidos nucleicos podem incluir uma plu- ralidade de ácidos nucleicos ligados ao substrato, na qual a pluralida- de de ácidos nucleicos está disposta em uma pluralidade de esferas, em vez de em um substrato plano unitário, como é descrito, entre ou- tros, em Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97 (4): 1.665 a
1.670 (2000). Exemplos de microarranjos de ácido nucleico podem ser encontrados na Pat. n.os. 6.391.623, 6.383.754, 6.383.749, 6.380.377,
6.379.897, 6.376.191, 6.372.431, 6.351.712, 6.344.316, 6.316.193,
6.312.906, 6.309.828, 6.309.824, 6.306.643, 6.300.063, 6.287.850,
6.284.497, 6.284.465, 6.280.954, 6.262.216, 6.251.601, 6.245.518,
6.263.287, 6.251.601, 6.238.866, 6.228.575, 6.214.587, 6.203.989,
6.171.797, 6.103.474, 6.083.726, 6.054.274, 6.040.138, 6.083.726,
6.004.755, 6.001.309, 5.958.342, 5.952.180, 5.936.731, 5.843.655,
5.814.454, 5.837.196, 5.436.327, 5.412.087 e 5.405.783, incorporados no presente documento a título de referência.
[00231] Exemplos de microarranjos também podem incluir "microar- ranjos de peptídeos" ou "microarranjos de proteínas" que têm uma plu- ralidade de polipeptídeos ligados ao substrato, a aglutinação de um oligonucleotídeo, um peptídeo ou uma proteína à pluralidade de poli- peptídeos ligados sendo detectáveis separadamente. Alternativamen- te, o microarranjo de peptídeo pode ter uma pluralidade de ligantes, incluindo, mas não limitado a, anticorpos monoclonais, anticorpos poli-
clonais, aglutinantes de exibição de fagos, aglutinantes híbridos de le- vedura 2, aptâmeros, que podem detectar especificamente a ligação de oligonucleotídeos, peptídeos ou proteínas. Exemplos de matrizes peptídicas podem ser encontrados nas Publicações Internacionais de Patentes n.os. WO 02/31463, WO 02/25288, WO 01/94946, WO 01/88162, WO 01/68671, WO 01/57259, WO 00/61806, WO 00/54046, WO 00/47774, WO 99/40434, WO 99/39210 e WO 97/42507, e nas Patentes n.os. U.S. 6.268.210, 5.766.960 e 5.143.854, no presente do- cumento incorporadas por referência.
[00232] Em algumas modalidades, se o estado da doença do sujei- to tiver permanecido em estado estacionário, ou não tiver melhorado, ou onde o estado da doença tiver piorado no sujeito, por exemplo, em comparação com o estado da doença no momento da primeira admi- nistração do vetor de ceDNA ou a qualquer momento antes da admi- nistração do vetor de ceDNA, o sujeito recebe uma segunda dose do vetor de ceDNA, por exemplo, em que em algumas modalidades, a quantidade de vetor de ceDNA administrada é uma dose titulada.
[00233] Em modalidades alternativas, se o nível de expressão do transgene no sujeito tiver declinado de um nível predeterminado ou declinado de uma quantidade terapeuticamente eficaz, por exemplo, caiu do nível de expressão inicial do transgene após a primeira admi- nistração do vetor de ceDNA, ao sujeito é administrado uma segunda dose do vetor de ceDNA, por exemplo, em que em algumas modalida- des, a quantidade de vetor de ceDNA administrada é uma dose titula- da. Em algumas modalidades, o nível da expressão do transgene é determinado medindo o nível do transgene (por exemplo, medindo o nível de proteína e/ou os níveis de mRNA) expresso a partir do vetor de ceDNA em uma amostra biológica obtida do sujeito. Em algumas modalidades, a amostra biológica é selecionada de qualquer uma das seguintes amostras de: sangue, plasma, fluido sinovial, LCR, saliva ou biópsia de tecido.
[00234] Em algumas modalidades, onde o vetor de ceDNA expres- sa uma proteína repórter, além de um transgene que codifica uma pro- teína ou gene terapêutico desejado, o nível do transgene pode ser de- terminado medindo o nível de proteína repórter expresso a partir do vetor de ceDNA in vivo, usando métodos comumente conhecidos pe- las pessoas versadas na técnica. Em algumas modalidades, a titula- ção do vetor de ceDNA está determinando o nível de transgene ex- presso a partir do vetor de ceDNA e administrando uma segunda dose do vetor de ceDNA ao sujeito para ajustar ou modular a expressão do transgene para um nível desejado predeterminado. III. VETOR DE ceDNA EM GERAL
[00235] Modalidades da invenção são baseadas em métodos e composições que compreendem vetores duplex lineares próximos (ceDNA) que podem expressar um transgene, como no presente do- cumento definido. Os vetores de ceDNA no presente documento des- critos não são limitados pelo tamanho, permitindo, por exemplo, a ex- pressão de todos os componentes necessários para a expressão de um transgene a partir de um único vetor. O vetor de ceDNA é prefe- rencialmente duplex, por exemplo, autocomplementar, sobre pelo me- nos uma porção da molécula, como a cassete de expressão (por exemplo, ceDNA não é uma molécula circular de fita dupla). O vetor de ceDNA tem extremidades covalentemente fechadas, e, assim, é resis- tente à digestão com exonuclease (por exemplo, exonuclease I ou exonuclease III), por exemplo, por mais de uma hora a 37 C. Em al- gumas modalidades, um vetor de ceDNA como no presente documen- to descrito é translocado para o núcleo onde a expressão do transgene no vetor de ceDNA, por exemplo, pode ocorrer o transgene para medi- cina genética. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como no presente documento descrito é translocado para o núcleo onde pode ocorrer a expressão do transgene, por exemplo, transgene de medici- na genética localizado entre as duas ITRs.
[00236] Em um aspecto, um vetor de ceDNA descrito no presente documento compreende, na direção 5' a 3': uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de vírus adenoassociado (AAV), uma sequên- cia de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um cassete de expres- são como no presente documento descrito) e um segundo ITR de AAV. As sequências de ITR selecionadas a partir de: (i) pelo menos uma WT ITR e pelo menos uma repetição terminal invertida de AAV modificada (mod-ITR) (por exemplo, ITRs assimétricas modificadas); (ii) duas ITRs modificadas, em que o par de mod-ITRs tem uma orga- nização espacial tridimensional diferente uma da outra (por exemplo, ITRs modificadas assimétricas) ou (iii) par WT-WT ITR simétrico ou substancialmente simétrico, em que cada WT-ITR tem a mesma orga- nização espacial tridimensional, ou (iv) par de ITRs modificado simétri- co ou substancialmente simétrico, em que cada mod-ITR tem a mes- ma organização espacial tridimensional.
[00237] São no presente documento abrangidos métodos e compo- sições compreendendo o vetor de ceDNA, que pode incluir ainda um sistema de entrega, tal como, sem limitação, um sistema de entrega de nanopartículas de lipossomas. Sistemas exemplificativos não limita- tivos de nanopartículas de lipossomas abrangidos para uso são no presente documento descritos. Em alguns aspectos, a invenção forne- ce uma nanopartícula lipídica que compreende ceDNA e um lipídeo ionizável. Por exemplo, uma formulação de nanopartículas lipídicas que é feita e carregada com um vetor de ceDNA obtido pelo processo é descrita no Pedido Internacional PCT/US2018/050042, depositado em 7 de setembro de 2018, que é incorporado ao presente documen- to.
[00238] Os vetores de ceDNA descritos no presente documento não têm restrições de empacotamento impostas pelo espaço limitador den- tro do capsídeo viral. Os vetores de ceDNA representam uma alterna- tiva viável produzida por eucariotos aos vetores de DNA de plasmídeo produzidos em procariotos, em oposição aos genomas de AAV encap- sulados. Isso permite a inserção de elementos de controle, por exem- plo, chaves reguladoras, conforme descrito neste documento, grandes transgenes, múltiplos transgenes etc.
[00239] A Figura 1A a 1E mostram esquemas de vetores de ceD- NA exemplares não limitativos ou a sequência correspondente de plasmídeos de ceDNA. Os vetores de ceDNA são livres de capsídeo e podem ser obtidos a partir de um plasmídeo que codifica nesta ordem: uma primeira ITR, um cassete de expressão compreendendo um transgene e uma segunda ITR. O cassete de expressão pode incluir uma ou mais sequências reguladoras que permitem e/ou controlam a expressão do transgene, por exemplo, onde o cassete de expressão pode compreender um ou mais de, nesta ordem: um potencia- dor/promotor, um repórter de ORF (transgene), um elemento regulador pós-transcrição (por exemplo, WPRE) e um sinal de poliadenilação e terminação (por exemplo, BGH poliA).
[00240] O cassete de expressão também pode compreender um local interno de entrada do ribossomo (IRES) (por exemplo, SEQ ID NO: 190) e/ou um elemento 2A. Os elementos cis-reguladores inclu- em, mas não estão limitados a um promotor, uma chave de ribossomo, um isolador, um elemento regulável por mir, um elemento regulador pós-transcricional, um promotor específico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor do transgene. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para regular a expressão do transgene, por exemplo, uma chave reguladora, que é descrita no pre- sente documento na seção intitulada "Chaves Reguladoras" para con-
trolar e regular a expressão do transgene e pode incluir, se desejado, uma chave reguladora que é uma chave de destruição para permitir a morte celular controlada de uma célula que compreende um vetor de ceDNA.
[00241] O cassete de expressão pode compreender mais de 4.000 nucleotídeos, 5.000 nucleotídeos, 10.000 nucleotídeos ou 20.000 nu- cleotídeos ou 30.000 nucleotídeos ou 40.000 nucleotídeos ou 50.000 nucleotídeos, ou qualquer faixa entre cerca de 4.000 a 10.000 nucleo- tídeos ou 10.000 a 50.000 nucleotídeos ou mais de 50.000 nucleotí- deos. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode com- preender um transgene na faixa de 500 a 50.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene na faixa de 500 a 75.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene na faixa de 500 a 10.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene na faixa de 1.000 a 10.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene na faixa de 500 a 5.000 nucleotídeos de comprimento. Os vetores de ceDNA não têm as limitações de ta- manho dos vetores de AAV encapsidados, permitindo, assim, a entre- ga de um cassete de expressão de tamanho grande para fornecer transgenes eficientes. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é desprovido de metilação específica de procarionte.
[00242] O cassete de expressão de ceDNA pode incluir, por exem- plo, uma sequência exógena expressável (por exemplo, quadro de lei- tura aberto) ou transgene que codifica uma proteína que está ausente, inativa ou é insuficiente no sujeito receptor ou um gene que codifica uma proteína que possui um efeito biológico ou terapêutico desejado. O transgene pode codificar um produto de gene que pode funcionar para corrigir a expressão de um gene ou transcrição defeituoso. Em princípio, o cassete de expressão pode incluir qualquer gene que codi- fique uma proteína, polipeptídeo ou RNA que seja reduzido ou ausente devido a uma mutação ou que transmita um benefício terapêutico quando superexpressado for considerado dentro do escopo da inven- ção.
[00243] O cassete de expressão pode compreender qualquer trans- gene útil para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um sujeito. O vetor de ceDNA pode ser usado para entregar e expressar qualquer gene de interesse no sujeito, que inclui, entre outros, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ou ácidos nucleicos não codificadores (por exemplo, RNAi, miRs etc.), bem como genes e nucleotídeos exógenos sequências, incluindo sequências de vírus no genoma de um sujeito, por exemplo, sequências de vírus de HIV e similares. Preferencialmen- te, um vetor de ceDNA descrito no presente documento é usado para fins terapêuticos (por exemplo, para usos médicos, de diagnóstico ou veterinários) ou polipeptídeos imunogênicos. Em certas modalidades, um vetor de ceDNA é útil para expressar qualquer gene de interesse no sujeito, que inclui um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, ácidos nucleicos peptídicos, siRNAs, RNAis, oligonucleotídeos antis- senso, polinucleotídeos antissenso ou RNAs (codificadores ou não co- dificadores; por exemplo, siRNAs, shRNAs, micro-RNAs e suas con- trapartes antissenso (por exemplo, antagoMiR)), anticorpos, fragmen- tos de ligação a antígeno ou qualquer combinação dos mesmos.
[00244] O cassete de expressão também pode codificar polipeptí- deos, oligonucleotídeos senso ou antissenso ou RNAs (codificadores ou não codificadores; por exemplo, siRNAs, shRNAs, micro-RNAs e seus equivalentes antissenso (por exemplo, antagoMiR)). Os cassetes de expressão podem incluir uma sequência exógena que codifica uma proteína repórter a ser usada para fins experimentais ou de diagnósti-
co, como β-lactamase, β-galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina, timi- dina cinase, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetil- transferase (CAT), luciferase e outros bem conhecidos na técnica.
[00245] As sequências fornecidas no cassete de expressão, cons- truto de expressão de um vetor de ceDNA no presente documento descrito podem ser otimizadas por códon para a célula hospedeira. Como usado no presente documento, o termo "otimização de códon" ou "otimização de códon" refere-se ao processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão aprimorada nas cé- lulas do vertebrado de interesse, por exemplo, camundongo ou ser humano, substituindo pelo menos um, mais de um ou um número sig- nificativo de códons da sequência nativa (por exemplo, uma sequência procariótica) com códons que são mais frequentemente ou mais fre- quentemente usados nos genes desse vertebrado. Várias espécies exibem viés particular para certos códons de um aminoácido particular. Tipicamente, a otimização do códon não altera a sequência de amino- ácidos da proteína traduzida original. Os códons otimizados podem ser determinados usando, por exemplo, a plataforma de otimização de có- dons Gene Forge® da Aptagen e síntese genética personalizada (Ap- tagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) ou outro banco de dados disponível publicamente.
[00246] Em algumas modalidades, um transgene expresso pelo ve- tor de ceDNA para expressão controlada como no presente documen- to descrito é um gene terapêutico. Em algumas modalidades, um gene terapêutico é um anticorpo, ou fragmento de anticorpo, ou seu frag- mento de ligação a antígeno, ou uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, o anticorpo ou proteína de fusão do mesmo é um anti- corpo ativador ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo neutralizan- te e similares. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de genes compreende um anticorpo ou proteína de fusão, conforme descrito na patente internacional PCT/US19/18016, depositada em 14 de fevereiro de 2019, que é incorporada no presente documento na sua totalidade por referência.
[00247] Em particular, um gene terapêutico é um ou mais agentes terapêuticos, incluindo, mas não limitado a, por exemplo, proteína (ou proteínas), polipeptídeo (ou polipeptídeos), peptídeo (ou peptídeos), enzima (ou enzimas), anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, bem como variantes e/ou fragmentos ativos dos mesmos, para uso no tratamento, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sintomas de uma doença, disfunção, lesão e/ou desordem. Genes terapêuticos exem- plares são descritos no presente documento na seção intitulada "Mé- todo de tratamento".
[00248] Existem muitas características estruturais dos vetores de ceDNA que diferem dos vetores de expressão baseados em plasmí- deo. Os vetores de ceDNA podem possuir uma ou mais das seguintes características: a falta de DNA bacteriano original (isto é, não inserido), a falta de uma origem de replicação procariótica, ser autossuficiente, ou seja, os mesmos não necessitam de nenhuma sequência além das duas ITRs, incluindo os locais de ligação a Rep e resolução terminal (RBS e TRS), e uma sequência exógena entre as ITRs, a presença de sequências ITR que formam grampos e a ausência de metilação do DNA do tipo bacteriano ou qualquer outra metilação considerada anormal por um hospedeiro mamífero. Em geral, é preferido que os presentes vetores não contenham DNA procariótico, mas é contem- plado que algum DNA procariótico possa ser inserido como uma se- quência exógena, como um exemplo não limitativo em uma região promotora ou intensificadora. Outra característica importante que dis- tingue os vetores de ceDNA dos vetores de expressão de plasmídeo é que os vetores de ceDNA são DNA linear de fita simples com extremi- dades fechadas, enquanto os plasmídeos são sempre DNA de fita du-
pla.
[00249] Os vetores de ceDNA produzidos pelos métodos no presen- te documento fornecidos preferencialmente têm uma estrutura linear e contínua em vez de uma estrutura não contínua, conforme determina- do pelo ensaio de digestão com enzimas de restrição (Figura 4D). Acredita-se que a estrutura linear e contínua seja mais estável do ata- que por endonucleases celulares, bem como menos provável de ser recombinada e causar mutagênese. Assim, um vetor de ceDNA de es- trutura linear e contínua é uma modalidade preferida. O vetor de ceD- NA duplex intramolecular de fita simples, linear e contínua, pode ter extremidades terminais ligadas covalentemente, sem sequências que codificam proteínas do capsídeo AAV. Esses vetores de ceDNA são estruturalmente distintos dos plasmídeos (incluindo plasmídeos de ce- DNA no presente documento descritos), que são moléculas de ácido nucleico duplex circular de origem bacteriana. As fitas complementares de plasmídeos podem ser separadas após a desnaturação para pro- duzir duas moléculas de ácido nucleico, enquanto, por outro lado, os vetores de ceDNA, embora tenham fitas complementares, são uma única molécula de DNA e, portanto, mesmo se desnaturados, perma- necem uma única molécula. Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA como no presente documento descritos podem ser produzidos sem a metilação da base de DNA do tipo procariótico, diferentemente dos plasmídeos. Portanto, os vetores de ceDNA e os plasmídeos ce- DNA são diferentes tanto em termos de estrutura (em particular, linea- res versus circulares) quanto em vista dos métodos utilizados para produzir e purificar esses diferentes objetos (consulte abaixo) e tam- bém em vista de sua metilação do DNA, que é do tipo procariótico pa- ra plasmídeos ceDNA e do tipo eucariótico para o vetor de ceDNA.
[00250] Existem várias vantagens do uso de um vetor de ceDNA, como descrito no presente documento, em comparação com vetores de expressão baseados em plasmídeos, tais vantagens incluem, mas não estão limitadas a: 1) plasmídeos conterem sequências de DNA bacterianas e estarem sujeitos a metilação específica de procarióticos, por exemplo, metilação de 6-metil adenosina e 5-metil citosina, en- quanto as sequências de vetores de AAV sem capsídeo são de origem eucariótica e não sofrem metilação específica de procariótica; como resultado, os vetores de AAV sem capsídeo são menos propensos a induzir respostas inflamatórias e imunológicas em comparação com plasmídeos; 2) enquanto os plasmídeos requerem a presença de um gene de resistência durante o processo de produção, os vetores de ceDNA não; 3) enquanto um plasmídeo circular não é entregue ao nú- cleo após a introdução em uma célula e requer sobrecarga para con- tornar a degradação por nucleases celulares, os vetores de ceDNA contêm elementos cis virais, ou seja, ITRs, que conferem resistência às nucleases e podem ser projetados para serem direcionados e en- tregues ao núcleo.
É hipotetizado que os elementos definidores míni- mos indispensáveis para a função ITR sejam um local de ligação a Rep (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) para AAV2) e um local de resolução terminal (TRS; 5'-AGTTGG-3' (SEQ ID NO: 64) para AAV2) mais uma sequência palindrômica variável que permite a formação de grampo; e 4) os vetores de ceDNA não têm a superrepresentação de dinucleotídeos CpG frequentemente encontra- dos em plasmídeos derivados de procariontes que supostamente li- gam um membro da família de receptores do tipo Toll, provocando uma resposta imune mediada por células T.
Por outro lado, as trans- duções com vetores de AAV sem capsídeo no presente documento descritos podem direcionar eficientemente tipos de células e tecidos que são difíceis de transduzir com vírions de AAV convencionais usando vários reagentes de entrega.
IV.
ITRs
[00251] Conforme descrito neste documento, os vetores de ceDNA para expressão controlada contêm uma sequência de ácido nucleico de edição de genes posicionada entre duas sequências de repetição terminal invertida (ITR), em que as sequências ITR podem ser um par de ITRs assimétricas ou um par de ITRs simétricas ou substancial- mente simétricas, conforme esses termos são definidos no presente documento. Um vetor de ceDNA descrito neste documento pode com- preender sequências ITR que são selecionadas a partir de: (i) pelo menos uma WT-ITR e pelo menos uma repetição terminal invertida de AAV modificada (mod-ITR) (por exemplo, ITRs assimétricas modifica- das); (ii) duas ITRs modificadas, em que o par de mod-ITRs possui uma organização espacial tridimensional diferente uma da outra (por exemplo, ITRs modificadas assimétricas) ou (iii) par de WT-WT ITRs simétricas ou substancialmente simétricas, em que cada WT-ITR tem a mesma organização espacial tridimensional ou (iv) par de ITRs modi- ficadas simétricas ou substancialmente simétricas, em que cada mod- ITR tem a mesma organização espacial tridimensional, em que os mé- todos da presente invenção podem incluir ainda um sistema de entre- ga, como, sem limitação, um sistema de entrega de nanopartículas de lipossomas.
[00252] Em algumas modalidades, a sequência ITR pode ser de vírus da família Parvoviridae, que inclui duas subfamílias: Parvovirinae, que infectam vertebrados, e Densovirinae, que infectam insetos. A subfamília Parvovirinae (denominada parvovírus) inclui o gênero De- pendovirus, cujos membros, na maioria das condições, necessitam de coinfecção com um vírus auxiliar, como adenovírus ou vírus do herpes, para infecção produtiva. O gênero Dependovírus inclui vírus adenoas- sociado (AAV), que normalmente infecta seres humanos (por exemplo, sorotipos 2, 3A, 3B, 5 e 6) ou primatas (por exemplo, sorotipos 1 e 4) e vírus relacionados que infectam outros vírus animais com sangue (por exemplo, vírus adenoassociados bovinos, caninos, equinos e ovinos). Os parvovírus e outros membros da família Parvoviridae são geral- mente descritos em Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Capítulo 69 em FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996).
[00253] Embora as ITRs exemplificativas na especificação e nos Exemplos no presente documento contidos sejam WT-ITRs AAV2, um especialista na técnica está ciente de que é possível, conforme indica- do acima, usar ITRs de qualquer parvovírus conhecido, por exemplo, um dependovírus como o AAV (por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ e AAV-DJ8. Por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITRs quiméricas ou ITRs de qualquer AAV sintético. Em algumas modalidades, o AAV pode infectar animais de sangue quente, por exemplo, vírus adenoassociado a aves (AAAV), bovinos (BAAV), caninos, equinos e ovinos. Em algumas modalidades, a ITR é do par- vovírus B19 (nº de acesso ao GenBank: NC 000883), vírus em minutos do mouse (MVM) (nº de acesso ao GenBank NC 001510); parvovírus de ganso (nº de acesso ao GenBank NC 001701); parvovírus de cobra 1 (número de acesso ao GenBank NC 006148). Em algumas modali- dades, o WT-ITR 5' pode ser de um sorotipo e o WT-ITR 3' de um so- rotipo diferente, como discutido no presente documento.
[00254] Um indivíduo versado na técnica sabe que as sequências de ITR têm uma estrutura comum de uma junção de Holliday de fita dupla, que normalmente é uma estrutura em formato de grampo em forma de T ou Y (consulte, por exemplo, Figura 2A e Figura 3A), em que cada WT-ITR é formada por dois braços ou alças palíndricas (B-B' e C-C') embebidos em um braço palíndrico maior (A-A') e uma se- quência D de cadeia simples (em que a ordem dessas sequências pa- lindrômicas define a orientação de inversão da ITR). Consulte, por exemplo, análise estrutural e comparação de sequências de ITRs de diferentes sorotipos de AAV (AAV1-AAV6) e descritas em Grimm et al., J. Virology, 2006; 80 (1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364- 379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14. Um versado na técnica po- de determinar facilmente sequências WT-ITR de qualquer sorotipo AAV para uso em um vetor de ceDNA ou ceDNA-plasmídeo com base nas sequências exemplificativos de ITR AAV2 no presente documento fornecidas. Consulte, por exemplo, a comparação de sequências de ITRs de diferentes sorotipos de AAV (AAV1 a AAV6 e AAV aviário (AAAV) e AAV bovino (BAAV)) descritos em Grimm et al., J. Virology, 2006; 80 (1); 426 a 439; que mostram a % de identidade da ITR es- querda do AAV2 para a ITR esquerda de outros sorotipos: AAV-1 (84%), AAV-3 (86%), AAV-4 (79%), AAV-5 (58%), AAV-6 (ITR esquer- da) (100%) e AAV-6 (ITR direita) (82%). A. PARES DE ITRS SIMÉTRICAS
[00255] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como des- crito no presente documento compreende, na direção 5' a 3': uma pri- meira repetição terminal invertida (ITR) de vírus adenoassociado (AAV), uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um cassete de expressão como descrito no presente documento) e uma segunda ITR de AAV, em que a primeira ITR (ITR 5') e a segunda ITR (ITR 3') são simétricas ou substancialmente simétricas uma em rela- ção à outra - ou seja, um vetor de ceDNA de edição de genes pode compreender sequências de ITR que possuem uma organização es- pacial tridimensional simétrica, de modo que sua estrutura tenha a mesma forma no espaço geométrico ou possua as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D. Em tal modalidade, um par de ITRs simétri- cas ou um par de ITRs substancialmente simétricas podem ser ITRs modificadas (por exemplo, mod-ITRs) que não são ITRs do tipo selva- gem. Um par de mod-ITRs pode ter a mesma sequência que tem uma ou mais modificações da ITR do tipo selvagem e são complementos reversos (invertidos) um do outro. Em modalidades alternativas, um par de ITRs modificado é substancialmente simétrico, conforme defini- do no presente documento, ou seja, o par de ITRs modificado pode ter uma sequência diferente, mas tem a forma tridimensional simétrica correspondente ou a mesma. (i) ITRs de tipo selvagem
[00256] Em algumas modalidades, as ITRs simétricas ou ITRs substancialmente simétricas são do tipo selvagem (WT-ITRs), confor- me descrito no presente documento. Ou seja, ambas as ITRs têm uma sequência do tipo selvagem, mas não necessariamente precisam ser WT-ITRs do mesmo sorotipo AAV. Ou seja, em algumas modalidades, uma WT-ITR pode ser de um sorotipo AAV e a outra WT-ITR pode ser de um sorotipo AAV diferente. Em tal modalidade, um par de WT-ITRs é substancialmente simétrico como no presente documento definido, ou seja, as mesmas podem ter uma ou mais modificações conservado- ras de nucleotídeo enquanto ainda mantêm a organização espacial tridimensional simétrica.
[00257] Por conseguinte, como no presente documento descrito, os vetores de ceDNA para expressão controlada de transgene contêm uma sequência de ácido nucleio heteróloga ou transgene posicionada entre duas sequências de repetição terminal invertida de tipo selvagem (WT-ITR), que são o complemento reverso (invertido) um do outro ou, alternativamente, são substancialmente simétricos em relação um ao outro - ou seja, um par de WT-ITRs tem organização espacial tridi- mensional simétrica. Em algumas modalidades, uma sequência ITR de tipo selvagem (por exemplo, AAV WT-ITR) compreende um local de ligação a Rep funcional (RBS; por exemplo, 5′- GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ para AAV2, SEQ ID NO: 60) e um local de resolução terminal funcional (TRS; por exemplo, 5'-AGTT-3', SEQ
ID NO: 62).
[00258] Em um aspecto, os vetores de ceDNA para expressão con- trolada de transgene obtidos a partir de um polinucleotídeo de vetor que codifica um ácido nucleico heterólogo posicionado operacional- mente entre duas sequências de repetição terminal invertida WT (WT- ITRs) (por exemplo, WT-ITRs AAV). Ou seja, ambas as ITRs têm uma sequência do tipo selvagem, mas não necessariamente precisam ser WT-ITRs do mesmo sorotipo AAV. Ou seja, em algumas modalidades, uma WT-ITR pode ser de um sorotipo AAV e a outra WT-ITR pode ser de um sorotipo AAV diferente. Em tal modalidade, o par de WT-ITRs é substancialmente simétricas como no presente documento definido, ou seja, as mesmas podem ter uma ou mais modificações conservadoras de nucleotídeo enquanto ainda mantêm a organização espacial tridi- mensional simétrica. Em algumas modalidades, a WT-ITR 5' é de um sorotipo AAV e a WT-ITR 3' é do mesmo ou de um sorotipo AAV dife- rente. Em algumas modalidades, a WT-ITR 5' e a WT-ITR 3'são ima- gens espelhadas um do outro, ou seja, são simétricas. Em algumas modalidades, a WT-ITR 5' e a WT-ITR 3' são do mesmo sorotipo AAV.
[00259] As WT ITRs são bem conhecidas. Em uma modalidade, as duas ITRs são do mesmo sorotipo AAV2. Em certas modalidades, po- de-se usar WT de outros sorotipos. Existem vários sorotipos homólo- gos, por exemplo, AAV2, AAV4, AAV6, AAV8. Em uma modalidade, podem ser usadas ITRs muito homólogas (por exemplo, ITRs com uma estrutura de alça similar). Em outra modalidade, pode-se usar WT ITRs AAV que são mais diversas, por exemplo, AAV2 e AAV5, e ainda outra modalidade, pode-se usar uma ITR que seja substancialmente WT - ou seja, possui a estrutura básica de alça do WT, mas alguns alterações conservadoras de nucleotídeos que não alteram ou afetam as propriedades. Ao usar WT-ITRs do mesmo sorotipo viral, uma ou mais sequências reguladoras podem ainda ser utilizadas. Em certas modalidades, a sequência reguladora é uma chave reguladora que permite a modulação da atividade do ceDNA.
[00260] Em algumas modalidades, um aspecto da tecnologia no presente documento descrita refere-se a um vetor de DNA, em que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma sequência de nucleotí- deos heteróloga, posicionada operacionalmente entre duas sequên- cias de repetição terminal invertida do tipo (WT-ITRs), em que as WT- ITRs podem ser do mesmo sorotipo, sorotipos diferentes ou substan- cialmente simétricas entre si (ou seja, têm a organização espacial tri- dimensional simétrica, de modo que sua estrutura seja a mesma forma no espaço geométrico ou ter as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espa- ço 3D). Em algumas modalidades, as WT-ITRs simétricas compreen- dem um local de resolução terminal funcional e um local de ligação a Rep. Em algumas modalidades, a sequência heteróloga de ácido nu- cleico codifica um transgene e em que o vetor não está em um capsí- deo viral.
[00261] Em algumas modalidades, as WT-ITRs são as mesmas, mas o complemento inverso uma das outras. Por exemplo, a sequên- cia AACG na ITR 5' pode ser CGTT (isto é, o complemento reverso) na ITR 3' no local correspondente. Em um exemplo, a fita de senso WT- ITR 5' compreende a sequência de ATCGATCG e a fita de senso WT- ITR 3' correspondente compreende CGATCGAT (isto é, o complemen- to reverso de ATCGATCG). Em algumas modalidades, o ceDNA de WT-ITRs compreende ainda um local de resolução terminal e um local de ligação à proteína de replicação (RPS) (às vezes dito como um lo- cal de ligação à proteína replicativa), por exemplo, um local de ligação a Rep.
[00262] Sequências de WT-ITRs exemplificativas para uso nos ve- tores de ceDNA para expressão controlada de transgene que compre- endem WT-ITRs são mostradas na Tabela 2 deste documento, que mostra pares de WT-ITRs (WT-ITR 5' e WT-ITR 3').
[00263] Como um exemplo de exemplo, a presente invenção forne- ce um vetor de DNA de extremidade fechada que compreende um promotor operacionalmente ligado a um transgene (por exemplo, se- quência de ácido nucleio heterólogo), com ou sem a chave reguladora, em que o ceDNA é desprovido de proteínas do capsídeo e é: (a) pro- duzido a partir de um ceDNA-plasmídeo (por exemplo, consulte as Fi- guras 1F a 1G) que codifica WT-ITRs, em que cada WT-ITR tem o mesmo número de pares de bases duplex intramolecularmente em sua configuração secundária em formato de grampo (de preferência, exclu- indo a deleção de qualquer alça terminal AAA ou TTT nesta configura- ção em relação a estas sequências de referência), e (b) é identificado como ceDNA utilizando o ensaio para a identificação de ceDNA por electroforese em gel de agarose sob gel nativo e condições de desna- turação no Exemplo 1.
[00264] Em algumas modalidades, as WT-ITRs de flanqueamento são substancialmente simétricas entre si. Nessa modalidade, a WT- ITR 5' pode ser de um sorotipo de AAV e a WT-ITR 3' de um sorotipo diferente de AAV, de modo que as WT-ITRs não sejam complementos reversos idênticos. Por exemplo, a WT-ITR 5' pode ser de AAV2 e a WT-ITR 3' de um sorotipo diferente (por exemplo, AAV1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12. Em algumas modalidades, as WT-ITRs podem ser selecionadas entre dois parvovírus diferentes selecionados entre qual- quer um dos seguintes: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, parvovírus de cobra (por exemplo, parvovírus python real), parvovírus bovino, parvo- vírus de cabra, parvovírus aviário, parvovírus canino, parvovírus equi- no, parvovírus de camarão, parvovírus suíno ou AAV de inseto. Em algumas modalidades, essa combinação de WT ITRs é a combinação de WT-ITRs de AAV2 e AAV6. Em uma modalidade, as WT-ITRs substancialmente simétricas ocorrem quando uma é invertida em rela- ção à outra ITR pelo menos 90% idêntico, pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96%... 97%... 98%... 99%.... 99,5% e todos os pontos in- termediários, e tem a mesma organização espacial tridimensional si- métrica. Em algumas modalidades, um par de WT-ITRs é substanci- almente simétrico, pois tem organização espacial tridimensional simé- trica, por exemplo, tem a mesma organização 3D dos braços A, C-C'. B-B' e D. Em uma modalidade, um par de WT-ITRs substancialmente simétrico é invertido em relação ao outro e é pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96%... 97%... 98%... 99%.... 99,5% e todos os pontos in- termediários entre si e uma WT-ITR retém o local de ligação à Rep (RBS) de 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) e um local de resolução terminal (trs). Em algumas modalidades, um par de WT- ITRs substancialmente simétrico é invertido um em relação ao outro e é pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96%... 97%... 98%... 99%.... 99,5% e todos os pontos intermediários entre si e uma WT-ITR retém o local de ligação à Rep (RBS) de 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) e um local de resolução terminal (trs) e, além de uma sequência palindrômica variável, permitindo a formação de estrutura secundária em formato de grampo. A homologia pode ser determinada por meios padrão bem conhecidos na técnica, como BLAST (Ferra- menta de busca básica de alinhamento local, Basic Local Alignment Search Tool), BLASTN na configuração padrão.
[00265] Em algumas modalidades, o elemento estrutural da ITR po- de ser qualquer elemento estrutural envolvido na interação funcional da ITR com uma grande proteína Rep (por exemplo, Rep 78 ou Rep 68). Em certas modalidades, o elemento estrutural fornece seletividade para a interação de uma ITR com uma proteína Rep grande, ou seja, determina pelo menos em parte qual proteína Rep interage funcional- mente com a ITR. Em outras modalidades, o elemento estrutural inte-
rage fisicamente com uma proteína Rep grande quando a proteína Rep está ligada à ITR. Cada elemento estrutural pode ser, por exem- plo, uma estrutura secundária da ITR, uma sequência de nucleotídeos da ITR, um espaçamento entre dois ou mais elementos ou uma com- binação de qualquer uma das alternativas acima. Em uma modalidade, os elementos estruturais são selecionados a partir do grupo que con- siste em um braço A e A', um braço B e um B', um braço C e C', um braço D, um local de ligação a Rep (RBE) e um RBE' (isto é, sequên- cia RBE complementar) e um reprodutor de resolução terminal (trs).
[00266] Apenas a título de exemplo, a Tabela 1 indica combinações exemplificativas de WT-ITRs.
[00267] Tabela 1: Combinações exemplificativas de WT-ITRs do mesmo sorotipo ou sorotipos diferentes ou parovírus diferentes. A or- dem mostrada não é indicativa da posição de ITR, por exemplo, "AAV1, AAV2" demonstra que o ceDNA pode compreender uma WT- ITR de AAV1 na posição 5' e uma WT-ITR de AAV2 na posição 3' ou vice-versa, uma WT-ITR de AAV2 na posição 5' e uma WT-ITR de AAV1 na posição 3'. Abreviações: AAV sorotipo 1 (AAV1), AAV soroti- po 2 (AAV2), AAV sorotipo 3 (AAV3), AAV sorotipo 4 (AAV4), AAV so- rotipo 5 (AAV5), AAV sorotipo 6 (AAV6), AAV sorotipo 7 (AAV7), AAV Sorotipo 8 (AAV8), AAV Sorotipo 9 (AAV9), AAV Sorotipo 10 (AAV10), AAV Sorotipo 11 (AAV11) ou AAV Sorotipo 12 (AAV12); Genoma AA- Vrh8, AAVrh10, AAV-DJ e AAV-DJ8 (por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITRs de animais de sangue quente (AAV aviário (AAAV), AAV bovino (BAAV), AAV canino, equino e ovino), ITRs de B19 parvo- viris (nº de acesso GenBank: NC 000883), vírus minuto de camundon- go (MVM) (nº de acesso GenBank NC 001510); Ganso: parvovírus de ganso (nº de acesso GenBank NC 001701); cobra: parvovírus de co- bra 1 (nº de acesso GenBank NC 006148).
TABELA 1 AAV1, AAV1 AAV2, AAV2 AAV3, AAV3 AAV4, AAV4 AAV5, AAV5 AAV1, AAV2 AAV2, AAV3 AAV3, AAV4 AAV4, AAV5 AAV5, AAV6 AAV1, AAV3 AAV2, AAV4 AAV3, AAV5 AAV4, AAV6 AAV5, AAV7 AAV1, AAV4 AAV2, AAV5 AAV3, AAV6 AAV4, AAV7 AAV5, AAV8 AAV1, AAV5 AAV2, AAV6 AAV3, AAV7 AAV4, AAV8 AAV5, AAV9 AAV1, AAV6 AAV2, AAV7 AAV3, AAV8 AAV4, AAV9 AAV5, AAV10 AAV1, AAV7 AAV2, AAV8 AAV3, AAV9 AAV4, AAV10 AAV5, AAV11 AAV1, AAV8 AAV2, AAV9 AAV3, AAV10 AAV4, AAV11 AAV5, AAV12 AAV1, AAV9 AAV2, AAV10 AAV3, AAV11 AAV4, AAV12 AAV5, AAVRH8 AAV1, AAV10 AAV2, AAV11 AAV3, AAV12 AAV4, AAVRH8 AAV5, AA- VRH10 AAV1, AAV11 AAV2, AAV12 AAV3, AAVRH8 AAV4, AA- AAV5, AAV13 VRH10 AAV1, AAV12 AAV2, AAVRH8 AAV3, AA- AAV4, AAV13 AAV5, AAVDJ VRH10 AAV1, AAVRH8 AAV2, AA- AAV3, AAV13 AAV4, AAVDJ AAV5, AAVDJ8 VRH10 AAV1, AA- AAV2, AAV13 AAV3, AAVDJ AAV4, AAVDJ8 AAV5, AVIÁRIO VRH10 AAV1, AAV13 AAV2, AAVDJ AAV3, AAVDJ8 AAV4, AVIÁRIO AAV5, BOVINO AAV1, AAVDJ AAV2, AAVDJ8 AAV3, AVIÁRIO AAV4, BOVINO AAV5, CANINO AAV1, AAVDJ8 AAV2, AVIÁRIO AAV3, BOVINO AAV4, CANINO AAV5, EQUINO AAV1, AVIÁRIO AAV2, BOVINO AAV3, CANINO AAV4, EQUINO AAV5, CAPRI-
NO AAV1, BOVINO AAV2, CANINO AAV3, EQUINO AAV4, CAPRI- AAV5, CAMA-
NO RÃO AAV1, CANINO AAV2, EQUINO AAV3, CAPRI- AAV4, CAMA- AAV5, PORCI-
NO RÃO NO AAV1, EQUINO AAV2, CAPRI- AAV3, CAMA- AAV4, PORCI- AAV5, INSETO
NO RÃO NO AAV1, CAPRI- AAV2, CAMA- AAV3, PORCI- AAV4, INSETO AAV5, OVINO
NO RÃO NO AAV1, CAMA- AAV2, PORCI- AAV3, INSETO AAV4, OVIN AAV5, B19
RÃO NO AAV1, PORCI- AAV2, INSETO AAV3, OVINO AAV4, B19 AAV5, MVM
NO AAV1, INSETO AAV2, OVINO AAV3, B19 AAV4, MVM AAV5, GANSO AAV1, OVINO AAV2, B19 AAV3, MVM AAV4, GANSO AAV5, COBRA AAV1, B19 AAV2, MVM AAV3, GANSO AAV4, COBRA
AAV1, MVM AAV2, GANSO AAV3, COBRA AAV1, GANSO AAV2, COBRA AAV1, COBRA AAV6, AAV6 AAV7, AAV7 AAV8, AAV8 AAV9, AAV9 AAV10, AAV10 AAV6, AAV7 AAV7, AAV8 AAV8, AAV9 AAV9, AAV10 AAV10, AAV11 AAV6, AAV8 AAV7, AAV9 AAV8, AAV10 AAV9, AAV11 AAV10, AAV12 AAV6, AAV9 AAV7, AAV10 AAV8, AAV11 AAV9, AAV12 AAV10, AA- VRH8 AAV6, AAV10 AAV7, AAV11 AAV8, AAV12 AAV9, AAVRH8 AAV10, AA- VRH10 AAV6, AAV11 AAV7, AAV12 AAV8, AAVRH8 AAV9, AA- AAV10, AAV13 VRH10 AAV6, AAV12 AAV7, AAVRH8 AAV8, AA- AAV9, AAV13 AAV10, AAVDJ VRH10 AAV6, AAVRH8 AAV7, AA- AAV8, AAV13 AAV9, AAVDJ AAV10, AAVDJ8 VRH10 AAV6, AA- AAV7, AAV13 AAV8, AAVDJ AAV9, AAVDJ8 AAV10, AVIÁ- VRH10 RIO AAV6, AAV13 AAV7, AAVDJ AAV8, AAVDJ8 AAV9, AVIÁRIO AAV10, BOVI-
NO AAV6, AAVDJ AAV7, AAVDJ8 AAV8, AVIÁRIO AAV9, BOVINO AAV10, CANI-
NO AAV6, AAVDJ8 AAV7, AVIÁRIO AAV8, BOVINO AAV9, CANINO AAV10, EQUI-
NO AAV6, AVIÁRIO AAV7, BOVINO AAV8, CANINO AAV9, EQUINO AAV10, CAPRI-
NO AAV6, BOVINO AAV7, CANINO AAV8, EQUINO AAV9, CAPRI- AAV10, CAMA-
NO RÃO AAV6, CANINO AAV7, EQUINO AAV8, CAPRI- AAV9, CAMA- AAV10, POR-
NO RÃO CINO AAV6, EQUINO AAV7, CAPRI- AAV8, CAMA- AAV9, PORCI- AAV10, INSETO
NO RÃO NO AAV6, CAPRI- AAV7, CAMA- AAV8, PORCI- AAV9, INSETO AAV10, OVINO
NO RÃO NO AAV6, CAMA- AAV7, PORCI- AAV8, INSETO AAV9, OVINO AAV10, B19
RÃO NO AAV6, PORCI- AAV7, INSETO AAV8, OVINO AAV9, B19 AAV10, MVM
NO AAV6, INSETO AAV7, OVINO AAV8, B19 AAV9, MVM AAV10, GANSO AAV6, OVINO AAV7, B19 AAV8, MVM AAV9, GANSO AAV10, COBRA AAV6, B19 AAV7, MVM AAV8, GANSO AAV9, COBRA
AAV6, MVM AAV7, GANSO AAV8, COBRA AAV6, GANSO AAV7, COBRA AAV6, COBRA AAV11, AAV11 AAV12, AAV12 AAVRH8, AA- AAVRH10, AA- AAV13, AAV13 VRH8 VRH10 AAV11, AAV12 AAV12, AA- AAVRH8, AA- AAVRH10, AAV13, AAVDJ VRH8 VRH10 AAV13 AAV11, AA- AAV12, AA- AAVRH8, AAVRH10, AA- AAV13, AAVDJ8 VRH8 VRH10 AAV13 VDJ AAV11, AA- AAV12, AAV13 AAVRH8, AA- AAVRH10, AA- AAV13, AVIÁ- VRH10 VDJ VDJ8 RIO AAV11, AAV13 AAV12, AAVDJ AAVRH8, AA- AAVRH10, AVI- AAV13, BOVI- VDJ8 ÁRIO NO AAV11, AAVDJ AAV12, AA- AAVRH8, AVI- AAVRH10, BO- AAV13, CANI- VDJ8 ÁRIO VINO NO AAV11, AA- AAV12, AVIÁ- AAVRH8, BO- AAVRH10, CA- AAV13, EQUI- VDJ8 RIO VINO NINO NO AAV11, AVIÁ- AAV12, BOVI- AAVRH8, CA- AAVRH10, AAV13, CAPRI-
RIO NO NINO EQUINO NO AAV11, BOVI- AAV12, CANI- AAVRH8, AAVRH10, CA- AAV13, CAMA-
NO NO EQUINO PRINO RÃO AAV11, CANI- AAV12, EQUI- AAVRH8, CA- AAVRH10, CA- AAV13, POR-
NO NO PRINO MARÃO CINO AAV11, EQUI- AAV12, CA- AAVRH8, CA- AAVRH10, AAV13, INSETO
NO PRINO MARÃO PORCINO AAV11, CA- AAV12, CAMA- AAVRH8, POR- AAVRH10, IN- AAV13, OVINO
PRINO RÃO CINO SETO AAV11, CAMA- AAV12, POR- AAVRH8, IN- AAVRH10, AAV13, B19
RÃO CINO SETO OVINO AAV11, POR- AAV12, INSETO AAVRH8, OVI- AAVRH10, B19 AAV13, MVM
CINO NO AAV11, INSETO AAV12, OVINO AAVRH8, B19 AAVRH10, AAV13, GANSO
MVM AAV11, OVINO AAV12, B19 AAVRH8, MVM AAVRH10, AAV13, COBRA
GANSO AAV11, B19 AAV12, MVM AAVRH8, GAN- AAVRH10, CO-
SO BRA AAV11, MVM AAV12, GANSO AAVRH8, CO-
BRA AAV11, GANSO AAV12, COBRA AAV11, COBRA
AAVDJ, AAVDJ AAVDJ8, AVIÁRIO, AVI- BOVINA, BO- CANINO, CA- AVVDJ8 ÁRIO VINA NINO AAVDJ, AA- AAVDJ8, AVIÁ- AVIÁRIO, BO- BOVINO, CA- CANINO, VDJ8 RIO VINO NINO EQUINO AAVDJ, AVIÁ- AAVDJ8, BO- AVIÁRIO, CA- BOVINO, CANINO, CA-
RIO VINO NINO EQUINO BRA AAVDJ, BOVI- AAVDJ8, CA- AVIÁRIO, BOVINO, CA- CANINO, CA-
NO NINO EQUINO BRA MARÃO AAVDJ, CANI- AAVDJ8, AVIÁRIO, CA- BOVINO, CA- CANINO POR-
NO EQUINO PRINO MARÃO CINO AAVDJ, EQUI- AAVDJ8, CA- AVIÁRIO, CA- BOVINOS, SU- CANINO, INSE-
NO PRINO MARÃO ÍNOS TO AAVDJ, CA- AAVDJ8, CA- AVIÁRIO, BOVINA, INSE- CANINO OVINO
PRINO MARÃO PORCINO TO AAVDJ, CAMA- AAVDJ8, POR- AVIÁRIO, IN- BOVINO, OVI- CANINO, B19
RÃO CINO SETO NO AAVDJ, POR- AAVDJ8, INSE- AVIÁRIOO, BOVINO, B19 CANINO, MVM
CINO TO OVINO AAVDJ, INSE- AAVDJ8, OVI- AVIÁRIO, B19 BOVINO, MVM CANINO, GAN-
TO NO SO AAVDJ, OVINO AAVDJ8, B19 AVIÁRIO, MVM BOVINO, GAN- CANINO, SER-
SO PENTE AAVDJ, B19 AAVDJ8, MVM AVIÁRIO, GAN- BOVINA, SER-
SO PENTE AAVDJ, MVM AAVDJ8, GAN- AVIÁRIO, SER-
SO PENTE AAVDJ, GANSO AAVDJ8, CO-
BRA AAVDJ, COBRA EQUINA, CABRA, CA- CAMARÃO, PORCINO, INSETO, INSE- EQUINA BRA CAMARÃO PORCINO TO EQUINA, CA- CABRA, CA- CAMARÃO, PORCINO, IN- INSETO, OVI-
BRA MARÃO PORCINO SETOS NO EQUINO, CA- CABRA, POR- CAMARÃO, PORCINO, INSETO, B19
MARÃO CINO INSETO OVINOS EQUINO, POR- CABRA, INSE- CAMARÃO, PORCINO, B19 INSETO, MVM
CINO TO OVINO EQUINO, INSE- CABRA, OVINO CAMARÃO, B19 PORCINO, INSETO, GAN-
TO MVM SO EQUINO, OVI- CAPRINO, B19 CAMARÃO, PORCINO, INSETO, CO-
NO MVM GANSO BRA
EQUINO, B19 CAPRINO, MVM CAMARÃO, PORCINO,
GANSO SERPENTE EQUINO, MVM CAPRINO, CAMARÃO, GANSO COBRA EQUINO, GAN- CAPRINO, CO- SO BRA EQUINO, CO-
BRA OVINO, OVINO B19, B19 MVM, MVM GANSO, GAN- COBRA, CO-
SO BRA OVINO, B19 B19, MVM MVM, GANSO GANSO, CO-
BRA OVINO, MVM B19, GANSO MVM, COBRA OVINO, GANSO B19, COBRA OVINO, COBRA
[00268] Apenas a título de exemplo, a Tabela 2 mostra as sequên- cias de WT-ITRs exemplificativas de alguns sorotipos diferentes de AAV. TABELA 2 Sorotipo WT-ITR 5' (ESQUERDA) WT-ITR 3' (DIREITA)
AAV AAV1 5'- 5'-
TTGCCCACTCCCTCTCTGC TTACCCTAGTGATGGAGTTG GCGCTCGCTCGCTCGGTGG CCCACTCCCTCTCTGCGCG GGCCTGCGGACCAAAGGTC CGTCGCTCGCTCGGTGGGG CGCAGACGGCAGAGGTCTC CCGGCAGAGGAGACCTCTG CTCTGCCGGCCCCACCGAG CCGTCTGCGGACCTTTGGT CGAGCGACGCGCGCAGAG CCGCAGGCCCCACCGAGC
AGGGAGTGGGCAACTCCAT GAGCGAGCGCGCAGAGAG CACTAGGGTAA-3' GGAGTGGGCAA-3' (SEQ ID (SEQ ID NO: 5) NO: 10)
Sorotipo WT-ITR 5' (ESQUERDA) WT-ITR 3' (DIREITA)
AAV AAV2 CCTGCAGGCAGCTGCGCGC AGGAACCCCTAGTGATGGA
TCGCTCGCTCACTGAGGCC GTTGGCCACTCCCTCTCTG GCCCGGGCAAAGCCCGGG CGCGCTCGCTCGCTCACTG CGTCGGGCGACCTTTGGTC AGGCCGGGCGACCAAAGGT GCCCGGCCTCAGTGAGCGA CGCCCGACGCCCGGGCTTT GCGAGCGCGCAGAGAGGG GCCCGGGCGGCCTCAGTGA
AGTGGCCAACTCCATCACTA GCGAGCGAGCGCGCAGCT GGGGTTCCT (SEQ ID NO: 2) GCCTGCAGG (SEQ ID NO: 1) AAV3 5'- 5'-
TTGGCCACTCCCTCTATGC ATACCTCTAGTGATGGAGTT GCACTCGCTCGCTCGGTGG GGCCACTCCCTCTATGCGC GGCCTGGCGACCAAAGGTC ACTCGCTCGCTCGGTGGGG GCCAGACGGACGTGGGTTT CCGGACGTGGAAACCCACG CCACGTCCGGCCCCACCGA TCCGTCTGGCGACCTTTGG GCGAGCGAGTGCGCATAGA TCGCCAGGCCCCACCGAGC
GGGAGTGGCCAACTCCATC GAGCGAGTGCGCATAGAGG ACTAGAGGTAT-3' (SEQ ID GAGTGGCCAA-3' (SEQ ID NO: 6) NO: 11) AAV4 5'- 5'-
TTGGCCACTCCCTCTATGC AGTTGGCCACATTAGCTATG GCGCTCGCTCACTCACTCG CGCGCTCGCTCACTCACTC GCCCTGGAGACCAAAGGTC GGCCCTGGAGACCAAAGGT TCCAGACTGCCGGCCTCTG CTCCAGACTGCCGGCCTCT GCCGGCAGGGCCGAGTGA GGCCGGCAGGGCCGAGTG
GTGAGCGAGCGCGCATAGA AGTGAGCGAGCGCGCATAG GGGAGTGGCCAACT-3' (SEQ AGGGAGTGGCCAA-3' (SEQ ID NO: 7) ID NO: 12)
Sorotipo WT-ITR 5' (ESQUERDA) WT-ITR 3' (DIREITA)
AAV AAV5 5'- 5'-
TCCCCCCTGTCGCGTTCGC CTTACAAAACCCCCTTGCTT TCGCTCGCTGGCTCGTTTG GAGAGTGTGGCACTCTCCC GGGGGGCGACGGCCAGAG CCCTGTCGCGTTCGCTCGC GGCCGTCGTCTGGCAGCTC TCGCTGGCTCGTTTGGGGG TTTGAGCTGCCACCCCCCC GGTGGCAGCTCAAAGAGCT AAACGAGCCAGCGAGCGAG GCCAGACGACGGCCCTCTG CGAACGCGACAGGGGGGA GCCGTCGCCCCCCCAAACG
GAGTGCCACACTCTCAAGC AGCCAGCGAGCGAGCGAAC AAGGGGGTTTTGTAAG -3' GCGACAGGGGGGA-3' (SEQ (SEQ ID NO: 8) ID NO: 13) AAV6 5'- 5'-
TTGCCCACTCCCTCTAATGC ATACCCCTAGTGATGGAGTT GCGCTCGCTCGCTCGGTGG GCCCACTCCCTCTATGCGC GGCCTGCGGACCAAAGGTC GCTCGCTCGCTCGGTGGGG CGCAGACGGCAGAGGTCTC CCGGCAGAGGAGACCTCTG CTCTGCCGGCCCCACCGAG CCGTCTGCGGACCTTTGGT CGAGCGAGCGCGCATAGAG CCGCAGGCCCCACCGAGC
GGAGTGGGCAACTCCATCA GAGCGAGCGCGCATTAGAG CTAGGGGTAT-3' (SEQ ID GGAGTGGGCAA (SEQ ID NO: 9) NO: 14)
[00269] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos da sequência WT-ITR pode ser modificada (por exemplo, modificando 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais nucleotídeos ou qualquer faixa na mesma), em que a modificação é uma substituição de um nucleotídeo complemen- tar por exemplo, G para um C e vice-versa e T para um A e vice-versa.
[00270] Em certas modalidades da presente invenção, o vetor de ceDNA produzido sinteticamente não tem uma WT-ITR que consiste na sequência de nucleotídeos selecionada de qualquer uma das se- guintes: SEQ ID NOs: 1, 2, 5 a 14. Em modalidades alternativas da presente invenção, se um vetor de ceDNA tiver uma WT-ITR que compreende a sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma das: SEQ ID NOs: 1, 2, 5 a 14, então a ITR de flanque-
amento também será uma WT e o vetor de ceDNA compreenderá uma chave reguladora, por exemplo, conforme no presente documento descrito e no pedido Internacional PCT/US18/49996 (por exemplo, consulte a Tabela 11 de PCT/US18/49996). Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende uma chave reguladora como no pre- sente documento descrito e uma WT-ITR selecionada que tem a se- quência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer um dos gru- pos que consiste em: SEQ ID NO: 1, 2, 5 a 14.
[00271] O vetor de ceDNA no presente documento descrito pode incluir estruturas de WT-ITR que retêm uma porção de RBE, trs e RBE operável. A Figura 2A e a Figura 2B, usando ITRs de tipo selvagem para fins exemplificativos, mostram um mecanismo possível para a operação de um local trs dentro de uma porção da estrutura de ITR de tipo selvagem de um vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA contém uma ou mais sequências polinucleotídicas WT-ITR funcionais que compreendem um local de ligação a Rep (RBS; 5′-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60) para AAV2) e um local de resolução terminal (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 62)). Em algumas modalidades, pelo menos uma WT-ITR é funcional. Em mo- dalidades alternativas, em que um vetor de ceDNA compreende duas WT-ITRs que são substancialmente simétricas entre si, pelo menos uma WT-ITR é funcional e pelo menos uma WT-ITR não é funcional. B. ITRS MODIFICADAS (MOD-ITRS) EM GERAL PARA VETORES DE ceDNA PARA EXPRESSÃO CONTROLADA DE TRANSGENE
QUE COMPREENDEM PARES DE ITRS ASSIMÉTRICAS OU PARES DE ITRS SIMÉTRICAS
[00272] Como discutido no presente documento, um vetor de ceD- NA pode compreender um par de ITRs simétricas ou um par de ITRs assimétricas. Em ambos os casos, uma ou ambas as ITRs podem ser modificadas por ITRs - a diferença é que, na primeira instância (por exemplo, mod-ITRs simétricas), as mod-ITRs têm a mesma organiza- ção espacial tridimensional (ou seja, têm as mesmas configurações de braço A-A', C-C' e B-B'), enquanto na segunda instância (ou seja, mod- ITRs assimétricas), as mod-ITRs têm uma organização espacial tridi- mensional diferente (ou seja, têm uma configuração diferente de bra- ços A-A', C-C' e B-B').
[00273] Em algumas modalidades, uma ITR modificada é uma ITR que é modificada por deleção, inserção e/ou substituição em compara- ção com uma sequência de ITR do tipo selvagem (por exemplo, ITR de AAV). Em algumas modalidades, pelo menos uma das ITRs no ve- tor de ceDNA compreende um local de ligação a Rep funcional (RBS; por exemplo, 5′-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ para AAV2, SEQ ID NO: 60) e um local de resolução terminal funcional (TRS; por exemplo, 5'- AGTT-3', SEQ ID NO: 62.) Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR não funcional. Em uma modalidade, as ITRs diferen- tes ou modificadas não são, cada uma, ITR de tipo selvagem de dife- rentes sorotipos.
[00274] Alterações e mutações específicas nas ITRs são descritas em detalhes no presente documento, mas no contexto das ITRs, "alte- radas" ou "mutadas" ou "modificadas", indica que os nucleotídeos fo- ram inseridos, excluídos e/ou substituídos em relação à sequência de selvagem tipo, referência ou sequência de ITR original. A ITR alterada ou mutada pode ser uma ITR geneticamente modificada. Como usado no presente documento, "geneticamente modificada" refere-se ao as- pecto de ter sido manipulado pela mão do homem. Por exemplo, um polipeptídeo é considerado "geneticamente modificado" quando pelo menos um aspecto do polipeptídeo, por exemplo, sua sequência, foi manipulado pela mão do homem para diferir do aspecto que existe na natureza.
[00275] Em algumas modalidades, uma mod-ITR pode ser sintética.
Em uma modalidade, uma ITR sintética é baseada em sequências ITR de mais de um sorotipo AAV. Em outra modalidade, uma ITR sintética não inclui sequência baseada em AAV. Em ainda outra modalidade, uma ITR sintética preserva a estrutura da ITR descrita acima, embora possua apenas alguma ou nenhuma sequência originada por AAV. Em alguns aspectos, uma ITR sintética pode interagir preferencialmente com uma Rep de tipo selvagem ou uma Rep de um sorotipo específico ou, em alguns casos, não será reconhecido por um Rep de tipo selva- gem e será reconhecido apenas por um Rep mutado.
[00276] O especialista na técnica pode determinar a sequência cor- respondente em outros sorotipos por meios conhecidos. Por exemplo, determinar se a alteração está na região A, A', B, B', C, C' ou D e de- terminar a região correspondente em outro sorotipo. Pode-se usar o BLAST® (Ferramenta de busca básica de alinhamento local) ou outros programas de alinhamento de homologia na situação padrão para de- terminar a sequência correspondente. A invenção fornece ainda popu- lações e pluralidades de vetores de ceDNA para expressão controlada de transgene que compreendem mod-ITRs a partir de uma combina- ção de diferentes sorotipos de AAV - ou seja, uma mod-ITR pode ser de um sorotipo de AAV e a outra mod-ITR pode ser de um sorotipo diferente. Sem desejar estar limitado pela teoria, em uma modalidade, uma ITR pode ser de ou com base em uma sequência ITR de AAV2 e a outra ITR do vetor de ceDNA pode ser de ou com base em qualquer uma ou mais sequência ITR do sorotipo 1 de AAV (AAV1), AAV Soro- tipo 4 (AAV4), AAV Sorotipo 5 (AAV5), AAV Sorotipo 6 (AAV6), AAV Sorotipo 7 (AAV7), AAV Sorotipo 8 (AAV8), AAV Sorotipo 9 (AAV9), AAV Sorotipo 10 (AAV10), AAV Sorotipo 11 (AAV11) AAV Sorotipo 12 (AAV12).
[00277] Qualquer ITR de parvovírus pode ser usada como uma ITR ou como uma ITR básica para modificação. De preferência, o parvoví-
rus é um dependovírus. Mais preferencialmente, AAV. O sorotipo es- colhido pode ser baseado no tropismo tecidual do sorotipo. O AAV2 possui um amplo tropismo tecidual, o AAV1 tem como alvo preferenci- al os músculos neuronais e esqueléticos e o AAV5 tem como alvo pre- ferencial os epitélios neuronais, pigmentados da retina e fotorrecepto- res. O AAV6 tem como alvo preferencial músculo esquelético e pul- mão. O AAV8 tem como alvo preferencial tecidos hepáticos, muscula- res esqueléticos, cardíacos e pancreáticos. O AAV9 tem como alvo preferencial tecido hepático, esquelético e pulmonar. Em uma modali- dade, a ITR modificada é baseada em uma ITR de AAV2.
[00278] Mais especificamente, a capacidade de um elemento estru- tural para interagir funcionalmente com uma proteína Rep grande es- pecífica pode ser alterada modificando o elemento estrutural. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos do elemento estrutural pode ser modificada em comparação com a sequência do tipo selvagem da ITR. Em uma modalidade, o elemento estrutural (por exemplo, braço A, braço A', braço B, braço B', braço C, braço C', braço D, RBE, RBE' e trs) de uma ITR pode ser removido e substituído com um elemento es- trutural do tipo selvagem de um parvovírus diferente. Por exemplo, a estrutura de substituição pode ser de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, parvovírus de cobra (por exemplo, parvovírus python real), parvovírus bovino, parvovírus de cabra, parvovírus aviário, parvovírus canino, parvovírus equino, parvovírus de camarão, parvovírus suíno ou AAV de inseto. Por exemplo, a ITR pode ser uma ITR AAV2 e o braço A ou A' ou RBE pode ser substituído por um elemento estrutural do AAV5. Em outro exemplo, a ITR pode ser uma ITR AAV5 e os braços C ou C', o RBE e os trs podem ser substituídos por um elemento estrutural do AAV2. Em outro exemplo, a ITR AAV pode ser uma ITR AAV5 com os braços B e B' substituídos pelos braços B e B' de ITR AAV2.
[00279] Apenas a título de exemplo, a Tabela 3 indica modificações exemplificativas de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma de- leção, inserção e/ou substituição) nas regiões de uma ITR modificada, em que X é indicativo de uma modificação de pelo menos um ácido nucleico (por exemplo, uma exclusão, inserção e/ou substituição) nes- sa seção em relação à ITR de tipo selvagem correspondente. Em al- gumas modalidades, qualquer modificação de pelo menos um nucleo- tídeo (por exemplo, uma exclusão, inserção e/ou substituição) em qualquer uma das regiões de C e/ou C' e/ou B e/ou B' retém três nu- cleotídeos T sequenciais (ou seja, TTT) em pelo menos uma alça de terminal. Por exemplo, se a modificação resultar em: uma ITR de bra- ço único (por exemplo, um braço C-C' único ou um braço B-B' único), ou um braço C-B' modificado ou um braço C'-B ou uma ITR de dois braços com pelo menos um braço truncado (por exemplo, um braço C- C' truncado e/ou braço B-B' truncado), pelo menos o braço único ou pelo menos um dos braços de uma ITR de dois braços (em que um braço pode ser truncado) retém três nucleotídeos T sequenciais (isto é, TTT) em pelo menos uma alça terminal. Em algumas modalidades, um braço C-C' truncado e/ou um braço B-B' truncado tem três nucleo- tídeos T sequenciais (isto é, TTT) na alça terminal.
[00280] Tabela 3: Combinações exemplificativas de modificações de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma exclusão, inserção e/ou substituição) em diferentes regiões B-B 'e C-C' ou braços de ITRs (X indica uma modificação de nucleotídeo, por exemplo, adição, exclu- são ou substituição de pelo menos um nucleotídeo na região). Região B Região B' Região C Região C'
X X X X X X
Região B Região B' Região C Região C'
X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X
[00281] Em algumas modalidades, a mod-ITR para uso em um ve- tor de ceDNA que compreende um par de ITRs assimétricas, ou um par de mod-ITRs simétricas, conforme descrito neste documento, pode compreender qualquer uma das combinações de modificações mos- tradas na Tabela 3 e também uma modificação de pelo menos um nu- cleotídeo em qualquer uma ou mais das regiões selecionadas entre: entre A' e C, entre C e C', entre C' e B, entre B e B' e entre B' e A. Em algumas modalidades, qualquer a modificação de pelo menos um nu- cleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) nas regiões C ou C' ou B ou B' ainda preserva a alça terminal da haste- laço. Em algumas modalidades, qualquer modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substitui- ção) entre C e C' e/ou B e B' retém três nucleotídeos T sequenciais (ou seja, TTT) em pelo menos um terminal ciclo. Em modalidades alterna- tivas, qualquer modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exem- plo, uma exclusão, inserção e/ou substituição) entre C e C' e/ou B e B' retém três nucleotídeos A sequenciais (ou seja, AAA) em pelo menos uma alça de terminal. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode compreender qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma exclusão, inserção e/ou substituição) em qualquer um ou mais das re- giões selecionadas de: A', A e/ou D. Por exemplo, em algumas moda- lidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode compreender qualquer uma das combinações de modificações mos- tradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) na região A. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode compreender qualquer uma das combina- ções de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modifi- cação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma exclusão, inserção e/ou substituição) na região A'. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode compre- ender qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma exclusão, inserção e/ou substituição) no A e/ou A'. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso no presente documento pode compreender qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) na região D.
[00282] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos do ele- mento estrutural pode ser modificada (por exemplo, modificando 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos ou qualquer faixa no mesmo) para produzir um elemento estrutural modificado. Em uma modalidade, as modificações específi- cas nas ITRs são exemplificadas no presente documento (por exem- plo, SEQ ID NOS: 3, 4, 15 a 47, 101 a 116 ou 165 a 187, ou mostradas nas Figuras 7A a 7B de PCT/US2018/064242, depositado em 6 de de- zembro de 2018 (por exemplo, SEQ ID Nos 97 a 98, 101 a 103, 105 a
108, 111 a 112, 117 a 134, 545 a 554 em PCT/US2018/064242). Em algumas modalidades, uma ITR pode ser modificada (por exemplo, modificando 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos ou qualquer faixa na mesma). Em ou- tras modalidades, a ITR pode ter pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais identidade de se- quência com uma das ITRs modificadas da SEQ ID NOS: 3, 4, 15 a 47, 101 a 116 ou 165 a 187, ou a seção contendo RBE dos braços A- A', braços C-C' e braços B-B' da SEQ ID NO: 3, 4, 15 a 47, 101 a 116 ou 165 a 187, ou mostrado nas Tabelas 2 a 9 (isto é, SEQ ID NO: 110 a 112, 115 a 190, 200 a 468) do documento PCT/US18/49996, que é incorporado no presente documento na sua totalidade por referência.
[00283] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode, por exemplo, compreender a remoção ou deleção de todo um braço espe- cífico, por exemplo, todo ou parte do braço A-A', ou todo ou parte do braço B-B' ou todo ou parte do braço C-C' ou, alternativamente, a re- moção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases que formam a haste da alça desde que a alça final que cobre a haste (por exemplo, braço único) ainda esteja presente (por exemplo, consulte ITR-21 na Figura 7A de PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018). Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compre- ender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço B-B'. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode com- preender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço C-C' (consulte, por exemplo, ITR-1 na Figura 3B ou ITR-45 na Figura 7A do documento PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018). Em algumas modalidades, uma ITR modifica- da pode compreender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pa- res de bases do braço C-C' e a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço B-B'. Está prevista qualquer combina- ção de remoção de pares de bases, por exemplo, 6 pares de bases podem ser removidos no braço C-C' e 2 pares de bases no braço B-B'. Como um exemplo ilustrativo, a Figura 3B mostra uma ITR modificada exemplificativa com pelo menos 7 pares de bases excluídos de cada porção C e porção C', uma substituição de um nucleotídeo na alça en- tre a região C e C' e pelo menos uma exclusão de pares de bases de cada uma dentre a região B e as regiões B', de modo que a ITR modi- ficada compreenda dois braços, em que pelo menos um braço (por exemplo, C-C') é truncado. Em algumas modalidades, a ITR modifica- da também compreende pelo menos uma exclusão de pares de bases de cada uma das regiões B e B', de modo que o braço B-B' também seja truncado em relação à WT-ITR.
[00284] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode ter entre 1 e 50 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50) de- leções de nucleotídeos em relação a uma sequência de ITR de tipo selvagem de tamanho completo. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode ter entre 1 e 30 deleções de nucleotídeos em relação a uma sequência de WT-ITR de tamanho completo. Em algumas mo- dalidades, uma ITR modificada tem entre 2 e 20 deleções de nucleotí- deos em relação a uma sequência de ITR de tipo selvagem de tama- nho completo.
[00285] Em algumas modalidades, uma ITR modificada não contém deleções nucleotídicas na porção que contém RBE das regiões A ou A', de modo a não interferir na replicação do DNA (por exemplo, liga- ção a um RBE pela proteína Rep ou corte em um local de resolução terminal). Em algumas modalidades, uma ITR modificada abrangida para uso no presente documento tem uma ou mais deleções nas regi-
ões B, B', C e/ou C, conforme descrito no presente documento.
[00286] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA produzido sinteticamente que compreende um par de ITRs simétricas ou par de ITRs assimétricas compreende uma chave reguladora conforme des- crito neste documento e pelo menos uma ITR modificada selecionada que tem a sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer um dos grupos que consiste em: SEQ ID NO: 3, 4, 15 a 47, 101 a 116 ou 165 a 187.
[00287] Em outra modalidade, a estrutura do elemento estrutural pode ser modificada. Por exemplo, o elemento estrutural altera a altura da haste e/ou o número de nucleotídeos na alça. Por exemplo, a altura da haste pode ser de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa na mesma. Em uma modalidade, a altura de haste pode ser de cerca de 5 nucleotídeos a cerca de 9 nucleotídeos e interage funcionalmente com a Rep. Em outra modalidade, a altura da haste pode ser de cerca de 7 nucleotídeos e interage funcionalmente com a Rep. Em outro exemplo, a alça pode ter 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa na mesma.
[00288] Em outra modalidade, o número de locais de ligação ao GAGY ou locais de ligação relacionados ao GAGY no RBE ou no RBE estendido pode ser aumentado ou diminuído. Em um exemplo, o RBE ou RBE estendido pode compreender 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais locais de ligação ao GAGY ou qualquer faixa no mesmo. Cada local de liga- ção ao GAGY pode ser independentemente uma sequência exata do GAGY ou uma sequência similar ao GAGY, desde que a sequência seja suficiente para ligar uma proteína Rep.
[00289] Em outra modalidade, o espaçamento entre dois elementos (como, sem limitação, o RBE e um grampo) pode ser alterado (por exemplo, aumentado ou diminuído) para alterar a interação funcional com uma grande proteína Rep. Por exemplo, o espaçamento pode ser de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa no mesmo.
[00290] O vetor de ceDNA no presente documento descrito pode incluir uma estrutura de ITR que é modificada em relação à estrutura ITR AAV2 de tipo selvagem descrita neste documento, mas ainda mantém uma porção operacional de RBE, trs e RBE. A Figura 2A e a Figura 2B mostram um mecanismo possível para a operação de um local de trs dentro de uma porção da estrutura ITR do tipo selvagem de um vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA contém uma ou mais sequências polinucleotídicas de ITR funcionais que compreendem um local de ligação a Rep (RBS; 5'- GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 60) para AAV2) e um local de resolução terminal (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 62)). Em algumas modalidades, pelo menos uma ITR (ITR modificada ou wt) é funcional. Em modalidades alternativas, em que um vetor de ceDNA compreende duas ITRs modificadas que são diferentes ou assimétricas entre si, pelo menos uma ITR modificada é funcional e pelo menos uma ITR modificada não é funcional.
[00291] Em algumas modalidades, a ITR modificada (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) do vetor de ceDNA produzido sinteticamen- te no presente documento descrito tem modificações no braço de alça, no braço truncado ou no espaçador. Sequências exemplificativas de ITRs que têm modificações dentro do braço de laço, braço truncado ou espaçador estão listadas na Tabela 2 (isto é, SEQ ID NOS: 135 a 190, 200 a 233); Tabela 3 (por exemplo, SEQ ID Nos: 234 a 263); Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOs: 264 a 293); Tabela 5 (por exemplo, SEQ ID Nos: 294 a 318 no presente documento); Tabela 6 (por exemplo, SEQ ID NO: 319 a 468); e Tabelas 7 a 9 (por exemplo, SEQ ID Nos: 101 a 110, 111 a 112, 115 a 134) ou Tabela 10A ou 10B (por exemplo, SEQ ID Nos: 9, 100, 469 a 483, 484 a 499) do pedido internacional
PCT/US18/49996, que é no presente documento incorporado na sua totalidade por referência.
[00292] Em algumas modalidades, a ITR modificada para uso em um vetor de ceDNA que compreende um par de ITRs assimétricas ou par de mod-ITRs simétricas é selecionada a partir de qualquer uma ou uma combinação daquelas mostradas nas Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10A a 10B do pedido internacional PCT/US18/49996, que é no pre- sente documento incorporado na sua totalidade por referência.
[00293] Exemplos de ITRs modificadas adicionais para uso em um vetor de ceDNA que compreende um par de ITR assimétrico ou par de mod-ITR simétrico em cada uma das classes acima são fornecidos nas Tabelas 4A e 4B. A estrutura secundária prevista das ITRs modifi- cadas à direita na Tabela 4A é mostrada na Figura 7A do Pedido In- ternacional PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018, e a estrutura secundária prevista das ITRs modificadas à es- querda na Tabela 4B são mostradas na Figura 7B do Pedido Interna- cional PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018, que são incorporados no presente documento a título de referência.
[00294] A Tabela 4A e a Tabela 4B mostram ITRs modificadas di- reita e esquerda exemplificativas.
[00295] Tabela 4a: ITRs direitas modificadas exemplificativas. Es- sas ITRs modificadas exemplificativas direitas podem compreender o RBE de GGCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60), espaçador de ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), o complemento de espaçador GCCT- CAGT (SEQ ID NO: 70) e RBE' (isto é, complemento ao RBE) de GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).
Tabela 4a: ITRs modificadas direitas exemplificativas Construto Sequência SEQ ID de ITR NO: ITR-18 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 15 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCC TCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCC
TGCAGG ITR-19 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 16 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGG CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTG
CCTGCAGG ITR-20 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 17 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGC
GCAGCTGCCTGCAGG ITR-21 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 18 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGC
GCAGCTGCCTGCAGG ITR-22 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 19 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCC GGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGC
GAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-23 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 20 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGG GCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGA GCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
Tabela 4a: ITRs modificadas direitas exemplificativas Construto Sequência SEQ ID de ITR NO: ITR-24 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 21 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGC TTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGC
GAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-25 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 22 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTT TGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGA
GCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-26 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 23 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGC
GAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-27 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 24 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGA
GCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-28 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 25 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGC
GAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-29 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 26 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGA GCGCGCAGCTGCCTGCAGG
Tabela 4a: ITRs modificadas direitas exemplificativas Construto Sequência SEQ ID de ITR NO: ITR-30 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 27 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGC
GCGCAGCTGCCTGCAGG ITR-31 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 28 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC TTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGC
GCAGCTGCCTGCAGG ITR-32 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 29 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGT TTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGC
AGCTGCCTGCAGG ITR-49 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 30 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGG CCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTG
CCTGCAGG ITR-50 Direi- AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACT 31 ta CCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGA
GGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGC CCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCG CGCAGCTGCCTGCAGG
[00296] TABELA 4B: ITRs modificadas esquerdas exemplificativas. Essas ITRs modificadas esquerdas exemplificativas podem compre- ender o RBE de GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60), espa- çador de ACTGAGGC (SEQ ID NO: 69), o complemento de espaçador GCCTCAGT (SEQ ID NO: 70) e complemento RBE (RBE') de GAG- CGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71).
Tabela 4b: ITRs modificadas esquerdas exemplificativas ITR-33 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 32 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCG
TGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCA GAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGG
GGTTCCT ITR-34 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 33 Esquerda CACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTC
GCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG CAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA
GGGGTTCCT ITR-35 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 34 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGG
CGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCG CAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTA
GGGGTTCCT ITR-36 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 35 Esquerda CACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACC
TTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGC GAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTC
CATCACTAGGGGTTCCT ITR-37 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 36 Esquerda CACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGC
GAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTC
CATCACTAGGGGTTCCT ITR-38 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 37 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGG
CGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCA GTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
TGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT ITR-39 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 38 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGG
CGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTG AGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG CCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
Tabela 4b: ITRs modificadas esquerdas exemplificativas ITR-40 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 39 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGG
CGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGA GCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGC
CAACTCCATCACTAGGGGTTCCT ITR-41 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 40 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGG
CGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGC GAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCA
ACTCCATCACTAGGGGTTCCT ITR-42 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 41 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCG
TCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCA GTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAG
TGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT ITR-43 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 42 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTC
GGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGT GAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTG
GCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT ITR-44 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 43 Esquerda CACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGG
GCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAG CGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCC
AACTCCATCACTAGGGGTTCCT ITR-45 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 44 Esquerda CACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGC
GACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCG AGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
CTCCATCACTAGGGGTTCCT ITR-46 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 45 Esquerda CACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGA
CCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAG CGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACT CCATCACTAGGGGTTCCT
Tabela 4b: ITRs modificadas esquerdas exemplificativas ITR-47 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 46 Esquerda CACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACC
TTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGC GAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTC
CATCACTAGGGGTTCCT ITR-48 CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCT 47 Esquerda CACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTT
GGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAG CGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCAT CACTAGGGGTTCCT
[00297] Em uma modalidade, um vetor de ceDNA compreende, na direção 5' a 3': uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de vírus adenoassociado (AAV), uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um cassete de expressão como descrito no presente documento) e uma segunda ITR de AAV, em que a primeira ITR (5' ITR) e a segunda ITR (3' ITR) são assimétricas uma com a outra - ou seja, têm uma configuração espacial 3D diferente uma da outra. Como uma modalidade exemplar, a primeira ITR pode ser uma ITR do tipo selvagem e a segunda ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada ou vice-versa, em que a primeira ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada e a segunda ITR um tipo selvagem ITR. Em alguma moda- lidade, a primeira ITR e a segunda ITR são ambas mod-ITRs, mas têm sequências diferentes ou têm modificações diferentes e, portanto, não são os mesmos ITRs modificadas e têm configurações espaciais 3D diferentes. Em outras palavras, um vetor de ceDNA com ITRs assimé- tricas compreende ITRs em que quaisquer alterações em uma ITR em relação à WT-ITR não são refletidas na outra ITR; ou alternativamente, em que as ITRs assimétricas têm um par de ITRs assimétricas modifi- cadas que podem ter uma sequência diferente e uma forma tridimen- sional diferente em relação uma à outra. ITRs assimétricas exemplares no vetor de ceDNA e para uso na geração de ceDNA-plasmídeo são mostrados na Tabelas 4A e 4B.
[00298] Em uma modalidade alternativa, um vetor de ceDNA produ- zido sinteticamente compreende duas mod-ITRs simétricas - ou seja, ambas as ITRs têm a mesma sequência, mas são complementos re- versos (invertidos) uma da outra. Em algumas modalidades, um par de mod-ITRs simétricas compreende pelo menos uma ou qualquer com- binação de uma deleção, inserção ou substituição em relação à se- quência de ITR de tipo selvagem do mesmo sorotipo de AAV. As adi- ções, exclusões ou substituições na ITR simétrica são iguais, mas o complemento inverso uma da outra. Por exemplo, uma inserção de 3 nucleotídeos na região C da ITR 5' seria refletida na inserção de 3 nu- cleotídeos do complemento reverso na seção correspondente na regi- ão C' da ITR 3'. Apenas para fins ilustrativos, se a adição for AACG na ITR 5', a adição será CGTT na ITR 3' no local correspondente. Por exemplo, se a fita senso ITR 5' for ATCGATCG com uma adição de AACG entre G e A para resultar na sequência ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51). A fita senso ITR 3' correspondente é CGATCGAT (o complemento reverso do ATCGATCG) com uma adição de CGTT (isto é, o complemento reverso do AACG) entre o T e C para resultar na sequência CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49) (o complemento rever- so de ATCGAACGATCG) (SEQ ID NO: 51).
[00299] Em modalidades alternativas, o par de ITR modificadas é substancialmente simétrico como no presente documento definido - ou seja, o par de ITRs modificadas pode ter uma sequência diferente, mas tem a forma tridimensional simétrica correspondente ou igual. Por exemplo, uma ITR modificada pode ser de um sorotipo e a outra ITR modificada pode ser de um sorotipo diferente, mas as mesmas têm a mesma mutação (por exemplo, inserção, exclusão ou substituição de nucleotídeos) na mesma região. Dito de forma diferente, apenas para fins ilustrativos, uma mod-ITR 5' pode ser do AAV2 e tem uma exclu-
são na região C, e a mod-ITR 3' pode ser do AAV5 e tem a exclusão correspondente na região C', e desde que a mod-ITR 5' e a mod-ITR 3' tenham a mesma organização espacial tridimensional ou simétrica, os mesmos são abrangidos para uso no presente documento como um par de ITRs modificadas.
[00300] Em algumas modalidades, um par de mod-ITRs substanci- almente simétricas tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D, por exemplo, se uma ITR modificada em um par de mod-ITRs subs- tancialmente simétricas tiver uma exclusão de um braço C-C', então, a mod-ITR cognata possui a deleção correspondente da alça C-C' e também possui uma estrutura 3D similar das demais alças A e B-B' da mesma forma no espaço geométrico de sua mod-ITR cognata. Apenas a título de exemplo, as ITRs substancialmente simétricas podem ter uma organização espacial simétrica, de modo que sua estrutura tenha a mesma forma no espaço geométrico. Isso pode ocorrer, por exem- plo, quando um par G-C é modificado, por exemplo, para um par C-G ou vice-versa, ou o par A-T é modificado para um par T-A ou vice- versa. Portanto, usando o exemplo exemplar acima de ITR 5' modifi- cada como um ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51) e ITR 3' modifica- da como CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49) (ou seja, o complemento reverso de ATCGAACGATCG (SEQ ID NO: 51)), essas ITRs modifi- cadas ainda seriam simétricas se, por exemplo, a ITR 5' tivesse a se- quência de ATCGAACCATCG (SEQ ID NO: 50), em que G, na adição, é modificado para C e a ITR 3' substancialmente simétrica tem a se- quência de CGATCGTTCGAT (SEQ ID NO: 49), sem a modificação correspondente do T na adição a um A. Em algumas modalidades, es- se par de ITR modificado é substancialmente simétrico, pois o par de ITR modificado possui estereoquímica simétrica.
[00301] A Tabela 5 mostra pares de ITRs modificadas simétricas exemplificativas (ou seja, uma ITR modificada esquerda e a ITR modi-
ficada direita simétrica). A porção em negrito (vermelho) das sequên- cias identifica sequências de ITR parciais (isto é, sequências de alças A-A', C-C' e B-B'), também mostradas nas Figuras 31A a 46B. Essas ITRs modificadas exemplificativas podem compreender o RBE de GGCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 60), espaçador de AC- TGAGGC (SEQ ID NO: 69), o complemento de espaçador GCCT- CAGT (SEQ ID NO: 70) e RBE' (isto é, complemento ao RBE) de GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 71). Tabela 5: pares de ITRs modificadas simétricas exemplificativas ITR modificada ESQUERDA ITR simétrica modificada DIREITA (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 32 CGCGCTCGCTCGCT 15 (ITR-18, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-33 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGGGAAACCCGGG CTCGCTCGCTCACT da) CGTGCGCCTCAGTG GAGGCGCACGCCC
AGCGAGCGAGCGC GGGTTTCCCGGGCG GCAGAGAGGGAGT GCCTCAGTGAGCGA GGCCAACTCCATCA GCGAGCGCGCAGCT
CTAGGGGTTCCT GCCTGCAGG SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 33 CGCGCTCGCTCGCT 48 (ITR-51, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-34 CACTGAGGCCGTCG direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- GGCGACCTTTGGTC CTCGCTCGCTCACT da) GCCCGGCCTCAGTG GAGGCCGGGCGAC
AGCGAGCGAGCGC CAAAGGTCGCCCGA GCAGAGAGGGAGT CGGCCTCAGTGAGC GGCCAACTCCATCA GAGCGAGCGCGCA CTAGGGGTTCCT GCTGCCTGCAGG
Tabela 5: pares de ITRs modificadas simétricas exemplificativas ITR modificada ESQUERDA ITR simétrica modificada DIREITA (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 34 CGCGCTCGCTCGCT 16 (ITR-19, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-35 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGGGCAAAGCCCG CTCGCTCGCTCACT da) GGCGTCGGCCTCA GAGGCCGACGCCC
GTGAGCGAGCGAG GGGCTTTGCCCGGG CGCGCAGAGAGGG CGGCCTCAGTGAGC AGTGGCCAACTCCA GAGCGAGCGCGCA TCACTAGGGGTTCC GCTGCCTGCAGG
T SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 35 CGCGCTCGCTCGCT 17 (ITR-20, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-36 CACTGAGGCGCCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- GGGCGTCGGGCGA CTCGCTCGCTCACT da) CCTTTGGTCGCCCG GAGGCCGGGCGAC
GCCTCAGTGAGCGA CAAAGGTCGCCCGA GCGAGCGCGCAGA CGCCCGGGCGCCTC GAGGGAGTGGCCAA AGTGAGCGAGCGA CTCCATCACTAGGG GCGCGCAGCTGCCT
GTTCCT GCAGG SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 36 CGCGCTCGCTCGCT 18 (ITR-21, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-37 CACTGAGGCAAAG direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CCTCAGTGAGCGAG CTCGCTCGCTCACT da) CGAGCGCGCAGAG GAGGCTTTGCCTCA
AGGGAGTGGCCAAC GTGAGCGAGCGAG TCCATCACTAGGGG CGCGCAGCTGCCTG TTCCT CAGG
Tabela 5: pares de ITRs modificadas simétricas exemplificativas ITR modificada ESQUERDA ITR simétrica modificada DIREITA (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 37 CGCGCTCGCTCGCT 19 (ITR-22 ATGGAGTTGGCCAC (ITR-38 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGGGCAAAGCCCG CTCGCTCGCTCACT da) GGCGTCGGGCGAC GAGGCCGGGCGAC
TTTGTCGCCCGGCC AAAGTCGCCCGACG TCAGTGAGCGAGC CCCGGGCTTTGCCC GAGCGCGCAGAGA GGGCGGCCTCAGTG GGGAGTGGCCAACT AGCGAGCGAGCGC CCATCACTAGGGGT GCAGCTGCCTGCAG
TCCT G SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 38 CGCGCTCGCTCGCT 20 (ITR-23, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-39 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGGGCAAAGCCCG CTCGCTCGCTCACT da) GGCGTCGGGCGATT GAGGCCGGGCGAA
TTCGCCCGGCCTCA AATCGCCCGACGCC GTGAGCGAGCGAG CGGGCTTTGCCCGG CGCGCAGAGAGGG GCGGCCTCAGTGAG AGTGGCCAACTCCA CGAGCGAGCGCGC TCACTAGGGGTTCC AGCTGCCTGCAGG
T SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 39 CGCGCTCGCTCGCT 21 (ITR-24, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-40 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGGGCAAAGCCCG CTCGCTCGCTCACT da) GGCGTCGGGCGTTT GAGGCCGGGCGAA
CGCCCGGCCTCAGT ACGCCCGACGCCC GAGCGAGCGAGCG GGGCTTTGCCCGGG CGCAGAGAGGGAGT CGGCCTCAGTGAGC GGCCAACTCCATCA GAGCGAGCGCGCA CTAGGGGTTCCT GCTGCCTGCAGG
Tabela 5: pares de ITRs modificadas simétricas exemplificativas ITR modificada ESQUERDA ITR simétrica modificada DIREITA (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 40 CGCGCTCGCTCGCT 22 (ITR-25 ATGGAGTTGGCCAC (ITR-41 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGGGCAAAGCCCG CTCGCTCGCTCACT da) GGCGTCGGGCTTTG GAGGCCGGGCAAA
CCCGGCCTCAGTGA GCCCGACGCCCGG GCGAGCGAGCGCG GCTTTGCCCGGGCG CAGAGAGGGAGTG GCCTCAGTGAGCGA GCCAACTCCATCAC GCGAGCGCGCAGCT
TAGGGGTTCCT GCCTGCAGG SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 41 CGCGCTCGCTCGCT 23 (ITR-26 ATGGAGTTGGCCAC (ITR-42 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGGGAAACCCGGG CTCGCTCGCTCACT da) CGTCGGGCGACCTT GAGGCCGGGCGAC
TGGTCGCCCGGCCT CAAAGGTCGCCCGA CAGTGAGCGAGCG CGCCCGGGTTTCCC AGCGCGCAGAGAG GGGCGGCCTCAGTG GGAGTGGCCAACTC AGCGAGCGAGCGC CATCACTAGGGGTT GCAGCTGCCTGCAG
CCT G SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 42 CGCGCTCGCTCGCT 24 (ITR-27 ATGGAGTTGGCCAC (ITR-43 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGGAAACCGGGCG CTCGCTCGCTCACT da) TCGGGCGACCTTTG GAGGCCGGGCGAC
GTCGCCCGGCCTCA CAAAGGTCGCCCGA GTGAGCGAGCGAG CGCCCGGTTTCCGG CGCGCAGAGAGGG GCGGCCTCAGTGAG AGTGGCCAACTCCA CGAGCGAGCGCGC TCACTAGGGGTTCC AGCTGCCTGCAGG T
Tabela 5: pares de ITRs modificadas simétricas exemplificativas ITR modificada ESQUERDA ITR simétrica modificada DIREITA (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 43 CGCGCTCGCTCGCT 25 (ITR-28 ATGGAGTTGGCCAC (ITR-44 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CGAAACGGGCGTC CTCGCTCGCTCACT da) GGGCGACCTTTGGT GAGGCCGGGCGAC
CGCCCGGCCTCAGT CAAAGGTCGCCCGA GAGCGAGCGAGCG CGCCCGTTTCGGGC CGCAGAGAGGGAGT GGCCTCAGTGAGCG GGCCAACTCCATCA AGCGAGCGCGCAG
CTAGGGGTTCCT CTGCCTGCAGG SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 44 CGCGCTCGCTCGCT 26 (ITR-29, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-45 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- CAAAGGGCGTCGG CTCGCTCGCTCACT da) GCGACCTTTGGTCG GAGGCCGGGCGAC
CCCGGCCTCAGTGA CAAAGGTCGCCCGA GCGAGCGAGCGCG CGCCCTTTGGGCGG CAGAGAGGGAGTG CCTCAGTGAGCGAG GCCAACTCCATCAC CGAGCGCGCAGCTG
TAGGGGTTCCT CCTGCAGG SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 45 CGCGCTCGCTCGCT 27 (ITR-30, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-46 CACTGAGGCCGCC direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- AAAGGCGTCGGGC CTCGCTCGCTCACT da) GACCTTTGGTCGCC GAGGCCGGGCGAC
CGGCCTCAGTGAGC CAAAGGTCGCCCGA GAGCGAGCGCGCA CGCCTTTGGCGGCC GAGAGGGAGTGGC TCAGTGAGCGAGCG CAACTCCATCACTA AGCGCGCAGCTGCC GGGGTTCCT TGCAGG
Tabela 5: pares de ITRs modificadas simétricas exemplificativas ITR modificada ESQUERDA ITR simétrica modificada DIREITA (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 46 CGCGCTCGCTCGCT 28 (ITR-31, ATGGAGTTGGCCAC (ITR-47, CACTGAGGCCGCA direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- AAGCGTCGGGCGA CTCGCTCGCTCACT da) CCTTTGGTCGCCCG GAGGCCGGGCGAC
GCCTCAGTGAGCGA CAAAGGTCGCCCGA GCGAGCGCGCAGA CGCTTTGCGGCCTC GAGGGAGTGGCCAA AGTGAGCGAGCGA CTCCATCACTAGGG GCGCGCAGCTGCCT
GTTCCT GCAGG SEQ ID CCTGCAGGCAGCTG SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGTG NO: 47 CGCGCTCGCTCGCT 29 (ITR-32 ATGGAGTTGGCCAC (ITR-48, CACTGAGGCCGAA direita) TCCCTCTCTGCGCG esquer- ACGTCGGGCGACCT CTCGCTCGCTCACT da) TTGGTCGCCCGGCC GAGGCCGGGCGAC
TCAGTGAGCGAGC CAAAGGTCGCCCGA GAGCGCGCAGAGA CGTTTCGGCCTCAG GGGAGTGGCCAACT TGAGCGAGCGAGC CCATCACTAGGGGT GCGCAGCTGCCTGC TCCT AGG
[00302] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA que com- preende um par de ITRs assimétricas pode compreender uma ITR com uma modificação correspondente a qualquer uma das modifica- ções nas sequências de ITRs ou sequências parciais de ITRs mostra- das em qualquer uma ou mais das Tabelas 4A a 4B deste documento ou nas sequências mostradas nas Figuras 7A ou 7B do Pedido Inter- nacional PCT/US2018/064242, depositado em 6 dezembro de 2018, que é incorporado no presente documento em sua totalidade, ou des- crito nas Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10A a 10B de PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018, que é incor- porado no presente documento na sua totalidade a título de referência.
V. EXEMPLOS DE VETORES DE ceDNA PARA EXPRESSÃO CON-
TROLADA DE TRANSGENE
[00303] Como descrito acima, a presente invenção refere-se a veto- res de expressão de ceDNA recombinantes e vetores de ceDNA para expressão controlada de transgene que codificam um transgene que compreende qualquer um de: um par de ITR assimétrico, um par de ITR simétrico ou par de ITR substancialmente simétrico, conforme descrito acima. Em certas modalidades, a invenção se refere a vetores de ceDNA recombinantes com sequências de ITR de flanqueamento e um transgene, em que as sequências de ITR são assimétricas, simé- tricas ou substancialmente simétricas uma em relação à outra, con- forme no presente documento definido, e o ceDNA compreende ainda uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um casse- te de expressão compreendendo o ácido nucleico de um transgene) localizado entre as ITRs de flanqueamento, em que a dita molécula de ácido nucleico é desprovida de sequências de codificação da proteína do capsídeo viral.
[00304] O vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser qualquer vetor de ceDNA que possa ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante, incluindo sequên- cia (ou sequências) de nucleotídeos, conforme descrito no presente documento, desde que pelo menos uma ITR seja alterada. Os vetores de ceDNA da presente invenção são compatíveis com a célula hospe- deira na qual o vetor de ceDNA deve ser introduzido. Em certas moda- lidades, os vetores de ceDNA podem ser lineares. Em certas modali- dades, os vetores de ceDNA podem existir como uma entidade extra- cromossômica. Em certas modalidades, os vetores de ceDNA da pre- sente invenção podem conter um elemento (ou elementos) que permi- te a integração de uma sequência doadora no genoma da célula hos- pedeira. Como no presente documento utilizado, "transgene" e "se-
quência de nucleotídeos heteróloga" são sinônimos.
[00305] Com referência agora às Figuras 1A a 1G, são mostrados esquemas dos componentes funcionais de dois plasmídeos não limita- tivos úteis na produção dos vetores de ceDNA da presente invenção. As Figuras 1A, 1B, 1D, 1F mostram o construto de vetores de ceDNA ou as sequências correspondentes de plasmídeos de ceDNA. Os veto- res de ceDNA são livres de capsídeo e podem ser obtidos a partir de um plasmídeo que codifica nesta ordem: uma primeira ITR, um casse- te de transgene expressível e uma segunda ITR, em que a primeira e a segunda sequências de ITRs são assimétricas, simétricas ou subs- tancialmente simétricas entre si, como no presente documento defini- do. Os vetores de ceDNA são livres de capsídeo e podem ser obtidos a partir de um plasmídeo que codifica nesta ordem: uma primeira ITR, um transgene expressável (proteína ou ácido nucleico) e uma segunda ITR, em que a primeira e a segunda sequências de ITR são assimétri- cas, simétricas ou substancialmente simétricas uma em relação à ou- tra, como no presente documento definido. Em algumas modalidades, o cassete transgene expressável inclui, conforme necessário: um in- tensificador/promotor, um ou mais braços de homologia, uma sequên- cia doadora, um elemento regulador pós-transcrição (por exemplo, WPRE, por exemplo, SEQ ID NO: 67)) e um sinal de poliadenilação e terminação (por exemplo, BGH poliA, por exemplo, SEQ ID NO: 68).
[00306] A Figura 5 é um gel que confirma a produção de ceDNA a partir de múltiplos construtos plasmídicos usando o método descrito nos Exemplos. O ceDNA é confirmado por um padrão característico de banda no gel, como discutido em relação à Figura 4A acima e nos exemplos. A. ELEMENTOS REGULATÓRIOS
[00307] Os vetores de ceDNA como no presente documento des- crito que compreende um par de ITRs assimétricas ou par de ITRs si-
métricas, conforme no presente documento definido, podem ainda compreender uma combinação específica de elementos cis- reguladores. Os elementos cis-reguladores incluem, mas não estão limitados a um promotor, uma chave de ribossomo, um isolador, um elemento regulável por mir, um elemento regulador pós-transcricional, um promotor específico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor do transgene. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene compreende componentes adicionais pa- ra regular a expressão do transgene, por exemplo, chaves regulado- ras, como descrito no presente documento, para regular a expressão do transgene, ou uma chave de destruição, que pode matar uma célu- la que compreende o vetor de ceDNA. Os elementos reguladores, in- cluindo os chaves reguladoras que podem ser utilizadas na presente invenção, são discutidos mais detalhadamente no pedido Internacional PCT/US18/49996, que é incorporado no presente documento na sua totalidade a título de referência.
[00308] Nas modalidades, a segunda sequência de nucleotídeos inclui uma sequência reguladora e uma sequência de nucleotídeos que codificam uma nuclease. Em certas modalidades, a sequência regula- dora do gene está operacionalmente ligada à sequência de nucleotí- deos que codifica a nuclease. Em certas modalidades, a sequência reguladora é adequada para controlar a expressão da nuclease em uma célula hospedeira. Em certas modalidades, a sequência regulado- ra inclui uma sequência promotora adequada, tendo capacidade de direcionar a transcrição de um gene operacionalmente ligado à se- quência promotora, como uma sequência de nucleotídeos que codifica a nuclease (ou nucleases) da presente invenção. Em certas modalida- des, a segunda sequência de nucleotídeos inclui uma sequência de íntron ligada ao terminal 5' da sequência de nucleotídeos que codifica a nuclease. Em certas modalidades, uma sequência intensificadora é fornecida a montante do promotor para aumentar a eficácia do promo- tor. Em certas modalidades, a sequência reguladora inclui um intensifi- cador e um promotor, em que a segunda sequência de nucleotídeos inclui uma sequência de íntrons a montante da sequência de nucleotí- deos que codifica uma nuclease, em que o íntron inclui um ou mais locais de clivagem da nuclease e em que o promotor está operacio- nalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica a nuclease.
[00309] Os vetores de ceDNA produzidos sinteticamente, ou usan- do um método de produção baseado em célula, como descrito no pre- sente documento nos Exemplos, podem compreender ainda uma combinação específica de elementos cis-reguladores, como o elemen- to regulador pós-transcricional WHP (WPRE) (por exemplo, SEQ ID NO: 67) e BGH poliA (SEQ ID NO: 68). Cassetes de expressão ade- quados para uso em construtos de expressão não são limitados pela restrição de embalagem imposta pelo capsídeo viral. (i). PROMOTORES:
[00310] Será entendido por um versado na técnica que os promoto- res utilizados nos vetores de ceDNA da invenção devem ser adapta- dos conforme apropriado para as sequências específicas que estão promovendo. Por exemplo, um RNA guia pode não exigir um promotor, uma vez que sua função é formar um duplex com uma sequência alvo específica no DNA nativo para efetuar um evento de recombinação. Em contraste, uma nuclease codificada pelo vetor de ceDNA se bene- ficiaria de um promotor para que ele pudesse ser eficientemente ex- presso a partir do vetor - e, opcionalmente, de uma maneira regulável.
[00311] Os cassetes de expressão da presente invenção incluem um promotor, que pode influenciar os níveis gerais de expressão, bem como a especificidade celular. Para expressão do transgene, os mes- mos podem incluir um promotor precoce imediato derivado de vírus altamente ativo. Os cassetes de expressão podem conter promotores eucarióticos específicos de tecido para limitar a expressão de transge- ne a tipos celulares específicos e reduzir efeitos tóxicos e respostas imunes resultantes de expressão ectópica não regulamentada. Em modalidades preferidas, um cassete de expressão pode conter um elemento regulador sintético, como um promotor CAG (SEQ ID NO: 72). O promotor CAG compreende (i) o elemento potencializador pre- coce do citomegalovírus (CMV), (ii) o promotor, o primeiro exón e o primeiro íntron do gene da beta-actina de frango e (iii) o aceitador de splice do gene da beta-globina de coelho. Alternativamente, um casse- te de expressão pode conter um promotor de alfa-1-antitripsina (AAT) (SEQ ID NO: 73 ou SEQ ID NO: 74), um promotor específico do fígado (LP1) (SEQ ID NO: 75 ou SEQ ID NO: 76) ou um promotor do fator de alongamento humano 1 alfa (EF1a) (por exemplo, SEQ ID NO: 77 ou SEQ ID NO: 78). Em algumas modalidades, o cassete de expressão inclui um ou mais promotores constitutivos, por exemplo, um promotor LTR retroviral do vírus do sarcoma Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV) ou um promotor precoce imediato de citomega- lovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV, por exem- plo, SEQ ID NO: 79). Alternativamente, pode ser usado um promotor induzível, um promotor nativo para um transgene, um promotor especí- fico de tecido ou vários promotores conhecidos na técnica.
[00312] Promotores adequados, incluindo os descritos acima, po- dem ser derivados de vírus e, portanto, podem ser ditos como promo- tores virais, ou podem ser derivados de qualquer organismo, incluindo organismos procarióticos ou eucarióticos. Promotores adequados po- dem ser usados para direcionar a expressão por qualquer RNA poli- merase (por exemplo, pol I, pol II, pol III). Promotores exemplificativos incluem, mas não estão limitados ao promotor inicial SV40, promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus do tumor mamário de ca-
mundongo; principal promotor tardio de adenovírus (Ad MLP); um promotor do vírus do herpes simplex (HSV), um promotor do citomega- lovírus (CMV), como a região do promotor imediato do CMV (CMVIE), um promotor do vírus do sarcoma rous (RSV), um pequeno promotor nuclear U6 humano (U6, por exemplo, SEQ ID NO: 80) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497 a 500 (2002)), um promotor U6 aprimorado (por exemplo, Xia et al., Nucleic Acids Res., 1 de setembro de 2003; 31 (17)), um promotor H1 humano (H1) (por exemplo, SEQ ID NO: 81), um promotor CAG (SEQ ID NO: 72), um promotor humano alfa 1-antitipsina (HAAT) (por exemplo, SEQ ID NO: 82) e similares. Em certas modalidades, esses promotores são alterados na extremi- dade contendo íntron a jusante para incluir um ou mais locais de cliva- gem de nuclease. Em certas modalidades, o DNA contendo os locais de clivagem da nuclease é estranho ao DNA do promotor.
[00313] Em uma modalidade, o promotor utilizado é o promotor na- tivo do gene que codifica a proteína terapêutica. Os promotores e ou- tras sequências reguladoras para os respectivos genes que codificam as proteínas terapêuticas são conhecidos e foram caracterizados. A região promotora usada pode ainda incluir uma ou mais sequências reguladoras adicionais (por exemplo, nativas), por exemplo, intensifi- cadores (por exemplo, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 83), incluindo intensificador SV40 (SEQ ID NO: 126).
[00314] Exemplos não limitativos de promotores adequados para uso de acordo com a presente invenção incluem o promotor CAG de, por exemplo (SEQ ID NO: 72), o promotor HAAT (SEQ ID NO: 82), o promotor humano EF1-α (SEQ ID NO: 77) ou um fragmento do promo- tor EF1a (SEQ ID NO: 78), promotor IE2 (por exemplo, SEQ ID NO: 84) e o promotor EF1-α de rato (SEQ ID NO: 85) ou fragmento do promotor 1E1 (SEQ ID NO: 125). (ii) SEQUÊNCIAS DE POLIADENILAÇÃO:
[00315] Uma sequência que codifica uma sequência de poliadenila- ção pode ser incluída no vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene para estabilizar um mRNA expresso a partir do vetor de ceDNA e para auxiliar na exportação e tradução nuclear.
Em uma mo- dalidade, o vetor de ceDNA não inclui uma sequência de poliadenila- ção.
Em outras modalidades, o vetor inclui pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50 ou mais dinucleotídeos de adenina.
Em algumas modalidades, a sequência de poliadenilação compreende cerca de 43 nucleotídeos, cerca de 40 a 50 nucleotídeos, cerca de 40 a 55 nucleotídeos, cerca de 45 a 50 nucleotídeos, cerca de 35 a 50 nucleotídeos ou qualquer faixa entre os mesmos.
Em algumas modali- dades, onde o vetor de ceDNA para expressão controlada de transge- ne pode compreender dois transgenes, por exemplo, no caso de ex- pressão controlada de um anticorpo, um vetor de ceDNA pode com- preender um ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anti- corpo (por exemplo, uma cadeia pesada exemplar é SEQ ID NO: 57) e um ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anticorpo (por exemplo, uma cadeia leve exemplar é SEQ ID NO: 58) e pode haver uma poliadenilação 3' do primeiro transgene e um IRES (por exemplo, SEQ ID NO: 190) localizado entre o primeiro e o segundo transgene (por exemplo, entre o ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada de anticorpo e o ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de anti- corpo). Em tais modalidades, um vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene que codifica mais de um transgene (por exemplo, 2 ou 3 ou mais) pode compreender uma sequência IRES (local de en- trada interno do ribossomo) (SEQ ID NO: 190), por exemplo, onde a sequência IRES está localizada 3' de uma sequência de poliadenila- ção, de modo que um segundo transgene (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno) localizado 3' de um primeiro transge- ne, seja traduzido e expresso pelo mesmo vetor de ceDNA, de modo que o vetor de ceDNA pode expressar dois ou mais transgenes codifi- cados pelo vetor de ceDNA.
[00316] Os cassetes de expressão podem incluir uma sequência de poliadenilação conhecida na técnica ou uma variação da mesma, co- mo uma sequência de ocorrência natural isolada de BGHpA bovino (por exemplo, SEQ ID NO: 68) ou um vírus SV40pA (por exemplo, SEQ ID NO: 86) ou uma sequência sintética (por exemplo, SEQ ID NO: 87). Alguns cassetes de expressão também podem incluir a se- quência de intensificador de sinal tardio poliA SV40 a montante (USE). Em algumas modalidades, o USE pode ser usado em combinação com SV40pA ou sinal poli-A heterólogo.
[00317] Os cassetes de expressão também podem incluir um ele- mento pós-transcricional para aumentar a expressão de um transgene. Em algumas modalidades, o elemento regulador pós-transcricional (WPRE) do vírus da hepatite da marmota (WHP) (por exemplo, SEQ ID NO: 67) é usado para aumentar a expressão de um transgene. Po- dem ser utilizados outros elementos de processamento pós- transcricionais, como o elemento pós-transcricional do gene da timidi- na-quinase do vírus do herpes simplex ou o vírus da hepatite B (HBV). As sequências secretoras podem ser ligadas aos transgenes, por exemplo, sequências VH-02 (SEQ ID NO: 88) e VK-A26 (SEQ ID NO: 89) ou sequência de sinal IgK (SEQ ID NO: 128), sequência de sinal secretora Glu (SEQ ID NO: 188) ou sequência de sinal secretor de TND (SEQ ID NO: 189). (iii). SEQUÊNCIAS DE LOCALIZAÇÃO NUCLEAR
[00318] Em algumas modalidades, o vetor que codifica uma endo- nuclease guiada por RNA compreende uma ou mais sequências de localização nuclear (NLSs), por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais NLSs. Em algumas modalidades, o um ou mais NLSs estão loca- lizados no terminal amino, ou próximo ao terminal carbóxi, ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, um ou mais NLS no terminal amino e/ou um ou mais NLS no terminal carbóxi). Quando mais de um NLS está presente, cada um pode ser selecionado independentemente dos outros, de modo que um único NLS esteja presente em mais de uma cópia e/ou em combinação com um ou mais NLSs presentes em uma ou mais cópias. Exemplos não limitativos de NLSs são mostrados na Tabela 6. TABELA 6: SINAIS DE LOCALIZAÇÃO NUCLEAR FONTE SEQUÊNCIA SEQ ID NO. Antígeno T grande PKKKRKV (codificado por 90 do vírus SV40 CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG; SEQ ID NO: 91) nucleoplasmina KRPAATKKAGQAKKKK 92 c-mic PAAKRVKLD 93 RQRRNELKRSP 94 hRNPA1 M9 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPY 95
GGGGQYFAKPRNQGGY Domínio IBB da im- RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEV 96 portina-alfa SVELRKAKKDEQILKRRNV proteína T do mioma VSRKRPRP 97 PPKKARED 98 p53 humano PQPKKKPL 99 camundongo c-abl SALIKKKKKMAP 100
IV vírus influenza NS1 DRLRR 117 PKQKKRK 118 Antígeno delta do RKLKKKIKKL 119 vírus da hepatite proteína Mx1 de REKKKFLKRR 120 camundongo
FONTE SEQUÊNCIA SEQ ID NO. polimerase de po- KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK 121 li(ADP-ribose) hu- mana glicocorticoide de RKCLQAGMNLEARKTKK 122 receptores de hor- mônios esteroides (humanos) B. COMPONENTES ADICIONAIS DOS VETORES DE ceDNA
[00319] Os vetores de ceDNA da presente invenção podem conter nucleotídeos que codificam outros componentes para expressão de genes. Por exemplo, para selecionar eventos específicos de alveja- mento gênico, um shRNA protetor pode ser incorporado em um mi- croRNA e inserido em um vetor de ceDNA recombinante projetado pa- ra integrar de maneira específica de local ao locus altamente ativo, como um locus de albumina. Tais modalidades podem fornecer um sistema para seleção e expansão in vivo de hepatócitos modificados por genes em qualquer contexto genético, como descrito em Nygaard et al., A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo, Gene Therapy, 8 de junho de 2016. Os vetores de ceDNA da presente invenção podem conter um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção de células transformadas, transfectadas, transdu- zidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto fornece resistência a biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos, NeoR e similares. Em certas modalidades, marcadores de seleção positiva são incorporados nas sequências de doadores, como NeoR. Marcadores de seleções negativas podem ser incorporados a jusante das sequências doadoras, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico HSV-tk que codifica um marcador de se- leção negativa pode ser incorporada em um construto de ácido nuclei- co a jusante da sequência doadora.
[00320] Em modalidades, o vetor de ceDNA para expressão contro-
lada de transgene produzido usando o processo sintético descrito no presente documento pode ser usado para edição de genes, por exem- plo, conforme descrito no Pedido Internacional PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018, que é incorporado no presente documento em sua totalidade por referência e pode incluir um ou mais dentre: um braço de homologia 5', um braço de homologia 3', um local de poliadenilação a montante e próximo ao braço de homologia 5'. Braços de homologia exemplificativos são braços de homologia de al- bumina 5' e 3' (SEQ ID NO: 151 e 152) ou braços de homologia CCR5 5' e 3' (por exemplo, SEQ ID NO: 153, 154). C. CHAVES REGULADORAS
[00321] Uma chave reguladora molecular é aquela que gera uma mudança mensurável de estado em resposta a um sinal. Tais chaves reguladoras podem ser utilmente combinadas com os vetores de ceD- NA no presente documento descritos para controlar a saída de ex- pressão do transgene do vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene compreende uma chave reguladora que serve para ajustar a expressão do transge- ne. Por exemplo, a mesma pode servir como uma função de biocon- tenção do vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, a chave é uma chave "ATIVADA/DESATIVADA" que é projetada para iniciar ou parar (isto é, desligar) a expressão do gene de interesse no ceDNA de uma maneira controlável e regulável. Em algumas modalidades, a chave pode incluir uma "chave de destruição" que pode instruir a célula que compreende o vetor de ceDNA a sofrer morte programada por célula uma vez que a chave é ativada. Chaves reguladoras exemplares abrangidas para uso em um vetor de ceDNA para expressão controla- da de transgene podem ser usados para regular a expressão de um transgene e são discutidos mais detalhadamente no pedido internacio- nal PCT/US18/49996, que é incorporado no presente documento na sua totalidade por referência (i) CHAVES REGULADORAS BINÁRIAS
[00322] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene compreende uma chave reguladora que pode servir para modular controladamente a expressão do transgene. Por exemplo, o cassete de expressão localizado entre as ITRs do ve- tor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode compre- ender adicionalmente uma região reguladora, por exemplo, um promo- tor, elemento cis, repressor, intensificador etc., que está operacional- mente ligado ao gene de interesse, em que a região reguladora é re- gulado por um ou mais cofatores ou agentes exógenos. Apenas a títu- lo de exemplo, as regiões reguladoras podem ser moduladas por cha- ves de pequenas moléculas ou promotores induzíveis ou repressíveis. Exemplos não limitativos de promotores induzíveis são promotores in- duzíveis a hormônios ou induzíveis a metais. Outros elementos promo- tores/intensificadores indutíveis exemplificativos incluem, mas não es- tão limitados a um promotor induzível por RU486, um promotor induzí- vel por ecdisona, um promotor induzível por rapamicina e um promotor de metalotioneína. (ii) CHAVES REGULADORAS DE MOLÉCULA PEQUENA
[00323] Uma variedade de chaves reguladoras à base de moléculas pequenas conhecidas na técnica é conhecida na técnica e pode ser combinada com os vetores de ceDNA no presente documento descri- tos para formar um vetor de ceDNA controlado por chave reguladora. Em algumas modalidades, a chave reguladora pode ser selecionada a partir de qualquer um ou uma combinação de: um par ligante ortogo- nal/receptor nuclear, por exemplo variante do receptor retinoide/LG335 e GRQCIMFI, juntamente com um promotor artificial que controla a expressão do transgene operacionalmente ligado, como o descrito em Taylor et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15; receptores de esteroi-
des geneticamente modificados, por exemplo, receptor de progestero- na modificado com um truncamento terminal C que não pode se ligar à progesterona, mas se liga ao RU486 (mifepristona) (Patente nº U.S.
5.364.791); um receptor de ecdisona de Drosophila e os seus ligantes de ecdiesteroide (Saez, et al., PNAS, 97 (26) (2000), 14512-14517;. ou uma chave controlada pelo antibiótico trimetoprima (TMP), tal como descrito em Sando R 3a; Nat Methods. 2013, 10 (11): 1.085 a 1.088. Em algumas modalidades, a chave reguladora para controlar o trans- gene ou expressa pelo vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene é uma chave de ativação de profármaco, como a descrita nas patentes U.S. 8.771.679 e 6.339.070. (iii) CHAVES REGULADORAS DE "CÓDIGO DE ACESSO"
[00324] Em algumas modalidades, a chave reguladora pode ser uma "chave de código de acesso" ou "circuito de código de acesso". As chaves de código de acesso permitem o ajuste fino do controle da expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene quando ocorrem condições específicas - isto é, uma combinação de condições precisa estar presente para que ocorra a expressão e/ou repressão do transgene. Por exemplo, para a expressão de um transgene ocorrer, pelo menos as condições A e B devem ocorrer. Uma chave reguladora de código de acesso pode ser qualquer número de condições, por exemplo, pelo menos 2, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6 ou pelo menos 7 ou mais condições presentes na expressão do transgene pa- ra ocorrer. Em algumas modalidades, pelo menos 2 condições (por exemplo, condições A, B) precisam ocorrer e em algumas modalida- des, pelo menos 3 condições precisam ocorrer (por exemplo, A, B e C, ou A, B e D). Apenas a título de exemplo, para que ocorra a expressão gênica de um ceDNA que possua uma chave reguladora "ABC" de có- digo de acesso, as condições A, B e C devem estar presentes. As condições A, B e C podem ser as seguintes; a condição A é a presen- ça de uma condição ou doença, a condição B é uma resposta hormo- nal e a condição C é uma resposta à expressão do transgene. Por exemplo, se o transgene edita um gene EPO defeituoso, a Condição A é a presença de Doença Renal Crônica (DRC), a Condição B ocorre se o sujeito tiver condições hipóxicas nos rins, a Condição C é o recru- tamento de células produtoras de eritropoietina (CEP) no rim está comprometido; ou, alternativamente, a ativação do HIF-2 é prejudica- da. Quando os níveis de oxigênio aumentam ou o nível desejado de EPO é alcançado, o transgene desliga novamente até que ocorram 3 condições, ligando-o novamente.
[00325] Em algumas modalidades, uma chave reguladora de código de acesso ou "circuito de código de acesso" abrangido para uso no vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene compreende fatores de transcrição híbridos (TFs) para expandir o alcance e a com- plexidade dos sinais ambientais utilizados para definir condições de biocontrole. Ao contrário de uma chave de segurança (deadman switch) que aciona a morte celular na presença de uma condição pre- determinada, o "circuito de código de acesso" permite a sobrevivência da célula ou expressão de transgene na presença de um "código de acesso" específico e pode ser facilmente reprogramado para permitir a expressão de transgene e/ou sobrevivência celular somente quando a condição ou código de acesso predeterminado estiver presente.
[00326] Qualquer e todas as combinações de chaves reguladoras no presente documento descritas, por exemplo, chaves de moléculas pequenas, chaves à base de ácidos nucleicos, chaves híbridas de pe- quenas moléculas-ácidos nucleicos, chaves de regulação de transge- ne pós-transcricionais, regulação pós-traducional, chaves controladas por radiação, chaves mediadas por hipóxia e outras chaves regulado- ras conhecidas por pessoas versados na técnica como descritos neste documento podem ser usadas em uma chave reguladora de código de acesso, conforme descrito neste documento. Chaves reguladoras abrangidas para uso também são discutidas no artigo de revisão Kis et al., JR Soc Interface. 12: 20141000 (2015) e resumidos na Tabela 1 de Kis. Em algumas modalidades, uma chave reguladora para uso em um sistema de código de acesso pode ser selecionada a partir de qual- quer uma ou uma combinação das chaves na Tabela 11. (iv. CHAVES REGULADORAS À BASE DE ÁCIDO NUCLEICO PARA
CONTROLAR A EXPRESSÃO DE TRANSGENE
[00327] Em algumas modalidades, a chave reguladora para contro- lar o transgene expresso pelo ceDNA é baseada em um mecanismo de controle à base de ácido nucleico. Mecanismos de controle de áci- do nucleico exemplificativos são conhecidos na técnica e estão previs- tos para uso. Por exemplo, esses mecanismos incluem chaves de ri- bossomo, como as descritas em, por exemplo, US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, patente U.S.
9.222.093 e pedido EP EP288071, e também descritos na revisão por Villa JK et al. Microbiol Spectr. maio de 2018; 6 (3). Também estão in- cluídos os biossensores de transcrição responsivos ao metabolito, co- mo os descritos nos documentos WO2018/075486 e WO2017/147585. Outros mecanismos conhecidos na técnica previstos para uso incluem o silenciamento do transgene com uma molécula de siRNA ou RNAi (por exemplo, miR, shRNA). Por exemplo, o vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene pode compreender uma chave regu- ladora que codifica uma molécula de RNAi que é complementar ao transgene expresso pelo vetor de ceDNA. Quando esse RNAi é ex- presso mesmo que o transgene seja expresso pelo vetor de ceDNA, o mesmo será silenciado pela molécula de RNAi complementar, e quan- do o RNAi não for expresso quando o transgene for expresso pelo ve- tor de ceDNA, o transgene não será silenciado pelo RNAi.
[00328] Em algumas modalidades, a chave reguladora é uma chave reguladora auto-inativadora específica de tecido, por exemplo, confor- me descrito em US2002/0022018, em que a chave reguladora desati- va deliberadamente a expressão de transgene em um local onde a ex- pressão de transgene pode, de outra forma, ser desvantajosa. Em al- gumas modalidades, a chave reguladora é um sistema de expressão gênica reversível por recombinase, por exemplo, como descrito em US2014/0127162 e Patente U.S. 8.324.436. (v). CHAVES REGULADORAS PÓS-TRANSCRICIONAIS E PÓS- TRADUCIONAIS.
[00329] Em algumas modalidades, a chave reguladora para contro- lar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene é um sistema de modificação pós-transcricional. Por exemplo, essa chave reguladora pode ser uma chave de ribossomo de aptazima que é sensível à tetraciclina ou teofi- lina, conforme descrito em US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, patente EP 2707487 e Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534; Zhong et al., Elife. 2 de novembro de 2016; 5 pii: e18858. Em algumas modalidades, é previsto que uma pessoa versada na técnica possa codificar o transgene e um siRNA inibidor que contém um aptâmero sensível ao ligante (chave DESATI- VADA), em que o resultado líquido é uma chave ATIVADA sensível ao ligante. (vi). OUTRAS CHAVES REGULADORAS EXEMPLIFICATIVAS
[00330] Qualquer chave reguladora conhecida pode ser usada no vetor de ceDNA para controlar a expressão gênica do transgene ex- pressa pelo vetor de ceDNA, incluindo aqueles desencadeados por mudanças ambientais. Exemplos adicionais incluem, mas não estão limitados a; o método BOC de Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018); expansão do código genético e um aminoácido não fisiológico;
chaves de ativação/ desativação controladas por radiação ou ultras- som (consulte, por exemplo, Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul; 7 (13): 1121-5; patentes nº U.S. 5.612.318; 5.571.797; 5.770.581;
5.817.636; e WO1999/025385A1. Em algumas modalidades, a chave reguladora é controlada por um sistema implantável, por exemplo, con- forme descrito na patente U.S. 7.840.263; US2007/0190028A1, em que a expressão do gene é controlada por uma ou mais formas de energia, incluindo energia eletromagnética, que ativa promotores ope- rativamente ligados ao transgene no vetor de ceDNA.
[00331] Em algumas modalidades, uma chave reguladora prevista para uso no vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene é uma chave mediada por hipóxia ou ativada por estresse, por exem- plo, como os descritos em WO1999060142A2, patente US 5.834.306;
6.218.179; 6.709.858; US2015/0322410; Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368, bem como elementos FROG, TOAD e NRSE e elementos de silêncio condutivamente indutíveis, incluindo elementos de resposta à hipóxia (HREs), elementos de resposta infla- matória (IREs) e elementos ativados por estresse de cisalhamento (SSAEs), por exemplo, como descrito na Patente nº U.S. 9.394.526. Tal modalidade é útil para ativar a expressão do transgene do vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene após isquemia ou em tecidos isquêmicos e/ou tumores. (iv). CHAVES DE DESTRUIÇÃO
[00332] Outras modalidades da invenção referem-se a um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene que compreende uma chave de destruição. Uma chave de destruição, como no presente do- cumento descrito, permite que uma célula que compreende o vetor de ceDNA seja morta ou sofra morte celular programada como um meio para remover permanentemente um vetor de ceDNA introduzido do sistema do sujeito. Será entendido por um versado na técnica que o uso de chaves de destruição nos vetores de ceDNA da invenção seria tipicamente acoplado ao alvejamento do vetor de ceDNA para um nú- mero limitado de células que o sujeito pode perder de maneira aceitá- vel ou para uma célula tipo onde a apoptose é desejável (por exemplo, células cancerígenas). Em todos os aspectos, uma "chave de destrui- ção", como descrito neste documento, é projetada para fornecer morte celular rápida e robusta da célula que compreende o vetor de ceDNA na ausência de um sinal de sobrevivência de entrada ou outra condi- ção especificada. Dito de outra maneira, uma chave de destruição co- dificada por um vetor de ceDNA no presente documento pode restrin- gir a sobrevivência celular de uma célula que compreende um vetor de ceDNA a um ambiente definido por sinais de entrada específicos. Tais chaves de destruição servem como uma função de biocontenção bio- lógica, caso seja desejável remover o vetor de ceDNA de um sujeito ou garantir que o mesmo não expresse o transgene codificado. VI. MÉTODO DETALHADO DE PRODUÇÃO DE UM VETOR DE ce-
DNA A. PRODUÇÃO EM GERAL
[00333] Certos métodos para a produção de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene que compreende um par de ITRs assimétricas ou par de ITRs simétricas, conforme no presente documento definido, são descritos na seção IV do Pedido Internacional PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018, que é incor- porado no presente documento na sua totalidade por referência. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene para uso nos métodos e composições no presente do- cumento descritos pode ser produzido usando células de inseto, como descrito no presente documento. Em modalidades alternativas, para uso nos métodos e composições no presente documento descritos, pode ser produzida sinteticamente e, em algumas modalidades, em um método sem células, conforme descrito no Pedido Internacional PCT/US19/14122, depositado em 18 de janeiro de 2019, que é no pre- sente documento incorporado na sua totalidade por referência.
[00334] Como descrito no presente documento, em uma modalida- de, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser obtido, por exemplo, pelo processo que compreende as etapas de: a) incubar uma população de células hospedeiras (por exemplo, célu- las de insetos) que abrigam o modelo de construto de expressão de polinucleotídeo (por exemplo, um ceDNA-plasmídeo, um ceDNA- bacmídeo e/ou ceDNA-baculovírus), que é desprovido de sequências codificantes do capsídeo viral, na presença de uma proteína Rep em condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células hospedeiras, e em que as células hos- pedeiras não compreendem sequências codificantes do capsídeo viral; e b) colher e isolar o vetor de ceDNA das células hospedeiras. A pre- sença da proteína Rep induz a replicação do polinucleotídeo do vetor com uma ITR modificada para produzir o vetor de ceDNA em uma cé- lula hospedeira. No entanto, não são expressas partículas virais (por exemplo, vírions AAV). Assim, não há limitação de tamanho como a imposta naturalmente no AAV ou em outros vetores à base de vírus.
[00335] A presença do vetor de ceDNA isolado das células hospe- deiras pode ser confirmada digerindo o DNA isolado da célula hospe- deira com uma enzima de restrição com um único local de reconheci- mento no vetor de ceDNA e analisando o material do DNA digerido em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas carac- terísticas de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
[00336] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece o uso de linhas de células hospedeiras que integraram estavelmente o modelo de ex- pressão de polinucleotídeo do vetor de DNA (modelo ceDNA) em seu próprio genoma na produção do vetor de DNA não viral, por exemplo, como descrito em Lee, L. et al. (2013) Plos One 8 (8): e69879. De pre- ferência, Rep é adicionada às células hospedeiras em um MOI de cer- ca de 3. Quando a linha celular hospedeira é uma linha celular de mamífero, por exemplo, células HEK293, as linhas celulares podem ter o modelo de vetor polinucleotídico integrado de forma estável e um segundo vetor como o vírus do herpes pode ser usado para introduzir a proteína Rep nas células, permitindo a excisão e amplificação do ceDNA na presença de Rep e vírus auxiliar.
[00337] Em uma modalidade, as células hospedeiras usadas para produzir os vetores de ceDNA no presente documento descritos são células de inseto, e o baculovírus é usado para distribuir o polinucleo- tídeo que codifica a proteína Rep e o modelo de construto de expres- são de polinucleotídeo de vetor de DNA não viral para ceDNA, por exemplo, como descrito nas Figuras 4A a 4C e Exemplo 1. Em algu- mas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada para expressar proteína Rep.
[00338] O vetor de ceDNA é, então, colhido e isolado das células hospedeiras. O tempo para colher e coletar vetores de ceDNA no pre- sente documento descritos a partir das células pode ser selecionado e otimizado para alcançar uma produção de alto rendimento dos vetores de ceDNA. Por exemplo, o tempo de colheita pode ser selecionado em vista da viabilidade celular, morfologia celular, crescimento celular, etc. Em uma modalidade, as células são cultivadas em condições suficien- tes e colhidas um tempo suficiente após a infecção baculoviral para produzir vetores de ceDNA, mas antes da maioria dos casos. as célu- las começam a morrer por causa da toxicidade baculoviral. Os vetores de DNA podem ser isolados usando kits de purificação de plasmídeo, como kits de plasmídeo Qiagen Endo-Free Plasmid. Outros métodos desenvolvidos para o isolamento de plasmídeo também podem ser adaptados para vetores de DNA. Geralmente, qualquer método de pu- rificação de ácido nucleico pode ser adotado.
[00339] Os vetores de DNA podem ser purificados por qualquer meio conhecido dos versados na técnica para purificação de DNA. Em uma modalidade, os vetores de ceDNA são purificados como molécu- las de DNA. Em outra modalidade, os vetores de ceDNA são purifica- dos como exossomos ou micropartículas.
[00340] A presença do vetor de ceDNA pode ser confirmada dige- rindo o DNA do vetor isolado das células com uma enzima de restrição com um único local de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o material de DNA digerido e não digerido usando eletroforese em gel para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo. A Figura 4C e a Figura 4D ilustra uma modalidade para identificar a presença dos vetores de ceDNA de extremidade fechada produzidos pelos pro- cessos no presente documento descritos. B. PLASMÍDEO DE CEDNA
[00341] Um ceDNA-plasmídeo é um plasmídeo usado para produ- ção posterior de um vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, um ceDNA-plasmídeo pode ser construído usando técnicas conhecidas para fornecer pelo menos o seguinte como componentes operacional- mente ligados na direção da transcrição: (1) uma sequência ITR 5' modificada; (2) um cassete de expressão contendo um elemento regu- lador cis, por exemplo, um promotor, promotor indutível, chave regula- dora, intensificadores e similares; e (3) uma sequência ITR 3' modifi- cada, em que a sequência ITR 3' é simétrica em relação à sequência ITR 5'. Em algumas modalidades, o cassete de expressão flanqueada pelas ITRs compreende um local de clonagem para a introdução de uma sequência exógena. O cassete de expressão substitui as regiões de codificação rep e cap dos genomas de AAV.
[00342] Em um aspecto, um vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene é obtido a partir de um plasmídeo, no presente documento dito como um "ceDNA-plasmídeo" que codifica nesta or- dem: uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de vírus adeno- associado (AAV), um cassete de expressão que compreende um transgene e uma ITR de AAV mutada ou modificada, em que o dito ceDNA-plasmídeo é desprovido de sequências de codificação da pro- teína do capsídeo de AAV. Em modalidades alternativas, o ceDNA- plasmídeo codifica nesta ordem: uma primeira (ou 5') ITR de AAV mo- dificada ou mutada, um cassete de expressão que compreende um transgene e uma segunda (ou 3') ITR de AAV modificada, em que o dito ceDNA-plasmídeo é desprovido de sequências de codificação da proteína do capsídeo AAV e em que as ITRs 5' e 3' são simétricas uma em relação à outra. Em modalidades alternativas, o ceDNA- plasmídeo codifica nesta ordem: uma primeira (ou 5') ITR AAV modifi- cada ou mutada, um cassete de expressão que compreende um transgene e uma segunda (ou 3') ITR AAV mutada ou modificada, em que o dito plasmídeo de ceDNA é desprovido de sequências de codifi- cação da proteína do capsídeo AAV, e em que as ITRs modificadas em 5' e 3' têm as mesmas modificações (isto é, são complemento in- versas ou simétricas entre si).
[00343] Em uma outra modalidade, o sistema de ceDNA-plasmídeo é desprovido de sequências codificadoras de proteínas do capsídeo viral (isto é, desprovido de genes do capsídeo do AAV, mas também de genes do capsídeo de outros vírus). Além disso, em uma modalida- de específica, o ceDNA-plasmídeo também é desprovido de sequên- cias de codificação da proteína AAV Rep. Por conseguinte, em uma modalidade preferida, o ceDNA-plasmídeo é desprovido dos genes funcionais de AAV cap e de rep de AAV GG-3' para AAV2) mais uma sequência palindrômica variável que permite a formação em formato de grampo.
[00344] Um ceDNA-plasmídeo da presente invenção pode ser ge- rado usando sequências nucleotídicas naturais dos genomas de quaisquer sorotipos de AAV bem conhecidos na técnica. Em uma mo- dalidade, a estrutura principal do ceDNA-plasmídeo é derivado do ge- noma AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ e AAV- DJ8. Por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin e Smith, The Springer Index of Virus, disponível na URL mantida pela Springer (no endereço web: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(note - referências para uma URL ou banco de dados refere-se ao conteúdo da URL ou banco de dados a partir da data efetiva de depósito deste pedido). Em uma modalidade específica, a estrutura principal do ceD- NA-plasmídeo é derivada do genoma AAV2. Em outra modalidade par- ticular, a estrutura principal do ceDNA-plasmídeo é uma cadeia princi- pal sintética geneticamente modificada para incluir em suas ITRs 5' e 3' derivadas de um desses genomas de AAV.
[00345] Um ceDNA-plasmídeo pode opcionalmente incluir um mar- cador selecionável ou de seleção para uso no estabelecimento de uma linha celular produtora de vetor de ceDNA. Em uma modalidade, o marcador de seleção pode ser inserido a jusante (isto é, 3') da se- quência ITR 3'. Em outra modalidade, o marcador de seleção pode ser inserido a montante (isto é, 5') da sequência ITR 5'. Marcadores de seleção apropriados incluem, por exemplo, aqueles que conferem re- sistência ao medicamento. Os marcadores de seleção podem ser, por exemplo, um gene de resistência a blasticidina S, canamicina, geneti- cina e similares. Em uma modalidade preferida, o marcador de seleção de fármacos é um gene de resistência à blasticidina S.
[00346] Um ceDNA exemplificativo (por exemplo, rAAV0) é produzi-
do a partir de um plasmídeo rAAV. Um método para a produção de um vetor rAAV pode compreender: (a) fornecer uma célula hospedeira com um plasmídeo rAAV como descrito acima, em que a célula hos- pedeira e o plasmídeo são desprovidos de genes que codificam a pro- teína do capsídeo, (b) cultivam o hospedeiro célula sob condições que permitem a produção de um genoma de ceDNA, e (c) colher as células e isolar o genoma de AAV produzido a partir das ditas células. C. MÉTODO EXEMPLIFICATIVO DE PRODUÇÃO DE VETORES DE
CEDNA A PARTIR DE PLASMÍDEOS DE CEDNA
[00347] Os métodos para produzir vetores de ceDNA sem capsí- deo também são no presente documento fornecidos, notadamente um método com um rendimento suficientemente alto para fornecer vetor suficiente para experiências in vivo.
[00348] Em algumas modalidades, um método para a produção de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene compre- ende as etapas de: (1) introduzir o construto de ácido nucleico que compreende um cassete de expressão e duas sequências ITR simétri- cas em uma célula hospedeira (por exemplo, células Sf9), (2) opcio- nalmente, estabelecer uma linha celular clonal, por exemplo, usando um marcador de seleção presente no plasmídeo, (3) introduzir um ge- ne de codificação Rep (por transfecção ou infecção por um baculovírus carregando o dito gene) na dita célula de inseto, e (4) colher a célula e purificar o vetor de ceDNA. O construto de ácido nucleico que compre- ende um cassete de expressão e duas sequências de ITR descritas acima para a produção do vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode estar na forma de um plasmídeo de ceDNA, ou Bacmídeo ou Baculovírus gerado com o plasmídeo de ceDNA como descrito abaixo. O construto de ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira por transfecção, transdução viral, integração estável ou outros métodos conhecidos na técnica.
D. LINHAS CELULARES:
[00349] As linhas celulares hospedeiras usadas na produção de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene podem incluir linhas celulares de insetos derivadas de Spodoptera frugiperda, como Sf9 Sf21, ou Trichoplusia ni cell, ou outras linhas celulares de inverte- brados, vertebrados ou outras linhas celulares eucarióticas, incluindo células de mamíferos. Também podem ser utilizadas outras linhas ce- lulares conhecidas por um versado na técnica, como HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, monócitos e células dendríticas maduras e imaturas. As linhas celulares hospedeiras podem ser transfectadas para expressão está- vel do ceDNA-plasmídeo para produção de vetor de ceDNA de alto rendimento.
[00350] Os ceDNA-plasmídeos podem ser introduzidos nas células Sf9 por transfecção transitória usando reagentes (por exemplo, lipos- sômico, fosfato de cálcio) ou meios físicos (por exemplo, eletropora- ção) conhecidos na técnica. Alternativamente, podem ser estabeleci- das linhas celulares Sf9 estáveis que integraram estavelmente o ceD- NA-plasmídeo em seus genomas. Tais linhas celulares estáveis po- dem ser estabelecidas incorporando um marcador de seleção no ceD- NA-plasmídeo como descrito acima. Se o ceDNA-plasmídeo usado para transfectar a linha celular incluir um marcador de seleção, como um antibiótico, as células que foram transfectadas com o plasmídeo de ceDNA e integraram o DNA do plasmídeo de ceDNA em seu genoma podem ser selecionadas para a adição do antibiótico para o meio de crescimento celular. Os clones resistentes das células podem então ser isolados por diluição de célula única ou por técnicas de transferên- cia de colônias e propagados. E. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE VETORES DE ceDNA:
[00351] Exemplos do processo para obter e isolar vetores de ceD-
NA são descritos nas Figuras 4A a 4E e os exemplos específicos abaixo. Os vetores de ceDNA no presente documento descritos podem ser obtidos a partir de uma célula produtora que expressa a proteína (ou proteínas) AAV Rep, posteriormente transformada com um ceD- NA-plasmídeo, ceDNA-bacmídeo ou ceDNA-baculovírus. Os plasmí- deos úteis para a produção de vetores de ceDNA incluem plasmídeos que incorporam uma ou mais proteínas de Rep e plasmídeos usados para obter um vetor de ceDNA. Exemplos de plasmídeos para produ- ção de vetor de ceDNA para expressão controlada de um transgene é um plasmídeo como mostrado na Figura 6B do pedido internacional PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018, que es- tá no presente documento incorporado na sua totalidade. Um plasmí- deo de ceDNA para produção de um vetor de ceDNA para expressão controlada de um anticorpo é descrito na Figura 6A e é a SEQ ID NO: 56 do Pedido Internacional PCT/US19/18016, depositado em 14 de fevereiro de 2019, que descreve um plasmídeo de ceDNA exemplar para produção de aducanmab.
[00352] Em um aspecto, um polinucleotídeo codifica a proteína de AAV Rep (Rep 78 ou Rep 68) é entregue a uma célula produtora em um plasmídeo (Rep-plasmídeo), um bacmídeo (Rep-bacmídeo) ou um baculovírus (Rep-baculovírus). O plasmídeo Rep, bacilo-rep e baculo- vírus Rep podem ser gerados pelos métodos descritos acima.
[00353] Os métodos para produzir um vetor de ceDNA, que é um vetor de ceDNA exemplar, são descritos no presente documento. Os construtos de expressão usadas para gerar vetores de ceDNA da pre- sente invenção podem ser um plasmídeo (por exemplo, ceDNA- plasmídeos), um Bacmídeo (por exemplo, ceDNA-bacmídeo) e/ou um baculovírus (por exemplo, ceDNA-baculovírus). Apenas a título de exemplo, um vetor de ceDNA pode ser gerado a partir das células co- infectadas com ceDNA-baculovírus e Rep-baculovírus. As proteínas rep produzidas a partir do baculovírus Rep podem replicar o ceDNA- baculovírus para gerar vetores de ceDNA. Alternativamente, os veto- res de ceDNA podem ser gerados a partir das células transfectadas de maneira estável com um construto que compreende uma sequência que codifica a proteína Rep AAV (Rep78/52) entregue em plasmídeos Rep, bacilos Rep ou baculovírus Rep. O CeDNA-Baculovírus pode ser transfectado transitoriamente para as células, ser replicado pela prote- ína Rep e produzir vetores de ceDNA.
[00354] O bacmídeo (por exemplo, ceDNA-bacmídeo) pode ser transfectado para células de inseto permissivas, como a célula Sf9, Sf21, Tni (Trichoplusia ni), célula High Five, e gerar ceDNA- baculovírus, que é um baculovírus recombinante, incluindo as sequên- cias que compreendem as ITRs simétricas e o cassete de expressão. O ceDNA-baculovírus pode ser novamente infectado nas células de insetos para obter uma próxima geração do baculovírus recombinante. Opcionalmente, a etapa pode ser repetida uma ou várias vezes para produzir o baculovírus recombinante em uma quantidade maior.
[00355] O tempo para colher e coletar vetores de ceDNA no presen- te documento descritos a partir das células pode ser selecionado e otimizado para alcançar uma produção de alto rendimento dos vetores de ceDNA. Por exemplo, o tempo de colheita pode ser selecionado em vista da viabilidade celular, morfologia celular, crescimento celular, etc. Normalmente, as células podem ser colhidas após tempo suficiente após a infecção baculoviral para produzir vetores de ceDNA (por exemplo, vetores de ceDNA), mas antes da maioria das células come- çar a morrer por causa da toxicidade viral. Os vetores de ceDNA po- dem ser isolados das células Sf9 usando kits de purificação de plas- mídeos, como os kits Qiagen ENDO-FREE PLASMID®. Outros méto- dos desenvolvidos para o isolamento de plasmídeo também podem ser adaptados para vetores de ceDNA. Geralmente, qualquer método de purificação de ácido nucleico conhecido na técnica pode ser adota- do, bem como kits de extração de DNA disponíveis comercialmente.
[00356] Alternativamente, a purificação pode ser implementada submetendo um sedimento celular a um processo de lise alcalina, cen- trifugando o lisado resultante e realizando a separação cromatográfica. Como um exemplo não limitativo, o processo pode ser realizado carre- gando o sobrenadante em uma coluna de troca iônica (por exemplo, SARTOBIND Q®) que retém ácidos nucleicos e eluindo (por exemplo, com uma solução de NaCl 1,2 M) e realizando uma purificação croma- tográfica adicional em um coluna de filtração em gel (por exemplo, 6 GE de fluxo rápido). O vetor AAV sem capsídeo é, então, recuperado por, por exemplo, precipitação.
[00357] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA também podem ser purificados na forma de exossomos ou micropartículas. Sa- be-se na técnica que muitos tipos de células liberam não apenas pro- teínas solúveis, mas também cargas complexas de proteínas/ácidos nucléicos via desprendimento de microvesículas de membrana (Co- cucci et al, 2009; EP 10306226.1). Essas vesículas incluem microvesí- culas (também conhecidas como micropartículas) e exossomos (tam- bém chamados de nanovesículas), que compreendem proteínas e RNA como carga. As microvesículas são geradas a partir da brotação direta da membrana plasmática, e os exossomos são liberados no ambiente extracelular mediante a fusão dos endossomos multivesicu- lares com a membrana plasmática. Assim, microvesículas e/ou exos- somos contendo vetores de ceDNA podem ser isolados de células que foram transduzidas com o ceDNA-plasmídeo ou um bacmídeo ou ba- culovírus gerado com o plasmídeo de ceDNA.
[00358] As microvesículas podem ser isoladas submetendo o meio de cultura a filtração ou ultracentrifugação a 20.000 xg e exossomos a
100.000 x g. A duração ideal da ultracentrifugação pode ser determi-
nada experimentalmente e dependerá do tipo de célula específico a partir do qual as vesículas são isoladas. Preferencialmente, o meio de cultura é primeiro limpo por centrifugação a baixa velocidade (por exemplo, a 2.000 xg por 5-20 minutos) e sujeito a concentração de centrifugação utilizando, por exemplo, uma coluna de centrifugação AMICON® (Millipore, Watford, Reino Unido). As microvesículas e exossomos podem ser ainda mais purificados via FACS ou MACS usando anticorpos específicos que reconhecem antígenos de superfí- cie específicos presentes nas microvesículas e exossomos. Outros métodos de purificação de microvesículas e exossomos incluem, mas não estão limitados a, imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, filtração e esferas magnéticas revestidas com anticorpos ou aptâmeros específicos. Após a purificação, as vesículas são lavadas com, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato. Uma vantagem do uso de microvesículas ou exossomos para fornecer vesículas conten- do ceDNA é que essas vesículas podem ser direcionadas a vários ti- pos de células, incluindo em suas membranas proteínas reconhecidas por receptores específicos nos respectivos tipos de células. (Consulte também EP 10306226)
[00359] Outro aspecto da invenção no presente documento relacio- nado refere-se a métodos de purificação de vetores de ceDNA de li- nhas celulares hospedeiras que integraram estavelmente um construto de ceDNA em seu próprio genoma. Em uma modalidade, os vetores de ceDNA são purificados como moléculas de DNA. Em outra modali- dade, os vetores de ceDNA são purificados como exossomos ou mi- cropartículas.
[00360] A Figura 5 do pedido Internacional PCT/US18/49996 mos- tra um gel que confirma a produção de ceDNA a partir de múltiplos construtos de ceDNA-plasmídeo usando o método descrito nos exem- plos. O ceDNA é confirmado por um padrão característico de banda no gel, como discutido em relação à Figura 4D nos exemplos. VII. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00361] Em outro aspecto, são fornecidas composições farmacêuti- cas. A composição farmacêutica compreende um vetor de DNA de ex- tremidade fechada, por exemplo, vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene produzido usando o processo sintético como descrito no presente documento e um veículo ou diluente farmaceuti- camente aceitável.
[00362] Os vetores de DNA como no presente documento descritos podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um sujeito para entrega in vivo a células, tecidos ou órgãos do sujeito. Tipicamente, a composição farmacêutica com- preende um vetor de ceDNA como no presente documento descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, os vetores de ceDNA no presente documento descritos podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para uma via desejada de administração terapêutica (por exemplo, administração parentérica). Transdução passiva de tecido por infusão intravenosa ou intra-arterial de alta pressão, bem como injeção intracelular, como microinjeção in- tranuclear ou injeção intracitoplasmática, também são contempladas. As composições farmacêuticas para fins terapêuticos podem ser for- muladas como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorpo- rando o composto do vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização fil- trada incluindo um vetor de ceDNA que pode ser formulado para for- necer um transgene no ácido nucleico para as células de um receptor, resultando na expressão terapêutica do transgene ou sequência doa-
dora. A composição também pode incluir um veículo farmaceuticamen- te aceitável.
[00363] As composições farmaceuticamente ativas que compreen- dem um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene po- dem ser formuladas para entregar um transgene para vários propósi- tos na célula, por exemplo, células de um sujeito.
[00364] Os vetores de DNA como no presente documento descritos podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um sujeito para entrega in vivo a células, tecidos ou órgãos do sujeito. Tipicamente, a composição farmacêutica com- preende os vetores de DNA no presente documento descritos e um carreador farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, os vetores de ceDNA da invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para uma via desejada de administração tera- pêutica (por exemplo, administração parentérica). Transdução passiva de tecido por infusão intravenosa ou intra-arterial de alta pressão, bem como injeção intracelular, como microinjeção intranuclear ou injeção intracitoplasmática, também são contempladas. As composições far- macêuticas para fins terapêuticos podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura or- denada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. As solu- ções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o com- posto de vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada.
[00365] As composições farmaceuticamente ativas que compreen- dem um vetor de ceDNA podem ser formuladas para entregar um transgene no ácido nucleico às células de um receptor, resultando na expressão terapêutica do transgene no mesmo. A composição tam- bém pode incluir opcionalmente um carreador e/ou excipiente farma-
ceuticamente aceitável.
[00366] As composições e vetores no presente documento forneci- dos podem ser utilizados para fornecer um transgene para vários pro- pósitos. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para fins de pesquisa, por exemplo, para criar um modelo animal transgênico somático que abriga o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgene. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo ani- mal de doença. Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tra- tamento ou prevenção de estados de doença em um mamífero. O transgene pode ser transferido (por exemplo, expresso em) para um paciente em quantidade suficiente para tratar uma doença associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene. Em al- gumas modalidades, o transgene é uma molécula de edição de genes (por exemplo, nuclease). Em certas modalidades, a nuclease é uma nuclease associada ao CRISPR (nuclease Cas).
[00367] As composições farmacêuticas para fins terapêuticos nor- malmente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabrica- ção e armazenamento. As soluções injetáveis estéreis podem ser pre- paradas incorporando o composto de vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de es- terilização filtrada.
[00368] Em certas circunstâncias, será desejável entregar uma composição ou vetor de ceDNA conforme descrito no presente docu- mento em composições farmacêuticas adequadamente formuladas no presente documento descritas por via subcutânea, intraopancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intratecal, adminis-
tração sistêmica ou oralmente, intraperitonealmente, ou por inalação.
[00369] É especificamente contemplado neste documento que as composições descritas neste documento compreendem um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene em uma determinada dose que é determinada pela relação dose-resposta do vetor de ceD- NA, por exemplo, uma "dose unitária" que, mediante administração, pode-se esperar de maneira confiável que produza um efeito ou nível de expressão desejado do medicamento genético em um sujeito típico.
[00370] As composições farmacêuticas para fins terapêuticos nor- malmente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabrica- ção e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura or- denada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. As solu- ções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o com- posto de vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada.
[00371] Um vetor de ceDNA para expressão controlada de transge- ne como no presente documento descrito pode ser incorporado a uma composição farmacêutica adequada para administração tópica, sistê- mica, intra-amniótica, intratecal, intracraniana, intra-arterial, intraveno- sa, intralinfática, intraperitoneal, subcutânea, traqueal, intratecido (por exemplo, intramuscular, intracardíaca, intra-hepática, intrarrenal, intra- cerebral), intratecal, intravesical, conjuntival (por exemplo, extraorbital, intraorbital, retro-orbital, intraretinal, sub-retiniana, coroide, subcoroi- dal, intrastromal, intracameral e intravítrea), intracoclear e em mucosa (por exemplo, oral, retal, nasal). Transdução passiva de tecido por in- fusão intravenosa ou intra-arterial de alta pressão, bem como injeção intracelular, como microinjeção intranuclear ou injeção intracitoplasmá- tica, também são contempladas.
[00372] Em alguns aspectos, os métodos no presente documento fornecidos compreendem entregar um ou mais vetores de ceDNA co- mo no presente documento descrito, a uma célula hospedeira. Tam- bém são fornecidas no presente documento células produzidas por esses métodos e organismos (como animais, plantas ou fungos) que compreende ou são produzidos a partir dessas células. Os métodos de administração de ácidos nucleicos podem incluir lipofecção, nucleofec- ção, microinjeção, biolística, lipossomas, imunolipossomas, polipolicá- tion ou lipídio: conjugados de ácidos nucleicos, DNA nu e captação de DNA aprimorada por agente. A lipofecção é descrita em, por exemplo, Pat. U.S. 5.049.386, 4.946.787; e 4.897.355) e os reagentes de lipo- fecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectam™ e Lipofectin™). A entrega pode ser em células (por exemplo, administra- ção in vitro ou ex vivo) ou tecidos alvo (por exemplo, administração in vivo).
[00373] Várias técnicas e métodos são conhecidos na técnica para fornecer ácidos nucleicos às células. Por exemplo, ácidos nucleicos, como ceDNA, podem ser formulados em nanopartículas lipídicas (LNPs), lipidoides, lipossomas, nanopartículas lipídicas, lipoplexes ou nanopartículas com núcleo-casca. Normalmente, as LNPs são com- postas de moléculas de ácido nucleico (por exemplo, ceDNA), um ou mais lipídios ionizáveis ou catiônicos (ou seus sais), um ou mais lipí- dios não iônicos ou neutros (por exemplo, um fosfolipídio), uma molé- cula que impede a agregação (por exemplo, PEG ou um conjugado de lipídio PEG) e, opcionalmente, um esterol (por exemplo, colesterol).
[00374] Outro método para fornecer ácidos nucleicos, como o ceD- NA a uma célula, é conjugando o ácido nucleico com um ligante que é internalizado pela célula. Por exemplo, o ligante pode se ligar a um receptor na superfície celular e internalizado via endocitose. O ligando pode ser covalentemente ligado a um nucleotídeo no ácido nucleico.
Conjugados exemplificativos para a entrega de ácidos nucleicos em uma célula são descritos, por exemplo, nos documentos WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 e WO2017/177326.
[00375] Ácidos nucleicos, como ceDNA, também podem ser entre- gues a uma célula por transfecção. Métodos de transfecção úteis in- cluem, mas não estão limitados a, transfecção mediada por lipídios, transfecção catiônica mediada por polímero ou precipitação de fosfato de cálcio. Os reagentes de transfecção são bem conhecidos na técni- ca e incluem, mas não estão limitados a, Reagente de Transfecção TurboFect (Thermo Fisher Scientific), Reagente Pro-Ject (Thermo Fis- her Scientific), Reagente de Transfecção de Proteína TRANSPASS™ P (New England Biolabs), CHARIOT™ Reagente para entrega de pro- teínas (motivo ativo), Reagente de transfecção de proteínas PROTEO- JUICE™ (EMD Millipore), 293fectina, LIPOFECTAMINE™ 2000, LI- POFECTAMINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMI- NE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™ (Thermo Fisher Sci- entific), DMRIE-C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLIGO- FECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGE- NE™ (Roche, Basileia, Suíça), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFEC- TAM™ (Transfectam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™ (Promega), TFX-20™ (Promega), TFX-50™ (Promega), TRANSFECTIN™ (Bio- Rad, Hercules, Califórnia), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Valencia, Califórnia), DC-chol (lipídios polares da Avanti), GENEPORTER™ (Gene Therapy Sy hastes, San Diego, Califórnia), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Lafayette, Colorado), DHARMA- FECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMA- FECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, St. Louis, Mo.) e ES-
CORT™ IV (Sigma Chemical Co.). Os ácidos nucleicos, como ceDNA, também podem ser entregues a uma célula através de métodos micro- fluídicos conhecidos dos versados na técnica.
[00376] Os vetores de ceDNA como no presente documento descri- tos também podem ser administrados diretamente a um organismo para a transdução de células in vivo. A administração é realizada por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma molé- cula no contato final com células sanguíneas ou teciduais, incluindo, entre outras, injeção, infusão, aplicação tópica e eletroporação. Os métodos adequados para administrar esses ácidos nucleicos estão disponíveis e são bem conhecidos dos versados na técnica e, embora mais de uma via possa ser usada para administrar uma composição específica, uma via específica pode frequentemente fornecer uma rea- ção mais imediata e mais eficaz do que outra via.
[00377] Os métodos para introdução de um vetor de ceDNA de ve- tor de ácido nucleico para expressão controlada de transgene, confor- me descrito neste documento, podem ser entregues em células-tronco hematopoiéticas, por exemplo, pelos métodos descritos, por exemplo, na Patente nº U.S. 5.928.638.
[00378] Os vetores de ceDNA de acordo com a presente invenção podem ser adicionados aos lipossomas para entrega a uma célula ou órgão alvo em um sujeito. Lipossomas são vesículas que possuem pe- lo menos uma bicamada lipídica. Os lipossomas são tipicamente utili- zados como carreadores para entrega de medicamentos/terapêuticos no contexto do desenvolvimento farmacêutico. Os mesmos trabalham fundindo-se com uma membrana celular e reposicionando sua estrutu- ra lipídica para fornecer um medicamento ou ingrediente farmacêutico ativo (API). As composições de lipossomas para essa distribuição são compostas por fosfolipídeos, especialmente compostos com um grupo fosfatidilcolina, no entanto, essas composições também podem incluir outros lipídeos. Exemplos de formulações de lipossomas e liposso- mas, incluindo, entre outros, compostos que contêm grupos funcionais de polietileno glicol (PEG), são descritos no Pedido Internacional PCT/US2018/050042, depositado em 7 de setembro de 2018, e no Pedido Internacional PCT/US2018/064242, depositado em 6 de de- zembro de 2018, por exemplo, consulte a seção "Formulações farma- cêuticas".
[00379] Vários métodos de entrega conhecidos na técnica ou modi- ficação dos mesmos podem ser utilizados para fornecer vetores de ceDNA in vitro ou in vivo. Por exemplo, em algumas modalidades, os vetores de ceDNA são entregues através da penetração transitória na membrana celular por energia mecânica, elétrica, ultrassônica, hidro- dinâmica ou baseada em laser, para facilitar a entrada de DNA nas células alvo. Por exemplo, um vetor de ceDNA para expressão contro- lada de transgene pode ser entregue interrompendo transitoriamente a membrana celular pressionando a célula através de um canal de ta- manho restrito ou por outros meios conhecidos na técnica. Em alguns casos, um vetor de ceDNA sozinho é injetado diretamente como DNA nu na pele, timo, músculo cardíaco, músculo esquelético ou células hepáticas. Em alguns casos, um vetor de ceDNA é entregue por gene gun. Partículas esféricas de ouro ou tungstênio (1 a 3 μm de diâmetro) revestidas com vetores de AAV sem capsídeo podem ser aceleradas em alta velocidade por gás pressurizado para penetrar nas células do tecido alvo.
[00380] As composições que compreendem um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene e um carreador farmaceuti- camente aceitável são especificamente contempladas no presente do- cumento. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene é formulado com um sistema de entrega de lipídeos, por exemplo, lipossomos, como no presente documento des-
crito. Em algumas modalidades, essas composições são administra- das por qualquer via desejada por um versado. As composições po- dem ser administradas a um sujeito por diferentes vias, incluindo via oral, parenteral, sublingual, transdérmica, retal, transmucosa, tópica, via inalação, via administração bucal, intrapleural, intravenosa, intra- arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal intrate- cal, e intra-articular ou combinações dos mesmos. Para uso veteriná- rio, a composição pode ser administrada como uma formulação ade- quadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal. O veterinário pode determinar prontamente o regime de dosagem e a via de administração mais apropriada para um animal em particular. As composições podem ser administradas por seringas tradicionais, dis- positivos de injeção sem agulha, "pistolas de gene de bombardeamen- to por microprojetos" ou outros métodos físicos, como eletroporação ("EP"), métodos hidrodinâmicos ou ultrassom.
[00381] Em alguns casos, um vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene é entregue por injeção hidrodinâmica, que é um método simples e altamente eficiente para a entrega intracelular direta de quaisquer compostos e partículas solúveis em água em órgãos in- ternos e músculo esquelético em um membro inteiro.
[00382] Em alguns casos, os vetores de ceDNA são entregues por ultrassom, produzindo poros nanoscópicos na membrana para facilitar a entrega intracelular de partículas de DNA nas células de órgãos ou tumores internos, de modo que o tamanho e a concentração do DNA do plasmídeo tenham um grande papel na eficiência do sistema. Em alguns casos, os vetores de ceDNA são entregues por magnetofecção usando campos magnéticos para concentrar partículas contendo ácido nucleico nas células alvo.
[00383] Em alguns casos, os sistemas de entrega química podem ser utilizados, por exemplo, usando complexos nanoméricos, que in-
cluem a compactação de ácido nucleico carregado negativamente por partículas nanoméricas policatiônicas, pertencentes a lipossomos ca- tiônicos/micelas ou polímeros catiônicos. Os lipídios catiônicos usados para o método de entrega incluem, mas não se limitam a, lipídios ca- tiônicos monovalentes, lipídios catiônicos polivalentes, compostos con- tendo guanidina, compostos derivados de colesterol, polímeros catiô- nicos (por exemplo, poli (etilenimina), poli-L-lisina, protamina, outros catiônicos polímeros) e híbrido lipídio-polímero. A. EXOSSOMOS:
[00384] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene como no presente documento des- crito é entregue por ser empacotado em um exossomo. Os exossomos são pequenas vesículas de membrana de origem endocítica que são liberadas no ambiente extracelular após a fusão de corpos multivesicu- lares com a membrana plasmática. Sua superfície consiste em uma bicamada lipídica da membrana celular da célula doadora, as mesmas contêm citosol da célula que produziu o exossomo e exibem proteínas da membrana da célula parental na superfície. Os exossomos são produzidos por vários tipos de células, incluindo células epiteliais, lin- fócitos B e T, mastócitos (MC) e células dendríticas (DC). Algumas modalidades, exossomos com diâmetro entre 10 nm e 1 μm, entre 20 nm e 500 nm, entre 30 nm e 250 nm, entre 50 nm e 100 nm, estão previstas para uso. Os exossomos podem ser isolados para uma en- trega às células-alvo usando suas células doadoras ou introduzindo ácidos nucleicos específicos nelas. Várias abordagens conhecidas na técnica podem ser usadas para produzir exossomos contendo vetores de AAV sem capsídeo da presente invenção. B. MICROPARTÍCULAS/NANOPARTÍCULAS:
[00385] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene como no presente documento des-
crito é entregue por uma nanopartícula lipídica. De um modo geral, as nanopartículas lipídicas compreendem um amino lipídeo ionizável (por exemplo, heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4- (dimetilamino)butanoato, DLIN-MC3-DMA, uma fosfatidilcolina (1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DSPC), colesterol e um lipídeo de revestimento (polietileno glicol-dimirristolglicerol, PEG-DMG), por exemplo, conforme descrito por Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5 (3): 498-507.
[00386] Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro médio entre cerca de 10 e cerca de 1.000 nm. Em algu- mas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro inferior a 300 nm. Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro entre cerca de 10 e cerca de 300 nm. Em algumas moda- lidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro inferior a 200 nm. Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro entre cerca de 25 e cerca de 200 nm. Em algumas modalidades, uma preparação de nanopartículas lipídicas (por exemplo, composição que compreende uma pluralidade de nanopartículas lipídicas) tem uma dis- tribuição de tamanho na qual o tamanho médio (por exemplo, diâme- tro) é de cerca de 70 nm a cerca de 200 nm e, mais tipicamente, o ta- manho médio é de cerca de 100 nm ou menos.
[00387] Várias nanopartículas lipídicas conhecidas na técnica po- dem ser usadas para fornecer o vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene descrito no presente documento. Por exemplo, vários métodos de administração utilizando nanopartículas lipídicas são descritos nas patentes nº U.S. 9.404.127, 9.006.417 e 9.518.272.
[00388] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene descrito neste documento é entregue por uma nanopartícula de ouro. Geralmente, um ácido nucleico pode ser ligado covalentemente a uma nanopartícula de ouro ou não cova-
lentemente a uma nanopartícula de ouro (por exemplo, ligado por uma interação carga-carga), por exemplo, como descrito por Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22 (6); 1075-1083. Em algumas modalidades, os conjugados de nanopartícu- las de ácido nucleico de ouro são produzidos usando métodos descri- tos, por exemplo, na Patente nº U.S. 6.812.334. C. CONJUGADOS
[00389] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene como no presente documento des- crito é conjugado (por exemplo, ligado covalentemente) a um agente que aumenta a captação celular. Um "agente que aumenta a captação celular" é uma molécula que facilita o transporte de um ácido nucleico através de uma membrana lipídica. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser conjugado com um composto lipofílico (por exemplo, coleste- rol, tocoferol, etc.), um peptídeo de penetração celular (CPP) (por exemplo, penetratina, TAT, Syn1B, etc.) e poliaminas (por exemplo, espermina). Outros exemplos de agentes que aumentam a captação celular são descritos, por exemplo, em Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4 (7); 791 a 809.
[00390] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene como no presente documento des- crito é conjugado com um polímero (por exemplo, uma molécula poli- mérica) ou uma molécula de folato (por exemplo, molécula de ácido fólico). Geralmente, a entrega de ácidos nucleicos conjugados com polímeros é conhecida na técnica, por exemplo, como descrito nos do- cumentos WO2000/34343 e WO2008/022309. Em algumas modalida- des, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene co- mo no presente documento descrito é conjugado com um polímero de poli(amida), por exemplo, como descrito pela Patente nº U.S.
8.987.377. Em algumas modalidades, um ácido nucleico descrito pela invenção é conjugado com uma molécula de ácido fólico como descrito na Patente nº U.S. 8.507.455.
[00391] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene como no presente documento des- crito é conjugado com um carboidrato, por exemplo, como descrito na Patente nº U.S. 8.450.467. D. NANOCÁPSULA
[00392] Alternativamente, podem ser utilizadas formulações de na- nocápsulas de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como descrito no presente documento. As nanocápsulas geralmente podem aprisionar substâncias de maneira estável e repro- duzível. Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga polimérica intracelular, essas partículas ultrafinas (dimensionadas em torno de 0,1 µm) devem ser projetadas usando polímeros com capacidade de serem degradados in vivo. Nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradáveis que atendem a esses requisitos são contempladas pa- ra uso. E. LIPOSSOMAS
[00393] Os vetores de ceDNA de acordo com a presente invenção podem ser adicionados aos lipossomas para entrega a uma célula ou órgão alvo em um sujeito. Lipossomas são vesículas que possuem pe- lo menos uma bicamada lipídica. Os lipossomas são tipicamente utili- zados como carreadores para entrega de medicamentos/terapêuticos no contexto do desenvolvimento farmacêutico. Os mesmos trabalham fundindo-se com uma membrana celular e reposicionando sua estrutu- ra lipídica para fornecer um medicamento ou ingrediente farmacêutico ativo (API). As composições de lipossomas para essa distribuição são compostas por fosfolipídeos, especialmente compostos com um grupo fosfatidilcolina, no entanto, essas composições também podem incluir outros lipídeos.
[00394] A formação e utilização de lipossomas é geralmente conhe- cida pelos especialistas na técnica. Os lipossomas foram desenvolvi- dos com melhor estabilidade do soro e circulação por meio de tempos (Patente nº U.S. 5.741.516). Além disso, foram descritos vários méto- dos de preparações de lipossomas e similares a lipossomas como po- tenciais carreadores de fármacos (Patentes nº U.S. 5.567.434;
5.552.157; 5.565.213; 5.565.213; 5.738.868 e 5.795.587). F. COMPOSIÇÕES DE LIPOSSOMAS E NANOPARTÍCULAS LIPÍDI- CAS (LNP) EXEMPLIFICATIVAS
[00395] Os vetores de ceDNA de acordo com a presente invenção podem ser adicionados aos lipossomas para entrega a uma célula, por exemplo, uma célula em necessidade de expressão do transgene. Li- possomas são vesículas que possuem pelo menos uma bicamada lipí- dica. Os lipossomas são tipicamente utilizados como carreadores para entrega de medicamentos/terapêuticos no contexto do desenvolvimen- to farmacêutico. Os mesmos trabalham fundindo-se com uma mem- brana celular e reposicionando sua estrutura lipídica para fornecer um medicamento ou ingrediente farmacêutico ativo (API). As composições de lipossomas para essa distribuição são compostas por fosfolipídeos, especialmente compostos com um grupo fosfatidilcolina, no entanto, essas composições também podem incluir outros lipídeos.
[00396] Nanopartículas lipídicas (LNPs) que compreendem ceDNA são descritas no Pedido Internacional PCT/US2018/050042, deposita- do em 7 de setembro de 2018, e no Pedido Internacional PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018, que são incorporados no presente documento na sua totalidade e previstos pa- ra uso nos métodos e composições no presente documento descritos.
[00397] Em alguns aspectos, uma nanopartícula lipídica que com- preende um ceDNA é um lipídeo ionizável.
[00398] Geralmente, as partículas lipídicas são preparadas na ra-
zão total entre lipídeos e ceDNA (massa ou peso) de cerca de 10:1 a 30:1. Em algumas modalidades, a razão lipídio/ceDNA (razão mas- sa/massa; razão p/p) pode estar na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de cerca de 10:1 a cerca de 14:1, de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 9:1 ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1. As quantidades de lipídios e ceDNA podem ser ajustadas para fornecer uma razão N/P desejada, por exemplo, razão N/P de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou superior.
Geralmente, o conteúdo lipídico geral da formulação de partículas lipídicas pode vari- ar de cerca de 5 mg/ml a cerca de 30 mg/ml.
Os lipídeos ionizáveis são também no presente documento ditos como lipídeos catiônicos.
Lipídeos ionizáveis exemplificativos são descritos nas publicações de patente PCT Internacionais WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825,
WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 e WO2013/086354, e publicações de patente US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 e US2013/0195920, cujos conteúdos são todos in- corporados ao presente documento a título de referência em suas tota- lidades.
[00399] Em algumas modalidades, o lipídeo ionizável é MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il-4- (dimetilamino)butanoato (DLin-MC3-DMA ou MC3) com a seguinte es- trutura: . VIII. MÉTODOS DE ENTREGA DE VETORES DE ceDNA
[00400] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex-
pressão controlada de transgene pode ser entregue a uma célula-alvo in vitro ou in vivo por vários métodos adequados. Os vetores de ceD- NA sozinhos podem ser aplicados ou injetados. Os vetores de CeDNA podem ser entregues a uma célula sem a ajuda de um reagente de transfecção ou outros meios físicos. Como alternativa, os vetores de ceDNA podem ser entregues usando qualquer reagente de transfec- ção conhecido na técnica ou outro meio físico conhecido na técnica que facilite a entrada de DNA na célula, por exemplo, lipossomas, ál- coois, compostos ricos em polilisina, compostos ricos em arginina, fos- fato de cálcio, microvesículas, microinjeção, eletroporação e similares.
[00401] Por outro lado, as transduções com vetores de AAV sem capsídeo no presente documento descritos podem direcionar eficien- temente tipos de células e tecidos que são difíceis de transduzir com vírions de AAV convencionais usando vários reagentes de entrega.
[00402] Em outra modalidade, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene é administrado ao CNS (por exemplo, ao cé- rebro ou ao olho). O vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser introduzido na medula espinhal, tronco cerebral (medula oblongada, ponte), mesencéfalo (hipotálamo, tálamo, epitála- mo, glândula pituitária, substância negra, glândula pineal), cerebelo, telencéfalo (corpo estriado, cérebro incluindo occipital, temporal, lobos parietais e frontais, córtex, gânglios da base, hipocampo e porta- amígdala), sistema límbico, neocórtex, corpo estriado, cérebro e colí- culo inferior. O vetor de ceDNA também pode ser administrado em di- ferentes regiões do olho, como retina, córnea e/ou nervo óptico. O ve- tor de ceDNA pode ser entregue no líquido cefalorraquidiano (por exemplo, por punção lombar). O vetor de ceDNA pode ainda ser admi- nistrado por via intravascular ao SNC em situações em que a barreira hematoencefálica foi perturbada (por exemplo, tumor cerebral ou infar- to cerebral).
[00403] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene pode ser administrado à região (ou regi- ões) desejada do CNS por qualquer via conhecida na técnica, incluin- do, mas não se limitando a, intratecal, intraocular, intracerebral, intra- ventricular, intravenosa (por exemplo, na presença de açúcar, como manitol), entrega intranasal, intra-aural, intraocular (por exemplo, intra- vítrea, subretiniana, câmara precedente) e periocular (por exemplo, região sub-Tenon), bem como entrega intramuscular com entrega re- trógrada aos neurônios motores.
[00404] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene é administrado em uma formulação líqui- da por injeção direta (por exemplo, injeção estereotática) na região ou compartimento desejado no CNS. Em outras modalidades, o vetor de ceDNA pode ser fornecido por aplicação tópica na região desejada ou por administração intranasal de uma formulação de aerossol. A admi- nistração ocular pode ser por aplicação tópica de gotículas de líquido. Como alternativa adicional, o vetor de ceDNA pode ser administrado como uma formulação sólida de liberação lenta (consulte, por exem- plo, Patente nº U.S. 7.201.898). Em modalidades ainda adicionais, o vetor de ceDNA pode ser usado para transporte retrógrado para tratar, melhorar e/ou prevenir doenças e distúrbios envolvendo neurônios mo- tores (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica (ALS); atrofia muscu- lar espinhal (SMA), etc.). Por exemplo, o vetor de ceDNA pode ser en- tregue ao tecido muscular a partir do qual pode migrar para os neurô- nios. IX. USOS ADICIONAIS DOS VETORES DE ceDNA
[00405] As composições e vetores de ceDNA como no presente do- cumento descritos podem ser utilizados para expressar um gene ou transgene alvo para vários propósitos. Em algumas modalidades, o transgene resultante codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para fins de pesquisa, por exemplo, para criar um modelo animal transgênico somático que abriga o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgene. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doença. Em al- gumas modalidades, o transgene resultante codifica um ou mais pep- tídeos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tratamento, prevenção ou melhoria de estados ou distúrbios de doenças em um sujeito mamífero. O transgene resultante pode ser transferido (por exemplo, expresso em) para um sujeito em uma quantidade suficiente para tratar uma doença associada à expressão reduzida, falta de ex- pressão ou disfunção do gene. Em algumas modalidades, o transgene resultante pode ser expresso em um sujeito em quantidade suficiente para tratar uma doença associada ao aumento da expressão, atividade do produto do gene ou regulação positiva inadequada de um gene que o transgene resultante suprime ou causa a expressão da qual ser re- duzido. Em ainda outras modalidades, o transgene resultante substitui ou suplementa uma cópia defeituosa do gene nativo. Será entendido por um versado na técnica que o transgene pode não ser um quadro de leitura aberta de um gene a ser transcrito; em vez disso, pode ser uma região promotora ou região repressora de um gene alvo, e o vetor de ceDNA pode modificar essa região com o resultado de modular a expressão de um gene de interesse.
[00406] Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteí- na ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doença. Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tratamento ou prevenção de estados de doença em um mamífero. O transgene pode ser transferido (por exemplo, expresso em) para um paciente em quantidade suficiente para tratar uma doença associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene. X. MÉTODOS DE USO
[00407] O vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, conforme descrito neste documento, também pode ser usado em um método para a entrega de uma sequência de nucleotídeos de interes- se (por exemplo, um transgene) a uma célula-alvo (por exemplo, uma célula hospedeira). O método pode, em particular, ser um método para entregar um transgene a uma célula de um sujeito em necessidade e tratar uma doença de interesse. A invenção permite a expressão in vivo de um transgene, por exemplo, uma proteína, anticorpo, ácido nu- cleico como miRNA etc. codificado no vetor de ceDNA em uma célula de um sujeito de tal modo que ocorra efeito terapêutico da expressão do transgene. Esses resultados são vistos com os modos in vivo e in vitro da entrega do vetor de ceDNA.
[00408] Além disso, a invenção fornece um método para a entrega de um transgene em uma célula de um sujeito em necessidade do mesmo, que compreende múltiplas administrações do vetor de ceDNA da invenção que compreende o dito ácido nucleico ou transgene de interesse para titular a expressão de transgene ao nível desejado.
[00409] Os ácidos nucleicos do vetor de ceDNA são administrados em quantidades suficientes para transfectar as células de um tecido desejado e fornecer níveis suficientes de transferência e expressão gênica sem efeitos adversos indevidos. As vias de administração con- vencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitadas a, intravenosa (por exemplo, em uma formulação de lipos- somas), entrega direta ao órgão selecionado (por exemplo, entrega intraportal ao fígado), intramuscular e outras vias de administração pa- rentais. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado.
[00410] A entrega do vetor de DNA fechado (por exemplo, vetor de ceDNA) não se limita às substituições de genes de entrega. Por exemplo, produzido convencionalmente (por exemplo, usando um mé- todo de produção baseado em células ou vetores de DNA fechados sinteticamente produzidos) (por exemplo, vetores de ceDNA) como descrito no presente documento pode ser usado com outros sistemas de entrega fornecidos para fornecer uma porção da terapia genética. Um exemplo não limitativo de um sistema que pode ser combinado com os vetores de ceDNA produzidos sinteticamente, de acordo com a presente invenção, inclui sistemas que entregam separadamente um ou mais cofatores ou supressores imunológicos para expressão gênica eficaz do transgene.
[00411] A invenção também fornece um método de tratamento de uma doença em um sujeito que compreende introduzir em uma célula alvo em necessidade (em particular, uma célula muscular ou tecido) do sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz um vetor de ceDNA, opcionalmente com um carreador farmaceuticamente aceitável. Embo- ra o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene possa ser introduzido na presença de um carreador, esse carreador não é necessário. O vetor de ceDNA selecionado compreende uma sequên- cia de nucleotídeos de interesse útil no tratamento da doença. Em par- ticular, o vetor de ceDNA pode compreender uma sequência de DNA exógena desejada operacionalmente ligada a elementos de controle capazes de direcionar a transcrição do polipeptídeo, proteína ou oligo- nucleotídeo desejado codificado pela sequência de DNA exógena quando introduzido no sujeito. O vetor de ceDNA pode ser administra- do por qualquer via adequada, como fornecido acima, e em outras par- tes deste documento.
[00412] As composições e vetores no presente documento forneci- dos podem ser utilizados para fornecer um transgene para vários pro- pósitos. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para fins de pesquisa,
por exemplo, para criar um modelo animal transgênico somático que abriga o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgene. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo ani- mal de doença. Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tra- tamento ou prevenção de estados de doença em um sujeito mamífero. O transgene pode ser transferido (por exemplo, expresso em) para um paciente em quantidade suficiente para tratar uma doença associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene.
[00413] A princípio, o cassete de expressão pode incluir um ácido nucleico ou qualquer transgene que codifique uma proteína ou polipep- tídeo que seja reduzido ou ausente devido a uma mutação ou que transmita um benefício terapêutico quando a expressão superexpressa estiver dentro do escopo da invenção. De preferência, o DNA bacteri- ano não inserido não está presente e, de preferência, nenhum DNA bacteriano está presente nas composições de ceDNA no presente do- cumento fornecidas.
[00414] Um vetor de ceDNA para expressão controlada de transge- ne não está limitado a uma espécie de vetor de ceDNA. Como tal, em outro aspecto, vários vetores de ceDNA compreendendo diferentes transgenes ou o mesmo transgene, mas operacionalmente ligados a diferentes promotores ou elementos cis-reguladores, podem ser entre- gues simultaneamente ou sequencialmente à célula, tecido, órgão ou sujeito alvo. Portanto, essa estratégia pode permitir a terapia genética ou a entrega de genes de múltiplos genes simultaneamente. Também é possível separar partes diferentes do transgene em vetores de ceD- NA separados (por exemplo, domínios diferentes e/ou cofatores ne- cessários para a funcionalidade do transgene) que podem ser adminis- trados simultaneamente ou em momentos diferentes e podem ser re-
guláveis separadamente, desse modo adicionando um nível adicional de controle da expressão do transgene. A entrega também pode ser realizada várias vezes e, principalmente para a terapia de genes no cenário clínico, em doses subsequentes crescentes ou decrescentes, dada a falta de uma resposta imune do hospedeiro anticapsídeo devi- do à ausência de um capsídeo viral. Prevê-se que não ocorra resposta anticapsídeo, pois não há capsídeo.
[00415] A invenção também fornece um método de tratamento de uma doença em um sujeito que compreende introduzir em uma célula alvo em necessidade do mesmo (em particular, uma célula muscular ou tecido) do sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de ceDNA conforme revelado no presente documento, opcional- mente com um carreador farmaceuticamente aceitável. Embora o vetor de ceDNA possa ser introduzido na presença de um carreador, esse carreador não é necessário. O vetor de ceDNA implementado compre- ende uma sequência de nucleotídeos de interesse útil no tratamento da doença. Em particular, o vetor de ceDNA pode compreender uma sequência de DNA exógena desejada operacionalmente ligada a ele- mentos de controle capazes de direcionar a transcrição do polipeptí- deo, proteína ou oligonucleotídeo desejado codificado pela sequência de DNA exógena quando introduzido no sujeito. O vetor de ceDNA pa- ra expressão controlada de transgene pode ser administrado por qual- quer via adequada, como fornecido acima, e em outras partes deste documento. XI. MÉTODOS DE TRATAMENTO
[00416] A tecnologia no presente documento descrita também de- monstra métodos para a fabricação, bem como métodos de uso dos vetores de ceDNA descritos de várias maneiras, incluindo, por exem- plo, aplicações ex situ, in vitro e in vivo, metodologias, procedimentos de diagnóstico e/ou esquemas de terapia genética.
[00417] É fornecido no presente documento um método de trata- mento de uma doença ou distúrbio em um sujeito que compreende a introdução em uma célula alvo que do mesmo necessite (por exemplo, uma célula ou tecido muscular ou outro tipo de célula afetada) do su- jeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma edição de genes de vetor de ceDNA, opcionalmente com um carreador farmaceutica- mente aceitável. Embora o vetor de ceDNA possa ser introduzido na presença de um carreador, esse carreador não é necessário. O vetor de ceDNA implementado compreende uma sequência de nucleotídeos de interesse útil no tratamento da doença. Em particular, o vetor de ceDNA pode compreender uma sequência de DNA exógena desejada operacionalmente ligada a elementos de controle capazes de direcio- nar a transcrição do polipeptídeo, proteína ou oligonucleotídeo deseja- do codificado pela sequência de DNA exógena quando introduzido no sujeito. O vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser administrado por qualquer via adequada, como fornecido acima, e em outras partes deste documento.
[00418] São descritas no presente documento composições e for- mulações de vetores de ceDNA que incluem um ou mais dos vetores de ceDNA da presente invenção, juntamente com um ou mais tam- pões, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições podem ser incluídas em um ou mais kits de diagnóstico ou terapêuticos, para diagnosticar, prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas de uma doença, lesão, distúrbio, trauma ou disfunção. Em um aspecto, a doença, lesão, distúrbio, trauma ou disfunção é uma doença, lesão, distúrbio, trauma ou disfunção humana.
[00419] Outro aspecto da tecnologia descrita neste documento for- nece um método para fornecer a um sujeito em necessidade do mes- mo uma quantidade diagnóstica ou terapeuticamente eficaz de um ve- tor de ceDNA, em que o método compreende o fornecimento a uma célula, tecido ou órgão de um sujeito em necessidade do mesmo, uma quantidade de vetor de ceDNA como no presente documento descrito; e por um tempo eficaz para permitir a expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA, fornecendo, assim, ao sujeito uma quantidade di- agnóstica ou terapeuticamente eficaz da proteína, peptídeo, ácido nu- cleico expresso pelo vetor de ceDNA. Em outro aspecto, o sujeito é um ser humano.
[00420] Outro aspecto da tecnologia descrita neste documento for- nece um método para diagnosticar, prevenir, tratar ou melhorar pelo menos um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio, disfunção, le- são, condição anormal ou trauma de um sujeito. Em um sentido geral e, geralmente, o método inclui pelo menos a etapa de administrar a um sujeito em necessidade um ou mais dos vetores de ceDNA descritos, em uma quantidade e por um tempo suficiente para diagnosticar, pre- venir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas da doença, distúrbio, disfunção, lesão, condição anormal ou trauma no sujeito. Em outro as- pecto, o sujeito é um ser humano.
[00421] Outro aspecto é o uso do vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como uma ferramenta para tratar ou reduzir um ou mais sintomas de uma doença ou estados de doença. Existem várias doenças hereditárias nas quais os genes defeituosos são co- nhecidos e geralmente se enquadram em duas classes: estados de deficiência, geralmente de enzimas, que geralmente são herdadas de maneira recessiva, e estados desequilibrados, que podem envolver proteínas reguladoras ou estruturais, e que são tipicamente, mas nem sempre, herdados de maneira dominante. Para doenças em estado de deficiência, os vetores de ceDNA podem ser usados para entregar transgenes para trazer um gene normal aos tecidos afetados para te- rapia de substituição, bem como, em algumas modalidades, para criar modelos animais para a doença usando mutações antissenso. Para estados de doença desequilibrados, os vetores de ceDNA podem ser usados para criar um estado de doença em um sistema modelo, que pode ser usado em esforços para combater o estado de doença. As- sim, os vetores e métodos de ceDNA no presente documento descritos permitem o tratamento de doenças genéticas. Como no presente do- cumento utilizado, um estado de doença é tratado por remediar parcial ou totalmente a deficiência ou desequilíbrio que causa a doença ou a torna mais grave. A. CÉLULAS HOSPEDEIRAS:
[00422] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene entrega o transgene em uma célula hos- pedeira em questão. Em algumas modalidades, a célula hospedeira em questão é uma célula hospedeira humana, incluindo, por exemplo, células sanguíneas, células-tronco, células hematopoiéticas, células CD34+, células hepáticas, células cancerígenas, células vasculares, células musculares, células pancreáticas, células neurais, células ocu- lares ou da retina, células epiteliais ou endoteliais, células dendríticas, fibroblastos ou qualquer outra célula de origem mamífera, incluindo, sem limitação, células hepáticas (isto é, fígado), células pulmonares, células cardíacas, células pancreáticas, células intestinais, células dia- fragmáticas, células renais (isto é, rim), células neurais, células san- guíneas, células da medula óssea ou qualquer um ou mais tecidos se- lecionados de um indivíduo para o qual a terapia gênica é contempla- da. Em um aspecto, a célula hospedeira do sujeito é uma célula hos- pedeira humana.
[00423] A presente invenção também se refere a células hospedei- ras recombinantes, como mencionado acima, incluindo vetores de ce- DNA, como no presente documento descrito. Assim, pode-se usar vá- rias células hospedeiras, dependendo da finalidade, como é óbvio para o versado. Um construto ou vetor de ceDNA para expressão controla-
da de transgene que inclui a sequência doadora é introduzido em uma célula hospedeira, de modo que a sequência doadora seja mantida como um integrador cromossômico, como descrito precedentemente. O termo célula hospedeira abrange qualquer progênie de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedei- ra dependerá em grande parte da sequência do doador e de sua fonte. A célula hospedeira também pode ser um eucarionte, como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula humana (por exemplo, uma célula primária, uma célula-tronco ou uma linha celular imortalizada). Em algumas mo- dalidades, a célula hospedeira pode ser administrada ao vetor de ce- DNA para a expressão controlada do transgene ex vivo e depois en- tregue ao sujeito após o evento de terapia genética. A célula hospedei- ra pode ser qualquer tipo de célula, por exemplo, uma célula somática ou uma célula-tronco, uma célula-tronco pluripotente induzida ou uma célula sanguínea, por exemplo, célula T ou célula B ou célula da me- dula óssea. Em certas modalidades, a célula hospedeira é uma célula alogênica. Por exemplo, a modificação genética do genoma de células T é útil para imunoterapias de câncer, modulação de doenças como terapia de HIV (por exemplo, nocaute de receptor, como CXCR4 e CCR5) e terapias de imunodeficiência. Os receptores MHC nas células B podem ser direcionados para imunoterapia. Em algumas modalida- des, células hospedeiras modificadas por gene, por exemplo, células- tronco da medula óssea, por exemplo, células CD34+, ou células- tronco pluripotentes induzidas, podem ser transplantadas de volta para um paciente para expressão de uma proteína terapêutica. B. DOENÇAS E TRANSGENES EXEMPLARES A SEREM TRATA- DOS COM UM VETOR DE ceDNA
[00424] Os vetores de ceDNA também são úteis para corrigir um gene defeituoso. Como um exemplo não limitativo, o gene DMD da Distrofia Muscular de Duchene pode ser entregue usando os vetores de ceDNA, conforme descrito no presente documento.
[00425] O vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene ou uma composição do mesmo pode ser utilizado no tratamento de qualquer doença hereditária. Como um exemplo não limitativo, o vetor de ceDNA ou uma composição do mesmo, por exemplo, pode ser usado no tratamento da transtirretina amiloidose (ATTR), uma doença órfã, em que a proteína mutante se dobra de maneira incorreta e se agrega nos nervos, no coração, no sistema gastrointestinal etc. É con- templado neste documento que a doença pode ser tratada por deleção do gene da doença mutante (mutTTR) usando os sistemas de edição de genes no presente documento descritos. Tais tratamentos de doen- ças hereditárias podem interromper a progressão da doença e podem permitir a regressão de uma doença estabelecida ou a redução de pe- lo menos um sintoma da doença em pelo menos 10%.
[00426] Em outra modalidade, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser usado no tratamento da deficiência de ornitina transcarbamilase (deficiência de OTC), hiperamonemia ou outros distúrbios do ciclo da ureia, que prejudicam a capacidade de um neonato ou criança de desintoxicar a amônia. Como em todas as do- enças do metabolismo congênito, é contemplado no presente docu- mento que mesmo uma restauração parcial da atividade enzimática em comparação com controles do tipo selvagem (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pe- lo menos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99%) podem ser sufici- entes para a redução de pelo menos um sintoma de OTC e/ou uma melhoria na qualidade de vida para um sujeito com deficiência de OTC. Em uma modalidade, um ácido nucleico que codifica OTC pode ser inserido atrás do promotor endógeno de albumina para substitui- ção de proteínas in vivo.
[00427] Em outra modalidade, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser usado no tratamento de fenilcetonú- ria (PKU), entregando uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima fenilalanina hidroxilase para reduzir o acúmulo de fenila- lanina alimentício, que pode ser tóxico para quem sofre de PKU. Como em todas as doenças do metabolismo congênito, é contemplado no presente documento que mesmo uma restauração parcial da atividade enzimática em comparação com controles do tipo selvagem (por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo me- nos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99%) po- dem ser suficientes para a redução de pelo menos um sintoma da PKU e/ou uma melhoria na qualidade da vida para um sujeito com PKU. Em uma modalidade, um ácido nucleico que codifica a fenilalani- na hidroxilase pode ser inserido atrás do promotor endógeno de albu- mina para substituição in vivo da proteína.
[00428] Em outra modalidade, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser usado no tratamento de doença de armazenamento de glicogênio (GSD), entregando uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima para corrigir a síntese ou de- composição aberrante de glicogênio em indivíduos com GSD. Exem- plos não limitativos de enzimas que podem ser entregues e expressas usando os vetores de ceDNA e métodos como no presente documento descritos incluem glicogênio sintase, glicose-6-fosfatase, ácido alfa- glucosidase, enzima de desramificadora de glicogênio, enzima ramifi- cadora de glicogênio, glicogênio fosforilase muscular, glicogênio fosfo- rilase hepática, fosfofructoquinase muscular, fosforilase quinase, car- reador de glicose-2 (GLUT-2), aldolase A, beta-enolase, fosfoglucomu-
tase-1 (PGM-1) e glicogenina-1. Como em todas as doenças do meta- bolismo congênito, é contemplado no presente documento que mesmo uma restauração parcial da atividade enzimática em comparação com controles do tipo selvagem (por exemplo, pelo menos 20%, pelo me- nos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo me- nos 95% ou pelo menos 99%) podem ser suficientes para a redução de pelo menos um sintoma de GSD e/ou uma melhoria na qualidade de vida para um sujeito com GSD. Em uma modalidade, um ácido nu- cleico que codifica uma enzima para corrigir o armazenamento aber- rante de glicogênio pode ser inserido atrás do promotor endógeno de albumina para substituição de proteína in vivo.
[00429] Os vetores de ceDNA no presente documento descritos também são contemplados para uso no tratamento de qualquer um dentre: amaurose congênita de Leber (LCA), doenças de poliglutami- na, incluindo repetições de poliQ e deficiência de alfa-1 antitripsina (A1AT). A LCA é uma doença ocular congênita rara que resulta em cegueira, que pode ser causada por uma mutação em qualquer um dos seguintes genes: GUCY2D, RPE65, SPATA7, AIPL1, LCA5, RPGRIP1, CRX, CRB1, NMNAT1, CEP290, IMPDH1, RD3, RDH12, LRAT, TULP1, KCNJ13, GDF6 e/ou PRPH2. É contemplado neste do- cumento que os vetores de ceDNA e composições e métodos como no presente documento descritos podem ser adaptados para a entrega de um ou mais dos genes associados à LCA, a fim de corrigir um erro no gene (ou genes) responsável pelos sintomas da LCA. As doenças da poliglutamina incluem, mas não estão limitadas a: atrofia dentatoru- bropalidoluisiana, doença de Huntington, atrofia muscular espinhal e bulbar e ataxia espinocerebelar dos tipos 1, 2, 3 (também conhecida como doença de Machado-Joseph), 6, 7 e 17. A deficiência de A1AT é um distúrbio genético que causa produção defeituosa de alfa-1 anti-
tripsina, levando à diminuição da atividade da enzima no sangue e nos pulmões que, por sua vez, podem levar ao enfisema ou doença pul- monar obstrutiva crônica nos indivíduos afetados. O tratamento de um sujeito com uma deficiência de A1AT é especificamente contemplado no presente documento, usando os vetores de ceDNA ou suas com- posições, conforme descrito no presente documento. É contemplado no presente documento que um vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína desejada para o tratamento de LCA, doenças de poliglu- tamina ou deficiência de A1AT pode ser administrado a um sujeito que precisa de tratamento.
[00430] Em outras modalidades, as composições que compreen- dem um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene con- forme descrito no presente documento podem ser usadas para entre- gar uma sequência de patógeno, uma sequência cromossômica, uma junção de translocação (por exemplo, uma translocação associada ao câncer), um gene de não codificação de RNA ou sequência de RNA, um gene associado à doença, entre outros.
[00431] Qualquer ácido nucleico ou gene alvo de interesse pode ser entregue ou expresso por um vetor de ceDNA para expressão contro- lada de transgene, como no presente documento descrito. Os ácidos nucleicos alvo e os genes alvo incluem, entre outros, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ou ácidos nucleicos não codificadores (por exemplo, RNAi, miRs etc.), de preferência, terapêuticos (por exemplo, para uso médico, diagnóstico ou veterinário) ou polipeptídeos imuno- gênicos (por exemplo, para vacinas). Em certas modalidades, os áci- dos nucleicos alvo ou genes alvo que são alvejados pelos vetores de ceDNA, conforme descrito no presente documento, codificam um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, ácidos nucleicos peptídicos, siRNAs, RNAis, oligonucleotídeos antissenso, polinucleotídeos antis-
senso, anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno ou qualquer com- binação dos mesmos.
[00432] Em particular, um alvo genético ou transgene para expres- são pelo vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene con- forme descrito neste documento pode codificar, por exemplo, mas não se limita a, proteína (ou proteínas), polipeptídeo (ou polipeptídeos), peptídeo (ou peptídeos), enzima (ou enzimas), anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, bem como variantes e/ou fragmentos ativos, para uso no tratamento, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sinto- mas de uma doença, disfunção, lesão e/ou distúrbio. Em um aspecto, a doença, disfunção, trauma, lesão e/ou distúrbio é uma doença, dis- função, trauma, lesão e/ou distúrbio humano.
[00433] O cassete de expressão também pode codificar polipeptí- deos, oligonucleotídeos senso ou antissenso ou RNAs (codificadores ou não codificadores; por exemplo, siRNAs, shRNAs, micro-RNAs e seus equivalentes antissenso (por exemplo, antagoMiR)). Os cassetes de expressão podem incluir uma sequência exógena que codifica uma proteína repórter a ser usada para fins experimentais ou de diagnósti- co, como β-lactamase, β-galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina, timi- dina cinase, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetil- transferase (CAT), luciferase e outros bem conhecidos na técnica.
[00434] As sequências fornecidas no cassete de expressão, cons- truto de expressão ou sequência doadora de um vetor de ceDNA no presente documento descrito podem ser otimizadas por códon para a célula hospedeira. Como usado no presente documento, o termo "oti- mização de códon" ou "otimização de códon" refere-se ao processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão aprimorada nas células do vertebrado de interesse, por exemplo, ca- mundongo ou ser humano, substituindo pelo menos um, mais de um ou um número significativo de códons da sequência nativa (por exem-
plo, uma sequência procariótica) com códons que são mais frequen- temente ou mais frequentemente usados nos genes desse vertebrado. Várias espécies exibem viés particular para certos códons de um ami- noácido particular. Tipicamente, a otimização do códon não altera a sequência de aminoácidos da proteína traduzida original. Os códons otimizados podem ser determinados usando, por exemplo, a platafor- ma de otimização de códons Gene Forge® da Aptagen e síntese ge- nética personalizada (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) ou outro banco de dados disponível publicamen- te.
[00435] Muitos organismos exibem uma tendência para o uso de códons específicos para codificar a inserção de um aminoácido espe- cífico em uma cadeia peptídica crescente. A preferência do códon ou o viés do códon, as diferenças no uso de códons entre organismos, são proporcionadas pela degeneração do código genético e estão bem do- cumentadas entre muitos organismos. O viés de códon frequentemen- te se correlaciona com a eficiência da tradução do RNA mensageiro (mRNA), que por sua vez se acredita ser dependente, entre outros, das propriedades dos códons sendo traduzidos e da disponibilidade de moléculas de RNA de transferência (tRNA) específicas. A predomi- nância de tRNAs selecionadas em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados com mais frequência na síntese de peptídeos. Por conseguinte, os genes podem ser adaptados para a expressão ideal de genes em um determinado organismo com base na otimização de códons.
[00436] Dado o grande número de sequências de genes disponíveis para uma grande variedade de espécies animais, vegetais e microbia- nas, é possível calcular as frequências relativas do uso de códons (Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res.
28: 292 (2000)).
[00437] Como observado neste documento, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene no presente documento des- crito pode codificar uma proteína ou peptídeo, ou sequência terapêuti- ca de ácido nucleico ou agente terapêutico, incluindo, mas não se limi- tando a um ou mais agonistas, antagonistas, fatores antiapoptose, ini- bidores receptores, citocinas, citotoxinas, agentes eritropoiéticos, gli- coproteínas, fatores de crescimento, receptores de fatores de cresci- mento, hormônios, receptores hormonais, interferons, interleucinas, receptores de interleucina, fatores de crescimento nervoso, peptídeos neuroativos, receptores de peptídeos neuroativos, proteases, inibido- res de protease, descarboxilases de proteínas, proteínas cinases, ini- bidores de proteínas cinases, enzimas, proteínas de ligação ao recep- tor, proteínas de transporte ou um ou mais inibidores das mesmas, re- ceptores de serotonina ou um ou mais inibidores da sua captação, serpinas, receptores de serpina, supressores de tumor, moléculas de diagnóstico, agentes quimioterapêuticos, citotoxinas ou qualquer com- binação dos mesmos.
[00438] Os vetores de ceDNA também são úteis para ablação da expressão do gene. Por exemplo, em uma modalidade, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser usado para expressar um ácido nucleico antissenso ou RNA funcional para induzir knockdown de um gene alvo. Como um exemplo não limitativo, a ex- pressão de CXCR4 e CCR5, receptores de HIV, foi eliminada com su- cesso em células T humanas primárias, ver Schumann et al. (2015), PNAS 112 (33): 10.437 a 10.442, no presente documento incorporado por referência na sua totalidade. Outro gene para inibição direcionada é PD-1, onde o vetor de ceDNA pode expressar um ácido nucleico ini- bidor ou RNAi ou RNA funcional para inibir a expressão de PD-1. PD-1 expressa um receptor de superfície celular de ponto de verificação imune em células T cronicamente ativas que ocorre em malignidade. Consulte Schumann et al. supra.
[00439] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA é útil para corrigir um gene defeituoso, expressando um transgene que tem como alvo o gene doente. Exemplos não limitativos de doenças ou distúrbios passíveis de tratamento por vetor de ceDNA conforme revelado no presente documento estão listados nas Tabelas A a C, juntamente com seus genes e os genes associados da publicação da patente n.º U.S. 2014/0170753, que é no presente documento incorporada por referência na sua totalidade.
[00440] Em modalidades alternativas, os vetores de ceDNA são usados para inserção de um cassete de expressão para expressão de uma proteína terapêutica ou proteína repórter em um gene de porto seguro, por exemplo, em um íntron inativo. Em certas modalidades, um cassete sem promotor é inserido no gene de porto seguro. Em tais modalidades, um cassete sem promotor pode tirar proveito dos ele- mentos reguladores do gene de porto seguro (promotores, intensifica- dores e peptídeos de sinalização), um exemplo não limitativo de inser- ção no local do porto seguro é a inserção no local da albumina que é descrito em Blood (2015) 126 (15): 1777-1784, que é incorporado no presente documento por referência na sua totalidade. A inserção na albumina tem o benefício de permitir a secreção do transgene no san- gue (consulte, por exemplo, exemplo 22). Além disso, um local de por- to seguro genômico pode ser determinado usando técnicas conheci- das na técnica e descritas em, por exemplo, Papapetrou, ER & Schambach, A. Molecular Therapy 24 (4): 678-684 (2016) ou Sadelain et al. Nature Reviews Cancer 12: 51-58 (2012), cujo conteúdo dos mesmos é incorporado no presente documento por referência na sua totalidade. É especificamente contemplado neste documento que lo- cais de porto seguro em um genoma de vírus adenoassociado (AAV)
(por exemplo, local de porto seguro AAVS1) podem ser usados com os métodos e composições no presente documento descritos (consulte, por exemplo, Oceguera-Yanez et al. Methods 101: 43 -55 (2016) ou Tiyaboonchai, A et al., Stem Cell Res 12 (3): 630-7 (2014), cujo conte- údo de cada um dos mesmos é incorporado por referência na sua tota- lidade). Por exemplo, o local de porto seguro genômico do AAVS1 po- de ser usado com os vetores e composições de ceDNA descritos no presente documento para fins de expressão específica do transgene hematopoiético e silenciamento de genes em células-tronco embrioná- rias (por exemplo, células-tronco embrionárias humanas) ou células- tronco pluripotentes induzidas (células iPS). Além disso, é contempla- do no presente documento que modelos de doadores de reparo direci- onados por homologia sintéticos ou comercialmente disponíveis para inserção em um local de porto seguro AASV1 no cromossomo 19 po- dem ser usados com os vetores ou composições de ceDNA, conforme descrito no presente documento. Por exemplo, modelos de reparo di- recionados à homologia e RNA guia podem ser adquiridos comercial- mente, por exemplo, junto à System Biosciences, Palo Alto, CA, e clo- nados em um vetor de ceDNA.
[00441] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA são usa- dos para expressar um transgene, realizar knock-out ou diminuir ex- pressão de um gene-alvo em uma célula T, por exemplo, para projetar a célula T para melhorar a transferência de células adotivas e/ou tera- pias CAR-T (consulte, por exemplo, Exemplo 24). Em algumas moda- lidades, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, como descrito no presente documento, pode expressar transgenes que realizam knock-out em genes. Exemplos não limitativos de knock- outs terapeuticamente relevantes de células T são descritos em PNAS (2015) 112(33):10.437 a 10.442, que é incorporado no presente docu- mento por referência em sua totalidade.
C. DOENÇAS ADICIONAIS PARA TERAPIA DE GENES:
[00442] Em geral, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como no presente documento descrito pode ser usado para entregar qualquer transgene de acordo com a descrição acima para tratar, prevenir ou melhorar os sintomas associados a qualquer distúr- bio relacionado à expressão gênica. Os estados ilustrativos de doen- ças incluem, mas não se limitam a: fibrose cística (e outras doenças pulmonares), hemofilia A, hemofilia B, talassemia, anemia e outras do- enças do sangue, AIDS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, amiotrófica esclerose lateral, epilepsia e outros distúrbios neurológicos, câncer, diabetes mellitus, distrofias muscula- res (por exemplo, Duchenne, Becker), doença de Hurler, deficiência de adenosina desaminase, defeitos metabólicos, doenças degenerativas da retina (e outras doenças oculares), mitocondriopatias (por exemplo, Neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON), síndrome de Leigh e encefalopatia esclerosante subaguda), miopatias (por exemplo, miopa- tia facioescapulo-umeral (FSHD) e cardiomiopatias), doenças de ór- gãos sólidos (por exemplo, cérebro, fígado, rim, coração) e similares. Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA como no presente documento descritos podem ser utilizados com vantagem no tratamen- to de indivíduos com distúrbios metabólicos (por exemplo, deficiência de omitina transcarbamilase).
[00443] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene no presente documento descrito pode ser usado para tratar, melhorar e/ou prevenir uma doença ou distúrbio causado por mutação em um gene ou produto genético. Doenças ou distúrbios exemplificativos que podem ser tratados com vetores de ceDNA incluem, mas não estão limitados a, doenças ou distúrbios me- tabólicos (por exemplo, doença de Fabry, doença de Gaucher, fenilce- tonúria (PKU), doença de armazenamento de glicogênio); doenças ou distúrbios do ciclo da ureia (por exemplo, deficiência de ornitina trans- carbamilase (OTC)); doenças ou distúrbios do armazenamento lisos- sômico (por exemplo, leucodistrofia metacromática (DLM), mucopolis- sacaridose tipo II (MPSII; síndrome de Hunter)); doenças ou distúrbios hepáticos (por exemplo, colestase intra-hepática familiar progressiva (PFIC); doenças ou distúrbios no sangue (por exemplo, hemofilia (A e B), talassemia e anemia); cânceres e tumores e doenças ou distúrbios genéticos (por exemplo, fibrose cística).
[00444] Como ainda um outro aspecto, um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como no presente documento des- crito pode ser usado para fornecer uma sequência de nucleotídeos he- teróloga em situações nas quais é desejável regular o nível de expres- são do transgene (por exemplo, transgenes que codificam hormônios ou fatores de crescimento, como no presente documento descrito).
[00445] Por conseguinte, em algumas modalidades, o vetor de ce- DNA para expressão controlada de transgene no presente documento descrito pode ser usado para corrigir um nível e/ou função anormal de um produto genético (por exemplo, uma ausência ou defeito em uma proteína) que resulta na doença ou distúrbio. O vetor de ceDNA pode produzir uma proteína funcional e/ou modificar os níveis da proteína para aliviar ou reduzir os sintomas resultantes de, ou conferir benefí- cios a, uma doença ou distúrbio específico causado pela ausência ou defeito na proteína. Por exemplo, o tratamento da deficiência de OTC pode ser alcançado através da produção de enzima OTC funcional; o tratamento da hemofilia A e B pode ser alcançado modificando os ní- veis do fator VIII, fator IX e fator X; o tratamento de PKU pode ser al- cançado modificando os níveis da enzima fenilalanina hidroxilase; o tratamento da doença de Fabry ou Gaucher pode ser alcançado atra- vés da produção de alfa galactosidase funcional ou beta glucocerebro- sidase, respectivamente; o tratamento de MLD ou MPSII pode ser al-
cançado produzindo arilsulfatase A funcional ou iduronato-2-sulfatase, respectivamente; o tratamento da fibrose cística pode ser alcançado através da produção de um regulador de condutância transmembrana funcional da fibrose cística; o tratamento da doença de armazenamen- to de glicogênio pode ser alcançado restaurando a função funcional da enzima G6Pase; e o tratamento de PFIC pode ser alcançado através da produção dos genes funcionais ATP8B1, ABCB11, ABCB4 ou TJP2.
[00446] Em modalidades alternativas, os vetores de ceDNA como no presente documento descritos podem ser usados para fornecer um ácido nucleico antissenso a uma célula in vitro ou in vivo. Por exemplo, onde o transgene é uma molécula de RNAi, a expressão do ácido nu- cleico antissenso ou RNAi na célula alvo diminui a expressão de uma proteína específica pela célula. Por conseguinte, os transgenes que são moléculas de RNAi ou ácidos nucleicos antissenso podem ser administrados para diminuir a expressão de uma proteína específica em um sujeito em necessidade. Os ácidos nucleicos antissenso tam- bém podem ser administrados às células in vitro para regular a fisiolo- gia celular, por exemplo, para otimizar os sistemas de cultura de célu- las ou tecidos.
[00447] Em algumas modalidades, exemplos de transgenes codifi- cados pelo vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene incluem, mas não estão limitados a: X, enzimas lisossômicas (por exemplo, hexosaminidase A, associada à doença de Tay-Sachs ou iduronato sulfatase, associada à síndrome de Hunter/MPS II), eritro- poietina, angiostatina, endostatina, superóxido dismutase, globina, lep- tina, catalase, tirosina hidroxilase, bem como citocinas (por exemplo, um interferon, β-interferon, interferon-γ, interleucina-2, interleucina-4, interleucina-12, fator estimulador de colônias de granulócito- macrófago, linfotoxina e similares), fatores de crescimento de peptí-
deos e hormônios (por exemplo, somatotropina, insulina, fatores de crescimento similares a insulina 1 e 2, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrófico 3 e 4, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento derivado da glia (GDNF), fator de cres- cimento transformador-α e -β e similares), receptores (por exemplo, receptor do fator de necrose tumoral).
[00448] Em algumas modalidades exemplificativas, o transgene co- difica um anticorpo monoclonal específico para um ou mais alvos de- sejados. Exemplos de vetores de ceDNA para expressão controlada de anticorpos e proteínas de fusão nos métodos no presente docu- mento descritos são descritos no Pedido Internacional PCT/US19/18016, depositado em 14 de fevereiro de 2019, que é in- corporado no presente documento na sua totalidade por referência.
[00449] Em algumas modalidades exemplificativas, mais de um transgene é codificado pelo vetor de ceDNA. Em algumas modalida- des exemplificativas, o transgene codifica uma proteína de fusão que compreende dois polipeptídeos diferentes de interesse. Em algumas modalidades, o transgene codifica um anticorpo, incluindo um anticor- po completo ou fragmento de anticorpo, conforme no presente docu- mento definido. Em algumas modalidades, o anticorpo é um domínio de ligação a antígeno ou uma sequência de domínio variável da imu- noglobulina, como no presente documento definido. Outras sequências transgênicas ilustrativas codificam produtos de genes suicidas (timdi- na-quinase, citosina-desaminase, toxina da difteria, citocromo P450, desoxicitidina-quinase e fator de necrose tumoral), proteínas que con- ferem resistência a um medicamento usado na terapia do câncer e produtos de genes supressores de tumores.
[00450] Em uma modalidade representativa, o transgene expresso pelo vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene pode ser usado para o tratamento de distrofia muscular em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o método compreende: administrar uma quantidade eficaz de tratamento, melhoria ou prevenção do vetor de ceDNA no presente documento descrito, em que o vetor de ceDNA compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica distrofina, uma minidistrofina, uma microdistrofina, propeptídeo de miostatina, folistati- na, receptor solúvel de ativina tipo II, IGF-1, polipeptídeos anti- inflamatórios, como o mutante dominante Ikappa B, sarcospana, utro- fina, uma microdistrofina, laminina-α2, α-sarcoglicano, β-sarcoglicano, γ-sarcoglicano, δ-sarcoglicano, IGF-1, um anticorpo ou fragmento de anticorpo contra miostatina ou propeptídeo de miostatina e/ou RNAi contra miostatina. Em modalidades particulares, o vetor de ceDNA po- de ser administrado ao músculo esquelético, diafragma e/ou cardíaco, como no presente documento descrito em outra parte.
[00451] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene pode ser usado para entregar um trans- gene ao músculo esquelético, cardíaco ou diafragma, para produção de um polipeptídeo (por exemplo, uma enzima) ou RNA funcional (por exemplo, RNAi, microRNA, RNA antissenso) que normalmente circula em sangue ou entrega sistêmica a outros tecidos para tratar, melhorar e/ou prevenir um distúrbio (por exemplo, um distúrbio metabólico, co- mo diabetes (por exemplo, insulina), hemofilia (por exemplo, VIII), um distúrbio de mucopolissacarídeo (por exemplo, síndrome de Sly, sín- drome de Hurler, síndrome de Scheie, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilippo A, B, C, D, síndrome de Morquio, síndrome de Maroteaux-Lamy etc.) ou um distúrbio de arma- zenamento lisossômico (como a doença de Gaucher [glucocerebrosi- dase], Doença de Pompe [ácido lisossômico α-glucosidase] ou doença de Fabry [α-galactosidase A]) ou um distúrbio de armazenamento de glicogênio (como a doença de Pompe [ácido lisossômico a glucosida- se]). Outras proteínas adequadas para o tratamento, melhoria e/ou prevenção de distúrbios metabólicos estão descritas acima.
[00452] Em outras modalidades, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como no presente documento descrito pode ser usado para entregar um transgene em um método de tratamento, melhoria e/ou prevenção de um distúrbio metabólico em um sujeito em necessidade do mesmo. Distúrbios metabólicos ilustrativos e transge- nes que codificam polipeptídeos são descritos no presente documento. Opcionalmente, o polipeptídeo é secretado (por exemplo, um polipep- tídeo que é um polipeptídeo secretado em seu estado nativo ou que foi projetado para ser secretado, por exemplo, por associação operável com uma sequência de sinal secretora, como é conhecido na técnica).
[00453] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de tra- tamento, melhoria e/ou prevenção de insuficiência cardíaca congênita ou DAP em um sujeito em necessidade do mesmo, em que o método compreende a administração de um vetor de ceDNA, conforme des- crito no presente documento, a um sujeito mamífero, em que o vetor de ceDNA compreende um transgene que codifica, por exemplo, um endorretículo sarcoplasmático Ca2+-ATPase (SERCA2a), um fator an- giogênico, inibidor da fosfatase I (I-1), RNAi contra fosfolambano; uma molécula inibidora de fosfolambano ou dominante negativa, como fos- folambano S16E, uma proteína de dedo de zinco que regula o gene fosfolambano, receptor β2-adrenérgico, receptor beta-2-adrenérgico quinase (BARK), PI3 quinase, calsarcano, um inibidor do receptor .beta.-adrenérgico quinase (βARKct), inibidor 1 da proteína fosfatase 1, S100A1, parvalbumina, adenilil ciclase tipo 6, uma molécula que afeta o knockdown do receptor quinase tipo 2 acoplado à proteína G, como um βARKct constitutivamente ativo truncado, Pim-1, PGC aco- plado à proteína G -1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, calicreína, HIF, ti-
mosina-β4, mir-1, mir-133, mir-206 e/ou mir-208.
[00454] Os vetores de ceDNA como no presente documento descri- tos podem ser administrados aos pulmões de um sujeito por qualquer meio adequado, opcionalmente, através da administração de uma suspensão de aerossol de partículas respiráveis que compreendem os vetores de ceDNA, que o sujeito inala. As partículas respiráveis podem ser líquidas ou sólidas. Aerossóis de partículas líquidas que compre- ende os vetores de ceDNA podem ser produzidos por qualquer meio adequado, como com um nebulizador de aerossol acionado por pres- são ou um nebulizador ultrassônico, como é conhecido pelos especia- listas na técnica. Consulte, por exemplo, Pat. nº U.S. 4.501.729. Ae- rossóis de partículas sólidas que compreende os vetores de ceDNA também podem ser produzidos com qualquer gerador de aerossóis de medicamentos em partículas sólidas, por técnicas conhecidas na téc- nica farmacêutica.
[00455] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA podem ser administrados aos tecidos do SNC (por exemplo, cérebro, olho). Em modalidades particulares, os vetores de ceDNA no presente documen- to descritos podem ser administrados para tratar, melhorar ou prevenir doenças do SNC, incluindo distúrbios genéticos, distúrbios neurode- generativos, distúrbios psiquiátricos e tumores. As doenças ilustrativas do SNC incluem, entre outras, doença de Alzheimer, doença de Par- kinson, doença de Huntington, doença de Canavan, doença de Leigh, doença de Refsum, síndrome de Tourette, esclerose lateral primária, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular progressiva, doença de Pick, distrofia muscular, esclerose múltipla, miastenia grave, doença de Binswanger, traumatismo por lesão medular ou na cabeça, doença de Tay Sachs, doença de Lesch-Nyan, epilepsia, infartos cerebrais, distúrbios psiquiátricos, incluindo distúrbios de humor (por exemplo, depressão, transtorno afetivo bipolar, transtorno afetivo persistente,
transtorno de humor secundário), esquizofrenia, dependência de dro- gas (por exemplo, alcoolismo e outras dependências de substâncias), neuroses (por exemplo, ansiedade, transtorno obsessivo, distúrbio somatoforme, distúrbio dissociativo, luto, depressão pós-parto), psico- se (por exemplo, alucinações e delírios), demência, paranoia, distúrbio de déficit de atenção, distúrbios psicossexuais, distúrbios do sono, dis- túrbios da dor, e distúrbios alimentares ou de peso (por exemplo, obe- sidade, caquexia, anorexia nervosa e bulemia) e câncer e tumores (por exemplo, tumores da hipófise) do SNC.
[00456] Os distúrbios oculares que podem ser tratados, melhorados ou prevenidos com os vetores de ceDNA da invenção incluem distúr- bios oftálmicos envolvendo a retina, trato posterior e nervo óptico (por exemplo, retinite pigmentosa, retinopatia diabética e outras doenças degenerativas da retina, uveíte, doenças relacionadas à idade degene- ração macular, glaucoma). Muitas doenças e distúrbios oftálmicos es- tão associados a um ou mais dos três tipos de indicações: (1) angio- gênese, (2) inflamação e (3) degeneração. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como no presente documento descrito pode ser usado para fornecer fatores an- tiangiogênicos; fatores anti-inflamatórios; fatores que retardam a de- generação celular, promovem a economia de células ou promovem o crescimento e combinações do supramencionado. A retinopatia diabé- tica, por exemplo, é caracterizada pela angiogênese. A retinopatia dia- bética pode ser tratada pela administração de um ou mais fatores anti- angiogênicos, intraocularmente (por exemplo, no vítreo) ou periocu- larmente (por exemplo, na região do sub-Tenon). Um ou mais fatores neurotróficos também podem ser coentregues, intraocularmente (por exemplo, intravítrea) ou periocularmente. As doenças oculares adicio- nais que podem ser tratadas, melhoradas ou prevenidas com os veto- res de ceDNA da invenção incluem atrofia geográfica, degeneração macular vascular ou "úmida", doença de Stargardt, Amaurose congêni- ta de Leber (LCA), síndrome de Usher, pseudoxantoma elástico (PXE), retinite pigmentar ligada ao x (XLRP), retinosquise ligada ao x (XLRS), choroideremia, neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON), arquo- matopsia, distrofia de cone-haste, distrofia da córnea endotelial de Fu- chs, distrofia endotelial da córnea de Fuchs, edema macular diabético e câncer ocular e tumores.
[00457] Em algumas modalidades, doenças ou distúrbios oculares inflamatórios (por exemplo, uveíte) podem ser tratados, melhorados ou impedidos pelos vetores de ceDNA da invenção. Um ou mais fatores anti-inflamatórios podem ser expressos pela administração intraocular (por exemplo, câmara precedente ou vítrea) do vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene, conforme descrito no presente documento. Em outras modalidades, doenças ou distúrbios oculares caracterizados por degeneração da retina (por exemplo, retinite pig- mentosa) podem ser tratados, melhorados ou prevenidos pelos veto- res de ceDNA da invenção. A intraocular (por exemplo, administração vítrea) do vetor de ceDNA, como no presente documento descrito, co- dificando um ou mais fatores neurotróficos, pode ser usado para tratar essas doenças baseadas em degeneração da retina. Em algumas mo- dalidades, doenças ou distúrbios que envolvem angiogênese e dege- neração da retina (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade) podem ser tratados com os vetores de ceDNA da invenção. A degeneração macular relacionada à idade pode ser tratada pela admi- nistração do vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documen- to, que codifica um ou mais fatores neurotróficos intraocularmente (por exemplo, vítreo) e/ou um ou mais fatores antiangiogênicos intraocu- larmente ou periocularmente (por exemplo, na região do sub-Tenon). O glaucoma é caracterizado por aumento da pressão ocular e perda de células ganglionares da retina. Os tratamentos para o glaucoma incluem a administração de um ou mais agentes neuroprotetores que protegem as células contra danos excitotóxicos usando o vetor de ce- DNA, como no presente documento descrito. Por conseguinte, esses agentes incluem antagonistas de N-metil-D-aspartato (NMDA), citoci- nas e fatores neurotróficos, podem ser entregues intraocularmente, opcionalmente intravitreamente usando o vetor de ceDNA, como no presente documento descrito.
[00458] Em outras modalidades, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como no presente documento descrito pode ser usado para tratar convulsões, por exemplo, para reduzir o início, a incidência ou a gravidade das convulsões. A eficácia de um tratamento terapêutico para convulsões pode ser avaliada por meios comporta- mentais (por exemplo, tremores, tremores do olho ou da boca) e/ou eletrográficos (a maioria das convulsões tem anormalidades eletrográ- ficas marcadas). Assim, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como no presente documento descrito também pode ser usado para tratar epilepsia, que é marcada por múltiplas convulsões ao longo do tempo. Em uma modalidade representativa, a somatosta- tina (ou um fragmento ativo da mesma) é administrada ao cérebro usando o vetor de ceDNA como no presente documento descrito para tratar um tumor da hipófise. De acordo com esta modalidade, o vetor de ceDNA como no presente documento descrito codificando somatos- tatina (ou um fragmento ativo do mesmo) é administrado por microin- fusão na hipófise. Da mesma forma, esse tratamento pode ser usado para tratar a acromegalia (secreção anormal do hormônio do cresci- mento da hipófise). O ácido nucleico (por exemplo, número de acesso GenBank J00306) e o aminoácido (por exemplo, número de acesso GenBank P01166; contém peptídeos ativos processados somatostatin- 28 e somatostatin-14) sequências de somatostatinas, como são co- nhecidas na técnica. Em modalidades particulares, o vetor de ceDNA pode codificar um transgene que compreende um sinal secretório co- mo descrito na Patente U.S. 7.071.172.
[00459] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso de um vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como no presente do- cumento descrito para produzir RNA antissenso, RNAi ou outro RNA funcional (por exemplo, uma ribozima) para entrega sistêmica a um sujeito in vivo. Por conseguinte, em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode compreender um transgene que codifica um ácido nuclei- co antissenso, uma ribozima (por exemplo, conforme descrito na Pa- tente nº U.S. 5.877.022), RNAs que afetam a trans-splicing mediada por spliceossomo (consulte Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; U.S. 6.013.487; U.S. 6.083.702), RNAs interferentes (RNAi) que medeiam o silenciamento de genes (consulte Sharp et al., (2000) Science 287: 2.431) ou outros RNAs não traduzidos, como RNAs "guia" (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 95: 4.929; Pa- tente U.S. 5.869.248 de Yuan et al.), e similar.
[00460] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene também pode compreender um transge- ne que codifica um polipeptídeo repórter (por exemplo, uma enzima como a Green Fluorescent Protein, ou fosfatase alcalina). Em algumas modalidades, um transgene que codifica uma proteína repórter útil pa- ra fins experimentais ou de diagnóstico é selecionado de qualquer uma das seguintes opções: β-lactamase, β-galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina, timidina quinase, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfe- nicol acetiltransferase (CAT), luciferase e outros bem conhecidos na técnica. Em alguns aspectos, os vetores de ceDNA que compreendem um transgene que codifica um polipeptídeo repórter podem ser utiliza- dos para fins de diagnóstico ou como marcadores da atividade do ve- tor de ceDNA no sujeito ao qual são administrados.
[00461] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres-
são controlada de transgene pode compreender um transgene ou uma sequência de nucleotídeos heteróloga que compartilha homologia com, e se recombina com, um locus no cromossomo hospedeiro. Essa abordagem pode ser utilizada para corrigir um defeito genético na cé- lula hospedeira.
[00462] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene pode compreender um transgene que pode ser usado para expressar um polipeptídeo imunogênico em um sujeito, por exemplo, para vacinação. O transgene pode codificar qual- quer imunógeno de interesse conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, imunogênicos do vírus da imunodeficiência humana, vírus da influenza, proteínas gag, antígenos tumorais, antígenos de câncer, antígenos bacterianos, antígenos virais e similares. D. TESTE DE EXPRESSÃO GÊNICA BEM-SUCEDIDA USANDO UM VETOR DE ceDNA
[00463] Os ensaios bem conhecidos na técnica que podem ser utili- zados para testar a eficiência da entrega de genes por um vetor de ceDNA podem ser realizados em ambos os modelos in vitro e in vivo. O knock-in ou knock-out de um transgene desejado pelo ceDNA pode ser avaliado por um versado na técnica, medindo os níveis de mRNA e de proteína do transgene desejado (por exemplo, PCR de transcrição reversa, análise de western blot e ensaio imunossorvente ligado a en- zima (ELISA)). As alterações do ácido nucléico pelo ceDNA (por exemplo, mutações pontuais ou deleção das regiões do DNA) podem ser avaliadas por sequenciamento profundo do DNA alvo genômico. Em uma modalidade, o ceDNA compreende uma proteína repórter que pode ser usada para avaliar a expressão do transgene desejado, por exemplo, examinando a expressão da proteína repórter por microsco- pia de fluorescência ou um leitor de placa de luminescência. Para apli- cações in vivo, podem ser utilizados ensaios de função proteica para testar a funcionalidade de um determinado gene e/ou produto de gene para determinar se a expressão de genes ocorreu com sucesso. Por exemplo, prevê-se que uma mutação pontual no gene regulador da condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR) iniba a capaci- dade do CFTR de mover ânions (por exemplo, Cl-) através do canal do ânion, possa ser corrigida pela entrega de um gene CFTR funcional (ou seja, não mutado) ao sujeito com um vetor ceDNA. Após a admi- nistração de um vetor de ceDNA, um versado na técnica pode avaliar a capacidade dos ânions de se moverem através do canal do ânion para determinar se o gene CFTR foi entregue e expresso. Um versado será capaz de determinar o melhor teste para medir a funcionalidade de uma proteína in vitro ou in vivo.
[00464] É contemplado no presente documento que os efeitos da expressão de gene do transgene a partir do vetor de ceDNA em uma célula ou indivíduo podem durar pelo menos 1 mês, pelo menos 2 me- ses, pelo menos 3 meses, pelo menos quatro meses, pelo menos 5 meses, pelo menos seis meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 2 anos, pelo menos 5 anos, pelo menos 10 anos, pelo menos 20 anos, ou podem ser permanen- tes.
[00465] Em algumas modalidades, um transgene na cassete de ex- pressão, construto de expressão ou vetor de ceDNA no presente do- cumento descrito pode ser otimizado por códon para a célula hospe- deira. Conforme usado neste documento, o termo "otimização de có- don" ou "otimização de códon" refere-se ao processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão aprimorada nas células do vertebrado de interesse, por exemplo, camundongo ou hu- mano (por exemplo, humanizado), substituindo pelo menos um, mais de um ou um número significativo de códons da sequência nativa (por exemplo, uma sequência procariótica) com códons que são mais fre-
quentemente ou mais frequentemente usados nos genes desse verte- brado. Várias espécies exibem viés particular para certos códons de um aminoácido particular. Tipicamente, a otimização do códon não al- tera a sequência de aminoácidos da proteína traduzida original. Os códons otimizados podem ser determinados usando, por exemplo, a plataforma de otimização de códons Gene Forge® da Aptagen e sínte- se genética personalizada (Aptagen, Inc.) ou outro banco de dados disponível publicamente. XII. ADMINISTRAÇÃO
[00466] Exemplos de modos de administração do vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene no presente documento des- critos incluem oral, retal, transmucosal, intranasal, inalação (por exem- plo, via aerossol), bucal (por exemplo, sublingual), vaginal, intratecal, intraocular, transdérmica, intraendotelial, in utero (ou in ovo), parente- ral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intracraniana, intramuscular [incluindo administração ao músculo esquelético, dia- fragma e/ou cardíaco], intrapleural, intracerebral e intra-articular), tópi- co (por exemplo, tanto na pele como nas superfícies mucosas, incluin- do superfícies das vias aéreas e administração transdérmica), intralin- fática e similares, bem como injeção direta de tecido ou órgão (por exemplo, fígado, olho, músculo esquelético, músculo cardíaco, múscu- lo diafragma ou cérebro).
[00467] A administração do vetor de ceDNA para expressão contro- lada de transgene pode ser em qualquer local de um sujeito, incluindo, sem limitação, um local selecionado do grupo que consiste no cérebro, em um músculo esquelético, em um músculo liso, no coração, no dia- fragma, no epitélio das vias aéreas, no fígado, no rim, no baço, no pâncreas, na pele e nos olhos. A administração do vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene também pode ser em um tu- mor (por exemplo, em um tumor ou em um linfonodo ou próximo ao mesmo). A via mais adequada em qualquer caso dependerá da natu- reza e da gravidade da condição a ser tratada, melhorada e/ou preve- nida e da natureza do vetor de ceDNA específico que está sendo usa- do. Além disso, o ceDNA permite administrar mais de um transgene em um único vetor ou vários vetores de ceDNA (por exemplo, um co- quetel de ceDNA).
[00468] A administração do vetor de ceDNA para expressão contro- lada de transgene descrito neste documento ao músculo esquelético de acordo com a presente invenção inclui, mas não está limitada à, administração no músculo esquelético dos membros (por exemplo, braço, braço, perna e/ou perna), costas, pescoço, cabeça (por exem- plo, língua), tórax, abdômen, pelve/períneo e/ou dígitos. O vetor de ceDNA, como descrito no presente documento, pode ser entregue ao músculo esquelético por administração intravenosa, administração in- tra-arterial, administração intraperitoneal, perfusão de membro (opcio- nalmente, perfusão de membro isolada de uma perna e/ou braço; con- sulte, por exemplo, Arruda et al., (2005) Blood 105:3.458 a 3.464) e/ou injeção intramuscular direta. Em modalidades particulares, o vetor de ceDNA conforme descrito neste documento é administrado a um membro (braço e/ou perna) de um sujeito (por exemplo, um sujeito com distrofia muscular como DMD) por perfusão de membro, perfusão de membro opcionalmente isolada (por exemplo, por via intravenosa ou administração intra-articular). Em certas modalidades, o vetor de ceDNA para expressão controlada de transgene como no presente do- cumento descrito pode ser administrado sem o uso de técnicas "hidro- dinâmicas".
[00469] A administração do vetor de ceDNA para expressão contro- lada de transgene como no presente documento descrito ao músculo cardíaco inclui administração no átrio esquerdo, átrio direito, ventrículo esquerdo, ventrículo direito e/ou septo. O vetor de ceDNA, conforme descrito no presente documento, pode ser entregue ao músculo cardí- aco por administração intravenosa, administração intra-arterial como administração intra-aórtica, injeção cardíaca direta (por exemplo, no átrio esquerdo, átrio direito, ventrículo esquerdo, ventrículo direito) e/ou perfusão da artéria coronária. A administração ao músculo dia- fragma pode ser por qualquer método adequado, incluindo administra- ção intravenosa, administração intra-arterial e/ou administração intra- peritoneal. A administração ao músculo liso pode ser por qualquer mé- todo adequado, incluindo administração intravenosa, administração intra-arterial e/ou administração intraperitoneal. Em uma modalidade, a administração pode ser em células endoteliais presentes no, próximo a e/ou dentro do músculo liso.
[00470] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA para ex- pressão controlada de transgene de acordo com a presente invenção é administrado ao músculo esquelético, músculo diafragma e/ou mús- culo cardíaco (por exemplo, para tratar, melhorar e/ou prevenir distro- fia muscular ou doença cardíaca (por exemplo, DAP ou insuficiência cardíaca congestiva)). A. TRATAMENTO EX VIVO
[00471] Em algumas modalidades, as células são removidas de um sujeito, um vetor de ceDNA é introduzido no mesmo e as células são, então, substituídas novamente no sujeito. Os métodos de remoção de células do sujeito para tratamento ex vivo, seguidos de introdução no sujeito, são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Patente nº U.S. 5.399.346; cuja invenção é no presente documento incorporada na sua totalidade). Alternativamente, um vetor de ceDNA é introduzido em células de outro sujeito, em células cultivadas ou em células de qualquer outra fonte adequada, e as células são administradas a um sujeito em necessidade.
[00472] As células transduzidas com um vetor de ceDNA são prefe-
rencialmente administradas ao sujeito em uma "quantidade terapeuti- camente eficaz" em combinação com um carreador farmacêutico. Os versados na técnica compreenderão que os efeitos terapêuticos não precisam ser completos ou curativos, desde que seja fornecido algum benefício ao sujeito.
[00473] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA para expres- são controlada de transgene pode codificar um transgene (às vezes, chamado de sequência de nucleotídeos heteróloga) que é qualquer polipeptídeo que é desejavelmente produzido em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, em contraste com o uso dos vetores de ceDNA em um método de tratamento discutido no presente docu- mento, em algumas modalidades, os vetores de ceDNA podem ser introduzidos em células cultivadas e o produto genético expresso iso- lado a partir dos mesmos, por exemplo, para a produção de antígenos ou vacinas.
[00474] Os vetores de ceDNA podem ser usados em aplicações veterinárias e médicas. Os sujeitos adequados para os métodos de entrega de genes ex vivo, conforme descrito acima, incluem tanto aves (por exemplo, galinhas, patos, gansos, codornas, perus e faisões) quanto mamíferos (por exemplo, seres humanos, bovinos, ovinos, ca- prinos, equinos, felinos, caninos e lagomorfos), sendo preferenciais os mamíferos. Os sujeitos humanos são os preferidos. Os sujeitos huma- nos incluem recém-nascidos, bebês, jovens e adultos.
[00475] Um aspecto da tecnologia no presente documento descrita refere-se a um método de entrega de um transgene a uma célula. Tipi- camente, para métodos in vitro, o vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene pode ser introduzido na célula usando os méto- dos como no presente documento descritos, bem como outros méto- dos conhecidos na técnica. Os vetores de ceDNA no presente docu- mento descritos são preferencialmente administrados à célula em uma quantidade biologicamente eficaz. Se o vetor de ceDNA for adminis- trado a uma célula in vivo (por exemplo, a um sujeito), uma quantidade biologicamente eficaz do vetor de ceDNA é uma quantidade que é su- ficiente para resultar na transdução e expressão do transgene em uma célula alvo. B. FORMAS DE DOSAGEM UNITÁRIA
[00476] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem uni- tária. Uma forma de dosagem unitária será tipicamente adaptada a uma ou mais vias de administração específicas da composição farma- cêutica. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por inalação. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um vaporizador. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um nebulizador. Em algumas moda- lidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um aerossolizador. Em algumas modalidades, a forma de dosa- gem unitária é adaptada para administração oral, para administração bucal ou para administração sublingual. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração intraveno- sa, intramuscular ou subcutânea. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração intratecal ou intra- cerebroventricular. Em algumas modalidades, a composição farmacêu- tica é formulada para administração tópica. A quantidade de ingredien- te ativo que pode ser combinada com um material carreador para pro- duzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade do composto que produz um efeito terapêutico. XIII. VÁRIAS APLICAÇÕES
[00477] As composições e vetores de ceDNA no presente docu- mento fornecidos podem ser utilizados para entregar um transgene para vários propósitos, como descrito acima. Em algumas modalida- des, um transgene pode codificar uma proteína ou ser um RNA funcio- nal e, em algumas modalidades, pode ser uma proteína ou RNA funci- onal que é modificado para fins de pesquisa, por exemplo, para criar um modelo animal transgênico somático que abrigue uma ou mais mu- tações ou uma sequência de genes corrigida, por exemplo, para estu- dar a função do gene alvo. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional para criar um modelo animal de doen- ça.
[00478] Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tratamen- to, melhoria ou prevenção de estados de doença em um sujeito mamí- fero. O transgene expresso pelo vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene é administrado a um paciente em quantidade su- ficiente para tratar uma doença associada a uma sequência genética anormal, que pode resultar em qualquer um ou mais dos seguintes: expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene alvo.
[00479] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA são previs- tos para uso em métodos de diagnóstico e triagem, nos quais um transgene é expresso de forma transitória ou estável em um sistema de cultura de células ou, alternativamente, em um modelo animal transgênico.
[00480] Outro aspecto da tecnologia no presente documento descri- ta fornece um método de transdução de uma população de células de mamíferos. Em um sentido geral e, geralmente, o método inclui pelo menos a etapa de introdução em uma ou mais células da população, uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais dos ceDNAs no presente documento descritos.
[00481] Além disso, a presente invenção fornece composições, bem como kits terapêuticos e/ou de diagnóstico, que incluem um ou mais vetores de ceDNA ou composições de ceDNA descritos, formulados com um ou mais ingredientes adicionais ou preparados com uma ou mais instruções para a sua utilização.
[00482] Uma célula em que o vetor de ceDNA para expressão con- trolada de transgene deve ser administrado, conforme descrito neste documento, pode ser de qualquer tipo, incluindo, mas não se limitando a células neurais (incluindo células do sistema nervoso periférico e central, em particular, células cerebrais), células pulmonares, células da retina, células epiteliais (por exemplo, células epiteliais respiratórias e do intestino), células musculares, células dendríticas, células pan- creáticas (incluindo células de ilhotas), células hepáticas, células do miocárdio, células ósseas (por exemplo, células-tronco da medula ós- sea), células-tronco hematopoiéticas, células do baço, queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais, células da próstata, células germinati- vas e similares. Alternativamente, a célula pode ser qualquer célula progenitora. Como alternativa adicional, a célula pode ser uma célula- tronco (por exemplo, célula-tronco neural, célula-tronco hepática). Co- mo ainda uma alternativa adicional, a célula pode ser uma célula de câncer ou tumor. Além disso, as células podem ser de qualquer espé- cie de origem, como indicado acima.
[00483] Algumas modalidades da tecnologia no presente documen- to descrita podem ser definidas de acordo com qualquer um dos se- guintes parágrafos numerados:
1. Uma composição que compreende um vetor de ceDNA que pode ser readministrado para aumentar o nível de expressão do transgene a partir de um nível de expressão precedente, o vetor de ceDNA compreendendo sequências ITR assimétricas ou simétricas que flanqueiam uma sequência polinucleotídica de transgene operaci- onalmente ligada a um promotor, em que a pelo menos uma ITR é uma ITR competente para replicação.
2. A composição do parágrafo 1, em que o vetor de ceD- NA expressa o transgene por um período de tempo selecionado entre pelo menos 42 dias, pelo menos 84 dias e pelo menos 132 dias.
3. A composição do parágrafo 1, em que o transgene é um medicamento genético selecionado a partir de: um ácido nucleico, um inibidor, peptídeo ou polipeptídeo, anticorpo ou fragmento de anticor- po, proteína de fusão, antígeno, antagonista, agonista ou molécula de RNAi.
4. Um método para aumentar o nível de expressão de um transgene em uma célula, o método compreendendo: a. administrar a uma célula em um primeiro momento, uma dose de preparação de uma composição para alcançar a expres- são de uma sequência de ácido nucleico heteróloga e b. administrar à célula em um segundo momento, uma do- se de uma composição para aumentar o nível de expressão da se- quência de ácido nucleico heterólogo em comparação com o nível de expressão do ácido nucleico heterólogo alcançado após a administra- ção da composição no primeiro momento, ou para aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico para atingir o nível de expressão desejado, em que a composição administrada no primeiro e no se- gundo momento compreende um vetor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência de ácido nucleico heteró- loga que codifica uma posição operacional de transgene entre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV assimétricas ou simétricas, uma das ITRs compreendendo um local de resolução terminal de AAV funcional e um local de ligação a Rep e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR,
em que o ceDNA quando digerido com uma enzima de res- trição que possui um único local de reconhecimento no vetor de ceD- NA tem a presença de bandas características de DNA linear e contí- nuo em comparação com os controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
5. O método do parágrafo 4, em que as duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) assimétricas ou simétricas são ITRs de AAV.
6. O método dos parágrafos 4 a 5, em que a ITR compre- endendo um local de resolução funcional terminal e um local de liga- ção a Rep é um ITR de AAV do tipo selvagem.
7. O método de qualquer um dos parágrafos 4 a 6, em que as ITRs do AAV são ITRs do AAV-2.
8. O método de qualquer um dos parágrafos 4 a 7, em que as duas ITRs assimétricas ou simétricas são um par de ITRs selecio- nadas do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4; e (ii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 2.
9. O método de qualquer um dos parágrafos 4 a 8, em que o vetor de ceDNA é administrado em combinação com um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
10. O método de qualquer um dos parágrafos 4 a 9, em que o segundo momento é pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias ou entre 60 a 90 dias, ou entre 90 a 120 dias, ou entre cerca de 3 a 6 me- ses após o primeiro momento.
11. O método de qualquer um dos parágrafos 4 a 10, em que a sequência heteróloga de ácido nucleico codifica um transgene terapêutico e o nível de expressão desejado do transgene é uma quantidade terapeuticamente eficaz.
12. O método de qualquer um dos parágrafos 4 a 11, em que o vetor de ceDNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor,
em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólo- go posicionado operacionalmente entre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) assimétricas ou simétricas, pelo menos uma das ITRs compreendendo um local de resolução terminal funcional e um local de ligação a Rep, e uma das ITRs compreendendo uma dele- ção, inserção ou substituição, em relação à outra ITR; a presença da proteína Rep induzindo a replicação do polinucleotídeo de vetor e a produção do vetor de DNA em uma célula de inseto, sendo o vetor de DNA obtido a partir de um processo compreendendo as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abri- gam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral na presença da proteína Rep sob condi- ções efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral não capsídico dentro das células do inseto, em que as células de inseto não compreendem DNA não viral de produção li- vre de capsídeo dentro das células de inseto; e b. colher e isolar o DNA não viral livre de capsídeo das cé- lulas de insetos; em que a presença do DNA isolado da célula hospedeira isento de capsídeo das células de inseto pode ser confirmada digerin- do o DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único local de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisan- do o material do DNA digerido em um gel não desnaturante para con- firmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
13. O método de qualquer um dos parágrafos 4 a 11, com- preendendo ainda administrar à célula, em um ou mais momentos após o segundo momento, uma dose da composição para aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico em comparação com o nível de expressão do ácido nucleico heterólogo alcançado após a administração da composição no segundo momento ou momento precedente, ou para aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico para atingir um nível de ex- pressão desejado, em que a composição administrada em um ou mais mo- mentos após o segundo momento compreende um vetor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um transgene posicionado ope- rativamente entre duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRs) assimétricas ou simétricas de AAV, uma das ITRs compreen- dendo um local de resolução terminal de AAV funcional e um local de ligação a Rep e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR, em que o ceDNA quando digerido com uma enzima de res- trição que possui um único local de reconhecimento no vetor de ceD- NA tem a presença de bandas características de DNA linear e contí- nuo em comparação com os controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
14. O método de qualquer um dos parágrafos 4 a 13, em que o vetor de ceDNA administrado em qualquer um dentre: o primei- ro, segundo ou qualquer momento subsequente, é administrado em combinação com um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
15. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 14, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou qualquer momento subsequente é o mesmo vetor de ceDNA compreendendo o mesmo transgene ou um transgene modificado.
16. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 15, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou qualquer momento subsequente é um vetor de ceDNA diferente compreenden- do o mesmo transgene ou um transgene modificado.
17. O método do parágrafo 16, em que o vetor de ceDNA diferente tem um promotor diferente operacionalmente ligado ao mes- mo transgene ou a um transgene modificado.
18. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 17, em que o transgene é um medicamento genético.
19. Um método para tratar uma doença em um sujeito, o método compreendendo: a. administrar ao sujeito em um primeiro momento, uma dose de preparação de uma composição compreendendo um vetor de DNA não viral do capsídeo com extremidades fechadas covalentemen- te (ceDNA) para alcançar a expressão de uma sequência heteróloga de ácido nucleico, e b. administrar ao sujeito em um segundo momento, uma dose de uma composição compreendendo um vetor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (ceD- NA) para aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico em comparação com o nível de expressão do ácido nu- cleico heterólogo alcançado após a administração da composição no primeiro momento, ou para aumentar o nível de expressão da sequên- cia heteróloga de ácido nucleico para atingir um nível de expressão desejado, tratando assim a doença no sujeito, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro e no segundo momento compreende uma sequência de ácido nucleico he- teróloga que codifica um transgene posicionado operacionalmente en- tre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV as- simétricas ou simétricas, uma das ITRs compreendendo um local de resolução terminal de AAV funcional e um local de ligação a Rep e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR, em que o vetor de ceDNA quando digerido com uma enzi- ma de restrição que tem um único local de reconhecimento no vetor de ceDNA tem a presença de bandas características de DNA linear e con- tínuo em comparação com controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
20. O método do parágrafo 19, em que as duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) assimétricas ou simétricas são ITRs de AAV.
21. O método dos parágrafos 19 a 20, em que a ITR com- preendendo um local de resolução terminal funcional e um local de li- gação a Rep é um ITR de AAV do tipo selvagem.
22. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 21, em que as ITRs do AAV são ITRs do AAV-2.
23. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 22, em que as duas ITRs assimétricas são um par de ITRs selecionadas do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4; e (ii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 2.
24. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 23, em que o vetor de ceDNA é administrado em combinação com um carrea- dor e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
25. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 24, em que o segundo momento é de pelo menos 30 dias, ou pelo menos 60 dias ou entre 60 a 90 dias, ou entre 90 a 120 dias ou entre cerca de 3 a 6 meses após o primeiro momento.
26. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 25, em que o nível de expressão desejado de transgene alcançado após a administração da composição no segundo momento é uma quantidade terapeuticamente eficaz do transgene.
27. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 26,
compreendendo ainda administrar ao sujeito em um ou mais momen- tos após o segundo momento, uma dose da composição compreen- dendo um vetor de ceDNA para aumentar o nível de expressão da se- quência heteróloga de ácido nucleico em comparação ao nível de ex- pressão do ácido nucleico heterólogo alcançado após a administração da composição no segundo momento ou momento precedente, ou pa- ra aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico para um nível de expressão desejado, em que a composição administrada em um ou mais mo- mentos após o segundo momento compreende um vetor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um transgene posicionado ope- rativamente entre duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRs) assimétricas ou simétricas de AAV, uma das ITRs compreen- dendo um local de resolução terminal de AAV funcional e um local de ligação a Rep e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR, em que o ceDNA quando digerido com uma enzima de res- trição que possui um único local de reconhecimento no vetor de ceD- NA tem a presença de bandas características de DNA linear e contí- nuo em comparação com os controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
28. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 27, em que o nível de expressão desejado de transgene alcançado após a administração da composição em um ou mais momentos após o se- gundo momento é uma quantidade terapeuticamente eficaz do trans- gene.
29. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 28, em que o vetor de ceDNA é administrado no primeiro, segundo ou qual-
quer momento subsequente é administrado com um carreador farma- ceuticamente aceitável.
30. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 29, em que o um ou mais momentos após o segundo momento é de pelo me- nos 30 dias, ou pelo menos 60 dias ou entre 60 a 90 dias, ou entre 90 a 120 dias ou entre aproximadamente 3 a 6 meses após o momento procedente.
31. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 30, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou em qual- quer momento subsequente é o mesmo vetor de ceDNA que compre- ende o mesmo transgene ou um transgene modificado.
32. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 30, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou em qual- quer momento subsequente é um vetor de ceDNA diferente que com- preende o mesmo transgene ou um transgene modificado.
33. O método do parágrafo 31, em que o vetor de ceDNA diferente tem um promotor diferente operacionalmente ligado ao mes- mo transgene ou a um transgene modificado.
34. O método de qualquer um dos parágrafos 19 ou 33, em que o vetor de ceDNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólo- go posicionado operacionalmente entre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) assimétricas ou simétricas, pelo menos uma das ITRs compreendendo um local de resolução terminal funcional e um local de ligação a Rep, e uma das ITRs compreendendo uma dele- ção, inserção ou substituição, em relação à outra ITR; a presença da proteína Rep induzindo a replicação do polinucleotídeo de vetor e a produção do vetor de DNA em uma célula de inseto, sendo o vetor de DNA obtido a partir de um processo compreendendo as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abri-
gam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral na presença da proteína Rep sob condi- ções efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral não capsídico dentro das células do inseto, em que as células de inseto não compreendem DNA não viral de produção li- vre de capsídeo dentro das células de inseto; e b. colher e isolar o DNA não viral livre de capsídeo das cé- lulas de insetos; em que a presença do DNA isolado da célula hospedeira isento de capsídeo das células de inseto pode ser confirmada digerin- do o DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único local de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisan- do o material do DNA digerido em um gel não desnaturante para con- firmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
35. O método de qualquer um dos parágrafos 19 a 34, em que o transgene é um medicamento genético.
36. Uma composição que compreende um vetor de ceDNA que pode ser readministrado para manter um nível de expressão sus- tentado do transgene, o vetor de ceDNA compreendendo sequências ITR assimétricas ou simétricas que flanqueiam uma sequência polinu- cleotídica de transgene operativamente ligada a um promotor, em que a pelo menos uma ITR é uma ITR competente para replicação.
37. A composição do parágrafo 36, em que o vetor de ceD- NA expressa o transgene por um período de tempo selecionado entre pelo menos 42 dias, pelo menos 84 dias e pelo menos 132 dias.
38. A composição do parágrafo 36, em que o transgene é um medicamento genético selecionado a partir de: um ácido nucleico, um inibidor, peptídeo ou polipeptídeo, anticorpo ou fragmento de anti- corpo, antígeno, antagonista, agonista ou molécula de RNAi.
39. Um método para sustentar o nível de expressão de um transgene em uma célula, o método compreendendo: a. administrar a uma célula em um primeiro momento, uma dose de preparação de uma composição para alcançar a expres- são de uma sequência de ácido nucleico heteróloga e b. administrar à célula em um segundo momento, uma do- se de uma composição para compensar qualquer diminuição no nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico após admi- nistração da composição no primeiro momento, em que a composição administrada no primeiro e no se- gundo momento compreende um vetor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência de ácido nucleico heteró- loga que codifica uma posição operacional de transgene entre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV assimétricas ou simétricas, uma das ITRs compreendendo um local de resolução terminal de AAV funcional e um local de ligação a Rep e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR, em que o ceDNA quando digerido com uma enzima de res- trição que possui um único local de reconhecimento no vetor de ceD- NA tem a presença de bandas características de DNA linear e contí- nuo em comparação com os controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
40. O método do parágrafo 39, em que as duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) assimétricas ou simétricas são ITRs de AAV.
41. O método dos parágrafos 39 a 40, em que a ITR com- preendendo um local de resolução terminal funcional e um local de li- gação à Rep é uma ITR de AAV do tipo selvagem.
42. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 41, em que as ITRs do AAV são ITRs do AAV-2.
43. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 42, em que as duas ITRs assimétricas são um par de ITRs selecionadas do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4; e (ii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 2.
44. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 43, em que o vetor de ceDNA é administrado em combinação com um carrea- dor e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
45. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 44, em que o segundo momento é de pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias ou entre 60 a 90 dias ou entre 90 a 120 dias ou entre cerca de 3 a 6 meses após o primeiro momento.
46. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 45, em que a sequência heteróloga de ácido nucleico codifica um transgene terapêutico e o nível sustentado de expressão do transgene é uma quantidade terapeuticamente eficaz.
47. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 46, em que o vetor de ceDNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólo- go posicionado operacionalmente entre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) assimétricas, pelo menos uma das ITRs com- preendendo um local de resolução terminal funcional e um local de li- gação a Rep, e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição, em relação à outra ITR; a presença da proteína Rep induzindo a replicação do polinucleotídeo de vetor e a produção do vetor de DNA em uma célula de inseto, sendo o vetor de DNA obtido a partir de um processo compreendendo as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abri- gam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral na presença da proteína Rep sob condi- ções efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral não capsídico dentro das células do inseto, em que as células de inseto não compreendem DNA não viral de produção li- vre de capsídeo dentro das células de inseto; e b. colher e isolar o DNA não viral livre de capsídeo das cé- lulas de insetos; em que a presença do DNA isolado da célula hospedeira isento de capsídeo das células de inseto pode ser confirmada digerin- do o DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único local de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisan- do o material do DNA digerido em um gel não desnaturante para con- firmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
48. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 47, compreendendo ainda administrar à célula, em um ou mais momentos após o segundo momento, uma dose adicional da composição para aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nu- cleico em comparação com o nível de expressão do ácido nucleico he- terólogo alcançado após a administração da composição no segundo momento ou momento precedente, ou para aumentar o nível de ex- pressão da sequência heteróloga de ácido nucleico para manter um nível de expressão sustentado desejado, em que a composição administrada em um ou mais mo- mentos após o segundo momento compreende um vetor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um transgene posicionado ope- rativamente entre duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRs) assimétricas ou simétricas de AAV, uma das ITRs compreen-
dendo um local de resolução terminal de AAV funcional e um local de ligação a Rep e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR, em que o ceDNA quando digerido com uma enzima de res- trição que possui um único local de reconhecimento no vetor de ceD- NA tem a presença de bandas características de DNA linear e contí- nuo em comparação com os controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
49. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 48, em que o vetor de ceDNA administrado em qualquer um dentre: o primei- ro, segundo ou qualquer momento subsequente, é administrado em combinação com um carreador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
50. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 49, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou qualquer momento subsequente é o mesmo vetor de ceDNA compreendendo o mesmo transgene ou um transgene modificado.
51. O método de qualquer um dos parágrafos 39 a 50, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou qualquer momento subsequente é um vetor de ceDNA diferente compreenden- do o mesmo transgene ou um transgene modificado.
52. O método do parágrafo 51, em que o vetor de ceDNA diferente tem um promotor diferente operacionalmente ligado ao mes- mo transgene ou a um transgene modificado.
53. O método de qualquer um dos parágrafos 1 a 52, em que o transgene é um medicamento genético.
54. Um método para tratar uma doença em um sujeito, o método compreendendo: a. administrar ao sujeito em um primeiro momento, uma dose de preparação de uma composição compreendendo um vetor de
DNA não viral do capsídeo com extremidades fechadas covalentemen- te (ceDNA) para alcançar a expressão de uma sequência heteróloga de ácido nucleico, e b. administrar ao sujeito em um segundo momento, uma dose de uma composição compreendendo um vetor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (ceD- NA) para manter o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico em um nível sustentado desejado, como em compara- ção com o nível de expressão do ácido nucleico heterólogo alcançado após a administração da composição no primeiro momento, tratando assim a doença no sujeito, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro e no segundo momento compreende uma sequência de ácido nucleico he- teróloga que codifica um transgene posicionado operacionalmente en- tre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV as- simétricas ou simétricas, uma das ITRs compreendendo um local de resolução terminal de AAV funcional e um local de ligação a Rep e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR, em que o vetor de ceDNA quando digerido com uma enzi- ma de restrição que tem um único local de reconhecimento no vetor de ceDNA tem a presença de bandas características de DNA linear e con- tínuo em comparação com controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
55. O método do parágrafo 54, em que as duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) assimétricas ou simétricas são ITRs de AAV.
56. O método dos parágrafos 54 ou 55, em que a ITR com- preendendo um local de resolução terminal funcional e um local de li- gação a Rep é um ITR de AAV do tipo selvagem.
57. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 56, em que as ITRs do AAV são ITRs do AAV-2.
58. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 57, em que as duas ITRs assimétricas são um par de ITRs selecionadas do grupo que consiste em: (i) SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4; e (ii) SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 2.
59. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 58, em que o vetor de ceDNA é administrado em combinação com um carrea- dor e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
60. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 59, em que o segundo momento é de pelo menos 30 dias ou pelo menos 60 dias ou entre 60 a 90 dias ou entre 90 a 120 dias ou entre cerca de 3 a 6 meses após o primeiro momento.
61. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 60, em que o nível de expressão desejado de transgene alcançado após a administração da composição no segundo momento é uma quantidade terapeuticamente eficaz do transgene.
62. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 61, compreendendo ainda administrar ao sujeito em um ou mais momen- tos após o segundo momento, uma dose da composição compreen- dendo um vetor de ceDNA para aumentar o nível de expressão da se- quência heteróloga de ácido nucleico em comparação ao nível de ex- pressão do ácido nucleico heterólogo alcançado após a administração da composição no segundo momento, de modo que seja mantido o nível de expressão sustentada desejado do ácido nucleico heterólogo, em que a composição administrada em um ou mais mo- mentos após o segundo momento compreende um vetor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades fechadas covalentemente (ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um transgene posicionado ope-
rativamente entre duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRs) assimétricas ou simétricas de AAV, uma das ITRs compreen- dendo um local de resolução terminal de AAV funcional e um local de ligação a Rep e uma das ITRs compreendendo uma deleção, inserção ou substituição em relação à outra ITR, em que o ceDNA quando digerido com uma enzima de res- trição que possui um único local de reconhecimento no vetor de ceD- NA tem a presença de bandas características de DNA linear e contí- nuo em comparação com os controles lineares e não contínuos de DNA quando analisados em um gel não desnaturante.
63. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 62, em que o nível de expressão desejado de transgene alcançado após a administração da composição em um ou mais momentos após o se- gundo momento é uma quantidade terapeuticamente eficaz do trans- gene.
64. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 63, em que o vetor de ceDNA é administrado no primeiro, segundo ou qual- quer momento subsequente é administrado com um carreador farma- ceuticamente aceitável.
65. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 64, em que o um ou mais momentos após o segundo momento é de pelo me- nos 30 dias, ou pelo menos 60 dias ou entre 60 a 90 dias, ou entre 90 a 120 dias ou entre aproximadamente 3 a 6 meses após o momento procedente.
66. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 65, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou em qual- quer momento subsequente é o mesmo vetor de ceDNA que compre- ende o mesmo transgene ou um transgene modificado.
67. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 65, em que o vetor de ceDNA administrado no primeiro, segundo ou em qual-
quer momento subsequente é um vetor de ceDNA diferente que com- preende o mesmo transgene ou um transgene modificado.
68. O método do parágrafo 67, em que o vetor de ceDNA diferente tem um promotor diferente operacionalmente ligado ao mes- mo transgene ou a um transgene modificado.
69. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 68, em que o vetor de ceDNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólo- go posicionado operacionalmente entre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) assimétricas ou simétricas, pelo menos uma das ITRs compreendendo um local de resolução terminal funcional e um local de ligação a Rep, e uma das ITRs compreendendo uma dele- ção, inserção ou substituição, em relação à outra ITR; a presença da proteína Rep induzindo a replicação do polinucleotídeo de vetor e a produção do vetor de DNA em uma célula de inseto, sendo o vetor de DNA obtido a partir de um processo compreendendo as etapas de: c. incubar uma população de células de inseto que abri- gam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral na presença da proteína Rep sob condi- ções efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral não capsídico dentro das células do inseto, em que as células de inseto não compreendem DNA não viral de produção li- vre de capsídeo dentro das células de inseto; e d. colher e isolar o DNA não viral livre de capsídeo das cé- lulas de insetos; em que a presença do DNA isolado da célula hospedeira isento de capsídeo das células de inseto pode ser confirmada digerin- do o DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único local de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisan- do o material do DNA digerido em um gel não desnaturante para con-
firmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.
70. O método de qualquer um dos parágrafos 54 a 69, em que o transgene é um medicamento genético.
EXEMPLOS
[00484] Os exemplos a seguir são fornecidos a título ilustrativo, não limitativo. Será observado por um versado na técnica que os vetores de ceDNA podem ser construídos a partir de qualquer uma das ITRs de tipo selvagem ou modificadas no presente documento descritas, e que os seguintes métodos exemplificativos podem ser usados para construir e avaliar a atividade desses vetores de ceDNA. Embora os métodos sejam exemplificados com certos vetores de ceDNA, os mesmos são aplicáveis a qualquer vetor de ceDNA de acordo com a descrição. EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE VETORES DE ceDNA USANDO UM
MÉTODO BASEADO EM CÉLULAS DE INSETOS
[00485] A produção dos vetores de ceDNA usando um modelo de construto de polinucleotídeo é descrita no Exemplo 1 do documento PCT/US18/49996, que é incorporado em sua totalidade no presente documento a título de referência. Por exemplo, um modelo de constru- to de polinucleotídeo usado para gerar os vetores de ceDNA da pre- sente invenção pode ser um ceDNA-plasmídeo, um ceDNA-bacmídeo e/ou um ceDNA-baculovírus. Sem se limitar à teoria, em uma célula hospedeira permissiva, na presença de, por exemplo, Rep, o modelo de construto de polinucleotídeo com duas ITRs simétricas e um cons- truto de expressão, em que pelo menos uma das ITRs é modificada em relação a uma sequência de ITR de tipo selvagem, replica para produzir vetores de ceDNA. A produção do vetor de ceDNA passa por duas etapas: primeiro, excisão ("resgate") do modelo da cadeia princi- pal modelo (por exemplo, ceDNA-plasmídeo, ceDNA-bacmídeo, ge-
noma ceDNA-baculovírus etc.) por meio de proteínas Rep e, segundo, replicação mediada por Rep do vetor de ceDNA excisado.
[00486] Um método exemplificativo para produzir vetores de ceDNA é de um ceDNA-plasmídeo como no presente documento descrito. Com referência às Figuras 1A e 1B, o modelo de construto polinucleo- tídica de cada um dos ceDNA-plasmídeos inclui uma ITR modificada esquerda e uma ITR modificada direita com o seguinte entre as se- quências de ITR: (i) um intensificador/promotor; (ii) um local de clona- gem para um transgene; (iii) um elemento de resposta pós- transcricional (por exemplo, o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite por marmota) (WPRE); e (iv) um sinal de poliadenila- ção (por exemplo, do gene do hormônio do crescimento bovino (BGHpA). Locais de reconhecimento de endonucleases de restrição únicos (R1 a R6) (mostrados na Figura 1A e na Figura 1B) também foram introduzidos entre cada componente para facilitar a introdução de novos componentes genéticos nos locais específicos do construto. Os locais das enzimas R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 123) e R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 124) são projetados no local de clona- gem para introduzir um quadro de leitura aberto de um transgene. Es- sas sequências foram clonadas em um plasmídeo pFastBac HT B ob- tido junto à ThermoFisher Scientific.
[00487] Produção de ceDNA-bacmídeos:
[00488] As células competentes DH10Bac (Células Competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) foram transformadas com plasmídeos de teste ou controle, seguindo um protocolo de acor- do com as instruções do fabricante. A recombinação entre o plasmídeo e um vetor shuttle de baculovírus nas células DH10Bac foi induzida para gerar ceDNA-bacmídeos recombinantes. Os bacmídeos recombi- nantes foram selecionados por triagem de uma seleção positiva base- ada na triagem azul-branca em E. coli (o marcador Φ80dlacZΔM15 fornece complementação α do gene da β-galactosidase do vetor bac- mídeo) em uma placa de ágar bacteriana contendo X-gal e IPTG com antibióticos para selecionar transformantes e manutenção dos plasmí- deos bacmídeos e transposases. As colônias brancas causadas por transposição que interrompe o gene indicador de β-galactoside foram colhidas e cultivadas em 10 ml de meio.
[00489] Os ceDNA-bacmídeos recombinantes foram isolados a par- tir de E. coli e transfectados para células de inseto Sf9 ou Sf21 usando FugeneHD para produzir baculovírus infeccioso. As células de inseto aderentes Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio em balões T25 a 25 °C. Quatro dias depois, o meio de cultura (contendo o vírus P0) foi removido das células, filtrado através de um filtro de 0,45 µm, separando as partículas infecciosas de baculovírus das células ou de- tritos celulares.
[00490] Opcionalmente, a primeira geração do baculovírus (P0) foi amplificada através da infecção de células de inseto Sf9 ou Sf21 vir- gens em 50 a 500 ml de meio. As células foram mantidas em culturas em suspensão em uma incubadora agitadora orbital a 130 rpm a 25 °C, monitorando o diâmetro e a viabilidade das células, até as células atingirem um diâmetro de 18 a 19 nm (a partir de um diâmetro ingênuo de 14 a 15 nm) e uma densidade de ~4,0E + 6 células/ml. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculovírus P1 no meio foram coletadas após centrifugação para remover células e detritos e filtra- ção através de um filtro de 0,45 µm.
[00491] Os ceDNA-baculovírus que compreendem os construtos de teste foram coletados e a atividade infecciosa, ou titulação, do baculo- vírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5E + 6 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas seguintes diluições: 1/1000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incu- badas a 25-27 °C. A infectividade foi determinada pela taxa de aumen-
to do diâmetro celular e parada do ciclo celular, e alteração na viabili- dade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.
[00492] Um "plasmídeo Rep" foi produzido em um vetor de expres- são pFASTBACTM -Dual (ThermoFisher) compreendendo Rep78 (SEQ ID NO: 131 ou 133) ou Rep68 (SEQ ID NO: 130) e Rep52 (SEQ ID NO: 132) ou Rep40 (SEQ ID NO: 129). O plasmídeo Rep foi transfor- mado nas células competentes DH10Bac (células competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ (Thermo Fisher) seguindo um protocolo fornecido pelo fabricante. A recombinação entre o plasmídeo Rep e um vetor shuttle de baculovírus nas células DH10Bac foi induzida para gerar bacmídeos recombinantes ("Rep-bacmids"). Os bacmídeos re- combinantes foram selecionados por uma seleção positiva que incluiu triagem azul-branca em E. coli (marcador Φ80dlacZΔM15 fornece a complementação α do gene da β-galactosidase do vetor bacmídeo) em uma placa de ágar bacteriana contendo X-gal e IPTG. Colônias brancas isoladas foram colhidas e inoculadas em 10 ml de meio de seleção (canamicina, gentamicina, tetraciclina em caldo LB). Os bac- mídeos recombinantes (Rep-bacmids) foram isolados a partir de E. coli e os Rep-bacmids foram transfectados em células de inseto Sf9 ou Sf21 para produzir baculovírus infeccioso.
[00493] As células de inseto Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio por 4 dias e os baculovírus recombinantes infecciosos ("Rep- baculovírus") foram isolados da cultura. Opcionalmente, a Rep- baculovírus de primeira geração (P0) foi amplificada através da infec- ção de células virgens de inseto Sf9 ou Sf21 e cultivada em 50 a 500 ml de meio. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculo- vírus P1 no meio foram coletadas por separação de células por centri- fugação ou filtração ou outro processo de fracionamento. Os Rep- baculovírus foram coletados e a atividade infecciosa do baculovírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células
Sf9 a 2,5x106 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas se- guintes diluições, 1/1000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incubadas. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celu- lar e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.
[00494] Geração e caracterização do vetor de ceDNA
[00495] Com referência à Figura 4B, meios de cultura de células de inseto Sf9 contendo (1) uma amostra contendo um ceDNA-bacmídeo ou um ceDNA-baculovírus e (2) rep-baculovírus descritos acima foram, então, adicionados a uma nova cultura de células Sf9 (2,5E + 6 célu- las/ml, 20 ml) em uma razão de 1:1000 e 1:10.000, respectivamente. As células foram, então, cultivadas a 130 rpm a 25 °C. 4 a 5 dias após a coinfecção, o diâmetro e a viabilidade celular são detectados. Quan- do os diâmetros celulares atingiram 18-20 nm com uma viabilidade de ~70-80%, as culturas celulares foram centrifugadas, o meio foi removi- do e os péletes celulares foram coletados. Os sedimentos celulares são, primeiro, novamente suspensos em um volume adequado de meio aquoso, água ou tampão. O vetor de ceDNA foi isolado e purifi- cado das células usando o protocolo de purificação Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, 0,2 mg de massa de grânulos de células processa- das por coluna).
[00496] Os rendimentos dos vetores de ceDNA produzidos e purifi- cados a partir das células de inseto Sf9 foram inicialmente determina- dos com base na absorvância de UV a 260 nm.
[00497] Os vetores de ceDNA podem ser avaliados por identifica- dos por eletroforese em gel de agarose em condições nativas ou des- naturantes, como ilustrado na Figura 4D, em que (a) a presença de bandas características migrando com o dobro do tamanho em géis desnaturantes versus géis nativos após a clivagem por endonuclease e a análise eletroforética em gel e (b) a presença de bandas de mo-
nômero e dímero (2x) em géis desnaturantes para material não clivado é característico da presença do vetor de ceDNA.
[00498] As estruturas dos vetores de ceDNA isolados foram poste- riormente analisadas pela digestão do DNA obtido a partir de células Sf9 coinfectadas (como descrito no presente documento) com endo- nucleases de restrição selecionadas para a) presença de apenas um único local de corte nos vetores de ceDNA e b) fragmentos resultantes que eram grandes o suficiente para serem vistos claramente quando fracionados em um gel de agarose desnaturante a 0,8% (>800 pb). Como ilustrado nas Figuras 4D e 4E, os vetores lineares de DNA com uma estrutura não contínua e o vetor de ceDNA com a estrutura linear e contínua podem ser distinguidos pelos tamanhos de seus produtos de reação - por exemplo, espera-se que um vetor de DNA com uma estrutura não contínua produza fragmentos de 1 kb e 2 kb, enquanto se espera que um vetor sem capsídeo com a estrutura contínua pro- duza fragmentos de 2 kb e 4 kb.
[00499] Portanto, para demonstrar de maneira qualitativa que os vetores de ceDNA isolados são covalentemente fechados, como é exi- gido por definição, as amostras foram digeridas com uma endonu- clease de restrição identificada no contexto da sequência específica do vetor de DNA como tendo um único local de restrição, de preferência, resultando em dois produtos de clivagem de tamanho desigual (por exemplo, 1.000 pb e 2.000 pb). Após digestão e eletroforese em um gel desnaturante (que separa as duas fitas complementares de DNA), um DNA linear e não covalentemente fechado será resolvido nos ta- manhos de 1.000 pb e 2.000 pb, enquanto um DNA covalentemente fechado (ou seja, um vetor de ceDNA) será resolvido em tamanhos 2x (2.000 pb e 4.000 pb), uma vez que as duas fitas de DNA estão liga- das e agora são desdobradas e duas vezes o comprimento (embora de fita simples). Além disso, a digestão das formas monoméricas, di-
méricas e n-méricas dos vetores de DNA será resolvida como frag- mentos do mesmo tamanho devido à ligação de ponta a ponta dos ve- tores de DNA multiméricos (consulte Figura 4D).
[00500] Tal como utilizado no presente documento, o "ensaio para a identificação de vetores de DNA por electroforese em gel de agarose sob gel nativo e condições desnaturantes" refere-se a um ensaio para avaliar a proximidade do ceDNA, realizando digestão com endonu- cleases de restrição seguida de avaliação eletroforética dos produtos digeridos. Um desses ensaios exemplificativos segue, embora um ver- sado na técnica compreenda que muitas variações conhecidas na téc- nica nesse exemplo são possíveis. A endonuclease de restrição é se- lecionada para ser uma enzima de corte único para o vetor de ceDNA de interesse que irá gerar produtos com aproximadamente 1/3x e 2/3x do comprimento do vetor de DNA. Isso resolve as bandas em géis na- tivos e desnaturantes. Antes da desnaturação, é importante remover o tampão da amostra. O kit de limpeza Qiagen PCR ou a dessalinização de "colunas giratórias", por exemplo, colunas GE HEALTHCARE ILUSTRA, MICROSPIN e G-25, são algumas opções conhecidas na técnica para a digestão de endonucleases. O ensaio inclui, por exemplo, i) digerir o DNA com endonuclease (ou endonucleases) de restrição apropriado, 2) aplicar, por exemplo, a um kit de limpeza Qia- gen PCR, eluir com água destilada, iii) adicionar solução de 10x natu- rante (10 x = 0,5 M NaOH, 10 mM de EDTA), adicionar 10 X de coran- te, não tamponado, e analisar, juntamente com as escadas de DNA preparadas adicionando 10X de solução desnaturante a 4x, em um gel de 0,8 a 1,0% previamente incubado com 1 mM de EDTA e 200 mM de NaOH para garantir que a concentração de NaOH seja uniforme na caixa de gel e no gel, e correr o gel na presença de uma solução des- naturante 1 x (NaOH 50 mM, EDTA 1 mM). Um versado na técnica apreciará qual voltagem usar para executar a eletroforese com base no tamanho e no tempo desejado dos resultados. Após a eletroforese, os géis são drenados e neutralizados em 1x TBE ou TAE e transferi- dos para água destilada ou 1x TBE/TAE com 1x SYBR Gold. As ban- das podem, então, ser visualizadas com, por exemplo, Thermo Fisher, mancha de gel de ácido nucleico SYBR® Gold (10.000X concentrado em DMSO) e luz epifluorescente (azul) ou UV (312nm).
[00501] A pureza do vetor de ceDNA gerado pode ser avaliada usando qualquer método conhecido na técnica. Como um método exemplificativo e não limitativo, a contribuição do ceDNA-plasmídeo para a absorbância total de UV de uma amostra pode ser estimada comparando a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA com um padrão. Por exemplo, se com base na absorbância de UV, 4 µg do ve- tor de ceDNA foram carregados no gel, e a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA for equivalente a uma banda de 2 kb que é conhecida por 1 µg, então, há 1 µg do vetor de ceDNA e o vetor de ceDNA é 25% do total de material absorvente de UV. A intensidade da banda no gel é plotada contra a entrada calculada que a banda representa - por exemplo, se o vetor de ceDNA total for 8kb e a banda comparativa ex- cisada for 2kb, a intensidade da banda será plotada como 25% da en- trada total que, neste caso, seria 0,25 µg para 1,0 µg de entrada. Usando a titulação do plasmídeo do vetor de ceDNA para plotar uma curva padrão, uma equação de linha de regressão é, então, usada pa- ra calcular a quantidade da banda do vetor de ceDNA, que pode ser usada para determinar a porcentagem da entrada total representada pelo vetor de ceDNA ou a porcentagem de pureza.
[00502] Para fins ilustrativos, o Exemplo 1 descreve a produção de vetores de ceDNA usando um método baseado em células de inseto e um modelo de construto de polinucleotídeo, e também é descrito no Exemplo 1 do PCT/US18/49996, que é incorporado no presente do- cumento na sua totalidade por referência. Por exemplo, um modelo de construto de polinucleotídeo usado para gerar os vetores de ceDNA da presente invenção de acordo com o Exemplo 1 pode ser um ceDNA- plasmídeo, um ceDNA-bacmídeo e/ou um ceDNA-baculovírus. Sem se limitar à teoria, em uma célula hospedeira permissiva, na presença de, por exemplo, Rep, o modelo de construto de polinucleotídeo com duas ITRs simétricas e um construto de expressão, em que pelo menos uma das ITRs é modificada em relação a uma sequência de ITR de tipo selvagem, replica para produzir vetores de ceDNA. A produção do vetor de ceDNA passa por duas etapas: primeiro, excisão ("resgate") do modelo da cadeia principal modelo (por exemplo, ceDNA- plasmídeo, ceDNA-bacmídeo, genoma ceDNA-baculovírus etc.) por meio de proteínas Rep e, segundo, replicação mediada por Rep do vetor de ceDNA excisado.
[00503] Um método exemplificativo para produzir vetores de ceDNA em um método usando célula inseto é de um ceDNA-plasmídeo como no presente documento descrito. Com referência às Figuras 1A e 1B, o modelo de construto polinucleotídica de cada um dos plasmídeos ceDNA inclui uma ITR modificada esquerda e uma ITR modificada di- reita com o seguinte entre as sequências de ITR: (i) um intensifica- dor/promotor; (ii) um local de clonagem para um transgene; (iii) um elemento de resposta pós-transcricional (por exemplo, o elemento re- gulador pós-transcricional do vírus da hepatite por marmota) (WPRE); e (iv) um sinal de poliadenilação (por exemplo, do gene do hormônio do crescimento bovino (BGHpA). Locais de reconhecimento de endo- nucleases de restrição únicos (R1 a R6) (mostrados na Figura 1A e na Figura 1B) também foram introduzidos entre cada componente para facilitar a introdução de novos componentes genéticos nos locais es- pecíficos do construto. Os locais das enzimas R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 123) e R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 124) são pro- jetados no local de clonagem para introduzir um quadro de leitura aberto de um transgene. Essas sequências foram clonadas em um plasmídeo pFastBac HT B obtido junto à ThermoFisher Scientific.
[00504] Produção de ceDNA-bacmídeos:
[00505] As células competentes DH10Bac (Células Competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) foram transformadas com plasmídeos de teste ou controle, seguindo um protocolo de acor- do com as instruções do fabricante. A recombinação entre o plasmídeo e um vetor shuttle de baculovírus nas células DH10Bac foi induzida para gerar ceDNA-bacmídeos recombinantes. Os bacmídeos recombi- nantes foram selecionados por triagem de uma seleção positiva base- ada na triagem azul-branca em E. coli (o marcador Φ80dlacZΔM15 fornece complementação α do gene da β-galactosidase do vetor bac- mídeo) em uma placa de ágar bacteriana contendo X-gal e IPTG com antibióticos para selecionar transformantes e manutenção dos plasmí- deos bacmídeos e transposases. As colônias brancas causadas por transposição que interrompe o gene indicador de galactoside foram colhidas e cultivadas em 10 ml de meio.
[00506] Os ceDNA-bacmídeos recombinantes foram isolados a par- tir de E. coli e transfectados para células de inseto Sf9 ou Sf21 usando FugeneHD para produzir baculovírus infeccioso. As células de inseto aderentes Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio em balões T25 a 25 °C. Quatro dias depois, o meio de cultura (contendo o vírus P0) foi removido das células, filtrado através de um filtro de 0,45 µm, separando as partículas infecciosas de baculovírus das células ou de- tritos celulares.
[00507] Opcionalmente, a primeira geração do baculovírus (P0) foi amplificada através da infecção de células de inseto Sf9 ou Sf21 vir- gens em 50 a 500 ml de meio. As células foram mantidas em culturas em suspensão em uma incubadora agitadora orbital a 130 rpm a 25 °C, monitorando o diâmetro e a viabilidade das células, até as células atingirem um diâmetro de 18 a 19 nm (a partir de um diâmetro ingênuo de 14 a 15 nm) e uma densidade de ~4,0E + 6 células/ml. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculovírus P1 no meio foram coletadas após centrifugação para remover células e detritos e filtra- ção através de um filtro de 0,45 µm.
[00508] Os ceDNA-baculovírus que compreendem os construtos de teste foram coletados e a atividade infecciosa, ou titulação, do baculo- vírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5E + 6 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas seguintes diluições: 1/1000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incu- badas a 25-27 °C. A infectividade foi determinada pela taxa de aumen- to do diâmetro celular e parada do ciclo celular, e alteração na viabili- dade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.
[00509] Um "plasmídeo Rep" foi produzido em um vetor de expres- são pFASTBACTM -Dual (ThermoFisher) compreendendo Rep78 (SEQ ID NO: 131 ou 133) ou Rep68 (SEQ ID NO: 130) e Rep52 (SEQ ID NO: 132) ou Rep40 (SEQ ID NO: 129). O plasmídeo Rep foi transfor- mado nas células competentes DH10Bac (células competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ (Thermo Fisher) seguindo um protocolo fornecido pelo fabricante. A recombinação entre o plasmídeo Rep e um vetor shuttle de baculovírus nas células DH10Bac foi induzida para gerar bacmídeos recombinantes ("Rep-bacmids"). Os bacmídeos re- combinantes foram selecionados por uma seleção positiva que incluiu triagem azul-branca em E. coli (marcador Φ80dlacZΔM15 fornece a complementação α do gene da β-galactosidase do vetor bacmídeo) em uma placa de ágar bacteriana contendo X-gal e IPTG. Colônias brancas isoladas foram colhidas e inoculadas em 10 ml de meio de seleção (canamicina, gentamicina, tetraciclina em caldo LB). Os bac- mídeos recombinantes (Rep-bacmids) foram isolados a partir de E. coli e os Rep-bacmids foram transfectados em células de inseto Sf9 ou
Sf21 para produzir baculovírus infeccioso.
[00510] As células de inseto Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio por 4 dias e os baculovírus recombinantes infecciosos ("Rep- baculovírus") foram isolados da cultura. Opcionalmente, a Rep- baculovírus de primeira geração (P0) foi amplificada através da infec- ção de células virgens de inseto Sf9 ou Sf21 e cultivada em 50 a 500 ml de meio. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculo- vírus P1 no meio foram coletadas por separação de células por centri- fugação ou filtração ou outro processo de fracionamento. Os Rep- baculovírus foram coletados e a atividade infecciosa do baculovírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5x106 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas se- guintes diluições, 1/1000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incubadas. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celu- lar e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.
[00511] Geração e caracterização do vetor de ceDNA
[00512] Meios de cultura de células de inseto Sf9 contendo (1) uma amostra contendo um ceDNA-bacmídeo ou um ceDNA-baculovírus e (2) rep-baculovírus descritos acima foram, então, adicionados a uma nova cultura de células Sf9 (2,5E + 6 células/ml, 20 ml) em uma razão de 1:1.000 e 1:10.000, respectivamente. As células foram, então, culti- vadas a 130 rpm a 25 °C. 4 a 5 dias após a coinfecção, o diâmetro e a viabilidade celular são detectados. Quando os diâmetros celulares atingiram 18-20 nm com uma viabilidade de ~70-80%, as culturas celu- lares foram centrifugadas, o meio foi removido e os péletes celulares foram coletados. Os sedimentos celulares são, primeiro, novamente suspensos em um volume adequado de meio aquoso, água ou tam- pão. O vetor de ceDNA foi isolado e purificado das células usando o protocolo de purificação Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, 0,2 mg de massa de grânulos de células processadas por coluna).
[00513] Os rendimentos dos vetores de ceDNA produzidos e purifi- cados a partir das células de inseto Sf9 foram inicialmente determina- dos com base na absorvância de UV a 260 nm. Os vetores de ceDNA purificados podem ser avaliados quanto à configuração final adequa- da, usando a metodologia eletroforética descrita no Exemplo 5. EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE ceDNA SINTÉTICO POR EXCISÃO DE
UMA MOLÉCULA DE DNA DE FITA DUPLA
[00514] A produção sintética dos vetores de ceDNA é descrita nos Exemplos 2 a 6 do Pedido Internacional PCT/US19/14122, depositado em 18 de janeiro de 2019, que é no presente documento incorporado na sua totalidade por referência. Um método exemplar de produção de um vetor de ceDNA usando um método sintético que envolve a exci- são de uma molécula de DNA de fita dupla. Em resumo, um vetor de ceDNA pode ser gerado usando um construto de DNA de fita dupla, por exemplo, ver Figuras 7A a 8E de PCT/US19/14122. Em algumas modalidades, o construto de DNA de fita dupla é um plasmídeo de ce- DNA, por exemplo, ver, por exemplo, a Figura 6 no pedido de patente internacional PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de
2018.
[00515] Em algumas modalidades, um construto para produzir um vetor de ceDNA compreende uma chave reguladora, como descrito no presente documento.
[00516] Para fins ilustrativos, o Exemplo 2 descreve a produção de vetores de ceDNA como vetores de DNA de extremidade fechada exemplares gerados usando este método. No entanto, enquanto os vetores de ceDNA são exemplificados neste exemplo para ilustrar mé- todos de produção sintética in vitro para gerar um vetor de DNA de ex- tremidade fechada por excisão de um polinucleotídeo de fita dupla compreendendo as ITRs e a cassete de expressão (por exemplo, se-
quência heteróloga de ácido nucleico) seguida de ligação das extremi- dades 3' e 5' livres, como descrito no presente documento, um versado na técnica está ciente de que é possível, como ilustrado acima, modifi- car a molécula de polinucleotídeo de DNA de fita dupla de modo que seja gerado qualquer vetor de DNA de extremidade fechada desejado, incluindo mas não limitado a, DNA de ossos de cachorro, DNA de hal- teres e similares.
[00517] O método envolve (i) extirpar uma sequência que codifica o cassete de expressão de um construto de DNA de fita dupla e (ii) for- mar estruturas em grampo em uma ou mais das ITRs e (iii) unir as ex- tremidades 5' e 3' livres por ligação, por exemplo, pela ligase de DNA T4.
[00518] O construto de DNA de fita dupla compreende, na ordem 5' a 3': um primeiro local de endonuclease de restrição; um ITR a mon- tante; um cassete de expressão; uma ITR a jusante; e um segundo local de endonuclease de restrição. O construto de DNA de fita dupla é então contatado com uma ou mais endonucleases de restrição para gerar quebras de fita dupla em ambos os locais de endonuclease de restrição. Uma endonuclease pode ter como alvo os dois locais ou ca- da local pode ser alvejado por uma endonuclease diferente, desde que os locais de restrição não estejam presentes no modelo de vetor de ceDNA. Isto excisa a sequência entre os locais de endonuclease de restrição do resto da construto de DNA de fita dupla. Após a ligação, um vetor de DNA fechado é formado.
[00519] Uma ou ambas as ITRs usadas no método podem ser ITRs do tipo selvagem. As ITRs modificadas também podem ser usadas, onde a modificação pode incluir deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da ITR de tipo selvagem nas sequências que formam o braço B e B' e/ou o braço C e C' (ver, por exemplo, Figuras 3B e 3D) e pode ter duas ou mais alças de grampo ou uma única alça de grampo. A ITR modificada com laço em grampo pode ser gerada por modificação genética de um oligo existente ou por síntese biológi- ca e/ou química de novo.
[00520] Em um exemplo não limitativo, a ITR-6 esquerda e direita (SEQ ID NOS: 111 e 112) inclui 40 deleções de nucleotídeos nos bra- ços BB' e CC' da ITR de tipo selvagem de AAV2. Prevê-se que os nu- cleotídeos restantes na ITR modificada formem uma única estrutura em grampo. A energia livre de Gibbs do desdobramento da estrutura é de cerca de -54,4 kcal/mol. Outras modificações no ITR também po- dem ser feitas, incluindo a deleção opcional de um local de ligação a Rep funcional ou de um local Trs. EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DE ceDNA VIA CONSTRUÇÃO DE OLI-
GONUCLEOTÍDEOS
[00521] Outro método exemplar de produção de um vetor de ceD- NA usando um método sintético que envolve a montagem de vários oligonucleotídeos é fornecido no Exemplo 3 do documento PCT/US19/14122, em que um vetor de ceDNA é produzido sintetizan- do um oligonucleotídeo 5' e um oligonucleotídeo ITR 3' e ligar os oli- gonucleotídeos ITR a um polinucleotídeos de fita dupla compreenden- do um cassete de expressão. A Figura 11B do documento PCT/US19/14122 mostra um método exemplar de ligação de um oli- gonucleotídeo ITR 5' e um oligonucleotídeo ITR 3' a um polinucleotí- deo de fita dupla compreendendo um cassete de expressão.
[00522] Como no presente documento descrito, os oligonucleotí- deos de ITR podem compreender WT-ITRs ou ITRs modificadas (por exemplo, ver Figuras 6A, 6B, 7A e 7B do documento PCT/US19/14122, que é incorporado no presente documento na sua totalidade). Os oligonucleotídeos de ITR exemplares incluem, mas não estão limitados a SEQ ID NOS: 134 a 145 (por exemplo, consulte a Tabela 7 em PCT/US19/14122). As ITRs modificadas podem incluir deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da ITR de tipo selvagem nas sequências que formam o braço B e B' e/ou o braço C e C'. Os oligonucleotídeos de ITR, que compreendem WT- ITRs ou mod-ITRs como no presente documento descrito, para serem utilizados na síntese livre de células, podem ser gerados por modifica- ção genética ou síntese biológica e/ou química. Como discutido no presente documento, os oligonucleotídeos de ITR nos Exemplos 2 e 3 podem compreender WT-ITRs ou ITRs modificadas (mod-ITRs) em configurações simétricas ou assimétricas, conforme discutido no pre- sente documento. EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE ceDNA ATRAVÉS DE UMA MOLÉCU-
LA DE DNA DE FITA SIMPLES
[00523] Outro método exemplar de produção de um vetor de ceD- NA usando um método sintético é fornecido no Exemplo 4 do docu- mento PCT/US19/14122, e usa um DNA linear de fita simples que compreende duas ITRs sensoriais que flanqueiam uma sequência de cassete de expressão sensorial e são ligados covalentemente a duas ITRs antissenso que flanqueiam um cassete de expressão antissenso, cujas extremidades são DNA linear de fita simples são então ligadas para formar uma molécula de fita simples de extremidade fechada. Um exemplo não limitativo compreende sintetizar e/ou produzir uma molé- cula de DNA de fita simples, emparelhar partes da molécula para for- mar uma única molécula de DNA linear que tem uma ou mais regiões emparelhadas em bases da estrutura secundária e depois ligar as ex- tremidades 5' e 3' livres uma na outra para formar uma molécula fe- chada de fita simples.
[00524] Uma molécula de DNA de fita simples exemplar para pro- dução de um vetor de ceDNA compreende, de 5' a 3':
[00525] uma a primeira ITR senso;
[00526] uma sequência de cassete de expressão senso;
[00527] uma segunda ITR senso;
[00528] uma segunda ITR antissenso;
[00529] uma sequência de cassete de expressão antissenso; e
[00530] uma primeira ITR antissenso.
[00531] Uma molécula de DNA de fita simples para uso no método exemplar do Exemplo 4 pode ser formada por qualquer metodologia de síntese de DNA no presente documento descrita, por exemplo, sín- tese de DNA in vitro, ou fornecida pela clivagem de um construto de DNA (por exemplo, um plasmídeo) com nucleases e fusão dos frag- mentos de dsDNA resultantes para fornecer fragmentos de ssDNA.
[00532] O anelamento pode ser realizado abaixando a temperatura abaixo das temperaturas de fusão calculadas dos pares de sequência senso e antissenso. A temperatura de fusão depende do teor específi- co da base de nucleotídeos e das características da solução utilizada, por exemplo, a concentração de sal. As temperaturas de fusão para qualquer combinação de sequência e solução são prontamente calcu- ladas por um versado na técnica.
[00533] As extremidades 5' e 3' livres da molécula emparelhada po- dem ser ligadas uma à outra ou ligadas a uma molécula em grampo para formar o vetor de ceDNA. Metodologias de ligação exemplares adequadas e moléculas em grampo são descritas nos Exemplos 2 e 3. EXEMPLO 5: PURIFICAR E/OU CONFIRMAR A PRODUÇÃO DE ceDNA
[00534] Qualquer um dos produtos vetoriais de DNA produzidos pe- los métodos no presente documento descritos, por exemplo, incluindo os métodos de produção baseados em células de inseto descritos no Exemplo 1, ou métodos de produção sintéticos descritos nos Exem- plos 2 a 4, podem ser purificados, por exemplo, para remover impure- zas, componentes não utilizados, ou subprodutos usando métodos comumente conhecidos por um versado na técnica; e/ou pode ser ana-
lisado para confirmar que o vetor de DNA produzido (neste caso, um vetor de ceDNA) é a molécula desejada. Um método exemplar para purificação do vetor de DNA, por exemplo, ceDNA está usando o pro- tocolo de purificação Qiagen Midi Plus (Qiagen) e/ou por purificação em gel,
[00535] A seguir, é apresentado um método exemplar para confir- mar a identidade dos vetores de ceDNA.
[00536] Os vetores de ceDNA podem ser avaliados por identifica- dos por eletroforese em gel de agarose em condições nativas ou des- naturantes, como ilustrado nas Figuras 4C e 4D, em que (a) a presen- ça de bandas características migrando com o dobro do tamanho em géis desnaturantes versus géis nativos após a clivagem por endonu- clease e a análise eletroforética em gel e (b) a presença de bandas de monômero e dímero (2x) em géis desnaturantes para material não cli- vado é característico da presença do vetor de ceDNA.
[00537] As estruturas dos vetores de ceDNA isolados foram poste- riormente analisadas pela digestão do DNA purificado com endonu- cleases de restrição selecionadas para a) presença de apenas um úni- co local de corte nos vetores de ceDNA e b) fragmentos resultantes que eram grandes o suficiente para serem vistos claramente quando fracionados em um gel de agarose desnaturante a 0,8% (>800 pb). Como ilustrado nas Figuras 4C e 4D, os vetores lineares de DNA com uma estrutura não contínua e o vetor de ceDNA com a estrutura linear e contínua podem ser distinguidos pelos tamanhos de seus produtos de reação - por exemplo, espera-se que um vetor de DNA com uma estrutura não contínua produza fragmentos de 1 kb e 2 kb, enquanto se espera que um vetor de ceDNA com a estrutura contínua produza fragmentos de 2 kb e 4 kb.
[00538] Portanto, para demonstrar de maneira qualitativa que os vetores de ceDNA isolados são covalentemente fechados, como é exi-
gido por definição, as amostras foram digeridas com uma endonu- clease de restrição identificada no contexto da sequência específica do vetor de DNA como tendo um único local de restrição, de preferência, resultando em dois produtos de clivagem de tamanho desigual (por exemplo, 1.000 pb e 2.000 pb). Após digestão e eletroforese em um gel desnaturante (que separa as duas fitas complementares de DNA), um DNA linear e não covalentemente fechado será resolvido nos ta- manhos de 1.000 pb e 2.000 pb, enquanto um DNA covalentemente fechado (ou seja, um vetor de ceDNA) será resolvido em tamanhos 2x (2.000 pb e 4.000 pb), uma vez que as duas fitas de DNA estão liga- das e agora são desdobradas e duas vezes o comprimento (embora de fita simples). Além disso, a digestão das formas monoméricas, di- méricas e n-méricas dos vetores de DNA será resolvida como frag- mentos do mesmo tamanho devido à ligação de ponta a ponta dos ve- tores de DNA multiméricos (consulte Figura 4D e 4E).
[00539] Tal como utilizado no presente documento, o "ensaio para a identificação de vetores de DNA por electroforese em gel de agarose sob gel nativo e condições desnaturantes" refere-se a um ensaio para avaliar a proximidade do ceDNA, realizando digestão com endonu- cleases de restrição seguida de avaliação eletroforética dos produtos de digestão. Um desses ensaios exemplificativos segue, embora um versado na técnica compreenda que muitas variações conhecidas na técnica nesse exemplo são possíveis. A endonuclease de restrição é selecionada para ser uma enzima de corte único para o vetor de ceD- NA de interesse que irá gerar produtos com aproximadamente 1/3x e 2/3x do comprimento do vetor de DNA. Isso resolve as bandas em géis nativos e desnaturantes. Antes da desnaturação, é importante remover o tampão da amostra. O kit de limpeza Qiagen PCR ou a dessaliniza- ção de "colunas giratórias", por exemplo, colunas GE HEALTHCARE ILUSTRA, MICROSPIN e G-25, são algumas opções conhecidas na técnica para a digestão de endonucleases. O ensaio inclui, por exemplo, i) digerir o DNA com endonuclease (ou endonucleases) de restrição apropriado, 2) aplicar, por exemplo, a um kit de limpeza Qia- gen PCR, eluir com água destilada, iii) adicionar solução de 10x natu- rante (10 x = 0,5 M NaOH, 10 mM de EDTA), adicionar 10 X de coran- te, não tamponado, e analisar, juntamente com as escadas de DNA preparadas adicionando 10X de solução desnaturante a 4x, em um gel de 0,8 a 1,0% previamente incubado com 1 mM de EDTA e 200 mM de NaOH para garantir que a concentração de NaOH seja uniforme na caixa de gel e no gel, e correr o gel na presença de uma solução des- naturante 1 x (NaOH 50 mM, EDTA 1 mM). Um versado na técnica apreciará qual voltagem usar para executar a eletroforese com base no tamanho e no tempo desejado dos resultados. Após a eletroforese, os géis são drenados e neutralizados em 1x TBE ou TAE e transferi- dos para água destilada ou 1x TBE/TAE com 1x SYBR Gold. As ban- das podem, então, ser visualizadas com, por exemplo, Thermo Fisher, mancha de gel de ácido nucleico SYBR® Gold (10.000X concentrado em DMSO) e luz epifluorescente (azul) ou UV (312nm). O método pre- cedente baseado em gel pode ser adaptado para fins de purificação, isolando o vetor de ceDNA da banda de gel e permitindo que ele rena- ture.
[00540] A pureza do vetor de ceDNA gerado pode ser avaliada usando qualquer método conhecido na técnica. Como um método exemplificativo e não limitativo, a contribuição do ceDNA-plasmídeo para a absorbância total de UV de uma amostra pode ser estimada comparando a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA com um padrão. Por exemplo, se com base na absorbância de UV, 4 µg do ve- tor de ceDNA foram carregados no gel, e a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA for equivalente a uma banda de 2 kb que é conhecida por 1 µg, então, há 1 µg do vetor de ceDNA e o vetor de ceDNA é 25%
do total de material absorvente de UV. A intensidade da banda no gel é plotada contra a entrada calculada que a banda representa - por exemplo, se o vetor de ceDNA total for 8kb e a banda comparativa ex- cisada for 2kb, a intensidade da banda será plotada como 25% da en- trada total que, neste caso, seria 0,25 µg para 1,0 µg de entrada. Usando a titulação do plasmídeo do vetor de ceDNA para plotar uma curva padrão, uma equação de linha de regressão é, então, usada pa- ra calcular a quantidade da banda do vetor de ceDNA, que pode ser usada para determinar a porcentagem da entrada total representada pelo vetor de ceDNA ou a porcentagem de pureza. EXEMPLO 6: EXPRESSÃO CONTROLADA DE TRANSGENE A PARTIR DE ceDNA: A EXPRESSÃO DE TRANSGENE A PARTIR DO VETOR DE ceDNA IN VIVO PODE SER SUSTENTADA E/OU AU- MENTADA POR ADMINISTRAÇÃO DE REDOSE.
[00541] Um vetor de ceDNA foi produzido de acordo com os méto- dos descritos no Exemplo 1 acima, usando um plasmídeo de ceDNA compreendendo um promotor CAG (SEQ ID NO: 72) e um transgene de luciferase (SEQ ID NO: 56) flanqueado entre ITRs assimétricas (por exemplo, uma WT-ITR 5' (SEQ ID NO: 2) e uma mod-ITR 3' (SEQ ID NO: 3) e foi avaliado em diferentes paragames de tratamento in vivo. Este vetor de ceDNA foi utilizado em todas as experiências subse- quentes descritas nos Exemplos 6 a 10. No Exemplo 6, o vetor de ce- DNA foi purificado e formulado com uma nanopartícula lipídica (LNP ceDNA) e injetado na veia da cauda de cada camundongo CD-1® IGS. Os lipossomas foram formulados com uma mistura lipídica adequada compreendendo quatro componentes para formar lipossomas de na- nopartículas lipídicas (LNP), incluindo lipídeos catiônicos, lipídeos au- xiliares, colesterol e lipídeos PEG.
[00542] Para avaliar a expressão sustentada do transgene in vivo a partir do vetor de ceDNA por um longo período de tempo, o LNP-
ceDNA foi administrado em PBS estéril por injeção intravenosa de vei- as da cauda em camundongos CD-1® IGS de aproximadamente 5 a 7 semanas de idade. Foram avaliados três grupos de dosagem diferen- tes: 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg e 1,0 mg/kg, dez camundongos por grupo (exceto 1,0 mg/kg, que possuíam 15 camundongos por grupo). As in- jeções foram administradas no dia 0. Cinco camundongos de cada um dos grupos foram injetados com uma dose idêntica adicional no dia 28. A expressão da luciferase foi medida por imagem IVIS após adminis- ® tração intravenosa em camundongos CD-1 IGS (Charles River Labo- ratories; camundongos WT). A expressão da luciferase foi avaliada por imagem IVIS após injeção intraperitoneal de 150 mg/kg de substrato de luciferina nos dias 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35 e 42 e rotineiramente (por exemplo, semanalmente, quinzenalmente ou a cada 10 dias ou a cada 2 semanas), entre os dias 42 e 110 dias. Os resultados são mos- trados na Figura 6. Esta figura é um gráfico que mostra a expressão do transgene da luciferase conforme medido por imagem IVIS por pelo menos 132 dias após 3 protocolos de administração diferentes.
[00543] Foi realizado um estudo de extensão para investigar o efei- to de uma redose, por exemplo, uma readministração de LNP-ceDNA expressando luciferase dos indivíduos tratados com LNP-ceDNA. Em particular, foi avaliado para determinar se os níveis de expressão po- dem ser aumentados por uma ou mais administrações adicionais do vetor de ceDNA.
[00544] Neste estudo, a biodistribuição da expressão de luciferase de um vetor de ceDNA foi avaliada por IVIS em camundongos CD-1® IGS após uma administração intravenosa inicial de 1,0mg/kg (isto é, uma dose de preparação) nos dias 0 e 28 (Grupo A). Uma segunda administração de um vetor de ceDNA foi administrada por injeção ve- nosa da cauda de 3 mg/kg (Grupo B) ou 10 mg/kg (Grupo C) em 1,2 ml na veia da cauda no dia 84. Neste estudo, cinco (5) camundongos
CD-1® foram usados em cada um dos grupos A, B e C. A imagem IVIS dos camundongos para expressão de luciferase foi realizada an- tes da dosagem adicional nos dias 49, 56, 63 e 70 como descrito aci- ma, bem como pós-redose no dia 84 e nos dias 91, 98, 105, 112 e
132. A expressão da luciferase foi avaliada e detectada nos três gru- pos A, B e C até pelo menos 110 dias (o período mais longo avaliado).
[00545] O nível de expressão da luciferase mostrou-se aumentado por uma redose (isto é, readministração da composição de ceDNA) do LNP-ceDNA-Luc, conforme determinado pela avaliação da atividade da luciferase na presença de luciferina. Os resultados são mostrados na Figura 6, que é um gráfico que mostra a expressão do transgene da luciferase conforme medido por imagem IVIS por pelo menos 110 dias após 3 protocolos de administração diferentes (Grupos A, B e C). Os camundongos que não receberam tratamento adicional com redose (dose de preparação de 1mg/kg (isto é, Grupo A) apresentaram ex- pressão estável de luciferase observada durante o período do estudo. Os camundongos do grupo B aos quais foi administrada uma redose de 3 mg/kg do vetor de ceDNA mostraram um aumento de aproxima- damente sete vezes na radiância observada em relação aos camun- dongos do grupo C. Surpreendentemente, os camundongos redosados com 10 mg/kg do vetor de ceDNA tiveram um aumento de 17 vezes na radiância observada da luciferase sobre os camundongos que não re- ceberam nenhuma redose (Grupo A).
[00546] Grupo A mostra a expressão de luciferase em camundon- gos CD-1® IGS após a administração intravenosa de 1 mg/kg de um vetor de ceDNA na veia da cauda nos dias 0 e 28. Grupo B e C mos- tram a expressão de luciferase em camundongos CD-1® IGS adminis- trados com 1 mg/kg de um vector ceDNA em um primeiro momento (dia 0) e redosados com a administração de um vector ceDNA em um segundo momento de 84 dias. Inesperadamente, a segunda adminis-
tração (ou seja, redose) do vetor de ceDNA aumentou a expressão em pelo menos 7 vezes, até 17 vezes.
[00547] Inesperadamente, um aumento de 3 vezes na dose (ou se- ja, a quantidade) do vetor de ceDNA em uma administração de redose no Grupo B (ou seja, 3 mg/kg administrado na redose) resultou em um aumento de 7 vezes na expressão de a luciferase. Também inespera- damente, um aumento de 10 vezes na quantidade de vetor de ceDNA em uma administração de redose (isto é, 10 mg/kg de redose adminis- trada) no Grupo C resultou em um aumento de 17 vezes na expressão da luciferase. Assim, a segunda administração (isto é, redose) do ce- DNA aumentou a expressão em pelo menos 7 vezes, até 17 vezes. Isso mostra que o aumento na expressão de transgene da redose é maior que o esperado e depende da dose ou quantidade do vetor de ceDNA na administração de redose e parece ser sinérgico à expres- são inicial do transgene da administração inicial de preparação no dia
0. Ou seja, o aumento dependente da dose na expressão do transge- ne não é aditivo, pelo contrário, o nível de expressão do transgene é dependente da dose e maior que a soma da quantidade do vetor de ceDNA administrado em cada momento.
[00548] Ambos os grupos B e C mostraram aumento significativo dependente da dose na expressão da luciferase em comparação com camundongos controle (Grupo A) que não foram redosados com um vetor de ceDNA no segundo momento. Tomados em conjunto, esses dados mostram que a expressão de um transgene a partir do vetor de ceDNA pode ser aumentada de maneira dependente da dose pela re- dose (isto é, readministração) do vetor de ceDNA pelo menos um se- gundo momento.
[00549] Tomados em conjunto, estes dados na Figura 6 mostram que o nível de expressão de um transgene a partir de vetores de ceD- NA pode ser mantido em um nível sustentado por pelo menos 84 dias e pode ser aumentado in vivo após uma redose do vetor de ceDNA administrada pelo menos em um segundo momento. EXEMPLO 7: EXPRESSÃO SUSTENTADA DE TRANSGENE IN VIVO DE VETORES DE ceDNA FORMULADOS COM LNP
[00550] A reprodutibilidade dos resultados no Exemplo 6 com uma nanopartícula lipídica diferente foi avaliada in vivo em camundongos. Os camundongos foram doseados no dia 0 com qualquer vetor de ce- DNA compreendendo um transgene de luciferase acionado por um promotor de CAG que foi encapsulado em um LNP diferente do usado no Exemplo 6 ou com o mesmo LNP compreendendo poliC, mas sem ceDNA ou gene da luciferase. Especificamente, os camundongos CD- 1® machos de aproximadamente 4 semanas de idade foram tratados com uma única injeção de 0,5 mg/kg de LNP-TTX-luciferase ou LNP- poliC controle, administrada por via intravenosa via veia da cauda late- ral no dia 0. No dia 14, os animais foram doseados sistemicamente com luciferina a 150 mg/kg por injeção intraperitoneal a 2,5 ml/kg. Aproximadamente 15 minutos após a administração da luciferina, cada animal foi fotografado usando o In Vivo Imaging System ("IVIS").
[00551] Como mostrado na Figura 7, observou-se fluorescência significativa no fígado em todos os quatro camundongos tratados com ceDNA, e muito pouca outra fluorescência foi observada nos animais que não no local da injeção, indicando que o LNP mediou a entrega específica do fígado do construto de ceDNA e que o vetor de ceDNA entregue foi capaz de expressão controlada sustentada de seu trans- gene por pelo menos duas semanas após a administração. EXEMPLO 8: EXPRESSÃO SUSTENTADA DE TRANSGENE NO FÍ- GADO IN VIVO A PARTIR DA ADMINISTRAÇÃO DO VETOR DE CE-
DNA
[00552] Em uma experiência separada, foi avaliada a localização do ceDNA entregue por LNP no fígado dos animais tratados. Um vetor de ceDNA compreendendo um transgene funcional de interesse foi en- capsulado no mesmo LNP usado no Exemplo 7 e administrado a ca- mundongos in vivo a um nível de dose de 0,5 mg/kg por injeção intra- venosa. Após 6 horas, os camundongos foram exterminados e as amostras de fígado foram colhidas, fixadas em formalina e embebidas em parafina usando protocolos padrão. Os ensaios de hibridação in situ do RNAscope® foram realizados para visualizar os vetores de ce- DNA no tecido usando uma sonda específica para o transgene de ce- DNA e detectando usando reação cromogênica e coloração com he- matoxilina (Advanced Cell Diagnostics). A Figura 8 mostra os resulta- dos, que indicam que o ceDNA está presente nos hepatócitos. EXEMPLO 9: EXPRESSÃO DO TRANSGENE OCULAR SUSTENTA-
DA DE CEDNA IN VIVO
[00553] A sustentabilidade da expressão do transgene do vetor de ceDNA em tecidos que não o fígado foi avaliada para determinar a to- lerabilidade e expressão de um vetor de ceDNA após administração ocular in vivo. No dia 0, ratos Sprague Dawley machos de aproxima- damente 9 semanas de idade foram injetados sub-retiniana com 5 µl de qualquer um dos vetores de ceDNA compreendendo um transgene de luciferase formulado com reagente de transfecção jetPEI® (Polyplus) ou DNA de plasmídeo que codifica luciferase formulado com jetPEI®, ambos a uma concentração de 0,25 µg/µl. Quatro ratos foram testados em cada grupo. Os animais foram sedados e injetados sub- retinianos no olho direito com o artigo de teste usando uma agulha de calibre 33. O olho esquerdo de cada animal não foi tratado. Imediata- mente após a injeção, os olhos foram verificados com tomografia de coerência óptica ou imagem de fundo, a fim de confirmar a presença de uma bolha sub-retiniana. Os ratos foram tratados com buprenorfina e pomada antibiótica tópica de acordo com procedimentos padrão.
[00554] Nos dias 7, 14, 21, 28 e 35, os animais de ambos os grupos foram dosados sistemicamente com luciferina recém-produzida a 150 mg/kg por injeção intraperitoneal a 2,5 ml/kg a 5 a 15 minutos após a administração de luciferina, todos os animais foram fotografados usando IVIS enquanto estavam sob anestesia com isoflurano. O fluxo total [p/s] e o fluxo médio (p/s/sr/cm2) em uma região de interesse en- volvendo o olho foram obtidos ao longo de 5 minutos de exposição. Os resultados foram representados graficamente como radiação média de cada grupo de tratamento no olho tratado ("injetado") em relação à ra- diação média de cada grupo de tratamento no olho não tratado ("não injetado") (Figura 9B). A fluorescência significativa foi prontamente detectável nos olhos tratados com vetor de ceDNA, mas muito mais fraca nos olhos tratados com plasmídeo (Figura 9A). Após 35 dias, os ratos injetados com plasmídeo foram exterminados, enquanto o estudo continuou para os ratos tratados com ceDNA, com injeção de luciferina e imagens IVIS nos dias 42, 49, 56, 63, 70 e 99. Os resultados de- monstram que o vetor de ceDNA introduzido em uma única injeção na expressão do transgene mediada pelo olho de rato in vivo e que essa expressão foi mantida em um nível alto pelo menos até 99 dias após a injeção. EXEMPLO 10: DOSAGEM E REDUÇÃO SUSTENTADAS DO VETOR DE CEDNA EM CAMUNDONGOS RAG2.
[00555] Em situações em que um ou mais dos transgenes codifica- dos na cassete de expressão gênica do vetor de ceDNA são expres- sos em um ambiente hospedeiro (por exemplo, célula ou sujeito) em que a proteína expressa é reconhecida como estranha, existe a possi- bilidade de o hospedeiro montar um resposta imune adaptativa que pode resultar em esgotamento indesejado do produto de expressão, que pode ser confundido por falta de expressão. Em alguns casos, is- so pode ocorrer com uma molécula repórter que é heteróloga ao am- biente hospedeiro normal. Por conseguinte, a expressão do transgene do vetor de ceDNA foi avaliada in vivo no modelo de camundongo Rag2 que carece de células B e T e, portanto, não monta uma respos- ta imune adaptativa a proteínas murinas não nativas, como a lucifera- se. Resumidamente, os camundongos knockout para c57bl/6 e Rag2 foram doseados por via intravenosa por injeção nas veias da cauda com 0,5 mg/kg de vetor de ceDNA encapsulado em LNP, expressando luciferase ou um controle poliC no dia 0 e no dia 21, certos camundon- gos foram redosados com o mesmo vetor de ceDNA encapsulado em LNP no mesmo nível de dose. Todos os grupos de teste consistiram em 4 camundongos cada. A imagem IVIS foi realizada após a injeção de luciferina como descrito no Exemplo 9 em intervalos semanais.
[00556] Comparando o fluxo total observado nas análises IVIS, a fluorescência observada nos camundongos do tipo selvagem (uma medida indireta da presença de luciferase expressa) dosados com o vetor LNP-ceDNA-Luc diminuiu gradualmente após o dia 21, enquanto os camundongos Rag2 administraram o mesmo o tratamento apresen- tou expressão sustentada relativamente constante da luciferase ao longo do experimento de 42 dias (Figura 10A). O momento de apro- ximadamente 21 dias da diminuição observada nos camundongos do tipo selvagem corresponde ao momento em que uma resposta imune adaptativa pode esperar ser produzida. A readministração do vetor LNP-ceDNA nos camundongos Rag2 resultou em um aumento acen- tuado na expressão que foi sustentada durante pelo menos 21 dias em que foi rastreada neste estudo (Figura 10B). Os resultados sugerem que a imunidade adaptativa pode desempenhar um papel quando uma proteína não nativa é expressa a partir de um vetor de ceDNA em um hospedeiro, e que as reduções observadas na expressão no período de mais de 20 dias após a administração inicial podem sinalizar uma resposta imune adaptativa confusa à molécula expressa em vez de (ou além de) um declínio na expressão. De notar, espera-se que esta res-
posta seja baixa ao expressar proteínas nativas em um hospedeiro em que se prevê que o hospedeiro reconheça adequadamente as molécu- las expressas como auto e não desenvolva essa resposta imune. EXEMPLO 11: IMPACTO DA EXPRESSÃO ESPECÍFICA DO FÍGADO
E DA MODULAÇÃO DE CPG NA EXPRESSÃO SUSTENTADA
[00557] Como descrito no Exemplo 10, a resposta imune indesejá- vel do hospedeiro pode, em alguns casos, amortecer artificialmente o que seria de outro modo a expressão sustentada de um ou mais transgenes desejados a partir de um vetor de ceDNA introduzido. Du- as abordagens foram adotadas para avaliar o impacto de evitar e/ou amortecer a resposta imune do hospedeiro em potencial na expressão sustentada de um vetor de ceDNA. Primeiro, como o vetor de ceDNA- Luc usado nos exemplos precedentes estava sob o controle de um promotor CAG constitutivo, um construto similar foi feito usando um promotor específico do fígado (hAAT) ou um promotor constitutivo dife- rente (hEF-1) para verificar se evitar a exposição prolongada a células mieloides ou tecido não hepático reduziu quaisquer efeitos imunológi- cos observados. Segundo, algumas das construções de ceDNA- luciferase foram projetadas para reduzir o teor de CpG, um gatilho co- nhecido para a reação imune do hospedeiro. A expressão do gene da luciferase codificada por ceDNA após a administração desses vetores de ceDNA modificados por engenharia e troca de promotor em ca- mundongos foi medida.
[00558] Foram utilizados três vetores de ceDNA diferentes, cada um codificando luciferase como o transgene. O primeiro vetor de ceD- NA tinha um número alto de CpG não metilado (~ 350) e compreendia o promotor CAG constitutivo ("ceDNA CAG"); o segundo tinha um nú- mero moderado de CpG não metilado (~ 60) e compreendia o promo- tor hAAT específico para o fígado ("ceDNA hAAT baixo CpG"); e o ter- ceiro era uma forma metilada da segunda, de modo que não continha
CpG não metilada e também compreendia o promotor hAAT ("ceDNA hAAT Sem CpG"). Os vetores de ceDNA eram idênticos. Os vetores foram preparados como descrito acima.
[00559] Quatro grupos de quatro camundongos CD-1® machos, com aproximadamente 4 semanas de idade, foram tratados com um dos vetores de ceDNA encapsulados em um controle LNP ou poliC. No dia 0, a cada camundongo foi administrada uma única injeção in- travenosa de veia da cauda de 0,5 mg/kg de vetor de ceDNA em um volume de 5 ml/kg. Os pesos corporais foram registrados nos dias -1, - , 1, 2, 3, 7 e semanalmente depois, até os camundongos serem exter- minados. Amostras de sangue total e soro foram coletadas nos dias 0, 1 e 35. A imagem in vivo foi realizada nos dias 7, 14, 21, 28 e 35 e, posteriormente, semanalmente, usando um sistema de imagem in vivo (IVIS). Para a imagem, cada camundongo foi injetado com luciferina a 150 mg/kg via injeção intraperitoneal a 2,5 ml/kg. Após 15 minutos, cada camundongo foi anestesiado e fotografado. Os camundongos foram exterminados no dia 93 e os tecidos terminais foram coletados, incluindo fígado e baço. As medições de citocinas foram realizadas 6 horas após a administração no dia 0.
[00560] Embora todos os camundongos tratados com ceDNA te- nham exibido fluorescência significativa nos dias 7 e 14, a fluorescên- cia diminuiu rapidamente nos camundongos ceDNA CAG após o dia 14 e diminuiu mais gradualmente durante o restante do estudo. Em contraste, o fluxo total para os camundongos tratados com ceDNA hAAT com baixa CpG e sem CpG permaneceu em um nível alto e es- tável (Figura 11). Isso sugeriu que direcionar a entrega do vetor de ceDNA especificamente para o fígado resultou em expressão susten- tada e durável do transgene a partir do vetor por pelo menos 77 dias após uma única injeção. Construções que foram minimizadas com CpG ou completamente ausentes do teor de CpG tinham perfis de ex-
pressão sustentáveis duráveis similares, enquanto o construto promo- tor constitutivo de CpG alto exibia um declínio na expressão ao longo do tempo, sugerindo que a ativação imune do hospedeiro pela introdu- ção do vetor de ceDNA pode desempenhar um papel em qualquer di- minuição expressão observada a partir desse vetor em um sujeito. Es- ses resultados fornecem métodos alternativos de adequar a duração da resposta ao nível desejado, selecionando um promotor restrito a tecidos e/ou alterar o teor de CpG do vetor de ceDNA no caso de uma resposta imune do hospedeiro ser observada - uma resposta potenci- almente específica de transgene.
REFERÊNCIAS
[00561] Todas as publicações e referências, incluindo, entre outras, patentes e pedidos de patentes, citadas neste relatório descritivo e Exemplos, são incorporadas ao presente documento a título de refe- rência em sua totalidade, como se cada publicação ou referência indi- vidual fosse específica e individualmente indicada para ser incorpora- da a título de referência ao presente documento como sendo totalmen- te estabelecido. Qualquer pedido de patente ao qual este pedido rei- vindica prioridade também é incorporado a título de referência ao pre- sente documento, da maneira descrita acima para publicações e refe- rências.

Claims (53)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para regular a expressão de um transgene em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: a. administrar a um sujeito uma quantidade suficiente de um vetor de DNA de extremidade fechada livre de capsídeo (ceDNA) que compreende um cassete de ácido nucleico contendo pelo menos um transgene operacionalmente ligado a um promotor entre repetições terminais invertidas (ITRs) de flanqueamento, para expressar um nível mensurável do transgene, em que o transgene codifica uma proteína desejada para tratar uma doença; e b. titular o vetor de ceDNA administrando ao sujeito pelo menos uma segunda dose do vetor de ceDNA que compreende o pelo menos um transgene entre ITRs de flanqueamento para obter a ex- pressão do transgene da proteína desejada em um nível predetermi- nado por um tempo predeterminado ou para aumentar a expressão do transgene da proteína desejada para um nível predeterminado.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito é avaliado após a etapa (a) para determinar a dose de titulação.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a avaliação é determinar o estado da doença após a etapa (a) ou o nível de proteína desejada expresso no sujeito.
4. Método para regular a expressão de um transgene em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende: a. administrar uma quantidade suficiente de um vetor de DNA (capsDNA) livre de capsídeo que compreende um cassete de ácido nucleico contendo pelo menos um transgene operacionalmente ligado a um promotor entre repetições terminais invertidas (ITRs) de flanqueamento, ao sujeito para expressar um nível mensurável do transgene, em que o transgene codifica uma proteína desejada; e b. administrar ao sujeito pelo menos uma segunda dose do vetor de ceDNA que compreende o pelo menos um transgene entre ITRs de flanqueamento para (i) continuar a expressão da proteína de- sejada em um nível predeterminado por um tempo predeterminado ou (ii) modular a expressão da proteína desejada para um nível predeter- minado.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a segunda administração do vetor de ceDNA não gera uma reação imune suficiente para impedir a obtenção do nível prede- terminado de expressão da proteína desejada.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o vetor de ceDNA é admi- nistrado em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitá- vel.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a segunda administração ocorre em um momento em que o nível da expressão do transgene diminui a partir de um nível desejado.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a segunda administração é pelo menos 90 dias após a primeira administração.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o transgene codifica uma proteína terapêutica e o nível de expressão desejado do transgene é uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína terapêutica.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que existem pelo menos três administrações do vetor de ceDNA e nenhuma das administrações ge- ra uma resposta imune ao vetor de ceDNA que impede a obtenção do nível predeterminado de expressão da proteína desejada.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as administrações são realizadas periodicamente.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a segunda administração é para aumentar o nível de expressão da proteína desejada.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a segunda administração é para prolongar a expressão da proteína desejada em um nível de ex- pressão predeterminado.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a proteína desejada é uma proteína inibidora.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a proteína inibidora é um anticorpo ou proteína de fusão.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a proteína desejada substi- tui uma proteína defeituosa ou uma proteína que não está sendo ex- pressa.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor induzível ou repressível.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o transgene está sob o controle de uma chave reguladora.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o vetor de ceDNA adminis- trado no primeiro, segundo ou qualquer momento subsequente é o mesmo tipo de vetor de ceDNA compreendendo o mesmo transgene ou um transgene modificado.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 194, caracterizado pelo fato de que o segundo vetor de ceD- NA tem um promotor diferente operacionalmente ligado ao mesmo transgene ou um transgene modificado.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que as duas sequências de re- petição terminal invertida (ITRs) são ITRs de AAV.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ITR com- preende um local de resolução funcional terminal e um local de ligação à Rep.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que as ITRs de AAV são ITRs de AAV-2.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que as ITRs de flanqueamento são simétricas ou assimétricas.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que as ITRs de flanqueamento são simétricas ou substancialmente simétricas.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 23, caracterizado pelo fato de que as ITRs de flanqueamento são assimétricas.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 a 26, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs são do tipo selvagem ou em que ambas as ITRs são do tipo selvagem.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que as ITRs de flanqueamento são de diferentes sorotipos virais.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1 a 285, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs compreendem uma sequência selecionada a partir das sequências nas Tabelas 2, 4A, 4B e 5.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 29, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das ITRs é alterada de uma sequência de ITR de AAV de tipo selvagem por uma deleção, adição ou substituição que afeta a conformação tridi- mensional geral da ITR.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 30, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs são derivadas de um sorotipo de AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 31, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs são sintéticas.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 32, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs não são uma ITR do tipo selvagem ou em que ambas as ITRs não são do tipo selvagem.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 33, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição em pelo menos uma das regiões ITR selecionadas dentre A, A', B, B', C, C', D e D'.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 34, caracterizado pelo fato de que a deleção, inserção e/ou substituição resultam na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-laço normalmente formada pelas regiões A, A', B, B', C ou C'.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1 a 34, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que re- sulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-laço nor- malmente formada pelas regiões B e B'.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 36, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que re- sulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-laço nor- malmente formada pelas regiões C e C'.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 37, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição que re- sulta na deleção de parte de uma estrutura de haste-laço normalmente formada pelas regiões B e B' e/ou parte de uma estrutura de haste- laço normalmente formada pelas regiões C e C'.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 38, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs compreendem uma única estrutura de haste-laço na região que nor- malmente compreende uma primeira estrutura de haste-laço formada pelas regiões B e B' e uma segunda haste estrutura formada pelas re- giões C e C'.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 39, caracterizado pelo fato de que uma ou ambas as ITRs compreendem uma haste única e duas alças na região que normal- mente compreende uma primeira estrutura de haste-laço formada pe- las regiões B e B' e uma segunda estrutura de haste-laço formada pe- las regiões C e C'.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 40, caracterizado pelo fato de que ambas as ITRs são altera- das de uma maneira que resulta em uma simetria tridimensional geral quando as ITRs são invertidas uma em relação à outra.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 41, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma sequên- cia nucleotídica heteróloga está sob o controle de pelo menos uma chave reguladora.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracteriza- do pelo fato de que pelo menos uma chave reguladora é selecionada a partir de uma chave reguladora binária, uma chave reguladora de pe- quenas moléculas, uma chave reguladora de código de acesso, uma chave reguladora baseada em ácido nucleico, uma chave reguladora pós-transcricional, uma chave reguladora controlada por radiação ou controlada por ultrassom, chave reguladora mediada por hipóxia, cha- ve reguladora de resposta inflamatória, chave reguladora ativada por cisalhamento e uma chave de destruição.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 43, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem uma doença ou distúrbio selecionado a partir de câncer, doença autoimune, um dis- túrbio neurodegenerativo, hipercolesterolemia, rejeição aguda de ór- gão, esclerose múltipla, osteoporose pós-menopausa, condições da pele, asma ou hemofilia.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de um tumor sólido, sarcoma de tecidos moles, linfoma e leucemia.
46. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a doença autoimune é selecionada a partir de artri- te reumatoide e doença de Crohn.
47. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a condição de pele é selecionada a partir de psorí- ase e dermatite atópica.
48. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza-
do pelo fato de que o distúrbio neurodegenerativo é a doença de Al- zheimer.
49. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que compreende ainda administrar ao sujeito, em um ou mais momentos após o segundo momento, uma dose da composi- ção para aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico em comparação com o nível de expressão da ácido nu- cleico heterólogo obtido após a administração da composição no se- gundo momento ou momento precedente, ou para aumentar o nível de expressão da sequência heteróloga de ácido nucleico para atingir um nível de expressão desejado.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 49, caracterizado pelo fato de que o transgene é um medica- mento genético selecionado a partir de: um ácido nucleico, um inibidor, peptídeo ou polipeptídeo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, proteí- na de fusão, antígeno, antagonista, agonista, molécula de RNAi, etc.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 50, caracterizado pelo fato de que a dose predeterminada da composição administrada no segundo ou em qualquer momento sub- sequente, está em uma quantidade que está entre 2 vezes e 10 vezes a dose da composição administrada no primeiro momento.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 51, caracterizado pelo fato de que a dose predeterminada da composição administrada no segundo ou em qualquer momento sub- sequente, está em uma quantidade que aumenta a expressão do transgene em pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou entre 2 a 15 vezes ou 2 a 20 vezes em compara- ção com a expressão do transgene após administração da composição no primeiro momento.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1 a 52, caracterizado pelo fato de que a dose predeterminada do vetor de ceDNA administrada no segundo momento é determinada usando uma relação dependente da dose para o vetor de ceDNA para atingir o nível de expressão desejado do transgene na célula.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA54188A (fr) * 2018-11-09 2021-09-15 Generation Bio Co Adn à extrémité fermée modifié (cedna) comprenant des répétitions terminales inversées modifiées symétriques
US20230134550A1 (en) * 2020-03-24 2023-05-04 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing gaucher therapeutics
US20230138409A1 (en) * 2020-03-24 2023-05-04 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing factor ix therapeutics
JP2023524010A (ja) * 2020-04-28 2023-06-08 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 高効率遺伝子送達系
CA3177612A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Targeting the human ccr5 locus as a safe harbor for the expression of therapeutic proteins
CN116234917A (zh) 2020-07-27 2023-06-06 安杰瑞姆生物科学公司 Dna分子组合物及其制备方法和使用方法
US20220090130A1 (en) * 2020-08-23 2022-03-24 Bioverativ Therapeutics Inc. MODIFIED BACULOVIRUS SYSTEM FOR IMPROVED PRODUCTION OF CLOSED-ENDED DNA (ceDNA)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003237805A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-27 Cornell Research Foundation, Inc. Use of aav integration efficiency element for mediating site-specific integration of a transcription unit
WO2006130581A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Avigen, Inc. Methods for delivering genes
US9115373B2 (en) * 2007-09-19 2015-08-25 Uniqure Ip B.V. Use of AAV replication machinery for improved protein production
EP2500434A1 (en) * 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
WO2015191508A1 (en) * 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
SG10201913688TA (en) * 2016-03-03 2020-03-30 Univ Massachusetts Closed-ended linear duplex dna for non-viral gene transfer

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