KR20200111726A - 무세포 합성으로부터 수득된 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 ceDNA 벡터를 수득하는 방법 - Google Patents

무세포 합성으로부터 수득된 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 ceDNA 벡터를 수득하는 방법 Download PDF

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KR20200111726A
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매튜 스탠턴
더글라스 안토니 케르
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제너레이션 바이오 컴퍼니
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Abstract

본 출원은 이식유전자의 전달 및 발현을 위해 선형 및 연속 구조를 갖는 DNA 벡터, 특히 폐쇄 말단 DNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터)의 합성적 합성 및 무세포 합성을 위한 방법을 기술한다. 본 발명은 폐쇄 말단 DNA 벡터의 시험관내 제조 방법, 상기 방법에 의해 생성된 상응하는 DNA 벡터 산물 및 이의 용도, 및 본 발명의 방법에 유용한 올리고뉴클레오티드 및 키트에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 DNA 벡터는 세포주, 예를 들어, 박테리아 또는 곤충 세포주에서 생산 동안 도입된 오염물로 인한 원치 않는 부작용이 없다. 또한, 본원의 방법을 사용하여 합성된 ceDNA 벡터를 사용하여 시험관내, 생체외 및 생체내에서 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 위한 방법 및 세포주가 본원에 제공된다.

Description

무세포 합성으로부터 수득된 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 ceDNA 벡터를 수득하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 1월 19일에 출원된 미국 가출원 제 62/619,392 호의 35 U.S.C. § 119(e)는 그 내용이 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 시퀀스 목록을 포함하며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.　2019년 1월 17일에 작성된 상기 ASCII 사본의 이름은 080170-091310-WOPT_SL.txt이며 크기는 102,804 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 대상체 또는 세포에서 이식유전자 또는 단리된 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 비-바이러스 벡터의 생성을 포함하는, 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용은 비-바이러스 DNA 벡터를 합성하는 무세포 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 이에 의해 생성된 핵산 작제물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
유전자 요법은 유전자 돌연변이 또는 유전자 발현 프로파일의 이상(aberration)에 의해 유발된 후천성 질환을 앓고 있는 환자의 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 유전자 요법은 장애, 질환, 악성 종양 등을 초래할 수 있는, 결함 유전자, 또는 비정상적 조절 또는 발현, 예를 들어 저발현(underexpression) 또는 과발현으로 인한 의학적 상태의 치료 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 결함 유전자에 의해 야기된 질환 또는 장애는 교정 유전 물질을 환자에게 전달하여 치료, 예방 또는 개선될 수 있거나, 또는 결함 유전자에 의해 야기된 질환 또는 장애는 결함 유전자를 변경 또는 침묵시키는 것, 예를 들어 환자에 대해 교정 유전 물질로 편집하여 환자 내에서 유전 물질의 치료적 발현을 초래함으로써 치료, 예방 또는 개선될 수 있다.
유전자 요법의 기초는, 예를 들어, 긍정적인 기능 획득 효과, 부정적인 기능 손실 효과, 또는 또 다른 결과를 초래할 수 있는 활성 유전자 산물 (때로는 이식유전자으로 지칭됨)을 전사 카세트에 공급하는 것이다. 유전자 요법은 또한 다른 요인들에 의해 야기된 질환 또는 악성 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 인간 단일유전인자 장애는 표적 세포로의 정상 유전자의 전달 및 발현에 의해 치료될 수 있다. 환자의 표적 세포에서 교정 유전자의 전달 및 발현은 조작된 바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터의 사용을 포함하여 수많은 방법을 통해 수행될 수 있다. 이용 가능한 많은 바이러스-유래 벡터 (예를 들어, 재조합 레트로바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 등) 중에서, 재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV)는 유전자 요법에서 다용도 벡터로서 인기를 얻고 있다.
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 파보비리다에(parvoviridae) 패밀리에 속하고 보다 구체적으로 데펜도파보바이러스(dependoparvovirus) 속을 구성한다. AAV로부터 유래된 벡터 (즉, 재조합 AAV (rAVV) 또는 AAV 벡터)는 (i) 근세포 및 뉴런을 포함하는 다양한 비-분열 및 분열 세포 유형을 감염 (형질도입)시킬 수 있고; (ii) 바이러스 구조 유전자가 결여되어 바이러스 감염에 대한 숙주 세포 반응, 예를 들어 인터페론-매개 반응을 감소시키고; (iii) 야생형 바이러스는 인간에서 비-병리학적인 것으로 간주되고; (iv) 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있는 야생형 AAV와 달리, 복제-결함 AAV 벡터는 rep 유전자가 결여되고 일반적으로 에피솜으로서 지속되므로, 삽입 돌연변이유발 또는 유전독성의 위험을 제한하고; (v) 다른 벡터 시스템과 비교하여, AAV 벡터는 일반적으로 상대적으로 열악한 면역원으로 간주되고 따라서 상당한 면역 반응을 유발하지 않으며 (ii 참조), 따라서 벡터 DNA의 지속성 및 잠재적으로 치료적 이식유전자(transgene)의 장기간 발현을 얻게 되기 때문에 유전 물질을 전달하는데 매력적이다.
그러나, AAV 입자를 유전자 전달 벡터로서 사용하는 데에는 몇 가지 주요 결점이 있다. rAAV와 관련된 하나의 주요 단점은 약 4.5 kb의 이종 DNA의 제한된 바이러스 패키징 용량 (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010)이고, 결과적으로, AAV 벡터의 사용은 150,000 Da 미만의 단백질 코딩 능력으로 제한되었다. 두 번째 단점은 개체군에서 야생형 AAV 감염의 유병률로 인해 rAAV 유전자 요법 후보가 환자로부터 벡터를 제거하는 중화 항체의 존재에 대해 스크리닝되어야 한다는 점이다. 세 번째 단점은 초기 치료에서 배제되지 않은 환자에게 재투여를 방지하는 캡시드 면역원성과 관련이 있다. 환자의 면역계는 향후 치료를 배제하는 높은 역가 항-AAV 항체를 생성하는 면역계를 자극하기 위해 "부스터"샷으로서 효과적으로 작용하는 벡터에 반응할 수 있다. 일부 최근 보고는 고용량 상황에서 면역원성에 대한 우려를 나타낸다. 또 다른 주목할 만한 단점은 단일-가닥 AAV DNA가 이종 유전자 발현 전에 이중 가닥 DNA로 전환되어야 하기 때문에 AAV 매개 유전자 발현의 개시가 상대적으로 느리다는 점이다.
또한, 캡시드를 갖는 통상적인 AAV 비리온은 AAV 게놈, rep 유전자 및 cap 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입함으로써 생성된다 (Grimm et al., 1998). 그러나, 이러한 캡시드로 이입된 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 유형을 비효율적으로 형질도입시키는 것으로 밝혀졌고, 캡시드는 또한 면역 반응을 유도한다.
따라서, 유전자 치료를 위한 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터의 사용은 환자에 대한 단일 투여 (환자 면역 반응으로 인해), 최소 바이러스 패키징 용량 (약 4.5 kb)으로 인한 AAV 벡터로의 전달에 적합한 이식유전자 유전 물질의 제한된 범위, 및 느린 AAV-매개 유전자 발현으로 인해 제한된다.
치료 또는 다른 목적을 위해 생체 내에서 하나 이상의 원하는 전이유전자를 전달할 수 있고 AAV 및 다른 바이러스 벡터 시스템의 상기 기재된 책임을 피할 수있는 폐쇄 말단 DNA 벡터가 개발되었다. 그러나, 이러한 ceDNA 벡터를 생산하는 방법은 전통적인 박테리아 또는 곤충 세포 생산 방법에 의존하 고있다. 이러한 방법은 제거하기에 불편하거나 비용이 많이 들고 ceDNA 치료 제형에 포함되는 경우 바람직하지 않은 부작용을 가질 수 있는 벡터를 생성하는데 사용된 세포로부터 오염물 (예를 들어, 핵산 오염물)을 초래할 수 있다. 따라서, 이러한 오염 물질 또는 정제 방법의 다른 인공물에 의해 도입되는 것과 같은 최소 표적 외 효과로 유전자 발현을 제어하는 방법에 사용될 재조합 벡터의 생성을 가능하게 하는 기술에 대한 분야가 필요하다. 본원에 제공된 방법은 이러한 문제를 줄이거나 피한다.
바이러스 및 바이러스-유래 DNA의 생산을 위한 통상적인 방법은 전형적으로 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 또는 곤충 세포를 사용한다. 일반적으로 사용되는 곤충 세포주는 Sf9이다. 그러나, 이들 세포는 복제될 DNA에 해로운 영향을 미칠 수 있는 효소 및 다른 단백질을 모두 함유할뿐만 아니라, 세포 용해물로부터 원하는 DNA를 정제하는 과정은 세포 핵산이 도입되는데, 이의 존재는 원하는 DNA 산물의 정제를 보다 어렵게 할 수 있다. 또한, 이러한 불순물 또는 오염물은 원하는 DNA가 투여되는 대상체에서 다양한 유해한 및/또는 원치 않는 효과를 가질 수 있다. 또한, 이러한 전통적인 세포-기반 생산 방법은 생성된 DNA 벡터 산물의 양과 관련하여 문제가 있을 수 있으며, 바람직한 수율을 생성하기 위해 세포주 자체 또는 생산 기술을 상당히 조작하는 일은 드물지 않다. 본원에 기재된 기술은 폐쇄된 원형 헤어핀 루프-함유 DNA 벡터, 예컨대, 비제한적으로, 폐쇄 말단 DNA 벡터 (ceDNA 벡터)를 상기 상세히 설명된 우려를 피하면서, 통상적인 수단에 비해 더 높은 순도 및 양으로 손쉽게 생산할 수 있는 합성 생산 방법에 관한 것이다.
본원에 기재된 발명은 무세포 시스템일 수 있는 합성 생산 시스템을 사용하여 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생산하는 합성 생산 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 폐쇄 말단 DNA 벡터는 ceDNA 벡터로, 이는 세포, 조직 또는 시스템에서 유전자 발현을 제어하거나 원하는 세포, 조직 또는 시스템으로 새로운 유전자 물질을 도입하는 방법에 사용될 수 있다. 하나의 특정 구현예에서, 본원에 기재된 기술은 변형된 AAV 역 말단 반복 서열 (ITR) 및, 예를 들어, 하나 이상의 발현 가능한 이식유전자를 함유하는 DNA 벡터를 제조하는 신규한 무세포 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 방법은 DNA의 단일 가닥으로부터 공유적으로-폐쇄된 말단 (선형, 연속적인 비-캡슐화된 구조)에 의해 형성된, 본원에서 ceDNA 벡터로 언급된, 캡시드가 없는 선형 듀플렉스 DNA 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 무세포 시스템에서 폐쇄 말단 헤어핀 루프-함유 DNA 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 제조를 사용하여 예시된, 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 하나의 예시적인 합성 생산 방법은 이중 가닥 DNA 작제물로부터 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성하는 전체 분자를 절제하는 것에 관한 것이다. 이러한 구현예에서, 이중 가닥 DNA 작제물은 5'에서 3'의 순서로 제1 제한 엔도뉴클레아제 부위; 상류 ITR; 발현 카세트; 하류 ITR; 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 부위가 제공된다. 이어서 이중 가닥 DNA 작제물을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시켜 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 양쪽에서 이중 가닥 파괴물(break)을 생성한다. 하나의 엔도뉴클레아제가 양쪽 부위를 표적화할 수 있거나, 제한 부위가 폐쇄 말단 벡터 주형 영역 내에 존재하지 않는 한 각각의 부위는 상이한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있다. 이는 나머지 이중 가닥 DNA 작제물로부터 제한 엔도뉴클레아제 부위들 사이의 서열을 절제한다. 이 절제된 분자는 유리 5' 및 3' 말단을 가질 것이며, 이는 이어서 결찰되어 ceDNA 벡터를 형성한다. 일부 측면에서, 절제된 분자는 유리 5' 및 3' 말단의 결찰 전에 헤어핀 형성을 용이하게 하기 위해 먼저 어닐링된다. 일부 측면에서, 원치 않는 이중 가닥 DNA 작제물 골격은 골격에 고유한 절단 부위에 특이적인 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되므로 분해되어 정제 중에 보다 쉽게 제거된다.
본원에 개시된 합성 생산 방법을 사용하여 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법은 다양한 올리고뉴클레오티드를 조립하여 완전한 벡터를 형성하는 것을 포함한다. 그러한 구현예에서, DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터는, 일부 구현예에서, 헤어핀 또는 다른 3차원 구성 (예를 들어, 홀리데이 접합(holliday junction) 구성)에 있는, 5' 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 발현 카세트 또는 이종 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 접합시킴으로써 생성된다. 선택적으로, 결찰 단계 전에 올리고를 3차원 구성으로 폴딩하는 것을 용이하게 하는 조건에 올리고(들)를 적용하는 단계가 추가된다. 도 11b는 5' ITR 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 발현 카세트를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰하는 것을 포함하는 ceDNA 벡터를 생성하는 예시적인 방법을 보여준다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드는 5' 및 3' 헤어핀 올리고뉴클레오티드이거나 헤어핀 구조 또는 상이한 3차원 구성 (예를 들어, T형 또는 Y형 홀리데이 접합)을 갖고, 시험관내 DNA 합성에 의해 선택적으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 상응하는 제한 엔도뉴클레아제 점착성 말단을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 점착성 말단을 가졌다. 일부 구현예에서, 5' ITR 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 말단은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 5' 센스 가닥 및 3' 안티센스 가닥에 상보적인 점착성 말단을 갖는다. 일부 구현예에서, 3' ITR 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 말단은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 3' 센스 가닥 및 5' 안티센스 가닥에 상보적인 점착성 말단을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' ITR 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 말단은 제한 엔도뉴클레아제 점착성 말단이 다르므로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 각 말단으로 유도된 결찰이 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR 올리고뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다의 말단에는 오버행(overhang)이 없고, 이러한 ITR 올리고(들)는 둔단(blunt end) 연결에 의해 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰된다. 일부 측면에서, 원치 않는 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드 골격은 골격에 고유한 절단 부위에 특이적인 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되므로 분해되어 정제 중에 보다 쉽게 제거된다.
DNA 벡터, (예를 들어, ceDNA 벡터)를 생산하는 또 다른 예시적인 방법은 발현 카세트를 포함하는 단일 가닥 선형 DNA를 형성한 다음 DNA 분자를 결찰로 폐쇄하는 것을 포함한다. 이 구현예에서, DNA 벡터는 임의의 당 업계에 공지된 수단을 통해 5'에서 3'의 방향으로 제1 센스 제1 ITR, 센스 발현 카세트 서열, 센스 제2 ITR, 안티센스 제2 ITR, 안티센스 발현 카세트 서열, 및 안티센스 제1 ITR을 포함하는 단일 가닥 선형 DNA를 합성하고, 이어서 유리 단부를 결찰하여 폐쇄 말단 ceDNA 벡터를 형성함으로써 제조된다. 일 구현예에서, 생성될 예시적인 DNA 벡터로서 ceDNA 벡터의 제조를 사용하여, ceDNA 벡터 제조를 위해 생성된 단일 가닥 DNA 분자는 5'에서 3'로 다음을 포함한다:
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR;
안티센스 제2 ITR;
안티센스 발현 카세트 서열; 및
안티센스 제1 ITR.
이러한 예시적인 방법에서, 일 구현예로, 센스 제1 ITR, 센스 발현 카세트 서열, 센스 제2 ITR, 안티센스 제2 ITR, 안티센스 발현 카세트 서열, 및 안티센스 제1 ITR 중 하나 이상을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상은 결찰되어 상기 나타낸 단일 가닥 DNA 분자를 형성할 수 있다. 단일 가닥 DNA 분자가 형성되면, 분자의 유리 3' 및 5' 말단은 결찰로 연결되어 ceDNA 벡터를 형성할 수 있다.
폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하는 또 다른 예시적인 방법은 발현 카세트 서열의 측면에 있는 적어도 하나의 ITR을 포함하고, 안티센스 발현 카세트 서열을 또한 포함하는 단일 가닥 서열의 합성에 의한 것이다. 하나의 비제한적인 예로, ceDNA 벡터는 아래와 같은 방법에 의해 제조된다.
5'에서 3'의 순서로
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR; 및
안티센스 발현 카세트 서열
을 포함하는 단일 가닥 서열이 제공되다. 일 구현예에서 단일 가닥 서열은 임의의 당 업계에 공지된 방법을 통해 직접적으로 합성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단일 가닥 서열은 센스 제1 ITR, 센스 발현 카세트 서열, 센스 제2 ITR 및 안티센스 발현 카세트 서열 중 하나 이상을 포함하는 2개 이상의 올리고를 결찰에 의해 연결시킴으로써 구축될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 단일 가닥 서열은 이중 가닥 DNA 작제물로부터 서열을 절제한 다음 절제된 이중 가닥 단편으로부터 가닥을 분리함으로써 수득될 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 제한 부위, 센스 제1 ITR, 센스 발현 카세트 서열, 센스 제2 ITR, 안티센스 발현 카세트 서열, 및 제2 제한 부위를 5'에서 3' 순서로 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물이 제공된다. 2개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 사이의 영역은 그러한 절단 부위(들)를 인식하는 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제로의 절단에 의해 절제된다. 생성된 절제된 이중 가닥 DNA 단편은 센스 및 안티센스 가닥이 원하는 단일 가닥 서열 단편으로 분리되도록 처리된다.
단일 가닥 서열은 센스 제1 ITR 및/또는 센스 제2 ITR에 의한 하나 이상의 헤어핀 루프의 형성, 및 안티센스 발현 카세트 서열에 대한 센스 발현 카세트 서열의 상보적인 결합을 용이하게 하기 위해 어닐링 단계를 거친다. 그 결과는 결찰을 형성할 필요가 없는 폐쇄 말단 구조이다. 어닐링 파라미터 및 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다.
본원에 개시된 바와 같은 DNA 벡터를 생성하기 위한 합성 생산 방법의 모든 측면에서, 결찰 단계는 화학적 결찰 단계 또는 효소적 결찰 단계일 수 있다. 일부 구현예에서, 결찰은 결찰-적격 효소, 예를 들어, DNA 리가아제, 예를 들어 5' 및 3' 점착성 오버행을 결찰하거나 말단을 블런트(blunt)하기 위해 DNA 리가아제를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 결찰 효소는 Rep 단백질 이외의 리가아제 효소이다. 일부 구현예에서, 결찰 효소는 AAV Rep 단백질이다.
본원에 개시된 바와 같은 DNA 벡터를 생성하기 위한 합성 생산 방법의 모든 측면에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 무세포 방법이며, 즉, 세포, 예를 들어, 곤충 세포에서 또는 이의 존재하에 수행되지 않는다.
당업자는 합성 생산 방법을 위한 하나 이상의 효소 또는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 성분이 세포로부터 생산될 수 있고, 정제된 형태로 본 발명의 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 합성 생산 방법은 무세포 방법이지만, 제한 효소 및/또는 리가아제 효소는 세포로부터 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 또는 리가아제 효소 중 하나 이상을 발현시키는 발현 벡터를 포함하는 박테리아 세포와 같은 세포가 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 주로 본원에 개시된 DNA 벡터를 생성하기 위한 무세포 합성 방법에 관한 것이지만, 일 구현예에서는 또한, 세포, 예를 들어, 곤충 세포가 아닌 박테리아 세포가 존재하고, 상기 방법에 필요한 하나 이상의 효소를 발현시키는데 사용될 수 있는 합성 생산 방법이 포함된다.
본원에 기술된 기술의 한 측면은 ceDNA 벡터를 생성하기 위해 합성 생산 방법을 사용하는 것이다. 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 5' 역 말단 반복 (ITR) 서열 및 3' ITR 서열을 포함하는 공유적으로 폐쇄된 말단 (선형, 연속 및 비-캡슐화된 구조)을 갖는 상보성 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드-비함유 선형 듀플렉스 DNA 분자이며, 여기서 5' ITR 및 3' ITR은 서로 동일한 대칭 3차원 구성을 가질 수 있거나 (즉, 대칭 또는 실질적으로 대칭), 또는 대안적으로 5' ITR 및 3' ITR은 서로 상이한 3차원 구성 (즉, 비대칭 ITR)을 가질 수 있다. 또한, ITR은 동일하거나 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록 대칭 3차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다 (즉, 이들은 동일하거나 서로 거울상임). 일부 구현예에서, 하나의 ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 기술의 일부 측면은 (i) 적어도 하나의 WT ITR 및 적어도 하나의 변형된 AAV 역 말단 반복부 (ITR) (예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 모드-ITR 쌍이 서로 상이한 3차원 공간 구성을 갖는 2개의 변형된 ITR (예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR), 또는 (iii) 각각의 WT-ITR이 동일한 3차원 공간 구성을 갖는 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍, 또는 (iv) 각각의 모드-ITR이 동일한 3차원 공간 구성을 갖는 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍 중 어느 것으로부터 선택된 ITR 서열을 포함하는 ceDNA 벡터의 합성 생산에 관한 것이다.
본 발명의 측면은 본원에 기재된 바와 같은 세포, 조직, 기관, 시스템 또는 대상체에서 목적하는 이식유전자의 발현에 유용한 ceDNA 벡터를 생성하기 위한 합성 생산 방법에 관한 것이다. 특히, 무 세포 환경에서 ceDNA 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하는 방법이 제공되어, 생산 공정 동안 주어진 벡터 제품의 효능 및/또는 안전성의 영향을 줄 수 있는 불순물의 양을 제한하고 오염물의 유입을 방지한다. 이러한 방법은 임의의 원하는 이식유전자를 발현하는 DNA 벡터, 예를 들어 ceDNA 벡터를 합성하는데 사용될 수 있다. 이식유전자는 주어진 질병의 치료, 최적의 건강 증진, 질병 발병 예방, 진단 목적으로, 또는 주어진 용도에 대해 당업자가 원하는 대로 선택될 수 있다.
본 측면 및 본원에 제공된 모든 다른 측면의 또 다른 구현예에서, 이식유전자는 관심있는 단백질, 예를 들어 관심있는 단백질이 수용체, 독소, 호르몬, 효소 또는 세포 표면 단백질인 경우에 코딩한다. 이 측면 및 본원에 제공된 모든 다른 측면의 다른 구현예에서, 관심있는 단백질은 수용체이다. 이 측면 및 본원에 제공된 모든 다른 측면의 다른 구현예에서, 관심있는 단백질은 효소이다. 표적화될 예시적인 유전자 및 관심있는 단백질은 본원의 사용 방법 및 치료 섹션의 방법에 상세히 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본 출원은 하기 단락 중 임의의 단락에서 정의될 수 있다:
1. (i) 제1 ITR을 포함하는 제1 단일 가닥 ITR 분자를 제공하는 단계; (ii) 제2 ITR을 포함하는 제2 단일 가닥 ITR 분자를 제공하는 단계; (iii) 발현 카세트 서열을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 제1 ITR 분자의 5' 및 3' 말단을 이중 가닥 분자의 제1 말단에 결찰하고 제2 ITR 분자의 5' 및 3' 말단을 이중 가닥 분자의 제2 말단에 결찰하여 DNA 벡터를 형성하는 단계를 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 제조 방법.
2. 다음을 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 제조 방법:
(i) 발현 카세트; (ii) 발현 카세트의 상류 (5'-말단) 상의 제1 ITR; (iii) 발현 카세트의 하류 (3'-말단) 상의 제2 ITR ; (iii) 및 제한 엔도뉴클레아제가 발현 카세트의 원위에 있도록 ITR의 측면에 있는 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물을, 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 이중 가닥 DNA 작제물을 절단하여 이중 가닥 DNA 작제물로부터의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 사이의 서열을 절제할 수 있는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 및 절제된 서열의 5' 및 3' 말단을 결찰하여 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성하는 단계.
3. 다음을 포함하는 DNA 벡터의 제조 방법:
5'에서 3'의 방향 순으로 하기를 포함하는 단일 가닥 DNA 분자를 합성하는 단계:
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR;
안티센스 제2 ITR;
안티센스 발현 카세트 서열; 및
안티센스 제1 ITR;
단일 가닥 분자로부터 헤어핀-함유 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 5' 및 3' 말단을 결찰하여 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성하는 단계.
4. 다음을 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 제조 방법:
5'에서 3'의 방향 순으로 하기를 포함하는 단일 가닥 DNA 분자를 합성하는 단계:
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR; 및
안티센스 발현 카세트 서열;
및 분자를 어닐링하는 단계.
5. 다음을 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 제조 방법:
5'에서 3'의 방향 순으로 하기를 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물을 제공하는 단계:
제1 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위;
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR;
안티센스 발현 카세트 서열; 및
제2 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위;
이중 가닥 DNA 작제물을, 제1 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 이중 가닥 DNA 작제물을 절단할 수 있는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시켜 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로부터의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 사이의 이중 가닥 서열을 절제하는 단계;
절제된 이중 가닥 서열을 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 분리하는 단계; 및
각각의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성하는 어닐링 단계를 수행하는 단계.
6. 이중 가닥 DNA 작제물이 박미드, 플라스미드, 미니서클(minicircle) 또는 선형 이중 가닥 DNA 분자인, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
7. 단일 제한 엔도뉴클레아제가 절제를 수행하는데 사용되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
8. 2가지 상이한 제한 엔도뉴클레아제가 절제를 수행하는데 사용되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
9. 센스 제1 ITR, 센스 발현 카세트 서열, 센스 제2 ITR, 안티센스 제2 ITR, 안티센스 발현 카세트 서열, 및 안티센스 제1 ITR 중 적어도 하나가 합성되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
10. 단일 가닥 DNA 분자가 센스 제1 ITR, 센스 발현 카세트 서열, 센스 제2 ITR, 안티센스 제2 ITR, 안티센스 발현 카세트 서열, 및 안티센스 제1 ITR 중 하나 이상을 올리고뉴클레오티드로서 합성하고 이러한 올리고뉴클레오티드를 결찰하여 단일 가닥 DNA 분자를 형성함으로써 구축되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
11. 단일 가닥 DNA 분자가 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드로부터 분자를 절제한 다음 절제된 이중 가닥 단편을 변성시켜 단일 가닥 DNA 분자를 생성함으로써 제공되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
12. 단일 가닥 분자로부터 헤어핀-포함 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계는 ITR 중 하나 이상이 헤어핀 루프를 형성하는 조건하에 단일 가닥 분자를 어닐링함으로써 수행되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
13. 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 합성되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
14. 이중 가닥 발현 카세트 서열이 발현 카세트 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물로부터 절제에 의해 수득된, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
15. 이중 가닥 DNA 작제물 내에서 발현 카세트 서열은 5' 말단에서 제1 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위의 측면에 있고, 3' 말단에서 제2 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위의 측면에 있는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
16. 이중 가닥 DNA 작제물이 박미드, 플라스미드, 미니서클, 또는 선형 이중 가닥 DNA 분자인, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
17. 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제는 동일한 제한 엔도뉴클레아제인, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
18. 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제는 상이한 제한 엔도뉴클레아제인, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
19. 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 발현 카세트 서열에 결찰되기 전에 어닐링되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
20. 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 각각 발현 카세트 서열의 제1 말단 또는 발현 카세트 서열의 제2 말단에 상보적인 오버행 영역을 포함하는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
21. 결찰은 화학적 결찰 및 단백질-보조된 결찰로부터 선택되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
22. 결찰은 T4 리가아제 또는 AAV Rep 단백질에 의해 수행되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
23. 제1 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
24. 제2 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
25. 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 적어도 하나의 RBE 부위를 포함하는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
26. 제1 ITR 및 제2 ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR 또는 AAV-유래된 ITR인, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
27. 제1 ITR의 서열은 표 3, 표 4b 또는 표 5에 제시된 좌측 ITR 서열 또는 서열 번호: 2, 5-9, 32-48 중 어느 것으로부터 선택되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
28. 제2 ITR의 서열은 표 3, 표 4a 또는 표 5에 제시된 우측 ITR 서열 또는 서열 번호: 1, 3, 10-14, 15-31 중 어느 것으로부터 선택되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
29. 발현 카세트 서열은 적어도 하나의 시스-조절 요소를 포함하는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
30. 시스-조절 요소는 프로모터, 인핸서, 전사 후 조절 요소 및 폴리아데닐화 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
31. 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
32. 프로모터는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
33. 발현 카세트 서열은 이식유전자 서열을 포함하는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
34. 이식유전자 서열은 적어도 2000개 뉴클레오티드 길이인, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
35. 이식유전자 서열은 단백질을 인코딩하는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
36. 이식유전자 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
37. 이식유전자 서열은 기능성 뉴클레오티드 서열인, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
38. 폐쇄 말단 DNA 벡터는 ceDNA 벡터인, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
39. ceDNA 벡터는 정제되는, 상기 단락 중 어느 하나의 방법.
40. 상기 단락 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 폐쇄 말단 DNA 벡터.
41. 상기 단락 중 어느 하나의 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 선택적으로, 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
42. 단락 1-6 또는 6-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 단리된 폐쇄 말단 DNA 벡터.
43. 상기 단락 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 단리된 폐쇄 말단 DNA 벡터를 포함하는 유전자 약(genetic medicine).
44. 단락 40의 폐쇄 말단 DNA 벡터를 포함하는 세포.
45. 단락 40의 폐쇄된 말단 DNA 벡터를 포함하는 형질전환 동물.
46. 단락 1-5 또는 6-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 투여함으로써 대상체를 치료하는 방법.
47. 대상체에게 치료 단백질을 전달하는 방법으로서,
청구항 40의 폐쇄 말단 DNA 벡터 또는 단락 1-5 또는 6-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 이식유전자 또는 치료 단백질을 인코딩하는, 방법.
48. 치료 단백질은 치료 항체, 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질인, 단락 47의 방법.
49. 패킷 삽입물을 갖는 용기에 포장된, 청구항 40의 폐쇄 말단 DNA 벡터 또는 단락 1-5 또는 6-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터, 및 나노캐리어를 포함하는 키트.
50. 단락 1-5 또는 6-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트.
51. 제1 ITR을 포함하는 제1-단일 가닥 ITR 분자, 제2 ITR을 포함하는 제2 단일 가닥 ITR 분자, 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자에 제1-단일 가닥 ITR 분자와 제2 단일 가닥 ITR 분자의 결찰을 위한 적어도 하나의 시약을 포함하는, 단락 1-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트.
52. (i) 발현 카세트; 발현 카세트의 상류 (5'-말단) 상의 제1 ITR; 발현 카세트의 하류 (3'-말단) 상의 제2 ITR; 및 제한 엔도뉴클레아제가 발현 카세트의 원위에 있도록 ITR의 측면에 있는 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물로서, 상기 발현 카세트는 이식유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 이중 가닥 DNA 작제물, 및 (ii) 결찰을 위한 적어도 하나의 결찰 시약을 포함하는, 단락 2-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트.
53. (i) 5'에서 3'의 방향 순으로 센스 제1 ITR; 센스 발현 카세트 서열; 센스 제2 ITR; 안티센스 제2 ITR; 안티센스 발현 카세트 서열; 및 안티센스 제1 ITR을 포함하는 단일 가닥 DNA 분자로서, 상기 센스 발현 카세트 서열 및 상기 안티센스 발현 카세트 서열은 이식유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 단일 가닥 DNA 분자, 및 (i) 결찰을 위한 적어도 하나의 결찰 시약을 포함하는, 단락 3-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트.
54. (i) 5'에서 3' 방향 순서로 센스 제1 ITR; 센스 발현 카세트 서열; 센스 제2 ITR; 및 안티센스 발현 카세트 서열을 포함하는 단일 가닥-DNA 분자로서, 상기 센스 발현 카세트 서열 및 상기 안티센스 발현 카세트 서열은 이식유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 단일 가닥-DNA 분자, 및 (ii) 결찰을 위한 적어도 하나의 결찰 시약을 포함하는, 단락 4-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트.
55. (i) 5'에서 3'의 방향 순으로 제1 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위; 센스 제1 ITR; 센스 발현 카세트 서열; 센스 제2 ITR; 안티센스 발현 카세트 서열; 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물로서, 상기 센스 발현 카세트 서열 및 상기 안티센스 발현 카세트 서열은 이식유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 이중 가닥 DNA 작제물, 및 (ii) 결찰을 위한 적어도 하나의 결찰 시약을 포함하는, 단락 5-39 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트.
56. 결찰을 위한 적어도 하나의 시약은 화학적 결찰을 위한 시약인, 단락 49-55 중 어느 하나의 키트.
57. 결찰을 위한 적어도 하나의 시약은 단백질-보조된 결찰을 위한 시약인, 단락 49-56 중 어느 하나의 키트.
58. 결찰은 T4 결찰 또는 AAV Rep 단백질에 의해 수행되는, 단락 49-57 중 어느 하나의 키트.
59. 제1-단일 가닥 ITR 분자 및 제2 단일 가닥 ITR 분자는 이들의 말단에 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는, 단락 49-58 중 어느 하나의 키트.
60. 키트는 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제 효소를 추가로 포함하는, 단락 49-59 중 어느 하나의 키트.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기술의 일 측면은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 합성적으로 생산된 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터 (ceDNA 벡터)에 관한 것이며, 여기서 ceDNA 벡터는 야생형 역 말단 반복 서열들 사이에 작동 가능하게 위치된, 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 선택적으로 이종 핵산 서열은 이식유전자를 인코딩하고, 벡터는 바이러스 캡시드가 아니다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기술의 한 측면은 공유적으로 패쇄 말단 (ceDNA 벡터)을 갖는 합성적으로 생성된 비-바이러스성 캡시드가 없는 DNA 벡터에 관한 것이며, 여기서 ceDNA 벡터는 비대칭 반전된 말단 반복 서열 (비대칭 ITR) 사이에 작동 가능하게 위치하는, 적어도 하나의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 비대칭 ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, 선택적으로 이종성 핵산 서열은 이식유전자를 암호화하고, 벡터는 바이러스성 캡시드에 존재하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기술의 일 측면은 공유적으로-폐쇄된 말단을 갖는 합성적으로 생산된 비-바이러스 캡시드-비함유 DNA 벡터에 관한 것이며, 여기서 ceDNA 벡터는 대칭적인 돌연변이 역 말단 반복 서열들 사이에 작동 가능하게 위치된, 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 ITR들 중 적어도 하나는 기능적 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함하고, 선택적으로 이종 핵산 서열은 이식유전자를 인코딩하고, 벡터는 바이러스 캡시드가 아니다.
본 발명의 이들 및 다른 측면은 아래에 더 상세히 설명된다.
위에서 간략하게 요약되고 아래에서 더 상세히 논의되는 본 개시의 구현예는 첨부된 도면에 도시된 본 개시의 예시적인 구현예를 참조하여 이해될 수 있다. 그러나, 첨부된 도면은 본 개시의 전형적인 구현예만을 도시하며, 따라서 본 개시는 다른 동등하게 유효한 구현예를 인정할 수 있기 때문에 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
도 1a는 비대칭 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이 구현예에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 이식유전자, 예를 들어, 루시퍼라제 이식유전자를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위 (R3/R4)에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 역 말단 반복부 (ITR), 즉 발현 카세트의 상류 (5'-말단)의 야생형 AAV2 ITR 및 하류 (3'-말단)의 변형된 ITR에 의해 플랭킹되며, 따라서 발현 카세트 측면에 있는 2개의 ITR은 서로 비대칭이다.
도 1b는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 이용한 비대칭 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이식유전자, 예를 들어, 루시퍼라제 이식유전자를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트는 발현 카세트의 상류 (5'-말단)의 변형된 ITR 및 하류 (3'-말단)의 야생형 ITR인, 2개의 역 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹된다.
도 1c는 인핸서/프로모터, 이식유전자, 전사 후 요소 (WPRE) 및 폴리 A 신호를 함유하는 발현 카세트를 갖는, 비대칭 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 이식유전자를 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위 내로의 삽입을 허용한다. 발현 카세트는 서로 비대칭인 2개의 역 말단 반복부 (ITR); 발현 카세트의 상류 (5'-말단)의 변형된 ITR 및 하류 (3'-말단)의 변형된 ITR에 의해 플랭킹되고, 여기서 5' ITR 및 3' ITR은 모두 변형된 ITR이지만 상이한 변형을 갖는다 (즉, 이들은 동일한 변형을 갖지 않는다).
도 1d는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이식유전자, 예를 들어, 루시퍼라제 이식유전자를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 변형된 역 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹되고, 여기서 5' 변형된 ITR 및 3' 변형된 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1e는 인핸서/프로모터, 이식유전자, 전사 후 요소 (WPRE) 및 폴리 A 신호를 포함하는 발현 카세트를 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 이식유전자의 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위 내로의 삽입을 허용한다. 발현 카세트는 2개의 변형된 역 말단 반복부 (ITR)에 의해 플랭킹되고, 여기서 5' 변형된 ITR 및 3' 변형된 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1f는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 대칭 WT-ITR 또는 실질적으로 대칭 WT-ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 이식유전자, 예를 들어, 루시퍼라제 이식유전자를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 야생형 역 말단 반복부 (WT-ITR)에 의해 플랭킹되고, 여기서 5' WT-ITR 및 3' WT ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1g는 인핸서/프로모터, 이식유전자, 전사 후 요소 (WPRE), 및 폴리 A 신호를 포함하는 발현 카세트를 갖는, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 도시한다. 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 이식유전자의 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위 내로의 삽입을 허용한다. 발현 카세트는 2개의 야생형 역 말단 반복부 (WT-ITR)에 의해 플랭킹되고, 여기서 5' WT-ITR 및 3' WT ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 2a는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위 (RBE 및 RBE')의 확인과 함께 AAV2의 야생형 좌측 ITR (서열 번호: 52)의 T형 스템-루프 구조를 제공하며, 말단 분해 부위 (trs)도 도시된다. RBE는 Rep 78 또는 Rep 68과 상호 작용하는 것으로 여겨지는 일련의 4개의 듀플렉스 사량체를 포함한다. 또한, RBE'는 또한 작제물에서 야생형 ITR 또는 돌연변이된 ITR 상에 조립된 Rep 복합체와 상호 작용하는 것으로 여겨진다. D 및 D' 영역은 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 함유한다. 도 2b는 A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위 (RBE 및 RBE')의 확인과 함께 AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T형 스템-루프 구조를 포함하는, 야생형 좌측 ITR (서열 번호: 53)에서 제안된 Rep-촉매화된 닉킹 및 결찰 활성을 도시하며, 또한 말단 분해 부위 (trs) 및 여러 전사 인자 결합 부위 및 다른 보존된 구조를 포함하는 D 및 D' 영역을 보여준다.
도 3a는 A-A' 아암, 및 야생형 좌측 AAV2 ITR (서열 번호: 54)의 C-C' 및 B-B' 아암의 RBE-함유 부분의 1차 구조 (폴리뉴클레오티드 서열) (왼쪽) 및 2차 구조 (오른쪽)를 제공한다. 도 3b는 좌측 ITR에 대한 예시적인 돌연변이된 ITR (또한 변형된 ITR이라고도 지칭됨) 서열을 도시한다. 예시적인 돌연변이된 좌측 ITR (ITR-1, 왼쪽) (서열 번호: 113)의 A-A' 아암, C 아암 및 B-B' 아암의 RBE 부분의 1차 구조 (왼쪽) 및 예측된 2차 구조 (오른쪽)가 도시되어 있다. 도 3c는 A-A' 루프 및 야생형 우측 AAV2 ITR (서열 번호: 55)의 B-B' 및 C-C' 아암의 RBE-함유 부분의 1차 구조 (왼쪽) 및 2차 구조 (오른쪽)를 도시한다. 도 3d는 예시적인 우측 변형된 ITR을 도시한다. 예시적인 돌연변이체 우측 ITR (ITR-1, 오른쪽) (서열 번호: 114)의 A-A' 아암, B-B' 및 C 아암의 일부를 함유하는 RBE의 1차 구조 (왼쪽) 및 예측된 2차 구조 (오른쪽)가 도시된다. 좌우 ITR (예를 들어, AAV2 ITR 또는 다른 바이러스 혈청형 또는 합성 ITR)의 임의의 조합이 본원에 교시된 바와 같이 사용될 수 있다. 도 3a-3d 폴리뉴클레오티드 서열 각각은 본원에 기재된 바와 같이 ceDNA를 생성하는 데 사용된 서열을 지칭한다. 또한, 도 3a-3d 각각에는 플라스미드 또는 박미드/바쿨로바이러스 게놈의 ceDNA 벡터 구성 및 예측된 깁스 자유 에너지 값으로부터 추론된 상응하는 ceDNA 2차 구조가 포함된다.
도 4a는 ceDNA를 제조하기 위한 무 세포 합성의 한 구현예를 도시한 개략도이다. 도 4a의 방법의 생성물은 도 4b의 하류 공정에 따라 분리 및 특성화될 수 있다. 도 4b는 ceDNA 생성을 확인하기 위한 비제한적인 생화학적 방법을 도시한다. 도 4c 및 도 4d는 도 4a의 무 세포 ceDNA 생산 공정 동안 수득된 ceDNA의 존재를 확인하기 위한 공정을 설명하는 개략도이다. 도 4c는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되지 않은 상태로 유지되거나 소화된 후 미변성 겔 또는 변성 겔 상에서 전기영동을 거친 예시적인 ceDNA에 대한 개략적인 예상 밴드를 보여준다. 가장 왼쪽의 도식은 미변성 겔이며, 다수의 밴드를 보여주는데, 이는 듀플렉스 및 절단되지 않은 형태에서 ceDNA가, 더 빠르게 이동하는 더 작은 단량체 및 더 느리게 이동하는 이량체 (단량체 크기의 2배임)로 보이는, 적어도 단량체 및 이량체 상태로 존재함을 시사한다. 왼쪽에서 두 번째 도식은 ceDNA가 제한 엔도뉴클레아제로 절단될 때, 원래 밴드가 사라지고 절단 후 남은 예상 단편 크기에 상응하는 더 빠르게 이동하는 (예를 들어, 더 작은) 밴드가 나타난다는 것을 보여준다. 변성 조건 하에서, 원래의 듀플렉스 DNA는 단일 가닥이고 상보적 가닥이 공유적으로 연결되어 있기 때문에 미변성 겔에서 관찰된 것보다 2배 큰 종으로 이동한다. 따라서 오른쪽에서 두 번째 도식에서, 소화된 ceDNA는 미변성 겔에서 관찰된 것과 유사한 밴딩 분포를 나타내지만, 밴드는 미변성 겔 대응물 크기의 두 배의 단편으로 이동한다. 가장 오른쪽 도식은 변성 조건 하에서 절단되지 않은 ceDNA가 단일 가닥 개방 원으로 이동하므로 관찰된 밴드는 원이 열리지 않은 미변성 조건 하에서 관찰된 크기의 두 배라는 것을 보여준다. 이 도면에서, "kb"는, 맥락에 따라, 뉴클레오티드 사슬 길이 (예를 들어, 변성 조건에서 관찰된 단일 가닥 분자의 경우) 또는 염기쌍의 수 (예를 들어, 미변성(native) 조건에서 관찰된 이중 가닥 분자의 경우)에 기초한 뉴클레오티드 분자의 상대적인 크기를 나타내기 위해 사용된다. 도 4d는 비연속 구조를 갖는 DNA를 나타낸다. ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 및 변성 조건 모두에서 상이한 크기 (1kb 및 2kb)를 갖는 2개의 DNA 단편을 생성한다. 도 4d는 또한 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA를 도시한다. ceDNA 벡터는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있고, 중성 조건에서 1kb 및 2kb로 이동하는 2 개의 DNA 단편을 생성하지만, 변성 조건에서 스탠드는 연결된 상태로 유지되고 2kb 및 4kb로 이동하는 단일 가닥을 생성한다.
도 5는 엔도뉴클레아제 (ceDNA 작제물 1 및 2에 대해 EcoRI; ceDNA 작제물 3 및 4에 대해 BamH1; ceDNA 작제물 5 및 6에 대해 SpeI; 및 ceDNA 작제물 7 및 8에 대해 XhoI)로 소화된 (+) 또는 소화되지 않은 (-) ceDNA 벡터의 변성 겔 실행 예의 예시적인 사진이다. 별표로 강조 표시된 밴드의 크기를 결정하고 사진 하단에 제공했다.
도 6a-6d는 본원에 기재된 구현예에서 사용하기 위한 ITR을 합성하기 위한 예시적인 ITR 및 예시적인 올리고를 도시한다. 도 6a는 ArvII 제한 부위를 갖는 5' WT-ITR을 생성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드 (WT-L-올리고-1)를 도시한다. 도 6a는 서열 번호 156의 상단 서열, 출현 순서대로 각각 서열 번호 134, 158 및 157의 이상적인 구조, 서열 번호 134의 예측된 구조, 및 서열 번호: 134의 WT-L-올리고-1을 개시하고 있다. 도 6b는 ArvII 제한 부위를 갖는 5' WT-ITR을 생성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드 (WT-L-올리고-2)를 도시한다. 도 6b는 출현 순서대로 각각 서열 번호 135 및 135를 개시하고 있다. 도 6c는 SbfI 제한 부위를 갖는 3' WT-ITR을 생성하기 위한 또 다른 예시적인 올리고뉴클레오티드 (WT-R-올리고-3)를 도시한다. 도 6c는 출현 순서대로 각각 서열 번호 159, 136, 및 136을 개시하고 있다. 도 6d는 DraIII 제한 부위를 갖는 3' 모드-ITR을 생성하기 위한 또 다른 예시적인 올리고뉴클레오티드 (MU-R-올리고-1)를 도시한다. 도 6d는 출현 순서대로 각각 서열 번호 160, 137, 및 137을 개시하고 있다.
도 7a-7e는 본원에 기재된 바와 같은 무세포 합성을 사용하여 ceDNA 벡터를 합성하기 위한 예시적인 ITR 및 예시적인 올리고를 도시한다. 도 7a는 ArvII 제한 부위를 갖는 5' WT-ITR을 생성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드 (WT-L-올리고-1)를 도시한다. 도 8a는 출현 순서대로 각각 서열 번호 138 및 138을 개시하고 있다. 도 7b는 ArvII 제한 부위를 갖는 5' WT-ITR을 생성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오티드 (WT-L-올리고-2)를 도시한다. 도 8b는 출현 순서대로 각각 서열 번호 161, 139, 및 139를 개시하고 있다. 도 7c는 SbfI 제한 부위를 갖는 3' WT-ITR을 생성하기 위한 또 다른 예시적인 올리고뉴클레오티드 (WT-R-올리고-3)를 도시한다. 도 8c는 출현 순서대로 각각 서열 번호 140 및 140을 개시하고 있다. 도 7d는 DraIII 제한 부위를 갖는 3' 모드-ITR을 생성하기 위한 또 다른 예시적인 올리고뉴클레오티드 (MU-R-올리고-1)를 도시한다. 도 8d는 출현 순서대로 각각 서열 번호 141 및 141을 개시하고 있다. 도 7e는 SbfI 제한 부위를 갖는 3' 모드-ITR을 생성하기 위한 또 다른 예시적인 올리고뉴클레오티드 (MU-R-올리고-6) (서열 번호: 142)를 도시한다. 도 8e는 출현 순서대로 각각 서열 번호 142 및 142를 개시하고 있다.
도 8은 3' 변형된 ITR을 생성하는데 사용된 예시적인 올리고뉴클레오티드를 도시한다. 도 8은 출현 순서대로 각각 서열 번호 160 및 162를 개시하고 있다. 도 9는 본원에 기재된 특정 구현예에 따른 예시적인 DNA 벡터 및 이의 조합의 다이어그램을 도시한다. 특히, 5' ITR 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA 분자의 5' 말단에 결찰되고, 3' ITR 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA 분자의 3'에 결찰된다. 5' ITR 올리고뉴클레오티드의 말단은 이중 가닥 DNA 분자의 '5 센스 가닥 및 3' 안티센스 가닥에 상보적이고 (즉, 이들은 동일한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 가짐), 유사하게, 3' ITR 올리고뉴클레오티드의 말단은 이중 가닥 DNA 분자의 '3 센스 가닥 및 5' 안티센스 가닥에 상보적이다. 도 9는 좌측에 출현 순서대로 각각 서열 번호 134, 158, 및 157, 및 우측에 출현 순서대로 각각 서열 번호 163, 137, 및 164을 개시하고 있다.
도 10a는 변형된 ITR ("ITR-6 (좌측)" 서열 번호: 111)의 최저 에너지 구조를 제공하고, 도 10b는 변형된 ITR ("ITR-6 (우측)" 서열 번호: 112)의 최저 에너지 구조를 제공한다. 이들은 단일 아암으로 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예상된다. 폴딩되지 않은 상태의 깁스 자유 에너지는 -54.4 kcal/mol로 예상된다.
도 11a는 2개의 헤어핀 루프 (B 및 C 영역) 및 RPE를 포함하는 A 및 D 영역을 포함하는 ITR, 및 선택적으로 관심 유전자를 포함하는 카세트의 양쪽에 플랭킹된 TRS, 선택적인 프로모터/인핸서 영역, 선택적인 전사 후 반응 요소 (예를 들어, 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사 후 조절 요소 (WPRE), 및 선택적인 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, 소 성장 호르몬 유래, BGHpA)를 도시하는, ceDNA 벡터의 개략도이다. 도 11b는 최종 ceDNA 벡터를 형성하기 위해 합성 및 연결된 상이한 올리고의 개략도를 도시한다.
도 12는 ceDNA 벡터를 합성적으로 제조하는데 사용된 예시적인 방법의 개략도이다.
도 13a는 실시예 6에 따라 합성적으로 생산된 2개의 야생형 AAV2 ITR을 갖는 ceDNA 벡터의 개략도를 도시한다. 도 13b는 실시예 6에 따른 WT/WT ITR을 갖는 정제된 ceDNA 벡터의 바이오분석기(bioanalyzer) 분석으로부터 생성된 크로마토그램이다. 크로마토그램 상의 각각의 피크로부터의 데이터는 표 8에 제시되어 있다.
도 14a는 실시예 5에 따라 합성적으로 생산된 좌측 야생형 AAV2 ITR 및 우측 절단 돌연변이 ITR을 갖는 ceDNA 벡터의 개략도를 도시한다. 도 14b는 실시예 6에 따른 WT/돌연변이 ITR을 갖는 정제된 ceDNA 벡터의 바이오분석기 분석으로부터 생성된 크로마토그램이다. 크로마토그램 상의 각각의 피크로부터의 데이터는 표 9에 제시되어 있다.
도 15a는 실시예 6에 따라 합성적으로 생산된 좌측 절단 돌연변이 ITR 및 상이한 우측 절단 돌연변이 ITR을 갖는 ceDNA 벡터의 개략도를 도시한다. 도 15b는 실시예 6에 따른 비대칭 돌연변이/돌연변이 ITR을 갖는 정제된 ceDNA 벡터의 바이오분석기 분석으로부터 생성된 크로마토그램이다. 크로마토그램 상의 각각의 피크로부터의 데이터는 표 10에 제시되어 있다.
도 16a는 Sf9 세포 생산을 사용하여 전통적으로 생산된 좌측 야생형 AAV2 ITR 및 우측 절단 돌연변이 ITR을 갖는 ceDNA 벡터의 개략도를 도시한다. 도 16b는 WT/돌연변이 ITR을 갖는 정제된 전통적으로-생산된 ceDNA 벡터의 바이오분석기 분석으로부터 생성된 크로마토그램이다. 크로마토그램 상의 각각의 피크로부터의 데이터는 표 11에 제시되어 있다.
도 17은 합성적으로-생산된 ceDNA 벡터로부터의 이식유전자의 발현을 HepaRG 세포에서 전통적으로 Sf9-생산된 ceDNA 벡터의 발현과 비교하여 실시예 7에 제시된 시험관내 세포 발현 분석 결과를 도시한다. 사용된 각각의 작제물의 개략도는 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 지시된 ceDNA 벡터를 도입하고 6일 후에 상기 ceDNA 벡터로 처리된 세포에 대한 형광 현미경 이미지 (백색 반점은 GFP 이식유전자-발현 세포 집단을 나타냄) 바로 위에 제시된다.
도 18a는 실시예 8에 따라 합성적으로 또는 전통적으로-생산된 ceDNA 벡터로 처리된 마우스로부터의 생체내 영상화 데이터의 정량적 3일차 및 7일차 결과를 보여주는 그래프를 제공한다. 도 18b는 처리 7일 후 처리된 마우스의 미가공(raw) IVIS 이미지 (이로부터 도 18a 그래프에 대한 정량화가 이루어짐)를 제공하고, 루시퍼라제 발현의 대부분이 마우스를 치료하는데 사용된 ceDNA의 생산 방법에 관계없이 예상대로 간에 국한되어 있음을 입증한다.
발명의 상세한 설명
본원에 제공된 방법 및 조성물은, 부분적으로, Sf9 세포주와 같은 곤충 세포주에서 생산된 DNA 벡터와 비교하여 더 적은 불순물 및/또는 더 높은 수율을 갖는 ceDNA 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하는데 유용한 합성 생산 방법의 발견에 기초하고, 및/또는 여기서 생산 공정은 능률화되거나 전통적인 세포-기반 생산 방법에 비해 더 효율적이거나 비용-효율적이다. 일 구현예에서, DNA 벡터를 복제하는데 세포가 사용되지 않으므로 상기 생산은 무세포이다. 따라서, 세포를 사용하지 않고 폐쇄 말단 DNA 벡터를 합성하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 곤충 세포를 사용하지 않고 폐쇄 말단 DNA 벡터를 합성하는 방법이 본원에 제공된다. 또한, ceDNA 벡터 조성물을 포함하는 본원의 합성적 생산 방법을 사용하여 생산된 폐쇄 말단 DNA 벡터 조성물, 및 이러한 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 ceDNA 벡터의 용도가 본원에 제공된다.
본 발명은 폐쇄 말단 DNA 벡터의 시험관내 생산 방법, 본원의 방법에 의해 생산된 상응하는 DNA 벡터 산물 및 이의 용도, 및 본 발명의 방법에 유용한 키트에 관한 것이다.
본원에 기재된 방법에 의해 제조된 폐쇄 말단 DNA 벡터는 세포, 조직 또는 대상체에서 이식유전자를 발현시키는데 보다 안전하게 사용될 수 있다는 점에서 다른 벡터에 비해 유리하다. 즉, 생성된 벡터에는 박테리아 또는 곤충 세포 오염물이 없기 때문에 이러한 무세포 방법에 의해 선형 벡터를 생성함으로써 바람직하지 않은 부작용을 잠재적으로 최소화할 수 있다. 합성적 생산 방법은 또한 원하는 벡터의 순도를 더 높일 수 있다. 합성적 생산 방법은 또한 이러한 벡터에 대한 전통적인 세포-기반 생산 방법보다 더 효율적이고/이거나 비용 효율적일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 합성된 벡터는 임의의 원하는 이식유전자, 예를 들어, 주어진 질병을 치료 또는 치유하기 위한 이식유전자를 발현시킬 수 있다. 당업자는, 통상적인 재조합 벡터를 갖는 통상적인 유전자 요법 방법에 사용된 임의의 이식유전자가 예를 들어, 본원에 기재된 합성 방법에 의해 제조된 ceDNA 벡터에 의한 발현을 위해 조정될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
I. 정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정의된다. 면역학 및 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 하기에서 찾을 수 있다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6th Edition, published by Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; and Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737) (이들의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).
본원에 사용된 용어 "무세포 생산", "합성적 폐쇄 말단 DNA 벡터 생산" 및 "합성적 생산" 및 이들의 문법적으로 관련된 대응물은 상호 교환적으로 사용되고, 세포에 의해 또는 세포 내부에서 또는 세포 추출물을 사용한 분자의 복제 또는 다른 증식을 수반하지 않는 방식으로 하나 이상의 분자를 생산하는 것을 지칭한다. 합성적 생산은 생성된 분자의 세포 오염물 (예를 들어, 세포 단백질 또는 세포 핵산)에 의한 오염을 피하고, 또한 생산 공정 동안 분자의 원치 않는 세포-특이적 변형 (예를 들어, 메틸화 또는 글리코실화 또는 다른 번역 후 변형)을 피한다.
본원에 사용된 용어 "이종 뉴클레오티드 서열" 및 "이식유전자"은 상호 교환적으로 사용되며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 통합되고 ceDNA 벡터에 의해 전달되고 발현될 수 있는 관심 핵산 (캡시드 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 이외)을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "발현 카세트" 및 "전사 카세트" 및 "유전자 발현 단위"는 상호 교환적으로 사용되며, 하나 이상의 프로모터 또는 이식유전자의 전사를 지시하기에 충분한 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결되지만, 캡시드-인코딩 서열, 다른 벡터 서열 또는 역 말단 반복 영역을 포함하지 않는 이식유전자를 포함하는 핵산의 선형 스트레치를 지칭한다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스-작용 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 리프레서), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사 후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일, 이중 또는 다중 가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리머를 포함한다. "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA의 약 5개 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그러나, 본 개시의 목적상, 올리고뉴클레오티드의 길이에 대한 상한은 없다. 올리고뉴클레오티드는 또한 "올리고머" 또는 "올리고"로 공지되어 있으며, 유전자로부터 단리되거나, 당 업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은, 기술된 구현예에 적용 가능한, 단일 가닥 (예컨대 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 작제물"은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자를 말하며, 이는 천연 발생 유전자로부터 단리되거나 또는 달리 자연적으로 존재하지 않거나 합성되는 방식으로 핵산 세그먼트를 함유하도록 변형된다. 핵산 작제물이라는 용어는 핵산 작제물이 본 개시내용의 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 함유할 때 "발현 카세트"라는 용어와 동의어이다. "발현 카세트"는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 코딩 서열을 포함한다.
"하이브리드화 가능" 또는 "상보적" 또는 "실질적으로 상보적"이란 핵산 (예를 들어, RNA)이 적절한 시험관내 및/또는 생체내 조건의 온도 및 용액 이온 강도 하에서 서열 특이적 역평행 방식으로 (즉, 핵산은 상보적인 핵산에 특이적으로 결합함) 또 다른 핵산에 비-공유적으로 결합하거나, 즉 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 및/또는 G/U 염기쌍을 형성하거나, "어닐링"하거나 "하이브리드화"될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함함을 의미한다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 표준 왓슨-크릭 염기쌍은 티미딘 (T)과 쌍을 이루는 아데닌 (A), 우라실 (U)과 쌍을 이루는 아데닌 (A) 및 시토신 (C)과 쌍을 이루는 구아닌 (G)을 포함한다. 또한, 2개의 RNA 분자 (예를 들어, dsRNA) 간의 하이브리드화, 우라실 (U)과 구아닌 (G)의 염기쌍에 대해 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, G/U 염기 짝짓기는 mRNA 내 코돈과 tRNA 항-코돈 염기 짝짓기의 맥락에서 유전자 코드의 축퇴 (즉 , 중복)를 부분적으로 담당한다. 본 개시의 맥락에서, 대상 DNA-표적화 RNA 분자의 단백질-결합 세그먼트 (dsRNA 듀플렉스)의 구아닌 (G)은 우라실 (U)과 상보적인 것으로 간주되고, 그 반대도 마찬가지이다. 이와 같이, G/U 염기쌍이 주어진 뉴클레오티드 위치 대상 DNA-표적화 RNA 분자의 단백질-결합 세그먼트 (dsRNA 듀플렉스)에서 만들어질 수 있는 경우, 위치는 비-상보적인 것으로 간주되지 않고, 대신에 상보적인 것으로 간주된다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 코딩된 및 코딩되지 않은 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩티드 골격을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있는, 임의의 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 지칭한다.
특정 RNA 또는 단백질 유전자 산물을 "인코딩"하는 DNA 서열은 특정 RNA 및/또는 단백질로 전사되는 DNA 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되는 RNA (mRNA)를 인코딩할 수 있거나, DNA 폴리뉴클레오티드는 단백질로 번역되지 않는 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA, 또는 DNA-표적화 RNA; "비-코딩" "RNA 또는 "ncRNA"라고도 함)를 인코딩 할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "게놈 세이프 하버 유전자" 또는 "세이프 하버 유전자"는 내인성 유전자 활성에 중대한 부정적인 영향 없이 또는 암의 촉진 없이 서열이 예측 가능한 방식으로 통합되고 기능할 수 있도록 (예를 들어, 관심 단백질을 발현하도록) 핵산 서열이 삽입될 수 있는 유전자 또는 유전자좌를 지칭한다. 일부 구현예에서, 세이프 하버 유전자는 또한 삽입된 핵산 서열이 비-세이프 하버 부위보다 효율적으로 그리고 더 높은 수준으로 발현될 수 있는 유전자좌 또는 유전자이다.
본원에 사용된 용어 "유전자 전달"은 외래 DNA가 유전자 요법 적용을 위해 숙주 세포로 전달되는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "말단 반복부" 또는 "TR"은 적어도 하나의 최소 요구된 복제 기원 및 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는 임의의 바이러스 말단 반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열 ("RBS") (RBE (Rep-결합 요소)로도 지칭됨) 및 말단 분해 부위 ("TRS")는 함께 "최소 요구된 복제 기원"을 구성하므로 TR은 적어도 하나의 RBS 및 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 주어진 폴리뉴클레오티드 서열의 스트레치 내에서 서로의 역 보체인 TR은 전형적으로 각각 "역 말단 반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스와 관련하여, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 구조를 중재한다. 본 발명에서 예기치 않게 발견된 바와 같이, 전장에 걸쳐 역 보체가 아닌 TR은 여전히 ITR의 전통적인 기능을 수행할 수 있으므로, ITR이라는 용어는 본원에서 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 TR을 지칭하는데 사용된다. 복잡한 ceDNA 벡터 구성에서 2개 이상의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비-AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비-AAV ITR로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파보바이러스 및 데펜도바이러스 (예를 들어, 개 파보바이러스, 소 파보바이러스, 마우스 파보바이러스, 돼지 파보바이러스, 인간 파보바이러스 B-19)를 포함하는 파보비리다에 패밀리로부터 유래될 수 있거나, SV40 복제 기원으로 사용되는 SV40 헤어핀을 ITR로 사용할 수 있으며, 이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 파보비리다에 패밀리 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파보비리나에(Parvovirinae), 및 무척추동물을 감염시키는 덴소비리나에(Densovirinae)의 2개의 하위패밀리로 구성된다. 데펜도파보바이러스는 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 척추동물 숙주에서 복제할 수 있는 아데노-관련 바이러스 (AAV)의 바이러스 패밀리를 포함한다. 본원의 편의를 위해, ceDNA 벡터에서 발현 카세트의 5'에 (상류에) 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터에서 발현 카세트의 3'에 (하류에) 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
"야생형 ITR" 또는 "WT-ITR"은, 예를 들어, Rep 결합 활성 및 Rep 닉킹 능력을 보유하는 AAV 또는 다른 데펜도바이러스에서 천연 발생 ITR 서열의 서열을 지칭한다. 임의의 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR의 뉴클레오티드 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 정규 천연 발생 서열과 약간 다를 수 있으므로, 본원에 사용하기 위해 포함된 WT-ITR 서열은 생성 과정 중에 발생하는 천연 발생 변화 (예를 들어, 복제 오류)의 결과로서 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 대칭인 WT-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍"은 둘 다 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 야생형 ITR인 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 WT-ITR을 지칭한다. 예를 들어, ITR은 변화가 서열의 특성 및 전체 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 한, 정규 천연 발생 서열로부터 벗어난 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 경우에도 야생형 서열로 간주될 수 있다. 일부 측면에서, 변형 뉴클레오티드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 정규 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고 (예를 들어, 디폴트 설정에서 BLAST를 사용하여 측정됨), 또한 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대해 대칭 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 그것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위 (RBE 또는 RBE') 및 말단 분해 부위 (trs)를 갖는 것으로 결정함으로써 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 허용 조건 하에서 이식유전자 발현을 포함하여, 다른 기능을 선택적으로 시험할 수 있다.
본원에 사용된 "변형된 ITR" 또는 "모드-ITR" 또는 "돌연변이 ITR"의 문구는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형으로부터의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드 내의 돌연변이를 갖는 ITR을 지칭한다. 돌연변이는 ITR에서 A, C, C', B, B' 영역 중 하나 이상에서의 변화를 초래할 수 있고, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성 (즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)의 변화를 초래할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "비대칭 ITR"은 "비대칭 ITR 쌍"으로도 지칭되고, 전체 길이에 걸쳐 역 보체가 아닌 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 ITR을 지칭한다. 하나의 비제한적인 예로서, 비대칭 ITR 쌍은 3D 구조가 기하학적 공간에서 상이한 형상이 되도록 동족 ITR에 대해 대칭인 3차원 공간 구성을 갖지 않는다. 다르게 말하면, 비대칭 ITR 쌍은 전체적인 기하학적 구조가 다르며, 즉, 3D 공간에서 A, C-C' 및 B-B' 루프의 구성이 다르다 (예를 들어, 하나의 ITR은 동족 ITR과 비교하여 짧은 C-C' 아암 및/또는 짧은 B-B' 아암을 가질 수 있음). 두 ITR 사이의 서열 차이는 하나 이상의 뉴클레오티드 첨가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이에 기인할 수 있다. 일 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍의 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 ITR은 본원에 정의된 변형된 ITR (예를 들어, 비-야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍의 모든 ITR은 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형상 (즉, 상이한 전체 기하학적 구조)을 갖는 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍의 하나의 모드-ITR은 짧은 C-C' 아암을 가질 수 있고 다른 ITR은 상이한 변형 (예를 들어, 단일 암 또는 짧은 B-B' 아암 등)을 가질 수 있으므로 동족 비대칭 모드-ITR과 비교하여 상이한 3차원 공간 구성을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "대칭 ITR"은 야생형 데펜도바이러스 ITR 서열에 대해 돌연변이되거나 변형되고 전장에 걸쳐 역 보체인 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 ITR을 지칭한다. ITR은 모두 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며 (즉, 돌연변이 ITR이라고도 하는 변형된 ITR임), 뉴클레오티드 첨가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이로 인해 야생형 ITR과 서열상 차이가 있을 수 있다. 본원의 편의를 위해, ceDNA 벡터에서 발현 카세트의 5'에 (상류에) 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터에서 발현 카세트의 3'에 (하류에) 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 대칭인 변형된-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍"은 둘 다 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내의 한 쌍의 변형된-ITR을 지칭한다. 예를 들어, 변형된 ITR은 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 역 보체 서열로부터 벗어난 일부 뉴클레오티드 서열을 가지더라도 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 정규 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고 (디폴트 설정에서 BLAST를 사용하여 측정됨), 또한 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대해 대칭 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 다르게 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된-ITR 쌍은 3D 공간에서 구성된 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 일부 구현예에서, 모드-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있지만 여전히 동일한 대칭 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며 - 즉, 두 ITR은 모두 동일한 전체 3D 형상을 초래하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 모드-ITR 쌍에서 하나의 ITR (예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 ITR (예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있지만, 둘 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로 (예를 들어, 5'ITR이 C 영역에서 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족 변형된 3'ITR은 C '영역 내 상응하는 위치에서 결실을 가짐) 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러일 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 AAV2 및 AAV6의 조합과 같은 다른 혈청형 (예를 들어 AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12)으로부터 유래할 수 있으며, 하나의 ITR에서의 변형은 다른 혈청형으로부터의 동족 ITR의 상응하는 위치에 반영된다. 일 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 ITR 사이의 뉴클레오티드 서열의 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한 변형된 ITR (모드-ITR)의 쌍을 지칭한다. 비제한적인 예로서, BLAST(기본 지역 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool)) 또는 디폴트 설정의 BLASTN과 같이 당 업계에 잘 알려진 표준 수단에 의해 결정된 정규 모드-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 또한 3D 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 대칭 3차원 공간 구성을 갖는, 모드-ITR. 실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어, 실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍의 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는다면, 동족 모드-ITR은 상응하는 C-C' 루프의 결실을 가지며 또한 동족 모드-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형태로 남은 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.
용어 "플랭킹"은 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적 위치를 지칭한다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B는 A 및 C에 의해 플랭킹된다. 배열 AxBxC에 대해서도 동일하다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열에 선행하거나 후속하지만 플랭킹된 서열에 근접하거나 또는 바로 인접할 필요는 없다. 일 구현예에서, 용어 플랭킹은 선형 듀플렉스 ceDNA 벡터의 각 말단에서의 말단 반복부를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA 게놈"은 적어도 하나의 역 말단 반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 지칭한다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 듀플렉스 폴리뉴클레오티드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 통합된다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA 스페이서 영역"은 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 게놈에서 기능적 요소를 분리하는 개재 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 최적의 기능성을 위해 2개의 기능성 요소를 원하는 거리로 유지한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 예를 들어, 플라스미드 또는 바쿨로바이러스 내에서 ceDNA 게놈의 유전자 안정성을 제공하거나 추가한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 클로닝 부위 등을 위한 편리한 위치를 제공함으로써 ceDNA 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 측면에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드 "폴리링커", 또는 공지된 단백질 (예를 들어, 전사 인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비-오픈 리딩 프레임 서열은, 예를 들어, 말단 분해 부위와 상류 전사 조절 요소 사이에 6mer, 12mer, 18mer, 24mer, 48mer, 86mer, 176mer 등을 삽입하여 시스 - 작용 인자를 분리하도록 ceDNA 게놈에 위치할 수 있다. 유사하게, 스페이서는 폴리아데닐화 신호 서열과 3'-말단 분해 부위 사이에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "Rep 결합 부위, "Rep 결합 요소, "RBE" 및 "RBS"는 상호 교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의해 결합될 때 Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 이의 부위-특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있도록 하는 Rep 단백질 (예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 지칭한다. RBS 서열 및 이의 역 보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, AAV2에서 확인된 RBS 서열인, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)를 포함한다. 다른 공지된 AAV RBS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 RBS 서열을 포함하는, 임의의 공지된 RBS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, Rep 단백질의 뉴클레아제 도메인은 듀플렉스 뉴클레오티드 서열 GCTC에 결합하고, 따라서 공지된 2개의 AAV Rep 단백질은 듀플렉스 올리고뉴클레오티드, 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3' (서열 번호: 60)에 직접 결합하고 안정적으로 조립된다고 생각된다. 또한, 가용성 응집된 컨포머 (즉, 정의되지 않은 수의 상호 연관된 Rep 단백질)는 해리되어 Rep 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 결합한다. 각각의 Rep 단백질은 각 가닥에서 질소 염기 및 포스포디에스테르 골격 둘 다와 상호 작용한다. 질소 염기와의 상호 작용은 서열 특이성을 제공하는 반면, 포스포디에스테르 골격과의 상호 작용은 서열에 특이적이지 않거나 덜 특이적이고, 단백질-DNA 복합체를 안정화시킨다.
본원에 사용된 용어 "말단 분해 부위" 및 "TRS"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, Rep가 DNA 중합 효소, 예를 들어, DNA pol 델타 또는 DNA pol 엡실론을 통해 DNA 확장을 위한 기질로 작용하는 3' OH를 생성하는 5' 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하여 영역을 지칭한다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 조정된 결찰 반응에 참여할 수 있다. 일부 구현예에서, TRS는 비-염기쌍을 이루는 티미딘을 최소로 포함한다. 일부 구현예에서, TRS의 닉킹 효율은 RBS로부터 동일한 분자 내에서의 거리에 의해 적어도 부분적으로 제어될 수 있다. 수용체 기질이 상보적 ITR인 경우, 생성된 생성물은 분자내 듀플렉스이다. TRS 서열은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, AAV2에서 확인된 헥사뉴클레오티드 서열인, 5'-GGTTGA-3' (서열 번호: 61)를 포함한다. 다른 공지된 AAV TRS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 TRS 서열 예컨대 AGTT (서열 번호: 62), GGTTGG (서열 번호: 63), AGTTGG (서열 번호: 64), AGTTGA (서열 번호: 65), 및 RRTTRR (서열 번호: 66)과 같은 다른 모티프를 포함하는, 임의의 공지된 TRS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA-플라스미드"는 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 플라스미드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA-박미드"는 이. 콜라이에서 플라스미드로서 증식할 수 있는 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바쿨로바이러스 게놈을 지칭하며, 따라서 바쿨로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA- 바쿨로바이러스"는 바쿨로바이러스 게놈 내의 분자간 듀플렉스로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바쿨로바이러스를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA-바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"는 상호 교환적으로 사용되며, ceDNA-바쿨로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주 세포 (곤충 세포 (예를 들어, Sf9 세포)를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "폐쇄 말단 DNA 벡터"는 적어도 하나의 공유적으로 폐쇄 된 말단을 갖는 캡시드-비함유 DNA 벡터를 지칭하며, 여기서 벡터의 적어도 일부는 분자 내 이중 구조를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "ceDNA 벡터"및 "ceDNA"는 상호교환적으로 사용되고 적어도 하나의 말단 회문(palindrome)을 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 지칭한다. 일부 구현예에서, ceDNA는 2 개의 공유적으로 패쇄 말단을 포함한다.
본원에 정의된 바와 같이, "리포터"는 검출 가능한 판독을 제공하는데 사용될 수 있는 단백질을 지칭한다. 리포터는 일반적으로 형광, 색 또는 발광과 같은 측정 가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 코딩 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 쉽게 관찰되는 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 일으키고, 루시퍼라제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉매하게 하며, β-갈락토시다제와 같은 효소는 기질을 착색된 생성물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩티드는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리 포스파타제 (AP), 티미딘 키나제 (TK), 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 기타 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제 및 당 업계에 잘 알려진 다른 것들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "이펙터 단백질"은, 예를 들어, 리포터 폴리펩티드로서 또는 보다 적절하게는, 세포를 사멸시키는 폴리펩티드, 예를 들어 독소, 또는 세포를 선택된 제제로의 사멸 또는 이의 결핍에 민감하게 하는 제제로서 검출 가능한 판독을 제공하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이펙터 단백질은 숙주 세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적화하거나 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 이펙터 단백질은 숙주 세포 DNA 서열 (게놈 또는 염색체외 요소에 관계없이)을 표적화하는 제한 엔도뉴클레아제, 세포 생존에 필요한 폴리펩티드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이레이스 억제제, 및 리보뉴클레아제-타입 독소를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 이펙터 단백질의 발현은 또 다른 합성 생물학적 회로의 인자로서 참여하여 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.
전사 조절제는 관심 유전자의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 활성화제 및 억제제를 지칭한다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성화제는 전형적으로 전사 프로모터 인근에 결합하고 전사를 직접 개시하기 위해 RNA 폴리머라제를 동원한다. 억제제는 전사 프로모터에 결합하고 RNA 폴리머라제에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절제는 이들이 결합하는 위치 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성화제 또는 억제제로서 작용할 수 있다. 전사 조절제 부류의 비제한적인 예는 호메오도메인 단백질, 아연-핑거 단백질, 윙드(winged)-헬릭스 (포크헤드) 단백질 및 류신-지퍼 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "억제 단백질" 또는 "유도 단백질"은 조절 서열 요소에 결합하고 조절 서열 요소에 작동적으로 연결된 서열의 전사를 각각 억제하거나 활성화시키는 단백질이다. 본원에 기술된 바람직한 억제 및 유도 단백질은 적어도 하나의 투입 제제 또는 환경 투입의 존재 또는 부재에 민감하다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은, 예를 들어, 분리 가능한 DNA-결합 및 투입 제제-결합 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 형태의 모듈이다.
본원에 사용된 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당 업계에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 문구 "약제학적으로 허용되는"은 숙주에 투여될 때 독성, 알레르기성 또는 유사한 유해 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 "입력 제제 반응 도메인"은 연결된 DNA 결합 융합 도메인이 그 조건 또는 입력의 존재에 반응하도록 하는 방식으로 조건 또는 입력 제제에 결합하거나 달리 반응하는 전사 인자의 도메인이다. 일 구현예에서, 조건 또는 투입의 존재는 전사 인자의 전사-조절 활성을 변형시키는, 투입 제제 반응 도메인 또는 그것이 융합된 단백질에서 형태적 변화를 초래한다.
"생체내"라는 용어는 유기체, 예컨대 다세포 동물에서 또는 내에서 발생하는 분석 또는 과정을 지칭한다. 본원에 기재된 일부 측면에서, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때 방법 또는 사용이 "생체내"에서 발생한다고 말할 수 있다. "생체외"라는 용어는 다세포 동물 또는 식물의 몸체 외부, 예를 들어, 외식편, 일차 세포 및 세포주를 비롯한 배양 세포, 형질전환 세포주, 및 추출된 조직 또는 특히 혈액 세포를 포함하는 세포의 외부인 온전한 막을 갖는 살아있는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 사용을 지칭한다. "시험관내"라는 용어는 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 분석 및 방법을 지칭하고, 비-세포 시스템, 예컨대 세포 추출물과 같이 세포 또는 세포 시스템을 포함하지 않는 배지에서 프로그램 가능한 합성 생물학적 회로의 도입을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 이종 표적 유전자일 수 있는, 핵산 서열의 전사를 유도함으로써 또 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직-특이적, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 개시 및 전사 속도를 제어하는 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전자 요소, 예컨대 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 측면의 일부 구현예에서, 프로모터는 프로모터 자체의 발현을 조절하는 전사 인자의 발현을 구동할 수 있다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위 및 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵생물 프로모터는 종종 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 포함하지만, 항상 그런 것은 아니다. 유도성 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터가 본원에 개시된 ceDNA 벡터에서 이식유전자의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에 결합될 수 있고, 배경 이상의 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류 (5' 방향)로 연장된다.
본원에 사용된 용어 "인핸서"는 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질 (예를 들어, 활성화제 단백질 또는 전사 인자)에 결합하는 시스-작용 조절 서열 (예를 들어, 50-1,500 염기쌍)을 지칭한다. 인핸서는 이들이 조절하는 유전자 개시 부위의 상류 또는 유전자 개시 부위의 하류에서 최대 1,000,000개의 염기 파스(base pars)에 위치할 수 있다. 인핸서는 인트론 영역 내에 또는 관련되지 않은 유전자의 엑손 영역에 위치할 수 있다.
프로모터는 그것이 조절하는 핵산 서열의 발현 또는 전사를 유도한다고 할 수 있다. "작동 가능하게 연결된", "작동적으로 위치된", "작동적으로 연결된", "제어 하" 및 "전사적 제어 하"라는 문구는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하도록 조절하는 올바른 기능적 위치 및/또는 배향에 있음을 나타낸다. 본원에 사용된 "역 프로모터"는 핵산 서열이 역 배향으로 되어, 코딩 가닥이 이제 비-코딩 가닥이 되거나 그 반대인 프로모터를 지칭한다. 역 프로모터 서열은 스위치의 상태를 조절하기 위해 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. 또한, 다양일 구현예에서, 프로모터는 인핸서와 함께 사용될 수 있다.
프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 관련된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 인핸서는 그 서열의 하류 또는 상류에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 관련된 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 코딩 핵산 세그먼트는 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 제어 하에 위치되며, 이들 둘 모두는 천연 환경에서 작동 가능하게 연결되는 인코딩된 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종 인핸서는 천연 환경에서 주어진 핵산 서열과 정상적으로 관련되지 않은 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "천연 발생"이 아닌 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있으며, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당 업계에 공지된 유전 공학 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본원에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, PCR을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,683,202, 미국 특허 번호 5,928,906 참조, 각각 본원에 참고로 포함됨). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비-핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
본원에 기재된 바와 같이, "유도성 프로모터"는 유도제 또는 유도 제제의 존재하, 이에 영향을 받거나 이에 의해 접촉될 때 전사 활성을 개시 또는 향상시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 본원에 정의된 "유도제" 또는 "유도 제제"는 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는데 활성이 있는 방식으로 투여되는 내인성, 또는 일반적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도제 또는 유도 제제, 즉, 화학 물질, 화합물 또는 단백질 자체는 핵산 서열의 전사 또는 발현 결과일 수 있으며 (즉, 유도제는 또 다른 성분 또는 모듈에 의해 발현된 유도 단백질일 수 있음), 이는 그 자체로 제어 하에 있거나 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 특정 작용제, 예컨대 억제제의 부재 하에 유도된다. 유도성 프로모터의 예는 테트라사이클린, 메탈로티오닌, 엑디손, 포유동물 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복부 (MMTV-LTR)) 및 다른 스테로이드-반응성 프로모터인, 라파마이신 반응성 프로모터 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "DNA 조절 서열", "제어 요소" 및 "조절 요소"는 전사 및 번역 제어 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결자, 단백질 분해 신호 등을 지칭하고, 비-코딩 서열 (예를 들어, DNA-표적화 RNA) 또는 코딩 서열 (예를 들어, 부위 지향적 변형 폴리펩티드, 또는 Cas9/Csn1 폴리펩티드)의 전사를 제공 및/또는 조절하고/하거나 인코딩된 폴리펩티드의 번역을 조절한다.
"작동 가능하게 연결된"은 설명된 구성 요소들이 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있는 근접부위(juxtaposition)를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터가 이의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. "발현 카세트"는 ceDNA 벡터에서 이식유전자의 전사를 지시하기에 충분한 프로모터 또는 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 DNA 서열을 포함한다. 적합한 프로모터는, 예를 들어, 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 프로모터는 또한 AAV 기원일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 예방적 치료를 포함하여, 본 발명에 따른 ceDNA 벡터를 사용한 치료가 제공되는 인간 또는 동물을 지칭한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰구스 원숭이(cynomologous monkey), 거미 원숭이 및 마카크(macaque), 예를 들어 레소스(Rhesus)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 설치류에는 마우스, 랫트, 우드척(woodchuck), 흰 족제비, 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 게임 동물에는 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종, 예를 들어, 집고양이, 개과 종, 예를 들어, 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어, 닭, 에뮤, 타조 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 측면의 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 영장류 또는 인간이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상체는 유아 또는 소아일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 신생아 또는 태어나지 않은 대상체일 수 있으며, 예를 들어, 대상체는 자궁 내에 있다. 바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예에 제한되지는 않는다. 인간 이외의 포유동물이 질환 및 장애의 동물 모델을 나타내는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 길들여진 동물 및/또는 애완 동물을 위해 사용될 수 있다. 인간 대상체는 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족 그룹, 예를 들어, 코카서스(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 임상 환경의 환자 또는 다른 대상체일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 이미 치료 중이다. 일부 구현예에서, 대상체는 배아, 태아, 신생아, 유아, 소아, 청소년 또는 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 태아, 인간 신생아, 인간 유아, 인간 소아, 인간 청소년 또는 인간 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 동물 배아, 또는 비인간 배아 또는 비인간 영장류 배아이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 배아이다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 개시내용의 핵산 작제물 또는 ceDNA 발현 벡터에 의한 형질전환, 형질감염, 형질도입 등에 민감한 임의의 세포 유형을 포함한다. 비제한적인 예로서, 숙주 세포는 단리된 1차 세포, 다능성 줄기세포, CD34+ 세포), 유도된 다능성 줄기세포, 또는 임의의 다수의 불멸화 세포주 (예를 들어, HepG2 세포)일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 조직, 기관 또는 유기체 내의 동일계 또는 생체내 세포일 수 있다.
용어 "외인성"은 천연 공급원이 아닌 세포에 존재하는 물질을 지칭한다. 본원에서 사용될 때 용어 "외인성"은 인간의 손을 포함하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템으로 도입된 핵산 (예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산) 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 이는 정상적으로는 발견되지 않으며, 그러한 세포 또는 유기체 내로 핵산 또는 폴리펩티드를 도입하고자 하는 것이다. 대안적으로, "외인성"은 인간의 손을 포함하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템으로 도입된 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 이는 비교적 적은 양으로 발견되고 세포 또는 유기체에서 핵산 또는 폴리펩티드의 양을 증가시키고자 하는 것, 예를 들어, 이소성 발현 또는 수준을 생성하고자 하는 것이다. 대조적으로, 용어 "내인성"은 생물학적 시스템 또는 세포에 자생하는 물질을 지칭한다.
용어 "서열 동일성"은 두 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성을 지칭한다. 본 개시의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: 유럽 분자 생물학 개방 소프트웨어 스위트, Rice et al., 2000, 상기)의 니들 프로그램, 바람직하게는 버전 3.0.0 이상에서 구현된 바와 같이 니들맨-운쉬 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, 상기)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 파라미터는 갭 오픈 페널티(gap open penalty) 10, 갭 연장 페널티(gap extension penalty) 0.5, 및 EDNA FULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "가장 긴 동일성"으로 표시된 니들의 출력 (-nobrief 옵션을 사용하여 획득)은 백분율 동일성으로 사용되며 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시리보뉴클레오티드.횟수.100)/(정렬의 길이-정렬에서의 총 갭의 수). 정렬의 길이는 바람직하게는 적어도 10개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 25개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 50개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 적어도 100개의 뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 용어 "상동성" 또는 "상동"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 후 표적 염색체 상의 상응하는 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 상동성 아암의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로 정의된다. 뉴클레오티드 서열 상동성 백분율을 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당 업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열이 숙주 세포의 상응하는 천연 또는 편집되지 않은 핵산 서열 (예를 들어, 게놈 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 이상 동일한 경우, 예를 들어 복구 주형의 상동성 아암의 핵산 서열 (예를 들어, DNA 서열)은 "상동성"인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "이종"은 각각 고유 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전 공학에 의해) 천연 발생 핵산 서열 (또는 이의 변이체)에 연결되어 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 키메라 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전 공학에 의해) 변이체 폴리펩티드에 연결되어 융합 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"는 또 다른 DNA 세그먼트, 즉 "삽입물"이 세포에 부착된 세그먼트의 복제를 야기하도록 부착될 수 있는 플라스미드, 박미드, 파지, 바이러스, 비리온 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다. 벡터는 숙주 세포로의 전달 또는 상이한 숙주 세포 사이의 이동을 위해 설계된 핵산 작제물일 수 있다. 본원에 사용된 벡터는 최초 및/또는 최종 형태의 바이러스성 또는 비-바이러스성일 수 있지만, 본 개시의 목적상, "벡터"는 일반적으로 그 용어가 본원에 사용된 바와 같이 ceDNA 벡터를 지칭한다. 용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 관련될 때 복제될 수 있고 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전자 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터 또는 재조합 벡터일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 종종 세포에 대해 이종성일 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있고, 따라서 2개의 유기체, 예를 들어 발현을 위한 인간 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵생물 숙주에서 유지될 수 있도록 한다. 용어 "발현"은, 적용 가능한 경우, 예를 들어, 전사, 전사체 프로세싱, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 프로세싱을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, RNA 및 단백질 및 적절한 경우, 분비 단백질을 생산하는데 관여하는 세포 과정을 지칭한다. "발현 산물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 경우 시험관내 또는 생체내에서 (DNA가) RNA로 전사되는 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역의 앞뒤에 있는 영역, 예를 들어, 5' 비번역 (5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트 (엑손) 간의 개재 서열 (인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
"재조합 벡터"는 이종 핵산 서열, 또는 생체내에서 발현될 수 있는 "이식유전자"을 포함하는 벡터를 의미한다. 본원에 기술된 벡터는, 일부 구현예에서, 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 에피솜이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 대상체에서 관심 뉴클레오티드를 높은 카피 수의 추가 염색체 DNA로 유지하여 염색체 통합의 잠재적 영향을 제거하는 수단을 제공한다.
본원에 사용된 문구 "유전 질환"은 게놈에서 하나 이상의 이상, 특히 출생시 존재하는 상태에 의해 부분적으로 또는 전적으로, 직접적으로 또는 간접적으로 유발되는 질환을 지칭한다. 이상은 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 이상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 줄 수 있다. 유전 질환은 DMD, 혈우병, 낭포성 섬유증, 헌팅턴 무도병, 가족성 고콜레스테롤혈증 (LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병(Wilson's disease), 선천성 간성 포르피린증, 간 대사의 유전성 장애, 레쉬 니한 증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상 적혈구 빈혈, 지중해빈혈, 색소피부건조증, 판코니 빈혈(Fanconi's anemia), 망막색소변성증, 모세혈관확장성 실조증, 블룸 증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종 및 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 방법 또는 조성물에 필수적인 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)을 언급하는데 사용되지만, 필수적인지 여부에 관계없이, 특정되지 않은 요소의 포함에도 개방적이다.
본원에 사용된 용어 "본질적으로 구성되는"은 주어진 구현예에 필요한 요소들을 지칭한다. 상기 용어는 그 구현예의 기본 및 신규 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. "포함하는"의 사용은 제한이 아니라 포함을 나타낸다.
"구성되는"이라는 용어는 구현예의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 배제한, 본원에 기재된 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성 요소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "본질적으로 구성되는"은 주어진 구현예에 필요한 요소들을 지칭한다. 상기 용어는 본 발명의 구현예의 기본 및 신규 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 하나 이상의 방법, 및/또는 여기에 설명된 유형의 단계를 포함하고/하거나 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 유사하게, 용어 "또는"은 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 후술된다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어 예컨대(Latin exempli gratia)로부터 유래되며, 비제한적인 예를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어(e.g.)"는 "예를 들어(for example)"라는 용어와 동의어이다.
작동 실시예 이외의, 또는 달리 지시된 경우에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 "약"이라는 용어는 ±1%를 의미할 수 있다. 이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 추가로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이것에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹핑은 제한으로서 해석되지 않아야 한다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 발견된 다른 요소와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹의 하나 이상의 구성원이 그룹에 포함되거나 그룹에서 삭제될 수 있다. 그러한 포함 또는 삭제가 발생할 때, 본 명세서는 본원에서 수정된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠시 그룹의 서면 설명을 충족시킨다.
임의의 측면의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 개시내용은 인간을 클로닝하는 과정, 인간의 생식선 유전자 동일성을 변형시키는 공정, 산업 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용 또는 사람이나 동물에게 어떠한 실질적인 의학적 이익 없이 고통을 유발할 수 있는 동물의 유전적 정체성을 변경시키는 과정, 및 그러한 과정으로 얻어진 동물에 관한 것이 아니다.
다른 용어는 본 발명의 다양한 측면의 설명 내에서 본원에 정의된다.
문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계류중인 특허 출원을 포함하고; 본원 전체에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 기타 출판물은, 예를 들어, 본원에 설명된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 그러한 공보에 기술된 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 명백히 본원에 참고로 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 공개만을 위해 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 발명자가 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시를 앞당길 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 문서의 날짜 또는 내용에 대한 표현에 관한 모든 진술은 출원인이 이용할 수 있는 정보를 기반으로 하며 이 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 어떠한 입장을 의미하지 않는다.
본 개시의 구현예의 설명은 완전하거나 본 개시내용을 개시된 정확한 형태로 제한하려는 것이 아니다. 본 개시의 특정 구현예 및 본 개시에 대한 예가 예시적인 목적으로 본 명세서에 기술되었지만, 관련 기술 분야의 숙련가들이 인식할 수 있는 바와 같이, 본 개시의 범위 내에서 다양한 등가의 변형들이 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되지만, 대안적인 구현예가 다른 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 다른 절차 또는 방법에 적절하게 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 구현예는 추가 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 개시의 측면은, 필요하다면, 본 개시의 추가 구현예를 제공하기 위해 상기 참조 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 사용하도록 변형될 수 있다. 또한, 생물학적 기능적 동등성 고려 사항으로 인해, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에서 약간의 변화가 이루어질 수 있다. 상세한 설명에 비추어 본 개시내용에 대한 이들 및 다른 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
임의의 전술한 구현예의 특정 요소는 조합되거나 다른 구현예의 요소를 대체할 수 있다. 또한, 본 개시내용의 특정 구현예와 관련된 이점이 이들 구현예의 맥락에서 설명되었지만, 다른 구현예도 그러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 구현예가 본 개시내용의 범위 내에 있도록 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요는 없다.
본원에 기재된 기술은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 결코 추가로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니며, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 정의된다.
II. ceDNA 벡터를 포함하는, 원형 DNA 벡터의 상세한 합성적 생산 방법.
본원에 기재된 기술은 일반적으로 세포 또는 세포주의 부재하에 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 생성된 벡터는 통상적인 세포 생산 방법을 사용하여 제조된 유사한 벡터보다 불순물이 더 적다.
A. 일반적인 합성적 생산 방법
일부 구현예에서, 임의의 미생물학적 단계의 사용이 필요하지 않은 ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 합성 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위해 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 효소적 절단 단계 및 결찰 단계를 사용하는 시스템에서 폐쇄 말단 DNA 벡터의 합성을 허용한다. 거의 모든 구현예에서, DNA 벡터 생산을 위한 합성 시스템은 무세포 시스템이다. 일부 구현예에서, 무세포 시스템은 곤충 무세포 시스템이다.
당업자는 합성적 생산 방법을 위한 하나 이상의 효소 또는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 성분이 세포로부터 생성될 수 있고, 정제된 형태로 본 발명의 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 합성적 생산 방법은 무세포 방법이지만, 제한 효소 및/또는 리가아제 효소는 세포로부터 생산될 수 있다.
일 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 결찰-적격 단백질은 세포, 예를 들어, 박테리아 세포에서 발현 벡터로부터 발현 또는 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 또는 리가아제 효소 중 하나 이상을 발현시키는 발현 벡터를 포함하는 박테리아 세포와 같은 세포가 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법이 주로 본원에 개시된 DNA 벡터를 생성하기 위한 무세포 합성 방법에 관한 것이지만, 일 구현예에서는 곤충 세포가 아닌 박테리아 세포와 같은 세포가 존재하며 상기 방법에 필요한 효소 중 하나 이상을 발현시키는데 사용될 수 있는 합성적 생산 방법이 또한 포함된다. 이러한 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 결찰-적격 단백질을 발현시키는 세포는 곤충 세포가 아니다. 세포가 존재하고 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 또는 결찰-적격 단백질을 발현시키는 모든 구현예에서, 세포는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 복제하지 않는다. 다르게 말하면, 세포의 세포내 기구는 복제되지 않거나 DNA 벡터의 복제에 관여하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 폐쇄 말단 DNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터)의 합성은 이중 가닥 DNA 작제물 또는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로부터 출발하는 시험관내 무세포 공정으로 수행된다. 이중 가닥 DNA 작제물 또는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되고 결찰되어 DNA 분자를 형성한다. 일부 구현예에서, 화학적으로 합성되어 전형적으로 박테리아에서 증식될 필요가 있는 원하는 서열 전체를 인코딩하는 거대 출발 주형의 사용을 피할 수 있는 올리고뉴클레오티드. 원하는 DNA 서열이 합성되면, 본원에 기재된 바와 같이 절단되어 다른 올리고뉴클레오티드와 결찰될 수 있다. 본원에 개시된 방법을 사용한 폐쇄 말단 DNA 벡터의 생성에서 다수의 올리고뉴클레오티드의 사용은 DNA 벡터 생성에 대한 모듈식 접근법을 허용하여, 말단 반복부, 예를 들어, ITR, 뿐만 아니라 말단 반복부의 간격의 조정 및/또는 특정 선택, 및 또한 합성적으로 생산된 폐쇄 말단 DNA 벡터에서 이종 핵산 서열의 선택을 가능하게 한다.
B. DNA 벡터의 합성적 생산 방법
세포-기반 방법을 사용하는 다양한 ITR 구성을 포함하는 ceDNA 벡터를 생산하는 특정 방법은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된, 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US18/49996, 및 2018년 12월 6일자로 출원된 PCT/US2018/064242의 실시예 1에 기재되어 있다.
대조적으로, 본원에 제공된 방법은 합성적 생산 방법, 예를 들어, 일부 구현예에서, 무세포 생산 방법에 관한 것이며, 또한 본원에서 "합성적 폐쇄 말단 DNA 벡터 생산"" 또는 "합성적 생산"으로도 지칭된다.
본원에서는, 폐쇄 말단 DNA 벡터의 합성적 생산 방법이 ceDNA 벡터의 합성적 생산을 사용하여 예시되고 설명되어 있다. 일부 구현예에서, 합성적 생산 방법은 무세포 방법, 예를 들어, 곤충 무세포 방법이다. 일부 구현예에서, 합성적 생산 방법은 박미드 또는 바쿨로바이러스, 또는 둘 다의 부재하에 발생한다. 대안적인 구현예에서, 합성적 생산 방법은 세포, 예를 들어, 박테리아 세포, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제, 및/또는 결찰-적격 Rep 단백질 등을 발현시키는 세포의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 세포는 폴리뉴클레오티드 벡터 주형이 안정적으로 통합되고, 제한 엔도뉴클레아제 단백질 및/또는 리가아제 적격 단백질, 예를 들어, 비제한적으로, Rep 단백질을 본원에 기재된 합성적 생산 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물에 도입하는데 사용될 수 있는 세포주일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 합성적 생산 방법을 사용하여 생성된 ceDNA 벡터를 생성하고 단리하는 공정의 예는 도 4a-4e 및 하기 실시예 섹션의 특정 실시예에서 설명된다.
본원에 개시된 바와 같은 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 합성적 생산 방법의 모든 측면에서, 결찰 단계는 화학적 결찰 단계 또는 효소적 결찰 단계일 수 있다. 일부 구현예에서, 결찰은, 예를 들어, 5' 및 3' 점착성 오버행을 결찰하거나 말단을 블런트하기 위해 결찰-적격 효소, 예를 들어, DNA 리가아제를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 결찰 효소는 Rep 단백질 이외의 리가아제 효소이다. 일부 구현예에서, 결찰 효소는 AAV Rep 단백질이다.
본원에 개시된 바와 같은 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 합성 방법의 모든 측면에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 무세포 방법이며, 즉, 세포, 예를 들어, 곤충 세포에서 또는 이의 존재하에 수행되지 않는다. 대안적인 구현예에서, 합성적 생산 방법을 위한 하나 이상의 효소는 세포, 예를 들어, 비-곤충 세포로부터 생산 또는 발현될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제한 엔도뉴클레아제 또는 리가아제 효소 중 하나 이상을 발현시키는 발현 벡터를 포함하는 박테리아 세포와 같은 세포가 존재할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법이 주로 본원에 개시된 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 무세포 합성 방법에 관한 것이지만, 박테리아 세포와 같은 세포가 상기 방법에 필요한 효소 중 하나 이상을 발현시키는데 사용될 수 있는 합성적 생산 방법이 또한 포함된다.
(i) 이중 가닥 DNA 작제물로부터의 합성적 생산 방법
일 측면에서, 폐쇄 말단 DNA 벡터는 이중 가닥 DNA 작제물로부터 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성하는 전체 분자를 절제한 다음 분자를 폐쇄하기 위해 말단을 결찰함으로써 생성된다. 이러한 구현예에서, 이중 가닥 DNA 작제물은 5'에서 3' 순서로 제1 제한 엔도뉴클레아제 부위; 상류 ITR; 발현 카세트; 하류 ITR; 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 부위가 제공된다. 이어서 이중 가닥 DNA 작제물을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시켜 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 양쪽에서 이중 가닥 파괴물을 생성한다. 하나의 엔도뉴클레아제가 양쪽 부위를 표적화할 수 있거나, 또는 제한 부위가 폐쇄 말단 벡터 주형 영역 내에 존재하지 않는 한 각각의 부위는 상이한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있다. 이는 나머지 이중 가닥 DNA 작제물로부터 제한 엔도뉴클레아제 부위들 사이의 서열을 절제한다. 이 절제된 분자는 유리 5' 및 3' 말단을 가질 것이며, 이는 이어서 결찰되어 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성한다. 결찰은 결찰 기능을 갖는 단백질, 예를 들어 Rep 또는 파지 단백질을 사용하여 또는 화학적 결찰에 의해 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 5'에서 3' 방향으로 벡터 길이는 AAV 비리온에서 캡슐화되는 것으로 알려진 최대 길이보다 더 크다. 일부 측면에서, 길이는 4.6 kb보다 크거나 5 kb보다 크거나 6 kb보다 크다. 일부 측면에서, 절제된 분자는 유리 5' 및 3' 말단의 결찰 전에 헤어핀 형성을 용이하게 하기 위해 먼저 어닐링된다. 일부 측면에서, 원치 않는 이중 가닥 DNA 작제물 골격은 골격에 고유한 절단 부위에 특이적인 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되므로 분해되어 정제 중에 보다 쉽게 제거된다. 일부 측면에서, 상기 방법은 결찰 단계 이전에 절제된 dsDNA 분자를 가열하거나 융융시켜 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2개의 제한 엔도뉴클레아제 부위는 서열상 동일하다. 일부 측면에서, 2개의 제한 엔도뉴클레아제 부위는 절단되어 둔단을 제공할 수 있다.
(ii) 단일 가닥 분자로부터의 합성적 생산 방법 (변형 1)
본원에 개시된 바와 같은 합성적 생산 방법을 사용하여 폐쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법은 폐쇄된 말단을 갖는 단일 가닥 선형 DNA를 사용하며, 먼저 센스 방향으로 이어서 안티센스 방향으로 발현 카세트 측면에 있는 2개의 ITR을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 방법은 a) 5'에서 3'로 센스 제1 ITR; 센스 발현 카세트 서열; 센스 제2 ITR; 안티센스 제2 ITR; 안티센스 발현 카세트 서열; 및 안티센스 제1 ITR을 함유하는 단일 가닥 분자를 합성하는 단계; b) 단일 가닥 분자 내에서 적어도 하나의 헤어핀 루프의 형성을 촉진하는 단계 c) 및 5' 및 3' 말단을 결찰하여 ceDNA 벡터를 형성하는 단계를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 합성하는 다양한 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 시험관내 또는 인실리코 합성 및 당 업계에 공지된 임의의 방법을 단계 a)에서 사용할 수 있다. 상기 방법에서 용어 "센스" 및 "안티센스"는 폴리뉴클레오티드 상의 구조 요소의 배향을 지칭한다. 요소의 센스 및 안티센스 버전은 서로 역 보체이다. 헤어핀 루프 서열은 임의의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 전체 길이를 따라 dsDNA를 형성하도록 혼성화되지 않을 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 선형 이중 가닥 구조를 형성하기 위해 DNA를 결찰하는 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 비-제한적인 예로는 바이러스 단백질, 예를 들어 Rep, 또는 파지, 또는 폭스(pox), 단백질, 또는 화학적 결찰이 사용된다.
이 구현예에서, 폐쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터는 센스 및 안티센스 ITR이 측면에 있는 발현 카세트를 인코딩하는 단일 가닥 선형 DNA 서열을 제공하고, 이어서 결찰에 의해 폐쇄 말단을 만듬으로써 생성된다. 생성된 예시적인 폐쇄 말단 DNA 벡터로서 ceDNA 벡터의 제조를 사용하여, ceDNA 벡터의 제조를 위한 단일 가닥 DNA 분자는 5'에서 3'로 다음을 포함한다:
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR;
안티센스 제2 ITR;
안티센스 발현 카세트 서열; 및
안티센스 제1 ITR.
이 예시적인 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 상기 나타낸 순서대로 결찰되고, 센스 제1 ITR에 상보적인 안티센스 제1 ITR, 및 마찬가지로 안티센스 제2 ITR 및 안티센스 발현 카세트 서열은 각각 센스 제2 ITR 및 센스 발현 카세트 서열에 상보적이다. 결찰 단계는 유리 5' 및 3' 말단을 연결하여 폐쇄 말단 DNA 벡터인, ceDNA가 형성된다.
본원에 개시된 바와 같은 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 합성적 생산 방법의 모든 측면에서, 결찰 단계는 화학적 결찰 단계 또는 효소적 결찰 단계일 수 있다. 일부 구현예에서, 결찰은, 예를 들어, 5' 및 3' 점착성 오버행을 결찰하거나 말단을 블런트하기 위해 결찰-적격 효소, 예를 들어, DNA 리가아제를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 결찰 효소는 Rep 단백질 이외의 리가아제 효소이다. 일부 구현예에서, 결찰 효소는 AAV Rep 단백질이다.
(iii) 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 사용한 합성적 생산
또 다른 측면은 a) 제1 ITR을 포함하는 제1 단일 가닥 ITR 분자를 합성 (및/또는 제공)하는 단계; b) 제2 ITR을 포함하는 제2 단일 가닥 ITR 분자를 합성 (및/또는 제공)하는 단계; c) 발현 카세트 서열을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및 d) 제1 ITR 분자의 5' 및 3' 말단을 이중 가닥 분자의 제1 말단에 결찰하고 제2 ITR 분자의 5' 및 3' 말단을 이중 가닥 분자의 제2 말단에 결찰하여 DNA 벡터를 형성하는 단계를 포함한다. 결찰 단계 전에, ITR 분자 및/또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제한 효소와 접촉시켜 적합한 말단, 예를 들어, 원하는 위치에서 적절한 결찰을 보장하기 위한 오버행을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 3개의 요소에는 둔단이 제공된다. 각각의 ITR의 이중 가닥 폴리뉴클레오티드와의 결찰은 순차적이거나 동시에 일어날 수 있다. 일 구현예에서, 결찰 단계는 헤어핀을 형성하는 단일 가닥 5'에서 3'올리고의 결찰을 포함한다.
이러한 구현예에서, 폐쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터는 일부 구현예에서, 헤어핀 또는 다른 3차원 구성 (예를 들어, T- 또는 Y- 홀리데이 접합 구성)에 있는, 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 발현 카세트 또는 이종 핵산 서열을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 접합시킴으로써 생성된다. 선택적으로, 결찰 단계 전에 올리고를 3차원 구성으로 폴딩하는 것을 용이하게 하는 조건에 올리고(들)를 적용하는 단계가 추가된다. 도 11b는 5' ITR 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 발현 카세트를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰하는 것을 포함하는 ceDNA 벡터를 생성하는 예시적인 방법을 보여준다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드는 5' 및 3' 헤어핀 올리고뉴클레오티드이거나 상이한 3차원 구성 (예를 들어, 홀리데이 접합)을 갖고, 시험관내 DNA 합성에 의해 선택적으로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 상응하는 제한 엔도뉴클레아제 점착성 말단을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 상보적인 점착성 말단을 가졌다. 일부 구현예에서, 5' ITR 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 말단은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 5' 센스 가닥 및 3' 안티센스 가닥에 상보적인 점착성 말단을 갖는다. 일부 구현예에서, 3' ITR 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 말단은 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 3' 센스 가닥 및 5' 안티센스 가닥에 상보적인 점착성 말단을 갖는다. 일부 구현예에서, 5' ITR 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드의 헤어핀 말단은 제한 엔도뉴클레아제 점착성 말단이 다르므로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로 유도된 결찰이 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR 올리고뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다의 말단에는 오버행이 없고, 이러한 ITR 올리고(들)는 둔단-연결에 의해 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰된다. 상기 방법에서 ITR 분자는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 합성 및/또는 결찰될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 합성하는 다양한 방법, 예를 들어, 고상 DNA 합성, 포스포르아미다이트 DNA 합성 및 PCR이 당 업계에 공지되어 있다. ITR 분자는 또한 ITR을 포함하는 DNA 작제물로부터 절제될 수 있다. 핵산을 결찰하는 다양한 방법, 예를 들어, 화학적 결찰 또는 결찰-적격 단백질, 예를 들어, 리가아제, AAV Rep 또는 토포이소머라아제에 의한 결찰이 당 업계에 공지되어 있다.
(iv) 결찰이 필요 없는 합성적 생산 방법
일부 구현예에서, 폐쇄 말단 DNA 벡터의 합성적 제조는 발현 카세트 서열의 측면에 있는 적어도 하나의 ITR을 포함하고, 안티센스 발현 카세트 서열을 또한 포함하는 단일 가닥 서열의 합성에 의한 것이다. 하나의 비제한적인 예로, ceDNA 벡터는 아래와 같은 방법에 의해 제조된다.
5'에서 3'의 순서로
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR; 및
안티센스 발현 카세트 서열
을 포함하는 단일 가닥 서열이 제공되다. 일 구현예에서 단일 가닥 서열은 임의의 당 업계에 공지된 방법을 통해 직접적으로 합성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 단일 가닥 서열은 센스 제1 ITR, 센스 발현 카세트 서열, 센스 제2 ITR 및 안티센스 발현 카세트 서열 중 하나 이상을 포함하는 2개 이상의 올리고를 결찰에 의해 연결시킴으로써 구축될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 단일 가닥 서열은 이중 가닥 DNA 작제물로부터 서열을 절제한 다음 절제된 이중 가닥 단편으로부터 가닥을 분리함으로써 수득될 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 제한 부위, 센스 제1 ITR, 센스 발현 카세트 서열, 센스 제2 ITR, 안티센스 발현 카세트 서열, 및 제2 제한 부위를 5'에서 3' 순서로 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물이 제공된다. 2개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 사이의 영역은 그러한 절단 부위(들)를 인식하는 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제로의 절단에 의해 절제된다. 생성된 절제된 이중 가닥 DNA 단편은 센스 및 안티센스 가닥이 원하는 단일 가닥 서열 단편으로 분리되도록 처리된다.
단일 가닥 서열은 센스 제1 ITR 및/또는 센스 제2 ITR에 의한 하나 이상의 헤어핀 루프의 형성, 및 안티센스 발현 카세트 서열에 대한 센스 발현 카세트 서열의 상보적인 결합을 용이하게 하기 위해 어닐링 단계를 거친다. 그 결과는 결찰을 형성할 필요가 없는 폐쇄 말단 구조이다. 어닐링 파라미터 및 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서 변형된 ITR은 서열 번호: 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 야생형 ITR은 서열 번호: 1의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 제공된 방법에 의해 생산된 DNA 벡터는 바람직하게는, 제한 효소 소화 분석에 의해 결정된 바와 같이, 비-연속 구조보다는 선형 및 연속 구조를 갖는다 (도 4c). 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정할뿐만 아니라 재조합되고 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조의 벡터가 일부 구현예에서 바람직하다. 연속적인, 선형의 단일 가닥 분자내 듀플렉스 DNA 벡터는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이 공유 결합된 말단을 가질 수 있다. 이들 DNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 듀플렉스 핵산 분자인 플라스미드와 구조적으로 구별된다. 상보적인 플라스미드 가닥은 변성 후에 분리될 수 있는 반면, 이들 DNA-벡터는 상보적인 가닥을 가지며 단일 DNA 분자이다. 바람직하게는, 벡터는 플라스미드와 달리 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생성될 수 있다.
도 5는 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 ceDNA 플라스미드 작제물로부터 ceDNA의 생성을 확인하는 겔이다. ceDNA는 상기 실시예에서 도 4c와 관련하여 논의된 바와 같이, 겔에서 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
C. ceDNA 벡터의 단리 및 정제 :
예시적인 폐쇄 말단 DNA 벡터인, ceDNA 벡터를 생성 및 분리하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 폐쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어, 본원에 기재된 합성 방법에 의해 생성된 ceDNA 벡터는 최종 결찰 반응 후 적절한 시간에 수거 또는 수집될 수 있고, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하도록 최적화될 수 있다. 폐쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터는 DNA의 정제를 위해 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다. 일 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 일반적으로, 상업적으로 입수 가능한 DNA 추출 키트뿐만 아니라 임의의 당 업계에 공지된 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
대안적으로, 정제는 반응 혼합물을 크로마토그래피 분리하여 구현될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 상기 공정은 핵산을 보유하는 이온 교환 칼럼 (예를 들어, SARTOBIND Q®) 상에 반응 혼합물을 로딩한 후 (예를 들어 1.2 M NaCl 용액으로) 용리하고 겔 여과 칼럼 (예를 들어, 6 빠른 흐름 GE) 상에서 추가 크로마토그래피 정제를 수행함으로써 수행될 수 있다. 이어서, DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터는, 예를 들어, 침전에 의해 회수된다.
ceDNA 벡터의 존재는 DNA 벡터 상의 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 세포로부터 단리된 벡터 DNA를 소화시키고 겔 전기영동을 사용하여 소화된 및 소화되지 않은 DNA 물질 둘 모두를 분석하여 선형 및 비-연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인함으로써 확인될 수 있다. 도 4b 및 도 4c는 본원의 방법에 의해 생성된 폐쇄된 말단 ceDNA 벡터의 존재를 식별하기 위한 일 구현예를 예시한다.
국제 출원 PCT/US18/49996의 도 5는 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 ceDNA-플라스미드 작제물로부터 ceDNA의 생성을 확인하는 겔을 보여준다. ceDNA는 실시예에서 도 4c와 관련하여 논의된 바와 같이, 겔에서 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 합성적 생산 방법에 의해 생성된 폐쇄 말단 DNA 벡터는 본원에 논의된 다양한 적합한 방법에 의해 시험관내 또는 생체내에서 표적 세포로 전달될 수 있다. 벡터만 적용되거나 주입될 수 있다. 형질감염 시약 또는 다른 물리적 수단의 도움 없이 벡터를 세포로 전달할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 세포로의 DNA의 진입을 용이하게 하는 형질감염 시약 또는 다른 물리적 수단, 예를 들어, 리포좀, 알코올, 폴리리신-풍부 화합물, 아르기닌-풍부 화합물, 인산칼슘, 미세소포, 미세주사 등을 사용하여 전달될 수 있다.
D. 합성적 생산 방법을 사용하여 생성된 원형 DNA 벡터
DNA 분자 및 폐쇄 말단 DNA 벡터의 다양한 시험관내 제조 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 폐쇄 말단 DNA 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 ceDNA 벡터이다. 대안적인 구현예에서, 폐쇄 말단 DNA 벡터는, 예를 들어, 덤벨(dumbbell) DNA 벡터 또는 도그-본(dog-bone) DNA 벡터이다 (예를 들어, WO2010/0086626 참조, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).
(2017): 65.
III. 일반적인 ceDNA 벡터
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생성된 폐쇄 말단 DNA 벡터는 이식유전자를 발현시킬 수 있는 ceDNA 벡터를 포함하는 ceDNA 벡터이다. 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 크기에 의해 제한되지 않으므로, 예를 들어, 단일 벡터로부터 이식유전자의 발현에 필요한 모든 성분의 발현을 허용한다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 듀플렉스, 예를 들어, 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 대한 자가-상보적이다 (예를 들어 ceDNA는 이중 가닥 원형 분자가 아니다). ceDNA 벡터는 공유 폐쇄된 말단을 가지므로, 예를 들어 37℃에서 1시간 이상 동안 엑소뉴클레아제 소화 (예를 들어 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 내성이 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생성된 ceDNA 벡터는 5'에서 3'의 방향으로 제1 아데노-관련 바이러스 (AAV) 역 말단 반복부 (ITR), 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 본원에 기재된 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함한다. (i) 적어도 하나의 WT ITR 및 적어도 하나의 변형된 AAV 역 말단 반복부 (모드-ITR) (예를 들어, 비대칭 변형된 ITR); (ii) 모드-ITR 쌍이 서로 상이한 3차원 공간 구성을 갖는 2개의 변형된 ITR (예를 들어, 비대칭 변형된 ITR), 또는 (iii) 대칭인 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍 (여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐), 또는 (iv) 대칭인 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍 (여기서 각각의 모드-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 어느 것으로부터 선택된 ITR 서열.
비제한적으로, 리포좀 나노입자 전달 시스템과 같은 전달 시스템을 추가로 포함할 수 있는, 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생성된 ceDNA 벡터를 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 포함된다. 사용을 위해 포함되는 비제한적인 예시적인 리포좀 나노입자 시스템이 본원에 개시되어 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 ceDNA 및 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 상기 공정에 의해 수득된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩된 지질 나노입자 제형은 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042에 개시되어 있으며, 이는 본원에 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생성된 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내의 제한된 공간에 의해 야기되는 패키징 제약이 없다. 이는 제어 요소, 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 이식유전자, 다수의 이식유전자 등의 삽입을 허용한다.
도 1a-1e는 비제한적인 예시적인 ceDNA 벡터 또는 상응하는 ceDNA 플라스미드 서열의 개략도를 도시한다. ceDNA 벡터는 캡시드가 없으며 다음 순서로 인코딩된 플라스미드로부터 수득될 수 있다: 제1 ITR, 이식유전자를 포함하는 발현 카세트 및 제2 ITR. 발현 카세트는 이식유전자의 발현을 허용 및/또는 제어하는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 발현 카세트는 다음 순서로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 인핸서/프로모터, ORF 리포터 (이식유전자), 전사 후 조절 요소 (예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 (예를 들어, BGH 폴리A).
발현 카세트는 또한 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 요소는 프로모터, 리보스위치(riboswitch), 절연체, mir-조절 가능 요소, 전사 후 조절 요소, 조직- 및 세포 유형-특이적 프로모터 및 인핸서를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서 ITR은 이식유전자의 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가 성분, 예를 들어, 이식유전자의 발현을 제어 및 조절하기 위한 "조절 스위치"라는 제목의 섹션으로 본원에 기재되어 있는 조절 스위치를 포함하며, 원하는 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.
발현 카세트는 4000개 초과의 뉴클레오티드, 5000개의 뉴클레오티드, 10,000개의 뉴클레오티드 또는 20,000개의 뉴클레오티드, 또는 30,000개의 뉴클레오티드, 또는 40,000개의 뉴클레오티드 또는 50,000개의 뉴클레오티드, 또는 약 4000-10,000개의 뉴클레오티드 또는 10,000-50,000개의 뉴클레오티드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 50,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 75,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 1000 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 500 내지 5,000개 뉴클레오티드 길이 범위의 이식유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡슐화된 AAV 벡터의 크기 제한을 갖지 않으므로, 효율적인 이식유전자를 제공하기 위해 대형 발현 카세트의 전달을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 원핵생물-특이적 메틸화가 없다.
ceDNA 발현 카세트는, 예를 들어, 수용 대상체에서 부재하거나, 비활성이거나 또는 활성이 불충분한 단백질을 인코딩하는 발현 가능한 외인성 서열 (예를 들어, 오픈 리딩 프레임) 또는 이식유전자, 또는 원하는 생물학적 또는 치료 효과를 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 이식유전자는 결함 유전자 또는 전사체의 발현을 교정하는 기능을 할 수 있는 유전자 산물을 인코딩할 수 있다. 원칙적으로, 발현 카세트는 돌연변이로 인해 감소되거나 부재하거나 과발현될 때 치료적 이점을 전달하는 단백질, 폴리펩티드 또는 RNA를 인코딩하는 임의의 유전자를 포함할 수 있으며, 이는 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
발현 카세트는 대상체에서 질환 또는 장애의 치료에 유용한 임의의 이식유전자를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생성된 ceDNA 벡터는 대상체에서 임의의 관심 유전자를 전달 및 발현시키는데 사용될 수 있으며, 이는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 비-코딩 핵산 (예를 들어, RNAi, miR 등), 뿐만 아니라 대상체의 게놈에 바이러스 서열, 예를 들어, HIV 바이러스 서열 등을 포함하는 외인성 유전자 및 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 치료 목적 (예를 들어, 의학적, 진단 또는 수의학적 용도) 또는 면역원성 폴리펩티드에 사용된다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상체에서 임의의 관심 유전자를 발현시키는데 유용하며, 이는 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 또는 RNA (코딩 또는 비-코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 이들의 안티센스 대응물 (예를 들어, antagoMiR)), 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
발현 카세트는 또한 폴리펩티드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 RNA (코딩 또는 비-코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 이들의 안티센스 대응물 (예를 들어, antagoMiR))를 인코딩할 수 있다. 발현 카세트는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제, 및 당 업계에 잘 알려진 다른 것들과 같은 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터의 발현 작제물인, 발현 카세트에 제공된 서열은 표적 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 천연 서열 (예를 들어, 원핵생물 서열)의 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당한 수의 코돈을 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 척추동물 세포, 예를 들어 마우스 또는 인간의 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 최초 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어, Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼 (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자는 치료 유전자이다. 일부 구현예에서, 치료 유전자는 항체, 항체 단편, 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어, 중화 항체 또는 항체 단편 등이다.
특히, 치료 유전자는, 예를 들어, 질환, 기능 장애, 손상 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한, 단백질(들), 폴리펩티드(들), 펩티드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편, 및 이의 변이체 및/또는 이의 활성 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 치료제(들)이다. 예시적인 치료 유전자는 "치료 방법"이라는 제목의 섹션으로 본원에 기재되어 있다.
플라스미드-기반 발현 벡터와 다른 ceDNA 벡터의 많은 구조적 특징이 존재한다. 본원에서 합성적 방법에 의해 생성된 ceDNA 벡터는 다음의 특징들 중 하나 이상을 가질 수 있다: 최초 (즉, 삽입되지 않은) 박테리아 DNA의 결핍, 원핵생물 복제 기원의 결핍, 자가-포함(being self-containing), 즉, 이들은 Rep 결합 및 말단 분해 부위 (RBS 및 TRS)를 포함하는 2개의 ITR, 및 ITR들 사이의 외인성 서열 이외의 임의의 서열을 요구하지 않음, 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재, 및 박테리아-유형 DNA 메틸화 또는 실제로 주어진 세포 유형에서의 생산과 관련되고 포유동물 숙주에 의해 비정상적인 것으로 간주되는 임의의 다른 메틸화의 부재. 일반적으로, 본 벡터는 임의의 원핵생물 DNA를 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 일부 원핵생물 DNA는 프로모터 또는 인핸서 영역에서 비제한적인 예로서 외인성 서열로 삽입될 수 있는 것으로 고려된다. 플라스미드 발현 벡터로부터 ceDNA 벡터를 구별하는 또 다른 중요한 특징은 ceDNA 벡터가 폐쇄된 말단을 갖는 단일 가닥 선형 DNA인 반면, 플라스미드는 항상 이중 가닥 DNA라는 점이다.
본원에 제공된 합성 방법에 의해 생성된 ceDNA 벡터는 바람직하게는 제한 효소 소화 분석에 의해 결정된 바와 같이, 비-연속 구조보다는 선형 및 연속 구조를 갖는다 (도 4c). 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정할뿐만 아니라 재조합되고 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조의 ceDNA 벡터가 바람직한 구현예이다. 연속적인, 선형의 단일 가닥 분자내 듀플렉스 ceDNA 벡터는 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이 공유 결합된 말단을 가질 수 있다. 이들 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 듀플렉스 핵산 분자인 플라스미드 (본원에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 상보적인 플라스미드 가닥은 변성 후에 분리되어 2개의 핵산 분자를 생성할 수 있는 반면, 대조적으로, 상보적인 가닥을 가지면서 ceDNA 벡터는 단일 DNA 분자이고, 따라서 변성되더라도 단일 분자로 남아있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 플라스미드와 달리, 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생성될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터 및 ceDNA-플라스미드는 둘 모두 구조 측면에서 (특히 선형 대 원형) 및 또한 이들 상이한 대상을 생성 및 정제하는데 사용된 방법의 관점에서 (아래 참조), 및 ceDNA-플라스미드에 대해 원핵생물 유형이고 ceDNA 벡터에 대해 진핵생물 유형인 DNA 메틸화의 관점에서 상이하다.
플라스미드-기반 발현 벡터에 비해 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 사용하는 것의 몇 가지 이점이 있으며, 이러한 이점은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다: 1) 플라스미드는 박테리아 DNA 서열을 함유하고 원핵생물-특이적 메틸화, 예를 들어, 6-메틸 아데노신 및 5-메틸 시토신 메틸화를 거친 박테리아 DNA 서열을 함유하고, 반면 캡시드-비함유 AAV 벡터 서열은 진핵생물 기원이고 원핵생물-특이적 메틸화를 겪지 않으며; 결과적으로, 캡시드-비함유 AAV 벡터는 플라스미드와 비교하여 염증 및 면역 반응을 유발할 가능성이 적고; 2) 플라스미드는 생산 공정 동안 저항성 유전자의 존재를 요구하지만, ceDNA 벡터는 그렇지 않고; 3) 원형 플라스미드가 세포 내로 도입될 때 핵으로 전달되지 않고, 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 우회하기 위해 과부하가 필요한 반면, ceDNA 벡터는 바이러스성 시스-요소, 즉, 클레아제에 대한 저항성을 부여하고 핵으로 표적화되고 전달되도록 설계될 수 있는 ITR을 함유한다. ITR 기능에 없어서는 안 될 최소 정의 요소는 Rep-결합 부위 (RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)) 및 말단 분해 부위 (TRS; AAV2의 경우 5'-AGTTGG-3' (서열 번호: 64)) 및 헤어핀 형성을 허용하는 가변 팔린드롬 서열인 것으로 가정되고; 4) ceDNA 벡터는 T 세포-매개 면역 반응을 유발하는, 톨-유사 수용체 패밀리의 일원에 결합하는 것으로 보고된 원핵생물-유래 플라스미드에서 종종 발견되는 CpG 디뉴클레오티드의 과다-표현(over-representation)을 갖지 않는다. 대조적으로, 본원에 개시된 캡시드-비함유 AAV 벡터를 이용한 형질도입은 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온으로 형질도입하기 어려운 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.
IV. ITR
본원에 개시된 바와 같이, ceDNA 벡터는 2개의 역 말단 반복 (ITR) 서열 사이에 위치된 이식유전자 또는 이종 핵산 서열을 함유하며, 여기서 ITR 서열은 이 용어가 본원에 정의된 바와 같이, 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 또는 실질적으로 대칭 ITR 쌍일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이 ceDNA 벡터는 (i) 적어도 하나의 WT ITR 및 적어도 하나의 변형된 AAV 역 말단 반복부 (모드-ITR) (예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 모드-ITR 쌍이 서로 상이한 3차원 공간 구성을 갖는 2개의 변형된 ITR (예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR), 또는 (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍 (여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐), 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍 (여기서 각각의 모드-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 어느 것으로부터 선택된 ITR 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 본 개시의 방법은 비제한적으로 리포좀 나노입자 전달 시스템과 같은 전달 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, ITR 서열은 2개의 서브패밀리: 척추동물을 감염시키는 파보비리나에, 및 곤충을 감염시키는 덴소비리나에를 포함하는 파보비리다에 패밀리의 바이러스로부터 유래될 수 있다. 파보비리나에 서브패밀리 (파보바이러스라고 함)에는 데펜도바이러스 속이 포함되는데, 대부분의 조건에서, 이의 구성원은 생산적인 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로 동시 감염이 필요하다. 데펜도바이러스 속에는 일반적으로 사람 (예를 들어, 혈청형 2, 3A, 3B, 5 및 6) 또는 영장류 (예를 들어, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 및 다른 온혈 동물 (예를 들어, 소, 개, 말 및 양 아데노-관련 바이러스)을 감염시키는 관련 바이러스가 포함한다. 파보바이러스 및 파보비리다에 패밀리의 다른 구성원은 일반적으로 하기에 기재되어 있다: Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996).
본원의 명세서 및 실시예에서 예시된 ITR은 AAV2 WT-ITR이지만, 당업자는, 상기 언급된 바와 같이, 임의의 공지된 파보바이러스, 예를 들어 데펜도바이러스 예컨대 AAV (예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈. 예를 들어, NCBI:NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261)로부터의 ITR, 키메라 ITR 또는 임의의 합성 AAV로부터의 ITR을 사용할 수 있다는 것을 알고 있다. 일부 구현예에서, AAV는 온혈 동물, 예를 들어, 조류 (AAAV), 소 (BAAV), 개, 말 및 양 아데노-관련 바이러스를 감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 B19 파보바이러스 (GenBank 수탁 번호: NC 000883), 마우스로부터의 미세 바이러스 (Minute Virus from Mouse; MVM) (GenBank 수탁 번호 NC 001510); 거위 파보바이러스 (GenBank 수탁 번호 NC 001701); 뱀 파보바이러스 1 (GenBank 수탁 번호 NC 006148)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR은 본원에 논의된 바와 같이, 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다.
통상의 숙련가는 ITR 서열이 이중 가닥 홀리데이 접합의 공통 구조를 가지며, 이는 전형적으로 T형 또는 Y형 헤어핀 구조 (예를 들어, 도 2a 및 도 3a 참조)임을 알고 있으며, 여기서 각각의 WT-ITR은 더 큰 팔린드롬 아암 (A-A')에 포매된 2개의 팔린드롬 아암 또는 루프 (B-B' 및 C-C')와 단일 가닥 D 서열 (여기서 이러한 팔린드롬 서열의 순서는 ITR의 플립 또는 플롭 배향을 한정함)에 의해 형성된다. 예를 들어, 하기에 기재된, 상이한 AAV 혈청형 (AAV1-AAV6)으로부터의 ITR의 구조 분석 및 서열 비교를 참조한다: Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14. 당업자는 본원에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열에 기초하여 ceDNA 벡터 또는 ceDNA-플라스미드에 사용하기 위한 임의의 AAV 혈청형으로부터 WT-ITR 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, AAV2의 좌측 ITR과 다른 혈청형으로부터의 좌측 ITR의% 동일성: AAV-1 (84%), AAV-3 (86%), AAV-4 (79%), AAV-5 (58%), AAV-6 (좌측 ITR) (100%) 및 AAV-6 (우측 ITR) (82%)을 보여주는, 문헌(Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439)에 기재된 상이한 AAV 혈청형 (AAV1-AAV6, 및 조류 AAV (AAAV) 및 소 AAV (BAAV))으로부터의 ITR의 서열 비교를 참조한다.
A. 대칭 ITR 쌍
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 5 '내지 3' 방향으로, 제1 아데노 관련 바이러스 (AAV) 역 말단 반복 (ITR), 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하며, 제1 ITR (5' ITR) 및 제2 ITR (3' ITR)이 서로 대칭이거나 실질적으로 대칭이며, 즉 ceDNA 벡터는, 이들의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 모양이거나 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록 대칭인 3 차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 대칭 ITR 쌍, 또는 실질적으로 대칭 ITR 쌍은 야생형 ITR이 아닌 변형된 ITR (예를 들어, 모드-ITR)일 수 있다. 모드-ITR 쌍은 야생형 ITR로부터 하나 이상의 변형을 갖고 서로의 역 보체 (역상)인 동일한 서열을 가질 수 있다. 대안적인 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본 명세서에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이고, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 가질 수 있지만 상응하는 또는 동일한 대칭 3차원 형상을 가질 수 있다.
(i) 야생형 ITR
일부 구현예에서, 대칭 ITR 또는 실질적으로 대칭 ITR은 본원에 기재된 야생형 (WT-ITR)이다. 즉, 두 ITR 모두 야생형 서열을 갖지만 반드시 동일한 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR일 필요는 없다. 즉, 일부 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 이러일 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서 하나 이상의 보존적 뉴클레오티드 변형을 가질 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 바와 같이, ceDNA 벡터는 2개의 플랭킹 야생형 역 말단 반복 (WT-ITR) 서열 사이에 위치된 이식유전자 또는 이종 핵산 서열을 함유하며, 이는 서로의 역 보체 (역상)이거나 또는 대안적으로는 서로 실질적으로 대칭이고, 즉, WT-ITR 쌍이 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 일부 구현예에서, 야생형 ITR 서열 (예를 들어, AAV WT-ITR)은 기능적 Rep 결합 부위 (RBS; 예를 들어, AAV2에 대한 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열 번호: 60) 및 기능성 말단 분해 부위 (TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3', 서열 번호: 62)를 포함한다.
일 측면에서, ceDNA 벡터는 2개의 WT 역 말단 반복 서열 (WT-ITR) (예를 들어 AAV WT-ITR) 사이에 작동적으로 위치된 이종 핵산을 인코딩하는 벡터 폴리뉴클레오티드로부터 얻을 수 있다. 즉, 두 ITR 모두 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형으로부터의 WT-ITR일 필요는 없다. 즉, 일부 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 이러일 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서 하나 이상의 보존적 뉴클레오티드 변형을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래되고, 3' WT-ITR은 동일하거나 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR 및 3'WT-ITR은 서로의 거울상이고, 즉 대칭이다. 일부 구현예에서, 5' WT-ITR 및 3' WT-ITR은 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다.
WT ITR은 잘 알려져 있다. 일 구현예에서, 2개의 ITR은 동일한 AAV2 혈청형으로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 다른 혈청형으로부터의 WT를 사용할 수 있다. 상동성인 다수의 혈청형, 예를 들어 AAV2, AAV4, AAV6, AAV8이 있다. 일 구현예에서, 밀접한 상동성 ITR (예를 들어, 유사한 루프 구조를 갖는 ITR)이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 보다 다양한 AAV WT ITR, 예를 들어, AAV2 및 AAV5를 사용할 수 있고, 또 다른 구현예에서, 실질적으로 WT인 ITR을 사용할 수 있으며, 즉, 그것은 WT의 기본 루프 구조를 갖지만 특성을 변경하거나 특성에 영향을 미치지 않는 일부 보존적 뉴클레오티드 변화를 갖는다. 동일한 바이러스 혈청형으로부터 WT-ITR을 사용할 때, 하나 이상의 조절 서열이 추가로 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 ceDNA의 활성의 조절을 허용하는 조절 스위치이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 기술의 한 측면은 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 관한 것이며, 여기서 ceDNA 벡터는 2개의 야생형 역 말단 반복 서열 (WT-ITR) 사이에 작동 가능하게 위치된 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하며, WT-ITR은 동일한 혈청형, 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있거나 서로 실질적으로 대칭일 수 있다 (즉, 이들의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가짐). 일부 구현예에서, 대칭 WT-ITR은 기능성 말단 분해 부위 및 Rep 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 핵산 서열은 이식유전자를 인코딩하고, 벡터는 바이러스 캡시드에 있지 않다.
일부 구현예에서, WT-ITR은 동일하지만 서로의 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR에서 서열 AACG는 상응하는 부위에서 3' ITR에서 CGTT (즉, 역 보체)일 수 있다. 일례에서, 5' WT-ITR 센스 가닥은 ATCGATCG의 서열을 포함하고 상응하는 3' WT-ITR 센스 가닥은 CGATCGAT (즉, ATCGATCG의 역 보체)를 포함한다. 일부 구현예에서, WT-ITR ceDNA는 말단 분해 부위 및 복제 단백질 결합 부위 (RPS) (때로는 복제 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 추가로 포함한다.
WT-ITR을 포함하는 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 예시적인 WT-ITR 서열은 본원의 표 2에 도시되어 있으며, 이는 WT-ITR의 쌍 (5' WT-ITR 및 3' WT-ITR)을 나타낸다.
예시적인 예로서, 본 개시내용은 조절 스위치의 존재 또는 부재 하에 이식유전자 (예를 들어, 이종 핵산 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 제공하며, 여기서 ceDNA는 캡시드 단백질이 없고, (a) ceDNA는 WT-ITR을 인코딩하는 ceDNA-플라스미드 (예를 들어, 도 1f-1g 참조)로부터 생성되며, 여기서 각각의 WT-ITR은 이의 헤어핀 이차 구성에서 동일한 수의 분자내 이중화 염기쌍을 갖고 (바람직하게는 이러한 참조 서열과 비교하여 이 구성에서 임의의 AAA 또는 TTT 말단 루프의 결실을 배제함), (b) ceDNA는 미변성 겔 및 실시예 1의 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의해 ceDNA 식별을 위한 분석을 사용하여 ceDNA로서 식별된다.
일부 구현예에서, 플랭킹 WT-ITR은 서로 실질적으로 대칭이다. 이 구현예에서, 5' WT-ITR은 AAV의 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 3' WT-ITR은 AAV의 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있으므로 WT-ITR은 동일한 역 보체가 아니다. 예를 들어, 5' WT-ITR은 AAV2로부터 유래될 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형 (예를 들어, AAV1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12)으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, WT-ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파보바이러스 (예를 들어, 로얄 피톤(royal python) 파보바이러스), 소 파보바이러스, 염소 파보바이러스, 조류 파보바이러스, 개 파보바이러스, 말 파보바이러스, 새우 파보바이러스, 돼지 파보바이러스 또는 곤충 AAV 중 어느 것으로부터 선택된 2개의 상이한 파보바이러스로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 WT ITR의 조합은 AAV2 및 AAV6으로부터의 WT-ITR의 조합이다. 일 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 하나가 다른 ITR에 대해 반전될 때, 적어도 90% 동일하고, 적어도 95% 동일하고, 적어도 96% ... 97% ... 98% ... 99% .... 99.5% 및 그 사이의 모든 포인트 동일하고, 동일한 대칭 3차원 공간 구성을 갖는다. 일부 구현예에서, WT-ITR 쌍은 대칭인 3차원 공간 구성, 예를 들어, A, C-C'. B-B' 및 D 아암의 동일한 3D 구성을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다. 일 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 다른 것에 대해 반전되고, 서로 적어도 95% 동일하고, 적어도 96% ... 97% ... 98% ... 99% .... 99.5% 및 그 사이의 모든 포인트 동일하고, 하나의 WT-ITR은 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열 번호: 60)의 Rep-결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs)를 보유한다. 일부 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 서로 반전되고, 서로 적어도 95% 동일하고, 적어도 96% ... 97% ... 98% ... 99% .... 99.5% 및 그 사이의 모든 포인트 동일하고, 하나의 WT-ITR은 헤어핀 이차 구조 형성을 허용하는 가변 팔린드롬 서열에 추가하여 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)의 Rep-결합 부위 (RBS) 및 말단 분해 부위 (trs)를 보유한다. 상동성은 디폴트 설정에서 BLAST (기본 지역 정렬 검색 도구), BLASTN과 같은 당 업계에 잘 알려진 표준 수단에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, ITR의 구조적 요소는 큰 Rep 단백질 (예를 들어, Rep 78 또는 Rep 68)과 ITR의 기능적 상호 작용에 관여하는 임의의 구조적 요소일 수 있다. 특정 구현예에서, 구조적 요소는 큰 Rep 단백질과 ITR의 상호 작용에 대한 선택성을 제공하고, 즉, Rep 단백질이 ITR과 기능적으로 상호 작용하는 것을 적어도 부분적으로 결정한다. 다른 구현예에서, Rep 단백질이 ITR에 결합될 때 구조적 요소는 큰 Rep 단백질과 물리적으로 상호 작용한다. 각각의 구조적 요소는, 예를 들어, ITR의 2차 구조, ITR의 뉴클레오티드 서열, 2개 이상의 요소 사이의 간격, 또는 임의의 상기의 조합일 수 있다. 일 구현예에서, 구조적 요소는 A 및 A' 아암, B 및 B' 아암, C 및 C' 아암, D 아암, Rep 결합 부위 (RBE) 및 RBE' (즉, 상보적인 RBE 서열) 및 말단 분해 부위 (trs)로 구성된 군으로부터 선택된다.
단지 예로서, 표 1은 WT-ITR의 예시적인 조합을 나타낸다.
표 1: 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형 또는 상이한 파로바이러스로부터의 WT-ITR의 예시적인 조합. 표시된 순서는 ITR 위치를 나타내지 않으며, 예를 들어, "AAV1, AAV2"는 ceDNA가 5' 위치에 WT-AAV1 ITR을, 3' 위치에 WT-AAV2 ITR을 포함할 수 있고, 반대로, 5' 위치에 WT-AAV2 ITR 및 3' 위치에 WT-AAV1 ITR을 포함할 수 있음을 나타낸다. 약어: AAV 혈청형 1 (AAV1), AAV 혈청형 2 (AAV2), AAV 혈청형 3 (AAV3), AAV 혈청형 4 (AAV4), AAV 혈청형 5 (AAV5), AAV 혈청형 6 (AAV6), AAV 혈청형 7 (AAV7) AAV 혈청형 8 (AAV8), AAV 혈청형 9 (AAV9), AAV 혈청형 10 (AAV10), AAV 혈청형 11 (AAV11) 또는 AAV 혈청형 12 (AAV12); AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈 (예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), 온혈 동물로부터의 ITR (조류 AAV (AAAV), 소 AAV (BAAV), 개, 말 및 양 AAV), B19 파보비리스로부터의 ITR (GenBank 수탁 번호: NC 000883), 마우스로부터의 미세 바이러스 (MVM) (GenBank 수탁 번호 NC 001510); 거위: 거위 파보바이러스 (GenBank 수탁 번호 NC 001701); 뱀: 뱀 파보바이러스 1 (GenBank 수탁 번호 NC 006148).
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
단지 예로서, 표 2는 일부 상이한 AAV 혈청형으로부터의 예시적인 WT-ITR의 서열을 보여준다.
[표 2]
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 구현예에서, WT-ITR 서열의 뉴클레오티드 서열은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위의 뉴클레오티드를 변형시킴으로써) 변형될 수 있는데, 변형은 상보적 뉴클레오티드에 대한 치환이고, 예를 들어, C 대신 G, 및 그 반대, 및 A 대신 T, 및 그 반대이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 서열 번호: 1, 2, 5-14 중 임의의 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열로 구성된 WT-ITR을 갖지 않는다. 본 발명의 대안의 구현예에서, ceDNA 벡터가 서열 번호: 1, 2, 5-14 중 임의의 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 WT-ITR을 갖는 경우, 플랭킹 ITR은 또한 WT이고, ceDNA 벡터는, 예를 들어, 본원 및 국제 출원 PCT/US18/49996 (예를 들어, PCT/US18/49996의 표 11 참조)에 개시된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치 및 서열 번호: 1, 2, 5-14로 구성된 군 중 어느 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 선택된 WT-ITR을 포함한다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터는 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분을 보유하는 WT-ITR 구조를 포함할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는 예시적인 목적으로 야생형 ITR을 사용하여 ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 보여준다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위 (RBS; AAV2에 대해 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열 번호: 60)) 및 말단 분해 부위 (TRS; 5'-AGTT (서열 번호: 62))를 포함하는 하나 이상의 기능성 WT-ITR 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능적이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서로 실질적으로 대칭인 2개의 WT-ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능적이고 적어도 하나의 WT-ITR은 비-기능적이다.
B. 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 ITR 쌍을 포함하는 ceDNA 벡터에 대한 일반적으로 변형된 ITR (모드-ITR)
본원에서 논의된 바와 같이, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 대칭 ITR 쌍 또는 비대칭 ITR 쌍을 포함할 수 있다. 두 경우 모두에서, ITR 중 하나 또는 둘다는 변형된 ITR일 수 있으며, 차이점은 첫 번째 경우 (즉, 대칭 모드-ITR), 모드-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가지며 (즉, 동일한 A-A', C-C' 및 B-B' 아암 구성를 가짐), 반면 두 번째 경우 (즉, 비대칭 모드-ITR), 모드-ITR은 다른 3차원 공간 구성을 갖는다 (즉, A-A', C-C' 및 B-B' 아암의 다른 구성을 가짐).
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 야생형 ITR 서열 (예를 들어 AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 ITR 중 적어도 하나는 기능적 Rep 결합 부위 (RBS; 예를 들어, AAV2에 대해 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열 번호: 60) 및 기능성 말단 분해 부위 (TRS; 5'-AGTT-3', 서열 번호: 62)를 포함한다. 일 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 비-기능적 ITR이다. 일 구현예에서, 상이한 또는 변형된 ITR은 각각 상이한 혈청형으로부터의 야생형 ITR이 아니다.
ITR에서의 특정 변경 및 돌연변이는 본원에 상세하게 기술되어 있지만, ITR의 맥락에서, "변경된" 또는 "돌연변이된" 또는 "변형된"은, 뉴클레오티드가 야생형, 참조 또는 원래 ITR 서열에 대해 삽입, 결실 및/또는 치환된 것을 나타낸다. 변경된 또는 돌연변이된 ITR은 조작된 ITR일 수 있다. 본원에 사용된 "조작된"은 인간의 손에 의해 조작된 측면을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 적어도 하나의 측면, 예를 들어, 이의 서열이 사람의 손에 의해 조작되어 자연에 존재하는 측면과 상이할 때 폴리펩티드가 "조작된" 것으로 간주된다.
일부 구현예에서, 모드-ITR은 합성일 수 있다. 일 구현예에서, 합성 ITR은 하나 초과의 AAV 혈청형으로부터의 ITR 서열에 기초한다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV 기반 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV에서 얻어진 서열의 일부만을 갖거나 갖지 않더라도 상기 기술된 ITR 구조를 보존한다. 일부 측면에서, 합성 ITR은 야생형 Rep 또는 특정 혈청형의 Rep와 우선적으로 상호 작용할 수 있거나, 일부 경우 야생형 Rep에 의해 인식되지 않고 돌연변이된 Rep에 의해서만 인식될 것이다.
당업자는 공지된 수단에 의해 다른 혈청형에서 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, 변화가 A, A', B, B', C, C' 또는 D 영역에 있는지 확인하고 또 다른 혈청형에서 해당 영역을 결정한다. BLAST® (기본 지역 정렬 검색 도구) 또는 다른 상동성 정렬 프로그램을 디폴트 상태로 사용하여 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 본 발명은 또한 상이한 AAV 혈청형의 조합으로부터의 모드-ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 집단 및 복수의 ceDNA 벡터를 제공하고, 즉, 하나의 모드-ITR은 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 모드-ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 일 구현예에서 하나의 ITR은 AAV2 ITR 서열로부터 유래하거나 이를 기초로 할 수 있고, ceDNA 벡터의 다른 ITR은 AAV 혈청형 1 (AAV1), AAV 혈청형 4 (AAV4), AAV 혈청형 5 (AAV5), AAV 혈청형 6 (AAV6), AAV 혈청형 7 (AAV7), AAV 혈청형 8 (AAV8), AAV 혈청형 9 (AAV9), AAV 혈청형 10 (AAV10) , AAV 혈청형 11 (AAV11), 또는 AAV 혈청형 12 (AAV12)의 임의의 하나 이상의 ITR 서열로부터 유래하거나 이를 기초로 할 수 있다.
임의의 파보바이러스 ITR은 변형을 위해 ITR 또는 기본 ITR로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파보바이러스는 데펜도바이러스이다. 보다 바람직하게는 AAV. 선택된 혈청형은 혈청형의 조직 향성(tropism)에 기초할 수 있다. AAV2는 광범위한 조직 향성을 가지며, AAV1은 뉴런 및 골격근을 우선적으로 표적화하고, AAV5는 뉴런, 망막 색소 상피 및 광수용체를 우선적으로 표적화한다. AAV6은 골격근 및 폐를 우선적으로 표적화한다. AAV8은 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 우선적으로 표적화한다. AAV9는 간, 골격 및 폐 조직을 우선적으로 표적화한다. 일 구현예에서, 변형된 ITR은 AAV2 ITR에 기초한다.
보다 구체적으로, 구조적 요소가 특정한 큰 Rep 단백질과 기능적으로 상호 작용하는 능력은 구조적 요소를 변형시킴으로써 변경될 수 있다. 예를 들어, 구조적 요소의 뉴클레오티드 서열은 ITR의 야생형 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 일 구현예에서, ITR의 구조적 요소 (예를 들어, A 아암, A' 아암, B 아암, B' 아암, C 아암, C' 아암, D 아암, RBE, RBE' 및 trs)는 제거되고 다른 파보바이러스로부터의 야생형 구조적 요소로 대체될 수 있다. 예를 들어, 대체 구조는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파보바이러스 (예를 들어, 로얄 피톤 파보바이러스), 소 파보바이러스, 염소 파보바이러스, 조류 파보바이러스, 개 파보바이러스, 말 파보바이러스, 새우 파보바이러스, 돼지 파보바이러스 또는 곤충 AAV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, ITR은 AAV2 ITR일 수 있고, A 또는 A' 아암 또는 RBE는 AAV5로부터의 구조적 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, ITR은 AAV5 ITR일 수 있고, C 또는 C' 아암, RBE, 및 trs는 AAV2로부터의 구조적 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, AAV ITR은 AAV2 ITR B 및 B' 아암으로 대체된 B 및 B' 아암을 갖는 AAV5 ITR일 수 있다.
단지 예로서, 표 3은 변형된 ITR의 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 예시적인 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타내며, 여기서 X는 상응하는 야생형 ITR에 대한 해당 섹션에서의 적어도 하나의 핵산의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타낸다. 일부 구현예에서, C 및/또는 C' 및/또는 B 및/또는 B'의 임의의 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에서 3개의 순차적인 T 뉴클레오티드 (즉, TTT)를 보유한다. 예를 들어, 변형 결과, 단일 아암 ITR (예를 들어, 단일 C-C' 아암 또는 단일 B-B' 아암) 또는 변형된 C-B' 아암 또는 C'-B 아암, 또는 적어도 하나의 절단된 아암 (예를 들어, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암)을 갖는 2개의 아암 ITR 중 어느 것이 된다면, 적어도 하나의 단일 아암 또는 2개의 아암 ITR 중 적어도 하나의 아암 (하나의 아암이 절단될 수 있는 경우)은 적어도 하나의 말단 루프에서 순차적인 T 뉴클레오티드 (즉, TTT)를 보유한다. 일부 구현예에서, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암은 말단 루프에서 3개의 순차적인 T 뉴클레오티드 (즉, TTT)를 갖는다.
표 3: ITR의 상이한 B-B' 및 C-C' 영역 또는 아암에 대한 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 예시적인 조합 (X는 뉴클레오티드 변형, 예를 들어, 상기 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 첨가, 결실 또는 치환을 나타냄).
Figure pct00007
일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍, 또는 본원에 개시된 바와 같은 대칭 모드-ITR 쌍을 포함하는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 모드-ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A'와 C 사이, C와 C' 사이, C'와 B 사이, B와 B' 사이, 및 B'와 A 사이에서 선택된 영역 중 어느 하나 이상에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C 또는 C' 또는 B 또는 B' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 여전히 스템-루프의 말단 루프를 보존한다. 일부 구현예에서, C 및 C' 및/또는 B 및 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적인 T 뉴클레오티드 (즉, TTT)를 보유한다. 대안적인 구현예에서, C 및 C' 및/또는 B 및 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 임의의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적인 A 뉴클레오티드 (즉, AAA)를 보유한다 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A', A 및/또는 D로부터 선택된 영역 중 임의의 하나에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 A 및/또는 A' 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 나타낸 변형, 및 또한 D 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 조합 중 임의의 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 구조적 요소의 뉴클레오티드 서열을 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위의 뉴클레오티드를 변형함으로써) 변형시켜 변형된 구조적 요소를 생성할 수 있다. 일 구현예에서, ITR에 대한 특정 변형은 본원에 예시되어 있거나 (예를 들어, 서열 번호: 3, 4, 15-47, 101-116 또는 165-187, 또는 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242의 도 7a-7b에 나타남 (예를 들어, PCT/US2018/064242에서 서열번호 97-98, 101-103, 105-108, 111-112, 117-134, 545-54)에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, ITR은 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위의 뉴클레오티드를 변형시킴으로써) 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, ITR은 서열 번호: 3, 4, 15-47, 101-116 또는 165-187의 변형된 ITR, 또는 서열 번호: 3, 4, 15-47, 101-116 또는 165-187의 A-A' 아암 및 C-C' 및 B-B' 아암의 RBE-함유 섹션, 또는 국제 출원 PCT/US18/49996 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 표 2-9 (즉, 서열 번호: 110-112, 115-190, 200-468)에 나타낸 것 중 하나와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 예를 들어 특정 아암의 전부, 예를 들어, A-A' 아암의 전부 또는 일부, 또는 B-B' 아암의 전부 또는 일부 또는 C-C' 아암의 전부 또는 일부의 제거 또는 결실, 또는 대안적으로, 스템 (예를 들어, 단일 아암)을 캡핑하는 최종 루프가 존재하는 한 루프의 스템을 형성하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다 (예를 들어, 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242의 도 7a에서 ITR-21을 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다 (예를 들어, 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242의 도 3b의 ITR-1 또는 도 7a의 ITR-45 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거 및 B-B' 아암으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 염기쌍의 제거의 임의의 조합이 구상되며, 예를 들어, C-C' 아암에서 6개의 염기쌍이 제거될 수 있고, B-B' 아암에서 2개의 염기쌍이 제거될 수 있다. 예시적인 예로서, 도 3b는 각각의 C 부분 및 C' 부분으로부터 결실된 적어도 7개의 염기쌍, C 및 C' 영역 사이의 루프에서 뉴클레오티드의 치환, 및 변형된 ITR이 적어도 하나의 아암 (예를 들어, C-C')이 절단된 2개의 아암을 포함하도록 B 영역 및 B' 영역 각각으로부터 적어도 하나의 염기쌍 결실을 갖는 예시적인 변형된 ITR을 보여준다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 또한, B-B' 아암이 WT ITR에 대해 또한 절단되도록 B 영역 및 B' 영역 각각으로부터 적어도 하나의 염기쌍 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 대해 1 내지 50개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개)의 뉴클레오티드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 WT ITR 서열에 대해 1 내지 30개의 뉴클레오티드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 대해 2 내지 20개의 뉴클레오티드 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 ITR은 A 또는 A' 영역의 RBE-함유 부분에서 임의의 뉴클레오티드 결실을 함유하지 않아서 DNA 복제 (예를 들어, Rep 단백질에 의한 RBE에의 결합 또는 말단 분해 부위에서의 닉킹)를 방해하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위해 포함된 변형된 ITR은 본원에 기재된 바와 같이 B, B', C 및/또는 C 영역에서 하나 이상의 결실을 갖는다.
일부 구현예에서, 대칭 ITR 쌍 또는 비대칭 ITR 쌍을 포함하는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치 및 서열 번호: 3, 4, 15-47, 101-116 또는 165-187로 구성된 군 중 어느 것으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 선택된 적어도 하나의 변형된 ITR을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 구조적 요소의 구조는 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조적 요소는 스템의 높이 및/또는 루프에서 뉴클레오티드 수의 변화이다. 예를 들어, 스템의 높이는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위일 수 있다. 일 구현예에서, 스템 높이는 약 5개의 뉴클레오티드 내지 약 9개의 뉴클레오티드일 수 있고, Rep와 기능적으로 상호 작용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 스템 높이는 약 7개의 뉴클레오티드일 수 있고, Rep와 기능적으로 상호 작용할 수 있다. 또 다른 예에서, 루프는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위를 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, RBE 또는 확장된 RBE 내의 GAGY 결합 부위 또는 GAGY 관련 결합 부위의 수는 증가 또는 감소될 수 있다. 일 예에서, RBE 또는 확장된 RBE는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 GAGY 결합 부위 또는 그 안의 임의의 범위를 포함할 수 있다. 서열이 Rep 단백질에 결합하기에 충분하다면, 각각의 GAGY 결합 부위는 독립적으로 정확한 GAGY 서열 또는 GAGY와 유사한 서열일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 두 요소 (예컨대 비제한적으로 RBE 및 헤어핀) 사이의 간격은 큰 Rep 단백질과의 기능적 상호 작용을 변경하기 위해 변경 (예를 들어, 증가 또는 감소)될 수 있다. 예를 들어, 간격은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 안의 임의의 범위일 수 있다.
본원에 기재된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 야생형 AAV2 ITR 구조와 관련하여 변형되지만, 여전히 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분을 보유하는 ITR 구조를 포함할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는 ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 도시한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위 (RBS; AAV2에 대해 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)) 및 말단 분해 부위 (TRS; 5'-AGTT (서열 번호: 62))를 포함하는 하나 이상의 기능적 ITR 폴리뉴클레오티드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR (wt 또는 변형된 ITR)은 기능적이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서로 상이하거나 비대칭인 2개의 변형된 ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 변형된 ITR은 기능적이고 적어도 하나의 변형된 ITR은 비-기능적이다.
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 본원에 제공된 바와 같이, 서열 번호: 500-529로 구성되거나 본질적으로 구성된 임의의 서열로부터 선택된 변형된 ITR을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열 번호: 500-529로부터 선택된 임의의 서열로부터 선택된 ITR을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 변형된 ITR (예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내의 변형을 갖는다. 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내의 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 국제 출원 PCT/US18/49996 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 표 2 (즉, 서열 번호: 135-190, 200-233); 표 3 (예를 들어, 서열 번호: 234-263); 표 4 (예를 들어, 서열 번호: 264-293); 표 5 (예를 들어, 본원의 서열 번호: 294-318); 표 6 (예를 들어, 서열 번호: 319-468; 및 표 7-9 (예를 들어, 서열 번호: 101-110, 111-112, 115-134) 또는 표 10a 또는 10b (예를 들어, 서열 번호: 9, 100, 469-483, 484-499)에 열거되어 있다.
일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 모드-ITR 쌍을 포함하는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 변형된 ITR은 국제 출원 PCT/US18/49996 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10a-10b에 도시된 것들 중 임의의 것 또는 조합으로부터 선택된다.
상기 클래스 각각에서 비대칭 ITR 쌍, 또는 대칭 모드-ITR 쌍을 포함하는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 추가의 예시적인 변형된 ITR이 표 4a 및 4b에 제공된다. 표 4a에서 우측 변형된 ITR의 예측된 2차 구조는 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242의 도 7a에 도시되어 있고, 표 4b에서 좌측 변형된 ITR의 예측된 2차 구조는 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242의 도 7b에 도시되어 있으며, 이는 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
표 4a 및 표 4b는 예시적인 우측 및 좌측 변형된 ITR을 나타낸다.
표 4a: 예시적인 변형된 우측 ITR. 이러한 예시적인 변형된 우측 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'의 RBE (서열 번호: 60), ACTGAGGC의 스페이서 (서열 번호: 69), 스페이서 보체 GCCTCAGT (서열 번호: 70) 및 GAGCGAGCGAGCGCGC (서열 번호: 71)의 RBE' (즉, RBE에 대한 보체)를 포함할 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
표 4b: 예시적인 변형된 좌측 ITR. 이러한 예시적인 변형된 좌측 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'의 RBE (서열 번호: 60), ACTGAGGC의 스페이서 (서열 번호: 69), 스페이서 보체 GCCTCAGT (서열 번호: 70) 및 GAGCGAGCGAGCGCGC의 RBE 보체 (RBE') (서열 번호: 71)를 포함할 수 있다.
[표 4b]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
일 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 5'에서 3'의 방향으로 제1 아데노-관련 바이러스 (AAV) 역 말단 반복 (ITR), 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 본원에 기재된 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하며, 여기서 제1 ITR (5' ITR) 및 제2 ITR (3' ITR)은 서로 비대칭이고, 즉, 이들은 서로 다른 3D-입체 구성을 갖는다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR일 수 있고 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있으며, 또는 반대로, 제1 ITR이 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR이 야생형 ITR일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 둘 다 모드-ITR이지만, 상이한 서열을 갖거나 상이한 변형을 가지므로 동일한 변형된 ITR이 아니며 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 다르게 말하면, 비대칭 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는 WT-ITR에 대한 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 ITR에 반영되지 않는 ITR을 포함하거나; 또는 대안적으로, 비대칭 ITR이 변형된 비대칭 ITR 쌍을 갖는 경우 서로 상이한 서열 및 상이한 3차원 형상을 가질 수 있다. ceDNA 벡터에서 및 ceDNA-플라스미드를 생성하기 위해 사용하기 위한 예시적인 비대칭 ITR은 표 4a 및 4b에서 보여준다.
대안적인 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 2개의 대칭인 모드-ITR을 포함하며, 즉, 두 ITR은 동일한 서열을 갖지만, 서로의 역 보체 (역상)이다. 일부 구현예에서, 대칭 모드-ITR 쌍은 동일한 AAV 혈청형으로부터의 야생형 ITR 서열에 대한 결실, 삽입 또는 치환 중 적어도 하나 또는 임의의 조합을 포함한다. 대칭 ITR에서의 첨가, 결실 또는 치환은 동일하지만 서로의 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR의 C 영역에서 3개의 뉴클레오티드의 삽입은 3' ITR의 C' 영역에서의 상응하는 섹션에서 3개의 역 보체 뉴클레오티드의 삽입에 반영될 것이다. 단지 설명의 목적으로만, 5' ITR에서 첨가가 AACG인 경우, 상응하는 부위에서의 3' ITR에서 첨가는 CGTT이다. 예를 들어, 5' ITR 센스 가닥이 ATCGATCG인 경우, G와 A 사이에 AACG가 첨가되어 ATCG AACG ATCG 서열 (서열번호 51)이 생성된다. 상응하는 3' ITR 센스 가닥은 CGAT CGTT CGAT (서열 번호 : 49)(ATCG AACG ATCG의 역 상보) (서열 번호 51) 서열을 생성하기 위해 T와 C 사이에 CGTT (즉, AACG의 역 상보)를 추가한 CGATCGAT (ATCGATCG의 역 상보)이다.
대안적인 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이고, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 가질 수 있지만 대응하는 또는 동일한 대칭 3차원 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 하나의 변형된 ITR은 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있고, 다른 변형된 ITR은 상이한 혈청형으로부터 유래될 수 있지만, 이들은 동일한 영역에서 동일한 돌연변이 (예를 들어, 뉴클레오티드 삽입, 결실 또는 치환)를 갖는다. 달리 언급하면, 단지 설명의 목적으로, 5' 모드-ITR은 AAV2로부터 유래될 수 있고, C 영역에서 결실을 가질 수 있으며, 3' 모드-ITR은 AAV5로부터 유래될 수 있고, C' 영역에서 상응하는 결실을 가질 수 있으며, 5' 모드-ITR 및 3' 모드-ITR이 동일하거나 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 경우, 이들은 본 명세서에서 변형된 ITR 쌍으로 사용하기 위해 포함된다.
일부 구현예에서, 실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어, 실질적으로 대칭인 모드-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 모드-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 가지며 또한 이의 동족 모드-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형태로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다. 단지 예로서, 실질적으로 대칭인 ITR은 그 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 대칭 공간 구성을 가질 수 있다. 이것은, 예를 들어, G-C 쌍이, 예를 들어, C-G 쌍으로 또는 그 반대로 변형될 때, 또는 A-T 쌍이 T-A 쌍으로 또는 그 반대로 변형될 때 발생할 수 있다. 따라서, ATCG AACG ATCG (서열 번호: 51)로서 변형된 5' ITR 및 CGAT CGTT CGAT (서열 번호: 49) (즉, ATCG AACG ATCG (서열 번호: 51)의 역 보체)로서 변형된 3' ITR의 상기 예시적인 예를 사용하면, 예를 들어, 5' ITR이 ATCG AAC C ATCG (서열 번호: 50)의 서열을 갖는 경우, 이러한 변형된 ITR은 여전히 대칭일 것이며, 여기서 첨가에서 G는 C로 변형되고, 실질적으로 대칭인 3' ITR은 a로의 첨가에서 T의 상응하는 변형 없이 CGATCGTT CGAT (서열 번호: 49)의 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 변형된 ITR 쌍은 변형된 ITR 쌍이 대칭 입체화학을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다.
표 5는 예시적인 대칭 변형된 ITR 쌍 (즉, 좌측 변형된 ITR 및 대칭 우측 변형된 ITR)을 보여준다. 서열의 굵은 체 (빨간색) 부분은 도 31a-46b에 또한 도시된 부분 ITR 서열 (즉, A-A', C-C' 및 B-B' 루프의 서열)을 식별한다. 이러한 예시적인 변형된 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (서열 번호: 60)의 RBE, ACTGAGGC (서열 번호: 69)의 스페이서, 스페이서 보체 GCCTCAGT (서열 번호: 70) 및 GAGCGAGCGAGCGCGC (서열 번호: 71)의 RBE' (즉, RBE에 대한 보체)를 포함할 수 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍을 포함하는 ceDNA 벡터는 본원의 표 4a-4b 중 임의의 하나 이상에 나타낸 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열 또는 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242의 도 7a 또는 도 7b에 도시되거나, 또는 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 2018년 9월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/US18/49996의 표 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10a-10b에 개시된 서열에서의 임의의 변형에 상응하는 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있다.
V. 예시적인 ceDNA 벡터
상술한 바와 같이, 본 개시내용은 비대칭 ITR 쌍, 대칭 ITR 쌍, 또는 전술한 바와 같이 실질적으로 대칭인 ITR 쌍 중 임의의 하나를 포함하는 이식유전자를 인코딩하는 ceDNA 벡터 및 합성적으로 생성된 재조합 ceDNA 발현 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 플랭킹 ITR 서열 및 이식유전자를 갖는 합성적으로 생성된 재조합 ceDNA 벡터에 관한 것으로, 여기서 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이며, ceDNA는 플랭킹 ITR 사이에 위치한 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어 이식유전자의 핵산을 포함하는 발현 카세트)을 추가로 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다.
합성적으로 생성된 ceDNA 발현 벡터는 적어도 하나의 ITR이 변경된 경우 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 ceDNA 벡터일 수 있다. 본 개시내용의 합성적으로 생성된 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터가 도입될 숙주 세포와 양립 가능하다. 특정 구현예에서, 합성적으로 생성된 ceDNA 벡터는 선형일 수 있다. 특정 구현예에서, 합성적으로 생성된 ceDNA 벡터는 염색체외 엔티티로서 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 공여체 서열을 숙주 세포의 게놈으로 통합시킬 수 있는 요소(들)를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 "이식유전자" 및 "이종 뉴클레오티드 서열"은 동의어이다.
이제 도 1a-1g를 참조하면, 본 개시내용의 ceDNA 벡터를 합성적으로 생성하는데 유용한 2개의 비제한적인 플라스미드의 기능성 성분의 개략도가 도시되어 있다. 도 1a, 1b, 1d, 1f는 ceDNA 벡터의 작제물 또는 상응하는 ceDNA 플라스미드 서열을 보여주며, 여기서 제1 및 제2 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭이거나, 대칭이거나 실질적으로 대칭이다. 일부 구현예에서, 발현 가능한 이식유전자 카세트는, 필요에 따라, 인핸서/프로모터, 하나 이상의 상동성 아암, 공여체 서열, 전사 후 조절 요소 (예를 들어, WPRE, 예를 들어, 서열 번호: 67)), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 (예를 들어, BGH 폴리A, 예를 들어, 서열 번호: 68)를 포함한다.
도 5는 본원 및 실시예에 기재된 합성적 과정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터의 생성을 확인하는 겔이다. 상기 도 4b와 관련하여 그리고 실시예에서 논의된 바와 같이, ceDNA 벡터의 발생은 겔에서의 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
A. 조절 요소.
본원에 기재된 합성 공정을 사용하여 생성되고 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 본원에 정의된 비대칭 ITR 쌍 또는 대칭 ITR 쌍을 포함할 수 있고, 시스-조절 요소의 특정 조합을 추가로 포함할 수 있다. 시스-조절 요소는 프로모터, 리보스위치, 절연체, 미르-조절 가능 요소, 전사 후 조절 요소, 조직- 및 세포 유형-특이적 프로모터 및 인핸서를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, ITR은 이식유전자의 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 추가 성분, 예를 들어, 이식유전자의 발현을 조절하기 위한 본원에 기재된 조절 스위치, 또는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 조절 스위치를 포함하는 조절 요소는 국제 출원 PCT/US18/49996에 보다 상세하게 논의되어 있으며, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 조절 서열, 및 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 유전자 조절 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 숙주 세포에서 뉴클레아제의 발현을 제어하기에 적합하다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자, 예컨대 본 개시내용의 뉴클레아제(들)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사를 지시할 수 있는, 적합한 프로모터 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 연결된 인트론 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 프로모터의 효능을 증가시키기 위해 인핸서 서열이 프로모터의 상류에 제공된다. 특정 구현예에서, 조절 서열은 인핸서 및 프로모터를 포함하고, 여기서 제2 뉴클레오티드 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 있는 인트론 서열을 포함하고, 상기 인트론은 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위(들)를 포함하고, 상기 프로모터는 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
본원에 기재된 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터는 시스-조절 요소, 예컨대 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE) (예를 들어, 서열 번호: 67) 및 BGH 폴리A (서열 번호: 68)의 특정 조합을 추가로 포함할 수 있다. 발현 작제물에 사용하기에 적합한 발현 카세트는 바이러스 캡시드에 의해 부과된 패키징 제약에 의해 제한되지 않는다.
(i). 프로모터:
본 발명의 합성적으로 생성된 ceDNA 벡터에 사용된 프로모터는 이들이 촉진하는 특정 서열에 적합하게 맞추어져야 한다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 예를 들어, 가이드 RNA는 프로모터가 전혀 필요하지 않을 수 있는데, 그 이유는 이의 기능이 재조합 사건을 수행하기 위해 천연 DNA 상에 특정 표적 서열을 갖는 듀플렉스를 형성하는 것이기 때문이다. 대조적으로, ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 뉴클레아제는 프로모터로부터 이익을 얻을 수 있으므로 이는 벡터로부터 효율적으로 그리고, 선택적으로, 조절 가능한 방식으로 발현될 수 있다.
본 발명의 발현 카세트는 세포-특이성뿐만 아니라 전체 발현 수준에 영향을 줄 수 있는 프로모터를 포함한다. 이식유전자 발현을 위해, 이들은 매우 활성인 바이러스-유래 즉각적인 조기 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 조직 특이적 진핵생물 프로모터를 함유하여 이식유전자 발현을 특정 세포 유형으로 제한하고 조절되지 않은 이소성 발현으로 인한 독성 효과 및 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 발현 카세트는 합성 조절 요소, 예컨대 CAG 프로모터 (서열 번호: 72)를 함유할 수 있다. CAG 프로모터는 (i) 사이토메갈로바이러스 (CMV) 조기 인핸서 요소, (ii) 치킨 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함한다. 대안적으로, 발현 카세트는 알파-1-항트립신 (AAT) 프로모터 (서열 번호: 73 또는 서열 번호: 74), 간 특이적 (LP1) 프로모터 (서열 번호: 75 또는 서열 번호: 76), 또는 인간 신장 인자-1 알파 (EF1a) 프로모터 (예를 들어, 서열 번호: 77 또는 서열 번호: 78)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 하나 이상의 구성적 프로모터, 예를 들어, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서를 가짐) 또는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 즉각적인 조기 프로모터 (선택적으로 CMV 인핸서, 예를 들어, 서열 번호: 79를 가짐)를 포함한다. 대안적으로, 유도성 프로모터, 이식유전자를 위한 천연 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 당 업계에 공지된 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.
상기 기재된 것들을 포함하여, 적합한 프로모터는 바이러스로부터 유래될 수 있으며 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물 유기체를 포함하는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 적합한 프로모터를 사용하여 임의의 RNA 폴리머라제 (예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 구동시킬 수 있다. 예시적인 프로모터는 SV40 조기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP); 단순 포진 바이러스 (HSV) 프로모터, CMV 즉각적인 조기 프로모터 영역 (CMVIE)과 같은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 인간 U6 소형 핵 프로모터 (U6, 예를 들어, 서열 번호: 80) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), 향상된 U6 프로모터 (예를 들어, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)), 인간 H1 프로모터 (H1) (예를 들어, 서열 번호: 81 또는 서열 번호: 155), CAG 프로모터, 인간 알파 1-안티팁신(antitypsin) (HAAT) 프로모터 (예를 들어, 서열 번호: 82) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 이들 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 하류 인트론 함유 말단에서 변경된다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)를 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 이질적이다.
일 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료 단백질을 인코딩하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료 단백질을 인코딩하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 공지되어 있고 특성화되어 있다. 사용된 프로모터 영역은 하나 이상의 추가 조절 서열 (예를 들어, 천연), 예를 들어 인핸서 (예를 들어, 서열 번호: 79 및 서열 번호: 83)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 프로모터의 비제한적인 예는, 예를 들어, (서열 번호: 72)의 CAG 프로모터, HAAT 프로모터 (서열 번호: 82), 인간 EF1-α 프로모터 (서열 번호: 77) 또는 EF1a 프로모터의 단편 (서열 번호: 78), IE2 프로모터 (예를 들어, 서열 번호: 84) 및 랫트 EF1-α 프로모터 (서열 번호: 85), 또는 1E1 프로모터 단편 (서열 번호: 125)를 포함한다.
(ii). 폴리아데닐화 서열:
ceDNA 벡터로부터 발현된 mRNA를 안정화시키고 핵 수출 및 번역을 돕기 위해 폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 서열이 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 벡터는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50개 또는 그 이상의 아데닌 디뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 약 43개 뉴클레오티드, 약 40-50개 뉴클레오티드, 약 40-55개 뉴클레오티드, 약 45-50개 뉴클레오티드, 약 35-50개 뉴클레오티드, 또는 이들 사이의 임의의 범위를 포함한다.
발현 카세트는 당 업계에 공지된 폴리아데닐화 서열 또는 이의 변형, 예컨대 소 BGHpA (예를 들어, 서열 번호: 68) 또는 바이러스 SV40pA (예를 들어, 서열 번호: 86), 또는 합성 서열 (예를 들어, 서열 번호: 87)로부터 단리된 천연 발생 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 폴리 A 신호 상류 인핸서 (USE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, USE는 SV40pA 또는 이종 폴리-A 신호와 조합하여 사용될 수 있다.
발현 카세트는 또한 이식유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사 후 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우드척 간염 바이러스 (WHP) 전사 후 조절 요소 (WPRE) (예를 들어, 서열 번호: 67)는 이식유전자의 발현을 증가시키는 데 사용된다. 단순 포진 바이러스 또는 B형 간염 바이러스 (HBV)의 티미딘 키나제 유전자로부터의 전사 후 요소와 같은 다른 전사 후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비 서열은 이식유전자, 예를 들어, VH-02 및 VK-A26 서열, 예를 들어, 서열 번호: 88 및 서열 번호: 89에 연결될 수 있다.
(iii). 핵 국재화 서열
일부 구현예에서, RNA 유도 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 벡터는 하나 이상의 핵 국재화 서열 (NLS), 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 NLS는 아미노-말단에 또는 그 근처, 카복시-말단에 또는 그 근처에 위치하거나, 또는 이들의 조합 (예를 들어, 아미노-말단에서 하나 이상의 NLS 및/또는 카복시 말단에서 하나 이상의 NLS)에 위치한다. 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 단일 NLS가 하나 초과의 카피에 존재하고/하거나 하나 이상의 다른 NLS와 조합하여 하나 이상의 카피에 존재하도록 다른 것과 독립적으로 선택될 수 있다. NLS의 비제한적인 예는 표 6에 제시되어 있다.
표 6: 핵 국재화 신호
Figure pct00018
E. ceDNA 벡터의 추가 성분
본원에 기재된 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터는 유전자 발현을 위해 다른 성분을 인코딩하는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 특정 유전자 표적화 사건을 선택하기 위해, 보호 shRNA가 마이크로RNA에 포매되어 알부민 유전자좌와 같은 고도로 활성인 유전자좌에 부위 특이적으로 통합되도록 설계된 재조합 ceDNA 벡터에 삽입될 수 있다. 이러일 구현예는 하기에 기재된 바와 같은 임의의 유전자 배경에서 유전자 변형 간세포의 생체내 선택 및 확장을 위한 시스템을 제공할 수 있다: Nygaard et al., A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo, Gene Therapy, June 8, 2016. 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 형질전환, 형질감염, 형질도입 또는 이와 유사한 세포의 선택을 허용하는 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 선택 가능한 마커는 그 산물이 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구성에 대한 프로토트로피(prototrophy), NeoR 등을 제공하는 유전자이다. 특정 구현예에서, 양성 선별 마커는 NeoR과 같은 공여체 서열에 포함된다. 음성 선별 마커는 공여체 서열의 하류에 통합될 수 있으며, 예를 들어 음성 선별 마커를 인코딩하는 핵산 서열 HSV-tk는 공여체 서열의 하류에 있는 핵산 작제물에 통합될 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 제조된 ceDNA 벡터는, 예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함된, 2018년 12월 6일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242에 개시된 바와 같이, 유전자 편집을 위해 사용될 수 있으며, 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 5' 상동성 아암, 3' 상동성 아암, 5' 상동성 아암의 상류에 있고 이에 근접한 폴리아데닐화 부위. 예시적인 상동성 아암은 5' 및 3' 알부민 상동성 아암 (서열 번호: 151 및 152) 또는 CCR5 5'- 및 3' 상동성 아암 (예를 들어, 서열 번호: 153, 154)이다.
F. 조절 스위치
분자 조절 스위치는 신호에 응답하여 측정 가능한 상태 변화를 생성하는 스위치이다. 이러한 조절 스위치는 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현의 출력을 제어하기 위해 본원에 기재된 바와 같이 합성적 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터와 유용하게 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 미세 조정하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 이는 ceDNA 벡터의 생화학적 봉쇄(biocontainment) 기능으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 스위치는 제어 가능하고 조절 가능한 방식으로 ceDNA에서 관심 유전자의 발현을 시작 또는 중지 (즉, 셧다운)하도록 설계된 "ON/OFF" 스위치이다. 일부 구현예에서, 스위치는 스위치가 활성화되면 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포 프로그래밍된 사멸을 겪도록 지시할 수 있는 "사멸 스위치"를 포함할 수 있다. ceDNA에 사용하기 위해 포함된 예시적인 조절 스위치는 이식유전자의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있고, 국제 출원 PCT/US18/49996에 보다 상세히 논의되며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
(i) 이진 조절 스위치
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터는 이식유전자의 발현을 제어 가능하게 조절하는 역할을 할 수 있는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, ceDNA 벡터의 ITR 사이에 위치한 발현 카세트는 관심 유전자에 작동적으로 연결된, 조절 영역, 예를 들어, 프로모터, 시스-요소, 리프레서, 인핸서 등을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 조절 영역은 하나 이상의 보조 인자 또는 외인성 제제에 의해 조절된다. 단지 예로서, 조절 영역은 소분자 스위치 또는 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터의 비-제한적인 예는 호르몬-유도성 또는 금속-유도성 프로모터이다. 다른 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
(ii) 소분자 조절 스위치
다양한 당 업계에 공지된 소분자 기반 조절 스위치가 당 업계에 공지되어 있고, 조절 스위치 제어 ceDNA 벡터를 형성하기 위해 본원에 개시된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 문헌(Taylor, et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15)에 기재된 것과 같이, 작동적으로 연결된 이식유전자의 발현을 제어하는 인공 프로모터와 함께, 직교 리간드/핵 수용체 쌍, 예를 들어 레티노이드 수용체 변이체/LG335 및 GRQCIMFI; 조작된 스테로이드 수용체, 예를 들어, 프로게스테론에 결합할 수 없지만 RU486 (미페프리스톤)에 결합하는 C-말단 절단을 갖는 변형된 프로게스테론 수용체 (미국 특허 번호 5,364,791); 드로소필라(Drosophila) 유래 엑디손 수용체 및 이의 엑디스테로이드 리간드 (Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517; 또는 문헌(Sando R 3rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8)에 개시된 바와 같은 항생제 트리메토프림 (TMP)에 의해 제어되는 스위치 중 임의의 하나 또는 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자를 제어하거나 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 조절 스위치는 미국 특허 8,771,679 및 6,339,070에 개시된 것과 같은 전구 약물 활성화 스위치이다.
(iii) "패스코드(Passcode)" 조절 스위치
일부 구현예에서, 조절 스위치는 "패스코드 스위치" 또는 "패스코드 회로"일 수 있다. 패스코드 스위치는 특정 조건이 발생할 때 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에서 이식유전자의 발현 제어를 미세 조정할 수 있도록 하며, 즉, 이식유전자 발현 및/또는 억제가 발생하려면 조건의 조합이 필요한다. 예를 들어, 이식유전자의 발현이 발생하기 위해서는 적어도 조건 A 및 B가 발생해야 한다. 패스코드 조절 스위치는 이식유전자 발현이 발생하기 위해 임의의 수의 조건, 예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6 또는 적어도 7개 또는 그 이상의 조건이 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 조건 (예를 들어, A, B 조건)이 발생해야 하고, 일부 구현예에서, 적어도 3개의 조건 (예를 들어, A, B 및 C, 또는 A, B 및 D)이 발생해야 한다. 단지 예로서, 패스코드 "ABC" 조절 스위치를 갖는 ceDNA로부터의 유전자 발현이 발생하기 위해서는 조건 A, B 및 C가 존재해야 한다. 조건 A, B 및 C는 다음과 같을 수 있다; 조건 A는 병태 또는 질환의 존재이고, 조건 B는 호르몬 반응이고, 조건 C는 이식유전자 발현에 대한 반응이다. 예를 들어, 이식유전자이 결함 있는 EPO 유전자를 편집하는 경우, 조건 A는 만성 신장 질환 (CKD)의 존재이고, 조건 B는 대상체가 신장에 저산소 상태에 있는 경우 발생하고, 조건 C는 신장에서 에리스로포이에틴 생성 세포 (EPC) 동원이 손상된 것이거나; 또는 대안적으로, HIF-2 활성화가 손상된 것이다. 산소 수준이 증가하거나 원하는 수준의 EPO에 도달하면, 3가지 조건이 발생할 때까지 이식유전자이 다시 꺼지고, 다시 켜진다.
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 패스코드 조절 스위치 또는 "패스코드 회로"는 생화학적 봉쇄 조건을 정의하는데 사용되는 환경 신호의 범위 및 복잡성을 확장시키기 위해 하이브리드 전사 인자 (TF)를 포함한다. 미리 결정된 조건의 존재하에 세포 사멸을 유발하는 데드맨 스위치(deadman switch)와는 달리, "패스코드 회로"는 특정 "패스코드"의 존재하에서 세포 생존 또는 이식유전자 발현을 허용하고, 미리 결정된 환경 조건 또는 패스코드가 존재하는 경우에만 이식유전자 발현 및/또는 세포 생존을 허용하도록 쉽게 재프로그래밍될 수 있다.
본원에 개시된 조절 스위치의 임의의 및 모든 조합, 예를 들어, 소분자 스위치, 핵산-기반 스위치, 소분자-핵산 하이브리드 스위치, 전사 후 이식유전자 조절 스위치, 번역 후 조절, 방사선-제어 스위치, 저산소증-매개 스위치 및 본원에 개시된 바와 같은 당업자에게 공지된 다른 조절 스위치는 본원에 개시된 바와 같은 패스코드 조절 스위치에 사용될 수 있다. 사용을 위해 포함된 조절 스위치는 리뷰 논문 (Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015))에서 또한 논의되며, Kis의 표 1에 요약되어 있다. 일부 구현예에서, 패스코드 시스템에 사용하기 위한 조절 스위치는 표 11의 스위치 중 임의의 것 또는 조합으로부터 선택될 수 있다.
(iv). 이식유전자 발현을 제어하기 위한 핵산 기반 조절 스위치
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 핵산 기반 제어 메커니즘에 기초한다. 예시적인 핵산 제어 메카니즘이 당 업계에 공지되어 있으며 사용이 구상된다. 예를 들어, 이러한 메커니즘은, 예를 들어, US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, 미국 특허 9,222,093 및 EP 출원 EP288071에 개시되고, 또한 문헌(Villa JK et al., Microbiol Spectr. 2018 May;6(3))에 의한 검토에 개시된 것과 같은 리보스위치를 포함한다. 또한, WO2018/075486 및 WO2017/147585에 개시된 것과 같은 대사 물질-반응성 전사 바이오센서가 포함된다. 사용이 구상된 당 업계에 공지된 다른 메커니즘은 siRNA 또는 RNAi 분자 (예를 들어, miR, shRNA)로 이식유전자의 침묵화를 포함한다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자에 상보적인 RNAi 분자를 인코딩하는 조절 스위치를 포함할 수 있다. 이식유전자이 ceDNA 벡터에 의해 발현되더라도 이러한 RNAi가 발현될 때, 상보적 RNAi 분자에 의해 침묵화될 것이고, 이식유전자이 ceDNA 벡터에 의해 발현될 때 RNAi가 발현되지 않을 때 이식유전자는 RNAi에 의해 침묵화되지 않는다.
일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2002/0022018에 개시된 바와 같은 조직-특이적 자가-활성화 조절 스위치이며, 따라서 조절 스위치는 이식유전자 발현이 그렇지 않으면 불리할 수 있는 부위에서 이식유전자 발현을 의도적으로 차단한다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2014/0127162 및 미국 특허 8,324,436에 개시된 바와 같은 재조합 효소 가역 유전자 발현 시스템이다.
(V). 전사 후 및 번역 후 조절 스위치.
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 의해 발현된 관심 이식유전자 또는 유전자를 제어하기 위한 조절 스위치는 전사 후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이러한 조절 스위치는 US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, EP 특허 2707487 및 문헌(Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526-534; Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858)에 개시된 바와 같이 테트라사이클린 또는 테오필린에 민감한 압타자임(aptazyme) 리보스위치일 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자는 리간드 감수성 (OFF-스위치) 압타머를 함유하는 억제성 siRNA 및 이식유전자 둘 다를 인코딩할 수 있으며, 최종 결과는 리간드 감수성 ON-스위치인 것으로 예상된다.
(vi). 다른 예시적인 조절 스위치
환경 변화에 의해 유발된 것들을 포함하여, ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자의 유전자 발현을 제어하기 위해 임의의 공지된 조절 스위치가 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에서 사용될 수 있다. 추가의 예는 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다; 문헌(Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018))의 BOC 방법; 유전자 코드 확장 및 비-생리적 아미노산; 방사선 제어 또는 초음파 제어 온/오프 스위치 (예를 들어, Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul;7(13):1121-5; 미국 특허 5,612,318; 5,571,797; 5,770,581; 5,817,636; 및 WO1999/025385A1 참조. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어, 미국 특허 7,840,263; US2007/0190028A1 (여기서 유전자 발현은 ceDNA 벡터의 이식유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 활성화시키는 전자기 에너지를 포함하는 하나 이상의 형태의 에너지에 의해 제어됨)에 개시된 바와 같은 이식 가능한 시스템에 의해 제어된다.
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 구상된 조절 스위치는 저산소증-매개 또는 스트레스-활성화 스위치, 예를 들어, WO1999060142A2, 미국 특허 5,834,306; 6,218,179; 6,709,858; US2015/0322410; 문헌(Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368)에 기재된 것, 뿐만 아니라, 예를 들어, 미국 특허 9,394,526에 개시된 바와 같은, FROG, TOAD 및 NRSE 요소 및 저산소증 반응 요소 (HRE), 염증 반응 요소 (IRE) 및 전단 응력 활성화 요소 (SSAE)를 포함한 조건부로 유도 가능한 침묵 요소이다. 이러한 구현예는 허혈 후 또는 허혈성 조직 및/또는 종양에서 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현을 켜는데 유용하다.
(iv). 사멸 스위치
본 발명의 다른 구현예는 사멸 스위치를 포함하는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 개시된 사멸 스위치는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 대상체 시스템으로부터 도입된 ceDNA 벡터를 영구적으로 제거하기 위한 수단으로 사멸되거나 프로그래밍된 세포 사멸을 겪도록 할 수 있다. 당업자는 본 발명의 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에서 사멸 스위치의 사용이 전형적으로 대상체가 수용 가능하게 상실할 수 있는 제한된 수의 세포 또는 아폽토시스가 바람직한 세포 유형 (예를 들어, 암 세포)에 대한 ceDNA 벡터의 표적화와 결합될 수 있음을 이해할 것이다. 모든 측면에서, 본원에 개시된 바와 같은 "사멸 스위치"는 입력 생존 신호 또는 다른 특정 조건이 없는 경우 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 빠르고 강력한 세포 사멸을 제공하도록 설계된다. 달리 말하면, 본 명세서에서 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 사멸 스위치는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 세포 생존을 특정 입력 신호에 의해 정의된 환경으로 제한할 수 있다. 이러한 사멸 스위치는 대상체로부터 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 제거하거나 그것이 인코딩된 이식유전자를 발현하지 않도록 보장하는 것이 바람직한 경우 생물학적 봉쇄 기능을 한다.
VI. 약제학적 조성물
또 다른 측면에서, 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 패쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 패쇄 말단 DNA 벡터는 대상체의 세포, 조직 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA-벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정에 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 패쇄 말단 DNA 벡터는 원하는 치료적 투여 경로 (예를 들어, 비경구 투여)에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포질내 주사를 통한 수동적인 조직 형질도입이 또한 고려된다. 치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 농도의 합성적으로 생산된 패쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 합성적으로 생산된 패쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 완충제에 혼입한 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있으며, ceDNA 벡터를 포함하여 제형화하여 핵 내의 이식유전자를 수용자의 유전자에 전달하여, 그 안의 이식유전자 또는 공여체 서열의 치료적 발현을 초래한다. 상기 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된, ceDNA 벡터를 포함하는 패쇄 말단 DNA 벡터를 포함하는 약제학적 활성 조성물은 다양한 목적을 위해 이식유전자를 세포, 예를 들어, 대상체의 세포로 전달하도록 제형화될 수 있다.
치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 합성적으로 생산된 패쇄 말단 DNA 벡터, 예를 들어 ceDNA 벡터의 높은 농도에 적합한 다른 정렬 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 합성적으로 생산된 패쇄 말든 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터 화합물을 필요한 양으로, 필요에 따라, 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 완충제에 혼입한 후 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은, 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된, ceDNA 벡터를 포함하는 패쇄 말단 DNA 벡터는 국소, 전신, 양막내, 경막내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내 (예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 경막내, 방광내, 결막 (예를 들어, 안와외(extra-orbital), 안와내, 안와후(retroorbital), 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막하, 간질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내 및 점막 (예를 들어, 구강, 직장, 코) 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입, 및 세포내 주사, 예컨대 핵내 미세주입 또는 세포질내 주사를 통한 수동 조직 형질도입이 또한 고려된다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 방법은 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하여, 하나 이상의 말단 패쇄 DNA 벡터를 숙주 세포로 전달하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법에 의해 생성된 세포, 및 이러한 세포를 포함하거나 이로부터 생성된 유기체 (예컨대 동물, 식물 또는 진균)가 본원에 제공된다. 핵산의 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 마이크로인젝션, 유전자총법(biolistics), 리포좀, 면역리포좀, 다가 양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 및 작용제-강화된 DNA 흡수를 포함할 수 있다. 리포펙션은 예를 들어, 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355)에 기재되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)으로의 전달일 수 있다.
핵산을 세포로 전달하기 위한 다양한 기술 및 방법이 당 업계에 공지되어 있다.　예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하여, 말단 패쇄 DNA 벡터는 지질 나노입자 (LNP), 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 리포플렉스 또는 코어-쉘 나노입자로 제형화될 수 있다. 전형적으로, LNP는 핵산 (예를 들어, ceDNA) 분자, 하나 이상의 이온화 가능한 또는 양이온성 지질 (또는 이의 염), 하나 이상의 비이온성 또는 중성 지질 (예를 들어, 인지질), 응집을 방지하는 분자 (예를 들어, PEG 또는 PEG-지질 접합체), 및 임의로 스테롤 (예를 들어, 콜레스테롤)로 구성된다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는, 말단 패쇄 DNA 벡터를 세포로 전달하는 또 다른 방법은 세포에 의해 내재화된 리간드와 핵산을 접합시키는 것이다. 예를 들어, 리간드는 세포 표면상의 수용체에 결합하고 세포내이입을 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산에서 뉴클레오티드에 공유적으로 연결될 수 있다. 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 예시적인 접합체는, 예를 들어, WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 및 WO2017/177326에 기재되어 있다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터와 핵산은 또한 형질감염에 의해 세포로 전달될 수 있다. 유용한 형질감염 방법은 지질-매개 형질감염, 양이온성 폴리머-매개 형질감염 또는 인산칼슘 침전을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 형질감염 시약은 당 업계에 잘 알려져 있으며, TurboFect 형질감염 시약 (Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject 시약 (Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P 단백질 형질감염 시약 (New England Biolabs), CHARIOT™ 단백질 전달 시약 (Active Motif), PROTEOJUICE™ 단백질 형질감염 시약 (EMD Millipore), 293fectin, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™ (Roche, Basel, Switzerland), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFECTAM™ (Transfectam, Pr오메가, Madison, Wis.), TFX-10™ (Pr오메가), TFX-20™ (Pr오메가), TFX-50™ (Pr오메가), TRANSFECTIN™ (BioRad, Hercules, Calif.), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Valencia, Calif.), DC-chol (Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™ (Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Lafayette, Colo.), DHARMAFECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMAFECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, St. Louis, Mo.) 및 ESCORT™ IV (Sigma Chemical Co.)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. ceDNA와 같은 핵산은 또한 당업자에게 공지된 미세유체 방법을 통해 세포로 전달될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉되게 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법은 이용 가능하고 당업자에게 잘 알려져 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 보다 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터의 도입 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,928,638에 기재된 바와 같은 방법에 의해 조혈 줄기세포로 전달될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 대상체에서 세포 또는 표적 기관으로 전달하기 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포이다. 리포좀은 제약 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이들은 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 제약 성분 (API)을 전달함으로써 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린 기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다. 예시적인 리포좀 및 리포좀 제형은 2018년 9월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242에, 예를 들어 "제약 제형"섹션을 참조한다.
당 업계에 공지된 다양한 전달 방법 또는 이의 변형은 시험관내 또는 생체내에서 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 패쇄 말단 DNA 벡터를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 표적화된 세포로의 DNA 유입이 촉진되도록 기계적, 전기, 초음파, 유체 역학적 또는 레이저-기반 에너지에 의해 세포막에 일시적 침투를 함으로써 전달된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 크기 제한 채널을 통해 또는 당 업계에 공지된 다른 수단을 통해 세포를 압착함으로써 일시적으로 세포막을 파괴함으로써 전달될 수 있다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 단독으로 피부, 흉선, 심장 근육, 골격근 또는 간 세포에 네이키드 DNA로서 직접 주사된다.
일부 경우에, ceDNA 벡터는 유전자 총에 의해 전달된다. 캡시드가 없는 AAV 벡터로 코팅된 금 또는 텅스텐 구형 입자 (1-3 μm 직경)는 가압된 가스를 통해 표적 조직 세포로 침투하기 위해 고속으로 가속화될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 본원에서 구체적으로 고려된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 지질 전달 시스템, 예를 들어, 본원에 기재된 리포좀으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물은 숙련된 전문가가 원하는 임의의 경로로 투여된다. 상기 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입, 협측 투여, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내 경막내, 및 관절내 또는 이들의 조합을 포함하여 상이한 경로로 대상체에게 투여될 수 있다. 수의용으로, 조성물은 정상적인 수의학적 실무에 따라 적합하게 허용되는 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적합한 투여 요법 및 투여 경로를 쉽게 결정할 수 있다. 조성물은 전통적인 주사기, 바늘이 없는 주입 장치, "미세발사체 충격 건(microprojectile bombardment gene gun)" 또는 전기천공 ("EP"), 유체 역학적 방법 또는 초음파와 같은 다른 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 유체 역학적 주사에 의해 전달되는데, 이는 임의의 수용성 화합물 및 입자를 사지 전체의 내부 기관 및 골격근으로 직접 세포내로 전달하기 위한 간단하고 매우 효율적인 방법이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 내부 장기 또는 종양의 세포 내로 DNA 입자의 세포내 전달을 용이하게 하기 위해 막에 나노스코픽 공극을 만들어 초음파에 의해 전달되므로, 패쇄 말단 DNA 벡터의 크기 및 농도는 시스템의 효율에 큰 역할을 한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 핵산을 함유하는 입자를 표적 세포 내로 농축시키기 위해 자기장을 사용하여 자기감염에 의해 전달된다.
일부 경우에, 화학적 전달 시스템은, 예를 들어, 나노머 복합체를 사용함으로써 사용될 수 있으며, 이는 양이온성 리포좀/미쉘 또는 양이온성 폴리머에 속하는, 다가 양이온 나노머 입자에 의한 음전하 핵산의 압축을 포함한다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질은 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아니딘 함유 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 폴리머 (예를 들어, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-리신, 프로타민, 기타 양이온성 폴리머), 및 지질-폴리머 하이브리드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
A. 엑소좀:
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 엑소좀에 패키징되어 전달된다. 엑소좀은 다소포체와 원형질막의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 식작용 기원의 작은 막 소포이다. 이들의 표면은 공여체 세포의 세포막으로부터의 지질 이중층으로 구성되며, 이들은 엑소좀을 생성하는 세포로부터의 시토졸을 함유하고, 표면상의 모 세포로부터 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 상피 세포, B 및 T 림프구, 비만 세포 (MC) 및 수지상 세포 (DC)를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생성된다. 일부 구현예, 직경이 10nm 내지 1μm, 20nm 내지 500nm, 30nm 내지 250nm, 50nm 내지 100nm인 엑소좀이 사용되는 것으로 예상된다. 공여체 세포를 사용하거나 특정 핵산을 이들에 도입함으로써 표적 세포로의 전달을 위한 엑소좀을 단리할 수 있다. 당 업계에 공지된 다양한 접근법을 사용하여 본 발명의 캡시드-비함유 AAV 벡터를 함유하는 엑소좀을 생성할 수 있다.
B. 미세입자/나노입자:
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 지질 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 지질 나노입자는 예를 들어 하기에 개시된 바와 같이, 이온화 가능한 아미노 지질 (예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린 (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질 (폴리에틸렌 글리콜-디미리스토글리세롤, PEG-DMG)을 포함한다: Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 1000 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 300 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 10 내지 약 300 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 200 nm 미만의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 25 내지 약 200 nm의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제제 (예를 들어, 복수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는 평균 크기 (예를 들어, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 보다 전형적으로 평균 크기가 약 100nm 이하인 크기 분포를 갖는다.
당 업계에 공지된 다양한 지질 나노입자가 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자를 사용한 다양한 전달 방법은 미국 특허 번호 9,404,127, 9,006,417 및 9,518,272에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 금 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 핵산은, 예를 들어, 하기에 기재된 바와 같이, 금 나노입자에 공유 결합될 수 있거나 금 나노입자에 비공유 결합 (예를 들어, 전하-전하 상호작용에 의해 결합)될 수 있다: Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083. 일부 구현예에서, 금 나노입자-핵산 접합체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,812,334에 기재된 방법을 사용하여 제조된다.
C. 접합체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 접합된다 (예를 들어, 세포 흡수를 증가시키는 작용제에 공유 결합됨). "세포 흡수를 증가시키는 작용제"는 지질 막을 통한 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친유성 화합물 (예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 침투 펩티드 (CPP) (예를 들어, 페네트라틴, TAT, Syn1B 등) 및 폴리아민 (예를 들어, 스퍼민)에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 작용제의 추가 예는, 예를 들어, 하기에 개시되어 있다: Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 폴리머 (예를 들어, 폴리머 분자) 또는 폴레이트 분자 (예를 들어, 엽산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 폴리머에 접합된 핵산의 전달은, 예를 들어 WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재된 바와 같이, 당 업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는, 예를 들어 미국 특허 번호 8,987,377에 기재된 바와 같은 폴리(아미드) 폴리머에 접합된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 핵산은 미국 특허 번호 8,507,455에 기재된 바와 같은 엽산 분자에 접합된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,450,467에 기재된 바와 같이 탄수화물에 접합된다.
D. 나노캡슐
대안적으로, 본원에 개시된 바와 같은 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 물질을 안정적이고 재현 가능한 방식으로 포획할 수 있다. 세포내 폴리머 과부하로 인한 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미립자 (약 0.1 μm 크기)는 생체내에서 분해될 수 있는 폴리머를 사용하여 설계되어야 한다. 이들 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용될 것으로 고려된다.
E. 리포솜
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 대상체에서 세포 또는 표적 기관으로 전달하기 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포이다. 리포좀은 제약 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이들은 세포막과 융합하고 이의 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 제약 성분 (API)을 전달함으로써 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린 기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다.
리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 리포좀은 개선된 혈청 안정성 및 순환 하프-타임(half-time)으로 개발되었다 (미국 특허 번호 5,741,516). 또한, 잠재적 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기술되어 있다 (미국 특허 번호 5,567,434; 5,552,157; 5,565,213; 5,738,868 및 5,795,587).
F. 예시적인 리포좀 및 지질 나노입자 (LNP) 조성물
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 세포, 예를 들어, 이식유전자의 발현이 필요한 세포로 전달하기 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 소포이다. 리포좀은 제약 개발의 맥락에서 약물/치료적 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이들은 세포막과 융합하고 이의 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 제약 성분 (API)을 전달함으로써 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린 기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이들 조성물은 또한 다른 지질을 포함할 수 있다.
ceDNA를 포함하는 지질 나노입자 (LNP)는 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042, 및 2018년 12월 6일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/064242에 개시되어 있으며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함되어 있으며, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 것으로 예상된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 화합물(들)의 면역원성/항원성을 감소시키고, 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 작용기를 갖는 하나 이상의 화합물 (소위 "PEG화 화합물")을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 또는 리포좀 제형은 단순히 추가 성분으로서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머를 포함한다. 이러한 측면에서, PEG 또는 PEG 작용기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 수 시간 내지 수 주에 걸쳐 연장 방출 또는 제어 방출 프로파일을 갖는 API를 전달할 리포좀 제형을 제공한다. 일부 관련 측면에서, 리포좀 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련 측면에서, 리포좀 제형은 승온에서 물리적 전이를 겪는 성분으로 API를 캡슐화하여 수 시간 내지 수 주에 걸쳐 API를 방출한다.
일부 측면에서, 리포좀 제형은 스핑고미엘린 및 본원에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 측면에서, 리포좀 제형은 옵티좀을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨염 (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-공액 지질, HSPC (수소화 대두 포스파티딜콜린); PEG (폴리에틸렌 글리콜); DSPE (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC (디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC (디올레오일포스파티딜콜린); DPPG (디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC (계란 포스파티딜콜린); DOPS (디올레오일포스파티딜세린); POPC (팔미토일로레오일포스파티딜콜린); SM (스핑고미엘린); MPEG (메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC (디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG (디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG (디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC (디에루코일포스파티딜콜린); DOPE (디올레올리-sn-글리세로-포스포에탄올아민). 콜레스테릴 설페이트 (CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), DOPC (디오롤리-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 56:38:5의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 리포좀 제형의 전체 지질 함량은 2-16 mg/mL이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을 각각 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, PEG화 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 접합체 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 하나 이상의 지질 및 에탄올아민 작용기를 함유하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 작용기를 함유하는 지질, 에탄올아민 작용기를 함유하는 지질 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤 중 하나 이상을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 리포좀 제형은 DOPC/DEPC; 및 DOPE를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약제학적 부형제, 예를 들어, 수 크로스 및/또는 글리신을 추가로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 구조상 단일 라멜라 또는 다중 라멜라인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 다중 소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 일반적인 나노입자에 비해 크기가 크고 크기가 약 150 내지 250 nm인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 측면에서, 리포좀 제형은 동결 건조된 분말이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 리포좀 외부에 단리된 ceDNA를 갖는 혼합물에 약한 염기를 첨가함으로써 본원에 개시되거나 기재된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩된 리포좀 제형을 제공한다. 이 첨가는 리포좀 외부의 pH를 약 7.3으로 증가시키고 API를 리포좀으로 유도한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 리포좀 내부에서 산성인 pH를 갖는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우, 리포좀 내부는 pH 4-6.9, 보다 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 리포좀내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 폴리머 또는 비-폴리머 고도로 하전된 음이온 및 리포좀내 포획제, 예를 들어 폴리포스페이트 또는 수크로스 옥타설페이트가 사용된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터 및 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 본원에 포함된, 2018년 9월 7일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042에 개시된 바와 같은 방법에 의해 수득된 ceDNA로 제조되고 로딩된 지질 나노입자 제형. 이는 이온화 가능한 지질을 양성화하고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵 형성에 유리한 에너지학을 제공하는 낮은 pH에서 에탄올성 지질과 수성 ceDNA의 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 입자는 유기 용매의 수성 희석 및 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 입자는 원하는 수준으로 농축될 수 있다.
일반적으로, 지질 입자는 약 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA (질량 또는 중량) 비로 제조된다. 일부 구현예에서, 지질 대 ceDNA 비 (질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질 및 ceDNA의 양은 원하는 N/P 비, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL의 범위일 수 있다.
이온화 가능한 지질은 전형적으로 핵산 카고, 예를 들어, ceDNA를 낮은 pH에서 응축시키고 막 회합 및 융합유도성(fusogenicity)을 유도하기 위해 사용된다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질은 산성 조건, 예를 들어 pH 6.5 이하에서 양으로 하전되거나 양성화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 이온화 가능한 지질은 또한 본원에서 양이온성 지질로 지칭된다.
예시적인 이온화 가능한 지질은 국제 PCT 특허 공보 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740 , WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406 , WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346, 및 WO2013/086354, 및 미국 특허 공보 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458, 및 US2013/0195920 (이들 내용은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 다음 구조를 갖는 MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노) 부타노에이트 (DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다.
Figure pct00019
.
지질 DLin-MC3-DMA는 Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533에 기재되어 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 WO2015/074085에 기재된 바와 같이 지질 ATX-002이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 WO2012/040184에 기재된 바와 같이 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민 (화합물 32)이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, 이온 가능한 지질은 WO2015/199952에 기재된 바와 같이 화합물 6 또는 화합물 22이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
제한 없이, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20-90% (mol)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이온화 가능한 지질 몰 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20-70% (mol), 30-60% (mol) 또는 40-50% (mol)일 수 있다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol% 내지 약 90 mol%를 포함한다.
일부 측면에서, 지질 나노입자는 비-양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비이온성 지질은 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함한다. 따라서, 비-양이온성 지질은 중성, 하전된, 양쪽이온성 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 전형적으로 융합유도성을 향상시키기 위해 사용된다.
본원에 기재된 합성 방법을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터를 포함하는 방법 및 조성물에 사용하기 위한 것으로 예상되는 비-양이온성 지질은 2018년 9월 7일에 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일에 출원된 PCT/US2018/064242에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 포함된다.
예시적인 비-양이온성 지질은 국제 출원 공보 WO2017/099823 및 미국 특허 공보 US2018/0028664에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
비-양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0-30% (mol)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비-양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5-20% (mol) 또는 10-15% (mol)이다. 다양일 구현예에서, 이온화 가능한 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1의 범위이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 임의의 인지질을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 지질 나노입자는 막 완전성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 성분을 추가로 포함할 수 있다.
지질 나노입자에 사용될 수 있는 하나의 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체이다. 예시적인 콜레스테롤 유도체는 국제 출원 WO2009/127060 및 미국 특허 공보 US2010/0130588에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
스테롤과 같은 막 완전성을 제공하는 성분은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0-50% (mol)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 성분은 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20-50% (mol) 30-40% (mol)이다.
일부 측면에서, 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 공액 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 억제하고/하거나 입체 안정화를 제공하는데 사용된다. 예시적인 공액 지질은 PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린 (POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체 (예컨대 ATTA-지질 접합체) , 양이온-폴리머 지질 (CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 접합된 지질 분자는 PEG-지질 접합체, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질이다. 예시적인 PEG-지질 접합체는 PEG-디아실글리세롤 (DAG) (예컨대 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤 (PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필 (DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드 (Cer), 페길화된(PEGylated) 포스파티딜에탄올로아민 (PEG-PE), PEG 석시네이트 디아실글리세롤 (PEGS-DAG) (예컨대 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트 (PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카밤, N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨염, 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224, 및 US2017/0119904에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 US2018/0028664에 개시된 화합물이며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 구현예에서, PEG-지질은 US20150376115 또는 US2016/0376224에 개시되며, 이들 내용은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
PEG-DAA 접합체는, 예를 들어, PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤 (1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복사미도-3',6'-디옥사옥타닐] 카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB (3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) 에테르), 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]이다. 일부 실시예에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
PEG 이외의 분자와 접합된 지질도 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린 (POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체 (예컨대 ATTA-지질 접합체), 및 양이온성-폴리머 지질 (CPL) 접합체가 PEG-지질 대신에 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 예시적인 접합된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA-지질 접합체 및 양이온성 폴리머-지질은 국제 특허 출원 공보 WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104, 및 WO2010/006282, 미국 특허 출원 공보 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587, 및 US20110123453 및 미국 특허 US5,885,613, US6,287,591, US6,320,017, 및 US6,586,559 (이들 내용은 모두 그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류로부터 선택될 수 있다. 다시 말해, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류로부터 선택될 수 있다. 즉, 치료제는 원하는 치료 목적 및 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, LNP 내의 ceDNA가 암 치료에 유용한 경우, 추가의 화합물은 항암제 (예를 들어, 화학요법제, 표적화된 암 요법 (소분자, 항체 또는 항체-약물 접합체를 포함하지만, 이에 제한되지 않음)일 수 있다. 또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 감염 치료에 유용한 경우, 추가의 화합물은 항균제 (예를 들어, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다.　또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 면역 반응을 조절하는 화합물 (예를 들어, 면역억제제, 면역자극 화합물, 또는 하나 이상의 특정 면역 경로를 조절하는 화합물일 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 단백질을 인코딩하는 ceDNA와 같은 상이한 화합물, 또는 치료제와 같은 상이한 화합물을 함유하는 상이한 지질 나노입자의 상이한 칵테일이 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 추가의 화합물은 면역 조절제이다. 예를 들어, 추가 화합물은 면역억제제이다. 일부 구현예에서, 추가의 화합물은 면역자극제이다.
지질 나노입자로 캡슐화된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본원에 제공된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약제학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제형은 수크로스, 트리스, 트레할로스 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 입자의 지질 부분과 복합체화되거나 지질 나노입자의 지질 부분에서 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터는 지질 나노입자의 지질 위치에서 완전히 캡슐화될 수 있으며, 이에 의해, 예를 들어, 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중에서 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 지질 나노입자를 37℃에서 적어도 약 20, 30, 45 또는 60분 동안 뉴클레아제에 노출시킨 후 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 ceDNA는 37℃에서 적어도 약 30, 45 또는 60분 또는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 또는 36시간 동안 혈청에서 입자의 인큐베이션 후 실질적으로 분해되지 않는다.
특정 구현예에서, 지질 나노입자는 대상체, 예를 들어, 인간과 같은 포유동물에 실질적으로 비-독성이다. 일부 측면에서, 지질 나노입자 제형은 동결 건조된 분말이다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 지질 이중층을 갖는 고체 코어 입자이다. 다른 구현예에서, 지질 나노입자는 비-이중층 구조, 즉, 비-라멜라 (즉, 비-이중층) 형태를 갖는다. 제한 없이, 비-이중층 형태는, 예를 들어, 3차원 튜브, 막대, 입방체 대칭 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자의 형태 (라멜라 대 비-라멜라)는, 예를 들어, US2010/0130588 (이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 쉽게 평가되고 특성화될 수 있다.
일부 추가의 구현예에서, 비-라멜라 형태를 갖는 지질 나노입자는 고전자밀도이다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 구조상 단일 라멜라 또는 다중 라멜라인 지질 나노입자를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 다중-소포성 입자 및/또는 발포체-기반 입자를 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
지질 성분의 조성 및 농도를 제어함으로써, 지질 접합체가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 이어서 지질 나노입자가 융합유도성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어, pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여 지질 나노입자가 융합유도성이 되는 속도를 변화 및/또는 제어할 수 있다. 지질 나노입자가 융합유도성이 되는 속도를 제어하는데 사용될 수 있는 다른 방법은 본 개시내용에 기초하여 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어함으로써 지질 입자 크기를 제어할 수 있음이 또한 명백할 것이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다 (Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (20l0) 참조, 둘 다 그 전문이 참고로 포함됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산 (TNS)의 형광에 기초한 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 측정될 수 있다.
VII. 말단 패쇄 DNA 벡터를 전달하는 방법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 다양한 적합한 방법에 의해 시험관내 또는 생체내 표적 세포로 전달될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터만 적용하거나 주사할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 형질감염 시약 또는 다른 물리적 수단의 도움 없이 세포로 전달될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 세포로의 DNA의 진입을 용이하게 하는 임의의 당 업계에 공지된 형질감염 시약 또는 다른 당 업계에 공지된 물리적 수단, 예를 들어, 리포좀, 알코올, 폴리리신-풍부 화합물, 아르기닌-풍부 화합물, 인산칼슘, 미세소포, 미세주사, 전기천공 등을 사용하여 전달될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 CNS (예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여된다. 예를 들어 ceDNA 벡터는 척수, 뇌간 (숨뇌, 뇌교), 중뇌 (시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑질, 송과선), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두를 포함한 대뇌, 측두엽, 두정엽, 전두엽, 피질, 기저핵, 해마 및 포르타아미달라(portaamygdala)), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구로 도입될 수 있다. ceDNA 벡터는 또한 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 다른 영역에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터는 뇌척수액 내로 전달될 수 있다 (예를 들어, 요추 천자에 의해). ceDNA 벡터는 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황 (예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 CNS에 혈관내로 추가로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 경막내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내 (예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재하에), 비강내, 귀내, 안구내 (예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위 (예를 들어, 서브-테논 부위(sub-Tenon's region)) 전달뿐만 아니라 운동 뉴런으로 역행 전달을 통한 근육내 전달을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당 업계에 공지된 임의의 경로에 의해 CNS의 원하는 영역(들)에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 CNS의 원하는 영역 또는 구획에 직접 주사 (예를 들어, 정위 주사)에 의해 액체 제형으로 투여된다. 다른 구현예에서, 예를 들어, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 원하는 영역에 국소 적용하거나 에어로졸 제형의 비강내 투여에 의해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 액체 액적의 국소 적용에 의한 것일 수 있다. 추가의 대안으로서, 예를 들어, ceDNA 벡터는 고체, 서방형 제형으로서 투여될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,201,898 참조). 또 다른 추가의 구현예에서, 예를 들어, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 운동 뉴런 (예를 들어, 근위축성 측삭 경화증 (ALS); 척수 근육 위축 (SMA) 등)을 포함하는 질환 및 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직으로 전달될 수 있다.
VIII. ceDNA 벡터의 추가 용도
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터 및 조성물은 다양한 목적을 위해 표적 유전자 또는 이식유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 생성된 이식유전자는 연구 목적, 예를 들어, 이식유전자 생성물의 기능을 연구하기 위한, 예를 들어, 이식유전자를 보유한 체세포성 형질전환 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 생성된 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 생성된 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에게 전달될 수 있다 (예를 들어, 발현될 수 있다). 일부 구현예에서, 생성된 이식유전자는 증가된 발현, 유전자 산물의 활성, 또는 생성된 이식유전자이 발현을 억제하거나 달리 발현이 감소되도록 하는 유전자의 부적절한 상향 조절과 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 대상체에서 발현될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 생성된 이식유전자는 천연 유전자의 결함 카피를 대체하거나 보충한다. 이식유전자는 그 자체로 전사될 유전자의 오픈 리딩 프레임이 아닐 수 있고; 대신에, 이는 표적 유전자의 프로모터 영역 또는 억제 영역일 수 있고, ceDNA 벡터는 관심 유전자의 발현을 조절하는 결과로 이러한 영역을 변형시킬 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 전달 (예를 들어, 발현)될 수 있다.
IX. 사용 방법
본원에 개시된 바와 같은 합성적으로 생산된 말단 패쇄 DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA 벡터는 또한 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 이식유전자)을 표적 세포 (예를 들어, 숙주 세포)로 전달하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 이식유전자를 이를 필요로 하는 대상체의 세포로 전달하고 관심 질병을 치료하는 방법일 수 있다. 본 발명은 이식유전자의 발현의 치료 효과가 발생하도록 대상체의 세포에서 ceDNA 벡터에 인코딩된 이식유전자, 예를 들어 단백질, 항체, 핵산, 예컨대 miRNA 등의 생체 내 발현을 허용한다. 이러한 결과는 폐쇄 말단 DNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터) 전달의 생체내 및 시험관내 모드 둘 다에서 볼 수있다.
또한, 본 발명은 상기 관심의 핵산 또는 이식유전자를 포함하는 본 발명의 합성적으로 생산된 패쇄 말단 DNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터)의 다중 투여를 포함하는, 이식유전자를 이를 필요로 하는 대상체의 세포로 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명의 ceDNA 벡터는 캡슐화된 바이러스 벡터에 대해 전형적으로 관찰되는 것과 같은 면역 반응을 유도하지 않기 때문에, 이러한 다중 투여 전략은 ceDNA-기반 시스템에서 더 큰 성공을 거둘 것이다.
합성적으로 생산된 패쇄 말단 DNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터) 핵산(들)은 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용되는 투여 경로는 정맥내 (예를 들어, 리포좀 제형으로), 선택된 기관으로의 직접 전달 (예를 들어, 간으로의 문맥내 전달), 근육내 및 기타 모 투여 경로를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 원하는 경우, 투여 경로가 조합될 수 있다.
패쇄 말단 DNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터) 전달은 전달 유전자 대체로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 합성적으로 생산된 패쇄 말단 DNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터)는 유전자 요법의 일부를 제공하기 위해 제공된 다른 전달 시스템과 함께 사용될 수 있다. 본 개시 내용에 따라 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터와 조합될 수 있는 시스템의 하나의 비제한적인 예는 이식유전자의 효과적인 유전자 발현을 위해 하나 이상의 보조 인자 또는 면역 억제제를 개별적으로 전달하는 시스템을 포함한다.
본 발명은 또한 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 치료적 유효량의 합성적으로 생산된 패쇄 말단 DNA 벡터 (예를 들어, ceDNA 벡터)를 대상체의 이를 필요로 하는 세포 (특히 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 것을 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 담체의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 예를 들어, 합성적으로 생산되고 선택된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는데 유용한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, 예를 들어, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 대상체에 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 상기 제공된 임의의 적합한 경로, 및 본원의 다른 곳을 통해 투여될 수 있다.
본원에 제공된 합성적으로 생산된 조성물 및 벡터는 다양한 목적으로 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 연구 목적으로, 예를 들어, 이식유전자 생성물의 기능을 연구하기 위한, 예를 들어, 이식유전자를 보유한 체세포성 형질전환 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되는 것으로 의도된 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 이식유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 부족 또는 기능 장애와 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 전달될 수 있다 (예를 들어, 발현된다).
원칙적으로, 발현 카세트는 돌연변이로 인해 감소되거나 부재하거나 또는 과발현될 때 치료적 이점을 전달하는 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 이식유전자 또는 핵산을 포함할 수 있으며, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 한 종의 ceDNA 벡터로 제한되지 않는다. 이와 같이, 또 다른 측면에서, 상이한 이식유전자 또는 동일한 이식유전자를 포함하지만 상이한 프로모터 또는 시스-조절 요소에 작동 가능하게 연결된 다수의 ceDNA 벡터는 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상체에 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 따라서,이 전략은 유전자 치료 또는 다수의 유전자의 유전자 전달을 동시에 허용할 수 있다. 또한, 이식유전자의 상이한 부분을 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있고 개별적으로 조절될 수 있는 별도의 ceDNA 벡터 (예를 들어, 이식유전자의 기능에 필요한 상이한 도메인 및/ 또는 보조 인자)로 분리하여, 이식유전자의 발현 조절 수준을 추가하는 것이 가능하다. 바이러스성 캡시드의 부재로 인한 항-캡시드 숙주 면역 반응의 부족을 고려하면, 전달은 후속적으로 증가하거나 감소하는 용량으로, 중요하게는 임상 환경에서의 유전자 요법에 대해 여러 번 수행될 수 있다. 캡시드가 없으므로 항-캡시드 반응이 일어나지 않을 것으로 예상된다.
본 발명은 또한 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 대상체의 치료적 유효량의 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 필요로 하는 대상체 세포 (특히 근육 세포 또는 조직)에 치료학적 유효량의 도입하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. ceDNA 벡터는 담체의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는데 유용한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는 대상체에 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 상기 제공된 임의의 적합한 경로 및 본원의 다른 곳을 통해 투여될 수 있다.
X. 치료 방법
본원에 기재된 기술은 또한, 예를 들어, 현장외(ex situ), 시험관내 및 생체내 적용, 방법, 진단 절차 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 개시된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 사용하는 방법뿐만 아니라 제조 방법을 입증한다.
선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 치료적 유효량을 대상체의 이를 필요로 하는 표적 세포 (예를 들어, 근육 세포 또는 조직, 또는 다른 병든 세포 유형)에 도입하는 것을 포함하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. ceDNA 벡터는 담체의 존재하에 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는데 유용한 관심 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 대상체에 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 원하는 폴리펩티드, 단백질 또는 올리고뉴클레오티드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 원하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 상기 제공된 임의의 적합한 경로 및 본원의 다른 곳을 통해 투여될 수 있다.
본원에는 본 발명의 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 중 하나 이상을, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 완충제, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 ceDNA 벡터 조성물 및 제형이 개시된다. 이러한 조성물은 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능 장애의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기 위한 하나 이상의 진단 또는 치료 키트에 포함될 수 있다. 일 측면에서, 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능 장애는 인간 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능 장애이다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 측면은 진단적 또는 치료적 유효량의 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체의 세포, 조직 또는 기관에, 본원에 개시된 바와 같은 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 양을; ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 발현을 가능하게 하기에 효과적인 시간 동안 제공하여 ceDNA 벡터에 의해 발현된 진단적 또는 치료적 유효량의 단백질, 펩티드, 핵산을 대상체에게 제공하는 단계를 포함한다. 추가 측면에서, 대상체는 인간이다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 측면은 대상체에서 질환, 장애, 기능 장애, 손상, 비정상적 상태 또는 외상의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 전체적이고 일반적인 의미에서, 상기 방법은 적어도, 이를 필요로 하는 대상체에게 하나 이상의 개시된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를, 상기 대상체의 질환, 장애, 기능 장애, 손상, 비정상적 상태 또는 외상의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하기에 충분한 양으로 그리고 시간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 추가 측면에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 측면은 질환 또는 질환 상태의 하나 이상의 증상을 치료 또는 감소시키기 위한 도구로서 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 사용하는 것이다. 결함이 있는 유전자가 알려져 있고, 전형적으로 다음의 두 가지 등급으로 분류되는 수많은 유전 질환이 있다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 일반적으로 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질을 포함할 수 있고, 전형적으로 우세 방식으로 유전되지만 항상 그런 것은 아닌 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 사용하여 이식유전자를 전달하여 대체 요법을 위해 정상 유전자를 병든 조직으로 가져오고, 또한, 일부 구현예에서, 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생성할 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 사용하여 모델 시스템에서 질환 상태를 생성한 다음 질병 상태를 저지하기 위한 노력에 사용할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 및 방법은 유전자 질환의 치료를 허용한다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환 상태는 질환을 유발하거나 더 심각하게 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 개선함으로써 치료된다.
A. 숙주 세포:
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 이식유전자를 대상체 숙주 세포 내로 전달한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는, 예를 들어 혈액 세포, 줄기세포, 조혈 세포, CD34+ 세포, 간 세포, 암 세포, 혈관 세포, 근육 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 눈 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상 세포, 섬유 모세포, 또는, 제한 없이, 간(hepatic) (즉, 간(liver)) 세포, 폐 세포, 심장 세포, 췌장 세포, 장 세포, 횡격막 세포, 신장(renal) (즉, 신장(kidney)) 세포, 신경 세포, 혈액 세포, 골수 세포, 또는 유전자 요법이 고려되는 대상체의 임의의 하나 이상의 선택된 조직을 포함하는 포유동물 기원의 임의의 다른 세포를 포함하는 인간 숙주 세포이다. 일 측면에서, 본 발명의 숙주 세포는 인간 숙주 세포이다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 포함하여, 상기 언급된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 숙련가에게 명백한 목적에 따라 다수의 숙주 세포를 사용할 수 있다. 공여체 서열을 포함하는 작제물 또는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터가 숙주 세포 내로 도입되어 공여체 서열이 전술한 바와 같이 염색체 구성 요소로 유지된다. 용어 숙주 세포는 복제 동안 발생하는 돌연변이로 인해 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다. 숙주 세포의 선택은 공여체 서열 및 그 공급원에 크게 좌우될 것이다. 숙주 세포는 또한 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 인간 세포 (예를 들어, 1차 세포, 줄기세포 또는 불멸화된 세포주)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 생체 외에서 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 투여한 후 유전자 요법 사건 후 대상체에게 전달될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형, 예를 들어, 체세포 또는 줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포, 또는 혈액 세포, 예를 들어, T-세포 또는 B-세포, 또는 골수 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 동종이계 세포이다. 예를 들어, T-세포 게놈 조작은 암 면역요법, HIV 요법과 같은 질환 조절 (예를 들어, 수용체 녹아웃, 예컨대 CXCR4 및 CCR5) 및 면역결핍 요법에 유용하다. B-세포 상의 MHC 수용체는 면역요법에 대해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 숙주 세포, 예를 들어, 골수 줄기세포, 예를 들어, CD34+ 세포, 또는 유도된 다능성 줄기세포는 치료 단백질의 발현을 위해 환자에게 다시 이식될 수 있다.
B. ceDNA 벡터로 치료될 예시적인 이식유전자 및 질환
본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터는 또한 결함 유전자를 교정하는데 유용하다. 비제한적인 예로서, Duchene Muscular Dystrophy의 DMD 유전자는 본원에 개시된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 사용하여 전달될 수 있다.
합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 또는 이의 조성물은 임의의 유전 질환의 치료에 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 또는 이의 조성물은 예를 들어 돌연변이 단백질이 신경, 심장, 위장 시스템 등에서 미스폴딩되고 응집되는 희귀 질환(orphan disease)인, 트랜스티레틴 아밀로이드증 (ATTR)의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 시스템을 사용하여 돌연변이 질환 유전자 (mutTTR)를 결실시킴으로써 질환을 치료할 수 있는 것으로 고려된다. 유전성 질환의 이러한 치료는 질환 진행을 중단시킬 수 있고 확립된 질환의 퇴행 또는 질환의 적어도 하나의 증상의 적어도 10% 감소를 가능하게 할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 또는 이의 조성물은 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍증 (OTC 결핍증), 고암모니아혈증 또는 다른 요소 주기 장애의 치료에 사용될 수 있으며, 이는 신생아 또는 영아의 암모니아 해독 능력을 손상시킨다. 모든 선천성 대사 질환에서와 같이, 야생형 대조군과 비교하여 효소 활성의 부분적인 회복 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)조차도 OTC 결핍증을 갖는 대상체에 대해 적어도 하나의 증상 OTC의 감소 및/또는 삶의 질 개선을 위해 충분할 수 있음이 본원에 고려된다. 일 구현예에서, OTC를 인코딩하는 핵산은 생체내 단백질 대체를 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 또는 이의 조성물은 페닐알라닌 하이드록실라제 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 전달하여 PKU 환자에게 유독할 수 있는, 식이 페닐알라닌의 축적을 감소시킴으로써 페닐케톤뇨증 (PKU)의 치료에 사용될 수 있다. 모든 선천성 대사 질환에서와 같이, 야생형 대조군과 비교하여 효소 활성의 부분적인 회복 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)조차도 PKU를 갖는 대상체에 대해 PKU의 적어도 하나의 증상의 감소 및/또는 삶의 질 개선을 위해 충분할 수 있음이 본원에 고려된다. 일 구현예에서, 페닐알라닌 하이드록실라제를 인코딩하는 핵산은 생체내 단백질 대체를 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 또는 이의 조성물은 글리코겐 저장병 (GSD)을 갖는 대상체에서 비정상 글리코겐 합성 또는 파괴를 교정하기 위해 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 전달함으로써 글리코겐 저장병 (GSD)의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 및 방법을 사용하여 전달되고 발현될 수 있는 효소의 비제한적인 예는 글리코겐 신타제, 글루코스-6-포스파타제, 산-알파 글루코시다제, 글리코겐 탈분지 효소, 글리코겐 분지 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라제, 간 글리코겐 포스포릴라제, 근육 포스포프럭토키나제, 포스포릴라제 키나제, 포도당 수송체-2 (GLUT-2), 알돌라제 A, 베타-에놀라제, 포스포글루코뮤타제-1 (PGM-1), 및 글리코게닌-1을 포함한다. 모든 선천성 대사 질환에서와 같이, 야생형 대조군과 비교하여 효소 활성의 부분적인 회복 (예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%)조차도 GSD를 갖는 대상체에 대해 GSD의 적어도 하나의 증상의 감소 및/또는 삶의 질 개선을 위해 충분할 수 있음이 고려된다. 일 구현예에서, 비정상 글리코겐 저장을 교정하기 위한 효소를 인코딩하는 핵산은 생체내 단백질 대체를 위해 알부민 내인성 프로모터 뒤에 삽입될 수 있다.
본원에 기재된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 또한 레베르 선천성 흑암시 (LCA), 폴리Q 반복부를 포함하는 폴리글루타민 질환, 및 알파-1항트립신 결핍증 (A1AT) 중 임의의 치료에 사용하기 위해 고려된다. LCA는 실명을 유발하는 희귀한 선천성 안과 질환으로, 이는 GUCY2D, RPE65, SPATA7, AIPL1, LCA5, RPGRIP1, CRX, CRB1, NMNAT1, CEP290, IMPDH1, RD3, RDH12, LRAT, TULP1, KCNJ13, GDF6 및/또는 PRPH2 중 임의의 하나의 유전자의 돌연변이에 의해 유발될 수 있다. 본원에 기재된 ceDNA 벡터 및 조성물 및 방법은 LCA의 증상을 담당하는 유전자(들)에서의 오류를 교정하기 위해 LCA와 관련된 하나 이상의 유전자의 전달에 적합할 수 있음이 고려된다. 폴리글루타민 질환은 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증 (dentatorubropallidoluysian atrophy), 헌팅턴병, 척수 및 구근 근위축증(spinal and bulbar muscular atrophy), 및 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia) 유형 1, 2, 3 (마카도-조셉 질환(Machado-Joseph disease)으로도 알려져 있음), 6, 7 및 17을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. A1AT 결핍은 알파-1항트립신의 결함 생성을 유발하여 혈액 및 폐에서 효소의 활성을 감소시키고, 결과적으로 병든 대상체에서 폐기종 또는 만성 폐쇄성 폐 질환을 유발할 수 있는 유전 장애이다. A1AT 결핍을 갖는 대상체의 치료는 본원에 개괄된 ceDNA 벡터 또는 이의 조성물을 사용하여 본원에서 구체적으로 고려된다. LCA, 폴리글루타민 질환 또는 A1AT 결핍의 치료를 위해 원하는 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 ceDNA 벡터는 치료를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있음이 본원에 고려된다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물은 바이러스 서열, 병원체 서열, 염색체 서열, 전위 접합(translocation junction) (예를 들어, 암과 관련된 전위), 비-코딩 RNA 유전자 또는 질환 관련 유전자인 RNA 서열 등에 전달되는데 사용될 수 있다.
관심있는 임의의 핵산 또는 표적 유전자는 본원에 개시된 바와 같은 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 의해 전달되고 발현될 수 있다. 표적 핵산 및 표적 유전자는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 비-코딩 핵산 (예를 들어, RNAi, miR 등) 바람직하게는 치료적 (예를 들어, 의학적, 진단적 또는 수의학적 용도를 위한) 또는 면역원성 (예를 들어, 백신을 위한) 폴리펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 관심있는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 의해 표적화되는 표적 핵산 또는 표적 유전자는 하나 이상의 폴리펩티드, 펩티드, 리보자임, 펩티드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩한다.
특히, 본원에 개시된 바와 같이 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 의한 발현에 대한 유전자 표적 또는 이식유전자는 질환, 기능 장애, 손상 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위해, 예를 들어, 비제한적으로, 단백질(들), 폴리펩티드(들), 펩티드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편, 뿐만 아니라 이의 변이체 및/또는 이의 활성 단편을 인코딩할 수 있다. 일 측면에서, 질환, 기능 장애, 외상, 손상 및/또는 장애는 인간 질환, 기능 장애, 외상, 손상 및/또는 장애이다.
발현 카세트는 또한, 폴리펩티드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 RNA (코딩 또는 비-코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 및 이들의 안티센스 대응물 (예를 들어, antagoMiR))를 인코딩할 수 있다. 발현 카세트는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 루시퍼라제, 및 당 업계에 잘 알려진 다른 것들과 같은 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 ceDNA 벡터의 발현 작제물인, 발현 카세트에 제공된 서열은 표적 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 천연 서열 (예를 들어, 원핵생물 서열)의 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당한 수의 코돈을 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 척추동물 세포, 예를 들어, 마우스 또는 인간의 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 최초 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어, Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼 (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
많은 유기체는 성장하는 펩티드 사슬에 특정 아미노산의 삽입을 코딩하기 위해 특정 코돈을 사용하기 위한 편향을 나타낸다. 유기체 간의 코돈 사용의 차이인, 코돈 선호도 또는 코돈 편향은 유전자 코드의 퇴화에 의해 제공되며, 많은 유기체 사이에 잘 기록되어 있다. 코돈 편향은 종종 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관 관계가 있으며, 이는 특히 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전이 RNA (tRNA) 분자의 유용성에 의존하는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
광범위한 동물, 식물 및 미생물 종에 이용 가능한 많은 유전자 서열을 고려할 때, 코돈 사용의 상대 빈도를 계산할 수 있다 (Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)).
본원에 언급된 바와 같이, 본원에 개시된 바와 같이 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 단백질 또는 펩티드, 또는 하나 이상의 작용제, 길항제, 항-아폽토시스 인자, 억제제, 수용체, 사이토카인, 세포독소, 적혈구 생성 촉진제, 당단백질, 성장 인자, 성장 인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터류킨, 인터류킨 수용체, 신경 성장 인자, 신경활성 펩티드, 신경활성 펩티드 수용체, 프로테아제, 프로테아제 억제제, 단백질 데카르복실라제, 단백질 키나제, 단백질 키나제 억제제, 효소, 수용체 결합 단백질, 수송 단백질 또는 이의 하나 이상의 억제제, 세로토닌 수용체 또는 이의 하나 이상의 흡수 억제제, 세르핀, 세르핀 수용체, 종양 억제제, 진단 분자, 화학요법제, 세포독소 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 치료 핵산 서열 또는 치료제를 인코딩할 수 있다.
합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 또한, 유전자 발현을 제거하는데 유용하다. 예를 들어, 일 구현예에서 ceDNA 벡터는 표적 유전자의 녹다운을 유도하도록 안티센스 핵산 또는 기능적 RNA를 발현시키는데 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, HIV 수용체인, CXCR4 및 CCR5의 발현은 1차 인간 T-세포에서 성공적으로 제거되었다, 그 전문이 본원에 참고로 포함된, Schumann et al. (2015), PNAS 112(33): 10437-10442를 참조한다. 표적화된 억제를 위한 또 다른 유전자는 PD-1이며, 여기서 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 PD-1의 발현을 억제하기 위해 억제 핵산 또는 RNAi 또는 기능적 RNA를 발현시킬 수 있다. PD-1은 악성 종양에서 발생하는 만성 활성 T 세포 상의 면역 체크포인트 세포 표면 수용체를 발현시킨다. 상기 Schumann 등 참고한다.
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 병든 유전자를 표적화하는 이식유전자를 발현시킴으로써 결함 유전자를 교정하는데 유용하다. 본원에 개시된 바와 같이 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애의 비제한적인 예는 그 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공보 2014/0170753의 이들의 및 이들의 관련 유전자와 함께 표 A-C에 열거되어 있다.
대안적인 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 세이프 하버 유전자, 예를 들어, 비활성 인트론에서 치료 단백질 또는 리포터 단백질의 발현을 위한 발현 카세트의 삽입에 사용된다. 특정 구현예에서, 프로모터가 없는 카세트가 세이프 하버 유전자에 삽입된다. 이러한 구현예에서, 프로모터가 없는 카세트는 세이프 하버 유전자 조절 요소 (프로모터, 인핸서 및 시그널링 펩티드)를 이용할 수 있으며, 세이프 하버 유전자좌에서의 삽입의 비제한적인 예는 하기에 기재된 알부민 유전자좌로의 삽입이다: Blood (2015) 126 (15): 1777-1784 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 알부민으로의 삽입은 이식유전자의 혈액으로의 분비를 가능하게 하는 이점이 있다 (예를 들어, 실시예 22 참조). 또한, 게놈 세이프 하버 부위는 당 업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 하기에 기재된 기술을 사용하여 결정될 수 있다: Papapetrou, ER & Schambach, A. Molecular Therapy 24(4):678-684 (2016) 또는 Sadelain et al. Nature Reviews Cancer 12:51-58 (2012) (이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 본원에서는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 게놈의 세이프 하버 부위 (예를 들어, AAVS1 세이프 하버 부위)는 본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다 (예를 들어, Oceguera-Yanez et al. Methods 101:43-55 (2016) 또는 Tiyaboonchai, A et al. Stem Cell Res 12(3):630-7 (2014) 참조, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고로 포함됨). 예를 들어, AAVS1 게놈 세이프 하버 부위는 배아 줄기세포 (예를 들어, 인간 배아 줄기세포) 또는 유도된 다능성 줄기세포 (iPS 세포)에서 조혈 특이적 이식유전자 발현 및 유전자 침묵의 목적으로 본원에 기재된 ceDNA 벡터 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 또한, 염색체 19 상의 AASV1 세이프 하버 부위에 삽입하기 위한 합성적 또는 상업적으로 이용 가능한 상동성-지정 복구 공여체 주형이 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 또는 조성물과 함께 사용될 수 있는 것으로 본원에 고려된다. 예를 들어, 상동성-지정 복구 주형, 및 가이드 RNA는, 예를 들어, 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 System Biosciences로부터 상업적으로 구입하여 ceDNA 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 이식유전자를 발현시키거나, T 세포에서 표적 유전자를 녹아웃하거나 또는 이의 발현을 감소시키는데, 예를 들어, 개선된 입양 세포 전달 및/또는 CAR-T 요법을 위해 T 세포를 조작하기 위해 사용된다 (예를 들어, 실시예 24 참조). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 유전자를 녹아웃하는 이식유전자를 발현시킬 수 있다. 치료적으로 적절한 T 세포의 녹아웃의 비제한적인 예는 하기에 기재되어 있다: PNAS (2015) 112(33):10437-10442 (이는 그 전문이 본원에 참고로 포함됨).
C. 유전자 요법을 위한 추가 질환:
일반적으로, 본원에 개시된 바와 같이 합성 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 관련된 증상을 치료, 예방 또는 개선하기 위해 상기 설명에 따라 임의의 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태는 낭포성 섬유증 (및 폐의 다른 질환), 혈우병 A, 혈우병 B, 지중해 빈혈, 빈혈 및 기타 혈액 장애, AIDS, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증, 간질 및 기타 신경계 장애, 암, 당뇨병, 근위축증 (예를 들어, 뒤센느, 베커), 헐러병(Hurler's disease), 아데노신 데아미나제 결핍, 대사 결함, 망막 퇴행성 질환 (및 눈의 다른 질환), 미토콘드리아증 (예를 들어, 레버의 유전성 시신경병증 (LHON), 리 증후군 및 아급성 경화성 뇌병증), 근병증 (예를 들어, 안면견갑상완 근병증 (FSHD) 및 심근병증), 고형 장기 (예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장) 질환 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 대사 장애 (예를 들어, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍)를 갖는 개체의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 유전자 또는 유전자 산물에서의 돌연변이에 의해 야기된 질환 또는 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터로 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애는 대사 질환 또는 장애 (예를 들어, 파브리병, 고셔병, 페닐케톤뇨증 (PKU), 글리코겐 저장병); 우레아 사이클 질환 또는 장애 (예를 들어, 오르니틴 트랜스카바밀라제 (OTC) 결핍); 리소좀 저장 질환 또는 장애 (예를 들어, 이염성백질디스트로피 (MLD), 점막다당류증 II형 (MPSII; 헌터 증후군)); 간 질환 또는 장애 (예를 들어, 진행 가족성 간내담즙정체 (PFIC); 혈액 질환 또는 장애 (예를 들어, 혈우병 (A 및 B), 지중해 빈혈 및 빈혈); 암 및 종양, 및 유전 질환 또는 장애 (예를 들어, 낭포성 섬유증)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면으로서, 본원에 개시된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 이식유전자 발현 수준 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 호르몬 또는 성장 인자를 인코딩하는 이식유전자)을 조절하는 것이 바람직한 상황에서 이종 뉴클레오티드 서열을 전달하는데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 질환 또는 장애를 초래하는 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능 (예를 들어, 단백질의 부재 또는 결함)을 교정하는데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터는 기능성 단백질을 생성하고/하거나 단백질의 수준을 변형시켜 단백질에서 부재 또는 결함에 의해 야기되는 특정 질환 또는 장애로 인한 증상을 완화시키거나 감소시키거나 상기 특정 질환 또는 장애에 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, OTC 결핍의 치료는 기능성 OTC 효소를 생성함으로써 달성될 수 있으며; 혈우병 A 및 B의 치료는 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X의 수준을 변형시킴으로써 달성될 수 있으며; PKU의 치료는 페닐알라닌 하이드록실라제 효소의 수준을 변형시킴으로써 달성될 수 있으며; 파브리병 또는 고셔병의 치료는 각각 기능성 알파 갈락토시다제 또는 베타 글루코세레브로시다제를 생성함으로써 달성될 수 있으며; MLD 또는 MPSII의 치료는 각각 기능성 아릴설파타제 A 또는 이듀로네이트-2-설파타제를 생성함으로써 달성될 수 있으며; 낭포성 섬유증의 치료는 기능성 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절제를 생성함으로써 달성될 수 있으며; 글리코겐 저장병의 치료는 기능적 G6Pase 효소 기능을 회복시킴으로써 달성될 수 있으며; PFIC의 치료는 기능적 ATP8B1, ABCB11, ABCB4 또는 TJP2 유전자를 생성함으로써 달성될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 안티센스 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 세포에 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이식유전자이 RNAi 분자인 경우, 표적 세포에서 안티센스 핵산 또는 RNAi의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, RNAi 분자 또는 안티센스 핵산인 이식유전자는 이를 필요로 하는 대상체에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어, 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관내에서 세포에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 예시적인 이식유전자는 X, 리소좀 효소 (예를 들어, 테이-삭스병과 관련된 헥소사미니다제 A, 또는 헌터 증후군/MPS II와 관련된 이듀로네이트 설파타제), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 초산화물 디스뮤타제, 글로빈, 렙틴, 카탈라제, 티로신 하이드록실라제, 및 사이토카인 (예를 들어, 인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨 12, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림프독소 등), 펩티드 성장 인자 및 호르몬 (예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유 모세포 성장 인자 (FGF), 신경 성장 인자 (NGF), 신경 영양 인자-3 및 4, 뇌-유래 신경 영양 인자 (BDNF), 신경교 유래 성장 인자 (GDNF), 형질전환 성장 인자-α 및 -β 등), 수용체 (예를 들어, 종양 괴사 인자 수용체)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 예시적인 구현예에서, 이식유전자는 하나 이상의 원하는 표적에 특이적인 모노클로날 항체를 인코딩한다. 일부 예시적인 구현예에서, 하나 초과의 이식유전자는 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 예시적인 구현예에서, 이식유전자는 2개의 상이한 관심 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 본원에 정의된 바와 같이, 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 바와 같이, 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다. 다른 예시적인 이식유전자 서열은 자살 유전자 산물 (티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나제, 및 종양 괴사 인자), 암 요법에 사용되는 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질, 및 종양 억제 유전자 산물을 인코딩한다.
대표적인 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터에 의해 발현된 이식유전자는 근위축증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 근위축증의 치료에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 본원에 기재된 치료-, 개선- 또는 예방-유효량의 ceDNA 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 ceDNA 벡터는 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴, 액티빈 II형 가용성 수용체, IGF-1, 항염증성 폴리펩티드, 예컨대 Ikappa B 우성 돌연변이체, 사르스코판, 우트로핀, 마이크로-디스트로핀, 라미닌-α2, α-사르코글리칸, β-사르코글리칸, γ-사르코글리칸, δ-사르코글리칸, IGF-1, 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편, 및/또는 미오스타틴에 대한 RNAi를 인코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 혈액에서 정상적으로 순환하는 폴리펩티드 (예를 들어, 효소) 또는 기능성 RNA (예를 들어, RNAi, 마이크로RNA, 안티센스 RNA)의 생성, 또는 장애 (예를 들어, 대사 장애, 예컨대 당뇨병 (예를 들어, 인슐린), 혈우병 (예를 들어, VIII), 무코다당류 장애 (예를 들어, Sly 증후군, 헐러 증후군, 샤이 증후군(Scheie Syndrome), 헐러-샤이 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군(Sanfilippo Syndrome) A, B, C, D, 모르키오 증후군(Morquio Syndrome), 마로토-라미 증후군(Maroteaux-Lamy Syndrome) 등) 또는 리소좀 저장 장애 (예컨대 고셔병 [글루코세레브로시다제], 폼페병 [리소좀산 .알파-글루코시다제] 또는 파브리병 [.알파-갈락토시다제 A]) 또는 글리코겐 저장 장애 (예컨대, 폼페병 [리소좀산 글루코시다제])를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 다른 조직으로 전신 전달하기 위해 골격, 심장 또는 횡격막 근육에 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 대사 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 다른 적합한 단백질이 상기 기재되어 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 이를 필요로 하는 대상체에서 대사 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 예시적인 대사 장애 및 폴리펩티드를 인코딩하는 이식유전자는 본원에 기재되어 있다. 선택적으로, 폴리펩티드는 분비된다 (예를 들어, 천연 상태의 분비된 폴리펩티드이거나, 예를 들어, 당 업계에 공지된 바와 같은 분비 신호 서열과의 작동 가능한 회합에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩티드).
본 발명의 또 다른 측면은 이를 필요로 하는 대상체에서 선천성 심부전 또는 PAD를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 ceDNA 벡터는, 예를 들어, 근형질 내부 세망(sarcoplasmic endoreticulum) Ca2+-ATPase (SERCA2a), 혈관 신생 인자, 포스파타제 억제제 I (I-1), 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 억제 또는 우세-음성 분자, 예컨대 포스포람반 S16E, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, β2-아드레날린 수용체, .베타.2-아드레날린 수용체 키나제 (BARK), PI3 키나제, 칼사르칸, .베타.-아드레날린 수용체 키나제 억제제 (βARKct), 단백질 포스파타제 1의 억제제 1, S100A1, 파발부민, 아데닐릴 사이클라제 6형, 절단된 구성적 활성 βARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, 칼리크레인, HIF, 티모신-β4, mir-1, mir-133, mir-206 및/또는 mir-208과 같은 G-단백질 결합 수용체 키나제 2형 녹다운에 영향을 미치는 분자를 인코딩하는 이식유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 임의의 적합한 수단에 의해, 선택적으로 대상체가 흡입하는, ceDNA 벡터를 포함하는 호흡 가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여함으로써 대상체의 폐에 투여될 수 있다. 호흡 가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. ceDNA 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 적합한 수단, 예컨대 압력 구동식 에어로졸 분무기 또는 초음파 분무기를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,501,729 호를 참조한다. 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸도 마찬가지로 제약 분야에 공지된 기술에 의해 임의의 고체 미립자 의약 에어로졸 발생기로 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 CNS의 조직 (예를 들어, 뇌, 눈)에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 유전 장애, 신경퇴행성 장애, 정신 장애 및 종양을 포함하는, CNS 질환을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. CNS의 예시적인 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 카나반병(Canavan disease), 라이병(Leigh's disease), 레프숨병(Refsum disease), 투렛 증후군, 1차 측삭 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 진행성 근위축증, 피크병(Pick's disease), 근위축증, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 빈스완거병(Binswanger's disease), 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이 삭스병, 레쉬-나이안병(Lesch-Nyan disease), 간질, 뇌경색, 기분 장애 (예를 들어, 우울증, 양극성 정동 장애, 지속성 정동 장애, 2차 기분 장애)를 포함한 정신 장애, 조현병, 약물 의존성 (예를 들어, 알코올 중독 및 기타 물질 의존성), 신경증 (예를 들어, 불안, 강박 장애, 신체형 장애, 해리성 장애, 비탄, 산후 우울증), 정신병 (예를 들어, 환각 및 망상), 치매, 편집증, 주의력 결핍 장애, 정신성적 장애, 수면 장애, 통증 장애, 식이 또는 체중 장애 (예를 들어, 비만, 악액질, 신경성 식욕부진 및 폭식증(bulemia)) 및 CNS의 암 및 종양 (예를 들어, 뇌하수체 종양)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 안구 장애에는 망막, 후관(posterior tract) 및 시신경을 포함하는 안과 질환 (예를 들어, 망막색소변성증, 당뇨병성 망막병증 및 기타 망막 퇴행성 질환, 포도막염, 연령-관련 황반 변성, 녹내장)을 포함한다. 많은 안과 질환 및 장애는 3가지 유형의 징후 중 하나 이상과 관련이 있다: (1) 혈관 신생, (2) 염증 및 (3) 변성. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 항-혈관 신생 인자; 항염증 인자; 세포 변성을 지연시키거나, 세포 스페어링(cell sparing)을 촉진시키거나, 또는 세포 성장를 촉진시키는 인자 및 상기의 조합을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 당뇨병성 망막병증은 혈관 신생을 특징으로 한다. 당뇨병성 망막병증은 안구 내로 (예를 들어, 유리체에서) 또는 안구 주위로 (예를 들어, 서브-테논 부위에서) 하나 이상의 항-혈관 신생 인자를 전달함으로써 치료될 수 있다. 하나 이상의 신경 영양 인자는 또한 안구 내로 (예를 들어, 유리체 내로) 또는 안구 주위로 공동-전달될 수 있다. 본 발명의 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 추가의 안 질환은 지도모양 위축(geographic atrophy), 혈관 또는 "습성" 황반 변성, 스타가르트, 질환(Stargardt disease), 레베르 선천성 흑암시 (LCA), 어셔 증후군(Usher syndrome), 탄력섬유성 가황색종 (PXE), x-연관 망막색소변성증 (XLRP), x-연관 망막층간분리증 (XLRS), 맥락막결손, 레베르 유전성 시신경병증 (LHON), 아코마톱시아(Archomatopsia), 추체-간체 이영양증, 퓨크스 내피 각막 이영양증(Fuchs endothelial corneal dystrophy), 당뇨병성 황반 부종 및 안암 및 안 종양을 포함한다.
일부 구현예에서, 염증성 안 질환 또는 장애 (예를 들어, 포도막염)는 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 항염증 인자는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 안내 (예를 들어, 유리체 또는 전방) 투여에 의해 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 망막 변성을 특징으로 하는 안 질환 또는 장애 (예를 들어, 망막색소변성증)는 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 신경 영양 인자를 인코딩하는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 안내 (예를 들어, 유리체 투여)는 이러한 망막 변성-기반 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈관 신생 및 망막 변성 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성)을 모두 포함하는 질환 또는 장애는 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터로 치료될 수 있다. 연령-관련 황반 변성은 안구 내로 (예를 들어, 유리체) 하나 이상의 신경 영양 인자 및/또는 안구 내로 또는 안구 주위로 (예를 들어, 서브-테논 부위에서) 하나 이상의 항-혈관 신생 인자를 인코딩하는 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 투여함으로써 치료될 수 있다. 녹내장은 안압 증가 및 망막 신경절 세포의 손실을 특징으로 한다. 녹내장의 치료는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 세포를 흥분독성 손상으로부터 보호하는 하나 이상의 신경보호제의 투여를 포함한다. 따라서, 이러한 작용제는 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 길항제, 사이토카인 및 신경 영양 인자를 포함하며, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 사용하여 안내, 선택적으로적으로 유리체 내로 전달될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 발작을 치료하기 위해, 예를 들어 발작의 개시, 발병 또는 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 발작에 대한 치료적 치료의 효능은 행동 (예를 들어, 눈 또는 입의 전율, 틱(tics)) 및/또는 전기 촬영술(electrographic) 수단 (대부분의 발작은 현저한 전기 촬영술 이상을 갖는다)에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 또한 간질을 치료하는데 사용될 수 있으며, 이는 시간이 지남에 따라 다수의 발작으로 나타난다. 하나의 대표적인 구현예에서, 뇌하수체 종양을 치료하기 위해 소마토스타틴 (또는 이의 활성 단편)이 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 사용하여 뇌에 투여된다. 이 구현예에 따르면, 소마토스타틴 (또는 이의 활성 단편)을 인코딩하는 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 뇌하수체로의 미세주입에 의해 투여된다. 마찬가지로, 이러한 치료는 말단 비대증 (뇌하수체에서 비정상적인 성장 호르몬 분비)을 치료하는데 사용될 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같이 소마토스타틴의 핵산 (예를 들어, GenBank 수탁 번호 J00306) 및 아미노산 (예를 들어, GenBank 수탁 번호 P01166; 프로세싱된 활성 펩티드 소마토스타틴-28 및 소마토스타틴-14를 함유함) 서열. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 미국 특허 7,071,172에 기재된 바와 같은 분비 신호를 포함하는 이식유전자를 인코딩할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 생체내에서 대상체에게 전신 전달하기 위한 안티센스 RNA, RNAi 또는 다른 기능성 RNA (예를 들어, 리보자임)를 생성하기 위한 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터의 용도에 관한 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 안티센스 핵산, 리보자임 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,877,022에 기재된 바와 같음), 스플라이세오솜(spliceosome)-매개 트랜스-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA (Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; 미국 특허 번호 6,013,487; 미국 특허 번호 6,083,702 참조), 유전자 침묵을 매개하는 간섭 RNA (RNAi) (Sharp et al., (2000) Science 287:2431 참조) 또는 다른 "비-번역" RNA, 예컨대 "가이드" RNA (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; Yuan et al.의 미국 특허 번호 5,869,248) 등을 인코딩하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 리포터 폴리펩티드 (예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 알칼리성 포스파타제와 같은 효소)를 인코딩하는 이식유전자를 또한 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 실험 또는 진단 목적에 유용한 리포터 단백질을 인코딩하는 이식유전자는 β-락타마제, β-갈락토시다제 (LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼 라제 (CAT), 루시퍼라제 및 당 업계에 잘 알려진 다른 것들 중 어느 것으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 리포터 폴리펩티드를 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 진단 목적으로 또는 이들이 투여되는 대상체에서 ceDNA 벡터의 활성의 마커로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 상기 유전자좌와 재조합하는 이식유전자 또는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이 접근법은 숙주 세포에서 유전적 결함을 교정하는데 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터는, 예를 들어 백신 접종을 위해 대상체에서 면역원성 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있는 이식유전자를 포함할 수 있다. 이식유전자는 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스, gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등으로부터의 면역원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당 업계에 공지된 임의의 관심 면역원을 인코딩할 수 있다.
D. ceDNA 벡터를 사용한 성공적인 유전자 발현 시험
당 분야에 널리 공지된 분석법을 합성적으로 생산된 ceDNA에 의한 유전자 전달의 효율을 시험하는데 사용하고 시험관내 및 생체내 모델 모두에서 수행될 수 있다. 합성적으로 생산된 ceDNA에 의한 원하는 이식유전자의 녹인 또는 녹아웃은 원하는 이식유전자의 mRNA 및 단백질 수준을 측정함으로써 (예를 들어, 역전사 PCR, 웨스턴 블롯 분석, 및 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)) 당업자에 의해 평가될 수 있다. 합성적으로 생산된 ceDNA에 의한 핵산 변경 (예를 들어, 점 돌연변이 또는 DNA 영역의 결실)은 게놈 표적 DNA의 심층 시퀀싱에 의해 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA는, 예를 들어 형광 현미경 또는 발광 플레이트 판독기에 의해 리포터 단백질의 발현을 조사함으로써, 원하는 이식유전자의 발현을 평가하는데 사용될 수 있는 리포터 단백질을 포함한다. 생체내 적용의 경우, 단백질 기능 분석을 사용하여 유전자 발현이 성공적으로 이루어졌는지 확인하기 위해 주어진 유전자 및/또는 유전자 산물의 기능성을 시험할 수 있다. 예를 들어, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절 유전자 (CFTR)의 점 돌연변이는 음이온 채널을 통해 음이온 (예를 들어, Cl-)을 이동시키는 CFTR의 능력을 억제하고, 기능적 (즉, 비-돌연변이) CFTR 유전자를 ceDNA 벡터를 갖는 대상체에게 전달함으로써 교정될 수 있는 것으로 예상된다. ceDNA 벡터의 투여 후, 당업자는 CFTR이 전달되었고 발현되었는지를 결정하기 위해 음이온이 음이온 채널을 통해 이동하는 능력을 평가할 수 있다. 당업자는 시험관내 또는 생체내에서 단백질의 기능성을 측정하기 위한 최상의 시험을 결정할 수 있을 것이다.
세포 또는 대상체에서 ceDNA 벡터로부터 이식유전자의 유전자 발현의 효과는 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 10개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 20년 동안 지속되거나 영구적일 수 있음이 고려된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 카세트, 발현 작제물 또는 ceDNA 벡터의 이식유전자는 숙주 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"는 천연 서열 (예를 들어, 원핵생물 서열)의 적어도 하나, 하나 초과 또는 상당수의 코돈을 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 척추동물의 세포, 예를 들어 마우스 또는 인간 (예를 들어, 인간화된)의 세포에서 발현을 향상시키기 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은 예를 들어, Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼 (Aptagen, Inc.) 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.
XI. 투여
특정 구현예에서, 다양한 간격, 예를 들어, 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 하나 초과의 투여 (예를 들어, 2, 3, 4회 또는 그 이상의 투여)가 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입 (예를 들어, 에어로졸을 통한), 협측 (예를 들어, 설하), 질, 경막내, 안내, 경피, 내피내, 자궁 내 (또는 난(ovo) 내), 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내 (골격, 횡격막 및/또는 심장 근육으로의 투여 포함), 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소 (예를 들어, 기도 표면, 및 경피 투여를 포함하는 피부 및 점막 표면 모두에), 림프내 등, 및 직접 조직 또는 기관 주사 (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌에)를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 투여는 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부 및 눈으로 구성된 군으로부터 선택된 부위를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 대상체의 임의의 부위에 투여될 수 있다. 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 투여는 또한 종양 (예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 그 근처)으로의 투여일 수 있다. 임의의 경우에 가장 적합한 경로는 치료, 개선 및/또는 예방되는 상태의 성질 및 중증도 및 사용되는 특정 ceDNA 벡터의 성질에 따라 달라질 것이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터는 하나의 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터 (예를 들어 ceDNA 칵테일)에서 하나 초과의 이식유전자를 투여할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 골격근으로 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 투여는 사지 (예를 들어, 상완, 하완, 상부 다리 및/또는 하부 다리), 등, 목, 머리 (예를 들어, 혀), 흉부, 복부, 골반/회음 및/또는 손발가락의 골격근으로의 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 합성적으로 생산된 ceDNA는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류, (선택적으로 다리 및/또는 팔의 고립된 사지 관류; 예를 들어, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464), 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근으로 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 사지 관류, 선택적으로 고립된 사지 관류 (예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여에 의해 대상체 (예를 들어, DMD와 같은 근위축증을 갖는 대상체)의 사지 (팔 및/또는 다리)로 투여된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터는 "유체 역학" 기술을 사용하지 않고 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 폐쇄 말단 DNA 벡터의 심장 근육으로의 투여는 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 중격으로의 투여를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 정맥내 투여, 대동맥내 투여와 같은 동맥내 투여, 직접 심장 주사 (예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실) 및/또는 관상 동맥 관류에 의해 심장 근육으로 전달될 수 있다. 횡격막 근육으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근으로의 투여는 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복막내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 일 구현예에서, 투여는 평활근에 존재하고/하거나, 그 근처에 및/또는 평활근 상에 존재하는 내피 세포로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터는 골격근, 횡격막 근육 및/또는 심장 근육으로 투여된다 (예를 들어, 근이영양증 또는 심장병 (예를 들어, PAD 또는 울혈성 심부전)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해).
A. 생체외 치료
일부 구현예에서, 대상체로부터 세포를 제거하고, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터가 그 안에 도입되고, 이어서 세포는 대상체 내로 다시 교체된다. 생체외 치료를 위해 대상체로부터 세포를 제거한 후 대상체로 다시 도입하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346 참조; 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 포함됨). 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 또 다른 대상체 유래 세포, 배양 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원 유래 세포 내로 도입되고, 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터로 형질도입된 세포는 바람직하게는 약제학적 담체와 함께 "치료 적 유효량"으로 대상체에게 투여된다. 당업자는 치료 효과가 대상체에게 약간의 이점이 제공되는 한 완전하거나 치유력이 있을 필요는 없음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 바람직하게는, 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에서 생산된 임의의 폴리펩티드인 이식유전자 (때로는 이종 뉴클레오티드 서열이라고도 함)을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본원에 이전에 논의된 바와 같은 치료 방법에서 ceDNA 벡터의 사용과 대조적으로, 일부 구현예에서 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는, 예를 들어, 항원 또는 백신의 생산을 위해 배양 세포 및 이로부터 단리된 발현된 유전자 산물 내로 도입될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 수의학 및 의학적 용도로 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 생체외 유전자 전달 방법에 적합한 대상체는 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유동물 (예를 들어, 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개 및 토끼목) 둘 다를 포함하며, 포유동물이 바람직하다. 인간 대상체가 가장 바람직하다. 인간 대상체에는 신생아, 유아, 청소년 및 성인이 포함된다.
본원에 기재된 기술의 한 측면은 이식유전자를 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 시험관내 방법의 경우, 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 본원에 개시된 방법, 뿐만 아니라 당 업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 본원에 개시된 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 바람직하게는 생물학적-유효량으로 세포에 투여된다. 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터가 생체내 세포 (예를 들어, 대상체)로 투여되는 경우, ceDNA 벡터의 생물학적-유효량은 표적 세포에서 이식유전자의 형질도입 및 발현을 야기하기에 충분한 양이다.
B. 투여 범위
생체내 및/또는 시험관내 분석은 선택적으로 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 사용을 위한 최적의 투약 범위를 식별하는데 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 상태의 심각성에 따라 달라질 것이며, 당업자의 판단 및 각 대상체의 상황에 따라 결정되어야 한다. 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 유효 용량이 추론될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터는 원하는 조직의 세포를 형질감염시키고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기에 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용되는 투여 경로는 선택된 기관으로의 직접 전달 (예를 들어, 간으로의 문맥내 전달), 경구, 흡입 (비강내 및 기관내 전달 포함), 안내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 기타 모 투여 경로와 같이 상기 "투여" 섹션에서 상기에 기재된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 원하는 경우, 투여 경로를 조합할 수 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하기 위해 요구되는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 양의 용량은 핵산 투여 경로, 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료되는 특정 질환 또는 장애, 및 유전자(들), RNA 산물(들), 또는 생성된 발현 단백질(들)의 안정성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 몇몇 요인에 기초하여 변할 것이다. 당업자는 상기 언급된 인자, 및 당 업계에 잘 알려진 다른 인자에 기초하여 특정 질환 또는 장애를 갖는 환자를 치료하기 위한 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 용량 범위를 쉽게 결정할 수 있다.
투약 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 반복적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어, 수회 용량이 매일 투여될 수 있거나, 치료 상황의 긴급성으로 지시되는 바와 같이 용량을 비례적으로 감소시킬 수 있다. 당업자는 올리고 뉴클레오티드가 세포 또는 대상체에게 투여되는지에 관계없이 대상 올리고뉴클레오티드의 적절한 용량 및 투여 스케줄을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
"치료적 유효 용량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이고, 특정 적용에 따라 달라질 것이다 (신경 세포는 매우 소량을 필요로 하는 한편, 전신 주사는 다량을 필요로 할 것임). 예를 들어, 인간 대상체의 골격 또는 심장 근육으로의 생체내 직접 주사의 경우, 치료적 유효 용량은 약 1 μg 내지 100 g 정도의 ceDNA 벡터일 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터를 전달하기 위해 사용되는 경우, 치료적 유효 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 1 μg 내지 약 100 g의 벡터를 전달할 것으로 예상된다. 또한, 치료적 유효량은 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키지만, 유의미한 표적-외 그리고 유의미한 부작용을 일으키지 않는, 대상체에 영향을 줄 정도로 충분한 양의 이식유전자를 발현하는 ceDNA 벡터의 양이다.
약제학적으로-허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형은 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.
시험관내 형질감염의 경우, 세포 (1x106 세포)로 전달되는 본원에 기재된 바와 같이 합성 생산 방법에 의해 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터의 유효량은 0.1 내지 100 μg ceDNA 벡터, 바람직하게는 1 내지 20 μg, 보다 바람직하게는 1 내지 15 μg 또는 8 내지 10 μg 정도일 것이다. 더 큰 ceDNA 벡터는 더 높은 용량을 요구할 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 사용되는 경우, 효과적인 시험관내 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만 일반적으로 동일한 양의 ceDNA 벡터를 전달하도록 의도될 것이다.
치료는 단일 용량 또는 다중 용량의 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 초과의 용량이 대상체에게 투여될 수 있으며; 실제로, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터가 바이러스 캡시드의 부재로 인해 항-캡시드 숙주 면역 반응을 유발하고 유발하지 않기 때문에, 필요에 따라 다중 용량이 투여될 수 있고, 그것의 제형은 합성 생산으로 인해 원치 않는 세포 오염물을 함유하지 않는다. 이와 같이, 당업자는 적절한 용량의 수를 쉽게 결정할 수 있다. 투여되는 용량의 수는, 예를 들어, 1 내지 100, 바람직하게는 2 내지 20개 정도의 용량일 수 있다.
임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 본원에 기재된 바와 같은 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 투여에 의해 유발된 전형적인 항-바이러스 면역 반응의 부재 (즉, 캡시드 성분의 부재)는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터가 숙주에 여러 번 투여될 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 이종 핵산이 대상체에게 전달되는 경우의 수는 2 내지 10배 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배) 범위이다. 일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는 10회 넘게 대상체에게 전달된다.
일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 용량은 캘린더 일(calendar day) (예를 들어, 24시간 기간)당 1회 이하로 대상에게 투여된다. 일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 용량은 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 캘린더 일당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 용량은 캘린더 주(calendar week) (예를 들어, 7 캘린더 주)당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 용량은 격주 이내에 (예를 들어, 2 캘린더 주 주기 중 1회) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 용량은 캘린더 개월(calendar month)당 1회 이하로 (예를 들어, 30 캘린더 일 내에 1회) 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 용량은 6 캘린더 개월당 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터의 용량은 캘린더 년(calendar year) (예를 들어, 365일 또는 윤년에는 366일)당 1회 이하로 대상체에게 투여된다.
C. 단위 투여 형태
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약제학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 적합할 것이다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸에 의한 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경막내 또는 뇌실내 투여에 적합하다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다.
XII. 다양한 응용
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터 및 조성물은 상기 기재된 바와 같은 다양한 목적을 위한 이식유전자를 전달하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 단백질을 인코딩하거나 기능성 RNA일 수 있고, 일부 구현예에서 이는 연구 목적으로, 예를 들어, 표적 유전자의 기능을 연구하기 위한, 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이 또는 교정된 유전자 서열을 보유하는 체세포성 형질전환 동물 모델을 생성하기 위해 변형되는 단백질 또는 기능성 RNA일 수 있다. 또 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 단백질 또는 기능적 RNA를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 이식유전자는 포유동물 대상체에서 질환 상태의 치료, 개선 또는 예방에 유용한, 하나 이상의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩한다. 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 이식유전자는 비정상적인 유전자 서열과 관련된 질환을 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 투여되며, 이는 표적 유전자의 발현 결핍 또는 기능 장애 중 하나 이상을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 진단 및 스크리닝 방법에 사용하기 위해, 이식유전자가 세포 배양 시스템, 또는 대안적으로 형질전환 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현되는 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터가 구상된다.
본원에 기재된 기술의 또 다른 측면은 포유동물 세포 집단을 형질도입시키는 방법을 제공한다. 전체적이고 일반적인 의미에서, 본 방법은 적어도, 집단의 하나 이상의 세포에, 본원에 개시된 합성적으로 생산된 ceDNA 중 하나 이상의 유효량을 포함하는 조성물을 도입하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 하나 이상의 개시된 말단 패쇄 DNA 벡터을 포함하거나, 하나 이상의 추가 성분으로 제형화되거나, 또는 이들의 사용을 위한 하나 이상의 설명서와 함께 준비된 조성물, 및 치료 및/또는 진단 키트를 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이 합성 공정을 사용하여 생산된 ceDNA 벡터를 포함하는 말단 패쇄 DNA 벡터가 투여되는 세포는 신경 세포 (말초 및 중추 신경계 세포, 특히 뇌 세포 포함), 폐 세포, 망막 세포, 상피 세포 (예를 들어, 장 및 호흡기 상피 세포), 근육 세포, 수지상 세포, 췌장 세포 (섬 세포 포함), 간 세포, 심근 세포, 골 세포 (예를 들어, 골수 줄기세포), 조혈 줄기세포, 비장 세포, 각질 세포, 섬유 모세포, 내피 세포, 전립선 세포, 생식 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형일 수 있다. 대안적으로, 세포는 임의의 전구 세포일 수 있다. 추가의 대안으로서, 세포는 줄기세포 (예를 들어, 신경 줄기세포, 간 줄기세포)일 수 있다. 또 다른 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 더욱이, 세포는, 상기 나타낸 바와 같이, 임의의 기원의 종으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원은 하기 단락 중 임의의 단락에서 정의될 수 있다:
1. 다음을 포함하는 DNA 벡터를 제조하는 방법:
발현 카세트;
발현 카세트의 상류 (5'-말단) 상의 ITR;
발현 카세트의 하류 (3'-말단) 상의 ITR;
제한 엔도뉴클레아제가 발현 카세트의 원위에 있도록 ITR의 측면에 있는 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위
를 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물을, 제한 엔도뉴클레아제 부위에서 이중 가닥 DNA 작제물을 절단하여 DNA 작제물로부터의 제한 엔도뉴클레아제 부위 사이의 서열을 절제할 수 있는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 및
절제된 서열의 5' 및 3' 말단을 결찰하여 DNA 벡터를 형성하는 단계로서, 적어도 하나의 ITR은 변형된 ITR인, 상기 DNA 벡터 형성 단계.
2. 이중 가닥 DNA 작제물이 박미드, 플라스미드, 미니서클, 또는 선형 이중 가닥 DNA 분자인, 단락 1의 방법.
3. 발현 카세트의 상류에 있는 ITR은 야생형 ITR인, 단락 1-2 중 어느 하나의 방법.
4. 야생형 ITR은 서열 번호: 1, 2, 또는 5-14의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 3의 방법.
5. 발현 카세트의 하류에 있는 ITR은 변형된 ITR인, 단락 1-4 중 어느 하나의 방법.
6. 변형된 ITR은 서열 번호: 3의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 5의 방법.
7. 발현 카세트의 상류에 있는 ITR은 변형된 ITR인, 단락 1-2 중 어느 하나의 방법.
8. 변형된 ITR은 서열 번호: 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 7의 방법.
9. 발현 카세트의 하류에 있는 ITR은 야생형 ITR인, 단락 7-8 중 어느 하나의 방법.
10. 야생형 ITR은 서열 번호: 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 9의 방법.
11. ITR은 복제-적격인, 단락 1-10 중 어느 하나의 방법.
12, ITR은 AAV ITR인, 단락 1-11 중 어느 하나의 방법.
13. 발현 카세트는 시스-조절 요소를 포함하는, 단락 1-12 중 어느 하나의 방법.
14. 시스-조절 요소는 전사 후 조절 요소, 및 BGH poly-A 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 단락 13의 방법.
15. 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 단락 14의 방법.
16. 발현 카세트는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 추가로 포함하는, 단락 1-15 중 어느 하나의 방법.
17. 상기 발현 카세트는 서열 번호: 72, 서열 번호: 123 또는 서열 번호: 124, 서열 번호: 67 및 서열 번호: 68의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 16의 방법.
18. 상기 발현 카세트는 외인성 서열을 추가로 포함하는, 단락 1-17 중 어느 하나의 방법.
19. 외인성 서열은 적어도 2000 또는 5000개의 뉴클레오티드를 포함하는, 단락 1-18의 방법.
20. 외인성 서열은 단백질을 인코딩하는, 단락 19의 방법.
21. 외인성 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 단락 20의 방법.
22. DNA 벡터는 선형 및 연속 구조를 갖는, 단락 1-21 중 어느 하나의 방법.
23. 단락 1-22 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 DNA 벡터.
24. 단락 23의 DNA 벡터; 및 선택적으로, 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
25. 발현 카세트;
발현 카세트의 상류 (5'-말단) 상의 ITR;
발현 카세트의 하류 (3'-말단) 상의 ITR;
제한 엔도뉴클레아제가 발현 카세트의 원위에 있도록 ITR의 측면에 있는 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위
를 포함하는 DNA 벡터를 생성하기 위한 폴리뉴클레오티드로서, 적어도 하나의 ITR은 변형된 ITR인, 폴리뉴클레오티드.
26. 폴리뉴클레오티드는 박미드, 플라스미드, 미니서클, 또는 선형 이중 가닥 DNA 분자인, 단락 25의 폴리뉴클레오티드.
27. 발현 카세트의 상류에 있는 ITR은 야생형 ITR인, 단락 25-26 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
28. 야생형 ITR은 서열 번호: 2의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 27의 폴리뉴클레오티드.
29. 발현 카세트의 하류에 있는 ITR은 변형된 ITR인, 단락 25-28 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
30. 변형된 ITR은 서열 번호: 3의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 29의 폴리뉴클레오티드.
31. 발현 카세트의 상류에 있는 ITR은 변형된 ITR인, 단락 25-26 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
32. 변형된 ITR은 서열 번호: 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 31의 폴리뉴클레오티드.
33. 발현 카세트의 하류에 있는 ITR은 야생형 ITR인, 단락 31-32 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
34. 야생형 ITR은 서열 번호: 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 33의 폴리뉴클레오티드.
35. 야생형 ITR은 복제-적격인, 단락 25-34 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
36. ITR은 AAV ITR인, 단락 25-35 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
37. 발현 카세트는 시스-조절 요소를 포함하는, 단락 25-36 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
38. 시스-조절 요소는 전사 후 조절 요소, 및 BGH poly-A 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 단락 37의 폴리뉴클레오티드.
39. 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 단락 38의 폴리뉴클레오티드.
40. 발현 카세트는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 추가로 포함하는, 단락 25-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
41. 상기 발현 카세트는 서열 번호: 72, 서열 번호: 123 or 서열 번호: 124, 서열 번호: 67 및 서열 번호: 68의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 40의 폴리뉴클레오티드.
42. 상기 발현 카세트는 외인성 서열을 추가로 포함하는, 단락 25-41 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
43. 외인성 서열은 적어도 5000개의 뉴클레오티드를 포함하는, 단락 42의 폴리뉴클레오티드.
44. 외인성 서열은 단백질을 인코딩하는, 단락 43의 폴리뉴클레오티드.
45. 외인성 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 단락 44의 폴리뉴클레오티드.
46. DNA 벡터는 선형 및 연속 구조를 갖는, 단락 25-45 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드.
47. 5'에서 3'로 다음을 포함하는 단일 가닥 분자를 합성하는 단계:
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR;
헤어핀 서열;
안티센스 제2 ITR;
안티센스 발현 카세트 서열; 및
안티센스 제1 ITR;
단일 가닥 분자로부터 헤어핀 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계;
및 5' 및 3' 말단을 결찰하여 DNA 벡터를 형성하는 단계를 포함하는 DNA 벡터의 제조 방법으로서, 하나의 적어도 하나의 ITR은 변형된 ITR인, 방법.
48. 제1 ITR은 야생형 ITR인, 단락 47의 방법.
49. 야생형 ITR은 서열 번호: 2의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 48의 방법.
50. 제2 ITR은 변형된 ITR인, 단락 47-49 중 어느 하나의 방법.
51. 변형된 ITR은 서열 번호: 3의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 50의 방법.
52. 제1 ITR 상류는 변형된 ITR인, 단락 47의 방법.
53. 변형된 ITR은 서열 번호: 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 52의 방법.
54. 제2 ITR은 야생형 ITR인, 단락 52-53 중 어느 하나의 방법.
55. 야생형 ITR은 서열 번호: 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 54의 방법.
56. 야생형 ITR은 복제-적격인, 단락 47-55 중 어느 하나의 방법.
57. ITR은 AAV ITR인, 단락 47-56 중 어느 하나의 방법.
58. 발현 카세트는 시스-조절 요소를 포함하는, 단락 47-57 중 어느 하나의 방법.
59. 시스-조절 요소는 전사 후 조절 요소, 및 BGH poly-A 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 단락 58의 방법.
60. 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 단락 59의 방법.
61. 발현 카세트는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 추가로 포함하는, 단락 47-60 중 어느 하나의 방법.
62. 상기 발현 카세트는 서열 번호: 72, 서열 번호: 123 또는 서열 번호: 124, 서열 번호: 67 및 서열 번호: 68의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 61의 방법.
63. 상기 발현 카세트는 외인성 서열을 추가로 포함하는, 단락 47-62 중 어느 하나의 방법.
64. 외인성 서열은 적어도 2000개의 뉴클레오티드를 포함하는, 단락 63의 방법.
65. 외인성 서열은 단백질을 인코딩하는, 단락 63의 방법.
66. 외인성 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 단락 65의 방법.
67. DNA 벡터는 선형 및 연속 구조를 갖는, 단락 47-66 중 어느 하나의 방법.
68. 단락 47-67 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 DNA 벡터.
69. 다음을 포함하는 약제학적 조성물:
단락 68의 DNA 벡터; 및
선택적으로, 부형제.
70. 다음을 포함하는 DNA 벡터를 제조하는 방법:
제1 ITR을 포함하는 제1 단일 가닥 ITR 분자를 합성하는 단계;
제2 ITR을 포함하는 제2 단일 가닥 ITR 분자를 합성하는 단계;
발현 카세트 서열을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및
제1 ITR 분자의 5' 및 3' 말단을 이중 가닥 분자의 제1 말단에 결찰하고, 제2 ITR 분자의 5' 및 3' 말단을 이중 가닥 분자의 제2 말단에 결찰하여 DNA 벡터를 형성하는 단계.
71. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA 작제물로부터 이중 가닥 분자를 절제하여 제공되는, 단락 70의 방법.
72. 제1 ITR은 야생형 ITR인, 단락 70-71 중 어느 하나의 방법.
73. 야생형 ITR은 서열 번호: 2의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 72의 방법.
74. 제2 ITR은 변형된 ITR인, 단락 70-73 중 어느 하나의 방법.
75. 변형된 ITR은 서열 번호: 3의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 74의 방법.
76. 제1 ITR 상류는 변형된 ITR인, 단락 70-71 중 어느 하나의 방법.
77. 변형된 ITR은 서열 번호: 4의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 76의 방법.
78. 제2 ITR은 야생형 ITR인, 단락 76-77 중 어느 하나의 방법.
79. 야생형 ITR은 서열 번호: 1의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 78의 방법.
80. 야생형 ITR은 복제-적격인, 단락 70-79 중 어느 하나의 방법.
81. ITR은 AAV ITR인, 단락 70-80 중 어느 하나의 방법.
82. 발현 카세트는 시스-조절 요소를 포함하는, 단락 70-81 중 어느 하나의 방법.
83. 시스-조절 요소는 전사 후 조절 요소, 및 BGH poly-A 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 단락 82의 방법
84. 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 단락 83의 방법.
85. 발현 카세트는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 추가로 포함하는, 단락 70-84 중 어느 하나의 방법.
86. 상기 발현 카세트는 서열 번호: 72, 서열 번호: 123 or 서열 번호: 124, 서열 번호: 67 및 서열 번호: 68의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단락 70-85의 방법.
87. 상기 발현 카세트는 외인성 서열을 추가로 포함하는, 단락 70-86의 방법.
88. 외인성 서열은 적어도 2000개의 뉴클레오티드를 포함하는, 단락 70-87의 방법.
89. 외인성 서열은 단백질을 인코딩하는, 단락 88의 방법.
90. 외인성 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 단락 88의 방법.
91. DNA 벡터는 선형 및 연속 구조를 갖는, 단락 70-90 중 어느 하나의 방법.
92. 단락 70-91 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 DNA 벡터.
93. 단락 92의 DNA 벡터; 및
선택적으로, 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
94. 결찰 단계는 화학적 결찰을 포함하는, 단락 1-22, 47-67, 및 70-91 중 어느 하나의 방법.
95. 결찰 단계는 결찰-적격 단백질에 의한 결찰을 포함하는, 단락 1-22, 47-67, 및 70-91 중 어느 하나의 방법.
96. 결찰-적격 단백질은 AAV Rep인, 단락 95의 방법.
97. ITR은 서열 번호:101 및 서열 번호:102; 서열 번호:103, 및 서열 번호:104, 서열 번호:105, 및 서열 번호:106; 서열 번호:107, 및 서열 번호:108; 서열 번호:109, 및 서열 번호:110; 서열 번호:111, 및 서열 번호:112; 서열 번호:113 및 서열 번호:114; 및 서열 번호:115 및 서열 번호:116 or any of 서열 번호: 1-48 서열 번호: 165-187로 구성된 군으로부터 선택되거나 표 2, 4a, 4b 또는 5 중 어느 것에 열거된 서열로부터 선택된 한 쌍의 ITR로부터 선택되는, 단락 1, 25, 47, 및 70 중 어느 하나의 방법.
98. 본원에 개시된 하나 또는 방법의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 단리된 DNA 벡터.
99. 단락 1-22 중 어느 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 단리된 DNA 벡터.
100. 단락 1-22 중 어느 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 DNA 벡터.
101. 단락 47-67 중 어느 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 단리된 DNA 벡터.
102. 단락 47-67 중 어느 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 DNA 벡터.
103. 단락 70-96 중 어느 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된 단리된 DNA 벡터.
104. 단락 70-96 중 어느 하나의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 단리된 DNA 벡터.
105. 본원에 개시된 바와 같은 단리된 DNA 벡터를 포함하는 유전자 약.
106. 단락 23-46 중 어느 하나의 단리된 DNA 벡터를 포함하는 유전자 약.
107. 단락 97-103 중 어느 하나의 단리된 DNA 벡터를 포함하는 유전자 약.
실시예
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다. 본원에 기재된 바와 같은 합성 공정을 사용하여 생성된 ceDNA 벡터를 포함하는 DNA 벡터는 야생형 또는 변형 된 임의의 것을 포함하는 임의의 대칭 또는 비대칭 ITR 구성으로부터 구축될 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다. 본원에 기술된 ITR 및 하기 예시적인 방법을 사용하여 이러한 ceDNA 벡터의 활성을 구축하고 평가할 수 있다. 방법은 특정 ceDNA 벡터로 예시되지만, 이는 설명과 일치하여 임의의 ceDNA 벡터를 포함하는 임의의 DNA 벡터에 적용 가능하다.
실시예 1: 곤충 세포 기반 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 구축
비교 목적으로, 실시예 1은 곤충 세포 기반 방법 및 폴리 뉴클레오타이드 작 제물 주형을 사용하여 ceDNA 벡터의 생성을 기술하고, 또한 PCT/US18/49996의 실시예 1에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 실시예 1에 따른 본 발명의 ceDNA 벡터를 생성하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드 작제 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바쿨로바이러스일 수 있다. 이론에 제한되지 않고, 허용 숙주 세포에서, 예를 들어, Rep의 존재하에, 2개의 대칭 ITR 및 발현 작제물을 갖는 폴리뉴클레오티드 작제 주형 (여기서 ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열에 대해 변형됨)은 ceDNA 벡터를 생성하기 위해 복제된다. ceDNA 벡터 생산은 두 단계, 즉, 우선, Rep 단백질을 통한 주형 골격 (예를 들어 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큘로바이러스(baculovirus) 게놈 등)으로부터 주형의 절제 ("구조") 단계 및 둘째, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계를 거친다.
곤충 세포를 사용하는 방법에서 ceDNA 벡터를 생성하는 예시적인 방법은 본원에 기재된 ceDNA-플라스미드로부터의 방법이다. 도 1a 및 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오티드 작제 주형은 ITR 서열 사이에 다음을 갖는 좌측 변형된 ITR 및 우측 변형된 ITR 둘 모두를 포함한다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 이식유전자의 클로닝 부위; (iii) 전사 후 반응 요소 (예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소 (WPRE)); 및 (iv) 폴리아데닐화 신호 (예를 들어, 소 성장 호르몬 유전자 (BGHpA)로부터). 작제물 내의 특정 부위에 새로운 유전자 성분의 도입을 용이하게 하기 위해 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 (R1-R6) (도 1a 및 도 1b에 도시됨)가 또한 각 성분 사이에 도입되었다. R3 (PmeI) GTTTAAAC (서열 번호: 123) 및 R4 (PacI) TTAATTAA (서열 번호: 124) 효소 부위는 클로닝 부위로 조작되어 이식유전자의 오픈 리딩 프레임을 도입한다. 이들 서열을 ThermoFisher Scientific으로부터 입수한 pFastBac HT B 플라스미드 내로 클로닝하였다.
ceDNA-박미드의 생산:
DH10Bac 적격 세포 (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher)를 제조사의 지시에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 간의 재조합을 유도하여 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드 및 트랜스포사제 플라스미드의 유지 및 형질전환체를 위해 선택하는 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서 이. 콜라이(E. coli)에서의 청색-백색 스크리닝 (Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터 β-갈락토시다제 유전자의 α-상보성을 제공함)에 기초한 양성 선별을 스크리닝함으로써 재조합 박미드를 선별하였다. β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 콜로니를 선별하여 10 ml의 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-박미드를 이. 콜라이로부터 단리하고 FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포로 형질감염시켜 감염성 바쿨로바이러스를 생성하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 중의 50 ml의 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지 (PO 바이러스 함유)를 세포로부터 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 감염성 바쿨로바이러스 입자를 세포 또는 세포 잔해로부터 분리하였다.
선택적으로, 제1 세대의 바쿨로바이러스 (P0)는 50 내지 500 ml의 배지에서 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시킴으로써 증폭되었다. 세포가 직경 18-19 nm (나이브 직경 14-15 nm), 및 밀도 ~4.0E+6 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존력을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 궤도 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일에서 8일 사이에, 배지에서 P1 바쿨로바이러스 입자를 원심분리 후 수집하여 세포 및 잔해물을 제거한 다음 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.
시험 작제물을 포함하는 ceDNA-바쿨로바이러스를 수집하고 바쿨로바이러스의 감염성 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 2.5E+6 세포/ml에서 4 x 20 ml Sf9 세포 배양물을 다음 희석에서 P1 바쿨로바이러스로 처리하고: 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000, 25-27℃에서 인큐베이션하였다. 감염력은 4 내지 5일 동안 매일, 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화에 의해 결정되었다.
"Rep-플라스미드"는 Rep 78 (서열 번호: 131 또는 133) 또는 Rep68 (서열 번호: 130) 및 Rep52 (서열 번호: 132) 또는 Rep40 (서열 번호: 129)을 포함하는 pFASTBAC™-이중 발현 벡터 (ThermoFisher)에서 생성되었다. Rep-플라스미드를 제조자가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격 세포 (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells (Thermo Fisher)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바쿨로바이러스 셔틀 벡터 간의 재조합을 유도하여 재조합 박미드 ("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상의 이. 콜라이에서의 청색-백색 스크리닝 (Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터 β-갈락토시다제 유전자의 α-상보성을 제공함)을 포함하는 양성 선별에 의해 재조합 박미드를 선별하였다. 단리된 백색 콜로니를 선별하고 10 ml의 선별 배지 (LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라사이클린)에 접종하였다. 재조합 박미드 (Rep-박미드)를 이. 콜라이로부터 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 형질감염시켜 감염성 바쿨로바이러스를 생성하였다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 4일 동안 50 ml의 배지에서 배양하고, 감염성 재조합 바쿨로바이러스 ("Rep-바쿨로바이러스")를 배양물로부터 단리하였다. 선택적으로, 제1 세대의 렙-바쿨로바이러스 (P0)는 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 증폭되고 50 내지 500 ml의 배지에서 배양되었다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 배지에서 P1 바쿨로바이러스 입자를 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 공정에 의해 세포를 분리함으로써 수집하였다. Rep-바쿨로바이러스를 수집하고 바쿨로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 2.5x106 세포/mL에서 4 x 20 mL Sf9 세포 배양물을 다음 희석, 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000에서 P1 바쿨로바이러스로 처리하고, 인큐베이션하였다. 감염력은 4 내지 5일 동안 매일, 세포 직경 증가율 및 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화에 의해 결정되었다.
ceDNA 벡터 생성 및 특성화
(1) ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바쿨로바이러스를 함유하는 샘플 및 (2) 상기 기재된 Rep-바쿨로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를 각각 1:1000 및 1:10,000의 비율로 Sf9 세포의 새로운 배양액 (2.5E+6 세포/ml, 20ml)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동 감염 후 4-5일 후에, 세포 직경 및 생존력이 검출된다. 세포 직경이 ~70-80%의 생존력으로 18-20nm에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿은 먼저 물 또는 완충제 중 적절한 부피의 수성 매질에 재현탁된다. ceDNA 벡터는 Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜 (Qiagen, 컬럼당 처리되는 세포 펠릿 덩어리 0.2mg)을 사용하여 세포로부터 단리 및 정제되었다.
Sf9 곤충 세포로부터 생성되고 정제된 ceDNA 벡터의 수율은 260nm에서의 UV 흡광도에 기초하여 초기에 결정되었다. 정제된 ceDNA 벡터는 실시예 5에 기재된 전기 영동 방법론을 사용하여 적절한 폐쇄 말단 구성에 대해 평가될 수 있다.
실시예 2: 이중 가닥 DNA 분자로부터 절제를 통한 ceDNA 생산
이중 가닥 DNA 분자의 절제를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생성하는 하나의 예시적인 방법. 간략하게, ceDNA 벡터는 이중 가닥 DNA 작제물을 사용하여 생성될 수 있으며, 예를 들어, 도 7a-8e를 참조한다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 DNA 작제물은 ceDNA 플라스미드이고, 예를 들어, 2018년 12월 6일자로 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242의 도 6을 참조한다).
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 제조하기 위한 작제물은 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.
예시적인 목적으로, 실시예 3은 이 방법을 사용하여 생성된 예시적인 폐쇄 말단 DNA 벡터로서 ceDNA 벡터를 생성하는 것을 기술한다. 그러나, ITR 및 발현 카세트 (예를 들어, 이종 핵산 서열)를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 절제에 이어서 본원에 기재된 바와 같이 유리 3' 및 5' 말단의 결찰에 의해 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 시험관내 합성적 생산 방법을 설명하기 위해 ceDNA 벡터가 본 실시예에서 예시되어 있지만, 당업자는, 상기 예시된 바와 같이, 도기본(doggybone) DNA, 덤벨 DNA 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 원하는 폐쇄 말단 DNA 벡터가 생성되도록 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드 분자를 변형시킬 수 있음을 알고 있다. 실시예 3에 기재된 합성적 생산 방법에 의해 생성될 수 있는 예시적인 DNA 벡터는 "II D. 합성적 생산 방법을 사용하여 생성된 DNA 벡터", "III. 일반적인 ceDNA 벡터" 및 "IV. 예시적인 ceDNA 벡터"라는 제목의 섹션에서 논의된다.
상기 방법은 (i) 이중 가닥 DNA 작제물로부터 발현 카세트를 인코딩하는 서열을 절제하는 단계 및 (ii) 하나 이상의 ITR에서 헤어핀 구조를 형성하는 단계 및 (iii) 유리 5' 및 3' 말단을 결찰, 예를 들어, T4 DNA 리가아제에 의한 결찰에 의해 연결하는 단계를 포함한다.
이중 가닥 DNA 작제물은 5'에서 3' 순서로 제1 제한 엔도뉴클레아제 부위; 상류 ITR; 발현 카세트; 하류 ITR; 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 이후 이중 가닥 DNA 작제물을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시켜 제한 엔도뉴클레아제 부위의 양쪽에서 이중 가닥 파괴물을 생성한다. 하나의 엔도뉴클레아제는 양쪽 부위를 표적화할 수 있거나, 제한 부위가 ceDNA 벡터 주형에 존재하지 않는 한 각각의 부위는 상이한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있다. 이는 나머지 이중 가닥 DNA 작제물로부터 제한 엔도뉴클레아제 부위들 사이의 서열을 절제한다 (도 9 참조). 결찰될 때 폐쇄 말단 DNA 벡터가 형성된다.
본 방법에 사용된 ITR 중 하나 또는 둘 다는 야생형 ITR일 수 있다. 변형된 ITR이 또한 사용될 수 있으며, 여기서 변형은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있고 (예를 들어, 도 6-8 및 10 참조), 2개 이상의 헤어핀 루프 (예를 들어, 도 6-8 참조) 또는 단일 헤어핀 루프 (예를 들어, 도 10a-10b 참조)를 가질 수 있다. 헤어핀 루프 변형된 ITR은 기존 올리고의 유전자 변형에 의해 또는 새로운 생물학적 및/또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
비제한적인 예로, 도 10a-10b에 제공된 ITR-6 좌측 및 우측 (서열 번호: 111 및 112)은 AAV2의 야생형 ITR로부터의 B-B' 및 C-C' 아암 내 40개의 뉴클레오티드 결실을 포함한다. 변형된 ITR에 남아있는 뉴클레오티드는 단일 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예측된다. 폴딩되지 않은 구조의 깁스 자유 에너지는 약 -54.4 kcal/mol이다. 기능적 Rep 결합 부위 또는 Trs 부위의 선택적 결실을 포함하여 ITR에 대한 다른 변형이 또한 이루어질 수 있다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드 구축을 통한 ceDNA 생산
다양한 올리고뉴클레오티드의 조립을 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생성하는 또 다른 예시적인 방법이 제공된다. 이 실시예에서, ceDNA 벡터는 5' 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를 합성하고 ITR 올리고뉴클레오티드를, 발현 카세트를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰함으로써 생성된다. 도 11b는 5' ITR 올리고뉴클레오티드 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드를, 발현 카세트를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰하는 예시적인 방법을 도시한다.
예시적인 목적으로, 실시예 3은 이 방법을 사용하여 생성된 예시적인 폐쇄 말단 DNA 벡터로서 ceDNA 벡터를 생성하는 것을 기술한다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트 (예를 들어, 이종 핵산 서열)를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 ITR-올리고뉴클레오티드를 결찰함으로써 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 시험관내 합성적 생산 방법을 예시하기 위해 ceDNA 벡터가 본 실시예에서 예시되어 있지만, 당업자는, 상기 예시된 바와 같이, 도기본 DNA, 덤벨 DNA 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 원하는 폐쇄 말단 DNA 벡터가 생성되도록 본 방법의 파라미터를 변형시킬 수 있음을 알고 있다. 실시예 3에 기재된 합성적 생산 방법에 의해 생성될 수 있는 예시적인 DNA 벡터는 "II D. 합성적 생산 방법을 사용하여 생성된 DNA 벡터", "III. 일반적인 ceDNA 벡터" 및 "IV. 예시적인 ceDNA 벡터"라는 제목의 섹션에서 논의된다.
ITR 올리고뉴클레오티드는 임의의 DNA 합성 방법 (예를 들어, 시험관내 DNA 합성 방법)에 의해 제공될 수 있고, 유리 5' 말단 및 유리 3' 말단을 갖는 선형 분자로서 제공된다. ITR 올리고뉴클레오티드는 이차 염기쌍 구조 (예를 들어, 스템-루프 또는 헤어핀)를 형성할 수 있지만, 일차 구조는 선형 단일 가닥 분자이다. 표 7은 도 11에 예시된 바와 같이 이중 가닥 DNA 작제물의 5' 및 3'에 결찰될 수 있는 예시적인 ITR 올리고뉴클레오티드를 보여준다.
표 7
Figure pct00020
본원에 개시된 바와 같이, ITR 올리고뉴클레오티드는 WT-ITR (예를 들어, 도 6a, 도 6b 참조), 또는 변형된 ITR (예를 들어, 도 7a 및 도 7b 참조)을 포함할 수 있다. 변형된 ITR은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 무세포 합성에 사용되는 본원에 기재된 바와 같은 WT-ITR 또는 모드-ITR을 포함하는 ITR 올리고뉴클레오티드는 유전자 변형 또는 생물학적 및/또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 실시예 2 및 3에서 ITR 올리고뉴클레오티드는 본원에 논의된 바와 같이, 대칭 또는 비대칭 구성으로 WT-ITR 또는 변형된 ITR (모드-ITR)을 포함할 수 있다.
합성 공정의 일부로서, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 부위가 ITR의 스템 부분으로 도입될 수 있다. 도 6a-7e는 제한 엔도뉴클레아제 부위가 포함된 구현예를 포함하여, 예시적인 ITR 올리고뉴클레오티드 서열 및 구조를 제공한다.
발현 카세트를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 각각의 가닥 상에 유리 5' 및 3' 말단을 갖는 선형 분자로서 제공된다. 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 DNA 합성, PCR 사슬 조립, 또는 플라스미드 또는 다른 벡터로부터 이러한 분자를 절제함으로써 제공될 수 있다. 예를 들어 도 11b를 참조한다.
이후 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 5' 및 3' ITR 올리고뉴클레오티드와 순차적으로 또는 동시에 접촉시키고 ITR 올리고뉴클레오티드를 이중 가닥 폴리뉴클레오티드에 결찰하여 ceDNA 벡터를 형성한다. 표준 결찰 반응은, 예를 들어 T4 DNA 리가아제를 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 도 11b에 도시된 것과 같이, ITR 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 상보적인 오버행 및 이들의 말단이 제공될 수 있고/있거나 상보적인 오버행을 제공하기 위해 동일한 제한 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있다. 둔단 결찰도 수행될 수 있다.
분자는 단계적으로 조립될 수 있다. 예를 들어, 올리고를 어닐링 한 후 어닐링된 이중 가닥 올리고를 서로 결찰한다. 2개의 올리고 가닥을 어닐링하기 위해, 올리고는 적합한 완충액: 예를 들어 100 mM 칼륨 아세테이트; 30 mM HEPES, pH 7.5)에서 동일한 몰량으로 혼합되고, 2분 동안 94℃로 가열하고 서서히 냉각시킨다. 유의한 2차 구조가 없는 올리고의 경우, 냉각 단계는 샘플을 열 블록 또는 수조에서 실온으로 옮기는 것만큼 간단할 수 있다. 많은 2차 구조를 갖는 것으로 예측되는 올리고의 경우, 보다 점진적인 냉각/어닐링 단계가 유리하다. 이는 올리고 용액을 수조 또는 열 블록에 넣고 기계의 플러그를 뽑거나 전원을 끔으로써 수행된다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제가 없는 완충액에 희석되어 4℃에서 이중 가닥 어닐링된 형태로 저장될 수 있다.
실시예 4: 단일 가닥 DNA 분자를 통한 ceDNA 생산
합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생성하는 또 다른 예시적인 방법은 센스 발현 카세트 서열의 측면에 있고, 안티센스 발현 카세트의 측면에 있는 2개의 안티센스 ITR에 공유적으로 부착되는 2개의 센스 ITR을 포함하는 단일 가닥 선형 DNA를 사용하며, 이후 이 단일 가닥 선형 DNA의 말단을 결찰하여 폐쇄 말단 단일 가닥 분자를 형성한다. 하나의 비제한적인 예는 단일 가닥 DNA 분자를 합성 및/또는 생성하고, 분자의 일부를 어닐링하여 2차 구조의 하나 이상의 염기쌍 영역을 갖는 단일 선형 DNA 분자를 형성한 다음, 유리 5' 및 3' 말단을 서로 결찰하여 폐쇄된 단일 가닥 분자를 형성하는 것을 포함한다.
예시적인 목적으로, 실시예 4는 이 방법을 사용하여 생성된 예시적인 DNA 벡터로서 ceDNA 벡터를 생성하는 것을 기술한다. 그러나, 본원에 기재된 바와 같이 폐쇄 말단 DNA 벡터를 생성하기 위한 시험관내 합성적 생산 방법을 예시하기 위해 ceDNA 벡터가 본 실시예에서 예시되어 있지만, 당업자는, 상기 예시된 바와 같이, 도기본 DNA, 덤벨 DNA 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 임의의 원하는 폐쇄 말단 DNA 벡터가 생성되도록 본 방법의 파라미터를 변형시킬 수 있음을 알고 있다. 실시예 3에 기재된 합성적 생산 방법에 의해 생성될 수 있는 예시적인 DNA 벡터는 "II D. 합성적 생산 방법을 사용하여 생성된 DNA 벡터", "III. 일반적인 ceDNA 벡터" 및 "IV. 예시적인 ceDNA 벡터"라는 제목의 섹션에서 논의된다.
ceDNA 벡터의 제조를 위한 예시적인 단일 가닥 DNA 분자는 5'에서 3'로 다음을 포함한다:
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR;
안티센스 제2 ITR;
안티센스 발현 카세트 서열; 및
안티센스 제1 ITR.
실시예 4의 예시적인 방법에 사용하기 위한 단일 가닥 DNA 분자는 본원에 기재된 임의의 DNA 합성 방법, 예를 들어, 시험관내 DNA 합성에 의해 형성될 수 있거나, DNA 작제물 (예를 들어, 플라스미드)을 뉴클레아제로 절단하고 생성된 dsDNA 단편을 용융시켜 ssDNA 단편을 제공함으로써 제공된다.
어닐링은 온도를 센스 및 안티센스 서열 쌍의 계산된 용융 온도 아래로 낮춤으로써 달성될 수 있다. 용융 온도는 특정 뉴클레오티드 염기 함량 및 사용된 용액의 특성, 예를 들어, 염 농도에 의존한다. 임의의 주어진 서열 및 용액 조합에 대한 용융 온도는 당업자에 의해 쉽게 계산된다.
어닐링된 분자의 유리 5' 및 3' 말단은 서로 결찰되거나 헤어핀 분자에 결찰되어 ceDNA 벡터를 형성할 수 있다. 예시적인 적합한 결찰 방법 및 헤어핀 분자는 실시예 2 및 3에 기재되어 있다.
실시예 5: ceDNA의 정제 및/또는 이의 생성 확인
예를 들어, 실시예 1-4에 기재된 방법을 포함하여, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 임의의 DNA 벡터 산물은, 예를 들어, 불순물, 미사용 성분 또는 부산물을 숙련가에게 흔히 알려진 방법을 사용하여 제거하기 위해 정제될 수 있고; 및/또는 생성된 DNA 벡터 (이 경우에, ceDNA 벡터)가 원하는 분자임을 확인하기 위해 분석될 수 있다. DNA 벡터, 예를 들어, ceDNA의 정제를 위한 예시적인 방법은 Qiagen Midi Plus 정제 프로토콜 (Qiagen) 및/또는 겔 정제를 사용하는 것이다.
다음은 ceDNA 벡터의 정체(identity)를 확인하기 위한 예시적인 방법이다.
ceDNA 벡터는 도 4c에 도시된 바와 같이 비변성 또는 변성 조건하에서 아가로스 겔 전기영동에 의해 동정함으로써 평가될 수 있으며, 여기서 (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 변성 겔 대 비변성 겔 상에서 크기의 2배로 이동하는 특징적인 밴드의 존재 및 (b) 비절단 물질에 대한 변성 겔 상의 단량체 및 이량체 (2x) 밴드의 존재는 ceDNA 벡터의 존재의 특징이다.
단리된 ceDNA 벡터의 구조는 a) ceDNA 벡터 내에 단일 절단 부위만 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로스 겔 상에서 분별될 때 명확하게 보일 정도로 충분히 큰 생성 단편 (>800 bp)에 대해 선택된 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 정제된 DNA를 소화함으로써 추가로 분석되었다. 도 4c 및 4d에 도시된 바와 같이, 비-연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터 및 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 반응 생성물의 크기에 의해 구별될 수 있고, 예를 들어, 비-연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1kb 및 2kb 단편을 생성할 것으로 예상되고, 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 2kb 및 4kb 단편을 생성할 것으로 예상된다.
따라서, 단리된 ceDNA 벡터가 정의에 의해 요구되는 바와 같이 공유적으로 폐쇄 말단이라는 것을 정성적인 방식으로 입증하기 위해, 샘플을 단일 제한 부위를 갖는 것으로 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화하여, 바람직하게는 동일하지 않은 크기 (예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)의 2개의 절단 산물을 생성한다. 소화 및 변성 겔 (2개의 상보적 DNA 가닥을 분리함) 상에서 전기영동 후, 선형의 비공유적으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp 크기로 분해되며, 공유적으로 폐쇄된 DNA (즉, ceDNA 벡터)는, 2개의 DNA 가닥이 연결되고 현재 펼쳐져(unfolded) 길이가 2배 (단일 가닥을 통해)이므로 2배 크기 (2000 bp 및 4000 bp)로 분해될 것이다. 또한, DNA 벡터의 단량체, 이량체 및 n-머릭(meric) 형태의 소화는 다량체 DNA 벡터의 말단-대-말단 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 모두 분해될 것이다 (도 4c 참조).
본원에 사용된 문구 "비변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 동정을 위한 분석"은 제한 엔도뉴클레아제 소화를 수행한 후 소화 생성물의 전기영동 평가를 수행하여 ceDNA의 폐쇄 말단성(close-endedness)을 평가하기 위한 분석을 지칭한다. 하나의 이러한 예시적인 분석이 뒤따르지만, 당업자는 이 예에서 많은 당 업계 공지된 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x의 생성물을 생성하는 관심 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소로 선택된다. 이것은 비변성 겔과 변성 겔 상의 밴드를 분해한다. 변성 전에, 샘플에서 완충제를 제거하는 것이 중요한다. Qiagen PCR 클린-업 키트 또는 탈염 "스핀 컬럼", 예를 들어 GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25 컬럼이 엔도뉴클레아제 소화를 위해 당 업계에 공지된 일부 옵션이다. 분석은 예를 들어, i) 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)를 사용하여 DNA 소화시키고, 2) 예를 들어, Qiagen PCR 클린-업 키트에 적용하고, 증류수로 용리하고, iii) 10x 변성 용액 (10x = 0.5M NaOH, 10mM EDTA)을 첨가하고, 완충되지 않은 10X 염료를 첨가하고, NaOH 농도가 겔 및 겔 박스에서 균일하도록 보장하기 위해 1mM EDTA 및 200mM NaOH와 함께 사전 인큐베이션된 0.8 - 1.0% 겔 상에서 10X 변성 용액을 4x로 첨가하여 제조된 DNA 레더와 함께 분석하고, 1x 변성 용액 (50 mM NaOH, 1mM EDTA)의 존재하에 겔을 작동시키는 것을 포함한다. 당업자는 크기 및 원하는 결과 타이밍에 기초하여 전기영동을 작동시키기 위해 어떤 전압을 사용할 것인지 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수하고 1x TBE 또는 TAE로 중화시키고 1x SYBR Gold를 사용하여 증류수 또는 1x TBE/TAE로 옮긴다. 그런 다음 밴드를 예를 들어 Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain (DMSO 중 10,000X 농축물) 및 에피플루오레센트 빛(epifluorescent light) (청색) 또는 UV (312nm)로 시각화할 수 있다. 상기 겔-기반 방법은 ceDNA 벡터를 겔 밴드로부터 단리하고 그것이 재생되도록함으로써 정제 목적에 적합할 수 있다.
생성된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 하나의 예시적이고 비-제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교함으로써 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도를 기준으로 4μg의 ceDNA 벡터가 겔에 로딩되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1μg인 것으로 알려진 2kb 밴드에 해당하는 경우, 1μg의 ceDNA 벡터가 있으며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수재의 25%이다. 그런 다음 겔 상의 밴드 강도는 밴드가 나타내는 계산된 입력에 대해 플로팅되며, 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8kb이고, 절단된 비교 밴드가 2kb인 경우, 밴드 강도는 전체 입력의 25%로 플롯팅될 것이며, 이 경우 1.0μg 입력의 경우 .25μg일 것이다. ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플롯팅하면, 회귀선 방정식이 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산하는데 사용되고, 그런 다음 ceDNA 벡터로 표시되는 총 입력 백분율 또는 순도 백분율을 결정하는데 사용될 수 있다.
실시예 6: 합성 접근법을 사용한 ceDNA 벡터 구축
본원에 기재된 ceDNA 벡터의 합성적 구축의 일 예로서, 다음의 절차가 사용되었다. ceDNA 벡터의 개략도는 도 11a에 도시되어 있으며, 이는 관심 유전자 및 선택적으로 프로모터/인핸서, 전사 후 조절 요소, 및/또는 폴리아데닐화 서열을 갖는 카세트의 측면에 있는 헤어핀 루프 ITR을 보여준다. 간략하게, 구축 방법은 ceDNA 벡터를 올바르게 형성하도록 올바른 결찰을 용이하게 하기 위한 상보적인 돌출 DNA 말단을 갖는 ceDNA 벡터의 여러 세그먼트의 구축 (도 11a 및 도 11b 참조), 및 그 다음 원치 않는 결찰 산물을 제거하기 위한 정제를 수반하였다.
보다 상세하게는, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드는 (a) 원하는 ITR 구조 (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이) 및 (b) 카세트 올리고데옥시뉴클레오티드 ("올리고")로 조작된 제한 부위에서 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생성된 오버행에 상보적인 RPE 요소와 헤어핀 루프 서열 B 및 C 사이의 ITR 서열의 A-스템의 오버행 영역을 포함하는 각각의 ITR에 대해 설계되었으며, 여기서 오버행 영역들 사이의 결찰이 바람직하다. 2개의 ITR 올리고 각각의 오버행은 도 A(B)에서 각각 R1 및 R2로 표시되어 있다. 각각의 ITR 올리고는 겔 또는 컬럼 정제를 포함하고 물에서 최종 농도가 10 내지 100 μM 인 전통적인 방법을 사용하여 합성된 후, 95℃에서 2분 동안 어닐링하고 빙조에서 급속 냉각시켰다. 야생형 AAV2 ITR을 갖는 ceDNA 벡터를 구축하기 위해, 합성된 올리고데옥시뉴클레오티드는 다음과 같았다:
좌측 ITR ("좌측 올리고-1") (AvrII 제한 부위 절단 오버행에 상보적인 R1 오버행 포함):
5'CTAGGACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTC3' (서열 번호: 135) 및
우측 ITR (우측 올리고-2") (SbfI 제한 부위 절단 오버행에 상보적인 R2 오버행 포함):
5'GGACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTCCTGCA3' (서열 번호:136).
카세트 영역 (도 A(B)에서 "유전자 발현 단위"로 표시됨)은 임의의 전통적인 뉴클레오티드 구축 방법에 의해 제조될 수 있지만, 이 실시예에서는 플라스미드 생산 시스템을 사용하여 편리하게 제조되었다. CAG 프로모터, 녹색 형광 단백질 (GFP) 오픈 리딩 프레임, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 및 ITR D- 및 RPE 영역 (총괄하여, 서열 번호: 146)을 모 플라스미드 (서열 번호: 147)에 삽입하였다.
상보적인 오버행으로 인해, 유전자 발현 단위의 제한 부위 및 각각의 ITR 올리고 상의 오버행이 정확한 배향으로 유전자 발현 단위에 대한 ITR 올리고의 특이적 결찰을 용이하게 하기 위해 선택되었다. 이 특정 예에서, 오버행 영역은 좌측 ITR에서 5' 유전자 발현 단위 AvrII 절단으로 생성된 오버행에 상보적으로 설계되었다. 그러나, 좌측 ITR 올리고의 말단 잔기 자체는 AvrII 제한 부위를 구성하지 않으므로, 효소는 오버행을 절단하지 않는다. 동종이량체화의 경우, 올리고의 이러한 동일한 영역이 ApaLI 제한 부위를 형성하고, 따라서 ApaLI는 좌측 ITR 올리고의 원치 않는 동종이량체가 절단되어 이들의 단량체 상태로 되돌아 오는 것을 보장하는데 사용될 수 있다. 우측 ITR에서도 유사한 접근이 이루어졌으며, 여기서 오버행 영역은 유전자 발현 단위의 3' 말단에서 조작된 Sbf1 부위에서 절단에 의해 생성된 오버행에 상보적으로 설계되었다. 우측 ITR 올리고의 말단 영역은 SbfI에 의해 인식되지 않고, 대신에 올리고의 동종이량체화시 Nhe1 부위를 형성하도록 설계되어, 동종이량체화는 그 효소에 의한 절단에 의해 제어될 수 있다. 마지막으로, 제한 부위 DraIII 및 BsaI는 모 플라스미드 골격에서 고유한 부위로서 존재하고, 원치 않는 골격 단편의 제거를 용이하게 하기 위해 이용되었다. 이러한 다양한 제한 부위는 편의상 선택되었으며, 당업자는 이용 가능한 시약 및 기본 뉴클레오티드 작제물과 호환될 수 있는 동일한 결과를 달성하기 위해 제한 부위의 임의의 조합을 용이하게 조작할 수 있다.
유전자 발현 단위를 함유하는 플라스미드를 사용하여 이. 콜라이를 형질전환시키고, 플라스미드를 유지하기 위한 선택적 압력은 표준 기술을 사용하여 배지에 암피실린을 포함시킴으로써 유지되었다. 플라스미드 DNA는 DNA 추출 키트 (Qiagen) 및 제조업자가 권장하는 정제 방법을 사용하여 수거되었다. 플라스미드로부터 유전자 발현 단위의 절제 (도 12에 제시된 바와 같은 단계 1B)는 제한 엔도뉴클레아제 절단 단계에 의해 수행되었다. 100 μL 반응 용적에서, 20 pmol의 모 플라스미드를 3개의 제한 효소 AvrII, SbfI 및 ApaLI 각각 3%와 배합하였다. 반응물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
다음으로, ITR 올리고 및 유전자 발현 단위 DNA 세그먼트를 결찰하였다 (도 12의 단계 2). 400 μL의 총 용적까지, 20 pmol의 소화된 모 플라스미드 반응물 (100 μL)을 10%의 ATP-함유 결찰 완충액, 2% T4 DNA 리가아제, 및 이들 제한 엔도뉴클레아제: AvrII, SbfI, ApaLI, NheI 각각 2%와 함께, 좌측 및 우측 어닐링된 ITR 올리고머 각각 160 pmol과 배합하였다. 리가아제는 결찰을 초래한 한편, AvrII 및 SbfI 효소는 유전자 발현 단위가 동종이량체화되지 않았음을 보장하였고, ApaL1 및 NheI 효소는 ITR 올리고가 동종이량체화되지 않았음을 보장하였다. 반응물을 22℃에서 4시간 내지 16시간 인큐베이션한 다음 반응물을 65℃에서 20분 동안 가열하여 T4 DNA 리가아제를 불활성화시켰다.
반응물로부터 남아있는 모 플라스미드를 제거하기 위해, 혼합물을 모 플라스미드 골격에서만 절단되고 ITR 올리고 또는 유전자 발현 단위에서는 절단되지 않는 것으로 공지된 제한 엔도뉴클레아제 효소로 처리하였다 (도 12의 단계 3 참조). 따라서, 400 μL의 바로 직전 반응 혼합물을 10%의 제조업자 권장 제한 효소 완충액, 3%의 DraIII 제한 엔도뉴클레아제 효소 및 5%의 BsaI 제한 엔도뉴클레아제 효소와 수중 총 1 mL의 반응 용적까지 배합한다. 반응물을 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다.
이어서 원치 않는 미결찰 올리고 및 남아있는 모 플라스미드 골격 조각을 엑소뉴클레아제 소화에 의해 제거하였다 (도 12의 단계 4). 1 mL의 이전 반응물에 10%의 제조업자 권장 엑소뉴클레아제 반응 완충액, 10% ATP (10mM), 및 8% T5 엑소뉴클레아제 및 총 반응 용적이 5 mL가 되도록 하기에 충분한 물을 첨가하였다. 반응물을 37℃에서 1시간 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. T5 엑소뉴클레아제는 단일 가닥 DNA를 절단하므로 임의의 올리고 또는 미결찰 오버행을 갖는 골격 조각은 효소에 의해 소화된다.
반응물은 정제를 위한 준비로 DNA를 농축시키기 위해 에탄올 침전 (도 12의 단계 5)을 거쳤다. T5 엑소뉴클레아제 절단으로부터의 전체 5mL 반응 용적을 10% 3M 나트륨 아세테이트 및 용적으로 2.5배 에탄올과 12.5mL 초과의 총 반응 용적으로 배합하였다. 상기 혼합물을 -80℃에서 적어도 20분 동안 인큐베이션한 다음 4℃에서 원심분리하여 DNA를 펠렛화하였다. 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고 원심분리하여 재펠렛화하였다. 생성된 세척 DNA 펠렛을 1 mL 물에 재현탁시켰다. ceDNA 벡터를 표준 DNA 정제 실리카 컬럼 (Zymo Research)을 사용하여 정제하여 단백질 및 잔여 작은 DNA 단편을 제거하였다 (도 12의 단계 6).
생성된 정제된 WT/WT ITR ceDNA 벡터 샘플을 표준 래더(standard ladder)와 스파이킹하고 제조업자 권장 조건 및 키트 (Agilent Technologies, DNA-12000 Kit)를 사용하여 Bioanalyzer (Agilent Technologies)를 사용하여 분석하였다. 생성된 크로마토그래프는 도 13b에 도시되어 있다. 2개의 가장 큰 피크는 단량체 및 이량체 ceDNA 벡터의 예상 크기에 상응하고, 매우 작은 피크는 올리고 이량체의 예상 크기에서 보여졌으며, 이는 최종 정제 단계 후 전체 샘플이 실질적으로 순수한 ceDNA 벡터였음을 나타낸다. 크로마토그래프의 표로 나타낸 피크 데이터는 표 8에서 제공된다.
표 8: 도 13b의 크로마토그래프에 상응하는 피크 파라미터
Figure pct00021
Figure pct00022
이 방법은 상이한 ITR 올리고로 수차례 반복하여, 도 14a에 도시된 WT/돌연변이 ceDNA 벡터, 및 도 15a에 도시된 비대칭 돌연변이/돌연변이 ceDNA 벡터, 뿐만 아니라 ITR 쌍 각각의 맥락에서 녹색 형광 단백질보다는 유전자 발현 단위 카세트에 루시퍼라제를 포함하는 대안적인 ceDNA 벡터 변이체를 포함하여, 상이한 ceDNA 벡터의 합성적 생산을 초래하였다. GFP ceDNA 작제물에 대한 이들의 바이오분석기 결과가 각각 도 14b 및 도 15b에 도시되어 있으며, WT/WT ceDNA 벡터 샘플에 대해 수득된 것 (도 13b)과 매우 유사하였다. 각각에 대한 피크 데이터 표는 아래 표 9 및 표 10에 각각 제시되어 있다.
표 9: 도 14b의 크로마토그래프에 상응하는 피크 파라미터
Figure pct00023
Figure pct00024
표 10: 도 15b의 크로마토그래프에 상응하는 피크 파라미터
Figure pct00025
전통적인 Sf9 곤충 세포 방법에 의해 생성된 ceDNA 벡터 (WT/돌연변이) (도 16a도 바이오분석기 분석을 거쳤다. 크로마토그래프는 도 16b에 도시되어 있으며, 특히 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 분석에서 보이는 것보다 더 많은, 다량체 및 서브-단량체 피크를 포함하여, 몇 가지 추가의 ceDNA 종을 포함한다. 표 8-11의 피크 파라미터 데이터를 비교하여 알 수 있는 바와 같이, 합성적으로 생산된 샘플은 단량체 ceDNA 벡터가 65% 초과이고, 일부 경우에 단량체 ceDNA 벡터가 85% 초과인 반면, Sf9-생산된 ceDNA 벡터 샘플은 단량체 ceDNA 벡터가 35% 미만이고 샘플에 다수의 추가 ceDNA 벡터 종이 존재하였다.
표 11: 도 16b에 도시된 크로마토그래프에 상응하는 피크 파라미터 데이터.
Figure pct00026
Figure pct00027
수득된 ceDNA 벡터가 적절한 공유 폐쇄 말단 ceDNA 벡터 구조를 갖도록 하기 위해, 각각의 샘플을 ceDNA 벡터에서 단일 제한 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 바람직하게는 크기가 다른 두 개의 절단 생성물을 생성하였다. 소화 및 변성 겔 상에서 전기영동 후, 선형의 비-공유적으로 폐쇄된 DNA는 두 개의 예상되는 단편에 해당하는 크기로 겔에서 이동하는 밴드를 나타낼 것이다. 대신 선형의 공유적으로 폐쇄된 DNA (예컨대 ceDNA 벡터)는 2개의 DNA 가닥이 연결되어 있고, 절단될 때 폴딩되지 않고 길이가 2배가 되기 때문에 절단 생성물의 예상 크기의 2배로 이동하는 밴드를 가져야 한다. 또한, ceDNA 벡터의 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 소화는 이들 다량체 DNA 벡터의 말단 간 연결로 인해 모두 동일한 크기의 단편으로 분해될 것이다. 각각의 합성 및 Sf9-생산된 ceDNA 벡터가 이 겔 전기영동 방법에 의해 평가될 때, 각각의 샘플은 유사한 밴딩 패턴을 가졌으며, 이는 모든 ceDNA 벡터가 적절한 공유적으로 폐쇄 말단 구조를 가졌음을 나타낸다.
당업자는 모든 시약의 양이 원하는 양의 ceDNA 벡터를 생성하도록 조정될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 7: ceDNA 벡터는 세포에서 이식유전자를 발현시킨다
합성적으로 생산된 ceDNA 벡터가 전통적으로 Sf9-생산된 ceDNA 벡터와 유사하게 이식유전자를 발현시킬 수 있는지를 평가하기 위해, 배양된 세포에서 ceDNA 벡터의 발현을 형광 단백질 (GFP) 생성 및 형광 방출 수준으로 측정하였다. 인간 간 세포 (HepaRG 세포주, Lonza)를 7.5 x 104 세포/mL의 농도로 플레이팅하였다. 원하는 ceDNA 벡터를 제조업자의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 장치 (Nucleofector™, Lonza)를 사용하여 배양된 세포에 도입하였다. 각각의 작제물 150 ng/웰을 함유하는 16-웰 스트립을 20 μL의 용적으로 뉴클레오펙션하였다. 각 웰에서 최종 용적이 100 μL가 되도록 뉴클레오펙션된 샘플을 96-웰 플레이트의 각 웰 내의 80 μL의 배지에 첨가하였다. 뉴클레오펙션 24시간 후에 배지를 교체한 후, 주 2회 교체하였다. 도 14a에 도시된 ceDNA 벡터를 포함하는 플라스미드를 대조군으로 사용하였다. 각 배양물의 형광은 Essen Bioscience IncuCyte® 생세포 영상화 현미경을 사용하여 뉴클레오펙션 후 6일째에 측정되었다. 이 시스템은 인큐베이터 내부에 위치하고 원하는 시간 프레임에 걸쳐 세포의 시간 경과 단계 및 형광 사진을 자동으로 촬영한다.
결과는 도 17에 도시되어 있다. GFP의 표현은 밝은 흰색 반점으로 나타낸다. WT/돌연변이 ITR을 갖는 Sf9-생산된 ceDNA 벡터로 처리된 세포는 플라스미드-처리된 세포에서 보인 것과 유사한 GFP의 발현을 나타냈다. 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터 중 3개 모두 (WT/WT, WT/Mut, 및 비대칭 돌연변이)는 플라스미드 대조군 또는 전통적으로 Sf9-생산된 ceDNA 벡터보다 분석에서 더 큰 형광 및 반점 수를 나타냈다. 이러한 형광의 상대적 증가는 적어도 부분적으로 합성적으로 생산된 물질의 순도가 전통적으로 제조된 물질의 순도보다 더 높기 때문일 수 있다. 그 결과는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터가 전통적으로 Sf9-생산된 ceDNA 벡터보다 적어도 잘, 아마도 더 우수하게 인코딩된 이식유전자를 발현시키고, 따라서 합성적으로 생산된 물질이 예상대로 기능한다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 마우스에서 ceDNA 벡터로부터의 단백질 발현
상기 기재된 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터로부터 반딧불이 루시퍼라제 이식유전자의 생체내 단백질 발현을 마우스에서 생체내에서 전통적으로 생산된 동등한 ceDNA 벡터와 비교하여 평가하였다. 대략 4주령의 수컷 CD-1 IGS 마우스 (Envigo) 30마리에게 (a) LNP- Sf9-생산된 WT/Mut ceDNA, (b) LNP-Sf9-생산된 Mut/Mut (비대칭) ceDNA, (c) LNP-Sf9-생산된 WT/WT ceDNA 벡터, (d) LNP-합성 WT/WT ceDNA 벡터, (e) LNP-합성 WT/Mut ceDNA, 또는 (f) 대조군 LNP-Poly C의 5 mL/kg 용적에서 0.5 mg/kg의 단일 정맥내 투여가 제공되었다. 주사 후 28일 동안 마우스를 평가하고, 0일, 1일 및 28일에 전혈을 수집한다. 2.5 mL/kg의 복강내 주사를 통해 150 mg/kg (60 mg/mL)의 루시페린을 각각의 마우스에 투여함으로써 각각의 전체 마우스의 생체내 영상화 (IVIS)를 3, 7, 14, 21 및 28일에 수행하고, 필요에 따라 마우스 털 코트를 면도하였다. 각각의 루시페린 주사 후 15분 이내에, 각 마우스를 마취시키고 영상화한다. 28일에 동물을 종료시키고, 간 및 비장을 수집하고, IVIS에 의해 생체외에서 영상화하였다. 루시퍼라제 발현은 간 샘플의 루시퍼라제에 대한 루시퍼라제 ELISA 분석 (MAXDISCOVERY®, BIOO Scientific/PerkinElmer), 및 qPCR에 의해 이들 조직에서 추가로 평가된다.
3일 및 7일 IVIS 분석 결과는 도 18a 및 18b (7일 데이터)에 도시되어 있다. 각각의 ceDNA-처리된 마우스 그룹에서 현저한 형광이 배경 수준 이상으로 나타났다. 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터로 처리된 마우스에서 검출된 형광은 전통적으로 생산된 ceDNA로 처리된 마우스에서 검출된 형광보다 적어도 크며 일부 경우에는 더 컸다. 7일째 데이터와 관련하여 도 18b에 도시된 바와 같이, 형광의 대부분은 각 치료 그룹에 대해 예상되는 바와 같이 간에 국한되었다. 이 결과는 또한 합성 방법에 의해 제조된 ceDNA가 생체내에서 Sf9-생산된 ceDNA 벡터와 유사하게 기능한다는 것을 보여준다.
참조
본 출원 및 본원의 실시예에 인용된 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 간행물 및 참고 문헌은, 각각의 개별 간행물 또는 참고 문헌이 본 명세서에 완전히 제시된 것으로 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 그 전문이 참고로 포함된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허 출원도 간행물 및 참고 문헌에 대해 전술한 방식으로 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENERATION BIO INC. <120> CLOSED-ENDED DNA (CEDNA) VECTORS OBTAINABLE FROM CELL-FREE SYNTHESIS AND PROCESS FOR OBTAINING CEDNA VECTORS <130> 080170-091310-WOPT <140> <141> <150> 62/619,392 <151> 2018-01-19 <160> 187 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 2 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 3 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide 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polynucleotide <400> 52 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165 <210> 53 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc 60 cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg 120 cgcagagaga tcactagggg 140 <210> 54 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 54 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 55 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 55 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60 ccgggcggcc tcagtgagcg 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6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 rrttrr 6 <210> 67 <211> 581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60 ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120 actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240 aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300 attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360 ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581 <210> 68 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 68 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180 ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225 <210> 69 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 actgaggc 8 <210> 70 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 70 gcctcagt 8 <210> 71 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 71 gagcgagcga gcgcgc 16 <210> 72 <211> 1923 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 72 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg 540 cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 600 attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg 660 gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg 720 cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg 780 aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg 840 ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc 900 gggacggccc 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 77 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc 240 gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt 300 acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg 360 gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg 420 cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct 480 ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg 540 caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc 600 gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga 660 gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct 720 ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca 780 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gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215 <210> 82 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 82 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540 gaactg 546 <210> 83 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 83 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 300 tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 360 cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 420 ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 480 aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 540 gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag 576 <210> 84 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 84 ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc 60 gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct 120 gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct 150 <210> 85 <211> 1313 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 85 ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga 60 ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc 120 atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg 180 gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg 240 tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt 300 agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg 360 gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc 420 gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg 480 ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc 540 tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct 600 gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta 660 aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc 720 gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg 780 aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc 840 tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca 900 ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg 960 gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct 1020 tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc 1080 gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt 1140 tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg 1200 aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt 1260 attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313 <210> 86 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 86 taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60 tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120 ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 180 tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta 213 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 87 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 88 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 88 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 89 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Simian virus 40 <400> 90 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 91 cccaagaaga agaggaaggt g 21 <210> 92 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Nucleoplasmin bipartite NLS sequence <400> 92 Lys Arg Pro Ala Ala 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sequence <400> 97 Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Myoma T protein sequence <400> 98 Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp 1 5 <210> 99 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu 1 5 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 100 Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro 1 5 10 <210> 101 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 102 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 103 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 gcgcgctcgc 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oligonucleotide <400> 112 gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 113 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 114 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 115 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 116 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60 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ttaattaa 8 <210> 125 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 125 aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60 cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120 tgcggcgcgc gcagcacctt t 141 <210> 126 <400> 126 000 <210> 127 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 128 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 128 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 129 <211> 1260 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 129 atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60 gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120 gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180 gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240 aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300 ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360 gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420 cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480 aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540 tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600 tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660 atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720 gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780 tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840 cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900 aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960 tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020 cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080 aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140 actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt 1200 taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga 1260 <210> 130 <211> 1932 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 130 atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60 ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120 tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180 cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240 caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300 aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360 taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420 gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480 acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540 aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600 gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660 tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720 cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780 tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840 cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900 attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960 acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020 accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080 aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140 aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200 gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260 aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320 ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380 gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440 gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500 gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560 gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620 aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680 ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740 tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800 ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860 caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920 cactctctct ga 1932 <210> 131 <211> 1876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 131 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac 840 taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg 900 gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct 960 gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac 1020 taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt 1080 aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg 1140 ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag 1200 caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat 1260 cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca 1320 ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga 1380 ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt 1440 ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc 1500 cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac 1560 gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca 1620 cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680 aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740 tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta 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ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggcctcagt cctgca 56 <210> 139 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 ctaggactga ggccgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc agtc 54 <210> 140 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 ggactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacggcctca gtcctgca 48 <210> 141 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 ctaggactga ggccgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc tcagtc 46 <210> 142 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 ggactgaggc ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcgcctcag 60 tcctgca 67 <210> 143 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 atacctaggc acgcgtgtta ctagttatta atagtaatca attacgg 47 <210> 144 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 atacctaggg gccgcacgcg tgttactag 29 <210> 145 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 atacactcag tgcctgcagg cacgtggtcc ggagatccag ac 42 <210> 146 <211> 3754 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 146 cctaggtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct 60 tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatcgcggcc gctcaatatt ggccattagc 120 catattattc attggttata tagcataaat caatattggc tattggccat tgcatacgtt 180 gtatctatat cataatatgt acatttatat tggctcatgt ccaatatgac cgccatgttg 240 gcattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 300 atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 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Claims (148)

  1. 폐쇄 말단 DNA 벡터의 제조 방법으로서,
    제1 ITR을 포함하는 제1 단일 가닥 ITR 분자를 제공하는 단계;
    제2 ITR을 포함하는 제2 단일 가닥 ITR 분자를 제공하는 단계;
    발현 카세트 서열을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계; 및
    상기 제1 ITR 분자의 5' 및 3' 말단을 상기 이중 가닥 분자의 제1 말단에 결찰하고 상기 제2 ITR 분자의 5' 및 3' 말단을 상기 이중 가닥 분자의 제2 말단에 결찰하여 DNA 벡터를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 ITR 및 상기 제2 ITR 중 적어도 하나는 합성되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 이중 가닥 발현 카세트 서열은 상기 발현 카세트 서열을 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물로부터 절제에 의해 수득된, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 작제물 내에서 상기 발현 카세트 서열은 5' 말단에서 제1 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위의 측면에 있고, 3' 말단에서 제2 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위의 측면에 있는, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 작제물은 박미드, 플라스미드, 미니서클, 또는 선형 이중 가닥 DNA 분자인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 상기 제2 제한 엔도뉴클레아제는 동일한 제한 엔도뉴클레아제인, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 상기 제2 제한 엔도뉴클레아제는 상이한 제한 엔도뉴클레아제인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR 및 상기 제2 ITR 중 적어도 하나는 상기 발현 카세트 서열에 결찰되기 전에 어닐링되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR 및 상기 제2 ITR 중 적어도 하나는 각각 상기 발현 카세트 서열의 제1 말단 또는 상기 발현 카세트 서열의 제2 말단에 상보적인 오버행 영역을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결찰은 화학적 결찰 및 단백질-보조된 결찰로부터 선택되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 결찰은 T4 리가아제 또는 AAV Rep 단백질에 의해 수행되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제2 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR 및 상기 제2 ITR 중 적어도 하나는 적어도 하나의 RBE 부위를 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR 및 상기 제2 ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR 또는 AAV-유래된 ITR인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 ITR의 서열은 표 4b 또는 표 5에 제시된 좌측 ITR 서열 또는 서열 번호: 2, 5-9, 32-48 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 제2 ITR의 서열은 표 4b 또는 표 5에 제시된 우측 ITR 서열 또는 서열 번호: 1, 3, 10-14, 15-31 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트 서열은 적어도 하나의 시스-조절 요소를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 시스-조절 요소는 프로모터, 인핸서, 전사 후 조절 요소 및 폴리아데닐화 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트 서열은 이식유전자 서열을 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 적어도 2000개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 단백질을 인코딩하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 기능성 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄 말단 DNA 벡터는 ceDNA 벡터인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 정제되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 폐쇄 말단 DNA 벡터.
  30. 제29항의 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 선택적으로 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  31. 폐쇄 말단 DNA 벡터의 제조 방법으로서,
    발현 카세트;
    발현 카세트의 상류 (5'-말단) 상의 제1 ITR;
    발현 카세트의 하류 (3'-말단) 상의 제2 ITR;
    및 제한 엔도뉴클레아제가 발현 카세트의 원위에 있도록 ITR의 측면에 있는 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위
    를 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물을, 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 이중 가닥 DNA 작제물을 절단하여 상기 이중 가닥 DNA 작제물로부터의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 사이의 서열을 절제할 수 있는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계; 및 상기 절제된 서열의 5' 및 3' 말단을 결찰하여 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 작제물은 박미드, 플라스미드, 미니서클, 또는 선형 이중 가닥 DNA 분자인, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 단일 제한 엔도뉴클레아제가 절제를 수행하는데 사용되는, 방법.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, 2개의 상이한 제한 엔도뉴클레아제가 절제를 수행하는데 사용되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결찰은 화학적 결찰 및 단백질-보조된 결찰로부터 선택되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 결찰은 T4 리가아제 또는 AAV Rep 단백질에 의해 수행되는, 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR 및 상기 제2 ITR 중 적어도 하나는 적어도 하나의 RBE 부위를 포함하는, 방법.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR 및 상기 제2 ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR 또는 AAV-유래된 ITR인, 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 ITR의 서열은 표 4b 또는 표 5에 제시된 좌측 ITR 서열 또는 서열 번호: 2, 5-9, 32-48 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 ITR의 서열은 표 4a 또는 표 5에 제시된 우측 ITR 서열 또는 서열 번호: 1, 3, 10-14, 15-31 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트 서열은 적어도 하나의 시스-조절 요소를 포함하는, 방법.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스-조절 요소는 프로모터, 인핸서, 전사 후 조절 요소 및 폴리아데닐화 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트 서열은 이식유전자 서열을 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 적어도 2000개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  49. 제47항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 단백질을 인코딩하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 방법.
  51. 제47항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 기능성 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄 말단 DNA 벡터는 ceDNA 벡터인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 정제되는, 방법.
  54. 제31항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 폐쇄 말단 DNA 벡터.
  55. 제54항의 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 선택적으로 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  56. DNA 벡터의 제조 방법으로서,
    5'에서 3'의 방향 순으로 하기를 포함하는 단일 가닥 DNA 분자를 합성하는 단계:
    센스 제1 ITR;
    센스 발현 카세트 서열;
    센스 제2 ITR;
    안티센스 제2 ITR;
    안티센스 발현 카세트 서열; 및
    안티센스 제1 ITR;
    상기 단일 가닥 분자로부터 헤어핀-포함 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계; 및 상기 5' 및 3' 말단을 결찰하여 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR, 상기 센스 발현 카세트 서열, 상기 센스 제2 ITR, 상기 안티센스 제2 ITR, 상기 안티센스 발현 카세트 서열, 및 상기 안티센스 제1 ITR 중 적어도 하나가 합성되는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 단일 가닥 DNA 분자가 상기 센스 제1 ITR, 상기 센스 발현 카세트 서열, 상기 센스 제2 ITR, 상기 안티센스 제2 ITR, 상기 안티센스 발현 카세트 서열, 및 상기 안티센스 제1 ITR 중 하나 이상을 올리고뉴클레오티드로서 합성하고, 이러한 올리고뉴클레오티드를 결찰하여 단일 가닥 DNA 분자를 형성함으로써 구축되는, 방법.
  59. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 단일 가닥 DNA 분자가 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드로부터 상기 분자를 절제한 다음 상기 절제된 이중 가닥 단편을 변성시켜 단일 가닥 DNA 분자를 생성함으로써 제공되는, 방법.
  60. 제56항 또는 제59항에 있어서, 상기 단일 가닥 분자로부터 헤어핀-포함 폴리뉴클레오티드를 형성하는 단계는 ITR 중 하나 이상이 헤어핀 루프를 형성하는 조건하에 상기 단일 가닥 분자를 어닐링함으로써 수행되는, 방법.
  61. 제56항 또는 제60항에 있어서, 상기 결찰은 화학적 결찰 및 단백질-보조된 결찰로부터 선택되는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 결찰은 T4 리가아제 또는 AAV Rep 단백질에 의해 수행되는, 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제2 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR, 상기 안티센스 제1 ITR, 상기 센스 제1 ITR 및 상기 센스 제2 ITR 중 적어도 하나는 적어도 하나의 RBE 부위를 포함하는, 방법.
  66. 제56항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR 및 상기 센스 제2 ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR 또는 AAV-유래된 ITR인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR의 서열은 표 4b 또는 표 5에 제시된 좌측 ITR 서열 또는 서열 번호: 2, 5-9, 32-48 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 제2 ITR의 서열은 표 4a 또는 표 5에 제시된 우측 ITR 서열 또는 서열 번호: 1, 3, 10-14, 15-31 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  69. 제56항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 발현 카세트 서열은 적어도 하나의 시스-조절 요소를 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 시스-조절 요소는 프로모터, 인핸서, 전사 후 조절 요소 및 폴리아데닐화 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  73. 제56항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 발현 카세트 서열은 이식유전자 서열을 포함하는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 적어도 2000개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 단백질을 인코딩하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 방법.
  77. 제73항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 기능성 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  78. 제56항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄 말단 DNA 벡터는 ceDNA 벡터인, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 정제되는, 방법.
  80. 제56항 내지 제79항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 폐쇄 말단 DNA 벡터.
  81. 제80항의 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 선택적으로 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  82. 폐쇄 말단 DNA 벡터의 제조 방법으로서,
    5'에서 3'의 방향 순으로 다음을 포함하는 단일 가닥 DNA 분자를 합성하는 단계:
    센스 제1 ITR;
    센스 발현 카세트 서열;
    센스 제2 ITR; 및
    안티센스 발현 카세트 서열;
    및 상기 분자를 어닐링하는 단계를 포함하는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR, 상기 센스 발현 카세트 서열, 상기 센스 제2 ITR 및 상기 안티센스 발현 카세트 서열 중 적어도 하나가 합성되는, 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 단일 가닥 DNA 분자가 상기 센스 제1 ITR, 상기 센스 발현 카세트 서열, 상기 센스 제2 ITR 및 상기 안티센스 발현 카세트 서열 중 하나 이상을 합성하고, 이러한 올리고뉴클레오티드를 결찰하여 단일 가닥 DNA 분자를 형성함으로써 구축되는, 방법.
  85. 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 단일 가닥 DNA 분자가 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드로부터 상기 분자를 절제한 다음 상기 절제된 이중 가닥 단편을 변성시켜 단일 가닥 DNA 분자를 생성함으로써 제공되는, 방법.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어닐링 단계는 헤어핀 루프를 형성하는 상기 센스 제1 ITR 및 상기 센스 제2 ITR 중 하나 또는 둘 다를 생성하는, 방법.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  88. 제82항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제2 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR 및 상기 센스 제2 ITR 중 적어도 하나는 적어도 하나의 RBE 부위를 포함하는, 방법.
  90. 제82항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR 및 상기 센스 제2 ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR 또는 AAV-유래된 ITR인, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR의 서열은 표 4b 또는 표 5에 제시된 좌측 ITR 서열 또는 서열 번호: 2, 5-9, 32-48 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  92. 제90항에 있어서, 상기 제2 ITR의 서열은 표 4a 또는 표 5에 제시된 우측 ITR 서열 또는 서열 번호: 1, 3, 10-14, 15-31 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  93. 제82항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 발현 카세트 서열은 적어도 하나의 시스-조절 요소를 포함하는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 시스-조절 요소는 프로모터, 인핸서, 전사 후 조절 요소 및 폴리아데닐화 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 방법.
  96. 제94항에 있어서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  97. 제82항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 발현 카세트 서열은 이식유전자 서열을 포함하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 적어도 2000개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  99. 제97항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 단백질을 인코딩하는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 방법.
  101. 제97항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 기능성 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  102. 제82항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄 말단 DNA 벡터는 ceDNA 벡터인, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 정제되는, 방법.
  104. 제82항 내지 제103항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 폐쇄 말단 DNA 벡터.
  105. 제104항의 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 선택적으로 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  106. 폐쇄 말단 DNA 벡터의 제조 방법으로서,
    5'에서 3'의 방향 순으로 다음을 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물을 제공하는 단계:
    제1 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위;
    센스 제1 ITR;
    센스 발현 카세트 서열;
    센스 제2 ITR;
    안티센스 발현 카세트 서열; 및
    제2 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위;
    상기 이중 가닥 DNA 작제물을, 상기 제1 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 및 상기 제2 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에서 상기 이중 가닥 DNA 작제물을 절단하여 상기 이중 가닥 폴리뉴클레오티드로부터의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 사이의 이중 가닥 서열을 절제할 수 있는 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계;
    상기 절제된 이중 가닥 서열을 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 분리하는 단계; 및
    각각의 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥이 폐쇄 말단 DNA 벡터를 형성하는 어닐링 단계를 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 작제물은 박미드, 플라스미드, 미니서클, 또는 선형 이중 가닥 DNA 분자인, 방법.
  108. 제106항 또는 제107항에 있어서, 단일 제한 엔도뉴클레아제는 절제를 수행하는데 사용되는, 방법.
  109. 제106항 또는 제107항에 있어서, 2개의 상이한 제한 엔도뉴클레아제는 절제를 수행하는데 사용되는, 방법.
  110. 제106항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어닐링 단계는 헤어핀 루프를 형성하는 상기 센스 제1 ITR 및 상기 센스 제2 ITR 중 하나 또는 둘 다를 생성하는, 방법.
  111. 제106항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  112. 제106항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 ITR은 야생형 ITR 및 변형된 ITR로부터 선택되는, 방법.
  113. 제106항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR 및 상기 센스 제2 ITR 중 적어도 하나는 적어도 하나의 RBE 부위를 포함하는, 방법.
  114. 제106항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR 및 상기 센스 제2 ITR 중 적어도 하나는 AAV ITR 또는 AAV-유래된 ITR인, 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 센스 제1 ITR의 서열은 표 4b 또는 표 5에 제시된 좌측 ITR 서열 또는 서열 번호: 2, 5-9, 32-48 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  116. 제114항에 있어서, 상기 제2 ITR의 서열은 표 4a 또는 표 5에 제시된 우측 ITR 서열 또는 서열 번호: 1, 3, 10-14, 15-31 중 어느 것으로부터 선택되는, 방법.
  117. 제106항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 발현 카세트 서열은 적어도 하나의 시스-조절 요소를 포함하는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 시스-조절 요소는 프로모터, 인핸서, 전사 후 조절 요소 및 폴리아데닐화 신호로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 전사 후 조절 요소는 WHP 전사 후 조절 요소 (WPRE)를 포함하는, 방법.
  120. 제118항에 있어서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터, AAT 프로모터, LP1 프로모터, 및 EF1a 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  121. 제106항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 발현 카세트 서열은 이식유전자 서열을 포함하는, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 적어도 2000개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  123. 제121항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 단백질을 인코딩하는, 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 리포터 단백질, 치료 단백질, 항원, 유전자 편집 단백질, 또는 세포독성 단백질을 인코딩하는, 방법.
  125. 제121항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 기능성 뉴클레오티드 서열인, 방법.
  126. 제106항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄 말단 DNA 벡터는 ceDNA 벡터인, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터는 정제되는, 방법.
  128. 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 폐쇄 말단 DNA 벡터.
  129. 제128항의 폐쇄 말단 DNA 벡터 및 선택적으로 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  130. 제1항 내지 제28항, 제31항 내지 제53항, 제56항 내지 제79항, 제82항 내지 제103항 및 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 단리된 폐쇄 말단 DNA 벡터.
  131. 제1항 내지 제28항, 제31항 내지 제53항, 제56항 내지 제79항, 제82항 내지 제103항 및 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득된 단리된 폐쇄 말단 DNA 벡터를 포함하는 유전자 약(genetic medicine).
  132. 제130항의 폐쇄 말단 DNA 벡터를 포함하는 세포.
  133. 제130항의 폐쇄된 말단 DNA 벡터를 포함하는 형질전환 동물.
  134. 제1항 내지 제28항, 제31항 내지 제53항, 제56항 내지 제79항, 제82항 내지 제103항 및 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 투여함으로써 대상체를 치료하는 방법.
  135. 대상체에 치료 단백질을 전달하는 방법으로서,
    제1항 내지 제28항, 제31항 내지 제53항, 제56항 내지 제79항, 제82항 내지 제103항 및 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열은 치료 단백질을 인코딩하는, 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 치료 단백질은 치료 항체인, 방법.
  137. 패킷 삽입물을 갖는 용기에 포장된, 제1항 내지 제28항, 제31항 내지 제53항, 제56항 내지 제79항, 제82항 내지 제103항 및 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터, 및 나노캐리어를 포함하는 키트.
  138. 제1항 내지 제28항, 제31항 내지 제53항, 제56항 내지 제79항, 제82항 내지 제103항 및 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트
  139. 제1 ITR을 포함하는 제1-단일 가닥 ITR 분자, 제2 ITR을 포함하는 제2 단일 가닥 ITR 분자, 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자에 상기 제1-단일 가닥 ITR 분자와 제2 단일 가닥 ITR 분자의 결찰을 위한 적어도 하나의 시약을 포함하는, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트.
  140. 제31항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트로서,
    a. 발현 카세트; 발현 카세트의 상류 (5'-말단) 상의 제1 ITR; 발현 카세트의 하류 (3'-말단) 상의 제2 ITR; 및 제한 엔도뉴클레아제가 발현 카세트의 원위에 있도록 ITR의 측면에 있는 적어도 2개의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물로서, 상기 발현 카세트는 이식유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 이중 가닥 DNA 작제물, 및
    b. 결찰을 위한 적어도 하나의 결찰 시약을 포함하는, 키트
  141. 제56항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트로서,
    a. 5'에서 3'의 방향 순으로 다음을 포함하는 단일 가닥 DNA 분자로서:
    센스 제1 ITR;
    센스 발현 카세트 서열;
    센스 제2 ITR;
    안티센스 제2 ITR;
    안티센스 발현 카세트 서열; 및
    안티센스 제1 ITR;
    상기 센스 발현 카세트 서열 및 상기 안티센스 발현 카세트 서열은 이식유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 단일 가닥 DNA 분자, 및
    b. 결찰을 위한 적어도 하나의 결찰 시약을 포함하는, 키트
  142. 제82항 내지 제103항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트로서,
    a. 5'에서 3' 방향 순서로 다음을 포함하는 단일 가닥-DNA 분자로서:
    센스 제1 ITR;
    센스 발현 카세트 서열;
    센스 제2 ITR; 및
    안티센스 발현 카세트 서열;
    상기 센스 발현 카세트 서열 및 상기 안티센스 발현 카세트 서열은 이식유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 단일 가닥-DNA 분자, 및
    b. 결찰을 위한 적어도 하나의 결찰 시약을 포함하는, 키트.
  143. 제106항 내지 제127항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 폐쇄 말단 DNA 벡터를 제조하기 위한 키트로서,
    a. 5'에서 3'의 방향 순으로 다음을 포함하는 이중 가닥 DNA 작제물로서:
    제1 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위;
    센스 제1 ITR;
    센스 발현 카세트 서열;
    센스 제2 ITR;
    안티센스 발현 카세트 서열; 및
    제2 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위;
    상기 센스 발현 카세트 서열 및 상기 안티센스 발현 카세트 서열은 이식유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 이중 가닥 DNA 작제물, 및
    b. 결찰을 위한 적어도 하나의 결찰 시약을 포함하는, 키트.
  144. 제138항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결찰을 위한 적어도 하나의 시약은 화학적 결찰을 위한 시약인, 키트.
  145. 제144항에 있어서, 상기 결찰을 위한 적어도 하나의 시약은 단백질-보조된 결찰을 위한 시약인, 키트.
  146. 제146항에 있어서, 상기 결찰은 T4 결찰 또는 AAV Rep 단백질에 의해 수행되는, 키트.
  147. 제138항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1-단일 가닥 ITR 분자 및 제2 단일 가닥 ITR 분자는 이들의 말단에 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 포함하는, 키트.
  148. 제138항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제 효소를 추가로 포함하는, 키트.
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202006431WA (en) * 2018-02-14 2020-08-28 Generation Bio Co Non-viral dna vectors and uses thereof for antibody and fusion protein production
CA3119310A1 (en) * 2018-11-09 2020-05-14 Generation Bio Co. Modified closed-ended dna (cedna) comprising symmetrical modified inverted terminal repeats
GB201905651D0 (en) 2019-04-24 2019-06-05 Lightbio Ltd Nucleic acid constructs and methods for their manufacture
BR112023001648A2 (pt) 2020-07-27 2023-04-04 Anjarium Biosciences Ag Moléculas de dna de fita dupla, veículo de entrega e método para preparar uma molécula de dna com extremidade em grampo
GB202014772D0 (en) 2020-09-18 2020-11-04 Lightbio Ltd Nucleic acid construct
GB202014751D0 (en) 2020-09-18 2020-11-04 Lightbio Ltd Targeting vector
JP2024504422A (ja) * 2021-01-25 2024-01-31 プリベイル セラピューティクス，インコーポレーテッド Ａａｖに基づく遺伝子発現の調節
CN112980862A (zh) * 2021-02-25 2021-06-18 通用生物系统（安徽）有限公司 一种高纯度微环dna的制备方法
EP4326860A1 (en) 2021-04-20 2024-02-28 Anjarium Biosciences AG Compositions of dna molecules encoding amylo-alpha-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase, methods of making thereof, and methods of use thereof
EP4329885A1 (en) * 2021-04-27 2024-03-06 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
WO2022232286A1 (en) * 2021-04-27 2022-11-03 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
EP4333886A1 (en) * 2021-05-07 2024-03-13 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors for vaccine delivery
WO2022236016A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Generation Bio Co. Lyophilized non-viral dna vector compositions and uses thereof
AU2022422134A1 (en) * 2021-12-23 2024-07-04 Generation Bio Co. Scalable and high-purity cell-free synthesis of closed-ended dna vectors
WO2023135273A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof
GB202204112D0 (en) 2022-03-23 2022-05-04 Lightbio Ltd Linear construct
EP4293101A1 (en) 2022-06-14 2023-12-20 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Reactor with temperature control and method of using the same
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
WO2024119017A1 (en) * 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Synthetic single stranded nucleic acid compositions and methods thereof
WO2024170778A1 (en) 2023-02-17 2024-08-22 Anjarium Biosciences Ag Methods of making dna molecules and compositions and uses thereof
US11993783B1 (en) * 2023-03-27 2024-05-28 Genecraft Inc. Nucleic acid molecule comprising asymmetrically modified ITR for improving expression rate of inserted gene, and use thereof

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6346415B1 (en) * 1997-10-21 2002-02-12 Targeted Genetics Corporation Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRS) for use with recombinant AAV vectors
US8709778B2 (en) * 2008-10-28 2014-04-29 Xavier Danthinne Method of adenoviral vector synthesis
EP2500434A1 (en) * 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
WO2014143932A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Synthetic adeno-associated virus inverted terminal repeats
SG10201913688TA (en) * 2016-03-03 2020-03-30 Univ Massachusetts Closed-ended linear duplex dna for non-viral gene transfer
SG11202006431WA (en) * 2018-02-14 2020-08-28 Generation Bio Co Non-viral dna vectors and uses thereof for antibody and fusion protein production
WO2020154645A1 (en) * 2019-01-24 2020-07-30 Generation Bio Co. Close-ended dna (cedna) and use in methods of reducing gene or nucleic acid therapy related immune response
WO2021011842A1 (en) * 2019-07-17 2021-01-21 Generation Bio Co. Synthetic production of single-stranded adeno associated viral dna vectors
CA3146966A1 (en) * 2019-07-17 2021-01-21 Generation Bio Co. Compositions and production of nicked closed-ended dna vectors

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IL275878A (en) 2020-08-31
CA3088984A1 (en) 2019-07-25
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