TW202100541A - 有用於治療龐貝氏病之組成物 - Google Patents

Abstract

提供一種有用於治療第II型肝醣貯積病(龐貝氏病)之重組腺相關病毒(rAAV)。該rAAV包含靶向肌肉、心臟、腎臟、及中樞神經系統之至少一者之細胞之AAV衣殼，且其具有包裝於其中的載體基因體，該載體基因體包含編碼嵌合融合蛋白質之核酸序列，該嵌合融合蛋白質包含在指導其表現之調控序列的控制下的訊息肽及與人類酸性-α-葡萄糖苷酶hGAA780I蛋白質融合的vIGF2胜肽。亦提供製造及使用此rAAV之方法。

Description

有用於治療龐貝氏病之組成物

本發明係關於一種有用於治療第II型肝醣貯積病(龐貝氏病)之重組腺相關病毒(rAAV)；及製造及使用此rAAV之方法。

親神經性病毒，諸如親神經性AAV血清型(例如，AAV9)，已被證實當於新生及幼年動物中高劑量靜脈內投予時，會轉導脊髓α運動神經元。此觀察造成最近成功應用AAV9遞送以治療患有脊髓性肌萎縮症(spinal muscular atrophy)的嬰兒，該症為運動神經元(SMN)蛋白質生存的遺傳缺陷，其特徵在於下運動神經元的選擇性死亡。在一涉及另一種親神經性AAV(AAVhu68)的研究中，觀察到相似的結果，其全身性投予及鞘內(腦脊髓液)投予後，有效轉導背根神經節(dorsal root ganglia)的脊髓運動神經元及感覺神經元(C. Hinderer, et al., Hum Gene Ther. 2018 Mar;29(3):285-298)。然而，DRG神經元的轉導伴隨著對脊髓背道(spinal cord dorsal tracts)中的感覺神經元和繼發性軸突病變(axonopathy)的毒性。於高劑量靜脈內和鞘內遞送AAV載體後，不論是衣殼血清型或轉基因，皆遭遇類似的發現。(See, J. Hordeaux, Molecular Therapy：Methods & Clinical Development Vol. 10, pp. 79-88, September 2018)。

龐貝氏病(Pompe disease)，亦已第II型肝醣病為著稱，為一種胞溶體貯積症(lysosomal storage disease)，係由酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因的突變所引起，導致肝醣蓄積於心臟(心肌病)、肌肉及運動神經元(神經肌肉疾病)中。於典型的嬰幼期龐貝氏病，嚴重GAA活性喪失引起多系統及早發性肝醣貯積，尤其是貯積於心臟及肌肉，且於最初幾年因心肺衰竭而死亡。嬰幼期龐貝氏病亦特徵在於明顯的肝醣貯積於神經元(尤其是運動神經元)及神經膠細胞。目前的照護標準，酶替代療法(enzyme replacement therapy，ERT)，對矯正肌肉具有次優效果，且無法通過血腦屏障，導致典型嬰幼期龐貝氏病長期倖存者的進行性神經學上的惡化。接受ERT的病患，其由於心臟矯正而活得更長，展現出進行性神經學表型(phenotype)的新自然史。此外，重組人類GAA為高度免疫原性的且由於骨骼肌吸收不良，而必須大量投劑。

對於龐貝氏病之治療有數種未滿足的需求，包括需要矯正該疾病的CNS組件、需要改善肌肉矯正、及需要更有效、免疫原性更低及/或更方便之目當ERT的替代方案。

於某些實施方式，提供一種表現匣(expression cassette)，其包含編碼嵌合融合蛋白質之核酸序列，該嵌合融合蛋白質包含訊息肽及與人類酸性-α-葡萄糖苷酶(hGAA)融合的vIGF2胜肽，該人類酸性-α-葡萄糖苷酶至少包含在指導其表現之調控序列的控制下hGAA780I之活性位，其中位置780係基於SEQ ID NO：3中胺基酸位置的編號。於某些實施方式，該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸890(hGAA780I)，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸952，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸123至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸952，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某一實施方式，該表現匣進一步包含miR目標序列之至少兩個串聯重複(tandem repeats)，其中該至少兩個串聯重複至少包含第一miRNA目標序列及至少包含第二miRNA目標序列，其可為相同或不同且可操作地3’連接至編碼融合蛋白質的序列。

於某些實施方式，此處提供的表現匣係由病毒載體攜帶，該病毒載體選自重組小病毒(recombinant parvovirus)、重組慢病毒(recombinant lentivirus)、重組反轉錄病毒(recombinant retrovirus)、及重組腺病毒(recombinant adenovirus)。於某些實施方式，重組小病毒為一演化支F腺相關病毒，可選擇為AAVhu68。於某些實施方式，此處提供的表現匣係由非病毒載體攜帶，該非病毒載體選自裸露的DNA、裸露的RNA、無機粒子、脂質粒子、聚合物系載體、或幾丁聚醣系調配物。

於某些實施方式，此處提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含(a)靶向肌肉、心臟及中樞神經系統之至少一者之細胞的AAV衣殼，及(b)包裝在AAV衣殼中的載體基因體，該載體基因體包含編碼嵌合融合蛋白質之核酸序列，該嵌合融合蛋白質包含訊息肽及與hGAA融合的vIGF2胜肽，該hGAA至少包含在指導其表現之調控序列的控制下hGAA780I之活性位，其中位置780係基於SEQ ID NO：3中胺基酸位置的編號。於某些實施方式，該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸890(hGAA780I)，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸952，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸123至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸952，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，該rAAV載體基因體進一步包含背根神經節(DRG)-特異性miR-183目標序列之至少兩個串聯重複，其中該至少兩個串聯重複包含至少第一miRNA目標序列及至少第二miRNA目標序列，其可為相同或不同且可操作地3’連接至編碼融合蛋白質的序列。

於某些實施方式，提供一組成物，其包含如本文所述之編碼hGAA780I融合蛋白質的表現匣及各醫藥上可接受的載劑、賦形劑及/或懸浮劑之至少一者。

於某些實施方式，此處提供的組成物包括rAAV及各醫藥上可接受的載劑、賦形劑及/或懸浮劑之至少一者，該rAAV包含如本文所述之編碼hGAA780I融合蛋白質的表現匣。

於某些實施方式，提供一種治療具有龐貝氏病的病患之方法及/或於具有α-葡萄糖苷酶(GAA)缺乏的病患中改善心臟、呼吸及/或骨骼肌肉功能之方法。此方法包含遞送至病患如本文所述之表現匣、rAAV、或組成物。該表現匣、rAAV、或組成物可經靜脈內及/或經由鞘內(intrathecal)、腦池內(intracisternal)或腦室內(intracerebroventricular)投予。另外或替代地，此種基因治療可能涉及直接遞送至心臟、遞送至肺臟(鼻內、吸入、氣管內)、及/或肌肉內注射。此等之一可為表現匣、載體或組成物的唯一投予途徑，或與其它遞送途徑共同投予。

治療具有龐貝氏病的病患之治療方案可包含： 單獨遞送至病患如本文所述之表現匣、rAAV、或組成物，或與共同療法組合，例如，與一種以上之免疫調節劑、支氣管擴張劑、乙醯膽鹼酶抑制劑、呼吸肌力訓練(respiratory muscle strength training，RMST)、酶替代療法、及/或橫膈節律治療(diaphragmatic pacing therapy)組合。

於某些實施方式，提供一種生產本文所述之表現匣及/或rAAV的核酸分子及宿主細胞。

於某些實施方式，提供一種表現匣、rAAV、及/或組成物於製備醫藥之用途。

於某些實施方式，提供一種適合用於治療具有龐貝氏病的病患之表現匣、rAAV、及/或組成物，及/或適合用於具有α-葡萄糖苷酶(GAA)缺乏的病患中改善心臟、呼吸及/或骨骼肌肉功能。

由以下本發明的詳細說明中，本發明的其它態樣及優點將顯而易見。

提供一種組成物，其用於將包含訊息肽及至少與hGAA780I酶的活性部分融合的vIGF2胜肽的融合蛋白胜肽遞送至具有龐貝病的病患。本文描述製備及使用它們之方法，包括以此等組成物治療病患的方案。

如本文所使用，術語「龐貝氏病」係指麥芽糖酶缺乏症、第II型肝醣貯積病(GSDII)、或第II型肝醣病，意指基因性胞溶體貯積症，其特徵為GAA基因之突變所引起之胞溶體酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的全部缺乏或部分缺乏，其編碼酸性α-葡萄糖苷酶。該術語包括但不限於疾病的早期及晚期發作形式，包括但不限於嬰幼、幼年、及成年發作型龐貝氏病。

應理解於整個說明書中，希臘字母「alpha」及符號「α」可互換使用。同樣地，於整個說明書中，希臘字母「delta」及「Δ」可互換使用。

如本文所使用，術語「酸性α-葡萄糖苷酶」或「GAA」係指水解肝醣、麥芽糖及異麥芽糖之D-葡萄糖單元之間的α-1,4鍵結之胞溶體酶。替代名稱包括但不限於胞溶體α-葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.20)；葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)；1,4-α-D-葡聚醣葡糖水解酶(1,4-α-D-glucan glucohydrolase)；澱粉葡萄糖苷酶(amyloglucosidase)；γ-澱粉酶及外-1,4-α-葡萄糖苷酶。人類酸性α-葡萄糖苷酶由GAA基因編碼(美國國家生物技術資訊中心(National Centre for Biotechnology Information，NCBI)Gene ID 2548)，其已被繪製於染色體17的長臂(位置17q25.2-q25.3)。於胺基酸殘基516-521之保留的六肽WIDMNE為酸性α-葡萄糖苷酶蛋白質之活性所需要。術語「hGAA」係指人類GAA之編碼序列。

如本文所使用，「rAAV.hGAA」係指具有AAV衣殼的rAAV，其中包裝了載體基因體，該基因體至少含有GAA酶的編碼序列(例如，780I變異體)。rAAVhu68.hGAA或rAAVhu68.hGAA係指其中該AAV衣殼為本文所定義的AAVhu68衣殼之rAAV。

關於全長hGAA之編號，於胺基酸位置1至27有訊息肽。此外，該酶已與多種成熟蛋白質關連，即，於胺基酸位置70至952之成熟蛋白質、位於胺基酸位置123至952之76 kD成熟蛋白質、及位於胺基酸204至胺基952之70 kD成熟蛋白質。該「活性催化位」包含位於胺基酸殘基516-521之六肽WIDMNE，基於SEQ ID NO：3中的編號。於某些實施方式，可選擇較長片段，例如，位置516至616。其它活性位包括配位子(ligand)結合位，其可位於位置376、404、405、441、481、516、518、519、600、613、616、649、674之一或多者。

除非另有規定，術語「hGAA780I」或「hGAAV780I」係指具有再現於SEQ ID NO：3之胺基酸序列的全長前原蛋白質(full-length pre-pro-protein)。在某些情況下，術語hGAAco780I或hGAAcoV780I係用於指編碼hGAA780I之工程化序列。於先前段落所述hGAA參考蛋白質相比，hGAA780I於位置780具有異白胺酸(Ile或I)，於此參考hGAA含有纈胺酸(Val或V)。未預期地發現，與在位置780具有纈胺酸的hGAA序列(hGAAV780)相比，該hGAA780I具有更佳的效果及改善的安全性，其已於文獻中被廣泛描述為「參考序列」。例如，如可見於圖5A–圖5H，hGAAV780參考序列誘導與hGAA780I酶相同劑量未見到的毒性(纖維化性心肌炎)。如此，於接受hGAA治療的患者中，hGAA780I之使用可減少或消除纖維化性心肌炎。hGAA訊息肽、成熟蛋白質、活性催化位、及結合位之位置可基於再現於SEQ ID NO：3之hGAA780I中的類似位置而決定，即，訊息肽位於胺基酸位置1至27；成熟蛋白質位於胺基酸位置70至952；76 kD成熟蛋白質位於胺基酸位置123至952，及70 kD成熟蛋白質位於胺基酸204至胺基酸952；「活性催化位」包含胺基酸殘基516-521之六肽WIDMNE(SEQ ID NO：61)；其它活性位包括配位子結合位，其可位於位置376、404..405、441、481、516、518..519、600、613、616、649、674之一或多者。

於某些實施方式，hGAA780I可選自其具有下列序列:與SEQ ID NO：3之hGAA780I至少95%相同，與SEQ ID NO：3之hGAA780I至少97%相同，或與SEQ ID NO：3之hGAA780I至少99%相同。於某些實施方式，所提供序列係與SEQ ID NO：3之成熟hGAA780I蛋白質至少95%、至少97%、或至少99%相同。於某些實施方式，具有至少95%至至少99%與hGAA780I相同的序列具有保留而無任何改變的活性催化位的序列。於某些實施方式，與SEQ ID NO：3之hGAA780I具有至少95%至至少99%相同之序列係特徵為當於適當動物模式中試驗時，較參考hGAAV780具有改良的生物學效果及較佳安全性。於某些實施方式，可如先前所述(參見，例如，J. Hordeaux, et. al., Acta Neuropathological Communications,(2107)5：66)或使用其它適合的方法進行GAA活性分析。於某些實施方式，該hGAA780I酶含有於hGAA胺基酸序列中其它位置的修飾。突變體之例可包括，例如，彼等述於US專利9,920,307號。於某些實施方式，此種突變體hGAA780I可保留最少該活性催化位：WIDMNE(SEQ ID NO：61)及780I之區域中的胺基酸如下所述。

於某些實施方式，提供一種新穎hGAA780I融合蛋白質，其包含至少一非天然hGAA訊息肽之引導子胜肽。於某些實施方式，此種外源的引導子胜肽較佳為人類來源且可包括，例如，IL-2引導子胜肽。可用於本發明的特定外源的訊息肽包括來自胰凝乳蛋白酶原B2之胺基酸1-20、人類α-1-抗胰蛋白酶之訊息肽、來自己醛醣酸鹽硫酸酯酶(iduronate-2-sulphatase)之胺基酸1-25、及來自蛋白酶CI抑制劑之胺基酸1-23。參見例如，WO2018046774。其它訊息/引導子胜肽可為天然地於免疫球蛋白中發現(例如，IgG)、細胞激素(例如，IL-2、IL12、IL18等)、胰島素、白蛋白、β-葡萄醣醛酸酶、鹼性蛋白酶或纖維接合素(fibronectin)分泌訊息肽、及其它。亦參見例如，signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia。

此種嵌合hGAA780I可具有外源的引導子替代完整27個胺基酸天然訊息肽。可選擇地，hGAA780I酶之N-末端切斷可僅沒有一部份訊息肽(例如，刪除約2至約25個胺基酸，或兩者之間的值)、完整訊息肽、或長於訊息肽之片段(例如，多至胺基酸70，基於SEQ ID NO：3之編號。可選擇地，此種酶可含有約5、10、15或20個胺基酸長度的C-末端切斷。

於某些實施方式，提供一種新穎的融合蛋白質，其包含與融合夥伴(fusion partner)結合之成熟hGAA780I蛋白質(aa 70至952)、成熟70 kD蛋白質(aa 123至aa 952)、或成熟76 kD蛋白質(aa 204至952)。可選擇地，該融合蛋白質進一步包含訊息肽，其對hGAA而言為非天然的。又可選擇地，此等實施方式之一可進一步含有約5、10、15、或20個胺基酸長度的C-末端切斷。

於某些實施方式，包含hGAA780I酶之融合蛋白質至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸890(hGAA780I)，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，hGAA780I酶至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸952或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，hGAA780I酶至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸123至胺基酸890 或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，hGAA780I酶至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸952或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。於某些實施方式，hGAA780I酶至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。

於某些實施方式，融合蛋白質包含訊息及引導子序列且具有與SEQ ID NO：3至少95%同一性、至少97%同一性、或至少99%同一性之hGAA780I序列，於活性位不具變化及/或於hGAA780I之N-末端及/或C-末端胺基酸3至12胺基酸無變化。於較佳實施方式，工程化hGAA表現匣編碼至少下列人類hGAA780I片段：T-Val(V)-P-Ile(780I)-Glu(E)- Ala(A)-Leu(L)(SEQ ID NO：62)。於某些實施方式，工程化hGAA表現匣編碼較長的人類hGAA780I片段：Gln(Q)-T-V-P-780I-E-A-L-Gly(G)(SEQ ID NO：63)。於某些實施方式，工程化hGAA表現匣編碼至少對應下列之片段：PLGT- Trp(W)-Tyr(Y)-Asp(D)-LQTVP-780I-EALG-(Ser或 S)-L- PPPPAA序列(SEQ ID NO：64)。相似地，於較佳實施方式，於活性結合位無胺基酸改變(SEQ ID NO：3之aa 518至521)。於某些實施方式，該結合位於位置600、616、及/或674維持不變。於某些實施方式，被稱為融合蛋白質者包含訊息肽、可選擇含有的vIGF+2GS延伸、可選擇含有的ER蛋白水解肽、及具hGAA之第一35胺基酸刪除的hGAA780I變異體(即，缺乏天然訊息肽及胺基酸28至35)。

於某些實施方式，提供一分泌的工程化GAA，其包含BiP訊息肽、IGF2+2GS延伸及hGAA 780I之胺基酸61至952(具有hGAA780I之胺基酸1至60之刪除)。於某些實施方式，本文所提供者為一包含SEQ ID NO：6之融合蛋白質、或至少95%與其相同的序列。於某些實施方式，該融合蛋白質係由SEQ ID NO：7或與其至少95%相同之序列編碼。於某些實施方式，融合蛋白質之hGAA780I部份係由SEQ ID NO：4或至少95%與其相同的序列編碼。於某些實施方式，hGAA780I係由SEQ ID NO：5或至少95%與其相同的序列編碼。

本文提供之融合蛋白質之組份進一步描述於下。

結合 CI-MPR 之胜肽 本文提供者為結合CI-MPR之胜肽(例如，vIGF2胜肽)。包含此種胜肽及hGAA780I蛋白質之融合蛋白質，當由基因治療載體表現時，靶向該hGAA780I至需要的細胞處，增加此種細胞的細胞攝入及靶向此治療性蛋白質次細胞(subcellular)位置(例如，溶酶體)。於一些實施方式，該胜肽融合至hGAA780I蛋白質之N-末端。於一些實施方式，該胜肽融合於hGAA780I蛋白質之C-末端。於一些實施方式，該胜肽為vIGF2胜肽。一些vIGF2胜肽保留對CI-MPR的高親和力結合，而它們對IGF1受體、胰島素受體及IGF結合蛋白質(IGFBP)的親和力被降低或消除。如此，與野生型IGF2相比，一些變異體IGF2胜肽實質上更具選擇性且具有降低的安全性風險。此處之vIGF2胜肽包括彼等具有SEQ ID NO：46之胺基酸序列。變異的IGF2胜肽進一步包括彼等與野生型IGF2相比，於位置6、26、27、43、48、49、50、54、55、或65具有變異的胺基酸(SEQ ID NO：34)。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有選自由E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R、及K65R所組成的群組之一或多個取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有E6R之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有F26S之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有Y27L之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有V43L之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有F48T之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有R49S之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有S50I之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有A54R之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有L55R之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有K65R之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一序列，該序列具有E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、及L55R之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有N-末端刪除。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有一個胺基酸之N-末端刪除。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有二個胺基酸之N-末端刪除。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有三個胺基酸之N-末端刪除。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有四個胺基酸之N-末端刪除。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有四個胺基酸之N-末端刪除及E6R、Y27L及K65R之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有四個胺基酸之N-末端刪除及E6R及Y27L之取代。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有五個胺基酸之N-末端刪除。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有六個胺基酸之N-末端刪除。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有七個胺基酸之N-末端刪除。於一些實施方式，該vIGF2胜肽具有七個胺基酸之N-末端刪除及Y27L與K65R之取代。

IGF2胺基酸序列(將變異的殘基劃底線)
胜肽	序列	SEQ ID NO：
野生型	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE	32
F26S	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE	33
Y27L	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE	34
V43L	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGILEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE	35
F48T	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCTRSCDLALLETYCATPAKSE	36
R49S	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFSSCDLALLETYCATPAKSE	37
S50I	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRICDLALLETYCATPAKSE	38
A54R	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLRLLETYCATPAKSE	39
L55R	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLARLETYCATPAKSE	40
F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R	AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGSLFSRPASRVSRRSRGILEECCTSICDLRRLETYCATPAKSE	41
Δ1-6、Y27L、K65R	TLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE	42
Δ1-7、Y27L、K65R	LCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE	43
Δ1-4、E6R、Y27L、K65R	SRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPARSE	44
Δ1-4、E6R、Y27L	SRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFLFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE	45
E6R	AYRPSRTLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE	46

IGF2 DNA編碼序列
胜肽	DNA 序列	SEQ ID NO
成熟WT IGF2	GCTTACCGCCCCAGTGAGACCCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAG	47
vIGF2 Δ1-4、E6R、Y27L、K65R	TCTAGAACACTGTGCGGAGGGGAGCTTGTAGACACTCTTCAGTTCGTGTGTGGAGATCGCGGGTTCCTCTTCTCTCGCCCCGCTTCCAGAGTTTCACGGAGGTCTAGGGGTATAGTAGAGGAGTGTTGTTTCAGGTCCTGTGACTTGGCGCTCCTCGAGACCTATTGCGCGACGCCAGCCAGGTCCGAA	48

訊息肽 此處提供一種組成物，於一些實施方式，其進一步包含訊息肽，該訊息肽改良hGAA780I自以基因治療構築體轉導的細胞的分泌。於一些實施方式中的該訊息肽改良治療性蛋白質的蛋白質加工，且促進新生多肽-核糖體複合體(nascent polypeptide-ribosome complex)易位至ER並確保適當的共轉譯及轉譯後修飾。於一些實施方式，該訊息肽位於：(i)於訊息轉譯起始序列的上游位置中，(ii)於轉譯起始序列與治療性蛋白質之間，或(iii)於治療性蛋白質的下游位置。有用於基因治療構築體之訊息肽包括但不限於來自HSP70蛋白質家族之結合免疫球蛋白蛋白質(BiP)訊息肽(例如，HSPA5、熱休克蛋白質家族A成員5)及Gaussia(海洋橈足類)訊息肽、及其變異體。此等訊息肽對訊息識別顆粒具有超高親和力。下表提供了BiP及Gaussia胺基酸序列的示例。於一些實施方式，該訊息肽具有至少90%與選自由SEQ ID Nos：49-53組成的群組之序列相同之胺基酸序列。於一些實施方式，該訊息肽與選自由SEQ ID Nos：49-53組成的群組之序列相差5個或以下、4個或以下、3個或以下、2個或以下、或1個胺基酸。

訊息肽序列
訊息肽	胺基酸序列	SEQ ID NO：
天然人類BiP	MKLSLVAAMLLLLSAARA	49
經修飾的BiP-1	MKLSLVAAMLLLLSLVAAMLLLLSAARA	50
經修飾的BiP-2	MKLSLVAAMLLLLWVALLLLSAARA	51
經修飾的BiP-3	MKLSLVAAMLLLLSLVALLLLSAARA	52
經修飾的BiP-4	MKLSLVAAMLLLLALVALLLLSAARA	53
Gaussia	MGVKVLFALICIAVAEA	54

該Gaussia訊息肽衍生自Gaussia princeps的螢光素酶，並指導增加的蛋白質合成及與該訊息肽融合的治療性蛋白質的分泌。於一些實施方式，該Gaussia訊息肽具有至少90%與SEQ ID NO：54相同的胺基酸序列。於一些實施方式，該訊息肽與SEQ ID NO：54相差5個或以下、4個或以下、3個或以下、2個或以下、或1個胺基酸。

連結子 本文提供之組成物，於一些實施方式，包含靶向胜肽與治療性蛋白質之間的連結子。此種連結子，於一些實施方式，維持正確的間距及減緩vIGF2胜肽及治療性蛋白質之間的空間位阻。連結子，於一些實施方式，包含重複的甘胺酸殘基、重複的甘胺酸-絲胺酸殘基、及其組合。於一些實施方式，該連結子係由5-20個胺基酸、5-15個胺基酸、5-10個胺基酸、8-12個胺基酸、或約5、6、7、8、9、10、11、12或13個胺基酸所組成。適合的連結子包括但不限於下表所提供的彼等：

連結子序列
序列	SEQ ID NO：
GGGGSGGGG	55
GGGGS	56
GGGSGGGGS	57
GGGGSGGGS	58
GGSGSGSTS	59
GGGGSGGGGS	60

於整個說明書，各種表現匣、載體基因體、載體、及組成物被描述為含有hGAA780I編碼序列或hGAA780I蛋白質。應當理解，除非另有說明，否則任一工程化hGAA780I蛋白質，包括如本文所描述之N-末端切斷、C-末端切斷、及融合蛋白質，或其編碼序列，可相似地工程化成表現匣、載體基因體、載體、及組成物。

適合地，提供之表現匣包含本文所述之核酸序列。

表現匣 如本文所使用，「表現匣」係指包含編碼功能基因產物的核酸序列的核酸分子，可操作地連接至指導其在目標細胞中表現的調節序列(例如，hGAA780I融合蛋白質編碼序列)啟動子，且可包括其它調節序列。該必要的調節序列，以允許其在目標細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式，可操作地連接至hGAA780I融合蛋白質編碼序列。

於某些實施方式，該表現匣於未轉譯區中可包括一或多個miRNA目標序列。miRNA目標序列被設計為可被存在於不希望轉基因表現及/或需要降低轉基因表現水平的細胞中的miRNA特異性識別。於某些實施方式，該表現匣包括於背根神經節中特異性減少hGAA780I融合蛋白質表現的miRNA目標序列。於某些實施方式，該miRNA目標序列位於3’ UTR、5’ UTR、及/或3’及5’ UTR兩者。於某些實施方式，該表現匣至少包含背根神經節(DRG)-特異性miRNA目標序列之兩個串聯重複，其中該至少兩個串聯重複至少包含第一miRNA目標序列及至少包含第二miRNA目標序列，其可為相同或不同。於某些實施方式，至少兩個drg-特異性miRNA串聯重複之第一者的起始係於自該hGAA780I融合蛋白質-編碼序列之3’端的20個核苷酸中。於某些實施方式，該至少兩個DRG-特異性miRNA串聯重複之第一者之起始係於自該hGAA780I融合蛋白質編碼序列之3’端的至少100核苷酸。於某些實施方式，該miRNA串聯重複包含200至1200個核苷酸長。於某一實施方式，相對於缺少miR目標序列的表現匣或載體基因體，miR目標的包含物於一或多個目標組織中不會修飾治療性轉基因的表現或效力。

於某些實施方式，該載體基因體或表現匣含有至少一個為miR-183目標序列之miRNA目標序列。於某些實施方式，該載體基因體或表現匣含有包括AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(SEQ ID NO：26)之miR-183目標序列，於該序列與miR-183種子序列互補處劃底線。於某些實施方式，該載體基因體或表現匣含有100%與miR-183種子序列互補的序列之超過一個拷貝(例如，二或三個拷貝)。於某些實施方式，miR-183目標序列為約7個核苷酸至約28個核苷酸長且包括至少100%與miR-183種子序列互補的至少一個區域。於某些實施方式，miR-183目標序列含有部分與SEQ ID NO：26互補的序列，如此，當與SEQ ID NO：26比對時，存在一個或多個錯配。於某些實施方式，miR-183目標序列包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個錯配之序列，當與SEQ ID NO：26比對時，於該錯配可能為不連續的。於某些實施方式，miR-183目標序列包括100%互補之一區域，其亦至少包含30%之該miR-183目標序列之長度。於某些實施方式，該100%互補之區域包括100%與miR-183種子序列互補之序列。於某些實施方式，miR-183目標序列之其餘部分具有至少約80%至約99%與miR-183。於某些實施方式，該表現匣或載體基因體包括包含經截斷的SEQ ID NO：26之miR-183目標序列，即，於SEQ ID NO：26之5’或3’端之任一或兩者中缺乏至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸之序列。於某些實施方式，該表現匣或載體基因體包含轉基因及一miR-183目標序列。於再其它實施方式，該表現匣或載體基因體至少包含二、三或四個miR-183目標序列。

於某些實施方式，該載體基因體或表現匣含有至少一個miRNA目標序列，其為miR-182目標序列。於某些實施方式，該載體基因體或表現匣含有miR-182目標序列，其包括AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO：27)。於某些實施方式，該載體基因體或表現匣含有100%與miR-182種子序列互補之序列之超過一個拷貝(例如，二或三個拷貝)。於某些實施方式，miR-182目標序列為約7個核苷酸至約28個核苷酸長，且包括至少100%與miR-182種子序列互補之至少一個區域。於某些實施方式，miR-182目標序列含有與SEQ ID NO：27部分互補的序列，當與SEQ ID NO：27比對時，有一或多個錯配。於某些實施方式，miR-183目標序列包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個錯配之序列，當與SEQ ID NO：27比對時，其中錯配可為非連續的。於某些實施方式，miR-182目標序列包括100%互補性之區域，其亦至少包含miR-182目標序列之30%之長度。於某些實施方式，100%互補性之區域包括與miR-182種子序列100%互補之序列。於某些實施方式，miR-182目標序列之其餘部分具有與miR-182至少約80%至約99%互補性。於某些實施方式，該表現匣或載體基因體包括包含經截斷的SEQ ID NO：27之miR-182目標序列，即，於SEQ ID NO：27之5’或3’端任一者或兩者缺少至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸的序列。於某些實施方式，該表現匣或載體基因體包含轉基因及一miR-182目標序列。於再其它實施方式。該表現匣或載體基因體至少包含二、三或四個miR-182目標序列。

此處所使用的術語「串聯重複」係指二或多個連續的miRNA目標序列之存在。此等miRNA目標序列可為連續的，即彼此緊挨著定位，使得一個3’端直接位於下一個5’端的上游，而沒有中間序列，反之亦然。於另一實施方式，二或多個之miRNA目標序列被一短間隔子(spacer)序列分開。

如本文所使用，「間隔子」為任何選擇的核酸序列，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸長，其位於二或多個連續的miRNA目標序列之間。於某些實施方式，該間隔子為1至8個核苷酸長、2至7個核苷酸長、3至6個核苷酸長、四個核苷酸長、4至9個核苷酸長、3至7個核苷酸長、或更長的值。適當地，間隔子為非編碼序列。於某些實施方式，該間隔子可為四(4)個核苷酸。於某些實施方式，該間隔子為GGAT。於某些實施方式，該間隔子為六(6)個核苷酸。於某些實施方式，該間隔子為CACGTG或GCATGC。

於某些實施方式，該串聯重複含有二、三、四個或多個相同miRNA目標序列。於某些實施方式，該串聯重複含有至少二個不同的miRNA目標序列、至少三個不同的miRNA目標序列、或至少四個不同的miRNA目標序列等。於某些實施方式，該串聯重複可含有二或三個相同miRNA目標序列及第四個不同的miRNA目標序列。

於某些實施方式，於該表現匣可有至少二個不同組之串聯重複。例如，3’ UTR可含有緊接於轉基因、UTR序列之下游的串聯重複，且二或多個串聯重複靠近該UTR 之3’端。於另一例中，5’ UTR可含有一、二或多個miRNA目標序列。於另一例中，3’可含有串聯重複且5’ UTR可含有至少一個miRNA目標序列。

於某些實施方式，該表現匣含有二、三、四或多個串聯重複，其起始於轉基因之終止密碼子的約0至20個核苷酸中。於其它實施方式，該表現匣含有從轉基因的終止密碼子起至少100至約4000個核苷酸的miRNA串聯重複。

參見2019年12月20日申請之PCT/US19/67872，其併入本文中，並主張2018年12月21日申請之US臨時專利申請案No. 62/783,956之優先權，其藉由引用併入本文。

如本文所使用，「BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183」係指含有hGAA780I之工程化編碼序列之表現匣(例如，如圖11所示)，該工程化編碼序列具有於普遍存在的CAG啟動子控制下的經修飾的BiP-vIGF2訊息序列及miR183目標序列之四個串聯重複。如本文提供的實施例所示，V780I變異及BiP-vIGF2修飾兩者有助於改善安全性及效力。於某些實施方式，該BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183包括編碼SEQ ID NO：3之融合蛋白質的序列，或至少95%與其相同的序列。於某些實施方式，該BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183包括SEQ ID NO：7之核酸序列、或至少95%至99%與其相同的序列。於再另一實施方式，本文提供一載體基因體，其中BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183係由5’ITR及3’ITR位於兩側。於某些實施方式，該載體基因體為SEQ ID NO：30。於再又一實施方式，提供之載體基因體包括至少95%與SEQ ID NO：30相同且編碼SEQ ID NO：6之融合蛋白質的序列。

如本文所使用，「可操作地連接」序列包括鄰接hGAA780I編碼序列的表現控制序列及反式或間隔作用以控制hGAA780I編碼序列的表現控制序列兩者。此種調節序列典型地包括例如，啟動子、增強子、內含子、Kozak序列、多腺苷酸化(polyadenylation)序列、及TATA訊息中的一或多個。

於某些實施方式，調節元件指導在受龐貝氏病影響的多個細胞和組織中表現，以便允許構築和遞送適合於治療多個目標細胞的單個表現匣。例如，調節元件(例如，啟動子)可以選擇在肝、骨骼肌、心臟及中樞神經系統細胞之兩或更多個中表現者。例如，調節元件(例如，啟動子)可選擇於中樞神經系統(例如，腦)細胞及骨骼肌中表現)。於其它實施方式，該調節元件於CNS、骨骼肌及心臟中表現。於其它實施方式，該表現匣允許經編碼的hGAA780I於肝臟、骨骼肌、心臟及中樞神經系統細胞之所有中表現。於其它實施方式，可以選擇調節元件以靶向特定組織並避免於某些細胞或組織中表現(例如，藉由使用本文所述的drg脫靶系統及/或藉由選擇組織特異性啟動子)。於某些實施方式，對病患投予本文提供的不同表現匣，其優先靶向不同組織。

該調節序列包含啟動子。可選擇適合的啟動子，包括但不限於在靶向的細胞中表現hGAAV780I蛋白質的啟動子。

於某些實施方式，選擇構成的啟動子或可誘導/調節的啟動子。構成的啟動子之一例為雞beta-肌動蛋白啟動子。單獨描述了多種雞beta-肌動蛋白啟動子，或與各種增強子元件組合使用(例如，CB7為一具有巨細胞病毒(cytomegalovirus)增強子元件之雞beta-肌動蛋白啟動子；CAG啟動子，其包括雞beta-肌動蛋白之啟動子、第一外顯子及第一內含子，及兔beta-球蛋白基因之剪接受體(splice acceptor)；CBh啟動子，SJ Gray et al, Hu Gene Ther, 2011 Sep；22(9)：1143-1153)。於某些實施方式，可選擇可調節的啟動子。參見，例如，WO 2011/126808B2，其藉由引用而併入本文。

於某些實施方式，可選擇組織特異性啟動子。組織特異性啟動子之例眾所周知有：肝臟(白蛋白，Miyatake et al.,(1997)J. Virol., 71:5124-32；B型肝炎病毒核啟動子，Sandig et al.,(1996)Gene Ther., 3:1002-9；α-胎兒蛋白(AFP)，Arbuthnot et al.,(1996)Hum. Gene Ther., 7:1503-14)；中樞神經系統，例如，神經元(諸如神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子，Andersen et al.,(1993)Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15；神經纖維絲輕鏈基因，Piccioli et al.,(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5；及神經元特異性vgf基因，Piccioli et al.,(1995)Neuron, 15:373-84)；心臟肌肉、骨骼肌、肺臟及其它組織。於另一實施方式，適合的啟動子可未限制地包括延伸因子1-α(EF1 alpha)啟動子(參見，例如，Kim DW et al, Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 1990 Jul 16;91(2):217-23)；突觸素1(Synapsin 1)啟動子(參見，例如，Kügler S et al, Human Synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term ransgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 2003 Feb;10(4):337-47)；神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(參見，例如，Kim J et al, Involvement of cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate cancer cells. Endocrinology. 2004 Feb;145(2):613-9. Epub 2003 Oct 16)；或CB6啟動子(參見，例如，Large-Scale Production of Adeno-Associated Viral Vector Serotype-9 Carrying the Human Survival Motor Neuron Gene, Mol Biotechnol. 2016 Jan;58(1):30-6. doi：10.1007/s12033-015-9899-5)。於某些實施方式，利用組織特異性啟動子，可選擇涉及不同表現匣的共療法(co-therapies)，該表現匣具有靶向不同細胞類型的組織特異性啟動子。

於一實施方式，該調節序列進一步包含增強子。於一實施方式，該調節序列包含一個增強子。於另一實施方式，該調節序列含有二或多個表現增強子。此等增強子可為相同或不同。例如，增強子可包括一αmic/bik增強子或CMV增強子。此增強子可以彼此相鄰的兩個拷貝中存在。或者，增強子的雙重拷貝可以被一個或多個序列分開。

於一實施方式，該調節序列進一步包含內含子。於另一實施方式，該內含子為雞beta-肌動蛋白內含子。其它適合的內含子包括本項技術領域中彼等已知者，可為人類β-球蛋白內含子，及/或市售Promega®內含子、及彼等述於WO 2011/126808者。

於一實施方式，該調節序列進一步包含一多腺苷酸化訊息(polyA)。於另一實施方式，該polyA為兔球蛋白poly A。參見，例如，WO 2014/151341。或者，另一polyA，例如，人類生長激素(hGH)多腺苷酸化序列、SV40 polyA、或合成的polyA，可被包括於表現匣中。

應當理解，本文所述的表現匣中的組成物係意圖應用於說明書中描述的其它組成物、治療方案、態樣、實施方式及方法。

表現匣可以經由任何適合的遞送系統遞送。適合的非病毒遞送系統為本領域已知(參見，例如，Ramamoorth and Narvekar. J Clin Diagn Res. 2015 Jan；9(1):GE01-GE06，其藉由引用而併入本文)且可由本項技術領域中具通常知識者容易地選擇，並且可包括，例如，裸露的DNA、裸露的RNA、樹枝狀聚合物(dendrimer)、PLGA、聚甲基丙烯酸酯、無機粒子、脂質粒子(例如，脂質奈米顆粒或LNP)、或幾丁聚醣系調配物。

於一實施方式，載體為非病毒質體，其包含所述的表現匣，例如，「裸露的DNA」、「裸露的質體DNA」、RNA及mRNA；與各種組成物及奈米顆粒偶合，包括例如微胞、脂質體、陽離子性脂質-核酸組成物、聚醣(poly-glycan)組成物及其它聚合物、脂質及/或膽固醇系-核酸結合物、及其它構築體，諸如本文所述者。參見，例如，X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8(3), pp 774–787；web publication：March 21, 2011；WO2013/182683、WO 2010/053572及WO 2012/170930，其全部藉由引用而併入本文。

於某些實施方式，本文提供者為具有編碼hGAA780I變異體、融合蛋白質、或經截斷的蛋白質之序列之核酸分子，如本文所述者。於一有利的實施方式，該hGAA780I由SEQ ID NO：4之工程化序列編碼或至少95%與編碼hGAA780I變異體之相同的序列。於某些實施方式，SEQ ID NO：4被修飾使得在位置780I處編碼Ile的密碼子是ATT或ATC。於某些實施方式，包含SEQ ID NO：4之工程化序列之核酸或其片段被用於表現融合蛋白質或經截斷的hGAA780I。儘管不太理想，於某些實施方式，該hGAA780I係由SEQ ID NO：5編碼。於某些實施方式，該核酸編碼具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列或至少95%與其相同的序列之融合蛋白質。於某些實施方式，提供之核酸具有SEQ ID NO：7之序列、或至少95%與其相同的序列。於某些實施方式，該核酸分子為一質體。

載體 如本文所使用的「載體」為一生物學或化學部分(moiety)，其包含可被導入用於複製或表現該核酸序列之適當目標細胞中的核酸序列。載體之例包括但不限於重組病毒、質體、脂質複合物(Lipoplexes)、聚合物囊泡(Polymersome)、聚合複合物(Polyplexes)、樹枝狀聚合物、細胞穿透胜肽(CPP)結合物、磁顆粒、或奈米顆粒。於一實施方式，載體為具有編碼功能性基因產物的外源的或異源的工程化核酸之核酸分子，然後其可被導入適當目標細胞中。此種載體較佳具有一或多個複製來源，及一或多個重組DNA可被插入的位置。載體通常具有可自彼等不具有者選擇帶有載體的細胞的手段，例如，它們編碼抗藥基因。一般載體包括質體、病毒基因體、及「人工染色體」。產生、生產、表徵或定量載體之常規方法對本項技術領域中具通常知識者為可用的。

於某些實施方式，本文所述載體為「複製缺陷病毒」或「病毒載體」，其係指合成或人工病毒顆粒，其中含有編碼功能性hGAA780I融合蛋白質之核酸序列的表現匣被包裝於病毒衣殼或封套中，於亦被包裝於此病毒衣殼或封套中的任一病毒基因體序列亦為複製缺陷；即，它們無法產生後代病毒粒子，但保留感染目標細胞的能力。於一實施方式，病毒載體之基因體不包括編碼複製所需酶的基因(該基因體可被工程化為「無能力的(gutless)」-僅含有編碼側翼為增幅和包裝人工基因體所需的訊息的核酸序列)，但這些基因可在生產過程中提供。因此，由於除非存在複製所需的病毒酶，否則子代病毒顆粒的複製和感染不會發生，所以被認為對用於基因治療是安全的。

如本文所使用，重組病毒載體為靶向所欲細胞之任一適合的病毒載體。如此，重組病毒載體較佳靶向受龐貝氏病影響的一種或多種細胞及組織，包括中樞神經系統(例如，腦)、骨骼肌、心臟、及/或肝臟。於某些實施方式，該病毒載體靶向至少中樞神經系統(例如，腦)細胞、肺臟、心臟細胞、或骨骼肌。於其它實施方式，該病毒載體靶向CNS(例如，腦)、骨骼肌及/或心臟。於其它實施方式，該病毒載體靶向肝臟、骨骼肌、心臟及中樞神經系統細胞之全部。實施例提供示例性重組腺相關病毒(rAAV)。然而，其它適合的病毒載體可包括，例如，重組腺病毒、重組小病毒如重組波卡病毒(bocavirus)、雜合AAV/波卡病毒、重組單純疱疹病毒、重組反轉錄病毒、或重組慢病毒。於較佳實施方式，此等重組病毒為無複製能力。

如本文所使用，術語「宿主細胞」可指其中產生載體(例如，重組AAV)的包裝細胞系。宿主細胞可為含有外源的異源的DNA之原核細胞或真核細胞(例如，人類、昆蟲、或酵母)，該DNA已藉由任何手段而被導入至細胞，例如，電穿孔、磷酸鈣沉澱、微注射、轉型(transformation)、病毒感染、轉染、脂質體遞送、膜融合技術、高速塗覆DNA的丸粒、病毒感染及原生質體(protoplast)融合。宿主細胞之例可包括，但未限於，單離的細胞、細胞培養、大腸桿菌(Escherichia coli)細胞、酵母菌細胞、人類細胞、非人類細胞細胞、非哺乳動物細胞、昆蟲細胞、HEK-293細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、中樞神經系統之細胞、神經元、神經膠細胞、或幹細胞。

於某些實施方式，宿主細胞包含用於產生hGAA780I的表現匣，而使在活體外產生足夠量的蛋白質用於分離或純化。於某些實施方式，宿主細胞包含編碼hGAAV780I或其片段的表現匣。如本文所提供，hGAA780I可包括於作為治療劑(即，酶替代療法)投予於受試者的醫藥組成物中。

如本文所使用，術語「目標細胞」係指其中希望功能性基因產物表現的任一目標細胞。

如本文所使用，「載體基因體」係指包裝在病毒載體內部的核酸序列。於一例中，「載體基因體」由5’至3’，至少含有載體-特異性序列、可操作地連接至調節控制序列之編碼功能性基因產物之核酸序列(例如，hGAAV780I、融合蛋白質hGAAV780I、或另一蛋白質)(該調節控制序列指導其在目標細胞中表現)、載體-特異性序列、及可選擇地於未轉譯區域含有miRNA目標序列及載體-特異性序列。載體-特異性序列末端重覆序列，其將載體基因體特異性包裝於病毒載體衣殼或封套蛋白質中。例如，將AAV反向末端重複序列用於包裝於AAV及某些其它小病毒衣殼中。慢病毒長末端重複序列可被用於包裝至所欲慢病毒載體。相似地，可選擇其它末端重複序列(例如，反轉錄病毒長末端重複序列)或其類似物。

應理解本文所述載體中的組成物意圖被應用於說明書中描述的其它組成物、治療方案、態樣、實施方式、及方法中。

腺相關病毒 (AAV) 於一態樣，本文所提供者為包含AAV衣殼及包裝於其中的載體基因體的重組AAV(rAAV)，其編碼如本文所述的hGAAV780I融合蛋白質(酶)。於某些實施方式，選擇的AAV衣殼靶向肝臟、肌肉、腎臟、心臟及/或中樞神經系統細胞類型中的兩或多種之細胞。於某些實施方式，期望於肝臟、骨骼肌、心臟、腎臟及/或至少一種中樞神經系統細胞類型中的至少兩或多種中表現hGAA780I融合蛋白質。如此，於一實施方式，選擇的AAV衣殼靶向心臟組織。於某些實施方式，選擇的靶向心臟組織的AAV衣殼係選自AAV 1、6、8、及9(參見，例如，Katz et al. Hum Gene Ther Clin Dev. 2017 Sep 1；28(3)：157-164)。於再其它實施方式，選擇的AAV衣殼靶向腎臟細胞。於一實施方式，靶向腎臟細胞的衣殼係選自AAV1、2、6、8、9、及Anc80(參見，例如，Ikeda Y et al. J Am Soc Nephrol. 2018 Sep；29(9):2287-2297 and Ascio et al. Biochem Biophys Res Commun. 2018 Feb 26；497(1)：19-24)。於某些實施方式，AAV衣殼為天然或工程化演化支F衣殼。於某些實施方式，該衣殼為AAV9衣殼或AAVhu68衣殼。

於一實施方式，載體基因體包含AAV 5’反向末端重複序列(ITR)、如本文所述表現匣、及AAV 3’ ITR。於一實施方式，載體基因體係指包裝於形成rAAV載體的rAAV衣殼中的核酸序列。此種核酸序列含有AAV反向末端重複序列(ITRs)位於表現匣兩側。於一例中，包裝於AAV或波卡病毒衣殼中的「載體基因體」，自5’至3’，至少含有AAV 5’ ITR、可操作地連接至調節控制序列之編碼如本文所述功能性hGAA780I融合蛋白質之核酸序列(該調節控制序列指導其在目標細胞中表現)、及AAV 3’ ITR。於某些實施方式，ITRs係來自AAV2且衣殼係來自不同的AAV。或者，可使用其它ITRs。於某些實施方式，載體基因體進一步包含於未轉譯區的miRNA目標序列，其被設計為於不希望轉基因表現及/或希望降低轉基因表現程度的細胞中特異性由miRNA序列識別。

ITR為於載體生產期間負責基因體複製和包裝的遺傳元件，並且是產生rAAV所需的唯一病毒順式元件。於一實施方式，ITRs係來自不同於提供衣殼的AAV。於較佳實施方式，該ITR序列來自AAV2，或其經刪除的版本(∆ITR)，其可用於為了方便和加快管理機關許可。然而，可選擇來自其它AAV來源的ITRs。於ITRs的來源來自AAV2，而AAV衣殼來自另一個AAV來源時，可以將所得載體稱為假型化(pseudotyped)。通常，AAV載體基因體包含AAV 5’ ITR、hGAA780I編碼序列及任何調控序列，以及AAV 3’ ITR。然而，此等元件的其它構型可能適合的。已經描述稱為ΔITR的5’ ITR的縮短版本，其中刪除了D序列及末端解析位點(terminal resolution site(trs))。於其它實施方式，使用了全長AAV 5’和3’ ITR。

如本文所使用的術語「AAV」係指天然發生的腺相關病毒、可由本項技術領域中具通常知識者獲得的腺相關病毒及/或根據本文所述之組成物及方法可獲得的腺相關病毒，以及人工AAV。腺相關病毒(AAV)病毒載體為具有AAV蛋白質衣殼的AAV核酸酶(例如，DNase)抗性顆粒，於該AAV蛋白質衣殼中包裝AAV反向末端重複序列(ITRs)位於兩側的表現匣以遞送至目標細胞。核酸酶抗性重組AAV(rAAV)表示AAV衣殼已完全組裝並保護此等經包裝的載體基因體序列免於在被設計用以去除生產過程中可能存在的污染核酸之核酸酶溫育步驟中被降解(消化)。於許多情況下，本文所述的rAAV為DNase抗性。

AAV衣殼由60個衣殼(cap)蛋白質次單元VP1、VP2及VP3組成，其以二十面體對稱性排列，比例約為1：1：10至1：1：20，取決於所選擇的AAV。可選擇各種AAV作為上述AAV病毒載體之衣殼來源。參見，例如，US公開的專利申請No. 2007-0036760-A1；US公開的專利申請No. 2009-0197338-A1；EP 1310571。亦參見，WO 2003/042397 (AAV7及其它猿猴AAV)、US專利7790449及US專利7282199(AAV8)、WO 2005/033321及US 7,906,111(AAV9)、及WO 2006/110689、及2003/042397(rh.10)。此等文件亦描述可被選擇用於生成AAV的其它AAV，且藉由引用將其併入。從人類或非人類的靈長類動物(NHP)分離或工程化的AAV中，人類AAV2是第一個被開發作為基因轉移載體的AAV；其已被廣泛用於在不同目標組織及動物模型中進行有效的基因轉移實驗。除非另有規定，否則本文所述的AAV衣殼、ITR及其它選擇的AAV組件可以容易地選自任何AAV，包括但不限於通常被標識為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8及AAVAnc80。參見，例如，WO 2005/033321，其藉由引用而併入本文。於一實施方式，AAV衣殼為AAV9衣殼或其變異體。於某些實施方式，衣殼蛋白係由rAAV載體名稱中術語「AAV」後的數字或數字與字母的組合來指定。

使用所屬技術領域中具通常知識者可利用的技術，可以容易地從AAV分離或工程化ITR或其它AAV組件。可自學術、商業或公共來源(例如，美國典型培養物保藏中心，Manassas，VA）分離、工程化或獲得此種AAV。或者，可參考諸如文獻或資料庫，例如GenBank、PubMed等，可用的公開序列，通過合成或其它適合的手段而工程化AAV。AAV病毒可藉由常規分子生物學技術進行工程化，而可以優化此等顆粒以細胞特異性遞送核酸序列，用於最小化免疫原性、調節穩定性及顆粒壽命、有效降解、準確遞送至核等。

如本文所使用，交替使用術語「rAAV」及「人工AAV」，意指(但未限於)包含衣殼蛋白質及包裝於其中的載體基因體之AAV，其中載體基因體包含對該AAV為異源的核酸。於一實施方式，衣殼蛋白質為非自然產生的衣殼。此種人工衣殼可藉由任何適合的技術而生產，使用選擇的AAV序列(例如，vp1衣殼蛋白質之片段)與異源的序列的組合，該異源的序列可獲自不同之選擇的AAV、相同AAV之非連續的部份，來自非-AAV病毒來源、或來自非病毒來源。人工AAV可以是但不限於假型化AAV、嵌合AAV衣殼、重組AAV衣殼、或「人類化」AAV衣殼。假型化載體，其中一種AAV的衣殼被異源的衣殼蛋白質替代，有用於本發明。於一實施方式，AAV2/5及AAV2/8為示例性假型化載體。可藉由任何適合的方法來遞送所選擇的遺傳元件，包括轉染、電穿孔、脂質體遞送、膜融合技術、高速DNA包覆的丸粒(high velocity DNA-coated pellet)、病毒感染及原生質體融合。用於製備此種構築體的方法為彼等專精核酸操作技術人員已知，且包括基因工程、重組工程及合成技術。參見，例如，Green and Sambrook, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2012)。

於某些實施方式，AAV衣殼選自天然及工程化演化支F腺相關病毒。於下列例中，演化支F腺相關病毒為AAVhu68。參見，WO 2018/160582，其藉由引用而完整併入本文。然而，於其它實施方式，AAV衣殼係選自不同演化支，例如，演化支A、B、C、D、或E、或來自此等演化支之任一者外的AAV來源。

如本文所使用，與AAV的群組有關的術語「演化支(clade)」係指在系統發生學上彼此相關的一群AAV，如使用近鄰相接演算法(Neighbor-Joining algorithm)通過至少75%(至少1000次重複)及基於AAV vp1胺基酸序列比對的泊松校正距離(Poisson correction distance)測量值不超過0.05。於文獻中已描述近鄰相接演算法。參見，例如，M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics(Oxford University Press, New York(2000)。可取得可用於實現此演算法的計算機程序。例如，MEGA v2.1程式實現修飾的Nei-Gojobori法。使用此等技術及電腦程式，及AAV vp1衣殼蛋白質之序列，本項技術領域中具通常知識者可容易地確定所選擇的AAV係包含於本文鑑別的一個演化支中、另一個演化支中、或是於此等演化支之外。參見，例如，G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun；7810：6381-6388，其鑑別演化支A、B、C、D、E及F，並提供新穎AAV之核酸序列，GenBank登錄號AY530553至AY530629。亦參見WO 2005/033321。

如本文所使用，「AAV9衣殼」係指(a)具有GenBank登錄號：AAS99264之胺基酸序列的AAV9，藉由引用併入本文及AAV vp1衣殼蛋白質 及/或(b)GenBank登錄號：AY530579.1:(nt 1..2211)之核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。該編碼序列的一些變化被本發明涵括，其可包括與GenBank登錄號：AAS99264和US7906111(亦為WO 2005/033321)中的參考胺基酸序列具有約99%同一性的序列。(即，與參考序列少於約1%的變化)。此種AAV可包括，例如，天然單離物(例如，hu31或hu32)，或具有胺基酸取代、刪除或添加的AAV9之變異體，例如，包括但不限於選自與AAV9衣殼比對的任何其它AAV衣殼中對應位置「所募集(recruited)」的替代殘基的胺基酸取代；例如，諸如述於US 9,102,949、US 8,927,514、US2015/349911、WO 2016/049230A1、US 9,623,120、及US 9,585,971者。然而，於其它實施方式，可選擇AAV9之其它變異體、或具有與上列參考序列至少約95%同一性的序列之AAV9衣殼。參見，例如，US 2015/0079038。已描述生產衣殼的方法，因而之編碼序列以及生產rAAV病毒載體的方法。參見，例如，Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(10), 6081-6086(2003)及US 2013/0045186A1。

於某些實施方式，AAVhu68衣殼係如WO 2018/160582所述，標題為「新穎腺相關病毒(AAV)演化支F 載體及其用途」，其藉由引用併入本文。於某些實施方式，AAVhu68衣殼蛋白質包含：AAVhu68 vp1蛋白質，由編碼預測的SEQ ID NO：2之1至736之胺基酸序列之核酸序列的表現所產生，由SEQ ID NO：2所產生的vp1蛋白質或由至少70%與SEQ ID NO：1相同的核酸序列所產生的vp1蛋白質，該核酸序列編碼SEQ ID NO：2之1至736之胺基酸預測的序列；由編碼預測的SEQ ID NO：2之至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列表現所產生的AAVhu68 vp2蛋白質，由包含SEQ ID NO：1之至少核苷酸412至2211之序列所產生的vp2蛋白質，或由至少70%與SEQ ID NO:1之至少核苷酸412至2211相同的核酸序列所產生的vp2蛋白質，該核酸序列編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列，及/或由編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列之核酸序列所產生的AAVhu68 vp3蛋白質，由包含SEQ ID NO：1之至少核苷酸607至2211的序列所產生的vp3蛋白質，或由至少70%與SEQ ID NO：1之至少核苷酸607至2211相同的核酸序列所產生的vp3蛋白質，該核酸序列編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列。

AAVhu68 vp1、vp2及vp3蛋白質一般表現為由相同核酸序列所編碼的選擇性剪接(alternative splice)變異體，其編碼SEQ ID NO：2(胺基酸1至736)之全長vp1胺基酸序列。可選擇地，單獨使用vp1編碼序列來表達vp1、vp2及vp3蛋白質。或者，此序列可與一個或多個核酸序列共表現，該核酸序列編碼SEQ ID NO：2的AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)而不具有vp1-獨特區(約aa 1至約aa137)及/或vp2-獨特區(約aa 1至約aa 202)，或其互補股，對應的mRNA(SEQ ID NO：1之約nt 607至約nt 2211)；或至少70%至至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)與SEQ ID NO：1相同的序列，其編碼SEQ ID NO：2之aa 203至736。另外或替代地，vp1-編碼及/或vp2-編碼序列可與核酸序列共表現，該核酸序列編碼SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)而不具有vp1-獨特區(約aa 1至約137)、或其互補股、對應的mRNA(SEQ ID NO：1之nt 412至2211)、或至少70%至至少99%之序列(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)與SEQ ID NO：1之nt 412至2211相同，其編碼SEQ ID NO：2之約aa 138至736。

如本文所述，rAAVhu68具有在生產系統中所生產的rAAVhu68衣殼，該衣殼表現自AAVhu68核酸，該核酸編碼SEQ ID NO：2的vp1胺基酸序列，及可選擇的額外核酸序列，例如，編碼不含vp1及/或vp2獨特區域的vp3蛋白質。使用單個核酸序列vp1生產的結果所產生的rAAVhu68產生vp1蛋白質、vp2蛋白質及vp3蛋白質的異源群體。更特別地，AAVhu68衣殼含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內和vp3蛋白質內的亞群(subpopulations)，它們具有來自SEQ ID NO：2中預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群至少包括去醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸被高度去醯胺。

於一實施方式，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO：1之序列、或與其互補的股，例如，對應的mRNA。於某些實施方式，vp2及/或vp3蛋白質可被額外地或替代地從不同於vp1的核酸序列表現，例如，以改變所選擇的表現系統中vp蛋白質的比例。於某些實施方式，亦提供者為一核酸序列，其編碼SEQ ID NO：2(約aa 203至736)之AAVhu68 vp3胺基酸序列而無vp1-獨特區域(約aa 1約aa 137)及/或vp2-獨特區(約aa 1至約aa 202)、或與其互補的股，對應的mRNA(SEQ ID NO：2之約nt 607至約nt 2211)。於某些實施方式，亦提供者為一核酸序列，其編碼SEQ ID NO：2(約aa 138 至736)之AAVhu68 vp2胺基酸序列而無vp1-獨特區域(約aa 1至約137)、或與其互補的股，對應的mRNA(SEQ ID NO：1之nt 412至2211)。

然而，可選擇編碼SEQ ID NO：2之胺基酸序列之其它核酸序列以用於生產rAAVhu68衣殼。於某些實施方式，核酸序列具有SEQ ID NO：1之核酸序列或至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%與SEQ ID NO：1相同的序列，其編碼SEQ ID NO：2。於某些實施方式，該核酸序列具有SEQ ID NO：1之核酸序列或至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%與SEQ ID NO：1之約nt 412至約nt 2211相同的序列，其編碼SEQ ID NO：2之vp2衣殼蛋白質(約aa 138至736)。於某些實施方式，該核酸序列具有SEQ ID NO:1之約nt 607至約nt 2211之核酸序列或至少70%至99.%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%與SEQ ID NO：1之nt 412至約nt 2211相同的序列，其編碼SEQ ID NO：1之vp3衣殼蛋白質(約aa 203至736)。

設計編碼該AAVhu68衣殼的核酸序列係於本領域技術範圍內，包括DNA(基因體或cDNA)或RNA(例如mRNA)。於某些實施方式，該編碼AAVhu68 vp1衣殼蛋白質之核酸序列係被提供於SEQ ID NO：2。於某些實施方式，使用SEQ ID NO：1之核酸序列或至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%之序列生產AAVhu68衣殼，該序列編碼SEQ ID NO：2之具有修飾的vp1胺基酸序列(例如，去醯胺的胺基酸)，如本文所述。於某些實施方式，該vp1胺基酸序列再現於SEQ ID NO：2。

於某些實施方式，可選擇具有減少衣殼去醯胺化的AAV衣殼。參見，例如，PCT/US19/19804及PCT/US18/19861，兩者申請於2019年2月27日，並藉由引用完整併入本文。

如本文所使用，當用於指vp衣殼蛋白質，術語「異源(heterogenous)」或其任何語法變化，係指由不相同元件組成的群體，例如，具有具不同修飾的胺基酸序列之vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。SEQ ID NO：2提供AAVhu68 vp1蛋白質之經編碼的胺基酸序列。與vp1、vp2及vp3蛋白質(亦稱為同功型)結合使用的術語「異源」係指衣殼內vp1、vp2及vp3蛋白質的胺基酸序列的不同。AAV衣殼包含vp1蛋白質內、vp2蛋白質內及vp3蛋白質內的亞群，其具有由預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群至少包括某些去醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞群於天冬醯胺酸-甘胺酸對包含至少一、二、三或四個高度去醯胺的天冬醯胺酸(N)位置及可選擇進一步包含其它去醯胺的胺基酸，其中該去醯胺化造成胺基酸改變及其它可選擇的修飾。

如本文所使用，vp蛋白質之「亞群」係指一群vp蛋白質，其具有至少一個共同的定義特徵，且由至少一組成員至少於參考組的所有成員所組成，除非另有指明。例如，vp1蛋白質之「亞群」係至少一個(1)vp1蛋白質且少於裝配好的AAV衣殼中的所有vp1蛋白質。除非另有指明，vp3蛋白質的「亞群」可為一(1)個vp3蛋白質，其數量少於組裝的AAV衣殼中的所有vp3蛋白質。例如，vp1蛋白質可為vp蛋白質之亞群；vp2蛋白質可為vp蛋白質之一不同的亞群，且vp3為於組裝的AAV衣殼中的vp蛋白質之又另一亞群。於另一例中，vp1、vp2及vp3蛋白質可含有具有不同的修飾的亞群，例如，至少一、二、三或四個高度去醯胺的天冬醯胺酸，例如，於天冬醯胺酸-甘胺酸對。

除非另有規定，高度去醯胺係指於參考的胺基酸位置上有至少45%去醯胺、至少50%去醯胺、至少60%去醯胺、至少65%去醯胺、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%、或高至約100%去醯胺，當與於參考胺基酸位置的預測的胺基酸序列比較(例如，至少80%之基於SEQ ID NO：2 [AAVhu68]編號的胺基酸57之天冬醯胺酸可去醯胺，基於總vp1蛋白質，可去醯胺，基於總vp1、vp2及vp3蛋白質)。此種百分比可使用2D膠體、質譜技術或其它適合的技術來確定。

如此，rAAV包括於vp1、vp2、及/或vp3蛋白質之rAAV衣殼亞群中具有去醯胺的胺基酸，至少包括至少一亞群，該亞群包含至少一高度去醯胺的天冬醯胺酸。此外，其它修飾可包括異構物化，特別是於選擇的天冬胺酸(D或Asp)殘基位置。於另一些實施方式，修飾可包括於Asp位置的醯胺化。

於某些實施方式，AAV衣殼含有與vp蛋白質之經編碼的胺基酸序列相比具有至少4個至至少約25個去醯胺的胺基酸殘基位置的vp1、vp2及vp3之亞群，其中至少1至10%被去醯胺。此等中的大多數可為N殘基。然而，Q殘基亦可被去醯胺。

於某些實施方式，rAAV具有具vp1、vp2及vp3蛋白質之AAV衣殼，該等蛋白質具有包含於實施例1所提供的表中所列位置的二、三、四或多個去醯胺殘基之組合的亞群，且藉由引用併入本文。於rAAV中去醯胺化可使用2D膠體電泳及/或質譜、及/或蛋白質建模(protein modelling)技術確定。線上層析可用Acclaim PepMap管柱及與具NanoFlex源的Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific)耦合的Thermo UltiMate 3000 RSLC 系統(Thermo Fisher Scientific)而進行。MS數據是使用Q Exactive HF的數據依賴性top-20方法所獲取，可從勘測掃描(200–2000 m/z)中動態選擇最豐富的尚未測序的前驅物離子。經由較高能量的碰撞解離片段進行定序，並以預測性自動增益控制確定目標值1e5離子，以4 m/z的窗口進行前驅物分離。以m/z 200時的解析度為120,000獲得勘測掃描。在m/z200時，HCD光譜的解析度可設置為30,000，最大離子注入時間為50 ms，正規化碰撞能量為30。S-lens RF水平可以設定為50，以使達到胜肽自消化物中佔據的m/z區域之最佳透射率。前驅物離子可以從片段化選擇中以單個、未指定的、或六個及更高的電荷狀態排除。BioPharma Finder 1.0軟件(Thermo Fischer Scientific)可用於分析所獲取的數據。對於胜肽作圖(peptide mapping)，使用單輸入蛋白質FASTA數據庫進行搜索，其中胺甲醯甲基化設定為固定修飾；將氧化、去醯胺及磷酸化設定為可變修飾，質量精度為10 ppm，高蛋白酶特異性，及MS/MS光譜的信賴度為0.8。適合的蛋白酶之例可以包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。去醯胺胜肽的質譜鑑定相對簡單，因去醯胺化增加完整分子的質量+0.984 Da(-OH及–NH² 基團之間的質量差)。特定胜肽的去醯胺化百分比由去醯胺胜肽的質量面積除以去醯胺和與天然胜肽的面積之和而確定。考慮到可能的去醯胺化位的數目，在不同位置去醯胺的同量異位物種(isobaric species)可能在一個峰中共遷移。因此，源自具有多個潛在去醯胺位點的胜肽的片段離子可用於定位或區分多個去醯胺位。於此等情形，觀察到的同位素圖譜內的相對強度可用於特異性確定不同的去醯胺胜肽異構體的相對豐度。此方法假定所有異構物的片段化效率相同，且在去醯胺化位點上是獨立的。本項技術領域中具通常知識者應理解，可使用此等說明性方法的多種變型。例如，適合的質譜儀可包括例如四極飛行時間質譜儀(QTOF)，諸如Waters Xevo或Agilent 6530或軌道儀器，諸如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(Thermo Fisher)。適合的液相層析系統包括：例如，來自Waters或Agilent systems(1100或1200系列)之Acquity UPLC system。適合的資料分析軟體可包括，例如，MassLynx(Waters)、Pinpoint及Pepfinder(Thermo Fischer Scientific)、Mascot(Matrix Science)、Peaks DB(Bioinformatics Solutions)。還可描述其它技術，例如，於X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267，線上公開於2017年6月16日。

除去醯胺化外，可發生其它修飾而不會導致一個胺基酸轉換為不同的胺基酸殘基。此種修飾可以包括乙醯化殘基、異構化、磷酸化或氧化。

去醯胺化的調節：於某些實施方式，修飾AAV以改變天冬醯胺酸-甘胺酸對中的甘胺酸，以減少去醯胺化。於其它實施方式，將天冬醯胺酸改變為不同的胺基酸，例如以較慢的速度去醯胺的麩醯胺；或缺少醯胺基的胺基酸(例如，麩醯胺及天冬醯胺酸含有醯胺基)；及/或缺少胺基的胺基酸(例如離胺酸、精胺酸及組胺酸含有胺基)。如本文所使用，缺乏醯胺或胺側基的胺基酸係指例如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、胱胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸及/或脯胺酸。諸如所述的修飾可為於編碼的AAV胺基酸序列中發現的一、二或三個天冬醯胺酸-甘胺酸對中。於某些實施方式，在所有四個天冬醯胺酸-甘胺酸對中沒有進行此種修飾。如此，用於減少具有較低去醯胺化率的AAV及/或工程化AAV變異體的去醯胺化的方法。另外，或替代地，可以將一或多個其它醯胺胺基酸改變為非醯胺胺基酸以減少AAV的去醯胺化。於某些實施方式，本文所述的突變體AAV衣殼含有天冬醯胺酸-甘胺酸對中的突變，使得甘胺酸改變為丙胺酸或絲胺酸。突變體AAV衣殼可以含有一個、兩個或三個突變體，其中參考AAV天然地含有四個NG對。於某些實施方式，AAV衣殼可含有一個、兩個、三個或四個此種突變體，其中參考AAV天然地含有五個NG對。於某些實施方式，突變體AAV衣殼在NG對中僅含有單個突變。於某些實施方式，突變體AAV衣殼含有兩個不同NG對中的突變。於某些實施方式，突變體AAV衣殼含有兩個不同的NG對的突變，其位於AAV衣殼中結構上分開的位置。於某些實施方式，該突變並未位於VP1-獨特區域。於某些實施方式，突變之一者位於VP1-獨特區域。可選擇地，突變體AAV衣殼於NG對不含修飾，但含有突變以最小化或消除位於NG對之外的一個或多個天冬醯胺酸或麩醯胺中的去醯胺化。於AAVhu68衣殼蛋白質，4殘基(N57、N329、N452、N512)通常顯示去醯胺化程度＞70%及多數情況下於各個批次中的去醯胺程度＞90%。其它天冬醯胺殘基(N94、N253、N270、N304、N409、N477及Q599)在各個批次中亦顯示出高達20%的去醯胺化程度。最初使用胰蛋白酶消化物鑑定去醯胺化程度，並用胰凝乳蛋白酶消化物驗證。

AAVhu68衣殼含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內和vp3蛋白質內的亞群，此等亞群具有對SEQ ID NO：2中預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群至少包括某些去醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞群包含SEQ ID NO：2的天冬醯胺酸-甘胺酸對中包含至少一、二、三或四個高度去醯胺的天冬醯胺酸(N)位置，且可選擇地進一步包含其它去醯胺的胺基酸，其中去醯胺化產生胺基酸改變及其它可選擇的修飾。此等及其它修飾的各種組合述於本文中。

於某些實施方式，本文所述的rAAV為自身互補AAV。「自身互補AAV」係指其中重組AAV核酸序列所攜帶的編碼區域已被設計以形成分子內雙股DNA模板的構築體。於感染時，scAAV的兩個互補部分將結合在一起，而不是等待細胞媒介的第二股的合成，而形成一個雙股DNA(dsDNA)單元，其準備用於立即複製及轉錄。參見，例如，D M McCarty et al, “Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”, Gene Therapy,(August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254。自身互補AAV述於例如，U.S.專利號6,596,535；7,125,717；及7,456,683，其每一者藉由引用而完整併入本文。

本文所述重組腺相關病毒(AAV)可使用已知技術生產。參見，例如，WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此種方法涉及培養含有編碼AAV衣殼的核酸序列；功能性rep基因；如本文所述的表現匣，其側翼為AAV反向末端重複序列(ITR)；及足夠的輔助者功能，以允許將表現匣包裝到AAV衣殼蛋白質中的宿主細胞。本文還亦提供宿主細胞，其含有編碼AAV衣殼的核酸序列；功能性rep基因；所述的載體基因體；以及足夠的輔助者功能以允許將載體基因體包裝到AAV衣殼蛋白質中。於一實施方式，宿主細胞是HEK 293細胞。於一實施方式，此等方法被更詳細地描述WO2017160360 A2，其藉由引用而併入本文。

可以利用本項技術領域中具通常知識者可獲得的生產rAAV的其它方法。適合的方法可包括但不限於桿狀病毒表現系統或經由酵母菌生產。參見，例如，Robert M. Kotin, Large-scale recombinant adeno-associated virus production. Hum Mol Genet. 2011 Apr 15；20(R1)：R2–R6. 2011年4月29日線上發表 doi：10.1093/hmg/ddr141；Aucoin MG et al., Production of adeno-associated viral vectors in insect cells using triple infection：optimization of baculovirus concentration ratios. Biotechnol Bioeng. 2006 Dec 20;95(6):1081-92；SAMI S. THAKUR, Production of Recombinant Adeno-associated viral vectors in yeast。2012年提交給佛羅里達大學研究生院的論文；Kondratov O et al. Direct Head-to-Head Evaluation of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors Manufactured in Human versus Insect Cells, Mol Ther. 2017 Aug 10. pii：S1525-0016(17)30362-3. doi：10.1016/j.ymthe.2017.08.003. [Epub ahead of print]；Mietzsch M et al, OneBac 2.0：Sf9 Cell Lines for Production of AAV1, AAV2, and AAV8 Vectors with Minimal Encapsidation of Foreign DNA. Hum Gene Ther Methods. 2017 Feb;28(1):15-22. doi：10.1089/hgtb.2016.164.；Li L et al. Production and characterization of novel recombinant adeno-associated virus replicative-form genomes：a eukaryotic source of DNA for gene transfer. PLoS One. 2013 Aug 1;8(8):e69879. doi：10.1371/journal.pone.0069879. Print 2013；Galibert L et al, Latest developments in the large-scale production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward the treatment of neuromuscular diseases. J Invertebr Pathol. 2011 Jul;107 Suppl:S80-93. doi：10.1016/j.jip.2011.05.008；and Kotin RM, Large-scale recombinant adeno-associated virus production. Hum Mol Genet. 2011 Apr 15;20(R1):R2-6. doi：10.1093/hmg/ddr141. Epub 2011 Apr 29。

於高鹽濃度下進行兩步驟親和層析純化，然後使用陰離子交換樹脂層析純化，以純化載體藥物產物並去除空衣殼。更詳細描述此等方法於WO 2017/160360，標題為「Scalable Purification Method for AAV9」，其藉由引用而併入本文。簡而言之，從基因體缺陷的AAV9中間體中分離具有包裝的基因體序列的rAAV9顆粒的方法涉及使包含重組AAV9病毒顆粒和AAV 9衣殼中間體的懸浮液進行快速高效液相層析，其中將AAV9病毒顆粒和AAV9中間體結合至一種強陰離子交換樹脂，平衡於pH值為10.2，並經過鹽梯度而同時監測洗脫液在約260和280的紫外線吸收率。儘管對於rAAV9不是最佳的，但pH可於約10.0至10.4的範圍內。於此方法中，從A260/A280之比達到反曲點時洗脫的劃分中收集AAV9完整衣殼。於一例中，對於親和層析步驟，可以將滲濾的產物應用於有效捕捉AAV2/9血清型的Capture SelectTM Poros-AAV2/9親和樹脂(Life Technologies)。於此等離子條件下，顯著百分比之殘留的細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。

表徵或定量rAAV的通常方法為本項技術領域中具通常知識者可獲得。為了計算空的及完整的顆粒含量，針對負載的GC顆粒繪製所選樣品(例如，在本文的實施例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中GC的#＝顆粒的#)的VP3帶體積。所生成的線性方程式(y=mx+c)用於計算測試物品峰的帶狀體積中的顆粒數量。然後將每20 µL負載的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到顆粒與基因體拷貝的比率(pt/GC)。 Pt/mL–GC/mL給予空的pt/mL。空的pt/mL除以pt/mL及x 100得到空顆粒的百分比。通常，用於分析具有包裝的基因體的空的衣殼及AAV載體顆粒的方法已為本領域所知。參見，例如，Grimm et al., Gene Therapy(1999)6:1322-1330；Sommer et al., Molec. Ther.(2003)7:122-128。為了測試衣殼的變性，該方法包括對處理過的AAV備料(stock)進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該電泳由能夠分離三種衣殼蛋白的任何凝膠組成，例如，在緩衝液中含有3-8%的Tris-醋酸鹽的梯度凝膠，然後運行凝膠直到分離出樣品材料，然後將凝膠印漬到尼龍或硝酸纖維素膜上，較佳為尼龍。然後將抗AAV衣殼抗體使用作為結合至變性衣殼蛋白質的一級抗體，較佳為抗AAV衣殼單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al., J. Viral.(2000)74:9281-9293)。然後使用二級抗體，該二級抗體與一級抗體結合且含有用於檢測與一級抗體的結合的手段，更佳為含有與其共價結合的檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化物酶共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體的抗體。使用檢測結合的方法用於半定量確定一級抗體和二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，可以從管柱劃分中取出樣品，並於含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE上樣緩衝液(loading buffer)中加熱，然後將衣殼蛋白質溶解於預製的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)上。可以根據製造商的說明使用SilverXpress(Invitrogen，CA)或其它適合的染色方法(即SYPRO紅寶石或考馬斯染色)進行銀染色。於一實施方式，可藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量管柱劃分中的AAV載體基因體(vg)的濃度。稀釋樣品並以DNase I(或其它合適的核酸酶)消化以移除外源的DNA。核酸酶失活後，使用引子及對引子之間的DNA序列特異的TaqMan™螢光探針進一步稀釋及擴增樣品。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量每個樣品達到定義的螢光水平所需的循環數(閾值循環，Ct)。使用含有與AAV載體中含的序列相同的序列的質體DNA，以於Q-PCR反應中生成標準曲線。從樣品獲得的循環閾值(Ct)數值係藉由將其標準化為質體標準曲線的Ct值來確定載體基因體力價(titer)。亦可使用基於數位PCR的終點分析。

於一態樣，使用了優化的q-PCR方法，其利用廣譜絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K（例如可由Qiagen商購)。更具體而言，優化的qPCR基因體力價分析與標準分析相似，除了係於DNase I消化後，將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後進行熱失活。適合地，以其量等於樣品量的蛋白酶K緩衝液稀釋樣品。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理為約0.2mg/mL，但可於0.1mg/mL至約1mg/mL之間變化。該處理步驟通常於約55℃下進行約15分鐘，但可於較低溫度(例如約37℃至約50℃)下於較長時間(例如約20分鐘至約30分鐘)下進行；或者於短的時間段(例如，約5至10分鐘)內使用較高的溫度(例如，高至約60°C)。相似地，熱失活通常於約95℃持續約15分鐘，但溫度可以降低(例如約70至約90℃)且時間延長(例如約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如1000倍)，並如標準分析進行TaqMan分析。

另外地或可替代地，可使用液滴數位PCR(droplet digital PCR(ddPCR))。例如，已描述一種藉由ddPCR確定單股及自身互補的AAV載體基因體力價的方法。參見，例如，M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi：10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。

亦可使用確定衣殼蛋白質之vp1、vp2及vp3之比率的方法。參見，例如，Vamseedhar Rayaprolu et al, Comparative Analysis of Adeno-Associated Virus Capsid Stability and Dynamics, J Virol. 2013 Dec；87(24)：13150–13160；Buller RM, Rose JA. 1978. Characterization of adenovirus-associated virus-induced polypeptides in KB cells. J. Virol. 25:331–338；and Rose JA, Maizel JV, Inman JK, Shatkin AJ. 1971. Structural proteins of adenovirus-associated viruses. J. Virol. 8:766–770。

應當理解，本文所述的rAAV中的組成意圖應用於整個說明書中描述的其它組成物、方案，態樣，實施方式及方法。

醫藥組成物 一種包含hGAA780I融合蛋白質或包含hGAA780I融合蛋白質轉基因的表現匣之醫藥組成物，其可為液體懸浮液、冷凍乾燥的冷凍的組成物、或其它適合的調配物。於某些實施方式，該組成物包含hGAA780I融合蛋白質或表現匣及生理上相容的液體(例如，溶液、稀釋液、載劑)，其形成懸浮液。此種液體較佳為水溶液系且可含有一或多種：緩衝劑、界面活性劑、pH調節劑、防腐劑或其它適合的賦形劑。適合的組件將於下文更詳細地討論。該醫藥組成物包含水性懸浮液及任何選擇的賦形劑，以及hGAA780I融合蛋白或表現匣。

於某些實施方式，該醫藥組成物包含表現匣及非病毒遞送系統，該表現匣包含轉基因。此可包括，例如，裸露的DNA、裸露的RNA、無機粒子、液體或類液體顆粒、幾丁聚醣系調配物及其它此領域已知者並例如上列引述之Ramamoorth and Narvekar)。於其它實施方式，該醫藥組成物為一懸浮液，其包含表現匣，該表現匣包含工程化於病毒載體系統中的轉基因。於某些實施方式，該醫藥組成物包含非複製的病毒載體。適合的病毒載體可包括任何適合的遞送載體，諸如例如，重組腺病毒、重組慢病毒、重組波卡病毒、重組腺相關病毒(AAV)、或其它重組小病毒。於某些實施方式，該病毒載體為遞送基因產物至需要其之病患中之重組AAV。

於一實施方式，該醫藥組成物包含hGAA780I融合蛋白質或包含hGAA780I融合蛋白質之編碼序列的表現匣及適於經由腦室內(ICV)、鞘內(IT)、腦池內、或靜脈內(IV)遞送之注射調配物緩衝液。於一實施方式，該表現匣為包裝有重組病毒載體(即攜帶融合蛋白質的rAAV.hGAA780I)的載體基因體的一部分。

於一實施方式，該醫藥組成物包含hGAA780I融合蛋白質、其功能性片段，以作為酶替代療法(ERT)遞送至受試者。此種醫藥組成物通常經靜脈內投予，然而於某些情況下亦也經皮內、肌肉內或口服投予。可以給予該組成物以預防罹患龐貝氏病或處於龐貝氏病風險的個體。於治療應用，將醫藥組成物以足以降低累積的代謝物的濃度及/或預防或阻止代謝物的進一步累積的量投予於罹患確立疾病的病患。對於有胞溶體酶缺乏症風險的個體，預防性地投予足以預防或抑制代謝物積聚的量之醫藥組成物。以治療有效量投予本文所述的經修飾的GAA組成物。一般而言，治療有效量可根據受試者的醫療狀況的嚴重度及受試者的年齡、一般狀況及性別而變化。劑量可由醫生確定，並可依需要進行調整以適合所觀察的治療的效果。於一態樣，本文提供者為用於ERT的醫藥組成物，其被調配為含有hGAA780I融合蛋白質或其功能片段hGAA780I融合蛋白質的單位劑量。

於一實施方式，組成物包括適於遞送至受試者的最終調配物，例如為緩衝至生理上可相容的pH和鹽濃度的水性液體懸浮液。可選擇地，調配物中存在一種或多種界面活性劑。於另一實施方式，可以將組成物作為濃縮物運送，將其稀釋以投予至受試者。於其它實施方式，組成物可被凍乾並在給藥時複溶。

於一實施方式，本文提供之組成物包含溶解在水性懸浮液中的界面活性劑、防腐劑、賦形劑、及/或緩衝劑。於一實施方式，緩衝劑為PBS。於另一實施方式，緩衝劑為人工腦脊髓液(aCSF)，例如，Eliott’s調配緩衝劑；或Harvard apparatus 灌注液(具有下列最終離子濃度的人工CSF(以mM表示)：Na 150；K 3.0；Ca 1.4；Mg 0.8；P 1.0；Cl 155)。已知各種適合的溶液，其包括彼等包括以下之一或多者：緩衝食鹽水、界面活性劑、及生理上可相容的鹽或鹽之混合物，其離子強度調節至相當於約100 mM氯化鈉(NaCl)至約250 mM氯化鈉，或調整至等效離子濃度的生理上可相容的鹽。

適合地，該調配物被調整至生理上可接受的pH，例如，於範圍pH 6至8、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7、或pH 7.2至7.8。由於腦脊髓液之pH為約7.28至約7.32，對於鞘內遞送，於此範圍內的pH為冀望的；而於靜脈內遞送，pH6.8至約7.2為冀望的。然而，可選擇最寬範圍及此等次範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。

適合的界面活性劑或界面活性劑的組合可選自無毒非離子界面活性劑。於一實施方式，選擇終止於一級羥基的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如Pluronic® F68 [BASF]，也稱為泊洛沙姆188(Poloxamer 188)，其具有中性pH，平均分子量為8400。可以選擇其它界面活性劑和其它泊洛沙姆，即由兩側是兩個聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))親水鏈的聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))中央疏水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(聚乙烯二醇-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧基辛基甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。於一實施方式，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常用字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給出聚氧丙烯核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧乙烯含量百分比。於一實施方式，選擇泊洛沙姆188。界面活性劑可於懸浮液之高至約0.0005%至約0.001%的量存在。

於一例中，調配物可含有，例如，緩衝食鹽溶液，其包含於水中的氯化鈉、碳酸氫鈉、右旋糖、硫酸鎂(例如硫酸鎂·7H2O)、氯化鉀、氯化鈣(例如氯化鈣·2H2O)、磷酸二鈉及其等之混合物中的一或多種。適合地，對於鞘內遞送，容積滲透濃度在與腦脊髓液相容的範圍內(例如，約275至約290)；參見，例如，emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。可選擇地，對於鞘內遞送，可使用市售稀釋劑作為懸浮劑，或與另一種懸浮劑及其它可選擇的賦形劑組合使用。參見，例如，Elliotts B® solution [Lukare Medical]。

於其它實施方式，調配物可含有一或多種滲透增強劑。適當的滲透增強劑之例可包括例如，甘露醇、甘胺膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。

此外提供一種醫藥組成物，其包含醫藥上可接受的載劑及包含本文所述核酸序列的載體。如本文所使用，「載劑」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒劑、塗料、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑、緩衝劑、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此類用於醫藥活性物質的介質及試劑的用途為技術領域中所熟知。補充的活性成分亦可併入此組成物中。遞送媒劑，例如脂質體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。特別是，可調配rAAV載體用於遞送包封於脂質粒子、脂質體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等之中。於一實施方式，治療上有效量之該載體被包括於醫藥組成物。載劑之選擇並非本發明之一限制要件。其它習用的醫藥上可接受的載劑，諸如防腐劑、或化學穩定劑。適合的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯、乙基香莢蘭素、甘油、苯酚及對氯苯酚。適合的化學穩定劑包括明膠及白蛋白。

用語「醫藥上可接受」係指當投予於宿主時不會產生過敏或類似的不良反應的分子實體及組成物。

如本文所使用，術語「劑量」或「量」可指於治療過程中投予至對象的總劑量或量，或以單一單位(或多個單位或分開的劑量)投予的方式所遞送的劑量或量。

本文所述水性懸浮液或醫藥組成物被設計用於藉由任何適的合途徑或不同途徑的組合遞送至有需要的受試者。於一實施方式，醫藥組成物被調配用於經由腦室內(ICV)、鞘內(IT)、或腦池內注射遞送。於一實施方式，本文所述組成物被設計用以藉由靜脈內注射遞送至需要其之受試者。或者，可選擇其它投予途徑(例如，口服、吸入、鼻內、氣管內、動脈內、眼內、肌肉內、及其它途徑)。

如本文所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指藥物藉由注射入椎管的投予途徑，更具體而言為進入蜘蛛膜下腔以使其到達腦脊液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內、枕骨下/腦池內及/或C1-2穿刺。例如，可以藉由腰椎穿刺方法導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。於另一例中，注射可進入小腦延髓池。腦池內遞送可增加載體擴散及/或減少由投予引起的毒性及炎症。參見，例如，Christian Hinderer et al, Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna, Mol Ther Methods Clin Dev. 2014; 1：14051，線上公開於2014年12月10日，doi： 10.1038/mtm.2014.51。

如本文所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指藥物直接進入腦室之腦脊髓液或小腦延髓池小腦延髓(cisterna magna cerebellomedularis)之腦脊液中的投予途徑，更具體而言為經由枕骨下穿刺或直接注射入至小腦延髓池或通過永久定位的管子注射入腦室大池。

於一態樣，本文所提供者為一種醫藥組成物，其包含如本文所述的載體於調配緩衝劑中。於某些實施方式，複製缺陷病毒組成物可以劑量單元被調配以含有一定量之複製缺陷病毒，範圍為約1.0 x 10⁹ GC至約1.0 x 10¹⁶ GC(治療平均體重70kg的受試者)，包括該範圍內的所有整數或分數量，並對於人類病患較佳為1.0x10¹² GC至1.0x10¹⁴ GC。於一實施方式，組成物被調配成每劑量含有至少1x10⁹ 、2x10⁹ 、3x10⁹ 、4x10⁹ 、5x10⁹ 、6x10⁹ 、7x10⁹ 、8x10⁹ 、或9x10⁹ GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一實施方式，組成物被調配成每劑量含有至少1x10¹⁰ 、2x10¹⁰ 、3x10¹⁰ 、4x10¹⁰ 、5x10¹⁰ 、6x10¹⁰ 、7x10¹⁰ 、8x10¹⁰ 、或9x10¹⁰ GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一實施方式，組成物被調配成每劑量含有至少1x10¹¹ 、2x10¹¹ 、3x10¹¹ 、4x10¹¹ 、5x10¹¹ 、6x10¹¹ 、7x10¹¹ 、8x10¹¹ 、或9x10¹¹ GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一實施方式，組成物被調配成每劑量含有至少1x10¹² 、2x10¹² 、3x10¹² 、4x10¹² 、5x10¹² 、6x10¹² 、7x10¹² 、8x10¹² 、或9x10¹² GC，包括該範圍內的所有整數或分數量，於另一實施方式，組成物被調配成每劑量含有至少1x10¹³ 、2x10¹³ 、3x10¹³ 、4x10¹³ 、5x10¹³ 、6x10¹³ 、7x10¹³ 、8x10¹³ 、或9x10¹³ GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一實施方式，組成物被調配成每劑量含有至少1x10¹⁴ 、2x10¹⁴ 、3x10¹⁴ 、4x10¹⁴ 、5x10¹⁴ 、6x10¹⁴ 、7x10¹⁴ 、8x10¹⁴ 、或9x10¹⁴ GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一實施方式，組成物被調配成每劑量含有至少1x10¹⁵ 、2x10¹⁵ 、3x10¹⁵ 、4x10¹⁵ 、5x10¹⁵ 、6x10¹⁵ 、7x10¹⁵ 、8x10¹⁵ 、或9x10¹⁵ GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於一實施方式，用於人類施用，劑量之範圍可在每劑量1x10¹⁰ 至約1x10¹² GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。

於一實施方式，所提供者為一醫藥組成物，其包含本文所述rAAV於調配緩衝劑中。於一實施方式，rAAV被調配為約1 x 10⁹ 基因體拷貝(GC)/mL至約1 x 10¹⁴ GC/mL。於另一實施方式，rAAV被調配為約3 x 10⁹ GC/mL至約3 x 10¹³ GC/mL。於再另一實施方式，rAAV被調配為約1 x 10⁹ GC/mL至約1 x 10¹³ GC/mL。於一實施方式，rAAV被調配為至少約1 x 10¹¹ GC/mL。

於一實施方式，包含本文所述之rAAV的醫藥組成物可以投予劑量每公克腦質量約1 x 10⁹ GC至每公克腦質量約1 x 10¹⁴ GC。

應理解，本文所述的藥物組成物中的組成物係意圖應用於整個說明書中描述的其它組成物、治療方案、態樣、實施方式及方法。

治療之方法 提供用於治療患有龐貝氏病的病患的治療方案，其包括如本文所述的表現匣、rAAV、及/或hGAA780I融合蛋白質，可選擇地與免疫調節劑組合。於某些實施方式，患者患有遲發型龐貝氏病。於其它實施方式，病患患有兒童期發作型龐貝氏病。於某些實施方式，共同治療與表現匣、rAAV或hGAA780I融合蛋白質諸如免疫調節方案一起被遞送。另外地或可替代地，共同治療可包括一或多種之支氣管擴張劑、乙醯膽鹼酶抑制劑、呼吸肌力量訓練(RMST)、酶替代療法、及/或橫膈節律治療法。於某些實施方式，病患接受單一投予之rAAV。於某些實施方式，病患接受單一投予之組成物，其包含本文所述之表現匣及/或rAAV。於某些實施方式，此單一投予之包含有效量之表現匣的組成物涉及至少一次共同治療。於某些實施方式，對病患投予表現匣、rAAV及/或hGAA780I融合蛋白質，或如本文所述實質上同時經由兩種不同途徑投予。於某些實施方式，兩種不同的注射途徑為靜脈內及鞘內投予。於一實施方式，組成物為一懸浮液，被腦室內、鞘內、腦池內、或靜脈內地遞送至受試者。於某些實施方式，對α-葡萄糖苷酶缺乏症的病患投予本文提供的組成物以改善心臟、呼吸及/或骨骼肌功能中的一或多者。於某些實施方式，作為治療的結果，於心臟、CNS(腦)及/或骨骼肌中的一或多者中肝醣貯積及/或自噬積累減少。

於某些實施方式，表現匣、rAAV、病毒或非病毒載體被用於製備醫藥。於某些實施方式，提供一種用於治療龐貝氏病之組成物之用途。

此等組成物可與其它療法組合使用，包括例如，免疫療法、酶替代療法(例如，Lumizyme，由Genzyme銷售，Sanofi公司，及美國外以Myozyme銷售)。龐貝氏病的其它治療為對症治療與支持性治療。例如，可能需要呼吸支持；物理療法可能有助於增強呼吸肌；一些病患可能需要在夜間及/或日間經由機械換氣(即雙呼吸或容積呼吸器)進行呼吸輔助。此外，於呼吸道感染期間可能需要額外的支持。對於某些病患，建議使用包括支架在內的骨科設備。對於某些骨科症狀可能需要手術，諸如攣縮或脊柱畸形。某些嬰兒可能需要插入一條穿過鼻子向下通過食道並進入胃的餵食管(鼻胃管)。於某些兒童中，可能需要通過腹壁上的一個小手術開口將餵食管直接插入胃中。一些患有遲發型龐貝氏病的個體可能需要軟質飲食，但少數需要餵食管。

如本文所述，術語「增加」(例如，於組織、血液等中測量之以hGAA780I融合蛋白質治療後增加hGAA水平)或「降低」、「減少」、「改善」「增進」、「延遲」或其任何語法變化，或表示變化的任何類似術語，除非另外說明，否則與對應的參考相比(例如，未經治療的對照組或處於正常狀況而未罹患龐貝氏病的受試者)，意指約5倍、約2倍、約1倍、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、或約5%的變化。

如本文可互換使用的「病患」或「受試者」，意指雄性或雌性哺乳動物，包括人類、獸醫學或農場動物、家畜或寵物、以及通常用於臨床研究的動物。於一實施方式，此等方法與組成物的對象為人類病患。於一實施方式，此等方法與組成物的對象為男性或女性人類。

於一實施方式，懸浮液具有約7.28至約7.32之pH。

可由本項技術領域中具通常知識者確定用於遞送此等劑量和濃度的適合體積。例如，可選擇約1 µL至150 mL的體積，成人則選擇較高的體積。 通常，對於新生嬰兒，適合的體積為約0.5mL至約10mL，對於年齡較大的嬰兒，可以選擇約0.5mL至約15mL。對於幼兒，可選擇約0.5 mL至約20 mL的體積。對於兒童，可選擇多至約30 mL的體積。對於前青少年(pre-teens)和青少年(teens)，可選擇多至約50 mL的體積。於另一些實施方式，病患可接受鞘內投予的體積為約5mL至約15mL，或約7.5mL至約10mL。可確定其它適合的體積及劑量。將調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可根據運用的重組載體的治療應用而變化。

於一實施方式，包含本文所述的rAAV之組成物可投予之劑量為每公克腦質量約1x10⁹ GC至每公克腦質量約1x10¹⁴ GC。於某些實施方式，以每公斤體重約1×10⁹ GC至每公斤體重約1×10¹³ GC的劑量全身性共同投予。

於一實施方式，受試者被遞送治療上有效量之本文所述的表現匣、rAAV或hGAA780I融合蛋白質。如本文所使用，「治療上有效量」係指表現匣、rAAV、或hGAA780I融合蛋白質、或其組合的量。如此，於某些實施方式，該方法包含投予至受試者rAAV或表現匣以遞送hGAA780I融合蛋白質-編碼核酸序列，與包含本文所提供的hGAA780I融合蛋白質酶之組成物一起投予。

於一實施方式，該表現匣於載體基因體中以每公克腦質量約1 x 10⁹ GC至約1 x 10¹³ 基因體拷貝(GC)被遞送，包括該範圍及端點內的所有整數或分數量。於另一實施方式，劑量為每公克腦質量1 x 10¹⁰ GC至每公克腦質量約1 x 10¹³ GC。於特定實施方式，投予至病患的載體之劑量為至少約1.0 x 10⁹ GC/g、約1.5 x 10⁹ GC/g、約2.0 x 10⁹ GC/g、約2.5 x 10⁹ GC/g、約3.0 x 10⁹ GC/g、約3.5 x 10⁹ GC/g、約4.0 x 10⁹ GC/g、約4.5 x 10⁹ GC/g、約5.0 x 10⁹ GC/g、約5.5 x 10⁹ GC/g、約6.0 x 10⁹ GC/g、約6.5 x 10⁹ GC/g、約7.0 x 10⁹ GC/g、約7.5 x 10⁹ GC/g、約8.0 x 10⁹ GC/g、約8.5 x 10⁹ GC/g、約9.0 x 10⁹ GC/g、約9.5 x 10⁹ GC/g、約1.0 x 10¹⁰ GC/g、約1.5 x 10¹⁰ GC/g、約2.0 x 10¹⁰ GC/g、約2.5 x 10¹⁰ GC/g、約3.0 x 10¹⁰ GC/g、約3.5 x 10¹⁰ GC/g、約4.0 x 10¹⁰ GC/g、約4.5 x 10¹⁰ GC/g、約5.0 x 10¹⁰ GC/g、約5.5 x 10¹⁰ GC/g、約6.0 x 10¹⁰ GC/g、約6.5 x 10¹⁰ GC/g、約7.0 x 10¹⁰ GC/g、約7.5 x 10¹⁰ GC/g、約8.0 x 10¹⁰ GC/g、約8.5 x 10¹⁰ GC/g、約9.0 x 10¹⁰ GC/g、約9.5 x 10¹⁰ GC/g、約1.0 x 10¹¹ GC/g、約1.5 x 10¹¹ GC/g、約2.0 x 10¹¹ GC/g、約2.5 x 10¹¹ GC/g、約3.0 x 10¹¹ GC/g、約3.5 x 10¹¹ GC/g、約4.0 x 10¹¹ GC/g、約4.5 x 10¹¹ GC/g、約5.0 x 10¹¹ GC/g、約5.5 x 10¹¹ GC/g、約6.0 x 10¹¹ GC/g、約6.5 x 10¹¹ GC/g、約7.0 x 10¹¹ GC/g、約7.5 x 10¹¹ GC/g、約8.0 x 10¹¹ GC/g、約8.5 x 10¹¹ GC/g、約9.0 x 10¹¹ GC/g、約9.5 x 10¹¹ GC/g、約1.0 x 10¹² GC/g、約1.5 x 10¹² GC/g、約2.0 x 10¹² GC/g、約2.5 x 10¹² GC/g、約3.0 x 10¹² GC/g、約3.5 x 10¹² GC/g、約4.0 x 10¹² GC/g、約4.5 x 10¹² GC/g、約5.0 x 10¹² GC/g、約5.5 x 10¹² GC/g、約6.0 x 10¹² GC/g、約6.5 x 10¹² GC/g、約7.0 x 10¹² GC/g、約7.5 x 10¹² GC/g、約8.0 x 10¹² GC/g、約8.5 x 10¹² GC/g、約9.0 x 10¹² GC/g、約9.5 x 10¹² GC/g、約1.0 x 10¹³ GC/g、約1.5 x 10¹³ GC/g、約2.0 x 10¹³ GC/g、約2.5 x 10¹³ GC/g、約3.0 x 10¹³ GC/g、約3.5 x 10¹³ GC/g、約4.0 x 10¹³ GC/g、約4.5 x 10¹³ GC/g、約5.0 x 10¹³ GC/g、約5.5 x 10¹³ GC/g、約6.0 x 10¹³ GC/g、約6.5 x 10¹³ GC/g、約7.0 x 10¹³ GC/g、約7.5 x 10¹³ GC/g、約8.0 x 10¹³ GC/g、約8.5 x 10¹³ GC/g、約9.0 x 10¹³ GC/g、約9.5 x 10¹³ GC/g、或約1.0 x 10¹⁴ GC/g腦質量。

於一實施方式，治療方法包含遞送hGAA780I融合蛋白質作為酶替代療法。於某些實施方式，hGAA780I融合蛋白質被遞送作為ERT，與基因治療(包括但不限於本文所提供之表現匣或rAAV)組合。於某些實施方式，該方法包含投予至受試者多於一種之ERT(例如，包含hGAA780I融合蛋白質與另一治療性蛋白質諸如Lumizyme組合之組成物)。於每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或以上之日可投予一種包含本文所述之hGAA780I融合蛋白質之組成物至受試者。可藉由靜脈內輸注至門診病患，每週、每月或每兩個月開一次處方。化合物之適當的治療有效劑量係由治療的臨床醫生選擇，且包括約1 μg/kg至約500 mg/kg、約10 mg/kg至約100 mg/kg、約20 mg/kg至約100 mg/kg及大致約20 mg/kg至大致約50 mg/kg。於一些實施方式，適合的治療劑為選自例如，0.1、0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、及100 mg/kg。

於某些實施方式，該方法包含投予hGAA780I融合蛋白質至受試者，每週以劑量10 mg/kg 病患體重或以上投予至病患。通常劑量大於每週10 mg/kg。劑量方案之範圍可由每週10 mg/kg至每週至少1000 mg/kg。典型地，劑量方案為每週10 mg/kg、每週15 mg/kg、每週20 mg/kg、每週25 mg/kg、每週30 mg/kg、每週35 mg/kg、每週40 mg/kg、每週45 mg/kg、每週60 mg/kg、每週80 mg/kg及每週120 mg/kg。於較佳方案，每週投予一次、二次、或三次10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg或40 mg/kg。治療通常持續至少4週，有時持續24週，有時持續整個病患的生命。可選擇地，於治療後監測人類α-葡萄糖苷酶之水平(例如，於血漿或肌肉中)且當偵測到的水平顯著低於正常人的值(例如，小於20%)時，投予另外劑量。於一實施方式，於初始「高」劑量(即，負載劑量」)投予hGAA780I，隨後投予較低劑量(即，「維持劑量」)。負載劑量之例為每週1至3次至少約40 mg/kg病患體重(例如，於1、2或3週)。維持劑量之例為每週至少約5至至少約10 mg/kg病患體重，或以上，諸如每週20 mg/kg、每週30 mg/kg、每週40 mg/kg。於某些實施方式，在劑量期間以增加的速率投予劑量。此可藉由增加靜脈內輸注的流速或藉由以恆定速率投予之遞增濃度的hGAA780I融合蛋白質的梯度而達成。以此方式投予可降低免疫原性反應的風險。於某些實施方式，靜脈內輸注發生在數小時的期間內(例如1-10小時，較佳為2-8小時，更佳為3-6小時)，且於投予期間，間隔一定時間增加輸注速率。

於一實施方式，此方法進一步包含受試者接受免疫抑制共療法。用於此種共療法的免疫抑制劑包括，但未限於糖皮質素、類固醇、抗代謝物質、T細胞抑制劑、巨環內酯(例如，雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物)、及細胞生長抑制劑(cytostatic agent)，包括烷化劑、抗代謝物、細胞毒性抗生素、抗體、或對親免素(immunophilin)有活性的藥劑。免疫抑制劑可包括氮芥(nitrogen mustard)、亞硝基脲、鉑化合物、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、氟尿嘧啶、放線菌素、蒽環類(anthracycline)、絲裂黴素C、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、IL-2受體或CD3導向抗體、抗IL-2抗體、環孢菌素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、類鴉片或TNF-α(腫瘤壞死因子-α)結合劑。於某些實施方式，免疫抑制療法可於基因療法施用之前的0、1、2、7或更多日開始。此等藥物中的一種或多種可於基因治療後以相同劑量或調整劑量持續投予。根據需要，此種治療可持續約1週(7日)，約60日或更長時間。

於一實施方式，將包含本文所述表現匣的組成物一次投予於需要的受試者。於某些實施方式，表現匣經由rAAV遞送。應當理解，本文所述的組成物及方法係意圖應用於整個說明書中描述的其它組成物、方案、態樣、實施方式及方法中。

本文提供的組成物及方法可被用於治療嬰幼期發作型-龐貝氏病或遲發型龐貝氏病及/或其相關症狀。於某些實施方式，可藉由改善一種或多種疾病症狀或減緩疾病進展而確定功效。嬰幼期發作型龐貝氏病的症狀包括但不限於肌張力不足、呼吸/吸氣問題、肝腫大、肥厚型心肌病，以及心臟、肌肉、中樞神經系統(尤其是運動神經元)中的肝醣貯積。遲發型龐貝氏病之症狀包括但未限於，近端肌肉無力、呼吸/吸氣問題以及肌肉和運動神經元中的肝醣貯積。可基於病患的狀況及/或診斷而確定投予途徑。於某些實施方式，提供一種用於治療被診斷出患有嬰幼兒發作型龐貝氏病或遲發型龐貝氏病的病患者之方法，該方法包括投予本文所述的rAAV以經由IV及ICM途徑的組合遞送hGAA780I融合蛋白質。於一些實施方式，對被鑑定為患有遲發型龐貝氏病的病患投予僅包括rAAV的全身遞送(例如，僅IV)的治療。如本文所述，包含rAAV的組成物之遞送可與酶替代療法(ERT)組合。於某些實施方式，提供一種用於治療被診斷患有龐貝氏病的受試者之方法，該方法包括與ERT組合而ICM遞送本文所述的rAAV。於某些實施方式，經由ICM注射對被鑑定為患有嬰幼兒發作型龐貝氏病的受試者投予本文所述的rAAV，且亦接受ERT以治療周圍疾病的各態樣。

「核酸」，如本文所述，可為RNA、DNA、或其修飾，且可為單股或雙股，且可自包括下列之群組選擇，例如：編碼目的蛋白質之核酸、寡核苷酸、核酸類似物，例如胜肽-核酸(PNA)、偽互補PNA(pc-PNA)、鎖定的核酸(LNA)等。此種核酸序列括但不限於，例如編碼蛋白質的核酸序列，作為轉錄抑制物、反義分子、核糖核酸酶(ribozyme)、小的抑制性核酸序列，例如但不限於RNAi、shRNAi、siRNA、微小RNAi(mRNAi)、反義寡核苷酸等。

「反向轉譯(backtranslating)」蛋白質、胜肽或多肽之方法為所屬技術領域中具通常知識者所知。一旦知悉蛋白質的序列，有基於網路及市售電腦程式，以及基於服務的公司，將胺基酸序列反向轉譯為核酸編碼序列。參見，例如，EMBOSS之 backtranseq(可於ebi.ac.uk/Tools/st線上取得)；Gene Infinity(可於geneinfinity.org/sms/sms_-backtranslation.html線上取得)；ExPasy(可於expasy.org/tools/線上取得)。於一實施方式，RNA及/或cDNA編碼序列被設計用以於人類細胞中最佳化表現。

於核酸序列之上下文中，術語「百分比(%)同一性」、「序列同一性」、「百分比序列同一性」、或「百分比相同的」係指兩個序列中對應比對時相同的殘基。序列同一性比較之長度冀望可為整個基因體之全長、基因編碼序列之全長、或至少約500至5000個核苷酸之片段。然而，亦可期望較小片段中的同一性，例如，至少約九個核苷酸，通常至少約20至24個核苷酸，至少約28至32個核苷酸，至少約36或更多個之核苷酸。

對於胺基酸序列，可在蛋白質、多肽、約32個胺基酸、約330個胺基酸或其胜肽片段或對應的核酸序列編碼序列的全長上容易地確定百分比同一性。適合的胺基酸片段的長度可為至少約8個胺基酸，且可為至多約700個胺基酸。一般而言，當提及兩個不同序列間的「同一性」、「同源性」或「相似性」時，參考「比對」序列來確定「同一性」、「同源性」或「相似性」。「比對」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常包含缺失或增加的鹼基或胺基酸的校正。

使用多種公開或市售的多序列比對程式中的任何一種進行比對。序列比對程序可用於胺基酸序列，例如，「Clustal X」、「Clustal Omega」「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及「Match-Box」程式。一般而言，儘管本項技術領域中具通常知識者可依需要更改此等設定，但是此等程式中的任何一個可以預設值使用。或者，本項技術領域中具通常知識者可利用另一種算法或電腦程式，該算法或電腦程式至少提供與所參考的算法及程式所提供的身份或比對水平。參見，例如，J. D. Thompson et al, Nucl. Acids. Res., 27(13):2682-2690(1999)。

多個序列比對程序亦可用於核酸序列。此種程式之示例包括：「Clustal W」、「Clustal Omega」、「CAP Sequence Assembly」、「BLAST」、「MAP」、及「MEME」，此等程式可通過網際網路上的網站伺服器進行存取。此種程式的其它來源為本項技術領域中具通常知識者已知。或者，亦可使用Vector NTI應用程式。本領域中亦有許多可用於測量核苷酸序列同一性的算法，包括上述程式中包含的那些。作為另一例，可使用GCG版本6.1  Fasta™中的程式Fasta TM，而比較多核苷酸序列。 Fasta™提供查詢序列及檢索序列之間最佳重疊區域的比對及百分比序列同一性。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用Fasta™及其內定參數(字長為6，得分矩陣的NOPAM因子)而確定，如GCG版本6.1中所提供，該文獻通過引用併入本文。

如本文所使用，術語「調節序列」、或 「表現控制序列」係指核酸序列，諸如起始子序列、增強子序列、及啟動子序列，其誘導、抑制或控制與其可操作連接的蛋白質編碼核酸序列的轉錄。

用於描述核酸序列或蛋白質的術語「外源」係意指核酸或蛋白質不是天然存在於染色體或宿主細胞中存在的位置。外源核酸序列亦指衍生自並插入相同宿主細胞或受試者，但以非天然狀態存在，例如，不同的拷貝數，或在不同的調節元件的控制下。

於描述核酸序列或蛋白質的術語「異源」係意指核酸或蛋白質與表現該核酸或蛋白質的宿主細胞或受試者相比源自不同的有機體或相同有機體的不同種。當用於關於質體、表現匣或載體中的蛋白質或核酸時，術語「異源」指該蛋白質或核酸與另一序列或子序列(subsequence)存在，該序列或子序列與所討論的蛋白質或核酸未發現於自然界中彼此有相同的關係。

「包含」為一術語，意指包括其它組件或方法步驟。當使用「包含」時，應理解相關實施方式包括使用「由...組成」的術語的描述，其排除其它組件或方法步驟，且「基本上由...組成」的術語，其排除實質上改變實施方式或發明的性質之任何組件或方法的步驟。應理解，儘管說明書中各種實施方式係使用「包含」語言呈現，但於各種情況下，相關實施方式亦使用「由...組成」或「基本上由...組成」語言來描述。

如本文所使用，術語「e」後跟隨數值(nn)值係指一指數，且此術語與「x 10nn」可互換使用。例如，3e13相當於3 x 10¹³ 。

應注意術語「一」或「一種」係指一或以上，例如，「一載體」應理解為代表一或多個載體。如此，術語「一」(或「一種」)、「一或以上」及「至少一種」於本文中可互換使用。

如本文所使用，除非另有說明，術語「約」意指相對於給定參考的正負10%的變異性。

實施例 參考以下實施例描述本發明。提供此等實施例僅係為了說明的目的，且本發明不應解釋為限於此等實施例，而是應解釋為涵括由於本文提供的教示而變得顯而易見的任何及所有變化。

實施例1：材料及方法

載體生產 將於780具有Val之參考GAA序列，及具有V780I變異的序列反向轉譯並將核苷酸序列工程化以產生於CAG啟動子下具有表現匣之AAV生產用之順式-質體。此外，將天然hGAA(參考序列)之cDNA序列選殖至相同AAV-順式骨架中，以與非工程化序列作比較。如前所述，藉由Penn Vector Core產生並滴定AAVhu68載體(Lock, et al. 2010, Hum Gene Ther 21(10)：1259-1271)。簡而言之，將HEK293細胞進行三重轉染，並收集培養上清液，濃縮並以碘克沙醇梯度純化。如前所述，使用靶向兔Beta-球蛋白polyA序列的引子，以液滴數位PCR滴定純化的載體(Lock, et al.(2014). Hum Gene Ther Methods 25(2)：115-125)。

動物

小鼠 龐貝氏病鼠(Gaa剃除(-/-)，C57BL/6/129背景)的創建者係購自Jackson Labs(存貨#004154，亦已知為6neo小鼠)。使用異型合子(heterozygote)對異型合子交配，以在同一窩內產生無效對照及WT對照，由基因治療計劃AAALAC認可的屏障小鼠設施維持該繁殖群體。Gaa剃除小鼠為龐貝氏病廣泛使用的模型。牠們展現胞溶體肝醣的進行性積累於心臟、中樞神經系統、骨骼肌和橫膈中，活動性降低和進行性肌無力。體積小、可再現的表型、及有效的育種可進行快速的研究，其對於前臨床候選者活體內篩選為最佳。 將動物飼養室保持於64-79°F(18-26°C)的溫度範圍內，濕度範圍為30-70%。 將動物與其父母及同窩仔飼養直到斷奶，然後於轉化研究實驗室(Translational Research Laboratories，TRL)GTP飼育器中以標準籠每籠關2至5隻動物。所有籠子的大小及住宿條件符合《實驗動物的護理及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Cages)》。將籠子、水瓶及墊料基材高壓滅菌於隔離設施中。 維持自動控制的12小時亮/暗週期。每個暗期間始於1900小時(±30分鐘)。隨意提供食物(Purina, LabDiet®, 5053, Irradiated, PicoLab®, Rodent Diet 20, 25lb)。經由在每個飼養籠中各別放置的水瓶，所有動物均可隨意攝取水。於每週更換籠子時，每週至少更換一次水瓶。供水來自費城，並使用Getinge淨水器進行氯化。氯化程度為每日藉由ULAR測試，且維持於2-4 ppm(parts per million)。Nestlets™作為富集物提供給每個飼養籠。

活體內研究及組織學 經由側尾靜脈(IV)以0.1 mL之5x10¹¹ GCs(約2.5x10¹³ GC/kg)之劑量或5x10¹⁰ GCs(約2.5x10¹² GC/kg)之劑量的AAVhu68.CAG.hGAA(各種hGAA 構築體)對小鼠投予，並於載體投予後第7日及第21日放血用於血清分離，於注射後28日最終放血(用於血漿分離)並藉由放血而安樂死。自大腦開始，迅速收集組織。 器官列表，屍體剖檢

組織	快速冷凍(用於蛋白質萃取)	福馬林浸漬(用於組織學檢查)
血漿	X
左腦		X
右腦	X
腦脊髓		X
胸+腰脊髓	X
心臟	X	X
肝臟	X	X
橫膈	X右	X左
三頭肌	X右	X左
四頭肌	X右	X左
腓腸肌	X右	X左
脛前肌	X右	X左

組織學檢查用組織以福馬林固定，並使用標準方法包埋石蠟。檢測腦和脊髓切片，腦和脊髓切片以luxol fast blue(luxol fast blue染色套組，Abcam ab150675)染色，外周器官以PAS(Periodic Acid-Schiff)染色，使用標準方法檢測組織中的多醣諸如肝醣。 hGAA的免疫染色係於福馬林固定石蠟包埋的樣品上進行。將切片去石蠟，於10 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中煮沸以回收抗原，於PBS+0.2%Triton中的1%驢血清封阻15分鐘，然後依次與稀釋於封阻緩衝液的一級抗體(Sigma HPA029126抗hGAA抗體)及生物素化二級抗體溫育；使用HRP系的比色反應偵測信號。 經執照認證的獸醫病理學家以盲測方式檢查切片。建立半定量評分系統，以測量肌肉中與龐貝氏病相關的組織學損傷的嚴重程度(肝醣貯積及自噬蓄積)，由呈現貯積及/或囊泡的細胞的總百分比確定：

組織學計分貯積
0	0%
1	1至9%
2	10至49%
3	50至74%
4	75至100%

當適用時，亦估計與載體相關的組織病理學病變。

非人類靈長類動物 對於載體投予，恒河獼猴以肌肉內右美托咪定(dexmedetomidine)及氯胺酮(ketamine)鎮靜，且單次小腦延髓池內(intra-cisterna magna，ICM)注射或靜脈內注射投予。如前所述，使用螢光鏡(OEC9800 C-Arm，GE)經由脊髓腔攝影對ICM注射的針頭位置進行驗證(Katz N, et al. Hum Gene Ther Methods. 2018 Oct; 29(5):212-219)。藉由巴比妥酸鹽(barbiturate)過量使動物安樂死。立即將收集的組織於乾冰上冷凍或固定於10%福爾馬林中以進行組織學檢查。

hGAA 780I 酶活體外性能表徵

GAA 活性 將均質化組織的血漿或上清液與5.6 mM4-MU-α-葡萄哌喃糖苷pH 4.0混合，並於37°C下溫育3小時。以0.4M碳酸鈉，pH 11.5停止反應。相對螢光單位RFU使用Victor3螢光計測量，激發355 nm，發射於460 nm。藉由自4-MU的標準曲線內插來計算nmol/mL/hr為單位的活性。對於均質上清液中的總蛋白質量，將各別組織樣品中的活性水平標準化。相等體積用於血漿樣品。

藉由 LC/MS 之 GAA 署名肽 (GAA Signature peptide) 血漿於100%甲醇中沉澱並離心。丟棄上清液。將沉澱物摻入hGAA獨有的穩定同位素標記的胜肽作為內標準，以胰蛋白酶再懸浮，並在37°C下溫育1小時。以10%甲酸停止消化。藉由C-18反相層析將胜肽分離，並藉由ESI-質譜法鑑定及定量。從特徵肽濃度計算血漿中的總GAA濃度。自署名肽濃度計算血漿中總GAA濃度。

細胞表面受體結合分析 96孔盤以受體塗覆，洗滌，並以BSA封阻。將含有相同活性的rhGAA或工程化GAA的CHO培養條件化培養基或血漿進行三倍系列稀釋，以得到一系列九種遞減濃度，並與共偶聯受體溫育。溫育後，將盤洗滌以去除任何未結合的GAA，並於37℃下添加4-MU-α-葡萄哌喃糖苷一小時。以1.0 M甘胺酸pH 10.5停止反應，並藉由Spectramax螢光計讀取RFU；激發370，發射460。各樣本的RFU，藉由自4-MU的標準曲線進行內插轉換為nmol/mL/hr。使用GraphPad Prism進行非線性回歸。

肝醣 –TFA 水解 組織勻質物於100°C下以4N TFA水解四小時，乾燥並於水中重構。將水解後的物質注入CarboPac PA-10 2x250 mm管柱，藉由高pH陰離子交換層析-脈衝安培流檢測法(HPAEC-PAD)進行葡萄糖測定。藉由自葡萄糖標準曲線內插計算各樣品中游離葡萄糖的濃度。最終數據報告為μg肝醣/mg蛋白質。

實施例2：rAAVhu68.hGAA 載體於龐貝氏病小鼠之評估 AAV載體稀釋於無菌的PBS以IV遞送至龐貝氏病小鼠。試驗物質包括：AAVhu68.CAG.hGAAco.rBG、AAVhu68.CAG.hGAAcoV780I.rBG、AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAco.rBG、AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.rBG、及AAVhu68.CAG.sp7co.Δ8.hGAAcoV780I.rBG。於此研究中包括野生型及媒劑對照組。

自處理的小鼠所收集的各種組織中測量hGAA蛋白質表現及活性，包括肝臟(圖1A、圖1B)、心臟(圖2A、圖2B)、四頭肌(圖3A、圖3B)、腦(圖4A、圖4B)、血漿(圖9)。於低劑量及高劑量兩者，所有啟動子在肝臟中的表現均相同。於兩劑量中，於UbC啟動子下投予載體表現造成骨骼肌中活性均降低，且具有CAG啟動子的載體具有最佳的總體活性。具有UbC啟動子的載體於兩種劑量下在心臟中亦具有較低活性。

龐貝氏病鼠媒劑(PBS)對照組(圖5D)在心臟中顯示出明顯的肝醣貯積(於PAS染色的切片中呈深染色)。野生型小鼠及所有載體處理小鼠幾乎完全清除貯積。然而，接受編碼hGAA參考序列(V780)載體的兩組，顯示中度至顯著的纖維化淋巴細胞性心肌炎(圖5B及圖5C)，其存在於接受hGAA天然轉基因的八隻動物中之七隻及存在於接受經BiP及vIGF2修飾的工程化hGAA的八隻動物中之三隻。因為接受hGAAcoV780I酶的小鼠均無心肌炎(圖5E、圖5F及圖5G)，故該病變被認為與載體相關，更具體而言，為hGAA參考序列特異性的。

四頭肌組織之分析顯示野生型小鼠及所有以編碼V780I變異體的載體處理過的小鼠，無論是否進一步修飾，幾乎完全清除貯積及自噬自噬蓄積(圖6A-圖6H)。然而，接受編碼hGAAV780的參考序列的載體的兩組顯示最小至中等的剩餘肝醣貯積以及自噬蓄積(圖10)，一起證明龐貝氏病的兩個主要特徵的次佳校正。自編碼其天然形式或具有BiP-vIGF2修飾的V780I變異體的兩個載體的遞送中觀察到最佳結果。sp7-delta8修飾似乎導致歸因於龐貝氏病的組織學病變的不一致校正。編碼參考hGAAV780序列的兩種構築體於清除肝醣貯積和積累皆為次佳。

於高劑量IV投予(5e11=2.5e13 GC/kg)，hGAAcoV780I及BiP-vIGF2.hGAAcoV780I 證實在四頭肌中顯示出接近正常的肝醣水平，且具有顯著較佳之hGAA至細胞的攝取(圖7A-圖7H)。其它骨骼肌之評估，包括脛骨前肌(TA)及腓腸肌，顯示相似結果(具V780I的變異體，且清除肝醣和中央自噬空泡兩者)。所有構築體減少心臟中肝醣貯積，以BiP-vIGF2.hGAAcoV780I投予造成最低水平。儘管四頭肌中的肝醣水平接近正常水平，但PAS染色說明一些差異，其中hGAAcoV780I和BiP-vIGF2.hGAAcoV780I顯示出最佳結果。

於低劑量IV投予(5e10=2.5e12 GC/kg)，BiP-vIGF2.hGAAcoV780I證實與hGAAcoV780I相比，於心臟和四頭肌中肝醣減少效果更佳。以BiP-vIGF2.hGAAcoV780I，腦和脊髓中的肝醣水平接近正常，即使組織水平約為15%，推測係由於較佳的靶向作用。於CNS，觀察到工程化構築體和V780I變異體之間效力大的協同作用。僅BiP-vIGF2.hGAAcoV780I清除CNS肝醣。

如圖8中所示，脊髓組織學之評估顯示以AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I治療的小鼠具有幾乎完全至完全清除之肝醣貯積，而以編碼參考hGAAV780酶的載體處理的小鼠則有殘餘肝醣貯積。腦部切片染色亦顯示以BiP-vIGF2.hGAAcoV780I進行校正，但不能使用天然hGAAV780酶進行校正。結果證實V780I變異及BiP-vIGF2修飾的貢獻。

實施例3：DRG脫靶對龐貝氏病小鼠中hGAA表現的影響 將BiP-vIGF2.hGAAcoV780I修飾為包括四個mir183靶位點(BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183，SEQ ID NO：30)(圖11)，包裝於AAVhu68衣殼中。

載體基因體含有下列序列元件： 反向末端重複序列(ITRs)：ITR係源自AAV2的相同之反向互補序列(130 bp，GenBank：NC_001401)，位於載體基因體的所有組件側邊。當反式提供AAV和腺病毒輔助功能時，ITR既是載體DNA複製的起點，且為載體基因體的包裝訊息。如此，ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。 CAG啟動子：由巨細胞病毒(CMV)增強子、雞beta-肌動蛋白(CB)啟動子(282 bp, GenBank：X00182.1)、及兔beta-球蛋白內含子所組成之雜合構築體。 編碼序列：編碼BiP-vIGF2.hGAAcoV780I(SEQ ID NO：31)之工程化cDNA(SEQ ID NO：30之nt 1141至4092)。 miR目標序列：四縱列miR-183目標序列(SEQ ID NO：26) 兔β-球蛋白多腺苷酸化訊息(rBG PolyA)：rBG PolyA訊息(127 bp, GenBank：V00882.1)促進順式轉基因 mRNA之有效的多腺苷酸化。該元件之功用為作為轉錄終止、新生轉錄物的3’端的特定切割事件以及長聚腺苷酸尾之添加的信號。

IV遞送AAVhu68至龐貝氏病小鼠後評估導入miR183靶位點至BiP-vIGF2-hGAAcoV780I載體基因體之效果。如在BiP-vIGF2.hGAAcoV780I構築體(無miR183標靶)中所觀察到，於高劑量靜脈內投予包括mir183目標序列的載體後，CNS中的肝醣貯積被校正(圖12及圖13)。於高劑量靜脈內投予後，四頭肌中的肝醣貯積和自噬蓄積被完全校正，而在低劑量投予後觀察到肝醣貯積的校正和自噬蓄積的部分校正(圖14)。以低劑量及高劑量於心臟中亦觀察到肝醣貯積的校正(圖15)。與投予CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I所觀察到的相似，於高劑量下自噬蓄積被完全消除且於低劑量下顯著降低(圖16)。結果證實，與對應之缺少miR目標序列者相比，添加miR183標靶未修飾治療性轉基因的功效。

實施例4：老年龐貝氏病小鼠的投予途徑及劑量研究 於靜脈內(IV)及經由腦室內(ICV)注射投予經hGAA編碼的AAVhu68載體(包括，例如，AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.rBG)的龐貝氏病鼠小鼠(以及野生型和媒劑對照組)中評估投予途徑及劑量的作用。使用相同載體的雙重投予途徑(靜脈內注射及注射至腦脊液)應校正該疾病的周圍及神經徵候。因將有資格接受基因治療的病患之相當一部分已有晚期病理，所以吾人選擇對有症狀的龐貝氏病鼠(七個月大)進行治療，並治療後至少追蹤六個月。使用靜脈內(IV)、腦室內(ICV)或雙重投予途徑，小鼠接受兩種劑量水平(低劑量或高劑量)之載體。本研究中使用的劑量(1x10¹¹ 或5x10¹⁰ GC ICV及1x10¹³ GC/kg或5x10¹³ GC/kg IV)對應於實施例6中描述的NHP研究中使用的低劑量及高劑量，且適合於對人類投予的劑量(1x10¹³ GC/kg 及5x10¹³ GC/kg)。

於研究過程中，使用滾輪(rotarod) 、掛線(wirehang)及握力(grip strength)評估測試小鼠的運動能力(locomotor activity)，並進行體積描記法(plethysmography)。於自處理過的小鼠所收集的各種組織(包括血漿、四頭肌、腓腸肌、橫膈、及腦)中，測量hGAA蛋白質的表現/活性及肝醣貯積。進行組織學以評估，例如，PAS(經由Luxol fast blue染色）、hGAA表現及神經炎症(星形細胞增多(astrocytosis))。將組織切片進行染色以評估自噬的蓄積或清除(例如，使用標記LC3B的抗體)。

於下表中提供研究設計。

該結果指出，藉由全身體積描記法評估的呼吸功能在接受中樞神經系統定向的(ICV)載體的小鼠中藉由治療得到顯著的改善。咸信龐貝氏病鼠(及病患)的呼吸功能受損與支配呼吸肌肉的運動神經元中的貯積損傷直接相關。於高劑量ICV治療的龐貝氏病小鼠中觀察到呼吸功能的改善，但於IV治療的小鼠中未觀察到呼吸功能的改善(圖27A及圖27B)。該發現支持雙重投予途徑可較佳針對疾病所有方面。

於來自經高劑量及低劑量ICV治療(圖28)及經高劑量及低劑量IV治療(圖29)的小鼠的四頭肌、心臟及脊髓樣品上進行組織學研究。於經由ICV途徑接受低或高載體劑量的小鼠之脊髓中，肝醣貯積被校正。高劑量IV注射有效校正四頭肌、心臟及脊髓中的肝醣貯積。

於以低劑量及高劑量之ICV和IV載體的組合(雙重投予途徑)治療的雄性中，體重顯著被校正(圖25A)。單一途徑(單獨使用IV或ICV)未顯著校正體重。於雌性龐貝氏病小鼠及WT小鼠之間，體重沒有差異(圖25B)。

於以低劑量的載體ICV及IV或雙重途徑投予(ICV+IV)治療的動物中，握力未顯著校正。然而，早在注射後第30天，高劑量IV注射即恢復強(圖26A)。高劑量的組合治療亦造成注射後180日的最後時間點進行校正(圖26B)。

實施例5：將DRG-脫靶基因治療載體投予至非人類靈長類 進行NHP靈長類動物研究，以評估毒性及評估AAVhu68衣殼中CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I或CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I-4xmir183的ICM遞送。載體以3x10¹³ GC/kg的劑量注射ICM，並在第35日犧牲動物。

miR183的四個串聯重複的添加抑制於頸部 DRG之感覺神經元中hGAA轉基因的表現(圖17)。在mir183載體的腰DRG的感覺神經元中亦觀察到hGAA轉基因的表現顯著降低，但保留了一些表現(圖18)。令人驚訝地，miR183的存在並未修飾運動神經元中轉基因的表現(圖19)，此暗示載體的投予將有利於減少龐貝氏病病患之運動神經元中的肝醣貯積。此外，於遞送含miR183的構築體後，心臟中轉基因表現沒有降低(圖20)。事實上，其似乎於心臟中表現增加，暗示龐貝氏病病患於心臟病治療中的功效將被增強。顯著地，miR183的串聯重複降低了自頸部和胸段的DRG之感覺神經元的毒性(圖21A及圖21B)。於此劑量水平下，腰椎段的毒性沒有降低(圖21C)，此可能由於在腰椎水平上的殘餘蛋白表現，如圖18所示。

實施例6：於非人類靈長類中投予途徑研究 進行了NHP靈長類動物研究，以評估毒性並評估載體投予的替代或組合途徑。例如，AAVhu68.CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I或AAVhu68.CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I-4xmir183以IV注射5x10¹³ GC/kg(高劑量)或1x10¹³ GC/kg (低劑量)或ICM注射3x10¹³ GC(高劑量)或1x10¹³ GC(低劑量)。例如，藉由投予指示的IV高劑量及ICM高劑量或IV低劑量及ICM低劑量，評估雙重投予途徑的可行性與毒性。IV低劑量和ICM低劑量的組合可顯示協同作用，其將對龐貝氏病病患的治療有益。

於整個研究過程，各種讀數被用於偵測hGAA署名肽(血漿及CSF)，以評估hGAA酶活性(血清及目標組織)，以及測量抗hGAA抗體的力價(血液及CSF)。進行組織病理學以評估目標組織的hGAA表現及毒性(例如CNS、心臟及肌肉之H＆E染色)。於圖31中提供顯示投予途徑及劑量的研究設計。

評估單一投予途徑的初步研究顯示，低劑量IV注射的動物於四頭肌及心臟中均有hGAA之表現(圖34)。IV注射的動物亦展現較ICM注射的動物更低的脊髓軸突病變等級(圖33D-圖33F)。藉由組織學於低劑量ICM注射的動物的脊髓中亦觀察到hGAA的表現(圖34)。注射ICM的動物中，DRG變性和脊髓軸突病變不為劑量依賴性(圖33A-圖33F)。此外，與IV高劑量注射的動物相比，一隻IV注射低劑量動物(RA3607：1e13 GC/Kg)具有較高的DRG變性、脊髓軸突病變及較高的心臟炎症反應。

(序列表非關鍵詞文字) 對於含有於數字識別號＜223＞下的非關鍵詞文字的序列，提供以下資訊。

SEQ ID NO: (含有非關鍵詞文字)	於＜223＞下的非關鍵詞文字
3	＜223＞ 合成構築體 ＜220＞ ＜221＞ MISC_特徵 ＜222＞(1)..(27) ＜223＞ 訊息肽 ＜220＞ ＜221＞ MISC_特徵 ＜222＞(70)..(952) ＜220＞ ＜221＞ MISC_特徵 ＜222＞(123)..(952) ＜223＞ 76kD具V780I的GAA蛋白質 ＜220＞ ＜221＞ MISC_特徵 ＜222＞(204)..(952) ＜223＞ 70 kD具V780I的GAA蛋白質
4	＜223＞ 工程化的hGAAI編碼序列
6	＜223＞ 包含hGAA780I之融合蛋白質
7	＜223＞ 編碼包含GAAV780I的融合蛋白質之工程化的序列 ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(810)..(810) ＜223＞ V810I
8	＜223＞ CAG啟動子   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(1)..(243) ＜223＞ CMV早期增強子元件   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(244)..(525) ＜223＞ 雞Βeta肌動蛋白啟動子   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(526)..(934) ＜223＞ 雜合內含子
9	＜223＞ 兔球蛋白 polyA
12	＜223＞ 工程化的hGAAV780I 訊息肽 ＜220＞ ＜221＞ sig_肽 ＜222＞(1)..(81) ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1)..(81)
13	＜223＞ 合成構築體
14	＜223＞ 工程化hGAAV780I成熟蛋白質 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1)..(2649)
15	＜223＞ 合成構築體
16	＜223＞ hGAA780I 123-890之工程化的DNA   ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1)..(2304)
17	＜223＞ 合成構築體
18	＜223＞ 工程化的hGAA 70kD cDNA   ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1)..(2247)
19	＜223＞ 合成構築體
20	＜223＞ hGAAV780I 76 kD 蛋白質之工程化的DNA   ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1)..(2490)
21	＜223＞ 合成構築體
22	＜223＞ 合成構築體   ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1)..(2952)   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(1)..(270) ＜223＞ BiP 訊息肽+vIGF2+2GS延伸   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(271)..(2952) ＜223＞ hGAA 61 - 952 780I之工程化DNA   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(2428)..(2430) ＜223＞ Ile密碼子
23	＜223＞ 合成構築體
24	＜223＞ 合成構築體   ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1)..(2952)   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(1)..(270) ＜223＞ BiP-vIGF胜肽   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(1)..(270) ＜223＞ BiP 訊息肽+ vIGF2+2GS延伸   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(271)..(2952) ＜223＞ hGAA 61-952 V780 DNA   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(2428)..(2430) ＜223＞ hGAA 780 纈胺酸之密碼子
25	＜223＞ 合成構築體
26	＜223＞ miRNA目標序列
27	＜223＞ miRNA目標序列
28	＜223＞ 合成構築體   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(1)..(130) ＜223＞ 5' ITR   ＜220＞ ＜221＞ 增強子 ＜222＞(195)..(437) ＜223＞ CMV IE增強子   ＜220＞ ＜221＞ 啟動子 ＜222＞(440)..(721) ＜223＞ 雞beta-肌動蛋白啟動子   ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞(721)..(1128) ＜223＞ 於CAG之雜合內含子   ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1141)..(4092) ＜223＞ BiP-vIGF2-hGAAco   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(3568)..(3570) ＜223＞ Ile密碼子   ＜220＞ ＜221＞ polyA_訊息 ＜222＞(4161)..(4287) ＜223＞ 兔beta-球蛋白poly a ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(4452)..(4581) ＜223＞ 3' ITR
29	＜223＞ 合成構築體
30	＜223＞ 合成構築體   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(1)..(130) ＜223＞ 5' ITR   ＜220＞ ＜221＞ 增強子 ＜222＞(195)..(437) ＜223＞ CMV IE 增強子   ＜220＞ ＜221＞ 啟動子 ＜222＞(440)..(721) ＜223＞ 雞beta-肌動蛋白啟動子   ＜220＞ ＜221＞ 內含子 ＜222＞(721)..(1128) ＜223＞ 於CAG之雜合內含子   ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞(1141)..(4092) ＜223＞ BiP-vIGF2-hGAAco   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(3568)..(3570) ＜223＞ Ile密碼子   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(4113)..(4134) ＜223＞ miR-183標靶   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(4139)..(4160) ＜223＞ miR-183標靶   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(4167)..(4188) ＜223＞ miR-183標靶   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(4195)..(4216) ＜223＞ miR-183標靶   ＜220＞ ＜221＞ polyA_訊息 ＜222＞(4267)..(4393) ＜223＞ 兔beta-球蛋白poly a   ＜220＞ ＜221＞ misc_特徵 ＜222＞(4558)..(4687) ＜223＞ 3' ITR
31	＜223＞ 合成構築體
32	＜223＞ IGF2 F26S
33	＜223＞ IGF2 Y27L
35	＜223＞ V43L
36	＜223＞ IGF2 F48T
37	＜223＞ IGF2 R49S
38	＜223＞ IGF2 S50I
39	＜223＞ IGF2 A54R
40	＜223＞ IGF2 L55R
41	＜223＞ IGF2 F26S, Y27L, V43L, F48T, R49S, S50I, A54R, L55
42	＜223＞ IGF2 delta1-6, Y27L, K65R
43	＜223＞ IGF2 delta1-7, Y27L, K65R
44	＜223＞ IGF2 delta1-4, E6R, Y27L, K65R
45	＜223＞ IGF2 delta1-4, E6R, Y27L
46	＜223＞ IGF2 E6R
48	＜223＞ vIGF2 delta1-4, E6R, Y27L, K65R
20	＜223＞ 經修飾的BiP-1
51	＜223＞ 經修飾的BiP-2
52	＜223＞ 經修飾的BiP-3
53	＜223＞ 經修飾的BiP-4
55	＜223＞ 連結子序列
57	＜223＞ 連結子序列
58	＜223＞ 連結子序列
59	＜223＞ 連結子序列
60	＜223＞ 連結子序列

本說明書所引用之所有文件藉由引用併入本文。2019年10月10日申請之美國臨時專利申請號No. 62/913,401，及2019年4月30日申請之美國臨時專利申請號No. 62/840,911，且與其序列表一起皆藉由引用完整併入。於此提出的序列表命名為「19-8856PCT_ST25.txt」且序列及其中之文本藉由引用併入。儘管已參考特定實施方式而描述本發明，應理解可在不脫離本發明之精神的狀況下進行修飾。此種修飾意圖落入所附申請專利範圍之範疇內。

無。

圖1A及圖1B顯示於CB6(第三列)、CAG(第四列)或UbC啟動子(最後列)之指引下各種AAVhu68.hGAA之靜脈內投予龐貝氏病(-/-)小鼠4週後肝臟中hGAA活性，該AAVhu68.hGAA具有工程化編碼hGAAV780I之序列。(圖1A)低劑量(1x10¹¹ GC)。(圖1B)高劑量(1x10¹² )。 圖2A及圖2B顯示於CB6(第三列)、CAG(第四列)或UbC啟動子(最後列)之指引下各種AAVhu68.hGAA之靜脈內投予龐貝氏病(-/-)小鼠4週後心臟中hGAA活性，該AAVhu68.hGAA具有工程化編碼hGAAV780I之序列。(圖2A)低劑量(1x10¹¹ GC)。(圖2B)高劑量(1x10¹² )。 圖3A及圖3B顯示於CB6(第三列)、CAG(第四列)或UbC啟動子(最後列)之指引下各種AAVhu68.hGAA之靜脈內投予龐貝氏病(-/-)小鼠4週後骨骼肌肉(四頭肌)中hGAA活性，該AAVhu68.hGAA具有工程化編碼hGAAV780I之序列。(圖3A)低劑量(1x10¹¹ GC)。(圖3B)高劑量(1x10¹² )。 圖4A及圖4B顯示於CB6(第三列)、CAG(第四列)或UbC啟動子(最後列)之指引下各種AAVhu68.hGAA之靜脈內投予龐貝氏病(-/-)小鼠4週後腦中hGAA活性，該AAVhu68.hGAA具有工程化編碼hGAAV780I之序列。(圖4A)低劑量(1x10¹¹ GC)。(圖4B)高劑量(1x10¹² )。於兩種劑量下於CB7活性之載體表現具有較低的活性，而在較高劑量下於CAG或UbC啟動子下載體表現具有相當的活性。 圖5A-圖5H顯示AAVhu68.hGAA遞送至龐貝氏病鼠(PAS染色顯示肝醣貯積)4週後心臟之組織學。製造並評估含有5個不同hGAA表現匣之rAAVhu68載體。媒劑對照龐貝氏病(-/-)(圖5D)及野生型(+/+)(圖5A)小鼠接受PBS注射。「hGAA」係指由具有天然訊息肽的野生型序列編碼的參考天然酶(hGAAV780)(圖5B)。「BiP-vIGF2.hGAAco」係指工程化參考hGAAV780蛋白質之編碼序列，其含有第一35 AA之刪除，且進一步具有BiP訊息肽，與具有對胰島素受體低親和力的IGF2變異體融合(圖5C)。「hGAAcoV780I」係指由工程化序列所編碼並含有天然訊息肽的hGAAV780I變異體(圖5E)。「BiP-vIGF2.hGAAcoV780I」係指含有第一35 AA刪除的hGAAcoV780I，且進一步具有與對胰島素受體具有低親和力的IGF2變異體融合的BiP訊息肽(圖5F)。 「Sp7.Δ8.hGAAcoV780I」係指由如前述構築體之相同工程化序列編碼但含編碼B2胰凝乳蛋白酶原訊息肽之序列以替代天然訊息肽的具有第一35 AA刪除的hGAAV780I變異體(圖5G)。(圖5H)盲試組織病理學半定量嚴重度評分。經認證的獸醫病理學家以盲試方式檢查載玻片並根據肝醣貯積和自噬蓄積建立嚴重度評分。 圖6A-圖6H顯示由龐貝氏病小鼠投予編碼各種hGAA之AAVhu68(2.5x10¹³ GC/kg)4週後四頭肌(PAS染色)之組織學的結果。對照龐貝氏病(-/-)(圖6D)及野生型(+/+)(圖6A)小鼠接受PBS注射。「hGAA」係指由具有天然訊息肽的野生型序列編碼的參考天然酶(hGAAV780)(圖6B)。「hGAAcoV780I」係指由工程化序列編碼並含有天然訊息肽的hGAAV780I變異體(圖6E)。「Sp7.Δ8.hGAAcoV780I」係指由與前述構築體相同的工程化序列編碼但含編碼B2胰凝乳蛋白酶原訊息肽以替代天然訊息肽的序列之具有第一35 AA刪除的hGAAV780I變異體(圖6F)。「BiP-vIGF2.hGAAco」係指含有第一35 AA刪除，並且進一步具有與對胰島素受體具有低親和力的IGF2變異體融合的BiP訊息肽且由工程化序列編碼的參考hGAAV780(圖6C)。「BiP-vIGF2.hGAAcoV780I」係指含有第一35 AA刪除的hGAAV780I，且進一步具有與對胰島素受體具有低親和力的IGF2變異體融合的BiP訊息肽且hGAAV780I經工程化序列編碼(圖6G)。(圖6H)盲試組織病理學半定量嚴重度評分。經認證的獸醫病理學家以盲試方式檢查載玻片並根據肝醣貯積和自噬蓄積建立嚴重度評分。分數0意指無損傷；1意指平均有少於9%之肌肉纖維受貯積影響；2意指10至49%；3意指50至75%及4意指76至100%。 圖7A-圖7H顯示由龐貝氏病小鼠投予編碼各種hGAA之AAVhu68(2.5x10¹² GC/Kg)4週後四頭肌(過碘酸雪夫氏(PAS)染色)之組織學的結果(即較圖6A-圖6H中低10倍劑量)。對照龐貝氏病(-/-)(圖7D)及野生型(+/+)(圖7A)小鼠接受PBS注射。「hGAA」係指由具有天然訊息肽的野生型序列編碼的參考天然酶(hGAAV780)(圖7B)。「hGAAcoV780I」係指由工程化序列編碼並含有天然訊息肽的hGAAV780I變異體(圖7E)。「Sp7.Δ8.hGAAcoV780I」係指由與前述構築體相同的工程化序列編碼但含編碼B2胰凝乳蛋白酶原訊息肽以替代天然訊息肽的序列之具有第一35 AA刪除的hGAAV780I變異體(圖7F)。「BiP-vIGF2.hGAAco」係指含有第一35 AA刪除的參考hGAAV780，且進一步具有與對胰島素受體具有低親和力的IGF2變異體融合的BiP 訊息肽且由工程化序列編碼(圖7C)。「BiP-vIGF2.hGAAcoV780I」係指含有第一35 AA刪除的hGAAV780I，且進一步具有與對胰島素受體具有低親和力的IGF2變異體融合的BiP訊息肽且hGAAV780I經工程化序列編碼(圖7G)。(圖7H)盲試組織病理學半定量嚴重度評分。經認證的獸醫病理學家以盲試方式檢查載玻片並根據肝醣貯積和自噬蓄積建立嚴重度評分。分數0意指無損傷；1意指平均有少於9%之肌肉纖維受貯積影響；2意指10至49 %；3意指50至75%及4意指76至100%。 圖8顯示由龐貝氏病小鼠投予(2.5x10¹² GC/Kg)具有編碼天然hGAA之序列的AAVhu68或含有第一35 AA刪除的hGAAV780I且進一步具有與對胰島素受體具有低親和力的IGF2變異體融合的BiP訊息肽且hGAAV780I經工程化序列編碼(「BiP-vIGF2.hGAAcoV780I」)4週後脊髓(PAS及luxol fast blue染色)之組織學的結果。於脊髓切片進行脊髓盲試組織病理學半定量嚴重度評分。 圖9A-圖9C顯示血漿中hGAA活性及與IGF2/CI-MPR的結合。龐貝氏病鼠以低劑量(2.5x10¹² GC)投予編碼野生型hGAA或BiP-vIGF2.hGAA的載體。(圖9A、圖9B)靜脈內投予後4週，於血漿中檢測到高水平的野生型及工程化hGAA。(圖9C)工程化的hGAA有效地結合至CI-MPR。 圖10顯示以2.5x10¹² GC/Kg(LD)之劑量投予AAVhu68 構築體於龐貝氏病小鼠4週後肝醣清除及自噬蓄積之消散。腓腸肌之石蠟切片以DAPI及抗-LC3B抗體染色。 圖11顯示BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmiR183構築體之示意圖。 圖12顯示以高劑量(HD：2.5x10¹³ GC/kg)或低劑量(LD：2.5x10¹² GC/kg)靜脈內投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183(含四拷貝之drg-脫靶序列，miR183)於龐貝氏病小鼠4週後肝醣貯積(PAS, luxol blue染色)於腦幹。箭號顯示神經元中PAS陽性貯積。 圖13顯示以高劑量(HD：2.5x10¹³ GC/kg)或低劑量(LD：2.5x10¹² GC/kg)靜脈內投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183於龐貝氏病小鼠4週後肝醣貯積(PAS, luxol blue染色)於脊髓。箭號顯示神經元中PAS陽性貯積。 圖14顯示以高劑量(HD：2.5x10¹³ GC/kg)或低劑量(LD：2.5x10¹² GC/kg)靜脈內投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183於龐貝氏病小鼠4週後肝醣貯積(PAS染色)於四頭肌。 圖15顯示顯示以高劑量(HD：2.5x10¹³ GC/kg)或低劑量(LD：2.5x10¹² GC/kg)靜脈內投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183於龐貝氏病小鼠4週後肝醣貯積(PAS染色)於心臟。 圖16顯示以高劑量(HD：2.5x10¹³ GC/kg)或低劑量(LD：2.5x10¹² GC/kg)靜脈內投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183於龐貝氏病小鼠4週後四頭肌中表現自噬空泡標記LC3b。 圖17顯示於高劑量之3e13 GC以ICM投予恆河獼猴AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I(左)或AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183(右)後35日，頸DRG之代表性影像中hGAA表現(hGAA之免疫組織化學)。 圖18顯示於高劑量之3e13 GC以ICM投予恆河獼猴AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I(左)或AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183(右)後35日，腰DRG中hGAA表現(hGAA之免疫組織化學)之代表性影像。 圖19顯示於高劑量之3e13 GC以ICM投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I(左)或AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183(右)於恆河獼猴35日後，脊髓下運動神經元中hGAA表現(hGAA之免疫組織化學)之代表性影像。 圖20顯示於高劑量之3e13 GC以ICM投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I(左)或AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183(右)於恆河獼猴35日後，心臟中hGAA表現(hGAA之免疫組織化學)之代表性影像。 圖21A-圖21C顯示於高劑量3x10¹³ GCs以ICM投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I或AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183於恆河獼猴35日後，於頸段DRG(圖21A)、胸段(圖21B)、及腰段(圖21C)中DRG神經元變性及炎症性細胞浸潤之組織病理學評分。AAVhu68載體於總體積1mL之無菌的人工CSF(媒劑)注射小腦延髓池(cisterna magna)而遞送，如前述於螢光指引下(Katz et al., Hum Gene Ther. Methods, 2018, 29:212-9)。經認證的獸醫病理學家盲試建立嚴重度以下列定義之載體組:0為無損傷存在，1為極微(＜10%)，2為輕微(10-25%)，3為中度(25-50%)，4為顯著(50-95%)，及5為嚴重(＞95%)。每個數據點代表一個DRG。每段及每隻動物評分最少5個DRGA。 圖22A-圖22C顯示於高劑量之3e13 GC以ICM投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I或AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183於恆河獼猴後之AST水平(圖22A)、ALT水平(圖22B)、及血小板計數(圖22C)。 圖23顯示於注射後0-35天以3e13GC的高劑量投予NHP(ICM)的AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I或AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183中的血漿hGAA活性水平。 圖24A–圖24G顯示於基線及第35日對NHP投予(ICM，3e13 GC)AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I或AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183進行神經傳導速度測試的結果。 圖25A及圖25B顯示於7個月齡之疾病後期治療並已於基線有症狀的龐貝氏病鼠中自載體注射(第0日)至180日注射後，體重縱剖式追蹤。其接受使用經由另外途徑投予之AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I且劑量水平為：腦室內(ICV)以高劑量(HD)(1e11 GC)或低劑量(LD)(5e10 GC)，靜脈內(IV)以HD(5e13 GC/Kg)或LD(1e13 GC/Kg)，及ICV及IV以低劑量或高劑量之組合。描述平均值及標準差。藉由KO PBS對照組及其它組之間的Wilcoxon-Mann-Whitney檢定，於各時間點進行統計分析。* p＜0.05；**p＜0.01 圖26A及圖26B顯示於7個月齡之疾病後期治療並已於基線有症狀的龐貝氏病鼠中自載體注射(第0日)至180日注射後，握力相對於體重縱剖式追蹤。小鼠接受使用經由另外途徑投予之AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I且劑量水平為：腦室內(ICV)以高劑量(ICV HD：1e11 GC)，靜脈內(IV)以高劑量(IV HD：5e13 GC/Kg)(圖26A)，及ICV與IV高劑量之組合(圖26B)。使用握力器(IITC Life Science)測量握力。握力器中的轉換器連接到與陽極氧化基板相連的金屬絲網。抓住動物的尾巴，將其輕輕越過網孔，直到用四隻爪子抓住網格為止。進行了三次握力測量，這些讀數的平均值代表該動物在特定時間的握力。藉由動物體重將數值常規化。描述平均值及標準差。藉由KO PBS 對照組及其它組之間的Wilcoxon-Mann-Whitney檢定，於各時間點進行統計分析。*p＜0.05；**p＜0.01 圖27A及圖27B顯示以龐貝氏病鼠IV、ICV、或IV及ICV(雙重途徑)投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I載體之體積描記器的結果。(圖27A)5%CO2刺激。(圖27B)7%CO2刺激。 圖28顯示有症狀後的龐貝氏病鼠於高劑量(HD：1e11 GC)或低劑量(LD：5e10 GC)ICV投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I後之於四頭肌、心臟、及脊髓的肝醣貯積。 圖29顯示有症狀後的龐貝氏病鼠於高劑量(HD：5e13 GC/Kg)或低劑量(LD：1e13 GC/Kg)IV投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I後之於四頭肌、心臟、及脊髓的肝醣貯積。 圖30A-圖30C顯示於第30日(圖30A)、60日(圖30B)、及90日(圖30C)IV、ICV、或IV及ICV(雙重途徑)投予龐貝氏病鼠AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I載體之血漿中hGAA活性。 圖31顯示用於單一(IV或ICM)及雙重途徑(IV+ICM)投予於NHP之評量的研究設計。 圖32A-圖32H顯示IV或ICM投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I後NHP之血漿及CSF中hGAA及hGAA活性的偵測。 圖33A-圖33F顯示恆河獼猴於IV(1e13 GC/Kg或5e13GC/Kg)或ICM(1e13 GC或3e13 GC)投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I後，DRG神經元變性及炎症性細胞浸潤(圖33A–圖33C)及脊髓軸突病變(圖33D–圖33F)之組織病理學評分。經認證的獸醫病理學家以盲試方式評量載體組而建立的嚴重度定義為0無損傷，1極微(＜10%)，2輕微(10-25%)，3中度(25-50%)，4顯著(50-95%)，及5嚴重(＞95%)。 圖34顯示低劑量(IV-1e13 GC/Kg, ICM-1e13 GC)投予AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I後，恆河獼猴之四頭肌、心臟、及脊髓中hGAA表現(hGAA之免疫組織化學)代表性影像。

無。

Claims (83)

1. 一種包含編碼嵌合融合蛋白質之核酸序列的表現匣，該嵌合融合蛋白質包含訊息肽及與人類酸性-α-葡萄糖苷酶(hGAA)融合的vIGF2胜肽，該人類酸性-α-葡萄糖苷酶(hGAA)至少包含在指導其表現之調控序列的控制下hGAA780I之活性位，其中位置780係基於SEQ ID NO：3中胺基酸位置的編號。
2. 如請求項1之表現匣，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸890(hGAA780I)，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
3. 如請求項1之表現匣，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸952，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
4. 如請求項1之表現匣，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸123至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
5. 如請求項1之表現匣，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸952，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
6. 如請求項1之表現匣，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
7. 如請求項1至6中任一項之表現匣，其中該hGAA780I係由SEQ ID NO：4或至少95%與其相同的序列所編碼。
8. 如請求項1至6中任一項之表現匣，其中該hGAA780I係由SEQ ID NO：5或至少95%與其相同的序列所編碼。
9. 如請求項1任一者之表現匣，其中該融合蛋白質包含SEQ ID NO：6，或至少95%與其相同的序列。
10. 如請求項9之表現匣，其中該融合蛋白質係由SEQ ID NO：7或至少95%與其相同的序列所編碼。
11. 如請求項1至10中任一項之表現匣，其進一步包含miR目標序列之至少兩個串聯重複，其中該至少兩個串聯重複至少包含第一miRNA目標序列及至少包含第二miRNA目標序列，其可為相同或不同且可操作地3’連接至編碼融合蛋白質的序列。
12. 如請求項11之表現匣，其中該miR目標序列係獨立選自SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：27。
13. 如請求項11或12之表現匣，其中二或多個miRNA目標序列被間隔子分開且一或多個間隔子係獨立選自(i)GGAT；(ii)CACGTG；及(iii)GCATGC。
14. 如請求項1至13中任一項之表現匣，其中該vIGF2胜肽包含：至少90%與SEQ ID NO：32相同且於選自下列位置之一或多個位置具有至少一個取代的胺基酸序列：SEQ ID NO：32之位置6、26、27、43、48、49、50、54、55、及65。
15. 如請求項14之表現匣，其中該至少一個取代係選自SEQ ID NO：32之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R、及K65R。
16. 如請求項1或15之表現匣，其中該vIGF2胜肽於選自下列位置之二或多個位置包含至少二個取代：SEQ ID NO：32之26、27、43、48、49、50、54、及55。
17. 如請求項16之表現匣，其中該至少二個取代係選自SEQ ID NO：32之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R、及K65R。
18. 如請求項1至17中任一項之表現匣，其中該vIGF2胜肽包含於SEQ ID NO：32之位置1的N-末端刪除。
19. 如請求項18之表現匣，其中該vIGF2胜肽包含於SEQ ID NO：32之位置1至4的N-末端刪除。
20. 如請求項1至19中任一項之表現匣，其中該vIGF2胜肽與天然IGF2胜肽相比，對胰島素受體及IGFR1具有降低的親和力或無親和力。
21. 如請求項1至20中任一項之表現匣，其中該vIGF2胜肽能夠促進hGAA780I攝入至細胞中的溶酶體中。
22. 如請求項1至21中任一項之表現匣，其中該核酸序列進一步包含於vIGF2核苷酸序列與編碼hGAA780I的核酸序列之間編碼連結子胜肽的連結子序列。
23. 如請求項22中任一項之表現匣，其中該連結子胜肽包含SEQ ID NOs：55-60之任一者。
24. 如請求項1至23中任一項之表現匣，其中該訊息肽為結合免疫球蛋白蛋白質(BiP)訊息肽或Gaussia(海洋橈足類)訊息肽。
25. 如請求項24之表現匣，其中該BiP訊息肽包含至少90%與SEQ ID NOs：49-53之任一者相同的胺基酸序列。
26. 如請求項25之表現匣，其中該BiP訊息肽包含SEQ ID NOs：49-53之任一者之胺基酸序列。
27. 如請求項24之表現匣，其中該訊息肽包含Gaussia訊息肽。
28. 如請求項27之表現匣，其中該Gaussia訊息肽包含至少90%與SEQ ID NO：54相同之胺基酸序列。
29. 如請求項28之表現匣，其中該Gaussia訊息肽包含SEQ ID NO：54。
30. 如請求項1至29中任一項之表現匣，其中該表現匣係由選自重組小病毒、重組慢病毒(recombinant lentivirus)、重組反轉錄病毒及重組腺病毒之病毒載體攜帶。
31. 如請求項30之表現匣，其中該重組小病毒為演化支F腺相關病毒。
32. 如請求項31之表現匣，其中該演化支F腺相關病毒為AAVhu68。
33. 如請求項1至29中任一項之表現匣，其中該表現匣係由選自裸露的DNA、裸露的RNA、無機粒子、脂質粒子、聚合物系載體、或幾丁聚醣系調配物之非病毒載體攜帶。
34. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含： (a)AAV衣殼，其靶向肌肉、心臟及中樞神經系統之至少一者之細胞；及 (b)包裝於AAV衣殼中的載體基因體，該載體基因體包含編碼嵌合融合蛋白質之核酸序列，該嵌合融合蛋白質包含訊息肽及與hGAA融合的vIGF2胜肽，該hGAA至少包含在指導其表現之調控序列的控制下hGAA780I之活性位，其中位置780係基於SEQ ID NO：3中胺基酸位置的編號。
35. 如請求項34之rAAV，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸890(hGAA780I)，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
36. 如請求項34之rAAV，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸204至胺基酸952，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
37. 如請求項34之rAAV，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸123至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
38. 如請求項34之rAAV，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸952，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
39. 如請求項34之rAAV，其中該hGAA至少包含SEQ ID NO：3之胺基酸70至胺基酸890，或至少95%與其相同的序列，其在位置780具有Ile。
40. 如請求項34至39中任一項之rAAV，其中該hGAA780I係由SEQ ID NO：4或至少95%與其相同的序列所編碼。
41. 如請求項34至39中任一項之rAAV，其中該hGAA780I係由SEQ ID NO：5或至少95%與其相同的序列所編碼。
42. 如請求項34之rAAV，其中該融合蛋白質包含SEQ ID NO：6或至少95%與其相同的序列。
43. 如請求項42之rAAV，其中該融合蛋白質係由SEQ ID NO：7或至少95%與其相同的序列所編碼。
44. 如請求項34至43中任一項之rAAV，其中該載體基因體進一步包含背根神經節(DRG)-特異性miR-183目標序列之至少兩個串聯重複，其中該至少兩個串聯重複至少包含第一miRNA目標序列及至少包含第二miRNA目標序列，其可為相同或不同且可操作地3’連接至編碼融合蛋白質的序列。
45. 如請求項44之rAAV，其中該miR-183目標序列為SEQ ID NO：26。
46. 如請求項44或45之rAAV，其中二或多個miRNA目標序列經間隔子分開且一或多個間隔子係獨立選自(i)GGAT；(ii)CACGTG；及(iii)GCATGC。
47. 如請求項34至46中任一項之rAAV，其中該vIGF2胜肽包含：至少90%與SEQ ID NO：32相同且於選自下列位置之一或多個位置具有至少一個取代的胺基酸序列：SEQ ID NO：32之位置6、26、27、43、48、49、50、54、55、及65。
48. 如請求項47之rAAV，其中該至少一個取代係選自SEQ ID NO：32之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R、及K65R。
49. 如請求項47或48之rAAV，其中該vIGF2胜肽於選自下列位置之二或多個位置包含至少二個取代：SEQ ID NO：32之26、27、43、48、49、50、54、及55。
50. 如請求項49之rAAV，其中該至少二個取代係選自SEQ ID NO：32之E6R、F26S、Y27L、V43L、F48T、R49S、S50I、A54R、L55R、及K65R。
51. 如請求項45至48中任一項之rAAV，其中該vIGF2胜肽包含於SEQ ID NO：32之位置1的N-末端刪除。
52. 如請求項51之rAAV，其中該vIGF2胜肽包含SEQ ID NO：32之位置1至4的N-末端刪除。
53. 如請求項34至52中任一項之rAAV，其中該vIGF2胜肽與天然IGF2胜肽相比，對胰島素受體及IGFR1具有降低的親和力或無親和力。
54. 如請求項34至53中任一項之rAAV，其中該vIGF2胜肽能夠促進hGAA780I攝入至細胞中的溶酶體中。
55. 如請求項34至54中任一項之rAAV，其中該核酸序列進一步包含於vIGF2核苷酸序列與編碼hGAA780I的核酸序列之間編碼連結子胜肽的連結子序列。
56. 如請求項55之rAAV，其中該連結子胜肽包含SEQ ID NOs：55-60之任一者。
57. 如請求項34至56中任一項之rAAV，其中該訊息肽為結合免疫球蛋白蛋白質(BiP)訊息肽或Gaussia訊息肽。
58. 如請求項57之rAAV，其中該BiP 訊息肽包含至少90%與SEQ ID NOs：49-53之任一者相同的胺基酸序列。
59. 如請求項58之rAAV，其中該 BiP 訊息肽包含SEQ ID NOs：49-53之任一者之胺基酸序列。
60. 如請求項57之rAAV，其中該訊息肽包含Gaussia訊息肽。
61. 如請求項60之rAAV，其中該Gaussia訊息肽包含至少90%與SEQ ID NO：54相同之胺基酸序列。
62. 如請求項61之rAAV，其中該 Gaussia 訊息肽包含SEQ ID NO：54。
63. 如請求項34之rAAV，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：30或至少95%與其相同的序列。
64. 如請求項34至63中任一項之rAAV，其中該衣殼為演化支F衣殼。
65. 如請求項64之rAAV，其中該衣殼為AAVhu68衣殼。
66. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項1至33中任一項之表現匣的序列。
67. 一種核酸分子，其包含SEQ ID NO：30或至少95%與其相同的序列。
68. 如請求項66或67之核酸分子，其中該分子為質體。
69. 一種宿主細胞，其含有如請求項66至68中任一項之核酸分子。
70. 一種組成物，其包含如請求項1至33中任一項之表現匣、及醫藥上可接受的載劑、賦形劑及/或懸浮劑之至少一者。
71. 一種組成物，其包含如請求項34至65中任一項之rAAV、及醫藥上可接受的載劑、賦形劑及/或懸浮劑之至少一者。
72. 如請求項70或71之組成物，其為被調配用於靜脈內遞送之懸浮液。
73. 如請求項70或71之組成物，其為被調配用於鞘內、腦池內、或腦室內投予之懸浮液。
74. 一種治療具有龐貝氏病(Pompe disease)的病患之方法，其包含遞送至病患如請求項1至33中任一項之表現匣或如請求項34至65中任一項之rAAV。
75. 如請求項74之方法，其中該表現匣及/或rAAV係經由分別途徑被共同遞送。
76. 如請求項74或75之方法，其中該病患經由靜脈內及/或鞘內遞送而投予該表現匣及/或rAAV。
77. 一種於具有α-葡萄糖苷酶(GAA)缺陷之病患中增進心臟、呼吸及/或骨骼肌功能之方法，其中該方法包含遞送至病患如請求項1至33中任一項之表現匣或如請求項34至65中任一項之rAAV。
78. 一種治療具有龐貝氏病的病患之治療方案，其包含如請求項1至33中任一項之表現匣或如請求項34至65中任一項之rAAV與免疫調節劑組合之使用。
79. 如請求項78之治療方案，其中該病患具有遲發型龐貝氏病。
80. 如請求項78之治療方案，其中該病患具有嬰幼期發作型龐貝氏病。
81. 如請求項78至80中任一項之治療方案，其中該病患接受與支氣管擴張劑、乙醯膽鹼酶抑制劑、呼吸肌力訓練(RMST)、酶替代療法、及/或橫膈節律治療之共同療法。
82. 一種如請求項1至33中任一項之表現匣或如請求項34至65中任一項之rAAV之用途，其用於治療具有龐貝氏病的病患。
83. 一種如請求項1至33中任一項之表現匣或如請求項34至65中任一項之rAAV之用途，其用於製備醫藥。

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