JP2024504422A - Ａａｖに基づく遺伝子発現の調節 - Google Patents

Abstract

本開示の側面は、遺伝子治療薬（例：AAVベクターから発現される治療用タンパク質）の発現を正または負に調節するための、組成物および方法に関する。本開示は部分的に、発現カセット（またはかかる発現カセットから転写されたmRNA）の特定の領域に結合するように構成された、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）などの特定の核酸に基づく。

Description

関連出願
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の下で、２０２１年１月２５日出願の米国仮出願第63/141,110号、表題「MODULATION OF AAV-BASED GENE EXPRESSION」の利益を主張し、この全内容は参照により本明細書に組み込まれる。

背景
AAV形質導入を介して患者に導入された治療用導入遺伝子の発現を調節する能力は、遺伝子治療の分野を変革するであろう。遺伝子治療への現在のウイルスアプローチを支える生物学は、治療用導入遺伝子の長期発現を保証する。治療用遺伝子のこの継続的な発現は、多くの適応症、特に患者のゲノムにおける機能喪失遺伝子変異に起因する適応症に適している。しかし、治療薬の投与の観点または安全性の観点から、治療用遺伝子の発現を増／減、オン／オフにする能力が非常に望まれるシナリオがいくつか存在する；本発明は、遺伝子発現のかかる制御を特定のASOの使用を通じて達成するための複数の方法について記載する。

概要
本開示の側面は、遺伝子治療薬（例：AAVベクターから発現される治療用タンパク質）の発現を、特定の核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）の使用を通じて正または負に調節するための、組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本開示により記載される方法は、一般的な広く使用されているシス作用性のDNAもしくはRNA調節要素からなる発現カセット、またはシス作用性のDNAもしくはRNA要素を有する発現カセットからの遺伝子発現の調節を、核酸（例：ASO）と、発現カセット内またはかかる発現カセットから転写されたmRNA内の要素との相互作用を介して、可能にする。
したがって、いくつかの側面において、本開示は、細胞における導入遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、AAV逆方向末端反復（ITR）の脇に配置される導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、AAV ITRの少なくとも１つに特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOのAAV ITRへの結合は、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす。

いくつかの態様において、１つ以上のASOの各々は、長さが約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である。いくつかの態様において、ASOの各々は、１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの態様において、１つ以上の化学的修飾は、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている。いくつかの態様において、核酸塩基修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む。いくつかの態様において、主鎖修飾は、ホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ASOは、１つ以上のロックド核酸（locked nucleic acid）（LNA）を含む。
いくつかの態様において、AAV ITRは、AAV2 ITRである。いくつかの態様において、AAV2 ITRは、配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む。いくつかの態様において、AAV2 ITRは、配列番号１に記載の核酸配列またはその相補体からなる。いくつかの態様において、ASOは、AAV ITRの少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する。

いくつかの態様において、少なくとも１つのASOは、配列番号２～８のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのASOは、配列番号２～８のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含み、少なくとも１つのASOの各々は、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体は修飾されている。いくつかの態様において、核酸塩基修飾は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む。いくつかの態様において、主鎖修飾はホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ASOは１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む。
いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の増加（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の増加）である。いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の減少（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の減少）である。

いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳類細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は対象内にある。
いくつかの態様において、導入遺伝子は治療用タンパク質である。いくつかの態様において、治療用タンパク質はβ－グルコセレブロシダーゼ（GBA）である。いくつかの態様において、GBAは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、GBAをコードする導入遺伝子は、配列番号４０に記載の核酸配列またはその相補体を含む。いくつかの態様において、rAAVベクターは、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む。
いくつかの側面において、本開示は、細胞における導入遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、導入遺伝子の転写制御領域配列に特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOの転写制御領域配列への結合は、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて導入遺伝子の発現の変化をもたらす。

いくつかの態様において、１つ以上のASOの各々は、長さが約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である。いくつかの態様において、ASOの各々は、１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体は修飾されている。いくつかの態様において、１つ以上の化学的修飾は、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される。いくつかの態様において、核酸塩基修飾は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む。いくつかの態様において、主鎖修飾はホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ASOは１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む。
いくつかの態様において、転写制御領域配列は、エンハンサー配列および／またはプロモーター配列を含む。いくつかの態様において、エンハンサー配列はサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー配列であり、および／またはプロモーター配列はニワトリβアクチン（CBA）プロモーター配列である。いくつかの態様において、CMVエンハンサー配列は、配列番号９に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含む。いくつかの態様において、ニワトリβアクチン（CBA）プロモーター配列は、配列番号２５に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含む。

いくつかの態様において、ASOは、転写制御領域配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する。
いくつかの態様において、少なくとも１つのASOは、配列番号１０～２４および２６～３９のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのASOは、配列番号１０～２４および２６～３９のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含み、少なくとも１つのASOの各々は、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている。いくつかの態様において、核酸塩基修飾は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む。いくつかの態様において、主鎖修飾はホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ASOは１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む。

いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の増加（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の増加）である。いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の減少（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の減少）である。
いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は対象内にある。
いくつかの態様において、導入遺伝子は治療用タンパク質である。いくつかの態様において、治療用タンパク質はβ－グルコセレブロシダーゼ（GBA）である。いくつかの態様において、GBAは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、GBAをコードする導入遺伝子は、配列番号４０に記載の核酸配列またはその相補体を含む。いくつかの態様において、rAAVベクターは、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む。

いくつかの側面において、本開示は、細胞における導入遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、導入遺伝子から転写されたmRNAのタンパク質コード領域に特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOのタンパク質コード領域への結合は、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす。
いくつかの態様において、１つ以上のASOの各々は、長さが約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である。いくつかの態様において、ASOの各々は、１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの態様において、１つ以上の化学的修飾は、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体は修飾されている。いくつかの態様において、核酸塩基修飾は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む。いくつかの態様において、主鎖修飾はホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ASOは１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む。いくつかの態様において、ASOはギャップマー構造を含む。いくつかの態様において、ASOは、タンパク質コード領域の少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する。

いくつかの態様において、少なくとも１つのASOは、配列番号４１～５０のいずれか１つ、配列番号９１～９５のいずれか１つ、もしくは配列番号１０６～１１０のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む。
いくつかの態様において、タンパク質コード領域は、β－グルコセレブロシダーゼ（GBA）タンパク質をコードする。いくつかの態様において、タンパク質コード領域は、配列番号４０に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含む。
いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の増加（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の増加）である。いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の減少（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の減少）である。いくつかの態様において、導入遺伝子の発現の減少は、１つ以上のASOによって結合されるmRNA転写物のRNaseH媒介性分解からもたらされる。

いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は対象内にある。
いくつかの態様において、rAAVベクターは、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む。
いくつかの側面において、本開示は、細胞における導入遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、導入遺伝子から転写されたmRNAのウッドチャック翻訳後調節要素（WPRE）に特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOのWPREへの結合は、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす。

いくつかの態様において、１つ以上のASOの各々は、長さが約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である。いくつかの態様において、ASOの各々は、１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの態様において、１つ以上の化学的修飾は、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている。いくつかの態様において、核酸塩基修飾は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む。いくつかの態様において、主鎖修飾はホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ASOは１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む。
いくつかの態様において、WPREは、配列番号５１に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含む。いくつかの態様において、ASOは、WPRE配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する。

いくつかの態様において、少なくとも１つのASOは、配列番号５２～７９のいずれか１つ、配列番号９６～１００のいずれか１つ、もしくは配列番号１１１～１１５のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む。
いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の増加（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の増加）である。いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の減少（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の減少）である。
いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は対象内にある。
いくつかの態様において、導入遺伝子は治療用タンパク質である。いくつかの態様において、治療用タンパク質はβ－グルコセレブロシダーゼ（GBA）である。いくつかの態様において、GBAは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、GBAをコードする導入遺伝子は、配列番号４０に記載の核酸配列またはその相補体を含む。いくつかの態様において、rAAVベクターは、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む。

いくつかの側面において、本開示は、細胞における導入遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、導入遺伝子から転写されたmRNAのポリアデニル化要素に特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOのポリアデニル化要素への結合は、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす。
いくつかの態様において、１つ以上のASOの各々は、長さが約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である。いくつかの態様において、ASOの各々は、１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの態様において、１つ以上の化学的修飾は、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体は修飾されている。いくつかの態様において、核酸塩基修飾は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む。いくつかの態様において、主鎖修飾はホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ASOは１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む。いくつかの態様において、ASOはギャップマー構造を含む。いくつかの態様において、ASOは、ポリアデニル化要素の少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する。

いくつかの態様において、ポリアデニル化要素は、配列番号８０に記載の核酸配列またはその相補体を含む。いくつかの態様において、少なくとも１つのASOは、配列番号８１～９０のいずれか１つ、配列番号１０１～１０４のいずれか１つ、もしくは配列番号１１６～１２０のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む。
いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の増加（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の増加）である。いくつかの態様において、発現の変化は、導入遺伝子の発現の減少（例：１つ以上のASOを含まない細胞と比較した発現の減少）である。いくつかの態様において、導入遺伝子の発現の減少は、１つ以上のASOによって結合されるmRNA転写物のRNaseH媒介性分解からもたらされる。

いくつかの態様において、導入遺伝子の発現は、発現された導入遺伝子の性質とは無関係に変化（すなわち、増加または減少）する。いくつかの態様において、１つ以上のASOは、導入遺伝子トランスフェクションと同時に細胞に送達される。いくつかの態様において、１つ以上のASOは、導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトして数時間後、例えば３時間後に、細胞に送達される。いくつかの態様において、１つ以上のASOは、導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトして数週間後に、細胞に送達される。
いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞は対象内にある。
いくつかの態様において、導入遺伝子は治療用タンパク質である。いくつかの態様において、治療用タンパク質はβ－グルコセレブロシダーゼ（GBA）である。いくつかの態様において、GBAは、コドン最適化された核酸配列によってコードされる。いくつかの態様において、GBAをコードする導入遺伝子は、配列番号４０に記載の核酸配列またはその相補体を含む。いくつかの態様において、rAAVベクターは、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む。

いくつかの側面において、本開示は、配列番号２～８、１０～２４、２６～３９、４１～５０、５２～７９、８１～１２０のいずれか１つに記載の配列を含む単離された核酸、またはその相補体を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸は、１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの態様において、１つ以上の化学的修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾、ホスホロチオアート結合、ロックド核酸（LNA）、または前述の任意の組み合わせを含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）である。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体は修飾されている。いくつかの態様において、単離された核酸はギャップマー構造を有する。

図１は、GBAに指向されたASOの、GBA発現に対する効果を、GBAをコードするプラスミドおよび指定のASOをトランスフェクトしたHEK293T細胞において示す。細胞は７２時間後に回収し、GBA発現はqRT-PCRを用いて定量化した。 図２は、WPREに指向されたASOの、GBA発現に対する効果を、GBAをコードするプラスミドおよび指定のASOをトランスフェクトしたHEK293T細胞において示す。細胞は７２時間後に回収し、GBA発現はqRT-PCRを用いて定量化した。 図３は、BGHポリＡに指向されたASOの、GBA発現に対する効果を、GBAをコードするプラスミドおよび指定のASOをトランスフェクトしたHEK293T細胞において示す。細胞は７２時間後に回収し、GBA発現はqRT-PCRを用いて定量化した。

図４は、ASOポリＡ ASO-2の、Trem2発現に対する効果を、Trem2をコードするプラスミドおよび指定のASOをトランスフェクトしたHEK293T細胞において示す。細胞は７２時間後に回収し、GBA発現はqRT-PCRを用いて定量化した。 図５は、逐次トランスフェクションにおけるASOの、GBA発現に対する効果を示す。HEK293T細胞に、GBA発現をコードするプラスミドをトランスフェクトした。３時間後、プラスミドトランスフェクション混合物を除去し、細胞に指定のASOをトランスフェクトした。細胞を７２時間後に回収し、GBA発現はqRT-PCRを用いて定量化した。 図６は、PR001構築物のASO標的配列を示す。 図７は、AAV-GBA注入とその後にGBA ASO 1、WPRE ASO 2、またはポリＡ ASO2処置を受けたマウスの肝臓における、GBA mRNAレベルを示す。

詳細な説明
いくつかの側面において、本開示は、遺伝子治療薬（例：AAVベクターから発現される治療用タンパク質）の発現を、特定の核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）の使用を通じて調節する（例えば、正または負に調節する）ための、組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本明細書に記載の核酸（例：ASO）は、一般的な広く使用されているシス作用性DNAもしくはRNA調節要素からなる発現カセットからの、シス作用性DNAもしくはRNA要素を有する発現カセットからの、またはかかる発現カセットから転写されたmRNAの、遺伝子発現を調節する。

単離された核酸
単離された核酸は、DNAであってもRNAであってもよい。いくつかの態様において、本開示のタンパク質および核酸は単離される。本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、人工的に生成されることを意味する。核酸に関して本明細書で使用される場合、用語「単離された」は以下を意味する：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってin vitroで増幅される；（ｉｉ）クローニングによって組換え的に生成される；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離などにより精製される；または（ｉｖ）例えば化学合成により、合成される。単離された核酸は、当技術分野で周知の組換えDNA技法によって容易に操作できるものである。したがって、５’および３’制限部位が既知であるか、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマー配列が開示されているところのベクターに含有されるヌクレオチド配列は、単離されているとみなされるが、天然の宿主内で天然の状態で存在する核酸配列は、単離されていない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、そうである必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内で単離された核酸は、それが存在する細胞内の物質のごく一部しか含まない可能性があるため、純粋ではない。しかしながらかかる核酸は、当業者に知られている標準的な技法によって容易に操作できるため、本明細書で使用されるように単離されている。タンパク質またはペプチドに関して本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、自然環境から単離されたか、または人工的に（例えば、化学合成により、組換えDNA技法などにより）生成された、タンパク質またはペプチドを指す。

当業者はまた、保存的アミノ酸置換を行って、カプシドタンパク質の機能的に同等なバリアントまたは相同体を提供し得ることを理解するであろう。いくつかの側面において、本開示は、保存的アミノ酸置換をもたらす配列変化を包含する。本明細書で使用する場合、保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的な電荷またはサイズ特性を変化させないアミノ酸置換を指す。バリアントは、かかる方法をまとめた参考文献に見出されるような、当業者に知られているポリペプチド配列を改変するための方法に従って、調製することができる；例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York。アミノ酸の保存的置換には、以下のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。したがって、本明細書に開示されるタンパク質およびポリペプチドのアミノ酸配列に対して、保存的アミノ酸置換を行うことができる。
本開示は、部分的に、標的ヌクレオチド配列、例えば、rAAVベクターや発現構築物からの配列、または発現構築物から転写されたmRNAの配列などと相補的な領域を含む、単離された核酸（例：人工または合成の単離された核酸）に関する。いくつかの態様において、単離された核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）である。

アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される場合、用語「アンチセンス核酸」または「ASO」は、標的配列に対して配列相補性を有し、かつ、例えばストリンジェントな条件下で、標的配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズ可能な核酸を指す。アンチセンス核酸が特異的にハイブリダイズ可能であるのは、アンチセンス核酸の標的核酸への結合が、アンチセンス核酸と標的核酸との間に相補性に基づく対形成を生成するのに十分であり、かつ、特異的結合が望まれる条件下、例えばin vivoアッセイまたは治療処置の場合は生理学的条件下で、およびin vitroアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下で、アンチセンス核酸の非標的核酸への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合である。ASOは、１つ以上のDNA核酸塩基、１つ以上のRNA核酸塩基、またはDNA核酸塩基とRNA核酸塩基の組み合わせを含み得る。

相補的とは、２つのヌクレオチド間の正確な対形成の能力を指す。例えば、アンチセンス核酸の特定の位置のヌクレオチドが、標的核酸（例：標的核酸配列）の対応する位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、アンチセンス核酸と標的核酸は、その位置で互いに相補的であるとみなされる。アンチセンス核酸と標的核酸は、各分子内で十分な数の対応する位置が、塩基を介して互いに水素結合できるヌクレオチドによって占められている場合、互いに相補的である。したがって「相補的」とは、アンチセンス核酸と標的核酸との間に安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性または正確な対形成を示すために使用される用語である。しかしながら、１００％の相補性は必要ではないことを理解されたい。例えば、いくつかの態様において、アンチセンス核酸（例：ASOなどのオリゴヌクレオチド）は、標的核酸配列の連続するヌクレオチドに対して、少なくとも８０％相補的（例：少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的）であり得る。

いくつかの態様において、アンチセンス核酸（ASO）であって、標的核酸（例：rAAVベクターの標的配列、発現構築物の標的配列、発現構築物から転写されたmRNA配列など）の一部に対して完全に相補的（例：１００％相補的）な相補性領域を有する、前記ASOが使用される。いくつかの態様において、アンチセンス核酸オリゴヌクレオチドは、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０のいずれか１つに記載の配列と相補的な相補性領域を含む。アンチセンス核酸の相補性領域は、標的核酸配列の少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、例えば、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、またはそれ以上の連続したヌクレオチドと、相補的であってよい。さらに、オフターゲット効果の可能性を最小限に抑えるために、ASOは、オフターゲット核酸と相補的な配列（例：５以上の連続したヌクレオチド）を有さないことを確実にするように設計してもよい。

しかし、いくつかの態様において、標的核酸と１００％未満の配列相補性を有するアンチセンス核酸が使用され得ることを理解されたい。したがって当技術分野では、相補的ヌクレオチド配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的ヌクレオチド配列に対して１００％相補的である必要はないことが、理解されている。例えば、いくつかの態様において、単離された核酸は、その標的配列と少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のミスマッチを含む。いくつかの態様において、本開示の目的のための相補的核酸配列が特異的にハイブリダイズ可能であるのは、標的核酸への配列の結合が遺伝子発現における所望の変化（例：遺伝子産物の発現の増加もしくは翻訳の増加、または遺伝子産物の発現の減少もしくは翻訳の減少）を生じさせ、かつ、非特異的結合の回避が望まれる条件下、例えばin vivoアッセイまたは治療処置の場合は生理学的条件下で、およびin vitroアッセイの場合にはアッセイが適切なストリンジェンシー条件下で実施される条件下で、非標的核酸への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合である。

核酸配列の配列相補性の決定を含む配列同一性は、当技術分野で知られている配列比較およびアラインメントアルゴリズムによって決定され得る。２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適な比較目的のために、配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために、第１の配列または第２の配列にギャップを導入できる）。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が第２の配列内の対応する位置と同じ残基によって占められている場合、分子はその位置で同一である。いくつかの態様において、２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一位置の数の関数であり（例：相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）、任意に、導入されたギャップの数および／または導入されたギャップの長さについて、スコアにペナルティを課す。

いくつかの態様において、本開示のオリゴヌクレオチド（例：ASO）は、長さが５～４０ヌクレオチド、５～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、または１５～２５ヌクレオチドの範囲である。本開示のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０またはそれ以上である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載のrAAVベクター配列、発現カセット配列、または発現カセットもしくはrAAVベクターから転写されたmRNAの配列の、５、１０、１５、２５、またはそれ以上のヌクレオチド内の領域と相補的な、相補性領域を含む。
いくつかの態様において、アンチセンス核酸（例：オリゴヌクレオチド）は、例えばオリゴヌクレオチドの少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が同一である、均質な調製物で提供される。いくつかの態様において、本開示に記載の組成物は、ASOに関して不均一である（例えば組成物は、ASOの２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の異なる配列を含み得る）。

本開示のアンチセンス核酸は、１つ以上の所望の特性を達成するため、例えば細胞取り込みの改善、安定性の改善、免疫原性の低下、効力の改善、標的ハイブリダイゼーションの改善、RNAse切断に対する感受性などを達成するために、修飾され得る。アンチセンス核酸は、塩基部分、糖部分および／またはリン酸主鎖で修飾され得る。したがってアンチセンス核酸は、１つ以上の修飾ヌクレオチド（例：ヌクレオチド類似体）および／または１つ以上の主鎖修飾（例：修飾されたヌクレオチド間結合）を有し得る。アンチセンス核酸は、修飾されたヌクレオチドと未修飾のヌクレオチドの組み合わせを有し得る。アンチセンス核酸はまた、修飾されたヌクレオチド間結合と未修飾のヌクレオチド間結合の組み合わせも有し得る。アンチセンス核酸はまた、修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド間結合のみから構成されていてもよい。

アンチセンス核酸には、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、およびそれらの組み合わせが含まれ得る。アンチセンス核酸において使用することができる修飾ヌクレオチドの例としては、例えば以下が挙げられる：５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン（mannosylqueosine）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン（queosine）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６－ジアミノプリン。

いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは２’－修飾ヌクレオチドである。例えば２’－修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－アミノおよび２’－アミノアルコキシ修飾ヌクレオチドであってもよい。いくつかの態様において、２’－修飾ヌクレオチドは、ロックド核酸（LNA）ヌクレオチドなどの２’－Ｏ－４’－Ｃメチレン架橋を含む。２’－修飾ヌクレオチドのいくつかの態様において、２’－ヒドロキシル基は糖環の３’または４’炭素原子に連結し、それによって二環式糖部分を形成する。かかる態様において、結合は、２’酸素原子と３’または４’炭素原子とを架橋するメチレン（－ＣＨ２－）_ｎ基であってもよく、ｎは１または２である。
アンチセンス核酸は、LNAヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドの組み合わせを含み得る。アンチセンス核酸は、LNAヌクレオチドとRNAヌクレオチドの組み合わせを含み得る。アンチセンス核酸は、LNAヌクレオチドとDNAヌクレオチドの組み合わせを含み得る。さらに好ましいオリゴヌクレオチド修飾は、２’－ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素原子に連結しそれによって二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（LNA）を含む。

アンチセンス核酸はまた、核酸塩基修飾ヌクレオチド、例えば、天然に存在する核酸塩基の代わりに天然に存在しない核酸塩基を含有するヌクレオチドも含み得る。例えば、塩基を修飾して、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックすることができる。修飾された核酸塩基の例としては、限定はされないが、５位で修飾されたウリジンおよび／またはシチジン、例えば５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位で修飾されたアデノシンおよび／またはグアノシン、例えば８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７－デアザ－アデノシン；Ｏ－およびＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンが適している。上記の修飾を組み合わせてもよいことに留意されたい。
本開示のアンチセンス核酸（例：オリゴヌクレオチド）内で、少なくとも１つのヌクレオチドから全ヌクレオチドまでを修飾することができる。例えば、オリゴヌクレオチド（例：長さ２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の修飾ヌクレオチドを含有し得る。いくつかの態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、所望のレベルのin vivo安定性および／または生体アクセス性または他の所望の特性を達成するのに必要な、最小限の修飾ヌクレオチドを含有するであろう。

特定のアンチセンス核酸には、非イオン性DNA類似体が含まれ得て、これは例えば、アルキルリン酸およびアリールリン酸（荷電したホスホナート酸素がアルキル基またはアリール基で置換されている）、荷電した酸素部分がアルキル化されているホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルなどである。テトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを一方また両方の末端に含有する核酸も、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性があることが示されており、本明細書で使用することができる。いくつかの態様において、アンチセンス核酸は、少なくとも１つの親油性置換ヌクレオチド類似体および／またはピリミジン－プリンジヌクレオチドを含み得る。
いくつかの態様において、アンチセンス核酸（例：オリゴヌクレオチド）は、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有し得る。例えば、２つのオリゴヌクレオチドを３’－３’結合を介して付着させて、１つまたは２つのアクセス可能な５’末端を有するオリゴヌクレオチドを生成することにより、２つのかかる５’末端を有する修飾オリゴヌクレオチドを作製することが可能である。３’－３’結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、またはその他の修飾ヌクレオシド間架橋であってもよい。さらに、３’末端ヌクレオシド間の結合がホスホジエステル、ホスホロチオアート、または他の修飾架橋ではない３’３’結合オリゴヌクレオチドは、トリまたはテトラエチレングリコールリン酸部分などの追加のスペーサーを使用して、調製することができる。

アンチセンス核酸のホスホジエステルヌクレオチド間結合を、修飾結合で置換することができる。修飾結合は、例えば以下から選択し得る：ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ＮＲ１Ｒ２－ホスホルアミダート、ボラノホスファート、α－ヒドロキシベンジルホスホナート、ホスファート－（Ｃ１～Ｃ２１）－Ｏ－アルキルエステル、ホスファート－［（Ｃ６～Ｃ１２）アリール－（Ｃ１～Ｃ２１）－Ｏ－アルキル］エステル、（Ｃ１～Ｃ８）アルキルホスホナートおよび／または（Ｃ６～Ｃ１２）アリールホスホナート橋、および（Ｃ７～Ｃ１２）－α－ヒドロキシメチル－アリール。
アンチセンス核酸のリン酸主鎖を修飾して、ペプチド核酸分子を生成することができる。本明細書で使用される場合、「ペプチド核酸」または「PNA」という用語は、核酸模倣物、例えばDNA模倣物であって、デオキシリボースリン酸主鎖がシュードペプチド主鎖によって置換され、４つの天然核酸塩基のみが保持されているものを指す。PNAの中性主鎖は、DNAおよびRNAへの特異的なハイブリダイゼーションを低イオン強度の条件下で可能にすることが示されている。PNAオリゴマーの合成は、例えば、標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して行うことができる。

アンチセンス核酸はまた、モルホリノオリゴヌクレオチドとして製剤化することもできる。かかる態様において、オリゴヌクレオチド試薬のオリゴヌクレオチドの各サブユニットのリボシド部分が、モルホリン部分に変換される。モルホリノも、例えばペプチド結合モルホリノとして修飾され得る。
他の態様において、アンチセンス核酸（例：オリゴヌクレオチド）は、ペプチドなどの官能基（例えば、in vivoで宿主細胞受容体を標的とするため）、または細胞膜もしくは血液脳関門を通過する輸送を促進する薬剤に連結することができる。本開示のオリゴヌクレオチド試薬は、オリゴヌクレオチド試薬のin vivo薬理学的特性を改善する化学部分（例：コレステロール）で修飾されてもよい。

本開示の側面は、「ギャップマー」構造を有するASOに関する。本明細書において「ギャップマー」とは、DNA塩基およびRNA塩基を含むキメラ核酸配列であって、以下：（修飾RNA核酸塩基）_Ｎ－（非修飾DNA核酸塩基）_Ａ－（修飾RNA核酸塩基）_Ｎのように配置されたものを指し、ここで各「Ｎ」は１～２０の整数であり、「Ａ」は２～１０の整数である。「ギャップマー」構造を有するASOの例は、以下を含む：「５－１０－５」構造のASOであって、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を有する５つのリボヌクレオチド（５’末端から開始）、その後に１０のデオキシヌクレオチド、その後に２’－Ｏ－メトキシエチル修飾を有する５つのリボヌクレオチドを含有し、これらはすべてホスホロチオアートヌクレオチド間結合を有する。いくつかの態様において、ギャップマーのシチジンヌクレオチドは、メチル化されていてもよい。いくつかの態様において、ギャップマーのウリジンヌクレオチドはメチル化されていてもよい。いくつかの態様において、ギャップマー構造は、LNA型ヌクレオチドとデオキシ型ヌクレオチドが交互に存在する１５個のヌクレオチドを含み、これらはすべてホスホロチオアートヌクレオチド間結合を有する。いくつかの態様において、ギャップマーの中央の２つのヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドである。いくつかの態様において、配列番号２～８、１０～２４、２６～３９、４１～５０、５２～７９、および８１～９０のいずれか１つに記載の配列を有する単離された核酸は、「ギャップマー」構造を含む（当業者は、本明細書に記載される核酸配列のいずれかにおいて、ギャップマー構造を有するASOを生成するために、１つ以上の「Ｔ」DNA核酸塩基が「Ｕ」RNA核により、またはその逆で、置換され得ることを認識するであろう）。

AAV ITRを標的とする核酸
本開示の側面は、導入遺伝子発現（例：rAAVベクターまたは発現カセットによって媒介される導入遺伝子発現）を調節するための方法であって、導入遺伝子を発現するように構成された細胞を、AAV逆方向末端反復（ITR）に結合する１つ以上（例：１、２、３、４、５、またはそれ以上）の単離された核酸（例：AAV ITRをコードする核酸配列）と接触させることによる、前記方法に関する。いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸の、AAV ITR配列への結合は、ITRを含有するrAAVベクターの発現を増加させるか、またはITRを含有するrAAVベクターの形質導入効率を増加させる。
単離された核酸は、rAAVベクターの５’ITR、３’ITR、または５’ITRと３’ITRの両方に、特異的に結合し得る。いくつかの態様において、単離された核酸は、AAV2 ITRに結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、AAV2 ITRは、配列番号１に記載の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、単離された核酸は、AAV2 ITR（例えば、配列番号１に記載の配列を有する）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドに、特異的に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号２～８のいずれか１つに記載の核酸配列を含むか、またはそれからなる。

１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のAAV ITRへの結合によって引き起こされる、導入遺伝子発現の調節（例：増加または減少）は、変化し得る。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のAAV ITRへの結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のAAV ITRへの結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ以上の形質導入効率の増加をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のAAV ITRへの結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、または１０００％の減少をもたらす。

転写調節因子（transcriptional regulator）領域を標的とする核酸
本開示の側面は、導入遺伝子発現（例：rAAVベクターまたは発現カセットによって媒介される導入遺伝子発現）を調節するための方法であって、導入遺伝子を発現するように構成された細胞を、転写制御領域配列（例：１つ以上の転写調節因子をコードする核酸配列）に結合する１つ以上（例：１、２、３、４、５、またはそれ以上）の単離された核酸と接触させることによる、前記方法に関する。転写制御領域配列の例としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、コザック配列などが挙げられる。いくつかの態様において、転写制御領域配列はプロモーター配列を含む。いくつかの態様において、転写制御領域配列はエンハンサー配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載される単離された核酸の転写調節因子配列への結合は、rAAVベクターの発現を増加させるか、またはrAAVベクターの形質導入効率を減少させる。

単離された核酸は、rAAVベクターのプロモーター配列に特異的に結合し得る。プロモーター配列は、構成的プロモーター配列、誘導性プロモーター配列、組織特異的プロモーター配列、ネイティブなプロモーター配列などであり得る。いくつかの態様において、単離された核酸は、ニワトリβアクチン（CBA）プロモーター配列に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、CBAプロモーター配列は、配列番号９に記載の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、単離された核酸は、CBAプロモーター配列（例えば、配列番号９に記載の配列を有する）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドに特異的に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号１０～２４のいずれか１つに記載の核酸配列を含むか、またはそれからなる。

単離された核酸は、rAAVベクターのエンハンサー配列に特異的に結合し得る。いくつかの態様において、単離された核酸は、サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー配列に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、CMVエンハンサー配列は、配列番号２５に記載の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、単離された核酸は、CMVプロモーター配列（例：配列番号２５に記載の配列を有する）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドに特異的に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号２６～３９のいずれか１つに記載の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
１つ以上の単離された核酸（例：ASO）の転写制御領域配列への結合によって引き起こされる導入遺伝子発現の調節（例：増加または減少）は、変化し得る。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）の転写制御領域配列への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）の転写制御領域配列への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、または１０００％の減少をもたらす。

コード配列を標的とする核酸
本開示の側面は、導入遺伝子発現（例：rAAVベクターまたは発現カセットによって媒介される導入遺伝子発現）を調節するための方法であって、導入遺伝子を発現するように構成された細胞を、１つ以上の治療用遺伝子（例：PD関連遺伝子）をコードするタンパク質コード領域（例：DNAまたはmRNA配列）に結合する１つ以上（例：１、２、３、４、５、またはそれ以上）の単離された核酸と接触させることによる、前記方法に関し、該治療用遺伝子としては、例えば、Gcase（例：GBA1遺伝子の遺伝子産物）またはその一部、プログラニュリン（例：PGRN遺伝子の遺伝子産物）またはその一部、プロサポシン（例：PSAP遺伝子の遺伝子産物）またはその一部、骨髄細胞２上で発現されるトリガー受容体（例：TREM2遺伝子の遺伝子産物）またはその一部、アポリポタンパク質（例：APOE遺伝子の遺伝子産物）、C9Orf72タンパク質（例：C9Orf72遺伝子の遺伝子産物）またはその一部などである。いくつかの態様において、遺伝子産物は、天然に存在する遺伝子のコード部分（例：cDNA）によってコードされる。いくつかの態様において、コード領域は、天然に存在する遺伝子のタンパク質断片をコードする。タンパク質断片は、天然に存在するタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％を含み得る。いくつかの態様において、タンパク質断片は、５０％～９９．９％（例：５０％と９９．９％の間の任意の値）の天然のタンパク質を含む。いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸の転写調節因子配列への結合は、rAAVベクターからのタンパク質の発現を減少させる。

単離された核酸は、rAAVベクター（例：rAAVベクターから転写されたmRNA）のタンパク質コード領域に、特異的に結合し得る。いくつかの態様において、単離された核酸は、前述の導入遺伝子のいずれか１つをコードするタンパク質コード領域（例：DNAまたはmRNA配列）、またはその遺伝子産物、または導入遺伝子のコドン最適化領域、または遺伝子産物のコドン最適化領域に、結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、単離された核酸は、前述の導入遺伝子のいずれか１つをコードするタンパク質コード領域、またはその遺伝子産物、または導入遺伝子のコドン最適化領域、または遺伝子産物のコドン最適化領域に、結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、単離された核酸は、β－グルコセレブロシダーゼまたはGBAをコードするタンパク質コード領域に結合（例：ハイブリダイズ）する。β－グルコセレブロシダーゼまたはGBAとも呼ばれるGcaseは、糖脂質代謝の中間体である化学グルコセレブロシドのβ－グルコシド結合を切断するリソソームタンパク質を指す。ヒトにおいては、Gcaseは、１番染色体上に位置するGBA1遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、GBA1は、NCBI参照配列 NCBI参照配列NP_000148.2によって表されるペプチドをコードする。

いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号４０に記載の配列などの、GBAタンパク質をコードするコドン最適化された（例：哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化された）核酸配列に、特異的に結合する。いくつかの態様において、単離された核酸は、GBAタンパク質コード配列（例えば、配列番号４０に記載の配列を有する）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドに、特異的に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号４１～５０のいずれか１つまたは配列番号９１～９５のいずれか１つに記載の核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
いくつかの態様において、タンパク質コード領域（例：GBAタンパク質をコードするmRNA配列などの、GBAタンパク質をコードする核酸配列）に特異的に結合する単離された核酸は、ギャップマー構造を含む。いくつかの態様において、ギャップマー構造を有する単離された核酸は、配列番号４１～５０のいずれか１つ、配列番号９１～９５のいずれか１つ、または配列番号１０６～１１０のいずれか１つに記載の配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドを含む。

１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のタンパク質コード配列への結合によって引き起こされる、導入遺伝子発現の調節（例：増加または減少）は、変化し得る。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）の転写制御領域配列への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のタンパク質コード配列への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、または１０００％の減少をもたらす。

転写後調節要素を標的とする核酸
本開示の側面は、導入遺伝子発現（例：rAAVベクターまたは発現カセットによって媒介される導入遺伝子発現）を調節するための方法であって、導入遺伝子を発現するように構成された細胞を、転写後調節要素配列（例：転写後調節要素配列を含むmRNAなどの核酸配列）に結合する１つ以上（例：１、２、３、４、５、またはそれ以上）の単離された核酸と接触させることによる、前記方法に関する。ポリアデニル化要素配列の例としては、Ｂ型肝炎ウイルス（HPRE）およびウッドチャック肝炎ウイルス（WPRE）などが挙げられる。いくつかの態様において、転写後調節要素配列は、ウッドチャック転写後調節要素配列（WPRE）である。いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸の転写後調節要素配列への結合は、rAAVベクターの発現を増加させるか、またはrAAVベクターの形質導入効率を減少させる。

単離された核酸は、rAAVベクターのWPREに特異的に結合し得る。いくつかの態様において、WPRE要素配列は、配列番号５１に記載の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、単離された核酸は、WPRE配列（例：配列番号５１に記載の配列を有する）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドに、特異的に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号５２～７９のいずれか１つ、配列番号９６～１００のいずれか１つ、もしくは配列番号１１１～１１５のいずれか１つに記載の核酸配列を含むか、またはそれらからなる。
１つ以上の単離された核酸（例：ASO）の、転写後調節要素配列（例：WPRE）への結合によって引き起こされる導入遺伝子発現の調節（例：増加または減少）は、変化し得る。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）の転写後調節要素配列への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ以上の導入遺伝子発現の増加をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）の転写後調節要素配列への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、または１０００％の減少をもたらす。

ポリアデニル化要素を標的とする核酸
本開示の側面は、導入遺伝子発現（例：rAAVベクターまたは発現カセットによって媒介される導入遺伝子発現）を調節するための方法であって、導入遺伝子を発現するように構成された細胞を、ポリアデニル化要素配列（例：ポリＡテールをコードするDNAまたはポリＵテールを含むmRNAなどの核酸配列）に結合する１つ以上（例：１、２、３、４、５、またはそれ以上）の単離された核酸と接触させることによる、前記方法に関する。ポリアデニル化要素配列の例としては、SV40ポリアデニル化要素、ウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化要素などが挙げられる。いくつかの態様において、ポリアデニル化要素はBGHポリＡ要素である。いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸の転写調節因子配列への結合は、rAAVベクターの発現を増加させるか、またはrAAVベクターの形質導入効率を減少させる。
単離された核酸は、rAAVベクターのBGHポリＡ要素に特異的に結合し得る。いくつかの態様において、BGHポリアデニル化要素配列は、配列番号８０に記載の配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、単離された核酸は、BGHポリアデニル化要素配列（例えば、配列番号８０に記載の配列を有する）の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドに特異的に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、単離された核酸は、配列番号８１～９０のいずれか１つもしくは配列番号１０１～１０４のいずれか１つに記載の核酸配列を含むか、またはそれらからなる。

いくつかの態様において、ポリアデニル化要素配列（例：BGHポリアデニル化要素をコードするmRNA配列などの、BGHポリアデニル化要素をコードする核酸配列）に特異的に結合する単離された核酸は、ギャップマー構造を含む。いくつかの態様において、ギャップマー構造を有する単離された核酸は、配列番号８１～９０のいずれか１つ、配列番号１０１～１０４のいずれか１つ、または配列番号１１６～１２０のいずれか１つに記載の配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドを含む。
１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のBGHポリアデニル化要素配列への結合によって引き起こされる導入遺伝子発現の調節（例：増加または減少）は、変化し得る。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のBGHポリアデニル化要素配列への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のBGHポリアデニル化要素配列への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターの導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、または１０００％の減少をもたらす。

医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはrAAVおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る」という用語は、化合物の生物活性または特性を無効にせず、また比較的非毒性である、担体または希釈剤などの材料を指し、例えば材料は、望ましくない生物学的影響を引き起こしたり、またはそれが含まれている組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用したりすることなく、個体に投与し得る。
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容し得る担体」とは、薬学的に許容し得る材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒または封入材料などであって、本発明内で有用な化合物をそれが意図する機能を果たすことができるように患者の内部に、または患者に運ぶかまたは輸送することに関連するものを、意味する。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得るさらなる成分は、当該分野で知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記載されている；これは参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で提供される組成物（例：医薬組成物）は、以下を含む任意の経路で投与することができる：経腸（例：経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内（intraventricular）、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、クリーム、および／または滴剤による）、粘膜、鼻腔、頬側、舌下；気管内注入、気管支注入、および／または吸入；および／または経口スプレー、鼻スプレー、および／またはエアロゾルとして。具体的に企図される経路は、経口投与、静脈内投与（例：全身静脈内注射）、血液および／またはリンパ供給による局所投与、および／または罹患部位への直接投与である。一般に、最も適切な投与経路は、様々な因子、例えば薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、および／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）などに依存するであろう。ある態様において、本明細書に記載の化合物または医薬組成物は、対象の眼への局所投与に好適である。

rAAVベクターおよびrAAV
本明細書に記載の単離された核酸は、それ自体で、またはベクターの一部として存在し得る。一般にベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（BAC）、またはウイルスベクター（例：アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）である。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド（例：本明細書に記載の単離された核酸を含むプラスミド）である。いくつかの態様において、rAAVベクターは、一本鎖である（例：一本鎖DNA）。いくつかの態様において、ベクターは、組換えAAV（rAAV）ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例：Autographa californica核多角体病（AcNPV）ベクター）である。
典型的には、rAAVベクター（例えばrAAVゲノム）は、２つのAAV逆方向末端反復（ITR）配列の脇に配置される導入遺伝子（例として、以下：プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、タンパク質コード配列、阻害性RNAコード配列、ポリＡテール配列などの各々を１以上含む発現コンストラクト）を含む。いくつかの態様において、rAAVベクターの導入遺伝子は、本開示に記載の単離された核酸を含む。いくつかの態様において、rAAVベクターの２つのITR配列のそれぞれは、完全長ITR（例えば、長さが約１４５ｂｐであり、機能的Rep結合部位（RBS）および末端分解部位（trs）を含有する）である。いくつかの態様において、rAAVベクターのITRの１つは、切断されている（例えば、短縮されているかまたは完全長ではない）。いくつかの態様において、切断型ITRは機能的末端分解部位（trs）を欠き、自己相補的AAVベクター（scAAVベクター）の生成のために使用される。いくつかの態様において、切断型ITRは、例えば、McCarty et al.(2003) Gene Ther. 10(26):2112-8に記載のΔITRである。

いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の核酸をコードする導入遺伝子を含む、組換えAAV（rAAV）に関する(例えば、本明細書に記載のrAAVベクター)。「rAAV」という用語は一般に、1つ以上のAAVカプシドタンパク質によってカプシド化されたrAAVベクターを含む、ウイルス粒子を指す。本開示に記載のrAAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9およびAAV10から選択される血清型を有するカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、rAAVは、非ヒト宿主由来のカプシドタンパク質、例えば、AAVrh.10、AAVrh.39などのアカゲザルAAVカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、本開示に記載のrAAVは、野生型カプシドタンパク質のバリアントであるカプシドタンパク質を含み、これは例えば、それが由来する野生型AAVカプシドタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多く（例えば、１５、２０、２５、５０、１００など）のアミノ酸置換（例えば、変異）を含む、カプシドタンパク質バリアントである。いくつかの態様において、AAVカプシドタンパク質バリアントは、例えばAlbright et al. Mol Ther. 2018 Feb 7;26(2):510-523に記載されているようなAAV1RXカプシドタンパク質である。いくつかの態様において、カプシドタンパク質バリアントは、例えばRosario et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016; 3: 16026に記載されているようなAAV TM6カプシドタンパク質である。

いくつかの態様において、本開示に記載のrAAVは、特にCSF空間にまたは直接脳実質に導入された場合に、CNSを通して容易に広がる。したがって、いくつかの態様において、本開示に記載のrAAVは、血液脳関門（BBB）を通過することができるカプシドタンパク質を含む。例えば、いくつかの態様において、rAAVは、AAV9またはAAVrh.10血清型を有するカプシドタンパク質を含む。rAAVの生成は、例えば、Samulski et al.(1989) J Virol. 63(9):3822-8およびWright(2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698-706に記載されている。いくつかの態様において、rAAVは、骨髄細胞、例えばミクログリア細胞を特異的または優先的に標的とするカプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、本開示に記載のrAAV（例えば、AAVカプシドタンパク質によってカプシド化されてrAAVカプシド粒子を形成する、組換えrAAVゲノムを含むもの）は、バキュロウイルスベクター発現系（BEVS）で生成される。BEVSを使用したrAAVの生成は、例えば以下に記載されている：Urabe et al.(2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43、Smith et al.(2009) Mol Ther 17(11):1888-1896、米国特許第8,945,918号、米国特許第9,879,282号、および国際PCT公開WO 2017/184879。しかしながらrAAVは、任意の適切な方法を使用して（例えば、組換えrepおよびcap遺伝子を使用して）生成され得る。

遺伝子発現の調節
本開示の側面は、遺伝子治療薬（例：AAVベクターから発現される治療用タンパク質）の発現を正または負に調節するための組成物および方法であって、特定の核酸の使用、例えば、ウイルスベクター領域（例：AAV ITR）、DNAまたはRNA調節要素（例：プロモーター配列、エンハンサー配列、転写後調節要素配列など）、およびrAAVベクターから転写されたmRNAのタンパク質コード配列、のうちの１つ以上に特異的に結合（例：ハイブリダイズ）するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）の使用を通じた、前記方法に関する。単離された核酸は、それが特異的に結合する発現カセットまたはrAAVベクターと同時に、または異なる時点（例：発現カセットもしくはrAAVベクターの投与前または後）に、細胞または対象に投与され得る。いくつかの態様において、対象にrAAVを投与し、その後、本明細書に記載の単離された核酸（または複数の単離された核酸）の１以上の用量を投与する。いくつかの態様において、単離された核酸の投与前の細胞または対象における導入遺伝子発現レベルの検出に基づいて、対象に１つ以上の単離された核酸を投与する。

いくつかの態様において、rAAVベクターは、宿主細胞などの細胞内にある。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例えば宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などであり得る。いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えばHEK293T細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は細菌細胞、例えば大腸菌細胞である。いくつかの態様において、細胞はin vitroにある。いくつかの態様において、細胞は対象、例えばヒト、マウス、イヌ、ネコなどの哺乳動物対象内にある。
いくつかの態様において、rAAVベクターまたは発現カセットに特異的に結合する１つの単離された核酸が、細胞または対象に提供される。いくつかの態様において、１つを超える（例：２、３、４、５、またはそれ以上）単離された核酸が、細胞または対象に提供される。１つを超える異なる単離された核酸（例：ASO）は、同じ領域または配列（例：それぞれがAAV ITRに結合する２つのASO）に結合してもよく、またはそれぞれが異なる領域または配列（例：AAV ITRに特異的に結合する第１のASOおよび転写後調節要素配列に結合する第２のASO）に結合してもよい。

本開示によって記載される１つ以上の単離された核酸の、細胞または対象への送達は、いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）の、細胞または対象に含有されるrAAVベクターまたは発現構築物の配列への結合によって引き起こされる、導入遺伝子発現の調節（例：増加または減少）をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のrAAVベクターまたは発現構築物への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターまたは発現構築物の導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１００％、またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のrAAVベクターまたは発現構築物への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターまたは発現構築物の導入遺伝子発現と比較して、形質導入効率の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１００％、またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸（例：ASO）のrAAVベクターまたは発現構築物への結合は、１つ以上の単離された核酸と接触していないrAAVベクターまたは発現構築物の導入遺伝子発現と比較して、導入遺伝子発現の約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、または１００％の減少をもたらす。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸は、導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトするのと同時に、細胞に送達される。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸は、導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした後に、細胞に送達される。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸は、導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２または２４時間後に、細胞に送達される。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸は、導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日後に、細胞に送達される。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸は、導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした１、２、３、４、１０、１５、２０、２６または５２週間後に、細胞に送達される。いくつかの態様において、１つ以上の単離された核酸は、導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドを細胞にトランスフェクトした１、２、３または５年後に、細胞に送達される。

本開示の側面は、対象における１つ以上のCNS疾患関連遺伝子産物の発現を調節してCNS関連疾患を処置するための、組成物に関する。１つ以上のCNS疾患関連遺伝子産物は、１つ以上の単離された核酸またはrAAVベクターによってコードされ得る。いくつかの態様において、対象には、１つ以上（１、２、３、４、５、またはそれ以上）の遺伝子産物をコードする単一のベクター（例：単離された核酸、rAAVなど）が投与される。いくつかの態様において、対象には、複数（例：２、３、４、５、またはそれ以上）のベクター（例：単離された核酸、rAAVなど）が投与され、各ベクターは、異なるCNS疾患関連遺伝子産物をコードする。
CNS関連疾患は、神経変性疾患、シヌクレイノパチー、タウオパチー、またはリソソーム蓄積症であり得る。神経変性疾患およびそれらの関連遺伝子の例を表１に示す。

「シヌクレイノパチー」とは、対象におけるα－シヌクレイン（SCNAの遺伝子産物）の発現または活性の低下（例：健康な対象、例えばシヌクレイノパチーを有さない対象と比べて）を特徴とする、疾患または障害を指す。シヌクレイノパチーおよびその関連遺伝子の例を表２に示す。
「タウオパチー」とは、対象（例：タウオパチーを有さない健康な対象）におけるタウタンパク質の発現または活性の低下を特徴とする、疾患または障害を指す。タウオパチーおよびそれに関連する遺伝子の例を表３に示す。
「リソソーム蓄積症」とは、対象のリソソームにおける有毒な細胞産物の異常な蓄積を特徴とする疾患を指す。リソソーム蓄積症およびその関連遺伝子の例を表４に示す。

本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置すること」とは、（ａ）CNS疾患の発症を予防または遅延させること；（ｂ）CNS疾患の重症度を軽減すること；（ｃ）CNS疾患に特徴的な症状の発症を軽減または予防すること；および／または（ｄ）対象におけるCNS疾患に特徴的な症状の悪化を予防すること、を指す。CNS疾患の症状としては、例えば、運動機能障害（例：震顫、固縮、動作緩慢、歩行困難、麻痺）、認知機能障害（例：認知症、うつ病、不安、精神病）、記憶障害、感情および行動機能障害が含まれ得る。
対象は典型的には哺乳動物であり、好ましくはヒトである。いくつかの態様において、対象は、生後１ヶ月～１０歳（例：１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２４ヶ月、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、またはその間の任意の年齢）である。いくつかの態様において、対象は２歳～２０歳の間である。いくつかの態様において、対象は３０歳～１００歳の間である。いくつかの態様において、対象は５５歳より年長である。

いくつかの態様において、組成物は、対象のCNSに直接的に、例えば対象の脳および／または脊髄への直接注射によって、投与される。CNS直接投与法の例には、限定はされないが、脳内注射、脳室内注射、槽内注射、実質内注射、髄腔内注射、および前述の任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、対象のCNSへの直接注射は、対象の中脳、線条体および／または大脳皮質における、導入遺伝子発現（例として、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。いくつかの態様において、CNSへの直接注射は、対象の脊髄および／またはCSFにおける導入遺伝子発現（例として、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。
いくつかの態様において、対象のCNSへの直接注射は、対流強化送達（CED）を含む。対流強化送達は、脳の外科的露出および小径カテーテルを脳の標的領域に直接配置し、続いて治療剤（例として、本明細書に記載の組成物またはrAAV)を対象の脳に直接注入することを含む、治療戦略である。CEDは、例えば、Debinski et al.(2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27に記載されている。

いくつかの態様において、組成物は、例えば末梢注射により、対象の末梢に投与される。末梢注射の例には、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、末梢注射は、動脈内注射、例えば対象の頸動脈への注射である。
いくつかの態様において、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはrAAV、および／または本明細書に記載の単離された核酸を含む組成物）は、対象の末梢および直接的にCNSの両方で投与される。例えば、いくつかの態様において、対象は、動脈内注射（例：頸動脈への注射）および実質内注射（例：CEDによる実質内注射）によって、組成物を投与される。いくつかの態様において、CNSへの直接注射および末梢注射は同時である（例えば、同時に起こる）。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の前（例：１分から１週間の間、またはそれより前）に行われる。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の後（例：１分から１週間の間、またはその後）に行われる。

いくつかの態様において、対象は、本明細書に記載の組成物の前（例：１ヶ月前から１分前まで）、またはそれと同時に、免疫抑制剤を投与される。いくつかの態様において、免疫抑制剤は、コルチコステロイド（例：プレドニゾン、ブデソニド等）、mTOR阻害剤（例：シロリムス、エベロリムス等）、抗体（例：アダリムマブ、エタネルセプト、ナタリズマブ等）、またはメトトレキサートである。
対象に投与される本開示に記載の組成物（例：単離された核酸またはベクターまたはrAAVを含む組成物）の量は、投与方法に応じて変化するであろう。
本開示に記載の組成物（例：単離された核酸またはベクターまたはrAAVを含む組成物）は、対象に1回または複数回（例：２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、またはそれ以上）投与され得る。いくつかの態様において、組成物は対象に継続的に（例えば、慢性的に）、例えば注入ポンプを介して、投与される。

例１～５：GBA欠損細胞へのウイルス形質導入の細胞ベースアッセイ
GBA1欠損細胞は、例えばGD患者からの線維芽細胞、単球、またはhES細胞、または患者由来の人工多能性幹細胞（iPSC）、またはHEK293T細胞として得る。これらの細胞は、グルコシルセラミドおよびグルコシルスフィンゴシン（GlcCerおよびGlcSph）などの基質を蓄積する。野生型または変異体の培養細胞株の、CBEなどのGcase阻害剤による処理も、GBA欠損細胞を得るために使用される。
細胞には、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列（例：PR001）を含むrAAVベクターを封入しているAAV９カプシドタンパク質を含むrAAVを投与する。形質導入効率およびGBA発現レベルを、細胞内でモニタリングする。PR001ベクターを標的とする１つ以上の単離された核酸（例：ASO）を、細胞に投与する。治療エンドポイント（例：in vivoアッセイにおけるPD関連病理の軽減）を、AAVベクターの形質導入の発現の文脈で測定し、PR001の活性および機能の増加または減少を確認および定量化する。GBA発現は、qRT-PCTを使用するか、またはタンパク質ELISA測定を用いたGcaseレベル測定を通して、または標準的なGcase活性アッセイによって定量化する。

例１：GBAに指向されたASOの効果
HEK293T細胞に、GBAタンパク質をコードするrAAVベクター（例：PR001）を含むプラスミドをトランスフェクトし、rAAVベクター（PR001）のGBAコード部分に指向されたASOを投与した。８つの実験群において投与されたASOのレベルおよび種類は以下の通りであった：２０ｎＭのGBA ASO 1修飾体（配列番号９１）、１００ｎＭのGBA ASO 1修飾体（配列番号９１）、２０ｎＭのGBA ASO 2修飾体（配列番号９２）、１００ｎＭのGBA ASO 2修飾体（配列番号９２）、２０ｎＭのGBA ASO 3修飾体（配列番号９３）、１００ｎＭのGBA ASO 3修飾体（配列番号９３）、２０ｎＭのGBA ASO 4修飾体（配列番号９４）、１００ｎＭのGBA ASO 4修飾体（配列番号９４）。陰性対照群と陽性対照群も実験計画に含めた。陰性対照において、細胞にはGBAをコードするプラスミドをトランスフェクトせず、いかなるASOも投与しなかった。陽性対照において、細胞にはGBA発現をコードするプラスミドをトランスフェクトし、配列番号１０５に記載の核酸配列を含む、GFP（緑色蛍光タンパク質）に指向された１００ｎＭのASOを投与した。細胞を７２時間後に回収し、GBA発現をqRT-PCRを用いて定量化した。全ての実験群は、陽性対照と比べてGBA発現の有意な減少を示した（図１）。

例２：WPREに指向されたASOの効果
HEK293T細胞に、GBAタンパク質をコードするrAAVベクター（例：PR001）を含むプラスミドをトランスフェクトし、rAAVベクター（PR001）のWPREコード部分に指向されたASOを投与した。１０の実験群において投与されたASOのレベルおよび種類は以下の通りであった：２０ｎＭのWPRE ASO 1修飾体（配列番号９６）、１００ｎＭのWPRE ASO 1修飾体（配列番号９６）、２０ｎＭのWPRE ASO 2修飾体（配列番号９７）、１００ｎＭのWPRE ASO 2修飾体（配列番号９７）、２０ｎＭのWPRE ASO 3修飾体（配列番号９８）、１００ｎＭのWPRE ASO 3修飾体（配列番号９８）、２０ｎＭのWPRE ASO 4修飾体（配列番号９９）、１００ｎＭのWPRE ASO 4修飾体（配列番号９９）、２０ｎＭのWPRE ASO 5修飾体（配列番号１００）、１００ｎＭのWPRE ASO 5修飾体（配列番号１００）。４つの対照群も実験計画に含めた：陰性対照群では、細胞にはGBAをコードするプラスミドをトランスフェクトせず、いかなるASOも投与しなかった；陽性対照群では、細胞にはGBA発現をコードするプラスミドをトランスフェクトし、GFPに指向された１００ｎＭのASO（配列番号１０５）を投与した；２つの群では、細胞にGBAをコードするプラスミドをトランスフェクトし、それぞれ、２０ｎＭのGBA ASO 1修飾体（配列番号９１）および１００ｎＭのGBA ASO 1修飾体（配列番号９１）を投与した。細胞を７２時間後に回収し、GBA発現をqRT-PCRを用いて定量化した。驚くべきことに、陽性対照と比べたGBA発現の増加が、いくつかの実験群、特に１００ｎＭのWPRE ASO 1修飾体（配列番号９６）、WPRE ASO 4修飾体（配列番号９９）、またはWPRE ASO 5修飾体（配列番号１００）を投与された群で観察された（図２）。

例３：ウシ成長ホルモンポリアデニル化要素（BGHポリＡ）に指向されたASOの効果
HEK293T細胞に、GBAタンパク質をコードするrAAVベクター（例：PR001）を含むプラスミドをトランスフェクトし、rAAVベクター（PR001）のBGHポリアデニル化要素（ポリＡ）コード部分に指向されたASOを投与した。８つの実験群において投与されたASOのレベルおよび種類は以下の通りであった：２０ｎＭのポリＡ ASO 1修飾体（配列番号１０１）、１００ｎＭのポリＡ ASO 1修飾体（配列番号１０１）、２０ｎＭのポリＡ ASO 2修飾体（配列番号１０２）、１００ｎＭのポリＡ ASO 2修飾体（配列番号１０２）、２０ｎＭのポリＡ ASO 3修飾体（配列番号１０３）、１００ｎＭのポリＡ ASO 3修飾体（配列番号１０３）、２０ｎＭのポリＡ ASO 5修飾体（配列番号１０４）、１００ｎＭのポリＡ ASO 5修飾体（配列番号１０４）。４つの対照群も実験計画に含めた：陰性対照群では、細胞にはGBAをコードするプラスミドをトランスフェクトせず、いかなるASOも投与しなかった；陽性対照群では、細胞にはGBA発現をコードするプラスミドをトランスフェクトし、GFPに指向された１００ｎＭのASO（配列番号１０５）を投与した；２つの群では、細胞にGBAをコードするプラスミドをトランスフェクトし、それぞれ、２０ｎＭのGBA ASO 1修飾体（配列番号９１）または１００ｎＭのGBA ASO 1修飾体（配列番号９１）を投与した。細胞を７２時間後に回収し、GBA発現をqRT-PCRを用いて定量化した。驚くべきことに、すべての実験群は、陽性対照と比べて、同等または有意に増加したGBA発現を示した。注目すべきことに、陽性対照に対してGBA発現の２０倍の増加が、１００ｎＭのポリＡ ASO 2修飾体（配列番号１０２）を投与した細胞で観察された（図３）。

例４：ポリＡ ASO 2修飾体（配列番号１０２）のTrem2発現に対する効果
HEK293T細胞に、Trem2タンパク質をコードするrAAVベクターを含むプラスミドをトランスフェクトし、それぞれ２０ｎＭまたは１００ｎＭのポリＡASO 2修飾体（配で列番号１０２）を投与した。２つの対照群も実験計画に含めた：陰性対照群では、細胞にはTrem2をコードするプラスミドをトランスフェクトせず、いかなるASOも投与しなかった；陽性対照群では、細胞にはTrem2発現をコードするプラスミドをトランスフェクトし、GFPに指向された１００ｎＭのASO（配列番号１０５）を投与した。細胞を７２時間後に回収し、Trem2発現をqRT-PCRを用いて定量化した。両方の実験群は、陽性対照と比べてTrem2発現の有意な増加を示した。注目すべきことに、１００ｎＭのポリＡ ASO 2修飾体（配列番号１０２）を投与した細胞は、陽性対照と比べてTrem2発現の１３倍の増加を示した（図４）。

例５：逐次トランスフェクションにおけるASO投与の効果
HEK293T細胞に、GBAタンパク質をコードするrAAVベクターを含むプラスミドをトランスフェクトした。３時間後、プラスミドトランスフェクション混合物を除去し、４つの実験群の細胞に、それぞれ以下をトランスフェクトした：２０ｎＭのGBA ASO 1修飾体（配列番号９１）、１００ｎＭのGBA ASO 1修飾体（配列番号９１）、２０ｎＭのポリＡ ASO 2修飾体（配列番号１０２）または１００ｎＭの修飾ポリＡ ASO 2（配列番号１０２）。２つの対照群も実験計画に含めた：陰性対照群では、細胞にはGBAをコードするプラスミドをトランスフェクトせず、いかなるASOも投与しなかった；陽性対照群では、細胞にはGBA発現をコードするプラスミドをトランスフェクトし、GFPに指向された１００ｎＭのASO（配列番号１０５）を投与した。細胞を７２時間後に回収し、GBA発現をqRT-PCRを用いて定量化した。GBA ASO 1修飾体（配列番号９１）を投与した両方の実験群は、陽性対照と比べてGBA発現の有意な減少を示した。２０ｎＭのポリＡ ASO 2修飾体（配列番号１０２）を投与した群は、陽性群と同様のレベルのGBA発現を示した。１００ｎＭのポリＡ ASO 2修飾体（配列番号１０２）を投与した細胞は最も顕著な変化を示し、陽性対照と比べてGBA発現が７～８倍増加した（図５）。

例６：in vivoアッセイ
C57／BL6J雄マウスに、GBAを発現するAAV（AAV-GBA）を１×１０^１２ｖｇ／ｋｇで、または賦形剤対照を、IV注入した。賦形剤群のマウスには次に生理食塩水対照を与え、一方、AAV-GBAを与えたマウスには、表５に詳述するように、生理食塩水またはASOのIV注入をAAV-GBA注入後７、１４および２１日目に行った。血漿を、顎下採血により、AAV-GBA注入前および、AAV-GBA注入後７日目と２１日目に収集した。AAV注入の３０日後にマウスを安楽死させ、分析のために組織を収集した。

結果は、GBA ASO 1およびWPRE ASO 2が肝臓におけるGBA mRNAレベルを有意に減少させ、ポリＡ ASO 2が肝臓におけるGBA mRNAを減少させる傾向を示したことを示す（図７）。
AAVベクターのin vivoアッセイを、変異マウスを用いて実施する。ビヒクル対照およびAAVベクター（例：PR001を２×１０^１１ｖｇ／マウスの用量で）の髄腔内または脳室内送達は、濃縮AAVストックを使用して、例えば５～１０μＬの注入量で行われる。対流強化送達による実質内送達が行われる。PR001ベクターを標的とする１つ以上の単離された核酸（例：ASO）を細胞に投与する。治療エンドポイント（例：PD関連病状の軽減）は、AAVベクターの形質導入の発現の文脈で測定し、PR001の活性および機能の増加または減少を確認および定量化する。測定されるエンドポイントは、CNSおよびCSFにおける基質の蓄積、ELISAによるGcase酵素および酵素活性の蓄積、運動および認知エンドポイント、リソソーム機能不全、およびα－シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたはフィブリルの蓄積である。

配列
いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸（例：ASO）は、以下に示す配列、またはその相補体、またはその逆相補体に特異的に結合（例：ハイブリダイズ）する。いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸（例：ASO）は、以下に示す配列のうちの１つ、またはその相補体、またはその逆相補体、またはそのギャップマー、または１つ以上の化学的修飾を含むその修飾バージョンを含むか、またはそれらからなり、ここで１つ以上の化学的修飾は、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される。いくつかの態様において、ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている。いくつかの態様において、核酸塩基修飾は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含み、主鎖修飾はホスホロチオアート結合を含む。いくつかの態様において、ASOは、１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む。以下に示す配列において、核酸塩基文字の前にある「m」の文字は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を示し、２つの核酸塩基間の「*」はホスホロチオアート結合を示す。

>AAV2 ITR核酸配列(配列番号1)
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct

>ITR ASO 1 (配列番号2)
gcgcgcagctgcctgcagg

>ITR ASO 2 (配列番号3)
cggcctcagtgagcgagcga

>ITR ASO 3 (配列番号4)
acgcccgggctttgcccggg

>ITR ASO 4 (配列番号5)
cgggcgaccaaaggtcgcccg

>ITR ASO 5 (配列番号6)
gctcgctcgctcactgaggc

>ITR ASO 6 (配列番号7)
tggccactccctctctgcgc

>ITR ASO 7 (配列番号8)
aggaacccctagtgatggagt

>CMVエンハンサー核酸配列(配列番号9)
Cgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatg

>CMV ASO 1 (配列番号10)
tttaccgtaagttatgtaacg

>CMV ASO 2 (配列番号11)
ggcggtcagccaggcgggcca

>CMV ASO 3 (配列番号12)
gtcaatgggcgggggtcgttg

>CMV ASO 4 (配列番号13)
ggaacatacgtcattattgac

>CMV ASO 5 (配列番号14)
gtccctattggcgttactatg

>CMV ASO 6 (配列番号15)
acccattgacgtcaatggaaa

>CMV ASO 7 (配列番号16)
gcagtttaccgtaaatactcc

>CMV ASO 8 (配列番号17)
acttgatgtactgccaagtgg

>CMV ASO 9 (配列番号18)
ggcgtacttggcatatgatac

>CMV ASO 10 (配列番号19)
ccgtcattgacgtcaataggg

>CMV ASO 11 (配列番号20)
taatgccaggcgggccattta

>CMV ASO 12 (配列番号21)
cataaggtcatgtactgggca

>CMV ASO 13 (配列番号22)
tactgccaagtaggaaagtcc

>CMV ASO 14 (配列番号23)
gcgatgactaatacgtagatg

>CMV ASO 15 (配列番号24)
ccatggtaatagcgatgac

>CBAプロモーター核酸配列(配列番号25)
tcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcg

>CB ASO 1 (配列番号26)
agaacgtggggctcacctcga

>CB ASO 2 (配列番号27)
gggagatggggagagtgaagc

>CB ASO 3 (配列番号28)
aaattgggggtggggaggggg

>CB ASO 4 (配列番号29)
attaaaaaataaataaataca

>CB ASO 5 (配列番号30)
cccccatcgctgcacaaaata

>CB ASO 6 (配列番号31)
cgcgccccccccccccccccg

>CB ASO 7 (配列番号32)
cccgccccgccccgcctggcg

>CB ASO 8 (配列番号33)
tcgccccgccccgcccctcgc

>CB ASO 9 (配列番号34)
ctgccgccgcacctctccgcc

>CB ASO 10 (配列番号35)
ggagcgcgccgctctgattgg

>CB ASO 11 (配列番号36)
tcgccataaaaggaaactttc

>CB ASO 12 (配列番号37)
agggccgccgccgccgccgcc

>CB ASO 13 (配列番号38)
gccgcgcgcttcgctttttat

>CB ASO 14 (配列番号39)
agcgcgcagcgactcccgccc

>GBAコドン最適化核酸配列(配列番号40)
auggaauucagcagccccagcagagaggaaugccccaagccucugagccgggugucaaucauggccggaucucugacaggacugcugcugcuucaggccgugucuugggcuucuggcgcuagaccuugcauccccaagagcuucggcuacagcagcgucgugugcgugugcaaugccaccuacugcgacagcuucgacccuccuaccuuuccugcucugggcaccuucagcagauacgagagcaccagauccggcagacggauggaacugagcaugggacccauccaggccaaucacacaggcacuggccugcugcugacacugcagccugagcagaaauuccagaaagugaaaggcuucggcggagccaugacagaugccgccgcucugaauauccuggcucugucuccaccagcucagaaccugcugcucaagagcuacuucagcgaggaaggcaucggcuacaacaucaucagagugcccauggccagcugcgacuucagcaucaggaccuacaccuacgccgacacacccgacgauuuccagcugcacaacuucagccugccugaagaggacaccaagcugaagaucccucugauccacagagcccugcagcuggcacaaagacccgugucacugcuggccucuccauggacaucucccaccuggcugaaaacaaauggcgccgugaauggcaagggcagccugaaaggccaaccuggcgacaucuaccaccagaccugggccagauacuucgugaaguuccuggacgccuaugccgagcacaagcugcaguuuugggccgugacagccgagaacgaaccuucugcuggacugcugagcggcuaccccuuucagugccugggcuuuacacccgagcaccagcgggacuuuaucgcccgugaucugggacccacacuggccaauagcacccaccauaaugugcggcugcugaugcuggacgaccagagacugcuucugccccacugggcuaaaguggugcugacagauccugaggccgccaaauacgugcacggaaucgccgugcacugguaucuggacuuucuggccccugccaaggccacacugggagagacacacagacuguuccccaacaccaugcuguucgccagcgaagccugugugggcagcaaguuuugggaacagagcgugcggcucggcagcugggauagaggcaugcaguacagccacagcaucaucaccaaccugcuguaccacgucgucggcuggaccgacuggaaucuggcccugaauccugaaggcggcccuaacuggguccgaaacuucguggacagccccaucaucguggacaucaccaaggacaccuucuacaagcagcccauguucuaccaccugggacacuucagcaaguucauccccgagggcucucagcgcguuggacugguggcuucccagaagaacgaucuggacgccguggcucugaugcacccugauggaucugcugugguggugguccugaaccgcagcagcaaagaugugccccugaccaucaaggaucccgccgugggauuccuggaaacaaucagcccuggcuacuccauccacaccuaccuguggcguagacaguga

>GBA ASO 1 (配列番号41)
gcugcugaauuccaugguggc

>GBA ASO 2 (配列番号42)
ggggcauuccucucugcuggg

>GBA ASO 3 (配列番号43)
ugacacccggcucagaggcuu

>GBA ASO 4 (配列番号44)
ugucagagauccggccaugau

>GBA ASO 5 (配列番号45)
ggccugaagcagcagcagucc

>GBA ASO 6 (配列番号46)
agcgccagaagcccaagacac

>GBA ASO 7 (配列番号47)
gcucuuggggaugcaaggucu

>GBA ASO 8 (配列番号48)
cacgacgcugcuguagccgaa

>GBA ASO 9 (配列番号49)
guagguggcauugcacacgca

>GBA ASO 10 (配列番号50)
aggagggucgaagcugucgca

>WPRE核酸配列(配列番号51)
Aaucaaccucuggauuacaaaauuugugaaagauugacugguauucuuaacuauguugcuccuuuuacgcuauguggauacgcugcuuuaaugccuuuguaucaugcuauugcuucccguauggcuuucauuuucuccuccuuguauaaauccugguugcugucucuuuaugaggaguuguggcccguugucaggcaacguggcguggugugcacuguguuugcugacgcaacccccacugguuggggcauugccaccaccugucagcuccuuuccgggacuuucgcuuucccccucccuauugccacggcggaacucaucgccgccugccuugcccgcugcuggacaggggcucggcuguugggcacugacaauuccgugguguugucggggaaaucaucguccuuuccuuggcugcucgccuguguugccaccuggauucugcgcgggacguccuucugcuacgucccuucggcccucaauccagcggaccuuccuucccgcggccugcugccggcucugcggccucuuccgcgucuucgccuucgcccucagacgagucggaucucccuuugggccgccuccccgc

>WPRE ASO 1 (配列番号52)
uuuguaauccagagguugauu

>WPRE ASO 2 (配列番号53)
accagucaaucuuucacaaau

>WPRE ASO 3 (配列番号54)
aggagcaacauaguuaagaau

>WPRE ASO 4 (配列番号55)
agcguauccacauagcguaaa

>WPRE ASO 5 (配列番号56)
augauacaaaggcauuaaagc

>WPRE ASO 6 (配列番号57)
agccauacgggaagcaauagc

>WPRE ASO 7 (配列番号58)
auacaaggaggagaaaaugaa

>WPRE ASO 8 (配列番号59)
aagagacagcaaccaggauuu

>WPRE ASO 9 (配列番号60)
aacgggccacaacuccucaua

>WPRE ASO 10 (配列番号61)
caccacgccacguugccugac

>WPRE ASO 11 (配列番号62)
ugcgucagcaaacacagugca

>WPRE ASO 12 (配列番号63)
aaugccccaaccagugggggu

>WPRE ASO 13 (配列番号64)
aaggagcugacaggugguggc

>WPRE ASO 14 (配列番号65)
ggggaaagcgaaagucccgga

>WPRE ASO 15 (配列番号66)
uuccgccguggcaauagggag

>WPRE ASO 16 (配列番号67)
ggcaaggcaggcggcgaugag

>WPRE ASO 17 (配列番号68)
ccgagccccuguccagcagcg

>WPRE ASO 18 (配列番号69)
ggaauugucagugcccaacag

>WPRE ASO 19 (配列番号70)
ugauuuccccgacaacaccac

>WPRE ASO 20 (配列番号71)
gagcagccaaggaaaggacga

>WPRE ASO 21 (配列番号72)
aauccagguggcaacacaggc

>WPRE ASO 22 (配列番号73)
gcagaaggacgucccgcgcag

>WPRE ASO 23 (配列番号74)
auugagggccgaagggacgua

>WPRE ASO 24 (配列番号75)
gcgggaaggaagguccgcugg

>WPRE ASO 25 (配列番号76)
ccgcagagccggcagcaggcc

>WPRE ASO 26 (配列番号77)
aaggcgaagacgcggaagagg

>WPRE ASO 27 (配列番号78)
gauccgacucgucugagggcg

>WPRE ASO 28 (配列番号79)
cggggaggcggcccaaaggga

>ウシ成長ホルモンポリアデニル化付加要素(配列番号80)
cugugccuucuaguugccagccaucuguuguuugccccucccccgugccuuccuugacccuggaaggugccacucccacuguccuuuccuaauaaaaugaggaaauugcaucgcauugucugaguaggugucauucuauucuggggggugggguggggcaggacagcaagggggaggauugggaagacaauagcaggcaugcugggga

>ポリA ASO 1 (配列番号81)
gcuggcaacuagaaggcacag

>ポリA ASO 2 (配列番号82)
gggaggggcaaacaacagaug

>ポリA ASO 3 (配列番号83)
ccagggucaaggaaggcacgg

>ポリA ASO 4 (配列番号84)
ggacagugggaguggcaccuu

>ポリA ASO 5 (配列番号85)
uuuccucauuuuauuaggaaa

>ポリA ASO 6 (配列番号86)
uacucagacaaugcgaugcaa

>ポリA ASO 7 (配列番号87)
cccccagaauagaaugacacc

>ポリA ASO 8 (配列番号88)
ugcuguccugccccaccccac

>ポリA ASO 9 (配列番号89)
ugucuucccaauccucccccu

>ポリA ASO 10 (配列番号90)
ucuccccagcaugccugcuau

>GBA ASO 1修飾体 (配列番号91)
mG*mG*mG*mG*mC*A*T*T*C*C*T*C*T*C*T*mG*mC*mU*mG*mG

>GBA ASO 2修飾体 (配列番号92)
mU*mG*mC*mA*mG*T*G*T*C*A*G*C*A*G*C*mA*mG*mG*mC*mC

>GBA ASO 3修飾体 (配列番号93)
mG*mG*mU*mG*mG*A*G*A*C*A*G*A*G*C*C*mA*mG*mG*mA*mU

>GBA ASO 4修飾体 (配列番号94)
mG*mC*mC*mU*mU*C*C*T*C*G*C*T*G*A*A*mG*mU*mA*mG*mC

>GBA ASO 5修飾体 (配列番号95)
mC*mG*mC*mA*mG*C*T*G*G*C*C*A*T*G*G*mG*mC*mA*mC*mU

>WPRE ASO 1修飾体 (配列番号96)
mC*mU*mU*mU*mC*A*C*A*A*A*T*T*T*T*G*T*mA*mA*mU*mC*mC

>WPRE ASO 2修飾体 (配列番号97)
mG*mG*mC*mA*mU*T*A*A*A*G*C*A*G*C*G*mU*mA*mU*mC*mC

>WPRE ASO 3修飾体 (配列番号98)
mC*mC*mC*mC*mG*A*C*A*A*C*A*C*C*A*C*G*G*mA*mA*mU*mU*mG

>WPRE ASO 4修飾体 (配列番号99)
mG*mG*mG*mC*mC*G*A*A*G*G*G*A*C*G*T*mA*mG*mC*mA*mG

>WPRE ASO 5修飾体 (配列番号100)
mG*mC*mG*mG*mG*G*A*G*G*C*G*G*C*C*C*A*mA*mA*mG*mG*mG

>ポリA ASO 1修飾体 (配列番号101)
mG*mG*mC*mU*mG*G*C*A*A*C*T*A*G*A*A*mG*mG*mC*mA*mC

>ポリA ASO 2修飾体 (配列番号102)
mG*mG*mU*mC*mA*A*G*G*A*A*G*G*C*A*C*mG*mG*mG*mG*mG

>ポリA ASO 3修飾体 (配列番号103)
mC*mC*mC*mC*mC*C*A*G*A*A*T*A*G*A*A*T*G*mA*mC*mA*mC*mC

>ポリA ASO 5修飾体 (配列番号104)
mG*mG*mA*mC*mA*mG*mU*mG*mG*mG*mA*mG*mU*mG*mG*mC*mA*mC*mC

>GFP ASO 1修飾体 (配列番号105)
mU*mG*mU*mG*mG*C*C*G*T*T*T*A*C*G*T*mC*mG*mC*mC*mG

>GBA ASO 1非修飾体 (配列番号106)
Ggggcauuccucucugcugg

>GBA ASO 2非修飾体 (配列番号107)
ugcagugucagcagcaggcc

>GBA ASO 3非修飾体 (配列番号108)
gguggagacagagccaggau

>GBA ASO 4非修飾体 (配列番号109)
gccuuccucgcugaaguagc

>GBA ASO 5非修飾体 (配列番号110)
cgcagcuggccaugggcacu

>WPRE ASO 1非修飾体 (配列番号111)
Cuuucacaaauuuuguaaucc

>WPRE ASO 2非修飾体 (配列番号112)
Ggcauuaaagcagcguaucc

>WPRE ASO 3非修飾体 (配列番号113)
Ccccgacaacaccacggaauug

>WPRE ASO 4非修飾体 (配列番号114)
Gggccgaagggacguagcag

>WPRE ASO 5非修飾体 (配列番号115)
Gcggggaggcggcccaaaggg

>ポリA ASO 1非修飾体 (配列番号116)
ggcuggcaacuagaaggcac

>ポリA ASO 2非修飾体 (配列番号117)
ggucaaggaaggcacggggg

>ポリA ASO 3非修飾体 (配列番号118)
ccccccagaauagaaugacacc

>ポリA ASO 4非修飾体 (配列番号119)
ccauagagcccaccgcaucccc

>ポリA ASO 5非修飾体 (配列番号120)
ggacagugggaguggcacc

Claims (121)

1. 細胞における導入遺伝子の発現を調節するための方法であって、AAV逆方向末端反復（ITR）の脇に配置される導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、AAV ITRの少なくとも１つに特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOのAAV ITRへの結合が、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす、前記方法。
2. １つ以上のASOの各々が、長さ約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である、請求項１に記載の方法。
3. 各ASOが１つ以上の化学的修飾を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. １つ以上の化学的修飾の各々が、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 各ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている、請求項４に記載の方法。
6. 核酸塩基修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む、請求項４または５に記載の方法。
7. 主鎖修飾が、ホスホロチオアート結合を含む、請求項４または５に記載の方法。
8. ASOが、１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む、請求項４または５に記載の方法。
9. AAV ITRが、AAV2 ITRである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. AAV2 ITRが、配列番号１に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含む、請求項９に記載の方法。
11. AAV2 ITRが、配列番号１に記載の核酸配列またはその相補体からなる、請求項１０に記載の方法。
12. ASOが、AAV ITRの少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 少なくとも１つのASOが、配列番号２～８のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の増加である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の減少である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
16. 細胞が哺乳動物細胞であり、任意にここで哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 細胞が対象内にある、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 導入遺伝子が、治療用タンパク質である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 治療用タンパク質が、β－グルコセレブロシダーゼ（GBA）である、請求項１８に記載の方法。
20. GBAが、コドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項１９に記載の方法。
21. GBAをコードする導入遺伝子が、配列番号４０に記載の核酸配列またはその相補体を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
22. rAAVベクターが、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 細胞における導入遺伝子の発現を調節するための方法であって、導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、導入遺伝子の転写制御領域配列に特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOの転写制御領域配列への結合が、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす、前記方法。
24. １つ以上のASOの各々が、長さ約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である、請求項２３に記載の方法。
25. 各ASOが１つ以上の化学的修飾を含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
26. １つ以上の化学的修飾の各々が、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 各ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている、請求項２６に記載の方法。
28. 核酸塩基修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
29. 主鎖修飾が、ホスホロチオアート結合を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
30. ASOが、１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
31. 転写制御領域配列が、エンハンサー配列および／またはプロモーター配列を含む、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. エンハンサー配列がサイトメガロウイルス（CMV）エンハンサー配列であり、および／またはプロモーター配列がニワトリβアクチン（CBA）プロモーター配列である、請求項３１に記載の方法。
33. （CMV）エンハンサー配列が、配列番号９に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含み、および／またはニワトリβアクチン（CBA）プロモーター配列が、配列番号２５に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含む、請求項３２に記載の方法。
34. ASOが、転写制御領域配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する、請求項２３～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 少なくとも１つのASOが、配列番号１０～２４および２６～３９のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む、請求項２３～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 少なくとも１つのASOが、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される１つ以上の化学的修飾を含む、請求項３５に記載の方法。
37. １つ以上の化学的修飾の各々が、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される、請求項３６に記載の方法。
38. 各ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている、請求項３７に記載の方法。
39. 核酸塩基修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
40. 主鎖修飾が、ホスホロチオアート結合を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
41. ASOが、１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
42. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の増加である、請求項２３～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の減少である、請求項２３～４１のいずれか一項に記載の方法。
44. 細胞が哺乳動物細胞であり、任意にここで哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２３～４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 細胞が対象内にある、請求項２３～４４のいずれか一項に記載の方法。
46. 導入遺伝子が、治療用タンパク質である、請求項２３～４５のいずれか一項に記載の方法。
47. 治療用タンパク質が、β－グルコセレブロシダーゼ（GBA）である、請求項４６に記載の方法。
48. GBAが、コドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項４７に記載の方法。
49. GBAをコードする導入遺伝子が、配列番号４０に記載の核酸配列またはその相補体を含む、請求項４７または４８に記載の方法。
50. rAAVベクターが、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む、請求項３５～４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 細胞における導入遺伝子の発現を調節するための方法であって、導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、導入遺伝子から転写されたmRNAのタンパク質コード領域に特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOのタンパク質コード領域への結合が、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす、前記方法。
52. １つ以上のASOの各々が、長さ約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である、請求項５１に記載の方法。
53. 各ASOが、１つ以上の化学的修飾を含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法。
54. １つ以上の化学的修飾の各々が、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される、請求項５３に記載の方法。
55. 各ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている、請求項５４に記載の方法。
56. 核酸塩基修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
57. 主鎖修飾が、ホスホロチオアート結合を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
58. ASOが、１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む、請求項５４または５５に記載の方法。
59. ASOが、ギャップマー構造を含む、請求項５１～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. ASOが、タンパク質コード領域の少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する、請求項５１～５９のいずれか一項に記載の方法。
61. 少なくとも１つのASOが、配列番号４１～５０のいずれか１つ、配列番号９１～９５のいずれか１つ、もしくは配列番号１０６～１１０のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の方法。
62. タンパク質コード領域が、β－グルコセレブロシダーゼ（GBA）タンパク質をコードする、請求項５１～６１のいずれか一項に記載の方法。
63. タンパク質コード領域が、配列番号４０に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含む、請求項６２に記載の方法。
64. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の増加である、請求項５１～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の減少である、請求項５１～６３のいずれか一項に記載の方法。
66. 発現の調節が、発現された導入遺伝子の性質に関係なく生じる、請求項５１～６５のいずれか一項に記載の方法。
67. １つ以上のASOが、導入遺伝子のトランスフェクションと同時に細胞に送達される、請求項５１～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. １つ以上のASOが、細胞に導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドをトランスフェクトした数時間後、例えば３時間後に、細胞に送達される、請求項５１～６６のいずれか一項に記載の方法。
69. １つ以上のASOが、細胞に導入遺伝子をコードするrAAVベクターを含むプラスミドをトランスフェクトした数週間後に、細胞に送達される、請求項５１～６６のいずれか一項に記載の方法。
70. 導入遺伝子の発現の減少が、１つ以上のASOによって結合されるmRNA転写物のRNaseH媒介性分解に起因する、請求項６５に記載の方法。
71. 細胞が哺乳動物細胞であり、任意にここで哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項５１～７０のいずれか一項に記載の方法。
72. 細胞が対象内にある、請求項５１～７１のいずれか一項に記載の方法。
73. rAAVベクターが、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む、請求項５１～７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 細胞における導入遺伝子の発現を調節するための方法であって、導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、導入遺伝子から転写されたmRNAのウッドチャック翻訳後調節要素（WPRE）に特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOのWPREへの結合が、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす、前記方法。
75. １つ以上のASOの各々が、長さ約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である、請求項７４に記載の方法。
76. 各ASOが、１つ以上の化学的修飾を含む、請求項７４また７５に記載の方法。
77. １つ以上の化学的修飾の各々が、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される、請求項７６に記載の方法。
78. 各ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている、請求項７７に記載の方法。
79. 核酸塩基修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む、請求項７７または７８に記載の方法。
80. 主鎖修飾が、ホスホロチオアート結合を含む、請求項７７または７８に記載の方法。
81. ASOが、１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む、請求項７７または７８に記載の方法。
82. WPREが、配列番号５１に記載の核酸配列と少なくとも９０％同一である核酸配列またはその相補体を含む、請求項８０または８１に記載の方法。
83. ASOが、WPRE配列の少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する、請求項７４～８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 少なくとも１つのASOが、配列番号５２～７９のいずれか１つ、配列番号９６～１００のいずれか１つ、もしくは配列番号１１１～１１５のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む、請求項７４～８３のいずれか一項に記載の方法。
85. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の増加である、請求項７４～８４のいずれか一項に記載の方法。
86. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の減少である、請求項７４～８５のいずれか一項に記載の方法。
87. 細胞が哺乳類細胞であり、任意にここで哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項７４～８６のいずれか一項に記載の方法。
88. 細胞が対象内にある、請求項７４～８７のいずれか一項に記載の方法。
89. 導入遺伝子が、治療用タンパク質である、請求項７４～８８のいずれか一項記載の方法。
90. 治療用タンパク質が、β－グルコセレブロシダーゼ（GBA）である、請求項８９に記載の方法。
91. GBAが、コドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項９０に記載の方法。
92. GBAをコードする導入遺伝子が、配列番号４０に記載の核酸配列またはその相補体を含む、請求項９０または９１に記載の方法。
93. rAAVベクターが、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む、請求項７４～９２のいずれか一項に記載の方法。
94. 細胞における導入遺伝子の発現を調節するための方法であって、導入遺伝子を含むrAAVベクターを含有する細胞を、導入遺伝子から転写されたmRNAのポリアデニル化要素に特異的に結合する１つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）と接触させることを含み、ここで１つ以上のASOのポリアデニル化要素への結合が、１つ以上のASOを含有しない細胞と比べて、導入遺伝子の発現の変化をもたらす、前記方法。
95. １つ以上のASOの各々が、長さ約１０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチドの範囲である、請求項９４に記載の方法。
96. 各ASOが、１つ以上の化学的修飾を含む、請求項９４または９５に記載の方法。
97. １つ以上の化学的修飾の各々が、核酸塩基修飾または主鎖修飾から選択される、請求項９６に記載の方法。
98. 各ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている、請求項９７に記載の方法。
99. 核酸塩基修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
100. 主鎖修飾が、ホスホロチオアート結合を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
101. ASOが、１つ以上のロックド核酸（LNA）を含む、請求項９６または９７に記載の方法。
102. ASOが、ギャップマー構造を含む、請求項９４～１０１のいずれか一項に記載の方法。
103. ASOが、ポリアデニル化要素の少なくとも３つの連続したヌクレオチドに結合する、請求項９４～１０２のいずれか一項に記載の方法。
104. ポリアデニル化要素が、配列番号８０に記載の核酸配列またはその相補体を含む、請求項９４～１０３のいずれか一項に記載の方法。
105. 少なくとも１つのASOが、配列番号８１～９０のいずれか１つ、配列番号１０１～１０４のいずれか１つ、もしくは配列番号１１６～１２０のいずれか１つに記載の配列と少なくとも９０％同一である核酸配列、またはその相補体を含む、請求項９４～１０４のいずれか一項に記載の方法。
106. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の増加である、請求項９４～１０５のいずれか一項に記載の方法。
107. 発現の変化が、導入遺伝子の発現の減少である、請求項９４～１０６のいずれか一項に記載の方法。
108. 導入遺伝子の発現の低下が、１つ以上のASOによって結合されるmRNA転写物のRNaseH媒介性分解に起因する、請求項１０７に記載の方法。
109. 細胞が哺乳動物細胞であり、任意にここで哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項９４～１０８のいずれか一項に記載の方法。
110. 細胞が対象内にある、請求項９４～１０９のいずれか一項に記載の方法。
111. 導入遺伝子が、治療用タンパク質である、請求項９４～１１０のいずれか一項に記載の方法。
112. 治療用タンパク質が、β－グルコセレブロシダーゼ（GBA）である、請求項１１１に記載の方法。
113. GBAが、コドン最適化された核酸配列によってコードされる、請求項１１２に記載の方法。
114. GBAをコードする導入遺伝子が、配列番号４０に記載の核酸配列またはその相補体を含む、請求項１１２～１１３に記載の方法。
115. rAAVベクターが、配列番号１、９、２５、４０、５１、および８０に記載の核酸配列を含む、請求項９４～１１４のいずれか一項に記載の方法。
116. 配列番号２～８、１０～２４、２６～３９、４１～５０、５２～７９、８１～１２０のいずれか１つに記載の配列、またはその相補体を含む、単離された核酸。
117. 単離された核酸が、１つ以上の化学的修飾を含む、請求項１１６に記載の単離された核酸。
118. １つ以上の化学的修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）修飾、ホスホロチオアート結合、ロックド核酸（LNA）、または前述の任意の組み合わせを含む、請求項１１６または１１７に記載の単離された核酸。
119. 単離された核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）である、請求項１１６～１１８のいずれか一項に記載の単離された核酸。
120. ASOのすべての核酸塩基および／または主鎖全体が修飾されている、請求項１１９に記載の単離された核酸。
121. 単離された核酸が、ギャップマー構造を有する、請求項１１６～１２０のいずれか一項に記載の単離された核酸。