JP2018501791A - 改変g6pcをコードするアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用 - Google Patents
改変g6pcをコードするアデノ随伴ウイルスベクターおよびその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
この出願は、2014年12月23日に出願された米国仮出願第62/096,400号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
GSD−Iaの動物モデルにおいて、G6Pase−αを保有する組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)を使用した遺伝子療法試験が以前実施されたが、肝臓G6Pase−α欠乏の完全な補正は誰にもできていない。そのため、GSD−Iaおよびその関連する合併症の処置のための遺伝子療法ベクターの改善に対する必要性がある。
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については3文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖へのいずれの言及にも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、2015年12月22日に作成された、52.8KBのASCIIテキストファイルとして提出され、これは、参照により本明細書に組み入れられる。添付の配列表では:
ITR−ヌクレオチド17〜163
G6PCプロモーター/エンハンサー−ヌクレオチド182〜3045
スタッファー−ヌクレオチド3051〜3184
イントロン−ヌクレオチド3185〜3321
スタッファー−ヌクレオチド3322〜3367
G6PCコード配列−ヌクレオチド3368〜4441
ITR−ヌクレオチド4674〜4819
ITR−ヌクレオチド17〜163
G6PCプロモーター/エンハンサー−ヌクレオチド182〜3045
スタッファー−ヌクレオチド3051〜3184
イントロン−ヌクレオチド3185〜3321
スタッファー−ヌクレオチド3322〜3367
G6PCコード配列−ヌクレオチド3368〜4441
S298C変異−ヌクレオチド4259〜4261(TCTからTGC)
ITR−ヌクレオチド4674〜4819
ITR−ヌクレオチド17〜163
G6PCプロモーター/エンハンサー−ヌクレオチド182〜3045
スタッファー−ヌクレオチド3051〜3184
イントロン−ヌクレオチド3185〜3321
スタッファー−ヌクレオチド3322〜3367
コドン最適化G6PCコード配列−ヌクレオチド3368〜4441
S298C変異−ヌクレオチド4259〜4261(AGCからTGC)
ITR−ヌクレオチド4674〜4819
I.略語
AAV アデノ随伴ウイルス
CBA ニワトリβ−アクチン
CMV サイトメガロウイルス
co コドン最適化
FGT 空腹時耐糖能
G6P グルコース−6−リン酸
G6Pase−α グルコース−6−ホスファターゼ−α
G6PC グルコース−6−ホスファターゼ、触媒サブユニット
G6PT グルコース−6−リン酸トランスポーター
GPE G6PCプロモーター/エンハンサー
GSD 糖原病
HCA 肝細胞腺腫
HCC 肝細胞癌
ITR 末端逆位配列
ORF オープンリーディングフレーム
rAAV 組換えAAV
SEM 標準誤差
vg ウイルスゲノム
vp ウイルス粒子
WT 野生型
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学において一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes V、Oxford University Press刊、1994年(ISBN 0−19−854287−9);Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、published by Blackwell Science Ltd.、1994年(ISBN 0−632−02182−9);およびRobert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.刊、1995年(ISBN 1−56081−569−8)に見出すことができる。
本開示の種々の実施形態の検討を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提示する:
糖原病Ia型(GSD−Ia)は、グルコース−6−ホスファターゼ−α(G6Pase−αまたはG6PC)の欠乏によって生じる生命を脅かす低血糖、肝臓悪性疾患および腎不全に関連する代謝の遺伝性障害であり、主に肝臓および腎臓を侵す。現在の治療法は、成長不全、痛風、肺高血圧症、腎不全の危険がある腎機能障害、骨粗鬆症および、悪性転換して肝細胞癌になる場合がある肝細胞腺腫(HCA)を含む長期合併症を多くの患者において予防できない(Chouら、Curr Mol Med 2巻:121〜143頁、2002年、Chouら、Nat Rev Endocrinol 6巻:676〜688頁、2010年)。したがって遺伝子療法などの新規治療法の開発は、GSD−Iaのための根治的処置の可能性として正当化される(Chouら、Expert Opin Biol Ther 11巻:1011〜1024頁、2011年)。
本明細書では、イヌG6Pase−α酵素がヒトG6Pase−α酵素よりも活性であることが開示される。2つのタンパク質のアミノ酸アラインメントは、それらが18個の残基で配列において異なっていることを明らかにした。ホスホヒドロラーゼ活性が増大しているヒトG6Pase−α変異体を同定するために、イヌG6Pase−α由来の少なくとも1つの対応するアミノ酸を含有する変異体が生成された。
イヌG6Pase−α酵素がヒトG6Pase−α酵素よりも活性であることが本明細書に開示されている。図1および表2に示す通り、2つのタンパク質は、18残基で配列において異なっている。部位特異的変異誘発を使用して、ホスホヒドロラーゼ活性が増大しているヒトG6Pase−α変異体が同定された。生成されたヒトG6Pase−α変異体は、イヌG6Pase−α由来の1つまたは複数の対応するアミノ酸を配列番号2の3、54、139、196、199、242、247、292、298、301、318、324、332、347、349、350および/または353位(複数可)に含有した。ヒトG6Pase−α配列およびヒト/イヌG6Pase−αコンセンサス配列は、下に記載される。
AAVは、Parvoviridae科Dependovirus属に属する。AAVは、直鎖状の一本鎖DNAゲノムをパッケージングする、小さな、エンベロープを有さないウイルスである。AAV DNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖はどちらも同等の頻度でAAVカプシドにパッケージングされる。
)。
この実施例は、18個のヒトG6PC変異体の生成およびホスホヒドロラーゼ活性が増大した特異的なG6Pase−α変異体の同定を記載する。
ヒトG6PC変異体を構築するために、ヒトG6PC cDNA(配列番号11;ヌクレオチド1〜3に開始コドンATGを含むコード領域全体)のヌクレオチド1から1074を含むpSVLベクターを鋳型として使用した。PCR誘導変異誘発のために鋳型を、中央で変異されたコドンを含む20ヌクレオチド長センスおよびアンチセンス変異体プライマーに隣接したヌクレオチド1から20(センス)および1055から1074(アンチセンス)に一致する2つの外側PCRプライマーを使用して増幅した(図4および下の表1を参照されたい)。hG6PC−S298C/A301V二重変異体のための鋳型はpSVL−hG6PC−S298C変異体であった。変異された配列をpSVLにクローニングし、DNA配列決定によって検証した。
COS−1細胞を4%ウシ胎児血清を補充したHEPES緩衝ダルベッコ改変最小基礎培地において、37℃で増殖させた。G6PC構築物をDEAEデキストラン/クロロキン法によってCOS−1細胞にトランスフェクトした。37℃、2日間のインキュベーション後、トランスフェクトした培養物をホスホヒドロラーゼ活性のために回収した。簡潔には、50mMカコジル酸緩衝液、pH6.5、10mMのG6Pおよび適量の細胞ホモジネートを含有する反応混合物(50μl)を37℃、10分間、以前に記載されている通りインキュベートした(Leiら、Science 262巻:580〜583頁、1993年)。
独立t検定を、GraphPad Prism Program、version 4(GraphPad Software、San Diego、CA)を使用して実施した。値は、p<0.05であれば統計学的に有意とみなした。
ヒトおよびイヌG6Pase−αのホスホヒドロラーゼ活性をin vitro発現アッセイによって比較した。結果はイヌ酵素がヒト酵素の約5倍の活性であったことを実証した。イヌおよびヒト配列の配列アラインメントは、2つの酵素が18個のアミノ酸残基だけ異なっていることを示した(図1および表2)。
この実施例は、HCA/HCC発症を予防し、グルコース恒常性を維持するレベルにG6Pase−α活性を回復させるために必要な最小用量を決定する研究を記載している。
この実施例は、改変G6PCをコードするAAVベクターをGSD−Iaの処置のために臨床使用する例示的な方法を記載している。
Claims (23)
- 改変グルコース−6−ホスファターゼ−α(G6Pase−α)をコードする単離された核酸分子であって、前記改変G6Pase−αがセリンからシステインへの置換をヒトG6Pase−α(配列番号2)のアミノ酸298に含む、単離された核酸分子。
- 前記改変G6Pase−αのアミノ酸配列が、配列番号8を含むまたはそれからなる、請求項1に記載の単離された核酸分子。
- 配列番号6または配列番号7のヌクレオチド配列を含む、請求項1または請求項2に記載の単離された核酸分子。
- 請求項1から3までのいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記改変G6Pase−αをコードする前記核酸分子がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項4に記載のベクター。
- 前記プロモーターがG6PCプロモーターを含む、請求項5に記載のベクター。
- 前記G6PCプロモーターが配列番号4のヌクレオチド182〜3045または配列番号5のヌクレオチド182〜3045を含む、請求項6に記載のベクター。
- 配列番号4のヌクレオチド182〜4441または配列番号5のヌクレオチド182〜4441を含む、請求項4から7までのいずれか一項に記載のベクター。
- 前記ベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項4から8までのいずれか一項に記載のベクター。
- 前記AAVベクターがAAV血清型8(AAV8)ベクターである、請求項9に記載のベクター。
- 配列番号4のヌクレオチド17〜4819または配列番号5のヌクレオチド17〜4819を含む、請求項9または請求項10に記載のベクター。
- 請求項1から3までのいずれか一項に記載の核酸分子または請求項4から11までのいずれか一項に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項1から3までのいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換えAAV(rAAV)。
- 前記rAAVがrAAV8である、請求項8に記載のrAAV。
- 薬学的に許容される担体中に請求項13または請求項14に記載のrAAVを含む組成物。
- 静脈内投与用に製剤化されている、請求項15に記載の組成物。
- 糖原病と診断された被験体を処置する方法であって、糖原病Ia型(GSD−Ia)を有する被験体を選択するステップと、前記被験体に、治療有効量の請求項13もしくは請求項14に記載のrAAVまたは請求項15もしくは請求項16に記載の組成物を投与するステップとを含む、方法。
- グルコース−6−ホスファターゼ−α(G6Pase−α)の欠乏を有する被験体において、前記被験体に、治療有効量の請求項13もしくは請求項14に記載のrAAVまたは請求項15もしくは請求項16に記載の組成物を投与するステップを含む、グルコース恒常性を促進する;低血糖を阻害する;肝細胞腺腫(HCA)の発症を阻害するもしくは予防する;肝細胞癌(HCC)の発症を阻害するもしくは予防する;または腎臓の機能障害もしくは不全を阻害するもしくは予防する方法。
- G6Pase−αの欠乏を有する前記被験体がGSD−Iaを有する、請求項18に記載の方法。
- 前記rAAVを静脈内に投与する、請求項17から19までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVを約1×1010から約1×1014ウイルス粒子(vp)/kgの用量で投与する、請求項17から20までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVを投与するステップが単回用量のrAAVの投与を含む、請求項17から21までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記rAAVを投与するステップが複数回用量のrAAVの投与を含む、請求項17から21までのいずれか一項に記載の方法。
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