JP2023520402A - プロピオン酸血症を処置するための遺伝子治療 - Google Patents
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Abstract
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、およびプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置するための遺伝子治療におけるそれらの使用の方法を提供する。本発明のｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物もまた提供される。これらの医薬組成物は、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼα－サブユニット（ＰＣＣＡ）中の変異またはプロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼβ－サブユニット（ＰＣＣＢ）中の変異によって引き起こされるＰＡの処置のための遺伝子治療において有用であり得る。
Description
関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年３月３１日出願の米国仮特許出願第６３／００２，５４１号の利益およびそれに対する優先権を主張し、その全内容は、全ての目的のためにその全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年３月３１日出願の米国仮特許出願第６３／００２，５４１号の利益およびそれに対する優先権を主張し、その全内容は、全ての目的のためにその全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年３月２４日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、名称ＵＬＰ－００９ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１０３，４３５バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年３月２４日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、名称ＵＬＰ－００９ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１０３，４３５バイトである。
発明の技術分野
本開示は一般に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、およびプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置するための遺伝子治療におけるそれらの使用の方法に関する。
本開示は一般に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、およびプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置するための遺伝子治療におけるそれらの使用の方法に関する。
発明の背景
プロピオン酸性尿（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ）としても公知のプロピオン酸血症（ＰＡ）は、奇数鎖脂肪酸ならびにプロピオン酸原性（ｐｒｏｐｉｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸、特に、イソロイシン、スレオニン、メチオニンおよびバリンに関する異化経路における重要なステップであるプロピオニル－ＣｏＡから（Ｄ）－メチルマロニル－ＣｏＡへの変換に必要とされる酵素である活性プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の欠損症によって引き起こされる、先天性有機酸代謝異常である。ＰＣＣ酵素は、それぞれＰＣＣＡ遺伝子およびＰＣＣＢ遺伝子によってコードされる２つの非同一なサブユニットαおよびβから構成される。プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症は、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢのいずれかにおける変異から生じ得る。１つの研究では、ＰＡを有する３０人の患者の変異解析が実施され、１５人の患者がα－サブユニット欠損であり、１５人の患者がβ－サブユニット欠損であることが見出された。Yang et al., 2004, Mol Genet and Metab. 81: 335-342を参照されたい。
プロピオン酸性尿（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄｕｒｉａ）としても公知のプロピオン酸血症（ＰＡ）は、奇数鎖脂肪酸ならびにプロピオン酸原性（ｐｒｏｐｉｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸、特に、イソロイシン、スレオニン、メチオニンおよびバリンに関する異化経路における重要なステップであるプロピオニル－ＣｏＡから（Ｄ）－メチルマロニル－ＣｏＡへの変換に必要とされる酵素である活性プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）の欠損症によって引き起こされる、先天性有機酸代謝異常である。ＰＣＣ酵素は、それぞれＰＣＣＡ遺伝子およびＰＣＣＢ遺伝子によってコードされる２つの非同一なサブユニットαおよびβから構成される。プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症は、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢのいずれかにおける変異から生じ得る。１つの研究では、ＰＡを有する３０人の患者の変異解析が実施され、１５人の患者がα－サブユニット欠損であり、１５人の患者がβ－サブユニット欠損であることが見出された。Yang et al., 2004, Mol Genet and Metab. 81: 335-342を参照されたい。
ＰＡの推定発生率は、米国では１：１０５，０００～１：１３０，０００である。この稀な常染色体劣性代謝障害は、不十分な摂食、嘔吐、嗜眠、てんかん発作、および筋緊張の欠如を伴って、早期新生児期間において呈される。未処置のままにすると、続発性高アンモニア血症、感染、心筋症または基底神経節卒中（basal ganglial stroke）に起因して、すぐに死亡し得る。ＰＡは、新生児ではほぼ即座に診断することができ、この疾患は、米国では新生児スクリーニングパネルに含まれている。
ＰＡは、現在、アミノ酸前駆体の食事制限、減少したカルニチンレベルに対処するためのＬ－カルニチンの補充、および腸細菌によるプロピオン酸産生を低減させるための抗生物質の投与によって管理されている。肝臓移植は、患者が標準的な処置によって管理できない状況において、ＰＡの管理において役割を得つつある。しかし、栄養、補因子および抗生物質治療の複雑な組合せを介して疾患に対処しようとする積極的な試みにもかかわらず、ＰＡを有する患者についての長期予後は、不良のままである。van der Meer et al., 1996, Eur. J. Pediatr. 155: 205-210を参照されたい。したがって、この疾患の根底にある原因、即ち、ＰＣＣの欠損症に対処する改善された治療アプローチが必要とされている。
近年興味が持たれてきた１つの戦略は、欠損タンパク質の機能的コピーのｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用である。ＰＡの処置のために、本出願人は、機能的ＰＣＣＡタンパク質をコードする遺伝子または機能的ＰＣＣＢタンパク質をコードする遺伝子を送達することが可能な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を以前に記載している。例えば、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５４００３（ＷＯ／２０２０／０７２４５１として公開された）を参照されたい。最適なＡＡＶベースの遺伝子治療のために、導入遺伝子発現レベルを最大化することが重要であり、これは次に、治療有効性を達成するために要求されるベクター用量における低減を可能にし、望まれない用量関連の免疫応答のリスクを減少させる。
本発明は、ＰＡの処置のための高発現ｒＡＡＶの必要性に対処する。特に、ＰＡ遺伝子治療ベクター中へのヒトβ－グロビンＩＶＳ２イントロン配列（配列番号１）の挿入は、代替的なイントロン配列を発現する比較対象ベクターと比較して、導入遺伝子発現を、実質的に、かつ驚くべきことに増加させることが、本出願人によって発見された。したがって、本発明のｒＡＡＶは、予想外に高い導入遺伝子発現を提供でき、それにより、ＰＡの首尾よい処置のために要求されるベクター用量を低減させる。
近年興味が持たれてきた１つの戦略は、欠損タンパク質の機能的コピーのｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用である。ＰＡの処置のために、本出願人は、機能的ＰＣＣＡタンパク質をコードする遺伝子または機能的ＰＣＣＢタンパク質をコードする遺伝子を送達することが可能な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を以前に記載している。例えば、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５４００３（ＷＯ／２０２０／０７２４５１として公開された）を参照されたい。最適なＡＡＶベースの遺伝子治療のために、導入遺伝子発現レベルを最大化することが重要であり、これは次に、治療有効性を達成するために要求されるベクター用量における低減を可能にし、望まれない用量関連の免疫応答のリスクを減少させる。
本発明は、ＰＡの処置のための高発現ｒＡＡＶの必要性に対処する。特に、ＰＡ遺伝子治療ベクター中へのヒトβ－グロビンＩＶＳ２イントロン配列（配列番号１）の挿入は、代替的なイントロン配列を発現する比較対象ベクターと比較して、導入遺伝子発現を、実質的に、かつ驚くべきことに増加させることが、本出願人によって発見された。したがって、本発明のｒＡＡＶは、予想外に高い導入遺伝子発現を提供でき、それにより、ＰＡの首尾よい処置のために要求されるベクター用量を低減させる。
Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ａｎｄ Ｍｅｔａｂ． ８１： ３３５－３４２
ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．（１９９６）１５５：２０５～２１０
発明の概要
本発明は、組成物および遺伝子治療におけるそれらの使用の方法を提供する。より具体的には、本開示は、ＰＡの処置のために有用な、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
本発明は、組成物および遺伝子治療におけるそれらの使用の方法を提供する。より具体的には、本開示は、ＰＡの処置のために有用な、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
一態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、（ａ）５’－逆位末端反復配列（５’－ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター配列；（ｃ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；（ｄ）ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列；および（ｅ）３’－逆位末端反復配列（３’－ＩＴＲ）配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）エンハンサー配列；（ｃ）プロモーター配列；（ｄ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；（ｅ）ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列；（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
本明細書に記載される種々の態様では、パッケージングされたベクターゲノムは、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列を含む。一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一なイントロン配列を含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号１を含むまたはそれからなる。
一実施形態では、ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列は、野生型コード配列である。代替的な実施形態では、ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列は、コドン最適化されたコード配列である。例示的な一実施形態では、ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。
一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号２に示される野生型コード配列によってコードされる。別の実施形態では、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５１６５－１（配列番号２５）、Ｐ０５１６５－２（配列番号２６）およびＰ０５１６５－３（配列番号２７）に示されるものなどの、ＰＣＣＡの天然のアイソフォームまたはバリアントを発現するコード配列が使用され得る。ある特定の実施形態では、ＰＣＣＡは、コドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の例示的な実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号３～７から選択されるコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号３～７から選択される配列と少なくとも８０％同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号３～７から選択される配列と少なくとも９０％同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡは、配列番号３～７から選択される配列と少なくとも９５％同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、３’末端に停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）をさらに含み得る。一部の実施形態では、発現されたＰＣＣＡは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、配列番号３０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一な配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３０からなる。
別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）プロモーター配列；（ｃ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；（ｄ）ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列；および（ｅ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）エンハンサー配列；（ｃ）プロモーター配列；（ｄ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；（ｅ）ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列；（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
一実施形態では、ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、野生型コード配列である。代替的な実施形態では、ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、コドン最適化されたコード配列である。例示的な一実施形態では、ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。
一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号８に示される野生型コード配列によってコードされる。別の実施形態では、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５１６６－１（配列番号２８）およびＰ０５１６６－２（配列番号２９）に示されるものなどの、ＰＣＣＢの天然のアイソフォームまたはバリアントを発現するコード配列が使用され得る。代替的な実施形態では、ＰＣＣＢは、コドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号８に示される野生型コード配列と８０％未満同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の例示的な実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号９～１３から選択されるコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号９～１３から選択される配列と少なくとも８０％同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号９～１３から選択される配列と少なくとも９０％同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢは、配列番号９～１３から選択される配列と少なくとも９５％同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、３’末端に停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）をさらに含み得る。一部の実施形態では、発現されたＰＣＣＢは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、配列番号３１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一な配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３１からなる。
一実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、ＣＢＡ遺伝子のプロモーター、第１エクソンおよび第１イントロン、ならびにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを使用して構築された）、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターおよびＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターから選択される。例示的な実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである。一実施形態では、ＣＢＡプロモーターは、配列番号２１を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列を含む。ある特定の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、配列番号１８を含むまたはそれからなる。他の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源由来である。
一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、１つまたは複数のエンハンサー配列をさらに含む。一実施形態では、エンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサーおよびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される。例示的な実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサーである。一実施形態では、ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサーは、配列番号２２を含むまたはそれからなる。ある特定の実施形態では、エンハンサーは、プロモーター配列の上流に位置する。
一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、イントロン配列の下流に位置する。一実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣ（配列番号２４）である。ある特定の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＰＣＣＡのコード配列の上流に位置する。ある特定の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＰＣＣＢのコード配列の上流に位置する。
一部の実施形態では、パッケージングされたベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列およびウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される。例示的な実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。一実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２３を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、血清型８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｈｕ３７のＡＡＶ（即ち、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）、またはそれらの操作されたバリアント由来である。例示的な実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）カプシド、ＡＡＶ９バリアントカプシド、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）カプシド、ＡＡＶ８バリアントカプシドまたはＡＡＶ血清型ｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシドである。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＰＡの処置における遺伝子治療のための薬剤として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされた本明細書に記載されるベクターゲノムを含む、ｒＡＡＶを提供する。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、血清型８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｈｕ３７のＡＡＶ（即ち、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）、またはそれらの操作されたバリアント由来である。例示的な実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）カプシド、ＡＡＶ９バリアントカプシド、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）カプシド、ＡＡＶ８バリアントカプシドまたはＡＡＶ血清型ｈｕ３７（ＡＡＶｈｕ３７）カプシドである。
ある特定の実施形態では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なｒＡＡＶであって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）配列番号２～７から選択されるＰＣＣＡのコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なｒＡＡＶであって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）エンハンサー配列；（ｃ）プロモーター配列；（ｄ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；（ｅ）配列番号２～７から選択されるＰＣＣＡのコード配列；（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なｒＡＡＶであって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）配列番号８～１３から選択されるＰＣＣＢのコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なｒＡＡＶであって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で、（ａ）５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）エンハンサー配列；（ｃ）プロモーター配列；（ｄ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；（ｅ）配列番号８～１３から選択されるＰＣＣＢのコード配列；（ｆ）ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なｒＡＡＶであって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８カプシドまたはＡＡＶ９カプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）配列番号２～７から選択されるＰＣＣＡのコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なｒＡＡＶであって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８カプシドまたはＡＡＶ９カプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）配列番号８～１３から選択されるＰＣＣＢのコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なｒＡＡＶであって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８カプシドまたはＡＡＶ９カプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で、（ａ）ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）ＣＭＶエンハンサー配列；（ｃ）ＣＢＡプロモーター配列；（ｄ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；（ｅ）配列番号２～７から選択されるＰＣＣＡのコード配列；（ｆ）ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）ＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なｒＡＡＶであって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８カプシドまたはＡＡＶ９カプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で、（ａ）ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列；（ｂ）ＣＭＶエンハンサー配列；（ｃ）ＣＢＡプロモーター配列；（ｄ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；（ｅ）配列番号８～１３から選択されるＰＣＣＢのコード配列；（ｆ）ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列；および（ｇ）ＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）ＰＣＣＡの部分的または完全なコード配列を含む組換え核酸構築物を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）ＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列を含む組換え核酸構築物を提供する。
一部の態様では、本開示は、ＰＡの処置のための本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用であって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、および３’－ＩＴＲ。例示的な実施形態では、パッケージングされたゲノムは、プロモーター配列の上流のエンハンサー配列および３’－ＩＴＲの上流のポリアデニル化シグナル配列もまた含む。例示的な一実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡのコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号２～７から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８カプシドである。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。
一部の態様では、本開示は、ＰＡの処置のための本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用であって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含むパッケージングされたゲノムは、以下を含む：５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、および３’－ＩＴＲ。例示的な実施形態では、パッケージングされたゲノムは、プロモーター配列の上流のエンハンサー配列および３’－ＩＴＲの上流のポリアデニル化シグナル配列もまた含む。例示的な一実施形態では、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含むパッケージングされたゲノムは、以下を含む：ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＢのコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号８～１３から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８カプシドである。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。
本開示は、本明細書で開示されるｒＡＡＶを含む医薬組成物にさらに関する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内または静脈内投与のために製剤化される。例示的な実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
さらに別の態様では、本開示は、ヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される少なくとも１つのｒＡＡＶを、ヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＰＡを処置する方法であって、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含み、ベクターゲノムが、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＰＡを処置する方法であって、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含み、ベクターゲノムが、ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＰＡを処置する方法であって、（１）ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、ベクターゲノムが、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶ；ならびに（２）ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、ベクターゲノムが、ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶ、を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、同時に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、順次投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、別々に投与され得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される少なくとも１つのｒＡＡＶを、ＰＣＣＡ中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＰＣＣＡ中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含み、ベクターゲノムが、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＰＣＣＡ中の変異は、表１から選択される。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号２～７から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８カプシドである。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される少なくとも１つのｒＡＡＶを、ＰＣＣＢ中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＰＣＣＢ中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含み、ベクターゲノムが、ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＰＣＣＢ中の変異は、表２から選択される。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号８～１３から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８カプシドである。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内または静脈内投与される。例示的な実施形態では、ｒＡＡＶは、静脈内投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０１１～約１×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０１２～約１×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、単一用量のｒＡＡＶが投与される。他の実施形態では、複数用量のｒＡＡＶが投与される。
一部の態様では、本開示は、本明細書で開示される組換え核酸分子、ＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶを含む宿主細胞を提供する。具体的な実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶの拡大増殖のために適切であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９またはＭＲＣ－５細胞から選択される。
本発明のこれらおよび他の態様および特色は、本開示の以下のセクションにおいて記載される。
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解することができる。
図７Ｂは、ＰＢＳの投与（「ＣＯＮＴ」）、または変動する用量の配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡをコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））のｒＡＡＶ媒介性送達後の、低形質ＰＡマウスモデルＰｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）における、血漿Ｃ３／Ｃ２（プロピオニルカルニチン／アシルカルニチン）濃度比を示す折れ線グラフである（注射後の時間は、週（Ｗ）で提供される）。「Ｐｒｅ」は、ＰＣＣＡをコードする導入遺伝子カセットを含むｒＡＡＶの注射の２週間前を示す。エラーバーは、標準誤差を示す。＊は、ダネット検定を使用してＰＢＳ処置群との比較でＰ＜０．０５を示す。
発明の詳細な説明
本明細書に記載されるように、ＰＡ遺伝子治療ベクター中へのヒトβ－グロビンＩＶＳ２イントロン配列（配列番号１）の挿入は、代替的なイントロン配列を発現する比較対象ベクターと比較して、導入遺伝子発現を、実質的に、驚くべきことに増加させることが、本出願人によって発見された。したがって、本発明のｒＡＡＶは、予想外に高い導入遺伝子発現を提供し、それにより、ＰＡの首尾よい処置のために要求されるベクター用量を低減させる。
本明細書に記載されるように、ＰＡ遺伝子治療ベクター中へのヒトβ－グロビンＩＶＳ２イントロン配列（配列番号１）の挿入は、代替的なイントロン配列を発現する比較対象ベクターと比較して、導入遺伝子発現を、実質的に、驚くべきことに増加させることが、本出願人によって発見された。したがって、本発明のｒＡＡＶは、予想外に高い導入遺伝子発現を提供し、それにより、ＰＡの首尾よい処置のために要求されるベクター用量を低減させる。
以下の詳細な説明により完全に記載されるように、本発明は、ＰＡを好転させる（ameliorate）、予防するまたは処置するための方法において使用される様々な新規薬剤および組成物を提供する。より具体的には、本発明は、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列を含む組換え核酸構築物、ベクター、宿主細胞および組換えＡＡＶを提供する。一部の実施形態では、本発明の組換え核酸構築物、ベクター、宿主細胞および組換えＡＡＶは、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一なイントロン配列を含み得る。一部の実施形態では、本発明の組換え核酸構築物、ベクター、宿主細胞および組換えＡＡＶは、配列番号１のイントロン配列を含み得る。
特記しない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)で見出すことができる。
本開示の種々の実施形態の再検討を促進するために、特定の用語の以下の説明が提供される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：ヒトおよび一部の他の霊長類種に感染する、小さい複製欠損非エンベロープウイルス。ＡＡＶは、疾患を引き起こさないことが公知であり、非常に軽度な免疫応答を惹起する。ＡＡＶを利用する遺伝子治療ベクターは、分裂細胞および静止状態細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノム中に組み込まれることなしに染色体外状態で存続できる。これらの特色により、ＡＡＶは、遺伝子治療のための魅力的なウイルスベクターになっている。現在、ＡＡＶの１２種の認識された血清型（ＡＡＶ１～１２）が存在する。
投与／投与する：任意の有効な経路によって、治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）などの薬剤を対象に提供するまたは与えること。例示的な投与経路には、注射（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣および吸入経路が含まれるがこれらに限定されない。
コドン最適化された：「コドン最適化された」核酸は、特定の系（例えば、特定の種、または種の群）における発現のためにコドンが最適になるように変更された核酸配列を指す。例えば、核酸配列は、哺乳動物細胞または特定の哺乳動物種（例えば、ヒト細胞）における発現のために最適化され得る。コドン最適化は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。
エンハンサー：プロモーターの活性を増加させることによって転写の速度を増加させる核酸配列。
イントロン：タンパク質のコード情報を含まない、遺伝子内のＤＮＡのストレッチ。イントロンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される。
逆位末端反復（ＩＴＲ）：効率的な複製のために必要とされるアデノ随伴ウイルスのゲノム中の対称な核酸配列。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＤＮＡゲノムの各末端に位置する。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡ合成のための複製起点として機能し、ＡＡＶ組み込みベクターを生成するための重要なシス構成要素である。
単離された：「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸分子、タンパク質、ウイルスまたは細胞）は、その構成要素が天然に存在する生物の細胞もしくは組織中または生物自体中の他の生物学的構成要素、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質ならびに細胞から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質もまた包含する。
作動可能に連結した：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的に関連して配置されている場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、近接しており、２つのタンパク質コード領域を接合させるために必要に応じて、同じリーディングフレームにある。
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th Edition (1975)は、１種または複数の治療的化合物、分子または薬剤の薬学的送達に適切な組成物および製剤を記載している。
一般に、担体の性質は、使用されている特定の投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的におよび生理学的に許容される流体、例えば、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどを含む注射可能な流体を、ビヒクルとして含む。固体組成物、例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態のために、従来の非毒性固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性な担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝化剤など、例えば、酢酸ナトリウムもしくはソルビタンモノラウレートを含み得る。
疾患を予防すること、処置することまたは好転させること：疾患（例えば、ＰＡ）を「予防すること」は、疾患の完全な発達を阻害することを指す。「処置すること」は、それが発達し始めた後にその疾患または病的状態（例えば、ＰＡ）の徴候または症状を好転させる治療介入を指す。「好転させること」は、疾患（例えば、ＰＡ）の徴候または症状の数または重症度における低減を指す。
プロモーター：核酸（例えば、遺伝子）の転写を指示する／開始させるＤＮＡの領域。プロモーターは、転写の開始部位近傍の必要な核酸配列を含む。多数のプロモーター配列が、当業者に公知であり、人工核酸分子における異なるプロモーター配列の組合せさえも可能である。本明細書で使用される場合、遺伝子特異的内因性プロモーターは、目的の内因性遺伝子の発現を調節するネイティブプロモーターエレメントを指す。一実施形態では、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターは、ＰＣＣＡ遺伝子の発現を調節する。別の実施形態では、ＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターは、ＰＣＣＢ遺伝子の発現を調節する。
精製された：用語「精製された」は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物は、天然に関連するタンパク質および他の夾雑物から、完全にまたは部分的に単離されたものである。ある特定の実施形態では、用語「実質的に精製された」は、細胞、細胞培養培地または他の粗製調製物から単離されており、初期の調製物の種々の構成要素、例えば、タンパク質、細胞デブリおよび他の構成要素を除去するための分別に供されている、ペプチド、タンパク質、ウイルスまたは他の活性化合物を指す。
組換え：組換え核酸分子は、天然に存在しない配列を有するもの、または配列のさもなくば分離されていた２つのセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学的合成によって、または核酸分子の単離されたセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって達成され得る。
同様に、組換えウイルスは、天然に存在しない、または異なる起源の少なくとも２つの配列の人工的な組合せによって作製された配列（例えば、ゲノム配列）を含むウイルスである。用語「組換え」は、天然の核酸分子、タンパク質またはウイルスの一部分の付加、置換または欠失によってもっぱら変更された核酸、タンパク質およびウイルスもまた含む。本明細書で使用される場合、「組換えＡＡＶ」は、組換え核酸分子、例えば、ＰＣＣＡをコードする組換え核酸分子および／またはＰＣＣＢをコードする組換え核酸分子がその中にパッケージングされたＡＡＶ粒子を指す。
配列同一性：２つもしくはそれよりも多くの核酸配列間、または２つもしくはそれよりも多くのアミノ酸配列間の同一性または類似性は、それらの配列間の同一性または類似性の観点から表現される。配列同一性は、パーセンテージ同一性の観点から測定され得る；パーセンテージが高くなるほど、配列はより同一である。配列類似性は、パーセンテージ類似性（これは、保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）の観点から測定され得る；パーセンテージが高くなるほど、配列はより類似である。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準的な方法を使用してアラインメントさせた場合、比較的高い程度の配列同一性／類似性を有する。オルソロガスなタンパク質またはｃＤＮＡが、より遠縁の種（例えば、ヒト配列とＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較して、より近縁の種（例えば、ヒト配列とマウス配列）に由来する場合、この相同性は、より重要である。
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970：Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988；Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988；Higgins & Sharp, CABIOS5:151-3, 1989；Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988；Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992：およびPearson et al., Meth. Mol. Rio. 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990は、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な検討を示している。
ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと併せた使用のために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびインターネット上を含む、いくつかの供給源から入手可能である。さらなる情報は、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて見出すことができる。
血清型：抗原の特徴的なセットによって識別される、近縁の微生物（例えば、ウイルス）の群。
スタッファー配列：２つの核酸特色間（例えば、プロモーターとコード配列との間）に所望の間隔を創出するため、または所望の長さのものになるように核酸分子を延長させるために典型的には使用される、より大きい核酸分子（例えば、ベクター）内に含まれるヌクレオチドの配列を指す。スタッファー配列は、タンパク質コード情報を含まず、未知／合成の起源のものであり得る、および／またはより大きい核酸分子内の他の核酸配列とは無関係であり得る。
対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含むカテゴリーである、脊椎を持つ生きた多細胞生物。
合成の：実験室において人工的な手段によって産生されたもの、例えば、合成の核酸は、実験室において化学的に合成され得る。
非翻訳領域（ＵＴＲ）：典型的なｍＲＮＡは、コード領域のそれぞれ上流および下流に、５’非翻訳領域（「５’ＵＴＲ」）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む（Mignone et al., 2002, Genome Biol 3: REVIEWS0004を参照されたい）。
治療有効量：薬剤で処置されている対象または細胞において所望の効果を達成するのに十分な、特定された医薬品または治療剤（例えば、組換えＡＡＶ）の量。薬剤の有効量は、処置されている対象または細胞、および治療的組成物の投与様式が含まれるがこれらに限定されない、いくつかの因子に依存する。
ベクター：ベクターは、宿主細胞において複製するおよび／または組み込まれるベクターの能力を破壊することなしに外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、宿主細胞においてそれが複製するのを可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝エレメントもまた含み得る。発現ベクターは、挿入された遺伝子（単数または複数）の転写および翻訳を可能にするために必要な調節配列を含むベクターである。本明細書の一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。
他に説明されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示さない限り、複数形の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」は、Ａを含むこと、またはＢを含むこと、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は、近似であり、記述のために提供されていることを、さらに理解すべきである。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）：
本発明は、組成物および遺伝子治療におけるそれらの使用の方法を提供する。より具体的には、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
本発明は、組成物および遺伝子治療におけるそれらの使用の方法を提供する。より具体的には、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のために有用なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
一態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
別の態様では、本開示は、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、（ａ）プロモーター配列；（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および（ｃ）ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを提供する。
一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、本明細書に記載されるように、５’－ＩＴＲ、エンハンサー、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲをさらに含み得る。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、１つまたは複数のスタッファー核酸配列をさらに含み得る。一実施形態では、スタッファー核酸配列は、イントロンとＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列との間に置かれる。
本明細書に記載される種々の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドを含む。ＡＡＶカプシドは、血清型８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０、ｈｕ３７のＡＡＶ（即ち、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７）、ならびにヒトおよび非ヒト霊長類組織から単離された１００種よりも多くのバリアントのうちいずれか１つ由来であり得る。例えば、Choi et al., 2005, Curr Gene Ther. 5: 299-310, 2005およびGao et al., 2005, Curr Gene Ther. 5: 285-297を参照されたい。
上述のカプシドを超えて、１つまたは複数の有益な治療特性（例えば、選択された組織への改善された標的化、免疫応答を逃れる能力の増加、中和抗体の刺激の低減など）を有するように操作されたバリアントＡＡＶカプシドもまた、本発明の範囲内に含まれる。かかる操作されたバリアントカプシドの非限定的な例は、米国特許第９，５０６，０８３号、同第９，５８５，９７１号、同第９，５８７，２８２号、同第９，６１１，３０２号、同第９，７２５，４８５号、同第９，８５６，５３９号、同第９，９０９，１４２号、同第９，９２０，０９７号、同第１０，０１１，６４０号、同第１０，０８１，６５９号、同第１０，１７９，１７６号、同第１０，２０２，６５７号、同第１０，２１４，５６６号、同第１０，２１４，７８５号、同第１０，２６６，８４５号、同第１０，２９４，２８１号、同第１０，３０１，６４８号、同第１０，３８５，３２０号および同第１０，３９２，６３２号、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１７／１６５８５９、ＷＯ／２０１８／０２２９０５、ＷＯ／２０１８／１５６６５４、ＷＯ／２０１８／２２２５０３およびＷＯ／２０１８／２２６６０２に記載されており、これらの開示は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の例示的な実施形態では、本発明に従って投与されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ８カプシドを含む。ＡＡＶ８カプシドは、複数のＡＡＶ８ ｖｐタンパク質から構成される自己アセンブルしたＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ８ ｖｐタンパク質は、典型的には、配列番号１５のｖｐ１アミノ酸配列をコードする、配列番号１４の核酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一な配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現される。これらのスプライスバリアントは、異なる長さの配列番号１５のタンパク質を生じる。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ８バリアントには、例えば、ＷＯ／２０１９／１６８９６１、ＷＯ／２０１７１８０８５４および米国特許第９，９０９，１４２号に記載されるものが含まれる。
ある特定の例示的な実施形態では、本発明に従って投与されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドを含む。ＡＡＶ９カプシドは、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質から構成される自己アセンブルしたＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は、典型的には、配列番号１７のｖｐ１アミノ酸配列をコードする、配列番号１６の核酸配列またはそれと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一な配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現される。これらのスプライスバリアントは、異なる長さの配列番号１７のタンパク質を生じる。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ９バリアントには、例えば、ＷＯ／２０１６／０４９２３０、米国特許第８，９２７，５１４号、米国特許出願公開第２０１５／０３４４９１１号および米国特許第８，７３４，８０９号に記載されるものが含まれる。
本明細書で示されるように、本発明に従って投与されるｒＡＡＶは、一部の実施形態では、ＡＡＶ８カプシドまたはＡＡＶ９カプシドを含み得る。しかし、他の実施形態では、別のＡＡＶカプシドが選択される。組織特異性は、カプシド型によって決定される。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒｌ、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ８を含む、適切な標的（例えば、肝臓、筋肉、肺またはＣＮＳ）を形質導入するＡＡＶ血清型が、ＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として選択され得る。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号；米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８号；およびＥＰ１３１０５７１号を参照されたい。ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７および他のサルＡＡＶ）、米国特許第７２８２１９９号および同第７７９０４４９号（ＡＡＶ８）もまた参照されたい。さらに、今後発見されるＡＡＶ、またはそれらに基づく組換えＡＡＶが、ＡＡＶカプシドの供給源として使用され得る。これらの文献は、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶもまた記載しており、参照により組み込まれる。一部の実施形態では、ウイルスベクターにおける使用のためのＡＡＶカプシドは、上述のＡＡＶカプシドまたはそのコード核酸のうち１つの変異誘発（即ち、挿入、欠失または置換による）によって生成され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、上述のＡＡＶカプシドタンパク質のうち２つまたは３つまたは４つまたはそれよりも多く由来のドメインを含むキメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ由来のＶｐｌ、Ｖｐ２およびＶｐ３モノマーのモザイクである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、上述のカプシドのうち１つよりも多くを含む。
プロモーター：
本明細書に記載される種々の態様では、ｒＡＡＶは、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢ発現を駆動および調節することを助けるプロモーター配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。例示的な実施形態では、プロモーター配列は、５’－ＩＴＲ配列とＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列との間に位置する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサー配列の下流に位置する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、イントロン配列の上流に位置する。
本明細書に記載される種々の態様では、ｒＡＡＶは、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢ発現を駆動および調節することを助けるプロモーター配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。例示的な実施形態では、プロモーター配列は、５’－ＩＴＲ配列とＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列との間に位置する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、エンハンサー配列の下流に位置する。一部の実施形態では、プロモーター配列は、イントロン配列の上流に位置する。
一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターおよびＣＡＧプロモーターから選択される。
例示的な実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである。一実施形態では、ＣＢＡプロモーターは、配列番号２１、またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一な配列を含むまたはそれからなる。
プロモーターに加えて、パッケージングされたゲノムは、他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列および効率的なＲＮＡプロセシングシグナルを含み得る。以下にさらに詳細に記載されるように、かかる配列には、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、発現を増強する調節エレメント（即ち、ＷＰＲＥ）、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を増強する配列（即ち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、およびタンパク質安定性を増強する配列が含まれる。
逆位末端反復（ＩＴＲ）：
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合に、ベクターＤＮＡ複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能するＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。さらに、ＩＴＲは、大きいＲｅｐタンパク質による一本鎖エンドヌクレアーゼニック形成（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｔｉｃ ｎｉｃｋｉｎｇ）のための標的として機能し、複製中間体から個々のゲノムを分解する。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合に、ベクターＤＮＡ複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能するＡＡＶ ＩＴＲ配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。さらに、ＩＴＲは、大きいＲｅｐタンパク質による一本鎖エンドヌクレアーゼニック形成（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｔｉｃ ｎｉｃｋｉｎｇ）のための標的として機能し、複製中間体から個々のゲノムを分解する。
一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来である。一部の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２由来であり、各々、配列番号１８を含むまたはそれからなる。他の実施形態では、５’－ＩＴＲ配列および／または３’－ＩＴＲ配列は、非ＡＡＶ２供給源由来である。
エンハンサー：
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、１つまたは複数のエンハンサー配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。一実施形態では、エンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサーおよびＡｐｏＥエンハンサーから選択される。例示的な実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー（例えば、ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー）である。一実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号２２、またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９％よりも高く同一であるが、１００％未満同一な配列を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、１つまたは複数のエンハンサー配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。一実施形態では、エンハンサーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサーおよびＡｐｏＥエンハンサーから選択される。例示的な実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー（例えば、ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー）である。一実施形態では、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号２２、またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９％よりも高く同一であるが、１００％未満同一な配列を含むまたはそれからなる。
Ｋｏｚａｋ配列：
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、イントロン配列の下流に位置する。一実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣ（配列番号２４）である。当業者に理解されるように、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、典型的には、コード配列の直ぐ上流に位置する；この例では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列の直ぐ上流に位置する。当業者に理解されるように、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、治療的ポリペプチド、例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの開始コドンに対応するＡＴＧ残基を共有するとみなすことができる。開示を単純にするために、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、本明細書に記載されるように、治療的ポリペプチド、例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢと共有されない領域に対応する６ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、イントロン配列の下流に位置する。一実施形態では、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、ＧＣＣＧＣＣ（配列番号２４）である。当業者に理解されるように、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、典型的には、コード配列の直ぐ上流に位置する；この例では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列の直ぐ上流に位置する。当業者に理解されるように、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、治療的ポリペプチド、例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの開始コドンに対応するＡＴＧ残基を共有するとみなすことができる。開示を単純にするために、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、本明細書に記載されるように、治療的ポリペプチド、例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢと共有されない領域に対応する６ヌクレオチド配列を含む。
ポリアデニル化シグナル配列：
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ポリアデニル化シグナル配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。一実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列およびウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される。例示的な実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。一実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２３、またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９％よりも高く同一であるが、１００％未満同一な配列を含むまたはそれからなる。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ポリアデニル化シグナル配列を含むパッケージングされたベクターゲノムを含む。一実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列およびウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される。例示的な実施形態では、ポリアデニル化シグナル配列は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である。一実施形態では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２３、またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９％よりも高く同一であるが、１００％未満同一な配列を含むまたはそれからなる。
ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢポリペプチド：
本明細書に記載されるように、本発明の態様は、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含むパッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。
本明細書に記載されるように、本発明の態様は、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含むパッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。
一実施形態では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、野生型コード配列である。本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、天然に存在するバイオポリマー（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）と同じバイオポリマー（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）を指す。
代替的な実施形態では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、コドン最適化されたコード配列である。一実施形態では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。
本明細書に記載される種々の実施形態では、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢのコード配列を含むパッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶが提供される。本明細書に記載されるｒＡＡＶを用いて送達されるポリペプチドは、ヒトを含む哺乳動物の処置において有用であり得るＰＣＣＡおよびＰＣＣＢポリペプチドを包含する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを用いて発現されるポリペプチドは、ＰＣＣＡ（配列番号１９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００２７３．２；７２８アミノ酸）またはその機能的断片、機能的バリアントもしくは機能的アイソフォームである。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを用いて発現されるポリペプチドは、ＰＣＣＡであり、配列番号１９を含むまたはそれからなる。
一実施形態では、ＰＣＣＡポリペプチドは、配列番号２に示される野生型コード配列によってコードされる。別の実施形態では、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５１６５－１（配列番号２５）、Ｐ０５１６５－２（配列番号２６）およびＰ０５１６５－３（配列番号２７）に示されるものなどの、ＰＣＣＡの天然のアイソフォームまたはバリアントを発現するコード配列が使用され得る。代替的な実施形態では、ＰＣＣＡポリペプチドは、コドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡポリペプチドは、配列番号１に示される野生型コード配列と８０％未満同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の例示的な実施形態では、ＰＣＣＡポリペプチドは、配列番号３～７から選択されるコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、３’末端に停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを用いて発現されるポリペプチドは、ＰＣＣＢ（配列番号２０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００５２３．２；５３９アミノ酸）またはその機能的断片、機能的バリアントもしくは機能的アイソフォームである。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを用いて発現されるポリペプチドは、ＰＣＣＢであり、配列番号２０を含むまたはそれからなる。
一実施形態では、ＰＣＣＢポリペプチドは、配列番号８に示される野生型コード配列によってコードされる。別の実施形態では、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０５１６６－１（配列番号２８）およびＰ０５１６６－２（配列番号２９）に示されるものなどの、ＰＣＣＢの天然のアイソフォームまたはバリアントを発現するコード配列が使用され得る。代替的な実施形態では、ＰＣＣＢポリペプチドは、コドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢポリペプチドは、配列番号８に示される野生型コード配列と８０％未満同一なコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の例示的な実施形態では、ＰＣＣＢポリペプチドは、配列番号９～１３から選択されるコドン最適化されたコード配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、３’末端に停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）をさらに含み得る。
種々の態様では、本発明は、本明細書に記載されるＰＣＣＡまたはＰＣＣＢポリペプチドの断片、バリアント、アイソフォームまたは融合物を送達するために使用され得る。
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００アミノ酸残基を含み、全長ポリペプチドに関連する１つまたは複数の活性（例えば、酵素の場合には触媒活性）を保持する、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢポリペプチドの断片を送達するために使用され得る。かかる断片は、当該分野で慣用的かつ周知の組換え技法によって得られ得る。さらに、かかる断片は、当業者に公知の慣用的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、触媒活性について試験され得る。例えば、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）活性は、（１）１ｍＭの２－メルカプトエタノールおよび０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にポリペプチドを希釈し、（２）５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ｍＭのグルタチオン、２ｍＭのＡＴＰ、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの［１４Ｃ］－バイカーボネート（比放射能１２．４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）、３ｍＭのプロピオニル－ＣｏＡを含む標準的な反応混合物を取り、酵素を３７℃で１５分間インキュベートし、（３）１０％トリクロロ酢酸の添加によって反応を停止させ、（４）２００×ｇで遠心分離し、（５）加熱ランプ下でアリコートを乾燥させ、（６）水中に溶解させ、（７）Ａｑｕａｓｏｌにおいて計数することによってアッセイされ得、このとき、１単位の酵素活性は、１分あたり固定量（fixation）の１ｐｍｏｌバイカーボネートを３７℃で触媒する酵素の量として定義される。ＰＣＣ活性アッセイの説明については、Kalousek et al., 1980, J Biol Chem 255(1): 60-65およびHsia et al., 1973 J. Pediatr. 83: 625-628を参照されたい。本発明は、上記ポリペプチド断片をコードする核酸分子をさらに含む。
一部の実施形態では、本発明は、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢポリペプチドのバリアントを送達するために使用され得る。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、野生型治療的ポリペプチド、例えば、配列番号１９の野生型ＰＣＣＡポリペプチドまたは配列番号２０の野生型ＰＣＣＢポリペプチドと少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％）同一であり得る。一部の実施形態では、バリアント治療的ポリペプチドは、それぞれの野生型ポリペプチドと比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０個の異なる残基を有し得る。かかるバリアントは、当該分野で慣用的かつ周知の組換え技法によって得られ得る。さらに、かかるバリアントは、当業者に公知の慣用的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、触媒活性について試験され得る。プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ活性アッセイの説明については、例えば、Kalousek et al., 1980, J Biol Chem 255(1): 60-65およびHsia et al., 1973 J. Pediatr. 83: 625-628を参照されたい。本発明は、上記治療的ポリペプチドバリアントをコードする核酸分子をさらに含む。
コドン最適化された配列：
一部の態様では、本開示は、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化された核酸配列を含むパッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。一実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号３～７から選択される配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％）同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号３～７から選択される配列と１００％同一である。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号３～７から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高く同一な核酸配列を提供する。例示的な実施形態では、本開示は、配列番号３～７から選択される、ＰＣＣＡをコードする核酸配列を提供する。機能的ＰＣＣＡ活性を有するポリペプチドを各々がコードする、配列番号３～７に示される核酸配列の断片がさらに提供される。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードする核酸配列は、３’末端に停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）をさらに含み得る。
一部の態様では、本開示は、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化された核酸配列を含むパッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。一実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号３～７から選択される配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％）同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号３～７から選択される配列と１００％同一である。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２に示される野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号３～７から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高く同一な核酸配列を提供する。例示的な実施形態では、本開示は、配列番号３～７から選択される、ＰＣＣＡをコードする核酸配列を提供する。機能的ＰＣＣＡ活性を有するポリペプチドを各々がコードする、配列番号３～７に示される核酸配列の断片がさらに提供される。一部の実施形態では、ＰＣＣＡをコードする核酸配列は、３’末端に停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）をさらに含み得る。
一部の態様では、本開示は、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化された核酸配列を含むパッケージングされたゲノムを含むｒＡＡＶを提供する。一実施形態では、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号８に示される野生型コード配列と８０％未満同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号９～１３から選択される配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％または１００％）同一である。一部の実施形態では、ＰＣＣＢをコードするコドン最適化された核酸配列は、配列番号９～１３から選択される配列と１００％同一である。一部の実施形態では、本開示は、配列番号８に示される野生型コード配列と８０％未満同一であり、配列番号９～１３から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれよりも高く同一な核酸配列を提供する。例示的な実施形態では、本開示は、配列番号９～１３から選択される、ＰＣＣＢをコードする核酸配列を提供する。機能的ＰＣＣＢ活性を有するポリペプチドを各々がコードする、配列番号９～１３に示される核酸配列の断片がさらに提供される。一部の実施形態では、ＰＣＣＢをコードする核酸配列は、３’末端に停止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ）をさらに含み得る。
組換え核酸構築物：
別の態様では、本開示は、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む組換え核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル配列および３’－ＩＴＲから選択される１つまたは複数のエレメントもまた含む。一実施形態では、組換え核酸構築物は、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを含む。さらなる実施形態では、組換え核酸構築物は、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡのコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号２～７から選択される。
別の態様では、本開示は、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む組換え核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル配列および３’－ＩＴＲから選択される１つまたは複数のエレメントもまた含む。一実施形態では、組換え核酸構築物は、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを含む。さらなる実施形態では、組換え核酸構築物は、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡのコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号２～７から選択される。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号３０と少なくとも９０％同一な配列を含む組換え核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、配列番号３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一な配列を含む。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、配列番号３０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一な配列からなる。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、配列番号３０を含む。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、配列番号３０からなる。
別の態様では、本開示は、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、およびＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む組換え核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル配列および３’－ＩＴＲから選択される１つまたは複数のエレメントもまた含む。一実施形態では、組換え核酸構築物は、５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲを含む。さらなる実施形態では、組換え核酸構築物は、ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＢのコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号８～１３から選択される。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号３１と少なくとも９０％同一な配列を含む組換え核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、配列番号３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一な配列を含む。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、配列番号３１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一な配列からなる。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、配列番号３１を含む。一部の実施形態では、組換え核酸構築物は、配列番号３１からなる。
ベクター：
別の態様では、本開示は、本発明の組換え核酸構築物を含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含む組換え核酸構築物を含む。別の実施形態では、ベクターは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含む組換え核酸構築物を含む。
別の態様では、本開示は、本発明の組換え核酸構築物を含むベクターを提供する。一実施形態では、ベクターは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含む組換え核酸構築物を含む。別の実施形態では、ベクターは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、および３’－ＩＴＲを含む組換え核酸構築物を含む。
この態様に従う一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、エピソーム、非ウイルス性送達ビヒクル（例えば、脂質ナノ粒子）およびウイルスから選択される。例示的な実施形態では、ベクターは、プラスミドである。
選択されたベクターは、トランスフェクション、電気穿孔、リポソームベースの送達および膜融合技法を含む任意の適切な方法によって、宿主細胞に送達され得る。例示的な実施形態では、ベクターは、トランスフェクションを介して宿主細胞に送達される。標準的なＤＮＡトランスフェクション技法が、宿主細胞にベクターを送達するために使用され得る。例えば、Sambrook et al., 2000, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d. Ed., Cold Spring Harbor Press, Plainview, NYを参照されたい。
一部の実施形態では、ベクター、例えば、プラスミドは、ＡＡＶ Ｒｅｐコード配列、ＡＡＶ Ｃａｐコード配列、および選択可能なマーカーのコード配列から選択される１つまたは複数の核酸配列をさらに含み得る。
宿主細胞：
別の態様では、本開示は、本発明の組換え核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のｒＡＡＶを含む宿主細胞を提供する。
別の態様では、本開示は、本発明の組換え核酸分子、本発明のベクターまたは本発明のｒＡＡＶを含む宿主細胞を提供する。
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＡＡＶの拡大増殖のために適切であり得る。幅広い宿主細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞などが、ＡＡＶの産生のために使用され得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生に適切な細胞（または細胞系）、例えば、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ－７、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＲＤ、ＨＴ－１０８０、ＡＲＰＥ－１９またはＭＲＣ－５細胞であり得る。
組換え核酸分子またはベクターは、当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、宿主細胞培養物中に送達され得る。一部の実施形態では、組換え核酸分子またはベクターがそのゲノム中に挿入された安定な宿主細胞系が生成される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを含む安定な宿主細胞系が生成される。宿主培養物へのｒＡＡＶベクターのトランスフェクションの後、宿主ゲノム中へのｒＡＡＶの組込みは、Nakai et al, Nature Genetics (2003) 34, 297-302；Philpott et al, Journal of Virology (2002) 76(11):5411-5421およびHowden et al, J Gene Med 2008; 10:42-50によって記載されるように、種々の方法、例えば、抗生物質選択、蛍光活性化細胞選別、サザンブロット、ＰＣＲベースの検出、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってアッセイされ得る。さらに、安定な細胞系は、Clark, Kidney International Vol 61 (2002):S9-S15およびYuan et al, Human Gene Therapy 2011 May;22(5):613-24に記載されるものなどの、当該分野で周知のプロトコールに従って樹立され得る。
遺伝子治療のための組換えＡＡＶ：
別の態様では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のための、本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用であって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列。例示的な実施形態では、パッケージングされたゲノムは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列の上流のエンハンサー配列、３’－ＩＴＲの上流のポリアデニル化配列、および３’－ＩＴＲもまた含む。したがって、別の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲ。さらなる例示的な実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡのコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号２～７から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドである。
別の態様では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のための、本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用であって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列。例示的な実施形態では、パッケージングされたゲノムは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列の上流のエンハンサー配列、３’－ＩＴＲの上流のポリアデニル化配列、および３’－ＩＴＲもまた含む。したがって、別の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲ。さらなる例示的な実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＡのコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号２～７から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドである。
ＰＣＣＡの発現のための例示的なパッケージングされたベクターゲノム構築物を示す例示的な略図は、５’から３’の順序で以下を示す図１に提供される：５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１のイントロン配列、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ＰＣＣＡコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲ。
別の態様では、本開示は、プロピオン酸血症（ＰＡ）の処置のための、本明細書で開示されるｒＡＡＶの使用であって、ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む、使用を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、およびＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列。例示的な実施形態では、パッケージングされたゲノムは、５’－ＩＴＲ、プロモーター配列の上流のエンハンサー配列、３’－ＩＴＲの上流のポリアデニル化配列、および３’－ＩＴＲもまた含む。したがって、別の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：５’－ＩＴＲ、エンハンサー配列、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列、ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲ。さらなる例示的な実施形態では、ｒＡＡＶは、作動可能に連結した構成要素として、５’から３’の順序で以下を含む、パッケージングされたゲノムを含む：ＡＡＶ２ ５’－ＩＴＲ配列、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列、ＰＣＣＢのコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、およびＡＡＶ２ ３’－ＩＴＲ。一部の実施形態では、パッケージングされたゲノムは、イントロン配列の下流に位置するコンセンサスＫｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、配列番号１を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号８～１３から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドである。
ＰＣＣＡの発現のための例示的なパッケージングされたベクターゲノム構築物を示す例示的な略図は、５’から３’の順序で以下を示す図２に提供される：５’－ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター、配列番号１のイントロン配列、コンセンサスＫｏｚａｋ配列、ＰＣＣＢコード配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、および３’－ＩＴＲ。
タンパク質局在化：
プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼは、ミトコンドリアマトリックスに局在化するマルチマータンパク質である（Browner et al., (1989). Journal of Biological Chemistry. 264:12680-5を参照されたい）。したがって、ＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢ遺伝子（複数可）を送達する遺伝子治療ベクターは、ミトコンドリアにおいて機能的でありかつその中に局在化されるタンパク質をコードすることが可能であることが必須である。一態様では、本明細書で開示される１つまたは複数のｒＡＡＶは、ミトコンドリア中に局在化するＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢタンパク質（複数可）をコードする遺伝子を送達することが可能である。
プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼは、ミトコンドリアマトリックスに局在化するマルチマータンパク質である（Browner et al., (1989). Journal of Biological Chemistry. 264:12680-5を参照されたい）。したがって、ＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢ遺伝子（複数可）を送達する遺伝子治療ベクターは、ミトコンドリアにおいて機能的でありかつその中に局在化されるタンパク質をコードすることが可能であることが必須である。一態様では、本明細書で開示される１つまたは複数のｒＡＡＶは、ミトコンドリア中に局在化するＰＣＣＡおよび／またはＰＣＣＢタンパク質（複数可）をコードする遺伝子を送達することが可能である。
医薬組成物：
別の態様では、本開示は、本発明のｒＡＡＶ（例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの送達のためのｒＡＡＶ）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶ（例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの送達のためのｒＡＡＶ）を含む医薬組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内または静脈内投与のために製剤化される。例示的な実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
別の態様では、本開示は、本発明のｒＡＡＶ（例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの送達のためのｒＡＡＶ）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明のｒＡＡＶ（例えば、ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの送達のためのｒＡＡＶ）を含む医薬組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内または静脈内投与のために製剤化される。例示的な実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ヒト対象における注入に適切な緩衝液／担体中で製剤化される。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブにくっつくのを防止するが、ｒＡＡＶ結合活性をｉｎ ｖｉｖｏで妨害しない構成要素を含むべきである。種々の適切な溶液は、緩衝食塩水、界面活性剤、および約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムと等価なイオン強度に調整された、生理学的に適合性の塩もしくは塩の混合物、または等価なイオン濃度に調整された生理学的に適合性の塩、のうち１種または複数を含み得る。ｐＨは、６．５～８．５、または７～８．５、または７．５～８の範囲内であり得る。適切な界面活性剤、または界面活性剤の組合せは、ポロキサマー、即ち、ポリオキシエチレン（ポリ（酸化エチレン））の２つの親水性鎖に挟まれたポリオキシプロピレン１０（ポリ（酸化プロピレン））の中央の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド（Polyoxy capryllic glyceride））、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノールおよびポリエチレングリコールの中から選択され得る。
例示的な実施形態では、ｒＡＡＶは、ＮａＣｌ（例えば、２００ｍＭのＮａＣｌ）、ＭｇＣｌ２（例えば、１ｍＭのＭｇＣｌ２）、Ｔｒｉｓ（例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ）、ｐＨ８．０およびポロキサマー１８８（例えば、０．００５％または０．０１％ポロキサマー１８８）を含む溶液中で製剤化される。
プロピオン酸血症を処置する方法：
別の態様では、本開示は、ヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される少なくとも１つのｒＡＡＶを、ヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、ヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される少なくとも１つのｒＡＡＶを、ヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、ＰＡを処置する方法であって、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含み、ベクターゲノムが、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一な、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、方法を提供する。
別の実施形態では、本開示は、ＰＡを処置する方法であって、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含み、ベクターゲノムが、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一な、およびＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本開示は、ＰＡを処置する方法であって、（１）ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一な、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶ；ならびに（２）ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶであって、前記ベクターゲノムが、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一な、およびＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、ｒＡＡＶを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、同時に投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、順次投与され得る。一部の実施形態では、（１）および（２）のｒＡＡＶは、別々に投与され得る。
別の態様では、本開示は、ヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される少なくとも１つのｒＡＡＶを、ＰＣＣＡ中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＰＣＣＡ中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含み、前記ベクターゲノムが、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一な、およびＰＣＣＡもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＰＣＣＡ中の変異は、表１から選択される。一部の実施形態では、ＰＣＣＡのコード配列は、配列番号２～７から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドである。
別の態様では、本開示は、ヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、治療有効量の本明細書で開示される少なくとも１つのｒＡＡＶを、ＰＣＣＢ中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ＰＣＣＢ中に少なくとも１つの変異を有すると診断されたヒト対象におけるＰＡを処置する方法であって、ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含むｒＡＡＶを投与するステップを含み、前記ベクターゲノムが、プロモーター配列、配列番号１と少なくとも９０％同一な、およびＰＣＣＢもしくはそのアイソフォームまたはそれらの機能的断片もしくは機能的バリアントの部分的または完全なコード配列を含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、ＰＣＣＢ中の変異は、表２から選択される。一部の実施形態では、ＰＣＣＢのコード配列は、配列番号８～１３から選択される。一部の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９カプシドである。
ＰＣＣＡおよびＰＣＣＢ中のＰＡを引き起こす変異を記載する総説論文は、Ugarte et al., 1999, Hum. Mutat. 14(4): 275-282に提供される。
変異したＰＣＣＡ遺伝子によって引き起こされるＰＡでは、ＰＣＣＡ遺伝子中の以下の変異および多型が同定されている：
変異したＰＣＣＢ遺伝子によって引き起こされるＰＡでは、ＰＣＣＢ遺伝子中の以下の変異および多型が同定されている：
任意の適切な方法または経路が、本明細書に記載されるｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ含有組成物を投与するために使用され得る。投与経路には、例えば、全身性、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が含まれる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ、ｒＡＡＶを含む組成物、または複数のｒＡＡＶ（例えば、ＰＣＣＡを発現する１つのｒＡＡＶおよびＰＣＣＢを発現する第２のｒＡＡＶ）を含む組成物は、静脈内投与される。
投与される具体的な用量は、各患者について均一な用量、例えば、患者１人当たり１．０×１０１１～１．０×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ）のウイルスであり得る。あるいは、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせることができる。適切な投薬量を決定する上での他の因子には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的状態が含まれ得る。処置のために適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる精緻化は、特に、本明細書で開示される投薬量情報およびアッセイに照らして、当業者によって慣用的に行われる。投薬量は、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための公知のアッセイの使用を介して決定することもできる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行をモニタリングしながら調整することもできる。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定した場合、例えば、患者体重１キログラム当たり約１．０×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）～約１×１０１４ＧＣ／ｋｇ、患者体重１キログラム当たり約５×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）～約５×１０１３ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０１２～約１×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０１２～約１×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約１．１×１０１１、約１．３×１０１１、約１．６×１０１１、約１．９×１０１１、約２×１０１１、約２．５×１０１１、約３．０×１０１１、約３．５×１０１１、約４．０×１０１１、約４．５×１０１１、約５．０×１０１１、約５．５×１０１１、約６．０×１０１１、約６．５×１０１１、約７．０×１０１１、約７．５×１０１１、約８．０×１０１１、約８．５×１０１１、約９．０×１０１１、約９．５×１０１１、約１．０×１０１２、約１．５×１０１２、約２．０×１０１２、約２．５×１０１２、約３．０×１０１２、約３．５×１０１２、約４．０×１０１２、約４．５×１０１２、約５．０×１０１２、約５．５×１０１２、約６．０×１０１２、約６．５×１０１２、約７．０×１０１２、約７．５×１０１２、約８．０×１０１２、約８．５×１０１２、約９．０×１０１２、約９．５×１０１２、約１．０×１０１３、約１．５×１０１３、約２．０×１０１３、約２．５×１０１３、約３．０×１０１３、約３．５×１０１３、約４．０×１０１３、約４．５×１０１３、約５．０×１０１３、約５．５×１０１３、約６．０×１０１３、約６．５×１０１３、約７．０×１０１３、約７．５×１０１３、約８．０×１０１３、約８．５×１０１３、約９．０×１０１３、約９．５×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される。ｒＡＡＶは、単一用量で、または所望の治療結果のために必要に応じて複数用量（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれよりも多くの用量）で、投与され得る。
用量は、毎週、毎月もしくは毎年１もしくは複数回、またはさらには、２～２０年毎に１回与えられ得る。例えば、各用量は、最低１週間あけて、２週間あけて、３週間あけて、１か月あけて、３か月あけて、６か月あけて、または１年あけて、与えられ得る。当業者は、体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時間および濃度に基づいて、投薬の繰り返し速度を容易に推定することができる。
本明細書を通じて、組成物が、特定の構成要素を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、またはプロセスおよび方法が、特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている場合、さらに、列挙された構成要素から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物が存在すること、および列挙された処理ステップから本質的になるまたはそれからなる本発明に従うプロセスおよび方法が存在することが企図される。
本開示では、要素または構成要素が、列挙された要素または構成要素のリスト中に含まれるおよび／またはかかるリストから選択されると言われる場合、その要素もしくは構成要素が、列挙された要素もしくは構成要素のうちいずれか１つであり得ること、またはその要素もしくは構成要素が、列挙された要素もしくは構成要素のうち２つもしくはそれよりも多くからなる群から選択され得ることを、理解すべきである。
さらに、本明細書に記載される組成物または方法の要素および／または特色は、本明細書で明示的であれ黙示的であれ、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに種々の方法で組み合わされ得ることを理解すべきである。例えば、特定の化合物に対して言及がなされる場合、文脈から他が理解されない限り、その化合物は、本発明の組成物のおよび／または本発明の方法における種々の実施形態において使用され得る。言い換えると、本開示内で、実施形態は、書かれ描かれる明確かつ簡潔な開示を可能にする方法で記載され示されてきたが、実施形態は、本明細書の教示および本発明（複数可）から離れることなしに様々に組み合わされまたは分離され得ることが意図され、それが理解される。例えば、本明細書に記載され示される全ての特色は、本明細書で記載され示される本発明（複数可）の全ての態様に適用可能であり得ることが理解される。
表現「少なくとも１つの」は、文脈および使用から他のように理解されない限り、この表現の後に列挙された対象物の各々を個々に含むこと、および列挙された対象物のうち２つまたはそれよりも多くの種々の組合せを含むことを理解すべきである。３つまたはそれよりも多くの列挙された対象物と併せた、表現「および／または」は、文脈から他のように理解されない限り、同じ意味を有すると理解すべきである。
その文法的等価物を含む、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、他のように具体的に述べられない限り、または文脈から他のように理解されない限り、オープンエンドであり非限定的である、例えば、さらなる列挙されていない要素もステップも排除しないと一般に理解すべきである。
用語「約」の使用が定量値の前である場合、本発明は、他が具体的に述べられない限り、具体的な定量値自体もまた含む。本明細書で使用される場合、用語「約」は、他に示されも推察もされない限り、額面値から±１０％の変動を指す。
ステップの順序またはある特定の動作を実施する順序は、本発明が作動可能なままである限り、重要でないことを理解すべきである。さらに、２つまたはそれよりも多くのステップまたは動作は、同時に実施され得る。
本明細書の任意のおよび全ての例、または例示的な表現、例えば、「例えば／など」または「含む」の使用は、本発明をよりよく例示することを意図しているに過ぎず、特許請求されていない限り、本発明の範囲に対して制限を課さない。本明細書中のいずれの表現も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施のために必須であるとして示していると解釈すべきではない。
ここで大まかに記載される開示は、本開示のある特定の態様および実施形態の例示を目的として含まれているに過ぎず、本開示の範囲を決して限定しないことを意図する、以下の実施例を参照してより容易に理解される。
（実施例１：ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７細胞からのＰＣＣＡのタンパク質発現）
この実施例では、ＰＣＣＡのタンパク質発現を、ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７肝細胞のトランスフェクション後に評価した。
この実施例では、ＰＣＣＡのタンパク質発現を、ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７肝細胞のトランスフェクション後に評価した。
簡潔に述べると、ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７細胞系に、以下の表３に示されるように、対照プラスミド（即ち、モック、空のベクターを有するプラスミド）、またはエンハンサー（「Ｅｎｈ」）、プロモーター（「Ｐｒｏ」）、イントロン配列、ＰＣＣＡコード配列およびポリアデニル化シグナル（「ＰＳ」）の７つの組合せのうち１つを保有するｒＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトした。
各プラスミドを、製造業者の使用説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの７２時間後に収集し、プロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｓｉｇｍａ）およびホスファターゼ阻害剤カクテル２＋３（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６およびＰ００４４）を補充したＮＰ－４０溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０）で溶解させた。タンパク質を、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン上に移した。ウエスタンブロット解析を、抗ＰＣＣＡ抗体を１：１０００希釈で使用し、その後、遠赤外フルオロフォアにコンジュゲートした二次抗体を使用して実施した。
図３Ａは、対照プラスミド（モック、空のベクターを有するプラスミド）、またはＤＴＣ３４６、ＤＴＣ４２６、ＤＴＣ４２７、ＤＴＣ４２８、ＤＴＣ４２９、ＤＴＣ４３０もしくはＤＴＣ４３１に対応するｒＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２肝細胞における、ウエスタンブロットによって検出したＰＣＣＡタンパク質発現レベルを示す画像である。アクチンをローディング対照として使用した。図３Ｂは、ブロット１から測定した相対的ＰＣＣＡタンパク質発現を示す棒グラフである。図３Ｂが示すように、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０）は、試験した全ての他のベクタープラスミドと比較して、実質的に、驚くほどより多くのＰＣＣＡタンパク質発現を示した。
図４Ａは、対照プラスミド、またはＤＴＣ３４６、ＤＴＣ４２６、ＤＴＣ４２７、ＤＴＣ４２８、ＤＴＣ４２９、ＤＴＣ４３０もしくはＤＴＣ４３１に対応するｒＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトしたＨｕＨ－７肝細胞における、ウエスタンブロットによって検出したＰＣＣＡタンパク質発現レベルを示す画像である。アクチンをローディング対照として使用した。図４Ｂは、ブロット１から測定した相対的ＰＣＣＡタンパク質発現を示す棒グラフである。図４Ｂが示すように、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０）は、試験した全ての他のベクタープラスミドと比較して、実質的に、驚くほどより多くのＰＣＣＡタンパク質発現を示した。
図５Ａは、対照プラスミド、またはＤＴＣ３４６、ＤＴＣ４８２、ＤＴＣ４８３、ＤＴＣ４８４もしくはＤＴＣ４８５に対応するｒＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトした（ブロット１）；対照プラスミド（ＵＦ）、またはＤＴＣ３４６、ＤＴＣ４８２、ＤＴＣ４８３、ＤＴＣ４８４、ＤＴＣ４８５もしくはＤＴＣ４３０に対応するｒＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトした（ブロット２）ＨｅｐＧ２肝細胞における、ウエスタンブロットによって検出したＰＣＣＡタンパク質発現レベルを示す画像である。アクチンをローディング対照として使用した。図５Ｂは、対照プラスミドまたはｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６、ＤＴＣ４８２、ＤＴＣ４８３、ＤＴＣ４８４、ＤＴＣ４８５もしくはＤＴＣ４３０）によるトランスフェクション後の相対的ＰＣＣＡタンパク質発現を示す棒グラフである。グラフは、ＵＦ、ＤＴＣ４８２、ＤＴＣ４８３、ＤＴＣ４８４およびＤＴＣ４８５についてのブロット１およびブロット２から測定した平均タンパク質発現レベルを示す。グラフは、ＤＴＣ４３０についてのブロット２から測定したタンパク質発現レベルを示す。図５Ｂが示すように、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０）は、試験した全ての他のベクタープラスミドと比較して、実質的に、驚くほどより多くのＰＣＣＡタンパク質発現を示した。
図６Ａは、対照プラスミド、またはＤＴＣ３４６、ＤＴＣ４８２、ＤＴＣ４８３、ＤＴＣ４８４もしくはＤＴＣ４８５に対応するｒＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトした（ブロット１）；対照プラスミド、またはＤＴＣ３４６、ＤＴＣ４８２、ＤＴＣ４８３、ＤＴＣ４８４、ＤＴＣ４８５もしくはＤＴＣ４３０に対応するｒＡＡＶベクタープラスミドをトランスフェクトした（ブロット２）ＨｕＨ－７肝細胞における、ウエスタンブロットによって検出したＰＣＣＡタンパク質発現レベルを示す画像である。アクチンをローディング対照として使用した。図６Ｂは、対照プラスミドまたはｒＡＡＶベクタープラスミド（ＤＴＣ３４６、ＤＴＣ４８２、ＤＴＣ４８３、ＤＴＣ４８４、ＤＴＣ４８５もしくはＤＴＣ４３０）によるトランスフェクション後の相対的ＰＣＣＡタンパク質発現を示す棒グラフである。グラフは、ＵＦ、ＤＴＣ４８２、ＤＴＣ４８３、ＤＴＣ４８４およびＤＴＣ４８５についてのブロット１およびブロット２から測定した平均タンパク質発現レベルを示す。グラフは、ＤＴＣ４３０についてのブロット２から測定したタンパク質発現レベルを示す。図６Ｂが示すように、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０）は、試験した全ての他のベクタープラスミドと比較して、実質的に、驚くほどより多くのＰＣＣＡタンパク質発現を示した。
この実施例は、ＰＡ遺伝子治療ベクター中へのヒトβ－グロビンＩＶＳ２イントロン配列（配列番号１）の挿入が、導入遺伝子発現に関して実質的な利点を提供し得ることを示唆している。ＰＣＣＡコードｒＡＡＶまたはＰＣＣＢコードｒＡＡＶにおけるこのイントロン配列の利用は、高い導入遺伝子発現を送達し、それにより、プロピオン酸血症の首尾よい遺伝子治療のために要求されるベクター用量を低減させるのに有望であることを示している。
（実施例２：低形質ＰＡマウスモデルにおけるヒトＰＣＣＡ活性）
この実施例は、低形質ＰＡマウスモデルにおけるプロピオン酸血症（ＰＡ）に対する、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡをコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））のｒＡＡＶ媒介性送達の処置効果を試験することに関する。マウスにおけるＰｃｃａ遺伝子の欠失は、最も重症な形態のヒト疾患を模倣する。Ｐｃｃａ－マウスは、誕生の３６時間以内に死亡するので、それらにおいて静脈内全身性治療を試験することは困難である（Guenzel et al., Mol Ther. 2013 Jul; 21 (7):1316-1323を参照されたい）。低形質ＰＡマウスモデルＰｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）を、ヒトＰＣＣＡタンパク質のＡ１３８Ｔ変異体を保有する導入遺伝子によるＰｃｃａの欠失によって生成した。Ｐｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）マウスは、野生型ＰＣＣ活性の２％を有し、成体期まで生存し、ＰＡを有する患者におけるものと類似の、プロピオニルカルニチン、メチルシトレート、グリシン、アラニン、リシン、アンモニア、および心筋症に関連するマーカーにおける上昇を有する。簡潔に述べると、８匹のマウスに、５×１０１１、１×１０１２、２×１０１２または４×１０１２ウイルスゲノム（ＶＧ）／ｋｇ（それぞれ、５Ｅ１１、１Ｅ１２、２Ｅ１２および４Ｅ１２）の、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０）をコードするｒＡＡＶ８を静脈内注射した（注射後のＰＣＣＡ発現レベルは、図８Ａに提供される）。５匹のマウスに、３×１０１１、１×１０１２または３×１０１２ＶＧ／ｋｇ（それぞれ、３Ｅ１１、１Ｅ１２または３Ｅ１２）の、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０）をコードするｒＡＡＶ９を静脈内注射した（注射後のＰＣＣＡ発現レベルは、図８Ｂに提供される）。ＰＢＳを対照マウスに注射した（「ＣＯＮＴ」）。
この実施例は、低形質ＰＡマウスモデルにおけるプロピオン酸血症（ＰＡ）に対する、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡをコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））のｒＡＡＶ媒介性送達の処置効果を試験することに関する。マウスにおけるＰｃｃａ遺伝子の欠失は、最も重症な形態のヒト疾患を模倣する。Ｐｃｃａ－マウスは、誕生の３６時間以内に死亡するので、それらにおいて静脈内全身性治療を試験することは困難である（Guenzel et al., Mol Ther. 2013 Jul; 21 (7):1316-1323を参照されたい）。低形質ＰＡマウスモデルＰｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）を、ヒトＰＣＣＡタンパク質のＡ１３８Ｔ変異体を保有する導入遺伝子によるＰｃｃａの欠失によって生成した。Ｐｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）マウスは、野生型ＰＣＣ活性の２％を有し、成体期まで生存し、ＰＡを有する患者におけるものと類似の、プロピオニルカルニチン、メチルシトレート、グリシン、アラニン、リシン、アンモニア、および心筋症に関連するマーカーにおける上昇を有する。簡潔に述べると、８匹のマウスに、５×１０１１、１×１０１２、２×１０１２または４×１０１２ウイルスゲノム（ＶＧ）／ｋｇ（それぞれ、５Ｅ１１、１Ｅ１２、２Ｅ１２および４Ｅ１２）の、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０）をコードするｒＡＡＶ８を静脈内注射した（注射後のＰＣＣＡ発現レベルは、図８Ａに提供される）。５匹のマウスに、３×１０１１、１×１０１２または３×１０１２ＶＧ／ｋｇ（それぞれ、３Ｅ１１、１Ｅ１２または３Ｅ１２）の、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０）をコードするｒＡＡＶ９を静脈内注射した（注射後のＰＣＣＡ発現レベルは、図８Ｂに提供される）。ＰＢＳを対照マウスに注射した（「ＣＯＮＴ」）。
ＰＡの公知のバイオマーカー（２－メチルシトレート（２ＭＣ）、プロピオニルカルニチン（Ｃ３）およびアシルカルニチン（Ｃ２））の血漿濃度を、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡ（配列番号２）をコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））を含むｒＡＡＶの注射の前（「Ｐｒｅ」）、ならびに注射の２、３および４週間後に、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって測定した。図７Ａおよび７Ｂは、対照（ＰＢＳ）を注射した場合のレベル（「ＣＯＮＴ」）と比較した、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡ（配列番号２）をコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））を含むｒＡＡＶによる処置後の、低形質ＰＡマウスモデルＰｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）におけるプロピオン酸血症の公知のバイオマーカーの血漿濃度を示す折れ線グラフである。
図７Ａは、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡ（配列番号２）をコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））を含むｒＡＡＶによる処置後の、低形質ＰＡマウスモデルＰｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）における、２－メチルシトレート（２ＭＣ）の血漿濃度を示す折れ線グラフである。図７Ｂは、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡ（配列番号２）をコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））を含むｒＡＡＶによる処置後の、低形質ＰＡマウスモデルＰｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）における、血漿Ｃ３／Ｃ２（プロピオニルカルニチン／アシルカルニチン）濃度比を示す折れ線グラフである。図７Ａおよび図７Ｂ中の用語「Ｐｒｅ」は、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡ（配列番号２）をコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））を含むｒＡＡＶ、またはＰＢＳ（「ＣＯＮＴ」）の注射の２週間前の、それぞれ、２ＭＣ値およびＣ３／Ｃ２値を示す。エラーバーは、標準誤差を示す。＊は、ダネット検定を使用してＰＢＳ処置群との比較でＰ＜０．０５を示す。
配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡ（配列番号２）をコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））を含むｒＡＡＶで処置したマウスは、ＰＢＳ処置（「ＣＯＮＴ」）のものと比較して、血漿２ＭＣおよびＣ３／Ｃ２レベルにおける統計的に有意な低減を示した。
注射の４週間後、肝臓をホモジナイズし、ヒトＰＣＣＡタンパク質をＬＣ－ＭＳによって測定した。図８Ａおよび８Ｂは、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含む、ＰＣＣＡ（配列番号２）をコードする導入遺伝子カセット（ＤＴＣ４３０（配列番号３０））を含むｒＡＡＶによる処置後の、低形質ＰＡマウスモデルＰｃｃａ－／－（Ａ１３８Ｔ）において発現されたヒトＰＣＣＡタンパク質の濃度（ｎｍｏｌ／ｇタンパク質で）を示す棒グラフである。列挙されたパーセンテージ数は、非ＰＡヒト肝臓（Ｈｕｍａｎ Ｌｉｖｅｒ Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ、Ｈ０６１０．Ｈ、ＸｅｎｏＴｅｃｈ）におけるヒトＰＣＣＡタンパク質レベルのものに対するパーセンテージとして計算したヒトＰＣＣＡ発現を示す。エラーバーは、標準誤差を示す。図８Ａに示されるように、５×１０１１、１×１０１２、２×１０１２または４×１０１２ＶＧ／ｋｇの、ＰＣＣＡ（配列番号２）（例えば、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０））をコードするｒＡＡＶ８を注射したマウスは、非ＰＡヒト肝臓におけるヒトＰＣＣＡタンパク質レベルと比較して、それぞれ、３６％、７７％、１２７％および２２６％のヒトＰＣＣＡレベルを発現した。図８Ｂに示されるように、３×１０１１、１×１０１２または３×１０１２ＶＧ／ｋｇ（それぞれ、３Ｅ１１、１Ｅ１２または３Ｅ１２）の、ＰＣＣＡ（配列番号２）（例えば、配列番号１のＩＶＳ２イントロン配列を含むＤＴＣ４３０（配列番号３０））をコードするｒＡＡＶ９を注射したマウスは、非ＰＡヒト肝臓におけるヒトＰＣＣＡタンパク質レベルと比較して、それぞれ、４．２％、２３％または４９％のヒトＰＣＣＡレベルを発現した。これらのデータは、ｒＡＡＶ媒介性ＰＣＣＡ遺伝子送達が、低形質ＰＡマウスモデルにおいて、実質的に上昇したレベルのＰＣＣＡを生じたことを実証した。
参照による組込み
本明細書で言及される特許文献および科学論文の各々の全開示は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及される特許文献および科学論文の各々の全開示は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
均等物
本開示は、その精神からも本質的な特徴からも逸脱することなしに、他の具体的な形態で具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、本明細書に記載される開示を限定するのではなく、あらゆる点において例示的であるとみなされる。異なる実施形態の種々の構造的要素、および種々の開示された方法ステップは、種々の組合せおよび並べ替えで利用され得、全てのかかる異形は、本開示の形態とみなされる。したがって、本開示の範囲は、上述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲内に入る全ての変化がその中に包含されることが意図される。
本開示は、その精神からも本質的な特徴からも逸脱することなしに、他の具体的な形態で具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、本明細書に記載される開示を限定するのではなく、あらゆる点において例示的であるとみなされる。異なる実施形態の種々の構造的要素、および種々の開示された方法ステップは、種々の組合せおよび並べ替えで利用され得、全てのかかる異形は、本開示の形態とみなされる。したがって、本開示の範囲は、上述の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲内に入る全ての変化がその中に包含されることが意図される。
Claims (51)
- ＡＡＶカプシドおよびその中にパッケージングされたベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ベクターゲノムが、
（ａ）プロモーター配列；
（ｂ）配列番号１と少なくとも９０％同一なイントロン配列；および
（ｃ）ＰＣＣＡまたはＰＣＣＢの部分的または完全なコード配列
を含む、ｒＡＡＶ。 - 前記ＡＡＶカプシドが、血清型８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、ｒｈ１０またはｈｕ３７のＡＡＶ由来である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ８由来である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ９由来である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ８バリアントカプシドである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ９バリアントカプシドである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記イントロン配列が、配列番号１を含む、請求項１から６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記イントロン配列が、配列番号１からなる、請求項１から６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記プロモーターが、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、アルファ－１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＰＣＣＡ遺伝子特異的内因性プロモーターおよびＰＣＣＢ遺伝子特異的内因性プロモーターから選択される、請求項１から８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記プロモーターがＣＢＡプロモーターである、請求項９に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＣＢＡプロモーターが、配列番号２１を含む、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＣＢＡプロモーターが、配列番号２１からなる、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ベクターゲノムが、５’－ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１から１２のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記ベクターゲノムが、３’－ＩＴＲ配列をさらに含む、請求項１から１３のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２由来である、請求項１３から１４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記５’－ＩＴＲ配列および前記３’－ＩＴＲ配列が各々、配列番号１８を含むまたはそれからなる、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記５’－ＩＴＲ配列および／または前記３’－ＩＴＲ配列が、非ＡＡＶ２供給源由来である、請求項１３から１４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記ベクターゲノムが、１つまたは複数のエンハンサー配列をさらに含む、請求項１から１７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記エンハンサーが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子エンハンサー、トランスサイレチンエンハンサー（ｅｎＴＴＲ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）エンハンサー、Ｅｎ３４エンハンサーおよびアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）エンハンサーから選択される、請求項１８に記載のｒＡＡＶ。
- 前記エンハンサーが、ＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサーである、請求項１９に記載のｒＡＡＶ。
- 前記エンハンサーが、配列番号２２を含む、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。
- 前記エンハンサーが、配列番号２２からなる、請求項２０に記載のｒＡＡＶ。
- 前記エンハンサーが、前記プロモーター配列の上流に位置する、請求項１８から２２に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ベクターゲノムが、ポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、請求項１から２３のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- 前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル配列およびウサギベータグロビンポリアデニル化シグナル配列から選択される、請求項２４に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ポリアデニル化シグナル配列が、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列である、請求項２５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２３を含む、請求項２６に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列が、配列番号２３からなる、請求項２６に記載のｒＡＡＶ。
- ＰＣＣＡの前記部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、請求項１から２８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- ＰＣＣＡの前記コード配列が、配列番号２を含む、請求項２９に記載のｒＡＡＶ。
- ＰＣＣＡの前記部分的または完全なコード配列が、コドン最適化されたコード配列である、請求項１から２８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- ＰＣＣＡの前記コード配列が、配列番号３～７から選択されるコード配列を含む、請求項３１に記載のｒＡＡＶ。
- ＰＣＣＢの前記部分的または完全なコード配列が、野生型コード配列である、請求項１から２８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- ＰＣＣＢの前記コード配列が、配列番号８を含む、請求項３３に記載のｒＡＡＶ。
- ＰＣＣＢの前記部分的または完全なコード配列が、コドン最適化されたコード配列である、請求項１から２８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
- ＰＣＣＢの前記コード配列が、配列番号９～１３から選択されるコード配列を含む、請求項３５に記載のｒＡＡＶ。
- 先行する請求項のいずれかに記載のｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
- ヒト対象におけるプロピオン酸血症（ＰＡ）を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１から３６のいずれかに記載のｒＡＡＶまたは請求項３７に記載の医薬組成物を、前記ヒト対象に投与するステップを含む、方法。
- 前記ｒＡＡＶまたは前記医薬組成物が、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内または静脈内投与される、請求項３８に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶまたは前記医薬組成物が、静脈内投与される、請求項３９に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、約１×１０１１～約１×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの用量で投与される、請求項３８から４０のいずれかに記載の方法。
- 配列番号３０と少なくとも９０％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号３０と少なくとも９５％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号３０と少なくとも９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号３０を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号３０からなるポリヌクレオチド。
- 配列番号３１と少なくとも９０％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号３１と少なくとも９５％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号３１と少なくとも９９％同一な核酸配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号３１を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号３１からなるポリヌクレオチド。
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