JP2023526923A - ポンペ病の治療に有用な組成物 - Google Patents

Abstract

患者において異常な筋肉病的状態の進行を低減し、及び／又は異常な筋肉病的状態を回復に向かわせるための方法であって、患者が、ポンペ病を有すると診断されているか、又はポンペ病を有することが疑われている、方法が本明細書で提供される。ＡＡＶカプシドとその中にパッケージングされたベクターゲノムとを有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を患者に投与することを含む方法であって、ベクターゲノムが、（ａ）５’逆位末端配列（ＩＴＲ）と、（ｂ）プロモーターと、（ｃ）シグナルペプチド、及びヒト酸－ａ－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）に融合されたｖＩＧＦ２ペプチドを含むキメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、（ｄ）ポリＡと、（ｅ）３’ＩＴＲと、を含む、方法。また、ポンペ病を有すると診断されているか、又はポンペ病を有することが疑われている患者を治療する際に使用するための本明細書に記載のｒＡＡＶを含む薬学的組成物も提供される。【選択図】図１Ａ

Description

ポンペ病は、ＩＩ型グリコーゲン症としても知られており、心臓（心筋症）、筋肉、及び運動ニューロン（神経筋疾患）にグリコーゲン蓄積をもたらす酸－α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子の変異によって引き起こされるリソソーム蓄積症である。古典的な乳児ポンペ病では、重度のＧＡＡ活性損失は、特に心臓及び筋肉内で多系統及び早期発症型のグリコーゲン貯蔵を引き起こし、最初の数年間で心肺不全によって死亡する。乳児ポンペ病はまた、ニューロン（特に運動ニューロン）及びグリア細胞内の顕著なグリコーゲン貯蔵を特徴とする。現在の標準治療である酵素補充療法（ＥＲＴ）は、筋肉を矯正するのに最適以下の効率を有し、血液脳関門を通過することができず、古典的な乳児ポンペ病の長期生存者における進行性神経学的悪化につながる。ＥＲＴを受けて、心臓矯正によって長く生存する患者は、進行性の神経学的表現型を有する新しい自然経過を明らかにする。加えて、組換えヒトＧＡＡは、高い免疫原性であり、骨格筋による取り込み不良のために、非常に大量に投与されなければならない。

ポンペ病の治療のためのいくつかの満たされていない需要があり、これには、疾患のＣＮＳ成分の矯正の必要性、改善された筋肉矯正の必要性、及びより効果的であり、免疫原性が低く、かつ／又はより便利な現在のＥＲＴの代替の必要性が含まれる。

一態様では、患者において異常な筋肉病的状態の進行を低減し、及び／又は異常な筋肉病的状態を回復に向かわせるための方法であって、患者が、ポンペ病を有すると診断されているか、又はポンペ病を有することが疑われており、本方法が、患者に、ＡＡＶカプシドとその中にパッケージングされたベクターゲノムとを有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、ベクターゲノムが、（ａ）５’逆位末端配列（ＩＴＲ）と、（ｂ）プロモーターと、（ｃ）シグナルペプチド、及びヒト酸性－α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）に融合されたｖＩＧＦ２ペプチドを含むキメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、キメラ融合タンパク質をコードする配列が、その発現を指示する調節配列に作動可能に連結しており、配列番号７、又は配列番号６のアミノ酸１～９８２をコードする、それに対して少なくとも９５％同一の配列を含む、ヌクレオチド配列と、（ｄ）ポリＡと、（ｅ）３’ＩＴＲと、を含む、方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、任意選択的にＣＡＧプロモーター又はＣＢ７プロモーターである。特定の実施形態では、異常な筋肉病的状態は、ｉ）中心核を有する筋細胞の割合の上昇、ｉｉ）筋線維萎縮、ｉｉｉ）筋細胞線維における大小不同、ｉｖ）オートファジービルドアップ、ｖ）空胞化、及びｖｉ）筋力低下のうちの１つ以上を特徴とする。特定の実施形態では、患者は、遅発性ポンペ病を有する。特定の実施形態では、患者は、乳児発症性ポンペ病を有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は少なくとも８個のｍｉＲ標的配列を更に含み、任意選択的に、ｍｉＲ標的配列の各々は、ｍｉＲ－１８３に特異的である。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、静脈内及び／又は髄腔内に投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、二重経路の投与を介して患者に投与され、任意選択的に、二重経路は、静脈内投与及び大槽内（ＩＣＭ）投与である。

一態様では、ＡＡＶカプシドとその中にパッケージングされたベクターゲノムとを有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含む、薬学的組成物であって、ベクターゲノムが、（ａ）５’逆位末端配列（ＩＴＲ）と、（ｂ）プロモーターと、（ｃ）シグナルペプチド、及びヒト酸性－α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）に融合されたｖＩＧＦ２ペプチドを含むキメ
ラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、キメラ融合タンパク質をコードする配列が、その発現を指示する調節配列に作動可能に連結しており、配列番号７、又は配列番号６のアミノ酸１～９８２をコードする、それに対して少なくとも９５％同一の配列を含む、ヌクレオチド配列と、（ｄ）ポリＡと、（ｅ）３’ＩＴＲと、を含む、薬学的組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、任意選択的にＣＡＧプロモーター又はＣＢ７プロモーターである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は少なくとも８個のｍｉＲ標的配列を含み、任意選択的に、ｍｉＲ標的配列の各々は、ｍｉＲ－１８３に特異的である。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである。特定の実施形態では、組成物は、静脈内及び／又は髄腔内送達のために製剤化される。

一態様では、治療が、患者において異常な筋肉病的状態の進行を低減し、及び／又は異常な筋肉病的状態を回復に向かわせる、ポンペ病を有する患者の治療において使用するための薬学的組成物が本明細書で提供される。特定の実施形態では、異常な筋肉病的状態は、ｉ）中心核を有する筋細胞の割合の上昇、ｉｉ）筋線維萎縮、ｉｉｉ）筋細胞線維における大小不同、ｉｖ）オートファジービルドアップ、ｖ）空胞化、及びｖｉ）筋力低下のうちの１つ以上を特徴とする。特定の実施形態では、患者は、遅発性ポンペ病を有する。特定の実施形態では、患者は、乳児発症性ポンペ病を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、二重経路の投与を介して患者に投与され、任意選択的に、二重経路は、静脈内投与及び大槽内（ＩＣＭ）投与である。

一態様では、本明細書で提供される薬学的組成物は、ポンペ病を有すると診断された、症候性になった後の患者に投与するのに好適である。特定の実施形態では、組成物は、ポンペ病を有する、症候性になった後の患者において異常な筋肉病的状態を回復に向かわせるのに好適である。特定の実施形態では、異常な筋肉病的状態は、ｉ）中心核を有する筋細胞の割合の上昇、ｉｉ）筋線維萎縮、ｉｉｉ）筋細胞線維における大小不同、ｉｖ）オートファジービルドアップ、ｖ）空胞化、及びｖｉ）筋力低下のうちの１つ以上を特徴とする。特定の実施形態では、薬学的組成物は、併用療法に使用するために好適であり、任意選択的に、患者は、気管支拡張剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、呼吸筋力トレーニング（ＲＭＳＴ）、酵素補充療法、及び／又は横隔膜ペーシング療法による治療を更に受けることを特徴とする。

一態様では、治療が、患者において異常な筋肉病的状態の進行を低減し、及び／又は異常な筋肉病的状態を回復に向かわせる、本明細書で提供されるポンペ病を治療することが必要な患者においてそれを行うために本明細書に記載のｒＡＡＶを投与することを含む、薬学的組成物の使用が提供される。

本発明の他の態様及び利点は、以下の本発明の詳細な説明から容易に明らかとなるであろう。

ＣＢ６（第３列）、ＣＡＧ（第４列）、又はＵｂＣプロモーター（最後の列）の指示の下で、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉのための操作されたコード配列を有する種々のＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの静脈内投与から４週間後のポンペ（－／－）マウスの肝臓におけるｈＧＡＡ活性を示す。（図１Ａ）低用量（１×１０^１１ＧＣ）。（図１Ｂ）高用量（１×１０^１２）。 ＣＢ６（第３列）、ＣＡＧ（第４列）、又はＵｂＣプロモーター（最後の列）の指示の下で、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉのための操作されたコード配列を有する種々のＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの静脈内投与から４週間後のポンペ（－／－）マウスの心臓におけるｈＧＡＡ活性を示す。（図２Ａ）低用量（１×１０^１１ＧＣ）。（図２Ｂ）高用量（１×１０^１２）。 ＣＢ６（第３列）、ＣＡＧ（第４列）、又はＵｂＣプロモーター（最後の列）の指示の下で、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉのための操作されたコード配列を有する種々のＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの静脈内投与から４週間後のポンペ（－／－）マウスの骨格筋（四頭筋）におけるｈＧＡＡ活性を示す。（図３Ａ）低用量（１×１０^１１ＧＣ）。（図３Ｂ）高用量（１×１０^１２）。 ＣＢ６（第３列）、ＣＡＧ（第４列）、又はＵｂＣプロモーター（最後の列）の指示の下で、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉのための操作されたコード配列を有する種々のＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの静脈内投与から４週間後のポンペ（－／－）マウスの脳におけるｈＧＡＡ活性を示す。（図４Ａ）低用量（１×１０^１１ＧＣ）。（図４Ｂ）高用量（１×１０^１２）。ＣＢ７活性下で発現するベクターは、両方の用量で低い活性を有し、一方、ＣＡＧ又はＵｂＣプロモーター下で発現するベクターは、高い用量で同等の活性を有する。 ＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡの送達から４週間後のポンペマウスにおける心臓の組織学（グリコーゲン貯蔵を示すＰＡＳ染色）を示す。５つの異なるｈＧＡＡ発現カセットを含有するｒＡＡＶｈｕ６８ベクターを生成し、評価した。ビヒクル対照ポンペ（－／－）（図５Ｄ）及び野生型（＋／＋）（図５Ａ）マウスにＰＢＳ注射を行った。「ｈＧＡＡ」は、天然シグナルペプチドを有する野生型配列によってコードされる参照天然酵素（ｈＧＡＡＶ７８０）を指す（図５Ｂ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏ」は、最初の３５ＡＡが欠失しており、インスリン受容体への親和性が低いＩＧＦ２バリアントとの融合物であるＢｉＰシグナルペプチドを更に有する、参照ｈＧＡＡＶ７８０タンパク質の操作されたコード配列を指す（図５Ｃ）。（図５Ｄ）ビヒクル治療対照からの画像。「ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、操作された配列によってコードされ、天然シグナルペプチドを含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図５Ｅ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、最初の３５ＡＡが欠失しており、インスリン受容体への親和性が低いＩＧＦ２バリアントと融合するＢｉＰシグナルペプチド、及び操作された配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉを更に有する、ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉを指す（図５Ｆ）。「Ｓｐ７．Δ８．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、以前の構築物と同じ操作された配列によってコードされる最初の３５ＡＡが欠失しているが、天然シグナルペプチドの代わりにＢ２キモトリプシノーゲンシグナルペプチドをコードする配列を含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図５Ｇ）。（図５Ｈ）盲検化した組織病理学的半定量的重症度スコアリング。委員会認定の獣医病理学者が盲検方式でスライドをレビューし、グリコーゲン貯蔵及びオートファジービルドアップに基づく重症度スコアを確立した。 種々のｈＧＡＡをコードするＡＡＶｈｕ６８（２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の投与から４週間後のポンペマウスにおける四頭筋の組織学（ＰＡＳ染色）からの結果を示す。対照ポンペ（－／－）（図６Ｄ）及び野生型（＋／＋）（図６Ａ）マウスにＰＢＳ注射を行った。「ｈＧＡＡ」は、天然シグナルペプチドを有する野生型配列によってコードされる参照天然酵素（ｈＧＡＡＶ７８０）を指す（図６Ｂ）。「ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、操作された配列によってコードされ、天然シグナルペプチドを含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図６Ｅ）。「Ｓｐ７．Δ８．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、以前の構築物と同じ操作された配列によってコードされる最初の３５ＡＡが欠失しているが、天然シグナルペプチドの代わりにＢ２キモトリプシノーゲンシグナルペプチドをコードする配列を含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図６Ｆ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏ」は、最初の３５ＡＡが欠失しており、インスリン受容体への親和性が低いＩＧＦ２バリアントとの融合物であり、操作された配列によってコードされるＢｉＰシグナルペプチドを更に有する、参照ｈＧＡＡＶ７８０を指す（図６Ｃ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、最初の３５ＡＡが欠失しており、インスリン受容体への親和性が低いＩＧＦ２バリアントと融合するＢｉＰシグナルペプチド、及び操作される配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉを更に有する、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉを指す（図６Ｇ）。（図６Ｈ）盲検化した組織病理学的半定量的重症度スコアリング。委員会認定の獣医病理学者が盲検方式でスライドをレビューし、グリコーゲン貯蔵及びオートファジービルドアップに基づく重症度スコアを確立した。０のスコアは、病変なしを意味し、１は、平均で貯蔵によって影響を受ける筋線維が９％未満であることを意味し、２は、１０～４９％を意味し、３は、５０～７５％を意味し、４は、７６～１００％を意味する。 種々のｈＧＡＡをコードするＡＡＶｈｕ６８（２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）（すなわち、図６Ａ～図６Ｈよりも１０倍低い用量）の投与から４週間後のポンペマウスからの四頭筋の組織学（過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色）からの結果を示す。対照ポンペ（－／－）（図７Ｄ）及び野生型（＋／＋）（図７Ａ）マウスにＰＢＳ注射を行った。「ｈＧＡＡ」は、天然シグナルペプチドを有する野生型配列によってコードされる参照天然酵素（ｈＧＡＡＶ７８０）を指す（図７Ｂ）。「ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、操作された配列によってコードされ、天然シグナルペプチドを含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図７Ｅ）。「Ｓｐ７．Δ８．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、以前の構築物と同じ操作された配列によってコードされる最初の３５ＡＡが欠失しているが、天然シグナルペプチドの代わりにＢ２キモトリプシノーゲンシグナルペプチドをコードする配列を含有するｈＧＡＡＶ７８０Ｉバリアントを指す（図７Ｆ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏ」は、最初の３５ＡＡが欠失しており、インスリン受容体への親和性が低いＩＧＦ２バリアントとの融合物であり、操作された配列によってコードされるＢｉＰシグナルペプチドを更に有する、参照ｈＧＡＡＶ７８０を指す（図７Ｃ）。「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」は、最初の３５ＡＡが欠失しており、インスリン受容体への親和性が低いＩＧＦ２バリアントと融合するＢｉＰシグナルペプチド、及び操作される配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉを更に有する、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉを指す（図７Ｇ）。（図７Ｈ）盲検化した組織病理学的半定量的重症度スコアリング。委員会認定の獣医病理学者が盲検方式でスライドをレビューし、グリコーゲン貯蔵及びオートファジービルドアップに基づく重症度スコアを確立した。０のスコアは、病変なしを意味し、１は、平均で貯蔵によって影響を受ける筋線維が９％未満であることを意味し、２は、１０～４９％を意味し、３は、５０～７５％を意味し、４は、７６～１００％を意味する。 天然ｈＧＡＡをコードする配列を有するＡＡＶｈｕ６８、又は最初の３５ＡＡが欠失しており、インスリン受容体への親和性が低いＩＧＦ２バリアントと融合するＢｉＰシグナルペプチド、及び操作される配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉを更に有する、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ（「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ」）（２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）の投与から４週間後のポンペマウスからの脊髄の組織学（ＰＡＳ及びルクソールファーストブルー染色）からの結果を示す。盲検化した組織病理学的半定量的重症度スコアリングが、脊髄切片で実施された。 血漿におけるｈＧＡＡ活性、及びＩＧＦ２／ＣＩ－ＭＰＲへの結合を示す。ポンペマウスに、野生型ｈＧＡＡ又はＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡをコードするベクターを低用量（２．５×１０^１２ＧＣ）で投与した。（図９Ａ、図９Ｂ）静脈内投与から４週間後に、高レベルの野生型及び操作されたｈＧＡＡ活性が、血漿において検出された。（図９Ｃ）操作されたｈＧＡＡは、ＣＩ－ＭＰＲに効率的に結合する。 ２．５×１０^１２ＧＣ／Ｋｇ（ＬＤ）の用量でのＡＡＶｈｕ６８構築物の投与から４週間後のポンペマウスにおけるグリコーゲンクリアランス及びオートファジービルドアップの分解を示す。腓腹筋のパラフィン切片を、ＤＡＰＩ及び抗ＬＣ３Ｂ抗体で染色した。 ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉＲ１８３構築物の概略図を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３（ｄｒｇ非標的化配列ｍｉＲ１８３の４つのコピーを含有する）を高用量（ＨＤ：２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）又は低用量（ＬＤ：２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で静脈内投与してから４週間後のポンペマウスの脳幹におけるグリコール貯蔵（ＰＡＳ、ルクソールブルー染色）を示す。矢印は、ニューロン内のＰＡＳ陽性貯蔵を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３を高用量（ＨＤ：２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）又は低用量（ＬＤ：２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で静脈内投与してから４週間後のポンペマウスの脊髄におけるグリコール貯蔵（ＰＡＳ、ルクソールブルー染色）を示す。矢印は、ニューロン内のＰＡＳ陽性貯蔵を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３を高用量（ＨＤ：２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）又は低用量（ＬＤ：２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で静脈内投与してから４週間後のポンペマウスの四頭筋におけるグリコール貯蔵（ＰＡＳ、ルクソールブルー染色）を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３を高用量（ＨＤ：２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）又は低用量（ＬＤ：２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で静脈内投与してから４週間後のポンペマウスの心臓におけるグリコール貯蔵（ＰＡＳ、ルクソールブルー染色）を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３を高用量（ＨＤ：２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）又は低用量（ＬＤ：２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で静脈内投与してから４週間後のポンペマウスの四頭筋におけるオートファジー空胞マーカーＬＣ３ｂの発現を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ（左）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３（右）を３×１０^１３ＧＣの高用量でＩＣＭ投与してから３５日後のアカゲザルの頸部ＤＲＧにおけるｈＧＡＡ発現（ｈＧＡＡのための免疫組織化学）の代表的な画像を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ（左）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３（右）を３×１０^１３ＧＣの高用量でＩＣＭ投与してから３５日後のアカゲザルの腰部ＤＲＧにおけるｈＧＡＡ発現（ｈＧＡＡのための免疫組織化学）の代表的な画像を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ（左）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３（右）を３×１０^１３ＧＣの高用量でＩＣＭ投与してから３５日後のアカゲザルの脊髄下位運動ニューロンにおけるｈＧＡＡ発現（ｈＧＡＡのための免疫組織化学）の代表的な画像を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ（左）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３（右）を３×１０^１３ＧＣの高用量でＩＣＭ投与してから３５日後のアカゲザルの心臓におけるｈＧＡＡ発現（ｈＧＡＡのための免疫組織化学）の代表的な画像を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３を３×１０^１３ＧＣの高用量でＩＣＭ投与してから３５日後のアカゲザルの頸部セグメント（図２１Ａ）、胸部セグメント（図２１Ｂ）、及び腰部セグメント（図２１Ｃ）のＤＲＧにおけるＤＲＧニューロン変性及び炎症性細胞浸潤の組織病理学的スコアリングを示す。ＡＡＶｈｕ６８ベクターは、既に報告されているように（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１８，２９：２１２－９）、蛍光透視誘導下で、大槽内に注射入された総体積１ｍＬの滅菌人工ＣＳＦ（ビヒクル）で送達された。ベクター群に対して盲検化された委員会認定の獣医病理学者が、重症度グレードを確立し、０．病変の不在、１．最小（１０％未満）、２．軽度（１０～２５％）、３．中等度（２５～５０％）、４．顕著（５０～９５％）、及び５．重度（９５％超）の定義がなされた。各データ点は、１つのＤＲＧを表す。１セグメント及び１動物当たり最低５つのＤＲＧのスコア付けをした。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３を３×１０^１３ＧＣの高用量でＩＣＭ投与した後のアカゲザルのＡＳＴレベル（図２２Ａ）、ＡＬＴレベル（図２２Ｂ）、及び血小板数（図２２Ｃ）を示す。 注射から０～３５日後にＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３を３×１０^１３ＧＣの高用量で投与（ＩＣＭ）されたＮＨＰにおける血漿ｈＧＡＡ活性レベルを示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３を投与（ＩＣＭ、３×１０^１３ＧＣ）されたＮＨＰについてのベースライン時及び３５日目の神経伝導速度試験からの結果を示す。 ７ヶ月齢で疾患の進行した病期で治療され、ベースライン時に既に症候であったポンペマウスにおける、ベクター注射（０日目）から注射１８０日後までの体重長期フォローアップを示す。これらは、以下の代替的な投与経路及び投与レベルを介して使用して、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉを受けた。高用量（ＨＤ）（１×１０^１１ＧＣ）又は低用量（ＬＤ）（５×１０^１０ＧＣ）での脳室内（ＩＣＶ）、ＨＤ（５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）又はＬＤ（１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）での静脈内（ＩＶ）、及び低用量又は高容量でのＩＣＶとＩＶの組み合わせ。平均値及び標準偏差を示す。各時点での統計分析は、ＫＯ ＰＢＳ対照群と他の群との間のＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって実施される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ７ヶ月齢で疾患の進行した病期で治療され、ベースライン時に既に症候であったポンペマウスにおける、ベクター注射（０日目）から注射１８０日後までの体重長期フォローアップに対する握力を示す。（図２６）マウスは、以下の代替的な投与経路及び投与レベルを介してＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉを受けた。高用量での脳室内（ＩＣＶ）（ＩＣＶ ＨＤ：１×１０^１１ＧＣ）、高用量での静脈内（ＩＶ）（ＩＶ ＨＤ：５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）、並びに高用量のＩＣＶとＩＶの組み合わせ、及び低用量のＩＣＶとＩＶの組み合わせ。握力は、握力計（ＩＩＴＣ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて様々な時点で測定した。握力計のトランスデューサは、陽極酸化されたベースプレートに接続されたワイヤメッシュグリッドに接続されている。動物を尻尾で保持し、その４本の足でグリッドを掴むまでゆっくりとメッシュの上を通過させる。３回握力測定を行い、これらの読み取りの平均は、その特定の時点での動物の握力を表す。（図２７）ＩＶ＋ＩＣＶ ＨＤ対ＩＶ ＨＤの増分利益を示す、１８０日目からの結果。値は、動物の体重によって正規化される。群当たりＮ＝雄４匹、雌４匹。各時点での統計解析は、ＫＯ ＰＢＳ対照群と比較して、一元配置ＡＮＯＶＡ（図２６）又は二元配置ＡＮＯＶＡ（図２７）、ｐｏｓｔ－ｈｏｃ多重比較検定によって決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 高用量（ＨＤ：１×１０^１１ＧＣ）又は低用量（ＬＤ：５×１０^１０ＧＣ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩのＩＣＶ投与後の症候性になった後のポンペマウスの四頭筋、心臓、及び脊髄におけるグリコーゲン貯蔵を示す。 高用量（ＨＤ：５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）又は低用量（ＬＤ：１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩのＩＶ投与後の症候性になった後のポンペマウスの四頭筋、心臓、及び脊髄におけるグリコーゲン貯蔵を示す。 ３０日目（図３０Ａ）、６０日目（図３０Ｂ）、及び９０日目（図３０Ｃ）でのＩＶ、ＩＣＶ、又はＩＶ及びＩＣＶ（二重経路）でＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉベクターを投与されたポンペマウスの血漿におけるｈＧＡＡ活性を示す。 ＮＨＰにおける単一経路（ＩＶ又はＩＣＭ）及び二重経路（ＩＶ＋ＩＣＭ）の投与の評価のための試験設計を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩのＩＶ又はＩＣＭ投与後のｈＧＡＡ（図３２Ａ及び図３２Ｃ－血漿、図３２Ｂ及び図３２Ｄ－ＣＳＦ）、並びにｈＧＡＡ活性（図３２Ｅ及び図３２Ｇ－血漿、図３２Ｆ及び図３２Ｈ－ＣＳＦ）の検出を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩのＩＶ（１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ若しくは５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）、ＩＣＭ（１×１０^１３ＧＣ若しくは３×１０^１３ＧＣ）、又はＩＶ＋ＩＣＭ（５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ ＩＶ＋３×１０^１３ＧＣ ＩＣＭ若しくは１×１０^１４ＧＣ／Ｋｇ ＩＶ＋１×１０^１３ＧＣＩＣＭ）投与後のアカゲザルにおける頸部セグメント（図３３Ａ）、胸部セグメント（図３３Ｂ）、及び腰部セグメント（図３３Ｃ）におけるＤＲＧニューロン変性及び炎症性細胞浸潤の組織病理学的スコア、並びに頸部セグメント（図３３Ｄ）、胸部セグメント（図３３Ｅ）、及び腰部セグメント（図３３Ｆ）における脊髄軸索障害の組織病理学的スコアを示す。ベクター群に対して盲検化された委員会認定の獣医病理学者が、重症度グレードを確立し、０．病変の不在、１．最小（１０％未満）、２．軽度（１０～２５％）、３．中等度（２５～５０％）、４．顕著（５０～９５％）、及び５．重度（９５％超）の定義がなされた。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩのＩＶ（１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ若しくは５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）、ＩＣＭ（１×１０^１３ＧＣ若しくは３×１０^１３ＧＣ）、又はＩＶ＋ＩＣＭ（５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ ＩＶ＋３×１０^１３ＧＣ ＩＣＭ）投与後のアカゲザルにおける血漿ＧＡＡ活性を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡ．ｃｏＶ７８０ＩのＩＶ（１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ若しくは５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）、ＩＣＭ（１×１０^１３ＧＣ若しくは３×１０^１３ＧＣ）、又はＩＶ＋ＩＣＭ（５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ ＩＶ＋３×１０^１３ＧＣ ＩＣＭ）投与後のアカゲザルからの肝臓及び心臓（図３５Ａ）、並びに横隔膜、三頭筋、及び前脛骨筋（図３５Ｂ）におけるＧＡＡ活性の測定を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡ．ｃｏＶ７８０ＩのＩＶ（１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ若しくは５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）、ＩＣＭ（１×１０^１３ＧＣ若しくは３×１０^１３ＧＣ）、又はＩＶ＋ＩＣＭ（５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ ＩＶ＋３×１０^１３ＧＣ ＩＣＭ）投与後のアカゲザルからの血清中の抗ＧＡＡ抗体力価を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉの低用量（ＩＶ－１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ、ＩＣＭ－１×１０^１３ＧＣ）投与後のアカゲザルの四頭筋、心臓、及び脊髄におけるｈＧＡＡ発現（ｈＧＡＡに対する免疫組織化学）の代表的な画像を示す。 高用量（ＨＤ：２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）で、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３（ＡＡＶ．ｈＧＡＡｅｎｇ）又は天然シグナルペプチド（ＡＡＶ．ｈＧＡＡｎａｔ）を有する野生型配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉの静脈内投与から４週間後のポンペマウスの四頭筋及び心臓のＧＡＡ活性及びグリコーゲン貯蔵（ＰＡＳ染色）の分析を示す。 高用量（ＨＤ：２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）で、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３（ＡＡＶ．ｈＧＡＡｅｎｇ）又は天然シグナルペプチド（ＡＡＶ．ｈＧＡＡｎａｔ）を有する野生型配列によってコードされるｈＧＡＡＶ７８０Ｉの静脈内投与から４週間後のポンペマウスのＣＮＳのＧＡＡ活性及びグリコーゲン貯蔵（ＰＡＳ染色）の分析を示す。 ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ＸｍｉＲ１８３（ＩＶ ２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の静脈内投与から４週間後のポンペマウスの四頭筋、心臓、及び脊髄におけるｈＧＡＡ発現（ｈＧＡＡに対する免疫組織化学）の代表的な画像を示す。 様々な用量のＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３のＩＶ投与を含む、症候前の（若い）ポンペマウスの治療を評価する試験としての試験概要を示す。 若いＷＴ、対照ＰＢＳ治療ＧＡＡ－／－、及びＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３治療ＧＡＡ－／－マウスからの四頭筋切片の代表的な免疫蛍光画像を示す。ＷＧＡ（細胞膜）、ＤＡＰＩ（核）、及びＬＣ３ｂ抗体（オートファゴソーム）。 ＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３を投与された若いポンペマウスからの四頭筋における中心核の定量化を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３を投与された若いポンペマウスからの四頭筋におけるＬＣ３ｂ染色後のオートファジービルドアップの定量化を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３を投与された若いポンペマウスからの四頭筋における筋線維直径の定量化を示す。 ヒラメ筋（図４６Ａ）、横隔膜（図４６Ｂ）、四頭筋（図４６Ｃ）、三頭筋（図４６Ｄ）、腓腹筋（図４６Ｅ）、及び前脛骨筋（図４６Ｆ）における様々な用量のＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３のＩＶ投与後の筋肉リソソーム貯蔵病的状態（空胞化の重症度）の半定量的スコアリングを示す。雄マウスは正方形であり、雌マウスは円形である。統計：一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌｌ Ｗａｌｌｉｓ検定）、その後、ｐｏｓｔ－ｈｏｃダン多重比較検定。星印は、ＧＡＡ ＫＯポンペＰＢＳ群（２列目）と比較した有意性を示す。スコアリング：空胞を有する筋線維の割合－０：０％、１：１～９％、２：１０～２４％、３：２５～４９％、４：５０～７４％、及び５：５％を超える。 ポンペＧＡＡノックアウトマウスにおける投与のＩＶ、ＩＣＶ、及びＩＶ＋ＩＣＶ経路の評価のための試験設計を提供する。 ６～７ヶ月齢のＷＴ、対照ＰＢＳ治療ＧＡＡ－／－、及びＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３治療ＧＡＡ－／－マウスからの四頭筋切片の代表的な免疫蛍光画像を示す。ＷＧＡ（細胞膜）、ＤＡＰＩ（核）、及びＬＣ３ｂ抗体（オートファゴソーム）。 ＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３を投与された症候性になった後のポンペマウスからの四頭筋における中心核の定量化を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧのＩＶ、ＩＣＶ、及びＩＶ＋ＩＣＶ投与後のＧＡＡ ＫＯマウスからの四頭筋組織のＬＣ３ｂ後のオートファジービルドアップの定量化を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧのＩＶ、ＩＣＶ、及びＩＶ＋ＩＣＶ投与後のポンペＧＡＡノックアウトマウスにおける筋線維サイズ分布を示す。線維直径を、Ｓ＝小（３０μｍ未満）、Ｍ＝中（３０～５０μｍ）、及びＬ＝大（５０μｍ超）のクラスに割り当てた。 非ヒト霊長類へのＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ＩＧＦ２－ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩベクターのＩＶ、ＩＣＭ、又はＩＶ＋ＩＣＭ投与後の脊髄セグメントにおけるｈＧＡＡ発現運動ニューロンの定量化を示す。

ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素の少なくとも活性部分に融合されたシグナルペプチド及びｖＩＧ
Ｆ２ペプチドを含む融合タンパク質を、ポンペ病を有する患者に送達するための組成物が提供される。それらの製造方法及び使用方法が本明細書に記載され、これらの組成物で患者を治療するためのレジメンを含む。

本明細書で使用される場合、「ポンペ病」という用語は、マルターゼ欠損症、糖原病ＩＩ型（ＧＳＤＩＩ）、又はＩＩ型グリコーゲン症とも称され、酸性α－グルコシダーゼをコードするＧＡＡ遺伝子の変異によって引き起こされるリソソーム酵素酸性ａ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の全欠損又は部分欠損を特徴とする遺伝的リソソーム蓄積症を指すことが意図される。本用語には、限定されないが、疾患の早期及び遅発形態が含まれ、乳児、若年、及び成人発症性ポンペ病が挙げられる。

ギリシャ文字「アルファ」及び記号「α」は、本明細書全体で互換的に使用されることが理解されるであろう。同様に、ギリシャ文字「デルタ」及び「Δ」は、本明細書全体で互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「酸性α－グルコシダーゼ」又は「ＧＡＡ」という用語は、グリコーゲン、マルトース、及びイソマルトースのＤ－グルコース単位間のα－１，４連鎖を加水分解するリソソーム酵素を指す。代替的な名称名としては、リソソームα－グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）、グルコアミラーゼ、１，４－α－Ｄ－グルカングルコヒドロラーゼ、アミログルコシダーゼ、ガンマ－アミラーゼ、及びエキソ－１，４－α－グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ヒト酸性α－グルコシダーゼは、ＧＡＡ遺伝子（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｇｅｎｅ ＩＤ ２５４８）によってコードされ、染色体１７の長腕（位置１７ｑ２５．２～ｑ２５．３）にマッピングされている。アミノ酸残基５１６～５２１で保存されたヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥは、酸性α－グルコシダーゼタンパク質の活性に必要である。「ｈＧＡＡ」という用語は、ヒトＧＡＡのコード配列を指す。

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ．ｈＧＡＡ」は、ＧＡＡ酵素（例えば、７８０Ｉバリアント、少なくともｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素の活性部分に融合されたシグナルペプチド及びｖＩＧＦ２ペプチドを含む融合タンパク質）のコード配列を最低限含むベクターゲノムをパッケージングしているＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶを指す。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡ又はｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡは、ＡＡＶカプシドがＡＡＶｈｕ６８カプシドであるｒＡＡＶを指し、本明細書で定義される。

全長ｈＧＡＡの番号付けに関して、アミノ酸１位～２７位にシグナルペプチドが存在する。更に、本酵素は、複数の成熟タンパク質、すなわち、アミノ酸７０位～９５２位の成熟タンパク質、アミノ酸１２３位～９５２位に位置する７６ｋＤ成熟タンパク質、及びアミノ酸２０４位～９５２位の７０ｋＤ成熟タンパク質と関連している。「活性触媒部位」は、ヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥ（配列番号３のアミノ酸残基５１６～５２１）を含む。特定の実施形態では、より長い断片、例えば、５１６位～６１６位が選択され得る。他の活性部位には、３７６、４０４、４０５、４４１、４８１、５１６、５１８、５１９、６００、６１３、６１６、６４９、６７４位のうちの１つ以上に位置し得る、リガンド結合部位が含まれる。

別途指定されない限り、「ｈＧＡＡ７８０Ｉ」又は「ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ」という用語は、配列番号３に再現されるアミノ酸配列を有する全長ｐｒｅ－ｐｒｏ－プロタンパク質を指す。いくつかの例では、ｈＧＡＡｃｏ７８０Ｉ又はｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉという用語は、ｈＧＡＡ７８０Ｉをコードする操作された配列を指すために使用される。前の段落に記載されるｈＧＡＡ参照タンパク質と比較して、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、参照ｈＧＡＡが
バリン（Ｖａｌ又はＶ）を含有する７８０位にイソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）を有する。このｈＧＡＡ７８０Ｉは、「参照配列」として文献に広く記載されている７８０位にバリンを有するｈＧＡＡ配列（ｈＧＡＡＶ７８０）よりも優れた効果及び改善された安全性プロファイルを有することが意外にも認められている。例えば、図５Ａ～図５Ｈからわかるだろうが、ｈＧＡＡＶ７８０参照配列は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素と同じ用量では見られない毒性（線維化心筋炎）を誘導する。したがって、ｈＧＡＡ７８０Ｉの使用は、ｈＧＡＡによる療法を受ける患者における線維化心筋炎を低減又は排除し得る。ｈＧＡＡシグナルペプチド、成熟タンパク質、活性触媒部位、及び結合部位の位置は、配列番号３で再現されるｈＧＡＡ７８０Ｉにおける類似の位置、すなわち、アミノ酸位置１～２７におけるシグナルペプチド、アミノ酸位置７０～９５２における成熟タンパク質、アミノ酸位置１２３～９５２に位置する７６ｋＤ成熟タンパク質、及びアミノ酸位置２０４～９５２における７０ｋＤ成熟タンパク質、アミノ酸残基５１６～５２１におけるヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥ（配列番号６１）を含む「活性触媒部位」に基づいて決定されてもよく、他の活性部位は、リガンド結合部位を含み、３７６、４０４．．４０５、４４１、４８１、５１６、５１８．．５１９、６００、６１３、６１６、６４９、６７４のうちの１つ以上の位置に位置し得る。

特定の実施形態では、配列番号３のｈＧＡＡ７８０Ｉに対して少なくとも９５％同一、ｈＧＡＡ７８０Ｉに対して少なくとも９７％同一、又はｈＧＡＡ７８０Ｉに対して少なくとも９９％同一である配列を有するｈＧＡＡ７８０Ｉを選択してもよい。特定の実施形態では、配列番号３の成熟ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質に対して少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性である配列が提供される。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉに対して少なくとも９５％～少なくとも９９％の同一性を有する配列は、いかなる変化もなく保持される活性触媒部位の配列を有する。特定の実施形態では、配列番号３に対してｈＧＡＡ７８０Ｉに対して少なくとも９５％～少なくとも９９％の同一性を有する配列は、適切な動物モデルで試験される場合に、参照ｈＧＡＡＶ７８０よりも改善された生物学的効果及びより良好な安全性プロファイルを有することを特徴とする。特定の実施形態では、ＧＡＡ活性アッセイは、以前に記載されているように（例えば、Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，（２１０７）５：６６）、又は他の好適な方法を使用して実施され得る。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素は、ｈＧＡＡアミノ酸配列における他の位置に修飾を含有する。特定の実施形態では、かかる変異体ｈＧＡＡ７８０Ｉは、最低限、活性触媒部位：ＷＩＤＭＮＥ（配列番号６１）及び以下に記載される７８０Ｉの領域中のアミノ酸を保持し得る。

特定の実施形態では、天然ｈＧＡＡシグナルペプチド以外のリーダーペプチドを含む、新規のｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質が提供される。特定の実施形態では、かかる外因性リーダーペプチドは、好ましくは、ヒト起源のものであり、例えば、ＩＬ－２リーダーペプチドを含み得る。特定の実施形態において作用可能な特定の外因性シグナルペプチドとしては、キモトリプシノゲンＢ２由来のアミノ酸１～２０、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンのシグナルペプチド、イズロン酸－２－スルファターゼ由来のアミノ酸１～２５、及びプロテアーゼＣＩ阻害剤由来のアミノ酸１～２３が挙げられる。例えば、ＷＯ２０１８／０４６７７４を参照されたい。他のシグナル／リーダーペプチドは、とりわけ、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ１８等）、インスリン、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ、又はフィブロネクチン分泌シグナルペプチドに天然に認められ得る。また、例えば、ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａを参照されたい。

かかるキメラｈＧＡＡ７８０Ｉは、全２７個のａａの天然シグナルペプチドの代わりに
外来性リーダーを有し得る。任意選択的に、ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素のＮ末端切断は、シグナルペプチドの一部分のみ（例えば、約２～約２５個のアミノ酸、若しくはその間の値のアミノ酸の欠失）、シグナルペプチド全体、又はシグナルペプチドよりも長い断片（例えば、配列番号３の番号付けに基づいて最大７０個のアミノ酸を欠いていてもよい。任意選択的に、かかる酵素は、約５、１０、１５、又は２０アミノ酸長のＣ末端切断を含有し得る。

特定の実施形態では、成熟ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質（ａａ７０～９５２）、成熟７０ｋＤタンパク質（ａａ１２３～ａａ９５２）、又は融合パートナーに結合した成熟７６ｋＤタンパク質（ａａ２０４～９５２）を含む、新規の融合タンパク質が提供される。任意選択的に、融合タンパク質は、ｈＧＡＡに対して非天然であるシグナルペプチドを更に含む。更に任意選択的に、これらの実施形態のうちの１つは、約５、１０、１５、又は２０アミノ酸長のＣ末端切断を更に含有し得る。

特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質を含む融合タンパク質は、配列番号３（ｈＧＡＡ７８０Ｉ）のアミノ酸８９０に対して少なくともアミノ酸２０４、又は７８０位にＩｌｅを有するそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質は、少なくとも配列番号３のアミノ酸２０４～アミノ酸９５２、又は７８０位にＩｌｅを有するそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質は、少なくとも配列番号３のアミノ酸１２３～アミノ酸８９０、又は７８０位にＩｌｅを有するそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素は、少なくとも配列番号３のアミノ酸７０～アミノ酸９５２、又は７８０位にＩｌｅを有するそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質は、少なくとも配列番号３のアミノ酸７０～アミノ酸８９０、又は７８０位にＩｌｅを有するそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。

特定の実施形態では、融合タンパク質は、シグナル及びリーダー配列、並びに配列番号７に対して少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性を有するｈＧＡＡ７８０Ｉ配列を含み、活性部位に変化を有さず、及び／又は活性部位に対してＮ末端及び／若しくはＣ末端の３～１２アミノ酸のアミノ酸に変化を有しない。好ましい実施形態では、操作されたｈＧＡＡ発現カセットは、Ｔ－Ｖａｌ（Ｖ）－Ｐ－Ｉｌｅ（７８０Ｉ）－Ｇｌｕ（Ｅ）－Ａｌａ（Ａ）－Ｌｅｕ（Ｌ）（配列番号６２）のヒトｈＧＡＡ７８０Ｉ断片を少なくともコードする。特定の実施形態では、操作されたｈＧＡＡ発現カセットは、より長いヒトｈＧＡＡ７８０Ｉ断片：Ｇｌｎ（Ｑ）－Ｔ－Ｖ－Ｐ－７８０Ｉ－Ｅ－Ａ－Ｌ－Ｇｌｙ（Ｇ）（配列番号６３）をコードする。特定の実施形態では、操作されたｈＧＡＡ発現カセットは、少なくともＰＬＧＴ－Ｔｒｐ（Ｗ）－Ｔｙｒ（Ｙ）－Ａｓｐ（Ｄ）－ＬＱＴＶＰ－７８０Ｉ－ＥＡＬＧ－（Ｓｅｒ又はＳ）－Ｌ－ＰＰＰＰＡＡ配列（配列番号６４）に対応する断片をコードする。同様に、好ましい実施形態では、活性結合部位にアミノ酸変化はない（配列番号３のａａ５１８～５２１）。特定の実施形態では、６００位、６１６位、及び／又は６７４位における結合部位は、変化しないままである。特定の実施形態では、融合タンパク質は、シグナルペプチドと、任意選択的なｖＩＧＦ＋２ＧＳ伸長と、任意選択的なＥＲタンパク質分解ペプチドと、ｈＧＡＡの最初の３５個のアミノ酸が欠失している（すなわち、天然シグナルペプチド及びアミノ酸２８～３５を欠く）ｈＧＡＡ７８０Ｉバリアントと、を含む。

特定の実施形態では、ＢｉＰシグナルペプチドと、ＩＧＦ２＋２ＧＳ伸長と、ｈＧＡＡ７８０Ｉのアミノ酸６１～９５２（ｈＧＡＡ７８０Ｉのアミノ酸１～６０の欠失を伴う）と、を含む、分泌された操作されたＧＡＡが提供される。特定の実施形態では、配列番号６、又はそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む融合タンパク質が本明細書で提
供される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７、又はそれに対して少なくとも９５％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４の配列、又はそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５の配列、又はそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。

本明細書で提供される融合タンパク質の構成要素は、以下で更に説明される。
ＣＩ－ＭＰＲに結合するペプチド
ＣＩ－ＭＰＲに結合するペプチド（例えば、ｖＩＧＦ２ペプチド）が本明細書で提供される。かかるペプチド及びｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質を含む融合タンパク質は、遺伝子療法ベクターから発現される場合、ｈＧＡＡ７８０Ｉを、それが必要とされる細胞に標的化し、かかる細胞による細胞取り込みを増加させ、治療用タンパク質を細胞内位置（例えば、リソソーム）に標的化する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ｖＩＧＦ２ペプチドである。いくつかのｖＩＧＦ２ペプチドは、ＣＩ－ＭＰＲに対する高い親和性結合を維持するが、ＩＧＦ１受容体、インスリン受容体、及びＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に対するそれらの親和性は低下又は排除される。したがって、いくつかのバリアントＩＧＦ２ペプチドは、野生型ＩＧＦ２と比較して、実質的により選択的であり、安全性のリスクが低減している。ｖＩＧＦ２ペプチドは、本明細書には、配列番号４６のアミノ酸配列を有するものが含まれる。バリアントＩＧＦ２ペプチドは、野生型ＩＧＦ２（配列番号３４）と比較して、６、２６、２７、４３、４８、４９、５０、５４、５５、又は６５位にバリアントアミノ酸を有するものを更に含む。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｅ６Ｒ、Ｆ２６Ｓ、Ｙ２７Ｌ、Ｖ４３Ｌ、Ｆ４８Ｔ、Ｒ４９Ｓ、Ｓ５０Ｉ、Ａ５４Ｒ、Ｌ５５Ｒ、及びＫ６５Ｒからなる群からの１つ以上の置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｅ６Ｒの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｆ２６Ｓの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｙ２７Ｌの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｖ４３Ｌの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｆ４８Ｔの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｒ４９Ｓの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｓ５０Ｉの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ａ５４Ｒの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｌ５５Ｒの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｋ６５Ｒの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｅ６Ｒ、Ｆ２６Ｓ、Ｙ２７Ｌ、Ｖ４３Ｌ、Ｆ４８Ｔ、Ｒ４９Ｓ、Ｓ５０Ｉ、Ａ５４Ｒ、及びＬ５５Ｒの置換を有する配列を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、Ｎ末端欠失がある。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、１個のアミノ酸のＮ末端欠失がある。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、２個のアミノ酸のＮ末端欠失がある。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、３個のアミノ酸のＮ末端欠失がある。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、４個のアミノ酸のＮ末端欠失がある。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、４つのアミノ酸のＮ末端欠失があり、かつＥ６Ｒ、Ｙ２７Ｌ、及びＫ６５Ｒの置換を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、４つのアミノ酸のＮ末端欠失があり、並びにＥ６Ｒ及びＹ２７Ｌの置換を有する。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、５個のアミノ酸のＮ末端欠失がある。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、６個のアミノ酸のＮ末端欠失がある。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、７個のアミノ酸のＮ末端欠失がある。いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドは、７個のアミノ酸のＮ末端欠失があり、かつＹ２７Ｌ及びＫ６５Ｒの置換を有する。

シグナルペプチド
本明細書に提供される組成物は、いくつかの実施形態では、遺伝子療法構築物で形質導入された細胞からのｈＧＡＡ７８０Ｉの分泌を改善するシグナルペプチドを更に含む。い
くつかの実施形態におけるシグナルペプチドは、治療用タンパク質のタンパク質プロセシングを改善し、新生ポリペプチドリボソーム複合体のＥＲへの転位置を促進し、適切な共翻訳及び翻訳後改変を確実にする。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、（ｉ）シグナル翻訳開始配列の上流位置、（ｉｉ）翻訳開始配列と治療用タンパク質との間、又は（ｉｉｉ）治療用タンパク質の下流位置に位置する。遺伝子療法構築物に有用なシグナルペプチドには、ＨＳＰ７０タンパク質ファミリー（例えば、ＨＳＰＡ５、熱ショックタンパク質ファミリーＡメンバー５）に由来する結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ）シグナルペプチド及びガウシアシグナルペプチド、並びにそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。これらのシグナルペプチドは、シグナル認識粒子に対して超高親和性を有する。ＢｉＰ及びガウシアアミノ酸配列の例を以下の表に提供する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４９～５３からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号４９～５３からなる群から選択される配列とは、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個のアミノ酸が異なる。

ガウシアシグナルペプチドは、Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓからのルシフェラーゼに由来しており、このシグナルペプチドに融合された治療用タンパク質のタンパク質合成及び分泌の増加を指示する。いくつかの実施形態では、ガウシアシグナルペプチドは、配列番号５４に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号５４とは、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個のアミノ酸が異なる。

リンカー
本明細書に提供される組成物は、いくつかの実施形態では、標的化ペプチドと治療用タンパク質との間にリンカーを含む。かかるリンカーは、いくつかの実施形態では、ｖＩＧＦ２ペプチドと治療用タンパク質との間の正しい間隔を維持し、立体的な衝突を緩和する。リンカーは、いくつかの実施形態では、反復グリシン残基、反復グリシン－セリン残基、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、５～２０個のアミノ酸、５～１５個のアミノ酸、５～１０個のアミノ酸、８～１２個のアミノ酸、又は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３個のアミノ酸からなる。好適なリンカーとしては、限定されないが、以下の表に提供されるものが挙げられる：

本明細書全体を通して、様々な発現カセット、ベクターゲノム、ベクター、及び組成物が、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列又はｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質又は融合タンパク質を含有するものとして記載されている。別途指定されない限り、Ｎ末端切断、Ｃ末端切断、及び本明細書に記載されるもの等の融合タンパク質、又はそれらのコード配列を含む、操作されたｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質のいずれも、同様に、発現カセット、ベクターゲノム、ベクター、及び組成物内で操作され得ることが理解されるであろう。

適切には、本明細書に記載の核酸配列を含む発現カセットが提供される。

発現カセット
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、標的細胞（例えば、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質コード配列）プロモーターにおいてその発現を指示する調節配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列を含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得る。必要な調節配列は、標的細胞におけるその転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする方式で、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質コード配列と操作可能に連結される。

特定の実施形態では、発現カセットは、非翻訳領域に１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子発現が望ましくない、及び／又は導入遺伝子発現のレベルの低減が望ましい細胞に存在するｍｉＲＮＡによって特異的に認識されるように設計される。特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節におけるｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質の発現を特異的に低減するｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、及び／又は３’ＵＴＲと５’ＵＴＲの両方に位置する。特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節（ＤＲＧ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復を含み、少なくとも２つのタンデム反復は、同じか又は異なり得る少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列及び少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質コード配列の３’末端から２０ヌクレオチド以内である。特定の実施形態では、少なくとも２つのＤＲＧ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質コード配列の３’末端から少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡタンデム反復は、２００～１２００ヌクレオチド長を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ標的の包含は、ｍｉＲ標的配列を欠く発現カセット又はベクターゲノムと比較して、１つ以上の標的組織における治療用導入遺伝子の発現又は有効性を改変しない。

特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、

を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含有する（ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている）。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的な配列を、１コピーより多く（例えば、２又は３コピー）含有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２６に部分的に相補的な配列を含有し、したがって、配列番号２６にアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２６とアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号２６を含むｍｉＲ－１８３標的配列（すなわち、配列番号２６の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子及び１つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２個、３個、又は４個のｍｉＲ－１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は少なくとも８個のｍｉＲ－１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムに、少なくとも２個、３個、又は４個のｍｉＲ－１８３標的配列を含むと、心臓等の標的組織における導入遺伝子発現のレベルが増加する。

特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号２７）を含むｍｉＲ－１８２標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的な配列を、１コピーより多く（例えば、２又は３コピー）含有する。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号２７に部分的に相補的な配列を含有し、したがって、配列番号２７にアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号２７とアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、切断された配列番号２７を含むｍｉＲ－１８２標的配列（すなわち、配列番号２７の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドを欠く配列）を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子及び１つのｍｉ
Ｒ－１８２標的配列を含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２個、３個、又は４個のｍｉＲ－１８２標的配列を含む。

「タンデム反復」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であってもよく、すなわち、一方の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端のすぐ上流にあるように、又はその逆で、互いの後に直接的に位置し得る。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。

本明細書で使用される場合、「スペーサー」は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、又はより長い数値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧ又はＧＣＡＴＧＣである。

特定の実施形態では、タンデム反復は、２個、３個、４個、又はそれより多くの同じｍｉＲＮＡ標的配列を含有する。特定の実施形態では、タンデム反復は、少なくとも２個の異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３個の異なるｍｉＲＮＡ標的配列、又は少なくとも４個の異なるｍｉＲＮＡ標的配列等を含有する。特定の実施形態では、タンデム反復は、同じｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２個又は３個、及びそれとは異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含有してもよい。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも４個のｍｉＲ１８３標的配列、及び少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、又は少なくとも４個のｍｉＲ１８２標的配列の組み合わせを含む。

特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２個の異なるセットのタンデム反復が存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子のすぐ下流のタンデム反復と、ＵＴＲ配列と、ＵＴＲの３’末端に近接する２個以上のタンデム反復と、を含有し得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１個、２個以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。別の例では、３’は、タンデム反復を含有し得、５’ＵＴＲは、少なくとも１個のｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。

特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内で開始する、２個、３個、４個以上のタンデム反復を含有する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００ヌクレオチドでｍｉＲＮＡタンデム反復を含有する。

２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号に対する優先権を主張する、２０１９年１２月２０日に出願され、現在ＷＯ２０２０／１３２４５５号として公開されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号を参照されたい（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。また、２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，５９３号、２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，４８８号、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５６２号、２０２０年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０７９，２９９号、２０２１年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２，０４２号、及び２０２１年５月１２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ
２１／３２００３号も参照されたい（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）。

本明細書で使用される場合、「ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３」は、ユビキタスＣＡＧプロモーターの制御下で、修飾されたＢｉＰ－ｖＩＧＦ２シグナル配列を有するｈＧＡＡ７８０Ｉの操作されたコード配列と、ｍｉＲ１８３標的配列の４つのタンデム反復とを含有する発現カセット（例えば、図１１に示されるような）を示す。本明細書に提供される実施例に例示されるように、Ｖ７８０Ｉ変異及びＢｉＰ－ｖＩＧＦ２修飾の両方が、安全性及び有効性の改善に寄与する。特定の実施形態では、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３は、配列番号３の融合タンパク質をコードする配列、又はそれに対して少なくとも９５％同一の配列を含む。特定の実施形態では、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３は、配列番号７の核酸配列、又はそれと少なくとも９５％～９９％同一の配列を有する。更に別の実施形態では、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３が、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲに隣接している、ベクターゲノムが本明細書で提供される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号３０である。なお更なる実施形態では、配列番号３０に対して少なくとも９５％同一の配列を含み、配列番号６の融合タンパク質をコードする、ベクターゲノムが提供される。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列と連続する発現制御配列、及びｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列を制御するためにトランスで又は離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。かかる調節配列は、典型的には、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、コザック配列、ポリアデニル化配列、及びＴＡＴＡシグナルのうちの１つ以上を含む。

特定の実施形態では、調節要素は、複数の標的細胞を治療するのに好適な単一の発現カセットの構築及び送達を可能にするために、ポンペ病によって影響を受ける複数の細胞及び組織における発現を指示する。例えば、調節要素（例えば、プロモーター）は、肝臓細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、及び中枢神経系細胞のうちの２つ以上で発現させるように選択され得る。例えば、調節要素（例えば、プロモーター）は、中枢神経系（例えば、脳）細胞、及び骨格筋で発現させるように選択され得る。他の実施形態では、調節要素は、ＣＮＳ、骨格筋、及び心臓で発現させる。他の実施形態では、発現カセットは、肝臓細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、及び中枢神経系細胞の全てにおけるコードされたｈＧＡＡ７８０Ｉの発現を可能にする。他の実施形態では、調節要素は、特定の組織を標的化し、特定の細胞又は組織内での発現を回避するために（例えば、本明細書に記載のｄｒｇ非標的化システムの使用によって、及び／又は組織特異的プロモーターの選択によって）選択され得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される異なる発現カセットが患者に投与され、異なる組織を優先的に標的とする。

調節配列は、プロモーターを含む。好適なプロモーターが選択されてもよく、これには、標的細胞においてｈＧＡＡＶ７８０Ｉタンパク質を発現するプロモーターが含まれるが、これに限定されない。

特定の実施形態では、構成的プロモーター又は誘導性／調節性プロモーターが選択される。構成的プロモーターの例は、ニワトリベータ－アクチンプロモーターである。様々なニワトリベータ－アクチンプロモーターが単独で、又は様々なエンハンサー要素と組み合わせて記載されている（例えば、ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサー要素を有するニワトリベータ－アクチンプロモーターであり、ニワトリベータアクチンの最初のエキソン及び最初のイントロンを含むＣＡＧプロモーター、及びウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプター（ＣＢｈプロモーター）：ＳＪ Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｈ
ｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３－１１５３）。特定の実施形態では、調節可能なプロモーターが選択され得る。例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、組織特異的プロモーターが選択され得る。組織特異的であるプロモーターの例は、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９、アルファ－フェトタンパク質（ＡＦＰ），Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４）、中枢神経系、例えば、ニューロン（例えば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５、及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）、心筋、骨格筋、肺及び他の組織について周知である。別の実施形態では、好適なプロモーターとしては、限定されないが、伸長因子１ファルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ
ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ
ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、又はＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ
Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６． ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９９－５）が挙げられ得る。組織特異的プロモーターを利用する特定の実施形態では、異なる発現カセットと、異なる細胞型を標的とする組織特異的プロモーターと、を含む併用療法が選択され得る。

一実施形態では、調節配列は、エンハンサーを更に含む。一実施形態では、調節配列は、１つのエンハンサーを含む。別の実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであり得るか、又は異なり得る。例えば、エンハンサーは、Ａｌｐｈａ ｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、又はＣＭＶエンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離され得る。

一実施形態では、調節配列は、イントロンを更に含む。更なる実施形態では、イントロ
ンは、ニワトリベータ－アクチンイントロンである。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、ヒトβ－グロブリンイントロン、及び／又は市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロン、並びにＷＯ２０１１／１２６８０８に記載のものであり得る。

一実施形態では、調節配列は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）を更に含む。更なる実施形態では、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡである。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。代替的には、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、又は合成ポリＡが、発現カセットに含まれ得る。

本明細書に記載の発現カセットにおける組成物は、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されることが意図されることを理解されたい。

発現カセットは、任意の好適な送達系を介して送達され得る。好適な非ウイルス送達システムは、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６、参照により本明細書に組み込まれる）、当業者によって容易に選択され得、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子（脂質ナノ粒子若しくはＬＮＰ）又はキトサンベースの製剤を含み得る。

一実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、その記載される発現カセット（例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）を含み、様々な組成物及びナノ粒子（例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、及び他のポリマー、脂質及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲート、並びに本明細書に記載されるような他の構築物を含む）と結合される。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ウェブ公開：２０１１年３月２１日、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたく、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、本明細書に記載のｈＧＡＡ７８０Ｉバリアント、融合タンパク質、又は切断タンパク質をコードする配列を有する核酸分子が本明細書に提供される。望ましい一実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、配列番号４の操作された配列、又はｈＧＡＡ７８０Ｉバリアントをコードする、それに対して少なくとも９５％同一の配列によってコードされる。特定の実施形態では、配列番号４は、７８０Ｉ位のＩｌｅをコードするコドンがＡＴＴ又はＡＴＣであるように修飾される。特定の実施形態では、配列番号４の操作された配列、又はその断片を含む核酸を、融合タンパク質又は切断されたｈＧＡＡ７８０Ｉを発現するために使用する。望ましさはこれより低いが、特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、配列番号５によってコードされる。特定の実施形態では、核酸は、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも９５％同一の配列を有する融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、配列番号７の配列、又はそれに対して少なくとも９５％同一の配列を有する核酸が提供される。特定の実施形態では、核酸分子は、プラスミドである。

ベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入することができる核酸配列を含む、生物学的部分又は化学的部分である。ベクターの例としては、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリ
プレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、機能的な遺伝子産物をコードする外因性又は異種の操作された核酸を有する核酸分子であり、そのため、適切な標的細胞に導入することができる。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点、及び組換えＤＮＡを挿入することができる１つ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を、有さない細胞から選択することができる手段を有しており、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が含まれる。ベクターの生成、産生、特性評価、又は定量化の従来の方法は、当業者にとって利用可能である。

特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、「複製欠陥ウイルス」又は「ウイルスベクター」であり、これらは、ウイルスカプシド若しくはエンベロープ内にパッケージングされた機能的ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現カセットが、ウイルスカプシド若しくはエンベロープ内にパッケージングされたいずれのウイルスゲノム配列も、複製欠損である（すなわち、後代ビリオンを生成することはできないが、標的細胞に感染する能力を保持する）、合成若しくは人工のウイルス粒子を指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接してコードする核酸配列のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。

本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、所望の細胞を標的とする任意の好適なウイルスベクターである。したがって、組換えウイルスベクターは、好ましくは、中枢神経系（例えば、脳）、骨格筋、心臓、及び／又は肝臓を含む、ポンペ病によって影響を受ける細胞及び組織のうちの１つ以上を標的とする。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、少なくとも中枢神経系（例えば、脳）細胞、肺、心臓細胞、又は骨格筋を標的とする。他の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳）、骨格筋、及び／又は心臓を標的とする。他の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、及び中枢神経系細胞の全てを標的とする。実施例は、例示的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。しかしながら、他の好適なウイルスベクターとしては、例えば、組換えアデノウイルス、組換えボカウイルス等の組換えパルボウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、組換え単純ヘルペスウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えレンチウイルスが挙げられ得る。好ましい実施形態では、これらの組換えウイルスは、複製不能である。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、又は酵母）であり得、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入された、外因性ＤＮＡ又は異種ＤＮＡを含有する。宿主細胞の例としては、限定されないが、単離された細胞、細胞培養物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非哺乳動物細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、又は幹細胞が挙げられ得る。

特定の実施形態では、宿主細胞は、ｈＧＡＡ７８０Ｉの産生のための発現カセットを含
有し、それによってタンパク質が単離又は精製のためにインビトロで十分な量で産生される。特定の実施形態では、宿主細胞は、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ又はその断片をコードする発現カセットを含有する。本明細書で提供される場合、ｈＧＡＡ７８０Ｉタンパク質は、治療剤（すなわち、酵素補充療法）として対象に投与される薬学的組成物に含まれ得る。

本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、機能的な遺伝子産物の発現が所望される任意の標的細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルスベクター内にパッケージングされる核酸配列を指す。一例では、「ベクターゲノム」は、最低限、５’から３’に向けて、ベクター特異的配列と、標的細胞における発現を指示する調節制御配列に作動可能に連結された機能的遺伝子産物（例えば、ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ、融合タンパク質ｈＧＡＡＶ７８０Ｉ、又は別のタンパク質）をコードする核酸配列と、ベクター特異的配列と、任意選択的に、非翻訳領域におけるｍｉＲＮＡ標的配列と、ベクター特異的配列と、を含有する。ベクター特異的配列は、ベクターゲノムをウイルスベクターカプシド又はエンベロープタンパク質に特異的にパッケージングする末端反復配列であり得る。例えば、ＡＡＶ逆位末端反復は、ＡＡＶ及び特定の他のパルボウイルスカプシドにパッケージングするために利用される。レンチウイルスの長い末端反復は、レンチウイルスベクターへのパッキングが所望される場合に利用され得る。同様に、他の末端反復（例えば、レトロウイルス長末端反復）等が選択され得る。

本明細書に記載のベクターにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
一態様では、本明細書に記載されるｈＧＡＡＶ７８０Ｉ融合タンパク質（酵素）をコードする、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が本明細書で提供される。特定の実施形態では、選択されるＡＡＶカプシドは、肝臓細胞型、筋肉細胞型、腎臓細胞型、心臓細胞型、及び／又は中枢神経系細胞型のうちの２つ以上の細胞を標的とする。特定の実施形態では、肝臓細胞型、骨格筋細胞型、心臓細胞型、腎臓細胞型、及び／又は少なくとも１つの中枢神経系細胞型のうちの少なくとも２つ以上においてｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質を発現することが望ましい。したがって、一実施形態では、選択されたＡＡＶカプシドは、心臓組織を標的とする。特定の実施形態では、心臓組織を標的とするように選択されるＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、６、８、及び９から選択される（例えば、Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７ Ｓｅｐ １；２８（３）：１５７－１６４を参照されたい）。更に他の実施形態では、選択されるＡＡＶカプシドは、腎臓の細胞を標的とする。一実施形態では、腎臓細胞を標的とするためのカプシドは、ＡＡＶ１、２、６、８、９、及びＡｎｃ８０から選択される（例えば、Ｉｋｅｄａ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１８ Ｓｅｐ；２９（９）：２２８７－２２９７、及びＡｓｃｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８ Ｆｅｂ ２６；４９７（１）：１９－２４を参照されたい）。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、天然又は操作されたクレードＦカプシドである。特定の実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシド又はＡＡＶｈｕ６８カプシドである。

一実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）と、本明細書に記載の発現カセットと、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、ｒＡＡＶベクターを形成するｒＡＡＶカプシド内にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、発現カセットに隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴ
Ｒ）を含有する。一例では、ＡＡＶ又はボカウイルスカプシドにパッケージングするための「ベクターゲノム」は、最低限、５’から３’に向けて、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、標的細胞において発現を指示する調節制御配列に操作可能に連結された本明細書に記載の機能的なｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質をコードする核酸配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含有する。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来であり、カプシドは、異なるＡＡＶ由来である。代替的に、他のＩＴＲが使用され得る。特定の実施形態において、ベクターゲノムは、導入遺伝子の発現が望ましくなく、及び／又は導入遺伝子の発現レベルの低下が所望される、細胞に存在するｍｉＲＮＡによって特異的に認識されるように設計される、非翻訳領域にｍｉＲＮＡ標的配列を更に含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム中のｍｉＲ１８３標的配列は、心臓における導入遺伝子の発現を増加させる。

ＩＴＲは、ベクター産生の際のゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝子要素であり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルス性シス要素である。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するのとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失態様（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、及び規制当局の承認を加速させるために使用され得る。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、ｈＧＡＡ７８０Ｉコード配列と、任意の調節配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。しかし、これらの要素の他の構成も好適であり得る。Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮態様が記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶの５’ＩＴＲ及びＡＡＶの３’ＩＴＲが使用される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、１３０塩基対の短縮された５’及び／又は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、ここで、外部「ａ」要素は欠失している。短縮されたＩＴＲは、内部Ａ要素を鋳型として使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型の長さに戻される。

本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者に、かつ／又は本明細書に記載の組成物及び方法の観点において利用可能であるアデノ随伴ウイルス、並びに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ）耐性粒子であり、その中にパッケージングされる発現カセットは、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ヌクレアーゼ耐性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶカプシドが完全に構築されていることを示し、これらのパッケージングされたベクターゲノム配列を、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計される、ヌクレアーゼインキュベーション工程の際の分解（消化）から保護する。多くの場合、本明細書に記載のｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ耐性である。

ＡＡＶカプシドは、６０カプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成され、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上で特定されるＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択されてもよい。例えば、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１、及びＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、及びＷＯ２００６／１１０６８９、並びにＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）も参照されたい。また、これらの文書には、他のＡＡＶも記載されており、ＡＡＶを生成するために選択され得る（参照により組み込まれる）。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され、又は操作され、十分に特性評価されたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２が、遺伝子導
入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、それは、異なる標的組織及び動物モデルにおいて、効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。別途指定されない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ９０（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２７３、参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＡＶｒｈ９１（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２６６、参照により本明細書に組み込まれる）、並びにＡＡＶｒｈ９２、ｒｈ９３、及びｒｈ９１．９３（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０／３０２８１、参照により本明細書に組み込まれる）として一般に特定されているＡＡＶ、既知の若しくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、又はまだ発見されていないＡＡＶ若しくはそのバリアント、あるいはそれらの混合物を含む、任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド又はそのバリアントである。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値と文字の組み合わせによって指定される。

ＩＴＲ又は他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離又は操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、又は公的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離され、操作されるか、又は入手することができる。代替的に、ＡＡＶ配列は、文献又はデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄ等）で利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成又は他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性及び粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のため等に最適化することを可能にする。

本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」及び「人工ＡＡＶ」という用語は、互換的に使用され、限定されないが、カプシドタンパク質と、その中にパッケージングされるベクターゲノムとを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、天然に存在しないカプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を使用して、異種配列（異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス源、又は非ウイルス源から得ることができる）と組み合わせて、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、限定されないが、疑似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、特定の実施形態で有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、天然及び操作されたクレードＦアデノ随伴ウ
イルスの中から選択される。以下の実施例では、クレードＦアデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶｈｕ６８である。ＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。しかしながら、他の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、異なるクレード、例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、若しくはＥから、又はこれらのクレードのいずれかからも外れたＡＡＶ供給源から選択される。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「クレード（ｃｌａｄｅ）」という用語は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、（少なくとも１０００複製物のうちの）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムを使用して決定されるような、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指す。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正されたＮｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術及びコンピュータプログラム、並びにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定されるクレードのうちの１つに含まれるか、別の系統群に含まれるか、又はこれらのクレード外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ
Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８１０：６３８１－６３８８（これは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを特定し、かつ新規ＡＡＶの核酸配列、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９を提供する）を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、（ａ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＳ９９２６４（参照により本明細書に組み込まれる）（ＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質）のアミノ酸配列、及び／又は（ｂ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ５３０５７９．１：（ｎｔ １．．２２１１）のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する、ＡＡＶ９を指す。このコード配列からのいくつかの変化は、本発明に包含され、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＳ９９２６４及びＵＳ７９０６１１１（同様に、ＷＯ２００５／０３３３２１）における参照アミノ酸配列に対して約９９％同一性を有する配列を含み得る（すなわち、参照配列からの約１％未満の変化）。かかるＡＡＶは、例えば、天然単離物（例えば、ｈｕ３１若しくはｈｕ３２）、又はアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するＡＡＶ９のバリアントを含み得、例えば、限定されないが、アミノ酸置換は、ＡＡＶ９カプシドとアラインメントされた任意の他のＡＡＶカプシドにおける対応する位置から「補充された」代替的な残基から選択されるアミノ酸置換を含み、例えば、ＵＳ９，１０２，９４９、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／３４９９１１、ＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１、ＵＳ９，６２３，１２０、及びＵＳ９，５８５，９７１に記載されているもの等が挙げられる。しかし、他の実施形態では、ＡＡＶ９の他のバリアント、又は上記の参照配列に対して少なくとも約９５％同一性を有するＡＡＶ９カプシドが選択され得る。例えば、ＵＳ２０１５／００７９０３８を参照されたい。カプシド、したがってコード配列を生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｃｌａｄｅ Ｆ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題されるＷＯ２０１８／１６０５８２に記載される通りであり
、参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現から産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されたｖｐ１タンパク質、若しくは配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、若しくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、及び／又は配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、若しくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質、を含む。

ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、典型的には、配列番号２の全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は単独で使用されて、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質を発現する。代替的に、この配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／又はｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、又は配列番号２のａａ２０３～７３６をコードする配列番号１に対して少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％）同一の配列、のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、又は代替的に、ｖｐ１コード配列及び／又はｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）、又は配列番号２の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号１のｎｔ４１２～２２１１に対して少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。

本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列、及び任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１及び／又はｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）からカプシドを発現する産生システムで産生されるｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に部分集合体を含有し、配列番号２の予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。

一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号１の配列、又はそれに
相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２及び／又はｖｐ３タンパク質は、追加的に、又は代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比率を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／又はｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号２の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）又はそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。

しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、又は配列番号１に対して少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、又は配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１に対して少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、又は配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１に対して少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号１のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。

ＤＮＡ（ゲノム若しくはｃＤＮＡ）、又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードする核酸配列を設計することは、当該技術分野の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号２に提供される。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１の核酸配列、又は本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を含む配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の配列、又は少なくとも９９％の配列、を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号２に再現される。

特定の実施形態では、カプシド脱アミド化が減少しているＡＡＶカプシドが選択され得る。例えば、ともに２０１９年２月２７日に出願され、それらの全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４及びＰＣＴ／ＵＳ１８／１９８６１を参照されたい。

本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号２は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基の修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タン
パク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対中の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。

本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群の全てのメンバーよりも少ないメンバーまでからなるｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、全てのｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、１つの（１）ｖｐ３タンパク質から、組み立てられたＡＡＶカプシド中の全てのｖｐ３タンパク質よりも少ないものまでであり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であってもよく、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の亜集団であってもよく、ｖｐ３は更に、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質の更なる亜集団であってもよい。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含有し得る。

別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号２［ＡＡＶｈｕ６８］の番号付けに基づくアミノ酸５７のアスパラギンの少なくとも８０％が、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化されてもよく、総ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化されてもよい）。かかる割合は、２Ｄゲル、質量分析技術、又は他の好適な技術を使用して決定され得る。

したがって、ｒＡＡＶは、少なくとも１つの高度に脱アミド化されたアスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を最低限含む、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、及び／又はｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶカプシド内の亜集団を含む。加えて、他の修飾は、特に、選択されたアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。更なる他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。

特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３の亜集団を含有し、そのうちの少なくとも１～１０％は、ｖｐタンパク質のコードされたアミノ酸配列と比較して脱アミド化される。これらの大部分は、Ｎ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基も脱アミド化され得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、実施例１に提供され、参照により本明細書に組み込まれる表に示される位置に、２つ、３つ、４つ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶカプシドを有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、及び／又は質量分析、及び／又はタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィーは、ＮａｎｏＦｌｅｘ ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラム及びＴ
ｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦにおけるデータ依存のｔｏｐ－２０法を用いてＭＳデータを取得し、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富な未配列前駆体イオンを動的に選択する。配列決定は、予測自動ゲイン制御によって決定される１ｅ５イオンの標的値を有する、より高エネルギーの衝突解離断片化によって行われ、前駆体の単離は、４ｍ／ｚのウィンドウで行われた。サーベイスキャンは、ｍ／ｚ２００、解像度１２０，０００で取得された。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注射時間５０ｍｓ及び正規化された衝突エネルギー３０で、ｍ／ｚ２００で３０，０００に設定されてもよい。ＳレンズＲＦレベルは、消化からのペプチドによって占められるｍ／ｚ領域の最適伝送を与えるために、５０に設定されてもよい。断片化選択からの単一の割り当てられていない帯電状態、又は６以上の帯電状態を有する前駆イオンは、除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、取得したデータの分析に使用してもよい。ペプチドマッピングのために、固定修飾としてカルバミドメチル化設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド化、及びリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、並びにＭＳ／ＭＳスペクトルにおける信頼レベル０．８を使用して検索を実施する。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシン又はキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨ及び－ＮＨ^２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化率は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化及びネイティブペプチドの面積の合計で除することによって決定される。脱アミド化の可能性がある部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている同重種は、単一のピークで共移動し得る。その結果、複数の脱アミド化の可能性がある部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、脱アミド化の複数の部位を位置決定又は区別することができる。これらの場合に、観測される同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的な存在率を特異的に決定することができる。この方法は、全ての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位に依存しないことを想定する。これらの例示的な方法について多くの変化が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ若しくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０等の四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、又はＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ若しくはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）等のオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィーとしては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ製のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム、又はＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００若しくは１２００シリーズ）が挙げられる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ ａｎｄ Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が挙げられ得る。更に他の技術は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。

脱アミド化に加えて、１つのアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない他の修飾が生じてもよい。かかる修飾は、アセチル化残基、異性化、リン酸化、又は酸化を含み得る。

脱アミド化の調節：特定の実施形態では、ＡＡＶは、アスパラギン－グリシン対の中のグリシンを変更して、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化するグルタミン、又はアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミン及びアスパラギンは、アミド基を含有する
）、及び／又はアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジンは、アミン基を含有する）に変更される。本明細書で使用される場合、アミド又はアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファン、及び／又はプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶアミノ酸配列中に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、又は３つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つ全てでは行われない。したがって、より低い脱アミド率を有する、ＡＡＶ及び／又は操作されたＡＡＶバリアントの脱アミドを低減するための方法。追加的に、又は代替え的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、ＡＡＶの脱アミド化を低減し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載される変異体ＡＡＶカプシドは、グリシンがアラニン又はセリンに変化するように、アスパラギン－グリシン対の中に変異を含む。変異体ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に４つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、又は３つの変異体を含有し得る。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、参照ＡＡＶが天然に５つのＮＧ対を含む位置に、１つ、２つ、３つ、又は４つのかかる変異体を含有し得る。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対に単一の変異のみを含有する。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対に変異を含有する。特定の実施形態では、変異体ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシド中で構造的に離れた位置に位置する２つの異なるＮＧ対に変異を含有する。特定の実施形態では、変異は、ＶＰ１固有領域にはない。特定の実施形態では、変異のうちの１つは、ＶＰ１固有領域にある。任意選択的に、変異体ＡＡＶカプシドは、ＮＧ対中に修飾を含まないが、ＮＧ対から外れて位置する１つ以上のアスパラギン若しくはグルタミン中の脱アミド化を最小限に抑えるか、又は排除するために変異を含有する。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロットにわたって７０％を超える脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合、９０％を超える。更なるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、及びＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミド化レベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。

ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有し、配列番号２の予測されたアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸の変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。これら及び他の修飾の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。

特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、自己相補性ＡＡＶである。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって保有されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の片割れが会合して、即時の複製及び転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するであろう。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３
号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接する本明細書に記載の発現カセットと、発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含有する宿主細胞を培養することを伴う。また、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、記載のベクターゲノムと、ベクターゲノムをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするのに十分なヘルパー機能と、を含有する宿主細胞も本明細書で提供される。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１６０３６０Ａ２に更に詳細に記載されている。

当業者に利用可能なｒＡＡＶの他の産生方法も利用することができる。好適な方法としては、バキュロウイルス発現系又は酵母を介した生成が挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１ Ａｐｒ ２９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１、Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ Ｄｅｃ ２０；９５（６）：１０８１－９２、ＳＡＭＩ Ｓ．ＴＨＡＫＵＲ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，２０１２、Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｕｇ １０．ｐｉｉ：Ｓ１５２５－００１６（１７）３０３６２－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＯｎｅＢａｃ ２．０：Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ
ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５－２２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４．、Ｌｉ
Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９．Ｐｒｉｎｔ ２０１３、Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔ
ｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８、及びＫｏｔｉｎ ＲＭ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。

２ステップの高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題するＷＯ２０１７／１６０３６０により詳細が記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子をゲノム欠損ＡＡＶ９中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を高速液体クロマトグラフィーに供することを含み、このときＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９中間体は、１０．２のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合され、約２６０及び約２８０の紫外吸光度で溶離液をモニタリングしながら塩勾配に供される。ｒＡＡＶ９には最適未満であるが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であってもよい。この方法では、ＡＡＶ９全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に達するときに溶離される画分から収集される。一例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、透析濾過された生成物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用し得る。これらのイオン条件下、かなりの割合の残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質が、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子が、効率的に捕捉される。

ｒＡＡＶの特性評価又は定量化のための従来の方法は、当業者に利用可能である。空及び充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド体積が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割り算し、ゲノムコピーに対する粒子の比率（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛け算することによって、空粒子の割合を得る。一般に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するために、本方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。抗ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する一次抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するため
の手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために、カラム断片からの試料を採取し、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディング緩衝液中で加熱してもよく、カプシドタンパク質を、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）上で解像させた。銀染色は、ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、あるいは他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー又はクマシー染色を使用して実施され得る。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー、及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用可能である。

一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より特定的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、標準アッセイと同様であるが、但し、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理した後、熱不活性化させる。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度で（例えば、約３７℃～約５０℃）より長い時間にわたって（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度で（例えば、最高約６０℃）より短い時間にわたって（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱不活性化は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

追加的に、又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用され得る。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

カプシドタンパク質のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３間の比率を決定する方法も利用可能である。例えば、Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；８７（２４）：１３１５０－１３１６０、Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．１９７８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕ
ｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２５：３３１－３３８、及びＲｏｓｅ ＪＡ，Ｍａｉｚｅｌ ＪＶ，Ｉｎｍａｎ ＪＫ，Ｓｈａｔｋｉｎ ＡＪ．１９７１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８：７６６－７７０を参照されたい。

本明細書に記載のｒＡＡＶにおける組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

薬学的組成物
ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質、又はｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質導入遺伝子を含む発現カセットを含む薬学的組成物は、液体懸濁液、凍結乾燥若しくは凍結組成物、又は別の好適な製剤であり得る。特定の実施形態では、組成物は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質又は発現カセットと、懸濁液を形成する生理学的に適合する液体（例えば、溶液、希釈剤、担体）と、を含む。かかる液体は、好ましくは水性ベースであり、１つ以上の緩衝剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、又は他の好適な賦形剤を含有し得る。好適な成分が以下でより詳細に考察される。薬学的組成物は、水性懸濁液と、任意の選択された賦形剤と、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質又は発現カセットと、を含む。

特定の実施形態では、薬学的組成物は、導入遺伝子と、非ウイルス送達系と、を含む、発現カセットを含む。これには、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質又は脂質様粒子、キトサンベースの製剤、及び当該技術分野で既知であり、例えば、上記で引用されるＲａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒによって記載されている他のものが含まれ得る。他の実施形態では、薬学的組成物は、ウイルスベクター系において操作された導入遺伝子を含む発現カセットを含む懸濁液である。特定の実施形態では、薬学的組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターには、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は別の組換えパルボウイルス等の任意の好適な送達ベクターが含まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、それを必要とする患者に遺伝子産物を送達するための組換えＡＡＶである。

一実施形態では、薬学的組成物は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質、又はｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質のコード配列を含む発現カセットと、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）注射を介した送達に好適な製剤緩衝液と、を含む。一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノムパッケージング化組換えウイルスベクター（すなわち、融合タンパク質を保有するｒＡＡＶ．ｈＧＡＡ７８０Ｉ）の一部である。

一実施形態では、薬学的組成物は、酵素補充療法（ＥＲＴ）として対象に送達するために、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質、又はその機能的断片を含む。かかる薬学的組成物は、通常、静脈内投与されるが、いくつかの状況では、皮内、筋肉内、又は経口投与も可能である。組成物は、ポンペ病に罹患しているか、又はポンペ病のリスクがある個体の予防的治療のために投与することができる。治療用途のために、薬学的組成物は、確立された疾患に罹患している患者に、蓄積された代謝産物の濃度を低下させる、及び／又は代謝産物の更なる蓄積を防止若しくは阻止するのに十分な量で投与される。リソソーム酵素欠乏症のリスクがある個体について、薬学的組成物は、代謝産物の蓄積を防止又は阻害するのに十分な量で予防的に投与される。本明細書に記載の修飾ＧＡＡ組成物は、治療有効量で投与される。一般に、治療有効量は、対象における医学的状態の重症度、並びに対象の年齢、一般的状態、及び性別に応じて変化し得る。投薬量は、医師によって決定され得、
観察された治療の効果に適するように、必要に応じて調整することができる。一態様では、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質、又はその機能的断片の単位投薬量を含有するように製剤化されたＥＲＴのための薬学的組成物が、本明細書に提供される。

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理学的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され、投与時に再構築されてもよい。

一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、水性懸濁液中に溶解される界面活性剤、防腐剤、賦形剤、及び／又は緩衝剤を含む。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。別の実施形態では、緩衝液は、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）、例えば、エリオット製剤緩衝液、又はハーバード装置灌流液（最終イオン濃度（ｍＭ単位）：Ｎａ １５０、Ｋ ３．０、Ｃａ １．４、Ｍｇ ０．８、Ｐ １．０、Ｃｌ １５５の人工ＣＳＦ）である。様々な好適な溶液が既知であり、緩衝化生理食塩水、界面活性剤、約１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムに相当するイオン強度に調整された生理学的に適合する塩若しくは塩の混合物、又は同等のイオン濃度に調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含むものが含まれる。

適切には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～８、又はｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましい可能性があるが、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかしながら、より広範囲にある他のｐＨ、及びこれらの部分範囲が、他の送達経路のために選択され得る。

好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］等の一級ヒドロキシル基末端の二官能ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの）に続いて、３桁の数字を用いて命名され、初めの２桁の数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量の割合を与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。

一実施例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達では、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）であり、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａ
ｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達では、商業的に入手可能な希釈剤が懸濁化剤として、又は別の懸濁化剤及び他の任意選択的な賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。

他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。適切な浸透促進剤の例は、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、又はＥＤＴＡを含んでもよい。

更に、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載される核酸配列を含むベクターと、を含む、薬学的組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成物中に組み込むこともできる。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞等の送達ビヒクルが、本明細書に記載の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子等のいずれかに封入された送達のために製剤化され得る。一実施形態では、治療有効量の上述のベクターが、薬学的組成物に含まれる。担体の選択は、本発明を限定しない。防腐剤又は化学安定化剤等の他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定化剤としては、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。

「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。

本明細書で使用される場合、「投薬量」又は「量」という用語は、対象に治療の過程で送達される総投薬量若しくは総量、あるいは単一単位（又は複数単位若しくは分割投薬量）投与で送達される投薬量若しくは量を指し得る。

本明細書に記載の水性懸濁液又は薬学的組成物は、任意の好適な経路又は異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達されるように設計される。一実施形態では、薬学的組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、又は大槽内注射を介した送達用に製剤化される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、静脈内注射によって、それを必要とする対象に送達するために設計される。代替的に、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋肉内、及び他の非経口経路）を選択してもよい。

本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注射を介する、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間への注射による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内、後頭下／大槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰椎穿刺の手段によって、クモ膜下腔全体に拡散させるために導入され得る。別の例では、大槽内への注射であってもよい。大槽内送達は、ベクター拡散を増加させ、及び／又は投与によって引き起こされる毒性及び炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ
ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔ
ｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「大槽内送達（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」又は「大槽内投与（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、脳室の脳脊髄液への、又は小脳延髄槽内への直接的な薬物の投与経路、より詳細には、後頭下穿刺による、又は大槽内への直接注射による、又は永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。

一態様では、本明細書に記載されるベクターを製剤緩衝液中に含む薬学的組成物が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、複製欠陥ウイルス組成物は、ヒト患者にとって、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣ（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）、好ましくは１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣの範囲にある一定量の複製欠陥ウイルスを含有するように投薬量単位で製剤化され得る。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０９、又は９×１０^９ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、又は９×１０^１０ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、又は９×１０^１１ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、又は９×１０^１２ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、又は９×１０^１３ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、又は９×１０^１４ＧＣを含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、又は９×１０^１５ＧＣを含有するように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は分数量を含む、用量当たり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

一実施形態では、製剤緩衝液中に本明細書に記載されるｒＡＡＶを含む薬学的組成物が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。なお更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０^９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０^１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０^１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む薬学的組成物は、脳質量１グラム当
たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。

本明細書に記載の薬学的組成物中の組成物が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるよう意図されることを理解されたい。

治療方法
ポンペ病を有する患者を治療するための治療レジメンであって、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶ、及び／又はｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質を、任意選択的に免疫調節剤と組み合わせて含む、治療レジメンが提供される。特定の実施形態では、患者は、遅発性ポンペ病を有する。他の実施形態では、患者は、小児発症性ポンペ病を有する。特定の実施形態では、併用治療剤は、免疫調節レジメン等、発現カセット、ｒＡＡＶ、又はｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質と共に送達される。追加的に、又は代替的に、併用療法は、気管支拡張剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、呼吸筋力トレーニング（ＲＭＳＴ）、酵素補充療法、及び／又は横隔膜ペーシング療法のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、患者は、ｒＡＡＶの単回投与を受ける。特定の実施形態では、患者は、本明細書に記載の発現カセット及び／又はｒＡＡＶを含む組成物の単回投与を受ける。特定の実施形態では、有効量の発現カセットを含む組成物のこの単回投与は、少なくとも１つの併用治療剤を含む。特定の実施形態では、患者に、発現カセット、ｒＡＡＶ、及び／又はｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質、あるいは本明細書に記載されるように、実質的に同時に２つの異なる経路を介して投与される。特定の実施形態では、２つの異なる注射経路は、静脈内及び髄腔内投与である。一実施形態では、組成物は、懸濁液であり、対象に、脳室内、髄腔内、大槽内、又は静脈内に送達される。特定の実施形態では、アルファ－グルコシダーゼの欠損を有する患者は、本明細書に提供される組成物が投与されて、心筋機能、呼吸筋機能、及び／又は骨格筋機能のうちの１つ以上が改善する。特定の実施形態では、治療の結果として、心臓、ＣＮＳ（脳）、及び／又は骨格筋のうちの１つ以上における減少したグリコーゲン貯蔵及び／又はオートファジービルドアップが存在する。

特定の実施形態では、発現カセット、ｒＡＡＶ、ウイルス又は非ウイルスベクターが、医薬品の調製に使用される。特定の実施形態では、ポンペ病を治療するための組成物の使用が提供される。

これらの組成物は、他の療法と組み合わせて使用され得、例えば、免疫療法、酵素補充療法（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｓａｎｏｆｉ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって市販され、米国外ではＭｙｏｚｙｍｅとして市販されるＬｕｍｉｚｙｍｅ）が含まれる。ポンペ病の追加の治療は、対症療法であり、支持療法である。例えば、呼吸支援が必要とされ得、物理療法が、呼吸筋を強化するのに役立ち得、一部の患者は、夜間及び／又は昼間の間、機械的換気（すなわち、バイパップ、又はボリューム・ベンチレーター）を介した呼吸補助を必要とし得る。加えて、気道感染の際に追加の支援が必要とされ得る。一部の患者には、固定具を含む整形外科機器が推奨され得る。手術が、拘縮又は脊椎変形等の特定の整形外科的症状のために必要とされ得る。一部の乳児は、鼻を通って食道を下って胃の中に流れる栄養チューブ（経鼻胃管）の挿入を必要とし得る。一部の小児では、栄養チューブが、腹壁の小さな外科的開口部を介して胃に直接的に挿入されることが必要とされ得る。遅発性ポンペ病を有する一部の個体は、軟食を必要とし得るが、栄養チューブを必要とする個体はほとんどいない。

ＥＲＴは、古典的な乳児ポンペ病を有する患者において生存率を有意に改善するが、一部には、酵素がリソソームに到達するのを抑制するオートファジービルドアップに起因して、骨格筋病的状態を完全に回復に向かわせることができない。本明細書で提供される組成物は、筋肉病的状態を治療し、回復に向かわせるのに有効であることが示されている。
例えば、オートファゴソーム蓄積は、治療時に既存の病的状態を有する高齢ポンペマウスにおいて、完全に解消された。所見はまた、本明細書で提供されるベクターによる治療が、骨格筋における大きな筋線維の割合を有意に増加させ、小さな筋線維の割合を有意に減少させることができることを示す。したがって、典型的には、筋線維サイズ及びオートファジービルドアップ等の治療抵抗性の病的状態は、治療に応答性である。

特定の実施形態では、本明細書に定義されるのは、ポンペ病を有すると診断されているか、又はポンペ病を有することが疑われている患者において、異常な筋肉病的状態の進行を低減し、及び／又は異常な筋肉病的状態を回復に向かわせるための方法が提供される。特定の実施形態では、患者は、症候前である。他の実施形態では、患者は、疾患のより進行した病期を有する高齢の患者を含め、症候性になった後であり、治療は、ポンペ病の症状を改善すること（又は回復に向かわせること）を含む。特定の実施形態では、異常な筋肉病的状態は、ｉ）中心核を有する筋細胞の割合の上昇、ｉｉ）筋線維萎縮、ｉｉｉ）筋細胞線維における大小不同、ｉｖ）オートファジービルドアップ、ｖ）空胞化、及びｖｉ）筋力低下のうちの１つ以上を特徴とする。特定の実施形態では、方法は、患者の呼吸及び／又は動きを改善する。

本明細書に記載される場合、「増加する」（例えば、組織、血液等で測定したｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質による治療後のｈＧＡＡレベルが増加すること）、又は「減少する」、「低減する」、「軽減する」、「改善する」、「遅延する」という用語、又はそれらの任意の文法的変形、又は変化を示す任意の同様の用語は、別途指定されない限り、対応する参照（例えば、未治療の対照、又はポンペを有しない正常な状態の対象）と比較して、約５倍、約２倍、約１倍、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、又は約５％の変動を意味する。

「患者」又は「対象」は、本明細書で互換的に使用される場合、雄又は雌の哺乳動物を意味し、ヒト、獣医学用動物又は農業用動物、家庭用動物又は愛玩動物、並びに通常臨床研究に使用される動物が含まれる。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ヒト患者である。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、男性又は女性のヒトである。

一実施形態では、懸濁液は、約７．２８～約７．３２のｐＨを有する。

これらの用量及び濃度の送達のために好適な体積は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択されてもよいが、より大きな体積が、成人用に選択されてもよい。典型的には、新生児のために、好適な体積は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児のために、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの体積が選択され得る。プレティーン及び１０代のために、最大約５０ｍＬの体積が選択され得る。更に他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの体積での髄腔内投与を受けてもよく、これが選択されるか、又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬを受けてもよい。他の適切な体積及び投薬量が決定され得る。投薬量を調整して、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとり、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療適用に応じて変化し得る。

一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１４ＧＣの用量で投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇ当たり約１×１０^９ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約１×１０^１３ＧＣの用量で全身に同時投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１１ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約５×１０^１３ＧＣの投薬量で全身
に投与されるか、又は同時投与される。

一実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶ、又はｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質が送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、発現カセット、ｒＡＡＶ、若しくはｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質、又はそれらの組み合わせの量を指す。したがって、特定の実施形態では、本方法は、対象に、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質コード核酸配列の送達のためのｒＡＡＶ又は発現カセットを投与することを、本明細書に提供されるｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質酵素を含む組成物を投与することと組み合わせて含む。

一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノム中、その範囲及びエンドポイント内の全ての整数又は分数量を含む、脳質量１グラム当たり約１×１０^９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）の量で送達される。別の実施形態では、投薬量は、脳質量１グラム当たり１×１０^１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０^１３ＧＣである。特定の実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^９ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^９ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１０ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１０ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１１ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１１ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０^１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０^１３ＧＣ／ｇ、又は約１．０×１０^１４ＧＣ／ｇ脳質量である。

特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１１ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約５×１０^１３ＧＣの用量で全身に投与される。特
定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＩＣＭを介して、約１×１０^１２ＧＣ～約５×１０^１３ＧＣの投薬量で投与される。更に他の実施形態では、ｒＡＡＶは、静脈内及びＩＣＭ経路を介して同時投与され、患者は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１１ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約５×１０^１３ＧＣの投薬量（ＩＶ）、及び約１×１０^１２ＧＣ～約５×１０^１３ＧＣの投薬量（ＩＣＭ）を投与される。

一実施形態では、治療方法は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質の送達を酵素補充療法として含む。特定の実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質は、遺伝子療法（本明細書に提供される発現カセット又はｒＡＡＶを含むが、これらに限定されない）と組み合わせてＥＲＴとして送達される。特定の実施形態では、本方法は、対象に、１つより多いＥＲＴ（例えば、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質を、別の治療用タンパク質、例えば、Ｌｕｍｉｚｙｍｅと組み合わせて含む組成物）を投与することを含む。本明細書に記載のｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質を含む組成物は、対象に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれより長い日ごとに投与され得る。投与は、静脈内注入によって外来患者に、毎週、毎月、又は毎月２回の投与が処方され得る。適切な治療有効投薬量の化合物は、治療する臨床医によって選択され、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、及びおよそ２０ｍｇ／ｋｇ～およそ５０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの実施形態では、好適な治療用量は、例えば、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、及び１００ｍｇ／ｋｇから選択される。

特定の実施形態では、本方法は、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質を、患者に対して１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ患者体重又はそれ以上の投薬量で対象に投与することを含む。多くの場合、投薬量は１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇを超える。投薬量レジームは、１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ～１週間当たり少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇの範囲であることができる。典型的には、投薬量レジームは、１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり１５ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり２０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり２５ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり３０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり３５ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり４０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり４５ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり６０ｍｇ／ｋｇ、１週間当たり８０ｍｇ／ｋｇ、及び１週間当たり１２０ｍｇ／ｋｇである。好ましいレジームでは、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、又は４０ｍｇ／ｋｇが、週に１回、２回、又は３回投与される。治療は、典型的には、少なくとも４週間、時には２４週間、時には患者の生涯にわたって継続される。任意選択的に、ヒトアルファ－グルコシダーゼのレベルは、治療後に監視され（例えば、血漿又は筋肉中）、検出されたレベルが、正常な人における値より実質的に低くなるとき（例えば、２０％未満）、更なる投薬量が投与される。一実施形態では、ｈＧＡＡ７８０Ｉは、最初に「高」用量（すなわち、「負荷用量」）で投与され、その後、より低い用量（すなわち、「維持用量」）で投与される。負荷用量の例は、週に１～３回（例えば、１、２、又は３週間）、少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。維持用量の例は、少なくとも約５～少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ患者体重／週、又はそれ以上、例えば、２０ｍｇ／ｋｇ／週、３０ｍｇ／ｋｇ／週、４０ｍｇ／ｋｇ／週である。特定の実施形態では、投薬量は、投薬期間中に速度を増加させて投与される。そのようなことは、静脈内注入の流速を増加させることによって、又は一定の速度で投与されるｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質の濃度を増加させる勾配を使用することによって達成することができる。この手段での投与は、免疫原性反応のリスクを低減させ得る。特定の実施形態では、静脈内注入は、数時間（例えば、１～１０時間、好ましくは２～８時間、より好ましくは３～６時間）にわたって行われ、注入速度は、投与期間中に時々増加させる。

一実施形態では、本方法は、対象が免疫抑制性併用療法を受けることを更に含む。かかる併用療法のための免疫抑制剤としては、限定されないが、グルココルチコイド、ステロ
イド、抗代謝剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシン若しくはラパログ）、及び細胞分裂阻害剤（アルキル化剤、抗代謝剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、又はイムノフィリンに対して活性な薬剤を含む）が挙げられる。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体指向性抗体若しくはＣＤ３指向性抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－アルファ）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日前、又はそれ以前に開始され得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、遺伝子療法投与後に、同じ用量又は調整された用量で継続され得る。かかる療法は、必要に応じて、約１週間（７日間）、約６０日間、又はそれ以上であり得る。

一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットを含む組成物は、必要とする対象に１回投与される。特定の実施形態では、発現カセットは、ｒＡＡＶを介して送達される。本明細書に記載の組成物及び方法が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。

本明細書に提供される組成物及び方法は、乳児発症性ポンペ病若しくは遅発性ポンペ病及び／又はそれらに関連する症状を治療するために使用され得る。特定の実施形態では、有効性は、疾患の１つ以上の症状の改善又は疾患進行の遅延によって決定することができる。乳児発症性ポンペ病の症状には、筋緊張低下、呼吸器／呼吸障害、肝腫大、肥大性心筋症、並びに心臓、筋肉、ＣＮＳ（特に運動ニューロン）におけるグリコーゲン貯蔵が含まれるが、これらに限定されない。遅発性ポンペ病の症状には、近位筋力低下、呼吸器／呼吸障害、並びに筋肉及び運動ニューロンにおけるグリコーゲン貯蔵が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、患者の状態及び／又は診断に基づいて決定され得る。特定の実施形態では、乳児発症性ポンペ病又は遅発性ポンペ病を有すると診断された患者の治療のための方法であって、ｈＧＡＡ７８０Ｉ融合タンパク質の送達のために、ＩＶ経路及びＩＣＭ経路の組み合わせを介して本明細書に記載されるｒＡＡＶを投与することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、遅発性ポンペ病を有すると特定された患者は、ｒＡＡＶの全身送達のみ（例えば、ＩＶのみ）を含む治療を投与される。本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶを含む組成物の送達は、酵素補充療法（ＥＲＴ）との組み合わせであることができる。特定の実施形態では、ポンペ病を有すると診断された対象を治療するための方法であって、ＥＲＴと組み合わせた本明細書に記載されるｒＡＡＶのＩＣＭ送達を含む、方法が提供される。特定の実施形態では、乳児発症性ポンペ病を有すると特定された対象は、ＩＣＭ注射を介して本明細書に記載のｒＡＡＶが投与され、また末梢疾患の態様の治療のためにＥＲＴを受ける。

「核酸」は、本明細書に記載されるように、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はその修飾であってもよく、一本鎖又は二本鎖であってもよく、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補的ＰＮＡ（ｐｃ－ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）等を含む群から選択され得る。そのような核酸配列には、例えば、限定されないが、転写リプレッサー、アンチセンス分子、リボザイム、小さな阻害性核酸配列、例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして機能する、タンパク質をコードする核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。

タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドを「逆翻訳する」ための方法は、当業者に既知である。タンパク質の配列が分ると、ウェブベース及び市販のコンピュータプログラム、並びにアミノ酸配列を核酸コード配列に逆翻訳するサービスベースの企業が存在する。
例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔでオンライン入手可能）、Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｓｍｓ＿－ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌでオンライン入手可能）、ＥｘＰａｓｙ（オンライン入手可能なｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。一実施形態では、ＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡコード配列は、ヒト細胞における最適な発現のために設計される。

核酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、又は「同一なパーセント」という用語は、対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、又は、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたってもよく、これが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。

同一性パーセントは、タンパク質の全長、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、若しくはそのペプチド断片にわたるアミノ酸配列、又は対応する核酸配列コード配列について容易に決定され得る。好適なアミノ酸断片は、長さが少なくとも約８個のアミノ酸であり得、最大で約７００個であり得る。一般に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、又は「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、又は「類似性」は、「アラインメントされた」配列を参照して決定される。「アラインメントされた」配列又は「アラインメント」とは、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損又は追加塩基又はアミノ酸についての補正を含む。

アラインメントは、公共の、又は市販のいずれかの様々な多重配列アラインメントプログラムを用いて行われる。配列整列プログラムは、アミノ酸配列に対して利用可能であり、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムが挙げられる。一般的に、これらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者は、これらの設定を必要に応じて変更し得る。代替的に、当業者は、参照のアルゴリズム及びプログラムによって提供されるものと少なくとも同じレベルの同一性又はアラインメントを提供する、別のアルゴリズム又はコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

多重配列アラインメントプログラムもまた、核酸配列に対して利用可能である。かかるプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能である。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。代替的に、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会及び検索配列の間の最良の重複領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、本明細書に参考として組み込まれる、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１で提供される、そのデ
フォルトパラメータ（ワードサイズ６及びスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）を用いるＦａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。

本明細書で使用される場合、「調節配列」又は「発現制御配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列等の核酸配列を指し、それらが操作可能に連結されるタンパク質コード核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、さもなければ制御する。

核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される「外因性」という用語は、核酸又はタンパク質が、染色体又は宿主細胞に存在する位置では、天然に発生しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ宿主細胞又は対象に由来し、それらに挿入されるが、非天然状態（例えば、異なるコピー数、又は異なる調節要素の制御下）で存在する配列を指す。

核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される場合、「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、それが発現される宿主細胞若しくは対象とは異なる生物又は同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。「異種」という用語は、タンパク質、又はプラスミド、発現カセット、若しくはベクターにおける核酸と関連して使用される場合、タンパク質又は核酸が、問題となるタンパク質又は核酸が天然には互いに同じ関係で認められない別の配列若しくはサブ配列で存在することを示す。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の構成要素又は方法ステップを含むことを意味する用語である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、関連する実施形態は、他の構成要素又は方法ステップを除外する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ
ｏｆ）」という用語、及び実施形態又は発明の性質を実質的に変化させる任意の構成要素又は方法ステップを除外する「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を使用する記述を含むことを理解されたい。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、様々な状況下では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して記載されることも理解されるべきである。

本明細書で使用される場合、「ｅ」の後に数値（ｎｎ）が続く用語は、指数を指し、この用語は、「×１０ｎｎ」と互換的に使用される。例えば、３ｅ１３は、３×１０^１３に相当する。

「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」は、１つ以上のベクターを表すと理解されることを留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照からプラス又はマイナス１０％の可変性を意味する。

ここで、以下の実施例を参照しながら、本発明を説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明がこれらの実施例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

実施例１：材料及び方法：
ベクター産生
７８０にＶａｌを有する参照ＧＡＡ配列、及びＶ７８０Ｉ変異を有する配列を逆翻訳し、ヌクレオチド配列を操作して、ＣＡＧプロモーター下での発現カセットを使用したＡＡＶ産生のためのシスプラスミドを生成した。加えて、天然のｈＧＡＡのｃＤＮＡ配列（参照配列）を、非操作配列との比較のために同じＡＡＶ－シス骨格にクローニングした。以前に記載されているように、ＡＡＶｈｕ６８ベクターを産生し、滴定した（Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１（１０）：１２５９－１２７１）。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を収集して濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように、ウサギベータ－グロビンポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、ドロップレットデジタルＰＣＲで滴定した（Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（２）：１１５－１２５）。

動物
マウス
ポンペマウス（Ｇａａノックアウト（－／－）、Ｃ５７ＢＬ／６／１２９バックグラウンド）ファウンダーは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ（ストック番号００４１５４、また６ｎｅｏマウスとしても知られている）から購入した。育種コロニーを遺伝子療法プログラムＡＡＡＬＡＣ認定のバリアマウス施設で維持し、ヘテロ接合体を使用してヘテロ接合体交配させ、同腹子内でヌル対照及びＷＴ対照を産生した。Ｇａａノックアウトマウスは、ポンペ病のために幅広く使用されるモデルである。これらは、心臓、中枢神経系、骨格筋、及び横隔膜にリソソームグリコーゲンの進行性蓄積を示し、移動性が低下し、進行性筋力低下を伴う。小サイズ、再現可能な表現型、及び効率的な育種は、インビボでの前臨床候補スクリーニングに最適である迅速な試験を可能にする。

動物飼育室を、６４～７９°Ｆ（１８～２６℃）の温度範囲、３０～７０％の湿度範囲で維持した。

動物を、離乳するまで、親及び同腹仔と共に飼育し、次いで、Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＴＲＬ）ＧＴＰビバリウムにおいて、１ケージ当たり２～５匹の動物の標準的なケージに飼育した。全てのケージサイズ及び飼育条件は、実験動物の管理及び使用に関するガイド（ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に準拠している。ケージ、水ボトル、及び床敷は、バリア施設内でオートクレーブ処理される。

自動制御の１２時間の明暗サイクルが維持された。各暗期間は、１９時（±３０分）に開始した。飼料は、自由摂食で提供された（Ｐｕｒｉｎａ、ＬａｂＤｉｅｔ（登録商標）、５０５３、放射線処理済み、ＰｉｃｏＬａｂ（登録商標）、Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０、２５ｌｂ）。水は、各飼育ケージ内に個別に配置された水ボトルを介して、全ての動物が自由にアクセスできた。最低限、水ボトルは、毎週のケージ交換の際、週に１回交換された。上水道はフィラデルフィア市から引かれ、Ｇｅｔｉｎｇｅ浄水器を使用して塩素化された。塩素化レベルは、ＵＬＡＲによって毎日試験され、２～４百万分率（ｐｐｍ）で維持される。Ｎｅｓｔｌｅｔｓ（商標）がエンリッチメントとして各飼育ケージに提供された。

インビボ試験及び組織学
マウスに、外側尾静脈（ＩＶ）を介して、０．１ｍＬ中の５×１０^１１ＧＣ（およそ２
．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）の用量、又は５×１０^１０ＧＣ（およそ２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）の用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ｈＧＡＡ（種々のｈＧＡＡ構築物）を投与し、血清単離のためにベクター投薬から７日後及び２１日後に出血させ、（血漿単離のために）末端出血させ、注射から２８日後に放血によって安楽死させた。脳から開始して、組織を速やかに収集した。

組織学のための組織をホルマリン固定し、標準的な方法を使用してパラフィン包埋した。脳及び脊髄切片を、ルクソールファーストブルー（ルクソールファーストブルー染色キット、Ａｂｃａｍ ａｂ１５０６７５）で染色し、末梢器官を、組織中のグリコーゲン等の多糖類を検出するための標準方法を使用して、ＰＡＳ（過ヨウ素酸シッフ）で染色した。ｈＧＡＡの免疫染色を、ホルマリン固定したパラフィン包埋試料について行った。切片を脱パラフィン化し、抗原回収のために１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で沸騰させ、ＰＢＳ＋０．２％トリトン中の１％ロバ血清で１５分間ブロッキングし、次いで、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（Ｓｉｇｍａ ＨＰＡ０２９１２６抗ｈＧＡＡ抗体）及びビオチン化二次抗体と連続的にインキュベートし、ＨＲＰベースの比色反応を使用してシグナルを検出した。

スライドは、委員会認定の獣医病理学者によって盲検で審査された。半定量的スコアリングシステムを確立して、貯蔵及び／又は空胞を提示する細胞の総割合によって決定されるような、筋肉内のポンペ関連組織学的病変（グリコーゲン貯蔵及びオートファジービルドアップ）の重症度を測定した。
貯蔵の組織学的スコアリング
０ ０％
１ １～９％
２ １０～４９％
３ ５０～７４％
４ ７５～１００％

該当する場合、ベクター関連組織病理学的病変も推定した。

非ヒト霊長類
ベクター投与のために、アカゲザルを、筋肉内デクスメデトミジン及びケタミンで鎮静させ、単回の大槽内（ＩＣＭ）注射又は静脈内注射を行った。ＩＣＭ注射のための針の配置は、前述のように、透視装置（ＯＥＣ９８００ Ｃ－Ａｒｍ，ＧＥ）を用いた脊髄造影法により検証した（Ｋａｔｚ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１８ Ｏｃｔ；２９（５）：２１２－２１９を参照されたい）。動物は、バルビツール酸過剰投与により、安楽死させた。収集した組織を、即時にドライアイス上で凍結するか、又は組織学のために１０％ホルマリンで固定した。

インビトロにおけるｈＧＡＡ７８０Ｉ酵素性能の特性評価
ＧＡＡ活性
ホモジナイズした組織の血漿又は上清を、５．６ｍＭの４－ＭＵ－α－グルコピラノシド（ｐＨ４．０）と混合し、３７℃で３時間インキュベートした。０．４Ｍの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．５）を用い、反応を停止させる。相対蛍光単位ＲＦＵは、Ｖｉｃｔｏｒ３蛍光計を３５５ｎｍの励起光及び４６０ｎｍの発光で使用して測定する。ｎｍｏｌ／ｍＬ／時間の単位での活性は、４－ＭＵの標準曲線からの補間によって計算される。個々の組織試料中の活性レベルは、ホモジネート上清中の総タンパク質含有量に対して正規化される。等体積が血漿試料について使用される。

ＬＣ／ＭＳによるＧＡＡシグネチャーペプチド
血漿を１００％メタノール中で沈殿させ、遠心分離する。上清は廃棄する。ペレットに、内部標準としてｈＧＡＡに特有の安定同位体標識ペプチドをスパイクし、トリプシンと共に再懸濁させ、３７℃で１時間インキュベートする。消化は、１０％ギ酸で停止させる。ペプチドを、Ｃ－１８逆相クロマトグラフィーによって分離し、ＥＳＩ－質量分析によって同定及び定量化する。血漿中の総ＧＡＡ濃度は、シグネチャーペプチド濃度から計算される。

細胞表面受容体結合アッセイ
９６ウェルプレートを、受容体でコーティングし、洗浄し、ＢＳＡでブロッキングする。ｒｈＧＡＡ又は操作されたＧＡＡのいずれかの等しい活性を含有するＣＨＯ培養馴化培地又は血漿を、３倍に連続的に希釈して、９系列の減少させた濃度を得て、共結合した受容体と共にインキュベートする。インキュベーション後、プレートを洗浄して、結合していないＧＡＡを除去し、４－ＭＵ－α－グルコピラノシドを３７℃で１時間かけて添加する。反応は、１．０Ｍのグリシン、ｐＨ１０．５で停止させ、ＲＦＵは、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ蛍光計、励起３７０、発光４６０によって読み取られた。各試料のＲＦＵは、４－ＭＵの標準曲線からの補間によってｎｍｏｌ／ｍＬ／時間に変換される。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して非線形回帰を行う。

グリコーゲン－ＴＦＡ加水分解
組織ホモジネートを、４ＮのＴＦＡで４時間、１００℃で加水分解し、乾燥させ、水中で再構成する。加水分解された材料を、パルスアメロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）を備えた高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィーによるグルコース決定のために、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ－１０ ２×２５０ｍｍカラムに注入する。各試料中の遊離グルコースの濃度は、グルコース標準曲線からの補間によって計算される。最終データは、μｇグリコーゲン／ｍｇタンパク質として報告される。

実施例２：ポンペマウスにおけるｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＡベクターの評価
ＡＡＶベクターを、ポンペマウスへのＩＶ送達のために滅菌ＰＢＳ中で希釈した。試験物品には、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ｈＧＡＡｃｏ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏ．ｒＢＧ、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧ、及びＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ｓｐ７ｃｏ．Δ８．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧが含まれていた。野生型及びビヒクル対照を試験に含めた。

ｈＧＡＡタンパク質の発現及び活性を、肝臓（図１Ａ、図１Ｂ）、心臓（図２Ａ、図２Ｂ）、四頭筋（図３Ａ、図３Ｂ）、脳（図４Ａ、図４Ｂ）、血漿（図９Ａ）を含む、治療マウスから収集した様々な組織で測定した。全てのプロモーターは、低用量及び高用量の両方で、肝臓において等しく十分に役割を果たした。ＵｂＣプロモーターの下で発現するベクターの投与は、両方の用量で骨格筋において、より低い活性をもたらし、ＣＡＧプロモーターを有するベクターは、最高の全体的な活性を有していた。ＵｂＣプロモーターを有するベクターはまた、両方の用量で心臓において、より低い活性を有していた。

ポンペマウスビヒクル（ＰＢＳ）対照（図５Ｄ）は、心臓において、顕著なグリコーゲン貯蔵（ＰＡＳ染色切片上の暗い染色）を示した。野生型マウス及びベクター治療された全てのマウスは、貯蔵のほぼ完全なクリアランスから、完全なクリアランスまでを有していた。しかしながら、ｈＧＡＡ参照配列（Ｖ７８０）をコードするベクターを受けた２つの群は、ｈＧＡＡ天然導入遺伝子を受けた８匹の動物のうちの７匹、並びにＢｉＰ及びｖＩＧＦ２修飾を有する操作されたｈＧＡＡを受けた８匹のうちの３匹に存在する、中等度から顕著な線維化リンパ性心筋炎を示した（図５Ｂ及び図５Ｃ）。ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ酵素を受けたマウスのいずれも心筋炎を有さなかったため（図５Ｅ、図５Ｆ、及び図５
Ｇ）、この病変は、ベクター関連であり、より具体的には、ｈＧＡＡ参照配列特異的であると考えられた。

四頭筋組織の分析により、野生型マウス及びＶ７８０Ｉバリアントをコードするベクターで治療された全てのマウスは、更なる修飾の有無にかかわらず、貯蔵及びオートファジービルドアップのほぼ完全なクリアランスから、完全なクリアランスまでを有していることが明らかになった（図６Ａ～図６Ｈ）。しかしながら、ｈＧＡＡＶ７８０の参照配列をコードするベクターを受けた２つの群は、最小限から中程度までの残存するグリコーゲン貯蔵とオートファジービルドアップを有しており（図１０）、これらを合わせて、ポンペ病の２つの主要な特徴の最適未満の矯正を示している。最良の転帰は、その天然形態又はＢｉＰ－ｖＩＧＦ２修飾のいずれかで、Ｖ７８０Ｉバリアントをコードする２つのベクターの送達から観察された。ｓｐ７－デルタ８修飾は、ポンペ病に起因する組織学的病変の一貫した矯正をもたらすように見えた。参照ｈＧＡＡＶ７８０配列をコードする両方の構築物は、グリコーゲン貯蔵及びビルドアップを消失させる際に最適未満であった。

高用量のＩＶ投与（５×１０^１１＝２．５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）において、ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ及びＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉは、四頭筋においてほぼ正常なグリコーゲンレベルを示し、細胞内へのｈＧＡＡの取り込みが著しく良好であった（図７Ａ～図７Ｈ及び図４２）。前脛骨筋（ＴＡ）及び腓腹筋を含む他の骨格筋の評価は、同様の結果を示した（Ｖ７８０Ｉを有するバリアント、並びにグリコーゲン及び中心オートファジー空胞の両方のクリアランス）。全ての構築物が、心臓内のグリコーゲン貯蔵を低減させ、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ投与が、最小レベルをもたらした。四頭筋におけるグリコーゲンレベルは、ほぼ正常であったが、ＰＡＳ染色はいくらかの差を示し、ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ及びＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉは、最良の結果を示した。免疫組織化学は、投与されたマウスにおける骨格筋、心臓、及び脊髄におけるｈＧＡＡの発現を確認した（図４３）。

低用量のＩＶ投与（５×１０^１０＝２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ）において、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉは、心臓及び四頭筋において、天然のｈＧＡＡＶ７８０Ｉよりも良好なグリコーゲン低減を示した（図４１）。脳及び脊髄におけるグリコーゲンレベルは、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉでほぼ正常であり、組織レベルが約１５％であるが、これはおそらく、より優れた標的化によるものであった。ＣＮＳでは、操作された構築物とＶ７８０Ｉバリアントとの間の強力な相乗効果が観察された。ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩのみがＣＮＳグリコーゲンをクリアランスした。

図８に示されるように、脊髄組織学の評価は、ＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉで治療されたマウスが、グリコーゲン貯蔵のほぼ完全なクリアランスを有しており、一方で、参照ｈＧＡＡＶ７８０酵素をコードするベクターで治療されたマウスが、残存するグリコーゲン貯蔵を有していたことを示した。脳及び脊髄切片の染色はまた、ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉによる矯正を明らかにしたが、天然ｈＧＡＡＶ７８０酵素による矯正は明らかにしなかった（図４２）。その結果は、Ｖ７８０Ｉ変異及びＢｉＰ－ｖＩＧＦ２修飾の両方の寄与を示す。

実施例３：ポンペマウスのｈＧＡＡ発現に対する、ＤＲＧ非標的化の効果
ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉを、４つのｍｉＲ１８３標的部位（ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３、配列番号３０）を含むように修飾し（図１１）、ＡＡＶｈｕ６８カプシドにパッケージングした。

ベクターゲノムは、以下の配列要素を含む。

逆位末端反復（ＩＴＲ）：ＩＴＲは、ベクターゲノムの全ての構成要素に隣接するＡＡＶ２（１３０ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１）に由来する同一の逆相補配列である。ＩＴＲは、ＡＡＶ及びアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターＤＮＡ複製の起点及びベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノム複製及びパッケージングに必要な唯一のシス配列を表す。

ＣＡＧプロモーター：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ニワトリベータ－アクチン（ＣＢ）プロモーター（２８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）、及びウサギベータ－グロビンイントロンからなるハイブリッド構築物。

コード配列：ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ（配列番号３１）をコードする、操作されたｃＤＮＡ（配列番号３０のｎｔ１１４１～４０９２）。

ｍｉＲ標的配列：４つのタンデムｍｉＲ－１８３標的配列（配列番号２６）。

ウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（ｒＢＧポリＡ）：ｒＢＧポリＡシグナル（１２７ｂｐ）は、シスで導入遺伝子のｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化を促進する。この要素は、転写終結、新生転写産物の３’末端での特異的切断事象、及び長いポリアデニレートテールの付加のためのシグナルとして機能する。

ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２－ｈＧＡＡｃｏＶ７８０ＩベクターゲノムにｍｉＲ１８３標的部位を導入する効果を、ポンペマウスへのＡＡＶｈｕ６８のＩＶ送達後に評価した。ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ構築物（ｍｉＲ１８３標的を含まない）で観察されるように、ｍｉＲ１８３標的配列を含むベクターを高用量静脈内投与した後、ＣＮＳにおいてグリコーゲン貯蔵が矯正された（図１２及び図１３）。四頭筋におけるグリコーゲン貯蔵及びオートファジービルドアップは、高用量静脈内投与後に完全に矯正されたが、一方で、低用量投与後にグリコーゲン貯蔵の矯正及びオートファジービルドアップの部分的な矯正が観察された（図１４）。低用量及び高用量の両方で、心臓においてもグリコーゲン貯蔵の矯正が観察された（図１５）。ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉの投与で観察されたものと同様に、オートファジービルドアップは、高用量で完全に解消され、低用量で顕著に減少した（図１６）。その結果は、ｍｉＲ１８３標的の添加が、ｍｉＲ標的配列を有しない対応するベクターと比較して、治療用導入遺伝子の有効性を改変しなかったことを確認した。

用量範囲研究を実施して、ＩＶ投与後のＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３構築物の有効性プロファイル及びＭＥＤを決定した。治験設計を以下の表に提供する。

ＡＡＶｈｕ６８．ＢｉＰ－ｖＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．４ｘｍｉｒ１８３ベクターのＩＶ投与から６０日後に、筋肉病的状態を、ＰＡＳ染色筋肉切片についてスコア付けした。四頭筋切片を、ＷＧＡ（細胞膜、筋線維直径の測定を可能にするため）、ＤＡＰＩ（核、中心核の存在を定量化するため）、及びＬＣ３ｂ抗体（オートファゴソーム、オートファジービルドアップを定量化するため）による染色を使用して、免疫組織化学によって分析した。切片をスキャンし、自動的にデジタル化し、次いでＶｉｓｉｏｐｈａｒｍソフトウェアを使用して分析した。

中心核定量化
健康な筋線維は、中心核（ＣＮ）を含有することはほとんどなく（ＷＴ筋では３％未満）、ＣＮの存在は、筋肉再生を示す。ＣＮを有する線維の割合は、ＷＴとＫＯ ＰＢＳ対照との間で有意に異なっていた（図４３）。ＫＯ－ＰＢＳ対照マウスと比較して、ＣＮを有する線維の割合は、２×１０^１１ＧＣ（１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）及びより高いベクター用量で治療した群において、有意に減少した。若いマウスでは、ＣＮを増加させる変性／再生サイクルは、試験の開始前には生じておらず、ポンペマウスにおける表現型矯正をもたらす治療によって防止された。

ＬＣ３ｂ定量化
生産的オートファジーの通常の条件下では、オートファゴソームは、リソソームによって速やかに分解され、ＬＣ３陽性構造はほとんど検出することができない。ＧＡＡ ＫＯマウスでは、損傷した／機能不全のリソソームは、オートファジーの増加を引き起こす可能性があり、リソソームは、オートファゴソームと融合し、その内容物を分解することができず、オートファジービルドアップを引き起こす。

５×１０^１１ＧＣ（２．５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）から始まる全ての用量で、オートファジービルドアップ（ＬＣ３ｂ＋細胞の％）を防止した（図４４）。有意なオートファゴソームビルドアップは、３ヶ月齢のＰＢＳ対照で観察された（線維の２０％を超える）。

直径が小さい四頭筋線維の定量化
野生型対照動物と比較した場合の繊維サイズの違いを定量化するために、繊維直径を、小（３０ｕｍ未満）、中（３０～５０ｕｍ）、及び大（５０ｕｍ超）のクラスに割り当てた。ＫＯ ＰＢＳ対照は、３ヶ月齢で有意な萎縮を示す。ＫＯ ＰＢＳ群と比較して、大きな四頭筋線維の割合に有意な増加が認められ、小さな四頭筋線維の割合に有意な減少が認められた（図４５）。小さな線維（Ｓ）の割合は、２×１０^１１ＧＣ（１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）、及びそれより多い用量で治療されたＧＡＡ－／－マウスにおいて有意に減少し、このことは、筋萎縮予防を示している。

空胞化の重症度
結果は、評価した全ての筋肉におけるリソソーム貯蔵の用量依存的矯正を示した（図４６Ａ～図４６Ｆ）。矯正は、ヒラメ筋及び横隔膜において試験された最低用量（５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、１×１０^１１ＧＣ）で達成され、一方で、試験された他の筋肉のほとんどは、２×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ（５×１０^１１ＧＣ）の中間用量で、ＧＡＡ ＫＯ ＰＢＳ対照マウスと比較して有意に改善された。筋肉病的状態は、まったく存在せず、切片は、５×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ（１×１０^１２ＧＣ）及び１×１０^１４ＧＣ／Ｋｇ（２×１０^１２ＧＣ）の２つの最高用量について、ＷＴマウス筋肉と同様に見えた。

実施例４：症候性になった後の高齢ポンペマウスにおける投与経路及び用量試験
投与経路及び用量の効果を、静脈内（ＩＶ）及び／又は脳室内（ＩＣＶ）注射を介してｈＧＡＡコードＡＡＶｈｕ６８ベクター（例えば、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ｖ
ＩＧＦ２．ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ．ｒＢＧを含む）を投与されたポンペマウス（並びに野生型及びビヒクル対照）において評価した。同じベクターを使用した二重経路の投与アプローチ（静脈内及び脳脊髄液への注射）は、疾患の末梢及び神経学的徴候を矯正するであろう。遺伝子療法の対象となる患者のかなりの割合が既に進行した病的状態を有しているため、症候性になった後のポンペマウス（６～７ヶ月齢）を治療し、治療後少なくとも６ヶ月間追跡することを選択した。

マウスは、静脈内（ＩＶ）、脳室内（ＩＣＶ）、又は二重経路の投与のいずれかを使用して、２つの用量レベル（低用量又は高用量）のベクターを受けた。本試験で使用される用量（５×１０^１０又は１×１０^１１ＧＣ ＩＣＶ、及び１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ又は５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ ＩＶ）は、実施例６に記載のＮＨＰ試験で使用される低用量及び高用量、並びにヒトへの投与に適した用量（１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ及び５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）に対応する。マウスを、１３～１４ヶ月齢で、注射からおよそ２１０日後に安楽死させ、分析用に組織を収集した。図４７に、試験設計が提供されている。

一連の試験中に、ロータロッド、ワイヤーハング、及び握力評価を使用して、マウスの運動活性を試験し、プレチスモグラフィーを実施した。ｈＧＡＡタンパク質の発現／活性及びグリコーゲン貯蔵を、血漿、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、及び脳を含む、治療されたマウスから収集された様々な組織で測定した。組織学を実施して、例えば、ＰＡＳ（ルクソールファーストブルー染色を介して）、ｈＧＡＡ発現、及び神経炎症（星細胞増加症）を評価した。組織切片を染色して、オートファジービルドアップ又はクリアランスを評価した（例えば、ＬＣ３Ｂを標識する抗体を使用して）。

組織学的試験は、高用量及び低用量のＩＣＶ治療マウス（図２８）、並びに高用量及び低用量のＩＶ治療マウス（図２９）からの四頭筋、心臓、及び脊髄の試料に対して行われた。グリコーゲン貯蔵は、ＩＣＶ経路を介して低ベクター用量又は高ベクター用量を受けたマウスの脊髄において矯正された。高用量のＩＶ投与は、四頭筋、心臓、及び脊髄におけるグリコーゲン貯蔵を矯正するのに有効であった。

低用量及び高用量の両方でＩＣＶ及びＩＶベクター（二重経路の投与）の組み合わせで治療された雄では、体重が有意に矯正された（図２５Ａ）。単一経路（ＩＶ単独又はＩＣＶ単独）は、体重を有意に矯正しなかった。体重は、雌のポンペとＷＴマウスとの間で差はなかった（図２５Ｂ）。

握力は、高用量ＩＶを受けたマウスについて（ベースラインと比較して、かつＰＢＳ対照と比較して）有意に改善された（図２６）。低用量のＩＣＶ及びＩＶ投与ベクター、又は二重経路の投与（ＩＣＶ ＬＤ＋ＩＶ ＬＣ）に対して有意な利益はなかった。しかしながら、高用量ＩＶ及びＩＣＶの組み合わせの投与は、注射から３０日後に早くも野生型レベルまで強度がレスキューされ、１８０日目には組み合わせの増分利益があった（図２７）。

ポンペ病関連所見を調べるために、異なる群にわたって筋肉病的状態を調査した。ポンペ病患者及び６^ｎｅｏＧＡＡ ＫＯポンペマウスモデルからの筋肉は、線維萎縮、大小不同、オートファジービルドアップ、及び中心核形成等の構造異常の存在によって特徴付けられる（図４８）。

中心核定量化
６ヶ月後に治療されたマウスでは、治療前にすでに変性／再生サイクルが生じていた（図４９）。

ＬＣ３ｂ定量化
既存の病的状態を有するポンペマンスの治療は、ＩＶ ＨＤ（１×１０^１２ＧＣ＝５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ）、及びＩＣＶ＋ＩＶ ＨＤ（ＩＣＶ１×１０^１１ＧＣ及びＩＶ１×１０^１２ＧＣ）群におけるオートファゴソーム蓄積を回復に向かわせた（図５０）。

四頭筋線維の直径の定量化
６ヶ月後に治療されたマウスでは、筋萎縮が既に顕著である場合、ＩＣＶ＋ＩＶ ＨＤ治療群（ＩＣＶ１ｘ１０^１１ＧＣ及びＩＶ１ｘ１０^１２ＧＣ＝１ｘ１０^１３ＧＣ／ｋｇ）において、小さい線維（Ｓ）の割合が減少し、ＩＶ ＨＤ及びＩＣＶ＋ＩＶ ＨＤ治療群において、大きい線維（Ｌ）の割合が改善した（図５１）。この治療群では、筋繊維のサイズ分布は、ＷＴマウスと同様であり、ＰＢＳ対照ポンペマウスと比較して、統計的に有意にレスキューされ、このことは、この進行した疾患の症候性になった後の治療パラダイムにおける既存の病的状態のレスキューを示している。その結果は、図２７に示されるように、同じ群のＷＴレベルへの握力のレスキューと相関関係にある。ＨＤ ＩＶ治療はまた、大きな線維の割合が増加し、萎縮性線維が減少する傾向を有しつつ、病的状態の改善につながった（図５１）。

所見は、疾患の全ての態様を標的とするよりも、二重経路の投与が好ましいことを裏付けている。ベクターの送達は、線維の萎縮及びオートファジービルドアップ等の典型的に治療抵抗性であるという所見を含む、高齢の症候性になった後のポンペマウスにおける既存の筋繊維病的状態を回復に向かわせた。

実施例５：非ヒト霊長類へのＤＲＧ非標的化遺伝子療法ベクターの投与
ＮＨＰ霊長類試験を行い、ＡＡＶｈｕ６８カプシドにおけるＣＡＧ．ＢｉＰ－ＩＧＦ２－ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ又はＣＡＧ．ＢｉＰ－ＩＧＦ２－ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ－４ｘｍｉｒ１８３の毒性を評価し、ＩＣＭ送達を評価した。ベクターを３×１０^１３ＧＣ／ｋｇでＩＣＭ注射し、３５日目に動物を安楽死させた。

ｍｉＲ１８３の４つのタンデム反復の添加は、頸部ＤＲＧの感覚ニューロンにおけるｈＧＡＡ導入遺伝子の発現を抑制した（図１７）。ｈＧＡＡ導入遺伝子の発現の顕著な減少は、ｍｉｒ１８３ベクターについての腰部ＤＲＧの感覚ニューロンにおいても観察されたが、いくつかの発現が残った（図１８）。驚くべきことに、ｍｉＲ１８３標的配列の存在は、運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を改変せず（図１９）、このことは、ベクターの投与が、ポンペ病患者の運動ニューロンにおけるグリコーゲン貯蔵を低減するのに有益であることを示唆する。加えて、ｍｉＲ１８３標的配列含有構築物の送達後の心臓における導入遺伝子発現の減少はなかった（図２０）。実際、心臓での発現が増加しているように見え、有効性がポンペ病患者の心臓疾患治療で高められることが示唆された。特に、ｍｉＲ１８３標的配列のタンデム反復は、頸部及び胸部セグメントからのＤＲＧの感覚ニューロンにおける毒性を低下させた（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。この用量レベルでの腰部セグメントにおける毒性の低下は存在せず（図２１Ｃ）、これは、図１８に示されるように、腰部レベルでの残存タンパク質発現に起因する可能性がある。

以下の表に、ｍｉＲ１８３標的配列を有する構築物のＮＨＰへのＩＶ送達を更に評価するための試験設計を提供する。この試験は、非自己免疫応答の潜在的な影響を評価するためのアカゲザルＧＡＡ（ｒｈＧＡＡ）配列を含む。

更に、ＣＡＧ．ＢｉＰ－ＩＧＦ２－ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉ－４ｘｍｉｒ１８３ベクターの安全性プロファイルを、用量範囲試験を使用して評価する。用量範囲試験におけるＮＨＰは、３×１０^１２ＧＣ、６×１０^１２ＧＣ、及び１×１０^１３ＧＣを含む、様々な用量でＩＣＭに投与される。

実施例６：非ヒト霊長類における投与経路試験
ＮＨＰ霊長類試験を実施して、毒性を評価し、ベクター投与の代替的経路又は組み合わせた経路を評価した。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＡＧ．ＢｉＰ－ＩＧＦ２－ｈＧＡＡｃｏＶ７８０Ｉを、５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ（高用量）若しくは１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ（低用量）をＩＶ投与したか、又は３×１０^１３ＧＣ（高用量）若しくは１×１０^１３ＧＣ（低用量）でＩＣＭ投与した。二重経路の投与の実現可能性及び毒性はまた、例えば、組み合わせたＩＶ及びＩＣＭ用量（ＩＶ ５×１０^１３ＧＣ／ｋｇ＋ＩＣＭ ３ｘ１０^１３ＧＣ又はＩＶ １ｘ１０^１４ＧＣ／ｋｇ＋ＩＣＭ １ｘ１０^１３ＧＣ／ｋｇ）を投与することによって評価された。ＩＶ及びＩＣＭの用量の組み合わせは、ポンペ患者の治療に有益な相乗効果を明らかにすることができる。

図３１に、投与経路及び投薬量を評価するための試験設計が提供されている。予備的試験は、低用量ＩＶ注射された動物が、四頭筋及び心臓におけるｈＧＡＡの発現を有していたことを明らかにした（図３７）。ＩＶ注射された動物はまた、ＩＣＭ注射された動物よりも低いグレードの脊髄軸索障害を示した（図３３Ｄ～図３３Ｆ）。ｈＧＡＡの発現は、低用量ＩＣＭ注射動物の脊髄において組織学によっても観察された（図３７）。

脊髄セグメント中のｈＧＡＡ発現運動ニューロンの定量化を、ヒトＧＡＡ導入遺伝子について免疫染色されたスライドについて実施した。結果は、ＩＣＭのみの投与動物及びＩＣＭ＋ＩＶ投与動物が、導入遺伝子を発現する有意な数の脊髄下位運動ニューロンを有することを示した。この結果は、直接的なＣＳＦ投与が、運動ニューロン病的状態を矯正するのに有益であろうことを示唆する。ＩＶ ＬＤ用量単独では、いかなるｈＧＡＡ陽性運動ニューロンをもたらさなかったが、ＩＶ ＨＤは、まばらなｈＧＡＡ陽性運動ニューロンをもたらした（図５５）。

ＩＣＭ注射された動物におけるＤＲＧ変性及び脊髄軸索障害は、用量依存性ではなかった（図３３Ａ～図３３Ｆ）。加えて、１つのＩＶ低用量動物（ＲＡ３６０７：１×１０^１３ＧＣ／Ｋｇ）及び１匹のＩＶ＋ＩＣＭ動物（１８０７１７：ＩＶ５×１０^１３ＧＣ／ｋＧ＋ＩＣＭ３×１０^１３ＧＣ）は、ＩＶ高用量注射動物よりも、ＤＲＧ変性の増加、脊髄軸索障害、及び高い心臓炎症反応を示した。しかしながら、ｍｉＲ標的配列を有する構築物のＩＣＭ投与後、及び炎症の不存在下で、心臓ＧＡＡ発現の増加が観察されている（図２０）。
（配列表フリーテキスト）

以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。

本明細書に引用される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。これと共に出願された配列表（「２１－９５９６ＰＣＴ＿ＳＴ２５」とラベルされた）並びにその中の配列及びテキストは、参照により組み込まれる。２０１９年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／８４０，９１１号、２０１９年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９１３，４０１号、２０２０年４月２９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０４８４号、２０２０年４月２９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０／３０４９３号、２０２０年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０２４，９４１号、２０２０年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１０９，６７７号、及び２０２１年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１８０，３７９号が参照により組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内に収まることが意図される。

Claims (28)

1. 患者において異常な筋肉病的状態の進行を低減し、及び／又は異常な筋肉病的状態を回復に向かわせるための方法であって、前記患者が、ポンペ病を有すると診断されているか、又はポンペ病を有することが疑われており、前記方法が、前記患者に、ＡＡＶカプシドとその中にパッケージングされたベクターゲノムとを有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、前記ベクターゲノムが、
   （ａ）５’逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
   （ｂ）プロモーターと、
   （ｃ）シグナルペプチド、及びヒト酸性－α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）に融合されたｖＩＧＦ２ペプチドを含むキメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記キメラ融合タンパク質をコードする配列が、その発現を指示する調節配列に作動可能に連結しており、配列番号７、又は配列番号６のアミノ酸１～９８２をコードする、それに対して少なくとも９５％同一の配列を含む、ヌクレオチド配列と、
   （ｄ）ポリＡと、
   （ｅ）３’ＩＴＲと、を含む、方法。
2. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、任意選択的にＣＡＧプロモーター又はＣＢ７プロモーターである、請求項１に記載の方法。
3. 前記異常な筋肉病的状態が、ｉ）中心核を有する筋細胞の割合の上昇、ｉｉ）筋線維萎縮、ｉｉｉ）筋細胞線維における大小不同、ｉｖ）オートファジービルドアップ、ｖ）空胞化、及びｖｉ）筋力低下のうちの１つ以上を特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記患者が、遅発性ポンペ病を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記患者が、乳児発症性ポンペ病を有する、請求項１に記載の方法。
6. 前記ベクターゲノムが、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は少なくとも８個のｍｉＲ標的配列を更に含み、任意選択的に、前記ｍｉＲ標的配列の各々が、ｍｉＲ－１８３に特異的である、請求項１に記載の方法。
7. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１に記載の方法。
8. 前記ｒＡＡＶが、静脈内及び／又は髄腔内に投与される、請求項１に記載の方法。
9. 前記ｒＡＡＶが、二重経路の投与を介して前記患者に投与され、任意選択的に、前記二重経路が、静脈内投与及び大槽内（ＩＣＭ）投与である、請求項１に記載の方法。
10. 前記ｒＡＡＶが、約１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ～約５×１０^１３ＧＣ／ｋｇの投薬量で静脈内投与される、請求項１に記載の方法。
11. 前記ｒＡＡＶが、前記ＩＣＭを介して、約１×１０^１２ＧＣ～約５×１０^１３ＧＣの投薬量で投与される、請求項１に記載の方法。
12. 前記ｒＡＡＶが、約１×１０^１１ＧＣ／ｋｇ～約５×１０^１３ＧＣ／ｋｇの投薬量でＩＶ投与され、かつ前記ＩＣＭを介して約１×１０^１２ＧＣ～約５×１０^１３ＧＣの投薬量で投与される、請求項１に記載の方法。
13. 前記患者に併用療法を行うことを更に含み、任意選択的に、前記併用療法が、気管支拡
    張剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、呼吸筋力トレーニング（ＲＭＳＴ）、酵素補充療法、及び／又は横隔膜ペーシング療法である、請求項１に記載の方法。
14. ＡＡＶカプシドとその中にパッケージングされたベクターゲノムとを有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含む、薬学的組成物であって、前記ベクターゲノムが、
    （ａ）５’逆位末端配列（ＩＴＲ）と、
    （ｂ）プロモーターと、
    （ｃ）シグナルペプチド、及びヒト酸性－α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）に融合されたｖＩＧＦ２ペプチドを含むキメラ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記キメラ融合タンパク質をコードする配列が、その発現を指示する調節配列に作動可能に連結しており、配列番号７、又は配列番号６のアミノ酸１～９８２をコードする、それに対して少なくとも９５％同一の配列を含む、ヌクレオチド配列と、
    （ｄ）ポリＡと、
    （ｅ）３’ＩＴＲと、を含む、薬学的組成物。
15. 前記プロモーターが、構成的プロモーター、任意選択的にＣＡＧプロモーター又はＣＢ７プロモーターである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
16. 前記ベクターゲノムが、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は少なくとも８個のｍｉＲ標的配列を更に含み、任意選択的に、前記ｍｉＲ標的配列の各々が、ｍｉＲ－１８３に特異的である、請求項１４又は１５に記載の薬学的組成物。
17. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
18. 前記組成物が、静脈内及び／又は髄腔内送達のために製剤化される、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
19. 治療が、患者において異常な筋肉病的状態の進行を低減し、及び／又は異常な筋肉病的状態を回復に向かわせる、ポンペ病を有する患者の前記治療において使用するための、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
20. 前記異常な筋肉病的状態が、ｉ）中心核を有する筋細胞の割合の上昇、ｉｉ）筋線維萎縮、ｉｉｉ）筋細胞線維における大小不同、ｉｖ）オートファジービルドアップ、ｖ）空胞化、及びｖｉ）筋力低下のうちの１つ以上を特徴とする、請求項１９に記載の使用のための薬学的組成物。
21. 前記患者が、遅発性ポンペ病を有する、請求項１９又は２０に記載の使用のための薬学的組成物。
22. 前記患者が、乳児発症性ポンペ病を有する、請求項１９又は２０に記載の使用のための薬学的組成物。
23. 前記ｒＡＡＶが、二重経路の投与を介して前記患者に投与され、任意選択的に、前記二重経路が、静脈内投与及び大槽内（ＩＣＭ）投与である、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の使用のための薬学的組成物。
24. ポンペ病を有すると診断された、症候性になった後の患者に投与するのに好適な、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
25. ポンペ病を有する、症候性になった後の患者において異常な筋肉病的状態を回復に向かわせるのに好適である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
26. 前記異常な筋肉病的状態が、ｉ）中心核を有する筋細胞の割合の上昇、ｉｉ）筋線維萎縮、ｉｉｉ）筋細胞線維における大小不同、ｉｖ）オートファジービルドアップ、ｖ）空胞化、及びｖｉ）筋力低下のうちの１つ以上を特徴とする、請求項２５に記載の薬学的組成物。
27. 併用療法に使用するために好適であり、任意選択的に、前記患者が、気管支拡張剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、呼吸筋力トレーニング（ＲＭＳＴ）、酵素補充療法、及び／又は横隔膜ペーシング療法による治療を更に受けることを特徴とする、請求項１４～１８又は２４～２６に記載の薬学的組成物。
28. 治療が、患者において異常な筋肉病的状態の進行を低減し、及び／又は異常な筋肉病的状態を回復に向かわせる、ポンペ病を治療することが必要な患者においてそれを行うための、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。

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