JP7369403B2 - ムコ多糖症ｉｖａ型治療用のアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

Description

DSMZ DSM 32791 DSMZ DSM 32792 DSMZ DSM 32793 DSMZ DSM 32794

発明の詳細な説明

〔技術分野〕
本発明は、目的のタンパク質の発現および遺伝子治療におけるそれらの利用に役立つポリヌクレオチド配列およびベクターに関する。本発明は、ムコ多糖症（ＭＰＳ）の治療、特にムコ多糖症ＩＶＡ型またはモルキオ症候群Ａ型の治療に有用なベクターおよび核酸配列にも関する。

〔背景技術〕
リソソームとは、動物細胞の細胞質に存在する細胞小器官で、５０種類以上の加水分解酵素を含み、古くなった細胞成分の再利用時、あるいはウイルスや細菌の貪食後に、生体分子を分解する。この細胞小器官は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼおよびスルファターゼを含むいくつかの種類の加水分解酵素を含む。すべての酵素は酸性の加水分解酵素である。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、１つまたは複数のリソソーム酵素に影響を及ぼす遺伝的欠陥によって引き起こされる。これらの遺伝疾患は一般に、リソソームに存在する特定の酵素活性の欠損に起因する。また、より少ない頻度ではあるが、これらの疾患は、リソソームの生合成に関与するタンパク質の欠損が原因であることもある。

ＬＳＤは個人ではまれであるが、集団としてはこれらの疾患は一般集団に比較的よくみられる。ＬＳＤの総罹患率は、出生５，０００人当たり約１人である。しかし、一般集団の中でもいくつかの集団は、特に高い発生率でＬＳＤに罹患する。例えば、中部および東ヨーロッパのユダヤ系（アシュケナージ）のそれぞれの子孫において、ゴーシュ病およびテイ＝サックス病の罹患率は、それぞれ、出生児の６００人に１人、および出生児の３９００人に１人である。

ムコ多糖症（ＭＰＳ）は、グルコサミノグリカン（ＧＡＧ）の代謝に関与する特定のリソソーム酵素の不在または欠損を特徴とする７つのＬＳＤ疾患群である。Ｘ染色体連鎖遺伝を有するＭＰＳＩＩ（ハンター病）以外のすべてのＭＰＳは常染色体劣性遺伝形式をとる。

７つのＭＰＳのうち、ムコ多糖症ＩＶ型（ＭＰＳＩＶまたはモルキオ症候群）にはＡとＢの２つの亜型がある。モルキオＡとＢはともに常染色体劣性遺伝の病態であり、男女とも等しく罹患する。モルキオＡまたはＭＰＳＩＶＡはまれな病態であり、罹患率に関する既存のデータは不足しており、変わりやすい。報告されている推定値は、北アイルランドの７６，３２０人当たり１人から西オーストラリアの６４１，１７８人当たり１人までの範囲である。ＭＰＳＩＶＡは、ＧＡＧケラタン硫酸（ＫＳ）およびコンドロイチン６‐硫酸（Ｃ６Ｓ）の劣化に関与する酵素の１つの欠損によって引き起こされる。この酵素をコードする遺伝子が同定され、様々な突然変異が報告されている。

ＭＰＳＩＶＡはガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ、ＥＣ３．１．６．４）という酵素の活性の欠損によって生じる。ＧＡＬＮＳは、コンドロイチン－６－硫酸（Ｃ６Ｓ）の非還元末端のＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸の硫酸エステル基と、ケラタン硫酸（ＫＳ）の非還元末端のガラクトース－６－硫酸の硫酸エステル基を加水分解するリソソーム酵素である。非分解Ｃ６ＳおよびＫＳの持続的な蓄積の結果として、進行性の細胞損傷が起こり、多臓器性疾患をもたらす。現在、ヒトＧＡＬＮＳ遺伝子中で、ＧＡＬＮＳ酵素の活性の欠損に至る、約１８０の異なる変異が同定されている。

ＫＳおよびＣ６Ｓの大部分は軟骨細胞によって産生されるため、分解されなかった基質は主に軟骨の細胞および細胞外マトリックスに蓄積する。これは、軟骨および骨の発達に直接的な影響を及ぼし、全身性骨格形成異常を引き起こす。モルキオＡの患者では、軟骨細胞が空胞化しており、その結果、軟骨形成異常および／または軟骨内骨化が生じる。ＭＰＳＩＶＡ患者のほとんどは健康な外見で生まれ、症状は徐々に進行する。初期症状は１～３歳の間に認められ、診断時の平均年齢は４．７歳前後である。主な骨格的特徴として、顕著な体幹小人症、歯突起形成不全、手根胸筋、脊柱後弯症、側弯症、外反膝、外反股、下位肋骨の発赤、過可動関節および転倒傾向を伴う異常歩行が挙げられる。その他の潜在的な合併症として、肺障害、心臓弁膜症、難聴、肝腫大、微細な角膜混濁、粗い顔貌、異常に薄いエナメル質と頻回の齲蝕を伴う広範囲の歯牙が挙げられる。ＭＰＳＩＶＡ患者は知能を保つ。疾患の進行速度および存在する表現型の特徴は、患者間で様々である。ＭＰＳＩＶＡの表現型は、一生を通して、最終身長が１２０ｃｍ未満の場合は重度、最終身長が１２０ｃｍを超え１４０ｃｍ未満の場合は中度、最終身長が１４０ｃｍ以上の場合は軽度と定義される。平均寿命は、１０歳代から７０歳代までの範囲で報告されている。この変動性は、突然変異の性質、民族性または患者が受ける医療における差など、複数の因子に関係している可能性がある。

最近まで、ＭＰＳＩＶＡ症候群に対する疾患に特定の承認された治療法はなかった。利用可能な治療は対症療法であり、疾患合併症の予防と管理のための広範囲の非特異的薬物の投与に基づいていた。しかし、最近数年間にＭＰＳＩＶＡ患者に対して２つの主な治療選択肢が利用可能になった。酵素補充療法（ＥＲＴ）と造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。両治療戦略の設計は、正常細胞がかなりの量のマンノース‐６‐リン酸（Ｍ６Ｐ）標識可溶性リソソーム酵素、例えばＧＡＬＮＳを分泌し、それがその後、血漿細胞膜上のＭ６Ｐ受容体を介して他の細胞によって細胞外コンパートメントから取り込まれ、リソソームに標的化されることができるという事実に基づいて、交差補正の可能性に依存している。さらに、残存酵素活性の閾値があり、一般に非常に低く、これを超えると細胞は基質流入に対処可能であり、疾患は被験者に影響を及ぼさないことから、正常な活性の回復は臨床経過を変える必要条件ではないことが示唆される。

ＭＰＳＩＶＡについて、ＥＲＴはこの疾患の２つの異なるマウスモデルにおいて試験されている（Tomatsu et al.、２００８、２０１０ａ、２０１５）。本試験では、組換えマウスＧＡＬＮＳ(ｒＧＡＬＮＳ)の２５０Ｕ／ｇの用量を、０．５週齢および１２週齢のＭＰＳＩＶＡマウスに週１回静脈内または腹腔内投与した。最終投与の１週間後、ＭＰＳＩＶＡマウスは、内臓器官、骨髄の洞内皮細胞、心臓弁、靭帯および結合組織におけるＧＡＧ蓄積の顕著な減少および血中ＫＳレベルの顕著な減少を示した。これは、ｒＧＡＬＮＳの注入による体性補正（somatic correction）の証拠である。

２０１４年、エロスルファーゼアルファ、VIMIZIM（登録商標）（BioMarin Pharmaceutical Inc）として商業化された組換えヒトＧＡＬＮＳは、食品医薬品局（ＦＤＡ）および欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によってＭＰＳＩＶＡの治療用に承認された。治療は２ｍｇ／ｋｇの投与量で週１回、静脈注入し、平均注入時間は３．５～４．５時間であった。登録患者の年齢は５～５７歳であった。ベースラインとして、６分間歩行テスト（６ＭＷＴ）では登録患者全員が３０～３２５ｍ歩行可能であった（Sanford and Lo、２０１４）。主要評価項目は、治療開始後２４週目の６ＭＷＴにおける歩行距離のベースラインからの変化として設定した。副次評価項目は、３分間での階段昇降速度（３ＭＳＣＴ）および２４週目の尿中ＫＳ濃度のベースラインからの変化とした。患者を２つの治療群に分けた：１週間に２ｍｇ／ｋｇの投与量でＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）を投与された患者および１週間おきに２ｍｇ／ｋｇのＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）を投与された患者の２つの治療群に分けた。ＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）２ｍｇ／ｋｇを週１回投与された患者では、６ＭＷＴの歩行距離が、治療開始２４週間後に、プラセボコホートと比較して２２，５ｍまで増加した。しかし、ＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）を投与された患者では、階段昇降速度に差はなかった。さらに、治療の最初の２４週間に関して歩行能力のさらなる改善は観察されなかった。一方、ＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）２ｍｇ／ｋｇを１週間おきに投与した患者では、プラセボ群と比較して、６ＭＷＴおよび３ＭＳＣＴに差はなかった。薬力学的効果の尺度であるベースラインからの尿中ＫＳレベルの減少は、全てのＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）処置群においてより大きかった（２０１４年）。プラセボ対照試験に最初に組み入れられた患者は、その後、非盲検延長試験（ＭＯＲ－００５）でＶＩＭＩＺＩＮ（登録商標）による治療を開始する資格があった。

ＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）に対する過敏症の可能性があるため、製剤投与中に医療支援が利用可能である。試験中、記載されている最も重篤な有害事象はアナフィラキシー反応および過敏症反応であり、ＶＩＭＩＺＩＭ（登録商標）注入中のいつでも、または製剤投与後３時間までに発現することがある。急性呼吸器疾患の患者はリスクが高い可能性があり、さらなるモニタリングが必要である。患者の生命を危うくするそのようなアナフィラキシー反応として、咳嗽、発疹、咽喉圧迫感、蕁麻疹、潮紅、皮膚色の変化、低血圧、息切れ、胸痛、および、悪心、腹痛、吐き気、嘔吐などの消化器症状が挙げられる（ｈｔｔｐ://ｖｉｍｉｚｉｍ.ｃｏｍ）。ＥＲＴの他の欠点として、以下のものが挙げられる。１）小児患者に３．５～４．５時間の静脈注入を行うことの難しさ。２）VIMIZIM（登録商標）２ｍｇ／ｋｇを週１回投与した患者の１００％が４週間後に抗薬物抗体を発現したこと。３）試験に参加した全患者が、試験期間中に少なくとも１回、本剤がマンノース－６－リン酸受容体に結合するのを阻害することができる中和抗体を発現した。４）在宅療養費も含めた治療費の高騰（２０１４年）。

骨髄由来幹細胞を用いた造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）（骨髄移植、ＢＭＴ）は、他のＭＰＳ患者の体性病理と神経病理の両方の治療において効率的であることが証明されている。ＨＳＣＴによる表現型の修正の主な欠点は、治療がＭＰＳＩＶＡ患者の成長に及ぼす影響が最小限であることである（Chinen et al., 2014; Wang et al., 2016; Yabe et al., 2016）。

ＭＰＳＩＶＡに対する現在の治療選択肢の限界を考慮すると、代替的なアプローチが必要とされる。

インビボ遺伝子治療は、ＭＰＳＩＶＡや他の遺伝性疾患に対する１回限りの治療の可能性を提供し、生涯にわたる有益な効果が期待される。

モルキオＡ病の遺伝子治療前臨床研究は、γ－レトロウイルス由来ベクター、レンチウイルス由来ベクター、およびアデノ関連由来ベクターの投与に主に基づいてきた。

ヒトＧＡＬＮＳ遺伝子をコードするγ－レトロウイルス由来ベクターを用いてＭＰＳＩＶＡヒトリンパ芽球様Ｂ細胞、ヒトケラチノサイト、マウス筋芽細胞、ウサギ滑膜細胞をin vitroで形質導入した結果、ＧＡＬＮＳ酵素活性が増加し、細胞内ＧＡＧ蓄積の低減につながった（Toietta et al., 2001）。

モルキオＡ皮膚線維芽細胞にヒトＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡをコードするレンチウイルス由来ベクターを投与したところ、ヒト健常線維芽細胞よりは低いもの、非形質導入ＭＰＳＩＶＡ線維芽細胞の７．５倍の酵素活性レベルを示した。レンチウイルスベクターの使用により、β－ヘキソサミニダーゼおよびβ－ガラクトシダーゼ活性も正常化した。これらの活性はモルキオＡの二次バイオマーカーであると報告されている（Almeciga et al., 2013; Salazar et al., 2016）。

特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター媒介遺伝子導入は形質導入効率が高く、これらベクターの病原性がないことから、多くのインビボ遺伝子治療用途の選択アプローチとして急速に現れている。ＡＡＶベクターは有糸分裂後細胞を形質導入することができ、いくつかの前臨床および臨床研究は、ＡＡＶベクター媒介遺伝子導入が、様々な疾患に対する治療用導入遺伝子の持続的発現を効率的に起こし得る可能性を実証している。

ＡＡＶベクターを用いることにより、酵素活性に対するＧＡＬＮＳおよびスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）の同時発現の効果を評価することが可能になった。この同時発現により、細胞培養における酵素活性が４倍まで増大した（Almeciga-Diaz et al., 2012）。インビボでは、モルキオＡマウスモデルにおけるＡＡＶ－ＧＡＬＮＳベクターの投与により、血漿中の酵素活性は単回静脈内投与１２週後に野生型レベルの８．５％まで回復したが、ＡＡＶ－ＳＵＭＦ１ベクターとの同時投与ではＧＡＬＮＳ活性が野生型レベルの１９％まで増加した。ＧＡＬＮＳ酵素活性はまた、それぞれ、心臓および骨において野生型の３０％および３３％まで増加した（Almeciga Javier, Montano Adriana, Shunji Tomatsu, 2012）。

ＧＡＬＮＳ酵素の骨送達を改善するために、骨ヒドロキシアパタイトに対するウイルスの親和性を付与するためにウイルスカプシド内に短絡酸性アミノ酸ペプチドを保有する改変ＡＡＶベクターを開発した。この改変ＧＡＬＮＳをコードするＡＡＶベクターは、ＭＰＳＩＶＡマウスモデルの骨におけるベクターゲノムコピーおよび導入遺伝子発現を有意に増加させ、野生型の４２％のＧＡＬＮＳ活性レベルをもたらした（Almeciga Javier, Montano Adriana, Shunji Tomatsu, 2012; Tomatsu et al., 2010b）。

前述のアプローチのいずれも、ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性を完全に回復させ、細胞質内封入体の完全な根絶を達成し、またはＭＰＳＩＶＡのすべての臨床徴候を直したものはない。このように、より良い有効性と安全性プロファイルを有するＭＰＳＩＶＡの治療に対する新規なアプローチが必要とされている。

本発明は、ムコ多糖症、特にムコ多糖症ＩＶＡ型すなわちモルキオ症候群Ａ型の治療のための新規なポリヌクレオチド配列およびベクターを提供する。

第一の態様において、本発明は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列と７５％～９０％の同一性を有する単離されたポリヌクレオチド配列であって、機能性ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼをコードする、新規な単離されたポリヌクレオチド配列を提供する。

別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド配列またはベクターを治療上効果的な量含む、薬学的組成物に関する。

さらに、本発明のさらなる態様は、薬剤として用いられる、特にムコ多糖症ＩＶＡ型すなわちモルキオ症候群Ａ型の治療用である、ポリヌクレオチド配列またはベクター、あるいは本明細書に記載した薬学的組成物に関する。

本発明はまた、本発明に係るアデノ随伴ウイルスベクターの製造方法を提供する。

〔図面の簡単な説明〕
図１は、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳの産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳおよびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｈＧＡＬＮＳコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。

図２は、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１の産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１およびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。

図３は、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２の産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２およびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。

図４は、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３の産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３およびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。

図５は、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓの産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｍＧａｌｎｓコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。

図６は、ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓの産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓおよびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｍＧａｌｎｓコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。

図７は、異なるヒトＧａｌｎバージョン（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧａｌｎｓ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧａｌｎｓ－ｖ１、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧａｌｎｓ－ｖ２、およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧａｌｎｓ－ｖ３）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄マウスへの静脈内送達。２ヶ月齢で各ベクターを５×１０^１０ｖｇずつ静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスの（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるＧＡＬＮＳ活性。ＷＴマウスのＧＡＬＮＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり４～５匹のマウスの平均±標準誤差である。

図８は、最適化マウスＧａｌｎ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄マウスへの静脈内送達。１ヶ月齢でＡＡＶ９－ＣＡＧｏｍＧａｌｎｓを１×１０^１２ｖｇずつ静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスの（Ａ）肝臓、（Ｂ）大腿骨および（Ｃ）脂肪組織におけるＧＡＬＮＳ活性。(Ｄ)同じ動物コホートの異なる注入後時点における血清中のＧＡＬＮＳ活性。ＷＴマウスのＧＡＬＮＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり４～５匹のマウスの平均±標準誤差である。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスに対してＰ＜０．０００１
図９は、最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ８ベクターの雄マウスへの静脈内送達。１ヶ月齢でＡＡＶ８－ＣＡＧｏｍＧａｌｎｓを１×１０^１２ｖｇずつ静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスの（Ａ）肝臓、（Ｂ）大腿骨および（Ｃ）脂肪組織におけるＧＡＬＮＳ活性。(Ｄ)同じ動物コホートの異なる注入後時点における血清中のＧＡＬＮＳ活性。ＷＴマウスのＧＡＬＮＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり４～５匹のマウスの平均±標準誤差である。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスに対してＰ＜０．０００１
図１０は、最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ８ベクターの雄マウスへの静脈内送達。１ヶ月齢でＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓを１×１０^１１ｖｇずつ静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスの（Ａ）肝臓、（Ｂ）大腿骨および（Ｃ）脂肪組織におけるＧＡＬＮＳ活性。(Ｄ)同じ動物コホートの異なる注入後時点における血清中のＧＡＬＮＳ活性。ＷＴマウスのＧＡＬＮＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり４～５匹のマウスの平均±標準誤差である。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスに対してＰ＜０．０００１
図１１は、最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターおよびＡＡＶ８ベクターの雄マウスへの静脈内送達。LC-MS/MS解析による（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるケラタン硫酸（ＫＳ）の定量。＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－雄マウスに対してＰ＜０．０００１
図１２は、最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターおよびＡＡＶ８ベクターの雄マウスへの静脈内送達。トルイジンブルーで染色した部分における脛骨骨端成長板の組織病理。元の拡大倍率：１００倍。

図１３は、最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターおよびＡＡＶ８ベクターのＧａｌｎｓ^－／－雄マウスへの静脈内送達。（Ａ）グリコサミノグリカンについてのＭｏｗｒｙ染色後の角膜上皮において得られた染色強度の定量。（Ｂ）静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスにおける、トルイジンブルーで染色した部分における涙腺の組織病理。元の拡大倍率：４０倍。＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－雄マウスに対してＰ＜０．０００１
図１４は、最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄マウスへの静脈内送達。最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ）をコードするベクター１×１０^１２ｖｇを全身投与された６ヶ月齢の健康なＷＴ雄およびＧａｌｎｓ^－／－雄から採取した歯状回および扁桃体の超微細構造の、透過型電子顕微鏡による解析。血管周囲マクロファージ（歯状回）、神経周囲グリア細胞および内皮細胞（扁桃体）のリソソームの肥大は矢尻で示してある。

〔微生物の寄託〕
プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳ（配列番号２）、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１（配列番号４）、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２（配列番号６）およびｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３（配列番号８）は、２０１８年４月１９日、アクセス番号ＤＳＭ３２７９１、ＤＳＭ３２７９２、ＤＳＭ３２７９３およびＤＳＭ３２７９４として、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, ドイツ連邦共和国）に寄託された。

〔定義〕
用語「ヌクレオチド配列」または「単離されたヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド配列」は、本明細書では互換的に用いられ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸分子（それぞれ、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を含んでいる）を指す。上記核酸は、二本鎖配列であっても、一本鎖配列であっても、または二本もしくは一本鎖配列の両方の一部分が含まれていてもよい。

用語「％の配列同一性」または「％の同一性」または「％の配列相同性」は、候補配列が最大の「％の配列同一性」を達成するように揃えた後において、参照配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸と同一である上記候補配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の割合を指す。好ましい実施形態では、配列同一性は、２つの任意の配列番号の全長またはその一部に基づき計算される。上記「％の配列同一性」は、本技術分野において定着している任意の方法またはアルゴリズム（ＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムなど）によって決定することができる（Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977;25:3389-3402およびAltschul S, et al., J Mol Biol. 1990;215:403-410を参照）。

本明細書において、上記「％の配列同一性」または「％の同一性」または「％の配列相同性」は、上記参照配列および上記候補配列を揃えた後に同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、上記参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の総数で除し、その結果を１００倍することにより計算される。

任意で、アミノ酸同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」なアミノ酸置換を考慮してもよい。このことは、当業者には明らかであろう。保存的なアミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の交換可能性に基づく。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む。脂肪族‐ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンを含む。アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンを含む。芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含む。塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンを含む。硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンを含む。本明細書で開示するアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に別の残基が挿入されたアミノ酸配列である。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸それぞれに対する好ましい保存的な置換は以下の通りである。AlaからSer; ArgからLys; AsnからGlnまたはHis; AspからGlu; CysからSerまたはAla; GlnからAsn; GluからAsp; GlyからPro; HisからAsnまたはGln; IleからLeuまたはVal; LeuからIleまたはVal; LysからArg; GlnからGlu; MetからLeuまたはIle; PheからMet, LeuまたはTyr; SerからThr; ThrからSer; TrpからTyr; TyrからTrpまたはPhe; ValからIleまたはLeu。

用語「コードする(codify)」または「コードしている(coding)」は、どのようにヌクレオチド配列がポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるかを決定する遺伝子コードを指す。配列中のヌクレオチドの順序は、ポリペプチドまたはタンパク質に沿ったアミノ酸の順序を決定する。

用語「タンパク質」は、１本以上のアミノ酸鎖またはポリペプチドから構成される高分子を指す。タンパク質は、システイン残基の３－オキソアラニンへの変換、糖鎖形成、または金属の結合のような翻訳後の修飾を受けうる。タンパク質の糖鎖形成とは、種々の炭化水素（アミノ酸鎖に共有結合されている）の付加である。

本明細書で用いられる用語「転写調節領域」は、１つ以上の遺伝子の発現を調節できる核酸フラグメントを指す。本発明のポリヌクレオチドの調節領域は、転写要素を結合してＲＮＡポリメラーゼ結合を助けるプロモーターおよび反応因子、アクチベーター、エンハンサー配列、および、リプレッサータンパク質が結合してＲＮＡポリメラーゼ結合をブロックし発現を妨げるオペレーターまたはサイレンサー配列を含む。

用語「プロモーター」は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えばコード配列の転写を調節するよう機能する核酸フラグメントとして理解されたい。すなわち、ポリヌクレオチド配列の５’上流に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位と、転写開始部位と、転写因子、リプレッサー、および当該分野で知られている、直接的または間接的に働いてプロモーターからの転写量を調節する他の任意のヌクレオチド配列に対する結合部位（ただし、これに限定されるものではない）とが存在することにより構造的に同定される、核酸フラグメントとして理解されたい。

プロモーターは、当該プロモーターに作動可能に連結しているヌクレオチド配列の転写を、所定のヌクレオチド配列に作動可能に連結している当該プロモーターを含む遺伝子コンストラクトを用いる発現システムにおいて、ＲＴ-ｑＰＣＲまたはノーザンブロッティングなどの好適なアッセイ（転写物の検出）を使用して開始できる場合、アクティブである、または上記ヌクレオチド配列の発現を進めると述べられる。上記プロモーターの活性はまた、コードされたタンパク質についての適切なアッセイ（例えば、ウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ）を使用して、タンパク質レベルで評価され得る。プロモーターは、転写物を検知できる場合、あるいは転写レベルまたはタンパク質レベルが、当該プロモーターを有さない点だけで異なるコンストラクトを用いた転写と比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％、１５００％または２０００％である場合、転写を開始できるという。

用語「構成的」プロモーターは、ほとんどの生理学的および発生条件下で活性であるプロモーターをいう。「誘導的」プロモーターは、好ましくは生理学的または発生条件に応じて調節されるプロモーターである。誘導的プロモーターは、薬物送達または光暴露後に活性であり得る。したがって、「構成的」プロモーターは、「誘導的」プロモーターの意味では調節されない。「組織特異的」プロモーターは、好ましくは特定の型の細胞／組織において活性である。遍在性プロモーターは、多くのまたは任意の異なる組織において活性であるプロモーターとして定義され得る。通常、本明細書の文脈において、「多くの」は、５以上または少なくとも６、１０、１５、２０または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個の異なる組織を意味する。

用語「ＣＡＧ」プロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサーを含むプロモーターをいう（Alexopoulou A. et al. BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11）。より正確に言えば、上記ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素、（ｉｉ）ニワトリβ－アクチンプロモーター、（ｉｉｉ）ニワトリβ－アクチン遺伝子の第一イントロン、および（ｉｖ）ウサギβ－グロビン遺伝子のイントロン２／エクソン３を含む。

用語「ｈＡＡＴ」プロモーターは、ヒトα１－アンチトリプシンプロモーターおよびアポリポタンパク質Ｅからの肝細胞制御領域（ＨＣＲ）エンハンサーの３つのコピーを含むハイブリッドプロモーターを指す。

用語「作動可能に連結されている(operably linked)」は、所定の遺伝子に対するプロモーター配列の機能上の関係および位置を指す（例えば、コード配列の転写に影響を及ぼすならば、プロモーターまたはエンハンサーは、当該コード配列に対して作動可能に連結されている）。一般的に、作動可能に連結されているプロモーターは、所定の配列に隣接している。しかし、エンハンサーは、所定の配列の発現を調節するために、当該所定の配列に隣接している必要はない。

本明細書で用いる用語「転写後調節領域」は、カセットまたは得られた遺伝子産物に含まれる配列の発現、安定化、または局在を容易にする任意のポリヌクレオチドを指す。

本明細書で用いる用語「ベクター」は、１つ以上の所定のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達、および任意で発現できるコンストラクトを指す。ベクターの例として、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性凝縮剤と結合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、安定であり得、自己複製であり得る。使用することができるベクターの種類に制限はない。ベクターは、伝播およびポリヌクレオチドの獲得に適したクローニングベクター、遺伝子コンストラクト、またはいくつかの異種生物に組み込まれた発現ベクターであり得る。

特定の実施形態では、上記ベクターは発現ベクターである。本明細書で使用される用語「発現ベクター」は、細胞における遺伝子発現のために設計されたベクターを指し、すなわち、ベクターは、特定の遺伝子を標的細胞に導入して、当該遺伝子によってコードされるタンパク質を産生するために使用される。

本発明に係るベクターは、エンハンサーおよび／またはプロモーター領域として作用し、発現ベクター上に担持された遺伝子の効率的な転写をもたらす調節配列を含むことができる。適切なベクターとして、原核生物発現ベクター（例えば、pUC18、pUC19、ブルースクリプト、およびそれらの誘導体）、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、CoIEl、pCRl、RP4、ファージおよびシャトルベクター（例えば、pSA3およびpAT28）、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）に基づく真核生物発現ベクター、および非ウイルスベクター、例えば、pSilencer 4.1-CMV (Ambion（登録商標）, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, US)、pcDNA3、pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEFl/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAXl、pZeoSV2、pCI、pSVLおよびpKSV-10、pBPV-l、pML2dおよびpTDTlが挙げられる。

用語「組み換えプラスミド」または「プラスミド」は、小型で、環状で、二本鎖の、自己複製するＤＮＡ分子であって、所定の遺伝物質を細胞に移入することができ、結果として当該遺伝物質によりコードされている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）を標的細胞において産生することができる遺伝子工学技術を経て得られた、ＤＮＡ分子を指す。さらに、用語「組み換えプラスミド」または「プラスミド」はまた、小型で、環状で、二本鎖の、自己複製するＤＮＡ分子であって、組み換えベクターゲノムの担体としてのウイルスベクターを作製する際に使用される遺伝子工学技術を経て得られた、ＤＮＡ分子も指す。

用語「組み換えウイルスベクター」または「ウイルスベクター」は、自然に産するウイルスから、所定の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に移入することができ、結果として当該遺伝物質によりコードされている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）を標的細胞において産生することができる遺伝子工学技術を経て得られた作用物質を指す。

本明細書で同義語として用いられる用語「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」、および「ＡＡＶ粒子」は、ＡＡＶの少なくとも１つのカプシドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型のすべてのカプシドタンパク質）と、ＡＡＶゲノムに対応する封入ポリヌクレオチドとからなるウイルス粒子を指す。野生型ＡＡＶは、パルボウイルス科、ディペンドウイルス属に属するウイルスである。野生型ＡＡＶゲノムは約４．７Ｋｂの長さで、正または負に感知できる一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。野生型ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆方向末端反復（ＩＴＲ）、および３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ORF repは、ＡＡＶのライフサイクルに必要な４つのＲｅｐタンパク質をコードしている。ＯＲＦキャップはカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするヌクレオチド配列を含み、これらは相互作用して正二十面体対称のカプシドを形成する。最後に、Cap ORFと重複するAAP ORFは、カプシドアセンブリを促進すると思われるＡＡＰタンパク質をコードしている。粒子がＡＡＶ ＩＴＲに隣接する異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子のような野生型ＡＡＶゲノムとは別のポリヌクレオチド）を含む場合、典型的には「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター」として知られている。本発明はまた、ｄｓＡＡＶまたはｓｃＡＡＶとも呼ばれる二本鎖ＡＡＶの使用を包含する。

用語「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、本明細書中で使用される場合、ＡＡＶのゲノムのＤＮＡ鎖の両末端に存在する逆方向末端反復をいう。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要である。これらの配列の別の特性は、ヘアピンを形成する能力である。この特徴は、プライマーゼに依存しない第二のＤＮＡ鎖の合成を可能にする自己プライミングに寄与する。また、ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＤＮＡを宿主細胞ゲノム（例えば、血清型２ ＡＡＶのヒト第１９染色体）に組み込み、そこからレスキューすること、およびＡＡＶ ＤＮＡを完全に集合したデオキシリボヌクレアーゼ耐性ＡＡＶ粒子に効率的にカプシド化することの両方に必要であることが示されている。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、ＩＴＲの全配列がＡＡＶウイルスベクターのゲノムにおいて使用されるが、これらの配列のある程度の小さな改変は許容される。野生型ＩＴＲ配列は、ＩＴＲが所望の機能（例えば、複製、ニッキング、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキュー）を媒介する限り、挿入、欠失、または切断によって改変され得る。これらのＩＴＲ配列を改変するための手順は、当該分野で周知である。ＩＴＲは任意の野生型ＡＡＶに由来するものでよく、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２、または既知もしくは後に発見された任意の他のＡＡＶが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＡＶは２つのＩＴＲを含み、これらは同じであっても異なっていてもよい。また、２つのＩＴＲは、ＡＡＶカプシドと同じＡＡＶ血清型に由来してもよく、または異なっていてもよい。好ましい実施形態において、５’および３’ AAV ITRはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８および／またはＡＡＶ９に由来する。好ましくは、ＩＴＲはＡＡＶ２、ＡＡＶ８および／またはＡＡＶ９に由来し、最も好ましくは、ＡＡＶ２である。一実施形態において、ＡＡＶ２ ＩＴＲは偽型ＡＡＶ（すなわち、異なる血清型に由来するカプシドおよびＩＴＲを有するＡＡＶ）を産生するように選択される。

本明細書で使用される「組換えウイルスゲノム」という表現は、少なくとも１つの外来ポリヌクレオチドが天然に存在するＡＡＶゲノムに挿入されているＡＡＶゲノムを指す。本発明に係るＡＡＶのゲノムは、典型的にはシス作用性５’および３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）および発現カセットを含む。

用語「遺伝子治療」は、遺伝的疾患もしくは状態または後天的疾患もしくは状態を、治療または予防するため、細胞に対する所定の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に移入して、遺伝的疾患もしくは病態または後天的疾患もしくは病態を治療または予防することを指す。上記所定の遺伝物質は、インビボにおける生産が望まれている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）をコードしている。上記所定の遺伝物質は、例えば、酵素、ホルモン、受容体または治療上価値のあるポリペプチドをコードしうる。

本明細書で使用される用語「形質導入する（transduce）」または「形質導入（transduction）」は、外来ヌクレオチド配列がウイルスベクターを介して細胞内に導入されるプロセスを指す。

本明細書で使用される用語「トランスフェクション」は、非ウイルス法によって精製核酸を真核細胞に意図的に導入するプロセスを指す。

本明細書で使用される用語「治療する」または「治療」は、本発明の化合物または組成物を投与して、疾患の進行を制御することを指す。疾患の進行の制御は有益または所望の臨床結果の達成として理解され、これらには症状の減少、疾患の持続期間の減少、病理学的状態の安定化（特に、さらなる悪化を回避するため）、疾患の進行の遅延、病理学的状態の改善、および寛解（部分的および全体的の両方）が含まれるが、これらに限定されない。疾患の進行の制御には、治療を適用しない場合に予期される生存期間と比較しての生存期間の延長も含まれる。

用語「効果的な量」は、意図された目的を達成するために充分な物質の量を指す。例えば、ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）活性を上昇させるために効果的な量のＡＡＶベクターは、グリコサミノグリカンの蓄積を減少させるために充分な量である。疾患または障害を治療するための発現ベクターの「治療上効果的な量」とは、疾患または障害のシグナルおよび症状を減少または根絶するのに十分な量である。所与の物質の有効量は、物質の性質、投与経路、物質を受ける動物のサイズおよび種、ならびに物質を与える目的などの要因によって変化する。個々の場合における有効量は、当業者によって、当技術分野において確立された方法に従って経験的に決定され得る。

用語「個体」は、哺乳類を指し、好ましくはヒトまたは非ヒト哺乳類を指し、より好ましくはマウス、ラット、その他の齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマまたは霊長類を指し、さらに好ましくはヒトを指す。

〔発明を実施するための形態〕
本発明は、ムコ多糖症、特にムコ多糖症ＩＶＡ型またはモルキオ症候群Ａ型の治療のための新規なポリヌクレオチド配列およびベクターを提供する。

したがって、第１の態様では、本発明は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列と７５％～９０％の同一性を有する単離されたポリヌクレオチド配列（以降、「本発明のポリヌクレオチド」と称する）であって、機能性ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列に関する。

上述のように、ＭＰＳＩＶＡはガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ(ＧＡＬＮＳ）という酵素の活性の欠損によって生じる。ＧＡＬＮＳは、コンドロイチン－６－硫酸（Ｃ６Ｓ）の非還元末端のＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸の硫酸エステル基と、ケラタン硫酸（ＫＳ）の非還元末端のガラクトース－６－硫酸の硫酸エステル基を加水分解するリソソーム酵素である。非分解Ｃ６ＳおよびＫＳの持続的な蓄積の結果として、進行性の細胞損傷が起こり、多臓器性疾患をもたらす。

本発明の発明者らは、カセットを発現するヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の異なるバージョンを含むベクターであって、上記ＧＡＬＮＳコード配列は、野生型コードＧＡＬＮＳヌクレオチド配列と７５％～９０％の同一性を有する、ベクターをインビボで投与すると、ＭＰＳＩＶＡ動物で測定したレベルよりＧＡＬＮＳ活性が実質的に増大したことを示した。実際、野生型と７５％～９０％の間の同一性を有する配列を含む発現ベクターで到達したヒトＧＡＬＮＳ活性のレベルは、野生型配列を含むベクターによって媒介されるものより高かった。

したがって、第１の態様では、本発明は、配列番号１に記載される野生型ＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列と７５％～９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列であって、当該配列は、本技術分野で既知の機能性ヒトＧＡＬＮＳ変異体およびフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド配列についても意図している。したがって、本発明は、ＧＡＬＮＳと機能的に等価な変異体をコードするＤＮＡを含むと解釈されるべきである。

本明細書で使用される用語「機能的に等価な変異体」は、ＧＡＬＮＳのポリペプチド配列によってコードされる酵素に実質的に相同であり、ＧＡＬＮＳの生物学的活性を保存する任意の酵素に関する。このような機能的に等価な変異体の配列は、１つ以上のアミノ酸の挿入、置換または欠失によってＧＡＬＮＳの配列から得られ得、これはＧＡＬＮＳの生物学的活性を実質的に保存する。変異体が天然ＧＡＬＮＳの生物学的活性を保存するかどうかを決定する方法は当業者に広く知られており、本出願の実験部分で使用されるアッセイのいずれかを含む。特に、本発明に包含されるＧＡＬＮＳの機能的に等価な変異体は、ＧＡＬＮＳの機能の少なくとも１つ、例えば、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベル、特にＣ６ＳおよびＫＳレベルを正常化または低下させる機能、を有する。本発明の実施例の項では、機能性ＧＡＬＮＳ酵素が上記ＧＡＧレベルを減少または正常化する能力を判定するのに適した方法を詳述する。

本発明に付随する実施例に示すように、本発明のポリヌクレオチド配列は、機能性ＧＡＬＮＳ酵素をコードする。上記酵素は、ＷＴと比較した場合、増大した活性を示す。これらの結果はベクター投与後のＧＡＬＮＳ活性の回復を示し、これは、ＭＰＳＩＶＡ動物において測定されたレベルを超えるガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性の実質的な増加をもたらした。本発明に付随する実施例に示されるように、ＧＡＬＮＳ活性レベルは、肝臓におけるＷＴレベルの１５００％～２６００％の範囲であった。

好ましい実施形態において、ポリペプチドが上記のような機能を果たす能力を示す場合、特に、ＧＡＬＮＳ野生型ポリペプチドの能力の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、好ましくはＧＡＬＮＳ野生型ポリペプチドの能力の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％で、グリコサミノグリカンケラタン硫酸（ＫＳ）およびコンドロイチン－６－硫酸（Ｃ６Ｓ）を分解することができる場合、当該ポリペプチドは、ＧＡＬＮＳ酵素の機能的に等価な変異体であると考えられる。

ＧＡＬＮＳの機能的に等価な変異体は、天然のＧＡＬＮＳに実質的に相同なポリペプチドである。「実質的に相同」という表現は、タンパク質配列がＧＡＬＮＳ野生型配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性の程度を有する場合のタンパク質配列に関する。２つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムおよび方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)）を使用することによって決定されるが、他の類似のアルゴリズムを使用することもできる。

ＧＡＬＮＳの機能的に等価な変異体は、当該ＧＡＬＮＳを産生するために使用される宿主細胞におけるコドン優先性を考慮して、そのコードポリヌクレオチド内のヌクレオチドを置換することによって得ることができる。

ＧＡＬＮＳの機能的に等価な変異体は、保存的アミノ酸変化を行い、得られた変異体を、上記の機能性アッセイまたは当該分野で公知の他の機能性アッセイの１つにおいて試験することによって産生され得る。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンであり、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群はセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸群はリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、およびアスパラギン－グルタミンである。

本発明の特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに含まれるＧＡＬＮＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその機能的に等価な変異体は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列と７５％～９０％の同一性を有する。さらなる特定の実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列と８０％～８５％の同一性を有する。より好ましい実施形態では、上記配列は、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される。

本発明の別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるＧＡＬＮＳタンパク質は、ヒトＧＡＬＮＳ（ｈＧＡＬＮＳ）およびマウスＧＡＬＮＳ（ｍＧＡＬＮＳ）からなる群から選択され、好ましくはヒトＧＡＬＮＳ（ｈＧＡＬＮＳ）である。

本発明のポリヌクレオチドは、発現制御配列をさらに含んでよい。上記発現制御配列として、適切な転写調節配列（すなわち、開始、終結、プロモーター、およびエンハンサー）、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナル）、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を高める配列、および所望の場合、コードされる産物の分泌を高める配列が挙げられるが、これらに限定されない。多数の発現制御配列が当該分野で公知であり、本発明に従って利用され得る。

したがって、本発明によれば、特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写調節領域を有する。本発明の特定の実施形態では、上記転写調節領域はプロモーターを含む。本発明の別の特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの転写調節領域は、プロモーターに作動可能に連結されたエンハンサーをさらに含む。

本発明ポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。特定の実施形態では、上記ベクターは発現ベクターである。したがって、別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（本明細書では「本発明のベクター」と称される）に関する。特定の実施形態では、上記ベクターはプラスミドである。別の特定の実施形態では、上記ベクターはＡＡＶベクターであり、上記ＡＡＶベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えウイルスゲノムを含む。

本発明のポリヌクレオチドの文脈において開示されるすべての実施形態はまた、本発明のベクターに適用可能である。

別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド配列は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する。より特定の実施形態では、上記ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲである。

別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、転写後調節領域をさらに含む。本明細書で用いる用語「転写後調節領域」は、カセットまたは得られた遺伝子産物に含まれる配列の発現、安定化、または局在を容易にする任意のポリヌクレオチドを指す。転写後調節領域は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後領域（ＷＰＲＥ）であってもよいが、これに限定されない。本明細書で用いられる用語「ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス調節後エレメント」または「ＷＰＲＥ」は、転写されると遺伝子の発現を増強することができる三次構造を作り出すＤＮＡ配列を指す。

別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。

本明細書で用いられる用語「ポリアデニル化シグナル」は、ｍＲＮＡの３’末端へのポリアデニン尾部の付着を媒介する核酸配列に関する。適当なポリアデニル化シグナルとして、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５Ｅｌｂポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ヒト変異体成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ウサギβグロビンポリＡシグナルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウサギβグロビンポリＡシグナルまたはその機能性変異体およびフラグメントである。

上述のように、本発明の特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはベクターに組み込まれる。特定の実施形態では、上記ベクターは発現ベクターである。特定の実施形態では、上記発現ベクターは、上記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。上記プロモーターは、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターであり得る。特定の実施形態では、上記プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、ｈＡＡＴプロモーターまたはＣＭＶプロモーターから選択される。本発明の好ましい実施形態では、上記プロモーターはＣＡＧプロモーターである。別の特定の実施形態では、上記プロモーターはｈＡＡＴプロモーターである。

本発明のポリヌクレオチドは、ＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列またはその機能的に等価な変異体を含む。一実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、ヒトＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列であり、アクセッション番号ＮＭ＿０００５１２．４を有するＮＣＢＩデータベースの配列に対応し、より詳細には配列番号１である。好ましい実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、ヒトＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列の変異体である。より詳細には、上記ヌクレオチド配列は、配列番号1に記載されるヌクレオチド配列と７５％～９０％の同一性を有する。より詳細には、上記配列は、配列番号1に記載されるヌクレオチド配列と８０％～８５％の同一性を有する。好ましくは、上記配列は、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される。

より特定の実施形態では、本発明に係る発現ベクターは、アクセッション番号がＤＳＭ ３２７９２である配列番号４に記載されるプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１、アクセッション番号がＤＳＭ ３２７９３である配列番号６に記載されるプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２およびアクセッション番号がＤＳＭ ３２７９４である配列番号８に記載されるプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３からなる群から選択される。

別の特定の実施形態では、本発明は発現ベクターを指す。より詳細には、組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターまたはＡＡＶベクターであって、上記組換えウイルスゲノムが、ＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列またはその機能的に等価な変異体に作動可能に連結された転写調節領域を含むポリヌクレオチドを含む、ＡＡＶベクターである。

本発明に係るＡＡＶは、ＡＡＶの既知の血清型のいずれかの血清型を含む。一般に、ＡＡＶの異なる血清型は有意な相同性を有するゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝子機能を提供し、物理的な点および機能性の点で本質的に同等なビリオンを産生し、事実上同一のメカニズムを介して複製し、組み立てられる。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶ(ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および任意の他のＡＡＶの血清型１に属し得る。異なるＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースで見つけることができる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ００６２６０（ＡＡＶ７）、ＮＣ００６２６１（ＡＡＶ８）、およびＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）を参照のこと。好ましい実施形態において、本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群より選択される血清型のものである。好ましい実施形態において、本発明の上記ＡＡＶベクターは、血清型９、ＡＡＶ９または血清型８、ＡＡＶ８である。

特定の実施形態において、上記ＡＡＶベクターは、ヒトまたはマウスのＧＡＬＮＳ配列を含む。一実施形態では、上記ベクターは、ヒトＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、当該ヌクレオチド配列はアクセッション番号ＮＭ＿０００５１２．４を有するＮＣＢＩデータベースの配列に対応し、より詳細には配列番号１である。好ましい実施形態では、上記ベクターは、ヒトＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列の変異体であるヌクレオチド配列を含む。より詳細には、上記配列は、配列番号1に記載されるヌクレオチド配列と７５％～９０％の同一性を有する。より詳細には、上記配列は、配列番号1に記載されるヌクレオチド配列と８０％～８５％の同一性を有する。好ましくは、上記配列は、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される。

本発明の別の特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳ、配列番号１２であり、これは、ＣＡＧプロモーターに連結されたヌクレオチド配列配列番号１を含む。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＣＡＧプロモーターに連結されたヌクレオチド配列、配列番号３を含むＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１、配列番号１３である。別の実施形態では、ＡＡＶは、ＣＡＧプロモーターに連結されたヌクレオチド配列、配列番号５を含むＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２、配列番号１４である。別の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＣＡＧプロモーターに連結されたヌクレオチド配列、配列番号７を含むＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３、配列番号１５である。

好ましい実施形態において、本発明のＡＡＶは、５’～３’方向に、（ｉ）５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、（ｉｉ）ＣＭＶ即時初期エンハンサー、（ｉｉｉ）ニワトリベータアクチンプロモーター、（ｉｖ）ニワトリベータアクチン遺伝子の第１イントロン、（ｖ）ウサギベータグロビン遺伝子由来のイントロン２／エキソン３、（ｖｉ）ＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡまたはその機能的に等価な変異体、（ｖｉｉ）ウサギベータグロビンポリＡシグナルなどのポリＡシグナル、および（ｖｉｉｉ）３’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含むポリヌクレオチド配列を含む組換えウイルスゲノムを含む。当業者ならば、ベクターゲノムが他の配列（例えば、具体的に上述した配列間の介在配列）を含み得ることを理解するであろう。構成要素（ｉ）～（ｖ）は、当業者によって通常、理解される意味を有する。

好ましい実施形態において、組換えウイルスゲノムは、ヌクレオチド配列、配列番号１２を含む。具体的には、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲはヌクレオチド１～１３１を含み、ＣＡＧプロモーターはヌクレオチド１８５～１７０７を含み、ヒトＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡはヌクレオチド１９１８～３４９４を含み、ウサギβグロビンポリＡシグナルはヌクレオチド３５２０～４０４８を含み、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは配列番号１２のヌクレオチド４１０７～４２１５を含む。

好ましい実施形態において、組換えウイルスゲノムは、ヌクレオチド配列、配列番号１３を含む。具体的には、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲはヌクレオチド１～１３１を含み、ＣＡＧプロモーターはヌクレオチド１８５～１７０７を含み、ヒトＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡはヌクレオチド１９１８～３４９４を含み、ウサギβグロビンポリＡシグナルはヌクレオチド３５２０～４０４８を含み、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは配列番号１３のヌクレオチド４１０７～４２１５を含む。

好ましい実施形態において、組換えウイルスゲノムは、ヌクレオチド配列、配列番号１４を含む。具体的には、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲはヌクレオチド１～１２０を含み、ＣＭＶエンハンサーはヌクレオチド１９４～５５７を含み、β－アクチンプロモーターはヌクレオチド５５８～８３９を含み、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１イントロンはヌクレオチド８４０～１８０４を含み、ウサギβ－グロビン遺伝子由来のイントロン２／エクソン３はヌクレオチド１８０５～１９０６を含み、ヒトＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡはヌクレオチド１９３４～３５９２を含み、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルはヌクレオチド３６１９～４１４７を含み、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは配列番号１４のヌクレオチド４２０６～４３１３を含む。

別の好ましい実施形態において、組換えウイルスゲノムは、ヌクレオチド配列、配列番号１５を含む。具体的には、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲはヌクレオチド１～１２０を含み、ＣＭＶエンハンサーはヌクレオチド１９４～５５７を含み、β－アクチンプロモーターはヌクレオチド５５８～８３９を含み、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１イントロンはヌクレオチド８４０～１８０４を含み、ウサギβ－グロビン遺伝子由来のイントロン２／エクソン3はヌクレオチド１８０５～１９０６を含み、ヒトＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡはヌクレオチド１９３４～３５９２を含み、ウサギβ－グロビンポリＡシグナルはヌクレオチド３６１９～４１４７を含み、３’ＡＡＶ２ ＩＴＲは配列番号１５のヌクレオチド４２０６～４３１３を含む。

改変されたＡＡＶ配列もまた、本発明の文脈において使用され得る。このような改変配列は例えば、既知の血清型のいずれかのＡＡＶ ＩＴＲまたはＶＰに対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性（例えば、約７５～９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸配列同一性を有する配列）を有し、上記構成要素の機能を維持する配列を含む。ＡＡＶ ＩＴＲまたはＶＰの機能を決定するためのアッセイは、当該分野で公知である。上記改変配列は、野生型ＡＡＶ ＩＴＲまたはＶＰ配列の代わりに使用することができる。

本発明のＡＡＶベクターは、任意の血清型に由来するカプシドを含む。一般に、ＡＡＶの異なる血清型はアミノ酸および核酸レベルで有意な相同性を有するゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝子機能を提供し、物理的な点および機能性の点で本質的に同等なビリオンを産生し、事実上同一のメカニズムを介して複製し、組み立てられる。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶ(ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および任意の他のＡＡＶの血清型１に属し得る。異なるＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースで見つけることができる。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ００６２６０（ＡＡＶ７）、ＮＣ００６２６１（ＡＡＶ８）、およびＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）を参照のこと。好ましい実施形態において、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群より選択される血清型のものである。より好ましい実施形態において、上記ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型９、ＡＡＶ９またはＡＡＶ血清型８、ＡＡＶ８である。

本発明のＡＡＶベクターのゲノムは、ｒｅｐオープンリーディングフレームおよびｃａｐオープンリーディングフレームを欠く。このようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子産物およびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質）をコードし、発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞においてのみ、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得、ここで、宿主細胞はアデノウイルス由来のタンパク質をコードし発現するベクターでトランスフェクトされている。

〔本発明の薬学的組成物〕
本発明のポリヌクレオチド発現ベクターは、薬学的組成物中での製剤化を必要とする従来の方法によってヒトまたは動物体に投与することができる。したがって、第２の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドの治療上効果的な量または本発明のベクターを含む薬学的組成物（以下、「本発明の薬学的組成物」と呼ぶ）に関する。薬学的組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含み得る。

本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターの文脈で開示されたすべての実施形態は、本発明の薬学的組成物にも適用可能である。

用語「治療上効果的な量」は、所望の効果を生じるように計算された本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターの量を指し、一般に、何よりも、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターの独自の特徴および得られる治療効果によって決定される。したがって、疾患の治療に有効である上記量は、本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の標準的な臨床技術によって決定することができる。製剤に使用される正確な用量は、投与経路に依存する。初期用量は当該分野で周知の技術を使用して、インビボデータ（例えば、動物モデル）から推定され得る。当技術分野において通常の経験を有する者は、動物におけるデータに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができる。

特定の実施形態では、製剤の投与量は、ウイルス粒子として、またはゲノムコピー（「ＧＣ」）／ウイルスゲノム（「ｖｇ」）として測定または計算することができる。

本発明のウイルス組成物１ミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するために、当技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。ＡＡＶのＧＣ数滴定を行う１つの方法は、以下の通りである。精製されたＡＡＶベクターサンプルを、まず、ＤＮａｓｅで処理し、カプシド化されていないＡＡＶゲノムＤＮＡまたは汚染プラスミドＤＮＡを産生プロセスから排除する。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理に供して、カプシドからゲノムを放出させる。次いで、放出されたゲノムを、ウイルスゲノムの特定の領域を標的とするプライマー／プローブセットを使用するリアルタイムＰＣＲによって定量する。

本明細書中で互換的に使用される用語「薬学的に許容できる担体」、「薬学的に許容できる希釈剤」、「薬学的に許容できる賦形剤」、または「薬学的に許容できるビヒクル」は、任意の従来型の非毒性固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、封入材料、または製剤補助剤を指す。薬学的に許容できる担体は、使用される投与量および濃度では受容者に対して本質的に非毒性であり、製剤の他の成分と両立できる。薬学的に許容できる担体の数および性質は、所望の投与形態に依存する。薬学的に許容できる担体は公知であり、当該分野で公知の方法により調製し得る。

薬学的組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、脳脊髄液（ＣＳＦ）（例えば槽内または脳室内）投与に適合した薬学的組成物として、常法に従って製剤することができる。好ましい実施形態において、薬学的組成物は、静脈内または脳脊髄液（ＣＳＦ）投与のためのものである。より好ましくは、薬学的組成物は静脈内投与用である。

連続注入ＡＡＶベクターは、注射（例えば、ボーラス注射または連続注入）による非経口投与のために製剤し得る。注射用製剤は、防腐剤を添加した単位剤形（例えば、アンプルまたは単回または複数回用量容器）で提供することができる。ウイルス組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。ＡＡＶ製剤の液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸塩またはソルビン酸）などの薬学的に許容できる添加剤を用いて従来の手段によって調製することができる。調製物はまた、緩衝塩を含み得る。あるいは、組成物は、使用前に、適切なビヒクル（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）で構成するための粉末形態であってもよい。必要に応じて、組成物は注射部位での疼痛を軽減するために、リドカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。組成物が浸透によって投与される場合、医薬品質の水または生理食塩水を含有する浸透ボトルを用いて、組成物を分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射または滅菌生理食塩水用の水バイアルを提供することができ、それにより、成分を投与前に混合することができる。好ましくは、薬学的に許容できる担体は、生理食塩水溶液および界面活性剤（例えば、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、Pluronic F６８（登録商標））である。

本発明の組成物は、ヒトの対象とともに、獣医学的目的のための動物（例えば、家畜（ウシ、ブタ、その他））、および他の非ヒト哺乳動物の対象への送達のために製剤し得る。本発明の薬学的組成物は、遺伝子導入および遺伝子治療用途で用いるために、生理学的に許容できる担体を用いて製剤し得る。

本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターと組合せた、またはそれらと混合したアジュバントの使用も本発明に含まれる。意図されるアジュバントとしては、無機塩アジュバントまたは無機塩ゲルアジュバント、粒子アジュバント、マイクロ粒子アジュバント、粘膜アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。

アジュバントは、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターとの混合物として、またはそれらと併用して、対象に投与し得る。

本発明の薬学的組成物は、局所投与または全身投与し得る。一実施形態では、薬学的組成物は、その細胞が形質導入されるべき組織または臓器の近傍に投与される。特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は全身投与される。

本明細書で使用される用語「全身投与される（systemically administered）」および「全身投与（systemic administration）」は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、ＡＡＶベクターまたは組成物が非局在的に対象に投与され得ることを意味する。全身投与は、対象の全身のいくつかの器官または組織に到達し得るか、または対象の特定の器官または組織に到達し得る。例えば、静脈内投与は、対象における２つ以上の組織または器官の形質導入をもたらし得る。本発明の薬学的組成物は、単回投与で投与されてもよく、または本発明の特定の実施形態では、治療効果をあげるために多回投与（例えば、２回、３回、４回、またはそれ以上の投与）してもよい。本発明の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は単回投与で投与される、すなわち、一生に一度投与される。

このように、他の態様では、本発明は、医薬に使用される、本発明に係るポリヌクレオチドまたはベクター、または本発明に係る薬学的組成物に関する。

さらなる態様では、本発明は、ムコ多糖症ＩＶＡ型あるいはモルキオ症候群Ａ型の治療に使用される、本発明に係るポリヌクレオチドまたはベクター、または本発明に係る薬学的組成物に関する。

本発明に付随する実施例に示すように、異なるバージョンのヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ発現カセットを含有するＡＡＶベクターを、２ヶ月齢のＭＰＳＩＶＡ罹患マウスに尾静脈注射を介して静脈内送達した。ＧＡＬＮＳ活性分析の結果、すべてのガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ含有ベクターによる形質導入が、ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性を、ＭＰＳＩＶＡ動物において測定されたレベルよりも実質的に増加させたことが示された。

このように、他の態様では、本発明は、ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性を増加させるための、本発明に係るポリヌクレオチドまたはベクター、または本発明に係る薬学的組成物に関する。

別の態様では、本発明は、ムコ多糖症ＩＶＡ型の治療および／または予防を、それを必要とする対象に対して行う方法であって、当該対象に対し、本発明に係るポリヌクレオチド、本発明に係るベクター、または本発明に係る薬学的組成物を投与する方法を提供する。

本明細書で使用される用語「予防する（prevent）」、「予防する（preventing）」、および「予防（prevention）」は、対象における疾患の開始を阻害するか、または発症を減少させることをいう。予防は完全であってもよいし（例えば、対象における病理学的細胞の完全な欠如）、または部分的であってもよい。予防はまた、臨床症状に対する感受性の減少をいう。本明細書中で使用される用語「処置する（treat）」または「処置（treatment）」は、臨床徴候が現れた後の疾患の進行を制御するための、本発明のポリヌクレオチド、またはベクター、またはＡＡＶベクター、または薬学的組成物の投与をいう。疾患の進行の制御は有益または所望の臨床結果の達成として理解され、これらには症状の減少、疾患の持続期間の減少、病理学的状態の安定化（特に、さらなる悪化を回避するため）、疾患の進行の遅延、病理学的状態の改善、および寛解（部分的および全体的の両方）が含まれるが、これらに限定されない。疾患の進行の制御には、治療を適用しない場合に予期される生存期間と比較しての生存期間の延長も含まれる。

本明細書で使用される用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）、農場動物（例えば、鳥類、魚類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、家畜哺乳類（例えば、イヌおよびネコ）、または実験動物（例えば、マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類）などの個体または動物を指す。この用語は、任意の年齢または性別の対象を含む。好ましい態様において、対象は哺乳類、好ましくはヒトである。

〔本発明のＡＡＶを得る方法〕
本発明はまた、本発明のＡＡＶベクターを得る方法に関する。前記ＡＡＶベクターは、構成的にＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質を発現する細胞、またはＲｅｐコード配列およびＣａｐコード配列がプラスミドまたはベクター中に提供された細胞に本発明のポリヌクレオチドを導入することによって得ることができる。

したがって、別の態様において、本発明はまた、
（ｉ）本発明のポリヌクレオチド、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、および任意でＡＡＶの複製が依存するウイルスタンパク質を含む細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）上記ＡＡＶの組み立てに適する条件下に上記細胞を維持する工程と、
（ｉｉｉ）上記細胞により産生されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製する工程と含む、本発明のＡＡＶベクターを得る方法に関する。

ＡＡＶベクターを産生し得る任意の細胞が、本発明において使用され得る。

本発明のポリヌクレオチドは、既に説明した通りである。本発明のポリヌクレオチドの文脈において開示される実施形態のいずれも、本発明のＡＡＶを得る方法の文脈において適用可能である。

本明細書で使用される「ｃａｐタンパク質」という用語は、天然ＡＡＶ ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰｌ、ＶＰ２、およびＶＰ３）の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｃａｐタンパク質の機能的活性の例としては、カプシドの形成を誘導し、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進し、カプシドへのＡＡＶ ＤＮＡパッケージングを促進し（すなわち、カプシド形成）、細胞受容体に結合し、かつビリオンの宿主細胞への侵入を促進する能力が挙げられる。原則として、任意のｃａｐタンパク質が、本発明の文脈において使用され得る。

好ましい実施形態において、ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来する。

用語「カプシド」は、本明細書中で使用される場合、ウイルスゲノムがパッケージングされる構造をいう。カプシドはタンパク質から構成されるいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶはＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３という３種類のカプシドタンパク質の相互作用によって形成される正二十面体カプシドをもつ。

本明細書で使用される「ｒｅｐタンパク質」という用語は、天然ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質の少なくとも１つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。ｒｅｐタンパク質の「機能的活性」はＤＮＡヘリカーゼ活性と同様に、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニッキングによるＤＮＡ複製の促進を含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性である。さらなる機能には、ＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節、および宿主染色体へのＡＡＶ ＤＮＡの部位特異的組み込みが含まれる。特定の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ２に由来する。

本明細書で使用される「ＡＡＶが複製において依存するウイルスタンパク質」という表現はＡＡＶが複製において依存する機能（すなわち、「ヘルパー機能」）を果たすポリペプチドを指す。ヘルパー機能にはＡＡＶ遺伝子転写の活性化に必要な機能、時期特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐタンパク質の合成、およびＡＡＶカプシドの組み立てが含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルス等の既知のヘルパーウイルスのいずれからも誘導することができる。ヘルパー機能にはアデノウイルスＥｌ、Ｅ２ａ、ＶＡ、およびＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。

本発明のポリヌクレオチド、すなわちＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびヘルパー機能を与える遺伝子は、これらの遺伝子を例えばプラスミド等のベクターに組み込み、当該ベクターを細胞に導入することによって、細胞に導入することができる。遺伝子は、同じプラスミドまたは異なるプラスミドに組み込むことができる。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは１つのプラスミドに組み込まれ、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は別のプラスミドに組み込まれ、そしてヘルパー機能を与える遺伝子は別のプラスミドに組み込まれる。

本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミド、および／またはＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子またはヘルパー機能を与える遺伝子は、本技術分野で周知の任意の好適な方法を用いて細胞内に導入することができる。トランスフェクション方法の例には、リン酸カルシウムとの共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介融合、リポフェクション、レトロウイルス感染およびバイオリスティックトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、トランスフェクションは、リン酸カルシウムとの共沈によって行われる。細胞がＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子およびアデノウイルスヘルパー機能を与える遺伝子のいずれかの発現を欠く場合、これらの遺伝子は、本発明のポリヌクレオチドと同時に細胞に導入され得る。あるいは、前記遺伝子は、本発明のポリヌクレオチドの導入の前後に細胞内に導入することができる。

特定の実施形態において、細胞は、ｉ）本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミド、ｉｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、ならびにｉｉｉ）ヘルパー機能を与える遺伝子を含むプラスミド、の３つのプラスミドで同時にトランスフェクトされる。

本発明の方法の工程（ｉｉ）は、ＡＡＶの組み立てに適する条件下に細胞を維持する。

細胞を培養する方法、およびＡＡＶベクター粒子の放出を促進する例示的な条件（例えば、細胞の溶解）は、本明細書中の実施例に記載されるように実施され得る。ＡＡＶの組み立ておよび培地中へのウイルスベクターの放出を促進するために、プロデューサー細胞を適当な期間増殖させる。一般に、培養時間は、ウイルス産生の時点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合、ウイルス産生は一般に、本明細書中に記載されるように、適切なプロデューサー細胞においてヘルパーウイルス機能を与える際に開始する。

本発明の方法の工程（ｉｉｉ）は、細胞により産生されたＡＡＶベクターを精製する。

前記細胞または前記培地からＡＡＶを精製するための任意の方法を、本発明のＡＡＶを得るために使用することができる。特定の実施形態において、本発明のＡＡＶは、ポリエチレングリコール沈殿工程および２つの連続した塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配に基づく最適化された方法に従って精製される。

様々な天然に存在するＡＡＶおよび操作されたＡＡＶ、それらをコードする核酸、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質およびＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、ならびにそのようなＡＡＶ、および特にＡＡＶの産生における使用に適したそれらのカプシドを単離または産生、増殖および精製するための方法が、本技術分野において公知である。

本発明はさらに、ＧＡＬＮＳタンパク質またはその機能的に等価な変異体をコードする本発明のポリヌクレオチド配列を含む単離細胞を提供する。

本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたはＡＡＶベクターおよび本発明の薬学的組成物の文脈において開示される全ての実施形態は、本発明の治療方法に適用可能である。

〔一般的な手順〕
［１．組み換えＡＡＶベクター］
本明細書において説明されているＡＡＶベクターは、３重のトランスフェクションによって得た。上記ベクターを作製するために必要な材料は、ＨＥＫ２９３細胞（アデノウイルスＥ１遺伝子を発現している）、アデノウイルス機能を与えるヘルパープラスミド、血清型２のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および血清型８または９（ＡＡＶ８またはＡＡＶ９）のｃａｐ遺伝子を与えるプラスミド、そして最後に、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有する骨格プラスミドおよび所定のコンストラクトである。

ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼを発現するＡＡＶベクターを産生するため、ヒトまたはマウスのガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼの最適化または非最適化コード配列を、ユビキタスハイブリッドＣＡＧプロモーターまたは肝臓特異型ｈＡＡＴプロモーターの制御下で、ＡＡＶ骨格プラスミド中にてクローニングした。EndoFree Plasmid Megaprep Kit（Qiagen）を用いて、プラスミドの大規模産生を行った。

３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターを産生した（Matsushita et al., 1998およびWright et al., 2005を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶのウイルスＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（上述）；２）ＡＡＶ ｒｅｐ２遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ８遺伝子またはＡＡＶ ｃａｐ９遺伝子を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., 2010を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで－８０℃にて保存した。

本発明のベクターは、本技術分野において周知である分子生物学技術によって作製された。

［２．インビトロトランスフェクション試験］
ＨＥＫ２９３細胞に、リポフェクタミン（登録商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Thermo Fisher Scientific、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、４μｇのｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ、ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳ、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳ、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２またはｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３を製造者の指示に従ってトランスフェクトした。４８時間後、細胞および培地を回収し、タンパク質抽出のために処理した。

２５０μｌのＭｉｌｉ－Ｑ水中で細胞を超音波処理することによってタンパク質抽出物を得、Bradford protein assay（Bio-Rad, Hercules, CA, US）を用いてタンパク質含有量を定量した。上述したように、４－メチルウンベリフェロン由来の蛍光源基質（Toronto Rerearch Chemicals Inc, Ontario, Canada）によって、ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性を、１μｇの細胞タンパク質抽出物および５μｌの培地中で決定し、タンパク質の総量および体積によってそれぞれ正規化した（van Diggelen et al., 1990）。

［３．動物］
International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC, www.mousephenotype.orgｇ）を介して利用可能なＧａｌｎｓ遺伝子にレポーター（ＬａｃＺ）遺伝子標識挿入を有する、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ－Ａ／ａ胚性幹細胞を得た。Universitat Autonoma de Barcelona（UAB）の動物バイオテクノロジー・遺伝子治療センター（CBATEG）のトランスジェニック動物課のＣ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄ胚盤胞にクローンをマイクロインジェクションし、得られたオスキメラをＣ５７Ｂｌ／６ＮＴａｃメスと交配してＧａｌｎｓノックアウト子孫（ＭＰＳＩＶＡまたはＧａｌｎｓ^－/－マウス）を作製した。テール・クリップサンプルをＰＣＲ分析し、目的の変異を含んでいる配列を増幅して、遺伝子型を決定した。それぞれのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの配列は、以下の通りであった。センスプライマー：５’ ＣＣＡ ＧＧＧ ＡＡＴ ＧＴＣ ＣＣＡ ＣＣＴ ＡＴＴ Ｔ ３’（配列番号２０）；アンチセンスプライマー：５’ ＧＴＣ ＡＧＧ ＴＴＧ ＡＣＡ ＣＧＡ ＡＧＣ ＴＧ ３’（配列番号２１）；およびアンチセンスプライマーＫＯ：５’ ＧＧＡ ＡＣＴ ＴＣＧ ＧＴＴ ＣＣＧ ＧＣＧ ３’（配列番号２２）。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーは、ＷＴマウスの遺伝子型決定を可能にする。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーＫＯは、Ｇａｌｎｓ^－/－マウスの遺伝子型決定を可能にする。

標準食（Harlan, Tekland）で行動制限を設けずにマウスを飼育し、明暗周期を１２時間に保った（午前９時に点灯）。

これらの動物はＧＡＬＮＳ活性がないため、大腿骨および脛骨からの骨端板の異なる領域におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積およびリソソーム区画の肥大を含む、ＭＰＳＩＶＡ疾患に特徴的ないくつかの病理学的特徴を早くも１か月齢で示す。さらに、これらの病理学的所見の多くは動物が高齢になると悪化し、このことは加齢動物ほど病態が悪化することを示唆している。同様に、動物が高齢になるにつれて、肝臓、心臓、脾臓などの末梢器官にＧＡＧが蓄積されることも観察される。しかし、Ｇａｌｎｓ^－/－とＷＴの同腹仔間の寿命に有意差は認められない。

［４．マウスへのベクター投与］
ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳベクターの静脈内ベクター送達のために、３～４週齢のＧａｌｎｓ^－/－動物の尾静脈を通して、総投与量１×１０^１１ｖｇを総量２００μｌでマウスに注射した。類似の動物コホートに、１×１０^１１ｖｇ対照非コード（ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｎｕｌｌ）ベクターを注射した。

ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳベクターの、マウスへの静脈内ベクター送達のために、３～４週齢のＧａｌｎｓ^－/－動物の尾静脈を通して、総投与量１×１０^１２ｖｇを総量２００μｌでマウスに注射した。類似の動物コホートに、１×１０^１２ｖｇ対照非コード（ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｎｕｌｌ）ベクターを注射した。

ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳベクターの、マウスへの静脈内ベクター送達のために、３～４週齢のＧａｌｎｓ^－/－動物の尾静脈を通して、総投与量１×１０^１２ｖｇを総量２００μｌでマウスに注射した。類似の動物コホートに、１×１０^１２ｖｇ対照非コード（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｎｕｌｌ）ベクターを注射した。

７月齢の時点、すなわちベクターの投与から６ヶ月後に、マウスを屠殺し、組織を摘出した。

静脈内ベクター送達のために、種々のバージョンのヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼコード配列を備えるＡＡＶ９ベクターの５×１０^１０個のベクターゲノムを、２か月齢のＧａｌｎｓ^－/－動物の尾静脈注射を通して全量２００μｌでマウスに送達した。ＷＴ動物および非処置Ｇａｌｎｓ^－/－動物を対照として用いた。

２．５月齢の時点、すなわちベクターの投与から１５日後に、マウスを屠殺し、組織を摘出した。

［５．サンプルの収集］
殺処分に際し、動物に深く麻酔を施し、その後、心臓を経由して５０ｍＬのＰＢＳを潅流させて、組織から血液を完全に除去した。全脳および複数の体性組織（肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、脂肪組織、眼、涙腺および骨を含む）を収集し、次の組織学的分析のために、液体窒素中で凍結させ－８０℃にて保存するか、ホルマリン中に浸漬した。

［６．ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性およびグリコサミノグリカンの定量］
肝臓サンプルおよび脂肪組織サンプルを、Ｍｉｌｉ－Ｑ水中で超音波処理し、大腿骨サンプルを、２５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２、および１ｍｍｏｌ／ｌのフェニルメチルスルホニルフルオリドからなるホモジナイゼーションバッファーでホモジナイズした。上述したように、４－メチルウンベリフェロン由来の蛍光源基質（Toronto Rerearch Chemicals Inc, Ontario, Canada）によって、ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性を決定した（van Diggelen et al., 1990）。タンパク質の全量に対して肝臓、脂肪組織および大腿骨の活性レベルを正規化し、Bradford protein assay（Bio-Rad, Hercules, CA, US）を用いて定量した。

ＧＡＧの定量のために、組織サンプルを計量し、プロテイナーゼＫで消化した。遠心分離および濾過により、抽出物を清澄化した。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により、組織抽出物中および血清中のＧＡＧレベルを決定した。ＧＡＧのレベルを、組織の含水重量または消化されたサンプルの全体積に対して、正規化した。

［７．組織学的分析］
組織をホルマリン中で１２～２４時間固定し、パラフィンに包埋し、切片を作製した。

角膜上皮におけるＧＡＧ蓄積の検出のために、パラフィン切片を、ＧＡＧを青色で顕在化させるＭｏｗｒｙコロイド染色に供した。涙腺および脛骨骨端成長板におけるＧＡＧ蓄積の検出のために、樹脂切片を、ＧＡＧ蓄積を白色で顕在化させるトルイジンブルー染色に供した。

NIS Elements Advanced Research 2.20ソフトウェアを用いて、動物１匹毎の各眼の１５～２０枚の画像（元の拡大倍率：４０倍）における、ＧＡＧ＋の面積の割合を定量した（すべての動物に対して同じ信号閾値を設定した）。次いで、ポジティブである面積の割合を計算した。すなわち、上記画像中の所定の領域における全組織の面積に対する、ポジティブ信号を有する面積を、ピクセルで計算した。

［８．透過型電子顕微鏡による分析］
イソフルラン（Isoflo, Labs. Esteve, Barcelona, ES）の過剰投与によりマウスを殺処分し、下大動脈を通して、１ｍＬの２．５％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒドを潅流させた。歯状回および扁桃体の小片（約１ｍｍ^３）から切片を作製し、同じ固定液中で、４℃にて２時間インキュベートした。冷却したカコジル酸緩衝液中で洗浄した後、１％４酸化オスミウム中で試料を後固定し、酢酸ウラニル水溶液中で染色した。次いで、濃度を段階的に高く変えながらエタノールに数回通して脱水し、エポキシ樹脂中に包埋した。樹脂ブロックから作製した極薄片（６００～８００オングストローム）を、クエン酸鉛を用いて染色し、透過型電子顕微鏡（H-7000; Hitachi, Tokyo, JP）で調査した。

［９．統計分析］
すべての結果を平均±標準誤差として表した。一元配置分散分析を用いて統計比較を行った。ダネットの事後検定を用いてコントロール群と処置群との間の多重比較を行い、チューキーの事後検定を用いてすべての群の間の多重比較を行った。Ｐ＜０．０５の場合、統計的有意であると見なした。

〔実施例〕
〔実施例１：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳの構築〕
ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩの参照配列：ＮＭ＿０００５１２．４）を出発材料として利用し、本実施例の目的のために化学的に合成した（GeneArt; Life Technologies）。プラスミドｐＭＫ－ＲＱ（KanR）内で、上記ＣＤＳ（配列番号１）をクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

MluI/EcoRIガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ断片を、ｐＭＫ－ＲＱプラスミドから切り出し、その後、ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧの、ＭｌｕＩの制限部位とＥｃｏＲＩの制限部位との間においてクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳ（アクセッション番号：ＤＳＭ３２７９１）と命名した（図１Ａおよび配列番号２を参照）。

ここで使用したＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧは、従前産生されてきた。上記ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧには、所定のＣＤＳのクローニングのためのマルチクローニングサイトに加え、ＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、およびウサギβ－グロビンのポリＡシグナルを含んでいた。上記ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶの初期／中期エンハンサーおよびニワトリβ－アクチンプロモーターから構成された、ハイブリッドプロモーターである。このプロモーターは、あらゆる部位において、強力な発現を促進することができる。

〔実施例２：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１の構築〕
ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼｃＤＮＡ配列の最適化バージョン（ｏｈＧＡＬＮＳ）を含んでいる発現カセットを設計して得た。配列の最適化を実行して、ヒトにおけるガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼタンパク質の産生効率を最大化した。上記最適化は、短いスプライス部位およびＲＮＡ非安定化配列要素の削除（ＲＮＡの安定性を上げるため）、ＲＮＡ安定化配列要素の付加、コドンの最適化およびＧ／Ｃの含有量の適応、種々の変化のうちＲＮＡの安定二次構造の変化の回避によって行った。ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００５１２．４）を配列最適化の出発点として用いた。

プラスミドｐＭＫ－ＲＱ（KanR）内で、上記最適化したＣＤＳ（配列番号３）（GeneArt; Life Technologies）をクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ断片をｐＭＫ－ＲＱプラスミドから切り出した。続いて、この断片を、上記ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にてクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１（アクセッション番号：ＤＳＭ３２７９２）と命名した（図２Ａおよび配列番号４を参照）。

〔実施例３：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２の構築〕
ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００５１２．４）を配列最適化した（GeneScript Inc）。最適化したＣＤＳ（配列番号５）を、プラスミドｐＵＣ５７（AmpR）内でクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ断片をｐＵＣ５７プラスミドから切り出した。続いて、この断片を、上記ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にてクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２（アクセッション番号：ＤＳＭ３２７９３）と命名した（図３Ａおよび配列番号６を参照）。

〔実施例４：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３の構築〕
ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００５１２．４）を配列最適化した（DNA 2.0 Inc）。最適化したＣＤＳ（配列番号７）を、プラスミドｐｊ２０１（KanR）内でクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ断片をｐｊ２０１プラスミドから切り出した。続いて、この断片を、上記ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にてクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３（アクセッション番号：ＤＳＭ３２７９４）と命名した（図４Ａおよび配列番号８を参照）。

〔実施例５：ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳの構築〕
マウスガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１６７２２．４）を配列最適化した（GeneArt; Life Technologies）。最適化したＣＤＳ（配列番号９）を、プラスミドｐＭＡ－ＲＱ－Ｂｂ（AmpR）内でクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化マウスガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ断片をｐＭＡ－ＲＱ－Ｂｂプラスミドから切り出した。続いて、この断片を、上記ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にてクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳと命名した（図５Ａおよび配列番号１０を参照）。

〔実施例６：ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳの構築〕
マウスガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１６７２２．４）を配列最適化した（GeneArt; Life Technologies）（配列番号９）。

ｈＡＡＴプロモーター（配列番号１９）を、プラスミドｐＧＧ２－ｈＡＡＴ（AmpR）内でクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ＣＡＧプロモーター（配列番号１８）をｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳプラスミドから切り出した後、ｈＡＡＴプロモーターで置換した。得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳと命名した（図６Ａおよび配列番号１１を参照）。

ｈＡＡＴプロモーターは、ヒトα１－アンチトリプシンプロモーターおよびアポリポタンパク質Ｅからの肝細胞制御領域（ＨＣＲ）エンハンサーの３つのコピーから構成された、ハイブリッドプロモーターである。このプロモーターは、肝臓特異的に強力な発現を促進することができる。

〔実施例７：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳの構築〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳ（配列番号１２）を産生した（Matsushita et al., 1998およびWright et al., 2005を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳ；配列番号２）により両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., 2010を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで－８０℃にて保存した（図１Ｂを参照）。

〔実施例８：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１の産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１（配列番号１３）を産生した（Matsushita et al., 1998およびWright et al., 2005を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１；配列番号４）により両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., 2010を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで－８０℃にて保存した（図２Ｂを参照）。

〔実施例９：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２の産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２（配列番号１４）を産生した（Matsushita et al., 1998およびWright et al., 2005を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２；配列番号６）により両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., 2010を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで－８０℃にて保存した（図３Ｂを参照）。

〔実施例１０：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３の産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３（配列番号１５）を産生した（Matsushita et al., 1998およびWright et al., 2005を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３；配列番号７）により両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., 2010を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで－８０℃にて保存した（図４Ｂを参照）。

〔実施例１１：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳの産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ（配列番号１６）を産生した（Matsushita et al., 1998およびWright et al., 2005を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ；配列番号１０）により両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., 2010を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで－８０℃にて保存した（図５Ｂおよび配列番号１６を参照）。

〔実施例１２：ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳの産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ（配列番号１６）を産生した（Matsushita et al., 1998およびWright et al., 2005を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ；配列番号１０）により両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ８）を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., 2010を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで－８０℃にて保存した（図５Ｂおよび配列番号１６を参照）。

〔実施例１３：ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳの産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳ（配列番号１７）を産生した（Matsushita et al., 1998およびWright et al., 2005を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳ；配列番号１１）により両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ８）を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., 2010を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで－８０℃にて保存した（図６Ｂおよび配列番号１７を参照）。

〔実施例１４：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３のＭＰＳＩＶＡマウスへの静脈注射〕
異なるバージョンのヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ発現カセットを含有するＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２またはＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３の総投与量５×１０^１０ベクターゲノムを、２ヶ月齢のＭＰＳＩＶＡ罹患マウスに尾静脈注射により静脈内送達した。

ベクター送達の２週間後にＧＡＬＮＳ活性分析を行った。４種類のガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ含有ベクターのすべてによる形質導入が、ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性を、ＭＰＳＩＶＡ動物において測定されたレベルよりも実質的に増加させた。ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ活性レベルは、肝臓におけるＷＴレベルの１５００％～２６００％の範囲であり、血清におけるＷＴレベルの５５％～９９％の範囲であった（図７Ａおよび７Ｂを参照）。肝臓において、ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのバージョン２およびバージョン３の両方を含む発現カセットで到達した活性のレベルは、野生型配列を含むベクターによって媒介されるものより高かった（図７Ａを参照）。血清において、ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼのバージョン２およびバージョン３の両方が、酵素活性を、野生型およびバージョン１よりも大幅に増加させた（図７Ｂを参照）。

〔実施例１５：ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳのＭＰＳＩＶＡマウスへの静脈内送達〕
３～４週齢のＭＰＳＩＶＡ動物に、１×１０^１２ベクターゲノムのＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ、１×１０^１２ベクターゲノムのＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ、または１×１０^１１ベクターゲノムのＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳベクターを、総投与量で２００μＬ、尾静脈に注射した。ベクター投与の４ヶ月後および６ヶ月後、動物を屠殺し、さらなる分析のためにサンプルを収集した。

ＡＡＶ処置の６か月後、ＭＰＳＩＶＡで処置された動物の肝臓、大腿骨、脂肪組織および血清中のＧＡＬＮＳの酵素活性は正常化し、健康な動物において観察された値と同程度またはさらに高い値に達した（図８、９および１０を参照）。ＧＡＬＮＳ活性の回復は、野生型の対照および処置されたＧａｌｎｓ^－/－マウスにおける同様の濃度のケラタン硫酸によって示されるように、肝臓および血清における疾病に特徴的な基質蓄積の完全に正常化をもたらした（図１１を参照）。

血流への異なるベクターの静脈内投与は他の組織および器官のなかでも主に肝臓の形質導入を生じさせる（Ruzo et al., 2012）。従って、異なるベクターで処置されたＭＰＳＩＶＡ雄マウスの肝臓におけるＧＡＬＮＳ活性は、健康な動物において観察されたものより約２５倍高かった（図８Ａ、９Ａおよび１０Ａを参照）。

肝臓において過剰発現させると、可溶性リソソームタンパク質が効率よく血流に分泌され、この器官を循環酵素の供給源に変える（Ruzo et al., 2012）。処理されたＭＰＳＩＶＡマウスの血清中では、ＧＡＬＮＳ活性は注射後３か月前後でピークに達し、その後、野生型同腹仔より２０～５０倍の範囲の値で長期安定化した（図８Ｄ、９Ｄおよび１０Ｄを参照）。上記治療の身体的効果を、血清および肝臓のＧＡＧ含有量の定量によって評価すると、循環ＫＳレベルおよび肝臓ＫＳレベルの完全な正常化が見られた（図１１を参照）。

ＡＡＶ送達の４ヶ月後、ＭＰＳＩＶＡで処置されたマウスの脛骨骨端成長板は、複数の細胞内ＧＡＧデポーの存在によって示される細胞内ＧＡＧ蓄積の明確な減少を示した（図１２を参照）。

ＡＡＶで処置された動物はまた、細胞内ＧＡＧ貯蔵の欠如によって示される涙腺におけるＧＡＧ蓄積の完全な正常化を示した（図１３Ｂを参照）。同様に、Ｍｏｗｒｙコロイド染色で染色した角膜上皮切片におけるＧＡＧ陽性領域のシグナル強度の定量化は、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧＡＬＮＳで処置したＧａｌｎｓ^－/－マウスにおいて、角膜上皮の表面のＧＡＧ沈着率がＧＡＬＮＳ欠損マウスにおいて記録された値よりも減少することを明らかにした（図１３Ａを参照）。

７か月齢の雄マウスの歯状回および扁桃体の透過型電子顕微鏡による超微細構造解析から、非処理ＧＡＬＮＳ欠損マウスの細胞の細胞質に明るく見える物質を含む大きな小胞の存在が明らかになった。これらの細胞は歯状回における血管周囲マクロファージ、あるいは扁桃体における神経周囲グリア細胞および内皮細胞と同定された。貯蔵物質で満たされたリソソームであるように見えるこれらの小胞は、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳで処置された健康な野生型動物またはＧａｌｎｓ^－/－動物からのサンプル中に全く存在せず、遺伝子導入後のリソソーム区画の正常な大きさの回復が確認された（図１４を参照）。

ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳおよびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳの産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｈＧＡＬＮＳおよびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｈＧＡＬＮＳコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１の産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１およびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ１コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２の産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２およびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ２コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３の産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３およびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖ３コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓの産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｍＧａｌｎｓコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓの産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓおよびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｍＧａｌｎｓコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 異なるヒトＧａｌｎバージョン（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｈＧａｌｎｓ、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧａｌｎｓ－ｖ１、ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧａｌｎｓ－ｖ２、およびＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｈＧａｌｎｓ－ｖ３）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄マウスへの静脈内送達。２ヶ月齢で各ベクターを５×１０^１０ｖｇずつ静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスの（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるＧＡＬＮＳ活性。ＷＴマウスのＧＡＬＮＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり４～５匹のマウスの平均±標準誤差である。 最適化マウスＧａｌｎ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄マウスへの静脈内送達。１ヶ月齢でＡＡＶ９－ＣＡＧｏｍＧａｌｎｓを１×１０^１２ｖｇずつ静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスの（Ａ）肝臓、（Ｂ）大腿骨および（Ｃ）脂肪組織におけるＧＡＬＮＳ活性。(Ｄ)同じ動物コホートの異なる注入後時点における血清中のＧＡＬＮＳ活性。ＷＴマウスのＧＡＬＮＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり４～５匹のマウスの平均±標準誤差である。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスに対してＰ＜０．０００１ 最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ８ベクターの雄マウスへの静脈内送達。１ヶ月齢でＡＡＶ８－ＣＡＧｏｍＧａｌｎｓを１×１０^１２ｖｇずつ静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスの（Ａ）肝臓、（Ｂ）大腿骨および（Ｃ）脂肪組織におけるＧＡＬＮＳ活性。(Ｄ)同じ動物コホートの異なる注入後時点における血清中のＧＡＬＮＳ活性。ＷＴマウスのＧＡＬＮＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり４～５匹のマウスの平均±標準誤差である。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスに対してＰ＜０．０００１ 最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ８ベクターの雄マウスへの静脈内送達。１ヶ月齢でＡＡＶ８－ｈＡＡＴ－ｏｍＧａｌｎｓを１×１０^１１ｖｇずつ静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスの（Ａ）肝臓、（Ｂ）大腿骨および（Ｃ）脂肪組織におけるＧＡＬＮＳ活性。(Ｄ)同じ動物コホートの異なる注入後時点における血清中のＧＡＬＮＳ活性。ＷＴマウスのＧＡＬＮＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり４～５匹のマウスの平均±標準誤差である。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスに対してＰ＜０．０００１ 最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターおよびＡＡＶ８ベクターの雄マウスへの静脈内送達。LC-MS/MS解析による（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるケラタン硫酸（ＫＳ）の定量。＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－雄マウスに対してＰ＜０．０００１ 最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターおよびＡＡＶ８ベクターの雄マウスへの静脈内送達。トルイジンブルーで染色した部分における脛骨骨端成長板の組織病理。元の拡大倍率：１００倍。 最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ、ＡＡＶ８－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓおよびＡＡＶ８－ｈＡＡＴｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターおよびＡＡＶ８ベクターのＧａｌｎｓ^－／－雄マウスへの静脈内送達。（Ａ）グリコサミノグリカンについてのＭｏｗｒｙ染色後の角膜上皮において得られた染色強度の定量。（Ｂ）静脈（ＩＶ）注射により全身投与された、野生型（健常）マウス（ＷＴ）、未処置のＧａｌｎｓ^－／－マウスおよびＧａｌｎｓ^－／－マウスにおける、トルイジンブルーで染色した部分における涙腺の組織病理。元の拡大倍率：４０倍。＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：未処置のＧａｌｎｓ^－／－雄マウスに対してＰ＜０．０００１ 最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧａｌｎｓ）をコードするＡＡＶ９ベクターの雄マウスへの静脈内送達。最適化マウスＧａｌｎｓ（ＡＡＶ９－ＣＡＧ－ｏｍＧＡＬＮＳ）をコードするベクター１×１０^１２ｖｇを全身投与された６ヶ月齢の健康なＷＴ雄およびＧａｌｎｓ^－／－雄から採取した歯状回および扁桃体の超微細構造の、透過型電子顕微鏡による解析。血管周囲マクロファージ（歯状回）、神経周囲グリア細胞および内皮細胞（扁桃体）のリソソームの肥大は矢尻で示してある。

Claims (13)

1. 配列番号１に記載されるヌクレオチド配列と７５％～９０％の同一性を有する単離されたポリヌクレオチドであって、機能性ヒトガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼをコードしており、
   配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
2. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
3. 上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター配列を含む発現ベクターであって、当該プロモーターはＣＡＧプロモーター、ｈＡＡＴプロモーターまたはＣＭＶプロモーターから選択される、請求項２に記載の発現ベクター。
4. 上記プロモーターはＣＡＧプロモーターである、請求項３に記載の発現ベクター。
5. 組み換えＡＡＶベクターである、請求項２～４の何れか一項に記載の発現ベクター。
6. 上記組み換えＡＡＶベクターはＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０から選択される、請求項５に記載の発現ベクター。
7. アクセッション番号がＤＳＭ ３２７９２である配列番号４に記載されるプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ１、アクセッション番号がＤＳＭ ３２７９３である配列番号６に記載されるプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ２およびアクセッション番号がＤＳＭ ３２７９４である配列番号８に記載されるプラスミドｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ｏｈＧＡＬＮＳ－ｖｅｒｓｉｏｎ３からなる群から選択される、請求項２～４の何れか一項に記載の発現ベクター。
8. 請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２～７の何れか一項に記載のベクターを治療上効果的な量含む、薬学的組成物。
9. 静脈内投与されることを特徴とする、請求項８に記載の薬学的組成物。
10. 一生に一度投与されることを特徴とする、請求項８または９に記載の薬学的組成物。
11. 医薬製造のための、請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項２～７の何れか一項に記載のベクターまたは請求項８～１０の何れか一項に記載の薬学的組成物の使用。
12. ムコ多糖症ＩＶＡ型すなわちモルキオ症候群Ａ型の治療用の医薬製造のための、請求項２～７の何れか一項に記載のベクターまたは請求項８～１０の何れか一項に記載の薬学的組成物の使用。
13. （ｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチド、ＡＡＶ ｃａｐタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、および任意でＡＡＶの複製が依存するウイルスタンパク質を含む細胞を提供する工程と、
    （ｉｉ）上記ＡＡＶの組み立てに適する条件下に上記細胞を維持する工程と、
    （ｉｉｉ）上記細胞により産生されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製する工程と含む、請求項５または６に記載のベクターを得る、方法。

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