KR20230003012A - 유전자 요법을 위한 아스파르토아실라아제(aspa)를 인코딩하는 변형된 핵산 및 벡터 - Google Patents

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파올라 레오네
제레미 프란시스
바젤 타리크 아사프
쇼 아사노
캐서린 헤일즈
앨리슨 피. 버그
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화이자 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 아스파르토아실라아제(ASPA: aspartoacylase)의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환 및 장애, 특히 카나반병의 치료에 사용하기 위한, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산 및 이의 변이체를 포함하는 재조합 핵산 및 유전자 요법 벡터에 관한 것이다.

Description

유전자 요법을 위한 아스파르토아실라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산 및 벡터
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 4월 28일자 출원된 미국 임시 출원 제63/016,507호 및 2020년 9월 11일자 출원된 미국 임시 출원 제63/077,144호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
기술분야
본 발명은 아스파르토아실라아제(ASPA: aspartoacylase)를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 사용하는 방법, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터, 및 N-아세틸-L-아스파르트산의 감소된 세포 이화작용과 관련된 질환, 장애 및 병태를 포함하는 기능성 ASPA의 감소된 수준과 관련된 질환, 장애 및 병태, 예를 들어 카나반병(Canavan disease)의 치료에서의 상기 벡터의 용도에 관한 것이다.
카나반병(CD)은 효소 아스파르토아실라아제(ASPA)(아미노아실라아제 2로도 알려짐)를 인코딩하는 ASPA 유전자의 발현 감소 및/또는 돌연변이와 관련이 있다. 감소된 아스파르토아실라아제 활성은 N-아세틸아스파르테이트(NAA)(N-아세틸-L-아스파르트산으로도 알려짐)의 아스파르테이트 및 아세테이트로의 전환 감소로 인해 NAA의 축적을 초래한다. ASPA 효소는 미엘린화(myelinating) 세포의 대사 완전성의 유지와 관련이 있다. 뇌에서, ASPA 유전자 발현은 주로 희소돌기아교세포를 생성하는 백색질로 제한된다. 뇌에서의 NAA의 축적은 희소돌기아교세포 기능장애, 미엘린초(myelin sheath) 발달 방해 및 뉴런과 관련된 기존 미엘린초의 파괴와 관련이 있다.
CD는 상염색체 열성 유전 질환이며, 주로 신생아/영아 형태로 나타난다. 이러한 형태에 영향을 받은 아동은 유아기에 뇌 및 척수에서 미엘린 변성과 관련된 증상이 나타난다. 증상에는, 지능 장애, 이전에 획득한 운동 기술의 상실, 섭식 장애, 비정상 근긴장, 대두증, 마비 및 발작이 포함된다. 기대 수명은 일반적으로 신생아/영아 형태의 CD를 앓고 있는 아동의 경우 첫 10년으로 제한된다. 경증/청소년 형태의 CD를 앓고 있는 개체는 언어 및 운동 기술 발달의 지연을 나타낼 수 있으며, 평균 수명을 가질 수 있다.
현재까지, CD의 신경변성 영향을 중단시키거나 더디게 하는 치료는 존재하지 않는다. 현재 임상 사용 중이거나 평가 중인 치료 접근법은 증상을 완화하고 삶의 질을 최대화하는 것을 목표로 한다. 물리적 요법, 영양 보급관 및 발작 방지 약물이 일부 증상을 치료하고 삶의 질을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, CD를 치료하는 신규한 치료적 접근법에 대한 중요한 필요성이 있다.
아스파르토아실라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산 및 변형된 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, rAAV 벡터), 및 변형된 핵산 또는 변형된 핵산을 포함하는 벡터를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여 ASPA 단백질의 감소된 수준에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법이 본원에 개시되고 예시된다.
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 등가물을 단지 통상의 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 구현예(E)에 포함되는 것으로 의도된다.
E1. 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 단리된 핵산.
E2. 서열번호 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 단리된 핵산.
E3. 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 단리된 핵산.
E4. 서열번호 1의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 단리된 핵산.
E5. 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 단리된 핵산.
E6. 서열번호 3의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 단리된 핵산.
E7. 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
E8. 서열번호 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
E9. 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
E10. 서열번호 1의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
E11. 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
E12. 서열번호 3의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
E13. 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 핵산.
E14. 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 핵산.
E15. 서열번호 1의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 핵산.
E16. 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 핵산.
E17. 서열번호 3의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 핵산.
E18. 서열번호 3의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 재조합 핵산.
E19. E13 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 인핸서, 프로모터, 엑손, 인트론 및 폴리아데닐화(polyA) 신호 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함하는, 재조합 핵산.
E20. E19에 있어서, 인핸서가 서열번호 6, 서열번호 17 또는 둘 모두의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
E21. E19 또는 E20에 있어서, 인핸서가 서열번호 6, 서열번호 17 또는 둘 모두의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 재조합 핵산.
E22. E19 내지 E21 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 구성적이거나 조절되는, 재조합 핵산.
E23. E19 내지 E22 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 유도성 또는 억제성인, 재조합 핵산.
E24. E19 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
E25. E19 내지 E24 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 재조합 핵산.
E26. E19 내지 E25 중 어느 하나에 있어서, 엑손이 서열번호 8, 서열번호 18 또는 둘 모두의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
E27. E19 내지 E26 중 어느 하나에 있어서, 엑손이 서열번호 8, 서열번호 18 또는 둘 모두의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 재조합 핵산.
E28. E19 내지 E27 중 어느 하나에 있어서, 인트론이 서열번호 9, 서열번호 10 또는 둘 모두의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
E29. E19 내지 E28 중 어느 하나에 있어서, 인트론이 서열번호 9, 서열번호 10 또는 둘 모두의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 재조합 핵산.
E30. E19 내지 E29 중 어느 하나에 있어서, polyA 서열이 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, 재조합 핵산.
E31. E19 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, polyA 서열이 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 재조합 핵산.
E32. E19 내지 E31 중 어느 하나에 있어서, 인핸서가 변형된 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는, 재조합 핵산.
E33. E19 내지 E32 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 변형된 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는, 재조합 핵산.
E34. E13 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 거대세포바이러스(CMV) 인핸서, 혼성체 형태의 CBA 프로모터(CBh 프로모터), 닭 β-액틴(CBA) 엑손, CBA 인트론, 마우스 미닛 바이러스(MVM: minute virus of mice) 인트론 및 소 성장 호르몬(BGH) polyA로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함하는 재조합 핵산.
E35. E13 내지 E18 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서, 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터, 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 CBA 엑손, 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 CBA 인트론, 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 MMV 인트론 및 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 BGH polyA로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함하는 재조합 핵산.
E36. E7 내지 E12 중 어느 하나의 변형된 핵산 또는 E13 내지 E35 중 어느 하나의 재조합 핵산을 포함하는 벡터 게놈으로서, 서열번호 5, 서열번호 12 또는 둘 모두의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 AAV ITR 반복 서열을 추가로 포함하는 벡터 게놈.
E37. E36에 있어서, 적어도 하나의 AAV ITR 반복 서열이 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, 벡터 게놈.
E38. E36 또는 E37에 있어서, ASPA를 인코딩하는 핵산 서열 및 ASPA를 인코딩하는 서열의 업스트림에 있는 CBh 프로모터를 플랭킹하는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는 벡터 게놈.
E39. E36 내지 E38 중 어느 하나에 있어서, ASPA 서열이 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는, 벡터 게놈.
E40. E36 내지 E39 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 AAV2 ITR 서열이 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는, 벡터 게놈.
E41. E36 내지 E40 중 어느 하나에 있어서, CBh 프로모터가 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, 벡터 게놈.
E42. 5'에서 3' 방향으로 하기 a) 내지 i)를 포함하는 핵산을 포함하는 벡터 게놈:
a) 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 AAV2 ITR;
b) 서열번호 6 또는 서열번호 17, 바람직하게는 서열번호 6의 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서;
c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
d) 서열번호 8, 서열번호 18, 바람직하게는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 CBA 엑손;
e) 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 CBA 인트론;
f) 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 MMV 인트론;
g) 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산;
h) 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 BGH polyA; 및
i) 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 AAV2 ITR.
E43. 5'에서 3' 방향으로 하기 a) 내지 i)를 포함하는 핵산을 포함하는 벡터 게놈:
a) 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 AAV ITR;
b) 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열, 바람직하게는 서열번호 6의 핵산 서열을 포함하는 인핸서;
c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 프로모터;
d) 서열번호 8 또는 서열번호 18, 바람직하게는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 엑손;
e) 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 인트론;
f) 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 인트론;
g) 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산;
h) 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 PolyA; 및
i) 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 AAV 말단 반복부.
E44. E36 내지 E43 중 어느 하나에 있어서, 자가 상보적인 벡터 게놈.
E45. E36 내지 E44 중 어느 하나의 벡터 게놈과 캡시드를 포함하는 재조합 아데노연관바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated virus) 벡터.
E46. 서열번호 2의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터.
E47. E46에 있어서, Olig001, Olig002, Olig003, AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV2i8, AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N 및 AAV-LK03의 캡시드로 이루어지는 군에서 선택되는 캡시드를 포함하는 rAAV 벡터.
E48. 서열번호 1의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터.
E49. E48에 있어서, Olig001, Olig002, Olig003, AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV2i8, AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N 및 AAV-LK03의 캡시드로 이루어지는 군에서 선택되는 캡시드를 포함하는 rAAV 벡터.
E50. 서열번호 3의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터.
E51. E50에 있어서, Olig001, Olig002, Olig003, AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV2i8, AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N 및 AAV-LK03의 캡시드로 이루어지는 군에서 선택되는 캡시드를 포함하는 rAAV 벡터.
E52. E45 내지 E51 중 어느 하나에 있어서, 캡시드가 Olig001, Olig002 및 Olig003 캡시드에서 선택되는, rAAV 벡터.
E53. E45 내지 E52 중 어느 하나에 있어서, 캡시드가 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Olig001 캡시드이며, 여기서 VP1은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E54. E45 내지 E53 중 어느 하나에 있어서, 캡시드가 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Oligo001 캡시드이며, 여기서 VP1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E55. E45 내지 E52 중 어느 하나에 있어서, 캡시드가 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Olig002 캡시드이며, 여기서 VP1은 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E56. E45 내지 E52 및 E55 중 어느 하나에 있어서, 캡시드가 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Oligo002 캡시드이며, 여기서 VP1은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E57. E45 내지 E52 중 어느 하나에 있어서, 캡시드가 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Olig003 캡시드이며, 여기서 VP1은 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E58. E46 내지 E52 및 E57 중 어느 하나에 있어서, 캡시드가 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Oligo003 캡시드이며, 여기서 VP1은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E59. E45 내지 E58 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 자가 상보적인, rAAV 벡터.
E60. E46 내지 E59 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR) 서열, 인핸서, 프로모터, 엑손, 인트론 및 폴리아데닐화(polyA) 신호 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 포함하는, rAAV 벡터.
E61. E60에 있어서, 인핸서가 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E62. E60 또는 E61에 있어서, 인핸서가 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, rAAV 벡터.
E63. E60 내지 E62 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 구성적이거나 조절되는, rAAV 벡터.
E64. E60 내지 E63 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 유도성 또는 억제성인, rAAV 벡터.
E65. E60 내지 E64 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E66. E60 내지 E65 중 어느 하나에 있어서, 프로모터가 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, rAAV 벡터.
E67. E60 내지 E66 중 어느 하나에 있어서, 엑손이 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E68. E60 내지 E67 중 어느 하나에 있어서, 엑손이 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, rAAV 벡터.
E69. E60 내지 E68 중 어느 하나에 있어서, 인트론이 서열번호 9, 서열번호 10 또는 둘 모두의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E70. E60 내지 E69 중 어느 하나에 있어서, 인트론이 서열번호 9, 서열번호 10 또는 둘 모두의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, rAAV 벡터.
E71. E60 내지 E70 중 어느 하나에 있어서, polyA 서열이 서열번호 11의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E72. E60 내지 E71 중 어느 하나에 있어서, polyA 서열이 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, rAAV 벡터.
E73. E60 내지 E72 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 AAV ITR 반복 서열이 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E74. E60 내지 E73 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 AAV ITR 반복 서열이 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인, rAAV 벡터.
E75. E46 내지 E59 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 적어도 하나의 AAV2 ITR 서열, CMV 인핸서, CBh 프로모터, CBA 엑손 1, CBA 인트론 1, MVM 인트론 및 BGH polyA로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
E76. E46 내지 E59 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 AAV2 ITR 서열, 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서, 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터, 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 CBA 엑손 1, 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 CBA 인트론 1, 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 MMV 인트론 및 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 BGH polyA로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
E77. E46 내지 E59 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈이 ASPA를 인코딩하는 서열 및 ASPA를 인코딩하는 서열의 업스트림에 있는 CBh 프로모터를 플랭킹하는 2개의 AAV2 ITR 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E78. E77에 있어서, ASPA 서열이 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E79. E77 또는 E78에 있어서, AAV ITR 서열이 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E80. E77 내지 E79 중 어느 하나에 있어서, CBh 프로모터가 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E81. 5'에서 3' 방향으로 하기 a) 내지 i)를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터:
a) 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는 AAV2 ITR;
b) 서열번호 6 또는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서;
c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
d) 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 CBA 엑손 1;
e) 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 CBA 인트론 1;
f) 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 MMV 인트론;
g) 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산;
h) 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 BGH polyA; 및
i) 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는 AAV2 ITR.
E82. 5'에서 3' 방향으로 하기 a) 내지 i)를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터:
a) 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는 AAV ITR;
b) 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하는 인핸서;
c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 프로모터;
d) 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 엑손;
e) 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 인트론;
f) 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 인트론;
g) 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산;
h) 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 PolyA; 및
a) 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는 AAV 말단 반복부;
E83. E81 또는 E82에 있어서, 벡터 게놈이 자가 상보적인, rAAV 벡터.
E84. E81 내지 E83 중 어느 하나에 있어서, VP1 단백질을 포함하는 Olig001 캡시드를 포함하며, 여기서 VP1은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E85. E81 내지 E83 중 어느 하나에 있어서, VP1 단백질을 포함하는 Olig002 캡시드를 포함하며, 여기서 VP1은 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E86. E81 내지 E83 중 어느 하나에 있어서, VP1 단백질을 포함하는 Olig003 캡시드를 포함하며, 여기서 VP1은 서열번호 16의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
E87. i) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VP1 단백질을 포함하는 Olig001 캡시드와, ii) 5'에서 3' 방향으로 하기 a) 내지 i)를 포함하는 자가 상보적 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터:
a) 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는 AAV2 ITR;
b) 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서;
c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
d) 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 CBA 엑손 1;
e) 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 CBA 인트론 1;
f) 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 MMV 인트론;
g) 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산;
h) 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 BGH polyA; 및
i) 서열번호 5 또는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 AAV2 ITR.
E88. i) 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VP1 단백질을 포함하는 Olig001 캡시드와, ii) 5'에서 3' 방향으로 하기 a) 내지 i)를 포함하는 자가 상보적 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터:
a) 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는 AAV ITR;
b) 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하는 인핸서;
c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 프로모터;
d) 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 엑손;
e) 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 인트론;
f) 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 인트론;
g) 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산;
h) 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 PolyA; 및
i) 서열번호 5, 서열번호 12, 서열번호 19 또는 이들의 조합의 핵산 서열을 포함하는 AAV ITR.
E89. E45 내지 E88 중 어느 하나에 있어서, 세포 내로 도입될 때, 세포에서 NAA의 수준을 감소시키는, rAAV 벡터.
E90. E89에서 있어서, 세포가 뇌세포인, rAAV 벡터.
E91. E89 또는 E90에 있어서, 세포가 희소돌기아교세포인, rAAV 벡터.
E92. E45 내지 E91 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상에서의 균형, 악력 및/또는 운동 협응과 비교하여 대상에서 균형, 악력 및/또는 운동 협응을 증가시키는, rAAV 벡터.
E93. E45 내지 E92 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상에서의 전신 운동 기능(generalized motor function)과 비교하여 대상에서 전신 운동 기능을 증가시키는, rAAV 벡터.
E94. E45 내지 E93 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상에서의 NAA 수준과 비교하여 대상에서 NAA 수준을 감소시키는, rAAV 벡터.
E95. E45 내지 E94 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상의 시상 내 액포 체적 분율과 비교하여 대상의 시상 내 액포 체적 분율을 감소시키는, rAAV 벡터.
E96. E45 내지 E95 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상의 소뇌 백색질/교뇌 내 액포 체적 분율과 비교하여 대상의 소뇌 백색질/교뇌 내 액포 체적 분율을 감소시키는, rAAV 벡터.
E97. E45 내지 E96 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상의 시상 내 희소돌기아교세포의 수와 비교하여 대상의 시상 내 희소돌기아교세포의 수를 증가시키는, rAAV 벡터.
E98. E45 내지 E97 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상의 뇌 피질 내 희소돌기아교세포의 수와 비교하여 대상의 뇌 피질 내 희소돌기아교세포의 수를 증가시키는, rAAV 벡터.
E99. E45 내지 E98 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상의 시상 내 뉴런의 수와 비교하여 대상의 시상 내 뉴런의 수를 증가시키는, rAAV 벡터.
E100. E45 내지 E99 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상의 뇌 피질 내 뉴런의 수와 비교하여 대상의 뇌 피질 내 뉴런의 수를 증가시키는, rAAV 벡터.
E101. E45 내지 E100 중 어느 하나에 있어서, ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에게의 상기 벡터의 투여가 상기 벡터의 투여 전 대상에서의 피질 미엘린화와 비교하여 대상에서 피질 미엘린화을 증가시키는, rAAV 벡터.
E102. E92 내지 E101 중 어느 하나에 있어서, 대상이 인간 환자인, rAAV 벡터.
E103. E92 내지 E102 중 어느 하나에 있어서, 대상이 카나반병을 앓고 있거나 카나반병의 발병 위험이 있는 인간 환자인, rAAV 벡터.
E104. E92 내지 E103 중 어느 하나에 있어서, 대상이 적어도 하나의 ASPA 유전자 돌연변이를 갖는, rAAV 벡터.
E105. E7 내지 E12 중 어느 하나의 변형된 핵산, E13 내지 E35 중 어느 하나의 재조합 핵산, E36 내지 E44 중 어느 하나의 벡터 게놈 또는 E45 내지 E104 중 어느 하나의 rAAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
E106. E7 내지 E12 중 어느 하나의 변형된 핵산, E13 내지 E35 중 어느 하나의 재조합 핵산, E36 내지 E44 중 어느 하나의 벡터 게놈 또는 E45 내지 E104 중 어느 하나의 rAAV 벡터와, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
E107. ASPA의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, E7 내지 E12 중 어느 하나의 변형된 핵산, E13 내지 E35 중 어느 하나의 재조합 핵산, E36 내지 E44 중 어느 하나의 벡터 게놈, E45 내지 E104 중 어느 하나의 rAAV 벡터 또는 E105 또는 E106의 약제학적 조성물을 치료적 유효량으로 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
E108. E107에 있어서, ASPA의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태가 카나반병인, 방법.
E109. E107 또는 E108에 있어서, 변형된 핵산, 재조합 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터 또는 약제학적 조성물이 치료를 필요로 하는 대상의 뇌에 직접 투여되는, 방법.
E110. E107 내지 E109 중 어느 하나에 있어서, 변형된 핵산, 재조합 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터 또는 약제학적 조성물이 치료를 필요로 하는 대상의 중추 신경계에 직접 투여되는, 방법.
E111. E107 내지 E110 중 어느 하나에 있어서, 변형된 핵산, 재조합 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터 또는 약제학적 조성물이 뇌 실질, 척추관, 지주막하 공간, 뇌실, 대수조(cisterna magna) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 중추 신경계의 적어도 하나의 영역에 투여되는, 방법.
E112. E107 내지 E111 중 어느 하나에 있어서, 변형된 핵산, 재조합 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터 또는 약제학적 조성물이 뇌실질내 투여, 척추강내 투여, 뇌실내 투여, 대수조내(intracisternal magna) 투여 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 한 방법에 의해 투여되는, 방법.
E113. E107 내지 E112 중 어느 하나에 있어서, 대상이 인간 환자인, 방법.
E114. E107 내지 E113 중 어느 하나에 있어서, 대상이 카나반병을 앓고 있거나 카나반병의 발병 위험이 있는 인간 환자인, 방법.
E115. E107 내지 E114 중 어느 하나에 있어서, 대상이 적어도 하나의 ASPA 유전자 돌연변이를 갖는, 방법.
E116. 카나반병을 치료하거나 예방하는 방법으로서, i) 대상이 적어도 하나의 ASPA 유전자 돌연변이를 포함하는지 여부를 평가하는 단계, 및 ii) E7 내지 E12 중 어느 하나의 변형된 핵산, E13 내지 E35 중 어느 하나의 재조합 핵산, E36 내지 E44 중 어느 하나의 벡터 게놈, E45 내지 E104 중 어느 하나의 rAAV 벡터 또는 E105 또는 E106의 약제학적 조성물을 치료적 유효량으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 이를 통해 대상에서 카나반병을 치료하거나 예방하는 방법.
E117. E116에 있어서, 대상이 카나반병으로 진단받았거나 카나반병의 발병 위험이 있는 것으로 진단받은 대상인, 방법.
E118. ASPA 결핍과 관련된 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에서 ASPA 결핍과 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 코돈 최적화된 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
E119. E118에 있어서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산이 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는, 방법.
E120. E118 또는 E119에 있어서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산이 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 ASPA 단백질을 인코딩하는, 방법.
E121. E118 내지 E120 중 어느 하나에 있어서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산이 표적 세포에서 발현되며, 여기서 표적 세포는 희소돌기아교세포인, 방법.
E122. E118 내지 E121 중 어느 하나에 있어서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산이 표적 세포로 벡터 내 전달되는, 방법.
E123. E122에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터인, 방법.
E124. E118 내지 E123 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터가 전신 주사, 직접 두개내 주사 또는 직접 척추관 주사에 의해 대상에게 투여되는, 방법.
E125. E7 내지 E12 중 어느 하나의 변형된 핵산, E13 내지 E35 중 어느 하나의 재조합 핵산, E36 내지 E44 중 어느 하나의 벡터 게놈 또는 E45 내지 E104 중 어느 하나의 rAAV 벡터를 포함하는 숙주 세포.
E126. E125에 있어서, VERO, WI38, MRC5, A549, HEK293, B-50 또는 임의의 다른 HeLa 세포, HepG2, Saos-2, HuH7 및 HT1080으로 이루어지는 군에서 선택되는, 숙주 세포.
E127. E125 또는 E126에 있어서, 현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293 세포인, 숙주 세포.
E128. E125 내지 E127 중 어느 하나에 있어서, ATCC(American Type Culture Collection) 번호 PTA 13274를 갖는 HEK293 세포인, 숙주 세포.
E129. E125 내지 E128 중 어느 하나에 있어서, AAV Rep 단백질, AAV 캡시드(Cap) 단백질, 아데노바이러스 초기 영역 1A(E1a) 단백질, E1b 단백질, E2a 단백질, E4 단백질 및 바이러스 연관(VA) RNA로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
E130. i) E45 내지 E104 중 어느 하나의 rAAV 벡터 또는 ii) E105 또는 E106의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 카나반병(CD) 치료용 키트.
E131. E130에 있어서, 키트 구성요소 중 하나 이상을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 표지 또는 삽입물을 추가로 포함하는, 키트.
E132. E7 내지 E106 중 어느 하나에 있어서, ASPA의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한, 변형된 핵산, 재조합 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터 또는 약제학적 조성물.
E133. E132에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 카나반병인, 변형된 핵산, 재조합 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터 또는 약제학적 조성물.
E134. ASPA의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의, E7 내지 E12 중 어느 하나의 변형된 핵산, E13 내지 E35 중 어느 하나의 재조합 핵산, E36 내지 E44 중 어느 하나의 벡터 게놈, E45 내지 E104 중 어느 하나의 rAAV 벡터 또는 E105 또는 E106의 약제학적 조성물의 용도.
E135. E134에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 카나반병인, 용도.
E136. Olig001 캡시드를 포함하는 rAAV 벡터에 의해 대상의 뇌에 전달된 전이유전자(transgene)의 생체분포를 결정하는 방법으로서, 뇌에서 전이유전자에 의해 인코딩되는 단백질이 발현되며, 하기 단계 a) 내지 f)를 포함하는 방법:
a) 대상에게의 rAAV 벡터의 투여;
b) 뇌 조직의 고정화;
c) 뇌의 전기영동 투명화;
d) 뇌 조직 절편의 3D 현미경 이미지화;
e) 단백질 검출;
f) 선택적으로, 뇌 조직에 존재하는 단백질 양의 정량화.
E137. E136에 있어서, 투여가 뇌실내(ICV) 주사, 뇌실질내(IP) 주사, 척추강내(IT) 투여, 대수조내(ICM) 주사 또는 이들의 조합에 의해 이루어지는, 방법.
E138. E136 또는 E137에 있어서, 뇌 조직을, 예를 들어 파라포름알데히드 또는 포르말린을 사용하여 고정시키는, 방법.
E139. E136 내지 E138 중 어느 하나에 있어서, 정량화가 체적 렌더링(volumetric rendering)을 포함하는, 방법.
E140. E136 내지 E139 중 어느 하나에 있어서, 전이유전자가 녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는, 방법.
E141. E136 내지 E140 중 어느 하나에 있어서, 조직에서 검출된 전이유전자 발현 수준이 rAAV 벡터 형질도입 효율과 상관관계가 있는, 방법.
E142. E136 내지 E141 중 어느 하나에 있어서, (g) 세포 형태의 평가 및 GFP 발현의 공간적 위치 결정에 의한 세포 유형 벡터 지향성(tropism)의 평가 단계를 추가로 포함하는, 방법.
E143. 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열과 프로모터를 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
E144. 서열번호 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산과 프로모터를 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
E145. 프로모터를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 변형된 핵산 서열은 서열번호 2의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것인 핵산.
E146. 프로모터를 특정하는 핵산 서열을 포함하고, 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열을 추가로 포함하는 단리된 핵산.
E147. E105에 있어서, PBS 중 350 mM NaCl 및 5% D-소르비톨을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
E148. E106에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체가 PBS 중 350 mM NaCl 및 5% D-소르비톨을 포함하는, 약제학적 조성물.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명, 도면, 예시적인 구현예 및 청구범위를 통해 명백해질 것이다.
도 1은 NAA 신타아제(Nat8L)를 발현하는 플라스미드 1.0 μg으로 트랜스펙션되고, 야생형 인간 ASPA 서열(서열번호 3) 또는 변형된, 예를 들어 원래 코돈 최적화된 ASPA 서열(버전 1)(서열번호 1) 또는 신규 코돈 최적화된 ASPA 서열(버전 2)(서열번호 2)을 포함하는 플라스미드 1.0 μg, 0.5 μg, 0.2 μg 또는 0.1 μg으로 공동 트랜스펙션된 세포에서 HPLC를 사용하여 결정된 NAA의 예시적인 용량 반응 감소를 도시한 것이다.
도 2는 뇌실질내(IP) 투여 경로(ROA)를 통해 투여된 rAAV 벡터에 의해 형질도입된 GFP 양성 세포의 예시적인 샘플링을 도시한 것이다. 형질도입된 세포 수(N)의 추정치를 생성하기 위해 각 관심 영역에서 GFP 양성 세포체(화살표)의 점수를 매겼다.
도 3은 AAV/Olig001-GFP의 뇌실질내(IP) 투여 후 6주령 nur7 마우스의 피질, 뇌량 및 외포의 피질하 백색질, 선조체 및 소뇌에서의 GFP 양성 세포의 예시적인 수(N), 및 1x 1011개 AAV/Olig001-GFP 벡터 게놈이 IP ROA를 통해 투여된 마우스 뇌의 시상 절편에서 고유 GFP 형광의 대표적인 이미지를 도시한 것으로, 이는 주사 부위에 인접하여 집중된 GFP 발현을 보여준다. 광학 분별기(k=4)를 사용하여 144개의 절편에서 N의 추정치를 생성하였다. 각 군에 대한 평균 +/- sem이 제시되어 있다(n=5마리 동물). 각 관심 영역 내 용량 코호트 간 GFP 양성 세포 수의 유의한 차이는 별표로 표시되어 있다.
도 4는 AAV/Olig001-GFP의 척추강내 (IT) 투여 후 6주령 nur7 마우스의 피질, 피질하 백색질, 선조체 및 소뇌에서의 GFP 양성 세포의 예시적인 수(N), 및 1x1011개 AAV/Olig001-GFP 벡터 게놈이 척추강내(IT) ROA를 통해 투여된 마우스 뇌의 시상 절편에서 고유 GFP 형광의 대표적인 이미지를 도시한 것으로, 이는 벡터에 의한 형질도입을 나타내는 미만성 피질 마커 발현 및 해당 영역 내 세포의 형질도입을 나타내는 중간 정도의 백색질 경로 세포 발현을 보여준다. 각 군에 대한 평균 +/- sem이 제시되어 있다(n=5마리 동물). 각 관심 영역 내 용량 코호트 간 GFP 양성 세포 수의 유의한 차이는 별표로 표시되어 있다.
도 5는 AAV/Olig001-GFP의 뇌실내(ICV) 투여 후 6주령 nur7 마우스의 피질, 피질하 백색질, 선조체 및 소뇌에서의 GFP 양성 세포의 예시적인 수(N), 및 1x1011개 AAV/Olig001-GFP 벡터 게놈이 ICV ROA를 통해 투여된 마우스 뇌의 시상 절편에서 고유 GFP 형광의 대표적인 이미지를 도시한 것으로, 이는 해당 영역 내 세포의 벡터에 의한 형질도입을 나타내는 강렬한 백색질 경로 GFP 발현을 보여준다. 각 군에 대한 평균 +/- sem이 제시되어 있다(n=5마리 동물). 각 관심 영역 내 용량 코호트 간 GFP 양성 세포 수의 유의한 차이는 별표로 표시되어 있다.
도 6은 AAV/Olig001-GFP의 대수조내(ICM) 투여 후 6주령 nur7 마우스의 피질, 피질하 백색질, 선조체 및 소뇌에서의 GFP 양성 세포의 예시적인 수(N), 및 1x1011개 AAV/Olig001-GFP 벡터 게놈이 ICM ROA를 통해 투여된 마우스 뇌의 시상 절편에서 고유 GFP 형광의 대표적인 이미지를 도시한 것으로, 이는 해당 영역 내 세포의 형질도입을 나타내는 중간 정도의 백색질 경로 GFP 마커 발현을 보여준다. 각 군에 대한 평균 +/- sem이 제시되어 있다(n=5마리 동물). 각 관심 영역 내 용량 코호트 간 GFP 양성 세포 수의 유의한 차이는 별표로 표시되어 있다.
도 7은 4가지 상이한 투여 경로(IP, IT, ICV 및 ICM)를 통해 각 동물에게 투여된 1x1011 vg 용량에 대한 4개의 관심 영역(피질, 피질하 백색질, 선조체 및 소뇌)에서의 예시적인 AAV/Olig001-GFP 형질도입 효율의 직접적인 비교, 및 뇌실질내 및 뇌실내 뇌의 주사 부위 측면 절편에서의 고유 GFP 형광의 대표적인 이미지를 도시한 것이다. 피질 및 피질하 백색질 경로 전이유전자 양성 세포는 모두 ICV 뇌의 측면 절편에서 더 많았다. 각 군에 대하여, n=5마리 동물, 평균 +/- sem.개별 관심 영역 간 GFP 양성 세포 수의 유의한 차이는 별표로 표시되어 있다(* p<0.05, ** p<0.01 및 ***p<0.001).
도 8은 뇌실질내(IP), 척추강내(IT), 뇌실내(ICV) 및 대수조내(ICM) 벡터 투여 후 6주령 nur7 마우스의 피질에서의 AAV/Olig001-GFP의 예시적인 희소돌기세포 지향성(oligotropism)을 도시한 것이다. 피질 절편을 Olig2 및 NeuN 항체를 사용하여 IHC로 분석하였다. 각 군에 대하여, n=5마리 동물, 각각의 표시된 항원과의 공동 표지화 평균 백분율 +/- sem. 별표는 군 간 유의한 차이를 나타낸다.
도 9는 뇌실질내(IP), 척추강내(IT), 뇌실내(ICV) 및 대수조내(ICM) 벡터 투여 후 6주령 nur7 마우스의 피질하 백색질에서의 AAV/Olig001-GFP의 예시적인 희소돌기세포 지향성을 도시한 것이다. 피질하 백색질 절편을 Olig2 및 NeuN 항체를 사용하여 IHC로 분석하였다. 각 군에 대하여, n=5마리 동물, 각각의 표시된 항원과의 공동 표지화 평균 백분율 +/- sem.
도 10은 뇌실질내(IP), 척추강내(IT), 뇌실내(ICV) 및 대수조내(ICM) 벡터 투여 후 6주령 nur7 마우스의 선조체 물질에서의 AAV/Olig001-GFP의 예시적인 희소돌기세포 지향성을 도시한 것으로, 여기서 마커 검출은 벡터에 의한 세포의 형질도입을 나타낸다. 선조체 물질 절편을 Olig2 및 NeuN 항체를 사용하여 IHC로 분석하였다. 각 군에 대하여, n=5마리 동물, 각각의 표시된 항원과의 공동 표지화 평균 백분율 +/- sem.
도 11은 뇌실질내(IP), 척추강내(IT), 뇌실내(ICV) 및 대수조내(ICM) 벡터 투여 후 6주령 nur7 마우스의 소뇌에서의 AAV/Olig001-GFP의 예시적인 희소돌기세포 지향성을 도시한 것으로, 여기서 마커 검출은 벡터에 의한 형질도입을 나타낸다. 소뇌 절편을 Olig2 및 NeuN 항체를 사용하여 IHC로 분석하였다. 각 군에 대하여, n=5마리 동물, 각각의 표시된 항원과의 공동 표지화 평균 백분율 +/- sem.
도 12는 1x1011개 벡터 게놈의 ICV 투여 2주 후 연령 일치 야생형(WT) 및 nur7 마우스 뇌의 피질 및 피질하 백색질에서의 AAV/Olig001-GFP 형질도입의 예시적인 효율, 및 AAV/Olig001-GFP의 투여 후 야생형 뇌에서의 고유 GFP 형광의 대표적인 이미지를 도시한 것으로, 이는 비교적 제한된 발현과 이에 따른 특히 피질하 백색질에서의 벡터에 의한 형질도입을 보여준다. 각 군에 대해, n=5마리 동물, 군 당 평균 GFP 양성 세포의 수 +/- sem, *p<0.05, ** p<0.01.
도 13은 코돈 최적화된 ASPA 코딩 서열 및 조절 요소를 인코딩하는 발현 플라스미드를 도시한 것이다.
도 14는 AAV/Olig001-ASPA 처리된(3가지 수준으로) 마우스, 야생형 마우스 및 nur7 모의 처리된 마우스에 대한 일생 연구 기간에 걸친 예시적인 로타로드 낙상 대기시간을 도시한 것이다. 데이터는 평균 +/- sem로 표시된다(군 당 n=12마리 동물).
도 15는 야생형(WT) 마우스, AAV/Olig001-ASPA 처리된(3가지 수준으로) 마우스 및 모의 처리된 nur7 마우스에 대한 일생 연구 기간에 걸친 예시적인 개방 영역 활성(open field activity)을 도시한 것이다. 데이터는 평균 +/- sem로 표시된다(군 당 n=12마리 동물).
도 16은 야생형(WT) 마우스, nur7 모의 처리된 마우스 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된(3가지 수준으로) 마우스 뇌의 예시적인 NAA 함량을 도시한 것이다. 데이터는 평균 +/- sem로 표시된다. NAA는 습윤 조직 중량 그램 당 밀리몰(mmole)로 표시된다(군 당 n=6마리 동물). AAV/Olig001-ASPA의 용량은 x-축에 표시되어 있다.
도 17은 22주령에 평가된 AAV/Olig001-ASPA의 3가지 상이한 용량 수준으로 처리된 nur7 마우스에 대한 뇌 조직 그램 당 예시적인 평균 벡터 게놈 카피 수(vg/mg)를 도시한 것이다. 평균 vg/mg 값은 +/- sem로 표시된다(용량 코호트 당 n=6마리 동물).
도 18은 nur7 모의 처리된 마우스, AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 마우스 및 야생형 마우스의 대표적인 H&E 염색된 뇌 절편을 도시한 것으로, 이는 액포형성 영역을 나타낸다.
도 19는 22주령 모의 처리된 마우스 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 마우스 뇌의 시상 및 대뇌 백색질/교뇌 관심 영역(ROI)의 백분율로서의 예시적인 액포 체적 분율을 도시한 것이다. 별표는 군 간 유의한 차이를 나타낸다.
도 20은 희소돌기아교세포를 나타내는 Olig2에 대해 염색된 모의 처리된 마우스 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된(2.5x1011 vg 용량) nur7 마우스 시상 및 피질의 대표적인 이미지를 도시한 것이다.
도 21은 22주령 야생형 마우스, 모의 처리된 마우스 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 마우스의 시상 및 피질 내 Olig2 양성 세포의 예시적인 수를 도시한 것이다. 데이터는 평균 Olig2 양성 세포 +/- sem로 표시된다(군 당 n=6마리 동물). 별표는 군 간 유의한 차이를 나타낸다.
도 22는 NeuN에 대해 염색된 모의 처리된 마우스 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된(2.5x1011 vg 용량) nur7 마우스 시상 및 피질의 대표적인 이미지를 도시한 것이다.
도 23은 22주령 야생형 마우스, 모의 처리된 마우스 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 마우스의 시상 및 피질 내 NeuN 양성 세포의 예시적인 수를 도시한 것이다. 데이터는 평균 NeuN 양성 세포 +/- sem로 표시된다(군 당 n=6마리 동물). 별표는 군 간 유의한 차이를 나타낸다.
도 24는 미엘린 염기성 단백질(MBP)에 대해 염색된 모의 처리된 마우스 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된(2.5x1011 vg 용량) nur7 마우스 피질의 대표적인 이미지를 도시한 것이다.
도 25는 야생형 마우스, 모의 처리된 마우스 및 AAV/001-ASPA 처리된 nur7 마우스 피질 내 예시적인 미엘린 염기성 단백질 양성 섬유 길이 밀도(MBP-LD)(μm/mm3)를 도시한 것이다. 데이터는 평균 MBP-LD +/- sem로 표시된다(군 당 n=6마리 동물). 별표는 군 간 유의한 차이를 나타낸다.
도 26은 (좌측에서 우측으로) 초기 고정되고 사전 투명화된 샘플, 조직 투명화 후 샘플, 3D GFP 형광 이미지, 반뇌 체적 분할 분석 및 강도 히트맵에서 얻은 ICV 주사된 마우스의 예시적인 뇌 이미지를 도시한 것이다.
도 27은 4개의 모든 ICV 주사된 반뇌의 강도 히트맵을 도시한 것이다. 전체 반뇌 체적을 계산하여 회색 영역으로 표시하였다. 계산된 "낮은" GFP 강도는 회색 영역으로 표시되어 있고; "높은" GFP 강도는 백색 영역으로 표시되어 있다.
도 28은 ICV 대 IP 투여 경로를 통해 AAV/Oligo001-GFP가 투여된 동물의 투명화된 뇌의 3D 단면광(lightsheet) GFP 형광 현미경 이미지를 도시한 것이다.
도 29a는 Olig2 또는 NeuN와 공동 표지된 GFP 양성 세포의 점수를 보여주는 대표적인 고배율 이미지를 도시한 것이다. 각 시야에서 총 GFP 세포의 점수를 매겼고, 동일한 필드 내에서 Olig2 및 NeuN 공동 표지화 백분율의 점수를 매겼다.
도 29b는 ICV ROA를 통해 AAV/Olig001-GFP가 제공된 동물의 뇌에서 SCWM 경로 세포 내 GFP와 Olig2의 공동 표지화에 대한 대표적인 이미지를 도시한 것으로, 이는 거의 100%의 희소돌기세포 지향성 및 뉴런 지향성(neurotropism)의 거의 완전한 부재를 보여준다.
도 29c는 백색질 내 희박한 Olig2 공동 표지화(화살표)가 있는, 대형 푸르키네(purkinje) 뉴런에서의 소뇌 GFP 전이유전자 발현의 대표적인 이미지를 도시한 것이다.
도 29d는 ICV ROA 뇌의 선조체 내 Olig2와 GFP의 공동 표지화의 대표적인 이미지를 도시한 것으로, 이는 소뇌 지향성과 대조를 보여준다.
도 29e는 BrdU 표지화 및 Olig2에 대한 처리 후 8주령의 nur7 및 연령 일치 야생형 나이브 마우스 뇌 내 백색질 경로의 대표적인 이미지를 도시한 것이다.
도29f는 2주령 및 8주령의 야생형 및 nur7 마우스 백색질 경로 내 BrdU 세포의 예시적인 수를 도시한 것이다. 군 당 평균 BrdU 양성 세포 +/- sem로 표시된다. 각 군에 대하여(각 연령의 유전자형), n=6.
도 29g는 ICV ROA를 통해 AAV/Olig001-GFP로 처리된 nur7 뇌의 피질하 백색질 내 BrdU/GFP 공동 표지된 세포의 대표적인 이미지를 도시한 것이다.
도 30a, 도 30b 및 도 30c는 생체분포 체적 분석을 도시한 것이다. (도 30a) ICV 및 IP 둘 모두에 대해 이미지화된 조직의 체적. (도 30b) 2가지 ROA에 대한 GFP 형광 광도의 평균 및 중앙값. (도 30c) ROA에 따라 저강도 및 고강도를 나타내는 GFP 양성 체적의 분율.
도 31a, 도 31b 및 도 31c는 약력학적 효과 평가에 대한 CLARITY 및 SWITCH 워크플로우를 도시한 것이다. (도 31a) 조직 투명화 및 표지화 접근법. 좌측에서 우측으로: 온전한 마우스 뇌, 투명화 전 우측 반뇌의 중앙 2 mm 절편, 수동 투명화 1일 후 및 수동 투명화 3일 후 동일한 조직, 및 이전에 표지된 단백질의 형광 신호(녹색: 핵, 적색: 미엘린 염기성 단백질(MBP))를 나타내는 3D 이미지. (도 31b) Nur7, WT 및 Olig1-ASPA 처리된 조직의 대표적인 2 mm 절편. 각 이미지의 적색 화살촉은 시상 영역을 나타냄. (도 31c) 수동 투명화 1일 후 조직 투명도.
도 32a, 도 32b 및 도 32c는 조직의 2D 영역 기반 세포 계수를 도시한 것이다. (도 32a) 유사한 해부학적 배향을 가진 3개의 모든 군의 3D 이미지에서 추출된 2D 단일 슬라이스. 적색 박스는 세포 계수가 수행된 시상 및 피질 내 영역을 표시함. (도 32b) (도 32a)의 적색 박스에서 확대된 이미지 데이터, 및 각각의 세포 분할. (도 32c) 평균 핵 밀도(분할 영역에 따라 정규화된 수).
도 33a, 도 33b, 도 33c, 도 33d, 도 33e, 도 33f, 도 33g, 도 33h 및 도 33i는 약력학적 치료 효과의 3D 체적 분석을 도시한 것이다. (도 33a) 2 mm 조직 슬라이스의 전체 3D 체적이 결정됨. (도 33b) 3D 체적 내에서 계산된 평균 형광 강도. (도 33c) 2000 초과의 형광 값으로 설정된 더 제한적인 임계값(좌측 패널) 또는 1000의 더 포괄적인 임계값(좌측 패널)을 통한 MBP 특징분석. (도 33d) 두 가지 경우 모두, Nur7에서의 MBP 결손이 관찰될 수 있음. Olig1-ASPA 군의 효과는 전체적인 값이 WT 수준에 접근하는 더 낮은 임계값에서 확인할 수 있음. (도 33e) 시상 영역에서의 영역 기반 3D 분석, 여기서 영역의 일부의 수동 분할은 노란색으로 표시됨. (도 33f) 핵(SYTO) 및 미엘린(MBP) 마커 둘 모두에 대한 이러한 영역 내 평균 형광. (도 33g) 피질의 일부에서의 영역 기반 분석, 여기서 수동 분할은 노란색으로 표시됨. (도 33h) 핵(SYTO) 및 미엘린(MBP) 마커 둘 모두에 대한 이러한 피질 영역 내 평균 형광. (도 33i) 3D 세포 집중도(100 um2 당 핵).
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태의 표현은, 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 하기 용어는 제시된 의미를 갖는다:
본원에 사용된 "약" 또는 "대략"이라는 용어는, 생물학적 활성의 양, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 길이, G 및 C 뉴클레오티드의 함량, 코돈 적응 지수(codon adaptation index), CpG 디뉴클레오티드의 수, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭하며, 달리 명시되지 않는 한, 문맥 상 달리 명백하거나, 이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우를 제외하고는, 명시된 양의 어느 한 방향으로의(더 크거나 더 작은 방향으로의) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 변화를 포함하는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "및/또는"이라는 용어는, 관련하여 열거된 항목 중 임의의 것 및 이러한 항목 중 하나 이상의 모든 조합뿐 아니라, 대안("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
본원에 사용된 "아데노연관바이러스" 및/또는 "AAV"라는 용어는, 선형 단일 가닥 DNA 게놈 및 이의 변이체를 갖는 파르보바이러스를 지칭한다. 상기 용어는, 달리 요구되는 경우를 제외하고는, 모든 하위유형과 자연 발생 및 재조합 형태를 포함한다. 야생형 게놈은 4681개 염기(문헌[Berns and Bohenzky (1987) Advances in Virus Research 32:243-307])를 포함하며, DNA 복제 기점 및 바이러스에 대한 패키징 신호로서 시스형으로 기능하는 각 말단에 있는 말단 반복 서열(예를 들어, 역 말단 반복부(ITR))을 포함한다. 게놈은, 각각, AAV 복제("AAV rep" 또는 "rep") 및 캡시드("AAV cap" 또는 "cap") 유전자로 알려진, 2개의 대형 오픈 리딩 프레임을 포함한다. AAV rep 및 cap은 본원에서 AAV "패키징 유전자"로도 지칭될 수 있다. 이러한 유전자는 바이러스 게놈의 복제 및 패키징에 관여하는 바이러스 단백질을 코딩한다.
야생형 AAV 바이러스에서, 3가지 캡시드 유전자 VP1, VP2 및 VP3은 단일 오픈 리딩 프레임 내에서 서로 중첩되고, 대체 스플라이싱은 VP1, VP2 및 VP3의 생산을 유도한다. (문헌[Grieger and Samulski (2005) J. Virol. 79(15):9933-9944]). 단일 P40 프로모터는, 각각, VP1, VP2, VP3에 대해 약 1:1:10의 비로 3가지 모든 캡시드 단백질이 발현되게 하며, 이는 AAV 캡시드 생산을 보완한다. 보다 구체적으로, VP1은 전장 단백질이고, VP2 및 VP3은 N-말단의 절단 증가로 인해 점점 더 짧아진다. 널리 알려진 예는 미국 특허 제7,906,111호에 기재된 AAV9의 캡시드로서, 여기서 VP1은 서열번호 123의 아미노산 잔기 1 내지 736을 포함하고, VP2는 서열번호 123의 아미노산 잔기 138 내지 736을 포함하고, VP3은 서열번호 123의 아미노산 잔기 203 내지 736을 포함한다. 본원에 사용된 "AAV Cap" 또는 "cap"이라는 용어는, AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3, 및 이의 변이체 및 유사체를 지칭한다.
AAV rep 유전자로부터 적어도 4가지 바이러스 단백질, 즉, Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40이 합성되며, 이들은 겉보기 분자량에 따라 명명된다. 본원에 사용된 "AAV rep" 또는 "rep"은, AAV 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및/또는 Rep 40뿐 아니라, 이의 변이체 및 유사체를 의미한다. 본원에 사용된 rep 및 cap은, 야생형 및 재조합(예를 들어, 변형된 키메라 등) rep 및 cap 유전자뿐 아니라, 이들이 인코딩하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, rep을 인코딩하는 핵산은 하나 초과의 AAV 혈청형으로부터의 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 예를 들어, rep을 인코딩하는 핵산은 AAV2 혈청형의 뉴클레오티드와 AA3 혈청형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다(문헌[Rabinowitz et al. (2002) J. Virology 76(2):791-801]).
본원에 사용된 "재조합 아데노연관바이러스 벡터", "rAAV" 및/또는 "rAAV 벡터"라는 용어는, AAV 기원이 아니거나 전적으로 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, AAV에 대해 이종성인 폴리뉴클레오티드)이 있고, 야생형 AAV 바이러스 게놈의 rep 및/또는 cap 유전자가 바이러스 게놈에서 제거된 벡터 게놈을 포함하는 AAV를 지칭한다. 표준 AAV의 rep 및/또는 cap 유전자가 제거되었거나 존재하지 않는 경우(및 플랭킹 ITR이 전형적으로, 비제한적으로, 캡시드가 AAV2가 아닌 AAV2 ITR과 같은 상이한 혈청형의 ITR에서 유래된 경우), 임의의 ITR 및 이들 사이의 임의의 핵산을 포함하는 AAV 내 핵산은 "벡터 게놈"으로 지칭된다. 따라서, rAAV 벡터라는 용어는 캡시드 및 이종 핵산, 즉, 자연에서 캡시드에 원래 존재하지 않으며 이하 "벡터 게놈"으로 지칭되는 핵산을 포함하는 rAAV 바이러스 입자를 포함한다. 따라서, "rAAV 벡터 게놈"(또는 "벡터 게놈")은 AAV 캡시드 내에 함유될 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없는 이종 폴리뉴클레오티드 서열(적어도 하나의 ITR, 반드시는 아니지만, 전형적으로, 원래 AAV에 존재하는 원래 핵산과 관련이 없는 ITR을 포함함)을 지칭한다. rAAV 벡터 게놈은 이중 가닥(dsAAV), 단일 가닥(ssAAV) 및/또는 자가 상보적(scAAV)일 수 있다.
본원에 사용된 "rAAV 벡터", "rAAV 바이러스 입자" 및/또는 "rAAV 벡터 입자"라는 용어는, (전형적으로 AAV의 모든 캡시드 단백질, 예를 들어 VP1, VP2 및 VP3, 또는 이의 변이체가 존재하지만) 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질로 구성되고, 원래 AAV 캡시드에 원래 존재하지 않는 이종 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈을 함유하는 AAV 캡시드를 지칭한다. 이러한 용어는, 캡시드가 rep 및 cap 유전자를 인코딩하는 바이러스 게놈을 함유하고, AAV 바이러스가 아데노바이러스 및/또는 단순헤르페스바이러스와 같은 헬퍼 바이러스, 및/또는 이로부터 필요한 헬퍼 유전자를 또한 포함하는 세포에 존재하는 경우 복제 가능하며, 재조합이 아닌 "AAV 바이러스 입자" 또는 "AAV 바이러스"와 구별되어야 한다. 따라서, rAAV 벡터 입자의 생산은 반드시 벡터 게놈이 캡시드 내 함유되어 있어 rAAV 벡터, rAAV 바이러스 입자 또는 rAAV 벡터 입자를 형성하는 것과 같은 재조합 DNA 기술을 사용한 재조합 벡터 게놈의 생산을 포함한다.
AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐 아니라, 역 말단 반복부(ITR), rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열(자연에 존재하는 것 및/또는 이의 돌연변이체 및 변이체 모두)은 당업계에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 GenBank와 같은 공개 데이터 베이스에서 확인할 수 있다. 예를 들어, GenBank 수탁번호 NC-002077(AAV-1), AF063497(AAV-1), NC-001401(AAV-2), AF043303(AAV-2), NC-001729(AAV-3), NC_001863(AAV-3B), NC-001829(AAV-4), U89790(AAV-4), NC-006152(AAV-5), AF513851(AAV-7), AF513852(AAV-8) 및 NC-006261(AAV-8)(이의 개시내용은 본원에 참조로 인용됨) 참조. 또한, 예를 들어 문헌[Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555]; 문헌[Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823]; 문헌[Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309]; 문헌[Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939]; 문헌[Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994]; 문헌[Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208]; 문헌[Shade et al. (1986) J. Virol. 58:921]; 문헌[Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854]; 문헌[Moris et al. (2004) Virology 33:375-383]; 국제 특허 출원 공개 WO 00/28061호, WO 99/61601호, WO 98/11244호; WO 2013/063379호, WO 2014/194132호, WO 2015/121501호; 및 미국 특허 제6,156,303호 및 제7,906,111호 참조.
본원에 사용된 "개선하다"라는 용어는, 대상의 질환, 장애 또는 병태, 또는 이의 증상, 또는 기저 세포 반응의 검출 가능하거나 측정 가능한 개선을 의미한다. 검출 가능하거나 측정 가능한 개선에는, 질환, 장애 또는 병태, 또는 이에 의해 유발되거나 이와 관련된 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 지속기간의 주관적 또는 객관적 감소, 저하, 저해, 억제, 제한 또는 제어, 질환, 장애 또는 병태의 증상의 개선, 또는 질환, 장애 또는 병태의 역전이 포함된다.
본원에 사용된 "관련이 있는"이라는 용어는, 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 하나의 존재, 수준 및/또는 형태와 상관관계가 있는 경우의 서로를 지칭한다. 예를 들어, 특정 엔티티(예를 들어, 폴리펩티드, 유전자 시그니처(genetic signature), 대사산물, 미생물 등)는, 이의 존재, 수준 및/또는 형태가 (예를 들어, 관련 집단에 걸쳐) 질환, 장애 또는 병태의 발병률 및/또는 이에 대한 감수성과 상관관계가 있는 경우, 특정 질환, 장애 또는 병태와 관련이 있는 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 엔티티는, 이들이 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 서로 물리적으로 근접해 있고/있거나 근접하게 유지되는 경우, 서로 물리적으로 "회합"되어 있다. 일부 구현예에서, 서로 물리적으로 회합된 둘 이상의 엔티티는 서로 공유결합으로 연결되어 있으며; 일부 구현예에서, 서로 물리적으로 회합된 둘 이상의 엔티티는 서로 공유결합으로 연결되어 있지 않지만, 예를 들어 수소 결합, 반데르발스 상호작용(van der Waals interaction), 소수성 상호작용, 자성 및 이들의 조합에 의해 비공유결합으로 회합되어 있다.
본원에 사용된 "시스-모티프" 또는 "시스-요소"라는 용어는, 게놈 서열의 말단 또는 그 부근에서 발견되고 복제 개시에 대해 인식되는 것과 같은 보존된 서열; 전사 개시, 스플라이싱 또는 종결에 사용될 가능성이 있는 내부 위치에 있는 잠재적 프로모터 또는 서열을 포함한다. 시스-모티프 또는 시스-요소는 이와 상호작용하는 서열과 동일한 핵산 분자 상에 존재한다. 이는 동일한 핵산 분자 상에 위치하지 않는 다른 서열과 "트랜스"로 작용하는 "트랜스-모티프" 서열과 구별되어야 한다.
본원에 사용된 "코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"이라는 용어는, 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하고, 적절한 조절 서열의 제어 하에 있는(이에 작동 가능하게 연결된) 경우 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드로 전사(DNA의 경우) 및 번역(mRNA의 경우)되는 서열을 나타내는 핵산 서열을 지칭한다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 5'(아미노) 말단의 개시 코돈 및 3'(카르복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은, 비제한적으로, 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA 유래의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 DNA 유래의 게놈 DNA 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "키메라"라는 용어는, Rabinowitz 등의 미국 특허 제6,491,907호에 기재된 바와 같은, 상이한 파르보바이러스, 바람직하게는 상이한 AAV 혈청형 유래의 캡시드 서열을 갖는 바이러스 캡시드를 지칭하며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 또한, 문헌[Rabinowitz et al. (2004) J. Virol. 78(9):4421-4432] 참조. 일부 구현예에서, 키메라 바이러스 캡시드는 하기 돌연변이를 갖는 AAV2 캡시드의 서열을 갖는 AAV2.5 캡시드이다: 263 Q → A; 265 삽입 T; 705 N → A; 708 V → A; 및 716 T → N. 이러한 캡시드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 WO 2006/066066호에 기재된 서열번호 15로 정의된다. 다른 바람직한 키메라 AAV 캡시드에는, 비제한적으로, WO 2010/093784호에 기재된 AAV2i8, WO 2014/144229호에 기재된 AAV2G9 및 AAV8G9, 및 AAV9.45(문헌[Pulicherla et al. (2011) Molecular Therapy 19(6):1070-1078]), WO 2103/029030호에 기재된 AAV-NP4, NP22, NP66, AAV-LK01 내지 AAV-LK019, WO 205/013313호에 기재된 RHM4-1 및 RHM15-1 내지 RHM5-6, WO 2007/120542호에 기재된 AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV-DJ/9가 포함된다.
본원에 사용된 "보존적 치환"이라는 용어는, 하나의 아미노산이 생물학적으로, 화학적으로 또는 구조적으로 유사한 잔기로 대체된 것을 지칭한다. 생물학적으로 유사하다는 것은, 치환이 생물학적 활성을 파괴하지 않는다는 것을 의미한다. 구조적으로 유사하다는 것은, 아미노산이 알라닌, 글리신 및 세린과 같이 유사한 길이의 측쇄를 갖거나, 유사한 크기를 갖는다는 것을 의미한다. 화학적 유사성은, 잔기들이 동일한 전하를 갖거나, 둘 모두 친수성 또는 소수성이라는 것을 의미한다. 특정 예에는, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 소수성 잔기의 또 다른 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또 다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 글루타민의 아스파라긴으로의 치환, 세린의 트레오닌으로의 치환 등이 포함된다. 보존적 치환의 특정 예에는, 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 소수성 잔기의 서로에 대한 치환, 극성 잔기의 또 다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등이 포함된다. 보존적 아미노산 치환에는, 전형적으로, 예를 들어 하기 기들 내에서의 치환이 포함된다: 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. "보존적 치환"은 또한 미치환된 모 아미노산 대신 치환된 아미노산을 사용하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 "플랭킹된"이라는 용어는, 다른 요소에 의해 플랭킹된 서열을 지칭하며, 서열에 대해 업스트림 및/또는 다운스트림에 있는, 즉, 5' 및/또는 3'에 있는 하나 이상의 플랭킹 요소의 존재를 나타낸다. "플랭킹된"이라는 용어는 서열들이 반드시 인접해있다는 것을 나타내려는 것은 아니다. 예를 들어, 전이유전자를 인코딩하는 핵산과 플랭킹 요소 사이에 개재 서열이 존재할 수 있다. 2개의 다른 요소(예를 들어, ITR)에 의해 "플랭킹된" 서열(예를 들어, 전이유전자)은, 하나의 요소가 서열의 5'에 위치하고, 다른 하나는 서열의 3'에 위치한다는 것을 나타내지만; 이들 사이에는 개재 서열이 존재할 수 있다.
본원에 사용된 "단편"이라는 용어는, 전체의 개별 부분을 포함하지만, 전체에서 발견되는 하나 이상의 모이어티가 결여된 구조를 갖는 물질 또는 엔티티를 지칭한다. 일부 구현예에서, 단편은 별개의 부분으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 단편은 전체에서 발견되는 특징적인 구조 요소 또는 모이어티를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 275개, 300개, 325개, 350개, 375개, 400개, 425개, 450개, 475개, 500개 또는 그 이상의 단량체 단위(예를 들어, 아미노산 잔기, 뉴클레오티드)를 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 사용된 "기능성"이라는 용어는, 해당 분자가 특징으로 하는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자를 지칭한다. 생물학적 분자는 2개의 관능기(즉, 이중기능성) 또는 다수의 관능기(즉, 다기능성)를 가질 수 있다.
본원에 사용된 "유전자"라는 용어는, 전사 및 번역된 후 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩할 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. "유전자 이동" 또는 "유전자 전달"은 외래 DNA를 숙주 세포 내에 안정적으로 삽입하는 방법 또는 시스템을 지칭한다. 이러한 방법은 비일체형으로 전달된 DNA의 일시적 발현, 전달된 레플리콘(예를 들어, 에피솜)의 염색체외 복제 및 발현, 및/또는 전달된 유전 물질의 숙주 세포의 게놈 DNA로의 통합을 유도할 수 있다.
본원에 사용된 "이종" 또는 "외인성" 핵산이라는 용어는, 핵산의 세포 내로의 벡터 매개 이동/전달을 위해 벡터(예를 들어, rAAV 벡터)에 삽입된 핵산을 지칭한다. 이종 핵산은 전형적으로 벡터(예를 들어, AAV) 핵산과 구별되며, 즉, 이종 핵산은 자연에 존재하는 AAV에서 발견되는 바이러스(예를 들어, AAV) 핵산에 대해 비천연(non-native)이다. 세포 내로 이동(예를 들어, 형질도입) 또는 전달되면, 벡터 내 함유된 이종 핵산이 발현될 수 있다(예를 들어, 적절한 경우 전사되고 번역됨). 대안적으로, 벡터 내 함유된 세포 내 이동(형질도입) 또는 전달된 이종 핵산은 발현될 필요가 없다. "이종"이라는 용어가 핵산에 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, "이종"이라는 수식어가 없는 경우에도 핵산에 대한 언급은 이종 핵산을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 이종 핵산은 ASPA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 카나반병의 치료에 사용되는 ASPA를 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산일 수 있다.
본원에 사용된 "상동성" 또는 "상동"이라는 용어는, 주어진 영역 또는 부분에 걸쳐 적어도 부분적으로 동일성을 공유하는 둘 이상의 참조 엔티티(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 2개의 펩티드 내 아미노산 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유되는 경우, 펩티드는 해당 위치에서 상동성이다. 특히, 상동성 펩티드는 변형되지 않은 또는 참조 펩티드와 관련된 활성 또는 기능을 보유할 것이고, 변형된 펩티드는 일반적으로 변형되지 않은 서열의 아미노산 서열과 "실질적으로 상동성"인 아미노산 서열을 가질 것이다. 폴리펩티드, 핵산 또는 이의 단편을 언급될 때, "실질적 상동성" 또는 "실질적 유사성"은, 또 다른 폴리펩티드, 핵산(또는 이의 상보적 가닥) 또는 이의 단편을 이용한 적절한 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬되는 경우, 서열의 적어도 약 95% 내지 99%에서 서열 동일성이 존재한다는 것을 의미한다. 2개의 서열 사이의 상동성(동일성) 정도는 컴퓨터 프로그램 또는 수학적 알고리즘을 사용하여 확인할 수 있다. 서열 상동성(또는 동일성) %를 계산하는 이러한 알고리즘은 일반적으로 비교 영역 또는 구역에 걸친 서열 갭(gap) 및 미스매치를 설명한다. 예시적인 프로그램 및 알고리즘은 하기에 제시되어 있다.
본원에 사용된 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이라는 용어는, 상호 교환적으로 사용되며, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭하고, 이러한 세포의 후손을 포함한다. 숙주 세포는 "트랜스펙션체(transfectant)", "형질전환체(transformant)", "형질전환된 세포" 및 "형질도입된 세포"를 포함하며, 이에는 1차 트랜스펙션된, 형질전환된 또는 형질도입된 세포, 및 계대 수에 관계없이 이로부터 유래된 자손이 포함된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 rAAV 벡터의 생산을 위한 패키징 세포이다.
본원에 사용된 "동일성" 또는 "~와 동일한"라는 용어는, 중합체 분자, 예를 들어 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적인 관련성을 지칭한다. 일부 구현예에서, 중합체 분자는 이의 서열들이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 동일한 경우 서로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다.
예를 들어, 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 동일성 %의 계산은 최적 비교를 위해 2개의 서열을 정렬하는 방식으로 수행될 수 있다(예를 들어, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 동일하지 않은 서열은 비교를 위해 무시될 수 있음). 특정 구현예에서, 비교를 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다. 이어서, 상응하는 위치의 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 위치가 제2 서열 내 상응하는 위치와 동일한 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 또는 아미노산)에 의해 점유되는 경우, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간의 동일성 %는 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며, 이때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 할 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한다. 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 %의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
동일성 또는 상동성 %를 결정하기 위해, 범세계 통신망 ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 입수 가능한 BLAST를 포함하는 컴퓨터 프로그램 및 방법을 사용하여 서열을 정렬할 수 있다. 또 다른 정렬 알고리즘은 Genetics Computing Group(GCG) 패키지(Madison, Wis., USA)에서 입수 가능한 FASTA이다. 정렬을 위한 다른 기술은 문헌[Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc.]에 기재되어 있다. 특히 관심있는 것은 서열 내에 갭을 허용하는 정렬 프로그램이다. Smith-Waterman은 서열 정렬에서 갭을 허용하는 알고리즘의 한 유형이다. 문헌[Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)] 참조. 또한, Needleman 및 Wunsch 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램을 이용하여 서열을 정렬할 수 있다. 문헌[J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)] 참조.
또한, 관심있는 것은 서열 동일성을 결정하기 위해 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(문헌[Advances in Applied Mathematics 2: 482-489(1981)])을 사용하는 BestFit 프로그램이다. 갭 생성 페널티는 일반적으로 1 내지 5, 통상적으로 2 내지 4 범위이며, 일부 구현예에서는 3일 것이다. 갭 확장 페널티는 일반적으로 약 0.01 내지 0.20 범위이며, 일부 예에서는 0.10일 것이다. 상기 프로그램에는 비교를 위해 입력되는 서열에 의해 결정되는 디폴트 매개변수가 있다. 바람직하게는, 서열 동일성은 상기 프로그램에 의해 결정된 디폴트 매개변수를 사용하여 결정된다. 이러한 프로그램 또한 Genetics Computing Group(GCG) 패키지(Madison, WI, USA)에서 입수 가능하다.
또 다른 관심 프로그램은 FastDB 알고리즘이다. FastDB는 문헌[Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc.]에 기재되어 있다. 하기 매개변수에 기반하여 FastDB에 의해 서열 동일성 %가 계산된다: 미스매치 페널티 1.00; 갭 페널티: 1.00; 캡 크기 페널티: 0.33; 및 결합 페널티: 30.0.
본원에 사용된 "증가시키다", "개선시키다" 또는 "감소시키다"라는 용어는, 본원에 기재된 치료의 개시 전 동일한 개체에서의 측정치, 또는 본원에 기재된 치료 부재 하의 대조군 개체(또는 복수의 대조군 개체들)에서의 측정치와 같은 기준선 측정치에 대해 비교된 값을 나타낸다. 일부 구현예에서, "대조군 개체"는 치료하고자 하는 개체와 동일한 형태의 질환 또는 손상으로 고통받는 개체이다.
본원에 사용된 "역 말단 반복부", "ITR", "말단 반복부" 및 "TR"이라는 용어는, AAV 게놈의 말단 또는 그 부근에 있으며, 대부분 상보적이고 대칭으로 정렬된 서열을 포함하는 회문구조(palindromic) 말단 반복 서열을 지칭한다. 이러한 ITR은 접혀져서 DNA 복제 개시 동안 프라이머와 같은 기능을 하는 T형 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 이는 또한 숙주 게놈으로의 바이러스 게놈 통합, 숙주 게놈으로부터의 구제(rescue); 및 성숙 비리온으로의 바이러스 핵산의 캡시드화에 필요하다. ITR은 벡터 게놈 복제 및 바이러스 입자로의 패키징을 위해 시스(cis)로 필요하다. "5' ITR"은 AAV 게놈의 5' 말단 및/또는 재조합 전이유전자에 대해 5'에 있는 ITR을 지칭한다. "3' ITR"은 AAV 게놈의 3' 말단 및/또는 재조합 전이유전자에 대해 3'에 있는 ITR을 지칭한다. 야생형 ITR의 길이는 대략 145 bp이다. 변형된 또는 재조합 ITR은 야생형 AAV ITR 서열의 단편 또는 일부를 포함할 수 있다. 당업자는, DNA 복제의 연속 회차 동안 ITR 서열이 5' ITR가 3' ITR가 되도록, 또는 그 반대가 되도록 교환될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 ITR은 벡터 게놈이 캡시드 내에 패키징되어 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터(본원에서 "rAAV 벡터 입자" 또는 "rAAV 바이러스 입자"로도 지칭됨)를 생성하도록 재조합 벡터 게놈의 5' 및/또는 3' 말단에 존재한다.
본원에 사용된 "단리된"이라는 용어는, 물질 또는 조성물이 1) 사람의 손으로 설계, 생산, 제조 및/또는 제작되고/되거나, 2) 초기에 생산될 때(자연에서 및/또는 실험 환경에서) 이와 회합되어 있었던 구성요소 중 적어도 하나로부터 분리된 것을 지칭한다. 일반적으로, 단리된 조성물은 자연에서 이와 통상적으로 회합되어 있는 하나 이상의 물질, 예를 들어 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 및/또는 세포막이 실질적으로 없다. "단리된"이라는 용어는, 사람이 만든 조합물, 예를 들어 재조합 핵산, 재조합 벡터 게놈(예를 들어, rAAV 벡터 게놈), 벡터 게놈을 패키징하는, 예를 들어 캡시드화하는 rAAV 벡터 입자(예를 들어, 비제한적으로, AAV/Olig001 캡시드를 포함하는 rAAV 벡터 입자와 같은 것) 및 약제학적 제형을 배제하지 않는다. "단리된"이라는 용어는 또한, 혼성체/키메라, 다량체/올리고머, 변형(예를 들어, 인산화, 글리코실화, 지질화), 변이체 또는 유도체화된 형태, 또는 사람이 만든 숙주 세포에서 발현되는 형태와 같은 조성물의 대안적인 물리적 형태를 배제하지 않는다.
단리된 물질 또는 조성물은 이와 초기에 회합되어 있었던 다른 구성요소의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 99% 초과로 순수하다. 본원에 사용된 바와 같이, 물질에 다른 구성요소가 실질적으로 없는 경우, 물질은 "순수한" 것이다. 일부 구현예에서, 당업자가 이해하는 바와 같이, 물질은 예를 들어 하나 이상의 담체 또는 부형제(예를 들어, 완충제, 용매, 물 등)와 같은 특정한 다른 구성요소와 조합된 후에도 여전히 "단리된" 또는 심지어 "순수한" 것으로 간주될 수 있으며; 이러한 구현예에서, 물질의 단리 또는 순도 %는 이러한 담체 또는 부형제를 포함시키지 않은 상태로 계산된다.
본원에 사용된 "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는, 상호 교환적으로, 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 단량체성 뉴클레오티드로 구성되거나 이를 포함하는 임의의 분자를 지칭한다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 본원에 제시되어 있다. 본 개시내용의 핵산 서열(즉, 폴리뉴클레오티드)은 데옥시리보핵산(DNA) 분자 또는 리보핵산(RNA) 분자일 수 있으며, 이는 이중 가닥 분자, 단일 가닥 분자, 소형 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA, 소형 또는 짧은 간섭 RNA(siRNA), 트랜스-스플라이싱 RNA, 안티센스 RNA, 메신저 RNA, 전달 RNA, 리보솜 RNA와 같은 핵산의 모든 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 DNA 분자인 경우, 해당 분자는 유전자, cDNA, 안티센스 분자 또는 전술한 분자 중 임의의 것의 단편일 수 있다. 뉴클레오티드는 본원에서 단일 문자 코드로 표시된다: 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 이노신(I) 및 우라실(U). 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 변형되거나 인공적일 수 있다. 뉴클레오티드 서열에는 펩티드 핵산(PNA), 모르폴리노 및 잠금 핵산(LNA)뿐 아니라, 글리콜 핵산(GNA) 및 트레오스 핵산(TNA)이 포함된다. 이러한 서열은 각각 분자의 백본에 대한 변화에 의해 자연 발생 DNA 또는 RNA와 구별된다. 또한, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 다른 데옥시뉴클레오티드 유사체에는, 본 개시내용의 뉴클레오티드 서열에 사용될 수 있는 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, N3'-P5'-포스포르아미데이트, 및 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트 및 이의 2'-O-알릴 유사체 및 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트가 포함된다.
본원에 사용된 "핵산 구조체"라는 용어는, 재조합 DNA 기술의 사용에 의해 생성된 비자연 발생 핵산 분자(예를 들어, 재조합 핵산)를 지칭한다. 핵산 구조체는 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합되고 배열된 핵산 서열의 단편을 함유하도록 변형된 단일 또는 이중 가닥의 핵산 분자이다. 핵산 구조체는 "벡터"(예를 들어, 플라스미드, rAAV 벡터 게놈, 발현 벡터 등), 즉, 외인성으로 생성된 DNA를 숙주 세포로 전달하도록 설계된 핵산 분자일 수 있다.
본원에 사용된 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, 기능적 관계에 있는 핵산 서열(또는 폴리펩티드) 요소의 연결을 지칭한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이게 될 때, 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터 또는 다른 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서)은 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 핵산 서열이 인접하게 연결되어 있음을 의미한다. 일부 구현예에서, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 핵산 서열이 인접하게 연결되어 있다는 것을 의미하는 것이 아니라, 오히려 연결된 핵산 서열들 사이에 개재 서열이 존재한다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용 가능한" 및 "생리학적으로 허용 가능한"이라는 용어는, 하나 이상의 투여 경로, 생체내 전달 또는 접촉에 적합한 생물학적으로 허용 가능한 제형, 가스, 액체 또는 고체, 또는 이들의 혼합물을 지칭한다.
본원에 사용된 "폴리펩티드", "단백질", "펩티드" 또는 "핵산 서열에 의해 인코딩된"(즉, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된)이라는 용어는, 자연 발생 단백질과 같은 전장 천연 서열뿐 아니라, 기능적 하위서열, 변형된 형태 또는 서열 변이체(단, 하위서열, 변형된 형태 또는 변이체가 천연 전장 단백질의 기능을 어느 정도 보유하는 경우)를 지칭한다. 본 개시내용의 방법 및 용도에서, 핵산 서열에 의해 인코딩되는 이러한 폴리펩티드, 단백질 및 펩티드는 유전자 요법으로 치료받은 대상에서 결함이 있거나, 발현이 불충분하거나 결핍이 있는 내인성 단백질과 동일할 필요는 없을 수 있다.
본원에 사용된 "예방하다" 또는 "예방"이라는 용어는, 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 카나반병)의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발병 지연, 및/또는 빈도 및/또는 중증도의 감소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 예방은, 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발병, 빈도 및/또는 강도의 통계적으로 유의한 감소가 질환, 장애 또는 병태에 민감한 집단에서 발견되는 경우, 작용제가 특정 질환, 장애 또는 병태를 "예방"하는 것으로 간주되도록 집단 기반으로 평가된다. 예방은, 질환, 장애 또는 병태의 발병이 사전 정의된 기간 동안 지연된 경우 완료된 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 "재조합"이라는 용어는, (예를 들어, 그 안에 포함된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련된) 클로닝, 제한 또는 결찰 단계, 및/또는 자연에서 발견되는 산물과 구별되는 구조체가 생성되는 다른 절차의 다양한 조합의 산물인 벡터, 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 재조합 핵산), 폴리펩티드 또는 세포를 지칭한다. 재조합 바이러스 또는 벡터(예를 들어, rAAV 벡터)는 재조합 핵산(예를 들어, 전이유전자와 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어 ASPA를 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산과 CBh 프로모터를 포함하는 핵산)을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다. 상기 용어는, 각각, 원래 폴리뉴클레오티드 구조체의 복제물 및 원래 바이러스 구조체의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 유기체, 예를 들어 포유동물(예를 들어 인간, 비인간 포유동물, 비인간 영장류, 영장류, 실험실 동물, 마우스, 래트, 햄스터, 저빌, 고양이, 개)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상은 nur7 마우스이다. 일부 구현예에서, 인간 대상은 성인, 청소년 또는 소아 대상이다. 일부 구현예에서, 대상은 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 본원에 제공된 바와 같이 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있는 대상이다. 일부 구현예에서, 대상은 아스파르토아실라아제 활성의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 카나반병을 앓고 있는 대상이다. 일부 구현예에서, 대상은 질환, 장애 또는 병태에 민감한 대상이다. 일부 구현예에서, 민감한 대상은 질환, 장애 또는 병태가 발병하기 쉽고/쉽거나 (참조 대상 또는 집단에서 발견된 평균 위험과 비교하여) 질환, 장애 또는 병태에 대한 증가된 발병 위험도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상은 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 구현예에서, 대상은 질환, 장애 또는 병태의 특정한 증상(예를 들어, 질환의 임상적 징후) 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상은 질환, 장애 또는 병태의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 대상은 인간 환자이다. 일부 구현예에서, 대상은 진단 및/또는 요법(예를 들어, 카나반병에 대한 유전자 요법)이 투여되고/되거나 투여된 적이 있는 개체이다. 일부 구현예에서, 대상은 카나반병을 앓고 있는 인간 환자이다.
본원에 사용된 "실질적으로"라는 용어는, 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 나타낸다. 당업자는, 생물학적 및 화학적 현상이 완성되고/되거나, 완전하게 진행되거나 절대적인 결과를 달성하는 경우가 거의 없다는 것을 이해할 것이다. 따라서, "실질적으로"라는 용어는, 다수의 생물학적 및 화학적 현상에서 고유한 완전성의 잠재적 결여를 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 "증상이 감소된" 또는 "증상을 감소시키다"라는 용어는, 특정 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상이 규모(예를 들어, 강도, 중증도 등) 및/또는 빈도의 측면에서 감소되는 경우를 지칭한다. 명확성을 위해, 특정 증상의 발병 지연은 해당 증상의 빈도를 감소시키는 한 가지 형태로 간주된다.
본원에 사용된 "치료용 폴리펩티드"라는 용어는, 표적 세포(예를 들어, 단리된 세포) 또는 유기체(예를 들어, 대상)에서 단백질의 부재 또는 결함으로 인한 증상을 완화시키거나 감소시킬 수 있는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질(예를 들어, 효소, 구조 단백질, 막관통 단백질, 수송 단백질)을 지칭한다. 전이유전자에 의해 인코딩되는 치료용 폴리펩티드 또는 단백질은, 예를 들어 유전자 결함을 교정하고, 발현 또는 기능과 관련된 유전자의 결핍을 교정하기 위해 대상에게 유익을 부여하는 것이다. 유사하게, "치료용 전이유전자"는 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는 전이유전자이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에서 발현되는 치료용 폴리펩티드는 전이유전자(즉, 숙주 세포에 도입된 외인성 핵산)로부터 발현된 효소이다. 일부 구현예에서, 치료용 폴리펩티드는 대뇌 피질 세포(예를 들어, 희소돌기아교세포)에 형질도입된 치료용 전이유전자로부터 발현된 ASPA 단백질이다.
본원에 사용된 "치료적 유효량"이라는 용어는, 투여되어 목적하는 치료 효과를 생성하는 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 용어는, 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 치료적 투여 요법에 따라 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있거나 이에 민감한 집단에 투여될 때 충분한 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발병률 및/또는 중증도를 감소시키고/시키거나, 이의 발병을 지연시키는 양이다. 당업자는, "치료적 유효량"이라는 용어가 실제로 특정 개체에서 달성되는 성공적인 치료를 필요로 하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 치료적 유효량은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때, 상당한 수의 대상에서 특정한 목적하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다.
본원에 사용된 "전이유전자"라는 용어는, 숙주 세포, 표적 세포 또는 유기체(예를 들어, 대상)에의 전달 및/또는 이들에서의 발현을 위한 임의의 이종 폴리뉴클레오티드를 의미하는 데 사용된다. 이러한 "전이유전자"는 벡터(예를 들어, rAAV 벡터)를 사용하여 숙주 세포, 표적 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 전이유전자는 프로모터와 같은 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 당업자는, 발현 제어 서열이 숙주 세포, 표적 세포 또는 유기체에서 전이유전자의 발현을 촉진시키는 능력에 기반하여 선택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 전이유전자는 자연에서 전이유전자와 관련이 있는 내인성 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있지만, 보다 전형적으로, 전이유전자는 자연에서 전이유전자와 관련이 없는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 전이유전자의 예는 치료용 폴리펩티드, 예를 들어 ASPA 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이며, 예시적인 프로모터는 자연에서 ASPA를 인코딩하는 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되지 않은 프로모터이다. 이러한 비내인성 프로모터는 당업자에게 알려진 다수의 것들 중에서 CBh 프로모터를 포함할 수 있다.
관심 핵산은 트랜스펙션 및 형질도입을 포함하는 당업계에 널리 알려진 다양한 기술을 통해 숙주 세포에 도입될 수 있다.
"트랜스펙션"은 일반적으로 바이러스 벡터의 사용 없이 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 기술로 공지되어 있다. 본원에 사용된 "트랜스펙션"이라는 용어는, 바이러스 벡터의 사용 없이 재조합 핵산(예를 들어, 발현 플라스미드)를 세포(예를 들어, 숙주 세포) 내로 전달하는 것을 지칭한다. 재조합 핵산이 도입된 세포는 "트랜스펙션된 세포"로 지칭된다. 트랜스펙션된 세포는 재조합 AAV 벡터의 생산을 위한 발현 플라스미드/벡터를 포함하는 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포, Pro10 세포, HEK293 세포)일 수 있다. 일부 구현예에서, 트랜스펙션된 세포(예를 들어, 패킹 세포)는 전이유전자(예를 들어, ASPA 전이유전자)를 포함하는 플라스미드, AAV rep 유전자와 AAV cap 유전자를 포함하는 플라스미드 및 헬퍼 유전자를 포함하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 다수의 트랜스펙션 기술이 당업계에 알려져 있으며, 이에는, 비제한적으로, 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 양이온성 또는 음이온성 리포솜, 및 핵 국소화 신호와 조합된 리포솜이 포함된다.
본원에 사용된 "형질도입"이라는 용어는, 바이러스 벡터(예를 들어, rAAV 벡터)에 의해 핵산(예를 들어, 벡터 게놈)을 세포(예를 들어, 비제한적으로, 희소돌기아교세포를 포함하는 표적 세포)로 전달하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 카나반병에 대한 유전자 요법은 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈을 희소돌기아교세포로 형질도입하는 것을 포함한다. 바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 전이유전자가 도입된 세포는 "형질도입된 세포"로 지칭된다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포는 단리된 세포이며, 형질도입은 생체외에서 일어난다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포는 유기체(예를 들어, 대상) 내에 있는 세포이며, 형질도입은 생체내에서 일어난다. 형질도입된 세포는 유기체의 표적 세포가 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 전이유전자, 예를 들어 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)를 발현하도록 재조합 AAV 벡터에 의해 형질도입된 유기체의 표적 세포일 수 있다.
형질도입될 수 있는 세포에는, 임의의 조직 또는 기관 유형, 또는 임의의 기원(예를 들어, 중배엽, 외배엽 또는 내배엽)의 세포가 포함된다. 세포의 비제한적인 예에는, 간(예를 들어, 간세포, 동모양 내피 세포(sinusoidal endothelial cell)), 췌장(예를 들어, 베타 섬 세포, 외분비), 폐, 중추 또는 말초 신경계, 예컨대 뇌(예를 들어, 신경 또는 뇌실막 세포, 희소돌기아교세포) 또는 척추, 신장, 눈(예를 들어, 망막), 비장, 피부, 흉선, 고환, 폐, 횡경막, 심장(cardiac), 근육 또는 요근, 또는 장(예를 들어, 내분비), 지방 조직(백색, 갈색 또는 베이지색), 근육(예를 들어, 섬유아세포, 근세포), 활막세포, 연골세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, 침샘 세포, 내이 신경 세포 또는 조혈(예를 들어, 혈액 또는 림프) 세포가 포함된다. 추가의 예에는, 간(예를 들어, 간세포, 동모양 내피 세포), 췌장(예를 들어, 베타 섬 세포, 외분비 세포), 폐, 중추 또는 말초 신경계, 예컨대 뇌(예를 들어, 신경 또는 뇌실막 세포, 희소돌기아교세포) 또는 척추, 신장, 눈(예를 들어, 망막), 비장, 피부, 흉선, 고환, 폐, 횡경막, 심장, 근육 또는 요근, 또는 장(예를 들어, 내분비), 지방 조직(백색, 갈색 또는 베이지색), 근육(예를 들어, 섬유아세포, 근세포), 활막세포, 연골세포, 파골세포, 상피 세포, 내피 세포, 침샘 세포, 내이 신경 세포 또는 조혈(예를 들어, 혈액 또는 림프) 세포로 발달하거나 분화하는 만능성 또는 다능성 전구 세포와 같은 줄기 세포가 포함된다.
일부 구현예에서, 조직 또는 기관(예를 들어, 뇌)의 특정 영역 내에 존재하는 세포는 조직 또는 기관에 투여되는 rAAV 벡터(예를 들어, ASPA 전이유전자를 포함하는 rAAV)에 의해 형질도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 뇌 세포는 ASPA 전이유전자를 포함하는 rAAV로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 뇌의 피질 세포는 ASPA 전이유전자를 포함하는 rAAV로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 뇌의 선조체 세포는 ASPA 전이유전자를 포함하는 rAAV로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 뇌의 피질하 백색질 세포는 ASPA 전이유전자를 포함하는 rAAV로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 뇌의 소뇌 세포는 ASPA 전이유전자를 포함하는 rAAV로 형질도입된다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 또는 치료라는 용어는, 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 특징 및/또는 원인의 발병을 부분적으로 또는 완전히 완화, 개선, 경감, 저해, 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나, 이 발병률을 감소시키는 요법의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 "벡터"라는 용어는, 핵산(예를 들어, 재조합 핵산)의 삽입 또는 혼입에 의해 조작될 수 있는 플라스미드, 바이러스(예를 들어, rAAV), 코스미드 또는 다른 비히클을 지칭한다. 벡터는, 예를 들어 유전자 조작(예를 들어, 벡터 클로닝), 세포 내로의 핵산의 도입/전달, 세포 내 삽입된 핵산의 전사 또는 번역을 포함하는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 핵산 서열은 적어도 세포 내 증식을 위한 복제 기점을 함유한다. 일부 구현예에서, 벡터 핵산은 이종 핵산 서열, 발현 제어 요소(들)(예를 들어, 프로모터, 인핸서), 선별 마커(예를 들어, 항생제 내성), 폴리아데노신(polyA) 서열 및/또는 ITR을 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에 전달될 때, 핵산 서열은 증식된다. 일부 구현예에서, 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달될 때, 세포는 이종 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에 전달될 때, 핵산 서열 또는 핵산 서열의 일부는 캡시드 내에 패키징된다. 숙주 세포는 단리된 세포 또는 숙주 유기체 내 세포일 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 전이유전자)에 더하여, 추가의 서열(예를 들어, 조절 서열)이 동일한 벡터 내에(즉, 유전자에 대해 시스로) 존재할 수 있고, 유전자를 플랭킹할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 서열은 유전자의 발현을 조절하기 위해 트랜스(trans)로 작용하는 별개의(예를 들어, 제2) 벡터 상에 존재할 수 있다. 플라스미드 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "벡터 게놈"이라는 용어는, rAAV 벡터를 형성하기 위해 패키징되거나 캡시드화되는 재조합 핵산 서열을 지칭한다. 전형적으로, 벡터 게놈은 이종 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 전이유전자, 조절 요소, 캡시드에 원래 존재하지 않는 ITR을 포함한다. 재조합 플라스미드가 재조합 벡터(예를 들어, rAAV 벡터)를 구성하거나 제조하는 데 사용되는 경우, 벡터 게놈은 전체 플라스미드가 아니라, 바이러스 벡터에 의해 전달되도록 의도된 서열만을 포함한다. 재조합 플라스미드의 이러한 비벡터 게놈 부분은, 전형적으로 재조합 바이러스 벡터 생산의 증식에 필요하지만, 그 자체가 rAAV 벡터 내로 패키징되거나 캡시드화되지 않는 과정인 플라스미드의 클로닝, 선별 및 증폭에 중요한 "플라스미드 백본"으로 지칭된다.
본원에 사용된 "바이러스 벡터"라는 용어는, 일반적으로 핵산 전달 비히클로서 기능하고, 바이러스 입자(즉, 캡시드) 내 패키징된 벡터 게놈(예를 들어, AAV rep 및 cap를 인코딩하는 핵산 대신 전이유전자를 포함함)을 포함하고, 예를 들어 AAV 혈청형 및 변이체(예를 들어, rAAV 벡터)를 포함하는 렌티바이러스 및 파르보바이러스를 포함하는 바이러스 입자를 지칭한다. 재조합 바이러스 벡터는 rep 및/또는 cap 유전자를 포함하는 벡터 게놈을 포함하지 않는다.
본 개시내용은 변형된 ASPA 코딩 서열을 포함하는 변형된 핵산, 및 유전자 요법 약제학적 조성물에서의 이의 용도를 제공한다. 본원에 사용된 "변형된"은, 자연에 존재하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이 변경된 것으로, 하나의 구현예에서, 변형된 핵산 서열이 다른 동일한 세포에서 변형되지 않은, 즉, 자연 발생(유전자의 돌연변이 형태 포함) 핵산 서열로부터의 단백질 발현 수준과 비교하여 세포에서 단백질의 더 높은 발현 수준을 유도하도록 변경된 것을 의미한다. 본 개시내용은 또한 변형된 ASPA 코딩 서열을 서열의 일부로 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 재조합 핵산을 제공한다. 나아가, 본 개시내용은 변형된 ASPA 코딩 서열을 포함하는 rAAV 벡터와 같은 패키징된 유전자 전달 비히클을 제공한다. 본 개시내용은 또한 세포에서 변형된 ASPA 코딩 서열의 전달, 및 바람직하게는 발현 방법을 포함한다. 본 개시내용은 또한 변형된 ASPA 코딩 서열이, 예를 들어 벡터의 구성요소로서 및/또는 바이러스 유전자 전달 비히클(예를 들어, rAAV 벡터)의 구성요소로서 패키징되어 대상에게 투여되는 유전자 요법 방법을 제공한다. 치료는, 예를 들어 대상에서 ASPA의 수준을 증가시키거나 대상에서 ASPA 결핍을 치료하기 위해 수행될 수 있다. 본 개시내용의 이러한 양태는 각각 뒤이은 섹션에서 추가로 논의된다.
AAV 및 rAAV 벡터
AAV
상기 논의된 바와 같이, "아데노연관바이러스" 및/또는 "AAV"라는 용어는, 선형 단일 가닥 DNA 게놈 및 이의 변이체를 갖는 파르보바이러스를 지칭한다. 상기 용어는, 달리 요구되는 경우를 제외하고는, 모든 하위유형과 자연 발생 및 재조합 형태를 포함한다. AAV를 포함하는 파르보바이러스는, 세포에 침투하여 핵산(예를 들어, 전이유전자)을 핵 내에 도입할 수 있기 때문에 유전자 요법 벡터로서 유용하다. 일부 구현예에서, 도입된 핵산(예를 들어, rAAV 벡터 게놈)은 형질도입된 세포의 핵에서 에피솜으로 유지되는 원형 콘카테머(concatemer)를 형성한다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 숙주 세포 게놈의 특정한 부위, 예를 들어 인간 염색체 19번 상의 위치에 삽입된다. 무작위 통합과 대조적으로 부위 특이적 통합은 예측 가능한 장기 발현 프로파일을 유도할 가능성이 있는 것으로 여겨진다. 인간 게놈으로의 AAV의 삽입 부위는 AAVS1로 지칭된다. 세포에 도입되면, 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 세포에 의해 발현될 수 있다. AAV는 인간에서 임의의 병원성 질환과 관련이 없기 때문에, AAV에 의해 전달되는 핵산은 인간 대상에서 질환, 장애 및/또는 병태의 치료를 위한 치료용 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있다.
지금까지 인간에서 확인된 적어도 15가지 야생형 혈청형(즉, AAV1 내지 AAV15)을 포함하여 AAV의 다수의 혈청형이 자연에 존재한다. 자연 발생 및 변이 혈청형은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 단백질 캡시드를 갖는 것으로 구별된다. AAV 유형 1(AAV1), AAV 유형 2(AAV2), AAV 유형 3(AAV3)(AAV 유형 3A(AAV3A) 및 AAV 유형 3B(AAV3B) 포함), AAV 유형 4(AAV4), AAV 유형 5(AAV5), AAV 유형 6(AAV6), AAV 유형 7(AAV7), AAV 유형 8(AAV8), AAV 유형 9(AAV9), AAV 유형 10(AAV10), AAV 유형 12(AAV12), AAVrh10, AAVrh74(WO 2016/210170호 참조), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비영장류 AAV 및 양 AAV, 및 재조합적으로 생성된 변이체(예를 들어, 삽입, 결실 및 치환이 있는 캡시드 변이체 등), 예컨대 특히 AAV 유형 2i8(AAV2i8), NP4, NP22, NP66, DJ, DJ/8, DJ/9, LK3, RHM4-1로 지칭되는 변이체. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비영장류 AAV"는 비영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하고, "소 AAV"는 소 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하는 식이다. 혈청형 구별은 또 다른 AAV와 비교하여 하나의 AAV에 대한 항체 간 교차 반응성의 결여에 기반하여 결정된다. 이러한 교차 반응성 차이는 통상적으로 캡시드 단백질 서열 및 항원 결정인자의 차이로 인한 것이다(예를 들어, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이로 인함). 하지만, 일부 자연 발생 AAV 또는 사람이 만든 AAV 돌연변이체(예를 들어, 재조합 AAV)는 현재 알려진 임의의 혈청형과 혈청학적으로 차이를 나타내지 않을 수 있다. 따라서, 이러한 바이러스는 상응하는 유형의 하위그룹, 또는 보다 간단히 변이형 AAV로 간주될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 "혈청형"이라는 용어는, 혈청학적으로 구별되는 바이러스, 예를 들어 AAV뿐 아니라, 혈청학적으로 구별되지 않지만, 주어진 혈청형의 하위그룹 또는 변이체 내에 속할 수 있는 바이러스, 예를 들어 AAV를 모두 지칭한다.
알려진 AAV 혈청형의 캡시드의 아미노산 서열의 포괄적인 목록 및 정렬은 문헌[Marsic et al. (2014) Molecular Therapy 22(11):1900-1909], 특히 보충된 도 1에 제공되어 있다.
AAV의 다양한 혈청형의 게놈 서열뿐 아니라, 천연 말단 반복부(ITR), rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열은 당업계에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 GenBank와 같은 공개 데이터 베이스에서 확인할 수 있다. 예를 들어, GenBank 수탁번호 NC_002077(AAV1), AF063497(AAV1), NC_001401(AAV2), AF043303(AAV2), NC_001729(AAV3), NC_001863(AAV3B), NC_001829(AAV4), U89790(AAV4), NC_006152(AAV5), NC_001862(AAV6), AF513851(AAV7), AF513852(AAV8) 및 NC_006261(AAV8) 참조(이의 개시내용은 본원에 참조로 인용됨). 또한, 예를 들어 문헌[Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555]; 문헌[Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823]; 문헌[Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309]; 문헌[Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939]; 문헌[Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994]; 문헌[Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208]; 문헌[Shade et al. (1986) J. Virol. 58:921]; 문헌[Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854]; 문헌[Moris et al. (2004) Virology 33:375-383]; 국제 특허 출원 공개 WO 00/28061호, WO 99/61601호, WO 98/11244호; WO 2013/063379호; WO 2014/194132호, WO 2015/121501호; 및 미국 특허 제6,156,303호 및 미국 특허 제7,906,111호 참조. 예시의 목적으로만, 야생형 AAV2는 중첩 서열이 있는 3가지 단백질(VP1, VP2 및 VP3; 총 60가지 캡시드 단백질이 AAV 캡시드를 구성함)로 구성된 AAV의 소형(20 nm 내지 25 nm) 정이십면체 바이러스 캡시드를 포함한다. 단백질 VP1(735 aa; Genbank 수탁번호 AAC03780), VP2(598 aa; Genbank 수탁번호 AAC03778) 및 VP3(533 aa; Genbank 수탁번호 AAC03779)은 캡시드에 1:1:10 비로 존재한다. 즉, AAV의 경우, VP1은 전장 단백질이고, VP2 및 VP3은 VP1에 비해 N-말단의 절단이 증가하는 VP1의 점진적으로 더 짧은 버전이다.
재조합 AAV
상기 논의된 바와 같이, "재조합 아데노연관바이러스" 또는 "rAAV"는 내인성 바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 비천연 서열로 대체함에 따라 야생형 AAV와 구별된다. 바이러스 내 비천연 서열의 혼입은 바이러스 벡터를 "재조합" 벡터, 따라서 "rAAV 벡터"로 정의한다. rAAV 벡터는 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, ASPA 폴리펩티드)를 인코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 재조합 벡터 서열은 AAV 캡시드 내에 캡시드화되거나 패키징될 수 있으며, "rAAV 벡터", "rAAV 벡터 입자", "rAAV 바이러스 입자" 또는 간단히 "rAAV"로 지칭될 수 있다.
rAAV 벡터의 생산을 위해, VP1:VP2:VP3의 목적하는 비는 약 1:1:1 내지 약 1:1:100 범위, 바람직하게는 약 1:1:2 내지 약 1:1:50 범위, 더욱 바람직하게는 약 1:1:5 내지 약 1:1:20 범위이다. VP1:VP2의 목적하는 비는 1:1이지만, VP1:VP2의 비 범위는 1:50 내지 50:1로 달라질 수 있다.
본 개시내용은 AAV 기원이 아닌 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, AAV에 대해 이종성인 폴리뉴클레오티드)을 포함하는 rAAV 벡터를 제공한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나, 때때로 2개의 AAV 말단 반복 서열(예를 들어, 역 말단 반복부(ITR))로 플랭킹될 수 있다. 본원에서 "벡터 게놈"으로도 지칭되는 ITR이 플랭킹된 이종 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 관심 폴리펩티드 또는 관심 유전자("GOI"), 예컨대 치료적 치료를 위한 표적(예를 들어, 카나반병의 치료를 위한 ASPA를 인코딩하는 핵산)을 인코딩한다. 대상(예를 들어, 환자)에의 rAAV 벡터의 전달 또는 투여는 대상에게 인코딩된 단백질 및 펩티드를 제공한다. 따라서, rAAV 벡터는, 예를 들어 다양한 질환, 장애 및 병태를 치료하기 위한 발현을 위해 이종 폴리뉴클레오티드를 이동/전달하는 데 사용될 수 있다.
rAAV 벡터 게놈은 일반적으로 바이러스 rep 및 cap 유전자를 대체한 이종 핵산 서열에 대해 시스로 145개 염기 ITR을 보유한다. 이러한 ITR은 재조합 AAV 벡터를 생산하는 데 필요하지만; 부분 또는 완전 합성 서열을 포함하는 변형된 AAV ITR 및 비AAV 말단 반복부도 이러한 목적에 적합할 수 있다. ITR은 헤어핀 구조를 형성하고, 예를 들어 감염 후 상보적 DNA 가닥의 숙주 세포 매개 합성을 위한 프라이머로서 작용하는 기능을 한다. ITR은 또한 바이러스 패키징, 통합 등에서 역할을 한다. ITR은 AAV 게놈 복제 및 rAAV 벡터로의 패키징을 위해 시스로 필요한 유일한 AAV 바이러스 요소이다. rAAV 벡터 게놈은 일반적으로 이종 서열(예를 들어, 관심 유전자를 인코딩하는 전이유전자, 또는 비제한적으로, 안티센스 및 siRNA, CRISPR 분자를 포함하는 관심 핵산 서열)을 포함하는 벡터 게놈의 5' 및 3' 말단에 있는 2개의 ITR을 선택적으로 포함한다. 5' 및 3' ITR은 모두 동일한 서열을 포함할 수 있거나, 각각 상이한 서열을 포함할 수 있다. AAV ITR은, 비제한적으로, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11을 포함하는 임의의 AAV 유래, 또는 임의의 다른 AAV 유래의 것일 수 있다.
본 개시내용의 rAAV 벡터는 캡시드의 혈청형(예를 들어, AAV8, Olig001)과 상이한 AAV 혈청형(예를 들어, 야생형 AAV2, 이의 단편 또는 변이체)의 ITR을 포함할 수 있다. 하나의 혈청형의 적어도 하나의 ITR을 포함하지만, 상이한 혈청형의 캡시드를 포함하는 이러한 rAAV 벡터는 혼성 바이러스 벡터로 지칭될 수 있다(미국 특허 제7,172,893호 참조). AAV ITR은 전체 야생형 ITR 서열을 포함할 수 있거나, 이의 변이체, 단편 또는 변형일 수 있지만, 기능성을 유지할 것이다.
일부 구현예에서, 이종 폴리펩티드는 벡터 게놈의 좌측 및 우측 말단(즉, 각각, 5' 및 3' 말단)에 위치한 ITR(예를 들어, AAV2 유래의 ITR이지만, 임의의 야생형 AAV 혈청형 또는 이의 변이체 유래의 ITR을 포함할 수 있음)을 포함한다. 일부 구현예에서, 좌측(예를 들어, 5') ITR은 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 좌측(예를 들어, 5') ITR은 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 우측(예를 들어, 3') ITR은 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 우측(예를 들어, 3') ITR은 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 각각의 ITR은 시스로 존재하지만, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산 및 조절 요소를 포함하는 재조합 핵산과 같은 가변 길이 핵산 서열에 의해 서로, 또는 벡터 게놈 내 다른 요소와 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV2 ITR 또는 이의 변이체이며, ASPA 전이유전자를 플랭킹한다. 일부 구현예에서, rAAV은 AAV2 ITR(예를 들어, 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19에 제시된 서열을 갖는 ITR)이 플랭킹된 ASPA 전이유전자(예를 들어, 서열번호 2의 핵산 서열을 포함함)를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터 게놈은 선형의 단일 가닥이며, AAV ITR이 플랭킹되어 있다. 이종 유전자의 전사 및 번역 전, 대략 4700개 뉴클레오티드의 단일 가닥 DNA 게놈은 제2 가닥 합성을 개시하기 위해 자가 프라이밍 ITR 중 하나의 유리 3'-OH를 사용하는 DNA 폴리머라아제(예를 들어, 형질도입된 세포 내 DNA 폴리머라아제)에 의해 이중 가닥 형태로 전환되어야 한다. 일부 구현예에서, 전장 단일 가닥 벡터 게놈(즉, 센스 및 안티센스)은 어닐링되어 전장 이중 가닥 벡터 게놈을 생성한다. 이는, 반대 극성(즉, 센스 또는 안티센스)의 게놈을 보유하는 다수의 rAAV 벡터가 동일한 세포를 동시에 형질도입하는 경우에 일어날 수 있다. 이들이 생산되는 방법에 관계없이, 이중 가닥 벡터 게놈이 형성되면, 세포는 이중 가닥 DNA를 전사 및 번역하고, 이종 유전자를 발현할 수 있다.
rAAV 벡터로부터의 전이유전자 발현 효율은 발현 전 단일 가닥 rAAV 게놈(ssAAV)의 이중 가닥 DNA로의 전환 필요성으로 인해 방해를 받을 수 있다. 이러한 단계는 DNA 합성 또는 다수의 벡터 게놈 간 염기쌍 형성 필요 없이 이중 가닥 DNA로 접힐 수 있는 역 반복 게놈을 패키징할 수 있는 자가 상보적 AAV 게놈(scAAV)을 사용하여 우회된다(문헌[McCarty, (2008) Molec. Therapy 16(10):1648-1656]; 문헌[McCarty et al., (2001) Gene Therapy 8:1248-1254]; 문헌[McCarty et al., (2003) Gene Therapy 10:2112-2118]). scAAV 벡터의 한계는 캡시드에 패키징되는 고유한 전이유전자, 조절 요소 및 IRT의 크기가 ssAAV 벡터 게놈(즉, 2개의 ITR을 포함하여 약 4,900개 뉴클레오티드)의 크기의 약 절반(즉, 전이유전자 및 조절 요소일 수 있는 2,200개 뉴클레오티드 + 약 145개 뉴클레오티드 ITR의 2개 카피를 포함하여 약 2,500개 뉴클레오티드)이라는 점이다.
scAAV 벡터 게놈은 말단 분해 부위(TRS)를 포함하지 않는 핵산을 사용하거나, 벡터 게놈을 포함하는 벡터, 예를 들어 플라스미드의 하나의 rAAV ITR에서 TRS를 변경하여 해당 말단으로부터의 복제 개시를 방지하는 방식으로 제조된다(미국 특허 제8,784,799호 참조). 숙주 세포 내 AAV 복제는 scAAV 벡터 게놈의 야생형 ITR에서 개시되어, 변경된 말단 분해 부위가 결여되어 있거나 이를 포함하는 ITR을 통해 계속된 후, 다시 게놈을 가로질러 상보적 가닥을 생성한다. 따라서, 생성된 상보적 단일 핵산 분자는 중간에 돌연변이된(분해되지 않은) ITR을 갖고, 각 말단에 야생형 ITR을 갖는 벡터 게놈을 생성하는 자가 상보적 핵산 분자이다. 일부 구현예에서, TRS가 결여되어 있거나 변경된 TRS를 포함하는 돌연변이 ITR은 벡터 게놈의 5' 말단에 존재한다. 일부 구현예에서, TRS가 결여되어 있거나 분해(절단)되지 않은 변경된 TRS를 포함하는 돌연변이 ITR은 벡터 게놈의 3' 말단에 존재한다. 일부 구현예에서, 돌연변이 ITR은 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산을 포함한다.
이론에 구애됨 없이, scAAV 게놈의 2개의 반쪽은 상보적이지만, 다수의 염기가 내부 캡시드 쉘의 아미노산 잔기와 접촉해 있고 포스페이트 백본이 중심을 향해 격리되어 있기 때문에, 캡시드 내에 실질적 염기쌍 형성이 존재할 가능성은 거의 없다(문헌[McCarty, Molec. Therapy (2008) 16(10):1648-1656]). 탈외피(uncoating) 시, scAAV 게놈의 2개의 반쪽은 어닐링되어 하나의 말단에 공유결합으로 폐쇄된 ITR과 다른 하나의 말단에 2개의 개방형 ITR을 갖는 dsDNA 헤어핀 분자를 형성할 가능성이 있다. ITR은, 특히 전이유전자, 및 이에 대해 시스로 존재하는 조절 요소를 인코딩하는 이중 가닥 영역을 플랭킹한다.
rAAV 벡터의 바이러스 캡시드는 야생형 AAV 또는 변이형 AAV, 예컨대 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAVrh74(WO2016/210170호 참조), AAV12, AAV2i8, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, RHM4-1(WO 2015/013313호의 서열번호 5), RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9,45, AAV2i8, AAV29G, AAV2,8G9, AVV-LK03, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, AAV 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비영장류 AAV, 뱀 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 양 AAV 및 이의 변이체에서 유래될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fields et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69, 4th ed., Lippincott-Raven Publishers] 참조). 캡시드는 미국 특허 제7,906,111호; 문헌[Gao et al. (2004) J. Virol. 78:6381]; 문헌[Morris et al. (2004) Virol. 33:375]; WO 2013/063379호; WO 2014/194132호에 개시된 다수의 AAV 혈청형에서 유래될 수 있으며; WO 2015/121501호에 개시된 트루 타입(true type) AAV(AAV-TT) 변이체, 및 WO 2015/013313호에 개시된 RHM4-1, RHM15-1 내지 RHM15-6, 및 이의 변이체를 포함한다. 당업자는 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 아직 확인되지 않은 다른 AAV 변이체가 존재할 가능성이 있음을 인지할 것이다. AAV cap 단백질의 완전 보완체에는 VP1, VP2 및 VP3이 포함된다. AAV VP 캡시드 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ORF는 완전 보완체보다 적은 AAV Cap 단백질을 포함할 수 있거나, AAV cap 단백질의 완전 보완체가 제공될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 생체내 치료적 유전자 요법에 사용하기 위한 조상(ancestral) AAV 벡터의 사용을 제공한다. 구체적으로, 인 실리코(in silico) 유래 서열이 새롭게 합성되어 생물학적 활성에 대해 특징분석될 수 있다. rAAV 벡터로 조립하는 것에 더하여, 조상 서열의 예측 및 합성은 WO 2015/054653호에 기재된 방법을 사용하여 달성될 수 있다(상기 문헌의 내용은 본원에 참조로 인용됨). 특히, 조상 바이러스 서열로부터 조립된 rAAV 벡터는 현재 바이러스 또는 이의 일부와 비교하여 인간 집단에서 기존 면역에 대해 감소된 민감성을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 초과의 AAV 혈청형(예를 들어, 야생형 AAV 혈청형, 변이형 AAV 혈청형)에서 유래된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 벡터는 "키메라 벡터" 또는 "키메라 캡시드"로 지칭된다(미국 특허 제6,491,907호(이의 전체 개시내용은 본원에 참조로 인용됨) 참조). 일부 구현예에서, 키메라 캡시드 단백질은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 AAV 혈청형에서 유래된 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터는, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAVrh74, AAVrh10, AAV2i8 또는 이의 변이체에서 유래된 캡시드 서열을 포함하여, 상기 AAV 혈청형 중 임의의 것의 아미노산의 조합을 포함하는 키메라 캡시드 단백질을 생성한다(문헌[Rabinowitz et al. (2002) J. Virology 76(2):791-801] 참조). 대안적으로, 키메라 캡시드는 하나의 혈청형의 VP1, 상이한 혈청형의 VP2, 또 다른 상이한 혈청형의 VP3 및 이들의 조합의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 바이러스 캡시드는 AAV1 cap 단백질 또는 서브유닛과 적어도 하나의 AAV2 cap 단백질 또는 서브유닛을 포함할 수 있다. 키메라 캡시드는, 예를 들어 하나 이상의 B19 cap 서브유닛을 갖는 AAV 캡시드를 포함할 수 있으며, 예를 들어 AAV cap 단백질 또는 서브유닛은 B19 cap 단백질 또는 서브유닛으로 대체될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, AAV 캡시드의 VP3 서브유닛은 B19의 VP2 서브유닛으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 키메라 캡시드는 WO2014052789호에 기재된 바와 같은 Olig001 캡시드이며, 상기 문헌은 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 키메라 벡터는 변경된 지향성, 또는 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 지향성을 나타내도록 조작되었다. "지향성"이라는 용어는, 특정 세포 또는 조직 유형으로의 바이러스의 우선적 진입 및/또는 특정 세포 또는 조직 유형으로의 진입을 용이하게 하는 세포 표면과의 우선적 상호작용을 지칭한다. AAV 지향성은 일반적으로 별개의 바이러스 캡시드 단백질과 이의 동족 세포 수용체 사이의 특정한 상호작용에 의해 결정된다(문헌[Lykken et al. (2018) J. Neurodev. Disord. 10:16]). 바람직하게는, 바이러스 또는 바이러스 벡터가 세포에 진입하면, 벡터 게놈(예를 들어, rAAV 벡터 게놈)에 의해 운반되는 서열(예를 들어, 전이유전자와 같은 이종 서열)이 발현된다.
"지향성 프로파일"은 다양한 조직 및/또는 기관에서 하나 이상의 표적 세포의 형질도입 패턴을 지칭한다. 예를 들어, 키메라 AAV 캡시드는 뉴런, 성상세포 및 다른 CNS 세포의 낮은 형질도입에 따른 희소돌기아교세포의 효율적인 형질도입을 특징으로 하는 지향성 프로파일을 가질 수 있다. WO2014/052789호 참조(상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨). 이러한 키메라 캡시드는 희소돌기아교세포에 대한 지향성을 나타내는 "희소돌기아교세포에 특이적인" 것으로 간주될 수 있으며, CNS로 직접 투여될 때, 뉴런, 성상세포 및 다른 CNS 세포 유형에 비해 우선적으로 희소돌기아교세포를 형질도입하는 경우 "희소돌기아교세포 지향성"으로 본원에서 지칭된다. 일부 구현예에서, 희소돌기아교세포에 특이적인 캡시드에 의해 형질도입된 세포의 적어도 약 80%는 희소돌기아교세포이고, 예를 들어 형질도입된 세포의 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상은 희소돌기아교세포이다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 "희소돌기아교세포 기능장애와 관련된 장애"를 치료하거나 예방하는 데 유용하다. 본원에 사용된 "희소돌기아교세포 기능장애와 관련된"이라는 용어는, 희소돌기아교세포가 다른 동일한 정상 희소돌기아교세포와 비교하여 손상되거나, 소실되거나 또는 부적절하게 기능하는 질환, 장애 또는 병태를 지칭한다. 상기 용어는, 희소돌기아교세포가 직접 영향을 받는 질환, 장애 및 병태뿐 아니라, 희소돌기아교세포가 다른 세포에 대한 손상에 따라 이차적으로 기능장애가 되는 질환, 장애 또는 병태를 포함한다. 일부 구현예에서, 희소돌기아교세포 기능장애와 관련된 장애는 카나반병(CD)이다.
일부 구현예에서, 희소돌기아교세포에 대한 지향성이 있는 키메라 AAV 캡시드는 Olig001(BNP61로도 알려짐)이며, AAV1, AAV2, AAV6, AAV8 및 AAV9 유래의 서열을 포함한다(WO 2014/052789호 참조). 일부 구현예에서, Oligo001 캡시드 VP1은 서열번호 13의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, Olig001 캡시드 VP1은 서열번호 13의 핵산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
핵산 서열은 중첩 AAV 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3을 인코딩한다. Olig001 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 14의 아미노산 잔기 1(메티오닌)에서 시작하는 VP1, 아미노산 잔기 148(트레오닌)에서 시작하는 VP2 및 아미노산 잔기 203(메티오닌)에서 시작하는 VP3을 갖는 서열번호 14로 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 희소돌기아교세포에 대한 지향성이 있는 키메라 AAV 캡시드는 Olig002(BNP62로도 알려짐) 또는 Olig003(BNP63으로도 알려짐)이다(WO 2014/052789호 참조). 일부 구현예에서, Oligo002 캡시드 VP1은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Olig002 캡시드 VP1 아미노산 서열은 서열번호 15의 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 15의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Oligo003 캡시드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, Olig003 캡시드 VP1 아미노산 서열은 서열번호 16과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 16의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 AAV 캡시드(예를 들어, Olig001) 및 치료용 전이유전자를 포함하는 rAAV 벡터는 희소돌기아교세포 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 이러한 질환, 장애 또는 병태에서, 희소돌기아교세포는 손상되거나, 소실되거나 또는 부적절하게 기능한다. 이는 희소돌기아교세포에 대한 직접적인 영향의 결과, 또는 희소돌기아교세포가 다른 세포에 대한 손상에 따라 이차적으로 기능장애가 되는 경우의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, AAV/Olig001 캡시드 및 변형된 ASPA 핵산을 포함하는 rAAV 벡터는 카나반병을 치료하는 데 사용된다.
재조합 핵산
본 개시내용의 재조합 핵산은 변형된 핵산뿐 아니라, 변형된 핵산을 포함하는 플라스미드 및 벡터 게놈을 포함한다. 재조합 핵산, 플라스미드 또는 벡터 게놈은 (예를 들어, 플라스미드의) 증식을 조절하고/하거나 변형된 핵산(예를 들어, 전이유전자)의 발현을 제어하기 위한 조절 서열을 포함할 수 있다. 재조합 핵산은 또한 바이러스 벡터(예를 들어, rAAV 벡터)의 구성요소로서 제공될 수 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터는 캡시드에 패키징된 재조합 핵산을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다.
변형된 핵산
유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 전이유전자)의 변형된 또는 변이체 형태는 참조 서열에서 벗어난 핵산을 지칭한다. 참조 서열은 자연 발생 야생형 서열(예를 들어, 유전자)일 수 있으며, 자연 발생 변이체(예를 들어, 스플라이스 변이체, 대체 판독 프레임)를 포함할 수 있다. 당업자는, 참조 서열을 GenBank와 같은 공개적으로 입수 가능한 데이터베이스(ncbi.nlm.nih.gov/genbank)에서 확인할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 변형된/변이체 핵산은 실질적으로 참조 서열과 비교하여 실질적으로 동일하거나, 더 크거나 또는 더 낮은 활성, 기능 또는 발현을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 본원에서 상호 교환적으로 사용되는 변형된 또는 변이체 핵산은 개선된 단백질 발현을 나타내며, 예를 들어 이에 의해 인코딩되는 단백질은 다른 동일한 세포에서 내인성 유전자(예를 들어, 야생형 유전자, 돌연변이 유전자)에 의해 제공되는 단백질의 발현 수준과 비교하여 세포에서 검출 가능하게 더 큰 수준으로 발현된다. 일부 구현예에서, 본원에서 상호 교환적으로 사용되는 변형된 또는 변이체 핵산(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)은 개선된 단백질 발현을 나타내며, 예를 들어 이에 의해 인코딩되는 단백질은 다른 동일한 세포에서 돌연변이를 포함하는 내인성 유전자에 의해 제공되는 단백질의 발현 수준과 비교하여 세포에서 검출 가능하게 더 큰 수준으로 발현된다.
핵산에 대한 변형에는, 참조 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드 치환(예를 들어, 1개 내지 3개, 3개 내지 5개, 5개 내지 10개, 10개 내지 15개, 15개 내지 20개, 20개 내지 25개, 25개 내지 30개, 30개 내지 40개, 40개 내지 50개, 50개 내지 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 치환), 부가(예를 들어, 1개 내지 3개, 3개 내지 5개, 5개 내지 10개, 10개 내지 15개, 15개 내지 20개, 20개 내지 25개, 25개 내지 30개, 30개 내지 40개, 40개 내지 50개, 50개 내지 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 삽입), 결실(예를 들어, 1개 내지 3개, 3개 내지 5개, 5개 내지 10개, 10개 내지 15개, 15개 내지 20개, 20개 내지 25개, 25개 내지 30개, 30개 내지 40개, 40개 내지 50개, 50개 내지 100개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 결실, 모티프, 도메인, 단편 등의 결실)이 포함된다. 변형된 핵산은 참조 서열과 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97% 약 98% 또는 약 99% 동일할 수 있다.
변형된 핵산은 참조 폴리펩티드와 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산(예를 들어, 서열번호 2)은 참조 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 4)와 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 변형된 핵산(예를 들어, 전이유전자)는 야생형 단백질을 인코딩한다. 이러한 변형된 핵산은 코돈 최적화될 수 있다. 본원에서 상호 교환적으로 언급되는 "최적화된" 또는 "코돈 최적화된"은, 폴리펩티드의 발현을 증가시키기 위해, 예를 들어 희귀 코돈 사용의 최소화, CpG 디뉴클레오티드 수의 감소, 잠재적 스플라이스 공여체 또는 수용체 부위 제거, Kozak 서열 제거, 리보솜 진입 부위 제거 등에 의해 야생형 코딩 서열 또는 참조 서열(예를 들어, ASPA 폴리펩티드에 대한 코딩 서열)에 비해 최적화된 코딩 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)로부터의 단백질 발현 수준은 다른 동일한 세포에서 야생형 유전자로부터의 단백질 발현 수준과 비교하여 증가된다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)로부터의 단백질 발현 수준은 다른 동일한 세포에서 야생형 유전자로부터의 단백질 발현 수준과 비교하여 증가되지 않는다(예를 들어, 발현은 실질적으로 유사함). 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 서열(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)로부터의 단백질 발현 수준은 다른 동일한 세포에서 돌연변이 유전자로부터의 단백질 발현 수준과 비교하여 증가된다.
변형의 예에는, 하나 이상의 시스-작용 모티프의 제거 및 하나 이상의 Kozak 서열의 도입이 포함된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스-작용 모티프가 제거되고, 하나 이상의 Kozak 서열이 도입된다.
제거될 수 있는 시스-작용 모티프의 예에는 내부 TATA-박스; 카이(chi)-부위; 리보솜 진입 부위; ARE, INS 및/또는 CRS 서열 요소; 반복 서열 및/또는 RNA 2차 구조; (잠재적) 스플라이스 공여체 및/또는 수용체 부위, 분기점; 및 제한 부위가 포함된다.
일부 구현예에서, 변형된 핵산은 변형된 또는 변이체 폴리펩티드를 인코딩한다. 변형된 핵산에 의해 인코딩되는 변형된 폴리펩티드는 야생형 코딩 또는 참조 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 기능 또는 활성의 전부 또는 일부를 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 폴리펩티드는 하나 이상의 비보존적 또는 보존적 아미노산 변화를 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드의 기능에서 제한된 역할을 하거나 역할을 하지 않는 것으로 입증된 특정 도메인은 변형된 폴리펩티드(예를 들어, 특정 결합 도메인)에 존재하지 않는다(예를 들어, WO 2016/097219호). rAAV 벡터에 존재하는 변형된 핵산은 rAAV 캡시드(예를 들어, 단축된 미니디스트로핀 전이유전자, WO 2001/83695호 참조; B-도메인 결실된 인간 제VIII 인자 전이유전자, WO 2017/074526호 참조)의 패키징 능력으로 인해 야생형 코딩 또는 참조 서열보다 적은 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한 절단되고 코돈 최적화된 단축된 전이유전자(예를 들어, WO 2017/221145호에 기재된 코돈 최적화된 미니디스트로핀 전이유전자)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 참조 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 기능 또는 활성보다 적거나, 이와 동일하거나 또는 더 크지만, 이의 적어도 일부는 갖는다.
변형된 핵산은 참조 및/또는 야생형 서열(예를 들어, 야생형 ASPA 코딩 서열)에 비해 변형된 GC 함량(예를 들어, 핵산 서열에 존재하는 G 및 C 뉴클레오티드의 수), 변형된(예를 들어, 증가되거나 감소된) CpG 디뉴클레오티드 함량 및/또는 변형된(예를 들어, 증가되거나 감소된) 코돈 적응 지수(CAI)를 가질 수 있다. 예를 들어, WO 2017/077451호(최적화를 위해 핵산 서열을 분석하는 공개적으로 이용 가능한 소프트웨어를 포함하여 관심 핵산 서열의 코돈 최적화에 대해 당업계에 널리 알려진 다양한 고려사항을 논의함) 참조. 본원에 사용된 변형된이라는 용어는, 특정 값, 양 또는 효과의 감소 또는 증가를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 핵산 서열의 GC 함량은 참조 및/또는 야생형 유전자 또는 코딩 서열에 비해 증가된다. 변형된 핵산의 GC 함량은 야생형 코딩 서열(예를 들어, 서열번호 3)의 GC 함량보다 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 12%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 17%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 더 많다. 일부 구현예에서, GC 함량은 서열 내 G(구아닌) 및 C(시토신) 뉴클레오티드의 백분율로 표시된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 핵산 서열의 코돈 적응 지수는 적어도 0.74, 적어도 0.76, 적어도 0.77, 적어도 0.80, 적어도 0.85, 적어도 0.86, 적어도 0.87, 적어도 0.90, 적어도 0.95 또는 적어도 0.98이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 핵산 서열은 야생형 또는 참조 핵산 서열과 비교하여 감소된 수준의 CpG 디뉴클레오티드를 가지며, 여기서 감소는 약 10%, 20%, 30%, 50% 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산은 참조 서열(예를 들어, 야생형 서열)보다 1개 내지 5개 더 적은, 5개 내지 10개 더 적은, 10개 내지 15개 더 적은, 15개 내지 20개 더 적은, 20개 내지 25개 더 적은, 25개 내지 30개 더 적은, 30개 내지 40개 더 적은, 40개 내지 45개 더 적은 또는 45개 내지 50개 더 적은, 또는 심지어 그 보다 더 적은 디뉴클레오티드를 갖는다.
CpG 디뉴클레오티드의 메틸화는 진핵생물에서 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 진핵생물에서 CpG 디뉴클레오티드의 메틸화는 본질적으로 전사 기구를 방해하는 것을 통해 유전자 발현을 침묵시키는 작용을 한다. 이와 같이, CpG 모티프의 메틸화에 의해 유발된 유전자 침묵으로 인해, 감소된 수의 CpG 디뉴클레오티드를 갖는 핵산 및 벡터는 더 높고 더 오래 지속되는 전이유전자 발현 수준을 제공할 것이다.
변형된 핵산 서열은 발현 벡터로 서브클로닝되는 것을 용이하게 하는 플랭킹 제한 부위를 포함할 수 있다. 다수의 이러한 제한 부위가 당업계에 널리 알려져 있으며, 이에는, 비제한적으로, AvaI, XmaI 및 XmaI와 같은 도 13에 제시된 것들이 포함된다.
본 개시내용은 ASPA 폴리펩티드의 기능적 활성 단편을 인코딩하는, 서열번호 1 내지 서열번호 3에 제시된 서열 중 어느 하나의 단편을 포함한다. "기능적으로 활성인" 또는 "기능성 ASPA 폴리펩티드"는, 해당 단편이 전장 ASPA 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 생물학적 기능 및/또는 활성을 제공한다는 것을 나타낸다. 즉, 단편은, 비제한적으로, NAA를 아세테이트 및 아스파르테이트로 전환시키는 능력을 포함하여 동일한 활성을 제공한다. ASPA 또는 이의 기능성 단편의 생물학적 활성은 또한, 본원의 다른 곳, 및 nur7 마우스에서 입증된 바와 같이, 카나반병과 관련된 신경변성 유전자형을 역전시키거나 방지하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 ASPA 폴리펩티드를 인코딩하고 야생형 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 3; GenBank 수탁번호 NM_000049.4 또는 NM_001128085.1, 대체 5' UTR을 갖지만 동일한 ASPA 단백질(서열번호 4)을 인코딩함)과 비교하여 적어도 하나의 변형을 포함하는 변형된 ASPA 핵산 서열을 제공한다.
일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산은 야생형 ASPA 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 4)를 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산이며, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산은 코돈 최적화된 핵산이며, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산은 코돈 최적화된 핵산이며, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열과 적어도 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 세포는 증가된 단백질 발현을 나타내며, 예를 들어 이에 의해 인코딩되는 단백질은 야생형 ASPA 핵산을 포함하는 다른 동일한 세포, 또는 ASPA를 인코딩하는 돌연변이 핵산을 포함하는 다른 동일한 세포에서의 단백질 발현 수준과 비교하여 세포에서 검출 가능하게 더 큰 수준으로 발현된다. 일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산(예를 들어, 서열번호 2의 핵산 서열을 포함함)을 포함하는 세포에서의 ASPA 단백질 발현 수준은 야생형 ASPA 핵산을 포함하는 다른 동일한 세포에서의 ASPA 단백질 발현 수준과 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 120%, 약 140%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400% 또는 그 이상 증가된다. 일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산(예를 들어, 서열번호 2의 핵산 서열을 포함함)을 포함하는 세포에서의 ASPA 단백질 발현 수준은 ASPA를 인코딩하는 돌연변이 핵산을 포함하는 다른 동일한 세포에서의 ASPA 단백질 발현 수준과 비교하여 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 120%, 약 140%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400% 또는 그 이상 증가된다.
일부 구현예에서, 이는 "발현 최적화된" 또는 "증강된 발현" 핵산, 또는 간단히 "변형된 핵산"으로 지칭될 수 있다.
당업자는, 본 개시내용의 변형된 핵산 및 이의 변이체(예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 2)에 의해 인코딩되는 폴리펩티드가 ASPA를 인코딩하는 야생형 핵산(예를 들어, 서열번호 3)에 의해 인코딩되는 ASPA 폴리펩티드와 동일하거나 유사한 생물학적 기능 및/또는 활성을 제공하는 "기능성 ASPA 폴리펩티드"라는 것을 이해할 것이다. 즉, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산에 의해 인코딩되는 ASPA 폴리펩티드는, 비제한적으로, NAA를 아세테이트 및 아스파르테이트로 전환시키는 능력을 포함하여 동일한 활성을 제공한다. ASPA의 생물학적 활성은, 비제한적으로, 로타로드 낙상 대기시간 성능의 개선, 가로지르는 개방 영역 거리의 개선, 뇌 조직 내 NAA의 감소, 뇌(예를 들어, 시상, 소뇌 백색질/교뇌) 내 액포 체적의 감소, 뇌(예를 들어, 시상, 피질) 내 Olig2 양성 세포의 증가 및/또는 피질 미엘린화의 증가를 포함하여, nur7 마우스에서 본원의 다른 곳에서 입증된 바와 같이, 카나반병과 관련된 신경변성 표현형을 역전시키거나 방지하는 것을 포함한다.
조절 요소
본 개시내용은 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산과 다양한 조절 또는 제어 요소를 포함하는 재조합 핵산을 포함한다. 전형적으로, 조절 요소는 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치는 핵산 서열(들)이다. 유전자 발현에 유용한 조절 요소의 정확한 특성은 적절한 이종 폴리뉴클레오티드 전사 및 번역을 용이하기 하게 위한 의도로, 유기체에 따라, 그리고 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인트론 등을 포함하는 세포 유형에 따라 달라질 것이다. 조절 제어는 전사, 번역, 스플라이싱, 메시지 안정성 등의 수준에서 영향을 받을 수 있다. 전형적으로, 전사를 조절하는 조절 제어 요소는 전사된 폴리뉴클레오티드의 5' 말단(즉, 업스트림) 부근에 병치된다. 조절 제어 요소는 또한 전사된 서열의 3' 말단(즉, 다운스트림)에 또는 전사체 내(예를 들어, 인트론 내)에 위치할 수 있다. 조절 제어 요소는 전사된 서열에서 (예를 들어, 1개 내지 100개, 100개 내지 500개, 500개 내지 1000개, 1000개 내지 5000개, 5000개 내지 10,000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드) 떨어진 거리에 위치할 수 있다. 하지만, AAV 벡터 게놈의 길이로 인해, 조절 제어 요소는 전형적으로 폴리뉴클레오티드에서 1개 내지 1000개 뉴클레오티드 이내에 있다.
프로모터
본원에 사용된 "프로모터", 예컨대 "진핵생물 프로모터"라는 용어는, 진핵생물 세포(예를 들어, 희소돌기아교세포)에서 특정 유전자 또는 하나 이상의 코딩 서열(예를 들어, ASPA 코딩 서열)의 전사를 개시하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 다른 조절 요소 또는 영역과 함께 작동하여 유전자 또는 코딩 서열(들)의 전사 수준을 지시할 수 있다. 이러한 조절 요소에는, 예를 들어 전사 결합 부위, 억제인자 및 활성인자 단백질 결합 부위, 및 예를 들어 감쇠인자, 인핸서 및 사일런서(silencer)를 포함하는 프로모터로부터의 전사의 양을 조절하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 것으로 알려진 다른 뉴클레오티드 서열이 포함된다. 프로모터는 대부분 동일한 가닥에 위치하며, 전사 개시 부위, 즉, 작동 가능하게 연결된 유전자 또는 코딩 서열의 5' 부근에 위치한다. 프로모터의 길이는 일반적으로 100개 내지 1000개 뉴클레오티드이다. 프로모터는 전형적으로 프로모터 부재 하에서의 동일한 유전자의 발현에 비해 유전자 발현을 증가시킨다.
본원에 사용된 "코어 프로모터" 또는 "최소 프로모터"는, 적절하게 전사를 개시하는 데 필요한 프로모터 서열의 최소 부분을 지칭한다. 이는 전사 개시 부위, RNA 폴리머라아제에 대한 결합 부위 및 일반 전사 인자 결합 부위 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 다른 1차 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 사일런서, 경계 요소, 절연인자)를 함유하는 근위 프로모터 서열(코어 프로모터의 5')뿐 아니라, 원위 프로모터 서열(코어 프로모터의 3')을 포함할 수 있다.
적합한 프로모터의 예에는, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터와 같은 아데노바이러스 프로모터; 거대세포바이러스(CMV) 프로모터와 같은 이종 프로모터; 호흡기 세포융합 바이러스 프로모터; 라우스 육종 바이러스(RSV: Rous Sarcoma Virus) 프로모터; 알부민 프로모터; 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터와 같은 유도성 프로모터; 메탈로티오네인 프로모터; 열 충격 프로모터; α-1-항트립신 프로모터; B형 간염 표면 항원 프로모터; 트랜스페린 프로모터; 아포지질단백질 A-1 프로모터; 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 신장 인자 1프로모터(EF1a), 혼성화 형태의 CBA 프로모터(CBh 프로모터) 및 CAG 프로모터(거대세포바이러스(cytomegalovirus) 초기 인핸서 요소, 및 닭 베타-액틴(actin) 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 토끼 베타-글로빈(globin) 유전자의 스플라이스 수용체)(문헌[Alexopoulou et al. (2008) BioMed. Central Cell Biol. 9:2]); 및 인간 ASPA 유전자 프로모터가 포함된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CBh 프로모터의 단편 또는 변이체이며, 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 진핵생물 프로모터 서열(예를 들어, CBh 프로모터)은 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 프로모터(예를 들어, CBh 프로모터)는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 프로모터는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되어, 희소돌기아교세포에서 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 서열번호 7을 포함하는 핵산을 포함하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현은, 다른 동일한 세포에서 서열번호 7의 핵산을 포함하는 프로모터에 작동 가능하게 연결되지 않은 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현 수준과 비교하여 세포에서 검출 가능하게 더 큰 수준이다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 프로모터를 포함하며, 희소돌기아교세포에서 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 유도한다.
프로모터는 구성적이거나, 조직 특이적이거나 조절될 수 있다. 구성적 프로모터는 작동 가능하게 연결된 유전자가 항상 본질적으로 발현되도록 하는 프로모터이다. 일부 구현예에서, 구성적 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달적 조건 하에서 대부분의 진핵생물 조직에서 활성이다.
조절된 프로모터는 활성화되거나 불활성화될 수 있는 프로모터이다. 조절된 프로모터는 통상적으로 "오프"이지만 "온"이 되도록 유도될 수 있는 유도성 프로모터, 및 통상적으로 "온"이지만 "오프"가 될 수 있는 "억제성" 프로모터를 포함한다. 온도, 호르몬, 사이토카인, 중금속 및 조절 단백질을 포함하는 다수의 상이한 조절인자가 알려져 있다. 구분은 절대적이지 않으며; 구성적 프로모터는 종종 어느 정도 조절될 수 있다. 일부 경우에, 내인성 경로는, 예를 들어 병리학적 상태가 개선될 때 자연적으로 하향조절되는 프로모터를 사용하여 전이유전자 발현의 조절을 제공하는 데 이용될 수 있다.
조직 특이적 프로모터는 특정 유형의 조직, 세포 또는 기관에서만 활성인 프로모터이다. 전형적으로, 조직 특이적 프로모터는 특정 조직, 세포 및/또는 기관에 특이적인 전사 활성인자 요소에 의해 인식된다. 예를 들어, 조직 특이적 프로모터는 다른 조직에서보다 하나 또는 몇몇(예를 들어, 2개, 3개 또는 4개의) 특정 조직에서 더 활성일 수 있다. 일부 구현예에서, 조직 특이적 프로모터에 의해 조절되는 유전자의 발현은 다른 조직에서보다 프로모터가 특이적인 조직에서 훨씬 더 높다. 일부 구현예에서, 특이적인 조직 이외의 임의의 조직에서 프로모터의 활성은 거의 없거나 실질적으로 없을 수 있다. 프로모터는 마우스 알부민 프로모터, 또는 간 세포에서 활성인 트랜스티레틴 프로모터(TTR)와 같은 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 조직 특이적 프로모터의 다른 예에는, 골격근에서 발현을 유도하는 골격 α-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나아제를 인코딩하는 유전자 유래의 프로모터가 포함된다(문헌[Li et al. (1999) Nat. Biotech. 17:241-245]). 간 특이적 발현은 알부민 유전자(문헌[Miyatake et al. (1997) J. Virol. 71:5124-5132]), B형 간염 바이러스 코어 프로모터(문헌[Sandig, et al. (1996) Gene Ther. 3:1002-1009]) 및 알파-태아단백질(문헌[Arbuthnot et al., (1996) Hum. Gene. Ther. 7:1503-1514]) 유래의 프로모터를 사용하여 유도될 수 있다.
인핸서
또 다른 양태에서, 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는 변형된 핵산은 치료용 폴리펩티드(예를 들어, ASPA 단백질)의 발현을 증가시키기 위한 인핸서를 추가로 포함한다. 전형적으로, 인핸서 요소는 프로모터 요소의 업스트림에 위치하지만, 다운스트림 또는 또 다른 서열(예를 들어, 전이유전자) 내에 위치할 수도 있다. 인핸서는 변형된 핵산의 100개 뉴클레오티드, 200개 뉴클레오티드, 300개 뉴클레오티드 또는 그 이상의 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있다. 인핸서는 전형적으로 프로모터 요소 단독에 의해 제공되는 증가된 발현보다 더 (예를 들어, 치료용 폴리펩티드를 인코딩하는, 예를 들어 ASPA를 인코딩하는) 변형된 핵산의 발현을 증가시킨다.
비제한적으로, 거대세포바이러스 주요 극초기 인핸서를 포함하는 다수의 인핸서가 당업계에 알려져 있다. 보다 구체적으로, 거대세포바이러스(CMV) MIE 프로모터는 3개의 영역을 포함한다: 조절인자, 고유 영역 및 인핸서(문헌[Isomura and Stinski (2003) J. Virol. 77(6):3602-3614]). CMV 인핸서 영역은 또 다른 프로모터 또는 이의 일부와 조합되어 혼성 프로모터를 형성하여, 이에 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 추가로 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 닭 β-액틴(CBA) 프로모터 또는 이의 일부는 CMV 프로모터/인핸서 또는 이의 일부와 조합되어, "CBh" 프로모터로 명명되는, 즉, 문헌[Gray et al., Human Gene Therapy 22:1143-1153(2011)]에 기재된 바와 같은, 닭(chicken) 베타(beta)-액틴 혼성(hybrid) 프로모터를 의미하는 CBA 버전을 만들 수 있다. 프로모터와 마찬가지로, 인핸서는 구성적이거나, 조직 특이적이거나 조절될 수 있다.
본 개시내용의 일부 구현예에서, 인핸서 서열(예를 들어, CMV 인핸서)은 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 인핸서(예를 들어, CMV 인핸서)는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 인핸서는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 핵산에 작동 가능하게 연결되고, 선택적으로 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 인핸서는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되어, 희소돌기아교세포에서 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 인핸서는 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되고, 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되며, 서열번호 6(또는 서열번호 17)과 서열번호 7의 핵산 서열은 함께 희소돌기아교세포에서 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 서열번호 6(또는 서열번호 17)의 핵산 서열을 포함하는 인핸서에 작동 가능하게 연결된 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현은, 다른 동일한 세포에서 서열번호 5의 핵산을 포함하는 인핸서에 작동 가능하게 연결되지 않은 서열번호 2에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현 수준과 비교하여 세포에서 검출 가능하게 더 큰 수준이다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 서열번호 7의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되고, 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 인핸서를 포함하고, 서열번호 6(또는 서열번호 17)과 서열번호 7의 핵산 서열은 함께 희소돌기아교세포에서 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 유도한다.
필러(filler), 스페이서 및 스터퍼(stuffer)
본원에 개시된 rAAV 벡터에 사용하기 위한 재조합 핵산은 rAAV 벡터로의 AAV 패키징에 허용 가능한 바이러스 게놈 서열의 정상 크기(예를 들어, 대략 4.7 킬로베이스 내지 4.9 킬로베이스)로 또는 이에 근접하게 핵산의 길이를 조정하기 위한 추가의 핵산 요소를 포함할 수 있다(문헌[Grieger and Samulski (2005) J. Virol. 79(15):9933-9944]). 이러한 서열은 필러, 스페이서 또는 스터퍼로 상호 교환적으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 필러 DNA는 핵산의 비번역된(비단백질 코딩) 분절이다. 일부 구현예에서, 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 길이가 약 1개 내지 10개, 10개 내지 20개, 20개 내지 30개, 30개 내지 40개, 40개 내지 50개, 50개 내지 60개, 60개 내지 70개, 70개 내지 80개, 80개 내지 90개, 90개 내지100개, 100개 내지 150개, 150개 내지 200개, 200개 내지 250개, 250개 내지 300개, 300개 내지 400개, 400개 내지 500개, 500개 내지 750개, 750개 내지 1000개, 1000개 내지 1500개, 1500개 내지 2000개, 2000개 내지 3000개 또는 그 이상인 서열이다.
AAV 벡터는 전형적으로 AAV 캡시드로의 핵산의 최적 패키징을 위해 약 4 kb 내지 약 5.2 kb 또는 약 4.1 kb 내지 4.9 kb 범위의 크기를 갖는 DNA의 삽입을 허용한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 총 길이가 약 3.0 kb 내지 약 3.5 kb, 약 3.5 kb 내지 약 4.0 kb, 약 4.0 kb 내지 약 4.5 kb, 약 4.5 kb 내지 약 5.0 kb 또는 약 5.0 kb 내지 약 5.2 kb인 벡터 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 총 길이 약 4.7 kb의 벡터 게놈을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 자가 상보적 벡터 게놈을 포함한다. rAAV 벡터에서 자가 상보적인(sc) 벡터 게놈의 총 길이는 단일 가닥(ss) 벡터 게놈(즉, 약 4 kb 내지 약 5.2 kb)과 동일하지만, sc 벡터 게놈을 인코딩하는 핵산 서열(즉, 전이유전자, 조절 요소 및 ITR을 포함함)은 sc 벡터 게놈이 캡시드 내에 패키징되도록 하기 위해 ss 벡터 게놈을 인코딩하는 핵산 서열의 절반 정도 길이여야 한다.
인트론 및 엑손
일부 구현예에서, 재조합 핵산은, 예를 들어 인트론, 엑손 및/또는 이의 일부를 포함한다. 인트론은 rAAV 벡터로의 벡터 게놈 패키징을 위해 적절한 길이를 달성하도록 필러 또는 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열로 기능할 수 있다. 인트론 및/또는 엑손 서열은 또한 인트론 및/또는 엑손 요소 부재 하의 발현과 비교하여 폴리펩티드(예를 들어, 전이유전자)의 발현을 증강시킬 수 있다(문헌[Kurachi et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 (10):576-5281]; WO 2017/074526호). 나아가, 필러/스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열("절연인자"로도 지칭됨)은 당업계에 널리 알려져 있으며, 이에는, 비제한적으로, WO 2014/144486호 및 WO 2017/074526호에 기재된 것들이 포함된다.
인트론 요소는 이종 폴리뉴클레오티드와 동일한 유전자에서 유래되거나, 완전히 상이한 유전자 또는 다른 DNA 서열(예를 들어 닭 β-액틴 유전자, 마우스 미닛 바이러스(MVM))에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 비동족 유전자에서 유래된(즉, 변형된 핵산, 예를 들어 전이유전자에서 유래되지 않은) 인트론 및 엑손에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은, 예를 들어 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 닭 β-액틴 유전자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 인트론은 서열번호 9의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론은, 예를 들어 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 MVM에서 유래된다. 일부 구현예에서, 인트론은 서열번호 10의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 엑손은, 예를 들어 서열번호 8의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 닭 β-액틴 유전자에서 유래된다. 일부 구현예에서, 엑손은 서열번호 8의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 인핸서 서열(예를 들어, 서열번호 6 또는 서열번호 17), 프로모터 서열(예를 들어, 서열번호 7), 엑손(예를 들어, 서열번호 8 또는 서열번호 18) 및 인트론(예를 들어, 서열번호 9, 서열번호 10) 중 적어도 하나로 구성되고, 선택적으로 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 이종 폴리펩티드의 발현을 조절한다. 일부 구현예에서, 인핸서 서열(예를 들어, 서열번호 6 또는 서열번호 17), 프로모터 서열(예를 들어, 서열번호 7), 엑손(예를 들어, 서열번호 8 또는 서열번호 18) 및 인트론(예를 들어, 서열번호 9, 서열번호 10) 중 적어도 하나를 포함하는 조절 영역에 작동 가능하게 연결된 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현은, 다른 동일한 세포에서 이러한 조절 요소에 작동 가능하게 연결되지 않은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현 수준과 비교하여 세포에서 검출 가능하게 더 큰 수준이다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 인핸서 서열(예를 들어, 서열번호 6 또는 서열번호 17), 프로모터 서열(예를 들어, 서열번호 7), 엑손(예를 들어, 서열번호 8 또는 서열번호 18) 및 인트론(예를 들어, 서열번호 9, 서열번호 10) 중 적어도 하나를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 서열번호 2의 변형된 핵산을 포함한다.
폴리아데닐화 신호 서열(polyA)
추가의 조절 요소는 정지 코돈, 종결 서열, 및 비제한적으로, 소 성장 호르몬 poly A 신호 서열(BHG polyA)과 같은 폴리아데닐화(polyA) 신호 서열을 포함할 수 있다. polyA 신호 서열은 유전자 전사의 종결을 안내하는 진핵생물 mRNA의 3' 말단에 폴리아데노신 "테일"의 효율적인 부가를 유도한다(예를 들어, 문헌[Goodwin and Rottman J. Biol. Chem. (1992) 267(23):16330-16334] 참조). polyA 신호는 3' 말단에서의 새로 형성된 전구체 mRNA의 뉴클레오티드내분해(endonucleolytic) 절단 및 아데노신 염기로만 이루어진 RNA 스트레치의 이러한 3' 말단에의 부가를 위한 신호로 작용한다. polyA 테일은 mRNA의 핵 방출, 번역 및 안정성에 중요하다. 일부 구현예에서, poly A는 SV40 초기 폴리아데닐화 신호, SV40 후기 폴리아데닐화 신호, HSV 티미딘 키나아제 폴리아데닐화 신호, 프로타민 유전자 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 E1b 폴리아데닐화 신호, 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, PBGD 폴리아데닐화 신호 또는 인 실리코로 설계된 폴리아데닐화 신호이다.
일부 구현예에서, 선택적으로 본원에 기재된 하나 이상의 다른 조절 요소와 조합으로, 재조합 핵산의 polyA 신호 서열은 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산(예를 들어, 서열번호 2)의 전사를 유도하는 전구체 mRNA의 뉴클레오티드내분해 절단 및 폴리아데닐화를 지시하고 이에 영향을 미칠 수 있는 polyA 신호이다. 일부 구현예에서, polyA 서열은 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, polyA 서열은 서열번호 11의 핵산 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 인핸서 서열(예를 들어, 서열번호 6 또는 서열번호 17), 프로모터 서열(예를 들어, 서열번호 7), 엑손(예를 들어, 서열번호 8 또는 서열번호 18), 인트론(예를 들어, 서열번호 9, 서열번호 10) 및 polyA(서열번호 11) 중 적어도 하나를 포함하고, 선택적으로 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 이종 폴리펩티드의 발현을 조절한다.
일부 구현예에서, 희소돌기아교세포에 대한 지향성을 갖는 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)는 AAV ITR(예를 들어, AAV2 ITR), ASPA를 인코딩하는 변형된(즉, 코돈 최적화된) 핵산을 포함하는 재조합 핵산, 및 하기 조절 요소: 인핸서(예를 들어, CMV 인핸서), 프로모터(예를 들어, CBh 프로모터), 엑손(예를 들어, CBA 엑손 1), 인트론(예를 들어, CBA 인트론, MVM 인트론) 및 poly A(예를 들어, BHG polyA) 중 적어도 하나를 포함하는 자가 상보적 벡터 게놈을 함유한다.
일부 구현예에서, 희소돌기아교세포에 대한 지향성을 갖는 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)는 AAV ITR(예를 들어, 서열번호 5, 서열번호 12 및/또는 서열번호 19), ASPA를 인코딩하는 변형된(즉, 코돈 최적화된) 핵산(예를 들어, 서열번호 2)을 포함하는 재조합 핵산, 및 하기 조절 요소: 인핸서(예를 들어, 서열번호 6 또는 서열번호 17), 프로모터(예를 들어, 서열번호 7), 엑손(예를 들어, CBA 엑손, 서열번호 8 또는 서열번호 18), 인트론(예를 들어, 서열번호 9 및 서열번호 10) 및 poly A(예를 들어, 서열번호 11) 중 적어도 하나를 포함하는 자가 상보적 게놈을 함유한다.
일부 구현예에서, 희소돌기아교세포에 대한 지향성을 갖는 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)는 서열번호 20을 포함하는 자가 상보적 게놈을 함유한다.
본 개시내용의 rAAV 벡터의 생물학적 활성
일부 구현예에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터(예를 들어, ASPA 전이유전자를 포함함)는 표적 세포(예를 들어, 희소돌기아교세포)를 형질도입하고 생물학적 활성을 매개한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)는 표적 세포(예를 들어, 희소돌기아교세포)를 형질도입하고 하기 (i) 내지 (xii)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 검출 가능한 활성을 매개한다:
(i) 시험관내 세포에서 NAA 수준을 감소시킴;
(ii) 균형, 악력 및/또는 운동 협응을 개선, 증가 및/또는 증강시킴;
(iii) 낙상 대기시간(단위: 초)을 개선, 증가 및/또는 증강시킴;
(iv) 전신 운동 기능을 개선, 증가 및/또는 증강시킴;
(v) 생체내 NAA 수준의 축적을 감소, 저해 및/또는 중화시킴;
(vi) 시상 내 액포 체적 분율을 감소, 저해 및/또는 중화시킴;
(vii) 소뇌 백색질/교뇌 내 액포 체적 분율을 감소, 저해 및/또는 중화시킴;
(viii) 시상 내 희소돌기아교세포의 수를 개선, 증가 및/또는 증강시킴;
(ix) 피질 내 희소돌기아교세포의 수를 개선, 증가 및/또는 증강시킴;
(x) 시상 내 뉴런의 수를 개선, 증가 및/또는 증강시킴;
(xi) 피질 내 뉴런의 수를 개선, 증가 및/또는 증강시킴; 및
(xii) 피질 미엘린화를 개선, 증가 및/또는 증강시킴.
일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어, 희소돌기아교세포)를 형질도입하고, (i) 내지 (xii) 중 적어도 하나의 검출 가능한 활성을 매개하는 rAAV 벡터는 AAV/Oligo001-ASPA이다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)로 형질도입된 세포는 ASPA를 인코딩하는 야생형 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 3)을 포함하는 rAAV로 형질도입된 다른 동일한 세포에서의 NAA의 수준과 비교하여 감소된 수준의 NAA를 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)로 형질도입된 세포는 ASPA를 인코딩하는 대안적인 코돈 최적화된 핵산(예를 들어, 서열번호 1)을 포함하는 rAAV로 형질도입된 다른 동일한 세포에서의 NAA의 수준과 비교하여 감소된 수준의 NAA를 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)로 형질도입된 세포는 형질도입되지 않은 ASPA를 인코딩하는 돌연변이 핵산을 포함하는 다른 세포에서의 NAA의 수준과 비교하여 감소된 수준의 NAA를 갖는다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)로 생체내 형질도입된 세포는 ASPA를 인코딩하는 야생형 핵산(예를 들어, 서열번호 3)을 포함하는 rAAV로 생체내 형질도입된 다른 동일한 세포에서의 NAA의 수준과 비교하여 감소된 수준의 NAA를 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)로 생체내 형질도입된 세포는 ASPA를 인코딩하는 대안적인 코돈 최적화된 핵산(예를 들어, 서열번호 1)을 포함하는 rAAV로 생체내 형질도입된 다른 동일한 세포에서의 NAA의 수준과 비교하여 감소된 수준의 NAA를 갖는다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)로 생체내 형질도입된 세포는 형질도입되지 않은 돌연변이 ASPA 유전자를 포함하는 다른 동일한 세포에서의 NAA의 수준과 비교하여 감소된 수준의 NAA를 갖는다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에서 균형, 악력 및/또는 운동 협응은, 예를 들어 로타로드 성능에 의해 측정 시, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 균형, 악력 및/또는 운동 협응과 비교하거나, rAAV 벡터의 투여 전 동일한 대상과 비교하여 유의하게 개선된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상에서 균형, 악력 및/또는 운동 협응은, 예를 들어 로타로드 성능에 의해 측정 시, ASPA 유전자 돌연변이가 없고 rAAV 벡터가 투여되지 않은 다른 유사한 대상에서의 균형, 악력 및/또는 운동 협응과 구별이 불가능하다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)는 뇌실내(ICV) 투여 경로를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 로타로드 성능은 낙상 대기시간(단위: 초)으로 측정된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 전신 운동 기능은, 예를 들어 개방 영역 활성에 의해 측정 시, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 전신 운동 기능과 비교하거나, rAAV 벡터의 투여 전 대상에서의 기능과 비교하여 유의하게 개선된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)는 뇌실내(ICV) 투여 경로를 통해 투여된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 전신 운동 기능은, 예를 들어 개방 영역 활성에 의해 측정 시, ASPA 유전자 돌연변이가 없고 rAAV 벡터가 투여되지 않은 다른 유사한 대상에서의 전신 운동 기능과 구별이 불가능하다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)는 뇌실내(ICV) 투여 경로를 통해 투여된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 뇌에서의 NAA 수준은, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 뇌에서의 NAA 수준과 비교하거나, rAAV 벡터의 투여 전 대상에서의 NAA 수준과 비교하여 유의하게 감소된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 뇌에서의 NAA 수준은, ASPA 유전자 돌연변이가 없고 rAAV 벡터가 투여되지 않은 다른 유사한 대상의 뇌에서의 NAA 수준과 비교하여 감소되거나 구별이 불가능하다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 시상 내 액포 체적 분율은, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 시상 내 액포 분율과 비교하거나, rAAV 벡터의 투여 전 대상과 비교하여 유의하게 감소되며, 여기서 액포 분율은, 예를 들어 비편향 입체학(unbiased stereology)에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 소뇌 백색질/교뇌 내 액포 체적 분율은, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 소뇌 백색질/교뇌 내 액포 분율과 비교하거나, rAAV 벡터의 투여 전 대상과 비교하여 유의하게 감소되며, 여기서 액포 분율은, 예를 들어 비편향 입체학에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 시상 내 희소돌기아교세포의 수는, 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 시상 내 희소돌기아교세포의 수와 비교하거나, 벡터가 투여되기 전 대상과 비교하여 유의하게 증가되며, 여기서 시상 내 희소돌기아교세포의 수는, 예를 들어 Olig2 항체를 사용하는 IHC 및 비편향 입체학에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 뇌 피질 내 희소돌기아교세포의 수는, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 뇌 피질 내 희소돌기아교세포의 수와 비교하거나, 벡터가 투여되기 전 동일한 대상과 비교하여 유의하게 증가되며, 여기서 뇌 피질 내 희소돌기아교세포의 수는, 예를 들어 Olig2 항체를 사용하는 IHC 및 비편향 입체학에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 뇌 피질 내 희소돌기아교세포의 수는, ASPA 유전자 돌연변이가 없고 rAAV 벡터가 투여되지 않은 다른 유사한 대상의 뇌 피질 내 희소돌기아교세포의 수와 구별이 불가능하며, 여기서 뇌 피질 내 희소돌기아교세포의 수는, 예를 들어 Olig2 항체를 사용하는 IHC 및 비편향 입체학에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 시상 내 뉴런의 수는, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 동일한 대상의 시상 내 뉴런의 수와 비교하거나, 벡터의 투여 전 대상의 시상 내 뉴런의 수와 비교하여 유의하게 증가되며, 여기서 시상 내 뉴런의 수는, 예를 들어 NeuN 항체를 사용하는 IHC 및 비편향 입체학에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 뇌 피질 내 뉴런의 수는, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 뇌 피질 내 뉴런의 수와 비교하거나, 벡터의 투여 전 대상의 뇌 피질 내 뉴런의 수와 비교하여 유의하게 증가되며, 여기서 뇌 피질 내 뉴런의 수는, 예를 들어 NeuN 항체를 사용하는 IHC 및 비편향 입체학에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 뇌 피질 내 뉴런의 수는, ASPA 유전자 돌연변이가 없고 rAAV 벡터가 투여되지 않은 다른 유사한 대상의 뇌 피질 내 뉴런의 수와 구별이 불가능하며, 여기서 뇌 피질 내 뉴런의 수는, 예를 들어 NeuN 항체를 사용하는 IHC 및 비편향 입체학에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Oligo001-ASPA)가 투여된 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 대상의 뇌에서의 피질 미엘린화는, rAAV 벡터가 투여되지 않은 ASPA 유전자 돌연변이가 있는 다른 유사한 대상의 뇌에서의 피질 미엘린화와 비교하거나, 벡터의 투여 전 대상의 뇌에서의 피질 미엘린화와 비교하여 유의하게 증가되며, 여기서 피질 미엘린화는, 예를 들어 피질 미엘린 염기성 단백질 양성 섬유 길이 밀도(MBP-LD)에 의해 측정된다.
바이러스 벡터의 조합
전이유전자(예를 들어, ASPA)를 운반하는 바이러스 벡터(예를 들어, rAAV 벡터)는 전이유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 적합한 조절 요소 및 세포 형질도입을 매개하는 바이러스 단백질의 생산에 필요한 요소로부터 조립된다. 바이러스 벡터의 예에는, 비제한적으로, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스바이러스, 아데노연관바이러스(AAV) 벡터, 및 특히 (상기 논의된 바와 같은) rAAV 벡터가 포함된다.
본 개시내용의 방법에 따라 생산된 rAAV 벡터의 벡터 게놈 구성요소에는, 적어도 하나의 전이유전자, 예를 들어 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산 및 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산의 발현을 제어하는 관련 발현 제어 서열이 포함된다.
바람직한 구현예에서, 벡터 게놈은 파르보바이러스 게놈, 예컨대 변형된 핵산(예를 들어, 전이유전자, 예를 들어 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)에 의해 rep 및 cap이 결실 및/또는 대체된 AAV 게놈의 일부, 및 이의 관련 발현 제어 서열을 포함한다. ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산은 바이러스 rep 및 cap 단백질을 인코딩하는 핵산 대신, 전형적으로 바이러스 복제에 적합한 1개 또는 2개의 AAV ITR 또는 ITR 요소에 인접하게 삽입된다(즉, 상기 ITR 또는 ITR 요소로 플랭킹됨)(문헌[Xiao et al. (1997) J. Virol. 71(2): 941-948]). 표적 세포(예를 들어, 희소돌기아교세포)에서 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산의 조직 특이적 발현을 용이하게 하는 데 사용하기에 적합한 다른 조절 서열이 또한 포함될 수 있다.
패키징 세포
당업자는, 전이유전자를 포함하고 바이러스 복제에 필요한 바이러스 단백질(예를 들어, cap 및 rep)이 결여된 rAAV 벡터는, 이러한 단백질이 바이러스 복제 및 패키징에 필요하기 때문에, 복제할 수 없다는 것을 이해할 것이다. cap 및 rep 유전자는 벡터 게놈에 전이유전자를 공급하는 플라스미드에서 분리되는 플라스미드의 일부로서 세포(예를 들어, 숙주 세포, 예를 들어 패키징 세포)에 공급될 수 있다.
"패키징 세포" 또는 "생산 세포"는 벡터, 플라스미드 또는 DNA 구조체로 트랜스펙션될 수 있는 세포 또는 세포주를 의미하며, 바이러스 벡터의 완전한 복제 및 패키징에 필요한 모든 결손 기능을 트랜스로 제공한다. rAAV 벡터 조립에 필요한 유전자에는, 벡터 게놈(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, 조절 요소 및 ITR), AAV rep 유전자, AAV cap 유전자, 및 예를 들어 아데노바이러스와 같은 다른 바이러스 유래의 특정 헬퍼 유전자가 포함된다. 당업자는, AAV 생산에 필요한 유전자가, 예를 들어 하나 이상의 플라스미드의 트랜스펙션을 포함하는 다양한 방식으로 패키징 세포에 도입될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 하지만, 일부 구현예에서, 일부 유전자(예를 들어, rep, cap, 헬퍼)는 게놈에 통합되거나 에피솜 상에서 운반되는 패키징 세포에 이미 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 구성적 또는 유도성 방식으로 하나 이상의 결손 바이러스 기능을 발현한다.
당업계에 알려진 임의의 적합한 패키징 세포가 패키징된 바이러스 벡터의 생산에 이용될 수 있다. 포유류 세포 또는 곤충 세포가 바람직하다. 본 개시내용의 실시에서 패키징 세포의 생산에 유용한 세포의 예에는, 예를 들어 PER.C6, WI38, MRC5, A549, HEK293 세포와 같은 인간 세포주(구성적 프로모터의 제어 하에서 기능성 아데노바이러스 E1을 발현함), B-50 또는 임의의 다른 HeLa 세포, HepG2, Saos-2, HuH7 및 HT1080 세포주가 포함된다. 적합한 비인간 포유류 세포주에는, 예를 들어 VERO, COS-1, COS-7, MDCK, BHK21-F, HKCC 또는 CHO 세포가 포함된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포는 현탁 배양에서 성장할 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 무혈청 배지에서 성장할 수 있다. 예를 들어, HEK293 세포는 무혈청 배지에서 현탁액으로 성장한다. 또 다른 구현예에서, 패키징 세포는 미국 특허 제9,441,206호에 기재되어 있고, ATCC(American Type Culture Collection) 번호 PTA 13274로 기탁되어 있는 HEK293 세포이다. 비제한적으로, WO 2002/46359호에 개시된 것들을 포함하는 다수의 rAAV 패키징 세포주가 당업계에 알려져 있다.
패키징 세포로 사용하기 위한 세포주에는 곤충 세포주가 포함된다. AAV의 복제를 가능하게 하고 배양물에서 유지될 수 있는 임의의 곤충 세포가 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 이의 예에는, Sf9 또는 Sf21과 같은 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포주, 드로소필라 종(Drosophila spp.) 세포주 또는 모기 세포주, 예를 들어 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 유래 세포주가 포함된다. 바람직한 세포주는 스포도프테라 프루기페르다 Sf9 세포주이다. 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 곤충 세포의 사용, 이러한 세포로의 핵산의 도입 방법 및 배양에서 이러한 세포를 유지하는 방법에 관한 교시를 위해 하기 참고문헌이 본원에 참조로 인용된다: 문헌[Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995)]; 문헌[O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)]; 문헌[Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828]; 문헌[Kajigaya et al. (1991) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-4650]; 문헌[Ruffing et al. (1992) J. Virol. 66:6922-6930]; 문헌[Kimbauer et al. (1996) Virol. 219:37-44]; 문헌[Zhao et al. (2000) Virol. 272:382-393]; 미국 특허 제6,204,059호.
추가의 대안으로서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는, 예를 들어 문헌[Urabe et al. (2002) Human Gene Therapy 13:1935-1943]에 기재된 바와 같이, rep/cap 유전자 및 rAAV 주형을 전달하기 위해 바큐로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 생산될 수 있다. AAV에 대한 바큐로바이러스 생산을 사용하는 경우, 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 자가 상보적이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 선택적으로 바큐로바이러스 헬퍼 기능을 인코딩하는 추가의 핵산을 포함하여 바이러스 캡시드의 생산을 용이하게 하는 바큐로바이러스 감염된 세포(예를 들어, 곤충 세포)이다.
패키징 세포는 일반적으로 바이러스 벡터의 복제 및 패키징을 유도하기에 충분한 헬퍼 기능 및 패키징 기능과 함께 하나 이상의 바이러스 벡터 기능을 포함한다. 이러한 다양한 기능은 플라스미드 또는 앰플리콘과 같은 유전자 구조체를 사용하여 패키징 세포에 함께 또는 개별적으로 공급될 수 있으며, 세포주 내 염색체외에 존재하거나 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 적어도 i) 코돈 최적화된 인간 ASPA 전이유전자(예를 들어, 서열번호 2) 및 AAV ITR(예를 들어, 서열번호 5 및 서열번호 12)을 포함하고, 하기 조절 요소: 인핸서(예를 들어, 서열번호 6), 프로모터(예를 들어, 서열번호 7), 엑손(예를 들어, CBA 엑손, 서열번호 8), 인트론(예를 들어, 서열번호 9 및 서열번호 10) 및 poly A(예를 들어, 서열번호 11) 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 플라스미드, 및 ii) rep 유전자(예를 들어, AAV2 rep) 및 cap 유전자(예를 들어, Olig001 cap)를 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션된다.
일부 구현예에서, 숙주 세포에는, 예를 들어 염색체외로 혼입되거나 세포의 염색체 DNA로 통합된 하나 이상의 벡터 기능을 갖는 숙주 세포주 내에 혼입된 패키징 또는 헬퍼 기능 중 하나 이상이 공급된다.
헬퍼 기능
AAV는 헬퍼 바이러스에 의한 세포의 동시 감염 없이는 세포에서 복제할 수 없다는 점에서 데펜도바이러스(Dependovirus)이다. 헬퍼 기능에는, 바이러스 벡터의 패키징을 개시하는 데 요구되는 패키징 세포의 활성 감염을 확립하는 데 필요한 헬퍼 바이러스 요소가 포함된다. 헬퍼 바이러스에는, 전형적으로 아데노바이러스 또는 단순헤르페스바이러스가 포함된다. 아데노바이러스 헬퍼 기능에는, 전형적으로 아데노바이러스 구성요소인 아데노바이러스 초기 영역 1A(E1a), E1b, E2a, E4 및 바이러스연관(VA) RNA가 포함된다. 헬퍼 기능(예를 들어, E1a, E1b, E2a, E4 및 VA RNA)은 다양한 헬퍼 요소를 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 트랜스펙션시키는 방식으로 패키징 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포(예를 들어, 패키징 세포)는 헬퍼 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, HEK293 세포는 인간 세포를 아데노바이러스 5 DNA로 형질전환시키는 방식으로 생성되었으며, 현재는 비제한적으로 E1 및 E3을 포함하는 다수의 아데노바이러스 유전자를 발현한다(예를 들어, 문헌[Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59-72] 참조). 따라서, 이러한 헬퍼 기능은, 예를 들어 이를 인코딩하는 플라스미드에 의해 세포에 공급할 필요 없이 HEK 293 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 적어도 i) 코돈 최적화된 인간 ASPA 전이유전자(예를 들어, 서열번호 2) 및 AAV ITR(예를 들어, 서열번호 5 및 서열번호 12)을 포함하고, 하기 조절 요소: 인핸서(예를 들어, 서열번호 6), 프로모터(예를 들어, 서열번호 7), 엑손(예를 들어, CBA 엑손, 서열번호 8), 인트론(예를 들어, 서열번호 9 및 서열번호 10) 및 poly A(예를 들어, 서열번호 11) 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 플라스미드, ii) rep 유전자(예를 들어, AAV2 rep) 및 cap 유전자(예를 들어, Olig001 cap)를 포함하는 플라스미드, 및 iii) 헬퍼 기능을 포함하는 플라스미드로 트랜스펙션된다.
복제 및 패키징을 위해 헬퍼 기능을 갖는 뉴클레오티드 서열을 세포 숙주 내로 도입하는 임의의 방법이 이용될 수 있으며, 이에는, 비제한적으로, 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 양이온성 또는 음이온성 리포솜, 및 핵 국소화 신호와 조합된 리포솜이 포함된다. 일부 구현예에서, 헬퍼 기능은 바이러스 벡터를 사용한 트랜스펙션 또는 헬퍼 바이러스를 사용한 감염에 의해 제공되며, 바이러스 감염을 생성하는 표준 방법이 사용될 수 있다.
벡터 게놈은 DNA 또는 RNA 구조체와 같은 임의의 적합한 재조합 핵산일 수 있으며, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 이중체일 수 있다(즉, WO 2001/92551호에 기재된 바와 같이 자가 상보적임).
패키징된 바이러스 벡터의 생산
바이러스 벡터는 당업자에게 알려진 몇 가지 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, WO 2013/063379호 참조). 바람직한 방법은 문헌[Grieger, et al. (2015) Molecular Therapy 24(2):287-297]에 기재된 방법으로, 상기 문헌의 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 인용된다. 간략하게, HEK293 세포의 효율적인 트랜스펙션이 시작점으로 사용되며, 여기서 적격한 임상 마스터 세포 은행에서 얻은 부착성 HEK293 세포주를 사용하여 신속하고 확장 가능한 rAAV 생산을 가능하게 하는 진탕 플라스크 및 WAVE 생물반응기에서 동물 성분이 없는 현탁 조건에서 성장시킨다. 삼중 트랜스펙션 방법(예를 들어, WO 96/40240호)을 사용하면, HEK293 세포주 현탁액은, 트랜스펙션 48시간 후 수확할 때, 1x105개 초과의 벡터 게놈 함유 입자(vg)/세포, 또는 1x1014 vg/L 초과의 세포 배양물을 생성할 수 있다. 보다 구체적으로, 삼중 트랜스펙션은 패키징 세포를 하기 3가지 플라스미드로 트랜스펙션시키는 방법을 지칭한다: 하나의 플라스미드는 AAV rep 및 cap(예를 들어, Olig001 cap) 유전자를 인코딩하고, 또 다른 플라스미드는 다양한 헬퍼 기능(예를 들어, E1a, E1b, E2a, E4 및 VA RNA와 같은 아데노바이러스 또는 HSV 단백질)을 인코딩하고, 또 다른 플라스미드는 전이유전자(예를 들어, ASPA) 및 전이유전자의 발현을 제어하기 위한 다양한 요소를 인코딩함.
단일 가닥 벡터 게놈은 대략 동일한 비율로 플러스 가닥 또는 마이너스 가닥으로 캡시드에 패키징된다. rAAV 벡터의 일부 구현예에서, 벡터 게놈은 플러스 가닥 극성(즉, DNA 가닥의 센스 또는 코딩 서열)에 있다. rAAV 벡터의 일부 구현예에서, 벡터는 마이너스 가닥 극성(즉, 안티센스 또는 주형 DNA 가닥)에 있다. 플러스 가닥의 뉴클레오티드 서열이 5' → 3' 배향으로 주어지면, 5' → 3' 배향의 마이너스 가닥의 뉴클레오티드 서열은 플러스 가닥의 뉴클레오티드 서열의 역보체로 결정될 수 있다.
목적하는 수율을 달성하기 위해, 성장 및 트랜스펙션을 모두 지원하는 적합한 무혈청 현택 배지의 선택, 트랜스펙션 시약의 선택, 트랜스펙션 조건 및 세포 밀도와 같은 다수의 변수가 최적화된다.
rAAV 벡터는 컬럼 크로마토그래피 또는 염화세슘 구배와 같은 당업계의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다. rAAV 벡터를 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 문헌[Clark et al. (1999) Human Gene Therapy 10(6):1031-1039]; 문헌[Schenpp and Clark (2002) Methods Mol. Med. 69:427-443]; 미국 특허 제6,566,118호 및 WO 98/09657호에 기재된 방법을 포함한다.
이온 교환 크로마토그래피 방법을 기반으로 하는 보편적인 정제 전략은 AAV 혈청형 1 내지 6, 8, 9 및 다양한 키메라 캡시드(예를 들어, Olig001)의 고순도 벡터 프렙(prep)을 생성하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 공정은 1주 이내에 완료되어, 빈(empty) 캡시드에 비해 높은 가득찬(full) 캡시드의 비(>90% 가득 찬 캡시드)를 유도하고, 임상 적용에 적합한 정제 후 수율(>1x1013 vg/L) 및 순도를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 모든 혈청형 및 키메라 캡시드에 대해 보편적이다. 확장 가능한 제조 기술은 (예를 들어, 카나반병의 치료를 위한) GMP 임상 및 상업용 등급 rAAV 벡터를 제조하는 데 이용될 수 있다.
본 개시내용의 rAAV 벡터는 생산되고 정제된 후, 카나반병을 앓고 있는 인간 대상과 같은 대상에게 투여하기 위한 조성물을 제조하기 위해 적정될 수 있다(예를 들어, 샘플 내 rAAV 벡터의 양이 정량화될 수 있음). rAAV 벡터 적정은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터 게놈을 함유하는 입자와 벡터 게놈을 함유하지 않는 "빈" 캡시드를 포함하는 바이러스 입자의 수는, 전자 현미경, 예를 들어 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 TEM 기반 방법은 샘플 내 벡터 입자(또는 야생형 AAV의 경우 바이러스 입자)의 수를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터 게놈은 벡터 게놈의 서열, 예를 들어 ITR 서열(예를 들어, 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19), 및/또는 전이유전자(예를 들어, 서열번호 2) 또는 조절 요소의 서열에 대한 프라이머를 사용하여 정량적 PCR(qPCR)을 통해 적정될 수 있다. 벡터 게놈의 서열을 함유하는 플라스미드와 같은 알려진 농도의 표준물 희석액에 대해 병렬로 qPCR을 수행하면, rAAV 벡터의 농도를 마이크로리터 또는 밀리리터와 같은 단위 부피 당 벡터 게놈의 수(vg)로 계산되게 하는 표준 곡선이 생성될 수 있다. 예를 들어 전자 현미경에 의해 측정된 벡터 입자의 수를 샘플 내 벡터 게놈의 수와 비교하면, 빈 캡시드의 수가 결정될 수 있다. 벡터 게놈이 치료용 전이유전자를 함유하기 때문에, vg/kg 또는 vg/ml 단위로의 벡터 샘플이 벡터 입자(이 중 일부는 비어있을 수 있고 벡터 게놈을 함유하지 않음)의 수보다 대상이 투여받게 되는 벡터의 치료량을 더 잘 나타낼 수 있다. 스톡 용액 중 rAAV 벡터 게놈의 농도가 결정되면, 이는 대상(예를 들어, 카나반병을 앓고 있는 대상)에게 투여하기 위한 조성물을 제조하는 데 사용하기 위해 적합한 완충액 중에 희석되거나 이에 대해 투석될 수 있다.
치료 방법
본원에 개시된 바와 같은 변형된 핵산, 예컨대 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산은, ASPA 폴리펩티드의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 카나반병), 및 ASPA 유전자의 상향조절이 치료 유익 또는 개선을 생성할 수 있는 임의의 다른 병태 또는 질병, 예를 들어 다른 건강한 개체에서의 ASPA 폴리펩티드의 수준 또는 기능과 비교하여 ASPA 폴리펩티드의 수준 또는 기능의 감소에 의해 매개되거나 이와 관련이 있는 질환, 장애 또는 병태의 유전자 요법 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 rAAV 벡터는, ASPA 효소의 결핍 또는 기능장애와 관련이 있거나 이에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 카나반병), 및 ASPA 효소의 상향조절이 치료 유익 또는 개선을 생성할 수 있는 임의의 다른 병태 및/또는 질병의 유전자 요법 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 대상의 카나반병의 치료에서 rAAV 벡터 또는 이의 약제학적 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 이를 필요로 하는 대상에서 ASPA의 수준을 증가시키기 위해 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Oligo001-ASPA) 또는 이의 약제학적 조성물을 사용하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Oligo001-ASPA)는, ASPA의 결핍 또는 기능장애(예를 들어, 카나반병에서와 같이 기능성 ASPA 효소의 수준 감소)와 관련이 있거나 이에 의해 유발되는 질환, 장애 또는 병태, 및 ASPA의 상향조절이 치료 유익 또는 개선을 생성할 수 있는 임의의 다른 병태 또는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, ASPA 효소의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 카나반병), 및 ASPA 유전자 발현의 상향조절 및/또는 기능성 ASPA 효소의 증가된 발현이 치료 유익 또는 개선을 생성할 수 있는 임의의 다른 병태 및/또는 질병의 유전자 요법 치료 및/또는 예방은, 본 개시내용의 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Oligo001-ASPA)를 치료적 유효량으로 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, 환자)에게 투여하는 것을 포함한다.
본 개시내용의 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Oligo001-ASPA)의 치료적 유효량을 이용한 대상(예를 들어, 환자)의 치료는, 카나반병의 하나 이상의 증상의 중증도를 기준선 측정치, 예컨대 본원에 개시된 치료 개시 전 동일한 개체에서의 측정치, 또는 본원에 기재된 치료 부재 하의 대조군 개체(또는 비교 수준 확립을 위한 다수의 대조군 개체)에서의 측정치와 비교하여 완화시키거나, 개선시키거나, 치료하거나, 예방하거나 또는 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, "대조군 개체"는 치료되는 개체와 동일한 형태의 질환 또는 손상으로 고통받고 있지만, 현재는 치료를 받고 있지 않으며, 미래에 치료를 받을 수 있는 개체이다.
예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Oligo001-ASPA)의 치료적 유효량을 이용한 대상의 치료는, 대조군 개체에서의 NAA 축적과 비교하거나, 치료 전 동일한 개체에서의 NAA 축적과 비교하여 NAA 축적을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, NAA 축적은 대조군 개체와 비교하거나, 치료 전 동일한 개체와 비교하여 치료되는 대상에서 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100% 감소된다.
일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Oligo001-ASPA)의 치료적 유효량을 이용한 대상의 치료는, 대조군 개체에서의 아스파르테이트 및/또는 아세테이트 수준과 비교하거나, 치료 전 동일한 개체에서의 아스파르테이트 및/또는 아세테이트 수준과 비교하여 아스파르테이트 수준을 증가시키고/시키거나 아세테이트 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 아스파르테이트 및/또는 아세테이트 수준은 대조군 개체와 비교하거나, 치료 전 동일한 개체와 비교하여 치료되는 대상에서 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100% 증가된다.
일부 구현예에서, 치료는 또한 대조군 개체 또는 치료 전 대상과 비교하여, 뇌 및 척수 내 미엘린 변성, 지능 장애, 이전에 획득한 운동 기술의 상실, 섭식 장애, 비정상 근긴장, 대두증, 마비 및 발작의 중증도, 및/또는 언어 및 운동 기술의 발달 지연을 완화시키거나, 개선시키거나, 치료하거나, 예방하거나 또는 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터의 치료적 유효량을 이용한 대상(예를 들어, 환자)의 치료는, 대조군 개체 또는 치료 전 대상과 비교하여, 균형, 악력 및/또는 운동 협응, 및 전신 운동 기능을 증가시키거나, 개선시키거나, 증강시키거나 또는 이의 추가의 손실을 예방할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV의 치료적 유효량을 이용한 대상(예를 들어, 환자)의 치료는, 대조군 개체 또는 치료 전 대상과 비교하여, 뇌(예를 들어, 시상, 소뇌 백색질/교뇌) 내 액포 체적 분율을 감소시키고/시키거나 뇌(예를 들어, 시상, 피질) 내 희소돌기아교세포의 수를 증가시키고/시키거나 뇌(예를 들어, 시상, 피질) 내 뉴런의 수를 증가시키고/시키거나 피질 미엘린화를 증가시킬 수 있다.
치료에 적절한 대상에는, 기능성 유전자 산물(단백질)이 불충분하거나 결핍되어 있거나 이를 불충분하거나 결핍되게 생산할 위험이 있거나, 또는 질환을 유도할 수 있는 비정상, 부분 기능성 또는 비기능성 유전자 산물(단백질, 예를 들어 효소)을 생성하는 임의의 대상이 포함된다. 일부 구현예에서, 환자는 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 카나반병)의 임의의 증상을 나타내기 전에 본 개시내용의 벡터 또는 약제학적 조성물로 치료된다. 일부 구현예에서, 유전자 분석에 의해 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 카나반병)의 위험이 있는 것으로 진단된 환자는, 증상을 나타내기 전 본 개시내용의 rAAV 벡터 또는 조성물로 치료된다.
일부 구현예에서, 치료되는 대상은 포유동물일 수 있으며, 특히 대상은 인간 환자, 예를 들어 카나반병을 앓고 있는 환자이다. 대상은, ASPA 유전자의 코딩 서열 내 하나 이상의 돌연변이로 인해, ASPA 단백질이 부정확한 아미노산 서열을 갖고, 이에 따라 기능이 감소되거나 기능이 없고, 잘못된 조직에서 또는 잘못된 시간에 발현되고, 과소발현되거나 전혀 발현되지 않기 때문에 치료를 필요로 할 수 있다. 본 발명의 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산은 본원의 다른 곳에 논의된 바와 같은 다른 생물학적 기능 중에서, 궁극적으로 NAA의 아스파르테이트 및 아세테이트로의 분해를 촉진시킬 수 있는 기능성 ASPA 효소의 생산을 증강시키거나, 개선시키거나 또는 제공하도록 투여될 수 있다.
본 발명의 rAAV 벡터의 표적 세포는 세포, 특히 희소돌기아교세포이며, 이는 통상적으로 포유동물의 뇌에서와 같은 ASPA 효소를 내인성으로 발현할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 치료 방법을 언급하는 구현예에서, 이러한 구현예는 또한 해당 치료에 사용하기 위한, 또는 대안적으로 해당 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 추가의 구현예이다.
약제학적 조성물
특정 구현예에서, 본 개시내용은 ASPA의 감소된 발현 및/또는 활성과 관련이 있거나 이에 의해 매개되는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 카나반병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물 또는 약제를 제공한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 변형된 핵산, 재조합 핵산, 바이러스 벡터 게놈, 발현 벡터, 숙주 세포 또는 rAAV 벡터와, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 세포에서 ASPA의 발현 수준 및/또는 활성 수준을 증가시킬 수 있는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 치료적 유효량의 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 게놈, 발현 벡터, rAAV 벡터) 또는 숙주 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 치료적 유효량의 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 게놈, 발현 벡터, rAAV 벡터) 또는 숙주 세포(예를 들어, 생체외 유전자 요법용)를 포함하며, 여기서 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 희석제, 부형제 및/또는 다른 의약제를 추가로 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 희석제, 부형제 또는 다른 의약제는 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아니며, 예를 들어 이러한 물질은 해당 물질의 유리한 생물학적 효과를 능가하는 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않으면서 대상에게 투여될 수 있다.
임의의 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형체가 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 제조에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, April 1997] 참조).
약제학적 조성물은 전형적으로 멸균되고, 무발열원이며, 제조 및 보관 조건 하에서 안정하다. 약제학적 조성물은 용액(예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로오스 용액, 완충 용액 또는 다른 약제학적 멸균 유체), 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 생성물(예를 들어, 바이러스 벡터 입자, 미세입자 또는 나노입자) 농도를 수용하기에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 핵산, 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈, 숙주 세포 또는 rAAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 물 또는 완충된 염수 용액 중에서 제형화된다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물에 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 조성물의 지속적인 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시키는 방식으로 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포는 제어 방출 제형, 예를 들어 생성물이 급속 방출되는 것을 막는 서방성 중합체 또는 다른 담체(임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템 포함)를 포함하는 조성물로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 피하, 피내, 복강내, 근육내, 관절내, 뇌실질내(IP), 척추강내(IT), 뇌실내(ICV) 및/또는 대수조내(ICM) 투여에 적합한 조성물을 포함하는 비경구 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 ICV 주사에 의해 투여되도록 제형화된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터(예를 들어, AAV/Olig001 ASPA)는 PBS 중 350 mM NaCl 및 5% D-소르비톨에서 제형화된다.
투여 방법
본 개시내용의 전이유전자(예를 들어, ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산, 또는 변형된 핵산을 포함하는 벡터(예를 들어, 벡터 게놈, rAAV 벡터)는, 대상(예를 들어, 환자)을 치료하기 위해 대상에게 투여될 수 있다. 벡터를 이를 필요로 하는 인간 대상 또는 동물에게 투여하는 것은, 벡터 투여에 대해 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 본 개시내용의 벡터의 표적 세포는 CNS의 세포, 바람직하게는 희소돌기아교세포를 포함한다.
벡터는 표준 치료에 더하여 및 이에 대한 부가물로서 투여될 수 있다. 즉, 벡터는 또 다른 작용제, 화합물, 약물, 치료 또는 치료 요법과, 동시에, 함께 또는 통상의 방법을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있는 결정된 투여 간격으로 병용투여될 수 있다. 본원에 개시된 용도는, 본 개시내용의 rAAV 벡터의 투여를 당업계에 알려진 카나반병에 대한 표준 치료와 동시에, 이에 더하여 및/또는 이와 동시 투여 일정에 따라 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 조합 조성물은 하나 이상의 면역억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조합 조성물은 전이유전자(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)를 포함하는 rAAV 벡터 및 하나 이상의 면역억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 전이유전자(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)를 포함하는 rAAV 벡터를 대상에게 투여하거나 전달하는 단계, 및 벡터의 투여 전 예방적으로 또는 벡터의 투여 후(즉, 벡터 및/또는 이에 의해 제공된 단백질에 대한 반응의 증상이 명백하기 전 또는 후) 대상에게 면역억제제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rAAV는 (예를 들어, ASPA를 인코딩하는) 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터와 동일하거나 상이한 캡시드 단백질을 포함하는 빈 캡시드(즉, 핵산 분자 또는 벡터 게놈을 함유하지 않는 바이러스 캡시드)와 병용투여될 수 있다. 당업자는, 빈 캡시드의 병용투여가 본 개시내용의 rAAV에 대한 면역 반응, 예를 들어 중화 반응을 감소시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 빈 캡시드는, 예를 들어 WO 2015/013313호에 논의된 바와 같이 (예를 들어, ASPA를 인코딩하는) 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터가 중화 항체(Nab) 면역 반응을 회피할 수 있게 하는 면역 유인물(immune decoy)로 작용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용의 벡터(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터)는 전신으로 투여된다. 예시적인 전신 투여 방법에는, 비제한적으로, 정맥내(예를 들어, 문맥), 동맥내(예를 들어, 대퇴동맥, 간동맥), 혈관내, 피하, 피내, 복강내, 경점막, 폐내, 림프내 및 근육내 투여 등뿐 아니라, 직접 조직 또는 기관 주사가 포함된다. 당업자는, 전신 투여가 변형된 핵산(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)을 모든 조직에 전달할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 직접 조직 또는 기관 투여는 간에의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 직접 조직 또는 기관 투여는 ASPA 결핍에 의해 직접적으로 영향을 받는 영역(예를 들어, 뇌 및/또는 중추 신경계)에의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터 및 이의 약제학적 조성물은 뇌 실질(즉, 뇌실질내 투여에 의해), 척추관 또는 지주막하 공간(이는 뇌척수액(CSF)에 이르게 됨)(즉, 척추강내 투여에 의해), 뇌의 실(즉, 뇌실내 투여에 의해) 및/또는 뇌의 대수조(즉, 대수조내 투여에 의해)에 투여된다.
따라서, 일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 본 개시내용의 벡터는, 카나반병의 신경변성 양태를 치료하기 위해, 뇌로(예를 들어, 실질, 뇌실, 대수조 등으로) 및/또는 CSF로(예를 들어, 척추관 또는 지주막하 공간으로) 직접 주사에 의해 투여된다. 본 개시내용의 벡터의 표적 세포는 피질, 뇌량의 피질하 백색질, 선조체 및/또는 소뇌에 위치한 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터의 표적 세포는 희소돌기아교세포이다. 추가 투여 경로는 또한 직접 가시화 하의 벡터의 국소 적용, 예를 들어 표면 피질 적용 또는 다른 비정위적(nonstereotaxic) 적용을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 벡터는 적어도 2가지 경로에 의해 투여된다. 예를 들어, 벡터는 전신으로 투여되고, 또한 뇌에 직접 투여된다. 적어도 2가지 경로를 통해 투여되는 경우, 벡터의 투여는 동시에 또는 함께 이루어질 수 있으나, 반드시 그러할 필요는 없다. 대신, 상이한 경로를 통한 투여는 각 투여 사이에 간격을 두고 개별적으로 수행될 수 있다.
본 개시내용의 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈 및/또는 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터는, 생체외 세포의 형질도입을 위해 또는 대상에 직접 투여를 위해(예를 들어, 카나반병을 앓고 있는 환자의 CNS에 직접) 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포(예를 들어, 숙주 세포)는 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위해(예를 들어, 카나반병을 위한 세포 요법을 위해) 대상에게 투여된다. (예를 들어, ASPA를 인코딩하는) 변형된 치료용 핵산을 포함하는 rAAV 벡터는 바람직하게는 생물학적 유효량으로 세포에 투여된다. 일부 구현예에서, 벡터의 생물학적 유효량은 표적 세포에서 ASPA(즉, 전이유전자)를 인코딩하는 변형된 핵산의 형질도입 및 발현을 유도하기에 충분한 양이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산을, 단독으로 또는 벡터(플라스미드, 바이러스 벡터, 나노입자, 리포솜, 또는 세포에 핵산을 제공하는 임의의 알려진 방법 포함)로 세포(생체내, 시험관내 또는 생체외)에 투여하는 방식으로 세포에서 ASPA의 수준 및/또는 활성을 증가시키는 방법을 포함한다.
rAAV 벡터의 투여량은, 예를 들어 투여 방식, 치료하고자 하는 질환 또는 병태, 질환의 병기 및/또는 공격성, 개체 대상의 조건(연령, 성별, 체중 등), 특정 바이러스 벡터, 발현되는 단백질의 안정성, 벡터에 대한 숙주 면역 반응 및/또는 전달되는 유전자에 따라 달라진다. 일반적으로, 용량은 치료 효과를 달성하기 위해 대상의 체중 1 킬로그램(kg) 당 적어도 1 x 108개 또는 그 이상, 예를 들어 1 x 109개, 1 x 1010개, 1 x 1011개, 1 x 1012개, 1 x 1013개, 1 x 1014개, 1 x 1015 개 또는 그 이상의 벡터 게놈(vg) 범위이다.
일부 구현예에서, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산은 표적 세포(예를 들어, 희소돌기아교세포)에서의 발현에 적절한 조절 요소(예를 들어, 프로모터)를 갖는 DNA 분자(예를 들어, 재조합 핵산)의 구성요소로서 투여될 수 있다. ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 rAAV 벡터의 구성요소로서 투여될 수 있다. rAAV 벡터는 치료를 필요로 하는 환자(예를 들어, 카나반병 환자)에게의 벡터의 직접 전달(예를 들어, CNS에의 직접 전달)에 의해 생체내로 투여될 수 있다. rAAV 벡터는 시험관내에서 치료를 필요로 하는 공여자 환자의 세포에 벡터를 투여한 후, 형질도입된 세포를 다시 공여자에게 도입하는 방식으로(예를 들어, 세포 요법) 환자에게 생체외로 투여될 수 있다.
본 개시내용은 변형된 핵산(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)이 투여되지 않은 다른 동일한 세포에서의 ASPA 발현(mRNA 및/또는 단백질) 또는 ASPA 활성 수준보다 검출 가능하게 더 큰 ASPA를 인코딩하는 mRNA의 수준, ASPA 단백질 발현 수준 및/또는 ASPA 활성 수준을 유도하는 투여 방법을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용은 변형된 핵산(예를 들어, ASPA를 인코딩하는 변형된 핵산)이 투여되지 않은 다른 동일한 세포에 존재하는 기능성 ASPA(mRNA 및/또는 단백질)의 수준보다 검출 가능하게 더 큰 기능성 ASPA를 인코딩하는 mRNA의 수준 및/또는 기능성(예를 들어, 생물학적 활성) ASPA 단백질 발현 수준을 유도하는 투여 방법을 포함한다. 즉, 본 발명은 정상 수준의 ASPA를 생성하지만, ASPA 단백질은 활성이 결여되어 있거나 정상 야생형 ASPA와 비교하여 감소된 활성을 나타내는 세포에서 기능성 ASPA의 수준을 증가시키는 방법을 포함한다.
당업자는, 세포가 시험관내에서 배양 또는 성장될 수 있거나, 유기체(즉, 생체내)에 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 나아가, 세포는 세포 내 ASPA의 수준이 증가하도록 내인성 ASPA를 발현할 수 있고/있거나, 세포는, 특히 인간 ASPA에 대한 하나 초과의 야생형 대립유전자가 있을 수 있기 때문에, 야생형 ASPA, 예를 들어 서열번호 3의 서열을 갖는 ASPA의 돌연변이체 또는 변이체인 내인성 ASPA를 발현한다. 따라서, ASPA의 수준은 그 외에는 동일하지만 처리되지 않은 다른 세포에서 발현된 ASPA의 수준과 비교하여 증가된다.
키트
본 개시내용은 패키징 재료 및 그 안의 하나 이상의 구성요소를 갖는 키트를 제공한다. 키트는 전형적으로 그 안의 구성요소의 시험관내, 생체내 또는 생체외에서의 사용을 위한 구성요소에 대한 설명 또는 설명서를 포함하는 표지 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 키트는 이러한 구성요소, 예를 들어 변형된 핵산, 재조합 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터, rAAV와, 선택적으로 제2 활성제, 예컨대 화합물, 치료제, 약물 또는 조성물의 집합을 함유할 수 있다.
키트는 키트의 하나 이상의 구성요소를 함유하는 물리적 구조를 지칭한다. 패키징 재료는 멸균 방식으로 구성요소들을 유지할 수 있으며, 이러한 목적을 위해 통상적으로 사용되는 재료(예를 들어, 종이, 유리, 플라스틱, 포일, 앰풀, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
표지 또는 삽입물은 그 안의 하나 이상의 구성요소, 용량, 작용 메커니즘을 포함하는 활성 성분(들)의 임상 약리학, 약동학 및 약력학에 대한 식별 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 제조, 로트 번호, 제조 위치 및 날짜, 유효 기간에 대한 식별 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 키트 구성요소가 사용될 수 있는 질환(예를 들어, 카나반병)에 대한 정보를 포함할 수 있다. 표지 또는 삽입물은 방법, 용도, 또는 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 키트 구성요소 중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 대상을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 투여량, 지속 빈도, 및 본원에 기재된 방법, 용도, 치료 프로토콜, 또는 예방 또는 치료 요법 중 임의의 것을 실시하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
표지 또는 삽입물은 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 대한 대상 또는 임상의에게의 경고와 같은 잠재적인 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보를 포함할 수 있다.
등가물
전술한 명세서는 당업자가 본 개시내용을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 간주된다. 전술한 설명 및 실시예는 본 개시내용의 특정 예시적인 구현예를 상세하게 설명한다. 하지만, 전술한 내용이 문맥에 상세하게 설명되어 있더라도, 본 개시내용은 다수의 방식으로 실시될 수 있으며, 본 개시내용은 첨부된 청구범위 및 이의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것을 이해해야 한다.
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등을 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌, 및 이들에 인용된 참고문헌은, 이들이 아직 존재하지 않는 범위까지, 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
예시적인 구현예
본 발명은 하기 실시예를 참조로 보다 상세하게 설명된다. 이러한 실시예는 단지 예시하기 위한 것으로, 달리 명시되지 않는 한, 제한하고자 하는 것이 아니다. 따라서, 본 발명은 하기 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1: ASPA를 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산을 포함하는 rAAV 벡터를 사용한 NAA의 용량 반응성 감소
인간 배아 신장(HEK) 세포를 NAA 신타아제(Nat8L)를 발현하는 플라스미드 1.0 ug으로 트랜스펙션시키고, 야생형 인간 ASPA 핵산 서열(서열번호 3), ASPA를 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산(서열번호 1의 핵산 서열을 포함함, 예를 들어 문헌[Francis et al. (2016) Neurobiol. Dis. 96:323-334] 참조) 또는 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 ASPA를 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산을 포함하는 플라스미드 0.1 μg, 0.2 μg, 0.5 μg 또는 1.0 μg으로 공동 트랜스펙션시켰다. NAA 농도를 HPLC로 측정하였다(n=4/군). ASPA를 인코딩하는 야생형 핵산 또는 서열번호 1의 ASPA를 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산으로 트랜스펙션된 배양물에 비해, 서열번호 2의 ASPA를 인코딩하는 코돈 최적화된 핵산을 사용하여 트랜스펙션된 배양물에서 NAA의 용량 반응성 감소가 관찰되었다(도 1).
실시예 2: 희소돌기아교세포 지향성 AAV/Olig001의 생체분포
본 연구는 유전성 인간 백색질형성장애인 카나반병의 마우스 모델에서 광범위한 CNS 희소돌기아교세포 형질도입을 촉진시키는 데 있어서 희소돌기아교세포 지향성 AAV(AAV/Olig001; (WO2014/052789호; 문헌[Powell et al. (2016) Gen. Ther.23:807-814])) 캡시드 변이체의 가장 효과적인 용량 및 투여 경로(ROA)를 정의하기 위해 수행되었다. 4가지 별개의 ROA를 통해 전달된 3가지 용량의 AAV/Olig001을 증상이 있는 성체 카나반병 마우스(nur7)에서 시험하고, 형질도입 2주 후 4군데 관심 해부학적 영역에서 리포터 녹색 형광 단백질(GFP) 양성 세포의 입체논리적 추정치를 생성하는 방식으로 벡터 확산 및 형질도입을 정량화하였다. 희소돌기아교세포 지향성을 평가하기 위해 이들 동일한 영역에서 GFP와 공동 표지된 계통 특이적 항원의 발생률을 점수화하여 각각의 ROA를 통해 전달된 AAV/Olig001의 지향성을 평가하였다. 이용된 ROA는 뇌실질내(IP), 척추강내(IT), 뇌실내(ICV) 및 대수조내(ICM)였다. 벡터의 3가지 용량(1x1010개, 1x1011개 및 5x1011개의 총 벡터 게놈(VG))을 각각의 경로를 통해 투여하였으며, 여기서 모든 처리된 코호트에 걸쳐 전달된 물질의 부피는 일정하였고, 카나반병에 대한 AAV/Olig001 적용을 위한 최적의 용량 및 ROA 조합을 정의하기 위해 각각의 직접 쌍별 비교를 수행하였다. 카나반병의 급성 증상 병기를 나타내는 6주령의 아스파르토아실라아제 결핍 nur7 마우스(문헌[Traka et al. (2008) J. Neurosci 28:11537-11549])를 이용하였다. 본 연구에 따라 생성된 결과는, 카나반병과 같은 현재 난치성인 백색질 질환에 대한 AAV/Olig001의 임상 적용을 지원하기 위한 후속 전임상 효능 연구의 기반을 형성하였다.
물질
AAV/Olig001 벡터
GFP 리포터 유전자에 대한 구성적 발현 카세트를 함유하는 AAV/Olig001 벡터의 2개 로트를 생산하였다(Lot# 7660 및 Lot# LAV38A). 생산된 모든 벡터는 자가 상보적 AAV ITR이 플랭킹된 혼성 CMV/닭 ß-액틴 프로모터(CBh)에 의해 구동되는 GFP 리포터 유전자를 함유하고 있었다. HEK293 세포의 일시적 트랜스펙션, 이어서 요오딕사놀 구배 원심분리 및 이온 교환 크로마토그래피를 통해 벡터를 생산하였다(문헌[Gray et al., (2013) Gene Ther. 20:450-9]). 벡터의 농도는 스톡 제제에서 DNAse 저항성 AAV 역 말단 반복부(ITR) 서열의 qPCR 정량화에 의해 결정된 바이러스 벡터 게놈(vg)의 총 수로 정의하였다.
동물
본 연구에 사용된 모든 동물은 승인된 기관 프로토콜에 따라 Rowan School of Osteopathic Medicine 동물 시설에서 유지 관리되는 콜로니에서 생성되었다. 시조 동물(founder animal)은 상업적 공급업체(Jackson Laboratories)에서 입수한 것이었다. nur7 마우스는 아교세포 가수분해 효소인 아스파르토아실라아제(aspa)를 인코딩하는 유전자에 불활성화 점 돌연변이가 있어 단백질을 비기능성으로 만드는 카나반병의 잘 특징분석된 모델이다(문헌[Traka et. al. J. Neuroscience (2008) 28(45)11537-11549]). 동형접합 nur7 돌연변이 동물을 이형접합보인자 동물의 쌍으로부터 생성하고, 자체 맞춤형 SNP 검정 및 실시간 PCR을 사용하여 유전자형을 분석하였다.
0.9% 식염수 중에 적절한 농도로 희석된 AAV/Olig001-GFP를 흡입 마취(효과가 있도록 4% 유도 및 유지로 적정됨) 하의 6주령 nur7 돌연변이 마우스에 정위 주사로 전달하였다. 상이한 투여 경로(ROA)의 제공에 따라 구별되는 4개의 치료 코호트를 생성하였다; 척추강내(IT), 뇌실질내(IP), 뇌실내(ICV) 및 대수조내(ICM). 각각의 ROA 코호트 내에서, 각 ROA에 의해 투여되는 벡터 용량에 따라 정의되는 동물의 하위군을 확립하였다(1x1010개, 1x1011개 및 5x1011개의 총 벡터 게놈).
따라서, 각 ROA에 대해, 용량에 따라 정의되는 3개의 하위군을 생성하였다: 각 ROA 및 각 용량에 대해 n=5마리 동물을 사용하여 본 연구를 위해 총 60마리 nur7 마우스를 제공하였음. AAV/Olig001-GFP를 마취된 마우스에 투여하고, 용량 또는 ROA에 관계 없이 모든 수술에 대해 총 전달 부피는 5 μL로 일정하였다. IP ROA는 5개의 정위 좌표에서 벡터 1 μL로 5회 주사가 필요하였다: 전방 및 후방 피질하 백색질에 대해 각 반구에서 2회(즉, 혀면결절(cingulum)에 총 4회 주사), 및 디지털 펌프를 사용하여 0.1 μL/분의 속도로 소뇌 백색질에 1회 추가의 주사(총 5회가 제공됨). IT ROA 동물은 L5와 L6 사이의 요추 천자를 통해 접근하는 지주막하 공간으로 벡터의 단일 5 μL 주입을 투여받았다. ICV ROA 동물은 0.1 μL/분의 속도로 각 측뇌실에 1회씩 2.5 μL 벡터 주사를 2회 투여받았다. ICM ROA 동물은 0.1 μL/분의 속도로 대수조를 통해 CSF에 직접 전달된 벡터 5 μL를 투여받았다. 모든 동물은 수술 20분 전 0.5 mL 20% 만니톨(ip)을 투여받았다. 모든 동물을 AAV/Olig001-GFP 전달 후 2주 동안 그룹으로 수용한 후, 사후 분석을 위해 희생시켰다.
나이브 2주령 및 8주령 야생형, 및 nur7 마우스의 군에 전신 BrdU(50 mg/kg, ip)를 연속 2일 동안 1일 2회 제공한 후, 3일째에 희생시켰다. BrdU는 동물에게 50 mg/kg의 농도로 투여하였다. 뇌 조직 절편을 상업적으로 입수 가능한 항체(Millipore-Sigma)를 사용하여 1 M HCl에서 DNA 가수분해한 후, BrdU 염색을 위해 처리하였다.
방법
비편향 입체학에 의한 벡터 생체분포의 정량화
벡터 수술 2주 후, 동물을 깊이 마취하고, 0.9% 식염수, 이어서 새로 제조된 완충된 4% 파라포름알데히드로 경심 관류하여 뇌를 준비하였다. 관류된 뇌를 절개하고, 4oC에서 밤새 4% PFA 중에서 후 고정시켰다. 고정된 뇌를 동결보존하고, 드라이아이스/이소펜탄 배쓰에서 급속 동결시키고, 면역조직화학 처리 전에 -80oC에서 보관하였다. 각각의 뇌에 대해 일련의 40 μm 시상 절편(총 144개 절편)을 생성하고, 모든 4번째 절편을 상업적으로 입수 가능한 항체(Sigma/Millipore)를 사용하여 GFP에 대해 염색하였다. 광학 분별기 방법을 사용하여 비편향 입체학에 따라 피질, 피질하 백색질, 선조체 및 소뇌 내 GFP 양성 세포체의 점수를 매겼다(도 2)(문헌[West et al. Anat. Rec. (1991) 231:482-97]). 전동 스테이지가 장착된 직립 명시야 현미경과 결합된 입체학 소프트웨어(Stereologer, Stereology Resource Center)를 사용하여, 4개의 상이한 관심 영역, 즉, 대뇌 피질, 뇌량 및 외포의 피질하 백색질, 선조체, 및 소뇌 내에서 GFP 양성 세포체의 수를 생성하였다. 샘플링 분획 내 GFP 양성 세포의 수를 하기 식을 사용하여 각 관심 영역에 걸쳐 절대 추정치로 다시 변환하였다: ΣQ*( t/h)*(1/asf)*(1/ssf), 여기서, ΣQ = 계수된 입자, t= 절편 두께, h= 계수 프레임 높이, asf= 영역 샘플링 분율, 및 ssf= 절편 샘플링 분율. 이와 같이 생성된 모든 데이터 세트에 대해, 샘플 간 실제 생물학적 분산을 차폐하는 기술적인 노이즈를 줄이기 위해 전체 분산(CV) 임계값에 대한 기여도가 15% 미만인 오차 계수(CE)를 계산하는 방식으로 샘플 내 변동을 모니터링하였다. N의 평균 그룹 평균 추정치의 유의한 차이는 임계값 유의성 p<0.05로 독립표본 양측 스튜던트 t 검정에 따라 결정하였다.
벡터 지향성의 정량화
GFP 형광과 공동 표지된 계통 특이적 항원에 대한 점수를 매기는 방식으로 AAV/Olig001-GFP 형질도입된 뇌에서 벡터 지향성을 정량화하였다. 각각, 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포를 표지하기 위해 상업적으로 입수 가능한 항체(Sigma/Millipore)를 사용하여 NeuN(척추동물의 대부분의 CNS 및 PNS 뉴런 세포 유형에 존재함), GFAP(신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic protein)) 또는 Olig2(희소돌기아교세포 계통 전사 인자 2) 면역조직화학에 대해 대체 절편을 처리하였다. 주사 공초점 현미경을 이용하여 각 관심 영역에 걸쳐 다중점 이미지 스택을 생성하였다. NIS-Elements Advanced Research 소프트웨어(Nikon)를 사용하여, 각 스택에서 총 GFP 양성 세포 및 각각의 계통 특이적 항원(Olig2 및 NeuN)과 공동 표지된 GFP 양성 세포의 수를 계수하였다. 각 개체의 뇌에 대해 개수를 수집 분석하였다(4개 샘플 간격으로 각 뇌에서 총 8개의 일련의 절편이 샘플링됨). GFP 면역형광 세포체 및 GFP/Olig2 또는 NeuN 양성 세포체 둘 모두에 대해 점수를 매기기 위해 고배율로 샘플링된 200 um2 마다 배치된 개별 포인트 및 소프트웨어를 통해 개별 절편의 ROI를 나타내었다. GFP 양성 세포체의 수를 각 일련의 절편에서의 계통 특이적 공동 표지화로 나누어 Olig2 또는 NeuN와 공동 표지된 GFP 양성 세포체의 총 수를 계산하였다. 각 ROA에 대한 평균을 계산하였다(n=5마리 동물).
결과
뇌실질내(IP) ROA 용량 반응
IP ROA 동물에게 반구 및 소뇌 둘 모두의 피질하 백색질을 표적으로 하는 5회의 개별 주사를 제공하였다. 처리된 동물을 벡터 투여 2주 후(8주령)에 희생시키고, 뇌를 GFP 면역조직화학을 위해 처리하고, 각 관심 영역 내 형질도입된 세포의 절대 추정치를 제공하기 위해 광학 분별기를 사용하여 비편향 입체학을 통해 피질, 피질하 백색질, 선조체 및 소뇌 내 GFP 양성 세포체의 점수를 매겼다. 투여된 AAV/Olig001-GFP의 모든 3가지 용량은 뇌 전체에 걸쳐 유의한 수준의 세포 형질도입을 유도하였다. (도 3) 피질 내에서, 형질도입된 세포 수의 증가는 1x1010 내지 1x1011 vg 용량(+1.6배, p=0.0096) 사이에서 유의하였지만, 최고 5x1011 용량에서 추가의 증가는 명백하지 않았으며(p=0.659), 이는 포화되었음을 시사한다(도 3). 뇌량 및 외포의 피질하 백색질에서, 높은 수준의 형질도입이 명백하였으며, 양성 세포는 4개의 주사 부위에 바로 인접하여 가장 집중되어 있었다. 피질하 백색질 GFP 양성 세포는 또한 용량 의존적 방식으로 증가하였으며, 여기서 1x1010 내지 1x1011 용량에서의 2.2배 증가는 통계적으로 유의하였지만(p=0.0144), 1x1011 내지 5x1011 용량에서의 1.3배 증가는 통계적 유의성에 이르지 못하였다(p=0.283). 중간 정도의 선조체 형질도입이 명백하였다. 1x1010 내지 1x1011에서의 3.4배 증가는 높은 유의성을 나타냈지만(p=4.38x10-5), 5x1011 용량에서는 형질도입의 추가 증가가 명백하지 않았다(p=0.706). 소뇌 내의 전이유전자 발현은 1x1011 및 5x1011 용량을 이용한 경우 모두 단일 주사 부위 바로 주변 영역에 제한되어, 이전 용량에 비해 유의한 증가를 나타냈다(1x1011: 1.5배 증가 [p=0.0016]; 5x1011: 1.4배 증가 [p=0.0019]). 피질이 가장 많은 수의 형질도입된 세포(513,477개)를 나타냈고, 이어서 피질하 백색질(178,362개), 소뇌(86,820개) 및 마지막으로 선조체(62,706개)였다. GFAP 공동 표지화는 2% 미만이었다.
척추강내(IT) ROA 용량 반응
AAV/Olig001-GFP의 IT 투여는 뇌량 및 외포의 피질하 백색질을 제외하고, 뇌 전체에 걸쳐 탁월한 전이유전자 발현 분포를 유도하였다(도 4). 1x1010 내지 1x1011 vg에서 피질 형질도입의 고도로 유의한 증가가 명백하였지만(6.1배 증가, p=0.000026), 5x1011 vg 용량에서는 유의한 증가가 없었다(p=0.273). IT ROA 피질 내 GFP 발현의 분포는 탁월하지만, 발현 강도는 IP 뇌에 비해 다소 감소하였다. 주목할 만한 GFP 발현이 놀랍지 않게 척수의 요추 영역에서 확인되었으며, 이는 뇌로 가는 도중에 척수 조직에 의해 벡터가 일부 희석되었음을 시사한다. IT ROA 뇌에서 가장 눈에 띄는 관찰은 뇌량 및 외포에서의 전이유전자 발현의 부족이었다. 용량을 1x1010에서 1x1011로 증가시켰을 때 GFP 발현 백색질 경로 세포의 매우 유의한 증가가 확인되었지만(6.3배 증가, p=0.00021), IT ROA 뇌 내 형질도입된 백색질 세포의 절대 수는 상대적으로 중간 정도였다. 뇌의 이러한 백색질 경로 영역 내 양성 세포의 평균 수는 1x1011 용량에서 64,970개였으며, 동일한 용량에서 IP 뇌의 경우에는 178,362개였다. 피질 ROA와 마찬가지로, IT ROA 뇌에서 용량을 1x1011에서 5x1011로 추가로 증가시킨 경우 형질도입된 백색질 경로 세포의 수는 유의하게 증가하지 않았다(p=0.203).
선조체는 각각의 연속 용량에서 형질도입된 세포의 용량 반응성 증가를 나타냈다. 1x1010에서 1 x1011로의 용량 증가는 선조체에서 2.7배 더 많은 GFP 양성 세포를 유도하였다(p=0.001). 5x1011 용량으로의 후속 증가는 양성 세포의 3.2배 증가를 나타냈으며(p=0.000037), IP ROA 뇌 선조체 형질도입과 비슷한 수를 유도하였다(5x1011에서의 IT: 평균79,444개, 5x1011에서의 IP: 평균 65,203개).
IT ROA는 강력한 소뇌 전이유전자 발현을 유도하였으며, 여기서 1x1010에서 1x1011 용량으로 이동할 때 유의한 1.5배 증가가 관찰되었지만(p=0.0064), 5x1011 용량에서는 추가 증가가 확인되지 않았다. 소뇌 형질도입은 IP ROA 뇌와 비슷하였으며, 1x1011 및 5x1011 용량에서 약간 더 높았지만 유의하게 높지는 않았다.
뇌실내(ICV) ROA 용량 반응
ICV 투여된 AAV/Olig001-GFP는 모든 관심 영역에 걸쳐 현저한 전이유전자 발현을 유도하였으며, 특히 피질하 백색질의 강력한 형질도입이 주목할 만하였다(도 5). 모든 관심 영역은 용량을 1x1010에서 1x1011로 증가시켰을 때 형질도입된 세포 수의 용량 반응성 증가를 나타냈지만, 소뇌를 제외하고는, 대부분의 영역에서 1x1011 용량과 비교하여 5x1011 용량에서는 미미하고 유의하지 않은 증가가 있었다. 피질 전이유전자 발현은 IP ROA 뇌와 비슷하였으며, 여기서 용량을 1x1010에서 1x1011로 증가시켰을 때 전이유전자 양성 세포는 2배 증가하였지만(p=0.00029), 5x1011 용량의 투여 후 추가 1.2배 증가는 통계적 유의성에 이르지 못하였다(p=0.123).
ICV 뇌의 피질하 백색질 형질도입은 실질적이었으며, 여기서 용량을 1x1010에서 1x1011로 증가시켰을 때 GFP 양성 백색질 경로 세포의 2배 증가가 관찰되었다(p=0.00052). 가장 높은 5x1011 용량에서는 중간 정도의 유의하지 않은 증가가 관찰되었다(p=0.334). 1x1011 용량에서 ICV 뇌의 피질하 백색질 형질도입은 IP 뇌에 비해 1.5배 유의하게 증가하였고(p=0.041), IT ROA 뇌에 비해 4.2배 증가하였다(p=0.0001).
ICV 용량 코호트의 선조체에서 매우 유사한 전이유전자 발현 패턴이 확인되었으며, 여기서 용량을 1x1010에서 1x1011로 증가시켰을 때 GFP 양성 세포의 유의한 2배 증가가 관찰되었지만(p=0.000043), 5x1011 용량에서는 유의한 추가 증가가 없었다(p=0.537). ICV 뇌에서 강력한 선조체 전이유전자 발현이 명백하였으며, 이러한 영역에서의 GFP 양성 세포 증가는 IP 뇌에 비해 2.5배였다(p=0.00004).
소뇌 ICV 형질도입은 강력하였으며, 연속적인 더 높은 용량에서 모두 GFP 양성 세포의 용량 의존적 증가가 관찰되었다(1x1011에서 +2배, p=9.56x10-6; 5x1011에서 +1.5배, p=0.00073). IP 뇌에 비해 GFP 양성 세포가 1.7배 증가하였으며(p=0.0001), 1x1011 용량에서는 IT 수에 비해 1.4배 증가하였다(p=0.0013). 소뇌는 ICV ROA 뇌에서 GFP 양성 세포의 추가의 주목할 만한 증가가 나타난 유일한 영역이었다.
샘플링 과정 전반에 걸쳐 명백하였던 IP ROA 뇌와 ICV ROA 뇌 사이의 차이에서 중요한 점은, ICV 군에서 벡터 분포가 더 컸다는 점이다. 주사 부위에서의 전이유전자 발현은 IP 뇌에서 더 강렬하였지만, 해당 부위에서 빠르게 희석되었다. 대조적으로, ICV 전이유전자 발현은 뇌의 훨씬 더 넓은 영역에 걸쳐 비교적 균일하게 분포되었다.
대수조내(ICM) ROA 용량 반응
AAV/Olig001-GFP의 ICM 투여는 비교적 광범위한 전이유전자 발현을 유도하였지만, 피질, 선조체 및 소뇌에서는 중간 정도의 전이유전자 발현을 나타냈다. 하지만, IT ROA 뇌와 마찬가지로, ICM 뇌의 피질하 백색질에서 유의한 전이유전자 발현은 존재하지 않았다(도 6). 피질 전이유전자 발현은 용량 반응성이었으며, 각각의 연속적으로 더 높은 용량은 GFP 양성 세포의 유의한 증가를 유도하였다(1x1011, 2.2배 증가 p=0.018; 5x1011, 1.3배 증가 p=0.043). 선조체와 소뇌 모두 1x1011 용량에서 GFP 양성 세포의 유의한 증가를 나타냈으며(각각, 선조체 및 소뇌의 경우, p=2.49x10-6 및 p=0.0062), 가장 높은 5x1011 용량은 소뇌에서만 양성 세포의 추가 증가를 유도하였다(p=0.061). ICM ROA에 의한 피질하 백색질 경로 세포의 형질도입은 확실히 중간 정도였다. 1x1010에서 1x1011로의 투여 용량의 증가는 GFP 양성 세포의 유의한 증가를 유도하였지만(p=0.00086), 실제 존재하는 전이유전자 양성 세포의 수는 상대적으로 무시할 만한 정도였다.
ICV 뇌와 비교하여, ICM 피질하 백색질 GFP 양성 세포는 14.2배 감소하였으며(ICV 평균 271,274개; ICM 평균 18,996개, p=0.00002), 다음으로 가장 낮은 피질하 백색질 형질도입된 ROA 동물 군인 IT에 비해 3.4배 감소하여(IT 평균 64,970개), ICM이 백색질 형질도입에서 가장 덜 효과적인 ROA라고 할 수 있었다. 다른 관심 영역에 걸친 분포는 다른 ROA 처리군과 비슷하였으며, 3개의 다른 ROA와 비교할 때 피질 형질도입에서 명백한 유의한 차이는 없었다. ICM을 통한 선조체 형질도입은 ICV ROA와 비교할 때 약간 감소하였다(p=0.043). 선조체 ICM GFP 발현은 1x1011 용량에서 IP(+2.0배, p=0.00005) 및 IT(+5.1배, p=0.0000005) 둘 모두보다 유의하게 더 높았다. ICM 뇌는 시험된 4가지 ROA 중에서 가장 많은 수의 형질도입된 소뇌 세포를 나타냈다. 1x1011 용량에서, 소뇌 ICM 형질도입은 ICV에 비해 1.5배 증가하였으며(ICM 평균 228,282개; ICV 평균 157,203개), IP에 비해 2.6배, IT에 비해 2.2배 증가하였다.
투여 경로(ROA) 비교
본원에서 연구된 모든 ROA에 대해, 모든 관심 영역에서, 1x1010에서 1x1011로의 벡터 용량 증가는 형질도입된 세포 수의 2배 내지 3배 증가를 유도하였으며, 5x1011로의 추가 용량 증가는 모든 형질도입된 세포에서 무시할 만한 증가를 유도하였다. 각 관심 영역에서 1x1011 용량에서 4가지 모든 ROA를 직접 비교한 결과, 4가지 모든 ROI에서 형질도입된 세포의 절대 수에 있어서 명백한 차이가 나타났다(도 7). 1x1011개 벡터 게놈으로 형질도입된 뇌의 피질 내 형질도입된 세포의 수는 각 ROA에서 유의한 차이가 없었으며, 모두 평균 44,000개 내지 50,000개 양성 세포체를 유도하였다. 대조적으로, 형질도입된 세포 수가 임의의 다른 군에 비해 ICV 뇌에서 유의하게 더 많았던 피질하 백색질에서는 ICV ROA에 명백한 이점이 있었다. ICV 및 IP 형질도입된 뇌는, 각각, 가장 많은 수와 두 번째로 많은 수의 형질도입된 백색질 경로 세포를 제공하였다. ICV ROA를 통해 1x1011개 AAV/Olig001-GFP 벡터 게놈으로 형질도입된 뇌의 백색질 경로 내 평균 2.7 x 105개 양성 세포는, 동일한 용량에 적용된 IP 뇌에 존재하는 평균 1.8x105개 양성 세포보다 유의하게 더 많았다(p=0.041).
IT 및 ICM ROA는 모두 피질하 백색질 세포의 형질도입에서 비효율적이었으며, ICM 군에서의 평균 1.9x104개 세포는 ICV 군에서의 평균 2.7x105개 양성 세포보다 유의하게 14배 더 적었고(p=0.000083), IT 군은 4배 더 적었다(p=0.0001). 이는 미엘린이 결손된 질환 모델 시스템에서 문제가 될 수 있다.
ICV 경로는 또한 선조체 내 세포의 효율적인 형질도입을 유도하였으며, 다른 모든 ROA보다 ICV 뇌에 더 많은 수의 GFP 양성 세포가 있었다(ICV 대 IP p=3.68x10-5; ICV 대 IT p=1.61x10-5;ICV 대 ICM p=0.043). 소뇌의 형질도입 효율은 모든 IP, IT 및 ICV ROA에 걸쳐 비슷하였지만, ICM 뇌는 가장 많은 수의 형질도입된 소뇌 세포를 나타냈다(ICM 대 ICV p=0.045).
IP 및 ICV ROA 뇌는 특정 영역에서 AAV/Olig001-GFP에 의해 형질도입된 세포의 절대 수가 비슷하였지만, IP 뇌에서의 양성 세포 수의 대부분은 주사 부위 바로 인접한 절편의 생성물이었으며, ICV 뇌에서의 양성 세포는 비교적 균일하게 분포되어 있었다. 체계적인 비무작위 입체논리적 샘플링을 통해 개별 뇌에서 샘플링된 절편들 사이의 분산(샘플내 분산)을 확인할 수 있으며, 이는 데이터 세트에서 오차 계수(CE)로 표시되고, 반복 추정치 평균의 표준 오차를 평균으로 나눈 값으로 계산된다. CE는 샘플링된 집단의 전체 분산의 절반이며, 실제 생물학적 분산(CV) 또는 개별 뇌 사이의 평균 차이가 나머지 절반을 구성한다. 개별 IP 뇌에 대한 평균 CE는 총 분산의 약 12%로 계산된 반면, ICV 뇌의 경우에는 3%로 계산되었으며, 이는 GFP 양성 세포가 ICV 뇌에서 샘플링된 모든 절편에 걸쳐 보다 균일하게 분포되어 있음을 의미한다. IP 뇌에서, 샘플링된 개별 절편의 실제 양성 세포의 수는 샘플링된 절편이 주사 부위에서 측면으로 갈수록 더 적었지만, ICV 뇌의 양성 세포 수는 샘플링된 모든 절편에서 샘플내 평균에 일관되게 더 근접하였다. 이러한 차이의 최종 결과는, IP 뇌, 특히 피질 및 피질하 백색질에 비해 ICV ROA 뇌에서 벡터가 더 크게 확산되었다는 것이다(도 7).
결론
4가지 개별 ROA를 사용하여, 진단 시 카나반병 뇌를 가깝게 모델링하는 급성 증상이 있는 동물에서 전체 CNS 희소돌기아교세포 형질도입에 도움이 되는 용량과 ROA의 조합을 정의하였다. AAV/Olig001-GFP 벡터의 투여는 계통 특이적 발현 요소의 필요 없이 소뇌를 제외한 모든 관심 영역에서 70% 초과의 희소돌기아교세포 지향성을 유도하였다. 전이유전자 양성 희소돌기아교세포의 용량 의존적 증가가 모든 ROA에서 명백하였으며, 뇌실질내 ROA는 이러한 핵심 관심 영역에서 90% 초과의 희소돌기아교세포 지향성을 유지하면서, 더 많은 수의 형질도입된 백색질 경로 세포를 촉진시켰다. 이러한 데이터는, 카나반병과 같은 희소돌기아교세포 특이적 이상에 대한 임상적 적용과 가장 관련이 있는 희소돌기아교세포 지향성의 주요 결정인자로서 캡시드 세포 표면 상호작용을 강조한다. 이러한 데이터는 또한, Olig001 캡시드가 카나반병을 포함하는 희소돌기아교세포 관련 질환, 장애 및/또는 병태의 치료를 위한 잠재적인 치료용 캡시드를 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 3: 투여 경로(ROA)에 따른 벡터 지향성
AAV/Olig001의 구별되는 특징은 다른 AAV 캡시드 변이체에 비해 이의 명백한 희소돌기아교세포 지향성이다(문헌[Powell et al. (2016) Gen. Ther. 23:807-814]; 문헌[Francis et al. (2016) Neurobiol. Dis. 96:323-334]). 정의상 백색질 장애인 카나반병에의 적용을 위해, AAV/Olig001 벡터는 상이한 ROA에 따라 적용될 때 이러한 지향성을 나타낼 수 있어야 한다. 희소돌기아교세포 지향성은 개입 연령과 같은 변수로 인해 달라질 수 있지만(문헌[Gholizadeh et al. Hum. Gene Ther. Methods (2013) 24:205-13]; 문헌[Foust et al. Nature Biotech. (2009) 27:59-65]), 이전 연구는 신생아 nur7 마우스에서 AAV/Olig001의 희소돌기아교세포 지향성 잠재력을 보고하였으며(문헌[Francis et al. Neurobiol. Dis. (2016) 96:323-334]), 이러한 지향성 잠재력을 더 성숙한 증상이 있는 동물의 형태로 옮기는 것은 아직 시험되지 않은 상태로 남아있다. 이를 위해, 실시예 2에 이용된 1x1011 용량으로의 4가지 모든 ROA를 6주령 동물에서 벡터 지향성에 대한 잠재적인 영향에 대해 평가하였다. GFP 양성 세포의 절대 수의 생성에 사용된 피질, 피질하 백색질, 선조체 및 소뇌를 GFP 전이유전자와 계통 특이적 항원인 Olig2(즉, 희소돌기아교세포에 대한 표적 특이적 표지화) 및 NeuN(즉, 뉴런에 대한 표적 특이적 표지화)의 공동 표지화에 대해 분석하였다.
결과
4가지 모든 ROA는 온전한 희소돌기아교세포 지향성을 갖는 비슷한 결과를 생성하였다. 비희소돌기아교세포 전이유전자 발현은 뉴런에 기인하였으며, 4가지 모든 ROA 코호트에서 GFP를 발현하는 성상세포는 거의 관찰되지 않았다(<5%).
Olig2와 GFP의 피질 공동 표지화는 IT, ICV 및 ICM ROA에서 비슷하였으며, Olig2와 공동 표지된 총 GFP 양성 세포의 백분율은 일관되게 대략 75%였다. IP 형질도입된 뇌에서, GFP 양성 세포의 약 62.3%가 Olig2와 공동 표지되었으며, 이는 작지만 유의한 감소였다(도 8). NeuN와 공동 표지된 동일한 뇌 내 GFP 양성 세포는 본질적으로 나머지 형질도입된 피질 집단을 차지하였다(35.1%). IT, ICV 및 ICM ROA의 3가지는 모두 대략 20%의 NeuN 공동 표지화를 나타냈다. IT ROA 뇌에서, 피질 GFP 양성 세포의 75.5%는 Olig2와 공동 표지되고, 20.2%는 NeuN과 공동 표지되었다. ICV ROA 뇌는 피질에서 70.8%의 희소돌기아교세포 지향성 및 23.6%의 뉴런 지향성을 나타냈지만, ICM 뇌의 피질은 76%의 GFP와 Olig2의 공동 표지화 및 17.4%의 GFP와 NeuN의 공동 표지화를 나타냈다. 4가지 상이한 ROA에서 나타난 희소돌기아교세포 지향성의 차이는 작았지만, IP ROA는 다른 3가지 ROA에 비해 Olig2 공동 표지화에서의 작지만 유의한 감소(p=0.026 대 IT; p=0.048 대 ICV; p=0.0085 대 ICM)와 일치하는, NeuN 공동 표지화의 유의한 증가를 나타냈으며(p=0.0043 대 IT; p=0.0119 대 ICV; p=0.00059 대 ICM), 이는 IP ROA가 희소돌기아교세포 지향성을 희생하면서 뉴런 지향성의 약간의 증가를 촉진시켰음을 시사한다. 다시 말하자면, IP ROA는 NeuN 공동 표지화의 증가(+1.5배, p=0.012)에 대해 주목할만 하였으며, 이는 감소된 Olig2 공동 표지화가 이러한 ROA에서의 증가된 뉴런 형질도입에 의해 설명된다는 것을 시사한다. IP ROA 뇌에서 GFP-NeuN 공동 표지화의 대부분은 주사 부위 주위에 클러스터링되어 있었으며, 이는 주사 부위에 바로 인접하여 AAV/Olig001-GFP의 양이 포화되었음을 나타낸다.
Olig2와 GFP의 피질하 백색질 공동 표지화는 4가지 모든 ROA에서 >90%였다(도 9). NeuN과 GFP의 공동 표지화는 4가지 모든 ROA에서 <6%였다. 두 가지 항원 중 어느 하나와의 공동 표지화 백분율에 있어서의 유의한 차이는 ROA 사이에서 관찰되지 않았으며, 이는 ROA에 관계없이 백색질 풍부 영역에서 희소돌기아교세포에 대한 강력한 선호도를 나타낸다. ICV 형질도입의 경우, 거의 유비쿼터스 Olig2 공동 표지화가 있었으며, 뇌량에서는 NeuN 공동 표지화가 없었다.
Olig2와 GFP의 선조체 공동 표지화는 모든 ROA에서 비슷하였으며, Olig2와 공동 표지된 총 GFP 양성 세포의 백분율은 >80%였다(도 10). 선조체에서 나머지 GFP 양성 세포(<20%)는 NeuN과 공동 표지되었다.
소뇌 공동 표지화는 연구된 뇌의 다른 영역과 비교하여 4가지 모든 ROA에서 Olig2와 NeuN의 반대 비율을 나타냈다. Olig2 공동 표지화 백분율은 4가지 모든 ROA에서 총 GFP 양성 세포의 10%였다(도 11). 전이유전자 발현은 소뇌에서 뉴런에 의해 지배되었으며, 이는 GFP 발현 세포의 80% 초과를 차지하였다. 두 가지 항원 중 어느 하나와의 공동 표지화 백분율에 있어서의 유의한 차이는 소뇌의 ROA 코호트 사이에서 관찰되지 않았다. 과립 세포 층의 거대 푸르키네 뉴런은 집중적으로 GFP 양성이었으며(도 29c), 소뇌 백색질 경로 내에서만 산발적 Olig2/GFP 공동 표지화가 있었다. 이는 피질하 백색질에서 관찰된 거의 100% 희소돌기아교세포 지향성과 대조적이었으며(도 29b), 피질 및 선조체와 같은 비교적 뉴런 밀집 영역에서는 70% 내지 80% 희소돌기아교세포 지향성이 관찰되었다(도 29d). 1x1011 용량에서 각 ROA에 대해 점수 매겨진 총 GFP 양성 세포를 총 GFP 양성 세포의 최고 평균에서 최저 평균(+/- sd)의 순서로 순위를 매겼다(n=5): ICV 1104256.4(106816.96); IP 841365.6(121722.7); ICM 815486.9(106979.7); IT 742143.1(79496.5).
ICV ROA는 총 GFP 양성 세포(개별 뇌의 모든 ROA 수의 합)를 가장 많이 유도하였으며, 이는 다음 순위 ROA인 IP보다 1.3배였다(p=0.0067). ICV 뇌의 총 수는 ICM(p=0.0027) 및 IT(p=0.0003)를 포함한 모든 ROA에 비해 유의하게 증가하였다. IP ROA 뇌의 세포 수는 ICM 수(p=0.730) 또는 IT 수(p=0.165)에 비해 유의하게 증가하지 않았으며, 이는 ICV ROA가 형질도입된 총 세포에 있어서 명백하게 우수하였음을 나타낸다. ICV 코호트와 IP 코호트 사이의 총 GFP 양성 세포 수 차이의 대략 75%(약 262,891개)는 피질하 백색질(35%) 및 선조체(36%) ROI가 차지하였으며, 이는 두 가지 ROA 코호트에서 >80% 희소돌기아교세포 지향성이 나타났음을 의미한다. 이는, ICV 뇌가 해당 영역 어딘가에 IP 뇌보다 적어도 210,000개 더 많은 형질도입된 희소돌기아교세포를 함유한다는 것을 의미한다. 이러한 분석이 피질하 백색질 내로 제한되는 경우, 모든 ROA에 의한 ROI는 >90% 희소돌기아교세포 지향성을 나타내며, ICV ROA를 통해 AAV/Olig001을 투여할 때 뇌 당 적어도 83,000개 더 많은 형질도입된 희소돌기아교세포가 예상된다. 가장 낮은 수준의 GFP 전이유전자 발현을 나타내는 ROA 코호트인 ICM 코호트에 대해 평가할 때, ICV 투여는 뇌 당 200,000개 세포 초과의 AAV/Olig001 형질도입된 희소돌기아교세포의 증가를 유도하였다.
성체 포유류 CNS는 백색질에 상당한 수의 희소돌기아교세포 전구체 세포를 보유하는 것으로 알려져 있으며(문헌[Dawson et al. Mol. Cell Neurosci. (2003) 24:476-488]), 미성숙 희소돌기아교세포의 증가된 전환의 형태로 청소년 nur7에서 시도된 재미엘린화의 증거(문헌[Francis et al. J. Cerebral Blood Flow Metabolism (2012) 32:1725-36])는 이전에 제시되어 있다. 백색질이 성체 뇌에서도 유의한 재미엘린화 능력을 갖고 있다는 점을 고려할 때, 성체 nur7 백색질에서 미성숙 희소돌기아교세포 상재 집단의 지속성은 희소돌기아교세포 지향성 유전자 전달 벡터에 대한 이상적인 표적으로 간주되어야 한다.
증식하는 희소돌기아교세포 전구체/미성숙 희소돌기아교세포의 상대적인 수를 평가하기 위해, nur7 마우스와 야생형 마우스 둘 모두에 전신 BrdU를 2일 동안 1일 2회 제공하고, BrdU/Olig2 공동 표지화를 위한 처리를 위해 3일째에 희생시켰다(도 29e 내지 도 29g). BrdU 투여를 2주령 및 8주령 코호트 모두에서 개시하여, 신생 및 성체 뇌에서 증식하는 희소돌기아교세포의 가능한 지속성을 정량화하였다. 각 연령의 유전자형 코호트의 뇌량 및 외포 내 BrdU 양성 세포의 수는 야생형에 비해 2주령 nur7 뇌에서 BrdU 양성 세포의 유의한 1.8배 증가를 나타냈으며(p=0.029), 8주령의 nur7 뇌에서는 1.6배 증가를 나타냈다(p=0.034)(도 29f). 두 가지 연령에서 nur7 백색질 내 BrdU 세포의 대부분은 Olig2와 공동 표지되었으며, 이는 증상이 있는 성체 nur7 마우스의 백색질 내 증식하는 전구/미성숙 희소돌기아교세포의 지속성을 나타낸다. 3마리 6주령 nur7 마우스의 서브세트에 1x1011 vg의 AAV/Olig001-GFP로 형질도입하기 전 2일 동안 전신 BrdU를 제공하고, 백색질 경로에서 증식하는 세포의 형질도입 증거를 위해 이러한 동물을 형질도입 2주 후에 희생시켰다. 이러한 동물의 백색질 경로에서 다수의 BrdU/GFP 공동 표지된 세포가 관찰되었으며, 이는 상재 전구/미성숙 세포의 성공적인 형질도입을 나타낸다.
nur7 ROA 코호트와 일치된 연령(즉, 6주령)의 건강한 야생형 동물의 군에 ICV ROA를 통해 1x1011 vg의 AAV/Olig001-GFP를 형질도입하고, 피질 및 피질하 백색질 경로 내 GFP 양성 세포의 입체논리적 추정치를 생성하기 위해 2주 후에 희생시켰다(도 8). GFP 양성 세포의 추정치는 nur7 뇌와 비교하여 야생형 뇌의 피질 및 피질하 백색질 둘 모두에서 유의한 2배 감소를 나타냈다(각각의 ROI에 대해, p=0.00032 및 p=0.0116). 야생형 뇌에서 피질하 백색질 GFP 전이유전자 발현은 야생형 뇌의 측뇌실 바로 주변 영역으로 매우 제한적이었고, 피질 발현은 상당히 확산되었지만, 형질도입된 세포의 절대 수에 있어서는 매우 적었다.
결론
실시예 2 및 실시예 3은, AAV/Olig001 GFP 벡터의 뇌실내(ICV) 투여 경로가 벡터 확산과 희소돌기아교세포 지향성의 최상의 조합을 제공하였음을 입증한다. 결정적으로, 이러한 ROA는 카나반병 병리에 의해 영향을 받은 조직인 피질하 백색질의 형질도입에 매우 적합한 것으로 보인다. 따라서, 수십만 개 세포를 형질도입하고, 희소돌기아교세포에 대해 거의 100% 지향성을 유지하는 능력은, 다른 AAV 캡시드보다 AAV/Olig001에 유의한 이점을 부여한다. 4주령 내지 6주령 nur7 뇌량/외포는 대략 1,500,000개 Olig2 양성 세포를 가졌기 때문에, ICV ROA를 통한 1x1011 용량의 AAV/Olig001 벡터 투여는 상재 희소돌기아교세포 집단의 약 20%를 형질도입할 가능성이 있다. nur7 마우스의 백색질 경로에는 재미엘린화 시도의 증거가 있고, 상당한 수의 증식하는 희소돌기아교세포 전구체가 함유되어 있다는 점에 유의해야 한다. 단일 희소돌기아교세포가 다수의 엑손의 미엘린화를 가능하게 한다는 점을 고려할 때, 치료용 AAV/Olig001 벡터를 이용한 백색질의 형질도입 후 재미엘린화 가능성은 중요하다.
다른 CSF 표적화된 ROA, 즉 IT 및 ICM은 상대적으로 불량한 백색질 경로 형질도입을 나타냈기 때문에, 치료용 ROA로서 고려하기 위한 첫 번째 선택은 아닐 것이다. IP 뇌는 형질도입된 세포 수의 측면에서 비슷한 형질도입 수준에 접근했지만, 이러한 세포의 대부분은 대략 주사 부위 주변에 집중되어 있었다. 이러한 부위에 있는 세포는 임의의 다른 ROA보다 더 큰 벡터 게놈 카피 수/세포를 가졌을 가능성이 있지만, 이러한 부위로부터의 벡터 확산은 ICV ROA와 비교하여 현저하게 더 낮았다. ICV 투여에 의한 GFP 형질도입의 더 넓은 분포는 형질도입된 세포 수와 형질도입된 세포 당 벡터 카피 수 사이의 적절한 균형이 달성될 수 있다는 점에서 유리하다.
실제로, 실시예 2 및 실시예 3의 IP 뇌에서 전이유전자 발현의 강렬한 집중은 희소돌기아교세포 지향성의 작지만 유의한 감소 및 피질 내 뉴런 지향성의 균형 증가와 관련이 있었다. 이는, AAV/Olig001로 영역을 포화시키면 희소돌기아교세포 특이성이 감소될 수 있다는 것을 나타낸다. 본 연구에 사용된 동물 중 nur7 마우스에서 피질 희소돌기아교세포는 야생형보다 수가 감소하였고, 스트레스 및 세포자멸사의 증거를 나타냈으며(문헌[Francis et al. (2012) J. Cereb. Blood Fl. Metab. 32:1725-1736]), 이는 형질도입 효율에 영향을 미칠 것으로 예상될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
모든 관심 영역에서의 벡터 지향성은, 소뇌를 제외하고는, 75% 내지 90% 희소돌기아교세포 지향성이었다. 이러한 영역은 모든 ROA 군에서 >80% 뉴런 지향성을 나타냈다. 과립층 푸르키네 뉴런에서 특히 강력한 전이유전자 발현이 확인되었다. 이러한 명백한 지향성의 역전 이유는 선뜻 명백하지는 않지만, 소뇌는 상재 세포 유형과 관련하여 명백하게 구별되는 해부학적 엔티티이다. 소뇌 내 푸르키네 세포는 Olig2를 낮지만 주목할 만한 수준으로 발현하며, AAV/Olig001 캡시드는 뇌의 다른 영역에서 다른 뉴런의 표면보다 푸르키네 뉴런 표면과 현저하게 상이한 상호작용을 나타낼 가능성이 있다.
현재 실시예는, AAV/Olig001이, 중요하게 소뇌를 제외하고는, nur7 카나반병 마우스 뇌 전체에 걸쳐 강력한 희소돌기아교세포 전이유전자 발현을 촉진시킨다는 것을 보여준다. 뇌의 모든 다른 영역에서, 계통 특이적 프로모터 필요 없이 >70% 희소돌기아교세포 지향성이 달성되었다. 희소돌기아교세포 표면에 대한 AAV/Olig001 캡시드의 고유한 친화성은 전달된 벡터의 총 용량에 가능한 가깝게 표적 세포에서 발현되는 것을 보장하기 때문에, 다른 비희소돌기아교세포 지향성 캡시드 혈청형에서의 선택적 프로모터 사용에 비해 상당한 이점이다. 이러한 데이터는 뇌의 백색질을 표적화하는 별개의 ROA의 이점을 식별하며, 여기서 ICV ROA는 카나반병 치료를 위한 모델로서 증상이 있는 성체 nur7 마우스에서 전임상 효능 연구에 대한 적용 가능성을 입증하였다.
실시예 4: 야생형 뇌와 nur7 뇌 간 AAV/Olig001-GFP 형질도입 효율 차이.
카나반병의 nur7 마우스 모델은 2주령에서 대근육운동 기능장애의 증상을 나타낸다. 6주령까지, nur7 뇌는 상당한 세포 손실, 백색질 손실을 겪으며, 광범위하게 액포가 형성된다. 따라서, 6주령 nur7 뇌는 건강한 뇌와 현저하게 상이한 미세환경으로, AAV/Olig001-GFP 확산 및 형질도입에 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 6주령 야생형 마우스 코호트에서, ICV ROA를 통한 1x1011 용량 투여는, nur7 마우스의 뇌 형질도입 수준과 비교하여 피질 및 피질하 백색질에서 형질도입 수준을 유의하게 감소시켰다(도 12)(각 군 당 n=5마리 동물, 평균 +/- sem으로 제시됨, *p<0.05, **p<0.01).
피질 및 피질하 백색질 내 GFP 양성 세포의 입체논리적 추정치는, 야생형 뇌에서 전이유전자 발현의 발생률이 유의하게 감소되었음(적어도 50% 감소)을 입증하였다. 강렬한 GFP 형광은 측뇌실에 바로 인접한 영역에 제한되어 있었으며, 야생형 뇌에서의 피질 및 피질하 백색질 GFP 형광 신호는 중간 정도였다. 소뇌에서의 전이유전자 발현은 불량하였다. 이러한 데이터는, AAV/Olig001 확산 및 형질도입 효율에 대한 유전자형 특이적 영향을 나타낸다. 또한, 인간 카나반병 뇌와 마찬가지로 nur7 뇌는 과하게 액포가 형성되어 있고, 뇌실이 과도하게 크며, 극심하게 상승된 NAA를 갖기 때문에, 이러한 징후 및 증상은 인간 AAV/Olig001 치료제의 벡터 확산 및 생체분포에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있다.
실시예 5: 로타로드 성능을 개선시키는 nur7 마우스에의 AAV/Olig001-ASPA의 생체내 투여
방법
6주령 nur7 마우스에 서열번호 2의 코돈 최적화된 ASPA 서열을 포함하는 AAV/Olig001-ASPA의 용량을 투여하였다. 코돈 최적화된 ASPA 및 조절 요소를 인코딩하는 발현 플라스미드는 도 13에 제시되어 있다. 2.5x1011, 7.5x1010 또는 2.5x1010 vg의 총 용량을 뇌실내(ICV) 투여 경로(ROA)를 통해 투여하였다. 모든 용량 코호트에 대한 벡터는 총 부피 5 μl로 전달하였으며, 뇌의 각 반구의 측뇌실에 2.5 μl씩 주사하였다. 연령 일치 nur7 동물의 대조군 코호트는 동일한 ROA를 통해 동일한 부피의 생리 식염수 주사를 투여 받았다. 연령 일치 나이브 야생형 동물을 모든 운동 기능 시험을 위한 보정 참조로 사용하였다. 벡터 투여 2주 후, 동물을 가속 로타로드의 낙상 대기시간에 대해, 그리고 개방 영역 활성 챔버를 사용하여 전신 활성에 대해 4개월 동안 1개월에 1회 시험하였다. 모든 행동 시험은 처리에 대해 맹검화된 개체로 수행하였다.
결과
로타로드 성능
투여된 최고 용량(2.5x1011 vg)에서, AAV/Olig001-ASPA는 nur7 마우스에서 로타로드 성능으로 측정 시 점진적으로 악화되는 균형, 악력 및/또는 운동 협응을 연령 일치 야생형 동물과 구별이 불가능하고 모의군 nur7 코호트에 비해 매우 유의하게 개선된 수준으로 구제하였다. 이러한 용량에서, AAV/Olig001-ASPA 처리된 동물에서의 증가된 로타로드 성능은 반복 측정 ANOVA(p=0.028)에 의해 결정된 바와 같이 전체 연구 기간에 걸쳐 유의하였고, 독립표본 스튜던트 t-검정에 의해 측정된 바와 같이 각 개별 시점에서 유의하게 더 높았다. 중간 범위 용량(7.5x1010 vg)에서, AAV/Olig001-ASPA는 또한 시험된 각 시점에서 nur7 마우스의 유의하게 개선된 로타로드 성능을 촉진시켰지만, 이러한 개선이 전체 연구 기간에 걸쳐 유의하지는 않았다(반복 측정 ANOVA p=0.19). 투여된 최저 용량(2.5x1010 vg)에서, AAV/Olig001-ASPA는 시험된 마지막 2개 시점(18개월 및 22개월)에서만 개선된 로타로드 성능을 촉진시키는 데 효과적이었다. 표 1은 각 처리군에 대해 초 단위로 측정된 평균 낙상 대기시간(표준 편차 포함)을 제공한다. 각 군에 대해, 12마리 마우스(수컷 6마리와 암컷 6마리)를 시험하였다. 표 2는 각 연령에서 AAV/Olig001-ASPA 처리된 마우스와 모의군 nur7 마우스 간 독립표본 스튜던트 t-검정에 대한 p 값을 제공한다. 10주 및 14주차에 모의 처리된 마우스에 비해, 2.5 x 1010으로 투여된 마우스를 제외한 모든 군에서 통계적으로 유의한 개선이 관찰되었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
도 14는 AAV/Olig001-ASPA nur7 용량 코호트, 모의군 nur7 및 나이브 야생형 대조군 각각에 대한 일생 연구 기간에 걸쳐 플롯팅된 평균 로타로드 낙상 대기시간을 보여준다. 3개의 모든 용량 코호트에서 낙상 대기시간이 증가하였으며, 여기서 가장 높은 용량은 반복 측정 ANOVA에 따라 전체 연구 기간에 걸쳐 유의하였다(*).
개방 영역 활성
로타로드가 수행된 각 연령에서, 동물을 개방 영역 활성 챔버에서 전신 운동 기능에 대해 평가하였다(도 15). 동물에게 매회 단일 20분 세션을 제공하고, 세션 당 총 이동 거리를 기록하였다. 연령 일치 야생형 동물에 비해, 모의군 nur7 마우스는 모든 연령에서, 특히 후기 시점에서 유의하게 과잉활성을 나타냈다. 22주령에서, 모의군 nur7 동물은 야생형에 비해 활성의 유의한 3배 증가를 나타냈다(이동 거리; p=0.0202). 대조적으로, 2.5x1011 용량의 AAV/Olig001-ASPA는 nur7 마우스에서 모의 대조군에 비해 통계적으로 유의하고(p=0.0312) 연령 일치 야생형과 구별이 불가능한 정규화된 활성 수준을 유도하였다. 더 낮은 7.5x1010 용량의 AAV/Olig001-ASPA는 모의군 nur7 패턴보다 야생형과 더 밀접하게 유사한 활성 패턴을 유도하였지만, 22주령에서는 모의군에 대한 통계적 유의성 임계값 바로 아래에 있었다(p=0.1181). 최저(2.5x1010) 용량의 AAV/Olig001-ASPA는 병리학적 과잉활성을 유의하게 정상화하지 않았고, 야생형 참조보다 모의 nur7 대조군과 더 밀접하게 유사하였다.
이러한 동일한 동물에서 개방 영역 활성의 평가는 AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 동물에서 과잉활성의 용량 의존적 정상화를 입증하였다. 데이터는 평균 +/- sem로 표시된다(군 당 n=6마리 동물).
NAA 축적 및 벡터 게놈(vg) 카피 수
22주차 로타로드 시험 후, 마우스를 희생시키고, 뇌 조직을 단리하였다. 각 뇌의 한쪽 반구는 NAA의 HPLC 분석을 위해 처리하고, 나머지 반구는 정량적 PCR에 의한 벡터 게놈(vg) 카피 수 분석을 위해 처리하였다.
모의군 식염수 처리된 nur7 마우스 뇌는 ASPA 기능 상실로부터 예상되는 바와 같이 전형적으로 상승된 NAA를 함유하였다(도 16). AAV/Olig001-ASPA 처리된 코호트에서 병리학적으로 상승된 NAA의 용량 반응 감소가 관찰되었으며, 여기서 최고 2.5x1011 용량은 고도로 유의한 2.6배 감소를 유도하였고(p=5.06x10-6), 중간 7.5x1010 용량은 1.6배 감소를 유도하였고(p=5.17x10-5), 최저 2.5x1010 용량은 1.4배 감소를 유도하였다(p=0.001). 최고 용량의 AAV/Olig001-ASPA로 처리된 nur7 뇌의 NAA는 실제로 연령 일치 야생형 뇌보다 유의하게 더 낮았다(p=0.0012).
NAA 분석을 위한 뇌의 나머지 반구는 재조합 AAV/Olig001-ASPA 발현 카세트의 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 서열에 대해 표적화된 맞춤형 TaqMan 프로브/프라이머 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 벡터 게놈(vg) 카피 수를 정량화하는 데 사용하였다. 반구의 총 DNA 함량을 상업적으로 입수 가능한 DNA 정제 컬럼 및 키트(Qiagen)를 사용하여 단리하고, 이와 같이 생성된 DNA 샘플을 정제된 플라스미드 표준 곡선에 대해 실행하여 각 샘플에 대한 vg/습윤 조직 중량을 생성하였다. 생성된 조직의 vg/mg 값은 벡터 용량에 대한 NAA의 반응성과 일치하는 투여된 AAV/Olig001-ASPA 용량을 반영하였다(도 17).
액포형성 분석
AAV/Olig001-ASPA로 처리된 nur7 마우스의 뇌를 비편향 입체학으로 분석하여 시상 및 소뇌 백색질/교뇌 내 액포 체적 분율을 벡터 용량의 함수로 정량화하였다(도 18). 빈 공간이 차지하는 각 관심 영역 내 영역을 액포로 정의하고, 전체 관심 영역 체적의 백분율로 표시하였다. 각 용량에서, AAV/Olig001-ASPA 처리는 모의 처리된 마우스와 비교하여 시상 액포 체적 분율의 고도로 유의한 감소로 나타난 바와 같이 시상 액포형성의 완전한 구제를 유도하였다(2.5x1011, p=4.6 x10-8; 7.5x1010, p=6.4x10-8; 및 2.5x1010, p=6.2x10-8)(도 19). 소뇌 백색질/교뇌에서의 액포형성 또한 모의 처리된 마우스와 비교하여 모든 용량에서 유의하게 구제되었으나(2.5x1011, p=1.3x10-5; 7.5x1010, p=2.5x10-5; 및 2.5x1010, p=0.0009), 구제 정도는 투여된 벡터 용량에 비례하였다. 최저 2.5x1010 용량 코호트는 최고 2.5x1011 용량에 비해 유의하게 증가된 액포 체적 분율을 나타냈지만(p=5.74x10-6), 모의 처리된 대조군의 액포 체적 분율보다는 유의하게 낮았다(p=0.0009)(도 19).
희소돌기아교세포 회복
액포형성에 대해 분석한 동일한 뇌를 희소돌기아교세포를 식별하기 위한 Olig2 면역조직화학을 위해 처리하였다. 각각 액포형성에 의해 영향을 받은 영역과 영향을 받지 않은 영역에서 상재 백색질 생성 세포의 유의한 차이를 식별하기 위해 비편향 입체학을 통해 시상 및 피질을 모두 Olig2 양성 세포에 대해 샘플링하였다(도 20). 모의군 nur7 뇌는 연령 일치 야생형 뇌에 비해 Olig2 양성 세포의 막대한 4.6배 손실을 나타냈으며, 이는 정상 야생형 함량의 21%에 불과하였다(p=4.9x10-7). AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 마우스 및 모의 처리된 nur7 마우스의 시상 내 Olig2 수(도 21)는 모의 대조군에 비해 3개의 모든 AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 코호트에서 희소돌기아교세포의 유의한 증가를 나타냈다(2.5x1011 vg, p= 6.75x10-8; 7.7x1010 vg, p= 0.026; 2.3x1010 vg, p= 3.18x10-5). 피질 영역에서의 Olig2 손실은 덜 극적이었지만, 유의한 수준이었다(야생형 마우스에 비해 모의 처리된 nur7 마우스에서 1.7배 감소; p=0.0025). 2.5x1011 vg 처리된 nur7 뇌의 피질 내 Olig2 함량(도 21) 또한 모의 처리된 nur7 대조군 마우스에 비해 유의하게 증가하였지만(p= 0.0002), 2개의 더 낮은 용량 코호트 뇌에서는 유의하지 않았다.
뉴런 회복
시상 및 피질에서 Olig2 염색에 사용된 동일한 22주령 뇌의 NeuN 양성 뉴런에 대해 점수를 매겼다(도 22). 모의 처리된 nur7 동물은 연령 일치 야생형 동물 값의 약 35%인 시상 뉴런의 수를 나타냈다(p=2.8x10-5)(도 23). 2.5x1011 AAV/Olig001-ASPA로 처리된 Nur7 마우스는 모의 처리된 대조군 마우스보다 2.3배 증가되고(p=0.0009), 야생형 마우스에서 관찰된 시상 뉴런의 약 84%인 시상 뉴런의 수를 함유하였다. 2개의 더 낮은 용량, 7.5x1010 및 2.5x1010에서, AAV/Olig001-ASPA는 모의 처리된 대조군 마우스보다, 각각, 1.8배 및 1.6배 증가된 정도로(p=0.012; p=0.042) 시상 NeuN 양성 세포 증가를 촉진시켰다. 피질(운동 및 체성감각)에서, 연령 일치 야생형 마우스 뇌에 비해 모의 처리된 nur7 마우스 뇌에서의 뉴런 손실은 덜 막대했지만, 유의하였다. 모의 처리된 마우스의 피질은 야생형 마우스에서 관찰된 NeuN 양성 세포의 약 80%를 함유하여, 1.2배 감소를 나타냈다(p=0.005). 2.5x1011 AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 마우스는 야생형 마우스에서 관찰된 피질 뉴런의 약 98%이고, 모의 처리된 nur7 마우스에서 관찰된 피질 뉴런 수에서 1.2배 증가된(p=0.013) 피질 뉴런의 수를 함유하였다. AAV/Olig001-ASPA의 연속 용량은 모의 처리된 군에 비해 피질 뉴런에서 안정한 1.2배 증가를 유도하였다. 7.5x1010 용량의 경우, 샘플링된 데이터의 높은 분산으로 인해 이러한 증가가 유의하지 않았다(p=0.113). 최저 2.5x1010 용량에서, AAV/Olig001-ASPA 처리된 마우스는 모의 처리된 대조군에 비해 피질 뉴런에서 유의한 1.2배 증가를 유지하였다(p=0.05).
개선된 미엘린화
AAV/Olig001-ASPA로의 처리 후 미엘린화 회복 정도의 지표를 제공하기 위해, 비편향 입체학을 사용하여 모의 처리된 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된 22주령 nur7 뇌 피질 전체에 걸쳐 피질 미엘린 염기성 단백질 양성 섬유 길이 밀도(MBP-LD)를 정량화하였다. 운동 및 체성감각 피질을 3차원 조직 공간에서 등방성 프로브 섬유 상호작용에 대한 점수를 매기기 위해 컴퓨터 생성 프로브를 사용하여 MBP 양성 섬유에 대해 샘플링하고, 피질 내 총 MBP 양성 섬유 길이의 합을 샘플링된 조직의 체적으로 나누어 최종 MBP 길이 밀도를 제공하였다(mm3 당 섬유 μm)(도 24). 연령 일치 야생형 뇌와 비교하여, 모의군 nur7 뇌는 피질 MBPLD에서 고도로 유의한 2배 감소를 나타냈다(p=0.0001). 3개의 모든 용량에서 AAV/Olig001-ASPA로의 처리는 모의 대조군에 비해 피질 MBP-LD의 유의한 증가를 나타냈으며, 개선 정도는 용량에 비례하였다(2.5x1011 p=0.0014; 7.5x1010 p=0.003; 2.5x1010 p=0.016). 모의 처리된 및 AAV/Olig001-ASPA 처리된 nur7 마우스 뇌를 항미엘린 염기성 단백질(MBP)로 염색하였다(도 25).
이러한 데이터는, 카나반병 마우스 모델의 AAV/Olig001-ASPA 처리가 균형, 악력 및/또는 운동 협응, 운동 기능을 개선시키고, 뇌에 존재하는 NAA의 양을 감소시키고, 뇌의 액포형성을 감소시키고, Olig2 및 NeuN 양성 세포의 수를 증가시키고, 미엘린화를 회복시킨다는 것을 입증한다.
실시예 6: 카나반병 유전자 요법을 위한 CLARITY-보조 생체분포
카나반병 표현형 제시 Nur7 마우스 뇌에서 녹색 형광 단백질(GFP) 전이유전자를 갖는 희소돌기아교세포 지향성 rAAV 벡터(Olig001)의 생체분포를 3차원(3D) 조직 투명화 및 이미지화 방법을 사용하여 평가하였다. 이는, 대체 투여 경로(ROA)를 통해 투여된 Nur7 마우스 반뇌 내 벡터 생체분포의 전반적인 제시 및 체적 측정을 가능하게 한다. 뇌실내(ICV) 및 뇌실질내(IP) ROA를 생체분포 효능에 대해 비교하고, 이러한 방법을 전통적인 2차원(2D) 조직학적 평가에서 얻은 전형적인 입체학 데이터를 보완하는 데 사용하였다.
본 실시예는, 카나반병 마우스 모델의 성체 마우스 반뇌에서 AAV/Olig001-GFP 생체분포를 평가하는 데 있어서의 3D 방법의 적용 가능성 및 이의 중요성을 입증한다. 결과는, 단면광 현미경 데이터의 3D 투명화된 뇌 이미지 및 생체분포 추정치의 표로 작성된 매개변수의 가시적 정성적 및 정량적 표현으로 제시된다.
샘플 제조 및 이미지화
ROA 당 4마리 성체 마우스(총 8마리)에 6주령에서 5 x 1011 벡터 게놈(vg)/동물을 투여하고, 투여 2주 후에 희생시켰다. PFA 고정된 뇌를 받아 3D 조직 투명화 및 체적 측정용 단면광 현미경 이미지화를 위해 준비하였다. 각 뇌를 시상으로 이등분하고, 우측 반구를 CLARITY를 사용하여 조직 투명화에 적용하였다(문헌[Chung et al., Nature, 2013]). 각 샘플을 히드로겔 포매 및 중합으로 동일하게 제조한 후, 상업적으로 입수 가능한 시약(Logos Biosystems)을 이용하는 상업용 장치(X-Clarity, Logos Biosystems)를 사용하여 전기영동 조직 투명화에 적용하였다. 샘플 취급 동안 주요 단계에서 거시적 현미경사진을 수집하여 샘플 조건을 문서화하였다(도 26).
Zeiss Z.1 단면광 현미경을 사용하고, 5x 배율 대물렌즈 및 각각의 반뇌 전체를 포괄하는 타일링 기반(tiling-based) 수집을 이용하여 각각의 투명화된 반뇌의 전체 3D 현미경 이미지화를 수행하였다. GFP 발현을 검출하기 위해 이미지화 매개변수를 조정하고, 일관성을 보장하고 샘플에 걸친 상대적인 비교를 가능하게 하도록 모든 샘플에 걸쳐 일정하게 유지하였다. 이미지 수집 및 분석을 통해 모든 샘플을 조직 투명화와 동일한 조건 하에서 처리하고 이미지화하였다.
이미지 처리 및 분석
미가공 데이터를 각각의 반뇌에 대해 자체 맞춤형으로 설계된 알고리즘을 사용하여 전체 매끄러운 3D 이미지로 사전처리하고 재구성하였다. 최종 이미지는 각각 하나의 반뇌를 포함하였고, 이를 전반적인 정량적 생체분포 분석을 위한 상업용 3D 이미지 처리 및 분석 프로그램(Imaris, Bitplane)에 임포팅하였다. 먼저, 전체 반뇌 체적 내에서 (GFP) 신호 값의 전체 평균 및 중간값을 계산하였다. 나아가, 2개의 GFP 강도 임계값을 선택하여 "낮은(저)" 또는 "높은(고)" GFP 발현을 지정하였다(도 27). 이어서, 이러한 임계값을 일관성을 위해 모든 샘플에 걸쳐 일정하게 유지하였다. 이어서, 이와 같이 분류된 강도 영역의 체적을 결정하고, 전체 반뇌 체적과 비교하여 "고/저 발현 vol%"을 생성하였다(표 3).
결과
각 반뇌의 거시적 현미경사진 및 완전 3D 이미지화는 2가지 ROA에 걸친 GFP 발현의 가변적인 생체분포 패턴을 나타냈다(IP 대 ICV; 도 28 및 도 30). 또한, 세포 유형 지향성을 세포 형태의 가시적 평가 및 이의 결정된 공간 위치로 평가하였다. 이러한 생체분포 패턴은 벡터 확산 정도에 따라 샘플에 걸쳐 상이하였지만, 하위영역 형질도입 패턴에서의 유사성은 소뇌에서의 푸르키네 세포의 높은 발현과 같이 샘플에 걸쳐 일관되게 유지되었다. 이어서, 전반적인 강도와 함께 '낮은' 및 '높은' GFP 발현의 정량화를 계산하고, 각 반뇌에 대해 표로 작성하였다(표 3). 이전 실시예에서의 입체논리적 평가와 일치하게, 투명화된 반뇌는 ICV 주사 후 카나반병에 대한 중요 영역인 피질하 백색질 내에서 우수한 벡터 확산을 나타냈다. 또한, IP 주사는 높은 GFP 강도의 하위영역을 생성하였지만, 이러한 하위영역의 대부분은 주사 부위 주변에 집중되어 있어, 입체논리적 평가에서 얻은 결론을 뒷받침하였다.
Figure pct00003
결론 및 의의
온전한 조직 투명화된 마우스 뇌의 체적 측정용 이미지화는 AAV/Olig001 생체분포의 보다 포괄적이고 전체적인 평가를 제공한다. 분포의 전체적인 수집 및 정량화를 가능하게 하는 맞춤형 알고리즘은 입체학 방법에서 얻은 고해상도 정량화를 뒷받침한다. 기관 수준 이미지화의 평가는 3D 공간 구조 및 영역 연결성을 유지하는 이러한 생체분포의 전반적인 평가를 제공한다. 최종적으로, 다양한 ROA의 디지털 편집을 사용하여 최적 형질도입 효율 및 세포 유형 특이적 지향성을 평가하기 위해 AAV/Olig001 ROA에 대한 추가 평가를 수행하는 경우 향후 참조로 사용되는 디지털 '라이브러리'를 생성할 수 있다.
실시예 7: AAV 생체분포 및 약력학적 효과의 CLARITY 기반 체적 평가
본 실시예에서, 상기 실시예 6에 기재된 CLARITY 조직 투명화 기술을 이용하여 nur7 마우스 뇌에서 AAV/Olig001-ASPA의 주사 후 탈미엘린화 역전에 대한 전체 및 국소 전이유전자 매개 약리학적 효과를 평가하고 입증하였다.
간략하게, nur7 마우스를 2개의 군으로 나누고, 상기 기재된 방식으로 ICV 또는 IP 경로를 통해 AAV/Olig001-ASPA("Olig1" 또는 "Olig1-ASPA") 또는 식염수("Nur7")를 투여하였다. 이어서, 상기 기재된 방식으로 시상 및 소뇌 백색질/교뇌 내 액포 체적 분율을 정량화하기 위해 2개 군의 마우스 뇌를 분석하였다. 야생형 마우스("WT")의 뇌를 대조군으로서 또한 분석하였다. 결과는 도 31에 제시되어 있다. 보다 구체적으로, 도 31b의 화살촉은, nur7 마우스의 시상 영역이 WT에는 존재하지 않고 Olig1-ASPA 처리된 조직에서는 거의 완전히 구제된 가시적 액포형성을 나타냈음을 나타낸다. 또한, 도 31c에 제시된 바와 같이, 수동 투명화 1일 후, nur7 마우스 조직은 WT 및 Olig1-ASPA 처리된 조직에서보다 더 높은 투명도에 이르렀다. 이러한 결과는, AAV/Olig001-ASPA 처리가 nur7 마우스에서 뇌의 액포형성을 감소시키고 미엘린화를 회복시켰음을 입증한다.
유사한 해부학적 배향으로 3개의 모든 군의 3D 이미지에서 추출된 2D 단일 슬라이스에서 세포 계수 분석을 또한 수행하였다(도 32a). 도 32b 및 도 32c에 제시된 바와 같이, 평균 핵 밀도(분할 영역에 의해 정규화된 수)는 피질 영역 내 세포 밀도에서 전반적으로 거의 차이를 나타내지 않았지만, Nur7 군의 마우스는 시상 영역에서 유의하게 더 낮은 전체 핵 밀도/핵 영역을 나타냈다. 대조적으로, Olig1-ASPA 군 및 WT 군은 시상 영역에서 유사한 전체 핵 밀도 또는 핵 영역을 나타냈다. 이러한 결과는, nur7 마우스의 AAV/Olig001-ASPA 처리가 시상 영역 내 세포의 수를 WT 군에서 볼 수 있는 바와 근접한 수준으로 유지하거나 증가시켰음을 입증한다.
상기 기재된 방식으로 희소돌기아교세포를 식별하기 위해 액포형성에 대해 분석된 뇌를 MBP의 면역형광 염색을 위해 처리하였다. 이를 위해, 약력학적 치료 효과를 검사하기 위해 3D 체적 분석을 수행하였다. 2 mm 조직 슬라이스의 전체 3D 체적을 결정하고, SYTO(핵 마커)뿐 아니라 MBP에 대한 평균 형광 강도를 계산하였다. Nur7 군 마우스의 조직이 더 낮은 평균 MBP 형광 값을 나타낸 것으로 확인되었다. 대조적으로, Olig1-ASPA 처리된 군은 거의 WT 군의 수준으로 전반적인 MBP 신호를 증가시켰다(도 33b).
MBP 체적을 신호 임계값을 통해 계산하는, 추가의 3D 체적 분석을 수행하였다. 임계값을 2000 초과의 형광 값으로 설정된 임계값을 이용하여 더 제한적으로(도 33c, 좌측 패널) 또는 임계값 1000을 이용하여 더 포괄적으로(도 33c, 우측 패널) 수행하였다. 두 경우 모두, Nur7 군의 마우스에서 MBP 결손이 관찰되었다(도 33d). 대조적으로, MBP 체적의 증가는 Olig1-ASPA 군에서, 특히 더 낮은 임계값을 사용한 경우에 명확하게 나타났으며, 여기서 전체 MBP 체적 값은 WT 군의 수준에 근접하였다(도 33d).
영역 기반 분석을 시상 영역에서 3D로 수행하였다. 영역의 일부의 수동 분할은 도 33e에 제시되어 있다. 핵(SYTO) 및 미엘린(MBP) 마커 둘 모두에 대한 이러한 영역 내 평균 형광 강도는 도 33f에 제시되어 있다. Olig1-ASPA 군의 SYTO 및 MBP 수준이 거의 WT 군의 수준에 이르렀음을 확인하였다. 대조적으로, Nur7 샘플은 두 가지 마커 모두에서 더 낮은 평균 형광 값을 나타냈다. 영역 기반 분석을 또한 피질의 일부에서 수행하였다. 핵(SYTO) 및 미엘린(MBP) 마커 둘 모두에 대한 이러한 피질 영역 내 평균 형광 강도 수준은 도 33g 및 도 33h에 제시되어 있다. 전반적인 경향은 도 33f에 제시된 바와 유사하였다. 피질 및 시상 영역 내 3D 세포 집중도(100 um2 당 핵) 또한 수득하였다. 도 33i에 제시된 바와 같이, 두 가지 영역 모두에서 전반적인 핵 집중도는 Nur7 군의 마우스에서 더 낮았다. 대조적으로, Olig1-ASPA 군의 마우스 시상 영역 내 3D 세포 집중도는 WT 군의 수준에 근접한 수준으로 나타났다.
이러한 결과는, AAV/Olig001-ASPA의 투여가 nur7 마우스 뇌에서 탈미엘린화 및 세포 손실을 구제하거나 역전시켰음을 입증한다.
등가물
전술한 명세서는 당업자가 본 개시내용을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 간주된다. 전술한 설명 및 실시예는 본 개시내용의 특정 예시적인 구현예를 상세하게 설명한다. 하지만, 전술한 내용이 문맥에 상세하게 설명되어 있더라도, 본 개시내용은 다수의 방식으로 실시될 수 있으며, 본 개시내용은 첨부된 청구범위 및 이의 등가물에 따라 해석되어야 한다는 것을 이해해야 한다.
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등을 포함하는 본원에 인용된 모든 참고문헌, 및 이들에 인용된 참고문헌은, 이들이 아직 존재하지 않는 범위까지, 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc. <120> Modified Nucleic Acids Encoding Aspartoacylase (ASPA) and Vector for Gene Therapy <130> 323429.00101 <150> 63/016,507 <151> 2020-04-28 <150> 63/077,144 <151> 2020-09-11 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 942 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 atgacctcct gtcatatagc cgaggagcac atccagaaag tggccatttt cggcgggaca 60 catgggaacg agctgactgg cgttttcctg gtcaagcact ggctcgaaaa tggcgcggaa 120 attcagagaa cgggcctgga ggtcaaacct tttattacta acccccgcgc ggtgaagaaa 180 tgtacccggt acatcgactg cgatcttaac cgaatctttg atctggaaaa tctgggaaaa 240 aaaatgagcg aggacctgcc ctacgaagtc cgcagagcac aggagattaa tcatctcttc 300 ggacccaagg actccgagga cagctacgat atcatcttcg acttgcacaa tactacttcc 360 aatatgggat gtaccttgat actggaggac tcacgaaata acttcttgat tcagatgttc 420 cattacatca aaacctctct cgctcctctc ccttgctacg tatatttgat cgagcaccct 480 agtctgaaat atgccactac acgaagcata gctaagtatc ccgttggtat tgaggtgggc 540 ccccagcccc agggagtgct gcgggctgac atccttgacc 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tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 1980 aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 2040 gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaacagca ggcatgctgg ggatgcggtg 2100 ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctttggac gcgtaggaac ccctagtgat 2160 ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt 2220 cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gccagctggc 2280 gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctg 2333

Claims (40)

  1. 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA: aspartoacyltransferase)를 인코딩하는 단리된 핵산.
  2. 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산.
  3. 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈.
  4. 제3항에 있어서, 재조합 아데노연관바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated virus) 벡터 게놈인 벡터 게놈.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 자가 상보적인 벡터 게놈.
  6. 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열을 포함하는 변형된 핵산을 포함하는 벡터 게놈과, Olig001, Olig002, Olig003, AAV1, AAV2, AAV3, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAVhu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV2i8, AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, AAV-DJ, AAV-DJ/8, AAV-DJ/9 및 AAV-LK03의 캡시드로 이루어지는 군에서 선택되는 캡시드를 포함하는 재조합 아데노연관바이러스(rAAV) 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 캡시드가 Olig001, Olig002 또는 Olig003 캡시드인, rAAV 벡터.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 캡시드가 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Olig001 캡시드이며, 여기서 VP1은 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드가 VP1을 포함하는 Oligo001 캡시드이며, 여기서 VP1은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 자가 상보적인, rAAV 벡터.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 적어도 하나의 AAV 역 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat) 서열, 인핸서, 프로모터, 엑손, 인트론 및 폴리아데닐화(polyA) 신호 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 적어도 하나의 AAV2 ITR, 거대세포바이러스(CMV) 인핸서, 혼성체 형태의 CBA 프로모터(CBh 프로모터), 닭 B-액틴(CBA) 엑손, CBA 인트론, 마우스 미닛 바이러스(MVM: minute virus of mice) 인트론 및 소 성장 호르몬(BGH) polyA로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나의 ITR, 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하는 인핸서, 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 프로모터, 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 엑손, 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 인트론, 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 인트론 및 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 polyA로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함하는, rAAV 벡터.
  14. 5'에서 3' 방향으로 하기 a) 내지 i)를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 rAAV 벡터:
    a) 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 AAV 역 말단 반복부(ITR);
    b) 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하는 인핸서;
    c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 프로모터;
    d) 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 엑손;
    e) 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 인트론;
    f) 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 인트론;
    g) 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산;
    h) 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 polyA; 및
    i) 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 AAV ITR.
  15. 제14항에 있어서, 핵산이 자가 상보적인, rAAV 벡터.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Olig001 캡시드를 포함하며, 여기서 VP1은 서열번호 14의 서열을 포함하는, rAAV 벡터.
  17. 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 단백질 1(VP1)을 포함하는 Olig001 캡시드와, 5'에서 3' 방향으로 하기 a) 내지 i)를 포함하는 자가 상보적 핵산을 포함하는 rAAV 벡터:
    a) 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 AAV2 역 말단 반복부(ITR);
    b) 서열번호 6 또는 서열번호 17의 핵산 서열을 포함하는 CMV 인핸서;
    c) 서열번호 7의 핵산 서열을 포함하는 CBh 프로모터;
    d) 서열번호 8 또는 서열번호 18의 핵산 서열을 포함하는 CBA 엑손 1;
    e) 서열번호 9의 핵산 서열을 포함하는 CBA 인트론 1;
    f) 서열번호 10의 핵산 서열을 포함하는 MMV 인트론;
    g) 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 아스파르토아실트랜스퍼라아제(ASPA)를 인코딩하는 변형된 핵산;
    h) 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 BGH polyA; 및
    i) 서열번호 5, 서열번호 12 또는 서열번호 19의 핵산 서열을 포함하는 AAV2 ITR.
  18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  19. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터, 또는 제17항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, ASPA의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, ASPA의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태가 카나반병(Canavan disease)인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, rAAV 벡터가 뇌 및/또는 중추신경계에 직접 투여되는, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 뇌 실질, 척추관, 지주막하 공간, 뇌실, 대수조 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 중추신경계 영역에 투여되는, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터가 뇌실질내 투여, 척추강내 투여, 뇌실내 투여, 대수조내 투여 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법에 의해 투여되는, 방법.
  24. 숙주 세포로서, 제1항의 단리된 핵산, 제2항의 변형된 핵산, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 벡터 게놈, 또는 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제24항에 있어서, VERO, WI38, MRC5, A549, HEK293, B-50 또는 임의의 다른 HeLa 세포, HepG2, Saos-2, HuH7 및 HT1080으로 이루어지는 군에서 선택되는, 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서, 현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293 세포인 숙주 세포.
  27. 제26항에 있어서, ATCC(American Type Culture Collection) 번호 PTA 13274를 갖는 HEK293 세포인 숙주 세포.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, AAV rep 단백질, AAV 캡시드(Cap) 단백질, 아데노바이러스(Ad) 초기 영역 1A(E1a) 단백질, Ad E1b 단백질, Ad E2a 단백질, Ad E4 단백질 및 바이러스 연관(VA) RNA로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
  29. 카나반병(CD) 치료용 키트로서, 제1항의 단리된 핵산, 제2항의 변형된 핵산, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 벡터 게놈, 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터, 또는 제18항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 카나반병(CD) 치료용 키트.
  30. 제29항에 있어서, 키트 구성요소 중 하나 이상을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 표지 또는 삽입물을 추가로 포함하는, 키트.
  31. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ASPA의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한, 단리된 핵산, 변형된 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터 또는 약제학적 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 카나반병인, 단리된 핵산, 변형된 핵산, 벡터 게놈, rAAV 벡터 또는 약제학적 조성물.
  33. ASPA의 결핍 또는 기능장애와 관련된 질환, 장애 또는 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 용도로서, 제1항의 단리된 핵산, 제2항의 변형된 핵산, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 벡터 게놈, 또는 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항의 rAAV 벡터의 용도.
  34. 제33항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 병태가 카나반병인, 용도.
  35. 하기 단계 a) 내지 e)를 포함하는, 대상의 뇌에서 Olig001 캡시드를 포함하는 rAAV 벡터로부터 발현되는 전이유전자(transgene)의 생체분포를 결정하는 방법:
    a) 뇌실내(ICV) 주사 또는 뇌실질내(IP) 주사에 의한 대상에게의 rAAV 벡터의 투여;
    b) 뇌의 고정화;
    c) 뇌의 전기영동 투명화;
    d) 뇌 조직 절편의 3D 현미경 이미지화;
    e) 전이유전자 발현의 정량화.
  36. 제35항에 있어서, 전이유전자가 마커를 인코딩하며, 여기서 마커는 녹색 형광 단백질(GFP)인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 전이유전자가 ASPA를 인코딩하는, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자 발현이 rAAV 벡터 형질도입 효율과 상관관계가 있는, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 형태의 평가 및 공간적 위치 결정에 의한 세포 유형 지향성(tropism)의 평가를 포함하는 단계 (f)를 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자 발현의 체적 렌더링(volumetric rendering)을 추가로 포함하는, 방법.
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