JP7467356B2 - ハイブリッド調節要素 - Google Patents
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Description
(i)第1の組織内で組織選択的発現を駆動又は増強することができる第1の転写調節要素と;
(ii)第2の組織内で組織選択的発現を駆動又は増強することができる第2の転写調節要素と
を含み、
第1の転写調節要素及び第2の転写調節要素は、互いに融合しており;
第1の転写調節要素及び第2の転写調節要素の少なくとも1つは、組織選択的プロモーターである、核酸配列に関する。
(i)ApoEエンハンサー及びhAATプロモーターの組合せ、そして(ii)は、spC5.12プロモーターであり;又は
(i)ApoEエンハンサー及びhAATプロモーターの組合せ、そして(ii)は、Synプロモーターであり;又は
(i)ApoEエンハンサー、そして(ii)は、spC5.12プロモーターである。
リソソーム蓄積症(LSD)、例えば、ムコ多糖症I~VII型(MPSI-VII)、サンドホフ病、及びテイ・サックス病;
代謝性疾患、例えば、メープルシロップ病(MSUD)、メチルマロン酸血症(MMA)、糖原病I型及びIII型、(GSDI及びIII)、ニーマン・ピック病(NPC)、カナバン病、フェニルケトン尿症(PKU);
神経筋障害、例えば、筋ジストロフィー(例えば、筋強直性ジストロフィー(シュタイナート病)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼球咽頭筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュシュ筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患(例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性筋萎縮症(乳児進行性脊髄性筋萎縮症(1型、ウェルドニッヒ・ホフマン病)、中間型脊髄性筋萎縮症(2型)、若年性脊髄性筋萎縮症(3型、クーゲルベルグ・ウェランダー病)、成人脊髄性筋萎縮症(4型))、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病))、炎症性筋疾患(例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎)、神経筋接合部の疾患(例えば、重症性筋無力症、ランバート・イートン(筋無力症)症候群、先天性筋無力症症候群)、末梢神経の疾患(例えば、シャルコー・マリー・ツース病、フリートライヒ運動失調症、デジュリーヌ・ソッタ病)、筋肉の代謝性疾患(例えば、ホスホリラーゼ欠損症(マッカードル病)、酸性マルターゼ欠損症(ポンぺ病)、ホスホフルクトキナーゼ欠損症(垂井病)、脱分枝酵素欠損症(コリ病又はフォーブズ病)、ミトコンドリア性筋障害、カルニチン欠損症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症)、内分泌異常に起因する筋疾患(例えば、甲状腺機能亢進筋疾患、甲状腺機能低下筋疾患)、及び他の筋疾患(例えば、先天性筋緊張症、先天性筋緊張症、セントラルコア病、ネマリン筋疾患、筋細管筋疾患、周期性四肢麻痺);並びに
他の疾患、例えば、血友病A、MPSI、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、トゥーレット症候群、精神分裂病、スライ病、ハンター病、痴呆、パラノイア、強迫性障害、学習障害、ALS、シャルコー・マリー・トゥース病、ケネディ病、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、自閉症、ゴーシェ病、ハーラー病、クラッベ病、及び変容行動(例えば、睡眠障害、知覚障害、又は認知障害)
からなる群において選択される。
リソソーム蓄積症(LSD)、例えば、ムコ多糖症I~VII型(MPSI-VII)、サンドホフ病、及びテイ・サックス病;
代謝性疾患、例えば、メープルシロップ病(MSUD)、メチルマロン酸血症(MMA)、糖原病I型及びIII型、(GSDI及びIII)、ニーマン・ピック病(NPC)、カナバン病、フェニルケトン尿症(PKU);
神経筋障害、例えば、筋ジストロフィー(例えば、筋強直性ジストロフィー(シュタイナート病)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼球咽頭筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュシュ筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患(例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性筋萎縮症(乳児進行性脊髄性筋萎縮症(1型、ウェルドニッヒ・ホフマン病)、中間型脊髄性筋萎縮症(2型)、若年性脊髄性筋萎縮症(3型、クーゲルベルグ・ウェランダー病)、成人脊髄性筋萎縮症(4型))、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病))、炎症性筋疾患(例えば、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎)、神経筋接合部の疾患(例えば、重症性筋無力症、ランバート・イートン(筋無力症)症候群、先天性筋無力症症候群)、末梢神経の疾患(例えば、シャルコー・マリー・ツース病、フリートライヒ運動失調症、デジュリーヌ・ソッタ病)
からなる群において選択されてもよい。
本発明の文脈において、「転写調節要素」は、組織又は細胞内で導入遺伝子発現を駆動又は増強することができるDNA配列である。本発明の文脈において、転写調節要素は、組織選択的プロモーター及び組織選択的エンハンサーから選択される。特定の実施形態において、転写調節要素は、組織選択的遺伝子又は組織特異的遺伝子の組織選択的プロモーター及び組織選択的エンハンサーから選択される。
本発明者らは、遺伝子治療効力を増大させるための、本明細書中で「ハイブリッド転写調節要素」とも呼ばれる、新規の多組織選択的転写調節要素を設計した。特に、新規の多組織選択的転写調節要素は、異なる組織選択的エンハンサー及び/又は組織選択的プロモーターを組み合わせてもよい。
(i)- 肝臓選択的プロモーター;及び
- 肝臓とは異なる組織選択性を有する他のあらゆる転写調節要素;又は
(ii)- 肝臓選択的プロモーター;及び
- 筋肉選択的転写調節要素、例えば筋肉選択的プロモーター;又は
(iii)- 肝臓選択的プロモーター;及び
- ニューロン選択的転写調節要素、例えばニューロン選択的プロモーター;又は
(iv)- 肝臓選択的プロモーター;
- 筋肉選択的転写調節要素、例えば筋肉選択的プロモーター;及び
- ニューロン選択的転写調節要素、例えばニューロン選択的プロモーター;又は
(v)- 肝臓選択的プロモーター;
- ニューロン選択的転写調節要素、例えばニューロン選択的プロモーター;及び
- 筋肉選択的転写調節要素、例えば筋肉選択的プロモーター
を含んでもよい。
- 肝臓選択的転写調節要素;並びに
- 筋肉選択的転写調節要素及び/又はニューロン選択的転写調節要素、特に筋肉選択的転写調節要素又はニューロン選択的転写調節要素
を含む。
- ApoEエンハンサー;及び
- spC5.12プロモーター
を含む。
- 免疫寛容原性組織中への導入遺伝子の発現を駆動/増強することができる転写調節要素、特にプロモーター;並びに
- 筋肉選択的転写調節要素及び/又はニューロン選択的転写調節要素、特にプロモーター、更に筋肉選択的プロモーター又はニューロン選択的プロモーター
を含む。
- 肝臓選択的プロモーター;並びに
- 筋肉選択的プロモーター及び/又はニューロン選択的プロモーター、特に筋肉選択的プロモーター又はニューロン選択的プロモーター
を含む。
- hAATプロモーター;及び
- spC5.12プロモーター
を含む。
- ApoEエンハンサー/hAATプロモーター;及び
- spC5.12プロモーター
を含む。
- hAATプロモーター;及び
- Synプロモーター
を含む。
- ApoEエンハンサー;及び
- Synプロモーター
を含む。
- ApoEエンハンサー/hAATプロモーター;及び
- Synプロモーター
を含む。
- hAATプロモーター;
- spC5.12プロモーター;及び
- Synプロモーター
を含む。
- hAATプロモーター;
- Synプロモーター;及び
- spC5.12プロモーター
を含む。
- ApoEエンハンサー/hAATプロモーター;
- spC5.12プロモーター;及び
- Synプロモーター
を含む。
- ApoEエンハンサー/hAATプロモーター;
- Synプロモーター;及び
- spC5.12プロモーター
を含む。
- spC5.12プロモーター;及び
- Synプロモーター
を含む。
- MHCK7プロモーター;及び
- Synプロモーター
を含む。
- CKプロモーター;及び
- Synプロモーター
を含む。
本発明の核酸配列は、注目する組織中への注目する導入遺伝子の発現を実現するように設計された発現カセット中に導入されてもよい。
- 本発明の核酸配列;
- 注目する導入遺伝子;及び
- ポリアデニル化シグナル
を含む。
- 本発明の核酸配列;
- イントロン、例えばHBB2又はSV40イントロン;
- 注目する導入遺伝子;及び
- ポリアデニル化シグナル
を含む。
本発明の発現カセットは、ベクター中に導入されてもよい。ゆえに、本発明はまた、上述の発現カセットを含むベクターに関する。本発明に用いられるベクターは、RNA/タンパク質発現に適した、特に遺伝子治療に適したベクターである。
本発明の核酸配列内に含まれる多選択的転写調節要素のおかげで、注目する導入遺伝子は、遍在性プロモーターによって高まる懸念を誘発することなく、複数の組織内で発現され得る。特に、本発明の核酸配列は、より遺伝毒性でない発現カセットを作製するのに用いられ得る。特に、本発明の核酸配列は、オンコジーンの不所望のアップレギュレーションを有利に回避し得る。
調節要素、及びニューロン選択的転写調節要素を含む。
前記切断型GAAポリペプチドは、1~75個の連続アミノ酸が、そのN末端にて、親GAAポリペプチドと比較して欠失しており、そして
前記切断型GAAポリペプチドは更に、そのN末端に融合するシグナルペプチドを含む。
GAA発現カセット及びAAVベクター
本研究で用いたGAA導入遺伝子発現カセットは、コドン最適化ヒトGAA(hGAA)コード配列を含有した[Puzzo及びColellaら、Sci Transl Med.2017年11月29日;9(418頁)]。コドン最適化を、市販のアルゴリズム(Thermo Fisher Scientific社)を用いて実行した[Puzzo及びColellaら、Sci Transl Med.2017年11月29日;9(418頁)]。用いたhGAA導入遺伝子は、2つである:1.天然のhGAAタンパク質(hGAA)をコードするhGAA;又は2.操作された高度に分泌可能なGAAをコードし、プロペプチド内に異種シグナルペプチド、及び8つのアミノ酸の欠失を有するsec-hGAA(sp7-Δ8-hGAAco、本文中でsec-hGAAと略記)[Puzzo及びColellaら、Sci Transl Med.2017年11月29日;9(418頁)]。導入遺伝子配列を、アポリポタンパク質E(肝細胞制御領域エンハンサー)及びヒトアルファ1-アンチトリプシン(hAAT)プロモーター、SPc5.12プロモーター、又はCMVエンハンサー/ニワトリβ-アクチンプロモーター(GAG)プロモーターの転写制御下のAAVベクター骨格中にクローニングした。本研究に用いたDNA配列は全て、GeneCust社又はThermo Fisher Scientific社のいずれかによって合成された。
ヒト肝癌細胞(HuH7)、マウス筋芽細胞C2細胞(C2)、及びマウスNSC34細胞に、6ウェルプレート内に播種して(5×105細胞/ウェル)、Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific社)を用いて、メーカーの指示に従って形質移入を行った。形質移入の72時間後に、細胞及び馴化培地を収穫して、GAA活性についてウエスタンブロット分析で分析した。ヒト骨格筋筋芽細胞(CSC-C3196、Creative Bioarray社)を、コラーゲンコーティングした12ウェルプレート上に播種して、OPTIMEM培地(Thermo Fisher Scientific社)中で2時間、2×105vg/細胞の感染多重度(MOI)にて、AAV9-hGAAベクター又はAAV9-EGFPベクターに感染させた。感染の後、細胞を、10%胎仔ウシ血清及びヒト線維芽細胞増殖因子-2(FGF-2、Miltenyi Biotec社)を補充したCreative Biorray SuperCult(登録商標)Skeletal Muscle Cell Growth Medium Kit(Creative Biorray社)内で維持した。感染を48時間毎に2回繰り返した;細胞を、第2の感染の48時間後に収穫した。
野生型C57BL/6マウスを、Charles River社(Charles River、仏国)から購入した。Gaa-/-マウスを、エキソン6の標的破壊によって作出した(Raben N.ら、J Biol Chem.1998年7月24日;273(30):19086~92頁)。C57BL/6J/129X1/SvJバックグラウンド(図5、6、8、9、10、11、12、13、16、17、18)又はDBA/2J C57バックグラウンド(図7、8、14、15)のGaa-/-マウスを用いた。雄同腹仔の罹患Gaa-/-マウス及び非罹患Gaa+/+マウスを用いた。AAVベクターを:1.0.2mlの容量で尾部静脈を介して、成体マウス;2.0.03ml.の容量で側頭静脈を介して、生後1~2日目の新生仔マウスに送達した。実験群は、統計分析を可能にする大きさに設定した;全ての動物を分析に含めて、いずれの外れ値も除外しなかった。マウスを実験群にランダムに割り当てて、ベクター送達及び機能分析を実行するオペレータを、群識別に対して盲目にした。免疫化-根絶研究(immunization-eradication study)のために、14頭のマウスを、合計3投与について2週毎に20mg/kgの用量でのrhGAAの静脈内注射によって処置した。以前に記載されるように、25mg/kgの抗ヒスタミン剤(塩酸ジフェンヒドラミン)の腹腔内投与の15分後に、各rhGAA点滴を実行した。最後のrhGAA投与の2週後に、抗hGAA IgGを測定した。免疫化Gaa-/-マウス(n=8)を、3つのAAV9-処置群(2×1012vg/kg;AAV-Ctrl n=2、AAV-hAAT n=3、AAV-LiMP n=3)に割り当てた。
GAA活性を、マウス血漿(1/1000~1/2000希釈)及び組織において測定した。急速凍結した組織を、di UltraPure(商標)DNase/RNase-Free Distilled Water(Thermo Fisher Scientific社)中でホモジナイズした。50~100mgの組織を秤量してホモジナイズしてから、10000×gにて20分間遠心分離して、上清を収集した。10μlのサンプル(血漿又は組織ホモジェネート)及び20μlの基質4MUα-D-グルコシドを96ウェルプレート内で用いて、酵素反応をセットアップした。反応混合液を37℃にて1時間インキュベートしてから、150μlの炭酸ナトリウムバッファpH10.5を加えて止めた。標準曲線(0~2500pmol/4MUμl)を用いて、個々の反応混合液から放出された蛍光4MUを、EnSpireアルファプレートリーダー(Perkin-Elmer社)を用いて449nm(放出)及び360nm(励起)にて測定した。清澄にした上清のタンパク質濃度を、BCA(Thermo Fisher Scientific社)によって定量化した。GAA活性を算出するために、放出された4MU濃度を、サンプルタンパク質濃度で割って、活性をnmol/時/タンパク質mgとして報告した。
DNAを組織ホモジェネートから、Nucleospin 8(Macherey-Nagel社、仏国)を用いて抽出して、定量化した。ベクターゲノムコピー数を、100ngのDNA、コドン最適化hGAA上にアニールするプライマー及びプローブ(Fw:agatacgccggacattggactg(配列番号10);Rev:gcacgcccagcagattgaac(配列番号11);プローブgtgtggtcctcttgggagc(配列番号12))を用いてqPCRによって決定した。以前に記載されるように[Puzzo及びColellaら、Sci Transl Med.2017年11月29日;9(418頁)]、Sybergreen系又はTaqman系のいずれかを用いた。VGCNを、qPCRに用いたDNAのマイクログラムによって標準化した。二倍体ゲノムあたりのVGCNを定量化するために、DNAを、Gentra Puregene Tissueキット(Qiagen社)を用いて組織ホモジェネートから抽出して、定量化した。
急速凍結した組織を秤量して、50~100mgを、Trizol試薬(Thermo Fisher Scientific社)中でホモジナイズした。PureLink DNaseセットによるPureLink RNAミニキット(Thermo Fisher Scientific社)を用いて、総RNAを組織ホモジェネートから抽出した。RNAを定量化して、2~5μgを、dsDNaseによるRT-qPCR用のMaxima First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific社)を用いてcDNAにレトロ転写した;RT-マイナス反応を、陰性対照として実行した。hGAA RNA発現について、Sybergreen、及びコドン最適化hGAAにアニールするプライマー(Fw:agatacgccggacattggactg(配列番号10);Rev:gcacgcccagcagattgaac(配列番号11)を用いて、cDNAのqPCR分析を実行した;マウスActin遺伝子にアニールするプライマーを用いて、hGAA発現を標準化した(mActin Fw:ggctgtattcccctccatcg(配列番号22);mActin Rev:ccagttggtaacaatgccatgt(配列番号23));マウスActin及びbeta-2 microglobulin(B2m;B2mフォワード:5'-ggtctttctggtgcttgtctca-3';B2mリバース:5'-gttcggcttcccattctcc-3')を用いて、図17に示すデータについて、hGAA発現を標準化した。Rtl1発現分析について、Chandler及び共著者ら(Chandlerら、JCI、2015年2月;125(2):870~80頁)によって以前に報告されたTaqMan法、市販のプローブ及びプライマー、並びにMaxima ROX qPCR Master Mix(Thermo Scientific社)を用いて、cDNAのqPCRを実行した。TaqMan遺伝子発現アッセイ(#4331182、Thermo Scientific社)は、以下の通りであった:Rtl1(Mm02392620_s1;Gapdh(Mm、99999915_g1)。
1%のTriton-X100及びプロテアーゼインヒビタ(Roche Diagnosis社)を含有する10mM PBS(pH7.4)を用いて、HuH7、C2、及びNSC34の細胞溶解液を調製した。マウス血漿のウエスタンブロットを、サンプル(蒸留水中に1:4に希釈した)に実行した。マウス組織を、GAA活性について示すように調製した。BCA Protein Assay(Thermo Fisher Scientific社)を用いて、タンパク質濃度を決定した。SDS-PAGE電気泳動を、4~15%勾配のポリアクリルアミドゲルで実行した。SDS-PAGE電気泳動を、4~15%勾配のポリアクリルアミドゲルで実行した。転写後、膜を、Odysseyバッファ(Li-Cor Biosciences社)でブロックして、抗GAA抗体(マウスモノクローナル、SantaCruz Biotechnology社、又はウサギモノクローナル、Abcam社)、抗eGFP(マウスモノクローナル、Santa Cruz社)又は抗チューブリン(マウスモノクローナル、Sigma Aldrich社);抗p62(マウスモノクローナル、Abcam社);抗Parkin(ウサギポリクローナル、Abcam社);Gapdh(ウサギポリクローナル、Thermo Fisher Scientific社)とインキュベートした。膜を洗浄して、適切な第2の抗体(Li-Cor Biosciences社)とインキュベートして、Odyssey画像化システム(Li-Cor Biosciences社)によって視覚化した。
抗GAA抗体測定を、公開されているプロトコルに従って実行した。手短に言うと、maxisorp 96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific社)を、1μg/mlのrhGAAでコーティングした。市販のマウス(Sigma Aldrich社)組換えIgGの連続1~2希釈(ウェル上に繰り返して直接コーティングした)によって、IgG標準曲線を作成した。抗マウス(Southern biotech社)IgG二次抗体を、第2の抗体として用いた。
グリップ強度を、既に報告されているように測定した。グリップ強度メーター(Columbus instruments社)を用いて、4つの四肢強度の3つの独立した測定値を算出した。グリップ強度/マウスの平均値を算出した。
1.AAVプラスミド内の多組織プロモーターのクローニング
発明者らは、文献から、基本的な単組織転写調節要素を選択して、多組織プロモーターを生成する可能性を評価した。
筋肉について、発明者らは、合成spC5.12筋肉選択的プロモーター(配列番号1)を選択した。
ニューロンについて、発明者らは、パン-ニューロンヒトシナプシン(hSYN)プロモーター(配列番号3)を選択した。
このプロモーターは、合成spC.12筋肉選択的プロモーターの上流に、ApoE肝細胞制御領域/エンハンサーをクローニングすることによって生成した。
このプロモーターは、合成spC5.12筋肉選択的プロモーターの上流に、ApoE肝細胞制御領域及びhAATプロモーターをクローニングすることによって生成した。
このプロモーターは、hSYNプロモーターの上流に、ApoE肝細胞制御領域及びhAATプロモーターをクローニングすることによって生成した。
最初に、発明者らは、基本的な単組織プロモーターと比較して、細胞株内の多組織プロモーターをインビトロで試験した(図2~図3)。GAA導入遺伝子の高度に分泌可能なバージョンを、モデル治療遺伝子として用いた[Puzzo及びColellaら、Sci Transl Med.2017年11月29日;9(418頁)]。
Enh.C5.12、LiMP、及びLiNeuPプロモーターの組織選択性及び免疫寛容原性特性をインビボで評価するために、発明者らは、AAVベクターを作製して、C57Bl/6マウスモデル内で、そしてポンペ病のマウスモデル内で、遺伝子移入を実行した。
設計通りに異なる組織において発現を駆動する、新たに生成したEnh.C5.12、LiMP、及びLiNeuPプロモーターの能力を評価するために、発明者らは、動物モデルへの静脈内投与の直ぐ後に肝臓、筋肉、及びニューロンに感染することができる血清型9のAAVベクターを生成した。発明者らは、導入遺伝子として、最適化された完全長GAAコドンである天然ヒトGAA(hGAA)を用いた。本研究において、発明者らは、遍在性CAGプロモーターである単組織プロモーター(hAAT、C5.12、及びhSYN)、及び発明者らの多組織プロモーター(Enh.C5.12、LiMP、及びLiNeuP、Table 2(表2))の双方を比較した。本研究は、循環系にhGAAを、そして所望の組織(肝臓、心臓、四頭筋、脊髄、及び脳)内での全プロモーターの活性を提供するこれらのプロモーターの能力についてのデータを提供する。
本研究において、発明者らは、肝臓及び筋肉の単組織プロモーター(hAAT及びC5.12)を、天然の(hGAA)、そして高度に分泌可能な(sec-hGAA)GAAタンパク質の双方の発現を駆動する発明者らの多組織肝臓+筋肉プロモーター(Enh.C5.12、LiMP)と比較した(Table 3(表3))。Gaa-/-マウスを用いて、ポンペ病態生理学をモデル化する。発明者ら及び他者らは以前に、Gaa-/-筋肉内の天然のGAAの発現が、当該タンパク質に対する強い体液性免疫応答を誘導することを報告した[Puzzo及びColellaら、Sci Transl Med.2017年11月29日;9(418頁)]、Zhang.ら、Hum Gene Ther.2012年5月;23(5):460~72頁)。次に、発明者らは最近、高度に分泌可能なGAAタンパク質が、天然のものよりも免疫原性でないことを示した[Puzzo及びColellaら、Sci Transl Med.2017年11月29日;9(418頁)]。したがって、本研究は、天然の形態、及び高度に分泌可能なGAA形態を用いてそれぞれ提供される高い免疫原性及び低い免疫原性の文脈での、新たに開発したハイブリッド肝臓-筋肉プロモーター(Enh.C5.12及びLiMP)の免疫寛容原性特性についてのデータを提供する。また、治療的な目的のために循環系内にGAAを提供するプロモーターの能力を評価した。発明者らが、天然の免疫原性GAAタンパク質(hGAA)を発現するAAVをGaa-/-マウスに送達した場合、発明者らは、筋肉において大部分発現されることとなる、研究Iにおいて示すプロモーター、C5.12及びEnh.C5.12(図4B)によって駆動されるGAA発現が、タンパク質に対する体液性免疫応答をもたらすことを観察した(図5A)。特に、ハイブリッド肝臓-筋肉LiMPプロモーターの使用は、抗hGAA免疫応答の誘導を有意に妨げた(図5A)。これらのデータは、LiMPによって提供される強いGAA肝臓発現(研究Iにおいて報告した、図4B)が、hGAAに対する免疫寛容を誘導したことを証明している(図5A)。マウス血漿におけるGAA酵素活性は、ハイブリッドEnh.C5.12及びLiMPプロモーターが、C5.12と比較して、治療的な目的のために循環系により高いGAAタンパク質レベルをもたらすことを確認した(図5B)。
発明者らの以前のデータ(図2~図5)に基づいて、本研究において、発明者らは、Gaa-/-マウスの全身疾患表現型をレスキューするための最良の実行免疫寛容原性多組織プロモーター(LiMP及びLiNeuP)を用いる利点を試験した。特に、発明者らは、高度に分泌可能なGAAタンパク質(sp7-Δ8-co、sec-hGAAと呼ぶ)を、肝臓選択的hAATプロモーター、肝臓-筋肉LiMPプロモーター、及び肝臓-ニューロンLiNeuPプロモーターの制御下で発現するAAVベクターの治療効力を評価した(Table 4(表4))。遍在性CAGプロモーターの制御下でsec-hGAAを発現するAAVベクターを対照として用いた。ポンペ病の文脈では、肝臓から循環系中に分泌可能なGAAの発現により、タンパク質吸収による他の組織の標的化が可能となろう。しかしながら、GAA吸収が、骨格筋及びニューロン内で:1.細胞表面上のGAA受容体の低いレベル、及び2.リソソームへのGAA標的化を弱める自食作用ブロックによって制限され;その後、血液-脳関門によって課されるサイズ制限が、CNSへのGAAバイオ分配を大きく制限する。
本研究において、発明者らは、肝臓-筋肉免疫寛容原性多組織プロモーターLiMPを用いて、肝臓からのAAVゲノム及び治療効力の希釈に至り得る肝細胞増殖の条件において、持続性のGAA発現及び治療効力が達成され得るかを判定する利点を試験した[Wangら、Hum Gene Ther.2012年5月;23(5):533~9頁]。この目的のために、発明者らは、Gaa-/-マウスにAAVベクターを注射して、初期の出生後のステージ中のポンペ対象の処置を模倣した。出生後1ヶ月における治療介入が、重要なことに、疾患の乳児形態を示すPD対象[乳児型PD(IOPD)]では医学的に必要とされる[Chienら、Pediatr Neonatol.2013年8月;54(4):219~27頁]。特に、PDについての新生児スクリーニングは、多く国々で承認されており、適時の治療介入を促進し得る。特に、ここでは、発明者らは、肝臓及び筋肉の双方においてGAA発現を提供し(研究Iにおいて観察される、図4B)、且つ循環系に治療酵素を提供する(研究I、図4A)LiMPプロモーター(Table 5(表5))と比較して、単組織プロモーター[筋肉(C5.12)及び肝臓(hAAT)]から高度に分泌可能なGAAタンパク質(sp7-Δ8-co、sec-hGAAと呼ぶ)を発現する利点を評価した。
次に、発明者らは、新生Gaa-/-マウスにおけるLiMP-sec-hGAAベクターによるAAV遺伝子治療が、低ベクター用量にて[1.2×1010vg/pup(6×1012vg/kg);図13]治療効力をもたらすことができるかを判断した。研究の終わり(処置の4ヶ月後)に、血流中の酵素量は、LiMP及びhAATベクターで処置したGaa-/-マウスにおいて、異ならなかった(図13A~図13B)。また、肝臓内でのhGAA RNA発現の分析は、LiMP及びhAATプロモーター間で、有意な差異を示さなかった。その代わりに、GAA活性は、hAATと比較して、LiMPで処置したGaa-/-マウスの心臓(図13C)、横隔膜(図13D)、四頭筋(データ示さず)、及び三頭筋(図13E)において、有意に高かった。また、LiMPプロモーターの使用は、AAV処置Gaa-/-マウスの三頭筋(代表的な筋肉として)及び脊髄(図13F)内で、より高い量のhGAAタンパク質をもたらした。LiMP及びhAATプロモーターを用いた場合、脳hGAA量の差異は見出されなかった(図13G)。
本研究において、発明者らは、新生仔Gaa-/-マウス内での全身性AAV遺伝子移入後の強い遍在性プロモーターとの比較において、肝臓-筋肉LiMP及び肝臓-ニューロンLiNeuPプロモーターを用いた場合の、筋肉に提供されるGAAの量を評価した。この状況において、先で示したように、肝細胞増殖は、肝臓からのAAVゲノム及び治療効力の希釈の原因となる[Wangら、Hum Gene Ther.2012年5月;23(5):533~9頁]。発明者らは、LiMP及びLiNeuPプロモーター(Table 7(表7))と比較して、遍在性プロモーターCAG[CMVエンハンサー/ニワトリベータ-アクチンプロモーター(CAG)プロモーター]から高度に分泌可能なGAAタンパク質(sp7-Δ8-co、sec-hGAAと呼ぶ)をコードするAAVベクターを、Gaa-/-マウスに注射した;単肝臓プロモーターhAATを対照として用いた(Table 7(表7))。
本研究において、発明者らは、全身性AAV遺伝子移入によって新生時に処置したGaa-/-マウスの筋肉において、p62(自食作用ブロックのマーカー)及びParkin(マイトファジーのマーカー)の標準化を評価した。この目的のために、発明者らは、単肝臓プロモーターhAATと比較して、肝臓-筋肉プロモーターLiMPから高度に分泌可能なGAAタンパク質(sp7-Δ8-co、sec-hGAAと呼ぶ)をコードするAAVベクターを、Gaa-/-マウスに注射した。先で報告したデータから予想されるように、新生仔Gaa-/-マウスの処置の4ヶ月後に、GAAタンパク質は、hAATと比較して、LiMPで処置したマウスの三頭筋におけるよりも高かった(図15A~図15B)。次に、p62が、非処置Gaa-/-マウスの三頭筋内で、非罹患Gaa+/+と比較して増大しており、自食作用ブロックを反映している(図15C)。特に、p62含有量を、hAATベクターではなくLiMPで処置したGaa-/-マウスの三頭筋内で標準化した(図15A、図15B)。その代わりに、Parkin量は、非罹患Gaa+/+と比較して、非処置Gaa-/-マウスの三頭筋内で有意に低下し(図15A、図15C)、障害のあるマイトファジーを反映している。特に、通常のParkin含有量は、hAATベクターではなくLiMPベクターによる処置の直ぐ後に、Gaa-/-マウスの三頭筋内で回復した(図15A、図15C)。図15及び図16に示すマウスの肝臓及び三頭筋内のベクターゲノムコピー数(VGCN)の分析は、有意に高いVCGNが肝臓内で見出されたCAGベクターを除いて、有意な差異を示さなかった(図16A~図16B)。
肝臓-筋肉プロモーターLiMP及び肝臓-ニューロンプロモーターLiNeuPの特異性を、非標的組織、例えば、腎臓、肺、及び脾臓において観察される低い活性又は活性の不在によって確認した(図17A~図17B)。肺において、LiMPプロモーターを用いて観察した一部の検出可能なhGAA mRNA発現が、おそらく、平滑筋細胞内でプロモーター活性に由来し得た(図17B)。予想されるように、VGCNは、他の組織と比較して、肝臓内でより高かった(図17C~図17D)。全体として、hGAA mRNA発現データは、ハイブリッドプロモーターLiMP及びLiNeuPが、標的組織内で効率的且つ特異的な導入遺伝子発現を駆動することを示している(図17)。
遍在性プロモーター又は筋肉特異的プロモーターによって駆動されるGaa-/-マウスへの天然のhGAAの遺伝子移入が、hGAAタンパク質に対する不所望の体液性免疫応答を誘導することが報告された[Falkら、Mol Ther Methods Clin Dev.2015年3月25日;2:15007頁;Francoら、Mol Ther.2005年11月;12(5):876~84頁]。逆に、発明者ら[Puzzoら、Sci Transl Med.2017年11月29日;9(418頁)]及び他者ら[Francoら、Mol Ther.2005年11月;12(5):876~84頁]は、肝細胞に対する天然のhGAA導入遺伝子発現の制限が、抗hGAA免疫の発達を妨げて、安定した免疫寛容を導入遺伝子生成物に提供することを示した。本発明のハイブリッド肝臓-筋肉及び肝臓-ニューロンプロモーターの免疫学的特性を評価するために、発明者らは、天然のhGAAをコードするAAV9ベクターを全身的に成体免疫応答性Gaa-/-マウスに送達し(ベクター用量:2×1012vg/kg)、そして抗hGAA体液性免疫応答を評価した(図18)。成体Gaa-/-マウスをこれらの実験に特に用いた。というのも、新生動物が、免疫寛容原性促進性応答をより発達させる傾向があることが報告されてきたからである。処置後の初期の時点にて、高い抗hGAA IgGが、対照CAG及びC5.12ベクターに加えて、Enh.C5.12ベクターで処置したマウスにおいて誘導された(図18A)。逆に、LiMP、LiNeuP、及び対照hAATベクターで処置したマウスにおいて初期の時点にて測定した抗hGAA IgG(図18A)は、低いか不在であり、CAGコホートにおいて測定したものと有意に異なった(図18A)。ハイブリッドプロモーターLiMP及びLiNeuPの使用は、抗hGAA IgGの誘導を長期に妨げた(図18B)。逆に、抗hGAA IgGは、C5.12コホートにおいて、時間と共にピークに達し、他のコホートにおいて測定されるものよりも有意に高いレベルに至った(図18B)。C5.12と比較して、Enh.C5.12で観察される体液性免疫応答の低下は、ApoEエンハンサーを用いて達成される肝臓内の導入遺伝子発現の増大(図4B、肝臓)により、抗GAA免疫を長期に低減することができることを示唆している(図5A、図18)。興味深いことに、これらのデータは、CAG及びEnh.C5.12プロモーターによって決定した肝臓導入遺伝子発現が、抗hGAA体液性免疫応答を妨げないが低減し得ることを示唆している(図18A~図18B)。VGCNは、肝臓形質導入に及ぼすベクターゲノムの大きな影響を示さなかった(図18C)。
肝臓/筋肉プロモーターLiMPの転写活性が更に、ヒト筋芽細胞内でインビトロで確認された(図19)。
本研究において、発明者らは、ハイブリッド調節要素により、AAV遺伝子移入によって媒介される導入遺伝子発現の持続性の制限を克服することができることを示した。特に、発明者らは、LiMPプロモーターによる全身性AAV遺伝子治療が、新生時に処置したGaa-/-マウスにおいて、単組織プロモーター(肝臓特異的、hAAT、又は筋肉特異的、C5.12)と比較して、優れた治療効力をもたらすことを実証した。このモデルにおいて、発明者らは、全身の病理グリコーゲン蓄積のクリアランス、並びに心肥大及び筋力の有意なレスキューを含む疾患表現型の長期の完全なレスキューを観察した。これらの結果は、新生仔動物における他の研究に、そして他の致死的神経筋疾患についての継続中の臨床治験に現在用いられているものよりも10~50倍低いAAVベクター用量を用いて達成された。これらの発見は、このAAV遺伝子治療アプローチの、乳児型ポンペ病への今後の利用を支持する。その有望な安全性及び効力プロファイルに基づいて、デュアルプロモーターは、全身性の多臓器に関与し、且つ初期の致死を伴ういくつかの他の疾患の処置用の遺伝子ベースの治療の開発において、重大な利点を提供し得る。
Claims (18)
- (i)肝臓内で組織選択的発現を駆動又は増強することができる第1の転写調節要素と;
(ii)第2の組織内で組織選択的発現を駆動又は増強することができる第2の転写調節要素と
を含み、
前記第2の転写調節要素が、筋肉選択的プロモーター及びニューロン選択的プロモーターからなる群において選択され、
前記第1の転写調節要素及び前記第2の転写調節要素が、互いに融合しており;
前記第2の転写調節要素が、組織選択的プロモーターである、
核酸(ただし、核酸がデスミンプロモーター又はその機能部分を含む場合を除く)。 - (a)前記第1の転写調節要素が、ApoEエンハンサー、Apo A-Iエンハンサー、アンチトリプシンプロモーター、トランスチレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター、LSPプロモーター、並びにApoEエンハンサーとアンチトリプシンプロモーター、トランスチレチンプロモーター(TTR)、アルブミンプロモーター(Alb)、チロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター、及びLSPプロモーターからなる群において選択される肝臓選択的プロモーターとの組合せからなる群において選択され;
(b)前記第2の転写調節要素が筋肉選択的プロモーターである場合、spC5.12プロモーター、MHCK7プロモーター、E-synプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ(MLC)プロモーター、ミオシン軽鎖(MLC)プロモーター、ミオシン重鎖(MHC)プロモーター、心臓トロポニンCプロモーター、トロポニンIプロモーター、myoD遺伝子ファミリープロモーター、アルファアクチンプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ガンマアクチンプロモーター、Pitx3の眼球形態のイントロン1内に存在する筋肉選択的プロモーター、及びCK6プロモーターからなる群において選択され;且つ
(b)前記第2の転写調節要素がニューロン選択的プロモーターである場合、シナプシン-1(Syn)プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター、ニューロン特異的vgf遺伝子プロモーター、シナプシン-2プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、低親和性NGF受容体プロモーター、コリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)プロモーター、Hb9プロモーター、GFAPプロモーター、カルビンジン2プロモーター、Mnx1プロモーター、ネスチンプロモーター、パルブアルブミンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、及びPlp1プロモーターからなる群において選択される、
請求項1に記載の核酸。 - (a)前記第1の転写調節要素が、アルファ-1アンチトリプシンプロモーター(hAAT)、ApoEエンハンサー、ApoEエンハンサー及びhAATプロモーターの組合せ、トランスチレチンプロモーター、アルブミンプロモーター、チロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーター、並びにLSPプロモーターからなる群において選択され;
(b)前記第2の転写調節要素が筋肉選択的プロモーターである場合、spC5.12プロモーター、MHCK7プロモーター、E-synプロモーター、筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、ミオシン軽鎖(MLC)プロモーター、ミオシン重鎖(MHC)プロモーター、心臓トロポニンCプロモーター、トロポニンIプロモーター、myoD遺伝子ファミリープロモーター、アルファアクチンプロモーター、ベータアクチンプロモーター、ガンマアクチンプロモーター、Pitx3の眼球形態のイントロン1内に存在する筋肉選択的プロモーター、及びCK6プロモーターからなる群において選択され;且つ
(b)前記第2の転写調節要素がニューロン選択的プロモーターである場合、シナプシン-1(Syn)プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター、ニューロン特異的vgf遺伝子プロモーター、シナプシン-2プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、低親和性NGF受容体プロモーター、コリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)プロモーター、Hb9プロモーター、GFAPプロモーター、カルビンジン2プロモーター、Mnx1プロモーター、ネスチンプロモーター、パルブアルブミンプロモーター、ソマトスタチンプロモーター、及びPlp1プロモーターからなる群において選択される、
請求項1又は2に記載の核酸。 - 前記第1の転写調節要素が、アルファ-1アンチトリプシンプロモーター(hAAT)、ApoEエンハンサー、並びにApoEエンハンサー及びhAATプロモーターの組合せからなる群において選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記筋肉選択的プロモーターが、spC5.12及び筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーターからなる群から選択され;又は
前記ニューロン選択的プロモーターが、Synプロモーターである、
請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸。 - (i)が、ApoEエンハンサー及びhAATプロモーターの組合せであり、そして(ii)が、spC5.12プロモーターである;又は
(i)が、ApoEエンハンサー及びhAATプロモーターの組合せであり、そして(ii)が、Synプロモーターである;又は
(i)が、ApoEエンハンサーであり、そして(ii)が、spC5.12プロモーターである、
請求項1から5のいずれか一項に記載の核酸。 - 請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸及び注目する治療導入遺伝子を含む、発現カセット。
- 注目する前記治療導入遺伝子として酸性アルファ-グルコシダーゼ(GAA)を含む、請求項7に記載の発現カセット。
- 請求項7又は8に記載の発現カセットを含むベクターであって、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、又はAAVベクターである、ベクター。
- AAV8カプシド又はAAV9カプシドを含むAAVベクターである、請求項9に記載のベクター。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸、請求項7若しくは8に記載の発現カセット、又は請求項9若しくは10に記載のベクターで形質転換された単離細胞。
- 請求項9若しくは10に記載のベクター又は請求項11に記載の細胞を含む医薬組成物。
- 請求項7若しくは8に記載の発現カセット、請求項9若しくは10に記載のベクター、又は請求項11に記載の細胞を含む医薬。
- 治療的に注目する組織中への治療導入遺伝子の発現による遺伝子治療による障害の処置のための方法における使用のための請求項13に記載の医薬。
- 前記障害が、
リソソーム蓄積症(LSD);
代謝性疾患;及び
神経筋障害
からなる群において選択される、請求項14に記載の医薬。 - 前記障害が、
ムコ多糖症I~VII型(MPSI-VII)、サンドホフ病、及びテイ・サックス病からなる群において選択されるリソソーム蓄積症(LSD);
メープルシロップ病(MSUD)、メチルマロン酸血症(MMA)、糖原病I型及びIII型(GSDI及びIII)、ニーマン・ピック病(NPC)、カナバン病、フェニルケトン尿症(PKU)からなる群において選択される代謝性疾患;
筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー(シュタイナート病)、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、眼球咽頭筋ジストロフィー、遠位筋ジストロフィー、エメリ・ドレフュシュ筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄性筋萎縮症、乳児進行性脊髄性筋萎縮症(1型、ウェルドニッヒ・ホフマン病)、中間型脊髄性筋萎縮症(2型)、若年性脊髄性筋萎縮症(3型、クーゲルベルグ・ウェランダー病)、成人脊髄性筋萎縮症(4型)、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病)、炎症性筋疾患、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎、神経筋接合部の疾患、重症性筋無力症、ランバート・イートン(筋無力症)症候群、先天性筋無力症症候群、末梢神経の疾患、シャルコー・マリー・ツース病、フリートライヒ運動失調症、デジュリーヌ・ソッタ病からなる群において選択される神経筋障害;及び
血友病A、MPSI、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、トゥーレット症候群、精神分裂病、スライ病、ハンター病、痴呆、パラノイア、強迫性障害、学習障害、シャルコー・マリー・ツース病、ケネディ病、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、自閉症、ゴーシェ病、ハーラー病、クラッベ病、睡眠障害、知覚障害、認知障害からなる群において選択される他の疾患
からなる群において選択される、請求項14に記載の医薬。 - 前記障害が、糖原病である、請求項14に記載の医薬。
- 前記糖原病が、ポンペ病である、請求項17に記載の医薬。
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