KR20230010255A - 폼페병의 치료에 유용한 조성물 - Google Patents

폼페병의 치료에 유용한 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230010255A
KR20230010255A KR1020227043641A KR20227043641A KR20230010255A KR 20230010255 A KR20230010255 A KR 20230010255A KR 1020227043641 A KR1020227043641 A KR 1020227043641A KR 20227043641 A KR20227043641 A KR 20227043641A KR 20230010255 A KR20230010255 A KR 20230010255A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
gly
pro
ala
ser
Prior art date
Application number
KR1020227043641A
Other languages
English (en)
Inventor
제임스 엠. 윌슨
줄리엣 호르도
헝 브이. 도
러셀 갓샬
스티븐 투스케
Original Assignee
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아, 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
Publication of KR20230010255A publication Critical patent/KR20230010255A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors (Somatomedins), e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect

Abstract

본원에서는 폼페병으로 진단 받았거나 폼페병에 걸린 것으로 의심되는 환자에서 비정상 근육 병리의 진행을 감소시키고/거나, 비정상 근육 병리를 역전시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 AAV 캡시드 및 이에 패키징된 벡터 게놈을 갖는 재조합 AAV (rAAV)를 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 벡터 게놈은 (a) 5' 역전된 말단 반복서열 (ITR); (b) 프로모터; (c) 신호 펩티드 및 인간 산-α-글루코시다제 (hGAA)에 융합된 vIGF2 펩티드를 포함하는 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; (d) 폴리 A; 및 (e) 3' ITR을 포함한다. 또한, 폼페병에 걸리거나 폼페병에 걸린 것으로 의심되는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

Description

폼페병의 치료에 유용한 조성물
제 Ⅱ형 글리코겐증으로도 알려진 폼페병은 심장 (심근병증), 근육, 및 운동 뉴런 (신경근육 질환)의 글리코겐 축적을 유도하는 산-α-글루코시다제 (GAA) 유전자의 돌연변이에 의해 유발된 리소좀 축적 질환이다. 고전적인 유아 폼페병에서, 심각한 GAA 활성 손실은 특히 심장 및 근육 내의 다계통 및 조기 발병 글리코겐 축적, 및 심폐 부전으로 인한 처음 수년 내 사망을 유발시킨다. 또한, 유아 폼페병은 뉴런 (특히, 운동 뉴런) 및 아교세포 내의 현저한 글리코겐 축적을 특징으로 한다. 현재의 치료 기준, 효소 대체 요법 (ERT)은 근육을 교정하는데 최적 이 하의 효율을 갖으며, 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 없어 고전적인 영아 폼페병의 장기 생존자에서 진행성 신경 퇴화로 이어진다. 심장 교정에 의해 더 오래 생존한 ERT로 치료 받은 환자는 진행성 신경학적 표현형을 갖는 새로운 자연 병력을 드러낸다. 추가적으로, 재조합 인간 GAA는 면역원성이 높으며 골격근에 의한 흡수 불량으로 인해 매우 많은 정량이 투약되어야 한다.
폼페병의 치료를 위해, 질환의 CNS 구성요소의 교정에 대한 필요성, 근육 교정 개선에 대한 필요성, 및 현재의 ERT보다 효능이 더 크고/거나 면역원성이 더 적고/거나 더 간편한 대안에 대한 필요성을 포함하여, 여러 충족되지 않은 요구가 있다.
일 양태에서, 본원에서는 환자에서 비정상 근육 병리의 진행을 감소시키고/거나, 비정상 근육 병리를 역전시키는 방법으로서, 환자는 폼페병으로 진단 받았거나 폼페병에 걸린 것으로 의심되고, 방법은 환자에게 AAV 캡시드 및 이에 패키징된 벡터 게놈을 갖는 재조합 AAV (rAAV)를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 벡터 게놈은 (a) 5' 역전된 말단 반복서열 (ITR); (b) 프로모터; (c) 신호 펩티드 및 인간 산-α-글루코시다제 (hGAA)에 융합된 vIGF2 펩티드를 포함하는 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 이의 발현을 구동하는 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 1번 내지 982번을 인코딩하는 서열번호 7 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열을 포함하는, 서열; (d) 폴리 A; 및 (e) 3' ITR을 포함하는, 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 프로모터는 전신발현 프로모터, 선택적으로 CAG 프로모터 또는 CB7 프로모터이다. 특정 구현예에서, 비정상 근육 병리는 (i) 중앙 핵을 갖는 근육 세포의 백분율 상승, (ii) 근육 섬유 위축증, (iii) 근육 세포 섬유의 부동세포증, (iv) 자가포식 구축, (v) 공포 형성, 및 (vi) 쇠약 중 하나 이상을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 환자는 후기 발병 폼페병을 갖는다. 특정 구현예에서, 환자는 유아 발병 폼페병을 갖는다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 miR 표적 서열을 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개 추가로 포함하고, 선택적으로 miR 표적 서열 각각은 miR-183에 특이적이다. 특정 구현예에서, AAV 캡시드는 AAVhu68 캡시드이다. 특정 구현예에서, rAAV는 정맥내로 및/또는 경막내로 투여된다. 특정 구현예에서, rAAV는 환자에게 이중 투여 경로를 통해 투여되고, 선택적으로 이중 경로는 정맥내 투여 및 대수조내 (ICM) 투여이다.
일 양태에서, 본원에서는 AAV 캡시드 및 이에 패키징된 벡터 게놈을 갖는 재조합 AAV (rAAV)를 포함하는 약제학적 조성물로서, 벡터 게놈은 (a) 5' 역전된 말단 반복서열 (ITR); (b) 프로모터; (c) 신호 펩티드 및 인간 산-α-글루코시다제 (hGAA)에 융합된 vIGF2 펩티드를 포함하는 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 이의 발현을 구동하는 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 1번 내지 982번을 인코딩하는 서열번호 7 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열을 포함하는, 서열; (d) 폴리 A; 및 (e) 3' ITR을 포함하는, 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 프로모터는 전신발현 프로모터, 선택적으로 CAG 프로모터 또는 CB7 프로모터이다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 miR 표적 서열을 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개 추가로 포함하고, 선택적으로 miR 표적 서열 각각은 miR-183에 특이적이다. 특정 구현예에서, AV 캡시드는 AAVhu68 캡시드이다. 특정 구현예에서, 조성물은 정맥내 및/또는 경막내 전달을 위해 제형되된다.
일 양태에서, 본원에서는 폼페병에 걸린 환자의 치료에 사용되는 약제학적 조성물로서, 치료가 환자에서 비정상 근육 병리의 진행을 감소시키고/거나, 비정상 근육 병리를 역전시키는, 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 비정상 근육 병리는 i) 중앙 핵을 갖는 근육 세포의 백분율 상승, (ii) 근육 섬유 위축증, (iii) 근육 세포 섬유의 부동세포증, (iv) 자가포식 구축, (v) 공포 형성, 및 (vi) 쇠약 중 하나 이상을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 환자는 후기 발병 폼페병을 갖는다. 특정 구현예에서, 환자는 유아 발병 폼페병을 갖는다. 특정 구현예에서, rAAV는 환자에게 이중 투여 경로를 통해 투여되고, 선택적으로 이중 경로는 정맥내 투여 및 대수조내 (ICM) 투여이다.
일 양태에서, 본원에 제공된 약제학적 조성물은 폼페병으로 진단 받았던 증상 이후의 환자에게 투여에 적합하다. 특정 구현예에서, 조성물은 폼페병에 걸린 증상 이후의 환자에서 비정상 근육 병리를 역전시키는데 적합하다. 특정 구현예에서, 비정상 근육 병리는 i) 중앙 핵을 갖는 근육 세포의 백분율 상승, (ii) 근육 섬유 위축증, (iii) 근육 세포 섬유의 부동세포증, (iv) 자가포식 구축, (v) 공포 형성, 및 (vi) 쇠약 중 하나 이상을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 보조요법으로 사용하기에 적합하고, 선택적으로 환자가 기관지 확장제, 아세틸콜린 에스테라제 저해제, 호흡기 근육 강도 훈련 (RMST), 효소 대체 요법 및/또는 횡격막 조율 요법으로의 치료를 추가로 받는 것을 특징으로 한다.
일 양태에서, 본원에 기술된 rAAV를 투여하여 본원에 제공된 이를 필요로 하는 환자에서 폼페병을 치료하는 것을 포함하는 약제학적 조성물의 용도로서, 치료가 환자에서 비정상 근육 병리의 진행을 감소시키고/거나, 비정상 근육 병리를 역전시키는, 용도가 제공된다.
본 발명의 다른 양태 및 장점은 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 쉽게 자명해질 것이다.
도 1a 및 도 1b는 CB6 (제 3열), CAG (제 4열) 또는 UbC 프로모터 (마지막 열)의 구동 하에 hGAAV780I (서열번호 4)에 대한 조작된 코딩 서열을 갖는 다양한 AAVhu68.hGAA의 정맥내 투여 4주 후 폼페병 (-/-) 마우스 간에서의 hGAA 활성을 나타낸다. (도 1a) 저-용량 (1×1011개 GC). (도 1b) 고-용량 (1×1012개).
도 2a 및 도 2b는 CB6 (제 3열), CAG (제 4열) 또는 UbC 프로모터 (마지막 열)의 구동 하에 hGAAV780I에 대한 조작된 코딩 서열을 갖는 다양한 AAVhu68.hGAA의 정맥내 투여 4주 후 폼페병 (-/-) 마우스 심장에서의 hGAA 활성을 나타낸다. (도 2a) 저-용량 (1×1011개 GC). (도 2b) 고-용량 (1×1012개).
도 3a 및 도 3b는 CB6 (제 3열), CAG (제 4열) 또는 UbC 프로모터 (마지막 열)의 구동 하에 hGAAV780I에 대한 조작된 코딩 서열을 갖는 다양한 AAVhu68.hGAA의 정맥내 투여 4주 후 폼페병 (-/-) 마우스 골격근 (대퇴사두근)에서의 hGAA 활성을 나타낸다. (도 3a) 저용량 (1×1011개 GC). (도 3b) 고용량 (1×1012개).
도 4a 및 도 4b는 CB6 (제 3열), CAG (제 4열) 또는 UbC 프로모터 (마지막 열)의 구동 하에 hGAAV780I에 대한 조작된 코딩 서열을 갖는 다양한 AAVhu68.hGAA의 정맥내 투여 4주 후 폼페병 (-/-) 마우스 뇌에서의 hGAA 활성을 나타낸다. (도 4a) 저-용량 (1×1011개 GC). (도 4b) 고-용량 (1×1012개). CB7 활성 하에 발현하는 벡터는 두 가지 용량 모두에서 더 낮은 활성을 갖는 반면, CAG 또는 UbC 프로모터 하에 발현하는 벡터는 더 높은 용량에서 비슷한 활성을 갖는다.
도 5a 내지 도 5h는 AAVhu68.hGAA의 전달 4주 후 폼페병 마우스에서 심장의 조직학 (PAS 염색이 글리코겐 축적을 나타냄)을 나타낸다. 5가지 상이한 hGAA 발현 카세트를 포함하는 rAAVhu68 벡터를 생성하고 평가하였다. 비히클 대조군 폼페병 (-/-) (도 5D) 및 야생형 (+/+) (도 5A) 마우스는 PBS 주사를 수여받았다. "hGAA"는 고유한 신호 펩티드를 갖는 야생형 서열에 의해 인코딩되는 기준 천연 효소 (hGAAV780)를 말한다 (도 5b). "BiP-vIGF2.hGAAco"는 처음 35개 아미노산의 결실을 포함하고, BiP 신호 펩티드 및 인슐린 수용체에 대한 낮은 친화성을 갖는 IGF2 변이체와의 융합을 추가로 갖는 기준 hGAAV780 단백질에 대한 조작된 코딩 서열을 말한다 (도 5c). 비히클 처리된 대조군으로부터의 영상 (도 5d). "hGAAcoV780I"는 조작된 서열에 의해 인코딩되고 고유한 신호 펩티드를 포함하는 hGAAV780I 변이체를 말한다 (도 5e). "BiP-vIGF2.hGAAcoV780I"는 처음 35개 아미노산의 결실을 포함하고, 인슐린 수용체에 대한 낮은 친화성을 갖는 IGF2 변이체와 융합된 BiP 신호 펩티드 및 조작된 서열에 의해 인코딩되는 hGAAV780I를 추가로 갖는 hGAAcoV780I를 말한다 (도 5f). "Sp7.Δ8.hGAAcoV780I"는 이전 구조물과 동일한 조작된 서열에 의해 인코딩되는 처음 35개 아미노산의 결실이 있지만 고유한 신호 펩티드 대신에 B2 키모트립시노겐 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 hGAAV780I 변이체를 말한다 (도 5g). 맹검 조직병리학 반-정량적 중증도 점수매김. 공인 수의 병리학자는 맹검 방식으로 슬라이드를 검토하고 글리코겐 축적 및 자가포식 구축을 기반으로 중증도 점수를 설정하였다 (도 5h).
도 6a 내지 도 6h는 다양한 hGAA를 인코딩하는 AAVhu68 (2.5×1013개 GC/㎏)의 투여 4주 후 폼페병 마우스에서 대퇴사두근 조직학의 결과 (PAS 염색)를 나타낸다. 대조군 폼페병 (-/-) (도 6d) 및 야생형 (+/+) (도 6a) 마우스는 PBS 주사를 수여받았다. "hGAA"는 고유한 신호 펩티드를 갖는 야생형 서열에 의해 인코딩되는 기준 천연 효소 (hGAAV780)를 말한다 (도 6b). "hGAAcoV780I"는 조작된 서열에 의해 인코딩되고 고유한 신호 펩티드를 포함하는 hGAAV780I 변이체를 말한다 (도 6e). "Sp7.Δ8.hGAAcoV780I"는 이전 구조물과 동일한 조작된 서열에 의해 인코딩되는 처음 35개 아미노산의 결실이 있지만 고유한 신호 펩티드 대신에 B2 키모트립시노겐 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 hGAAV780I 변이체를 말한다 (도 6f). "BiP-vIGF2.hGAAco"는 처음 35개 아미노산의 결실을 포함하고, 인슐린 수용체에 대한 낮은 친화성을 갖는 IGF2 변이체와 융합된 BiP 신호 펩티드를 추가로 갖고 조작된 서열에 의해 인코딩되는 기준 hGAAV780을 말한다 (도 6c). "BiP-vIGF2.hGAAcoV780I"는 처음 35개 아미노산의 결실을 포함하고, 인슐린 수용체에 대한 낮은 친화성을 갖는 IGF2 변이체와 융합된 BiP 신호 펩티드를 추가로 갖고, 조작된 서열에 의해 인코딩되는 hGAAV780I를 말한다 (도 6g). 맹검 조직병리학 반-정량적 중증도 점수매김. 공인 수의 병리학자는 맹검 방식으로 슬라이드를 검토하고 글리코겐 축적 및 자가포식 구축을 기반으로 중증도 점수를 설정하였다. 0점은 병변이 없음을 의미하고; 1점은 평균적으로 저장에 의해 이환된 근육 섬유의 9% 미만을 의미하며; 2점은 10% 내지 49%를 의미하고; 3점은 50% 내지 75%를 의미하며; 4점은 76% 내지 100%를 의미한다 (도 6h).
도 7a 내지 도 7h는 2.5×1012개 GC/㎏ (즉, 도 6a 내지 도 6h에서보다 10배 더 적은 용량)의 다양한 hGAA를 인코딩하는 AAVhu68의 투여 4주 후 폼페병 마우스로부터의 대퇴사두근 조직학의 결과 (과요오드산-쉬프 (PAS) 염색)를 나타낸다. 대조군 폼페병 (-/-) (도 7d) 및 야생형 (+/+) (도 7a) 마우스는 PBS 주사를 수여받았다. "hGAA"는 고유한 신호 펩티드를 갖는 야생형 서열에 의해 인코딩되는 기준 천연 효소 (hGAAV780)를 말한다 (도 7b). "hGAAcoV780"는 조작된 서열에 의해 인코딩되고 고유한 신호 펩티드를 포함하는 hGAAV780I 변이체를 말한다 (도 7e). "Sp7.Δ8.hGAAcoV780I"는 이전 구조물과 동일한 조작된 서열에 의해 인코딩되는 처음 35개 AA의 결실이 있지만 고유한 신호 펩티드 대신에 B2 키모트립시노겐 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 hGAAV780I 변이체를 말한다 (도 7f). "BiP-vIGF2.hGAAco"는 처음 35개 AA의 결실을 포함하고, 인슐린 수용체에 대한 낮은 친화성을 갖는 IGF2 변이체와의 융합된 BiP 신호 펩티드를 추가로 갖고, 조작된 서열에 의해 인코딩되는 기준 hGAAV780을 말한다 (도 7c). "BiP-vIGF2.hGAAcoV780I"는 처음 35개 AA의 결실을 포함하고, 인슐린 수용체에 대한 낮은 친화성을 갖는 IGF2 변이체와 융합된 BiP 신호 펩티드를 추가로 갖고, 조작된 서열에 의해 인코딩되는 hGAAV780I를 말한다 (도 7g). 맹검 조직병리학 반-정량적 중증도 점수매김. 공인 수의 병리학자는 맹검 방식으로 슬라이드를 검토하고 글리코겐 축적 및 자가포식 구축을 기반으로 중증도 점수를 설정하였다 (도 7h). 0점은 병변이 없음을 의미하고; 1점은 평균적으로 저장에 의해 이환된 근육 섬유의 9% 미만을 의미하며; 2점은 10% 내지 49%를 의미하고; 3점은 50% 내지 75%를 의미하며; 4점은 76% 내지 100%를 의미한다.
도 8은 고유한 hGAA, 또는 처음 35개 AA의 결실을 포함하고 인슐린 수용체에 대한 낮은 친화성을 갖는 IGF2 변이체와 융합된 BiP 신호 펩티드를 추가로 갖으며 조작된 서열에 의해 인코딩되는 hGAAV780I ("BiP-vIGF2.hGAAcoV780I")를 인코딩하는 서열을 갖는 AAVhu68 (2.5×1012개 GC/㎏)의 투여 4주 후 폼페병 마우스로부터의 척수 조직학의 결과 (PAS 및 룩솔 패스트 블루 염색)를 나타낸다. 맹검 조직병리학 반-정량적 중증도 점수매김은 척수 절편에 대해 수행하였다.
도 9a 내지 도 9c는 혈장에서 hGAA 활성 및 IGF2/CI-MPR에 대한 결합을 나타낸다. 폼페병 마우스에게 야생형 hGAA 또는 BiP-vIGF2.hGAA를 인코딩하는 벡터를 저-용량 (2.5×1012개 GC)으로 투여하였다 (도 9a 및 도 9b). 정맥내 투여 4주 후 높은 수준의 야생형 및 조작된 hGAA 활성이 혈장에서 검출되었다 (도 9c). 조작된 hGAA는 CI-MPR에 효율적으로 결합한다.
도 10은 2.5×1012개 GC/kg (LD) 용량의 AAVhu68 구조물의 투여 4주 이후에 폼페병 마우스에서 글리코겐 제거 및 자가포식 구축의 해소를 나타낸다. 비복근의 파라핀 절편은 DAPI 및 항-LC3B 항체로 염색되었다.
도 11은 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmiR183 구조물의 모식도를 나타낸다.
도 12는 고-용량 (HD: 2.5×1013개 GC/kg) 또는 저-용량 (LD: 2.5×1012개 GC/kg)의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183 (drg-탈표적화 서열, miR183의 4개 사본을 포함함)의 정맥내 투여 4주 이후에 폼페병 마우스의 뇌간에서 글리코겐 축적 (PAS, 룩솔 블루 염색)을 나타낸다. 화살표는 뉴런 내의 PAS 양성 축적을 나타낸다.
도 13은 고-용량 (HD: 2.5×1013개 GC/kg) 또는 저-용량 (LD: 2.5×1012개 GC/kg)의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183의 정맥내 투여 4주 이후에 폼페병 마우스의 척수에서 글리코겐 축적 (PAS, 룩솔 블루 염색)을 나타낸다. 화살표는 뉴런 내의 PAS 양성 축적을 나타낸다.
도 14는 고-용량 (HD: 2.5×1013개 GC/kg) 또는 저-용량 (LD: 2.5×1012개 GC/kg)의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183의 정맥내 투여 4주 이후에 폼페병 마우스의 대퇴사두근에서 글리코겐 축적 (PAS 염색)을 나타낸다.
도 15는 고-용량 (HD: 2.5×1013개 GC/kg) 또는 저-용량 (LD: 2.5×1012개 GC/kg)의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183의 정맥내 투여 4주 이후에 폼페병 마우스의 심장에서 글리코겐 축적 (PAS 염색)을 나타낸다.
도 16은 고-용량 (HD: 2.5×1013개 GC/kg) 또는 저-용량 (LD: 2.5×1012개 GC/kg)의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183의 정맥내 투여 4주 이후에 폼페병 마우스의 대퇴사두근에서 자가포식 공포 마커 LC3b의 발현을 나타낸다.
도 17은 고-용량 3×1013개 GC의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I (왼쪽) 또는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183 (오른쪽)의 ICM 투여 35일 이후에 레서스 머커크의 경추 DRG에서 hGAA 발현의 대표적인 영상 (hGAA에 대한 면역조직화학)을 나타낸다.
도 18은 고-용량 3×1013개 GC의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I (왼쪽) 또는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183 (오른쪽)의 ICM 투여 35일 이후에 레서스 머커크의 요추 DRG에서 hGAA 발현의 대표적인 영상 (hGAA에 대한 면역조직화학)을 나타낸다.
도 19는 고-용량 3×1013개 GC의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I (왼쪽) 또는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183 (오른쪽)의 ICM 투여 35일 이후에 레서스 머커크의 척추 하위 운동 뉴런에서 hGAA 발현의 대표적인 영상 (hGAA에 대한 면역조직화학)을 나타낸다.
도 20은 고-용량 3×1013개 GC의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I (왼쪽) 또는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183 (오른쪽)의 ICM 투여 35일 이후에 레서스 머커크의 심장에서 hGAA 발현의 대표적인 영상 (hGAA에 대한 면역조직화학)을 나타낸다.
도 21a 내지 도 21c는 고-용량 3×1013개 GC의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I 또는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183의 ICM 투여 35일 이후 레서스 머커크에 있는 경추 분절 (도 21a), 흉추 분절 (도 21b) 및 요추 분절 (도 21c)의 DRG에서 DRG 뉴런성 퇴화 및 염증 세포 침윤의 조직병리학적 점수매김을 나타낸다. AAVhu68 벡터는 이전에 설명된 바와 같이 형광 투시 하에 대수조 내에 주사되는 총 1 mL 부피의 멸균 인공 CSF (비히클)로 전달된다 (Katz et al., Hum. Gene Ther. Methods 2018, 29: 212-9). 벡터 실험군에 대한 맹검으로 공인 수의 병리학자는 0점이 병변 없음, 1점이 최소 (< 10%), 2점이 경증 (10% 내지 25%), 3점이 중등도 (25% 내지 50%), 4점이 현저함 (50% 내지 95%) 및 5점이 중증 (> 95%)으로서 정의된 중증도 등급을 확립하였다. 각 데이터 지점은 하나의 DRG이다. 분절 당 및 동물 당 최소 5개 DRG의 점수를 매긴다.
도 22a 내지 도 22c는 고-용량 3×1013개 GC의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I 또는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183의 ICM 투여 이후 레서스 머커크에 대한 AST 수준 (도 22a), ALT 수준 (도 22b) 및 혈장 계수 (도 22c)를 나타낸다.
도 23은 고-용량 3×1013개 GC/kg의 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I 또는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183가 투여된 NHP에서 주사 0 내지 35일 이후에 혈장 hGAA 활성 수준을 나타낸다.
도 24a 내지 도 24g는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I 또는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183가 투여된 (ICM, 3×1013개 GC) NHP에 대한 기저선 및 35일째 신경 전도 속도로부터의 결과를 나타낸다.
도 25a 및 도 25b는 생후 7개월에 질환의 상급 병기로 치료받고, 기저선에서 이미 증상이 있는 폼페병 마우스에서 벡터 주사 (0일)부터 주사 180일 이후까지의 체중 종단 추적 관찰을 나타낸다. 대안의 투여 경로 및 용량 수준, 고-용량 (HD)(1×1011개 GC) 또는 저-용량 (LD)(5×1010개 GC)으로 뇌실내 (ICV), HD (5×1013개 GC/kg) 또는 LD (1×1013개 GC/kg)로 정맥내 (IV), 및 저-용량 또는 고-용량의 ICV 및 IV의 조합을 사용하여 이들에게 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I를 투여하였다. 평균값 및 표준 편차가 도시된다. 각 시점에서 통계적 분석은 KO PBS 대조군 및 나머지 실험군 사이의 윌콕슨-만-휘트니 테스트에 의해 수행하였다. * p < 0.05; **p < 0.01.
도 26 및 도 27은 생후 7개월에 질환의 상급 병기로 치료받고, 기저선에서 이미 증상이 있는 폼페병 마우스에서 벡터 주사 (0일)부터 주사 180일 이후까지의 체중 종단 추적 관찰과 비교한 그립 강도를 나타낸다 (도 26). 대안의 투여 경로 및 용량 수준, 고-용량 (ICV HD: 1×1011개 GC)으로 뇌실내 (ICV), 고-용량 (ICV HD: 5×1013개 GC)으로 정맥내 (IV), 및 ICV 및 IV 고-용량 및 ICV 및 IV 저-용량의 조합을 사용하여 이들에게 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I를 투여하였다. 그립 강도는 송잡이 강도 측정기 (IITC 라이프 사이언스사)를 사용하여 다양한 시점에서 측정되었다. 그립 강도 측정기의 변환 장치는 양극 처리된 베이스 플레이트에 연결된 와이어 메쉬 그리드에 연결된다. 동물은 꼬리로 유지하고, 네 발로 그리드를 잡으면서 메쉬를 가만히 통과한다. 3가지 그립 힘 척도가 작성되고, 판독 평균이 특정한 시점의 동물의 그립 힘이다 (도 27). 값은 동물의 체중에 의해 정규화된다. 실험군 당 N = 4 수컷 및 N = 4 암컷. 각 시점에서 통계적 분석은 KO PBS 대조군과 대비하여 일방 ANOVA (도 26) 또는 이방 ANOVA (도 27), 사후 복수 비교 테스트에 의해 결정하였다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 28은 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 고-용량 (HD: 1×1011개 GC) 또는 저-용량 (LD: 5×1010개 GC) ICV 투여 이후에 증상 이후의 폼페병 마우스의 대퇴사두근, 심장 및 척수에서 글리코겐 축적을 나타낸다.
도 29는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 고-용량 (HD: 5×1013개 GC/kg) 또는 저-용량 (LD: 1×1013개 GC/kg) IV 투여 이후에 증상 이후의 폼페병 마우스의 대퇴사두근, 심장 및 척수에서 글리코겐 축적을 나타낸다.
도 30a 내지 도 30c는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I 벡터가 IV, ICV, 또는 IV 및 ICV (이중 경로)로 투여된 폼페병 마우스의 혈장에서 30일째 (도 30a), 60일째 (도 30b) 및 90일째 (도 30c) hGAA 활성을 나타낸다.
도 31은 NHP에서 단일 (IV 또는 ICV) 및 이중 (IV + ICV) 투여 경로의 평가를 위한 연구 설계를 나타낸다.
도 32a 내지 도 32h는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 IV 또는 ICM 투여 이후에 hGAA (도 32a 및 도 32c - 혈장; 도 32b 및 도 32d - CSF) 및 hGAA 활성 (도 32e 및 도 32g - 혈장; 도 32f 및 도 32h -CSF)의 검출을 나타낸다.
도 33a 내지 도 33f는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 IV (1×1013개 GC/kg 또는 5×1013개 GC/kg), ICM (1×1013개 GC 또는 3×1013개 GC), 또는 IV + ICM (5×1013개 GC/kg IV + 3×1013개 GC ICM 또는 1×1014개 GC/kg IV 또는 1×1013개 GC/kg ICM) 투여 이후에 레서스 머카크에서 경추 분절 (도 33a), 흉추 분절 (도 33b) 및 요추 분절 (도 33c)의 DRG 뉴런성 퇴화 및 염증 세포 침윤, 및 경추 분절 (도 33d), 흉추 분절 (도 33e) 및 요추 분절 (도 33f)의 축수 축삭병증의 조직병리학적 점수매김을 나타낸다. 벡터 실험군에 대한 맹검으로 공인 수의 병리학자는 0점이 병변 없음, 1점이 최소 (< 10%), 2점이 경증 (10% 내지 25%), 3점이 중등도 (25% 내지 50%), 4점이 현저함 (50% 내지 95%) 및 5점이 중증 (> 95%)으로서 정의된 중증도 등급을 확립하였다.
도 34는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 IV (1×1013개 GC/kg 또는 5×1013개 GC/kg), ICM (1×1013개 GC 또는 3×1013개 GC), 또는 IV + ICM (5×1013개 GC/kg IV + 3×1013개 GC ICM) 투여 이후에 레서스 머카크의 혈장 GAA 활성을 나타낸다.
도 35a 내지 도 35d는 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 IV (1×1013개 GC/kg 또는 5×1013개 GC/kg), ICM (1×1013개 GC 또는 3×1013개 GC), 또는 IV + ICM (5×1013개 GC/kg IV + 3×1013개 GC ICM) 투여 이후에 레서스 머카크로부터의 간 및 심장 (도 35a), 및 횡격막, 삼두근 및 전방 경골 (도 35b)에서 GAA 활성의 측정을 나타낸다.
도 36은 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 IV (1×1013개 GC/kg 또는 5×1013개 GC/kg), ICM (1×1013개 GC 또는 3×1013개 GC), 또는 IV + ICM (5×1013개 GC/kg IV + 3×1013개 GC ICM) 투여 이후에 레서스 머커크로부터의 혈청에서 항-GAA 항체 역가를 나타낸다.
도 37은 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 저-용량 (IV - 1×1013개 GC/kg, ICM - 5×1013개 GC) 투여 이후에 레서스 머카크의 대퇴사두근, 심장 및 척수에서 hGAA 발현의 대표적인 영상 (hGAA에 대한 면역조직화학)을 나타낸다.
도 38은 고-용량 (HD: 2.5×1013개 GC/kg)의 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183 (AAV.hGAAeng), 또는 고유한 신호 펩티드를 갖는 야생형 서열에 의해 인코딩된 hGAAV780I (AAV.hGAAnat)의 투여 4주 이후에 폼페병 마우스 대퇴사두근 및 심장 GAA 활성 및 글리코겐 축적 (PAS 염색)의 분석을 나타낸다.
도 39는 고-용량 (HD: 2.5×1013개 GC/kg)의 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183 (AAV.hGAAeng), 또는 고유한 신호 펩티드를 갖는 야생형 서열에 의해 인코딩된 hGAAV780I (AAV.hGAAnat)의 투여 4주 이후에 폼페병 마우스 CNS GAA 활성 및 글리코겐 축적 (PAS 염색)의 분석을 나타낸다.
도 40은 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4XmiR183의 정맥내 투여 (IV - 2.5×1013개 GC/kg) 4주 이후에 폼페병 마우스의 대퇴사두근, 심장 및 척수에서 hGAA 발현의 대표적인 영상 (hGAA에 대한 면역조직화학)을 나타낸다.
도 41은 다양한 용량의 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183의 IV 투여를 포함하는, 증상 이전의 (어린) 폼페병 마우스의 치료를 평가하는 연구에 관한 연구 개요를 나타낸다.
도 42는 어린 WT, PBS 처리된 대조군 GAA -/-, 및 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183 처리된 GAA -/- 마우스로부터의 대퇴사두근 절편의 대표적인 면역형광 영상을 나타낸다. WGA (세포막), DAPI (핵) 및 LC3b 항체 (자가포식소체).
도 43은 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183이 투여된 어린 폼페병 마우스로부터의 대퇴사두근에서 중앙 핵의 정량화를 나타낸다.
도 44는 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183이 투여된 어린 폼페병 마우스로부터의 대퇴사두근에서 LC3b 염색 이후 자가포식 구축의 정량화를 나타낸다.
도 45는 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183이 투여된 어린 폼페병 마우스로부터의 대퇴사두근에서 근육 섬유 직경의 정량화를 나타낸다.
도 46a 내지 도 46f는 다양한 용량의 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183의 IV 투여 이후에, 가자미근 (도 46a), 횡격막 (도 46b), 대퇴사두근 (도 46c), 삼두근 (도 46d), 비복근 (도 46e) 및 전방 경골근 (도 46f)에서 근육 리소좀 저장 병리 (공포 형성의 중증도)의 반정량적 점수매김을 나타낸다. 수컷 마우스의 경우 네모 표기, 암컷 마우스의 경우 원 표기. 통계: 일방 ANOVA (크루스칼 월리스 테스트)에 이어진 사후 던 복수 비교 테스트. 별표는 GAA KO 폼페병 PBS 실험군 (제 2열)과 비교한 유의성을 나타낸다. 점수매김: 공포와 근육 섬유의 비율 - 0: 0%, 1: 1% 내지 9%, 2: 10% 내지 24%, 3: 25% 내지 49%, 4: 50% 내지 74%, 및 5: > 5%.
도 47은 폼페병 GAA 녹아웃 마우스에서 IV, ICV, 및 IV + ICV 투여 경로를 평가하는 연구 설계를 나타낸다.
도 48은 생후 6 내지 7개월의 어린 WT, PBS 처리된 대조군 GAA -/-, 및 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183 처리된 GAA -/- 마우스로부터의 대퇴사두근 절편의 대표적인 면역형광 영상을 나타낸다. WGA (세포막), DAPI (핵) 및 LC3b 항체 (자가포식소체).
도 49는 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183이 투여된 증상 이후의 폼페병 마우스로부터의 대퇴사두근에서 중앙 핵의 정량화를 나타낸다.
도 50은 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.rBG의 IV, ICV, 및 IV + ICV 투여 이후에 GAA KO 마우스로부터의 대퇴사두근 조직의 LC3b 염색에 이어지는 자가포식 구축의 정량화를 나타낸다.
도 51은 AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.rBG의 IV, ICV, 및 IV + ICV 투여 이후에 폼페병 GAA 녹아웃 마우스의 근육 섬유 크기 분포를 나타낸다. 섬유 직경은 S = 소 (< 30 μm), M = 중 (30 μm 내지 50 μm) 및 L = 대 (> 50 μm)의 부류로 할당되었다.
도 52는 비-인간 영장류에게 AAVhu68.CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I 벡터의 IV, ICM, 및 IV + ICM 투여 이후에 척수 분절에서 hGAA 발현하는 운동 뉴런의 정량화를 나타낸다.
폼페병에 걸린 환자에게 신호 펩티드 및 hGAA780I 효소의 적어도 활성 부분에 융합된 vIGF2 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 전달하기 위한 조성물이 제공된다. 이들 조성물로 환자를 치료하기 위한 요법을 포함하여, 이를 제조하고 사용하는 방법이 본원에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 말타제 결핍증, 글리코겐 축적 질환 II형 (GSDII), 또는 글리코겐증 II형으로도 지칭되는 "폼페병"은 산 α-글루코시다제를 코딩하는 산 α-글루코시다제 (GAA) 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 리소좀 효소인 GAA의 전체 부재 또는 부분적 결핍을 특징으로 하는 유전적 리소좀 축적 장애를 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 용어는 영아, 청소년 및 성인 발병 폼페병을 포함하나 이들에 한정되지 않는 질환의 초기 및 후기 발병 형태를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
그리스 문자 "알파" 및 기호 "α"는 본 명세서 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용됨이 이해될 것이다. 유사하게, 그리스 문자 "델타" 및 "Δ"는 본 명세서 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "산-α-글루코시다제" 또는 "GAA"는 글리코겐, 말토스, 및 아이소말토스의 D-글루코스 단위 사이의 α-1,4 연결을 가수분해하는 리소좀 효소를 지칭한다. 대체 명칭은 리소좀 α-글루코시다제 (EC:3.2.1.20); 글루코아밀라제; 1,4-α-D-글루칸 글루코하이드롤라제; 아밀로글루코시다제; 감마-아밀라제 및 엑소-1,4-α-글루코시다제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 인간 산 α-글루코시다제는 GAA 유전자 (미국 국립 생체공학 정보센터 (NCBI); 유전자 ID 2548)에 의해 인코딩되며, 상기 유전자는 17번 염색체의 긴 팔에 대해 매핑되었다 (위치 17q25.2-q25.3). 아미노산 잔기 516번 내지 521번에서 보존된 헥사펩티드 WIDMNE는 산 α-글루코시다제 단백질의 활성에 필요하다. 용어 "hGAA"는 인간 GAA에 대한 코딩 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "rAAV.hGAA"는 최소한 GAA 효소에 대한 코딩 서열을 포함하는 벡터 게놈 (예로, 780I 변이체, 신호 펩티드 및 hGAA780I 효소의 적어도 활성 부분에 융합된 vIGF2 펩티드를 포함하는 융합 단백질)을 내부에 패키징한 AAV 캡시드를 갖는 rAAV를 지칭한다. rAAVhu68.hGAA 또는 rAAVhu68.hGAA는 AAV 캡시드가 본 명세서에 정의된 AAVhu68 캡시드인 rAAV를 말한다.
전장 hGAA의 번호매김을 참조하여, 아미노산 위치 1번 내지 27번에 신호 펩티드가 있다. 추가적으로, 효소는 다수의 성숙한 단백질, 즉, 아미노산 위치 70 내지 952번의 성숙한 단백질, 아미노산 위치 123번 내지 952번에 위치한 76 kD 성숙한 단백질, 및 204번 아미노산 내지 952번 아미노산의 70 kD 성숙한 단백질과 연관되어 있다. "활성 촉매 부위"는 헥사펩티드 WIDMNE (서열번호 3의 아미노산 잔기 516번 내지 521번)를 포함한다. 특정 구현예에서, 더 긴 단편, 예를 들면, 위치 516 내지 616번이 선택될 수 있다. 다른 활성 부위는 위치 376번, 404번, 405번, 441번, 481번, 516번, 518번, 519번, 600번, 613번, 616번, 649번, 674번 중 하나 이상에 위치할 수 있는 리간드 결합 부위를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "hGAA780I" 또는 "hGAAV780I"는 서열번호 3으로 재현되는 아미노산 서열을 갖는 전장 프리-프로-단백질을 지칭한다. 일부 경우에, 용어 hGAAco780I 또는 hGAAcoV780I는 hGAA780I를 인코딩하는 조작된 서열을 지칭하는 데 사용된다. 앞의 단락에 기재된 hGAA 참조 단백질과 비교하여, hGAA780I는 참조 hGAA가 발린 (Val 또는 V)을 포함하는 780번 위치에 아이소류신 (Ile 또는 I)을 갖는다. 이러한 hGAA780I는 "기준 서열"로 문헌에 널리 기재되어 있는 780번 위치에 발린을 갖는 hGAA 서열 (hGAAV780)보다 더 우수한 효과 및 개선된 안전성 프로파일을 갖는 것으로 예기치 않게 발견되었다. 예를 들면, 도 5A 내지 5H에서 볼 수 있는 바와 같이, hGAAV780 기준 서열은 hGAA780I 효소에 의해 동일한 용량으로 보이지 않는 독성 (섬유화 심근염)을 유도한다. 따라서, hGAA780I의 사용으로 hGAA를 이용한 요법을 받는 환자의 섬유화 심근염을 감소시키거나 없앨 수 있다. hGAA 신호 펩티드, 성숙한 단백질, 활성 촉매 부위, 및 결합 부위, 즉 아미노산 위치 1번 내지 27번의 신호 펩티드; 아미노산 위치 70번 내지 952번의 성숙한 단백질; 아미노산 위치 123번 내지 952번에 위치한 76 kDa 성숙한 단백질, 및 아미노산 204번 아미노산 내지 952번의 70 kD 성숙한 단백질; 아미노산 잔기 516번 내지 521번의 헥사펩티드 WIDMNE를 포함하는 "활성 촉매 부위" (서열번호 61)의 위치는 서열번호 3으로 재현되는 hGAA780I에서 유사한 위치를 기반으로 결정될 수 있으며; 다른 활성 부위는 위치 376번, 404번, 405번, 441번, 481번, 516번, 518번, 519번, 600번, 613번, 616번, 649번, 674번 중 하나 이상에 위치할 수 있는 리간드 결합 부위를 포함한다.
특정 구현예에서, 서열번호 3의 hGAA780I와 적어도 95% 동일, hGAA780I와 적어도 97% 동일, 또는 hGAA780I와 적어도 99% 동일한 서열을 갖는 hGAA780I가 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 서열번호 3의 성숙한 hGAA780I 단백질과 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일한 서열이 제공된다. 특정 구현예에서, hGAA780I와 적어도 95% 내지 적어도 99% 동일성을 갖는 서열은 임의의 변화 없이 유지된 활성 촉매 부위에 대한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 서열번호 3에 대한 hGAA780I에 대해 적어도 95% 내지 적어도 99% 동일성을 갖는 서열은 적절한 동물 모델에서 테스트할 때 참조 hGAAV780보다 개선된 생물학적 효과 및 더 우수한 안전성 프로파일을 갖는 것을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, GAA 활성 검정은 이전에 기재된 바와 같이 (예로, J. Hordeaux, et. al., Acta Neuropathological Communications, (2107) 5: 66 참조) 또는 다른 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, hGAA780I 효소는 hGAA 아미노산 서열의 다른 위치에 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 이러한 돌연변이체 hGAA780I는 최소한 활성 촉매 부위의 WIDMNE (서열번호 61) 및 하기 기술된 780I 영역의 아미노산을 유지할 수 있다.
특정 구현예에서, 고유한 hGAA 신호 펩티드 이외의 리더 펩티드를 포함하는 신규 hGAA780I 융합 단백질이 제공된다. 특정 구현예에서, 이와 같은 외인성 리더 펩티드는 바람직하게는 인간 기원이고, 예를 들면, IL-2 리더 펩티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서 작동 가능한 특정 외인성 신호 펩티드는 키모트립시노겐 B2 유래의 아미노산 1 내지 20개, 인간 알파-1-항트립신의 신호 펩티드, 이듀로네이트-2-설파타제 유래의 아미노산 1 내지 25개, 및 프로테아제 CI 저해제 유래의 아미노산 1 내지 23개를 포함한다. 예를 들면, 국제특허출원 제 WO 2018046774호 참조. 다른 신호/리더 펩티드는 특히 면역글로불린 (예를 들면, IgG), 사이토카인 (예를 들면, IL-2, IL-12, IL-18 등), 인슐린, 알부민, β-글루쿠로니다제, 알칼리성 프로테아제 또는 피브로넥틴 분비 신호 펩티드에서 자연적으로 발견될 수 있다. 또한, 예로 signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia 참조.
이러한 키메라 hGAA780I는 전체 27개 아미노산의 고유한 신호 펩티드 대신에 외인성 리더를 갖을 수 있다. 선택적으로, hGAA780I 효소의 N-말단 절단으로 신호 펩티드 (예를 들면, 약 2개 내지 약 25개 아미노산, 또는 그 사이 값의 결실), 전체 신호 펩티드, 또는 신호 펩티드보다 더 긴 단편 (서열번호 3의 번호매김을 기준으로 하여 최대 70개 아미노산)의 단지 일부만 결여될 수 있다. 선택적으로, 이와 같은 효소는 길이가 약 5개, 10개, 15개 또는 20개 아미노산인 C-말단 절단을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 융합 파트너에 결합되는 성숙한 hGAA780I 단백질 (aa 70 내지 952번), 성숙한 70 kD 단백질 (아미노산 123번 내지 아미노산 952번), 또는 성숙한 76 kD 단백질 (아미노산 204번 내지 952번)을 포함하는 신규 융합 단백질이 제공된다. 선택적으로, 융합 단백질은 hGAA에 고유하지 않은 신호 펩티드를 더 포함한다. 추가로 선택적으로, 이들 구현예 중 하나는 길이가 약 5개, 10개, 15개 또는 20개 아미노산인 C-말단 절단을 더 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, hGAA780I 단백질을 포함하는 융합 단백질은 780번 위치에 Ile를 갖는 서열번호 3 (hGAA780I)의 적어도 204번 아미노산 내지 890번 아미노산, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, hGAA780I 단백질은 780번 위치에 Ile를 갖는 서열번호 3의 적어도 204번 아미노산 내지 952번 아미노산 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, hGAA780I 단백질은 780번 위치에 Ile를 갖는 서열번호 3의 적어도 123번 아미노산 내지 890번 아미노산 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, hGAA780I 효소는 780번 위치에 Ile를 갖는 서열번호 3의 적어도 70번 아미노산 내지 952번 아미노산 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, hGAA780I 단백질은 780번 위치에 Ile를 갖는 서열번호 3의 적어도 70번 아미노산 내지 890번 아미노산, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 융합 단백질은 신호 및 리더 서열, 및 서열번호 7과 적어도 95% 동일성, 적어도 97% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 hGAA780I 서열을 포함하고, 활성 부위의 변화가 없고/거나 활성 부위에 대한 N-말단 및/또는 C-말단의 3개 내지 12개 아미노산에 변화가 없다. 바람직한 구현예에서, 조작된 hGAA 발현 카세트는 적어도, T - Val (V) - P - Ile (780I) - Glu (E) - Ala (A) - Leu (L) (서열번호 62)의 인간 hGAA780I 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 조작된 hGAA 발현 카세트는, Gln (Q) - T - V - P - 780I - E - A - L - Gly (G) (서열번호 63)의 더 긴 인간 hGAA780I 단편을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 조작된 hGAA 발현 카세트는 적어도 PLGT - Trp (W) - Tyr (Y) - Asp (D) - LQTVP - 780I - EALG - (Ser 또는 S) - L - PPPPAA 서열 (서열번호 64)에 해당하는 단편을 인코딩한다. 유사하게, 바람직한 구현예에서 활성 결합 부위 (서열번호 3의 아미노산 518번 내지 521번)에 아미노산 변화가 없다. 특정 구현예에서, 위치 600번, 616번 및/또는 674번에서의 결합 부위는 변화되지 않은 상태로 유지된다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 신호 펩티드, 선택적인 vIGF + 2개 GS 연장, 선택적인 ER 단백질분해 펩티드, 및 hGAA의 처음 35개 아미노산의 결실이 있는 (즉, 고유한 신호 펩티드 및 아미노산 28번 내지 35번이 결여됨) hGAA780I 변이체를 포함한다.
특정 구현예에서, BiP 신호 펩티드, IGF2 + 2개 GS 연장 및 hGAA780I의 아미노산 61번 내지 952번 (hGAA780I의 아미노산 1번 내지 60번이 결실됨)을 포함하는 분비된 조작된 GAA가 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서는 서열번호 6 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열을 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 7 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열에 의해 인코딩된다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 4의 서열 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 5의 서열 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열을 포함한다.
본원에 제공된 융합 단백질의 구성요소는 하기에 추가로 설명된다.
CI-MPR에 결합하는 펩티드
본원에서는 CI-MPR에 결합하는 펩티드 (예로, vIGF2 펩티드)가 제공된다. 이러한 펩티드 및 hGAA780I 단백질을 포함하는 융합 단백질은 유전자 요법으로부터 발현될 때 hGAA780I를 필요한 세포에 표적시키고, 이러한 세포에 의한 세포성 흡수를 증가시키며, 치료용 단백질을 세포하위 위치 (예로, 리소좀)에 표적시킨다. 일부 구현예에서, 펩티드는 hGAA780I 단백질의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 펩티드는 hGAA780I 단백질의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 펩티드는 vIGF2 펩티드이다. 일부 vIGF2 펩티드는 CI-MPR에 대한 고-친화 결합을 유지하는 반면, IGF1 수용체, 인슐린 수용체 및 IGF 결합 단백질 (IGFBP)에 대한 이들의 친화도는 감소되거나 제거된다. 따라서, 일부 변이체 IGF2 펩티드는 실질적으로 더욱 선택적이고, 야생형 IGF2와 비교하여 감소된 안전성 위험을 갖는다. 본원에서 vIGF2 펩티드는 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 변이체 IGF2 펩티드는 야생형 IGF2 (서열번호 34)와 비교하여 위치 6번, 26번, 27번, 43번, 48번, 49번, 50번, 54번, 55번 또는 65번에서 변이 아미노산을 갖는 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 E6R, F26S, Y27L, V43L, F48T, R49S, S50I, A54R, L55R 및 K65R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 E6R의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 F26S의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 Y27L의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 V43L의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 F48T의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 R49S의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 S50I의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 A54R의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 L55R의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 K65R의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 E6R, F26S, Y27L, V43L, F48T, R49S, S50I, A54R 및 L55R의 치환을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 N-말단 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 1개 아미노산의 N-말단 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 2개 아미노산의 N-말단 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 3개 아미노산의 N-말단 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 4개 아미노산의 N-말단 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 4개 아미노산의 N-말단 결실, 및 E6R, Y27L 및 K65R의 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 4개 아미노산의 N-말단 결실, 및 E6R 및 Y27L의 치환을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 5개 아미노산의 N-말단 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 6개 아미노산의 N-말단 결실을 갖는다. 일부 구현예에서, vIGF2 펩티드는 7개 아미노산의 N-말단 결실, 및 Y27L 및 K65R의 치환을 갖는다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
신호 펩티드
본원에 제공된 조성물은, 일부 구현예에서 유전자 요법 구조물로 형질도입된 세포로부터 hGAA780I의 분비를 개선하는 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 치료용 단백질의 단백질 프로세싱을 개선하고, ER로 폴리펩티드-리보좀 복합체의 이동을 용이하게 하며, 적절한 보조-번역 및 번역-후 변형을 보장한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 (i) 신호 번역 개시 서열의 상류 위치, (ii) 번역 개시 서열 및 치료용 단백질 사이 또는 (iii) 치료용 단백질의 하류 위치에 위치한다. 유전자 요법 구조물에 유용한 신호 펩티드는 HSP70 단백질의 패밀리 (예로, HSP5, 열 충격 단백질 패밀리 A 구성원 5)로부터의 결합 면역글로불린 단백질 (BiP) 신호 펩티드, 가우시아 신호 펩티드 및 이들의 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 신호 펩티드는 신호 인식 입자에 대한 한외 고-친화성을 갖는다. BiP 및 가우시아 아미노산 서열의 예는 하기 표에 제공된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 49 내지 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 49 내지 53으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개의 아미노산(들)이 상이하다.
Figure pct00004
가우시아 신호 펩티드는 가우시아 프린셉스로부터의 루시페라제로부터 유래하고, 이 신호 펩티드에 융합된 치료용 단백질의 단백질 합성 및 분비의 증가를 유도한다. 일부 구현예에서, 가우시아 신호 펩티드는 서열번호 54와 적어도 90% 일치하는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 가우시아 신호 펩티드는 서열번호 54와 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개의 아미노산(들)이 상이하다.
링커
본원에 제공된 조성물은, 일부 구현예에서 표적화 펩티드 및 치료용 단백질 사이에 링커를 포함한다. 이러한 링커는, 일부 구현예에서 정확한 간격을 유지시키고, vIGF2 펩티드 및 치료용 단백질 사이의 입체적 마찰을 완화한다. 링커는, 일부 구현예에서 반복된 글리신 잔기, 반복된 글리신-세린 잔기 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 5개 내지 20개의 아미노산, 5개 내지 15개의 아미노산, 5개 내지 10개의 아미노산, 8개 내지 12개의 아미노산, 또는 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 13개의 아미노산으로 구성된다. 적합한 링커는 하기 표에 제공된 링커를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
Figure pct00005
본 명세서 전반에 걸쳐, 다양한 발현 카세트, 벡터 게놈, 벡터, 및 조성물이 hGAA780I 코딩 서열 또는 hGAA780I 단백질 또는 융합 단백질을 포함하는 것으로 기재되어 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 것과 같은 N-말단 절단, C-말단 절단, 및 융합 단백질을 포함하여 조작된 hGAA780I 단백질, 또는 이에 대한 코딩 서열 중 임의의 것이 발현 카세트, 벡터 게놈, 벡터, 및 조성물로 유사하게 조작될 수 있음을 이해할 것이다.
적합하게는, 본 명세서에 기재된 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 제공된다.
발현 카세트
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현 카세트"는 표적 세포에서 발현을 구동하는 조절 서열, 프로모터에 작동가능하게 연결된 기능적 유전자 산물을 인코딩하는 핵산 서열 (예로, hGAA780I 융합 단백질 코딩 서열)을 포함하는 핵산 분자를 말하고, 이에 따라 다른 조절 서열을 포함할 수 있다. 필요한 조절 서열은 표적 세포에서 hGAA780I 융합 단백질 코딩 서열의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 해당 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 미번역 영역(들)에 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. miRNA 표적 서열은 이식유전자 발현이 바람직하지 않고/않거나 감소된 수준의 이식유전자 발현이 요구되는 세포에 존재하는 miRNA에 의해 특이적으로 인식되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 배근신경절에서 hGAA780I 융합 단백질의 발현을 특이적으로 감소시키는 miRNA 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, miRNA 표적 서열은 3' UTR, 5' UTR, 및/또는 3' 및 5' UTR 둘 다에 위치한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 배근신경절 (DRG)-특이적 miRNA 서열의 적어도 2개의 일렬 반복서열을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 일렬 반복서열은 동일하거나 상이할 수 있는 적어도 제1 miRNA 표적 서열 및 적어도 제2 miRNA 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 2개의 drg-특이적 miRNA 일렬 반복서열 중 첫 번째 시작은 hGAA780I 융합 단백질-코딩 서열의 3' 말단으로부터 20개의 뉴클레오티드 이내이다. 특정 구현예에서, 적어도 2개의 DRG-특이적 miRNA 일렬 반복서열 중 첫 번째의 시작은 hGAA780I 융합 단백질 코딩 서열의 3' 말단으로부터 적어도 100개의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, miRNA 일렬 반복서열은 200 내지 1200개의 뉴클레오티드 길이를 포함한다. 특정 구현예에서, miR 표적의 포함은 miR 표적 서열이 결여된 발현 카세트 또는 벡터 게놈에 비해, 하나 이상의 표적 조직에서 치료용 이식유전자의 발현 또는 효능을 변형시키지 않는다.
특정 구현예에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 miR-183 표적 서열인 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 AGTGAATTCTACCAGTGCCATA (서열번호 26)를 포함하는 miR-183 표적 서열을 포함하며, 여기서 miR-183 시드 서열에 상보적인 서열은 밑줄이 그어져 있다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 miR-183 시드 서열에 100% 상보적인 서열의 하나 초과의 복제물 (예를 들면, 2개 또는 3개 복제물)을 포함한다. 특정 구현예에서, miR-183 표적 서열은 길이가 약 7개의 뉴클레오티드 내지 약 28개의 뉴클레오티드이고 miR-183 시드 서열에 적어도 100% 상보적인 적어도 하나의 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, miR-183 표적 서열은 서열번호 26에 부분적인 상보성을 갖는 서열을 포함하고, 따라서 서열번호 2에 대해 정렬될 때, 하나 이상의 미스매치가 있다. 특정 구현예에서, miR-183 표적 서열은 서열번호 26에 대해 정렬될 때 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 미스매치를 갖는 서열을 포함하며, 여기서 미스매치는 비-연속적일 수 있다. 특정 구현예에서, miR-183 표적 서열은 miR-183 표적 서열 길이의 적어도 30%를 또한 포함하는 100% 상보성의 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 100% 상보성의 영역은 miR-183 시드 서열에 100% 상보성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, miR-183 표적 서열의 나머지는 miR-183에 적어도 약 80% 내지 약 99% 상보성을 갖는다. 특정 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 절단된 서열번호 26, 즉, 서열번호 26의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나 또는 둘 다에서 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드가 결여된 서열을 포함하는 miR-183 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 이식유전자 및 하나의 miR-183 표적 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 적어도 2개, 3개 또는 4개의 miR-183 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개의 miR-183 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈 내의 적어도 2개, 3개 또는 4개의 miR-183 표적 서열의 포함은 심장과 같은 표적 조직에서 이식유전자의 수준 증가를 유도한다.
특정 구현예에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 miR-182 표적 서열인 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA (서열번호 27)를 포함하는 miR-182 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈 또는 발현 카세트는 miR-182 종자 서열에 100% 상보적인 서열의 하나 초과의 복제물 (예를 들면, 2개 또는 3개 복제물)을 포함한다. 특정 구현예에서, miR-182 표적 서열은 길이가 약 7개의 뉴클레오티드 내지 약 28개의 뉴클레오티드이고 miR-182 시드 서열에 적어도 100% 상보적인 적어도 하나의 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, miR-182 표적 서열은 서열번호 27에 부분적인 상보성을 갖는 서열을 포함하고, 따라서 서열번호 27에 대해 정렬될 때, 하나 이상의 미스매치가 있다. 특정 구현예에서, miR-183 표적 서열은 서열번호 27에 대해 정렬될 때 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 미스매치를 갖는 서열을 포함하며, 여기서 미스매치는 비-연속적일 수 있다. 특정 구현예에서, miR-182 표적 서열은 miR-182 표적 서열 길이의 적어도 30%를 또한 포함하는 100% 상보성의 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 100% 상보성의 영역은 miR-182 시드 서열에 100% 상보성을 갖는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, miR-182 표적 서열의 나머지는 miR-182에 적어도 약 80% 내지 약 99% 상보성을 가진다. 특정 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 절단된 서열번호 27, 즉, 서열번호 27의 5' 또는 3' 말단 중 어느 하나 또는 둘 다에서 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드가 결여된 서열을 포함하는 miR-182 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 이식유전자 및 하나의 miR-182 표적 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 적어도 2개, 3개 또는 4개의 miR-182 표적 서열을 포함한다.
용어 "일렬 반복서열"는 본 명세서에서 2개 이상의 연속적인 miRNA 표적 서열의 존재를 말하는데 사용된다. 이러한 miRNA 표적 서열은 연속적일 수 있으며, 즉 하나의 3' 말단이 개입하는 서열 없이 다음의 5' 말단의 바로 상류에 있거나, 역으로 서로 바로 뒤에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 2개 이상의 miRNA 표적 서열은 짧은 스페이서 서열에 의해 분리된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "스페이서"는 2개 이상의 연속적인 miRNA 표적 서열 사이에 위치한, 예를 들면, 길이가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오티드인 임의의 선택된 핵산 서열이다. 특정 구현예에서, 스페이서는 길이가 1 내지 8개의 뉴클레오티드, 길이가 2 내지 7개의 뉴클레오티드, 길이가 3 내지 6개의 뉴클레오티드, 길이가 4개의 뉴클레오티드, 4 내지 9개의 뉴클레오티드, 3 내지 7개의 뉴클레오티드, 또는 더 긴 값이다. 적합하게는, 스페이서는 비-코딩 서열이다. 특정 구현예에서, 스페이서는 네 (4)개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GGAT이다. 특정 구현예에서, 스페이서는 여섯 (6)개의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 스페이서는 CACGTG 또는 GCATGC이다.
특정 구현예에서, 일렬 반복서열은 2, 3, 4개 또는 그 이상의 동일한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 일렬 반복서열은 적어도 2개의 상이한 miRNA 표적 서열, 적어도 3개의 상이한 miRNA 표적 서열, 또는 적어도 4개의 상이한 miRNA 표적 서열 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 일렬 반복서열은 2개 또는 3개의 동일한 miRNA 표적 서열 및 상이한 제 4 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트 또는 벡터 게놈은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-183 표적 서열의 조합, 및 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 miR-183 표적 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 발현 카세트에 일렬 반복서열의 적어도 2개의 상이한 세트가 있을 수 있다. 예를 들면, 3' UTR은 이식유전자의 바로 하류에 일렬 반복서열, UTR 서열, 및 UTR의 3' 말단에 더 가까운 2개 이상의 일렬 반복서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 5' UTR은 1, 2개 또는 그 이상의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 3'은 일렬 반복서열을 포함할 수 있고 5' UTR은 적어도 1개의 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 이식유전자에 대한 정지 코돈의 약 0 내지 20개의 뉴클레오티드 내에서 시작하는 2, 3, 4개 또는 그 이상의 일렬 반복서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 발현 카세트는 이식유전자에 대한 종결 코돈으로부터 적어도 100개 내지 약 4000개의 뉴클레오티드의 miRNA 일렬 반복서열을 포함한다.
2019년 12월 20일에 제출되고 이제 국제출원 제 WO 2020/132455호로서 공개된 국제특허출원 제 PCT/US19/67872호 참조, 이는 2018년 12월 21일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 62/783,956호에 대한 우선권을 주장하며, 이들은 본원에 참고문헌으로 통합된다. 또한, 2020년 5월 12일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 63/023,593호, 2020년 6월 12일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 63/038,488호, 2020년 6월 24일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 63/043,562호, 2020년 9월 16일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 63/079,299호, 2021년 2월 22일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 63/152,042호, 2021년 5월 12일에 제출된 미국 가특허출원 제 PCT/US21/32003호 참조, 이들 모두는 본원에 참고문헌으로 통합된다.
본원에 사용된 바, "BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183"는 만능 CAG 프로모터의 조절 하에 변형된 BiP-vIGF2 신호 서열을 갖는 hGAA780I의 조작된 코딩 서열, 및 miR183 표적 서열의 4개 일렬 반복서열을 포함하는 발현 카세트 (예로, 도 11에 도시됨)를 말한다. 본원에 제공된 실시예에 도시된 바, V780I 돌연변이 및 BiP-vIGF2 변형은 안전성 및 효능의 개선에 기여한다. 특정 구현예에서, BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183은 서열번호 3 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열의 융합 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183은 서열번호 7 또는 이와 적어도 95% 내지 99% 일치하는 서열의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본원에서는 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183가 5'ITR 및 3' ITR에 의해 연접되는 벡터 게놈이 제공된다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호 30이다. 추가의 구현예에서, 서열번호 30과 적어도 95% 일치하는 서열을 포함하고, 서열번호 6의 융합 단백질을 인코딩하는 벡터 게놈이 제공된다.
본 명세서에서 사용된 바, "작동가능하게 연결된" 서열은 hGAA780I 코딩 서열과 인접한 발현 제어 서열 및 hGAA780I 코딩 서열을 제어하기 위해 트랜스 배향으로 또는 이격되어 작용하는 발현 조절 서열을 둘 다 포함한다. 이와 같은 조절 서열은 전형적으로, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 인트론, 코작 서열, 폴리아데닐화 서열 및 TATA 신호 중 하나 이상을 포함한다.
특정 구현예에서, 조절 요소는 다수의 표적 세포를 치료하는 데 적합한 단일 발현 카세트의 작제 및 전달을 허용하기 위해, 폼페병에 의해 이환된 다수의 세포 및 조직에서 발현을 지시한다. 예를 들면, 간, 골격근, 심장 및 중추신경계 세포 중 둘 이상에서 발현하는 조절 요소 (예를 들면, 프로모터)가 선택될 수 있다. 예를 들면, 중추신경계 (예를 들면, 뇌) 세포, 및 골격근에서 발현하는 조절 요소 (예를 들면, 프로모터)가 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 조절 요소는 CNS, 골격근 및 심장에서 발현한다. 다른 구현예에서, 발현 카세트는 간, 골격근, 심장 및 중추신경계 세포 모두에서 인코딩된 hGAA780I의 발현을 허용한다. 다른 구현예에서, 조절 요소는 (예를 들면, 본 명세서에 기재된 drg-탈표적화 시스템의 사용 및/또는 조직-특이적 프로모터의 선택에 의해) 특정 조직을 표적화하고 특정 세포 또는 조직에서 발현을 회피하도록 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 상이한 조직을 우선적으로 표적화하는 본 명세서에서 제공되는 상이한 발현 카세트가 환자에게 투여된다.
조절 서열은 프로모터를 포함한다. 표적화된 세포에서 hGAAV780I 단백질을 발현할 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는 적합한 프로모터가 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 전신발현 프로모터 또는 유도성/조절 프로모터가 선택된다. 전신발현 프로모터의 예는 닭 베타-액틴 프로모터이다. 다양한 닭 베타-액틴 프로모터가 단독으로, 또는 다양한 인핸서 요소와 조합하여 기재되었다 (예를 들면, CB7은 거대세포바이러스 인핸서 요소; 프로모터, 닭 베타 액틴의 제 1 엑손 및 제 1 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함하는 CAG 프로모터; CBh 프로모터가 있는 닭 베타-액틴 프로모터임 (S. J. Gray et al., Hu. Gene Ther., 2011년 9월, 22 (9): 1143-1153)). 특정 구현예에서, 조절가능한 프로모터가 선택될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 제 WO 2011/126808B2호 참조.
특정 구현예에서, 조직-특이적 프로모터가 선택될 수 있다. 조직-특이적인 프로모터의 예는 간 (알부민, Miyatake et al. (1997), J. Virol., 71: 5124-32; B형 간염 바이러스 코어 프로모터, Sandig et al. (1996). Gene Ther., 3: 1002-9; 알파-태아단백질 (AFP), Arbuthnot et al. (1996), Hum. Gene Ther., 7: 1503-14]), 중추신경계, 예로 뉴런 (예컨대, 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터, Andersen et al. (1993), Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15; 신경미세섬유 경쇄 유전자, Piccioli et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5; 및 뉴런-특이적 vgf 유전자, Piccioli et al. (1995), Neuron, 15: 373-84), 심장 근육, 골격근, 폐, 및 다른 조직에 대하여 잘 알려져 있다. 또 다른 구현예에서, 적합한 프로모터는 연장인자 1 알파 (EF1 알파) 프로모터 (예로, Kim D. W. et al. Use of the human elongation factor 1 alpha promoter as a versatile and efficient expression system. Gene., 1990년 7월 16일, 91(2): 217-23 참조), 시냅신 1 프로모터 (예를 들면, Krugler S. et al., Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 2003년 2월, 10(4): 337-47 참조), 뉴런-특이적 에놀라제 (NSE) 프로모터 (예로, Kim J. et al., Involvement of cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate cancer cells. Endocrinology, 2004년 2월, 145(2): 613-9. Epub 2003년 10월 16일 참조), 또는 CB6 프로모터 (예로, Large-Scale Production of Adeno-Associated Viral Vector Serotype-9 Carrying the Human Survival Motor Neuron Gene, Mol. Biotechnol. 2016년 1월, 58(1): 30-6. doi: 10.1007/s12033-015-9899-5 참조)를 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 조직-특이적 프로모터를 이용하는 특정 구현예에서, 상이한 세포 유형을 표적화하는 조직-특이적 프로모터를 갖는 상이한 발현 카세트를 포함하는 공동-요법이 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 조절 서열은 인핸서를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 조절 서열은 하나의 인핸서를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조절 서열은 2개 이상의 발현 인핸서를 포함한다. 이들 인핸서는 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 예를 들면, 인핸서는 알파 mic/bik 인핸서 또는 CMV 인핸서를 포함할 수 있다. 이러한 인핸서는 서로 인접하게 위치한 2개의 복제물로 존재할 수 있다. 대안적으로, 인핸서의 이중 복제물은 하나 이상의 서열에 의해 분리될 수 있다.
일 구현예에서, 조절 서열은 인트론을 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 인트론은 닭 베타-액틴 인트론이다. 다른 적합한 인트론은 인간 β-글로불린 인트론, 및/또는 상업적으로 입수가능한 프로메가® 인트론, 및 제 WO 2011/126808호에 기재된 것에 의해 당업계에 알려진 것을 포함한다.
일 구현예에서, 조절 서열은 폴리아데닐화 신호 (폴리 A)를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 폴리 A는 토끼 글로빈 폴리 A이다. 예를 들면, 제 WO 2014/151341호 참조. 대안적으로, 또 다른 폴리 A, 예를 들면, 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 서열, SV40 폴리 A, 또는 합성 폴리 A가 발현 카세트에 포함될 수 있다.
본원에 기술된 발현 카세트에서의 조성물은 본 명세서 전반에 걸쳐 기술된 다른 조성물, 요법, 양태, 구현예 및 방법에 적용하도록 의도된 것으로 이해되어야 한다.
발현 카세트는 임의의 적합한 전달 시스템을 통해 전달될 수 있다. 적합한 비-바이러스 전달 시스템은 당업계에 알려져 있으며 (예로, Ramamoorth and Narvekar., J. Clin. Diagn. Res. 2015년 1월, 9 (1): GE01-GE06 참조, 이는 본 명세서에 참고문헌으로 통합됨) 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있고, 예를 들면 노출 DNA, 노출 RNA, 덴드리머, PLGA, 폴리메트아크릴레이트, 무기 입자, 지질 입자 (예로, 지질 나노입자 또는 LNP), 또는 키토산 기반의 제형물을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 벡터는 이의 기재된 발현 카세트, 예를 들면, "노출 DNA", "노출 플라스미드 DNA", RNA 및 mRNA; 예를 들면, 미셀, 리포좀, 양이온성 지질-핵산 조성물, 폴리-글리칸 조성물 및 다른 중합체, 지질 및/또는 콜레스테롤-기반 핵산 컨쥬게이트를 포함하는 나노 입자 및 다양한 조성물과 커플링된 발현 카세트, 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 구조물을 포함하는 비-바이러스 플라스미드이다. 예로, X. Su et al., Mol. Pharmaceutics, 2011년, 8(3): 774-787; 웹 공개 2011년 3월 21일]; 국제특허출원 제 WO 2013/182683호, 제 WO 2010/053572호 및 제 WO 2012/170930호 참조, 이들 모두는 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 hGAA780I 변이체, 융합 단백질, 또는 절단된 단백질을 인코딩하는 서열을 갖는 핵산 분자가 본 명세서에서 제공된다. 바람직한 일 구현예에서, hGAA780I는 서열번호 4의 조작된 서열 또는 hGAA780I 변이체를 인코딩하는 이와 적어도 95% 동일한 서열에 의해 인코딩된다. 특정 구현예에서, 서열번호 4는 780I 위치에서 Ile를 인코딩하는 코돈이 ATT 또는 ATC가 되도록 변형된다. 특정 구현예에서, 서열번호 4의 조작된 서열을 포함하는 핵산, 또는 이의 단편은 융합 단백질 또는 절단된 hGAA780I를 발현하는 데 사용된다. 덜 바람직하지만, 특정 구현예에서, hGAA780I는 서열번호 5에 의해 인코딩된다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 6 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열의 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 서열번호 7 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열의 서열을 갖는 핵산이 제공된다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 플라스미드이다.
벡터
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "벡터"는 핵산 서열의 복제 또는 발현을 위해 적절한 표적 세포로 도입될 수 있는 핵산 서열을 포함하는 생물학적 또는 화학적 모이어티이다. 벡터의 예는 재조합 바이러스, 플라스미드, 리포플렉스, 폴리머좀, 폴리플렉스, 덴드리머, 세포 투과 펩티드 (CPP) 컨쥬게이트, 자성 입자, 또는 나노입자를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 벡터는 이후에 적절한 표적 세포 내로 도입될 수 있는, 기능적 유전자 산물을 인코딩하는 외인성 또는 이종성 조작된 핵산을 갖는 핵산 분자이다. 이와 같은 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 복제 기원, 및 재조합 DNA가 삽입될 수 있는 하나 이상의 부위를 가진다. 벡터는 종종 벡터를 갖는 세포가 벡터가 없는 세포로부터 선택될 수 있는 수단을 가지며, 예를 들면, 벡터는 약물 내성 유전자를 인코딩한다. 일반적인 벡터는 플라스미드, 바이러스 게놈, 및 "인공 염색체"를 포함한다. 벡터의 생성, 생산, 특성화, 또는 정량화의 통상적인 방법은 당업자에게 이용가능하다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 벡터는 기능적 hGAA780I 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 외피에 패키징되는 합성 또는 인공 바이러스 입자를 말하는 "복제 결함성 바이러스" 또는 "바이러스성 벡터"이며, 여기서 바이러스 캡시드 또는 외피 내에 패키징되는 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제 결함성이고; 즉, 이들은 자손 비리온을 생성할 수 없지만 표적 세포를 감염시키는 능력은 보유한다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 필요한 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하지 않지만 (게놈은 "무기력" (인공 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 신호가 측접한 인코딩하는 핵산 서열만을 포함함)하도록 조작될 수 있음), 이들 유전자는 생성 동안 공급될 수 있다. 따라서, 복제에 필요한 바이러스 효소가 존재하는 경우를 제외하고 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 일어나지 못하므로 유전자 요법에 사용하기에 안전하다고 여겨진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 재조합 바이러스 벡터는 원하는 세포 (들)를 표적화하는 임의의 적합한 바이러스 벡터이다. 따라서, 재조합 바이러스 벡터는 바람직하게는, 중추신경계 (예를 들면, 뇌), 골격근, 심장, 및/또는 간을 포함하는 폼페병에 의해 이환된 세포 및 조직 영향 중 하나 이상을 표적화한다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 중추신경계 (예를 들면, 뇌), 폐, 심장 세포, 또는 골격근을 표적화한다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 CNS (예를 들면, 뇌), 골격근 및/또는 심장을 표적화한다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 간, 골격근, 심장 및 중추신경계 세포를 모두 표적화한다. 예는 예시적인 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)를 제공한다. 그러나, 다른 적합한 바이러스 벡터는, 예를 들면, 재조합 아데노바이러스, 재조합 파보바이러스, 예컨대, 재조합 보카바이러스, 하이브리드 AAV/보카바이러스, 재조합 단순 헤르페스 바이러스, 재조합 레트로바이러스, 또는 재조합 렌티바이러스를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이들 재조합 바이러스는 복제 불능성이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 벡터 (예를 들면, 재조합 AAV)가 생성되는 패키징 세포주를 지칭할 수 있다. 숙주 세포는 임의의 수단, 예를 들면, 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주입, 형질전환, 바이러스 감염, 형질감염, 리포솜 전달, 막 융합 기법, 고속 DNA-코팅 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합에 의해 세포 내로 도입된 외인성 또는 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포 (예를 들면, 인간, 곤충, 또는 효모)일 수 있다. 숙주 세포의 예는 단리된 세포, 세포 배양물, 대장균 (에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)) 세포, 효모 세포, 인간 세포, 비-인간 세포, 포유동물 세포, 비-포유동물 세포, 곤충 세포, HEK-293 세포, 간 세포, 신장 세포, 중추신경계의 세포, 뉴런, 신경아교세포, 또는 줄기 세포를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 단백질이 단리 또는 정제를 위해 시험관내에서 충분한 양으로 생성되도록 hGAA780I의 생성을 위한 발현 카세트를 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 hGAA780I, 또는 이의 단편을 인코딩하는 발현 카세트를 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같이, hGAA780I 단백질은 치료제 (즉, 효소 대체 요법)로서 대상체에게 투여되는 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 세포"는 기능적 유전자 산물의 발현이 요구되는 임의의 표적 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터 게놈"은 바이러스 벡터 내부에 패키징된 핵산 서열을 지칭한다. 일 예에서, "벡터 게놈"은 최소한 5'에서 3'으로 벡터 특이적 서열, 표적 세포에서 발현을 지시하는 조절 제어 서열에 작동가능하게 연결된 기능적 유전자 산물 (예를 들면, hGAA780I, 융합 단백질 hGAA780I, 또는 또 다른 단백질)을 인코딩하는 핵산 서열, 벡터-특이적 서열, 및 선택적으로 미번역 영역 (들) 및 벡터-특이적 서열의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 벡터-특이적 서열은 벡터 게놈을 바이러스 벡터 캡시드 또는 외피 단백질 내로 특이적으로 패키징하는 말단 반복 서열일 수 있다. 예를 들면, AAV 역전된 말단 반복서열은 AAV 및 다른 특정 파보바이러스 캡시드 내로 패키징하는 데 이용된다. 렌티바이러스 긴 말단 반복서열은 렌티바이러스 벡터 내로의 패키징이 요구되는 경우에 이용될 수 있다. 유사하게, 다른 말단 반복서열 (예를 들면, 레트로바이러스 긴 말단 반복서열) 등이 선택될 수 있다.
본 명세서에 기재된 벡터에서의 조성물은 본 명세서 전반에 걸쳐 기재된 다른 조성물, 요법, 양태, 구현예, 및 방법에 적용하도록 의도되는 것으로 이해되어야 한다.
아데노 관련 바이러스 (AAV)
일 양태에서, 본원에 기술된 hGAAV780I 융합 단백질 (효소)을 인코딩하는 AAV 캡시드 및 내부에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 재조합 AAV (rAAV)가 본 명세서에서 제공된다. 특정 구현예에서, 선택된 AAV 캡시드는 간, 근육, 신장, 심장 및/또는 중추신경계 세포 유형 중 둘 이상의 세포를 표적화한다. 특정 구현예에서, 간, 골격근, 심장, 신장 및/또는 적어도 하나의 중추신경계 세포 유형 중 적어도 둘 이상에서 hGAA780I 융합 단백질을 발현시키는 것이 바람직하다. 따라서, 일 구현예에서 선택된 AAV 캡시드는 심장 조직을 표적화한다. 특정 구현예에서, 심장 조직을 표적화하도록 선택된 AAV 캡시드는 AAV 1, 6, 8, 및 9로부터 선택된다 (예를 들면, 문헌[Katz et al. Hum Gene Ther Clin Dev. 2017 Sep 1; 28 (3): 157-164] 참조). 또 다른 구현예에서, 선택된 AAV 캡시드는 신장의 세포를 표적화한다. 일 구현예에서, 신장 세포를 표적화하기 위한 캡시드는 AAV1, 2, 6, 8, 9, 및 Anc80으로부터 선택된다 (예를 들면, Ikeda Y et al., J. Am. Soc. Nephrol. 2018년 9월, 29(9): 2287-2297 및 Ascio et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2018년 2월 26일, 497 (1): 19-24 참조). 특정 구현예에서, AAV 캡시드는 고유한 또는 조작된 클라드 F 캡시드이다. 특정 구현예에서, 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 AAVhu68 캡시드이다.
일 구현예에서, 벡터 게놈은 AAV 5' 역전된 말단 반복서열 (ITR), 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 카세트, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 일 구현예에서, 벡터 게놈은 rAAV 벡터를 형성하는 rAAV 캡시드 내부에 패키징된 핵산 서열을 지칭한다. 이와 같은 핵산 서열은 발현 카세트에 측접하는 AAV 역전된 말단 반복서열 서열 (ITR)을 포함한다. 일 예에서, AAV 또는 보카바이러스 캡시드로 패키징하기 위한 "벡터 게놈"은 최소한 5'에서 3'으로 AAV 5' ITR, 표적 세포에서 발현을 구동하는 조절 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능적 hGAA780I 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, ITR은 AAV2 유래이고 캡시드는 상이한 AAV 유래이다. 대안적으로, 다른 ITR이 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 이식유전자 발현이 바람직하지 않고/않거나 감소된 수준의 이식유전자 발현이 바람직한 세포에서 miRNA 서열에 의해 특이적으로 인식되도록 설계된 미번역 영역 (들)에 miRNA 표적 서열을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈의 miRNA 표적 서열은 심장에서 이식유전자의 발현 증가를 유도한다.
ITR은 벡터 생성 동안 게놈의 복제 및 패키징을 담당하는 유전 요소이며 rAAV를 생성하는 데 필요한 유일한 바이러스 시스 배향 요소이다. 일 구현예에서, ITR은 캡시드를 공급하는 것과 상이한 AAV 유래이다. 바람직한 구현예에서, AAV2 유래의 ITR 서열, 또는 이의 결실된 형태 (ΔITR)는 편의를 위해 그리고 규제 승인을 가속화하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 다른 AAV 출처로부터의 ITR이 선택될 수 있다. ITR의 출처가 AAV2이고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 출처로부터 나오는 경우, 생성된 벡터는 슈도형으로 불릴 수 있다. 전형적으로, AAV 벡터 게놈은 AAV 5' ITR, hGAA780I 코딩 서열 및 임의의 조절 서열, 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 이들 요소의 다른 입체구조가 적합할 수 있다. D-서열 및 말단 분해 부위 (trs)가 결실된 ΔITR로 명명되는 5' ITR의 단축된 형태가 설명된 바 있다. 다른 구현예에서, 전장 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다. 다른 구현예에서, 전장의 AAV 5' ITR 및 AAV 3' ITR이 사용된다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 130개 염기쌍의 단축된 5' 및/또는 3' AAV2 ITR을 포함하는 한편, 외부 "a" 요소는 결실된다. 단축된 ITR은 내부 A 요소를 주형으로서 사용한 벡터 DNA의 증폭 과정 동안 145개 염기쌍의 야생형 길이로 재전환된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "AAV"는 자연 발생 아데노 관련 바이러스, 당업자에게 입수가능한 및/또는 본 명세서에 기재된 구성 (들) 및 방법 (들)을 고려한 아데노 관련 바이러스뿐만 아니라, 인공 AAV를 말한다. 아데노 관련 바이러스 (AAV) 바이러스 벡터는 표적 세포로 전달하기 위해 AAV 역전된 말단 반복서열 서열 (ITR)이 측접한 발현 카세트에 패키징된 AAV 단백질 캡시드를 갖는AAV 뉴클레아제 (예를 들면, DNase)-내성 입자이다. 뉴클레아제-내성 재조합 AAV (rAAV)는 AAV 캡시드가 완전히 조립되었고 생성 공정에서 존재할 수 있는 오염 핵산을 제거하도록 설계된 뉴클레아제 인큐베이션 단계 동안 이들 패키징된 벡터 게놈 서열을 분해 (소화)로부터 보호함을 나타낸다. 많은 경우에, 본 명세서에 기재된 rAAV는 DNase 내성이다.
AAV 캡시드는 60개의 캡시드 (cap) 단백질 소단위체, VP1, VP2 및 VP3로 구성되고, 이는 선택된 AAV에 따라 대략 1 : 1: 10 내지 1 : 1 : 20 비의 정이십면체 대칭으로 배열된다. 다양한 AAV는 상기 확인된 AAV 바이러스성 벡터의 캡시드를 위한 출처로서 선택될 수 있다. 예로, 미국 특허출원 공개 제 US 2007-0036760-A1호; 제 US 2009-0197338-A1호; 유럽 특허 제 EP 1310571호 참조. 또한, 국제특허출원 제 WO 2003/042397호 (AAV7 및 다른 원숭이 AAV), 미국 특허 제 US 7790449호 및 제 US 7282199호 (AAV8), 제 WO 2005/033321호 및 제 US 7,906,111호 (AAV9), 및 제 WO 2006/110689호 및 제 WO 2003/042397호 (rh.10) 참조. 또한, 이들 문서는 AAV를 생성하기 위해 선택될 수 있는 다른 AAV를 기재하고 있으며, 참고문헌으로 통합된다. 인간 또는 비-인간 영장류 (NHP)로부터 단리되거나 조작되어 잘 특성화된 AAV 중에, 인간 AAV2는 유전자 전달 벡터로서 개발된 첫 번째 AAV이고, 이는 상이한 표적 조직 및 동물 모델에서 효율적인 유전자 전달 실험에 널리 사용되어 왔다. 달리 명시되지 않는 한, AAV 캡시드, ITR, 및 본원에 기술된 다른 선택된 AAV 구성요소는, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAVrh10, AAVhu37, AAV7M8 and AAVAnc80, AAVrh90 (본원에 참고문헌으로 통합되는, 2020년 4월 28일에 제출된 국제특허출원 제 PCT/US20/30273호), AAVrh91 (본원에 참고문헌으로 통합되는, 2020년 4월 28일에 제출된 국제특허출원 제 PCT/US20/30266호), AAVrh92, rh93 및 rh91.93 (본원에 참고문헌으로 통합되는, 2020년 4월 28일에 제출된 국제특허출원 제 PCT/US20/30281호), 및 임의의 공지되거나 언급된 AAV의 변이체, 또는 아직 발견되지 않은 AAV 또는 이의 변이체 또는 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 AAV로부터 쉽게 선택될 수 있다. 예로, 본원에 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 제 WO 2005/033321호 참조. 일 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV9 캡시드 또는 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, 캡시드 단백질은 rAAV 벡터의 명칭에서 용어 "AAV"에 이어진 숫자 또는 숫자 및 문자의 조합에 의해 명명된다.
ITR 또는 다른 AAV 구성요소는 당업자에게 이용가능한 기법을 사용하여 AAV로부터 용이하게 단리되거나 조작될 수 있다. 이러한 AAV는 학문적, 상업적 또는 공공 출처 (예로, 미국 타입 배양물 수집기관, 미국 매너서스 소재)로부터 단리되거나, 조작되거나, 입수할 수 있다. 대안적으로, AAV 서열은, 예를 들면, GenBank, PubMed 등과 같은 데이터베이스 또는 문헌에서 이용가능한 것과 같은 공개된 서열을 참조하여 합성 또는 다른 적합한 수단을 통해 조작될 수 있다. AAV 바이러스는 통상적인 분자 생물학 기법에 의해 조작되어, 핵산 서열의 세포 특이적 전달, 면역원성의 최소화, 안정성 및 입자 수명 조정, 효율적인 분해, 핵으로의 정확한 전달 등을 위해 이러한 입자를 최적화하는 것을 가능하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 상호교환적으로 사용되는 용어 "rAAV" 및 "인공 AAV"는 캡시드 단백질 및 그 안에 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 AAV를 의미하지만, 이로 제한되지 않으며, 여기서 벡터 게놈은 AAV에 이종성인 핵산을 포함한다. 일 구현예에서, 캡시드 단백질은 비-자연 발생 캡시드이다. 이와 같은 인공 캡시드는 선택된 AAV 서열 (예를 들면, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 상이한 선택된 AAV, 동일한 AAV의 비-연속적인 부분, 비-AAV 바이러스 출처, 또는 비-바이러스 출처로부터 얻을 수 있는 이종성 서열과 조합하여 사용함으로써 임의의 적합한 기법에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV는 슈도형 AAV, 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화" AAV 캡시드일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 하나의 AAV의 캡시드가 이종 캡시드 단백질로 대체된 슈도형 벡터가 본 발명에 유용하다. 일 구현예에서, AAV2/5 및 AAV2/8은 예시적인 슈도형 벡터이다. 선택된 유전 요소는 형질감염, 전기천공, 리포좀 전달, 막 융합 기법, 고속 DNA-코팅 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 이와 같은 구조물을 제조하는 데 사용되는 방법은 핵산 조작의 숙련자에게 알려져 있으며, 유전 공학, 재조합 공학, 및 합성 기법을 포함한다. 예를 들면, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012) 참조.
특정 구현예에서, AAV 캡시드는 자연 및 조작된 클라드 F 아데노 관련 바이러스로부터 선택된다. 하기 예에서, 클라드 F 아데노 관련 바이러스는 AAVhu68이다. 본 명세서에 전문이 참고문헌으로 통합되는 제 WO 2018/160582호 참조. 그러나, 다른 구현예에서, AAV 캡시드는 상이한 클라드, 예를 들면, 클라드 A, B, C, D, 또는 E로부터, 또는 이들 클라드 중 임의의 것의 외부 AAV 출처로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, AAV의 그룹과 관련되는 용어 "클라드"는 (적어도 1000개 복제물의) 적어도 75%의 부트스트랩 값에 의해 이웃 결합 알고리즘 (Neighbor-Joining algorithm) 및 AAV vp1 아미노산 서열의 정렬을 기반으로 0.05 이하의 푸아송 보정 거리 측정을 사용하여 결정된 서로 계통 발생적으로 관련된 AAV의 그룹을 지칭한다. 이웃 결합 알고리즘은 문헌에 설명된 바 있다. 예를 들면, M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (뉴욕, 옥스포드 대학 출판사 (2000) 참조. 이 알고리즘을 구현하는 데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 예를 들면, MEGA v2.1 프로그램은 변형된 Nei-Gojobori 방법을 구현한다. 이러한 기법 및 컴퓨터 프로그램, 및 AAV vp1 캡시드 단백질의 서열을 사용하여, 당업자는 선택된 AAV가 본 명세서에서 식별된 클라드 중 하나에 포함되는지, 다른 클라드에 포함되는지, 또는 이들 클라드의 외부에 있는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 클라드 A, B, C, D, E 및 F를 식별하고, GenBank 수탁번호 AY530553 내지 AY530629인 신규 AAV의 핵산 서열을 제공하는, G Gao, et al., J. Virol. 2004년 6월, 7810: 6381-6388 참조. 또한, 국제특허출원 제 WO 2005/033321호 참조.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "AAV9 캡시드"는 (a) 본 명세서에 참고문헌으로 통합되는 GenBank 수탁번호 AAS99264의 아미노산 서열 및 AAV vp1 캡시드 단백질 및/또는 (b) GenBank 수탁번호 AY530579.1 (nt 1..2211)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 갖는 AAV9를 말한다. 이러한 인코딩된 서열로부터의 일부 변이는 본 발명에 포함되며, 이는 GenBank 수탁번호 AAS99264 및 제 US7906111호 (또한 제 WO 2005/033321호)의 참조된 아미노산 서열과 약 99% 동일성 (즉, 참조된 서열로부터 약 1% 미만의 변이)을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 이와 같은 AAV는, 예를 들면, 자연 분리주 (예를 들면, hu31 또는 hu32), 또는 예를 들면, AAV9 캡시드와 정렬된 임의의 다른 AAV 캡시드에서 상응하는 위치로부터 "모집된" 대체 잔기로부터 선택되는 아미노산 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는 아미노산 치환, 결실 또는 첨가가 있는 AAV9의 변이체; 예를 들면, 제 US 9,102,949호, 제 US 8,927,514호, 제 US 2015/349911호, 제 WO 2016/049230A1호, 제 US 9,623,120호, 및 제 US 9,585,971호에 기재된 것을 포함할 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, AAV9의 다른 변이체, 또는 상기 참조된 서열과 적어도 약 95% 동일성을 갖는 AAV9 캡시드가 선택될 수 있다. 예를 들면, 제 US 2015/0079038호 참조. 캡시드를 생성하는 방법, 이에 대한 코딩 서열, 및 rAAV 바이러스 벡터의 생성 방법은 설명된 바 있다. 예를 들면, Gao, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10): 6081-6086 (2003) 및 제 US 2013/0045186A1호 참조.
특정 구현예에서, AAVhu68 캡시드는 "Novel Adeno-associated virus (AAV) Clade F Vector and Uses Therefor"라는 제목의 국제특허출원 제 WO 2018/160582호에 기재된 바와 같으며, 이는 본원에서 참고문헌으로 통합된다. 특정 구현예에서, AAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 1번 내지 736번의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 발현에 의해 생성되는 AAVhu68 vp1 단백질, 서열번호 1로부터 생성되는 vp1 단백질, 또는 서열번호 2의 1번 내지 736번의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp1 단백질; 서열번호 2의 적어도 약 138번 내지 736번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생성되는 AAVhu68 vp2 단백질, 서열번호 1의 적어도 412번 내지 2211번 뉴클레오티드를 포함하는 서열로부터 생성되는 vp2 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 138번 내지 736번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 412번 내지 2211번 뉴클레오티드와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp2 단백질, 및/또는 서열번호 2의 적어도 약 203번 내지 736번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열로부터 발현에 의해 생성되는 AAVhu68 vp3 단백질, 서열번호 1의 적어도 607번 내지 2211번 뉴클레오티드를 포함하는 서열로부터 생성되는 vp3 단백질, 또는 서열번호 2의 적어도 약 203번 내지 736번 아미노산의 예상되는 아미노산 서열을 인코딩하는 서열번호 1의 적어도 607번 내지 2211번 뉴클레오티드와 적어도 70% 동일한 핵산 서열로부터 생성되는 vp3 단백질을 포함한다.
AAVhu68 vp1, vp2 및 vp3 단백질은 전형적으로 서열번호 2의 전장 vp1 아미노산 서열 (1 내지 736번 아미노산)을 인코딩하는 동일한 핵산 서열에 의해 인코딩되는 대안적인 스플라이스 변이체로서 발현된다. 선택적으로 vp1-인코딩 서열은 단독으로 vp1, vp2, 및 vp3 단백질을 발현하는 데 사용된다. 대안적으로, 이 서열은 vp1-고유 영역 (약 아미노산 1번 내지 약 아미노산 137번) 및/또는 vp2-고유 영역 (약 아미노산 1번 내지 약 아미노산 202번), 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA (서열번호 1의 약 뉴클레오티드 607번 내지 약 뉴클레오티드 2211번), 또는 서열번호 2의 아미노산 203번 내지 736번을 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 적어도 99% (예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열 없이 서열번호 2의 AAVhu68 vp3 아미노산 서열 (약 아미노산 203번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열 중 하나 이상과 공동발현될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, vp1 인코딩 및/또는 vp2 인코딩하는 서열은 vp1 독특한 영역 (약 아미노산 1번 내지 약 137번), 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA (서열번호 1의 뉴클레오티드 412번 내지 뉴클레오티드 2211번), 또는 서열번호 2의 아미노산 138번 내지 736번을 인코딩하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 412번 내지 2211번과 적어도 70% 내지 적어도 99% (예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일한 서열 없이 서열번호 2의 AAVhu68 vp2 아미노산 서열 (약 아미노산 138번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열과 공동발현될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, rAAVhu68은 서열번호 2의 vp1 아미노산 서열을 인코딩하는 AAVhu68 핵산으로부터 캡시드를 발현하는 생성 시스템에서 생성되는 rAAVhu68 캡시드, 및 선택적으로, 예를 들면, vp1 및/또는 vp2 독특한 영역이 없는 vp3 단백질을 인코딩하는, 추가적인 핵산 서열을 갖는다. 단일 핵산 서열 vp1을 사용하는 생성으로부터 생성된 rAAVhu68은 vp1 단백질, vp2 단백질 및 vp3 단백질의 이종 집단을 생성한다. 보다 구체적으로, AAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 예상되는 아미노산 잔기로부터 변형을 갖는 vp1 단백질 내, vp2 단백질 내 및 vp3 단백질 내의 하위집단을 포함한다. 이들 하위집단은 최소한 탈아마이드화된 아스파라긴 (N 또는 Asn) 잔기를 포함한다. 예를 들면, 아스파라긴-글리신 쌍의 아스파라긴은 고도로 탈아마이드화되어 있다.
일 구현예에서, AAVhu68 vp1 핵산 서열은 서열번호 1의 서열, 또는 이에 상보적인 가닥, 예를 들면, 상응하는 mRNA를 가진다. 특정 구현예에서, vp2 및/또는 vp3 단백질은, 예를 들면, 선택된 발현 시스템에서 vp 단백질의 비율을 변경하기 위해, vp1과 상이한 핵산 서열로부터 추가적으로 또는 대안적으로 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 또한 vp1 독특한 영역 (약 아미노산 1번 내지 약 아미노산 137번) 및/또는 vp2 독특한 영역 (약 아미노산 1번 내지 약 아미노산 202번)이 없는 서열번호 2의 AAVhu68 vp3 아미노산 서열 (약 아미노산 203번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA (서열번호 2의 약 뉴클레오티드 607번 내지 약 뉴클레오티드 2211번)가 제공된다. 특정 구현예에서, 또한 vp1 독특한 영역 (약 아미노산 1번 내지 약 137번)이 없는 서열번호 2의 AAVhu68 vp2 아미노산 서열 (약 아미노산 138번 내지 736번)을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 이에 상보적인 가닥, 상응하는 mRNA (서열번호 1의 뉴클레오티드 412번 내지 2211번)가 제공된다.
그러나, 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 다른 핵산 서열이 rAAVhu68 캡시드를 생성하는 데 사용하기 위해 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열 또는 서열번호 2를 인코딩하는 서열번호 1과 적어도 70% 내지 99% 동일, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 핵산 서열 또는 서열번호 2의 vp2 캡시드 단백질 (약 아미노산 138번 내지 736번)을 인코딩하는 서열번호 1의 약 뉴클레오티드 412번 내지 약 뉴클레오티드 2211번과 적어도 70% 내지 99%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 1의 약 뉴클레오티드 607번 내지 약 뉴클레오티드 2211번의 핵산 서열 또는 서열번호 1의 vp3 캡시드 단백질 (약 아미노산 203번 내지 736번)을 인코딩하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 412번 내지 약 뉴클레오티드 2211번과 적어도 70% 내지 99.%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다.
DNA (게놈 또는 cDNA), 또는 RNA (예를 들면, mRNA)를 포함하여, 이러한 AAVhu68 캡시드를 인코딩하는 핵산 서열을 설계하는 것은 당업계의 기술 범위에 속한다. 특정 구현예에서, AAVhu68 vp1 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2에서 제공된다. 특정 구현예에서, AAVhu68 캡시드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형 (예를 들면, 탈아마이드화된 아미노산)이 있는 서열번호 1의 핵산 서열 또는 서열번호 2의 vp1 아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 서열을 사용하여 생성된다. 특정 구현예에서, vp1 아미노산 서열은 서열번호 2로 재현된다.
특정 구현예에서, 캡시드 탈아마이드화가 감소된 AAV 캡시드가 선택될 수 있다. 예를 들면, 국제특허출원 제 PCT/US19/19804호 및 제 PCT/US18/19861호 참조, 둘 다는 2019년 2월 27일에 출원되고 전문이 참고문헌으로 통합된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 vp 캡시드 단백질을 지칭하는 데 사용될 때, 용어 "이종" 또는 이의 임의의 문법적 변형은, 예를 들면, 상이한 변형된 아미노산 서열이 있는 vp1, vp2 또는 vp3 단량체 (단백질)를 갖는, 동일하지 않은 요소로 이루어진 집단을 지칭한다. 서열번호 2는 AAVhu68 vp1 단백질의 인코딩된 아미노산 서열을 제공한다. vp1, vp2 및 vp3 단백질 (대안적으로 이소형으로 명명됨)과 관련하여 사용될 때 용어 "이종"은 캡시드 내 vp1, vp2 및 vp3 단백질의 아미노산 서열의 차이를 지칭한다. AAV 캡시드는 vp1 단백질 내, vp2 단백질 내 및 vp3 단백질 내에 예상되는 아미노산 잔기로부터 변형이 있는 하위집단을 포함한다. 이러한 하위집단은, 최소한 특정 탈아마이드화된 아스파라긴 (N 또는 Asn) 잔기를 포함한다. 예를 들면, 특정 하위집단은 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴 (N) 위치를 포함하고 선택적으로 다른 탈아마이드화된 아미노산을 더 포함하며, 여기서 탈아마이드화는 아미노산 변화 및 다른 선택적인 변형을 유도한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, vp 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 공통적으로 적어도 하나의 정의된 특징을 가지고, 적어도 하나의 그룹 구성원 내지 참조 그룹의 모든 구성원보다 더 적은 수의 그룹 구성원으로 이루어진 vp 단백질의 그룹을 지칭한다. 예를 들면, vp1 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 조립된 AAV 캡시드 내에 적어도 하나 (1)의 vp1 단백질이 있고 모든 vp1 단백질보다 더 적은 수의 vp1 단백질이 있다. vp3 단백질의 "하위집단"은 달리 명시되지 않는 한, 조립된 AAV 캡시드 내에 하나 (1)의 vp3 단백질 내지 모든 vp3 단백질보다 더 적은 수의 vp3 단백질이 있을 수 있다. 예를 들면, vp1 단백질은 vp 단백질의 하위집단일 수 있고; vp2 단백질은 vp 단백질의 별개의 하위집단일 수 있으며, vp3은 또한 조립된 AAV 캡시드 내의 vp 단백질의 추가의 하위집단이다. 또 다른 예에서, vp1, vp2 및 vp3 단백질은, 예를 들면, 아스파라긴-글리신 쌍에서 상이한 변형, 예를 들면, 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴을 갖는 하위집단을 포함할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한, 고도로 탈아마이드화된 것은 참조된 아미노산 위치에서 예상되는 아미노산 서열과 비교하여, 참조된 아미노산 위치에서 적어도 45% 탈아마이드화된, 적어도 50% 탈아마이드화된, 적어도 60% 탈아마이드화된, 적어도 65% 탈아마이드화된, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%, 또는 최대 약 100%의 탈아마이드화된 것을 지칭한다 (예를 들면, 서열번호 2[AAVhu68]의 번호매김을 기준으로 57번 아미노산에서 아스파라긴의 적어도 80%가 총 vp1 단백질을 기준으로 탈아미드화될 수 있고 총 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 기준으로 탈아마이드화될 수 있음). 이와 같은 백분율은 2D-겔, 질량분석법 기법, 또는 다른 적합한 기법을 사용하여 결정될 수 있다.
따라서, rAAV는, 최소한 적어도 하나의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴을 포함하는 적어도 하나의 하위집단을 포함하는, 탈아마이드화된 아미노산이 있는 vp1, vp2, 및/또는 vp3 단백질의 rAAV 캡시드 내의 하위집단을 포함한다. 추가적으로, 다른 변형은 특히 선택된 아스파트산 (D 또는 Asp) 잔기 위치에서 이성질체화를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 변형은 Asp 위치에서의 아마이드화를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, AAV 캡시드는 적어도 4 내지 적어도 약 25개의 탈아마이드화된 아미노산 잔기 위치를 갖는 vp1, vp2 및 vp3의 하위집단을 포함하며, 이의 적어도 1 내지 10%는 vp 단백질의 인코딩된 아미노산 서열과 비교하여 탈아마이드화된다. 이들 대부분은 N 잔기일 수 있다. 그러나, Q 잔기가 또한 탈아마이드화될 수 있다.
특정 구현예에서, rAAV는 실시예 1에서 제공되고 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되는 표에 제시된 위치에서 2개, 3개 또는 4개 이상의 탈아마이드화된 잔기의 조합을 포함하는 하위집단을 갖는 vp1, vp2 및 vp3 단백질을 갖는 AAV 캡시드를 갖는다. rAAV에서의 탈아마이드화는 2D 겔 전기영동법, 질량 분석법 및/또는 단백질 모델링 기법을 사용하여 결정될 수 있다. 온라인 크로마토그래피는 어클레임 PepMap 칼럼 및 나노플렉스 소스가 있는 Q 이그잭티브 HF (써모피셔 사이언티픽사)에 커플링된 써모 울티메이트 3000 RSLC 시스템 (써모피셔 사이언티픽사)을 사용하여 수행될 수 있다. MS 데이터는 조사 스캔 (200 내지 2000 m/z)으로부터의 가장 풍부한 시퀸싱되지 않은 전구체 이온을 역동적으로 선택하는, Q 이그잭티브 HF에 대한 데이터 의존적인 상위 20 방법을 사용하여 획득된다. 시퀸싱은 예측된 자동 획득 제어로 결정된 1e5 이온의 목표 값으로의 고-에너지 충돌 분열 단편화를 통해서 수행되고, 전구체의 단리는 4 m/z의 창으로 수행되었다. 조사 스캔은 m/z 200에서 분해능 120,000으로 획득되었다. HCD 스펙트럼에 대한 분해능은 50㎳의 최대 이온 주입 시간 및 30의 정규화된 충돌 에너지를 이용하여 m/z 200에서 30,000으로 설정될 수 있다. S-렌즈 RF 수준은 50에서 설정되어, 소화로부터 펩티드에 의해서 점유된 m/z 영역의 최적의 전달을 제공할 수 있다. 전구체 이온은 단편화 선택으로부터 단일, 미배정, 또는 6 및 더 높은 전하 상태로 제외될 수 있다. 바이오파마 파인더 1.0 소프트웨어 (써모피셔 사이언티픽사)가 획득된 데이터의 분석에 사용될 수 있다. 펩티드 맵핑을 위해, 고정된 변형으로서 설정된 카바미도메틸화; 및 가변성 변형으로서 설정된 산화, 탈아마이드화 및 인산화, 10 ppm 질량 정확도, 높은 프로테아제 특이성 및 MS/MS 스펙트럼에 대한 신뢰 수준 0.8을 갖는 단기식 단백질 FASTA 데이터베이스를 사용하여 검색을 수행한다. 적합한 프로테아제의 예는, 예를 들면 트립신 또는 키모트립신을 포함할 수 있다. 탈아마이드화된 펩티드의 질량 분광분석적 식별은 비교적 간단한데, 그 이유는 탈아마이드화가 무손상 분자 +0.984 Da의 질량 (-OH 및 -NH2 기 사이의 질량 차이)에 추가되기 때문이다. 특정 펩티드의 탈아마이드화 백분율은 탈아마이드화된 펩티드의 질량 면적을, 탈아마이드화된 펩티드와 고유한 펩티드의 면적의 합으로 나눔으로써 결정된다. 가능한 탈아마이드화 부위의 수를 고려하여, 상이한 부위에서 탈아마이드화된 동중 원소종 (isobaric species)이 단일 피크에서 동시에 이동할 수 있다. 결론적으로, 다수의 잠재적인 탈아마이드화 부위가 있는 펩티드로부터 기원한 단편 이온을 사용하여 탈아마이드화의 다수의 부위를 배치하거나 구별할 수 있다. 이러한 경우에, 관찰된 동위원소 양상 내의 상대 강도를 사용하여 상이한 탈아마이드화된 펩티드 이성질체의 상대 풍부도를 구체적으로 결정할 수 있다. 이러한 방법은, 모든 이성질체 종에 대한 단편화 효율성이 동일하고, 탈아마이드화 부위에 독립적이라고 가정한다. 이러한 예시적인 방법에 대한 다수의 변경이 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들면, 적합한 질량 분석기는, 예를 들면, 사중극자 비행시간 질량 분석기 (QTOF), 예컨대 워터스 엑스보 또는 애질런트 6530 또는 오비트랩 기기, 예컨대 오비트랩 퓨전 또는 오비트랩 벨로스 (써모피셔사)를 포함할 수 있다. 적합하게 액체 크로마토그래피 시스템은, 예를 들면 워터스 또는 애질런트 시스템으로부터의 액퀴티 UPLC 시스템 (1100 또는 1200 시리즈)을 포함한다. 적합한 데이터 분석 소프트웨어는, 예를 들면, MassLynx (워터스), 핀포인트 및 펩파인더 (써모피셔 사이언티픽사), 마스코트 (매트릭스 사이언스사), 피크 DB (바이오인포매틱스 솔루션사)를 포함할 수 있다. 또 다른 기법은, 예를 들면 X. Jin et al., Hu. Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267 (2017년 6월 16일자로 온라인 공개됨)에 기재될 수 있다.
탈아마이드화에 추가적으로, 다른 변형이 일어날 수 있는데, 이는 하나의 아미노산의 상이한 아미노산 잔기로의 전환을 초래하지 않는다. 이와 같은 변형은 아세틸화된 잔기, 이성질체화, 인산화 또는 산화를 포함할 수 있다.
탈아마이드화의 조정: 특정 구현예에서, AAV는 아스파라긴-글리신 쌍에서 글리신을 변화시키도록 변형되어, 탈아마이드화를 감소시킨다. 다른 구현예에서, 아스파라긴은 상이한 아미노산, 예를 들면, 더 느린 속도로 탈아마이드화시키는 글루타민으로; 또는 아마이드기가 결여된 아미노산 (예를 들면, 글루타민 및 아스파라긴은 아마이드기를 포함함)으로; 및/또는 아민기가 결여된 아미노산 (예를 들면, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘은 아민기를 포함함)으로 변경된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아마이드 또는 아민 측쇄가 결여된 아미노산은, 예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 페닐알라닌, 타이로신, 또는 트립토판, 및/또는 프롤린을 지칭한다. 예컨대, 기재된 변형은 인코딩된 AAV 아미노산 서열에서 발견되는 아스파라긴-글리신 쌍 중 1, 2 또는 3개에 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 이와 같은 변형은 아스파라긴-글리신 쌍 중 4개 모두에서 일어나지는 않는다. 따라서, AAV 및/또는 조작된 AAV 변이체의 탈아마이드화를 감소시키는 방법은 더 낮은 탈아마이드화 속도를 가진다. 추가적으로, 또는 대안적으로 하나 이상의 다른 아마이드 아미노산은 비-아마이드 아미노산으로 변화되어 AAV의 탈아마이드화를 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이체 AAV 캡시드는 아르기닌-글리신 쌍에서 돌연변이를 포함하여, 글리신은 알라닌 또는 세린으로 변화된다. 돌연변이체 AAV 캡시드는 1, 2 또는 3개의 돌연변이체를 포함할 수 있고, 여기서 참조 AAV는 본래 4개의 NG 쌍을 포함한다. 특정 구현예에서, AAV 캡시드는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 이와 같은 돌연변이체를 포함할 수 있고, 여기서 참조 AAV는 본래 5개의 NG 쌍을 포함한다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 NG 쌍 내에 단일 돌연변이만을 포함한다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 2개의 상이한 NG 쌍 내에 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 AAV 캡시드는 AAV 캡시드에서 구조적으로 분리된 위치에 위치된 2개의 상이한 NG 쌍이다. 특정 구현예에서, 돌연변이는 VP1 독특한 영역에 존재하지 않는다. 특정 구현예에서, 돌연변이 중 하나는 VP1 독특한 영역에 존재한다. 선택적으로, 돌연변이체 AAV 캡시드는 NG 쌍 내에 어떠한 변형도 포함하지 않지만, NG 쌍의 위부에 위치된 하나 이상의 아스파라긴 또는 글루타민에서 탈아마이드화를 최소화 또는 제거하기 위해서 돌연변이를 포함한다. AAVhu68 캡시드 단백질에서, 4개의 잔기 (N57, N329, N452, N512)는 일상적으로 70% 초과의 탈아마이드화 수준을 나타내고 대부분의 경우 다양한 로트에 걸쳐 90% 초과의 수준을 나타낸다. 추가적인 아스파라긴 잔기 (N94, N253, N270, N304, N409, N477 및 Q599)는 또한 다양한 로트에 걸쳐 최대 약 20%의 탈아마이드화 수준을 나타낸다. 탈아마이드화 수준은 초기에 트립신 소화를 사용하여 확인하였고, 키모트립신 소화를 이용하여 검증하였다.
AAVhu68 캡시드는 서열번호 2의 예상되는 아미노산 잔기로부터 변형을 갖는 vp1 단백질 내, vp 단백질 내 및 vp3 단백질 내의 하위집단을 포함한다. 이들 하위집단은 최소한 특정 탈아마이드화된 아스파라긴 (N 또는 Asn) 잔기를 포함한다. 예를 들면, 특정 하위집단은 서열번호 2의 아스파라긴-글리신 쌍에서 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 고도로 탈아마이드화된 아스파라긴 (N) 위치를 포함하고 선택적으로 다른 탈아마이드화된 아미노산을 더 포함하며, 여기서 탈아마이드화는 아미노산 변화 및 다른 선택적인 변형을 초래한다. 이들 및 다른 변형의 다양한 조합이 본 명세서에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV는 자가-상보성 AAV이다. "자가-상보성 AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 운반되는 코딩 영역이 분자내 이중가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 구조물을 지칭한다. 감염시, 두번째 가닥의 세포 매개 합성을 기다리기 보다는, scAAV의 2개의 상보적인 절반이 회합하여 즉각적인 복제 및 전사 준비가 된 하나의 이중가닥 DNA (dsDNA) 단위를 형성할 것이다. 예를 들면, D. M. McCarty et al., "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (2001년 8월), Vol. 8, No. 16, pp 1248-1254 참조. 자가-상보성 AAV는, 예를 들면 미국 특허 제 US 6,596,535호; 제 US 7,125,717호; 및 제 US 7,456,683호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참고문헌으로 통합된다.
본원에 기술된 재조합 아데노 관련 바이러스 (AAV)는 공지되어 있는 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예로, 국제특허출원 제 WO 2003/042397호; 제 WO 2005/033321호; 제 WO 2006/110689호; 미국 특허 제 US 7588772 B2호 참조. 이러한 방법은 AAV 캡시드를 인코딩하는 핵산 서열; 기능적 rep 유전자; 본원에 기술된, AAV 역전된 말단 반복서열 (ITR)에 의해 연접된 발현 카세트; 및 AAV 캡시드 단백질 내에 발현 카세트의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것이 관여한다. 또한, 본원에서는 AAV 캡시드를 인코딩하는 핵산 서열; 기능적 rep 유전자; 본원에 기술된 벡터 게놈; 및 AAV 캡시드 단백질 내에 벡터 게놈의 패키징을 허용하기에 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 HEK 293 세포이다. 이러한 방법은 본원에 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 제 WO 2017160360 A2호에 더 자세하게 기술된다.
당업자에게 입수가능한 rAAV를 생산하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 적합한 방법은 배큘로바이러스 발현 시스템 또는 효모를 통한 생산을 이에 한정되지 않고 포함할 수 있다. 예로, Robert M. Kotin, Large-scale recombinant adeno-associated virus production. Hum. Mol. Genet. 2011년 4월 15일, 15; 20(R1): R2-R6. 2011년 4월 29일 온라인 공개됨. doi: 10.1093/hmg/ddr141; Aucoin M. G. et al., Production of adeno-associated viral vectors in insect cells using triple infection: optimization of baculovirus concentration ratios. Biotechnol. Bioeng., 2006년 12월 20일, 95(6): 1081-92; SAMI S. THAKUR, Production of Recombinant Adeno-associated viral vectors in yeast. 플로리다 대학 대학원 졸업 논문, 2012년; Kondratov O. et al., Direct Head-to-Head Evaluation of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors Manufactured in Human versus Insect Cells, Mol. Ther. 2017년 8월 10일, pii: S1525-0016(17)30362-3. doi: 10.1016/j.ymthe.2017.08.003. [인쇄 전 e 공개]; Mietzsch M. et al., OneBac 2.0: Sf9 Cell Lines for Production of AAV1, AAV2, and AAV8 Vectors with Minimal Encapsidation of Foreign DNA. Hum. Gene Ther. Methods 2017년 2월, 28(1): 15-22. doi: 10.1089/hgtb.2016.164.; Li L. et al., Production and characterization of novel recombinant adeno-associated virus replicative-form genomes: a eukaryotic source of DNA for gene transfer. PLoS One 2013년 8월 1일, 8(8): e69879. doi: 10.1371/journal.pone.0069879. 2013년 인쇄; Galibert L. et al., Latest developments in the large-scale production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward the treatment of neuromuscular diseases. J. Invertebr. Pathol. 2011년 7월, 107 Suppl:S80-93. doi: 10.1016/j.jip.2011.05.008; 및 Kotin R. M., Large-scale recombinant adeno-associated virus production. Hum. Mol. Genet. 2011년 4월 15일, 20(R1): R2-6. doi: 10.1093/hmg/ddr141. Epub 2011년 4월 29일 참조.
높은 염 농도에서 두 단계 친화 크로마토그래피 정제에 이어진 음이온 교환 레진 크로마토그래피는 벡터 의약품을 정제하고, 빈 캡시드를 제거하는데 사용된다. 이러한 방법은 본원에 참고문헌으로 통합되는, "Scalable Purification Method for AAV9"라는 제목의 제 WO 2017/1603604호에 더 자세하게 기술된다. 간략하게, 게놈 결함성 AAV9 중간물로부터 패키징된 게놈 서열을 갖는 rAAV9 입자를 분리하는 방법은 재조합 AAV9 바이러스 입자 및 AAV9 캡시드 중간물을 포함하는 현탁액에 대해 신속 성능 액체 크로마토그래피를 시행하는 단계를 포함하고, 여기서 AAV9 바이러스 입자 및 AAV9 중간물은 pH 약 10.2에서 평형화된 강한 음이온 교환 레진에 결합되고, 용리물을 약 260 nm 및 약 280 nm의 자외선 흡광도에 대해 모니터링하면서 염 구배를 시행한다. rAAV9를 위한 최적은 아니지만, pH는 약 10.0 내지 10.4의 범위일 수 있다. 이러한 방법에서, AAV 완전한 캡시드는 A260/A280 비율이 감염점에 도달할 때 용리되는 분획으로부터 수집된다. 일 예에서, 친화 크로마토그래피 단계의 경우, 투과여과된 산물은 AAV2/9 혈청형을 효율적으로 포획하는 캡쳐 셀렉트TM 포로스 - 친화 레진 (라이프 테크놀로지사)에 적용될 수 있다. 이러한 이온 조건 하에, 유의한 백분율의 잔류 세포성 DNA 및 단백질은 컬럼을 통과하는 반면, AAV 입자는 효율적으로 포획된다.
rAAV의 특성화 또는 정량화를 위한 통상적인 방법은 당업자에게 사용가능하다. 비어있는 및 완전된 입자 내용물을 계산하기 위하여, 선택된 시료 (예로, 본원의 실시예에서, GC의 갯수 = 입자의 갯수인 이오딕산올 구배-정제된 제조물)에 대한 VP3 밴드 부피가 로딩된 GC 입자에 대응하여 좌표화된다. 결과로 나온 선형 방정식 (y = mx + c)이 테스트 항목 피크의 밴드 부피에서 입자의 갯수를 계산하는데 사용된다. 다음으로 로딩된 20 μL 당 입자의 갯수 (pt)에 50을 곱하여 입자 (pt)/mL을 수득한다. GC/mL로 나누기한 pt/mL은 입자 대 게놈 사본 (pt/GC) 비를 제공한다. Pt/mL - GC/mL은 비어있는 pt/mL를 제공한다. pt/mL로 나누기한 비어있는 pt/mL × 100은 비어있는 입자의 백분율을 제공한다. 일반적으로, 빈 캡시드 및 패키징된 게놈을 갖는 AAV 벡터 입자를 검정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예로, Grimm et al.,　Gene Therapy　(1999), 6: 1322-1330; Sommer et al.,　Molec. Ther. (2003), 7: 122-128 참조. 변성된 캡시드를 테스트하기 위해, 방법은 처리된 AAV 스톡을 3가지 캡시드 단백질을 분리할 수 있는 임의의 겔, 예를 들면 완충액 중 3% 내지 8% 트리스-아세테이트를 포함한 구배 겔로 구성되는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 시행하고, 다음으로 시료 물질이 분리될 때까지 겔을 전개시키고, 나일론 또는 니트로셀룰로스 막, 바람직하게 나일론 상에 겔을 블럿팅하는 단계를 포함한다. 다음으로 항-AAV 캡시드 항체, 바람직하게 항-AAV 캡시드 단일클론 항체, 가장 바람직하게 B1 항-AAV-2 단일클론 항체가 변성된 캡시드 단백질에 결합하는 일차 항체로서 사용된다 (Wobus et al., J. Virol. (2000), 74: 9281-9293). 다음으로 일차 항체에 결합하는 이차 항체가 사용되고, 일차 항체와 결합을 검출하기 위한 수단, 더욱 바람직하게 이에 공유 결합하는 검출 분자를 포함하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게 호스래디쉬 퍼옥시다제에 공유 결합된 양 항-마우스 IgG 항체를 포함한다. 결합을 검출하는 방법은 일차 및 이차 항체 사이의 결합을 반정량적으로 결정하는데 사용되고, 바람직하게 방사성 동위원소 방출, 전자기적 방사선 조사 또는 비색측정 변화를 검출할 수 있는 검출 방법, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트이다. 예를 들면, SDS-PAGE의 경우, 컬럼 분획으로부터의 시료는 채취되어 환원제 (예로, DTT)를 포함한 SDS-PAGE 로딩 완충액에서 가열될 수 있으며, 캡시드 단백질은 미리 주입한 구배 폴리아크릴아미드 겔 (예로, 노벡스사) 상에서 분리되었다. 은 염색이 제조사의 지침에 따른 실버엑스프레스 (인비트로겐사, CA) 또는 다른 적합한 염색 방법, 즉 SYPRO 루비 또는 쿠마시 염색을 사용하여 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 컬럼 분획에서 AAV 벡터 게놈 (vg)의 농도는 정량적 실시간 PCR (Q-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 시료는 외인성 DNA를 제거하도록 희석하여 DNase I (또는 또 다른 적합한 뉴클레아제)로 소화시킨다. 뉴클레아제의 불활성화 이후에, 시료는 추가로 희석되고, 프라이머 및 프라이머의 DNA 서열에 특이적인 TaqManTM 형광생성 프로브를 사용하여 증폭된다. 정의된 수준의 형광에 도달하는데 필요한 주기의 횟수 (역치 주기, Ct)는 각 시료에 대해 어플라이드 바이오시스템 프리즘 7700 서열 검출 시스템으로 측정된다. AAV 벡터에 포함된 서열과 일치하는 서열을 포함하는 플라스미드 DNA는 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성하는데 채용된다. 시료로부터 획득된 주기 역치 (Ct) 값은 벡터 게놈 역가를 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값으로 정규화함으로써 이를 결정하는데 사용된다. 디지털 PCR을 기초로 한 종결점 검정법도 사용될 수 있다.
일 양태에서, 광범위 스펙트럼 세린 프로테아제, 예로 프로테아제 K (예컨대 퀴아젠사로부터 구입가능함)를 사용하는 최적화된 q-PCR 방법이 사용된다. 보다 구체적으로, 최적화된 q-PCR 게놈 역가 검정법은 DNase I 소화 이후에 시료를 프로테아제 K 완충액으로 희석하여 프로테아제 K로 처리하고, 이어서 열 불활성화를 시행하는 점을 제외하고는 표준 검정법과 유사하다. 적합하게, 시료는 시료 크기와 동등한 양의 프로테아제 K 완충액으로 희석된다. 프로테아제 K 완충액은 2배 이상으로 농축될 수 있다. 전형적으로, 프로테아제 K 처리는 약 0.2 mg/mL이지만, 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL으로 변화될 수 있다. 처리 단계는 일반적으로 약 55℃에서 약 15분 동안 시행되지만, 더 낮은 온도 (예로, 약 37℃ 내지 약 50℃)에서 더 긴 시간 (예로, 약 20분 내지 약 30분) 동안, 또는 더 높은 온도 (예로, 최고 약 60℃)에서 더 짧은 시간 (예로, 약 5분 내지 10분) 동안 수행될 수 있다. 유사하게, 열 불활성화는 일반적으로 약 95℃에서 약 15분 동안이지만, 온도를 낮추고 (예로, 약 70℃ 내지 약 90℃) 시간을 연장할 수 있다 (예로, 약 20분 내지 30분). 다음으로 시료를 희석하고 (예로, 1,000배), 표준 검정법에서 설명된 바와 같이 TaqMan 분석에 착수한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 비말 디지털 PCR (ddPCR)이 사용될 수 있다. 예를 들면, ddPCR에 의해 단일가닥 및 자가-상보적 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하는 방법이 기재되어 있다. 예로, M. Lock et al., Hu Gene Therapy Methods, Hum. Gene Ther. Methods, 2014년 4월; 25(2): 115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014년 2월 14일 참조.
캡시드 단백질의 vp1, vp2 및 vp3 비율을 결정하는 방법도 사용가능하다. 예로, Vamseedhar Rayaprolu et al., Comparative Analysis of Adeno-Associated Virus Capsid Stability and Dynamics, J. Virol. 2013년 12월, 87(24): 13150-13160; Buller R. M., Rose J. A. 1978, Characterization of adenovirus-associated virus-induced polypeptides in KB cells. J. Virol., 25: 331-338; 및 Rose J. A., Maizel J. V., Inman J. K., Shatkin A. J. 1971, Structural proteins of adenovirus-associated viruses. J. Virol., 8: 766-770 참조.
본원에 기재된 rAAV에서 조성물은 본 명세서 전반에 걸쳐 기재된 다른 조성물, 요법, 양태, 구현예, 및 방법에 적용하도록 의도되는 것으로 이해되어야 한다.
약제학적 조성물
hGAA780I 융합 단백질, 또는 hGAA780I 융합 단백질 이식유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 약제학적 조성물은 액체 현탁액, 동결건조 또는 동결된 조성물, 또는 또 다른 적합한 제형물일 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 hGAA780I 융합 단백질 또는 발현 카세트 및 현탁액을 형성하는 생리학적으로 적격한 액체 (예를 들면, 용액, 희석제, 담체)를 포함한다. 이러한 액체는 바람직하게 수성 기반이고, 완충제(들), 계면활성제(들), pH 조정제(들), 보존제(들), 또는 다른 적합한 부형제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 적합한 구성요소는 하기에 더 자세하게 논의된다. 약제학적 조성물은 수성 현탁액 및 임의의 선택된 부형제, 및 hGAA780I 융합 단백질 또는 발현 카세트를 포함한다.
특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 이식유전자 및 비-바이러스 전달 시스템을 포함하는 발현카세트를 포함한다. 이는, 예를 들면, 노출 DNA, 노출 RNA, 무기 입자, 지질 또는 지질-유사 입자, 키토산 기반의 제형물, 및 당업계에 알려지고, 예를 들면 상기 인용된 라마무르스 및 나베카르에 의해 설명된 다른 것을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 바이러스 벡터 시스템에서 조작된 이식유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 현탁액이다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 비-복제 바이러스 벡터를 포함한다. 적합한 바이러스 벡터는 예를 들면, 재조합 아데노바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 보카바이러스, 재조합 아데노 관련 바이러스 (AAV), 또는 또 다른 재조합 파보바이러스와 같은 임의의 적합한 전달 벡터를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 이를 필요로 하는 환자에게 유전자 산물을 전달하기 위한 재조합 AAV이다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 hGAA780I 융합 단백질, 또는 hGAA780I 융합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트, 및 뇌실내 (ICV), 경막내 (IT), 수조내, 또는 정맥내 (IV) 주사를 통한 전달에 적합한 제형물 완충액을 포함한다. 일 구현예에서, 발현 카세트는 재조합 바이러스 벡터 (즉, 융합 단백질을 보유하는 rAAV.hGAA780I)가 패키징된 벡터 게놈의 일부이다.
일 구현예에서, 약제학적 조성물은 효소 대체 요법 (ERT)로서 대상체에게 전달하기 위한 hGAA780I 단백질 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 이와 같은 약제학적 조성물은 보통 정맥내로 투여되지만, 일부 상황에서는 피내, 근육내 또는 경구 투여가 또한 가능하다. 조성물은 폼페병으로 고생하거나 이에 걸릴 위험이 있는 개체의 예방적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용을 위해, 약제학적 조성물은 확립된 질환으로 고생하는 환자에게 축적된 대사산물의 농도를 감소시키고/시키거나 대사산물의 추가 축적을 방지하거나 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 리소좀 효소 결핍 질환의 위험이 있는 개체의 경우, 약제학적 조성물은 대사산물의 축적을 방지하거나 저해하기에 충분한 양으로 예방적으로 투여된다. 본 명세서에 기재된 변형된 GAA 조성물은 치료적 유효량으로 투여된다. 일반적으로, 치료적 유효량은 대상체의 의학적 상태의 중증도뿐만 아니라, 대상체의 연령, 전반적인 상태, 및 성별에 따라 달라질 수 있다. 용량은 의사에 의해 결정될 수 있으며, 관찰된 치료의 효과에 맞게 필요에 따라 조정될 수 있다. 일 양태에서, hGAA780I 융합 단백질 또는 이의 기능적 단편의 단위 용량을 포함하도록 제형화된 ERT용 약제학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다.
일 구현예에서, 조성물은 대상체에게 전달하기에 적합한 최종 제형물을 포함하고, 예를 들면, 생리학적으로 적격한 pH 및 염 농도로 완충된 수성 액체 현탁액이다. 선택적으로, 하나 이상의 계면활성제가 제형물에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 대상체에 투여하기 위해 희석되는 농축물로서 수송될 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 동결건조되고 투여 시에 재구성될 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 조성물은 수성 현탁액 액체에 용해된 계면활성제, 보존제, 부형제, 및/또는 완충액을 포함한다. 일 구현예에서, 완충액은 PBS이다. 또 다른 구현예에서, 완충액은 인공 뇌척수액 (aCSF), 예를 들면, 엘리엇 제형물 완충액; 또는 하바드 장치 관류액 (Harvard apparatus perfusion fluid) (다음과 같은 최종 이온 농도 (단위: mM)를 갖는 인공 CSF: Na 150; K 3.0; Ca 1.4; Mg 0.8; P 1.0; Cl 155). 완충 식염수, 계면활성제, 및 약 100mM 염화나트륨 (NaCl) 내지 약 250mM 염화나트륨과 동등한 이온 강도로 조정된 생리학적으로 적격한 염 또는 염의 혼합물, 또는 동등한 이온 농도로 조정된 생리학적으로 적격한 염을 포함하는 다양한 적합한 용액이 알려져 있다.
적합하게, 제형물은 생리학적으로 허용가능한 pH, 예를 들면, pH 6 내지 8, 또는 pH 6.5 내지 7.5, pH 7.0 내지 7.7, 또는 pH 7.2 내지 7.8의 범위로 조정된다. 뇌척수액의 pH가 약 7.28 내지 약 7.32이므로, 경막내 전달을 위해 이 범위 내의 pH가 바람직할 수 있는 반면, 정맥내 전달을 위해 pH 6.8 내지 약 7.2가 바람직할 수 있다. 그러나, 가장 넓은 범위 내의 다른 pH 및 이들의 하위범위가 다른 전달 경로를 위해 선택될 수 있다.
적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합이 무독성인 비-이온성 계면활성제 중에서 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들면, 중성 pH를 가지고, 평균 분자량이 8400인 폴록사머 188로도 알려진 플루로닉® F68 [바스프사]과 같은 일차 히드록실기로 종결되는 이작용성 블록 공중합체 계면활성제가 선택된다. 다른 계면활성제 및 다른 폴록사머, 즉 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개 친수성 사슬에 의해 연접된 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 사슬로 구성된 비이온성 삼중블록 공중합체, 솔루톨 HS 15 (마크로골-15 히드록시스테아레이트), 라브로졸 (폴리옥시 카프릴산 글리세리드), 폴리옥시 10 올레일 에터, 트윈 (폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌 글라이콜이 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 제형물은 폴록사머를 포함한다. 이러한 공중합체는 일반적으로 문자 "P" (폴록사머의 경우) 뒤에 3자리 숫자가 있는 명칭으로 명명되며: 처음 2자리 숫자×100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적 분자량을 제공하고, 마지막 숫자×10은 폴리옥시에틸렌 함량의 백분율을 제공한다. 일 구현예에서, 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 최대 약 0.0005% 내지 약 0.001%의 양으로 존재할 수 있다.
일 예에서, 제형물은, 예를 들면, 염화나트륨, 중탄산나트륨, 덱스트로스, 황산마그네슘 (예를 들면, 황산마그네슘·7H2O), 염화칼륨, 염화칼슘 (예를 들면, 염화칼슘·2H2O), 이염기성 인산나트륨, 및 이들의 혼합물 중 하나 이상을 물에 포함하는 완충된 식염수 용액을 포함할 수 있다. 적합하게, 경막내 전달의 경우 삼투도는 뇌척수액과 양립가능한 범위 (예를 들면, 약 275 내지 약 290) 이내이며, 예로 emedicine.medscape.com/article/2093316-overview 참조. 선택적으로, 경막내 전달을 위해 구입가능한 희석제가 현탁화제로서, 또는 또 다른 현탁화제 및 기타 선택적인 부형제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 엘리어트 B® 용액 [루카레 메디칼사] 참조.
다른 구현예에서, 제형물은 하나 이상의 투과 증진제를 포함할 수 있다. 적합한 투과 증진제의 예는, 예를 들면 만니톨, 소듐 글리콜레이트, 소듐 타우로콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 살리실레이트, 소듐 카프릴레이트, 소듐 카프레이트, 소듐 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우렐 에테르 또는 EDTA를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 추가적으로 제공된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항박테리아 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다. 전달 비히클, 예컨대, 리포좀, 나노캡슐, 마이크로입자, 마이크로스피어, 지질 입자, 소포 등이 본 명세서에 기재된 조성물을 적합한 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 구체적으로, rAAV 벡터는 지질 입자, 리포좀, 비히클, 나노구체, 또는 나노입자 등에 피막화되는 전달을 위해 제형화될 수 있다. 일 구현예에서, 치료적 유효량의 벡터가 약제학적 조성물에 포함된다. 담체의 선택은 본 발명에서 제한이 없다. 다른 통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체, 예컨대, 보존제, 또는 화학적 안정화제. 적합한 예시적인 보존제는 클로로뷰탄올, 솔빈산칼륨, 솔빈산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
어구 "약제학적으로 허용가능한"은 숙주에게 투여될 때 알레르기 반응 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자적 실체 및 조성물을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "용량" 또는 "양"은 치료 과정에서 대상체에게 전달되는 총 용량 또는 양, 또는 단일 단위 (또는 다중 단위 또는 분할 용량) 투여로 전달되는 용량 또는 양을 지칭할 수 있다.
본 명세서에 기재된 수성 현탁액 또는 약제학적 조성물은 임의의 적합한 경로 또는 상이한 경로의 조합에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하도록 설계된다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 뇌실내 (ICV), 경막내 (IT), 또는 수조내 주사를 통해 전달하도록 제형화된다. 일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 정맥내 주사에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하도록 설계된다. 대안적으로, 다른 투여 경로 (예를 들면, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 동맥내, 안내, 근육내, 및 다른 비경구 경로)가 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경막내 전달" 또는 "경막내 투여"는 약물이 뇌척수액 (CSF)에 도달하도록 척추관으로, 보다 구체적으로는 지주막하 공간으로 주사를 통한 약물에 대한 투여 경로를 지칭한다. 경막내 전달은 요추 천자, 뇌실내, 후두하/수조내, 및/또는 C1-2 천자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 물질은 요추 천자에 의해 지주막하 공간 전체에 확산을 위해 도입될 수 있다. 또 다른 예에서, 주사는 대조 내로 이루어질 수 있다. 수조내 전달은 벡터 확산을 증가시키고/거나 투여에 의해 유발되는 독성 및 염증을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, Christian Hinderer et al., Widespread gene transfer in the central nervous system of cynomolgus macaques following delivery of AAV9 into the cisterna magna, Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2014년, 1: 14051. 2014년 12월 10일 온라인 공개됨, doi: 10.1038/mtm.2014.51 참조.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수조내 전달" 또는 "수조내 투여"는 뇌실의 뇌척수액으로 직접 또는 소뇌수질 내에, 보다 구체적으로 후두하 천자를 통한 또는 대수조내 직접 주사에 의한 또는 영구적으로 위치시킨 튜브를 통한 약물의 투여 경로를 말한다.
일 양태에서, 제형물 완충액 중에 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 특정 구현예에서, 복제 결함성 바이러스 조성물은 인간 환자의 경우 (체중이 70 ㎏인 평균 대상체를 치료하기 위해) 약 1.0×109개 GC 내지 약 1.0×1016개 GC의 범위 (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함), 바람직하게는 1.0×1012개 GC 내지 1.0×1014개 GC인 복제 결함성 바이러스의 양을 포함하도록 투약 단위로 제형화될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 용량 당 적어도 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 또는 9×109개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함)를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 용량 당 적어도 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 또는 9×1010개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함)를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 용량 당 적어도 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 또는 9×1011개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함)를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 용량 당 적어도 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 또는 9×1012개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함)를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 용량 당 적어도 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, 또는 9×1013개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함)를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 용량 당 적어도 1×1014, 2×1014, 3×1014, 4×1014, 5×1014, 6×1014, 7×1014, 8×1014, 또는 9×1014개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함)를 포함하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 용량 당 적어도 1×1015, 2×1015, 3×1015, 4×1015, 5×1015, 6×1015, 7×1015, 8×1015, 또는 9×1015개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함)를 포함하도록 제형화된다. 일 구현예에서, 인간 적용의 경우 용량은 용량 당 1×1010 내지 약 1×1012개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양을 포함함)의 범위일 수 있다.
일 구현예에서, 제형물 완충액 중에 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, rAAV는 약 1×109개 게놈 복제물 (GC)/mL 내지 약 1×1014개 GC/mL로 제형화된다. 추가 구현예에서, rAAV는 약 3×109개 GC/mL 내지 약 3×1013개 GC/mL로 제형화된다. 추가의 구현예에서, rAAV는 약 1×109개 GC/mL 내지 약 1×1013개 GC/mL로 제형화된다. 일 구현예에서, rAAV는 적어도 약 1×1011개 GC/mL로 제형화된다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV를 포함하는 약제학적 조성물은 뇌 질량 그램 당 약 1×109개 GC 내지 뇌 질량 그램 당 약 1×1014개 GC의 용량으로 투여 가능하다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물에서 조성물은 본 명세서 전반에 걸쳐 기재된 다른 조성물, 요법, 양태, 구현예, 및 방법에 적용되는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다.
치료 방법
폼페병에 걸린 환자를 치료하기 위한 치료 요법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 발현 카세트, rAAV, 및/또는 hGAA780I 융합 단백질을 선택적으로 면역조절제와 조합하여 포함하는, 치료 요법이 제공된다. 특정 구현예에서, 환자는 후기 발병 폼페병을 갖는다. 다른 구현예에서, 환자는 아동기 발병 폼페병을 갖는다. 특정 구현예에서, 보조치료제는 발현 카세트, rAAV, 또는 hGAA780I 단백질 또는 융합 단백질, 예컨대, 면역조절 요법과 함께 전달된다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 보조요법은 기관지확장제, 아세틸콜린 에스테라제 저해제, 호흡근 강화 훈련 (RMST), 효소 대체 요법, 및/또는 횡격막 조율 요법 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 rAAV의 단일 투여를 받는다. 특정 구현예에서, 환자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 카세트 및/또는 rAAV를 포함하는 조성물의 단일 투여를 받는다. 특정 구현예에서, 유효량의 발현 카세트를 포함하는 조성물의 이러한 단일 투여는 적어도 하나의 보조치료제를 포함한다. 특정 구현예에서, 환자는 2가지의 상이한 경로를 통해 실질적으로 동시에 발현 카세트, rAAV, 및/또는 hGAA780I 단백질 또는 융합 단백질 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 것을 투여받는다. 특정 구현예에서, 2가지 상이한 주사 경로는 정맥내 및 경막내 투여이다. 일 구현예에서, 조성물은 뇌실내, 경막내, 수조내, 또는 정맥내로 대상체에게 전달되는 현탁액이다. 특정 구현예에서, 알파-글루코시다제의 결핍이 있는 환자는 심장, 호흡기, 및/또는 골격근 기능 중 하나 이상을 개선시키기 위해 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 조성물을 투여받는다. 특정 구현예에서, 치료의 결과로서 심장, CNS (뇌), 및/또는 골격근 중 하나 이상에서 글리코겐 축적 및/또는 자가포식 구축의 감소가 있다.
특정 구현예에서, 발현 카세트, rAAV, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 약제를 제조하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 폼페병을 치료하기 위한 조성물의 용도가 제공된다.
이들 조성물은, 예를 들면, 면역요법, 효소 대체 요법 (예로, 사노피사의 젠자임으로 시판되는 루미자임 및 미국 외부에서 미오자임)을 포함하는 다른 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 폼페병의 추가적인 치료는 대증적이고 지지적이다. 예를 들면, 호흡기 지원이 필요할 수 있고; 물리적 요법은 호흡근을 강화시키는 데 도움이 될 수 있으며; 일부 환자는 밤 및/또는 낮 시간 동안 기계적 인공호흡 (즉, 바이팝 (bipap) 또는 용적 인공호흡기)을 통한 호흡 보조를 필요로 할 수 있다. 추가적으로, 기도 감염 동안 추가적인 지원이 필요할 수 있다. 교정기를 포함하여 정형외과적 장치가 일부 환자에게 권장될 수 있다. 구축 또는 척추 변형과 같은 특정 정형외과적 증상에 대해 수술이 필요할 수 있다. 일부 영아는 코를 통해 식도를 거쳐 위로 이어지는 급식관 (비위관)의 삽입을 필요로 할 수 있다. 일부 아동에 있어서, 급식관은 복벽의 작은 수술 구멍을 통해 위로 직접 삽입될 필요가 있을 수 있다. 후기 발병 폼페병에 걸린 일부 개체는 연한 식사를 필요로 할 수 있지만 급식관을 필요로 하는 개체는 거의 없다.
ERT가 고전적인 유아 폼페병에 걸린 환자에서 생존을 유의하게 개선하지만, 부분적으로 효소가 리소좀에 도달하는 것을 억제하는 자가포식 구축으로 인해 골격근 병리를 완전히 역전시킬 수는 없다. 본 발명자들은 본원에 제공된 조성물이 근육 병리를 치료하고 역전시키는데 효과적임을 확인하였다. 예를 들면, 자가포식소체 축적은 치료 시 기존의 병리를 갖는 노령 폼페병 마우스에서 완전히 해소되었다. 또한, 연구는 본원에 제공된 벡터를 사용한 치료가 유의하게 골격근에서 큰 근육 섬유의 백분율을 증가시키고, 작은 근육 섬유의 백분율은 감소시킬 수 있음을 입증하고 있다. 따라서, 전형적으로 근육 섬유 크기 및 자가포식 구축과 같은 치료 내성 병리가 치료에 반응적이다.
특정 구현예에서, 본원에서는 폼페병으로 진단 받았거나 폼페병에 걸린 것으로 의심된 환자에서 비정상 근육 병리의 진행을 감소시키고/거나, 비정상 근육 병리를 역전시키는 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 환자는 증상 이전이다. 다른 구현예에서, 환자는 질환의 더 상급 병기를 갖는 노령 환자를 포함하여 증상 이후이다. 특정 구현예에서, 비정상 근육 병리는 (i) 중앙 핵을 갖는 근육 세포의 백분율 상승, (ii) 근육 섬유 위축증, (iii) 근육 세포 섬유의 부동세포증, (iv) 자가포식 구축, (v) 공포 형성, 및 (vi) 쇠약 중 하나 이상을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 방법은 환자의 호흡 및/또는 이동을 개선한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "증가하다" (예를 들면, 조직, 혈액 등에서 측정된 바와 같이 hGAA780I 융합 단백질로 치료한 이후 hGAA 수준의 증가) 또는 "감소하다", "저하하다", "완화하다", "개선하다", "지연시키다", 또는 이들의 임의의 문법적 활용형, 또는 변화를 나타내는 임의의 유사한 용어는 달리 명시되지 않는 한, 상응하는 기준 (예를 들면, 미처리 대조군 또는 폼페병이 없는 정상 대조군의 대상체)과 비교하여 약 5배, 약 2배, 약 1배, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5%의 변동을 의미한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 바, "환자" 또는 "대상체"는 인간, 수의 또는 농장 동물, 가축 또는 애완동물, 임상 연구에 일반적으로 사용되는 동물을 포함하여 수컷 또는 암컷 포유류 동물을 의미한다. 일 구현예에서, 이러한 방법 및 조성물의 대상체는 인간 환자이다. 일 구현예에서, 이러한 방법 및 조성물의 대상체는 남성 또는 여성 인간이다.
일 구현예에서, 현탁액은 pH가 7.28 내지 약 7.32이다.
이러한 용량 및 농도의 전달에 적합한 부피는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 약 1 μL 내지 150 mL의 부피가 선택될 수 있으며, 성인의 경우 더 많은 부피가 선택된다. 전형적으로, 신생아의 경우, 적합한 부피는 약 0.5 mL 내지 약 10 mL이고, 더 큰 영아의 경우, 약 0.5 mL 내지 약 15 mL가 선택될 수 있다. 유아의 경우, 약 0.5 mL 내지 약 20 mL의 부피가 선택될 수 있다. 아동의 경우, 최대 약 30 mL의 부피가 선택될 수 있다. 십대 초반 및 십대의 경우, 최대 약 50 mL의 부피가 선택될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 환자는 선택된 약 5 mL 내지 약 15 mL, 또는 약 7.5 mL 내지 약 10 mL의 부피로 경막내 투여를 받을 수 있다. 다른 적합한 부피 및 용량이 결정될 수 있다. 용량은 임의의 부작용에 대한 치료적 이익의 균형을 맞추기 위해 조정될 것이며, 이러한 용량은 재조합 벡터가 이용되는 치료적 적용에 따라 달라질 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 rAAV를 포함하는 조성물은 뇌 질량의 그램 당 약 1×109개 GC 내지 뇌 질량의 그램 당 약 1×1014개 GC의 용량으로 투여가능하다. 특정 구현예에서, rAAV는 체중 ㎏ 당 약 1×109개 GC 내지 체중 ㎏ 당 약 1×1013개 GC의 용량으로 전신으로 공동-투여된다. 특정 구현예에서, rAAV는 체중 ㎏ 당 약 1×1011개 GC 내지 체중 ㎏ 당 약 5×1013개 GC의 용량으로 전신으로 투여되거나 공동-투여된다.
일 구현예에서, 대상체는 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 발현 카세트, rAAV 또는 hGAA780I 융합 단백질을 전달 받는다. 본 명세서에서 사용되는 바, "치료적 유효량"은 발현 카세트, rAAV 또는 hGAA780I, 또는 이들의 조합의 양을 말한다. 따라서, 특정 구현예에서 방법은 본원에 제공된 hGAA780I 융합 단백질 효소를 포함하는 조성물을 투여하는 것과 조합하여 hGAA780I 융합 단백질 인코딩하는 핵산 서열의 전달을 위한 rAAV 또는 발현 구조물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 발현 카세트는 벡터 게놈으로 뇌 질량 그램 (g) 당 약 1×109개 게놈 복제물 (GC) 내지 뇌 질량 그램 당 약 1×1013개 GC (범위 내의 모든 정수 또는 분수 양 및 종점을 포함함)의 양으로 전달된다. 또 다른 구현예에서, 용량은 뇌 질량 그램 당 1×1010개 GC 내지 뇌 질량 그램 당 약 1×1013개 GC이다. 구체적인 구현예에서, 환자에게 투여되는 벡터의 용량은 적어도 약 1.0×109개 GC/g, 약 1.5×109개 GC/g, 약 2.0×109개 GC/g, 약 2.5×109개 GC/g, 약 3.0×109개 GC/g, 약 3.5×109개 GC/g, 약 4.0×109개 GC/g, 약 4.5×109개 GC/g, 약 5.0×109개 GC/g, 약 5.5×109개 GC/g, 약 6.0×109개 GC/g, 약 6.5×109개 GC/g, 약 7.0×109개 GC/g, 약 7.5×109개 GC/g, 약 8.0×109개 GC/g, 약 8.5×109개 GC/g, 약 9.0×109개 GC/g, 약 9.5×109개 GC/g, 약 1.0×1010개 GC/g, 약 1.5×1010개 GC/g, 약 2.0×1010개 GC/g, 약 2.5×1010개 GC/g, 약 3.0×1010개 GC/g, 약 3.5×1010개 GC/g, 약 4.0×1010개 GC/g, 약 4.5×1010개 GC/g, 약 5.0×1010개 GC/g, 약 5.5×1010개 GC/g, 약 6.0×1010개 GC/g, 약 6.5×1010개 GC/g, 약 7.0×1010개 GC/g, 약 7.5×1010개 GC/g, 약 8.0×1010개 GC/g, 약 8.5×1010개 GC/g, 약 9.0×1010개 GC/g, 약 9.5×1010개 GC/g, 약 1.0×1011개 GC/g, 약 1.5×1011개 GC/g, 약 2.0×1011개 GC/g, 약 2.5×1011개 GC/g, 약 3.0×1011개 GC/g, 약 3.5×1011개 GC/g, 약 4.0×1011개 GC/g, 약 4.5×1011개 GC/g, 약 5.0×1011개 GC/g, 약 5.5×1011개 GC/g, 약 6.0×1011개 GC/g, 약 6.5×1011개 GC/g, 약 7.0×1011개 GC/g, 약 7.5×1011개 GC/g, 약 8.0×1011개 GC/g, 약 8.5×1011개 GC/g, 약 9.0×1011개 GC/g, 약 9.5×1011개 GC/g, 약 1.0×1012개 GC/g, 약 1.5×1012개 GC/g, 약 2.0×1012개 GC/g, 약 2.5×1012개 GC/g, 약 3.0×1012개 GC/g, 약 3.5×1012개 GC/g, 약 4.0×1012개 GC/g, 약 4.5×1012개 GC/g, 약 5.0×1012개 GC/g, 약 5.5×1012개 GC/g, 약 6.0×1012개 GC/g, 약 6.5×1012개 GC/g, 약 7.0×1012개 GC/g, 약 7.5×1012개 GC/g, 약 8.0×1012개 GC/g, 약 8.5×1012개 GC/g, 약 9.0×1012개 GC/g, 약 9.5×1012개 GC/g, 약 1.0×1013개 GC/g, 약 1.5×1013개 GC/g, 약 2.0×1013개 GC/g, 약 2.5×1013개 GC/g, 약 3.0×1013개 GC/g, 약 3.5×1013개 GC/g, 약 4.0×1013개 GC/g, 약 4.5×1013개 GC/g, 약 5.0×1013개 GC/g, 약 5.5×1013개 GC/g, 약 6.0×1013개 GC/g, 약 6.5×1013개 GC/g, 약 7.0×1013개 GC/g, 약 7.5×1013개 GC/g, 약 8.0×1013개 GC/g, 약 8.5×1013개 GC/g, 약 9.0×1013개 GC/g, 약 9.5×1013개 GC/g, 또는 약 1.0×1014개 GC/g 뇌 질량이다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 rAAV를 포함하는 조성물은 약 1×1011개 GC/kg 체중 내지 약 5×1013개 GC/kg 체중의 용량으로 전신으로 투여된다. 특정 구현예에서, rAAV는 약 1×1012개 GC 내지 약 5×1013개 GC의 용량으로 ICM을 통해 투여된다. 또 다른 구현예에서, rAAV는 정맥내 및 ICM 경로를 통해 공동-투여되고, 여기서 환자에게 약 1×1011개 GC/kg 체중 내지 약 5×1013개 GC/kg 체중의 용량 (IV), 및 약 1×1012개 GC 내지 약 5×1013개 GC의 용량 (ICM)이 투여된다.
일 구현예에서, 치료 방법은 효소 대체 요법으로서 hGAA780I 융합 단백질의 전달을 포함한다. 특정 구현예에서, hGAA780I 융합 단백질은 유전자 요법 (본 명세서에서 제공되는 바와 같은 발현 카세트 또는 rAAV를 포함하나 이들에 한정되지 않음)과 조합하여 ERT로서 전달된다. 특정 구현예에서, 방법은 하나 이상의 ERT (예를 들면, hGAA780I 융합 단백질을 루미자임과 같은 또 다른 치료용 단백질과 조합하여 포함하는 조성물)를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기재된 hGAA780I 융합 단백질을 포함하는 조성물은 매 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 10일 이상 대상체에게 투여될 수 있다. 투여는 매주, 매월, 또는 격월 투여가 처방된 외래 환자에게 정맥내 주입에 의할 수 있다. 화합물의 적절한 치료적 유효 용량은 치료하는 임상의에 의해 선택되며 약 1 μg/㎏ 내지 약 500 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 약 20 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 및 대략 20 mg/kg 내지 대략 50 mg/kg을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 치료적 용량은, 예를 들면, 0.1 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg 및 100 ㎎/㎏으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 방법은 hGAA780I 융합 단백질을 환자에게 주 당 10 ㎎/환자 체중 ㎏ 이상의 용량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 종종 용량은 주 당 10 mg/kg 이상이다. 투약 요법은 주 당 10 mg/kg 내지 주 당 적어도 1000 mg/kg의 범위일 수 있다. 전형적으로 투약 요법은 주 당 10 mg/kg, 주 당 15 mg/kg, 주 당 20 mg/kg, 주 당 25 mg/kg, 주 당 30 mg/kg, 주 당 35 mg/kg, 주 당 40 mg/kg, 주 당 45 mg/kg, 주 당 60 mg/kg, 주 당 80 mg/kg 및 주 당 120 mg/kg이다. 바람직한 요법에서, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg 또는 40 mg/kg이 매주 1회, 2회 또는 3회 투여된다. 치료는 전형적으로 적어도 4주, 때로 24주, 때로 환자의 평생 동안 계속된다. 선택적으로, 인간 알파-글루코시다제의 수준은 치료 이후 (예를 들면, 혈장 또는 근육에서) 모니터링되고, 검출된 수준이 실질적으로 정상인 갑 미만 (예를 들면, 20% 미만)으로 강하할 때 추가 용량이 투여된다. 일 구현예에서, hGAA780I는 초기에 "고"용량 (즉, "부하 용량")으로 투여되고, 다음으로 더 낮은 용량 (즉, "유지 용량")으로 투여된다. 부하 용량의 예는 주 당 1회 내지 3회 (예를 들면, 1주, 2주 또는 3주 동안) 적어도 약 40 ㎎/환자 체중 ㎏이다. 유지 용량의 예는 주당 적어도 약 5 내지 적어도 약 10 mg/kg 환자 체중 또는 그 이상, 예컨대, 주당 20 ㎎/㎏, 주당 30 ㎎/㎏, 주당 40 ㎎/㎏이다. 특정 구현예에서, 용량은 투약 기간 동안 증가하는 속도로 투여된다. 이는 유동 정맥내 주입의 속도를 증가시킴으로써 또는 일정한 속도로 투여되는 hGAA780I 융합 단백질의 농도를 증가시키는 구배를 사용함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방식으로 투여하면 면역원성 반응의 위험을 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 정맥내 주입은 수 시간 (예를 들면, 1 내지 10시간, 바람직하게는 2 내지 8시간, 더 바람직하게는 3 내지 6시간)의 기간에 걸쳐 일어나고, 주입 속도는 투여 기간 동안 간격을 두고 증가된다.
일 구현예에서, 방법은 대상체가 면역억제 보조요법을 받는 것을 추가로 포함한다. 이와 같은 보조요법을 위한 면역억제제는 글루코코르티코이드, 스테로이드, 항대사물, T-세포 저해제, 매크롤리드 (예를 들면, 라파마이신 또는 라파로그), 및 알킬화제, 항-대사물, 세포독성 항생제, 항체, 또는 이뮤노필린에 대한 활성 제제를 포함하는 세포증식억제제를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 면역억제제는 질소 머스터드, 니트로소우레아, 백금 화합물, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미트라마이신, IL-2 수용체- 또는 CD3-유도 항체, 항-IL-2 항체, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 시롤리무스, IFN-β, IFN-γ, 아편 또는 TNF-α (종양 괴사 인자-알파) 결합제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 면역억제제 요법은 유전자 요법 투여 0일, 1일, 2일 또는 7일 이상 이전에 시작될 수 있다. 이들 약물 중 하나 이상은 유전자 요법 투여 후 동일한 용량 또는 조정된 용량으로 계속될 수 있다. 이와 같은 요법은 필요에 따라 약 1주 (7일) 또는 약 60일 이상 동안일 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 카세트를 포함하는 조성물은 필요로 하는 대상체에게 1회 투여된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 rAAV를 통해 전달된다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법이 본 명세서 전반에 걸쳐 기재된 다른 조성물, 요법, 양태, 구현예 및 방법에 적용되는 것으로 의도됨이 이해되어야 한다.
본 명세서에서 제공되는 조성물 및 방법은 유아 발병 폼페병 또는 후기 발병 폼페병 및/또는 이와 연관된 증상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 효능은 질환의 하나 이상의 증상의 개선에 의해 또는 질환 진행의 둔화에 의해 결정될 수 있다. 유아 발병 폼페병의 증상은 근긴장 저하, 호흡기/호흡 문제, 간비대, 비후성 심근병증뿐만 아니라 심장, 근육, CNS (특히, 운동 뉴런)에의 글리코겐 축적을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 후기 발병 폼페병의 증상은 근위근 약화, 호흡기/호흡 문제뿐만 아니라 근육 및 운동 뉴런에의 글리코겐 축적을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 투여 경로는 환자의 상태 및/또는 진단을 기반으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, IV 및 ICM 경로의 조합을 통한 hGAA780I 융합 단백질의 전달을 위해 본 명세서에 기재된 rAAV를 투여하는 단계를 포함하는, 유아 발병 폼페병 또는 후기 발병 폼페병으로 진단된 환자의 치료를 위한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 후기 발병 폼페병에 걸린 것으로 확인된 환자는 rAAV의 전신 전달만을 포함하는 치료 (예를 들면, IV만)를 투여받는다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, rAAV를 포함하는 조성물의 전달은 효소 대체 요법 (ERT)과 조합될 수 있다. 특정 구현예에서, ERT와 조합하여 본 명세서에 기재된 rAAV를 ICM 전달하는 것을 포함하는, 폼페병으로 진단된 대상체를 치료하기 위한 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 유아 발병 폼페병에 걸린 것으로 확인된 대상체는 ICM 주사를 통해 본 명세서에 기재된 rAAV를 투여받고 또한 말초 질환의 양상의 치료를 위해 ERT를 받는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 "핵산"은 RNA, DNA 또는 이들의 변형일 수 있고, 단일 또는 이중가닥일 수 있으며, 예를 들면, 관심이 있는 단백질을 인코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산 유사체, 예를 들면, 펩티드-핵산 (PNA), 슈도상보성 PNA (pc-PNA), 잠금 핵산 (LNA) 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 이러한 핵산 서열은 예를 들면 전사 억제인자로 작용하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 안티센스 분자, 리보자임, 예를 들면 RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로RNAi (mRNAi), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등에 한정되지 않는 작은 억제성 핵산 서열을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 "역번역"하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 일단 단백질의 서열이 알려지면, 아미노산 서열을 핵산 코딩 서열로 역번역하는 웹-기반 및 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램, 뿐만 아니라 서비스 기반의 회사가 있다. 예를 들면, 엠보스사에 의한 backtranseq (ebi.ac.uk/Tools/st에서 온라인으로 이용가능함); 유전자 인피니티 (geneinfinity.org/sms/sms_-backtranslation.html에서 온라인으로 이용가능함); ExPasy (expasy.org/tools/에서 온라인으로 이용가능함) 참조. 일 구현예에서, RNA 및/또는 cDNA 코딩 서열은 인간 세포에서 최적의 발현을 위해 설계된다.
핵산 서열과 관련하여 용어 "동일성 백분율 (%)", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율", 또는 "동일한 백분율"은 관련성을 위해서 정렬되는 경우 동일한 2개의 서열에서의 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 게놈의 전장, 유전자 코딩 서열의 전장, 또는 적어도 약 500 내지 5000개의 뉴클레오티드의 단편에 걸친 것일 수 있으며, 이것이 바람직하다. 그러나, 예를 들면, 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 보통 적어도 약 20 내지 24개의 뉴클레오티드, 적어도 약 28 내지 32개의 뉴클레오티드, 적어도 약 36개 이상의 뉴클레오티드의 더 작은 단편 간의 동일성이 또한 바람직할 수 있다.
동일성 백분율은 단백질의 전장, 폴리펩티드, 약 32개의 아미노산, 약 330개의 아미노산, 또는 이들의 펩티드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 코딩 서열에 걸친 아미노산 서열에 대하여 용이하게 결정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 적어도 약 8개의 아미노산 길이일 수 있고, 최대 약 700개의 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 2개의 상이한 서열 사이의 "동일성", "상동성", 또는 "유사성"을 지칭하는 경우, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조로 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은, 종종 기준 서열과 비교하여 누락되거나 추가적인 염기 또는 아미노산에 대한 수정을 포함하는, 다수의 핵산 서열 또는 단백질 (아미노산) 서열을 지칭한다.
정렬은 다양한 공공 또는 상업적으로 입수 가능한 다중 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 수행된다. 서열 정렬 프로그램, 예를 들면, "크러스탈 X", "크러스탈 오메가", "MAP", "PIMA", "MSA", "블록메이커", "MEME" 및 "매치-박스" 프로그램이 아미노산 서열에 이용가능하다. 일반적으로, 이들 프로그램 중 임의의 것은 디폴트 설정으로 사용되지만, 당업자는 필요에 따라 이러한 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 적어도 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 것과 같은 동일성 또는 정렬의 수준을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 예를 들면, J. D. Thomson et al., Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27 (13): 2682-2690 (1999) 참조.
다중 서열 정렬 프로그램도 핵산 서열에 대해 이용가능하다. 이러한 프로그램의 예는 "크러스탈 W", "크러스탈 오메가", "CAP 서열 어셈블리", "BLAST", "MAP" 및 "MEME"를 포함하며, 이들은 인터넷 웹 서버를 통해 접근가능하다. 이러한 프로그램에 대한 다른 출처는 당업자에게 알려져 있다. 대안적으로, 벡터 NTI 유틸리티도 사용된다. 또한 상기 기재된 프로그램에 포함된 것을 포함하여, 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 당업계에 알려진 다수의 알고리즘이 있다. 또 다른 예로서, 폴리뉴클레오티드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 파스타™을 사용하여 비교될 수 있다. 파스타™은 질의 서열과 검색 서열 사이의 최상의 중복 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다. 예를 들면, 핵산 서열 사이의 서열 동일성 백분율은 본 명세서에 참고문헌으로 통합되는 GCG 버전 6.1에서 제공되는 바와 같이 디폴트 매개변수 (단어 크기 6, 득점 매트릭스에 대한 NOPAM 인자)와 함께 파스타™를 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 서열", 또는 "발현 조절 서열"은 작동가능하게 연결된 단백질 인코딩하는 핵산 서열의 전사를 유도, 억제, 또는 달리 조절하는 개시자 서열, 인핸서 서열, 및 프로모터 서열과 같은 핵산 서열을 말한다.
핵산 서열 또는 단백질을 설명하는 데 사용되는 용어 "외인성"은 핵산 또는 단백질이 염색체 또는 숙주 세포에 존재하는 위치에서 자연적으로 발생하지 않음을 의미한다. 외인성 핵산 서열은 또한 동일한 숙주 세포 또는 대상체로부터 유래되고 이들 내로 삽입되지만, 비-자연 상태, 예를 들면, 상이한 복제물 수, 또는 상이한 조절 요소의 제어 하에 존재하는 서열을 지칭한다.
핵산 서열 또는 단백질을 설명하는 데 사용되는 용어 "이종"은 핵산 또는 단백질이 단백질이 발현되는 숙주 세포 또는 대상체와 상이한 유기체 또는 동일한 유기체의 상이한 종으로부터 유래되었음을 의미한다. 플라스미드, 발현 카세트, 또는 벡터에서 단백질 또는 핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "이종"은 단백질 또는 핵산이 당해 단백질 또는 핵산이 자연에서 서로 동일한 관계에서 발견되지 않는 또 다른 서열 또는 하위서열과 함께 존재함을 나타낸다.
"포함하는"은 다른 구성요소 또는 방법 단계를 포함하는 것을 의미하는 용어이다. "포함하는"이 사용될 때, 관련된 구현예는 다른 구성요소 또는 방법 단계를 배제하는 "로 구성되는" 용어, 및 구현예 또는 발명의 성질을 실질적으로 변화시키는 임의의 구성요소 또는 방법 단계를 배제하는 "로 필수적으로 구성되는" 용어를 사용하는 설명을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 다양한 구현예가 "포함하는" 용어를 사용하여 제시되어 있지만, 다른 상황 하에서, 관련 구현예는 또한 "로 구성되는" 또는 "로 필수적으로 구성되는" 용어를 사용하여 기재되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 숫자 (nn) 값이 이어지는 용어 "e"는 지수를 지칭하며, 이 용어는 "× 10nn"과 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 3e13은 3×1013과 동등하다.
용어 "하나"는 하나 이상을 지칭하며, 예를 들면, "벡터"는 하나 이상의 벡터 (들)를 나타내는 것으로 이해된다는 점에 유의해야 한다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 달리 명시되지 않는 한, 주어진 참조로부터 ± 10%의 변동성을 의미한다.
실시예
이제 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 설명한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명은 결코 이들 실시예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고 본 명세서에서 제공되는 교시내용의 결과로서 명백해지는 임의의 그리고 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: 재료 및 방법
벡터 생산
780번 위치에 Val이 있는 참조 GAA 서열, 및 V780I 돌연변이가 있는 서열을 역번역하고 뉴클레오티드 서열을 조작하여 CAG 프로모터 하에 발현 카세트를 이용하여 AAV 생성을 위한 시스-플라스미드를 생성하였다. 추가적으로, 조작되지 않은 서열과의 비교를 위해 고유한 hGAA (기준 서열)에 대한 cDNA 서열을 동일한 AAV-시스 배향 골격 내로 클로닝하였다. 앞서 기재된 바와 같이 AAVhu68 벡터를 생성하고 적정하였다. (Lock, et al. 2010, Hum Gene Ther 21 (10): 1259-1271). 간단히 말해서, HEK293 세포를 삼중 형질감염시킨 다음, 배양액 상청액을 수확하고, 농축시킨 다음, 이오딕사놀 구배를 이용하여 정제하였다. 정제된 벡터를 앞서 기재된 바와 같이 토끼 베타-글로빈 폴리 A 서열을 표적화하는 프라이머를 사용하여 액적 디지털 PCR로 적정하였다 (Lock, et al. (2014), Hum. Gene Ther. Methods, 25(2): 115-125).
동물
마우스
폼페병 마우스 (Gaa 녹아웃 (-/-), C57BL/6/129 배경) 원조를 Jackson Labs에서 구입하였다 (스톡 NO. 004154, 6네오 마우스라고도 함). 동일한 한배 새끼 내에서 무효 (null) 및 WT 대조군을 생성하기 위해 이형접합체 대 이형접합체 교배를 사용하여, 유전자 요법 프로그램 (Gene Therapy Program) AAALAC의 공인된 장벽 마우스 시설에서 번식 콜로니를 유지하였다. Gaa 녹아웃 마우스는 폼페병에 널리 사용되는 모델이다. 이는 심장, 중추신경계, 골격근, 및 횡경막에 리소좀 글리코겐의 점진적인 축적을 나타내며, 이동성이 감소하고 점진적인 근육 약화가 있다. 작은 크기, 재현가능한 표현형, 및 효율적인 교배는 전임상 후보 생체내 스크리닝에 최적인 신속한 연구를 가능하게 한다.
동물 수용실을 64℉ 내지 79℉ (18℃ 내지 26℃)의 온도 범위에서 30 내지 70%의 습도 범위로 유지하였다.
이유기까지 동물을 부모 및 한배 새끼와 함께 수용하였고, 그 다음 Translational Research Laboratories (TLR) GTP 동물 사육장에서 케이지 당 2 내지 5마리의 동물의 표준 케이지에 수용하였다. 모든 케이지 크기 및 수용 조건은 연구실 동물 관리 및 사용에 대한 지침을 준수하였다. 케이지, 물병, 및 침구 기재를 차단 시설로 고압멸균 처리하였다.
자동으로 제어되는 12시간 명/암 주기를 유지하였다. 각각의 암기는 1900시간 (± 30분)에 시작되었다. 음식은 임의로 제공하였다 (Purina, LabDiet®, 5053, Irradiated, PicoLab®, Rodent Diet 20, 25lb). 물은 각각의 수용 케이지에서 개별적으로 배치된 물병을 통해 모든 동물이 임의로 접근가능하였다. 최소한, 매주 케이지를 바꾸는 동안 일주일에 1회 물병을 교체하였다. 물 공급은 필라델피아 시에서 가져와 Getinge 정수기를 사용하여 염소 처리하였다. ULAR에 의해 염소화 수준을 매일 테스트하였고 2 내지 4 ppm (백만분율)으로 유지하였다. 각각의 수용 케이지에 농축물로서 Nestlets™를 제공하였다.
생체내 연구 및 조직학
측면 꼬리 정맥 (IV)을 통해 0.1 mL 중 5×1011개 GC (대략 2.5×1013개 GC/㎏) 용량 또는 5×1010개 GC (대략 2.5×1012개 GC/㎏) 용량의 AAVhu68.CAG.hGAA (다양한 hGAA 구조물)를 마우스에게 투여하고, 혈청 분리를 위해 벡터 투약 후 제7일 및 제21일에 채혈한 다음, (혈장 분리를 위해) 말기에 채혈하고, 주사하고 28일 후에 방혈에 의해 안락사시켰다. 뇌로 시작하여 조직을 즉시 수집하였다.
조직학용 조직을 표준 방법을 사용하여 포말린으로 고정시키고 파라핀에 포매시켰다. 표준 방법을 사용하여 뇌 및 척수 절편을 룩솔 패스트 블루 (룩솔 패스트 블루 염색 키트, Abcam ab150675)로 염색하고, 말초 장기를 PAS (과요오드산-쉬프)로 염색하여 조직에서 글리코겐과 같은 다당류를 검출하였다. hGAA에 대한 면역염색을 포말린-고정 파라핀-포매 시료에서 수행하였다. 절편을 탈파라핀화하고, 항원 회수를 위해 10 mM 시트레이트 완충액 (pH 6.0)에서 끓이며, PBS 중 1% 당나귀 혈청 + 0.2% 트리톤으로 15분 동안 차단한 다음, 1차 항체 (시그마사 HPA029126 항-hGAA 항체) 및 차단 완충액에 희석된 비오틴화된 2차 항체와 함께 순차적으로 인큐베이션하였고; HRP 기반 비색 반응을 사용하여 신호를 검출하였다.
공인 수의 병리학자에 의해 맹검 방식으로 슬라이드를 검토하였다. 반-정량적 점수매김 시스템을 확립하여 축적 및/또는 공포를 나타내는 세포의 총 백분율에 의해 결정되는 바, 근육의 폼페병 관련 조직학적 병변 (글리코겐 축적 및 자가포식 구축)의 중증도를 측정하였다.
Figure pct00006
적용가능할 때 벡터 관련 조직병리학적 병변도 추정하였다.
비-인간 영장류
벡터 투여를 위해, 레서스 머카크는 근육내 덱스메데토미딘 및 케타민으로 진정시키고, 단일 대수조내 (ICM) 주사 또는 정맥내 주사를 투여하였다. ICM 주사를 위한 바늘 위치는 이전에 기술된 바와 같이, 형광투시기 (OEC9800 C-Arm, GE)를 사용한 척수조영술을 통해 확인하였다 (Katz N. et al., Hum Gene Ther Methods. 2018년 10월, 29(5): 212-219). 동물은 바비튜레이트 과다용량에 의해 안락사되었다. 수집된 조직은 드라이아이스 위에서 즉시 냉동시키거나, 조직학용 10% 포르말린으로 고정하였다.
시험관내 hGAA780I 효소 성능의 특성화
GAA Activity
균질화된 조직의 혈장 또는 상청액을 5.6 mM 4-MU-α-글루코피라노시드 (pH 4.0)와 혼합하고 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 0.4 M 탄산나트륨 (pH 11.5)을 사용하여 반응을 중단시킨다. 빅터 3 형광측정기 (355 ㎚에서 여기 및 460 ㎚에서 방출)를 사용하여 상대 형광 단위 (RFU)를 측정한다. 4-MU의 표준 곡선으로부터의 외삽법에 의해 nmol/mL/시간 단위의 활성을 계산한다. 개별 조직 시료에서 활성 수준을 균질화물 상청액의 총 단백질 함량에 대해 정규화한다. 혈장 시료에 동등한 부피를 사용한다.
LC/MS에 의한 GAA 서명 펩티드
혈장은 100% 메탄올로 침전시켜 원심분리하였다. 상청액은 제거하였다. 펠렛은 내부 표준으로서 hGAA에 독특한 안정한 동위원소 표지된 펩티드로 스파이크 처리하고, 트립신으로 재현탁하며, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 10% 포름산으로 소화를 중단하였다. 펩티드는 C-18 역상 크로마토그래피에 의해 분리시키고, ESI-질량 분광분석법에 의해 식별하여 정량화하였다. 혈장에서 총 GAA 농도는 서명 펩티드 농도로부터 계산하였다.
세포 표면 수용체 결합 검정
96-웰 플레이트는 수용체로 코팅하고, 세척하여 BSA로 차단시켰다. rhGAA 또는 조작된 GAA 둘 중 하나의 동등한 활성을 포함하는 CHO 배양 조정화 배지 또는 혈장이 일련으로 3배 희석되어 일련의 9가지 감소하는 농도를 제공하고, 보조-결합된 수용체와 함께 배양하였다. 배양 이후에, 플레이트를 세척하여 결합되지 않은 임의의 GAA 및 첨가된 4-MU-α-글루코피라노시드를 1시간 동안 37℃에서 제거하였다. 반응은 1.0 M 글리신, pH 10.5을 사용하여 중단시키고, RFU를 스펙트라맥스 형광측정기, 370 ㎚의 여기 및 460 ㎚의 방출에 의해 판독하였다. 각 시료에 대한 RFU는 4-MU의 표준 곡선으로부터의 외삽법에 의해 nmol/mL/시간으로 변환된다. 그래프패드 프리즘을 사용하여 비선형 회귀 분석을 시행한다.
글리코겐 - TFA 가수분해
조직 균질화물은 100℃에서 4시간 동안 4 N TFA로 가수분해하고, 건조시켜 물에 재구성하였다. 가수분해된 물질은 펄스 전류측정 검출이 장착된 고-pH 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC-PAD)에 의한 포도당 결정을 위한 카보팩 PA-10 2 × 250 mm 컬럼 내에 주입하였다. 각 시료에서 유리 포도당의 농도는 포도당 표준 곡선으로부터의 외삽법에 의해 계산하였다. 최종 데이터는 μg 글리코겐/mg 단백질로서 보고하였다.
실시예 2: 폼페병 마우스에서 rAAVhu68.hGAA 벡터의 평가
폼페병 마우스에 대한 IV 전달을 위해 AAV 벡터를 멸균 PBS로 희석하였다. 테스트 항목은 AAVhu68.CAG.hGAAco.rBG, AAVhu68.CAG.hGAAcoV780I.rBG, AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAco.rBG, AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.rBG 및 AAVhu68.CAG.sp7co.△8.hGAAcoV780I.rBG를 포함하였다. 야생형 및 비히클 대조군을 연구에 포함하였다.
hGAA 단백질 발현 및 활성은 간 (도 1a 및 도 1b), 심장 (도 2a 및 도 2b), 대퇴사두근 (도 3a 및 도 3b), 뇌 (도 4a 및 도 4b), 혈장 (도 9a)을 포함하여, 처리된 마우스로부터 수집된 다양한 조직에서 측정하였다. 모든 프로모터는 저-용량 및 고-용량 둘 다에서 간에서 동등하게 잘 수행하였다. UbC 프로모터 하에서 발현하는 벡터의 투여는 두 가지 용량 모두에서 골격근에서 더 낮은 활성을 유도하였고, CAG 프로모터가 있는 벡터는 최고의 전반적 활성을 보였다. UbC 프로모터가 있는 벡터는 또한 두 가지 용량 모두에서 심장에서 더 낮은 활성을 보였다.
폼페병 마우스 비히클 (PBS) 대조군 (도 5d)은 심장에서 뚜렷한 글리코겐 축적 (PAS로 염색된 절편에서 어두운 염색)을 나타내었다. 야생형 마우스 및 모든 벡터로 처리된 마우스는 축적의 거의 완전하거나 완전한 제거를 보였다. 그러나, hGAA 기준 서열 (V780)을 인코딩하는 벡터를 받은 2가지 실험군은 중등도 내지 뚜렷한 섬유화 림프구성 심근염을 나타내었으며 (도 5b 및 도 5c), 상기 섬유화 림프구성 심근염은 고유한 hGAA 이식유전자를 받은 8마리 동물 중 7마리 및 BiP 및 vIGF2 변형이 있는 조작된 hGAA를 받은 8마리 동물 중 3마리에 존재하였다. hGAAcoV780I 효소를 받은 마우스 중 어느 것도 심근염에 걸리지 않았기 때문에 (도 5e, 도 5f, 및 도 5g), 이러한 병변은 벡터 관련된 것, 보다 구체적으로는 hGAA 기준 서열 특이적인 것으로 간주되었다.
대퇴사두근 조직의 분석은, 야생형 마우스 및 추가 변형이 있거나 없이 V780I 변이체를 인코딩하는 벡터로 처리된 모든 마우스가 축적 및 자가포식 구축의 거의 완전하거나 완전한 제거를 보이는 것을 드러내었다 (도 6a 내지 도 6h). 그러나, hGAAV780의 기준 서열을 인코딩하는 벡터를 받은 2가지 실험군은 남아있는 최소 내지 중간 정도의 글리코겐 축적뿐만 아니라 자가포식 구축을 나타내었으며 (도 10), 이와 함께 폼페병의 2가지 주요 특징의 차선의 교정을 입증하였다. 최상의 결과는 고유한 형태로 또는 BiP-vIGF2 변형이 있는 V780I 변이체를 인코딩하는 2가지 벡터의 전달로부터 관찰되었다. sp7-델타8 변형은 폼페병에 기인한 조직학적 병변의 일관되지 않는 교정을 유발하는 것으로 나타났다. 기준 hGAAV780 서열을 인코딩하는 2가지 구조물은 글리코겐 축적 및 구축을 제거하는 데 차선책이었다.
고-용량 IV 투여 (5×1011개 = 2.5×1013개 GC/㎏)에서, hGAAcoV780I 및 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I는 대퇴사두근에서 거의 정상의 글리코겐 수준을 나타내었고, 세포 내로의 hGAA 흡수가 현저하게 더 우수하였다 (도 7a 내지 도 7h 및 도 42). 전방 경골근 (TA) 및 비복근을 포함하는 다른 골격근의 평가는 유사한 결과를 나타내었다 (V780I 및 글리코겐 및 중앙 자가포식 공포 둘 다의 소거가 있는 변이체). 모든 구조물은 심장에서 글리코겐 축적을 감소시켰으며, 이 때 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I 투여가 최저 수준을 유도하였다. 대퇴사두근의 글리코겐 수준이 거의 정상이지만, PAS 염색은 약간의 차이를 나타내었으며, hGAAcoV780I 및 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I가 최상의 결과를 나타내었다. 투여받은 마우스의 골격근, 심장 및 척수에서 hGAA의 발현은 면역조직화학으로 검증하였다 (도 43).
저-용량 IV 투여 (5×1010개 = 2.5×1012개 GC/㎏)에서, BiP-vIGF2.hGAAcoV780I는 고유한 hGAAcoV780I보다 심장 및 대퇴사두근에서 더 양호한 글리코겐 감소를 입증하였다 (도 41). 뇌 및 척수의 글리코겐 수준은, 아마도 더 양호한 표적화로 인하여, BiP-vIGF2.hGAAcoV780I에 의해 거의 정상이었고, 심지어 약 15%의 조직 수준이었다. CNS에서, 조직된 구조물과 V780I 변이체 사이의 강력한 상승작용 효과가 관찰되었다. BiP-vIGF2.hGAAcoV780I만이 CNS 글리코겐을 소거하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 척수 조직학의 평가는 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I로 처리된 마우스가 글리코겐 축적을의 거의 완전한 내지 완전한 제거를 보였던 반면, 기준 hGAAV780 효소를 인코딩하는 벡터로 처리된 마우스는 잔류하는 글리코겐 축적을 보였다. 또한, 뇌 및 척수 절편의 염색은 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I를 사용한 교정을 드러낸 반면, 고유한 hGAAcoV780I로는 교정하지 못하였다 (도 42). 결과는 V780I 돌연변이 및 BiP-vIGF2 변형 둘 다의 기여를 입증하고 있다.
실시예 3: 폼페병 마우스의 hGAA 발현에 미치는 DRG-탈표적화의 효과
BiP-vIGF2.hGAAcoV780I는 miR-183 표적 부위 (BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183, 서열번호 30)를 포함하도록 변형시켜 (도 11) 및 AAVhu68 캡시드에 패키징하였다.
벡터 게놈은 하기 서열 요소를 포함한다:
역전된 말단 반복서열 (ITR): ITR은 벡터 게놈의 모든 구성요소와 연접하는, AAV2 (130 bp, GenBank: NC_001401)로부터 유래한 일치하는 역상보적인 서열이다. ITR은 AAV 및 아데노바이러스 헬퍼 기능이 트랜스 배향으로 제공될 때 벡터 DNA 복제의 원점 및 벡터 게놈을 위한 패키징 신호 둘 다로서 기능한다. 이와 같이, ITR 서열은 벡터 게놈 복제 및 패키징을 위해 요구되는 유일한 시스 배향 서열이다.
CAG 프로모터: 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서, 닭 베타-액틴 (CB) 프로모터 (282 bp, GenBank: X00182.1) 및 토끼 베타-글로빈 인트로으로 구성된 하이브리드 구조물.
코딩 서열: BiP-vIGF2.hGAAcoV780I (서열번호 31)을 인코딩하는 조작된 cDNA (서열번호 30의 뉴클레오티드 1141번 내지 4092번).
miR 표적 표적 서열: 4개의 일렬 miR-183 표적 서열 (서열번호 26).
토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호 (rBG PolyA): rBG 폴리 A 신호 (127 bp)는 시스 배향으로 이식유전자 mRNA의 효율적인 폴리아데닐화를 용이하게 한다. 이러한 요소는 전사 종결, 미가공 전사체의 3' 말단에서 특이적 절단 과정 및 긴 폴리아데닐레이트 미단의 첨가를 위한 신호로서 작용한다.
BiP-vIGF2-hGAAcoV780I 벡터 게놈 내에 miR-183 표적 부위를 도입하는 것의 효과는 폼페병 마우스로의 AAVhu68의 IV 전달 이후에 평가하였다. BiP-vIGF2-hGAAcoV780I 구조물 (miR-183 표적이 없음)을 사용하여 관찰된 바와 같이, miR-183 표적 서열을 포함한 벡터의 고-용량 정맥내 투여 이후에 글리코겐 축적이 CNS에서 교정되었다 (도 12 및 도 13). 대퇴사두근에서 글리코겐 축적 및 자가포식 구축은 고-용량 정맥내 투여 이후에 완전히 교정된 반면, 저-용량 투여 이후에는 글리코겐 축적 교정 및 자가포식 구축의 일부 교정이 관찰되었다 (도 14). 또한, 글리코겐의 교정은 저-용량 및 고-용량으로 심장에서 관찰되었다 (도 15). CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I의 투여로 관찰된 것과 유사하게, 자가포식 구축은 고-용량에서 완전히 해소되고, 저-용량에서 현저하게 감소되었다 (도 16). 결과는 miR-183 표적의 첨가가 miR-183 표적 서열이 없는 상응하는 벡터와 비교하여 치료용 이식유전자의 효능을 변경시키지 않음을 검증하였다.
용량 범위 연구는 IV 투여 이후에 BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183 구조물에 대한 효능, 프로파일 및 MED를 결정하도록 수행하였다. 연구 설계는 하기 표에 제공된다.
Figure pct00007
근육 병리는 AAVhu68.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.4xmir183 벡터의 IV 투여 이후 60일째 PAS 염색된 근육 절편 상에서 점수 매겨졌다. 대퇴사두근 절편은 WGA (세포막; 근육 섬유 직경을 측정함), DAPI (핵; 중앙 핵의 존재를 정량함), 및 Lc3b (자가포식소체; 자가포식 구축을 정량함)으로의 염색을 사용한 면역조직화학에 의해 분석하였다. 절편을 스캔하고, 자동으로 디지탈화한 다음 비지오팜 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
중앙 핵 정량화
건강한 근육 섬유는 중앙 핵 (CN)을 거의 포함하지 않고 (야생형 근육에서 35% 미만), CN 존재는 근육 퇴화를 표시한다. CN을 갖는 섬유의 백분율은 WT 및 KO PBS 대조군 사이에 유의하게 상이하였다 (도 43). CN을 갖는 섬유의 백분율은 KO PBS 대조군 마우스와 비교하여 2 × 1011개 GC (1 × 1013개 GC/kg) 및 더 높은 벡터 용량으로 처리된 실험군에서 유의하게 감소하였다. 어린 마우스에서, CN을 증가시키는 퇴화/재생 주기가 연구의 시작 이전에 발생하지 않았으며, 처리에 의해 예방되어 폼페병 마우스에서 표형형 교정을 유도하였다.
LC3b 정량화
생산적인 자가포식의 정상 조건 하에, 자가포식소체는 리소좀에 의해 신속하게 분해되어, LC3 양성 구조가 그대로 검출가능하다. GAA KO 마우스에서, 손상된/기능이상 리소좀은 자가포식의 증가를 촉발시킬 수 있으며, 리소좀이 자가포식소체와 융합하지 못하고, 이의 내용물을 분해하여 자가포식 구축을 유도한다.
자가포식 구축 (LC3b + 세포의 %)이 5 × 1011개 GC (2.5 × 1013개 GC/kg)로부터 시작하여 모든 용량에서 예방되었다 (도 44). 유의한 자가포식소체 구축은 생후 3개월에 PBS 대조군에서 관찰하였다 (> 20% 섬유).
대퇴사두근 섬유의 더 작은 직경 정량화
야생형 대조군 동물과 비교할 때 섬유 크기의 차이를 정량화하기 위하여, 섬유 직경은 소 (< 30 μm), 중 (30 μm 내지 50 μm) 및 대 (> 50 μm) 부류로 구분하였다. KO PBS 대조군은 생후 3개월에 유의한 위축증을 나타낸다. KO PBS 실험군과 비교하여, 큰 대퇴사두근 섬유의 백분율의 유의한 증가 및 작은 대퇴사두근 섬유의 백분율의 감소가 있었다. 작은 섬유 (S)의 비율이 2 × 1011개 GC (1 × 1013개 GC/kg) 용량 이상으로 처리된 GAA -/- 마우스에서 유의하게 감소하고, 근육 위축증 예방을 나타내었다.
공포 형성의 중증도
결과는 평가된 모든 근육에서 리소좀 저장의 용량 의존적 교정을 보여주었다 (도 46a 내지 도 46f). 가자미근 및 횡격막에서 테스트된 가장 낮은 용량 (5 × 1012개 GC/kg, 1 × 1011개 GC)으로 교정이 달성된 반면, 테스트된 나머지 근육 대부분은 2 × 1013개 GC/kg (5 × 1011개 GC)의 중간 용량으로 GAA KO PBS 대조군 마우스와 비교하여 유의하게 개선되었다. 가장 높은 2가지 용량 - 5 × 1013개 GC/kg (1 × 1012개 GC) 및 1 × 1014개 GC/kg (2 × 1012개 GC)의 경우 근육 병리가 완벽하게 없었으며, 절편이 WT 마우스 근육과 유사한 것으로 관찰되었다.
실시예 4: 증상 이후의 노령 폼페병 마우스에서 투여 경로 및 용량 연구
hGAA 인코딩하는 AAVhu68 벡터 (예로, AAVhu68.CAG.BiP-vIGF2.hGAAcoV780I.rBG를 포함함)가 정맥내 (IV) 및/또는 뇌실내 (ICV) 주사를 통해 투여된 폼페병 마우스 (뿐만 아니라 야생형 및 비히클 대조군)에서 투여 경로 및 용량의 효과가 평가되었다. 동일한 벡터를 사용한 이중 투여 경로 접근법 (정맥 내 및 뇌척수액 내로의 주사)은 질환의 말초적 및 신경학적 소견 둘 다를 교정하여야 한다. 유전자 요법에 적격할 유의한 비율의 환자가 이미 상급 병리를 보일 것이기 때문에, 본 발명자들은 증상 이후의 폼페병 마우스 (생후 7개월의 6마리)를 선별하여 처리하고, 처리 후 적어도 6개월 동안 추적 관찰하였다.
마우스는 벡터의 2가지 용량 수준 (저-용량 또는 고-용량)을 정맥내 (IV), 뇌실내 (ICV) 또는 이중 투여 경로를 사용하여 투여 받았다. 본 연구에 사용된 용량 (5 × 1010개 GC 또는 1 × 1011개 GC ICV 및 1 × 1013개 GC/kg 또는 5 × 1013개 GC/kg IV)은 실시예 6에 기술된 NHP 연구에 사용된 저-용량 및 고-용량에 상응하고, 인간에게 투여에 적합한 용량 (1 × 1013개 GC/kg 및 5 × 1013개 GC/kg)이다. 마우스는 대략 주사 후 210일째, 생후 13개월 내지 14개월에 희생되어 분석을 위한 조직을 수집하였다. 연구 설계는 도 47에 제공되어 있다.
연구의 과정 동안, 마우스는 회전막대, 와이어 매달리기 및 그립 강도 평가를 사용하여 보행 활동에 대해 테스트하고, 체적변동기록을 수행하였다. hGAA 단백질 발현/활성 및 글리코겐 축적을 혈장, 대퇴사두근, 비복근, 횡격막 및 뇌를 포함하는, 처리된 마우스로부터 수집된 다양한 조직에서 측정하였다. 조직학을 수행하여 예를 들면 PAS (룩솔 패스트 블루 염색에 의함), hGAA 발현 및 신경염증 (별아교세포증)을 평가하였다. 조직 절편을 염색하여 자가포식 구축 또는 제거 (예를 들면, LC3B를 표지하는 항체를 사용함)를 평가하였다.
조직학적 연구는 고-용량 및 저-용량 ICV 처리된 (도 28), 및 고-용량 및 저-용량 IV 처리된 (도 29) 마우스로부터의 대퇴사두근, 심장 및 척수 시료에 대해 수행하였다. 글리코겐 축적은 ICV 경로를 통해 저- 또는 고-용량 벡터 용량을 투여받은 마우스의 척수에서 교정되었다. 고-용량 IV 투여는 대퇴사두근, 심장 및 척수에서 글리코겐 축적을 교정하는데 효과적이었다.
체중은 저-용량 및 고-용량 둘 다의 ICV 및 IV 벡터의 조합으로 처리된 수컷에서 유의하게 교정되었다 (도 25a). 단일 경로 (ICV 단독 또는 IV 단독)는 체중을 유의하게 교정하지 못하였다. 체중은 암컷 폼페병 마우스 및 WT 마우스 상이에 상이하지 않았다 (도 25b).
그립 강도는 고-용량 IV를 투여받은 마우스의 경우에 (기저선과 비교하여 및 PBS 대조군과 비교하여) 유의하게 개선되었다 (도 26). ICV 및 IV 투여된 저-용량 벡터 또는 이중 투여 경로 (ICV LD + IV LC) 투여의 경우 유의한 이익이 없었다. 그러나, 고-용량 IV 및 ICV 조합의 투여는 주사 후 30일 정도에 야생형 수준과 비교하여 강도를 복구하였고, 180일째 조합의 이익 증가가 있었다 (도 27).
근육 병리는 상이한 실험군 전체를 조사하여 폼페병과 관련된 결과를 관찰하였다. 폼페병 환자 및 6neo GAA KO 폼페병 마우스 모델로부터의 근육은 섬유 위축증, 부동세포증, 자가포식 구축 및 중앙 핵 형성과 같은 구조적 이상의 존재를 특징으로 한다 (도 48).
중앙 핵 정량화
6개월 이후에 처리된 마우스에서, 퇴화/재생 주기가 이미 처리 이전에 발생하였다 (도 49).
LC3b 정량화
기존의 병리를 갖는 폼페병 마우스의 처리는 IV HD (1 × 1012개 GC = 5 × 1013개 GC/kg), 및 ICV + IV HD (ICV 1 × 1011개 GC 및 IV 1 × 1012개 GC) 실험군에서 자가포식소체 축적을 역전시켰다 (도 50).
대퇴사두근 섬유 직경 정량화
6개월 이후에 처리된 마우스에서 근육 위축증이 이미 현저할 때, 작은 섬유 (S)의 비율이 ICV + IV HD 처리된 실험군 (ICV 1 × 1011개 GC 및 IV 1 × 1012개 GC)에서 감소되고, 큰 섬유 (L)의 비율은 IV HD 및 ICV + IV HD 처리된 실험군에서 개선되었다 (도 51). 이러한 처리 실험군에서, 근윤 섬유 크기 분포는 WT 마우스와 유사하고, PBS 대조군 폼페병 바우스와 비교하여 통계적으로 유의하게 복구되었으며, 상급 질환 증상 이후의 치료 파라다임에서 기존 병리의 구제를 나타낸다. 도 27에 나타낸 바와 같이, 결과는 동일한 실험군에서 WT 수준과 비교하여 그립 강도 복구와 상관된다. 또한, HD IV 처리도 병리 개선을 유도하고, 큰 섬유의 비율 증가 및 위축성 섬유의 감소 경향성을 보여준다 (도 51).
결과는 이중 투여 경로가 모든 양태의 질환을 표적하는데 바람직한 점을 뒷받침하고 있다. 벡터의 전달은 섬유의 위축 및 자가포식 구축과 같은 전형적으로 치료 저항성인 결과를 포함하는, 증상 이후의 노령 폼페병 마우스에서 기존의 근육 섬유 병리를 역전시켰다.
실시예 5: 비-인간 영장류에게 DRG-탈표적화 유전자 요법 벡터의 투여
NHP 영장류 연구는 독성을 측정하고, AAVhu68 캡시드에서 CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I 또는 CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I-4xmir183의 ICM 전달을 평가하도록 시행하였다. 벡터는 3 × 1013개 GC/kg으로 ICM 주사하고, 동물은 35일째 희생되었다.
4개의 miR-183의 일렬 반복서열의 첨가는 경추 DRG의 감각 뉴런에서 hGAA 이식유전자의 발현을 억압하였다 (도 17). mir183 벡터에 대한 hGAA 이식유전자 의 현저한 감도도 요추 DRG의 감각 뉴런에서 관찰되지만, 일부 발현은 남아있었다 (도 18). 놀랍게도, miR-183 표적 서열이 운동 뉴런에서 이식유전자의 발현을 변형하지 않았고 (도 19), 이는 벡터의 투여가 폼페병 환자의 운동 뉴런에서 글리코겐 축적을 감소시키는데 이익이 될 것임을 시사한다. 또한, miR-183 표적 서열 포함하는 구조물의 전달 이후에 심장에서 이식유전자 발현의 감소가 없었다 (도 20). 사실상, 심장에서 발현이 증가되는 것으로 보였으며, 폼페병 환자에서 심장병 치료를 위한 효능이 증진될 것임을 시사한다. 명백하게, miR-183 표적 서열의 일렬 반복서열은 경추 및 흉추 분절로부터 나온 DRG의 감각 뉴런에서 독성을 감소시켰다 (도 21a 및 도 21b). 이러한 용량 수준에서 요추 분절의 독성은 감소되지 않았으며 (도 21c), 도 18에 도시된 바와 같이 요추 수준에서 잔류 단백질 발현으로 인한 것 같다.
NHP에게 miR-183 표적 서열을 갖는 구조물의 IV 전달을 추가로 평가하는 연구 설계는 하기 표에 제공된다. 연구는 레서스 GAA (rhGAA) 서열을 포함하여 비-자가 면역 반응의 잠재적인 효과를 평가한다.
Figure pct00008
또한, CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I-4xmir183 벡터의 안전성 프로파일은 용량 범위 연구를 사용하여 평가하였다. 용량 범위 연구에서 NHP는 3 × 1012개 GC, 6 × 1013개 GC 및 1 × 1013개 GC를 포함한 다양한 용량으로 ICM 투여되었다.
Figure pct00009
실시예 6: 비-인간 영장류에서 투여 경로 연구
NHP 영장류 연구는 독성을 측정하고, 대안의 또는 조합된 벡터 투여 경로를 평가하도록 시행하였다. AAVhu68.CAG.BiP-IGF2-hGAAcoV780I는 5 × 1013개 GC/kg (고-용량) 또는 1 × 1013개 GC/kg (저-용량)으로 IV 투여되거나, 3 × 1013개 GC (고-용량) 또는 1 × 1013개 GC (저-용량)으로 ICM 투여되었다. 또한, 이중 투여 경로의 유용성 및 독성도 예를 들면 IV 및 ICM 용량을 조합하여 (IV 5 × 1013개 GC/kg + ICM 3 × 1013개 GC, 또는 IV 1 × 1014개 GC/kg + ICM 1 × 1013개 GC) 투여함으로써 평가하였다. IV 및 ICM 용량의 조합은 폼페병 환자의 치료에 유익할 상승작용 효과를 나타낼 수 있다.
투여 경로 및 용량을 평가하기 위한 연구 설계는 도 31에 제공된다. 예비적인 연구는 저-용량 IV 주사된 동물이 대퇴사두근 및 심장에서 hGAA 발현을 보이는 것을 드러내었다 (도 37). 또한, IV 주사된 동물은 ICM 주사된 동물보다 낮은 등급의 척수 축삭병증을 나타내었다 (도 33d 내지 도 33f). 또한, hGAA의 발현은 저-용량 ICM 주사된 동물의 척수에서 조직학에 의해 관찰되었다 (도 37).
척수 분절에서 hGAA 발현하는 운동 뉴런의 정량화는 인간 GAA 이식유전자에 대해 면역염색된 슬라이드 상에서 시행하였다. 결과는 ICM 단독 투약된 동물 및 ICM + IV 투약된 동물이 이식유전자를 발현하는 의미있는 갯수의 척수 하부 운동 뉴런을 갖는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 직접적인 CSF 투여가 운동 뉴런 별리를 교정하는데 유익할 것임을 시사한다. IV LD 용량 단독이 hGAA 양성 운동 뉴런을 유도하지 않는 반면, IV HD는 분산된 hGAA 양성 운동 뉴런을 유도하였다 (도 55).
ICM 주사된 동물에서 DRG 퇴화 및 척수 축삭병증은 용량 의존적이지 않았다 (도 33a 내지 도 33f). 또한, 1마리의 저-용량 동물 (RA3607: 1 × 1013개 GC/kg) 및 1마리의 IV + ICM 동물 (180717: IV 5 × 1013개 GC/kg + ICM 3 × 1013개 GC)은 IV 고-용량 주사된 동물보다 증가된 DRG 퇴화, 척수 축삭병증 및 더 높은 심장 염증 반응을 나타내었다. 그러나, miR 표적 서열을 갖는 구조물의 ICM 투여 이후에 심장 GAA 발현의 증가가 관찰되고, 염증은 없었다 (도 20).
(형식이 없는 서열목록 텍스트)
숫자 식별자 <223> 하에 형식이 없는 텍스트를 포함하는 서열에 대한 하기 정보를 제공한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
본 명세서에 인용된 모든 문서는 본원에 참고문헌으로 통합된다. 본원에 함께 제출된 서열목록 ("21-9596PCT_ST25"로 라벨됨), 및 내부의 서열 및 텍스트는 참고문헌으로 통합된다. 2019년 4월 30에 제출된 미국 가특허출원 제 US 62/840,911호, 2019년 10월 10일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 62/913,401호, 2020년 4월 29일에 제출된 국제특허출원 제 PCT/US20/30484호, 2020년 4월 29일에 제출된 국제특허출원 제 PCT/US20/30493호, 2020년 5월 14일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 62/024,941호, 2020년 11월 4일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 63/109,677호, 및 2021년 4월 27일에 제출된 미국 가특허출원 제 US 63/180,379호는 본원에 참고문헌으로 통합된다. 본 발명이 특정한 구현예를 참조하여 설명되는 한편, 본 발명의 정신을 벗어나지 않고도 변형이 만들어질 수 있음이 이해될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범주 내에 속하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA AMICUS THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS USEFUL FOR TREATING POMPE DISEASE <130> UPN-21-9596.PCT <150> US 63/024,941 <151> 2020-05-14 <150> US 63/109,677 <151> 2020-11-04 <150> US 63/180,379 <151> 2021-04-27 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2211 <212> DNA <213> adeno-associated virus hu.68 <220> <221> CDS <222> (1)..(2211) <400> 1 atg gct gcc gat ggt tat ctt cca gat tgg ctc gag gac aac ctc agt 48 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 gaa ggc att cgc gag tgg tgg gct ttg aaa cct gga gcc cct caa ccc 96 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 aag gca aat caa caa cat caa gac aac gct cgg ggt ctt gtg ctt ccg 144 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 ggt tac aaa tac ctt gga ccc ggc aac gga ctc gac aag ggg gag ccg 192 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 gtc aac gaa gca gac gcg gcg gcc ctc gag cac gac aag gcc tac gac 240 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 cag cag ctc aag gcc gga gac aac ccg tac ctc aag tac aac cac gcc 288 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 gac gcc gag ttc cag gag cgg ctc aaa gaa gat acg tct ttt ggg ggc 336 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 aac ctc ggg cga gca gtc ttc cag gcc aaa aag agg ctt ctt gaa cct 384 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 ctt ggt ctg gtt gag gaa gcg gct aag acg gct cct gga aag aag agg 432 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 cct gta gag cag tct cct cag gaa ccg gac tcc tcc gtg ggt att ggc 480 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Val Gly Ile Gly 145 150 155 160 aaa tcg ggt gca cag ccc gct aaa aag aga ctc aat ttc ggt cag act 528 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 ggc gac aca gag tca gtc ccc gac cct caa cca atc gga gaa cct ccc 576 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 gca gcc ccc tca ggt gtg gga tct ctt aca atg gct tca ggt ggt ggc 624 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 gca cca gtg gca gac aat aac gaa ggt gcc gat gga gtg ggt agt tcc 672 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 tcg gga aat tgg cat tgc gat tcc caa tgg ctg ggg gac aga gtc atc 720 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 acc acc agc acc cga acc tgg gcc ctg ccc acc tac aac aat cac ctc 768 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 tac aag caa atc tcc aac agc aca tct gga gga tct tca aat gac aac 816 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 gcc tac ttc ggc tac agc acc ccc tgg ggg tat ttt gac ttc aac aga 864 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 ttc cac tgc cac ttc tca cca cgt gac tgg caa aga ctc atc aac aac 912 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 aac tgg gga ttc cgg cct aag cga ctc aac ttc aag ctc ttc aac att 960 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 cag gtc aaa gag gtt acg gac aac aat gga gtc aag acc atc gct aat 1008 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 aac ctt acc agc acg gtc cag gtc ttc acg gac tca gac tat cag ctc 1056 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 ccg tac gtg ctc ggg tcg gct cac gag ggc tgc ctc ccg ccg ttc cca 1104 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 gcg gac gtt ttc atg att cct cag tac ggg tat cta acg ctt aat gat 1152 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 gga agc caa gcc gtg ggt cgt tcg tcc ttt tac tgc ctg gaa tat ttc 1200 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 ccg tcg caa atg cta aga acg ggt aac aac ttc cag ttc agc tac gag 1248 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 ttt gag aac gta cct ttc cat agc agc tat gct cac agc caa agc ctg 1296 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 gac cga ctc atg aat cca ctc atc gac caa tac ttg tac tat ctc tca 1344 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 aag act att aac ggt tct gga cag aat caa caa acg cta aaa ttc agt 1392 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 gtg gcc gga ccc agc aac atg gct gtc cag gga aga aac tac ata cct 1440 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 gga ccc agc tac cga caa caa cgt gtc tca acc act gtg act caa aac 1488 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 aac aac agc gaa ttt gct tgg cct gga gct tct tct tgg gct ctc aat 1536 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 gga cgt aat agc ttg atg aat cct gga cct gct atg gcc agc cac aaa 1584 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 gaa gga gag gac cgt ttc ttt cct ttg tct gga tct tta att ttt ggc 1632 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 aaa caa gga act gga aga gac aac gtg gat gcg gac aaa gtc atg ata 1680 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 acc aac gaa gaa gaa att aaa act acc aac cca gta gca acg gag tcc 1728 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 tat gga caa gtg gcc aca aac cac cag agt gcc caa gca cag gcg cag 1776 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 acc ggc tgg gtt caa aac caa gga ata ctt ccg ggt atg gtt tgg cag 1824 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 gac aga gat gtg tac ctg caa gga ccc att tgg gcc aaa att cct cac 1872 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 acg gac ggc aac ttt cac cct tct ccg ctg atg gga ggg ttt gga atg 1920 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 aag cac ccg cct cct cag atc ctc atc aaa aac aca cct gta cct gcg 1968 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 gat cct cca acg gct ttc aac aag gac aag ctg aac tct ttc atc acc 2016 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 cag tat tct act ggc caa gtc agc gtg gag att gag tgg gag ctg cag 2064 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 aag gaa aac agc aag cgc tgg aac ccg gag atc cag tac act tcc aac 2112 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 tat tac aag tct aat aat gtt gaa ttt gct gtt aat act gaa ggt gtt 2160 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 tat tct gaa ccc cgc ccc att ggc acc aga tac ctg act cgt aat ctg 2208 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 taa 2211 <210> 2 <211> 736 <212> PRT <213> adeno-associated virus hu.68 <400> 2 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Val Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735 <210> 3 <211> 952 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(27) <223> Signal peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(952) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (123)..(952) <223> 76kD GAA Protein with V780I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (204)..(952) <223> 70 kD GAA Protein with V780I <400> 3 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly 290 295 300 Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val 305 310 315 320 Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile 325 330 335 Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln 340 345 350 Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly 355 360 365 Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr 370 375 380 Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val 385 390 395 400 Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe 405 410 415 Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser 435 440 445 Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg 450 455 460 Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val 465 470 475 480 Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu 485 490 495 Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe 500 505 510 Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly 515 520 525 Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val 530 535 540 Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser 545 550 555 560 Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly 565 570 575 Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly 580 585 590 Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg 595 600 605 Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu 610 615 620 Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro 625 630 635 640 Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu 645 650 655 Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg 660 665 670 Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser 675 680 685 Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala 690 695 700 Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly 705 710 715 720 Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser 725 730 735 Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile 740 745 750 Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro 755 760 765 Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly 770 775 780 Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser 785 790 795 800 Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val 805 810 815 His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr 820 825 830 Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr 835 840 845 Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser 850 855 860 Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala 865 870 875 880 Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly 885 890 895 Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala 900 905 910 Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr 915 920 925 Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly 930 935 940 Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 945 950 <210> 4 <211> 2856 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered hGAAI Coding sequence <400> 4 atgggcgtta gacaccctcc ttgctctcac agactgctgg ccgtgtgtgc tctggtgtct 60 ctggctacag ctgccctgct gggacatatc ctgctgcacg actttctgct ggtgcccaga 120 gagctgtctg gcagctctcc tgtgctggaa gagacacacc ctgcacatca gcagggcgcc 180 tctagacctg gacctagaga cgctcaggcc catcctggca gacctagagc tgtgcccaca 240 cagtgtgacg tgccacctaa cagcagattc gactgcgccc ctgacaaggc catcacacaa 300 gagcagtgtg aagccagagg ctgctgctac atccctgcca aacaaggact gcagggcgct 360 cagatgggac agccctggtg cttcttccca ccatcttacc ccagctacaa gctggaaaac 420 ctgagcagca gcgagatggg ctacaccgcc acactgacca gaaccacacc tacattcttc 480 ccgaaggaca tcctgacact gcggctggac gtgatgatgg aaaccgagaa ccggctgcac 540 ttcaccatca aggaccccgc caatcggaga tacgaggtgc cactggaaac ccctcacgtg 600 cactctagag ccccatctcc actgtacagc gtggaatttt ccgaggaacc cttcggcgtg 660 atcgtgcgga gacagctgga tggaagagtg ctgctgaaca ccacagtggc ccctctgttc 720 ttcgccgacc agtttctgca gctgagcacc agcctgccta gccagtatat cacaggcctg 780 gccgagcacc tgtctccact gatgctgagc acatcctgga ccagaatcac cctgtggaac 840 agagatctgg cccctacacc tggcgccaac ctgtacggct ctcacccctt ttatctggcc 900 ctggaagacg gcggatctgc ccacggtgtt tttctgctga actccaacgc catggacgtg 960 gtgctgcagc catctcctgc tctgtcttgg agaagcacag gcggcatcct ggacgtgtac 1020 atctttctgg gccccgagcc taagagcgtg gtgcagcagt atctggacgt cgtgggctac 1080 cccttcatgc ctccttattg gggcctgggc ttccacctgt gcaggtgggg atacagcagc 1140 accgccatca ccagacaggt ggtggaaaac atgacccggg ctcacttccc actggacgtg 1200 cagtggaacg acctggacta catggacagc agacgggact tcaccttcaa caaggacggc 1260 ttcagagact tccccgccat ggtgcaagaa ctgcaccaag gcggcagacg gtacatgatg 1320 attgtggacc cagccatcag ctctagcggc cctgccggaa gctacagacc ttacgatgag 1380 ggcctgagaa gaggcgtgtt catcaccaac gagacaggcc agcctctgat cggcaaagtg 1440 tggcctggca gcacagcctt tccagacttc acaaacccca ccgctctggc ttggtgggaa 1500 gatatggtgg ccgagttcca cgatcaggtg cccttcgatg gcatgtggat cgacatgaac 1560 gagcccagca acttcatccg gggcagcgag gacggctgcc ccaacaacga actggaaaat 1620 cctccttacg tgcccggcgt tgtcggcgga acacttcagg ccgctacaat ctgtgccagc 1680 agccaccagt tcctcagcac ccactacaac ctgcacaacc tgtacggcct gaccgaggcc 1740 attgcctctc atagagccct ggttaaggcc agaggcaccc ggccttttgt gatcagcaga 1800 agcacattcg ccggccacgg cagatacgcc ggacattgga caggcgacgt gtggtctagt 1860 tgggagcagc tggctagcag cgtgccagag atcctgcagt tcaatctgct gggcgtgcca 1920 ctcgtgggag ccgacgtttg tggcttcctg ggcaacacca gcgaggaact gtgtgtgcgt 1980 tggacacagc tgggcgcctt ctatcccttc atgagaaacc acaacagcct gctgagcctg 2040 cctcaagagc cctacagctt tagcgagcct gcacagcagg ccatgagaaa ggccctgact 2100 ctgagatacg ctctgctgcc ccacctgtac accctgtttc accaggctca cgtggccggg 2160 gagacagtgg ctagacctct gttcctggaa tttcccaagg acagctccac ctggaccgtg 2220 gatcatcagc tgctgtgggg agaagccctg ctcatcacac ctgttctgca ggccggaaag 2280 gccgaagtga ccggctattt tcctctcggc acttggtacg acctgcagac cgtgcctatt 2340 gaggccctgg gatctcttcc tccacctcct gctgctccta gagagcctgc catccactct 2400 gaaggccagt gggttacact gcccgctcct ctggacacca tcaacgtgca cctgagagct 2460 ggctacatca tcccactgca aggccctggc ctgaccacaa ccgaatctag acagcagccc 2520 atggctctgg ccgtggctct tacaaaaggc ggagaggcta gaggcgagct gttctgggac 2580 gacggcgagt ctctggaagt gctggaacgg ggcgcttata cccaagtgat cttcctggcc 2640 agaaacaaca ccatcgtgaa cgaactcgtg cgcgtgacca gtgaaggtgc tggactgcaa 2700 ctgcagaaag tgaccgtgct cggagtggcc acagctcctc aacaggtgct gtctaacggc 2760 gtgcccgtgt ccaacttcac atacagcccc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtgtca 2820 ctgctgatgg gcgagcagtt cctggtgtcc tggtgc 2856 <210> 5 <211> 2859 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgggagtga ggcacccgcc ctgctcccac cggctcctgg ccgtctgcgc cctcgtgtcc 60 ttggcaaccg ctgcactcct ggggcacatc ctactccatg atttcctgct ggttccccga 120 gagctgagtg gctcctcccc agtcctggag gagactcacc cagctcacca gcagggagcc 180 agtagaccag ggccccggga tgcccaggca caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca 240 cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag 300 gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc 360 cagatggggc agccctggtg cttcttccca cccagctacc ccagctacaa gctggagaac 420 ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc accctgaccc gtaccacccc caccttcttc 480 cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac 540 ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc 600 cacagccggg caccgtcccc actctacagc gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg 660 atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc 720 tttgcggacc agttccttca gctgtccacc tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc 780 gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc accagctgga ccaggatcac cctgtggaac 840 cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg 900 ctggaggacg gcgggtcggc acacggggtg ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg 960 gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac 1020 atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac 1080 ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc 1140 accgctatca cccgccaggt ggtggagaac atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc 1200 cagtggaacg acctggacta catggactcc cggagggact tcacgttcaa caaggatggc 1260 ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg 1320 atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag 1380 ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta 1440 tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc accaacccca cagccctggc ctggtgggag 1500 gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac 1560 gagccttcca acttcatcag gggctctgag gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac 1620 ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc 1680 agccaccagt ttctctccac acactacaac ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc 1740 atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc 1800 tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc 1860 tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct 1920 ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc 1980 tggacccagc tgggggcctt ctaccccttc atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg 2040 ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc 2100 ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg 2160 gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag ttccccaagg actctagcac ctggactgtg 2220 gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag 2280 gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc acatggtacg acctgcagac ggtgccaata 2340 gaggcccttg gcagcctccc acccccacct gcagctcccc gtgagccagc catccacagc 2400 gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct 2460 gggtacatca tccccctgca gggccctggc ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc 2520 atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt ggggaggccc gaggggagct tttctgggac 2580 gatggagaga gcctggaagt gctggagcga ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc 2640 aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag 2700 ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt 2760 gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg 2820 ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc tggtgttag 2859 <210> 6 <211> 982 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fusion Protein comprising hGAA780I <400> 6 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 <210> 7 <211> 2952 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered sequence encoding fusion protein comprising GAAV780I <220> <221> misc_feature <222> (810)..(810) <223> V810I <400> 7 atgaagctgt ctctggtggc tgctatgctg ctgctcctgt ctgccgccag agccagcaga 60 acactttgtg gcggagagct ggtggacacc ctgcagtttg tgtgtggcga cagaggcttc 120 ctgttcagca gacctgccag ccgggtttcc agacggtcta gaggaatcgt ggaagagtgc 180 tgcttcagaa gctgcgatct ggccctgctg gaaacctact gtgccacacc agccagatct 240 gaaggcggcg gaggatctgg cggaggcgga tctagacctg gacctagaga cgcccaggct 300 caccctggta gacctagagc tgtgcctaca cagtgcgacg tgccacctaa cagcagattc 360 gactgcgccc ctgacaaggc catcacacaa gagcagtgtg aagccagagg ctgctgctac 420 atccctgcca aacaaggact gcagggcgcc cagatgggac agccttggtg cttcttccca 480 ccatcttacc ccagctacaa gctggaaaac ctgagcagct ccgagatggg ctacaccgcc 540 acactgacca gaaccacacc tacattcttc ccgaaggaca tcctgacact gcggctggac 600 gtgatgatgg aaaccgagaa ccggctgcac ttcaccatca aggaccccgc caatcggaga 660 tacgaggtgc ccctggaaac accccacgtg cactctagag caccctctcc actgtacagc 720 gtggaatttt ccgaggaacc cttcggcgtg atcgtgcgga gacagctgga tggcagagtg 780 ctcctgaata ccacagtggc ccctctgttc ttcgccgacc agtttctgca gctgagcacc 840 agcctgccta gccagtatat cacaggcctg gccgagcatc tgagccctct gatgctgagc 900 acatcctgga ccagaatcac cctgtggaac cgcgacctgg ctcctacacc tggcgccaat 960 ctgtacggct ctcacccctt ctacctggca ctggaagacg gtggatctgc ccacggtgtc 1020 tttctgctga atagcaacgc catggacgtg gtgctgcagc cctctcctgc actgtcttgg 1080 agatctacag gcggcatcct ggacgtgtac atctttctgg gccccgagcc taagagcgtg 1140 gtgcagcagt atctggacgt cgtgggctac cccttcatgc ctccttattg gggcctgggc 1200 ttccacctgt gtaggtgggg ctacagcagc accgccatca ccagacaggt ggtggaaaac 1260 atgacccggg ctcacttccc actggacgtg cagtggaacg acctggacta catggacagc 1320 agacgggact tcaccttcaa caaggacggc ttcagagact tccccgccat ggtgcaagag 1380 ctgcatcaag gcggacggcg gtacatgatg attgtggacc ctgccatcag cagctctgga 1440 ccagccggca gctacagacc ttacgatgag ggactgagaa gaggcgtgtt catcaccaac 1500 gagacaggcc agcctctgat cggcaaagtg tggcctggca gcacagcctt tccagacttc 1560 acaaacccca ccgctctggc ttggtgggaa gatatggtgg ccgagttcca cgatcaggtg 1620 cccttcgatg gcatgtggat cgacatgaac gagcccagca acttcatccg gggcagcgag 1680 gatggctgcc ccaacaacga actagaaaat cctccttacg tgcccggcgt tgtcggcgga 1740 acacttcagg ccgctacaat ctgtgccagc agccatcagt ttctgagcac ccactacaac 1800 ctgcacaacc tgtacggcct gaccgaggcc attgcctctc atagagccct ggttaaggcc 1860 agaggcaccc ggccttttgt gatcagcaga agcacattcg ccggccacgg cagatacgca 1920 ggacattgga caggcgacgt gtggtctagt tgggagcagc tggctagcag cgtgccagag 1980 atcctgcagt tcaatctgct gggcgtgcca ctcgtgggag ccgacgtttg tggcttcctg 2040 ggcaacacca gcgaggaact gtgtgtgcgt tggacacagc tgggcgcctt ctatcccttc 2100 atgagaaacc acaacagcct gctgagcctg cctcaagagc cctacagctt tagcgagcct 2160 gcacagcagg ccatgagaaa ggccctgact ctgagatacg ccctgctgcc tcacctgtac 2220 accctgtttc atcaggccca cgtggcaggc gagacagtgg ctagacctct gttcctggaa 2280 tttcccaagg acagctccac ctggaccgtg gatcatcagc tgctgtgggg agaagccctg 2340 ctgattacac cagtgctgca ggccggaaag gccgaagtga caggctattt ccctctcggc 2400 acttggtacg acctgcagac cgtgcctatc gaggctctgg gatctcttcc tccacctcct 2460 gccgctccta gagagcctgc cattcactct gaaggccagt gggttaccct gcctgctcct 2520 ctggacacca tcaacgtgca cctgagagcc ggctacatca tccctctgca aggccctggc 2580 ctgaccacaa ccgaatctag acagcagccc atggcactgg ccgtggctct tacaaaaggc 2640 ggagaggcta gaggcgagct gttctgggat gatggcgaga gcctagaagt gctggaacgg 2700 ggcgcttata cccaagtgat cttcctggcc agaaacaaca ccatcgtgaa cgaactcgtg 2760 cgcgtgacca gtgaaggtgc tggactgcaa ctgcagaaag tgaccgtgct cggagtggcc 2820 acagctcctc agcaggttct gtctaatggc gtgcccgtgt ccaacttcac atacagcccc 2880 gacaccaagg tcctggacat ctgtgtgtcc ctgcttatgg gcgagcagtt cctggtgtcc 2940 tggtgctgat aa 2952 <210> 8 <211> 934 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> CAG promoter <220> <221> misc_feature <222> (1)..(243) <223> CMV early enhancer element <220> <221> misc_feature <222> (244)..(525) <223> Chicken Beta actin promoter <220> <221> misc_feature <222> (526)..(934) <223> hybrid intron in CAG (b-actin intron and rabbit beta 1-globin <220> <221> misc_feature <222> (526)..(934) <223> hybrid intron <400> 8 attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 60 tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 120 gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 180 gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 240 taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 300 acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 360 gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 420 gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 480 gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgcg 540 ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 600 gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 660 gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttgaggggct 720 ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggctg tccgcggggg gacggctgcc 780 ttcggggggg acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag 840 cctctgctaa ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg 900 ttattgtgct gtctcatcat tttggcaaag aatt 934 <210> 9 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Rabbit globin polyA <400> 9 gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60 tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120 tcactcg 127 <210> 10 <211> 188 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 10 gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacgt agccatgctc 180 taggaaga 188 <210> 11 <211> 188 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 11 tcttcctaga gcatggctac gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg 60 aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 120 ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag 180 cgcgcagc 188 <210> 12 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered hGAAV780I signal peptide <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(81) <220> <221> CDS <222> (1)..(81) <400> 12 atg ggc gtt aga cac cct cct tgc tct cac aga ctg ctg gcc gtg tgt 48 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 gct ctg gtg tct ctg gct aca gct gcc ctg ctg 81 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu 20 25 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu 20 25 <210> 14 <211> 2649 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered hGAAV780I mature protein <220> <221> CDS <222> (1)..(2649) <400> 14 gcc cat cct ggc aga cct aga gct gtg ccc aca cag tgt gac gtg cca 48 Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro 1 5 10 15 cct aac agc aga ttc gac tgc gcc cct gac aag gcc atc aca caa gag 96 Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu 20 25 30 cag tgt gaa gcc aga ggc tgc tgc tac atc cct gcc aaa caa gga ctg 144 Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu 35 40 45 cag ggc gct cag atg gga cag ccc tgg tgc ttc ttc cca cca tct tac 192 Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr 50 55 60 ccc agc tac aag ctg gaa aac ctg agc agc agc gag atg ggc tac acc 240 Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr 65 70 75 80 gcc aca ctg acc aga acc aca cct aca ttc ttc ccg aag gac atc ctg 288 Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu 85 90 95 aca ctg cgg ctg gac gtg atg atg gaa acc gag aac cgg ctg cac ttc 336 Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe 100 105 110 acc atc aag gac ccc gcc aat cgg aga tac gag gtg cca ctg gaa acc 384 Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr 115 120 125 cct cac gtg cac tct aga gcc cca tct cca ctg tac agc gtg gaa ttt 432 Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe 130 135 140 tcc gag gaa ccc ttc ggc gtg atc gtg cgg aga cag ctg gat gga aga 480 Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg 145 150 155 160 gtg ctg ctg aac acc aca gtg gcc cct ctg ttc ttc gcc gac cag ttt 528 Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe 165 170 175 ctg cag ctg agc acc agc ctg cct agc cag tat atc aca ggc ctg gcc 576 Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala 180 185 190 gag cac ctg tct cca ctg atg ctg agc aca tcc tgg acc aga atc acc 624 Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr 195 200 205 ctg tgg aac aga gat ctg gcc cct aca cct ggc gcc aac ctg tac ggc 672 Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly 210 215 220 tct cac ccc ttt tat ctg gcc ctg gaa gac ggc gga tct gcc cac ggt 720 Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly 225 230 235 240 gtt ttt ctg ctg aac tcc aac gcc atg gac gtg gtg ctg cag cca tct 768 Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser 245 250 255 cct gct ctg tct tgg aga agc aca ggc ggc atc ctg gac gtg tac atc 816 Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile 260 265 270 ttt ctg ggc ccc gag cct aag agc gtg gtg cag cag tat ctg gac gtc 864 Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val 275 280 285 gtg ggc tac ccc ttc atg cct cct tat tgg ggc ctg ggc ttc cac ctg 912 Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu 290 295 300 tgc agg tgg gga tac agc agc acc gcc atc acc aga cag gtg gtg gaa 960 Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu 305 310 315 320 aac atg acc cgg gct cac ttc cca ctg gac gtg cag tgg aac gac ctg 1008 Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu 325 330 335 gac tac atg gac agc aga cgg gac ttc acc ttc aac aag gac ggc ttc 1056 Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe 340 345 350 aga gac ttc ccc gcc atg gtg caa gaa ctg cac caa ggc ggc aga cgg 1104 Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg 355 360 365 tac atg atg att gtg gac cca gcc atc agc tct agc ggc cct gcc gga 1152 Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly 370 375 380 agc tac aga cct tac gat gag ggc ctg aga aga ggc gtg ttc atc acc 1200 Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr 385 390 395 400 aac gag aca ggc cag cct ctg atc ggc aaa gtg tgg cct ggc agc aca 1248 Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr 405 410 415 gcc ttt cca gac ttc aca aac ccc acc gct ctg gct tgg tgg gaa gat 1296 Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp 420 425 430 atg gtg gcc gag ttc cac gat cag gtg ccc ttc gat ggc atg tgg atc 1344 Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile 435 440 445 gac atg aac gag ccc agc aac ttc atc cgg ggc agc gag gac ggc tgc 1392 Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys 450 455 460 ccc aac aac gaa ctg gaa aat cct cct tac gtg ccc ggc gtt gtc ggc 1440 Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly 465 470 475 480 gga aca ctt cag gcc gct aca atc tgt gcc agc agc cac cag ttc ctc 1488 Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu 485 490 495 agc acc cac tac aac ctg cac aac ctg tac ggc ctg acc gag gcc att 1536 Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile 500 505 510 gcc tct cat aga gcc ctg gtt aag gcc aga ggc acc cgg cct ttt gtg 1584 Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val 515 520 525 atc agc aga agc aca ttc gcc ggc cac ggc aga tac gcc gga cat tgg 1632 Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp 530 535 540 aca ggc gac gtg tgg tct agt tgg gag cag ctg gct agc agc gtg cca 1680 Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro 545 550 555 560 gag atc ctg cag ttc aat ctg ctg ggc gtg cca ctc gtg gga gcc gac 1728 Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp 565 570 575 gtt tgt ggc ttc ctg ggc aac acc agc gag gaa ctg tgt gtg cgt tgg 1776 Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp 580 585 590 aca cag ctg ggc gcc ttc tat ccc ttc atg aga aac cac aac agc ctg 1824 Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu 595 600 605 ctg agc ctg cct caa gag ccc tac agc ttt agc gag cct gca cag cag 1872 Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln 610 615 620 gcc atg aga aag gcc ctg act ctg aga tac gct ctg ctg ccc cac ctg 1920 Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu 625 630 635 640 tac acc ctg ttt cac cag gct cac gtg gcc ggg gag aca gtg gct aga 1968 Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg 645 650 655 cct ctg ttc ctg gaa ttt ccc aag gac agc tcc acc tgg acc gtg gat 2016 Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp 660 665 670 cat cag ctg ctg tgg gga gaa gcc ctg ctc atc aca cct gtt ctg cag 2064 His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln 675 680 685 gcc gga aag gcc gaa gtg acc ggc tat ttt cct ctc ggc act tgg tac 2112 Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr 690 695 700 gac ctg cag acc gtg cct att gag gcc ctg gga tct ctt cct cca cct 2160 Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro 705 710 715 720 cct gct gct cct aga gag cct gcc atc cac tct gaa ggc cag tgg gtt 2208 Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val 725 730 735 aca ctg ccc gct cct ctg gac acc atc aac gtg cac ctg aga gct ggc 2256 Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly 740 745 750 tac atc atc cca ctg caa ggc cct ggc ctg acc aca acc gaa tct aga 2304 Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg 755 760 765 cag cag ccc atg gct ctg gcc gtg gct ctt aca aaa ggc gga gag gct 2352 Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala 770 775 780 aga ggc gag ctg ttc tgg gac gac ggc gag tct ctg gaa gtg ctg gaa 2400 Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu 785 790 795 800 cgg ggc gct tat acc caa gtg atc ttc ctg gcc aga aac aac acc atc 2448 Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile 805 810 815 gtg aac gaa ctc gtg cgc gtg acc agt gaa ggt gct gga ctg caa ctg 2496 Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu 820 825 830 cag aaa gtg acc gtg ctc gga gtg gcc aca gct cct caa cag gtg ctg 2544 Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu 835 840 845 tct aac ggc gtg ccc gtg tcc aac ttc aca tac agc ccc gac acc aag 2592 Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys 850 855 860 gtc ctg gac atc tgt gtg tca ctg ctg atg ggc gag cag ttc ctg gtg 2640 Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val 865 870 875 880 tcc tgg tgc 2649 Ser Trp Cys <210> 15 <211> 883 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro 1 5 10 15 Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu 20 25 30 Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu 35 40 45 Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr 50 55 60 Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr 65 70 75 80 Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu 85 90 95 Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe 100 105 110 Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr 115 120 125 Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe 130 135 140 Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg 145 150 155 160 Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe 165 170 175 Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala 180 185 190 Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr 195 200 205 Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly 210 215 220 Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly 225 230 235 240 Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser 245 250 255 Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile 260 265 270 Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val 275 280 285 Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu 290 295 300 Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu 305 310 315 320 Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu 325 330 335 Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe 340 345 350 Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg 355 360 365 Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly 370 375 380 Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr 385 390 395 400 Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr 405 410 415 Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp 420 425 430 Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile 435 440 445 Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys 450 455 460 Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly 465 470 475 480 Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu 485 490 495 Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile 500 505 510 Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val 515 520 525 Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp 530 535 540 Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro 545 550 555 560 Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp 565 570 575 Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp 580 585 590 Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu 595 600 605 Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln 610 615 620 Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu 625 630 635 640 Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg 645 650 655 Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp 660 665 670 His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln 675 680 685 Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr 690 695 700 Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro 705 710 715 720 Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val 725 730 735 Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly 740 745 750 Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg 755 760 765 Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala 770 775 780 Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu 785 790 795 800 Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile 805 810 815 Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu 820 825 830 Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu 835 840 845 Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys 850 855 860 Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val 865 870 875 880 Ser Trp Cys <210> 16 <211> 2304 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered DNA for hGAA780I 123-890 <220> <221> CDS <222> (1)..(2304) <400> 16 gga cag ccc tgg tgc ttc ttc cca cca tct tac ccc agc tac aag ctg 48 Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu 1 5 10 15 gaa aac ctg agc agc agc gag atg ggc tac acc gcc aca ctg acc aga 96 Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg 20 25 30 acc aca cct aca ttc ttc ccg aag gac atc ctg aca ctg cgg ctg gac 144 Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp 35 40 45 gtg atg atg gaa acc gag aac cgg ctg cac ttc acc atc aag gac ccc 192 Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro 50 55 60 gcc aat cgg aga tac gag gtg cca ctg gaa acc cct cac gtg cac tct 240 Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser 65 70 75 80 aga gcc cca tct cca ctg tac agc gtg gaa ttt tcc gag gaa ccc ttc 288 Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe 85 90 95 ggc gtg atc gtg cgg aga cag ctg gat gga aga gtg ctg ctg aac acc 336 Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr 100 105 110 aca gtg gcc cct ctg ttc ttc gcc gac cag ttt ctg cag ctg agc acc 384 Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr 115 120 125 agc ctg cct agc cag tat atc aca ggc ctg gcc gag cac ctg tct cca 432 Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro 130 135 140 ctg atg ctg agc aca tcc tgg acc aga atc acc ctg tgg aac aga gat 480 Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp 145 150 155 160 ctg gcc cct aca cct ggc gcc aac ctg tac ggc tct cac ccc ttt tat 528 Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr 165 170 175 ctg gcc ctg gaa gac ggc gga tct gcc cac ggt gtt ttt ctg ctg aac 576 Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn 180 185 190 tcc aac gcc atg gac gtg gtg ctg cag cca tct cct gct ctg tct tgg 624 Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp 195 200 205 aga agc aca ggc ggc atc ctg gac gtg tac atc ttt ctg ggc ccc gag 672 Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu 210 215 220 cct aag agc gtg gtg cag cag tat ctg gac gtc gtg ggc tac ccc ttc 720 Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe 225 230 235 240 atg cct cct tat tgg ggc ctg ggc ttc cac ctg tgc agg tgg gga tac 768 Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr 245 250 255 agc agc acc gcc atc acc aga cag gtg gtg gaa aac atg acc cgg gct 816 Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala 260 265 270 cac ttc cca ctg gac gtg cag tgg aac gac ctg gac tac atg gac agc 864 His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser 275 280 285 aga cgg gac ttc acc ttc aac aag gac ggc ttc aga gac ttc ccc gcc 912 Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala 290 295 300 atg gtg caa gaa ctg cac caa ggc ggc aga cgg tac atg atg att gtg 960 Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val 305 310 315 320 gac cca gcc atc agc tct agc ggc cct gcc gga agc tac aga cct tac 1008 Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr 325 330 335 gat gag ggc ctg aga aga ggc gtg ttc atc acc aac gag aca ggc cag 1056 Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln 340 345 350 cct ctg atc ggc aaa gtg tgg cct ggc agc aca gcc ttt cca gac ttc 1104 Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe 355 360 365 aca aac ccc acc gct ctg gct tgg tgg gaa gat atg gtg gcc gag ttc 1152 Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe 370 375 380 cac gat cag gtg ccc ttc gat ggc atg tgg atc gac atg aac gag ccc 1200 His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro 385 390 395 400 agc aac ttc atc cgg ggc agc gag gac ggc tgc ccc aac aac gaa ctg 1248 Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu 405 410 415 gaa aat cct cct tac gtg ccc ggc gtt gtc ggc gga aca ctt cag gcc 1296 Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala 420 425 430 gct aca atc tgt gcc agc agc cac cag ttc ctc agc acc cac tac aac 1344 Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn 435 440 445 ctg cac aac ctg tac ggc ctg acc gag gcc att gcc tct cat aga gcc 1392 Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala 450 455 460 ctg gtt aag gcc aga ggc acc cgg cct ttt gtg atc agc aga agc aca 1440 Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr 465 470 475 480 ttc gcc ggc cac ggc aga tac gcc gga cat tgg aca ggc gac gtg tgg 1488 Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp 485 490 495 tct agt tgg gag cag ctg gct agc agc gtg cca gag atc ctg cag ttc 1536 Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe 500 505 510 aat ctg ctg ggc gtg cca ctc gtg gga gcc gac gtt tgt ggc ttc ctg 1584 Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu 515 520 525 ggc aac acc agc gag gaa ctg tgt gtg cgt tgg aca cag ctg ggc gcc 1632 Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala 530 535 540 ttc tat ccc ttc atg aga aac cac aac agc ctg ctg agc ctg cct caa 1680 Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln 545 550 555 560 gag ccc tac agc ttt agc gag cct gca cag cag gcc atg aga aag gcc 1728 Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala 565 570 575 ctg act ctg aga tac gct ctg ctg ccc cac ctg tac acc ctg ttt cac 1776 Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His 580 585 590 cag gct cac gtg gcc ggg gag aca gtg gct aga cct ctg ttc ctg gaa 1824 Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu 595 600 605 ttt ccc aag gac agc tcc acc tgg acc gtg gat cat cag ctg ctg tgg 1872 Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp 610 615 620 gga gaa gcc ctg ctc atc aca cct gtt ctg cag gcc gga aag gcc gaa 1920 Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu 625 630 635 640 gtg acc ggc tat ttt cct ctc ggc act tgg tac gac ctg cag acc gtg 1968 Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val 645 650 655 cct att gag gcc ctg gga tct ctt cct cca cct cct gct gct cct aga 2016 Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg 660 665 670 gag cct gcc atc cac tct gaa ggc cag tgg gtt aca ctg ccc gct cct 2064 Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro 675 680 685 ctg gac acc atc aac gtg cac ctg aga gct ggc tac atc atc cca ctg 2112 Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu 690 695 700 caa ggc cct ggc ctg acc aca acc gaa tct aga cag cag ccc atg gct 2160 Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala 705 710 715 720 ctg gcc gtg gct ctt aca aaa ggc gga gag gct aga ggc gag ctg ttc 2208 Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe 725 730 735 tgg gac gac ggc gag tct ctg gaa gtg ctg gaa cgg ggc gct tat acc 2256 Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr 740 745 750 caa gtg atc ttc ctg gcc aga aac aac acc atc gtg aac gaa ctc gtg 2304 Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val 755 760 765 <210> 17 <211> 768 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu 1 5 10 15 Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg 20 25 30 Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp 35 40 45 Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro 50 55 60 Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser 65 70 75 80 Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe 85 90 95 Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr 100 105 110 Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr 115 120 125 Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro 130 135 140 Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp 145 150 155 160 Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr 165 170 175 Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn 180 185 190 Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp 195 200 205 Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe 225 230 235 240 Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr 245 250 255 Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala 260 265 270 His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser 275 280 285 Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala 290 295 300 Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val 305 310 315 320 Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr 325 330 335 Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln 340 345 350 Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe 355 360 365 Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe 370 375 380 His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro 385 390 395 400 Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu 405 410 415 Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala 420 425 430 Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn 435 440 445 Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala 450 455 460 Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr 465 470 475 480 Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp 485 490 495 Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe 500 505 510 Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu 515 520 525 Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala 530 535 540 Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln 545 550 555 560 Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala 565 570 575 Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His 580 585 590 Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu 595 600 605 Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp 610 615 620 Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu 625 630 635 640 Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val 645 650 655 Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg 660 665 670 Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro 675 680 685 Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu 690 695 700 Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala 705 710 715 720 Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe 725 730 735 Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr 740 745 750 Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val 755 760 765 <210> 18 <211> 2247 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Engineered hGAA 70kD cDNA <220> <221> CDS <222> (1)..(2247) <400> 18 gcc cca tct cca ctg tac agc gtg gaa ttt tcc gag gaa ccc ttc ggc 48 Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly 1 5 10 15 gtg atc gtg cgg aga cag ctg gat gga aga gtg ctg ctg aac acc aca 96 Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr 20 25 30 gtg gcc cct ctg ttc ttc gcc gac cag ttt ctg cag ctg agc acc agc 144 Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser 35 40 45 ctg cct agc cag tat atc aca ggc ctg gcc gag cac ctg tct cca ctg 192 Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu 50 55 60 atg ctg agc aca tcc tgg acc aga atc acc ctg tgg aac aga gat ctg 240 Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu 65 70 75 80 gcc cct aca cct ggc gcc aac ctg tac ggc tct cac ccc ttt tat ctg 288 Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu 85 90 95 gcc ctg gaa gac ggc gga tct gcc cac ggt gtt ttt ctg ctg aac tcc 336 Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser 100 105 110 aac gcc atg gac gtg gtg ctg cag cca tct cct gct ctg tct tgg aga 384 Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg 115 120 125 agc aca ggc ggc atc ctg gac gtg tac atc ttt ctg ggc ccc gag cct 432 Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro 130 135 140 aag agc gtg gtg cag cag tat ctg gac gtc gtg ggc tac ccc ttc atg 480 Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met 145 150 155 160 cct cct tat tgg ggc ctg ggc ttc cac ctg tgc agg tgg gga tac agc 528 Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser 165 170 175 agc acc gcc atc acc aga cag gtg gtg gaa aac atg acc cgg gct cac 576 Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His 180 185 190 ttc cca ctg gac gtg cag tgg aac gac ctg gac tac atg gac agc aga 624 Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg 195 200 205 cgg gac ttc acc ttc aac aag gac ggc ttc aga gac ttc ccc gcc atg 672 Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met 210 215 220 gtg caa gaa ctg cac caa ggc ggc aga cgg tac atg atg att gtg gac 720 Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp 225 230 235 240 cca gcc atc agc tct agc ggc cct gcc gga agc tac aga cct tac gat 768 Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp 245 250 255 gag ggc ctg aga aga ggc gtg ttc atc acc aac gag aca ggc cag cct 816 Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro 260 265 270 ctg atc ggc aaa gtg tgg cct ggc agc aca gcc ttt cca gac ttc aca 864 Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr 275 280 285 aac ccc acc gct ctg gct tgg tgg gaa gat atg gtg gcc gag ttc cac 912 Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His 290 295 300 gat cag gtg ccc ttc gat ggc atg tgg atc gac atg aac gag ccc agc 960 Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser 305 310 315 320 aac ttc atc cgg ggc agc gag gac ggc tgc ccc aac aac gaa ctg gaa 1008 Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu 325 330 335 aat cct cct tac gtg ccc ggc gtt gtc ggc gga aca ctt cag gcc gct 1056 Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala 340 345 350 aca atc tgt gcc agc agc cac cag ttc ctc agc acc cac tac aac ctg 1104 Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu 355 360 365 cac aac ctg tac ggc ctg acc gag gcc att gcc tct cat aga gcc ctg 1152 His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu 370 375 380 gtt aag gcc aga ggc acc cgg cct ttt gtg atc agc aga agc aca ttc 1200 Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe 385 390 395 400 gcc ggc cac ggc aga tac gcc gga cat tgg aca ggc gac gtg tgg tct 1248 Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser 405 410 415 agt tgg gag cag ctg gct agc agc gtg cca gag atc ctg cag ttc aat 1296 Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn 420 425 430 ctg ctg ggc gtg cca ctc gtg gga gcc gac gtt tgt ggc ttc ctg ggc 1344 Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly 435 440 445 aac acc agc gag gaa ctg tgt gtg cgt tgg aca cag ctg ggc gcc ttc 1392 Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe 450 455 460 tat ccc ttc atg aga aac cac aac agc ctg ctg agc ctg cct caa gag 1440 Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu 465 470 475 480 ccc tac agc ttt agc gag cct gca cag cag gcc atg aga aag gcc ctg 1488 Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu 485 490 495 act ctg aga tac gct ctg ctg ccc cac ctg tac acc ctg ttt cac cag 1536 Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln 500 505 510 gct cac gtg gcc ggg gag aca gtg gct aga cct ctg ttc ctg gaa ttt 1584 Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe 515 520 525 ccc aag gac agc tcc acc tgg acc gtg gat cat cag ctg ctg tgg gga 1632 Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly 530 535 540 gaa gcc ctg ctc atc aca cct gtt ctg cag gcc gga aag gcc gaa gtg 1680 Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val 545 550 555 560 acc ggc tat ttt cct ctc ggc act tgg tac gac ctg cag acc gtg cct 1728 Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro 565 570 575 att gag gcc ctg gga tct ctt cct cca cct cct gct gct cct aga gag 1776 Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu 580 585 590 cct gcc atc cac tct gaa ggc cag tgg gtt aca ctg ccc gct cct ctg 1824 Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu 595 600 605 gac acc atc aac gtg cac ctg aga gct ggc tac atc atc cca ctg caa 1872 Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln 610 615 620 ggc cct ggc ctg acc aca acc gaa tct aga cag cag ccc atg gct ctg 1920 Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu 625 630 635 640 gcc gtg gct ctt aca aaa ggc gga gag gct aga ggc gag ctg ttc tgg 1968 Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp 645 650 655 gac gac ggc gag tct ctg gaa gtg ctg gaa cgg ggc gct tat acc caa 2016 Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln 660 665 670 gtg atc ttc ctg gcc aga aac aac acc atc gtg aac gaa ctc gtg cgc 2064 Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg 675 680 685 gtg acc agt gaa ggt gct gga ctg caa ctg cag aaa gtg acc gtg ctc 2112 Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu 690 695 700 gga gtg gcc aca gct cct caa cag gtg ctg tct aac ggc gtg ccc gtg 2160 Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val 705 710 715 720 tcc aac ttc aca tac agc ccc gac acc aag gtc ctg gac atc tgt gtg 2208 Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val 725 730 735 tca ctg ctg atg ggc gag cag ttc ctg gtg tcc tgg tgc 2247 Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 740 745 <210> 19 <211> 749 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly 1 5 10 15 Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr 20 25 30 Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser 35 40 45 Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu 50 55 60 Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu 65 70 75 80 Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu 85 90 95 Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser 100 105 110 Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg 115 120 125 Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro 130 135 140 Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met 145 150 155 160 Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser 165 170 175 Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His 180 185 190 Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg 195 200 205 Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met 210 215 220 Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp 225 230 235 240 Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp 245 250 255 Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro 260 265 270 Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr 275 280 285 Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His 290 295 300 Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser 305 310 315 320 Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu 325 330 335 Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala 340 345 350 Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu 355 360 365 His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu 370 375 380 Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe 385 390 395 400 Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser 405 410 415 Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn 420 425 430 Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly 435 440 445 Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe 450 455 460 Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu 465 470 475 480 Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu 485 490 495 Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln 500 505 510 Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe 515 520 525 Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly 530 535 540 Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val 545 550 555 560 Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro 565 570 575 Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu 580 585 590 Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu 595 600 605 Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln 610 615 620 Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu 625 630 635 640 Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp 645 650 655 Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln 660 665 670 Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg 675 680 685 Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu 690 695 700 Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val 705 710 715 720 Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val 725 730 735 Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 740 745 <210> 20 <211> 2490 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered DNA for hGAAV780I 76 kD protein <220> <221> CDS <222> (1)..(2490) <400> 20 gga cag ccc tgg tgc ttc ttc cca cca tct tac ccc agc tac aag ctg 48 Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu 1 5 10 15 gaa aac ctg agc agc agc gag atg ggc tac acc gcc aca ctg acc aga 96 Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg 20 25 30 acc aca cct aca ttc ttc ccg aag gac atc ctg aca ctg cgg ctg gac 144 Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp 35 40 45 gtg atg atg gaa acc gag aac cgg ctg cac ttc acc atc aag gac ccc 192 Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro 50 55 60 gcc aat cgg aga tac gag gtg cca ctg gaa acc cct cac gtg cac tct 240 Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser 65 70 75 80 aga gcc cca tct cca ctg tac agc gtg gaa ttt tcc gag gaa ccc ttc 288 Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe 85 90 95 ggc gtg atc gtg cgg aga cag ctg gat gga aga gtg ctg ctg aac acc 336 Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr 100 105 110 aca gtg gcc cct ctg ttc ttc gcc gac cag ttt ctg cag ctg agc acc 384 Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr 115 120 125 agc ctg cct agc cag tat atc aca ggc ctg gcc gag cac ctg tct cca 432 Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro 130 135 140 ctg atg ctg agc aca tcc tgg acc aga atc acc ctg tgg aac aga gat 480 Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp 145 150 155 160 ctg gcc cct aca cct ggc gcc aac ctg tac ggc tct cac ccc ttt tat 528 Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr 165 170 175 ctg gcc ctg gaa gac ggc gga tct gcc cac ggt gtt ttt ctg ctg aac 576 Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn 180 185 190 tcc aac gcc atg gac gtg gtg ctg cag cca tct cct gct ctg tct tgg 624 Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp 195 200 205 aga agc aca ggc ggc atc ctg gac gtg tac atc ttt ctg ggc ccc gag 672 Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu 210 215 220 cct aag agc gtg gtg cag cag tat ctg gac gtc gtg ggc tac ccc ttc 720 Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe 225 230 235 240 atg cct cct tat tgg ggc ctg ggc ttc cac ctg tgc agg tgg gga tac 768 Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr 245 250 255 agc agc acc gcc atc acc aga cag gtg gtg gaa aac atg acc cgg gct 816 Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala 260 265 270 cac ttc cca ctg gac gtg cag tgg aac gac ctg gac tac atg gac agc 864 His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser 275 280 285 aga cgg gac ttc acc ttc aac aag gac ggc ttc aga gac ttc ccc gcc 912 Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala 290 295 300 atg gtg caa gaa ctg cac caa ggc ggc aga cgg tac atg atg att gtg 960 Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val 305 310 315 320 gac cca gcc atc agc tct agc ggc cct gcc gga agc tac aga cct tac 1008 Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr 325 330 335 gat gag ggc ctg aga aga ggc gtg ttc atc acc aac gag aca ggc cag 1056 Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln 340 345 350 cct ctg atc ggc aaa gtg tgg cct ggc agc aca gcc ttt cca gac ttc 1104 Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe 355 360 365 aca aac ccc acc gct ctg gct tgg tgg gaa gat atg gtg gcc gag ttc 1152 Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe 370 375 380 cac gat cag gtg ccc ttc gat ggc atg tgg atc gac atg aac gag ccc 1200 His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro 385 390 395 400 agc aac ttc atc cgg ggc agc gag gac ggc tgc ccc aac aac gaa ctg 1248 Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu 405 410 415 gaa aat cct cct tac gtg ccc ggc gtt gtc ggc gga aca ctt cag gcc 1296 Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala 420 425 430 gct aca atc tgt gcc agc agc cac cag ttc ctc agc acc cac tac aac 1344 Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn 435 440 445 ctg cac aac ctg tac ggc ctg acc gag gcc att gcc tct cat aga gcc 1392 Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala 450 455 460 ctg gtt aag gcc aga ggc acc cgg cct ttt gtg atc agc aga agc aca 1440 Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr 465 470 475 480 ttc gcc ggc cac ggc aga tac gcc gga cat tgg aca ggc gac gtg tgg 1488 Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp 485 490 495 tct agt tgg gag cag ctg gct agc agc gtg cca gag atc ctg cag ttc 1536 Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe 500 505 510 aat ctg ctg ggc gtg cca ctc gtg gga gcc gac gtt tgt ggc ttc ctg 1584 Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu 515 520 525 ggc aac acc agc gag gaa ctg tgt gtg cgt tgg aca cag ctg ggc gcc 1632 Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala 530 535 540 ttc tat ccc ttc atg aga aac cac aac agc ctg ctg agc ctg cct caa 1680 Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln 545 550 555 560 gag ccc tac agc ttt agc gag cct gca cag cag gcc atg aga aag gcc 1728 Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala 565 570 575 ctg act ctg aga tac gct ctg ctg ccc cac ctg tac acc ctg ttt cac 1776 Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His 580 585 590 cag gct cac gtg gcc ggg gag aca gtg gct aga cct ctg ttc ctg gaa 1824 Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu 595 600 605 ttt ccc aag gac agc tcc acc tgg acc gtg gat cat cag ctg ctg tgg 1872 Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp 610 615 620 gga gaa gcc ctg ctc atc aca cct gtt ctg cag gcc gga aag gcc gaa 1920 Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu 625 630 635 640 gtg acc ggc tat ttt cct ctc ggc act tgg tac gac ctg cag acc gtg 1968 Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val 645 650 655 cct att gag gcc ctg gga tct ctt cct cca cct cct gct gct cct aga 2016 Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg 660 665 670 gag cct gcc atc cac tct gaa ggc cag tgg gtt aca ctg ccc gct cct 2064 Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro 675 680 685 ctg gac acc atc aac gtg cac ctg aga gct ggc tac atc atc cca ctg 2112 Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu 690 695 700 caa ggc cct ggc ctg acc aca acc gaa tct aga cag cag ccc atg gct 2160 Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala 705 710 715 720 ctg gcc gtg gct ctt aca aaa ggc gga gag gct aga ggc gag ctg ttc 2208 Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe 725 730 735 tgg gac gac ggc gag tct ctg gaa gtg ctg gaa cgg ggc gct tat acc 2256 Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr 740 745 750 caa gtg atc ttc ctg gcc aga aac aac acc atc gtg aac gaa ctc gtg 2304 Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val 755 760 765 cgc gtg acc agt gaa ggt gct gga ctg caa ctg cag aaa gtg acc gtg 2352 Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val 770 775 780 ctc gga gtg gcc aca gct cct caa cag gtg ctg tct aac ggc gtg ccc 2400 Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro 785 790 795 800 gtg tcc aac ttc aca tac agc ccc gac acc aag gtc ctg gac atc tgt 2448 Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys 805 810 815 gtg tca ctg ctg atg ggc gag cag ttc ctg gtg tcc tgg tgc 2490 Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 820 825 830 <210> 21 <211> 830 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu 1 5 10 15 Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg 20 25 30 Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp 35 40 45 Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro 50 55 60 Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser 65 70 75 80 Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe 85 90 95 Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr 100 105 110 Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr 115 120 125 Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro 130 135 140 Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp 145 150 155 160 Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr 165 170 175 Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn 180 185 190 Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp 195 200 205 Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe 225 230 235 240 Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr 245 250 255 Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala 260 265 270 His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser 275 280 285 Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala 290 295 300 Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val 305 310 315 320 Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr 325 330 335 Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln 340 345 350 Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe 355 360 365 Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe 370 375 380 His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro 385 390 395 400 Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu 405 410 415 Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala 420 425 430 Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn 435 440 445 Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala 450 455 460 Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr 465 470 475 480 Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp 485 490 495 Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe 500 505 510 Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu 515 520 525 Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala 530 535 540 Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln 545 550 555 560 Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala 565 570 575 Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His 580 585 590 Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu 595 600 605 Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp 610 615 620 Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu 625 630 635 640 Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val 645 650 655 Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg 660 665 670 Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro 675 680 685 Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu 690 695 700 Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala 705 710 715 720 Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe 725 730 735 Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr 740 745 750 Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val 755 760 765 Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val 770 775 780 Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro 785 790 795 800 Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys 805 810 815 Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 820 825 830 <210> 22 <211> 2952 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> CDS <222> (1)..(2952) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(270) <223> BiP signal peptide + vIGF2 + 2GS extension <220> <221> misc_feature <222> (271)..(2952) <223> engineered DNA for hGAA 61 - 952 780I <220> <221> misc_feature <222> (2428)..(2430) <223> Ile codon <400> 22 atg aag ctg tct ctg gtg gct gct atg ctg ctg ctc ctg tct gcc gcc 48 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 aga gcc agc aga aca ctt tgt ggc gga gag ctg gtg gac acc ctg cag 96 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 ttt gtg tgt ggc gac aga ggc ttc ctg ttc agc aga cct gcc agc cgg 144 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 gtt tcc aga cgg tct aga gga atc gtg gaa gag tgc tgc ttc aga agc 192 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 tgc gat ctg gcc ctg ctg gaa acc tac tgt gcc aca cca gcc aga tct 240 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 gaa ggc ggc gga gga tct ggc gga ggc gga tct aga cct gga cct aga 288 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 gac gcc cag gct cac cct ggt aga cct aga gct gtg cct aca cag tgc 336 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 gac gtg cca cct aac agc aga ttc gac tgc gcc cct gac aag gcc atc 384 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 aca caa gag cag tgt gaa gcc aga ggc tgc tgc tac atc cct gcc aaa 432 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 caa gga ctg cag ggc gcc cag atg gga cag cct tgg tgc ttc ttc cca 480 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 cca tct tac ccc agc tac aag ctg gaa aac ctg agc agc tcc gag atg 528 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 ggc tac acc gcc aca ctg acc aga acc aca cct aca ttc ttc ccg aag 576 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 gac atc ctg aca ctg cgg ctg gac gtg atg atg gaa acc gag aac cgg 624 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 ctg cac ttc acc atc aag gac ccc gcc aat cgg aga tac gag gtg ccc 672 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 ctg gaa aca ccc cac gtg cac tct aga gca ccc tct cca ctg tac agc 720 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 gtg gaa ttt tcc gag gaa ccc ttc ggc gtg atc gtg cgg aga cag ctg 768 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 gat ggc aga gtg ctc ctg aat acc aca gtg gcc cct ctg ttc ttc gcc 816 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 gac cag ttt ctg cag ctg agc acc agc ctg cct agc cag tat atc aca 864 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 ggc ctg gcc gag cat ctg agc cct ctg atg ctg agc aca tcc tgg acc 912 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 aga atc acc ctg tgg aac cgc gac ctg gct cct aca cct ggc gcc aat 960 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 ctg tac ggc tct cac ccc ttc tac ctg gca ctg gaa gac ggt gga tct 1008 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 gcc cac ggt gtc ttt ctg ctg aat agc aac gcc atg gac gtg gtg ctg 1056 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 cag ccc tct cct gca ctg tct tgg aga tct aca ggc ggc atc ctg gac 1104 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 gtg tac atc ttt ctg ggc ccc gag cct aag agc gtg gtg cag cag tat 1152 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 ctg gac gtc gtg ggc tac ccc ttc atg cct cct tat tgg ggc ctg ggc 1200 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 ttc cac ctg tgt agg tgg ggc tac agc agc acc gcc atc acc aga cag 1248 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 gtg gtg gaa aac atg acc cgg gct cac ttc cca ctg gac gtg cag tgg 1296 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 aac gac ctg gac tac atg gac agc aga cgg gac ttc acc ttc aac aag 1344 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 gac ggc ttc aga gac ttc ccc gcc atg gtg caa gag ctg cat caa ggc 1392 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 gga cgg cgg tac atg atg att gtg gac cct gcc atc agc agc tct gga 1440 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 cca gcc ggc agc tac aga cct tac gat gag gga ctg aga aga ggc gtg 1488 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 ttc atc acc aac gag aca ggc cag cct ctg atc ggc aaa gtg tgg cct 1536 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 ggc agc aca gcc ttt cca gac ttc aca aac ccc acc gct ctg gct tgg 1584 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 tgg gaa gat atg gtg gcc gag ttc cac gat cag gtg ccc ttc gat ggc 1632 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 atg tgg atc gac atg aac gag ccc agc aac ttc atc cgg ggc agc gag 1680 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 gat ggc tgc ccc aac aac gaa cta gaa aat cct cct tac gtg ccc ggc 1728 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 gtt gtc ggc gga aca ctt cag gcc gct aca atc tgt gcc agc agc cat 1776 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 cag ttt ctg agc acc cac tac aac ctg cac aac ctg tac ggc ctg acc 1824 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 gag gcc att gcc tct cat aga gcc ctg gtt aag gcc aga ggc acc cgg 1872 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 cct ttt gtg atc agc aga agc aca ttc gcc ggc cac ggc aga tac gca 1920 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 gga cat tgg aca ggc gac gtg tgg tct agt tgg gag cag ctg gct agc 1968 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 agc gtg cca gag atc ctg cag ttc aat ctg ctg ggc gtg cca ctc gtg 2016 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 gga gcc gac gtt tgt ggc ttc ctg ggc aac acc agc gag gaa ctg tgt 2064 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 gtg cgt tgg aca cag ctg ggc gcc ttc tat ccc ttc atg aga aac cac 2112 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 aac agc ctg ctg agc ctg cct caa gag ccc tac agc ttt agc gag cct 2160 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 gca cag cag gcc atg aga aag gcc ctg act ctg aga tac gcc ctg ctg 2208 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 cct cac ctg tac acc ctg ttt cat cag gcc cac gtg gca ggc gag aca 2256 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 gtg gct aga cct ctg ttc ctg gaa ttt ccc aag gac agc tcc acc tgg 2304 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 acc gtg gat cat cag ctg ctg tgg gga gaa gcc ctg ctg att aca cca 2352 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 gtg ctg cag gcc gga aag gcc gaa gtg aca ggc tat ttc cct ctc ggc 2400 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 act tgg tac gac ctg cag acc gtg cct atc gag gct ctg gga tct ctt 2448 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 cct cca cct cct gcc gct cct aga gag cct gcc att cac tct gaa ggc 2496 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 cag tgg gtt acc ctg cct gct cct ctg gac acc atc aac gtg cac ctg 2544 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 aga gcc ggc tac atc atc cct ctg caa ggc cct ggc ctg acc aca acc 2592 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 gaa tct aga cag cag ccc atg gca ctg gcc gtg gct ctt aca aaa ggc 2640 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 gga gag gct aga ggc gag ctg ttc tgg gat gat ggc gag agc cta gaa 2688 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 gtg ctg gaa cgg ggc gct tat acc caa gtg atc ttc ctg gcc aga aac 2736 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 aac acc atc gtg aac gaa ctc gtg cgc gtg acc agt gaa ggt gct gga 2784 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 ctg caa ctg cag aaa gtg acc gtg ctc gga gtg gcc aca gct cct cag 2832 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 cag gtt ctg tct aat ggc gtg ccc gtg tcc aac ttc aca tac agc ccc 2880 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 gac acc aag gtc ctg gac atc tgt gtg tcc ctg ctt atg ggc gag cag 2928 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 ttc ctg gtg tcc tgg tgc tga taa 2952 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 <210> 23 <211> 982 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 <210> 24 <211> 2952 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> CDS <222> (1)..(2952) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(270) <223> BiP-vIGF peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(270) <223> BiP signal peptide + vIGF2+2GS extension <220> <221> misc_feature <222> (271)..(2952) <223> hGAA 61-952 V780 DNA <220> <221> misc_feature <222> (2428)..(2430) <223> codon for hGAA 780 Valine <400> 24 atg aag ctg tct ctg gtg gct gct atg ctg ctg ctc ctg tct gcc gcc 48 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 aga gcc agc aga aca ctt tgt ggc gga gag ctg gtg gac acc ctg cag 96 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 ttt gtg tgt ggc gac aga ggc ttc ctg ttc agc aga cct gcc agc cgg 144 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 gtt tcc aga cgg tct aga gga atc gtg gaa gag tgc tgc ttc aga agc 192 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 tgc gat ctg gcc ctg ctg gaa acc tac tgt gcc aca cca gcc aga tct 240 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 gaa ggc ggc gga gga tct ggc gga ggc gga tct aga cct gga cct aga 288 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 gac gcc cag gct cac cct ggt aga cct aga gct gtg cct aca cag tgc 336 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 gac gtg cca cct aac agc aga ttc gac tgc gcc cct gac aag gcc atc 384 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 aca caa gag cag tgt gaa gcc aga ggc tgc tgc tac atc cct gcc aaa 432 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 caa gga ctg cag ggc gcc cag atg gga cag cct tgg tgc ttc ttc cca 480 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 cca tct tac ccc agc tac aag ctg gaa aac ctg agc agc tcc gag atg 528 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 ggc tac acc gcc aca ctg acc aga acc aca cct aca ttc ttc ccg aag 576 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 gac atc ctg aca ctg cgg ctg gac gtg atg atg gaa acc gag aac cgg 624 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 ctg cac ttc acc atc aag gac ccc gcc aat cgg aga tac gag gtg ccc 672 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 ctg gaa aca ccc cac gtg cac tct aga gca ccc tct cca ctg tac agc 720 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 gtg gaa ttt tcc gag gaa ccc ttc ggc gtg atc gtg cgg aga cag ctg 768 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 gat ggc aga gtg ctc ctg aat acc aca gtg gcc cct ctg ttc ttc gcc 816 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 gac cag ttt ctg cag ctg agc acc agc ctg cct agc cag tat atc aca 864 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 ggc ctg gcc gag cat ctg agc cct ctg atg ctg agc aca tcc tgg acc 912 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 aga atc acc ctg tgg aac cgc gac ctg gct cct aca cct ggc gcc aat 960 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 ctg tac ggc tct cac ccc ttc tac ctg gca ctg gaa gac ggt gga tct 1008 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 gcc cac ggt gtc ttt ctg ctg aat agc aac gcc atg gac gtg gtg ctg 1056 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 cag ccc tct cct gca ctg tct tgg aga tct aca ggc ggc atc ctg gac 1104 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 gtg tac atc ttt ctg ggc ccc gag cct aag agc gtg gtg cag cag tat 1152 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 ctg gac gtc gtg ggc tac ccc ttc atg cct cct tat tgg ggc ctg ggc 1200 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 ttc cac ctg tgt agg tgg ggc tac agc agc acc gcc atc acc aga cag 1248 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 gtg gtg gaa aac atg acc cgg gct cac ttc cca ctg gac gtg cag tgg 1296 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 aac gac ctg gac tac atg gac agc aga cgg gac ttc acc ttc aac aag 1344 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 gac ggc ttc aga gac ttc ccc gcc atg gtg caa gag ctg cat caa ggc 1392 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 gga cgg cgg tac atg atg att gtg gac cct gcc atc agc agc tct gga 1440 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 cca gcc ggc agc tac aga cct tac gat gag gga ctg aga aga ggc gtg 1488 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 ttc atc acc aac gag aca ggc cag cct ctg atc ggc aaa gtg tgg cct 1536 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 ggc agc aca gcc ttt cca gac ttc aca aac ccc acc gct ctg gct tgg 1584 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 tgg gaa gat atg gtg gcc gag ttc cac gat cag gtg ccc ttc gat ggc 1632 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 atg tgg atc gac atg aac gag ccc agc aac ttc atc cgg ggc agc gag 1680 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 gat ggc tgc ccc aac aac gaa cta gaa aat cct cct tac gtg ccc ggc 1728 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 gtt gtc ggc gga aca ctt cag gcc gct aca atc tgt gcc agc agc cat 1776 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 cag ttt ctg agc acc cac tac aac ctg cac aac ctg tac ggc ctg acc 1824 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 gag gcc att gcc tct cat aga gcc ctg gtt aag gcc aga ggc acc cgg 1872 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 cct ttt gtg atc agc aga agc aca ttc gcc ggc cac ggc aga tac gca 1920 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 gga cat tgg aca ggc gac gtg tgg tct agt tgg gag cag ctg gct agc 1968 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 agc gtg cca gag atc ctg cag ttc aat ctg ctg ggc gtg cca ctc gtg 2016 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 gga gcc gac gtt tgt ggc ttc ctg ggc aac acc agc gag gaa ctg tgt 2064 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 gtg cgt tgg aca cag ctg ggc gcc ttc tat ccc ttc atg aga aac cac 2112 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 aac agc ctg ctg agc ctg cct caa gag ccc tac agc ttt agc gag cct 2160 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 gca cag cag gcc atg aga aag gcc ctg act ctg aga tac gcc ctg ctg 2208 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 cct cac ctg tac acc ctg ttt cat cag gcc cac gtg gca ggc gag aca 2256 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 gtg gct aga cct ctg ttc ctg gaa ttt ccc aag gac agc tcc acc tgg 2304 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 acc gtg gat cat cag ctg ctg tgg gga gaa gcc ctg ctg att aca cca 2352 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 gtg ctg cag gcc gga aag gcc gaa gtg aca ggc tat ttc cct ctc ggc 2400 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 act tgg tac gac ctg cag acc gtg cct atc gag gct ctg gga tct ctt 2448 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 cct cca cct cct gcc gct cct aga gag cct gcc att cac tct gaa ggc 2496 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 cag tgg gtt acc ctg cct gct cct ctg gac acc atc aac gtg cac ctg 2544 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 aga gcc ggc tac atc atc cct ctg caa ggc cct ggc ctg acc aca acc 2592 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 gaa tct aga cag cag ccc atg gca ctg gcc gtg gct ctt aca aaa ggc 2640 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 gga gag gct aga ggc gag ctg ttc tgg gat gat ggc gag agc cta gaa 2688 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 gtg ctg gaa cgg ggc gct tat acc caa gtg atc ttc ctg gcc aga aac 2736 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 aac acc atc gtg aac gaa ctc gtg cgc gtg acc agt gaa ggt gct gga 2784 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 ctg caa ctg cag aaa gtg acc gtg ctc gga gtg gcc aca gct cct cag 2832 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 cag gtt ctg tct aat ggc gtg ccc gtg tcc aac ttc aca tac agc ccc 2880 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 gac acc aag gtc ctg gac atc tgt gtg tcc ctg ctt atg ggc gag cag 2928 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 ttc ctg gtg tcc tgg tgc tga taa 2952 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 <210> 25 <211> 982 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA target sequence <400> 26 agtgaattct accagtgcca ta 22 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA target sequence <400> 27 agtgtgagtt ctaccattgc caaa 24 <210> 28 <211> 4581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(130) <223> 5' ITR <220> <221> enhancer <222> (195)..(437) <223> CMV IE Enhancer <220> <221> promoter <222> (440)..(721) <223> chicken beta-actin promoter <220> <221> Intron <222> (721)..(1128) <223> hybrid intron in CAG <220> <221> CDS <222> (1141)..(4092) <223> BiP-vIGF2-hGAAco <220> <221> misc_feature <222> (3568)..(3570) <223> Ile codon <220> <221> polyA_signal <222> (4161)..(4287) <223> rabbit beta-globin poly a <220> <221> misc_feature <222> (4452)..(4581) <223> 3' ITR <400> 28 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatcg taccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 240 actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 300 caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 360 tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 420 ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 480 tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg 540 atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 600 ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 660 ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 720 ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 780 ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 840 ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 900 agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gctgtccgcg 960 gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 1020 cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct 1080 gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattgg atccgccacc 1140 atg aag ctg tct ctg gtg gct gct atg ctg ctg ctc ctg tct gcc gcc 1188 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 aga gcc agc aga aca ctt tgt ggc gga gag ctg gtg gac acc ctg cag 1236 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 ttt gtg tgt ggc gac aga ggc ttc ctg ttc agc aga cct gcc agc cgg 1284 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 gtt tcc aga cgg tct aga gga atc gtg gaa gag tgc tgc ttc aga agc 1332 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 tgc gat ctg gcc ctg ctg gaa acc tac tgt gcc aca cca gcc aga tct 1380 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 gaa ggc ggc gga gga tct ggc gga ggc gga tct aga cct gga cct aga 1428 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 gac gcc cag gct cac cct ggt aga cct aga gct gtg cct aca cag tgc 1476 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 gac gtg cca cct aac agc aga ttc gac tgc gcc cct gac aag gcc atc 1524 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 aca caa gag cag tgt gaa gcc aga ggc tgc tgc tac atc cct gcc aaa 1572 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 caa gga ctg cag ggc gcc cag atg gga cag cct tgg tgc ttc ttc cca 1620 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 cca tct tac ccc agc tac aag ctg gaa aac ctg agc agc tcc gag atg 1668 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 ggc tac acc gcc aca ctg acc aga acc aca cct aca ttc ttc ccg aag 1716 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 gac atc ctg aca ctg cgg ctg gac gtg atg atg gaa acc gag aac cgg 1764 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 ctg cac ttc acc atc aag gac ccc gcc aat cgg aga tac gag gtg ccc 1812 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 ctg gaa aca ccc cac gtg cac tct aga gca ccc tct cca ctg tac agc 1860 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 gtg gaa ttt tcc gag gaa ccc ttc ggc gtg atc gtg cgg aga cag ctg 1908 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 gat ggc aga gtg ctc ctg aat acc aca gtg gcc cct ctg ttc ttc gcc 1956 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 gac cag ttt ctg cag ctg agc acc agc ctg cct agc cag tat atc aca 2004 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 ggc ctg gcc gag cat ctg agc cct ctg atg ctg agc aca tcc tgg acc 2052 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 aga atc acc ctg tgg aac cgc gac ctg gct cct aca cct ggc gcc aat 2100 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 ctg tac ggc tct cac ccc ttc tac ctg gca ctg gaa gac ggt gga tct 2148 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 gcc cac ggt gtc ttt ctg ctg aat agc aac gcc atg gac gtg gtg ctg 2196 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 cag ccc tct cct gca ctg tct tgg aga tct aca ggc ggc atc ctg gac 2244 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 gtg tac atc ttt ctg ggc ccc gag cct aag agc gtg gtg cag cag tat 2292 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 ctg gac gtc gtg ggc tac ccc ttc atg cct cct tat tgg ggc ctg ggc 2340 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 ttc cac ctg tgt agg tgg ggc tac agc agc acc gcc atc acc aga cag 2388 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 gtg gtg gaa aac atg acc cgg gct cac ttc cca ctg gac gtg cag tgg 2436 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 aac gac ctg gac tac atg gac agc aga cgg gac ttc acc ttc aac aag 2484 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 gac ggc ttc aga gac ttc ccc gcc atg gtg caa gag ctg cat caa ggc 2532 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 gga cgg cgg tac atg atg att gtg gac cct gcc atc agc agc tct gga 2580 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 cca gcc ggc agc tac aga cct tac gat gag gga ctg aga aga ggc gtg 2628 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 ttc atc acc aac gag aca ggc cag cct ctg atc ggc aaa gtg tgg cct 2676 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 ggc agc aca gcc ttt cca gac ttc aca aac ccc acc gct ctg gct tgg 2724 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 tgg gaa gat atg gtg gcc gag ttc cac gat cag gtg ccc ttc gat ggc 2772 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 atg tgg atc gac atg aac gag ccc agc aac ttc atc cgg ggc agc gag 2820 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 gat ggc tgc ccc aac aac gaa cta gaa aat cct cct tac gtg ccc ggc 2868 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 gtt gtc ggc gga aca ctt cag gcc gct aca atc tgt gcc agc agc cat 2916 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 cag ttt ctg agc acc cac tac aac ctg cac aac ctg tac ggc ctg acc 2964 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 gag gcc att gcc tct cat aga gcc ctg gtt aag gcc aga ggc acc cgg 3012 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 cct ttt gtg atc agc aga agc aca ttc gcc ggc cac ggc aga tac gca 3060 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 gga cat tgg aca ggc gac gtg tgg tct agt tgg gag cag ctg gct agc 3108 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 agc gtg cca gag atc ctg cag ttc aat ctg ctg ggc gtg cca ctc gtg 3156 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 gga gcc gac gtt tgt ggc ttc ctg ggc aac acc agc gag gaa ctg tgt 3204 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 gtg cgt tgg aca cag ctg ggc gcc ttc tat ccc ttc atg aga aac cac 3252 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 aac agc ctg ctg agc ctg cct caa gag ccc tac agc ttt agc gag cct 3300 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 gca cag cag gcc atg aga aag gcc ctg act ctg aga tac gcc ctg ctg 3348 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 cct cac ctg tac acc ctg ttt cat cag gcc cac gtg gca ggc gag aca 3396 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 gtg gct aga cct ctg ttc ctg gaa ttt ccc aag gac agc tcc acc tgg 3444 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 acc gtg gat cat cag ctg ctg tgg gga gaa gcc ctg ctg att aca cca 3492 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 gtg ctg cag gcc gga aag gcc gaa gtg aca ggc tat ttc cct ctc ggc 3540 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 act tgg tac gac ctg cag acc gtg cct atc gag gct ctg gga tct ctt 3588 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 cct cca cct cct gcc gct cct aga gag cct gcc att cac tct gaa ggc 3636 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 cag tgg gtt acc ctg cct gct cct ctg gac acc atc aac gtg cac ctg 3684 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 aga gcc ggc tac atc atc cct ctg caa ggc cct ggc ctg acc aca acc 3732 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 gaa tct aga cag cag ccc atg gca ctg gcc gtg gct ctt aca aaa ggc 3780 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 gga gag gct aga ggc gag ctg ttc tgg gat gat ggc gag agc cta gaa 3828 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 gtg ctg gaa cgg ggc gct tat acc caa gtg atc ttc ctg gcc aga aac 3876 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 aac acc atc gtg aac gaa ctc gtg cgc gtg acc agt gaa ggt gct gga 3924 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 ctg caa ctg cag aaa gtg acc gtg ctc gga gtg gcc aca gct cct cag 3972 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 cag gtt ctg tct aat ggc gtg ccc gtg tcc aac ttc aca tac agc ccc 4020 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 gac acc aag gtc ctg gac atc tgt gtg tcc ctg ctt atg ggc gag cag 4068 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 ttc ctg gtg tcc tgg tgc tga taa gcggccgcac gcgtggtacc tctagagtcg 4122 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 acccgggcgg cctcgaggac ggggtgaact acgcctgaga tctttttccc tctgccaaaa 4182 attatgggga catcatgaag ccccttgagc atctgacttc tggctaataa aggaaattta 4242 ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc actcggttaa caacaacaat 4302 tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg aggtttttta aagcaagtaa 4362 aacctctaca aatgtggtaa aatcgataag gatcttccta gagcatggct acgtagataa 4422 gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc 4482 ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg 4542 ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcag 4581 <210> 29 <211> 982 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 <210> 30 <211> 4687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(130) <223> 5' ITR <220> <221> enhancer <222> (195)..(437) <223> CMV IE Enhancer <220> <221> promoter <222> (440)..(721) <223> chicken beta-actin promoter <220> <221> Intron <222> (721)..(1128) <223> Hybrid intron in CAG <220> <221> CDS <222> (1141)..(4092) <223> BiP-vIGF2-hGAAco <220> <221> misc_feature <222> (3568)..(3570) <223> Ile codon <220> <221> misc_feature <222> (4113)..(4134) <223> miR-183 target <220> <221> misc_feature <222> (4139)..(4160) <223> miR-183 target <220> <221> misc_feature <222> (4167)..(4188) <223> miR-183 target <220> <221> misc_feature <222> (4195)..(4216) <223> miR-183 target <220> <221> polyA_signal <222> (4267)..(4393) <223> rabbit beta-globin poly a <220> <221> misc_feature <222> (4558)..(4687) <223> 3' ITR <400> 30 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatcg taccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 240 actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 300 caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 360 tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 420 ttagtcatcg ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc 480 tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg 540 atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg 600 ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt 660 ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 720 ggagtcgctg cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 780 ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 840 ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 900 agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gctgtccgcg 960 gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 1020 cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct 1080 gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattgg atccgccacc 1140 atg aag ctg tct ctg gtg gct gct atg ctg ctg ctc ctg tct gcc gcc 1188 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 aga gcc agc aga aca ctt tgt ggc gga gag ctg gtg gac acc ctg cag 1236 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 ttt gtg tgt ggc gac aga ggc ttc ctg ttc agc aga cct gcc agc cgg 1284 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 gtt tcc aga cgg tct aga gga atc gtg gaa gag tgc tgc ttc aga agc 1332 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 tgc gat ctg gcc ctg ctg gaa acc tac tgt gcc aca cca gcc aga tct 1380 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 gaa ggc ggc gga gga tct ggc gga ggc gga tct aga cct gga cct aga 1428 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 gac gcc cag gct cac cct ggt aga cct aga gct gtg cct aca cag tgc 1476 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 gac gtg cca cct aac agc aga ttc gac tgc gcc cct gac aag gcc atc 1524 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 aca caa gag cag tgt gaa gcc aga ggc tgc tgc tac atc cct gcc aaa 1572 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 caa gga ctg cag ggc gcc cag atg gga cag cct tgg tgc ttc ttc cca 1620 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 cca tct tac ccc agc tac aag ctg gaa aac ctg agc agc tcc gag atg 1668 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 ggc tac acc gcc aca ctg acc aga acc aca cct aca ttc ttc ccg aag 1716 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 gac atc ctg aca ctg cgg ctg gac gtg atg atg gaa acc gag aac cgg 1764 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 ctg cac ttc acc atc aag gac ccc gcc aat cgg aga tac gag gtg ccc 1812 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 ctg gaa aca ccc cac gtg cac tct aga gca ccc tct cca ctg tac agc 1860 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 gtg gaa ttt tcc gag gaa ccc ttc ggc gtg atc gtg cgg aga cag ctg 1908 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 gat ggc aga gtg ctc ctg aat acc aca gtg gcc cct ctg ttc ttc gcc 1956 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 gac cag ttt ctg cag ctg agc acc agc ctg cct agc cag tat atc aca 2004 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 ggc ctg gcc gag cat ctg agc cct ctg atg ctg agc aca tcc tgg acc 2052 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 aga atc acc ctg tgg aac cgc gac ctg gct cct aca cct ggc gcc aat 2100 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 ctg tac ggc tct cac ccc ttc tac ctg gca ctg gaa gac ggt gga tct 2148 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 gcc cac ggt gtc ttt ctg ctg aat agc aac gcc atg gac gtg gtg ctg 2196 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 cag ccc tct cct gca ctg tct tgg aga tct aca ggc ggc atc ctg gac 2244 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 gtg tac atc ttt ctg ggc ccc gag cct aag agc gtg gtg cag cag tat 2292 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 ctg gac gtc gtg ggc tac ccc ttc atg cct cct tat tgg ggc ctg ggc 2340 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 ttc cac ctg tgt agg tgg ggc tac agc agc acc gcc atc acc aga cag 2388 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 gtg gtg gaa aac atg acc cgg gct cac ttc cca ctg gac gtg cag tgg 2436 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 aac gac ctg gac tac atg gac agc aga cgg gac ttc acc ttc aac aag 2484 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 gac ggc ttc aga gac ttc ccc gcc atg gtg caa gag ctg cat caa ggc 2532 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 gga cgg cgg tac atg atg att gtg gac cct gcc atc agc agc tct gga 2580 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 cca gcc ggc agc tac aga cct tac gat gag gga ctg aga aga ggc gtg 2628 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 ttc atc acc aac gag aca ggc cag cct ctg atc ggc aaa gtg tgg cct 2676 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 ggc agc aca gcc ttt cca gac ttc aca aac ccc acc gct ctg gct tgg 2724 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 tgg gaa gat atg gtg gcc gag ttc cac gat cag gtg ccc ttc gat ggc 2772 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 atg tgg atc gac atg aac gag ccc agc aac ttc atc cgg ggc agc gag 2820 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 gat ggc tgc ccc aac aac gaa cta gaa aat cct cct tac gtg ccc ggc 2868 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 gtt gtc ggc gga aca ctt cag gcc gct aca atc tgt gcc agc agc cat 2916 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 cag ttt ctg agc acc cac tac aac ctg cac aac ctg tac ggc ctg acc 2964 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 gag gcc att gcc tct cat aga gcc ctg gtt aag gcc aga ggc acc cgg 3012 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 cct ttt gtg atc agc aga agc aca ttc gcc ggc cac ggc aga tac gca 3060 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 gga cat tgg aca ggc gac gtg tgg tct agt tgg gag cag ctg gct agc 3108 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 agc gtg cca gag atc ctg cag ttc aat ctg ctg ggc gtg cca ctc gtg 3156 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 gga gcc gac gtt tgt ggc ttc ctg ggc aac acc agc gag gaa ctg tgt 3204 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 gtg cgt tgg aca cag ctg ggc gcc ttc tat ccc ttc atg aga aac cac 3252 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 aac agc ctg ctg agc ctg cct caa gag ccc tac agc ttt agc gag cct 3300 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 gca cag cag gcc atg aga aag gcc ctg act ctg aga tac gcc ctg ctg 3348 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 cct cac ctg tac acc ctg ttt cat cag gcc cac gtg gca ggc gag aca 3396 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 gtg gct aga cct ctg ttc ctg gaa ttt ccc aag gac agc tcc acc tgg 3444 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 acc gtg gat cat cag ctg ctg tgg gga gaa gcc ctg ctg att aca cca 3492 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 gtg ctg cag gcc gga aag gcc gaa gtg aca ggc tat ttc cct ctc ggc 3540 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 act tgg tac gac ctg cag acc gtg cct atc gag gct ctg gga tct ctt 3588 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 cct cca cct cct gcc gct cct aga gag cct gcc att cac tct gaa ggc 3636 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 cag tgg gtt acc ctg cct gct cct ctg gac acc atc aac gtg cac ctg 3684 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 aga gcc ggc tac atc atc cct ctg caa ggc cct ggc ctg acc aca acc 3732 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 gaa tct aga cag cag ccc atg gca ctg gcc gtg gct ctt aca aaa ggc 3780 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 gga gag gct aga ggc gag ctg ttc tgg gat gat ggc gag agc cta gaa 3828 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 gtg ctg gaa cgg ggc gct tat acc caa gtg atc ttc ctg gcc aga aac 3876 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 aac acc atc gtg aac gaa ctc gtg cgc gtg acc agt gaa ggt gct gga 3924 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 ctg caa ctg cag aaa gtg acc gtg ctc gga gtg gcc aca gct cct cag 3972 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 cag gtt ctg tct aat ggc gtg ccc gtg tcc aac ttc aca tac agc ccc 4020 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 gac acc aag gtc ctg gac atc tgt gtg tcc ctg ctt atg ggc gag cag 4068 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 ttc ctg gtg tcc tgg tgc tga taa gcggccgcac gcgtggtacc agtgaattct 4122 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 accagtgcca taggatagtg aattctacca gtgccataca cgtgagtgaa ttctaccagt 4182 gccatagcat gcagtgaatt ctaccagtgc catagcggcc gcctcgaccc gggcggcctc 4242 gaggacgggg tgaactacgc ctgagatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc 4302 atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata 4362 gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggttaacaac aacaattgca ttcattttat 4422 gtttcaggtt cagggggaga tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg 4482 tggtaaaatc gataaggatc ttcctagagc atggctacgt agataagtag catggcgggt 4542 taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc 4602 gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 4662 cctcagtgag cgagcgagcg cgcag 4687 <210> 31 <211> 982 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln 20 25 30 Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg 35 40 45 Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser 50 55 60 Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser 65 70 75 80 Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Pro Gly Pro Arg 85 90 95 Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys 100 105 110 Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile 115 120 125 Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys 130 135 140 Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro 145 150 155 160 Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met 165 170 175 Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys 180 185 190 Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg 195 200 205 Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro 210 215 220 Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser 225 230 235 240 Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu 245 250 255 Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala 260 265 270 Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr 275 280 285 Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr 290 295 300 Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn 305 310 315 320 Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser 325 330 335 Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu 340 345 350 Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp 355 360 365 Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr 370 375 380 Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly 385 390 395 400 Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln 405 410 415 Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp 420 425 430 Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys 435 440 445 Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly 450 455 460 Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly 465 470 475 480 Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val 485 490 495 Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro 500 505 510 Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp 515 520 525 Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly 530 535 540 Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu 545 550 555 560 Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly 565 570 575 Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His 580 585 590 Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr 595 600 605 Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg 610 615 620 Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala 625 630 635 640 Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser 645 650 655 Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val 660 665 670 Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys 675 680 685 Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His 690 695 700 Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro 705 710 715 720 Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu 725 730 735 Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr 740 745 750 Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp 755 760 765 Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro 770 775 780 Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly 785 790 795 800 Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu 805 810 815 Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly 820 825 830 Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu 835 840 845 Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr 850 855 860 Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 865 870 875 880 Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 885 890 895 Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 900 905 910 Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 915 920 925 Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 930 935 940 Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 945 950 955 960 Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 965 970 975 Phe Leu Val Ser Trp Cys 980 <210> 32 <211> 67 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 33 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 F26S <400> 33 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 34 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 Y27L <400> 34 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 35 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V43L <400> 35 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Leu Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 36 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 F48T <400> 36 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Thr 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 37 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 R49S <400> 37 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Ser Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 38 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 S50I <400> 38 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ile Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 39 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 A54R <400> 39 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Arg Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 40 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 L55R <400> 40 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 41 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 F26S, Y27L, V43L, F48T, R49S, S50I, A54R, L55R <400> 41 Ala Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Ser Leu Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Leu Glu Glu Cys Cys Thr 35 40 45 Ser Ile Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 42 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 delta1-6, Y27L, K65R <400> 42 Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg 20 25 30 Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala 35 40 45 Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser Glu 50 55 60 <210> 43 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 delta1-7, Y27L, K65R <400> 43 Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp 1 5 10 15 Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser 20 25 30 Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu 35 40 45 Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser Glu 50 55 60 <210> 44 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 delta1-4, E6R, Y27L, K65R <400> 44 Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser 20 25 30 Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp 35 40 45 Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Arg Ser Glu 50 55 60 <210> 45 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 delta1-4, E6R, Y27L <400> 45 Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Phe Val 1 5 10 15 Cys Gly Asp Arg Gly Phe Leu Phe Ser Arg Pro Ala Ser Arg Val Ser 20 25 30 Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp 35 40 45 Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys Ser Glu 50 55 60 <210> 46 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF2 E6R <400> 46 Ala Tyr Arg Pro Ser Arg Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr 1 5 10 15 Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala 20 25 30 Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe 35 40 45 Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala 50 55 60 Lys Ser Glu 65 <210> 47 <211> 201 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gcttaccgcc ccagtgagac cctgtgcggc ggggagctgg tggacaccct ccagttcgtc 60 tgtggggacc gcggcttcta cttcagcagg cccgcaagcc gtgtgagccg tcgcagccgt 120 ggcatcgttg aggagtgctg tttccgcagc tgtgacctgg ccctcctgga gacgtactgt 180 gctacccccg ccaagtccga g 201 <210> 48 <211> 189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vIGF2 delta1-4, E6R, Y27L, K65R <400> 48 tctagaacac tgtgcggagg ggagcttgta gacactcttc agttcgtgtg tggagatcgc 60 gggttcctct tctctcgccc cgcttccaga gtttcacgga ggtctagggg tatagtagag 120 gagtgttgtt tcaggtcctg tgacttggcg ctcctcgaga cctattgcgc gacgccagcc 180 aggtccgaa 189 <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1 5 10 15 Arg Ala <210> 50 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified BiP-1 <400> 50 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25 <210> 51 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified BiP-2 <400> 51 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25 <210> 52 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified BiP-3 <400> 52 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ser Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25 <210> 53 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified BiP-4 <400> 53 Met Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val 1 5 10 15 Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ala Ala Arg Ala 20 25 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Gaussia princeps <400> 54 Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu 1 5 10 15 Ala <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 55 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 56 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 57 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 58 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 59 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser 1 5 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker sequence <400> 60 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Trp Ile Asp Met Asn Glu 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly 1 5 <210> 64 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala 20 25

Claims (28)

  1. 환자에서 비정상 근육 병리의 진행을 감소시키고/거나, 비정상 근육 병리를 역전시키는 방법으로서, 상기 환자는 폼페병으로 진단 받았거나 폼페병에 걸린 것으로 의심되고, 상기 방법은 상기 환자에게 AAV 캡시드 및 이에 패키징된 벡터 게놈을 갖는 재조합 AAV (rAAV)를 투여하는 것을 포함하고, 상기 벡터 게놈은
    (a) 5' 역전된 말단 반복서열 (ITR);
    (b) 프로모터;
    (c) 신호 펩티드 및 인간 산-α-글루코시다제 (hGAA)에 융합된 vIGF2 펩티드를 포함하는 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 이의 발현을 구동하는 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 1번 내지 982번을 인코딩하는 서열번호 7 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열을 포함하는, 서열;
    (d) 폴리 A; 및
    (e) 3' ITR을 포함하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 프로모터는 전신발현 프로모터, 선택적으로 CAG 프로모터 또는 CB7 프로모터인, 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 비정상 근육 병리는 (i) 중앙 핵을 갖는 근육 세포의 백분율 상승, (ii) 근육 섬유 위축증, (iii) 근육 세포 섬유의 부동세포증, (iv) 자가포식 구축, (v) 공포 형성, 및 (vi) 쇠약 중 하나 이상을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 환자는 후기 발병 폼페병을 갖는, 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 환자는 유아 발병 폼페병을 갖는, 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 벡터 게놈은 miR 표적 서열을 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 miR 표적 서열 각각은 miR-183에 대해 특이적인, 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 AAV 캡시드는 AAVhu68 캡시드인, 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 rAAV는 정맥내 및/또는 경막내로 투여되는, 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 rAAV는 상기 환자에게 이중 투여 경로를 통해 투여되고, 선택적으로 상기 이중 경로는 정맥내 투여 및 대수조내 (ICM) 투여인, 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 rAAV는 약 1 × 1011개 게놈 사본 (GC)/kg 내지 약 5 × 1013개 GC/kg의 용량으로 정맥내로 투여되는, 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 rAAV는 약 1 × 1012개 GC 내지 약 5 × 1013개 GC의 용량으로 ICM을 통해 투여되는, 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 rAAV는 약 1 × 1011개 GC/kg 내지 약 5 × 1013개 GC/kg의 용량으로 정맥내로, 그리고 약 1 × 1012개 GC 내지 약 5 × 1013개 GC의 용량으로 ICM을 통해투여되는, 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 환자에게 보조요법을 투여하는 것을 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 보조요법은 기관지 확장제, 아세틸콜린 에스테라제 저해제, 호흡기 근육 강도 훈련 (RMST), 효소 대체 요법 및/또는 횡격막 조율 요법인, 방법.
  14. AAV 캡시드 및 이에 패키징된 벡터 게놈을 갖는 재조합 AAV (rAAV)를 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 벡터 게놈은
    (a) 5' 역전된 말단 반복서열 (ITR);
    (b) 프로모터;
    (c) 신호 펩티드 및 인간 산-α-글루코시다제 (hGAA)에 융합된 vIGF2 펩티드를 포함하는 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 키메라 융합 단백질을 인코딩하는 서열은 이의 발현을 구동하는 조절 서열에 작동가능하게 연결되고, 서열번호 6의 아미노산 1번 내지 982번을 인코딩하는 서열번호 7 또는 이와 적어도 95% 일치하는 서열을 포함하는, 서열;
    (d) 폴리 A; 및
    (e) 3' ITR을 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 프로모터는 전신발현 프로모터, 선택적으로 CAG 프로모터 또는 CB7 프로모터인, 약제학적 조성물.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서,
    상기 벡터 게놈은 miR 표적 서열을 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 또는 적어도 8개 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 miR 표적 서열 각각은 miR-183에 대해 특이적인, 약제학적 조성물.
  17. 제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 AAV 캡시드는 AAVhu68 캡시드인, 약제학적 조성물.
  18. 제 14항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 정맥내 및/또는 경막내 전달을 위해 제형되는, 약제학적 조성물.
  19. 제 14항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    폼페병에 걸린 환자의 치료에 사용되고, 상기 치료는 상기 환자에서 비정상 근육 병리의 진행을 감소시키고/거나, 비정상 근육 병리를 역전시키는, 약제학적 조성물.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 비정상 근육 병리는 i) 중앙 핵을 갖는 근육 세포의 백분율 상승, (ii) 근육 섬유 위축증, (iii) 근육 세포 섬유의 부동세포증, (iv) 자가포식 구축, (v) 공포 형성, 및 (vi) 쇠약 중 하나 이상을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서,
    상기 환자는 후기 발병 폼페병을 갖는, 약제학적 조성물.
  22. 제 19항 또는 제 20항에 있어서,
    상기 환자는 유아 발병 폼페병을 갖는, 약제학적 조성물.
  23. 제 19항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 rAAV는 상기 환자에게 이중 투여 경로를 통해 투여되고, 선택적으로 상기 이중 경로는 정맥내 투여 및 대수조내 (ICM) 투여인, 약제학적 조성물.
  24. 제 14항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    폼페병으로 진단 받았던 증상 이후의 환자에게 투여에 적합한, 약제학적 조성물.
  25. 제 14항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    폼페병에 걸린 증상 이후의 환자에서 비정상 근육 병리를 역전시키는데 적합한, 약제학적 조성물.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 비정상 근육 병리는 i) 중앙 핵을 갖는 근육 세포의 백분율 상승, (ii) 근육 섬유 위축증, (iii) 근육 세포 섬유의 부동세포증, (iv) 자가포식 구축, (v) 공포 형성, 및 (vi) 쇠약 중 하나 이상을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  27. 제 14항 내지 제 18항 또는 제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서,
    보조요법으로 사용하기에 적합하고, 선택적으로 상기 환자는 기관지 확장제, 아세틸콜린 에스테라제 저해제, 호흡기 근육 강도 훈련 (RMST), 효소 대체 요법 및/또는 횡격막 조율 요법으로의 치료를 추가로 받는 것을 특징으로 하는, 약제학적 조성물.
  28. 폼페병을 필요로 하는 환자에서 치료하기 위한 제 14항 내지 제 18항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물의 용도로서, 상기 치료는 상기 환자에서 비정상 근육 병리의 진행을 감소시키고/거나, 비정상 근육 병리를 역전시키는, 용도.
KR1020227043641A 2020-05-14 2021-05-14 폼페병의 치료에 유용한 조성물 KR20230010255A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063024941P 2020-05-14 2020-05-14
US63/024,941 2020-05-14
US202063109677P 2020-11-04 2020-11-04
US63/109,677 2020-11-04
US202163180379P 2021-04-27 2021-04-27
US63/180,379 2021-04-27
PCT/US2021/032451 WO2021231863A1 (en) 2020-05-14 2021-05-14 Compositions useful for treatment of pompe disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230010255A true KR20230010255A (ko) 2023-01-18

Family

ID=78525047

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227043641A KR20230010255A (ko) 2020-05-14 2021-05-14 폼페병의 치료에 유용한 조성물

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20230173108A1 (ko)
EP (1) EP4149519A1 (ko)
JP (1) JP2023526923A (ko)
KR (1) KR20230010255A (ko)
CN (1) CN115916334A (ko)
AU (1) AU2021273273A1 (ko)
BR (1) BR112022022704A2 (ko)
CA (1) CA3177954A1 (ko)
CL (1) CL2022003132A1 (ko)
CO (1) CO2022017224A2 (ko)
IL (1) IL298178A (ko)
MX (1) MX2022014255A (ko)
WO (1) WO2021231863A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024003687A1 (en) * 2022-06-28 2024-01-04 Pfizer Inc. Nucleic acids encoding acid alpha-glucosidase (gaa) and vectors for gene therapy

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120322861A1 (en) * 2007-02-23 2012-12-20 Barry John Byrne Compositions and Methods for Treating Diseases
WO2013134530A1 (en) * 2012-03-07 2013-09-12 Amicus Therapeutics, Inc. High concentration alpha-glucosidase compositions for the treatment of pompe disease
ES2862526T3 (es) * 2014-01-21 2021-10-07 Univ Brussel Vrije Elementos reguladores de ácido nucleico específicos de músculo y métodos y uso de los mismos
US20170037431A1 (en) * 2014-05-01 2017-02-09 University Of Washington In vivo Gene Engineering with Adenoviral Vectors
WO2019060454A2 (en) * 2017-09-20 2019-03-28 4D Molecular Therapeutics Inc. CAPSID VARIANT ADENO-ASSOCIATED VIRUSES AND METHODS OF USE
JP2021521851A (ja) * 2018-04-30 2021-08-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド 遺伝子治療構築物及び使用方法
KR20220004696A (ko) * 2019-04-30 2022-01-11 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 폼페병의 치료에 유용한 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
CL2022003132A1 (es) 2023-05-19
CN115916334A (zh) 2023-04-04
BR112022022704A2 (pt) 2023-03-28
IL298178A (en) 2023-01-01
US20230173108A1 (en) 2023-06-08
JP2023526923A (ja) 2023-06-26
EP4149519A1 (en) 2023-03-22
WO2021231863A1 (en) 2021-11-18
MX2022014255A (es) 2022-12-07
CA3177954A1 (en) 2021-11-18
CO2022017224A2 (es) 2023-02-16
AU2021273273A1 (en) 2023-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220193261A1 (en) Compositions useful for treatment of pompe disease
US20240009327A1 (en) Gene therapy for mucopolysaccharidosis iiib
US20230365955A1 (en) Compositions and methods for treatment of fabry disease
US20220370638A1 (en) Compositions and methods for treatment of maple syrup urine disease
KR20230010255A (ko) 폼페병의 치료에 유용한 조성물
JP2022553406A (ja) 導入遺伝子発現のｄｒｇ特異的低減のための組成物
US20240115733A1 (en) Compositions and methods for treatment of niemann pick type a disease
CN117897492A (zh) 用于肌肉和cns中的基因表达的杂合启动子
WO2023102517A1 (en) Compositions and methods for treatment of fabry disease

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination