KR20210105390A - 글리코겐 저장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

글리코겐 저장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210105390A
KR20210105390A KR1020217022096A KR20217022096A KR20210105390A KR 20210105390 A KR20210105390 A KR 20210105390A KR 1020217022096 A KR1020217022096 A KR 1020217022096A KR 20217022096 A KR20217022096 A KR 20217022096A KR 20210105390 A KR20210105390 A KR 20210105390A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
raav
sequence
seq
nucleic acid
aav
Prior art date
Application number
KR1020217022096A
Other languages
English (en)
Inventor
크리스토퍼 티퍼
켈리 리드 클락
사무엘 워즈워스
Original Assignee
울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드 filed Critical 울트라제닉스 파마수티컬 인코포레이티드
Publication of KR20210105390A publication Critical patent/KR20210105390A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
    • C12N15/8645—Adeno-associated virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03009—Glucose-6-phosphatase (3.1.3.9)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/35—Special therapeutic applications based on a specific dosage / administration regimen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/34—Vector systems having a special element relevant for transcription being a transcription initiation element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 글리코겐 저장 질환 유형 Ia (GSD-Ia)의 치료에서 유전자 요법 적용을 위한 다양한 신규 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 제공한다. 변형된 G6PC 프로모터/인핸서 서열이 혼입된 다수의 재조합 핵산 분자, 벡터 및 재조합 AAV가 본원에 개시된다. 변형된 G6PC 프로모터/인핸서 서열을 활용하면 다양한 숙주 세포 플랫폼에서 발현될 때 AAV 수율 및 품질이 향상된다. 또한, 본 발명의 신규 AAV를 포함하는 조성물 및 이를 사용하여 GSD-Ia를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

글리코겐 저장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 12월 18일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/781,380의 이익 및 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2019년 12월 16일에 생성된 상기 ASCII 카피는 DIM-010WO_SL_ST25.txt로 명명되며, 크기는 42,290 바이트이다.
발명의 기술분야
본 출원은 일반적으로 글리코겐 저장 질환 유형 Ia와 같은 글리코겐 저장 질환의 치료를 위한 바이러스 벡터, 보다 특히 아데노-연관 바이러스 벡터에 관한 것이다.
글리코겐 저장 질환 유형 Ia (GSD-Ia 또는 폰 기르케 질환으로도 공지됨)는 신체 세포에 글리코겐이 축적되어 유발되는 유전 장애이다. 특정 기관 및 조직, 특히 간, 신장, 및 소장에 글리코겐이 축적되면 정상적으로 기능하는 능력이 손상된다. GSD-Ia는 전형적으로 글리코겐 축적에 의해 유발되는 심각한 저혈당 및 간비대로 생후 첫해 동안 나타난다. 병에 걸린 개체는 성장 지체, 지연된 사춘기, 락트산 산혈증, 고지혈증, 고요산혈증, 및 성인에서 간 선종의 높은 발생률을 나타낸다 (문헌 (Lei et al., 1993, Science 262: 580-3) 참조).
GSD-Ia는 글루코스 항상성 유지에 관련되는 주요 효소인 활성 글루코스-6-포스파타제-알파 (G6Pase-α)의 결핍으로 유발되는 드문 희귀 유전 질환이다. G6PC 유전자에 의해 코딩되는 G6Pase-α는 글리코겐분해 및 글루코스신합성의 마지막 단계에서 글루코스-6-포스페이트 (G6P)의 글루코스 및 포스페이트로의 가수분해를 촉매한다. 현재까지 G6Pase-α 결핍 및 GSD-Ia의 관련된 발병에 책임이 있는 80개 초과의 돌연변이가 확인되었다 (문헌 (Chou et al., 2010, Nat Rev Endocrinol 6(12): 676-88) 참조).
현재 GSD-Ia에 대한 치료법은 없으며, 식이 보충이 환자에 대한 현재의 치료 표준이다. 엄격하게 따르면, 식이 전략은 전형적으로 정상적인 성장 및 사춘기 발달을 허용하지만, 식이 요법은 고지혈증, 고요산혈증, 락트산 산혈증, 및 간 지방 축적의 발생을 완전히 예방하지 못한다 (문헌 (Rake et al., 2002, Eur J Pediatr 161 Suppl 1: S20-34) 참조).
G6Pase-α를 운반하는 재조합 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 사용하는 유전자 요법 접근법은 GSD-Ia의 관리를 위해 탐구되었다 (예컨대, 미국 특허 번호 9,644,216 및 미국 특허 공개 번호 2017/0362670 참조). 그러나, 인간 유전자 요법에 AAV 벡터를 사용하려면, 벡터에 대한 강력하고 신뢰할 수 있으며 확장 가능한 생산 공정의 개발이 중요하다. 본 발명자들은 G6PC 유전자의 프로모터/인핸서 영역을 변형하여 본원에서 "Alu 요소"로 기재된 특정 서열을 제거하는 것이 다양한 숙주 세포 플랫폼으로부터 발현될 때 rAAV 수율 및 품질을 극적으로 개선할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명은 글리코겐 저장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로, GSD-Ia의 치료를 위한 유전자 요법 적용에 사용될 수 있는 재조합 핵산 분자, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, 및 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)가 본원에서 제공된다.
한 측면에서, 본 출원은 Alu 요소와 적어도 80% 동일한 하나 이상의 서열이 결여된 변형된 G6PC 프로모터/인핸서 (GPE) 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, Alu 요소는 서열식별번호 (SEQ ID NO): 6의 인접 뉴클레오티드 1079-1272 (Alu-1), 1633-1968 (Alu-2), 및 2140-2495 (Alu-3)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 1의 인접 뉴클레오티드 146-2123과 80% (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%) 동일하거나 또는 서열식별번호: 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 중 어느 하나와 80% (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%) 동일한 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 G6Pase-α 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 본원에 기재된 변형된 G6PC 프로모터/인핸서 (GPE) 서열 및 G6Pase-α 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, G6Pase-α 코딩 서열은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 80% (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%) 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 분자는 SV40 폴리A 신호 서열 (서열식별번호: 14)과 같은 폴리아데닐화 (폴리A) 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 분자는 인트론 (서열식별번호: 13)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 분자는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 rh10의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (즉, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 rh10)와 같은 AAV 벡터이다. 예시적인 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 8 (AAV8) 벡터이다. 본원에 개시된 재조합 핵산 분자 또는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포가 추가로 제공된다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 AAV의 증식에 적합할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 AAV 벡터를 숙주 세포 배양물에 전달하는 단계 및 세포 배양물로부터 rAAV를 수거하는 단계를 포함하는, rAAV 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 배양물은 진핵 숙주 세포 배양물이다.
또한, 본원에 개시된 재조합 핵산 분자 또는 AAV 벡터를 포함하는 rAAV가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 출원은 GSD-Ia의 치료를 위한 rAAV, 및 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된 AAV 벡터 게놈을 포함하는 rAAV에 관한 것이며, 상기 AAV 벡터 게놈은 AAV 5' 역위 말단 반복부 서열 (ITR); 본원에 개시된 변형된 GPE 서열; 글루코스-6-포스파타제 알파 (G6Pase-α) 또는 그의 활성 단편 또는 변이체를 코딩하는 코딩 서열; 및 AAV 3' ITR 서열을 포함한다. 일부 예시적인 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV8 캡시드이다. 일부 실시양태에서, 벡터 게놈은 서열식별번호: 15와 동일한 5' 및 3' ITR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 게놈은 서열식별번호: 1의 인접 뉴클레오티드 146-2123을 포함하는 변형된 GPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 게놈은 폴리아데닐화 (폴리A) 신호 서열, 예컨대 SV40 폴리A 신호 서열 (서열식별번호: 14)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터 게놈은 인트론 (서열식별번호: 13)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, G6Pase-α는 서열식별번호: 5와 적어도 80% (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, G6Pase-α의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5를 포함한다. 일부 실시양태에서, G6Pase-α의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5로 이루어진다. 일부 실시양태에서, G6Pase-α의 코딩 서열은 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 80% (예컨대, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%) 동일하다. 일부 예시적인 실시양태에서, 벡터 게놈은 서열식별번호: 1 또는 2와 동일한 핵산 서열을 포함한다.
본 출원은 또한 본 발명의 rAAV를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 피하, 근육내, 피내, 복강내 또는 정맥내 투여용으로 제형화된다. 예시적인 실시양태에서, 제약 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 인간 대상체에게 본원에 개시된 rAAV의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 글리코겐 저장 질환 유형 Ia (GSD-Ia)를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, rAAV는 피하, 근육내, 피내, 복강내 또는 정맥내로 투여된다. 예시적인 실시양태에서, rAAV는 정맥내로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여된다. 추가 실시양태에서, rAAV는 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1013 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 단일 용량의 rAAV가 투여된다. 다른 실시양태에서, 다중 용량의 rAAV가 투여된다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 특징은 본 출원의 하기 섹션에서 설명된다.
본 발명은 하기의 도면을 참조하여 보다 완전하게 이해될 수 있다.
도 1A는 2개의 AAV2 역위 말단 반복부 (ITR, 서열식별번호: 15)가 결합되고 GPE, 인트론, 코돈-최적화된 인간 G6PC 유전자 (hG6PCco) 및 SV40 후기 폴리A 테일을 포함하는 G6PC 발현 카세트의 개략도이다. 사용된 약어: GPE- G6Pase 프로모터/인핸서 영역; hG6PCco- 인간 글루코스-6-포스파타제 코딩 영역 (코돈-최적화됨); ITR- 역위 말단 반복부; SV40L pA- SV40 후기 폴리아데닐화 신호; UTR- 비번역 영역. 도 1B는 야생형 (DTC161) 또는 변형된 GPE (Alu-1 및 Alu-2 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하는 DTC175, 3개의 Alu 요소가 모두 존재하나 Alu-1 및 Alu-2 서열의 배향이 역위된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하는 DTC176, Alu-1, Alu-2 및 Alu-3 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하는 DTC177, Alu-3 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하는 DTC178, 3개의 Alu 요소가 모두 존재하나 Alu-3 서열의 배향이 역위된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하는 DTC179)를 함유하는 G6PC 발현 카세트의 예시이다.
도 2는 예시적인 AAV 벡터 (DTC161)의 개략도이며, 다양한 주요 성분이 그 안에 표시된다. 벡터의 특징은 하기와 같다:
유형 시작 끝 설명
영역 1 145 역위 말단 반복부 (ITR)
영역 146 3,009 G6PC 프로모터/인핸서 (GPE)
영역 3,010 3,331 키메라 인트론
유전자 3,332 4,405 hG6PC 코돈 최적화된 cDNA
영역 4,426 4,623 SV40 후기 폴리아데닐화 신호
영역 4,624 4,768 역위 말단 반복부 (ITR)
도 3은 숙주 세포에 AAV 벡터를 공동 형질감염시킬 때 rAAV 패키징에서 Rep 및 Cap 기능을 제공하는 pAAV2-8.KanR(p2123-FH) AAV Rep/Cap 플라스미드의 개략도이다.
도 4는 숙주 세포에 AAV 벡터 및 Rep/Cap 플라스미드를 공동 형질감염시킬 때 rAAV 생산을 위한 pAdDeltaF6(Kan) 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드의 개략도이다.
도 5는 다양한 AAV 벡터의 형질감염 후 숙주 세포로부터 생산된 rAAV의 역가를 나타내는 막대 그래프이다. 각각의 조건 하에서 3개의 시험이 수행되었으며, 표준 편차가 표시되었다. *는 DTC161과 비교하여 P<0.05를 나타낸다.
도 6은 벡터 게놈 크기의 함수로서 플롯팅된 생산된 rAAV의 역가를 나타내는 그래프이다.
도 7은 대조군 바이러스 벡터, DTC161, DTC175, DTC176, DTC177, DTC178, 및 DTC179의 rAAV로부터 단리된 전장 DNA가 아가로스 겔 전기영동되었을 때, 캡시드 분해 및 패키징된 DNA 방출 능력을 평가하는, 방출된 DNA의 밴드를 나타내는 아가로스 겔의 이미지이다. 전장 바이러스 DNA는 3.8 kb-5 kb이다. '*'는 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 처리 시 대조군 바이러스 벡터로부터 단리된 전장 DNA의 캡시드 분해 및 온전한 게놈을 나타낸다.
도 8A는 HEK293 세포에서 생산된 DTC161 벡터 제제로부터의 입자 밀도의 분석형 초원심분리 트레이스를 나타내는 그래프이다. 도 8B는 HEK293 세포에서 생산된 DTC177 벡터 (서열식별번호: 1로 표시됨) 제제로부터의 입자 밀도의 분석형 초원심분리 트레이스를 나타내는 그래프이다. 사용된 약어: RI- 굴절률.
도 9A는 DTC161 벡터로부터 유래된 rAAV로 감염 후 유도된 G6Pase-α 발현에 대한 용량-반응 곡선이다. 도 9B는 DTC177 벡터 (서열식별번호: 1로 표시됨)로부터 유래된 rAAV로 감염 후 유도된 G6Pase-α 발현에 대한 용량-반응 곡선이다. X 축은 HuH7 간 세포를 감염시키는데 사용된 rAAV 용량을 나타낸다. Y 축은 세포에서 유도된 G6PC mRNA 발현을 나타낸다. 개발 배치-생산된 DTC161 벡터로부터 유래된 rAAV를 참조 표준으로 사용하였다. 사용된 약어: REF-참조 표준; UNK- 시험 샘플.
본 발명은 치료 적용에 사용될 다양한 신규 작용제 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 분자 및 조성물은 대상체에서 글리코겐 저장 질환 유형 Ia (GSD-Ia)와 관련된 질환을 개선, 예방 또는 치료하거나, 글루코스-6-포스파타제-알파 (G6Pase-α)의 존재 또는 기능을 증가시키는데 사용될 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 기술 용어는 통상의 사용에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 문헌 (Benjamin Lewin,　Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.),　The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Robert A. Meyers (ed.),　Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8))에서 찾을 수 있다.
본 개시내용의 다양한 실시양태의 검토를 용이하게 하기 위해, 특정 용어에 대한 하기 설명이 제공된다:
아데노-연관 바이러스 (AAV): 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 복제-결함이 있는 비-외피 바이러스. AAV는 질환을 유발하는 것으로 공지되어 있지 않으며, 매우 가벼운 면역 반응을 유발한다. AAV를 활용하는 유전자 요법 벡터는 분열 세포 및 정지 세포를 모두 감염시킬 수 있고, 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고 염색체외 상태로 지속될 수 있다. 이들 특징은 AAV를 유전자 요법을 위한 매력적인 바이러스 벡터로 만든다. 현재 12개의 AAV 혈청형 (AAV1-12)이 확인되었다.
투여/투여하기: 임의의 효과적인 경로에 의해 치료제 (예컨대, 재조합 AAV)와 같은 작용제를 대상체에게 제공하거나 주기 위함. 예시적인 투여 경로는 주사 (예컨대, 피하, 근육내, 피내, 복강내, 및 정맥내), 경구, 관내, 설하, 직장, 경피, 비강, 질 및 흡입 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
코돈-최적화: "코돈-최적화된" 핵산은 코돈이 특정 시스템 (예컨대, 특정 종 또는 종의 그룹)에서 발현에 최적이도록 변경된 핵산 서열을 지칭한다. 예컨대, 핵산 서열은 포유동물 세포 또는 특정 포유동물 종 (예컨대, 인간 세포)에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는다.
인핸서: 프로모터의 활성을 증가시켜 전사 속도를 증가시키는 핵산 서열.
G6PC: 글루코스-6-포스파타제-α (G6Pase-α)를 코딩하는 인간 염색체 17q21 상에 위치된 유전자. G6Pase-α는 이를 소포체에 고정하는 9개의 나선을 갖는 357개 아미노산의 소수성 단백질이다 (Chou et al.,　Nat Rev Endocrinol　6:676-688, 2010). G6Pase-α 단백질은 글루코스신합성 및 글리코겐분해의 말기 단계에서 글루코스 6-포스페이트의 글루코스 및 포스페이트로의 가수분해를 촉매하며, 글루코스 항상성의 주요 효소이다. G6PC 유전자에서의 돌연변이는 간 및 신장에서 글리코겐 및 지방 축적과 관련된 심각한 공복 저혈당을 특징으로 하는 대사 장애인 글리코겐 저장 질환 유형 Ia (GSD-Ia)를 유발한다.
글리코겐 저장 질환 (GSD): 글리코겐 합성 과정의 결함 또는 근육, 간 및 다른 조직 내에서의 분해로부터 발생하는 질환 그룹. GSD는 유전적 또는 후천적일 수 있다. 유전적 GSD는 이들 공정과 관련된 임의의 선천성 대사 오류에 의해 유발된다. 현재 11개의 글리코겐 저장 질환 (GSD 유형 I, II, III, IV, V, VI, VII, IX, XI, XII 및 XIII)이 확인되었다. GSD-I는 2개의 상염색체 열성 장애인 GSD-Ia 및 GSD-Ib로 이루어진다 (Chou et al.,　Nat Rev Endocrinol　6:676-688, 2010). GSD-Ia는 글루코스-6-포스파타제-α의 결핍으로부터 발생한다. 글루코스-6-포스페이트 수송체 (G6PT)의 결핍은 GSD-Ib의 원인이다.
글리코겐 저장 질환 유형 Ia (GSD-Ia): 폰 기르케 질환으로도 공지된 GSD-Ia는 가장 흔한 글리코겐 저장 질환으로, 발생률은 100,000명의 출생 중 약 1명이다. GSD-Ia는 글루코스-6-포스파타제-α (G6Pase-α)의 결핍으로 발생하는 유전 질환이다. G6Pase-α의 결핍은 글리코겐 및 글루코스신합성으로부터 유리 글루코스를 생산하는 간의 능력을 손상시킨다. GSD-Ia에 걸린 환자는 글루코스 항상성을 유지할 수 없으며, 공복 저혈당, 성장 지체, 간비대, 신장비대, 고지혈증, 고요산혈증 및 락트산혈증을 나타낸다 (Chou et al.,　Nat Rev Endocrinol　6:676-688, 2010). 현재 GSD-Ia에 대한 치료법은 없다.
인트론: 단백질에 대한 코딩 정보를 함유하지 않는 유전자 내의 DNA 스트레치. 인트론은 메신저 RNA의 번역 전에 제거된다.
역위 말단 반복부 (ITR): 효율적인 복제에 필요한 아데노-연관 바이러스 게놈의 대칭적 핵산 서열. ITR 서열은 AAV DNA 게놈의 각각의 끝에 위치된다. ITR은 바이러스 DNA 합성을 위한 복제 기점 역할을 하며 벡터 캡슐화에 필요하다.
단리: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대, 핵산 분자, 단백질, 바이러스 또는 세포)은 유기체의 세포 또는 조직 내의 다른 생물학적 성분 (다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포와 같은 성분은 자연적으로 발생함) 또는 유기체 자체로부터 실질적으로 분리 또는 정제되었다. "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법으로 정제된 것들을 포함한다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 분자 및 단백질 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자 및 단백질을 포괄한다.
작동 가능하게 연결: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동 가능하게 연결된다. 예컨대, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하며, 필요한 경우, 2개의 단백질-코딩 영역을 동일한 판독 프레임으로 연결한다.
제약상 허용되는 담체: 본 개시내용에 유용한 제약상 허용되는 담체 (비히클)는 통상적이다. 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th Edition (1975))은 하나 이상의 치료 화합물, 분자 또는 작용제의 약제 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기재한다.
일반적으로, 담체의 특성은 사용되는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예컨대, 비경구 제형은 일반적으로 비히클로서 물, 생리 식염수, 균형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 제약상 및 생리학상 허용되는 유체를 포함하는 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물, 예컨대 분말, 알약, 정제, 또는 캡슐 형태의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학상-중성 담체에 더하여, 투여될 제약 조성물은 습윤제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충제 등과 같은 소량의 무독성 보조 물질, 예컨대 나트륨 아세테이트 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
질환을 예방, 치료 또는 개선: 질환 (예컨대, GSD-Ia)을 "예방"하는 것은 질환의 완전한 발병을 억제하는 것을 지칭한다. "치료"는 질환 또는 병적 상태가 발병하기 시작한 후 이의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 지칭한다. "개선"은 질환의 징후 또는 증상의 수 또는 중증도의 감소를 지칭한다.
프로모터: 핵산 (예컨대, 유전자)의 전사를 지시/개시하는 DNA 영역. 프로모터는 전사 시작 부위 근처에 필요한 핵산 서열을 포함한다.
정제: 용어 "정제된"은 절대적인 순도를 요구하지 않으며; 오히려 상대 용어로 의도된 것이다. 따라서, 예컨대, 정제된 펩티드, 단백질, 바이러스, 또는 다른 활성 화합물은 자연적으로 회합된 단백질 및 다른 오염물질로부터 전체 또는 부분적으로 단리된 것이다. 특정 실시양태에서, 용어 "실질적으로 정제된"은 세포, 세포 배양 배지 또는 다른 조 제제로부터 단리되고 단백질, 세포 파편 및 다른 성분과 같은 초기 제제의 다양한 성분을 제거하기 위해 분획화된 펩티드, 단백질, 바이러스 또는 다른 활성 화합물을 지칭한다.
재조합: 재조합 핵산 분자는 자연적으로 발생하지 않는 서열을 갖거나 2개의 다른 분리된 서열 분절의 인위적 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이 인위적인 조합은 화학적 합성에 의해 또는 유전 공학 기술에 의하는 것과 같이 핵산 분자의 단리된 분절을 인위적으로 조작하여 달성될 수 있다.
유사하게, 재조합 바이러스는 비-자연적으로 발생하거나 상이한 기원의 적어도 2개의 서열의 인위적 조합에 의해 만들어진 서열 (예컨대, 게놈 서열)을 포함하는 바이러스이다. 용어 "재조합"은 또한 천연 핵산 분자, 단백질 또는 바이러스의 일부의 추가, 치환 또는 결실에 의해서만 변경된 핵산, 단백질 및 바이러스를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "재조합 AAV"는 G6Pase-α를 코딩하는 재조합 핵산 분자와 같은 재조합 핵산 분자가 패키징된 AAV 입자를 지칭한다.
서열 동일성: 2개 이상의 핵산 서열 또는 2개 이상의 아미노산 서열 간의 동일성 또는 유사성은 서열들 간의 동일성 또는 유사성 측면에서 표현된다. 서열 동일성은 동일성 백분율의 관점에서 측정될 수 있으며; 백분율이 높을수록 서열은 더 동일하다. 서열 유사성은 (보존적 아미노산 치환을 고려하는) 유사성 백분율의 관점에서 측정될 수 있으며; 백분율이 높을수록 서열은 더 유사하다. 핵산 또는 아미노산 서열의 상동체 또는 이종상동체는 표준 방법을 이용하여 정렬될 때 상대적으로 높은 정도의 서열 동일성/유사성을 보유한다. 이 상동성은 이종상동성 단백질 또는 cDNA가 더 먼 관련 종 (예컨대, 인간 및 씨. 엘레간스 (C. elegans) 서열)과 비교하여 보다 밀접하게 관련된 종 (예컨대, 인간 및 마우스 서열)으로부터 유래될 때 더 중요하다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 문헌 (Smith & Waterman,　Adv. Appl. Math.　2:482, 1981; Needleman & Wunsch,　J. Mol. Biol.　48:443, 1970: Pearson & Lipman,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA　85:2444, 1988; Higgins & Sharp,　Gene,　73:237-44, 1988; Higgins & Sharp,　CABIOS5:151-3, 1989; Corpet et al.,　Nuc. Acids Res.　16:10881-90, 1988; Huang et al.　Computer Appls. in the Biosciences　8, 155-65, 1992: 및 Pearson et al.,　Meth. Mol. Rio.　24:307-31, 1994. Altschul et al.,　J. Mol. Biol.　215:403-10, 1990)에 기재되어 있고, 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고려 사항을 제시한다.
NCBI 기본 국소 정렬 검색 도구 (Basic Local Alignment Search Tool: BLAST) (Altschul et al.,　J. Mol. Biol.　215:403-10, 1990)는 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 함께 사용하기 위해 국립 생물학 정보 센터 (National Center for Biological Information: NCBI)를 포함한 몇몇 출처로부터 및 인터넷에서 이용 가능하다. 추가 정보는 NCBI 웹 사이트에서 찾을 수 있다.
혈청형: 특징적인 항원 세트로 구별되는 밀접하게 관련된 미생물 (예컨대, 바이러스) 그룹.
스터퍼 서열: 전형적으로 2개의 핵산 특징 사이에 (예컨대, 프로모터와 코딩 서열 사이에) 원하는 간격을 생성하거나 핵산 분자를 확장하여 원하는 길이가 되도록 하는데 사용되는 더 큰 핵산 분자 (예컨대, 벡터) 내에 함유된 뉴클레오티드 서열을 지칭함. 스터퍼 서열은 단백질 코딩 정보를 함유하지 않으며, 미지/합성 기원일 수 있고/이거나 더 큰 핵산 분자 내의 다른 핵산 서열과 관련이 없을 수 있다.
대상체: 살아있는 다세포 척추동물 유기체로서, 인간 및 비-인간 포유동물을 포함하는 범주.
합성: 실험실에서 인위적 수단으로 생산됨, 예컨대 합성 핵산은 실험실에서 화학적으로 합성될 수 있다.
치료 유효량: 작용제로 치료되는 대상체 또는 세포에서 원하는 효과를 달성하기에 충분한 특정 약제 또는 치료제 (예컨대, 재조합 AAV)의 양. 작용제의 유효량은 치료되는 대상체 또는 세포 및 치료 조성물의 투여 방식을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 인자에 따라 달라질 것이다.
벡터: 벡터는 숙주 세포에서 복제 및/또는 통합하는 벡터의 능력을 방해하지 않고 외래 핵산의 삽입을 허용하는 핵산 분자이다. 벡터는 복제 기점과 같은 숙주 세포에서 복제하도록 하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선별 가능한 마커 유전자 및 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 삽입된 유전자 또는 유전자들의 전사 및 번역을 허용하는데 필요한 조절 서열을 함유하는 벡터이다. 본원의 일부 실시양태에서, 벡터는 AAV 벡터이다.
달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. "A 또는 B를 포함하는"은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 근사치이고 설명을 위해 제공된다는 것을 이해해야 한다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 설명된다. 본원에 언급된 모든 공개문, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 용어 설명을 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
I. 재조합 핵산
본 발명의 한 측면은 야생형 GPE와 비교하여 하나 이상의 Alu 요소가 결여된, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열 (서열식별번호: 5)의 발현을 지시할 수 있는 변형된 G6PC 프로모터/인핸서 (GPE)를 포함하는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 6의 인접 뉴클레오티드 1079-1272 (Alu-1), 1633-1968 (Alu-2), 및 2140-2495 (Alu-3) 중 하나 이상을 제거하는 것과 같이 인간 G6PC 유전자에 대한 내인성 프로모터로부터 하나 이상의 Alu 요소를 제거함으로써 수득된다. 일부 다른 실시양태에서, 변형된 GPE는 비-인간 영장류, 양, 설치류 등과 같은 다른 포유동물의 G6PC 유전자에 대한 내인성 프로모터로부터 하나 이상의 Alu 요소를 제거함으로써 수득된다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 야생형 GPE와 비교하여 G6PC 유전자 발현에 영향을 미치지 않는다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 야생형 GPE와 비교하여 G6PC 유전자의 발현을 향상시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 야생형 GPE와 같이 간에서 G6PC 유전자 발현을 유도하는데 유사한 활성을 갖고, 다른 조직에서 G6Pase-α 발현을 유도하는데 매우 낮은 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 6으로부터의 인접 뉴클레오티드 1079-1272 (Alu-1)와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열이 없는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 6으로부터의 인접 뉴클레오티드 1633-1968 (Alu-2)과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열이 없는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 6으로부터의 인접 뉴클레오티드 2140-2495 (Alu-3)와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열이 없는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 6으로부터의 Alu-1과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열 및 Alu-2와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열이 없는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 6으로부터의 Alu-1과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열 및 Alu-3과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열이 없는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 6으로부터의 Alu-2와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열 및 Alu-3과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열이 없는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 GPE는 서열식별번호: 6으로부터의 Alu-1과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열, Alu-2와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열, 및 Alu-3과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 서열이 없는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 서열은 서열식별번호: 1의 인접 뉴클레오티드 146-2123과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖고, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 GPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 서열은 서열식별번호: 7과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖고, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 GPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 서열은 서열식별번호: 8과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖고, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 GPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 서열은 서열식별번호: 9와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖고, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 GPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 서열은 서열식별번호: 10과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖고, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 GPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 서열은 서열식별번호: 11과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖고, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 GPE를 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 핵산 서열은 서열식별번호: 12와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖고, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 GPE를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 변형된 GPE 및 G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, G6Pase-α는 서열식별번호: 5와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, G6Pase-α는 서열식별번호: 5 또는 그의 활성 단편 또는 변이체를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, G6Pase-α는 서열식별번호: 5를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열은 서열식별번호: 4와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 옵티멈진(OptimumGene)™ 코돈 최적화 기술 (진스크립트 (GenScript), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 인간 G6PC cDNA에서 코돈 최적화를 수행할 수 있다. 최적화된 G6PC cDNA 서열은 이론적으로 9개 이상의 아미노산 길이의 펩티드를 코딩할 수 있는 내부 비-인-프레임 ATG 서열로부터 잠재적인 대체 판독 프레임 (ARF)을 제거하기 위해 조사되고 추가로 변형될 수 있다. 예컨대, ARF로부터 생성된 트랜스진 생성물에 대한 잠재적인 세포독성 T 림프구 반응을 피하기 위해 코돈-최적화 G6PC cDNA 서열에서 추가 변형을 수행할 수 있다 (Li et al., 2009, PNAS 106: 10770-4). 일부 실시양태에서, 인간 G6Pase-α에 대한 코돈-최적화된 코딩 서열은 서열식별번호: 3과 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 변형된 GPE 및 G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 서열은 인트론 및/또는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인트론은 GPE와 G6Pase-α 코딩 서열 사이에 위치된다. 일부 실시양태에서, 인트론은 G6Pase-α 트랜스진 발현을 증가시키는 키메라 인트론이다. 인트론은 인간 β-글로빈 유전자의 제1 인트론으로부터의 5'-도너 부위 및 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 인트론으로부터의 분기 및 3'-억셉터 부위로 구성될 수 있으며, 여기서 도너 및 억셉터 부위의 서열은 분기점 부위와 함께 스플라이싱을 위한 컨센서스 서열과 일치하도록 변경되었다. 일부 실시양태에서, 인트론은 서열식별번호: 13과 적어도 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 포함한다.
폴리아데닐화 신호는 G6PC mRNA의 효율적인 폴리아데닐화를 위해 G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열의 하류에 위치될 수 있다. 다양한 폴리아데닐화 신호, 예컨대 시미안 바이러스 40 (SV40) 후기 폴리아데닐화 신호, hGH 폴리아데닐화 신호, BGH 폴리아데닐화 신호, 또는 rbGlob 폴리아데닐화 신호가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 SV40 후기 폴리아데닐화 신호이다. 일부 실시양태에서, 폴리아데닐화 신호는 서열식별번호: 14와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 변형된 GPE 및 G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 본원에 기재된 인트론 및/또는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다. 벡터는 포유동물 발현 벡터, 박테리아 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터, RNAi 벡터, Cre-Lox 발현 벡터, CRISPR 발현 벡터, TALEN 발현 벡터 등일 수 있다. 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 인트론 및/또는 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 GPE와 인트론 사이 및/또는 인트론과 G6Pase-α 코딩 서열 사이에 위치된 스터퍼 핵산 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 재조합 벡터는 AAV 벡터이다. AAV 벡터는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12의 AAV 벡터 (즉, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 또는 AAV12) 뿐만 아니라 인간 및 비인간 영장류 조직으로부터 단리된 100개 이상의 변이체 중 어느 하나일 수 있다 (예컨대, 문헌 (Choi et al., Curr Gene Ther., 5:299-310, 2005; 및 Gao et al., Curr Gene Ther., 5:285-297, 2005) 참조). 임의의 혈청형의 AAV 벡터가 본 발명에서 사용될 수 있고, AAV 혈청형의 선택은 부분적으로 유전자 요법을 위해 표적화된 세포 유형(들)에 따라 달라질 것이다. GSD-Ia의 치료를 위해, 간은 관련 표적 기관 중 하나이다.
일부 실시양태에서, 재조합 AAV 벡터는, AAV 및 아데노바이러스 헬퍼 기능이 트랜스로 제공될 때, 벡터 DNA 복제의 기점 및 벡터 게놈의 패키징 신호 둘 다로서 기능하는 AAV ITR 서열을 포함한다. 또한, ITR은 큰 Rep 단백질에 의한 단일-가닥 내핵 닉킹에 대한 표적 역할을 하여 복제 중간체로부터 개별 게놈을 분리한다.
일부 예시적인 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 8 (AAV8) 벡터이고, 벡터는 본원에 기재된 변형된 GPE, 인트론, G6Pase-α를 코딩하는 코딩 서열, 및 SV40 후기 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 2개의 AAV2 역위 말단 반복부 (ITR) 서열 (서열식별번호: 15)을 추가로 포함한다: 하나는 GPE의 5' 및 하나는 폴리아데닐화 신호의 3'. 일부 특정 비제한적 예에서, 재조합 벡터는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2와 적어도 80% (예컨대, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 동일한 핵산 서열을 포함한다.
II. 재조합 핵산을 포함하는 숙주 세포
본원에 개시된 재조합 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포가 추가로 제공된다. 광범위한 숙주 세포, 예컨대 박테리아, 효모, 곤충, 포유동물 세포 등이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 재조합 AAV (rAAV)의 생산에 적합한 세포 (또는 세포주), 예컨대 HeLa, Cos-7, HEK293, A549, BHK, Vero, RD, HT-1080, ARPE-19, 또는 MRC-5 세포일 수 있다.
재조합 핵산 분자 또는 벡터는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 숙주 세포 배양물로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈에 삽입된 재조합 핵산 분자 또는 벡터를 갖는 안정한 숙주 세포주가 생성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 AAV 벡터를 함유하는 안정한 숙주 세포주가 생성된다. AAV 벡터를 숙주 배양물로 형질감염시킨 후, 숙주 게놈으로의 rAAV의 통합은 문헌 (Nakai et al., Nature Genetics (2003) 34, 297-302; Philpott et al., Journal of Virology (2002) 76(11):5411-5421, 및 Howden et al., J Gene Med 2008; 10:42-50)에 기재된 바와 같이 항생제 선별, 형광-활성화된 세포 분류, 서던 블롯, PCR 기반 검출, 형광 제자리 하이브리드화와 같은 다양한 방법으로 검정될 수 있다. 또한, 안정한 세포주는 문헌 (Clark, Kidney International Vol 61 (2002):S9-S15, 및 Yuan et al., Human Gene Therapy 2011 May;22(5):613-24)에 기재된 것과 같이 관련 기술분야에 널리 공지된 프로토콜에 따라 확립될 수 있다.
III. 재조합 AAV
본 발명은 또한 본원에 기재된 AAV 캡시드 및 AAV 벡터 게놈을 포함하는 rAAV를 제공한다. AAV 캡시드는 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 (즉, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 rh10)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡시드는 AAV8 캡시드이다.
rAAV는 본원에 개시된 AAV 벡터 및 AAV Rep 및 Cap 유전자 기능 뿐만 아니라 추가 헬퍼 기능이 제공되는 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. Rep 및 Cap 유전자 기능은 다양한 수단, 예컨대 야생형 AAV Rep 및 Cap 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 임의의 유형의 벡터, 및 Rep 및 Cap mRNA의 전기천공에 의해 숙주 세포에 제공될 수 있다. 추가 헬퍼 기능은, 예컨대 아데노바이러스 (AV) 감염, 필요한 모든 AV 헬퍼 기능 유전자를 운반하는 플라스미드, 또는 단순 포진 바이러스 (HSV) 또는 바큘로바이러스와 같은 다른 바이러스에 의해 제공될 수 있다. 숙주 세포에 의한 rAAV 생산에 필요한 임의의 유전자, 유전자 기능, 또는 기타 유전 물질은 숙주 세포 내에 일시적으로 존재하거나 숙주 세포 게놈에 안정적으로 삽입될 수 있다. 본 발명의 방법과 함께 사용하기에 적합한 rAAV 생산 방법은 문헌 (Clark et al., Human Gene Therapy 6:1329-1341 (1995), Martin et al., Human Gene Therapy Methods 24:253-269 (2013), Thorne et al., Human Gene Therapy 20:707-714 (2009), Fraser Wright, Human Gene Therapy 20:698-706 (2009), 및 Virag et al., Human Gene Therapy 20:807-817 (2009))에 개시된 것들을 포함한다.
예시적인 실시양태에서, HEK293 세포는 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터; 4개의 야생형 AAV2 바이러스 복제 (Rep) 단백질 및 혈청형 8로부터의 3개의 야생형 AAV 바이러스 캡시드 (캡) 단백질을 코딩하는 플라스미드; 및 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈의 영역, 즉 E2A, E4 및 VA RNA를 함유하는 플라스미드로 형질감염된다. 후속적으로 AAV8 캡시드를 함유하는 rAAV가 생산되고 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터에서 하나 이상의 Alu 요소가 결여된 변형된 GPE는 숙주 세포로부터 생산되는 rAAV의 패키징을 향상시킨다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터에서 하나 이상의 Alu 요소가 결여된 변형된 GPE는 자가-상보적 구조 형성에 영향을 미치고, 따라서 숙주 세포로부터 생산되는 rAAV의 수율을 향상시킨다.
AAV-감염된 세포의 용해는 감염성 바이러스 입자를 방출시키기 위해 세포를 화학적으로 또는 효소적으로 처리하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 방법은 벤조나제 또는 DNAse와 같은 뉴클레아제, 트립신과 같은 프로테아제, 또는 세제 또는 계면활성제의 사용을 포함한다. 균질화 또는 분쇄와 같은 물리적 파괴, 또는 미세유동기 압력 셀을 통한 압력 적용, 또는 동결-해동 주기도 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포 용해 없이 AAV-감염된 세포로부터 상청액을 수집할 수 있다.
예컨대, 세포 용해로 인한 세포 파편을 제거하기 위해 rAAV 및 헬퍼 바이러스 입자를 함유하는 샘플을 정제해야 할 수 있다. 헬퍼 바이러스 및 AAV 입자의 최소 정제 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 AAV 및 헬퍼 바이러스 입자 둘 다를 함유하는 샘플을 제조하기 위해 임의의 적절한 방법을 이용할 수 있다. 2개의 예시적인 정제 방법은 염화세슘 (CsCl)- 및 요오딕사놀-기반 밀도 구배 정제이다. 두 방법 모두 문헌 (Strobel et al., Human Gene Therapy Methods, 26(4): 147-157 (2015))에 기재되어 있다. 최소 정제는 또한, 예컨대 AVB 세파로스 (Sepharose) 친화성 수지 (GE 헬스케어 바이오-사이언시스 AB (GE Healthcare Bio-Sciences AB), 스웨덴 웁살라) 또는 POROSTM 캡쳐셀렉트(CaptureSelect)TM AAV8, AAV9 또는 AAVX 친화성 수지 (써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific), 펜실베니아주 밀러스버그)를 사용하는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 달성될 수 있다. AVB 세파로스 친화성 수지를 사용하는 AAV 정제 방법은, 예컨대 문헌 (Wang et al., Mol Ther Methods Clin Dev., 2:15040 (2015))에 기재되어 있다.
열로 헬퍼 바이러스를 불활성화시켜야 할 수도 있다. 열 불활성화 기술은 AAV 및 헬퍼 바이러스 입자의 상이한 열 안정성을 기반으로 한다. 예컨대, AAV 입자는 56℃의 높은 온도로 가열되어 여전히 무손상 상태로 유지될 수 있는 반면, AV 입자는 불활성화된다. 문헌 (Conway et al., Gene Therapy 6, 986-993, 1999)은 AAV 함유 샘플에서 HSV의 차등적 열 불활성화를 기재한다. 열 불활성화는 임의의 공지된 방법론에 의해 달성될 수 있다. 하기에 기재된 예에서, 열 불활성화는 300 μL 이하의 샘플 부피를 빠르게 가열하고 냉각시키기 위해 열순환기를 사용하여 달성되었다. 이 시스템은 주로 전도성인 열 전달에 의존하기 때문에 선택되었으며, 연속-유동 시스템 및 능동 혼합을 이용하는 더 큰 배치 시스템 모두에서 실행 가능한 모델이 되었다. 연속-유동 시스템의 예는 생물-치료 제조용 DHXTM 일회용 열 교환기 (DHXTM Single-Use Heat Exchanger for Bio-therapeutic Manufacturing) (써모 피셔 사이언티픽, 펜실베니아주 밀러스버그)와 같은 연속-유동 열 교환기를 통한 샘플 통과를 포함한다. 이러한 시스템을 통해 작업자는 열 교환기를 통과하는 샘플의 유량을 제어하여 가열 공정의 지속기간 및 열 교환기의 온도를 제어하고 이로써 열 불활성화 온도를 제어함으로써 열 불활성화를 제어할 수 있다.
대안적으로, 열 불활성화는 다양한 크기의 배치 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. 예컨대, 열 불활성화는 AAV-함유 샘플을 1 L PETG 병에 넣고, 혼합하면서, 병을 원하는 기간 동안 원하는 불활성화 온도로 설정된 수조에 넣어 1 L 규모로 달성될 수 있으며; 예컨대, 샘플은 20분 동안 47℃로 가열될 수 있다. 더 큰 규모에서, 열 불활성화는 원하는 기간 동안 원하는 불활성화 온도로 설정된 온도 제어된 락킹 플랫폼 상의 5 L 바이오프로세싱 백에 rAAV-함유 샘플을 배치함으로써 달성될 수 있다. 예컨대, 락킹 플랫폼은 40분 동안 12°혼합 각도와 함께 30 RPM의 락킹 속도로 49℃로 설정될 수 있다.
열 불활성화는 rAAV 입자와 헬퍼 바이러스 입자 사이의 안정성에 충분한 차이가 있어 활성 rAAV 입자는 남아 있으면서 헬퍼 바이러스 입자는 실질적으로 불활성화되는 경우 임의의 온도에서 발생할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 더 높은 수준의 AV 감소를 달성하기 위해 더 높은 온도가 필요할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 열 불활성화 단계는 코스모트로픽 염 및/또는 2가 또는 3가 양이온을 함유하는 버퍼의 사용을 포함한다. 코스모트로픽 염 및/또는 2가 또는 3가 양이온을 함유하는 버퍼의 존재 하에서의 열 불활성화 방법은 WO/2017/172772에 기재되어 있다.
열 불활성화가 달성되면 불활성화 효율을 결정하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있다. 불활성화 프로토콜의 효능은 플라크 검정과 같은 복제 적격 헬퍼 바이러스의 존재를 검출하는 검정에 의해 결정된다. AV, HSV, 바큘로바이러스 등에 대한 플라크 검정을 포함하여 헬퍼 바이러스에 대한 플라크 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 아데노바이러스의 플라크 검정은 임의의 적절한 세포 유형, 예컨대 HeLa 또는 HEK293 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 표준 플라크 검정 프로토콜은, 예컨대 문헌 (Current Protocols in Human Genetics, 2003)에 기재되어되어 있다. 아데노바이러스 역가를 측정하기 위한 대체 검정은 면역세포화학 염색을 이용하여 헥손 단백질과 같은 바이러스 단백질을 검출함으로써 배양물에서 감염된 세포의 확인을 가능하게 하는 것들을 포함한다. 이러한 검정은 퀵타이터TM 아데노바이러스 타이터 면역검정 키트 (QuickTiterTM Adenovirus Titer Immunoassay Kit) (셀 바이오랩스 (Cell Biolabs), 캘리포니아주 샌 디에고)를 포함한다. 불활성화 효율은 일반적으로 바이러스의 로그 감소 (LRV)로 보고된다.
rAAV 입자의 정량화는 AAV 감염이 시험관내에서 세포변성 효과를 일으키지 않으므로 감염 역가를 결정하는데 플라크 검정을 사용할 수 없다는 사실로 인해 복잡해진다. 그러나, AAV 입자는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR) (Clark et al., Hum. Gene Ther. 10, 1031-1039 (1999)) 또는 도트-블롯 하이브리드화 (Samulski et al., J. Virol. 63, 3822-3828 (1989))를 포함한 다수의 방법을 이용하거나 고도로 정제된 벡터 제제의 광학 밀도 (Sommer et al., Mol. Ther. 7, 122-128 (2003))에 의해 정량화될 수 있다. DNase-내성 입자 (DRP)는 열순환기 (예컨대, 아이사이클러 (iCycler) iQ 96-웰 블록 형식 열순환기 (바이오-라드 (Bio-Rad), 캘리포니아주 헤르쿨레스)에서 실시간 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR) (DRP-qPCR)에 의해 정량화될 수 있다. AAV 입자를 함유하는 샘플을 37℃에서 60분 동안 DNase I (100 U/ml; 프로메가 (Promega), 위스콘신주 메디슨)의 존재 하에 인큐베이션하고, 이어서 50℃에서 60분 동안 프로테이나제 K (인비트로겐 (Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드) 분해 (10 U/ml)한 후, 95℃에서 30분 동안 변성시킨다. 사용된 프라이머-프로브 세트는 AAV 벡터 게놈의 비-천연 부분, 예컨대 관심 단백질의 폴리(A) 서열에 특이적이어야 한다. PCR 생성물은 프라이머, 프로브 및 증폭된 서열의 길이 및 조성에 기반하여 임의의 적절한 순환 파라미터 세트를 사용하여 증폭될 수 있다. 대체 프로토콜은, 예컨대 문헌 (Lock et al., Human Gene Therapy Methods 25(2): 115-125 (2014))에 개시되어 있다.
rAAV 입자의 감염성은, 예컨대 문헌 (Zhen et al., Human Gene Therapy 15:709-715 (2004))에 기재된 바와 같이 TCID50 (50%의 조직 배양 감염 용량) 검정을 이용하여 결정될 수 있다. 이 검정에서 AAV 벡터 입자는 연속 희석되고 96-웰 플레이트에서 AV 입자와 함께 Rep/Cap-발현 세포주를 공동 감염시키는데 사용된다. 감염 후 48시간에, 감염된 웰 및 대조군 웰로부터 총 세포 DNA가 추출된다. AAV 벡터 복제는 트랜스진-특이적 프로브 및 프라이머와 함께 qPCR을 이용하여 측정된다. 밀리리터당 TCID50 감염률 (TCID50/ml)은 10배 연속 희석에서 AAV에 대해 양성인 웰의 비율을 사용하여 캐르버 (Karber) 수학식으로 계산된다.
IV. 유전자 요법을 위한 재조합 AAV
AAV는 파르보비리다에 (Parvoviridae) 과 및 데펜도비루스 (Dependovirus) 속에 속한다. AAV는 선형의 단일-가닥 DNA 게놈을 패키징하는 작은 비-외피 바이러스이다. AAV DNA의 센스 및 안티센스 가닥은 모두 동일한 빈도로 AAV 캡시드에 패키징된다.
AAV 게놈은 2개의 개방 판독 프레임 (ORB) 옆에 배치되는 2개의 역위 말단 반복부 (ITR)를 특징으로 한다. 예컨대, AAV2 게놈에서, ITR의 처음 125개 뉴클레오티드는 팔린드롬이며, 이는 그 자체로 접혀 염기 짝지음을 최대화하고 T-모양의 헤어핀 구조를 형성한다. D 서열로 불리는 ITR의 나머지 20개 염기는 짝을 이루지 않는다. ITR은 AAV DNA 복제에 중요한 cis-작용 서열이며; ITR은 복제 기점이며 DNA 폴리머라제에 의한 제2-가닥 합성을 위한 프라이머 역할을 한다. 복제-형태 단량체로 불리는 이 합성 동안 형성된 이중-가닥 DNA는 자가-프라이밍 복제의 제2 라운드에 사용되어 복제-형태 이량체를 형성한다. 이들 이중-가닥 중간체는 가닥 변위 메커니즘을 통해 처리되어 패키징에 사용되는 단일-가닥 DNA 및 전사에 사용되는 이중-가닥 DNA가 생성된다. ITR 내에는 Rep 결합 요소 및 말단 분해 부위 (terminal resolution site: TRS)가 위치된다. 이들 특징은 AAV 복제 동안 바이러스 조절 단백질 Rep에 의해 이중-가닥 중간체를 처리하는데 사용된다. AAV 복제에서의 역할 외에, ITR은 AAV 게놈 패키징, 전사, 비-허용 조건 하에서의 음성 조절, 및 부위-특이적 통합에도 필수적이다 (Days and Berns,　Clin Microbiol Rev　21(4):583-593, 2008).
AAV의 왼쪽 ORF는 4개의 단백질 - Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 코딩하는 Rep 유전자를 함유한다. 오른쪽 ORF는 3개의 바이러스 캡시드 단백질 (VP1, VP2 및 VP3)을 생산하는 Cap 유전자를 함유한다. AAV 캡시드는 이십면체 대칭으로 배열된 60개의 바이러스 캡시드 단백질을 함유한다. VP1, VP2 및 VP3는 1:1:10 몰비로 존재한다 (Daya and Berns,　Clin Microbiol Rev　21(4):583-593, 2008).
AAV는 현재 유전자 요법에 가장 자주 사용되는 바이러스 중 하나이다. AAV는 인간 및 일부 다른 영장류 종을 감염시키지만 질환을 유발하는 것으로 공지되어 있지 않으며 매우 가벼운 면역 반응을 유발한다. AAV를 활용하는 유전자 요법 벡터는 분열 세포 및 정지 세포를 모두 감염시키고 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않고 염색체외 상태로 지속될 수 있다. AAV의 유리한 특징 때문에, 본 개시내용은 본원에 개시된 재조합 핵산 분자 및 방법에 대해 AAV의 사용을 고려한다.
AAV는 표적 세포에 결합하여 들어가는 능력, 핵에 들어가는 능력, 장기간 동안 핵에서 발현되는 능력, 및 낮은 독성을 포함하여 유전자 요법 벡터를 위한 몇몇 바람직한 특징을 보유한다. 그러나, AAV 게놈의 작은 크기는 통합될 수 있는 이종 DNA의 크기를 제한한다. 이 문제를 최소화하기 위해, Rep 및 통합 효율 요소 (IEE)를 코딩하지 않는 AAV 벡터가 구축되었다. ITR은 패키징에 필요한 cis 신호이므로 유지된다 (Daya and Berns,　Clin Microbiol Rev, 21(4):583-593, 2008).
유전자 요법에 적합한 rAAV를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며 (예컨대, 미국 특허 출원 번호 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971; 및 2013/0072548; 및 Ghosh et al.,　Gene Ther　13(4):321-329, 2006 참조), 본원에 개시된 재조합 핵산 분자 및 방법과 함께 활용될 수 있다.
본원에 개시된 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 본 개시내용에 의해 제공된다. rAAV의 투여에 적합한 약제학적 제형은, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0219528에서 찾을 수 있다. 본 개시내용에 유용한 제약상 허용되는 담체 (비히클)는 통상적이다. 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th Edition (1975))은 하나 이상의 치료 화합물, 분자 또는 작용제의 약제 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기재한다.
일부 실시양태에서, rAAV는 인간 대상체에서의 주입에 적합한 버퍼/담체에 제형화된다. 버퍼/담체는 rAAV가 주입 튜브에 달라 붙는 것은 방지하지만 생체내에서 rAAV 결합 활성을 방해하지 않는 성분을 포함해야 한다. 다양한 적합한 용액은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 완충 식염수, 계면활성제, 및 약 100 mM 염화나트륨 (NaCl) 내지 약 250 mM 염화나트륨과 동등한 이온 강도로 조정된 생리학적으로 적합한 염 또는 염의 혼합물, 또는 동등한 이온 농도로 조정된 생리학적으로 적합한 염. pH는 6.5 내지 8.5, 또는 7 내지 8.5, 또는 7.5 내지 8의 범위일 수 있다. 적합한 계면활성제 또는 계면활성제의 조합은 폴록사머, 즉 2개의 친수성 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥사이드)) 쇄가 옆에 있는 중심의 소수성 폴리옥시프로필렌 10 (폴리(프로필렌 옥사이드)) 쇄로 구성된 비이온성 삼블록 공중합체, 솔루톨 (SOLUTOL) HS 15 (마크로골-15 히드록시스테아레이트), 라브라솔 (LABRASOL) (폴리옥시 카프릴릭 글리세라이드), 폴리옥시 10 올레일 에테르, 트윈 (TWEEN) (폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 글리코겐 저장 질환 유형 1a (GSD-Ia)로 진단된 대상체를 치료하고 본원에 개시된 rAAV (또는 rAAV를 포함하는 조성물)의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다.
임의의 적절한 방법 또는 경로를 이용하여 본원에 기재된 rAAV 또는 rAAV- 함유 조성물을 투여할 수 있다. 투여 경로는, 예컨대 전신, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 동맥내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 및 다른 비경구 투여 경로를 포함한다. 일부 실시양태에서, rAAV 또는 rAAV를 포함하는 조성물은 정맥내로 투여된다.
투여되는 특정 용량은 각각의 환자에 대해 균일한 용량, 예컨대 환자당 1.0 x 1013 내지 1.0 x 1015 게놈 카피 (GC)의 바이러스일 수 있다. 대안적으로, 환자의 용량은 환자의 대략적인 체중 또는 표면적에 맞춰질 수 있다. 적절한 용량을 결정하는 다른 요인은 치료 또는 예방될 질환 또는 병태, 질환의 중증도, 투여 경로, 및 환자의 연령, 성 및 의학적 상태를 포함할 수 있다. 치료를 위한 적절한 용량을 결정하는데 필요한 계산의 추가 개선은 특히 본원에 개시된 용량 정보 및 검정에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일상적으로 이루어진다. 용량은 적절한 용량-반응 데이터와 함께 사용되는 용량을 결정하기 위한 공지된 검정을 이용하여 결정될 수도 있다. 예컨대, 투여되는 rAAV의 최적 생물학적 용량은 저혈당이 발생하거나 15시간에 도달하면 종료될 제어된 공복 챌린지 동안 제1 저혈당 이벤트 (글루코스 < 60 mg/dL (<3.33 mmol/L)로 정의됨)까지의 시간 (분)을 평가하여 확인될 수 있다. 질환의 진행을 모니터링하면서 개별 환자의 용량을 조정할 수도 있다.
일부 실시양태에서, rAAV는 qPCR 또는 디지털 소적 PCR (ddPCR)로 측정 시, 예컨대 환자 체중 킬로그램당 약 1.0 x 1011 게놈 카피 (GC/kg) 내지 약 1 x 1014 GC/kg, 환자의 체중 킬로그램당 약 5 x 1011 게놈 카피 (GC/kg) 내지 약 5 x 1013 GC/kg, 또는 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1013 GC/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 약 2 x 1012　 GC/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 약 6 x 1012　 GC/kg의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rAAV는 약 1 x 1013　 GC/kg의 용량으로 투여된다. rAAV는 원하는 치료 결과를 위해 필요에 따라 단일 용량으로 또는 다중 용량 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 용량)으로 투여될 수 있다.
용량은 매주, 매월 또는 매년 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 20년에 1회 제공될 수 있다. 예컨대, 각각의 용량은 최소 1주 간격, 2주 간격, 3주 간격, 1개월 간격, 3개월 간격, 6개월 간격, 또는 1년 간격으로 제공될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 체액 또는 조직에서 표적화 가능한 구축물 또는 복합체의 측정된 체류 시간 및 농도에 기반하여 투여를 위한 반복률을 쉽게 추정할 수 있다.
V. 재조합 바이러스 수율 및 유전자 요법 효능을 증가시키는 방법
본 발명은 또한 재조합 바이러스 벡터로부터 하나 이상의 Alu 요소 또는 Alu 요소-관련 서열을 제거하는 단계를 포함하는, 숙주 세포로부터 재조합 바이러스의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, Alu 요소-관련 서열은 Alu 요소와 적어도 50% 동일하며, 예컨대 서열식별번호: 6의 인접 뉴클레오티드 1079-1272 (Alu-1), 1633-1968 (Alu-2), 및 2140-2495 (Alu-3)로부터 선택된다. 재조합 바이러스 벡터는, 예컨대 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 Alu 요소 또는 Alu 요소-관련 서열은 바이러스 벡터 내의 프로모터/인핸서 영역으로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 Alu 요소 또는 Alu 요소-관련 서열은 바이러스 벡터 내의 인트론 영역으로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, Alu 요소(들) 또는 Alu 요소-관련 서열의 제거는 재조합 바이러스 입자의 패키징 동안 형성된 자가-상보적 구조를 감소시키고, 따라서 숙주 세포로부터 바이러스 수율을 개선한다.
설명 전반에 걸쳐, 조성물이 특정 성분을 갖거나 포함하는 것으로 기재되는 경우, 또는 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나 포함하는 것으로 기재되는 경우, 추가적으로, 언급된 성분으로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 본 발명의 조성물이 있으며, 언급된 처리 단계로 필수적으로 이루어지거나 이로 이루어진 본 발명에 따른 공정 및 방법이 있다는 것이 고려된다.
본 출원에서, 요소 또는 성분이 언급된 요소 또는 성분 목록에 포함되고/되거나 이로부터 선택된다고 하는 경우, 요소 또는 성분은 언급된 요소 또는 성분 중 어느 하나일 수 있거나, 요소 또는 성분은 언급된 요소 또는 성분 중 2개 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
또한, 본원에 기재된 조성물 또는 방법의 요소 및/또는 특징은 본원에서 명시적이든 묵시적이든 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 방식으로 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예컨대, 특정 화합물을 언급하는 경우, 문맥으로부터 달리 이해되지 않는 한, 그 화합물은 본 발명의 조성물 및/또는 본 발명의 방법의 다양한 실시양태에서 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 출원 내에서 실시양태는 명확하고 간결한 적용이 글로 표현되고 그려질 수 있는 방식으로 설명되고 묘사되었지만, 실시양태는 본 교시 및 발명(들)로부터 벗어나지 않고 다양하게 조합되거나 분리될 수 있다는 것이 의도되고 이해될 것이다. 예컨대, 본원에 설명되고 묘사된 모든 특징은 본원에 설명되고 묘사된 본 발명(들)의 모든 측면에 적용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
표현 "적어도 하나의"는 문맥 및 사용으로부터 달리 이해되지 않는 한, 표현 후 언급된 대상 및 2개 이상의 언급된 대상의 다양한 조합 각각을 개별적으로 포함한다는 것을 이해해야 한다. 3개 이상의 언급된 대상과 관련하여 표현 "및/또는"은 문맥에서 달리 이해되지 않는 한 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "포함하다", "포함하는", "갖는다", "갖는", "함유하다", 또는 "함유하는" 및 그의 문법적 등가물의 사용은 일반적으로 문맥으로부터 달리 구체적으로 언급되거나 이해되지 않는 한, 예컨대 추가적인 언급되지 않은 요소 또는 단계를 배제하지 않는 개방형 및 비제한적인 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약"의 사용이 정량적 값 앞에 있는 경우, 본 발명은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 특정 정량적 값 자체도 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약"은 달리 지시되거나 추론되지 않는 한 공칭 값으로부터 ± 10% 변동을 지칭한다.
단계의 순서 또는 특정 조치를 수행하기 위한 순서는 본 발명이 작동 가능한 상태로 유지되는 한 중요하지 않다는 것을 이해해야 한다. 또한, 2개 이상의 단계 또는 조치가 동시에 수행될 수 있다.
본원에서 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 용어, 예컨대 "~와 같은" 또는 "포함하는"의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 용어도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
이제 일반적으로 설명된 본 발명은 본 발명의 특정 측면 및 실시양태의 예시 목적으로만 포함되고 본 발명을 제한하려는 것이 아닌 하기 실시예를 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이다.
실시예 1 - 벡터로부터 생산된 AAV 벡터 및 rAAV
AAV 벡터
2개의 AAV2 역위 말단 반복부 (ITR, 서열식별번호: 15)가 결합된 G6PC 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터를 구축하였다. G6PC 발현 카세트는 그의 G6PC 프로모터/인핸서 (GPE) 5' 말단에서 문헌 (Yiu et al., 2010, Molecular Therapy 18(6): 1076-84)에 열거된 프라이머 서열 "1S" 및 그의 관련된 KpnI 제한 엔도뉴클레아제 부위에 의해 정의되었다. G6PC 발현 카세트는 SV40 후기 폴리아데닐화 신호 3' 말단에서 SV40 게놈 및 관련된 SalI 제한 엔도뉴클레아제 부위와의 정렬에 의해 정의되었다. 모든 G6PC 발현 카세트는 도 1A에 예시된 바와 같이 GPE, 인트론, 코돈 최적화된 인간 G6PC 유전자, 및 SV40 후기 폴리A 테일을 함유한다. 상이한 버전의 G6PC 발현 카세트가 생성되었으며, 각각은 도 1B에 예시된 바와 같이 야생형 GPE, 또는 변형된 GPE를 함유한다. G6PC 발현 카세트의 요소는 하기에 기재된다.
야생형 G6PC 프로모터/인핸서 (GPE, 서열식별번호: 6)는 호모 사피엔스 (Homo sapiens)로부터 유래되고, RefSeq NG_011808에 의해 정의된다. 이 서열은 인간 G6PC 유전자에 대한 내인성 프로모터이며, 간에서 거의 배타적인 활성을 갖고 신장에서 최소한의 활성을 갖는다. 야생형 GPE는 서열식별번호: 6의 인접 뉴클레오티드 1079-1272 (Alu-1), 1633-1968 (Alu-2) 및 2140-2495 (Alu-3)에 위치된 3개의 Alu 요소를 함유한다. AAV 벡터 DTC161은 야생형 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함한다. AAV 벡터 DTC175는 Alu-1 및 Alu-2 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 함유한다. AAV 벡터 DTC176은 Alu-1 및 Alu-2 서열의 배향이 역위된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 함유한다. AAV 벡터 DTC177 (서열식별번호: 1로 표시됨)은 Alu-1, Alu-2 및 Alu-3 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 함유한다. AAV 벡터 DTC178은 Alu-3 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 함유한다. AAV 벡터 DTC179는 Alu-3 서열의 배향이 역위된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 함유한다.
키메라 인트론 (서열식별번호: 13)은 인간 β-글로빈 유전자의 제1 인트론으로부터의 5'-도너 부위 및 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 인트론으로부터의 분기 및 3'-억셉터 부위로 구성된다. 도너 및 억셉터 부위의 서열은 분기점 부위와 함께 스플라이싱을 위한 컨센서스 서열과 일치하도록 변경되었다 (CI-neo Mammalian Expression Vector Technical Bulletin TB215, Promega Life Sciences Corporation). 키메라 인트론의 목적은 유전자 발현을 개선하는 것이다.
G6PC cDNA (서열식별번호: 4)는 호모 사피엔스로부터 유래되고, 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 코돈 최적화는 독점적인 옵티멈진™ 코돈 최적화 기술 (진스크립트, 뉴저지주 피스카타웨이)을 이용하여 인간 G6PC cDNA에서 수행되었다. 최적화된 cDNA 서열은 이론적으로 9개 이상의 아미노산 길이의 펩티드를 코딩할 수 있는 내부 비-인-프레임 ATG 서열로부터 잠재적인 대체 판독 프레임 (ARF)을 제거하기 위해 조사되고 추가로 변형되었다. 예컨대, 코돈 최적화된 G6PC cDNA는 서열식별번호: 3으로 표시된다.
시미안 바이러스 40 (SV40) 후기 폴리아데닐화 신호 (진뱅크 (Genbank) # J02400, 서열식별번호: 14)는 G6PC mRNA의 효율적인 폴리아데닐화를 위한 cis 서열을 제공한다. 이 요소는 초기 전사체의 3' 말단에서 특정 절단 이벤트 및 긴 폴리아데닐 테일의 추가에 대한 신호로 기능한다.
각각의 G6PC 발현 카세트를 AAV 벡터에 클로닝하였다. 모든 AAV 벡터는 카나마이신-내성 유전자를 코딩하는 백본을 가졌다. AAV 벡터 DTC161 (pDTX.hG6PCco.401)이 예로서 도 2에 예시되어 있다.
rAAV 비리온
AAV 벡터 게놈은 단일-가닥 DNA 게놈이다. ITR 서열 사이의 서열 및 이를 포함하는 서열만 AAV 비리온에 패키징된다. 비리온은 E1a 및 E1b 유전자 생성물을 제공하는 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포로 3개의 플라스미드를 형질감염시켜 생산되었다. 제1 플라스미드는 본원에 기재된 AAV 벡터이다. 제2 플라스미드는 야생형 AAV2 rep 및 AAV8 cap 유전자를 함유하는 패키징 플라스미드인 pAAV2-8.KanR (p2123-FH)이다. 제3 플라스미드는 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드인 pAdDeltaF6(Kan)이다.
아데노-연관 Rep/Cap 플라스미드 pAAV2/8.KanR(p2123-FH) (8354 bp)은 4개의 야생형 AAV2 바이러스 복제 (Rep) 단백질 및 혈청형 8로부터의 3개의 야생형 AAV VP 캡시드 (cap) 단백질을 코딩한다. pAAV2/8.KanR (p2123-FH) 플라스미드의 예시가 도 3에 나타나 있다. 플라스미드 내에서 Rep 유전자 발현을 정상적으로 유도하는 AAV p5 프로모터는 Rep 영역의 5' 말단으로부터 AAV8 cap 영역의 3' 말단으로 이동되었다. 이 배열은 프로모터와 Rep 유전자 (즉, 플라스미드 백본) 사이에 스페이서를 도입하여 Rep의 발현을 하향 조절하고 높은 역가 rAAV 생산을 지원하는 능력을 증가시킨다. 카나마이신 내성 유전자 및 MB1 기점은 이. 콜리 (E. coli)에서 플라스미드 생산을 위해 포함된다.
플라스미드 pAdDeltaF6(Kan)은 AAV 복제에 중요한 아데노바이러스 게놈 영역, 즉 E2A, E4 및 VA RNA를 함유한다 (도 4). 아데노바이러스 E1 기능도 필요하지만 HEK293 숙주 세포에 의해 제공한다. 플라스미드는 다른 아데노바이러스 복제, 구조 유전자, 또는 아데노바이러스 ITR과 같은 아데노바이러스 복제에 중요한 시스 요소를 함유하지 않으므로 감염성 아데노바이러스가 생성되지 않을 것으로 예상된다. 카나마이신 내성 유전자 및 MB1 기점은 이. 콜리에서 플라스미드 생산을 위해 포함된다.
실시예 2 - Alu 요소의 결실은 rAAV 수율을 개선한다
야생형 GPE 또는 변형된 GPE를 함유하는 AAV 벡터를 사용하여 HEK293 세포를 전술된 Rep/Cap 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드와 함께 형질감염시켰다.
변형된 GPE는 결실된 Alu 요소 (DTC175, DTC177 및 DTC178 벡터) 또는 방향이 역위된 Alu 요소 (DTC176 및 DTC179 벡터)를 함유한다. DTC175 바이러스 벡터는 Alu-1 및 Alu-2 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하고, DTC176 바이러스 벡터는 3개의 Alu 요소가 모두 존재하지만 Alu-1 및 Alu-2 서열의 배향이 역위된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하고, DTC177 바이러스 벡터는 Alu-1, Alu-2 및 Alu-3 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하고, DTC178 바이러스 벡터는 Alu-3 서열이 결실된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함하고, DTC179 바이러스 벡터는 3개의 Alu 요소가 모두 존재하지만 Alu-3 서열의 배향이 역위된 GPE를 포함하는 G6PC 발현 카세트를 포함한다.
공동-형질감염 후 제5일에, 감염된 세포를 나트륨 데옥시콜레이트 및 벤조나제(Benzonase)®를 함유하는 용해 버퍼에서 37℃에서 2시간 동안 용해시켰다. 이어서, 샘플로부터의 상청액을 DNase I 및 프로테이나제 K로 순차적으로 분해하여 rAAV 게놈 DNA를 방출하였다. 이어서, AAV 벡터의 BGH-PolyA 코딩 영역을 증폭시키는 TaqMan qPCR을 이용하여 rAAV 플라스미드 표준 곡선을 기반으로 rAAV 게놈 카피 수 (GC)를 결정하였다. 도 5는 다양한 AAV 벡터의 형질감염 후 숙주 세포로부터 생산된 rAAV의 역가를 나타내는 막대 그래프이다. 도 5는 qPCR에 의해 측정된 rAAV 역가를 나타내고, GPE로부터 하나 이상의 Alu 요소의 결실 (DTC175, DTC177 및 DTC178 벡터)이 야생형 GPE를 함유하는 DTC161과 비교하여 rAAV 수율을 상당히 증가시켰음을 시사한다. 그러나, 하나 이상의 Alu 요소의 역위 (DTC176 및 DTC179 벡터)는 DTC161과 비교하여 rAAV 수율을 개선하지 못하였다. 바이러스 수율의 정량화가 표 1에 요약되어 있다. 표 1에 나타낸 바와 같이, GPE로부터 하나 이상의 Alu 요소의 결실은 rAAV 수율을 상당히 개선한다. 벡터 게놈 크기의 함수로 플롯팅된 생산된 rAAV의 역가를 나타내는 제2 분석은 도 6에 그래프로 제시된다. 도 6은 가장 작은 크기를 갖는 벡터 게놈, DTC177 (서열식별번호: 1로 표시됨)이 가장 높은 역가를 생산하였다는 것을 나타낸다.
<표 1>
Figure pct00001
실시예 3 - Alu 요소 결실은 rAAV 패키징을 개선한다
하나 이상의 Alu 요소의 결실이 rAAV의 패키징에 영향을 미치는지의 여부를 평가하기 위해, 실시예 2에 기재된 바와 같이 생산된 rAAV를 수거하고, (대조군 바이러스 벡터, DTC161, DTC175, DTC176, DTC177, DTC178, 또는 DTC179로부터 생산된) 각각의 rAAV로부터 총 DNA를 단리하였다. 대략적으로, 각각의 rAAV GC의 7.12x 1010 총량을 아가로스 겔 전기영동을 한 후, SYBR 골드 (SYBR Gold)로 염색하였다. 이 실험에 사용된 대조군 바이러스 벡터는 AAV8-LSP-hFIXco3-WPRE-pA (비로벡 (Virovek)에서 생성됨, 맞춤형 정제, 카탈로그/로트# 061015의 150282)였으며, 이는 겔에서 공지된 DNA 크기 이동, 및 실험 방법이 AAV 캡시드의 통합성을 파괴하고 패키징된 DNA를 방출시킬 수 있었다는 확인을 제공하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 전장 바이러스 DNA는 3.8 kb-5 kb였다. '*'는 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 처리 시 대조군 바이러스 벡터로부터 단리된 전장 DNA의 캡시드 분해 및 온전한 게놈을 나타낸다.
하나 이상의 Alu 요소가 GPE로부터 결실된 DTC177, DTC175 및 DTC178의 rAAV로부터 단리된 전장 DNA의 더 높은 염색 강도가 관찰되었다 (도 7 참조). 이 결과는 적어도 하나의 Alu 요소의 결실이 전장 바이러스 게놈의 rAAV 패키징을 개선한다는 것을 시사한다. 또한, 각각 빈 입자 (약 60S에서 나타남) 및 전체 벡터 DNA-함유 입자 (약 100S에서 나타남)에 대해 분석된 DTC161 및 DTC177 입자의 분석형 초원심분리 트레이스는 Alu 요소가 결실된 구축물이 더 높은 백분률의 전체 입자를 생산하였다는 것을 입증하였다 (도 8A-8B 참조). 도 8A는 HEK293 세포에서 생산된 DTC161 벡터 제제로부터의 입자 밀도의 분석형 초원심분리 트레이스를 나타내는 그래프이다. 도 8B는 HEK293 세포에서 생산된 DTC177 벡터 (서열식별번호: 1로 표시됨) 제제로부터의 입자 밀도의 분석형 초원심분리 트레이스를 나타내는 그래프이다.
이들 데이터는 Alu 서열은 결여된 벡터에서 개선된 패키징이 발생함을 나타낸다.
실시예 4 - GPE에서 Alu 요소의 결실은 프로모터 효력에 영향을 미치지 않는다
하나 이상의 Alu 요소의 결실이 생체내에서 G6PC 유전자 발현을 지시하는 GPE의 효력에 영향을 미치는지의 여부를 평가하기 위해, 상이한 벡터 (표 2에 표시됨)로부터 유래된 rAAV를 사용하여 HuH7 간 세포를 감염시켰다. 감염 48시간 후, 세포를 용해시키고, 전체 mRNA를 수거하였다. G6PC mRNA 발현은 정량적 RT-PCR로 분석되었다. 도 9A-9B는 DTC161 및 DTC177 (서열식별번호: 1로 표시됨)로부터 유래된 rAAV에 대해 HuH7 간 세포에서 rAAV 용량과 G6PC mRNA 발현 수준 사이의 예시적인 용량 반응 곡선을 나타낸다. 도 9A는 DTC161을 함유하는 rAAV로 감염시킨 후 유도된 G6Pase-α 발현에 대한 용량-반응 곡선이다. 도 9B는 DTC177 (서열식별번호: 1로 표시됨)을 함유하는 rAAV로 감염시킨 후 유도된 G6Pase-α 발현에 대한 용량-반응 곡선이다. 시험 샘플의 상대적 효력을 계산하기 위해, 참조 표준 (개발 배치-생산된 DTC161 벡터에서 유래된 rAAV) 및 시험 샘플 모두에 대한 각각의 감염 다중도 (MOI)에서 RNA 값 (총 RNA의 μg당 게놈 카피)을 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 파일 템플릿에 추가하였다. 템플릿은 데이터의 로그-로그 변환 및 곡선이 공유 기울기를 갖도록 제한된 선형 맞춤을 사용한다. Y 축은 RNA 값에 해당하고, X 축은 샘플의 MOI에 해당한다. 그래프패드 프리즘 템플릿에 의해 생성된 Y 절편 및 기울기 데이터는 사용하여 하기 수학식을 구현하여 참조 표준 및 시험 샘플의 X 절편을 결정하였다: X 절편 = (0-[Y 절편])/기울기. 최종 상대적 효력 값은 하기 수학식을 활용하여 X 절편을 비교함으로써 결정된다: 10^{[X 절편 참조]-[X 절편 샘플].
<표 2>
Figure pct00002
이 결과는 GPE에서 하나 이상의 Alu 요소의 결실 (DTC175, DTC177 및 DTC178 벡터)이 생체내에서 G6PC 유전자 발현을 유도하는 GPE의 효력을 손상시키지 않는다는 것을 시사한다.
본원에서 구체적으로 언급된 모든 공개문, 특허 및 문헌은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
본 발명은 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 재료 및 시약이 다양할 수 있기 때문에 이들로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며 첨부된 청구범위에 의해 포괄될 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 참조 사항을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 또한, 용어 "하나", "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "포함하다", "포함하는", "함유하는", 및 "갖는"도 상호 교환적으로 사용될 수 있다는 것에 주목해야 한다.
더 이상의 설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기반하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 믿어진다. 따라서, 특정 실시양태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하지 않는다.
본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본원에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 동등하거나, 유사한 목적을 제공하는 대체 특징으로 대체될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ULTRAGENYX PHARMACEUTICAL INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING GLYCOGEN STORAGE DISEASES <130> DIM-010WO <150> 62/781,380 <151> 2018-12-18 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: DTC177: ITR to ITR <400> 1 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctccttt gagaatccac ggtgtctcga tgcagtcagc 180 tttctaacaa gctggggcct cacctgtttt cccacggata aaaacgtgct ggaggaagca 240 gaaaggggct ggcaggtgga aagatgagga ccagctcatc gtctcatgac tatgaggttg 300 ctctgatcca gagggtcccc ctgcctggtg gcccaccgcc aggaagactc ccactgtccc 360 tggatgccca gagtgggatg tcaactccat cacttatcaa ctccttatcc ataggggtat 420 tcttcctgag gcgtctcaga aaacagggcc ctccccatat gctgaccaca taatagaacc 480 cctcccaact cagagaccct ggctgctagc tgccctggca tgacccagac agtggccttt 540 gtatatgttt ttagactcac cttgactcac ctctgaccat agaaactctc atcccagagg 600 tcactgcaat agttactcca caacagaggc ttatctgggt agagggaggc tccctaccta 660 tggcccagca gccctgacag tgcagatcac atatacccca cgccccagca ctgcctgcca 720 cgcatgggct tactttacac ccacccacag tcaccaacac attacctgct ctccaaggtt 780 aggcgtggca ggagaagttt gcttggacca gcagaaacca tgcagtcaag gacaactgga 840 gtcagcatgg gctgggtgcg agcccttggt ggggtgggga ggagactcca ggtcatacct 900 cctggaggat gttttaatca tttccagcat ggaatgctgt caacttttgc cacagattca 960 ttagctctga gtttcttttt tctgtcccca gctacccctt acatgtcaat atggacttaa 1020 tgatgggaaa ttcaggcaag tttttaaaca ttttattccc cctggctctt atcctcaaaa 1080 aatgcatgag ttcgttacct gattcattcc ctggttcctt tcacagtcct ccgtgaccca 1140 agtgttaggg ttttggtctc tctactattt gtaggctgat atatagtata cacacacaca 1200 cacacacaca tatacacaca cacagtgtat cttgagcttt cttttgtata tctacacaca 1260 tatgtataag aaagctcaag atatagaagc cctttttcaa aaataactga aagtttcaaa 1320 ctctttaagt ctccagttac cattttgctg gtattcttat ttggaaccat acattcatca 1380 tattgttgca cagtaagact atacattcat tattttgctt aaacgtatga gttaaaacac 1440 tttaaggtca ttaaatgaat taatcactgc attcaaaaac gattactttc tggccctaag 1500 agacatgagg ccaataccag gaagggggtt gatctcccaa accagaggca gaccctagac 1560 tctaatacag ttaaggaaag accagcaaga tgatagtccc caatacaata gaactttact 1620 aattttaaaa ttaagaactt aaaacttgaa tagctagagc accaagattt ttctttgtcc 1680 ccaaataagt gcagttgcag gcatagaaaa tctgacatct ttgcaagaat catcgtggat 1740 gtagactctg tcctgtgtct ctggcctggt ttcggggacc aggagggcag acccttgcac 1800 tgccaagaag catgccaaag ttaatcattg gccctgctga gtacatggcc gatcaggctg 1860 tttttgtgtg cctgtttttc tattttacgt aaatcaccct gaacatgttt gcatcaacct 1920 actggtgatg cacctttgat caatacattt tagacaaacg tggtttttga gtccaaagat 1980 cagggctggg ttgacctgaa tactggatac agggcatata aaacaggggc aaggcacaga 2040 ctcatagcag agcaatcacc accaagcctg gaataactgc aagggctctg ctgacatctt 2100 cctgaggtgc caaggaaatg aggtctagag aagctttatt gcggtagttt atcacagtta 2160 aattgctaac gcagtcagtg cttctgacac aacagtctcg aacttaagct gcagtgactc 2220 tcttaaggta gccttgcaga agttggtcgt gaggcactgg gcaggtaagt atcaaggtta 2280 caagacaggt ttaaggagac caatagaaac tgggcttgtc gagacagaga agactcttgc 2340 gtttctgata ggcacctatt ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg 2400 tccactccca gttcaattac agctcttaag gccctgcagg ccaccatgga agagggcatg 2460 aacgtgctgc acgacttcgg catccagagc acccactatc tgcaggtcaa ctaccaggac 2520 agccaggact ggttcatcct ggtgtccgtg atcgccgacc tgcggaacgc cttctacgtg 2580 ctgttcccca tctggttcca tctgcaagaa gccgtcggca tcaagctgct gtgggtggcc 2640 gtgatcggcg attggctgaa cctggtgttc aagtggatcc tgttcggcca gcggccctat 2700 tggtgggtgc tggacaccga ctactacagc aacaccagcg tgcccctgat caagcagttc 2760 cccgtgacct gcgagacagg ccctggctct ccttctggcc acgccatggg aacagccggc 2820 gtgtactacg tgatggtcac cagcaccctg agcatcttcc agggcaagat caagcccacc 2880 taccggttcc ggtgcctgaa cgtgatcctg tggctgggct tctgggccgt gcagctgaac 2940 gtgtgcctga gccggatcta cctggccgcc cacttcccac atcaagtggt ggccggcgtg 3000 ctgagcggaa tcgccgtggc cgagacattc agccacatcc acagcatcta caacgccagc 3060 ctgaagaagt acttcctgat cacattcttt ctgttcagct tcgccatcgg cttctacctg 3120 ctgctgaagg gcctgggcgt ggacctgctg tggaccctgg aaaaggccca gcggtggtgc 3180 gagcagcccg agtgggtgca catcgacacc acccccttcg ccagcctgct gaagaacctg 3240 ggcaccctgt ttggactggg cctggccctg aacagcagca tgtacagaga gagctgcaag 3300 ggcaagctga gcaagtggct gcccttccgg ctgagcagca tcgtggccag cctggtgctg 3360 ctgcacgtgt tcgacagcct gaagcccccc agccaggtgg aactggtgtt ttacgtgctg 3420 agcttctgca agagcgccgt ggtgcccctg gcctccgtgt ctgtgatccc ctactgcctg 3480 gctcaggtgc tgggccagcc ccacaagaag tccctctgag cgctctaggc ggccgcgcgg 3540 atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 3600 aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 3660 gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg 3720 tgtgggaggt tttttagagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 3780 tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 3840 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aa 3882 <210> 2 <211> 3882 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of artificial sequence: DTC177wt: Replacement of coG6PC sequence with wildtype coding sequence <400> 2 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcctccttt gagaatccac ggtgtctcga tgcagtcagc 180 tttctaacaa gctggggcct cacctgtttt cccacggata aaaacgtgct ggaggaagca 240 gaaaggggct ggcaggtgga aagatgagga ccagctcatc gtctcatgac tatgaggttg 300 ctctgatcca gagggtcccc ctgcctggtg gcccaccgcc aggaagactc ccactgtccc 360 tggatgccca gagtgggatg tcaactccat cacttatcaa ctccttatcc ataggggtat 420 tcttcctgag gcgtctcaga aaacagggcc ctccccatat gctgaccaca taatagaacc 480 cctcccaact cagagaccct ggctgctagc tgccctggca tgacccagac agtggccttt 540 gtatatgttt ttagactcac cttgactcac ctctgaccat agaaactctc atcccagagg 600 tcactgcaat agttactcca caacagaggc ttatctgggt agagggaggc tccctaccta 660 tggcccagca gccctgacag tgcagatcac atatacccca cgccccagca ctgcctgcca 720 cgcatgggct tactttacac ccacccacag tcaccaacac attacctgct ctccaaggtt 780 aggcgtggca ggagaagttt gcttggacca gcagaaacca tgcagtcaag gacaactgga 840 gtcagcatgg gctgggtgcg agcccttggt ggggtgggga ggagactcca ggtcatacct 900 cctggaggat gttttaatca tttccagcat ggaatgctgt caacttttgc cacagattca 960 ttagctctga gtttcttttt tctgtcccca gctacccctt acatgtcaat atggacttaa 1020 tgatgggaaa ttcaggcaag tttttaaaca ttttattccc cctggctctt atcctcaaaa 1080 aatgcatgag ttcgttacct gattcattcc ctggttcctt tcacagtcct ccgtgaccca 1140 agtgttaggg ttttggtctc tctactattt gtaggctgat atatagtata cacacacaca 1200 cacacacaca tatacacaca cacagtgtat cttgagcttt cttttgtata tctacacaca 1260 tatgtataag aaagctcaag atatagaagc cctttttcaa aaataactga aagtttcaaa 1320 ctctttaagt ctccagttac cattttgctg gtattcttat ttggaaccat acattcatca 1380 tattgttgca cagtaagact atacattcat tattttgctt aaacgtatga gttaaaacac 1440 tttaaggtca ttaaatgaat taatcactgc attcaaaaac gattactttc tggccctaag 1500 agacatgagg ccaataccag gaagggggtt gatctcccaa accagaggca gaccctagac 1560 tctaatacag ttaaggaaag accagcaaga tgatagtccc caatacaata gaactttact 1620 aattttaaaa ttaagaactt aaaacttgaa tagctagagc accaagattt ttctttgtcc 1680 ccaaataagt gcagttgcag gcatagaaaa tctgacatct ttgcaagaat catcgtggat 1740 gtagactctg tcctgtgtct ctggcctggt ttcggggacc aggagggcag acccttgcac 1800 tgccaagaag catgccaaag ttaatcattg gccctgctga gtacatggcc gatcaggctg 1860 tttttgtgtg cctgtttttc tattttacgt aaatcaccct gaacatgttt gcatcaacct 1920 actggtgatg cacctttgat caatacattt tagacaaacg tggtttttga gtccaaagat 1980 cagggctggg ttgacctgaa tactggatac agggcatata aaacaggggc aaggcacaga 2040 ctcatagcag agcaatcacc accaagcctg gaataactgc aagggctctg ctgacatctt 2100 cctgaggtgc caaggaaatg aggtctagag aagctttatt gcggtagttt atcacagtta 2160 aattgctaac gcagtcagtg cttctgacac aacagtctcg aacttaagct gcagtgactc 2220 tcttaaggta gccttgcaga agttggtcgt gaggcactgg gcaggtaagt atcaaggtta 2280 caagacaggt ttaaggagac caatagaaac tgggcttgtc gagacagaga agactcttgc 2340 gtttctgata ggcacctatt ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg 2400 tccactccca gttcaattac agctcttaag gccctgcagg ccaccatgga ggaaggaatg 2460 aatgttctcc atgactttgg gatccagtca acacattacc tccaggtgaa ttaccaagac 2520 tcccaggact ggttcatctt ggtgtccgtg atcgcagacc tcaggaatgc cttctacgtc 2580 ctcttcccca tctggttcca tcttcaggaa gctgtgggca ttaaactcct ttgggtagct 2640 gtgattggag actggctcaa cctcgtcttt aagtggattc tctttggaca gcgtccatac 2700 tggtgggttt tggatactga ctactacagc aacacttccg tgcccctgat aaagcagttc 2760 cctgtaacct gtgagactgg accagggagc ccctctggcc atgccatggg cacagcaggt 2820 gtatactacg tgatggtcac atctactctt tccatctttc agggaaagat aaagccgacc 2880 tacagatttc ggtgcttgaa tgtcattttg tggttgggat tctgggctgt gcagctgaat 2940 gtctgtctgt cacgaatcta ccttgctgct cattttcctc atcaagttgt tgctggagtc 3000 ctgtcaggca ttgctgttgc agaaactttc agccacatcc acagcatcta taatgccagc 3060 ctcaagaaat attttctcat taccttcttc ctgttcagct tcgccatcgg attttatctg 3120 ctgctcaagg gactgggtgt agacctcctg tggactctgg agaaagccca gaggtggtgc 3180 gagcagccag aatgggtcca cattgacacc acaccctttg ccagcctcct caagaacctg 3240 ggcacgctct ttggcctggg gctggctctc aactccagca tgtacaggga gagctgcaag 3300 gggaaactca gcaagtggct cccattccgc ctcagctcta ttgtagcctc cctcgtcctc 3360 ctgcacgtct ttgactcctt gaaaccccca tcccaagtcg agctggtctt ctacgtcttg 3420 tccttctgca agagtgcggt agtgcccctg gcatccgtca gtgtcatccc ctactgcctc 3480 gcccaggtcc tgggccagcc gcacaagaag tcgttgtaag cgctctaggc ggccgcgcgg 3540 atccagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 3600 aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 3660 gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg 3720 tgtgggaggt tttttagagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 3780 tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 3840 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aa 3882 <210> 3 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Codon-optimized G6PC coding sequence <400> 3 atggaagagg gcatgaacgt gctgcacgac ttcggcatcc agagcaccca ctatctgcag 60 gtcaactacc aggacagcca ggactggttc atcctggtgt ccgtgatcgc cgacctgcgg 120 aacgccttct acgtgctgtt ccccatctgg ttccatctgc aagaagccgt cggcatcaag 180 ctgctgtggg tggccgtgat cggcgattgg ctgaacctgg tgttcaagtg gatcctgttc 240 ggccagcggc cctattggtg ggtgctggac accgactact acagcaacac cagcgtgccc 300 ctgatcaagc agttccccgt gacctgcgag acaggccctg gctctccttc tggccacgcc 360 atgggaacag ccggcgtgta ctacgtgatg gtcaccagca ccctgagcat cttccagggc 420 aagatcaagc ccacctaccg gttccggtgc ctgaacgtga tcctgtggct gggcttctgg 480 gccgtgcagc tgaacgtgtg cctgagccgg atctacctgg ccgcccactt cccacatcaa 540 gtggtggccg gcgtgctgag cggaatcgcc gtggccgaga cattcagcca catccacagc 600 atctacaacg ccagcctgaa gaagtacttc ctgatcacat tctttctgtt cagcttcgcc 660 atcggcttct acctgctgct gaagggcctg ggcgtggacc tgctgtggac cctggaaaag 720 gcccagcggt ggtgcgagca gcccgagtgg gtgcacatcg acaccacccc cttcgccagc 780 ctgctgaaga acctgggcac cctgtttgga ctgggcctgg ccctgaacag cagcatgtac 840 agagagagct gcaagggcaa gctgagcaag tggctgccct tccggctgag cagcatcgtg 900 gccagcctgg tgctgctgca cgtgttcgac agcctgaagc cccccagcca ggtggaactg 960 gtgttttacg tgctgagctt ctgcaagagc gccgtggtgc ccctggcctc cgtgtctgtg 1020 atcccctact gcctggctca ggtgctgggc cagccccaca agaagtccct ctga 1074 <210> 4 <211> 1074 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggaggaag gaatgaatgt tctccatgac tttgggatcc agtcaacaca ttacctccag 60 gtgaattacc aagactccca ggactggttc atcttggtgt ccgtgatcgc agacctcagg 120 aatgccttct acgtcctctt ccccatctgg ttccatcttc aggaagctgt gggcattaaa 180 ctcctttggg tagctgtgat tggagactgg ctcaacctcg tctttaagtg gattctcttt 240 ggacagcgtc catactggtg ggttttggat actgactact acagcaacac ttccgtgccc 300 ctgataaagc agttccctgt aacctgtgag actggaccag ggagcccctc tggccatgcc 360 atgggcacag caggtgtata ctacgtgatg gtcacatcta ctctttccat ctttcaggga 420 aagataaagc cgacctacag atttcggtgc ttgaatgtca ttttgtggtt gggattctgg 480 gctgtgcagc tgaatgtctg tctgtcacga atctaccttg ctgctcattt tcctcatcaa 540 gttgttgctg gagtcctgtc aggcattgct gttgcagaaa ctttcagcca catccacagc 600 atctataatg ccagcctcaa gaaatatttt ctcattacct tcttcctgtt cagcttcgcc 660 atcggatttt atctgctgct caagggactg ggtgtagacc tcctgtggac tctggagaaa 720 gcccagaggt ggtgcgagca gccagaatgg gtccacattg acaccacacc ctttgccagc 780 ctcctcaaga acctgggcac gctctttggc ctggggctgg ctctcaactc cagcatgtac 840 agggagagct gcaaggggaa actcagcaag tggctcccat tccgcctcag ctctattgta 900 gcctccctcg tcctcctgca cgtctttgac tccttgaaac ccccatccca agtcgagctg 960 gtcttctacg tcttgtcctt ctgcaagagt gcggtagtgc ccctggcatc cgtcagtgtc 1020 atcccctact gcctcgccca ggtcctgggc cagccgcaca agaagtcgtt gtaa 1074 <210> 5 <211> 357 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Glu Glu Gly Met Asn Val Leu His Asp Phe Gly Ile Gln Ser Thr 1 5 10 15 His Tyr Leu Gln Val Asn Tyr Gln Asp Ser Gln Asp Trp Phe Ile Leu 20 25 30 Val Ser Val Ile Ala Asp Leu Arg Asn Ala Phe Tyr Val Leu Phe Pro 35 40 45 Ile Trp Phe His Leu Gln Glu Ala Val Gly Ile Lys Leu Leu Trp Val 50 55 60 Ala Val Ile Gly Asp Trp Leu Asn Leu Val Phe Lys Trp Ile Leu Phe 65 70 75 80 Gly Gln Arg Pro Tyr Trp Trp Val Leu Asp Thr Asp Tyr Tyr Ser Asn 85 90 95 Thr Ser Val Pro Leu Ile Lys Gln Phe Pro Val Thr Cys Glu Thr Gly 100 105 110 Pro Gly Ser Pro Ser Gly His Ala Met Gly Thr Ala Gly Val Tyr Tyr 115 120 125 Val Met Val Thr Ser Thr Leu Ser Ile Phe Gln Gly Lys Ile Lys Pro 130 135 140 Thr Tyr Arg Phe Arg Cys Leu Asn Val Ile Leu Trp Leu Gly Phe Trp 145 150 155 160 Ala Val Gln Leu Asn Val Cys Leu Ser Arg Ile Tyr Leu Ala Ala His 165 170 175 Phe Pro His Gln Val Val Ala Gly Val Leu Ser Gly Ile Ala Val Ala 180 185 190 Glu Thr Phe Ser His Ile His Ser Ile Tyr Asn Ala Ser Leu Lys Lys 195 200 205 Tyr Phe Leu Ile Thr Phe Phe Leu Phe Ser Phe Ala Ile Gly Phe Tyr 210 215 220 Leu Leu Leu Lys Gly Leu Gly Val Asp Leu Leu Trp Thr Leu Glu Lys 225 230 235 240 Ala Gln Arg Trp Cys Glu Gln Pro Glu Trp Val His Ile Asp Thr Thr 245 250 255 Pro Phe Ala Ser Leu Leu Lys Asn Leu Gly Thr Leu Phe Gly Leu Gly 260 265 270 Leu Ala Leu Asn Ser Ser Met Tyr Arg Glu Ser Cys Lys Gly Lys Leu 275 280 285 Ser Lys Trp Leu Pro Phe Arg Leu Ser Ser Ile Val Ala Ser Leu Val 290 295 300 Leu Leu His Val Phe Asp Ser Leu Lys Pro Pro Ser Gln Val Glu Leu 305 310 315 320 Val Phe Tyr Val Leu Ser Phe Cys Lys Ser Ala Val Val Pro Leu Ala 325 330 335 Ser Val Ser Val Ile Pro Tyr Cys Leu Ala Gln Val Leu Gly Gln Pro 340 345 350 His Lys Lys Ser Leu 355 <210> 6 <211> 2864 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cctttgagaa tccacggtgt ctcgatgcag tcagctttct aacaagctgg ggcctcacct 60 gttttcccac ggataaaaac gtgctggagg aagcagaaag gggctggcag gtggaaagat 120 gaggaccagc tcatcgtctc atgactatga ggttgctctg atccagaggg tccccctgcc 180 tggtggccca ccgccaggaa gactcccact gtccctggat gcccagagtg ggatgtcaac 240 tccatcactt atcaactcct tatccatagg ggtattcttc ctgaggcgtc tcagaaaaca 300 gggccctccc catatgctga ccacataata gaacccctcc caactcagag accctggctg 360 ctagctgccc tggcatgacc cagacagtgg cctttgtata tgtttttaga ctcaccttga 420 ctcacctctg accatagaaa ctctcatccc agaggtcact gcaatagtta ctccacaaca 480 gaggcttatc tgggtagagg gaggctccct acctatggcc cagcagccct gacagtgcag 540 atcacatata ccccacgccc cagcactgcc tgccacgcat gggcttactt tacacccacc 600 cacagtcacc aacacattac ctgctctcca aggttaggcg tggcaggaga agtttgcttg 660 gaccagcaga aaccatgcag tcaaggacaa ctggagtcag catgggctgg gtgcgagccc 720 ttggtggggt ggggaggaga ctccaggtca tacctcctgg aggatgtttt aatcatttcc 780 agcatggaat gctgtcaact tttgccacag attcattagc tctgagtttc ttttttctgt 840 ccccagctac cccttacatg tcaatatgga cttaatgatg ggaaattcag gcaagttttt 900 aaacatttta ttccccctgg ctcttatcct caaaaaatgc atgaatttgg aggcagtggc 960 tcatgcctgt aatcccaatg ctttgctagg ttgaggcggg aggatcactt gaagccagga 1020 atttgagacc agcctgggcc gcatagtgag accccgtttc tacaaaaata aataaataaa 1080 taataaataa tagtgatatg aagcatgatt aaatagccct attttttaaa atgcatgagt 1140 tcgttacctg attcattccc tggttccttt cacagtcctc cgtgacccaa gtgttagggt 1200 tttggtctct ctactatttg taggctgata tatagtatac acacacacac acacacacat 1260 atacacacac acagtgtatc ttgagctttc ttttgtatat ctacacacat atgtataaga 1320 aagctcaaga tatagaagcc ctttttcaaa aataactgaa agtttcaaac tctttaagtc 1380 tccagttacc attttgctgg tattcttatt tggaaccata cattcatcat attgttgcac 1440 agtaagacta tacattcatt attttgctta aacgtatgag ttaaaacact tggccaggca 1500 tggtggttca cacctgtaat cccagagctt tgggaagcca agactggcag atctcttgag 1560 ctcaggaatt caagaccagc ctgggcaaca tggaaaaacc ccatctctac aaaagataga 1620 aaaattagcc aggcatggtg gcgtgtgcct gtggtcccag ctactcagga ggctgaggtg 1680 ggaggatcac attagcccag gaggttgagg ctgcagtgag ccgtgattat gccactgcac 1740 tccagcctgg gagacagagt gagaccctgt ttcaaaaaaa agagagagaa aatttaaaaa 1800 agaaaacaac accaagggct gtaactttaa ggtcattaaa tgaattaatc actgcattca 1860 aaaacgatta ctttctggcc ctaagagaca tgaggccaat accaggaagg gggttgatct 1920 cccaaaccag aggcagaccc tagactctaa tacagttaag gaaagaccag caagatgata 1980 gtccccaata caatagaagt tactatattt tatttgttgt ttttcttttg ttttgttttg 2040 ttttgttttg ttttgtttta gagactgggg tcttgctcga ttgcccaggc tgtagtgcag 2100 cggtgggaca atagctcact gcagactcca actcctgggc tcaagcaatc ctcctgcctc 2160 agcctcctga atagctggga ctacaagggt acaccatcac acacaccaaa acaatttttt 2220 aaatttttgt gtagaaacga gggtcttgct ttgttgccca ggctggtctc caactcctgg 2280 cttcaaggga tcctcccacc tcagcctccc aaattgctgg gattacaggt gtgagccacc 2340 acaaccagcc agaactttac taattttaaa attaagaact taaaacttga atagctagag 2400 caccaagatt tttctttgtc cccaaataag tgcagttgca ggcatagaaa atctgacatc 2460 tttgcaagaa tcatcgtgga tgtagactct gtcctgtgtc tctggcctgg tttcggggac 2520 caggagggca gacccttgca ctgccaagaa gcatgccaaa gttaatcatt ggccctgctg 2580 agtacatggc cgatcaggct gtttttgtgt gcctgttttt ctattttacg taaatcaccc 2640 tgaacatgtt tgcatcaacc tactggtgat gcacctttga tcaatacatt ttagacaaac 2700 gtggtttttg agtccaaaga tcagggctgg gttgacctga atactggata cagggcatat 2760 aaaacagggg caaggcacag actcatagca gagcaatcac caccaagcct ggaataactg 2820 caagggctct gctgacatct tcctgaggtg ccaaggaaat gagg 2864 <210> 7 <211> 2670 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: wildtype GPE but lacking Alu - 1 <400> 7 cctttgagaa tccacggtgt ctcgatgcag tcagctttct aacaagctgg ggcctcacct 60 gttttcccac ggataaaaac gtgctggagg aagcagaaag gggctggcag gtggaaagat 120 gaggaccagc tcatcgtctc atgactatga ggttgctctg atccagaggg tccccctgcc 180 tggtggccca ccgccaggaa gactcccact gtccctggat gcccagagtg ggatgtcaac 240 tccatcactt atcaactcct tatccatagg ggtattcttc ctgaggcgtc tcagaaaaca 300 gggccctccc catatgctga ccacataata gaacccctcc caactcagag accctggctg 360 ctagctgccc tggcatgacc cagacagtgg cctttgtata tgtttttaga ctcaccttga 420 ctcacctctg accatagaaa ctctcatccc agaggtcact gcaatagtta ctccacaaca 480 gaggcttatc tgggtagagg gaggctccct acctatggcc cagcagccct gacagtgcag 540 atcacatata ccccacgccc cagcactgcc tgccacgcat gggcttactt tacacccacc 600 cacagtcacc aacacattac ctgctctcca aggttaggcg tggcaggaga agtttgcttg 660 gaccagcaga aaccatgcag tcaaggacaa ctggagtcag catgggctgg gtgcgagccc 720 ttggtggggt ggggaggaga ctccaggtca tacctcctgg aggatgtttt aatcatttcc 780 agcatggaat gctgtcaact tttgccacag attcattagc tctgagtttc ttttttctgt 840 ccccagctac cccttacatg tcaatatgga cttaatgatg ggaaattcag gcaagttttt 900 aaacatttta ttccccctgg ctcttatcct caaaaaatgc atgagttcgt tacctgattc 960 attccctggt tcctttcaca gtcctccgtg acccaagtgt tagggttttg gtctctctac 1020 tatttgtagg ctgatatata gtatacacac acacacacac acacatatac acacacacag 1080 tgtatcttga gctttctttt gtatatctac acacatatgt ataagaaagc tcaagatata 1140 gaagcccttt ttcaaaaata actgaaagtt tcaaactctt taagtctcca gttaccattt 1200 tgctggtatt cttatttgga accatacatt catcatattg ttgcacagta agactataca 1260 ttcattattt tgcttaaacg tatgagttaa aacacttggc caggcatggt ggttcacacc 1320 tgtaatccca gagctttggg aagccaagac tggcagatct cttgagctca ggaattcaag 1380 accagcctgg gcaacatgga aaaaccccat ctctacaaaa gatagaaaaa ttagccaggc 1440 atggtggcgt gtgcctgtgg tcccagctac tcaggaggct gaggtgggag gatcacatta 1500 gcccaggagg ttgaggctgc agtgagccgt gattatgcca ctgcactcca gcctgggaga 1560 cagagtgaga ccctgtttca aaaaaaagag agagaaaatt taaaaaagaa aacaacacca 1620 agggctgtaa ctttaaggtc attaaatgaa ttaatcactg cattcaaaaa cgattacttt 1680 ctggccctaa gagacatgag gccaatacca ggaagggggt tgatctccca aaccagaggc 1740 agaccctaga ctctaataca gttaaggaaa gaccagcaag atgatagtcc ccaatacaat 1800 agaagttact atattttatt tgttgttttt cttttgtttt gttttgtttt gttttgtttt 1860 gttttagaga ctggggtctt gctcgattgc ccaggctgta gtgcagcggt gggacaatag 1920 ctcactgcag actccaactc ctgggctcaa gcaatcctcc tgcctcagcc tcctgaatag 1980 ctgggactac aagggtacac catcacacac accaaaacaa ttttttaaat ttttgtgtag 2040 aaacgagggt cttgctttgt tgcccaggct ggtctccaac tcctggcttc aagggatcct 2100 cccacctcag cctcccaaat tgctgggatt acaggtgtga gccaccacaa ccagccagaa 2160 ctttactaat tttaaaatta agaacttaaa acttgaatag ctagagcacc aagatttttc 2220 tttgtcccca aataagtgca gttgcaggca tagaaaatct gacatctttg caagaatcat 2280 cgtggatgta gactctgtcc tgtgtctctg gcctggtttc ggggaccagg agggcagacc 2340 cttgcactgc caagaagcat gccaaagtta atcattggcc ctgctgagta catggccgat 2400 caggctgttt ttgtgtgcct gtttttctat tttacgtaaa tcaccctgaa catgtttgca 2460 tcaacctact ggtgatgcac ctttgatcaa tacattttag acaaacgtgg tttttgagtc 2520 caaagatcag ggctgggttg acctgaatac tggatacagg gcatataaaa caggggcaag 2580 gcacagactc atagcagagc aatcaccacc aagcctggaa taactgcaag ggctctgctg 2640 acatcttcct gaggtgccaa ggaaatgagg 2670 <210> 8 <211> 2528 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: wildtype GPE but lacking Alu - 2 <400> 8 cctttgagaa tccacggtgt ctcgatgcag tcagctttct aacaagctgg ggcctcacct 60 gttttcccac ggataaaaac gtgctggagg aagcagaaag gggctggcag gtggaaagat 120 gaggaccagc tcatcgtctc atgactatga ggttgctctg atccagaggg tccccctgcc 180 tggtggccca ccgccaggaa gactcccact gtccctggat gcccagagtg ggatgtcaac 240 tccatcactt atcaactcct tatccatagg ggtattcttc ctgaggcgtc tcagaaaaca 300 gggccctccc catatgctga ccacataata gaacccctcc caactcagag accctggctg 360 ctagctgccc tggcatgacc cagacagtgg cctttgtata tgtttttaga ctcaccttga 420 ctcacctctg accatagaaa ctctcatccc agaggtcact gcaatagtta ctccacaaca 480 gaggcttatc tgggtagagg gaggctccct acctatggcc cagcagccct gacagtgcag 540 atcacatata ccccacgccc cagcactgcc tgccacgcat gggcttactt tacacccacc 600 cacagtcacc aacacattac ctgctctcca aggttaggcg tggcaggaga agtttgcttg 660 gaccagcaga aaccatgcag tcaaggacaa ctggagtcag catgggctgg gtgcgagccc 720 ttggtggggt ggggaggaga ctccaggtca tacctcctgg aggatgtttt aatcatttcc 780 agcatggaat gctgtcaact tttgccacag attcattagc tctgagtttc ttttttctgt 840 ccccagctac cccttacatg tcaatatgga cttaatgatg ggaaattcag gcaagttttt 900 aaacatttta ttccccctgg ctcttatcct caaaaaatgc atgaatttgg aggcagtggc 960 tcatgcctgt aatcccaatg ctttgctagg ttgaggcggg aggatcactt gaagccagga 1020 atttgagacc agcctgggcc gcatagtgag accccgtttc tacaaaaata aataaataaa 1080 taataaataa tagtgatatg aagcatgatt aaatagccct attttttaaa atgcatgagt 1140 tcgttacctg attcattccc tggttccttt cacagtcctc cgtgacccaa gtgttagggt 1200 tttggtctct ctactatttg taggctgata tatagtatac acacacacac acacacacat 1260 atacacacac acagtgtatc ttgagctttc ttttgtatat ctacacacat atgtataaga 1320 aagctcaaga tatagaagcc ctttttcaaa aataactgaa agtttcaaac tctttaagtc 1380 tccagttacc attttgctgg tattcttatt tggaaccata cattcatcat attgttgcac 1440 agtaagacta tacattcatt attttgctta aacgtatgag ttaaaacact ttaaggtcat 1500 taaatgaatt aatcactgca ttcaaaaacg attactttct ggccctaaga gacatgaggc 1560 caataccagg aagggggttg atctcccaaa ccagaggcag accctagact ctaatacagt 1620 taaggaaaga ccagcaagat gatagtcccc aatacaatag aagttactat attttatttg 1680 ttgtttttct tttgttttgt tttgttttgt tttgttttgt tttagagact ggggtcttgc 1740 tcgattgccc aggctgtagt gcagcggtgg gacaatagct cactgcagac tccaactcct 1800 gggctcaagc aatcctcctg cctcagcctc ctgaatagct gggactacaa gggtacacca 1860 tcacacacac caaaacaatt ttttaaattt ttgtgtagaa acgagggtct tgctttgttg 1920 cccaggctgg tctccaactc ctggcttcaa gggatcctcc cacctcagcc tcccaaattg 1980 ctgggattac aggtgtgagc caccacaacc agccagaact ttactaattt taaaattaag 2040 aacttaaaac ttgaatagct agagcaccaa gatttttctt tgtccccaaa taagtgcagt 2100 tgcaggcata gaaaatctga catctttgca agaatcatcg tggatgtaga ctctgtcctg 2160 tgtctctggc ctggtttcgg ggaccaggag ggcagaccct tgcactgcca agaagcatgc 2220 caaagttaat cattggccct gctgagtaca tggccgatca ggctgttttt gtgtgcctgt 2280 ttttctattt tacgtaaatc accctgaaca tgtttgcatc aacctactgg tgatgcacct 2340 ttgatcaata cattttagac aaacgtggtt tttgagtcca aagatcaggg ctgggttgac 2400 ctgaatactg gatacagggc atataaaaca ggggcaaggc acagactcat agcagagcaa 2460 tcaccaccaa gcctggaata actgcaaggg ctctgctgac atcttcctga ggtgccaagg 2520 aaatgagg 2528 <210> 9 <211> 2508 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: wildtype GPE but lacking Alu - 3 <400> 9 cctttgagaa tccacggtgt ctcgatgcag tcagctttct aacaagctgg ggcctcacct 60 gttttcccac ggataaaaac gtgctggagg aagcagaaag gggctggcag gtggaaagat 120 gaggaccagc tcatcgtctc atgactatga ggttgctctg atccagaggg tccccctgcc 180 tggtggccca ccgccaggaa gactcccact gtccctggat gcccagagtg ggatgtcaac 240 tccatcactt atcaactcct tatccatagg ggtattcttc ctgaggcgtc tcagaaaaca 300 gggccctccc catatgctga ccacataata gaacccctcc caactcagag accctggctg 360 ctagctgccc tggcatgacc cagacagtgg cctttgtata tgtttttaga ctcaccttga 420 ctcacctctg accatagaaa ctctcatccc agaggtcact gcaatagtta ctccacaaca 480 gaggcttatc tgggtagagg gaggctccct acctatggcc cagcagccct gacagtgcag 540 atcacatata ccccacgccc cagcactgcc tgccacgcat gggcttactt tacacccacc 600 cacagtcacc aacacattac ctgctctcca aggttaggcg tggcaggaga agtttgcttg 660 gaccagcaga aaccatgcag tcaaggacaa ctggagtcag catgggctgg gtgcgagccc 720 ttggtggggt ggggaggaga ctccaggtca tacctcctgg aggatgtttt aatcatttcc 780 agcatggaat gctgtcaact tttgccacag attcattagc tctgagtttc ttttttctgt 840 ccccagctac cccttacatg tcaatatgga cttaatgatg ggaaattcag gcaagttttt 900 aaacatttta ttccccctgg ctcttatcct caaaaaatgc atgaatttgg aggcagtggc 960 tcatgcctgt aatcccaatg ctttgctagg ttgaggcggg aggatcactt gaagccagga 1020 atttgagacc agcctgggcc gcatagtgag accccgtttc tacaaaaata aataaataaa 1080 taataaataa tagtgatatg aagcatgatt aaatagccct attttttaaa atgcatgagt 1140 tcgttacctg attcattccc tggttccttt cacagtcctc cgtgacccaa gtgttagggt 1200 tttggtctct ctactatttg taggctgata tatagtatac acacacacac acacacacat 1260 atacacacac acagtgtatc ttgagctttc ttttgtatat ctacacacat atgtataaga 1320 aagctcaaga tatagaagcc ctttttcaaa aataactgaa agtttcaaac tctttaagtc 1380 tccagttacc attttgctgg tattcttatt tggaaccata cattcatcat attgttgcac 1440 agtaagacta tacattcatt attttgctta aacgtatgag ttaaaacact tggccaggca 1500 tggtggttca cacctgtaat cccagagctt tgggaagcca agactggcag atctcttgag 1560 ctcaggaatt caagaccagc ctgggcaaca tggaaaaacc ccatctctac aaaagataga 1620 aaaattagcc aggcatggtg gcgtgtgcct gtggtcccag ctactcagga ggctgaggtg 1680 ggaggatcac attagcccag gaggttgagg ctgcagtgag ccgtgattat gccactgcac 1740 tccagcctgg gagacagagt gagaccctgt ttcaaaaaaa agagagagaa aatttaaaaa 1800 agaaaacaac accaagggct gtaactttaa ggtcattaaa tgaattaatc actgcattca 1860 aaaacgatta ctttctggcc ctaagagaca tgaggccaat accaggaagg gggttgatct 1920 cccaaaccag aggcagaccc tagactctaa tacagttaag gaaagaccag caagatgata 1980 gtccccaata caatagaact ttactaattt taaaattaag aacttaaaac ttgaatagct 2040 agagcaccaa gatttttctt tgtccccaaa taagtgcagt tgcaggcata gaaaatctga 2100 catctttgca agaatcatcg tggatgtaga ctctgtcctg tgtctctggc ctggtttcgg 2160 ggaccaggag ggcagaccct tgcactgcca agaagcatgc caaagttaat cattggccct 2220 gctgagtaca tggccgatca ggctgttttt gtgtgcctgt ttttctattt tacgtaaatc 2280 accctgaaca tgtttgcatc aacctactgg tgatgcacct ttgatcaata cattttagac 2340 aaacgtggtt tttgagtcca aagatcaggg ctgggttgac ctgaatactg gatacagggc 2400 atataaaaca ggggcaaggc acagactcat agcagagcaa tcaccaccaa gcctggaata 2460 actgcaaggg ctctgctgac atcttcctga ggtgccaagg aaatgagg 2508 <210> 10 <211> 2334 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: wildtype GPE, but lacking Alu - 1 and Alu - 2 <400> 10 cctttgagaa tccacggtgt ctcgatgcag tcagctttct aacaagctgg ggcctcacct 60 gttttcccac ggataaaaac gtgctggagg aagcagaaag gggctggcag gtggaaagat 120 gaggaccagc tcatcgtctc atgactatga ggttgctctg atccagaggg tccccctgcc 180 tggtggccca ccgccaggaa gactcccact gtccctggat gcccagagtg ggatgtcaac 240 tccatcactt atcaactcct tatccatagg ggtattcttc ctgaggcgtc tcagaaaaca 300 gggccctccc catatgctga ccacataata gaacccctcc caactcagag accctggctg 360 ctagctgccc tggcatgacc cagacagtgg cctttgtata tgtttttaga ctcaccttga 420 ctcacctctg accatagaaa ctctcatccc agaggtcact gcaatagtta ctccacaaca 480 gaggcttatc tgggtagagg gaggctccct acctatggcc cagcagccct gacagtgcag 540 atcacatata ccccacgccc cagcactgcc tgccacgcat gggcttactt tacacccacc 600 cacagtcacc aacacattac ctgctctcca aggttaggcg tggcaggaga agtttgcttg 660 gaccagcaga aaccatgcag tcaaggacaa ctggagtcag catgggctgg gtgcgagccc 720 ttggtggggt ggggaggaga ctccaggtca tacctcctgg aggatgtttt aatcatttcc 780 agcatggaat gctgtcaact tttgccacag attcattagc tctgagtttc ttttttctgt 840 ccccagctac cccttacatg tcaatatgga cttaatgatg ggaaattcag gcaagttttt 900 aaacatttta ttccccctgg ctcttatcct caaaaaatgc atgagttcgt tacctgattc 960 attccctggt tcctttcaca gtcctccgtg acccaagtgt tagggttttg gtctctctac 1020 tatttgtagg ctgatatata gtatacacac acacacacac acacatatac acacacacag 1080 tgtatcttga gctttctttt gtatatctac acacatatgt ataagaaagc tcaagatata 1140 gaagcccttt ttcaaaaata actgaaagtt tcaaactctt taagtctcca gttaccattt 1200 tgctggtatt cttatttgga accatacatt catcatattg ttgcacagta agactataca 1260 ttcattattt tgcttaaacg tatgagttaa aacactttaa ggtcattaaa tgaattaatc 1320 actgcattca aaaacgatta ctttctggcc ctaagagaca tgaggccaat accaggaagg 1380 gggttgatct cccaaaccag aggcagaccc tagactctaa tacagttaag gaaagaccag 1440 caagatgata gtccccaata caatagaagt tactatattt tatttgttgt ttttcttttg 1500 ttttgttttg ttttgttttg ttttgtttta gagactgggg tcttgctcga ttgcccaggc 1560 tgtagtgcag cggtgggaca atagctcact gcagactcca actcctgggc tcaagcaatc 1620 ctcctgcctc agcctcctga atagctggga ctacaagggt acaccatcac acacaccaaa 1680 acaatttttt aaatttttgt gtagaaacga gggtcttgct ttgttgccca ggctggtctc 1740 caactcctgg cttcaaggga tcctcccacc tcagcctccc aaattgctgg gattacaggt 1800 gtgagccacc acaaccagcc agaactttac taattttaaa attaagaact taaaacttga 1860 atagctagag caccaagatt tttctttgtc cccaaataag tgcagttgca ggcatagaaa 1920 atctgacatc tttgcaagaa tcatcgtgga tgtagactct gtcctgtgtc tctggcctgg 1980 tttcggggac caggagggca gacccttgca ctgccaagaa gcatgccaaa gttaatcatt 2040 ggccctgctg agtacatggc cgatcaggct gtttttgtgt gcctgttttt ctattttacg 2100 taaatcaccc tgaacatgtt tgcatcaacc tactggtgat gcacctttga tcaatacatt 2160 ttagacaaac gtggtttttg agtccaaaga tcagggctgg gttgacctga atactggata 2220 cagggcatat aaaacagggg caaggcacag actcatagca gagcaatcac caccaagcct 2280 ggaataactg caagggctct gctgacatct tcctgaggtg ccaaggaaat gagg 2334 <210> 11 <211> 2172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: wildtype GPE, but lacking Alu - 2 and Alu - 3 <400> 11 cctttgagaa tccacggtgt ctcgatgcag tcagctttct aacaagctgg ggcctcacct 60 gttttcccac ggataaaaac gtgctggagg aagcagaaag gggctggcag gtggaaagat 120 gaggaccagc tcatcgtctc atgactatga ggttgctctg atccagaggg tccccctgcc 180 tggtggccca ccgccaggaa gactcccact gtccctggat gcccagagtg ggatgtcaac 240 tccatcactt atcaactcct tatccatagg ggtattcttc ctgaggcgtc tcagaaaaca 300 gggccctccc catatgctga ccacataata gaacccctcc caactcagag accctggctg 360 ctagctgccc tggcatgacc cagacagtgg cctttgtata tgtttttaga ctcaccttga 420 ctcacctctg accatagaaa ctctcatccc agaggtcact gcaatagtta ctccacaaca 480 gaggcttatc tgggtagagg gaggctccct acctatggcc cagcagccct gacagtgcag 540 atcacatata ccccacgccc cagcactgcc tgccacgcat gggcttactt tacacccacc 600 cacagtcacc aacacattac ctgctctcca aggttaggcg tggcaggaga agtttgcttg 660 gaccagcaga aaccatgcag tcaaggacaa ctggagtcag catgggctgg gtgcgagccc 720 ttggtggggt ggggaggaga ctccaggtca tacctcctgg aggatgtttt aatcatttcc 780 agcatggaat gctgtcaact tttgccacag attcattagc tctgagtttc ttttttctgt 840 ccccagctac cccttacatg tcaatatgga cttaatgatg ggaaattcag gcaagttttt 900 aaacatttta ttccccctgg ctcttatcct caaaaaatgc atgaatttgg aggcagtggc 960 tcatgcctgt aatcccaatg ctttgctagg ttgaggcggg aggatcactt gaagccagga 1020 atttgagacc agcctgggcc gcatagtgag accccgtttc tacaaaaata aataaataaa 1080 taataaataa tagtgatatg aagcatgatt aaatagccct attttttaaa atgcatgagt 1140 tcgttacctg attcattccc tggttccttt cacagtcctc cgtgacccaa gtgttagggt 1200 tttggtctct ctactatttg taggctgata tatagtatac acacacacac acacacacat 1260 atacacacac acagtgtatc ttgagctttc ttttgtatat ctacacacat atgtataaga 1320 aagctcaaga tatagaagcc ctttttcaaa aataactgaa agtttcaaac tctttaagtc 1380 tccagttacc attttgctgg tattcttatt tggaaccata cattcatcat attgttgcac 1440 agtaagacta tacattcatt attttgctta aacgtatgag ttaaaacact ttaaggtcat 1500 taaatgaatt aatcactgca ttcaaaaacg attactttct ggccctaaga gacatgaggc 1560 caataccagg aagggggttg atctcccaaa ccagaggcag accctagact ctaatacagt 1620 taaggaaaga ccagcaagat gatagtcccc aatacaatag aactttacta attttaaaat 1680 taagaactta aaacttgaat agctagagca ccaagatttt tctttgtccc caaataagtg 1740 cagttgcagg catagaaaat ctgacatctt tgcaagaatc atcgtggatg tagactctgt 1800 cctgtgtctc tggcctggtt tcggggacca ggagggcaga cccttgcact gccaagaagc 1860 atgccaaagt taatcattgg ccctgctgag tacatggccg atcaggctgt ttttgtgtgc 1920 ctgtttttct attttacgta aatcaccctg aacatgtttg catcaaccta ctggtgatgc 1980 acctttgatc aatacatttt agacaaacgt ggtttttgag tccaaagatc agggctgggt 2040 tgacctgaat actggataca gggcatataa aacaggggca aggcacagac tcatagcaga 2100 gcaatcacca ccaagcctgg aataactgca agggctctgc tgacatcttc ctgaggtgcc 2160 aaggaaatga gg 2172 <210> 12 <211> 2314 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: wildtype GPE, but lacking Alu - 1 and Alu - 3 <400> 12 cctttgagaa tccacggtgt ctcgatgcag tcagctttct aacaagctgg ggcctcacct 60 gttttcccac ggataaaaac gtgctggagg aagcagaaag gggctggcag gtggaaagat 120 gaggaccagc tcatcgtctc atgactatga ggttgctctg atccagaggg tccccctgcc 180 tggtggccca ccgccaggaa gactcccact gtccctggat gcccagagtg ggatgtcaac 240 tccatcactt atcaactcct tatccatagg ggtattcttc ctgaggcgtc tcagaaaaca 300 gggccctccc catatgctga ccacataata gaacccctcc caactcagag accctggctg 360 ctagctgccc tggcatgacc cagacagtgg cctttgtata tgtttttaga ctcaccttga 420 ctcacctctg accatagaaa ctctcatccc agaggtcact gcaatagtta ctccacaaca 480 gaggcttatc tgggtagagg gaggctccct acctatggcc cagcagccct gacagtgcag 540 atcacatata ccccacgccc cagcactgcc tgccacgcat gggcttactt tacacccacc 600 cacagtcacc aacacattac ctgctctcca aggttaggcg tggcaggaga agtttgcttg 660 gaccagcaga aaccatgcag tcaaggacaa ctggagtcag catgggctgg gtgcgagccc 720 ttggtggggt ggggaggaga ctccaggtca tacctcctgg aggatgtttt aatcatttcc 780 agcatggaat gctgtcaact tttgccacag attcattagc tctgagtttc ttttttctgt 840 ccccagctac cccttacatg tcaatatgga cttaatgatg ggaaattcag gcaagttttt 900 aaacatttta ttccccctgg ctcttatcct caaaaaatgc atgagttcgt tacctgattc 960 attccctggt tcctttcaca gtcctccgtg acccaagtgt tagggttttg gtctctctac 1020 tatttgtagg ctgatatata gtatacacac acacacacac acacatatac acacacacag 1080 tgtatcttga gctttctttt gtatatctac acacatatgt ataagaaagc tcaagatata 1140 gaagcccttt ttcaaaaata actgaaagtt tcaaactctt taagtctcca gttaccattt 1200 tgctggtatt cttatttgga accatacatt catcatattg ttgcacagta agactataca 1260 ttcattattt tgcttaaacg tatgagttaa aacacttggc caggcatggt ggttcacacc 1320 tgtaatccca gagctttggg aagccaagac tggcagatct cttgagctca ggaattcaag 1380 accagcctgg gcaacatgga aaaaccccat ctctacaaaa gatagaaaaa ttagccaggc 1440 atggtggcgt gtgcctgtgg tcccagctac tcaggaggct gaggtgggag gatcacatta 1500 gcccaggagg ttgaggctgc agtgagccgt gattatgcca ctgcactcca gcctgggaga 1560 cagagtgaga ccctgtttca aaaaaaagag agagaaaatt taaaaaagaa aacaacacca 1620 agggctgtaa ctttaaggtc attaaatgaa ttaatcactg cattcaaaaa cgattacttt 1680 ctggccctaa gagacatgag gccaatacca ggaagggggt tgatctccca aaccagaggc 1740 agaccctaga ctctaataca gttaaggaaa gaccagcaag atgatagtcc ccaatacaat 1800 agaactttac taattttaaa attaagaact taaaacttga atagctagag caccaagatt 1860 tttctttgtc cccaaataag tgcagttgca ggcatagaaa atctgacatc tttgcaagaa 1920 tcatcgtgga tgtagactct gtcctgtgtc tctggcctgg tttcggggac caggagggca 1980 gacccttgca ctgccaagaa gcatgccaaa gttaatcatt ggccctgctg agtacatggc 2040 cgatcaggct gtttttgtgt gcctgttttt ctattttacg taaatcaccc tgaacatgtt 2100 tgcatcaacc tactggtgat gcacctttga tcaatacatt ttagacaaac gtggtttttg 2160 agtccaaaga tcagggctgg gttgacctga atactggata cagggcatat aaaacagggg 2220 caaggcacag actcatagca gagcaatcac caccaagcct ggaataactg caagggctct 2280 gctgacatct tcctgaggtg ccaaggaaat gagg 2314 <210> 13 <211> 301 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Intron <400> 13 agctttattg cggtagttta tcacagttaa attgctaacg cagtcagtgc ttctgacaca 60 acagtctcga acttaagctg cagtgactct cttaaggtag ccttgcagaa gttggtcgtg 120 aggcactggg caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc aatagaaact 180 gggcttgtcg agacagagaa gactcttgcg tttctgatag gcacctattg gtcttactga 240 catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag ttcaattaca gctcttaagg 300 c 301 <210> 14 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: SV40 polyA tail <400> 14 ggccgctatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 60 taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 120 ggaggttttt taggcat 137 <210> 15 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: AAV2 ITR <400> 15 ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60 cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120 gccaactcca tcactagggg ttcct 145

Claims (41)

  1. Alu 요소와 적어도 80% 동일한 하나 이상의 서열이 결여된 변형된 G6PC 프로모터/인핸서 (GPE) 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, Alu 요소가 서열식별번호: 6의 인접 뉴클레오티드 1079-1272 (Alu-1), 1633-1968 (Alu-2) 및 2140-2495 (Alu-3)로부터 선택되는 것인 재조합 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 GPE가 서열식별번호: 1의 인접 뉴클레오티드 146-2123과 80% 동일하거나 또는 서열식별번호: 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 중 어느 하나와 80% 동일한 서열을 갖는 것인 재조합 핵산 분자.
  4. G6Pase-α 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 변형된 G6PC 프로모터/인핸서 (GPE) 서열 및 G6Pase-α 코딩 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 변형된 GPE가 서열식별번호: 6의 인접 뉴클레오티드 1079-1272 (Alu-1), 1633-1968 (Alu-2), 및 2140-2495 (Alu-3)로부터 선택되는 Alu 요소와 적어도 80% 동일한 하나 이상의 서열이 결여되는 것인 재조합 핵산 분자.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 변형된 GPE가 서열식별번호: 1의 인접 뉴클레오티드 146-2123과 80% 동일하거나 또는 서열식별번호: 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 중 어느 하나와 90% 동일한 서열을 갖는 것인 재조합 핵산 분자.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, G6Pase-α 코딩 서열이 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 동일한 서열을 포함하는 것인 재조합 핵산 분자.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 (폴리A) 신호 서열을 추가로 포함하는 재조합 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, 폴리아데닐화 신호 서열이 SV40 폴리A 신호 서열인 재조합 핵산 분자.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인트론을 추가로 포함하는 재조합 핵산 분자.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2를 포함하는 재조합 핵산 분자.
  12. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
  14. 제13항에 있어서, AAV 벡터가 AAV 혈청형 8 (AAV8) 벡터인 벡터.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 재조합 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  17. 제13항 또는 제14항의 재조합 벡터를 진핵 숙주 세포 배양물에 전달하는 단계 및 진핵 세포 배양물로부터 rAAV를 수거하는 단계를 포함하는, rAAV 수율을 증가시키는 방법.
  18. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 재조합 AAV (rAAV).
  19. 제18항에 있어서, rAAV8인 rAAV.
  20. 제18항 또는 제19항의 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 또는 그의 조성물의 치료 유효량을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 글리코겐 저장 질환 유형 Ia (GSD-Ia)를 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, rAAV가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, rAAV가 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, rAAV가 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1013 GC/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV를 투여하는 것이 단일 용량의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  26. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV를 투여하는 것이 다중 용량의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  27. AAV 캡시드 및 이에 패키징된,
    (a) AAV 5' 역위 말단 반복부 서열 (ITR) 서열;
    (b) 서열식별번호: 1의 인접 뉴클레오티드 146-2123을 포함하는 프로모터/인핸서 서열;
    (c) 글루코스-6-포스파타제 알파 (G6Pase-α)를 코딩하는 코딩 서열; 및
    (d) AAV 3' ITR
    을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는, GSD-Ia를 치료하기 위한 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV).
  28. 제27항에 있어서, G6Pase-α가 서열식별번호: 5와 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 rAAV.
  29. 제27항에 있어서, G6Pase-α의 아미노산 서열이 서열식별번호: 5와 동일한 것인 rAAV.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 코딩 서열이 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 4와 적어도 90% 동일한 것인 rAAV.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 캡시드가 AAV8 캡시드인 rAAV.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 폴리아데닐화 (폴리A) 신호 서열을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
  33. 제32항에 있어서, 폴리아데닐화 신호 서열이 SV40 폴리A 신호 서열인 rAAV.
  34. 제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 게놈이 인트론을 추가로 포함하는 것인 rAAV.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항의 rAAV 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  36. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 rAAV 또는 제35항에 따른 그의 조성물의 치료 유효량을 인간 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 글리코겐 저장 질환 유형 Ia (GSD-Ia)를 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, rAAV가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, rAAV가 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1014 게놈 카피 (GC)/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, rAAV가 약 1 x 1012 내지 약 1 x 1013 GC/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV를 투여하는 것이 단일 용량의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  41. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV를 투여하는 것이 다중 용량의 rAAV를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
KR1020217022096A 2018-12-18 2019-12-18 글리코겐 저장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 KR20210105390A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862781380P 2018-12-18 2018-12-18
US62/781,380 2018-12-18
PCT/US2019/067247 WO2020132115A1 (en) 2018-12-18 2019-12-18 Methods and compositions for treating glycogen storage diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210105390A true KR20210105390A (ko) 2021-08-26

Family

ID=69400618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217022096A KR20210105390A (ko) 2018-12-18 2019-12-18 글리코겐 저장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20220017922A1 (ko)
EP (1) EP3898981B1 (ko)
JP (1) JP7486274B2 (ko)
KR (1) KR20210105390A (ko)
CN (1) CN113454226A (ko)
AU (1) AU2019405758A1 (ko)
BR (1) BR112021012104A2 (ko)
CA (1) CA3123841A1 (ko)
DK (1) DK3898981T5 (ko)
ES (1) ES2969222T3 (ko)
IL (1) IL283956A (ko)
MX (1) MX2021007379A (ko)
PL (1) PL3898981T3 (ko)
PT (1) PT3898981T (ko)
WO (1) WO2020132115A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023069891A1 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 University Of Connecticut Compositions and methods for the treatment of glycogen storage disorders

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6759050B1 (en) 1998-12-03 2004-07-06 Avigen, Inc. Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith
JP2002191363A (ja) * 1999-07-29 2002-07-09 Herikkusu Kenkyusho:Kk 全長ｃＤＮＡ合成用プライマー、およびその用途
ATE490307T1 (de) 2003-05-21 2010-12-15 Genzyme Corp Verfahren zur herstellung von präparationen rekombinanter aav-virionen, die weitgehend frei von leeren capsiden sind
CA2713338C (en) 2008-01-29 2021-10-26 Applied Genetic Technologies Corporation Recombinant virus production using mammalian cells in suspension
US8679837B2 (en) 2009-04-02 2014-03-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Inducible system for highly efficient production of recombinant Adeno-associated virus (rAAV) vectors
AU2011209743B2 (en) 2010-01-28 2016-03-10 The Children's Hospital Of Philadelphia A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy
US9873893B2 (en) * 2013-02-15 2018-01-23 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Methods and compositions for treating genetically linked diseases of the eye
JP6649265B2 (ja) 2013-11-26 2020-02-19 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 糖原病の処置のためのアデノ随伴ウイルスベクター
JP6824169B2 (ja) * 2014-12-23 2021-02-03 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 改変ｇ６ｐｃをコードするアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用
HUE061100T2 (hu) 2016-03-28 2023-05-28 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Adenovírus hõinaktiválásának módszerei
EP3574104A1 (en) * 2017-01-30 2019-12-04 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant virus vectors for the treatment of glycogen storage disease

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020132115A8 (en) 2021-05-14
AU2019405758A2 (en) 2022-05-12
US20220017922A1 (en) 2022-01-20
EP3898981B1 (en) 2023-10-18
DK3898981T3 (da) 2024-01-22
MX2021007379A (es) 2021-07-15
WO2020132115A1 (en) 2020-06-25
BR112021012104A2 (pt) 2021-09-08
EP3898981A1 (en) 2021-10-27
CA3123841A1 (en) 2020-06-25
AU2019405758A1 (en) 2021-07-01
PL3898981T3 (pl) 2024-04-02
PT3898981T (pt) 2023-12-28
JP2022514271A (ja) 2022-02-10
DK3898981T5 (da) 2024-08-05
ES2969222T3 (es) 2024-05-17
JP7486274B2 (ja) 2024-05-17
CN113454226A (zh) 2021-09-28
IL283956A (en) 2021-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI848038B (zh) 用於治療威爾森氏症之基因療法構築體
JP2020096642A (ja) 減少した免疫反応性を有するａａｖビリオン、およびその使用
KR20210132684A (ko) 비에띠 결정 이상증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
CN112225793B (zh) 一种溶酶体靶向肽及其融合蛋白、携带融合蛋白编码序列的腺相关病毒载体及其应用
CN112955557A (zh) 用于治疗丙酸血症的基因疗法
CA3193833A1 (en) Compositions and methods for treatment of fabry disease
CN113508130A (zh) 用于治疗达农病的基因治疗载体
CN115151648A (zh) 用于治疗cdkl5缺陷障碍的基因疗法
CN113755524B (zh) 用于治疗脊髓性肌萎缩的腺相关病毒载体及其用途
WO2022235614A2 (en) Novel aav vectors and methods and uses thereof
KR20210105390A (ko) 글리코겐 저장 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물
RU2807158C2 (ru) Генотерапевтические конструкции для лечения болезни вильсона
US20220389450A1 (en) Vector system
CN114507692A (zh) 用于治疗法布里病的腺相关病毒载体及其用途
KR20230019062A (ko) 연령-관련 황반 변성 및 다른 안구 질환 및 장애의 치료를 위한 아데노-연관 바이러스 (aav) 벡터
WO2023102518A1 (en) Gnao1 gene therapy vectors and uses thereof
WO2023102517A1 (en) Compositions and methods for treatment of fabry disease
CN117836420A (zh) 重组tert编码病毒基因组和运载体
CN115836128A (zh) 用于基因疗法的编码葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase-a)的载体