KR20200124250A - 폐쇄-말단 dna (cedna) 벡터를 사용한 이식유전자의 제어된 발현 - Google Patents

폐쇄-말단 dna (cedna) 벡터를 사용한 이식유전자의 제어된 발현 Download PDF

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매튜 쥐. 스탠턴
매트 치오코
마크 디. 안젤리노
로버트 엠. 코틴
필립 사마요아
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Abstract

미리 정의된 시간 동안 미리 결정된 수준 또는 범위에서 이식유전자 발현 수준을 유지 또는 지속시키거나, 세포 또는 대상체에서 이식유전자 발현 수준을 증가시키기 위한 폐쇄-말단 DNA (ceDNA 벡터)를 포함하는 방법 및 작제물이 본원에 제공되고, 여기서 이식유전자 발현 수준은 초기 프라이밍 투여 후 1회 이상의 후속 투여 (예를 들어, 재복용 또는 부스터 투여)로 조절 (예를 들어, 증가)될 수 있다. 초기 프라이밍 투여 후 (예를 들어, 시간 0에) 1회 이상의 투여로 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 이식유전자의 발현 수준을 점진적으로 또는 단계적으로 조절하여 이식유전자의 발현 수준을 원하는 미리 결정된 발현 수준 또는 원하는 발현 수준 범위로 적정 가능하게 함으로써 개체의 요구를 충족시키는 수준으로 이식유전자를 발현시키도록 개체의 수명 전반에 걸쳐 유전자 요법을 개인화하는 방법이 제공된다.

Description

폐쇄-말단 DNA (CEDNA) 벡터를 사용한 이식유전자의 제어된 발현
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 2월 22일에 제출된 미국 가출원 62/633,882, 2018년 2월 22일에 제출된 미국 가출원 62/633,757, 2018년 2월 22일에 제출된 미국 가출원 62/633,795 및 미국 가출원 2018년 10월 17일에 제출된 62/746,762의 35 U.S.C. § 119 (e)에 따른 이익을 주장하며, 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.　2019년 2월 21일에 작성된 상기 ASCII 사본의 이름은 080170-091190-WOPT_SL.txt이며 크기는 116,872 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 대상체 또는 세포에서 이식유전자 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 제어된 발현을 위한 캡시드-무함유 벡터를 포함하는 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 본원에 기재된 기술은 발현 수준이 미리 결정된 시간 동안 원하는 수준으로 유지되거나 하나 이상의 후속 투여(예를 들어, 부스터(booster) 투여 또는 재-복용(re-dose))로 증가될 수 있는 폐쇄-말단 (ceDNA) 벡터를 갖는 캡시드-무함유 DNA 벡터로부터 생체 내 이식유전자의 제어된 발현 방법에 관한 것이다.
유전자 요법은 유전자 돌연변이 또는 유전자 발현 프로파일의 이상(aberration)에 의해 유발된 후천성 질환을 앓고 있는 환자의 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 유전자 요법은 장애, 질환, 악성 종양 등을 초래할 수 있는, 결함 유전자, 또는 비정상적 조절 또는 발현, 예를 들어 저발현(underexpression) 또는 과발현으로 인한 의학적 병태의 치료 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 결함 유전자에 의해 야기된 질환 또는 장애는 환자에게 교정 유전 물질을 전달함으로써, 결함 유전자를 변경 또는 침묵시키거나, 또는 치료 항체를 전달함으로써, 예를 들어 환자 내에서 유전 물질의 치료적 발현을 초래함으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있다.
유전자 요법의 기초는, 예를 들어, 긍정적인 기능 획득 효과, 부정적인 기능 손실 효과, 또는 다른 결과를 초래할 수 있는 활성 유전자 산물 (때로는 이식유전자으로 지칭됨)을 전사 카세트에 공급하는 것이다. 유전자 요법은 또한 다른 요인들에 의해 야기된 질환 또는 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 인간 단일유전인자 장애는 표적 세포로의 정상 유전자의 전달 및 발현에 의해 치료될 수 있다. 환자의 표적 세포에서 교정 유전자의 전달 및 발현은 조작된 바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터의 사용을 포함하여 수많은 방법을 통해 수행될 수 있다. 이용 가능한 많은 바이러스-유래 벡터 (예를 들어, 재조합 레트로바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 등) 중에서, 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)는 유전자 요법에서 다용도 벡터로서 인기를 얻고 있다.
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 파보비리다에(parvoviridae) 패밀리에 속하고 보다 구체적으로 데펜도파보바이러스(dependoparvovirus) 속을 구성한다. AAV로부터 유래된 벡터 (즉, 재조합 AAV (rAVV) 또는 AAV 벡터)는 (i) 근세포 및 뉴런을 포함하는 다양한 비-분열 및 분열 세포 유형을 감염 (형질도입)시킬 수 있고; (ii) 바이러스 구조 유전자가 결여되어 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 반응, 예를 들어 인터페론-매개 반응을 감소시키고; (iii) 야생형 바이러스는 인간에서 비-병리학적인 것으로 간주되고; (iv) 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있는 야생형 AAV와 달리, 복제-결함 AAV 벡터는 rep 유전자가 결여되고 일반적으로 에피솜으로서 지속되므로, 삽입 돌연변이유발 또는 유전독성의 위험을 제한하고; (v) 다른 벡터 시스템과 비교하여, AAV 벡터는 일반적으로 상대적으로 열악한 면역원으로 간주되고 따라서 상당한 면역 반응을 유발하지 않으며 (ii 참조), 따라서 벡터 DNA의 지속성 및 잠재적으로 치료적 이식유전자의 장기간 발현을 얻게 되기 때문에 유전 물질을 전달하는 데 매력적이다.
그러나, AAV 입자를 유전자 전달 벡터로서 사용하는 데에는 몇 가지 주요 결점이 있다. rAAV와 관련된 하나의 주요 단점은 약 4.5 kb의 이종 DNA의 제한된 바이러스 패키징 용량이고 (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010), 그리고 결과적으로, AAV 벡터의 사용은 150,000 Da 미만의 단백질 코딩 능력으로 제한되었다. 두 번째 단점은 개체군에서 야생형 AAV 감염의 유병률로 인해 rAAV 유전자 요법 후보가 환자로부터 벡터를 제거하는 중화 항체의 존재에 대해 스크리닝되어야 한다는 점이다. 세 번째 단점은 초기 치료에서 배제되지 않은 환자에게 재투여를 방지하는 캡시드 면역원성과 관련이 있다. 환자의 면역계는 향후 치료를 배제하는 높은 역가 항-AAV 항체를 생성하는 면역계를 자극하기 위해 "부스터"샷으로서 효과적으로 작용하는 벡터에 반응할 수 있다. 일부 최근 보고는 고용량 상황에서 면역원성에 대한 우려를 나타낸다. 또 다른 주목할 만한 단점은 단일-가닥 AAV DNA가 이종 유전자 발현 전에 이중 가닥 DNA로 전환되어야 하기 때문에 AAV 매개 유전자 발현의 개시가 상대적으로 느리다는 점이다.
또한, 캡시드를 갖는 통상적인 AAV 비리온은 AAV 게놈, rep 유전자 및 cap 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입함으로써 생성된다 (Grimm et al., 1998). 그러나, 이러한 캡시드로 이입된 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 유형을 비효율적으로 형질도입시키는 것으로 밝혀졌고 그리고 캡시드는 또한 면역 반응을 유도한다.
또한, 이식유전자의 전달을 위한 전통적인 유전자 요법 벡터 (예를 들어, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 아데노바이러스, 렌티바이러스 벡터 등)는 전형적으로, 부분적으로 바이러스 단백질에 대한 환자의 면역 반응으로 인해, 환자에게 벡터를 단일 투여하는 것으로 제한된다. 또한, 이식유전자의 지속적인 장기간 발현을 위해, 초기 투여시 높은 역가를 투여하는 것이 전형적으로 요구되며, 이는 유해한 부작용을 초래할 수 있다. 이와 같이, 유전자 요법을 위한 전통적인 바이러스 벡터는 지속적인 장기간 이식유전자 발현의 결핍으로 인해 유용성이 부족하다. 또한, 이러한 바이러스 벡터에 전달하기에 적합한 이식유전자 유전 물질의 범위는 바이러스 캡시드 단백질의 바이러스 패키징 용량 (예를 들어, AAV의 경우 약 4.5kb)에 의해 제한되어, 요법을 위한 보다 큰 이식유전자의 전달이 배제된다. 유전자 요법을 위한 종래의 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터와 관련하여, 환자에 대한 단일 투여 (환자 면역 반응 때문에), 최소 바이러스 패키징 용량 (약 4.5kb)으로 인한 AAV 벡터로의 전달에 적합한 이식유전자 유전 물질의 제한된 범위, 및 느린 AAV-매개 유전자 발현으로 인해 이들의 사용이 제한된다.
또한, 너무 많은 용량의 바이러스 벡터를 사용하는 것에 대한 우려를 제기하는 다수의 보고가 있었다. 대부분의 바이러스 벡터는 또한 AAV에 관해 제기된 면역원성 문제를 겪는다.
따라서, 유전자 요법을 위해 다중 용량의 벡터를 허용하는 기술이 당해 분야에서 필요하다. 또한, 최소 오프-표적 효과를 갖는 유전자 요법 벡터로부터 유전자 발현을 제어하는 방법이 당 업계에 필요하고, 개선된 생산 및/또는 발현 특성을 갖는 제어 가능한 재조합 DNA 벡터에 대한 충족되지 않은 중요한 요구가 남아있다. 또한, 숙련된 의사에 의해 이해되는 바와 같이, 이식유전자의 발현/용량을 적정하는 능력은 대상체의 특정 증상 세트 및/또는 질환의 중증도에 기초하여 유전자 요법 치료를 맞춤화하고 추가로 부작용 또는 독성을 최소화하기 위해 요망된다.
발명의 간단한 설명
본원에 기재된 발명은, 예를 들어, 질환을 치료하기 위해 세포에서 이식유전자의 제어된 발현을 위한 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 캡시드-비함유 DNA 벡터 (본원에서 "폐쇄-말단 DNA 벡터" 또는 "ceDNA 벡터"로도 지칭됨)이다. 특히, 본원에 기재된 기술은 본원에 기재된 벡터를 사용하여 이식유전자의 지속적인 발현, 이식유전자의 장기간 제어된 발현, 이식유전자의 용량-의존적 및/또는 적정 가능한 발현, 및 이식유전자의 반복 투약(dosing) 중 어느 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 이식유전자의 제어된 발현을 위한 캡시드-비함유 폐쇄-말단 DNA (ceDNA) 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 이식유전자 발현 수준을 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 수준으로 유지하거나, 또는 대안적으로, 초기 프라이밍 투여 후 1회 이상의 투여에 의해 이식유전자의 발현을 용량-의존적 방식으로 증가시켜 이식유전자 발현 수준을 재-복용 투여시 ceDNA 벡터의 농도에 기초하여 원하는 발현 수준 또는 원하는 발현 수준 범위로 제어하여 세포 또는 대상체에서 이식유전자의 발현의 제어되고 특이적인 증가를 가능하게 함으로써 개체의 수명 전체에 걸쳐 유전자 요법을 개인화하여 개인의 요구를 충족시키는 수준으로 이식유전자를 발현시킬 수 있게 한다.
따라서, 일부 구현예에서 본원에 개시된 ceDNA 벡터를 재투여하여 (본원에서 "재복용" 또는 "부스터" 투여로도 지칭됨) 이식유전자 발현 수준을 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 수준으로 지속시키거나 이식유전자의 발현 수준을 제1, 또는 이전 ceDNA 벡터 투여로 달성된 이전 발현 수준을 초과하여 증가시킬 수 있으며, 여기서 제2 투여 또는 부스터 투여는 이식유전자의 발현에 영향을 미치는 벡터 자체에 대한 면역 반응을 생성하지 않음으로써 이식유전자의 발현을 방지하는 면역 반응을 생성하지 않거나, 파보바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 바이러스 단백질을 포함하는 바이러스 벡터의 재투여와 비교하여 면역 반응이 적다.
이론에 제한되지 않고, 연구는 통상적인 AAV 바이러스 벡터를 사용한 장기간 이식유전자 발현이 시간이 지남에 따라 약해진다는 것을 보여준다. 통상적인 AAV 벡터를 사용하여 장기간 이식유전자 발현을 보장하는 한 가지 방법은 전통적으로 초기 투여시 전달되는 AAV 벡터의 역가 및 용량을 증가시키는 것이었다. 그러나, AAV 벡터의 역가 또는 용량이 너무 높으면 다양한 부작용이 발생할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 상기 논의된 바와 같이, AAV 바이러스 벡터의 재투여는 전통적으로 면역 반응으로 인해 가능하지 않다. AAV 벡터의 재투여에 대한 면역 반응 유발을 피하는 방법은 전형적으로 임의의 이전 투여에서 투여된 AAV 벡터와 비교하여 상이한 캡시드 구성을 갖는 AAV 벡터의 재투여를 필요로 한다. 그러나, 이러한 전략은 AAV 벡터에 대한 면역 반응 및 잠재적으로 유해한 영향을 유도함으로써 대상체에게 여전히 상당한 위험을 끼칠 수 있다.
본원에서, 본 발명은 폐쇄-말단 DNA (ceDNA) 벡터를 사용한 장기간 발현을 포함하는, 이식유전자의 제어된 발현 방법을 제공한다. 예를 들어, ceDNA 벡터의 반복 또는 재투여에 의해 이식유전자 발현 수준을 증가시키기 위해 ceDNA 벡터가 적정될 수 있음이 본원에서 입증된다. 또한, 이식유전자 발현 수준은 장기간에 걸쳐 유지될 수 있고, 발현 수준의 임의의 감소가 관찰되는 경우, ceDNA 벡터의 재복용 투여가 원하는 수준을 유지하거나 심지어 대상체 및/또는 치료될 질환 또는 장애를 위해 바람직한 경우 이식유전자 발현 수준을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 세포 또는 대상체에서 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현 수준을 유지 및/또는 증가시키기 위해 ceDNA 벡터를 투여하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 발현 수준은 1회 이상의 후속 투여 (예를 들어, 재복용 또는 부스터 투여)로 유지되거나 증가될 수 있다. ceDNA-전달된 이식유전자 발현이 어떤 이유로 감소하는 경우, ceDNA 벡터의 재복용은 이식유전자의 원하는 발현을 원하는 수준으로 재확립하거나 유지할 수 있다. ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자의 발현 수준을 초기 프라이밍 투여 (예를 들어, 시간 0에서) 후 1회 이상의 투여로 점진적으로 또는 단계적으로 증가시켜, 대상체에 의해 요구되는 바와 같이, 이식유전자의 발현 수준을 원하는 발현 수준으로 또는 원하는 발현 수준 범위 내로 조정 (예를 들어, 적정)할 수 있도록 개인화된 유전자 요법을 위한 방법이 또한 본원에 제공된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 ceDNA 벡터 및 방법은 ceDNA 벡터에 의한 이식유전자의 발현 수준의 증가를 적정 또는 실행하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 이식유전자의 발현 수준은 1회 이상의 후속 투여 (예를 들어, 용량-의존적 재복용 또는 부스터 투여)로 용량-의존적 방식으로 적정될 수 있다. 이와 같이, 본원에 개시된 방법은 이식유전자 발현 수준을 미리 결정된 수준으로 유지하거나, 또는 대안적으로, 초기 프라이밍 투여 (예를 들어, 시간 0에서) 후 1회 이상의 투여에 의해 이식유전자의 발현을 용량-의존적 방식으로 증가시켜 이식유전자 발현 수준을 재복용 투여시 ceDNA 벡터의 농도에 기초하여 원하는 발현 수준 또는 원하는 발현 수준 범위로 제어하여 세포 또는 대상체에서 이식유전자의 발현의 제어되고 특이적인 증가를 가능하게 함으로써 개체의 수명 전체에 걸쳐 유전자 요법을 개인화하여 개인의 요구를 충족시키는 수준으로 이식유전자를 발현시킬 수 있게 한다.
따라서, 일부 구현예에서 본원에 개시된 ceDNA 벡터를 재투여하여 (본원에서 "재복용" 또는 "부스터" 투여로도 지칭됨) 이식유전자 발현 수준을 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 수준으로 지속시키거나 이식유전자의 발현 수준을 제1, 또는 이전 ceDNA 벡터 투여로 달성된 이전 발현 수준을 초과하여 증가시킬 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 기술의 일 측면은 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법, 예를 들어, 이식유전자의 발현 수준을 조절하는 방법, 또는 이식유전자 발현 수준의 제어된 증가 방법, 또는 세포 또는 대상체에서 이식유전자 수준의 용량-의존적 발현 방법에서 ceDNA 벡터의 용도에 관한 것이며, 여기서 ceDNA 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 2개의 역 말단 반복 서열 사이에 위치한 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 이식유전자)을 포함하고, 상기 ITR 서열은 이 용어가 본원에 정의된 바와 같이 비대칭 또는 대칭 또는 실질적으로 대칭일 수 있고, 상기 ITR 중 적어도 하나는 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, 선택적으로 이종 핵산 서열은 이식유전자를 인코딩하고, 상기 벡터는 바이러스 캡시드에 있지 않다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 ceDNA 벡터는 공유적으로 폐쇄 말단 (선형, 연속 및 비-캡슐화 구조)을 갖는 상보적 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드-무함유 선형 듀플렉스 DNA 분자이고, 이는 본원에 기재된 바와 같이 프로모터 또는 다른 조절 스위치에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 측면에 있는 2개의 역 말단 반복부 (ITR) 서열을 포함한다. 5' ITR 및 3' ITR은 이 용어가 여기에 정의된 대로, 서로 동일한 대칭 3차원 구성을 가질 수 있거나 (즉, 대칭 또는 실질적으로 대칭), 또는 대안적으로 5' ITR 및 3' ITR은 서로 상이한 3차원 구성 (즉, 비대칭 ITR)을 가질 수 있다. 또한, ITR은 동일하거나 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이들 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록 대칭 3차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다 (즉, 이들은 동일하거나 서로 거울상임). 일부 구현예에서, 하나의 ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 기술의 일부 측면은 이식유전자의 지속 또는 장기 발현, 이식유전자의 용량-의존적 또는 삼중화가능한 발현, 또는 이식유전자의 반복되는 용량을 포함하나 이에 제한되지 않는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 관한 것이며, 여기서 ceDNA 벡터는 다음 중 임의의 것에서 선택된 ITR 서열을 포함한다: (i) 적어도 하나의 WT ITR 및 적어도 하나의 변형된 AAV 역 말단 반복부 (ITR) (예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 모드-ITR 쌍이 서로 상이한 3차원 공간 구성을 갖는 2개의 변형된 ITR (예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR), 또는 (iii) 각각의 WT-ITR이 동일한 3차원 공간 구성을 갖는 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍, 또는 (iv) 각각의 모드-ITR이 동일한 3차원 공간 구성을 갖는 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍 중 어느 것으로부터 선택된 ITR 서열을 포함하는 개선된 항체 또는 융합 단백질 발현 및/또는 생산용 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 진핵 세포에서 생성될 수 있으며, 따라서 곤충 세포에서 원핵생물 DNA 변형 및 박테리아 내독소 오염이 없다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 ceDNA 벡터는 개인화된 유전 의학 접근법, 즉, 농도-의존적 방식으로 재복용 투여에 의해 이식유전자 발현 수준의 증가를 적정하는 것을 가능하게 한다. 이식유전자 발현의 증가는 재복용 투여를 사용하여 용량-의존적, 단계적 방식으로 달성될 수 있고, 따라서 각각의 재복용 투여에 의해 규정된 또는 특정 양만큼 이식유전자의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이는 용량-의존적 방식으로 이식유전자 발현 수준의 제어된 증가를 가능하게 하고, 점진적으로 달성될 수 있다. 따라서, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 또는 6회 초과의 규정된 양의 ceDNA의 재복용이, 매번 규정된 양만큼 이식유전자의 발현 수준을 증가시키거나, 이전 투여로 또는 이 재복용 투여 이전에 달성된 발현 수준보다 더 높은 원하는 수준 또는 원하는 발현 수준 범위를 달성하기 위해 투여될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 숙주에서 이식유전자의 발현을 조절하는 방법: (i) 플랭킹 역 말단 반복부 (ITR) 사이의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 이식유전자를 함유하는 핵산 카세트를 포함하는 충분한 양의 본원에 개시된 ceDNA 벡터를 숙주에게 투여하여 측정 가능한 수준의 이식유전자를 발현시키는 단계로서, 상기 이식유전자는 원하는 단백질을 인코딩하는, 상기 단계; 및 (ii) 플랭킹 ITR 사이에 적어도 하나의 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 적어도 제2 용량의 ceDNA 벡터를 투여하여 (i) 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 수준으로 원하는 단백질의 발현을 지속시키거나 (ii) 원하는 단백질의 발현을 미리 결정된 수준으로 조절하는 단계로서, 상기 ceDNA 벡터의 제2 투여는 원하는 단백질의 발현을 방지하는 면역 반응을 생성하지 않는, 상기 단계.
본원에 기재된 기술의 일 측면은 세포에서 이식유전자의 원하는 발현 수준을 유지하는 방법에서 ceDNA 벡터의 용도에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현을 달성하기 위해 제1 용량의 ceDNA 벡터를 제1 시점에 세포에 투여하는 단계, 및 (b) 또 다른 용량의 동일하거나 상이한 ceDNA 벡터를 제2 시점에 세포에 투여하여 이식유전자의 발현 수준을 원하는 수준으로 증가시키거나, 또는 초기 ceDNA 벡터 투여 후 이식유전자의 발현 수준의 임의의 감소를 보상하는 단계를 포함한다. 이식유전자 발현에서의 이러한 점진적 증가는 대상체에서, 이러한 대상체에 대한 원하는 수준으로 투여량의 적정을 허용한다는 것이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 세포 내 이식유전자의 발현 수준을 유지하는 방법에서 ceDNA 벡터의 사용은 이식유전자를 적어도 42일 동안 원하는 발현 수준으로 발현시킨다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자를 적어도 84일 동안 원하는 발현 수준으로 발현시킨다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자를 적어도 132일 동안 원하는 발현 수준으로 발현시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 세포에서 이식유전자의 발현을 유지하는 방법 및/또는 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법에서 사용된 ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 제2 시점에 투여되고, 제1 시점 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일 또는 60일 내지 90일, 또는 90일 내지 120일, 또는 약 3개월 내지 6개월, 또는 6개월 내지 12개월, 또는 1년 내지 2년, 또는 2년 내지 3년 후에 투여된다.
발현 수준이 시간 경과에 따라 감소된 경우, 단순히 이식유전자 발현 수준을 증가시키기 위한 (예를 들어, 원하는 미리 결정된 수준으로 이식유전자 발현을 지속시키기 위한) ceDNA 벡터의 재복용 투여에 추가하여, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 재투여 방법 및 조성물은 이식유전자의 수준을 용량-의존적 방식으로 증가시킬 수 있으며, 즉, 규정된 양의 ceDNA 벡터의 재복용 투여는 이식유전자의 발현 수준의 규정된 증가를 가져올 수 있다. 다르게 말하면, 그리고 단지 예시의 목적으로 임의의 단위를 사용하면, 재복용 투여에서 ceDNA의 1 단위 용량은 이전 수준으로부터 이식유전자 발현 수준의 10% 증가를 달성할 것이고, cDNA 벡터의 2 단위 용량은 이전 수준으로부터 이식유전자 수준의 20% 증가를 달성할 것이고, ceDNA의 0.5 단위 용량은 이전 수준으로부터 이식유전자 발현 수준의 5% 증가를 달성할 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 세포 또는 대상체에서 이식유전자의 발현 수준을 제어된 방식으로 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이식유전자의 발현 수준은 ceDNA 벡터의 1회 이상의 후속 투여 (예를 들어, 재복용 또는 부스터 투여)로 증가될 수 있다.
본원의 기술의 또 다른 측면은, 예를 들어, 이식유전자의 발현 수준을, 이전 ceDNA 투여로 달성된 이전 발현 수준을 초과하여 증가시키기 위해 세포에서 이식유전자의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 이식유전자의 발현을 달성하기 위한 ceDNA 벡터의 프라이밍 용량을 제1 시점에 세포에 투여하는 단계, 및 (b) 제1 시점에 ceDNA 벡터의 투여 후 달성된 이식유전자의 발현 수준과 비교하여 이식유전자의 발현 수준을 증가시키거나 또는 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위한 ceDNA 벡터의 용량을 제2 시점에 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 모든 측면에서, ceDNA 벡터는 임의의 시점 (예를 들어 제1, 제2, 제3 시점 등)에 투여되고, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여되고, 선택적으로 담체, 예를 들어, 입자, 리포좀 또는 지질 나노입자 (LNP)와 함께 투여될 수 있다. 본원의 모든 측면에서, 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점 중 어느 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다.
본원에 기재된 모든 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법, 예를 들어, 이식유전자의 발현을 유지하는 방법 또는 이식유전자의 발현의 제어된 증가 방법 또는 이식유전자의 용량-의존적 발현 방법, 및/또는 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법에서 사용된 ceDNA 벡터, 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점 중 어느 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여된다.
ceDNA의 1회 초과의 투여가 투여되는 (예를 들어, 제2 또는 임의의 후속 시점에) 일부 구현예에서, 제2 시점 또는 임의의 후속 시점은 제1 시점 또는 이전 시점에 ceDNA 벡터를 투여하고 적어도 10일 또는 10일 내지 30일, 또는 적어도 30일, 또는 30일 내지 60일, 적어도 60일, 또는 60일 내지 90일, 또는 90일 내지 120일, 또는 약 3개월 내지 6개월, 또는 6개월 내지 12개월, 또는 적어도 1년 후이다.
일부 구현예에서, 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 동일한 ceDNA 벡터이고, 대안적인 구현예에서, 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 상이한 ceDNA 벡터, 예를 들어, 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터를 갖는 상이한 ceDNA 벡터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 또는 억제성 프로모터이다. 이식유전자는 또한 본원에 개시된 바와 같이, 조절 스위치의 일부일 수 있다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위해 본원에 기재된 방법에서 사용된 ceDNA 벡터, 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 동일한 ceDNA 벡터이다. 대안적인 구현예에서, 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 상이한 ceDNA 벡터이고, 예를 들어, 비제한적으로, 상기 상이한 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자, 또는 변형된 이식유전자, 또는 상이한 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터를 갖는다. 단지 예시의 목적으로, 제1 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 이식유전자 및 제1 프로모터 또는 조절 스위치를 포함할 수 있고, 제2 또는 후속 시점에 투여된 ceDNA는 동일하거나 변형된 이식유전자 및 제2 프로모터 또는 조절 스위치를 포함할 수 있고, 여기서, 제1 및 제2 프로모터 (또는 조절 스위치)는 상이한 프로모터 또는 상이한 조절 스위치이다. 예시적인 조절 스위치가 본 명세서에 정의된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법, 예를 들어, 이식유전자의 발현을 유지하는 방법, 또는 이식유전자의 발현의 제어된 증가 방법, 또는 이식유전자의 용량-의존적 발현 방법, 및/또는 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법에서 ceDNA 벡터의 사용은 선택적으로, 제2 시점 또는 이전 시점에 ceDNA 벡터의 투여 후 달성된 이식유전자의 발현 수준과 비교하여 이식유전자의 발현 수준을 증가시키거나 원하는 지속된 발현 수준을 유지하기 위해 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위한 추가 용량의 ceDNA 벡터를 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 세포에 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 투여된 조성물은 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위해 본원에 개시된 방법에 유용한 ceDNA 벡터는 치료적 유효량으로 이식유전자의 발현을 허용한다.
일부 구현예에서, 제2 시점, 또는 임의의 후속 시점에 투여되는 ceDNA 벡터의 미리 결정된 용량을 증가시키는 것은 세포 및/또는 대상체에서 이식유전자의 발현 수준을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 제2 시점, 또는 후속 시점에 세포 및/또는 대상체에게 투여되는 ceDNA 벡터의 미리 결정된 용량은 세포 또는 대상체에서 이식유전자의 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 ceDNA 벡터에 대한 용량-의존적 관계를 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여되는 ceDNA 벡터의 미리 결정된 용량은 제1 시점에 투여되는 ceDNA 벡터의 용량의 2배 내지 10배의 양이다. 일부 구현예에서, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여되는 ceDNA 벡터의 미리 결정된 용량은 제1 시점 또는 이전 시점에 ceDNA의 투여 후 달성된 이식유전자의 발현과 비교하여 이식유전자의 발현이 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 2배 내지 15배 또는 2배 내지 20배, 또는 20배 이상 증가하는 양이다. 일부 구현예에서, 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이식유전자의 원하는 발현 수준은 치료적 유효량의 이식유전자이다.
본 발명의 측면은 본원에 기재된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법, 예를 들어, 이식유전자의 발현을 유지하는 방법, 또는 이식유전자의 발현의 제어된 증가 방법, 또는 이식유전자의 용량-의존적 발현 방법, 및/또는 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용되는 ceDNA 벡터를 생성하는 방법에 관한 것이다. 모든 측면에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 캡시드 비함유, 비-바이러스 DNA 벡터 (ceDNA 벡터)는, 제1 5' 역 말단 반복부 (예를 들어 AAV ITR); 이종 핵산 서열; 및 3' ITR (예를 들어 AAV ITR) 순으로 포함하는 폴리뉴클레오티드 발현 작제물 주형을 포함하는 플라스미드 (본원에서 "ceDNA-플라스미드"로 지칭됨)로부터 얻어지며, 여기서 5' ITR 및 3'ITR은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭이거나 대칭 (예를 들어, WT-ITR 또는 변형된 대칭 ITR)일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법 (예를 들어, 이식유전자의 발현 수준 및/또는 이식유전자 발현 수준의 제어된 증가, 또는 용량-의존성 이식유전자 발현 수준을 유지하는 방법)에서 유용한 ceDNA 벡터는 본 개시 내용을 읽은 후 통상의 기술자에게 공지될 다수의 수단에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용된 폴리뉴클레오티드 발현 작제물 주형은 ceDNA-플라스미드(예를 들어, 도 4b 참조), ceDNA-박미드(bacmid) 및/또는 ceDNA-바쿨로바이러스일 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제한 클로닝 부위 (예를 들어, ITR 사이에 작동 가능하게 위치된 서열번호: 123 및/또는 124를 포함하며, 여기서 발현 카세트는 예를 들어 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어 리포터 유전자 및/또는 치료 유전자)가 삽입 될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 대칭 또는 비대칭 ITR (변형된 또는 WT ITR)을 함유하는 폴리뉴클레오티드 주형 (예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바쿨로바이러스)으로부터 생성된다.
허용 숙주 세포에서, 예를 들어, Rep의 존재하에, 적어도 2개의 ITR을 갖는 폴리뉴클레오티드 주형이 복제되어 ceDNA 벡터를 생성한다. ceDNA 벡터 생산은 두 단계, 즉 우선, Rep 단백질을 통한 주형 골격 (예를 들어 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바쿨로바이러스 게놈 등)으로부터 주형의 절제 ("구조") 단계 및 둘째, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계를 거친다. 다양한 AAV 혈청형의 Rep 단백질 및 Rep 결합 부위는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 당업자는 적어도 하나의 기능성 ITR에 기초하여 핵산 서열에 결합하고 이를 복제하는 혈청형으로부터 Rep 단백질을 선택하는 것을 이해한다. 예를 들어, 복제 적격 ITR이 AAV 혈청형 2에서 유래한 경우, 상응하는 Rep는 AAV2 또는 AAV4 Rep를 갖는 AAV2 ITR과 같은 혈청형과 작동하는 AAV 혈청형에서 유래하지만 AAV5 Rep는 그렇지 않다. 복제시, 공유-폐쇄된 말단 ceDNA 벡터는 허용 세포에 계속 축적되고, ceDNA 벡터는 바람직하게는 표준 복제 조건 하에서 Rep 단백질의 존재하에 시간 경과에 따라 충분히 안정적이어서, 예를 들어, 적어도 1 pg/세포, 바람직하게는 적어도 2 pg/세포, 바람직하게는 적어도 3 pg/세포, 보다 바람직하게는 적어도 4 pg/세포, 더욱 더 바람직하게는 적어도 5 pg/세포의 양으로 축적된다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 a) 숙주 세포 내에서 ceDNA 벡터의 생성을 유도하는데 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에서 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는, 폴리뉴클레오티드 발현 작제물 주형 (예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바쿨로바이러스)을 보유하는 숙주 세포 (예를 들어, 곤충 세포)의 개체군을 인큐베이션하는 단계로서, 숙주 세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는, 상기 단계; 및 b) 숙주 세포로부터 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계를 포함하는 본원에 기재된 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법에서 유용한 ceDNA 벡터의 제조 방법에 관한 것이다. Rep 단백질의 존재는 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 생성하기 위해 변형된 ITR로 벡터 폴리뉴클레오티드의 복제를 유도한다. 그러나, 바이러스 입자 (예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, 비리온-적용 크기 제한은 없다.
본원에 기재된 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법에서 유용한 ceDNA 벡터의 존재는 숙주 세포로부터 단리되어 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 숙주 세포로부터 단리된 DNA를 소화시키고 선형 및 비-연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하기 위해 변성 및 비-변성 겔에서 소화된 DNA 물질을 분석함으로써 확인될 수 있다.
본원에 제공된 이 측면 및 다른 모든 측면의 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터로부터 제어된 방식으로 발현된 이식유전자는 치료 이식유전자, 예를 들어, 수용체, 독소, 호르몬, 효소 또는 세포 표면 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 관심 단백질이다. 본원에 제공된 이 측면 및 다른 모든 측면의 또 다른 구현예에서, 관심 단백질은 수용체이다. 본원에 제공된 이 측면 및 다른 모든 측면의 또 다른 구현예에서, 관심 단백질은 효소이다. 표적화될 예시적인 유전자 및 관심 단백질은 본원의 사용 방법 및 치료 방법 섹션에서 상세히 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 출원은 하기 단락 중 임의의 단락에서 정의될 수 있다:
다음을 포함하는 대상체에서 이식유전자의 발현을 조절하는 방법: (a) 측정 가능한 수준의 이식유전자를 발현시키기 위해 플랭킹 역 말단 반복부 (ITR) 사이의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 이식유전자를 함유하는 핵산 카세트를 포함하는 충분한 양의 비-바이러스, 캡시드-비함유 폐쇄-말단 DNA (ceDNA) 벡터를 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 이식유전자는 질환을 치료하기 위해 원하는 단백질을 인코딩하는, 상기 단계; 및 (b) 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 수준으로 원하는 단백질의 이식유전자 발현을 얻거나 원하는 단백질의 이식유전자 발현을 미리 결정된 수준으로 증가시키기 위해 플랭킹 ITR 사이에 적어도 하나의 이식유전자를 포함하는 적어도 제2 용량의 ceDNA 벡터를 대상체에게 투여함으로써 ceDNA 벡터를 적정하는 단계.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 적정 용량을 결정하기 위해 단계 (a) 이후 미리 결정된 시간에, 예를 들어, 단계 (a) 이후 적어도 30일, 또는 적어도 60일, 또는 60일 내지 90일 또는 90일보다 긴 기간에 평가된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 대상체는 단계 (a) 이후 대상체의 질환 상태 및/또는 대상체에서 ceDNA 벡터에 의해 발현된 원하는 단백질의 수준을 결정하기 위해 평가된다. 일부 구현예에서, 질환 상태의 평가는 대상체에서 질환의 적어도 하나의 증상의 평가이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, ceDNA 벡터를 처음 투여할 때 또는 단계 (a) 이전 임의의 시기의 질환 상태와 비교하여, 대상체의 질환 상태가 정상 상태로 유지되거나 개선되지 않았거나 대상체에서 질환 상태가 감소한 경우, 대상체에게 단계 (b)에 따라 제2 용량의 ceDNA 벡터가 투여된다. 임의의 주어진 질환에 대한 질환 상태는 당업자 또는 의사에 의해 결정될 수 있고, 단백질 바이오마커, miRNA 및 mRNA 바이오마커 등을 포함하는, 질환의 하나 이상의 임상 증상 및/또는 바이오마커를 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 이식유전자 발현 수준이 미리 결정된 수준으로부터 감소하거나 치료적 유효량으로부터 감소한 경우, 대상체에게 단계 (b)에 따라 제2 용량의 ceDNA 벡터가 투여된다. 일부 구현예에서, 이식유전자 발현 수준은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 중의 ceDNA 벡터로부터 발현된 이식유전자 수준을 측정 (예를 들어, 단백질 수준 또는 mRNA 수준을 측정)함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈장, 활액, CSF, 타액 또는 조직 생검 샘플로부터 선택된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터가 원하는 단백질 또는 치료 유전자 및 리포터 단백질을 인코딩하는 이식유전자를 발현시키는 경우, 이식유전자 수준은 당업자에게 통상적으로 공지된 방법을 사용하여 생체내에서 ceDNA 벡터로부터 발현된 원하는 리포터 단백질을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 적정은 ceDNA 벡터로부터 발현된 이식유전자의 수준을 결정하고, 제2 용량의 ceDNA 벡터를 대상체에게 투여하여 이식유전자 발현을 미리 결정된 원하는 수준으로 조정 또는 조절하는 것이다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 측면은 다음을 포함하는 대상체에서 이식유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다: (a) 측정 가능한 수준의 이식유전자를 발현시키기 위해 플랭킹 역 말단 반복부 (ITR) 사이의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 이식유전자를 함유하는 핵산 카세트를 포함하는 충분한 양의 비-바이러스 캡시드-비함유 폐쇄-말단 DNA (ceDNA) 벡터를 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 이식유전자는 원하는 단백질을 인코딩하는, 상기 단계; 및 (b) 플랭킹 ITR 사이에 적어도 하나의 이식유전자, 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 적어도 제2 용량의 ceDNA 벡터를 대상체에게 투여하여 (i) 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 수준으로 원하는 단백질의 발현을 지속시키거나 (ii) 원하는 단백질의 발현을 미리 결정된 수준으로 조절하는 단계.
본원의 모든 측면에서, ceDNA 벡터의 대상체로의 제2 투여는 원하는 단백질의 미리 결정된 발현 수준을 얻는 것을 방지하기에 충분한 면역 반응을 생성하지 않는다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 임의의 후속 투여에서 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 제2 투여는 이식유전자의 발현 수준이 원하는 미리 결정된 수준에서 감소할 때이며, 예를 들어, 일부 구현예에서, 제2 투여는 제1 투여 후 적어도 약 30일, 또는 적어도 약 60일, 또는 적어도 약 90일 후이다. ceDNA 벡터의 2회 초과 용량이 대상체에게 투여될 때, 각각의 재복용 (예를 들어, 제3, 제4, 제5, 제6 및 후속 재복용)은 이식유전자의 발현 수준이 이전 투여로부터 달성된 원하는 미리 결정된 수준에서 감소하거나 떨어질 때 투여되고, 예를 들어, 일부 구현예에서, 각각의 재투여는 이전 ceDNA 벡터 투여 후 적어도 약 30일, 또는 적어도 약 60일, 또는 적어도 약 90일 후이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체에게 ceDNA 벡터의 적어도 3회 또는 그 이상의 투여가 실시되는 것을 포함하고, 여기서 ceDNA 벡터의 적어도 3회 투여가 실시되고, 상기 투여 중 어느 것도 원하는 단백질의 미리 결정된 발현 수준의 달성을 방해하는 ceDNA 벡터에 대한 면역 반응을 생성하지 않는다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 예를 들어, 2개월마다, 3개월마다, 6개월마다, 12개월마다, 18개월마다 등과 같이 주기적인 스케줄로 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 제2 투여는 원하는 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것, 예를 들어, 미리 결정된 발현 수준에서 원하는 단백질의 발현을 연장시키는 것이다.
본원의 모든 측면에서, 이식유전자는 치료 단백질을 인코딩하고, 이식유전자의 원하는 발현 수준은 치료 단백질의 치료적 유효량이다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 핵산, 억제제, 펩티드 또는 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질, 항원, 길항제, 작용제, RNAi 분자, 등 중 어느 것으로부터 선택된 유전자 의약품(genetic medicine)이다. 일부 구현예에서, 원하는 단백질 또는 치료 단백질은 억제제 단백질, 예를 들어, 비제한적으로, 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 원하는 단백질 또는 치료 단백질은 결함이 있는 단백질 또는 발현되지 않거나 낮은 수준으로 발현된 단백질을 대체한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 정의된 바와 같이, 조절 스위치의 제어하에 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 유도성 또는 억제성 프로모터인 프로모터를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여되는 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 동일한 유형의 ceDNA 벡터이다. 예를 들어, 다르게 말하면, 동일한 ceDNA 벡터가 대상체에게 여러 번 투여되고, 동일한 혈청형의 바이러스 벡터를 대상체에게 여러 번 투여하는 것과 비교될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여 (예를 들어, 재복용 투여)에서 대상체에게 투여되는 ceDNA 벡터는 조기 시점 또는 투여시 투여된 ceDNA 벡터에서의 프로모터와 비교하여, 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터를 갖는다.
일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에 투여되는 ceDNA 벡터는, AAV ITR이고, 예를 들어, AAV-2, 표 1로부터 선택된 임의의 ITR, 또는 AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ, 및 AAV-DJ8일 수 있는 2개의 역 말단 반복 서열 (ITR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR은 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터에서의 플랭킹 ITR은 본원에 정의된 바와 같이, 대칭이거나 실질적으로 대칭이거나 비대칭이다. 일부 구현예에서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형이거나, 상기 ITR 둘 모두는 야생형이다. 일부 구현예에서, 플랭킹 ITR은 상이한 바이러스 혈청형에서 유래한다. 일부 구현예에서, 플랭킹 ITR가 둘 모두 야생형인 경우, 이들은 표 1에 나타낸 임의의 AAV 혈청형으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터에서의 플랭킹 ITR은 본원의 표 2, 4a, 4b 또는 5의 서열로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터 내 ITR 중 적어도 하나는 ITR의 전체 3차원 입체 형태에 영향을 주는 결실, 첨가 또는 치환에 의해 야생형 AAV ITR 서열로부터 변경된다. 일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터 내 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터 내 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 합성이다. 일부 구현예에서, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형 ITR이 아니거나 ITR 둘 모두 야생형이 아니다.
일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터 내 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 A, A', B, B', C, C', D, 및 D'로부터 선택된 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 결실, 삽입 및/또는 치환은 A, A', B, B' C, 또는 C' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시킨다. 일부 구현예에서, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 C 및 C' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 C 및 C' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 일반적으로 포함하는 영역에서 단일 스템-루프 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 일반적으로 포함하는 영역에서 단일 스템 및 2개의 루프를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터 내의 두 ITR은 모두, 상기 ITR이 서로 반전될 때, 전체적으로 3차원 대칭이 되는 방식으로 변경된다.
일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터는 적어도 하나의 조절 스위치의 제어하에 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 예를 들어, 적어도 하나의 조절 스위치는 이진 조절 스위치, 소분자 조절 스위치, 패스코드(passcode) 조절 스위치, 핵산-기반 조절 스위치, 전사 후 조절 스위치, 방사선-제어 또는 초음파 제어 조절 스위치, 저산소증-매개 조절 스위치, 염증 반응 조절 스위치, 전단-활성화 조절 스위치, 및 사멸 스위치로부터 선택된다. 조절 스위치는 본 명세서에서 아래에 보다 상세하게 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 제1 투여, 또는 제2 투여 또는 그 이후 임의의 후속 투여에서 투여되는 ceDNA 벡터는 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 신경퇴행성 장애, 고콜레스테롤혈증, 급성 기관 거부, 다발성 경화증, 폐경기후 골다공증, 피부 병태, 천식, 또는 혈우병으로부터 선택되는 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 암을 갖는 대상체는 고형 종양, 연조직 육종, 림프종, 및 백혈병을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 예를 들어, 류마티스 관절염 및 크론병으로부터 선택된 자가면역 질환을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 예를 들어, 건선 및 아토피 피부염으로부터 선택된 피부 병태를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 신경퇴행성 장애, 예를 들어, 알츠하이머병, ALS, 파킨슨병, 헌팅턴병을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에, 제2 시점 또는 이전 시점에서 ceDNA 벡터의 투여 후 달성된 이식유전자의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열 (예를 들어, 이식유전자)의 발현 수준을 증가시키거나 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위한 ceDNA 벡터의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 또는 임의의 후속 시점에 대상체에게 투여된 ceDNA 벡터의 미리 결정된 용량은 제1 시점에 투여된 ceDNA 벡터 조성물의 용량의 2배 내지 10배의 양이다. 일부 구현예에서, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터 조성물의 미리 결정된 용량은 제1 시점 또는 이전 투여시 ceDNA 벡터의 투여 후 이식유전자의 발현 수준과 비교하여 이식유전자의 발현이 적어도 3배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 2배 내지 15배 또는 2배 내지 20배 증가하는 양이다. 일부 구현예에서, 제2 투여시, 또는 제2 시점에 투여된 ceDNA 벡터의 미리 결정된 용량은 세포에서 이식유전자의 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 ceDNA 벡터에 대한 용량-의존적 관계를 사용하여 결정된다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 아래에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
위에서 간략하게 요약되고 아래에서 더 상세히 논의되는 본 개시의 구현예는 첨부된 도면에 도시된 본 개시의 예시적인 구현예를 참조하여 이해될 수 있다. 그러나, 첨부된 도면은 본 개시의 전형적인 구현예만을 도시하며, 따라서 본 개시는 다른 동등하게 유효한 구현예를 인정할 수 있기 때문에 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
도 1a는 비대칭 ITR을 포함하는, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이 구현예에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 이식유전자를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위 (R3/R4)에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 역 말단 반복부 (ITR), 즉 발현 카세트의 상류 (5'-말단)의 야생형 AAV2 ITR 및 하류 (3'-말단)의 변형된 ITR에 의해 플랭킹되며, 따라서 발현 카세트 측면에 있는 2개의 ITR은 서로 비대칭이다.
도 1b는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 갖는 비대칭 ITR을 포함하는, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이식유전자를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입될 수 있다. 발현 카세트는 발현 카세트의 상류 (5'-말단)의 변형된 ITR 및 하류 (3'-말단)의 야생형 ITR인, 2개의 역 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된다.
도 1c는 인핸서/프로모터, 이식유전자, 전사 후 요소 (WPRE) 및 폴리 A 신호를 함유하는 발현 카세트를 갖는, 비대칭 ITR을 포함하는 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 이식유전자를 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위 내로의 삽입을 허용한다. 발현 카세트는 서로 비대칭인 2개의 역 말단 반복부 (ITR); 발현 카세트의 상류 (5'-말단)의 변형된 ITR 및 하류 (3'-말단)의 변형된 ITR에 의해 플랭킹되고, 여기서 5' ITR 및 3' ITR은 모두 변형된 ITR이지만 상이한 변형을 갖는다 (즉, 이들은 동일한 변형을 갖지 않는다).
도 1d는 CAG 프로모터, WPRE, 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 대칭 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭 변형된 ITR을 포함하는, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이식유전자를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 상기 발현 카세트는 2개의 변형된 역 말단 반복부 (ITR)의 측면에 있으며, 여기서 5' 변형된 ITR 및 3' 변형된 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1e는 인핸서/프로모터, 이식유전자, 전사 후 요소 (WPRE), 및 폴리A 신호를 함유하는 발현 카세트를 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 대칭 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭 변형된 ITR을 포함하는 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 이식유전자를 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입할 수 있게 한다. 상기 발현 카세트는 2개의 변형된 역 말단 반복부 (ITR)의 측면에 있으며, 여기서 5' 변형된 ITR 및 3' 변형된 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1f는 CAG 프로모터, WPRE, 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 대칭 WT-ITR 또는 실질적으로 대칭 WT-ITR을 포함하는, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이식유전자를 인코딩하는 핵산을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 상기 발현 카세트는 2개의 야생형 역 말단 반복부 (WT-ITR)의 측면에 있으며, 여기서 5' WT-ITR 및 3' WT-ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1g는 인핸서/프로모터, 이식유전자, 전사 후 요소(WPRE) 및 폴리A 신호를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 개시된 바와 같은 대칭 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 이식유전자를 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입할 수 있게 한다. 발현 카세트는 2 개의 야생형 역 말단 반복부 (WT-ITR)에 의해 측면(flanked) 위치하며, 여기서 5' WT-ITR 및 3' WT ITR은 대칭 또는 실질적으로 대칭이다.
도 2a는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위 (RBE 및 RBE')의 확인과 함께 AAV2의 야생형 좌측 ITR (서열 번호: 52)의 T형 스템-루프 구조를 제공하며, 말단 분해 부위 (trs)도 도시된다. RBE는 Rep 78 또는 Rep 68과 상호 작용하는 것으로 여겨지는 일련의 4개의 듀플렉스 사량체를 포함한다. 또한, RBE'는 또한 작제물에서 야생형 ITR 또는 돌연변이된 ITR 상에 조립된 Rep 복합체와 상호 작용하는 것으로 여겨진다. D 및 D' 영역은 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 함유한다. 도 2b는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위 (RBE 및 RBE')의 확인과 함께 AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T형 스템-루프 구조를 포함하는, 야생형 좌측 ITR (서열 번호: 53)에서 제안된 Rep-촉매화된 닉킹 및 결찰 활성을 도시하며, 또한 말단 분해 부위 (trs) 및 여러 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 포함하는 D 및 D' 영역을 보여준다.
도 3a는 A-A' 아암, 및 야생형 좌측 AAV2 ITR (서열 번호: 54)의 C-C' 및 B-B' 아암의 RBE-함유 부분의 1차 구조 (폴리뉴클레오티드 서열) (왼쪽) 및 2차 구조 (오른쪽)를 제공한다. 도 3b는 좌측 ITR에 대한 예시적인 돌연변이된 ITR (또한 변형된 ITR이라고도 지칭됨) 서열을 도시한다. 예시적인 돌연변이된 좌측 ITR (ITR-1, 왼쪽) (서열 번호: 113)의 A-A' 아암, C 아암 및 B-B' 아암의 RBE 부분의 1차 구조 (왼쪽) 및 예측된 2차 구조 (오른쪽)가 도시되어 있다. 도 3c는 A-A' 루프 및 야생형 우측 AAV2 ITR (서열 번호: 55)의 B-B' 및 C-C' 아암의 RBE-함유 부분의 1차 구조 (왼쪽) 및 2차 구조 (오른쪽)를 도시한다. 도 3d는 예시적인 우측 변형된 ITR을 도시한다. 예시적인 돌연변이체 우측 ITR (ITR-1, 오른쪽) (서열 번호: 114)의 A-A' 아암, B-B' 및 C 아암의 일부를 함유하는 RBE의 1차 구조 (왼쪽) 및 예측된 2차 구조 (오른쪽)가 도시된다. 좌우 ITR (예를 들어, AAV2 ITR 또는 다른 바이러스 혈청형 또는 합성 ITR)의 임의의 조합이 본원에 교시된 바와 같이 사용될 수 있다. 도 3a-3d 폴리뉴클레오티드 서열 각각은 본원에 기재된 바와 같이 ceDNA를 생성하는 데 사용된 플라스미드 또는 박미드/바쿨로바이러스 게놈에 사용된 서열을 지칭한다. 또한, 도 3a-3d 각각에는 플라스미드 또는 박미드/바쿨로바이러스 게놈의 ceDNA 벡터 구성 및 예측된 깁스 자유 에너지 값으로부터 추론된 상응하는 ceDNA 2차 구조가 포함된다.
도 4a는 도 4b의 개략도에 기술된 과정에서 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA의 생성에 유용한 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포 (BIIC)를 제조하기 위한 상류 공정을 도시한 개략도이다. 도 4b는 ceDNA 생산의 예시적인 방법의 개략도이고, 도 4c는 ceDNA 벡터 생성을 확인하기 위한 생화학적 방법 및 과정을 도시한다. 도 4d 및 도 4e는 도 4b의 ceDNA 생산 공정 동안 수득된 세포 펠렛으로부터 수거된 DNA에서 ceDNA의 존재를 확인하기 위한 과정을 설명하는 개략도이다. 도 4d는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되지 않은 상태로 유지되거나 소화된 후 미변성 겔 또는 변성 겔 상에서 전기영동을 거친 예시적인 ceDNA에 대한 개략적인 예상 밴드를 보여준다. 가장 왼쪽의 도식은 미변성 겔이며, 다수의 밴드를 보여주는데, 이는 듀플렉스 및 절단되지 않은 형태에서 ceDNA가, 더 빠르게 이동하는 더 작은 단량체 및 더 느리게 이동하는 이량체 (단량체 크기의 2배임)로 보이는, 적어도 단량체 및 이량체 상태로 존재함을 시사한다. 왼쪽에서 두 번째 도식은 ceDNA가 제한 엔도뉴클레아제로 절단될 때, 원래 밴드가 사라지고 절단 후 남은 예상 단편 크기에 상응하는 더 빠르게 이동하는 (예를 들어, 더 작은) 밴드가 나타난다는 것을 보여준다. 변성 조건 하에서, 원래의 듀플렉스 DNA는 단일 가닥이고 상보적 가닥이 공유적으로 연결되어 있기 때문에 미변성 겔에서 관찰된 것보다 2배 큰 종으로 이동한다. 따라서 오른쪽에서 두 번째 도식에서, 소화된 ceDNA는 미변성 겔에서 관찰된 것과 유사한 밴딩 분포를 나타내지만, 밴드는 미변성 겔 대응물 크기의 두 배의 단편으로 이동한다. 가장 오른쪽 도식은 변성 조건 하에서 절단되지 않은 ceDNA가 단일 가닥 개방 원으로 이동하므로 관찰된 밴드는 원이 열리지 않은 미변성 조건 하에서 관찰된 크기의 두 배라는 것을 보여준다. 이 도면에서, "kb"는, 맥락에 따라, 뉴클레오티드 사슬 길이 (예를 들어, 변성 조건에서 관찰된 단일 가닥 분자의 경우) 또는 염기쌍의 수 (예를 들어, 미변성 조건에서 관찰된 이중 가닥 분자의 경우)에 기초한 뉴클레오티드 분자의 상대적인 크기를 나타내기 위해 사용된다. 도 4e는 비-연속 구조를 갖는 DNA를 도시한다. ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 및 변성 조건 모두에서 상이한 크기 (1kb 및 2kb)를 갖는 2개의 DNA 단편을 생성한다. 도 4e는 또한 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA를 도시한다. ceDNA 벡터는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 조건에서 1kb 및 2kb로 이동하는 2개의 DNA 단편을 생성하지만, 변성 조건에서, 스탠드는 연결된 상태로 유지되고 2kb 및 4kb로 이동하는 단일 가닥을 생성한다.
도 5는 엔도뉴클레아제 (ceDNA 작제물 1 및 2에 대해 EcoRI; ceDNA 작제물 3 및 4에 대해 BamH1; ceDNA 작제물 5 및 6에 대해 SpeI; 및 ceDNA 작제물 7 및 8에 대해 XhoI)로 소화된 (+) 또는 소화되지 않은 (-) ceDNA 벡터의 변성 겔 실행 예의 예시적인 사진이다. 작제물 1-8은 국제 출원 PCT PCT/US18/49996의 실시예 1에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 별표로 강조 표시된 밴드의 크기를 결정하고 사진 하단에 제공했다.
도 6은 리포좀을 포함하는 조성물에 존재하는 루시퍼라제를 발현시키는 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위한 재복용 (즉, 부스터 투여)의 효과를 도시하는 그래프이다. 루시퍼라제의 발현은 실시예 6에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 투여한 다음 84일 또는 87일에 ceDNA 벡터로부터 생성된 ceDNA 벡터를 재투여한 후에 측정되었다. 루시퍼라제 발현은 적어도 132일까지 3개의 모든 그룹에서 평가되고 검출되었다 (가장 긴 기간이 평가됨). 도 6은 80일째 또는 약 80일에, 리포좀의 존재하에 1mg/kg ceDNA 벡터 (LNPceDNA)가 투여된 마우스에서 이식유전자의 발현 수준이 약간 감소함을 보여준다. 84일 또는 87일에 리포좀의 존재하에 ceDNA 벡터를 재투여하여 이식유전자 발현을 원하는 미리 결정된 수준으로 지속시키거나 (데이터는 제시되지 않음), ceDNA로부터의 이식유전자 발현 수준을 이전 ceDNA 벡터 투여로부터 달성된 수준을 초과하는 수준까지 증가시킬 수 있다. 여기에는, 3mg/kg LNPceDNA 벡터를 투여함으로써 이전 이식유전자 발현 수준보다 7배의 발현 증가, 또는 10 mg/kg LNPceDNA 벡터 조성물을 투여함으로써 이전 이식유전자 발현 수준보다 17배의 발현 수준 증가를 보여준다.
도 7은 실시예 7에 기재된 실험 결과를 도시하고, LNP-폴리C 대조군으로 처리된 마우스 (왼쪽에서 가장 먼 마우스) 및 LNP-ceDNA-루시퍼라제로 처리된 4마리의 마우스 (왼쪽에서 가장 먼 마우스를 제외한 모든 마우스)로부터 수득된 IVIS 이미지를 분명히 보여준다. 4마리의 ceDNA-처리된 마우스는 마우스의 간-포함 영역에서 상당한 형광을 보여준다.
도 8은 실시예 8에 기재된 실험 결과를 도시한다. 어두운 반점은 발현된 ceDNA 이식유전자로부터 생성된 단백질의 존재를 나타내며, 투여된 LNP-ceDNA와 간세포의 연관성을 입증한다.
도 9a-9b는 실시예 9에 제시된 안구 연구 결과를 도시한다. 도 9a는 JetPEI®-ceDNA-루시퍼라제-주사된 랫트의 눈 (상단 왼쪽) 대 주사되지 않은 동일한 랫트의 눈 (상단 오른쪽) 또는 플라스미드-루시퍼라제 DNA-주사된 랫트의 눈 (하단 왼쪽) 및 주사되지 않은 동일한 랫트의 눈 (하단 오른쪽)으로부터의 대표적인 IVIS 이미지를 보여준다. 도 9b는 각각의 처리 그룹에서 처리된 눈 또는 상응하는 처리되지 않은 눈에서 관찰된 평균 복사휘도(radiance) 그래프를 도시한다. ceDNA-처리된 랫트는 최소 상대 형광 (및 따라서 루시퍼라제 이식유전자 발현)이 관찰되는 플라스미드-루시퍼라제로 처리된 랫트와는 극명하게 대조적으로, 99일에 걸쳐 장기간의 상당한 형광 (및 따라서 루시퍼라제 이식유전자 발현)을 나타냈다.
도 10 및 10b는 실시예 10에 기재된 Rag2 마우스에서의 ceDNA 지속성 및 재투약 연구의 결과를 도시한다. 도 10a는 LNP-ceDNA-Luc-처리된 야생형 c57bl/6 마우스 또는 Rag2 마우스에서 관찰된 시간 경과에 따른 총 플럭스(flux)의 그래프를 도시한다. 도 10b는 Rag2 마우스에서 루시퍼라제 이식유전자의 발현 수준에 대한 재투여의 영향을 도시하는 그래프를 제공하고, 그 결과 재투여 후 안정적인 발현 증가가 관찰된다 (화살표는 재복용 투여 시간을 나타냄).
도 11은 연구 기간 내내 각각의 마우스 그룹에서의 총 플럭스를 보여주는, 실시예 11에 기재된 처리된 마우스에서의 ceDNA 루시퍼라제 발현 연구로부터의 데이터를 제공한다. 높은 수준의 비메틸화된 CpG는 시간이 지남에 따라 마우스에서 관찰된 낮은 총 플럭스와 상관관계가 있는 반면, 간-특이적 프로모터의 사용은 적어도 77일에 걸쳐 ceDNA 벡터로부터의 이식유전자의 오래가는, 안정적인 발현과 상관관계가 있었다.
상세한 설명
이식유전자의 제어된 발현을 위한, 예를 들어, 원하는 시간에 미리 결정된 시간 동안 원하는 이식유전자의 지속적인 발현을 가능하게 하거나, 또는 생체내 또는 시험관내 세포에서 이식유전자 수준의 발현을 조절 (발현 수준 증가 포함)하기 위한 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 신규한 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 이식유전자의 발현 수준은 적어도 1회의 (즉, 1회 이상의) 후속 투여 (예를 들어, 부스터 투여 또는 재복용)로 증가될 수 있다.
본원에 개시된 ceDNA 벡터 및 방법은 숙주 세포 또는 대상체에서 시험관내 및 생체내에서 이식유전자의 발현 수준을 유지할 수 있게 하고, 즉, 초기 투여 이후 시점에 적어도 1회의 재투여 (본원에서 재복용 또는 부스터 투여로도 지칭됨)에 의해 발현을 원하는 수준으로 유지하거나, 발현 수준의 임의의 하락을 중지시킬 수 있게 한다.
본원에 개시된 ceDNA 벡터 및 방법은 시험관내 및 생체내에서 이전 수준으로부터 이식유전자의 발현 수준이 증가할 수 있게 하고, 즉, 초기 투여 이후 시점에 적어도 1회의 재투여 (본원에서 "재복용" 또는 "부스터" 투여로도 지칭됨)에 의해 발현이 원하는 수준으로 또는 원하는 수준을 초과하여 증가하거나 발현 수준이 원하는 발현 범위 내로 증가할 수 있게 한다.
즉, ceDNA에 의해 발현된 이식유전자의 발현은 이전 투여로부터의 수준을 초과하여 증가될 수 있다. 이전 투여가 초기 용량 (즉, 프라이밍 용량)인 경우, 제2 시점에서의 재복용 투여는 이식유전자의 발현 수준을 증가시키는데 사용될 수 있다. 유사하게, 이전 투여가 제2 투여 (즉, 재복용 투여)인 경우, 추가의 재복용 투여는 이식유전자의 발현 수준을 이전 재복용 투여보다 더 높은 수준으로 또는 원하는 발현 수준 또는 범위로 증가시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 기술, 방법 및 ceDNA 벡터는 제어된 방식으로 이식유전자의 발현 수준을 원하는 발현 수준으로 점진적으로 증가시키는데 사용될 수 있다. 이식유전자의 발현 수준의 이러한 단계적이고 점진적인 증가는, 실제로 필요한 용량을 초과하여 높은 초기 용량을 투여해야 할 위험 없이 및/또는 다른 AAV-기반 벡터와 관련된 면역 합병증 없이, 대상체의 필요 및/또는 대상체에서 ceDNA 벡터 및/또는 발현된 이식유전자 (예를 들어, 유전자 의약품)의 효능에 기초하여 이식유전자의 발현 수준을 특정 개체에 맞게 적정할 수 있게 하므로, 대상체의 치료에 유리하다.
정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정의된다. 면역학 및 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 하기에서 찾을 수 있다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6th Edition, published by Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; and Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737) (이들의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).
본원에 사용된 용어 "이종 뉴클레오티드 서열" 및 "이식유전자"은 상호 교환적으로 사용되며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 통합되고 ceDNA 벡터에 의해 전달되고 발현될 수 있는 관심 핵산 (캡시드 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 이외)을 지칭한다. 관심 이식유전자는 폴리펩티드, 바람직하게는 치료 (예를 들어, 의료, 진단 또는 수의학 용도) 또는 면역원성 폴리펩티드 (예를 들어, 백신)를 인코딩하는 핵산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 관심 핵산은 치료 RNA로 전사되는 핵산을 포함한다. 본 발명의 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 이식유전자는 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 앱타머, 펩티드 핵산, siRNA, RNAis, miRNA, lncRNA, 안티센스 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드, 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 발현하거나 인코딩하는 유전자를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이식유전자는 "유전 의학"일 수 있고 억제제, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 침묵 핵산, miRNA, RNAi, 길항제, 작용제, 폴리펩티드, 펩티드, 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질 또는 이의 변이체, 에피토프, 항원, 앱타머, 리보솜 등 중 임의의 것을 포함한다. ceDNA 벡터에서 본원에 사용된 이식유전자는 크기에 제한이 없다.
본원에 개시된 용어 "유전 의학"은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있는 임의의 DNA 구조 또는 핵산 서열과 관련된다.
본원에 사용된 용어 "발현 카세트" 및 "전사 카세트"는 상호 교환적으로 사용되며, 하나 이상의 프로모터 또는 이식유전자의 전사를 지시하기에 충분한 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결되지만, 캡시드-인코딩 서열, 다른 벡터 서열 또는 역 말단 반복 영역을 포함하지 않는 이식유전자를 포함하는 핵산의 선형 스트레치를 지칭한다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스 -작용 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 리프레서), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사 후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 적어도 하나의 최소 요구된 복제 기원 및 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는 임의의 바이러스 말단 반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열 ("RBS") (RBE (Rep-결합 요소)로도 지칭됨) 및 말단 분해 부위 ("TRS")는 함께 "최소 요구된 복제 기원"을 구성하므로 TR은 적어도 하나의 RBS 및 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 주어진 폴리뉴클레오티드 서열의 스트레치 내에서 서로의 역 보체인 TR은 전형적으로 각각 "역 말단 반복부" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스와 관련하여, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 구조(provirus rescue)를 중재한다. 본 발명에서 예기치 않게 발견된 바와 같이, 전장에 걸쳐 역 보체가 아닌 TR은 여전히 ITR의 전통적인 기능을 수행할 수 있으므로, ITR이라는 용어는 본원에서 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 TR을 지칭하는데 사용된다. 복잡한 ceDNA 벡터 구성에서 2개 이상의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비-AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비-AAV ITR로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파보바이러스 및 데펜도바이러스 (예를 들어, 개 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보비리다에 패밀리로부터 유래될 수 있거나, SV40 복제 기원으로 사용되는 SV40 헤어핀을 ITR로 사용할 수 있으며, 이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 파보비리다에 패밀리 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파보비리나에(Parvovirinae), 및 무척추동물을 감염시키는 덴소비리나에(Densovirinae)의 2개의 하위패밀리로 구성된다. 데펜도파보바이러스는 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 척추동물 숙주에서 복제할 수 있는 아데노-관련 바이러스 (AAV)의 바이러스 패밀리를 포함한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일, 이중 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리머를 포함한다. "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA의 약 5개 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그러나, 본 개시의 목적상, 올리고뉴클레오티드의 길이에 대한 상한은 없다. 올리고뉴클레오티드는 또한 "올리고머" 또는 "올리고"로 공지되어 있으며, 유전자로부터 단리되거나, 당 업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은, 기술된 구현예에 적용 가능한, 단일 가닥 (예컨대 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 작제물"은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 말하며, 이는 천연 발생 유전자로부터 단리되거나 또는 달리 자연적으로 존재하지 않거나 합성되는 방식으로 핵산 세그먼트를 함유하도록 변형된다. 핵산 작제물이라는 용어는 핵산 작제물이 본 개시내용의 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 함유할 때 "발현 카세트"라는 용어와 동의어이다. "발현 카세트"는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 코딩 서열을 포함한다.
"하이브리드화 가능" 또는 "상보적" 또는 "실질적으로 상보적"이란 핵산 (예를 들어, RNA)이 적절한 시험관내 및/또는 생체내 조건의 온도 및 용액 이온 강도 하에서 서열 특이적 역평행 방식으로 (즉, 핵산은 상보적인 핵산에 특이적으로 결합함) 또 다른 핵산에 비-공유적으로 결합하거나, 즉 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 및/또는 G/U 염기쌍을 형성하거나, "어닐링"하거나 "하이브리드화"될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함함을 의미한다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 표준 왓슨-크릭 염기쌍은 티미딘 (T)과 쌍을 이루는 아데닌 (A), 우라실 (U)과 쌍을 이루는 아데닌 (A) 및 시토신 (C)과 쌍을 이루는 구아닌 (G)을 포함한다. 또한, 2개의 RNA 분자 (예를 들어, dsRNA) 간의 하이브리드화, 우라실 (U)과 구아닌 (G)의 염기쌍에 대해 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, G/U 염기 짝짓기는 mRNA 내 코돈과 tRNA 항-코돈 염기 짝짓기의 맥락에서 유전자 코드의 축퇴 (즉 , 중복)를 부분적으로 담당한다. 본 개시의 맥락에서, 대상 DNA-표적화 RNA 분자의 단백질-결합 세그먼트 (dsRNA 듀플렉스)의 구아닌 (G)은 우라실 (U)과 상보적인 것으로 간주되고, 그 반대도 마찬가지이다. 이와 같이, G/U 염기쌍이 주어진 뉴클레오티드 위치 대상 DNA-표적화 RNA 분자의 단백질-결합 세그먼트 (dsRNA 듀플렉스)에서 만들어질 수 있는 경우, 위치는 비-상보적인 것으로 간주되지 않고, 대신에 상보적인 것으로 간주된다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 코딩된 및 코딩되지 않은 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는, 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 지칭한다.
특정 RNA 또는 단백질 유전자 산물을 "인코딩"하는 DNA 서열은 특정 RNA 및/또는 단백질로 전사되는 DNA 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되는 RNA (mRNA)를 인코딩할 수 있거나, DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되지 않는 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA 또는 DNA-표적화 RNA; "비-코딩" RNA 또는 "ncRNA"라고도 함)를 인코딩할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "게놈 세이프 하버 유전자" 또는 "세이프 하버 유전자"는 내인성 유전자 활성에 중대한 부정적인 영향 없이 또는 암의 촉진 없이 서열이 예측 가능한 방식으로 통합되고 기능할 수 있도록 (예를 들어, 관심 단백질을 발현하도록) 핵산 서열이 삽입될 수 있는 유전자 또는 유전자좌를 지칭한다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자는 또한 삽입된 핵산 서열이 비-세이프 하버 부위보다 효율적으로 그리고 더 높은 수준으로 발현될 수 있는 유전자좌 또는 유전자이다.
본원에 사용된 용어 "유전자 전달"은 외래 DNA가 유전자 요법 적용을 위해 숙주 세포로 전달되는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 적어도 하나의 최소 요구된 복제 기원 및 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는 임의의 바이러스 말단 반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열 ("RBS") (RBE (Rep-결합 요소)로도 지칭됨) 및 말단 분해 부위 ("TRS")는 함께 "최소 요구된 복제 기원"을 구성하므로 TR은 적어도 하나의 RBS 및 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 주어진 폴리뉴클레오티드 서열의 스트레치 내에서 서로의 역 보체인 TR은 전형적으로 각각 "역 말단 반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스와 관련하여, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 구조를 중재한다. 본 발명에서 예기치 않게 발견된 바와 같이, 전장에 걸쳐 역 보체가 아닌 TR은 여전히 ITR의 전통적인 기능을 수행할 수 있으므로, ITR이라는 용어는 본원에서 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 TR을 지칭하는데 사용된다. 복잡한 ceDNA 벡터 구성에서 2개 이상의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비-AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비-AAV ITR로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파보바이러스 및 데펜도바이러스 (예를 들어, 개 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보비리다에 패밀리로부터 유래될 수 있거나, SV40 복제 기원으로 사용되는 SV40 헤어핀을 ITR로 사용할 수 있으며, 이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 파보비리다에 패밀리 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파보비리나에(Parvovirinae), 및 무척추동물을 감염시키는 덴소비리나에(Densovirinae)의 2개의 하위패밀리로 구성된다. 데펜도파보바이러스는 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 척추동물 숙주에서 복제할 수 있는 아데노-관련 바이러스 (AAV)의 바이러스 패밀리를 포함한다. 본원의 편의를 위해, ceDNA 벡터에서 발현 카세트의 5'에 (상류에) 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터에서 발현 카세트의 3'에 (하류에) 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
"야생형 ITR" 또는 "WT-ITR"은, 예를 들어, Rep 결합 활성 및 Rep 닉킹 능력을 보유하는 AAV 또는 다른 데펜도바이러스에서 천연 발생 ITR 서열의 서열을 지칭한다. 임의의 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR의 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 정규 천연 발생 서열과 약간 다를 수 있으므로, 본원에 사용하기 위해 포함된 WT-ITR 서열은 생성 과정 중에 발생하는 천연 발생 변화 (예를 들어, 복제 오류)의 결과로서 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 대칭인 WT-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍"은 둘 다 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 야생형 ITR인 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 WT-ITR을 지칭한다. 예를 들어, ITR은 변화가 서열의 특성 및 전체 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 한, 정규 천연 발생 서열로부터 벗어난 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 경우에도 야생형 서열로 간주될 수 있다. 일부 측면에서, 변형 뉴클레오티드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 정규 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고 (예를 들어, 디폴트 설정에서 BLAST를 사용하여 측정됨), 또한 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대해 대칭 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 그것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위 (RBE 또는 RBE') 및 말단 분해 부위 (trs)를 갖는 것으로 결정함으로써 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 허용 조건 하에서 이식유전자 발현을 포함하여, 다른 기능을 선택적으로 시험할 수 있다.
본원에 사용된 "변형된 ITR" 또는 "모드-ITR" 또는 "돌연변이 ITR"의 문구는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형으로부터의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 내의 돌연변이를 갖는 ITR을 지칭한다. 돌연변이는 ITR에서 A, C, C', B, B' 영역 중 하나 이상에서의 변화를 초래할 수 있고, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성 (즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)의 변화를 초래할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "비대칭 ITR"은 "비대칭 ITR 쌍"으로도 지칭되고, 전체 길이에 걸쳐 역 보체가 아닌 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 ITR을 본원에서 지칭한다. 두 ITR 사이의 서열 차이는 뉴클레오티드 추가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이에 기인할 수 있다. 한 구현예에서, 하나의 쌍의 ITR은 야생형 AAV 서열이고 다른 하나는 비-야생형 또는 합성 서열일 수 있다. 또 다른 구현예에서, ITR의 쌍은 야생형 AAV 서열이 아니고 2 개의 ITR은 서로 서열이 다르다. 본원의 편의를 위해, ceDNA 벡터에서 5'에서 발현 카세트의 (상류)에 위치한 ITR은 "5'ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터에서 3'에서 발현 카세트의 (하류)에 위치한 ITR은 "3'ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다. 하나의 비제한적인 예로서, 비대칭 ITR 쌍은 3D 구조가 기하학적 공간에서 상이한 형상이 되도록 동족 ITR에 대해 대칭인 3차원 공간 구성을 갖지 않는다. 다르게 말하면, 비대칭 ITR 쌍은 전체적인 기하학적 구조가 다르며, 즉, 3D 공간에서 A, C-C' 및 B-B' 루프의 구성이 다르다 (예를 들어, 하나의 ITR은 동족 ITR과 비교하여 짧은 C-C' 아암 및/또는 짧은 B-B' 아암을 가질 수 있음). 두 ITR 사이의 서열 차이는 하나 이상의 뉴클레오티드 첨가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이에 기인할 수 있다. 일 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍의 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 ITR은 본원에 정의된 변형된 ITR (예를 들어, 비-야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍의 모든 ITR은 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형상 (즉, 상이한 전체 기하학적 구조)을 갖는 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍의 하나의 모드-ITR은 짧은 C-C' 아암을 가질 수 있고 다른 ITR은 상이한 변형 (예를 들어, 단일 아암 또는 짧은 B-B' 아암 등)을 가질 수 있으므로 동족 비대칭 모드-ITR과 비교하여 상이한 3차원 공간 구성을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "대칭 ITR"은 야생형 데펜도바이러스 ITR 서열에 대해 돌연변이되거나 변형되고 전장에 걸쳐 역 보체인 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 ITR을 지칭한다. ITR은 모두 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며 (즉, 돌연변이 ITR이라고도 하는 변형된 ITR임), 뉴클레오티드 첨가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이로 인해 야생형 ITR과 서열상 차이가 있을 수 있다. 본원의 편의를 위해, ceDNA 벡터에서 발현 카세트의 5'에 (상류에) 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터에서 발현 카세트의 3'에 (하류에) 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 대칭인 변형된-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍"은 둘 다 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 변형된-ITR을 지칭한다. 예를 들어, 변형된 ITR은 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 역 보체 서열로부터 벗어난 일부 뉴클레오티드 서열을 가지더라도 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 정규 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고 (디폴트 설정에서 BLAST를 사용하여 측정됨), 또한 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대해 대칭 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 다르게 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된-ITR 쌍은 3D 공간에서 구성된 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 일부 구현예에서, 모드-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있지만 여전히 동일한 대칭 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며 - 즉, 두 ITR은 모두 동일한 전체 3D 형상을 초래하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 모드-ITR 쌍에서 하나의 ITR (예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 ITR (예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있지만, 둘 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로 (예를 들어, 5'ITR이 C 영역에서 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족 변형된 3'ITR은 C' 영역 내 상응하는 위치에서 결실을 가짐) 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러일 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 AAV2 및 AAV6의 조합과 같은 다른 혈청형 (예를 들어 AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12)으로부터 유래할 수 있으며, 하나의 ITR에서의 변형은 다른 혈청형으로부터의 동족 ITR의 상응하는 위치에 반영된다. 일 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 ITR 사이의 뉴클레오티드 서열의 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한 변형된 ITR (모드-ITR)의 쌍을 지칭한다. 비제한적인 예로서, BLAST(기본 지역 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool)) 또는 디폴트 설정의 BLASTN과 같이 당 업계에 잘 알려진 표준 수단에 의해 결정된 정규 모드-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 또한 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 대칭 3차원 공간 구성을 갖는, 모드-ITR. 실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어, 실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍의 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는다면, 동족 모드-ITR은 상응하는 C-C' 루프의 결실을 가지며 또한 동족 모드-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형태로 남은 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.
용어 "플랭킹"은 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적 위치를 지칭한다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B는 A 및 C에 의해 플랭킹된다. 배열 AxBxC에 대해서도 동일하다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열에 선행하거나 후속하지만 플랭킹된 서열에 근접하거나 또는 바로 인접할 필요는 없다. 일 구현예에서, 용어 플랭킹은 선형 듀플렉스 ceDNA 벡터의 각 말단에서의 말단 반복부를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA 게놈"은 적어도 하나의 역 말단 반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 지칭한다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 듀플렉스 폴리뉴클레오티드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 통합된다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA 스페이서 영역"은 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 게놈에서 기능적 요소를 분리하는 개재 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 최적의 기능성을 위해 2개의 기능성 요소를 원하는 거리로 유지한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 예를 들어, 플라스미드 또는 바쿨로바이러스 내에서 ceDNA 게놈의 유전자 안정성을 제공하거나 추가한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 클로닝 부위 등을 위한 편리한 위치를 제공함으로써 ceDNA 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 측면에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드 "폴리링커", 또는 공지된 단백질 (예를 들어, 전사 인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비-오픈 리딩 프레임 서열은, 예를 들어, 말단 분해 부위와 상류 전사 조절 요소 사이에 6mer, 12mer, 18mer, 24mer, 48mer, 86mer, 176mer 등을 삽입하여 시스 - 작용 인자를 분리하도록 ceDNA 게놈에 위치할 수 있다. 유사하게, 스페이서는 폴리아데닐화 신호 서열과 3'-말단 분해 부위 사이에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Rep 결합 부위, "Rep 결합 요소, "RBE" 및 "RBS"는 상호 교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의해 결합될 때 Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 이의 부위-특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있도록 하는 Rep 단백질 (예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 지칭한다. RBS 서열 및 이의 역 보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, AAV2에서 확인된 RBS 서열인, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)를 포함한다. 다른 공지된 AAV RBS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 RBS 서열을 포함하는, 임의의 공지된 RBS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, Rep 단백질의 뉴클레아제 도메인은 듀플렉스 뉴클레오티드 서열 GCTC에 결합하고, 따라서 공지된 2개의 AAV Rep 단백질은 듀플렉스 올리고뉴클레오티드, 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3' (서열 번호: 60)에 직접 결합하고 안정적으로 조립된다고 생각된다. 또한, 가용성 응집된 컨포머 (즉, 정의되지 않은 수의 상호 연관된 Rep 단백질)는 해리되어 Rep 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 결합한다. 각각의 Rep 단백질은 각 가닥에서 질소 염기 및 포스포디에스테르 골격 둘 다와 상호 작용한다. 질소 염기와의 상호 작용은 서열 특이성을 제공하는 반면, 포스포디에스테르 골격과의 상호 작용은 서열에 특이적이지 않거나 덜 특이적이고, 단백질-DNA 복합체를 안정화시킨다.
본원에 사용된 용어 "말단 분해 부위" 및 "TRS"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, Rep가 셀룰러 DNA 중합 효소, 예를 들어, DNA pol 델타 또는 DNA pol 엡실론을 통해 DNA 확장을 위한 기질로 작용하는 3' OH를 생성하는 5' 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하여 영역을 지칭한다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 조정된 결찰 반응에 참여할 수 있다. 일부 구현예에서, TRS는 비-염기쌍을 이루는 티미딘을 최소로 포함한다. 일부 구현예에서, TRS의 닉킹 효율은 RBS로부터 동일한 분자 내에서의 거리에 의해 적어도 부분적으로 제어될 수 있다. 수용체 기질이 상보적 ITR인 경우, 생성된 생성물은 분자내 듀플렉스이다. TRS 서열은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, AAV2에서 확인된 헥사뉴클레오티드 서열인, 5'-GGTTGA-3' (서열 번호: 61)를 포함한다. 다른 공지된 AAV TRS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 TRS 서열 예컨대 AGTT (서열 번호: 62), GGTTGG (서열 번호: 63), AGTTGG (서열 번호: 64), AGTTGA (서열 번호: 65), 및 RRTTRR (서열 번호: 66)과 같은 다른 모티프를 포함하는, 임의의 공지된 TRS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA-플라스미드"는 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 플라스미드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA-박미드"는 이. 콜라이에서 플라스미드로서 증식할 수 있는 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바쿨로바이러스 게놈을 지칭하며, 따라서 바쿨로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA-바쿨로바이러스"는 바쿨로바이러스 게놈 내의 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바쿨로바이러스를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA-바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"는 상호 교환적으로 사용되며, ceDNA-바쿨로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주 세포 (곤충 세포 (예를 들어, Sf9 세포)를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폐쇄-말단 DNA 벡터"는 적어도 하나의 공유적으로 폐쇄된 말단을 갖는 캡시드 비함유 DNA 벡터 (즉, 분자내 듀플렉스)를 지칭하고, 벡터의 적어도 일부는 분자 내 듀플렉스를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"는 상호교환 가능하게 사용되고 적어도 하나의 말단 회문을 포함하는 폐쇄-말단 DNA 벡터를 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA는 2개의 공유적으로 폐쇄된 말단을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같이, "리포터"는 검출 가능한 판독을 제공하는데 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 리포터는 일반적으로 형광, 색 또는 발광과 같은 측정 가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 코딩 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 쉽게 관찰되는 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 일으키고, 루시퍼라제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉매하게 하며, β-갈락토시다제와 같은 효소는 기질을 착색된 생성물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩티드는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리 포스파타제 (AP), 티미딘 키나제 (TK), 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 기타 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제 및 당 업계에 잘 알려진 다른 것들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "이펙터 단백질"은, 예를 들어, 리포터 폴리펩티드로서 또는 보다 적절하게는, 세포를 사멸시키는 폴리펩티드, 예를 들어 독소, 또는 세포를 선택된 제제로의 사멸 또는 이의 결핍에 민감하게 하는 제제로서 검출 가능한 판독을 제공하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이펙터 단백질은 숙주 세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적화하거나 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 이펙터 단백질은 숙주 세포 DNA 서열 (게놈 또는 염색체외 요소에 관계없이)을 표적화하는 제한 엔도뉴클레아제, 세포 생존에 필요한 폴리펩티드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이레이스 억제제, 및 리보뉴클레아제-타입 독소를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 이펙터 단백질의 발현은 또 다른 합성 생물학적 회로의 인자로서 참여하여 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.
전사 조절제는 관심 유전자의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 활성화제 및 억제제를 지칭한다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성화제는 전형적으로 전사 프로모터 인근에 결합하고 전사를 직접 개시하기 위해 RNA 폴리머라제를 동원한다. 억제제는 전사 프로모터에 결합하고 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절제는 이들이 결합하는 위치 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성화제 또는 억제제로서 작용할 수 있다. 전사 조절제 부류의 비제한적인 예는 호메오도메인 단백질, 아연-핑거 단백질, 윙드(winged)-헬릭스 (포크헤드) 단백질 및 류신-지퍼 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "억제 단백질" 또는 "유도 단백질"은 조절 서열 요소에 결합하고 조절 서열 요소에 작동적으로 연결된 서열의 전사를 각각 억제하거나 활성화시키는 단백질이다. 본원에 기술된 바람직한 억제 및 유도 단백질은 적어도 하나의 투입 제제 또는 환경 투입의 존재 또는 부재에 민감하다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은, 예를 들어, 분리 가능한 DNA-결합 및 투입 제제-결합 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 형태의 모듈이다.
본원에 사용된 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당 업계에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 문구 "약제학적으로 허용되는"은 숙주에 투여될 때 독성, 알레르기성 또는 유사한 유해 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 "입력 제제 반응 도메인"은 연결된 DNA 결합 융합 도메인이 그 조건 또는 입력의 존재에 반응하도록 하는 방식으로 조건 또는 입력 제제에 결합하거나 달리 반응하는 전사 인자의 도메인이다. 일 구현예에서, 조건 또는 투입의 존재는 전사 인자의 전사-조절 활성을 변형시키는, 투입 제제 반응 도메인 또는 그것이 융합된 단백질에서 형태적 변화를 초래한다.
"생체내"라는 용어는 유기체, 예컨대 다세포 동물에서 또는 내에서 발생하는 분석 또는 과정을 지칭한다. 본원에 기재된 일부 측면에서, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때 방법 또는 사용이 "생체내"에서 발생한다고 말할 수 있다. "생체외"라는 용어는 다세포 동물 또는 식물의 몸체 외부, 예를 들어, 외식편, 일차 세포 및 세포주를 비롯한 배양 세포, 형질전환 세포주, 및 추출된 조직 또는 특히 혈액 세포를 포함하는 세포의 외부인 온전한 막을 갖는 살아있는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 사용을 지칭한다. "시험관내"라는 용어는 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 분석 및 방법을 지칭하고, 비-세포 시스템, 예컨대 세포 추출물과 같이 세포 또는 세포 시스템을 포함하지 않는 배지에서 프로그램 가능한 합성 생물학적 회로의 도입을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 이종 표적 유전자일 수 있는, 핵산 서열의 전사를 유도함으로써 또 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직-특이적, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 개시 및 전사 속도를 제어하는 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전자 요소, 예컨대 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 측면의 일부 구현예에서, 프로모터는 프로모터 자체의 발현을 조절하는 전사 인자의 발현을 유도하거나 본원에 기재된 합성 생물학적 회로의 또 다른 모듈 성분에 사용되는 또다른 프로모터의 발현을 유도할 수 있다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위 및 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵생물 프로모터는 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 포함하지만, 항상 그런 것은 아니다. 유도성 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터가 본원에 개시된 ceDNA 벡터에서 이식유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에 결합될 수 있고, 배경 이상의 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 (5' 방향)로 연장된다.
본원에 사용된 용어 "인핸서"는 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 활성화제 단백질 또는 전사 인자)에 결합하는 시스-작용 조절 서열 (예를 들어, 50-1,500 염기쌍)을 지칭한다. 인핸서는 이들이 조절하는 유전자 개시 부위의 상류 또는 유전자 개시 부위의 하류에서 최대 1,000,000개의 염기 파스(base pars)에 위치할 수 있다. 인핸서는 인트론 영역 내에 또는 관련되지 않은 유전자의 엑손 영역에 위치할 수 있다.
프로모터는 그것이 조절하는 핵산 서열의 발현 또는 전사를 유도한다고 할 수 있다. "작동 가능하게 연결된", "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어 하" 및 "전사적 제어 하"라는 문구는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하도록 조절하는 올바른 기능적 위치 및/또는 배향에 있음을 나타낸다. 본원에 사용된 "역 프로모터"는 핵산 서열이 역 배향으로 되어, 코딩 가닥이 이제 비-코딩 가닥이 되거나 그 반대인 프로모터를 지칭한다. 역 프로모터 서열은 스위치의 상태를 조절하기 위해 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 또한, 다양일 구현예에서, 프로모터는 인핸서와 함께 사용될 수 있다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 관련된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 인핸서는 그 서열의 하류 또는 상류에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 관련된 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 코딩 핵산 세그먼트는 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 제어 하에 위치되며, 이들 둘 모두는 천연 환경에서 작동 가능하게 연결되는 인코딩된 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종 인핸서는 천연 환경에서 주어진 핵산 서열과 정상적으로 관련되지 않은 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "천연 발생"이 아닌 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있으며, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당 업계에 공지된 유전 공학 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본원에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, PCR을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,202, 미국 특허 번호 5,928,906 참조, 각각 본원에 참고로 포함됨). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
본원에 기재된 바와 같이, "유도성 프로모터"는 유도제 또는 유도 제제의 존재하, 이에 영향을 받거나 이에 의해 접촉될 때 전사 활성을 개시 또는 향상시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 본원에 정의된 "유도제" 또는 "유도 제제"는 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는데 활성이 있는 방식으로 투여되는 내인성, 또는 일반적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도제 또는 유도 제제, 즉, 화학 물질, 화합물 또는 단백질 자체는 핵산 서열의 전사 또는 발현 결과일 수 있으며 (즉, 유도제는 또 다른 성분 또는 모듈에 의해 발현된 유도 단백질일 수 있음), 이는 그 자체로 제어 하에 있거나 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 특정 작용제, 예컨대 억제제의 부재 하에 유도된다. 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린, 메탈로티오닌, 엑디손, 포유동물 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복부 (MMTV-LTR)) 및 다른 스테로이드-반응성 프로모터인, 라파마이신 반응성 프로모터 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "DNA 조절 서열", "제어 요소" 및 "조절 요소"는 전사 및 번역 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결자, 단백질 분해 신호 등을 지칭하고, 비-코딩 서열 (예를 들어, DNA-표적화 RNA) 또는 코딩 서열 (예를 들어, 부위 지향적 변형 폴리펩티드, 또는 Cas9/Csn1 폴리펩티드)의 전사를 제공 및/또는 조절하고/하거나 인코딩된 폴리펩티드의 번역을 조절한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 설명된 구성 요소들이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있는 근접부위(juxtaposition)를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 이의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. "발현 카세트"는 ceDNA 벡터에서 이식유전자의 전사를 지시하기에 충분한 프로모터 또는 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 DNA 서열을 포함한다. 적합한 프로모터는, 예를 들어, 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 프로모터는 또한 AAV 기원일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 예방적 치료를 포함하여, 본 발명에 따른 ceDNA 벡터를 사용한 치료가 제공되는 인간 또는 동물을 지칭한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰구스 원숭이(cynomologous monkey), 거미 원숭이 및 마카크(macaque), 예를 들어 레소스(Rhesus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 설치류에는 마우스, 랫트, 우드척(woodchuck), 흰 족제비, 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 게임 동물에는 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종, 예를 들어, 집고양이, 개과 종, 예를 들어, 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어, 닭, 에뮤, 타조 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 측면의 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 영장류 또는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상체는 유아 또는 소아일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 신생아 또는 태어나지 않은 대상체일 수 있으며, 예를 들어, 대상체는 자궁 내에 있다. 바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예에 제한되지는 않는다. 인간 이외의 포유동물이 질환 및 장애의 동물 모델을 나타내는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 길들여진 동물 및/또는 애완 동물을 위해 사용될 수 있다. 인간 대상체는 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족 그룹, 예를 들어, 코카서스(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 임상 환경의 환자 또는 다른 대상체일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 이미 치료 중이다. 일부 구현예에서, 대상체는 배아, 태아, 신생아, 유아, 소아, 청소년 또는 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 태아, 인간 신생아, 인간 유아, 인간 소아, 인간 청소년 또는 인간 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물 배아, 또는 비인간 배아 또는 비인간 영장류 배아이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 배아이다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 개시내용의 핵산 작제물 또는 ceDNA 발현 벡터에 의한 형질전환, 형질감염, 형질도입 등에 민감한 임의의 세포 유형을 포함한다. 비제한적인 예로서, 숙주 세포는 단리된 1차 세포, 다능성 줄기세포, CD34+ 세포), 유도된 다능성 줄기세포, 또는 임의의 다수의 불멸화 세포주 (예를 들어, HepG2 세포)일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 조직, 기관 또는 유기체 내의 동일계 또는 생체내 세포일 수 있다.
용어 "외인성"은 천연 공급원이 아닌 세포에 존재하는 물질을 지칭한다. 본원에서 사용될 때 용어 "외인성"은 인간의 손을 포함하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템으로 도입된 핵산 (예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산) 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 이는 정상적으로는 발견되지 않으며, 그러한 세포 또는 유기체 내로 핵산 또는 폴리펩티드를 도입하고자 하는 것이다. 대안적으로, "외인성"은 인간의 손을 포함하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템으로 도입된 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 이는 비교적 적은 양으로 발견되고 세포 또는 유기체에서 핵산 또는 폴리펩티드의 양을 증가시키고자 하는 것, 예를 들어, 이소성 발현 또는 수준을 생성하고자 하는 것이다. 대조적으로, 용어 "내인성"은 생물학적 시스템 또는 세포에 자생하는 물질을 지칭한다.
용어 "서열 동일성"은 두 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 지칭한다. 본 개시의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: 유럽 분자 생물학 개방 소프트웨어 스위트, Rice et al., 2000, 상기)의 니들 프로그램, 바람직하게는 버전 3.0.0 이상에서 구현된 바와 같이 니들맨-운쉬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, 상기)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 파라미터는 갭 오픈 페널티(gap open penalty) 10, 갭 연장 페널티(gap extension penalty) 0.5, 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "가장 긴 동일성"으로 표시된 니들의 출력 (-nobrief 옵션을 사용하여 획득)은 백분율 동일성으로 사용되며 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시리보뉴클레오티드.횟수.100)/(정렬의 길이-정렬에서의 총 갭의 수). 정렬의 길이는 바람직하게는 적어도 10개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 25개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 50개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 100개의 뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 용어 "상동성" 또는 "상동"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 표적 염색체 상의 상응하는 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다. 뉴클레오티드 서열 상동성 백분율을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당 업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열이 숙주 세포의 상응하는 천연 또는 편집되지 않은 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상 동일한 경우, 예를 들어 상동성 아암의 핵산 서열 (예를 들어, DNA 서열)은 "상동성"인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 각각 고유 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전 공학에 의해) 천연 발생 핵산 서열 (또는 이의 변이체)에 연결되어 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 키메라 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전 공학에 의해) 변이체 폴리펩티드에 연결되어 융합 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"는 또 다른 DNA 세그먼트, 즉 "삽입물"이 세포에 부착된 세그먼트의 복제를 야기하도록 부착될 수 있는 플라스미드, 박미드, 파지, 바이러스, 비리온 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다. 벡터는 숙주 세포로의 전달 또는 상이한 숙주 세포 사이의 이동을 위해 설계된 핵산 작제물일 수 있다. 본원에 사용된 벡터는 최초 및/또는 최종 형태의 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있지만, 본 개시의 목적상, "벡터"는 일반적으로 그 용어가 본원에 사용된 바와 같이 ceDNA 벡터를 지칭한다. 용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 관련될 때 복제될 수 있고 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전자 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터 또는 재조합 벡터일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 종종 세포에 대해 이종성일 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있고, 따라서 2개의 유기체, 예를 들어 발현을 위한 인간 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵생물 숙주에서 유지될 수 있도록 한다. 용어 "발현"은, 적용 가능한 경우, 예를 들어, 전사, 전사체 프로세싱, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 프로세싱을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, RNA 및 단백질 및 적절한 경우, 분비 단백질을 생산하는데 관여하는 세포 과정을 지칭한다. "발현 산물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 경우 시험관내 또는 생체내에서 (DNA가) RNA로 전사되는 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역의 앞뒤에 있는 영역, 예를 들어, 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 (엑손) 간의 개재 서열 (인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
"재조합 벡터"는 이종 핵산 서열, 또는 생체내에서 발현될 수 있는 "이식유전자"를 포함하는 벡터를 의미한다. 본원에 기술된 벡터는, 일부 구현예에서, 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 에피솜이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 대상체에서 관심 뉴클레오티드를 높은 카피 수의 추가 염색체 DNA로 유지하여 염색체 통합의 잠재적 영향을 제거하는 수단을 제공한다.
본원에 사용된 문구 "유전 질환"은 게놈에서 하나 이상의 이상, 특히 출생시 존재하는 상태에 의해 부분적으로 또는 전적으로, 직접적으로 또는 간접적으로 유발되는 질환을 지칭한다. 이상은 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 이상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 줄 수 있다. 유전 질환은 DMD, 혈우병, 낭포성 섬유증, 헌팅턴 무도병, 가족성 고콜레스테롤혈증 (LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병(Wilson's disease), 선천성 간성 포르피린증, 간 대사의 유전성 장애, 레쉬 니한 증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상 적혈구 빈혈, 지중해빈혈, 색소피부건조증, 판코니 빈혈(Fanconi's anemia), 망막색소변성증, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종 및 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "바이오마커"는 대상체 또는 샘플의 병태 (예를 들어, 질환) 또는 병태의 상태 (예를 들어, 질환 상태)를 식별하는데 사용될 수 있는 임의의 분석 가능한 특성 또는 조성물을 의미한다. 본원에 개시된 일부 예에서, 바이오마커는 발현 특성이 대상체 또는 샘플에서 병태 또는 병태의 상태를 식별하기 위해 사용될 수 있는 유전자일 수 있다. 다른 예에서, 바이오마커는 유전자 산물일 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "바이오마커"는 개체에서 내생적으로 발현되거나 개체로부터의 생물학적 샘플에서 발견되거나 격리된 폴리펩티드를 지칭한다.
"유전자 산물"은 전사체 (예를 들어, mRNA), 핵산 (예를 들어, miRNA), 또는 단백질을 의미한다. 따라서, 존재, 부재 또는 상대량이 대상체 또는 샘플에서 병태 또는 병태의 상태를 식별하는데 사용될 수 있는 바이오마커가 본원에 개시된다. 하나의 특정 예에서, 바이오마커는 대상체에서의 존재 또는 부재가 특정 신경퇴행성 질환을 갖거나 갖지 않거나, 질환 (예를 들어, 신경퇴행성 질환)이 발병할 특정 위험에 있거나, 질환의 특정 단계에 있는 대상체의 특징인 유전자 산물일 수 있다. 또 다른 예에서, 바이오마커는 증가 또는 감소가 특정 질환 상태, 질환이 발병할 특정 위험, 또는 질환의 특정 단계를 나타내는 유전자 산물일 수 있다. 또 다른 예에서, 바이오마커는 다양한 유전자 산물의 그룹일 수 있고, 이의 존재 또는 부재는 특정 질환을 갖거나 갖지 않거나, 질환이 발병할 특정 위험이 있거나, 질환의 특정 단계에 있는 대상체를 나타낸다. 추가의 예에서, 바이오마커는 발현의 증가 및 감소 패턴이 특정 질환 또는 이의 결핍을 특징으로 하는 유전자 산물의 그룹일 수 있다. 또한, 바이오마커는 발현 패턴이 질환의 존재 또는 부재, 또는 질환의 특정 예후 또는 결과의 특징인 유전자 산물 또는 유전자 산물의 그룹일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 바이오마커는 다른 임상 시험에 대한 대용물이 될 수 있다. 본원에서 식별된 바이오마커는 수준, 발현, 활성을 결정하거나 변이체를 검출하기 위해 측정될 수 있다. 발현 수준 또는 활성 수준의 검출이 논의될 때 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이, 이는 주어진 바이오마커의 변이체를 반영할 수 있는 것으로 이해된다. 변이체는 아미노산 또는 핵산 변이체 또는 번역 후 변형된 변이체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터의 세포 또는 세포 집단 또는 다량의 조직 또는 유체를 지칭한다. 가장 흔히, 샘플은 대상체로부터 제거되었지만, "생물학적 샘플"이라는 용어는 생체내에서, 즉 대상체로부터 제거되지 않고 분석된 세포 또는 조직을 지칭할 수도 있다. 종종, "생물학적 샘플"은 대상체로부터의 세포를 함유할 것이지만, 이 용어는 또한 유전자 발현 또는 단백질 발현 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있는 비-세포 생물학적 물질, 예컨대 혈액, 타액 또는 소변의 비-세포 분획을 지칭할 수도 있다. 생물학적 샘플은 조직 생검, 스크레이프(scrape) (예를 들어, 협측 스크레이프), 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 세포 배양물 또는 뇌척수액을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 생물학적 샘플은 또한 조직 생검, 세포 배양물을 포함한다. 생물학적 샘플 또는 조직 샘플은, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 종양 생검, 소변, 대변, 가래, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 피부의 외부 섹션, 기도, 장관 및 비뇨생식관, 눈물, 타액, 우유, 세포 (혈액 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않음), 종양, 장기, 및 또한 시험관내 세포 배양 성분의 샘플을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 개체로부터 단리된 조직 또는 유체 샘플을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 원발성 또는 전이성 종양의 절제, 기관지경 생검, 또는 중심부 바늘 생검, 또는 흉수로부터의 셀블럭(cellblock)으로부터의 것이다. 또한, 미세 바늘 흡인물 샘플이 사용된다. 샘플은 파라핀-포매 또는 동결 조직일 수 있다. 샘플은 대상체로부터 세포 샘플을 제거함으로써 수득될 수 있지만, 이전에 단리된 세포 (예를 들어, 또 다른 사람에 의해 단리된 세포)를 사용하거나 생체내에서 ceDNA 벡터로부터 이식유전자 발현 수준의 분석을 수행함으로써 또한 달성될 수 있다. 생물학적 샘플은 또한, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 종양 생검, 소변, 대변, 가래, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 피부의 외부 섹션, 기도, 장관 및 비뇨생식관, 눈물, 타액, 우유, 세포 (혈액 세포를 포함하지만 이에 국한되지 않음), 종양, 장기, 및 또한 시험관내 세포 배양 성분의 샘플을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 개체로부터 단리된 조직 또는 유체 샘플을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 제조될 수 있고, 예를 들어 생물학적 샘플은 신선하거나, 고정되거나, 동결되거나 파라핀에 포매될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "혈액 샘플" 또는 "혈액"은 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 전혈 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플로 추가로 처리된다. 이 용어는 또한 상기-언급된 샘플의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "억제제"는 단백질 생물학적 활성의 억제를 초래하는 임의의 제제 또는 실체를 지칭한다. 유전자의 활성 수준과 관련하여 사용된 "감소" 또는 "억제"는 세포, 세포 추출물, 또는 세포 상청액에서의 단백질 또는 핵산 수준 또는 생물학적 활성의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 이러한 억제는 폴리펩티드의 이의 내인성 리간드와의 결합 감소, 또는 표적 리간드 등에 대한 촉매 활성 또는 친화성을 감소시키기 위한 억제제의 폴리펩티드와의 비-완전한 결합, 또는 대안적으로 감소된 RNA 안정성, 전사, 또는 번역, 증가된 단백질 분해, 또는 RNA 간섭으로 인한 것일 수 있다. 바람직하게는, 감소는 제어 조건하에 발현 또는 활성 수준의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 또는 심지어 적어도 약 90%이다. 토포이소머라제 I 단백질 또는 이의 변이체의 활성의 억제와 관련하여 본원에 사용된 용어 "억제하는"은 반드시 발현 및/또는 활성의 완전한 억제를 의미하는 것은 아니다. 오히려, 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성은 원하는 효과를 생성하기에 충분한 정도로 및/또는 시간 동안 억제된다.
용어 "낮추다", "감소된", "감소" 또는 "감소하다" 또는 "억제하다"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼 감소하는 것을 의미하기 위해 본 명세서에서 일반적으로 사용된다. 그러나, 의심을 피하기 위해, "낮추다", "감소된", "감소" 또는 "감소하다" 또는 "억제하다"는 기준 수준과 비교하여 적어도 10% 감소, 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 감소 또는 최대 100% 감소 (즉 기준 샘플과 비교하여 없는 수준), 또는 기준 수준과 비교하여 10-100% 사이의 임의의 감소를 의미한다.
용어 "증가된", "증가하다" 또는 "향상시키다" 또는 "더 높은"은 모두 통계적으로 유의한 양만큼 증가하는 것을 의미하기 위해 본 명세서에서 일반적으로 사용되고; 어떠한 의심도 피하기 위해, 용어 "증가된", "증가하다" 또는 "향상시키다" 또는 "더 높은"은 기준 수준과 비교하여 적어도 10% 증가, 예를 들어 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 증가 또는 최대 100% 증가 또는 기준 수준과 비교하여 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 기준 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 이상의 임의의 증가를 의미한다.
유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성에서 "증가"는 세포, 세포 추출물, 또는 세포 상청액에서 단백질 또는 폴리펩티드 또는 핵산 수준 또는 활성의 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 이러한 증가는 증가된 RNA 안정성, 전사 또는 번역, 또는 감소된 단백질 분해에 기인할 수 있다. 바람직하게는, 이 증가는 제어 조건하에 발현 또는 활성 수준보다 적어도 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 100%, 적어도 약 200%, 또는 심지어 약 500% 이상이다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 방법 또는 조성물에 필수적인 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)을 언급하는데 사용되지만, 필수적인지 여부에 관계없이, 특정되지 않은 요소의 포함에도 개방적이다.
본원에 사용된 용어 "본질적으로 구성되는"은 주어진 구현예에 필요한 요소들을 지칭한다. 상기 용어는 그 구현예의 기본 및 신규 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. "포함하는"의 사용은 제한이 아니라 포함을 나타낸다.
"구성되는"이라는 용어는 구현예의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 배제한, 본원에 기재된 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성 요소를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "본질적으로 구성되는"은 주어진 구현예에 필요한 요소를 지칭한다. 이 용어는 본 발명의 구현예의 기본적이고 신규하거나 기능적인 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 하나 이상의 방법, 및/또는 여기에 설명된 유형의 단계를 포함하고/하거나 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 유사하게, 용어 "또는"은 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 후술된다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 예컨대(Latin exempli gratia)로부터 유래되며, 비제한적인 예를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어(e.g.)"는 "예를 들어(for example)"라는 용어와 동의어이다.
작동 실시예 이외의, 또는 달리 지시된 경우에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 "약"이라는 용어는 ±1%를 의미할 수 있다. 이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 추가로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이것에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹핑은 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 발견된 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹의 하나 이상의 구성원이 그룹에 포함되거나 그룹에서 삭제될 수 있다. 그러한 포함 또는 삭제가 발생할 때, 본 명세서는 본원에서 수정된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠시 그룹의 서면 설명을 충족시킨다.
임의의 측면의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 개시내용은 인간을 클로닝하는 과정, 인간의 생식선 유전자 동일성을 변형시키는 공정, 산업 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용 또는 사람이나 동물에게 어떠한 실질적인 의학적 이익 없이 고통을 유발할 수 있는 동물의 유전적 정체성을 변경시키는 과정, 및 그러한 과정으로 얻어진 동물에 관한 것이 아니다.
다른 용어는 본 발명의 다양한 측면의 설명 내에서 본원에 정의된다.
문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계류중인 특허 출원을 포함하고; 본원 전체에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 기타 출판물은, 예를 들어, 본원에 설명된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 그러한 공보에 기술된 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 명백히 본원에 참고로 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 공개만을 위해 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 발명자가 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시를 앞당길 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 문서의 날짜 또는 내용에 대한 표현에 관한 모든 진술은 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며 이 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 입장을 의미하지 않는다.
본 개시의 구현예의 설명은 완전하거나 본 개시내용을 개시된 정확한 형태로 제한하려는 것이 아니다. 본 개시의 특정 구현예 및 본 개시에 대한 예가 예시적인 목적으로 본 명세서에 기술되었지만, 관련 기술 분야의 숙련가들이 인식할 수 있는 바와 같이, 본 개시의 범위 내에서 다양한 등가의 변형들이 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되지만, 대안적인 구현예가 다른 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 다른 절차 또는 방법에 적절하게 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 구현예는 추가 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 개시의 측면은, 필요하다면, 본 개시의 추가 구현예를 제공하기 위해 상기 참조 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 사용하도록 변형될 수 있다. 또한, 생물학적 기능적 동등성 고려 사항으로 인해, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에서 약간의 변화가 이루어질 수 있다. 상세한 설명에 비추어 본 개시내용에 대한 이들 및 다른 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
임의의 전술한 구현예의 특정 요소는 조합되거나 다른 구현예의 요소를 대체할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 특정 구현예와 관련된 이점이 이들 구현예의 맥락에서 설명되었지만, 다른 구현예도 그러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 구현예가 본 개시내용의 범위 내에 있도록 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요는 없다.
본원에 기재된 기술은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 결코 추가로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정의된다.
I. ceDNA 벡터를 사용한 이식유전자의 제어된 발현 방법
(i) 미리 결정된 기간 동안 이식유전자 수준의 지속적인 발현을 가능하게 하거나 (즉, 이식유전자의 발현 수준 유지), 또는 (ii) 이식유전자의 발현 수준을 용량-의존적 방식으로 증가시킬 수 있게 하는 생체내 또는 시험관내 ceDNA 벡터의 투여 방법이 본원에 기재되어 있으며, 상기 방법은 ceDNA 벡터의 적어도 1회 (예를 들어, 1회 이상의) 후속 투여(예를 들어, "부스터" 또는 "재-복용" 투여)를 포함한다.
따라서, 본원에 기재된 기술은 생체내 ceDNA 벡터의 투여에 관한 것이며, 여기서 이식유전자 발현 수준은 1회 이상의 후속 투여 (예를 들어, 부스터 투여, 또는 재-복용)로 원하는 수준으로 유지되거나 수준이 증가된다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 시험관내 및 생체내에서 이전 수준으로부터 이식유전자 발현 수준의 증가를 가능하게 한다. 이식유전자 수준의 증가는 초기 투여 후 임의의 시점에 적어도 1회의 재투여 (본원에서 "재-복용"으로도 지칭됨)에 의해 원하는 수준으로 또는 그 이상, 또는 원하는 발현 범위 내로 발현 수준을 증가시키는 것일 수 있다. 일부 경우에, 원하는 증가는 최종 용량이 이전에 원하는 수준, 예를 들어, 지속 용량 수준으로 복귀하도록 이들 수준에서 자연 발생적 감소를 교정하는 것이다. ceDNA 벡터가 숙주 면역 반응을 유발하는 캡시드를 갖지 않기 때문에 (예를 들어, 벡터는 비-면역원성 특성을 가지므로) 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 이러한 재복용 투여 또는 반복 용량은 이식유전자 발현 수준을 증가시키는데 사용될 수 있음이 가능하고, 따라서 재-복용이 이전 AAV 노출, 또는 예를 들어 초기 AAV 벡터 투여로 인한 숙주에서의 면역 반응 또는 AAV 면역으로 인해 가능하지 않은 기존 AAV 벡터 기술에 비해 상당한 이점을 제공한다. 따라서, rAAV 벡터를 사용하여 높은 수준의 발현을 달성하기 위해, 전형적으로 초기 고용량이 필요하고, 면역 반응 문제로 인해 재복용이 가능하지 않고/않거나 효과적이지 않다. 대조적으로, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 1회 이상의 재복용 투여는 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해, 예를 들어, 발현 수준을 원하는 발현 수준으로, 또는 원하는 역치 수준 이상으로 또는 원하는 발현 수준 범위 내로 증가시키기 위해 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 (i) 하나 이상의 시점에 ceDNA 벡터의 재투여에 의해 미리 결정된 시간 동안 이식유전자 발현 수준을 원하는 수준으로 유지하거나 지속시키는 것, (ii) 하나 이상의 시점에 ceDNA 벡터의 재투여에 의해 이식유전자 발현 수준을 증가시키는 것 또는 (iii) 용량-의존적 방식으로 ceDNA 벡터의 투여에 의한 용량-의존적 이식유전자 발현 (즉, 이식유전자의 적정 가능한 발현) 중 어느 것을 위한 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법 및 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 논의된 바와 같이, cDNA 벡터는, 다른 바이러스 벡터와 비교하여, ceDNA 벡터가, 예를 들어, 짧은 기간 동안 (예를 들어, 몇 개월), 또는 긴 기간 동안 (예를 들어, 몇 년 동안) 대상체에게 여러 번 투여되어 이식유전자의 발현이 제어될 수 있게 함으로써 대상체의 필요에 따라 유전자 요법을 맞춤화하거나 조정될 수 있게 한다는 점에서 특별하다.
A. 이식유전자로부터의 증가된 또는 용량-의존적 제어된 발현
(i) 제어된 이식유전자 발현: ceDNA 벡터의 재투여에 의한 지속적인 이식유전자 발현
본원에 기재된 기술의 일 측면은 세포에서 이식유전자의 발현 수준을 유지하거나 지속시키는 방법에서 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 용도에 관한 것이고, 상기 방법은 (a) 이식유전자의 발현을 달성하기 위해 ceDNA 벡터의 프라이밍 용량을 제1 시점에 세포에 투여하는 단계, 및 (b) 제1 시점에 ceDNA 벡터의 투여 후 이식유전자의 발현 수준의 임의의 감소를 보상하기 위한 ceDNA 벡터의 용량을 제2 시점에 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
도 6에 도시된 바와 같이, ceDNA에 의해 발현된 이식유전자의 발현 수준은 적어도 42일, 또는 적어도 60일 또는 적어도 80일 동안 달성되고 지속 (즉, 유지)될 수 있고, 초기 프라이밍 투여 (예를 들어, 시간 0에서) 후 제2 또는 그 이상의 후속 시점에 재복용 투여로 요구되는 미리 결정된 발현 수준으로 증가될 수 있다. 도 6은 또한, ceDNA에 의해 발현된 이식유전자의 발현 수준이 적어도 42일, 또는 적어도 60일 동안 달성되고 지속될 수 있고, 초기 프라이밍 투여 (예를 들어, 시간 0에서) 후 제2 또는 그 이상의 후속 시점에서 규정된 양의 ceDNA 벡터를 포함하는 재복용 투여로 용량-의존적 방식으로 증가될 수 있음을 입증한다.
이식유전자의 발현은 전형적으로 재복용 투여 후 약 7-20일 이내에 발생하고, 제2 용량의 투여 (즉, 재복용, 또는 제2 또는 후속 시점에 투여) 후 적어도 약 30일, 또는 약 60일, 또는 약 90일, 또는 약 120일 또는 120일 이상 동안 재복용 투여 후부터 이식유전자의 발현 수준을 유지한다 (즉, 발현이 지속된다).
본원에 기재된 기술의 또 다른 측면은 대상체에서 질환을 치료하는 방법, 또는 대안적으로, 대상체에서 제어된 이식유전자 발현을 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 (a) 제1 수준 (또는 제1 양)으로 이식유전자의 발현을 달성하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 프라이밍 용량을 제1 시점에 대상체에게 투여하는 단계, 및 (b) 이식유전자의 발현 수준을 원하는 지속된 발현 수준으로 유지하기 위한 ceDNA 벡터의 용량 또는 양을 제2 시점에 대상체에게 투여하여 대상체에서 질환을 치료하는 단계로서, 상기 지속된 발현 수준은 제1 시점에 ceDNA 벡터의 초기 (즉, 프라이밍) 투여만이 제공되는 경우 달성된 이식유전자 발현 수준과 비교하여 더 높은 발현 수준인, 상기 단계를 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 원하는 이식유전자 발현 수준을 유지하기 위해 재투여 (본원에서 "재복용"으로도 지칭됨)될 수 있고, 여기서 ceDNA 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 폴리뉴클레오티드 서열의 측면에 있는 2개의 ITR 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 대칭 ITR 쌍 또는 비대칭 ITR 쌍)을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포에서 이식유전자의 발현 수준을 유지하는 방법에서 ceDNA 벡터의 사용은 이식유전자를 적어도 42일 동안 원하는 발현 수준으로 발현시킨다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자를 적어도 84일 동안 원하는 발현 수준으로 발현시킨다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자를 적어도 132일 동안 원하는 발현 수준으로 발현시킨다. 단지 예시의 목적으로, 실시예 1에 개시된 방법에 의해 생성된 ceDNA 벡터는 다른 방법에 의해 생성되고 동일한 마우스 모델에서 시험된 유사한 폐쇄-말단 DNA 벡터와 비교하여 투여 후 7-28일부터 CD-1 IGS 마우스의 뮤린 모델에서 이식유전자의 발현 수준을 더 높은 수준으로 유지시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 증가된 이식유전자 발현은 용량-의존적이 아니거나 전체 용량 의존적이 아니지만, 이식유전자의 증가된 발현이 전형적으로 재복용 투여 후 7-20일 이내에 발생하고, 제2 용량의 투여 (즉, 재복용, 또는 제2 또는 후속 시점에 투여) 후 적어도 약 30일, 또는 적어도 약 60일, 또는 적어도 약 90일, 또는 적어도 약 120일 또는 약 120일 이상 동안 재복용으로부터 이식유전자의 증가된 발현 수준이 유지된다는 점에서 지속적인 발현이다.
본원에 개시된 주어진 ceDNA 벡터 또는 조성물에 대한 특정 용량 반응 관계는 예를 들어, 실시예 6에 기재된 바와 같이 당업자에게 잘 알려진 수단에 의해 결정될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 요구되는 바와 같이 초기 투여 후 추가 용량의 ceDNA 벡터를 1회 이상 투여함으로써 적정될 수 있다. 이식유전자의 발현 수준을 원하는 수준으로 또는 그 근처로 적정하기 위해 1회 초과, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 이상의 반복 투여가 실시될 수 있다. 전형적으로, 각각의 반복 투여는 이전 투여로부터 이식유전자의 발현 감소가 관찰되기 대략 7일 전에 실시된다. 사실상, 반복 투여는 이식유전자의 발현 수준을 원하는 수준으로 적정하는 역할을 하거나, 다른 방식으로 언급하면, 반복 투여는 이식유전자의 발현 수준이 원하는 발현 수준 범위 내에서, 예를 들어, 질환 또는 장애를 치료하기 위해 치료적인 원하는 범위에서 또는 조성물의 치료 범위 내에서 유지될 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 생체내 이식유전자 발현 수준을 조정하는데 사용될 수 있고, 여기서 발현 수준은 이전 수준 (여기서 이전 수준은 이전 프라이밍 또는 재복용 투여 후 수준임)에서 원하는 발현 수준으로, 또는 원하는 발현 수준 범위 이내로, 또는 생체내 원하는 역치 수준을 초과하여 증가되고, 여기서 증가된 발현 수준은 ceDNA 벡터의 재복용 투여 후 약 30-60일, 또는 약 40-70일, 또는 약 50-80일, 또는 약 60-90일, 또는 약 70-100일 또는 약 80-110일, 또는 약 40-120일, 또는 120일 이상 지속 또는 유지된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 세포에서 이식유전자의 발현을 지속시키고/시키거나 질환을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법에 사용된 ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 제2 시점에 투여되고, 제1 시점 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일 또는 60-90일, 또는 90-120일, 또는 약 3-6개월, 또는 6-12개월, 또는 1-2년, 또는 2-3년 후 투여된다.
(ii) 제어된 이식유전자 발현: ceDNA 벡터의 재투여에 의한 이식유전자 발현 증가
발현 수준이 시간 경과에 따라 감소된 경우, 단순히 이식유전자 발현 수준을 증가시키기 위한 (예를 들어, 이식유전자 발현을 원하는 미리 결정된 수준으로 지속 또는 유지하기 위한) ceDNA 벡터의 재복용 투여에 추가하여, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 재투여 방법 및 조성물은 이식유전자의 수준을 용량-의존적 방식으로 증가시킬 수 있고, 즉, 규정된 양의 ceDNA 벡터의 재복용 투여는 이식유전자의 발현 수준의 규정된 증가를 가져올 수 있다. 다르게 말하면, 그리고 단지 예시의 목적으로 임의의 단위를 사용하면, 재복용 투여에서 ceDNA의 1 단위 용량은 이전 수준으로부터 이식유전자 발현 수준의 10% 증가를 달성할 것이고, cDNA 벡터의 2 단위 용량은 이전 수준으로부터 이식유전자 수준의 20% 증가를 달성할 것이고, ceDNA의 0.5 단위 용량은 이전 수준으로부터 이식유전자 발현 수준의 5% 증가를 달성할 것이다.
따라서, 일 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 세포 또는 대상체에서 이식유전자의 발현 수준을 제어된 방식으로 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 이식유전자의 발현 수준은 ceDNA 벡터의 1회 이상의 후속 투여 (예를 들어, 재복용 또는 부스터 투여)로 증가될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 생체내에서 이식유전자의 발현 수준을 규정된 양만큼 증가시키기 위해 초기 프라이밍 투여 후 하나 이상의 시점에 ceDNA의 용량-의존적 또는 농도 의존적 재복용 투여를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 규정된 양만큼 이식유전자 발현 증가는 생체내에서 이식유전자의 발현 수준을 원하는 역치 (또는 미리 결정된 수준) 또는 그 이상으로, 또는 원하는 발현 수준 범위 내로 가져올 수 있고, 여기서 원하는 역치 또는 원하는 발현 수준 범위는 이전 투여 (즉, 초기 프라이밍 투여 또는 이전 재복용 투여)의 이식유전자 발현 수준을 초과한다.
도 6은 생체내에서 대상체에게 ceDNA 벡터의 재복용 투여 (즉, 재투여 또는 부스터) 후 이식유전자의 발현 수준을 쉽게 증가시킬 수 있음을 보여준다. 특히, 도 6은 생체내에서 재복용 투여시 대상체에게 상이한 농도의 ceDNA 벡터가 투여된 후 이식유전자의 발현 수준의 상이한 증가를 보여준다. 특히, 3mg/ml의 ceDNA의 재복용 농도는 용량-의존적 재복용 투여가 없는 발현 수준과 비교하여 이식유전자의 발현의 7배 증가를 달성하였고, 10mg/kg의 ceDNA의 재복용 농도는 이식유전자의 발현의 17배 증가를 초래하였다. 따라서, 본원에 기재된 기술은 생체내에서 대상체에게 ceDNA의 적어도 2회 투여에 관한 것이고, 여기서 제2 또는 후속 투여는 원하는 양만큼, 일부 구현예에서, 용량-의존적 재복용 투여 없이 ceDNA 벡터의 이전 투여로 달성된 이식유전자의 발현 수준과 비교하여, 원하는 발현 수준 범위, 또는 원하는 발현 수준, 또는 역치 발현 수준을 달성하기 위해 이식유전자의 발현 수준의 용량 의존적 증가를 초래한다. 즉, 이식유전자의 발현 수준 증가는 이식유전자의 발현 수준을 제어된 방식으로 증가시키기 위해, 즉, 재복용 투여시 ceDNA의 용량 (또는 양)에 기초하여 이식유전자의 발현을 적정하기 위해 1회 이상의 용량-의존적 재복용 투여에 의해 달성된다.
다르게 말하면, 본원에 개시된 용량-의존적 재복용 투여는 이식유전자 발현 수준을 증가시킨다. 증가된 이식유전자 발현은 용량-의존적이고, 지속 가능한 발현이고, 즉, (용량-의존적 재복용 투여로 인한) 고수준에서의 이식유전자의 발현은 규정된 기간 동안 유지되거나 용량은 재복용 투여 없이 관찰된 발현 수준 아래로 감소되거나 떨어지지 않는다.
전형적으로, 각각의 용량-의존적 재복용은 이식유전자의 발현의 원하는 증가가 요구되기 대략 7일 전에 투여된다. 사실상, 용량-의존적 재복용은 이식유전자의 발현 수준을 원하는 수준 또는 원하는 발현 수준 범위로 적정하는 역할을 하거나, 다른 방식으로 언급하면, 용량-의존적 재복용은 이식유전자의 발현 수준이 이전 발현 수준보다 규정된 양만큼 증가될 수 있게 하고, 그 증가는 적어도 1회의 용량-의존적 재복용 투여로, 또는 대안적으로, 1회 초과의 용량-의존적 재복용 투여에 의한 점진적 증가로 이루어지고, 따라서 이식유전자가 원하는 발현 수준 범위 내에 있는 수준, 예를 들어, 질환 또는 장애를 치료하기 위해 치료적인 원하는 범위에서 발현되도록 제어된 적정 방식으로 증가된다.
일부 구현예에서, 이식유전자의 원하는 발현 수준의 범위 또는 원하는 발현 수준 범위는 질환의 증상을 효과적으로 치료 또는 감소시키기 위한 이식유전자의 치료적 유효량일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이러한 이식유전자의 치료적 유효량을 달성하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 1회 이상의 재복용 투여를 사용하여 이식유전자의 발현 수준을 증가시켜 그 수준을 이식유전자의 치료적 유효량으로 점진적으로 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 대상체에게 낮은 발현 수준 (즉, 하위-치료학적 유효량)으로 이식유전자를 발현시키는 프라이밍 용량의 ceDNA 벡터가 투여될 수 있고, 원하는 치료 효과가 달성될 때까지 발현 수준을 증가시키기 위해 일정 기간에 걸쳐 대상체에게 1회 이상의 재복용 투여가 실시될 수 있다. 이러한 전략은 대상체의 신체가 발현된 이식유전자의 수준에 맞게 조정될 수 있게 하고, 원하는 치료 목표 또는 효과에 도달하고/하거나 이식유전자의 과발현으로 인한 과잉 약물 및/또는 부작용을 예방하기 위해 점진적으로 이식유전자의 발현 수준을 효과적으로 적정 또는 조정 (이 경우에는 증가)할 수 있게 한다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 대상체가 영아 또는 소아일 때 이식유전자를 원하는 발현 수준, 전형적으로 낮은 발현 수준으로 발현시키는 ceDNA 벡터의 프라이밍 용량이 대상체에게 투여될 수 있고, 대상체가 성장함에 따라 치료 효과가 유지되도록 발현 수준을 증가시키기 위해 일정 기간에 걸쳐 대상체에게 1회 이상의 용량-의존적 재복용 투여가 실시될 수 있다.
B. ceDNA 벡터의 재투여 타이밍 및 양
본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현 수준은 초기 투여 후 1회 이상 ceDNA 벡터의 재투여 (즉, 재복용)에 의해 이전 수준 (즉, 0일에 이전 프라이밍 투여 또는 이전 재복용으로부터 달성된 발현 수준)으로부터 증가될 수 있다. 전형적으로, 발현 수준을 원하는 수준 또는 원하는 발현 수준 범위로 증가시키는 재복용 투여는 발현의 증가가 요구되기 약 7일, 또는 7일 초과 전에 투여된다. 예시적인 예로서, 이전 투여 (즉, 프라이밍 또는 이전 재복용 투여) 후 약 30일째에 이식유전자 발현 수준의 증가가 요구되는 경우, 재복용은 28일 또는 그 이전에 제공될 수 있다. 유사하게, 이전 투여 (즉, 프라이밍 또는 이전 재복용 투여) 후 약 90일 (또는 약 3개월)째에 이식유전자 발현의 증가가 요구되는 경우, 재복용은 90일 또는 그 주위에 이식유전자 발현 수준을 원하는 수준으로 또는 원하는 발현 수준 범위 내로 증가시키기 위해 약 83 또는 84일 또는 그 이전에 투여될 수 있고, 여기서 원하는 수준 또는 원하는 발현 수준 범위는 이전 투여로 달성된 이식유전자 발현 수준을 초과한다.
본원에 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 방법 및 ceDNA 벡터가 개인화된 유전 의학 접근법을 허용하므로, 즉, 재복용 투여로 단계적으로 이식유전자 발현 수준을 적정하여 발현 수준을 점진적으로 증가시킬 수 있으므로, 이전 투여로 또는 이 재복용 투여 이전에 달성된 발현 수준보다 더 높은 원하는 수준, 또는 원하는 발현 수준 범위로 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 또는 6회 초과의 재복용이 시간 경과에 따라 투여될 수 있는 것으로 생각된다. 각각의 재복용 투여에 의한 이식유전자의 발현 수준의 점진적 증가는 동일할 수 있거나, 즉, 각각의 재복용 투여는 이식유전자의 발현 수준을 이전 발현 수준으로부터 약 10% 증가시킬 수 있거나, 상이할 수 있고, 즉, 제1 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 발현을 약 10% 증가시킬 수 있고, 제2 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 발현을 약 20% 증가시킬 수 있다. 전형적으로, 각각의 재복용은 이식유전자의 원하는 발현 증가가 요구되기 대략 7일 전에 투여된다. 사실상, 재복용은 이식유전자의 발현 수준을 원하는 수준 또는 원하는 발현 수준 범위로 적정하는 역할을 하거나, 다른 방식으로 언급하면, 재복용은 이식유전자의 발현 수준이 이전 발현 수준보다 증가될 수 있게 하고, 그 증가는 1회 이상의 재복용 투여로 점진적 증가될 수 있어 이식유전자가 원하는 발현 수준 범위 내에 있는 수준, 예를 들어, 질환 또는 장애를 치료하기 위해 치료적인 원하는 범위에서 발현되도록 한다.
일부 구현예에서, 이식유전자 발현 수준을 증가시키는 재복용은 ceDNA 조성물의 이전 투여 (예를 들어, 0일에 초기 프라이밍 투여, 또는 재복용 투여 이전) 후 적어도 약 20일, 또는 적어도 약 30일, 또는 적어도 약 40일, 또는 적어도 약 50일, 또는 적어도 약 60일, 또는 약 60-90일, 또는 약 90-120일, 또는 약 120-150일 후이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기술은 생체내에서 이식유전자 발현을 증가시키기 위한 ceDNA의 재복용에 관한 것이고, 여기서 이식유전자의 발현은 ceDNA 조성물의 1회 이상의 재복용 (즉, 재투여 또는 부스터 투여)에 의해 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 또는 후속 시점에 재복용 투여시 ceDNA 벡터의 용량 (또는 양)은 이 재복용 투여 이전 또는 이에 선행하는 투여 (0일에 초기 프라이밍 투여, 또는 이전 재복용 투여)에서 ceDNA의 용량 (즉, 양)과 동일하거나 상이한 양이다. 일 예로서, 제1 시점에 투여된 ceDNA의 양이 1mg/kg인 경우, 제2 또는 후속 시점에서의 재복용 투여의 양은 1mg/kg, 또는 1mg/kg 미만 또는 1mg/kg 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 재복용은 약 2mg/kg, 약 3mg/kg, 약 4mg/kg, 약 5mg/kg, 약 6mg/kg, 약 7mg/kg, 약 8mg/kg, 약 9mg/kg, 약 10mg/kg, 또는 약 2-5mg/kg, 또는 5-10mg/kg, 또는 10-15mg/kg 또는 15mg/kg 초과 중 어느 것으로부터 선택된 양일 수 있다.
일부 구현예에서, 1회 이상의 재복용 투여 (즉, 이식유전자 발현 수준을 점진적으로 증가시키기 위한 순차적인 재복용 투여)에 의해 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해, 각각의 재복용 투여는 동일할 수 있거나, 즉, 각각의 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 이식유전자의 발현 수준을 약 10% 증가시킬 수 있거나, 상이할 수 있고, 즉, 제1 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 발현을 약 10% 증가시킬 수 있고, 제2 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 발현을 약 20% 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 초과의 재복용이 투여되는 경우, 각각의 재복용 투여에 의한 이식유전자의 발현 수준의 증가량은 동일할 수 있거나, 즉, 각각의 투여된 재복용은 이전 발현 수준으로부터 이식유전자의 발현 수준을 약 10% 증가시킬 수 있거나, 상이할 수 있고, 즉, 제1 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 발현을 약 10% 증가시킬 수 있고, 제2 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 발현을 약 20% 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 재복용이 투여되는 경우, 각각의 재복용 투여에 의한 이식유전자의 발현 수준의 증가량은 동일할 수 있거나, 즉, 각각의 투여된 재복용은 이전 발현 수준으로부터 이식유전자의 발현 수준을 약 1배 또는 2배 또는 3배 등으로 증가시킬 수 있거나, 상이할 수 있고, 즉, 제1 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 발현을 약 2배 증가시킬 수 있고, 제2 재복용 투여는 이전 발현 수준으로부터 약 6배, 또는 초기 프라이밍 투여로 달성된 발현 수준으로부터 약 6배 발현을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 제2 또는 임의의 후속 투여 (예를 들어, 재복용 투여)시 세포 또는 대상체에게 투여된 것과 같은 프라임 투여 (즉, 시간 0에서의 제1 투여)시 투여된 동일한 ceDNA 벡터이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 동일한 ceDNA 벡터일 수 있다. 단지 예시의 목적으로, 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터의 재투여는 일반적으로 이전에 투여된 것과 상이한 혈청형이다. 대조적으로, 재투여시 ceDNA 벡터는 이전에 투여된 ceDNA 벡터와 동일하고, 즉, ceDNA 벡터는 동일한 혈청형의 AAV를 여러 번 투여하는 것과 동등하도록 변하지 않았다.
다시 말해, 동일한 ceDNA 벡터 혈청형이 재투여되는 것과 동일하지만, 일부 구현예에서, 초기 프라임 투여 후에 제2 또는 임의의 후속 투여 (예를 들어, 재복용 투여)로 투여된 ceDNA 벡터는, 예를 들어, 상이한 ITR-쌍, 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터, 상이한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자 등과 같이 상이하다. 일부 구현예에서, 이식유전자 유전자는 동일하거나 변형된 이식유전자일 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 제1 투여 (즉, 프라이밍 투여)와 재복용 투여 (즉, 제2 시점에 또는 그 이후 임의의 후속 시점, 예를 들어, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 시점 등에) 사이의 간격은 이전 투여 (즉, 프라이밍 용량 또는 이전-재복용 투여) 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일, 또는 적어도 80일, 또는 60-90일, 또는 90-120일, 또는 약 2-3개월, 또는 약 3-6개월, 또는 약 6-12개월, 또는 약 1년 또는 1-2년, 또는 약 2년 또는 2-3년, 또는 약 3년 또는 3-4년, 또는 약 5년 또는 5-6년, 또는 5-10년, 또는 10-20년 등일 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 일 구현예에서 이식유전자의 발현 수준을 증가시키는 재복용 투여는 발현의 증가가 요구되기 약 7일, 또는 7일 초과 (예를 들어, 8-10일, 또는 14일) 전에 투여된다.
단지 예시 목적으로, 0일에 초기 투여시 ceDNA 벡터의 양이 1의 임의의 단위로 설정되는 경우, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 시점에 재복용 투여시 ceDNA 벡터의 양은 0일에 초기 투여시 ceDNA 벡터의 양보다 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 또는 15-20배, 또는 20-50배 더 많은 (이상의) 양 중 어느 것으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 0일에 초기 투여시 ceDNA 벡터의 양이 1배의 임의의 단위로 제공된 발현 수준을 초래하는 경우, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6 시점에 재복용 투여시 ceDNA 벡터의 양은 0일에 ceDNA 벡터의 초기 투여로부터의 이식유전자 발현 수준과 비교하여 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 또는 15-20배, 또는 20-50배 더 많은 (이상의) 이식유전자의 발현 수준의 증가를 초래하는 ceDNA 벡터의 양일 수 있다.
일부 구현예에서, 재복용은 0일에 ceDNA의 초기 투여와 동일한 투여 방식 또는 동일한 투여 경로로 투여된다. 일부 구현예에서, 재복용은 0일에 ceDNA의 초기 투여와 상이한 투여 방식 또는 상이한 투여 경로로 투여된다. 일부 구현예에서, 초기 투여 (즉, 시간 0에서의 프라임 투여)에 이어서 하나 이상의 재복용 (즉, 부스터 투여)가 뒤따르는 경우, 투여는 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 정맥내 투여, 비강내 또는 근육내 투여, 또는 임의의 다른 의학적으로 적절한 투여 경로에 의해 이루어질 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 제1 시점 (예를 들어, 초기 투여, 예를 들어, 0일에), 및 필요하거나 바람직한 경우 제1 시점 이후 시점에 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 이식유전자의 수준을 원하는 수준 (예를 들어, 효능에 대한 역치 값 초과)으로 또는 원하는 발현 수준 범위 내로 (예를 들어, 조성물의 치료 범위 내로) 적정하기 위해 제2 시점에 투여될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 하나 초과의 용량의 ceDNA 벡터가 대상체에게 투여될 수 있고, 예를 들어, 반복 투여가 제2 시점, 제3 시점, 제4 시점 등 중 임의의 하나 이상의 시점에 제공될 수 있는 것으로 생각된다. 원하는 수준의 이식유전자 발현을 유지하기 위해 (즉, 동일한 수준의 이식유전자 발현을 유지 또는 지속시키기 위해) 추가 용량이 투여될 수 있음이 포함된다. 제1 및 제2 또는 임의의 2번의 연이은 재복용 사이의 간격은 동일할 필요가 없다.
C. 미리 결정된 이식유전자 발현 수준
일부 구현예에서, 미리 결정된 이식유전자 발현 수준 (이식유전자의 원하는 발현 수준의 범위, 또는 원하는 발현 수준 범위로도 지칭됨)은 질환의 증상을 효과적으로 치료 또는 감소시키기 위한 이식유전자의 치료적 유효량일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이러한 이식유전자의 치료적 유효량을 달성하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 1회 이상의 재복용 투여를 사용하여, 본원에 개시된 바와 같이, 이식유전자 발현 수준을 유지하고/하거나 이식유전자의 발현 수준을 증가시켜 그 수준을 이식유전자의 치료적 유효량으로 점진적으로 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 대상체에게 원하는 발현 수준, 전형적으로 낮은 발현 수준 (즉, 하위-치료학적 유효량)으로 이식유전자를 발현시키는 프라이밍 용량의 ceDNA 벡터가 투여될 수 있고, 원하는 치료 효과가 달성될 때까지 발현 수준을 증가시키기 위해 일정 기간에 걸쳐 대상체에게 1회 이상의 용량-의존적 재복용 투여가 실시될 수 있다. 이러한 전략은 대상체의 신체가 발현된 이식유전자의 수준에 맞게 조정될 수 있게 하고, 원하는 치료 목표 또는 효과에 도달하고/하거나 이식유전자의 과발현으로 인한 과잉 약물 및/또는 부작용을 예방하기 위해 적어도 1회의 용량-의존적 재복용 투여로 (즉, 적어도 2번 이상의 증분으로) 이식유전자의 발현 수준을 효과적으로 적정 또는 조정 (이 경우에는 증가)할 수 있게 한다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 대상체가 영아 또는 소아일 때 이식유전자를 원하는 발현 수준, 전형적으로 낮은 발현 수준으로 발현시키는 ceDNA 벡터의 프라이밍 용량이 대상체에게 투여될 수 있고, 대상체가 성장함에 따라 치료 효과가 유지되도록 발현 수준을 증가시키기 위해 일정 기간에 걸쳐 대상체에게 1회 이상의 용량-의존적 재복용 투여가 실시될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 이식유전자를 대상체에서 원하는 발현 수준으로 발현시키는 프라이밍 용량의 ceDNA 벡터가 대상체에게 투여될 수 있고, 대상체의 체중이 증가하는 등에 따라 치료 효과가 유지되도록 발현 수준을 증가시키기 위해 일정 기간에 걸쳐 대상체에게 1회 이상의 용량-의존적 재복용 투여가 실시될 수 있다.
즉, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 제1 시점 (예를 들어, 초기 투여, 예를 들어, 0일에)에 대상체에게 투여되고, 그리고 제1 시점 이후 시점에 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 제2 시점에 투여되어 이식유전자의 발현 수준을 미리 결정된 이식유전자 발현 수준으로 (예를 들어, 원하는 수준으로 또는 원하는 발현 수준 범위 내로) 증가시키고, 여기서 미리 결정된 이식유전자 발현 수준은 재복용 투여 이전 이식유전자의 발현 수준을 초과한다. 일부 구현예에서, 미리 결정된 이식유전자 발현 수준은 이식유전자의 치료적 유효량일 필요는 없으며, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 하나 초과의 용량-의존적 재복용은 제2 시점, 제3 시점, 제4 시점, 등 중 임의의 하나 이상의 시점에 대상체에게 투여될 수 있고, 여기서 이식유전자는 미리 결정된 이식유전자 발현 수준으로 증가된다. 용량-의존적 재복용은 재복용 투여시 ceDNA의 용량에 의존적인 규정된 양만큼 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 투여될 수 있고, 일부 구현예에서, 이식유전자의 치료적 유효량인 (예를 들어, 원하는 치료 효과를 생성하거나 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키는 수준인) 발현 수준을 달성하기 위해 단계적으로 발현 수준을 증가시키는데 사용될 수 있음이 포함된다.
재복용 투여로 인해 이식유전자의 발현이 용량-의존적으로 증가하는 반면, 일부 구현예에서 재복용 투여의 효과는 상승적이고, 즉, 이식유전자 발현 증가는 단일 투여의 합보다 크다. 예를 들어, 도 6에 입증된 바와 같이, 재복용 투여시 ceDNA 벡터 양의 3배 증가는 3배보다 큰 이식유전자 발현 증가를 초래했고; 재복용 투여시 ceDNA 벡터 양의 10배 증가는 10배보다 큰 이식유전자 발현 증가를 초래했다.
본원에 기재된 특정 구현예에서, 초기 투여 (즉, 제1 시점에서, 즉, 0일)에 대해 ceDNA의 용량-반응 곡선에서 낮은 용량을 선택하고, 선택적으로 제2, 제3, 제4 등의 투여에서 1회 이상의 용량-의존적 재복용 투여로 점진적으로 용량 (즉, 이식유전자 발현 수준)을 증가시켜 조성물에 대한 바람직하지 않은 부작용 또는 불내성의 개시를 예방하면서 치료 효과를 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 일 구현예에서, 주어진 ceDNA 벡터에 대한 용량 반응 관계는 조성물의 치료 범위 내에 있는 주어진 질환의 효과적인 치료를 위한 최적의 용량을 결정 및/또는 추정하는데 사용된다. 즉, 초기 프라이밍 투여 (예를 들어, 0일에) 및 후속 시점에 재복용 투여시 증분적 용량-의존적 증가를 사용한 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 용량의 적정이 발현된 이식유전자의 치료 효과를 최대화하는 한편 또한 부작용 또는 원치 않는 독성을 최소화하면서 달성될 수 있다.
생체내 및/또는 시험관내 분석은 미리 결정된 이식유전자 발현 수준을 달성하기 위해 재투여시 ceDNA 벡터의 최적의 투여 범위의 식별을 돕는데 사용될 수 있다. 초기 프라이밍 투여 (예를 들어, 시간 0에서) 및 그 이후 각각의 재투여시 ceDNA 벡터의 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 상태의 심각성에 따라 달라질 것이고, 당업자의 판단 및 각 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 유효 용량이 추론될 수 있다.
제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 이식유전자 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용되는 투여 경로는 상기 "투여" 섹션에 기재된 것들, 예컨대 선택된 기관으로의 직접 전달 (예를 들어, 간으로의 문맥내(intraportal) 전달), 경구, 흡입 (비강내 및 기관내 전달 포함), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 기타 모(parental) 투여 경로를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 원하는 경우, 투여 경로가 조합될 수 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하기 위해 요구되는 제어된 이식유전자 발현을 위한 초기 프라이밍 투여 (예를 들어, 시간 0에서) 및 그 이후 각각의 재투여시 ceDNA 벡터의 양의 용량은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 몇 가지 요인에 기초하여 달라질 것이다: 핵산의 투여 경로, 치료 효과를 달성하는데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료되는 특정 질환 또는 장애, 및 유전자(들), RNA 산물(들), 또는 생성된 발현 단백질(들)의 안정성. 당업자는 상기 언급된 요인뿐만 아니라 당 업계에 잘 알려진 다른 요인에 기초하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 ceDNA 벡터 용량 범위를 쉽게 결정할 수 있다.
투여 요법(dosage regimen)은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 반복적으로 투여될 수 있고, 예를 들어, 수회 용량이 매일 투여될 수 있거나 또는 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 용량이 비례적으로 감소될 수 있다. 당업자는 올리고뉴클레오티드가 세포 또는 대상체에게 투여되는지 여부에 관계없이, 대상 올리고뉴클레오티드의 적절한 용량 및 투여 스케줄을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
"치료적 유효 용량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이고 특정 용도에 따라 달라질 것이다 (신경 세포는 매우 소량을 필요로 하는 한편, 전신 주사는 다량을 필요로 한다). 예를 들어, 인간 대상체의 골격 또는 심장 근육으로의 생체내 직접 주사의 경우, 치료적 유효 용량은 약 1 μg 내지 100 g의 ceDNA 벡터일 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 ceDNA 벡터를 전달하기 위해 사용되는 경우, 치료적 유효 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 1 μg 내지 약 100 g의 벡터를 전달할 것으로 예상된다. 또한, 치료적 유효 용량은 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키지만, 유의한 오프-표적 또는 유의한 불리한 부작용을 일으키지 않는 대상체에게 영향을 미치기에 충분한 양의 이식유전자를 발현시키는 양의 ceDNA 벡터이다.
약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형은 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투약 및 치료 요법의 개발과 같이, 당업자에게 잘 알려져 있다.
시험관내 형질감염의 경우, 세포 (lx106 세포)로 전달될 ceDNA 벡터의 유효량은 약 0.1 내지 100 μg ceDNA 벡터, 바람직하게는 1 내지 20 μg, 더 바람직하게는 1 내지 15 μg 또는 8 내지 10 μg일 것이다. 더 큰 ceDNA 벡터는 더 높은 용량을 요구할 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 사용되는 경우, 효과적인 시험관내 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만 일반적으로 동일한 양의 ceDNA 벡터를 전달하도록 의도될 것이다.
임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 투여에 의해 유발된 전형적인 항-바이러스 면역 반응의 부재 (즉, 캡시드 성분의 부재)는 ceDNA 벡터가 숙주에 여러 번 투여될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 이종 핵산이 대상체에게 전달되는 경우의 수는 2 내지 10배 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배)의 범위이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 10회 넘게 대상체에게 전달된다.
특정 구현예에서, 예를 들어, 매일, 매주, 매달, 매년 등과 같이 다양한 간격의 기간에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 1회 초과의 투여 (예를 들어, 2회, 3회, 4회 이상의 투여)가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 이식유전자는, 그것이 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월/1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 15년, 적어도 20년, 적어도 30년, 적어도 40년, 적어도 50년 이상 동안 대상체에서 발현되도록 조절 스위치, 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 일 구현예에서, 발현은 미리 결정된 또는 원하는 간격으로 본원에 기재된 ceDNA 벡터의 반복 투여에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터로부터의 제어된 발현은 유전자 편집 시스템의 성분 (예를 들어, CRISPR/Cas, TALEN, 아연 핑거 엔도뉴클레아제 등)을 추가로 포함하여 질환의 실질적으로 영구적인 치료 또는 "치유"를 위한 이식유전자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열의 삽입을 가능하게 할 수 있다. 유전자 편집 성분을 포함하는 이러한 ceDNA 벡터는 국제 출원 PCT/US18/64242에 개시되어 있고, 예컨대 알부민 유전자 또는 CCR5 유전자를 포함하지 않는, 세이프 하버 영역에 이식유전자를 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 5' 및 3' 상동성 아암 (예를 들어, 서열 번호: 151-154, 또는 이와 적어도 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 상동성을 갖는 서열)을 포함할 수 있다.
치료 기간은 대상체의 임상 진행 및 치료에 대한 반응성에 따라 달라진다. 초기의 높은 치료 용량 후에는 지속적이고 비교적 낮은 유지 용량이 고려된다.
II. 개인화된 유전자 요법
본원에 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 방법 및 ceDNA 벡터는 개인화된 유전 의학 접근법, 즉, 각각의 재복용 투여로 특정 양만큼 이식유전자 발현 수준을 증가시키기 위해, 재복용을 사용하여, 예를 들어, 1회 이상의 재복용 투여로 단계적으로 이식유전자 발현 수준의 용량-의존적 적정을 가능하게 한다. 이와 같이, 재복용은 이식유전자의 발현 수준을 점진적으로 적정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서 이전 투여로 달성되거나 재복용 투여 이전 발현 수준보다 높은 원하는 수준, 또는 원하는 발현 수준 범위로 발현 수준을 증가시키기 위해, 매번 (즉, 각각의 재복용) 규정된 양만큼 이식유전자의 발현 수준이 유지되고/되거나 증가하도록 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 또는 6개 초과의 용량-의존적 재복용이 투여될 수 있다.
벡터에 대한 용량-반응 관계에 기초하여 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 용량을 적정하는 숙련가의 능력은 다양한 방식으로 질환의 치료에 유리하다. 최소한, 숙련가는 효과의 증가가 요구될 때 (예를 들어, 이식유전자의 발현) ceDNA 벡터의 용량을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 숙련가는 ceDNA 조성물에 대한 용량-반응 관계에 대한 사전 지식에 기초하여 치료적인 발현 수준을 달성하는 것으로 알려진 용량을 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 주어진 질환의 중증 증상을 갖는 대상체에 대한 치료를 가속화하기 위해 용량-반응 곡선에서 상대적으로 높은 용량을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 이와 달리, 용량-반응 곡선에서 낮은 용량을 선택하고, 선택적으로 조성물에 대한 바람직하지 않은 부작용 또는 불내성의 개시를 예방하면서 치료 효과를 유도하기 위해 용량을 점진적으로 증가시키는 것이 일반적으로 바람직할 수 있다. 일 구현예에서, 주어진 ceDNA 벡터에 대한 용량 반응 관계는 조성물의 치료 범위 내에 있는 주어진 질환의 효과적인 치료를 위한 최적의 용량을 결정 및/또는 추정하는데 사용된다. 즉, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 용량의 적정은 발현된 이식유전자의 치료 효과를 최대화하는 한편 또한 부작용 또는 원치 않는 독성을 최소화한다.
단지 예시적인 예로서, 낭포성 섬유증을 갖는 대상체는 질환의 중증도가 상이하고/하거나 CFTR1 유전자의 동일한 수준의 이식유전자 발현에 상이하게 반응하고/하거나 정상 약물 제거율보다 낮거나 높은 제거율을 가질 수 있으므로, CFTR1 이식유전자를 포함하는 ceDNA 벡터의 1회 이상의 재복용 투여로 단계적으로 CFTR1 이식유전자의 발현을 증가시킴으로써, CFTR1 이식유전자의 발현 수준이 증분 단계로, 즉, 특정 대상체에서 낭포성 섬유증 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키는데 효과적인 발현 수준으로 증가될 수 있게 한다. 이전에, 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위한 이러한 개인화된 접근법, 또는 적정 방법은 AAV 벡터와 같은 다른 바이러스-기반 벡터와 관련된 면역 반응으로 인해 효과적이지 않고/않거나 가능하지 않았다.
일부 구현예에서, 용량-의존적 재복용 투여는 이식유전자 발현 수준의 제어된 증가를 허용하므로, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물은 유전자 요법에 대한 개인화된 의학 접근법을 허용한다. 단지 예시적인 예로서, 낭포성 섬유증을 갖는 대상체는 질환의 중증도가 상이하고/하거나 CFTR1 유전자의 동일한 수준의 이식유전자 발현에 상이하게 반응하고/하거나 정상 약물 제거율보다 낮거나 높은 제거율을 가질 수 있으므로, CFTR1 이식유전자를 포함하는 ceDNA 벡터의 1회 이상의 용량-의존적 재복용 투여에 의한 CFTR1 이식유전자의 발현의 제어된 증가는 CFTR1 이식유전자의 발현 수준이 제어된 방식으로 증가되게 할 수 있고, 일부 구현예에서, 발현의 제어된 증가는 특정 대상체에서 낭포성 섬유증 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키는데 효과적인 발현 수준으로 증가된 것일 수 있다. 이전에, 이식유전자의 발현 수준을 용량-의존적으로 증가시키기 위한 이러한 개인화된 접근법, 또는 적정 방법은 다른 바이러스-기반 또는 AAV-기반 벡터와 관련된 면역 반응으로 인해 효과적이지 않고/않거나 가능하지 않았다.
본원에 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, 대상체는 적정 용량을 결정하기 위해 ceDNA 벡터의 제1 투여 후 미리 결정된 시간에, 예를 들어, ceDNA 벡터의 제1 투여 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일, 또는 60-90일 또는 90일보다 긴 기간 후 임의의 시점에 평가된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 대상체는 ceDNA 벡터의 제1 투여 후 대상체의 질환 상태 및/또는 대상체에서 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자의 수준을 결정하기 위해 평가된다.
일부 구현예에서, 질환 상태의 평가는 대상체에서 질환의 적어도 하나의 증상의 평가이다. 임의의 주어진 질환에 대한 질환 상태는 의사 또는 당업자에 의해 결정될 수 있고, 단백질 바이오마커, miRNA 및 mRNA 바이오마커 및 다른 분자 프로파일링 시스템을 포함하는, 질환의 하나 이상의 임상 증상 및/또는 바이오마커를 평가하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체에서 질환 상태의 평가는 의사에 의한 관찰 (예를 들어, 국제 질환 분류의 코드, 및 그러한 코드가 결정된 날짜), 실험실 검사 결과, x-선, 생검 결과, 환자의 진술, 및 특정 질환으로 진단을 내리기 위해 의사가 일반적으로 의존하는 기타 의료 정보와 같은 환자의 임상적 특성화와 함께 분자 프로파일링을 사용하여 결정될 수 있다. 대상체에서 분자 프로파일링에 기초하여 질환 상태를 결정하는 방법은 특허 및 미국 특허 출원 7,167,734, 9,372,193, 9,383,365, 2006/0224191, 2011/0172501, 2009/0104596, 2009/0023149에 개시되어 있고, 이들은 각각 그 전문이 본원에 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 특정 질환 상태에 대한 개별화된 의학적 개입을 위해 대상체에 대해 ceDNA 벡터를 적정하기 위해 사용될 수 있다.
다양한 바이오마커의 변화를 조사하면 바이오마커가 수득된 대상체의 상태에 관한 정보가 제공된다. 단일 시점에 단일 생물학적 샘플을 측정하여 검증 (예를 들어, 질환 또는 질환 없음), 질환 유형, 및 질환 상태의 특성화 (예를 들어, 조기 또는 "발병" 대 후기 또는 "회복" 단계)를 허용하도록 바이오마커가 질환 진행에 따라 어떻게 변화 (예를 들어, 증가, 감소, 변화 없음)하는지 이해하는 것.
일부 구현예에서, 각각의 바이오마커의 수준 및 시간에 따른 경향 (증가, 감소 또는 일정)에 기초하여 발병 또는 회복과 같은 질환 진행 상태를 평가하기 위한 바이오마커가 평가될 수 있다. 대상체 질환 상태에 대한 바이오마커 프로파일링은 또한 개체가 건강한 또는 질환 상태인지를 평가하기 위해 호흡에서 자연적으로 발생하는 안정한 동위원소 비율 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,912,178)과 같은 다른 기술과 결합될 수 있다. 질환 상태는 바이오마커 수준의 변화, 특히 질환 상태와 관련된 생물학적 경로 내에서 밀접하게 관련된 복수의 바이오마커의 변화를 측정함으로써 검출된다. 일부 구현예에서, 특정 질환 상태는 질환이 진행됨에 따라 수준이 변하는 바이오마커를 결정하기 위해 NMR 스펙트럼으로부터 복합 신호를 검출 및 분석함으로써 특성화될 수 있다. 이 초기 질환 상태 평가는 질환 진행과 관련된 동적 변화를 "핑거프린팅(fingerprinting)"할 수 있게 하며, 질환 진행 및 과정의 현재 상태를 평가하는데 도움을 준다. 질환 상태가 식별되면, 시간이 지남에 따라 질환을 감소시키기 위해 ceDNA 벡터의 투여가 대상체에 맞게 조정 및/또는 적정될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 내에서 바이오마커 프로파일을 평가함으로써 질환 상태를 평가할 수 있다. 측정된 특정 바이오마커는 질환 및 관련된 숙주 면역 반응에 기저하는 주요 생화학적 경로의 분석으로부터 결정된다. 구현예에서, 표준 바이오마커 프로파일은 건강한 개체 및 질환을 갖는 개체로부터 얻어진다. 생물학적 샘플로부터 바이오마커 프로파일을 표준 바이오마커 프로파일 (건강한 및 질병)과 비교하면 질병 상태가 긍정적으로 식별될 수 있다. 선택적으로, 바이오마커 프로파일 경향 (예를 들어, 제1 및 제2 샘플 사이에 어떤 바이오마커가 변화하고 있는지)을 획득하기 위해 제2 시점 또는 질환 진행 시점에 제2 생물학적 샘플을 환자로부터 단리함으로써 환자의 질환 상황 또는 상태에 관한 추가 정보를 제공한다. 일부 구현예에서, 표준 바이오마커 프로파일은 다음 시점 중 하나 이상의 시점에 평가된다: ceDNA 벡터의 제1 투여 전, ceDNA 벡터의 제1 투여 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일, 또는 60-90일 또는 90일보다 긴 기간 후, 또는 ceDNA 벡터의 제2 (예를 들어, 재복용) 투여 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일, 또는 60-90일 또는 90일보다 긴 기간 후, 또는 ceDNA 벡터의 임의의 후속 투여 (예를 들어, 재복용 투여) 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일, 60-90일 또는 90일보다 긴 기간 후.
단백질 바이오마커는 당뇨병, 알츠하이머병 및 암에 대해 식별되었다 (참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,125,663; 7,097,989; 7,074,576; 및 6,925,389, 이들은 그 전문이 본원에 포함됨). 질량 분석법 및 항체와의 특이적 결합과 같은 단백질 바이오마커의 검출 방법이 또한 사용될 수 있다. 마이크로어레이를 사용하는 고처리량 발현 분석 방법은 mRNA 바이오마커, 뿐만 아니라 스트레스 관련 유전자를 식별하기 위한 다중 관련 유전자에 대한 초점형 어레이(focused array) 및 qPCR에 사용될 수 있으며, 예를 들어, WO2007106685A2를 참조한다. DNA 마이크로어레이는 환자의 종양 샘플에서 유전자 발현을 측정하고 진단을 용이하게 하기 위해 사용되어 왔다. 유전자 발현은 환자에서 암의 존재, 이의 유형, 단계 및 기원, 및 유전적 돌연변이가 수반되는지 여부를 나타낼 수 있다. 유전자 발현은 화학요법의 효능을 예측하는 역할을 할 수도 있다. 최근 수십 년 동안, 미국 국립 암 연구소 (National Cancer Institute; NCI)는 화학요법제를 포함한 화합물을 60개의 인간 암 세포주의 성장 제한에 미치는 영향에 대해 시험하였다. NCI는 또한 DNA 마이크로어레이를 사용하여 이러한 60개의 암 세포주에서 유전자 발현을 측정하였다. 다양한 연구에서 NCI 데이터세트를 사용하여 유전자 발현과 화합물 효과 사이의 관계를 조사하였다. 암 환자에게 효과적인 화학요법을 찾기 위한 시행착오 접근법으로 인해 중요한 시간이 종종 손실된다. 또한, 암 세포는 종종 이전에 효과적인 치료법에 대한 내성을 발달시킨다. 이러한 상황에서, 이러한 내성의 조기 발견에 의해 환자 결과가 크게 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 질환 상태의 바이오마커 발현 수준은 유전자(들)로부터 전사된 mRNA 수준을 측정하거나, 유전자(들)의 단백질 산물 수준을 검출하거나, 유전자(들)의 단백질 산물의 생물학적 활성 수준을 검출함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 질환 상태의 바이오마커 (miRNA 바이오마커 포함) 수준은 정량적 역전사-중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)을 사용하여 측정된다. 유전자 발현 산물, 예를 들어, 단백질 수준을 측정하기 위한 이러한 방법은 ELISA (효소 결합 면역흡착 분석), 웨스턴 블롯, 및 면역침전, 항체 또는 단백질 결합 제제와 같은 검출 시약을 사용한 면역형광을 포함한다. 대안적으로, 펩티드는 표지된 항-펩티드 항체 및 다른 유형의 검출 제제를 대상체에게 도입함으로써 대상체에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 항체는 대상체에서의 존재 및 위치가 표준 이미징 기술에 의해 검출되는 방사성 마커로 표지될 수 있다.
특정 구현예에서, 유전자 발현 산물은 질환 바이오마커의 메신저 RNA (mRNA) 발현 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 이러한 분자는 생물학적 샘플, 예컨대 전혈 또는 혈장, 예를 들어, 혈소판 풍부 혈장으로부터 단리, 유래 또는 증폭될 수 있다. mRNA 발현의 검출은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 PCR 절차, RT-PCR, 노던 블롯 분석, 차등 유전자 발현, RNA 보호 분석, 마이크로어레이 분석, 하이브리드화 방법 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, mRNA의 수준은 정량적 RT-PCR을 사용하여 측정될 수 있다. 일반적으로, PCR 절차는 (i) 핵산 샘플 또는 라이브러리 내의 특정 유전자 또는 서열에 프라이머의 서열-특이적 하이브리드화, (ii) 열안정 DNA 중합효소를 사용한 여러 번의 어닐링, 신장 및 변성을 포함하는 후속 증폭, 및 (iii) 정확한 크기의 밴드에 대한 PCR 산물의 스크리닝으로 구성되는 유전자 증폭 방법을 기술한다. 사용된 프라이머는 중합 개시를 제공하기에 충분한 길이 및 적절한 서열의 올리고뉴클레오티드이고, 즉, 각각의 프라이머는 증폭될 게놈 유전자좌의 가닥에 상보적이도록 특이적으로 설계된다. 대안적인 구현예에서, 본원에 기재된 유전자 발현 산물의 mRNA 수준은 역전사 (RT) PCR 및 정량적 RT-PCR (QRT-PCR) 또는 실시간 PCR 방법에 의해 결정될 수 있다. RT-PCR 및 QRT-PCR 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 질환 상태, 또는 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현 수준에 대한 하나 이상의 바이오마커를 측정하는 방법은 다음 중 어느 것으로부터 선택된 분석법일 수 있다: 면역조직화학 (IHC) 분석 및/또는 마이크로 어레이 분석, 비교 게놈 하이브리드화 (CGH) 마이크로 어레이, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 마이크로 어레이, 형광 동소 하이브리드화 (ISH), 동소 하이브리드화 (ISH), 및 프로테오믹 어레이(proteomic array).
본원에 사용된 용어 "마이크로어레이"는 한 번에 하나 이상의 대상 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA, 또는 이의 유사체를 정량화하는 임의의 방법에 의해 사용되는 장치를 의미한다. 하나의 예시적인 마이크로어레이 클래스는 유리 또는 석영 표면에 부착된 DNA 프로브로 구성된다. 많은 마이크로어레이, 예를 들어, 아피메트릭스(Affymetrix)에 의해 제조된 마이크로어레이는 단일 유전자의 발현을 결정하기 위해 여러 프로브를 사용한다. DNA 마이크로어레이는, 예를 들어, RNA에 상보적인 전장 cDNA 또는 RNA의 일부에 하이브리드화하는 cDNA 단편일 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유할 수 있다. 예시적인 RNA는 mRNA, miRNA, 및 miRNA 전구체를 포함한다. 예시적인 마이크로어레이는 또한 기판-결합된 복수의 핵산을 갖는 "핵산 마이크로어레이"를 포함하고, 복수의 결합된 핵산 각각에 대한 하이브리드화는 개별적으로 검출 가능하다. 기판은 고체 또는 다공성, 평면 또는 비-평면, 단일 또는 분산성일 수 있다. 예시적인 핵산 마이크로어레이는 이른바 하기의 모든 장치를 포함한다: Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Oxford University Press (1999); Nature Genet. 21(1)(suppl.):1-60 (1999); 및 Schena (ed.), Microarray Biochip: Tools and Technology, Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000). 추가로, 예시적인 핵산 마이크로어레이는, 특히, 문헌[Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1665-1670 (2000)]에 기재된 바와 같이, 단일 평면 기판이 아니라 복수의 비드 상에 복수의 핵산이 배치된 기판-결합된 복수의 핵산을 포함할 수 있다. 핵산 마이크로어레이의 예는, 본원에 참고로 포함된, 미국 특허 번호 6,391,623, 6,383,754, 6,383,749, 6,380,377, 6,379,897, 6,376,191, 6,372,431, 6,351,712 6,344,316, 6,316,193, 6,312,906, 6,309,828, 6,309,824, 6,306,643, 6,300,063, 6,287,850, 6,284,497, 6,284,465, 6,280,954, 6,262,216, 6,251,601, 6,245,518, 6,263,287, 6,251,601, 6,238,866, 6,228,575, 6,214,587, 6,203,989, 6,171,797, 6,103,474, 6,083,726, 6,054,274, 6,040,138, 6,083,726, 6,004,755, 6,001,309, 5,958,342, 5,952,180, 5,936,731, 5,843,655, 5,814,454, 5,837,196, 5,436,327, 5,412,087, 및 5,405,783에서 확인할 수 있다.
예시적인 마이크로어레이는 또한 기판-결합된 복수의 폴리펩티드를 갖는 "펩티드 마이크로어레이" 또는 "단백질 마이크로어레이"를 포함할 수 있고, 복수의 결합된 폴리펩티드에 대한 올리고뉴클레오티드, 펩티드 또는 단백질의 결합은 별도로 검출될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 마이크로어레이는, 특정 올리고뉴클레오티드, 펩티드 또는 단백질의 결합을 특이적으로 검출할 수 있는, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 파지 디스플레이 결합제, 효모 2 하이브리드 결합제, 압타머를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 복수의 결합제를 가질 수 있다. 펩티드 어레이의 예는, 본원에 참고로 포함된, 국제 특허 공보 번호 WO 02/31463, WO 02/25288, WO 01/94946, WO 01/88162, WO 01/68671, WO 01/57259, WO 00/61806, WO 00/54046, WO 00/47774, WO 99/40434, WO 99/39210, 및 WO 97/42507, 및 미국 특허 번호 6,268,210, 5,766,960, 및 5,143,854에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어, ceDNA 벡터의 제1 투여시 또는 ceDNA 벡터의 투여 전 임의의 시간에 질환 상태와 비교하여, 대상체의 질환 상태가 정상 상태로 유지되거나 개선되지 않았거나 대상체에서 질환 상태가 감소한 경우, 대상체에게 제2 용량의 ceDNA 벡터가 투여되고, 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여된 ceDNA 벡터의 양은 적정 용량이다.
대안적인 구현예에서, 대상체에서 이식유전자 발현 수준이 미리 결정된 수준에서 감소하거나 치료적 유효량으로부터 감소한 경우, 예를 들어, ceDNA 벡터의 제1 투여 후 초기 이식유전자 발현 수준에서 떨어진 경우, 대상체에게 제2 용량의 ceDNA 벡터가 투여되고, 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여되는 ceDNA 벡터의 양은 적정 용량이다. 일부 구현예에서, 이식유전자 발현 수준은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 ceDNA 벡터로부터 발현된 이식유전자의 수준을 측정 (예를 들어, 단백질 수준 및/또는 mRNA 수준 측정)함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 활액, CSF, 타액 또는 조직 생검 샘플 중 어느 것으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터가 원하는 단백질 또는 치료 유전자를 인코딩하는 이식유전자 이외에 리포터 단백질을 발현시키는 경우, 이식유전자의 수준은 당업자에게 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 생체내에서 ceDNA 벡터로부터 발현된 리포터 단백질의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 적정은 ceDNA 벡터로부터 발현된 이식유전자의 수준을 결정하고, 제2 용량의 ceDNA 벡터를 대상체에게 투여하여 이식유전자 발현을 미리 결정된 원하는 수준으로 조정 또는 조절하는 것이다.
III. 일반적인 ceDNA 벡터
본 발명의 구현예는 본원에 정의된 바와 같이, 이식유전자를 발현시킬 수 있는 폐쇄-말단 선형 이중화 (ceDNA) 벡터를 포함하는 방법 및 조성물에 기반한다. 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 크기에 의해 제한되지 않으므로, 예를 들어, 단일 벡터로부터 이식유전자의 발현에 필요한 모든 성분의 발현을 허용한다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 듀플렉스, 예를 들어, 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 대해 자가-상보적이다 (예를 들어 ceDNA는 이중 가닥 원형 분자가 아니다). ceDNA 벡터는 공유적으로 폐쇄된 말단을 가지므로, 예를 들어 37℃에서 1시간 이상 동안 엑소뉴클레아제 소화 (예를 들어 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 저항성이 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터 내 이식유전자의 발현, 예를 들어, 유전 의학 이식유전자가 발생할 수 있는 핵으로 전위된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현, 예를 들어, 2개의 ITR 사이에 위치한 유전 의학 이식유전자가 발생할 수 있는 핵으로 전위된다.
일반적으로, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 5'에서 3'의 방향으로 제1 아데노-관련 바이러스 (AAV) 역 말단 반복부 (ITR), 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함한다. (i) 적어도 하나의 WT ITR 및 적어도 하나의 변형된 AAV 역 말단 반복부 (모드-ITR) (예를 들어, 비대칭 변형된 ITR); (ii) 모드-ITR 쌍이 서로 상이한 3차원 공간 구성을 갖는 2개의 변형된 ITR (예를 들어, 비대칭 변형된 ITR), 또는 (iii) 대칭인 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍 (여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐), 또는 (iv) 대칭인 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍 (여기서 각각의 모드-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 어느 것으로부터 선택된 ITR 서열.
비제한적으로, 리포좀 나노입자 전달 시스템과 같은 전달 시스템을 추가로 포함할 수 있는, ceDNA 벡터를 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 포함된다. 사용을 위해 포함되는 비제한적인 예시적인 리포좀 나노입자 시스템이 본원에 개시되어 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 ceDNA 및 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 상기 공정에 의해 수득된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩된 지질 나노입자 제형은 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042에 개시되어 있으며, 이는 본원에 포함된다.
본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내의 제한된 공간에 의해 야기되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는 캡슐화된 AAV 게놈과는 대조적으로, 원핵생물-생산 플라스미드 DNA 벡터에 대한 생존 가능한 진핵생물적으로 생산된 대안을 나타낸다. 이는 제어 요소, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 이식유전자, 다수의 이식유전자 등의 삽입을 허용한다.
도 1a-1e는 비제한적인 예시적인 ceDNA 벡터 또는 상응하는 ceDNA 플라스미드 서열의 개략도를 도시한다. ceDNA 벡터는 캡시드가 없으며 다음 순서로 인코딩된 플라스미드로부터 수득될 수 있다: 제1 ITR, 이식유전자를 포함하는 발현 카세트 및 제2 ITR. 발현 카세트는 이식유전자의 발현을 허용 및/또는 제어하는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 발현 카세트는 다음 순서로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 인핸서/프로모터, ORF 리포터 (이식유전자), 전사 후 조절 요소 (예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 (예를 들어, BGH 폴리A).
발현 카세트는 또한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (예를 들어, 서열 번호: 190) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 요소는 프로모터, 리보스위치(riboswitch), 절연체, mir-조절 가능 요소, 전사 후 조절 요소, 조직- 및 세포 유형-특이적 프로모터 및 인핸서를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서 ITR은 이식유전자의 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가 성분, 예를 들어, 이식유전자의 발현을 제어 및 조절하기 위한 "조절 스위치"라는 제목의 섹션으로 본원에 기재되어 있는 조절 스위치를 포함하며, 원하는 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.
발현 카세트는 4000개 초과의 뉴클레오티드, 5000개의 뉴클레오티드, 10,000개의 뉴클레오티드 또는 20,000개의 뉴클레오티드, 또는 30,000개의 뉴클레오티드, 또는 40,000개의 뉴클레오티드 또는 50,000개의 뉴클레오티드, 또는 약 4000-10,000개의 뉴클레오티드 또는 10,000-50,000개의 뉴클레오티드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 50,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 75,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 1000 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 5,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡슐화된 AAV 벡터의 크기 제한을 갖지 않으므로, 효율적인 이식유전자를 제공하기 위한 대형 발현 카세트의 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 원핵생물-특이적 메틸화가 없다.
ceDNA 발현 카세트는, 예를 들어, 수용 대상체에서 부재하거나, 비활성이거나 또는 활성이 불충분한 단백질을 인코딩하는 발현 가능한 외인성 서열 (예를 들어, 오픈 리딩 프레임) 또는 이식유전자, 또는 원하는 생물학적 또는 치료 효과를 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 이식유전자는 결함이 있는 유전자 또는 전사체의 발현을 교정하는 기능을 할 수 있는 유전자 산물을 인코딩할 수 있다. 원칙적으로, 발현 카세트는 돌연변이로 인해 감소되거나 부재하거나 과발현될 때 치료적 이점을 전달하는 단백질, 폴리펩티드 또는 RNA를 인코딩하는 임의의 유전자를 포함할 수 있으며, 이는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
발현 카세트는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료에 유용한 임의의 이식유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 대상체에서 임의의 관심 유전자를 전달 및 발현시키는데 사용될 수 있으며, 이는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 비-코딩 핵산 (예를 들어, RNAi, miR 등), 뿐만 아니라 대상체의 게놈에 바이러스 서열, 예를 들어, HIV 바이러스 서열 등을 포함하는 외인성 유전자 및 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 치료 목적 (예를 들어, 의학적, 진단 또는 수의학적 용도) 또는 면역원성 폴리펩티드에 사용된다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상체에서 임의의 관심 유전자를 발현시키는데 유용하며, 이는 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 RNA (코딩 또는 비-코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 이들의 안티센스 대응물 (예를 들어, antagoMiR)), 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
발현 카세트는 또한 폴리펩티드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 RNA (코딩 또는 비-코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 이들의 안티센스 대응물 (예를 들어, antagoMiR))을 인코딩할 수 있다. 발현 카세트는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제, 및 당 업계에 잘 알려진 다른 것들과 같은 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터의 발현 작제물인, 발현 카세트에 제공된 서열은 표적 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 천연 서열 (예를 들어, 원핵생물 서열)의 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당한 수의 코돈을 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 척추동물 세포, 예를 들어, 마우스 또는 인간의 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 최초 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어, Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼 (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 제어된 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자는 치료 유전자이다. 일부 구현예에서, 치료 유전자는 항체, 항체 단편, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 융합 단백질은 활성화 항체 또는 중화 항체 또는 항체 단편 등이다. 일부 구현예에서, 제어된 유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2019년 2월 14일자로 출원된 국제 특허 PCT/US19/18016에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특히, 치료 유전자는 질병, 기능장애, 상해 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한, 예를 들어 단백질(들), 폴리펩티드(들), 펩티드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편, 뿐만 아니라 이의 변이체 및/또는 활성 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 치료제(들)이다. 예시적인 치료 유전자는 본원에서 "치료 방법"이라는 제목의 섹션에 설명되어 있다.
플라스미드 기반 발현 벡터와 상이한 ceDNA 벡터의 많은 구조적 특징이 있다. ceDNA 벡터는 다음의 특징들 중 하나 이상을 가질 수 있다: 원래 (즉, 삽입되지 않은) 박테리아 DNA의 결핍, 원핵생물 복제 기원의 결핍, 자가-포함(being self-containing), 즉, 이들은 Rep 결합 및 말단 분해 부위 (RBS 및 TRS)를 포함하는 2개의 ITR, 및 ITR들 사이의 외인성 서열 이외의 임의의 서열을 요구하지 않음, 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재 및 박테리아 유형 DNA 메틸화 또는 실제로 포유동물 숙주에 의해 비정상적인 것으로 간주되는 임의의 다른 메틸화의 부재. 일반적으로, 본 벡터는 임의의 원핵생물 DNA를 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 일부 원핵생물 DNA는 프로모터 또는 인핸서 영역에서 비제한적인 예로서 외인성 서열로서 삽입될 수 있는 것으로 고려된다. 플라스미드 발현 벡터로부터 ceDNA 벡터를 구별하는 또 다른 중요한 특징은 ceDNA 벡터가 폐쇄-말단을 갖는 단일 가닥 선형 DNA인 반면, 플라스미드는 항상 이중 가닥 DNA라는 것이다.
본원에 제공된 방법에 의해 생성된 ceDNA 벡터는 바람직하게는 제한 효소 소화 분석에 의해 결정된 바와 같이, 비-연속 구조보다는 선형 및 연속 구조를 갖는다 (도 4d). 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정할뿐만 아니라 재조합되고 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조에서 ceDNA 벡터는 바람직일 구현예이다. 연속적인, 선형의 단일 가닥 분자내 듀플렉스 ceDNA 벡터는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이 공유 결합된 말단을 가질 수 있다. 이들 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 듀플렉스 핵산 분자인 플라스미드 (본원에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 상보적인 플라스미드 가닥은 변성 후에 분리되어 2개의 핵산 분자를 생성할 수 있는 반면, 대조적으로, 상보적인 가닥을 가지면서 ceDNA 벡터는 단일 DNA 분자이고, 따라서 변성되더라도 단일 분자로 남아있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 플라스미드와 달리, 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생성될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터 및 ceDNA-플라스미드는 둘 모두 구조 측면에서 (특히 선형 대 원형) 및 또한 이들 상이한 대상을 생성 및 정제하는데 사용된 방법의 관점에서 (아래 참조), 및 ceDNA-플라스미드에 대해 원핵생물 유형이고 ceDNA 벡터에 대해 진핵생물 유형인 DNA 메틸화의 관점에서 상이하다.
플라스미드-기반 발현 벡터에 비해 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 사용하는 것의 몇 가지 이점이 있으며, 이러한 이점은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 1) 플라스미드는 박테리아 DNA 서열을 함유하고 원핵생물-특이적 메틸화, 예를 들어, 6-메틸 아데노신 및 5-메틸 시토신 메틸화를 거친 박테리아 DNA 서열을 함유하고, 반면 캡시드-비함유 AAV 벡터 서열은 진핵생물 기원이고 원핵생물-특이적 메틸화를 겪지 않으며; 결과적으로, 캡시드-비함유 AAV 벡터는 플라스미드와 비교하여 염증 및 면역 반응을 유발할 가능성이 적고; 2) 플라스미드는 생산 공정 동안 저항성 유전자의 존재를 요구하지만, ceDNA 벡터는 그렇지 않고; 3) 원형 플라스미드가 세포 내로 도입될 때 핵으로 전달되지 않고, 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 우회하기 위해 과부하가 필요한 반면, ceDNA 벡터는 바이러스성 시스-요소, 즉, 클레아제에 대한 저항성을 부여하고 핵으로 표적화되고 전달되도록 설계될 수 있는 ITR을 함유한다. ITR 기능에 없어서는 안 될 최소 정의 요소는 Rep-결합 부위 (RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)) 및 말단 분해 부위 (TRS; AAV2의 경우 5'-AGTTGG-3' (서열 번호: 64)) 및 헤어핀 형성을 허용하는 가변 팔린드롬 서열인 것으로 가정되고; 4) ceDNA 벡터는 T 세포-매개 면역 반응을 유발하는, 톨-유사 수용체 패밀리의 일원에 결합하는 것으로 보고된 원핵생물-유래 플라스미드에서 종종 발견되는 CpG 디뉴클레오티드의 과다-표현(over-representation)을 갖지 않는다. 대조적으로, 본원에 개시된 캡시드-비함유 AAV 벡터를 이용한 형질도입은 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온으로 형질도입하기 어려운 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.
IV. ITR
본원에 개시된 바와 같이, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 역 말단 반복부 (ITR) 서열 사이에 위치된 이식유전자 또는 이종 핵산 서열을 함유하며, 여기서 ITR 서열은 이 용어가 본원에 정의된 바와 같이, 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 또는 실질적으로 대칭 ITR 쌍일 수 있다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 (i) 적어도 하나의 WT ITR 및 적어도 하나의 변형된 AAV 역 말단 반복부 (모드-ITR) (예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 모드-ITR 쌍이 서로 상이한 3차원 공간 구성을 갖는 2개의 변형된 ITR (예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR), 또는 (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍 (여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐), 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍 (여기서 각각의 모드-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 어느 것으로부터 선택된 ITR 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 본 개시의 방법은 비제한적으로 리포좀 나노입자 전달 시스템과 같은 전달 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, ITR 서열은 2개의 서브패밀리: 척추동물을 감염시키는 파보비리나에, 및 곤충을 감염시키는 덴소비리나에를 포함하는 파보비리다에 패밀리의 바이러스로부터 유래될 수 있다. 파보비리나에 서브패밀리 (파보바이러스라고 함)에는 데펜도바이러스 속이 포함되는데, 대부분의 조건에서, 이의 구성원은 생산적인 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 동시 감염이 필요하다. 데펜도바이러스 속에는 일반적으로 사람 (예를 들어, 혈청형 2, 3A, 3B, 5 및 6) 또는 영장류 (예를 들어, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 및 다른 온혈 동물 (예를 들어, 소, 개, 말 및 양 아데노-관련 바이러스)을 감염시키는 관련 바이러스가 포함한다. 파보바이러스 및 파보비리다에 패밀리의 다른 구성원은 일반적으로 하기에 기재되어 있다: Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996).
본원의 명세서 및 실시예에서 예시된 ITR은 AAV2 WT-ITR이지만, 당업자는, 상기 언급된 바와 같이, 임의의 공지된 파보바이러스, 예를 들어 데펜도바이러스 예컨대 AAV (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈. 예를 들어, NCBI:NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261)로부터의 ITR, 키메라 ITR 또는 임의의 합성 AAV로부터의 ITR을 사용할 수 있다는 것을 알고 있다. 일부 구현예에서, AAV는 온혈 동물, 예를 들어, 조류 (AAAV), 소 (BAAV), 개, 말 및 양 아데노-관련 바이러스를 감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 B19 파보바이러스 (GenBank 수탁 번호: NC 000883), 마우스로부터의 미세 바이러스 (Minute Virus from Mouse; MVM) (GenBank 수탁 번호 NC 001510); 거위 파보바이러스 (GenBank 수탁 번호 NC 001701); 뱀 파보바이러스 1 (GenBank 수탁 번호 NC 006148)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR은 본원에 논의된 바와 같이, 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다.
통상의 숙련가는 ITR 서열이 이중 가닥 홀리데이 접합의 공통 구조를 가지며, 이는 전형적으로 T형 또는 Y형 헤어핀 구조 (예를 들어, 도 2a 및 도 3a 참조)임을 알고 있으며, 여기서 각각의 WT-ITR은 더 큰 팔린드롬 아암 (A-A')에 포매된 2개의 팔린드롬 아암 또는 루프 (B-B' 및 C-C')와 단일 가닥 D 서열 (여기서 이러한 팔린드롬 서열의 순서는 ITR의 플립 또는 플롭 배향을 한정함)에 의해 형성된다. 예를 들어, 하기에 기재된, 상이한 AAV 혈청형 (AAV1-AAV6)으로부터의 ITR의 구조 분석 및 서열 비교를 참조한다: Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14. 당업자는 본원에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열에 기초하여 ceDNA 벡터 또는 ceDNA-플라스미드에 사용하기 위한 임의의 AAV 혈청형으로부터 WT-ITR 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, AAV2의 좌측 ITR과 다른 혈청형으로부터의 좌측 ITR의% 동일성: AAV-1 (84%), AAV-3 (86%), AAV-4 (79%), AAV-5 (58%), AAV-6 (좌측 ITR) (100%) 및 AAV-6 (우측 ITR) (82%)을 보여주는, 문헌(Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439)에 기재된 상이한 AAV 혈청형 (AAV1-AAV6, 및 조류 AAV (AAAV) 및 소 AAV (BAAV))으로부터의 ITR의 서열 비교를 참조한다.
A. 대칭 ITR 쌍
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 5 '내지 3'방향으로: 제1 아데노 관련 바이러스 (AAV) 역 말단 반복부 (ITR), 관심대상의 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하며, 여기서 제1 ITR (5' ITR)과 제2 ITR (3' ITR)이 서로에 대해 대칭이거나 실질적으로 대칭이며, 즉, ceDNA 벡터는 그들의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록 대칭 3 차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 대칭 ITR 쌍, 또는 실질적으로 대칭 ITR 쌍은 야생형 ITR이 아닌 변형된 ITR (예를 들어, 모드-ITR)일 수 있다. 모드-ITR 쌍은 야생형 ITR로부터 하나 이상의 변형을 갖고 서로의 역 보체 (역상)인 동일한 서열을 가질 수 있다. 대안적인 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본 명세서에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이고, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 가질 수 있지만 상응하는 또는 동일한 대칭 3차원 형상을 가질 수 있다.
(i) 야생형 ITR
일부 구현예에서, 대칭 ITR 또는 실질적으로 대칭 ITR은 본원에 기재된 야생형 (WT-ITR)이다. 즉, 두 ITR 모두 야생형 서열을 갖지만 반드시 동일한 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR일 필요는 없다. 즉, 일부 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 이러일 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서 하나 이상의 보존적 뉴클레오티드 변형을 가질 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 바와 같이, 이식유전자 또는 이종 핵산을 함유하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 플랭킹 야생형 역 말단 반복부 (WT-ITR) 서열 사이에 위치된 이식유전자 또는 이종 핵산 서열을 함유하며, 이는 서로의 역 보체 (역상)이거나 또는 대안적으로는 서로 실질적으로 대칭이고, 즉, WT-ITR 쌍이 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 일부 구현예에서, 야생형 ITR 서열 (예를 들어, AAV WT-ITR)은 기능적 Rep 결합 부위 (RBS; 예를 들어, AAV2에 대한 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열 번호: 60) 및 기능성 말단 분해 부위 (TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3', 서열 번호: 62)를 포함한다. //여기서부터 257 p70
일 측면에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 WT 역 말단 반복 서열 (WT-ITR) (예를 들어 AAV WT-ITR) 사이에 작동적으로 위치된 이종 핵산을 인코딩하는 벡터 폴리뉴클레오티드로부터 얻을 수 있다. 즉, 두 ITR 모두 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR일 필요는 없다. 즉, 일부 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 이러일 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서 하나 이상의 보존적 뉴클레오티드 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래되고, 3' WT-ITR은 동일하거나 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR 및 3'WT-ITR은 서로의 거울상이고, 즉 대칭이다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR 및 3' WT-ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다.
WT ITR은 잘 알려져 있다. 일 구현예에서, 2개의 ITR은 동일한 AAV2 혈청형으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 다른 혈청형으로부터의 WT를 사용할 수 있다. 상동성인 다수의 혈청형, 예를 들어 AAV2, AAV4, AAV6, AAV8이 있다. 일 구현예에서, 밀접한 상동성 ITR (예를 들어, 유사한 루프 구조를 갖는 ITR)이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 보다 다양한 AAV WT ITR, 예를 들어, AAV2 및 AAV5를 사용할 수 있고, 또 다른 구현예에서, 실질적으로 WT인 ITR을 사용할 수 있으며, 즉, 그것은 WT의 기본 루프 구조를 갖지만 특성을 변경하거나 특성에 영향을 미치지 않는 일부 보존적 뉴클레오티드 변화를 갖는다. 동일한 바이러스 혈청형으로부터 WT-ITR을 사용할 때, 하나 이상의 조절 서열이 추가로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 ceDNA의 활성의 조절을 허용하는 조절 스위치이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기술의 한 측면은 ceDNA 벡터에 관한 것이며, 여기서 ceDNA 벡터는 2개의 야생형 역 말단 반복 서열 (WT-ITR) 사이에 작동 가능하게 위치된 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하며, WT-ITR은 동일한 혈청형, 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있거나 서로 실질적으로 대칭일 수 있다 (즉, 이들의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가짐). 일부 구현예에서, 대칭 WT-ITR은 기능성 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 핵산 서열은 이식유전자를 인코딩하고, 벡터는 바이러스 캡시드에 있지 않다.
일부 구현예에서, WT-ITR은 동일하지만 서로의 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR에서 서열 AACG는 상응하는 부위에서 3' ITR에서 CGTT (즉, 역 보체)일 수 있다. 일례에서, 5' WT-ITR 센스 가닥은 ATCGATCG의 서열을 포함하고 상응하는 3' WT-ITR 센스 가닥은 CGATCGAT (즉, ATCGATCG의 역 보체)를 포함한다. 일부 구현예에서, WT-ITR ceDNA는 말단 분해 부위 및 복제 단백질 결합 부위 (RPS) (때로는 복제 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 추가로 포함한다.
WT-ITR을 포함하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 예시적인 WT-ITR 서열은 본원의 표 2에 도시되어 있으며, 이는 WT-ITR의 쌍 (5' WT-ITR 및 3' WT-ITR)을 나타낸다.
예시적인 예로서, 본 개시내용은 조절 스위치의 존재 또는 부재 하에 이식유전자 (예를 들어, 이종 핵산 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 ceDNA 벡터를 제공하며, 여기서 ceDNA는 캡시드 단백질이 없고, (a) ceDNA는 WT-ITR을 인코딩하는 ceDNA-플라스미드 (예를 들어, 도 1f-1g 참조)로부터 생성되며, 여기서 각각의 WT-ITR은 이의 헤어핀 이차 구성에서 동일한 수의 분자내 이중화 염기쌍을 갖고 (바람직하게는 이러한 참조 서열과 비교하여 이 구성에서 임의의 AAA 또는 TTT 말단 루프의 결실을 배제함), (b) ceDNA는 미변성 겔 및 실시예 1의 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의해 ceDNA 식별을 위한 분석을 사용하여 ceDNA로서 식별된다.
일부 구현예에서, 플랭킹 WT-ITR은 서로 실질적으로 대칭이다. 이 구현예에서, 5' WT-ITR은 AAV의 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 3' WT-ITR은 AAV의 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있으므로 WT-ITR은 동일한 역 보체가 아니다. 예를 들어, 5' WT-ITR은 AAV2로부터 유래될 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형 (예를 들어, AAV1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12)으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, WT-ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파보바이러스 (예를 들어, 로얄 피톤(royal python) 파보바이러스), 소 파보바이러스, 염소 파보바이러스, 조류 파보바이러스, 개 파보바이러스, 말 파보바이러스, 새우 파보바이러스, 돼지 파보바이러스 또는 곤충 AAV 중 어느 것으로부터 선택된 2개의 상이한 파보바이러스로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 WT ITR의 조합은 AAV2 및 AAV6으로부터의 WT-ITR의 조합이다. 일 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 하나가 다른 ITR에 대해 반전될 때, 적어도 90% 동일하고, 적어도 95% 동일하고, 적어도 96% ... 97% ... 98% ... 99% .... 99.5% 및 그 사이의 모든 포인트 동일하고, 동일한 대칭 3차원 공간 구성을 갖는다. 일부 구현예에서, WT-ITR 쌍은 대칭인 3차원 공간 구성, 예를 들어, A, C-C'. B-B' 및 D 아암의 동일한 3D 구성을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다. 일 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 다른 것에 대해 반전되고, 서로 적어도 95% 동일하고, 적어도 96% ... 97% ... 98% ... 99% .... 99.5% 및 그 사이의 모든 포인트 동일하고, 하나의 WT-ITR은 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열 번호: 60)의 Rep-결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs)를 보유한다. 일부 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 서로 반전되고, 서로 적어도 95% 동일하고, 적어도 96% ... 97% ... 98% ... 99% .... 99.5% 및 그 사이의 모든 포인트 동일하고, 하나의 WT-ITR은 헤어핀 이차 구조 형성을 허용하는 가변 팔린드롬 서열에 추가하여 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)의 Rep-결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs)를 보유한다. 상동성은 디폴트 설정에서 BLAST (기본 지역 정렬 검색 도구), BLASTN과 같은 당 업계에 잘 알려진 표준 수단에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, ITR의 구조적 요소는 큰 Rep 단백질 (예를 들어, Rep 78 또는 Rep 68)과 ITR의 기능적 상호 작용에 관여하는 임의의 구조적 요소일 수 있다. 특정 구현예에서, 구조적 요소는 큰 Rep 단백질과 ITR의 상호 작용에 대한 선택성을 제공하고, 즉, Rep 단백질이 ITR과 기능적으로 상호 작용하는 것을 적어도 부분적으로 결정한다. 다른 구현예에서, Rep 단백질이 ITR에 결합될 때 구조적 요소는 큰 Rep 단백질과 물리적으로 상호 작용한다. 각각의 구조적 요소는, 예를 들어, ITR의 2차 구조, ITR의 뉴클레오티드 서열, 2개 이상의 요소 사이의 간격, 또는 임의의 상기의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 구조적 요소는 A 및 A' 아암, B 및 B' 아암, C 및 C' 아암, D 아암, Rep 결합 부위 (RBE) 및 RBE' (즉, 상보적인 RBE 서열) 및 말단 분해 부위 (trs)로 구성된 군으로부터 선택된다.
단지 예로서, 표 1은 WT-ITR의 예시적인 조합을 나타낸다.
표 1: 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형 또는 상이한 파로바이러스로부터의 WT-ITR의 예시적인 조합. 표시된 순서는 ITR 위치를 나타내지 않으며, 예를 들어, "AAV1, AAV2"는 ceDNA가 5' 위치에 WT-AAV1 ITR을, 3' 위치에 WT-AAV2 ITR을 포함할 수 있고, 반대로, 5' 위치에 WT-AAV2 ITR 및 3' 위치에 WT-AAV1 ITR을 포함할 수 있음을 나타낸다. 약어: AAV 혈청형 1 (AAV1), AAV 혈청형 2 (AAV2), AAV 혈청형 3 (AAV3), AAV 혈청형 4 (AAV4), AAV 혈청형 5 (AAV5), AAV 혈청형 6 (AAV6), AAV 혈청형 7 (AAV7) AAV 혈청형 8 (AAV8), AAV 혈청형 9 (AAV9), AAV 혈청형 10 (AAV10), AAV 혈청형 11 (AAV11) 또는 AAV 혈청형 12 (AAV12); AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈 (예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), 온혈 동물로부터의 ITR (조류 AAV (AAAV), 소 AAV (BAAV), 개, 말 및 양 AAV), B19 파보비리스로부터의 ITR (GenBank 수탁 번호: NC 000883), 마우스로부터의 미세 바이러스 (MVM) (GenBank 수탁 번호 NC 001510); 거위: 거위 파보바이러스 (GenBank 수탁 번호 NC 001701); 뱀: 뱀 파보바이러스 1 (GenBank 수탁 번호 NC 006148).
표 1:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
단지 예로서, 표 2는 일부 상이한 AAV 혈청형으로부터의 예시적인 WT-ITR의 서열을 보여준다.
표 2
Figure pct00004
Figure pct00005
일부 구현예에서, WT-ITR 서열의 뉴클레오티드 서열은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위의 뉴클레오티드를 변형시킴으로써) 변형될 수 있는데, 변형은 상보적 뉴클레오티드에 대한 치환이고, 예를 들어, C 대신 G, 및 그 반대, 및 A 대신 T, 및 그 반대이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 서열 번호: 1, 2, 5-14 중 임의의 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열로 구성된 WT-ITR을 갖지 않는다. 본 발명의 대안의 구현예에서, ceDNA 벡터가 서열 번호: 1, 2, 5-14 중 임의의 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 WT-ITR을 갖는 경우, 플랭킹 ITR은 또한 WT이고, ceDNA 벡터는 예를 들어, 본원 및 PCT/US18/49996 (예를 들어, PCT/US18/49996의 표 11 참조)에 개시된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치 및 서열 번호: 1, 2, 5-14로 구성된 군 중 어느 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 선택된 WT-ITR을 포함한다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터는 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분을 보유하는 WT-ITR 구조를 포함할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는 예시적인 목적으로 야생형 ITR을 사용하여 ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 보여준다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위 (RBS; AAV2에 대해 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열 번호: 60)) 및 말단 분해 부위 (TRS; 5'-AGTT (서열 번호: 62))를 포함하는 하나 이상의 기능성 WT-ITR 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능적이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서로 실질적으로 대칭인 2개의 WT-ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능적이고 적어도 하나의 WT-ITR은 비-기능적이다.
B. 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 ITR 쌍을 포함하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 대한 일반적으로 변형된 ITR (모드- ITR )
본원에서 논의된 바와 같이, ceDNA 벡터는 대칭 ITR 쌍 또는 비대칭 ITR 쌍을 포함할 수 있다. 두 경우 모두에서, ITR의 하나 또는 둘 모두는 변형된 ITR일 수 있으며, 차이점은 첫 번째 경우 (즉, 대칭 모드-ITR), 모드-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가지며 (즉, 동일한 A-A', C-C' 및 B-B' 아암 구성를 가짐), 반면 두 번째 경우 (즉, 비대칭 모드-ITR), 모드-ITR은 다른 3차원 공간 구성을 갖는다 (즉, A-A', C-C' 및 B-B' 아암의 다른 구성을 가짐).
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 야생형 ITR 서열 (예를 들어 AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 ITR 중 적어도 하나는 기능적 Rep 결합 부위 (RBS; 예를 들어, AAV2에 대해 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열 번호: 60) 및 기능성 말단 분해 부위 (TRS; 5'-AGTT-3', 서열 번호: 62)를 포함한다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 비-기능적 ITR이다. 일 구현예에서, 상이한 또는 변형된 ITR은 각각 상이한 혈청형으로부터의 야생형 ITR이 아니다.
ITR에서의 특정 변경 및 돌연변이는 본원에 상세하게 기술되어 있지만, ITR의 맥락에서, "변경된" 또는 "돌연변이된" 또는 "변형된"은, 뉴클레오티드가 야생형, 참조 또는 원래 ITR 서열에 대해 삽입, 결실 및/또는 치환된 것을 나타낸다. 변경된 또는 돌연변이된 ITR은 조작된 ITR일 수 있다. 본원에 사용된 "조작된"은 인간의 손에 의해 조작된 측면을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 적어도 하나의 측면, 예를 들어, 이의 서열이 사람의 손에 의해 조작되어 자연에 존재하는 측면과 상이할 때 폴리펩티드가 "조작된" 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, 모드-ITR은 합성일 수 있다. 일 구현예에서, 합성 ITR은 하나 초과의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 서열에 기초한다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV 기반 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV-공급 서열을 일부만을 갖거나 갖지 않더라도 상기 기술된 ITR 구조를 보존한다. 일부 측면에서, 합성 ITR은 야생형 Rep 또는 특정 혈청형의 Rep와 우선적으로 상호 작용할 수 있거나, 일부 경우 야생형 Rep에 의해 인식되지 않고 돌연변이된 Rep에 의해서만 인식될 것이다.
당업자는 공지된 수단에 의해 다른 혈청형에서 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 변화가 A, A', B, B', C, C' 또는 D 영역에 있는지 확인하고 또 다른 혈청형에서 해당 영역을 결정한다. BLAST® (기본 지역 정렬 검색 도구) 또는 다른 상동성 정렬 프로그램을 디폴트 상태로 사용하여 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 본 발명은 또한 상이한 AAV 혈청형의 조합으로부터의 모드-ITR을 포함하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 집단 및 복수의 ceDNA 벡터를 제공하고, 즉, 하나의 모드-ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 모드-ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 일 구현예에서 하나의 ITR은 AAV2 ITR 서열로부터 유래하거나 이를 기초로 할 수 있고, ceDNA 벡터의 다른 ITR은 AAV 혈청형 1 (AAV1), AAV 혈청형 4 (AAV4), AAV 혈청형 5 (AAV5), AAV 혈청형 6 (AAV6), AAV 혈청형 7 (AAV7), AAV 혈청형 8 (AAV8), AAV 혈청형 9 (AAV9), AAV 혈청형 10 (AAV10) , AAV 혈청형 11 (AAV11), 또는 AAV 혈청형 12 (AAV12)의 임의의 하나 이상의 ITR 서열로부터 유래하거나 이를 기초로 할 수 있다.
임의의 파보바이러스 ITR은 변형을 위해 ITR 또는 기본 ITR로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파보바이러스는 데펜도바이러스이다. 보다 바람직하게는 AAV. 선택된 혈청형은 혈청형의 조직 향성(tropism)에 기초할 수 있다. AAV2는 광범위한 조직 향성을 가지며, AAV1은 뉴런 및 골격근을 우선적으로 표적화하고, AAV5는 뉴런, 망막 색소 상피 및 광수용체를 우선적으로 표적화한다. AAV6은 골격근 및 폐를 우선적으로 표적화한다. AAV8은 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 우선적으로 표적화한다. AAV9는 간, 골격 및 폐 조직을 우선적으로 표적화한다. 일 구현예에서, 변형된 ITR은 AAV2 ITR에 기초한다.
보다 구체적으로, 구조적 요소가 특정한 큰 Rep 단백질과 기능적으로 상호 작용하는 능력은 구조적 요소를 변형시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 구조적 요소의 뉴클레오티드 서열은 ITR의 야생형 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 일 구현예에서, ITR의 구조적 요소 (예를 들어, A 아암, A' 아암, B 아암, B' 아암, C 아암, C' 아암, D 아암, RBE, RBE' 및 trs)는 제거되고 다른 파보바이러스로부터의 야생형 구조적 요소로 대체될 수 있다. 예를 들어, 대체 구조는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파보바이러스 (예를 들어, 로얄 피톤 파보바이러스), 소 파보바이러스, 염소 파보바이러스, 조류 파보바이러스, 개 파보바이러스, 말 파보바이러스, 새우 파보바이러스, 돼지 파보바이러스 또는 곤충 AAV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, ITR은 AAV2 ITR일 수 있고, A 또는 A' 아암 또는 RBE는 AAV5로부터의 구조적 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, ITR은 AAV5 ITR일 수 있고, C 또는 C' 아암, RBE, 및 trs는 AAV2로부터의 구조적 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR B 및 B' 아암으로 대체된 B 및 B' 아암을 갖는 AAV5 ITR일 수 있다.
단지 예로서, 표 3은 변형된 ITR의 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 예시적인 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타내며, 여기서 X는 상응하는 야생형 ITR에 대한 해당 섹션에서의 적어도 하나의 핵산의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타낸다. 일부 구현예에서, C 및/또는 C' 및/또는 B 및/또는 B'의 임의의 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에서 3개의 순차적인 T 뉴클레오티드 (즉, TTT)를 보유한다. 예를 들어, 변형 결과, 단일 아암 ITR (예를 들어, 단일 C-C' 아암 또는 단일 B-B' 아암) 또는 변형된 C-B' 아암 또는 C'-B 아암, 또는 적어도 하나의 절단된 아암 (예를 들어, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암)을 갖는 2개의 아암 ITR 중 어느 것이 된다면, 적어도 하나의 단일 아암 또는 2개의 아암 ITR 중 적어도 하나의 아암 (하나의 아암이 절단될 수 있는 경우)은 적어도 하나의 말단 루프에서 3개의 순차적인 T 뉴클레오티드 (즉, TTT)를 보유한다. 일부 구현예에서, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암은 말단 루프에서 3개의 순차적인 T 뉴클레오티드 (즉, TTT)를 갖는다.
표 3: ITR의 상이한 B-B' 및 C-C' 영역 또는 아암에 대한 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 예시적인 조합 (X는 뉴클레오티드 변형, 예를 들어, 상기 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 첨가, 결실 또는 치환을 나타냄).
Figure pct00006
일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍, 또는 본원에 개시된 바와 같은 대칭 모드-ITR 쌍을 포함하는 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 모드-ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A'와 C 사이, C와 C' 사이, C'와 B 사이, B와 B' 사이, 및 B'와 A 사이에서 선택된 영역 중 어느 하나 이상에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C 또는 C' 또는 B 또는 B' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 여전히 스템-루프의 말단 루프를 보존한다. 일부 구현예에서, C 및 C' 및/또는 B 및 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적인 T 뉴클레오티드 (즉, TTT)를 보유한다. 대안적인 구현예에서, C 및 C' 및/또는 B 및 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적인 A 뉴클레오티드 (즉, AAA)를 보유한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A', A 및/또는 D로부터 선택된 영역 중 임의의 하나에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A 및/또는 A' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 D 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 구조적 요소의 뉴클레오티드 서열을 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위의 뉴클레오티드를 변형함으로써) 변형시켜 변형된 구조적 요소를 생성할 수 있다. 일 구현예에서, ITR에 대한 특정 변형은 본원에 예시되어 있거나 (예를 들어, 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242의 서열 번호: 3, 4, 15-47, 101-116 또는 165-187, 또는 도 7a-7b에 도시됨 (예를 들어, PCT/US2018/064242 중의 서열번호: 97-98, 101-103, 105-108, 111-112, 117-134, 545-54)에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, ITR은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위의 뉴클레오티드를 변형시킴으로써) 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, ITR은 서열 번호: 3, 4, 15-47, 101-116 또는 165-187의 변형된 ITR, 또는 서열 번호: 3, 4, 15-47, 101-116 또는 165-187의 A-A' 아암 및 C-C' 및 B-B' 아암의 RBE-함유 섹션, 또는 국제 출원 PCT/US18/49996 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 표 2-9 (즉, 서열 번호: 110-112, 115-190, 200-468)에 나타낸 것 중 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 예를 들어 특정 아암의 전부, 예를 들어, A-A' 아암의 전부 또는 일부, 또는 B-B' 아암의 전부 또는 일부 또는 C-C' 아암의 전부 또는 일부의 제거 또는 결실, 또는 대안적으로, 스템 (예를 들어, 단일 아암)을 캡핑하는 최종 루프가 존재하는 한 루프의 스템을 형성하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다 (예를 들어, 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242의 도 7a의 ITR-21 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다 (예를 들어, 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242의 도 3b의 ITR-1 또는 도 7a의 ITR-45 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거 및 B-B' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 염기쌍의 제거의 임의의 조합이 구상되며, 예를 들어, C-C' 아암에서 6개의 염기쌍이 제거될 수 있고, B-B' 아암에서 2개의 염기쌍이 제거될 수 있다. 예시적인 예로서, 도 3b는 각각의 C 부분 및 C' 부분으로부터 결실된 적어도 7개의 염기쌍, C 및 C' 영역 사이의 루프에서 뉴클레오티드의 치환, 및 변형된 ITR이 적어도 하나의 아암 (예를 들어, C-C')이 절단된 2개의 아암을 포함하도록 B 영역 및 B' 영역 각각으로부터 적어도 하나의 염기쌍 결실을 갖는 예시적인 변형된 ITR을 보여준다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 또한, B-B' 아암이 WT ITR에 대해 또한 절단되도록 B 영역 및 B' 영역 각각으로부터 적어도 하나의 염기쌍 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 대해 1 내지 50개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개)의 뉴클레오티드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 WT ITR 서열에 대해 1 내지 30개의 뉴클레오티드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 대해 2 내지 20개의 뉴클레오티드 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 A 또는 A' 영역의 RBE-함유 부분에서 임의의 뉴클레오티드 결실을 함유하지 않아서 DNA 복제 (예를 들어, Rep 단백질에 의한 RBE에의 결합 또는 말단 분해 부위에서의 닉킹)를 방해하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위해 포함된 변형된 ITR은 본원에 기재된 바와 같이 B, B', C 및/또는 C 영역에서 하나 이상의 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 대칭 ITR 쌍 또는 비대칭 ITR 쌍을 포함하는, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치 및 서열 번호: 3, 4, 15-47, 101-116 또는 165-187로 구성된 군 중 어느 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 선택된 적어도 하나의 변형된 ITR을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 구조적 요소의 구조는 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조적 요소는 스템의 높이 및/또는 루프에서 뉴클레오티드 수의 변화이다. 예를 들어, 스템의 높이는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위일 수 있다. 일 구현예에서, 스템 높이는 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 9개의 뉴클레오티드일 수 있고, Rep와 기능적으로 상호 작용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 스템 높이는 약 7개의 뉴클레오티드일 수 있고, Rep와 기능적으로 상호 작용할 수 있다. 또 다른 예에서, 루프는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위를 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, RBE 또는 확장된 RBE 내의 GAGY 결합 부위 또는 GAGY 관련 결합 부위의 수는 증가 또는 감소될 수 있다. 일 예에서, RBE 또는 확장된 RBE는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 GAGY 결합 부위 또는 그 안의 임의의 범위를 포함할 수 있다. 서열이 Rep 단백질에 결합하기에 충분하다면, 각각의 GAGY 결합 부위는 독립적으로 정확한 GAGY 서열 또는 GAGY와 유사한 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 두 요소 (예컨대 비제한적으로 RBE 및 헤어핀) 사이의 간격은 큰 Rep 단백질과의 기능적 상호 작용을 변경하기 위해 변경 (예를 들어, 증가 또는 감소)될 수 있다. 예를 들어, 간격은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위일 수 있다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 야생형 AAV2 ITR 구조와 관련하여 변형된 ITR 구조를 포함할 수 있지만 여전히 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분을 보유한다. 도 2a 및 도 2b는 ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 보여준다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위 (AAV2의 경우 RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열번호 60)) 및 말단 확인 부위 (TRS; 5'-AGTT (서열 번호 62))를 포함하는 하나 이상의 기능성 ITR 폴리뉴클레오티드 서열 를 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 ITR (wt 또는 변형된 ITR)은 기능적이다. 대안적 구현예에서, ceDNA 벡터가 서로 상이하거나 비대칭인 2 개의 변형된 ITR을 포함하는 경우, 하나 이상의 변형된 ITR은 기능적이고 하나 이상의 변형된 ITR은 비-기능적이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 변형된 ITR (예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에서 변형을 갖는다. 루프 암, 절단된 암 또는 스페이서 내에서 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 국제 출원 PCT/US18/49996의 표 2 (즉, 서열 번호: 135-190, 200-233); 표 3 (예를 들어, 서열 번호: 234-263); 표 4 (예를 들어, 서열 번호: 264-293); 표 5 (예를 들어, 본원의 서열 번호: 294-318); 표 6 (예를 들어, 서열 번호: 319-468; 및 표 7-9 (예를 들어, 서열 번호: 101-110, 111-112, 115-134)) 또는 표 10A 또는 10B (예를 들어, 서열 번호: 9, 100, 469-483, 484-499)에 열거되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 mod-ITR 쌍을 포함하는 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 변형된 ITR은 국제 출원 PCT/US18/49996의 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10A-10B에 나타나며, 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.
상기 부류 각각에서 비대칭 ITR 쌍, 또는 대칭 mod-ITR 쌍을 포함하는 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 추가의 예시적인 변형된 ITR이 표 4A 및 4B에 제공되어 있다. 표 4A에서 우측 변형된 ITR의 예측된 이차 구조는 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242의 도 7a 및 표 4B에서 좌측 변형된 ITR의 예측된 2차 구조가 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242의 도 7b에 도시되며, 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.
표 4A 및 표 4B는 예시적인 우측 및 좌측 변형된 ITR을 나타낸다.
표 4A: 예시적인 변형된 우측 ITR. 이러한 예시적인 변형된 우측 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'의 RBE (서열 번호: 60), ACTGAGGC의 스페이서 (서열 번호: 69), 스페이서 보체 GCCTCAGT (서열 번호: 70) 및 RBE' (즉, GAGCGAGCGAGCGCGC (서열 번호 71)의 RBE에 대한 보체).
Figure pct00007
Figure pct00008
표 4B : 예시적인 변형된 좌측 ITR. 이러한 예시적인 변형된 좌측 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'의 RBE (서열 번호: 60), ACTGAGGC의 스페이서 (서열 번호: 69), 스페이서 보체 GCCTCAGT (서열 번호: 70) 및 GAGCGAGCGAGCGCGC (서열 번호 71)의 RBE 보체 (RBE')을 포함할 수 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
일 구현예에서, ceDNA 벡터는 5'에서 3'의 방향으로 제1 아데노-관련 바이러스 (AAV) 역 말단 반복부 (ITR), 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 본원에 기재된 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR (5' ITR) 및 제2 ITR (3' ITR)은 서로에 대해 비대칭이고, 즉, 이들은 서로 상이한 3차원 구성을 갖는다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR일 수 있고, 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있거나, 반대로, 제1 ITR이 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR이 야생형 ITR일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 둘 다 모드-ITR이지만, 상이한 서열, 또는 상이한 변형을 갖고, 따라서 동일한 변형된 ITR이 아니고, 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 다르게 말하면, 비대칭 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는 WT-ITR에 대해 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 ITR에 반영되지 않거나; 또는 대안적으로, 비대칭 ITR이, 서로 상이한 서열 및 상이한 3차원 형상을 가질 수 있는 변형된 비대칭 ITR 쌍을 갖는 ITR을 포함한다. ceDNA-플라스미드를 생성하는데 사용하기 위한 ceDNA 벡터 내의 예시적인 비대칭 ITR은 표 4A 및 4B에서 보여준다.
대안적 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 2개의 대칭인 모드-ITR을 포함하며, 즉, 두 ITR은 동일한 서열을 갖지만, 서로의 역 보체 (역상)이다. 일부 구현예에서, 대칭 모드-ITR 쌍은 동일한 AAV 혈청형으로부터의 야생형 ITR 서열에 대한 결실, 삽입 또는 치환 중 적어도 하나 또는 임의의 조합을 포함한다. 대칭 ITR에서의 첨가, 결실 또는 치환은 동일하지만 서로의 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR의 C 영역에서 3개의 뉴클레오티드의 삽입은 3' ITR의 C' 영역에서의 상응하는 섹션에서 3개의 역 보체 뉴클레오티드의 삽입에 반영될 것이다. 단지 설명의 목적으로만, 5' ITR에서 첨가가 AACG인 경우, 상응하는 부위에서의 3' ITR에서 첨가는 CGTT이다. 예를 들어, 5' ITR 센스 가닥이 ATCGATCG인 경우, G와 A 사이에 AACG가 첨가되어 ATCG AACG ATCG 서열 (서열번호: 51)이 생성된다. 상응하는 3' ITR 센스 가닥은 CGATCGAT (ATCGATCG의 역 보체)이고, T와 C 사이에 CGTT (즉, AACG의 역 보체)를 첨가하여 CGAT CGTT CGAT (서열번호: 49) (ATCG AACG ATCG의 역 보체) 서열 (서열번호: 51)이 생성된다.
대안적인 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이고, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 가질 수 있지만 대응하는 또는 동일한 대칭 3차원 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 하나의 변형된 ITR은 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 변형된 ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있지만, 이들은 동일한 영역에서 동일한 돌연변이 (예를 들어, 뉴클레오티드 삽입, 결실 또는 치환)를 갖는다. 달리 언급하면, 단지 설명의 목적으로, 5' 모드-ITR은 AAV2로부터 유래될 수 있고, C 영역에서 결실을 가질 수 있으며, 3' 모드-ITR은 AAV5로부터 유래될 수 있고, C' 영역에서 상응하는 결실을 가질 수 있으며, 5' 모드-ITR 및 3' 모드-ITR이 동일하거나 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 경우, 이들은 본 명세서에서 변형된 ITR 쌍으로 사용하기 위해 포함된다.
일부 구현예에서, 실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어, 실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 모드-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 가지며 또한 이의 동족 모드-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형태로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다. 단지 예로서, 실질적으로 대칭인 ITR은 그 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 대칭 공간 구성을 가질 수 있다. 이것은, 예를 들어, G-C 쌍이, 예를 들어, C-G 쌍으로 또는 그 반대로 변형될 때, 또는 A-T 쌍이 T-A 쌍으로 또는 그 반대로 변형될 때 발생할 수 있다. 따라서, ATCG AACG ATCG (서열 번호: 51)로서 변형된 5' ITR 및 CGAT CGTT CGAT (서열 번호: 49) (즉, ATCG AACG ATCG (서열 번호: 51)의 역 보체)로서 변형된 3' ITR의 상기 예시적인 예를 사용하면, 예를 들어, 5' ITR이 ATCG AAC C ATCG (서열 번호: 50)의 서열을 갖는 경우, 이러한 변형된 ITR은 여전히 대칭일 것이며, 여기서 첨가에서 G는 C로 변형되고, 실질적으로 대칭인 3' ITR은 A로의 첨가에서 T의 상응하는 변형 없이 CGATCGTT CGAT (서열 번호: 49)의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 변형된 ITR 쌍은 변형된 ITR 쌍이 대칭 입체화학을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다.
표 5는 예시적인 대칭 변형된 ITR 쌍 (즉, 좌측 변형된 ITR 및 대칭 우측 변형된 ITR)을 보여준다. 서열의 굵은 체 (빨간색) 부분은 도 31a-46b에 또한 도시된 부분 ITR 서열 (즉, A-A', C-C' 및 B-B' 루프의 서열)을 식별한다. 이러한 예시적인 변형된 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)의 RBE, ACTGAGGC (서열 번호: 69)의 스페이서, 스페이서 보체 GCCTCAGT (서열 번호: 70) 및 GAGCGAGCGAGCGCGC (서열 번호: 71)의 RBE' (즉, RBE에 대한 보체)를 포함할 수 있다.
Figure pct00011
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Figure pct00013
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일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍을 포함하는 ceDNA 벡터는 본원의 표 4A-4B 중 임의의 하나 이상에 나타낸 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열 또는 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242의 도 7a-도 7b에 도시된 서열(이는 그 전문이 본원에 참고로 포함), 또는 2018년 9월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/US18/49996의 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10A-10B에 개시된 서열에서의 임의의 변형에 상응하는 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있다.
V. 제어된 이식유전자 발현을 위한 예시적인 ceDNA 벡터
상술한 바와 같이, 본 개시내용은 비대칭 ITR 쌍, 대칭 ITR 쌍, 또는 전술한 바와 같이 실질적으로 대칭인 ITR 쌍 중 임의의 하나를 포함하는 이식유전자를 인코딩하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 재조합 ceDNA 발현 벡터 및 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 플랭킹 ITR 서열 및 이식유전자를 갖는 제어된 이식유전자 발현을 위한 재조합 ceDNA 벡터에 관한 것으로, 여기서 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이며, ceDNA는 플랭킹 ITR 사이에 위치한 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 이식유전자의 핵산을 포함하는 발현 카세트)을 추가로 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다.
제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 적어도 하나의 ITR이 변경된 경우 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 ceDNA 벡터일 수 있다. 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터가 도입될 숙주 세포와 양립 가능하다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 선형일 수 있다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 염색체외 엔티티로서 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 공여체 서열을 숙주 세포의 게놈으로 통합시킬 수 있는 요소(들)를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 "이식유전자" 및 "이종 뉴클레오티드 서열"은 동의어이다.
이제 도 1a-1g를 참조하면, 본 개시내용의 ceDNA 벡터를 제조하는데 유용한 2개의 비제한적 플라스미드의 기능적 성분의 개략도가 도시되어 있다. 도 1a, 1b, 1d, 1f는 ceDNA 벡터 또는 상응하는 ceDNA 플라스미드 서열의 작제물을 보여준다. ceDNA 벡터는 캡시드가 없고, 제1 ITR, 발현성 이식유전자 카세트 및 제2 ITR의 순서로 인코딩된 플라스미드로부터 수득될 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 ITR 서열은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이다. ceDNA 벡터는 캡시드가 없고, 하기 순서로 코딩하는 플라스미드로부터 얻을 수 있다: 제1 ITR, 발현성 이식유전자 (단백질 또는 핵산) 및 제2 ITR, 여기서 제1 및 제2 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로에 대해 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이다. 일부 구현예에서, 발현성 이식유전자 카세트는 필요에 따라 인핸서/프로모터, 하나 이상의 상동성 아암, 공여체 서열, 전사 후 조절 요소 (예를 들어, WPRE, 예를 들어, 서열번호 67)) 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 (예를 들어, BGH 폴리A, 예를 들어, 서열번호 68)를 포함한다.
도 5는 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다중 플라스미드 작제물로부터 ceDNA의 생성을 확인하는 겔이다. ceDNA는 상기 도 4a와 관련하여 그리고 실시예에서 논의된 바와 같이, 겔에서의 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
A. 조절 요소.
본원에 정의된 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 ITR 쌍을 포함하는 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 시스-조절 요소의 특정 조합을 추가로 포함한다. 시스-조절 요소는 프로모터, 리보스위치, 절연체, 미르-조절 가능 요소, 전사 후 조절 요소, 조직- 및 세포 유형-특이적 프로모터 및 인핸서를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, ITR은 이식유전자에 대한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가 성분, 예를 들어, 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 본원에 기재된 조절 스위치, 또는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 조절 스위치를 포함하는 조절 요소는 국제 출원 PCT/US18/49996에 보다 상세하게 논의되어 있으며, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 조절 서열, 및 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 유전자 조절 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 숙주 세포에서 뉴클레아제의 발현을 제어하기에 적합하다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자, 예컨대 본 개시내용의 뉴클레아제(들)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 지시할 수 있는, 적합한 프로모터 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 연결된 인트론 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터의 효능을 증가시키기 위해 인핸서 서열이 프로모터의 상류에 제공된다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 인핸서 및 프로모터를 포함하고, 여기서 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 있는 인트론 서열을 포함하고, 상기 인트론은 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위(들)를 포함하고, 상기 프로모터는 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
합성적으로 또는 실시예에서 본원에 기재된 바와 같은 세포-기반 생산 방법을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터는 시스-조절 요소, 예컨대 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE) (예를 들어, 서열 번호: 67) 및 BGH 폴리A (서열 번호: 68)의 특정 조합을을 추가로 포함할 수 있다. 발현 작제물에 사용하기에 적합한 발현 카세트는 바이러스 캡시드에 의해 부과된 패키징 제약에 의해 제한되지 않는다.
(i). 프로모터:
당업자는 본 발명의 ceDNA 벡터에 사용되는 프로모터가 그들이 촉진하는 특정 서열에 적합하도록 조정되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 가이드 RNA는 프로모터가 전혀 필요하지 않을 수 있으며, 그 기능은 재조합 이벤트에 영향을 미치기 위해 천연 DNA에 특정 표적 서열을 가진 이중체를 형성하는 것이다. 대조적으로, ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 뉴클레아제는 벡터로부터 효율적으로 발현 될 수 있도록 프로모터의 이점을 얻을 수 있고, 선택적으로 조절가능한 방식으로도 발현될 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 세포-특이성뿐만 아니라 전체 발현 수준에 영향을 줄 수 있는 프로모터를 포함한다. 이식유전자 발현을 위해, 이들은 매우 활성인 바이러스-유래 즉각적인 조기 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 조직 특이적 진핵생물 프로모터를 함유하여 이식유전자 발현을 특정 세포 유형으로 제한하고 조절되지 않은 이소성 발현으로 인한 독성 효과 및 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발현 카세트는 합성 조절 요소, 예컨대 CAG 프로모터 (서열 번호: 72)를 함유할 수 있다. CAG 프로모터는 (i) 사이토메갈로바이러스 (CMV) 조기 인핸서 요소, (ii) 치킨 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함한다. 대안적으로, 발현 카세트는 알파-1-항트립신 (AAT) 프로모터 (서열 번호: 73 또는 서열 번호: 74), 간 특이적 (LP1) 프로모터 (서열 번호: 75 또는 서열 번호: 76), 또는 인간 신장 인자-1 알파 (EF1a) 프로모터 (예를 들어, 서열 번호: 77 또는 서열 번호: 78)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 하나 이상의 구성적 프로모터, 예를 들어, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서를 가짐) 또는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 즉각적인 조기 프로모터 (선택적으로 CMV 인핸서, 예를 들어, 서열 번호: 79를 가짐)를 포함한다. 대안적으로, 유도성 프로모터, 이식유전자를 위한 천연 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 당 업계에 공지된 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.
상기 기재된 것들을 포함하여, 적합한 프로모터는 바이러스로부터 유래될 수 있으며 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물 유기체를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 적합한 프로모터를 사용하여 임의의 RNA 폴리머라제 (예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 구동시킬 수 있다. 예시적인 프로모터는 SV40 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP); 단순 포진 바이러스 (HSV) 프로모터, CMV 즉각적인 조기 프로모터 영역 (CMVIE)과 같은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 인간 U6 소형 핵 프로모터 (U6, 예를 들어, 서열 번호: 80) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), 향상된 U6 프로모터 (예를 들어, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)), 인간 H1 프로모터 (H1) (예를 들어, 서열 번호: 81), CAG 프로모터 (서열 번호: 72), 인간 알파 1-안티팁신(antitypsin) (HAAT) 프로모터 (예를 들어, 서열 번호: 82) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 이들 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 하류 인트론 함유 말단에서 변경된다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)를 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 이질적이다.
일 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료 단백질을 인코딩하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료 단백질을 인코딩하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 공지되어 있고 특성화되어 있다. 사용된 프로모터 영역은 SV40 인핸서 (서열 번호 126)를 포함하는, 하나 이상의 추가 조절 서열 (예를 들어, 천연), 예를 들어 인핸서 (예를 들어, 서열 번호: 79 및 서열 번호: 83)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 프로모터의 비제한적인 예는, 예를 들어, (서열 번호: 72)의 CAG 프로모터, HAAT 프로모터 (서열 번호: 82), 인간 EF1-α 프로모터 (서열 번호: 77) 또는 EF1a 프로모터의 단편 (서열 번호: 78), IE2 프로모터 (예를 들어, 서열 번호: 84) 및 랫트 EF1-α 프로모터 (서열 번호: 85), 또는 1E1 프로모터 단편 (서열 번호: 125)를 포함한다.
(ii). 폴리아데닐화 서열:
ceDNA 벡터로부터 발현된 mRNA를 안정화시키고 핵 유출 및 번역을 돕기 위해 폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 서열이 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 포함될 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 벡터는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50개 또는 그 이상의 아데닌 디뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 약 43개 뉴클레오티드, 약 40-50개 뉴클레오티드, 약 40-55개 뉴클레오티드, 약 45-50개 뉴클레오티드, 약 35-50개 뉴클레오티드, 또는 이들 사이의 임의의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터가, 예를 들어, 항체의 제어된 발현의 경우에, 2개의 이식유전자를 포함할 수 있는 경우, ceDNA 벡터는 항체 중쇄 (예를 들어, 예시적인 중쇄는 서열 번호: 57임)를 인코딩하는 핵산 및 항체 경쇄 (예를 들어, 예시적인 경쇄는 서열 번호: 58임)를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있고, 제1 이식유전자의 3' 폴리아데닐화, 및 제1 및 제2 이식유전자 사이에 (예를 들어, 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산과 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 사이에) 위치한 IRES (예를 들어, 서열 번호: 190)가 존재할 수 있다. 이러한 구현예에서, 하나 초과의 이식유전자 (예를 들어, 2 또는 3개 이상)를 인코딩하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어, IRES (내부 리보솜 진입 부위) 서열 (서열 번호: 190)을 포함할 수 있고, 여기서 IRES 서열은 폴리아데닐화 서열의 3'에 위치하여 제1 이식유전자의 3'에 위치한 제2 이식유전자 (예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편)가 동일한 ceDNA 벡터에 의해 번역 및 발현되어 ceDNA 벡터가 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 2개 이상의 이식유전자를 발현시킬 수 있도록 한다.
발현 카세트는 당 업계에 공지된 폴리아데닐화 서열 또는 이의 변형, 예컨대 소 BGHpA (예를 들어, 서열 번호: 68) 또는 바이러스 SV40pA (예를 들어, 서열 번호: 86), 또는 합성 서열 (예를 들어, 서열 번호: 87)로부터 단리된 천연 발생 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 폴리 A 신호 상류 인핸서 (USE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, USE는 SV40pA 또는 이종 폴리-A 신호와 조합하여 사용될 수 있다.
발현 카세트는 또한 이식유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사 후 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE) (예를 들어, 서열 번호: 67)는 이식유전자의 발현을 증가시키는 데 사용된다. 단순 포진 바이러스 또는 B형 간염 바이러스 (HBV)의 티미딘 키나제 유전자로부터의 전사 후 요소와 같은 다른 전사 후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비 서열은 이식유전자, 예를 들어, VH-02 (서열 번호: 88) 및 VK-A26 서열 (서열 번호: 89), 또는 IgK 신호 서열 (서열 번호: 128), Glu 분비 신호 서열 (서열 번호: 188) 또는 TND 분비 신호 서열 (서열 번호: 189)에 연결될 수 있다.
(iii). 핵 국재화 서열
일부 구현예에서, RNA 가이드 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 벡터는 하나 이상의 핵 국재화 서열 (NLS), 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 NLS는 아미노-말단에 또는 그 근처, 카복시-말단에 또는 그 근처에 위치하거나, 또는 이들의 조합 (예를 들어, 아미노-말단에서 하나 이상의 NLS 및/또는 카복시 말단에서 하나 이상의 NLS)에 위치한다. 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 단일 NLS가 하나 초과의 카피에 존재하고/하거나 하나 이상의 다른 NLS와 조합하여 하나 이상의 카피에 존재하도록 다른 것과 독립적으로 선택될 수 있다. NLS의 비제한적인 예는 표 6에 제시되어 있다.
표 6: 핵 국재화 신호
Figure pct00017
B. ceDNA 벡터의 추가 성분
본 개시내용의 ceDNA 벡터는 유전자 발현을 위해 다른 성분을 인코딩하는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 특정 유전자 표적화 사건을 선택하기 위해, 보호 shRNA가 마이크로RNA에 포매되어 알부민 유전자좌와 같은 고도로 활성인 유전자좌에 부위 특이적으로 통합되도록 설계된 재조합 ceDNA 벡터에 삽입될 수 있다. 이러일 구현예는 하기에 기재된 바와 같은 임의의 유전자 배경에서 유전자 변형 간세포의 생체내 선택 및 확장을 위한 시스템을 제공할 수 있다: Nygaard et al., A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo , Gene Therapy, June 8, 2016. 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 형질전환, 형질감염, 형질도입 또는 이와 유사한 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 선택 가능한 마커는 그 산물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구성에 대한 프로토트로피(prototrophy), NeoR 등을 제공하는 유전자이다. 특정 구현예에서, 양성 선별 마커는 NeoR과 같은 공여체 서열에 포함된다. 음성 선별 마커는 공여체 서열의 하류에 통합될 수 있으며, 예를 들어 음성 선별 마커를 인코딩하는 핵산 서열 HSV-tk는 공여체 서열의 하류에 있는 핵산 작제물에 통합될 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 합성 공정을 사용하여 생산된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 예를 들어 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242에 개시된 바와 같이 유전자 편집에 사용될 수 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함되며, 5' 상동성 아암, 3' 상동성 아암, 5' 상동성 아암 상류 및 근접한 폴리아데닐화 부위 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예시적인 상동성 아암은 5' 및 3' 알부민 상동성 아암 (서열번호: 151 및 152) 또는 CCR5 5'- 및 3' 상동성 아암 (예를 들어, 서열번호: 153, 154)이다.
C. 조절 스위치
분자 조절 스위치는 신호에 응답하여 측정 가능한 상태 변화를 생성하는 스위치이다. 이러한 조절 스위치는 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현의 출력을 제어하기 위해 본원에 기재된 ceDNA 벡터와 유용하게 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 미세 조정하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 이는 ceDNA 벡터의 생화학적 봉쇄(biocontainment) 기능으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 스위치는 제어 가능하고 조절 가능한 방식으로 ceDNA에서 관심 유전자의 발현을 시작 또는 중지 (즉, 셧다운)하도록 설계된 "ON/OFF" 스위치이다. 일부 구현예에서, 스위치는 스위치가 활성화되면 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포 프로그래밍된 사멸을 겪도록 지시할 수 있는 "사멸 스위치"를 포함할 수 있다. 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA에 사용하기 위해 포함된 예시적인 조절 스위치는 이식유전자의 발현을 조절하는데 이용될 수 있고 국제 출원 PCT/US18/49996 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에서 보다 상세히 논의된다.
(i) 이진 조절 스위치
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 제어 가능하게 조절하는 역할을 할 수 있는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 ITR 사이에 위치한 발현 카세트는 관심 유전자에 작동적으로 연결된, 조절 영역, 예를 들어, 프로모터, 시스-요소, 리프레서, 인핸서 등을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 조절 영역은 하나 이상의 보조 인자 또는 외인성 제제에 의해 조절된다. 단지 예로서, 조절 영역은 소분자 스위치 또는 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예는 호르몬-유도성 또는 금속-유도성 프로모터이다. 다른 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
(ii) 소분자 조절 스위치
다양한 당 업계에 공지된 소분자 기반 조절 스위치가 당 업계에 공지되어 있고, 조절 스위치 제어 ceDNA 벡터를 형성하기 위해 본원에 개시된 ceDNA 벡터와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 문헌(Taylor, et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15)에 기재된 것과 같이, 작동적으로 연결된 이식유전자의 발현을 제어하는 인공 프로모터와 함께, 직교 리간드/핵 수용체 쌍, 예를 들어 레티노이드 수용체 변이체/LG335 및 GRQCIMFI; 조작된 스테로이드 수용체, 예를 들어, 프로게스테론에 결합할 수 없지만 RU486 (미페프리스톤)에 결합하는 C-말단 절단을 갖는 변형된 프로게스테론 수용체 (미국 특허 번호 5,364,791); 드로소필라(Drosophila) 유래 엑디손 수용체 및 이의 엑디스테로이드 리간드 (Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517; 또는 문헌(Sando R 3rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8)에 개시된 바와 같은 항생제 트리메토프림 (TMP)에 의해 제어되는 스위치 중 임의의 하나 또는 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자를 제어하거나 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 조절 스위치는 미국 특허 8,771,679 및 6,339,070에 개시된 것과 같은 전구 약물 활성화 스위치이다.
(iii) "패스코드( Passcode )" 조절 스위치
일부 구현예에서, 조절 스위치는 "패스코드 스위치" 또는 "패스코드 회로"일 수 있다. 패스코드 스위치는 특정 조건이 발생할 때 제어된 이식유전자 발현을 위한 DNA 벡터에서 이식유전자의 발현 제어를 미세 조정할 수 있도록 하며, 즉, 이식유전자 발현 및/또는 억제가 발생하려면 조건의 조합이 필요한다. 예를 들어, 이식유전자의 발현이 발생하기 위해서는 적어도 조건 A 및 B가 발생해야 한다. 패스코드 조절 스위치는 이식유전자 발현이 발생하기 위해 임의의 수의 조건, 예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7개 또는 그 이상의 조건이 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 조건 (예를 들어, A, B 조건)이 발생해야 하고, 일부 구현예에서, 적어도 3개의 조건 (예를 들어, A, B 및 C, 또는 A, B 및 D)이 발생해야 한다. 단지 예로서, 패스코드 "ABC" 조절 스위치를 갖는 ceDNA로부터의 유전자 발현이 발생하기 위해서는 조건 A, B 및 C가 존재해야 한다. 조건 A, B 및 C는 다음과 같을 수 있다; 조건 A는 병태 또는 질환의 존재이고, 조건 B는 호르몬 반응이고, 조건 C는 이식유전자 발현에 대한 반응이다. 예를 들어, 이식유전자이 결함 있는 EPO 유전자를 편집하는 경우, 조건 A는 만성 신장 질환 (CKD)의 존재이고, 조건 B는 대상체가 신장에 저산소 상태에 있는 경우 발생하고, 조건 C는 신장에서 에리스로포이에틴 생성 세포 (EPC) 동원이 손상된 것이거나; 또는 대안적으로, HIF-2 활성화가 손상된 것이다. 산소 수준이 증가하거나 원하는 수준의 EPO에 도달하면, 3가지 조건이 발생할 때까지 이식유전자이 다시 꺼지고, 다시 켜진다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 패스코드 조절 스위치 또는 "패스코드 회로"는 생화학적 봉쇄 조건을 정의하는데 사용되는 환경 신호의 범위 및 복잡성을 확장시키기 위해 하이브리드 전사 인자 (TF)를 포함한다. 미리 결정된 조건의 존재하에 세포 사멸을 유발하는 데드맨 스위치(deadman switch)와는 달리, "패스코드 회로"는 특정 "패스코드"의 존재하에서 세포 생존 또는 이식유전자 발현을 허용하고, 미리 결정된 환경 조건 또는 패스코드가 존재하는 경우에만 이식유전자 발현 및/또는 세포 생존을 허용하도록 쉽게 재프로그래밍될 수 있다.
본원에 개시된 조절 스위치의 임의의 및 모든 조합, 예를 들어, 소분자 스위치, 핵산-기반 스위치, 소분자-핵산 하이브리드 스위치, 전사 후 이식유전자 조절 스위치, 번역 후 조절, 방사선-제어 스위치, 저산소증-매개 스위치 및 본원에 개시된 바와 같은 당업자에게 공지된 다른 조절 스위치는 본원에 개시된 바와 같은 패스코드 조절 스위치에 사용될 수 있다. 사용을 위해 포함된 조절 스위치는 리뷰 논문 (Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015))에서 또한 논의되며, Kis의 표 1에 요약되어 있다. 일부 구현예에서, 패스코드 시스템에 사용하기 위한 조절 스위치는 표 11에서 스위치 중 임의의 것 또는 조합으로부터 선택될 수 있다.
(iv). 이식유전자 발현을 제어하기 위한 핵산 기반 조절 스위치
일부 구현예에서, ceDNA에 의해 발현된 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 핵산 기반 제어 메커니즘에 기초한다. 예시적인 핵산 제어 메카니즘이 당 업계에 공지되어 있으며 사용이 구상된다. 예를 들어, 이러한 메커니즘은, 예를 들어, US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, 미국 특허 9,222,093 및 EP 출원 EP288071에 개시되고, 또한 문헌(Villa JK et al., Microbiol Spectr. 2018 May;6(3))에 의한 검토에 개시된 것과 같은 리보스위치를 포함한다. 또한, WO2018/075486 및 WO2017/147585에 개시된 것과 같은 대사 물질-반응성 전사 바이오센서가 포함된다. 사용이 구상된 당 업계에 공지된 다른 메커니즘은 siRNA 또는 RNAi 분자 (예를 들어, miR, shRNA)로 이식유전자의 침묵화를 포함한다. 예를 들어, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자에 상보적인 RNAi 분자를 인코딩하는 조절 스위치를 포함할 수 있다. 이식유전자가 ceDNA 벡터에 의해 발현되더라도 이러한 RNAi가 발현될 때, 상보적 RNAi 분자에 의해 침묵화될 것이고, 이식유전자이 ceDNA 벡터에 의해 발현될 때 RNAi가 발현되지 않을 때 이식유전자는 RNAi에 의해 침묵화되지 않는다.
일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2002/0022018에 개시된 바와 같은 조직-특이적 자가-활성화 조절 스위치이며, 따라서 조절 스위치는 이식유전자 발현이 그렇지 않으면 불리할 수 있는 부위에서 이식유전자 발현을 의도적으로 차단한다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2014/0127162 및 미국 특허 8,324,436에 개시된 바와 같은 재조합 효소 가역 유전자 발현 시스템이다.
(V). 전사 후 및 번역 후 조절 스위치.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자 또는 관심 유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 전사 후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이러한 조절 스위치는 US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, EP 특허 2707487 및 문헌(Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534; Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858)에 개시된 바와 같이 테트라사이클린 또는 테오필린에 민감한 압타자임(aptazyme) 리보스위치일 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자는 리간드 감수성 (OFF-스위치) 압타머를 함유하는 억제성 siRNA 및 이식유전자 둘 다를 인코딩할 수 있으며, 최종 결과는 리간드 감수성 ON-스위치인 것으로 예상된다.
(vi). 다른 예시적인 조절 스위치
환경 변화에 의해 유발된 것들을 포함하여, ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자의 유전자 발현을 제어하기 위해 임의의 공지된 조절 스위치가 ceDNA 벡터에서 사용될 수 있다. 추가의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다; 문헌(Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018))의 BOC 방법; 유전자 코드 확장 및 비-생리적 아미노산; 방사선 제어 또는 초음파 제어 온/오프 스위치 (예를 들어, Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul;7(13):1121-5; 미국 특허 5,612,318; 5,571,797; 5,770,581; 5,817,636; 및 WO1999/025385A1 참조. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어, 미국 특허 7,840,263; US2007/0190028A1 (여기서 유전자 발현은 ceDNA 벡터의 이식유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 활성화시키는 전자기 에너지를 포함하는 하나 이상의 형태의 에너지에 의해 제어됨)에 개시된 바와 같은 이식 가능한 시스템에 의해 제어된다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 구상된 조절 스위치는 저산소증-매개 또는 스트레스-활성화 스위치, 예를 들어, WO1999060142A2, 미국 특허 5,834,306; 6,218,179; 6,709,858; US2015/0322410; 문헌(Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368)에 기재된 것, 뿐만 아니라, 예를 들어, 미국 특허 9,394,526에 개시된 바와 같은, FROG, TOAD 및 NRSE 요소 및 저산소증 반응 요소 (HRE), 염증 반응 요소 (IRE) 및 전단 응력 활성화 요소 (SSAE)를 포함한 조건부로 유도 가능한 침묵 요소이다. 이러한 구현예는 허혈 후 또는 허혈성 조직 및/또는 종양에서 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현을 켜는데 유용하다.
(iv). 사멸 스위치
본 발명의 다른 구현예는 사멸 스위치를 포함하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 개시된 사멸 스위치는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 대상체 시스템으로부터 도입된 ceDNA 벡터를 영구적으로 제거하기 위한 수단으로 사멸되거나 프로그래밍된 세포 사멸을 겪도록 할 수 있다. 당업자는 본 발명의 ceDNA 벡터에서 사멸 스위치의 사용이 전형적으로 대상체가 수용 가능하게 상실할 수 있는 제한된 수의 세포 또는 아폽토시스가 바람직한 세포 유형 (예를 들어, 암 세포)에 대한 ceDNA 벡터의 표적화와 결합될 수 있음을 이해할 것이다. 모든 측면에서, 본원에 개시된 바와 같은 "사멸 스위치"는 입력 생존 신호 또는 다른 특정 조건이 없는 경우 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 빠르고 강력한 세포 사멸을 제공하도록 설계된다. 달리 말하면, 본원의 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 사멸 스위치는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 세포 생존을 특정 입력 신호에 의해 정의된 환경으로 제한할 수 있다. 이러한 사멸 스위치는 대상체로부터 ceDNA 벡터를 제거하거나 그것이 인코딩된 이식유전자를 발현하지 않도록 보장하는 것이 바람직한 경우 생물학적 봉쇄 기능을 한다.
VI. ceDNA 벡터의 상세한 생산 방법
A. 일반적인 생산
본원에 기재된 바와 같이 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 ITR 쌍을 포함하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 특정 생산 방법은 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US18/49996의 섹션 IV에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법과 조성물에서 사용되기 위한 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 기재된 바와 같이, 곤충 세포를 사용하여 생성될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법과 조성물에서 사용되기 위한 것은 합성적으로 그리고 일부 구현예에서, 그 전문이 본원에 참고로 포함된, 2019년 1월 18일자로 출원된 국제 출원 PCT/US19/14122에 개시된 바와 같은 무세포 방법으로 생성될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 일 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어, a) 숙주 세포 내에서 ceDNA 벡터의 생성을 유도하기에 효과적인 조건 하에서 및 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에, 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는, 폴리뉴클레오티드 발현 작제물 주형 (예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바쿨로바이러스)을 보유하는 숙주 세포 (예를 들어, 곤충 세포) 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 숙주 세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는, 상기 단계; 및 b) 숙주 세포로부터 ceDNA 벡터를 수거하고 분리하는 단계를 포함하는 과정에 의해 얻어질 수 있다. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR로 벡터 폴리뉴클레오티드의 복제를 유도하여 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 생성한다. 그러나, 바이러스 입자 (예를 들어 AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, AAV 또는 다른 바이러스 기반 벡터에 자연적으로 부과되는 것과 같은 크기 제한은 없다.
숙주 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 존재는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 숙주 세포로부터 단리된 DNA를 소화하고 비-변성 겔 상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이, 비-바이러스성 DNA 벡터의 생산에서 DNA 벡터 폴리뉴클레오티드 발현 주형 (ceDNA 주형)을 그들 자신의 게놈에 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주의 사용을 제공한다: Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879. 바람직하게는, Rep는 약 3의 MOI에서 숙주 세포에 첨가된다. 숙주 세포주가 포유동물 세포주, 예를 들어, HEK293 세포인 경우, 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오티드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스 바이러스와 같은 제2 벡터를 사용하여 Rep 단백질을 세포 내로 도입할 수 있으며, 이는 Rep 및 헬퍼 바이러스의 존재하에 ceDNA의 절제 및 증폭을 허용한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 제조하는데 사용된 숙주 세포는 곤충 세포이고, 바쿨로바이러스는 Rep 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및, 예를 들어, 도 4a-4c 및 실시예 1에 기재된 바와 같이, ceDNA에 대한 비-바이러스성 DNA 벡터 폴리뉴클레오티드 발현 작제물 주형 둘 다를 전달하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 Rep 단백질을 발현하도록 조작된다.
이어서 ceDNA 벡터를 수거하고 숙주 세포로부터 단리한다. 세포로부터 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은 ceDNA 벡터의 고-수율 생산을 달성하도록 선택되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존력, 세포 형태, 세포 성장 등을 고려하여 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 세포는 충분한 조건 하에서 성장하고, ceDNA 벡터를 생성하기 위해 바쿨로바이러스 감염 후 그러나 바쿨로바이러스 독성으로 인해 대부분의 세포가 죽기 시작하기 전에 충분한 시간 수거한다. Qiagen Endo-Free Plasmid 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 DNA 벡터를 분리할 수 있다. 플라스미드 분리를 위해 개발된 다른 방법도 DNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
DNA 벡터는 DNA의 정제를 위해 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로서 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로서 정제된다.
ceDNA 벡터의 존재는 DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 세포로부터 단리된 벡터 DNA를 소화시키고, 겔 전기영동을 사용하여 소화된 및 소화되지 않은 DNA 물질 모두를 분석하여, 선형 및 비-연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인할 수 있다. 도 4c 및 도 4d는 본원의 공정에 의해 생성된 폐쇄-말단 ceDNA 벡터의 존재를 확인하기 위한 일 구현예를 도시한다.
B. ceDNA 플라스미드
ceDNA-플라스미드는 ceDNA 벡터의 추후 생산에 사용되는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 적어도 다음을 전사 방향으로 작동적으로 연결된 성분으로서 제공하기 위해 공지된 기술을 사용하여 구축될 수 있다: (1) 변형된 5' ITR 서열; (2) 시스-조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 인핸서 등을 함유하는 발현 카세트; 및 (3) 3' ITR 서열이 5' ITR 서열에 대해 대칭인 변형된 3' ITR 서열. 일부 구현예에서, ITR이 측면에 있는 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 발현 카세트는 AAV 게놈의 rep 및 cap 코딩 영역을 대체한다.
일 측면에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에서, 제1 아데노-관련 바이러스 (AAV) 역 말단 반복부 (ITR), 이식유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 돌연변이 또는 변형된 AAV ITR 순서로 인코딩하는 "ceDNA-플라스미드"로 지칭되는 플라스미드로부터 수득되며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1 (또는 5') 변형 또는 돌연변이된 AAV ITR, 이식유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2 (또는 3') 변형된 AAV ITR 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' ITR은 서로 대칭이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1 (또는 5') 변형 또는 돌연변이된 AAV ITR, 이식유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2 (또는 3') 돌연변이 또는 변형된 AAV ITR 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' 변형된 ITR은 동일한 변형을 갖는다 (즉, 이들은 서로 역 보체이거나 대칭이다).
추가의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 시스템은 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다 (즉, AAV 캡시드 유전자가 없고 다른 바이러스의 캡시드 유전자도 없다). 또한, 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 바람직한 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 AAV2)에 대한 기능성 AAV 캡 및 AAV rep 유전자 GG-3', 및 헤어핀 형성을 허용하는 가변 팔린드롬 서열이 없다.
본 발명의 ceDNA-플라스미드는 당 업계에 널리 공지된 임의의 AAV 혈청형의 게놈의 천연 뉴클레오티드 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA-플라스미드 골격은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈으로부터 유도된다. 예를 들어, NCBI: NC　002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses, Springer가 유지 관리하는 URL에서 이용 가능 (www 웹 주소: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(참고 -URL 또는 데이터베이스에 대한 참조는 본 출원의 유효 출원일자의 URL 또는 데이터베이스의 내용을 지칭함). 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 골격은 AAV2 게놈으로부터 유래된다. 또 다른 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 골격은 이들 AAV 게놈 중 하나로부터 유래된 5' 및 3' ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 골격이다.
ceDNA-플라스미드는 선택적으로 ceDNA 벡터-생성 세포주의 확립에 사용하기 위한 선택 가능한 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 선별 마커는 3' ITR 서열의 하류 (즉, 3')에 삽입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선별 마커는 5' ITR 서열의 상류 (즉, 5')에 삽입될 수 있다. 적절한 선별 마커는, 예를 들어, 약물 내성을 부여하는 마커를 포함한다. 선별 마커는, 예를 들어, 블라스티시딘 S-저항성 유전자, 카나마이신, 제네티신 등일 수 있다. 바람직일 구현예에서, 약물 선별 마커는 블라스티시딘 S-저항성 유전자이다.
예시적인 ceDNA (예를 들어, rAAV0) 벡터는 rAAV 플라스미드로부터 생성된다. rAAV 벡터의 생산 방법은 (a) 상기 기재된 바와 같은 rAAV 플라스미드를 숙주 세포에 제공하는 단계로서, 상기 숙주 세포 및 상기 플라스미드 둘 다는 캡시드 단백질 코딩 유전자가 없는, 상기 단계, (b) 숙주 세포를 ceDNA 게놈의 생성을 허용하는 조건 하에 배양하는 단계, 및 (c) 세포를 수거하고 상기 세포로부터 생성된 AAV 게놈을 분리하는 단계를 포함한다.
C. ceDNA 플라스미드로부터 ceDNA 벡터를 제조하는 예시적인 방법
캡시드-무함유 ceDNA 벡터를 제조하는 방법, 특히 생체내 실험에 충분한 벡터를 제공하기 위해 충분히 높은 수율을 갖는 방법이 또한 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산 방법은 (1) 발현 카세트 및 2개의 대칭 ITR 서열을 포함하는 핵산 작제물을 숙주 세포 (예를 들어, Sf9 세포)에 도입하는 단계, (2) 선택적으로, 예를 들어, 플라스미드 상에 존재하는 선별 마커를 사용하여 클론 세포주를 확립하는 단계, (3) Rep 코딩 유전자를 상기 곤충 세포 내로 (상기 유전자를 운반하는 바쿨로바이러스에 의한 형질감염 또는 감염에 의해) 도입하는 단계; 및 (4) 세포를 수거하고 ceDNA 벡터를 정제하는 단계를 포함한다. 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생성을 위해 상기 기술된 발현 카세트 및 2개의 ITR 서열을 포함하는 핵산 작제물은 ceDNA 플라스미드, 또는 하기 기재된 바와 같이 ceDNA 플라스미드로 생성된 박미드 또는 바쿨로바이러스의 형태일 수 있다. 핵산 작제물은 형질감염, 바이러스 형질도입, 안정적인 통합 또는 당 업계에 공지된 다른 방법에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다.
D. 세포주 :
제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산에 사용되는 숙주 세포주는 Sf9 Sf21과 같은 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포, 또는 기타 무척추동물, 척추동물 또는 포유동물 세포를 포함하는 다른 진핵 세포주로부터 유래된 곤충 세포주를 포함할 수 있다. HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, 단핵구 및 성숙 및 미성숙 수지상 세포과 같은, 당업자에게 공지된 다른 세포주가 또한 사용될 수 있다. 높은 수율의 ceDNA 벡터 생산을 위해 ceDNA-플라스미드의 안정적인 발현을 위해 숙주 세포주를 형질감염시킬 수 있다.
CeDNA-플라스미드는 당 업계에 공지된 시약 (예를 들어, 리포좀, 인산칼슘) 또는 물리적 수단 (예를 들어, 전기천공)을 사용하여 일시적 형질감염에 의해 Sf9 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, ceDNA-플라스미드를 게놈에 안정적으로 통합시킨 안정적인 Sf9 세포주가 확립될 수 있다. 이러한 안정적인 세포주는 상기 기술된 바와 같이 선별 마커를 ceDNA-플라스미드에 통합시킴으로써 확립될 수 있다. 세포주를 형질감염시키기 위해 사용된 ceDNA-플라스미드가 항생제와 같은 선별 마커를 포함하는 경우, ceDNA-플라스미드로 형질감염되고 ceDNA-플라스미드 DNA를 게놈에 통합시킨 세포는 세포 성장 배지에 항생제의 첨가에 의해 선별될 수 있다. 이어서, 세포의 내성 클론을 단일 세포 희석 또는 콜로니 전달 기술에 의해 단리하고 증식시킬 수 있다.
E. ceDNA 벡터 분리 및 정제 :
ceDNA 벡터를 수득 및 분리하는 과정의 예는 도 4a-4e 및 아래의 특정 예에 기재되어 있다. 본원에 개시된 ceDNA-벡터는 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바쿨로바이러스로 추가로 형질전환된, AAV Rep 단백질(들)을 발현하는 생산 세포로부터 얻을 수 있다. ceDNA 벡터의 생산에 유용한 플라스미드는 ceDNA 벡터를 얻기 위해 사용되는 하나 이상의 Rep 단백질(들) 및 플라스미드를 포함하는 플라스미드를 포함한다. 제어된 이식유전자의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산을 위한 예시적인 플라스미드는, 그 전체가 본원에 포함되는 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242의 도 6b에 나타낸 바와 같은 플라스미드이다. 항체의 제어 된 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산을 위한 ceDNA 플라스미드는 도 6a에 개시되어 있으며, 아두칸맙 생산을 위한 예시적인 ceDNA 플라스미드를 개시하는 2019년 2월 14일에 출원된 국제 출원 PCT/US19/18016의 서열 번호: 56이다.
일 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 (Rep-플라스미드), 박미드 (Rep-박미드) 또는 바쿨로바이러스 (Rep-바쿨로바이러스)에서 생산 세포로 전달된 AAV Rep 단백질 (Rep 78 또는 Rep68)을 인코딩한다. Rep-플라스미드, Rep-박미드 및 Rep-바쿨로바이러스는 위에서 설명한 방법으로 생성될 수 있다.
예시적인 ceDNA 벡터인 ceDNA-벡터를 생성하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 ceDNA 벡터를 생성하기 위해 사용되는 발현 작제물은 플라스미드 (예를 들어, ceDNA-플라스미드), 박미드 (예를 들어, ceDNA-박미드) 및/또는 바쿨로바이러스 (예를 들어, ceDNA-바쿨로바이러스)일 수 있다. 단지 예로서, ceDNA-벡터는 ceDNA-바쿨로바이러스 및 Rep-바쿨로바이러스로 공동 감염된 세포로부터 생성될 수 있다. Rep-바쿨로바이러스로부터 생산된 Rep 단백질은 ceDNA-바쿨로바이러스를 복제하여 ceDNA-벡터를 생성할 수 있다. 대안적으로, ceDNA 벡터는 Rep-플라스미드, Rep-박미드 또는 Rep-바쿨로바이러스로 전달된 AAV Rep 단백질 (Rep78/52)을 인코딩하는 서열을 포함하는 작제물로 안정적으로 형질감염된 세포로부터 생성될 수 있다. ceDNA-바쿨로바이러스는 세포로 일시적으로 형질감염될 수 있고, Rep 단백질에 의해 복제되고 ceDNA 벡터를 생성할 수 있다.
박미드 (예를 들어, ceDNA- 박미드)는 Sf9, Sf21, Tni (트리코플루시아 니) 세포, 하이 파이브(High Five) 세포와 같은 허용 곤충 세포로 형질감염될 수 있고, ceDNA-바쿨로바이러스를 생성할 수 있으며, 이는 대칭 ITR 및 발현 카세트를 포함하는 서열을 포함하는 재조합 바쿨로바이러스이다. ceDNA-바쿨로바이러스는 곤충 세포 내로 다시 감염되어 차세대 재조합 바쿨로바이러스를 수득할 수 있다. 선택적으로, 단계는 재조합 바쿨로바이러스를 대량으로 생성하기 위해 한 번 또는 여러 번 반복될 수 있다.
세포로부터 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은 ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하도록 선택되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존력, 세포 형태, 세포 성장 등을 고려하여 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포는 ceDNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터)를 생성하기 위해 바쿨로바이러스 감염 후 충분한 시간 후에 그러나 바이러스 독성으로 인해 대부분의 세포가 죽기 시작하기 전에 수거될 수 있다. ceDNA-벡터는 Qiagen ENDO-FREE PLASMID® 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 Sf9 세포로부터 분리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법들도 ceDNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 상업적으로 입수 가능한 DNA 추출 키트뿐만 아니라 임의의 당 업계에 공지된 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
대안적으로, 정제는 세포 펠릿을 알칼리 용해 공정에 적용하고, 생성된 용해물을 원심분리하고 크로마토그래피 분리를 수행함으로써 구현될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 상기 공정은 핵산을 보유하는 이온 교환 컬럼 (예를 들어, SARTOBIND Q®) 상에 상청액을 로딩한 후 (예를 들어 1.2 M NaCl 용액으로) 용리하고 겔 여과 칼럼 (예를 들어, 6 빠른 흐름 GE) 상에서 추가 크로마토그래피 정제를 수행함으로써 수행될 수 있다. 이어서, 캡시드-비함유 AAV 벡터는, 예를 들어, 침전에 의해 회수된다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 또한 엑소좀 또는 미세입자 형태로 정제될 수 있다. 많은 세포 유형이 막 미세소포 쉐딩(membrane microvesicle shedding)을 통해 가용성 단백질뿐만 아니라 복잡한 단백질/핵산 카고도 방출한다는 것이 당 업계에 공지되어 있다 (Cocucci et al, 2009; EP 10306226.1) 이러한 소포는 미세소포 (미세입자로도 지칭됨) 및 엑소좀 (나노소포로도 지칭됨)을 포함하는데, 이 둘은 모두 단백질 및 RNA를 카고로서 포함한다. 미세소포는 원형질막의 직접 버딩(budding)으로부터 생성되고, 엑소좀은 다소포성 엔도좀과 원형질막의 융합시 세포외 환경으로 방출된다. 따라서, ceDNA 벡터-함유 미세소포 및/또는 엑소좀은 ceDNA-플라스미드 또는 ceDNA-플라스미드로 생성된 박미드 또는 바쿨로바이러스로 형질도입된 세포로부터 단리될 수 있다.
미세소포는 배양 배지를 여과하거나 20,000 x g에서, 엑소좀은 100,000 x g에서 초원심분리함으로써 단리될 수 있다. 초원심분리의 최적 지속 시간은 실험적으로 결정될 수 있으며, 소포가 분리되는 특정 세포 유형에 의존할 것이다. 바람직하게는, 배양 배지는 먼저 저속 원심분리 (예를 들어, 2000 x g에서 5-20분 동안)로 제거되고, 예를 들어, AMICON® 스핀 컬럼 (Millipore, Watford, UK)을 사용하여 스핀 농축된다. 미세소포 및 엑소좀은 미세소포 및 엑소좀 상에 존재하는 특정 표면 항원을 인식하는 특정 항체를 사용함으로써 FACS 또는 MACS를 통해 추가로 정제될 수 있다. 다른 미세소포 및 엑소좀 정제 방법은 면역침전, 친화성 크로마토그래피, 여과 및 특정 항체 또는 압타머로 코팅된 자성 비드를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 정제시, 소포는, 예를 들어, 포스페이트-완충 염수로 세척된다. ceDNA-함유 소포를 전달하기 위해 미세소포 또는 엑소좀을 사용하는 것의 하나의 이점은 이들 소포가 각각의 세포 유형 상의 특정 수용체에 의해 인식되는 막 단백질을 포함하여 다양한 세포 유형에 표적화될 수 있다는 것이다. (또한 EP 10306226 참조)
본원의 또 다른 측면은 ceDNA 작제물을 자신의 게놈에 안정적으로 통합한 숙주 세포주로부터 ceDNA 벡터를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로서 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로서 정제된다.
국제 출원 PCT/US18/49996의 도 5는 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 ceDNA-플라스미드 작제물로부터 ceDNA의 생성을 확인하는 겔을 보여준다. ceDNA는 실시예에서 도 4d와 관련하여 논의된 바와 같이, 겔에서 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
VII. 약제학적 조성물
또 다른 측면에서, 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 제어된 이식유전자 발현을 위한 패쇄-말단 DNA 벡터, 예를 들어, DNA 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같이 ceDNA-벡터는 대상체의 세포, 조직 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA-벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 원하는 치료적 투여 경로 (예를 들어, 비경구 투여)에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포질내 주사를 통한 수동적인 조직 형질도입이 또한 고려된다. 치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 완충제에 혼입한 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있으며, ceDNA 벡터를 포함하여 제형화하여 핵 내의 이식유전자를 수용자의 유전자에 전달하여, 그 안의 이식유전자 또는 공여체 서열의 치료적 발현을 초래한다. 상기 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 약제학적 활성 조성물은 다양한 목적을 위해 이식유전자를 세포, 예를 들어, 대상체의 세포로 전달하도록 제형화될 수 있다. //367
본원에 개시된 ceDNA 벡터는 대상체의 세포, 조직 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 DNA-벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 ceDNA 벡터는 원하는 치료적 투여 경로 (예를 들어, 비경구 투여)에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포질내 주사를 통한 수동적인 조직 형질도입이 또한 고려된다. 치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 완충제에 혼입한 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다.
ceDNA 벡터를 포함하는 약제학적 활성 조성물은 핵산 내 이식유전자를 수용자의 세포에 전달하여 그 안의 이식유전자의 치료적 발현을 초래하도록 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 또한 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 벡터는 다양한 목적으로 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 연구 목적, 예를 들어, 이식유전자 생성물의 기능을 연구하기 위한, 예를 들어, 이식유전자를 보유한 체세포성 형질전환 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 전달될 수 있다 (예를 들어, 발현될 수 있다). 일부 구현예에서, 이식유전자는 유전자 편집 분자 (예를 들어, 뉴클레아제)이다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 CRISPR-관련 뉴클레아제 (Cas 뉴클레아제)이다.
치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정적이어야 한다. 멸균 주사용 용액은 ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 완충제에 혼입한 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다.
특정 상황에서, 피하, 췌장내(intraopancreatically), 비강내, 비경구, 정맥내, 근육내, 경막내, 전신 투여, 또는 경구, 복강내 또는 흡입에 의해 본원에 개시된 적합하게 제형화된 약제학적 조성물로 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 조성물 또는 벡터를 전달하는 것이 바람직할 것이다.
본원에 기재된 조성물은, ceDNA 벡터의 용량-반응 관계에 의해 결정되는 주어진 용량, 예를 들어, 투여시 전형적인 대상체에서 유전자 의약품의 원하는 효과 또는 발현 수준을 초래할 것으로 확실하게 예상될 수 있는 "단위 용량"으로 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 것으로 구체적으로 고려된다.
치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 완충제에 혼입한 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 국소, 전신, 양막내, 경막내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내 (예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 경막내, 방광내, 결막 (예를 들어, 안와외(extra-orbital), 안와내, 안와후(retroorbital), 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막하, 간질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내 및 점막 (예를 들어, 구강, 직장, 코) 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포질내 주사를 통한 수동 조직 형질도입이 또한 고려된다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 ceDNA 벡터를 숙주 세포로 전달하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법에 의해 생성된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 이로부터 생성된 유기체 (예컨대 동물, 식물 또는 진균)가 본원에 제공된다. 핵산의 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 마이크로인젝션, 유전자총법(biolistics), 리포좀, 면역리포좀, 다가 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 및 작용제-강화된 DNA 흡수를 포함할 수 있다. 리포펙션은 예를 들어, 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355)에 기재되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 전달은 세포 (예를 들어, 시험관 내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)으로의 전달일 수 있다.
핵산을 세포로 전달하기 위한 다양한 기술 및 방법이 당 업계에 공지되어 있다.　예를 들어, ceDNA와 같은 핵산은 지질 나노입자 (LNP), 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 리포플렉스 또는 코어-쉘 나노입자로 제형화될 수 있다. 전형적으로, LNP는 핵산 (예를 들어, ceDNA) 분자, 하나 이상의 이온화 가능한 또는 양이온성 지질 (또는 이의 염), 하나 이상의 비이온성 또는 중성 지질 (예를 들어, 인지질), 응집을 방지하는 분자 (예를 들어, PEG 또는 PEG-지질 접합체), 및 임의로 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)로 구성된다.
ceDNA와 같은 핵산을 세포로 전달하는 또 다른 방법은 세포에 의해 내재화된 리간드와 핵산을 접합시키는 것이다. 예를 들어, 리간드는 세포 표면상의 수용체에 결합하고 세포내이입을 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산에서 뉴클레오티드에 공유적으로 연결될 수 있다. 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 예시적인 접합체는, 예를 들어, WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 및 WO2017/177326에 기재되어 있다.
ceDNA 벡터와 같은 핵산은 또한 형질감염에 의해 세포로 전달될 수 있다. 유용한 형질감염 방법은 지질-매개 형질감염, 양이온성 폴리머-매개 형질감염 또는 인산칼슘 침전을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 형질감염 시약은 당 업계에 잘 알려져 있으며, TurboFect 형질감염 시약 (Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject 시약 (Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P 단백질 형질감염 시약 (New England Biolabs), CHARIOT™ 단백질 전달 시약 (Active Motif), PROTEOJUICE™ 단백질 형질감염 시약 (EMD Millipore), 293fectin, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™ (Roche, Basel, Switzerland), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFECTAM™ (Transfectam, Pr오메가, Madison, Wis.), TFX-10™ (Pr오메가), TFX-20™ (Pr오메가), TFX-50™ (Pr오메가), TRANSFECTIN™ (BioRad, Hercules, Calif.), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Valencia, Calif.), DC-chol (Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™ (Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Lafayette, Colo.), DHARMAFECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMAFECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, St. Louis, Mo.) 및 ESCORT™ IV (Sigma Chemical Co.)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. ceDNA와 같은 핵산은 또한 당업자에게 공지된 미세유체 방법을 통해 세포로 전달될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉되게 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 이용 가능하고 당업자에게 잘 알려져 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 보다 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 핵산 벡터 ceDNA 벡터의 도입 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,928,638에 기재된 바와 같은 방법에 의해 조혈 줄기세포로 전달될 수 있다.
본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 대상체에서 세포 또는 표적 기관으로 전달하기 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포이다. 리포좀은 약학 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 그들은 세포막과 융합하고 그의 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 제약 성분 (API)을 전달함으로써 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-작용기 함유 화합물을 포함하나 이에 제한되지 않는 예시적인 리포좀 및 리포좀 제형은 2018년 9월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242에 개시되어 있으며, 예를 들어, "제약 제형" 섹션을 참조한다.]
당 업계에 공지된 다양한 전달 방법 또는 이의 변형을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 표적화된 세포로의 DNA 유입이 촉진되도록 기계적, 전기, 초음파, 유체 역학적 또는 레이저-기반 에너지에 의해 세포막에 일시적 침투를 함으로써 전달된다. 예를 들어, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 크기 제한 채널을 통해 또는 당 업계에 공지된 다른 수단을 통해 세포를 압착함으로써 일시적으로 세포막을 파괴함으로써 전달될 수 있다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 단독으로 피부, 흉선, 심장 근육, 골격근 또는 간 세포에 네이키드 DNA로서 직접 주사된다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 유전자 총에 의해 전달된다. 캡시드-무함유 AAV 벡터로 코팅된 금 또는 텅스텐 구형 입자 (1-3 μm 직경)는 가압된 가스를 통해 표적 조직 세포로 침투하기 위해 고속으로 가속화될 수 있다.
제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 본원에서 구체적으로 고려된다. 일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 지질 전달 시스템, 예를 들어, 본원에 기재된 리포좀으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 숙련된 전문가가 원하는 임의의 경로로 투여된다. 상기 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입, 협측 투여, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내 경막내, 및 관절내 또는 이들의 조합을 포함하여 상이한 경로로 대상체에게 투여될 수 있다. 수의용으로, 조성물은 정상적인 수의학적 실무에 따라 적합하게 허용되는 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적합한 투여 요법 및 투여 경로를 쉽게 결정할 수 있다. 조성물은 전통적인 주사기, 바늘이 없는 주입 장치, "미세발사체 충격 유전자 건(mjicroprojectile bombardment gene gun)" 또는 전기천공 ("EP"), 유체 역학적 방법 또는 초음파와 같은 다른 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다.
일부 경우에, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유체 역학적 주사에 의해 전달되는데, 이는 임의의 수용성 화합물 및 입자를 사지 전체의 내부 기관 및 골격근으로 직접 세포내로 전달하기 위한 간단하고 매우 효율적인 방법이다.
일부 경우에, ceDNA 벡터는 내부 장기 또는 종양의 세포 내로 DNA 입자의 세포내 전달을 용이하게 하기 위해 막에 나노스코픽 공극을 만들어 초음파에 의해 전달되므로, 플라스미드 DNA의 크기 및 농도는 시스템의 효율에 큰 역할을 한다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 핵산을 함유하는 입자를 표적 세포 내로 농축시키기 위해 자기장을 사용하여 자기감염에 의해 전달된다.
일부 경우에, 화학적 전달 시스템은, 예를 들어, 나노머 복합체를 사용함으로써 사용될 수 있으며, 이는 양이온성 리포좀/미쉘 또는 양이온성 폴리머에 속하는, 다가 양이온 나노머 입자에 의한 음전하 핵산의 압축을 포함한다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질은 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아니딘 함유 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 폴리머 (예를 들어, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-리신, 프로타민, 기타 양이온성 폴리머), 및 지질-폴리머 하이브리드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
A. 엑소좀:
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 엑소좀에 패키징되어 전달된다. 엑소좀은 다소포체와 원형질막의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 식작용 기원의 작은 막 소포이다. 이들의 표면은 공여체 세포의 세포막으로부터의 지질 이중층으로 구성되며, 이들은 엑소좀을 생성하는 세포로부터의 시토졸을 함유하고, 표면상의 모 세포로부터 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 상피 세포, B 및 T 림프구, 비만 세포 (MC) 및 수지상 세포 (DC)를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생성된다. 일부 구현예, 직경이 10nm 내지 1μm, 20nm 내지 500nm, 30nm 내지 250nm, 50nm 내지 100nm인 엑소좀이 사용되는 것으로 예상된다. 공여체 세포를 사용하거나 특정 핵산을 이들에 도입함으로써 표적 세포로의 전달을 위한 엑소좀을 단리할 수 있다. 당 업계에 공지된 다양한 접근법을 사용하여 본 발명의 캡시드-비함유 AAV 벡터를 함유하는 엑소좀을 생성할 수 있다.
B. 미세입자/나노입자:
일부 구현예에서, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 지질 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 지질 나노입자는 예를 들어 하기에 개시된 바와 같이, 이온화 가능한 아미노 지질 (예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린 (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질 (폴리에틸렌 글리콜-디미리스토글리세롤, PEG-DMG)을 포함한다: Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 1000 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 300 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 300 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 200 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 25 내지 약 200 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제제 (예를 들어, 복수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는 평균 크기 (예를 들어, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 보다 전형적으로 평균 크기가 약 100nm 이하인 크기 분포를 갖는다.
당 업계에 공지된 다양한 지질 나노입자가 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자를 사용한 다양한 전달 방법은 미국 특허 번호 9,404,127, 9,006,417 및 9,518,272에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 금 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 핵산은, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이, 금 나노입자에 공유 결합될 수 있거나 금 나노입자에 비공유 결합 (예를 들어, 전하-전하 상호작용에 의해 결합)될 수 있다: Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083. 일부 구현예에서, 금 나노입자-핵산 접합체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,812,334에 기재된 방법을 사용하여 제조된다.
C. 접합체
일부 구현예에서, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 접합된다 (예를 들어, 세포 흡수를 증가시키는 작용제에 공유 결합됨). "세포 흡수를 증가시키는 작용제"는 지질 막을 통한 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친유성 화합물 (예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 침투 펩티드 (CPP) (예를 들어, 페네트라틴, TAT, Syn1B 등) 및 폴리아민 (예를 들어, 스퍼민)에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 작용제의 추가 예는, 예를 들어, 하기에 개시되어 있다: Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 폴리머 (예를 들어, 폴리머 분자) 또는 폴레이트 분자 (예를 들어, 엽산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 폴리머에 접합된 핵산의 전달은, 예를 들어 WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재된 바와 같이, 당 업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 미국 특허 번호 8,987,377에 기재된 바와 같은 폴리(아미드) 폴리머에 접합된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 핵산은 미국 특허 번호 8,507,455에 기재된 바와 같은 엽산 분자에 접합된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,450,467에 기재된 바와 같이 탄수화물에 접합된다.
D. 나노캡슐
대안적으로, 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 물질을 안정적이고 재현 가능한 방식으로 포획할 수 있다. 세포내 폴리머 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자 (약 0.1 μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 폴리머를 사용하여 설계되어야 한다. 이들 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용될 것으로 고려된다.
E. 리포솜
본 개시내용에 따른 ceDNA 벡터는 대상체에서 세포 또는 표적 기관으로 전달하기 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포이다. 리포좀은 제약 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이들은 세포막과 융합하고 이의 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 제약 성분 (API)을 전달함으로써 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린 기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다.
리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 리포좀은 개선된 혈청 안정성 및 순환 하프-타임(half-time)으로 개발되었다 (미국 특허 번호 5,741,516). 또한, 잠재적 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기술되어 있다 (미국 특허 번호 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 및 5,795,587).
F. 예시적인 리포좀 및 지질 나노입자 (LNP) 조성물
본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현이 필요한 세포, 예를 들어 세포로 전달하기 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포이다. 리포좀은 제약 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이들은 세포막과 융합하고 이의 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 제약 성분 (API)을 전달함으로써 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린 기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다.
ceDNA를 포함하는 지질 나노입자 (LNP)는 2018년 9월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242에 개시되어 있으며, 이들은 전체가 본원에 포함되고 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용되도록 계획된다.
일부 측면에서, ceDNA를 포함하는 지질 나노입자는 이온화가능한 지질이다.
일반적으로, 지질 입자는 약 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA (질량 또는 중량) 비로 제조된다. 일부 구현예에서, 지질 대 ceDNA 비 (질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질 및 ceDNA의 양은 원하는 N/P 비, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL의 범위일 수 있다. 이온화 가능한 지질은 또한 본원에서 양이온성 지질로 지칭된다. 예시적인 이온화 가능한 지질은 국제 PCT 특허 공보 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740 , WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406 , WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346, 및 WO2013/086354, 및 미국 특허 공보 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458, 및 US2013/0195920 (이들 내용은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 다음 구조를 갖는 MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트 (DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다.
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.
VIII. ceDNA 벡터의 전달 방법
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 다양한 적합한 방법에 의해 시험관내 또는 생체내에서 표적 세포에 전달될 수 있다. ceDNA 벡터는 단독으로 적용되거나 주사될 수 있다. ceDNA 벡터는 형질감염 시약 또는 기타 물리적 수단의 도움 없이 세포에 전달될 수 있다. 대안적으로, ceDNA 벡터는 DNA의 세포로의 진입을 촉진시키는 임의의 당 업계에 공지된 형질감염 시약 또는 기타 당 업계에 공지된 물리적 수단, 예를 들어, 리포좀, 알코올, 폴리리신-풍부 화합물, 아르기닌-풍부 화합물, 인산칼슘, 미세소포, 미세주사, 전기천공 등을 사용하여 전달될 수 있다.
대조적으로, 본원에 개시된 캡시드-비함유 AAV 벡터를 사용한 형질도입은 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온으로 형질도입하기 어려운 세포 및 조직-유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 CNS (예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여된다. 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 척수, 뇌간 (숨뇌, 뇌교), 중뇌 (시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑질, 송과선), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두를 포함한 대뇌, 측두엽, 두정엽, 전두엽, 피질, 기저핵, 해마 및 포르타아미그달라(portaamygdala)), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구로 도입될 수 있다. ceDNA 벡터는 또한 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 다른 영역에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터는 뇌척수액 내로 전달될 수 있다 (예를 들어, 요추 천자에 의해). ceDNA 벡터는 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황 (예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 CNS에 혈관내로 추가로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 경막내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내 (예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재하에), 비강내, 귀내, 안구내 (예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위 (예를 들어, 서브-테논 부위(sub-Tenon's region)) 전달뿐만 아니라 운동 뉴런으로 역행 전달을 통한 근육내 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당 업계에 공지된 임의의 경로에 의해 CNS의 원하는 영역(들)에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 CNS의 원하는 영역 또는 구획에 직접 주사 (예를 들어, 정위 주사)에 의해 액체 제형으로 투여된다. 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 원하는 영역에 국소 적용하거나 에어로졸 제형의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 액체 액적의 국소 적용에 의한 것일 수 있다. 추가의 대안으로서, ceDNA 벡터는 고체, 서방형 제형으로서 투여될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,201,898 참조). 또 다른 추가의 구현예에서, ceDNA 벡터는 운동 뉴런 (예를 들어, 근위축성 측삭 경화증 (ALS); 척수 근육 위축 (SMA) 등)을 포함하는 질환 및 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직으로 전달될 수 있다.
IX. ceDNA 벡터의 추가 용도
본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 ceDNA 벡터는 다양한 목적을 위해 표적 유전자 또는 이식유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생성된 이식유전자는 연구 목적, 예를 들어, 이식유전자 생성물의 기능을 연구하기 위한, 예를 들어, 이식유전자를 보유한 체세포성 형질전환 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 생성된 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 생성된 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게 전달될 수 있다 (예를 들어, 발현될 수 있다). 일부 구현예에서, 생성된 이식유전자는 증가된 발현, 유전자 산물의 활성, 또는 생성된 이식유전자가 발현을 억제하거나 달리 발현이 감소되도록 하는 유전자의 부적절한 상향 조절과 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에서 발현될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생성된 이식유전자는 천연 유전자의 결함 카피를 대체하거나 보충한다. 이식유전자는 그 자체로 전사될 유전자의 오픈 리딩 프레임이 아닐 수 있고; 대신에, 이는 표적 유전자의 프로모터 영역 또는 억제 영역일 수 있고, ceDNA 벡터는 관심 유전자의 발현을 조절하는 결과로 이러한 영역을 변형시킬 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 전달 (예를 들어, 발현)될 수 있다.
X. 사용 방법
본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 이식유전자)을 표적 세포 (예를 들어, 숙주 세포)로 전달하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 이식유전자를 이를 필요로 하는 대상체의 세포로 전달하여 관심 질환을 치료하는 방법일 수 있다. 본 발명은 이식유전자의 발현의 치료 효과가 발생하도록 대상체의 세포에서 ceDNA 벡터에 인코딩된 이식유전자, 예를 들어, 단백질, 항체, 핵산 예컨대 miRNA 등의 생체내 발현을 허용한다. 이러한 결과는 ceDNA 벡터 전달의 생체내 및 시험관내 모드 둘 다에서 볼 수 있다.
또한, 본 발명은 이식유전자 발현을 원하는 수준으로 적정하기 위해 상기 관심 핵산 또는 이식유전자를 포함하는 본 발명의 ceDNA 벡터의 다중 투여를 포함하는, 이식유전자를 이를 필요로 하는 대상체의 세포로 전달하는 방법을 제공한다.
ceDNA 벡터 핵산(들)은 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용되는 투여 경로는 정맥내 (예를 들어, 리포좀 제형으로), 선택된 기관으로의 직접 전달 (예를 들어, 간으로의 문맥내 전달), 근육내 및 기타 모 투여 경로를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 원하는 경우, 투여 경로가 조합될 수 있다.
폐쇄-말단 DNA 벡터 (예를 들어 ceDNA 벡터) 전달은 전달 유전자 대체로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 통상적으로 생성된 (예를 들어, 세포-기반 생산 방법을 사용하여 또는 합성적으로 생성된 폐쇄된 말단 DNA 벡터) (예를 들어, ceDNA 벡터)는 유전자 요법의 일부를 제공하기 위해 제공된 다른 전달 시스템과 함께 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따른 합성적으로 생성된 ceDNA 벡터와 조합될 수 있는 시스템의 하나의 비제한적인 예는 이식유전자의 효과적인 유전자 발현을 위해 하나 이상의 보조 인자 또는 면역 억제제를 개별적으로 전달하는 시스템을 포함한다.
본 발명은 또한 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를 대상체의 이를 필요로 하는 표적 세포 (특히 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 것을 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 담체의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 담체를 요하는 것은 아니다. 선택된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는데 유용한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는 대상체에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 바와 같은 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 벡터는 다양한 목적으로 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 연구 목적으로, 예를 들어, 이식유전자 생성물의 기능을 연구하기 위한, 예를 들어, 이식유전자를 보유한 체세포성 형질전환 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 전달될 수 있다 (예를 들어, 발현된다).
원칙적으로, 발현 카세트는 돌연변이로 인해 감소되거나 부재하거나 또는 과발현될 때 치료적 이점을 전달하는 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 임의의 이식유전자를 포함할 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 바람직하게는, 비삽입된 박테리아 DNA는 존재하지 않으며, 바람직하게는 박테리아 DNA가 본원에 제공된 ceDNA 조성물에 존재하지 않는다.
제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 한 종의 ceDNA 벡터로 제한되지 않는다. 이와 같이, 또 다른 측면에서, 상이한 이식유전자 또는 동일한 이식유전자를 포함하지만 상이한 프로모터 또는 시스-조절 요소에 작동 가능하게 연결된 다수의 ceDNA 벡터는 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 따라서, 이 전략은 동시에 여러 유전자의 유전자 치료 또는 유전자 전달을 허용할 수 있다. 또한, 이식유전자의 상이한 부분을, 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있고, 개별적으로 조절할 수 있는 별도의 ceDNA 벡터 (예를 들어, 이식유전자의 기능에 필요한 상이한 도메인 및/또는 보조-인자)로 분리하여 이식유전자의 발현의 추가 제어 수준을 추가할 수 있다. 바이러스성 캡시드의 부재로 인한 항-캡시드 숙주 면역 반응의 부족을 고려하면, 전달은 또한, 후속적으로 증가하거나 감소하는 용량으로, 중요하게는 임상 환경에서의 유전자 요법에 대해 여러 번 수행될 수 있다. 캡시드가 없으므로 항-캡시드 반응이 일어나지 않을 것으로 예상된다.
본 발명은 또한 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 본원에 개시된 바와 같은 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를 대상체의 이를 필요로 하는 표적 세포 (특히 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 것을 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. ceDNA 벡터는 담체의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 담체를 요하는 것은 아니다. 구현된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는데 유용한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는 대상체에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 바와 같은 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
XI. 치료 방법
본원에 기재된 기술은 또한, 예를 들어, 현장외(ex situ), 시험관내 및 생체내 적용, 방법론, 진단 절차 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 개시된 ceDNA 벡터를 사용하는 방법뿐만 아니라 제조 방법을 입증한다.
선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를 대상체의 이를 필요로 하는 표적 세포 (예를 들어, 근육 세포 또는 조직, 또는 다른 병든 세포 유형)에 도입하는 것을 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. ceDNA 벡터는 담체의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 담체를 요하는 것은 아니다. 구현된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는데 유용한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는 대상체에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 바와 같은 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.
본원에는 본 발명의 ceDNA 벡터 중 하나 이상을, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 완충제, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 ceDNA 벡터 조성물 및 제형이 개시된다. 이러한 조성물은 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능 장애의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기 위한 하나 이상의 진단 또는 치료 키트에 포함될 수 있다. 일 측면에서, 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능 장애는 인간 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능 장애이다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 측면은 진단적 또는 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직 또는 기관에, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 양을; ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현을 가능하게 하기에 효과적인 시간 동안 제공하여 ceDNA 벡터에 의해 발현된 진단적 또는 치료적 유효량의 단백질, 펩티드, 핵산을 대상체에게 제공하는 단계를 포함한다. 추가 측면에서, 대상체는 인간이다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 측면은 대상체에서 질환, 장애, 기능 장애, 손상, 비정상적 상태 또는 외상의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 전반적이고 일반적인 의미에서, 상기 방법은 적어도, 이를 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 개시된 ceDNA 벡터를, 상기 대상체의 질환, 장애, 기능 장애, 손상, 비정상적 상태 또는 외상의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로 그리고 시간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 추가 측면에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 측면은 질환 또는 질환 상태의 하나 이상의 증상을 치료 또는 감소시키기 위한 도구로서 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터를 사용하는 것이다. 결함이 있는 유전자가 알려져 있고, 전형적으로 다음의 두 가지 등급으로 분류되는 수많은 유전 질환이 있다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 일반적으로 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질을 포함할 수 있고, 전형적으로 우세 방식으로 유전되지만 항상 그런 것은 아닌 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, ceDNA 벡터를 사용하여 이식유전자를 전달하여 대체 요법을 위해 정상 유전자를 병든 조직으로 가져오고, 또한, 일부 구현예에서, 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생성할 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, ceDNA 벡터를 사용하여 모델 시스템에서 질환 상태를 생성한 다음 질환 상태를 저지하기 위한 노력에 사용할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 ceDNA 벡터 및 방법은 유전 질환의 치료를 허용한다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환 상태는 질환을 유발하거나 더 심각하게 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 개선함으로써 치료된다.
A. 숙주 세포:
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 이식유전자를 대상체 숙주 세포 내로 전달한다. 일부 구현예에서, 대상 숙주 세포는, 예를 들어 혈액 세포, 줄기세포, 조혈 세포, CD34+ 세포, 간 세포, 암 세포, 혈관 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 눈 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상 세포, 섬유 모세포, 또는, 제한 없이, 간(hepatic) (즉, 간(liver)) 세포, 폐 세포, 심장 세포, 췌장 세포, 장 세포, 횡격막 세포, 신장(renal) (즉, 신장(kidney)) 세포, 신경 세포, 혈액 세포, 골수 세포, 또는 유전자 요법이 고려되는 대상체의 임의의 하나 이상의 선택된 조직을 포함하는 포유동물 기원의 임의의 다른 세포를 포함하는 인간 숙주 세포이다. 일 측면에서, 대상 숙주 세포는 인간 숙주 세포이다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 포함하여, 상기 언급된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 숙련가에게 명백한 목적에 따라 다수의 숙주 세포를 사용할 수 있다. 공여체 서열을 포함하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 작제물 또는 ceDNA 벡터가 숙주 세포 내로 도입되어 공여체 서열이 전술한 바와 같이 염색체 구성 요소로 유지된다. 용어 숙주 세포는 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인해 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 공여체 서열 및 그 공급원에 크게 좌우될 것이다. 숙주 세포는 또한 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 인간 세포 (예를 들어, 1차 세포, 줄기세포 또는 불멸화된 세포주)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 생체외에서 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터가 투여된 다음 유전자 치료 사건 후 대상체에게 전달될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형, 예를 들어, 체세포 또는 줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포, 또는 혈액 세포, 예를 들어, T-세포 또는 B-세포, 또는 골수 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 동종이계 세포이다. 예를 들어, T-세포 게놈 조작은 암 면역요법, HIV 요법과 같은 질환 조절 (예를 들어, 수용체 녹아웃, 예컨대 CXCR4 및 CCR5) 및 면역결핍 요법에 유용하다. B-세포 상의 MHC 수용체는 면역요법에 대해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 숙주 세포, 예를 들어, 골수 줄기세포, 예를 들어, CD34+ 세포, 또는 유도된 다능성 줄기세포는 치료 단백질의 발현을 위해 환자에게 다시 이식될 수 있다.
B. 예시적인 이식유전자 및 ceDNA 벡터로 치료될 질환
ceDNA 벡터는 또한 결함이 있는 유전자를 교정하는데 유용하다. 비제한적인 예로서, 뒤센느 근위축증(Duchene Muscular Dystrophy)의 DMD 유전자는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 전달될 수 있다.
제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터 또는 이의 조성물은 임의의 유전 질환의 치료에 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, ceDNA 벡터 또는 이의 조성물은 예를 들어 돌연변이 단백질이 신경, 심장, 위장 시스템 등에서 미스폴딩되고 응집되는 희귀 질환(orphan disease)인, 트랜스티레틴 아밀로이드증 (ATTR)의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 ceDNA 벡터 시스템을 사용하여 돌연변이 질환 유전자 (mutTTR)를 결실시킴으로써 질환을 치료할 수 있는 것으로 본원에서 고려된다. 유전 질환의 이러한 치료는 질환 진행을 중단시킬 수 있고 확립된 질환의 퇴행 또는 질환의 적어도 하나의 증상의 적어도 10% 감소를 가능하게 할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 신생아 또는 영아의 암모니아 해독 능력을 손상시키는, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍증 (OTC 결핍증), 고암모니아혈증 또는 다른 요소 주기 장애의 치료에 사용될 수 있다. 모든 선천성 대사 질환에서와 같이, 야생형 대조군과 비교하여 효소 활성의 부분적인 회복 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)조차도 OTC 결핍증을 갖는 대상체에 대해 적어도 하나의 증상 OTC의 감소 및/또는 삶의 질 개선을 위해 충분할 수 있음이 본원에 고려된다. 일 구현예에서, OTC를 인코딩하는 핵산은 생체내 단백질 대체를 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 페닐알라닌 하이드록실라제 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 전달하여 PKU 환자에게 유독할 수 있는, 식이 페닐알라닌의 축적을 감소시킴으로써 페닐케톤뇨증 (PKU)의 치료에 사용될 수 있다. 모든 선천성 대사 질환에서와 같이, 야생형 대조군과 비교하여 효소 활성의 부분적인 회복 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)조차도 PKU를 갖는 대상체에 대해 PKU의 적어도 하나의 증상의 감소 및/또는 삶의 질 개선을 위해 충분할 수 있음이 본원에 고려된다. 일 구현예에서, 페닐알라닌 하이드록실라제를 인코딩하는 핵산은 생체내 단백질 대체를 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 글리코겐 저장병 (GSD)을 갖는 대상체에서 비정상 글리코겐 합성 또는 파괴를 교정하기 위해 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 전달함으로써 글리코겐 저장병 (GSD)의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 및 방법을 사용하여 전달 및 발현될 수 있는 효소의 비제한적인 예는 글리코겐 신타제, 글루코스-6-포스파타제, 산-알파 글루코시다제, 글리코겐 탈분지 효소, 글리코겐 분지 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라제, 간 글리코겐 포스포릴라제, 근육 포스포프럭토키나제, 포스포릴라제 키나제, 포도당 수송체-2 (GLUT-2), 알돌라제 A, 베타-에놀라제, 포스포글루코뮤타제-1 (PGM-1), 및 글리코게닌-1을 포함한다. 모든 선천성 대사 질환에서와 같이, 야생형 대조군과 비교하여 효소 활성의 부분적인 회복 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)조차도 GSD를 갖는 대상체에 대해 GSD의 적어도 하나의 증상의 감소 및/또는 삶의 질 개선을 위해 충분할 수 있음이 고려된다. 일 구현예에서, 비정상 글리코겐 저장을 교정하기 위한 효소를 인코딩하는 핵산은 생체내 단백질 대체를 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터는 또한 다음 중 어느 것의 치료에 사용하기 위해 고려된다: 레베르 선천성 흑암시 (LCA), 폴리Q 반복부를 포함하는 폴리글루타민 질환, 및 알파-1 항트립신 결핍증 (A1AT). LCA는 실명을 유발하는 희귀한 선천성 안과 질환으로, 이는 GUCY2D, RPE65, SPATA7, AIPL1, LCA5, RPGRIP1, CRX, CRB1, NMNAT1, CEP290, IMPDH1, RD3, RDH12, LRAT, TULP1, KCNJ13, GDF6 및/또는 PRPH2의 유전자 중 임의의 하나의 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 및 조성물 및 방법은 LCA의 증상을 담당하는 유전자(들)에서의 오류를 교정하기 위해 LCA와 관련된 하나 이상의 유전자의 전달을 위해 조정될 수 있음이 고려된다. 폴리글루타민 질환은 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증 (dentatorubropallidoluysian atrophy), 헌팅턴병, 척수 및 구근 근위축증(spinal and bulbar muscular atrophy), 및 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia) 유형 1, 2, 3 (마카도-조셉 질환(Machado-Joseph disease)으로도 알려져 있음), 6, 7 및 17을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. A1AT 결핍은 알파-1 항트립신의 결함 생성을 유발하여 혈액 및 폐에서 효소의 활성을 감소시키고, 결과적으로 병든 대상체에서 폐기종 또는 만성 폐쇄성 폐 질환을 유발할 수 있는 유전 장애이다. 본원에 개괄된 바와 같은 ceDNA 벡터 또는 이의 조성물을 사용한 A1AT 결핍을 갖는 대상체의 치료가 본원에서 구체적으로 고려된다. LCA, 폴리글루타민 질환 또는 A1AT 결핍의 치료를 위해 원하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터가 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있음이 본원에서 고려된다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물은 바이러스 서열, 병원체 서열, 염색체 서열, 전위 접합부(translocation junction) (예를 들어, 암과 관련된 전위), 비-코딩 RNA 유전자 또는 RNA 서열, 질환 관련 유전자 등을 전달하는데 사용될 수 있다.
관심 있는 임의의 핵산 또는 표적 유전자는 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 전달 또는 발현될 수 있다. 표적 핵산 및 표적 유전자는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 비-코딩 핵산 (예를 들어, RNAi, miR 등) 바람직하게는 치료적 (예를 들어, 의학적, 진단적 또는 수의학적 용도를 위한) 또는 면역원성 (예를 들어, 백신을 위한) 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터에 의해 표적화되는 표적 핵산 또는 표적 유전자는 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩한다.
특히, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의한 발현을 위한 유전자 표적 또는 이식유전자는 질환, 기능 장애, 손상 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위해, 예를 들어, 비제한적으로, 단백질(들), 폴리펩티드(들), 펩티드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편, 뿐만 아니라 이의 변이체 및/또는 이의 활성 단편을 인코딩할 수 있다. 일 측면에서, 질환, 기능 장애, 외상, 손상 및/또는 장애는 인간 질환, 기능 장애, 외상, 손상 및/또는 장애이다.
발현 카세트는 또한 폴리펩티드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 RNA (코딩 또는 비-코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 이들의 안티센스 대응물 (예를 들어, antagoMiR))을 인코딩할 수 있다. 발현 카세트는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제, 및 당 업계에 잘 알려진 다른 것들과 같은 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 발현 작제물인, 발현 카세트에 제공된 서열은 표적 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 천연 서열 (예를 들어, 원핵생물 서열)의 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당한 수의 코돈을 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 척추동물 세포, 예를 들어, 마우스 또는 인간의 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 최초 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어, Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼 (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
많은 유기체는 성장하는 펩티드 사슬에 특정 아미노산의 삽입을 코딩하기 위해 특정 코돈을 사용하기 위한 편향을 나타낸다. 유기체 간의 코돈 사용의 차이인 코돈 선호도 또는 코돈 편향은 유전자 코드의 축퇴에 의해 제공되며, 많은 유기체 사이에서 잘 기록되어 있다. 코돈 편향은 종종 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관 관계가 있으며, 이는 특히 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전이 RNA (tRNA) 분자의 유용성에 의존하는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
광범위한 동물, 식물 및 미생물 종에 이용 가능한 많은 유전자 서열을 고려할 때, 코돈 사용의 상대 빈도를 계산할 수 있다 (Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)).
본원에 언급된 바와 같이, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 하나 이상의 작용제, 길항제, 항-아폽토시스 인자, 억제제, 수용체, 사이토카인, 세포독소, 적혈구 생성 촉진제, 당단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 신경 성장 인자, 신경활성 펩티드, 신경활성 펩티드 수용체, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 데카르복실라제, 단백질 키나제, 단백질 키나제 억제제, 효소, 수용체 결합 단백질, 수송 단백질 또는 이의 하나 이상의 억제제, 세로토닌 수용체 또는 이의 하나 이상의 흡수 억제제, 세르핀, 세르핀 수용체, 종양 억제제, 진단 분자, 화학요법제, 세포독소 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 단백질 또는 펩티드, 또는 치료 핵산 서열 또는 치료제를 인코딩할 수 있다.
ceDNA 벡터는 또한 유전자 발현을 제거하는데 유용하다. 예를 들어, 일 구현예에서 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 안티센스 핵산 또는 기능적 RNA를 발현시켜 표적 유전자의 녹다운을 유도하기 위해 사용된다. 비제한적인 예로서, HIV 수용체인, CXCR4 및 CCR5의 발현은 1차 인간 T-세포에서 성공적으로 제거되었고, 그 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Schumann et al. (2015), PNAS 112(33): 10437-10442]을 참조한다. 표적화된 억제를 위한 또 다른 유전자는 PD-1이고, 여기서 ceDNA 벡터는 억제 핵산 또는 RNAi 또는 기능적 RNA를 발현시켜 PD-1의 발현을 억제할 수 있다. PD-1은 악성 종양에서 발생하는 만성 활성 T 세포에서 면역 체크포인트 세포 표면 수용체를 발현시킨다. 상기 슈만(Schumann) 등을 참고한다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 병든 유전자를 표적으로 하는 이식유전자를 발현시킴으로써 결함이 있는 유전자를 교정하는데 유용하다. ceDNA 벡터에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애의 비제한적 예는 미국 특허 공보 2014/0170753의 이들 및 이들의 관련 유전자와 함께 표 A-C에 열거되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터는 세이프 하버 유전자, 예를 들어, 불활성 인트론에서 치료 단백질 또는 리포터 단백질의 발현을 위한 발현 카세트의 삽입에 사용된다. 특정 구현예에서, 프로모터가 없는 카세트는 세이프 하버 유전자에 삽입된다. 이러일 구현예에서, 프로모터가 없는 카세트는 세이프 하버 유전자 조절 요소 (프로모터, 인핸서 및 시그널링 펩티드)를 이용할 수 있으며, 세이프 하버 유전자좌에서의 삽입의 비제한적인 예는 하기에 기재된 알부민 유전자좌로의 삽입이다: Blood (2015) 126 (15): 1777-1784 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 알부민으로의 삽입은 이식유전자의 혈액으로의 분비를 가능하게 하는 이점이 있다 (예를 들어, 실시예 22 참조). 또한, 게놈 세이프 하버 부위는 당 업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 하기에 기재된 기술을 사용하여 결정될 수 있다: Papapetrou, ER & Schambach, A. Molecular Therapy 24(4):678-684 (2016) 또는 Sadelain et al. Nature Reviews Cancer 12:51-58 (2012) (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 본원에서는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 게놈의 세이프 하버 부위 (예를 들어, AAVS1 세이프 하버 부위)가 본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다 (예를 들어, Oceguera-Yanez et al. Methods 101:43-55 (2016) or Tiyaboonchai, A et al. Stem Cell Res 12(3):630-7 (2014) 참조, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고로 포함됨). 예를 들어, AAVS1 게놈 세이프 하버 부위는 배아 줄기세포 (예를 들어, 인간 배아 줄기세포) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPS 세포)에서 조혈 특이적 이식유전자 발현 및 유전자 침묵의 목적으로 본원에 기재된 ceDNA 벡터 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 또한, 염색체 19 상의 AASV1 세이프 하버 부위에 삽입하기 위한 합성 또는 상업적으로 이용 가능한 상동성-지정 복구 공여체 주형이 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 또는 조성물과 함께 사용될 수 있는 것으로 본원에 고려된다. 예를 들어, 상동성-지정 복구 주형, 및 가이드 RNA는, 예를 들어, 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 System Biosciences로부터 상업적으로 구입하여 ceDNA 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자를 발현하거나, T 세포에서 표적 유전자의 발현을 녹아웃시키거나 감소시키는데, 예를 들어, 개선된 입양 세포 전달 및/또는 CAR-T 요법을 위해 T 세포를 조작하기 위해 사용된다 (예를 들어, 실시예 24 참조). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유전자를 녹아웃시키는 이식유전자를 발현할 수 있다. 치료적으로 적절한 녹아웃 및 T 세포의 유전자 편집의 비제한적 예는 하기에 기재되어 있다: PNAS (2015) 112(33):10437-10442 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).
C. 유전자 요법을 위한 추가 질환:
일반적으로, 본원에 개시된 바와 같이 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 관련된 증상을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 상기 설명에 따라 임의의 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태는 낭포성 섬유증 (및 폐의 다른 질환), 혈우병 A, 혈우병 B, 지중해 빈혈, 빈혈 및 기타 혈액 장애, AIDS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 간질 및 기타 신경계 장애, 암, 당뇨병, 근위축증 (예를 들어, 뒤센느, 베커), 헐러병(Hurler's disease), 아데노신 데아미나제 결핍, 대사 결함, 망막 퇴행성 질환 (및 눈의 다른 질환), 미토콘드리아증 (예를 들어, 레버의 유전성 시신경병증 (LHON), 리 증후군 및 아급성 경화성 뇌병증), 근병증 (예를 들어, 안면견갑상완 근병증 (FSHD) 및 심근병증), 고형 장기 (예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장) 질환 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 대사 장애 (예를 들어, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍)를 갖는 개체의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유전자 또는 유전자 산물에서의 돌연변이에 의해 야기된 질환 또는 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터로 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애는 대사 질환 또는 장애 (예를 들어, 파브리병, 고셔병, 페닐케톤뇨증 (PKU), 글리코겐 저장병); 우레아 사이클 질환 또는 장애 (예를 들어, 오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC) 결핍); 리소좀 저장 질환 또는 장애 (예를 들어, 이염성백질디스트로피 (MLD), 점막다당류증 II형 (MPSII; 헌터 증후군)); 간 질환 또는 장애 (예를 들어, 진행 가족성 간내담즙정체 (PFIC); 혈액 질환 또는 장애 (예를 들어, 혈우병 (A 및 B), 지중해 빈혈 및 빈혈); 암 및 종양, 및 유전 질환 또는 장애 (예를 들어, 낭포성 섬유증)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면으로서, 본원에 개시된 바와 같이 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 이식유전자 발현 수준 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 호르몬 또는 성장 인자를 인코딩하는 이식유전자)을 조절하는 것이 바람직한 상황에서 이종 뉴클레오티드 서열을 전달하는데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 질환 또는 장애를 초래하는 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능 (예를 들어, 단백질의 부재 또는 결함)을 교정하는데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터는 기능성 단백질을 생성하고/하거나 단백질의 수준을 변형시켜 단백질에서 부재 또는 결함에 의해 야기되는 특정 질환 또는 장애로 인한 증상을 완화시키거나 감소시키거나 상기 특정 질환 또는 장애에 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, OTC 결핍의 치료는 기능성 OTC 효소를 생성함으로써 달성될 수 있으며; 혈우병 A 및 B의 치료는 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X의 수준을 변형시킴으로써 달성될 수 있으며; PKU의 치료는 페닐알라닌 하이드록실라제 효소의 수준을 변형시킴으로써 달성될 수 있으며; 파브리병 또는 고셔병의 치료는 각각 기능성 알파 갈락토시다제 또는 베타 글루코세레브로시다제를 생성함으로써 달성될 수 있으며; MLD 또는 MPSII의 치료는 각각 기능성 아릴설파타제 A 또는 이듀로네이트-2-설파타제를 생성함으로써 달성될 수 있으며; 낭포성 섬유증의 치료는 기능성 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절제를 생성함으로써 달성될 수 있으며; 글리코겐 저장병의 치료는 기능적 G6Pase 효소 기능을 회복시킴으로써 달성될 수 있으며; PFIC의 치료는 기능적 ATP8B1, ABCB11, ABCB4 또는 TJP2 유전자를 생성함으로써 달성될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 안티센스 핵산 을 시험관내 또는 생체내에서 세포에 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이식유전자이 RNAi 분자인 경우, 표적 세포에서 안티센스 핵산 또는 RNAi의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, RNAi 분자 또는 안티센스 핵산인 이식유전자는 이를 필요로 하는 대상체에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어, 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관내에서 세포에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 예시적인 이식유전자는 X, 리소좀 효소 (예를 들어, 테이-삭스병과 관련된 헥소사미니다제 A, 또는 헌터 증후군/MPS II와 관련된 이듀로네이트 설파타제), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 초산화물 디스뮤타제, 글로빈, 렙틴, 카탈라제, 티로신 하이드록실라제, 및 사이토카인 (예를 들어, 인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨 12, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림프독소 등), 펩티드 성장 인자 및 호르몬 (예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유 모세포 성장 인자 (FGF), 신경 성장 인자 (NGF), 신경 영양 인자-3 및 4, 뇌-유래 신경 영양 인자 (BDNF), 신경교 유래 성장 인자 (GDNF), 형질전환 성장 인자-α 및 -β 등), 수용체 (예를 들어, 종양 괴사 인자 수용체)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예시적인 구현예에서, 이식유전자는 하나 이상의 원하는 표적에 특이적인 모노클로날 항체를 인코딩한다. 본원에 개시된 방법에서 항체 및 융합 단백질의 제어된 발현을 위한 예시적인 ceDNA 벡터는 2019년 2월 14일에 출원된 국제 출원 PCT/US19/18016에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 예시적인 구현예에서, 하나 초과의 이식유전자는 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 예시적인 구현예에서, 이식유전자는 2개의 상이한 관심 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 정의된 바와 같이, 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 바와 같이, 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다. 다른 예시적인 이식유전자 서열은 자살 유전자 산물 (티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나제, 및 종양 괴사 인자), 암 요법에 사용되는 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질, 및 종양 억제 유전자 산물을 인코딩한다.
대표적인 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자는 근위축증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증의 치료에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 본원에 기재된 치료-, 개선- 또는 예방-유효량의 ceDNA 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 ceDNA 벡터는 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴, 액티빈 II형 가용성 수용체, IGF-1, 항염증성 폴리펩티드, 예컨대 Ikappa B 우성 돌연변이체, 사르스코판, 우트로핀, 마이크로-디스트로핀, 라미닌-α2, α-사르코글리칸, β-사르코글리칸, γ-사르코글리칸, δ-사르코글리칸, IGF-1, 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편, 및/또는 미오스타틴에 대한 RNAi를 인코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 혈액에서 정상적으로 순환하는 폴리펩티드 (예를 들어, 효소) 또는 기능적 RNA (예를 들어, RNAi, 마이크로RNA, 안티센스 RNA)의 생성, 또는 장애 (예를 들어, 대사 장애, 예컨대 당뇨병 (예를 들어, 인슐린), 혈우병 (예를 들어, VIII), 무코다당류 장애 (예를 들어, Sly 증후군, 헐러 증후군, 샤이 증후군(Scheie Syndrome), 헐러-샤이 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군(Sanfilippo Syndrome) A, B, C, D, 모르키오 증후군(Morquio Syndrome), 마로토-라미 증후군(Maroteaux-Lamy Syndrome) 등) 또는 리소좀 저장 장애 (예컨대 고셔병 [글루코세레브로시다제], 폼페병 [리소좀산 .알파-글루코시다제] 또는 파브리병 [.알파-갈락토시다제 A]) 또는 글리코겐 저장 장애 (예컨대, 폼페병 [리소좀산 글루코시다제])를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 다른 조직으로 전신 전달하기 위해 골격, 심장 또는 횡격막 근육에 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 대사 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 다른 적합한 단백질이 상기 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 이를 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 예시적인 대사 장애 및 폴리펩티드를 인코딩하는 이식유전자는 본원에 기재되어 있다. 선택적으로, 폴리펩티드는 분비된다 (예를 들어, 천연 상태의 분비된 폴리펩티드이거나, 예를 들어, 당 업계에 공지된 바와 같은 분비 신호 서열과의 작동 가능한 회합에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩티드).
본 발명의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 심부전 또는 PAD를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같이 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 ceDNA 벡터는, 예를 들어, 근형질 내부 세망(sarcoplasmic endoreticulum) Ca2+-ATPase (SERCA2a), 혈관 신생 인자, 포스파타제 억제제 I (I-1), 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 억제 또는 우세-음성 분자, 예컨대 포스포람반 S16E, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, β2-아드레날린 수용체, .베타.2-아드레날린 수용체 키나제 (BARK), PI3 키나제, 칼사르칸, .베타.-아드레날린 수용체 키나제 억제제 (βARKct), 단백질 포스파타제 1의 억제제 1, S100A1, 파발부민, 아데닐릴 사이클라제 6형, 절단된 구성적 활성 βARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, 칼리크레인, HIF, 티모신-β4, mir-1, mir-133, mir-206 및/또는 mir-208과 같은 G-단백질 결합 수용체 키나제 2형 녹다운에 영향을 미치는 분자를 인코딩하는 이식유전자를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 임의의 적합한 수단에 의해, 선택적으로 대상체가 흡입하는, ceDNA 벡터를 포함하는 호흡 가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함으로써 대상체의 폐에 투여될 수 있다. 호흡 가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. ceDNA 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 적합한 수단, 예컨대 압력 구동식 에어로졸 분무기 또는 초음파 분무기를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,501,729 호를 참조한다. ceDNA 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸도 마찬가지로 제약 분야에 공지된 기술에 의해 임의의 고체 미립자 의약 에어로졸 발생기로 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 CNS의 조직 (예를 들어, 뇌, 눈)에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 유전 장애, 신경퇴행성 장애, 정신 장애 및 종양을 포함하는, CNS 질환을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. CNS의 예시적인 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 카나반병(Canavan disease), 라이병(Leigh's disease), 레프숨병(Refsum disease), 투렛 증후군, 1차 측삭 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 진행성 근위축증, 피크병(Pick's disease), 근위축증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 빈스완거병(Binswanger's disease), 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이 삭스병, 레쉬-나이안병(Lesch-Nyan disease), 간질, 뇌경색, 기분 장애 (예를 들어, 우울증, 양극성 정동 장애, 지속성 정동 장애, 2차 기분 장애)를 포함한 정신 장애, 조현병, 약물 의존성 (예를 들어, 알코올 중독 및 기타 물질 의존성), 신경증 (예를 들어, 불안, 강박 장애, 신체형 장애, 해리성 장애, 비탄, 산후 우울증), 정신병 (예를 들어, 환각 및 망상), 치매, 편집증, 주의력 결핍 장애, 정신성적 장애, 수면 장애, 통증 장애, 식이 또는 체중 장애 (예를 들어, 비만, 악액질, 신경성 식욕부진 및 폭식증(bulemia)) 및 CNS의 암 및 종양 (예를 들어, 뇌하수체 종양)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 안구 장애에는 망막, 후관(posterior tract) 및 시신경을 포함하는 안과 질환 (예를 들어, 망막색소변성증, 당뇨병성 망막병증 및 기타 망막 퇴행성 질환, 포도막염, 연령-관련 황반 변성, 녹내장)을 포함한다. 많은 안과 질환 및 장애는 3가지 유형의 징후 중 하나 이상과 관련이 있다: (1) 혈관 신생, (2) 염증 및 (3) 변성. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 항-혈관 신생 인자; 항염증 인자; 세포 변성을 지연시키거나, 세포 스페어링(cell sparing)을 촉진시키거나, 또는 세포 성장를 촉진시키는 인자 및 상기의 조합을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 당뇨병성 망막병증은 혈관 신생을 특징으로 한다. 당뇨병성 망막병증은 안구 내로 (예를 들어, 유리체에서) 또는 안구 주위로 (예를 들어, 서브-테논 부위에서) 하나 이상의 항-혈관 신생 인자를 전달함으로써 치료될 수 있다. 하나 이상의 신경 영양 인자는 또한 안구 내로 (예를 들어, 유리체 내로) 또는 안구 주위로 공동-전달될 수 있다. 본 발명의 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 추가의 안 질환은 지도모양 위축(geographic atrophy), 혈관 또는 "습성" 황반 변성, 스타가르트, 질환(Stargardt disease), 레베르 선천성 흑암시 (LCA), 어셔 증후군(Usher syndrome), 탄력섬유성 가황색종 (PXE), x-연관 망막색소변성증 (XLRP), x-연관 망막층간분리증 (XLRS), 맥락막결손, 레베르 유전성 시신경병증 (LHON), 아코마톱시아(Archomatopsia), 추체-간체 이영양증, 퓨크스 내피 각막 이영양증(Fuchs endothelial corneal dystrophy), 당뇨병성 황반 부종 및 안암 및 안 종양을 포함한다.
일부 구현예에서, 염증성 안 질환 또는 장애 (예를 들어, 포도막염)는 본 발명의 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 항염증 인자는 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 안내 (예를 들어, 유리체 또는 전방) 투여에 의해 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 망막 변성을 특징으로 하는 안 질환 또는 장애 (예를 들어, 망막색소변성증)는 본 발명의 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 신경 영양 인자를 인코딩하는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 안내 (예를 들어, 유리체 투여)는 이러한 망막 변성-기반 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈관 신생 및 망막 변성 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성)을 모두 포함하는 질환 또는 장애는 본 발명의 ceDNA 벡터로 치료될 수 있다. 연령-관련 황반 변성은 안구 내로 (예를 들어, 유리체) 하나 이상의 신경 영양 인자 및/또는 안구 내로 또는 안구 주위로 (예를 들어, 서브-테논 부위에서) 하나 이상의 항-혈관 신생 인자를 인코딩하는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 투여함으로써 치료될 수 있다. 녹내장은 안압 증가 및 망막 신경절 세포의 손실을 특징으로 한다. 녹내장의 치료는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 세포를 흥분독성 손상으로부터 보호하는 하나 이상의 신경보호제의 투여를 포함한다. 따라서, 이러한 작용제는 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 길항제, 사이토카인 및 신경 영양 인자를 포함하며, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 안내, 선택적으로적으로 유리체 내로 전달될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 발작을 치료하기 위해, 예를 들어 발작의 개시, 발병 또는 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 발작에 대한 치료적 치료의 효능은 행동 (예를 들어, 눈 또는 입의 전율, 틱(tick)) 및/또는 전기 촬영술(electrographic) 수단 (대부분의 발작은 현저한 전기 촬영술 이상을 갖는다)에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한 간질을 치료하는데 사용될 수 있으며, 이는 시간이 지남에 따라 다수의 발작으로 나타난다. 하나의 대표적인 구현예에서, 뇌하수체 종양을 치료하기 위해 소마토스타틴 (또는 이의 활성 단편)이 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 뇌에 투여된다. 이 구현예에 따르면, 소마토스타틴 (또는 이의 활성 단편)을 인코딩하는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 뇌하수체로의 미세주입에 의해 투여된다. 마찬가지로, 이러한 치료는 말단 비대증 (뇌하수체에서 비정상적인 성장 호르몬 분비)을 치료하는데 사용될 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같이 소마토스타틴의 핵산 (예를 들어, GenBank 수탁 번호 J00306) 및 아미노산 (예를 들어, GenBank 수탁 번호 P01166; 프로세싱된 활성 펩티드 소마토스타틴-28 및 소마토스타틴-14를 함유함) 서열. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 미국 특허 7,071,172에 기재된 바와 같은 분비 신호를 포함하는 이식유전자를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 생체내에서 대상체에게 전신 전달하기 위한 안티센스 RNA, RNAi 또는 다른 기능적 RNA (예를 들어, 리보자임)를 생성하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 용도에 관한 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 안티센스 핵산, 리보자임 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,877,022에 기재된 바와 같음), 스플라이세오솜(spliceosome)-매개 트랜스-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA (Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; 미국 특허 번호 6,013,487; 미국 특허 번호 6,083,702 참조), 유전자 침묵을 매개하는 간섭 RNA (RNAi) (Sharp et al., (2000) Science 287:2431 참조) 또는 다른 "비-번역" RNA, 예컨대 "가이드" RNA (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; Yuan et al.의 미국 특허 번호 5,869,248) 등을 인코딩하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 리포터 폴리펩티드 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소)를 인코딩하는 이식유전자를 또한 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 실험 또는 진단 목적에 유용한 리포터 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼 라제 (CAT), 루시퍼라제 및 당 업계에 잘 알려진 다른 것들 중 어느 것으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 리포터 폴리펩티드를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 ceDNA 벡터는 진단 목적으로 또는 이들이 투여되는 대상체에서 ceDNA 벡터의 활성의 마커로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 상기 유전자좌와 재조합하는 이식유전자 또는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 접근법은 숙주 세포에서 유전적 결함을 교정하는데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 백신 접종을 위해 대상체에서 면역원성 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있는 이식유전자를 포함할 수 있다. 이식유전자는 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등으로부터의 면역원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당 업계에 공지된 임의의 관심 면역원을 인코딩할 수 있다.
D. ceDNA 벡터를 사용한 성공적인 유전자 발현 시험
당 분야에 널리 공지된 분석법을 사용하여 시험관내 및 생체내 모델 모두에서 수행될 수 있는 ceDNA에 의한 유전자 전달의 효율을 시험할 수 있다. ceDNA에 의한 원하는 이식유전자의 녹인 또는 녹아웃은 원하는 이식유전자의 mRNA 및 단백질 수준을 측정함으로써 (예를 들어, 역전사 PCR, 웨스턴 블롯 분석, 및 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)) 당업자에 의해 평가될 수 있다. ceDNA에 의한 핵산 변경 (예를 들어, 점 돌연변이 또는 DNA 영역의 결실)은 게놈 표적 DNA의 심층 시퀀싱에 의해 평가될 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA는, 예를 들어 형광 현미경 또는 발광 플레이트 판독기에 의해 리포터 단백질의 발현을 조사함으로써, 원하는 이식유전자의 발현을 평가하는데 사용될 수 있는 리포터 단백질을 포함한다. 생체내 적용의 경우, 단백질 기능 분석을 사용하여 유전자 전달이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위해 주어진 유전자 및/또는 유전자 산물의 기능성을 시험할 수 있다. 예를 들어, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절 유전자 (CFTR)의 점 돌연변이는 음이온 채널을 통해 음이온 (예를 들어, Cl-)을 이동시키는 CFTR의 능력을 억제하고, 기능적 (즉, 돌연변이되지 않은) CFTR 유전자를 ceDNA 벡터를 사용하여 대상체에게 전달함으로써 교정될 수 있다. ceDNA 벡터의 투여 후, 당업자는 CFTR 유전자가 전달되고 발현되었는지를 결정하기 위해 음이온이 음이온 채널을 통해 이동하는 능력을 평가할 수 있다. 당업자는 시험관내 또는 생체내에서 단백질의 기능성을 측정하기 위한 최상의 시험을 결정할 수 있을 것이다.
세포 또는 대상체에서 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 유전자 발현의 효과는 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 10개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 20년 동안 지속되거나 영구적일 수 있음이 고려된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 카세트, 발현 작제물 또는 ceDNA 벡터의 이식유전자는 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 천연 서열 (예를 들어, 원핵생물 서열)의 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당수의 코돈을 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 척추동물의 세포, 예를 들어 마우스 또는 인간 (예를 들어, 인간화된)의 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어, Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼 (Aptagen, Inc.) 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
XII. 투여
본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입 (예를 들어, 에어로졸을 통한), 협측 (예를 들어, 설하), 질, 경막내, 안내, 경피, 내피내, 자궁 내 (또는 난(ovo) 내), 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내 (골격, 횡격막 및/또는 심장 근육으로의 투여 포함), 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소 (예를 들어, 기도 표면, 및 경피 투여를 포함하는 피부 및 점막 표면 모두에), 림프내 등, 및 직접 조직 또는 기관 주사 (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌에)를 포함한다.
제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 투여는 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부 및 눈으로 구성된 군으로부터 선택된 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 대상체의 임의의 부위에 투여될 수 있다. 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 투여는 또한 종양 (예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 그 근처)으로의 투여일 수 있다. 임의의 경우에 가장 적합한 경로는 치료, 개선 및/또는 예방되는 상태의 성질 및 중증도 및 사용되는 특정 ceDNA 벡터의 성질에 따라 달라질 것이다. 또한, ceDNA는 하나의 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터 (예를 들어 ceDNA 칵테일)에서 하나 초과의 이식유전자를 투여할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 골격근으로 본원에 개시된 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 투여는 사지 (예를 들어, 상완, 하완, 상부 다리 및/또는 하부 다리), 등, 목, 머리 (예를 들어, 혀), 흉부, 복부, 골반/회음 및/또는 손발가락의 골격근으로의 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류, (선택적으로 다리 및/또는 팔의 고립된 사지 관류; 예를 들어, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464), 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근으로 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 사지 관류, 선택적으로 고립된 사지 관류 (예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여에 의해 대상체 (예를 들어, DMD와 같은 근위축증을 갖는 대상체)의 사지 (팔 및/또는 다리)로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 "유체 역학" 기술을 사용하지 않고 투여될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터의 심장 근육으로의 투여는 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 중격으로의 투여를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 정맥내 투여, 대동맥내 투여와 같은 동맥내 투여, 직접 심장 주사 (예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실) 및/또는 관상 동맥 관류에 의해 심장 근육으로 전달될 수 있다. 횡격막 근육으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 투여는 평활근에 존재하고/하거나, 그 근처에 및/또는 평활근 상에 존재하는 내피 세포로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 골격근, 횡격막 근육 및/또는 심장 근육으로 투여된다 (예를 들어, 근이영양증 또는 심장병 (예를 들어, PAD 또는 울혈성 심부전)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해).
A. 생체외 치료
일부 구현예에서, 대상체로부터 세포를 제거하고, ceDNA 벡터가 그 안에 도입되고, 이어서 세포는 대상체 내로 다시 교체된다. 생체외 치료를 위해 대상체로부터 세포를 제거한 후 대상체로 다시 도입하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346 참조; 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 포함됨). 대안적으로, ceDNA 벡터는 또 다른 대상체 유래 세포, 배양 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원 유래 세포 내로 도입되고, 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
ceDNA 벡터로 형질도입된 세포는 바람직하게는 약제학적 담체와 함께 "치료 적 유효량"으로 대상체에게 투여된다. 당업자는 치료 효과가 대상체에게 약간의 이점이 제공되는 한 완전하거나 치유력이 있을 필요는 없음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 바람직하게는, 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에서 생산된 임의의 폴리펩티드인 이식유전자 (때로는 이종 뉴클레오티드 서열이라고도 함)을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본원에 논의된 바와 같은 치료 방법에서 ceDNA 벡터의 사용과 대조적으로, 일부 구현예에서 ceDNA 벡터는, 예를 들어, 항원 또는 백신의 생산을 위해 배양 세포 및 이로부터 단리된 발현된 유전자 산물 내로 도입될 수 있다.
ceDNA 벡터는 수의학 및 의학적 용도로 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 생체외 유전자 전달 방법에 적합한 대상체는 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유동물 (예를 들어, 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개 및 토끼목) 둘 다를 포함하며, 포유동물이 바람직하다. 인간 대상체가 가장 바람직하다. 인간 대상체에는 신생아, 유아, 청소년 및 성인이 포함된다.
본원에 기재된 기술의 한 측면은 이식유전자를 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 시험관내 방법의 경우, 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 방법, 뿐만 아니라 당 업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 바람직하게는 생물학적-유효량으로 세포에 투여된다. ceDNA 벡터가 생체내 세포 (예를 들어, 대상체)로 투여되는 경우, ceDNA 벡터의 생물학적-유효량은 표적 세포에서 이식유전자의 형질도입 및 발현을 야기하기에 충분한 양이다.
B. 단위 투여 형태
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약제학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 적합할 것이다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경막내 또는 뇌실내 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다.
XIII. 다양한 응용
본원에 제공된 조성물 및 ceDNA 벡터는 상기 기재된 바와 같은 다양한 목적을 위한 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 단백질을 인코딩하거나 또는 기능적 RNA일 수 있고, 그리고 일부 구현예에서, 연구 목적으로, 예를 들어, 표적 유전자의 기능을 연구하기 위한, 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이 또는 교정된 유전자 서열을 보유하는 체세포성 형질전환 동물 모델을 생성하기 위해 변형된 기능적 RNA 또는 단백질일 수 있다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료, 개선 또는 예방에 유용한, 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자는 비정상적인 유전자 서열과 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 투여되며, 이는 표적 유전자의 발현 결핍 또는 기능 장애 중 임의의 하나 이상을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 진단 및 스크리닝 방법에 사용하기 위해, 이식유전자가 세포 배양 시스템, 또는 대안적으로 형질전환 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현되는 ceDNA 벡터가 구상된다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 측면은 포유동물 세포 집단을 형질도입시키는 방법을 제공한다. 전체적이고 일반적인 의미에서, 본 방법은 적어도, 집단의 하나 이상의 세포에, 본원에 개시된 ceDNA 중 하나 이상의 유효량을 포함하는 조성물을 도입하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 발명은 하나 이상의 개시된 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 조성물을 포함하거나, 하나 이상의 추가 성분으로 제형화되거나, 또는 이들의 사용을 위한 하나 이상의 설명서와 함께 준비된 조성물, 및 치료 및/또는 진단 키트를 제공한다.
본원에 개시된 바와 같은 제어된 이식유전자 발현을 위한 ceDNA 벡터가 투여되는 세포는 신경 세포 (말초 및 중추 신경계 세포, 특히 뇌 세포 포함), 폐 세포, 망막 세포, 상피 세포 (예를 들어, 장 및 호흡기 상피 세포), 근육 세포, 수지상 세포, 췌장 세포 (섬 세포 포함), 간 세포, 심근 세포, 골 세포 (예를 들어, 골수 줄기세포), 조혈 줄기세포, 비장 세포, 각질 세포, 섬유 모세포, 내피 세포, 전립선 세포, 생식 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형일 수 있다. 대안적으로, 세포는 임의의 전구 세포일 수 있다. 추가의 대안으로서, 세포는 줄기세포 (예를 들어, 신경 줄기세포, 간 줄기세포)일 수 있다. 또 다른 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 더욱이, 세포는, 상기 나타낸 바와 같이, 임의의 기원의 종으로부터 유래될 수 있다.
본원에 기재된 기술의 일부 구현예는 하기 번호가 매겨진 단락 중 임의의 단락에 따라 정의될 수 있다:
1. 이전 발현 수준으로부터 이식유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 재복용될 수 있는 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 ceDNA 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 폴리뉴클레오티드 서열의 측면에 있는 비대칭 또는 대칭 ITR 서열을 포함하고, 여기서 상기 ITR 중 적어도 하나는 복제 적격 ITR인, 조성물.
2. ceDNA 벡터는 이식유전자를 적어도 42일, 적어도 84일, 및 적어도 132일로부터 선택된 기간 동안 발현시키는, 단락 1의 조성물.
3. 이식유전자는 핵산, 억제제, 펩티드 또는 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질, 항원, 길항제, 작용제 또는 RNAi 분자 중 어느 것으로부터 선택된 유전자 의약품인, 단락 1의 조성물.
4. 세포에서 이식유전자의 발현 수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은
a. 이종 핵산 서열의 발현을 달성하기 위해 프라이밍 용량의 조성물을 제1 시점에 세포에 투여하는 단계, 및
b. 제1 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키거나 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키기 위한 용량의 조성물을 제2 시점에 세포에 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 제1 및 제2 시점에 투여된 조성물은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하고, 상기 ceDNA 벡터는 2개의 비대칭 또는 대칭 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이의 작동 가능한 위치에 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능적 AAV 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고,
여기서 ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 비-변성 겔 상에서 분석되는 경우의 선형 및 비-연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 방법.
5. 2개의 비대칭 또는 대칭 역 말단 반복 서열 (ITR)은 AAV ITR인, 단락 4의 방법.
6. 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는 ITR은 야생형 AAV ITR인, 단락 4-5의 방법.
7. AAV ITR은 AAV-2 ITR인, 단락 4-6 중 어느 하나의 방법.
8. 2개의 비대칭 또는 대칭 ITR은 (i) 서열 번호: 1과 서열 번호: 4; 및 (ii) 서열 번호: 3과 서열 번호: 2로 구성된 군으로부터 선택된 ITR 쌍인, 단락 4-7 중 어느 하나의 방법.
9. ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여되는, 단락 4-8 중 어느 하나의 방법.
10. 제2 시점은 제1 시점 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일 또는 60-90일, 또는 90-120일, 또는 약 3-6개월 후인, 단락 4-9 중 어느 하나의 방법.
11. 이종 핵산 서열은 치료 이식유전자를 인코딩하고, 이식유전자의 원하는 발현 수준은 치료적 유효량인, 단락 4-10 중 어느 하나의 방법.
12. ceDNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오티드로부터 수득되고, 상기 벡터 폴리뉴클레오티드는 2개의 비대칭 또는 대칭 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이의 작동 가능한 위치에 이종 핵산을 인코딩하고, ITR 중 적어도 하나는 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고; Rep 단백질의 존재는 벡터 폴리뉴클레오티드의 복제 및 곤충 세포에서 DNA 벡터의 생산을 유도하고, 상기 DNA 벡터는 다음의 단계를 포함하는 공정으로부터 수득될 수 있고:
a. 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건하에 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 벡터 폴리뉴클레오티드를 보유한 곤충 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 곤충 세포는 곤충 세포 내에 생산 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 포함하지 않는, 상기 단계; 및
b. 상기 곤충 세포로부터 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 수거 및 단리하는 단계;
여기서 상기 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 곤충 세포로부터 단리된 DNA를, DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화하고, 비-변성 겔 상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여 선형 및 비-연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있는, 단락 4-11 중 어느 하나의 방법.
13. 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에, 제2 시점 또는 이전 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키거나 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키기 위한 용량의 조성물을 세포에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고,
여기서 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 투여된 조성물은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하고, 상기 ceDNA 벡터는 2개의 비대칭 또는 대칭 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이의 작동 가능한 위치에 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능적 AAV 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고,
여기서 ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 비-변성 겔 상에서 분석되는 경우의 선형 및 비-연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 단락 4-11 중 어느 하나의 방법.
14. ceDNA 벡터는 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점 중 어느 시점에 투여되고, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여되는, 단락 4-13 중 어느 하나의 방법.
15. 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여되는 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 동일한 ceDNA 벡터인, 단락 1-14 중 어느 하나의 방법.
16. 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여되는 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 상이한 ceDNA 벡터인, 단락 1-15 중 어느 하나의 방법.
17. 상이한 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터를 갖는, 단락 16의 방법.
18. 상기 이식유전자는 유전자 의약품인, 단락 1-17 중 어느 하나의 방법.
19. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 제1 시점에, 이종 핵산 서열의 발현을 달성하기 위해 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하는 프라이밍 용량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계, 및
b. 제2 시점에, 제1 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키거나 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키기 위한 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하는 조성물의 용량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 질환을 치료하는 단계를 포함하고,
여기서 제1 및 제2 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 2개의 비대칭 또는 대칭 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이에 작동 가능하게 위치한 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능적 AAV 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고,
여기서 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 비-변성 겔 상에서 분석되는 경우의 선형 및 비-연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 방법.
20. 2개의 비대칭 또는 대칭 역 말단 반복 서열 (ITR)은 AAV ITR인, 단락 19의 방법.
21. 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는 ITR은 야생형 AAV ITR인, 단락 19-20의 방법.
22. AAV ITR은 AAV-2 ITR인, 단락 19-21 중 어느 하나의 방법.
23. 2개의 비대칭 ITR은 (i) 서열 번호: 1과 서열 번호: 4; 및 (ii) 서열 번호: 3과 서열 번호: 2로 구성된 군으로부터 선택된 ITR 쌍인, 단락 19-22 중 어느 하나의 방법.
24. ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여되는, 단락 19-23 중 어느 하나의 방법.
25. 제2 시점은 제1 시점 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일 또는 60-90일, 또는 90-120일, 또는 약 3-6개월 후인, 단락 19-24 중 어느 하나의 방법.
26. 제2 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이식유전자의 원하는 발현 수준은 이식유전자의 치료적 유효량인, 단락 19-25 중 어느 하나의 방법.
27. 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에, 제2 시점 또는 이전 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키거나 원하는 발현 수준으로 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키기 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고,
여기서 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 투여된 조성물은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하고, 상기 ceDNA 벡터는 2개의 비대칭 또는 대칭 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이에 작동 가능하게 위치한 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능적 AAV 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고,
여기서 ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 비-변성 겔 상에서 분석되는 경우의 선형 및 비-연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 단락 19-26 중 어느 하나의 방법.
28. 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이식유전자의 원하는 발현 수준은 이식유전자의 치료적 유효량인, 단락 19-27 중 어느 하나의 방법.
29. ceDNA 벡터는 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여되고, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여되는, 단락 19-28 중 어느 하나의 방법.
30. 제2 시점 이후 하나 이상의 시점은 이전 시점 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일 또는 60-90일, 또는 90-120일, 또는 약 3-6개월 후인, 단락 19-29 중 어느 하나의 방법.
31. 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 동일한 ceDNA 벡터인, 단락 19 내지 30 중 어느 하나의 방법.
32. 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 상이한 ceDNA 벡터인, 단락 19 내지 30 중 어느 하나의 방법.
33. 상이한 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터를 갖는, 단락 31의 방법.
34. ceDNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오티드로부터 수득되고, 상기 벡터 폴리뉴클레오티드는 2개의 비대칭 또는 대칭 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이에 작동 가능하게 위치한 이종 핵산을 인코딩하고, ITR 중 적어도 하나는 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고; Rep 단백질의 존재는 벡터 폴리뉴클레오티드의 복제 및 곤충 세포에서 DNA 벡터의 생산을 유도하고, 상기 DNA 벡터는 다음의 단계를 포함하는 공정으로부터 수득될 수 있고:
a. 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건하에 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 벡터 폴리뉴클레오티드를 보유한 곤충 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 곤충 세포는 곤충 세포 내에 생산 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 포함하지 않는, 상기 단계; 및
b. 상기 곤충 세포로부터 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 수거 및 단리하는 단계;
여기서 상기 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 곤충 세포로부터 단리된 DNA를, DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화하고, 비-변성 겔 상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여 선형 및 비-연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있는, 단락 19 또는 33 중 어느 하나의 방법.
35. 이식유전자는 유전자 의약품인, 단락 19 내지 34 중 어느 하나의 방법.
36. 이식유전자의 지속된 발현 수준을 유지하기 위해 재투약될 수 있는 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 ceDNA 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이식유전자 폴리뉴클레오티드 서열의 측면에 있는 비대칭 또는 대칭 ITR 서열을 포함하고, 여기서 ITR 중 적어도 하나는 복제 적격 ITR인, 조성물.
37. ceDNA 벡터는 적어도 42일, 적어도 84일, 및 적어도 132일로부터 선택된 기간 동안 이식유전자를 발현시키는, 단락 36의 조성물.
38. 이식유전자는 핵산, 억제제, 펩티드 또는 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 항원, 길항제, 작용제 또는 RNAi 분자 중 어느 것으로부터 선택된 유전자 의약품인, 단락 36의 조성물.
39. 세포에서 이식유전자의 발현 수준을 지속시키는 방법으로서, 상기 방법은
a. 이종 핵산 서열의 발현을 달성하기 위해 프라이밍 용량의 조성물을 제1 시점에 세포에 투여하는 단계, 및
b. 제1 시점에 조성물의 투여 후 이종 핵산 서열의 발현 수준의 임의의 감소를 보상하기 위한 용량의 조성물을 제2 시점에 세포에 투여하는 단계를 포함하고,
여기서 제1 및 제2 시점에 투여된 조성물은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하고, 상기 ceDNA 벡터는 2개의 비대칭 또는 대칭 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이의 작동 가능한 위치에 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능적 AAV 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고,
여기서 ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 비-변성 겔 상에서 분석되는 경우의 선형 및 비-연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 방법.
40. 2개의 비대칭 또는 대칭 역 말단 반복 서열 (ITR)은 AAV ITR인, 단락 39의 방법.
41. 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는 ITR은 야생형 AAV ITR인, 단락 39-40의 방법.
42. AAV ITR은 AAV-2 ITR인, 단락 39-41 중 어느 하나의 방법.
43. 2개의 비대칭 ITR은 (i) 서열 번호: 1과 서열 번호: 4; 및 (ii) 서열 번호: 3과 서열 번호: 2로 구성된 군으로부터 선택된 ITR 쌍인, 단락 39-42 중 어느 하나의 방법.
44. ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여되는, 단락 39-43 중 어느 하나의 방법.
45. 제2 시점은 제1 시점 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일 또는 60-90일, 또는 90-120일, 또는 약 3-6개월 후인, 단락 39-44 중 어느 하나의 방법.
46. 이종 핵산 서열은 치료 이식유전자를 인코딩하고, 이식유전자의 지속된 발현 수준은 치료적 유효량인, 단락 39-45 중 어느 하나의 방법.
47. ceDNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오티드로부터 수득되고, 상기 벡터 폴리뉴클레오티드는 2개의 비대칭 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이에 작동 가능하게 위치한 이종 핵산을 인코딩하고, ITR 중 적어도 하나는 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고; Rep 단백질의 존재는 벡터 폴리뉴클레오티드의 복제 및 곤충 세포에서 DNA 벡터의 생산을 유도하고, 상기 DNA 벡터는 다음의 단계를 포함하는 공정으로부터 수득될 수 있고:
a. 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건하에 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 벡터 폴리뉴클레오티드를 보유한 곤충 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 곤충 세포는 곤충 세포 내에 생산 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 포함하지 않는, 상기 단계; 및
b. 상기 곤충 세포로부터 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 수거 및 단리하는 단계;
여기서 상기 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 곤충 세포로부터 단리된 DNA를, DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화하고, 비-변성 겔 상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여 선형 및 비-연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있는, 단락 39-46 중 어느 하나의 방법.
48. 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에, 제2 시점 또는 이전 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키거나 원하는 지속된 발현 수준을 유지하기 위해 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키기 위한 조성물의 추가 용량을 세포에 투여하는 단계를 추가로 포함하고,
여기서 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 투여된 조성물은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하고, 상기 ceDNA 벡터는 2개의 비대칭 또는 대칭 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이에 작동 가능하게 위치한 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능적 AAV 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고,
여기서 ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 비-변성 겔 상에서 분석되는 경우의 선형 및 비-연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 단락 39-47 중 어느 하나의 방법.
49. ceDNA 벡터는 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점 중 임의의 시점에 투여되고, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여되는, 단락 39-48 중 어느 하나의 방법.
50. 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 동일한 ceDNA 벡터인, 단락 39-49 중 어느 하나의 방법.
51. 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 상이한 ceDNA 벡터인, 단락 39-50 중 어느 하나의 방법.
52. 상이한 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터를 갖는, 단락 51의 방법.
53. 이식유전자는 유전자 의약품인, 단락 1-52 중 어느 하나의 방법.
54. 대상체에서 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 제1 시점에, 이종 핵산 서열의 발현을 달성하기 위해 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하는 프라이밍 용량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계, 및
b. 제2 시점에, 제1 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열의 발현 수준을 원하는 지속된 수준으로 유지하기 위한 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하는 조성물의 용량을 대상체에게 투여하여 대상체에서 질환을 치료하는 단계를 포함하고,
여기서 제1 및 제2 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 2개의 비대칭 또는 대칭 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이에 작동 가능하게 위치한 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능적 AAV 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고,
여기서 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 비-변성 겔 상에서 분석되는 경우의 선형 및 비-연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 방법.
55. 2개의 비대칭 또는 대칭 역 말단 반복 서열 (ITR)은 AAV ITR인, 단락 54의 방법.
56. 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는 ITR은 야생형 AAV ITR인, 단락 54 또는 55의 방법.
57. AAV ITR은 AAV-2 ITR인, 단락 54-56 중 어느 하나의 방법.
58. 2개의 비대칭 ITR은 (i) 서열 번호: 1과 서열 번호: 4; 및 (ii) 서열 번호: 3과 서열 번호: 2로 구성된 군으로부터 선택된 ITR 쌍인, 단락 54-57 중 어느 하나의 방법.
59. ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 투여되는, 단락 54-58 중 어느 하나의 방법.
60. 제2 시점은 제1 시점 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일 또는 60-90일, 또는 90-120일, 또는 약 3-6개월 후인, 단락 54-59 중 어느 하나의 방법.
61. 제2 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이식유전자의 원하는 발현 수준은 이식유전자의 치료적 유효량인, 단락 54-60 중 어느 하나의 방법.
62. 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에, 제2 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시켜 이종 핵산의 원하는 지속된 발현 수준이 유지되도록 하기 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하고,
여기서 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 투여된 조성물은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA)를 포함하고, 상기 ceDNA 벡터는 2개의 비대칭 또는 대칭 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이에 작동 가능하게 위치한 이식유전자를 인코딩하는 이종 핵산 서열을 포함하고, ITR 중 하나는 기능적 AAV 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고,
여기서 ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화될 때 비-변성 겔 상에서 분석되는 경우의 선형 및 비-연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드가 존재하는, 단락 54-61 중 어느 하나의 방법.
63. 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에 조성물의 투여 후 달성된 이식유전자의 원하는 발현 수준은 이식유전자의 치료적 유효량인, 단락 54-62 중 어느 하나의 방법.
64. ceDNA 벡터는 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여되고, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여되는, 단락 54-63 중 어느 하나의 방법.
65. 제2 시점 이후 하나 이상의 시점은 이전 시점 후 적어도 30일, 또는 적어도 60일 또는 60-90일, 또는 90-120일, 또는 약 3-6개월 후인, 단락 54-64 중 어느 하나의 방법.
66. 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 동일한 ceDNA 벡터인, 단락 54 내지 65 중 어느 하나의 방법.
67. 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 상이한 ceDNA 벡터인, 단락 54 내지 65 중 어느 하나의 방법.
68. 상이한 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터를 갖는, 단락 67의 방법.
69. ceDNA 벡터는 벡터 폴리뉴클레오티드로부터 수득되고, 상기 벡터 폴리뉴클레오티드는 2개의 비대칭 또는 대칭 역 말단 반복 서열 (ITR) 사이에 작동 가능하게 위치한 이종 핵산을 인코딩하고, ITR 중 적어도 하나는 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, ITR 중 하나는 다른 ITR에 대한 결실, 삽입 또는 치환을 포함하고; Rep 단백질의 존재는 벡터 폴리뉴클레오티드의 복제 및 곤충 세포에서 DNA 벡터의 생산을 유도하고, 상기 DNA 벡터는 다음의 단계를 포함하는 공정으로부터 수득될 수 있고:
c. 곤충 세포 내에서 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA 벡터의 생산을 유도하기에 효과적인 조건하에 충분한 시간 동안 Rep 단백질의 존재하에 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 벡터 폴리뉴클레오티드를 보유한 곤충 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 곤충 세포는 곤충 세포 내에 생산 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 포함하지 않는, 상기 단계; 및
d. 상기 곤충 세포로부터 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA를 수거 및 단리하는 단계;
여기서 상기 곤충 세포로부터 단리된 캡시드-비함유, 비-바이러스 DNA의 존재는 곤충 세포로부터 단리된 DNA를, DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화하고, 비-변성 겔 상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여 선형 및 비-연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있는, 단락 54-68 중 어느 하나의 방법.
70. 이식유전자는 유전자 의약품인, 단락 54 내지 69 중 어느 하나의 방법.
실시예
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다. 당업자는 ceDNA 벡터가 본원에 기재된 임의의 야생형 또는 변형된 ITR로부터 구축될 수 있고, 하기 예시적인 방법이 이러한 ceDNA 벡터의 활성을 구축 및 평가하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 상기 방법은 특정 ceDNA 벡터로 예시되지만, 설명에 따라 임의의 ceDNA 벡터에 적용 가능하다.
실시예 1: 곤충 세포-기반 방법을 사용하는 ceDNA 벡터의 구축
폴리뉴클레오티드 작제 주형을 사용한 ceDNA 벡터의 생성은 PCT/US18/49996의 실시예 1에 기재되어 있으며, 이는 본원에 그 전체가 참조된다. 예를 들어, 본 발명의 ceDNA 벡터를 생성하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드 작제 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바쿨로바이러스일 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 허용 숙주 세포에서, 예를 들어, Rep의 존재하에, 2개의 대칭 ITR 및 발현 작제물을 갖는 폴리뉴클레오티드 작제 주형 (여기서 ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열에 대해 변형됨)은 ceDNA 벡터를 생성하기 위해 복제된다. ceDNA 벡터 생산은 두 단계, 즉, 우선, Rep 단백질을 통한 주형 골격 (예를 들어 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-배큘로바이러스(baculovirus) 게놈 등)으로부터 주형의 절제 ("구조") 단계 및 둘째, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계를 거친다.
ceDNA 벡터를 생성하는 예시적인 방법은 본원에 기재된 ceDNA-플라스미드로부터의 방법이다. 도 1a 및 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오티드 작제 주형은 ITR 서열 사이에 다음을 갖는 좌측 변형된 ITR 및 우측 변형된 ITR 둘 모두를 포함한다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 이식유전자의 클로닝 부위; (iii) 전사 후 반응 요소 (예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소 (WPRE)); 및 (iv) 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, 소 성장 호르몬 유전자 (BGHpA)로부터). 작제물 내의 특정 부위에 새로운 유전자 성분의 도입을 용이하게 하기 위해 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 (R1-R6) (도 1a 및 도 1b에 도시됨)가 또한 각 성분 사이에 도입되었다. R3 (PmeI) GTTTAAAC (서열 번호: 123) 및 R4 (PacI) TTAATTAA (서열 번호: 124) 효소 부위는 클로닝 부위로 조작되어 이식유전자의 오픈 리딩 프레임을 도입한다. 이들 서열을 ThermoFisher Scientific으로부터 입수한 pFastBac HT B 플라스미드 내로 클로닝하였다.
ceDNA-박미드의 생산:
DH10Bac 적격 세포 (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ 적격 세포, Thermo Fisher)를 제조사의 지시에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 간의 재조합을 유도하여 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드 및 트랜스포사제 플라스미드를 유지 및 형질전환체를 선택하기 위해 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서 이. 콜라이(E. coli)에서의 청색-백색 스크리닝 (Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터 β-갈락토시다제 유전자의 α-상보성을 제공함)에 기초한 양성 선별을 스크리닝함으로써 재조합 박미드를 선별하였다. β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 콜로니를 선별하여 10 ml의 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-박미드를 이. 콜라이로부터 단리하고 FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 형질감염시켜 감염성 바쿨로바이러스를 생성하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 중의 50 ml의 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지 (P0 바이러스 함유)를 세포로부터 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 감염성 바쿨로바이러스 입자를 세포 또는 세포 잔해로부터 분리하였다.
선택적으로, 제1 세대의 바쿨로바이러스 (P0)는 50 내지 500 ml의 배지에서 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시킴으로써 증폭되었다. 세포가 직경 18-19 nm (나이브 직경 14-15 nm), 및 밀도 ~4.0E+6 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존력을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 궤도 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일에서 8일 사이에, 배지에서 P1 바쿨로바이러스 입자를 원심분리 후 수집하여 세포 및 잔해물을 제거한 다음 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.
시험 작제물을 포함하는 ceDNA-바쿨로바이러스를 수집하고, 바쿨로바이러스의 감염성 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 2.5E+6 세포/ml에서 4 x 20 ml Sf9 세포 배양물을 다음 희석에서 P1 바쿨로바이러스로 처리하고: 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000, 25-27℃에서 인큐베이션하였다. 감염력은 4 내지 5일 동안 매일, 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화에 의해 결정되었다.
"Rep-플라스미드"는 Rep78 (서열 번호: 131 또는 133) 또는 Rep68 (서열 번호: 130) 및 Rep52 (서열번호: 132) 또는 Rep40 (서열 번호: 129) 둘 모두를 포함하는 pFASTBAC™-이중 발현 벡터 (ThermoFisher)에서 생성되었다. Rep-플라스미드를 제조자가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격 세포 (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells (Thermo Fisher)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 간의 재조합을 유도하여 재조합 박미드 ("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상의 이. 콜라이에서의 청색-백색 스크리닝 (Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터 β-갈락토시다제 유전자의 α-상보성을 제공함)을 포함하는 양성 선별에 의해 재조합 박미드를 선별하였다. 단리된 백색 콜로니를 선별하고 10 ml의 선별 배지 (LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라사이클린)에 접종하였다. 재조합 박미드 (Rep-박미드)를 이. 콜라이로부터 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 형질감염시켜 감염성 바쿨로바이러스를 생성하였다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 4일 동안 50 ml의 배지에서 배양하고, 감염성 재조합 바쿨로바이러스 ("Rep-바쿨로바이러스")를 배양물로부터 단리하였다. 선택적으로, 제1 세대의 렙-바쿨로바이러스 (P0)는 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 증폭되고 50 내지 500 ml의 배지에서 배양되었다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 배지에서 P1 바쿨로바이러스 입자를 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 공정에 의해 세포를 분리함으로써 수집하였다. Rep-바쿨로바이러스를 수집하고 바쿨로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 2.5x106 세포/mL에서 4 x 20 mL Sf9 세포 배양물을 다음 희석, 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000에서 P1 바쿨로바이러스로 처리하고, 인큐베이션하였다. 감염력은 4 내지 5일 동안 매일, 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화에 의해 결정되었다.
ceDNA 벡터 생성 및 특성화
도 4b를 참조하면, (1) ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바쿨로바이러스를 함유하는 샘플 및 (2) 상기 기재된 Rep-바쿨로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를 각각 1:1000 및 1:10,000의 비율로 Sf9 세포의 새로운 배양액 (2.5E+6 세포/ml, 20ml)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동 감염 후 4-5일 후에, 세포 직경 및 생존력이 검출된다. 세포 직경이 ~70-80%의 생존력으로 18-20nm에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿은 먼저 물 또는 완충제 중 적절한 부피의 수성 매질에 재현탁된다. ceDNA 벡터는 Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜 (Qiagen, 컬럼당 처리되는 세포 펠릿 덩어리 0.2mg)을 사용하여 세포로부터 단리 및 정제되었다.
Sf9 곤충 세포로부터 생성되고 정제된 ceDNA 벡터의 수율은 260nm에서의 UV 흡광도에 기초하여 초기에 결정되었다.
ceDNA 벡터는 도 4d에 도시된 바와 같이 비변성 또는 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의해 동정함으로써 평가될 수 있으며, 여기서 (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 변성 겔 대 비변성 겔 상에서 크기의 2배로 이동하는 특징적인 밴드의 존재 및 (b) 비절단 물질에 대한 변성 겔 상의 단량체 및 이량체 (2x) 밴드의 존재는 ceDNA 벡터의 존재의 특징이다.
단리된 ceDNA 벡터의 구조는 a) ceDNA 벡터 내에 단일 절단 부위만 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로스 겔 상에서 분별될 때 명확하게 보일 정도로 충분히 큰 생성 단편 (>800 bp)에 대해 선택된 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 공동-감염된 Sf9 세포 (본원에 기재된 바와 같음)로부터 수득된 DNA를 소화함으로써 추가로 분석되었다. 도 4d 및 4e에 도시된 바와 같이, 비-연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터 및 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 반응 생성물의 크기에 의해 구별될 수 있고, 예를 들어, 비-연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1kb 및 2kb 단편을 생성할 것으로 예상되고, 연속 구조를 갖는 비-캡슐화된 벡터는 2kb 및 4kb 단편을 생성할 것으로 예상된다.
따라서, 단리된 ceDNA 벡터가 정의에 의해 요구되는 바와 같이 공유적으로 폐쇄-말단이라는 것을 정성적인 방식으로 입증하기 위해, 샘플을 단일 제한 부위를 갖는 것으로 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여, 바람직하게는 동일하지 않은 크기 (예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)의 2개의 절단 산물을 생성한다. 소화 및 변성 겔 (2개의 상보적 DNA 가닥을 분리함) 상에서 전기영동 후, 선형의 비공유적으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp 크기로 분해되며, 공유적으로 폐쇄된 DNA (즉, ceDNA 벡터)는, 2개의 DNA 가닥이 연결되고 현재 펼쳐져(unfolded) 길이가 2배 (단일 가닥을 통해)이므로 2배 크기 (2000 bp 및 4000 bp)로 분해될 것이다. 또한, DNA 벡터의 단량체, 이량체 및 n-머릭(meric) 형태의 소화는 다량체 DNA 벡터의 말단-대-말단 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 모두 분해될 것이다 (도 4d 참조).
본원에 사용된 문구 "비변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 동정을 위한 분석"은 제한 엔도뉴클레아제 소화를 수행한 후 소화 생성물의 전기영동 평가를 수행하여 ceDNA의 폐쇄-말단성(close-endedness)을 평가하기 위한 분석을 지칭한다. 하나의 이러한 예시적인 분석이 뒤따르지만, 당업자는 이 예에서 많은 당 업계 공지된 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x의 생성물을 생성하는 관심 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소로 선택된다. 이것은 비변성 겔과 변성 겔 상의 밴드를 분해한다. 변성 전에, 샘플에서 완충제를 제거하는 것이 중요한다. Qiagen PCR 클린-업 키트 또는 탈염 "스핀 컬럼", 예를 들어 GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25 컬럼이 엔도뉴클레아제 소화를 위해 당 업계에 공지된 일부 옵션이다. 분석은 예를 들어, i) 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)를 사용하여 DNA 소화시키고, 2) 예를 들어, Qiagen PCR 클린-업 키트에 적용하고, 증류수로 용리하고, iii) 10x 변성 용액 (10x = 0.5M NaOH, 10mM EDTA)을 첨가하고, 완충되지 않은 10X 염료를 첨가하고, NaOH 농도가 겔 및 겔 박스에서 균일하도록 보장하기 위해 1mM EDTA 및 200mM NaOH와 함께 사전 인큐베이션된 0.8 - 1.0% 겔 상에서 10X 변성 용액을 4x로 첨가하여 제조된 DNA 레더와 함께 분석하고, 1x 변성 용액 (50 mM NaOH, 1mM EDTA)의 존재하에 겔을 작동시키는 것을 포함한다. 당업자는 크기 및 원하는 결과 타이밍에 기초하여 전기영동을 작동시키기 위해 어떤 전압을 사용할 것인지 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수하고 1x TBE 또는 TAE로 중화시키고 1x SYBR Gold를 사용하여 증류수 또는 1x TBE/TAE로 옮긴다. 그런 다음 밴드를 예를 들어 Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain (DMSO 중 10,000X 농축물) 및 에피플루오레센트 빛(epifluorescent light) (청색) 또는 UV (312nm)로 시각화할 수 있다.
생성된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 하나의 예시적이고 비제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교함으로써 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도를 기준으로 4μg의 ceDNA 벡터가 겔에 로딩되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1μg인 것으로 알려진 2kb 밴드에 해당하는 경우, 1μg의 ceDNA 벡터가 있으며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수 물질의 25%이다. 그런 다음 겔 상의 밴드 강도는 밴드가 나타내는 계산된 입력에 대해 플로팅되며, 예를 들어, 총 ceDNA 벡터가 8kb이고, 절단된 비교 밴드가 2kb인 경우, 밴드 강도는 전체 입력의 25%로 플롯팅될 것이며, 이 경우 1.0μg 입력에 대해 .25μg일 것이다. 이어서 ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플롯팅하면, 회귀선 방정식은 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산하는데 사용되고, 그런 다음 ceDNA 벡터로 표시되는 총 입력 백분율 또는 순도 백분율을 결정하는데 사용될 수 있다.
비교 목적으로, 실시예 1은 곤충 세포 기반 방법 및 폴리뉴클레오티드 작제물 주형을 사용하여 ceDNA 벡터의 생성을 기술하고, 또한 PCT/US18/49996의 실시예 1에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 실시예 1에 따른 본 발명의 ceDNA 벡터를 생성하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드 작제 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바쿨로바이러스일 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 허용 숙주 세포에서, 예를 들어, Rep의 존재하에, 2개의 대칭 ITR 및 발현 작제물을 갖는 폴리뉴클레오티드 작제 주형 (여기서 ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열에 대해 변형됨)은 ceDNA 벡터를 생성하기 위해 복제된다. ceDNA 벡터 생산은 두 단계, 즉, 우선, Rep 단백질을 통해 주형 골격 (예를 들어 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바쿨로바이러스 게놈 등)으로부터 주형의 절제 ("구조") 단계 및 둘째, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계를 거친다.
곤충 세포를 사용하는 방법에서 ceDNA 벡터를 생성하는 예시적인 방법은 본원에 기재된 ceDNA-플라스미드로부터의 방법이다. 도 1a 및 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오티드 작제 주형은 ITR 서열 사이에 다음을 갖는 좌측 변형된 ITR 및 우측 변형된 ITR 둘 모두를 포함한다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 이식유전자의 클로닝 부위; (iii) 전사 후 반응 요소 (예를 들어 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소 (WPRE)); 및 (iv) 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, 소 성장 호르몬 유전자 (BGHpA)로부터). 작제물 내의 특정 부위에 새로운 유전자 성분의 도입을 용이하게 하기 위해 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 (R1-R6) (도 1a 및 도 1b에 도시됨)가 또한 각 성분 사이에 도입되었다. R3 (PmeI) GTTTAAAC (서열 번호: 123) 및 R4 (PacI) TTAATTAA (서열 번호: 124) 효소 부위는 이식유전자의 오픈 리딩 프레임을 도입하기 위해 클로닝 부위로 조작된다. 이들 서열을 ThermoFisher Scientific으로부터 입수한 pFastBac HT B 플라스미드 내로 클로닝하였다.
ceDNA-박미드의 생산:
DH10Bac 적격 세포 (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ 적격 세포, Thermo Fisher)를 제조사의 지시에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 간의 재조합을 유도하여 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드 및 트랜스포사제 플라스미드를 유지 및 형질전환체를 선택하기 위해 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서 이. 콜라이에서의 청색-백색 스크리닝 (Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터 β-갈락토시다제 유전자의 α-상보성을 제공함)에 기초한 양성 선별을 스크리닝함으로써 재조합 박미드를 선별하였다. β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 콜로니를 선별하여 10 ml의 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-박미드를 이. 콜라이로부터 단리하고 FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 형질감염시켜 감염성 바쿨로바이러스를 생성하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 중의 50 ml의 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지 (P0 바이러스 함유)를 세포로부터 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 감염성 바쿨로바이러스 입자를 세포 또는 세포 잔해물로부터 분리하였다.
선택적으로, 제1 세대의 바쿨로바이러스 (P0)는 50 내지 500 ml의 배지에서 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시킴으로써 증폭되었다. 세포가 직경 18-19 nm (나이브 직경 14-15 nm), 및 밀도 ~4.0E+6 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존력을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 궤도 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일에서 8일 사이에, 배지에서 P1 바쿨로바이러스 입자를 원심분리 후 수집하여 세포 및 잔해물을 제거한 다음 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.
시험 작제물을 포함하는 ceDNA-바쿨로바이러스를 수집하고, 바쿨로바이러스의 감염성 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 2.5E+6 세포/ml에서 4 x 20 ml Sf9 세포 배양물을 다음 희석에서 P1 바쿨로바이러스로 처리하고: 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000, 25-27℃에서 인큐베이션하였다. 감염력은 4 내지 5일 동안 매일, 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화에 의해 결정되었다.
"Rep-플라스미드"는 Rep 78 (서열 번호: 131 또는 133) 또는 Rep68 (서열 번호: 130) 및 Rep52 (서열 번호: 132) 또는 Rep40 (서열 번호: 129) 둘 다를 포함하는 pFASTBAC™-이중 발현 벡터 (ThermoFisher)에서 생성되었다. Rep-플라스미드를 제조자가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격 세포 (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ 적격 세포 (Thermo Fisher)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 간의 재조합을 유도하여 재조합 박미드 ("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상의 이. 콜라이에서의 청색-백색 스크리닝 (Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터 β-갈락토시다제 유전자의 α-상보성을 제공함)을 포함하는 양성 선별에 의해 재조합 박미드를 선별하였다. 단리된 백색 콜로니를 선별하고 10 ml의 선별 배지 (LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라사이클린)에 접종하였다. 재조합 박미드 (Rep-박미드)를 이. 콜라이로부터 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 형질감염시켜 감염성 바쿨로바이러스를 생성하였다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 4일 동안 50 ml의 배지에서 배양하고, 감염성 재조합 바쿨로바이러스 ("Rep-바쿨로바이러스")를 배양물로부터 단리하였다. 선택적으로, 제1 세대 Rep-바쿨로바이러스 (P0)는 50 내지 500 ml의 배지에서 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시킴으로써 증폭되었다. 감염 후 3일에서 8일 사이에, 배지에서 P1 바쿨로바이러스 입자를, 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 공정에 의해 세포를 분리함으로써 수집하였다. Rep-바쿨로바이러스를 수집하고, 바쿨로바이러스의 감염성 활성을 측정하였다. 구체적으로, 2.5x106 세포/ml에서 4 x 20 ml Sf9 세포 배양물을 다음 희석에서 P1 바쿨로바이러스로 처리하고: 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000, 인큐베이션하였다. 감염력은 4 내지 5일 동안 매일, 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화에 의해 결정되었다.
ceDNA 벡터 생성 및 특성화
이어서, (1) ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바쿨로바이러스를 함유하는 샘플 및 (2) 상기 기재된 Rep-바쿨로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를 각각 1:1000 및 1:10,000의 비율로 Sf9 세포의 새로운 배양액 (2.5E+6 세포/ml, 20ml)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동-감염 후 4-5일 후에, 세포 직경 및 생존력을 검출한다. 세포 직경이 ~70-80%의 생존력으로 18-20nm에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿은 먼저 물 또는 완충제 중 적절한 부피의 수성 매질에 재현탁된다. ceDNA 벡터는 Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜 (Qiagen, 컬럼당 처리되는 세포 펠릿 덩어리 0.2mg)을 사용하여 세포로부터 단리 및 정제되었다.
Sf9 곤충 세포로부터 생성되고 정제된 ceDNA 벡터의 수율은 260nm에서의 UV 흡광도에 기초하여 초기에 결정되었다. 정제된 ceDNA 벡터는 실시예 5에 기재된 전기영동 방법론을 사용하여 적절한 폐쇄-말단 구성에 대해 평가될 수 있다.
실시예 2: 이중 가닥 DNA 분자로부터 절제를 통한 합성 ceDNA 생산
ceDNA 벡터의 합성적 생산은 2019년 1월 18일자로 출원된 국제 출원 PCT/US19/14122의 실시예 2-6에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 이중 가닥 DNA 분자의 절제를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생성하는 하나의 예시적인 방법. 간략하게, ceDNA 벡터는 이중 가닥 DNA 작 제물을 사용하여 생성될 수 있으며, 예를 들어, PCT/US19/14122의 도 7a-8e를 참조한다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 DNA 작제물은 ceDNA 플라스미드이고, 예를 들어, 2018년 12월 6일자로 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242의 도 6을 참조한다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 제조하기 위한 작제물은 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.
예시적인 목적으로, 실시예 2는 이 방법을 사용하여 생성된 예시적인 폐쇄-말단 DNA 벡터로서 ceDNA 벡터를 생성하는 것을 기술한다. 그러나, ITR 및 발현 카세트 (예를 들어, 이종 핵산 서열)를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 절제에 이어서 본원에 기재된 바와 같이 유리 3' 및 5' 말단의 결찰에 의해 폐쇄-말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 시험관내 합성적 생산 방법을 설명하기 위해 ceDNA 벡터가 본 실시예에서 예시되어 있지만, 당업자는, 상기 예시된 바와 같이, 도기본(doggybone) DNA, 덤벨 DNA 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 원하는 폐쇄-말단 DNA 벡터가 생성되도록 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드 분자가 변형될 수 있다는 것을 알고 있다.
본 방법은 (i) 이중 가닥 DNA 작제물로부터 발현 카세트를 인코딩하는 서열을 절제하는 단계 및 (ii) 하나 이상의 ITR에서 헤어핀 구조를 형성하는 단계 및 (iii) 유리 5' 및 3' 말단을 결찰, 예를 들어, T4 DNA 리가아제에 의한 결찰에 의해 연결하는 단계를 포함한다.
이중 가닥 DNA 작제물은 5'에서 3' 순서로 제1 제한 엔도뉴클레아제 부위; 상류 ITR; 발현 카세트; 하류 ITR; 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 이어서, 이중 가닥 DNA 작제물을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시켜 제한 엔도뉴클레아제 부위의 양쪽에서 이중 가닥 파괴물을 생성한다. 하나의 엔도뉴클레아제는 양쪽 부위를 표적화할 수 있거나, 제한 부위가 ceDNA 벡터 주형에 존재하지 않는 한 각각의 부위는 상이한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있다. 이는 나머지 이중 가닥 DNA 작제물로부터 제한 엔도뉴클레아제 부위들 사이의 서열을 절제한다. 결찰될 때 폐쇄-말단 DNA 벡터가 형성된다.
본 방법에 사용된 ITR 중 하나 또는 둘 다는 야생형 ITR일 수 있다. 변형된 ITR이 또한 사용될 수 있고, 여기서 변형은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있고 (예를 들어, 도 3b 및 3d 참조), 2개 이상의 헤어핀 루프 또는 단일 헤어핀 루프를 가질 수 있다. 헤어핀 루프 변형된 ITR은 기존 올리고의 유전자 변형에 의해 또는 새로운 생물학적 및/또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
비제한적인 예로, ITR-6 좌측 및 우측 (서열 번호: 111 및 112)은 AAV2의 야생형 ITR로부터의 B-B' 및 C-C' 아암 내 40개의 뉴클레오티드 결실을 포함한다. 변형된 ITR에 남아있는 뉴클레오티드는 단일 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예측된다. 구조를 언폴딩(unfolding)하는 깁스 자유 에너지는 약 -54.4 kcal/mol이다. 기능적 Rep 결합 부위 또는 Trs 부위의 선택적 결실을 포함하여, ITR에 대한 다른 변형이 또한 이루어질 수 있다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드 구축을 통한 ceDNA 생산
다양한 올리고뉴클레오티드의 어셈블리를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생성하는 또 다른 예시적인 방법이 PCT/US19/14122의 실시예 3에서 제공되고, 여기서 ceDNA 벡터는 5' 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 합성하고 ITR 올리고뉴클레오티드를, 발현 카세트를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰함으로써 생성된다. PCT/US19/14122의 도 11b는 5' ITR 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를, 발현 카세트를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰하는 예시적인 방법을 도시한다.
본원에 개시된 바와 같이, ITR 올리고뉴클레오티드는 WT-ITR 또는 변형된 ITR을 포함할 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 본원에 포함된, PCT/US19/14122의 도 6a, 6b, 7a 및 7b 참조). 예시적인 ITR 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 134-145를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, PCT/US19/14122의 표 7 참조). 변형된 ITR은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 무세포 합성에서 사용되는 본원에 기재된 바와 같은 WT-ITR 또는 모드-ITR을 포함하는 ITR 올리고뉴클레오티드는 유전자 변형 또는 생물학적 및/또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 실시예 2 및 3의 ITR 올리고뉴클레오티드는 본원에 논의된 바와 같이, 대칭 또는 비대칭 구성으로 WT-ITR 또는 변형된 ITR (모드-ITR)을 포함할 수 있다.
실시예 4: 단일 가닥 DNA 분자를 통한 ceDNA 생산
합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생성하는 또 다른 예시적인 방법은 PCT/US19/14122의 실시예 4에 제공되고, 안티센스 발현 카세트의 측면에 있는 2개의 안티센스 ITR에 공유적으로 부착되고, 센스 발현 카세트 서열의 측면에 있는 2개의 센스 ITR을 포함하는 단일 가닥 선형 DNA를 사용하고, 이후 이 단일 가닥 선형 DNA의 말단이 결찰되어 폐쇄-말단 단일 가닥 분자를 형성한다. 하나의 비제한적인 예는 단일 가닥 DNA 분자를 합성 및/또는 생성하고, 분자의 일부를 어닐링하여 2차 구조의 하나 이상의 염기쌍 영역을 갖는 단일 선형 DNA 분자를 형성한 다음, 유리 5' 및 3' 말단을 서로 결찰하여 폐쇄된 단일 가닥 분자를 형성하는 것을 포함한다.
ceDNA 벡터의 생산을 위한 예시적인 단일 가닥 DNA 분자는 5'에서 3'로 다음을 포함한다:
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR;
안티센스 제2 ITR;
안티센스 발현 카세트 서열; 및
안티센스 제1 ITR.
실시예 4의 예시적인 방법에 사용하기 위한 단일 가닥 DNA 분자는 본원에 기재된 임의의 DNA 합성 방법, 예를 들어, 시험관내 DNA 합성에 의해 형성될 수 있거나, DNA 작제물 (예를 들어, 플라스미드)을 뉴클레아제로 절단하고 생성된 dsDNA 단편을 용융시켜 ssDNA 단편을 제공함으로써 제공될 수 있다.
어닐링은 온도를 센스 및 안티센스 서열 쌍의 계산된 용융 온도 아래로 낮춤으로써 달성될 수 있다. 용융 온도는 특정 뉴클레오티드 염기 함량 및 사용된 용액의 특성, 예를 들어, 염 농도에 의존한다. 임의의 주어진 서열 및 용액 조합에 대한 용융 온도는 당업자에 의해 쉽게 계산된다.
어닐링된 분자의 유리 5' 및 3' 말단은 서로 결찰되거나 헤어핀 분자에 결찰되어 ceDNA 벡터를 형성할 수 있다. 예시적인 적합한 결찰 방법 및 헤어핀 분자는 실시예 2 및 3에 기재되어 있다.
실시예 5: ceDNA의 정제 및/또는 생산 확인
예를 들어, 실시예 1에 기재된 곤충 세포 기반 생산 방법, 또는 실시예 2-4에 기재된 합성적 생산 방법을 포함하여, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 임의의 DNA 벡터 산물은, 예를 들어, 불순물, 미사용 성분 또는 부산물을, 숙련가에게 흔히 알려진 방법을 사용하여 제거하기 위해 정제될 수 있고; 및/또는 생성된 DNA 벡터 (이 경우에, ceDNA 벡터)가 원하는 분자임을 확인하기 위해 분석될 수 있다. DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA의 정제를 위한 예시적인 방법은 Qiagen Midi Plus 정제 프로토콜 (Qiagen) 및/또는 겔 정제를 사용하는 것이다.
다음은 ceDNA 벡터의 정체(identity)를 확인하기 위한 예시적인 방법이다.
ceDNA 벡터는 도 4c 및 4d에 도시된 바와 같이 비변성 또는 변성 조건하에 아가로스 겔 전기영동에 의한 동정에 의해 평가될 수 있고, 여기서 (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 변성 겔 대 비변성 겔 상에서 크기의 2배로 이동하는 특징적인 밴드의 존재 및 (b) 비절단 물질에 대한 변성 겔 상의 단량체 및 이량체 (2x) 밴드의 존재는 ceDNA 벡터의 존재의 특징이다.
단리된 ceDNA 벡터의 구조는 a) ceDNA 벡터 내에 단일 절단 부위만 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로스 겔 상에서 분별될 때 명확하게 보일 정도로 충분히 큰 생성 단편 (>800 bp)을 위해 선택된 제한 엔도뉴클레아제로 정제된 DNA를 소화시킴으로써 추가로 분석되었다. 도 4c 및 4d에 도시된 바와 같이, 비-연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터 및 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 반응 생성물의 크기에 의해 구별될 수 있고, 예를 들어, 비-연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1kb 및 2kb 단편을 생성할 것으로 예상되고, 한편 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 2kb 및 4kb 단편을 생성할 것으로 예상된다.
따라서, 단리된 ceDNA 벡터가 정의상 요구되는 바와 같이 공유적으로 폐쇄-말단이라는 것을 정성적인 방식으로 입증하기 위해, 샘플을 단일 제한 부위를 갖는 것으로 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 바람직하게는 크기가 동일하지 않은 (예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp) 2개의 절단 산물을 생성한다. 소화 및 변성 겔 상에서 전기영동 (2개의 상보적 DNA 가닥을 분리함) 후, 선형의 비공유적으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp 크기로 분해될 것이며, 한편 공유적으로 폐쇄된 DNA (즉, ceDNA 벡터)는, 2개의 DNA 가닥이 연결되고 이제 언폴딩되어(unfolded) 길이가 2배 (단일 가닥이지만)가 되므로 2배 크기 (2000 bp 및 4000 bp)로 분해될 것이다. 또한, DNA 벡터의 단량체, 이량체 및 n-머릭(meric) 형태의 소화는 다량체 DNA 벡터의 말단-대-말단 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 모두 분해될 것이다 (도 4d 및 4e 참조).
본원에 사용된 문구 "비변성 겔 및 변성 조건하에 아가로스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 동정을 위한 분석"은 제한 엔도뉴클레아제 소화를 수행한 후 소화 생성물의 전기영동적 평가를 수행하여 ceDNA의 폐쇄-말단성(close-endedness)을 평가하기 위한 분석을 지칭한다. 이러한 하나의 예시적인 분석이 뒤따르지만, 당업자는 이 예에서 많은 당 업계에 공지된 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x의 생성물을 생성할 수 있는 관심 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소인 것으로 선택된다. 이것은 비변성 겔과 변성 겔 상에서 밴드를 분해한다. 변성 전에, 샘플에서 완충제를 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR 클린-업 키트 또는 탈염 "스핀 컬럼", 예를 들어 GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25 컬럼이 엔도뉴클레아제 소화를 위해 당 업계에 공지된 일부 옵션이다. 분석은 예를 들어, i) 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)로 DNA를 소화시키고, 2) 예를 들어, Qiagen PCR 클린-업 키트에 적용하고, 증류수로 용리하고, iii) 10x 변성 용액 (10x = 0.5 M NaOH, 10mM EDTA)을 첨가하고, 완충되지 않은 10X 염료를 첨가하고, NaOH 농도가 겔 및 겔 박스에서 균일하도록 보장하기 위해 1mM EDTA 및 200mM NaOH와 함께 사전 인큐베이션된 0.8 - 1.0% 겔 상에서 10X 변성 용액을 4x로 첨가하여 제조된 DNA 레더와 함께 분석하고, 1x 변성 용액 (50 mM NaOH, 1mM EDTA)의 존재하에 겔을 작동시키는 것을 포함한다. 당업자는 크기 및 원하는 결과 타이밍에 기초하여 전기영동을 작동시키기 위해 어떤 전압을 사용할 것인지 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수하고 1x TBE 또는 TAE로 중화시키고 1x SYBR Gold를 사용하여 증류수 또는 1x TBE/TAE로 옮긴다. 그런 다음 밴드를 예를 들어 Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain (DMSO 중 10,000X 농축물) 및 에피플루오레센트 빛(epifluorescent light) (청색) 또는 UV (312nm)로 시각화할 수 있다. 상기 겔-기반 방법은 겔 밴드로부터 ceDNA 벡터를 단리하고 그것이 재생되도록 함으로써 정제 목적에 맞게 조정될 수 있다.
생성된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 하나의 예시적이고 비제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교함으로써 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도를 기준으로 4μg의 ceDNA 벡터가 겔에 로딩되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1μg인 것으로 알려진 2kb 밴드에 해당하는 경우, 1μg의 ceDNA 벡터가 존재하며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수 물질의 25%이다. 그런 다음 겔 상의 밴드 강도는 밴드가 나타내는 계산된 입력에 대해 플로팅되며, 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8kb이고, 절제된 비교 밴드가 2kb인 경우, 밴드 강도는 전체 입력의 25%로 플롯팅될 것이며, 이 경우 1.0μg 입력에 대해 .25μg일 것이다. 이어서, ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플롯팅하면, 회귀선 방정식이 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산하는데 사용되고, 그런 다음 ceDNA 벡터로 표시되는 총 입력 백분율 또는 순도 백분율을 결정하는데 사용될 수 있다.
실시예 6: ceDNA로부터의 제어된 이식유전자 발현: 생체내 ceDNA 벡터로부터의 이식유전자 발현은 재복용 투여에 의해 지속 및/또는 증가될 수 있다.
ceDNA 벡터는 CAG 프로모터 (서열 번호: 72) 및 비대칭 ITR (예를 들어, 5' WT-ITR (서열 번호: 2) 및 3' 모드-ITR (서열 번호: 3) 사이의 측면에 있는 루시퍼라제 이식유전자 (서열 번호: 56)를 포함하는 ceDNA 플라스미드를 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 생성되고, 생체내에서 상이한 치료 파라감(paragam)에서 평가되었다. 이 ceDNA 벡터는 실시예 6-10에 기재된 모든 후속 실험에 사용되었다. 실시예 6에서, ceDNA 벡터를 정제하고 지질 나노입자로 제형화하고 (LNP ceDNA) 각 CD-1® IGS 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 리포좀은 양이온성 지질, 헬퍼 지질, 콜레스테롤 및 PEG-지질을 포함하는 지질 나노입자 (LNP) 리포좀을 형성하기 위해 4가지 성분을 포함하는 적합한 지질 블렌드로 제형화되었다.
장기간에 걸쳐 ceDNA 벡터로부터의 생체내 이식유전자의 지속된 발현을 평가하기 위해, LNP-ceDNA를 대략 5-7주령의 CD-1® IGS 마우스에 대한 꼬리 정맥 정맥내 주사로 멸균 PBS 중에서 투여하였다. 3가지 상이한 투여 그룹이 평가되었다: 0.1mg/kg, 0.5 mg/kg, 및 1.0 mg/kg, 그룹당 10마리의 마우스 (그룹당 15마리의 마우스가 있는 1.0 mg/kg 제외). 주사는 0일에 투여되었다. 28일에 각 그룹으로부터 5마리의 마우스에게 동일한 추가 용량을 주사하였다. 루시퍼라제 발현은 CD-1® IGS 마우스 (Charles River Laboratories; WT 마우스)에게 정맥내 투여 후 IVIS 영상화에 의해 측정되었다. 루시퍼라제 발현은 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35, 및 42일 및 42일 내지 110일 사이에는 정기적으로 (예를 들어, 매주, 격주 또는 10일마다 또는 2주마다) 150 mg/kg 루시페린 기질을 복강내 주사한 후 IVIS 영상화에 의해 평가되었다. 그 결과는 도 6에 도시되어 있다. 이 도면은 3개의 상이한 투여 프로토콜 후 적어도 132일 동안 IVIS 영상화에 의해 측정된 루시퍼라제 이식유전자 발현을 보여주는 그래프이다.
재복용, 예를 들어, LNP-ceDNA 처리된 대상체의 루시퍼라제를 발현시키는 LNP-ceDNA의 재투여의 효과를 조사하기 위해 확장 연구를 수행하였다. 특히, 발현 수준이 ceDNA 벡터의 1회 이상의 추가 투여에 의해 증가될 수 있는지를 결정하기 위해 평가되었다.
이 연구에서, ceDNA 벡터로부터 루시퍼라제 발현의 생체 분포는 0일 및 28일에 1.0mg/kg (즉, 프라이밍 용량) (그룹 A)의 초기 정맥내 투여 후 CD-1® 마우스에서 IVIS에 의해 평가되었다. ceDNA 벡터의 제2 투여는 84일에 꼬리 정맥에서 1.2 mL로 3mg/kg (그룹 B) 또는 10mg/kg (그룹 C)의 꼬리 정맥 주사를 통해 투여되었다. 이 연구에서, 5마리의 CD-1® 마우스를 그룹 A, B 및 C 각각에 사용하였다. 루시퍼라제 발현에 대한 마우스의 IVIS 영상화는 상기 기재된 바와 같이 49, 56, 63 및 70일에 추가 투약 전, 및 84일 및 91, 98, 105, 112, 및 132일에 재복용 후 수행되었다. 루시퍼라제 발현은 적어도 110일까지 (최장 기간 평가됨) 3개의 그룹 A, B 및 C 모두에서 평가 및 검출되었다.
루시퍼라제의 발현 수준은, 루시페린의 존재하에 루시퍼라제 활성 평가에 의해 결정된 바와 같이, LNP-ceDNA-Luc의 재복용 (즉, ceDNA 조성물의 재투여)에 의해 증가되는 것으로 나타났다. 그 결과는 도 6에 도시되어 있으며, 이는 3개의 상이한 투여 프로토콜 (그룹 A, B 및 C) 후 적어도 110일 동안 IVIS 영상화에 의해 평가된 바와 같은 루시퍼라제 이식유전자 발현을 보여주는 그래프이다. 임의의 추가 재복용 (1mg/kg 프라이밍 용량 (즉, 그룹 A) 처리를 받지 않은 마우스는 연구 기간 동안 안정적인 루시퍼라제 발현이 관찰되었다. 3mg/kg의 ceDNA 벡터의 재복용이 투여된 그룹 B의 마우스는 그룹 C의 마우스에 비해 관찰된 복사휘도가 대략 7배 증가한 것으로 나타났다. 놀랍게도, 10 mg/kg의 ceDNA 벡터로 재투약된 마우스는 어떠한 재복용도 받지 않은 마우스 (그룹 A)에 비해 관찰된 루시퍼라제 복사휘도가 17배 증가하였다.
그룹 A는 0일 및 28일에 꼬리 정맥에 1mg/kg의 ceDNA 벡터를 정맥내 투여한 후 CD-1® IGS 마우스에서의 루시퍼라제 발현을 보여준다. 그룹 B 및 C는 제1 시점 (0일)에 1mg/kg의 ceDNA 벡터가 투여되고 84일의 제2 시점에서 ceDNA 벡터의 투여로 재투약된 CD-1® IGS 마우스에서 루시퍼라제 발현을 보여준다. 예기치 않게, ceDNA 벡터의 제2 투여 (즉, 재복용)는 발현을 적어도 7배, 심지어 최대 17배까지 증가시켰다.
예기치 않게, 그룹 B에서 재복용 투여시 ceDNA 벡터의 용량 (즉, 양)의 3배 증가 (즉, 재복용에서 3mg/kg 투여)는 루시퍼라제의 발현을 7배 증가시켰다. 또한, 예기치 않게, 그룹 C에서 재복용 투여시 ceDNA 벡터의 양의 10배 증가 (즉, 10mg/kg 재복용 투여)는 루시퍼라제의 발현을 17배 증가시켰다. 따라서, ceDNA의 제2 투여 (즉, 재복용)는 발현을 적어도 7배, 심지어 최대 17배까지 증가시켰다. 이는 재복용으로 인한 이식유전자 발현의 증가가 예상보다 크고, 재복용 투여시 ceDNA 벡터의 용량 또는 양에 따라 달라지며, 0일에 초기 프라이밍 투여로부터 초기 이식유전자 발현에 상승 작용하는 것으로 보인다는 것을 보여준다. 즉, 이식유전자 발현의 용량-의존적 증가는 상가적이지 않고, 오히려 이식유전자의 발현 수준은 용량-의존적이고, 각 시점에서 투여된 ceDNA 벡터 양의 합보다 크다.
그룹 B 및 C는 둘 다 제2 시점에서 ceDNA 벡터로 재투약되지 않은 대조군 마우스 (그룹 A)와 비교하여 루시퍼라제의 발현에서 상당한 용량-의존적 증가를 나타냈다. 종합하면, 이들 데이터는 ceDNA 벡터로부터의 이식유전자의 발현이 적어도 제2 시점에 ceDNA 벡터의 재복용 (즉, 재투여)에 의해 용량-의존적 방식으로 증가될 수 있음을 보여준다.
종합하면, 도 6의 이러한 데이터는 ceDNA 벡터로부터의 이식유전자의 발현 수준이 적어도 84일 동안 지속된 수준으로 유지될 수 있고, 적어도 제2 시점에 투여된 ceDNA 벡터의 재복용 후 생체내에서 증가될 수 있음을 보여준다.
실시예 7: LNP-제형화된 ceDNA 벡터의 생체내 지속된 이식유전자 발현
상이한 지질 나노입자를 사용한 실시예 6의 결과의 재현성을 마우스에서 생체내 평가하였다. 실시예 6에서 사용된 것과는 다른 LNP로 캡슐화된 CAG 프로모터에 의해 구동되는 루시퍼라제 이식유전자를 포함하는 ceDNA 벡터, 또는 폴리C를 포함하지만 ceDNA 또는 루시퍼라제 유전자가 없는 동일한 LNP를 마우스에게 0일에 투약하였다. 구체적으로, 대략 4주령의 수컷 CD-1® 마우스를 0.5 mg/kg LNP-TTX-루시퍼라제 또는 LNP-폴리C의 단일 주사로 처리하였는데, 이는 0일에 측면 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여되었다. 14일에 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 동물에게 전신 투약하였다. 루시페린 투여 후 대략 15분에 각 동물을 생체내 이미징 시스템 ("IVIS")을 사용하여 영상화하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 4마리의 ceDNA-처리된 마우스는 모두 간에서 상당한 형광이 관찰되었고, 동물에서는 주사 부위 이외에 다른 형광이 거의 관찰되지 않았으며, 이는 LNP가 ceDNA 작제물의 간-특이적 전달을 매개하고, 전달된 ceDNA 벡터가 투여 후 적어도 2주 동안 이의 이식유전자의 제어된 지속적인 발현을 할 수 있었음을 나타낸다.
실시예 8: ceDNA 벡터 투여로부터 생체내 간에서 지속된 이식유전자 발현
별도의 실험에서, 처리된 동물의 간 내에서 LNP-전달된 ceDNA의 국재성을 평가하였다. 관심 있는 기능성 이식유전자를 포함하는 ceDNA 벡터를 실시예 7에 사용된 것과 동일한 LNP에 캡슐화하고, 정맥내 주사에 의해 0.5 mg/kg의 용량 수준으로 생체내에서 마우스에게 투여하였다. 6시간 후 마우스를 종결시키고, 간 샘플을 채취하고, 포르말린 고정하고, 표준 프로토콜을 사용하여 파라핀-포매하였다. RNAscope® 동소 하이브리드화 분석을 수행하여 조직 내 ceDNA 벡터를 ceDNA 이식유전자에 특이적인 프로브를 사용하여 시각화하고, 발색 반응 및 헤마톡실린 염색 (Advanced Cell Diagnostics)을 사용하여 검출하였다. 도 8은 ceDNA가 간세포에 존재함을 나타내는 결과를 보여준다.
실시예 9: 생체내 에서 ceDNA의 지속적인 안구 이식유전자 발현
간 이외의 조직에서 ceDNA 벡터 이식유전자 발현의 지속 가능성을 평가하여 생체내에서 안구 투여 후 ceDNA 벡터의 내약성 및 발현을 결정하였다. 0일에, 대략 9주령의 수컷 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 랫트에 jetPEI® 형질감염 시약 (Polyplus)으로 제형화된 루시퍼라제 이식유전자를 포함하는 ceDNA 벡터, 또는 jetPEI®로 제형화된 루시퍼라제를 인코딩하는 플라스미드 DNA 5 μL를 둘 다 0.25 μg/μL의 농도로 망막하 주사하였다. 각 그룹에서 4마리의 랫트를 시험하였다. 동물을 진정시키고, 33 게이지 바늘을 사용하여 오른쪽 눈에 시험품을 망막하 주사하였다. 각 동물의 왼쪽 눈은 처리되지 않았다. 주사 직후 눈은 망막하 수포의 존재를 확인하기 위해 광 간섭 단층 촬영(optical coherence tomography) 또는 안저 영상화(fundus imaging)로 검사되었다. 랫트는 표준 절차에 따라 부프레노르핀 및 국소 항생제 연고로 처리되었다.
7, 14, 21, 28, 및 35일에, 두 그룹의 동물은 루시페린 투여 후 5-15분에 2.5mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 새로 만든 루시페린이 전신 투약되었고, 모든 동물은 이소플루란 마취하에 IVIS를 사용하여 영상화되었다. 눈을 포함하는 관심 영역의 총 플럭스 [p/s] 및 평균 플럭스 (p/s/sr/cm2)는 노출 5분에 걸쳐 얻어졌다. 결과는 처리되지 않은 눈 ("주사되지 않음")에서 각 처리 그룹의 평균 복사휘도에 대한 처리된 눈 ("주사됨")에서 각 치료 그룹의 평균 복사휘도로서 그래프로 표시되었다 (도 9b). 상당한 형광은 ceDNA 벡터-처리된 눈에서 쉽게 검출될 수 있었지만 플라스미드-처리된 눈에서는 훨씬 약했다 (도 9a). 35일 후, 플라스미드-주사된 랫트를 종결시키는 반면, ceDNA-처리된 랫트에 대한 연구는 계속되었고, 42, 49, 56, 63, 70, 및 99일에 루시페린을 주사하고 IVIS 영상화하였다. 그 결과는 랫트 눈에 단일 주사로 도입된 ceDNA 벡터가 생체내에서 이식유전자 발현을 매개하고, 그 발현은 주사 후 적어도 99일 내내 높은 수준으로 지속되었음을 입증한다.
실시예 10: Rag2 마우스에서 ceDNA 벡터의 지속적인 투약 및 재투약.
ceDNA 벡터의 유전자 발현 카세트에 인코딩된 하나 이상의 이식유전자가, 발현된 단백질이 이물로 인식되는 숙주 환경 (예를 들어, 세포 또는 대상체)에서 발현되는 상황에서, 숙주가 발현 산물의 원치 않는 고갈을 초래할 수 있는 적응 면역 반응을 일으킬 가능성이 존재하며, 이는 발현 부족으로 잠재적으로 혼동될 수 있다. 어떤 경우에는 정상적인 숙주 환경과 이종인 리포터 분자에서 발생할 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터 이식유전자 발현은 B 및 T 세포가 결여되어 루시퍼라제와 같은 비-천연 뮤린 단백질에 대한 적응 면역 반응을 일으키지 않는 Rag2 마우스 모델에서 생체내 평가되었다. 간략하게, c57bl/6 및 Rag2 녹아웃 마우스는 0일에 폴리C 대조군 또는 루시퍼라제를 발현시키는 0.5 mg/kg의 LNP-캡슐화된 ceDNA 벡터가 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내로 투약되고, 21일에 특정 마우스에게 동일한 LNP-캡슐화된 ceDNA 벡터를 동일한 용량 수준으로 재투약하였다. 모든 시험 그룹은 각각 4마리의 마우스로 구성되었다. IVIS 영상화는 실시예 9에 기재된 대로 루시페린 주사 후 매주 간격으로 수행되었다.
IVIS 분석에서 관찰된 총 플럭스를 비교하면, LNP-ceDNA 벡터-Luc가 투약된 야생형 마우스에서 관찰된 형광 (발현된 루시퍼라제의 존재에 대한 간접 측정)은 21일 후에 점진적으로 감소한 반면 동일한 처리가 투여된 Rag2 마우스는 42일 실험에 걸쳐 루시퍼라제의 상대적으로 일정한 지속된 발현을 나타냈다 (도 10a). 야생형 마우스에서 관찰된 감소의 대략 21일 시점은 적응 면역 반응이 생성될 것으로 예상될 수 있는 기간에 해당한다. Rag2 마우스에서 LNP-ceDNA 벡터의 재투여는 이 연구에서 추적된 적어도 21일 동안 지속된 발현의 현저한 증가를 초래하였다 (도 10b). 그 결과는, 숙주의 ceDNA 벡터로부터 비-천연 단백질이 발현될 때 적응 면역이 역할을 할 수 있고, 초기 투여로부터 20일 이상 기간 내에 관찰된 발현 감소는 발현 감소보다는 (또는 이에 더하여) 발현된 분자에 대한 교란 적응 면역 반응을 신호할 수 있음을 시사한다. 특히, 이 반응은 숙주가 발현된 분자를 자기로 적절하게 인식하고 이러한 면역 반응을 일으키지 않을 것으로 예상되는 숙주에서 천연 단백질을 발현시킬 때 낮을 것으로 예상된다.
실시예 11: 간-특이적 발현 및 CpG 조절이 지속적인 발현에 미치는 영향
실시예 10에 기재된 바와 같이, 원하지 않는 숙주 면역 반응은 어떤 경우에 그렇지 않았다면 도입된 ceDNA 벡터로부터 하나 이상의 원하는 이식유전자의 지속적인 발현이었을 것을 인위적으로 약화시킬 수 있다. ceDNA 벡터로부터의 지속적인 발현에 미치는 잠재적 숙주 면역 반응의 회피 및/또는 약화의 영향을 평가하기 위해 두 가지 접근법이 취해졌다. 첫째, 이전 실시예에서 사용된 ceDNA-Luc 벡터는 구성적 CAG 프로모터의 제어하에 있었기 때문에, 유사한 작제물이 간-특이적 프로모터 (hAAT) 또는 상이한 구성적 프로모터 (hEF-1)를 사용하여 만들어져 골수 세포 또는 비-간 조직에 대한 장기간 노출을 피하는 것이 임의의 관찰된 면역 효과를 감소시키는지 확인하였다. 둘째, 특정 ceDNA-루시퍼라제 작제물은 숙주 면역 반응에 대한 알려진 유발 요인인, CpG 함량이 감소되도록 조작되었다. 이러한 조작되고 프로모터-스위치된 ceDNA 벡터를 마우스에게 투여할 때 ceDNA-인코딩된 루시퍼라제 유전자 발현이 측정되었다.
3개의 상이한 ceDNA 벡터를 사용하였고, 각각은 루시퍼라제를 이식유전자로서 인코딩하였다. 첫 번째 ceDNA 벡터는 많은 수의 메틸화되지 않은 CpG (~350)를 갖고 구성적 CAG 프로모터 ("ceDNA CAG")를 포함하였고; 두 번째는 적당한 수의 메틸화되지 않은 CpG (~60)를 갖고 간-특이적 hAAT 프로모터 ("ceDNA hAAT 저 CpG")를 포함하였고; 세 번째는 메틸화되지 않은 CpG를 포함하지 않고 또한 hAAT 프로모터를 포함하도록 ("ceDNA hAAT 무 CpG") 두 번째의 메틸화된 형태였다. ceDNA 벡터는 그렇지 않으면 동일하였다. 벡터는 상기 기재된 바와 같이 제조되었다.
대략 4주령의 4마리의 수컷 CD-1® 마우스의 4개 그룹을 LNP에 캡슐화된 ceDNA 벡터 또는 폴리C 대조군 중 하나로 처리하였다. 0일에 각 마우스에게 0.5 mg/kg ceDNA 벡터의 단일 정맥내 꼬리 정맥 주사를 5 mL/kg의 용적으로 투여하였다. 체중을 -1, -, 1, 2, 3, 7일 및 그 후 마우스를 종결시킬 때까지 매주 기록하였다. 전혈 및 혈청 샘플은 0, 1 및 35일에 채취되었다. 인-라이프(In-life) 영상화는 7, 14, 21, 28, 및 35일 및 그 후 매주 생체내 영상화 시스템 (IVIS)을 사용하여 수행되었다. 영상화를 위해, 각 마우스에게 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg의 루시페린을 주사하였다. 15분 후, 각 마우스를 마취하고 영상화하였다. 93일에 마우스를 종결시키고, 간 및 비장을 포함한 말단 조직을 수집하였다. 사이토카인 측정은 0일에 투약하고 6시간 후에 이루어졌다.
모든 ceDNA-처리된 마우스가 7일 및 14일에 상당한 형광을 나타내는 반면, 형광은 14일 후에 ceDNA CAG 마우스에서 급격히 감소하고 나머지 연구 기간 동안 보다 점진적으로 감소하였다. 대조적으로, ceDNA hAAT 저 CpG 및 무 CpG-처리된 마우스의 총 플럭스는 변함없이 높은 수준을 유지하였다 (도 11). 이것은 ceDNA 벡터를 간으로 특이적으로 전달하는 것을 유도하는 것이 단일 주사 후 적어도 77일에 걸쳐 벡터로부터 지속적이고, 오래가는 이식유전자 발현을 초래함을 시사하였다. CpG가 최소화되었거나 CpG 함량이 전혀 없는 작제물은 유사한 오래가는 지속적인 발현 프로파일을 보인 반면, 높은 CpG 구성적 프로모터 작제물은 시간이 지남에 따라 발현 감소를 보였으며, 이는 ceDNA 벡터 도입에 의한 숙주 면역 활성화가 대상체에서 이러한 벡터로부터 관찰된 어떠한 발현 감소에도 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이러한 결과는 숙주 면역 반응, 즉 잠재적으로 이식유전자-특이적 반응이 관찰되는 경우 조직-제한 프로모터를 선택하고/하거나 ceDNA 벡터의 CpG 함량을 변경시킴으로써 원하는 수준으로 반응 지속기간을 조정하는 대안적인 방법을 제공한다.
참조
본 출원 및 본원의 실시예에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 간행물 및 참고 문헌은, 각각의 개별 간행물 또는 참고 문헌이 본 명세서에 완전히 제시된 것으로 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전문이 참고로 포함된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원도 간행물 및 참고 문헌에 대해 전술한 방식으로 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENERATION BIO INC. <120> CONTROLLED EXPRESSION OF TRANSGENES USING CLOSE-ENDED DNA (CEDNA) VECTORS <130> 080170-091190-WOPT <140> <141> <150> 62/746,762 <151> 2018-10-17 <150> 62/633,882 <151> 2018-02-22 <150> 62/633,795 <151> 2018-02-22 <150> 62/633,757 <151> 2018-02-22 <160> 190 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 2 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 3 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<400> 16 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 17 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120 gcctgcagg 129 <210> 18 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g 101 <210> 19 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaca aagtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120 gcgcgcagct gcctgcagg 139 <210> 20 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaaa atcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120 gcgcagctgc ctgcagg 137 <210> 21 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgaaa cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120 gcagctgcct gcagg 135 <210> 22 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120 agctgcctgc agg 133 <210> 23 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120 gcgcgcagct gcctgcagg 139 <210> 24 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120 gcgcagctgc ctgcagg 137 <210> 25 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120 gcagctgcct gcagg 135 <210> 26 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 120 agctgcctgc agg 133 <210> 27 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 120 ctgcctgcag g 131 <210> 28 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct 120 gcctgcagg 129 <210> 29 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgtttcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 120 ctgcagg 127 <210> 30 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 30 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 31 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 31 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120 tgcctgcagg 130 <210> 32 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 120 <210> 33 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 33 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120 ct 122 <210> 34 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 34 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc 120 ct 122 <210> 35 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 35 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 36 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc 60 gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t 101 <210> 37 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120 tccatcacta ggggttcct 139 <210> 38 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgatttt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 39 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 40 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 40 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 41 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 41 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg 60 gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120 tccatcacta ggggttcct 139 <210> 42 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 42 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc 60 gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 43 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga 60 cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 44 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 44 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 45 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 45 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc t 131 <210> 46 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 46 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 47 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120 ggttcct 127 <210> 48 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 48 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 49 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 cgatcgttcg at 12 <210> 50 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 atcgaaccat cg 12 <210> 51 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 atcgaacgat cg 12 <210> 52 <211> 165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165 <210> 53 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc 60 cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg 120 cgcagagaga tcactagggg 140 <210> 54 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 55 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60 ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 56 <211> 1662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 56 gccgccacca tggaagacgc caaaaacata aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg 60 gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat aaggctatga agagatacgc cctggttcct 120 ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc 180 gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga 240 atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt 300 atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt 360 atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg 420 aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa aaaattatta tcatggattc taaaacggat 480 taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc gtcacatctc atctacctcc cggttttaat 540 gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat agggacaaga caattgcact gatcatgaac 600 tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg 660 agattctcgc atgccagaga tcctattttt ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt 720 ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt ggaatgttta ctacactcgg atatttgata 780 tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt 840 caggattaca agattcaaag tgcgctgctg gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa 900 agcactctga ttgacaaata cgatttatct aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct 960 cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg 1020 caaggatatg ggctcactga gactacatca gctattctga ttacacccga gggggatgat 1080 aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat 1140 accgggaaaa cgctgggcgt taatcaaaga ggcgaactgt gtgtgagagg tcctatgatt 1200 atgtccggtt atgtaaacaa tccggaagcg accaacgcct tgattgacaa ggatggatgg 1260 ctacattctg gagacatagc ttactgggac gaagacgaac acttcttcat cgttgaccgc 1320 ctgaagtctc tgattaagta caaaggctat caggtggctc ccgctgaatt ggaatccatc 1380 ttgctccaac accccaacat cttcgacgca ggtgtcgcag gtcttcccga cgatgacgcc 1440 ggtgaacttc ccgccgccgt tgttgttttg gagcacggaa agacgatgac ggaaaaagag 1500 atcgtggatt acgtcgccag tcaagtaaca accgcgaaaa agttgcgcgg aggagttgtg 1560 tttgtggacg aagtaccgaa aggtcttacc ggaaaactcg acgcaagaaa aatcagagag 1620 atcctcataa aggccaagaa gggcggaaag atcgccgtgt aa 1662 <210> 57 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <400> 57 Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 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Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly 450 <210> 58 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 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ccggggagct ggcgcggggc aaactgggaa agcggtgtcg tgtgctggct 240 ccgccctctt cccgagggtg ggggagaacg gtatataagt gcggcagtcg ccttggacgt 300 tctttttcgc aacgggtttg ccgtcagaac gcaggtgagg ggcgggtgtg gcttccgcgg 360 gccgccgagc tggaggtcct gctccgagcg ggccgggccc cgctgtcgtc ggcggggatt 420 agctgcgagc attcccgctt cgagttgcgg gcggcgcggg aggcagagtg cgaggcctag 480 cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc tagcgtggtg tccgcgccgc 540 cgccgcgtgc tactccggcc gcactctggt cttttttttt tttgttgttg ttgccctgct 600 gccttcgatt gccgttcagc aataggggct aacaaaggga gggtgcgggg cttgctcgcc 660 cggagcccgg agaggtcatg gttggggagg aatggaggga caggagtggc ggctggggcc 720 cgcccgcctt cggagcacat gtccgacgcc acctggatgg ggcgaggcct ggggtttttc 780 ccgaagcaac caggctgggg ttagcgtgcc gaggccatgt ggccccagca cccggcacga 840 tctggcttgg cggcgccgcg ttgccctgcc tccctaacta gggtgaggcc atcccgtccg 900 gcaccagttg cgtgcgtgga aagatggccg ctcccgggcc ctgttgcaag gagctcaaaa 960 tggaggacgc ggcagcccgg tggagcgggc gggtgagtca cccacacaaa ggaagagggc 1020 ctggtccctc accggctgct gcttcctgtg accccgtggt cctatcggcc gcaatagtca 1080 cctcgggctt ttgagcacgg ctagtcgcgg cggggggagg ggatgtaatg gcgttggagt 1140 ttgttcacat ttggtgggtg gagactagtc aggccagcct ggcgctggaa gtcatttttg 1200 gaatttgtcc ccttgagttt tgagcggagc taattctcgg gcttcttagc ggttcaaagg 1260 tatcttttaa accctttttt aggtgttgtg aaaaccaccg ctaattcaaa 1310 <210> 60 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 gcgcgctcgc tcgctc 16 <210> 61 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 ggttga 6 <210> 62 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 agtt 4 <210> 63 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 ggttgg 6 <210> 64 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 64 agttgg 6 <210> 65 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 agttga 6 <210> 66 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 rrttrr 6 <210> 67 <211> 581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60 ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120 actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240 aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300 attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360 ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581 <210> 68 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 68 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180 ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225 <210> 69 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 actgaggc 8 <210> 70 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 gcctcagt 8 <210> 71 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 gagcgagcga gcgcgc 16 <210> 72 <211> 1923 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg 540 cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 600 attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg 660 gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca 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taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tctctctttt agattccaac 1260 ctttggaact ga 1272 <210> 74 <211> 1177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 74 ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60 tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac 120 ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac 180 agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca 240 tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc 300 ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag 360 tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa 420 tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt 480 tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga 540 cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca 600 agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt 660 tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta 720 attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt 780 accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca 840 gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca 900 ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 960 tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 1020 gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 1080 gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 1140 tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177 <210> 75 <211> 547 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 75 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540 gaactga 547 <210> 76 <211> 556 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 76 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt 180 agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc 240 aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt 300 ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc 360 ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacactcg agggccctgt ctcctcagct 420 tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atccggacat cgattctaag gtaaatataa 480 aatttttaag tgtataattt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc ttttagattc 540 caacctttgg aactga 556 <210> 77 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg 840 acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg 900 tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat 960 tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg 1020 gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa 1080 ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca 1140 gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga 1179 <210> 78 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 78 aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60 cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120 tgcggcgcgc gcagcacctt t 141 <210> 79 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of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 81 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215 <210> 82 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 82 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 84 ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc 60 gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct 120 gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct 150 <210> 85 <211> 1313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60 ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc 120 atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg 180 gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg 240 tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt 300 agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg 360 gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc 420 gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg 480 ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc 540 tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct 600 gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta 660 aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc 720 gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg 780 aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc 840 tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca 900 ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg 960 gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct 1020 tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc 1080 gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt 1140 tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg 1200 aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt 1260 attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313 <210> 86 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 86 taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60 tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120 ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 180 tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta 213 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 88 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 89 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Simian virus 40 <400> 90 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 91 cccaagaaga agaggaaggt g 21 <210> 92 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Nucleoplasmin bipartite NLS sequence <400> 92 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: C-myc NLS sequence <400> 93 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: C-myc NLS sequence <400> 94 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 95 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro 20 25 30 Arg Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 96 <211> 42 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: IBB domain from importin-alpha sequence <400> 96 Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys 20 25 30 Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val 35 40 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Myoma T protein sequence <400> 97 Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Myoma T protein sequence <400> 98 Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu 1 5 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro 1 5 10 <210> 101 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 102 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 103 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 104 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 105 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 106 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 107 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 108 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 109 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60 tgagcgagcg agcgcgc 77 <210> 110 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag 60 tgagcgagcg agcgcgc 77 <210> 111 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 112 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 113 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 114 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 115 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 116 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 117 <211> 5 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 117 Asp Arg Leu Arg Arg 1 5 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 118 Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 119 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis delta virus <400> 119 Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 120 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg 1 5 10 <210> 121 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Lys 20 <210> 122 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys 1 5 10 15 Lys <210> 123 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 gtttaaac 8 <210> 124 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 ttaattaa 8 <210> 125 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 125 aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60 cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120 tgcggcgcgc gcagcacctt t 141 <210> 126 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 126 ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300 gcctaggctt ttgcaaa 317 <210> 127 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 128 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gagacagaca cactcctgct atgggtactg ctgctctggg ttccaggttc cactggtgac 60 <210> 129 <211> 1260 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 129 atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60 gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120 gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180 gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240 aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300 ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360 gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420 cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480 aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540 tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600 tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660 atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720 gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780 tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840 cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900 aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960 tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020 cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080 aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140 actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt 1200 taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga 1260 <210> 130 <211> 1932 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 130 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 131 <211> 1876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 131 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840 taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900 gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960 gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020 taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080 aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140 ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200 caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260 cgtcacctcc 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gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180 gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240 aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300 ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360 gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420 cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480 aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540 tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600 tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660 atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720 gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780 tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840 cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900 aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960 tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020 cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080 aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140 actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa 1194 <210> 133 <211> 1876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 133 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg 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gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 780 cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 840 ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 900 agtcgctgcg acgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc 960 cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc 1020 cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa 1080 gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1140 gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct 1200 gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg 1260 gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 1320 gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac 1380 ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1440 ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 1500 gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 1560 ggctgtcgag 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Claims (53)

  1. 대상체에서 이식유전자의 발현을 조절하는 방법으로서,
    a. 측정 가능한 수준의 이식유전자를 발현시키기 위해 플랭킹 역 말단 반복부 (ITR) 사이의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 이식유전자를 함유하는 핵산 카세트를 포함하는 충분한 양의 캡시드-비함유 폐쇄-말단 DNA (ceDNA) 벡터를 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 이식유전자는 질환을 치료하기 위해 원하는 단백질을 인코딩하는, 단계; 및
    b. 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 수준으로 원하는 단백질의 이식유전자 발현을 얻거나 원하는 단백질의 이식유전자 발현을 미리 결정된 수준으로 증가시기 위해 플랭킹 ITR 사이에 적어도 하나의 이식유전자를 포함하는 적어도 제2 용량의 ceDNA 벡터를 대상체에게 투여함으로써 ceDNA 벡터를 적정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 적정 용량을 결정하기 위해 단계 (a) 이후 평가되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 평가는 단계 (a) 이후 질환 상태 또는 대상체에서 발현된 원하는 단백질의 수준을 결정하는 것인, 방법.
  4. 대상체에서 이식유전자의 발현을 조절하는 방법으로서,
    a. 플랭킹 역 말단 반복부 (ITR) 사이의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 이식유전자를 함유하는 핵산 카세트를 포함하는 충분한 양의 캡시드-비함유 폐쇄-말단 DNA (ceDNA) 벡터를 대상체에게 투여하여 측정 가능한 수준의 이식유전자를 발현시키는 단계로서, 상기 이식유전자는 원하는 단백질을 인코딩하는, 단계; 및
    b. 플랭킹 ITR 사이에 적어도 하나의 이식유전자를 포함하는 적어도 제2 용량의 ceDNA 벡터를 대상체에게 투여하여 (i) 미리 결정된 시간 동안 미리 결정된 수준으로 원하는 단백질의 발현을 지속시키거나 (ii) 원하는 단백질의 발현을 미리 결정된 수준으로 조절하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터의 제2 투여는 원하는 단백질의 미리 결정된 발현 수준을 얻는 것을 방지하기에 충분한 면역 반응을 생성하지 않는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 투여는 상기 이식유전자의 발현 수준이 원하는 수준에서 감소할 때인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 투여는 상기 제1 투여 후 적어도 90일 후인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자는 치료 단백질을 인코딩하고, 상기 이식유전자의 원하는 발현 수준은 치료 단백질의 치료적 유효량인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터가 적어도 3회 투여되고, 상기 투여 중 어느 것도 원하는 단백질의 미리 결정된 발현 수준의 달성을 방해하는 ceDNA 벡터에 대한 면역 반응을 생성하지 않는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 주기적인 스케줄로 이루어지는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 투여는 원하는 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 투여는 미리 결정된 발현 수준으로 원하는 단백질의 발현을 연장시키는 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 억제제 단백질인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제 단백질은 항체 또는 융합 단백질인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 결함이 있는 단백질 또는 발현되지 않는 단백질을 대체하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 또는 억제성 프로모터인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자는 조절 스위치의 제어하에 있는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2 또는 임의의 후속 시점에 투여된 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자를 포함하는 동일한 유형의 ceDNA 벡터인, 방법.
  20. 제1항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 ceDNA 벡터는 동일한 이식유전자 또는 변형된 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 상이한 프로모터를 갖는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2개의 역 말단 반복 서열 (ITR)은 AAV ITR인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 ITR은 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 AAV ITR은 AAV-2 ITR인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랭킹 ITR은 대칭 또는 비대칭인, 방법.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랭킹 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭인, 방법.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랭킹 ITR은 비대칭인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형이거나, ITR의 둘 모두는 야생형인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랭킹 ITR은 상이한 바이러스 혈청형으로부터 유래하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 표 2, 4a, 4b 또는 5의 서열로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 적어도 하나는 상기 ITR의 전체 3차원 입체 형태에 영향을 주는 결실, 첨가 또는 치환에 의해 야생형 AAV ITR 서열로부터 변경되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및 AAV12로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터 유래되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 합성인, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형 ITR이 아니거나, 상기 ITR의 둘 모두는 야생형이 아닌, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 A, A', B, B', C, C', D 및 D'로부터 선택된 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결실, 삽입 및/또는 치환이 A, A', B, B' C 또는 C' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는, 방법.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 C 및 C' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 C 및 C' 영역에 의해 일반적으로 형성된 스템-루프 구조의 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 일반적으로 포함하는 영역에서 단일 스템-루프 구조를 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 B 및 B' 영역에 의해 형성된 제1 스템-루프 구조 및 C 및 C' 영역에 의해 형성된 제2 스템-루프 구조를 일반적으로 포함하는 영역에서 단일 스템 및 2개의 루프를 포함하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 두 ITR은 모두, 상기 ITR이 서로 반전될 때, 전체적으로 3차원 대칭이 되는 방식으로 변경되는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 조절 스위치의 제어하에 있는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 적어도 하나의 조절 스위치는 이진 조절 스위치, 소분자 조절 스위치, 패스코드(passcode) 조절 스위치, 핵산-기반 조절 스위치, 전사 후 조절 스위치, 방사선-제어 또는 초음파 제어 조절 스위치, 저산소증-매개 조절 스위치, 염증 반응 조절 스위치, 전단-활성화 조절 스위치, 및 사멸 스위치로부터 선택되는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 암, 자가면역 질환, 신경퇴행성 장애, 고콜레스테롤혈증, 급성 기관 거부, 다발성 경화증, 폐경기후 골다공증, 피부 병태, 천식, 또는 혈우병으로부터 선택된 질환 또는 장애를 갖는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 암은 고형 종양, 연조직 육종, 림프종 및 백혈병으로부터 선택되는, 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염 및 크론병으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 피부 병태는 건선 및 아토피 피부염으로부터 선택되는, 방법.
  48. 제44항에 있어서, 상기 신경퇴행성 장애는 알츠하이머병인, 방법.
  49. 제44항에 있어서, 제2 시점 이후 하나 이상의 시점에, 제2 시점 또는 이전 시점에서 조성물의 투여 후 달성된 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키거나 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 이종 핵산 서열의 발현 수준을 증가시키기 위한 조성물의 용량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자는 핵산, 억제제, 펩티드 또는 폴리펩티드, 항체 또는 항체 단편, 융합 단백질, 항원, 길항제, 작용제, RNAi 분자, 등 중 임의의 것으로부터 선택된 유전자 의약품(genetic medicine)인, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 시점 또는 임의의 후속 시점에 투여된 조성물의 미리 결정된 용량은 제1 시점에 투여된 조성물의 용량의 2배 내지 10배의 양인, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 시점 또는 임의의 후속 시점에 투여된 조성물의 미리 결정된 용량은 제1 시점에 조성물의 투여 후 이식유전자의 발현과 비교하여 이식유전자의 발현이 적어도 3배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배, 또는 2배 내지 15배 또는 2배 내지 20배 증가하는 양인, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 시점에 투여된 ceDNA 벡터의 미리 결정된 용량은 상기 세포에서 이식유전자의 원하는 발현 수준을 달성하기 위해 ceDNA 벡터에 대한 용량-의존적 관계를 사용하여 결정되는, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210090619A (ko) * 2018-11-09 2021-07-20 제너레이션 바이오 컴퍼니 대칭인 변형된 역말단반복을 포함하는 변형된 폐쇄형 DNA(ceDNA)
CN115667530A (zh) * 2020-03-24 2023-01-31 世代生物公司 非病毒dna载体和其用于表达因子ix治疗剂的用途
KR20230003478A (ko) * 2020-03-24 2023-01-06 제너레이션 바이오 컴퍼니 비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도
EP4142758A2 (en) * 2020-04-28 2023-03-08 President and Fellows of Harvard College High efficiency gene delivery system
CA3177612A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Targeting the human ccr5 locus as a safe harbor for the expression of therapeutic proteins
JP2023535632A (ja) 2020-07-27 2023-08-18 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー Ｄｎａ分子の組成物、その作製方法、及びその使用方法
JP2023538666A (ja) * 2020-08-23 2023-09-08 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の改善された製造のための改変バキュロウイルス系

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003237805A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-27 Cornell Research Foundation, Inc. Use of aav integration efficiency element for mediating site-specific integration of a transcription unit
LT2816118T (lt) * 2005-05-31 2018-12-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Genų pristatymo būdai
US9115373B2 (en) * 2007-09-19 2015-08-25 Uniqure Ip B.V. Use of AAV replication machinery for improved protein production
EP2500434A1 (en) * 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
WO2015191508A1 (en) * 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
EP3985115A1 (en) * 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
SG11201806663TA (en) * 2016-03-03 2018-09-27 Univ Massachusetts Closed-ended linear duplex dna for non-viral gene transfer

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