CN114127275A

CN114127275A - 可用于治疗庞贝病的组合物

Info

Publication number: CN114127275A
Application number: CN202080048355.1A
Authority: CN
Inventors: J·M·威尔逊; J·奥尔多瓦
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2022-03-01
Also published as: CN114072515A; CL2021002755A1; TW202100541A; WO2020223362A1; CO2021016198A2; CL2021002754A1; JP2022530833A; SG11202111400TA; CA3134523A1; EP3980548A1; WO2020223362A8; MX2021013364A; JP2022530824A; WO2020223356A1; CO2021016200A2; EP3963063A1; EP3963063A4; IL287523A; AU2020266829A1; KR20220004696A

Abstract

提供了一种可用于治疗II型糖原贮积病(庞贝)病的重组腺相关病毒(rAAV)。所述rAAV包括AAV衣壳，所述AAV衣壳靶向肌肉、心脏、肾脏和中枢神经系统中的至少一种的细胞并且所述AAV衣壳中包装有载体基因组，所述载体基因组包括在调控序列的控制下编码人酸性a‑葡萄糖苷酶hGAA780I蛋白或融合蛋白的核酸序列，所述调控序列指导所述人酸性a‑葡萄糖苷酶hGAA780I蛋白或融合蛋白的表达。还提供了制造和使用此rAAV的方法。

Description

可用于治疗庞贝病的组合物

背景技术

庞贝病(Pompe disease)，也称为II型糖原贮积症，是由酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因中的突变引起的导致心脏(心肌病)、肌肉和运动神经元(神经肌肉疾病)中的糖原积累的溶酶体贮积病。在经典的婴儿庞贝病中，严重的GAA活性丧失会引起多系统和早发性糖原贮积，尤其是在心脏和肌肉内，并在最初几年因心肺衰竭而死亡。婴儿庞贝病的特征还在于神经元(尤其是运动神经元)和神经胶质细胞内显著的糖原贮积。目前的护理标准(酶替代疗法(ERT))在矫正肌肉方面的效果欠佳，并且无法穿过血脑屏障，从而导致经典婴儿庞贝病长期幸存者的神经系统逐渐恶化。接受ERT的患者由于心脏矫正而活得更久，显示出具有进行性神经系统表型的新自然病程。另外，重组人GAA具有高度免疫原性，并且由于骨骼肌吸收不良而必须大量给药。

庞贝病的治疗有若干个未满足的需求，包含需要矫正所述疾病的CNS组分，需要改善肌肉矫正，以及需要更有效、更少免疫原性和/或者更方便的针对当前ERT的替代方案。

发明内容

在某些实施例中，提供了一种表达盒，其包括在调控序列的控制下编码人酸性α-葡萄糖苷酶(hGAA)的核酸序列，所述hGAA至少包括hGAA780I的活性位点，所述调控序列指导所述hGAA的表达，其中位置780基于SEQ ID NO:3中的氨基酸的位置的编号。在某些实施例中，所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3(hGAA780I)的氨基酸204到氨基酸890或与SEQ IDNO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述hGAA至少包括SEQID NO:3的氨基酸204到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸123到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述表达盒进一步包括miR靶序列的至少两个串联重复序列，其中所述至少两个串联重复序列包括至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列，所述第一miRNA靶序列和所述第二miRNA靶序列可以相同或不同并且在3'处与编码所述hGAA780I蛋白的所述序列可操作地连接。

在某些实施例中，本文提供的表达盒由选自以下的病毒载体携带：重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒和重组腺病毒。在某些实施例中，所述重组细小病毒是进化枝F腺相关病毒，任选地AAVhu68。在某些实施例中，本文提供的表达盒由选自以下的非病毒载体携带：裸DNA、裸RNA、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物。

在某些实施例中，本文提供了一种可用于治疗II型糖原贮积病(庞贝)病的重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包括：(a)AAV衣壳，所述AAV衣壳靶向肌肉、心脏和中枢神经系统中的至少一种的细胞；以及(b)载体基因组，所述载体基因组包装在所述AAV衣壳中，其中载体基因组包括在调控序列的控制下编码人酸性α-葡萄糖苷酶(hGAA)的核酸序列，所述hGAA至少包括hGAA780I的活性位点，所述调控序列指导所述hGAA的表达，其中位置780基于SEQID NO:3中的氨基酸的位置的编号。在某些实施例中，所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3(hGAA780I)的氨基酸204到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸204到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸123到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述rAAV载体基因组进一步包括miR靶序列的至少两个串联重复序列，其中所述至少两个串联重复序列包括至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列，所述第一miRNA靶序列和所述第二miRNA靶序列可以相同或不同并且在3'处与编码所述hGAA780I蛋白的所述序列可操作地连接。

在某些实施例中，提供了一种组合物，其包括如本文所述的编码hGAA780I蛋白的表达盒和药学上可接受的载体、赋形剂和/或悬浮剂中的至少一种。

在某些实施例中，提供了一种组合物，其包含rAAV，所述rAAV包括如本文所述的编码hGAA780I蛋白的表达盒和药学上可接受的载体、赋形剂和/或悬浮剂中的至少一种。

在某些实施例中，提供了一种用于治疗患有庞贝病的患者和/或用于改善患有α-葡萄糖苷酶(GAA)缺乏症的患者的心脏、呼吸和/或骨骼肌功能的方法。此方法包括向所述患者递送如本文所述的表达盒、rAAV或组合物。所述表达盒、rAAV或组合物可以静脉内和/或通过鞘内、脑池内或脑室内施用来递送。另外或可替代地，此类基因疗法可以涉及直接递送到心脏(heart)(心脏(cardiac))、递送到肺(鼻内、吸入、气管内)和/或肌肉内注射。其中之一可以是表达盒、载体或组合物的唯一施用途径，或与其它递送途径共施用。

用于治疗患有庞贝病的患者的治疗方案可以包括

向所述患者单独地或与共疗法组合，例如与以下中的一种或多种组合来递送本文所述的表达盒、rAAV或组合物：免疫调节剂、支气管扩张剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、呼吸肌力量训练(RMST)、酶替代疗法和/或膈肌起搏疗法。

在某些实施例中，提供了用于产生本文所述的表达盒和/或rAAV的核酸分子和宿主细胞。

在某些实施例中，提供了一种表达盒、rAAV和/或组合物在制备药物中的用途。

在某些实施例中，提供了一种适用于治疗患有庞贝病的患者和/或用于改善患有α-葡萄糖苷酶(GAA)缺乏症的患者的心脏、呼吸和/或骨骼肌功能的表达盒、rAAV和/或组合物。

根据本发明的以下详细描述，本发明的其它方面和优点将显而易见。

附图说明

图1A和图1B示出了在静脉内施用具有在CB6启动子(第三列)、CAG启动子(第四列)或UbC启动子(最后一列)的指导下的hGAAV780I的经工程化的编码序列(SEQ ID NO:4)的各种AAVhu68.hGAA后四周，庞贝病(-/-)小鼠的肝脏中的hGAA活性。(图1A)低剂量(1×10¹¹GC)。(图1B)高剂量(1×10¹²)。

图2A和图2B示出了在静脉内施用具有在CB6启动子(第三列)、CAG启动子(第四列)或UbC启动子(最后一列)的指导下的hGAAV780I的经工程化的编码序列的各种AAVhu68.hGAA后四周，庞贝病(-/-)小鼠的心脏中的hGAA活性。(图2A)低剂量(1×10¹¹GC)。(图2B)高剂量(1×10¹²)。

图3A和图3B示出了在静脉内施用具有在CB6启动子(第三列)、CAG启动子(第四列)或UbC启动子(最后一列)的指导下的hGAAV780I的经工程化的编码序列的各种AAVhu68.hGAA后四周，庞贝病(-/-)小鼠的骨骼肌(四头肌)中的hGAA活性。(图3A)低剂量(1×10¹¹GC)。(图3B)高剂量(1×10¹²)。

图4A和图4B示出了在静脉内施用具有在CB6启动子(第三列)、CAG启动子(第四列)或UbC启动子(最后一列)的指导下的hGAAV780I的经工程化的编码序列的各种AAVhu68.hGAA后四周，庞贝病(-/-)小鼠的脑中的hGAA活性。(图4A)低剂量(1×10¹¹GC)。(图4B)高剂量(1×10¹²)。在CB7活性下表达的载体在两种剂量下都具有较低的活性，而在CAG或UbC启动子下表达的载体在较高剂量下具有相当的活性。

图5A-图5H示出了在AAVhu68.hGAA递送后四周庞贝病小鼠的心脏的组织学(PAS染色显示糖原贮积)。产生并评估了含有五种不同hGAA表达盒的rAAVhu68载体。媒剂对照庞贝病(-/-)(图5D)和野生型(+/+)(图5A)小鼠接受PBS注射。“hGAA”是指由野生型序列编码的具有天然信号肽的参考天然酶(hGAAV780)(图5B)。“BiP-vIGF2.hGAAco”是指参考hGAAV780蛋白的经工程化的编码序列，所述经工程化的编码序列含有前35个AA的缺失并进一步具有与对胰岛素受体的亲和力较低的IGF2变体融合的BiP信号肽(图5C)。“hGAAcoV780I”是指由经工程化的序列编码并含有天然信号肽的hGAAV780I变体(图5E)。“BiP-vIGF2.hGAAcoV780I”是指含有前35个AA的缺失并进一步具有与对胰岛素受体的亲和力较低的IGF2变体和由经工程化的序列编码的hGAAV780I融合的BiP信号肽的hGAAcoV780I(图5F)。“Sp7.Δ8.hGAAcoV780I”是指前35个AA缺失的hGAAV780I变体，所述变体由与先前构建体相同但含有编码B2胰凝乳蛋白酶原信号肽而非天然信号肽的序列的经工程化的序列编码(图5G)。(图5H)盲法组织病理学半定量严重性评分。通过职业验证的兽医病理学家以不知情的方式审查了载玻片，并基于糖原贮积和自噬积累建立严重性评分。

图6A-图6H示出了在施用编码各种hGAA的AAVhu68(2.5×10¹³GC/kg)后四周的庞贝病小鼠的四头肌的组织学(PAS染色)的结果。对照庞贝病(-/-)(图6D)和野生型(+/+)(图6A)小鼠接受PBS注射。“hGAA”是指由野生型序列编码的具有天然信号肽的参考天然酶(hGAAV780)(图6B)。“hGAAcoV780I”是指由经工程化的序列编码并含有天然信号肽的hGAAV780I变体(图6E)。“Sp7.Δ8.hGAAcoV780I”是指前35个AA缺失的hGAAV780I变体，所述变体由与先前构建体相同但含有编码B2胰凝乳蛋白酶原信号肽而非天然信号肽的序列的经工程化的序列编码(图6F)。“BiP-vIGF2.hGAAco”是指含有前35个AA的缺失并进一步具有与对胰岛素受体的亲和力较低的IGF2变体融合的BiP信号肽且由经工程化的序列编码的参考hGAAV780(图6C)。“BiP-vIGF2.hGAAcoV780I”是指含有前35个AA的缺失并进一步具有与对胰岛素受体的亲和力较低的IGF2变体和由经工程化的序列编码的hGAAV780I融合的BiP信号肽的hGAAV780I(图6G)。(图6H)盲法组织病理学半定量严重性评分。通过职业验证的兽医病理学家以不知情的方式审查了载玻片，并基于糖原贮积和自噬积累建立严重性评分。评分为0意指无病变；1意指平均少于9％的肌肉纤维受贮积影响；2意指10％到49％；3意指50％到75％，并且4意指76％到100％。

图7A-图7H示出了在以2.5×10¹²GC/Kg(即，比图6A-图6H中的剂量低10倍的剂量)施用编码各种hGAA的AAVhu68后四周，来自庞贝病小鼠的四头肌的组织学(过碘酸希夫(Periodic acid-Schiff，PAS)染色)的结果。对照庞贝病(-/-)(图7D)和野生型(+/+)(图7A)小鼠接受PBS注射。“hGAA”是指由野生型序列编码的具有天然信号肽的参考天然酶(hGAAV780)(图7B)。“hGAAcoV780I”是指由经工程化的序列编码并含有天然信号肽的hGAAV780I变体(图7E)。“Sp7.Δ8.hGAAcoV780I”是指前35个AA缺失的hGAAV780I变体，所述变体由与先前构建体相同但含有编码B2胰凝乳蛋白酶原信号肽而非天然信号肽的序列的经工程化的序列编码(图7F)。“BiP-vIGF2.hGAAco”是指含有前35个AA的缺失并进一步具有与对胰岛素受体的亲和力较低的IGF2变体融合的BiP信号肽且由经工程化的序列编码的参考hGAAV780(图7C)。“BiP-vIGF2.hGAAcoV780I”是指含有前35个AA的缺失并进一步具有与对胰岛素受体的亲和力较低的IGF2变体和由经工程化的序列编码的hGAAV780I融合的BiP信号肽的hGAAV780I(图7G)。(图7H)盲法组织病理学半定量严重性评分。通过职业验证的兽医病理学家以不知情的方式审查了载玻片，并基于糖原贮积和自噬积累建立严重性评分。评分为0意指无病变；1意指平均少于9％的肌肉纤维受贮积影响；2意指10％到49％；3意指50％到75％，并且4意指76％到100％。

图8示出了在施用(2.5×10¹²GC/kg)AAVhu68后四周的庞贝病小鼠的脊髓组织学(PAS和劳克坚牢蓝(luxol fast blue)染色)的结果，所述AAVhu68具有编码天然hGAA或含有前35个AA的缺失并进一步具有与对胰岛素受体的亲和力较低的IGF2变体和由经工程化的序列编码的hGAAV780I融合的BiP信号肽的hGAAV780I(“BiP-vIGF2.hGAAcoV780I”)的序列。对脊髓切片进行盲法组织病理学半定量严重性评分。

图9示出了血浆中的hGAA活性。以低剂量(2.5×10¹²GC)向庞贝病小鼠施用编码野生型hGAA或BiP-vIGF2.hGAA的载体。在静脉内施用后四周，在血浆中检测到高水平的野生型和经工程化的hGAA活性。

具体实施方式

提供了用于向患有庞贝病的患者递送hGAA780I酶的组合物。本文描述了制备和使用所述组合物的方法，包含用于用这些组合物治疗患者的方案。

如本文所使用的，术语“庞贝病”也称为麦芽糖酶缺乏症、II型糖原贮积病(GSDII)或II型糖原贮积症，其旨在指特征在于由编码酸性α-葡萄糖苷酶的GAA基因中的突变引起的溶酶体酶酸性a-葡萄糖苷酶(GAA)完全缺失或部分缺乏的遗传性溶酶体贮积病症。所述术语包含但不限于所述疾病的早发型和晚发型形式，包含但不限于婴儿型、青年型和成年型庞贝病。

应当理解，希腊字母“alpha”和符号“α”在本说明书中可互换使用。类似地，希腊字母“delta”和“Δ”在本说明书中可互换使用。

如本文中所使用的，术语“酸性α-葡萄糖苷酶”或“GAA”是指水解糖原、麦芽糖和异麦芽糖的D-葡萄糖单元之间的α-1,4键的溶酶体酶。替代性名称包含但不限于溶酶体α-葡萄糖苷酶(EC:3.2.1.20)；葡糖淀粉酶；1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶；淀粉葡萄糖苷酶；γ-淀粉酶和外切-1,4-α-葡萄糖苷酶。人酸性α-葡萄糖苷酶由GAA基因(美国国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information，NCBI)基因ID 2548)编码，所述基因已经被定位到染色体17的长臂(位置17q25.2-q25.3)。在氨基酸残基516-521处的保守六肽WIDMNE对于酸性α-葡萄糖苷酶蛋白的活性是必需的。术语“hGAA”是指人GAA的编码序列。

如本文所使用的，“rAAV.hGAA”是指具有AAV衣壳的rAAV，所述AAV衣壳中包装有载体基因组，所述载体基因组至少含有GAA酶(例如，780I变体)的编码序列。rAAVhu68.hGAA或rAAVhu68.hGAA是指其中AAV衣壳是本文定义的AAVhu68衣壳的rAAV。

参考全长hGAA的编号，在氨基酸位置1-27处存在信号肽。另外，所述酶已经与多个成熟蛋白，即氨基酸位置70到952处的成熟蛋白、定位于氨基酸位置123到952处的76kD成熟蛋白和氨基酸204到氨基酸952处的70kD成熟蛋白相关联。“活性催化位点”包括六肽WIDMNE(SEQ ID NO:3的氨基酸残基516-521)。在某些实施例中，可以选择更长的片段，例如位置516到616。其它活性位点包含配体结合位点，所述配体结合位点可以定位于位置376、404、405、441、481、516、518、519、600、613、616、649、674中的一个或多个位置处。

除非另有说明，否则术语“hGAA780I”或“hGAAV780I”是指具有在SEQ ID NO:3中复制的氨基酸序列的全长前原蛋白。在一些情况下，术语hGAAco780I或hGAAcoV780I用于指代编码hGAA780I的经工程化的序列。与前一段中描述的hGAA参考蛋白相比，hGAA780I在位置780处具有异亮氨酸(Ile或I)，参考hGAA在所述位置处含有缬氨酸(Val或V)。出人意料地发现，与在文献中被广泛描述为“参考序列”的在位置780处具有缬氨酸的hGAA序列(hGAAV780)相比，此hGAA780I具有更好的效果和改善的安全性曲线。例如，如在图5A-图5H中可以看到的，hGAAV780参考序列诱导毒性(纤维化心肌炎)，在相同剂量的hGAA780I下未看到所述毒性。因此，使用hGAA780I可以减少或消除接受hGAA疗法的患者的纤维化心肌炎。hGAA信号肽、成熟蛋白、活性催化位点和结合位点的位置可以基于SEQ ID NO:3中复制的hGAA780I中的类似位置来确定，即氨基酸位置1到27处的信号肽；氨基酸位置70到952处的成熟蛋白；定位于氨基酸位置123到952处的76kD成熟蛋白和氨基酸204到氨基952处的70kD成熟蛋白；氨基酸残基516-521处的包括六肽WIDMNE(SEQ ID NO:28)的“活性催化位点”；其它活性位点包含配体结合位点，所述配体结合位点可以定位于位置376、404..405、441、481、516、518..519、600、613、616、649、674中的一个或多个位置处。

在某些实施例中，可以选择具有与SEQ ID NO:3的hGAA780I至少95％相同、与所述hGAA780I至少97％相同或与所述hGAA780I至少99％相同的序列的hGAA780I。在某些实施例中，提供了与SEQ ID NO:3的成熟hGAA780I蛋白具有至少95％、至少97％或至少99同一性的序列。在某些实施例中，与hGAA780I具有至少95％到至少99％同一性的所述序列保留了活性催化位点的序列，而没有任何变化。在某些实施例中，与SEQ ID NO:3的hGAA780I具有至少95％到至少99％同一性的序列的特征在于：当在适当的动物模型中测试时，所述序列与参考hGAAV780相比具有改善的生物学效应和更好的安全性曲线。在某些实施例中，GAA活性测定可以如先前描述的那样(参见例如J.Hordeaux等人,《神经病理学通讯学报(ActaNeuropathological Communications)》,(2107)5:66)或使用其它合适的方法进行。在某些实施例中，hGAA780I酶在hGAA氨基酸序列中的其它位置含有修饰。突变体的实例可以含有例如美国专利9,920,307中描述的那些。在某些实施例中，此类突变体hGAA780I可以至少保留活性催化位点：WIDMNE(SEQ ID NO:28)和780I区中的氨基酸，如下所述。

在某些实施例中，提供了新的hGAA780I融合蛋白，所述融合蛋白包括不同于天然hGAA信号肽的前导肽。在某些实施例中，此外源前导肽优选地是人源的并且可以包含例如IL-2前导肽。在某些实施例中可行的特定外源信号肽包含来自胰凝乳蛋白酶原B2的氨基酸1-20、人α-1-抗胰蛋白酶的信号肽、来自艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的氨基酸1-25和来自蛋白酶CI抑制剂的氨基酸1-23。参见例如WO 2018046774。其它信号/前导肽可以天然存在于免疫球蛋白(例如，IgG)、细胞因子(例如，IL-2、IL12、IL18等)、胰岛素、白蛋白、β-葡萄糖醛酸酶、碱性蛋白酶或纤连蛋白分泌信号肽等中。还参见例如signalpeptide.de/index.php？m＝listspdb_mammalia。

此类嵌合hGAA780I可以具有外源前导来代替整个27aa天然信号肽。任选地，hGAA780I酶的N末端截短可能仅缺少信号肽的一部分(例如，约2到约25个氨基酸的缺失或其间的值)、整个信号肽或长于信号肽的片段(例如，基于SEQ ID NO:3的编号，至多到氨基酸70。任选地，此类酶可以含有长度为约5、10、15或20个氨基酸的C末端截短。

在某些实施例中，提供了一种新的融合蛋白，其包括与融合配偶体结合的成熟hGAA780I蛋白(aa 70到952)、成熟70kD蛋白(aa 123到aa 952)或成熟76kD蛋白(aa 204到952)。任选地，所述融合蛋白进一步包括对hGAA非天然的信号肽。进一步任选地，这些实施例之一可以进一步含有长度为约5、10、15或20个氨基酸的C末端截短。

在某些实施例中，包括hGAA780I蛋白的融合蛋白至少包括SEQ ID NO:3(hGAA780I)的氨基酸204到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，hGAA780I蛋白至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸204到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，hGAA780I蛋白至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸123到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述hGAA780I酶至少包括SEQ IDNO:3的氨基酸70到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。在某些实施例中，所述hGAA780I蛋白至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

在某些实施例中，融合蛋白包括信号序列和前导序列，并且与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的hGAA780I序列的活性位点没有变化和/或距hGAA780I的N端和/或C端氨基酸3到12个氨基酸没有变化。在优选实施例中，经工程化的hGAA表达盒至少编码以下的人hGAA780I片段：T-Val(V)-P-Ile(780I)-Glu(E)-Ala(A)-Leu(L)(SEQ ID NO:29)。在某些实施例中，经工程化的hGAA表达盒编码更长的人hGAA780I片段：Gln(Q)-T-V-P-780I-E-A-L-Gly(G)(SEQ ID NO:30)。在某些实施例中，经工程化的hGAA表达盒编码至少与以下相对应的片段：PLGT-Trp(W)-Tyr(Y)-Asp(D)-LQTVP-780I-EALG-(Ser或S)-L-PPPPAA序列(SEQ ID NO:31)。类似地，在优选实施例中，活性结合位点(SEQ ID NO:3的aa 518到521)没有氨基酸变化。在某些实施例中，位置600、616和/或674处的结合位点保持不变。在某些实施例中，称为的融合蛋白包括信号肽、任选的vIGF+2GS延伸序列、任选的ER蛋白水解肽和hGAA的前35个氨基酸缺失(即，缺乏天然信号肽和氨基酸28到35)的hGAA780I变体。

在某些实施例中，融合蛋白可以使用其它截短的hGAA780I蛋白(例如，使用通过引用并入本文的WO2018/0467741(Genethon)中描述的截短)构建。一个此类实施例是被称为：sp7-Δ8.hGAA780I的分泌型hGAA，其包括胰凝乳蛋白酶B2信号肽、ER蛋白水解肽和hGAA780I的氨基酸57到952(其中hGAA780I的氨基酸1到56缺失)。在某些实施例中，hGAA780I是融合蛋白包含SEQ ID NO:3的片段。在某些实施例中，所述SEQ ID NO:3的片段由SEQ ID NO:4的序列或与所述序列至少95％相同的序列编码。在某些实施例中，所述SEQID NO:3的片段由SEQ ID NO:5的序列或与所述序列至少95％相同的序列编码。

在整个本说明书中，各种表达盒、载体基因组、载体和组合物被描述为含有hGAA780I编码序列或hGAA780I蛋白或融合蛋白。应当理解，除非另有说明，否则包含N末端截短、C末端截短和融合蛋白如本文所述的那些在内的任何经工程化的hGAA780I蛋白或其编码序列可以类似地工程化到表达盒、载体基因组、载体和组合物中。

合适地，提供了包括本文所述的核酸序列的表达盒。

表达盒

如本文所使用的，“表达盒”是指包括编码功能性基因产物(例如，hGAA780I编码序列)的核酸序列的核酸分子，所述核酸序列可操作地连接到指导所述功能性基因产物在靶细胞中的表达的调控序列(例如，启动子)，并且可以包含用于其的其它调控序列。所需的调控序列以允许hGAA780I编码序列在靶细胞中转录、翻译和/或表达的方式与所述编码序列可操作地连接。

在某些实施例中，所述表达盒可以包含非翻译区中的一个或多个miRNA靶序列。如本文所描述的，miRNA靶序列被设计成由存在于细胞中的miRNA特异性地识别，在所述细胞中不期望转基因表达和/或期望降低转基因表达水平。在某些实施例中，所述表达盒包含特异性地降低背根神经节中hGAA780I融合蛋白表达的miRNA靶序列。在某些实施例中，miRNA靶序列定位于3'UTR、5'UTR和/或3'和5'UTR两者中。在某些实施例中，所述表达盒包括背根神经节(DRG)特异性miRNA靶序列的至少两个串联重复序列，其中所述至少两个串联重复序列包括可以相同或不同的至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列。在某些实施例中，所述至少两个drg特异性miRNA串联重复序列中的第一个的起点在距hGAA780I融合蛋白编码序列的3'端20个核苷酸内。在某些实施例中，所述至少两个DRG特异性miRNA串联重复序列中的第一个的起点距hGAA780I融合蛋白编码序列的3'端至少100个核苷酸。在某些实施例中，所述miRNA串联重复序列的长度为200到1200个核苷酸。在某些实施例中，相对于缺少miR靶序列的表达盒或载体基因组，包含miR靶不会改变治疗性转基因在一种或多种靶组织中的表达或功效。

在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为miR-183靶序列的至少一个miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有miR-183靶序列，其包含AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(SEQ ID NO:26)，其中与miR-183种子序列互补的序列加下划线。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与miR-183种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-183靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包含与miR-183种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-183靶序列含有与SEQ ID NO:26具有部分互补性的序列，并且因此当与SEQ ID NO:2比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:26比对时，miR-183靶序列包括具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个错配的序列，其中错配可以不连续。在某些实施例中，miR-183靶序列包含具有100％互补性的区，所述区还包括miR-183靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包含与miR-183种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-183靶序列的剩余部分与miR-183具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miR-183靶序列，所述miR-183靶序列包括截短的SEQ ID NO:26，即在SEQ ID NO:26的5'或3'端中的任一端或两端处缺少至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和一个miR-183靶序列。在又其它实施例中，表达盒或载体基因组包括至少两个、三个或四个miR-183靶序列。

在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有作为miR-182靶序列的至少一个miRNA靶序列。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有miR-182靶序列，其包含AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO:27)。在某些实施例中，载体基因组或表达盒含有与miR-182种子序列100％互补的序列的多于一个拷贝(例如，两个或三个拷贝)。在某些实施例中，miR-182靶序列的长度为约7个核苷酸到约28个核苷酸并且包含与miR-182种子序列至少100％互补的至少一个区。在某些实施例中，miR-182靶序列含有与SEQ ID NO:27具有部分互补性的序列，并且因此当与SEQ ID NO:27比对时，存在一个或多个错配。在某些实施例中，当与SEQ ID NO:27比对时，miR-183靶序列包括具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个错配的序列，其中错配可以不连续。在某些实施例中，miR-182靶序列包含具有100％互补性的区，所述区还包括miR-182靶序列的长度的至少30％。在某些实施例中，具有100％互补性的区包含与miR-182种子序列具有100％互补性的序列。在某些实施例中，miR-182靶序列的剩余部分与miR-182具有至少约80％到约99％的互补性。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包含miR-182靶序列，所述miR-182靶序列包括截短的SEQID NO:27，即在SEQ ID NO:27的5'或3'端中的任一端或两端处缺少至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的序列。在某些实施例中，表达盒或载体基因组包括转基因和一个miR-182靶序列。在又其它实施例中，表达盒或载体基因组包括至少两个、三个或四个miR-182靶序列。

本文所使用的术语“串联重复序列”是指存在两个或更多个连续的miRNA靶序列。这些miRNA靶序列可以是连续的，即一个接一个地直接定位，使得一个靶序列的3'端直接位于下一个靶序列的5'端的上游，没有中间序列，或者反之亦然。在另一个实施例中，miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由短间隔子序列隔开。

如本文所使用的，“间隔子”是任何所选核酸序列，例如，长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的定位在两个或更多个连续miRNA靶序列之间的核酸序列。在某些实施例中，间隔子的长度为1个到8个核苷酸、长度为2个到7个核苷酸、长度为3个到6个核苷酸、长度为四个核苷酸、4个到9个核苷酸、3个到7个核苷酸或更大的值。合适地，间隔子是非编码序列。在某些实施例中，间隔子可以具有四(4)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是GGAT。在某些实施例中，间隔子是六(6)个核苷酸。在某些实施例中，间隔子是CACGTG或GCATGC。

在某些实施例中，串联重复序列含有相同的miRNA靶序列中的两个、三个、四个或更多个。在某些实施例中，串联重复序列含有至少两个不同的miRNA靶序列、至少三个不同的miRNA靶序列或至少四个不同的miRNA靶序列等。在某些实施例中，串联重复序列可以含有相同的miRNA靶序列中的两个或三个以及不同的第四miRNA靶序列。

在某些实施例中，表达盒中可以有至少两组不同的串联重复序列。例如，3'UTR可以含有紧邻转基因下游的串联重复序列、UTR序列和两个或更多个更接近UTR的3'端的串联重复序列。在另一个实例中，5'UTR可以含有一个、两个或更多个miRNA靶序列。在另一个实例中，3'可以含有串联重复序列，并且5'UTR可以含有至少一个miRNA靶序列。

在某些实施例中，表达盒含有两个、三个、四个或更多个串联重复序列，所述串联重复序列在转基因的终止密码子的约0个到20个核苷酸内开始。在其它实施例中，表达盒含有距转基因的终止密码子至少100个到约4000个核苷酸的miRNA串联重复序列。

参见2019年12月20日提交的PCT/US19/67872，其通过引用并入本文并且要求于2018年12月21日提交的美国临时美国专利申请第62/783,956号的优先权，所述申请通过引用特此并入。

如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包含与hGAA780I编码序列邻接的表达控制序列和以反式或在远处起作用以控制hGAA780I编码序列的表达控制序列。此类调控序列通常包含例如启动子、增强子、内含子、Kozak序列、聚腺苷酸化序列和TATA信号中的一种或多种。

在某些实施例中，调控元件在受庞贝病影响的多种细胞和组织中指导表达，以便允许构建和递送适用于治疗多种靶细胞的单一表达盒。例如，可以选择在肝脏、骨骼肌、心脏和中枢神经系统细胞中的两种或更多种中表达的调控元件(例如，启动子)。例如，可以选择在中枢神经系统(例如，脑)细胞和骨骼肌中表达的调控元件(例如，启动子)。在其它实施例中，调控元件在CNS、骨骼肌和心脏中表达。在其它实施例中，表达盒允许编码的hGAA780I在肝脏、骨骼肌、心脏和中枢神经系统细胞中的全部中表达。在其它实施例中，可以选择调控元件以靶向特定组织并避免在某些细胞或组织中表达(例如，通过使用本文所述的drg-去靶向系统和/或通过选择组织特异性启动子)。在某些实施例中，将本文提供的优先靶向不同组织的不同表达盒施用于患者。

调控序列包括启动子。可以选择合适的启动子，包含但不限于将在靶细胞中表达hGAAV780I蛋白的启动子。

在某些实施例中，选择组成型启动子或诱导型/调控型启动子。组成型启动子的实例是鸡β-肌动蛋白启动子。多种鸡β-肌动蛋白启动子已单独描述，或与各种增强子元件(例如，CB7是具有巨细胞病毒增强子元件的鸡β-肌动蛋白启动子；CAG启动子，其包含启动子、鸡β肌动蛋白的第一外显子和第一内含子以及兔β珠蛋白基因的剪接受体；CBh启动子，SJGray等人,《人类基因疗法(Hu Gene Ther)》,2011年9月；22(9):1143-1153)组合描述。在某些实施例中，可以选择可调控的启动子。参见例如WO 2011/126808B2，其通过引用并入本文。

在某些实施例中，可以选择组织特异性启动子。组织特异性启动子的实例已熟知用于肝(白蛋白，Miyatake等人,(1997)《病毒学杂志(J.Virol.)》,71:5124-32；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,(1996)《基因疗法(Gene Ther.)》,3:1002-9；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人,(1996)《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》,7:1503-14)；中枢神经系统，例如神经元(如神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子，Andersen等人,(1993)《细胞分子神经生物学(Cell.Mol.Neurobiol.)》,13:503-15；神经丝轻链基因，Piccioli等人,(1991)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,88:5611-5；以及神经元特异性vgf基因，Piccioli等人,(1995)《神经元(Neuron)》,15:373-84)；心肌；骨骼肌；肺和其它组织。在另一个实施例中，合适的启动子可以包含但不限于以下：延伸因子1α(EF1α)启动子(参见例如Kim DW等人,使用人延伸因子1α启动子作为通用且高效的表达系统(Use of the humanelongation factor 1alpha promoter as a versatile and efficient expressionsystem).《基因(Gene)》.1990年7月16日；91(2):217-23)；突触蛋白1启动子(参见例如Kügler S等人,人突触蛋白1基因启动子根据转导区域从成年大鼠脑中的腺病毒载体赋予高度神经元特异性的长期转基因表达(Human synapsin1gene promoter confers highlyneuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector inthe adult rat brain depending on the transduced area).《基因疗法(Gene Ther.)》2003年2月；10(4):337-47)；神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子(参见例如Kim J等人,富含胆固醇的脂质筏参与白介素6诱导的LNCaP前列腺癌细胞的神经内分泌分化(Involvementof cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrinedifferentiation of LNCaP prostate cancer cells).《内分泌学(Endocrinology)》.2004年2月；145(2):613-9.电子版2003年10月16日)；或CB6启动子(参见例如携带人存活运动神经元基因的腺相关病毒载体血清型9的大规模生产(Large-Scale Production ofAdeno-Associated Viral Vector Serotype-9Carrying the Human Survival MotorNeuron Gene),《分子生物技术(Mol Biotechnol.)》2016年1月；58(1):30-6.doi:10.1007/s12033-015-9899-5)。在利用组织特异性启动子的某些实施例中，可以选择涉及具有靶向不同细胞类型的组织特异性启动子的不同表达盒的共疗法。

在一个实施例中，调控序列进一步包括增强子。在一个实施例中，调控序列包括一个增强子。在另一个实施例中，调控序列含有两个或更多个表达增强子。这些增强子可以相同或者可以不同。例如，增强子可以包含αmic/bik增强子或CMV增强子。此增强子可以存在于彼此相邻定位的两个拷贝中。可替代地，增强子的双拷贝可以被一个或多个序列隔开。

在一个实施例中，调控序列进一步包括内含子。在另外的实施例中，内含子是鸡β-肌动蛋白内含子。其它合适的内含子包含本领域已知的内含子，所述内含子可以是人β-球蛋白内含子和/或可商购获得的

内含子以及WO 2011/126808中描述的内含子。

在一个实施例中，调控序列进一步包括聚腺苷酸化信号(polyA)。在另外的实施例中，polyA是兔珠蛋白polyA。参见例如WO 2014/151341。可替代地，另一种polyA(例如，人生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列、SV40 polyA或合成polyA)可以包含在表达盒中。

表达盒可以通过任何合适的递送系统递送。合适的非病毒递送系统是本领域已知的(参见例如Ramamoorth和Narvekar.《临床诊断研究(J Clin Diagn Res.)》2015年1月；9(1):GE01-GE06，其通过引用并入本文中)并且可以由本领域技术人员容易地选择并且可以包含例如裸DNA、裸RNA、树状聚合物、PLGA、聚甲基丙烯酸酯、无机颗粒、脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒或LNP)或基于壳聚糖的调配物。

在一个实施例中，载体是非病毒质粒，所述非病毒质粒包括其描述的表达盒，例如，“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA；与各种组合物和纳米颗粒偶联，包含例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、多聚糖组合物和其它聚合物、基于脂质和/或胆固醇的核酸缀合物以及如本文所描述的其它构建体。参见例如X.Su等人,《分子制药学(Mol.Pharmaceutics)》,2011,8(3),第774-787页；网络出版物:2011年3月21日；WO2013/182683、WO 2010/053572和WO 2012/170930，所有所述文献都通过引用并入本文中。

在某些实施例中，本文提供了具有编码如本文所述的hGAA780I变体、融合蛋白或截短的蛋白的序列的核酸分子。在一个期望的实施例中，hGAA780I由SEQ ID NO:4的经工程化的序列或与所述经工程化的序列至少95％相同的编码hGAA780I变体的序列编码。在某些实施例中，SEQ ID NO:4被修饰成使得在位置780I处编码Ile的密码子是ATT或ATC。在某些实施例中，包括SEQ ID NO:4的经工程化的序列或其片段的核酸用于表达融合蛋白或截短的hGAA780I。尽管不太期望，但在某些实施例中，hGAA780I由SEQ ID NO:5编码。在某些实施例中，核酸分子是质粒。

应当理解，本文所描述的表达盒中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

载体

如本文所使用的，“载体”是包括核酸序列的生物或化学部分，所述生物或化学部分可以被引入到合适的靶细胞中以复制或表达所述核酸序列。载体的实例包含但不限于重组病毒、质粒、脂质体、聚合物体、复合物、树状聚合物、细胞穿透肽(CPP)缀合物、磁性颗粒或纳米颗粒。在一个实施例中，载体是具有对功能性基因产物进行编码的外源性或异源性经工程化的核酸的核酸分子，然后可以将所述核酸分子引入到适当的靶细胞中。此类载体优选地具有一个或多个复制起点以及重组DNA可以插入到的一个或多个位点。载体通常具有装置，通过所述装置，可以从没有载体的细胞中选择具有载体的细胞，例如，所述载体对耐药基因进行编码。常见的载体包含质粒、病毒基因组和“人工染色体”。载体的产生、生产、表征或定量的常规方法对于本领域技术人员是可用的。

在某些实施例中，本文所描述的载体是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，其是指其中含有对功能性hGAA780I基因产物或hGAA780I融合蛋白进行编码的核酸序列的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列均是复制缺陷型的；即，其不能产生子代病毒粒子，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含对复制所需的酶进行编码的基因(基因组可以被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有核酸序列编码，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，这被认为可以安全地用于基因疗法，因为除非存在复制所需的病毒酶，否则不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。

如本文所使用的，重组病毒载体是靶向期望细胞的任何合适的病毒载体。因此，重组病毒载体优选地靶向受庞贝病影响的细胞和组织中的一种或多种细胞和组织，包含中枢神经系统(例如，脑)、骨骼肌、心脏和/或肝脏。在某些实施例中，病毒载体至少靶向中枢神经系统(例如，脑)细胞、肺、心肌细胞或骨骼肌。在其它实施例中，病毒载体靶向CNS(例如，脑)、骨骼肌和/或心脏。在其它实施例中，病毒载体靶向肝脏、骨骼肌、心脏和中枢神经系统细胞中的全部。实例提供了说明性重组腺相关病毒(rAAV)。然而，其它合适的病毒载体可以包含例如重组腺病毒、重组细小病毒如重组博卡病毒、杂交AAV/博卡病毒、重组单纯疱疹病毒、重组逆转录病毒或重组慢病毒。在优选实施例中，这些重组病毒不能复制。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”可以指其中产生载体(例如，重组AAV)的包装细胞系。宿主细胞可以是原核或真核细胞(例如，人、昆虫或酵母)，所述原核或真核细胞含有通过任何方式(例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合)引入到细胞中的外源性或异源性DNA。宿主细胞的实例可以包含但不限于分离的细胞、细胞培养物、大肠杆菌(Escherichia coli)细胞、酵母细胞、人细胞、非人细胞、哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞、昆虫细胞、HEK-293细胞、肝细胞、肾细胞、中枢神经系统的细胞、神经元、神经胶质细胞或干细胞。

在某些实施例中，宿主细胞含有用于产生hGAA780I的表达盒，使得在体外以足够的量产生用于分离或纯化的蛋白质。在某些实施例中，宿主细胞含有编码hGAAV780I或其片段的表达盒。如本文所提供的，hGAA780I可以包含在作为治疗剂(即酶替代疗法)施用于受试者的药物组合物中。

如本文所使用的，术语“靶细胞”是指其中期望功能性基因产物的表达的任何靶细胞。

如本文所使用的，“载体基因组”是指包装在病毒载体内部的核酸序列。在一个实例中，“载体基因组”从5'到3'至少含有载体特异性序列、核酸序列以及载体特异性序列，所述核酸序列对功能性基因产物(例如，hGAAV780I、融合蛋白hGAAV780I或另一种蛋白质)进行编码，所述核酸序列与指导所述功能性基因产物在靶细胞中的表达的调控序列、载体特异性序列和任选的一个或多个非翻译区中的miRNA靶序列可操作地连接。载体特异性序列可以是特异性地将载体基因组包装到病毒载体衣壳或包膜蛋白中的末端重复序列。例如，AAV反向末端重复序列用于包装到AAV和某些其它细小病毒衣壳中。在期望包装到慢病毒载体中的情况下，可以利用慢病毒长末端重复序列。类似地，可以选择其它末端重复序列(例如，逆转录病毒长末端重复序列)等。

应当理解，本文所描述的载体中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

腺相关病毒(AAV)

在一方面，本文提供了包括AAV衣壳和包装在所述AAV衣壳中的载体基因组的重组AAV(rAAV)，所述载体基因组编码如本文所述的hGAAV780I蛋白(酶)，包含融合蛋白。在某些实施例中，所选AAV衣壳靶向肝脏、肌肉、肾脏、心脏和/或中枢神经系统细胞类型中的两种或更多种细胞。在某些实施例中，期望在肝脏、骨骼肌、心脏、肾脏和/或至少一种中枢神经系统细胞类型中的至少两种或更多种中表达hGAA780I蛋白。因此，在一个实施例中，所选AAV衣壳靶向心脏组织。在某些实施例中，被选择成靶向心脏组织的AAV衣壳选自AAV1、6、8和9(参见例如Katz等人,《人类基因疗法临床开发(Hum Gene Ther Clin Dev.)》2017年9月1日；28(3):157–164)。在又其它实施例中，所选AAV衣壳靶向肾脏细胞。在一个实施例中，用于靶向肾脏细胞的衣壳选自AAV1、2、6、8、9和Anc80(参见例如Ikeda Y等人,《美国肾脏病学会杂志(J Am Soc Nephrol.)》,2018年9月；29(9):2287-2297和Ascio等人《生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)》2018年2月26日；497(1):19–24)。

在一个实施例中，载体基因组包括AAV 5'反向末端重复序列(ITR)、如本文所描述的表达盒和AAV 3'ITR。在一个实施例中，载体基因组是指包装在形成rAAV载体的rAAV衣壳内部的核酸序列。此类核酸序列含有侧接表达盒的AAV反向末端重复序列(ITR)。在一个实例中，用于包装到AAV或博卡病毒衣壳中的“载体基因组”从5'到3'至少含有AAV 5'ITR、编码如本文所述的功能性hGAA780I(例如，hGAA780I融合蛋白)的核酸序列和AAV 3'ITR，所述核酸序列与指导所述功能性hGAA780I在靶细胞中的表达的调控序列可操作地连接。在某些实施例中，ITR来自AAV2，并且衣壳来自不同的AAV。可替代地，可以使用其它ITR。在某些实施例中，载体基因组进一步包括非翻译区中的miRNA靶序列，所述miRNA靶序列被设计成由细胞中的miRNA序列特异性地识别，在所述细胞中不期望转基因表达和/或期望降低转基因表达水平。

ITR是在载体产生期间负责基因组复制和包装的基因元件，并且是产生rAAV所需的唯一病毒顺式元件。在一个实施例中，ITR来自与供应衣壳的AAV不同的AAV。在优选实施例中，来自AAV2的ITR序列或其缺失版本(ΔITR)可以为了方便而使用和加速调控批准。然而，可以选择来自其它AAV来源的ITR。在ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一种AAV来源的情况下，所得载体可以被称为假型。通常，AAV载体基因组包括AAV 5'ITR、hGAA780I编码序列和任何调控序列以及AAV 3'ITR。然而，这些元件的其它构型可以是合适的。已经描述了被称为ΔITR的5'ITR的缩短版本，其中缺失了D序列和末端解析位点(trs)。在其它实施例中，使用了全长AAV 5'和3'ITR。

如本文所使用的，术语“AAV”是指天然存在的腺相关病毒、本领域技术人员可获得的和/或根据本文所描述的组合物和方法可获得的腺相关病毒以及人工AAV。腺相关病毒(AAV)病毒载体是具有AAV蛋白衣壳的AAV核酸酶(例如，DNase)抗性颗粒，其中包装有侧接AAV反向末端重复序列(ITR)的用于递送到靶细胞的表达盒。核酸酶抗性重组AAV(rAAV)表示AAV衣壳已经完全组装并保护这些包装的载体基因组序列在被设计成去除产生过程中可能存在的污染性核酸的核酸酶温育步骤期间免于降解(消化)。在许多情况下，本文所描述的rAAV是DNase抗性的。

AAV衣壳的来源可能是数十种天然存在和可用的腺相关病毒中的任何腺相关病毒之一以及经工程化的AAV。腺相关病毒(AAV)病毒载体是具有AAV蛋白衣壳的AAV DNase抗性颗粒，所述AAV蛋白衣壳中包装有用于递送到靶细胞的核酸序列。AAV衣壳由60个衣壳(cap)蛋白亚基VP1、VP2和VP3构成，其以二十面体对称布置，比率为大约1:1:10到1:1:20，具体取决于所选AAV。可以选择各种AAV作为如上文所鉴定的AAV病毒载体的衣壳的来源。参见例如美国公开专利申请第2007/0036760A1；美国公开专利申请第2009/0197338A1；EP 1310571。还参见WO 2003/042397(AAV7和其它猿猴类AAV)、美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)、WO 2005/033321和US 7,906,111(AAV9)和WO 2006/110689、WO 2003/042397(rh.10)以及WO 2018/160582(AAVhu68)。这些文档还描述了可以选择用于产生AAV的其它AAV，并且通过引用并入。除非另有说明，否则本文所描述的AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组分可以容易地选自任何AAV，包含但不限于通常鉴定为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8、AAVAnc80、AAVrh10和AAVPHP.B的AAV、任何已知或提及的AAV或尚未发现的AAV的变体或其变体或混合物。参见例如WO 2005/033321，其通过引用并入本文。在一个实施例中，AAV衣壳是AAV1衣壳或其变体、AAV8衣壳或其变体、AAV9衣壳或其变体、AAVrh.10衣壳或其变体、AAVrh64R1衣壳或其变体、AAVhu.37衣壳或其变体、或AAV3B或其变体。在一方面，衣壳是AAVhu.37衣壳。在某些实施例中，衣壳蛋白由rAAV载体名称中的术语“AAV”之后的数字或数字和字母的组合指定。还参见各自于2019年2月27日提交的标题为“新型腺相关病毒(AAV)载体、具有减少的衣壳脱酰胺的AAV载体及其用途(NovelAdeno-Associated Virus(AAV)Vectors,AAV Vectors Having Reduced CapsidDeamidation And Uses Therefor)”的PCT/US19/19804和PCT/US19/19861，所述文献通过引用整体并入本文。

ITR或其它AAV组分可以使用本领域技术人员可用的技术从AAV中容易地分离出来或进行工程化。此类AAV可以从学术、商业或公共来源分离、工程化或获得(例如，维吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA))。可替代地，AAV序列可以通过合成或其它适合的方式通过参考公开的序列(如在文献中或在如GenBank、PubMed等数据库中可获得的公开的序列)进行工程化。AAV病毒可以通过常规的分子生物学技术进行工程化，从而可以优化这些颗粒以用于核酸序列的细胞特异性递送、用于最小化免疫原性、用于调节稳定性和颗粒寿命、用于高效降解、用于准确递送到细胞核等。

如本文所使用的，可互换使用的术语“rAAV”和“人工AAV”意指但不限于包括衣壳蛋白和包装在其中的载体基因组的AAV，其中载体基因组包括与AAV异源的核酸。在一个实施例中，衣壳蛋白是非天然存在的衣壳。此类人工衣壳可以通过任何合适的技术使用所选AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)与异源序列的组合产生，所述异源序列可以从不同的所选AAV、同一AAV的非连续部分、从非AAV病毒来源或从非病毒来源获得。人工AAV可以是但不限于假型AAV、嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。假型载体可用于本发明中，其中一个AAV的衣壳被异源衣壳蛋白替代。在一个实施例中，AAV2/5和AAV2/8是示例性假型载体。所选基因元件可以通过任何合适的方法递送，包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员而言是已知的并且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如Green和Sambrook,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A[Laboratory Manual)》,纽约市冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)(2012)。

在某些实施例中，AAV衣壳选自天然的和经工程化的进化枝F腺相关病毒。在下面的实例中，进化枝F腺相关病毒是AAVhu68。参见WO 2018/160582，其通过引用整体并入本文。然而，在其它实施例中，AAV衣壳选自不同的进化枝，例如进化枝A、B、C、D或E，或选自这些进化枝中的任何进化枝之外的AAV源。

如本文所使用的，与AAV的组有关的术语“进化枝”是指如基于对AAV vp1氨基酸序列进行的比对，通过(至少1000个复制品的)至少75％的自举值(bootstrap value)和不大于0.05的泊松校正距离测量结果(Poisson correction distance measurement)使用邻接算法(Neighbor-Joining algorithm)确定的一组在系统发育上彼此相关的AAV。在文献中已经描述了邻接算法。参见例如M.Nei和S.Kumar,《分子进化和系统发育学(MolecularEvolution and Phylogenetics)》(牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(2000))。提供了可以用于实施此算法的可用计算机程序。例如，MEGApv2.1程序实施了经修改的Nei-Gojobori方法。使用这些技术和计算机程序以及AAV vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选AAV是含在本文所鉴定的进化枝之一中，还是在这些进化枝之外的另一个进化枝中。参见例如G Gao等人,《病毒学杂志(JVirol)》,2004年6月；7810:6381-6388，所述文献鉴定进化枝A、B、C、D、E和F，并提供新颖AAV的核酸序列，GenBank登录号AY530553到AY530629。还参见WO 2005/033321。

如本文所使用的，“AAV9衣壳”是指具有以下的氨基酸序列的AAV9：(a)GenBank登录：AAS99264，其通过引用并入本文中，以及AAV vp1衣壳蛋白；和/或(b)由GenBank登录：AY530579.1：(nt 1..2211)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。本发明涵盖来自此经过编码的序列的一些变化，其可以包含与GenBank登录：AAS99264和US7906111(也为WO 2005/033321)中的参考氨基酸序列具有约99％的同一性的序列(即与参考序列的变化小于约1％)。此类AAV可以包含例如天然分离物(例如，hu31或hu32)或具有氨基酸取代、缺失或添加的AAV9的变体，例如包含但不限于选自从与AAV9衣壳比对的任何其它AAV衣壳中的对应位置“招募”的替代性残基；例如，如US 9,102,949、US 8,927,514、US2015/349911、WO2016/049230A1、US 9,623,120和US 9,585,971中所述。然而，在其它实施例中，可以选择与上文所引用的序列具有至少约95％的同一性的AAV9或AAV9衣壳的其它变体。参见例如US2015/0079038。已经描述了产生衣壳的方法、其编码序列以及产生rAAV病毒载体的方法。参见例如Gao等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》100(10):6081-6086(2003)和US 2013/0045186A1。

在某些实施例中，AAVhu68衣壳如标题为“新型腺相关病毒(AAV)进化枝F载体及其用途(Novel Adeno-associated virus(AAV)Clade F Vector and Uses Therefor)”的WO2018/160582中所述，所述文献在此通过引用并入。在某些实施例中，AAVhu68衣壳蛋白包括：通过从对SEQ ID NO:2的1到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列的表达产生的AAVhu68 vp1蛋白、从SEQ ID NO:2产生的vp1蛋白或从与SEQ ID NO:1至少70％相同的对SEQ ID NO:2的1到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp1蛋白；通过从对SEQ ID NO:2的至少约氨基酸138到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列的表达产生的AAVhu68 vp2蛋白、从包括SEQ ID NO:1的至少核苷酸412到2211的序列产生的vp2蛋白或从与SEQ ID NO:1的至少核苷酸412到2211至少70％相同的对SEQ ID NO:2的至少约氨基酸138到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp2蛋白，和/或通过从对SEQID NO:2的至少约氨基酸203到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列的表达产生的AAVhu68 vp3蛋白、从包括SEQ ID NO:1的至少核苷酸607到2211的序列产生的vp3蛋白或从与SEQ ID NO:1的至少核苷酸607到2211至少70％相同的对SEQ ID NO:2的至少约氨基酸203到736的预测的氨基酸序列进行编码的核酸序列产生的vp3蛋白。

AAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白通常表示为由对SEQ ID NO:2的全长vp1氨基酸序列(氨基酸1到736)进行编码的相同核酸序列编码的替代剪接变体。任选地，单独使用vp1编码序列来表达vp1、vp2和vp3蛋白。可替代地，此序列可以与以下中的一个或多个共表达：对SEQ ID NO:2的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203到736)进行编码的核酸序列，所述AAVhu68 vp3氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1到约aa 202)或与其互补的链，即对应的mRNA(SEQ ID NO:1的约nt 607到约nt 2211)；或与SEQID NO:1至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的对SEQ ID NO:2的aa 203到736进行编码的序列。另外地或可替代地，vp1编码和/或vp2编码序列可以与以下共表达：对SEQ ID NO:2的AAVhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138到736)进行编码的核酸序列，所述AAVhu68 vp2氨基酸序列没有vp1独特区(约aa 1到约aa 137)或与其互补的链，即对应的mRNA(例如，SEQ ID NO:1的nt 412到2211)；或与SEQ ID NO:1的nt 412到2211至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)相同的对SEQ ID NO:2的约aa 138到736进行编码的序列。

如本文所描述的，rAAVhu68具有在产生系统中产生的rAAVhu68衣壳，所述产生系统表达来自以下的衣壳：对SEQ ID NO:2的vp1氨基酸序列进行编码的AAVhu68核酸以及任选地例如对不含vp1和/或vp2独特区的vp3蛋白进行编码的另外的核酸序列。使用单个核酸序列vp1从生产中产生的rAAVhu68产生vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白的异质群体。更具体地，AAVhu68衣壳含有具有来自SEQ ID NO:2中的预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，天冬酰胺-甘氨酸对中的天冬酰胺是高度脱酰胺化的。

在一个实施例中，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO:1的序列或与其互补的链，例如，对应的mRNA。在某些实施例中，vp2和/或vp3蛋白可以另外地或可替代地由不同于vp1的核酸序列表达，例如以改变所选表达系统中的vp蛋白的比率。在某些实施例中，还提供了对SEQ ID NO:2的AAVhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203到736)进行编码的核酸序列，所述AAVhu68 vp3氨基酸序列没有vp1-独特区(约aa 1到约aa 137)和/或vp2独特区(约aa 1到约aa 202)或与其互补的链，即对应的mRNA(SEQ ID NO:2的约nt 607到约nt 2211)。在某些实施例中，还提供了对SEQ ID NO:2的AAVhu68vp2氨基酸序列(约aa 138到736)进行编码的核酸序列，所述AAVhu68 vp2氨基酸序列没有vp1-独特区(约aa 1到约137)或与其互补的链，即对应的mRNA(SEQ ID NO:1的nt 412到nt 2211)。

然而，可以选择对SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行编码的其它核酸序列用于产生rAAVhu68衣壳。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:1的核酸序列或对SEQ ID NO:2进行编码的与SEQ ID NO:1至少70％到99％相同、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的序列。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ IDNO:1的核酸序列或对SEQ ID NO:2的vp2衣壳蛋白(约aa 138到736)进行编码的与SEQ IDNO:1的约nt 412到约nt 2211至少70％到99％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％相同的序列。在某些实施例中，核酸序列具有SEQ ID NO:1的约nt 607到约nt 2211的核酸序列或对SEQ ID NO:1的vp3衣壳蛋白(约aa 203到736)进行编码的与SEQ ID NO:1的nt 412到约nt 2211至少70％到99.％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％相同的序列。

设计对此AAVhu68衣壳进行编码的核酸序列在本领域的技术范围内，包含DNA(基因组或cDNA)或RNA(例如，mRNA)。在某些实施例中，SEQ ID NO:2中提供了对AAVhu68 vp1衣壳蛋白进行编码的核酸序列。在某些实施例中，AAVhu68衣壳是使用SEQ ID NO:1的核酸序列或具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的如本文所描述的修饰(例如，脱酰胺化的氨基酸)的对SEQ ID NO:2的vp1氨基酸序列进行编码的序列产生的。在某些实施例中，vp1氨基酸序列在SEQ ID NO:2中重现。

在某些实施例中，可以选择具有减少的衣壳脱酰胺的AAV衣壳。参见例如PCT/US19/19804和PCT/US18/19861，两者均于2019年2月27日提交并通过引用整体并入。

如本文所使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质”或其任何语法变型是指由不相同的元件组成的群体，例如具有带有不同的经过修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。SEQ ID NO:2提供了AAVhu68 vp1蛋白的经过编码的氨基酸序列。与vp1、vp2和vp3蛋白(可替代地被称为同种型)结合使用的术语“异质的”是指衣壳内的vp1、vp2和vp3蛋白的氨基酸序列中的差异。AAV衣壳含有具有来自预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含某些脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，某些亚群体包括天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)位置，并且任选地进一步包括其它脱酰胺化的氨基酸，其中脱酰胺化引起氨基酸变化和其它任选的修饰。

如本文所使用的，除非另有说明，否则vp蛋白的“亚群体”是指一组vp蛋白，所述一组vp蛋白具有至少一个限定的共同特性，并且由至少一个组成员到少于参考组的所有成员组成。例如，除非另有说明，否则vp1蛋白的“亚群体”是至少一种(1)vp1蛋白，并且少于组装的AAV衣壳中的所有vp1蛋白。除非另有说明，否则vp3蛋白的“亚群体”可以是少于组装的AAV衣壳中的所有vp3蛋白的一种(1)vp3蛋白。例如，vp1蛋白可以是vp蛋白的亚群体；vp2蛋白可以是vp蛋白的单独的亚群体，并且vp3是组装的AAV衣壳中的vp蛋白的又另外的亚群体。在另一个实例中，vp1、vp2和vp3蛋白可以含有具有不同修饰的亚群体，例如，至少一种、两种、三种或四种高度脱酰胺化的天冬酰胺，例如在天冬酰胺-甘氨酸对处。

除非另有说明，否则高度脱酰胺化的是指与在参考氨基酸位置处的预测的氨基酸序列相比，在参考的氨基酸位置处被至少45％脱酰胺化的、至少50％脱酰胺化的、至少60％脱酰胺化的、至少65％脱酰胺化的、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或至多约100％脱酰胺化的(例如，在基于SEQ ID NO:2的编号[AAVhu68]的氨基酸57处的天冬酰胺的至少80％可以基于总vp1蛋白脱酰胺化、可以基于总vp1、vp2和vp3蛋白脱酰胺化)。此类百分比可以使用2D凝胶、质谱技术或其它合适的技术来确定。

因此，rAAV包含vp1、vp2和/或vp3蛋白的rAAV衣壳内具有脱酰胺化的氨基酸的亚群体，至少包含至少一个包括至少一种高度脱酰胺化的天冬酰胺的亚群体。另外，其它修饰可以包含异构化，特别是在所选天冬氨酸(D或Asp)残基位置处。在仍其它实施例中，修饰可以包含在Asp位置处的酰胺化。

在某些实施例中，AAV衣壳含有具有至少4个到至少约25个脱酰胺化的氨基酸残基位置的vp1、vp2和vp3的亚群体，与vp蛋白的经过编码的氨基酸序列相比，所述氨基酸残基位置中的至少1％到10％被脱酰胺化。这些中的大多数可以是N残基。然而，Q残基也可以被脱酰胺化。

在某些实施例中，rAAV具有含有vp1、vp2和vp3蛋白的AAV衣壳，所述蛋白具有包括在实例1中提供的表中列出的位置处的两个、三个、四个或更多个脱酰胺化的残基的组合的亚群体，并通过引用并入本文中。rAAV中的脱酰胺化可以使用2D凝胶电泳和/或质谱和/或蛋白质建模技术来确定。在线色谱可以使用Acclaim PepMap柱和与Q Exactive HF和NanoFlex源(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))耦合的Thermo UltiMate3000RSLC系统(赛默飞世尔科技公司)执行。MS数据是使用用于Q Exactive HF的数据依赖性前20种方法获取的，所述方法从调查扫描(200-2000m/z)中动态选择最丰富的尚未测序的前体离子。测序通过高能碰撞解离片段进行，其中通过预测性自动增益控制确定的靶值为1e5离子，并且以4m/z的窗口进行前体分离。在m/z 200下以120,000的分辨率获取调查扫描。HCD光谱的分辨率可以在m/z 200下设置为30,000，其中最大离子注入时间为50毫秒，并且归一化碰撞能量为30。S-透镜RF水平可以设置为50，以使消化肽所占据的m/z区达到最佳传输。可以从片段选择中排除具有单个、未分配或六个和更高电荷状态的前体离子。BioPharma Finder 1.0软件(赛默飞世尔科技公司)可以用于分析所获取的数据。对于肽作图，使用单进入蛋白FASTA数据库进行搜索，其中脲基甲基化设置为固定的修饰；并将氧化、脱酰胺化和磷酸化设置为可变修饰、10ppm质量准确度、高蛋白酶特异性和置信水平为0.8的MS/MS光谱。合适的蛋白酶的实例可以包含例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。脱酰胺化的肽的质谱鉴定相对简单，因为脱酰胺化向完整分子的质量添加了+0.984Da(-OH基团与-NH₂基团之间的质量差)。特定肽的脱酰胺化百分比通过将脱酰胺化的肽的质量面积除以脱酰胺化的和天然的肽的面积之和来确定。考虑到可能的脱酰胺化位点的数量，在不同位点处被脱酰胺化的同量异位物种可以在单个峰中共迁移。因此，源自具有多个潜在的脱酰胺化位点的肽的片段离子可以用于定位或区分多个脱酰胺化位点。在这些情况下，观察到的同位素图案内的相对强度可以用于特异性确定不同的脱酰胺化的肽异构体的相对丰度。此方法假设所有异构物种的片段化效率是相同的，并且在脱酰胺化位点上是独立的。本领域的技术人员将理解的是，可以使用这些说明性方法的多种变型。例如，合适的质谱仪可以包含例如四极杆飞行时间质谱仪(QTOF)，如Waters Xevo或Agilent 6530，或Orbitrap仪器，如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(赛默飞世尔科技公司)。合适的液相色谱系统包含例如来自沃特世(Waters)的Acquity UPLC系统或Agilent系统(1100或1200系列)。合适的数据分析软件可以包含例如MassLynx(沃特世)、Pinpoint和Petfinder(赛默飞世尔科技公司)、Mascot(矩阵科学公司(Matrix Science))、Peaks DB(生物信息学解决方案公司(Bioinformatics Solutions))。可以在例如X.Jin等人,于2017年6月16日在线公开的《人类基因疗法方法(Hu Gene Therapy Methods)》,第28卷,第5期,第255-267页中描述仍其它技术。

除脱酰胺化之外，可能发生不会导致一个氨基酸转化为不同的氨基酸残基的其它修饰。这种修饰可以包含乙酰化残基、异构化、磷酸化或氧化。

脱酰胺化的调节：在某些实施例中，AAV被修饰成改变天冬酰胺-甘氨酸对中的甘氨酸，以降低脱酰胺化。在其它实施例中，将天冬酰胺改变为不同的氨基酸，例如以较慢速率进行脱酰胺化的谷氨酰胺；或改变为缺乏酰胺基的氨基酸(例如，含有酰胺基的谷氨酰胺和天冬酰胺)；和/或改变为缺乏胺基的氨基酸(例如，含有胺基的赖氨酸、精氨酸和组氨酸)。如本文所使用的，缺乏酰胺或胺侧基的氨基酸是指例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸和/或脯氨酸。如所描述的修饰可以在经过编码的AAV氨基酸序列中存在的天冬酰胺-甘氨酸对中的一个、两个或三个天冬酰胺-甘氨酸对中。在某些实施例中，在所有四个天冬酰胺-甘氨酸对中没有进行此类修饰。因此，一种用于降低具有较低脱酰胺化速率的AAV和/或经工程化的AAV变体的脱酰胺化的方法。另外地或可替代地，可以将一种或多种其它酰胺氨基酸改变为非酰胺氨基酸以降低AAV的脱酰胺化。在某些实施例中，本文所描述的突变AAV衣壳含有天冬酰胺-甘氨酸对中的突变，使得甘氨酸变为丙氨酸或丝氨酸。突变AAV衣壳可以含有一个、两个或三个突变体，其中参考AAV天然地含有四个NG对。在某些实施例中，AAV衣壳可以含有一个、两个、三个或四个此类突变体，其中参考AAV天然地含有五个NG对。在某些实施例中，突变AAV衣壳含有NG对中的仅单个突变。在某些实施例中，突变AAV衣壳含有两个不同的NG对中的突变。在某些实施例中，突变AAV衣壳含有定位在AAV衣壳中的结构上分开的位置中的两个不同的NG对中的突变。在某些实施例中，突变不在VP1-独特区中。在某些实施例中，突变之一不在VP1-独特区中。任选地，突变AAV衣壳不含有NG对中的修饰，但是含有突变以最小化或消除定位在NG对的外部的一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺中的脱酰胺化。在AAVhu68衣壳蛋白中，4个残基(N57、N329、N452、N512)跨不同批次常规地显示出脱酰胺化水平>70％，并且在大多数情况下脱酰胺化水平>90％。另外的天冬酰胺残基(N94、N253、N270、N304、N409、N477和Q599)跨不同批次也显示出至多约20％的脱酰胺化水平。最初使用胰蛋白酶消化物鉴定脱酰胺化水平，并用胰凝乳蛋白酶消化对其进行验证。

AAVhu68衣壳含有具有来自SEQ ID NO:2中的预测的氨基酸残基的修饰的vp1蛋白内、vp2蛋白内和vp3蛋白内的亚群体。这些亚群体至少包含某些脱酰胺化的天冬酰胺(N或Asn)残基。例如，某些亚群体包括SEQ ID NO:2中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺化的天冬酰胺(N)位置，并且任选地进一步包括其它脱酰胺化的氨基酸，其中脱酰胺化引起氨基酸变化和其它任选的修饰。在本文中描述了这些和其它修饰的各种组合。

在某些实施例中，如本文所描述的rAAV是自身互补AAV。“自身互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列所携带的编码区已经被设计成形成分子内双链DNA模板的构建体。感染后，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见例如D M McCarty等人,“自身互补重组腺相关病毒(scAAV)载体独立于DNA合成而促进高效转导(Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independentlyof DNA synthesis)”,《基因疗法(Gene Therapy)》,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自身互补AAV在例如美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；和第7,456,683号中描述，所述美国专利中的每个美国专利通过引用整体并入本文中。

应当理解，本文所描述的rAAV中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

药物组合物

包括hGAA780I蛋白或融合蛋白或包括hGAA780I蛋白或融合蛋白转基因的表达盒的药物组合物可以是液体悬浮液、经冻干或经冷冻的组合物或另一种合适的调配物。在某些实施例中，所述组合物包括hGAA780I蛋白或融合蛋白或表达盒和形成悬浮液的生理上相容的液体(例如，溶液、稀释剂、载体)。此类液体优选地是水基的并且可以含有以下中的一种或多种：缓冲剂、表面活性剂、pH调节剂、防腐剂或其它合适的赋形剂。下文更详细地讨论了合适的组分。所述药物组合物包括水性悬浮液和任何所选赋形剂以及hGAA780I蛋白或融合蛋白或表达盒。

在某些实施例中，药物组合物包括包含转基因和非病毒递送系统的表达盒。这可以包含例如裸DNA、裸RNA、无机颗粒、脂质或脂质样颗粒、基于壳聚糖的调配物和本领域已知的并且例如由Ramamoorth和Narvekar描述的其它调配物，如上所述。在其它实施例中，药物组合物是包括表达盒的悬浮液，所述表达盒包括在病毒载体系统中工程化的转基因。在某些实施例中，药物组合物包括非复制病毒载体。合适的病毒载体可以包含任何合适的递送载体，例如重组腺病毒、重组慢病毒、重组博卡病毒、重组腺相关病毒(AAV)或另一种重组细小病毒。在某些实施例中，病毒载体是用于向有需要的患者递送基因产物的重组AAV。

在一个实施例中，药物组合物包括hGAA780I蛋白或融合蛋白或包括hGAA780I蛋白或融合蛋白的编码序列的表达盒和适合通过脑室内(ICV)、鞘内(IT)、脑池内或静脉内(IV)注射递送的调配物缓冲液。在一个实施例中，表达盒是重组病毒载体(即，rAAV.hGAA780I)中包装的载体基因组的一部分。

在一个实施例中，药物组合物包括用于作为酶替代疗法(ERT)递送给受试者的hGAA780I蛋白或其功能片段。此类药物组合物通常静脉内施用，然而在一些情况下皮内、肌肉内或口服施用也是可能的。可以施用组合物来预防性治疗患有庞贝病或有患庞贝病风险的个体。对于治疗应用，将药物组合物以足以降低积累代谢物浓度和/或防止或阻止代谢物进一步积累的量施用于患有已确定疾病的患者。对于有溶酶体酶缺乏症风险的个体，以足以防止或抑制代谢物积累的量预防性地施用药物组合物。本文所述的经修饰的GAA组合物以治疗有效量施用。一般而言，治疗有效量可以根据受试者的医学状况的严重性以及受试者的年龄、一般状况和性别而变化。剂量可以由医生确定，并可以根据需要进行调整以适应所观察到的治疗效果。在一方面，本文提供了一种用于ERT的药物组合物，所述药物组合物被调配成含有单位剂量的hGAA780I蛋白或融合蛋白或其功能片段。

在一个实施例中，组合物包含适合于递送到受试者的最终调配物，所述组合物是例如缓冲到生理上相容的pH和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，调配物中存在一种或多种表面活性剂。在另一个实施例中，可以将组合物作为稀释以施用于受试者的浓缩物运输。在其它实施例中，可以在施用时将组合物冻干并重构。

在一个实施例中，如本文所提供的组合物包括溶解于水性悬浮液中的表面活性剂、防腐剂、赋形剂和/或缓冲液。在一个实施例中，缓冲液是PBS。在另一个实施例中，缓冲液是人工脑脊液(aCSF)，例如艾略特调配物缓冲液(Eliott's formulation buffer)；或哈佛设备灌注流体(Harvard apparatus perfusion fluid)(具有以下最终离子浓度(以mM为单位)的人工CSF：Na 150；K 3.0；Ca 1.4；Mg 0.8；P 1.0；Cl 155)。各种合适的溶液是已知的，包含那些包含以下中的一种或多种的溶液：缓冲盐水、表面活性剂和生理上相容的盐或盐的混合物，其离子强度被调节到等同于约100mM氯化钠(NaCl)到约250mM氯化钠，或被调节到等离子浓度的生理上相容的盐。

合适地，将调配物调节到生理上可接受的pH，例如，在pH 6到8、或pH 6.5到7.5、pH7.0到7.7或pH 7.2到7.8的范围内。由于脑脊液的pH为约7.28到约7.32，对于鞘内递送，可能期望在此范围内的pH；而对于静脉内递送，可能期望的pH为6.8到约7.2。然而，可以选择最宽范围和这些子范围内的其它pH用于其它递送途径。

可以从无毒的非离子表面活性剂中选择合适的表面活性剂或表面活性剂的组合。在一个实施例中，选择终止于伯羟基的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如

F68[BASF]，也被称为泊洛沙姆(Poloxamer)188，其具有中性pH，平均分子量为8400。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子型三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(对于泊洛沙姆)命名，后跟三个数字：前两位数字×100给出了聚氧丙烯核的近似分子量，并且最后一位数字×10给出了聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择了泊洛沙姆188。表面活性剂可以以悬浮液的至多约0.0005％到约0.001％的量存在。

在一个实例中，调配物可以含有例如缓冲盐水溶液，所述缓冲盐水溶液包括水中的氯化钠、碳酸氢钠、葡聚糖、硫酸镁(例如，硫酸镁7H2O)、氯化钾、氯化钙(例如，氯化钙2H2O)、磷酸氢二钠及其混合物中的一种或多种。合适地，对于鞘内递送，同渗浓摩在与脑脊液相容的范围内(例如，约275到约290)；参见例如emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。任选地，对于鞘内递送，可以将可商购获得的稀释剂用作悬浮剂，或与另一种悬浮剂和其它任选的赋形剂组合。参见例如Elliotts

解决方案[LukareMedical]。

在其它实施例中，调配物可以含有一种或多种渗透增强剂。合适的渗透增强剂的实例可以包含例如甘露醇、甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。

另外提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和包括如本文所描述的核酸序列的载体。如本文所使用的，“载体”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶质物等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。补充性活性成分也可以并入到组合物中。递送媒剂(如脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)可以用于将本文描述的组合物引入到合适的宿主细胞中。具体地，rAAV载体基可以被调配成用于递送或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中。在一个实施例中，治疗有效量的载体包含在药物组合物中。载体的选择不是限制。其它常规的药学上可接受的载体，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包含氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包含明胶和白蛋白。

短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。

如本文所使用的，术语“剂量”或“量”可以指在治疗过程中向受试者递送的总剂量或量或以单一单位(或多单位或分剂量)施用递送的剂量或量。

本文所描述的水性悬浮液或药物组合物被设计成用于通过任何合适的途径或不同途径的组合递送到有需要的受试者。在一个实施例中，药物组合物被调配用于通过脑室内(ICV)、鞘内(IT)或脑池内注射递送。在一个实施例中，本文所描述的组合物被设计成用于通过静脉内注射递送到有需要的受试者。可替代地，可以选择其它施用途径(例如，口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内和其它肠胃外途径)。

如本文所使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”是指通过注射到椎管中，更具体地注射到蛛网膜下腔中使得其到达脑脊液(CSF)的药物施用途径。鞘内递送可以包含腰椎穿刺、心室内、枕骨下/脑池内和/或C1-2穿刺。例如，可以通过腰椎穿刺引入材料以在整个蛛网膜下腔扩散。在另一个实例中，可以向小脑延髓池中注射。脑池内递送可以增加载体扩散和/或减少施用引起的毒性和炎症。参见例如Christian Hinderer等人,在将AAV9递送到小脑延髓池中之后食蟹猴的中枢神经系统中的广泛基因转移(Widespread gene transferin the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery ofAAV9 into the cisterna magna).《分子疗法方法临床发展(Mol Ther Methods ClinDev.)》.2014；1:14051.于2014年12月10日在线公开.doi:10.1038/mtm.2014.51。

如本文所使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”是指药物直接进入到脑室或小脑延髓池(cisterna magna cerebellomedularis)的脑脊液中，更具体地是通过枕骨下穿刺或通过直接注射到小脑延髓池(cisterna magna)中或通过永久定位的管的施用途径。

在一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括含如本文所描述的载体的调配物缓冲液。在某些实施例中，可以以剂量单位调配复制缺陷型病毒组合物，以使含有的复制缺陷型病毒的量在约1.0×10⁹GC到约1.0×10¹⁶GC的范围内(以治疗平均体重为70kg的受试者)，包含所述范围内的所有整数或分数量，并且对于人类患者而言，优选地为1.0×10¹²GC到1.0×10¹⁴GC。在一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹或9×10⁹GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹¹、2×10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹或9×10¹¹GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²或9×10¹²GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³或9×10¹³GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁴、2×10¹⁴、3×10¹⁴、4×10¹⁴、5×10¹⁴、6×10¹⁴、7×10¹⁴、8×10¹⁴或9×10¹⁴GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁵、2×10¹⁵、3×10¹⁵、4×10¹⁵、5×10¹⁵、6×10¹⁵、7×10¹⁵、8×10¹⁵或9×10¹⁵GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，对于人类应用，剂量的范围可以为每剂量1×10¹⁰到约1×10¹²GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。

在一个实施例中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括含如本文所描述的rAAV的调配物缓冲液。在一个实施例中，rAAV以约1×10⁹基因组拷贝(GC)/mL到约1×10¹⁴GC/mL调配。在另外的实施例中，rAAV以约3×10⁹GC/mL到约3×10¹³GC/mL调配。在又另外的实施例中，rAAV以约1×10⁹GC/mL到约1×10¹³GC/mL调配。在一个实施例中，rAAV以至少约1×10¹¹GC/mL调配。

在一个实施例中，包括如本文所描述的rAAV的药物组合物以每克脑质量约1×10⁹GC到每克脑质量约1×10¹⁴GC的剂量施用。

应当理解，本文所描述的药物组合物中的组合物旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

治疗方法

提供了用于治疗患有庞贝病的患者的治疗方案，所述治疗方案包括任选地与免疫调节剂组合的如本文所述的表达盒、rAAV和/或hGAA780I蛋白或融合蛋白。在某些实施例中，所述患者患有晚发性庞贝病。在其它实施例中，所述患者患有儿童期初发型庞贝病。在某些实施例中，共治疗剂与表达盒、rAAV或hGAA780I蛋白或融合蛋白一起递送，如免疫调节方案。另外地或可替代地，共疗法可以包含支气管扩张剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、呼吸肌力量训练(RMST)、酶替代疗法和/或膈肌起搏疗法中的一种或多种。在某些实施例中，所述患者接受rAAV的单次施用。在某些实施例中，所述患者接受包括如本文所述的表达盒和/或rAAV的组合物的单次施用。在某些实施例中，包括有效量表达盒的组合物的这种单次施用涉及至少一种共治疗剂。在某些实施例中，基本上同时通过两种不同的途径向患者施用表达盒、rAAV和/或hGAA780I蛋白或融合蛋白或如本文所述。在某些实施例中，两种不同的注射途径是静脉内和鞘内施用。在一个实施例中，所述组合物是悬浮液，通过脑室内、鞘内、脑池内或静脉内递送到受试者。在某些实施例中，向患有α-葡萄糖苷酶缺乏症的患者施用本文提供的组合物以改善心脏、呼吸和/或骨骼肌功能中的一种或多种。在某些实施例中，由于治疗，心脏、CNS(脑)和/或骨骼肌中的一个或多个中的糖原贮积和/或自噬积累减少。

在某些实施例中，表达盒、rAAV、病毒或非病毒载体用于制备药物。在某些实施例中，提供了组合物用于治疗庞贝病的用途。

这些组合物可以与其它疗法组合使用，所述其它疗法包含例如免疫疗法、酶替代疗法(例如，Lumizyme，由健赞公司(Genzyme)、赛诺菲公司(Sanofi Corporation)销售，并且在美国以外以Myozyme销售)。庞贝病的另外的治疗是对症和支持性的。例如，可能需要呼吸支持；物理疗法可能有助于增强呼吸肌；一些患者可能需要在夜间和/或白天通过机械通气(即双水平气道正压通气(bipap)或容积通气机)进行呼吸辅助。另外，在呼吸道感染期间可能需要另外的支持。一些患者可能会被推荐使用包含支具在内的矫形装置。如挛缩或脊柱畸形等某些骨科症状可能需要手术。一些婴儿可能需要插入经鼻部、沿食道向下并到胃中的喂食管(鼻胃管)。在一些儿童中，可能需要通过腹壁上的小手术开口将喂食管直接插入胃中。一些患有晚发型庞贝病的个体可能需要软饮食，但很少有个体需要喂食管。

如本文所描述的，除非另外指明，否则术语“增加”(例如，在用hGAA780I治疗后增加hGAA水平，如在组织、血液等中所测量的)或“减少”、“降低”、“减轻”、“改善”、“延迟”或其任何语法变体或指示变化的任何类似术语意指与对应的参考(例如，未经治疗的对照或未患有庞贝病的处于正常状况的受试者)相比约5倍、约2倍、约1倍、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％的变化。

在本文中可互换使用的“患者”或“受试者”意指雄性或雌性哺乳动物，包含人、兽医或农场动物、家畜或宠物以及通常用于临床研究的动物。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是人类患者。在一个实施例中，这些方法和组合物的受试者是男性或女性人类。

在一个实施例中，悬浮液的pH为约7.28到约7.32。

可以由本领域的技术人员确定用于递送这些剂量和浓度的合适的体积。例如，可以选择约1μL到150mL的体积，其中对于成人而言，选择更大的体积。通常，对于新生婴儿，合适的体积为约0.5mL到约10mL，对于年龄较大的婴儿，可以选择约0.5mL到约15mL。对于幼儿，可以选择约0.5mL到约20mL的体积。对于儿童，可以选择至多约30mL的体积。对于青春期前的少年和青少年，可以选择至多约50mL的体积。在仍其它实施例中，患者可以接受鞘内施用的体积选择为约5mL到约15mL或约7.5mL到约10mL。可以确定其它合适的体积和剂量。将调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，并且这种剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变化。

在一个实施例中，包括如本文所描述的rAAV的组合物以每克脑质量约1×10⁹GC到每克脑质量约1×10¹⁴GC的剂量施用。在某些实施例中，rAAV以每千克体重约1×10⁹GC到每千克体重约1×10¹³GC的剂量全身共同施用。

在一个实施例中，向受试者递送治疗有效量的本文所述的表达盒、rAAV或hGAA780I酶(即蛋白质或融合蛋白)。如本文所使用的，“治疗有效量”是指表达盒、rAAV或hGAA780I或其组合的量。因此，在某些实施例中，所述方法包括与施用包括本文提供的hGAA780I酶的组合物组合来向受试者施用rAAV或用于递送hGAA780I编码核酸序列的表达盒。

在一个实施例中，表达盒在载体基因组中以每克脑质量约1×10⁹GC到每克(g)脑质量约1×10¹³个基因组拷贝(GC)的量递送，包含所述范围内的所有整数或分数量和端点。在另一个实施例中，剂量为每克脑质量1×10¹⁰GC到每克脑质量约1×10¹³GC。在具体实施例中，向患者施用的载体的剂量为至少约1.0×10⁹GC/g、约1.5×10⁹GC/g、约2.0×10⁹GC/g、约2.5×10⁹GC/g、约3.0×10⁹GC/g、约3.5×10⁹GC/g、约4.0×10⁹GC/g、约4.5×10⁹GC/g、约5.0×10⁹GC/g、约5.5×10⁹GC/g、约6.0×10⁹GC/g、约6.5×10⁹GC/g、约7.0×10⁹GC/g、约7.5×10⁹GC/g、约8.0×10⁹GC/g、约8.5×10⁹GC/g、约9.0×10⁹GC/g、约9.5×10⁹GC/g、约1.0×10¹⁰GC/g、约1.5×10¹⁰GC/g、约2.0×10¹⁰GC/g、约2.5×10¹⁰GC/g、约3.0×10¹⁰GC/g、约3.5×10¹⁰GC/g、约4.0×10¹⁰GC/g、约4.5×10¹⁰GC/g、约5.0×10¹⁰GC/g、约5.5×10¹⁰GC/g、约6.0×10¹⁰GC/g、约6.5×10¹⁰GC/g、约7.0×10¹⁰GC/g、约7.5×10¹⁰GC/g、约8.0×10¹⁰GC/g、约8.5×10¹⁰GC/g、约9.0×10¹⁰GC/g、约9.5×10¹⁰GC/g、约1.0×10¹¹GC/g、约1.5×10¹¹GC/g、约2.0×10¹¹GC/g、约2.5×10¹¹GC/g、约3.0×10¹¹GC/g、约3.5×10¹¹GC/g、约4.0×10¹¹GC/g、约4.5×10¹¹GC/g、约5.0×10¹¹GC/g、约5.5×10¹¹GC/g、约6.0×10¹¹GC/g、约6.5×10¹¹GC/g、约7.0×10¹¹GC/g、约7.5×10¹¹GC/g、约8.0×10¹¹GC/g、约8.5×10¹¹GC/g、约9.0×10¹¹GC/g、约9.5×10¹¹GC/g、约1.0×10¹²GC/g、约1.5×10¹²GC/g、约2.0×10¹²GC/g、约2.5×10¹²GC/g、约3.0×10¹²GC/g、约3.5×10¹²GC/g、约4.0×10¹²GC/g、约4.5×10¹²GC/g、约5.0×10¹²GC/g、约5.5×10¹²GC/g、约6.0×10¹²GC/g、约6.5×10¹²GC/g、约7.0×10¹²GC/g、约7.5×10¹²GC/g、约8.0×10¹²GC/g、约8.5×10¹²GC/g、约9.0×10¹²GC/g、约9.5×10¹²GC/g、约1.0×10¹³GC/g、约1.5×10¹³GC/g、约2.0×10¹³GC/g、约2.5×10¹³GC/g、约3.0×10¹³GC/g、约3.5×10¹³GC/g、约4.0×10¹³GC/g、约4.5×10¹³GC/g、约5.0×10¹³GC/g、约5.5×10¹³GC/g、约6.0×10¹³GC/g、约6.5×10¹³GC/g、约7.0×10¹³GC/g、约7.5×10¹³GC/g、约8.0×10¹³GC/g、约8.5×10¹³GC/g、约9.0×10¹³GC/g、约9.5×10¹³GC/g或约1.0×10¹⁴GC/g脑质量。

在一个实施例中，治疗方法包括递送hGAA780I蛋白或融合蛋白作为酶替代疗法。在某些实施例中，hGAA780I蛋白或融合蛋白作为ERT与基因疗法(包含但不限于本文提供的表达盒或rAAV)组合递送。在某些实施例中，所述方法包括向受试者施用多于一种ERT(例如，包括与另一种治疗性蛋白如Lumizyme组合的haGAA780I蛋白或融合蛋白的组合物)。可以每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更多天向受试者施用包括本文所述的hGAA780I蛋白或融合蛋白的组合物。施用可以通过静脉内输注给门诊患者，规定每周、每月或每两个月施用。化合物的适当治疗有效剂量由治疗临床医生选择并且包含约1μg/kg到约500mg/kg、约10mg/kg到约100mg/kg、约20mg/kg到约100mg/kg和大约20mg/kg到大约50mg/kg。在一些实施例中，合适的治疗剂量选自例如0.1、0.25、0.5、0.75、1、5、10、15、20、30、40、50、60、70和100mg/kg。

在某些实施例中，所述方法包括以每周向患者10mg/kg患者体重或更多的剂量向受试者施用hGAA780I蛋白或融合蛋白。通常每周剂量大于10mg/kg。剂量方案的范围可以为每周10mg/kg到每周至少1000mg/kg。通常，剂量方案是每周10mg/kg、每周15mg/kg、每周20mg/kg、每周25mg/kg、每周30mg/kg、每周35mg/kg、40mg/kg周、每周45mg/kg、60mg/kg周、每周80mg/kg和每周120mg/kg。在优选方案中，10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、30mg/kg或40mg/kg每周施用一次、两次或三次。治疗通常持续至少4周，有时持续24周，并且有时持续患者的一生。任选地，在治疗后(例如，在血浆或肌肉中)监测人α-葡萄糖苷酶的水平，并且当检测到的水平显著低于正常人的值(例如，小于所述值的20％)时施用另外的剂量。在一个实施例中，hGAA780I蛋白或融合蛋白以初始“高”剂量(即，“负荷剂量”)施用，随后以较低剂量(即，“维持剂量”)施用。负荷剂量的实例是至少约40mg/kg患者体重，每周1到3次(例如，持续1、2或3周)。维持剂量的实例是每周至少约5到至少约10mg/kg患者体重或更多，如每周20mg/kg、每周30mg/kg、40mg/kg周。在某些实施例中，在剂量时间段期间以增加的速率施用剂量。这可以通过增加静脉内输注的速率或通过使用以恒定速率施用的hGAA780I蛋白或融合蛋白的浓度增加的梯度来实现。以这种方式施用可以降低免疫原性反应的风险。在某些实施例中，静脉内输注发生在几个小时的时间段内(例如，1-10小时，并且优选地2-8小时，更优选地3-6小时)，并且在施用时间段期间每隔一段时间增加输注速率。

在一个实施例中，所述方法进一步包括受试者接受免疫抑制共疗法。用于此类共疗法的免疫抑制剂包含但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢药、T细胞抑制剂、大环内酯类(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物)以及细胞生长抑制剂，包含烷化剂、抗代谢药、细胞毒性抗生素、抗体或对免疫亲和素具有活性的药剂。免疫抑制剂可以包含氮芥(nitrogenmustard)、亚硝基脲(nitrosourea)、铂化合物、甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、更生霉素(dactinomycin)、蒽环霉素(anthracycline)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、IL-2受体或CD3定向抗体、抗IL-2抗体、环孢素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、阿片类或TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施例中，可以在施用基因疗法之前或之后的第0天、第1天、第2天、第7天或更多天开始免疫抑制疗法。可以在基因疗法施用之后以相同的剂量或经过调整的剂量继续使用这些药物中的一种或多种药物。根据需要，此类疗法可以持续约1周(7天)、约60天或更长时间。

在一个实施例中，将包括如本文所描述的表达盒的组合物施用于有需要的受试者一次。在某些实施例中，表达盒通过rAAV递送。应当理解，本文所描述的组合物和方法旨在应用于本说明书中描述的其它组合物、方案、方面、实施例和方法。

本文提供的组合物和方法可以用于治疗婴儿型庞贝病或晚发型庞贝病和/或与其相关的症状。在某些实施例中，功效可以通过疾病的一种或多种症状的改善或疾病进展的减缓来确定。婴儿型庞贝病的症状包含但不限于肌张力减退、呼吸(respiratory/breathing)问题、肝肿大、肥厚性心肌病以及心脏、肌肉、CNS(尤其是运动神经元)中的糖原贮积。晚发型庞贝病的症状包含但不限于近端肌肉无力、呼吸问题以及肌肉和运动神经元中的糖原贮积。施用途径可以基于患者的状况和/或诊断确定。在某些实施例中，提供了一种用于治疗被诊断为患有婴儿型庞贝病或晚发型庞贝病的患者的方法，所述方法包含通过IV和ICM途径的组合施用本文所述的用于递送hGAA780I蛋白或融合蛋白的rAAV。在一些实施例中，向被鉴定为患有晚发型庞贝病的患者施用仅包含全身递送rAAV(例如，仅IV)的治疗。如本文所描述的，包括rAAV的组合物的递送可以与酶替代疗法(ERT)组合。在某些实施例中，提供了一种用于治疗被诊断为患有庞贝病的受试者的方法，所述方法包含ICM递送本文所述的rAAV与ERT的组合。在某些实施例中，通过ICM注射向被鉴定为患有婴儿型庞贝病的受试者施用本文所述的rAAV，并且所述受试者还接受ERT以治疗外周疾病的各个方面。

如本文所描述的，“核酸”可以是RNA、DNA或其修饰，并且可以是单链或双链的，并且可以选自例如包含以下的组：编码所关注蛋白质的核酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如肽-核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)等。此类核酸序列包含例如但不限于编码例如充当转录阻遏物的蛋白质的核酸序列、反义分子、核酶、小的抑制性核酸序列，例如但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。

用于“反向翻译”蛋白质、肽或多肽的方法是本领域技术人员已知的。一旦已知蛋白质的序列，就会有基于网络的和可商购获得的计算机程序以及基于服务的公司，所述基于服务的公司将氨基酸序列反向翻译为核酸编码序列。参见例如EMBOSS的backtranseq(可在ebi.ac.uk/Tools/st在线获得)；Gene Infinity(可在geneinfinity.org/sms/sms_-backtranslation.html在线获得)；ExPasy(可在expasy.org/tools/在线获得)。在一个实施例中，RNA和/或cDNA编码序列被设计成在人细胞中最佳表达。

在核酸序列的上下文中，术语“百分比(％)同一性”、“序列同一性”、“百分比序列同一性”或“百分比相同的”是指两个序列中的残基在比对以获得对应性时是相同的。期望序列同一性比较的长度可以超过基因组的全长、基因编码序列的全长或至少约500到5000个核苷酸的片段。然而，也可能期望较小片段之间的同一性，例如至少约九个核苷酸，通常至少约20到24个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸。

可以容易地确定蛋白质全长、多肽、约32个氨基酸、约330个氨基酸或其肽片段或对应核酸序列编码序列上的氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段的长度可以是至少约8个氨基酸并且可以是至多约700个氨基酸。通常，当提及两种不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“类似性”时，参考“比对”序列来确定“同一性”、“同源性”或“类似性”。“比对”序列或“比对”是指与参考序列相比，通常含有对丢失的或另外的碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。

使用多种公开或可商购获得的多序列比对程序中的任一种进行比对。序列比对程序可供用于氨基酸序列，所述程序例如“Clustal X”、“Clustal Omega”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”以及“Match-Box”程序。通常，以默认设置使用这些程序中的任何程序，但是本领域技术人员可以根据需要改变这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，所述算法或程序提供至少与通过参考算法和程序所提供的一样水平的同一性或比对。参见例如J.D.Thompson等人,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》,27(13):2682-2690(1999)。

多个序列比对程序也可用于核酸序列。此类程序的实例包含“Clustal W”、“Clustal Omega”、“CAP序列组装”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，所述程序可通过因特网上的Web服务器进行访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，也使用了载体NTI实用程序。本领域已知的许多算法可以用于测量核苷酸序列同一性，包含上述程序中包含的那些。作为另一个实例，可以使用GCG 6.1版本的程序Fasta^TM比较多核苷酸序列。Fasta^TM提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和序列同一性百分比。例如，核酸序列之间的序列同一性百分比可以是使用如GCG 6.1版本中所提供的采用其默认参数(字号6和评分矩阵的NOPAM系数)的Fasta^TM所确定的，所述程序通过引用并入本文中。

如本文所使用的，术语“调控序列”或“表达控制序列”是指核酸序列，如起始子序列、增强子序列和启动子序列，所述核酸序列诱导、抑制或以其它方式控制与其可操作地连接的蛋白质编码核酸序列的转录。

如用于描述核酸序列或蛋白质的术语“外源性”意指核酸或蛋白质并非天然存在于其在染色体或宿主细胞中的存在位置中。外源性核酸序列还指源自相同宿主细胞或受试者并插入到所述相同宿主细胞或受试者中的序列，但其以非天然状态存在，例如，不同的拷贝数或在不同调控元件的控制下。

如用于描述核酸序列或蛋白质的术语“异源性”意指核酸或蛋白质源自与在其中表达所述核酸或蛋白质的宿主细胞或受试者不同的生物体或相同的生物体的不同物种。术语“异源性”当参考质粒、表达盒或载体中的蛋白质或核酸使用时表明蛋白质或核酸与另一序列或子序列一起存在，在自然界中未发现所讨论蛋白质或核酸与所述蛋白质或核酸彼此间的相同关系。

“包括”是意指包含其它组分或方法步骤的术语。当使用“包括”时，应当理解，相关实施例包含：使用“由……组成”术语的描述，其不包括其它组成或方法步骤；以及使用“基本上由……组成”术语的描述，其不包括基本上改变实施例或本发明的性质的任何组成或方法步骤。应当理解，虽然说明书中的各个实施例是使用“包括”语言来呈现的，但是在各种情况下，也使用“由……组成”或“基本上由……组成”语言来描述相关实施例。

如本文所使用的，后跟数字(nn)值的术语“e”是指指数并且此术语可与“×10ⁿⁿ”互换使用。例如，3e13等效于3×10¹³。

应当注意，术语“一个/一种(a/an)”是指一个或多个/一种或多种，例如，“一种载体”应被理解为表示一种或多种载体。如此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换地使用。

如本文所使用的，除非另有说明，否则术语“约”意指相对于给定参考的正或负10％的变化性。

实例

现在将参考以下实例描述本发明。提供这些实例仅为了说明目的，并且本发明绝不应理解为限制于这些实例，而是应理解为涵盖由于本文所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。

实例1：材料与方法

载体产生

将在780处具有Val的参考GAA序列和具有V780I突变的序列反向翻译，并且将核苷酸序列工程化以产生用于AAV产生的具有在CAG启动子的控制下的表达盒的顺式质粒。另外，将天然hGAA的cDNA序列(参考序列)克隆到相同的AAV-顺式骨架中，以与非经工程化的序列进行比较。如前所述，AAVhu68载体由宾夕法尼亚大学载体核心公司(Penn VectorCore)生产和滴定。(Lock等人2010,《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》21(10):1259-1271)。简而言之，HEK293细胞被三重转染，并且采集培养物上清液，浓缩并用碘克沙醇梯度纯化。如先前所述，使用靶向兔β-珠蛋白polyA序列的引物，通过液滴数字PCR滴定经过纯化的载体(Lock等人(2014).《人类基因疗法方法(Hum Gene Ther Methods)》25(2):115-125)。

动物

小鼠

创始庞贝病小鼠(Gaa敲除(-/-)，C57BL/6/129背景)购自杰克逊实验室(JacksonLabs)(库存编号004154，也称为6^neo小鼠)。在基因疗法计划AAALAC认可的屏障小鼠设施中使用杂合子与杂合子交配维持繁殖群，以便在同一窝内产生无效对照和WT对照。Gaa基因敲除小鼠是广泛使用的庞贝病模型。所述基因敲除小鼠表现出在心脏、中枢神经系统、骨骼肌和膈膜中溶酶体糖原的逐渐积累，并伴有活动性降低和进行性肌肉无力。小尺寸、可再现的表型和高效的繁殖允许快速研究，是临床前候选物体内筛选的最佳选择。

将动物饲养室维持在64-79°F(18-26℃)的温度范围以及30-70％的湿度范围内。

将动物与其父母和同窝出生仔畜一起饲养直到断奶，并且然后在转化研究实验室(Translational Research Laboratories，TRL)GTP动物饲养室中每笼二到五只动物的标准笼子中饲养。所有笼子尺寸和饲养条件均符合《实验室动物护理和使用指南(the Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)》。笼子、水瓶和寝具基底被高压灭菌到屏障设施中。

维持自动控制的12小时光/暗循环。每个暗周期开始于1900小时(±30分钟)。随意提供食物(普瑞纳公司(Purina)，

5053，Irradiated，

啮齿动物饲料20、25lb)。所有动物都可通过在每个饲养笼子中单独放置的水瓶来随意获取水。在每周更换笼子期间，至少每周更换一次水瓶。供水取自费城市并使用Getinge净水器进行氯化。氯化水平每天由ULAR测试并维持在2-4份每百万份(ppm)。将Nestlets^TM提供给每个饲养笼子作为富集物。

体内研究和组织学

通过侧尾静脉(IV)向小鼠施用0.1mL中5×10¹¹GC(大约2.5×10¹³GC/kg)剂量或5×10¹⁰GC(大约2.5×10¹²GC/kg)剂量的AAVhu68.CAG.hGAA(各种hGAA构建体)，在载体给药后第7天和第21天采血以用于血清分离，并在注射后28天进行终末采血(用于血浆分离)并通过放血执行安乐死。从脑开始，迅速收集组织。

器官列表，尸检

组织	快速冷冻(用于蛋白质提取)	福尔马林浸泡(用于组织学)
			血浆	X
左脑		X
			右脑	X
颈脊髓		X
			胸+腰脊髓	X
心脏	X	X
			肝脏	X	X
隔膜	X右	X左
			三头肌	X右	X左
四头肌	X右	X左
			腓肠肌	X右	X左
胫前肌	X右	X左

用于组织学的组织使用标准方法进行福尔马林固定和石蜡包埋。脑和脊髓切片用劳克坚牢蓝(劳克坚牢蓝染色试剂盒，艾博抗(Abcam)ab150675)染色，并且外周器官用PAS(过碘酸希夫)染色，使用标准方法检测组织中的如糖原等多糖。对福尔马林固定的石蜡包埋样品进行针对hGAA的免疫染色。将切片去石蜡，在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中煮沸用于抗原修复，用含1％驴血清的PBS+0.2％Triton封闭15分钟，并且然后依次与初级抗体(Sigma HPA029126抗hGAA抗体)和在封闭缓冲液中稀释的生物素化的二级抗体一起温育；使用基于HRP的比色反应来检测信号。

由通过职业验证的兽医病理学家以不知情的方式审查载玻片。建立半定量评分系统以测量如由呈现贮积和/或空泡的细胞的总百分比所确定的肌肉中庞贝病相关组织学病变(糖原贮积和自噬积累)的严重性：

组织学评分贮积

在适用时还估计了与载体相关的组织病理学病变。

hGAA780I酶体外性能的表征

GAA活性

将匀浆组织的血浆或上清液与5.6mM 4-MU-α-吡喃葡萄糖苷pH 4.0混合，并在37℃下温育三小时。反应用0.4M碳酸钠，pH 11.5终止。相对荧光单位RFU使用Victor3荧光计测量，其中ex为355nm并且发射为460nm。以纳摩尔/毫升/小时为单位的活性是通过从4-MU的标准曲线内插来计算的。将单个组织样品中的活性水平针对匀浆上清液中的总蛋白质含量进行归一化。等体积用于血浆样品。

实例2：在庞贝病小鼠中评估rAAVhu68.hGAA载体

将AAV载体在无菌PBS中稀释以用于IV递送到庞贝病小鼠。测试制品包含：AAVhu68.CAG.hGAAco.rBG、AAVhu68.CAG.hGAAcoV780I.rBG、AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAco.rBG、AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.rBG和AAVhu68.CAG.sp7co.Δ8.hGAAcoV780I.rBG。hGAAcoV780I的经工程化的序列在SEQ ID NO:4中提供。研究中包含野生型和媒剂对照。

在从经处理的小鼠收集的各种组织中测量hGAA蛋白表达和活性，所述组织包含肝脏(图1A、图1B)、心脏(图2A、图2B)、四头肌(图3A、图3B)、脑(图4A、图4B)、血浆(图9)。所有启动子在肝脏中在低剂量和高剂量下都表现得同样出色。在UbC启动子下表达的载体的施用使得在两种剂量下在骨骼肌中的活性较低，并且具有CAG启动子的载体具有最佳总体活性。具有UbC启动子的载体在两种剂量下在心脏中的活性也较低。

庞贝病小鼠媒剂(PBS)对照(图5D)在心脏中显示出明显的糖原贮积(PAS染色切片上的深色染色)。野生型小鼠和所有经载体处理的小鼠几乎完全清除了贮积。然而，接受编码hGAA参考序列(V780)的载体的两个组表现出中度到显著的纤维化淋巴细胞性心肌炎(图5B和图5C)，这在接受hGAA天然转基因的八只动物中有七只出现，并且在接受具有BiP和vIGF2修饰的经工程化的hGAA的八只动物中有三只动物出现。因为接受hGAAcoV780I酶的小鼠都没有心肌炎(图5E、图5F和图5G)，所以认为这种病变与载体相关，并且更具体地，是hGAA参考序列特异性的。

四头肌组织分析揭示了野生型小鼠和所有用编码具有或不具有另外的修饰的V780I变体的载体处理的小鼠都几乎完全清除了贮积和自噬积累(图6A-图6G)。然而，接受编码hGAAV780的参考序列的载体的两个组显示出最小到中等的糖原贮积剩余以及自噬积累(图10)，这共同表现出对庞贝病的两个主要标志的次优矫正。最好的结果是从编码呈天然形式或具有BiP-vIGF2修饰的V780I变体的两种载体的递送中观察到的。sp7-delta8修饰似乎会引起对归因于庞贝病的组织学病变的不一致矫正。编码参考hGAAV780序列的两种构建体在清除糖原贮积和积累方面都是次优的。

在高剂量IV施用(5e11＝2.5e13 GC/kg)下，hGAAcoV780I和BiP-vIGF2.hGAAcoV780I在四头肌中表现出接近正常的糖原水平，并且细胞中的hGAA吸收明显更好。对包含胫前肌(TA)和腓肠肌在内的其它骨骼肌的评估显示出类似的结果(V780I的变体并清除了糖原和中央自噬空泡)。所有构建体都减少了心脏中的糖原贮积，其中BiP-vIGF2.hGAAcoV780I施用使得水平最低。虽然四头肌中的糖原水平接近正常，但PAS染色显示出一些差异，其中hGAAcoV780I和BiP-vIGF2.hGAAcoV780I显示出最佳结果。

在低剂量IV施用(5e10＝2.5e12 GC/kg)下，与hGAAcoV780I相比，BiP-vIGF2.hGAAcoV780I在心脏和四头肌中表现出更佳的糖原减少。在利用BiP-vIGF2.hGAAcoV780I的情况下，脑和脊髓中的糖原水平接近正常(即使组织水平为约15％)，这可能是由于更好的靶向性。在CNS中，观察到经工程化的构建体与V780I变体之间的有效协同作用。仅BiP-vIGF2.hGAAcoV780I清除了CNS糖原。

如图8所示，脊髓组织学的评估表明，用AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I处理的小鼠几乎完全清除了糖原贮积，而用编码参考hGAAV780酶的载体处理的小鼠具有剩余的糖原贮积。

(序列表自由文本)

对于在数字标识符<223>下含有自由文本的序列，提供了以下信息。

本说明书中引用的所有文献均通过引用并入本文。于2019年10月10日提交的美国临时专利申请第62/913,401号以及于2019年4月30日提交的美国临时专利申请第62/840,911号连同其序列表以全文引用的方式并入。随此提交的名称为“19-8856PCT2_ST25.txt”的序列表及其中的序列和文本通过引用并入。尽管已经参考特定实施例描述了本发明，但是应当理解的是，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

Claims

1.一种表达盒，其包括在调控序列的控制下编码人酸性α-葡萄糖苷酶(hGAA)的核酸序列，所述hGAA至少包括hGAA780I的活性位点，所述调控序列指导所述hGAA的表达，其中位置780基于SEQ ID NO:3中的氨基酸的位置的编号。

2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3(hGAA780I)的氨基酸204到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

3.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸204到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

4.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸123到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

5.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

6.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的表达盒，其中所述hGAA780I是进一步包括外源信号序列的嵌合融合蛋白。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的表达盒，其中所述hGAA780I被表达为SEQ ID NO:3的全长。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的表达盒，其中所述hGAA780I由SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4至少95％相同的序列编码。

10.根据权利要求1到8中任一项所述的表达盒，其中所述hGAA780I由SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5至少95％相同的序列编码。

11.根据权利要求1到10中任一项所述的表达盒，其中所述调控元件在多种靶组织中指导表达。

12.根据权利要求11所述的表达盒，其中所述多种靶组织包含肝脏、骨骼肌、心脏和中枢神经系统细胞中的两种或更多种。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的表达盒，其进一步包括miR靶序列的至少两个串联重复序列，其中所述至少两个串联重复序列包括至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列，所述第一miRNA靶序列和所述第二miRNA靶序列可能相同或不同并且在3'处与编码所述融合蛋白的所述序列可操作地连接。

14.根据权利要求13所述的表达盒，其中所述miR靶序列独立地选自SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。

15.根据权利要求13或14所述的表达盒，其中所述miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由间隔子隔开，并且所述间隔子中的一个或多个间隔子独立地选自(i)GGAT；(ii)CACGTG；以及(iii)GCATGC。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒由选自以下的病毒载体携带：重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒、重组腺病毒。

17.根据权利要求16所述的表达盒，其中所述重组细小病毒是腺相关病毒。

18.根据权利要求17所述的表达盒，其中所述腺相关病毒是AAVhu.68或其变体、AAV9或其变体、或AAVrh.10或其变体。

19.根据权利要求1到15中任一项所述的表达盒，其中所述表达盒由选自以下的非病毒载体携带：裸DNA、裸RNA、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的调配物。

20.一种能用于治疗II型糖原贮积病(庞贝)病的重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV包括：

(a)AAV衣壳，所述AAV衣壳靶向肌肉、心脏和中枢神经系统中的至少一种的细胞；以及

(b)载体基因组，所述载体基因组包装在所述AAV衣壳中，所述载体基因组包括在调控序列的控制下编码人酸性α-葡萄糖苷酶(hGAA)的核酸序列，所述hGAA至少包括hGAA780I的活性位点，所述调控序列指导所述hGAA的表达，其中位置780基于SEQ ID NO:3中的氨基酸的位置的编号。

21.根据权利要求20所述的rAAV，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3(hGAA780I)的氨基酸204到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

22.根据权利要求20所述的rAAV，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸204到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

23.根据权利要求20所述的rAAV，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸123到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

24.根据权利要求20所述的rAAV，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸952或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

25.根据权利要求20所述的rAAV，其中所述hGAA至少包括SEQ ID NO:3的氨基酸70到氨基酸890或与SEQ ID NO:3至少95％相同的在位置780处具有Ile的序列。

26.根据权利要求20到25中任一项所述的rAAV，其中所述hGAA780I是进一步包括外源信号序列的嵌合融合蛋白。

27.根据权利要求20到26中任一项所述的rAAV，其中所述AAV衣壳靶向肝脏、肌肉、心脏和中枢神经系统中的两种或更多种的细胞。

28.根据权利要求27中任一项所述的rAAV，其中所述调控元件指导所述靶细胞中的表达。

29.根据权利要求20到28中任一项所述的rAAV，其中所述衣壳来自AAVhu.68或其变体、AAV9或其变体、或AAVrh.10或其变体。

30.根据权利要求20到29中任一项所述的rAAV，其中所述hGAA780I被表达为SEQ IDNO:3的全长。

31.根据权利要求20到30中任一项所述的rAAV，其中所述hGAA780I由SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4至少95％相同的序列编码。

32.根据权利要求20到30中任一项所述的rAAV，其中所述hGAA780I由SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5至少95％相同的序列编码。

33.根据权利要求20到32中任一项所述的rAAV，其中所述载体基因组进一步包括：miRNA靶序列的至少两个串联重复序列，其中所述至少两个串联重复序列包括可能相同或不同的至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列。

34.根据任何权利要求33所述的rAAV，其中所述miR靶序列独立地选自SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。

35.根据权利要求33或34所述的rAAV，其中所述miRNA靶序列中的两个或更多个miRNA靶序列由间隔子隔开，并且所述间隔子中的一个或多个间隔子独立地选自(i)GGAT；(ii)CACGTG；以及(iii)GCATGC。

36.一种核酸分子，其包括编码根据权利要求1到19中任一项所述的表达盒的序列。

37.根据权利要求36所述的核酸分子，其中所述分子是质粒。

38.一种宿主细胞，其含有根据权利要求36到37所述的核酸分子。

39.一种组合物，其包括根据权利要求1到19中任一项所述的表达盒和药学上可接受的载体、赋形剂和/或悬浮剂中的至少一种。

40.一种组合物，其包括根据权利要求20到35中任一项所述的rAAV和药学上可接受的载体、赋形剂和/或悬浮剂中的至少一种。

41.根据权利要求39或40所述的组合物，其是被调配用于静脉内递送的悬浮液。

42.根据权利要求39或40所述的组合物，其是被调配用于鞘内、脑池内或脑室内施用的悬浮液。

43.一种用于治疗患有庞贝病的患者的方法，所述方法包括向所述患者递送根据权利要求1到19中任一项所述的表达盒或根据权利要求20到35中任一项所述的rAAV。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述表达盒和/或所述rAAV通过单独的途径共递送。

45.根据权利要求43或44所述的方法，其中通过静脉内和/或鞘内递送向所述患者施用所述表达盒和/或所述rAAV。

46.一种用于改善患有α-葡萄糖苷酶(GAA)缺乏症的患者的心脏、呼吸和/或骨骼肌功能的方法，所述方法包括向所述患者递送根据权利要求1到19中任一项所述的表达盒或根据权利要求20到35中任一项所述的rAAV。

47.一种用于治疗患有庞贝病的患者的治疗方案，所述治疗方案包括使用根据权利要求1到19中任一项所述的表达盒或根据权利要求20到35中任一项所述的rAAV与免疫调节剂的组合。

48.根据权利要求47所述的治疗方案，其中所述患者患有晚发性庞贝病。

49.根据权利要求47所述的治疗方案，其中所述患者患有婴儿型庞贝病。

50.根据权利要求47到49中任一项所述的治疗方案，其中所述患者接受与支气管扩张剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、呼吸肌力量训练(RMST)、酶替代疗法和/或膈肌起搏疗法的共疗法。

51.一种根据权利要求1到19中任一项所述的表达盒或根据权利要求20到35中任一项所述的rAAV用于治疗患有庞贝病的患者的用途。

52.一种根据权利要求1到19中任一项所述的表达盒或根据权利要求18到35中任一项所述的rAAV用于制备药物的用途。