TW202204624A - 用於治療丙酸血症之基因療法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)及其用於治療丙酸血症(PA)之基因療法之方法。亦提供包含本發明之rAAV及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。此等醫藥組合物可用於治療由丙醯輔酶A羧化酶α-次單位(PCCA)中之突變或丙醯輔酶A羧化酶β-次單位(PCCB)中之突變引起之PA的基因療法。

Description

用於治療丙酸血症之基因療法
本發明大體上係關於重組腺相關病毒(rAAV)及其用於治療丙酸血症(PA)之基因療法之方法。
丙酸血症(PA) (亦稱為丙酸尿症)為由活性丙醯輔酶A羧化酶(PCC)不足引起之先天性有機酸代謝異常，該羧化酶為一種將丙醯輔酶A轉化為(D)-甲基丙二醯輔酶A所需之酶，該轉化為奇數鏈脂肪酸及丙生胺基酸(propiogenic amino acids)，尤其係異白胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸及纈胺酸之分解代謝途徑中之關鍵步驟。PCC酶由兩個不相同的次單位(α及β)構成，其分別由PCCA基因及PCCB基因編碼。丙醯輔酶A羧化酶缺乏可由PCCA或PCCB中之突變引起。在一項研究中，對30名患有PA之患者進行突變分析且發現15名患者為α-次單位缺乏及15名患者為β-次單位缺乏。參見Yang等人, 2004,Mol Genet and Metab . 81: 335-342。
在美國，PA之估計發病率為1:105,000至1:130,000。此罕見的常染色體隱性代謝障礙在新生兒早期呈現為攝食不良、嘔吐、嗜睡、癲癇發作及缺乏肌肉張力。若不治療，由於繼發性高氨血症、感染、心肌症或基底神經節中風，死亡可訊速發生。在美國，可在新生兒中幾乎立即診斷出PA且該疾病包括於新生兒篩查項目中。
PA目前係藉由膳食限制胺基酸前驅體、補充L-肉鹼以解決肉鹼水準降低及投與抗生素以減少腸道細菌產生之丙酸來控制。在患者無法藉由標準治療管理之情況下，肝移植在管理PA中起作用。然而，儘管積極努力經由營養、輔因子及抗生素療法之複雜組合以解決該疾病，但患有PA之患者之長期預後仍然不佳。參見van der Meer等人, 1996,Eur. J. Pediatr. 155: 205-210。因此，需要改良之解決疾病之潛在病因(亦即PCC缺乏)的治療方法。
近年來引起增加之關注的一種策略為腺相關病毒(AAV)載體用於活體內遞送缺陷蛋白之功能性複本的用途。為治療PA，本申請人先前已描述能夠遞送編碼功能性PCCA蛋白質之基因或編碼功能性PCCB蛋白質之基因的重組AAV (rAAV)。參見例如PCT/US2019/054003 (公開為WO/2020/072451)，其以全文引用之方式併入本文中。對於最佳的基於AAV之基因療法，重要的係最大化轉基因表現量，此轉而能夠減少實現治療功效所需之載體劑量，且降低非所需的劑量相關免疫反應之風險。
本發明解決對用於治療PA之高表現rAAV的需求。值得注意的係，本申請人已發現，相對於表現替代內含子序列之比較載體，將人類β-球蛋白IVS2內含子序列(SEQ ID NO: 1)插入PA基因療法載體中實質上且出人意料地增加轉基因表現。因此，本發明之rAAV可出乎意料地提供高轉基因表現，藉此降低成功治療PA所需之載體劑量。
本發明提供組合物及其在基因療法中之使用方法。更特定而言，本發明提供適用於治療PA之重組腺相關病毒(rAAV)，其包含腺相關病毒(AAV)蛋白殼及封裝於其中之載體基因體。
在一個態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含：(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c) PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。
在另一態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含：(a) 5'-反向末端重複(5'-ITR)序列；(b)啟動子序列；(c)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；(d) PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列；及(e) 3'-反向末端重複(3'-ITR)序列。
在另一態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；(e) PCCA之部分或完整編碼序列；(f)多腺苷酸化訊息序列；及(g) 3'-ITR序列。
在本文描述之各種態樣中，該經封裝載體基因體包含與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列。在一些實施例中，該經封裝載體基因體包含與SEQ ID NO: 1至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之內含子序列。在一些實施例中，該內含子序列包含SEQ ID NO: 1或由其組成。
在一個實施例中，該PCCA之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。在一替代實施例中，該PCCA之部分或完整編碼序列為密碼子最佳化編碼序列。在一個例示性實施例中，該PCCA之部分或完整編碼序列經密碼子最佳化以用於在人類中表現。
在一些實施例中，PCCA由SEQ ID NO: 2中所展示之野生型編碼序列編碼。在另一實施例中，可使用表現PCCA之天然同功異型物或變異體之編碼序列，諸如UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05165-1 (SEQ ID NO: 25)、P05165-2 (SEQ ID NO: 26)及P05165-3 (SEQ ID NO: 27)中所展示之彼等編碼序列。在某些實施例中，PCCA由密碼子最佳化之編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCA由密碼子最佳化之編碼序列編碼，該編碼序列與SEQ ID NO: 2中所展示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些例示性實施例中，PCCA由選自SEQ ID NO: 3-7之密碼子最佳化之編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCA由密碼子最佳化之編碼序列編碼，該編碼序列與選自SEQ ID NO: 3-7之序列至少80%一致。在一些實施例中，PCCA由密碼子最佳化之編碼序列編碼，該編碼序列與選自SEQ ID NO: 3-7之序列至少90%一致。在一些實施例中，PCCA由密碼子最佳化之編碼序列編碼，該編碼序列與選自SEQ ID NO: 3-7之序列至少95%一致。在一些實施例中，PCCA之編碼序列可在3'端處進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。在一些實施例中，所表現之PCCA包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列或由其組成。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含與SEQ ID NO: 30至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之序列。在一些實施例中，該載體基因體包含SEQ ID NO: 30。在一些實施例中，載體基因體由SEQ ID NO: 30組成。
在另一態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含：(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c) PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。
在另一態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含：(a) 5'-ITR序列；(b)啟動子序列；(c)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；(d) PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列；及(e) 3'-ITR序列。
在另一態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；(e) PCCB之部分或完整編碼序列；(f)多腺苷酸化訊息序列；及(g) 3'-ITR序列。
在一個實施例中，該PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。在一替代實施例中，該PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子最佳化編碼序列。在一個例示性實施例中，該PCCB之部分或完整編碼序列經密碼子最佳化以用於在人類中表現。
在一些實施例中，PCCB由SEQ ID NO: 8中所展示之野生型編碼序列編碼。 在另一實施例中，可使用表現PCCB之天然同功異型物或變異體之編碼序列，諸如UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05166-1 (SEQ ID NO: 28)及P05166-2 (SEQ ID NO: 29)中所展示之彼等編碼序列。在替代實施例中，PCCB由密碼子最佳化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCB由密碼子最佳化編碼序列編碼，該編碼序列與SEQ ID NO: 8中所展示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些例示性實施例中，PCCB由選自SEQ ID NO: 9-13之密碼子最佳化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCB由密碼子最佳化編碼序列編碼，該編碼序列與選自SEQ ID NO: 9-13之序列至少80%一致。在一些實施例中，PCCB由密碼子最佳化編碼序列編碼，該編碼序列與選自SEQ ID NO: 9-13之序列至少90%一致。在一些實施例中，PCCB由密碼子最佳化編碼序列編碼，該編碼序列與選自SEQ ID NO: 9-13之序列至少95%一致。在一些實施例中，PCCB之編碼序列可在3'端處進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。在一些實施例中，所表現之PCCB包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列或由其組成。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含與SEQ ID NO: 31至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之序列。在一些實施例中，該載體基因體包含SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，載體基因體由SEQ ID NO: 31組成。
在一個實施例中，啟動子係選自以下：雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)立即早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin) (TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子、CAG啟動子(使用CBA基因之CMV早期強化子元件、啟動子、第一外顯子及第一內含子及兔β球蛋白基因之剪接受體來構築)、PCCA基因特異性內源性啟動子及PCCB基因特異性內源性啟動子。在一例示性實施例中，該啟動子為CBA啟動子。在一個實施例中，該CBA啟動子包含SEQ ID NO: 21或由其組成。
在一些實施例中，該經封裝載體基因體包含5'-ITR序列及/或3'-ITR序列。在某些實施例中，該5'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，該3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，該5'-ITR序列及/或該3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，該5'-ITR序列及/或該3'-ITR序列包含SEQ ID NO: 18或由其組成。在其他實施例中，該5'-ITR序列及/或該3'-ITR序列來自非AAV2源。
在一些實施例中，該經封裝載體基因體進一步包含一或多個強化子序列。在一個實施例中，該強化子係選自細胞巨大病毒(CMV)立即早期基因強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及脂蛋白元(apolipoprotein) E (ApoE)強化子。在一例示性實施例中，該強化子為CMV立即早期基因強化子。在一個實施例中，該CMV立即早期基因強化子包含SEQ ID NO: 22或由其組成。在某些實施例中，該強化子位於該啟動子序列上游。
在一些實施例中，經封裝載體基因體進一步包含共有Kozak序列。在一些實施例中，共有Kozak序列位於內含子序列下游。在一個實施例中，共有Kozak序列為GCCGCC (SEQ ID NO: 24)。在某些實施例中，共有Kozak序列位於PCCA之編碼序列上游。在某些實施例中，共有Kozak序列位於PCCB之編碼序列上游。
在一些實施例中，經封裝載體基因體進一步包含多腺苷酸化訊息序列。在某些實施例中，該多腺苷酸化訊息序列係選自SV40多腺苷酸化訊息序列、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊息序列及兔β球蛋白多腺苷酸化訊息序列。在一例示性實施例中，該多腺苷酸化訊息序列為SV40多腺苷酸化訊息序列。在一個實施例中，該SV40多腺苷酸化訊息序列包含SEQ ID NO: 23或由其組成。
在一些實施例中，該AAV蛋白殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10、hu37之AAV (亦即，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10或AAVhu37)或其經基因工程化變異體。在一例示性實施例中，AAV蛋白殼為AAV血清型9 (AAV9)蛋白殼、AAV9變異體蛋白殼、AAV血清型8 (AAV8)蛋白殼、AAV8變異體蛋白殼或AAV血清型hu37 (AAVhu37)蛋白殼。
在某些實施例中，本發明提供一種適用作用於治療PA之基因療法之藥劑的重組腺相關病毒(rAAV)，其中該rAAV包含AAV蛋白殼及封裝於其中之如本文所描述之載體基因體。在一些實施例中，該AAV蛋白殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10、hu37之AAV (亦即，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10或AAVhu37)或其經基因工程化變異體。在一例示性實施例中，AAV蛋白殼為AAV血清型9 (AAV9)蛋白殼、AAV9變異體蛋白殼、AAV血清型8 (AAV8)蛋白殼、AAV8變異體蛋白殼或AAV血清型hu37 (AAVhu37)蛋白殼。
在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之rAAV，該rAAV包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c)選自SEQ ID NO: 2-7之PCCA之編碼序列。
在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之rAAV，該rAAV包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；(e)選自SEQ ID NO: 2-7之PCCA之編碼序列；(f)多腺苷酸化訊息序列；及(g) 3'-ITR序列。
在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之rAAV，該rAAV包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c)選自SEQ ID NO: 8-13之PCCB之編碼序列。
在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之rAAV，該rAAV包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；(e)選自SEQ ID NO: 8-13之PCCB之編碼序列；(f)多腺苷酸化訊息序列；及(g) 3'-ITR序列。
在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之rAAV，該rAAV包含AAV8蛋白殼或AAV9蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c)選自SEQ ID NO: 2-7之PCCA之編碼序列。
在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之rAAV，該rAAV包含AAV8蛋白殼或AAV9蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c)選自SEQ ID NO: 8-13之PCCB之編碼序列。
在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之rAAV，該rAAV包含AAV8蛋白殼或AAV9蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：(a) AAV2 5'-ITR序列；(b) CMV強化子序列；(c) CBA啟動子序列；(d)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；(e)選自SEQ ID NO: 2-7之PCCA之編碼序列；(f) SV40多腺苷酸化訊息序列；及(g) AAV2 3'-ITR序列。
在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之rAAV，該rAAV包含AAV8蛋白殼或AAV9蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：(a) AAV2 5'-ITR序列；(b) CMV強化子序列；(c) CBA啟動子序列；(d)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；(e)選自SEQ ID NO: 8-13之PCCB之編碼序列；(f) SV40多腺苷酸化訊息序列；及(g) AAV2 3'-ITR序列。
在某些實施例中，本發明提供一種重組核酸構築體，其包含(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c) PCCA之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，本發明提供一種重組核酸構築體，其包含(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c) PCCB之部分或完整編碼序列。
在一些態樣中，本發明提供本文所揭示之rAAV用於治療PA之用途，其中該rAAV包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體。在一些實施例中，該rAAV含有封裝基因體，其包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：5'-ITR、啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列及3'-ITR。在一例示性實施例中，經封裝基因體亦包含啟動子序列上游之強化子序列及3'-ITR上游之多腺苷酸化訊息序列。在一個例示性實施例中，rAAV含有經封裝基因體，其包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、CBA啟動子、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCA之編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，經封裝基因體進一步包含位於內含子序列下游之共有Kozak序列。在一些實施例中，PCCA之編碼序列係選自SEQ ID NO: 2-7。在一些實施例中，蛋白殼為AAV8蛋白殼。在一些實施例中，蛋白殼為AAV9蛋白殼。
在一些態樣中，本發明提供本文所揭示之rAAV用於治療PA之用途，其中該rAAV包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體。在一些實施例中，包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的經封裝基因體包含：5'-ITR、啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列及3'-ITR。在一例示性實施例中，經封裝基因體亦包含啟動子序列上游之強化子序列及3'-ITR上游之多腺苷酸化訊息序列。在一個例示性實施例中，包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的經封裝基因體包含：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、CBA啟動子、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCB之編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，經封裝基因體進一步包含位於內含子序列下游之共有Kozak序列。在一些實施例中，PCCB之編碼序列係選自SEQ ID NO: 8-13。在一些實施例中，蛋白殼為AAV8蛋白殼。在一些實施例中，蛋白殼為AAV9蛋白殼。
本發明進一步係關於包含本文所揭示之rAAV的醫藥組合物。在一些實施例中，該醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，該醫藥組合物經調配用於皮下、肌肉內、皮內、腹膜內或靜脈內投與。在一例示性實施例中，該醫藥組合物經調配用於靜脈內投與。
在又一態樣中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向人類個體投與治療有效量的本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供治療PA之方法，其包含投與包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中載體基因體包含PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在另一實施例中，本發明提供治療PA之方法，其包含投與包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中載體基因體包含PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。
在某些實施例中，本發明提供一種治療PA之方法，其包含投與(1)包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中載體基因體包含PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列；及(2)包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中載體基因體包含PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在一些實施例中，可同時投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可依序投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可單獨投與(1)及(2)之rAAV。
在某些實施例中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向診斷患有PCCA中之至少一種突變的人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供治療經診斷患有PCCA中之至少一種突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中載體基因體包含PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，PCCA中之突變係選自表1。在一些實施例中，PCCA之編碼序列係選自SEQ ID NO: 2-7。在一些實施例中，蛋白殼為AAV8蛋白殼。在一些實施例中，蛋白殼為AAV9蛋白殼。
在某些實施例中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向經診斷患有PCCB中之至少一種突變的人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供一種治療經診斷患有PCCB中之至少一種突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中載體基因體包含PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，PCCB中之突變係選自表2。在一些實施例中，PCCB之編碼序列係選自SEQ ID NO: 8-13。在一些實施例中，蛋白殼為AAV8蛋白殼。在一些實施例中，蛋白殼為AAV9蛋白殼。
在一些實施例中，皮下、肌肉內、皮內、腹膜內或靜脈內投與該rAAV。在一個例示性實施例中，靜脈內投與該rAAV。在一些實施例中，該rAAV係以約1 × 1011 至約1 × 1014 個基因體拷貝(GC)/公斤之劑量投與。在其他實施例中，該rAAV係以約1 × 1012 至約1 × 1013 個基因體拷貝(GC)/公斤之劑量投與。在一些實施例中，投與單次劑量之rAAV。在其他實施例中，投與多次劑量之rAAV。
在一些態樣中，本發明提供宿主細胞，其包含本文所揭示之重組核酸分子、AAV載體或rAAV。在特定實施例中，宿主細胞可適用於AAV增殖。在某些實施例中，宿主細胞係選自HeLa、Cos-7、HEK293、A549、BHK、Vero、RD、HT-1080、ARPE-19或MRC-5細胞。
本發明之此等及其他態樣及特徵描述於本發明之以下章節中。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年3月31日申請之美國臨時專利申請案第63/002,541號之權益及優先權，其全部內容出於所有目的特此以全文引用之方式併入。
如本文所描述，本申請人已發現，相對於表現替代性內含子序列之比較載體，將人類β-球蛋白IVS2內含子序列(SEQ ID NO: 1)插入PA基因療法載體中實質上且出人意料地增加轉基因表現。因此，本發明之rAAV出乎意料地提供高轉基因表現，藉此降低成功治療PA所需之載體劑量。
如以下詳細描述中更充分地描述，本發明提供一系列新穎的待在用於改善、預防或治療PA之方法中使用之藥劑及組合物。更特定而言，本發明提供重組核酸構築體、載體、宿主細胞及重組AAV，其包含與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列。在一些實施例中，本發明之重組核酸構築體、載體、宿主細胞及重組AAV可包含與SEQ ID NO: 1至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之內含子序列。在一些實施例中，本發明之重組核酸構築體、載體、宿主細胞及重組AAV可包含SEQ ID NO: 1之內含子序列。
除非另外指出，否則根據習知用法使用技術術語。分子生物學中之常用術語之定義可在以下中找到：Benjamin Lewin,Genes V , Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編),The Encyclopedia of Molecular Biology , Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A. Meyers (編),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference , VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
為了促進檢閱本發明之各種實施例，提供特定術語之以下解釋：
腺相關病毒(AAV)：一種感染人類及一些其他靈長類物種之小型、複製缺陷型、無包膜型病毒。未知AAV會引起疾病且引發極輕度的免疫反應。利用AAV之基因療法載體可感染分裂及靜止細胞兩者且可保持染色體外狀態而不整合至宿主細胞之基因體中。此等特徵使AAV成為一種有吸引力的基因療法之病毒載體。目前存在12種公認之AAV血清型(AAV1-12)。
投藥(administration/administer)：藉由任何有效途徑向個體提供或給予藥劑，諸如治療劑(例如，重組AAV)。例示性投藥途徑包括(但不限於)注射(諸如皮下、肌肉內、皮內、腹膜內及靜脈內)、經口、經導管內、經舌下、經直腸、經皮、經鼻內、經陰道及吸入途徑。
密碼子最佳化：「密碼子最佳化」核酸係指已經更改以使得密碼子針對特定系統(諸如特定物種或物種群)中之表現最佳化的核酸序列。舉例而言，核酸序列可針對在哺乳動物細胞或特定哺乳動物物種(諸如人類細胞)中之表現進行最佳化。密碼子最佳化不更改經編碼蛋白質之胺基酸序列。
強化子：一種藉由增加啟動子之活性來增加轉錄速率的核酸序列。
內含子：基因內不含有蛋白質之編碼資訊的一段DNA。在轉譯信使RNA之前移除內含子。
反向末端重複序列(ITR)：有效複製所需之腺相關病毒之基因體中的對稱核酸序列。ITR序列位於AAV DNA基因體之各末端處。ITR充當病毒DNA合成之複製起點，且為用於產生AAV整合載體之必要順式組分。
經分離：「經分離」生物組分(諸如核酸分子、蛋白質、病毒或細胞)已與其中組分天然存在之有機體之細胞或組織中的其他生物組分或有機體自身(諸如其他染色體及染色體外DNA及RNA、蛋白質及細胞)實質上分離或純化。已「分離」之核酸分子及蛋白質包括藉由標準純化方法純化之彼等核酸分子及蛋白質。該術語亦涵蓋藉由在宿主細胞中重組表現而製備之核酸分子及蛋白質以及化學合成之核酸分子及蛋白質。
可操作地連接：當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能關係時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。一般而言，可操作地連接之DNA序列為連續的，且當必需接合兩個蛋白質編碼區時，處於相同閱讀框架中。
醫藥學上可接受之載劑：適用於本發明之醫藥學上可接受之載劑(媒劑)為習知的。Remington's Pharmaceutical Sciences , 由E. W. Martin著, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 第15版(1975)，描述適用於一或多種治療性化合物、分子或藥劑之醫藥遞送的組合物及調配物。
一般而言，載劑之性質將視所採用之特定投藥模式而定。舉例而言，非經腸調配物通常包含包括醫藥學上及生理學上可接受之流體的可注射流體，諸如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油或其類似物作為媒劑。對於固體組合物(例如，粉末、丸劑、錠劑或膠囊形式)，習知的無毒固體載劑可包括例如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除生物學中性載劑以外，待投與之醫藥組合物亦可含有少量無毒輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑及pH緩衝液及其類似者，例如乙酸鈉或脫水山梨醇單月桂酸酯。
預防、治療或改善疾病：「預防」疾病(諸如PA)係指抑制疾病之完全發展。「治療」係指改善疾病或病理性病狀(諸如PA)之病徵或症狀在其開始發展之後的治療性干預。「改善」係指疾病(諸如PA)之病徵或症狀之數目或嚴重程度降低。
啟動子：引導/引發核酸(例如，基因)之轉錄的DNA區。啟動子包括轉錄起始位點附近之必需核酸序列。許多啟動子序列為熟習此項技術者所已知，且甚至人工核酸分子中之不同啟動子序列之組合為可能的。如本文所使用，基因特異性內源性啟動子係指調節相關內源性基因之表現的天然啟動子元件。在一個實施例中，PCCA基因特異性內源性啟動子調節PCCA基因之表現。在另一實施例中，PCCB基因特異性內源性啟動子調節PCCB基因之表現。
純化：術語「純化」不要求絕對純度；相反，其意欲為相對術語。因此，舉例而言，經純化之肽、蛋白質、病毒或其他活性化合物為自天然相關蛋白質及其他污染物完全或部分地分離之物。在某些實施例中，術語「實質上經純化」係指已自細胞、細胞培養基或其他粗製劑分離且經歷分餾以移除初始製劑之各種組分(諸如蛋白質、細胞碎片及其他組分)之肽、蛋白質、病毒或其他活性化合物。
重組：重組核酸分子為具有並非天然存在之序列或具有藉由人工組合兩個另外間隔開的序列段製得之序列的核酸分子。此人工組合可藉由化學合成或藉由人工操縱分離的核酸分子段來實現，諸如藉由基因工程化技術來實現。
類似地，重組病毒為包含並非天然存在或藉由人工組合不同來源之至少兩個序列製得之序列(諸如基因體序列)的病毒。術語「重組」亦包括僅藉由添加、取代或刪除天然核酸分子、蛋白質或病毒之一部分而更改的核酸、蛋白質及病毒。如本文所使用，「重組AAV」係指一種AAV粒子，其中重組核酸分子，諸如編碼PCCA之重組核酸分子及/或編碼PCCB之重組核酸分子已經封裝。
序列一致性：兩種或更多種核酸序列或兩種或更多種胺基酸序列之間的一致性或相似性係根據序列之間的一致性或相似性來表現。序列一致性可依據一致性百分比進行量測；百分比愈高，序列愈一致。序列相似性可依據相似性百分比(其考慮保守胺基酸取代)進行量測；百分比愈高，序列愈相似。當使用標準方法比對時，核酸或胺基酸序列之同源物或異種同源物擁有相對較高程度之序列一致性/相似性。當直系同源蛋白質或cDNA衍生自與更遠相關之物種(諸如人類及秀麗隱桿線蟲(C. elegans )序列)相比更緊密相關之物種(諸如人類及小鼠序列)時，此同源性更顯著。
用於比較之序列比對方法在此項技術中已熟知。各種程式及比對演算法描述於以下中：Smith及Waterman,Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；Needleman及Wunsch,J. Mol. Biol. 48:443, 1970；Pearson及Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988；Higgins及Sharp,Gene , 73:237-44, 1988；Higgins及Sharp,CABIOS 5:151-3, 1989；Corpet等人,Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988；Huang等人Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992；及Pearson等人,Meth. Mol. Rio. 24:307-31, 1994。Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990呈現序列比對方法及同源性計算之詳細考慮。
NCBI鹼基局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST) (Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)可獲自數種來源，包括國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)及在網際網路上，其與序列分析程式blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx結合使用。額外資訊可發現於NCBI網站處。
血清型：經特徵性抗原集合區分之一組緊密相關的微生物(諸如病毒)。
填充序列：係指較大核酸分子(諸如載體)內所含有之核苷酸序列，該核苷酸序列通常用以在兩個核酸特徵之間(諸如在啟動子與編碼序列之間)形成所需間隔，或用以延伸核酸分子以使得其具有所需長度。填充序列不含有蛋白質編碼資訊，且可具有未知/合成來源，且/或與較大核酸分子內之其他核酸序列無關。
個體：活的多細胞脊椎動物生物體，其為包括人類及非人類哺乳動物之類別。
合成：由人工手段產生於實驗室中，例如合成核酸可在實驗室中以化學方式合成。
非轉譯區(UTR)：典型的mRNA含有分別在編碼區上游及下游之5'非轉譯區(「5' UTR」)及3'非轉譯區(3' UTR) (參見Mignone等人, 2002,Genome Biol 3: REVIEWS0004)。
治療有效量：一定量之指定醫藥或治療劑(例如，重組AAV)，其足以在用該藥劑治療之個體或細胞中實現所需效果。藥劑之有效量將視若干因素而定，該等因素包括(但不限於)所治療之個體或細胞及治療性組合物之投與方式。
載體：載體為允許插入外來核酸而不妨礙載體在宿主細胞中複製及/或整合之能力的核酸分子。載體可包括准許其在宿主細胞中複製之核酸序列，諸如複製起點。載體亦可包括一或多個可選標記基因及其他基因元件。表現載體為含有允許轉錄及轉譯一或多個插入基因之必需調節序列的載體。在本文中之一些實施例中，載體為AAV載體。
除非另外解釋，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同的含義。除非上下文另外明確指示，否則單數術語「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。「包含A或B」意謂包括A，或B，或A及B。應進一步理解，對核酸或多肽所給出之所有鹼基大小或胺基酸大小以及所有分子量或分子量值均為近似值，且係出於描述而提供。儘管與本文所描述之彼等方法及材料類似或等效的方法及材料可用於實踐或測試本發明，但下文描述適合方法及材料。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考案均以全文引用之方式併入本文中。在有衝突之情況下，將以本說明書(包括對術語之解釋)為凖。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。重組腺相關病毒 (rAAV) ：
本發明提供組合物及其在基因療法中之使用方法。更特定而言，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，其包含腺相關病毒(AAV)蛋白殼及封裝於其中之載體基因體。
在一個態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含：(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c) PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。
在另一態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含：(a)啟動子序列；(b)與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及(c) PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。
在一些實施例中，經封裝基因體可進一步包含如本文所描述之5'-ITR、強化子、共有Kozak序列、多腺苷酸化訊息序列及3'-ITR。在一些實施例中，經封裝基因體可進一步包含一或多個填充核酸序列。在一個實施例中，填充核酸序列位於PCCA或PCCB之內含子與部分或完整編碼序列之間。
在本文所描述之各種實施例中，rAAV包含AAV蛋白殼。AAV蛋白殼可來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10、hu37之AAV (亦即，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10、AAVhu37)，以及自人類及非人類靈長類動物組織分離的超過100種變異體中之任一者。參見例如Choi等人, 2005, Curr Gene Ther. 5: 299-310, 2005及Gao等人, 2005, Curr Gene Ther. 5: 285-297。
除前述蛋白殼以外，本發明之範圍內亦包括已經基因工程化以攜帶一或多種有益治療特性(例如，對選擇組織之靶向改良、逃避免疫反應之能力提高、中和抗體之刺激減小等)之變異體AAV蛋白殼。此類經基因工程化變異體蛋白殼之非限制性實例描述於美國專利第9,506,083號、第9,585,971號、第9,587,282號、第9,611,302號、第9,725,485號、第9,856,539號、第9,909,142號、第9,920,097號、第10,011,640號、第10,081,659號、第10,179,176號、第10,202,657號、第10,214,566號、第10,214,785號、第10,266,845號、第10,294,281號、第10,301,648號、第10,385,320號及第10,392,632號中以及PCT公開案第WO/2017/165859號、第WO/2018/022905號、第WO/2018/156654號、第WO/2018/222503號及第WO/2018/226602號中，該等揭示以引用之方式併入本文中。
在某些例示性實施例中，根據本發明投與之rAAV包含AAV8蛋白殼。AAV8蛋白殼為由多種AAV8 vp蛋白質構成之自組裝AAV蛋白殼。AAV8 vp蛋白質通常表現為由SEQ ID NO: 14之核酸序列或與其至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%一致之序列編碼的替代性剪接變異體，該序列編碼SEQ ID NO: 15之vp1胺基酸序列。此等剪接變異體產生不同長度之SEQ ID NO: 15的蛋白質。如本文所使用，AAV8變異體包括例如描述於WO/2019/168961、WO/2017180854及美國專利案第9,909,142號中者。
在某些例示性實施例中，根據本發明投與之rAAV包含AAV9蛋白殼。AAV9蛋白殼為由多種AAV9 vp蛋白質構成之自組裝AAV蛋白殼。AAV9 vp蛋白質通常表現為由SEQ ID NO: 16之核酸序列或與其至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%一致之序列編碼的替代性剪接變異體，該序列編碼SEQ ID NO: 17之vp1胺基酸序列。此等剪接變異體產生不同長度之SEQ ID NO:17的蛋白質。如本文所使用，AAV9變異體包括例如描述於WO/2016/049230、美國專利第8,927,514號、美國專利公開案第2015/ 0344911號及美國專利第8,734,809號中之彼等變異體。
如本文所指示，在一些實施例中，根據本發明投與之rAAV可包含AAV8蛋白殼或AAV9蛋白殼。然而，在其他實施例中，選擇另一AAV蛋白殼。藉由蛋白殼類型測定組織特異性。可選擇轉導適合目標(例如，肝臟、肌肉、肺或CNS)之AAV血清型作為AAV病毒載體之蛋白殼源，該等AAV病毒載體包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh64Rl、AAVrh64R2、AAVrh8。參見例如美國專利公開案第2007/0036760號；美國專利公開案第2009/0197338號；及EP1310571。亦參見WO 2003/042397 (AAV7及其他猿猴AAV)、美國專利第7282199號及第7790449號(AAV8)。另外，尚待發現之AAV或基於其之重組AAV可用作AAV蛋白殼源。此等文獻亦描述可經選擇用於產生AAV之其他AAV，且以引用之方式併入。在一些實施例中，適用於病毒載體中之AAV蛋白殼可藉由前述AAV蛋白殼中之一者或其編碼核酸的突變誘發(亦即，藉由插入、刪除或取代)來產生。在一些實施例中，AAV蛋白殼為嵌合的，包含來自前述AAV蛋白殼蛋白中之兩者或三者或四者或更多者的域。在一些實施例中，AAV蛋白殼為來自兩種或三種不同AAV或重組AAV之Vpl、Vp2及Vp3單體之嵌合體。在一些實施例中，rAAV組合物包含超過一個前述蛋白殼。啟動子：
在本文描述之各種態樣中，rAAV包含經封裝載體基因體，其包含有助於驅動且控制PCCA或PCCB表現之啟動子序列。在例示性實施例中，啟動子序列位於5'-ITR序列與PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列之間。在一些實施例中，啟動子序列位於強化子序列下游。在一些實施例中，啟動子序列位於內含子序列上游。
在一些實施例中，啟動子係選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒立即早期基因(CMV)啟動子、甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子及CAG啟動子。
在一例示性實施例中，啟動子為CBA啟動子。在一個實施例中，CBA啟動子包含SEQ ID NO: 21或與其至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之序列或由其組成。
除啟動子以外，經封裝基因體可含有其他適當轉錄起始、終止、強化子序列及高效RNA處理訊息。如下文進一步詳細描述，此類序列包括剪接及多腺苷酸化(poly A)訊息、增強表現之調節元件(亦即，WPRE)、使細胞質mRNA穩定之序列、增強轉譯效率之序列(亦即，Kozak共有序列)及增強蛋白質穩定性之序列。反向末端重複序列 (ITR) ：
在一些實施例中，rAAV包含經封裝載體基因體，其包含AAV ITR序列，當以反式提供AAV及腺病毒輔助功能時，該AAV ITR序列充當載體DNA複製之起點及載體基因體之封裝訊息兩者。另外，ITR充當大Rep蛋白質進行單股核酸內切酶切刻之目標，從而自複製中間物分解個別基因體。
在一些實施例中，5'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，5'-ITR序列及3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，5'-ITR序列及/或3'-ITR序列來自AAV2且各自包含SEQ ID NO: 18或由其組成。在其他實施例中，5'-ITR序列及/或3'-ITR序列來自非AAV2源。強化子：
在一些實施例中，rAAV含有包含一或多個強化子序列之經封裝載體基因體。在一個實施例中，強化子係選自細胞巨大病毒(CMV)立即早期基因強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及ApoE強化子。在一例示性實施例中，強化子為CMV強化子(例如，CMV立即早期基因強化子)。在一個實施例中，CMV強化子包含SEQ ID NO: 22或與其至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%但小於100%一致之序列或由其組成。Kozak 序列：
在一些實施例中，rAAV含有包含共有Kozak序列之經封裝載體基因體。在一些實施例中，共有Kozak序列位於內含子序列下游。在一個實施例中，共有Kozak序列為GCCGCC (SEQ ID NO: 24)。如熟習此項技術者應理解，共有Kozak序列通常緊鄰編碼序列之上游定位；在此情況下，緊鄰PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列之上游定位。如熟習此項技術者應瞭解，共有Kozak序列可視為共用對應於治療性多肽之起始密碼子之ATG殘基，例如PCCA或PCCB。為簡化本發明，如本文所描述之共有Kozak序列包含對應於不與治療性多肽共用之區域的六核苷酸序列，例如PCCA或PCCB。多腺苷酸化訊息序列：
在一些實施例中，rAAV含有包含多腺苷酸化訊息序列之經封裝載體基因體。在一個實施例中，多腺苷酸化訊息序列係選自SV40多腺苷酸化訊息序列、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊息序列及兔β球蛋白多腺苷酸化訊息序列。在一例示性實施例中，多腺苷酸化訊息序列為SV40多腺苷酸化訊息序列。在一個實施例中，SV40多腺苷酸化訊息序列包含SEQ ID NO: 23或與其至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或超過99%但小於100%一致之序列或由其組成。PCCA 或 PCCB 多肽：
如本文所描述，本發明之態樣提供包括經封裝基因體之rAAV，該經封裝基因體包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。
在一個實施例中，PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。如本文所使用，術語「野生型」係指與自然界中存在之生物聚合物(例如，多肽序列或聚核苷酸序列)相同的生物聚合物(例如，多肽序列或聚核苷酸序列)。
在一替代實施例中，PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子最佳化編碼序列。在一個實施例中，PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列經密碼子最佳化以用於在人類中表現。
在本文描述之各種實施例中，提供一種rAAV，其含有包含PCCA或PCCB之編碼序列的經封裝基因體。用本文描述之rAAV遞送的多肽涵蓋可適用於治療哺乳動物(包括人類)之PCCA及PCCB多肽。
在一些實施例中，用本文描述之rAAV表現的多肽為PCCA (SEQ ID NO: 19；Genbank寄存編號NP_000273.2；728個胺基酸)或其功能性片段、功能性變異體或功能性同功異型物。在一些實施例中，用本文所描述之rAAV表現的多肽為PCCA且包含SEQ ID NO: 19或由其組成。
在一個實施例中，PCCA多肽由SEQ ID NO: 2中所展示之野生型編碼序列編碼。在另一實施例中，可使用表現PCCA之天然同功異型物或變異體之編碼序列，諸如UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05165-1 (SEQ ID NO: 25)、P05165-2 (SEQ ID NO: 26)及P05165-3 (SEQ ID NO: 27)中所展示之彼等編碼序列。在替代實施例中，PCCA多肽由密碼子最佳化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCA多肽由密碼子最佳化編碼序列編碼，該編碼序列與SEQ ID NO: 1中所展示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些例示性實施例中，PCCA多肽由選自SEQ ID NO: 3-7之密碼子最佳化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCA之編碼序列可在3'端處進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。
在一些實施例中，用本文描述之rAAV表現的多肽為PCCB (SEQ ID NO: 20；Genbank寄存編號NP_000523.2；539個胺基酸)或其功能性片段、功能性變異體或功能性同功異型物。在一些實施例中，用本文所描述之rAAV表現的多肽為PCCB且包含SEQ ID NO: 20或由其組成。
在一些實施例中，PCCB多肽由SEQ ID NO: 8中所展示之野生型編碼序列編碼。在另一實施例中，可使用表現PCCB之天然同功異型物或變異體之編碼序列，諸如UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05166-1 (SEQ ID NO: 28)及P05166-2 (SEQ ID NO: 29)中所展示之彼等編碼序列。在替代實施例中，PCCB多肽由密碼子最佳化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCB多肽由密碼子最佳化編碼序列編碼，該編碼序列與SEQ ID NO: 8中所展示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些例示性實施例中，PCCB多肽由選自SEQ ID NO: 9-13之密碼子最佳化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCB之編碼序列可在3'端處進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。
在各種態樣中，本發明可用於遞送本文所描述之PCCA或PCCB多肽之片段、變異體、同功異型物或融合物。
在一些實施例中，本發明可用於遞送PCCA或PCCB多肽之片段，其包含至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600個胺基酸殘基且保留與全長多肽相關之一或多種活性(例如，在酶之情況下的催化活性)。此類片段可藉由此項技術中常規且熟知之重組技術獲得。此外，此類片段可藉由熟習此項技術者已知之常規活體外分析來測試催化活性。舉例而言，丙醯輔酶A羧化酶(PCC)活性可藉由以下分析：(1)將多肽稀釋在含有1 mM 2-巰基乙醇及0.1 mg/ml牛血清白蛋白之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中，(2)採用含有50 mM Tris-HCl pH 8.0、5 mM麩胱甘肽、2 mM ATP、100 mM KCl、10 mM MgCl2 、10 mM [14 C]-碳酸氫鹽(特定活性12.4 mCi/mmol)、3 mM丙醯輔酶A之標準反應混合物，且將酶在37℃下培育15 min，(3)藉由添加10%三氯乙酸停止反應，(4)以200 × g離心，(5)在熱燈下乾燥等分試樣，(6)溶解在水中，及(7)在Aquasol中計數，其中將一個單位之酶活性定義為在37℃下催化固定1 pmol碳酸氫鹽/分鐘的酶量。對於PCC活性分析之描述，參見Kalousek等人, 1980,J Biol Chem 255(1): 60-65及Hsia等人, 1973J. Pediatr. 83: 625-628。本發明進一步包括編碼上文描述之多肽片段之核酸分子。
在一些實施例中，本發明可用於遞送PCCA或PCCB多肽之變異體。在一些實施例中，變異體多肽可與野生型治療性多肽，例如SEQ ID NO: 19之野生型PCCA多肽或SEQ ID NO: 20之野生型PCCB多肽至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)一致。在一些實施例中，變異體治療性多肽與各別野生型多肽相比可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個不同殘基。此類變異體可藉由此項技術中常規且熟知之重組技術獲得。此外，此類變異體可藉由熟習此項技術者已知之常規活體外分析來測試催化活性。對於丙醯輔酶A羧化酶活性分析之描述，參見例如Kalousek等人, 1980,J Biol Chem 255(1): 60-65及Hsia等人, 1973J. Pediatr. 83: 625-628。本發明進一步包括編碼上文描述之治療多肽變異體的核酸分子。密碼子最佳化序列：
在一些態樣中，本發明提供一種包含經封裝基因體之rAAV，該經封裝基因體包含編碼PCCA之密碼子最佳化核酸序列。在一個實施例中，編碼PCCA之密碼子最佳化核酸序列與SEQ ID NO: 2中所展示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些實施例中，編碼PCCA之密碼子最佳化核酸序列與選自SEQ ID NO: 3-7之序列至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)一致。在一些實施例中，編碼PCCA之密碼子最佳化核酸序列與選自SEQ ID NO: 3-7之序列100%一致。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO:2中所展示之野生型編碼序列小於80%一致且與選自SEQ ID NO: 3-7之序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的核酸序列。在例示性實施例中，本發明提供一種編碼選自SEQ ID NO: 3-7之PCCA的核酸序列。進一步提供SEQ ID NO: 3-7中所展示之核酸序列之片段，其各自編碼具有功能性PCCA活性之多肽。在一些實施例中，編碼PCCA之核酸序列可在3'端處進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。
在一些態樣中，本發明提供一種包含經封裝基因體之rAAV，該經封裝基因體包含編碼PCCB之密碼子最佳化核酸序列。在一個實施例中，編碼PCCB之密碼子最佳化核酸序列與SEQ ID NO: 8中所展示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些實施例中，編碼PCCB之密碼子最佳化核酸序列與選自SEQ ID NO: 9-13之序列至少80% (例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)一致。在一些實施例中，編碼PCCB之密碼子最佳化核酸序列與選自SEQ ID NO: 9-13之序列100%一致。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 8中所展示之野生型編碼序列小於80%一致且與選自SEQ ID NO: 9-13之序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的核酸序列。在例示性實施例中，本發明提供一種編碼選自SEQ ID NO: 9-13之PCCB的核酸序列。進一步提供SEQ ID NO: 9-13中所展示之核酸序列之片段，其各自編碼具有功能性PCCB活性之多肽。在一些實施例中，編碼PCCB之核酸序列可在3'端處進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。重組核酸構築體：
在另一態樣中，本發明提供重組核酸構築體，其包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在一些實施例中，重組核酸構築體亦包含一或多個選自以下之元件：5'-ITR、強化子序列、多腺苷酸化訊息序列及3'-ITR。在一個實施例中，重組核酸構築體包含5'-ITR、強化子序列、啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列、多腺苷酸化訊息序列及3'-ITR。在一其他實施例中，重組核酸構築體包含AAV2 5'-ITR、CMV強化子、CBA啟動子、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCA之編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，重組核酸構築體進一步包含位於內含子序列下游之共有Kozak序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 1或由其組成。在一些實施例中，PCCA之編碼序列係選自SEQ ID NO: 2-7。
在一些實施例中，本發明提供一種重組核酸構築體，其包含與SEQ ID NO: 30至少90%一致之序列。在一些實施例中，重組核酸構築體包含與SEQ ID NO: 30至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之序列。在一些實施例中，重組核酸構築體由與SEQ ID NO: 30至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之序列組成。在一些實施例中，重組核酸構築體包含SEQ ID NO: 30。在一些實施例中，重組核酸構築體由SEQ ID NO: 30組成。
在另一態樣中，本發明提供重組核酸構築體，其包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在一些實施例中，重組核酸構築體亦包含一或多個選自以下之元件：5'-ITR、強化子序列、多腺苷酸化訊息序列及3'-ITR。在一個實施例中，重組核酸構築體包含5'-ITR、強化子序列、啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列、多腺苷酸化訊息序列及3'-ITR。在一其他實施例中，重組核酸構築體包含AAV2 5'-ITR、CMV強化子、CBA啟動子、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCB之編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，重組核酸構築體進一步包含位於內含子序列下游之共有Kozak序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 1或由其組成。在一些實施例中，PCCB之編碼序列係選自SEQ ID NO: 8-13。
在一些實施例中，本發明提供一種重組核酸構築體，其包含與SEQ ID NO: 31至少90%一致之序列。在一些實施例中，重組核酸構築體包含與SEQ ID NO: 31至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之序列。在一些實施例中，重組核酸構築體由與SEQ ID NO: 31至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之序列組成。在一些實施例中，重組核酸構築體包含SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，重組核酸構築體由SEQ ID NO: 31組成。載體：
在另一態樣中，本發明提供一種載體，其包含本發明之重組核酸構築體。在一個實施例中，載體包含重組核酸構築體，其包含5'-ITR、啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列及3'-ITR。在另一實施例中，載體包含重組核酸構築體，其包含5'-ITR、啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列及3'-ITR。
在根據此態樣之一些實施例中，載體係選自質體、黏質體、噬菌粒、游離基因體、非病毒遞送媒劑(例如，脂質奈米粒子)及病毒。在一例示性實施例中，載體為質體。
可藉由任何適合方法(包括轉染、電穿孔、基於脂質體之遞送及膜融合技術)將所選擇之載體遞送至宿主細胞。在一例示性實施例中，經由轉染將載體遞送至宿主細胞。標準DNA轉染技術可用於將載體遞送至宿主細胞。參見例如Sambrook等人, 2000,Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 第3版, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY。
在一些實施例中，載體(例如，質體)可進一步包含一或多個選自AAV Rep編碼序列、AAV Cap編碼序列及可選標記之編碼序列的核酸序列。宿主細胞：
在另一態樣中，本發明提供宿主細胞，其包含本發明之重組核酸分子、本發明之載體或本發明之rAAV。
在一些實施例中，宿主細胞可適用於AAV增殖。大量宿主細胞可用於產生AAV，諸如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等。在一些實施例中，宿主細胞可為適合於產生重組AAV (rAAV)之細胞(或細胞株)，例如HeLa、Cos-7、HEK293、A549、BHK、Vero、RD、HT-1080、ARPE-19或MRC-5細胞。
可使用此項技術中所已知之任何適合的方法將重組核酸分子或載體遞送至宿主細胞培養物中。在一些實施例中，產生穩定的宿主細胞株，該宿主細胞株具有插入至其基因體中之重組核酸分子或載體。在一些實施例中，產生穩定的宿主細胞株，其含有本文描述之rAAV載體。在將rAAV載體轉染至宿主培養物之後，可藉由各種方法分析將rAAV整合至宿主基因體中，諸如抗生素選擇、螢光活化細胞分選、南方墨點(southern blot)、基於PCR之偵測、螢光原位雜交，如Nakai等人, Nature Genetics (2003) 34, 297-302；Philpott 等人, Journal of Virology (2002) 76(11):5411-5421及Howden 等人, J Gene Med 2008; 10:42-50所描述。此外，穩定細胞株可根據此項技術中熟知之方案建立，諸如Clark, Kidney International第61卷(2002):S9-S15及Yuan等人, Human Gene Therapy, 2011年5月;22(5):613-24中所描述之彼等方案。用於基因療法之重組 AAV ：
在另一態樣中，本發明提供一種本文所揭示之rAAV用於治療丙酸血症(PA)之用途，其中rAAV包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體。在一些實施例中，rAAV含有經封裝基因體，其包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在一例示性實施例中，經封裝基因體亦包含5'-ITR、啟動子序列上游之強化子序列、3'-ITR上游之多腺苷酸化序列及3'-ITR。因此，在另一例示性實施例中，rAAV含有經封裝基因體，其包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：5'-ITR、強化子序列、啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列、多腺苷酸化訊息序列及3'ITR。在一其他例示性實施例中，rAAV含有經封裝基因體，其包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、CBA啟動子、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCA之編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，經封裝基因體進一步包含位於內含子序列下游之共有Kozak序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 1或由其組成。在一些實施例中，PCCA之編碼序列係選自SEQ ID NO: 2-7。在一些實施例中，蛋白殼為AAV8或AAV9蛋白殼。
展示用於表現PCCA之例示性經封裝載體基因體構築體的例示性圖式提供於圖 1 中，其以5'至3'次序展示5'-ITR、CMV強化子、CBA啟動子、SEQ ID NO: 1之內含子序列、共有Kozak序列、PCCA編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息序列及3'-ITR。
在另一態樣中，本發明提供一種本文所揭示之rAAV用於治療丙酸血症(PA)之用途，其中rAAV包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體。在一些實施例中，rAAV含有經封裝基因體，其包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在一例示性實施例中，經封裝基因體亦包含5'-ITR、啟動子序列上游之強化子序列、3'-ITR上游之多腺苷酸化序列及3'-ITR。因此，在另一例示性實施例中，rAAV含有經封裝基因體，其包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：5'-ITR、強化子序列、啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列、多腺苷酸化訊息序列及3'-ITR。在一其他例示性實施例中，rAAV含有經封裝基因體，其包含作為以5'至3'次序可操作地連接之組分的以下各者：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、CBA啟動子、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列、PCCB之編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，經封裝基因體進一步包含位於內含子序列下游之共有Kozak序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 1或由其組成。在一些實施例中，PCCB之編碼序列係選自SEQ ID NO: 8-13。在一些實施例中，蛋白殼為AAV8或AAV9蛋白殼。
展示用於表現PCCB之例示性經封裝載體基因體構築體的例示性圖式提供於圖 2 中，其以5'至3'次序展示：5'-ITR、CMV強化子、CBA啟動子、SEQ ID NO: 1之內含子序列、共有Kozak序列、PCCB編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息序列及3'-ITR。蛋白質位置：
丙醯輔酶A羧化酶為位於粒線體基質之多聚體蛋白(參見Browner 等人, (1989).Journal of Biological Chemistry. 264:12680-5)。因此，有必要的係，遞送PCCA及/或PCCB基因之基因療法載體能夠編碼在粒線體中具有功能性且定位於粒線體中之蛋白質。在一個態樣中，本文所揭示之一或多種rAAV能夠遞送編碼定位於粒線體中之PCCA及/或PCCB蛋白質的基因。醫藥組合物：
在另一態樣中，本發明提供一種包含本發明之rAAV (例如，遞送PCCA或PCCB之rAAV)及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物。在一些實施例中，包含本發明之rAAV (例如，遞送PCCA或PCCB之rAAV)的醫藥組合物經調配用於皮下、肌內、皮內、腹膜內或靜脈內投與。在一例示性實施例中，醫藥組合物經調配用於靜脈內投與。
在一些實施例中，rAAV在適用於輸注於人類個體中之緩衝液/載劑中進行調配。緩衝液/載劑應包括防止rAAV黏附至輸注管但不干擾活體內rAAV結合活性之組分。各種適合的溶液可包括以下中之一或多者：緩衝生理鹽水、界面活性劑及生理學上相容之鹽或鹽之混合物(經調節至等效於約100 mM氯化鈉(NaCl)至約250 mM氯化鈉之離子強度)，或經調節至等效離子濃度之生理學上相容之鹽。pH可在6.5至8.5、或7至8.5、或7.5至8之範圍內。適合的界面活性劑或界面活性劑之組合可選自泊洛沙姆(Poloxamer) (亦即非離子三嵌段共聚物，其由側接聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))之兩條親水鏈的聚氧丙烯10 (聚(環氧丙烷))之中心疏水鏈構成)、SOLUTOL HS 15 (聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL (聚氧辛酸甘油酯)、聚氧基10油基醚、TWEEN (聚氧伸乙基脫水山梨糖醇脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。
在一例示性實施例中，rAAV在包含以下之溶液中進行調配：NaCl (例如，200 mM NaCl)、MgCl2 (例如，1 mM MgCl2 )、pH 8.0之Tris (例如，20 mM Tris)及泊洛沙姆188 (例如，0.005%或0.01%泊洛沙姆188)。治療丙酸血症之方法：
在另一態樣中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向人類個體投與治療有效量的本文所揭示之至少一種rAAV。
在一個實施例中，本發明提供一種治療PA之方法，其包含投與包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中載體基因體包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。
在另一實施例中，本發明提供一種治療PA之方法，其包含投與包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中載體基因體包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。
在又一實施例中，本發明提供一種治療PA之方法，其包含投與(1)包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中該載體基因體包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列；及(2)包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中該載體基因體包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在一些實施例中，可同時投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可依序投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可單獨投與(1)及(2)之rAAV。
在另一態樣中，本發明提供治療人類個體之PA之方法，其包含向經診斷患有PCCA中之至少一種突變的人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供一種治療經診斷患有PCCA中之至少一種突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中該載體基因體包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCA或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，PCCA中之突變係選自表1。在一些實施例中，PCCA之編碼序列係選自SEQ ID NO: 2-7。在一些實施例中，蛋白殼為AAV8或AAV9蛋白殼。
在另一態樣中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向經診斷患有PCCB中之至少一種突變的人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供一種治療經診斷患有PCCB中之至少一種突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體的rAAV，其中該載體基因體包含啟動子序列、與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列及PCCB或其同功異型物或其功能性片段或功能性變異體之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，PCCB中之突變係選自表2。在一些實施例中，PCCB之編碼序列係選自SEQ ID NO: 8-13。在一些實施例中，蛋白殼為AAV8或AAV9蛋白殼。
描述PCCA及PCCB中之引起PA之突變的綜述文章提供於Ugarte等人, 1999,Hum. Mutat. 14(4): 275-282中。
在由突變PCCA基因引起之PA中，已鑑別出PCCA基因中之以下突變及多形現象：表 1 - PCCA 基因突變及多形現象 ：
錯義突變： 148 GàC, 154 CàT, 337 GàA, 416 TàC, 611 TàC, 815 AàG, 1028 AàG, 1043 TàA, 1061 GàT 1121 GàA, 1193 CàT,   1601 GàT, 1816 GàC, 1927 GàT
無義突變： 862 CàT, 1610 CàG
小缺失： 700 del5, 1115del4, 2058del3
剪接突變： 1645IVS+1GàA, 1671IVS+5GàC, 1771IV2-2del9, 1824IVS+3del4, 1824IVS+3insCT
多形現象 ： 552AàG, 1348AàG
在由突變PCCB基因引起之PA中，已鑑別出PCCB基因中之以下突變及多形現象：表 2 - PCCB 基因突變及多形現象 ：
錯義突變： 49 CàA, 131 GàC, 318 CàA, 391 GàC, 493 CàT, 502 GàA, 593 GàA, 605 TàA, 683 CàT 1228 CàT, 1283 CàT,1325 TàC, 1490 CàT, 1534 CàT, 1556 TàC, 1606 AàG,
無義突變： 1495 CàT, 1593 GàA
插入及缺失： 418ins12, 790insG, 1170insT, 1218del14ins12, 1222del3, 1298insA
剪接突變： IVS1+3GàC, IVS4+3del4, IVS10-11del6, IVS12+3del8, IVS13+1GàT
可使用任何適合的方法或途徑來投與本文所描述之rAAV或含rAAV組合物。投藥途徑包括例如全身性、經口、吸入、經鼻內、經氣管內、經動脈內、經眼內、經靜脈內、經肌肉內、經皮下、經皮內及其他非經腸投藥途徑。在一些實施例中，rAAV、包含rAAV之組合物或包含多種rAAV之組合物(例如，表現PCCA之一種rAAV及表現PCCB之第二種rAAV)係經靜脈內投與。
所投與之特定劑量可為用於各患者之均一劑量，例如每名患者1.0 × 1011 至1.0 × 1014 個基因體拷貝(GC)之病毒。可替代地，可根據患者之大致體重或表面積定製患者的劑量。判定適當劑量之其他因素可包括待治療或預防之疾病或病狀、疾病之嚴重程度、投藥途徑以及患者之年齡、性別及醫學病狀。熟習此項技術者依常規方式，尤其根據劑量資訊及本文所揭示之分析，進一步改進判定適當治療劑量所必需的計算。劑量亦可經由使用用於判定與適當的劑量反應資料結合使用之劑量的已知分析來判定。亦可在監測疾病進展時調整個別患者之劑量。
在一些實施例中，以例如每公斤患者體重約1.0 × 1011 個基因體可能(GC/kg)至約1 × 1014 GC/kg、每公斤患者體重約5 × 1011 個基因體拷貝(GC/kg)至約5 × 1013 GC/kg或約1 × 1012 至約1 × 1013 GC/kg之劑量投與rAAV，如藉由qPCR或數位液滴PCR (ddPCR)所量測。在一些實施例中，以約1 × 1012 至約1 × 1013 個基因體拷貝(GC)/公斤之劑量投與rAAV。在一些實施例中，以約1.1 × 1011 、約1.3 × 1011 、約1.6 × 1011 、約1.9 × 1011 、約2 × 1011 、約2.5 × 1011 、約3.0 × 1011 、約3.5 × 1011 、約4.0 × 1011 、約4.5 × 1011 、約5.0 × 1011 、約5.5 × 1011 、約6.0 × 1011 、約6.5 × 1011 、約7.0 × 1011 、約7.5 × 1011 、約8.0 × 1011 、約8.5 × 1011 、約9.0 × 1011 、約9.5 × 1011 、約1.0 × 1012 、約1.5 × 1012 、約2.0 × 1012 、約2.5 × 1012 、約3.0 × 1012 、約3.5 × 1012 、約4.0 × 1012 、約4.5 × 1012 、約5.0 × 1012 、約5.5 × 1012 、約6.0 × 1012 、約6.5 × 1012 、約7.0 × 1012 、約7.5 × 1012 、約8.0 × 1012 、約8.5 × 1012 、約9.0 × 1012 、約9.5 × 1012 、約1.0 × 1013 、約1.5 × 1013 、約2.0 × 1013 、約2.5 × 1013 、約3.0 × 1013 、約3.5 × 1013 、約4.0 × 1013 、約4.5 × 1013 、約5.0 × 1013 、約5.5 × 1013 、約6.0 × 1013 、約6.5 × 1013 、約7.0 × 1013 、約7.5 × 1013 、約8.0 × 1013 、約8.5 × 1013 、約9.0 × 1013 、約9.5 × 1013 個基因體拷貝(GC)/公斤之劑量投與rAAV。rAAV可按所需治療結果之需要而以單次劑量或以多次劑量(諸如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次劑量)投與。
劑量可每日、每週、每月或每年給予一次或更多次或甚至每2年至20年給予一次。舉例而言，各劑量可最少相隔1週、相隔2週、相隔3週、相隔1個月、相隔3個月、相隔6個月或相隔1年給予。一般熟習此項技術者可容易地基於體液或組織中之可靶向構築體或複合物之所量測的滯留時間及濃度估計給藥之重複率。
在通篇說明書中，在組合物描述為具有、包括或包含特定組分之情況下，或在製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟的情況下，另外經考慮，存在基本上由所列組分組成或由所列組分組成之本發明之組合物，且存在基本上由所列處理步驟組成或由所列處理步驟組成的根據本發明之製程及方法。
在本發明中，在據稱要素或組分包括於所敍述要素或組分之清單中且/或選自所敍述要素或組分之清單的情況下，應理解，該要素或組分可為所敍述要素或組分中之任一者，或該要素或組分可選自由所敍述要素或組分中之兩者或更多者組成之群。
此外，應理解，在不背離本發明之精神及範疇的情況下，本文所描述之組合物或方法中的要素及/或特徵可以多種方式進行組合，無論在本文中為明確或隱含的。舉例而言，除非上下文另外理解，否則當參考特定化合物時，該化合物可用於本發明之組合物的各種實施例中及/或本發明之方法中。換言之，在本發明內，已以使得本發明能夠得以清晰且簡潔書寫及繪製之方式來描述且描繪實施例，但希望且應瞭解，可在不背離本發明教示內容及本發明之情況下以各種方式組合或分離實施例。舉例而言，應瞭解，本文所描述及描繪之所有特徵可適用於本文所描述及描繪的本發明之所有態樣。
應理解，除非自上下文及用途另外理解，否則表述「…中之至少一者」個別地包括該表述之後的所敍述對象中之每一者及所敍述對象中之兩者或更多者之各種組合。除非自上下文另外理解，否則結合三個或更多個所敍述對象之表述「及/或」應理解為具有相同含義。
除非另外特定陳述或自上下文中理解，否則使用術語「包括(include/includes/including)」、「具有(have/has/having)」、「含有(contain/contains/containing)」(包括其文法等效物)應通常理解為開端式及非限制性的，例如不排除其他未列元素或步驟。
在量值之前使用術語「約」時，除非另外特定陳述，否則本發明亦包括特定量值本身。除非另外指示或推斷，否則如本文所使用，術語「約」係指自標稱值之± 10%偏差。
應理解，步驟次序或用於執行某些行動之次序為非實質的，只要本發明仍可操作即可。此外，可同時進行兩個或更多個步驟或動作。
除非主張，否則本文中任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」或「包括」)之使用僅意欲更好地說明本發明且不對本發明之範疇造成限制。本說明書中之任何語言均不應視為指示實踐本發明所必需的任何未主張要素。 實例
現大體上所描述之本發明將參考以下實例更容易理解，該等實例僅出於說明本發明之某些態樣及實施例的目的而包括在內，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實例 1 ： HepG2 及 Huh-7 細胞中 PCCA 之蛋白質表現
在此實施例中，在轉染HepG2及HuH-7肝細胞之後評估PCCA之蛋白質表現。
簡言之，HepG2及HuH-7細胞株係經對照質體(亦即，模擬物，具有空白載體之質體)或攜帶強化子(「Enh」)、啟動子(「Pro」)、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息(「PS」)之七種組合中之一者之rAAV載體質體轉染，該rAAV載體質體如按以下表3中所展示：表 3 ： rAAV 載體質體
DTC346 CMV Enh, CBA Pro, SV40內含子, PCCA (SEQ ID NO: 2), SV40 PS
DTC426 CMV Enh, CBA Pro, SV40內含子, PCCA (SEQ ID NO: 2), 兔球蛋白PS
DTC427 CMV Enh, CBA Pro, SV40內含子, PCCA (SEQ ID NO: 2), BGH PS
DTC428 CMV Enh, CBA Pro, hFIX內含子1, PCCA (SEQ ID NO: 2), SV40 PS
DTC429 CMV Enh, CBA Pro, β-球蛋白/IgG嵌合內含子, PCCA (SEQ ID NO: 2), SV40 PS
DTC430 CMV Enh, CBA Pro, IVS2內含子(SEQ ID NO: 1), PCCA (SEQ ID NO: 2), SV40 PS
DTC431 CMV Enh, CBA Pro, rHBB內含子, PCCA (SEQ ID NO: 2), SV40 PS
根據製造商之說明書使用脂染胺(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen)轉染各質體。轉染後72小時採集細胞且用補充有蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)及磷酸酶抑制劑混合液2+3 (Sigma P5726及P0044)之NP-40溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1% NP-40)溶解。在10% SDS-PAGE凝膠上解析蛋白質且轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用抗PCCA抗體以1:1000稀釋，隨後使用結合至遠紅外線螢光團(far red fluorophores)之二級抗體進行西方墨點分析。
圖 3A 為展示藉由西方墨點在經對照質體(模擬物，具有空白載體之質體)或對應於DTC346、DTC426、DTC427、DTC428、DTC429、DTC430或DTC431之rAAV載體質體轉染的HepG2肝細胞中所偵測之PCCA蛋白質表現量的影像。使用肌動蛋白作為負載對照。圖 3B 為展示自墨點1量測之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。如圖 3B 所說明，相較於所測試之所有其他載體質體，包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的DTC430 (SEQ ID NO: 30)顯示實質上且出人意料地更多的PCCA蛋白質表現。
圖 4A 為展示藉由西方墨點在經對照質體或對應於DTC346、DTC426、DTC427、DTC428、DTC429、DTC430或DTC431之rAAV載體質體轉染的HuH-7肝細胞中所偵測之PCCA蛋白質表現量的影像。使用肌動蛋白作為負載對照。圖 4B 為展示自墨點1量測之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。如圖 4B 所說明，相較於所測試之所有其他載體質體，包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的DTC430 (SEQ ID NO: 30)顯示實質上且出人意料地更多的PCCA蛋白質表現。
圖 5A 為展示藉由西方墨點在經對照質體或對應於DTC346、DTC482、DTC483、DTC484或DTC485之rAAV載體質體(墨點1)轉染；經對照質體(UF)或對應於DTC346、DTC482、DTC483、DTC484、DTC485或DTC430之rAAV載體質體(墨點2)轉染的HepG2肝細胞中所偵測之PCCA蛋白質表現量的影像。使用肌動蛋白作為負載對照。圖 5B 為展示經對照質體或rAAV載體質體(DTC346、DTC482、DTC483、DTC484、DTC485或DTC430)轉染後之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。該圖描繪自UF、DTC482、DTC483、DTC484及DTC485之墨點1及墨點2所量測的平均蛋白質表現量。該圖描繪自DTC430之墨點2所量測的蛋白質表現量。如圖 5B 所說明，相較於所測試之所有其他載體質體，包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的DTC430 (SEQ ID NO: 30)顯示實質上且出人意料地更多的PCCA蛋白質表現。
圖 6A 為展示如藉由西方墨點在經對照質體或對應於DTC346、DTC482、DTC483、DTC484或DTC485之rAAV載體質體(墨點1)轉染；經對照質體或對應於DTC346、DTC482、DTC483、DTC484、DTC485或DTC430之rAAV載體質體(墨點2)轉染的HuH-7肝細胞中偵測之PCCA蛋白質表現量的影像。使用肌動蛋白作為負載對照。圖 6B 為展示經對照質體或rAAV載體質體(DTC346、DTC482、DTC483、DTC484、DTC485或DTC430)轉染後之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。該圖描繪自UF、DTC482、DTC483、DTC484及DTC485之墨點1及墨點2量測的平均蛋白質表現量。該圖描繪自DTC430之墨點2量測的蛋白質表現量。如圖 6B 所展示，相較於所測試之所有其他載體質體，包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的DTC430 (SEQ ID NO: 30)顯示實質上且出人意料地更多的PCCA蛋白質表現。
此實例表明，將人類β-球蛋白IVS2內含子序列(SEQ ID NO: 1)插入至PA基因療法載體中可提供關於轉基因表現之大量優點。此內含子序列在編碼PCCA或PCCB之rAAV中的利用率展示遞送高轉基因表現之前景，藉此降低成功的丙酸血症基因療法所需之載體劑量。實例 2 ： 次等位基因 PA 小鼠模型中之人類 PCCA 活性
此實例與測試rAAV介導之編碼PCCA之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之遞送對次等位基因PA小鼠模型中之丙酸血症(PA)的治療效果有關。小鼠中Pcca 基因之缺失模擬人類疾病之最嚴重形式。Pcca 小鼠在出生36小時內死亡，使得難以在其中測試靜脈內全身性療法(參見Guenzel等人, Mol Ther. 2013年7月; 21 (7):1316-1323)。次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)係由具有帶有人類PCCA蛋白質之A138T突變異體之轉基因的Pcca 之缺失產生。Pcca-/- (A138T)小鼠具有2%野生型PCC活性，存活至成年期且丙醯基肉鹼、甲基檸檬酸酯、甘胺酸、丙胺酸、離胺酸、氨及與心肌症相關之標記升高，與患有PA之患者中之彼等相似。簡言之，八隻小鼠係經靜脈內注射有5×1011 、1×1012 、2×1012 或4×1012 個病毒基因體(VG)/公斤(分別為5E11、1E12、2E12及4E12)之編碼包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列之DTC430 (SEQ ID NO: 30)的rAAV8 (注射後之PCCA表現量提供於圖 8A 中)。五隻小鼠係經靜脈內注射有3×1011 、1×1012 或3×1012 VG/kg (分別為3E11、1E12或3E12)之編碼包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列之DTC430 (SEQ ID NO: 30)的rAAV9 (注射後之PCCA表現量提供於圖 8B 中)。將PBS注射至對照小鼠(「CONT」)。
在(「Pre」)之前及注射包含編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之rAAV後2、3及4週藉由液相層析-質譜法(LC-MS)量測PA (2-甲基檸檬酸酯(2MC)、丙醯基肉鹼(C3)及醯基肉鹼(C2))之已知生物標記的血漿濃度。圖 7A 及圖 7B 為展示與注射對照物(PBS) (「CONT」)時之含量相比，在用包含編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之rAAV處理後，次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中之丙酸血症之已知生物標記之血漿濃度的線圖。
圖 7A 為展示在用包含編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之rAAV處理後，次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中之2-甲基檸檬酸酯(2MC)之血漿濃度的線圖。圖 7B 為展示在用包含編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之rAAV處理後，次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中之血漿C3/C2 (丙醯基肉鹼/醯基肉鹼)濃度比的線圖。圖 7A 及圖 7B 中之術語「Pre」分別指示注射包含編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之rAAV或PBS(「CONT」)之前2週的2MC及C3/C2值。誤差條表示標準誤差。*表示相較於使用鄧尼特氏檢定之PBS處理組，p＜0.05。
與PBS處理(「CONT」)之彼等小鼠相比，用包含編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之rAAV處理的小鼠顯示統計學上顯著的血漿2MC及C3/C2含量之降低。
注射後四週，肝臟經均質化，且藉由LC-MS量測人類PCCA蛋白質。圖 8A 及圖 8B 為展示在用包含編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之rAAV處理後，在次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中表現之人類PCCA蛋白質之濃度(以nmol/g蛋白質計)的條形圖。所列百分比數字表示經計算為非PA人類肝臟(人類肝組織勻漿，H0610.H，XenoTech)中人類PCCA蛋白質含量之百分比的人類PCCA表現。誤差條表示標準誤差。如圖 8A 中所展示，與非PA人類肝臟中之人類PCCA蛋白質含量相比，注射有5×1011 、1×1012 、2×1012 或4×1012 VG/kg之編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之rAAV8 (例如，包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的DTC430 (SEQ ID NO: 30))之小鼠分別表現36%、77%、127%及226%之人類PCCA含量。如圖 8B 中所展示，與非PA人類肝臟中之人類PCCA蛋白質含量相比，注射有3×1011 、1×1012 或3×1012 VG/kg (分別為3E11、1E12或3E12)之編碼PCCA (SEQ ID NO: 2)之rAAV9 (例如，包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的DTC430 (SEQ ID NO: 30))之小鼠分別表現4.2%、23%或49%之人類PCCA含量。此等資料顯示，rAAV介導之PCCA基因遞送在次等位基因PA小鼠模型中導致PCCA之含量實質上升高。 序列表 SEQ ID NO: 1 (IVS2內含子)
Figure 02_image001
SEQ ID NO: 2 (PCCA編碼序列-野生型)
Figure 02_image003
Figure 02_image005
SEQ ID NO: 3 (PCCA編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image007
SEQ ID NO: 4 (PCCA編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image009
Figure 02_image011
SEQ ID NO: 5 (PCCA編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image013
Figure 02_image015
SEQ ID NO: 6 (PCCA編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image017
Figure 02_image019
SEQ ID NO: 7 (PCCA編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image021
Figure 02_image023
SEQ ID NO: 8 (PCCB編碼序列-野生型)
Figure 02_image025
SEQ ID NO: 9 (PCCB編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image027
SEQ ID NO: 10 (PCCB編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image029
Figure 02_image031
SEQ ID NO: 11 (PCCB編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image033
SEQ ID NO: 12 (PCCB編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image035
Figure 02_image037
SEQ ID NO: 13 (PCCB編碼序列-密碼子最佳化)
Figure 02_image039
Figure 02_image041
SEQ ID NO: 14 (AAV8 VP1核酸序列)
Figure 02_image043
SEQ ID NO: 15 (AAV8 VP1胺基酸序列)
Figure 02_image045
SEQ ID NO: 16 (AAV9 VP1核酸序列)
Figure 02_image047
Figure 02_image049
SEQ ID NO: 17 (AAV9 VP1胺基酸序列)
Figure 02_image051
SEQ ID NO: 18 (AAV2 ITR)
Figure 02_image053
SEQ ID NO: 19 (PCCA胺基酸序列)
Figure 02_image055
SEQ ID NO: 20 (PCCB胺基酸序列)
Figure 02_image057
Figure 02_image059
SEQ ID NO: 21 (CBA啟動子)
Figure 02_image061
SEQ ID NO: 22 (CMV強化子)
Figure 02_image063
SEQ ID NO: 23 (SV40晚期多腺苷酸化訊息序列)
Figure 02_image065
SEQ ID NO: 24 (共有Kozak序列)
Figure 02_image067
SEQ ID NO: 25 (UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05165-1胺基酸序列)
Figure 02_image069
SEQ ID NO: 26 (UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05165-2胺基酸序列)
Figure 02_image071
SEQ ID NO: 27 (UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05165-3胺基酸序列)
Figure 02_image073
SEQ ID NO: 28 (UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05166-1胺基酸序列)
Figure 02_image075
SEQ ID NO: 29 (UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05166-2胺基酸序列)
Figure 02_image077
Figure 02_image079
SEQ ID NO: 30 (DTC430)
Figure 02_image081
Figure 02_image083
SEQ ID NO: 31 (DTC504)
Figure 02_image085
Figure 02_image087
參考文獻併入
本文所提及之專利文獻及科學論文中之每一者的全部揭示內容出於所有目的以引用之方式併入。等效物
在不背離本發明之精神或基本特徵之情況下，本發明可以其他特定形式體現。因此，前述實施例在所有方面中應視為說明性的，而非限制本文所描述之揭示內容。不同實施例及多種所揭示方法步驟之多種結構要素可以多種組合及排列形式加以利用，且所有此類變化形式均視為本發明之形式。因此，本發明之範圍係由所附申請專利範圍而非前述描述指示，且在與申請專利範圍等效之含義及範圍內的所有變化均意欲涵蓋在本文中。
可參考以下圖式更完整地理解本發明。
圖 1 為展示根據一個實施例的包含PCCA之例示性經封裝載體基因體構築體之例示性圖式。5'至3'次序中之元件為如下：5'-ITR、CMV強化子、雞β-肌動蛋白啟動子、SEQ ID NO: 1之內含子序列(人類β-球蛋白IVS2)、共有Kozak序列、PCCA編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息及3'-ITR。
圖 2 為展示根據一個實施例的包含PCCB之例示性經封裝載體基因體構築體之例示性圖式。5'至3'次序中之元件為如下：5'-ITR、CMV強化子、雞β-肌動蛋白啟動子、SEQ ID NO: 1之內含子序列(人類β-球蛋白IVS2)、共有Kozak序列、PCCB編碼序列、SV40多腺苷酸化訊息及3'-ITR。
圖 3A 為展示藉由西方墨點(Western blot)在經對照質體(模擬物，具有空白載體之質體，泳道1)或攜帶強化子、啟動子、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息之七種組合中之一者的rAAV載體質體(泳道2至8，如西方墨點下方之圖例所展示)轉染之HepG2肝細胞中所偵測之PCCA蛋白質表現量的影像。使用β-肌動蛋白(下文為「肌動蛋白」)作為負載對照(loading control)。
圖 3B 為展示自經對照質體(模擬物，具有空白載體之質體)或攜帶強化子、啟動子、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息之七種組合中之一者的rAAV載體質體轉染之HepG2肝細胞之西方墨點量測之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。
圖 4A 為展示藉由西方墨點在經對照質體(模擬物，具有空白載體之質體，泳道1)或攜帶強化子、啟動子、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息之七種組合中之一者的rAAV載體質體(泳道2至8，如西方墨點下方之圖例所展示)轉染之HuH-7肝細胞中所偵測之PCCA蛋白質表現量的影像。使用肌動蛋白作為負載對照。
圖 4B 為展示自經對照質體(模擬物，具有空白載體之質體)或攜帶強化子、啟動子、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息之七種組合中之一者的rAAV載體質體轉染之HuH-7肝細胞之西方墨點量測之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。
圖 5A 為展示藉由西方墨點在經對照質體(模擬物，具有空白載體之質體，泳道1)或攜帶強化子、啟動子、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息之五種(墨點1)或六種(墨點2)組合中之一者的rAAV載體質體(墨點1之泳道2至6，墨點2之泳道2至7，如西方墨點下方之圖例所展示)轉染之HepG2肝細胞中所偵測之PCCA蛋白質表現量的影像。使用肌動蛋白作為負載對照。
圖 5B 為展示如自經對照質體(UF，具有空白載體之質體)或攜帶強化子、啟動子、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息之六種組合中之一者的rAAV載體質體轉染之HepG2肝細胞之西方墨點量測之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。
圖 6A 為展示自經對照質體(模擬物，具有空白載體之質體)或攜帶強化子、啟動子、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息之五種(墨點1)或六種(墨點2)組合中之一者的rAAV載體質體(墨點1之泳道2至6；墨點2之泳道2至7，如西方墨點下方之圖例所展示)轉染的HuH-7肝細胞之西方墨點法量測之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。使用肌動蛋白作為負載對照。
圖 6B 為展示自經對照質體(UF，具有空白載體之質體)或攜帶強化子、啟動子、內含子序列、PCCA編碼序列及多腺苷酸化訊息之六種組合中之一者之rAAV載體質體轉染的HuH-7肝細胞之西方墨點量測之相對PCCA蛋白質表現的條形圖。
圖 7A 及圖 7B 為展示在rAAV介導之編碼PCCA之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之遞送之後，次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中之丙酸血症之已知生物標記之血漿濃度的線圖(注射後之時間以週(W)為單位提供)。圖 7A 為展示在rAAV介導之編碼PCCA之包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列的轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))之遞送之後，次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中之2-甲基檸檬酸酯(2MC)之血漿濃度的線圖。
圖 7B 為展示在投與PBS (「CONT」)或不同劑量之rAAV介導之編碼PCCA的包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列之轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))的遞送之後，次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中之血漿C3/C2 (丙醯基肉鹼/醯基肉鹼)濃度比的線圖(注射後之時間以週(W)為單位提供)。「Pre」指示在注射包含編碼PCCA之轉基因卡匣之rAAV之前的2週。誤差條表示標準誤差。*表示相較於使用鄧尼特氏檢定(Dunnett's test)之PBS處理組，p＜0.05。
圖 8A 為展示在投與PBS (「CONT」)或不同劑量之rAAV8介導之編碼PCCA的包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列之轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))的遞送之後，在次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中表現之人類PCCA蛋白質之濃度(以nmol/g蛋白質計)的條形圖。所列百分比數字表示經計算為非PA人類肝臟中人類PCCA蛋白質含量之百分比的人類PCCA表現。誤差條表示標準誤差。
圖 8B 為展示在投與PBS (「CONT」)或不同劑量之rAAV9介導之編碼PCCA的包含SEQ ID NO: 1之IVS2內含子序列之轉基因卡匣(DTC430 (SEQ ID NO: 30))的遞送之後，在次等位基因PA小鼠模型Pcca-/- (A138T)中表現之人類PCCA蛋白質之濃度(以nmol/g蛋白質計)的條形圖。所列百分比數字表示經計算為非PA人類肝臟中人類PCCA蛋白質含量之百分比的人類PCCA表現。誤差條表示標準誤差。
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Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (51)

  1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV蛋白殼及封裝於其中之載體基因體，其中該載體基因體包含： (a)     啟動子序列； (b)    與SEQ ID NO: 1至少90%一致之內含子序列；及 (c)     PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列。
  2. 如請求項1之rAAV，其中該AAV蛋白殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV。
  3. 如請求項1之rAAV，其中該AAV蛋白殼來自AAV8。
  4. 如請求項1之rAAV，其中該AAV蛋白殼來自AAV9。
  5. 如請求項1之rAAV，其中該AAV蛋白殼為AAV8變異體蛋白殼。
  6. 如請求項1之rAAV，其中該AAV蛋白殼為AAV9變異體蛋白殼。
  7. 如請求項1至6中任一項之rAAV，其中該內含子序列包含SEQ ID NO: 1。
  8. 如請求項1至6中任一項之rAAV，其中該內含子序列由SEQ ID NO: 1組成。
  9. 如請求項1至8中任一項之rAAV，其中該啟動子係選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)立即早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin) (TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子、CAG啟動子、PCCA基因特異性內源性啟動子及PCCB基因特異性內源性啟動子。
  10. 如請求項9之rAAV，其中該啟動子為CBA啟動子。
  11. 如請求項10之rAAV，其中該CBA啟動子包含SEQ ID NO: 21。
  12. 如請求項10之rAAV，其中該CBA啟動子由SEQ ID NO: 21組成。
  13. 如請求項1至12中任一項之rAAV，其中該載體基因體進一步包含5'-ITR序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之rAAV，其中該載體基因體進一步包含3'-ITR序列。
  15. 如請求項13至14中任一項之rAAV，其中該5'-ITR序列及/或該3'-ITR序列來自AAV2。
  16. 如請求項15之rAAV，其中該5'-ITR序列及該3'-ITR序列各自包含SEQ ID NO: 18或由其組成。
  17. 如請求項13至14中任一項之rAAV，其中該5'-ITR序列及/或該3'-ITR序列來自非AAV2源。
  18. 如請求項1至17中任一項之rAAV，其中該載體基因體進一步包含一或多個強化子序列。
  19. 如請求項18之rAAV，其中該強化子係選自細胞巨大病毒(CMV)立即早期基因強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及脂蛋白元(apolipoprotein) E (ApoE)強化子。
  20. 如請求項19之rAAV，其中該強化子為CMV立即早期基因強化子。
  21. 如請求項20之rAAV，其中該強化子包含SEQ ID NO: 22。
  22. 如請求項20之rAAV，其中該強化子由SEQ ID NO: 22組成。
  23. 如請求項18至22之rAAV，其中該強化子位於該啟動子序列上游。
  24. 如請求項1至23中任一項之rAAV，其中該載體基因體進一步包含多腺苷酸化訊息序列。
  25. 如請求項24之rAAV，其中該多腺苷酸化訊息序列係選自SV40多腺苷酸化訊息序列、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊息序列，及兔β球蛋白多腺苷酸化訊息序列。
  26. 如請求項25之rAAV，其中該多腺苷酸化訊息序列為SV40多腺苷酸化訊息序列。
  27. 如請求項26之rAAV，其中該SV40多腺苷酸化訊息序列包含SEQ ID NO: 23。
  28. 如請求項26之rAAV，其中該SV40多腺苷酸化訊息序列由SEQ ID NO: 23組成。
  29. 如請求項1至28中任一項之rAAV，其中該PCCA之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。
  30. 如請求項29之rAAV，其中該PCCA之編碼序列包含SEQ ID NO: 2。
  31. 如請求項1至28中任一項之rAAV，其中該PCCA之部分或完整編碼序列為密碼子最佳化編碼序列。
  32. 如請求項31之rAAV，其中該PCCA之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 3-7之編碼序列。
  33. 如請求項1至28中任一項之rAAV，其中該PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。
  34. 如請求項33之rAAV，其中該PCCB之編碼序列包含SEQ ID NO: 8。
  35. 如請求項1至28中任一項之rAAV，其中該PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子最佳化編碼序列。
  36. 如請求項35之rAAV，其中該PCCB之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 9-13之編碼序列。
  37. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之rAAV及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  38. 一種治療人類個體之丙酸血症(PA)的方法，其包含向該人類個體投與治療有效量的如請求項1至36中任一項之rAAV或如請求項37之醫藥組合物。
  39. 如請求項38之方法，其中該rAAV或該醫藥組合物係經皮下、經肌肉內、經皮內、經腹膜內或經靜脈內投與。
  40. 如請求項39之方法，其中該rAAV或該醫藥組合物係經靜脈內投與。
  41. 如請求項38至40中任一項之方法，其中該rAAV係以約1 × 1011 至約1 × 1014 個基因體拷貝(GC)/公斤之劑量投與。
  42. 一種多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 30至少90%一致之核酸序列。
  43. 一種多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 30至少95%一致之核酸序列。
  44. 一種多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 30至少99%一致之核酸序列。
  45. 一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 30。
  46. 一種多核苷酸，其由SEQ ID NO: 30組成。
  47. 一種多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 31至少90%一致之核酸序列。
  48. 一種多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 31至少95%一致之核酸序列。
  49. 一種多核苷酸，其包含與SEQ ID NO: 31至少99%一致之核酸序列。
  50. 一種多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 31。
  51. 一種多核苷酸，其由SEQ ID NO: 31組成。
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