TW202246499A - 以腺相關病毒（ａａｖ）為基礎的基因表現之調節 - Google Patents
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Abstract
本揭露之態樣係關於正向或負向調控基因治療劑(例如，從AAV載體所表現之治療蛋白質)表現之組成物及方法。本揭露部分係基於某些核酸(例如反義寡核苷酸(ASO))，其經組態以與表現匣(或從此類表現匣所轉錄之mRNA)的特定區域結合。
Description
本案係關於透過使用某些核酸、例如反義寡核苷酸(ASO)，正向或負向調控基因治療劑(例如，從AAV載體所表現之治療蛋白質)表現之組成物及方法。
相關申請案
本申請案依35 U.S.C. § 119(e)主張2020年1月25日標題為“以AAV為基礎的基因表現之調節”的美國臨時申請案編號63/141,110之利益，其全部內容係以引用方式併入本文中。
經由AAV轉導引入患者的治療性轉殖基因的表現之調節能力，將轉變基因療法領域。打下目前基因療法的病毒方法基礎的生物學確保治療性轉殖基因的長期表現。此種治療性基因的持續表現適合於許多適應症，特別是由於患者基因體中的功能缺失基因突變導致者。然而，在一些情境下，從治療給劑的角度，或從安全性角度，極為理想的有能力將治療性基因的表現調高或調低、打開或關閉；本發明說明多種方法，透過使用特定的ASO來達到此類基因表現控制。
本揭露之態樣係關於透過使用某些核酸、例如反義寡核苷酸(ASO)，正向或負向調控基因治療劑(例如，從AAV載體所表現之治療蛋白質)表現之組成物及方法。在一些實施態樣中，本揭露所述之方法能從包含通用性(generic)、被廣泛使用、同側作用(cis-acting)之DNA或RNA調節元件之表現匣、或從帶有同側作用(cis-acting)之DNA或RNA元件之表現匣，透過核酸(例如，ASO)與表現匣中的元件或從此類表現匣所轉錄的mRNA之交互作用，調節基因表現。
因此，在一些態樣中，本揭露提供用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含側翼是AAV反向末端重複(ITR)之轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至該等AAV ITR的至少一者，其中該等一個或多個ASO與該AAV ITR之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
在一些實施態樣中，該等一個或多個ASO的每一者之長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。在一些實施態樣中，該等ASO的每一者包含一個或多個化學修飾。在一些實施態樣中，該等一個或多個化學修飾係選自核鹼基修飾或骨架修飾。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。在一些實施態樣中，骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯(phosphorothioate linkage)。在一些實施態樣中，ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
在一些實施態樣中，AAV ITR係AAV2 ITR。在一些實施態樣中，AAV2 ITR包含與SEQ ID NO：1中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列。在一些實施態樣中，AAV2 ITR由SEQ ID NO：1中所列之核酸序列或其互補序列組成。在一些實施態樣中，ASO與AAV ITR的至少三個連續核苷酸結合。
在一些實施態樣中，至少一個ASO包含與SEQ ID NO：2-8的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。在一些實施態樣中，至少一個ASO包含與SEQ ID NO：2-8的任一者中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列；以及該至少一個ASO的每一者包含一個或多個化學修飾，其選自核鹼基修飾或骨架修飾。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。在一些實施態樣中，骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現增加(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現增加)。在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現降低(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現降低)。
在一些實施態樣中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施態樣中，哺乳動物細胞係人細胞。在一些實施態樣中，細胞係在個體中。
在一些實施態樣中，轉殖基因係治療性蛋白質。在一些實施態樣中，治療性蛋白質是β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。在一些實施態樣中，GBA係由經密碼子最適化之核酸序列所編碼。在一些實施態樣中，編碼GBA之轉殖基因包含SEQ ID NO：40中所列之核酸序列或其互補序列。在一些實施態樣中，rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
在一些態樣中，本揭露提供用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至該轉殖基因之轉錄控制區域序列，其中該等一個或多個ASO與該轉錄控制區域序列之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
在一些實施態樣中，該等一個或多個ASO的每一者之長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。在一些實施態樣中，該等ASO的每一者包含一個或多個化學修飾。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，該等一個或多個化學修飾係選自核鹼基修飾或骨架修飾。在一些實施態樣中，核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。在一些實施態樣中，骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
在一些實施態樣中，轉錄控制區域序列包含強化子序列及/或啟動子序列。在一些實施態樣中，強化子序列係巨細胞病毒(CMV)強化子序列及/或啟動子序列係雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子序列。在一些實施態樣中，CMV強化子序列包含與SEQ ID NO：9中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列。在一些實施態樣中，雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子序列包含與SEQ ID NO：25中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列。
在一些實施態樣中，ASO與轉錄控制區域序列的至少三個連續核苷酸結合。
在一些實施態樣中，至少一個ASO包含與SEQ ID NO：10-24及26-39的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。在一些實施態樣中，至少一個ASO包含與SEQ ID NO：10-24及26-39的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列；以及該至少一個ASO的每一者包含一個或多個化學修飾，其選自核鹼基修飾或骨架修飾。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。在一些實施態樣中，骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現增加(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現增加)。在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現降低(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現降低)。
在一些實施態樣中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施態樣中，哺乳動物細胞係人細胞。在一些實施態樣中，細胞係在個體中。
在一些實施態樣中，轉殖基因係治療性蛋白質。在一些實施態樣中，治療性蛋白質是β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。在一些實施態樣中，GBA係由經密碼子最適化之核酸序列所編碼。在一些實施態樣中，編碼GBA之轉殖基因包含SEQ ID NO：40中所列之核酸序列或其互補序列。在一些實施態樣中，rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
在一些態樣中，本揭露提供用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至從該轉殖基因所轉錄的mRNA的蛋白質編碼區域，其中該等一個或多個ASO與該蛋白質編碼區域之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
在一些實施態樣中，該等一個或多個ASO的每一者之長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。在一些實施態樣中，該等ASO的每一者包含一個或多個化學修飾。在一些實施態樣中，該等一個或多個化學修飾係選自核鹼基修飾或骨架修飾。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。在一些實施態樣中，骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。在一些實施態樣中，ASO包含缺口體(gapmer)結構。在一些實施態樣中，ASO與該蛋白質編碼區域的至少三個連續核苷酸結合。
在一些實施態樣中，至少一個ASO包含與SEQ ID NO：41-50的任一者、SEQ ID NO：91-95的任一者、或SEQ ID NO：106-110的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。
在一些實施態樣中，蛋白質編碼區域編碼β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)蛋白質。在一些實施態樣中，蛋白質編碼區域包含與SEQ ID NO：40中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列。
在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現增加(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現增加)。在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現降低(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現降低)。在一些實施態樣中，轉殖基因之表現降低源自被該等一個或多個ASO所結合之mRNA轉錄本之核糖核酸酶H媒介式降解(RNaseH-mediated degradation)。
在一些實施態樣中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施態樣中，哺乳動物細胞係人細胞。在一些實施態樣中，細胞係在個體中。
在一些實施態樣中，rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
在一些態樣中，本揭露提供用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至從該轉殖基因所轉錄的mRNA的土撥鼠轉譯後調節元件(WPRE)，其中該等一個或多個ASO與該WPRE之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
在一些實施態樣中，該等一個或多個ASO的每一者之長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。在一些實施態樣中，該等ASO的每一者包含一個或多個化學修飾。在一些實施態樣中，該等一個或多個化學修飾係選自核鹼基修飾或骨架修飾。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。在一些實施態樣中，骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
在一些實施態樣中，WPRE包含與SEQ ID NO：51中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列。在一些實施態樣中，ASO與該WPRE序列的至少三個連續核苷酸結合。
在一些實施態樣中，至少一個ASO包含與SEQ ID NO：52-79的任一者、SEQ ID NO：96-100的任一者、或SEQ ID NO：111-115的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。
在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現增加(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現增加)。在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現降低(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現降低)。
在一些實施態樣中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施態樣中，哺乳動物細胞係人細胞。在一些實施態樣中，細胞係在個體中。
在一些實施態樣中，轉殖基因係治療性蛋白質。在一些實施態樣中，治療性蛋白質是β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。在一些實施態樣中，GBA係由經密碼子最適化之核酸序列所編碼。在一些實施態樣中，編碼GBA之轉殖基因包含SEQ ID NO：40中所列之核酸序列或其互補序列。在一些實施態樣中，rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
在一些態樣中，本揭露提供用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至從該轉殖基因所轉錄的mRNA的多腺核苷酸化元件(polyadenylation element)，其中該等一個或多個ASO與該多腺核苷酸化元件之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
在一些實施態樣中，該等一個或多個ASO的每一者之長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。在一些實施態樣中，該等ASO的每一者包含一個或多個化學修飾。在一些實施態樣中，該等一個或多個化學修飾係選自核鹼基修飾或骨架修飾。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。在一些實施態樣中，骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。在一些實施態樣中，ASO包含缺口體(gapmer)結構。在一些實施態樣中，ASO與多腺核苷酸化元件的至少三個連續核苷酸結合。
在一些實施態樣中，多腺核苷酸化元件包含SEQ ID NO：80中所列之核酸序列或其互補序列。在一些實施態樣中，至少一個ASO包含與SEQ ID NO：81-90的任一者、SEQ ID NO：101-104的任一者、或SEQ ID NO：116-120的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。
在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現增加(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現增加)。在一些實施態樣中，經改變之表現係該轉殖基因之表現降低(例如，相對於未包含該等一個或多個ASO的細胞，表現降低)。在一些實施態樣中，轉殖基因之表現降低源自被該等一個或多個ASO所結合之mRNA轉錄本之核糖核酸酶H媒介式降解(RNaseH-mediated degradation)。
在一些實施態樣中，該轉殖基因之表現係經改變(即，增加或降低)，不論該經表現之轉殖基因之本質。在一些實施態樣中，該等一個或多個ASO係與轉殖基因轉染之相同時間經遞輸至該細胞。在一些實施態樣中，該等一個或多個ASO係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後的數小時、例如3小時，經遞輸至該細胞。在一些實施態樣中，該等一個或多個ASO係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後的數週，經遞輸至該細胞。
在一些實施態樣中，細胞係哺乳動物細胞。在一些實施態樣中，哺乳動物細胞係人細胞。在一些實施態樣中，細胞係在個體中。
在一些實施態樣中，轉殖基因係治療性蛋白質。在一些實施態樣中，治療性蛋白質是β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。在一些實施態樣中，GBA係由經密碼子最適化之核酸序列所編碼。在一些實施態樣中，編碼GBA之轉殖基因包含SEQ ID NO：40中所列之核酸序列或其互補序列。在一些實施態樣中，rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
在一些態樣中，本揭露提供經單離之核酸，其包含SEQ ID NO：2-8、10-24、26-39、41-50、52-79、81-120的任一者中所示之序列，或其互補序列。在一些實施態樣中，經單離之核酸包含一個或多個化學修飾。在一些實施態樣中，該等一個或多個化學修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾、硫代磷酸酯鍵聯、鎖核酸(LNA)、或前述之任何組合。在一些實施態樣中，該等經單離之核酸係反義寡核苷酸(ASO)。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，該經單離之核酸具有缺口體結構。
在一些態樣中，本揭露係關於透過使用某些核酸、例如反義寡核苷酸(ASO)，(例如，正向或負向)調控基因治療劑(例如，從AAV載體所表現之治療蛋白質)表現之組成物及方法。在一些實施態樣中，如本文中所述之核酸(例如，ASO)，從包含通用性、被廣泛使用、同側作用之DNA或RNA調節元件的之表現匣、從帶有同側作用之DNA或RNA元件之表現匣、或從此類表現匣所轉錄的mRNA，調控基因表現。
經單離之核酸
經單離之核酸可為DNA或RNA。在一些實施態樣中，本揭露之蛋白質及核酸係經單離。如本文中所使用，用語“經單離(之)(isolated)”意指經人工製造的。如本文中所使用，就核酸而言，用語“經單離(之)”意指：(i) 藉由例如聚合酶連鎖反應(PCR)在體外擴增；(ii) 藉由選殖重組製造；(iii) 像是藉由截切和凝膠分離而純化；或(iv) 藉由例如化學合成來合成。經單離之核酸是藉由本技術領域中熟知的重組DNA技術而可容易操縱者。因此，含在5’及3’限制性位點已知或聚合酶連鎖反應(PCR)引子序列業經揭示的載體中之核苷酸序列，被認為係經單離，但以其天然狀態存在於其自然宿主中之核酸序列則否。經單離之核酸可為實質上經純化，但不必然為如此。例如，於選殖或表現載體內而經單離的核酸不是純的，因為它可只包含其所在細胞中的物質的極小百分比。然而，此類核酸係經單離，如本文中所用之用語，因為它係可藉由所屬技術領域中具有通常知識者已知標準技術容易操縱的。如本文中所使用，就蛋白質或胜肽而言，用語“經單離(之)”係指已經從其天然環境所單離或經人工製造(例如，藉由化學合成、藉由重組DNA技術等等)之蛋白質或胜肽。
熟習本技術領域者亦將暸解，可進行保守式胺基酸取代，以提供殼體蛋白質之功能性等效變異體、或同源物。在一些態樣中，本揭露涵括導致保守式胺基酸取代之序列改變。如本文中所使用，保守式胺基酸取代係指不改變有進行胺基酸取代蛋白質的相對電荷或尺寸特徵之胺基酸取代。變異體可根據本技術領域中具有通常知識者已知的改變多肽序列的方法來製備，諸如在彙編此等方法的參考文獻中可見之方法，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，J. Sambrook等人編輯，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989，或Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons, Inc., New York。胺基酸的保守式取代包括在下列群組內之間所進行之取代：(a) M、I、L、V；(b) F、Y、W；(c) K、R、H；(d) A、G；(e) S、T；(f) Q、N；及(g) E、D。因此，可對如本文中所揭示之蛋白質和多肽的胺基酸序列進行保守式胺基酸取代。
本揭露部分係關於經單離之核酸(例如，人工或合成的經單離之核酸)，其包含與標的核苷酸(諸如來自rAAV載體、表現構築體、或從表現構築體所轉錄之mRNA之序列)互補之區域。在一些實施態樣中，經單離之核酸係反義寡核苷酸(ASO)。
反義寡核苷酸
如本文中所使用，用語“反義核酸”或“ASO”係指具有與標的序列互補的序列且例如在嚴苛條件下可與具有標的序列的核酸特異性雜交之核酸。當反義核酸與標的核酸的結合足以在反義核酸和標的核酸之間產生基於互補的配對，並且有足夠互補性程度以避免反義核酸在需要特異性結合的條件下(例如，在體內檢定或醫療性治療的情況下，在生理條件下，及在體外檢定的情況下，在進行檢定的條件下)與非標的核酸的非特異性結合，反義核酸是可特異性雜交的。ASO可包含一個或多個DNA核鹼基、一個或多個RNA核鹼基、或DNA和RNA核鹼基的組合。
互補是指二個核苷酸之間精確配對的能力。例如，如果反義核酸某一位置的核苷酸能夠與標的核酸(例如標的核酸序列)相應位置的核苷酸氫鍵結合，則反義核酸和標的核酸在該位置被認為是彼此互補。當每個分子中足夠多的對應位置被可透過鹼基彼此氫鍵結合的核苷酸占據時，反義核酸和標的核酸係彼此互補。因此，“互補(complementary)”是用來表示足夠互補性或精確配對程度、以便在反義核酸和標的核酸之間發生穩定和特定的結合之用語。然而，應該理解的是，並不要求100%的互補性。例如，在一些實施態樣中，反義核酸(例如寡核苷酸，諸如ASO)可與標的核酸序列的連續核苷酸至少80%互補(例如，至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補)。
在一些實施態樣中，使用反義核酸(ASO)，其具有與標的核酸(例如，rAAV載體的標的序列、表現構築體的標的序列、從表現構築體所轉錄的mRNA序列等)的一部分完全互補(例如，100%互補)的互補區域。在一些實施態樣中，反義核酸寡核苷酸包含與SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80的任一者中所列之序列互補的互補區域。反義核酸的互補區域可與標的核酸序列的至少3個、至少4個、至少5個、至少6、例如至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、或更多個的連續核苷酸互補。此外，為了最小化脫靶效應(off-target effect)的可能性，ASO可經設計以確保它沒有與脫靶核酸互補的序列(例如5個或更多個的連續核苷酸)。
然而，應該理解的是，在一些實施態樣中，可使用與標的核酸的序列互補性低於100%的反義核酸。因此，在本技術領域中，可理解的是，互補核苷酸序列不需要與其標的序列100%互補以可特異性雜交。例如，在一些實施態樣中，經單離之核酸包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個與其標的序列的誤配。在一些實施態樣中，為了本揭露的目的，當核酸與標的核酸結合產生所欲之基因表現改變(例如，基因產物的表現或轉譯增加或基因產物的表現或轉譯減少)發生、並且有足夠的互補性程度以避免在避免非特異性結合為所欲之條件下(例如，在體內檢定或醫療性治療的情況下，在生理條件下，及在體外檢測的情況下，在檢定係在適合嚴苛條件下進行條件下)與非標的核酸的非特異性結合，該序列是可特異性雜交的。
序列同一性，包括判定核酸序列的序列互補性，可藉由本技術領域中已知的序列比較及比對演算法來判定。為了判定二個核酸序列的同一性百分比，序列為最適比較目的來比對(例如，為了最適比對，可在第一序列或第二序列中引入間隔)。接著，比較對應核苷酸位置的核苷酸。當第一序列中的一個位置被與第二序列中的對應位置相同的殘基所占據時，則分子在該位置是相同的。在一些實施態樣中，二個序列之間的同一性百分比是序列共有的相同位置數量的函數(例如，同源性% = 相同的位置#/位置總# × 100)，視需要，針對所引入的間隔之數目及/或所引入的間隔之長度之分數來罰分。
在一些實施態樣中，本揭露之寡核苷酸(例如ASO)具有在5至40個核苷酸、5至30個核苷酸、10至30個核苷酸、10至25個核苷酸、或15至25個核苷酸的範圍之長度。在本揭露之一些實施態樣中，寡核苷酸具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40個或更多個之長度。在一些實施態樣中，該寡核苷酸包括互補區域，該區域與如本文中所述的rAAV載體序列、表現匣序列、或從表現匣或rAAV載體所轉錄的mRNA序列的5個、10個、15個、25個或更多個核苷酸內的區域互補。
在一些實施態樣中，反義核酸(例如，寡核苷酸)以均一製劑提供，例如，其中至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%的寡核苷酸是相同的。在一些實施態樣中，本揭露之組成物就ASO而言是非均一的(例如，組成物可包含2、3、4、5、6、7、或更多個不同序列的ASO)。
本揭露之反義核酸可經修飾以達到一種或多種所欲的特性，諸如，改善細胞攝入、改善穩定性、降低致免疫性、改善效力、改善標的雜交、對核糖核酸酶截切的敏感性等。反義核酸可在鹼基、糖部分及/或磷酸骨架(phosphate backbone)處經修飾。因此，反義核酸可具有一個或多個經修飾之核苷酸(例如核苷酸類似物)及/或一個或多個骨架修飾(例如經修飾之核苷酸間鍵聯)。反義核酸可具有經修飾及未經修飾之核苷酸之組合。反義核酸亦可具有經修飾及未經修飾之核苷酸間鍵聯之組合。反義核酸亦可完全由經修飾之核苷酸及/或經修飾之核苷酸間鍵聯組成。
反義核酸可包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、及其組合。可用於反義核酸的經修飾之核苷酸之實例包括例如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖苷基Q核苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥糞嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥糞嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥糞嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥糞嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖苷基Q核苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧醋酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧醋酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、及2,6-二胺基嘌呤。
在一些實施態樣中，經修飾之核苷酸係2’-經修飾之核苷酸。例如，2’-經修飾之核苷酸可為經2’-去氧、2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基、2’-胺基及2’-胺基烷氧基修飾之核苷酸。在一些實施態樣中，2’-經修飾之核苷酸包含2’-O-4’-C 亞甲基橋，諸如鎖核酸(LNA)核苷酸。在2’經修飾之核苷酸的一些實施態樣中，2’-羥基與糖環的3’或4’碳原子相連，從而形成一個雙環糖部分。 在此等實施例中，鍵聯可為橋接2’氧原子及3’或4’碳原子的亞甲基(—CH2—)
n基團，其中n是1或2。
反義核酸可包括LNA核苷酸和未經修飾之核苷酸的組合。反義核酸可包括LNA和RNA核苷酸的組合。反義核酸可包括LNA和DNA核苷酸的組合。進一步較佳寡核苷酸修飾包括鎖核酸(LNA)，其中2’-羥基與糖環的3’或4’碳原子相連，從而形成雙環糖部分。
反義核酸亦可包括經核鹼基修飾之核苷酸，例如，含有非天然存在的核鹼基而不是天然存在的核鹼基之核苷酸。例如，鹼基可經修飾以阻斷腺苷去胺酶的活性。經修飾之核鹼基的實例包括但不限於在位置5處經修飾之尿苷和/或胞苷，例如5-(2-胺基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在位置8處經修飾之腺苷及/或鳥苷，例如8-溴鳥苷；去氮核苷酸類，例如7-去氮腺苷；O-和N-烷基化核苷酸類，例如N6-甲基腺苷係合適的。應該注意的是，上述修飾可經組合。
在本揭露之反義核酸(例如，寡核苷酸)內，少如一個及多如所有的核苷酸可經修飾。 例如，寡核苷酸(例如長度為20個核苷酸的寡核苷酸)可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個經修飾之核苷酸。在一些實施態樣中，經修飾之寡核苷酸將含有盡可能少的經修飾之核苷酸，以達到所欲的體內穩定性及/或生體生物可及性或其他所欲特性之量。
某些反義核酸可包括非離子型DNA類似物，諸如烷基及芳基磷酸酯(其中帶電荷的膦酸氧被烷基或芳基替代)、磷酸二酯及烷基磷酸三酯，其中帶電荷的氧部分係經烷基化。含有二元醇的核酸，諸如四甘醇(tetraethyleneglycol)或六甘醇(hexaethyleneglycol)，在任一或兩個末端也經顯示對核酸酶降解有很大的抵抗力，且可在此使用。在一些實施態樣中，反義核酸可包括至少一種親脂取代的核苷酸類似物及/或嘧啶-嘌呤二核苷酸。
在一些實施態樣中，反義核酸(例如，寡核苷酸)可具有一個或二個可及的5’端。可創造具有二個此類的5’末端的經修飾之寡核苷酸，例如，透過3’-3’鍵聯將二個寡核苷酸接附，以產生具有一個或二個可及的5’末端的寡核苷酸。3’-3’鍵聯可係磷酸二酯、硫代磷酸酯或任何其他經修飾之核苷間橋。此外，3’-3’-連接的寡核苷酸，如果3’端核苷之間的鍵聯不是磷酸二酯、硫代磷酸酯或其他經修飾之橋，可使用另外的間隔子，諸如三或四乙二醇磷酸酯部分來製備。
反義核酸的磷酸二酯核苷酸間鍵聯可以經修飾之鍵聯替代。經修飾之鍵聯可選自例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R2-磷醯胺酯(NR1R2-phosphoramidate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、α-羥基苄基膦酸酯(α-hydroxybenzyl phosphonate)、磷酸-(C1-C21)—O-烷基酯、磷酸-[(C6-C12)芳基-(C1-C21)—O-烷基]酯、(C1-C8)烷基膦酸酯及/或(C6-C12)芳基膦酸酯橋、及(C7-C12)-α-羥基甲基-芳基。
反義核酸的磷酸骨架可經修飾以產生胜肽核酸分子。如本文中所使用，用語“胜肽核酸”或“PNA”是指核酸模擬物，例如DNA模擬物，其中去氧核糖磷酸骨架被假胜肽骨架替代，且只保留四個天然核鹼基。PNA的中性骨架業經顯示可在低離子強度的條件下與DNA及RNA特異性雜交。PNA低聚物的合成可例如使用標準的固相胜肽合成操作程序來進行。
反義核酸也經調製為N-𠰌啉基寡核苷酸。在此等實施例中，寡核苷酸試劑的寡核苷酸的各個次單位之核糖苷部分係經轉化成N-𠰌啉基部分。N-𠰌啉基亦可經修飾例如作為胜肽結合N-𠰌啉基。
在其他實施態樣中，反義核酸(例如寡核苷酸)可與功能基團(諸如胜肽(例如用於在體內靶定宿主細胞受體))、或促進跨越細胞膜或血腦屏障運輸之劑連接。 本揭露之寡核苷酸試劑亦可用化學部分(例如膽固醇)來修飾，其改善寡核苷酸試劑的體內藥理特性。
本揭露之態樣係關於具有“缺口體(gapmer)”結構的ASO。如本文中所使用，“缺口體”係指包含DNA鹼基及RNA鹼基之嵌合核酸序列，其排列如下：(經修飾之RNA核鹼基)
N-(未經修飾之DNA核鹼基)
A-(經修飾之RNA核鹼基)
N，其中各個“N”係1到20之間的整數，且“A”係2到10之間的整數。具有“缺口體”結構的ASO之實例包括：具有“5-10-5”結構的ASO，其含有(從5’端開始)5個具有2’-O-甲氧基乙基修飾的核糖核苷酸、接以10個去氧核苷酸、接以5個具有2’-O-甲氧基乙基修飾的核糖核苷酸，所有均具有硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施態樣中，缺口體的胞苷核苷酸可為經甲基化。在一些實施態樣中，缺口體的尿苷核苷酸可為經甲基化。在一些實施態樣中，缺口體結構將包括15個核苷酸，交替有LNA型和去氧型核苷酸，所有均具有硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。在一些實施態樣中，缺口體的中心二個核苷酸係去氧核苷酸。在一些實施態樣中，具有SEQ ID NO：2-8、10-24、26-39、41-50、52-79、及81-90的任一者中所示之序列的經單離之核酸包含“缺口體”結構(熟習本技術領域者將理解，如本文中所述的任何核酸序列中，一個或多個“T”DNA核鹼基可經“U”RNA核鹼基取代，或反之亦同，以產生具有缺口體結構的ASO)。
靶定AAV ITR之核酸
本揭露之態樣係關於用於藉由將細胞與一個或多個(例如1、2、3、4、5或更多個)經單離之核酸接觸來調節轉殖基因的表現(例如，由rAAV載體或表現匣所媒介的轉殖基因表現)之方法，該細胞經組態以表現轉殖基因，該等經單離之核酸與AAV反向末端重複(ITR)(例如編碼AAV ITR之核酸序列)結合。在一些實施態樣中，如本文中所述之經單離之核酸與AAV ITR序列的結合增加含有ITR的rAAV載體的表現，或增加含有ITR的rAAV載體的轉導效率。
經單離之核酸可特異性結合至rAAV載體的5’ ITR、3’ ITR、或5’及3’ ITR兩者。在一些實施態樣中，經單離之核酸與AAV2 ITR結合(例如，雜交)。在一些實施態樣中，AAV2 ITR包含下列所列序列或由下列所列序列組成：SEQ ID NO：1。在一些實施態樣中，經單離之核酸特異性結合(例如，雜交)至AAV2 ITR(例如，具有如SEQ ID NO：1中所示之序列)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個核苷酸。在一些實施態樣中，該等單離核酸包含下列所列序列中任一者或由下列所列序列中任一者組成：SEQ ID NO：2-8。
一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與AAV ITR的結合所引起的轉殖基因表現的調節(例如增加或減少)可以不同。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與AAV ITR的結合，導致轉殖基因表現增加約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、1000%或更多。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與AAV ITR的結合，導致轉導效率增加約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、1000%或更多。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與AAV ITR的結合，導致轉殖基因表現減低約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或1000%。
靶定轉錄調節子區域之核酸
本揭露之態樣係關於用於藉由將細胞與一個或多個(例如1、2、3、4、5或更多個)經單離之核酸接觸來調節轉殖基因的表現(例如，由rAAV載體或表現匣所媒介的轉殖基因表現)之方法，該細胞經組態以表現轉殖基因，該等經單離之核酸與轉錄控制區域序列(例如編碼一個或多個轉錄調節子之核酸序列)結合。轉錄控制區域序列的實例包括啟動子序列、強化子序列、抑制子序列、Kozak氏序列等等。在一些實施態樣中，轉錄控制區域序列包含啟動子序列。在一些實施態樣中，轉錄控制區域序列包含強化子序列。在一些實施態樣中，如本文中所述之經單離之核酸與轉錄控制區域序列的結合，增加rAAV載體的表現，或降低rAAV載體的轉導效率。
經單離之核酸可特異性結合至rAAV載體的啟動子序列。啟動子序列可為持續型啟動子序列、可誘導型啟動子序列、組織特異性啟動子序列、原態啟動子序列等等。在一些實施態樣中，經單離之核酸與雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子序列結合(例如，雜交)。在一些實施態樣中，CBA啟動子序列包含下列所列序列或由下列所列序列組成：SEQ ID NO：9。在一些實施態樣中，經單離之核酸特異性結合(例如，雜交)至CBA啟動子序列(例如，具有如SEQ ID NO：9中所示之序列)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個核苷酸。在一些實施態樣中，該等單離核酸包含下列所列序列中任一者或由下列所列序列中任一者組成：SEQ ID NO：10-24。
經單離之核酸可特異性結合至rAAV載體的強化子序列。在一些實施態樣中，經單離之核酸與巨細胞病毒(CMV)強化子序列結合(例如，雜交)。在一些實施態樣中，CMV強化子序列包含下列所列序列或由下列所列序列組成：SEQ ID NO：25。在一些實施態樣中，經單離之核酸特異性結合(例如，雜交)至CMV啟動子序列(例如，具有如SEQ ID NO：25中所示之序列)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個核苷酸。在一些實施態樣中，該等單離核酸包含下列所列序列中任一者或由下列所列序列中任一者組成：SEQ ID NO：26-39。
一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與轉錄控制區域序列的結合所引起的轉殖基因表現的調節(例如增加或減少)可以不同。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與轉錄控制區域序列的結合，導致轉殖基因表現增加約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、1000%或更多。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與轉錄控制區域序列的結合，導致轉殖基因表現減低約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或1000%。
靶定編碼序列之核酸
本揭露之態樣係關於用於藉由將細胞與一個或多個(例如1、2、3、4、5或更多個)經單離之核酸接觸來調節轉殖基因的表現(例如，由rAAV載體或表現匣所媒介的轉殖基因表現)之方法，該細胞經組態以表現轉殖基因，該等經單離之核酸與編碼一個或多個治療性基因(例如PD相關基因)的蛋白質編碼區域(例如DNA或mRNA序列)結合，例如Gcase (例如，GBA1基因的基因產物)或其一部分，顆粒蛋白原(progranulin)(例如，PGRN基因的基因產物)或其一部分，神經鞘脂活化因子蛋白原(prosaposin)(例如，PSAP基因的基因產物)或其一部分，表現在骨髓細胞上的觸發受體2(例如，TREM2基因的基因產物)或其一部分，載脂蛋白(apolipoprotein)(例如，APOE基因的基因產物)，C9Orf72蛋白(例如，C9Orf72基因的基因產物)或其一部分等等。在一些實施態樣中，基因產物係由天然存在基因的編碼部分(例如，cDNA)所編碼。在一些實施態樣中，編碼區域編碼天然存在基因的蛋白質片段。蛋白質片段可包含約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約99%的天然存在的蛋白質。在一些實施態樣中，蛋白質片段包含50%與99.9%之間(例如，50%至99.9%之間的任何數值)的天然存在的蛋白質。在一些實施態樣中，如本文中所述之經單離之核酸與轉錄調節子序列的結合，降低來自rAAV載體的蛋白質之表現。
經單離之核酸可特異性結合至rAAV載體的蛋白質編碼區域(例如，從rAAV載體所轉錄之mRNA)。在一些實施態樣中，經單離之核酸結合(例如，雜交)至蛋白質編碼區域(例如，DNA或mRNA序列)，該蛋白質編碼區域編碼前述轉殖基因的任一者、或其基因產物、或轉殖基因的經密碼子最適化之區域、或基因產物的經密碼子最適化之區域。在一些實施態樣中，經單離之核酸結合(例如，雜交)至蛋白質編碼區域，該蛋白質編碼區域編碼前述轉殖基因的任一者、或其基因產物、或轉殖基因的經密碼子最適化之區域、或基因產物的經密碼子最適化之區域。在一些實施態樣中，經單離之核酸結合(例如，雜交)至編碼β-葡萄糖腦苷脂酶或GBA的蛋白質編碼區域。Gcase，亦被稱為β-葡萄糖腦苷脂酶或GBA，係指一種溶酶體蛋白，其截切化學葡萄糖腦苷脂(醣脂質代謝中的中間體)的β-葡萄糖苷鍵聯。在人中，Gcase是由位於第1號染色體上的GBA1基因所編碼。在一些實施態樣中，GBA1編碼的多肽由NCBI參考序列NP_000148.2代表。
在一些實施態樣中，經單離之核酸特異性結合至編碼GBA蛋白的經密碼子最適化(例如，針對在哺乳動物細胞、例如人細胞中表現的密碼子最適化)之核酸序列，諸如SEQ ID NO：40中所列之序列。在一些實施態樣中，經單離之核酸特異性結合(例如，雜交)至GBA蛋白質編碼序列(例如，具有如SEQ ID NO：40中所示之序列)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個核苷酸。在一些實施態樣中，該等單離核酸包含下列所列核酸序列中任一者或由下列所列核酸序列中任一者組成：SEQ ID NO：41-50或SEQ ID NO：91-95。
在一些實施態樣中，特異性結合至蛋白質編碼區域(例如，編碼GBA蛋白之核酸序列，諸如編碼GBA蛋白的mRNA序列)之經單離之核酸包含缺口體結構。在一些實施態樣中，具有缺口體結構之經單離之核酸包含SEQ ID NO：41-50的任一者、SEQ ID NO：91-95的任一者、或SEQ ID NO：106-110的任一者中所列之序列的至少3個連續核苷酸。
一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與蛋白質編碼序列的結合所引起的轉殖基因表現的調節(例如增加或減少)可以不同。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與轉錄控制區域序列的結合，導致轉殖基因表現增加約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、1000%或更多。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與蛋白質編碼序列的結合，導致轉殖基因表現減低約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或1000%。
靶定轉錄後調節元件之核酸
本揭露之態樣係關於用於藉由將細胞與一個或多個(例如1、2、3、4、5或更多個)經單離之核酸接觸來調節轉殖基因的表現(例如，由rAAV載體或表現匣所媒介的轉殖基因表現)之方法，該細胞經組態以表現轉殖基因，該等經單離之核酸與轉錄後調節元件序列(例如，諸如包含轉錄後調節元件序列的mRNA之核酸序列)結合。多腺核苷酸化元件序列之實例包括B型肝炎病毒(HPRE)及土撥鼠肝炎病毒(WPRE)等等。在一些實施態樣中，轉錄後調節元件序列係土撥鼠轉錄後調節元件序列(WPRE)。在一些實施態樣中，如本文中所述之經單離之核酸與轉錄後調節元件序列的結合，增加rAAV載體的表現，或降低rAAV載體的轉導效率。
經單離之核酸可特異性結合至rAAV載體的WPRE。在一些實施態樣中，WPRE元件序列包含下列所列序列或由下列所列序列組成：SEQ ID NO：51。在一些實施態樣中，經單離之核酸特異性結合(例如，雜交)至WPRE序列(例如，具有如SEQ ID NO：51中所示之序列)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個核苷酸。在一些實施態樣中，該等單離核酸包含下列所列核酸序列中任一者或由下列所列核酸序列中任一者組成：SEQ ID NO：52-79、SEQ ID NO：96-100，或SEQ ID NO：111-115。
一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與轉錄後調節元件序列(例如WPRE)的結合所引起的轉殖基因表現的調節(例如增加或減少)可以不同。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與轉錄後調節元件序列的結合，導致轉殖基因表現增加約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、1000%或更多。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與轉錄後調節元件序列的結合，導致轉殖基因表現減低約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或1000%。
靶定多腺核苷酸化元件之核酸
本揭露之態樣係關於用於藉由將細胞與一個或多個(例如1、2、3、4、5或更多個)經單離之核酸接觸來調節轉殖基因的表現(例如，由rAAV載體或表現匣所媒介的轉殖基因表現)之方法，該細胞經組態以表現轉殖基因，該等經單離之核酸與多腺核苷酸化元件序列(例如，諸如編碼多A尾的DNA或包含多U尾(poly-U tail)的mRNA之核酸序列)結合。多腺核苷酸化元件序列的實例包括SV40多腺核苷酸化元件、牛生長激素(BGH)多腺核苷酸化元件等。在一些實施態樣中，多腺核苷酸化元件係BGH多A元件。在一些實施態樣中，如本文中所述之經單離之核酸與轉錄控制區域序列的結合，增加rAAV載體的表現，或降低rAAV載體的轉導效率。
經單離之核酸可特異性結合至rAAV載體的BGH多A元件。在一些實施態樣中，BGH多腺核苷酸化元件序列包含下列所列序列或由下列所列序列組成：SEQ ID NO：80。在一些實施態樣中，經單離之核酸特異性結合(例如，雜交)至BGH多腺核苷酸化元件序列(例如，具有如SEQ ID NO：80中所示之序列)的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25個核苷酸。在一些實施態樣中，該等單離核酸包含下列所列核酸序列中任一者或由下列所列核酸序列中任一者組成：SEQ ID NO：81-90或SEQ ID NO：101-104。
在一些實施態樣中，特異性結合至多腺核苷酸化元件序列(例如，編碼BGH多腺核苷酸化元件的核酸序列，諸如編碼BGH多腺核苷酸化元件的mRNA序列)的經單離之核酸包含缺口體結構。在一些實施態樣中，具有缺口體結構之經單離之核酸包含SEQ ID NO：81-90的任一者、SEQ ID NO：101-104的任一者、或SEQ ID NO：116-120的任一者中所列之序列的至少3個連續核苷酸。
一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與BGH多腺核苷酸化元件序列的結合所引起的轉殖基因表現的調節(例如增加或減少)可以不同。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與BGH多腺核苷酸化元件序列的結合，導致轉殖基因表現增加約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、1000%或更多。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與BGH多腺核苷酸化元件序列的結合，導致轉殖基因表現減低約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或1000%。
醫藥組成物
在一些態樣中，本揭露提供醫藥組成物，其包含如本文中所述的經單離之核酸或rAAV以及醫藥上可接受之載劑。如本文中所使用，用語“醫藥上可接受”係指一種材料，諸如載劑或稀釋劑，它不會消除化合物的生物活性或特性，並且相對無毒，例如，該材料可經投予至個體，而不會造成未所欲的生物效果或以有害的方式與含有它的組成物的任何組分交互作用。
如本文中所使用，用語“醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)”意指醫藥上可接受之材料、組成物或載劑，諸如液體或固體填料、穩定劑、分散劑、懸浮劑、稀釋劑、賦形劑、增稠劑、溶劑或包封材料，參與將本發明中可用之化合物攜帶或運輸到患者體內，以便它可進行其所欲功能。可包括在本發明實施中所使用的醫藥組成物中的其他成分係本技術領域中已知，例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)中所描述，其以引用方式併入本文。
在本文中所提供的組成物(例如，醫藥組成物)可藉由任何途徑投予，其包括腸道(例如，口服)、腸胃外、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、皮下、室內(腦或心)、經皮、皮間、直腸、陰道內、腹腔內、局部(如藉由粉劑、軟膏、霜劑、及/或滴劑)、黏膜、鼻腔、口頰、舌下；藉由氣管內滴入、支氣管滴入、及/或吸入；及/或作為口服噴霧、鼻腔噴霧、及/或氣霧劑。特定涵蓋之途徑係口服投予、靜脈內投予(例如，全身性靜脈內注射)、經由血液及/或淋巴供應的區域投予，及/或直接投予到受影響部位。一般來說，最合適的投予途徑將取決於各種因素，包括該劑的本質(例如，其在胃腸道環境中的穩定性)，及/或個體的狀況(例如，個體是否能夠耐受口服投予)。在某些實施態樣中，如本文中所述的化合物或醫藥組成物適合於對個體的眼睛局部投予。
rAAV載體及rAAV
如本文中所述的經單離之核酸可單獨存在，或作為載體的一部分。大致上，載體可係質體、黏接質體、噬菌質體、細菌人工染色體(BAC)、或病毒載體(例如，腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、反轉錄病毒載體、桿狀病毒載體等)。在一些實施態樣中，該載體是質體(例如，包含如本文中所述的經單離之核酸之質體)。在一些實施態樣中，rAAV載體是單股的(例如，單鏈DNA)。在一些實施例中，該載體是重組AAV (rAAV)載體。在一些實施態樣中，載體是桿狀病毒載體(例如，苜蓿夜蛾(Autographa californica)核多角體病毒(AcNPV)載體)。
通常，rAAV載體(例如，rAAV基因體)包含轉殖基因(例如，表現構築體，其包含以下各個中的一個或多個：啟動子、內含子、強化子序列、蛋白質編碼序列、抑制性RNA編碼序列、多A尾序列等)，側翼是二個AAV反向末端重複(ITR)序列。在一些實施態樣中，rAAV載體的轉殖基因包含如本揭露所述的經單離之核酸。在一些實施態樣中，rAAV載體的二個ITR序列中的各者係全長ITR(例如，長度大約145 bp，且含有功能性Rep結合位點(RBS)及末端解構位點(terminal resolution site)(trs))。在一些實施態樣中，rAAV載體的ITR之一者是經截斷(例如，經縮短或非全長)。在一些實施態樣中，經截斷之ITR缺乏功能性末端解構位點(trs)，且用於製造自互補(self-complementary)AAV載體(scAAV載體)。在一些實施態樣中，經截斷之ITR是ΔITR，例如McCarty等人(2003) Gene Ther. 10(26):2112-8中所述。
在一些態樣中，本揭露係關於重組AAV (rAAV)，其包含編碼如本文中所述的核酸的轉殖基因(例如，如本文中所述的rAAV載體)。用語“rAAV”一般係指包含由一種或多種AAV殼體蛋白所包被的rAAV載體之病毒顆粒。本揭露所述的rAAV可包含具有選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、及AAV10的血清型的殼體蛋白。在一些實施態樣中，rAAV包含來自非人宿主的殼體蛋白，例如恆河猴AAV的殼體蛋白，諸如AAVrh.10、AAVrh.39等。在一些實施態樣中，本揭露所述的rAAV包含殼體蛋白，其係野生型殼體蛋白的變異體，諸如相對於野生型AAV殼體蛋白(殼體蛋白變異體衍生自彼)，殼體蛋白變異體包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、或多於10個(例如，15、20、25、50、100個等等)的胺基酸取代(例如，突變)。在一些實施態樣中，AAV殼體蛋白變異體是AAV1RX殼體蛋白，例如Albright等人Mol Ther. 2018 Feb 7;26(2):510-523所述。在一些實施態樣中，殼體蛋白變異體是AAV TM6殼體蛋白，例如Rosario等人Mol Ther Methods Clin Dev. 2016; 3: 16026所述。
在一些實施態樣中，本揭露所述的rAAV易於透過CNS傳播，特別是當引入CSF空間或直接進入腦實質時。因此，在一些實施態樣中，本揭露之rAAV包含能夠穿越血腦屏障(BBB)的殼體蛋白。例如，在一些實施態樣中，rAAV包含具有AAV9或AAVrh.10血清型的殼體蛋白。rAAV的製造係描述於例如Samulski等人(1989) J Virol. 63(9):3822-8及Wright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698–706。在一些實施態樣中，rAAV包含特異或偏好靶定骨髓細胞、例如小神經膠質細胞的殼體蛋白。
在一些實施態樣中，如本揭露所述的rAAV(例如，包含由AAV殼體蛋白所包被的重組rAAV基因體以形成rAAV殼體顆粒)是在桿狀病毒載體表現系統(BEVS)中來製造。使用BEVS製造rAAV係描述於例如Urabe等人，(2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43、Smith 等人，(2009) Mol Ther 17(11):1888-1896、美國專利號8,945,918、美國專利號9,879,282、以及國際PCT公開號WO 2017/184879。 然而，rAAV可使用任何合適的方法來製造(例如，使用重組rep及cap基因)。
基因表現之調節
本揭露之態樣係關於透過使用某些核酸、例如反義寡核苷酸(ASO)，正向或負向調控基因治療劑(例如，從AAV載體所表現之治療蛋白質)表現之組成物及方法，該ASO特異性結合(例如，雜交)至一個或多個下列者：病毒載體區域(例如，AAV ITR)、DNA或RNA調節元件(例如，啟動子序列、強化子序列、轉錄後調節元件序列等等)、及從rAAV載體所轉錄之mRNA的蛋白質編碼序列。經單離之核酸可與其特異性結合的表現匣或rAAV載體的同時、或不同時間(例如，在表現匣或rAAV載體的投予之前或之後)，經投予至細胞或個體。在一些實施態樣中，個體係經投予rAAV，且接著隨後經投予一個或多個劑量的如本文中所述之經單離之核酸(或多種經單離之核酸)。在一些實施態樣中，在經單離之核酸的投予前，基於偵測細胞或個體內的轉殖基因表現量，個體經投予一個或多個經單離之核酸。
在一些實施態樣中，rAAV載體係在細胞中，諸如宿主細胞。宿主細胞可係原核生物細胞或真核生物細胞。例如，宿主細胞可係哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞等。在一些實施態樣中，宿主細胞是哺乳動物細胞，例如HEK293T細胞。在一些實施態樣中，宿主細胞是細菌細胞，例如大腸桿菌細胞。在一些實施態樣中，細胞是在體外。在一些實施態樣中，細胞在個體內，例如哺乳動物個體，諸如人、小鼠、狗、貓等。
在一些實施態樣中，一個特異性結合至rAAV載體或表現匣的經單離之核酸係經提供予細胞或個體。在一些實施態樣中，多於一個(例如，2、3、4、5或更多個)經單離之核酸係提供予細胞或個體。多於一個經單離之核酸(例如，ASO)與相同的區域或序列(例如，二個ASO各與AAV ITR結合)結合，或各自與不同的區域或序列結合(例如，第一ASO與AAV ITR特異性結合，第二ASO與轉錄後調節元件序列結合)。
在一些實施態樣中，本揭露所述的一個或多個經單離之核酸遞輸至細胞或個體，導致由一個或多個經單離之核酸(例如，ASO)與細胞或個體中所含有的rAAV載體或表現構築體的序列之結合而引起的轉殖基因表現的調節(例如，增加或降低)。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體或表現構築體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與rAAV載體或表現構築體的結合，導致轉殖基因表現增加約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、100%或更多。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體或表現構築體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與rAAV載體或表現構築體的結合，導致轉導效率增加約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、100%或更多。在一些實施態樣中，相對於未與一個或多個經單離之核酸接觸的rAAV載體或表現構築體的轉殖基因表現，一個或多個經單離之核酸(例如ASO)與rAAV載體或表現構築體的結合，導致轉殖基因表現減低約1%、5%、10%、20%、50%、100%、500%、或100%。在一些實施態樣中，該等一個或多個經單離之核酸係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染之相同時間，經遞輸至該細胞。在一些實施態樣中，該等一個或多個經單離之核酸係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後，經遞輸至該細胞。在一些實施態樣中，該等一個或多個經單離之核酸係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22或24小時，經遞輸至該細胞。在一些實施態樣中，該等一個或多個經單離之核酸係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天，經遞輸至該細胞。在一些實施態樣中，該等一個或多個經單離之核酸係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後的1、2、3、4、10、15、20、26或52週，經遞輸至該細胞。在一些實施態樣中，該等一個或多個經單離之核酸係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後的1、2、3或5年，經遞輸至該細胞。
本揭露之態樣係關於用於調節個體的一個或多個CNS疾病相關基因產物表現之組成物，以治療CNS相關疾病。一個或多個CNS疾病相關基因產物可由一個或多個經單離之核酸或rAAV載體所編碼。在一些實施態樣中，個體係經投予編碼一個或多個(1、2、3、4、5或更多個)基因產物的單一載體(例如，經單離之核酸、rAAV等)。在一些實施態樣中，個體係經投予複數個(例如2、3、4、5或更多個)載體(例如經單離之核酸、rAAV等)，其中各個載體編碼不同的CNS疾病相關基因產物。
CNS相關疾病可係神經退化性疾病、突觸核蛋白病(synucleinopathy)、tau異常沉積病變(tauopathy)或溶酶體儲存疾病。神經退化性疾病及其相關基因的實例列於表1。
“突觸核蛋白病”係指一種疾病或失調，其特徵在於個體(例如，相對於健康個體，例如沒有突觸核蛋白病的個體)中α-突觸核蛋白(SCNA的基因產物)的表現或活性減少。突觸核蛋白病及其相關基因的實例列於表2。
“tau異常沉積病變”係指一種疾病或失調，其特徵在於個體(例如，健康沒有tau蛋白病的個體)中Tau蛋白的表現或活性減少。tau異常沉積病變及其相關基因的實例列於表3。
“溶酶體儲存疾病”係指其特徵在於個體的溶酶體中異常堆積有毒細胞產物之疾病。溶酶體儲存疾病及其相關基因的實例列於表4。
如本文中所使用，“治療(treat或treating)”係指，在個體中，(a) 防止或推遲CNS疾病的開始；(b) 減少CNS疾病的嚴重度；(c) 減少或防止CNS疾病症狀特徵的發展；及/或(d) 防止CNS疾病症狀特徵的惡化。CNS疾病的症狀可包括例如運動功能障礙(例如，顫抖、僵硬、運動遲緩、行走困難、癱瘓)、認知功能障礙(例如，失智、抑鬱、焦慮、精神病)、記憶困難、情緒和行為功能障礙。
個體通常是哺乳動物，較佳的是人。在一些實施態樣中，個體的年齡在1個月大到10歲之間(例如，1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、24個月、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年，或其間任何年齡)。在一些實施態樣中，個體係介於2歲與20歲之間。在一些實施態樣中，個體係介於30歲與100歲之間。在一些實施態樣中，個體係大於55歲。
在一些實施態樣中，一種或多種組成物係經直接投予至個體CNS，例如藉由直接注射到個體的大腦及/或脊髓。CNS直接投予形式之實例包括但不限於腦內注射、腦室內注射、腦池內注射、腦實質內注射、鞘內注射，以及上述的任何組合。在一些實施態樣中，直接注射到個體的CNS導致個體的中腦、紋狀體及/或大腦皮層中的轉殖基因表現(例如，第一基因產物、第二基因產物，以及如果適用，第三基因產物的表現)。在一些實施態樣中，直接注射到CNS導致個體的脊髓及/或CSF中的轉殖基因表現(例如，第一基因產物、第二基因產物，以及如果適用，第三基因產物的表現)。
在一些實施態樣中，直接注射到個體的CNS包含增強對流傳輸(convection enhanced delivery)(CED)。增強對流傳輸是一種醫療性策略，其涉及手術暴露腦並將小直徑導管直接放入腦的標的區域，接以將治療劑(例如，如本文中所述的組成物或rAAV)直接輸注到個體的腦。CED係描述於例如Debinski等人(2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27中。
在一些實施態樣中，組成物係周邊投予至個體，例如藉由周邊注射。周邊注射的實例包括皮下注射、靜脈內注射、動脈內注射、腹腔內注射，或上述的任何組合。在一些實施態樣中，周邊注射是動脈內注射，例如注射到個體的頸動脈。
在一些實施態樣中，如本揭露所述的組成物(例如，包含經單離之核酸或載體或rAAV之組成物，及/或如本文中所述的經單離之核酸)係周邊及直接注射兩者到個體的CNS。例如，在一些實施態樣中，個體係藉由動脈內注射(例如，注射到頸動脈)和腦實質內注射(例如，藉由CED的腦實質內注射)而經投予組成物。在一些實施態樣中，對CNS的直接注射和周邊注射是同時進行的(例如，在同一時間發生)。在一些實施態樣中，直接注射發生在周邊注射之前(例如，1分鐘與1週之間，或更早)。在一些實施態樣中，直接注射發生在周邊注射之後(例如，1分鐘與1週之間，或更之後)。
在一些實施態樣中，個體係在如本文中所述的組成物之前(例如，介於在1個月與1分鐘之前)或同時經投予免疫抑制劑。在一些實施態樣中，免疫抑制劑是皮質類固醇(例如，強體松(prednisone)、亞丁皮質醇(budesonide)等)、mTOR抑制劑(例如，西羅莫司(sirolimus)、依維莫司(everolimus)等)、抗體(例如，阿達木單抗(adalimumab)、依那西普(etanercept)、那他珠單抗(natalizumab)等)、或胺甲喋呤(methotrexate)。
向個體投予如本揭露所述的組成物(例如，包含經單離之核酸或載體或rAAV的組成物)的量將取決於投予方法而異。
如本揭露所述的組成物(例如，包含經單離之核酸或載體或rAAV的組成物)可一次或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、或更多次)投予個體。在一些實施態樣中，組成物係例如經由輸液泵連續(例如，長期)投予個體。
實施例
實施例1-5：病毒轉導至GBA缺陷細胞的基於細胞之試驗
獲得缺乏GBA1的細胞，例如來自GD患者的纖維母細胞、單核球、或hES細胞，或患者衍生的經誘發之多能幹細胞(iPSCs)，或HEK293T細胞。這些細胞累積諸如葡苷基腦醯胺(glucosylceramide)和葡苷基神經鞘胺醇(GlcCer及GlcSph)之基質。以Gcase抑制劑(諸如CBE)處理野生型或突變型經培養之細胞株，也可用於獲得GBA缺陷細胞。
細胞經投予rAAV，該rAAV包含AAV9殼體蛋白，其包住rAAV載體，該rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列(例如，PR001)。監測細胞轉導效率和GBA表現量。靶定PR001載體之一個或多個經單離之核酸(例如，ASO)係經投予至細胞。在AAV載體轉導表現的背景下，測量治療終點(例如，體內檢定PD相關病理的減少)，以確認和定量PR001的活性和功能的增加或減少。GBA的表現係使用qRT-PCT、或透過使用蛋白質ELISA測量的Gcase量測定、或藉由標準的Gcase活性檢定來定量。
實施例1：針對GBA的ASO之效果。
以包含編碼GBA蛋白的rAAV載體的質體(例如，PR001)轉染HEK293T細胞，並投予針對rAAV載體(PR001)的GBA編碼部分的ASO。八個實驗組中所投予的ASO的量和類型如下：20 nM GBA ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：91)、100 nM GBA ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：91)、20 nM GBA ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：92)、100 nM GBA ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：92)、20 nM GBA ASO 3，經修飾 (SEQ ID NO：93)、100 nM GBA ASO 3，經修飾 (SEQ ID NO：93)、20 nM GBA ASO 4，經修飾 (SEQ ID NO：94)、100 nM GBA ASO 4，經修飾 (SEQ ID NO：94)。實驗設計中亦包括陰性對照及陽性對照。在陰性對照中，細胞沒有被GBA編碼質體轉染，且也沒有經投予任何ASO。在陽性對照中，用編碼GBA表現的質體轉染細胞，且投予100 nM的針對GFP(綠色螢光蛋白)的ASO，其包含SEQ ID NO：105中所列的核酸序列。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。與陽性對照相比，所有實驗組的GBA表現都有顯示顯著降低(圖1)。
實施例2：針對WPRE的ASO之效果。
以包含編碼GBA蛋白的rAAV載體的質體(例如，PR001)轉染HEK293T細胞，並投予針對rAAV載體(PR001)的WPRE編碼部分的ASO。十個實驗組中所投予的ASO的量和類型如下：20 nM WPRE ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：96)、100 nM WPRE ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：96)、20 nM WPRE ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：97)、100 nM WPRE ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：97)、20 nM WPRE ASO 3，經修飾 (SEQ ID NO：98)、100 nM WPRE ASO 3，經修飾 (SEQ ID NO：98)、20 nM WPRE ASO 4，經修飾 (SEQ ID NO：99)、100 nM WPRE ASO 4，經修飾 (SEQ ID NO：99)、20 nM WPRE ASO 5，經修飾 (SEQ ID NO：100)、100 nM WPRE ASO 5，經修飾 (SEQ ID NO：100)。實驗設計中亦包括四個對照組：陰性對照組，其中細胞沒有被GBA編碼質體轉染，且也沒有經投予任何ASO；陽性對照組，其中用編碼GBA表現的質體轉染細胞，且投予100 nM的針對GFP的ASO(SEQ ID NO：105)；以及有二組是用編碼GBA表現的質體轉染細胞，並分別投予20 nM GBA ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：91)及100 nM GBA ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：91)。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。令人驚訝的是，與陽性對照相比，在幾個實驗組中觀察到GBA的表現增加，特別是投予100 nM的WPRE ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：96)、WPRE ASO 4，經修飾 (SEQ ID NO：99)、或WPRE ASO 5，經修飾 (SEQ ID NO：100)的組 (圖2)。
實施例3：針對牛生長激素多腺核苷酸化元件(BGH 多A)的ASO之效果。
以包含編碼GBA蛋白的rAAV載體的質體(例如，PR001)轉染HEK293T細胞，並投予針對rAAV載體(PR001)的BGH多腺核苷酸化元件(多A)編碼部分的ASO。八個實驗組中所投予的ASO的量和類型如下：20 nM 多A ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：101)、100 nM 多A ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：101)、20 nM 多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102)、100 nM 多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102)、20 nM 多A ASO 3，經修飾 (SEQ ID NO：103)、100 nM 多A ASO 3，經修飾 (SEQ ID NO：103)、20 nM 多A ASO 5，經修飾 (SEQ ID NO：104)、100 nM 多A ASO 5，經修飾 (SEQ ID NO：104)。實驗設計中亦包括四個對照組：陰性對照組，其中細胞沒有被GBA編碼質體轉染，且也沒有經投予任何ASO；陽性對照組，其中用編碼GBA表現的質體轉染細胞，且投予100 nM的針對GFP的ASO(SEQ ID NO：105)；以及有二組是用編碼GBA表現的質體轉染細胞，並分別投予20 nM GBA ASO 1，經修飾(SEQ ID NO：91)或100 nM GBA ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：91)。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。令人驚訝的是，與陽性對照相比，所有實驗組均顯示類似或顯著提高的GBA表現。值得注意的是，與陽性對照相比，在投予100 nM的多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102)的細胞中，觀察到GBA的表現增加20倍(圖3)。
實施例4：多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102)對Trem2表現之效果。
以包含編碼Trem2蛋白的rAAV載體的質體轉染HEK293T細胞，並分別投予20 nM或100 nM的多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102) 。實驗設計中亦包括二個對照組：陰性對照組，其中細胞沒有被Trem2編碼質體轉染，且也沒有經投予任何ASO；及陽性對照組，其中用編碼Trem2表現的質體轉染細胞，且投予100 nM的針對GFP的ASO(SEQ ID NO：105)。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量Trem2表現。與陽性對照相比，兩者實驗組顯示Trem2表現都顯著增加。值得注意的是，與陽性對照相比，經投予100 nM的多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102)的細胞顯示Trem2的表現增加13倍(圖4)。
實施例5：以順序轉染投予ASO之效果。
HEK293T細胞係以包含編碼GBA蛋白質的rAAV載體之質體來轉染。3小時後，移除質體轉染混合物，且對四個實驗組的細胞轉染下列者：分別為20 nM GBA ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：91)、100 nM GBA ASO 1，經修飾 (SEQ ID NO：91)、20 nM的多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102) or 100 nM的多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102)。實驗設計中亦包括二個對照組：陰性對照組，其中細胞沒有被GBA編碼質體轉染，且也沒有經投予任何ASO；及陽性對照組，其中用編碼GBA表現的質體轉染細胞，且投予100 nM的針對GFP的ASO(SEQ ID NO：105)。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。與陽性對照相比，經投予GBA ASO 1，經修飾(SEQ ID NO：91)的兩個實驗組的GBA表現量都有顯著下降。經投予20 nM的多A ASO 2，經修飾(SEQ ID NO：102)的組顯示與陽性組相似的GBA表現量。與陽性對照相比，經投予100 nM的多A ASO 2，經修飾 (SEQ ID NO：102)的細胞具有最顯著變化，GBA的表現增加7-8倍(圖5)。
實施例6：體內檢定
C57/BL6J雄性小鼠接受1 x 10
12vg/kg的表現GBA的AAV (AAV-GBA)或賦形劑對照的IV輸注。賦形劑組的小鼠接著接受鹽水對照，而接受AAV-GBA的小鼠在AAV-GBA輸注後7、14及21天接受生理鹽水或ASO的IV輸注，詳見表5。在AAV-GBA輸注前和AAV-GBA輸注後7天和21天，藉由頜下血來收集血漿。AAV輸注30天後，小鼠經安樂死，並收集組織以供分析。
結果顯示，GBA ASO 1及WPRE ASO 2顯著降低了肝臟中的GBA mRNA量，而多A ASO 2顯示在肝臟中GBA mRNA降低的趨勢(圖7)。
使用突變型小鼠，進行AAV載體的體內檢定。使用經濃縮的AAV庫存，例如注射量在5–10 μL之間，進行載體對照和AAV載體(例如，劑量為2×10
11vg/小鼠的PR001)的鞘內或腦室內遞輸。腦實質內遞輸係藉由增強對流傳輸來進行。靶定PR001載體之一個或多個經單離之核酸(例如，ASO)係經投予至細胞。在AAV載體轉導表現的背景下，測量治療終點(例如，PD相關病理的減少)，以確認和定量PR001的活性和功能的增加或減少。所測量的終點為基質在CNS和CSF中的累積，藉由ELISA檢測Gcase酵素的累積及酵素活性、運動和認知的終點、溶酶體功能障礙、以及α-突觸核蛋白單體、原纖絲或纖絲的累積。
序列
在一些實施態樣中，如本文中所述之經單離之核酸(例如，ASO)特異性結合(例如，雜合)至如下面所示之序列，或其互補序列，或其反向互補(reverse complement)序列。在一些實施態樣中，如本文中所述之經單離之核酸(例如，ASO)包含下列所示之序列中之一者或由下列所列之序列中之一者組成、或其互補序列、或其反向互補序列、或其缺口體、或其經修飾之版本(其包含一個或多個化學修飾)，其中該一個或多個化學修飾選自核鹼基修飾或骨架修飾。在一些實施態樣中，該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。在一些實施態樣中，核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾，且骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。在一些實施態樣中，ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。在下面所列之序列中，核鹼基字母前面的“m”表示2’-O-甲基(2’OMe)修飾，且二個核鹼基之間的“*”表示硫代磷酸酯鍵聯。
[圖1]顯示針對GBA之ASO(ASOs directed against GBA)對經以編碼GBA之質體及以所指示之ASO所轉染之HEK293T細胞中的GBA表現之效果。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。
[圖2]顯示針對WPRE之ASO對經以編碼GBA之質體及以所指示之ASO所轉染之HEK293T細胞中的GBA表現之效果。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。
[圖3]顯示針對BGH多A(BGH PolyA)之ASO對經以編碼GBA之質體及以所指示之ASO所轉染之HEK293T細胞中的GBA表現之效果。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。
[圖4]顯示ASO多A ASO-2對經以編碼Trem2之質體及以所指示之ASO所轉染之HEK293T細胞中的Trem2表現之效果。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。
[圖5]顯示順序轉染ASO對GBA表現之效果。HEK293T細胞係經以編碼GBA表現之質體轉染。3小時後，質體轉染混合物係經移除，且細胞係以所指示之ASO來轉染。於72小時後收穫細胞，並使用qRT-PCR定量GBA表現。
[圖6]顯示用於PR001構築體的ASO標的序列。
[圖7]顯示接受AAV-GBA輸液再接以GBA ASO 1、WPRE ASO 2或多A ASO2處理的小鼠的肝臟中的GBA mRNA量。
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catg 304
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cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg aggcggcggc 240
ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcg 278
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auggccggau cucugacagg acugcugcug cuucaggccg ugucuugggc uucuggcgcu 120
agaccuugca uccccaagag cuucggcuac agcagcgucg ugugcgugug caaugccacc 180
uacugcgaca gcuucgaccc uccuaccuuu ccugcucugg gcaccuucag cagauacgag 240
agcaccagau ccggcagacg gauggaacug agcaugggac ccauccaggc caaucacaca 300
ggcacuggcc ugcugcugac acugcagccu gagcagaaau uccagaaagu gaaaggcuuc 360
ggcggagcca ugacagaugc cgccgcucug aauauccugg cucugucucc accagcucag 420
aaccugcugc ucaagagcua cuucagcgag gaaggcaucg gcuacaacau caucagagug 480
cccauggcca gcugcgacuu cagcaucagg accuacaccu acgccgacac acccgacgau 540
uuccagcugc acaacuucag ccugccugaa gaggacacca agcugaagau cccucugauc 600
cacagagccc ugcagcuggc acaaagaccc gugucacugc uggccucucc auggacaucu 660
cccaccuggc ugaaaacaaa uggcgccgug aauggcaagg gcagccugaa aggccaaccu 720
ggcgacaucu accaccagac cugggccaga uacuucguga aguuccugga cgccuaugcc 780
gagcacaagc ugcaguuuug ggccgugaca gccgagaacg aaccuucugc uggacugcug 840
agcggcuacc ccuuucagug ccugggcuuu acacccgagc accagcggga cuuuaucgcc 900
cgugaucugg gacccacacu ggccaauagc acccaccaua augugcggcu gcugaugcug 960
gacgaccaga gacugcuucu gccccacugg gcuaaagugg ugcugacaga uccugaggcc 1020
gccaaauacg ugcacggaau cgccgugcac ugguaucugg acuuucuggc cccugccaag 1080
gccacacugg gagagacaca cagacuguuc cccaacacca ugcuguucgc cagcgaagcc 1140
ugugugggca gcaaguuuug ggaacagagc gugcggcucg gcagcuggga uagaggcaug 1200
caguacagcc acagcaucau caccaaccug cuguaccacg ucgucggcug gaccgacugg 1260
aaucuggccc ugaauccuga aggcggcccu aacugggucc gaaacuucgu ggacagcccc 1320
aucaucgugg acaucaccaa ggacaccuuc uacaagcagc ccauguucua ccaccuggga 1380
cacuucagca aguucauccc cgagggcucu cagcgcguug gacugguggc uucccagaag 1440
aacgaucugg acgccguggc ucugaugcac ccugauggau cugcuguggu ggugguccug 1500
aaccgcagca gcaaagaugu gccccugacc aucaaggauc ccgccguggg auuccuggaa 1560
acaaucagcc cuggcuacuc cauccacacc uaccuguggc guagacagug a 1611
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ccuuuuacgc uauguggaua cgcugcuuua augccuuugu aucaugcuau ugcuucccgu 120
auggcuuuca uuuucuccuc cuuguauaaa uccugguugc ugucucuuua ugaggaguug 180
uggcccguug ucaggcaacg uggcguggug ugcacugugu uugcugacgc aacccccacu 240
gguuggggca uugccaccac cugucagcuc cuuuccggga cuuucgcuuu cccccucccu 300
auugccacgg cggaacucau cgccgccugc cuugcccgcu gcuggacagg ggcucggcug 360
uugggcacug acaauuccgu gguguugucg gggaaaucau cguccuuucc uuggcugcuc 420
gccuguguug ccaccuggau ucugcgcggg acguccuucu gcuacguccc uucggcccuc 480
aauccagcgg accuuccuuc ccgcggccug cugccggcuc ugcggccucu uccgcgucuu 540
cgccuucgcc cucagacgag ucggaucucc cuuugggccg ccuccccgc 589
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agcguaucca cauagcguaa a 21
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aagagacagc aaccaggauu u 21
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ggacaguggg aguggcacc 19
Claims (121)
- 一種用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含側翼是AAV反向末端重複(ITR)之轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至該等AAV ITR的至少一者，其中該等一個或多個ASO與該AAV ITR之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
- 如請求項1之方法，其中該等一個或多個ASO中的每一者的長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。
- 如請求項1或請求項2之方法，其中該等ASO中的每一者包含一個或多個化學修飾。
- 如請求項3之方法，其中該等一個或多個化學修飾中的各者係選自核鹼基修飾或骨架修飾。
- 如請求項4之方法，其中該等ASO的各者的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。
- 如請求項4或5之方法，其中該核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。
- 如請求項4或5之方法，其中該骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。
- 如請求項4或5之方法，其中ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
- 如請求項1至8中任一項之方法，其中該AAV ITR是AAV2 ITR。
- 如請求項9之方法，其中該AAV2 ITR包含與SEQ ID NO：1中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項10之方法，其中該AAV2 ITR由SEQ ID NO：1中所列之核酸序列或其互補序列組成。
- 如請求項1至11中任一項之方法，其中該ASO與該AAV ITR的至少三個連續核苷酸結合。
- 如請求項1至12中任一項之方法，其中該至少一個ASO包含與SEQ ID NO：2-8的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。
- 如請求項1至13中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現增加。
- 如請求項1至13中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現降低。
- 如請求項1至15中任一項之方法，其中該細胞係哺乳動物細胞，視需要，其中該哺乳動物細胞係人細胞。
- 如請求項1至16中任一項之方法，其中該細胞是在個體中。
- 如請求項1至17中任一項之方法，其中該轉殖基因是治療性蛋白質。
- 如請求項18之方法，其中該治療性蛋白質是β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。
- 如請求項19之方法，其中該GBA係由經密碼子最適化之核酸序列所編碼。
- 如請求項19或20之方法，其中編碼GBA之該轉殖基因包含SEQ ID NO：40中所列之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項1至21中任一項之方法，其中該rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
- 一種用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至該轉殖基因之轉錄控制區域序列，其中該等一個或多個ASO與該轉錄控制區域序列之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
- 如請求項23之方法，其中該等一個或多個ASO中的每一者的長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。
- 如請求項23或請求項24之方法，其中該等ASO中的每一者包含一個或多個化學修飾。
- 如請求項25之方法，其中該等一個或多個化學修飾中的各者係選自核鹼基修飾或骨架修飾。
- 如請求項26之方法，其中該等ASO的各者的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。
- 如請求項26或27之方法，其中該核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。
- 如請求項26或27之方法，其中該骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。
- 如請求項26或27之方法，其中ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
- 如請求項23至30中任一項之方法，其中該轉錄控制區域序列包含強化子序列及/或啟動子序列。
- 如請求項31之方法，其中該強化子序列係巨細胞病毒(CMV)強化子序列及/或該啟動子序列係雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子序列。
- 如請求項32之方法，其中該CMV強化子序列包含與SEQ ID NO：9中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列，及/或該雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子序列包含與SEQ ID NO：25中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項23至33中任一項之方法，其中該ASO與該轉錄控制區域序列的至少三個連續核苷酸結合。
- 如請求項23至34中任一項之方法，其中該至少一個ASO包含與SEQ ID NO：10-24及26-39的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。
- 如請求項35之方法，其中該至少一個ASO包含一個或多個化學修飾，其選自核鹼基修飾或骨架修飾。
- 如請求項36之方法，其中該等一個或多個化學修飾中的各者係選自核鹼基修飾或骨架修飾。
- 如請求項37之方法，其中該等ASO的各者的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。
- 如請求項37或38之方法，其中該核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。
- 如請求項37或38之方法，其中該骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。
- 如請求項37或38之方法，其中ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
- 如請求項23至41中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現增加。
- 如請求項23至41中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現降低。
- 如請求項23至43中任一項之方法，其中該細胞係哺乳動物細胞，視需要，其中該哺乳動物細胞係人細胞。
- 如請求項23至44中任一項之方法，其中該細胞是在個體中。
- 如請求項23至45中任一項之方法，其中該轉殖基因是治療性蛋白質。
- 如請求項46之方法，其中該治療性蛋白質是β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。
- 如請求項47之方法，其中該GBA係由經密碼子最適化之核酸序列所編碼。
- 如請求項47或48之方法，其中編碼GBA之該轉殖基因包含SEQ ID NO：40中所列之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項35至49中任一項之方法，其中該rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
- 一種用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至從該轉殖基因所轉錄的mRNA的蛋白質編碼區域，其中該等一個或多個ASO與該蛋白質編碼區域之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
- 如請求項51之方法，其中該等一個或多個ASO中的每一者的長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。
- 如請求項51或請求項52之方法，其中該等ASO中的每一者包含一個或多個化學修飾。
- 如請求項53之方法，其中該等一個或多個化學修飾中的各者係選自核鹼基修飾或骨架修飾。
- 如請求項54之方法，其中該等ASO的各者的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。
- 如請求項54或55之方法，其中該核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。
- 如請求項54或55之方法，其中該骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。
- 如請求項54或55之方法，其中ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
- 如請求項51至58中任一項之方法，其中該ASO包含缺口體(gapmer)結構。
- 如請求項51至59中任一項之方法，其中該ASO與該蛋白質編碼區域的至少三個連續核苷酸結合。
- 如請求項51至60中任一項之方法，其中該至少一個ASO包含與SEQ ID NO：41-50的任一者、SEQ ID NO：91-95的任一者、或SEQ ID NO：106-110的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。
- 如請求項51至61中任一項之方法，其中該蛋白質編碼區域編碼β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)蛋白質。
- 如請求項62之方法，其中該蛋白質編碼區域包含與SEQ ID NO：40中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項51至63中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現增加。
- 如請求項51至63中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現降低。
- 如請求項51至65中任一項之方法，其中該表現調節會發生，不論該經表現之轉殖基因之本質。
- 如請求項51至66中任一項之方法，該等一個或多個ASO係與轉殖基因轉染之相同時間經遞輸至該細胞。
- 如請求項51至66中任一項之方法，該等一個或多個ASO係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後的數小時、例如3小時，經遞輸至該細胞。
- 如請求項51至66中任一項之方法，該等一個或多個ASO係在該細胞經以包含編碼該轉殖基因之該rAAV載體之質體轉染後的數週，經遞輸至該細胞。
- 如請求項65之方法，其中該轉殖基因之表現降低源自被該等一個或多個ASO所結合之mRNA轉錄本之核糖核酸酶H媒介式降解(RNaseH-mediated degradation)。
- 如請求項51至70中任一項之方法，其中該細胞係哺乳動物細胞，視需要，其中該哺乳動物細胞係人細胞。
- 如請求項51至71中任一項之方法，其中該細胞是在個體中。
- 如請求項51至72中任一項之方法，其中該rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
- 一種用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至從該轉殖基因所轉錄的mRNA的土撥鼠轉譯後調節元件(WPRE)，其中該等一個或多個ASO與該WPRE之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
- 如請求項74之方法，其中該等一個或多個ASO中的每一者的長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。
- 如請求項74或請求項75之方法，其中該等ASO中的每一者包含一個或多個化學修飾。
- 如請求項76之方法，其中該等一個或多個化學修飾中的各者係選自核鹼基修飾或骨架修飾。
- 如請求項77之方法，其中該等ASO的各者的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。
- 如請求項77或78之方法，其中該核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。
- 如請求項77或78之方法，其中該骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。
- 如請求項77或78之方法，其中ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
- 如請求項80或81之方法，其中該WPRE包含與SEQ ID NO：51中所列之核酸序列至少90%一致性之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項74至82中任一項之方法，其中該ASO與該WPRE序列的至少三個連續核苷酸結合。
- 如請求項74至83中任一項之方法，其中該至少一個ASO包含與SEQ ID NO：52-79的任一者、SEQ ID NO：96-100的任一者、或SEQ ID NO：111-115的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。
- 如請求項74至84中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現增加。
- 如請求項74至85中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現降低。
- 如請求項74至86中任一項之方法，其中該細胞係哺乳動物細胞，視需要，其中該哺乳動物細胞係人細胞。
- 如請求項74至87中任一項之方法，其中該細胞是在個體中。
- 如請求項74至88中任一項之方法，其中該轉殖基因是治療性蛋白質。
- 如請求項89之方法，其中該治療性蛋白質是β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。
- 如請求項90之方法，其中該GBA係由經密碼子最適化之核酸序列所編碼。
- 如請求項90或91之方法，其中編碼GBA之該轉殖基因包含SEQ ID NO：40中所列之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項74至92中任一項之方法，其中該rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
- 一種用於調節細胞中的轉殖基因的表現之方法，該方法包含使含有rAAV載體之細胞與一個或多個反義寡核苷酸(ASO)接觸，該rAAV載體包含轉殖基因，該等一個或多個ASO特異性結合至從該轉殖基因所轉錄的mRNA的多腺核苷酸化元件(polyadenylation element)，其中該等一個或多個ASO與該多腺核苷酸化元件之結合，導致相對於未含有該等一個或多個ASO的細胞的該轉殖基因之經改變之表現。
- 如請求項94之方法，其中該等一個或多個ASO中的每一者的長度範圍在約10個核苷酸至約30個核苷酸。
- 如請求項94或請求項95之方法，其中該等ASO中的每一者包含一個或多個化學修飾。
- 如請求項96之方法，其中該等一個或多個化學修飾中的各者係選自核鹼基修飾或骨架修飾。
- 如請求項97之方法，其中該等ASO的各者的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。
- 如請求項96或97之方法，其中該核鹼基修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾。
- 如請求項96或97之方法，其中該骨架修飾包含硫代磷酸酯鍵聯。
- 如請求項96或97之方法，其中ASO包含一個或多個鎖核酸(LNA)。
- 如請求項94至101中任一項之方法，其中該ASO包含缺口體(gapmer)結構。
- 如請求項94至102中任一項之方法，其中該ASO與該多腺核苷酸化元件的至少三個連續核苷酸結合。
- 如請求項94至103中任一項之方法，其中該多腺核苷酸化元件包含SEQ ID NO：80中所列之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項94至104中任一項之方法，其中該至少一個ASO包含與SEQ ID NO：81-90的任一者、SEQ ID NO：101-104的任一者、或SEQ ID NO：116-120的任一者中所列之序列至少90%一致性之核酸序列，或其互補序列。
- 如請求項94至105中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現增加。
- 如請求項94至106中任一項之方法，其中該經改變之表現係該轉殖基因之表現降低。
- 如請求項107之方法，其中該轉殖基因之表現降低源自被該等一個或多個ASO所結合之mRNA轉錄本之核糖核酸酶H媒介式降解(RNaseH-mediated degradation)。
- 如請求項94至108中任一項之方法，其中該細胞係哺乳動物細胞，視需要，其中該哺乳動物細胞係人細胞。
- 如請求項94至109中任一項之方法，其中該細胞是在個體中。
- 如請求項94至110中任一項之方法，其中該轉殖基因是治療性蛋白質。
- 如請求項111之方法，其中該治療性蛋白質是β-葡萄糖腦苷脂酶(GBA)。
- 如請求項112之方法，其中該GBA係由經密碼子最適化之核酸序列所編碼。
- 如請求項112至113之方法，其中編碼GBA之該轉殖基因包含SEQ ID NO：40中所列之核酸序列或其互補序列。
- 如請求項94至114中任一項之方法，其中該rAAV載體包含SEQ ID NO：1、9、25、40、51、及80中所列之核酸序列。
- 一種經單離之核酸，其包含SEQ ID NO：2-8、10-24、26-39、41-50、52-79、81-120的任一者中所示之序列，或其互補序列。
- 如請求項116之經單離之核酸，其中該經單離之核酸包含一個或多個化學修飾。
- 如請求項116或117之經單離之核酸，其中該等一個或多個化學修飾包含2’-O-甲基(2’OMe)修飾、硫代磷酸酯鍵聯、鎖核酸(LNA)、或前述之任何組合。
- 如請求項116至118中任一項之經單離之核酸，其中該經單離之核酸係反義寡核苷酸(ASO)。
- 如請求項119之經單離之核酸，其中該ASO的所有核鹼基及/或整個骨架係經修飾。
- 如請求項116至120中任一項之經單離之核酸，其中該經單離之核酸具有缺口體結構。
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