JP7059285B2 - ムコ多糖症の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

Description

DSMZ DSM 32345

本発明は、目的のタンパク質の発現と遺伝子治療におけるこれらの利用のために有用なポリヌクレオチドとベクターに関する。本発明はまた、ムコ多糖症（ＭＰＳ）の治療、特にムコ多糖症ＩＩＩ－Ｄ型すなわちサンフィリッポＤ症候群の治療に役立つ、ベクターおよび核酸配列に関する。

リソソームは動物細胞の細胞質に見出される細胞小器官であり、使い古された細胞成分のリサイクル中またはウイルスやバクテリアの貪食後に、生体分子を分解する５０以上の加水分解酵素を含む。この細胞小器官は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼおよびスルファターゼなどの何種類かの加水分解酵素を含む。すべての酵素は酸性加水分解酵素である。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、１つまたは複数のリソソーム酵素に影響を与える遺伝的欠陥によって引き起こされる。これらの遺伝病は、一般的にはリソソームに存在する特定の酵素活性の不足から生じる。より少ない場合においてであるが、これらの疾患は、リソソーム生合成に関与するタンパク質の不足によるものであり得る。

ＬＳＤは個々人レベルではまれであるが、集団としてはこれらの疾患は、一般の人口集団において比較的に一般的である。ＬＳＤの合計有病率は、生児出生５，０００人あたり約１人である。しかしながら、一般の人口集団内で、ＬＳＤの高発症に特に悩まされる集団がいくつか存在する。例えば、中央ヨーロッパおよび東ヨーロッパのユダヤ人（アシュケナジ）の子孫におけるゴーシェ病およびテイ－サックス病の有病率は、それぞれ、出生６００人に１人、出生３，９００人に１人である。

ムコ多糖症（ＭＰＳ）は、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）の代謝に関与する特定のリソソーム酵素の欠如または不足により特徴づけられる７つの型（Ｉ～ＶＩＩ）のＬＳＤ疾患のグループである。すべてのＭＰＳは、Ｘ染色体に関連した遺伝形質を有するＭＰＳＩＩ（ハンター症候群）を除いて、常染色体劣性遺伝の様式を有する。

７つのＭＰＳのうち、ムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ型すなわちサンフィリッポ症候群）が最も一般的であり、その報告された出生時有病率は１００，０００人あたり０．２８人から４．１人の範囲である。この症候群は、ＧＡＧヘパラン硫酸（ＨＳ）の分解に関与する酵素の１つが不足することによって引き起こされる。サンフィリッポの４つの亜型、Ａ型（ＭＰＳＩＩＩ－Ａ）、Ｂ型（ＭＰＳＩＩＩ－Ｂ）、Ｃ型（ＭＰＳＩＩＩ－Ｃ）、Ｄ型（ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ）が定義されており、それぞれは異なる酵素の不足によって引き起こされる。これらの酵素をコードする遺伝子は同定されており、種々の突然変異が報告されている。

ＭＰＳＩＩＩ型は、酵素Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ（ＧＮＳ、ＥＣ ３．１．６．１４）の活性の不足によって引き起こされる。ＧＮＳは、ＨＳのＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン６－硫酸単位の６－硫酸基の加水分解を触媒する。非分解性ＨＳの継続的蓄積の結果として、進行性の細胞損傷が起こり、多系統性疾患を生じさせる。ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型は、既知のＭＰＳで最も稀な形態で、これまでのところ３１人の患者が文献に記載されているだけである。ＧＮＳ酵素の活性の不足へと導く、２２の異なる突然変異がヒトＧＮＳ遺伝子において同定されている。

ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型の患者は、進行性の中枢神経系（ＣＮＳ）変性および比較的軽度の身体的疾患を特徴とする、サンフィリッポ症候群の臨床症状の一般的なパターンに従っているようである。初期の正常な発達の期間の後、病気の最初の徴候は通常、発話と発育の遅延という形態で現れる。これに続いて、精神運動スキルの進行的な喪失、言語障害、落ち着きのない行動、多動性、睡眠障害、環境との接触喪失、および精神遅滞などを含む、乳児期におけるその他の症状が出現する。神経学的症状に加えて、上気道感染症、多毛症、大頭症、肝肥大、関節可動性の低下、粗野な顔貌などの他の非神経学的併存疾患もＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型患者に共通している。最終的には、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型は寝たきりの段階に到る。疾患の進行速度および存在する表現型の特徴は患者間で大きく異なり、報告された平均余命は１４年という短い期間から３０代までの範囲にわたる。こうした変動の大きさは、突然変異の性質、民族性、または患者が受け取る健康管理サービスの違いなど、複数の要因に関連している可能性がある。

これまでのところ、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型に対する具体的な治療法はなく、この疾患の管理は対症的であり、患者とその家族の生活の質の向上を目指すものとなっている。その他のＭＰＳに関しては、ここ数年で２つの主要な治療の選択肢が利用可能となった。それは酵素補充療法（ＥＲＴ）と造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。両方の治療戦略の設計は通過矯正（ｃｒｏｓｓ－ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）の可能性に依存しており、すなわち正常細胞がＧＮＳのようなマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）タグ付き可溶性リソソーム酵素を有意な量分泌し、この酵素が細胞膜上のＭ６Ｐ受容体を介して他の細胞による細胞外区画から次いで取り入れられ、リソソームを標的とするという事実に基づいている。さらに、残留酵素活性の閾値が存在し、それは一般的には非常に低く、それを超えると、細胞は基質流入に対応することができ、そして対象は疾患によって影響されず、このことは正常な活性の回復が臨床経過を変更するための必須条件ではないことを示唆する。

ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型のために、ＥＲＴが、この疾患のヤギモデルにおいて試験された。非特許文献１：Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔａｒｙ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９２；１５（５）：７６０－８．を参照されたい。 この研究では、投与量１ｍｇ／ｋｇの組換えヤギＧＮＳ（ｒｃＧＮＳ）を、２、３および４週齢のＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型ヤギに静脈内投与した。最後の投与から５日後、リソソーム貯蔵液胞とウロン酸（ＧＡＧ ＨＳの構成成分）量の顕著な減少が肝臓において観察され、ｒｃＧＮＳの注入による体細胞の矯正を証明した。形態学的研究およびウロン酸の定量化は、ＣＮＳにおける改善を示さなかった。この研究とは別に、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型に対するＥＲＴの効力についての他の研究は今日まで行われていない。

ヒト組換え酵素を有するＥＲＴは、ＭＰＳ Ｉ型、ＩＩ型およびＶＩ型について市販されている。報告されているＥＲＴの恩恵には、酵素を静脈内に注入したときの、尿中ＧＡＧ排泄の減少に伴う関節運動性、歩行能力、肺および呼吸機能の改善、ならびに肝臓および脾臓の体積の改善が含まれる。しかしながら、注入されたタンパク質に対する過敏症のため、静脈内製剤投与中において、医療上のサポートが利用可能でなければならないこれらの患者の生活を、危険にさらす可能性があるアナフィラキシー反応には、呼吸困難、低酸素、低血圧、じんま疹、および／または喉または舌の血管浮腫が含まれ、蘇生または緊急気管切開などの介入、そして吸入β－アドレナリンア作用薬、エピネフリンまたは静脈内コルチコステロイドによる治療を必要とすることがある。ＥＲＴの他の欠点としては、以下の３点が挙げられる。１）小児患者において１－３時間長の静脈内注入を行うことが困難であり、その多くは精神疾患に罹患していること。２）未だ臨床的に重要性が不明の酵素に対する抗体について患者が陽性となり得るが、それは長期における製品の有効性を制限する可能性があるという事実。３）在宅ケアのコストも含まれた治療コストの高さ。安全性の懸念または費用に関わりなく、推奨用量では、酵素が血液脳関門（ＢＢＢ）を効率的に通過しないので、静脈内ＥＲＴはＭＰＳ神経疾患を改善することができない。

ＥＲＴの静脈内送達の代替案として、ＣＮＳに直接到達するために、脳脊髄液（ＣＳＦ）に外因性酵素を供給することがある。ＭＰＳＩＩＩ－Ａ型の動物モデルにおける実験は、髄腔内への組換え酵素の投与が脳組織を貫通し、リソソーム貯蔵物質のクリアランスを促進し、そして行動を改善し得ることを示した。髄腔内酵素送達を試験するための臨床試験が、ＭＰＳＩＩＩ－Ａ型（ＮＣＴ０１１５５７７８）およびＭＰＳＩＩ型（ＮＣＴ００９２０６４７）について実施されている。髄腔内ＥＲＴの潜在的な利点にもかかわらず、治療するのに必要な永久的な髄腔内薬物送達装置の移植は、相当なリスクと欠点に関連しており、治療自体は、患者／年あたりで、経済的コストが非常に高い。

骨髄由来幹細胞を用いた造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）（骨髄移植、ＢＭＴ）は、他のＭＰＳ型患者の体性および神経性の両方の病状の治療に有効であることが証明されている。ＨＳＣＴによる矯正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）の根底にある原理は、ドナー単球がＢＢＢにおいても毛細血管壁を通過する（ｃｒｏｓｓ）ことができ、その後それらは組織マクロファージ、ＣＮＳの場合はミクログリアに分化し、そして様々な細胞への送達のために欠乏酵素を分泌することである。しかしながら、骨髄移植は、ＭＰＳＩＩＩ型患者において、症状が出る前の段階で治療されたとしても不成功であることが証明されており、この疾患に対する治療選択肢とはみなされていない。臍帯血由来幹細胞移植に関しては、このアプローチがＭＰＳＩＩＩ患者における変性からＣＮＳの保護をもたらすかどうかはまだ不明である。

基質枯渇療法（ＳＤＴ）は、ＧＡＧ合成速度を低下させることを目的としているので、残留活性が残っている場合、これは、ＧＡＧの過剰蓄積を防ぐために、または少なくとも蓄積速度を遅くするために、十分であり得る。大豆イソフラボンであるゲニステインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のキナーゼ活性を低下させることにより、ＨＳ産生の阻害剤として作用することが示唆されている。非特許文献２；Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． ２００６；１４（７）：８４６－５２．を参照されたい。最近の研究は、ゲニステインが種々のムコ多糖症（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ－Ａ型およびＩＩＩ－Ｂ型）に罹患している患者の線維芽細胞におけるＧＡＧの合成を阻害することを示している。Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋａ ，ｅｔ ａｌ．、前出（非特許文献２）を参照されたい。静脈内に投与される場合、ゲニステインはＢＢＢを通過する（ｃｒｏｓｓ）ことが可能であり、ＣＮＳ病態の治療を可能にすることが期待される。この概念を支持して、ゲニステイン強化大豆抽出物を５人のＭＰＳＩＩＩ－Ａ型患者と５人のＭＰＳＩＩＩ－Ｂ型患者に１２ヶ月間投与した非盲検パイロット試験は、体性と神経学的パラメータの両方の著しい改善をもたらした。しかしながら、その後の研究では、ＭＰＳＩＩＩ－Ａ型患者、ＭＰＳＩＩＩ－Ｂ型患者、およびＭＰＳＩＩＩ－Ｃ患者に１２ヶ月間ゲニステインを投与した後の、障害スケールや行動スコアの改善は示されていない。

ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型患者に対する現在の治療選択肢の限界を考慮すると、別のアプローチが必要とされる。インビボ遺伝子治療は、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型および他の遺伝性疾患に対するワンタイムでの治療の可能性を提供し、生涯にわたる有益な効果の見込みを有する。

特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを介した遺伝子導入は、これらベクターの高い形質導入効率と病原性の欠如のために、多くのインビボ遺伝子治療応用のために選択されるアプローチとして急速に浮上している。ＡＡＶベクターは有糸分裂後細胞を形質導入することができ、いくつかの前臨床的研究および臨床研究は、様々な疾患について、治療用導入遺伝子の持続的発現を効率的に推進するためのＡＡＶベクター媒介遺伝子導入の可能性を実証した。

ＡＡＶの使用に基づくいくつかの遺伝子治療アプローチは、ＭＰＳＩＩＩ型のマウスモデルにおいて、疾患を改善するのに有効であることが証明されている。これらの症候群の強力な神経変性成分を考慮すると、最も関連性のある研究は、ＣＮＳに治療ベクターを送達することに焦点を当てている。マンニトールでＢＢＢを透過させるための前処理の後、ＭＰＳＩＩＩ－Ｂ型のマウスモデルへのＮ－アセチルグルコサミニダーゼアルファ（ＮＡＧＬＵ）をコードするＡＡＶ２ベクターの単回静脈内注入は、有意に延長された生存、改善された行動成績、および脳リソソーム病理の減少をもたらしたが、体性病理の部分的な矯正が達成されたにすぎなかった。非特許文献３：ＭｃＣａｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；１６（１１）：１３４０－５２．を参照されたい。ＢＢＢを通過することができる静脈内投与されたＡＡＶ９ベクターは、最近、酵素活性の増加と、ＣＮＳおよび体器官におけるリソソーム蓄積病理の矯正を促進することに効果があり、ＭＰＳＩＩＩ－Ａ型およびＭＰＳＩＩＩ－Ｂ型マウスモデルにおいて改善された行動成績および寿命の延長をもたらすことが証明された。ＣＮＳの矯正を達成するのに必要な用量は一般に非常に高いにもかかわらず、末梢肢静脈に投与されたＡＡＶ９を用いたＭＰＳＩＩＩ－Ａ型についての第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が現在進行中である（ＮＣＴ０２７１６２４６）。

ＣＮＳに到達するための代替法は、脳実質へのＡＡＶの直接投与である。脳へのＡＡＶベクターの定位固定投与は、ＭＰＳＩＩＩ型のマウスモデルおよびイヌモデルにおいて試験されている。注射部位からのＡＡＶの拡散が制限されるため、このアプローチではベクターの生体内分布を改善するために複数回の注射を必要とする。ＮＡＧＬＵをコードするＡＡＶ５ベクターの４回の注射で処置したＭＰＳＩＩＩ－Ｂ型イヌの脳全体に酵素活性が検出されたにもかかわらず、リソソーム病変は改善されたが完全に矯正されなかったことから、このアプローチで達成された酵素活性のレベルはＧＡＧ保存に対処するには不十分であることが示された。スルファミダーゼおよびスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）をコードするＡＡＶｒｈ１０ベクターで処置したＭＰＳＩＩＩ－Ａ型マウスは、改善されたヘパラン硫酸異化作用および減少した炎症の徴候を示したが、それは注入点に制限された領域、または注入点の近傍領域のみにおいてであった。非特許文献４：Ｔａｒｄｉｅｕ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１４；２５（６）：５０６－１６．を参照されたい。これらの制限にもかかわらず、２つの臨床試験が、それぞれＡＡＶｒｈ１０ベクターとＡＡＶ５ベクターを使用してＭＰＳＩＩＩ－Ａ型（ＮＣＴ０２０５３０６４）とＭＰＳＩＩＩ－Ｂ型（ＩＳＲＣＴＮ１９８５３６７２）のために行われている。脳が大きくなればなるほど、実質内注射で器官の全容積をカバーすることがより困難になり、ヒトへの送達はいくつかの部位でのベクター投与を必要とし、これにより送達が技術的に困難になり、特定の外科処置の開発が必要となる。

ＭＰＳＩＩＩ型の他の形態のためにはいくつかの治療戦略が開発されているにもかかわらず、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型には上記のアプローチはいずれも適用されていない。従って、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型を治療するための新規なアプローチが必要とされている。

トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔａｒｙ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９２；１５（５）：７６０－８． ピオトロウスカ Ｅ（Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋａ Ｅ）ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． ２００６；１４（７）：８４６－５２． マッカーティ（ＭｃＣａｒｔｙ）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９；１６（１１）：１３４０－５２． ターディユ Ｍ（Ｔａｒｄｉｅｕ Ｍ）ら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１４；２５（６）：５０６－１６．

本発明は、ムコ多糖症、特にムコ多糖症ＩＩＩ－Ｄ型（ＭＰＳＩＩＤ）、すなわちサンフィリッポＤ症候群の治療のための新規ポリヌクレオチドおよびベクターを提供する。

第１の態様では、本発明は、発現カセットを含むポリヌクレオチドに関し、ここで前記発現カセットは、ＧＮＳタンパク質またはその機能的に等価な変異体をコードするヌクレオチド配列に作用的に連結された転写調節領域を含む。

第２の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含有する新規ベクターを提供する。特定の実施形態では、前記ベクターは、ムコ多糖症ＩＩＩ－Ｄ型を治療するための新規の組換えベクターである。前記組換えベクターは、特にアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターの治療有効量を含む医薬組成物に関する。

さらに、本発明のさらなる態様は、薬剤として使用するための、特にムコ多糖症ＩＩＩ－Ｄ型の治療のための、本発明のポリヌクレオチドもしくは本明細書に記載のベクター、または本明細書に記載の医薬組成物に関する。

本発明はまた、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターの製造方法を提供する。

ｐＡＡＶ ＣＡＧ ｈＧＮＳおよびＡＡＶ９ＣＡＧ ｈＧＮＳの生成を示す。（Ａ）は、プラスミドｐＡＡＶ ＣＡＧ ｈＧＮＳおよびその成分の概略図である。（Ｂ）は、ｈＧＮＳコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－バージョン１（ｖｅｒｓｉｏｎ１）およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１の生成を示す。（Ａ）は、プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１およびその成分の概略図である。（Ｂ）は、ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２の生成を示す。（Ａ）は、プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２およびその成分の概略図である。（Ｂ）は、ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３の生成を示す。（Ａ）は、プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３およびその成分の概略図である。（Ｂ）は、ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの生成を示す。（Ａ）は、プラスミド ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳおよびその成分の概略図である。（Ｂ）は、ｏｍＧＮＳ コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの概略図である。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２、およびｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３のインビトロ試験を示す。４μｇのｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖ１、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖ２またはｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖ３によるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを示す。（Ａ）は、異なる構築物からのＧＮＳの発現の定量的ＲＴ－ＰＣＲ定量化を示す。（Ｂ）および（Ｃ）は、異なる発現カセットによって媒介された培地または細胞抽出物中のＧＮＳ活性のレベルの比較を示す。値は、条件当たり３ウェルの平均値±ＳＥＭ（標準誤差）である。ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳによりトランスフェクトした細胞に対して＊ Ｐ＜０．０５、＊＊＊ Ｐ＜０．００１。「ＮＴ」はトランスフェクトされていないことを示す。 ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型マウスへのＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２、またはＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３の静脈内注射を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、野生型（健康）マウス（ＷＴ）、無処置Ｇｎｓ^－／－マウス、およびＡＡＶ９－ＣＡＧ ｈＧＮＳ、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２、またはＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３ベクターの１ｘ１０^１０個のベクターゲノムを、尾静脈注射を介して投与されたＧｎｓ^－／－マウスの肝臓および血清におけるＧＮＳ活性を示す。（Ｃ）は、（Ａ）におけるのと同じコホート（ｃｏｈｏｒｔｓ）の肝臓におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化を示す。値は、１群あたり２～５匹の動物の平均値±ＳＥＭである。血清については、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１に対してｎ＝１。ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳで処置したＧｎｓ^－／－マウスに対して＊ Ｐ＜０．０５、＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。野生型（健康な）マウス（ＷＴ）、無処置Ｇｎｓ^－／－マウスおよび５ｘ１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９Ｎｕｌｌ）またはＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳを、槽内（ＩＣ）注射を介して、ＣＳＦ中に投与されたＧｎｓ^－／－マウスの脳におけるＧＮＳ活性を示す。ＷＴ ＧＮＳ活性は１００％に設定された。値は、１群あたり４～５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－マウスに対して＊ Ｐ＜０．０５である。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄マウスへのＣＳＦ内送達を示す。（Ａ）は、野生型（健康）マウス（ＷＴ）および、未処置のＧｎｓ^－／－雄マウスおよび、５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９－ヌル（Ｎｕｌｌ））または５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳのいずれかを大槽に投与されたＧｎｓ^－／－雄マウスにおける脳の異なる部分（切片Ｉ－Ｖ）におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化を示す。（Ｂ）は、（Ａ）と同じ動物のコホートにおけるリソソームマーカーＬＡＭＰ－２についての染色後の脳の異なる領域において得られたシグナル強度の定量化を示す。（Ｃ）は、（Ａ）と同じ動物のコホートから得られた脳抽出物中の他のリソソーム酵素の活性を示す。ＩＤＵＡ、イズロニダーゼ、α－Ｌ－、ＧＡＬＮＳガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、ＧＵＳＢ、グルクロニダーゼ、β、Ｂ－ＨＥＸＯ、ヘキソサミニダーゼＢ。値は１群あたり４～５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－ 雄マウスに対して＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄へのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。６ヶ月齢の健康な野生型（ＷＴ）雄性マウスおよびＡＡＶ９－ヌル（Ｎｕｌｌ）またはＡＡＶ９－Ｇｎｓベクターのいずれかの５ｘ１０^１０ｖｇを２ヶ月齢で注射されたＧｎｓ－／－同腹仔の大脳皮質の超微細構造分析を示す。治療用ベクターの送達は、拡大されたリソソーム（白矢印で示される）の神経周囲グリア細胞（星印で示される）を完全に除去した。スケールバー：１０μｍ。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄へのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。（Ａ、Ｂ）ヒストグラムは、野生型（健康な）および、５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ－ｎｕｌｌ）または５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳを大槽内に投与したＧｎｓ－／－雄マウスからの前頭皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、上丘、および視床の切片における、星状細胞マーカーＧＦＡＰ（Ａ）およびミクログリアマーカーＢＳＩ－Ｂ４（Ｂ）についての、免疫染色後に測定されたシグナル強度を表す。結果は１群あたり５匹のマウスの平均値±ＳＥＭとして示す。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－雄マウスに対して＊＊ Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。野生型（健康な）マウス、無処置Ｇｎｓ^－／－マウスおよび５ｘ１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌ）またはＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳを、槽内（ＩＣ）注射を介して、ＣＳＦ中に投与されたＧｎｓ^－／－マウス肝臓におけるＧＮＳ活性を示す。ＷＴ ＧＮＳ活性は１００％に設定された。値は、１群あたり４～５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－ マウスに対して＊＊＊ Ｐ＜０．００１である。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。６ヶ月齢の雄マウス、すなわちＧＮＳ欠乏動物のＣＳＦへのＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳまたはＡＡＶ９Ｎｕｌｌのいずれかの５ｘ１０^１０ｖｇの送達の４ヶ月後、におけるＷＴ活性の％として表される循環中のＧＮＳ活性を示す。年齢を合わせた未処置Ｇｎｓ^－／－マウスも対照として使用した。ＷＴ ＧＮＳ活性は１００％に設定された。値は、１群あたり４～５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－ マウスに対して＊＊＊ Ｐ＜０．００１である。値は１群あたり５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／－ 雄マウスに対して＊＊＊ Ｐ＜０．００１。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。（Ａ）は、野生型（健康）マウス（ＷＴ）および、未処置のＧｎｓ^－／－ 雄マウスおよび、５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９－ｎｕｌｌ）または５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳのいずれかを大槽に投与されたＧｎｓ^－／－雄マウスからの体器官におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化を示す。（Ｂ）は、（Ａ）と同じ動物のコホートから得られた肝臓抽出物中の他のリソソーム酵素の活性を示す。ＩＤＵＡ、イズロニダーゼ、α－Ｌ－、ＳＧＳＨ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ＮＡＧＬＵ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、α、ＨＧＳＮＡＴ、ヘパラン－α－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、ＧＡＬＮＳガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、ＧＵＳＢ、グルクロニダーゼ、ベータ、Ｂ－ＨＥＸＯ、ヘキソサミニダーゼＢ。ＷＴ酵素活性は１００％に設定された。値は、１群あたり４～５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－ 雄マウスに対して＊ Ｐ＜０．０５，＊＊ Ｐ＜０．０１，＊＊＊ Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊ Ｐ＜０．０００１である。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。野生型（健康な）、無処置Ｇｎｓ－／－雄マウス、および５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌ）または５ｘ１０^１０ｖｇのＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳベクターを２ヶ月齢でＣＳＦ中に投与し４ヶ月後に分析した場合のＧｎｓ^－／－雄マウス、における全体重に対する肝臓（Ａ）および脾臓（Ｂ）の湿潤重量を示す。値は、ｎ＝８～１３動物（匹）／群の平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／－ 雄マウスに対して＊＊＊ Ｐ＜０．００１。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。６ヶ月齢の健康なＷＴおよび５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９Ｎｕｌｌ）または等量の最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするベクターのいずれかをＣＳＦ投与したＧｎｓ^－／－雄から採取した臓器の肝細胞（肝臓）および繊毛気管支細胞（肺）の微細構造の透過型電子顕微鏡による分析を示す。拡大されたリソソームは矢印で示されている。スケールバー：肝臓、１０μｍ。肺、５μｍ。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。短期研究。素朴な野生型（健康な）、無処置Ｇｎｓ－／－雄マウス、および５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌ）または５ｘ１０^１０ｖｇのＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳベクターを２ヶ月齢でＣＳＦ中に投与し４ヶ月後に分析した場合のＧｎｓ^－／－雄マウス、において、オープンフィールド試験による一般的な自発運動および探索的活動の評価を示す。移動した総距離および休止した時間結果は平均±ＳＥＭ、群あたりｎ＝１５～１８動物（匹）として示される。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。長期研究。（Ａ）は、野生型（健康な）マウス（ＷＴ）および、未処置のＧｎｓ^－／－ 雄マウス、および５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９－ｎｕｌｌ）または５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳのいずれかを大槽に投与されたＧｎｓ^－／－雄マウスにおける脳の異なる部分（切片Ｉ－ＩＶ）におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化を示す。マウスを２ヶ月齢で処置し、１０ヶ月後に分析した。値は、１群当たり５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。（Ｂ）は、ヒストグラムは、リソソームマーカーＬＡＭＰ－２を認識する抗体で脳切片を染色した後の脳の異なる領域で得られたシグナル強度を表す。値は、１群あたり３～５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－ 雄マウスに対して＊ Ｐ＜０．０５，＊＊ Ｐ＜０．０１，＊＊＊ Ｐ＜０．００１である。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。長期研究。（Ａ、Ｂ）は、野生型（健康な）および、５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ－ｎｕｌｌ）または５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳを２ヵ月齢で大槽内に投与し、１０ヵ月後に分析したＧｎｓ－／－雄マウスからの前頭皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、上丘、および視床の切片における、星状細胞マーカーＧＦＡＰ（Ａ）およびミクログリアマーカーＢＳＩ－Ｂ４（Ｂ）についての免疫染色後に測定されたシグナル強度の定量化を示す。結果は、１群あたり３～５匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－ 雄マウスに対して＊ Ｐ＜０．０５，＊＊ Ｐ＜０．０１，＊＊＊ Ｐ＜０．００１。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。長期研究。（Ａ）は、野生型（健康）マウス（ＷＴ）および、未処置のＧｎｓ^－／－ 雄マウスおよび、５×１０^０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９－ｎｕｌｌ）または５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳのいずれかを大槽に投与されたＧｎｓ^－／－雄マウスからの体器官におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化を示す。マウスを２ヶ月齢で処置し、１０ヶ月後に分析した。（Ｂ）は、（Ａ）と同じ動物のコホートから得られた肝臓抽出物中の突然変異によって影響されないリソソーム酵素の活性を示す。ＩＤＵＡ、イズロニダーゼ、α－Ｌ－、ＳＧＳＨ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ＮＡＧＬＵ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、α、ＨＧＳＮＡＴ、ヘパラン－α－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、ＧＡＬＮＳガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、ＧＵＳＢ、グルクロニダーゼ、ベータ、Ｂ－ＨＥＸＯ、ヘキソサミニダーゼＢ。ＷＴ 酵素活性は１００％に設定された。値は、１群あたり４～８匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌで処置したＧｎｓ^－／^－ 雄マウスに対して＊ Ｐ＜０．０５，＊＊ Ｐ＜０．０１，＊＊＊ Ｐ＜０．００１である。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。長期研究。素朴な野生型（健康な）、無処置Ｇｎｓ－／－雄マウス、および５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９Ｎｕｌｌ）または５ｘ１０^１０ｖｇのＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳベクターを２ヶ月齢でＣＳＦ中に投与し１０ヶ月後に分析した場合のＧｎｓ^－／－雄マウスの、自発運動および探索的活動のオープンフィールド評価を示す。移動した総距離、休止時間および後ろ足立ち回数。結果は、１群あたり５～１５動物（匹）の平均値±ＳＥＭである。Ｇｎｓ^－／－ 雄マウスに対して＊ Ｐ＜０．０５。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。長期研究。野生型（健康な）マウス（ＷＴ）および５ｘ１０^１０ｖｇのＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳを、槽内（ＩＣ）注射を介して、ＣＳＦ中に投与されたＧｎｓ^－／－マウスの脳におけるＧＮＳ活性を示す。ＷＴ ＧＮＳ活性は１００％に設定された。活性は２２ヶ月齢で、すなわちベクター投与後２０ヶ月で分析した。値は、１群当たり４匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。長期研究。（Ａ）は、野生型（健康な）マウス（ＷＴ）およびＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳベクターの５ｘ１０^１０個のベクターゲノムを大槽内に投与されたＧｎｓ^－／－雄マウスの、脳中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量を示す。ベクター送達の２０ヶ月後に分析を実施した。（Ｂ）は、（Ａ）と同じ動物のコホートにおけるリソソームマーカーＬＡＭＰ－２についての染色後の脳の異なる領域におけるシグナル強度の定量化を示す。（Ｃ）は、（Ａ）と同じ動物のコホートから得られた脳抽出物中の他のリソソーム酵素の活性を示す。ＧＡＬＮＳガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、ＧＵＳＢ、グルクロニダーゼ、ベータ、Ｂ－ＨＥＸＯ、ヘキソサミニダーゼＢ値は、１群当たり４匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。長期研究。野生型（健康）およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターの５×１０^１０ベクターゲノムを大槽に投与され、２０ヶ月後に分析されたＧｎｓ^－／－ 雄マウスからの脳切片における神経炎症の評価を示す。ヒストグラムは、前頭皮質、頭頂葉皮質、後頭皮質、上丘、および視床の切片における、星状細胞マーカーＧＦＡＰ（Ａ）およびミクログリアマーカーＢＳＩ－Ｂ４（Ｂ）のシグナル強度を表す。結果は、１群当たり４匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。長期研究。野生型（健康）マウスおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターの５×１０^１０個のベクターゲノムを２ヶ月齢で大槽に投与されたＧｎｓ^－／－ 雄マウスからの体器官におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量化を示す。結果は、１群当たり４匹のマウスの平均値±ＳＥＭである。 最適化されたマウスＧＮＳ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ）をコードするＡＡＶ９ベクターのＣＳＦ内送達を示す。野生型（健康な）、無処置Ｇｎｓ^－／－雄マウス、および５×１０^１０ｖｇの対照ベクター（ＡＡＶ９－Ｎｕｌｌ）または５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターを２ヶ月齢で投与したＧｎｓ－／－雄マウスにおける、ＷＴについてはｎ＝２０、無処置Ｇｎｓ^－／－ マウスについてはｎ＝１９、ＡＡＶ９－ヌル注入Ｇｎｓ^－／－ マウスについてはｎ＝１９、およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ－注入Ｇｎｓ^－／－ マウスについてはｎ＝２０での、生存率のカプラン－マイヤー分析を示す。

〔微生物の寄託〕
プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ（配列番号５）、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１（配列番号６）、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号７）およびｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３（配列番号８）は、２０１６年７月２１日にそれぞれアクセス番号ＤＳＭ ３２３４２、ＤＳＭ ３２３４３、ＤＳＭ ３２３４４、およびＤＳＭ ３２３４５で、それぞれ、ＤＳＭＺ（ドイツ連邦共和国ブラウンシュヴァイクＤ－３８１２４インホフェンシュトラーセ７ Ｂドイツの微生物と細胞培養のコレクション）に寄託された。

［ＤＳＭ ３２３４２寄受託証の写し］

［ＤＳＭ ３２３４３寄受託証の写し］

［ＤＳＭ ３２３４４寄受託証の写し］

［ＤＳＭ ３２３４５寄受託証の写し］

〔定義〕
「ヌクレオチド配列」または「単離されたヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、それぞれデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、をいう。核酸は、二本鎖もしくは一本鎖であり得るし、または二本鎖配列もしくは一本鎖配列の両方の部分を含むものであり得る。

「配列同一性％」、「同一性％」または「配列相同性％」という用語は、配列を整列させて最大配列同一性％を達成した後、参照配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である候補配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の百分率を指す。好ましい実施形態では、配列同一性は、２つの与えられた配列番号の全長に基づいて、またはその一部に基づいて計算される。配列同一性％は、ＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムなどの当技術分野において確立されている任意の方法またはアルゴリズムによって決定することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９７７；２５：３３８９－３４０２ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０；２１５：４０３－４１０．を参照されたい。

任意選択的に、アミノ酸類似性の程度を決定する際に、これは当業者に明らかであるように、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることもできる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性に基づいている。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群には、セリンおよびトレオニンが含まれる。アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群には、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。芳香族側鎖を有するアミノ酸の群には、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンが含まれる。塩基性側鎖を有するアミノ酸の群には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群には、システインおよびメチオニンが含まれる。本明細書に開示されたアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、そしてその場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存的置換は以下の通りである。ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｉｎまたはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａ；ＧｉｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎまたはＧｉｎ；Ｈｅ から Ｌｅｕ または Ｖａｌ；Ｌｅｕ から Ｈｅ または Ｖａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｉｎからＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕまたはＨｅ；ＰｈｅからＭｅｔまたはＬｅｕまたはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；Ｔｈｒ から Ｓｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；Ｔｙｒ から Ｔｒｐ または Ｐｈｅ；Ｖａｌ から Ｈｅ または Ｌｅｕ。

「コード化する」（ｃｏｄｉｆｙ）または「コードする」（ｃｏｄｉｎｇ）という用語は、ヌクレオチド配列がポリペプチドまたはタンパク質にどのように翻訳されるかを決定する遺伝暗号を指す。配列中のヌクレオチドの順序は、ポリペプチドまたはタンパク質に沿ったアミノ酸の順序を決定する。

「タンパク質」という用語は、アミノ酸またはポリペプチドの１つまたは複数の直鎖から構成される巨大分子を意味する。タンパク質は、システイン残基の３－ｏｘｏａｌａｎｉｎｅへの変換、グリコシル化または金属結合のような翻訳後修飾を受けることができる。タンパク質のグリコシル化とは、アミノ酸鎖に共有結合的に連結されるさまざまな炭水化物を付加することである。

「転写調節領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、１つまたは複数の遺伝子の発現を調節することができる核酸断片を指す。本発明のポリヌクレオチドの調節領域は、ＲＮＡポリメラーゼ結合を補助し、発現を促進する転写因子の結合のためのプロモーター、加えて応答エレメント、アクチベーターおよびエンハンサー配列を、ならびに、ＲＮＡポリメラーゼ付着をブロックし、発現を防止するためにリプレッサータンパク質が結合するオペレーターまたはサイレンサー配列を含み得る。

「プロモーター」という用語は、１つまたは複数のポリヌクレオチドの転写を制御するように機能する核酸断片として理解されなければならず、それは例えばポリヌクレオチド配列の５’上流に配置され、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位、転写開始部位、ならびに以下に限られないが転写因子、リプレッサーおよびプロモーターからの転写の量を調節するために直接または間接的に作用する当該分野で公知の任意の他のヌクレオチド配列、に対する結合部位の存在によって構造的に同定されるコード配列である。

ＲＴ－ｑＰＣＲまたはノーザンブロッティング（転写物の検出）のような適切なアッセイを用いて目的のヌクレオチド配列に作用的に連結されたプロモーターを含む遺伝子構築物を用いて発現系においてヌクレオチド配列の転写を開始することができる場合、前記プロモーターは活性であると言われるかまたは前記プロモーターはそれに作用可能に連結された前記ヌクレオチド配列の発現を駆動すると言われる。前記プロモーターの活性はまた、ウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡなどの、コードされたタンパク質についての適切なアッセイを用いてタンパク質レベルで評価され得る。転写物を検出することができる場合、または構築物が前記プロモーターを含まないという点でのみ異なる構築物を使用する転写と比較して、転写物もしくはタンパク質レベルの増加が少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％、１５００％または２０００％であることが見出される場合、プロモーターは転写を開始することができると言われる。

「構成的」プロモーターという用語は、ほとんどの生理学的および発生的条件下で活性であるプロモーターを指す。「誘導性」プロモーターは、生理学的条件または発生条件に応じて調節されることが好ましいプロモーターである。誘導性プロモーターは、薬物送達後または光曝露後に活性であり得る。したがって、「構成的」プロモーターは、「誘導性」プロモーターの意味においては調節されない。「組織特異的」プロモーターは、特定の種類の細胞／組織において活性であることが好ましい。「組織特異的」プロモーターとは対照的に、本発明の文脈において使用されるプロモーターは「遍在的」プロモーターである。遍在的プロモーターは、多くのまたは任意の異なる組織において活性であるプロモーターとして定義され得る。通常、この文脈で「多くの」とは、組織が、５より多い、もしくは少なくとも６、１０、１５、２０の、または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０の異なる組織においてであることを意味する。

「ＣＡＧ」プロモーターという用語は、ニワトリβ－アクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサーを含むプロモーターをいう（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ Ａ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００８； ９（２）：１－１１）。より正確には、上記ＣＡＧプロモーターは、以下を含む。（ｉ）サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素、（ｉｉ）ニワトリβ－アクチンプロモーター、（ｉｉｉ）ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１イントロン、（ｉｖ）ウサギβ－グロビン遺伝子のイントロン２／エクソン３。

「作用可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子に対するプロモーター配列の機能的関係および位置を指す（例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に作用可能に連結されている）。一般に、作用可能に連結されたプロモーターは、目的の配列に隣接している。しかしながら、エンハンサーは、発現を制御するために、目的の配列に隣接している必要はない。

「転写後調節領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、カセットまたは得られる遺伝子産物に含まれる配列の発現、安定化、または局在化を促進する任意のポリヌクレオチドを指す。

「ベクター」という用語は、本明細書中で使用される場合、目的の１つまたは複数のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができ、任意選択で発現させることができる構築物を指す。ベクターの例としては、これらに限定されないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの特定の真核細胞、が挙げられる。ベクターは安定であり得、そして自己複製的であり得る。使用することができるベクターの種類に関しては、限定されない。ベクターは、増殖に、そしていくつかの異種生物に組み込まれたポリヌクレオチド、遺伝子構築物または発現ベクターを得るのに適したクローニングベクターであり得る。適切なベクターとしては、原核生物発現ベクター（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体）、ｍｐｌ８、ｍｐｌ９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥＬ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４、ファージおよびシャトルベクター（例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８）、およびウイルスベクターに基づく真核生物発現ベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ならびにレトロウイルスおよびレンチウイルス）、ならびに非ウイルスベクターとしてｐサイレンサー４．１－ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州カールズバッド）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐｌＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ－ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣｌ、ｐＳＶＬとｐＫＳＶ－１０、ｐＢＰＶ－ｌ、ｐＭＬ２ｄとｐＴＤＴｌなどが挙げられる。

「組換えプラスミド」または「プラスミド」という用語は、目的の遺伝物質を細胞に移入することができる遺伝子工学技術を介して得られる小型、円形、二本鎖、自己複製ＤＮＡ分子をいい、これは、標的細胞中の前記遺伝物質（例えば、タンパク質ポリペプチド、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）によってコードされる産物の産生をもたらす。さらに、「組換えプラスミド」または「プラスミド」という用語はまた、組換えベクターゲノムの担体としてのウイルスベクターの製造中に使用される遺伝子工学技術を介して得られる、小型、環状、二本鎖、自己複製ＤＮＡ分子を指す。

「組換えウイルスベクター」または「ウイルスベクター」という用語は、目的の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に移入することができる遺伝子工学技術を介して天然に存在するウイルスから得られる作用物質を指し、これは、標的細胞中の上記遺伝物質（例えば、タンパク質ポリペプチド、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）によってコードされる産物の産生をもたらす。

本明細書中で同義語として使用される「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」および「ＡＡＶ粒子」という用語は、ＡＡＶの少なくとも１つのキャプシドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型の全てのキャプシドタンパク質から構成される）と、ＡＡＶゲノムに対応するカプセル化ポリヌクレオチドとから構成されるウイルス粒子をいう。野生型ＡＡＶは、デペンドウイルス属、パルボウイルス科に属するウイルスを指す。野生型ＡＡＶゲノムは長さが約４．７Ｋｂであり、ポジティブセンスまたはネガティブセンスであり得る一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。野生型ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含み、３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ＯＲＦ ｒｅｐは、ＡＡＶライフサイクルに必要な４つのＲｅｐタンパク質をコードする。ＯＲＦ ｃａｐは、キャプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするヌクレオチド配列を含み、これらは相互作用して正二十面体対称性のキャプシドを形成する。最後に、Ｃａｐ ＯＲＦとオーバーラップするＡＡＰ ＯＲＦは、キャプシド集合を促進すると思われるＡＡＰタンパク質をコードする。粒子が、ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接される異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノムとは異なるポリヌクレオチド）を含む場合、それは、一般的には、「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」として知られる。本発明はまた、ｄｓＡＡＶまたはｓｃＡＡＶとも呼ばれる二本鎖ＡＡＶの使用を包含する。

「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶのゲノムのＤＮＡ鎖の両端に存在する、逆方向末端反復を指す。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖のために必要とされる。これらの配列の他の特性は、ヘアピンを形成するそれらの能力である。この特徴はそれらの自己プライミングに寄与し、これは第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存的合成を可能にする。ＩＴＲはまた、野生型ＡＡＶ ＤＮＡの宿主細胞ゲノムへの組み込み（例えば、血清型２ＡＡＶのためのヒト１９番染色体）とそれからのレスキューの両方に必要であることが示されており、また、完全に集合されたデオキシリボヌクレアーゼ耐性ＡＡＶ粒子へのＡＡＶ ＤＮＡの効率的なキャプシド形成にもまた、必要であることが示されている。ＩＴＲ配列は、長さが約１４５ｂｐである。好ましくは、ＩＴＲの全配列がＡＡＶウイルスベクターのゲノムにおいて使用されるが、これらの配列のある程度のわずかな改変は許容される。野生型ＩＴＲ配列は、ＩＴＲが所望の機能、例えば複製、ニッキング、ウイルスパッケージング、組み込みおよび／またはプロウイルスレスキューなどを媒介する限り、挿入、欠失または切断によって改変することができる。これらのＩＴＲ配列を修飾するための手順は、当該技術分野において周知である。ＩＴＲは、任意の野生型ＡＡＶ由来であってもよく、これには、限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２、または既知のもしくは後で発見される任意の他のＡＡＶが含まれる。ＡＡＶは、２つのＩＴＲを含み、これらは、同一であっても異なっていてもよい。さらに、２つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶキャプシドと同じＡＡＶ血清型由来であり得るか、または異なり得る。好ましい実施形態において、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ １、ＡＡＶ ２、ＡＡＶ ４、ＡＡＶ ５、ＡＡＶ ７、ＡＡＶ ８および／またはＡＡＶ ９に由来する。好ましくは、ＩＴＲはＡＡＶ２、ＡＡＶ８および／またはＡＡＶ２に由来し、最も好ましいのはＡＡＶ２である。一実施形態では、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、偽型ＡＡＶ（すなわち、異なる血清型から誘導されるキャプシドおよびＩＴＲを有するＡＡＶ）を生成するように選択される。

「組換えウイルスゲノム」という表現は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの外来ポリヌクレオチドが天然に存在するＡＡＶゲノムに挿入されているＡＡＶゲノムを指す。本発明によるＡＡＶのゲノムは、通常は、シス作用性５’および３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）ならびに発現カセットを含む。

「遺伝子治療」という用語は、遺伝的または後天性の疾患または病態を治療または予防するために、目的の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞内に移入することを指す。目的の遺伝物質は、インビボでの産生が所望される産物（例えば、タンパク質ポリペプチド、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）をコードする。例えば、目的の遺伝物質は、治療的価値のある酵素、ホルモン、受容体、またはポリペプチドをコードし得る。

「形質導入する」（ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）または「形質導入」（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）という用語は、本明細書中で使用される場合、外来ヌクレオチド配列がウイルスベクターを介して細胞内に導入されるプロセスを指す。

「トランスフェクション」という用語は、本明細書で使用される場合、非ウイルス法により精製された核酸を真核細胞中に意図的に導入するプロセスを指す。

「治療する」（ｔｒｅａｔ）または「治療」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）という用語は、本明細書で使用される場合、疾患の進行を制御するための本発明の化合物または組成物の投与を指す。疾患進行の制御は、これらに限定されないが、症状の減少、疾患の持続期間の減少、病理学的状態の安定化（特にさらなる悪化を回避するため）、疾患の進行の遅延、病理学的状態の改善、および寛解（部分的および全体的）を含む、有益なまたは所望の臨床結果の達成として理解される。疾患の進行の制御はまた、治療が適用されない場合の予想生存期間と比較しての、生存期間の延長も含む。

「有効量」という用語は、意図された目的を達成するのに十分な物質の量を指す。例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）活性を増加させるためのＡＡＶ９ベクターの有効量は、グリコサミノグリカンの蓄積を減少させるのに十分な量である。疾患または障害を治療するための発現ベクターの「治療有効量」は、疾患または障害の徴候および症状を減少または根絶するのに十分な発現ベクターの量である。所与の物質の有効量は、物質の性質、投与経路、その物質を受容する動物のサイズおよび種、ならびにその物質を与える目的などの因子によって変化する。個々の場合における有効量は、当技術分野で確立された方法に従って当業者によって経験的に決定され得る。

「個体」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトまたは非ヒト哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマまたは霊長類、さらにより好ましくはヒトを指す。

本発明は、ムコ多糖症、特にムコ多糖症ＩＩＩ型（ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型）すなわちサンフィリッポ Ｄ症候群を治療するための新規ポリヌクレオチドおよびベクターを提供する。

したがって、第１の態様において、本発明は、発現カセットを含むポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」と称する）に関するものであり、上記発現カセットは、ＧＮＳタンパク質またはこれについて機能的に等価な変異体をコードするヌクレオチド配列に作用的に連結された転写調節領域を含む。

上述したように、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ（ＧＮＳ）はすべての細胞において見出されるリソソーム酵素である。それは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）の異化に関与する。この酵素は、ヘパラン硫酸のＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン６－硫酸単位の６－硫酸基の加水分解を触媒する。この酵素の欠乏は、劣化した基質の蓄積と、リソソーム蓄積障害ムコ多糖症ＩＩＩ－Ｄ型（サンフィリッポＤ症候群）をもたらす。

本発明はまた、当該分野で公知のＧＮＳ変異体および断片をコードするポリヌクレオチド配列を意図する。したがって、本発明は、ＧＮＳの機能的に等価な変異体をコードするＤＮＡを含むように解釈されるべきである。

「機能的に等価な変異体」という用語は、本明細書で使用される場合、上記で定義されたＧＮＳの配列と実質的に相同であり、かつＧＮＳの生物学的活性を保持する任意のポリペプチドに関する。このような機能的に等価な変異体の配列は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、置換または欠失によって、そしてＧＮＳの生物学的活性を実質的に保存することにより、上記で定義されたＧＮＳの配列から得ることができる。変異体が天然ＧＮＳの生物学的活性を保存しているかどうかを決定するための方法は当業者に広く知られており、この出願の実験部分で使用されるアッセイのいずれかを含む。特に、本発明に包含されるＧＮＳの機能的に等価な変異体は、例えば、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベル、特にＨＳレベルを正常化するか、または低下させるなどの、ＧＮＳの機能の少なくとも１つを有する。

本発明に付随する実施例に示されるように、ＧＮＳの最適化されたコード配列または最適化されていないコード配列は、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型の動物を治療するために使用されてきた。結果は、ベクター投与後のＧＮＳ活性の回復を示し、これは、動物モデルで分析された全ての中枢神経系領域における疾患に特徴的な基質蓄積（ＧＡＧ）のほぼ完全な正常化をもたらした。

ＧＡＧレベルを低下または正常化する能力を決定するのに適した方法は、本発明の実施例のセクションで詳述される。

好ましい実施形態では、ポリペプチドは、それが、上記のような機能において能力を示す場合、特にそれがヘパラン硫酸のＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン６－硫酸単位の６－硫酸基を、ＧＮＳ野生型ポリペプチドの能力の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％で、加水分解することが可能である場合に、ＧＮＳの機能的に等価な変異体であると考えられる。

ＧＮＳの機能的に等価な変異体は、天然のＧＮＳと実質的に相同なポリペプチドである。「実質的に相同な」という表現は、上記タンパク質配列が、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のＧＮＳ野生型配列に関して同一性の程度を有する場合のタンパク質配列に関する。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピューターアルゴリズムと方法を使用して決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）］を使用することによって決定されるが、他の類似のアルゴリズムも使用することができる。

ＧＮＳの機能的に等価な変異体は、ＧＮＳを産生するために使用される宿主細胞におけるコドン優先性を考慮して、そのコードポリヌクレオチド内のヌクレオチドを置換することによって得ることができる。

ＧＮＳの機能的に等価な変異体は、保存的アミノ酸変化を行い、得られた変異体を上記の機能的アッセイの１つまたは当技術分野において公知の他の機能的アッセイで試験することによって作製することができる。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。

本発明の特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに含まれるＧＮＳタンパク質またはその機能的に等価な変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１と７０％から８５％の間の同一性を有する。より特定の実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、配列番号１と７５％から８５％の間の同一性を有する。さらにより好ましい実施形態では、上記配列は、配列番号１と７５％から８０％の間の同一性を有する。好ましい実施形態では、上記ＧＮＳヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択される。

本発明の別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＧＮＳタンパク質は、ヒトＧＮＳおよびマウスＧＮＳからなる群から選択される。

本発明のポリヌクレオチドの一部を形成する発現カセットは、発現制御配列をさらに含んでもよく、この配列は、これらに限定されないが、適切な転写調節配列（すなわち、開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー）、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナル）、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を高める配列、および所望される場合、コードされた産物の分泌を高める配列を含む。多数の発現制御配列が当該分野で公知であり、そして本発明に従って利用され得る。

本発明によれば、本発明のポリヌクレオチドは、発現カセットを含み、ここで、上記発現カセットは、ＧＮＳをコードするヌクレオチド配列に作用的に連結された転写調節領域を含む。本発明の特定の実施形態では、上記転写調節領域はプロモーターを含む。本発明の別の特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの転写調節領域は、プロモーターに作用的に連結されたエンハンサーをさらに含む。より特定の実施形態では、上記プロモーターは、構成的プロモーターである。好ましい実施形態では、上記プロモーターは、配列番号１５に記載のＣＡＧプロモーターである。

別の実施形態では、発現カセットは、ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接される。より特定の実施形態では、上記ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ＩＴＲである。

本発明のポリヌクレオチドの発現カセットは、ＧＮＳまたはその機能的に等価な変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ＿００２０７６．３を有するＮＣＢＩデータベースの配列に対応するヒトＧＮＳをコードするヌクレオチド配列であり、より具体的には、それは、配列番号１である。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒトＧＮＳをコードするヌクレオチド配列の変異体であり、好ましくは、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択される配列である。

別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの一部を形成する発現カセットは、転写後調節領域をさらに含む。「転写後調節領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、カセットまたは得られる遺伝子産物に含まれる配列の発現、安定化、または局在化を促進する任意のポリヌクレオチドを指す。転写後調節領域は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後領域（ＷＰＲＥ）であり得るが、これに限定されない。「ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス後調節エレメント」または「ＷＰＲＥ」という用語は、本明細書で使用される場合は、転写されると、遺伝子の発現を増強することができる三次構造を作り出すＤＮＡ配列を指す。

別の実施形態では、発現カセットは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。

「ポリアデニル化シグナル」という用語は、本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡの３’末端へのポリアデニンテイルの付着を媒介する核酸配列に関する。適切なポリアデニル化シグナルには、これらに限定されるものではないが、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５Ｅｌｂポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ヒト変異成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルなどが含まれる。特定の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルまたはその機能的変異体およびその断片である。

本発明のポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれ得る。したがって、別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む、本明細書で「本発明のベクター」と呼ばれるベクターに関する。特定の実施形態では、上記ベクターはプラスミドである。別の特定の実施形態では、上記ベクターはＡＡＶベクターであり、上記ＡＡＶベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えウイルスゲノムを含む。

本発明のポリヌクレオチドに関連して開示される全ての実施形態は、本発明のベクターにも適用可能である。

より特定の実施形態において、上記ベクターは、配列番号５に記載される、受託番号ＤＳＭ ３２３４２を有するプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、配列番号６に記載される受託番号ＤＳＭ ３２３４３を有するプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、配列番号７に記載される受託番号ＤＳＭ ３２３４４を有するプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２、配列番号８に記載される受託番号ＤＳＭ ３２３４５を有するｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３、からなる群から選択される。

別の特定の実施形態において、本発明は、アデノ随伴ウイルスベクター、ＡＡＶベクターに関し、上記ＡＡＶベクターは、組換えウイルスゲノムを含み、上記組換えウイルスゲノムは、ＧＮＳまたはその機能的等価変異体をコードするヌクレオチド配列に作用的に連結された転写調節領域を含む発現カセットを含むポリヌクレオチドを含む。

本発明によるＡＡＶは、ＡＡＶの既知の血清型の任意の血清型を含む。一般的に、ＡＡＶの異なる血清型は、有意な相同性を有するゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝機能を提供し、物理的および機能的関係において本質的に等価なビリオン（ｖｉｒｉｏｎｓ）を産生し、そして実質的に同一の機構により複製し集合する。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および任意の他のＡＡＶの血清型１に属し得る。異なるＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースに見出され得る。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ００６２６０（ＡＡＶ７）、ＮＣ００６２６１（ＡＡＶ８）、およびＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）を参照されたい。好ましい実施形態では、本発明の上記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群から選択される血清型のものである。好ましい実施形態では、本発明の前記ＡＡＶベクターは、血清型９、ＡＡＶ９のものである。

特定の実施形態では、上記ＡＡＶベクターは、ヒトＧＮＳまたはマウスＧＮＳ配列を含む。より特定の実施形態では、本発明によるＡＡＶベクターは、配列番号１と７０％から８５％の同一性を有するＧＮＳコードヌクレオチド配列を含む。より特定の実施形態では、上記ＧＮＳコードヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群から選択される。

特定の実施形態では、発現カセット内の転写調節領域はプロモーターを含む。より特定の実施形態では、上記プロモーターは、構成的プロモーターである。より特定の実施形態では、上記プロモーターは、配列番号１５に記載されるＣＡＧプロモーターである。

本発明の別の特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＣＡＧプロモーターに連結された配列番号１のヌクレオチド配列を含む配列番号９のＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＮＳである。別の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＣＡＧプロモーターに連結された配列番号２のヌクレオチド配列を含む配列番号１０のＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－バージョン１（ｖｅｒｓｉｏｎ１）である。別の実施形態では、ＡＡＶは、ＣＡＧプロモーターに連結された配列番号３のヌクレオチド配列を含む、配列番号１１のＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２である。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＣＡＧプロモーターに連結された配列番号４のヌクレオチド配列を含む配列番号１２のＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３である。

好ましい実施形態では、本発明のＡＡＶは、５’から３’方向に、（ｉ）５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、（ｉｉ）ＣＭＶ即時初期（Ｉｉｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ）エンハンサー、（ｉｉｉ）ニワトリＢ－アクチンプロモーター、（ｉｖ）ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１イントロン、（ｖ）ウサギβ－グロビン遺伝子由来のイントロン２／エクソン３、（ｖｉ）ＧＮＳ ｃＤＮＡまたはその機能的に等価な変異体、（ｖｉｉ）ウサギβ－グロビンポリＡシグナルなどのポリＡシグナル、（ｖｉｉｉ）３’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、を含む発現カセットを含むヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノムを含む。当業者は、ベクターゲノムが、他の配列（例えば、具体的に上記に記載の配列間の介在配列）を含み得ることを理解するであろう。成分（ｉ）～（ｖ）は、当業者によって通常に理解される意味を有する。

好ましい実施形態では、組換えウイルスゲノムは、配列番号９のヌクレオチド配列を含む。特に、５’ＡＡＶ ＩＴＲはヌクレオチド１～１２０を含み、ＣＭＶエンハンサーはヌクレオチド１９４～５５７を含み、Ｂ－アクチンプロモーターはヌクレオチド５５８～８３９を含み、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１イントロンはヌクレオチド８４０～１８０４を含み、ウサギβ－グロビン遺伝子由来のイントロン２／エクソン３はヌクレオチド１８０５～１９０６を含み、ヒトＧＮＳ ｃＤＮＡはヌクレオチド１９３４～３５９２を含み、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルはヌクレオチド１９３４～３５９２を含み、ウサギベータ－グロビンポリＡシグナルはヌクレオチド３６１９～４１４７を含み、そして３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは配列番号５のヌクレオチド４２０６～４３１３を含む。

好ましい実施形態では、組換えウイルスゲノムは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。特に、５’ＡＡＶ ＩＴＲはヌクレオチド１～１２０を含み、ＣＭＶエンハンサーはヌクレオチド１９４～５５７を含み、Ｂ－アクチンプロモーターはヌクレオチド５５８～８３９を含み、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１イントロンはヌクレオチド８４０～１８０４を含み、ウサギβ－グロビン遺伝子由来のイントロン２／エクソン３はヌクレオチド１８０５～１９０６を含み、ヒトＧＮＳ ｃＤＮＡはヌクレオチド１９３４～３５９２を含み、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルはヌクレオチド１９３４～３５９２を含み、ウサギベータ－グロビンポリＡシグナルはヌクレオチド３６１９～４１４７を含み、３’ＡＡＶ２ＩＴＲは配列番号６のヌクレオチド４２０６～４３１３を含む。

好ましい実施形態では、組換えウイルスゲノムは、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。特に、５’ＡＡＶ ＩＴＲはヌクレオチド１～１２０を含み、ＣＭＶエンハンサーはヌクレオチド１９４～５５７を含み、Ｂ－アクチンプロモーターはヌクレオチド５５８～８３９を含み、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１イントロンはヌクレオチド８４０～１８０４を含み、ウサギβ－グロビン遺伝子由来のイントロン２／エクソン３はヌクレオチド１８０５～１９０６を含み、ヒトＧＮＳ ｃＤＮＡはヌクレオチド１９３４～３５９２を含み、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルはヌクレオチド３６１９～４１４７を含み、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは配列番号７のヌクレオチド４２０６～４３１３を含む。

好ましい実施形態では、組換えウイルスゲノムは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。特に、５’ＡＡＶ ＩＴＲはヌクレオチド１～１２０を含み、ＣＭＶエンハンサーはヌクレオチド１９４～５５７を含み、Ｂ－アクチンプロモーターはヌクレオチド５５８～８３９を含み、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１イントロンはヌクレオチド８４０～１８０４を含み、ウサギβ－グロビン遺伝子由来のイントロン２／エクソン３はヌクレオチド１８０５～１９０６を含み、ヒトＧＮＳ ｃＤＮＡはヌクレオチド１９３４～３５９２を含み、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルはヌクレオチド３６１９～４１４７を含み、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは配列番号８のヌクレオチド４２０６～４３１３を含む。

修飾されたＡＡＶ配列もまた、本発明の文脈において使用することができる。このような修飾された配列は、例えば、既知の血清型のいずれかのＡＡＶ ＩＴＲまたはＶＰに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％またはそれ以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性（例えば、約７５～９９％ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性を有する配列）を有し、前記成分の機能を維持する配列を含む。ＡＡＶ ＩＴＲまたはＶＰの機能を決定するためのアッセイは、当該分野において公知である。上記の修飾された配列は、野生型のＡＡＶ ＩＴＲまたはＶＰ配列の代わりに使用することができる。

本発明のＡＡＶベクターは、任意の血清型由来のキャプシドを含む。一般的に、異なるＡＡＶ血清型は、アミノ酸および核酸レベルで有意な相同性を有するゲノム配列を有して、同一の遺伝子機能のセットを提供し、物理的および機能的関係において実質的に等価なビリオンを産生し、実質的に同一の機構を通して複製し構築する。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および任意の他のＡＡＶの血清型１に属し得る。異なるＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースに見出され得る。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ００６２６０（ＡＡＶ７）、ＮＣ００６２６１（ＡＡＶ８）、およびＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）を参照されたい。好ましい実施形態では、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群から選択される血清型のものである。より好ましい実施形態では、前記ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型９、ＡＡＶ９である。

本発明のＡＡＶベクターのゲノムは、ｒｅｐおよびｃａｐオープンリーディングフレームを欠く。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）をコードし発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中でのみ複製されて感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得、ここにおいて、宿主細胞は、アデノウイルス由来のタンパク質をコードし発現するベクターでトランスフェクトされている。

〔本発明の医薬組成物〕
本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターは、医薬組成物においてその処方を必要とする従来の方法によって、ヒトまたは動物の体に投与することができる。したがって、第２の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクターまたは本発明のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療上有効量を含む医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」と称する）に関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体（ｃａｒｒｉｅｒ）をさらに含み得る。

本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクター、または本発明のＡＡＶベクターの文脈（ｃｏｎｔｅｘｔ）において開示される全ての実施形態はまた、本発明の医薬組成物にも適用可能である。

「治療有効量」という用語は、所望の効果を生じるように計算された本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターの量を指し、他の理由の中でも、一般的には、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクター、および得られる治療効果の、独自の特徴によって決定される。したがって、疾患の治療に有効であろう上記量は、本明細書に記載されているかまたはそうでなければ当該分野で知られている標準的な臨床技術によって決定することができる。処方において使用される正確な用量は、投与経路に依存するであろう。初期用量は、当技術分野で周知の技術を用いてインビボデータ（例えば動物モデル）から推定することができる。技術水準において通常の経験を有する者は、動物におけるデータに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができる。

特定の実施形態では、この処方の用量は、ウイルス粒子数またはゲノムコピー数（“ＧＣ”）／ウイルスゲノム数（“ｖｇ”）として測定または計算することができる。

当技術分野で知られている任意の方法を使用して、本発明のウイルス組成物の１ミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶ ＧＣ数のタイトレーションを実施するための１つの方法は、以下のとおりである。精製されたＡＡＶベクターサンプルを、最初にＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）で処理して、キャプシド化されていないＡＡＶゲノムＤＮＡまたは汚染プラスミドＤＮＡを製造プロセスから除去する。次いで、ＤＮＡ分解酵素耐性粒子は、熱処理を受けて、キャプシドからゲノムを放出する。次いで、放出されたゲノムを、ウイルスゲノムの特定の領域を標的とするプライマー／プローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲにより定量する。

本明細書において互換的に使用される「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、または「薬学的に許容される溶剤」という用語は、任意の従来型の、非毒性固体、もしくは半固体、または液体充填剤、希釈剤、もしくはカプセル化材料、または製剤補助剤を指す。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して本質的に非毒性であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容される担体の数および性質は、所望の投与形態に依存する。薬学的に許容される担体は公知であり、当技術分野で周知の方法によって調製され得る。

医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、脳脊髄液（ＣＳＦ）、例えば、槽内または脳室内など、ヒトへの投与に適合させた医薬組成物として、日常的な手順に従って製剤化することができる。好ましい実施形態では、医薬組成物は静脈内または脳脊髄液（ＣＳＦ）投与用である。

ＡＡＶベクターは、注射による（例えば、ボーラス注射または連続注入による）非経口投与のために処方することができる。注射用製剤は、保存剤を添加した単位剤形（例えば、アンプルまたは単一用量または複数用量の容器）で提供されてもよい。ウイルス組成物は、油性または水性溶媒中の懸濁液、液剤または乳剤のような形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤または分散剤のような製剤化剤を含むことができる。ＡＡＶ製剤の液体製剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチン又はアラビアゴム）、非水性溶媒（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分別植物油）、及び保存剤（例えば、メチル又はプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）などの製薬上許容される添加剤を用いた従来の手段によって調製され得る。製剤は緩衝塩を含んでもよい。あるいは、組成物は、使用前に、適切な溶媒（例えば、無菌の発熱物質を含まない水）で構成するための粉末形態であってもよい。必要に応じて、組成物は、注射部位での疼痛を緩和するために、リドカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。組成物が浸潤によって投与されようとする場合、それは、医薬品品質の水または生理食塩水溶液を含有する浸潤瓶を用いて投薬することができる。組成物が注射により投与される場合、投与の前に成分を混合することができるように、注射用または滅菌生理食塩水溶液用にバイアル瓶を提供することができる。好ましくは、薬学的に許容される担体は、生理食塩水溶液およびポリエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（登録商標）などの界面活性剤である。

本発明の組成物は、獣医学的目的のための動物（例えば家畜（ウシ、ブタ、その他））、および他の非ヒト哺乳動物対象、ならびにヒト対象者への送達のために処方され得る。本発明の医薬組成物は、遺伝子導入および遺伝子治療用途で使用するための生理学的に許容される担体とともに製剤化することができる。

本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターと組み合わせて、またはそれらと混合してアジュバントを使用することも包含される。企図されるアジュバントとしては、無機塩アジュバントもしくは無機塩ゲルアジュバント、粒状アジュバント、微粒子アジュバント、粘膜アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。

アジュバントは、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターとの混合物として対象に投与され得るか、または組み合わせて使用され得る。

本発明の医薬組成物は、局所的または全身的に投与することができる。一実施形態では、医薬組成物は、細胞が形質導入されるべき組織または器官の近くに投与される。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、側脳室中で局所的に投与される。別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、全身的に投与される。

「全身に投与される」（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）および「全身投与」（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）という用語は、本明細書で使用される場合、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ＡＡＶベクターまたは組成物が、局所的ではない方法で対象に投与され得ることを意味する。全身投与は、対象の体中のいくつかの器官または組織に到達することができ、または対象の特定の器官または組織に到達することができる。例えば、静脈内投与は、対象における２つ以上の組織または器官の形質導入をもたらし得る。本発明の医薬組成物は、単回投与で投与することができ、または本発明の特定の実施形態では、治療効果を達成するために複数回投与（例えば、２回、３回、４回またはそれ以上の投与）を用いることができる。

したがって、別の態様において、本発明は、医療における使用のための、本発明によるポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクター、または本発明による医薬組成物に関する。

さらなる態様において、本発明は、ムコ多糖症ＩＩＩ－Ｄ型の治療に使用するための、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクター、または本発明の第２の態様による医薬組成物に関する。

したがって、別の態様において、本発明は、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ活性を増加させるための、本発明によるポリヌクレオチド、ベクターもしくはＡＡＶベクター、または本発明による医薬組成物に関する。

別の態様では、本発明は、必要とされる対象におけるムコ多糖症ＩＩＩ－Ｄ型の治療および／または予防のための方法であって、その方法は、上記対象への、本発明によるポリヌクレオチド、または本発明によるベクター、または本発明による組換えベクター、または本発明による医薬組成物の投与を含む。

「予防する」（ｐｒｅｖｅｎｔ）、「予防すること」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、および「予防」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）という用語は、本明細書で使用される場合、対象における疾患の開始を阻害することまたは疾患の発生を減少させることをいう。予防は、完全であり得る（例えば、対象における病理学的細胞の完全な不存在）か、または部分的であり得る。予防はまた、臨床症状に対する感受性の低下を指す。「処置する」（ｔｒｅａｔ）または「処置」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）という用語は、本明細書で使用される場合、その臨床的徴候が現れた後に、疾患の進行を制御するための本発明のポリヌクレオチド、またはベクターもしくはＡＡＶベクターもしくは医薬組成物の投与を指す。疾患進行の制御とは、これらに限定されるものではないが、症状の軽減、疾患の期間の短縮、病的状態の安定化（特に、さらなる悪化を回避するため）、疾患の進行の遅延、病理学的状態の改善、及び寛解（部分的及び全体的）を含む、有益又は所望の臨床結果の達成を意味するものと理解される。疾患の進行の制御はまた、治療が適用されない場合の予想生存期間と比較しての、生存期間の延長も含む。

「対象」（ｓｕｂｊｅｃｔ）という用語は、本明細書中で使用される場合、ヒト、非ヒト霊長類（例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種）、家畜（例えば鳥類、魚類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ）、家畜（例えばイヌ及びネコ）、又は実験動物（例えばマウス、ラット及びモルモットなどのげっ歯類）などの個体又は動物を指す。この用語には、任意の年齢または性別の対象が含まれる。好ましい実施形態では、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。

〔本発明のＡＡＶを得るための方法〕
本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターを得るための方法に関する。上記ＡＡＶベクターは、本発明のポリヌクレオチドを、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を構成的に発現する細胞中に導入することによって、またはＲｅｐおよびＣａｐコード配列がプラスミドまたはベクター中に提供されることによって得ることができる。

したがって、別の態様において、本発明は、以下のステップを含むＡＡＶベクターを得るための方法に関する。
（ｉ）本発明のポリヌクレオチド、ＡＡＶｃａｐタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、および任意選択で、ＡＡＶが複製のために依存するウイルスタンパク質を含む細胞、を提供するステップ。
（ｉｉ）ＡＡＶの集合に適した条件下で細胞を維持するステップ。
（ｉｉｉ）細胞によって産生されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製するステップ。

ＡＡＶベクターを産生することができる任意の細胞を、本発明において使用することができる。

この方法で使用される本発明のポリヌクレオチドは、前述したとおりである。本発明のポリヌクレオチドの文脈において開示された実施形態のいずれも、本発明のＡＡＶを得るための方法の文脈において適用可能である。

「ｃａｐタンパク質」という用語は、本明細書中で使用される場合、天然のＡＡＶ ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｃａｐタンパク質の機能的活性の例としては、キャプシドの形成を誘導し、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進し、キャプシドへのＡＡＶ ＤＮＡパッケージングを促進し（すなわちキャプシド形成）、細胞受容体に結合し、そして宿主細胞へのビリオンの進入を促進するという能力がある。原則として、任意のｃａｐタンパク質を本発明の文脈において使用することができる。

好ましい態様において、ｃａｐタンパク質はＡＡＶ９に由来する。

「キャプシド」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスゲノムがパッケージングされる構造を指す。キャプシドは、タンパク質から作製されたいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、３つのキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成される正二十面体キャプシドを有する。

「ｒｅｐタンパク質」という用語は、本明細書中で使用される場合、天然のＡＡＶｒｅｐタンパク質の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｒｅｐタンパク質の「機能的活性」は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の認識、結合およびニック形成、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性を介するＤＮＡ複製の促進を含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性である。さらなる機能には、ＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節、および宿主染色体へのＡＡＶ ＤＮＡの部位特異的組み込みが含まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は血清型ＡＡＶ２に由来する。

「ＡＡＶが複製に依存するウイルスタンパク質」という表現は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶが複製のために依存する機能（すなわち、「ヘルパー機能」）を果たすポリペプチドを指す。ヘルパー機能には、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐタンパク質の合成、およびＡＡＶキャプシド集積、の活性化に必要な機能が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスをベースにしたアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの任意の公知のヘルパーウイルスに由来し得る。ヘルパー機能としては、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。

本発明のポリヌクレオチド、または遺伝子ＡＡＶｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐおよびヘルパー機能を提供する遺伝子は、例えばプラスミドなどのベクターに上記遺伝子を組み込み、上記ベクターを細胞に導入することによって、上記細胞内に導入することができる。遺伝子は、同じプラスミド中に、または異なるプラスミド中に、組み込むことができる。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは１つのプラスミド中に組み込まれ、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は別のプラスミド中に組み込まれ、そしてヘルパー機能を提供する遺伝子は、それらのプラスミド中に組み込まれる。

本発明のポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子もしくはヘルパー機能を提供する遺伝子を含有するプラスミドは、当該分野で周知の任意の適切な方法を使用することによって、細胞内に導入され得る。トランスフェクションの方法の例としては、リン酸カルシウムとの共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介融合、リポフェクション、レトロウイルス感染およびバイオリスティックトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、トランスフェクションはリン酸カルシウムとの共沈によって行われる。細胞が、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のいずれか、ならびにアデノウイルスヘルパー機能を提供する遺伝子のいずれかの発現を欠く場合、当該遺伝子は、本発明のポリヌクレオチドと同時に細胞内に導入され得る。あるいは、当該遺伝子は、本発明のポリヌクレオチドを導入する前または後に、細胞中に導入することができる。

特定の実施形態において、細胞は、３つのプラスミド、すなわちｉ）本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミド、ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびにｉｉｉ）ヘルパー機能を提供する遺伝子を含むプラスミドで、同時にトランスフェクトされる。

本発明の方法のステップ（ｉｉ）は、ＡＡＶの集合に適切な条件下で細胞を維持するステップを含む。

細胞を培養する方法およびＡＡＶベクター粒子の放出を促進する例示的な条件（例えば、細胞の溶解）は、本明細書中の実施例に記載されるように実施され得る。プロデューサー細胞は、ＡＡＶの集合および培地中へのウイルスベクターの放出を促進するために、適切な期間増殖される。一般的に、培養の時間は、ウイルス産生の時点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合、ウイルス産生は一般に、本明細書中に記載されるように、適切なプロデューサー細胞においてヘルパーウイルス機能を供給することによって開始される。

本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）は、細胞によって産生されたＡＡＶベクターを精製するステップを含む。

上記細胞または上記培養培地からＡＡＶを精製するための任意の方法は、本発明のＡＡＶを得るために使用することができる。特定の実施形態において、本発明のＡＡＶは、ポリエチレングリコール沈殿工程および２つの連続した塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配に基づく最適化された方法に従って精製される。

ＡＡＶの産生における使用に適した、種々の天然に存在する、および操作されたＡＡＶ、それらをコードする核酸、ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐタンパク質、ならびにこのようなＡＡＶ、そして特にそれらのキャプシドを、単離または生成、増殖、および精製する方法は、当該分野において公知である。

本発明はさらに、ＧＮＳタンパク質またはその機能的に等価な変異体をコードする本発明のポリヌクレオチド配列を含む単離された細胞を提供する。

本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターおよび本発明の医薬組成物の文脈で開示される全ての実施形態は、本発明の治療方法に適用され得る。

〔一般的な手順〕
［１．組換えＡＡＶベクター］
本明細書中に記載されるＡＡＶベクターは、三重トランスフェクションによって得られた。ベクターを作製するために必要な材料は以下のとおりであった。ＨＥＫ２９３細胞（アデノウイルスＥ１遺伝子を発現する）、アデノウイルス機能を提供するヘルパープラスミド、血清型２由来のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および血清型９（ＡＡＶ９）由来のｃａｐ遺伝子を提供するプラスミド、そして最後にＡＡＶ２ ＩＴＲおよび目的の構築物を有する骨格プラスミド。

グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ－発現ＡＡＶベクターを生成するために、ヒト又はマウスのグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼの最適化された又は最適化されていないコード配列が、遍在性ハイブリッドＣＡＧプロモーターの制御下でＡＡＶ骨格プラスミド中にクローニングされた。プラスミドの大規模生産は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。

ベクターは、修飾を有する３つのプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスフリートランスフェクションによって生成された。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８；５：９３８－９４５．及びＷｒｉｇｈｔ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．２００５；１２：１７１－１７８．を参照されたい。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、ローラーボトル（ＲＢ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，米国）中で、７０％コンフルエントまで培養し、次に、以下のもので同時トランスフェクトした。１）血清型２ＡＡＶのウイルスＩＴＲによって隣接された発現カセットを担持するプラスミド（上述）。２）ＡＡＶ ｒｅｐ２およびｃａｐ９遺伝子を担持するプラスミド。３）アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミド。ベクターは、前述のように、最適化されたプロトコルを使用して、２つの連続する塩化セシウム勾配により精製された。Ａｙｕｓｏ Ｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１０；１７：５０３－５１０．を参照されたい。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８に対して透析し、濾過し、ｑＰＣＲにより滴定し、そして使用するまで－８０℃で保存した。

本発明のベクターは、当技術分野において周知の分子生物学的技術に従って構築された。

［２．インビトロトランスフェクション研究］
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、製造業者の指示に従って、４μｇのｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖ１、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖ２、またはｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖ３を用いてトランスフェクトした。４８時間後、細胞および培養培地を回収し、ＲＮＡおよびタンパク質抽出のために処理した。

全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者の指示に従って得られ、そしてＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｒｏｃｈｅ）を用いて逆転写された。ヒトＧＮＳ遺伝子の異なるバージョンの発現は、ｈＧＮＳ（配列番号１９：Ｆｗ：５’ ＡＡＡ ＣＴＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＧＡ ３’、配列番号２０：Ｒｖ：５’ ＴＧＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＧＧ ＴＣＣ ＴＣ ３’）、ｏｈＧＮＳ－ｖ１（配列番号２１ Ｆｗ：５’ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＡＧＴ ＴＴ ３’、配列番号２２：Ｒｖ：５’ ＣＧＴ ＴＧＴ ＣＧＣ ＴＧＧ ＴＧＴ ＡＧＡ ＡＧ ３’）、ｏｈＧＮＳ－ｖ２（配列番号２３：Ｆｗ：５’ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＡＡＧ ＧＣＧ ＣＴ ３’、配列番号２４：Ｒｖ：５’ ＡＧＴ ＴＣＣ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＡＧ ＴＧＴ ＴＧ ３’）および ｏｈＧＮＳ－ｖ３（配列番号２５：Ｆｗ：５’ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＧＧＣ ＡＣ ３’、配列番号２６：Ｒｖ： ＡＣＴ ＣＣＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＣＡ ＧＣ ３’）に対して特異的なプライマーを使用する定量リアルタイムＰＣＲにより評価された。値は、ヒトＲＰＬＰＰ０（配列番号２７：Ｆｗ：５’ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＧＡ ＡＡＣ ＴＧＣ ＴＧＣ ＣＴ ３’，配列番号２８：Ｒｖ：５’ ＣＴＧ ＣＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＴＣ ＡＡ ３’）の発現対して標準化された。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ Ｉ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中でリアルタイムＰＣＲが実施された。

タンパク質抽出物を２５０μＬのＭｉｌｉ－Ｑ水中で細胞を超音波処理することにより得、タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳ）を使用して定量した。Ｎ－アセチルグルコサミン ６－スルファターゼ活性は、５μｇの細胞タンパク質抽出物および５μｌの培養培地中で決定され、そして、前述のように、４－メチルウンベリフェロン由来の蛍光発生基質（Ｍｏｓｃｅｒｄａｍ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ， Ｏｅｇｓｔｇｅｅｓｔ， ＮＬ）を用いて、タンパク質の総量および体積によって標準化された。Ｗａｎｇ Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｈｅｒ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｓ １９９３；１６：９３５－９４１．を参照されたい。

［３．動物］
国際マウスフェノタイピング・コンソーシアム（ＩＭＰＣ，ｗｗｗ．ｍｏｕｓｅｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．ｏｒｇ）を通して入手可能なＧｎｓ遺伝子へのタグ挿入を有するレポーター（ｌａｃＺ）遺伝子を保有するＣ５７ＢＬ／６ＮＡ／ａ胚性幹細胞を得た。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ａｕｔｏｎｏｍａ ｄｅ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ（ＵＡＢ）のｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＣＢＡＴＥＧ）のｔｈｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ ＵｎｉｔのＣ５７ＢＬ／６Ｊ未分化胚芽細胞にクローンを微量注入し、得られた雄キメラをＣ５７ＢＬ／Ｂ雌と交配させ、Ｇｎｓノックアウト子孫を生成した。遺伝子型は、標的変異を包含する配列を増幅するＰＣＲ分析を用いて、切り取ったしっぽのサンプル由来のゲノムＤＮＡについて決定された。それぞれのセンスおよびアンチセンスプライマーの配列は以下のとおりであった：センスプライマー：５’－ＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＴＣＴＣＴＴ－３’（配列番号１３）。アンチセンスプライマー：５’－ＧＴＧＧＧＡＣＣＣＡＡＧＴＣＧＡＴＧＴＴ－３’（配列番号１４）。マウスは、標準的な食餌（Ｈａｒｌａｎ、Ｔｅｋｌａｄ）を自由に摂取させ、１２時間の明暗サイクル下（午前９：００時に点灯）に維持した。

ＧＮＳ活性の欠如のため、これらの動物は、生後２ヶ月という早い時期に、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型疾患に特徴的ないくつかの病理学的特徴を示し、これには脳および、肝臓、心臓、脾臓、肺および腎臓のような末梢器官の、異なる領域におけるＧＡＧの蓄積およびリソソーム区画の拡大が含まれる。小膠細胞症およびアストログリオーシスの存在によって明らかにされるように、神経炎症は脳の異なる領域で検出される。さらに、これらの病理学的所見の多くは、動物が６ヶ月齢である場合に悪化し、動物が加齢するにつれて病態の悪化を示唆する。したがって、Ｇｎｓ^－／－マウスは２ヶ月齢で正常に行動するが、６ヶ月齢で低活動行動を示す。最後に、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型マウスは寿命が短くなった。

［４．マウスへのベクター投与］
静脈内ベクター送達のために、ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼコード配列の異なるバージョンを除いたＡＡＶ９ベクターの１×１０^１０のベクターゲノムを、尾静脈注射を介して総容量２００μＬをマウスに送達した。ＷＴおよび無処置Ｇｎｓ－／－動物を対照として使用したマウスへのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターのＣＳＦ内送達のために、総投与量５×１０^１０ｖｇを２ヶ月齢のＧｎｓ^－／－ 動物の大槽内に注射した。動物の類似コホートに、５×１０^１０ｖｇの対照非コード（ＡＡＶ９－ｎｕｌｌ）ベクターを注射した。６、１２および２２ヶ月齢で、すなわちベクター投与後４、１０および２０ヶ月で、マウスを屠殺し、そして組織を回収した。

［５．サンプル収集］
屠殺時に、動物を深く麻酔し、次いで１２ｍＬのＰＢＳで経心臓的に灌流して組織から血液を完全に除去した。脳全体および複数の体細胞組織（肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓および脂肪組織を含む）を収集し、液体窒素中で凍結させ、－８０℃で保存するか、またはその後の組織学的分析のためにホルマリン中に浸漬した。

［６．Ｎ－アセチルグルコサミン ６－スルファターゼ活性およびグリコサミノグリカンの定量化］
肝臓および脳のサンプルを、Ｍｉｌｅ－Ｑ水中で超音波処理した。Ｎ－アセチルグルコサミン ６－スルファターゼ活性は、前述のように、４－メチルウンベリフェロン由来の蛍光発生基質（Ｍｏｓｃｅｒｄａｍ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ， Ｏｅｇｓｔｇｅｅｓｔ，ＮＬ）を用いて、決定された。Ｗａｎｇ Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｈｅｒ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｓ １９９３；１６：９３５－９４１．を参照されたい。脳および肝臓の活性レベルは、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳ）を用いて定量化されたタンパク質の総量に対して標準化された。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）定量化のために、組織サンプルを秤量し、次いでプロテイナーゼＫで消化し、そして抽出物を遠心分離および濾過によって清澄化した。ＧＡＧレベルは、標準としてコンドロイチン４－硫酸塩を使用して、Ｂｌｙｓｃａｎ硫酸化グリコサミノグリカンキット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ、Ｃａｒｒｉｃｋｆｅｒｇｕｓ、Ｃｏｕｎｔｙ Ａｎｔｒｉｍ、ＧＢ）を用いて組織抽出物中で決定された。ＧＡＧのレベルは組織湿重量に対して標準化された。

［７．他のリソソーム酵素の活性］
脳および肝臓のサンプルを５００μＬのＭｉｌｉ－Ｑ水中で超音波処理し、酵素活性を４－メチルウンベリフェロン由来の蛍光発生基質を用いて上清中で測定した。ＩＤＵＡ活性は、４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロナイド（ｉｄｕｒｏｎｉｄｅ）（Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ）とともに、３７℃で１時間インキュベートした１５μｇのタンパク質中でアッセイした Ｂａｃｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００２；９９（５）１８５７－９．を参照されたい。ＳＧＳＨ活性は前述のように測定された。Ｋａｒｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ． １９９６；１９（３）：２７８－２８５．，Ｈａｕｒｉｇｏｔ Ｖ，ｅｔ ａｌ，．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２０１３；１；ｐｉｉ：６６７７８．を参照されたい。簡単に言えば、３０μｇのタンパク質を、最初に４－ＭＵ－αＧＩｃＮＳとともに、４７℃で１７時間インキュベートした。第２のインキュベーションは、０．２％ＢＳＡ中の１０Ｕ／ｍＬのα－グルコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下、３７℃で２４時間実施した。ＮＡＧＬＵ活性については、以前に記載のように、３０μｇの組織タンパク質抽出物を、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミニド（Ｍｏｓｃｅｒｄａｍ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）とともに、３７℃で３時間インキュベートした。Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ． １９８５；２７（３）：２５８－６２，Ｒｉｂｅｒａ Ａ，ｅｔ ａｌ，．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１５；２４（７）：２０７８－９５．を参照されたい。

ＨＧＳＮＡＴ活性は、アセチル補酵素Ａおよび４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコサミン（ＭＵ－βＧｌｃＮＨ_２，Ｍｏｓｃｅｒｄａｍ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）とともに３７℃で１７時間インキュベートしたタンパク質抽出物３０μｇから決定した。Ｖｏｚｎｙｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｈ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ １９９３；１６：４６５－７２．を参照されたい。ＧＡＬＮＳ活性は、３７℃で１７時間の最初のインキュベーション中に、１０μｇのタンパク質抽出物および４－メチルウンベリフェリル β－Ｄ－ガラクトピラノシド－６－硫酸ナトリウム塩（ＭＵ－βＧａｌ－６Ｓ）を使用する２段階プロトコルにより、アッセイした。第二段階は、Ｐｉ緩衝液（０．９Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／０．９Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４緩衝液、ｐＨ４．３＋０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）およびβ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌ－Ａｏ，Ｓｉｇｍａ）を添加し、その混合物を３７℃で２時間インキュベートすることによって実施した。ｖａｎ Ｄｉｇｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ １９９０；１８７：１３１－４０．を参照されたい。ＧＵＳＢ酵素の活性は、４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（Ｓｉｇｍａ）と共に３７℃で１時間インキュベートしたタンパク質抽出物１０μｇから決定した。ＨＥＸＢ活性は、０．１μｇのタンパク質抽出物を４－メチルウンベリフェリルＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニド（Ｓｉｇｍａ）とともに３７℃で１時間インキュベートすることによってアッセイした。ｐＨを上げて反応を停止させた後、放出された蛍光をＦＬｘ８００蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で測定した。すべての脳および肝臓の活性レベルは、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳ）を用いて定量化されたタンパク質の総量に対して標準化された。

［８．組織学的分析］
組織をホルマリン中で１２～２４時間固定し、パラフィンに包埋して切片にした。脳内のＬＡＭＰ２の免疫組織化学的検出のために、パラフィン切片をクエン酸緩衝液、ｐＨ６中で熱誘導エピトープ回収に供し、次いで１：５００に希釈したラット抗－ＬＡＭＰ２抗体（Ａｂ１３５２４；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）とともに４℃で一晩インキュベートし、続いて１：３００に希釈したビオチン化ウサギ抗－ラット抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，ＤＫ）とともにインキュベートした。脳サンプル中のＧＦＡＰ免疫染色については、パラフィン切片を、１：１０００に希釈したウサギ抗－ＧＦＡＰ抗体（Ａｂ６６７３；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）とともに４℃で一晩インキュベートし、続いて１：３００に希釈したビオチン化ヤギ抗－ウサギ抗体（３１８２０；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）ととともにインキュベートした。ＬＡＭＰ２およびＧＦＡＰシグナルは、１：１００に希釈されたＡＢＣ－ペルオキシダーゼ染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳ）とともに切片をインキュベートすることによって増幅され、クロモゲンとして３，３－ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳ）を使用して可視化された。

脳サンプル中のミクログリア細胞を染色するために、パラフィン切片を、１：１００に希釈したＢＳＩ－Ｂ４レクチン（Ｌ５３９１； Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）とともに、４℃で一晩インキュベートした。色原体として３，３－ジアミノベンジジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳ）を用いてＢＳＩ－Ｂ４シグナルを可視化した。明視野画像は、光学顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ９０Ｉ；Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，ＪＰ）を用いて得られた。

ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２．２０ソフトウェアを使用して、すべての動物について同じシグナル閾値設定を用いて、動物あたり各脳領域の３～５画像（オリジナル倍率、×２０）におけるＬＡＭＰ２、ＧＦＡＰ、およびＢＳＩ－Ｂ４シグナルを定量した。次いで、画像中の全組織領域にわたる陽性シグナルを用いて、面積をピクセルで、陽性面積のパーセンテージを計算した。

［９．透過型電子顕微鏡分析］
マウスを過剰量のイソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｏ、Ｌａｂｓ。Ｅｓｔｅｖｅ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、ＥＳ）で屠殺し、下大静脈を介して１ｍｌの２．５％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒドで灌流した。大脳皮質の小部分（約１ｍｍ^３）、肝臓の左外側葉、または肺を切片化し、同じ固定剤中で４℃で２時間インキュベートした。冷カコジル酸緩衝液中で洗浄した後、標本を１％四酸化オスミウム中で後固定し、酢酸ウラニル水溶液中で染色し、次いでエタノールで段階的に脱水し、そしてエポキシ樹脂中に包埋した。樹脂ブロックからの超薄切片（６００～８００Å）をクエン酸鉛を用いて染色し、透過型電子顕微鏡（Ｈ－７０００；Ｈｉｔａｃｈｉ，ＴＯＫＹＯ，ＪＰ）で検査した。

［１０．オープンフィールドテスト］
６ヶ月齢および２２ヶ月齢のマウスの行動は、午前９時から午後１時の間に行われたオープンフィールド試験によって分析された。マウスの水平方向および垂直方向の動きを検出する２束のフォトビーム（ＳｅｄａＣｏｍ３２； Ｐａｎｌａｂ）が交差した明るく照らされたチャンバー（４１×４１×３０ｃｍ）の左下隅に動物を置いた。面積表面は、中心（１４×１４ｃｍ）（ｃｅｎｔｅｒ）、周辺（２７×２７ｃｍ）（ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ）及び境界（４１×４１ｃｍ）（ｂｏｒｄｅｒ）の３つの四角形の同一中心の領域に分割された。予備的な自発運動が、ビデオ追跡システム（ＳｍａｒｔＪｕｎｉｏｒ、Ｐａｎｌａｂ）を使用して、試験の最初の３分間において記録された。

［１１．統計的分析］
全ての結果は平均±標準誤差で表す。統計的比較は、一元配置分散分析を用いて行った。対照群および処置群間の多重比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストテストを用いて行い、すべての群間の多重比較は、Ｔｕｋｅｙのポストテストを用いて行った。Ｐ＜０．０５であれば、統計的有意性が認められたと考慮した。

〔実施例１：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳの構築〕
ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２０７６．３）のためのＣＤＳが出発物質として使用され、この目的のために化学的に合成された（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＣＤＳは、５’および３’においてそれぞれＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が隣接するプラスミドｐＭＡ－ＲＱ（ＡｍｐＲ）の内部にクローニングされて受け取られた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼＣＤＳ断片をｐＭＡ－ＲＱプラスミドから切り出し、続いてＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧのＭｌｕＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部位との間にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ（受託番号ＤＳＭ３２３４２）と命名した。図１Ａ及び配列番号５を参照されたい。

本明細書中で使用されるＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧは以前に生成されており、ＡＡＶ２ゲノム由来のＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、およびウサギβ－グロビン由来のポリＡシグナル、ならびに目的のＣＤＳをクローニングするためのマルチクローニング部位を含んでいた。ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶ初期／中間エンハンサーとニワトリβ－アクチンプロモーターからなるハイブリッドプロモーターである。このプロモーターは、普遍的に強力な発現を推進することができる。

〔実施例２：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１の構築〕
グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼｃＤＮＡ配列（ｏｈＧＮＳ）の最適化されたバージョンを含む発現カセットが設計され、得られた配列最適化は、ＲＮＡ安定性を高めるための潜在的スプライス部位およびＲＮＡ不安定化配列要素の除去、ＲＮＡ安定化配列要素の付加、コドン最適化およびＧ／Ｃ含量適合化、中でも安定したＲＮＡ二次構造の回避により、ヒトにおけるＮ－アセチルグルコサミン ６－スルファターゼタンパク質産生の効率を最大化するために行った。ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２０７６．３）を、配列最適化の開始点として使用した。

最初に最適化されたＣＤＳ（ＧｅｎｅＡｒｔ； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、５’および３’においてそれぞれ、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が隣接したプラスミドｐＭＡ－Ｔ（ＡｍｐＲ）内にクローニングされて受け取られた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼＣＤＳ断片を、ｐＭＡ－Ｔプラスミドから切り出し、続いて、ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１（受託番号ＤＳＭ３２３４３）と命名した。図２Ａ及び配列番号６を参照されたい。

〔実施例３：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２の構築〕
ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２０７６．３）のためのＣＤＳを、配列最適化（ＤＮＡ２．０Ｉｎｃ）に供した。最適化されたＣＤＳは、５’および３’においてそれぞれＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が隣接するプラスミドｐＪ２０４（ＡｍｐＲ）の内部にクローニングされて受け取られた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼＣＤＳ断片を、ｐＪ２０４プラスミドから切り出し、続いて、ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２（受託番号ＤＳＭ３２３４４）と命名した。図３Ａ及び配列番号７を参照されたい。

〔実施例４：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３の構築〕
ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００２０７６．３）のためのＣＤＳを、配列最適化（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ）に供した。最適化されたＣＤＳは、５’および３’においてそれぞれＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が隣接するプラスミドｐＵＣ５７（ＡｍｐＲ）の内部にクローニングされて受け取られた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼＣＤＳ断片を、ｐＵＣ５７プラスミドから切り出し、続いて、ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３（受託番号ＤＳＭ３２３４５）と命名した。図４Ａ及び配列番号８を参照されたい。

〔実施例５：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの構築〕
マウスグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２９３６４．３）のためのＣＤＳを、配列最適化（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に供した。最適化されたＣＤＳ、配列番号１６は、５’および３’においてそれぞれＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位が隣接するプラスミド ｐＭＡ－ＲＱ（ＡｍｐＲ）の内部にクローニングされて受け取られた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化マウスグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼＣＤＳ断片を、ｐＭＡ－ＲＱプラスミドから切り出し、続いて、ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳと命名した。図５Ａ及び配列番号１７を参照されたい。

〔実施例６：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＮＳの産生〕
ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ（配列番号９）は、修飾を有する３つのプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスフリートランスフェクションによって生成された。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９８；５（７）：９３８－４５．，Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５；１２（１）１７１－８．を参照されたい。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、ローラーボトル（ＲＢ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，米国）中で、７０％コンフルエントまで培養し、次に、以下のもので同時トランスフェクトした。 １）ＡＡＶ２ ＩＴＲ （ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ；配列番号５によって隣接された発現カセットを担持するプラスミド。２）ＡＡＶ ｒｅｐ２およびｃａｐ９遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有するプラスミド。３）アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミド。ベクターは、前述のように、最適化されたプロトコルを使用して、２つの連続する塩化セシウム勾配により精製された。Ａｙｕｓｏ Ｅ， ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；１７（４）：５０３－１０．を参照されたい。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８に対して透析し、濾過し、ｑＰＣＲにより滴定し、そして使用するまで－８０℃で保存した。図１Ｂを参照されたい。

〔実施例７：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１の産生〕
ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１（配列番号１０）は、修飾を有する３つのプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスフリートランスフェクションによって生成された。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，及びＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、ローラーボトル（ＲＢ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，米国）中で、７０％コンフルエントまで培養し、次に、以下のもので同時トランスフェクトした。１）ＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１；配列番号６）によって隣接された発現カセットを有するプラスミド。２）ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有するプラスミド。３）アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミド。ベクターは、前述のように、最適化されたプロトコルを使用して、２つの連続する塩化セシウム勾配により精製された。Ａｙｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８に対して透析し、濾過し、ｑＰＣＲにより滴定し、そして使用するまで－８０℃で保存した。図２Ｂを参照されたい。

〔実施例８：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２の産生〕
ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号１１）は、修飾を有する３つのプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスフリートランスフェクションによって生成された。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，及びＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、ローラーボトル（ＲＢ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，米国）中で、７０％コンフルエントまで培養し、次に、以下のもので同時トランスフェクトした。１）ＡＡＶ２ ＩＴＲ （ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２； 配列番号７）によって隣接された発現カセットを有するプラスミド。２）ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有するプラスミド。３）アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミド。ベクターは、前述のように、最適化されたプロトコルを使用して、２つの連続する塩化セシウム勾配により精製された。Ａｙｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８に対して透析し、濾過し、ｑＰＣＲにより滴定し、そして使用するまで－８０℃で保存した。図３Ｂを参照されたい。

〔実施例９：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３の産生〕
ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３（配列番号１２）は、修飾を有する３つのプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスフリートランスフェクションによって生成された。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，及びＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、ローラーボトル（ＲＢ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，米国）中で、７０％コンフルエントまで培養し、次に、以下のもので同時トランスフェクトした。１）ＡＡＶ２ ＩＴＲ （ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３；配列番号８）によって隣接された発現カセットを有するプラスミド。２）ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有するプラスミド。３）アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミド。ベクターは、前述のように、最適化されたプロトコルを使用して、２つの連続する塩化セシウム勾配により精製された。Ａｙｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８に対して透析し、濾過し、ｑＰＣＲにより滴定し、そして使用するまで－８０℃で保存した。図４Ｂを参照されたい。

〔実施例１０：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの産生〕
ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ（配列番号１８）は、修飾を有する３つのプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３細胞のヘルパーウイルスフリートランスフェクションによって生成された。Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，及びＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、ローラーボトル（ＲＢ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，米国）中で、７０％コンフルエントまで培養し、次に、以下のもので同時トランスフェクトした。１）ＡＡＶ２ ＩＴＲ （ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ；配列番号１７）によって隣接された発現カセットを有するプラスミド。２）ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有するプラスミド。３）アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミド。ベクターは、前述のように、最適化されたプロトコルを使用して、２つの連続する塩化セシウム勾配により精製された。Ａｙｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８に対して透析し、濾過し、ｑＰＣＲにより滴定し、そして使用するまで－８０℃で保存した。図５Ｂ及び配列番号１８を参照されたい。

〔実施例１１：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２、およびｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３のインビトロ試験〕
ＨＥＫ２９３細胞に、異なるバージョンのヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼを含むプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２およびｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３を４μｇトランスフェクトした。

トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収し、全ＲＮＡを抽出し、そしてグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼの発現を、各配列に特異的なプライマーを使用して定量的ＲＴ－ＰＣＲによって測定した。４つのグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ含有プラスミドすべてによるトランスフェクションは、グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼｍＲＮＡの検出をもたらした。図６Ａを参照されたい。さらにグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性は、治療用構築物でトランスフェクトされたウェルの培地および細胞抽出物の両方において増加した。図６Ｂ及び６Ｃを参照されたい。両方の場合において、タンパク質（ｐＡＡＶ ｏｈＧＮＳ ｖｅｒｓｉｏｎ１～３）のコドン最適化バージョンをコードするプラスミドは、野生型配列を含有するプラスミドよりも、統計的に有意に高いレベルのグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼの産生をもたらした。図６Ｂ及び６Ｃを参照されたい。

〔実施例１２：ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型マウスへのＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２、またはＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３の静脈内注射〕
ヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ発現カセットの異なるバージョンを含有するＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＮＳ、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２またはＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３の１×１０^１０ベクターゲノムの総用量を、２ヶ月齢のＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型罹患マウスに尾静脈注射により静脈内投与した。

ベクター送達の２週間後に分析を実施した。４つすべてのグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ含有ベクターによる形質導入は、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型動物において測定されたレベルを超えた、グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性の実質的な増加をもたらした。グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性レベルは、肝臓におけるＷＴレベルの１３００％から２７００％、および血清におけるＷＴレベルの９００％から３３００％の範囲であった。図７Ａ及び７Ｂを参照されたい。肝臓では、最適化されたヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのｖｅｒｓｉｏｎ３を含む発現カセットで達成された活性レベルは、野生型配列を含むベクターによって媒介されるレベルよりも統計的に高かった。図７Ａを参照されたい。血清では、最適化されたヒトグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのｖｅｒｓｉｏｎ２およびｖｅｒｓｉｏｎ３の両方が、酵素活性において統計的に有意な増加をもたらした。図７Ｂを参照されたい。

肝臓および血清中に記録された高レベルのグルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性と整合して、ＧＡＧ含有量は全てのベクター構築物を注射された動物の肝臓において完全に正常化された。図７Ｃを参照されたい。

〔実施例１３：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの槽内送達－短期試験〕
ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターの５×１０^１０ベクターゲノムの総用量を、５μＬの総容量で２ヶ月齢のＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型動物の大槽内に注射した。ベクター投与の４ヶ月後、ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型処置動物の脳におけるＧＮＳの酵素活性は正常化され、健康な動物において観察されたものと同様の値に達した。図８を参照されたい。ＧＮＳ活性の回復は、野生型対照群および処置したＧｎｓ^－／－マウスにおける同様のレベルのＧＡＧ蓄積によって示されるように、分析した全てのＣＮＳ領域において、疾患に特徴的な基質蓄積の完全な正常化をもたらした。図９Ａを参照されたい。同様に、リソソーム区画のサイズの指標として使用されるリソソームマーカー、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２）に反応する抗体で染色された脳切片のシグナル強度の定量化は、オスのＧｎｓ^－／－処置マウスにおいて、対照「Ｎｕｌｌ」ベクターを投与したＧＮＳ欠乏マウスで記録された値を上回って、約９０％のＬＡＭＰ２＋面積の減少を示した。図９Ｂを参照されたい。

非分解基質蓄積による正常なリソソームホメオスタシスの破壊は、突然変異によって直接影響を受けるリソソーム酵素とは異なる他のリソソーム酵素の活性を変える可能性がある。Ｒｉｂｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１４；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｕ７２７を参照されたい。ＩＤＵＡ（イズロニダーゼ、アルファ－Ｌ－）、ＧＡＬＮＳ（ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ）、ＧＵＳＢ（グルクロニダーゼ、ベータ）、およびＨＥＸＢ（ヘキソサミニダーゼＢ）の活性は、無処置のＧｎｓ^－／－雄マウスまたは対照「Ｎｕｌｌ」ベクターで処置されたＧｎｓ^－／－雄マウスの脳で変化したが、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳで処置したところ、これらの活性は健康な野生型マウスで観察されたレベルに戻り、このことはリソソームホメオスタシスが、Ｇｎｓのベクター由来発現により回復されたことを証明する。図９Ｃを参照されたい。

６ヶ月齢の雄マウスの大脳皮質の透過型電子顕微鏡による超微細構造分析は、神経周囲グリア細胞として同定された細胞の細胞質中に、電子顕微鏡で明るく見える物質を含有する大きな液胞が、Ｎｕｌｌ注入ＧＮＳ欠乏マウスにおいて存在することを明らかにした。これらの小胞は、貯蔵材料で満たされたリソソームであると思われるが、健康な野生型またはＡＡＶ９－Ｇｎｓ処置Ｇｎｓ^－／－動物からのサンプル中には完全に欠けており、これにより遺伝子導入の後にリソソーム区画が正常サイズに回復したことを確認した。図１０を参照されたい。

中枢神経系のグリア細胞の活性化を特徴とする神経炎症は、サンフィリッポ症候群の証明である。星状細胞増加症（ＧＦＡＰ）および小膠細胞症（ＢＳＩＢ４）を検出するために使用される染色のシグナル強度は、健常対照群と比較して、Ｎｕｌｌベクターで処置されたＧｎｓ^－／－マウスにおいて増加した。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳを用いたＧｎｓ^－／－マウスの処置は、研究した全ての脳領域において両方の炎症マーカーの陽性面積の％を減少させた。図１１Ａ及び１１Ｂを参照されたい。

ＣＳＦに投与されたＡＡＶ９ベクターは周縁部に漏出し、肝臓に形質導入を生じさせる。Ｈａｕｒｉｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１２３（８）：３２５４－３２７１．を参照されたい。したがって、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳで処置したＧｎｓ^－／－雄マウスの肝臓におけるＧＮＳの活性は、健康な動物において観察されたものより約２０倍高かった。図１２を参照されたい。肝臓において過剰発現されると、可溶性のリソソームタンパク質は血流に効率的に分泌され、この器官が循環酵素の供給源となる。Ｒｕｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２；２０（２）：２５４－６．を参照されたい。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターで処置したＧＮＳ欠乏マウスの血清では、ＧＮＳ活性は野生型同腹仔におけるよりも２０倍高かった。図１３を参照されたい。治療の体細胞有効性を、異なる器官におけるＧＡＧ含有量の定量化により評価すると、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓および脂肪組織を含むほとんどの組織において、完全な正常化が観察された。図１４Ａを参照されたい。

Ｇｎｓ^－／－マウスにおけるリソソーム病理を緩和するためのＣＳＦ内ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ処置の可能性のさらなる実証は、肝臓抽出物中の他のリソソーム酵素の活性を測定することによってなされた。ＳＧＳＨ（スルファミダーゼ）、ＮＡＧＬＵ（Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼアルファ）、ＨＧＳＮＡＴ（ヘパランアルファグルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ）、ＩＤＵＡ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＨＥＸＢは、無処置Ｇｎｓ^－／－マウスにおけるＷＴレベル、または対照「Ｎｕｌｌ」ベクターで処置されたＧｎｓ^－／－マウスにおけるＷＴレベルに関して、大きく変化した。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳによる処置は、これらすべての酵素の活性を完全に正常化した。図１４Ｂを参照されたい。ＧＡＧ含有量データに従って、肝臓の重量を、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳで処置したＧｎｓ^－／－マウスにおいて標準化した。図１５Ａを参照されたい。脾臓の重量もまた、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ処置動物において標準化した。図１５Ｂを参照されたい。最後に、透過電子顕微鏡分析によって、６ヶ月齢のＡＡＶ９Ｎｕｌｌ注入ＧＮＳ欠乏マウスが、肝細胞および肺の気管支繊毛上皮細胞内に多数の電子顕微鏡で明るく見える液胞を呈するが、健康なＷＴおよびＡＡＶ９ＣＡＧ ｏｍＧＮＳ処置マウスにおいてはそうではない、ということを明らかにした。図１６を参照されたい。

行動に対するＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳのＣＳＦ内投与の影響を、オープンフィールド試験で評価したが、これは、未知の環境におけるマウスの一般的な自発運動および探索的活動を評価するものである。無処置およびＡＡＶ９ｎｕｌｌ処置Ｇｎｓ^－／－マウスは、健康なマウスと比較して、試験中に移動した総距離および休止した時間量に関して、自発運動量の減少を示した。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの槽内投与は、Ｇｎｓ^－／－雄マウスにおける行動障害を完全に矯正した。図１７を参照されたい。

〔実施例１４：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの槽内送達－長期試験〕
ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型の長期的矯正を媒介することにおけるＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの単回投与の治療効果を評価するために、ＧＮＳ欠乏動物のコホートに、２ヶ月齢で、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターの５×１０^１０個のベクターゲノムを大槽に注射し、ベクター投与の１０ヶ月後、すなわちマウスが１歳の時に、分析した。ＧＮＳ遺伝子導入は脳全体のＧＡＧ含有量を減少させた。１２ヶ月齢までに、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳ処置動物は健康な動物と同じＧＡＧレベルを示し、これは長期の治療効果の証拠を提供している。図１８Ａを参照されたい。

持続的に疾患矯正を提供する治療の能力をさらに評価するために、ＬＡＭＰ２の免疫組織化学的検出を１２ヶ月齢の動物の脳切片に対して行った。リソソームＧＡＧの病理学的貯蔵を反映して、無処置またはヌル注入Ｇｎｓ^－／－オスは、分析した脳のすべての領域においてＬＡＭＰ２シグナルの強度における有意な増加を示した。図１８Ｂを参照されたい。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳで処理したマウスでは、遺伝子導入後に観察されるＧＡＧの蓄積における減少は、異なる領域でのほぼＷＴレベルまでのＬＡＭＰ２陽性シグナルの顕著な低下に翻訳され、このことはＧＡＧレベルの常態化故のリソソーム区画の縮小を示す。図１８Ｂを参照されたい。

アストログリオーシスおよび小膠細胞症を単回ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクター投与の１０ヵ月後に分析した場合、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターを投与されたＧＮＳ欠乏雄マウスは、形態学的分析により実証されるように、研究したすべての脳領域においてＧＦＡＰシグナル強度の顕著な減少を示した。図１９Ａを参照されたい。同様に、ＧＮＳをコードするベクターによる処置は、ＢＳＩ－Ｂ４陽性シグナルを、野生型の健康な動物において定量されたレベルとほぼ同じレベルまで低下させた。図１９Ｂを参照されたい。

ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの送達の１０ヶ月後、処置されたＧＮＳ欠乏マウスは、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓および脂肪組織などの末梢器官において正常またはほぼ正常なＧＡＧ含有量を示した。図２０Ａを参照されたい。

病理学的ＨＳ蓄積のこの完全なクリアランスと一致して、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターで処置したＧＮＳ欠乏動物の肝臓は、突然変異によって影響されずかつＨＳ（例えば、ＩＤＵＡ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵおよびＨＧＳＮＡＴ）の異化に関与し、またはＨＳ経路（例えば、ＧＡＬＮＳ、ＧＵＳＢおよびβ－ＨＥＸＯ）とは無関係の、他のリソソーム酵素の正常レベルの活性を示した。図２０Ｂを参照されたい。これらの酵素の活性は、処置の年齢、即ち２ヶ月齢の若い動物において既に撹乱されており、このことは、疾患の発症の早い段階でリソソームホメオスタシスが破壊されることを実証するものである。Ｒｏｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２０１７；２６（８）：１５３５－５１．を参照されたい。したがって、結果は、遺伝子治療の処置によるリソソーム生理機能の変更という持続的な逆転を示唆している。

最後に、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターの単回投与から１０ヶ月後の治療効果の持続性も、動物を行動試験に供した場合に明らかであった。１歳の処置されたＧｎｓ^－／－雄マウスは、年齢を合わせた未処置のＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型マウスにおいて観察された自発運動量の減少とは対照的に、健康な同腹仔と同じ挙動を示した。図２１を参照されたい。

サンフィリッポ病の動物モデルはかなり短縮された寿命を有する。Ｈａｕｒｉｇｏｔ Ｖ，ｅｔ ａｌ，．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１３；１；ｐｉｉ：６６７７８．；Ｒｉｂｅｒａ Ａ，ｅｔ ａｌ，．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１５；２４（７）：２０７８－９５．を参照されたい。疾患の非常に進行した段階であるはずの治療効果を評価するために、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの５×１０^１０個のベクターゲノムを用いて、２ヶ月齢で処置した動物の別のコホートを、ベクター投与の２０ヶ月後に、すなわちマウスがほぼ２歳であり、そしてほとんどの未処置のＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型動物がもはや生存していない場合において、分析した。２２ヶ月齢の処置されたＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型動物では、脳ＧＮＳ活性は非常に高いレベルで維持された。図２２を参照されたい。ＧＮＳ活性の治療レベルがこのように維持されることは、処置されたＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型マウスの脳におけるＧＡＧの正常なレベルを説明しており、このことは、健康な野生型同腹仔の脳と同様のＧＡＧ含有量を示している。図２３Ａを参照されたい。したがって、リソソームマーカーＬＡＭＰ２のシグナル強度の定量化により形態計測的に評価されたリソソーム区画のサイズは、分析されたＣＮＳ領域のいずれにおいても統計的に有意に増加することはなかった。図２３Ｂを参照されたい。同様に、突然変異によって影響されない他のリソソーム酵素の活性は、健康な野生型同腹仔において記録されたものと類似しており、このことは老齢の処置されたＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型マウスにおける正常なリソソームホメオスタシスを確認するものである。図２３Ｃを参照されたい。２２ヶ月齢の処置ＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型マウスの脳もまた非常に低いＧＦＡＰおよびＢＳＩ－Ｂ４シグナルを示し、このことは、神経炎症に対する治療の著しい効果が、治療用ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターの単回投与後２０ヶ月持続したことを示している。図２４ＡおよびＢを参照されたい。最後に、ＧＮＳの持続的産生は、処置されたＭＰＳＩＩＩ－Ｄ型マウスの末梢器官において正常レベルのＧＡＧ含有量をもたらし、ここで、肝臓、心臓、脾臓、肺および脂肪組織は、健康な、年齢を合わせた動物の末梢器官と同じＧＡＧ含有量を有した。図２５を参照されたい。

〔実施例１５：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳの槽内送達－生存研究〕
最後に、生存に対するＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＮＳベクターのＣＳＦ内投与の効果を評価した。１８ヶ月の時点で、すべての野生型対照マウスは生存していたが、無処置のＧｎｓ^－／－マウスの１００％と、ＡＡＶ９－ｎｕｌｌ処置Ｇｎｓ^－／－マウスの８０％が死亡し、このことは、ＧＮＳ欠乏が寿命を相当程度短縮することを示す。ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧｎｓを投与した２０匹のＧｎｓ^－／－マウスの群のうちの２匹のみが同じ期間において死亡し、このことは治療の有効性をさらに証明するものである。図２６を参照されたい。

Claims (13)

1. 発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、
   前記発現カセットが、ＧＮＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作用的に連結された転写調節領域を含み、
   前記ヌクレオチド配列が配列番号４であることを特徴とするポリヌクレオチド。
2. 前記転写調節領域がプロモーターを含むことを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記プロモーターが恒常的なプロモーターであることを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
4. 前記プロモーターがＣＡＧプロモーターであることを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記発現カセットがアデノ随伴ウイルスＩＴＲによって隣接されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
6. 請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とするベクター。
7. 前記ベクターはプラスミドまたはアデノ随伴ウイルスベクターであり、前記アデノ随伴ウイルスベクターが請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスゲノムを含むことを特徴とする請求項６に記載のベクター。
8. 前記ベクターが、配列番号８に記載される受託番号ＤＳＭ ３２３４５を有するプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３であることを特徴とする請求項６又は７に記載のベクター。
9. 前記ベクターが、血清型９のアデノ随伴ウイルスベクター、ＡＡＶ９であることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
10. 請求項１乃至５のいずれかに１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６乃至９のいずれか１項に記載のベクターの治療有効量を含むことを特徴とする医薬組成物。
11. 薬物の製造のための、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６乃至９のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１０に記載の医薬組成物の使用。
12. ムコ多糖症ＩＩＩ－Ｄ型の治療のための薬物の製造のための、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項６乃至９のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１０に記載の医薬組成物の使用。
13. 請求項７又は９に記載のベクターを取得する方法であって、
    （ｉ）請求項１乃至５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、ＡＡＶｃａｐタンパク質と、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質と、を含む細胞を提供するステップと、
    （ｉｉ）前記ＡＡＶの集合に適した条件下で前記細胞を維持するステップと、
    （ｉｉｉ）前記細胞によって産生された前記アデノ随伴ウイルスベクターを精製するステップと、を含むことを特徴とする方法。
    

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