JP7486274B2 - 糖原病を処置するための方法および組成物 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月１８日出願の米国仮特許出願第６２／７８１，３８０号（その開示は、全ての目的のために本明細書に参考として援用される）の優先権の利益を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式において電子提出され、その全体において参考として援用される配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピー（作成日：２０１９年１２月１６日）は、名称 ＤＩＭ－０１０ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、大きさが４２，２９０バイトである。

発明の技術分野
本出願は概して、糖原病（例えば、糖原病Ｉａ型）の処置のための、ウイルスベクター、およびより詳細には、アデノ随伴ウイルスベクターに関する。

発明の背景
糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａまたはフォンギールケ病としても公知）は、身体の細胞におけるグリコーゲンの蓄積によって引き起こされる遺伝性の障害である。ある特定の器官および組織、特に、肝臓、腎臓、および小腸におけるグリコーゲンの蓄積は、それらが正常に機能する能力を障害する。ＧＳＤ－Ｉａは、代表的には、０歳の間に、重篤な低血糖症、およびグリコーゲンの蓄積によって引き起こされる肝腫大とともに出現する。罹患した個体は、成長遅延、遅発思春期、乳酸血症、高脂血症、高尿酸血症、および成人では、肝細胞腺腫の高発生率を示す。Ｌｅｉら， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： ５８０－３を参照のこと。

ＧＳＤ－Ｉａは、グルコースホメオスタシスの維持に関与する重要な酵素である、活性グルコース－６－ホスファターゼα（Ｇ６Ｐａｓｅ－α）の欠損によって引き起こされる希な遺伝性希少疾患である。Ｇ６Ｐａｓｅ－α（Ｇ６ＰＣ遺伝子によってコードされる）は、グリコーゲン分解および糖新生の最初の工程において、グルコース－６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をグルコースおよびホスフェートへと加水分解することを触媒する。Ｇ６Ｐａｓｅ－α欠損症の原因である８０を超える変異および関連するＧＳＤ－Ｉａ発症が、今日まで同定されている。Ｃｈｏｕら， ２０１０， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６（１２）： ６７６－８８を参照のこと。

現在のところ、ＧＳＤ－Ｉａは治癒せず、食品栄養補充が、患者にとっての現在の標準治療である。厳密に従った場合、食事ストラテジーは、代表的には、正常な成長および思春期発生を可能にするが、食事療法は、高脂血症、高尿酸血症、乳酸血症、および肝臓脂肪蓄積の発生を完全には防止できない。Ｒａｋｅら， ２００２， Ｅｕｒ Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ １６１ Ｓｕｐｐｌ １： Ｓ２０－３４を参照のこと。
Ｇ６Ｐａｓｅ－αを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用する遺伝子治療アプローチは、ＧＳＤ－Ｉａの管理のために探られてきた。例えば、米国特許第９，６４４，２１６号および米国特許公開２０１７／０３６２６７０を参照のこと。しかし、ヒト遺伝子治療にＡＡＶベクターを使用するために、ベクターの堅固で信頼性のある、かつ拡張性のある生成プロセスの開発は、極めて重要である。本発明者らは、Ｇ６ＰＣ遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域を改変して、「Ａｌｕエレメント」と本明細書で記載されるある特定の配列を除去することによって、種々の宿主細胞プラットフォームから発現される場合に、ｒＡＡＶ収量および品質が劇的に改善されることを発見した。

米国特許第９，６４４，２１６号明細書 米国特許出願公開第２０１７／０３６２６７０号明細書

発明の要旨
本発明は、糖原病を処置するための方法および組成物を提供する。より具体的には、ＧＳＤ－Ｉａの処置に関する遺伝子治療適用において使用され得る組換え核酸分子、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、本明細書で提供される。

一局面において、本出願は、改変されたＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列を含む組換え核酸分子であって、ここで上記改変されたＧＰＥは、Ａｌｕエレメントと少なくとも８０％同一の１またはこれより多くの配列を欠いている組換え核酸分子に関する。いくつかの実施形態において、上記Ａｌｕエレメントは、配列番号６の連続するヌクレオチド９３４～１１２７（Ａｌｕ－１）、１４８８～１８２３（Ａｌｕ－２）、および１９９５～２３５０（Ａｌｕ－３）から選択される。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３と８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）同一の配列、または配列番号７、８、９、１０、１１、もしくは１２のうちのいずれか１つと８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）同一の配列を有する。

別の局面において、本出願は、本明細書で記載される改変されたＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列およびＧ６Ｐａｓｅ－αコード配列を含む組換え核酸分子であって、ここで上記改変されたＧＰＥは、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αコード配列の発現を指示し得る組換え核酸分子に関する。いくつかの実施形態において、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αコード配列は、配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）同一な配列を含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸分子は、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列（配列番号１４））をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸分子は、イントロン（配列番号１３）をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸分子は、配列番号１または配列番号２を含む。

別の局面において、本出願は、本明細書で記載される組換え核酸分子を含む組換えベクターに関する。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはｒｈ１０のＡＡＶベクター（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはｒｈ１０））である。例示的実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクターである。本明細書で開示される組換え核酸分子または組換えベクターを含む宿主細胞がさらに提供される。具体的実施形態において、上記宿主細胞は、ＡＡＶの増殖に適切であり得る。

別の局面において、本出願は、ｒＡＡＶ収量を増大させる方法に関し、上記方法は、本明細書で開示されるＡＡＶベクターを宿主細胞培養物に送達する工程および上記ｒＡＡＶを上記細胞培養物から採取する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞培養物は、真核生物宿主細胞培養物である。

本明細書で開示される組換え核酸分子またはＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶがまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、本出願は、ＧＳＤ－Ｉａの処置のためのｒＡＡＶに関し、上記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド、および上記キャプシドの中にパッケージングされるＡＡＶベクターゲノムを含み、上記ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；本明細書に開示される改変されたＧＰＥ配列；グルコース－６－ホスファターゼα（Ｇ６Ｐａｓｅ－α）をコードするコード配列またはその活性フラグメントもしくは改変体；およびＡＡＶ ３’ ＩＴＲ配列を含む。いくつかの例示的実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。いくつかの実施形態において、上記ベクターゲノムは、配列番号１５と同一の５’および３’ ＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ベクターゲノムは、配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３を含む改変されたＧＰＥを含む。いくつかの実施形態において、上記ベクターゲノムは、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列（配列番号１４））をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記ベクターゲノムは、イントロン（配列番号１３）をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｇ６Ｐａｓｅ－αは、配列番号５と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αのアミノ酸配列は、配列番号５を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αのアミノ酸配列は、配列番号５からなる。いくつかの実施形態において、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αのコード配列は、配列番号３または配列番号４と少なくとも８０％ （例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）同一である。いくつかの例示的実施形態において、上記ベクターゲノムは、配列番号１または２と同一の核酸配列を含む。

本出願はさらに、本発明のｒＡＡＶを含む薬学的組成物に関する。いくつかの実施形態において、上記薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、上記薬学的組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内投与のために製剤化される。例示的実施形態において、上記薬学的組成物は、静脈内投与のために製剤化される。

さらに別の局面において、本出願は、ヒト被験体において糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）を処置する方法であって、上記方法は、上記ヒト被験体に、治療上有効な量の、本明細書で開示されるｒＡＡＶを投与する工程を包含する方法に関する。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、または静脈内に投与される。例示的実施形態において、上記ｒＡＡＶは、静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^１１～約１×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。さらなる実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^１２～約１×１０^１３ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、単一用量のｒＡＡＶが投与される。他の実施形態において、複数用量のｒＡＡＶが投与される。

本発明のこれらおよび他の局面ならびに特徴は、本出願の以下の節において記載される。

本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。

図１Ａは、２つのＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ、配列番号１５）によって境を接して、ＧＰＥ、イントロン、コドン最適化したヒトＧ６ＰＣ遺伝子（ｈＧ６ＰＣｃｏ）、およびＳＶ４０後期ポリＡテールを含むＧ６ＰＣ発現カセットの模式図である。使用した略語： ＧＰＥ － Ｇ６Ｐａｓｅプロモーター／エンハンサー領域； ｈＧ６ＰＣｃｏ － ヒトグルコース－６ホスファターゼコード領域（コドン最適化）； ＩＴＲ－ 逆位末端反復配列； ＳＶ４０Ｌ ｐＡ － ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル； ＵＴＲ － 非翻訳領域。図１Ｂは、野生型（ＤＴＣ１６１）または改変されたＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセット（Ａｌｕ－１およびＡｌｕ－２配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含むＤＴＣ１７５、全３個のＡｌｕエレメントが存在するが、Ａｌｕ－１およびＡｌｕ－２配列の配向が逆であるＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含むＤＴＣ１７６、Ａｌｕ－１、Ａｌｕ－２およびＡｌｕ－３配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含むＤＴＣ１７７、Ａｌｕ－３配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含むＤＴＣ１７８、および全３個のＡｌｕエレメントが存在するが、Ａｌｕ－３配列の配向が逆であるＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含むＤＴＣ１７９）の図示である。

図２は、種々の重要な構成要素が示される、例示的ＡＡＶベクター（ＤＴＣ１６１）の模式図である。上記ベクターの特徴は、以下で提供される：

図３は、ＡＡＶベクターで宿主細胞へと共トランスフェクトされる場合に、ｒＡＡＶをパッケージングするにあたってＲｅｐおよびＣａｐ機能を提供するｐＡＡＶ２－８．ＫａｎＲ（ｐ２１２３－ＦＨ）ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドの模式図である。

図４は、ＡＡＶベクターおよびＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドで宿主細胞へと共トランスフェクトされる場合に、ｒＡＡＶ生成のためのｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）アデノウイルスヘルパープラスミドの模式図である。

図５は、種々のＡＡＶベクターのトランスフェクション後の宿主細胞から生成されたｒＡＡＶの力価を示す棒グラフである。３回の試験を、各条件下で行い、標準偏差を示した。＊は、ＤＴＣ１６１との比較においてＰ＜０．０５を示す。

図６は、ベクターゲノムサイズの関数としてプロットした、生成されたｒＡＡＶの力価を示すグラフである。

図７は、コントロールウイルスベクター、ＤＴＣ１６１、ＤＴＣ１７５、ＤＴＣ１７６、ＤＴＣ１７７、ＤＴＣ１７８、およびＤＴＣ１７９のｒＡＡＶから単離された全長ＤＮＡが、アガロースゲル電気泳動に供される場合に、放出されたＤＮＡのバンドを示し、キャプシド分解およびパッケージされたＤＮＡを放出する能力を評価する、アガロースゲルの画像である。全長ウイルスＤＮＡは、３．８ｋｂ～５ｋｂの間である。「＊」は、キャプシド分解およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理した際のコントロールウイルスベクターから単離された全長ＤＮＡの無傷のゲノムを示す。

図８Ａは、ＨＥＫ２９３細胞において生じたＤＴＣ１６１ベクター調製物からの粒子密度の分析用超遠心分離トレースを示すグラフである。図８Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞において生じたＤＴＣ１７７ベクター（配列番号１によって示される）調製物からの粒子密度の分析用超遠心分離トレースを示すグラフである。使用した略語： ＲＩ－ 屈折率。

図９Ａは、ＤＴＣ１６１ベクターに由来するｒＡＡＶでの感染後に誘導されたＧ６Ｐａｓｅ－α発現の用量応答曲線である。図９Ｂは、ＤＴＣ１７７ベクター（配列番号１によって示される）に由来するｒＡＡＶでの感染後に誘導されたＧ６Ｐａｓｅ－α発現の用量応答曲線である。Ｘ軸は、ＨｕＨ７肝細胞を感染させるために使用したｒＡＡＶ用量を示す。Ｙ軸は、上記細胞における誘導されたＧ６ＰＣ ｍＲＮＡ発現を示す。バッチ生成したＤＴＣ１６１ベクターの確立に由来するｒＡＡＶを、参照標準として使用した。使用した略語： ＲＥＦ－ 参照標準； ＵＮＫ － 試験サンプル。

発明の詳細な説明
本発明は、治療的適用のために使用される、ある範囲の新規な薬剤および組成物を提供する。本発明の分子および組成物は、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）と関連する疾患を改善、防止、もしくは処置するために、または被験体においてグルコース－６－ホスファターゼα（Ｇ６Ｐａｓｅ－α）の存在もしくは機能を増大させるために使用され得る。

別段注記されなければ、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学において共通する用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ、発行 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９４（ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 発行 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４（ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ（編）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， 発行 ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）において見出され得る。

本開示の種々の実施形態の検討を促進するために、具体的な用語の以下の説明が提供される：

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）： ヒトおよびいくらかの他の霊長類の種に感染する、小さな複製欠損性の、エンベロープのないウイルス。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂中の細胞および休止細胞の両方に感染し得、宿主細胞のゲノムへと組み込まれることなく、染色体外状態で持続し得る。これらの特徴は、ＡＡＶを遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターにしている。現在では、１２の認識されているＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～１２）が存在する。

投与／投与する： 被験体に任意の効果的な経路によって薬剤（例えば、治療剤（例えば、組換えＡＡＶ））を提供するまたは与えること。例示的な投与経路としては、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、および静脈内）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻内、膣および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。

コドン最適化した： 「コドン最適化した」核酸とは、そのコドンが、特定のシステム（例えば、特定の種または種の群）における発現のために最適であるように変化させた核酸配列に言及する。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞または特定の哺乳動物種（例えば、ヒト細胞）における発現のために最適化され得る。コドン最適化は、そのコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。

エンハンサー： プロモーターの活性を増大させることによって、転写速度を増大させる核酸配列。

Ｇ６ＰＣ： グルコース－６－ホスファターゼα（Ｇ６Ｐａｓｅ－α）をコードするヒト染色体１７ｑ２１上に位置する遺伝子。Ｇ６Ｐａｓｅ－αは、これを小胞体に固定する９個のらせんを有する３５７アミノ酸の疎水性タンパク質である（Ｃｈｏｕら， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：６７６－６８８， ２０１０）。そのＧ６Ｐａｓｅ－αタンパク質は、糖新生およびグリコーゲン分解の最後の工程においてグルコース－６－リン酸をグルコースおよびホスフェートへと加水分解するのを触媒し、グルコースホメオスタシスの重要な酵素である。Ｇ６ＰＣ遺伝子における変異は、肝臓および腎臓におけるグリコーゲンおよび脂肪の蓄積と関連する重篤な空腹時低血糖症によって特徴づけられる代謝障害である、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）を引き起こす。

糖原病（ＧＳＤ）： 筋肉、肝臓および他の組織内でのグリコーゲン合成または分解の処理における欠陥から生じる疾患群。ＧＳＤは、遺伝的または後天的のいずれかであり得る。遺伝性のＧＳＤは、これらのプロセスに関与する代謝の任意の先天的エラーによって引き起こされる。現在、１１の認識されている糖原病が存在する（ＧＳＤＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、ＶＩＩ型、ＩＸ型、ＸＩ型、ＸＩＩ型、およびＸＩＩＩ型）。ＧＳＤ－Ｉは、２つの常染色体劣性障害、ＧＳＤ－ＩａおよびＧＳＤ－Ｉｂからなる（Ｃｈｏｕら， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：６７６－６８８， ２０１０）。ＧＳＤ－Ｉａは、グルコース－６－ホスファターゼαにおける欠損症から生じる。グルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）における欠損が、ＧＳＤ－Ｉｂの原因である。

糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）： フォンギールケ病としても公知であり、ＧＳＤ－Ｉａは、１００，０００出生において約１例の発生率を有する最も一般的な糖原病である。ＧＳＤ－Ｉａは、酵素グルコース－６－ホスファターゼα（Ｇ６Ｐａｓｅ－α）の欠損症から生じる遺伝的疾患である。Ｇ６Ｐａｓｅ－αにおける欠損症は、遊離グルコースをグリコーゲンからおよび糖新生から生成する肝臓の能力を障害する。ＧＳＤ－Ｉａに罹患した患者は、グルコースホメオスタシスを維持できず、空腹時低血糖症、成長遅延、肝腫大、腎肥大、高脂血症、高尿酸血症、および乳酸血症を呈する（Ｃｈｏｕら， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：６７６－６８８， ２０１０）。現在のところ、ＧＳＤ－Ｉａは治癒しない。

イントロン： タンパク質のコード情報を含まない遺伝子内のＤＮＡの伸長部。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。

逆位末端反復配列（ＩＴＲ）： 効率的な複製のために必要とされるアデノ随伴ウイルスのゲノムにおける対称的な核酸配列。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。上記ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成のための複製起点として働き、ベクター被包化のために必要とされる。

単離された： 「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞）は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞もしくは組織、または生物自体における他の生物学的構成要素（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞）から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製されたものを含む。上記用語はまた、宿主細胞において組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク、ならびに化学合成された核酸分子およびタンパク質を含む。

作動可能に連結された： 第１の核酸配列は、この第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係性に配置されている場合に、この第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、このプロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、そのコード配列に作動可能に連結されている。概して、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、同じリーディングフレームにある。

薬学的に受容可能なキャリア： 本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリア（ビヒクル）は、従来どおりである。Ｅ． Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， 第１５版（１９７５））は、１またはこれより多くの治療用化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載する。

概して、上記キャリアの性質は、使用されている特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は通常、薬学的におよび生理学的に受容可能な流体（例えば、水、生理食塩水、平衡化塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固形の組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の非毒性固体キャリアは、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与されるべき薬学的組成物は、微量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝化剤など（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート））を含み得る。

疾患を防止する、処置する、または改善する： 疾患（例えば、ＧＳＤ－Ｉａ）を「防止する」とは、疾患の完全な発生を阻害することをいう。「処置する」とは、疾患または疾患が発生し始めた後の病的状態の徴候または症状を改善する、治療的介入をいう。「改善する」とは、疾患の徴候または症状の数または重篤度の低減をいう。

プロモーター： 核酸（例えば、遺伝子）の転写を指示する／開始するＤＮＡの領域。プロモーターは、転写開始部位の近くに必要な核酸配列を含む。

精製された： 用語「精製された」は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、それは相対的な用語として意図される。従って、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に関連付けられたタンパク質および他の夾雑物から完全にまたは部分的に単離されているものである。ある特定の実施形態において、用語「実質的に精製された」とは、細胞、細胞培養培地、または他の粗製調製物から単離され、その最初の調製物の種々の構成要素（例えば、タンパク質、細胞デブリ、および他の構成要素）を除去するために分画に供された、ペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物に言及する。

組換え： 組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するか、または２つの別の方法で分離された配列セグメントの人工的な組み合わせによって作製される配列を有するものである。この人工的な組み合わせは、化学合成によって、または核酸分子の単離されたセグメントの人工的な操作によって（例えば、遺伝子工学技術によって）達成され得る。

同様に、組換えウイルスは、天然に存在しない配列（例えば、ゲノム配列）または異なる由来の少なくとも２つの配列の人工的組み合わせによって作製される配列を含むウイルスである。用語「組換え」はまた、天然の核酸分子、タンパク質またはウイルスの一部の付加、置換、または欠失によってのみ変更された核酸、タンパク質およびウイルスを含む。本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ」とは、組換え核酸分子（例えば、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードする組換え核酸分子）がパッケージされたＡＡＶ粒子をいう。

配列同一性： ２もしくはこれより多くの核酸配列、または２もしくはこれより多くのアミノ酸配列の間の同一性または類似性は、その配列間の同一性または類似性に関して表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性に関して測定され得る；パーセンテージが高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、パーセンテージ類似性に関して測定され得る（保存的アミノ酸置換が考慮される）；パーセンテージが高いほど、配列はより類似である。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的方法を使用して整列される場合、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。この相同性は、そのオルソログのタンパク質またはｃＤＮＡが、関係性がより遠い種（例えば、ヒト配列およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して、関係性がより近い種（例えば、ヒト配列およびマウス配列）に由来する場合により顕著である。

比較のための配列のアラインメント法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、以下に記載される： Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２， １９８１； Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３， １９７０： Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， Ｇｅｎｅ， ７３：２３７－４４， １９８８； Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ， ＣＡＢＩＯＳ５：１５１－３， １９８９； Ｃｏｒｐｅｔら， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０８８１－９０， １９８８； Ｈｕａｎｇら Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｓ． ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８， １５５－６５， １９９２：およびＰｅａｒｓｏｎら， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｒｉｏ． ２４：３０７－３１， １９９４。Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０は、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な考慮事項を示す。

ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－１０， １９９０）は、配列分析プログラム、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとともに使用するために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を含むいくつかの情報源から、およびインターネット上で入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩウェブサイトで見出され得る。

血清型： 抗原の特徴的なセットによって区別される、関連性が近い微生物（例えば、ウイルス）の群。

Ｓｔｕｆｆｅｒ配列： ２つの核酸特徴の間に（例えば、プロモーターとコード配列との間に）所望の間隔を作り出すために、または核酸分子が所望の長さのものであるように、核酸分子を伸長させるために代表的には使用されるより大きな核酸分子（例えば、ベクター）内部に含まれるヌクレオチドの配列をいう。Ｓｔｕｆｆｅｒ配列は、タンパク質コード情報を含まず、未知／合成由来／および／またはより大きな核酸分子の内部の他の核酸配列に関連しないものであり得る。

被験体： 生きている多細胞の脊椎のある生物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリー）。

合成の： 実験室において人工的手段によって生成される。例えば、合成核酸は、実験室において化学合成され得る。

治療上有効な量： 薬剤で処置される被験体において、または細胞において、所望の効果を達成するために十分な、特定の医薬または治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）の量。上記薬剤の有効量は、処置されている被験体または細胞、および治療用組成物の投与様式が挙げられるが、これらに限定されないいくつかの要因に依存する。

ベクター： ベクターは、ベクターが宿主細胞において複製するおよび／または組み込まれる能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、１またはこれより多くの選択マーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含み得る。発現ベクターは、挿入された遺伝子の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。本明細書中のいくつかの実施形態において、上記ベクターは、ＡＡＶベクターである。

別段説明されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「その、この、上記（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に示さなければ、複数形への言及を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値が、近似値であり、説明のために提供されることは、さらに理解されるべきである。本明細書で記載されるものに類似または等価な方法および材料が本開示の実施または試験において使用され得るものの、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（用語の説明を含む）が優先する、さらに、上記材料、方法および例は、例証に過ぎず、限定ではないことが意図される。

Ｉ． 組換え核酸
本発明の１つの局面は、野生型ＧＰＥと比較して、１またはこれより多くのＡｌｕエレメントを欠いている改変されたＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）を含む組換え核酸配列であって、ここで上記改変されたＧＰＥは、Ｇ６Ｐａｓｅ－α（配列番号５）をコードするコード配列の発現を指示し得る組換え核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、１またはこれより多くのＡｌｕエレメントを、ヒトＧ６ＰＣ遺伝子の内因性プロモーターから除去する（例えば、配列番号６の連続するヌクレオチド９３４～１１２７（Ａｌｕ－１）、１４８８～１８２３（Ａｌｕ－２）、および１９９５～２３５０（Ａｌｕ－３）のうちの１またはこれより多くを除去する）ことによって得られる。いくつかの他の実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、１またはこれより多くのＡｌｕエレメントを、他の哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、齧歯類など）のＧ６ＰＣ遺伝子の内因性プロモーターから除去することによって得られる。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、野生型ＧＰＥと比較して、Ｇ６ＰＣ遺伝子発現に影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、野生型ＧＰＥと比較して、Ｇ６ＰＣ遺伝子の発現を増強し得る。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、野生型ＧＰＥとして肝臓においてＧ６ＰＣ遺伝子発現を駆動するために匹敵する活性を、および他の組織においてＧ６Ｐａｓｅ－α発現を駆動するために非常に低い活性を有する。

いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、配列番号６の連続するヌクレオチド９３４～１１２７（Ａｌｕ－１）と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を欠く核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、配列番号６の連続するヌクレオチド１４８８～１８２３（Ａｌｕ－２）と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を欠く核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、配列番号６の連続するヌクレオチド１９９５～２３５０（Ａｌｕ－３）と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を欠く核酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、配列番号６の、Ａｌｕ－１と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列およびＡｌｕ－２と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を欠く核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、配列番号６の、Ａｌｕ－１と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列およびＡｌｕ－３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を欠く核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、配列番号６の、Ａｌｕ－２と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列およびＡｌｕ－３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を欠く核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記改変されたＧＰＥは、配列番号６の、Ａｌｕ－１と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列、Ａｌｕ－２と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列、およびＡｌｕ－３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の配列を欠く核酸配列を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、上記組換え核酸配列は、配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を有するＧＰＥであって、ここで上記ＧＰＥは、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列の発現を指示し得るＧＰＥを含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸配列は、配列番号７と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を有するＧＰＥであって、ここで上記ＧＰＥは、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列の発現を指示し得るＧＰＥを含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸配列は、配列番号８と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を有するＧＰＥであって、ここで上記ＧＰＥは、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列の発現を指示し得るＧＰＥを含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸配列は、配列番号９と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を有するＧＰＥであって、ここで上記ＧＰＥは、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列の発現を指示し得るＧＰＥを含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸配列は、配列番号１０と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を有するＧＰＥであって、ここで上記ＧＰＥは、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列の発現を指示し得るＧＰＥを含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸配列は、配列番号１１と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を有するＧＰＥであって、ここで上記ＧＰＥは、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列の発現を指示し得るＧＰＥを含む。いくつかの実施形態において、上記組換え核酸配列は、配列番号１２と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を有するＧＰＥであって、ここで上記ＧＰＥは、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列の発現を指示し得るＧＰＥを含む。

本発明の別の局面は、本明細書で開示される改変されたＧＰＥおよびＧ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列を含む組換え核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αは、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αは、配列番号５またはその活性フラグメントもしくは改変体を含む。例示的実施形態において、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αは、配列番号５を含むかまたはそれからなる。

いくつかの実施形態において、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列は、配列番号４と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、上記ヒトＧ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列は、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ^ＴＭ コドン最適化技術（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用して、ヒトＧ６ＰＣ ｃＤＮＡに対して行われ得る。その最適化されたＧ６ＰＣ ｃＤＮＡ配列は、調べられ得、潜在的な代替リーディングフレーム（ＡＲＦ）を、長さにおいて９またはこれより多くのアミノ酸のペプチドを理論的にはコードし得る内部のインフレームではないＡＴＧ配列から排除するようにさらに改変され得る。例えば、さらなる改変は、ＡＲＦから生成される導入遺伝子生成物に対する潜在的な細胞傷害性Ｔリンパ球応答を回避するために、コドン最適化したＧ６ＰＣ ｃＤＮＡ配列上で行われ得る（Ｌｉら， ２００９， ＰＮＡＳ １０６： １０７７０－４）。いくつかの実施形態において、上記コドン最適化したヒトＧ６Ｐａｓｅ－αのコード配列は、配列番号３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を組み込む。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりの、上記改変されたＧＰＥおよびＧ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列を含む組換え核酸配列は、イントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルをさらに含む。いくつかの実施形態において、上記イントロンは、上記ＧＰＥと上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αコード配列との間に配置される。いくつかの実施形態において、上記イントロンは、キメライントロンであり、これは、上記Ｇ６Ｐａｓｅ－α導入遺伝子発現を増大させる。上記イントロンは、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロンに由来する５’－ドナー部位および分岐および免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンに由来する３’－アクセプター部位から構成され得、ここで上記ドナー部位およびアクセプター部位の配列は、分岐点部位とともに、スプライシングのためのコンセンサス配列に合うように変更されている。いくつかの実施形態において、上記イントロンは、配列番号１３と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を含む。

ポリアデニル化シグナルは、Ｇ６ＰＣ ｍＲＮＡの効率的ポリアデニル化のために、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列の下流に配置され得る。種々のポリアデニル化シグナルが使用され得る（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル、ｈＧＨポリアデニル化シグナル、ＢＧＨポリアデニル化シグナル、またはｒｂＧｌｏｂポリアデニル化シグナル）。いくつかの実施形態において、上記ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態において、上記ポリアデニル化シグナルは、配列番号１４と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を含む。

本発明の別の局面は、本明細書で開示される、改変されたＧＰＥ、およびＧ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列を含む組換えベクターを提供する。いくつかの実施形態において、上記組換えベクターは、本明細書で記載されるイントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルをさらに含む。上記ベクターは、哺乳動物発現ベクター、細菌発現ベクター、酵母発現ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ＲＮＡｉベクター、またはＣｒｅ－Ｌｏｘ発現ベクター、ＣＲＩＳＰＲ発現ベクター、ＴＡＬＥＮ発現ベクターなどであり得る。上記ベクターは、本明細書で記載されるイントロンおよび／またはポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、上記組換えベクターは、上記ＧＰＥと上記イントロンとの間に、および／または上記イントロンと上記Ｇ６Ｐａｓｅ－αコード配列との間に置かれたｓｔｕｆｆｅｒ核酸配列をさらに含む。

いくつかの実施形態において、上記組換えベクターは、ＡＡＶベクターである。上記ＡＡＶベクターは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２のＡＡＶベクター（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２）、ならびにヒトおよび非ヒト霊長類組織から単離された１００を超える改変体のうちのいずれか１つであり得る（例えば、Ｃｈｏｉら， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ５：２９９－３１０， ２００５；およびＧａｏら， Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ５：２８５－２９７， ２００５を参照のこと）。任意の血清型ＡＡＶベクターは、本発明において使用され得、ＡＡＶ血清型の選択は、遺伝子治療のために標的化される細胞タイプに一部依存する。ＧＳＤ－Ｉａの処置に関しては、肝臓は、関連する標的器官のうちの１つである。

いくつかの実施形態において、上記組換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、これは、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がｔｒａｎｓで提供される場合に、ベクターＤＮＡ複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。さらに、上記ＩＴＲは、大きなＲｅｐタンパク質による１本鎖ヌクレオチド内部ニック形成（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｔｉｃ ｎｉｃｋｉｎｇ）の標的として働き、個々のゲノムを複製中間体から分離する。

いくつかの例示的実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクターであり、上記ベクターは、本明細書で記載される、改変されたＧＰＥ、イントロン、Ｇ６Ｐａｓｅ－αをコードするコード配列、およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含む。いくつかの実施形態において、上記ベクターは、２つのＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）配列（配列番号１５）をさらに含む：一方は、上記ＧＰＥの５’側、および一方は上記ポリアデニル化シグナルの３’側。いくつかの特定の非限定的例において、上記組換えベクターは、配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一の核酸配列を含む。

ＩＩ． 組換え核酸を含む宿主細胞
本明細書で開示される組換え核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞が、さらに提供される。非常に広い範囲の宿主細胞が使用され得る（例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物の細胞など）。いくつかの実施形態において、上記宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の生成に適した細胞（または細胞株）、例えば、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９、またはＭＲＣ－５細胞であり得る。

上記組換え核酸分子またはベクターは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、宿主細胞培養物に送達され得る。いくつかの実施形態において、ゲノムに挿入された上記組換え核酸分子またはベクターを有する適切な宿主細胞株が、生成される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＡＡＶベクターを含む適切な宿主細胞株が生成される。上記宿主培養物へのＡＡＶベクターのトランスフェクション後に、上記ｒＡＡＶの、上記宿主ゲノムへの組み込みは、Ｎａｋａｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２００３） ３４， ２９７－３０２； Ｐｈｉｌｐｏｔｔら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ （２００２） ７６（１１）：５４１１－５４２１、およびＨｏｗｄｅｎら， Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００８； １０：４２－５０によって記載されるように、種々の方法（例えば、抗生物質選択、蛍光活性化セルソーティング、サザンブロット、ＰＣＲベースの検出、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）によってアッセイされ得る。さらに、安定な細胞株が、当該分野で周知のプロトコール（例えば、Ｃｌａｒｋ， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｏｌ ６１ （２００２）：Ｓ９－Ｓ１５、およびＹｕａｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１１ Ｍａｙ；２２（５）：６１３－２４に記載されるもの）に従って樹立され得る。

ＩＩＩ． 組換えＡＡＶ
本発明はまた、本明細書で記載されるＡＡＶキャプシドおよびＡＡＶベクターゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。上記ＡＡＶキャプシドは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２（すなわち、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはｒｈ１０）であり得る。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。

ｒＡＡＶは、本明細書で開示されるＡＡＶベクター、ならびにＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子機能、ならびにさらなるヘルパー機能を供給している宿主細胞によって生成され得る。上記ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子機能は、種々の手段によって、例えば、野生型ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含むプラスミドまたは任意のタイプのベクター、ならびにＲｅｐおよびＣａｐ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションによって、宿主細胞に提供され得る。さらなるヘルパー機能は、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）感染によって、必要とされるＡＶヘルパー機能遺伝子の全てを有するプラスミドによって、または他のウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはバキュロウイルス）によって、提供され得る。任意の遺伝子、遺伝子機能、または宿主細胞がｒＡＡＶ生成に必要な他の遺伝的物質は、上記宿主細胞内に一過性に存在し得るか、または上記宿主細胞ゲノムに安定して挿入され得る。本発明の方法とともに使用するために適したｒＡＡＶ生成法は、Ｃｌａｒｋら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１３２９－１３４１ （１９９５）， Ｍａｒｔｉｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３－２６９ （２０１３）， Ｔｈｏｒｎｅら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：７０７－７１４ （２００９）， Ｆｒａｓｅｒ Ｗｒｉｇｈｔ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：６９８－７０６ （２００９）、およびＶｉｒａｇら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：８０７－８１７ （２００９）に開示されるものを含む。

例示的実施形態において、ＨＥＫ２９３細胞は、以下でトランスフェクトされる：配列番号１または配列番号２の核酸配列を含むＡＡＶベクター；血清型８の４つの野生型ＡＡＶ２ウイルス複製（Ｒｅｐ）タンパク質および３つの野生型ＡＡＶウイルスキャプシド（ｃａｐ）タンパク質をコードするプラスミド；ならびにＡＡＶ複製にとって重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡを含むプラスミド。ＡＡＶ８キャプシドを含むｒＡＡＶは、その後生成され得、上記宿主細胞から単離され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターにおいて上記Ａｌｕエレメントのうちの１またはこれより多くを欠いている上記改変されたＧＰＥは、上記宿主細胞から生成されるｒＡＡＶのパッケージングを増強する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターにおいて上記Ａｌｕエレメントのうちの１またはこれより多くを欠いている上記改変されたＧＰＥは、自己相補的構造形成に影響を及ぼし、よって、宿主細胞から生成されるｒＡＡＶの収量を増強する。

ＡＡＶ感染細胞の溶解は、感染性ウイルス粒子を放出するために、上記細胞を化学的にまたは酵素的に処理する方法によって達成され得る。これらの方法は、ヌクレアーゼ（例えば、ベンゾナーゼもしくはＤＮＡｓｅ）、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、または洗剤もしくは界面活性剤の使用を含む。物理的破壊（例えば、ホモジナイゼーションまたは粉砕）、または微小流動化機圧力セル（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を介する圧力の印加、または凍結－融解サイクルがまた、使用され得る。あるいは、上清は、細胞溶解を必要とすることなくＡＡＶ感染細胞から集められ得る。

ｒＡＡＶおよびヘルパーウイルス粒子を含むサンプルを精製して、例えば、細胞溶解から生じる細胞デブリを除去することは、必要であり得る。ヘルパーウイルスおよびＡＡＶ粒子の最小限の精製の方法は、当該分野で公知であり、任意の適切な方法が、本発明の方法において使用するためのＡＡＶおよびヘルパーウイルス粒子の両方を含むサンプルを調製するために使用され得る。２つの例示的精製法は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）ベースの、およびイオジキサノールベースの密度勾配精製である。両方の方法が、Ｓｔｒｏｂｅｌら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２６（４）： １４７－１５７ （２０１５）において記載される。最小限の精製はまた、例えば、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティー樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）またはＰＯＲＯＳ^ＴＭ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶＸアフィニティー樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｍｉｌｌｅｒｓｂｕｒｇ， ＰＡ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して達成され得る。ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティー樹脂を使用するＡＡＶ精製の方法は、例えば、Ｗａｎｇら， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．， ２：１５０４０ （２０１５）に記載される。

ヘルパーウイルスを熱によって不活性化することは必要であり得る。熱不活性化技術は、ＡＡＶおよびヘルパーウイルス粒子の異なる熱安定性に基づく。例えば、ＡＡＶ粒子は、５６℃程度の温度に加熱されてもなお無傷のままであることができる一方で、ＡＶ粒子は、不活性になる。Ｃｏｎｗａｙら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６， ９８６－９９３， １９９９は、ＡＡＶ含有サンプル中でのＨＳＶ差次的な熱不活性化を記載する。熱不活性化は、任意の公知の方法論によって達成され得る。以下で記載される例では、熱不活性化は、３００μＬまたはこれより少ないサンプル容積を急激に加熱および冷却するために、サーモサイクラーを使用して達成された。このシステムを、これが主に伝導性である伝熱に依拠することから選択し、連続フローシステムおよび能動的な混合を使用するより大きなバッチシステムの両方に関する実行可能なモデルにする。連続フローシステムの例は、連続フロー熱交換器（例えば、ＤＨＸ^ＴＭ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｕｓｅ Ｈｅａｔ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｍｉｌｌｅｒｓｂｕｒｇ， ＰＡ））にサンプルを通過させることを含む。このようなシステムは、そのオペレーターが、熱交換器を通過するサンプルの流量を制御し、従って、加熱プロセスの継続時間およびその熱交換器の温度を制御し、従って、熱不活性化の温度を制御することによって熱不活性化プロセスを制御することを可能にする。

あるいは、熱不活性化は、種々のサイズのバッチシステムを使用して達成され得る。例えば、熱不活性化は、ＡＡＶ含有サンプルを１Ｌ ＰＥＴＧボトルの中に入れ、そのボトルを、混合しながら所望の不活性化温度に設定したウォーターバスの中に所望の時間にわたって入れることによって、１Ｌスケールで達成され得る；例えば、上記サンプルは、４７℃へと２０分間にわたって加熱され得る。より大きなスケールでは、熱不活性化は、そのｒＡＡＶ含有サンプルを、所望の不活性化温度に設定した温度制御揺動プラットフォーム上の５Ｌバイオプロセシングバッグの中に所望の期間にわたって入れることによって達成され得る。例えば、上記揺動プラットフォームは、３０ＲＰＭの揺動速度、４０分間にわたる１２°の角度の混合で４９℃に設定され得る。

熱不活性化は、ヘルパーウイルス粒子が実質的に不活性化される一方で活性なｒＡＡＶ粒子が残る、ｒＡＡＶ粒子とヘルパーウイルス粒子との間での安定性に十分な差異が存在する任意の温度で起こり得る。当業者は、より高い温度が、より大きなレベルのＡＶ低減を達成するために必要とされ得ることを理解する。いくつかの実施形態において、上記熱不活性化工程は、コスモトロピック塩および／または二価もしくは三価カチオンを含む緩衝液の使用を含む。コスモトロピック塩および／または二価もしくは三価カチオンを含む緩衝液の存在下での熱不活性化の方法は、ＷＯ／２０１７／１７２７７２に記載される。

熱不活性化がいったん達成されると、不活性化の効率を決定することが必要であり得るか、または望ましいことであり得る。不活性化プロトコールの有効性は、複製能力のあるヘルパーウイルスの存在を検出するアッセイ（例えば、プラークアッセイ）によって決定される。ヘルパーウイルスに関するプラークアッセイは、当業者に周知である（ＡＶ、ＨＳＶ、バキュロウイルスなどに関するプラークアッセイを含む）。アデノウイルスのプラークアッセイは、任意の適切な細胞タイプ（例えば、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３細胞）を使用して行われ得る。標準的なプラークアッセイプロトコールは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００３に記載される。アデノウイルス力価を測定するための代替のアッセイは、ウイルスタンパク質（例えば、ヘキソン（ｈｅｘｏｎ）タンパク質）を、免疫細胞化学染色を使用して検出することによって、培養物中の感染細胞の同定を可能にするものを含む。このようなアッセイとしては、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ^ＴＭ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）が挙げられる。不活性化の効率は、ウイルスの対数低減（ＬＲＶ）として概して報告される。

ｒＡＡＶ粒子の定量は、ＡＡＶ感染がインビトロで細胞変性効果を生じず、従って、プラークアッセイが感染性力価を決定するために使用できないという事実によって複雑にされる。しかし、ＡＡＶ粒子は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（Ｃｌａｒｋら， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １０， １０３１－１０３９ （１９９９））もしくはドットブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｕｌｓｋｉら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３， ３８２２－３８２８ （１９８９））を含む多くの方法を使用して、または高度精製ベクター調製物の光学密度（Ｓｏｍｍｅｒら， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． ７， １２２－１２８ （２００３））によって定量され得る。ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）は、サーモサイクラー（例えば、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ ９６ウェルブロックフォーマットサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ））においてリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（ＤＲＰ－ｑＰＣＲ）によって定量され得る。ＡＡＶ粒子を含むサンプルは、ＤＮａｓｅ Ｉ（１００ Ｕ／ｍｌ； Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）の存在下で、３７℃において６０分間インキュベートされ、続いて、５０℃において６０分間のプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）消化（１０ Ｕ／ｍｌ）、次いで、９５℃において３０分間変性される。使用されるプライマー－プローブセットは、ＡＡＶベクターゲノムの天然でない部分、例えば、目的のタンパク質のポリ（Ａ）配列に特異的であるべきである。そのＰＣＲ生成物は、プライマー、プローブ、および増幅された配列の長さおよび組成に基づいて、サイクリングパラメーターの任意の適切なセットを使用して増幅され得る。代替のプロトコールは、例えば、Ｌｏｃｋら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（２）： １１５－１２５ （２０１４）に開示される。

ｒＡＡＶ粒子の感染性は、例えば、Ｚｈｅｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５：７０９－７１５ （２００４）に記載されるように、ＴＣＩＤ_５０（５０％における組織培養感染用量）アッセイを使用して決定され得る。このアッセイにおいて、ＡＡＶベクター粒子は、段階希釈され、Ｒｅｐ／Ｃａｐ発現細胞株を、９６ウェルプレート中でＡＶ粒子とともに共感染させるために使用される。感染の４８時間後、感染およびコントロールウェルの全細胞ＤＮＡが、抽出される。次いで、ＡＡＶベクター複製は、導入遺伝子特異的プローブおよびプライマーでのｑＰＣＲを使用して測定される。ＴＣＩＤ_５０ 感染性／ミリリットル（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）を、１０倍連続希釈においてＡＡＶに関して陽性のウェルの比率を使用して、Ｋaeｒｂｅｒの式で計算する。

ＩＶ． 遺伝子治療のための組換えＡＡＶ
ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科およびＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ＡＡＶは、直線状の１本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージする、小さなエンベロープのないウイルスである。ＡＡＶ ＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が、等しい頻度でＡＡＶキャプシドへとパッケージされる。

上記ＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接する２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって特徴づけられる。上記ＡＡＶ２ゲノムにおいて、例えば、上記ＩＴＲの最初の１２５ヌクレオチドは、パリンドロームであり、これは、塩基対合を最大にするようにそれら自体を折りたたんで、Ｔ字型ヘアピン構造を形成する。上記ＩＴＲの他の２０塩基（Ｄ配列といわれる）は、対合しないままである。上記ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡ複製にとって重要なｃｉｓ作用性配列である；上記ＩＴＲは複製起点であり、ＤＮＡポリメラーゼによる第２鎖合成のプライマーとして働く。この合成の間に形成される２本鎖ＤＮＡ（これは、複製形態モノマーといわれる）は、第２回の自己感作複製のために使用され、複製形態ダイマーを形成する。これらの２本鎖中間体は、鎖置換機構を介して処理され、パッケージングに使用される１本鎖ＤＮＡおよび転写に使用される２本鎖ＤＮＡを生じる。Ｒｅｐ結合エレメントおよび末端分離部位（ＴＲＳ）が、ＩＴＲ内に位置する。これらの特徴は、２本鎖中間体を処理するために、ＡＡＶ複製の間にウイルス調節タンパク質Ｒｅｐによって使用される。ＡＡＶ複製におけるそれらの役割に加えて、上記ＩＴＲはまた、ＡＡＶゲノムパッケージング、転写、許容できない条件下での負の調節、および部位特異的組み込みにとって必須である（Ｄａｙｓ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

ＡＡＶの左側のＯＲＦは、４つのタンパク質－ Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードするＲｅｐ遺伝子を含む。右側のＯＲＦは、３つのウイルスキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）を生成するＣａｐ遺伝子を含む。そのＡＡＶキャプシドは、正二十面体対称へと配置される６０のウイルスキャプシドタンパク質を含む。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１：１：１０モル比で存在する（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

ＡＡＶは、現在のところ、遺伝子治療のために最も頻繁に使用されるウイルスのうちの１つである。ＡＡＶは、ヒトおよび数種の他の霊長類種に感染するものの、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫応答を誘発する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂中の細胞および休止細胞の両方に感染し得、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、染色体外の状態で持続する。ＡＡＶの有利な特徴が原因で、本開示は、本明細書で開示される組換え核酸分子および方法のためのＡＡＶの使用を企図する。

ＡＡＶは、標的細胞に結合し、進入し、核に入る能力、長期間にわたって核において発現される能力、および低毒性を含め、遺伝子治療ベクターのいくつかの望ましい特徴を有する。しかし、ＡＡＶゲノムのサイズは小さいことから、組み込まれ得る異種ＤＮＡのサイズは制限がある。この問題を最小限にするために、Ｒｅｐおよび組み込み効率エレメント（ＩＥＥ）をコードしないＡＡＶベクターは、構築されている。上記ＩＴＲは、これらがパッキングに必要とされるｃｉｓシグナルであることから保持される（Ｄａｙａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｓ， Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ， ２１（４）：５８３－５９３， ２００８）。

遺伝子治療に適したｒＡＡＶを生成するための方法は、当該分野で周知であり（例えば、米国特許出願公開２０１２／０１００６０６；同第２０１２／０１３５５１５；同第２０１１／０２２９９７１；および同第２０１３／００７２５４８；ならびにＧｈｏｓｈら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（４）：３２１－３２９， ２００６を参照のこと）、本明細書で開示される組換え核酸分子および方法とともに利用され得る。

本明細書で開示されるｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物は、本開示によって提供される。ｒＡＡＶの投与のための適切な薬学的製剤は、例えば、米国特許出願公開２０１２／０２１９５２８において見出され得る。本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリア（ビヒクル）は、従来どおりである。Ｅ． Ｗ． ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， 第１５版（１９７５））は、１またはこれより多くの治療用化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適した組成物および製剤を記載する。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ヒト被験体における注入に適した緩衝液／キャリア中に製剤化される。上記緩衝液／キャリアは、ｒＡＡＶが注入チューブに貼り付くことを防止するが、インビボでのｒＡＡＶ結合活性に干渉しない構成要素を含むべきである。種々の適切な溶液が、以下のうちの１またはこれより多くを含み得る：緩衝化食塩水、界面活性剤、および約１００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭ 塩化ナトリウムに等しいイオン強度に調節された生理学的に適合性の塩または塩の混合物、または等しいイオン濃度に調節された生理学的に適合性の塩。そのｐＨは、６．５～８．５、または７～８．５、または７．５～８の範囲にあり得る。適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマ―、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２本の親水性鎖が隣接したポリオキシプリピレン１０（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールおよびポリエチレングリコールから選択され得る。

本発明はまた、糖原病１ａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）と診断された被験体を処置する方法、および治療上有効な量の本明細書で開示されるｒＡＡＶ（またはそのｒＡＡＶを含む組成物）を上記被験体に投与する方法を提供する。

任意の適切な方法または経路は、本明細書で記載されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ含有組成物を投与するために使用され得る。投与経路としては、例えば、全身、経口、吸入、鼻内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶまたは上記ｒＡＡＶを含む組成物は、静脈内投与される。

投与される具体的用量は、各患者に対して均一な用量、患者１名あたり例えば、１．０×１０^１３～１．０×１０^１５ ゲノムコピー（ＧＣ）のウイルスであり得る。あるいは、患者の用量は、上記患者のおおよその体重または表面積に合わせて調節され得る。適切な投与量を決定することにおける他の要因としては、処置または防止される疾患または状態、疾患の重篤度、投与経路、および上記患者の年齢、性別および医学的状態が挙げられ得る。処置に適切な投与量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、当業者によって、特に、本明細書で開示される投与量情報およびアッセイに鑑みて慣用的に行われる。上記投与量はまた、適切な用量－応答データとともに使用される投与量を決定するために公知のアッセイの使用を通じて決定され得る。例えば、投与されるｒＡＡＶの最適な生物学的用量は、最初の低血糖事象（制御された絶食チャレンジの間でのグルコース＜６０ｍｇ／ｄＬ（＜３．３３ｍｍｏｌ／Ｌ）と定義される）までの時間（分単位）を評価することによって同定され得る。制御された絶食チャレンジは、低血糖症が起こるか、または１５時間に達したときに終了する。個々の患者の投与量はまた、上記疾患の進行がモニターされるにつれて調節され得る。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、ｑＰＣＲまたは液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるように、例えば、約１．０×１０^１１ ゲノムコピー／ｋｇ 患者体重（ＧＣ／ｋｇ）～約１×１０^１４ ＧＣ／ｋｇ、約５×１０^１１ ゲノムコピー／ｋｇ 患者体重（ＧＣ／ｋｇ）～約５×１０^１３ ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０^１２～約１×１０^１３ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約２×１０^１２ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約６×１０^１２ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶは、約１×１０^１３ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される。上記ｒＡＡＶは、単一用量で、または所望の治療結果にとって必要とされる場合は、複数回用量で投与され得る（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くの用量）、

用量は、１週間に、１ヶ月に、もしくは１年に１回もしくはより多くの回数、またはさらに２～２０年ごとに１回与えられ得る。例えば、各用量は、最低でも１週間空けて、２週間空けて、３週間空けて、１ヶ月空けて、３ヶ月空けて、６ヶ月空けて、または１年空けて与えられ得る。当業者は、体液もしくは組織において測定される標的化可能な構築物または複合体の滞留時間および濃度に基づく投与のための反復割合を容易に推定し得る。

Ｖ． 組換えウイルス収量および遺伝子治療有効性を増大させる方法
本発明はまた、宿主細胞からの組換えウイルスの収量を増大させる方法であって、ここで上記方法は、１またはこれより多くのＡｌｕエレメントまたはＡｌｕエレメント関連配列を組換えウイルスベクターから除去する工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記Ａｌｕエレメント関連配列は、例えば、配列番号６の連続するヌクレオチド９３４～１１２７（Ａｌｕ－１）、１４８８～１８２３（Ａｌｕ－２）、および１９９５～２３５０（Ａｌｕ－３）から選択されるＡｌｕエレメントと少なくとも５０％同一である。上記組換えウイルスベクターは、例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのＡｌｕエレメントまたはＡｌｕエレメント関連配列は、上記ウイルスベクター内のプロモーター／エンハンサー領域から除去される。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くのＡｌｕエレメントまたはＡｌｕエレメント関連配列は、上記ウイルスベクター内のイントロン領域から除去される。ある実施形態において、上記ＡｌｕエレメントまたはＡｌｕエレメント関連配列の除去は、上記組換えウイルス粒子のパッケージングの間に形成される自己相補性構造を低減し、従って、宿主細胞からのウイルス収量を改善する。

詳細な説明全体を通じて、組成物が、特定の構成要素を有する、包含する、もしくは含むと記載される場合、またはプロセスおよび方法が、特定の工程を有する、包含する、もしくは含むと記載される場合、さらに、その記載される構成要素から本質的になるかまたはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびにその記載される処理工程から本質的になるかまたはそれからなる本発明に従うプロセスおよび方法が存在することは、企図される。

本出願において、要素または構成要素が、記載される要素または構成要素のリストの中に含まれるおよび／またはリストから選択されるといわれる場合、その要素もしくは構成要素が、その記載される要素もしくは構成要素のうちのいずれか１つであり得るか、またはその要素もしくは構成要素が、その記載される要素もしくは構成要素のうちの２もしくはこれより多くからなる群より選択され得ることは、理解されるべきである。

さらに、本明細書で記載される組成物または方法の要素および／または特徴が、本明細書で明示的であろうと暗示的であろうと、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく種々の方法において組み合わされ得ることは、理解されるべきである。例えば、特定の化合物に対して言及がなされる場合、その化合物は文脈から別段理解されなければ、本発明の組成物の種々の実施形態においておよび／または本発明の方法において使用され得る。言い換えると、本出願の中で、実施形態は、明確かつ簡潔な適用が書かれ、描かれることを可能にする方法で記載され、示されているが、実施形態が、本教示および本発明から切り離されることなく、種々に組み合わされてもよいし、分離されてもよいことは、意図され、認識される。例えば、本明細書で記載され、示される全ての特徴が、本明細書で記載され、示される本発明の全ての局面に適用可能であり得ることは、認識される。

表現「のうちの少なくとも１」が、文脈および用途から別段理解されなければ、その表現の後に来る記載される物体の各々、およびその記載される物体のうちの２またはこれより多くの種々の実施形態を個々に含むことは、理解されるべきである。３またはこれより多くの記載される物体に関連して、表現「および／または」は、文脈から別段理解されなければ、同じ意味を有することが理解されるべきである。

用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、これらの文法上等価なものを含め、概して制限がなくかつ非限定的である、例えば、別段具体的に述べられなければ、または文脈から理解されなければ、さらなる記載されない要素または工程を排除しないと概して理解されるべきである。

用語「約」が定量的値の前で使用される場合、本発明はまた、別段具体的に述べられなければ、その特定の定量的値自体を含む。本明細書で使用される場合、用語「約」とは、別段示されなければまたは推測されなければ、名目上の値からの±１０％ 変動に言及する。

工程の順序またはある特定の行為を行うための順序は、本発明が実施可能なままである限りにおいて、重要ではないことが理解されるべきである。さらに、２またはこれより多くの工程または行為は、同時と見做されてもよい。

任意のおよび全ての例、または例示的な文言、例えば、「のような、例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の本明細書での使用は、本発明をよりよく例証することを意図するに過ぎず、別段特許請求されなければ、本発明の範囲に対する限定を課すものではない。本明細書中のいかなる文言も、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須として示すと解釈されるべきではない。

ここで一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによって容易に理解される。その実施例は、本発明のある特定の局面および実施形態を例証する目的でのみ含まれ、本発明を限定することは意図されない。

実施例１－ＡＡＶベクターおよびこのベクターから生成されるｒＡＡＶ
ＡＡＶベクター
２つのＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ、配列番号１５）によって境を接するＧ６ＰＣ発現カセットを含むＡＡＶベクターを、構築した。上記Ｇ６ＰＣ発現カセットを、そのＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）５’末端において、Ｙｉｕら， ２０１０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（６）： １０７６－８４において列挙されるプライマー配列「１Ｓ」およびその関連づけられたＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位によって画定した。上記Ｇ６ＰＣ発現カセットを、そのＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル３’末端において、ＳＶ４０ゲノムとのアラインメントおよび関連づけられたＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位によって画定した。全てのＧ６ＰＣ発現カセットは、図１Ａに図示されるように、ＧＰＥ、イントロン、コドン最適化したヒトＧ６ＰＣ遺伝子、およびＳＶ４０後期ポリＡテールを含む。上記Ｇ６ＰＣ発現カセットの異なるバージョンを作成した。その各々は、図１Ｂに図示されるように、野生型ＧＰＥ、または改変されたＧＰＥのいずれかを含む。上記Ｇ６ＰＣ発現カセットのエレメントを、以下に記載する。

上記野生型Ｇ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ、配列番号６）は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来し、ＲｅｆＳｅｑ ＮＧ＿０１１８０８によって規定される。この配列は、ヒトＧ６ＰＣ遺伝子の内因性プロモーターであり、肝臓においてほとんど専ら活性を有し、腎臓においては最低限の活性を有する。上記野生型ＧＰＥは、配列番号６の連続するヌクレオチド９３４～１１２７（Ａｌｕ－１）、１４８８～１８２３（Ａｌｕ－２）および１９９５～２３５０（Ａｌｕ－３）に位置する３個のＡｌｕエレメントを含む。ＡＡＶベクターＤＴＣ１６１は、野生型ＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含む。ＡＡＶベクターＤＴＣ１７５は、Ａｌｕ－１およびＡｌｕ－２配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含む。ＡＡＶベクターＤＴＣ１７６は、Ａｌｕ－１およびＡｌｕ－２配列の配向が逆であるＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含む。ＡＡＶベクターＤＴＣ１７７（配列番号１によって示される）は、Ａｌｕ－１、Ａｌｕ－２、およびＡｌｕ－３配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含む。ＡＡＶベクターＤＴＣ１７８は、Ａｌｕ－３配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含む。ＡＡＶベクターＤＴＣ１７９は、Ａｌｕ－３の配向が逆であるＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含む。

キメライントロン（配列番号１３）は、ヒトβ－グロビン遺伝子の第１のイントロンに由来する５’－ドナー部位および分岐および免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロンに由来する３’－アクセプター部位から構成される。ドナー部位およびアクセプター部位の配列は、分岐点部位とともに、スプライシングのためのコンセンサス配列と合うように変更された（ＣＩ－ｎｅｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２１５， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。キメライントロンの目的はまた、遺伝子発現を改善することである。

上記Ｇ６ＰＣ ｃＤＮＡ（配列番号４）は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓに由来し、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、商標名ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ^ＴＭ コドン最適化技術（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を使用してヒトＧ６ＰＣ ｃＤＮＡに対して行った。その最適化したｃＤＮＡ配列を調べ、長さにおいて９またはこれより多くのアミノ酸のペプチドを理論的にはコードし得る内部のインフレームにないＡＴＧ配列から潜在的代替リーディングフレーム（ＡＲＦ）を排除するようにさらに改変した。例えば、コドン最適化したＧ６ＰＣ ｃＤＮＡは、配列番号３によって示される。

シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）後期ポリアデニル化シグナル（Ｇｅｎｂａｎｋ ＃ Ｊ０２４００， 配列番号１４）は、Ｇ６ＰＣ ｍＲＮＡの効率的ポリアデニル化のためのｃｉｓ配列を提供する。このエレメントは、新生転写物の３’末端における特異的切断事象および長いポリアデニルテールのためのシグナルとして機能する。

各Ｇ６ＰＣ発現カセットを、ＡＡＶベクターにクローニングした。全てのＡＡＶベクターは、カナマイシン耐性遺伝子をコードする骨格を有した。ＡＡＶベクターＤＴＣ１６１（ｐＤＴＸ．ｈＧ６ＰＣｃｏ．４０１）を、例として図２に図示する。

ｒＡＡＶビリオン
上記ＡＡＶベクターゲノムは、１本鎖ＤＮＡゲノムである。ＩＴＲ配列の間のおよびＩＴＲ配列を含む配列のみが、ＡＡＶビリオンへとパッケージされる。３種のプラスミドを、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子生成物を提供するヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞へとトランスフェクトすることによって、ビリオンを生成した。第１のプラスミドは、本明細書で開示されるＡＡＶベクターである。第２のプラスミドは、ｐＡＡＶ２－８．ＫａｎＲ（ｐ２１２３－ＦＨ）、野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子を含むパッケージングプラスミドである。第３のプラスミドは、ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）、ヘルパーアデノウイルスプラスミドである。

アデノ随伴Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド ｐＡＡＶ２／８．ＫａｎＲ（ｐ２１２３－ＦＨ）（８３５４ｂｐ）は、血清型８に由来する、４つの野生型ＡＡＶ２ウイルス複製（Ｒｅｐ）タンパク質および３つの野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシド（ｃａｐ）タンパク質をコードする。ｐＡＡＶ２／８．ＫａｎＲ（ｐ２１２３－ＦＨ）プラスミドの図は、図３に示される。そのプラスミド内で、Ｒｅｐ遺伝子発現を通常駆動するＡＡＶ ｐ５プロモーターは、Ｒｅｐ領域の５’末端からＡＡＶ８ ｃａｐ領域の３’末端まで動かされる。この配置は、プロモーターとＲｅｐ遺伝子（すなわち、プラスミド骨格）との間にスペーサーを導入し、Ｒｅｐの発現のダウンレギュレーションおよび高力価ｒＡＡＶ生成を支持する能力の増大を生じる。カナマイシン耐性の遺伝子およびＭＢ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド生成のために含められる。

プラスミド ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）は、ＡＡＶ複製にとって重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわち、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡを含む（図４）。アデノウイルスＥ１機能はまた必要とされるが、ＨＥＫ２９３宿主細胞によって提供される。そのプラスミドは、他のアデノウイルスの複製、構造遺伝子、またはアデノウイルス複製にとって極めて重要なｃｉｓエレメント（例えば、アデノウイルスＩＴＲ）を含まないので、感染性アデノウイルスは、生成されるとは予測されない。カナマイシン耐性の遺伝子およびＭＢ１起点は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド生成のために含められる。

実施例２ － Ａｌｕエレメントの欠失は、ｒＡＡＶ収量を改善する
野生型ＧＰＥまたは改変されたＧＰＥを含むＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３細胞をＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドおよび上記のヘルパープラスミドでトランスフェクトするために使用した。

上記改変されたＧＰＥは、Ａｌｕエレメントの欠失（ＤＴＣ１７５、ＤＴＣ１７７、およびＤＴＣ１７８ベクターにおいて）または方向を逆にしたＡｌｕエレメント（ＤＴＣ１７６およびＤＴＣ１７９ベクターにおいて）のいずれかを含む。ＤＴＣ１７５ウイルスベクターは、Ａｌｕ－１およびＡｌｕ－２配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含み、ＤＴＣ１７６ウイルスベクターは、全３個のＡｌｕエレメントが存在するが、Ａｌｕ－１およびＡｌｕ－２配列の配向が逆であるＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含み、ＤＴＣ１７７ウイルスベクターは、Ａｌｕ－１、Ａｌｕ－２およびＡｌｕ－３配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含み、ＤＴＣ１７８ウイルスベクターは、Ａｌｕ－３配列の欠失を伴うＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含み、ＤＴＣ１７９ウイルスベクターは、全３個のＡｌｕエレメントが存在するが、Ａｌｕ－３の配向が逆であるＧＰＥを含むＧ６ＰＣ発現カセットを含む。

共トランスフェクション後５日目に、感染細胞を、３７℃において、デオキシコール酸ナトリウムおよびベンゾナーゼ^{（登録商標）}を含む溶解緩衝液中で２時間溶解した。次いで、そのサンプルに由来する上清を、ＤＮａｓｅ ＩおよびプロテイナーゼＫで逐次的に消化して、ｒＡＡＶゲノムＤＮＡを遊離させた。次いで、上記ＡＡＶベクターのＢＧＨ－ＰｏｌｙＡコード領域を増幅するＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶプラスミド標準曲線に基づいて上記ｒＡＡＶゲノムコピー数（ＧＣ）を決定した。図５は、種々のＡＡＶベクターのトランスフェクション後に宿主細胞から生じたｒＡＡＶの力価を示す棒グラフである。図５は、ｑＰＣＲによって測定したｒＡＡＶ力価を示し、ＧＰＥからのＡｌｕエレメントのうちの１またはこれより多くの欠失（ＤＴＣ１７５、ＤＴＣ１７７、およびＤＴＣ１７８ベクターにおいて）が、野生型ＧＰＥを含むＤＴＣ１６１と比較して、ｒＡＡＶ収量を有意に増大させたことを示唆する。しかし、Ａｌｕエレメントのうちの１またはこれより多くの逆転（ＤＴＣ１７６およびＤＴＣ１７９ベクターにおける）は、ＤＴＣ１６１と比較して、ｒＡＡＶ収量を改善しなかった。ウイルス収量の定量を、表１にまとめる。表１に示されるように、ＧＰＥからの１またはこれより多くのＡｌｕエレメントの欠失は、ｒＡＡＶ収量を有意に改善する。ベクターゲノムサイズの関数としてプロットした、生成されるｒＡＡＶの力価を示す第２の分析を、図６においてグラフとして示す。図６は、最小のサイズを有するベクターゲノム、ＤＴＣ１７７（配列番号１によって示される）が、最高の力価を生じたことを示す。
表１： ＡＡＶベクター（ＤＴＣ１６１、ＤＴＣ１７５、ＤＴＣ１７６、ＤＴＣ１７７、ＤＴＣ１７８、またはＤＴＣ１７９）のトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞から生じるウイルス収量の定量のまとめ

実施例３ － Ａｌｕエレメントの欠失は、ｒＡＡＶパッケージングを改善する
Ａｌｕエレメントのうちの１またはこれより多くの欠失が、ｒＡＡＶのパッケージングに影響するか否かを評価するために、実施例２に記載されるように生成したｒＡＡＶを採取し、全ＤＮＡを各ｒＡＡＶから単離した（コントロールウイルスベクター、ＤＴＣ１６１、ＤＴＣ１７５、ＤＴＣ１７６、ＤＴＣ１７７、ＤＴＣ１７８、またはＤＴＣ１７９から生成した）。およそ７．１２×１０^１０の各ｒＡＡＶ ＧＣの全量を、アガロースゲル電気泳動に供し、その後、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色した。この実験において使用したコントロールウイルスベクターは、ＡＡＶ８－ＬＳＰ－ｈＦＩＸｃｏ３－ＷＰＲＥ－ｐＡ（Ｖｉｒｏｖｅｋで生成、特注精製、０６１０１５のカタログ／ロット＃ １５０２８２）であり、これは、ゲル上で既知のＤＮＡサイズの移動および実験方法が、ＡＡＶキャプシドの完全性を破壊し、パッケージされたＤＮＡを放出できたという確認を提供した。

図７に示されるように、全長ウイルスＤＮＡは、３．８ｋｂ～５ｋｂの間であった。「＊」は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での処理の際に、キャプシド分解およびコントロールウイルスベクターから単離された全長ＤＮＡの無傷のゲノムを示す。

１またはこれより多くのＡｌｕエレメントがＧＰＥから欠失されたＤＴＣ１７７、ＤＴＣ１７５、およびＤＴＣ１７８のｒＡＡＶから単離される全長ＤＮＡのより高い染色強度が、観察された（図７を参照のこと）。この結果は、少なくとも１個のＡｌｕエレメントの欠失が、全長ウイルスゲノムのｒＡＡＶパッケージングを改善することを示唆する。さらに、空の（およそ６０Ｓに出現）および完全ベクターＤＮＡ含有粒子（およそ１００Ｓにおいて出現）に関して分析したＤＴＣ１６１およびＤＴＣ１７７粒子の分析的超遠心分離トレースは、それぞれ、Ａｌｕエレメントの欠失した構築物が、より高いパーセンテージの完全粒子を生じることを示した（図８Ａ～８Ｂを参照のこと）。図８Ａは、ＨＥＫ２９３細胞において生成したＤＴＣ１６１ベクター調製物からの粒子密度の分析的超遠心分離トレースを示すグラフである。図８Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞において生成したＤＴＣ１７７ベクター（配列番号１によって示される）調製物からの粒子密度の分析的超遠心分離トレースを示すグラフである。

これらのデータは、Ａｌｕ配列を欠いているベクターにおいて改善されたパッケージングが起こることを示す。

実施例４ － ＧＰＥにおけるＡｌｕエレメントの欠失は、プロモーター効力に影響を及ぼさない
Ａｌｕエレメントのうちの１またはこれより多くの欠失が、ＧＰＥがＧ６ＰＣ遺伝子発現をインビボで指示する効力に影響するか否かを評価するために、異なるベクターに由来するｒＡＡＶ（表2に示される）を使用して、ＨｕＨ７肝細胞を感染させた。感染の４８時間後に、細胞を溶解し、全ｍＲＮＡを採取した。Ｇ６ＰＣ ｍＲＮＡ発現を、定量的ＲＴ－ＰＣＲによって分析した。図９Ａ～９Ｂは、ＤＴＣ１６１およびＤＴＣ１７７（配列番号１によって示される）に由来するｒＡＡＶに関して、ｒＡＡＶ用量とＨｕＨ７肝細胞におけるＧ６ＰＣ ｍＲＮＡ発現レベルとの間の例示的用量応答曲線を示す。図９Ａは、ｒＡＡＶ含有ＤＴＣ１６１で感染させた後に誘導されたＧ６Ｐａｓｅ－α発現の用量応答曲線である。図９Ｂは、ｒＡＡＶ含有ＤＴＣ１７７（配列番号１によって示される）で感染させた後に誘導されたＧ６Ｐａｓｅ－α発現の用量応答曲線である。試験サンプルの相対的効力を計算するために、参照標準（開発バッチ生成したＤＴＣ１６１ベクターに由来するｒＡＡＶ）および試験サンプルの両方の各感染多重度（ＭＯＩ）でのＲＮＡ値（ゲノムコピー／μｇ 全ＲＮＡ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍファイルテンプレートに追加した。そのテンプレートは、データの対数－対数変換およびその曲線が共有した傾きを有するように制約された線形フィットを使用する。Ｙ軸は、ＲＮＡ値に対応し、Ｘ軸は、サンプルのＭＯＩに対応する。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍテンプレートによって生成したＹ切片および傾きのデータを使用して、以下の式を実行することによって参照標準および試験サンプルのＸ切片を決定した：Ｘ Ｉｎｔ＝（０－［Ｙ切片］）／傾き。最終的な相対的効力値を、以下の式を利用してＸ切片を比較することによって決定する：１０＾｛［Ｘ 切片参照］－［Ｘ切片サンプル］。
表２． 各ｒＡＡＶサンプルにおけるＧＰＥの相対的効力のまとめ

この結果は、ＧＰＥにおける（ＤＴＣ１７５、ＤＴＣ１７７、およびＤＴＣ１７８ベクターにおける）Ａｌｕエレメントのうちの１またはこれより多くの欠失が、インビボでＧ６ＰＣ遺伝子発現を駆動するＧＰＥの効力を損なわないことを示唆する。

本明細書で具体的に言及される全ての刊行物、特許および文献は、全ての目的のために参考として援用される。

本発明は、記載される特定の方法論、プロトコール、材料、および試薬に限定されないことは理解される。なぜならこれらは変動し得るからである。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図されず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって包含されることは、理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「」，「１つの、ある（ａｎ）」および「その、この、上記（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に示さなければ、複数形への言及を含むことは注記されなければならない。同様に、用語「１つの（ａ）（または１つの「ａｎ」）」、「１またはこれより多くの（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、本明細書で公館可能に使用され得る。用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、本明細書で公館可能に使用され得ることがまた、注記されるべきである。

さらなる詳細なしに、当業者は、上記に基づいて、さらなる程度まで本発明を利用し得ると考えられる。従って、具体的実施形態は、単なる例証として解釈されるべきであり、どのようにしても本開示の残りの限定として解釈されるべきではない。

本明細書で開示される特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本明細書で開示される各特徴は、同じか、均等か、または類似の目的に適う代替の特徴によって置き換えられ得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目１)
改変されたＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列を含む組換え核酸分子であって、ここで前記改変されたＧＰＥは、Ａｌｕエレメントと少なくとも８０％同一の１またはこれより多くの配列を欠いている、組換え核酸分子。
(項目２)
前記Ａｌｕエレメントは、配列番号６の連続するヌクレオチド１０７９～１２７２（Ａｌｕ－１）、１６３３～１９６８（Ａｌｕ－２）、および２１４０～２４９５（Ａｌｕ－３）から選択される、項目１に記載の組換え核酸分子。
(項目３)
前記改変されたＧＰＥは、配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３と８０％同一の配列、または配列番号７、８、９、１０、１１、もしくは１２のうちのいずれか１つと８０％同一の配列を有する、項目１または２に記載の組換え核酸分子。
(項目４)
改変されたＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列およびＧ６Ｐａｓｅ－αコード配列を含む組換え核酸分子であって、ここで前記改変されたＧＰＥは、前記Ｇ６Ｐａｓｅ－αコード配列の発現を指示し得る、組換え核酸分子。
(項目５)
前記改変されたＧＰＥは、配列番号６の連続するヌクレオチド１０７９～１２７２（Ａｌｕ－１）、１６３３～１９６８（Ａｌｕ－２）、および２１４０～２４９５（Ａｌｕ－３）から選択されるＡｌｕエレメントと少なくとも８０％同一の１またはこれより多くの配列を欠いている、項目４に記載の組換え核酸分子。
(項目６)
前記改変されたＧＰＥは、配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３と８０％同一の配列、または配列番号７、８、９、１０、１１、もしくは１２のうちのいずれか１つと９０％同一の配列を有する、項目４または５に記載の組換え核酸分子。
(項目７)
前記Ｇ６Ｐａｓｅ－αコード配列は、配列番号３または配列番号４と同一の配列を含む、項目４～６のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
(項目８)
前記組換え核酸分子は、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列をさらに含む、項目４～７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
(項目９)
前記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列である、項目８に記載の組換え核酸分子。
(項目１０)
前記組換え核酸分子は、イントロンをさらに含む、項目４～９のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
(項目１１)
前記組換え核酸分子は、配列番号１または配列番号２を含む、項目４～１０のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
(項目１２)
項目４～１１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む、組換えベクター。
(項目１３)
前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目１２に記載のベクター。
(項目１４)
前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクターである、項目１３に記載のベクター。
(項目１５)
項目１～１１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
(項目１６)
項目１２～１４のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む、単離された宿主細胞。
(項目１７)
ｒＡＡＶ収量を増大させる方法であって、前記方法は、項目１３または１４に記載の組換えベクターを、真核生物宿主細胞培養物に送達する工程、および前記ｒＡＡＶを前記真核生物細胞培養物から採取する工程を包含する、方法。
(項目１８)
項目４～１１のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
(項目１９)
前記ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ８である、項目１８に記載のｒＡＡＶ。
(項目２０)
項目１８または１９に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
(項目２１)
ヒト被験体において糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、治療上有効な量の、項目１８～２０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたはその組成物を投与する工程を包含する、方法。
(項目２２)
前記ｒＡＡＶは、静脈内投与される、項目２１に記載の方法。
(項目２３)
前記ｒＡＡＶは、約１×１０ ^１１ ～約１×１０ ^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、項目２１または２２に記載の方法。
(項目２４)
前記ｒＡＡＶは、約１×１０ ^１２ ～約１×１０ ^１３ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される、項目２３に記載の方法。
(項目２５)
前記ｒＡＡＶを投与する工程は、単一用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目２１～２４のいずれか１項に記載の方法。
(項目２６)
前記ｒＡＡＶを投与する工程は、複数用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目２１～２４のいずれか１項に記載の方法。
(項目２７)
ＧＳＤ－Ｉａの処置のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび前記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、
（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；
（ｂ）配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３を含むプロモーター／エンハンサー配列；
（ｃ）グルコース－６－ホスファターゼα（Ｇ６Ｐａｓｅ－α）をコードするコード配列；および
（ｄ）ＡＡＶ ３’ ＩＴＲ、
を含む、ｒＡＡＶ。
(項目２８)
前記Ｇ６Ｐａｓｅ－αは、配列番号５と９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目２７に記載のｒＡＡＶ。
(項目２９)
前記Ｇ６Ｐａｓｅ－αのアミノ酸配列は、配列番号５と同一である、項目２７に記載のｒＡＡＶ。
(項目３０)
（ｃ）のコード配列は、配列番号３または配列番号４と少なくとも９０％同一である、項目２７～２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３１)
前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである、項目２７～３０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３２)
前記ベクターゲノムは、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列をさらに含む、項目２７～３１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３３)
前記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列である、項目３２に記載のｒＡＡＶ。
(項目３４)
前記ベクターゲノムは、イントロンをさらに含む、項目２７～３３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３５)
項目２７～３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
(項目３６)
ヒト被験体において糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）を処置する方法であって、前記方法は、前記ヒト被験体に、治療上有効な量の、項目２７～３４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは項目３５に記載のその組成物を投与する工程を包含する、方法。
(項目３７)
前記ｒＡＡＶは、静脈内投与される、項目３６に記載の方法。
(項目３８)
前記ｒＡＡＶは、約１×１０ ^１１ ～約１×１０ ^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、項目３６または３７に記載の方法。
(項目３９)
前記ｒＡＡＶは、約１×１０ ^１２ ～約１×１０ ^１３ ＧＣ／ｋｇの用量で投与される、項目３８に記載の方法。
(項目４０)
前記ｒＡＡＶを投与する工程は、単一用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目３６～３９のいずれか１項に記載の方法。
(項目４１)
前記ｒＡＡＶを投与する工程は、複数用量のｒＡＡＶの投与を含む、項目３６～３９のいずれか１項に記載の方法。

Claims (37)

1. 改変されたＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列を含む組換え核酸分子であって、ここで前記改変されたＧＰＥ配列は、配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号７、８、９、１０、１１、もしくは１２のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を有する、組換え核酸分子。
2. 改変されたＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列およびＧ６Ｐａｓｅ－αコード配列を含む組換え核酸分子であって、ここで前記改変されたＧＰＥ配列は、配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３と少なくとも９０％同一の配列、または配列番号７、８、９、１０、１１、もしくは１２のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を有する、組換え核酸分子。
3. 前記Ｇ６Ｐａｓｅ－αコード配列は、配列番号３または配列番号４と同一の配列を含む、請求項２に記載の組換え核酸分子。
4. 前記組換え核酸分子は、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列をさらに含む、請求項２～３のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
5. 前記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列である、請求項４に記載の組換え核酸分子。
6. 前記組換え核酸分子は、イントロン配列をさらに含む、請求項２～５のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
7. 前記組換え核酸分子は、配列番号１または配列番号２の核酸配列を含む、請求項２～６のいずれか１項に記載の組換え核酸分子。
8. 請求項２～７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む、組換えベクター。
9. 前記組換えベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８に記載の組換えベクター。
10. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）ベクターである、請求項９に記載の組換えベクター。
11. 請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む、単離された宿主細胞。
12. 請求項８～１０のいずれか１項に記載の組換えベクターを含む、単離された宿主細胞。
13. Ｇ６Ｐａｓｅ－αコード配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の製造において、ｒＡＡＶの収量を増大させる方法であって、前記方法は、請求項９または１０に記載の組換えベクターを、真核生物宿主細胞培養物に送達する工程、および前記ｒＡＡＶを前記真核生物細胞培養物から採取する工程を包含する、方法。
14. 請求項２～７のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
15. 前記ｒＡＡＶは、組換えＡＡＶ血清型８ベクター（ｒＡＡＶ８）である、請求項１４に記載のｒＡＡＶ。
16. 請求項１４または１５に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
17. ヒト被験体において糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）を処置するための、請求項１６に記載の組成物であって、
    前記処置は、前記ヒト被験体に、治療上有効な量の前記ｒＡＡＶまたはその組成物を投与する工程を包含することを特徴とする、組成物。
18. 前記処置は、前記ｒＡＡＶの静脈内投与を含むものである、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記処置は、前記ｒＡＡＶの１×１０^１１ ～１×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量での投与を含むものである、請求項１７または１８に記載の組成物。
20. 前記処置は、前記ｒＡＡＶの１×１０^１２ ～１×１０^１３ ＧＣ／ｋｇの用量での投与を含むものである、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記処置は、単一用量としての前記ｒＡＡＶの投与を含むものである、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. 前記処置は、複数用量としての前記ｒＡＡＶの投与を含むものである、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の組成物。
23. ＧＳＤ－Ｉａの処置のための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物であって、
    前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドおよび前記ＡＡＶキャプシド内にパッケージされたベクターゲノムを含み、
    前記ベクターゲノムは、
    （ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列；
    （ｂ）配列番号１の連続するヌクレオチド１４６～２１２３を含むＧ６ＰＣプロモーター／エンハンサー（ＧＰＥ）配列；
    （ｃ）グルコース－６－ホスファターゼα（Ｇ６Ｐａｓｅ－α）をコードするコード配列；および
    （ｄ）ＡＡＶ ３’ ＩＴＲ配列、
    を含む、組成物。
24. 前記Ｇ６Ｐａｓｅ－αは、配列番号５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の組成物。
25. Ｇ６Ｐａｓｅ－αのアミノ酸配列は、配列番号５と同一である、請求項２３に記載の組成物。
26. （ｃ）の前記コード配列は、配列番号３または配列番号４と少なくとも９０％同一である、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の組成物。
27. 前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の組成物。
28. 前記ベクターゲノムは、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列をさらに含む、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の組成物。
29. 前記ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリＡシグナル配列である、請求項２８に記載の組成物。
30. 前記ベクターゲノムは、イントロン配列をさらに含む、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の組成物。
31. 薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項２３～３０のいずれか１項に記載の組成物。
32. ヒト被験体において糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ－Ｉａ）を処置するための、請求項２３～３０のいずれか１項に記載の組成物であって、
    前記処置は、前記ヒト被験体に、治療上有効な量の前記ｒＡＡＶを投与する工程を包含することを特徴とする、組成物。
33. 前記処置は、前記ｒＡＡＶの静脈内投与を含むものである、請求項３２に記載の組成物。
34. 前記処置は、前記ｒＡＡＶの１×１０^１１ ～１×１０^１４ ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量での投与を含むものである、請求項３２または３３に記載の組成物。
35. 前記処置は、前記ｒＡＡＶの１×１０^１２ ～１×１０^１３ ＧＣ／ｋｇの用量での投与を含むものである、請求項３４に記載の組成物。
36. 前記処置は、単一用量としての前記ｒＡＡＶの投与を含むものである、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の組成物。
37. 前記処置は、複数用量としての前記ｒＡＡＶの投与を含むものである、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の組成物。