KR20210132684A - 비에띠 결정 이상증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

비에띠 결정 이상증을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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야체크 크롤
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노파르티스 아게
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Abstract

비에띠 결정 이상증을 갖는 대상체를 치료하기 위해 망막, 예를 들어, 망막의 RPE 세포에 이종성 CYP4V2 유전자를 전달하기 위한 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다.

Description

비에띠 결정 이상증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
관련출원에 대한 상호참조 및 서열목록의 포함
본 출원은 미국 특허법(35 U.S.C. § 119(e)) 하에서 2019년 2월 25일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/810,250호의 유익을 주장하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 포함된다. 파일명 "PAT058467-WO-PCT SQL_ST25"으로 포함되고, 204,397 바이트(운영 체제 MS-윈도우에서 측정)이며, 2020년 2월 22일자에 생성된 서열목록은 본 명세서와 함께 제출되고, 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
비에띠 결정 이상증(Bietti crystalline dystrophy: BCD)은 지질의 다수의 작은, 황색 또는 백색 결정질-유사 침착물이 망막에 축적된 후에, 맥락 망막 위축 및 진행성 시력상실이 이어지는, 상염색체 열성 장애이다. BCD를 갖는 대상체는 전형적으로 이들의 십대 또는 이십대에 시력 문제를 알아차리기 시작한다. 이들은 종종 시력 감소에 추가로 야맹증을 경험한다. 이들은 또한 보통 시야 영역, 가장 흔하게는 주변시를 상실한다. 또한 색각이 손상될 수도 있다.
시력 문제는 각 눈에서 상이한 속도로 악화될 수 있고, 증상의 중증도 및 진행은 동일한 가족 내에서조차 영향받는 대상체 간에 크게 다르다. 그러나, BCD를 갖는 대부분의 대상체는 40 또는 50세에 법적으로 맹인이 된다. 가장 영향받은 대상체는 보통 시야 중앙에서는 어느 정도의 시력을 유지하지만, 이는 전형적으로 흐릿하고, 처방 렌즈에 의해 교정될 수 없다.
BCD는 CYP4V2 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 인간 염색체 4의 긴 아암(arm) 상에 위치된 유전자는 시토크롬 P450 패밀리 4 서브패밀리 V 구성원 2를 암호화한다. 효소의 시토크롬 P450 패밀리 구성원으로서, ω-하이드록실라제는 지질 대사, 구체적으로는 다불포화된 지방산, 예컨대, 도코사헥사엔산(DHA) 및 에이코사펜타엔산(EPA)의 산화에 수반된다. 적어도 80종의 상이한 CYP4V2 유전자 돌연변이가 BCD를 갖는 대상체에서 확인되었다(Zhang et al., Mol Vis 24:700-711, 2018). BCD를 야기하는 CYP4V2 유전자 돌연변이는 효소 기능을 손상시키거나 제거하고, 지질 분해에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 그러나, 이들이 BCD의 구체적 징후 및 증상을 야기하는 방법은 알려져 있지 않다.
BCD는 전세계에서 대략 65,000명의 사람에 영향을 미치는 것으로 추정된다(문헌[Xiao et al., Biochem Biophys Res Co㎜ 409:181-186, 2011]; 및 문헌[Mataftsi et al., Retina 24:416-426, 2004]). 이는 동아시아 혈통의 사람, 특히 중국 및 일본 배경 혈통의 사람에서 더욱 흔하다. 현재, BCD에 대해 이용 가능한 치료는 없다.
본 발명은 일반적으로 재조합 바이러스 벡터, 및 망막 질환 및 실명, 예를 들어, BCD를 앓고 있는 대상체의 망막, 예를 들어, 망막 색소 상피(RPE) 세포에서 단백질을 발현시키기 위해 재조합 바이러스 벡터를 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 일 양상에서, 망막에 이종성 유전자를 전달할 수 있는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 망막, 예를 들어, 망막의 RPE 세포에 이종성 유전자를 보낼 수 있는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)인 바이러스 벡터에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, rAAV 바이러스 벡터는, AAV1 내지 AAV12를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 AAV 혈청형 중에서 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, rAAV 벡터 캡시드는 AAV8 혈청형이다. 특정 다른 실시형태에서, rAAV 벡터 캡시드는 AAV9 혈청형이다. 특정 실시형태에서, rAAV 벡터 캡시드는 AAV2 혈청형이다. 특정 실시형태에서, rAAV 벡터 캡시드는 AAV5 혈청형이다. 특정 실시형태에서, rAAV 벡터는 변형된 야생형 AAV 캡시드 서열로부터 유래된 신규한 합성 AAV 혈청형이다.
일 양상에서, 바이러스 벡터가 제공되되, 바이러스 벡터는, 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(iv) 폴리아데닐화(폴리A) 신호 서열; 및
(v) 3' ITR
을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) 인트론;
(iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(v) 폴리A 신호 서열; 및
(vi) 3' ITR
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(iv) 조절 요소;
(v) 폴리A 신호 서열; 및
(vi) 3' ITR
을 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) 인트론;
(iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(v) 조절 요소;
(vi) 폴리A 신호 서열; 및
(vii) 3' ITR
을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하의 길이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 벡터 게놈은 약 5 kb 이하의 길이를 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은 폴리A 신호 서열과 3' ITR 사이에 위치된 스터퍼(stuffer) 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 스터퍼 서열은 길이가 약 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 750, 750 내지 1,000, 1,000 내지 1,500, 1,500 내지 2,000, 2,000 내지 2,500 또는 2,500 내지 3,000개인 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에서, 5' ITR은 서열번호 1에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 편재하는 프로모터, 예를 들어, 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터, CBA 프로모터 또는 CAG 프로모터이되, 예를 들어, 프로모터는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 프로모터는 망막 색소 상피(RPE)-특이적 프로모터, 예를 들어, ProC2 프로모터, VMD2 프로모터, CYP4V2 프로모터 또는 RPE65 프로모터이되, 예를 들어, 프로모터는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 우선적으로 RPE 세포, 예를 들어, 인간 RPE 세포에서 CYP4V2의 발현을 촉진한다.
따라서, 본 발명은 서열번호 5의 핵산 서열 또는 서열번호 5의 상기 핵산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 이들로 이루어진 단리된 핵산 분자를 제공한다. 서열번호 5의 단리된 핵산은 서열번호 5의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 인간 또는 NHP 망막 세포, 예를 들어, 인간 또는 NHP RPE 세포에서 발현을 야기한다.
일부 실시형태에서, CYP4V2 암호화 서열은 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47 또는 서열번호 49에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 폴리A 신호 서열은 소 성장 호르몬 또는 유인원 바이러스 40 폴리A 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 예를 들어, 폴리A 신호 서열은 서열번호 18 또는 서열번호 19에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 3' ITR은 서열번호 22에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 인트론은 인간 성장 호르몬, 유인원 바이러스 40 또는 인간 베타 고빈(beta gobin) 인트론 서열을 포함하되, 예를 들어, 인트론은 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조절 요소는 B형 간염 바이러스 또는 우두처크 간염 바이러스 서열을 포함하되, 예를 들어, 조절 요소는 서열번호 16 또는 서열번호 17에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열의 바로 상류에 위치된 Kozak 서열을 포함하되, 예를 들어, Kozak 서열은 서열번호 12, 서열번호 51, 서열번호 52 또는 서열번호 53의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22; 및
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22; 및
xxviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22; 및
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
xxviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 혈청형 8, 9, 2 또는 5 캡시드를 포함한다. 일 실시형태에서, AAV8 캡시드는 서열번호 24, 25 및 26 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV8 캡시드는 서열번호 23에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, AAV9 캡시드는 서열번호 28, 29 및 30 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV9 캡시드는 서열번호 27에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, AAV2 캡시드는 서열번호 32, 33 및 34 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV2 캡시드는 서열번호 31에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 일 실시형태에서, AAV5 캡시드는 서열번호 36, 37 및 38 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV5 캡시드는 서열번호 35에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조성물은, 예를 들어, BCD를 갖는 대상체에서 시력을 개선시키는 데 사용하기 위한, BCD를 갖는 대상체를 치료함에 있어서의 용도를 위한 것이다.
또한 본 명세서에서 망막 세포에서 이종성 CYP4V2 유전자를 발현시키는 방법이 제공되되, 상기 방법은 망막 세포를 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 망막 세포는 RPE 세포이다.
다른 양상에서, 비에띠 결정 이상증(BCD)을 갖는 대상체의 치료 방법이 제공되되, 상기 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 예를 들어, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, BCD를 갖는 대상체에서 시력을 개선시키거나, 시기능(visual function) 또는 기능적 시력(functional vision)을 개선시키거나, 또는 시기능 또는 기능적 시력의 감소를 저해하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 예를 들어, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다.
일 양상에서, 유전자 카세트를 포함하는 핵산이 제공되되, 유전자 카세트는 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(iv) 폴리A 신호 서열; 및
(v) 3' ITR
을 포함한다.
일 실시형태에서, 유전자 카세트를 포함하는 핵산은 플라스미드이다.
일부 실시형태에서, 유전자 카세트는 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
용어 "캡시드"는 바이러스 또는 바이러스 벡터의 단백질 외피를 지칭한다. 용어 "AAV 캡시드"는 총 60개의 서브유닛으로 구성된 아데노-관련 바이러스(AAV)의 단백질 외피를 지칭하며; 각 서브유닛은 바이러스 단백질 1(VP1), VP2 또는 VP3일 수 있는 아미노산 서열이다(Muzyczka N and Berns KI (2001) Chapter 69, Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins).
용어 "유전자 카세트"는, 예를 들어, 걸쳐있는 제한 부위가 필요하지 않음에도 불구하고, 제한 부위의 하나 이상의 세트 사이에서 관심 대상의 하나 이상의 유전자 또는 암호화 서열을 운반하고, 이를 발현시킬 수 있는 DNA의 조작 가능한 단편을 지칭한다. 유전자 카세트, 또는 이의 일부는 제한 효소를 이용하여 단편을 절단하고 이를 다시 새로운 상황에, 예를 들어, 새로운 플라스미드 골격에 결찰시킴으로써 (종종 플라스미드 벡터에서) 하나의 DNA 서열로부터 다른 서열까지 전달될 수 있다.
용어 "이종성 유전자" 또는 "이종성 뉴클레오티드 서열"은 전형적으로 바이러스에서 천연 유래가 아닌 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭할 것이다. 대안적으로, 이종성 유전자 또는 이종성 뉴클레오티드 서열은 (예를 들어, 바이러스에서 자연적으로 결합되지 않는 프로모터와의 결합에 의해) 비천연 유래 환경에 놓인 바이러스 서열을 지칭할 수 있다.
용어 "역위 말단 반복부(inverted terminal repeat)" 또는 "ITR"은 야생형 AAV 용해 및 잠재적 수명 주기를 완료하는 데 필요한 T-형 회문구조를 형성할 수 있는 아데노-관련 바이러스(AAV) 및/또는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)에 존재하는 뉴클레오티드 서열의 신장부를 지칭한다(Muzyczka N and Berns KI (2001) Chapter 69, Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins). rAAV에서, 이들 서열은 게놈 패키징에서 그리고 제2 가닥 합성에서 기능적 역할을 한다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA) 세그먼트들 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 상기 용어는 전사될 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 기타 발현 시스템에서의 암호화 서열의 전사를 자극하거나 조절할 경우, 이 서열이 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사 가능한 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사 가능한 서열에 인접해 있고, 즉 이들은 시스-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 자신이 전사를 강화하는 암호화 서열에 물리적으로 인접해 있거나 이에 근접하여 위치할 필요가 없다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "서열 동일성 백분율"은 임의의 주어진 질의 서열과 대상 서열 간의 동일성 정도를 지칭한다. 대상 서열은 전형적으로 질의 서열 길이의 약 80% 내지 250%, 예를 들어, 질의 서열 길이의 82, 85, 87, 89, 90, 93, 95, 97, 99, 100, 105, 110, 115 또는 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 250%인 길이를 가진다. 2개의 뉴클레오티드 서열, 또는 2개의 아미노산 서열의 동일성%를 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예컨대 최적 정렬을 위해 갭이 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있으며, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다). 이어서, 상응하는 뉴클레오티드 위치 또는 아미노산 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용된 바와 같은 뉴클레오티드 또는 아미노산 "동일성"은 뉴클레오티드 또는 아미노산 "상동성"과 동등함). 2개의 서열 간 동일성%는 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수로서, 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려한다.
다른 실시형태에서, 두 아미노산 서열의 동일성 백분율은 아미노산 서열 둘 다의 상응하는 위치에서 동일한 패밀리의 아미노산(예를 들어, 양전하, 음전하, 극성 및 비하전, 소수성) 내의 아미노산 잔기의 보존의 함수로서 평가될 수 있다(예를 들어, 서열 둘 다의 특정 위치에서 발린 잔기 대신 알라닌 잔기의 존재는 높은 수준의 보존을 나타내지만, 서열 둘 다에서 특정 위치에서 아스파르테이트 잔기 대신 아르기닌 잔기의 존재는 낮은 수준의 보존을 나타냄). 본 발명의 목적을 위해, 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 백분율의 결정은 12의 갭 페널티, 4의 갭 연장 페널티, 및 5의 틀이동 갭 페널티로 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 이용하여 달성될 수 있다.
용어 "프로모터"는 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 조절하는 서열, 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 전사를 지시하는 데 충분한 서열뿐만 아니라 RNA 중합효소에 대한 인식 부위 및 효율적인 전사에 필요한 다른 전사 인자를 제공하고, 세포 특이적 발현을 지시할 수 있다. 전사를 지시하는 데 충분한 서열에 추가로, 본 발명의 프로모터 서열은 또한 전사를 조절하는 데 수반된 다른 조절 요소(예를 들어, 인핸서, 최소 프로모터, Kozak 서열 및 인트론)의 서열을 포함할 수 있다. 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터에서 유용한 프로모터의 예는 편재하는 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터(예를 들어, 서열번호 2), CBA 프로모터(예를 들어, 서열번호 3) 및 CAG 프로모터(예를 들어, 서열번호 4)를 포함한다. 대안적으로, RPE-특이적 프로모터는 우선적으로 망막의 RPE 세포에서 CYP4V2의 발현을 표적화하는 데 사용될 수 있다. RPE-특이적 프로모터의 예는 ProC2 프로모터(예를 들어, 서열번호 5) 및 VMD2 프로모터(서열번호 6)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CYP4V2 프로모터(서열번호 7) 또는 RPE65 프로모터(서열번호 8)는 RPE-특이적 프로모터로서 사용될 수 있다. 또한, 공지된 조절 요소를 혼합 및 매칭함으로써 기능적 프로모터를 생성하기 위한 표준 기법은 당업계에 공지되어 있다. "절단된 프로모터"는 또한 프로모터 단편으로부터 또는 공지된 조절 요소의 단편을 혼합 및 매칭함으로써 생성될 수 있다.
용어 "CYP4V2"는 시토크롬 P450 패밀리 4 서브패밀리 V 구성원 2를 지칭한다. 인간 CYP4V2 유전자는 염색체 4 상에서 발견되고, 예를 들어, 서열번호 13에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 암호화 서열을 가진다. 일 실시형태에서, 인간 CYP4V2 유전자의 코돈-최적화 서열이 사용될 수 있다. 이러한 코돈-최적화 CYP4V2 유전자의 일례는 서열번호 14에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 암호화 서열을 가진다. "CYP4V2 유전자 산물"은 CYP4V2 유전자에 의해 암호화된 단백질이다. 일 실시형태에서, 예시적인 인간 CYP4V2 유전자 산물은 서열번호 15에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 가진다. 일 실시형태에서, CYP4V2 암호화 서열은 서열번호 15의 아미노산 서열 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화한다. 다른 종으로부터의 CYP4V2 암호화 서열 및 CYP4V2 유전자 산물의 예는 표 2(예를 들어, 서열번호 39 내지 50)에서 찾을 수 있다. 용어 "CYP4V2 암호화 서열" 또는 "CYP4V2 유전자 CDS" 또는 "CYP4V2 CDS"는 CYP4V2 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 당업자는 CYP4V2 암호화 서열이 CYP4V2 유전자 산물 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일 실시형태에서, CYP4V2 암호화 서열은 서열번호 15, 40, 42, 44, 46, 48, 50의 아미노산 서열, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 암호화한다. CYP4V2 암호화 서열은 개재 조절 요소(예를 들어, 인트론, 인핸서, 또는 다른 비-암호화 서열)를 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수도 있다.
용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물(예를 들어, 포유류 및 비-포유류), 예컨대, 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이), 마우스, 랫트, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 언급된 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 임의의 질환 또는 장애(예를 들어, BCD)에 대한 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 호전시키는 것, 예컨대, 질환 또는 이의 임상적 증상 중 적어도 하나의 발생을 둔화 또는 정지 또는 감소시키는 것을 지칭한다. "치료하다" 또는 "치료"는 또한 대상체가 식별할 수 없는 것들을 포함하여 적어도 하나의 신체적 파라미터를 완화시키거나 개선하는 것을 지칭할 수 있다. "치료하는" 또는 "치료"는 또한 물리적으로(예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화) 또는 둘 모두로 질환 또는 장애를 조절하는 것을 지칭할 수 있다. 더 구체적으로, BCD의 "치료"는 BCD를 갖는 대상체에서 시기능, 기능적 시력, 망막 구조, 및/또는 삶의 질의 개선 또는 보존을 초래하는 임의의 조치를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료"는 BCD 증상 중 하나 이상이 개선되거나 또는 달리 유리하게 변경되는 임의의 방식을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 BCD 증상의 개선은 영구적이든 또는 순간적이든, 지속적이든 또는 일시적이든, 본 발명의 조성물 및 방법에 의한 치료에 기인하거나 이와 관련될 수 있는 임의의 완화를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "예방하는" 또는 "예방"은 질환 또는 장애의 발병 또는 발생 또는 진행을 예방 또는 지연시키는 것을 지칭한다. "예방"이 BCD에 관한 것이라면, 이하에 기재하는 바와 같이 BCD를 갖는 환자에서 그리고 악화에 대한 위험이 있는 환자에서 시기능, 기능적 시력, 망막 구조, 삶의 질, 및/또는 BCD 질환 파라미터의 악화를 방지하거나 늦추는 임의의 조치를 의미한다. 질환의 치료 및/또는 예방을 평가하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본 명세서에서 이하에 기재된다.
용어 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스의 벡터"는 유전자 전달 비히클로서 작용하고, 바이러스(예를 들어, AAV) 캡시드 내에 패키징된 재조합 바이러스 게놈을 포함하는 비-야생형 재조합 바이러스 입자(예를 들어, 파보바이러스 등)를 지칭하고자 한다. 특정 유형의 바이러스 벡터는 "재조합 아데노-관련 바이러스 벡터", 또는 "rAAV 벡터"일 수 있다. 바이러스 벡터에 패키징된 재조합 바이러스 게놈은 또한 본 명세서에서 "벡터 게놈"으로서 지칭된다.
도 1은 후부 아이컵(posterior eyecup)의 플랫마운트(flatmount)에서의 ChR2d-eGFP 발현을 나타내는 광학현미경 사진이다. 아이컵을 PFA-고정 눈으로부터 분리시키고, 페탈(petal)로 절단하고, eGFP 형광에 대해 분석하였다.
도 2a 및 도 2b는 ddPCR에 의해 측정할 때, ChR2d-eGFP의 mRNA 발현 수준을 나타내는 그래프이다. TM073에 대한 발현의 배수 변화를 (도　2a) 후부 아이컵과 (도 2b) 신경 망막 둘 다에 대해 나타낸다. ChR2d-eGFP 발현을 각 샘플에 대한 Rab7 대조군 발현에 대해 정규화하였다.
도 3은 AAV-ProC2-CatCh-GFP로 감염된 NHP 망막의 공초점 이미지를 나타낸다. 도 3a 및 도 3b: CatCh-GFP(상부의 그레이스케일 이미지에서 녹색 또는 회색 영역) 및 핵 염색(훽스트(Hoechst), 백색)을 나타내는 망막 절편. 도 3c: AAV-감염 망막(상부도), CatCh-GFP(검정)의 공초점 이미지. 도 3d 및 도 3e: 표적 세포 유형 또는 세포 부류 밀도의 백분율로서의 CatCh-GFP+ 세포 밀도의 정량화; 값은 n = 10의 공초점 이미지로부터의 평균 ± s.e.m.이다. AAV-표적화 특이성의 정량화는 이식유전자를 발현시키는 세포 중 주요(검정) 세포 유형의 백분율로서 나타낸다. T, 측두 망막 1/4; N, 코쪽 망막 1/4.
본 개시내용은 선택 프로모터, AAV 게놈 및 캡시드 혈청형의 조합을 갖는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)로부터의 CYP4V2의 발현이, 예를 들어, CYP4V2 유전자에 돌연변이(표 1)를 갖는 대상체에 BCD에 대한 강력하고 효능있는 치료를 제공한다는 발견에 부분적으로 기반한다. 따라서, 본 개시내용은 망막에 CYP4V2 암호화 서열의 발현을 지시하는 재조합 바이러스 벡터, 바이러스 벡터 조성물, 바이러스 벡터를 생성하는 데 유용한 플라스미드, CYP4V2 암호화 서열을 망막에 전달하는 방법, 망막의 RPE 세포에서 CYP4V2 암호화 서열을 발현시키는 방법, 및 이러한 바이러스 벡터의 사용 방법을 제공한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
달리 표시된 경우를 제외하고, 당업자에게 공지된 표준 방법은 바이러스 유전자 카세트를 운반하는 재조합 플라스미드, 파보바이러스 rep 및/또는 cap 서열을 발현시키는 패키징 플라스미드뿐만 아니라 일시적이고 안정적으로 형질감염된 패키징 세포를 이용하여, 재조합 파보바이러스 및 rAAV 벡터의 작제를 위해 사용될 수 있다. 이러한 기법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)]; 문헌[Choi et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (2007)]).
바이러스 벡터가 특정 단백질 또는 활성을 발현시킬 때, 적절한 유전자(들)가 천연에서 발견되거나 본 명세서에 개시된 상응하는 유전자(들)와 동일할 필요는 없다. 단백질이 기능적이라면, 이는 본 발명의 일 양상에 따라 사용될 수 있다. 당업자는 하이드록실라제 활성을 검출함으로써 CYP4V2 암호화 서열이 기능적 ω-하이드록실라제를 암호화하는지의 여부를 용이하게 결정할 수 있었다. 간략하게, 관심 대상의 단백질은 지방산 및 다른 필요한 인자와 혼합되고, 하이드록실화 반응이 일어나도록 인큐베이션된다. 이어서, 하이드록실화된 지방산은 질량분석법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Nakano et al., Drug Metab Dispos 37:2119-2122, 2009]에 기재된 바와 같은 기능적 분석 참조. 그러나, 천연 단백질과의 매우 높은 서열 동일성이 일반적으로 선호된다. 예를 들어, 큰 결실(예를 들어, 약 50개 초과의 아미노산)은 일반적으로 본 발명의 특정 실시형태에 따라 회피되어야 한다. 따라서, 당업자는 존재하는 바이러스 벡터 서열이 본 명세서에 기재된 서열과 다를 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 본 명세서에 제공된 서열에 대해 약 80% 이상의 동일성, 예를 들어, 본 명세서에 제공된 서열에 대해 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 가진다.
일부 실시형태에서, 서열 변화는 보존적 치환이다. 이러한 변화는 이소류신(I), 발린(V) 및 류신(L) 중 임의의 것을 이들 소수성 아미노산 중 임의의 다른 것으로 치환하는 것; 글루탐산(E)을 아스파르트산(D)으로 치환하는 것 및 그 반대; 아스파라긴(N)을 글루타민(Q)으로 치환하는 것 및 그 반대; 및 트레오닌(T)을 세린(S)으로 치환하는 것 및 그 반대를 포함한다. 다른 치환은 또한 특정 아미노산의 환경 및 단백질의 3차원 구조에서의 이의 역할에 따라 보존적으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 글리신(G) 및 알라닌(A)은 알라닌(A) 및 발린(V)과 같이, 빈번하게 상호 호환 가능할 수 있다. 상대적으로 소수성인 메티오닌(M)은 류신 및 이소류신과, 때때로 발린과 빈번하게 상호 호환될 수 있다. 리신(K) 및 아르기닌(R)은 아미노산 잔기의 중요한 특징이 이의 전하이며 이들 두 아미노산 잔기의 pK 차이가 유의미하지 않은 위치에서 빈번하게 상호 호환 가능하다. 또 다른 변화는 특정 환경에서 "보존적"으로 간주될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제20110201052호의 표 III; 문헌[페이지 13 내지 15 "Biochemistry" 2nd Ed. Stryer ed (Stanford University)]; 문헌[Henikoff et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:10915-10919, 1992]; 문헌[Lei et al., J Biol Chem 270:11882-11886, 1995]).
바이러스 벡터
본 발명은 망막에 이종성 유전자의 발현을 지시하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양상에서, 발현은 망막의 RPE 세포에 우선적으로 지시된다. 당업계에 공지된 다양한 바이러스 벡터, 예를 들어, 재조합 아데노-관련 바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 폭스바이러스 및 재조합 바큘로바이러스는 본 발명에서의 사용을 위해 당업자에 의해 적합하게 될 수 있다.
특히, 본 발명의 바이러스 벡터는 재조합 아데노-관련(rAAV) 벡터일 수 있다는 것이 상정된다. AAV는 효율적인 복제를 용이하게 하기 위해 헬퍼 바이러스를 필요로 하는 작은, 단일-가닥 DNA 바이러스이다(Muzyczka N and Berns KI (2001) Chapter 69, Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins). 바이러스 벡터는 벡터 게놈 및 단백질 캡시드를 포함한다. 바이러스 벡터 캡시드는 현재 확인된 인간 및 비-인간 AAV 혈청형 및 아직 확인되지 않은 AAV 혈청형을 포함하는, 당업계에 알려진 임의의 AAV 혈청형으로부터 공급될 수 있다(예를 들어, 문헌[Choi et al., Curr Gene Ther 5:299-310, 2005]; 문헌[Schmidt et al., J Virol 82:1399-1406, 2008]; 미국 특허 제9,193,956호; 제9;186;419호; 제8,632,764호; 제8,663,624호; 제8,927,514호; 제8,628,966호; 제8,263,396호; 제8,734,809호; 제8,889,641호; 제8,632,764호; 제8,691,948호; 제8,299,295호; 제8,802,440호; 제8,445,267호; 제8,906,307호; 제8,574,583호; 제8,067,015호; 제7,588,772호; 제7,867,484호; 제8,163,543호; 제8,283,151호; 제8,999,678호; 제7,892,809호; 제7,906,111호; 제7,259,151호; 제7,629,322호; 제7,220,577호; 제8,802,080호; 제7,198,951호; 제8,318,480호; 제8,962,332호; 제7,790,449호; 제7,282,199호; 제8,906,675호; 제8,524,446호; 제7,712,893호; 제6,491,907호; 제8,637,255호; 제7,186,522호; 제7,105,345호; 제6,759,237호; 제6,984,517호; 제6,962,815호; 제7,749,492호; 제7,259,151호; 및 제6,156,303호; 미국 특허 공개 제2013/0295614호; 제2015/0065562호; 제2014/0364338호; 제2013/0323226호; 제2014/0359799호; 제2013/0059732호; 제2014/0037585호; 제2014/0056854호; 제2013/0296409호; 제2014/0335054호 제2013/0195801호; 제2012/0070899호; 제2011/0275529호; 제2011/0171262호; 제2009/0215879호; 제2010/0297177호; 제2010/0203083호; 제2009/0317417호; 제2009/0202490호; 제2012/0220492호; 제 2006/0292117호; 및 제2004/0002159호; 유럽 특허 공개 제2692731 Al호; 제2383346 Bl호; 제2359865 Bl호; 제2359866 Bl호; 제2359867 Bl호; 및 제2357010 Bl호; 제1791858 Bl호; 제1668143 Bl호; 제1660678 Bl호; 제1664314 Bl호; 제1496944 Bl호; 제1456383 Bl호; 제2341068 Bl호; 제2338900 Bl호; 제1456419 Bl호; 제1310571 Bl호; 제1456383 Bl호; 제1633772 Bl호; 및 제1135468 Bl호; 및 PCT 공개 번호 WO 2014/124282; WO 2013/170078; WO 2014/160092; WO 2014/103957; WO 2014/052789; WO 2013/174760; WO 2013/123503; WO 2011/038187; WO 2008/124015; 및 WO 2003/054197 참조).
본 명세서의 개시내용의 목적을 위해, AAV는 바이러스 그 자체 및 이의 유도체를 지칭한다. 달리 표시되는 경우를 제외하고, 용어는 모든 아형 또는 혈청형 및 복제-적격과 재조합 형태를 둘 다 지칭한다. 용어 "AAV"는 1형 AAV(AAV1), 2형 AAV(AAV2), 3A형 AAV(AAV3A), 3B형 AAV(AAV3B), 4형 AAV(AAV4), 5형 AAV(AAV5), 6형 AAV(AAV6), 7형 AAV(AAV7), 8형 AAV(AAV8), 9형 AAV(AAV9), 10형 AAV(AAV 10 또는 AAVrh10), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 염소 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV 및 양 AAV를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하며, "비-영장류 AAV"는 비-영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "소 AAV"는 소 포유류를 감염시키는 AAV를 지칭하는 등이다.
다양한 혈청형의 AAV의 게놈 서열뿐만 아니라 천연 역위 말단 반복체(ITR), Rep 단백질, 및 캡시드 서브유닛의 서열도 당업계에 알려져 있다. 이러한 서열은 문헌 또는 공개 데이터베이스, 예컨대 GenBank에서 확인될 수 있다. 예를 들어, 젠뱅크(GenBank) 수탁번호 NC_002077.1(AAV1), AF063497.1(AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1(AAV2), J01901.1(AAV2), U48704.1(AAV3A), NC_001729.1(AAV3A), AF028705.1(AAV3B), NC .001829.1(AAV4), U89790.1(AAV4), NC_006152.1(AA5), AF085716.1(AAV-5), AF028704.1(AAV6), NC 006260.1(AAV7), AF513851.1(AAV7), AF513852.1(AAV8) NC 006261.1(AAV8), AY530579.1(AAV9), AAT46337(AAV10) 및 AAO88208(AAVrh10)을 참조하며; 이들의 개시내용은 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 또한, 예를 들어, 문헌[Srivastava et al., J Virol. 45:555-564, 1983]; 문헌[Chiorini et al., J Virol 71:6823-6833, 1998]; 문헌[Chiorini et al., J Virol 73:1309-1319, 1999]; 문헌[Bantel-Schaal et al., J Virol 73:939-947, 1999]; 문헌[Xiao et al., J Virol 73:3994-4003, 1999]; 문헌[Muramatsu et al., Virology 221:208-217, 1996]; 문헌[Shade et al., J Virol 58:921-936, 1986]; 문헌[Gao et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:11854-11859, 2002]; PCT 공개 번호 WO 00/28061, WO 99/61601 및 WO 98/11244; 및 미국 특허 제6,156,303호 참조.
바이러스 캡시드는 혼성 위형 바이러스 벡터를 형성하기 위해 다른 벡터 성분과 혼합되고 매칭될 수 있으며, 예를 들어, 바이러스 벡터의 ITR 및 캡시드는 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 일 양상에서, ITR은 AAV2 혈청형으로부터 유래될 수 있는 한편, 캡시드는, 예를 들어, AAV8, AAV9, AAV2 또는 AAV5 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 또한, 당업자는 벡터 캡시드가 또한 모자이크 캡시드(예를 들어, 상이한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 혼합물로 구성된 캡시드), 또한 심지어 키메라 캡시드(예를 들어, 마커를 생성하고/하거나 조직 친화성을 변경시키기 위한 외래 또는 비관련 단백질 서열을 포함하는 캡시드 단백질)일 수 있다는 것을 인식할 것이다. 본 발명의 바이러스 벡터는 AAV8 캡시드(예를 들어, 서열번호 23에 의해 암호화된, 예를 들어, 서열번호 24, 25 및 26)를 포함할 수 있다는 것이 상정된다. 또한 본 발명의 바이러스 벡터는 AAV9 캡시드(예를 들어, 서열번호 27에 의해 암호화된, 예를 들어, 서열번호 28, 29 및 30)를 포함할 수 있다는 것이 상정된다. 또한 본 발명의 바이러스 벡터는 AAV2 캡시드(예를 들어, 서열번호 31에 의해 암호화된, 예를 들어, 서열번호 32, 33 및 34)를 포함할 수 있다는 것이 상정된다. 추가로 본 발명이 AAV5 캡시드(예를 들어, 서열번호 35에 의해 암호화된, 예를 들어, 서열번호 36, 37 및 38)를 포함할 수 있다는 것이 상정된다.
일 양상에서, AAV는 자기 상보성 아데노-관련 바이러스(scAAV)이다.
추가 특정 양상에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하, 예를 들어, 약 4.2 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하, 약 4.3 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하, 약 4.4 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하, 약 4.5 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하, 약 4.6 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하, 약 4.7 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하, 약 4.8 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하, 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.8 kb 이하, 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.7 kb 이하, 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.6 kb 이하, 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.5 kb 이하, 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.4 kb 이하, 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.3 kb 이하, 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.2 kb 이하, 약 4.2 kb 이상 내지 약 4.8 kb 이하, 약 4.3 kb 이상 내지 약 4.7 kb 이하, 약 4.4 kb 이상 내지 약 4.6 kb 이하, 약 4.1 kb, 약 4.2 kb, 약 4.3 kb, 약 4.4 kb, 약 4.5 kb, 약 4.6 kb, 약 4.7 kb, 약 4.8 kb, 또는 약 4.9 kb의 길이를 가진다.
특정 양상에서, 본 발명은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR, (ii) 프로모터, (iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열, (iv) 폴리아데닐화(폴리A) 신호 서열 및 (v) 3' ITR을 포함하는, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양상에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR, (ii) 프로모터, (iii) 인트론, (iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열, (v) 폴리A 신호 서열, 및 (vi) 3' ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR, (ii) 프로모터, (iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열, (iv) 조절 요소, (v) 폴리A 신호 서열, 및 (vi) 3' ITR을 포함한다. 본 발명의 특정 양상에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR, (ii) 프로모터, (iii) 인트론, (iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열, (v) 조절 요소, (vi) 폴리A 신호 서열, 및 (vii) 3' ITR을 포함한다. 벡터 요소는 표 2에 기재되어 있는 서열에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
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일부 실시형태에서, 5' 및 3' ITR은 각각 약 130 내지 약 145개의 뉴클레오티드를 포함한다. ITR은 AAV 게놈의 효율적인 조작에 필요하며, 이들 서열의 대칭적 특징은 이들에 헤어핀을 형성하는 능력을 제공하며, 이는 제2 DNA 가닥의 프리마제(primase)-독립적 합성을 가능하게 하는 소위 자기-프라이밍에 기여한다. AAV 혈청형 2의 5' 및 3' ITR이 사용될 수 있다는 것이 상정된다(예를 들어, 서열번호 1 및 22에 대해 각각 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열). 다른 양상에서, 다른 적합한 혈청형으로부터의 ITR은 본 명세서에 기재된 바와 같이 당업계에 공지된 임의의 AAV 혈청형 중에서 선택될 수 있고, 예를 들어, ITR은 AAV8, AAV9 또는 AAV5로부터 유래될 수 있다. 이들 ITR 또는 다른 AAV 성분은 공지된 임의의 AAV 혈청형 또는 아직 확인되지 않은 혈청형으로부터 당업자가 이용 가능한 기법을 이용하여 용이하게 단리될 수 있고, 예를 들어, AAV 서열은 합성일 수 있거나, 문헌에서 이용 가능한 것과 같은 공개된 서열을 참고로 하여, 또는, 예를 들어, GenBank, PubMed 등과 같은 데이터베이스에서 임의의 적합한 수단을 통해 얻을 수 있다. 대안적으로, 이러한 AAV 성분은 또한 학문적, 상업적, 또는 공공의 공급원(예를 들어, 버지니아주 매너서스에 소재한 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection))으로부터 단리되거나 얻을 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터의 5' 또는 3' ITR 영역은, 예를 들어, 말단 분해 부위(terminal resolution site: trs)를 결실/돌연변이시킴으로써 ΔITR을 형성하도록 돌연변이되고, 얻어진 AAV 게놈은 이량체 역위 반복부 DNA 분자를 형성함으로써 자기-상보성(self-complementary: sc)이 된다. 일 실시형태에서, ΔITR 서열은 서열번호 54를 포함한다. 추가적인 ΔITR 서열은, 예를 들어, 문헌[Wang et al., Gene Therapy, 2003, 10: 2105-2111]; 문헌[McCarty et al., Gene Therapy, 2003, 10: 2112-2118]; 및 문헌[McCarty et al., Gene Therapy, 2001, 8: 1248-1254]에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 각각의 하나는 전문이 참조에 의해 포함된다.
특정 실시형태에서, 프로모터는 편재하는 프로모터, 예를 들어, CMV 프로모터, CBA 프로모터 또는 CAG 프로모터일 수 있다. 예를 들어, CMV 프로모터는 서열번호 2에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있고, CBA 프로모터는 서열번호 3에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, CAG 프로모터는 서열번호 4에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, RPE-특이적 프로모터는 우선적으로 망막의 RPE 세포, 예를 들어, 인간 RPE 세포에서 CYP4V2의 발현을 표적화하는 데 사용될 수 있다. RPE-특이적 프로모터의 예는 ProC2 프로모터, VMD2 프로모터, CYP4V2 프로모터 및 RPE65 프로모터를 포함한다. 예를 들어, ProC2 프로모터는 서열번호 5에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, VMD2 프로모터는 서열번호 6에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, CYP4V2 프로모터는 서열번호 7에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편, 예를 들어, 서열번호 7의 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900개의 뉴클레오티드의 단편을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, RPE65 프로모터는 서열번호 8에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터 게놈은 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하되, 프로모터는 망막 세포, 예를 들어, 비-인간 영장류 또는 인간 망막 세포에서 CYP4V2의 발현을 표적화할 수 있고, 프로모터는 이하의 표 3에서 선택된다:
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상기 참고문헌 중 각각 하나는 그 전문이 참고로 포함된다.
일 실시형태에서, AAV 벡터 게놈은 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하되, 프로모터는 서열번호 55 내지 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 망막 세포, 예를 들어, 비-인간 영장류 또는 인간 망막 세포에서 CYP4V2의 발현을 표적화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은 인트론 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인트론은 인간 성장 호르몬(hGH) 인트론, 유인원 바이러스 40(SV40) 인트론, 또는 인간 베타 고빈 인트론, 예를 들어, 서열번호 9, 10 또는 11에 대해 각각 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은 CYP4V2 암호화 서열, 예를 들어, 인간 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다. CYP4V2 암호화 서열은 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 하나의 특정 실시형태에서, 벡터 게놈은 서열번호 14에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은 이종성 CYP4V2 유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. 조절 요소는 적절한 전사 개시, 종결, 및 인핸서 서열, 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대, 스플라이싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열; 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요할 때, 암호화된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 매우 다수의 조절 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 이용될 수 있다. 본 발명의 조절 요소 서열은 서열번호 16 및 17 각각에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는 표 2에 기재된 것, 예를 들어, B형 간염 바이러스 조절 요소(HPRE) 및 우두처크 간염 바이러스 조절 요소(WPRE)를 포함한다.
일 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은 폴리A 신호 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리A 신호 서열은 서열번호 18 및 19 각각에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는 표 2에 기재된 것, 예를 들어, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리A 신호 서열 및 유인원 바이러스 40(SV40) 폴리A 신호 서열을 포함한다. 하나의 특정 실시형태에서, 벡터 게놈은 서열번호 18에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있는 bGH 폴리A 신호 서열을 포함한다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR(예를 들어, 서열번호 1), (ii) 프로모터(예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8), (iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49), (iv) 폴리A 신호 서열(예를 들어, 서열번호 18 또는 19), 및 (v) 3' ITR(예를 들어, 서열번호 22)를 포함하는, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양상에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR(예를 들어, 서열번호 1), (ii) 프로모터(예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8), (iii) 인트론(예를 들어, 서열번호 9, 10 또는 11), (iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49), (v) 폴리A 신호 서열(예를 들어, 서열번호 18 또는 19), 및 (vi) 3' ITR(예를 들어, 서열번호 22)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR(예를 들어, 서열번호 1), (ii) 프로모터(예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8), (iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49), (iv) 조절 요소(예를 들어, 서열번호 16 또는 17), (v) 폴리A 신호 서열(예를 들어, 서열번호 18 또는 19), 및 (vi) 3' ITR(예를 들어, 서열번호 22)을 포함한다. 본 발명의 특정 양상에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR(예를 들어, 서열번호 1), (ii) 프로모터(예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8), (iii) 인트론(예를 들어, 서열번호 9, 10 또는 11), (iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49), (v) 조절 요소(예를 들어, 서열번호 15 또는 17), (vi) 폴리A 신호 서열(예를 들어, 서열번호 18 또는 19), 및 (vii) 3' ITR(예를 들어, 서열번호 22)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터의 기능 또는 활성을 막지 않도록 임의의 목적하는 위치에서 벡터 서열에 위치될 수 있다. 일 양상에서, 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리A 신호 서열과 3' ITR 사이에 위치된다. 전형적으로, 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 비활성 또는 무해하고, 기능 또는 활성을 갖지 않는다. 다양한 특정 양상에서, 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리아 폴리뉴클레오티드 서열이 아니고; 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 서열이 아니며; 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 ITR 서열, 프로모터, CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 및 폴리A 신호 서열과 별개이다. 일부 실시형태에서, 스터퍼 서열은 서열번호 20 또는 21에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 다양한 추가적인 양상에서, 스터퍼 폴리뉴클레오티드 서열은 길이가 약 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 750, 750 내지 1,000, 1,000 내지 1,500, 1,500 내지 2,000, 2,000 내지 2,500 또는 2,500 내지 3,000개의 뉴클레오티드이다.
따라서, 특정 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR(예를 들어, 서열번호 1), (ii) 프로모터(예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8), (iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49), (iv) 폴리A 신호 서열(예를 들어, 서열번호 18 또는 19), (v) 스터퍼 서열(예를 들어, 서열번호 20 또는 21), 및 (vi) 3' ITR(예를 들어, 서열번호 22)을 포함한다. 본 발명의 특정 양상에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR(예를 들어, 서열번호 1), (ii) 프로모터(예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8), (iii) 인트론(예를 들어, 서열번호 9, 10 또는 11), (iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49), (v) 폴리A 신호 서열(예를 들어, 서열번호 18 또는 19), (vi) 스터퍼 서열(예를 들어, 서열번호 20 또는 21), 및 (vii) 3' ITR(예를 들어, 서열번호 22)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR(예를 들어, 서열번호 1), (ii) 프로모터(예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8), (iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49), (iv) 조절 요소(예를 들어, 서열번호 16 또는 17), (v) 폴리A 신호 서열(예를 들어, 서열번호 18 또는 19), (vi) 스터퍼 서열(예를 들어, 서열번호 20 또는 21), 및 (vii) 3' ITR(예를 들어, 서열번호 22)을 포함한다. 본 발명의 특정 양상에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로: (i) 5' ITR(예를 들어, 서열번호 1), (ii) 프로모터(예를 들어, 서열번호 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8), (iii) 인트론(예를 들어, 서열번호 9, 10 또는 11), (iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49), (v) 조절 요소(예를 들어, 서열번호 16 또는 17), (vi) 폴리A 신호 서열(예를 들어, 서열번호 18 또는 19), (vii) 스터퍼 서열(예를 들어, 서열번호 20 또는 21), 및 (viii) 3' ITR(예를 들어, 서열번호 22)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은 또한 Kozak 서열을 포함할 수 있다. Kozak 서열은 진핵생물 mRNA에서 생기는 서열이며, 공통 (gcc)gccRccAUGG 서열을 갖고, 번역 과정의 개시에서 어떤 역할을 한다. Kozak 서열은 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열 바로 상류에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, Kozak 서열은 GCCACC(서열번호 12)이다. 대안적으로, 벡터 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 벡터 게놈은 GCCGCC(서열번호 51), GACACC(서열번호 52) 또는 GCCACG(서열번호 53)의 Kozak 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 양상에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어, 서열번호 23에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 서열번호 24, 25 및 26 각각에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는 AAV8 캡시드, 및 5'에서 3' 방향으로 뉴클레오티드 서열의 다음의 세트 중 하나에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은 5'에서 3' 방향으로 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22; 또는 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, AAV8 캡시드는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3의 하위조합을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 바이러스 벡터는, 예를 들어, 서열번호 27에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 서열번호 28, 29 및 30 각각에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는 AAV9 캡시드, 및 5'에서 3' 방향으로 뉴클레오티드 서열의 다음의 세트 중 하나에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은 5'에서 3' 방향으로 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22; 또는 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, AAV9 캡시드는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3의 하위조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양상에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어, 서열번호 31에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 서열번호 32, 33 및 34각각에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는 AAV2 캡시드, 및 5'에서 3' 방향으로 뉴클레오티드 서열의 다음의 세트 중 하나에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은 5'에서 3' 방향으로 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22; 또는 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, AAV2 캡시드는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3의 하위조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양상에서, 바이러스 벡터는, 예를 들어, 서열번호 35에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 서열번호 36, 37 및 38 각각에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는 AAV5 캡시드, 및 5'에서 3' 방향으로 뉴클레오티드 서열의 다음의 세트 중 하나에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함한다:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은 5'에서 3' 방향으로 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22; 또는 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, AAV5 캡시드는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3의 하위조합을 포함할 수 있다.
바이러스 벡터의 생성 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 당업자가 표 4에 기재된 바이러스 벡터를 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터를 생성하는 것을 가능하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제7,465,583호). 일반적으로, rAAV 벡터의 생성 방법은 본 발명의 바이러스 벡터의 생성에 적용 가능하며; 본 방법 사이의 주된 차이는 패키징될 유전자 요소의 구조이다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터를 생성하기 위해, 표 2에 기재된 유전자 요소의 서열은 캡시드화된 바이러스 게놈을 생성하는 데 사용될 수 있다.
표 2에 기재된 바와 같은 유전자 요소는 원형 플라스미드 또는 바이러스 게놈, 예를 들어, 단일 가닥 또는 자기-상보성 바이러스 게놈에 대한 것이지만, 당업자는 DNA 기질이 플라스미드, 네이키드 DNA 벡터, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 포진바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, AAV, 바큘로바이러스, 레트로바이러스 벡터 등)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 형태로 제공될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터를 생성하는 데 필요한 표 2의 유전자 요소는 패키징 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입될 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터 입자는, 예를 들어, 복제되고 패키징될 서열을 허용적 또는 패키징 세포에 도입함으로써, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있으며, 해당 용어들은 당업계에서 이해되는 바와 같다(예를 들어, "허용적" 세포는 바이러스에 의해 감염 또는 형질도입될 수 있고; "패키징" 세포는 헬퍼 기능을 제공하는 안정하게 형질전환된 세포이다).
일 실시형태에서, CYP4V2 바이러스 벡터를 생성하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 세포에서 생성될 파보바이러스 캡시드 내에서 캡시드화되는 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터에 충분한 조건 하에서, 파보바이러스 복제에 허용적인 세포에: (a) 본 발명의 벡터 게놈(이하 및 표 2에 상세하게 기재하는 바와 같음)을 생성하기 위한 유전자 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열; (b) 벡터 게놈을 생성하기 위한 (a)에서의 벡터 게놈 서열 복제에 충분한 뉴클레오티드 서열; (c) 벡터 게놈을 파보바이러스 캡시드에 패키징하는 데 충분한 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 파보바이러스 복제 및/또는 캡시드 암호화 서열은 AAV 서열이다.
이하에 기재되는 유전자 카세트를 운반하는 뉴클레오티드 서열을 복제 및 패키징을 위해 세포 숙주에 도입하는 임의의 방법이 사용될 수 있으며, 전기천공법, 인산칼슘 침전, 선형 폴리에틸렌이민 중합체 침전, 미세주사법, 양이온성 또는 음이온성 리포좀, 및 핵 국소화 신호와 조합한 리포좀을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 삼중 형질감염 또는 바큘로바이러스 매개 바이러스 생성을 이용하여 생성될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 허용적 또는 패키징 세포는 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 포유류 세포가 바람직하다. 또한 복제-결함 헬퍼 바이러스, 예를 들어, 293 세포 또는 다른 E1a 트랜스-상보성 세포로부터 결실된 기능을 제공하는 트랜스-상보성 패키징 세포주가 바람직하다. 또한 당업계에 공지된 바와 같이 DNA 수선에 결함있는 포유류 세포 또는 세포주가 바람직한데, 이들 세포주는 본 명세서에 기재된 플라스미드에 도입된 돌연변이를 수정하는 이들의 능력이 손상될 것이기 때문이다.
유전자 카세트는 파보바이러스(예를 들어, AAV) cap 및 rep 유전자의 일부 또는 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 그러나, cap 및 rep 기능의 일부 또는 모두는 캡시드 및/또는 Rep 단백질을 암호화하는 패키징 벡터(들)를 세포에 도입함으로써 도중에 제공된다. 가장 바람직하게는, 유전자 카세트는 캡시드 또는 Rep 단백질을 암호화하지 않는다. 대안적으로, cap 및/또는 rep 유전자를 발현시키기 위해 안정하게 형질전환되는 패키징 세포주가 사용된다(예를 들어, 문헌[Gao et al., Hum Gene Ther 9:2353-2362, 1998]; 문헌[Inoue et al., J Virol 72:7024-7031, 1998]; 미국 특허 제5,837,484호; WO 98/27207; 미국 특허 제5,658,785호; WO 96/17947).
또한, 헬퍼 바이러스 기능은 바람직하게는 바이러스 벡터가 새로운 바이러스 입자를 증식시키도록 제공된다. 아데노바이러스와 단순 포진 바이러스는 둘 다 AAV에 대한 헬퍼 바이러스로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bernard N. Fields et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (3d ed., Lippincott-Raven Publishers)] 참조. 예시적인 헬퍼 바이러스는 단순 포진(HSV) 수두 대상포진, 거대세포 바이러스 및 엡스타인-바르 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 감염 다중도(MOI) 및 감염의 지속기간은 사용되는 바이러스 유형 및 사용되는 패키징 세포주에 따를 것이다. 임의의 적합한 헬퍼 벡터가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 벡터는, 예를 들어, 문헌[Xiao et al., J Virol 72:2224, 1998]에 의해 기재되는 바와 같은 플라스미드이다. 벡터는 상기 기재한 바와 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 패키징 세포에 도입될 수 있다.
오염 헬퍼 바이러스가 없는 벡터 저장액은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 재조합 단일 가닥 또는 자기 상보성 바이러스 및 헬퍼 바이러스는 크기에 기반하여 용이하게 분화될 수 있다. 바이러스는 또한 헤어핀 기질에 대한 친화도에 기반하여 헬퍼 바이러스로부터 분리될 수 있다(문헌[Zolotukhin et al., Gene Ther 6:973-985, 1999]). 바람직하게는, 임의의 오염 헬퍼 바이러스가 복제 적격이 아니도록, 결실된 복제-결함 헬퍼 바이러스가 사용된다. 추가 대안으로서, 이중가닥 바이러스의 패키징을 매개하는 데 아데노바이러스 초기 유전자 발현만이 필요하기 때문에, 후기 유전자 발현을 결여하는 아데노바이러스 헬퍼가 사용될 수 있다. 후기 유전자 발현에 결함있는 아데노바이러스 돌연변이체는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, ts100K 및 ts149 아데노바이러스 돌연변이체).
헬퍼 기능을 제공하기 위한 한 가지 방법은 효율적인 AAV 생성에 필요한 헬퍼 유전자 모두를 운반하는 비-감염성 아데노바이러스 미니 플라스미드를 사용한다(문헌[Ferrari et al., Nat Med 3:1295-1297, 1997]; 문헌[Xiao et al., J Virol 72:2224-2232, 1998]). 아데노바이러스 미니플라스미드에 의해 얻어진 rAAV 역가는 야생형 아데노바이러스 감염의 통상적인 방법에 의해 얻은 것보다 40배 더 높다(문헌[Xiao et al., J Virol 72:2224-2232, 1998]). 이 접근은 아데노바이러스와의 공동형질감염을 수행할 필요를 제거한다(문헌[
Figure pct00044
et al., J Virol 68:7169-7177, 1994]; 문헌[Clark et al., Hum Gene Ther 6:1329-1341, 1995]; 문헌[Trempe and Yang, (1993), in, Fifth Parvovirus Workshop, Crystal River, FL]).
복제-적격 AAV의 생성을 방지하기 위해 별도의 발현 카세트 상에 rep 및 cap 유전자를 분할하는 방법(예를 들어, 문헌[Allen et al., J Virol 71:6816-6822, 1997] 참조), 패키징 세포주의 사용 방법(예를 들어, 문헌[Gao et al., Hum Gene Ther 9:2353-2362, 1998]; 문헌[Inoue et al., J Virol 72:7024-7031, 1998]; 미국 특허 제5,837,484호; WO　98/27207; 미국 특허 제5,658,785호; WO 96/17947 참조), 및 기타 무 헬퍼 바이러스 시스템(예를 들어, 미국 특허 제5,945,335호 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, rAAV 저장액을 생성하는 다른 방법이 기재되었다.
포진바이러스는 또한 AAV 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로서 사용될 수 있다. AAV Rep 단백질(들)을 암호화하는 혼성 포진바이러스는 유리하게는 더 확장 가능한 AAV 벡터 생성 계획을 용이하게 할 수 있다. AAV-2 rep 및 cap 유전자를 발현시키는 혼성 단순 포진 바이러스 I형(HSV-1) 벡터가 기재되었다(문헌[Conway et al., Gene Ther 6:986-993, 1999], 및 WO 00/17377).
요약하면, 복제 및 패키징될 유전자 카세트, 파보바이러스 cap 유전자, 적절한 파보바이러스 rep 유전자 및 (바람직하게는) 헬퍼 기능은 벡터 게놈을 운반하는 rAAV 입자를 생성하기 위해 세포(예를 들어, 허용적 또는 패키징 세포)에 제공된다. 유전자 카세트 및/또는 패키징 벡터(들)에 의해 암호화된 rep 및 cap 유전자 및/또는 안정하게 형질전환된 패키징 세포의 조합된 발현은 바이러스 벡터 캡시드가 본 발명에 따른 바이러스 벡터 게놈을 패키징하는 바이러스 벡터 입자의 생성을 초래한다. 단일 가닥 바이러스 벡터는 세포 내에서 조립되는 것이 가능하며, 이어서, 당업자에게 공지되어 있고 실시예에 기재되는 임의의 방법에 의해 회수될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 표준 CsCl 원심분리 방법(문헌[Grieger et al., Nat Protoc 1:1412-1428, 2006]), 이오딕사놀 원심분리 방법에 의해, 또는 당업자에게 공지된 칼럼 크로마토그래피의 다양한 방법에 의해 정제될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lock et al., Hum Gene Ther 21:1259-1271, 2010]; 문헌[Smith et al., Mol Ther 17:1888-1896, 2009]; 및 문헌[Vandenberghe et al., Hum Gene Ther 21:1251-1257, 2010] 참조).
본 명세서에 개시된 시약 및 방법은, 바람직하게는 본질적으로 야생형 역가에서 본 발명의 바이러스 벡터의 고역가 저장액을 생성하는 데 사용될 수 있다. 또한 파보바이러스 저장액은 역가가 약 1010 vg/㎖ 내지 약 1013 vg/㎖, 예를 들어, 적어도 또는 약 1010 vg/㎖, 6.6×1010 vg/㎖, 1011 vg/㎖, 5×1011 vg/㎖, 1012 vg/㎖, 5×1012 vg/㎖, 1013 vg/㎖, 5×1013 vg/㎖ 이상인 것이 바람직하다.
바이러스 벡터를 생성하는 데 사용하기 위한 핵산
본 발명은 또한 바이러스 벡터의 생성에 유용한 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양상에서, 바이러스 벡터의 생성에 유용한 핵산은 플라스미드 형태일 수 있다. 바이러스 벡터 플라스미드로도 지칭되는 바이러스 벡터의 생성에 유용한 플라스미드는 유전자 카세트를 포함할 수 있다. 최소한으로, 바이러스 벡터 플라스미드의 유전자 카세트는: 프로모터, 이종성 CYP4V2 유전자, 폴리A 신호 서열, 및 5' 및 3' ITR을 포함한다.
이종성 유전자 및 기타 요소의 조성은 얻어진 벡터가 사용될 용도에 따라 다를 것이다. 예를 들어, 이종성 유전자 서열의 한 가지 유형은 발현 시 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 이러한 리포터 서열은 β-락타마제, β-갈락토시다제(LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 막 결합 단백질(예를 들어, CD2, CD4, CD8을 포함), 인플루엔자 혈구응집소 단백질, 및 이에 대한 고친화도 항체가 존재하거나 통상적인 수단에 의해 생성될 수 있는 당업계에 잘 공지된 다른 것, 및 항원 태그 도메인에 적절하게 융합된 막 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질, 특히, 혈구응집소 또는 Myc를 암호화하는, DNA 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 리포터 서열이 LacZ 유전자인 경우, 신호를 운반하는 벡터의 존재는 베터-갈락토시다제 활성에 대한 분석에 의해 검출된다. 리포터 서열이 GFP 또는 루시퍼라제인 경우, 신호를 운반하는 벡터는 루미노미터에서 색 또는 광 생성에 의해 시각적으로 측정될 수 있다.
이종성 유전자 서열은, 이들의 발현을 유도하는 요소와 연관될 때, 효소, 방사선 촬영, 색채학, 형광 또는 기타 분광 사진술 분석, 형광 활성화 세포 분류 분석, 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 면역조직화학을 포함하는 면역학적 분석을 포함하는, 통상적인 수단에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다.
이종성 유전자는 또한 생물학 및 의학에서 유용한 생성물, 예컨대, 단백질, 펩티드, RNA, 효소, 우성 음성 돌연변이체, 또는 촉매적 RNA를 암호화하는 비-마커 서열일 수 있다. 바람직한 RNA 분자는 tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매적 RNA, siRNA, 소형 헤어핀 RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA, 및 안티센스 RNA를 포함한다. 유용한 RNA 서열의 일례는 처리 동물에서 표적화된 뉴클레오티드 서열의 발현을 저해하거나 또는 없애는 서열이다.
이종성 유전자는 또한 정상 유전자가 정상 수준 미만에서 발현되는 결핍증 또는 기능성 유전자 산물이 발현되지 않는 결핍증을 포함할 수 있는 유전자 결핍증을 교정하거나 개선하는 데 사용될 수 있다. 본 발명에서 이종성 유전자 서열은 CYP4V2 암호화 서열일 수 있다는 것이 상정된다. CYP4V2 암호화 서열의 예는 표 2에 제공된다: 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 및 49.
본 발명의 일 양상은 5'에서 3' 방향으로 뉴클레오티드 서열의 다음의 세트 중 하나에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 카세트를 포함하는 핵산에 관한 것이다:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22.
일부 실시형태에서, 유전자 카세트는 5'에서 3' 방향으로 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22; 또는 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 유전자 카세트를 포함하는 핵산은 플라스미드일 수 있다.
표 2의 요소를 혼입하기 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 당업자가 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 본 발명의 핵산 및 플라스미드를 생성하는 것을 가능하게 한다.
약제학적 조성물
일 양상에서, 본 발명은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 본 발명의 바이러스 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 BCD를 치료 또는 예방하는 데 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 향상시키거나 안정화시키며, 또는 조성물의 제제화를 촉진하는 데 이용될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리적으로 적합한 용매, 계면활성제, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 지연제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 공지된 여러 가지 방법들에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 요망되는 결과에 따라 다르다. 투여는 망막하인 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 망막하, 유리체강내, 정맥내, 피하 또는 국소 투여에 적합하여야 한다.
조성물은 멸균성이고 유체여야 한다. 적절한 유체성은 예를 들어, 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성 물질, 예를 들어 당, 다가알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 그리고 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 상기 조성물은 계면활성제로서 1X　PBS 및 0.001% PLURONIC™ F-68을 갖고, 약 6.5 내지 8.0의 pH, 예를 들어, pH　6.5 내지 7.5 및 6.5 내지 7.0의 pH를 갖는 완충제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 잘 공지되고 일상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000]; 및 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.] 참조. 약제학적 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, 치료적 유효 용량 또는 효능 용량의 바이러스 벡터가 본 발명의 약제학적 조성물에 이용된다. 바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약제학적으로 허용 가능한 투약 형태로 제형화될 수 있다. 투약 요법은 최적의 목적하는 반응(예컨대 치료적 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 번 용량이 시간이 지남에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 특히, 투여의 용이성 및 투약량의 균일성을 위해 투약량 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투약량 단위 형태는 치료받고자 하는 대상체에 대한 단일 투약량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 연계되어 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 약제학적 조성물 내의 활성 성분의 실제 투약량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서, 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 요망되는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하기 위해 다양해질 수 있다. 선택된 투약량 수준은 이용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 조성물과 병용하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 질환, 일반적인 건강 상태 및 과거 병력 및 유사한 인자들을 포함하여 여러 가지 약물동력학적 인자들에 따라 다르다.
의사 또는 수의사는, 약제학적 조성물에 이용되는 본 발명의 바이러스 벡터의 용량을 요망되는 치료 효과를 달성하는 데 필요한 용량보다 낮은 수준에서 시작하고, 요망되는 효과가 달성될 때까지, 투약량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 BCD의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 및 치료가 예방적인지 치료적인지의 여부를 포함하는, 상이한 인자에 따라 다르다. 치료 투약량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 적정될 필요가 있다. 바이러스 벡터와 함께 망막하 투여를 위해, 투약량은 약 1×108개의 벡터 게놈(vg)/눈 내지 약 1×1012개의 vg/눈의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투약량은 약 1×108 vg/눈, 2.5×108 vg/눈, 5×108 vg/눈, 7.5×108 vg/눈, 1×109 vg/눈, 2.5×109 vg/눈, 5×109 vg/눈, 7.5×109 vg/눈, 1×1010 vg/눈, 2.5×1010 vg/눈, 5×1010 vg/눈, 7.5×1010 vg/눈, 1×1011 vg/눈, 2×1011 vg/눈, 2.5×1011 vg/눈, 5×1011 vg/눈, 7.5×1011 vg/눈, 또는 1×1012 vg/눈 이상일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 주로 눈당 1회의 용량으로서 사용되며, 이전의 투약에 포함되지 않은 망막 영역을 치료하기 위해 반복 투약 가능성이 있다. 투여의 투약량은 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 다를 수 있다.
상기 개개 부문 및 실시형태에 대해 지칭된 본 발명의 다양한 특정 및 실시형태는 적절하다면, 다른 부문 및 실시형태를 필요한 부분만 수정하여 적용한다. 결과적으로, 하나의 부문 또는 실시형태에서 구체화된 특징은 적절하다면, 다른 부문 또는 실시형태에서 구체화된 특징과 조합될 수 있다.
치료적 용도
본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터는 유효량의 본 발명의 바이러스 벡터를 치료가 필요한 대상체에게 투여함으로써 눈 관련 질환을 치료를 위한 치료적으로 유용한 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는, 예를 들어, 서열번호 23에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 서열번호 24, 25 및 26 각각에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는 AAV8 캡시드, 및 5'에서 3' 방향으로 뉴클레오티드 서열의 다음의 세트 중 하나에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함할 수 있다:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈은 5'에서 3' 방향으로 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22; 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22; 또는 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22에 대해 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100%의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 다른 실시형태에서, AAV8 캡시드는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및/또는 VP3의 하위조합을 포함할 수 있다.
치료가 필요한 대상체는 CYP4V2 유전자에서 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 표 1을 갖는 것을 포함할 수 있다. 더 구체적으로는, 본 발명은 CYP4V2 암호화 서열(예를 들어, 인간 CYP4V2 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 서열번호 15)을 포함하는 유효량의 바이러스 벡터를 BCD 치료가 필요한 대상체에게 투여함으로써 BCD를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 본 명세서에 CYP4V2 암호화 서열(예를 들어, 인간 CYP4V2 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 서열번호 15)을 포함하는 유효량의 바이러스 벡터를 BCD 치료가 필요한 대상체에게 투여함으로써 BCD를 갖는 대상체에서 시력을 개선시키는 방법이 제공된다. 일부 양상에서, 본 명세서에 CYP4V2 암호화 서열(예를 들어, 인간 CYP4V2 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 서열번호 15)을 포함하는 유효량의 바이러스 벡터를 BCD 치료가 필요한 대상체에게 투여함으로써 BCD를 갖는 대상체에서 시력 감소를 방지하는 방법이 제공된다. 구체적 양상에서, 본 발명은 대상체에서 BCD를 치료하는 데 사용하기 위한 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 망막하에 또는 유리체강내로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 대상체가 BCD와 관련된 하나 이상의 CYP4V2 돌연변이(예를 들어, 표 1 참조)를 갖는지의 여부를 결정하기 위해 대상체를 유전형질분석(genotypying)하는 단계, 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 투여함으로써 BCD에 대해 BCD와 연관된 하나 이상의 CYP4V2 돌연변이로 대상체를 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적 실시형태에서, BCD를 치료하는 방법과 함께 사용하기 위한 본 명세서에 제공된 바이러스 벡터는 프로모터, 예를 들어, ProC2 프로모터에 작동 가능하게 연결된 CYP4V2 암호화 서열(예를 들어, 인간 CYP4V2 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 서열번호 15)을 포함한다.
재조합 AAV의 용도는 망막 질환의 치료에 대해 실현 가능하며 안전한 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌[Bainbridge et al., N Engl J Med 358:2231-2239, 2008]; 문헌[Bainbridge et al., Gene Ther 15:1191-1192, 2008]; 문헌[Hauswirth et al., Hum Gene Ther 19:979-990, 2008]; 문헌[Maguire et al., N Engl J Med 358:2240-2248, 2008]; 문헌[Bennett et al., Lancet 388:661-672, 2016]; 및 문헌[Russell et al., Lancet 390:849-860, 2017] 참조. 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는 특히 BCD의 진행을 치료 및 예방하고, 시력 상실을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 바이러스 벡터를 CYP4V2 암호화 서열의 발현이 필요한 대상체, 예를 들어, CYP4V2 유전자에 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어, 표 1을 갖는 대상체에게 투여함으로써 RPE 세포에서 CYP4V2 암호화 서열을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CYP4V2 암호화 서열의 발현이 필요한 대상체 망막의 RPE 세포에서 CYP4V2 암호화 서열을 발현시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 망막에, 구체적으로는 BCD를 갖는 대상체 망막의 RPE 세포에 CYP4V2 암호화 서열을 전달하고 발현시키는 방법을 상정한다. CYP4V2 암호화 서열은 대상체의 망막 및/또는 RPE 세포를 (예를 들어, 망막하 또는 유리체강내로 투여하여) 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터와 접촉시킴으로써 CYP4V2 암호화 서열의 전달이 필요한 대상체에게 전달되는 것으로 상정된다. 대안적으로, CYP4V2 암호화 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 대상체에게 투여함으로써 대상체에게 전달된다.
일부 양상에서, 본 발명은 대상체의 망막을 본 발명의 바이러스 벡터와 접촉시킴으로써 BCD를 갖는 대상체 망막의 RPE 세포에서 CYP4V2 암호화 서열을 발현시키는 방법을 추가로 포함한다. 특정 양상에서, 대상체 망막의 RPE 세포는 본 발명의 바이러스 벡터와 접촉된다.
BCD와 같은 안질환의 치료 및/또는 예방은 시기능, 기능적 시력, 망막 구조 및/또는 삶의 질의 임상적으로 적절한 측정을 이용하여 안과 의사, 검안사, 또는 보건 전문가에 의해 결정될 수 있다. BCD의 치료는 시기능, 기능적 시력, 망막 구조 및/또는 삶의 질을 개선 또는 보존하도록 상정된 임의의 조치(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터의 투여)를 의미한다. 또한, BCD와 관련하여 예방은 상기 악화의 위험에 있는 대상체에서 본 명세서에 나타낸 바와 같은 시기능, 기능적 시력, 망막 구조, 및/또는 BCD 표현형의 악화를 저해하거나, 예방하거나 또는 늦추는, 예를 들어, 망막 내 황색 또는 백색 결정질 유사 침착물의 수 및/또는 크기를 감소시키는 임의의 조치(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터의 투여)를 의미한다.
시기능은, 예를 들어, 시력, 낮은 조도에 따른 시력, 시야, 중심 시야, 주변시, 대비 민감도, 암순응, 광피로 회복, 색 식별, 읽기 속도, 보조도구에 대한 의존도(예를 들어, 큰 활자체, 확대 도구, 망원경), 안면 인식, 자동차 조작의 능숙함, 일상 생활 중 하나 이상의 활동을 수행하는 능력 및/또는 시기능과 관련된 환자-보고 만족감을 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, BCD의 치료는 대상체가 적어도 10%, 20% 또는 30%의 감소를 갖거나, 사전 특정된 암순응 정도까지의 10%, 20% 또는 30% 이상의 증가가 없는 경우에 일어나는 것으로 언급될 수 있다. 또한, BCD의 치료는 대상체가 어린 나이에 조기 중증의 야맹증 및 느린 암순응 다음에 시력, 시야 및 색각의 진행성 상실을 나타내어, 자격이 있는 보건 전문가, 예를 들어, 안과 의사 및 검안사에 의해 결정된 법적실명을 야기하는 경우에 일어나는 것으로 언급될 수 있다.
시기능의 예시적인 측정은 스넬(Snellen) 시력, ETDRS 시력, 저휘도 시력, 암슬러 격자(Amsler grid), 골드만(Goldmann) 시야, 표준 자동 시야측정법, 미세시야계검사, 펠리-롭슨 차트(Pelli-Robson chart), SKILL 카드, 이시하라(Ishihara) 색각검사표, 판스워스(Farnsworth) D15 또는 D100 정색 검사, 표준 망막전위도검사, 다병소성 망막전위도검사, 읽기 속도에 대한 유효 시험, 안면 인식, 드라이빙 시뮬레이션 및 환자가 보고한 만족감을 포함한다. 따라서, BCD의 치료는 ETDRS 척도에서 2줄 이상(또는 10글자)의 시력을 획득 시 또는 상실 실패 시 달성되는 것으로 언급될 수 있다. 또한, 특정 양상에서, BCD의 치료는, 예를 들어, 망막전위도검사에 의해 측정한 바와 같은 망막 기능의 개선 또는 상실의 늦춤; 예를 들어, 광 간섭성 단층촬영기술(optical coherence tomography: OCT)에 의해 측정된 바와 같은 망막 구조의 개선 또는 진행의 늦춤; 예를 들어, 다양한 조명 강도에서 미로를 통한 보행 내비게이션의 개선 또는 상실의 늦춤; 및/또는 읽기 속도(분당 단어 수)의 적어도 10%, 20% 또는 30%의 증가 또는 10%, 20% 또는 30% 감소 결여 시 일어나는 것으로 언급될 수 있다. 또한, 일부 양상에서, BCD의 치료는 대상체가 이시하라 검사에 대해 정확하게 확인된 판 또는 판스워스 검사에 대해 정확하게 배열된 원판의 적어도 20% 증가 또는 20% 감소의 결여를 나타내는 경우에 일어나는 것으로 언급될 수 있다. 따라서, BCD의 치료는, 예를 들어, 암순응률의 개선, 시력의 개선, 또는 시력 상실 속도의 늦춤에 의해 결정될 수 있다.
치료 또는 예방될 수 있는 망막 구조의 바람직하지 않은 양상은, 예를 들어, 망막 내 지질의 작은, 황색 또는 백색 결정질-유사 침착물 축적, 망막 위축, 망막 색소 상피 위축, 망막 혈관이 좁아짐, 색소성 응괴, 및 망막하액을 포함한다. 망막 구조를 평가하는 예시적인 수단은 안저검사, 안저촬영, 플루오레세인 혈관조영술, 형인도시아닌 그린 형광안저조영술, OCT, 스펙트럼 도메인 광 간섭성 단층촬영기술, 주사 레이저 안저검사, 공초점 현미경, 적응 광학계, 안저 자가형광, 생체검사, 검시 및 면역조직화학을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터는, 예를 들어, 망막 위축 발생률의 감소 및/또는 망막 내 황색 또는 백색 결정질-유사 침착물의 수 및/또는 크기의 감소에 의해 결정되는 바와 같은 대상체의 BCD를 치료하는 데 사용될 수 있다.
BCD의 치료는 또한, 예를 들어, 삶의 질의 개선 또는 보존에 의해 결정될 수 있다. 당업자는 삶의 질이 다수의 상이한 검사, 예를 들어, 국립안연구소(National Eye Institute) NEI-VFQ25 설문지에 의해 결정될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 치료제로 치료될 수 있는 대상체는 또한 망막 이상증을 치료하는 데 공지된 효능을 갖는 다른 치료제 또는 장치, 예컨대, 비타민 및 미네랄 제제, 저시력 보조기, 안내견, 또는 저시력을 갖는 환자를 보조하는 것으로 알려진 다른 장치와 함께 투여될 수 있다.
현재, BCD의 치료를 위한 다른 승인된 치료제는 없다. 다른 새로운 요법이 나타남에 따라, 본 조성물 및 보다 새로운 요법은 임상적으로 지시된 바와 같은 순서로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
다음은 본 발명의 예시적인 실시형태이다.
1. 바이러스 벡터로서, 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(iv) 폴리아데닐화(폴리A) 신호 서열; 및
(v) 3' ITR
을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는, 바이러스 벡터.
2. 실시형태 1에 있어서, 상기 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) 인트론;
(iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(v) 폴리A 신호 서열; 및
(vi) 3' ITR
을 포함하는, 바이러스 벡터.
3. 실시형태 1에 있어서, 상기 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(iv) 조절 요소;
(v) 폴리A 신호 서열; 및
(vi) 3' ITR
을 포함하는, 바이러스 벡터.
4. 실시형태 1에 있어서, 상기 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) 인트론;
(iv) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(v) 조절 요소;
(vi) 폴리A 신호 서열; 및
(vii) 3' ITR
을 포함하는, 바이러스 벡터.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터 게놈은 약 4.1 kb 이상 내지 약 4.9 kb 이하의 길이를 포함하는, 바이러스 벡터.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터 게놈은 폴리A 신호 서열과 3' ITR 사이에 위치된 스터퍼 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
7. 실시형태 6에 있어서, 스터퍼 서열은 길이가 약 1 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150, 150 내지 200, 200 내지 250, 250 내지 300, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 750, 750 내지 1,000, 1,000 내지 1,500, 1,500 내지 2,000, 2,000 내지 2,500 또는 2,500 내지 3,000개의 뉴클레오티드인, 바이러스 벡터.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 5' ITR은 서열번호 1에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 편재하는 프로모터인, 바이러스 벡터.
10. 실시형태 9에 있어서, 프로모터는 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터, CBA 프로모터 또는 CAG 프로모터인, 바이러스 벡터.
11. 실시형태 10에 있어서, 프로모터는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
12. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 프로모터는 망막 색소 상피(RPE)-특이적 프로모터인, 바이러스 벡터.
13. 실시형태 12에 있어서, 프로모터는 ProC2 프로모터, VMD2 프로모터, CYP4V2 프로모터 또는 RPE65 프로모터인, 바이러스 벡터.
14. 실시형태 13에 있어서, 프로모터는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, RPE 세포에서 CYP4V2의 발현을 촉진시키는, 바이러스 벡터.
15. 실시형태 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, CYP4V2 암호화 서열은 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47 또는 서열번호 49에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
16. 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 폴리A 신호 서열은 소 성장 호르몬 또는 유인원 바이러스 40 폴리A 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
17. 실시형태 16에 있어서, 폴리A 신호 서열은 서열번호 18 또는 서열번호 19에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 3' ITR은 서열번호 22에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
19. 실시형태 2 및 4 중 어느 하나에 있어서, 인트론은 인간 성장 호르몬, 유인원 바이러스 40, 또는 인간 베타 고빈 인트론 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
20. 실시형태 19에 있어서, 인트론은 서열번호 9, 서열번호 10 또는 서열번호 11에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
21. 실시형태 3 및 4 중 어느 하나에 있어서, 조절 요소는 B형 간염 바이러스 또는 우두처크 간염 바이러스 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
22. 실시형태 21에 있어서, 조절 요소는 서열번호 16 또는 서열번호 17에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
23. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 벡터 게놈은 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열 바로 상류에 위치된 Kozak 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
24. 실시형태 23에 있어서, Kozak 서열은 서열번호 12, 서열번호 51, 서열번호 52 또는 서열번호 53의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
25. 실시형태 1에 있어서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22; 및
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
26. 실시형태 2에 있어서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22; 및
xxviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
27. 실시형태 3에 있어서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22; 및
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
28. 실시형태 4에 있어서, 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
xxviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
29. 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 혈청형 8, 9, 2 또는 5 캡시드를 포함하는, 바이러스 벡터.
30. 실시형태 29에 있어서, AAV8 캡시드는 서열번호 24, 25 및 26 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
31. 실시형태 29에 있어서, AAV8 캡시드는 서열번호 23에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 바이러스 벡터.
32. 실시형태 29에 있어서, AAV9 캡시드는 서열번호 28, 29 및 30 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
33. 실시형태 29에 있어서, AAV9 캡시드는 서열번호 27에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 바이러스 벡터.
34. 실시형태 29에 있어서, AAV2 캡시드는 서열번호 32, 33 및 34 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
35. 실시형태 29에 있어서, AAV2 캡시드는 서열번호 31에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 바이러스 벡터.
36. 실시형태 29에 있어서, AAV5 캡시드는 서열번호 36, 37 및 38 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
37. 실시형태 29에 있어서, AAV5 캡시드는 서열번호 35에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된, 바이러스 벡터.
38. 선행하는 실시형태 중 어느 것의 바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
39. 실시형태 38에 있어서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함하는, 조성물.
40. 망막 세포에서 이종성 CYP4V2 유전자를 발현시키는 방법으로서, 상기 망막 세포를 선행하는 실시형태 중 어느 것의 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
41. 실시형태 40에 있어서, 망막 세포는 RPE 세포인, 방법.
42. 비에띠 결정 이상증(BCD)을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 유효량의 실시형태 39의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
43. BCD를 갖는 대상체에서 시력을 개선시키거나, 시기능 또는 기능적 시력을 개선시키거나, 또는 시기능 또는 기능적 시력의 감소를 저해하는 방법으로서, 유효량의 실시형태 39의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
44. BCD를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한 실시형태 39의 조성물.
45. BCD를 갖는 대상체에서 시력을 개선시키는 데 사용하기 위한 실시형태 39의 조성물.
46. 유전자 카세트를 포함하는 핵산으로서, 유전자 카세트는 5'에서 3' 방향으로:
(i) 5' ITR;
(ii) 프로모터;
(iii) CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
(iv) 폴리A 신호 서열; 및
(v) 3' ITR
을 포함하는, 핵산.
47. 실시형태 46에 있어서, 핵산은 플라스미드인, 핵산.
48. 실시형태 46에 있어서, 유전자 카세트는 5'에서 3' 방향으로:
i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22
로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
49. CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터로서, 프로모터는 ProC2 프로모터인, 바이러스 벡터.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 본 발명을 더 예시하기 위해 제공된다. 본 발명의 다른 변화는 당업자에게 매우 자명할 것이고, 첨부된 청구범위에 포함된다.
실시예 1: AAV-ITR 플라스미드의 작제
1.1. AAV-ITR 플라스미드의 클로닝:
개개 플라스미드 요소의 뉴클레오티드 서열을 표 2에 기재한다. 서열을 합성하거나 상업적으로 구입하였다. 표 4는 작제한 각 플라스미드에 존재하는 요소를 기재한다. 표 4에 기재한 플라스미드를 생성함에 있어서 표준 분자 생물학 클로닝 기법을 사용하였다. 골격 및 출발물질로서 카나마이신 내성을 갖는 플라스미드 골격을 사용하였다. 개개 서열 요소를 제한 효소 부위에서 또는 평활 말단 클로닝을 이용하여 클로닝시켰다.
플라스미드 골격에 포함된 항생제 내성 유전자 카세트는 AAV 벡터의 생성에서 어떤 역할을 하지 않기 때문에, 당업자는 교번의 플라스미드 골격 및/또는 항생제 내성 유전자 카세트를 사용할 수 있고, 동일한 바이러스 벡터를 수득할 수 있을 것이다.
1.2. rAAV 벡터를 생성하기 위한 삼중 플라스미드 형질감염:
삼중 형질감염 방법에 의해 재조합 AAV(rAAV) 바이러스 벡터를 생성하였다. 삼중 형질감염에 대한 방법은 당업계에 공지되어 있다(Ferrari et al., Nat Med 3:1295-1297, 1997). 간략하게, AAV-ITR-함유 플라스미드(표 4에 기재), AAV-RepCap 함유 플라스미드(Rep2 및 Cap8을 운반) 및 아데노-헬퍼 플라스미드(AAV 복제 주기를 완료하는 데 도움이 되는 유전자를 운반)를 293 세포에 공동 형질감염시켰다. 세포를 4일 동안 배양시켰다. 배양 기간의 마지막에, 세포를 용해시키고, AVB 세파로스 친화도 칼럼(GE Healthcare Life Sciences)을 이용하여 배양 상청액 중의 벡터 및 세포 용해물 중의 벡터를 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 당업자는 표준 CsCl 구배 원심분리 방법(문헌[Grieger et al., Nat Protoc 1:1412-1428, 2006]에 기반한 방법)이 또한 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
대안적으로, GMP-유사 rAAV 벡터를 상기 기재한 세포 형질감염 및 배양 방법에 의해 생성할 수 있다. 이어서, 채취한 세포 배양 물질을 문헌[Lock et al., Hum Gene Ther 21:1259-1271, 2010]; 문헌[Smith et al., Mol Ther 17:1888-1896, 2009]; 및 문헌[Vandenberghe et al., Hum Gene Ther 21:1251-1257, 2010]에 기재된 방법에 기반하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 처리한다.
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
실시예 2: hGH 인트론, bGH 폴리A 신호 서열, 및 HPRE의 포함은 eGFP의 향상된 발현을 제공한다
망막에서 최적의 유전자 발현에 대한 최고 조합을 결정하기 위해, 상이한 인트론, 상이한 폴리A 신호 서열을 포함하여 상이한 요소를 포함하고, HPRE를 포함하거나 포함하지 않는 ChR2d-eGFP를 발현시키는 AAV8 벡터를 설계하였다.
방법
C57BL/6 마우스에게는, eGFP에 융합된 채널로돕신(channelrhodopsin)(ChR2d-eGFP)을 발현시키고, 상이한 요소, 예를 들어, 상이한 인트론(예를 들어, hGH 인트론 및 SV40 인트론), 폴리A 신호 서열(예를 들어, bGH 폴리A 신호 서열 및 SV40 폴리A 신호 서열)을 포함하며, HPRE를 포함하거나 포함하지 않는, 1×109 vg의 AAV8 벡터를 망막하에 주사하였다. 4주 후에, 마우스로부터 눈을 채취하고, 일부를 4℃에서 밤새 1 ㎖ 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정액으로 고정시키고, 이어서, 인산염-완충 식염수(PBS)에 넣었다. 이어서, 이들을 종이 타월로 건조시키고, 35 ㎜ 접시에 옮겼다. 눈 바깥쪽뿐만 아니라 각막 및 수정체로부터 관련 없는 조직을 제거하고, 이어서, 아이컵을 1 ㎖ PBS 중에 담그었다. 이어서, 망막을 아이컵으로부터 제거하고, 둘 다 페탈로 절단하고, 슬라이드 상에 장착하였다. Zeiss Axio Imager M1 형광 현미경 및 AxioVision 소프트웨어를 이용하여 eGFP 형광 이미지를 얻었다. 2.5× 배율로 동일한 노출 시간으로 모든 이미지를 촬영하였다.
다른 채취한 눈을 신경 망막 및 후부 아이컵으로 분리시키고, 액적 디지털(droplet digital PCR: ddPCR)을 이용하여 ChR2d-eGFP mRNA 발현의 분석을 위해 냉동시켰다. 간략하게, Qiagen RNeasy 미니 키트를 이용하여 조직 샘플로부터 RNA를 단리시키고, 이어서, ThermoFisher Scientific으로부터의 고 용량 cDNA 역전사 키트를 이용하여 cDNA를 생성하기 위해 200 ng RNA를 사용하였다. 각 샘플에 대해 1 ng의 cDNA를 ddPCR Supermix 및 프라이머에 첨가하고, eGFP(Mr04097229_mr; ThermoFisher Scientific) 및 마우스 Rab7(Mm00784318_sH; ThermoFisher Scientific)을 인식하는 프로브를 각 반응물에 첨가하였다. 제조업자의 프로토콜(Bio-Rad)에 따라 ddPCR을 수행하였다. ChR2d-eGFP 발현을 각 샘플에 대한 Rab7 대조군 발현에 대해 정규화하였다.
결과 및 결론
5가지 상이한 AAV8 벡터를 작제하고, 마우스에 망막하 주사하였다. 주사 4주 후에, 눈을 마우스로부터 채취하고, 플랫마운트와 ddPCR 둘 다에 의해 ChR2d-eGFP 발현을 시험하였다. 후부 아이컵의 플랫마운트는 eGFP 형광이 hGH 인트론을 포함하는 벡터를 주사한 눈에서 가장 밝다는 것을 나타내었다(도 1). 또한, bGH 폴리A 신호 서열의 포함은 SV40 폴리A 신호 서열을 갖는 동일한 벡터에 약간 더 높은 형광을 나타내었다(AAV8-TM078 대 AAV8-TM073).
ChR2d-eGFP 발현 수준의 더 정량적인 분석을 얻기 위해, 분리된 신경 망막 및 후부 아이컵 샘플로부터 분리한 mRNA에 대해 ddPCR을 수행하였다. 결과는 후부 아이컵에서, 발현이 HPRE의 첨가에 의해 가장 유의미하게 향상되었다는 것을 나타내었다(AAV8-TM075)(도 2a). 또한, bGH 폴리A 신호 서열을 포함하는 벡터는 SV40 폴리A 신호 서열을 포함하는 각 벡터에 비해 더 높은 발현을 나타내었다(AAV8-TM078을 AAV8-TM073과 비교하고, AAV8-TM079를 AAV8-TM074와 비교함). 신경 망막에서, HPRE의 첨가는 또한 eGFP의 발현 수준의 향상을 야기하였지만(AAV8-TM075), bGH 폴리A 신호 서열의 첨가로부터 발현의 가장 큰 증가가 관찰되었다(AAV8-TM078 및 AAV8-TM079)(도 2b).
종합하면, 이들 결과는 망막에서 유전자 발현을 위한 최적의 발현 카세트가 hGH 인트론, bGH 폴리A 신호 서열 및 HPRE 요소를 포함할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, BCD의 치료를 위한 CYP4V2 cDNA의 전달을 위해 해당 요소 중 하나, 둘 또는 셋 모두를 포함하는 벡터를 작제하였다.
실시예 3: Cyp4v3 넉아웃 마우스에 AAV-CYP4V2 벡터의 망막하 주사는 질환 진행을 방지한다.
Cyp4v3은 인간 CYP4V2의 마우스 오솔로그이다(82% 동일성). CRISPR/Cas9를 이용하여 Cyp4v3 유전자를 넉아웃시키고, Cyp4v3 넉아웃 마우스에 눈당 대략 1×109 vg으로 CYP4V2를 발현시키는 AAV 벡터를 주사한다. 주사 후 상이한 시점에, 마우스를 안저 영상 및 광 간섭성 단층촬영기술로 시험하여 망막에 존재하는 결정질 침착물의 수 및 크기를 결정한다. 또한, 시기능(예를 들어, 시력, 암순응) 및 기능적 시력(예를 들어, 가동 검사)에 대해 마우스를 평가한다. 대조군-주사 눈(AAV-eGFP 벡터)와 비교할 때, CYP4V2를 발현시키는 벡터를 주사한 눈은 결정질 침착물의 수 및/또는 크기의 감소 및/또는 시기능 및/또는 기능적 시력의 개선을 나타내며, 이는 RPE 세포에서 CYP4V2의 성공적인 발현 및 CYP4V2 단백질 기능의 회복을 입증한다.
실시예 4: 비-인간 영장류에 AAV-ProC2 벡터의 망막하 주사는 RPE 세포에서 유전자 발현을 야기한다
ProC2 프로모터 서열을 GENEWIZ에 의해 화학적으로 합성하고, 짧은 측면은 MluI/NheI/AscI 및 BamHI/EcoRI/BglII 제한 부위를 포함한다. EF1a 또는 hRO 프로모터를 대신하여 pAAV-EF1a-CatCh-GFP에 적절한 제한 부위 조합을 이용하여 ProC2 프로모터 서열을 서브클로닝하였다. pcDNA3.1(-)-CatCh-GFP를 이용하여 어댑터 PCR 및 Clontech In-Fusion 키트에 의해 pAAV-EF1a-CatCh-GFP 플라스미드를 작제하였다.
HEK293T 세포를 AAV 이식유전자 플라스미드, 선택 캡시드(BP2)에 대해 AAV Rep2 및 Cap 단백질을 암호화하는 AAV 헬퍼 플라스미드, 및 분지형 폴리에틸렌이민(Polysciences)을 이용하여 아데노바이러스 유전자를 보유하는 pHGT1-Adeno1 헬퍼 플라스미드로 공동 형질감염시켰다. 직경이 15 ㎝인 하나의 세포 배양 접시를 HEK293T 세포의 80% 합류(confluence)에서 플라스미드 혼합물과 공동형질감염시켰다. 5 ㎖의 DMEM에서 7 ㎍ AAV 이식유전자 플라스미드, 7 ㎍ Rep2 및 Cap-암호화 플라스미드, 20 ㎍ AAV 헬퍼 플라스미드 및 6.8 μM 폴리에틸렌이민을 함유하는 세포 형질감염 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨 후에, 10 ㎖의 DMEM을 함유하는 세포 배양물 접시에 첨가하였다. 형질감염 60시간 후에, 세포를 수집하고, 150 mM NaCl 및 20 mM Tris-HCl, pH 8.0을 함유하는 완충제에서 재현탁시켰다. 반복된 냉동-해동 주기에 의해 세포를 용해시키고, MgCl2를 첨가하여 1mM의 최종 농도를 만들었다. 37℃에서 10분 동안 250 Uml-1의 TurboNuclease에 의한 처리에 의해 플라스미드 및 게놈 DNA를 제거하였다. 세포 파편을 4,000 r.p.m.에서 30분 동안 원심분리에 의해 제거하였다. AAV 입자를 정제하고, Millipore Amicon 100K 칼럼(카탈로그 번호 UFC910008; Merck Millipore)에서 농축시켰다. 프로테아제 K를 이용하는 AAV 입자의 변성 후 TaqMan 역전사 PCR에 의해 캡시드화된 바이러스 DNA를 정량화하고; ㎖당 게놈 복제물로서 역가를 계산하였다.
마우스에서의 AAV 투여를 위해, 2.5% 이소플루란으로 마취시킨 마우스에서 안구 주사를 수행하였다. 수정체 근처의 공막에서 뾰족한 30-G 마늘을 이용하여 작은 절개부를 만들고, 이 절개부를 통해 미세조작장치에 보유된 뭉툭한 5-㎕ Hamilton 주사기(Hamilton Company)를 이용하여 망막하/유리체강내 공간에 2 ㎕의 AAV 현탁액을 주사하였다.
비-인간 영장류에서 AAV 투여에 대해, 50 마이크로리터의 AAV 입자 현탁액을 안과 의사 및 중국 쿤밍의 제3 계약자와 협력하여 망막하에 주사하였다. 3개월 후에, 분리한 아이컵을 PBS 중 4% PFA에서 밤새 고정시킨 후에, 4℃에서 PBS에서 세척 단계가 이어졌다. 고정된 아이컵을 수용한 후에, 감염시킨 망막 영역을 절개하고, 1시간 동안 실온에서 PBS 중 10% 정상 당나귀 혈청(NDS), 1% BSA, 0.5% Triton X-100으로 처리하였다. PBS 중 3% NDS, 1% BSA, 0.5% Triton X-100 중 단클론성 랫트 항 GFP Ab(Molecular Probes Inc.; 1:500) 및 다클론성 염소 항-ChAT(Millipore: 1:200)에 의한 처리를 실온에서 5일 동안 수행하였다. 2차 당나귀 항-랫트 Alexa Fluor-488 Ab(Molecular Probes Inc.; 1:200), 항-염소 Alexa Fluor-633 및 훽스트에 의한 처리를 2시간 동안 수행하였다. 단면을 세척하고, 유리 슬라이드 상에 ProLong Gold antifade reagent(Molecular Probes Inc.)을 놓고, Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2 레이저 주사 공초점 현미경(Carl Zeiss Inc.)을 사용하여 촬영하였다.
도 3은 RPE 세포에서의 사이노몰거스 원숭이(NHP) 유도 발현에서 AAV-ProC2-CatCh-GFP의 망막하 주사를 나타낸다(도 3a 및 도 3b 상부에서 그레이 스케일 영상의 회색 영역).
이하의 표 5는 합성 프로모터 ProC2가 마우스 및 NHP 망막 세포에서 발현을 유도하는 능력을 요약한다.
Figure pct00050
실시예 5: RPE 세포를 표적화하기 위한 최고의 캡시드 혈청형을 결정하기 위한 사이노몰거스 원숭이에 대한 AAV 벡터의 망막하 주사.
CMV 프로모터로부터 GFP를 발현시키는 AAV2, AAV6, AAV8 및 AAV9 벡터를 눈당 1×1011 vg의 용량으로 사이노몰거스 원숭이에 망막하 주사하였다. 주사 4주 후에, 안저 자가형광 영상화에 의해 생전에 그리고 면역조직화학에 의해 채취 후에 원숭이 눈에서의 GFP 발현을 시험하였다. 또한, 동소 혼성화(in-situ hybridization)에 의해 GFP mRNA 및 AAV 게놈 DNA 수준 및 국소화를 평가하였다.
시험한 4종의 혈청형은 모두 광수용체 및 RPE 세포에서 GFP 발현이 용이하였다. 주사 부위 근처에서 발현이 관찰되었고 주변 영역까지의 확산 정도는 다양하였다. 시험한 임의의 혈청형에 대한 시신경 또는 뇌절편에서 GFP 발현은 검출되지 않았다.
실시예 6: RPE-특이적 발현을 위한 최고의 프로모터를 결정하기 위한 사이노몰거스 원숭이에 대한 AAV 벡터의 망막하 주사.
RPE-특이적 프로모터로부터 GFP를 발현시키는 AAV 벡터를 눈당 1×1011 vg의 용량으로 사이노몰거스 원숭이에 망막하 주사하였다. RPE-특이적 프로모터는 ProC2 및 VMD2를 포함한다. 주사 4주 후에, 안저 자가형광 영상화에 의해 생전에 그리고 면역조직화학에 의해 채취 후에 원숭이 눈에서의 GFP 발현을 시험한다. 또한, 동소 혼성화에 의해 GFP mRNA 및 AAV 게놈 DNA 수준 및 국소화를 평가한다. 두 상이한 프로모터는 둘 다 RPE-특이적 GFP 발현을 나타내지만, 발현 수준을 가변적이다.
실시예 7: 인간 망막 조직에서의 AAV-유도 유전자 발현
인간 망막 조직은 정밀한 가위를 이용하여 망막을 해부한 적출된 인간 안구로부터 준비한다. RPE-특이적 프로모터로부터 GFP를 발현시키는 AAV 벡터를 인간 망막 조직과 함께 인큐베이션시킨다. RPE-특이적 프로모터는 ProC2 및 VMD2를 포함한다. 바이러스 투여의 6 내지 8주에 AAV-유도 GFP 발현을 시험한다. 주사 6주 후에, 면역 형광 및 영상화를 통해 인간 망막 조직에서의 GFP 발현을 시험한다. 두 상이한 프로모터는 둘 다 RPE-특이적 GFP 발현을 나타낸다.
실시예 8: NHP 및 인간 조직에서의 ProC2 프로모터 하의 CYP4V2의 AAV-유도 발현
ProC2 프로모터 하에 인간 CYP4V2를 발현시키는 AAV 벡터("AAV-ProC2-CYP4V2 벡터")를 실시예 7에 기재한 바와 같은 인간 망막 조직과 함께 인큐베이션시킨다. 바이러스 투여의 6 내지 8주 후에 CYP4V2 유전자 발현을 시험한다. 주사 6주 후에, 인간 망막 조직에서 CYP4V2 발현을 검출한다.
AAV-ProC2-CYP4V2 벡터를 눈당 1×1011 vg의 용량으로 사이노몰거스 원숭이에 망막하 주사한다. 주사 4주 후에, 면역조직화학에 의해 채취 후에 원숭이 눈에서의 CYP4V2 발현을 시험한다. 또한, 동소 혼성화에 의해 CYP4V2 mRNA 및 AAV 게놈 DNA 수준 및 국소화를 평가한다. ProC2 프로모터는 원숭이 눈에서의 CYP4V2 유전자의 RPE-특이적 발현을 유도한다.
본 개시내용을 상세하게 기재하였지만, 변형, 변화 및 동등한 양상이 본 발명에 기재하고 첨부하는 청구범위에 기재한 바와 같은 본 개시내용의 사상과 범주로부터 벗어나는 일 없이 가능하다는 것은 분명할 것이다. 더 나아가, 본 개시내용의 모든 실시예는 비제한적 예로서 제공된다는 것이 인식되어야 한다. 예를 들어, 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 비특허 간행물을 포함하는 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌은 이들의 전문이 참조에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Novartis AG; Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research <120> Compositions and Methods to Treat Bietti Crystalline Dystrophy <130> PAT058467-WO-PCT <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 130 <212> DNA <213> Adeno-associated virus <400> 1 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 2 <211> 545 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 2 tgtttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 60 tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 120 aatgggtgga ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 180 caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 240 acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 300 ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 360 gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 420 gggactttcc 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tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg ggttaaggca 240 atagcaatat ttctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt 300 tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt atggttggga 360 taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt catacctctt 420 atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 480 aaagaattgg gat 493 <210> 12 <211> 6 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Kozak sequence <400> 12 gccacc 6 <210> 13 <211> 1578 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atggcggggc tctggctggg gctcgtgtgg cagaagctgc tgctgtgggg cgcggcgagt 60 gccctttccc tggccggcgc cagtctggtc ctgagcctgc tgcagagggt ggcgagctac 120 gcgcggaaat ggcagcagat gcggcccatc cccacggtgg cccgcgccta cccactggtg 180 ggccacgcgc tgctgatgaa gccggacggg cgagaatttt ttcagcagat cattgagtac 240 acagaggaat accgccacat gccgctgctg aagctctggg tcgggccagt gcccatggtg 300 gccctttata atgcagaaaa tgtggaggta attttaacta gttcaaagca aattgacaaa 360 tcctctatgt acaagttttt agaaccatgg cttggcctag gacttcttac aagtactgga 420 aacaaatggc gctccaggag aaagatgtta acacccactt tccattttac cattctggaa 480 gatttcttag atatcatgaa tgaacaagca aatatattgg ttaagaaact tgaaaaacac 540 attaaccaag aagcatttaa ctgctttttt tacatcactc tttgtgcctt agatatcatc 600 tgtgaaacag ctatggggaa gaatattggt gctcaaagta atgatgattc cgagtatgtc 660 cgtgcagttt atagaatgag tgagatgata tttcgaagaa taaagatgcc ctggctttgg 720 cttgatctct ggtaccttat gtttaaagaa ggatgggaac acaaaaagag ccttcagatc 780 ctacatactt ttaccaacag tgtcatcgct gaacgggcca atgaaatgaa cgccaatgaa 840 gactgtagag gtgatggcag gggctctgcc ccctccaaaa ataaacgcag ggcctttctt 900 gacttgcttt taagtgtgac tgatgacgaa gggaacaggc taagtcatga agatattcga 960 gaagaagttg acaccttcat gtttgagggg cacgatacaa ctgcagctgc aataaactgg 1020 tccttatacc tgttgggttc taacccagaa gtccagaaaa aagtggatca tgaattggat 1080 gacgtgtttg ggaagtctga ccgtcccgct acagtagaag acctgaagaa acttcggtat 1140 ctggaatgtg ttattaagga gacccttcgc ctttttcctt ctgttccttt atttgcccgt 1200 agtgttagtg aagattgtga agtggcaggt tacagagttc taaaaggcac tgaagccgtc 1260 atcattccct atgcattgca cagagatccg agatacttcc ccaaccccga ggagttccag 1320 cctgagcggt tcttccccga gaatgcacaa gggcgccatc catatgccta cgtgcccttc 1380 tctgctggcc ccaggaactg tataggtcaa aagtttgctg tgatggaaga aaagaccatt 1440 ctttcgtgca tcctgaggca cttttggata gaatccaacc agaaaagaga agagcttggt 1500 ctagaaggac agttgattct tcgtccaagt aatggcatct ggatcaagtt gaagaggaga 1560 aatgcagatg aacgctaa 1578 <210> 14 <211> 1578 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon-optimized CYP4V2 sequence <400> 14 atggccggac tgtggctggg actggtctgg cagaagttat tactgtgggg agctgcctcc 60 gctctgtctt tagctggagc ttctttagtg ctgtctttac tgcagagggt cgcctcctat 120 gctaggaagt ggcagcagat gaggcctatt cctaccgtgg ccagagccta tcctttagtg 180 ggccacgctc tgctgatgaa acccgacgga agggagttct tccagcagat catcgagtac 240 accgaagagt acagacacat gcctttactg aaactgtggg tgggacccgt tcctatggtg 300 gctttataca atgccgagaa tgtggaggtg attttaacca gcagcaagca gatcgacaag 360 tccagcatgt ataagttttt agagccttgg ctcggtttag gactgctgac ctccactggt 420 aataagtgga ggtctcgtag gaaaatgctg acccccacct ttcacttcac cattttagag 480 gactttttag atatcatgaa cgagcaagct aacattttag tgaagaagct cgaaaagcac 540 attaaccaag aagctttcaa ctgttttttc tacatcactt tatgcgccct cgatatcatc 600 tgcgagacag ccatgggcaa gaacattggc gctcagagca acgacgattc cgagtacgtg 660 agggctgtct acagaatgag cgagatgatc ttcagaagaa tcaagatgcc ttggctgtgg 720 ctggacctct ggtatttaat gtttaaggaa ggctgggagc ataagaagtc tttacagatt 780 ttacatacat ttaccaacag cgtgatcgcc gagagggcca atgaaatgaa cgccaacgag 840 gattgtcgtg gcgacggaag aggctccgct ccttccaaga acaagaggag agccttttta 900 gatctcttat tatccgtgac agacgatgag ggcaataggc tgagccacga ggacatcaga 960 gaagaggtgg acaccttcat gttcgaggga cacgacacaa ccgccgccgc catcaattgg 1020 tctttatatt tactcggcag caaccccgag gtgcaaaaaa aggtcgacca cgagctcgac 1080 gacgtgttcg gcaagagcga tcgtcccgcc acagtggaag atttaaagaa gctgaggtat 1140 ctcgagtgcg tgatcaaaga gactttaaga ctgttcccca gcgtgcctct gtttgctcgt 1200 tccgtgtccg aagactgcga ggtggctgga tatcgtgtcc tcaagggcac cgaggccgtg 1260 atcattccct acgccctcca tcgtgatccc agatacttcc 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tcttaataca gtgttgtgga taggactaaa aacacaggag tcagatcttc 1320 ttggttcaac ttcctgctta ctccttacca gctgtgtgtt ttttgcaagg ttcttcacct 1380 ctatgtgatt tagcttcctc atctataaaa taattcagtg aattaatgta cacaaaacat 1440 ctggaaaaca aaagcaaaca atatgtattt tataagtgtt acttatagtt ttatagtgaa 1500 ctttcttgtg caacattttt acaactagtg gagaaaaata tttctttaaa tgaatacttt 1560 tgatttaaaa atcagagtgt aaaaataaaa cagactcctt tgaaactagt tctgttagaa 1620 gttaattgtg cacctttaat gggctctgtt gcaatccaac agagaagtag ttaagtaagt 1680 ggactatgat ggcttctagg gacctcctat aaatatgata ttgtgaagca tgattataat 1740 aagaactaga taacagacag gtggagactc cactatctga agagggtcaa cctagatgaa 1800 tggtgttcca tttagtagtt gaggaagaac ccatgaggtt tagaaagcag acaagcatgt 1860 ggcaagttct ggagtcagtg gtaaaaatta aagaacccaa ctattactgt cacctaatga 1920 tctaatggag actgtggaga tgggctgcat ttttttaatc ttctccagaa tgccaaaatg 1980 taaacacata tctgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgagagag agagagagag 2040 agagagagac tgaagtttgt acaattagac attttataaa atgttttctg aaggacagtg 2100 gctcacaatc 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agatggcagg gaacagcatc 480 agcatggtgt gagggatagg cattttttca ttgtgtacag cttgtaaatc agtattttta 540 aaactcaaag ttaatggctt gggcatattt agaaaagagt tgccgcacgg acttgaaccc 600 tgtattccta aaatctagga tcttgttctg atggtctgca caactggctg ggggtgtcca 660 gccactgtcc ctcttgcctg ggctccccag ggcagttctg tcagcctctc catttccatt 720 cctgttccag caaaacccaa ctgatagcac agcagcattt cagcctgtct acctctgtgc 780 ccacatacct ggatgtctac cagccagaaa ggtggcttag atttggttcc tgtgggtgga 840 ttatggcccc cagaacttcc ctgtgcttgc tgggggtgtg gagtggaaag agcaggaaat 900 gggggaccct ccgatactct atgggggtcc tccaagtctc tttgtgcaag ttagggtaat 960 aatcaatatg gagctaagaa agagaagggg aactatgctt tagaacagga cactgtgcca 1020 ggagcattgc agaaattata tggttttcac gacagttctt tttggtaggt actgttatta 1080 tcctcagttt gcagatgagg aaactgagac ccagaaaggt taaataactt gctagggtca 1140 cacaagtcat aactgacaaa gcctgattca aacccaggtc tccctaacct ttaaggtttc 1200 tatgacgcca gctctcctag ggagtttgtc ttcagatgtc ttggctctag gtgtcaaaaa 1260 aagacttggt gtcaggcagg cataggttca agtcccaact ctgtcactta ccaactgtga 1320 ctaggtgatt gaactgacca tggaacctgg tcacatgcag gagcaggatg gtgaagggtt 1380 cttgaaggca cttaggcagg acatttaggc aggagagaaa acctggaaac agaagagctg 1440 tctccaaaaa tacccactgg ggaagcaggt tgtcatgtgg gccatgaatg ggacctgttc 1500 tgg 1503 <210> 22 <211> 130 <212> DNA <213> Adeno-associated virus <400> 22 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag 130 <210> 23 <211> 2217 <212> DNA <213> Adeno-associated virus <400> 23 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60 gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120 gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180 aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300 caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480 ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540 gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600 cctaatacaa tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660 ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720 atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780 atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840 ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag 900 cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac tcagcttcaa gctcttcaac 960 atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taacctcacc 1020 agcaccatcc aggtgtttac ggactcggag taccagctgc cgtacgttct cggctctgcc 1080 caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtgttca tgattcccca gtacggctac 1140 ctaacactca acaacggtag tcaggccgtg ggacgctcct ccttctactg cctggaatac 1200 tttccttcgc agatgctgag aaccggcaac aacttccagt ttacttacac cttcgaggac 1260 gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg accggctgat gaatcctctg 1320 attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa caggaggcac ggcaaatacg 1380 cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg ccaatcaggc aaagaactgg 1440 ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga caaccgggca aaacaacaat 1500 agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga atggaagaaa ttcattggct 1560 aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg agcgtttttt tcccagtaac 1620 gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca atgcggatta cagcgatgtc 1680 atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg tggctacaga ggaatacggt 1740 atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc aaattggaac tgtcaacagc 1800 cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860 tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt ctccgctgat gggcggcttt 1920 ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca cgcctgtacc tgcggatcct 1980 ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca cgcaatacag caccggacag 2040 gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca gcaagcgctg gaaccccgag 2100 atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg actttgctgt taatacagaa 2160 ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217 <210> 24 <211> 738 <212> PRT <213> Adeno-associated virus <400> 24 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile 145 150 155 160 Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg 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agacgcagac 540 tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600 aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660 gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780 tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840 tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900 aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960 aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020 caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080 tgcctcccgc cgttcccagc agacgtcttc atggtgccac agtatggata cctcaccctg 1140 aacaacggga gtcaggcagt aggacgctct tcattttact gcctggagta ctttccttct 1200 cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260 cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320 tacctgtatt acttgagcag aacaaacact ccaagtggaa ccaccacgca gtcaaggctt 1380 cagttttctc aggccggagc gagtgacatt cgggaccagt ctaggaactg gcttcctgga 1440 ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500 tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560 ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620 atctttggga agcaaggctc agagaaaaca aatgtggaca ttgaaaaggt catgattaca 1680 gacgaagagg aaatcaggac aaccaatccc gtggctacgg agcagtatgg ttctgtatct 1740 accaacctcc agagaggcaa cagacaagca gctaccgcag atgtcaacac acaaggcgtt 1800 cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860 attccacaca cggacggaca ttttcacccc tctcccctca tgggtggatt cggacttaaa 1920 caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980 ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040 gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100 acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160 tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208 <210> 32 <211> 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tgctgatgaa gcgggacggg cgagaatttt ttcagcagat cattgagtac 240 acagaggaat accgccacat gccactcctg aagctctggg tcgggccggt gcccatggtg 300 gccctttata atgcagaaaa tgtggaggta attttaacta gttcaaagca aattgacaaa 360 tcctctatgt acaagttttt agaaccatgg cttggcctag gacttcttac aagtactgga 420 aacaaatggc gctccaggag aaagatgtta acacccactt tccattttac cattctggaa 480 gatttcttag atatcatgaa tgaacaagca aatatattgg ttaagaaact tgaaaaacat 540 gttaaccaag aagcatttaa ctgctttgtt tacatcactc tttgtgcctt agatatcatc 600 tgtgaaacag ctatggggaa gaatattggt gctcaaagta acgatgattc cgagtatgtc 660 cgtgcagttt atagaatgag tgagatgata tttcgaagaa taaagatgcc gtggctttgg 720 cttgacctct ggtaccttat gtttaaagag ggatgggaac acaaaaagag ccttaagatc 780 ctacatgctt ttaccaacaa tgttatcgct gaacgggcca atgaaatgaa cgtggatgaa 840 gactgtagag gtgatggcag ggactccgcc ccctccaaaa ataaacgcag ggcctttctt 900 gacttgcttt taagtgtgac tgacgacgaa gggaacaggc taagtcatga agatattcga 960 gaagaagttg acaccttcat gtttgagggc cacgacacaa ctgcagctgc aatgaactgg 1020 tccttatacc tgttggggtc taacccagaa gtccagaaaa aagtggacca tgaactggat 1080 gacgtgtttg ggaggtctga ccgtcccgct actgtagaag acctgaagaa acttcggtat 1140 ctggaatgtg ttattaagga gacccttcgc ctttttcctt ctgttccttt atttgcccgc 1200 agtgttagtg aagattgtga agtggcaggt tacagagttc tgaaaggcac tgaagccgtc 1260 atcattccct atgcattgca tagagatcca agatacttcc ccaaccctga ggagttccgg 1320 cctgagcggt tcttccccga gaatgcacaa gggcgccatc catatgccta cgtgcccttc 1380 tctgctggcc ccaggaactg tataggtcaa aagtttgctg tgatggaaga aaagaccatt 1440 ctttcgtgca tcctaaggca cttttggata gaatccaacc agaaaagaga agaacttggt 1500 ctagaaggac agttgattct tcgtccaact aatggcatct ggatcaagtt gaagaggaga 1560 aatgcagatg aaccctaa 1578 <210> 40 <211> 525 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 40 Met Ala Gly Ile Trp Leu Gly Leu Val Trp Gln Lys Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ser Ala Val Ser Leu Ala Gly Ala Ser Leu Val Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Gln Arg Val Ala Ser Tyr Val Arg Lys Trp Gln Gln Met Arg 35 40 45 Pro Ile Pro Thr Val Ala Arg Ala Tyr Pro Leu Val Gly His Ala Leu 50 55 60 Leu 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ccaaccaaaa aagagaagaa 1500 cttggtctag caggagagct cattcttcgt ccaagtaacg gcatctggat caagttgaag 1560 aggagaaaca cagatgaatc ctaa 1584 <210> 42 <211> 527 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 42 Met Leu Ala Pro Trp Leu Leu Ser Val Gly Pro Lys Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Ser Gly Leu Cys Ala Val Ser Leu Ala Gly Ala Thr Leu Thr Leu Asn 20 25 30 Leu Leu Lys Met Val Ala Ser Tyr Ala Arg Lys Trp Arg Gln Met Arg 35 40 45 Pro Val Pro Thr Ile Gly Asp Pro Tyr Pro Leu Val Gly His Ala Leu 50 55 60 Met Met Lys Pro Asp Ala Arg Asp Phe Phe Gln Gln Ile Ile Asp Phe 65 70 75 80 Thr Glu Glu Cys Arg His Leu Pro Leu Leu Lys Leu Trp Leu Gly Pro 85 90 95 Val Pro Leu Val Ala Leu Tyr Asn Ala Glu Thr Val Glu Val Ile Leu 100 105 110 Ser Ser Ser Lys His Ile Glu Lys Ser Tyr Met Tyr Lys Phe Leu Glu 115 120 125 Pro Trp Leu Gly Leu Gly Leu Leu Thr Ser Thr Gly Asn Lys Trp Arg 130 135 140 Ser Arg Arg Lys Met Leu Thr Pro Thr Phe His Phe Thr Ile Leu Glu 145 150 155 160 Asp Phe Leu Asp Val Met Asn Glu Gln Ala Asn Ile Leu Val Thr Lys 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aagtggacaa ggagctggat 1080 gatgtgtttg gaagatccca tcgccctgtc accttggaag acctgaagaa acttaaatat 1140 ctggattgtg tcattaagga gaccctccgt gttttcccat ctgtcccttt atttgcccgg 1200 agtcttagcg aagactgtga agtggcgggt tacaaaatct caaaaggaac ggaagcagtc 1260 atcattccct atgcactaca tcgagaccct agatacttcc cagaccctga ggaattccag 1320 ccagagcggt tctttcctga aaactcccaa ggacgccacc cctatgccta tgtgccattc 1380 tctgctggac ctagaaactg cattggtcaa aagtttgcgg tcatggagga aaagaccatt 1440 cttgcctgta tcctgaggga gttttggata gaatccaacc agaagagaga agaactcggc 1500 ctggctggag atttgattct taggccaaat aatggcatct ggatcaagct gaagaggagg 1560 catgaagatg acccctaa 1578 <210> 44 <211> 525 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 44 Met Leu Trp Leu Trp Leu Gly Leu Ser Gly Gln Lys Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ser Ala Val Ser Val Ala Gly Ala Thr Val Leu Leu Asn 20 25 30 Ile Leu Gln Met Leu Val Ser Tyr Ala Arg Lys Trp Gln Gln Met Arg 35 40 45 Pro Ile Pro Ser Val Ala Arg Ala Tyr Pro Leu Val Gly His Ala Leu 50 55 60 Phe Met Lys Pro Asn Asn 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tatgctgatg agttcaggaa aatgccaatg ttcaaactct ggttaggtcc actgcctgtc 300 acagtattgt tccatcctga tagtgtggag gttattctga gcagttcaaa gcatattaaa 360 aaatcattcc tgtacacatt tctgcaccca tggctgggga ctggactttt gacaagcact 420 ggagacaagt ggcggtcacg gaggaagatg ataactccta cattccactt tgcaatctta 480 aatgactttc ttgaggttat gaatgaacaa gggggtgttt tgttggagaa acttgagaag 540 catgttgaca aggaaccatt taatatcttt acagacatca ctctgtgtgc acttgatatt 600 atctgtgaaa ctgcaatggg caagaatctg ggtgctcaag acaataagga ttctgagtat 660 gttcgtgctg tctacaggat gagtgatcta atccaacagc gacagaagag cccttggctt 720 tggcatgatc ttatgtatct tctgttcaag gaaggaagag agcatgagcg gaatcttaag 780 attctgcatg gttttacaga tacggtaatt gcagaaaaag ttgcagaact tgaaaacacc 840 aagctaacaa aacacgatac tgacgtgaac actgaagaag aaagtggttc caaaaagaga 900 gaagctttct tagacatgct gctgaatgcc acagatgatg aagggaaaaa actcagctac 960 aaggacattc gtgaagaagt ggatactttt atgtttgagg gtcatgatac aacagcagct 1020 gctatgaact gggtcctata cttgcttggt catcatcctg aagcccagaa gaaggttcac 1080 caagaactgg atgaggtgtt tggcaacaca gagcgtcctg ttacagtgga tgatttgaag 1140 aaacttcgat acctcgagtg tgttgtgaaa gaagccctga ggctcttccc ttcagttccc 1200 atgttcgccc gttccttgca agaggattgc tacattagtg gatataagct accaaaaggc 1260 acgaatgtcc ttgtcttaac ttatgtgctg cacagagatc ctgagatctt ccctgagcca 1320 gatgaattca ggcctgagcg cttcttccct gaaaatagca aaggaaggca cccatatgct 1380 tatgtgccct tctctgctgg ccccaggaac tgcattggcc aacgctttgc acaaatggaa 1440 gagaaaactc ttctagccct catcctgcgg cgcttttggg tggactgttc tcaaaagcca 1500 gaagagcttg gtctgtcagg agaactaatt cttcgtccaa ataatggcat ctgggttcaa 1560 ctgaagagga gaccaaaaac tgtaacagaa tga 1593 <210> 48 <211> 530 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 48 Met Ala Met Glu Ile Thr Leu Gly Ser Met Glu Gly Thr Gln Leu Leu 1 5 10 15 Pro Trp Val Ala Gly Ala Ile Thr Leu Leu Leu Thr Val Val Thr Val 20 25 30 His Phe Leu Pro Ser Leu Leu Asn Tyr Trp Trp Trp Trp Trp Val Met 35 40 45 Lys Pro Ile Pro Gly Ile Arg Pro Cys Tyr Pro Phe Val Gly Asn Ala 50 55 60 Leu Leu Leu Glu Arg Asn Gly Glu Gly Phe Phe Lys 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gccacccggc 1980 ctagttctgc caagcgctga 2000 <210> 73 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynP78 (ProA27) <400> 73 ggtcagtaaa gtgaatgaga tgaggtcatg ttccatgtgg gataaacatg gttagtagac 60 tgcaccaggt gatgggggaa aggagagaaa aagatgtgag aggggagggg accaggagaa 120 gggaccaaga gcgaagagaa tcaagatagc caagagagca aatggccaaa aatggcaggg 180 ttacatagga aagagaagct tgcagaagag tagccagggc cccagggagg agatgtttag 240 ttcaggggag aggtgagaaa aactgagaag agctacaggt actgatggaa gatagaagcc 300 agaatgaatt ttggtgtgct aataggtacc acagttagcc agttgcttct ttggaaccca 360 acataaagga ctttttttcc tcctcctcct cctcctcctc ctcttcctct tcctcttcct 420 cctcctcctc ttccttctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct catacatagg 480 tgtagctaga aactggagca ctgtgacctt attcaagggg ccacaaaggt gcctctacac 540 ccccatgcac acaccttaca aaaaaggatc tctagcattt ttgcagtctt tcagtggaat 600 tcaaaaagga atcatttgat tggtaatgag aatgtttttc ctctcggctt ttcacagctc 660 aggaaggagt aatttatcaa gtactctgct tggagaagta gagcatagcc tggaatggag 720 gaacatggat ccctgtgggc gcttgcaatc ttctgctttc attttgtcag tcatgcaagc 780 acagttttaa gtactcacca ggggagaaaa agctctcttc ccagcttgtg cttgccagta 840 agacactctc ctttcagagt caaggctgca gctggccttg ggagcttctt cctaggtctc 900 tagcaagtgg agccagagct gctacagagg aggtaagggc catgggcagc atcccaggaa 960 ggtggttggc aagagggtgg gagacctctc tgcacgtcct cctgggacct gcatgctctc 1020 cccatgcctc accctcaccc tagttgtgac accagaccaa gaaaggcgat gtggttcccc 1080 agccacatcc aaagccaagc ctttggccag aggaaggaag gctgtcccag tcatggtttt 1140 gcttttgttt ttcccctcag cttgcttttt gaacctctat ctgagaggac agtgccctgc 1200 tgctccatag cttcaatcct ggctgcaggg atggaggttg ggaaggaagc tggtgagatc 1260 ctagatcctc aaaaatgata actggatgta gccctggtag ctaaacatcc acagatacac 1320 agctgtgaat ggcctgtact tggacaaact ggagttctga gtttaggatc cagatggatt 1380 aggagtgagt cccaagcagg acttgcttac ccacttcagg gaccagcttc cttccaaata 1440 gacacaggag agtgtctctc ttccctgtca cccatagcct gactagggag agtgagtggc 1500 aaacccaaat ttgcatattt cattccagct gagactaaag ccttgacctc aggcatggag 1560 gactgtaacc actgagaact aatatgataa cattgttatc ttacgagaat tctcctgtat 1620 gcagagtagg tccatatggt tttctggatt cattgcacag atgaattcga acctgacatc 1680 ccacagggag agagatgtgt gagctccaga cagaaggctg tgtagtgtgg gcactgtgcc 1740 aggaccacca gcataatttc tcctaagaca cacctgtcta gaaagttaga gccataagac 1800 aaccttggcc ctgggccatg tcactgctca tatctggccc cagctttgtg tgcctagagg 1860 agtattcttg cctctttgga aaaattggag ggagccggat taacctactg caggtgctag 1920 gggtgggtgg caaagctgtg ataggtgttg gtagtgttgt agctggcaaa gctgatctcc 1980 tgtctgttgc agccttcacc 2000 <210> 74 <211> 774 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynP151 (ProC29) <400> 74 cttaccgatt gcagacgaaa ccgaaactta gctgacatcg agtcgaaacc gaaacttttc 60 atggccgaag gcgaaaccga aacttgcgtc cgtgtaacgc gaaaccgaaa cttcccgagc 120 atccttacga aaccgaaact gcaaccggct acactcgaaa ccgaaactac taatgatacc 180 aaccgaaacc gaaactcggt aagtgaaact gcgaaaccga aacttggtgg acagccttcc 240 gaaaccgaaa ctggacgatg ttcgttccga aaccgaaact atattcgtgc ccaagcgaaa 300 ccgaaactag ggggccgata tcccgaaacc gaaactacag gccccgcccg tcgaaaccga 360 aacttacgtc tcaggaagtc gaaaccgaaa ctggctacca ctgaccacga aaccgaaact 420 tctactgttc cgtgacgaaa ccgaaactga cggacaagag taccgaaacc gaaacttagt 480 caggcgtcca tcgaaaccga aactcaaaga ttcaaaaaac gaaaccgaaa ctttctgttg 540 ggatgtccga aaccgaaact gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta gtcagcaacc 600 atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 660 ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 720 gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaa 774 <210> 75 <211> 1706 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynP194 (ProB15) <400> 75 gcccctgcct gcgcgagggc gggaagacag cccccgggcc ctcctcctcc ctctgccttt 60 ttaagggacg ccctccaggg cgaccccgga gggcggactt gccaagctga agagaatcag 120 tcaaaaatcc gcccacaggg gacacatcat ttaaataaat gtgtttcttt gcccgaacag 180 aagttcagat aggctcgatt atcattaatt ctgggtttca cgtaacgaga ggaaacacag 240 gttgcaataa aaataaaaaa atggtttgaa atcaatttta actcattttg aacgtcctca 300 cacgtttgac aaaccgattt gtttcaggag acttgctaat atctaaatcg gtgacagggt 360 gtttgctgtg agtgtggctc tggaaaagtt attaagcgtt ataaaaaaaa tgatgtaatg 420 aaattctaat taatgggagg gaagtgccaa caaatcactc cttaaaatat taacgctatc 480 aaagaacagc tggagaagga ggaaacttga cccttggggg ggaaaagaac cccgagcacc 540 ctctgaataa gtcaaataga caagggctct aaatgaggaa attaattatt attttccaag 600 ttgcaccatt ggcagggcac actctccgta ggcaaacaac aaaaacctct ctcactcaca 660 caaaagccca ccttgcaaat gaatggaata ttaatgatta ggaatttggg ggcgggccct 720 ggcctggcga gctggtgatc cttgcaaaac aacaactccc tggtacccag atgcacgctg 780 ccaatgctcc agggaagata acccagtgga aagaaggaag agactgcaga aataacttct 840 ggggcatcgc taacttattc agcaggtcta ctttatgggt ttaatgagaa acccaggcca 900 aagaagtccc cagatggata aactgatctt ttattctgaa agagttaagg ctttgccagc 960 tctgcttaac tgctttgcca gtttggttga atccaaagtg tattaaagcg gccgaattct 1020 aaatctttca aaggtgggat ttataaggga agtgctaaca cgacctcaac catgccaggc 1080 tgccaggaat tatactggga ccaagagcat gcttttccac attagagcca gagattgtgc 1140 aactgtcaaa caatgcgggg cgctggagga ggcggtcagg ctgaggacca gtgatctccc 1200 agccccctct gtttggaaca gggaattttg gacatgcaaa aacacacctt gttttaaacg 1260 cagagggcac tctaagatca aggctgaaat tcccccttcc ctccttaaga agataaatca 1320 cctgacttcc tcaaaagctc tgaaacacac cctttggcct caccttggca gccaagccag 1380 tccaagttgg agccggagct ggtagggtta tctgtgtcag gttcagatct attcagggga 1440 atagttctag accctgacgc aggcaggctg aggccctctg ggaaccccac tccagctact 1500 ggcgactgtg cctttaaatt gctgctttca gagggtgcat ctagggggat gtgggaggga 1560 gagaaacatc tttctactgg tctctttcct ccctcccctc caggacttcc agggtttgga 1620 gagtgattgc tacccaaaga gaatcagcag cccaagctcc tcccgagttg gaggctggac 1680 ctaacaccct tgactccagg ctaaaa 1706 <210> 76 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynP5 (ProA9) <400> 76 gctgatgtgt cttactgatg atgcatcttt caggtgtgtg ctggtggccg gaggatgctg 60 tgagtagcct aaggttgata ctcagatggt acagccaccg caggctgctg ctaccataga 120 cttccaacag cactggactt ccccttttgt gtctttgttt tttctgggtg cagcttggta 180 gctcctgtct tccacagacc tttgtctaga gcctatgtac agcctcagag ggtccttcac 240 tgaagccgag cttgcagccc cccctcccat gcctcagaga cccttcaggg ctaaacctgt 300 gccttgttcc catctgcctc taaggcctat agaagcatac agcacaccct ctgtccacag 360 tgcatccatg tttagaaagc cagaaggaac agttagaaac ttagaagcca tctatttttg 420 tccccttaat ttcaggggat ggaaagtggg gccttgaggt gaagtgagtt gcctaaggtc 480 tcccaactag ataggtttct ctcagcttgc tggccagcac ttgtactgcg agggtgatag 540 ctgtagagtt tagctttgcc tgaagcatat tcaggcagag gccagtcagc caacctgccc 600 ttggggaagg gcttttgggg gtcagggagg gacatgtttc tggaaacttc cacaggagcc 660 tgaccagttc agaccctact caactcagga aatcccttcc caactcctgg ttcccaagac 720 tctaccttta gctagcagct gctctgaccc ttccgacctt ctaatgttcc cagagctgct 780 ctgactgcat ttcatttgcc tgtcggaggc atggcctgcc ttgctggtta tgctctgctg 840 gcctttccag agggcctccc gaatctgctt tgccccaggc aaggctaccc cttccctctt 900 agagccattc tgcctcttca ttccacccaa ccagcagatg atctctggat aatttatgca 960 gcaaatcctc tttaatcttt aatctggggt cttgaacaaa aggaacctgc cgctaacctg 1020 tgtctttttc acagcttgag tggaggtggg gaatgtctga catttccctc ataggaggtg 1080 tagtgtgggt atgagcaatg agtaacttgg atgttcagtc agctcactcc cctaaatcct 1140 tgttgaatct ccgggaggta actccaactc ttgccacaac tcaccctccc agcagtctct 1200 cttccaggga tgccaggtgg gcaggtttat ttttctgtga gaactgactc gagttcctac 1260 ggtgcaacac tgcctggaga gactatttta gaaaaaaaaa aaaaaaaagc agttgcccgg 1320 tgcagccctg ggcttcagga gaagctcacg caggcaccgg ttgtggctgc agaggtacag 1380 gccccgcccc aggcccgact agccccgccc caccctgcca ccagcggacc gcactcttgc 1440 aaggctagtg ggggcccccg cggtgcaaag aggtcggtgc gcagctcgca tcacgggtga 1500 ctggggcgct gtccaggagg agctggcccg gctcgggctg caaccatggt aaggagagag 1560 gacagccaga aacgcagggc ctgccactcc ggggctgctc cgaggggaca ctcggcgctg 1620 cagctctggc tgggcagggc gggaggtact gtccccggct ccgggttccg aaatgcactg 1680 ctggcgctag gcgcgccgcg ttgccgttct caagttattc tttctgagca gagctgcttt 1740 gagcgggccg agacccccag ggtgctgccc aaggtcttgg aggaaggact aggtcagttt 1800 tgtgggaggt gcctgctggt agcctctcgt gatggagata aggatggtag ggggtccccg 1860 ccccgtgccc gaataagctg tgttacctgg atggcccttc ctcacctacc tggggtacag 1920 agaccagcac caacttcctt tggaaaacac agaggaaatc cgtaaacaca gccagcctca 1980 ctagaaggga tgatgacaga 2000 <210> 77 <211> 814 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynP35 (ProC8) <400> 77 cgaatccgcg atagcaccgc ctgaggggat tgaggactcc gtcagaccgc ctgaggggat 60 ggaagaaaga taatcaccgc ctgaggggat ggctcggttt tgcacaccgc ctgaggggat 120 acgaaattct atcgcaccgc ctgaggggat aagctcgttc ctatgaccgc ctgaggggat 180 aatctcctca atacgaccgc ctgaggggat tatagaatgc attcaaccgc ctgaggggat 240 gaactaccgg ttttcaccgc ctgaggggat tgagctccca cggctaccgc ctgaggggat 300 aaggccagaa ctgtcaccgc ctgaggggat tctgactaat tcgggaccgc ctgaggggat 360 agtttcggtc tggataccgc ctgaggggat aacctctccg cggtgaccgc ctgaggggat 420 gcgccatggc ggttaaccgc ctgaggggat attccgcctt ctacaaccgc ctgaggggat 480 aaagagcgag ccgagaccgc ctgaggggat catccacggg tctctaccgc ctgaggggat 540 tcccctacga gttggaccgc ctgaggggat tctaactcag tggcaaccgc ctgaggggat 600 gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc 660 gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatc gctgactaat 720 tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 780 aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaa 814 <210> 78 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynP66 (ProA21) <400> 78 aaggaatccc aagttttaaa aattcgtaga gaagccaaga ggtggcgcca ggcgagacgc 60 acttcctggg aggctgaaag tcggtcgtag atgctgcagg ggagctctgt cctgataggg 120 gttattctat ccaaacctcc tctttcctac cttgtgaaat atgtgtcaat tctcctttca 180 cccccacccc acccccctct taactttccg gacaccaaag aaatcttaac ttgtattcac 240 atcttttatt cttcctagat gggactggat gaggctttgg aagaacttta agacggaaac 300 ttttttttag gggatgaagt attcgcaaag cgataaaacg ttgtgtgtgt gtgtgtgtgt 360 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtattttaaa tatatatata tatttttaaa aagtccttac 420 tctgaagctc agtcgtggga cagaaaagca ctctgagctc ctgtctccgc aggagtgatg 480 acctggcaca tgcattattc tgttcatttg gcttttatcc cgtgcccttg tttggcttct 540 gctcctttgt tttggctatt tattgctact tgataggagt aaggagggca gaaagacctc 600 acagaggtta tggaggagag atttcaccat ctagcttgaa attatctgtg gtcttcacac 660 tcactaatga gggacttagg atgtacattc cgatcgggat ttctagtccc gtgggggagc 720 gcacaccagc cacattcctg agacgccacg cagcctccat gctccactag caaactcagt 780 tccaccacag caagtttcac ttgatcccac aggacctgcc tggacccttt gttgggtggg 840 cgggaagccc ctggacccct cacccacctg gtcacatggc ctttctatgg cccctcccct 900 ctctttcttt ggagtccgcc tttttctcat ggtgacagta attgtttcta cagtcaccca 960 tcactcctcc tgcccggcct ctctgctagg ggtcagtgtc ctcttcagtg acaaaaggcg 1020 ccctagatct gggctccctg gggagggagg tggctggatc tggtagttag aatgctgtct 1080 ctccctggtg ctgcgacaac ccctcccccg ctgtgcacac aaatgggctt tatccggcaa 1140 acaaaaccgc acccccaccc caggctacac aggcacgtgg acctaagcct caccaaggga 1200 agggggtggt gacaggcgcc agagaaagac gaggcagaag acaaatattc tcctcgcccc 1260 acttcttgct ctccacaatc cagattttaa agtttgactt tccactcccc acctgctccc 1320 tgagcctcca acttctgttc tcctatctcc cgaatctgaa ttctttctgg ttccaaccag 1380 ctcaacttct cttggtttca gaaacaggtt ccccaccagc agtcccatac cacccaggga 1440 tgtgctcctc aggcagggga atgagaacac ggtgtcctgg gagggagagg tgcgaaaccc 1500 cccttccctg accgagagtt ccaggggaca cccgtacgag cggcagtgta aatagcaaag 1560 gaagagctca ctccagggtc ctgagccaag gccagggcgc tgggctctgc tgggccatcc 1620 tgcatgccta atccgctatt taaggagctg ctcggctgca gcccaggcac cacccccctc 1680 ctcacgtaca ccggtttcga gccaccttaa aagcgggagg caactgtgaa gttgctggcc 1740 agtaagtggt gtggagatta cgaagggaca tacggagagg gcagagagag gaagagagag 1800 aaagtgagag aggaagaaat ttatcctggg atccagaagt tcgtgttaac ctgtggaaaa 1860 tcaagtccct ggaagtctgc agagacagag acaagaagaa aagagataga acgccagaaa 1920 ctcctctctc tccctccctc tccacctctc tcttctaaac cccaaattcc tggtcccttg 1980 taccccattg tggggataat 2000 <210> 79 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SynP166 (ProA36) <400> 79 gggaatacgt atgtagttcc tggggatgcc ttgaaaaaga gaaatcccag tgtgtaaggt 60 cagtattgta tggagtacca ggtaataggg tggcatcaga aggaaggggt ggggtttgct 120 ttctaaaact tactatacac cccaacagtc ctctagtctc taaggaaatg gcaggggcag 180 ctatgaataa cacataaaca caacaccaaa atgtatctaa aattacaacc cctgagacta 240 cactcaaatg acacattcac cattgccaat gtgacaggcc tctctgtctc ttgccacctg 300 cctggtctgc ctgctcactc ctcctaggca gctttattct acctttgtta cttaggaaca 360 ataacaccag ggcttaactt ataatagaga ctcacaacgg acccaggtcc ccatgaccca 420 gtcttgcctt gaacacacca taagtaaaca tgtatagagc gcatccaaca cactgaactt 480 tgtaactcag gcttacccac ctctgtccgc tcagaacact cacgttggac aaaatcccgg 540 agaaataatc tcctgtggtt gtataaggca tgttgtggta ctgtggtaaa gtcaaaacat 600 ttaaactgtg gtagattcaa aacatttagg tgagcctata gtgagtctgg agccgtgttt 660 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtaaatgaat gtatatatgt gtatctgtgt 720 gtgcatgatg taaatgtgtg tatgtaaatg tgtgtatatg tgtatatgta tgaatttgta 780 tgtacatgtg tatatgtgtg tatatgtgca tatgtatgtg tcagtgtctg tgtgtgcatg 840 tatatgtgtg tatgtatatg tgagtgtctg tgtgaatgta catgtgtatc tgtgtgcatg 900 taaatgttta tatgtaaatg tgtgaatgtg tgtgtgtgta tatgtgtata tgtatgaata 960 tatgtgtatg tacatgtgtg tgcatgtgtc tgtatgaata tgtgtttata tgtgcatatg 1020 tatgtgtatg tttctgtgtg tgcatgtata tgtgtgtaca tctatgaata tgtgtgtgtg 1080 tgtctgtgtg tctgtgtgtc tgtgtgtgtc tgtgtgtgaa tgtatatata tgtgtctctg 1140 tgtgtatgta aatgtgtgta tgtgtgtata tgtgcatatg tatgaatgtg tgtatatgtg 1200 tgtatgaata ggtgtatgtg tgtgaatgtg tctgtgtggg catatatatg tatgtatgaa 1260 tgtatgtata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatattgtgt 1320 gtctgtgtct gtgtgtgcac gtgtgtgtgt gtgtgcacat gtgtgtgcac gtgtgtgttc 1380 agcacctttt ccagccagtt tgagctattt tgtactgttc tggcagtgga gataacaacc 1440 cacagaacac aatctttccc tatctggcac ttccattctg gcagacagtt tggggtttcc 1500 cagcagcggt gaggaaggag ccatcagaga gtgatggata aaaggtcttg ctgagaaggt 1560 gaagtgtcta ggcccaaatg tgactggggg aggattagaa aaactcccat gcagtgtagg 1620 ttaagtggta gggctgcctt tagaccctaa gctcccaaac tcctgcacta taaggtccca 1680 tgggtgcccc tcagatgggg aagacaaaca gcaagcagtg tggctcttcg ggggcttaaa 1740 tgccgaggat gcttggttca agggtccctc cttgttcctt tcttctcaac aagcacagga 1800 aaggtaagtg gctgctcttg gctctttatt ttaatctcag aagggtgccc ctcctccctc 1860 caaggactgg gcagacctgg ccgcaaatcc cccctaatcc atcagcacct gggtctccac 1920 cccatagcag cacacagcct tgttagccag gcgaccacac ttgtccctcc cgccccccgc 1980 ggcgcctact ctccctcacc 2000 <210> 80 <211> 953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dalkara <400> 80 cacccacaag ccagttcctg tccctgagga cttggctcag ggactctggg aatgtggtag 60 acatggggtg gccccaccaa atgcatcctt atgggaacct gctccctggg agccatgaaa 120 agagcgtgga cttcgaggtg gggccacagg aagtggtcag gtccatctca ggggacctgc 180 tgcccatcca cactgctggc caggaaatgg ggggcaattc atgcctcctc agcaccttca 240 gcactgggcg gctcaaagaa ggcaagggac tattctgggg tcacacagca tgcagccaga 300 ggccaaggca tgaggaagtc cttcatttcc ccacccccac ccacctcaga tcctccaacc 360 ggtttcatgg cagcccaggg tccagcggca tccaggatgc tggtgggtag ctgcacagcc 420 caggccgcgg gaggttggct gctctcacct aacaggccta tgtggccctg acccctacct 480 aggaagctgg ggacaatggc caaggcgcct cccctctctg tgcctgtctg tccaggtgca 540 gcatagacac agcacccctg gggccaagag cacccagcca gggctgcccc catgggtggg 600 cagggcagta aatgaatgag ggacaggttg ggaggtggcc agccccctcc agcccatgga 660 gggcacgggg caggagagct gggctgagcc agcaggagcc cagggagcct ggtctctgcc 720 ttcctatcct ggaggaaggt gaggctgaac ctccttccct ccctccctcc ctccccgccc 780 ccactgcacg cagggctggc tgggctccag ctggcctccg catcaatatt tcatcggcgt 840 caataggagg catcggggac agccgctgcg gcagcactcg agccagctca agcccgcagc 900 tcgcagggag atccagctcc gtcctgcctg cagcagcaca accctgcaca ccc 953

Claims (20)

  1. 바이러스 벡터로서, 5'에서 3' 방향으로,
    i. 5' 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR);
    ii. 프로모터;
    iii. CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열;
    iv. 폴리아데닐화(폴리A) 신호 서열; 및
    v. 3' ITR
    을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는, 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 ProC2 프로모터인, 바이러스 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 5에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 VMD2 프로모터, CYP4V2 프로모터 및 RPE65 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된, 바이러스 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 6, 서열 번호 7 또는 서열 번호 8에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, RPE 세포에서 CYP4V2의 발현을 촉진시키는, 바이러스 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 편재하는 프로모터인, 바이러스 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프로모터는 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터, CBA 프로모터 또는 CAG 프로모터인, 바이러스 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 55 내지 80으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CYP4V2 암호화 서열은 서열번호 13, 14, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리A 신호는 서열번호 18 또는 19에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 9, 10 또는 11에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인트론 서열을 더 포함하는, 바이러스 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1) B형 간염 바이러스 또는 우두처크 간염 바이러스(woodchuck hepatitis virus) 서열을 포함하는 조절 요소 및/또는 2) 상기 CYP4V2 암호화 서열을 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 바로 상류에 위치된 Kozak 서열을 더 포함하는, 바이러스 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터 게놈은, 5'에서 3' 방향으로:
    i) 서열번호 1, 2, 13, 18 및 22;
    ii) 서열번호 1, 3, 13, 18 및 22;
    iii) 서열번호 1, 4, 13, 18 및 22;
    iv) 서열번호 1, 5, 13, 18 및 22;
    v) 서열번호 1, 6, 13, 18 및 22;
    vi) 서열번호 1, 7, 13, 18 및 22;
    vii) 서열번호 1, 8, 13, 18 및 22;
    viii) 서열번호 1, 2, 14, 18 및 22;
    ix) 서열번호 1, 3, 14, 18 및 22;
    x) 서열번호 1, 4, 14, 18 및 22;
    xi) 서열번호 1, 5, 14, 18 및 22;
    xii) 서열번호 1, 6, 14, 18 및 22;
    xiii) 서열번호 1, 7, 14, 18 및 22;
    xiv) 서열번호 1, 8, 14, 18 및 22;
    xv) 서열번호 1, 2, 13, 19 및 22;
    xvi) 서열번호 1, 3, 13, 19 및 22;
    xvii) 서열번호 1, 4, 13, 19 및 22;
    xviii) 서열번호 1, 5, 13, 19 및 22;
    xix) 서열번호 1, 6, 13, 19 및 22;
    xx) 서열번호 1, 7, 13, 19 및 22;
    xxi) 서열번호 1, 8, 13, 19 및 22;
    xxii) 서열번호 1, 2, 14, 19 및 22;
    xxiii) 서열번호 1, 3, 14, 19 및 22;
    xxiv) 서열번호 1, 4, 14, 19 및 22;
    xxv) 서열번호 1, 5, 14, 19 및 22;
    xxvi) 서열번호 1, 6, 14, 19 및 22;
    xxvii) 서열번호 1, 7, 14, 19 및 22;
    xxviii) 서열번호 1, 8, 14, 19 및 22;
    xxix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 18 및 22;
    xxx) 서열번호 1, 3, 9, 13, 18 및 22;
    xxxi) 서열번호 1, 4, 9, 13, 18 및 22;
    xxxii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 18 및 22;
    xxxiii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 18 및 22;
    xxxiv) 서열번호 1, 7, 9, 13, 18 및 22;
    xxxv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 18 및 22;
    xxxvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 18 및 22;
    xxxvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 18 및 22;
    xxxviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 18 및 22;
    xxxix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 18 및 22;
    xl) 서열번호 1, 6, 9, 14, 18 및 22;
    xli) 서열번호 1, 7, 9, 14, 18 및 22;
    xlii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 18 및 22;
    xliii) 서열번호 1, 2, 9, 13, 19 및 22;
    xliv) 서열번호 1, 3, 9, 13, 19 및 22;
    xlv) 서열번호 1, 4, 9, 13, 19 및 22;
    xlvi) 서열번호 1, 5, 9, 13, 19 및 22;
    xlvii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 19 및 22;
    xlviii) 서열번호 1, 7, 9, 13, 19 및 22;
    xlix) 서열번호 1, 8, 9, 13, 19 및 22;
    l) 서열번호 1, 2, 9, 14, 19 및 22;
    li) 서열번호 1, 3, 9, 14, 19 및 22;
    lii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 19 및 22;
    liii) 서열번호 1, 5, 9, 14, 19 및 22;
    liv) 서열번호 1, 6, 9, 14, 19 및 22;
    lv) 서열번호 1, 7, 9, 14, 19 및 22;
    lvi) 서열번호 1, 8, 9, 14, 19 및 22;
    lvii) 서열번호 1, 2, 13, 16, 18 및 22;
    lviii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 18 및 22;
    lix) 서열번호 1, 4, 13, 16, 18 및 22;
    lx) 서열번호 1, 5, 13, 16, 18 및 22;
    lxi) 서열번호 1, 6, 13, 16, 18 및 22;
    lxii) 서열번호 1, 7, 13, 16, 18 및 22;
    lxiii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 18 및 22;
    lxiv) 서열번호 1, 2, 14, 16, 18 및 22;
    lxv) 서열번호 1, 3, 14, 16, 18 및 22;
    lxvi) 서열번호 1, 4, 14, 16, 18 및 22;
    lxvii) 서열번호 1, 5, 14, 16, 18 및 22;
    lxviii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 18 및 22;
    lxix) 서열번호 1, 7, 14, 16, 18 및 22;
    lxx) 서열번호 1, 8, 14, 16, 18 및 22;
    lxxi) 서열번호 1, 2, 13, 16, 19 및 22;
    lxxii) 서열번호 1, 3, 13, 16, 19 및 22;
    lxxiii) 서열번호 1, 4, 13, 16, 19 및 22;
    lxxiv) 서열번호 1, 5, 13, 16, 19 및 22;
    lxxv) 서열번호 1, 6, 13, 16, 19 및 22;
    lxxvi) 서열번호 1, 7, 13, 16, 19 및 22;
    lxxvii) 서열번호 1, 8, 13, 16, 19 및 22;
    lxxviii) 서열번호 1, 2, 14, 16, 19 및 22;
    lxxix) 서열번호 1, 3, 14, 16, 19 및 22;
    lxxx) 서열번호 1, 4, 14, 16, 19 및 22;
    lxxxi) 서열번호 1, 5, 14, 16, 19 및 22;
    lxxxii) 서열번호 1, 6, 14, 16, 19 및 22;
    lxxxiii) 서열번호 1, 7, 14, 16, 19 및 22;
    lxxxiv) 서열번호 1, 8, 14, 16, 19 및 22;
    lxxxv) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 18 및 22;
    lxxxvi) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 18 및 22;
    lxxxvii) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 18 및 22;
    lxxxviii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 18 및 22;
    lxxxix) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 18 및 22;
    xc) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 18 및 22;
    xci) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 18 및 22;
    xcii) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 18 및 22;
    xciii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 18 및 22;
    xciv) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 18 및 22;
    xcv) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 18 및 22;
    xcvi) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 18 및 22;
    xcvii) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 18 및 22;
    xcviii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 18 및 22;
    xcix) 서열번호 1, 2, 9, 13, 16, 19 및 22;
    c) 서열번호 1, 3, 9, 13, 16, 19 및 22;
    ci) 서열번호 1, 4, 9, 13, 16, 19 및 22;
    cii) 서열번호 1, 5, 9, 13, 16, 19 및 22;
    ciii) 서열번호 1, 6, 9, 13, 16, 19 및 22;
    civ) 서열번호 1, 7, 9, 13, 16, 19 및 22;
    cv) 서열번호 1, 8, 9, 13, 16, 19 및 22;
    cvi) 서열번호 1, 2, 9, 14, 16, 19 및 22;
    cvii) 서열번호 1, 3, 9, 14, 16, 19 및 22;
    cviii) 서열번호 1, 4, 9, 14, 16, 19 및 22;
    cix) 서열번호 1, 5, 9, 14, 16, 19 및 22;
    cx) 서열번호 1, 6, 9, 14, 16, 19 및 22;
    cxi) 서열번호 1, 7, 9, 14, 16, 19 및 22; 및
    cxii) 서열번호 1, 8, 9, 14, 16, 19 및 22
    로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 혈청형 8, 9, 2 또는 5 캡시드를 더 포함하는, 바이러스 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 1) 서열번호 28, 29 및 30 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는 AAV9 캡시드; 또는 2) 서열번호 27에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 AAV9 캡시드를 더 포함하는, 바이러스 벡터.
  16. 제14항에 있어서, 1) 서열번호 24, 25 및 26 각각에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 VP1, VP2 및 VP3 아미노산 서열을 포함하는 AAV8 캡시드; 또는 2) 서열번호 23에 대해 약 90% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 AAV8 캡시드를 더 포함하는, 바이러스 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
  18. 망막 세포에서 이종성 CYP4V2 유전자를 발현시키는 방법으로서, 상기 망막 세포를 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 비에띠 결정 이상증(Bietti crystalline dystrophy: BCD)을 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 유효량의 제17항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. BCD를 갖는 대상체에서 시력을 개선시키거나, 시기능(visual function) 또는 기능적 시력(functional vision)을 개선시키거나, 또는 시기능 또는 기능적 시력의 감소를 저해하는 방법으로서, 유효량의 제17항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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