BR112021012104A2 - Métodos e composições para o tratamento de doenças de armazenamento de glicogênio - Google Patents

Métodos e composições para o tratamento de doenças de armazenamento de glicogênio Download PDF

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Abstract

métodos e composições para o tratamento de doenças de armazenamento de glicogênio. essa invenção fornece vários novos vetores de vírus adenoassociado (aav) para aplicações de terapia gênica no tratamento de doença de armazenamento de glicogênio tipo-ia (gsd-ia). são reveladas nesse relatório descritivo diversas moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, vetores e aav recombinante que incorporam uma sequência promotora/intensificadora de g6pc modificada. a utilização da sequência promotora/intensificadora de g6pc modificada resulta em rendimento e qualidade de aav aumentados quando expressa por várias plataformas de células hospedeiras. também são fornecidas nesse relatório descritivo composições que compreendem o novo aav da invenção e métodos de tratamento de gsd-ia que o utilizam.

Description

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE ARMAZENAMENTO DE GLICOGÊNIO REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
[001]Esse pedido reivindica o benefício e prioridade para o Pedido de Patente U.S. Provisório Nº 62/781.380, depositado em 18 de dezembro de 2018, cuja revelação é incorporada por referência nesse relatório descritivo em sua totalidade para todas as finalidades.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002]O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é pelo presente incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia em ASCII, criada em 16 de dezembro de 2019, é denominada DIM-010WO_SL_ST25.txt e tem 42.290 bytes de tamanho.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[003]Esse pedido está relacionado de forma geral aos vetores virais e, mais particularmente, vetores virais adenoassociados, para o tratamento de doenças de armazenamento de glicogênio como, por exemplo, doença de armazenamento de glicogênio tipo-Ia.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004]A doença de armazenamento de glicogênio tipo-Ia (também conhecida como GSD-Ia ou doença de von Gierke) é um distúrbio herdado causado pelo acúmulo de glicogênio nas células do corpo. O acúmulo de glicogênio em certos órgãos e tecidos, especialmente no fígado, rins e intestinos delgados, prejudica sua habilidade para funcionar normalmente. GSD-Ia tipicamente se manifesta durante o primeiro ano de vida com hipoglicemia severa e hepatomegalia causadas pelo acúmulo de glicogênio. Os indivíduos afetados exibem retardo do crescimento, puberdade retardada, acidemia lática, hiperlipidemia, hiperuricemia e, em adultos, uma incidência elevada de adenomas hepáticos. Veja Lei e cols., 1993, Science 262: 580-3.
[005]GSD-Ia é uma doença genética órfã rara, causada pela deficiência de glicose-6-fosfatase-alfa ativa (G6Pase- α), uma enzima crucial envolvida na manutenção da homeostasia de glicose. G6Pase-α, codificada pelo gene G6PC, catalisa a hidrólise de glicose-6-fosfato (G6P) em glicose e fosfato na etapa final de glicogenólise e gliconeogênese. Mais de 80 mutações responsáveis pela deficiência de G6Pase-α e pelo desenvolvimento associado de GSD-Ia foram identificadas até hoje. Veja Chou e cols., 2010, Nat. Rev. Endocrinol. 6 (12): 676-88.
[006]Atualmente não há cura para a GSD-Ia e a suplementação dietética é o padrão de cuidado atual para os pacientes. Quando seguidas rigorosamente, as estratégias dietéticas tipicamente permitem o crescimento e desenvolvimento da puberdade normais; no entanto, a terapia dietética não consegue evitar completamente a ocorrência de hiperlipidemia, hiperuricemia, acidemia lática e o acúmulo de gordura hepática. Veja Rake e cols., 2002, Eur. J. Pediatr. 161 Suplemento 1: S20-34.
[007]Foram exploradas abordagens de terapia gênica com o uso de vírus adenoassociados recombinantes (AAV) que carregam G6Pase-α para o gerenciamento de GSD-Ia. Veja, por exemplo, a Patente U.S. Nº 9.644.216 e a Publicação de Patente U.S. Nº 2017/0362670. No entanto, para usar vetores de AAV para terapia gênica humana, o desenvolvimento de processos de produção robustos, confiáveis e escalonáveis para os vetores é crucial. Os presentes inventores descobriram que a modificação da região promotora/intensificadora do gene G6PC para remover certas sequências, descritas nesse relatório descritivo como “elementos Alu”, aumenta dramaticamente o rendimento e qualidade de rAAV quando expressas por várias plataformas de células hospedeiras.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[008]Essa invenção fornece métodos e composições para o tratamento de doenças de armazenamento de glicogênio. Mais especificamente, são fornecidas nesse relatório descritivo moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, vetores de vírus adenoassociado (AAV) e vírus adenoassociado recombinante (rAAV) que podem ser usados em aplicações de terapia gênica para o tratamento de GSD-Ia.
[009]Em um aspecto, o pedido está relacionado a uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende uma sequência promotora/intensificadora (GPE) de G6PC modificada, em que o GPE modificado é desprovido de uma ou mais sequências pelo menos 80% idênticas a um elemento Alu. Em algumas modalidades, o elemento Alu é selecionado dos nucleotídeos contíguos 1079 - 1272 (Alu - 1), 1633 - 1968 (Alu - 2) e 2140 - 2495 (Alu - 3) do ID. DE SEQ. Nº: 6. Em algumas modalidades, o GPE modificado possui uma sequência 80% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) idêntica aos nucleotídeos contíguos 146-2123 do ID. DE SEQ. Nº: 1, ou 80% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
[0010]Em outro aspecto, o pedido está relacionado a uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende uma sequência promotora/intensificadora (GPE) de G6PC modificada descrita nesse relatório descritivo e uma sequência codificadora de G6Pase-α, em que o GPE modificado é capaz de dirigir a expressão da sequência codificadora de G6Pase-α. Em algumas modalidades, a sequência codificadora de G6Pase- α compreende uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 3 ou ID. DE SEQ. Nº: 4. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante ainda compreende uma sequência sinalizadora de poliadenilação (poliA), por exemplo, uma sequência sinalizadora de poliA de SV40 (ID. DE SEQ. Nº: 14). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante ainda compreende um íntron (ID. DE SEQ. Nº: 13). Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico recombinante compreende o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou o ID. DE SEQ. Nº: 2.
[0011]Em outro aspecto, o pedido está relacionado a um vetor recombinante que compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante descrita nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de vírus adenoassociado (AAV), por exemplo, um vetor de AAV do sorotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou rh10 (ou seja, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 ou rh10). Em uma modalidade exemplar, o vetor de AAV é um vetor de AAV do sorotipo 8 (AAV8). São ainda fornecidas células hospedeiras que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vetor recombinante revelado nesse relatório descritivo. Em modalidades específicas, as células hospedeiras podem ser adequadas para a propagação de AAV.
[0012]Em outro aspecto, o pedido está relacionado a um método de aumento do rendimento de rAAV, e o método compreende a liberação de um vetor de AAV descrito nesse relatório descritivo a uma cultura de célula hospedeira e a colheita do rAAV da cultura de células. Em algumas modalidades, a cultura de célula hospedeira é uma cultura de célula hospedeira eucariótica.
[0013]Também é fornecido nesse relatório descritivo um rAAV que compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vetor de AAV revelado nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o pedido está relacionado a um rAAV para o tratamento de GSD-Ia, e um rAAV que compreende um capsídeo de AAV, e um genoma de vetor de AAV nele empacotado, o referido genoma de vetor de AAV compreende uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) 5’ de AAV; uma sequência de GPE modificada revelada nesse relatório descritivo; uma sequência codificadora que codifica uma glicose-6-fosfatase alfa (G6Pase-α), ou um fragmento ativo ou variante desta; e uma sequência ITR 3’ de AAV. Em algumas modalidades exemplares, o capsídeo de AAV é um capsídeo de AAV8. Em algumas modalidades, o genoma do vetor inclui a sequência ITR 5’ e 3’ idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 15. Em algumas modalidades, o genoma do vetor inclui o GPE modificado que compreende os nucleotídeos contíguos 146- 2123 do ID. DE SEQ. Nº: 1. Em algumas modalidades, o genoma do vetor ainda compreende uma sequência sinalizadora de poliadenilação (poliA), por exemplo, uma sequência sinalizadora de poliA de SV40 (ID. DE SEQ. Nº: 14). Em algumas modalidades, o genoma do vetor ainda compreende um íntron (ID. DE SEQ. Nº: 13). Em algumas modalidades, G6Pase- α compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 5. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de G6Pase-α compreende o ID. DE SEQ. Nº: 5. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de G6Pase-α consiste no ID. DE SEQ. Nº: 5. Em algumas modalidades, a sequência codificadora de G6Pase-α é pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 3 ou ID. DE SEQ. Nº: 4. Em algumas modalidades exemplares, o genoma do vetor compreende uma sequência de ácidos nucleicos idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1 ou 2.
[0014]O pedido ainda está relacionado às composições farmacêuticas que compreendem um rAAV da invenção. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal ou intravenosa. Em uma modalidade exemplar, a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa.
[0015]Ainda em outro aspecto adicional, o pedido está relacionado aos métodos de tratamento de doença de armazenamento de glicogênio tipo-Ia (GSD-Ia) em um indivíduo humano que compreende a administração ao indivíduo humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um rAAV revelado nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado por via subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal ou intravenosa. Em uma modalidade exemplar, o rAAV é administrado por via intravenosa. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1011 até cerca de 1 x 1014 cópias do genoma (GC)/kg. Em modalidades adicionais, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1012 até cerca de 1 x 1013 cópias do genoma (GC)/kg. Em algumas modalidades, uma dose única de rAAV é administrada. Em outras modalidades, múltiplas doses de rAAV são administradas.
[0016]Esses e outros aspectos e características da invenção são descritos nas seções seguintes do pedido.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0017]A invenção pode ser mais completamente compreendida com referência aos desenhos seguintes.
[0018]A Figura 1A é uma representação esquemática do cassete de expressão de G6PC ligado por duas repetições terminais invertidas de AAV2 (ITRs, ID. DE SEQ. Nº: 15) e que compreende um GPE, um íntron, um gene G6PC humano códon- otimizado (hG6PCco), e uma cauda poliA tardia de SV40. Abreviações usadas: GPE- REGIÃO PROMOTORA/INTENSIFICADORA de G6Pase; hG6PCco- região codificadora de glicose-6-fosfatase humana (códon-otimizada); ITR- repetição terminal invertida; SV40L pA- sinal de poliadenilação tardio de SV40; UTR- região não traduzida. A Figura 1B é uma ilustração de cassetes de expressão de G6PC que contêm o GPE do tipo selvagem (DTC161) ou modificada (DTC175 que compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE com uma deleção das sequências de Alu - 1 e Alu - 2, DTC176 que compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE no qual todos os três elementos Alu estão presentes, mas as orientações das sequências de Alu - 1 e Alu - 2 estão invertidas, DTC177 que compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um
GPE com uma deleção das sequências de Alu - 1, Alu - 2 e Alu - 3, DTC178 que compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE com uma deleção da sequência de Alu - 3, e DTC179 que compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE no qual todos os três elementos Alu estão presentes, mas a orientação da sequência de Alu - 3 está invertida).
[0019]A Figura 2 é uma representação esquemática de um vetor de AAV exemplar (DTC161), com vários componentes cruciais nela mostrados. As características do vetor são fornecidas abaixo: Tipo Início Final Descrição Região 1 145 Repetição terminal invertida (ITR) Região 146 3.009 Promotor/intensificador de G6PC (GPE) Região 3.010 3.331 íntron quimérico Gene 3.332 4.405 cDNA códon-otimizado de hG6PC Região 4.426 4.623 Sinal de poliadenilação tardio de SV40 Região 4.624 4.768 Repetição terminal invertida (ITR).
[0020]Figura 3 é uma representação esquemática do plasmídeo Rep/Cap de AAV pAAV2-8.KanR (p2123-FH), que fornece a função Rep e Cap no empacotamento de rAAV quando cotransfectado com vetores de AAV em células hospedeiras.
[0021]A Figura 4 é uma representação esquemática do plasmídeo auxiliar (helper) de adenovírus pAdDeltaF6(Kan)
para produção de rAAV quando cotransfectado com vetores de AAV e plasmídeos Rep/Cap em células hospedeiras.
[0022]A Figura 5 é um gráfico de barras que mostra titulações de rAAV produzidas por células hospedeiras após transfecção de vários vetores de AAV. Três testes foram realizados sob cada condição, e os desvios-padrão foram mostrados. * indica P<0,05 em comparação com DTC161.
[0023]A Figura 6 é um gráfico que mostra titulações de rAAV produzidas plotadas em função do tamanho do genoma do vetor.
[0024]A Figura 7 é uma imagem de um gel de agarose, que mostra bandas de DNA liberado, que avalia degradação do capsídeo e habilidade para liberar DNA empacotado, quando o DNA de comprimento total isolado de rAAVs de um vetor viral de controle, DTC161, DTC175, DTC176, DTC177, DTC178 e DTC179 é submetido a uma eletroforese em gel de agarose. Os DNAs virais de comprimento total estão entre 3,8 kb - 5 kb. ‘*’ representa degradação do capsídeo e genoma intacto de DNA de comprimento total isolado do vetor viral de controle mediante tratamento com dodecil sulfato de sódio (SDS).
[0025]A Figura 8A é um gráfico que mostra traçados analíticos de ultracentrífuga de densidades de partícula da preparação de vetor DTC161 produzido em células HEK293. A Figura 8B é um gráfico que mostra traçados analíticos de ultracentrífuga de densidades de partícula da preparação de um vetor DTC177 (representado pelo ID. DE SEQ. Nº: 1) produzido em células HEK293. Abreviações usadas: RI- índice de refração.
[0026]A Figura 9A é uma curva de dose-resposta para expressão induzida de G6Pase-α após infecção com rAAV derivado do vetor DTC161. A Figura 9B é uma curva de dose- resposta para expressão induzida de G6Pase-α após infecção com rAAV derivado do vetor DTC177 (representado pelo ID. DE SEQ. Nº: 1). O eixo X indica doses de rAAV usadas para infectar células hepáticas HuH7. O eixo Y indica a expressão de mRNA de G6PC induzida nas células. rAAV derivado de um vetor DTC161 produzido por batelada de desenvolvimento foi usado como um padrão de referência. Abreviações usadas: REF- Padrão de referência; UNK- amostra de teste.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0027]Essa invenção fornece uma gama de novos agentes e composições a serem usados para aplicações terapêuticas. As moléculas e composições dessa invenção podem ser usadas para a melhora, prevenção ou tratamento de doença associada com doença de armazenamento de glicogênio tipo-Ia (GSD-Ia) ou aumento da presença ou função de glicose-6-fosfatase-alfa (G6Pase-α) em um indivíduo.
[0028]Salvo observação em contrário, termos técnicos são usados de acordo com uso convencional. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, “Genes V”, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew e cols. (eds.), “The Encyclopedia of Molecular Biology”, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), “Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference”, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0029]A fim de facilitar a revisão das várias modalidades da revelação, as seguintes explicações de termos específicos são fornecidas:
[0030]Vírus adenoassociado (AAV): Um pequeno vírus, com replicação defeituosa, não envelopado, que infecta humanos e algumas outras espécies de primatas. O AAV não é conhecido por causar doença e provoca uma resposta imune muito leve. Vetores de terapia gênica que utilizam AAV podem infectar células tanto em divisão quanto quiescentes e podem persistir em um estado cromossômico sem integração no genoma da célula hospedeira. Essas características tornam o AAV um vetor viral atrativo para terapia gênica. Há atualmente 12 sorotipos reconhecidos de AAV (AAV1 - 12).
[0031]Administração/administrar: Fornecer ou dar a um indivíduo um agente, por exemplo, um agente terapêutico (por exemplo, um AAV recombinante), por qualquer via eficaz. Vias de administração exemplares incluem, sem limitação, por injeção (por exemplo, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), a via oral, intraductal, sublingual, retal, transdérmica, intranasal, vaginal e por inalação.
[0032]Códon-otimizado: Um ácido nucleico “códon- otimizado” se refere a uma sequência de ácidos nucleicos que foi alterada de modo que os códons são ótimos para expressão em um sistema particular (por exemplo, uma espécie ou grupo de espécies particular). Por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos pode ser otimizada para expressão em células de mamíferos ou em uma espécie mamífera particular (por exemplo, células humanas). A otimização de códons não altera a sequência de aminoácidos da proteína codificada.
[0033]Intensificador: Uma sequência de ácidos nucleicos que aumenta a taxa de transcrição por aumento da atividade de um promotor.
[0034]G6PC: Um gene localizado on cromossomo humano 17q21 que codifica glicose-6-fosfatase-α (G6Pase-α). G6Pase- α é uma proteína hidrofóbica de 357 aminoácidos que possui 9 hélices que a ancoram no retículo endoplasmático (Chou e cols., Nat. Rev. Endocrinol. 6: 676-688, 2010). A proteína G6Pase-α catalisa a hidrólise de glicose 6-fosfato em glicose e fosfato na etapa terminal da gliconeogênese e glicogenólise e é uma enzima crucial na homeostasia de glicose. Mutações no gene G6PC causa a doença de armazenamento de glicogênio tipo-Ia (GSD-Ia), que é um distúrbio metabólico caracterizado por hipoglicemia de jejum severa associada com o acúmulo de glicogênio e gordura no fígado e rins.
[0035]Doença de armazenamento de glicogênio (GSD): Um grupo de doenças que resultam de defeitos no processamento da síntese ou quebra de glicogênio dentro dos músculos, fígado e outros tecidos. A GSD pode ser genética ou adquirida. A GSD genética é causada por qualquer erro inato do metabolismo envolvido nesses processos. Há atualmente 11 doenças de armazenamento de glicogênio reconhecidas (GSD tipo I, II, III, IV, V, VI, VII, IX, XI, XII e XIII). GSD-I consiste em dois distúrbios autossômicos recessivos, GSD-Ia e GSD-Ib (Chou e cols., Nat. Rev. Endocrinol. 6: 676-688, 2010). GSD-Ia resulta de uma deficiência na glicose-6- fosfatase-α. Deficiências no transportador de glicose-6- fosfato (G6PT) são responsáveis por GSD-Ib.
[0036]Doença de armazenamento de glicogênio tipo-Ia (GSD-Ia): Também conhecida como doença de von Gierke, GSD- Ia é a doença de armazenamento de glicogênio mais comum, tendo uma incidência de cerca de 1 em 100.000 nascidos vivos. GSD-Ia é uma doença genética que resulta da deficiência da enzima glicose-6-fosfatase-α (G6Pase-α). A deficiência em G6Pase-α prejudica a habilidade do fígado para produzir glicose livre a partir de glicogênio e da gliconeogênese. Pacientes afetados por GSD-Ia são incapazes de manter homeostasia de glicose e se apresentam com hipoglicemia de jejum, retardo do crescimento, hepatomegalia, nefromegalia, hiperlipidemia, hiperuricemia e acidemia lática (Chou e cols., Nat. Rev. Endocrinol. 6: 676-688, 2010). Atualmente não há cura para GSD-Ia.
[0037]Íntron: Um trecho de DNA dentro de um gene que não contém informação de codificação para uma proteína. Íntrons são removidos antes da tradução de um RNA mensageiro.
[0038]Repetição terminal invertida (ITR): Sequências de ácidos nucleicos assimétricas no genoma de vírus adenoassociados necessárias para replicação eficiente. Sequências ITR estão localizadas em cada extremidade do genoma do DNA de AAV. As ITRs servem como as origens de replicação para a síntese do DNA viral e são necessárias para encapsidação vetor.
[0039]Isolado: Um componente biológico “isolado” (por exemplo, uma molécula de ácido nucleico, proteína, vírus ou célula) foi substancialmente separado ou purificado de outros componentes biológicos na célula ou tecido do organismo, ou do próprio organismo, no qual o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outro DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos, proteínas e células. Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram “isolados” são aqueles purificados por métodos de purificação padronizados. O termo também engloba moléculas de ácido nucleico e proteínas preparadas por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucleico e proteínas quimicamente sintetizadas.
[0040]Ligada Operacionalmente: Uma primeira sequência de ácidos nucleicos está ligada operacionalmente a uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos está colocada em um relacionamento funcional com a segunda sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor está ligado operacionalmente a uma sequência codificadora se o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência codificadora. Geralmente, sequências de DNA ligadas operacionalmente são contíguas e, quando necessário para unir duas regiões codificadoras de proteína, no mesmo quadro de leitura.
[0041]Carreador farmaceuticamente aceitável: Os carreadores (veículos) farmaceuticamente aceitáveis úteis nessa revelação são convencionais. “Remington's Pharmaceutical Sciences”, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15ª Edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para liberação farmacêutica de um ou mais compostos, moléculas ou agentes terapêuticos.
[0042]Em geral, a natureza do carreador dependerá do modo de administração particular que está sendo empregado. Por exemplo, formulações parenterais normalmente compreendem líquidos injetáveis que incluem líquidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis como, por exemplo, água, solução salina fisiológica, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes como um veículo. Para composições sólidas, por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido ou cápsula), carreadores sólidos atóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além de carreadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares atóxicas, por exemplo, agentes umidificantes ou emulsificantes, conservantes, e agentes de tamponamento do pH e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.
[0043]Prevenção, tratamento ou melhora de uma doença: A “prevenção” de uma doença (por exemplo, GSD-Ia) se refere à inibição do desenvolvimento completo de uma doença. O “tratamento” se refere a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após ela ter começado a se desenvolver. Uma “melhora” se refere à redução no número ou severidade de sinais ou sintomas de uma doença.
[0044]Promotor: Uma região de DNA que dirige/inicia transcrição de um ácido nucleico (por exemplo, um gene). Um promotor inclui sequências de ácidos nucleicos necessárias próximas ao sítio de início da transcrição.
[0045]Purificado: O termo “purificado” não exige pureza absoluta; ao contrário, ele é entendido como um termo relativo. Dessa forma, por exemplo, um peptídeo, proteína, vírus ou outro composto ativo purificado é aquele que é isolado no todo ou em parte de proteínas e outros contaminantes naturalmente associados. Em certas modalidades, o termo “substancialmente purificado” se refere a um peptídeo, proteína vírus ou outro composto ativo que foi isolado de uma célula, meio de cultura de células ou de outra preparação bruta e submetido ao fracionamento para remover vários componentes da preparação inicial, por exemplo, proteínas, restos celulares e outros componentes.
[0046]Recombinante: Uma molécula de ácido nucleico recombinante é aquela que possui uma sequência que não ocorre naturalmente ou que possui uma sequência que é feita por uma combinação artificial de dois segmentos de sequência de outro modo separados. Essa combinação artificial pode ser obtida por síntese química ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de moléculas de ácido nucleico, por exemplo, por técnicas de engenharia genética.
[0047]Similarmente, um vírus recombinante é um vírus que compreende uma sequência (por exemplo, sequência genômica) que não ocorre naturalmente ou é feita por combinação artificial de pelo menos duas sequências de origem diferente. O termo “recombinante” também inclui ácidos nucleicos, proteínas e vírus que foram alterados exclusivamente por adição, substituição ou deleção de uma porção de uma molécula de ácido nucleico, proteína ou vírus natural. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “AAV recombinante” se refere a uma partícula de AAV na qual uma molécula de ácido nucleico recombinante como, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica G6Pase-α, foi empacotada.
[0048]Identidade de sequência: A identidade ou similaridade entre duas ou mais sequências de ácidos nucleicos, ou duas ou mais sequências de aminoácidos, é expressa em termos da identidade ou similaridade entre as sequências. A identidade de sequência pode ser medida em termos de identidade percentual; quanto maior a percentagem, mais idênticas são as sequências. A similaridade de sequência pode ser medida em termos de similaridade percentual (que leva em conta substituições de aminoácidos conservativas); quanto maior a percentagem, mais similares são as sequências. Homólogos ou ortólogos de sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos possuem um grau relativamente alto de identidade/similaridade de sequência quando alinhados usando métodos padronizados. Essa homologia é mais significante quando as proteínas ou cDNAs ortólogos são derivados de espécies que estão mais intimamente relacionadas (por exemplo, sequências humanas e de camundongo), comparadas com espécies mais distantemente relacionadas (por exemplo, sequências humanas e de C. elegans).
[0049]Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970: Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2.444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73: 237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS5: 151-3, 1989; Corpet e cols., Nuc. Acids Res. 16: 10.881-90, 1988; Huang e cols. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992: e Pearson e cols., Meth. Mol. Rio. 24: 307-31,
1994. Altschul e cols., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990, que apresentam uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequências e cálculos de homologia.
[0050]O “NCBI Basic Local Alignment Search Tool” (BLAST) (Altschul e cols., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990) está disponível por várias fontes, incluindo o “National Center for Biological Information” (NCBI) e na Internet, para uso em conexão com os programas de análise de sequências BLASTP, BLASTN, BLASTX, TBLASTN e TBLASTX. Informação adicional pode ser encontrada na página na Internet do NCBI.
[0051]Sorotipo: Um grupo de microorganismos intimamente relacionados (por exemplo, vírus) distinguidos por um conjunto característico de antígenos.
[0052]Sequência stuffer: Se refere a uma sequência de nucleotídeos contida dentro de uma molécula de ácido nucleico maior (por exemplo, um vetor) que é tipicamente usada para criar espaçamento desejado entre duas características do ácido nucleico (por exemplo, entre uma sequência promotora e uma sequência codificadora), ou para estender uma molécula de ácido nucleico de modo que ela seja de um comprimento desejado. Sequências stuffer não contêm informação codificadora de proteína e podem ser de origem desconhecida/sintética e/ou não relacionadas com outras sequências de ácidos nucleicos dentro de uma molécula de ácido nucleico maior.
[0053]Indivíduo: Organismos multicelulares vertebrados vivos, uma categoria que inclui humanos e mamíferos não humanos.
[0054]Sintético: Produzido por meios artificiais em um laboratório, por exemplo, um ácido nucleico sintético pode ser sintetizado quimicamente em um laboratório.
[0055]Quantidade terapeuticamente eficaz: Uma quantidade de um agente farmacêutico ou terapêutico especificado (por exemplo, um AAV recombinante) suficiente para obter um efeito desejado em um indivíduo, ou em uma célula, que está sendo tratado com o agente. A quantidade eficaz do agente dependerá de vários fatores incluindo, sem limitação, do indivíduo ou células que estão sendo tratadas, e da forma de administração da composição terapêutica.
[0056]Vetor: Um vetor é uma molécula de ácido nucleico que permite a inserção de ácido nucleico estranho sem rompimento da habilidade do vetor para replicar e/ou se integrar em uma célula hospedeira. Um vetor pode incluir sequências de ácidos nucleicos que o permitem replicar em uma célula hospedeira, por exemplo, uma origem de replicação. Um vetor também pode incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos. Um vetor de expressão é um vetor que contém as sequências regulatórias necessárias para permitir a transcrição e tradução de gene ou genes inseridos. Em algumas modalidades nesse relatório descritivo, o vetor é um vetor de AAV.
[0057]Salvo explicação em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa revelação pertence. Os termos no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referentes no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. O termo “que compreende A ou B” significa que inclui A, ou B, ou A e B. Subentende-se ainda que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácidos, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximações, e são fornecidos para descrição. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos nesse relatório descritivo possam ser usados na prática ou testagem da presente revelação, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencionadas nesse relatório descritivo são incorporados por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explicações de termos, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos, e não visam ser limitantes. I. Um ácido nucleico recombinante
[0058]Um aspecto da invenção fornece uma sequência de ácidos nucleicos recombinante, que inclui um promotor/intensificador (GPE) de G6PC modificado desprovido de um ou mais elementos Alu, comparado com o GPE do tipo selvagem, em que o GPE modificado é capaz de dirigir a expressão de uma sequência codificadora que codifica G6Pase- α (ID. DE SEQ. Nº: 5). Em algumas modalidades, o GPE modificado é obtido por remoção de um ou mais elementos Alu do promotor endógeno para o gene G6PC humano, por exemplo, remoção de um ou mais dos nucleotídeos contíguos 1079 - 1272 (Alu - 1), 1633 - 1968 (Alu - 2) e 2140 - 2495 (Alu - 3) do ID. DE SEQ. Nº: 6. Em algumas outras modalidades, o GPE modificado é obtido por remoção de um ou mais elementos Alu do promotor endógeno para o gene G6PC de outros mamíferos, por exemplo, primatas não humanos, carneiros, roedores etc. Em algumas modalidades, o GPE modificado não afeta a expressão do gene G6PC, em comparação com o GPE do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o GPE modificado é capaz de aumentar a expressão do gene G6PC, em comparação com o GPE do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o GPE modificado possui atividade comparável para dirigir a expressão do gene G6PC no fígado ao GPE do tipo selvagem, e atividade muito baixa para dirigir a expressão de G6Pase-α em outros tecidos.
[0059]Em algumas modalidades, o GPE modificado inclui uma sequência de ácidos nucleicos desprovida de uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica aos nucleotídeos contíguos 1079- 1272 (Alu - 1) do ID. DE SEQ. Nº: 6. Em algumas modalidades, o GPE modificado inclui uma sequência de ácidos nucleicos desprovida de uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica aos nucleotídeos contíguos 1633-1968 (Alu - 2) do ID. DE SEQ. Nº: 6. Em algumas modalidades, o GPE modificado inclui uma sequência de ácidos nucleicos desprovida de uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica aos nucleotídeos contíguos 2140- 2495 (Alu - 3) do ID. DE SEQ. Nº: 6.
[0060]Em algumas modalidades, o GPE modificado inclui uma sequência de ácidos nucleicos desprovida de uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 1 e uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 2 do ID. DE SEQ. Nº: 6. Em algumas modalidades, o GPE modificado inclui uma sequência de ácidos nucleicos desprovida de uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 1 e uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,
89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 3 do ID. DE SEQ. Nº: 6. Em algumas modalidades, o GPE modificado inclui uma sequência de ácidos nucleicos desprovida de uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 2 e uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 3 do ID. DE SEQ. Nº: 6. Em algumas modalidades, o GPE modificado inclui uma sequência de ácidos nucleicos desprovida de uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 1, uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 2, e uma sequência pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica a Alu - 3 do ID. DE SEQ. Nº: 6.
[0061]Em algumas modalidades da presente invenção, a sequência de ácidos nucleicos recombinante inclui um GPE com uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica aos nucleotídeos contíguos 146 - 2123 do ID. DE SEQ. Nº: 1, em que o GPE é capaz de dirigir a expressão de uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinante inclui um GPE com uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID.
DE SEQ.
Nº: 7, em que o GPE é capaz de dirigir a expressão de uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α.
Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinante inclui um GPE com uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID.
DE SEQ.
Nº: 8, em que o GPE é capaz de dirigir a expressão de uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α.
Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinante inclui um GPE com uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID.
DE SEQ.
Nº: 9, em que o GPE é capaz de dirigir a expressão de uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α.
Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinante inclui um GPE com uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID.
DE SEQ.
Nº: 10, em que o GPE é capaz de dirigir a expressão de uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α.
Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinante inclui um GPE com uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID.
DE
SEQ. Nº: 11, em que o GPE é capaz de dirigir a expressão de uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinante inclui um GPE com uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 12, em que o GPE é capaz de dirigir a expressão de uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α.
[0062]Outro aspecto da invenção fornece uma sequência de ácidos nucleicos recombinante que inclui o GPE modificado revelado nesse relatório descritivo e uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α. Em algumas modalidades, a G6Pase-α inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 5. Em algumas modalidades, a G6Pase-α inclui ID. DE SEQ. Nº: 5 ou um fragmento ativo ou variante desta. Em uma modalidade exemplar, a G6Pase-α compreende ou consiste no ID. DE SEQ. Nº: 5.
[0063]Em algumas modalidades, a sequência codificadora que codifica G6Pase-α incorpora uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 4.
[0064]Em algumas modalidades, a sequência codificadora que codifica G6Pase-α humana é códon-otimizada para expressão em células humanas. A otimização de códons pode ser realizada em cDNA de G6PC humana usando tecnologia de otimização de códons OptimumGene™ (GenScript, Piscataway,
NJ). As sequências de cDNA de G6PC otimizadas podem ser examinadas e adicionalmente modificadas para eliminar quadros de leitura alternativos (ARFs) potenciais de sequências ATG não in-frame internas que poderiam teoricamente codificar peptídeos de 9 ou mais aminoácidos de comprimento. Por exemplo, a modificação adicional pode ser realizada nas sequências de cDNA de G6PC códon-optimizadas para evitar respostas de linfócitos T citotóxicos potenciais aos produtos de transgene gerados pelos ARFs (Li e cols., 2009, PNAS 106: 10.770-4). Em algumas modalidades, a sequência códon-otimizada codificadora para G6Pase-α humana incorpora uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 3.
[0065]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinante que inclui o GPE modificado e a sequência codificadora que codifica G6Pase-α como descritas nesse relatório descritivo ainda inclui um íntron e/ou um sinal de poliadenilação. Em algumas modalidades, o íntron é colocado entre o GPE e a sequência codificadora de G6Pase- α. Em algumas modalidades, o íntron é um íntron quimérico, que aumenta a expressão do transgene de G6Pase-α. O íntron pode ser formado pelo sítio doador-5´ do primeiro íntron do gene de β-globina humana e pela ramificação e sítio aceitador-3´ do íntron de uma região variável da cadeia pesada do gene de imunoglobulina, em que as sequências dos sítios doadores e aceitadores, juntamente com o sítio do ponto de ramificação, foram alteradas para combinar com as sequências de consenso para splicing. Em algumas modalidades, o íntron inclui uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 13.
[0066]Um sinal de poliadenilação pode ser colocado a jusante da sequência codificadora que codifica G6Pase-α para poliadenilação eficiente do mRNA de G6PC. Diversos sinais de poliadenilação podem ser usados, por exemplo, um sinal de poliadenilação tardio do vírus Símio 40 (SV40), um sinal de poliadenilação de hGH, um sinal de poliadenilação de BGH ou um sinal de poliadenilação de rbGlob. Em algumas modalidades, o sinal de poliadenilação é um sinal de poliadenilação tardio de SV40. Em algumas modalidades, o sinal de poliadenilação inclui uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 14.
[0067]Outro aspecto da invenção fornece um vetor recombinante que inclui o GPE modificado, e uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α revelada nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o vetor recombinante ainda inclui um íntron e/ou um sinal de poliadenilação descrito nesse relatório descritivo. O vetor pode ser um vetor de expressão mamífero, um vetor de expressão bacteriano, um vetor de expressão de levedura, um vetor de lentivírus, um vetor de retrovírus, um vetor de adenovírus, um vetor de vírus adenoassociado (AAV), um vetor de RNAi, um vetor de expressão Cre-Lox, um vetor de expressão CRISPR, um vetor de expressão TALEN etc. O vetor pode ainda incluir um íntron e/ou um sinal de poliadenilação como descrito nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o vetor recombinante ainda inclui uma sequência de ácidos nucleicos stuffer situada entre o GPE e o íntron, e/ou entre o íntron e a sequência codificadora de G6Pase-α.
[0068]Em algumas modalidades, o vetor recombinante é um vetor de AAV. O vetor de AAV pode ser um vetor de AAV do sorotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 (ou seja, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, ou AAV12), bem como qualquer uma das mais de 100 variantes isoladas de tecidos humanos e de primatas não humanos (veja, por exemplo, Choi e cols., Curr. Gene Ther., 5: 299-310, 2005; e Gao e cols., Curr. Gene Ther., 5: 285- 297, 2005). Vetores de AAV de qualquer sorotipo podem ser usados na presente invenção, e a seleção do sorotipo de AAV dependerá, em parte, dos tipos de células que são visados para terapia gênica. Para o tratamento de GSD-Ia, o fígado é um dos órgãos-alvo mais relevantes.
[0069]Em algumas modalidades, o vetor recombinante de AAV inclui uma sequência ITR de AAV, que funciona tanto como a origem da replicação do DNA do vetor quanto como o sinal de empacotamento do genoma do vetor, quando as funções auxiliares do AAV e adenovírus são fornecidas em trans. Adicionalmente, as ITRs servem como o alvo para o entalhe endonucleático de fita simples pelas proteínas Rep grandes, que resolve genomas individuais de intermediários de replicação.
[0070]Em algumas modalidades exemplares, o vetor de AAV é um vetor de AAV do sorotipo 8 (AAV8), e o vetor inclui o GPE modificado, um íntron, uma sequência codificadora que codifica G6Pase-α e um sinal de poliadenilação tardio de
SV40 descrito nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o vetor ainda inclui duas sequências de repetição terminal invertida (ITR) de AAV2 (ID. DE SEQ. Nº: 15): uma 5’ do GPE e uma 3’ do sinal de poliadenilação. Em alguns exemplos não limitantes particulares, o vetor recombinante inclui uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80% (por exemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2. II. Uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico recombinante
[0071]São ainda fornecidas células hospedeiras isoladas que compreendem as moléculas de ácidos nucleicos recombinantes ou vetores revelados nesse relatório descritivo. Uma ampla variedade de células hospedeiras pode ser usada como, por exemplo, bactérias, leveduras, insetos, células de mamíferos etc. Em algumas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célula (ou a linhagem de célula) apropriada à produção de AAV recombinante (rAAV), por exemplo, uma célula HeLa, Cos-7, HEK293, A549, BHK, Vero, RD, HT-1080, ARPE-19 ou MRC-5.
[0072]As moléculas de ácidos nucleicos recombinantes ou vetores podem ser liberados na cultura de célula hospedeira com o uso de qualquer método adequado conhecido na técnica. Em algumas modalidades, é gerada uma linhagem de célula hospedeira estável que possui a molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor inserido em seu genoma. Em algumas modalidades, é gerada uma linhagem de célula hospedeira estável, que contém um vetor de AAV descrito nesse relatório descritivo. Após transfecção do vetor de AAV na cultura hospedeira, a integração do rAAV no genoma do hospedeiro pode ser testado por vários métodos como, por exemplo, seleção antibiótica, separação de células ativada por fluorescência, Southern blot, detecção baseada em PCR, hibridização por fluorescência in situ, como descrito por Nakai e cols., Nature Genetics (2003) 34, 297-302; Philpott e cols., Journal of Virology (2002) 76 (11): 5.411-5.421, e Howden e cols., J. Gene Med. 2008; 10: 42-50. Além disso, uma linhagem de célula estável pode ser estabelecida de acordo com protocolos bem conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em Clark, “Kidney International”, Vol 61 (2002): S9-S15, e Yuan e cols., Human Gene Therapy; maio de 2011; 22 (5): 613-24. III. Um AAV recombinante
[0073]Essa invenção também fornece um rAAV que compreende um capsídeo de AAV e um genoma de vetor de AAV descritos nesse relatório descritivo. O capsídeo de AAV pode ser do sorotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 (ou seja, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 ou rh10). Em algumas modalidades, o capsídeo é um capsídeo de AAV8.
[0074]Um rAAV pode ser produzido por células hospedeiras, que são fornecidas com os vetores de AAV revelados nesse relatório descritivo, e funções dos genes de AAV Rep e Cap, bem como funções auxiliares adicionais. As funções dos genes Rep e Cap podem ser fornecidas à célula hospedeira por vários meios, por exemplo, por um plasmídeo ou qualquer tipo de vetor que contém os genes Rep e Cap de AAV do tipo selvagem, e eletroporação dos mRNAs de Rep e
Cap. Funções auxiliares adicionais podem ser fornecidas, por exemplo, por uma infecção por adenovírus (AV), por um plasmídeo que carrega todos os genes de função auxiliar de AV necessários, ou por outros vírus como, por exemplo, vírus do herpes simples (HSV) ou baculovírus. Quaisquer genes, funções de genes ou outro material genético necessário à produção de rAAV pela célula hospedeira podem existir transitoriamente dentro da célula hospedeira, ou podem ser inseridos estavelmente no genoma da célula hospedeira. Métodos de produção de rAAV adequados para uso com os métodos da presente invenção incluem aqueles revelados em Clark e cols., Human Gene Therapy 6: 1.329–1.341 (1995), Martin e cols., Human Gene Therapy Methods 24: 253–269 (2013), Thorne e cols., Human Gene Therapy 20: 707–714 (2009), Fraser Wright, Human Gene Therapy 20: 698–706 (2009) e Virag e cols., Human Gene Therapy 20: 807–817 (2009).
[0075]Em uma modalidade exemplar, células HEK293 são transfectadas com o vetor de AAV que inclui a sequência de ácidos nucleicos do ID. DE SEQ. Nº: 1 ou ID. DE SEQ. Nº: 2; um plasmídeo que codifica quatro proteínas de replicação viral (Rep) de AAV2 do tipo selvagem e as três proteínas do capsídeo viral (cap) de AAV do tipo selvagem do sorotipo 8; e um plasmídeo que contém regiões de um genoma de adenovírus que são importantes para replicação do AAV, especificamente RNA de E2A, E4 e VA. rAAVs que contêm um capsídeo de AAV8 podem ser subsequentemente produzidos e isolados das células hospedeiras. Em algumas modalidades, o GPE modificado desprovido de um ou mais dos elementos Alu no vetor de AAV aumenta o empacotamento do rAAV produzido pelas células hospedeiras. Em algumas modalidades, o GPE modificado desprovido de um ou mais dos elementos Alu no vetor de AAV afeta a formação da estrutura autocomplementar e, dessa forma, aumenta o rendimento do rAAV produzido pelas células hospedeiras.
[0076]A lise de células infectadas por AAV pode ser obtida por métodos que tratam quimicamente ou enzimaticamente as células a fim de liberar partículas virais infecciosas. Esses métodos incluem o uso de nucleases como, por exemplo, benzonase ou DNAse, proteases como, por exemplo, tripsina, ou detergentes ou tensoativos. A ruptura física, por exemplo, homogeneização ou trituração, ou a aplicação de pressão por meio de uma célula de pressão de microfluidificador, ou ciclos de congelamento- descongelamento, também podem ser usados. Alternativamente, o sobrenadante pode ser coletado de células infectadas por AAV sem a necessidade de lise das células.
[0077]Pode ser necessário purificar a amostra que contém partículas do rAAV e do vírus auxiliar para remover, por exemplo, os restos celulares que resultam da lise da célula. Métodos de purificação mínima de partículas do vírus auxiliar e do AAV são conhecidos na técnica, e qualquer método apropriado pode ser usado para preparar amostras que contêm tanto partículas do AAV quanto do vírus auxiliar para uso nos métodos da presente invenção. Dois métodos de purificação exemplares são os métodos de purificação por gradiente de densidade baseados em cloreto de césio (CsCl) e em iodixanol. Ambos os métodos são descritos em Strobel e cols., Human Gene Therapy Methods, 26 (4): 147–157 (2015). A purificação mínima também pode ser obtida com o uso de cromatografia de afinidade usando, por exemplo, resina de afinidade de
Sefarose de AVB (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suécia) ou uma resina de afinidade POROS™ CaptureSelect™ de AAV8, AAV9 ou AAVX (Thermo Fisher Scientific, Millersburg, PA). Métodos de purificação de AAV com o uso de resina de afinidade de Sefarose de AVB são descritos, por exemplo, em Wang e cols., Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 2: 15.040 (2015).
[0078]Pode ser necessário inativar o vírus auxiliar por calor. Técnicas de inativação térmica se baseiam nas diferentes estabilidades térmicas de partículas do AAV e do vírus auxiliar. Por exemplo, partículas de AAV podem ser aquecidas até temperaturas tão altas quanto 56°C e ainda permanecem intactas, enquanto partículas de AV ficam inativas. Conway e cols., Gene Therapy 6, 986–993, 1999, descrevem inativação térmica diferencial de HSV em amostras que contêm AAV. A inativação térmica pode ser obtida por qualquer metodologia conhecida. Nos exemplos descritos abaixo, a inativação térmica foi obtida usando um termociclador para aquecer e resfriar rapidamente volumes de amostra de 300 µl ou menos. Esse sistema foi escolhido porque ele se baseia na transferência de calor que é primariamente condutiva, tornando-o um modelo viável tanto para sistemas de fluxo contínuo quanto para sistemas de batelada maior que empregam mistura ativa. Exemplos de sistemas de fluxo contínuo incluem passagem da amostra através de um trocador de calor de fluxo contínuo como, por exemplo, o “DHX™ Single- Use Heat Exchanger for Bio-therapeutic Manufacturing” (Thermo Fisher Scientific, Millersburg, PA). Esses sistemas permitem que o operador controle o processo de inativação térmica por controle da taxa de fluxo da amostra através do trocador de calor controlando, dessa forma, a duração do processo de aquecimento, e a temperatura do trocador de calor controlando, dessa forma, a temperatura da inativação térmica.
[0079]Alternativamente, a inativação térmica pode ser obtida com o uso de sistemas de batelada de vários tamanhos. Por exemplo, a inativação térmica pode ser obtida na escala de 1 litro, por colocação da amostra que contém AAV em uma garrafa PETG de 1 litro e colocação da garrafa em um banho- maria configurado na temperatura de inativação desejada pelo período de tempo desejado, com mistura; por exemplo, as amostras podem ser aquecidas até 47°C por 20 minutos. Em uma escala maior, a inativação térmica pode ser obtida por colocação da amostra que contém rAAV em uma bolsa de bioprocessamento de 5 litros em uma plataforma em agitação com temperatura controlada configurada na temperatura de inativação desejada, pelo período de tempo desejado. Por exemplo, a plataforma em agitação pode ser configurada para 49°C em uma velocidade de agitação de 30 RPM, com um ângulo de mistura de 12° por 40 minutos.
[0080]A inativação térmica pode ocorrer em qualquer temperatura na qual haja diferença suficiente na estabilidade entre partículas do rAAV e partículas do vírus auxiliar, na qual as partículas do vírus auxiliar são substancialmente inativadas, enquanto as partículas de rAAV ativas permanecem. Aqueles habilitados na técnica saberão que podem ser necessárias temperaturas maiores para obter níveis maiores de redução de AV. Em algumas modalidades, a etapa de inativação térmica inclui o uso de um tampão contendo sais cosmotrópicos e/ou cátions divalentes ou trivalentes. Métodos de inativação térmica na presença de um tampão contendo sais cosmotrópicos e/ou cátions divalentes ou trivalentes são descritos em WO/2017/172772.
[0081]Após obtenção da inativação térmica, pode ser necessário ou desejável determinar a eficiência da inativação. A eficácia de um protocolo de inativação é determinada por ensaios que detectam a presença de vírus auxiliar replicação-competente, por exemplo, um ensaio em placa. Ensaios em placa para vírus auxiliar são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, incluindo ensaios em placa para AV, HSV, baculovírus e outros. Ensaios em placa de adenovírus podem ser realizados usando qualquer tipo de célula apropriado, por exemplo, células HeLa ou HEK293. Protocolos padronizados de ensaios em placa são descritos, por exemplo, em “Current Protocols in Human Genetics”, 2003. Ensaios alternativos para a medição de titulações adenovirais incluem aqueles que permitem a identificação de células infectadas em cultura por detecção de proteínas virais, por exemplo, proteínas do héxon, usando coloração imunocitoquímica. Esses ensaios incluem o Kit de Imunoensaio de Titulação de Adenovírus QuickTiter™ (Cell Biolabs, San Diego, CA). A eficiência da inativação é geralmente registrada como a redução log de vírus (LRV).
[0082]A quantificação de partículas de rAAV é complicada pelo fato de que a infecção por AAV não resulta em efeito citopático in vitro e, portanto, ensaios em placa não podem ser usados para determinar titulações infecciosas. Partículas de AAV podem ser quantificadas usando diversos métodos, no entanto, incluindo reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) (Clark e cols., Hum. Gene Ther. 10,
1.031–1.039 (1999)) ou hibridização dot-blot (Samulski e cols., J. Virol. 63, 3.822–3.828 (1989)), ou por densidade óptica de preparações de vetor altamente purificadas (Sommer e cols., Mol. Ther. 7, 122–128 (2003)). Partículas DNase- resistentes (DRP) podem ser quantificadas por reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) em tempo real (DRP- qPCR) em um termociclador (por exemplo, um termociclador em formato de bloco de 96 poços iCycler iQ (Bio-Rad, Hercules, CA)). Amostras que contêm partículas de AAV são incubadas na presença de DNase I (100 U/ml; Promega, Madison, WI) a 37°C por 60 min, seguida por digestão com proteinase K (Invitrogen, Carlsbad, CA) (10 U/ml) a 50°C por 60 min, e depois desnaturadas a 95°C por 30 min. O conjunto iniciador– sonda usado deve ser específico para uma porção não nativa do genoma de vetor de AAV, por exemplo, a sequência poli(A) da proteína de interesse. O produto de PCR pode ser amplificado com o uso de qualquer conjunto apropriado de parâmetros de ciclagem, com base no comprimento e composição dos iniciadores, sondas e sequência amplificada. Protocolos alternativos são revelados, por exemplo, em Lock e cols., Human Gene Therapy Methods 25 (2): 115–125 (2014).
[0083]A infectividade de partículas de rAAV pode ser determinada usando um ensaio de TCID50 (dose infecciosa de cultura de tecido a 50%), como descrito, por exemplo, em Zhen e cols., Human Gene Therapy 15: 709–715 (2004). Nesse ensaio, partículas do vetor de AAV são diluídas serialmente e usadas para coinfectar uma linhagem de células que expressam Rep/Cap, em conjunto com partículas de AV em placas de 96 poços. Quarenta e oito hours pós-infecção, DNA celular total de poços infectados e de controle é extraído. A replicação do vetor de AAV é então medida usando qPCR com sondas e iniciadores transgene-específicos. A TCID50 da infectividade por mililitro (TCID50/ml) é calculada com a equação de Kärber, usando as proporções de poços positivos para AAV em diluições seriais de 10 vezes. IV. AAV recombinante para terapia gênica
[0084]AAV pertence à família Parvoviridae e ao gênero Dependovirus. AAV é um vírus não envelopado pequeno que empacota um linear, genoma de DNA de fita simples. Tanto a fita senso quanto a anti-senso de DNA de AAV são empacotadas em capsídeos de AAV com frequência igual.
[0085]O genoma do AAV é caracterizado por duas repetições terminais invertidas (ITRs) que flanqueiam dois quadros de leitura aberta (ORB). No genoma do AAV2, por exemplo, os primeiros 125 nucleotídeos da ITR são um palíndromo, que se dobra sobre si mesmo para maximizar o pareamento de bases e forma uma estrutura hairpin em forma de “T”. As outras 20 bases da ITR, denominadas a sequência D, permanecem não pareadas. As ITRs são as sequências atuantes em cis importantes para replicação do DNA de AAV; a ITR é a origem de replicação e serve como um iniciador para a síntese de segunda fita por DNA polimerase. O DNA de fita dupla formado durante essa síntese, que é denominado monômero de forma replicante, é usado para uma segunda rodada de replicação de auto-iniciação e forma um dímero de forma replicante. Esses intermediários de fita dupla são processados por meio de um mecanismo de deslocamento de fita, resultando no DNA de fita simples usado para empacotamento e DNA de fita dupla usado para transcrição. Localizados dentro da ITR estão os elementos de ligação a Rep e um sítio de resolução terminal
(TRS). Essas características são usadas pela proteína reguladora viral Rep durante a replicação do AAV para processar os intermediários de fita dupla. Além de seu papel na replicação do AAV, a ITR também é essencial para empacotamento do genoma do AAV, transcrição, regulação negativa sob condições não permissivas, e integração sítio- específica (Days e Berns, Clin. Microbiol. Ver. 21 (4): 583- 593, 2008).
[0086]O ORF esquerdo de AAV contém o gene Rep, que codifica quatro proteínas - Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40. O ORF direito contém o gene Cap, que produz três proteínas do capsídeo viral (VP1, VP2 e VP3). O capsídeo de AAV contém 60 proteínas do capsídeo viral dispostas em uma simetria icosaédrica. VP1, VP2 e VP3 estão presentes em uma proporção molar de 1:1:10 (Daya e Berns, Clin. Microbiol. Rev. 21 (4): 583-593, 2008).
[0087]O AAV é atualmente um dos vírus mais frequentemente usados para terapia gênica. Embora o AAV infecte humanos e algumas outras espécies de primatas, ele não é conhecido por causar doença e provoca uma resposta imune muito leve. Vetores de terapia gênica que utilizam AAV podem infectar tanto células em divisão quanto células quiescentes e persistem em um estado cromossômico sem integração no genoma da célula hospedeira. Por causa das características vantajosas do AAV, a presente revelação contempla o uso de AAV para as moléculas de ácidos nucleicos recombinantes e métodos revelados nesse relatório descritivo.
[0088]O AAV possui várias características desejáveis para um vetor de terapia gênica, incluindo a habilidade para se ligar e entrar nas células-alvo, entrar no núcleo, a habilidade para ser expresso no núcleo por um período de tempo prolongado, e baixa toxicidade. No entanto, o pequeno tamanho do genoma do AAV limita o tamanho de DNA heterólogo que pode ser incorporado. Para minimizar esse problema, foram construídos vetores de AAV que não codificam Rep e o elemento de eficiência de integração (IEE). As ITRs são retidas, na medida em que são sinais cis necessários para empacotamento (Daya e Berns, Clin. Microbiol. Rev., 21 (4): 583-593, 2008).
[0089]Métodos para a produção de rAAV adequado para terapia gênica são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, os Pedidos de Patente U.S. Nos 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971; e 2013/0072548; e Ghosh e cols., Gene Ther. 13 (4): 321-329, 2006), e podem ser utilizados com as moléculas de ácidos nucleicos recombinantes e métodos revelados nesse relatório descritivo.
[0090]São fornecidas composições que compreendem o rAAV revelado nesse relatório descritivo e um carreador farmaceuticamente aceitável pela presente revelação. Formulações farmacêuticas adequadas para administração de rAAV podem ser encontradas, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nº 2012/0219528. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis (veículos) úteis nessa revelação são convencionais. “Remington's Pharmaceutical Sciences”, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15ª Edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para liberação farmacêutica de um ou mais compostos, moléculas ou agentes terapêuticos.
[0091]Em algumas modalidades, O rAAV é formulado em um tampão/carreador adequado para infusão em indivíduos humanos. O tampão/carreador deve incluir um componente que evita que o rAAV cole na tubulação de infusão, mas não interfira com a atividade de ligação ao rAAV in vivo. Várias soluções adequadas podem incluir um ou mais de: uma solução salina de tamponamento, um tensoativo e um sal ou uma mistura de sais fisiologicamente compatível ajustada a uma força iônica equivalente a cerca de 100 mM de cloreto de sódio (NaCl) até cerca de 250 mM de cloreto de sódio, ou um sal fisiologicamente compatível ajustado a uma concentração iônica equivalente. O pH pode estar na faixa de 6,5 a 8,5, ou 7 a 8,5, ou 7,5 a 8. Um tensoativo adequado, ou combinação de tensoativos, pode ser selecionado entre Poloxâmeros, ou seja, copolímeros triblocos não iônicos formados por uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno 10 (poli(óxido de propileno)), flanqueada por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)), SOLUTOL HS 15 (Hidroxiestearato de Macrogol-15), LABRASOL (Polióxi glicerídeo caprílico), oleil éter de polióxi 10, TWEEN (ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano), etanol e polietileno glicol.
[0092]A presente invenção também fornece métodos de tratamento de um indivíduo diagnosticado com uma doença de armazenamento de glicogênio tipo 1a (GSD-Ia) e a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um rAAV (ou uma composição que compreende o rAAV) revelado nesse relatório descritivo.
[0093]Qualquer método ou via adequada pode ser usada para administrar um rAAV ou uma composição contendo rAAV descrita nesse relatório descritivo. As vias de administração incluem, por exemplo, administração sistêmica,
oral, por inalação, intranasal, intratraqueal, intra- arterial, intra-ocular, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, e outras vias de administração parentais. Em algumas modalidades, o rAAV ou a composição que compreende rAAVs é administrada por via intravenosa.
[0094]A dose específica administrada pode ser uma dose uniforme para cada paciente, por exemplo, 1,0 x 1013 - 1,0 x 1015 cópias do genoma (GC) de vírus por paciente. Alternativamente, a dose de um paciente pode ser customizada para o peso ou área de superfície corporal aproximada do paciente. Outros fatores na determinação da dosagem apropriada podem incluir a doença ou condição a ser tratada ou evitada, a severidade da doença, a via de administração, e a idade, sexo e condição médica do paciente. Um refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para tratamento é rotineiramente feito por aqueles habilitados na técnica, especialmente à luz da informação de dosagem e ensaios revelados nesse relatório descritivo. A dosagem também pode ser determinada por meio do uso de ensaios conhecidos para a determinação de dosagens usadas em conjunto com dados de dose-resposta apropriados. Por exemplo, a dose biológica ótima do rAAV administrada pode ser identificada por avaliação do tempo (em minutos) até o primeiro evento hipoglicêmico (definido como glicose < 60 mg/dl (< 3,33 mmol/l) durante um desafio de jejum controlado, que terminará quando ocorre hipoglicemia ou 15 horas são alcançados. A dosagem de um paciente individual também pode ser ajustada à medida que o progresso da doença é monitorado.
[0095]Em algumas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de, por exemplo, cerca de 1,0 x 1011 cópias do genoma por quilograma de peso corporal do paciente (GC/kg) até cerca de 1 x 1014 GC/kg, cerca de 5 x 1011 cópias do genoma por quilograma de peso corporal do paciente (GC/kg) até cerca de 5 x 1013 GC/kg, ou cerca de 1 x 1012 até cerca de 1 x 1013 GC/kg, como medida por qPCR ou PCR digital de gotícula (ddPCR). Em algumas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 2 x 1012 GC/kg. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 6 x 1012 GC/kg. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1013 GC/kg. O rAAV pode ser administrado em uma dose única, ou em múltiplas doses (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais doses) como necessário para os resultados terapêuticos desejados.
[0096]As doses podem ser dadas uma vez ou mais vezes semanalmente, mensalmente ou anualmente, ou até mesmo uma vez a cada 2 a 20 anos. Por exemplo, cada dose pode ser dada em um intervalo de, no mínimo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, um mês, 3 meses, 6 meses ou 1 ano. Aqueles habilitados na técnica podem facilmente estimar as taxas de repetição para dosagem com base nos tempos de residência e concentrações medidas da construção ou complexo direcionável nos líquidos ou tecidos corporais. V. Métodos de aumento do rendimento viral recombinante e eficácia da terapia gênica A presente invenção também fornece um método de aumento do rendimento de um vírus recombinante por células hospedeiras, em que o método compreende a remoção de um ou mais elementos Alu ou sequências relacionadas ao elemento Alu de um vetor viral recombinante. Em algumas modalidades,
a sequência relacionada ao elemento Alu é pelo menos 50% idêntica a um elemento Alu, por exemplo, selecionado dos nucleotídeos contíguos 1079 - 1272 (Alu - 1), 1633 - 1968 (Alu - 2) e 2140 - 2495 (Alu - 3) do ID. DE SEQ. Nº: 6. O vetor viral recombinante pode ser, por exemplo, um vetor de lentivírus, um vetor de retrovírus, um vetor de adenovírus ou um vetor de vírus adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, um ou mais elementos Alu ou sequências relacionadas ao elemento Alu são removidas de uma região promotora/intensificadora dentro do vetor viral. Em algumas modalidades, um ou mais elementos Alu ou sequências relacionadas ao elemento Alu são removidas de uma região do íntron dentro do vetor viral. Em algumas modalidades, a remoção do(s) elemento(s) Alu ou sequências relacionadas ao elemento Alu reduz estruturas autocomplementares formadas durante o empacotamento das partículas virais recombinantes e, dessa forma, aumenta o rendimento viral por células hospedeiras.
[0097]Ao longo da descrição, quando composições são descritas como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, ou quando processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, é contemplado que, adicionalmente, há composições da presente invenção que consistem basicamente ou que consistem nos componentes citados, e que há processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem basicamente ou que consistem nas etapas de processamento citadas.
[0098]No pedido, quando um elemento ou componente é dito como estando incluído e/ou selecionado de uma lista de elementos ou componentes citados, deve ser subentendido que o elemento ou componente pode ser qualquer um dos elementos ou componentes citados, ou o elemento ou componente pode ser selecionado de um grupo que consiste em dois ou mais dos elementos ou componentes citados.
[0099]Além disso, deve ser subentendido que elementos e/ou características de uma composição ou um método descrito nesse relatório descritivo podem ser combinados de diversas formas, sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção, esteja explícito ou implícito nesse relatório descritivo. Por exemplo, quando é feita referência a um composto particular, aquele composto pode ser usado em várias modalidades de composições da presente invenção e/ou em métodos da presente invenção, a menos que seja entendido de outra forma a partir do contexto. Em outras palavras, dentro desse pedido, modalidades foram descritas e retratadas em uma forma que permita que um pedido claro e conciso seja escrito e desenhado, mas se deseja e será observado que as modalidades podem ser variadamente combinadas ou separadas, sem se afastar dos presente ensinamentos e invenção (ou invenções). Por exemplo, será observado que todas as características descritas e retratadas nesse relatório descritivo podem ser aplicáveis a todos os aspectos da invenção (invenções) descritos e retratados nesse relatório descritivo.
[00100]Deve ser subentendido que a expressão “pelo menos um de” inclui individualmente cada um dos objetos citados após a expressão e as várias combinações de dois ou mais dos objetos citados, a menos que seja entendido de outra forma a partir do contexto e uso. A expressão “e/ou”, em conexão com três ou mais objetos citados, deve ser subentendido como tendo o mesmo significado, a menos que seja entendido de outra forma a partir do contexto.
[00101]O uso do termo “incluir”, “inclui”, “que inclui”, “possuem”, “possui”, “que tem”, “conter”, “contém” ou “que contém”, incluindo seus equivalentes gramaticais, devem ser subentendidos geralmente como em aberto e não limitantes, por exemplo, não excluindo elementos ou etapas adicionais não citadas, salvo quando especificamente estabelecido ou subentendido de outro modo pelo contexto.
[00102]Quando o uso do termo “cerca de” precede um valor quantitativo, a presente invenção também inclui o valor quantitativo específico propriamente dito, salvo quando especificamente estabelecido de modo diferente. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “cerca de” se refere a uma variação ± 10% do nominal valor, exceto quando indicado ou inferido.
[00103]Deve ser subentendido que a ordem de etapas ou ordem para a realização de certas ações é irrelevante, desde que a presente invenção permaneça operável. Além disso, duas ou mais etapas ou ações podem ser efetuadas simultaneamente.
[00104]O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar nesse relatório descritivo, por exemplo, “por exemplo” ou “incluindo”, visa simplesmente ilustrar melhor a presente invenção e não impõe uma limitação no escopo da invenção, a menos que reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da presente invenção.
EXEMPLOS
[00105]A invenção que agora está sendo geralmente descrita, será mais prontamente compreendida por referência aos exemplos seguintes, que são incluídos simplesmente para fins de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não visam limitar a invenção. Exemplo 1 - Vetores de AAV e rAAV produzidos pelos vetores Vetor de AAV
[00106]Foi construído um vetor de AAV que inclui um cassete de expressão de G6PC ligado por duas repetições terminais invertidas de AAV2 (ITRs, ID. DE SEQ. Nº: 15). O cassete de expressão de G6PC foi definido em sua extremidade promotora/intensificadora (GPE) de G6PC 5’ pela sequência iniciadora “1S” listada em Yiu e cols., 2010, Molecular Therapy 18 (6): 1.076-84 e seu sítio de endonuclease de restrição KpnI associado. O cassete de expressão de G6PC foi definido em sua extremidade do sinal de poliadenilação tardio de SV40 3’ por alinhamento com o genoma de SV40 e um sítio de endonuclease de restrição SalI associado. Todos os cassetes de expressão de G6PC contêm um GPE, um íntron, um gene G6PC humano códon-otimizado e uma cauda poliA tardia de SV40, como ilustrado na Figura 1A. Diferentes versões dos cassetes de expressão de G6PC foram criadas, cada uma delas contendo um GPE do tipo selvagem, ou a GPE modificado como ilustrado na Figura 1B. Elementos dos cassetes de expressão de G6PC são descritos abaixo.
[00107]O promotor/intensificador de G6PC do tipo selvagem (GPE, ID. DE SEQ. Nº: 6) é do Homo sapiens, e definido por RefSeq NG_011808. Essa sequência é o promotor endógeno para o gene G6PC humano, e possui atividade quase exclusiva no fígado e atividade mínima no rim. O GPE do tipo selvagem contém 3 elementos Alu, localizados nos nucleotídeos contíguos 1079 - 1272 (Alu - 1), 1633-1968 (Alu - 2) e 2140-2495 (Alu - 3) do ID. DE SEQ. Nº: 6. O vetor de AAV DTC161 contém um cassete de expressão de G6PC que compreende o GPE do tipo selvagem. O vetor de AAV DTC175 contém um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE com uma deleção das sequências de Alu - 1 e Alu - 2. O vetor de AAV DTC176 contém um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE no qual as orientações das sequências de Alu - 1 e Alu - 2 estão invertidas. O vetor de AAV DTC177 (representado pelo ID. DE SEQ. Nº: 1) contém um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE com uma deleção das sequências de Alu - 1, Alu - 2 e Alu - 3. O vetor de AAV DTC178 contém um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE com uma deleção da sequência de Alu - 3. O vetor de AAV DTC179 contém um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE no qual a orientação da sequência de Alu - 3 está invertida.
[00108]O íntron quimérico (ID. DE SEQ. Nº: 13) é composto pelo sítio doador-5´ do primeiro íntron do gene de β-globina humana e pela ramificação e sítio aceitador-3´ do íntron de uma região variável da cadeia pesada do gene de imunoglobulina. As sequências dos sítios doadores e aceitadores, juntamente com o sítio do ponto de ramificação, foram alteradas para combinar com as sequências de consenso para splicing (“CI-neo Mammalian Expression Vector Technical Bulletin TB215”, Promega Life Sciences Corporation). A finalidade do íntron quimérico é aumentar a expressão gênica.
[00109]O cDNA de G6PC (ID. DE SEQ. Nº: 4) é de Homo sapiens, e é códon-otimizado para expressão em células humanas. A otimização de códons foi realizada em cDNA de G6PC humana usando tecnologia de otimização de códons proprietária OptimumGene™ (GenScript, Piscataway, NJ). As sequências de cDNA otimizadas foram examinadas e adicionalmente modificadas para eliminar quadros de leitura alternativos (ARFs) potenciais de sequências ATG não inframe internas que poderiam teoricamente codificar peptídeos de 9 ou mais aminoácidos de comprimento. Por exemplo, um cDNA de G6PC códon-otimizado é representado pelo ID. DE SEQ. Nº: 3.
[00110]O sinal de poliadenilação tardio do vírus Símio 40 (SV40) (Genbank # J02400, ID. DE SEQ. Nº: 14) fornece uma sequência em cis para poliadenilação eficiente do mRNA de G6PC. Esse elemento funciona como um sinal para um evento de clivagem específico na extremidade 3’ do transcrito nascente e adição de uma cauda de poliadenil longa.
[00111]Cada cassete de expressão de G6PC foi clonado em um vetor de AAV. Todos os vetores de AAV tinham um arcabouço que codifica o gene de resistência à canamicina. Um vetor de AAV DTC161 (pDTX.hG6PCco.401) é ilustrado na Figura 2 como um exemplo. Vírions de rAAV
[00112]O genoma de vetor de AAV é um genoma de DNA de fita simples. Somente as sequências entre e incluindo as sequências ITR estão empacotadas no vírion de AAV. Vírions foram produzidos por transfecção de três plasmídeos em células de rim embrionário humano 293 (HEK293), que fornecem produtos dos genes E1a e E1b. O primeiro plasmídeo é o vetor de AAV descrito nesse relatório descritivo. O segundo plasmídeo é pAAV2-8.KanR (p2123-FH), um plasmídeo de empacotamento que contém os genes rep de AAV2 e cap de AAV8 do tipo selvagem. O terceiro plasmídeo é pAdDeltaF6(Kan), um plasmídeo de adenovírus auxiliar.
[00113]O plasmídeo de Rep/Cap adenoassociado pAAV2/8.KanR (p2123-FH) (8354 bp) codifica as quatro proteínas de replicação viral (Rep) de AAV2 do tipo selvagem e as três proteínas do capsídeo VP de AAV (cap) do sorotipo 8 do tipo selvagem. Uma ilustração do plasmídeo pAAV2/8.KanR (p2123-FH) é mostrada na Figura 3. Dentro do plasmídeo, o promotor p5 de AAV, que normalmente dirige a expressão do gene Rep, foi movido da extremidade 5’ da região Rep para a extremidade 3’ da região cap de AAV8. Esse arranjo introduz um espaçador entre o promotor e o gene Rep (ou seja, o arcabouço do plasmídeo) resultando em infra-regulação da expressão de Rep e em um aumento na habilidade para suportar produção de rAAV em titulação elevada. O gene para resistência à canamicina e a origem MB1 estão incluídos para produção do plasmídeo em E. coli.
[00114]O plasmídeo pAdDeltaF6(Kan) contém as regiões do genoma de adenovírus que são importantes para replicação do AAV, especificamente RNA de E2A, E4 e VA (Figura 4). As funções de E1 de adenovírus também são necessárias, mas são fornecidas pelas células HEK293 hospedeiras. O plasmídeo não contém outra replicação de adenovírus, genes estruturais ou os elementos cis críticos para replicação do adenovírus como, por exemplo, as ITRs adenovirais e, portanto, não se espera que seja gerado adenovírus infeccioso. O gene para resistência à canamicina e a origem MB1 estão incluídos para produção do plasmídeo em E. coli. Exemplo 2 – A deleção de elementos Alu aumenta o rendimento de rAAV
[00115]Vetores de AAV que contêm o GPE do tipo selvagem ou um GPE modificado foram usados para transfectar células HEK293 com o plasmídeo Rep/Cap e o plasmídeo auxiliar descrito acima.
[00116]O GPE modificado contém elementos Alu deletados (nos vetores DTC175, DTC177 e DTC178) ou elementos Alu revertidos em direção (nos vetores DTC176 e DTC179). O vetor viral DTC175 compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE com uma deleção das sequências de Alu - 1 e Alu - 2, o vetor viral DTC176 compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE no qual todos os três elementos Alu estão presentes, mas as orientações das sequências de Alu - 1 e Alu - 2 estão invertidas, o vetor viral DTC177 compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE com uma deleção das sequências de Alu - 1, Alu - 2 e Alu - 3, o vetor viral DTC178 compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE com uma deleção da sequência de Alu - 3 e o vetor viral DTC179 compreende um cassete de expressão de G6PC que compreende um GPE no qual todos os três elementos Alu estão presentes, mas a orientação da sequência de Alu - 3 está invertida).
[00117]No dia 5 após cotransfecção, as células infectadas foram lisadas por 2 horas a 37°C no tampão de lise contendo desoxicolato de sódio e Benzonase®. Os sobrenadantes das amostras foram então sequencialmente digeridos com DNase I e Proteinase K para liberar DNA genômico de rAAV. qPCR TaqMan que amplifica a região codificadora BGH-Poli-A do vetor de AAV foi então usada para determinar o número de cópia do genoma (GC) de rAAV com base em uma curva-padrão de plasmídeo de rAAV. A Figura 5 é um gráfico de barras que mostra as titulações de rAAV produzidas por células hospedeiras após transfecção de vários vetores de AAV. A Figura 5 mostra as titulações de rAAV medidas por qPCR, e sugere que a deleção de um ou mais dos elementos Alu do GPE (nos vetores DTC175, DTC177 e DTC178) aumentou significantemente o rendimento de rAAV, em comparação com DTC161, que contém o GPE do tipo selvagem. No entanto, a reversão de um ou mais dos elementos Alu (nos vetores DTC176 e DTC179) não aumentou o rendimento de rAAV, em comparação com DTC161. A quantificação do rendimento viral está resumida na Tabela 1. Como mostrado na Tabela 1, a deleção de um ou mais elementos Alu do GPE aumenta significantemente o rendimento de rAAV. Uma segunda análise que mostra as titulações de rAAV produzidas plotadas em função do tamanho do genoma do vetor é apresentada como um gráfico na Figura
6. A Figura 6 mostra que o genoma do vetor que possui o menor tamanho, DTC177 (representado pelo ID. DE SEQ. Nº: 1), produziu as maiores titulações. Tabela 1: Resumo da quantificação dos rendimentos virais produzidos por células HEK293 após transfecção de vetores de AAV (DTC161, DTC175, DTC176, DTC177, DTC178 ou DTC179). GC/ml médio pós- Rendimento cromatografia bruto (razão Nome da Tamanho do de afinidade Teor de Alu de aumento amostra genoma (bp) (razão de em relação a aumento em DTC161) relação a DTC161) DTC161 Todos os 3 4768 1,20e10 4,72E+12 Deleção de 1,58e10 9,50E+12 DTC175 4238 1 + 2 (1,3) (2,0) 1,15e10 4,95E+12 DTC176 Todos os 3 4768 (0,9) (1,1) Deleção de 2,22e10 9,75E+12 DTC177 3882 1 + 2 + 3 (1,9) (2,1) Deleção de 1,70e10 8,22E+12 DTC178 4412 3 (1,4) (1,7) DTC179 Todos os 3 4768 0,98e10 3,56E+12
(0,8) (0,8) Exemplo 3 - Deleção de elementos Alu aumenta o empacotamento de rAAV
[00118]A fim de avaliar se a deleção de um ou mais dos elementos Alu impacta o empacotamento dos rAAVs, os rAAVs produzidos como descrito no Exemplo 2 foram colhidos e o DNA total foi isolado de cada rAAV (produzido por um vetor viral de controle, DTC161, DTC175, DTC176, DTC177, DTC178 ou DTC179). Aproximadamente, 7,12 x 1010 de quantidade total de cada rAAV GC foram submetidos à eletroforese em gel de agarose, e subsequentemente corados com Ouro SYBR. O vetor viral de controle usado nesse experimento foi AAV8-LSP- hFIXco3-WPRE-pA (gerado em Virovek, purificação customizada, catálogo/lote # 150282 de 061015), que forneceu migração de tamanho de DNA conhecido no gel, e confirmação de que o método experimental era capaz de romper a integridade do capsídeo de AAV e liberar DNA empacotado.
[00119]Como mostrado na Figura 7, DNAs virais de comprimento total tinham entre 3,8 kb - 5 kb. ‘*’ representa degradação do capsídeo e genoma intacto de DNA de comprimento total isolado do vetor viral de controle mediante tratamento com dodecil sulfato de sódio (SDS).
[00120]Foi observada uma intensidade de coloração maior de DNA de comprimento total isolado de rAAVs de DTC177, DTC175 e DTC178, nos quais um ou mais elementos Alu foram deletados de GPE (veja a Figura 7). Esse resultado sugere que a deleção de pelo menos um elemento Alu aumenta o empacotamento de rAAV do genoma viral de comprimento total. Além disso, traçados analíticos de ultracentrífuga de partículas de DTC161 e DTC177 analisadas para partículas vazias (que aparecem em aproximadamente 60 S) e contendo DNA do vetor completo (que aparece a aproximadamente 100 S), respectivamente, demonstraram que a construção com os elementos Alu deletados produziu uma percentagem maior de partículas completas (veja as FIGS. 8A-8B). A Figura 8A é um gráfico que mostra traçados analíticos de ultracentrífuga de densidades de partícula da preparação do vetor DTC161 produzido em células HEK293. A Figura 8B é um gráfico que mostra traçados analíticos de ultracentrífuga de densidades de partícula pela preparação de vetor DTC177 (representado pelo ID. DE SEQ. Nº: 1) produzido em células HEK293.
[00121]Esses dados indicam que ocorre empacotamento aumentado em vetores desprovidos de sequências Alu. Exemplo 4 - Deleção de elementos Alu em GPE não afeta a potência do promotor A fim de avaliar se a deleção de um ou mais dos elementos Alu impacta a potência de GPE para dirigir a expressão do gene G6PC in vivo, rAAVs derivados de diferentes vetores (mostrados na Tabela 2) foram usados para infectar células hepáticas HuH7. Após 48 horas de infecção, as células foram lisadas e mRNA total foi colhido. A expressão de mRNA de G6PC foi analisada por RT-PCR quantitativa. As FIGS. 9A-9B mostram curvas de dose-resposta exemplares entre a dose de rAAV e o nível de expressão de mRNA de G6PC em células hepáticas HuH7 para rAAVs derivados de DTC161 e DTC177 (representado pelo ID. DE SEQ. Nº: 1). Figura 9A é uma curva de dose-resposta para expressão induzida de G6Pase-α após infecção com rAAV contendo DTC161. A Figura 9B é uma curva de dose-resposta para expressão induzida de G6Pase-α após infecção com rAAV contendo DTC177 (representado pelo ID. DE
SEQ. Nº: 1). Para calcular a potência relativa de uma amostra de teste, os valores de RNA (cópias do genoma por µg de RNA total) em cada multiplicidade de infecção (MOI) tanto para o padrão de referência (rAAV derivado de um vetor DTC161 produzido por batelada de desenvolvimento) quanto para a amostra de teste foram adicionados a um modelo de arquivo GraphPad Prism. O modelo usa uma transformação log-log dos dados e um ajuste linear que é limitado, de modo que as curvas possuem uma inclinação compartilhada. O eixo Y corresponde aos valores de RNA, e o eixo X corresponde à MOI da amostra. Os dados da Intercepção e Inclinação Y gerados pelo modelo de GraphPad Prism foram usados para determinar as Intercepções X do padrão de referência e da amostra de teste por implementação da seguinte fórmula: Int X = (0 - [Intercepção Y])/ Inclinação. O valor final da potência relativa é determinado por comparação das intercepções X utilizando a seguinte fórmula: 10^{[ Intercepção X de Referência] - [Intercepção X da Amostra]. Tabela 2. Resumo da potência relativa de GPE em cada amostra de rAAV. Amostra Potência relativa DTC-161 80% DTC-175 83% DTC-176 79% DTC-177 89% DTC-178 75% DTC-179 85%
[00122]Esse resultado sugere que a deleção de um ou mais de elementos Alu em GPE (nos vetores DTC175, DTC177 e DTC178) não compromete a potência do GPE para dirigir a expressão do gene G6PC in vivo.
[00123]Todas as publicações, patentes e literatura especificamente mencionadas nesse relatório descritivo são incorporadas por referência para todas as finalidades.
[00124]Subentende-se que essa invenção não está limitada à metodologia, protocolos, materiais e reagentes particulares descritos, na medida em que estes podem variar. Subentende-se também que a terminologia usada nesse relatório descritivo tem o único objetivo de descrever modalidades particulares, e não visa limitar o escopo da presente invenção, que será englobado pelas reivindicações em anexo.
[00125]Deve ser observado que, como usadas nesse relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas no singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências no plural, a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Além disso, os termos “um” (ou “uma”), “um ou mais” e “pelo menos um” podem ser usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Observa-se também que os termos “compreende”, “que compreende”, “contendo”, “incluindo” e “que possui” podem ser usados de forma intercambiável.
[00126]Sem mais elaboração, acredita-se que aqueles habilitados na técnica podem, com base na descrição acima, utilizar a presente invenção em toda a sua extensão. As modalidades específicas, portanto, devem ser consideradas como meramente ilustrativas, e não limitantes, do restante da revelação de qualquer forma.
[00127]Todas as características reveladas nesse relatório descritivo podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica revelada nesse relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que sirva para o mesmo fim, ou para um fim equivalente ou similar.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucleico recombinante caracterizada por compreender uma sequência promotora/intensificadora (GPE) de G6PC modificada, em que o GPE modificado é desprovido de uma ou mais sequências pelo menos 80% idênticas a um elemento Alu.
2. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o elemento Alu é selecionado dos nucleotídeos contíguos 1079 - 1272 (Alu - 1), 1633 - 1968 (Alu - 2) e 2140 - 2495 (Alu - 3) do ID. DE SEQ. Nº: 6.
3. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o GPE modificado possui uma sequência 80% idêntica aos nucleotídeos contíguos 146 - 2123 do ID. DE SEQ. Nº: 1, ou 80% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
4. Molécula de ácido nucleico recombinante caracterizada por compreender uma sequência promotora/intensificadora (GPE) de G6PC modificada e uma sequência codificadora de G6Pase-α, em que o GPE modificado é capaz de dirigir a expressão da sequência codificadora de G6Pase-α.
5. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o GPE modificado é desprovido de uma ou mais sequências pelo menos 80% idênticas a um elemento Alu selecionada dos nucleotídeos contíguos 1079 - 1272 (Alu - 1), 1633 - 1968 (Alu - 2) e 2140 - 2495 (Alu - 3) do ID. DE SEQ. Nº: 6.
6. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que o GPE modificado possui uma sequência 80% idêntica a nucleotídeos contíguos 146 - 2123 do ID. DE SEQ. Nº: 1, ou 90% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
7. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 - 6, caracterizada pelo fato de que a sequência codificadora de G6Pase-α compreende uma sequência idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 3 ou ID. DE SEQ. Nº: 4.
8. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 - 7, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante ainda compreende uma sequência sinalizadora de poliadenilação (poliA).
9. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a sequência sinalizadora de poliadenilação é uma sequência sinalizadora de poliA de SV40.
10. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 - 9, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante ainda compreende um íntron.
11. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 - 10, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante compreende o ID. DE SEQ. Nº: 1 ou o ID. DE SEQ. Nº: 2.
12. Vetor recombinante caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 - 11.
13. Vetor, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de vírus adenoassociado (AAV).
14. Vetor, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é um vetor de AAV do sorotipo 8 (AAV8).
15. Célula hospedeira isolada caracterizada por compreender a molécula de ácido nucleico recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 - 11.
16. Célula hospedeira isolada caracterizada por compreender o vetor recombinante conforme definido em qualquer uma das reivindicações 12 - 14.
17. Método de aumento do rendimento de rAAV, caracterizado por compreender a liberação do vetor recombinante conforme definido na reivindicação 13 ou 14 a uma cultura de célula hospedeira eucariótica e a colheita do rAAV da eucariótica cultura de células.
18. AAV recombinante (rAAV) caracterizado por compreender a molécula de ácido nucleico recombinante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 - 11.
19. rAAV, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o rAAV é rAAV8.
20. Composição caracterizada por compreender o rAAV conforme definido na reivindicação 18 ou 19 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
21. Método de tratamento de doença de armazenamento de glicogênio tipo-Ia (GSD-Ia) em um indivíduo humano, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz do rAAV ou a composição deste conforme definida em qualquer uma das reivindicações 18 - 20.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado por via intravenosa.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1011 até cerca de 1 x 1014 cópias do genoma (GC)/kg.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1012 até cerca de 1 x 1013 GC/kg.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 - 24, caracterizado pelo fato de que a administração do rAAV compreende a administração de uma dose única de rAAV.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 - 24, caracterizado pelo fato de que a administração do rAAV compreende a administração de múltiplas doses de rAAV.
27. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV) para o tratamento de GSD-Ia, o referido rAAV caracterizado por compreender um capsídeo de AAV e um genoma do vetor nele empacotado, o referido genoma do vetor compreendendo: (a) uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) 5’ de AAV; (b) uma sequência promotora/intensificadora que compreende os nucleotídeos contíguos 146 - 2123 do ID. DE SEQ. Nº: 1; (c) uma sequência codificadora que codifica uma glicose-6-fosfatase alfa (G6Pase-α); e
(d) uma ITR 3’ de AAV.
28. rAAV, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a G6Pase-α compreende uma sequência de aminoácidos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 5.
29. rAAV, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos de G6Pase-α é idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 5.
30. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 - 29, caracterizado pelo fato de que a sequência codificadora de (c) é pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. Nº: 3 ou ID. DE SEQ. Nº: 4.
31. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 - 30, caracterizado pelo fato de que o capsídeo de AAV é um capsídeo de AAV8.
32. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 - 31, caracterizado pelo fato de que o genoma do vetor ainda compreende uma sequência sinalizadora de poliadenilação (poliA).
33. rAAV, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a sequência sinalizadora de poliadenilação é uma sequência sinalizadora de poliA de SV40.
34. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 - 33, caracterizado pelo fato de que o genoma do vetor ainda compreende um íntron.
35. Composição caracterizada por compreender o rAAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 27 - 34 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
36. Método de tratamento de doença de armazenamento de glicogênio tipo-Ia (GSD-Ia) em um indivíduo humano, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz do rAAV conforme definido em qualquer uma das reivindicações 27 - 34 ou a composição deste conforme definido na reivindicação 35.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado por via intravenosa.
38. Método, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1011 até cerca de 1 x 1014 cópias do genoma (GC)/kg.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1012 até cerca de 1 x 1013 GC/kg.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 - 39, caracterizado pelo fato de que a administração do rAAV compreende a administração de uma dose única de rAAV.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 - 39, caracterizado pelo fato de que a administração do rAAV compreende a administração de múltiplas doses de rAAV.
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