BR112016011997B1 - Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, vírus adenoassociado recombinante (raav), composição e seus usos - Google Patents
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Abstract
MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA ISOLADA, VÍRUS ADENO-ASSOCIADO RECOMBINANTE (rAAV), COMPOSIÇÃO E SEUS USOS. A presente invenção descreve os vetores de vírus adeno-associado (AAV) melhorados para as aplicações de terapia de gene no tratamento de doença de armazenamento de glicogênio, particularmente doença de armazenamento de glicogênio tipo Ia (GSD-Ia). Descritas são as moléculas de ácido nucleico recombinantes, os vetores e o AAV recombinante que inclui um realçador/promotor de G6PC, um íntron sintético, uma sequência de codificação de G6PC (tal como, uma sequência de codificação de G6PC de códon otimizado ou tipo selvagem), e sequência de ácido nucleico de enrugamento por compressão situada entre o realçador/promotor de G6PC e o íntron, assim como entre o íntron e a sequência de codificação de G6PC. Os AAVs recombinantes descritos aqui apresentam transdução de fígado altamente eficiente e são capazes de corrigir anomalias metabólicas em um modelo de animal de GSD- Ia.
Description
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório no U.S. 61/908.861, depositado em 26 de novembro de 2013, o qual é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0002] A presente revelação refere-se a vetores para terapia de gene para o tratamento de doença de armazenamento de glicogênio, particularmente, doença de armazenamento de glicogênio tipo Ia.
[0003] A doença de armazenamento de glicogênio tipo Ia (GSD-Ia ou Doença de von Gierke, MIM232200) é causada por uma deficiência em glicose-6-fosfatase-α (G6Pase-α), uma enzima que é expressa principalmente no fígado, no rim e no intestino (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010). A G6Pase-α, codificada pelo gene 6PC gene, é uma proteína hidrofóbica ancorada no retículo endoplasmático (ER) por nove hélices transmembranas (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010). Essa enzima catalisa a hidrólise de glicose-6-fosfato (G6P) para glicose e fosfato na etapa terminal de glicogenólise e glico- neogênese. Os pacientes afetados por GSD-Ia não tem capacidade para manter a homeostasia da glicose, e apresentam hipoglicemia em jejum, retardamento de crescimento, hepatomegalia, nefromegalia, hi- perlipidemia, hiperuricemia e academia lática (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010).
[0004] Atualmente, não há cura para GSD-Ia. A hipoglicemia pode ser gerenciada usando-se terapias dietética (Greene et al., N Engl J Med 294: 423 a 425, 1976; Chen et al ., N Engl J Med 310: 171 a 175, 1984) que permitem que pacientes alcancem desenvolvimento puberal e crescimento quase normais. Contudo, as complicações clínicas a longo prazo e seus processos patológicos subjacentes permanecem não corrigidos. Um dos riscos crônicos mais significativos é o adenoma hepatocelular (HCA), que se desenvolve em 70 a 80% dos pacientes com GSD-I acima de 25 anos de idade (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010; Labrune et al., J Pediatr Gastroenterol Nutr 24:276 a 279, 1997; Rake et al., Eur J Pediatr 161(Suppl 1):S20 a S34, 2002). Os HCAs em pacientes com GSD-Ia são pequenos, múltiplos e não encapsulados, com complicações que incluem compressão local e hemorragia intratumoral. Em 10% dos pacientes com GSD-Ia, os HCAs sofrem transformação maligna para carcinoma hepatocelular (HCC) (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010; Rake et al., Eur J Pediatr 161(Suppl 1):S20 a S34, 2002; Franco et al., J Inherit Metab Dis 28:153 a 162, 2005).
[0005] Estudos de terapia de gene usando vírus adeno-associado recombinante (AAV) que carrega G6Pase-α foram realizados em modelos animais de GSD-Ia; esses estudos demonstraram eficácia na ausência de toxicidade (revisado em Chou e Mansfield, Expert Opin Biol Ther 11:1011 a 1024, 2011). Estudos anteriores usando o modelo de camundongo de GSD-Ia mostraram que AAV recombinante que expressa G6Pase-α direcionado pelo promotor de CBA/realçador de CMV (Ghosh et al., Gene Ther 13:321 a 329, 2006), o promotor de G6PC canino (Koeberl et al., Gene Ther 13:1281 a 1289, 2006), ou o promotor de G6PC humano em nucleotídeos -298 a +128 da região de flanqueamento 5' deG6PC (Koeberl et al., Mol Ther 16:665 a 672, 2008) entregam o transgene G6Pase-α para o fígado e alcançam correção estendida desse distúrbio. Contudo, apesar de esses estudos parecerem promissores, nenhum teve capacidade para corrigir completamente a deficiência de G6Pase-α hepática.
[0006] São fornecidas, no presente documento, moléculas de ácido nucleico recombinantes, vetores de vírus adeno-associado (AAV) e AAV recombinante que podem ser usados nas aplicações de terapia de gene para o tratamento de doença de armazenamento de glicogê- nio, especificamente, GSD-Ia.
[0007] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes incluem um realçador/promotor de G6PC, um íntron sintético e a região de codificação de G6PC, sendo o último opcionalmente de códon otimizado para expressão em células humanas. As moléculas de ácido nucleico recombinantes incluem adicionalmente sequência de ácido nucleico de enrugamento por compressão situada entre o realçador/promotor de G6PC e o íntron, assim como entre o íntron e a sequência de codificação de G6PC. Em particular exemplos não limitadores, as moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendem nucleotídeos 182 a 4441 da SEQ ID N°: 1 ou nucleotídeos 182 a 4441 da SEQ ID N°: 3.
[0008] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes incluem adicionalmente sequências de repetição de terminal invertido (IRT) 5' e 3'. Em alguns exemplos, as moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendem nucleotídeos 17 a 4819 da SEQ ID N°: 1 ou nucleotídeos 17 a 4819 da SEQ ID N°: 3. Em outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendem as sequências de ácido nucleico de vetor completo da SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 3.
[0009] São também fornecidos vetores que compreendem as moléculas de ácido nucleico recombinantes reveladas no presente documento. Em algumas modalidades, os vetores são vetores de AAV, tal como vetores de AAV8. Adicionalmente, são fornecidas células hospedeiras isoladas que compreendem as moléculas de ácido nucleico recombinantes ou vetores revelados no presente documento. Por exemplo, as células hospedeiras isoladas podem ser células adequadas para a propagação de AAV.
[0010] Também é fornecido no presente documento AAV recombi- nante (rAAV) que compreendem as moléculas de ácido nucleico re- combinantes reveladas no presente documento. As composições que compreendem o rAAV são também fornecidas pela presente revelação.
[0011] Adicionalmente, é fornecido um método de tratamento de um indivíduo diagnosticado com uma doença de armazenamento de glicogênio, sendo que o método compreende selecionar um indivíduo com a doença de armazenamento de glicogênio tipo Ia (GSD-Ia) e administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do rAAV ou composições que compreendam o rAAV reveladas no presente documento.
[0012] Os precedentes e outros objetivos, características e vantagens da invenção se tornarão mais aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, a qual procede com referência às figuras anexas.
[0013] As Figuras 1A a 1B são gráficos que mostram os resultados de análise fenotípica de camundongos G6pc-/- infundidos em AAV- GPE. (Figura 1A) Pesos corporais de camundongos G6pc-/- fêmeas infundidos com 1,2 x 1011 vg/camundongo de AAV-GPE e suas ninhadas de G6pc+/+/G6pc+/- fêmeas são mostrados. A idade na infusão (2 dias, 2 semanas ou 4 semanas) é mostrada acima do gráfico. (o), camundongos G6pc+/+/G6pc+/-; (•), camundongos G6pc-/- infundidos em AAV-GPE. (Figura 1B) Níveis de glicose, colesterol, triglicerídeo, ácido úrico e ácido lático no sangue de camundongos infundidos com AAV- GPE são mostrados. Devido às similaridades dos respectivos metabóli- tos em cada grupo, os dados mostrados são dados reunidos das idades de 6 a 24 semanas. Camundongos (+/+ & +/-), G6pc+/+/G6pc+/-, (-/-), G6pc-/-, ou (-/- GPE), G6pc-/- infundidos com AAV-GPE com idade de 2 dias (n = 36), 2 semanas (n = 24) ou 4 semanas (n = 9). Os dados são apresentados como valores padrão da média. *p < 0,05, **p < 0,005.
[0014] As Figuras 2A a 2B são gráficos que mostram atividade de G6Pase-α hepática e expressão de mRNA em camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE e do tipo selvagem seguindo um jejum de 24 horas. Sete camundongos G6pc-/- de 2 semanas de idade, 11 de quatro semanas, um de 15 semanas (*) e um de 30 semanas de idade (**) foram infundidos com doses variáveis de AAV-GPE; a atividade de G6Pase-α e a expressão de mRNA foram avaliadas quando camundongos tinham de 70 a 90 semanas de idade. (Figura 2A) A atividade de G6Pase-α hepática é mostrada nas idades indicadas em semanas (S). Os camundongos são agrupados com base em sua atividade de G6Pase-α em relação à atividade do tipo selvagem como baixo (AAV- L), médio (AAV-M) e alto (AAV-H). (Figura 2B) A expressão de G6Pase-α hepática de mRNA e sua relação com a atividade de G6Pase-α em camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE. Os dados são apresentados como valores padrão da média. Na Figura 2B, *P < 0,05, **P < 0,005.
[0015] As Figuras 3A a 3C são gráficos que mostram os resultados de análise fenotípica de camundongos G6pc-/- tratados com AAV- GPE com idade de 70 a 90 semanas. (Figura 3A) Níveis de glicose, colesterol, triglicerídeo, ácido úrico e ácido lático no sangue. (Figura 3B) solução de glicose, comprimento corporal e IMC. F, fêmeas; M, machos. (Figura 3C) Peso do fígado. Tratamentos são indicados como: (+/+), camundongos do tipo selvagem; (-/- AAV), camundongos G6pc-/- infundidos com várias dosagens de AAV-GPE. AAV-L (n = 6), AAV-M (n = 9) e AAV-H (n = 5) são camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE que expressam atividade de G6Pase-α hepática normal de 3 a 9% (baixa, L), de 22 a 63% (média, M) e de 81 a 128% (alta, H), respectivamente. Os dados são apresentados como valores padrão da média. *P < 0,05, **P < 0,005.
[0016] As Figuras 4A a 4C são gráficos que mostram perfis de tolerância à glicose e glicose no sangue em jejum. (Figura 4A) Perfis de glicose no sangue do tipo selvagem e camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE com idade de 70 a 90 semanas. (Figura 4B) Perfis de glicose no sangue em jejum de camundongos G6pc-/- não tratados com idade de 6 a 8 semanas. (Figura 4C) Perfis de tolerância à glicose de camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE e do tipo selvagem com idade de 70 a 90 semanas. Camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE ou do tipo selvagem ficaram em jejum por 6 horas, foram injetados intraperitonealmente com 2 mg/g de dextrose e, depois, tive-rem seu sangue amostrado a cada 30 minutos através da veia caudal. Os dados são apresentados como valores padrão da média. (+/+), camundongos do tipo selvagem; (-/-), camundongos G6pc-/- não tratados. AAV-L (n = 6), AAV-M (n = 9) e AAV-H (n = 5) são expressão de camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE de 3 a 9%, 22 a 63% e 81 a 129% de atividade de G6Pase-α hepática normal, respectivamente.
[0017] As Figuras 5A a 5C são gráficos que mostram níveis de mRNA hepáticos e de insulina no sangue para SREBP-1c e glicoci- nase em camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE e do tipo selvagem de 70 a 90 semanas de idade após 24 horas de jejum. (Figura 5A) Níveis de insulina no sangue em jejum e sua relação com pesos corporais dos animais. (Figura 5B) Quantificação de mRNA de SREBP-1c por RT-PCR em tempo real. (Figura 5C) Quantificação de mRNA de glicocinase e a relação de insulina no sangue em jejum com níveis de mRNA de glicocinase hepática. (+/+, o), camundongos do tipo selvagem (n = 20); (-/- AAV, •) camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE (n = 20). Os dados são apresentados como valores padrão da média. **P< 0,005.
[0018] As Figuras 6A a 6D são gráficos que mostram os resultados de análise bioquímica em camundongos G6pc-/- tratados com rAAV- miGPE e rAAV-GPE do tipo selvagem com 12 semanas. Sendo que rAAV-GPE e rAAV-miGPE são vetores de rAAV que expressam G6Pase humana direcionada pelo 2864-bp do realçador/promotor deG6PC (GPE) humano e pelo 382-bp do realçador/promotor de G6PC (miGPE) de humano mínimo, respectivamente. (Figura 6A) Atividade de G6Pase-α microssômica hepática e sua relação com os números de cópia de genoma de vetor. (Figura 6B) Curva de crescimento. (Figura 6C) Valores de IMC. (Figura 6D) Níveis de glicose no sangue. (o) tratados com rAAV-GPE de dose alta e alto GPE; (•) tratados com rAAV- miGPE de dose alta e alto miGPE; (□) tratados com rAAV-GPE de dose baixa e baixo GPE; camundongos G6pc-/- (■) tratados com rAAV- miGPE de dose baixa e baixo miGPE; camundongos (▼) do tipo selvagem, (+/+). Os dados são valores padrão da média. *P < 0,05.
[0019] As Figuras 7A a 7C são gráficos que mostram os resultados da análise fenotípica em camundongos G6pc-/- tratados com rA- AV-miGPE e rAAV-GPE, tipo selvagem com 12 semanas de idade. (Figura 7A) Peso de fígado. (Figura 7B) Teores de glicogênio hepático. (Figura 7C) Teores de triglicerídeo hepático. Camundongos G6pc-/- tratados com rAAV-GPE de dose alta e alto GPE (n = 6), tratados com rAAV-miGPE de dose alta e alto GPE (n = 6); tratados com rAAV-GPE de dose baixa e baixo GPE (n = 6); tratados com rAAV-GPE de baixa dose e baixo miGPE (n = 6); (+/+), camundongos do tipo selvagem. Os dados são valores padrão da média. *P < 0,05.
[0020] As Figuras 8A a 8C são gráficos que mostram perfis de tolerância à glicose e glicose no sangue em jejum em camundongos G6pc-/- tratados com rAAV-miGPE e rAAV-GP, do tipo selvagem com 12 semanas de idade. (Figura 8A) Perfis de glicose no sangue em jejum. (Figura 8B) Níveis de glicose no sangue em seguida de um jejum de 24 horas. (Figura 8C) Perfis de tolerância à glicose. (o) tratados com rAAV-GPE de dose alta e alto GPE (n = 6); (•) tratados com rA- AV-miGPE de dose alta e alto miGPE (n = 6); (□) tratados com rAAV- GPE de dose baixa e baixo GPE (n = 6); (■) tratados com rAAV- miGPE de dose baixa e baixo miGPE; (+/+), camundongos do tipo selvagem (n = 24) (▼). Os dados são valores padrão da média. *P < 0,05, **P < 0,005.
[0021] A Figura 9 é um alinhamento das sequências de proteína de G6Pase-α glicogênio (SEQ ID N°: 10) e humana (SEQ ID N°: 4).
[0022] A Figura 10 é uma tabela que mostra as diferenças de aminoácidos entre G6Pase-α humana, de camundongo, de rato e canina.
[0023] A Figura 11 é um gráfico que mostra a atividade de G6pase hepática em camundongos com GSD-Ia transduzida com rA- AV. Os camundongos com GSD-Ia foram transduzidos com um vetor de rAVV8 (1013 vg/kg) que expressa tanto G6Pase (co) humana nativa quanto a de códon otimizado direcionada pelo realçador/promotor GPE. A atividade de G6pase hepática em camundongos com 12 semanas de idade foi de 165,4 ± 18,2 nmol/min/mg.
[0024] A Figura 12 é um gráfico que mostra peso de fígado em camundongos com GSD-Ia tratados com rAAV e (+/+) tipo selvagem com 12 semanas de idade.
[0025] As Figuras 13A e 13B são gráficos que mostram perfis de glicose no sangue em jejum e de tolerância à glicose, respectivamente, em camundongos (•) com GSD-Ia tratados com rAAV8-GPE-co- G6Pasee (o) do tipo selvagem com 12 semanas de idade.
[0026] As sequências de aminoácido e ácido nucleico listadas na listagem de sequência anexa são mostradas usando-se abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, e código de três letras para aminoácidos, conforme definido em 37 C.F.R. 1.822. Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, mas o filamento complementar é compreendido como incluído por qualquer referência ao filamento exibido. A Listagem de Sequência é enviada como um arquivo de texto ASCII criado em 12 de novembro de 2014, com 39,6 KB, que é incorporado a título de referência no presente documento. Na Listagem de Sequência anexa: SEQ ID N°: 1 é a sequência de nucleotídeo do plasmídeo UF11-GPE- G6PC, que inclui as seguintes características: ITR - nucleotídeos 17 a 163 Realçador/promotor de G6PC - nucleotídeos 182 a 3045 Enrugamento por compressão - nucleotídeos 3051a 3184 Íntron - nucleotídeos 3185 a 3321 Enrugamento por compressão - nucleotídeos 3322 a 3367 Sequência de codificação de G6PC - nucleotídeos 3368 a 4441 ITR - nucleotídeos 4674 a 4819 SEQ ID N°: 2 é a sequência de nucleotídeo do plasmídeo UF11-K29- G6PC incluindo as seguintes características: ITR - nucleotídeos 17 a 163 Realçador/promotor de G6PC - nucleotídeos 182 a 3045 Íntron - nucleotídeos 3052 a 3188 Sequência de codificação de G6PC - nucleotídeos 3202 a 4275 ITR - nucleotídeos 4508 a 4653 SEQ ID N°: 3 é a sequência de nucleotídeo do plasmídeo UF11-GPE- co-G6PC incluindo as seguintes características: ITR - nucleotídeos 17 a 163 Realçador/promotor de G6PC - nucleotídeos 182 a 3045 Enrugamento por compressão - nucleotídeos 3051a 3184 Íntron - nucleotídeos 3185 a 3321 Enrugamento por compressão - nucleotídeos 3322 a 3367 Sequência de codificação de G6PC - nucleotídeos 3368 a 4441 ITR - nucleotídeos 4674 a 4819 SEQ ID N°: 4 é a sequência de aminoácido da proteína de G6PC humano. SEQ ID N°s: 5 a 8 são sequências iniciadoras. SEQ ID N°: 9 é a sequência de nucleotídeo de G6PC canino. SEQ ID N°: 10 é a sequência de aminoácido de G6PC canino. DESCRIÇÃO DETALHADA I. Abreviações AAV vírus adeno-associado IMC índice de massa corporal CBA β-actina de galinha CMV citomegalovírus ELISA ensaio imunoabsorvente ligado à enzima G6P glicose-6-fosfato G6PC glicose-6-fosfato, subunidade catalítica G6PT transportador de glicose-6-fosfato GPE realçador/promotor de G6PC GSD doença de armazenamento de glicogênio H&E hematoxilina &eosina HCA adenoma hepatocelular HCC carcinoma hepatocelular ITR repetição de terminal invertido ORF quadro de leitura aberta rAAVAAV recombinante vg genomas virais vp partículas virais
[0027] Exceto quando indicado de outro modo, os termos técnicos são usados de acordo com o uso convencional. As definições de termos comuns na biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado pela Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado pela Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado pela VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0028] A fim de facilitar a revisão das várias modalidades da revelação, as seguintes explicações dos termos específicos são fornecidas:
[0029] Vírus adeno-associado (AAV): Um pequeno vírus não en- velopado e defectivo em replicação que infecta humanos e algumas outras espécies de primata. O AAV não é conhecido por causar doença e obtém uma resposta imunológica muito fraca. Os vetores para terapia de gene que utilizam AAV podem infectar tanto células quies- centes quanto divisoras e podem persistir em um estado extracromos- sômico sem se integrar ao genoma da célula hospedeira. Essas características tornam o AAV um vetor viral atrativo para terapia de gene. Atualmente, há 11 serotipos reconhecidos de AAV (AAV1 a 11).
[0030] Administração/Administrador: Para fornecer ou proporcionar a um indivíduo um agente, tal como um agente terapêutico (por exemplo, um AAV recombinante), por qualquer rota eficaz. Rotas exemplificativas de administração incluem, mas sem limitação, rotas de injeção (tais como subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), oral, intraductal, sublingual, retal, transdérmica, intranasal, vaginal e inalação.
[0031] Códon otimizado: Um ácido nucleico "de códon otimizado" se refere a uma sequência de ácido nucleico que foi alterada de modo que os códons sejam ideias para expressão em um sistema particular (tal como um grupo ou espécie particular de espécies). Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico pode ser aperfeiçoada para expressão em células de mamíferos ou em uma espécie de mamífero particular (tal como células humanas). O aperfeiçoamento do códon não altera a sequência de aminoácido da proteína codificada.
[0032] Realçador: Uma sequência de ácido nucleico que aumenta a taxa de transcrição aumentando a atividade de um promotor.
[0033] G6PC: Um gene localizado em cromossomo humano 17q21 que codifica glicose-6-fosfatase-α (G6Pase-α). G6Pase-α é uma proteína hidrofóbica de 357 aminoácidos que tem 9 hélices que ancoram a mesma no retículo endoplasmático (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010). A proteína de G6Pase-α catalisa a hidrólise de glicose 6-fosfato para glicose e fosfato na etapa terminal de glico- neogênese e glicogenólise e é uma enzima fundamental na homeosta- sia da glicose. As mutações no gene G6PC causam a doença de armazenamento de glicogênio tipo Ia (GSD-Ia), que é um distúrbio metabólico caracterizado por hipoglicemia grave em jejum associada ao acúmulo de glicogênio e gordura no fígado e rins.
[0034] Doença de armazenamento de glicogênio (GSD): Um grupo de doenças que resulta de defeitos no processamento de síntese ou quebra de glicogênio dentro dos músculos, fígado e outros tecidos. A GSD pode tanto ser genética ou adquirida. A GSD genética é causada por qualquer defeito congênito de metabolismo envolvido nesses processos. Atualmente, há 11 doenças de armazenamento de glicogênio reconhecidas (GSD tipo I, II, III, IV, V, VI, VII, IX, XI, XII e XIII). A GSD-I consiste em dois distúrbios autossômicos recessivos, GSD-Ia e GSD-Ib (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010). A GSD-Ia resulta de uma deficiência em glicose-6-fosfatase-α. As deficiências no transportador de glicose-6-fosfato (G6PT) são responsáveis por GSD-Ib.
[0035] Doença de armazenamento de glicogênio tipo Ia (GSD- Ia): Também conhecida como doença de von Gierke, a GSD-Ia é a doença de armazenamento de glicogênio mais comum, que tem uma incidência de cerca de 1 em 100.000 nascimentos vivos. A GSD-Ia é uma doença genética que resulta da deficiência da enzima glicose-6- fosfatase-α (G6Pase-α). A deficiência em G6Pase-α prejudica a capacidade do fígado de produzir glicose livre a partir de glicogênio e a partir da gliconeogênese. Os pacientes afetados por GSD-Ia não tem capacidade para manter a homeostasia da glicose e apresentam hipogli- cemia em jejum, retardamento de crescimento, hepatomegalia, nefro- megalia, hiperlipidemia, hiperuricemia e academia lática (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010). Atualmente, não há cura para GSD-Ia.
[0036] Íntron: Um estiramento de DNA dentro de um gene que não contém informações de códon para uma proteína. Íntrons são removidos antes da tradução de um RNA mensageiro.
[0037] Repetição de terminal invertido (ITR): Sequências de ácido nucleico simétricas no genoma de vírus adeno-associados exigidas para replicação eficiente. As sequências de ITR são localizadas em cada extremidade do genoma do DNA de AAV. As ITRs servem como as origens da replicação para síntese de DNA viral e são componentes cis essenciais para a geração de vetores de integração de AAV.
[0038] Isolado: Um componente biológico "isolado" (tais como uma molécula de ácido nucleico, proteína, vírus ou célula) foi substancialmente separado, ou purificado, dos outros componentes biológicos na célula ou tecido do organismo, ou do próprio organismo, em que o componente ocorre naturalmente, tal como outro DNA e RNA cromos- sômico e extracromossômico, proteínas e células. As moléculas e proteínas de ácido nucleico que foram "isoladas" incluem aquelas purifi- cadas por métodos de purificação padrão. O termo também engloba moléculas e proteínas de ácido nucleico preparadas por expressão recombinante em uma célula hospedeira assim como moléculas e proteínas de ácido nucleico quimicamente sintetizadas.
[0039] Ligado Operacionalmente: Uma primeira sequência de ácido nucleico é ligada operacionalmente a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação se o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Em geral, sequências de DNA operacionalmente ligadas são contíguas e, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, no mesmo quadro de leitura.
[0040] Transportador farmaceuticamente aceitável: Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis (veículos) úteis nessa revelação são convencionais. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a Edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para entrega farmacêutica de um ou mais compostos, moléculas ou agentes terapêuticos.
[0041] Em geral, a natureza do transportador irá depender do modo de administração particular sendo empregado. Por exemplo, formulações parenterais geralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos fisiologica e farmaceuticamente aceitáveis tais como água, salina fisiológica, soluções de sal equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou similares como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, pó, pílula, tablete ou formas de cápsula), transportadores sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Adicionalmente aos transportadores biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes emulsificantes ou umectantes, conservantes e agentes de tampona- mento de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaura- to de sorbitano.
[0042] Prevenir, tratar ou melhorar uma doença: "Prevenir" uma doença (tal como GSD-Ia) se refere à inibição todo o desenvolvimento de uma doença. "Tratar" se refere a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica após a mesma ter começado a se desenvolver. "Melhorar" se refere à redução no número ou gravidade de sinais ou sintomas de uma doença.
[0043] Promotor: Uma região de DNA que direciona/inicia a transcrição de um ácido nucleico (por exemplo, um gene). Um promotor inclui sequências de ácido nucleico necessárias próximas ao local de início de transcrição. Tipicamente, os promotores são localizados próximos aos genes que os mesmos transcrevem. Um promotor também inclui opcionalmente um acentuador distal ou elementos repres- sores que podem ser localizados tanto quanto diversos milhares de pares de base a partir do local inicial de transcrição.
[0044] Purificado: O termo "purificado" não exige pureza absoluta; em vez disso, o mesmo se destina a ser um termo relativo. Portanto, por exemplo, um peptídeo, proteína, vírus ou outro composto ativo purificado é um que é isolado no total ou em parte de proteínas associadas naturalmente e outros contaminantes. Em certas modalidades, o termo "substancialmente purificado" se refere a um peptídeo, proteína, vírus ou outro composto ativo que foi isolado a partir de uma célula, meio de cultura de célula, ou outra preparação crua e submetido a fracionamento para remover vários componentes da preparação inicial, tais como proteínas, resíduos celulares, e outros componentes.
[0045] Recombinante: Uma molécula de ácido nucleico recombi- nante é um que tem uma sequência que não ocorre naturalmente ou tem uma sequência que é produzida a partir de uma combinação artificial de dois segmentos separados de outro modo da sequência. Essa combinação artificial pode ser alcançada por síntese química ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de moléculas de ácido nucleico, tal como por técnicas de engenharia genética.
[0046] De modo similar, um vírus recombinante é um vírus que compreende uma sequência (tal como sequência genômica) que não ocorre naturalmente ou que é feita por combinação artificial de pelo menos duas sequências de origem diferente. O termo "recombinante" inclui também ácidos nucleicos, proteínas e vírus que foram unicamente alterados por adição, substituição, ou deleção de uma porção de um vírus, proteína ou molécula de ácido nucleico natural. Conforme usado no presente documento, "AAV recombinante" se refere a uma partícula de AAV em que uma molécula de ácido nucleico recombinante (tal como uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica G6Pase-α) foi empacotada.
[0047] Identidade de sequência: A identidade ou similaridade entre duas ou mais sequências de ácido nucleico, ou duas ou mais sequências de aminoácidos, é expressa em termos da identidade ou similaridade entre as sequências. A identidade de sequência pode ser medida em termos da identidade percentual; quanto maior a porcentagem, mais idênticas são as sequências. A similaridade de sequência pode ser medida em termo de similaridade percentual (que leva em consideração substituições de aminoácido conservadoras); quanto maior a porcentagem, mais similar são as sequências. Homólogos ou ortólogos de sequências de ácido nucleico ou aminoácidos têm um grau relativamente alto de identidade/similaridade de sequência quando alinhados usando métodos padrão. Essa homologia é mais signifi- cativa quando as proteínas ortólogas ou cDNAs são derivadas de espécies que são relacionadas de modo mais próximo (tais como sequências de humano e camundongo), em comparação a espécies relacionadas de modo mais distante (tais como sequências de humano e C. elegans).
[0048] Os métodos para alinhar as sequências para a comparação são bem conhecidos na técnica. Os vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith & Waterman, Adv. (PCT) Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237 a 244, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 a 153, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10.881 a 10.890; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155 a 165, 1992; e Pearson et al., Meth. Mol. bio. 24 307 a 331 1994 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 a 410, 1990 apresentam uma consideração deta-lhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homolo- gia.
[0049] NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. está disponível a partir de diversas fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) e na internet para o uso em relação a diversos programas de análise de sequência blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx. Informações adicionais podem ser encontradas na página da web do NCBI.
[0050] Serotipo: Um grupo de micro-organismos relacionados de modo próximo (tais como vírus) distinguidos por um conjunto característico de antígenos.
[0051] Sequência de enrugamento por compressão: Se refere a uma sequência de nucleotídeos contida dentro de uma molécula de ácido nucleico maior (tal como um vetor) que é usado tipicamente para criar espaçamento desejado entre duas características de ácido nu- cleico (tal como entre um promotor e uma sequência de codificação), ou para estender uma molécula de ácido nucleico de modo que a mesma tenha um comprimento desejado. As sequências de enruga- mento por compressão não contêm informações de codificação de proteína e podem ser de origem desconhecida/sintética e/ou não relacionada a outras sequências de ácido nucleico dentro de uma molécula de ácido nucleico maior.
[0052] Indivíduo: Organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui mamíferos humanos e não humanos.
[0053] Sintético: Produzido por meios artificiais em um laboratório, por exemplo, um ácido nucleico sintético pode ser quimicamente sintetizado em um laboratório.
[0054] Quantidade terapeuticamente eficaz: Uma quantidade de um agente terapêutico ou farmacêutico especificado (por exemplo, um AAV recombinante) suficiente para alcançar um efeito desejado em um indivíduo, ou em uma célula, sendo tratado com o agente. A quantidade eficaz do agente será dependente de diversos fatores, incluindo, mas sem limitação ao indivíduo ou células sendo tratados, e da maneira de administração da composição terapêutica.
[0055] Vetor: Um vetor é uma molécula de ácido nucleico que permite a inserção de ácido nucleico estranho sem prejudicar a capacidade do vetor de replicar e/ou se integrar a uma célula hospedeira. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que permitem ao mesmo se replicar em uma célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Um vetor pode inclui também um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos. Um vetor de expressão é um vetor que contém as sequências reguladoras necessárias para permitir a transcrição e tradução de gene ou genes inseridos. Em algumas modalidades no presente documento, o vetor é um vetor AAV.
[0056] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica ao qual a invenção pertence. As formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referências plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. "Que compreende A ou B" significa que inclui A, ou B, ou A e B. Deve ser compreendido adicionalmente que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados e são fornecidos para a descrição. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas no presente documento estão aqui incorporados em sua totalidade a título de referência. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as explicações de termos, prevalecerá. Ainda, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes. Exemplos III. Visão Geral de Diversas Modalidades
[0057] São fornecidos no presente documento moléculas de ácido nucleico recombinantes, vetores de AAV e AAV recombinante que podem ser usados em aplicações de terapia de gene para o tratamento da doença de armazenamento de glicogênio, especificamente, GSD-Ia.
[0058] As moléculas de ácido nucleico recombinantes incluem um realçador/promotor de G6PC (GPE), um íntron sintético e a região de codificação de G6PC. A região de codificação de G6PC é opcionalmente de códon otimizado para expressão em células humanas. As moléculas de ácido nucleico recombinantes incluem adicionalmente sequência de ácido nucleico de enrugamento por compressão situada entre o realçador/promotor de G6PC e o íntron, assim como entre o íntron e a sequência de codificação de G6PC. As moléculas de ácido nucleico recombinantes podem incluir adicionalmente sequências de repetição de terminal invertido (ITR) 5' e 3' quando englobadas dentro de um vetor de AAV.
[0059] É revelado no presente documento que uma G6Pase-α que expressa AAV recombinante com o realçador/promotor de G6PC (AAV-GPE) é significativamente mais eficiente no direcionamento de expressão transgênica hepática in vivo do que outras G6Pase-α que expressa AAV recombinante que tem um promotor/realçador alternativo (isto é, o promotor de actina-β de galinha/realçador de CMV). Acima de um período de estudo de 24 semanas, camundongos deficientes em G6PC (um modelo para GSD-Ia) tratados com AAV-GPE exibiram normalização completa de deficiência de G6PC hepático conforme evidenciado pelos níveis normais de glicose, metabólitos no sangue, glicogênio hepático e gordura hepática (consulte Exemplo 1 e Yiu et al., Mol Ther 18:1076 a 1084, 2010). Além disso, um estudo a longo prazo de camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE demonstrou que terapia de gene mediada por AAV-GPE foi eficaz por pelo menos 70 a 90 semanas em camundongos que expressam mais do que 3% de G6Pase-α hepática. Em particular, camundongos tratados com AAV-GPE exibiram armazenamento de gordura hepática normal, me- tabólito sanguíneo normal e perfis de tolerância à glicose, níveis de insulina no sangue em jejum reduzidos, e não tiveram evidência de anormalidades hepáticas, tais como adenoma hepatocelular (consulte Exemplo 2 e Lee et al., Hepatology 56:1719 a 1729, 2012).
[0060] Adicionalmente revelada no presente documento está a constatação de que os elementos de realçador a montante do promotor de G6PC são críticos para a expressão ideal de G6PC em um modelo animal de GSD-Ia. Especificamente, é demonstrado que o trata- mento com AAV-GPE, que compreende o realçador/promotor de G6PC em nucleotídeos -2684 a -1 (relativo ao local inicial de G6PC) produz níveis significativamente superiores de expressão de G6Pase-α hepática, atingiu maior redução em acúmulo de glicogênio hepático e levou a uma tolerância maior de jejum em um modelo de camundongo de GSD-Ia, em comparação com a G6Pase-α que expressa AAV re- combinante que contém apenas um realçador/promotor de G6PC mínimo de 383 bp (consulte Exemplo 3 e Lee et al., Mol Genet Metab. 110(3):275-280, 2013).
[0061] Também é revelada no presente documento a constatação de que sequências de nucleotídeo de enrugamento por compressão presentes entre o realçador/promotor de G6PC e o íntron, assim como entre o íntron e a sequência de codificação de G6PC, são importantes para a transdução de fígado e expressão de G6Pase-α. Em particular, o AAV recombinante produzido a partir do plasmídeo UF11-K29-G6PC (SEQ ID N°: 2) que não tem as sequências de enrugamento por compressão, exibiram atividade de G6Pase de 7,3 nmol/min/mg. Em comparação, AAV recombinante produzido a partir de plasmídeo UF11- GPE-G6PC (SEQ ID N°: 1) exibiu atividade de G6Pase de 33,0 nmol/min/mg (consulte Exemplo 4). A presente revelação fornece a primeira descrição das sequências de enrugamento por compressão presente nos vetores de AAV estabelecidos no presente documento como SEQ ID N°: 1 e SEQ ID N°: 3.
[0062] Adicionalmente, dados revelados no presente documento demonstram que a otimização de códon da sequência de codificação de G6PC aumenta a eficiência da tradução aproximadamente 1,5 a 2,5 vezes o que resulta em expressão de G6Pase-α significativamente maior no fígado em seguida da administração de AAV-co-GPE (que contém uma sequência de ácido nucleico de G6PC de códon otimizado), em comparação com a administração de AAV-GPE, que codifica G6PC do tipo selvagem (consulte Exemplo 5).
[0063] Juntos, esses resultados indicam que AAV recombinante que compreende o realçador/promotor de G6PC em nucleotídeos -2684 a -1, um íntron sintético, sequências de enrugamento por compressão flanqueando o íntron e a região de codificação de G6PC (do tipo selvagem ou de códon otimizado) são características críticas para expressão transgênica hepática e o tratamento de GSD-Ia in vivo eficientes.
[0064] São fornecidas, no presente documento, moléculas de ácido nucleico recombinantes que compreendem uma sequência de nu- cleotídeo que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a nucleotídeos 182 a 4441 da SEQ ID N°: 1 ou nucleotídeos 182 a 4441 da SEQ ID N°: 3. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode conter substituições de nucleotídeo dentro da região de codificação de G6PC, tal como para otimização de códon. Como outro exemplo, a região de codificação de G6PC pode ser um G6PC de uma espécie diferente, tal como G6PC canino ou uma versão de códon otimizado (para expressão em humanos) de G6PC canino. Em alguns exemplos, a região de codificação de G6PC estabelecida como nucleotídeos 182 a 3045 SEQ ID N°: 1 ou nucleotídeos 182 a 3045 da SEQ ID N°: 3 é substituída pela sequência de codificação de G6PC canina (SEQ ID N°: 9). Alternativamente, a região de codificação de G6PC humana da SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 3 pode conter substituições de nucleotídeo que resultam em mudanças de codificação em resíduos que diferem entre as sequências de proteína de G6PC humana e canina. Por exemplo, substituições de nucleotídeo podem ser introduzidas para resultar em mudanças de codificação em resíduos 3, 54, 139, 196, 199, 242, 247, 292, 298, 301, 318, 324, 332, 347, 349, 350 e/ou 353 da proteína de G6PC humana (SEQ ID N°: 4). A Figura 9 mostra um alinhamento das sequências de proteína de G6Pase-α humana e canina, e a Figura 10 fornece uma tabela que mostra as diferenças de aminoácidos entre G6Pase-α humana, de camundongo, de rato e canina. A presente revelação contempla substituições de nucleotídeo que alteram a sequência de aminoácido em qualquer um dos resíduos listados na Figura 10.
[0065] Em outros casos, substituições de nucleotídeo podem estar presentes na sequência de enrugamento por compressão ou na sequência do íntron sintético. As substituições de nucleotídeo são também provavelmente toleradas dentro da sequência de vetor, tal como sequência de vetor a jusante (isto é, 3' até a ITR 3'), ou entre a ITR 5' e GPE, ou entre a região de codificação de G6PC e a ITR 3'. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendem nucleotídeos 182 a 4441 da SEQ ID N°: 1 ou nucleotídeos 182 a 4441 da SEQ ID N°: 3. Essas moléculas de ácido nucleico recombinantes incluem a sequência do realçador/promotor de G6PC em nucleotídeos -2684 a -1, um íntron sintético, sequências de enru- gamento por compressão flanqueando o íntron, e a região de codificação de G6PC. SEQ ID N°: 1 inclui uma sequência de codificação de G6PC do tipo selvagem, enquanto a SEQ ID N°: 3 inclui uma sequência de codificação de G6PC de códon otimizado.
[0066] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes incluem adicionalmente sequências de ITR 3' e 5'. Portanto, são fornecidas moléculas de ácido nucleico recombinantes que compreendem uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica aos nucleotídeos 17 a 4819 da SEQ ID N°: 1 ou nucleotídeos 17 a 4819 da SEQ ID N°: 3. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendem nucleotídeos 17 a 4819 da SEQ ID N°: 1 ou nucleotídeos 17 a 4819 da SEQ ID N°: 3. Em par- ticular exemplos não limitadores, as moléculas de ácido nucleico re- combinantes compreendem a sequência completa da SEQ ID N°: 1 (o plasmídeo UF11-GPE-G6PC usado para gerar AAV-GPE) ou a SEQ ID N°: 3 (o plasmídeo UF11-GPE-co-G6PC usado para gerar de códon otimizado AAV-co-GPE). Em outros exemplos, as moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendem uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 3.
[0067] Em outras modalidades, é fornecida uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende uma sequência de nucleotí- deo que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica aos nucleotídeos 182 a 4275 da SEQ ID N°: 2. Em alguns exemplos, a molécula nucleica recombinante compreende nucleotídeos 182 a 4275 da SEQ ID N°: 2. Em alguns exemplos, a molécula de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica aos nucleotídeos 17 a 4653 da SEQ ID N°: 2. Em alguns exemplos, a molécula de ácido nucleico re- combinante compreende nucleotídeos 17 a 4653 da SEQ ID N°: 2. Em exemplos específicos não limitadores, a molécula de ácido nucleico recombinante compreende a sequência completa da SEQ ID N°: 2 (o plasmídeo UF11-K29-G6PC que não tem sequência de enrugamento por compressão). Em outros exemplos, a molécula de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à SEQ ID N°: 2.
[0068] São adicionalmente fornecidos vetores que compreendem as moléculas de ácido nucleico recombinantes reveladas no presente documento. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de AAV. O serotipo de AAV pode ser qualquer serotipo adequado para entrega de transgenes a um indivíduo. Em alguns exemplos, o vetor de AAV é um AAV de serotipo 8 (AAV8). Em outros exemplos o vetor de AAV é um vetor de serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 ou 12 (isto é, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11 ou AAV12). Em ainda outros exemplos, o vetor de AAV é um híbrido de dois ou mais serotipos de AAV (tais como, mas sem limitação, AAV2/1, AAV2/7, AAV2/8 ou AAV2/9). A seleção de serotipo de AAV irá depender, em parte, do(s) tipo(s) de células que são alvejados para a terapia de gene. Para o tratamento de GSD-Ia, o fígado e o rim são os órgãos- alvo relevantes.
[0069] São também fornecidas no presente documento células hospedeiras isoladas que compreendem a moléculas de ácido nuclei- co recombinantes ou vetores revelados no presente documento. Por exemplo, a célula hospedeira isolada pode ser uma célula (ou linhagem de célula) apropriada para a produção de AAV recombinante (rA- AV). Em alguns exemplos, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, tais como células HEK-293, BHK, Vero, RD, HT-1080, A549, Cos- 7, ARPE-19, ou MRC-5.
[0070] São fornecidos adicionalmente rAAV que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante revelada no presente documento. Em algumas modalidades, o rAAV é rAAV8 e/ou rAAV2. Contudo, o serotipo de AAV pode ser qualquer outro serotipo adequado de AAV, tal como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11 ou AAV12, ou um híbrido de dois ou mais sero- tipos de AAV (tal como, mas sem limitação, AAV2/1, AAV2/7, AAV2/8 ou AAV2/9). As composições que compreendem um rAAV revelado no presente documento e um transportador farmaceuticamente aceitável são também fornecidos pela presente revelação. Em algumas modalidades, as composições são formuladas para administração intravenosa ou intramuscular. Formulações farmacêuticas adequadas para a administração de rAAV podem ser encontradas, por exemplo, no Pedido de Patente n° U.S. 2012/0219528.
[0071] São adicionalmente fornecidos métodos de tratamento de um indivíduo diagnosticado com uma doença de armazenamento de glicogênio, que compreende selecionar um indivíduo com GSD-Ia e administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um rAAV (o uma composição que compreende um rAAV) revelado no presente documento. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado intravenosamente.
[0072] Em algumas modalidades, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1011 a cerca de 1 x 1014 de partículas virais (vp)/kg. Em alguns exemplos, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1012 a cerca de 8 x 1013 vp/kg. Em outros exemplos, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1013 a cerca de 6 x 1013 vp/kg. Em exemplos específicos não limitadores, o rAAV é administrado em uma dose de pelo menos cerca de 1 x 1011, pelo menos cerca de 5 x 1011, pelo menos cerca de 1 x 1012, pelo menos cerca de 5 x 1012, pelo menos cerca de 1 x 1013, pelo menos cerca de 5 x 1013, ou pelo menos cerca de 1 x 1014 vp/kg. Em outros exemplos não limitadores, o rAAV é administrado em uma dose de não mais do que cerca de 5 x 1011, não mais do que cerca de 1 x 1012, não mais do que cerca de 5 x 1012, não mais do que cerca de 1 x 1013, não mais do que cerca de 5 x 1013, ou não mais do que cerca de 1 x 1014 vp/kg. Em um exemplo não limitante, o rAAV é administrado em uma dose de cerca de 1 x 1012 vp/kg. O rAAV pode ser administrado em uma dose única, ou em múltiplas doses (tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou10 doses) con- forme necessário para os resultados terapêuticos. IV. Aplicações de Terapia de Gene para AAV Recombinante
[0073] AAV pertence à família Parvoviridae e ao gênero Dependo- virus. AAV é um vírus pequeno, não envelopado que empacota um genoma de DNA de filamento único linear. Ambos os filamentos senso e antissenso de DNA de AAV são empacotados em capsídeos de AAV com igual frequência.
[0074] O genoma de AAV é distinguido por duas repetições de terminal invertido (ITRs) que flanqueiam dois quadros de leitura aberta (ORFs). No genoma de AAV2, por exemplo, os primeiros 125 nucleotí- deos da ITR são um palíndromo, que se dobra sobre si mesmo para maximizar o pareamento de base e forma uma estrutura em forma de gancho com formato em T. As outras 20 bases da ITR, chamadas de a sequência D, permanecem não pareadas. As ITRs são sequências de atuação cis importantes para a replicação do DNA de AAV; sendo que a ITR é a origem da replicação e serve como um iniciador para a síntese de segundo filamento por polimerase de DNA. O DNA de filamento duplo formado durante essa síntese, que é chamado de monômero de forma replicante, é usado para um segundo ciclo de replicação au- toiniciante e forma um dímero de forma replicante. Esses intermediários de filamento duplo são processados através de um mecanismo de deslocamento de filamento, o que resulta em DNA de filamento único usado para o DNA de empacotamento e de filamento duplo usados para transcrição. Localizados dentro da ITR estão os elementos de aglutinação de Rep e um local de resolução terminal (TRS). Essas características são usadas pela Rep proteína regulatória viral durante a replicação de AAV para processar os intermediários de filamento duplo. Adicionalmente a seu papel na replicação de AAV, a ITR é também essencial para o empacotamento, transcrição, regulação negativa em condições não permissivas e integração específica de local do ge- noma de AAV (Daya e Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583 a 593, 2008).
[0075] O ORF esquerdo do AAV contém o gene Rep, que codifica quatro proteínas - Rep78, Rep68, Rep52 e Rep40. O ORF direito contém o gene Cap que produz três proteínas de capsídeo viral (VP1, VP2 e VP3). O capsídeo de AAV contém 60 proteínas de capsídeo viral dispostas em uma simetria icosahedral. VP1, VP2 e VP3 estão presentes em uma razão molar de 1:1:10 (Daya e Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583 a 593, 2008).
[0076] Atualmente, o AAV é um dos vírus mais frequentemente usados para terapias de gene. Apesar de o AAV infectar humanos e algumas outras espécies de primata, não se conhece que cause doença e tem uma resposta imunológica muito fraca. Os vetores para terapia de gene que utilizam AAV podem afetar células tanto divisoras quanto quiescentes e persistem em um estado extracromossômico sem se integrar ao genoma da célula hospedeira. Por causa das características vantajosas da AAV, a presente revelação contempla o uso de AAV para as moléculas de ácido nucleico recombinantes e métodos revelados no presente documento.
[0077] O AAV tem diversas características desejáveis para um vetor de terapia de gene, incluindo a capacidade para aglutinar e entrar em células-alvo, entrar no núcleo, a capacidade para ser expressa no núcleo por um período de tempo prolongado e baixa toxicidade. Contudo, o tamanho pequeno do genoma de AAV limita o tamanho do DNA heterólogo que pode ser incorporado. Para minimizar esse problema, vetores de AAV foram construídos, os quais não codificam Rep e o elemento de eficiência de integração (IEE). As ITRs são retidas, visto que as mesmas são sinais cis exigidos para o empacotamento (Daya e Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583 a 593, 2008).
[0078] Os métodos para produzir rAAV adequado para terapia de gene são bastante conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Pedido de Patente nos U.S. 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971 e 2013/0072548; e Ghosh et al., Gene Ther 13(4):321 a 329, 2006), e podem ser utilizados com as moléculas de ácido nucleico recombinan- tes e métodos revelados no presente documento.
[0079] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar determinados recursos e/ou modalidades específicos. Os exemplos não devem ser interpretados por limitar a revelação aos recursos ou modalidades específicos descritos.
[0080] Esse exemplo descreve uma comparação de dois vetores de AAV que expressam G6Pase-α, acionados por dois promotores diferentes, em eficiência de entrega de gene hepático e expressão de G6Pase-α em camundongos deficientes em G6PC. Os resultados demonstram que o vetor de AAV com o realçador/promotor de G6PC (AAV-GPE) foi mais eficiente no direcionamento de expressão de transgene hepático in vivo persistente do que o vetor de AAV com o promotor de actina-β de galinha/realçador de CMV (AAV-CBA). Adici-onalmente, camundongos deficientes em G6PC tratados com AAV- GPE exibiram níveis normais de glicose no sangue, metabólitos no sangue, glicogênio hepático e gordura hepática.
[0081] O plasmídeo UF11-GPE-G6PC, que contém G6Pase -α humana sob o controle do realçador/promotor de G6PC foi construído modificando-se pUF11-mG6Pase-α-CBA (Ghosh et al., Gene Ther 13:321 a 329, 2006) onde a G6Pase-α de murino é acionada pelo promotor de CBA/realçador de CMV (Xu et al., Hum Gene Ther 12:563 a 573, 2001) conforme o seguinte: O fragmento Tkp-neo de pUF11- mG6Pase-α-CBA foi cortado pela digestão de XhoI/SphI, sendo que o vetor restante purificado com gel, polido com polimerase de DNA T4, depois autoligado para produzir pUF11-mG6Pase-α-CBA-[Tkp-neo]-/-. A mG6Pase-α, junto com o promotor de CBA/realçador de CMV, em pUF11-mG6Pase-α-CBA-[Tkp-neo]-/- foi depois substituída pelo cDNA G6Pase-α humano nos locais 5'-SbfI e 3'-NotI, produzindo pUF11- G6PC. Depois, a PCR foi usada para clonar nucleotídeos -2864 a -1 da região flanqueando 5' de G6PC que contém o realçador/promotor de G6PC humano. O modelo de PCR foi um cromossomo artificial bac- teriano que contém o gene G6PC humano (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) e os pares de iniciadores foram: 5'- CAGCAACTACCAGGATCGC-3' (SEQ ID n° 5) 5) e 2AS (5'- CCTCATTTCCTTGGCACCTC-3'; SEQ ID N°: 6), que contêm locais de KpnI e XbaI adicionais nas extremidades 5' e 3', respectivamente. Depois, o fragmento KpnI-XbaI que contém o realçador/promotor de G6PC foi ligado no pUF11-G6PC linearizado KpnI-XbaI, para produzir pUF11-G6PC-GPE-1. Em seguida, a PCR foi usada para clonar o ín- tron quimérico a parti do vetor de pCI (Promega, Madison, WI) usando par de iniciador 3S (5'-AGGTAAGTATCAAGGTTACA-3‘; SEQ ID N°: 7) e KNTC2-A02-10-3 (SEQ ID N°: 8) que contêm locais de Spel e Sbfl adicionais nas extremidades 5' e 3', respectivamente. Depois, esse íntron quimérico foi ligado como um fragmento de SpeI-SbfI no fragmento de pUF11-G6PC-GPE-I grande linearizado de SpeI-SbfI, para produzir pUF11-GPE-G6PC (SEQ ID N°: 1). Todos os construtos foram verificados pelo sequenciamento de DNA.
[0082] AAV-GPE e AAV-CBA foram produzidos usando pUF11- GPE-G6PC e pUF11-mG6Pase-α-CBA, respectivamente, e gerados, purificados e titulado conforme previamente descrito (Ghosh et al., Gene Ther 13:321 a 329, 2006). A quantificação de genoma de vetor foi realizada usando-se PCR em tempo real com iniciadores e sondas direcionadas contra o G6PC ou o promotor de CBA.
[0083] Uma terapia de glicose, que consiste de injeção intraperitoneal de 25 a 100 μl de 15% de glicose a cada 12 horas, foi administrada aos camundongos G6pc-/- conforme anteriormente descrito (Lei et al., Nat Genet 13:203 a 209, 1996). Permitiu-se que os camundongos que sobreviveram tivessem acesso irrestrito a camundongo Ração de Camundongo (Zeigler Bros., Inc., Gardners, PA).
[0084] O vetor de AAV foi infundido em camundongos G6pc-/- com 2 dias de idade através da veia temporal, e infundido em camundongos G6pc-/- com 2 ou 4 semanas de idade através sino retro-orbital. Camundongos G6pc+/+/G6pc+/- com idade compatível assim como camundongos G6pc-/- com 4 a 6 semanas de idade foram usados como controles. Para os camundongos infundidos com vírus, a terapia de glicose terminou imediatamente após a infusão.
[0085] O teste de tolerância à glicose de camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE de 12 a 14 semanas de idade consistiu no jejum por 6 horas antes da amostragem de sangue, seguido da injeção de 0,25 ml de 10% de dextrose subcutaneamente, e amostragem repetida de sangue através da veia caudal a cada 30 minutos por duas horas adicionais.
[0086] Isolamento de microssoma e ensaios de fosfohidrolase foram determinados essencialmente conforme anteriormente descrito (Lei et al., Nat Genet 13:203 a 209, 1996). As misturas de reação (100 μl) continham 50 mM de tampão de cacodilato, pH 6,5, 10 mM de G6P e quantidades apropriadas de preparações microssômicas foram incubadas a 37°C por 10 minutos. As membranas microssômicas interrom- pidas foram preparadas ao incubar membranas intactas em 0,2% de desoxicolato por 20 minutos a 0°C. A atividade de fosfatase não específica foi estimada pela pré-incubação de preparações microssômicas interrompidas em pH 5 por 10 minutos a 37°C, para inativar a G6Pase- α ácido-lábil.
[0087] A análise histoquímica de enzima de G6Pase-α foi realizada incubando-se 10 μm de seções de tecido de fígado espessas por 10 minutos em temperatura ambiente em uma solução que contém 40 mM de Tris-maleato pH 6,5, 10 mM de G6P, 300 mM de sacarose e 3,6 mM de nitrato de chumbo (Teutsch, Prog Histochem Cytochem 14:1 a 92, 1981). O fosfato de chumbo capturado foi visualizado em seguida à conversão para o sulfeto de chumbo de cor marrom (Teu- tsch, Prog Histochem Cytochem 14:1 a 92, 1981).
[0088] As amostras de sangue foram coletadas a partir da veia caudal. A glicose no sangue, colesterol total e ácido úrico foram analisados usando-se kits obtidos pela Thermo Electron (Louisville, CO). Os triglicerídeos foram medidos com um kit da Sigma Diagnostics (St Louis, MO) e o lactato foi medido por um kit da Trinity Biotech (St. Louis, MO).
[0089] Para hematoxilina e eosina (H&E) e coloração Oil Red O, as seções do fígado foram preservadas em 10% de formalina tampo- nada neutra e seccionadas em 4 a 10 mícrons de espessura. As seções marcadas foram visualizadas usando-se o microscópio Axios- kop2 plus e o software AxioVision 4.5 (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Para a medição histoquímica quantitativa de acúmulo de lipídeo, a marca com Oil Red O foi convertida em unidades de densidade de pixel usando-se Adobe Photoshop CS3 (Adobe System Incorporated, San Jose, CA).
[0090] Para determinar o teor de glicogênio do fígado, o tecido foi homogeneizado com HCl, fervido por 10 minutos e neutralizado com acetato de sódio até um pH final de 4,5 (Teutsch, Prog Histochem Cytochem 14:1 a 92, 1981). Depois, o tecido hidrolisado foi digerido com amilo-α-1,4-α-1,6-glucosidase e a glicose liberada foi medida usando um kit obtido pela Sigma Diagnostics. O teor de glicogênio foi relatado como unidades de glicosil em nmol por mg de proteína hepática.
[0091] Os anticorpos contra G6Pase-α de murino ou humana foram detectados por análise de Western-blot. As proteínas microssômi- cas de células COS-1 infectadas por G6Pase-α Ad-humana ou G6Pase-α Ad-camundongo (Ghosh et al., J Biol Chem 277: 32837 a 32842, 2002) foram resolvidas por eletroforese através de 12% de gel de poliacrilamida-SDS e borradas de modo transversal em membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA). A membrana foi colocada em um Aparelho de Triagens Múltiplas (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que contém múltiplos canais. A tira de membrana abaixo de cada canal foi incubada com um soro anti-G6Pase-α humano de coelho (Ghosh et al., J Biol Chem 277: 32837 a 32842, 2002) diluído 1:3000, ou amostras de soro de animais infundido em AAV- GPE ou AAV-CBA 1:200. Amostras de soro de ninhadas de G6pc-/- e G6pc+/+/G6pc+/- não tratadas diluídas 1:200 foram usadas como controles. Após uma noite de incubação, as tiras de membrana foram, então, incubadas com IgG anticoelho de cabra conjugado com peroxidase de rábano silvestre ou IgG anticamundongo de cabra (Kirkegarrd & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). O imunocomplexo foi visualizado pelo sistema quimioluminescente usando o substrato de SuperSignalTM West Pico Chemiluminescent de Pierce (Rockford, IL).
[0092] Fígados de camundongo foram congelados rapidamente, embutidos em O.C.T. (Sakura Finetek, Terrance, CA), e seccionados a 8 mícrons de espessura. As seções foram fixadas em acetona por 10 minutos a -20°C, secas, lavadas com PBS, bloqueadas com PBS que contém 2% de BSA por 30 minutos e incubadas a 4°C d urante a noite com um anticorpo policlonal de coelho contra CD8 (Abcam Inc., Cambridge, MA) em PBS suplementado com 1% de BSA. Após lavagens com PBS, as seções foram incubadas por 1 hora a 25°C no escuro com um anticorpo IgG anticoelho de cabra conjugado com corante de Alexa Fluor® 488 (Invitrogen). As lavagens seguintes com PBS, as células rotuladas foram montadas um antidescolorante, meio de montagem à base de água que contém DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e visualizadas usando o microscópio de fluorescência Axi- oskop2 (Carl Zeiss, Thornwood, NY). As células CD8+ foram contadas em dez campos aleatoriamente selecionados com ampliação de 200 vezes, e relatadas como a média mediana.
[0093] O teste t não pareado foi realizado usando o programa GraphPad Prism®, versão 4 (Software GraphPad, San Diego, CA). Os valores foram considerados estatisticamente significativos a p < 0,05. RESULTADOS
[0094] Para examinar o impacto in vivo de sequências a montante de nucleotídeos -298 do elemento promotor de G6PC humano anteriormente estudado (Koeberl et al., Mol Ther 16:665 a 672, 2008), AAV- GPE, um vetor de AAV8 que expressa G6Pase-α humana sob o controle de nucleotídeos -2864 a -1 da região de flanqueamento de 5' de G6PC humano foi construído. Visto que não há padrão em que se inicia a terapia de gene mediada por AAV em camundongos (Ghosh et al., Gene Ther 13:321 a 329, 2006; Koeberl et al., Gene Ther 13:1281 a 1289, 2006; Koeberl et al., Mol Ther 16:665 a 672, 2008), e que há evidência de que a perda de eficiência e persistência de transferência de gene é influenciada pela taxa aumentada de proliferação hepatoce- lular associada com crescimento do fígado (Cunningham et al., Mol Ther 16:1081 a 1088, 2008), os camundongos G6pc-/- foram infundidos em três idades diferentes, 2 anos de idade, duas semanas de idade ou 4 semanas de idade, e a expressão de G6Pase-α hepática foi examinada até as 24 semanas de idade. Apesar da diferença de idade, cada grupo de camundongos foi infundido com a mesma dose de AAV-GPE (1,2 x 1011 genomas virais (vg) /camundongo). Os perfis metabólicos dos animais infundidos foram monitorados durante o estudo de 24 semanas e todas as medições em comparação com aquelas de suas ninhadas de G6pc+/+/G6pc+/- e camundongos G6pc-/- não tratados de 4 a 6 semanas de idade. A GSD-Ia é um distúrbio autossômico recessivo, e estudos anteriores mostraram que o fenótipo das ninhadas de G6pc+/+ e G6pc+/- são indistinguíveis e do tipo selvagem (Lei et al., Nat Genet 13:203 a 209, 1996).
[0095] Houve mortes prematuras nos animais de G6pc-/- infundidos durante a duração do estudo de 24 semanas da ITR, independentemente da idade de infusão. Em camundongos G6pc-/- infundidos com idade de 2 dias com AAV-GPE (1,2 x 1011 vg/camundongo, equivalente a 6 x 1013 vg/kg), a atividade de G6Pase-α hepática foi de 77,6% de atividade controle com idade de duas semanas, diminuindo para 16,2% com idade de 4 semanas e 6,5% de atividade controle com idade de 6 semanas (Tabela 1). Contudo, acima de 6 semanas os níveis de atividade de G6Pase-α hepática estabilizaram até 24 semanas (Tabela 1). Portanto, a expressão caiu 11,9 vezes durante todo o estudo de 24 semanas, sendo que a maioria da queda de ITR ocorreu dentro das primeiras 6 semanas.
[0096] Em contraste, em camundongos G6pc-/- infundidos com idade de 2 semanas com AAV-GPE (1,2 x 1011 vg/camundongo, equivalente a 1,5 x 1013 vg/kg) a atividade de G6Pase-α hepática duas semanas após infusão (com idade de 4 semanas) foi 2,4 vezes maior do que a atividade em suas ninhadas de G6pc+/+/G6pc+/- (Tabela 1), alcançando 433,4 ± 11,1 nmol/mg/min. Apesar de a atividade de G6Pase-α hepática ter sofrido subsequentemente um declínio de 2,6 vezes entre as idades de 4 a 6 semanas, o mesmo resultou em uma atividade de G6Pase-α hepática quase normal (174,0 ± 22,4 nmol/mg/min) sendo mantida da idade de 6 semanas até a duração do estudo de 24 semanas da ITR (Tabela 1). De modo similar, em camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE com idade de 4 semanas com a mesma dosagem (1,2 x 1011 vg/camundongo, equivalente a 1 x 1013 vg/kg) a atividade de G6Pase-α hepática com idade de 24 semanas foi 335,6 ± 40,2 nmol/min/mg, 1,9 vezes maior do que a atividade nas ninhadas de controle (Tabela 1). Essas descobertas são consistentes com a proposta anterior (Cunningham et al., Mol Ther 16:1081 a 1088, 2008) de que a perda de eficiência e persistência de transferência de gene são influenciadas pela taxa aumentada de proliferação hepatocelular associada com o crescimento do fígado. As injeções em estágios posteriores de desenvolvimento, quando a taxa de crescimento do fígado é mais baixa, resultaram em menos perda de expressão genética.
[0097] A distribuição da expressão de transgene de G6Pase-α no fígado foi investigada. Conforme esperado, não houve atividade de G6Pase-α marcada nas seções de fígado de camundongos G6pc-/- não tratados. Em camundongos G6pc+/+/G6pc+/-, a análise histoquími- ca de enzima mostrou G6Pase-α distribuída pelo fígado, mas com níveis significativamente superiores em proximidade aos vasos sanguíneos.
[0098] Em camundongos G6pc-/- infundidos com idade de 2 dias com AAV-GPE, a atividade de G6Pase-α hepática foi distribuída pelo fígado com idade de duas semanas. Diferente de camundongos do tipo selvagem, a expressão foi desigual com centros marcados mais fortemente do que nos fígados controle. A atividade de G6Pase-α marcada notavelmente diminuiu da idade de 2 a 4 semanas, consistente com um declínio de 4,8 vezes em atividade de fosfohidrolase (Tabela 1). Novamente, a atividade de G6Pase marcada diminuiu e estabilizou com a idade de 6 semanas.
[0099] Em camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE com idade de 2 ou 4 semanas, as análises histoquímicas de enzima novamente mostraram que a transgene de G6Pase-α foi distribuída pelo fígado com centros que continham níveis significativamente superiores de atividade enzimática. Novamente, as atividades de G6Pase-α estimadas por análises histoquímicas estavam de acordo com os ensaios de fosfohidrolase quantitativos (Tabela 1). Em camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE com idade de duas semanas, houve células no fígado que marcaram menos intensamente do que células nos fígados do tipo selvagem. Portanto, um padrão normal de expressão de G6Pase-α hepática não foi restaurado em camundongos infundidos com AAV-GPE, apesar de exibirem atividade de G6Pase-α do tipo selvagem.TABELA 1. ATIVIDADE DE G6Pase HEPÁTICA EM CAMUNDONGOS G6PC-/- INFUNDIDOS COM 1,2 X 1011 VG/CAMUNDONGO DE AAV-GPE
[00100] Camundongos G6pc-/- (-/-) foram infundidos com 1,2 x 1011 vg/camundongo de AAV-GPE com idade de 2 dias, duas semanas, ou 4 semanas conforme descrito em MATERIAIS e MÉTODOS. Camundongos G6pc+/+/G6pc+/- (+/+ & +/-) de idade compatível foram usados como controles positivos e camundongos G6pc-/- (-/-) com 4 a 6 sema- nas de idade foram usados como controles negativos. Valores na tabela foram corrigidos em relação aos anteriores ao subtrair a atividade de G6Pase-α (1,8 ± 0,2 nmol/min/mg) nos microssomas do fígado de camundongos G6pc-/- não tratados a partir dos respectivos resultados. Os dados são apresentados como valores padrão da média.
[00101] O promotor de CBA/realçador de CMV foi amplamente usado para direcionar altos níveis de expressão de transgene hepática (Xu et al., Hum Gene Ther 12:563-573, 2001). Contudo, o realçador de CMV é conhecido por ser silenciado por metilação de CpG e não-CpG extensiva (Brooks et al., J Gene Med 6:395 a 404, 2004; Mehta et al., Gene 428: 20 a 24, 2009). Em experimentos anteriores in vivo usando AAV-CBA, um vetor de AAV8 que expressa G6Pase-α de murino sob o controle do promotor de CBA/realçador de CMV híbrido mostrou pouca expressão (Ghosh et al., Gene Ther 13:321 a 329, 2006), possivelmente relacionada à metilação do promotor de CMV. Para comparar a eficácia in vivo da transferência de gene hepática entre AAV-CBA e AAV-GPE, camundongos G6pc-/-foram infundidos com uma dose aumentada de AAV-CBA a 4,8 x 1011 vg/camundongo de uma maneira similar aos experimentos com AAV-GPE - nas idades de 2 dias e duas semanas, e seguiu até 24 semanas de idade.
[00102] Para camundongos G6pc-/- infundidos com 2 dias de idade, a atividade de G6Pase-α hepática com idade de duas semanas foi de 2,8 vezes maior em camundongos infundidos em AAV-CBA em comparação com camundongos infundidos em AAV-GPE (Tabelas 1 e 2), o que reflete a dosagem 4 vezes maior de AAV-CBA infundido. Contudo, a atividade de G6Pase-α hepática nos animais infundidos com AAV-CBA de modo neonatal diminuiu rapidamente para 20,6 ± 1,1 nmol/mg/min com a idade de 4 semanas (Tabela 2), um declínio de 18,6 vezes em duas semanas, em comparação com um declínio de 4,8 vezes em camundongos G6pc-/- neonatais infundidos com AAV- GPE (Tabela 1). Visto que CBA e GPE estão em situação de vetor idêntico, essa constatação sugere que o promotor de CBA/realçador de CMV é menos eficiente no direcionamento de expressão de transgene hepática in vivo persistente do que o realçador/promotor de G6PC.
[00103] Em camundongos G6pc-/- infundidos com 4,8 x 1011 vg/camundongo de AAV-CBA com idade de duas semanas, a atividade de G6Pase-α hepática foi 236,9 ± 64,7 com idade de 4 semanas (Tabela 2), que foi 1,83 vezes menor do que camundongos G6pc-/- com 4 semanas de idade infundidos com idade de 2 semanas com 1,2 x 1011 vg/camundongo de AAV-GPE (Tabela 1). Além disso, a atividade de G6Pase-α hepática continuou a declinar com o vetor de CBA de 55,7 ± 2,7 nmol/mg/min com idade de 6 semanas a 38,1 ± 1,7 nmol/mg/min com idade de 24 semanas (Tabela 2). Isso foi em contraste com os níveis expressos com o vetor de GPE que estabilizou durante esse período de tempo em níveis próximos ao tipo selvagem (Tabela 1).
[00104] As análises histoquímicas de enzima de animais infundidos com AAV-CBA mostraram que a coloração de atividade foi similar àquelas do vetor de GPE, distribuída de modo não uniforme com inúmeros centros coloridos mais forte do que nos fígados controle. Mas consistente com os ensaios de fosfohidrolase quantitativos (Tabela 2), as intensidades de coloração gerais foram significativamente inferiores com o aumento da idade dos camundongos infundidos.TABELA 2. ATIVIDADE DE G6Pase HEPÁTICA EM CAMUNDONGOS G6PC-/- INFUNDIDOS COM 4,8 X 1011 VG/CAMUNDONGO DE AAV-CBA
[00105] Camundongos (-/-) G6pc-/- foram infundidos com 4,8 x 1011 vg/camundongo de AAV-CBA com idade de 2 dias e 2 semanas conforme descrito em MATERIAIS e MÉTODOS. Camundongos G6pc+/+/G6pc+/- (+/+ & +/-) de idade compatível foram usados como controles positivos e camundongos G6pc-/- (-/-) com 4 a 6 semanas de idade foram usados como controles negativos. Valores na tabela foram corrigidos em relação aos anteriores ao subtrair a atividade de G6Pase-α (1,8 ± 0,2 nmol/min/mg) nos microssomas do fígado de camundongos G6pc-/- não tratados a partir dos respectivos resultados. Os dados são apresentados como valores padrão da média.
[00106] Camundongos G6pc-/- em terapia de glicose têm retardamento no crescimento e com duas semanas de idade sua solução de glicose média é aproximadamente 60% de suas ninhadas G6pc+/+/G6pc+/- (Lei et al., Nat Genet 13:203 a 209, 1996). Camundongos G6pc-/- neonatais infundidos com AAV-GPE tiveram uma taxa de crescimento notavelmente aprimorada e os pesos corporais dos animais infundidos foram comparáveis aos camundongos controle (Figura 1A). Camundongos G6pc-/- infundidos com idade de 2 ou 4 semanas com AAV-GPE exibiram uma curva de crescimento que foi paralela à de suas ninhadas G6pc+/+/G6pc+/-, mas em valores inferiores, consistente com os pesos corporais iniciais inferiores de camundongos G6PC-/- antes de começar a terapia de gene (Figura 1A).
[00107] Em terapia de glicose, os camundongos G6pc-/-continuaram a manifestar hipoglicemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperuricemia e academia lática (Lei et al., Nat Genet 13:203 a 209, 1996; Kim et al., J Hepatol 48: 479 a 485, 2008). Em contraste, os camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE tiveram perfis de glicose no sangue normais (Figura 1B), e nenhum dos animais infundidos sofreu da crise hipoglicêmica frequente típica dos camundongos G6pc-/- não tratados (Lei et al., Nat Genet 13:203 a 209, 1996) e de pacientes humanos com GSD-Ia (Chou et al., Curr Mol Med 2:121 a 143, 2002). Os níveis de glicose no sangue em camundongos G6pc-/- infundidos de modo neonatal foram significativamente menores do que suas ni-nhadas controle (Figura 1B), o que sugere que a atividade de G6Pase- α hepática restaurada para 6,5% dos níveis controle é insuficiente para manter perfil de glicose no sangue normal. Em contraste, os níveis de glicose no sangue em camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE com idade de 2 ou 4 semanas foram indistinguíveis daqueles em suas ninhadas controle (Figura 1B). A infusão de AAV-GPE também norma- lizou os níveis de colesterol soro, triglicerídeo, ácido úrico e ácido láti- co, apesar de que os camundongos G6pc-/- infundidos tiveram níveis ligeiramente maiores de colesterol no sangue e de ácido lático (Figura 1B).
[00108] A hepatomegalia é outra apresentação clínica em GSD-Ia e é principalmente causada pelo excesso de deposição de glicogênio e lipídeo (Chou et al., Curr Mol Med 2:121 a 143, 2002). Nenhuma anormalidade histológica foi observada nas seções de tecido do fígado dos camundongos transduzidos com AAV-GPE e dos não afetados com idade de 24 semanas. O teor de glicogênio no fígado de camundongos G6pc+/+/G6pc+/- de 24 semanas de idade teve a média de 1,89 ± 0,17 nmol de unidades de glicosil por mg de proteína. Em animais infundidos com AAV-GPE de modo neonatal, o teor de glicogênio em 24 semanas de idade foi significativamente superior a 4,65 ± 0,19 nmol de unidades de glicosil por mg de proteína, indicativo do defeito no armazenamento de glicogênio observado em camundongos com GSD- Ia. Em contraste, os camundongos que recebem infusões a 2 ou 4 semanas de idade mostraram níveis do tipo selvagem de glicogênio em 24 semanas de idade, a saber, 1,61 ± 0,39 e 1,65 ± 0,19 nmol de unidades de glicosil por mg de proteína, respectivamente, indicativo da ausência da histologia característica da doença de GSD-Ia nesse estágio de desenvolvimento.
[00109] A coloração Oil red O mostrou que os teores de lipídeo em animais infundidos com AAV-GPE foram similares àqueles nas ninhadas G6pc+/+/G6pc+/- com idade de 24 semanas. Para medição histo- química quantitativa, o lipídeo imageado com coloração Oil red O foi convertido em unidades de densidade de pixel usando Adobe Photoshop. As unidades de densidade no fígado dos camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE foram inferiores aquelas nos camundongos controle (aproximadamente 150 unidades de densidade pixel /μ m2 em comparação com aproximadamente 300 unidades de densidade pixel /μ m2), apesar da diferença não ter sido estatisticamente significativa. Juntos, esses resultados indicam que camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE não exibiram anormalidade histológica e tiveram teores de gordura e glicogênio normais no fígado.
[00110] Os níveis de glicose no sangue em jejum foram examinados em camundongos com 12 e 14 semanas de idade infundidos com AAV-GPE na idade de 2 e 4 semanas, respectivamente. Os níveis de glicose no sangue em camundongos G6pc+/+/G6pc+/- ficaram inalterados após 6 horas de jejum. É importante notar que os níveis de glicose no sangue em camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE tanto em 2 quanto em 4 semanas de idade ficaram também inalterados após 6 horas de jejum, demonstrando que os camundongos G6pc-/- infundidos não mais sofrem de hipoglicemia em jejum, características da GSD-Ia (Chou et al., Curr Mol Med 2:121 a 143, 2002). Experimentos de jejum similares com os camundongos G6pc-/- não tratados resultaram em rápida hipoglicemia seguida de crises hipoglicêmicas após apenas um jejum curto.
[00111] Estudos mostraram que a superexpressão de G6Pase-α hepática pode induzir à diabetes (Liu et al., Biochem Biophys Res Commun 205:680 a 686, 1994; Antinozzi et al., Annu Rev Nutr 19: 511 a 544, 1999; Clore et al., Diabetes 49:969 a 974, 2000). Visto que a atividade de G6Pase-α hepática em camundongos G6pc-/- de 24 semanas de idade infundidos na idade de 4 semanas com AAV-GPE foi quase duas vezes maior do que a atividade em suas ninhadas G6pc+/+/G6pc+/-+/-, foi conduzido um teste de tolerância à glicose em camundongos G6pc-/- de 14 semanas de idade infundidos na idade de 4 semanas com AAV-GPE. Como um controle, um teste de tolerância à glicose foi realizado também em camundongos G6pc-/- de 12 semanas de idade infundidos na idade de duas semanas com AAV-GPE. Esses animais exibiram níveis do tipo selvagem de atividade de G6Pase-α hepática. Os perfis de tolerância à glicose nos camundongos G6pc-/- infundidos foram indistinguíveis daquele das ninhadas controle.
[00112] Para determinar se uma resposta humoral direcionada contra G6Pase-α humana é gerada nos camundongos G6pc-/- infundidos, a análise Western blot foi realizada usando soros de camundongos infundidos com AAV-GPE ou AAV-CBA. Como um controle positivo, um antissoro de G6Pase-α anti-humano de coelho que também reconhece G6Pase-α de murino foi usado (Ghosh et al., J Biol Chem 277: 32837 a 32842, 2002). Nenhum anticorpo direcionado contra G6Pase- α foi detectado em qualquer um dos camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-GPE ou AAV-CBA que viveram até a idade de 24 semanas. Além disso, não houve anticorpos endógenos direcionados contra G6Pase-α presentes nos soros das ninhadas G6PC+/+/G6pc+/- ou de camundongos G6pc -/- não tratados.
[00113] A ausência de anticorpos contra G6Pase-α detectáveis no fígado de camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-CBA sugere que uma resposta imunológica mediada por célula para o transgene de G6Pase-α não é a causa para o rápido declínio na expressão de transgene direcionada por esse vetor. Outra possibilidade é uma resposta imunológica inflamatória obtida pelo vetor AAV-CBA. Portanto, a infiltração de linfócito CD8+ hepático foi examinada 2 semanas depois da infusão de camundongos G6PC-/- com AAV-CBA ou AAV-GPE. Em camundongos G6pc-/- ou do tipo selvagem de 2 e 4 semanas de idade, as contagens de linfócito CD8+ hepáticos foram baixas. Em camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-CBA ou AAV-GPE com idade de 2 dias, as contagens de CD8+ hepáticos com idade de duas semanas foram similares para cada em dos tipos de vetor e comparáveis às contagens em animais G6pc-/- ou do tipo selvagem com duas semanas de idade não tratados. Em camundongos G6pc-/-infundidos com AAV- GPE na idade de duas semanas, as contagens de linfócitos CD8+ hepáticos permaneceram baixas na idade de 4 semanas. Em contraste, em camundongos G6pc-/- infundidos com AAV-CBA na idade de duas semanas, as contagens de linfócitos CD8+ hepáticos foram notavelmente superiores na idade de 4 semanas. Os resultados sugerem que uma resposta inflamatória obtida por AAV-CBA pode explicar, pelo menos em parte, o rápido declínio e a baixa eficácia da expressão de G6Pase-α hepática direcionados pelo promotor de CBA/realçador de CMV.
[00114] Esse exemplo descreve estudos para avaliar a eficácia do vetor AAV-GPE em um estudo de longo prazo. A terapia de gene mediada pelo vetor de AAV-GPE em camundongos G6pc-/- foi eficaz por pelo menos de 70 a 90 semanas em camundongos que expressam mais do que 3% de G6Pase-α hepática do tipo selvagem. Os resultados demonstraram que camundongos tratados com AAV-GPE exibiram armazenamento de gordura hepática normal, metabólito no sangue normal e perfis de tolerância à glicose, níveis de insulina no sangue em jejum reduzidos nenhuma evidência de anormalidades hepáti-cas.
[00115] O vetor AAV-GPE (conforme descrito no Exemplo 1 e Yiu et al., Mol Ther 18:1076 a 1084, 2010) foi infundido em camundongos G6pc-/- (Lei et al., Nat Genet 13: 203 a 209, 1996) através do sino retro-orbital. camundongos G6pc+/+/G6pc+/- com idades compatíveis assim como G6pc-/- com 6 a 10 semanas de idade foram usados como controles. Para os camundongos infundidos com vírus, a terapia de glicose (Lei et al., Nat Genet 13: 203 a 209, 1996) terminou imediatamente após a infusão.
[00116] O teste de tolerância à glicose de camundongos consistiu em jejum por 6 horas, antes da amostragem de sangue, seguido por injeção intraperitoneal de uma solução de glicose a 2 mg/g peso corporal e amostragem de sangue repetida através da veia caudal por 2 horas.
[00117] O isolamento de microssoma, ensaios de fosfohidrolase, análise histoquímica de enzima de G6Pase-α e ensaios de absorção de G6P microssômico foram realizados conforme anteriormente descrito (Yiu et al., Mol Ther 18:1076 a 1084, 2010; Lei et al., Nat Genet 13: 203 a 209, 1996).
[00118] Os camundongos foram, primeiro, examinados em relação a nódulos hepáticos por ultrassom usando o sistema Vevo 2100 (VisualSonics, Ontário, Canadá), e amostras sanguíneas foram coletadas da veia caudal. A glicose no sangue, colesterol total e ácido úrico foram analisados usando kits obtidos pela Thermo Electron (Louisville, CO); triglicerídeos, por um kit pela Sigma Diagnostics (St Louis, MO); lactato, por um kit da Trinity Biotech (St. Louis, MO); e insulina, por um kit ELISA de insulina para camundongo ultrassensível da Crystal Chem (Downers Grove, IL). Os teores de glicogênio hepático foram medidos conforme anteriormente descrito (Yiu et al., Mol Ther 18:1076 a 1084, 2010). Para determinar os teores de triglicerídeo hepático, glicose e G6P, os tecidos do fígado foram homogeneizados em tampão RIPA (50 mM de Tris HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X100, 0,5% de Na-desoxicolato e 0,1% de SDS) (Thermo Scientific, Rockford, IL), e triglicerídeos foram medidos usando um kit da Sigma Diagnostics, glicose, por um kit da Thermo Electron, e G6P, por um kit da BioVision (Mountain View, CA).
[00119] Para hematoxilina e eosina (H&E) e coloração oil red O (Yiu et al., Mol Ther 18:1076 a 1084, 2010), as seções de fígado foram preservadas em 10% formalina tamponada neutra e seccionadas com 4 a 10 mícrons de espessura. As seções marcadas foram visualizadas usando-se o microscópio Axioskop2 plus e o software AxioVision 4.5 (Carl Zeiss, Thornwood, NY).
[00120] Os RNAs totais foram isolados a partir de tecidos do fígado usando o Reagente TRIzolTM (Invitrogen, Carlsbad, CA). A expressão de mRNA foi quantificada por RT-PCR em tempo real pelo Sistema de PCR em tempo real 7300 da Applied Biosystems usando sondas TaqMan da Applied Biosystems (Foster City, CA). Os dados foram analisados usando o software SDS v 1.3 da Applied Biosystems e normalizados para RNA β-actina. Os anticorpos contra G6Pase huma- na-α foram detectados por análise Western-blot conforme anteriormente descrito (Yiu et al., Mol Ther 18:1076 a 1084, 2010).
[00121] O teste t não pareado foi realizado usando o Programa GraphPad Prism®, versão 4 (San Diego, CA). Os valores foram considerados estatisticamente significativos a P < 0,05.
[00122] Camundongos G6pc-/- com duas ou quatro semanas de idade (n = 18) foram infundidos com doses variáveis de AAV-GPE (5 x 1012 a 3 x 1013 de partículas virais (vp) /kg) previstas restaurar e manter 3% a 100% de G6Pase-α hepática do tipo selvagem atividade. Um camundongo G6pc-/- de 15 semanas de idade (5 x 1012 vp/kg) e um de 30 semanas de idade (1 x 1013 vp/kg) foram também infundidos. A baixa taxa de sobrevivência de camundongos com GSD-Ia em terapia de glicose restringiu gravemente os números de camundongos adultos disponíveis para estudo (Lei et al., Nat Genet 13: 203 a 209, 1996). Os perfis metabólico e histológico de 20 animais infundidos foram monitorados por 70 a 90 semanas, e todas as medições em comparação com aquelas de suas ninhadas G6pc+/+ e G6pc+/-. O fenótipo de camundongos G6pc+/+ e G6pc+/- são indistinguíveis do tipo selvagem (Lei et al., Nat Genet 13: 203 a 209, 1996).
[00123] Não houve morte prematura dos camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE. A atividade de G6Pase-α hepática e o teor de glicogênio foram avaliados em camundongos sacrificados após um jejum de 24 horas. A atividade de G6Pase-α hepática em jejum médio de camundongos do tipo selvagem com 70 a 90 semanas (n = 20) foi de 185,8 ± 12,7 nmol/mg/min (Figura 2A). Conforme planejado, houve uma faixa de atividades de G6Pase-α hepática restaurada nos camundongos tratados. Dos 20 camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE sacrificados com idade de 70 a 90 semanas, 6 camundongos tiveram baixos níveis (3% a 9% de atividade do tipo selvagem) de atividade de G6Pase-α hepática e foram atribuídos com AAV-L, 9 camundongos tiveram níveis médios (22% a 63% da atividade do tipo selvagem) da atividade de G6Pase-α hepática, atribuídos com AAV-M, e 5 camun- dongos tiveram altos níveis (81% a 128% da atividade do tipo selvagem) da atividade de G6Pase-α hepática, atribuídos com AAV-H (Figura 2A). A análise RT-PCR em tempo real mostrou uma relação linear entre a expressão de G6Pase-α hepática de mRNA e a atividade de G6Pase-α (Figura 2B).
[00124] A análise histoquímica de enzima mostrou que G6Pase-α em camundongos do tipo selvagem foi distribuída pelo fígado com níveis significativamente superiores em proximidade aos vasos sanguíneos. Não houve atividade de G6Pase-α passível de coloração nas seções de fígado dos camundongos G6pc-/- não tratados. Em camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE, G6Pase-α foi distribuída também pelo o fígado, mas com centros, não relacionados aos vasos sanguíneos, contendo níveis de atividade enzimática marcadamente maiores. A distribuição desigual de G6Pase-α hepática nos camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE sugere que uma proporção substancial de hepatócitos abrigou baixa ou pouca G6Pase-α, incluindo fígados AAV-H que expressando 81 a 128% de atividade de G6Pase-α do tipo selvagem. A expressão de G6Pase-α hepática uniforme não é exigida para recuperar o fenótipo GSD-Ia.
[00125] A GSD-Ia é caracterizada por hipoglicemia, hipercolestero- lemia, hipertrigliceridemia, hiperuricemia e academia lática (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010). Os níveis de glicose no sangue em camundongos AAV-H que expressam atividade de G6Pase-α do tipo selvagem hepática foram indistinguíveis daqueles das ninhadas controle (Figura 3A). AAV-M e AAV-L expressando 22 a 63% e 3 a 9% de atividade de G6Pase-α hepática normal, respectiva- mente, também mantiveram um estado de euglicemia (~100 mg/dl) (Yoshizawa et al., J Clin Invest 119:2807 a 2817, 2009), mas seus níveis de glicose no sangue foram consideravelmente menores do que as ninhadas controle (Figura 3A). Todos os camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE exibiram perfis de soro normais de colesterol e triglicerídeo, enquanto os níveis de soro de ácido úrico e ácido lático nos camundongos G6pc-/- tratados foram menores do que aqueles nas ninhadas controle (Figura 3A).
[00126] Os pesos corporais médios de camundongos fêmeas e machos tratados com AAV-GPE com idade de 70 a 90 semanas foram 70% e 62%, respectivamente, de seus camundongos de controle compatíveis em sexo e idade (Figura 3B). Contudo, os comprimentos corporais médios dos camundongos G6pc-/- tratados foram 90% dos controles (Figura 3B). Consequentemente, os valores do índice de massa corporal (BMI) (Bahary et al., Proc Natl Acad Sci USA 87:8642 a 8646, 1990) de camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE foram significativamente menores do que aqueles das ninhadas controle (Figura 3B). Embora os valores de IMC de ambos os grupos de camundongo significam crescimento normal (Bahary et al., Proc Natl Acad Sci USA 87:8642 a 8646, 1990), os camundongos G6pc-/- tratados com AAV- GPE foram consideravelmente mais magros. Os pesos de fígado em camundongos do tipo selvagem foram relativamente constantes (Figura 3C). Em camundongos infundidos com AAV-GPE, os pesos de fígado foram inversamente correlacionados à atividade de G6Pase-α hepática restaurada (Figura 3C). Quando pesos de fígado foram expressos como porcentagem de peso corporal, camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE tiveram valores significativamente superiores por causa de seus pesos corporais mais baixos. Contudo, quando os pesos de fígado absolutos foram em comparados diretamente, houve diferença significativa entre ninhadas de AAV-M, AAV-H e controle (Fi- gura 3C). Contudo, os camundongos AAV-L continuaram exibindo he- patomegalia. AAV-GPE entrega pouco ou nenhum transgene ao rim (Yiu et al., Mol Ther 18:1076 a 1084, 2010). Contudo, os camundongos infundidos que expressam maior atividade de G6Pase-α hepática tiveram pesos de rim inferiores, o que sugere boa nefromegalia normalizada de controle metabólico hepático.
[00127] Para determinar a presença de nódulos de HCA em camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE, a análise de ultrassom foi conduzida, seguida por extensivo exame dos fígados e análise histológica de amostras de biópsia de fígado, usando 5 ou mais seções separadas por fígado. O ultrassom e análise morfológica não detectaram nódulos hepáticos no tipo selvagem (n = 20) e camundongos G6pc-/- transduzidos com AAV-GPE (n = 20) que viveram até a idade de 70 a 90 semanas. Os camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE infundidos na idade de 2 ou 4 semanas (n = 18) não exibiram anormalida-des histológicas hepáticas exceto em armazenamento de glicogênio aumentado. Os camundongos com 84 semanas de idade infundidos com idade de 15 semanas, que expressaram 6% de atividade de G6Pase-α hepática normal, exibiram armazenamento de glicogênio elevado e poucos centros necróticos em uma seção do fígado. Enquanto a maior parte das seções do tecido do fígado do camundongo de 90 semanas de idade infundidas na idade de 30 semanas, que expressou 38% de atividade de G6Pase-α hepática normal, não exibiu anormalidades histológicas, uma seção do fígado teve muitos centros necróticos. Como centros necróticos são uma patologia hepática característica vista em camundongos com GSD-Ia não tratados de 6 semanas de idade ou mais (Kim et al., J Hepatol 48: 479 a 485, 2008), é bem provável que os centros necróticos se desenvolveram antes do início da terapia de gene com idade de 15 ou 30 semanas.
[00128] Os fígados de camundongos sem G6pc específicos de fígado foram relatados desenvolver HCA com esteatose marcada (Mutel et al., J Hepatol 54:529 a 537, 2011). Enquanto poucos camundongos do tipo selvagem tiveram armazenamento de gordura hepática aumentado, houve pouco ou nenhum armazenamento de gordura nos fígados de camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE. Além disso, os teores de triglicerídeo hepático em camundongos G6pc-/-tratados com AAV-GPE (n = 20) não foram estatisticamente diferentes daqueles nos camundongos do tipo selvagem. A coloração Oil red O confirmou que teores de lipídeo em animais tratados com AAV-GPE (n = 20) foram similares àqueles nos controles.
[00129] Já foi bastante estabelecido que ciclooxigenase-2 (COX-2) é um marcador que é superexpressado em muitos cânceres pré- malignos e malignos, incluindo HCC (Wu, Cancer Treat Rev 32:28 a 44, 2006). A análise RT-PCR quantitativa mostrou que níveis similares de mensagem de COX-2 hepático foram expressos em G6pc-/- tratados com AAV-GPE e ninhadas controle.
[00130] Os níveis médios de glicose no sangue de camundongos do tipo selvagem (n = 20) antes de começar o jejum foram 165,0 ± 3,0 mg/dl (tempo zero) que diminuíram para 113,3 ± 6,5 mg/dl após 24 horas de jejum (Figura 4A). Os perfis de glicose no sangue de camundongos AAV-L e AAV-M foram paralelos àqueles camundongos controle, mas os níveis de glicose no sangue foram consistentemente mais baixos (Figura 4A), enquanto o perfil de glicose em jejum de camundongos AAV-H foi indistinguível daqueles dos camundongos controle. Em contraste significativo, camundongos G6pc-/- não tratados exibiram hipogli- cemia marcada dentro de 60 a 75 minutos de jejum (Figura 4B), uma marca registrada de GSD-Ia (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010). Em resumo, camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE não sofrem mais da hipoglicemia em jejum característica da GSD-Ia (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010).
[00131] Os perfis de tolerância à glicose no sangue em camundongos AAV-M e AAV-H foram indistinguíveis daqueles das ninhadas do tipo selvagem (Figura 4C). Em camundongos AAV-L, em seguida à injeção intraperitoneal, os níveis de glicose no sangue declinaram em uma taxa mais rápida do que os controles tipo selvagem.
[00132] A sinalização de insulina regula glicose hepática e metabolismo de lipídeo (Leavens e Birnbaum, Crit Rev Biochem Mol Biol 46:200 a 215, 2011). Após 24 horas de jejum, os níveis de insulina no sangue em camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE (n = 20) e do tipo selvagem (n = 20) de 70 a 90 semanas de idade foram 1,84 ± 0,29 e 0,56 ± 0,09 ng/ml, respectivamente (Figura 5A). Ambos estavam dentro da faixa normal (de Luca et al., J Clin Invest 115:3484 a 3493, 2005), apesar de que os níveis de insulina no sangue em jejum nos camundongos G6pc-/- tratados foram mais próximos aos valores médios normais (de Luca et al., J Clin Invest 115:3484 a 3493, 2005). En-quanto os níveis de insulina no sangue em jejum em camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE não se correlacionaram com G6Pase-α hepática restaurada, os níveis de insulina do tipo selvagem e os camundongos G6pc-/- tratados exibiram uma relação linear aos seus pesos corporais (Figura 5A).
[00133] O efeito transcricional é mediado pela proteína-1c aglutinante de elemento regulatório de esterol (SREBP-1c) (Leavens e Birnbaum, Crit Rev Biochem Mol Biol 46:200 a 215, 2011). A análise RT- PCR quantitativa mostrou que níveis similares de transcritos de SREBP-1c hepática foram expressos nos camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE em jejum por 24 horas e camundongos controle (Figura 5B). A glicocinase é um sensor de glicose (Massa et al., IU- BMB Life 63:1 a 6, 2011). A atividade de glicocinase hepática diminui quando níveis de insulina no sangue estão baixos, como durante o jejum (Massa et al., IUBMB Life 63:1 a 6, 2011). Como visto com a insulina no sangue, após 24 horas de jejum, os transcritos de glicocinase hepática em camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE foram significativamente mais baixos do que nas ninhadas controle (Figura 5C). É interessante observar que os níveis de mRNA de glicocinase hepática e insulina no sangue em jejum exibiram uma relação linear tanto em camundongos G6pc-/ tratados com AAV-GPE quanto com o do tipo selvagem (Figura 5C).
[00134] Durante o jejum, a homeostasia de glicose no sangue é mantida por glicose endógena produzida no fígado a partir da hidrólise de G6P pelo complexo G6PT/G6Pase-α na etapa terminal de glicone- ogênese e glicogenólise (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010). Camundongos G6pc-/-, com ausência de uma G6Pase-α funcional não tem capacidade para produzir glicose endógena no fígado, rim ou intestino. Após 24 horas de jejum, os níveis de glicose livre hepática em camundongos do tipo selvagem (n = 20) foram 389 ± 17 nmol/mg de proteína e em camundongos AAV-L (n = 6), AAV-M (n = 9), e AAV-H (n = 5) foram 61%, 68% e 90% disso em camundongos do tipo selvagem, respectivamente. Níveis intracelulares de G6P nos fígados de AAV-L e AAV-M em jejum foram 2,9 e 1,6 vezes, respecti-vamente maiores do que fígados do tipo selvagem, mas os níveis de G6P intracelulares nos fígados AAV-H em jejum foram estatisticamente similares àqueles dos fígados do tipo selvagem.
[00135] G6P hepática participa em diversas trajetórias metabólicas, incluindo a síntese de glicogênio, glicólise, a trajetória pentose-fosfato, no citoplasma e produção de glicose endógena no lúmen ER. A expressão hepática de diversas enzimas essenciais envolvidas nas trajetórias mencionadas acima foi examinada em camundongos após um jejum de 24 horas. Isso incluiu a fosfoenolpiruvato carboxiquinase cito- sólica (PEPCK-C) que catalisa a primeira etapa comprometida em gli- coneogênese hepática (Hanson e Reshef, Biochimie 85:1199 a 1205, 2003); frutose-1,6-bisfosfatase (FBPase-1) que converte frutose-1,6- bisfosfato para frutose-6-fosfato (Hers, J Inherit Metab Dis 13:395 a 410, 1990); fosfoglucomutase (PGMase) que catalisa a conversão reversível de glicose-6-P e glicose-1-P em glicogenólise e síntese de gli- cogênio (Hers, J Inherit Metab Dis 13:395 a 410, 1990); fosfofructoqui- anse-1 (PFK-1) que catalisa a etapa limitante de taxa irreversível em glicólise convertendo frutose-6-P para frutose-1,6-difosfato (Hers, J Inherit Metab Dis 13:395 a 410, 1990); desidrogenase de G6P (G6PDH) que catalisa a primeira reação no trajetória de pentose- fosfato convertendo G6P para 6-fosfgluconolactona (Wamelink et al., J Inherit Metab Dis 31:703 a 717, 2008); e G6PT que transporta G6P citoplasmática para o lúmen ER (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676 a 688, 2010).
[00136] A análise de RT-PCR em tempo real mostrou que nos fígados em jejum, transcritos de PEPCK-C e PGMase ficaram inalterados enquanto transcritos de FBPase-1 foram aumentados nos camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE, em comparação com os controles. Tanto os transcritos de PFK-1 quanto de G6PDH em fígados AAL-L foram aumentados apesar de que nos fígados AAV-M e AAV-H eles foram estatisticamente similares àqueles dos fígados do tipo selvagem. Os níveis de mRNA G6PT nos camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE foram 2,2 vezes maiores do que aqueles dos controles do tipo selvagem, independentemente dos níveis de atividade de G6Pase-α hepática restaurados. A atividade de absorção de G6P mi- crossômico hepático mediada por G6PT é o limitante de taxa na produção de glicose endógena (Arion et al., J Biol Chem 251:6784 a 690, 1976), mas é codependente da atividade de G6Pase-α (Lei et al., Nat Genet 13: 203-209, 1996). Os microssomas hepáticos preparados a partir de camundongos G6pc-/-, com um G6PT intacto, exibiram atividade de absorção de G6P notavelmente inferior em comparação com os microssomas hepáticos do tipo selvagem (Lei et al., Nat Genet 13: 203 a 209, 1996), que pode ser revertida se a atividade de G6Pase-α é restaurada através de transferência de gene (Zingone et al., J Biol Chem 275:828 a 832, 2000). Em fígados AAV-L, AAV-M e AAV-H atividades de absorção de G6P microssômico foram 43%, 50% e 72%, respectivamente, da atividade do tipo selvagem, refletindo o aumento na atividade de G6Pase-α hepática (Figura 2A) que foi paralela aos níveis de glicose livre hepática.
[00137] Para determinar se uma resposta humoral direcionada contra G6Pase-α humana gerada nos camundongos infundidos, a análise de Western blot foi realizada usando os soros obtidos a partir de camundongos G6pc-/- tratados com AAV-GPE e controle de 70 a 90 semanas de idade. Um anticorpo monoclonal contra G6Pase humana-α que também reconhece G6Pase-α de murino (Yiu et al., Mol Ther 18:1076 a 1084, 2010) foi usado como um controle positivo. Nenhum anticorpo direcionado contra G6Pase-α foi detectado em quaisquer camundongos G6pc-/-infundidos com AAV-GPE ou do tipo selvagem controle que viveu até a idade de 70 a 90 semanas.
[00138] Esse exemplo descreve estudos para avaliar adicionalmente a eficácia do vetor AAV-GPE. O AAV-GPE, que é um vetor de filamento único que compreende 2684 bp do realçador/promotor de G6PC foi comparado com AAV-miGPE, um vetor de filamento duplo que contém um realçador/promotor de G6PC mínimo de 382 bp. Os resultados descritos nesse exemplo mostram que o vetor AAV-GPE direcionou níveis de expressão de G6Pase-α hepática significativamente superiores, alcançaram redução maior em acúmulo de glicogê- nio hepático e levaram a uma melhore tolerância de jejum em camun-dongos com GSD-Ia do que o vetor AAV-miGPE.
[00139] Todos os camundongos foram mantidos vivos com a terapia de glicose (Lei et al., Nat. Genet. 13:203 a 209 (1996)). Os vetores de rAAV foram infundidos em camundongos G6pc-/- de 2 semanas de idade através do sino retro-orbital. Camundongos G6pc+/+/G6pc+/- com idade compatível foram usados como controles. Para camundongos infundidos com vetor de rAAV, a terapia de glicose terminou imediatamente após a infusão. Todas as transduções foram realizadas em camundongos G6pc-/- de 3 semanas de idade e a eficácia avaliada na idade de 12 semanas.
[00140] O isolamento de microssoma e os ensaios de fosfohidro- lase foram determinados essencialmente conforme descrito anteriormente (Lei et al., Nat. Genet. 13:203 a 209 (1996)). Para ensaios de fosfohidrolase, as misturas de reação (100 μl) que contém 50 mM de tampão de cacodilato, pH 6,5, 10 mM de G6P e quantidades apropriadas de preparações microssômicas foram incubadas a 30°C por 10 minutos. As membranas microssômicas interrompidas foram preparadas ao incubar membranas intactas em 0,2% de desoxicolato por 20 minutos a 0°C. A atividade de fosfatase não específ ica foi estimada pela pré-incubação de preparações microssômicas interrompidas em pH 5 por 10 minutos a 37°C, para inativar a G6Pase- α ácido-lábil.
[00141] O DNA total dos tecidos de camundongo foi isolado usando os Kits Mammalian Genomic DNA Miniprep da GenElute™ (Sigma- Aldrich, St Louis, MO) e os RNAs totais foram isolados dos tecidos de camundongo usando o Reagente TRIzolTM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os números de genoma de vetor e expressão de mRNA foram quantificados por PCR e RT-PCR em tempo real, respectivamente, em um Applied Biosystems 7300 de Sistema de PCR em tempo real usando sondas TaqMan do Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os números de genoma de vetor de gene G6PC humano foram normalizados para β-actina de camundongo usando conjuntos de sonda TaqMan Hs00609178_m1 for G6PC e Mm00607939_s1 para β-actina. DNA de plasmídeo que corresponde a 0,01 a 100 cópias do gene G6PC humanos foi usado em uma curva padrão. Para determinar o número de cópias do genoma de vetor, os valores de Ct da amostra foram comparados à curva padrão. A expressão de mRNA de G6PC foi normalizada para RNA Rpl19 usando conjuntos de sonda da TaqMan® Hs00609178_m1 para G6PC e Mm02601633_g1 para Rpl19.
[00142] A glicose no sangue foi analisada usando kits obtidos a partir da Thermo Electron (Louisville, CO). Os teores de glicogênio hepático e triglicerídeo foram medidos conforme anteriormente descrito (consulte exemplos 1 e 2, e Yiu et al., Mol. Ther, 18:1076 a 1084, 2010; Lee et al., Hepatology 56:1719 a 1729, 2012). Para determinar triglicerídeo hepático, os tecidos do fígado foram homogeneizados em tampão de RIPA (50 mM de Tris HCl, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,5% de Na-deoxicolato e 0,1% de SDS) (Thermo Scientific, Rockford, IL), e os triglicerídeos foram medidos usando um kit da Sigma Diagnostics (St Louis, MO).
[00143] O teste de tolerância à glicose de camundongos consistiu em jejum por 6 horas, antes da amostragem de sangue, seguido por injeção intraperitoneal de uma solução de glicose a 2 mg/g peso corporal e amostragem de sangue repetida através da veia caudal por 2 horas.
[00144] O teste t não pareado foi realizado usando o Programa GraphPad da Prism®, versão 4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Os valores foram considerados estatisticamente significativos a p <0,05.
[00145] Os estudos foram conduzidos para examinar a eficácia do rAAV-GPE (consulte Exemplo 1 e Yiu et al., Mol. Ther, 18:1076 a 1084, 2010) e rAAV-miGPE (Koeberl et al., Mol. Ther, 16:665 a 672, 2008) vetores em tratamento de camundongos G6pc-/- durante 12 semanas. Cada vetor foi usado em duas doses, 1 x 1013 partículas virais (vp)/kg (dose alta) e 2 x 1012 vp/kg (dose baixa) com 6 camundongos por grupo, em dois centros de pesquisas diferentes. Resultados similares foram obtidos a partir de ambos os centros. Enquanto a atividade de G6Pase-α hepática nos camundongos G6pc-/- transduzidos representa os dados combinados a partir de dois centros, outros dados reportados são de um estudo único. Os estudos mostraram que a eficiência e persistência da transferência de gene hepático mediada por rAAV são inferiores durante o início do desenvolvimento, por causa da taxa rápida da proliferação hepatocelular associada com o crescimento do fígado, que dilui o número de células efetivamente infectadas com rAAV (Yiu et al., Mol. Ther, 18:1076 a 1084, 2010; Cunningham, Mol. Ther, 16:1081 a 1088 (2008)). Nesse estudo, os vetores de rAAV foram administrados em camundongos G6pc-/- de 2 semanas de idade quando a proliferação hepatocelular permanece alta. Consequentemente, a expressão de G6Pase-α hepática examinada com idade de 12 semanas é significativamente inferior em relação àquela vista em camundongos adultos infundidos com a mesma dosagem de vetor. O melhor momento de intervenção na doença humana permanece a ser estabelecido.
[00146] Todos os camundongos G6pc-/- sobreviveram até a idade de 12 semanas sem nenhuma morte prematura em ambos os centros. No fígado de camundongos do tipo selvagem de 12 semanas de idade, a atividade microssômica de G6Pase-α foi 203,5 ± 10,3 nmol/min/mg (n = 24). Os dados combinados (n = 12 por tratamento), determinados independentemente nos dois centros, mostraram que com idade de 12 semanas, a terapia de rAAV-GPE com dose alta reconstituiu cerca de 18% da atividade de G6Pase-α do tipo selvagem hepática que foi 3,5 vezes mais atividade do que rAAV-miGPE, enquanto a terapia de rAAV-GPE com dose baixa produziu mais de 3,6 vezes mais atividade do que rAAV-miGPE (Figura 6A). A atividade de G6Pase-α hepática aumentou linearmente com o genoma de vetor hepático e os números de cópia, a os números de cópia em camundongos G6pc-/- tratados com rAAV-GPE (n = 6) foram significativamente superiores em relação aos camundongos tratados com rAAV-miGPE (n = 6) (Figura 6A).
[00147] Todos os perfis metabólicos de camundongos G6pc-/- tratados com rAAV-GPE e rAAV-miGPE exibiram curvas de crescimento que foram paralelas a suas ninhadas do tipo selvagem, no entanto em pesos inferiores (Figura 6B). Os valores de índice de massa corporal (BMI) dos camundongos tratados foram indistinguíveis daqueles de camundongos do tipo selvagem não respectivo ao vetor ou nível de dose (Figura 6C). Todos os camundongos G6pc-/- tratados tiveram níveis de glicose no sangue consistentemente inferiores em relação aos controles tipo selvagem, mas ainda acima da extremidade inferior da faixa normal (Figura 6D), e nenhum dos animais infundidos sofreu de crises hipoglicêmicas frequentes típicas de GSD-Ia (Chou et al., Curr. Mol. Med. 2:121 a 143, 2002; Chou et al., Nat. Rev. Endocrinol. 6. 676-688, 2010; Lee et al., Hepatology 56:1719 a 1729, 2012).
[00148] O peso corporal relativo do fígado em relação ao corpo, uma medida de glicogênio do fígado e/ou acúmulo de gordura neutro (Chou et al., Curr. Mol. Med. 2:121 a 143, 2002; Chou et al., Nat. Rev. Endocrinol. 6. 676 a 688, 2010), foi maior em todos os 4 grupos de camundongos G6pc-/- tratados em relação aos camundongos do tipo selvagem, apesar de que os camundongos tratados com rAAV-GPE em dose alta foram significativamente mais próximos ao normal do que os outros grupos (Figura 7A). Consistente com isso, os teores de gli- cogênio em camundongos G6pc-/- tratados com rAAV-GPE e rAAV- miGPE- foram marcadamente maiores do que seus controles do tipo selvagem (Figura 7B) com as doses de vetor maiores reduzindo o gli- cogênio melhor do que as doses de vetor inferiores, demonstrando que restaurar maior expressão de G6Pase-α hepática aprimora a he- patomegalia. Contudo, as comparar apenas terapias de dose alta, os camundongos tratados com rAAV-miGPE tiveram 43% mais glicogênio do que camundongos tratados com rAAV-GPE. Apesar da elevação continuada em glicogênio do fígado não houve anormalidades histológicas observadas nas seções de tecido do fígado de quaisquer camundongos G6pc-/- tratados com rAAV na idade de 12 semanas. Com a exceção de camundongos tratados com rAAV-miGPE em uma dose baixa, os teores de triglicerídeo hepático não foram diferentes entre o tipo selvagem e os outros 3 grupos de camundongos G6pc-/- tratados com rAAV (Figura 7C).
[00149] Para camundongos do tipo selvagem (n = 24), o nível de glicose no sangue médio antes do jejum foi 172,2 ± 2,6 mg/dl (tempo zero), que diminuiu para 134,6 ± 3,8 mg/dl após 8 horas de jejum (Figura 8A). Os perfis de glicose no sangue dos camundongos em terapia de dose alta (n = 6 por tratamento) foram significativamente melhores do que dos camundongos em terapia de dose baixa (n = 6 por tratamento), contudo, mesmo camundongos tratados com rAAV-GPE mantiveram níveis de glicose significativamente superiores que estabilizaram para níveis de glicose do tipo selvagem 6 horas depois do jejum, enquanto camundongos tratados com rAAV-miGPE estabilizaram bem abaixo em 60% dos níveis do tipo selvagem (Figura 8A). Os camundongos tratados com rAAV-GPE e rAAV-miGPE em dose alta puderam também sustentar um jejum de 24 horas, mas os níveis de glicose no sangue em jejum foram significativamente superiores em camundongos tratados com rAAV-GPE do que camundongos tratados com rA- AV-miGPE (Figura 8B). Em resumo, os camundongos G6pc-/- tratados com rAAV-GPE foram mais próximos ao tipo selvagem e tiveram mais capacidade para tolerar o jejum do que os camundongos G6pc-/- tratados com rAAV-miGPE.
[00150] Os perfis de tolerância à glicose no sangue dos camundon- gos G6pc-/- tratados (n = 6 por tratamento) foram monitorados em seguida de uma injeção de glicose intraperitoneal. Em geral, os perfis ficam paralelos àqueles dos camundongos do tipo selvagem (Figura 8C) com os camundongos tratados com dose alta respondendo melhor do que os camundongos tratados com dose baixa.
[00151] A biodistribuição do transgene G6PC humano no fígado, rim, intestino, cérebro, testículos e ovário em camundongos G6pc-/- tratados com rAAV-GPE de dose alta com 12 semanas de idade foi analisada por PCR quantitativo (Tabela 1). No fígado transduzido, os números de cópia de genoma de vetor/μg de DNA foi 94,440 ± 7,624 (ou 0,51 ± 0,04 de cópias de vetor/genoma diploide). No rim e intestino transduzidos, os números foram drasticamente inferiores, tendo a média de apenas 2,57% e 0,64%, respectivamente, do número de cópia do fígado, o que mostra que o vírus rAAV8 não transduziu o rim e intestino eficientemente. Os números de cópia de genoma/μg de DNA no cérebro e testículos foram ainda menores a 0,12% e 0,02%, respectivamente, de número de cópia de fígado. Apenas níveis antecedentes de genomas G6PC humanos foram detectados no ovário.
[00152] O vetor de rAAV-GPE contém um elemento promo- tor/realçador específicos quanto a tecido expresso principalmente no fígado, tubos proximais no rim e intestino (Chou et al., Curr. Mol. Med. 2:121 a 143, 2002; Chou et al., Nat. Rev. Endocrinol. 6. 676 a 688, 2010). A análise de RT-PCR em tempo real dos transcritos de G6PC humano mostrou uma correlação entre número de cópia de genoma e expressão genética (Tabela 3). No fígado, os níveis de mRNA de G6PC humano em relação ao transcrito de RpI19 foram 0,62740 ± 0,04445. Como exceção em relação à análise de cópia de genoma, o rim expressou apenas 0,03% do mRNA de G6PC humano de fígado, e apenas níveis antecedentes de mRNA de G6PC humano foram detectados no intestino, cérebro, testículos e ovário. TABELA 3. DISTRIBUIÇÃO DE GENOMA DE G6PC HUMANO E EXPRESSÃO DE MRNA EM CAMUNDONGOS G6PC-/- TRATADOS COM RAAV-GPE COM DOSE ALTA DE 12 SEMANAS
[00153] Os dados são apresentados como valores padrão da média. Os valores dos tecidos do tipo selvagem que não contêm transgene, foram o desvio padrão da média do fígado, rim, intestino, cérebro, testículos e ovário. Números em parênteses são % do valor do fígado.
[00154] Esse exemplo descreve a constatação de que a sequência de enrugamento por compressão de nucleotídeo flanqueando o íntron em G6Pase-α-que expressa vetores de AAV é importante para trans- dução hepática eficiente.
[00155] Para avaliar a contribuição da sequência de enrugamento por compressão para entrega de transgene e expressão hepática de G6Pase-α, plasmídeo UF11-K29-G6PC foi construído. UF11-K29- G6PC (SEQ ID N°: 2) difere de UF11-GPE-G6PC (SEQ ID N°: 1) na ausência da sequência de enrugamento por compressão em torno do íntron. O realçador/promotor de G6PC (GPE) e das sequências de codificação de G6PC são idênticas em cada plasmídeo.
[00156] Camundongos G6pc-/- foram administrados 1 x 1013 vp/kg de AAV-K29-G6PC recombinante ou AAV -GPE-G6PC recombinante. Os resultados indicaram que AAV-K29-G6PC exibiu marcadamente eficiência de transdução hepática reduzida em camundongos com GSD-Ia, em comparação com AAV-GPE-G6PC. As atividades de G6Pase em fígado transduzido com AAV-K29-G6PC- e AAV-GPE- G6PC foram 7,3 e 33,0 nmol/min/mg, respectivamente. Esses resultados demonstraram que a sequência de enrugamento por compressão flanqueando o íntron é importante para transdução hepática eficiente.
[00157] Esse exemplo descreve a construção e a caracterização de um vetor de AAV que contém G6PC de códon otimizado.
[00158] O plasmídeo UF11-GPE-co-G6PC (que compreende G6PC de códon otimizado; SEQ ID N°: 3) foi derivado do plasmídeo UF11- GPE-G6PC (SEQ ID N°: 1), mas a sequência de codificação de G6Pase do tipo selvagem em AAV-GPE-G6PC foi substituída por uma G6Pase de códon otimizado sintética (nucleotídeos 3368 a 4441 da SEQ ID N°: 3).
[00159] Ensaios de expressão in vitro transientes mostraram que co-G6Pase exibiu atividade de enzima 1,9 vezes maior do que G6Pase humana do tipo selvagem. Adicionalmente, dois lotes de AAV- GPE-co-G6PC recombinante foram avaliadas para atividade in vivo e em comparação com a atividade de AAV-GPE-G6PC recombinante em camundongos com GSD-Ia. O primeiro lote de AAV-GPE-co-G6PC foi 50% mais eficiente do que AAV-GPE-G6PC na transdução do fígado do que AAV-GPE-G6PC. O segundo lote de AAV-GPE-co-G6PC foi 2,5 vezes mais eficiente na transdução do fígado do que AAV-GPE- G6PC recombinante.
[00160] Esses resultados demonstram que a otimização de códon de G6PC aumenta a capacidade de transdução do fígado de AAV re- combinante que expressa G6Pase-α.
[00161] O exemplo descreve um estudo para comparar a eficácia da entrega de gene mediada por rAAV8-GPE-G6Pase e rAAV8-GPE- co-G6Pase em camundongos com GSD-Ia.
[00162] A eficácia da entrega de gene em camundongos com GSD- Ia foi comparada usando 2-3 lotes independentes de dois vetores de AAV: 1) rAAV8-GPE-G6Pase (um vetor de rAVV8 que expressa G6Pase-α humana direcionado pelo realçador/promotor de G6PC (GPE) humano de ~3kb; e 2) rAAV8-GPE-co-G6Pase (um vetor de rAVV8 que expressa a G6Pase-α (co) humana de códon otimizado direcionada por GPE). Os resultados na Figura 11 mostram que atividades de G6Pase hepática em camundongos com GSD-Ia e tratados com rAAV8-GPE-co-hG6Pase de 4 e 12 semanas de idade foram 1,9 vezes maior do que as respectivas atividades restauradas pelo vetor de rAAV8-GPE-G6Pase.
[00163] Todos os camundongos tratados com GSD-Ia exibiram perfis de soro normais de colesterol, triglicerídeo, ácido úrico e ácido láti- co e níveis normais de gordura hepática. Em camundongos infundidos com rAAV, pesos de fígado foram inversamente correlacionados à atividade de G6pase hepática restaurada. Os camundongos tratados com rAAV-GPE-G6Pase exibiram significativamente mais hepatome- galia grave do que os camundongos tratados com rAAV-GPE-co- G6Pase (Figura 12).
[00164] Funcionalmente, os camundongos com GSD-Ia tratados com rAAV8-GPE-co-G6Pase de 12 semanas de idade exibiram perfis normais de tolerância à glicose (Figura 13A) e mantiveram normogli- cemia durante um jejum de 24 horas (Figura 13B).
[00165] Esse exemplo descreve um método exemplificativo para uso clínico de vetores de AAV que codificam G6PC para o tratamento de GSD-Ia.
[00166] Um paciente diagnosticado com GSD-Ia é selecionado para tratamento. Tipicamente o paciente tem pelo menos 18 anos de idade e pode ou não ter pré-exposição à imunomodulação. Ao paciente é administrada uma quantidade terapeuticamente eficaz de um AAV re- combinante que expressa G6PC, tal como AAV-GPE-G6PC ou AAV- GPE-co-G6PC, conforme revelado no presente documento. O AAV recombinante pode ser administrado intravenosamente. Uma dose terapêutica apropriada pode ser selecionada por um médico. Em alguns casos, a dose terapeuticamente eficaz está na faixa de 1 x 1011 a 1 x 1014 de partículas virais (vp)/kg, tal como cerca de 1 x 1012 vp/kg. Na maioria dos casos, o paciente é administrado uma dose única. Na ausência de imunomodulação, o paciente irá provavelmente tolerar ape- nar uma única infusão de rAAV. Se o indivíduo teve pré-exposição à imunomodulação, duas ou mais doses podem ser administradas. A saúde do indivíduo pode ser monitorada por um tempo para determinar a efetividade do tratamento.
[00167] Em vista das várias modalidades possíveis para as quais os princípios da invenção revelada podem ser aplicados, deve ser reconhecido que as modalidades ilustradas são apenas exemplos preferidos da invenção e não devem ser consideradas limitantes do escopo da invenção. Ao invés disso, o escopo da invenção é definido pelas reivindicações a seguir. É reivindicado, portanto, como a presente invenção tudo que está dentro do escopo dessas reivindicações.
Claims (11)
1. Molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende os nucleotídeos 182-4441 da SEQ ID N°: 3 ou os nucleotídeos 182-4441 da SEQ ID N°: 1.
2. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende os nucle- otídeos 17-4819 da SEQ ID N°: 3 ou os nucleotídeos 17-4819 da SEQ ID N°: 1.
3. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 1.
4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico recombinante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor de vírus adeno-associado (AAV).
6. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor de AAV é um vetor de AAV sorotipo 8 (AAV8).
7. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico re- combinante, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
8. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV), de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o rAAV é rAAV8.
9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o rAAV, como definido na reivindicação 7 ou 8, em um veículo farma- ceuticamente aceitável.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração intravenosa.
11. Uso do rAAV, como definido na reivindicação 7 ou 8, ca-racterizado pelo fato de que é para o preparo de uma composição, como definida na reivindicação 9 ou 10, para o tratamento de um indivíduo diagnosticado com uma doença de armazenamento de glicogênio.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361908861P | 2013-11-26 | 2013-11-26 | |
| US61/908,861 | 2013-11-26 | ||
| PCT/US2014/067415 WO2015081101A1 (en) | 2013-11-26 | 2014-11-25 | Adeno-associated virus vectors for treatment of glycogen storage disease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112016011997A2 BR112016011997A2 (pt) | 2017-09-26 |
| BR112016011997B1 true BR112016011997B1 (pt) | 2024-04-16 |
Family
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