JP2021531044A - ムコ多糖症ｉｖａ型の治療 - Google Patents

ムコ多糖症ｉｖａ型の治療 Download PDF

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Abstract

本発明で提供するのは、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）を治療するための遺伝子療法の方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いて、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の骨に、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）を送達することを伴う方法である。また、本発明で提供するのは、その遺伝子療法の方法で使用できるｒＡＡＶと、そのようなｒＡＡＶの作製方法である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年７月２７日に出願した米国特許仮出願第６２／７１１，２３８号、２０１８年１１月７日に出願した同第６２／７５６，８８０号、及び２０１９年２月１日に出願した同第６２／７９９，８３４号に基づく利益を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に援用される。
電子的に提出した配列表の参照
本願では、２０１９年７月２２日に作成した「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１２６５６−１１６−２２８．ｔｘｔ」という名称であり、サイズが２８，６７２バイトであるテキストファイルとして、本願とともに提出した配列表を参照により援用する。
１．技術分野
本発明の技術分野は、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の治療に関するものである。本発明で提供するのは、ＭＰＳ ＩＶＡを治療するための方法及び組成物であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を伴う方法及び組成物である。
２．背景
ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ、モルキオＡ症候群）は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）の欠損を原因とする常染色体劣性リソソーム貯蔵障害である（Ｋｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．，２０１７；１２０（１−２）：７８−９５）。この酵素の欠損により、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、コンドロイチン６−硫酸（Ｃ６Ｓ）及びケラタン硫酸（ＫＳ）が進行性に蓄積することで、不完全骨化、及び発育の継続的不均衡とともに、全身性かつ特有の骨格形成異常に至り、その結果、短頸及び短躯、頸髄圧迫、気管閉塞、鳩胸、関節弛緩、脊柱後側弯、外反股、ならびに外反膝が認められる。この疾患の他の臨床症状としては、難聴、心弁膜症及び角膜混濁を挙げることができる。患者において、２００個を超える異なる変異が特定されており、米国内の有病率は、２５０，０００人に１人ほどである。
重症型の患者は、治療しなければ、２０代または３０代で、気道障害、頸髄合併症または心弁膜症で死亡する（Ｋｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．，２０１７；１２０（１−２）：７８−９５、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．２０１６；１１７，１５０−１５６、Ｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２００７；３０，１６５−１７４、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓ．Ｒｅｐ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｄｉｓｏｒｄ．２０１２；２０１２，６５−７７、Ｐｉｚａｒｒｏ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２０１６；１０２，ｅ３２９−３３１）。現在、臨床診療において、ＭＰＳ ＩＶＡ患者に対する支持療法として、酵素補充療法（ＥＲＴ）、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）及び様々な外科的介入が利用可能である。２０１４年２月、ＦＤＡは、ＥＲＴ（エロスルファーゼアルファ）の使用を認可した（Ｈｅｎｄｒｉｋｓｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．，２０１４；３７（６）：９７９−９９０）。現在の標準ケアであるＥＲＴでは、ＭＰＳ ＩＶＡ患者の軟組織病態と日常生活活動（ＡＤＬ）が部分的に改善されるが、これらの療法は、それらの病変の無血管の特徴により、骨及び軟骨においては、及ぼす作用が非常に限られている。ＥＲＴの現時点での制約としては、ｉ）週に１回、５〜６時間注射する必要があること、ｉｉ）薬物が循環血液から速やかに除去されること、ｉｉｉ）治療費が非常に高額であること（患者１人当たり年間５００，０００ドル）、及びｖ）薬物の骨への浸透が限定的であることが挙げられる（Ａｌｇａｈｉｍ ａｎｄ Ａｌｍａｓｓｉ，Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｒｉｓｋ Ｍａｎａｇ．，２０１３；９：４５−５３、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１；１２：９３１−９４５）。ＭＰＳ ＩＶＡに関しては、現時点では、組み換えヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｒｈＧＡＬＮＳ：Ｖｉｍｉｚｉｍ（商標）、エロスルファーゼアルファ）を週に１回投与しても、ＭＰＳ ＩＶＡ患者の骨及び軟骨の病変に対する作用は得られない。ＨＳＣＴは、骨に対して、ＥＲＴよりも大きい作用を及ぼし得るが、この細胞ベースの療法は、すべての患者に適用可能であるとは限らない。適合ドナーが限られており、有効な治療を行うには年齢制限があり、精通している施設が不足しており、その施術には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、感染症及びその他の合併症などの死亡リスクがあるからである（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ．，２０１５；９：１９３７−１９５３）。この意味では、ＭＰＳ ＩＶＡ用の新規薬物、特に、ＭＰＳ ＩＶＡ患者の骨格形成異常を治療するための新規薬物が至急必要である。
遺伝子療法は、１回限りの永続的な療法となる可能性がある。ウイルスベクター及び非ウイルスベクターを用いた遺伝子移入の非臨床試験の多くでは、ＭＰＳ疾患におけるこの療法の潜在的な治療能力が示された。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、治療用遺伝子を標的器官に送達するための魅力的なビヒクルである。そのベクターは、導入遺伝子産物を長期的に発現させるとともに、免疫原性のリスクが低いからである。これらの利点により、ＭＰＳ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ及びＶＩ用として、ＡＡＶを介した遺伝子療法の臨床試験が行われているか、または予定されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ；Ｓａｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｏｒｐｈａｎ Ｄｒｕｇｓ，２０１６；４，９４１−９５１）。充分な酵素を軟骨病変及び成長板領域に送達すると、ＭＰＳ ＩＶＡ患者の骨格形成異常が解消される可能性がある。我々の以前の研究では、ＡＡＶ２ベクターを用いてＧＡＬＮＳ遺伝子を移入すると、組織において治療的な酵素レベルが得られることが示された（Ａｌｍｅｃｉｇａ−Ｄｉａｚ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．２０１８；８４，５４５−５５１）が、ＡＡＶを介した遺伝子療法が、ＭＰＳ ＩＶＡマウスモデルの骨格病変を矯正することを示した試験は現時点では存在しない。
フルオロフォアＡｌｅｘａ−４８８にコンジュゲートしたｒｈＧＡＬＮＳを１０ｍｇ／ｋｇ、野生型マウスに、１日おきに５回静脈内注射したところ、その酵素が成長板及び関節軟骨で検出されたことをＤｖｏｒａｋ−Ｅｗｅｌｌらは示した（Ｄｖｏｒａｋ−Ｅｗｅｌｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０；５，ｅ１２１９４）。この知見から、高レベルの循環酵素によって、酵素を軟骨病変の中まで浸透させることができることが示されている。ＡＡＶ８ベクターが、肝臓へのトランスダクション効率のよいこと、及び組み換えＡＡＶ８ベクターを用いると、初期世代のＡＡＶ２ベクターと比較して、肝臓への遺伝子移入の効率性が１０〜１００倍高いことが示された（Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９，１１８５４−１１８５９）。肝臓特異的プロモーターの利用により、宿主の免疫応答が有意に軽減された。肝臓指向性ＡＡＶ遺伝子療法は、ユビキタスプロモーターと比べて、導入遺伝子産物に対して免疫寛容を誘導することが報告されているからである（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００３；１１１，１３４７−１３５６、Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４；９，２３１−２４０、Ｄｏｂｒｚｙｎｓｋｉ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６；１０３，４５９２−４５９７、Ｃａｏ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００７；１１０，１１３２−１１４０、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００７；１１０，２３３４−２３４１）。この免疫応答の抑制により、導入遺伝子産物の長期的な発現をもたらすことができる（Ｗａｎｇ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０００；１，１５４−１５８、Ｓｏｎｄｈｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５；１２，１６１８−１６３２）。肝臓特異的プロモーターと組み合わせた組み換えＡＡＶ８ベクターによって、ＭＰＳ ＶＩのマウスモデル及びネコモデルの骨格病変に対する作用が大きくなったことが以前の研究によって示された（Ｔｅｓｓｉｔｏｒｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００８；１６，３０−３７、Ｃｏｔｕｇｎｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１１；１９，４６１−４６９）。
ＭＰＳ ＩＶＡ患者では、ＭＰＳのすべての型の中で最も重篤な骨格異常が見られ（Ｍｅｌｂｏｕｃｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．２０１８；１２４，１−１０）、骨ターゲティング型の方策であれば、軟骨領域に浸透するのに充分な酵素を供給できる。短い酸性アミノ酸タグをいくつかの酵素のＮ末端またはＣ末端に結合することによって、骨へのターゲティングが増強されることを我々は以前に示した（Ｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．２００８；９４，１７８−１８９、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０；１８，１０９４−１１０２）。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）は、骨における主な無機成分であり、カルシウムイオンを含む正帯電表面を有する。骨のシアロタンパク質及びオステオポンチンは、ＨＡに結合し、これらのリン酸化酸性糖タンパク質は、負電荷を持つ酸性アミノ酸（Ａｓｐ及びＧｌｕ）の反復配列を有し、骨ターゲティング型の方策の標的候補となり得る（Ｏｌｄｂｅｒｇ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８；２６３，１９４３０−１９４３２、Ｋａｓｕｇａｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２０００；１５，９３６−９４３）。
ｒＡＡＶは、その安全性プロファイル、汎用性、及び特定の機能に合わせて操作できる点により、多くの疾患における広範な遺伝子療法用途で利用できる（例えば、Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７；３１（４）：３１７−３３４を参照されたい）。神経筋疾患、眼疾患及び免疫疾患を含む広範な遺伝子疾患に関して、ＡＡＶ遺伝子療法を用いた臨床試験が行われている（例えば、Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１６，３：１６０３４を参照されたい）。
本明細書における参照文献の引用は、それらが本開示の先行技術であると認めるものとしては解釈してならない。
３．概要
本発明で提供するのは、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）を治療するための遺伝子療法の方法であって、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いて、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の骨に、ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）を送達することを伴う方法である。また、本発明で提供するのは、その遺伝子療法の方法で使用できるｒＡＡＶと、そのようなｒＡＡＶの作製方法と、そのようなｒＡＡＶを作製する際に使用できるポリヌクレオチド、プラスミド及び細胞である。
一態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えばＡＡＶ８キャプシド）と、（ｂ）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセット（例えばＡＡＶ８−ＩＴＲ）を含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、酸性オリゴペプチド（例えばＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＡＡＶゲノムとを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。具体的な実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、上記の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。さらに具体的な実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターである。
別の態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＡＡＶキャプシド（例えばＡＡＶ８キャプシド）と、（ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲ（例えばＡＡＶ８−ＩＴＲ）に挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている組み換えＡＡＶゲノムとを含むｒＡＡＶである。具体的な実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。
別の態様では、本発明で提供するのは、本発明で提供するｒＡＡＶと、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＡＡＶ−ＩＴＲ（例えばＡＡＶ８−ＩＴＲ）に挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、酸性オリゴペプチド（例えばＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。具体的な実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。さらに具体的な実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＡＡＶ−ＩＴＲ（例えばＡＡＶ８−ＩＴＲ）に挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されているポリヌクレオチドである。具体的な実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。
別の態様では、本発明で提供するのは、本発明で提供するポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶプラスミドである。
別の態様では、本発明で提供するのは、本発明で提供するポリヌクレオチドまたは本発明で提供するｒＡＡＶプラスミドを含むｅｘ ｖｉｖｏ細胞である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ｒＡＡＶの作製方法であって、本発明で提供するｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、ＶＡ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子及びＥ４遺伝子のヌクレオチド配列を合わせて含む１つ以上のヘルパープラスミドとをｅｘ ｖｉｖｏ細胞にトランスフェクションすることを含む方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、本発明で提供するｒＡＡＶまたは本発明で提供する医薬組成物を投与することを含む方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、本発明で提供するｒＡＡＶを投与することによって、酸性オリゴペプチド（例えばＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法である。具体的な実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳは、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、本発明で提供するｒＡＡＶを投与することによって、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に、酸性オリゴペプチド（例えばＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量送達することを含み、その融合タンパク質が、ｒＡＡＶゲノム（例えば、組み換えＡＡＶ８ゲノム（すなわち、ＡＡＶ８ゲノムの主鎖を含む組み換えゲノム））から産生される方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に、酸性オリゴペプチド（例えばＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子をコードする導入遺伝子を治療有効量送達することを含み、その融合タンパク質が、ｒＡＡＶゲノム（例えば、組み換えＡＡＶ８ゲノム（すなわち、ＡＡＶ８ゲノムの主鎖を含む組み換えゲノム））から産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される方法である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、ｒＡＡＶゲノム（例えば、組み換えＡＡＶ８ゲノム（すなわち、ＡＡＶ８ゲノムの主鎖を含む組み換えゲノム））から産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法である。
ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法の特定の態様及び実施形態では、その骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程は、骨及び／または軟骨に送達する工程である。
ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法の特定の態様及び実施形態では、その骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程は、（ａ）骨及び／または軟骨、ならびに（ｂ）靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達する工程である。
３．１ 例示的実施形態（Ｉ）
１．（ａ）ＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＡＡＶゲノムと、
を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
２．その酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、第１項に記載のｒＡＡＶ。
３．そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、第１項または第２項に記載のｒＡＡＶ。
４．その肝臓特異的プロモーターが、ＴＢＧプロモーターである、第３項に記載のｒＡＡＶ。
５．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第１項〜第４項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
６．（ａ）ＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている組み換えＡＡＶゲノムと、
を含むｒＡＡＶ。
７．その肝臓特異的プロモーターが、ＴＢＧプロモーターである、第６項に記載のｒＡＡＶ。
８．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第６項または第７項に記載のｒＡＡＶ。
９．第１項〜８項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
１０．ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
１１．その酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、第１０項に記載のポリヌクレオチド。
１２．そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、第１０項または第１１項に記載のポリヌクレオチド。
１３．その肝臓特異的プロモーターが、ＴＢＧプロモーターである、第１２項に記載のポリヌクレオチド。
１４．ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されているポリヌクレオチド。
１５．その肝臓特異的プロモーターが、ＴＢＧプロモーターである、第１４項に記載のポリヌクレオチド。
１６．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第１０項〜第１５項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
１７．第１０項〜第１６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶプラスミド。
１８．第１０項〜第１６項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは第１７項に記載のｒＡＡＶプラスミドを含むｅｘ ｖｉｖｏ細胞。
１９．ｒＡＡＶの作製方法であって、第１７項に記載のｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、ＶＡ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子及びＥ４遺伝子のヌクレオチド配列を合わせて含む１つ以上のヘルパープラスミドとをｅｘ ｖｉｖｏ細胞にトランスフェクションすることを含む方法。
２０．ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、第１項〜第８項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは第９項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
２１．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、第１項〜第５項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することによって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法。
２２．前記ｈＧＡＬＮＳが、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される、第２１項に記載の方法。
２３．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、第６項〜第８項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することによって、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法。
２４．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達することを含み、その融合タンパク質が、ｒＡＡＶゲノムから産生される方法。
２５．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達することを含み、その融合タンパク質が、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される方法。
２６．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法。
２７．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第２４項〜第２６項のいずれか１項に記載の方法。
２８．その骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達する工程が、骨及び／または軟骨に送達する工程である、第２１項〜第２７項のいずれか１項に記載の方法。
２９．その骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達する工程が、（ａ）骨及び／または軟骨、ならびに（ｂ）靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、心筋及び／または心臓弁に送達する工程である、第２１項〜第２７項のいずれか１項に記載の方法。
３．２ 例示的実施形態（ＩＩ）
１．（ａ）ＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記導入遺伝子が、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする組み換えＡＡＶゲノムと、
を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
２．その酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、第１項に記載のｒＡＡＶ。
３．そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、第１項または第２項に記載のｒＡＡＶ。
４．その肝臓特異的プロモーターが、
（ａ）ＴＢＧプロモーターであるか、
（ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｃ）配列番号１３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｄ）配列番号１３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｅ）配列番号１３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｆ）配列番号１３と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｇ）配列番号１３と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｈ）配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｉ）配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｊ）配列番号１４と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｋ）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｌ）配列番号１４と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｍ）配列番号１４と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｎ）配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｏ）配列番号１５と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｐ）配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｑ）配列番号１５と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｒ）配列番号１５と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
（ｓ）配列番号１５と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
第３項に記載のｒＡＡＶ。
５．そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、第１項または第２項項に記載のｒＡＡＶ。
６．そのプロモーターが、ＣＡＧプロモーターである、第５項に記載のｒＡＡＶ。
７．そのプロモーターが、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターである、第５項に記載のｒＡＡＶ。
８．その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターが、
（ａ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｂ）配列番号１６と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｃ）配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｄ）配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｅ）配列番号１６と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
（ｆ）配列番号１６と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
第７項に記載のｒＡＡＶ。
９．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第１項〜第１０項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
１０．そのＡＡＶが、ＡＡＶ９である、第１項〜第１０項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
１１．そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列またはその融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、第１項〜第１０項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
１２．そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列またはその融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列において、ＣｐＧ部位が除去されている、第１項〜第１３項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
１３．（ａ）ＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている組み換えＡＡＶゲノムと、
を含むｒＡＡＶ。
１４．その肝臓特異的プロモーターが、
（ａ）ＴＢＧプロモーターであるか、
（ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｃ）配列番号１３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｄ）配列番号１３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｅ）配列番号１３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｆ）配列番号１３と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｇ）配列番号１３と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｈ）配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｉ）配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｊ）配列番号１４と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｋ）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｌ）配列番号１４と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｍ）配列番号１４と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｎ）配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｏ）配列番号１５と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｐ）配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｑ）配列番号１５と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｒ）配列番号１５と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
（ｓ）配列番号１５と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
第１３項に記載のｒＡＡＶ。
１５．（ａ）ＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、そのプロモーターが、ＣＡＧプロモーターである組み換えＡＡＶゲノムと、
を含むｒＡＡＶ。
１６．
（ａ）ＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターが、
（ａ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｂ）配列番号１６と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｃ）配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｄ）配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｅ）配列番号１６と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
（ｆ）配列番号１６と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む組み換えＡＡＶゲノムと、
を含むｒＡＡＶ。
１７．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第１３項〜第１８項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
１８．そのＡＡＶが、ＡＡＶ９である、第１３項〜第１８項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
１９．そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列またはその融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、第１３項〜第１８項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
２０．そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列またはその融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列において、ＣｐＧ部位が除去されている、第１３項〜第１９項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
２１．第１項〜第２０項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
２２．ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記導入遺伝子が、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
２３．その酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、第２２項に記載のポリヌクレオチド。
２４．そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、第２２項または第２３項に記載のポリヌクレオチド。
２５．その肝臓特異的プロモーターが、
（ａ）ＴＢＧプロモーターであるか、
（ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｃ）配列番号１３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｄ）配列番号１３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｅ）配列番号１３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｆ）配列番号１３と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｇ）配列番号１３と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｈ）配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｉ）配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｊ）配列番号１４と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｋ）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｌ）配列番号１４と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｍ）配列番号１４と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｎ）配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｏ）配列番号１５と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｐ）配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｑ）配列番号１５と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｒ）配列番号１５と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
（ｓ）配列番号１５と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
第２４項に記載のポリヌクレオチド。
２６．そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、第２２項または第２３項に記載のポリヌクレオチド。
２７．その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターが、
（ａ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｂ）配列番号１６と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｃ）配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｄ）配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｅ）配列番号１６と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
（ｆ）配列番号１６と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
第２６項に記載のポリヌクレオチド。
２８．そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、第２２項または第２３項に記載のポリヌクレオチド。
２９．そのプロモーターが、ＣＡＧプロモーターである、第２８項に記載のポリヌクレオチド。
３０．ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、その肝臓特異的プロモーターが、
（ａ）ＴＢＧプロモーターであるか、
（ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｃ）配列番号１３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｄ）配列番号１３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｅ）配列番号１３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｆ）配列番号１３と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｇ）配列番号１３と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｈ）配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｉ）配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｊ）配列番号１４と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｋ）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｌ）配列番号１４と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｍ）配列番号１４と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｎ）配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｏ）配列番号１５と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｐ）配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｑ）配列番号１５と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｒ）配列番号１５と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
（ｓ）配列番号１５と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。
３１．ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、そのプロモーターが、ＣＡＧプロモーターであるポリヌクレオチド。
３２．ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターが、
（ａ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｂ）配列番号１６と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｃ）配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｄ）配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
（ｅ）配列番号１６と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
（ｆ）配列番号１６と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。
３３．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第２２項〜第３２項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
３４．そのＡＡＶが、ＡＡＶ９である、第２２項〜第３２項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
３５．第２２項〜第３４項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶプラスミド。
３６．第２２項〜第３４項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは第３５項に記載のｒＡＡＶプラスミドを含むｅｘ ｖｉｖｏ細胞。
３７．ｒＡＡＶの作製方法であって、第３５項に記載のｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、ＶＡ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子及びＥ４遺伝子のヌクレオチド配列を合わせて含む１つ以上のヘルパープラスミドとを、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞にトランスフェクションすることを含む方法。
３８．ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、第１項〜第２０項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは第２１項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
３９．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、第１項〜第５項及び第７項〜第１２項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することによって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法。
４０．前記ｈＧＡＬＮＳが、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される、第３９項に記載の方法。
４１．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、そのヒト対象に、第１３項〜１４項及び第１６項〜第２０項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することによって、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法。
４２．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含み、その融合タンパク質が、ｒＡＡＶゲノムから産生される方法。
４３．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含み、その融合タンパク質が、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される方法。
４４．ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む方法。
４５．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第４２項〜第４４項のいずれか１項に記載の方法。
４６．そのＡＡＶが、ＡＡＶ９である、第４２項〜第４４項のいずれか１項に記載の方法。
４７．その骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程が、骨及び／または軟骨に送達する工程である、第３９項〜第４６項のいずれか１項に記載の方法。
４８．その骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程が、（ａ）その骨及び／または軟骨、ならびに（ｂ）靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程である、第３９項〜第４６項のいずれか１項に記載の方法。
４９．（ａ）ＡＡＶキャプシドと、
（ｂ）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記導入遺伝子がｈＧＡＬＮＳをコードする組み換えＡＡＶゲノムと、
を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
５０．そのＡＡＶが、ＡＡＶ８である、第４９項に記載のｒＡＡＶ。
５１．そのＡＡＶが、ＡＡＶ９である、第４９項に記載のｒＡＡＶ。
５２．そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、第４９項に記載のｒＡＡＶ。
５３．そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列において、ＣｐＧ部位が除去されている、第４９項に記載のｒＡＡＶ。
４．略語
Figure 2021531044
５．図面の簡単な説明
上記及びその他の目的、特徴及び利点は、添付の図面に例示されているように、本発明の特定の実施形態の下記の説明から明らかであろう。それらの図面は必ずしも、縮尺通りに描かれているわけではなく、本発明の各種の実施形態の原理を説明することに重点が置かれている。
ｒＡＡＶゲノムの概略図である。 ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミドのいずれかをトランスフェクションした後のＨｕＨ−７細胞において、細胞内酵素活性を求めた（ｎ＝２）。 ＨｕＨ−７細胞で求めた細胞内酵素活性の個々の実験結果を示している。 ＨｕＨ−７細胞に、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションした後、培地中の酵素活性を求めた（ｎ＝２）。 培地中の酵素活性をＨｕＨ−７細胞で求めたものの個々の実験結果を示している。 ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミドのいずれかをトランスフェクションした後のＨｅｐＧ２細胞で、細胞内酵素活性を求めた。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを４週齢のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）及び免疫寛容性マウス（ＧＡＬＮＳｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ、Ｍｔｏｌ）に投与したｉｎ ｖｉｖｏ試験のスケジュールである。血液における酵素アッセイ及びＫＳアッセイのスケジュールが示されている。投与量について記載されている場合、１キログラム当たりのベクターコピー数（ｖｃ／ｋｇ）及び１キログラム当たりの遺伝子コピー数（ＧＣ／ｋｇ）は同義的に使用されている。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｒまたはＡＡＶ−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の白血球（ＷＢＣ）で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｒまたはＡＡＶ−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の血漿で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ（ｎ＝４）またはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ（ｎ＝４）を投与した後のＭｔｏｌマウスの血漿で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。 ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の肝臓で測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。 Ｍｔｏｌマウスの肝臓で測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。 ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の心臓及びＭｔｏｌマウスの心臓で測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。 ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の骨及びＭｔｏｌマウスの骨で測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の血漿におけるモノ硫酸化ＫＳレベルである。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳでＭｔｏｌマウスの血漿における経時的なモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭｔｏｌマウス及びＷＴマウスと比較したものである。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの血漿におけるモノ硫酸化ＫＳレベルは、１６週齢において、未処置のＭｔｏｌマウスのレベルと比べて有意に低かった（ｎ＝４〜５、平均±標準偏差、＊：ＷＴに対するｐ＜０．０５、＃：未処置群に対するｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のマウスまたはＷＴマウスにおいて経時的に測定した血中のｄｉＨＳ−０Ｓレベルである。 骨の病理スコアのグラフ図である。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）において、ＡＡＶ８−ｈＧＡＬＮＳベクターまたはＡＡＶ８−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳベクターを投与してから１２週間後に、骨の病態を組織病理学的解析によって評価した。 膝関節（Ｌｉｇ−靭帯、Ｍ−半月板、Ｆ−大腿骨、Ｔ−脛骨）の組織病態である。 大腿関節軟骨の組織病態（４０倍拡大画像）である。 大腿関節軟骨の組織病態（４０倍拡大画像）である。 大腿関節軟骨の組織病態（４０倍拡大画像）である。 大腿関節軟骨の組織病態（４０倍拡大画像）である。 大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である。 大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である。 大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である。 大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である。 半月板の組織病態（４０倍拡大画像）である。 靭帯の組織病態（脛骨側、４０倍拡大画像）である。 心臓弁の基部の組織病態（４０倍拡大画像）である。 心臓弁の基部の組織病態（４０倍拡大画像）である。 心臓弁の組織病態（４０倍拡大画像）である。 心臓弁の組織病態（４０倍拡大画像）である。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）及びＭｔｏｌマウスの肝臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の脾臓及びＭｔｏｌマウスの脾臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の肺及びＭｔｏｌマウスの肺でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の骨及びＭｔｏｌマウスの骨でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の心臓及びＭｔｏｌマウスの心臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較したものである（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の血漿におけるモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスと比較したものである（ｎ＝４〜８、平均±標準偏差）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの血漿における経時的なモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭｔｏｌマウス及びＷＴマウスと比較したものである。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの血漿におけるモノ硫酸化ＫＳレベルは、１６週齢において、未処置のＭｔｏｌマウスレベルと比べて有意に低かった（ｎ＝４〜５、平均±標準偏差、＊：ＷＴに対するｐ＜０．０５、＃：未処置群に対するｐ＜０．０５、一元ＡＮＯＶＡ）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の肝臓におけるモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスと比較したものである。ｎ＝３〜８、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の肺におけるモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスと比較したものである。ｎ＝３〜８、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの肝臓におけるモノ硫酸化ＫＳレベルを未処置のＭｔｏｌマウス及び未処置の野生型マウスと比較したものである。ｎ＝３〜８、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。 野生型マウスにおける大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞はいずれも空胞化しておらず、カラム構造は充分に組織化されていた）。 未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）における大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞はいずれも空胞化しており、カラム構造は大部分が崩壊し、歪んでいた）。 未処置のＭｔｏｌマウスにおける大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞はいずれも空胞化しており、カラム構造は大部分が崩壊し、歪んでいた）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスにおける大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞の空胞化は中度であったが、カラム構造は良質であった）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスにおける大腿骨成長板の組織病態（４０倍拡大画像）である（軟骨細胞の空胞化は中度であったが、カラム構造は部分的に回復していた）。 Ａは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）またはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の大腿骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズである。ｎ＝４〜６であり、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。Ｂは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの大腿骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズである。ｎ＝４〜６であり、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。Ｃは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）またはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の脛骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズである。ｎ＝４〜６であり、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。Ｄは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの脛骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズである。ｎ＝４〜６であり、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）及びＭｔｏｌマウスにおける心臓弁の組織病態（４０倍拡大画像）を未処置のマウスと比較したものである。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスにおける心筋の組織病態（４０倍拡大画像）を未処置のＭｔｏｌマウスと比較したものである。 未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの心臓弁組織の病理スコアである。（ｎ＝４〜６、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ））。 未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心臓弁組織の病理スコアである。（ｎ＝４〜６、平均±標準偏差であり、＊は、ＷＴに対するｐ＜０．０５であり、＃は、未処置群に対するｐ＜０．０５である（一元ＡＮＯＶＡ））。 未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの心筋組織の病理スコアである。（ｎ＝４〜６、平均±標準偏差である）。 未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心筋組織の病理スコアである。（ｎ＝４〜６、平均±標準偏差である。） ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の血漿で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である（ｎ＝４〜７、平均＋標準偏差）。 ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与した後のＭｔｏｌマウスの血漿で測定した経時的なｈＧＡＬＮＳ酵素活性である（ｎ＝４〜５、平均＋標準偏差）。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）酵素活性である。（Ａ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳウイルスベクターのゲノムの概略的な構造である。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから、１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ｂ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｃ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝４〜７）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｄ）肝臓、（Ｅ）脾臓、（Ｆ）肺、（Ｇ）腎臓、（Ｈ）心臓及び（Ｉ）骨（肢骨）を含む組織におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を測定した（ｎ＝３〜８。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析し、データは、平均±標準偏差として示されている。＊：ｐ＜０．０５）。ＡＡＶベクターを静脈内送達してから１２週間後のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｊ）に示されている。ＡＡＶベクターを静脈内送達してからから１２週間後のＭＴＯＬマウスの肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、（Ｋ）に示されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液及び組織中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ａ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｂ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルを測定した（ｎ＝４〜８）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクター、または骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）肺を含む組織におけるＫＳの量を測定した（ｎ＝４〜８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表されている。＊は、ｐ＜０．０５である。 ミノグリカン（ＧＡＧ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ａ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｂ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルを測定した（ｎ＝４〜８）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクター、または骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）肺を含む組織におけるＫＳの量を測定した（ｎ＝４〜８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表されている。＊は、ｐ＜０．０５である。 ミノグリカン（ＧＡＧ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ａ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｂ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルを測定した（ｎ＝４〜８）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクター、または骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）肺を含む組織におけるＫＳの量を測定した（ｎ＝４〜８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表されている。＊は、ｐ＜０．０５である。 ミノグリカン（ＧＡＧ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから１週間おきに、１６週齢まで採取し、（Ａ）ノックアウト（ＫＯ）マウス及び（Ｂ）寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルを測定した（ｎ＝４〜８）。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクター、または骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて、（Ｃ）肝臓及び（Ｄ）肺を含む組織におけるＫＳの量を測定した（ｎ＝４〜８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表されている。＊は、ｐ＜０．０５である。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける骨の病態の矯正である。トルイジンブルー染色解析によって、ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスの膝関節における成長板の光学顕微鏡観察を用いて、軟骨細胞の空胞化の矯正を評価した。ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおける骨の病態を野生型、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ、及び骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡと比較した。スケールバーは２５μｍである。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける骨の病態の矯正である。トルイジンブルー染色解析によって、ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスの膝関節における関節円板の光学顕微鏡観察を用いて、軟骨細胞の空胞化の矯正を評価した。ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおける骨の病態を野生型、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ、及び骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡと比較した。スケールバーは２５μｍである。 大腿骨または脛骨の成長板病変における軟骨細胞の細胞サイズをＩｍａｇｅ Ｊというソフトウェアによって定量した。データは、野生型群からの変化倍率で表した。ｎ＝４〜７である。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表されている。＊は、ｐ＜０．０５である。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける心臓の病態の矯正である。トルイジンブルー染色解析によって、ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスの（Ａ）心臓弁及び（Ｂ）心筋の光学顕微鏡観察を用いて、空胞化の矯正を評価した。ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおける心臓の病態を野生型、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ、及び骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡと比較した。矢印は、疾患と関連する小胞の位置を示している。スケールバーは、２５μｍである。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける循環抗ｈＧＡＬＮＳ抗体の力価である。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶ８ベクターを注射してから１２週間後に、血漿をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。循環抗ｈＧＡＬＮＳ抗体の力価を間接ＥＬＩＳＡアッセイによって検出した。ＯＤ４０５値をマイクロプレート分光光度計で測定した（ｎ＝４〜８）。統計値は、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって解析した。データは、平均±標準偏差として表されている。＊は、ｐ＜０．０５である。 骨ターゲティングシグナルを有する最適化ｈＧＡＬＮＳまたは骨ターゲティングシグナルを有さない最適化ｈＧＡＬＮＳの評価である。Ｈｕｈ−７細胞に、骨ターゲティングシグナルを有するか、または骨ターゲティングシグナルを有さないｈＧＡＬＮＳまたはコドン最適化ｈＧＡＬＮＳを発現するＡＡＶ８ベクタープラスミドをそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後、細胞ペレットと培地を回収し、ｈＧＡＬＮＳ活性を測定した。（Ａ）ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミドのいずれかをトランスフェクションした後、ＨｕＨ−７細胞において、細胞内酵素活性を求めた。（Ｂ）ＨｕＨ−７細胞に、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳプラスミド、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミド、ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ−ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションした後、その培地中の酵素活性を求めた。データは、平均として表されている。ｎ＝２である。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける血液中のヘパラン硫酸（ＨＳ）レベルである。血液試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取し、ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性（Ｍｔｏｌ）マウスにおいて、血漿中のｄｉＨＳ−０Ｓレベルを１６週齢において測定した。データは、平均±標準偏差として表されている。ＡＡＶは、アデノ随伴ウイルス、ＴＢＧは、サイロキシン結合グロブリン、ｈＧＡＬＮＳは、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼである。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける組織中のヘパラン硫酸（ＨＳ）レベルである。骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶベクターを注射してから１２週間後に、組織試料をＭＰＳ ＩＶＡマウスから採取した。肝臓、脾臓、肺及び腎臓を含む組織中のｄｉＨＳ−０Ｓの量をＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおいて測定した。データは、平均±標準偏差として表されている。 ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける骨の病態の矯正である。トルイジンブルー染色解析によって、ＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡマウスの膝関節における（Ａ）靭帯及び（Ｂ）半月板の光学顕微鏡観察を用いて、軟骨細胞の空胞化の矯正を評価した。ノックアウト（ＫＯ）マウス及び寛容性マウス（Ｍｔｏｌ）における骨の病態を野生型、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ、及び骨ターゲティングシグナルを含むＡＡＶ８ベクターまたは骨ターゲティングシグナルを含まないＡＡＶ８ベクターで処置したＭＰＳ ＩＶＡと比較した。矢印は、疾患と関連する小胞の位置を示している（スケールバーは２５μｍである）。 体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスと比較したものである。 体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスと比較したものである。 体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスと比較したものである。 体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスと比較したものである。 体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＴＯＬマウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスと比較したものである。 体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＴＯＬマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスと比較したものである。 体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣのＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスと比較したものである。 体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣのＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスの場合と比較したものである。 体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣのＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性を未処置の野生型マウスと比較したものである。
６．詳細な説明
本発明は、特定のｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）をムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）の動物モデルにおいて投与したところ、モニタリング期間全体を通じて、高レベルのｈＧＡＬＮＳ酵素活性が維持され、骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び心臓弁を含む組織が改善され、酵素補充療法（ＥＲＴ）で得られる改善を上回る改善が見られたという驚くべき知見に少なくとも部分的に基づくものである。
本明細書に記載されているのは、治療の必要なヒト対象のＭＰＳ ＩＶＡの治療に用いるｒＡＡＶである。これらのｒＡＡＶは、ｈＧＡＬＮＳをコードする組み換えＡＡＶゲノムを含む。そのｒＡＡＶは、ＭＰＳ ＩＶＡ患者に投与でき、その結果、ｈＧＡＬＮＳが合成され、ｈＧＡＬＮＳが、骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁のような罹患組織に送達され、それによって、病態が改善され、その疾患の進行が抑えられる。
提供するのは、ＡＡＶキャプシドと、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムとを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。特定の実施形態では、そのｒＡＡＶキャプシドは、セロタイプＡＡＶ８のキャプシドと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一である。特定の実施形態では、そのｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一である。特定の実施形態では、そのｒＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、配列番号１と８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％または９９〜９９．９％同一である。ｒＡＡＶキャプシドに関するさらなる詳細については、６．１．１項を参照されたい。いくつかの実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その酸性オリゴペプチドは、Ｄ８である。特定の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーター（例えばサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは追加として、ポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーター（例えばＴＢＧプロモーター）をコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。特定の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは追加として、ポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列を含む。
また、本発明で提供するのは、本明細書に記載されているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドである。さらに提供するのは、本発明で提供する方法及び組成物とともに用いるためのｒＡＡＶを作製する目的で、本発明で提供するポリヌクレオチドを含むプラスミド及び細胞（例えばｅｘ ｖｉｖｏ宿主細胞）である。
本発明でさらに提供するのは、本明細書に記載されているｒＡＡＶの作製方法である。
また、本発明で提供するのは、ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）と診断されたヒト対象の治療方法である。一態様では、その方法は、本明細書に記載されているｒＡＡＶをそのヒト対象に投与することを含む。別の態様では、その方法は、糖化ｈＧＡＬＮＳ（例えば、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳ）をその罹患組織（複数可）に送達することを含む別の態様では、その方法は、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をその罹患組織（複数可）に送達することを含む。その融合タンパク質は、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されることができる。
本発明でさらに提供するのは、本明細書に記載されているｒＡＡＶを含む医薬組成物及びキットである。
本発明で提供するｒＡＡＶは、６．１節に記載されており、この節には、６．１．１項におけるｒＡＡＶキャプシドの説明と、６．１．２項におけるｈＧＡＬＮＳ発現カセットの説明が含まれる。６．２節には、本発明で提供するｒＡＡＶの作製方法、ならびにその方法で使用できるポリヌクレオチド、プラスミド及び細胞が説明されている。６．３節には、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法が、標的患者集団、投与経路及び投与レジメンを含め、説明されている。６．４節には、併用療法が説明されている。６．５節には、疾患マーカー、及び臨床転帰の評価方法が説明されている。７節には、非限定的な実施例が示されている。
理論に拘束される訳ではないが、本発明のｒＡＡＶの作製、組成物及び使用方法は、ＭＰＳ ＩＶＡに対する治療として、ｈＧＡＬＮＳ酵素をヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板及び／または心臓弁に変わらず送達されるようにして修正することができる。
６．１ 組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
本発明で提供するのは、治療の必要なヒト対象のＭＰＳ ＩＶＡの治療に有用なｒＡＡＶであり、そのｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドと、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムとを含む。
一態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＡＡＶキャプシドと、（ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えＡＡＶゲノムとを含むｒＡＡＶである。そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。
別の態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＡＡＶキャプシドと、（ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている組み換えＡＡＶゲノムとを含むｒＡＡＶである。
好ましくは、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、そのｈＧＡＬＮＳタンパク質が、肝臓で発現されるようになっており、そのｈＧＡＬＮＳタンパク質は、肝細胞から分泌されると、他の組織（骨、軟骨及び関連組織のような重症器官、ならびに心臓弁が挙げられるが、これらに限らない）に移動する。
本発明で提供するｒＡＡＶのそれぞれ異なる成分については、以下に詳細に説明されている。
６．１．１ キャプシド
キャプシドは、ウイルスゲノムを包み込んで保護すると同時に、宿主環境と相互作用する、ウイルスのタンパク質シェルである。本発明に従って、本発明で提供するｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドを含む。具体的な実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、天然に見られるＡＡＶのキャプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ１１のキャプシド）である。別の具体的な実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、例えば、天然に見られるＡＡＶのキャプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ１１のキャプシド）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有することによって、天然に見られるＡＡＶのキャプシドから誘導されたものである。
特定の実施形態では、本明細書に記載されている本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドとしては、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６−１０６８に記載されているようなＡｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５が挙げられ、その文献は、参照により、その全体が援用される。特定の実施形態では、本明細書に記載されている本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドは、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９，４５８，５１７号、及び同第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載されているようなＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰというアミノ酸挿入のうちの１つを含み、それらの特許はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。特定の実施形態では、本明細書に記載されている本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドとしては、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９，４５８，５１７号及び同第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載されているようなＡＡＶ．７ｍ８が挙げられ、それらの特許はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。特定の実施形態では、本明細書に記載されている本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドとしては、米国特許第９，５８５，９７１号に開示されているいずれかのＡＡＶ（ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂなど）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明に従って使用できるＡＡＶバリアントキャプシドとしては、米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，９０６，１１１号、同第８，５２４，４４６号、同第８，９０６，６７５号、同第８，９９９，６７８号、同第８，６２８，９６６号、同第８，９２７，５１４号、同第８，７３４，８０９号、同第９，２８４，３５７号、同第９，４０９，９５３号、同第９，１６９，２９９号、同第９，１９３，９５６号、同第９４５８５１７号、同第９，５８７，２８２号、同第９，７３７，６１８号、同第９，８４０，７１９号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、同第２０１５／０１２６５８８号、同第２０１７／００６７９０８号、同第２０１３／０２２４８３６号、同第２０１６／０２１５０２４号、同第２０１７／００５１２５７号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６３０号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８８１７号、同第ＰＣＴ／２００２／０３３６２９号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３３７５号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４２４７２号、同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７３９２号という特許及び特許出願のいずれかに開示されているものが挙げられるが、これらに限らず、これらの特許及び特許出願はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。
特定の実施形態では、上記において一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を用いてよい。特定の実施形態では、自己相補型ベクター、例えばｓｃＡＡＶを用いてもよい（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１−８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ１２４８−１２５４、ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号及び同第７，４５６，６８３号（これらの文献はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。
好ましい実施形態では、本発明のｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８のキャプシドであるか、ＡＡＶ８のキャプシドから誘導されたものである。ＡＡＶ８は、他のセロタイプよりも、肝臓へのトランスダクション効率が高く、ヒトＡＡＶに対する抗体への反応性が低い。重要なことに、ＡＡＶ８キャプシドの所定の領域は、核移行及びキャプシド脱殻を媒介することによって、肝臓への高度なトランスダクションに寄与する（Ｔｅｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１４，４５４−４５５：２２７−２３６、Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，２００７ ８１（２２）：１２２６０−１２２７１）。その結果、ＡＡＶ８は、肝細胞に対するトロピズムを有する（Ｓａｎｄｓ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１１；８０７：１４１−１５７）。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ８キャプシドのアミノ酸配列（配列番号１）と同一である。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ８キャプシドのアミノ酸配列（配列番号１）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．９％同一である一方で、ＡＡＶ８キャプシドがウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ８キャプシドが肝細胞に高効率でトランスダクションさせる能力を保持している。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶに含まれるＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のアミノ酸残基以外は、ＡＡＶ８キャプシドのアミノ酸配列（配列番号１）と同一である一方で、ＡＡＶ８キャプシドがウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ８キャプシドが肝細胞に高効率でトランスダクションさせる能力を保持している。本明細書に記載されている治療方法の好ましい実施形態では、ｈＧＡＬＮＳタンパク質を肝臓で標的発現させるのに、ＡＡＶ８を使用する。
６．１．２ ｈＧＡＬＮＳ発現カセット
ＡＡＶは、末端に２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む直鎖状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶは、エンドサイトーシスによって細胞に進入する（Ｍｅｉｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｂｅｒ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．，２００４；６ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ１５２−６３）。キャプシドが破壊されると、ｓｓＤＮＡゲノムが放出され、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＮＤＡ）に変換され、そのｄｓＤＮＡから、そのウイルスゲノムによってコードされる遺伝子を発現させることができる（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２：８７３−８８０）。
本発明によれば、本発明で提供するｒＡＡＶは、組み換えＡＡＶゲノムを含む。その組み換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶゲノムまたはそのバリアントの主鎖（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０もしくはＡＡＶ１１のゲノム、またはそのバリアントの主鎖）を含むことができる。好ましくは、その組み換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８ゲノムまたはそのバリアントの主鎖を含むことができる。
本発明によれば、その組み換えＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでよく、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。別の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。
（ａ）ｈＧＡＬＮＳ
特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳまたは本発明の融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２または３の配列を含む。特定の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳまたは融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２または３に示されている配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。
特定の実施形態では、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４または５の配列を含む。特定の実施形態では、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４または５に示されている配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。
特定の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳまたは融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードするヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳのｃＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳまたは融合タンパク質のｈＧＡＬＮＳ部分をコードするヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳのｃＤＮＡ配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。
特定の実施形態では、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質のｃＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質のｃＤＮＡ配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。
特定の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列またはその融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えば、当業者に知られているいずれかのコドン最適化技法によって、コドン最適化されている（例えば、Ｑｕａｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５９：１４９−１６１による論評を参照されたい）。
特定の実施形態では、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列またはその融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列において、ＣｐＧ部位が除去されている。
（ｂ）酸性オリゴペプチド
酸性オリゴペプチドは、骨及び軟骨の主な成分であるヒドロキシアパタイトに対する結合親和性が高い。「酸性オリゴペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、グルタミン酸（Ｅ）残基及び／またはアスパラギン酸（Ｄ）残基の繰り返しアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを指す。酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は例えば、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個であってよい。具体的な実施形態では、酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、４〜８個である。具体的な実施形態では、酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、６〜８個である。具体的な実施形態では、酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、６個である。別の具体的な実施形態では、酸性オリゴペプチドのアミノ酸残基の数は、８個である。
好ましい実施形態では、本発明の酸性オリゴペプチドは、Ｄ８（すなわち、８個のアスパラギン酸残基からなるアミノ酸配列を有するオリゴペプチド）である。別の実施形態では、本発明の酸性オリゴペプチドは、Ｅ６（すなわち、６個のグルタミン酸残基からなるアミノ酸配列を有するオリゴペプチド）である。Ｅ６の配列は、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（６）：１１０９４−１１０２に説明されており、参照により、その全体が本明細書に援用される。
好ましい実施形態では、その酸性オリゴペプチドは、ｈＧＡＬＮＳのＮ末端に融合されている。別の実施形態では、その酸性オリゴペプチドは、ｈＧＡＬＮＳのＣ末端に融合されている。
具体的な実施形態では、その酸性オリゴペプチドは、ｈＧＡＬＮＳに直接融合されており、介在するアミノ酸配列がない。別の具体的な実施形態では、その酸性オリゴペプチドは、リンカーアミノ酸配列（例えば、１〜１０個、２〜８個または４〜６個のアミノ酸残基の長さであるアミノ酸配列）を介して、ｈＧＡＬＮＳに融合されている。
特定の実施形態では、ｈＧＡＬＮＳ酵素は、骨及び軟骨の区域におけるリソソームに送達して、骨及び軟骨の病態を改善できる。
（ｃ）遺伝子発現のプロモーター及び調節因子：
特定の実施形態では、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、遺伝子の送達または遺伝子の発現を調節する成分（例えば「発現制御エレメント」）を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、遺伝子の発現を調節する成分を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、細胞への結合またはターゲティングに影響を及ぼす成分を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、取り込み後、細胞内のｈＧＡＬＮＳの局在化に影響を及ぼす成分を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、例えば、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットを取り込んだ細胞について検出または選択を行う目的で、検出可能または選択可能なマーカーとして利用できる成分を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上のプロモーターをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含み、それらのうちの少なくとも１つは、ｈＧＡＬＮＳ、または酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。特定の実施形態では、そのプロモーターは、構成的プロモーターであることができる。代替的な実施形態では、そのプロモーターは、誘導性プロモーターであることができる。
特定の実施形態では、そのプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。
特定の実施形態では、そのプロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。
その肝臓特異的プロモーターは、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｇｅｎｅ，５０６（２）：２８９−９４（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい）であることができるが、これに限らない。
特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５である。
特定の実施形態では、そのプロモーターは、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターである。
特定の実施形態では、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターは、配列番号１６との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターは、配列番号１６である。
特定の実施形態では、そのプロモーターは、ｈＧＡＬＮＳまたはその融合タンパク質の発現を高める１つ以上のエレメントを含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む。
特定の実施形態では、その１つ以上のプロモーターエレメントは、逆向きになっているか、または互いに対して移動されていることができる。特定の実施形態では、そのプロモーターのエレメントは、協同的に機能するように配置されていることができる。特定の実施形態では、そのプロモーターのエレメントは、独立して機能するように配置されていることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的なＴＢＧプロモーター、ヒトＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ）長鎖末端反復配列及びラットインスリンプロモーターからなる群から選択した１つ以上のプロモーターを含む。特定の実施形態では、本発明で提供するｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上の組織特異的プロモーターを含む。具体的な実施形態では、その組織特異的プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。具体的な実施形態では、そのＴＢＧプロモーターは、配列番号６のヌクレオチド配列を有する。
特定の実施形態では、本発明のｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上の追加の発現制御エレメントを含み、それらのエレメントは、エンハンサー（例えばアルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー）をコードするヌクレオチド配列、リプレッサー、イントロンもしくはキメライントロン（例えば、ニワトリβ−アクチン遺伝子の第１イントロン）をコードするヌクレオチド配列、及び／またはポリＡ部位（例えば、ウサギグロビンポリＡ部位）をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。具体的な実施形態では、ウサギグロビンポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９の配列を有する。具体的な実施形態では、そのイントロンをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０の配列を有する。具体的な実施形態では、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１の配列を有する。
具体的な実施形態では、本発明のｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーと、イントロンをコードするヌクレオチド配列と、ＴＢＧプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳまたは酸性オリゴペプチド（好ましくはＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ウサギグロビンポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、そのウサギグロビンポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９の配列を有する。具体的な実施形態では、そのイントロンをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０の配列を有する。具体的な実施形態では、そのアルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１の配列を有する。
（ｄ）逆位末端反復配列
本発明によれば、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれている。ＩＴＲ配列は、組み換え遺伝子発現カセットをビリオンにパッケージングするのに用いてよい（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９（１）：３６４−３７９、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。具体的な実施形態では、挟んでいるそのＩＴＲは、ＡＡＶ８ ＩＴＲである。具体的な実施形態では、そのＩＴＲ配列は、配列番号７の配列を有することができる。具体的な実施形態では、そのＩＴＲ配列は、配列番号８の配列を有することができる。具体的な実施形態では、その５’ＩＴＲは、配列番号７の配列を有することができる。具体的な実施形態では、その３’ＩＴＲは、配列番号８の配列を有することができる。
（ｅ）非翻訳領域
特定の実施形態では、本明細書に記載されているｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、１つ以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば３’及び／または５’ＵＴＲを含む。特定の実施形態では、そのＵＴＲは、所望のタンパク質発現レベルに合わせて最適化されている。特定の実施形態では、そのＵＴＲは、ｈＧＡＬＮＳのｍＲＮＡ半減期に合わせて最適化されている。特定の実施形態では、そのＵＴＲは、ｈＧＡＬＮＳのｍＲＮＡの安定性に合わせて最適化されている。特定の実施形態では、そのＵＴＲは、ｈＧＡＬＮＳのｍＲＮＡの二次構造に合わせて最適化されている。
６．１．３ 医薬組成物及びキット
特定の実施形態では、本発明で提供するのは、本発明で提供するｒＡＡＶと、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。その医薬組成物は、個別の単回用量単位形態として調製し得る。本発明で提供する医薬組成物は、例えば、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与または経皮投与用に調合されていることができる。具体的な実施形態では、その医薬組成物は、静脈内投与用に調合されている。好適な薬学的に許容される担体（例えば、静脈内投与及び肝細胞へのトランスダクション用の担体）は、当業者であれば選択するのが容易であろう。
本発明で提供するのは、本明細書に記載されている医薬組成物が１つ以上の容器に入ったものを含むキットである。本発明の医薬組成物を入れることができる容器としては、ボトル、袋、アンプル、チューブ、吸入器、バッグ、バイアル及び容器を挙げることができるが、これらに限らない。特定の実施形態では、そのキットは、本発明の医薬組成物の投与に関する説明を含む。特定の実施形態では、そのキットは、本発明の医薬組成物を投与するのに使用できる器具を含み、その器具としては、シリンジ、無針注射器、点滴バッグ、パッチ及び吸入器が挙げられるが、これらに限らない。
また、提供するのは、遺伝子療法によって、本明細書に記載されているｒＡＡＶを用いて、ＭＰＳ ＩＶＡを治療するときに使用できる器具及び血液循環システムである。このような器具及びシステムは、当業者であれば選択するのは容易であろう。
６．２ ｒＡＡＶの作製
また、本発明で提供するのは、本明細書に記載されているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチド、プラスミド及び細胞であって、本発明で提供するｒＡＡＶを作製するのに使用できるポリヌクレオチド、プラスミド及び細胞と、本発明で提供するｒＡＡＶの作製方法である。
６．２．１ ポリヌクレオチド、プラスミド及び細胞
本発明で提供するのは、ｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドである。
一態様では、本発明で提供するのは、ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、酸性オリゴペプチド（例えばＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓特異的プロモーター（例えばＴＢＧプロモーター）をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーター（例えばＴＢＧプロモーター）をコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されているポリヌクレオチドである。
一態様では、本発明で提供するのは、ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、酸性オリゴペプチド（例えばＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。特定の実施形態では、そのプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。
一態様では、本発明で提供するのは、ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、酸性オリゴペプチド（例えばＤ８）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。特定の実施形態では、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターは、配列番号１６との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１６である。
別の態様では、本発明で提供するのは、ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、そのｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されているポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、そのプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１３との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１４との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１５との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１６との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１５である。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１６である。
そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、６．１．２項に記載されているようなものであることができる。
具体的な実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡの形態である。別の具体的な実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡの形態である。
また、本発明で提供するのは、本発明で提供するポリヌクレオチドを含むプラスミド（以下、「ｒＡＡＶプラスミド」という）である。具体的な実施形態では、そのｒＡＡＶプラスミドは、ｓｓＤＮＡプラスミドである。別の具体的な実施形態では、そのｒＡＡＶプラスミドは、ｄｓＤＮＡプラスミドである。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶプラスミドは、環状の形態である。別の実施形態では、そのｒＡＡＶプラスミドは、直鎖状の形態である。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）２つのタンデムなＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｂ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｃ）ヒトＡＡＴプロモーター、ｄ）ポリＡシグナル及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分（ＬＳＰＸ１）を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ２逆位末端反復配列、（２）ａ）２つのタンデムなＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｂ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｃ）ヒトＡＡＴプロモーター、ｄ）ウサギβ−グロビンポリＡシグナル及びｅ）任意に、ヒトβ−グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）２つのタンデムなＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ヒトＡＡＴプロモーター、ｃ）ポリＡシグナル及びｄ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分（ＬＳＰＸ２）を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ２逆位末端反復配列、（２）ａ）２つのタンデムなＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）ヒトＡＡＴプロモーター、ｃ）ポリＡシグナル及びｄ）任意に、ヒトβ−グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）２つのタンデムなＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｂ）ＴＢＧプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル及びｅ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分（ＬＴＰ１）を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ２逆位末端反復配列、（２）ａ）２つのタンデムなＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｂ）ＴＢＧプロモーター、ｃ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｄ）ポリＡシグナル及びｅ）任意に、ヒトβ−グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）２つのタンデムなＭｉｋ／ＢｉｋＥエンハンサー、ｃ）ＴＢＧプロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル及びｆ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分（ＬＴＰ２）を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ２逆位末端反復配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）２つのタンデムなＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＴＢＧプロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル及びｆ）任意に、ヒトβ−グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）３つのタンデムなＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＣＫプロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル及びｆ）任意にイントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分（ＬＭＴＰ６）を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているコンストラクトは、（１）発現カセットを挟み込むＡＡＶ２逆位末端反復配列、（２）ａ）ＡｐｏＥエンハンサー、ｂ）３つのタンデムなＭｃｋＥエンハンサー、ｃ）ＣＫプロモーター、ｄ）ヒトＡＡＴ（ΔＡＴＧ）プロモーター、ｅ）ポリＡシグナル及びｆ）任意に、ヒトβ−グロビン及びＩｇ重鎖に由来するキメライントロンを含む制御エレメント、ならびに（３）ｈＧＡＬＮＳまたはｈＧＡＬＮＳｃｏをコードするヌクレオチド配列という成分を含む。
さらに、本発明で提供するのは、本発明で提供するｒＡＡＶを発現する（例えば、組み換え発現する）細胞（好ましくはｅｘ ｖｉｖｏ細胞）である。特定の実施形態では、その細胞（好ましくはｅｘ ｖｉｖｏ細胞）は、本発明で提供するポリヌクレオチドまたは本発明で提供するｒＡＡＶプラスミドを含む。特定の実施形態では、その細胞（好ましくはｅｘ ｖｉｖｏ細胞）は、ＡＡＶのＲｅｐ、Ｃａｐ及びＡｄ５の機能をもたらすヘルパーポリヌクレオチド（複数可）またはヘルパープラスミドをさらに含む。その細胞（好ましくはｅｘ ｖｉｖｏ細胞）は、哺乳動物宿主細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞、Ａ５４９細胞、ＷＥＨＩ細胞、１０Ｔ１／２細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、Ｓａｏｓ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞であることができる。その哺乳動物宿主細胞は、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターに由来することができる。具体的な実施形態では、その哺乳動物宿主細胞は、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞）またはＨＥＫ２９３−Ｔ細胞である。
６．２．２ ｒＡＡＶの作製方法
提供するのは、本発明で提供するｒＡＡＶの作製方法である。特定の実施形態では、その方法は、６．２．１項に示されているｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶのＲｅｐ、Ｃａｐ及びＡｄ５の機能を合わせてもたらす１つ以上のヘルパープラスミドとを細胞（好ましくはｅｘ ｖｉｖｏ細胞）にトランスフェクションすることを含む。特定の実施形態では、その１つ以上のヘルパープラスミドは、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、ＶＡ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子及びＥ４遺伝子のヌクレオチド配列を合わせて含む。
本発明で提供する、遺伝子療法用途用のｒＡＡＶの作製には、当該技術分野において知られている方法、例えば、Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２７：１６００２（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されているような方法を用いることができる。特定の実施形態では、プラスミドＤＮＡのトランスフェクションは、当該技術分野において説明されているように、リン酸カルシウムプラスミド沈殿を用いて、ヒト胎児腎２９３細胞（ＨＥＫ２９３細胞）またはＨＥＫ２９３−Ｔ細胞で、ｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶのＲｅｐ及びＣａｐの機能、ならびにＡｄ５遺伝子（ＶＡ ＲＮＡ、Ｅ２ａ及びＥ４）をもたらすヘルパープラスミド（複数可）によって行う。特定の実施形態では、Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子及びＡｄ５遺伝子は、同じヘルパープラスミドに存在することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶのＲｅｐ、Ｃａｐ及びＡｄ５の機能を別々のプラスミドからもたらす２ヘルパー法（すなわち、トリプルトランスフェクション）を用いる。特定の実施形態では、そのＨＥＫ２９３細胞は、動物成分及び抗生物質不含培地において、浮遊状態で増殖するように適応させることができる。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、パッケージング細胞株及びプロデューサー細胞株を用いて作製できる。本発明で提供するｒＡＡＶは、哺乳動物宿主細胞、例えば、Ａ５４９細胞、ＷＥＨＩ細胞、１０Ｔ１／２細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞、Ｓａｏｓ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞を用いて作製してよい。本発明で提供するｒＡＡＶは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターに由来する宿主細胞を用いて作製してよい。特定の実施形態では、宿主細胞内でウイルスを産生させる手段、例えば、複製遺伝子及びキャプシド遺伝子（例えば、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子及びＣａｐ遺伝子）と、本発明で提供するｒＡＡＶプラスミドを導入することによって、安定細胞株を操作できる。具体的な実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、ＨＥＫ２９３細胞を用いて作製できる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、Ｓｆ９昆虫細胞において、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子及びそのｒＡＡＶのゲノムをコードする遺伝子を有する３つの組み換えバキュロウイルスプラスミドに共感染させることによって産生させることができる。
その細胞は、当業者であれば選択するのが容易である適切なプロトコールに従って、培養、トランスフェクション及び回収を行うことができる。特定の実施形態では、その細胞は、ウシ胎仔血清、グルコース、ペニシリン、ストレプトマイシン及び１−グルタミンを含む（ただし、これらに限らない）ダルベッコ改変イーグル基礎培地（ＤＭＥＭ）で培養できる（ＭｃＣｌｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１１，（５７）：３３４８、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２，７９８：２６７−２８４）。細胞は、当業者であれば選択するのが容易である成分中でトランスフェクションできる。特定の実施形態では、トランスフェクションは、培地溶液中で行うことができ、その培地溶液としては、ＤＭＥＭ及びイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）が挙げられるが、これらに限らない。特定の実施形態では、そのトランスフェクション時間は、４６時間、４７時間、４８時間、４９時間、５０時間、５１時間、５２時間、５３時間、５４時間、５５時間、５６時間、５７時間、５８時間、５９時間、６０時間、６１時間、６２時間、６３時間、６４時間、６５時間、６６時間、６７時間、６８時間、６９時間、７０時間、５０〜５５時間、５５〜６０時間、６０〜６５時間または６５〜７０時間を要することがある。トランスフェクション後、培養ウェルから細胞を剥がすために細胞を掻き取り、トランスフェクションされた細胞をすべて集めるためにそれらのウェルを洗浄することによって、細胞を回収できる。
ＡＡＶ８キャプシドを含むｒＡＡＶの作製方法については、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号（参照により、その全体が本明細書に援用される）のＤｅｔａｉｌｅｄ ＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎのＳｅｃｔｉｏｎ ＩＶを参照されたい。例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標）解析によって、前記ベクターのゲノムコピー力価を求めてもよい。ビリオンは、例えばＣｓＣｌ２沈降法によって回収してよい。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているｒＡＡＶは、単離ｒＡＡＶまたは精製ｒＡＡＶである。
複数のＡＡＶセロタイプが同定されている。特定の実施形態では、本発明で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶの１つ以上の成分を１つ以上含む。特定の実施形態では、本発明で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ１１のうちの１つ以上に由来する成分を１つ以上含む。特定の実施形態では、本発明で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１というセロタイプのうちの１つ以上に由来する成分を１つ以上含むことができる。好ましい実施形態では、本発明で提供するｒＡＡＶまたはポリヌクレオチドは、ＡＡＶ８というセロタイプの成分を１つ以上含むことができる。ＡＡＶ成分の核酸配列、ならびに組み換えＡＡＶ及び組み換えＡＡＶキャプシドの作製方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。具体的な実施形態では、本発明で提供するのは、ｈＧＡＬＮＳをコードするｒＡＡＶ８である。
特定の実施形態で説明されているのは、（ｉ）調節エレメントの制御下で、そのｈＧＡＬＮＳまたは酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を含む発現カセットであって、ＩＴＲに挟まれた発現カセットを含む組み換えゲノムと、（ｉｉ）ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するか、またはＡＡＶ８キャプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．９％同一である一方で、ＡＡＶ８キャプシドがウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ８キャプシドが肝細胞に高効率でトランスダクションさせる能力を保持しているウイルスキャプシドを含むｒＡＡＶ８である。特定の実施形態では、そのＡＡＶ８キャプシドは、配列番号１の配列において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個または３０個のアミノ酸が置換された配列を有するとともに、ＡＡＶ８キャプシドがウイルスゲノムを包み込む能力、かつ好ましくは、ＡＡＶ８キャプシドが肝細胞に高効率でトランスダクションさせる能力を保持している。
６．２．３ 有効性の評価
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイを用いて、本明細書に記載されているｒＡＡＶからのｈＧＡＬＮＳの発現を測定することができ、すなわち、例えば、そのｒＡＡＶの効能を示すことができる。そのアッセイで用いる細胞としては、Ａ５４９細胞、ＷＥＨＩ細胞、１０Ｔ１／２細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３−Ｔ細胞、ＨｕＨ７細胞、Ｓａｏｓ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞を挙げることができるが、これらに限らない。具体的な実施形態では、細胞培養アッセイで用いる細胞は、ＨｕＨ７細胞を含む。特定の実施形態では、本発明のｒＡＡＶをトランスフェクションした細胞は、ｈＧＡＬＮＳ酵素活性について解析できる。
動物モデルを用いて、本明細書に記載されているｒＡＡＶからのｈＧＡＬＮＳの発現と、その有効性を評価してもよい。ＭＰＳ ＩＶＡのマウスモデルは、説明されている（例えば、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １２（２４）：３３４９−３３５８を参照されたい）。ＭＰＳ ＩＶＡのマウスモデルは、マウスＧＡＬＮＳのエキソン２が標的破壊されている。これらのマウスは、検出可能なＧＡＬＮＳ酵素活性が見られず、尿において、ＧＡＧレベルの上昇が検出される。２月齢において、細網内皮系細胞であるクッパー細胞、及び脾臓の内側を覆う類洞内皮細胞で、ＧＡＧの貯蔵の増加が見られる。１２月齢においては、糸球体の内臓上皮細胞及び心臓弁基部の細胞で、空胞変性が観察されるが、肝細胞及び尿細管上皮細胞などの実質細胞には存在しない。海馬及び新皮質のニューロン、髄膜細胞で、ＧＡＧのリソソーム貯蔵が見られる。このマウスモデルの角膜上皮細胞では、野生型と比べて、ケラタン硫酸（ＫＳ）及びコンドロイチン−６−硫酸（Ｃ６Ｓ）が増加するが、このマウスモデルにおいて、骨格の適応症状は認められない。加えて、ヒトＧＡＬＮＳに対する寛容性を持つ、ＭＰＳ ＩＶＡのマウスモデルも説明されている（例えば、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４（２２）：３３２１−３３３５を参照されたい）。本明細書に記載されているｒＡＡＶからのｈＧＡＬＮＳの発現及びその有効性を評価するための例示的なアッセイについては、７章の実施例を参照されたい。
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、遺伝子療法ベクター、例えば、調節エレメントと、機能性ｈＧＡＬＮＳタンパク質の発現を増加させる導入遺伝子を組み合わせたベクターを含む。機能性ｈＧＡＬＮＳタンパク質の発現は、１）当業者に知られているいくつかのタンパク質（ｈＧＡＬＮＳ）測定アッセイ（以下に限らないが、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、組織学的染色及び液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ））２）酵素アッセイもしくは機能アッセイのようないくつかのタンパク質活性アッセイ、及び／または３）いくつかの基質検出アッセイ（以下に限らないが、ケラタン硫酸（ＫＳ）、グリコサミノグリカン（ＣＡＧ）及び／またはコンドロイチン−６−硫酸（Ｃ６Ｓ）の検出）によって測定してよく、ヒトの治療に有効または好適であると判断してよい（Ｈｉｎｔｚｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ２０１１：６ ６９−７８）。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞試験、血液試験及び組織試験を用いて、ｈＧＡＬＮＳの量及び機能の特性を評価した結果は、特定の療法の有効性と相関することが示されており（上記のＨｉｎｔｚｅ，Ｊ．Ｐらの２０１１年の文献）、その結果を用いて、本明細書に記載されているベクターを用いた遺伝子療法によるＭＰＳ ＩＶＡ治療の奏効を評価した。
したがって、本発明は、対象の組織細胞（例えば、肝細胞、筋肉細胞、白血球、腎細胞、肺細胞、脾臓細胞、心臓細胞、骨細胞または軟骨細胞を含む）において、細胞内のｈＧＡＬＮＳ酵素活性を野生型レベルよりも向上させるか、またはｈＧＡＬＮＳ酵素活性アッセイによって、例えば、本発明の実施例２、３及び８に記載されているようなアッセイ形式、もしくは実質的に同様のアッセイを用いて測定した場合に、細胞内ｈＧＡＬＮＳの酵素活性を野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約２倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約５倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約１０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約２５倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約４０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約５０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約６０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約７０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約７５倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約８０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約８５倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約９０倍、野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約９５倍もしくは野生型ｈＧＡＬＮＳの活性レベルの約１００倍まで向上させる方法及び遺伝子療法用ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子療法は、その対象において、その遺伝子療法を実施してから２週間後に、ｈＧＡＬＮＳの活性レベルを実施前のレベルまたは未治療のその対象における平均レベルよりも上昇させる方法をもたらす。いくつかの実施形態では、その遺伝子療法剤は、その対象において、その遺伝子療法を実施してから２週間後に、ｈＧＡＬＮＳの活性レベルを上昇させる方法をもたらす。いくつかの実施形態では、その遺伝子療法は、その遺伝子療法を実施してから２週間後に、その対象の血液または組織、例えば、肝臓、筋肉、腎臓、肺、脾臓、心臓、骨もしくは軟骨におけるｈＧＡＬＮＳの活性レベルを上昇させる方法をもたらす。いくつかの実施形態では、その対象におけるｈＧＡＬＮＳの活性レベルの上昇は、その遺伝子療法を実施してから１０週間後に測定する。
本発明は、その対象におけるＫＳの血液（例えば血漿もしくは血清）中レベルまたは組織中レベルを、未治療の野生型対象におけるＫＳのレベルよりも低下させるか、あるいはＫＳアッセイによって、例えば、本発明の実施例２、３及び８に記載されているようなアッセイ形式または実質的に同様のアッセイを用いて測定した場合に、ＫＳレベルを野生型ＫＳレベルの約１．１分の１、野生型ＫＳレベルの約１．２分の１、野生型ＫＳレベルの約１．３分の１、野生型ＫＳレベルの約１．４分の１、野生型ＫＳレベルの約１．５分の１、野生型ＫＳレベルの約１．６分の１、野生型ＫＳレベルの約１．７分の１、野生型ＫＳレベルの約１．８分の１、野生型ＫＳレベルの約１．９分の１、野生型ＫＳレベルの約２分の１、野生型ＫＳレベルの約２．５分の１、野生型ＫＳレベルの約３分の１、野生型ＫＳレベルの約３．５分の１、または野生型ＫＳレベルの約４分の１に低下させる方法及び遺伝子療法ベクターも提供する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子療法は、その対象において、その遺伝子療法を実施してから２週間後に、ＫＳレベルを低下させる方法をもたらす。いくつかの実施形態では、その遺伝子療法は、その対象において、その遺伝子療法を実施してから２週間後に、ＫＳの組織中レベルを低下させる方法をもたらす。いくつかの実施形態では、ＫＳアッセイは、血液または組織中のモノ硫酸化ＫＳを測定することを含み、本発明の遺伝子療法は、その対象において、その遺伝子療法を実施してから２週間後に、モノ硫酸化ＫＳレベルを低下させる方法をもたらす。
６．３ 治療方法
本発明で提供するのは、ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法である。
一態様では、その方法は、そのヒト対象に、本明細書に記載されているｒＡＡＶまたは本明細書に記載されている医薬組成物を投与することを含む。
別の態様では、その方法は、そのヒト対象に、本発明で提供するｒＡＡＶを投与することによって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする導入遺伝子のような導入遺伝子を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含む。具体的な実施形態では、前記ｈＧＡＬＮＳは、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される。
別の態様では、その方法は、そのヒト対象に、本発明で提供するｒＡＡＶを投与することによって、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含む。
別の態様では、その方法は、酸性オリゴペプチド（６．１．２（ｂ）項に記載されている酸性オリゴペプチド、例えばＤ８など）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含み、その融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノムから産生される。そのｒＡＡＶゲノムは、６．１．２項に記載されているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含んでよい。
別の態様では、その方法は、酸性オリゴペプチド（６．１．２（ｂ）項に記載されている酸性オリゴペプチド、例えばＤ８など）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含み、その融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される。そのｒＡＡＶゲノムは、６．１．２項に記載されているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含んでよい。好ましい実施形態では、そのｒＡＡＶゲノムは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。好ましい実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、配列番号１５である。
別の態様では、その方法は、酸性オリゴペプチド（６．１．２（ｂ）項に記載されている酸性オリゴペプチド、例えばＤ８など）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含み、その融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される。そのｒＡＡＶゲノムは、６．１．２項に記載されているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含んでよい。好ましい実施形態では、そのｒＡＡＶゲノムは、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。特定の実施形態では、その肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターは、配列番号１６との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１６である。
別の態様では、その方法は、酸性オリゴペプチド（６．１．２（ｂ）項に記載されている酸性オリゴペプチド、例えばＤ８など）に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含み、その融合タンパク質は、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される。そのｒＡＡＶゲノムは、６．１．２項に記載されているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含んでよい。好ましい実施形態では、そのｒＡＡＶゲノムは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。特定の実施形態では、そのプロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。
別の態様では、その方法は、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含む。そのｒＡＡＶゲノムは、６．１．２項に記載されているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含んでよい。好ましい実施形態では、そのｒＡＡＶゲノムは、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、その肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。好ましい実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、ＴＢＧプロモーターである。
別の態様では、その方法は、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、その細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、成長板、半月板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達すること（例えば、骨及び／または軟骨に送達すること）を含む。そのｒＡＡＶゲノムは、６．１．２項に記載されているようなｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含んでよい。好ましい実施形態では、そのｒＡＡＶゲノムは、プロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み、そのプロモーターをコードするヌクレオチド配列は、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１３との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１４との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１５との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１６との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１３である。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１４である。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１５である。特定の実施形態では、そのプロモーターは、配列番号１６である。
本明細書に記載されている治療方法の各種実施形態では、そのｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶの１つ以上のセロタイプに由来する成分を１つ以上含む。特定の実施形態では、そのｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０またはＡＡＶ１１のうちの１つ以上に由来する成分を１つ以上含む。特定の実施形態では、そのｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１というセロタイプのうちの１つ以上に由来する成分を１つ以上含む。好ましい実施形態では、そのｒＡＡＶまたはｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ８というセロタイプの成分を１つ以上含む。ＡＡＶ成分の核酸配列、ならびに組み換えＡＡＶ及び組み換えＡＡＶキャプシドの作製方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号及び国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本明細書に記載されている治療方法の各種実施形態では、骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程は、（ａ）骨及び／または軟骨、ならびに（ｂ）靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程である。
６．３．１ 標的患者集団
本発明によれば、そのヒト対象または患者は、ＭＰＳ ＩＶＡ（モルキオＡ症候群）と診断された個体である。具体的な実施形態では、その患者は、心臓弁の形態異常、う蝕、頸髄脊髄症、頸椎亜脱臼、コンドロイチン硫酸の尿中排泄、粗野な顔貌、腸骨翼狭窄、外反股、不均衡型短躯、低身長、長管骨骨端変形、肋骨胸郭フレア、外反膝、灰色のエナメル質、聴覚障害、肝腫大、脊柱前弯過度、歯突起形成不全、鼠径ヘルニア、関節弛緩、若年発症、ケラタン硫酸の尿中排泄、脊柱後弯、拡大した肘、下顎前突、骨幹端の拡大、角膜実質の混濁、骨粗しょう症、腰椎卵円化、扁平脊椎、第２〜第５中手骨近位端の先細り、胸骨の突出、頻回の上気道感染、拘束性換気障害、脊柱側弯症、手の尺側偏位、幅広い口及び広い歯間というＭＰＳ ＩＶＡ症状うちの１つ以上が見られる。
特定の実施形態では、その患者は、ｈＧＡＬＮＳによる治療に応答する者として確認されている。
具体的な実施形態では、その患者は、重篤かつ急速進行性の早発型ＭＰＳ ＩＶＡである。別の具体的な実施形態では、その患者は、緩徐進行性の遅発型ＭＰＳ ＩＶＡである。
具体的な実施形態では、その患者は、成人（少なくとも１６歳）である。別の具体的な実施形態では、その患者は、青年期（１２〜１５歳）である。別の具体的な実施形態では、その患者は、小児（１２歳未満）である。
具体的な実施形態では、その患者は、６歳未満である。
６．３．２ 投与及び投与量
本明細書に記載されているｒＡＡＶの投与経路、及びヒト患者に投与するｒＡＡＶの量は、その疾患の重症度、そのヒト患者の状態及び治療する医師の知見に基づいて定めることができる。
（ａ）治療投与量
好ましい実施形態では、ヒト対象に投与するｒＡＡＶの量は、ｈＧＡＬＮＳを治療有効量、罹患組織（骨、軟骨、靭帯、半月板、及び／または心臓弁）に供給するのに充分な量である。
特定の実施形態では、投与量は、本発明で提供するｒＡＡＶを介して、そのヒト対象に投与されるゲノムコピー数によって測定する。具体的な実施形態では、１×１０１０〜１×１０１６ゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態では、１×１０１０〜１×１０１１ゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態では、１×１０１１〜１×１０１２ゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態では、１×１０１２〜１×１０１３ゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態では、１×１０１３〜１×１０１４ゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態では、１×１０１４〜１×１０１５ゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態では、１×１０１５〜１×１０１６ゲノムコピーを投与する。
理論に拘束される訳ではないが、投与したｒＡＡＶの少なくとも１０％が、投与されたヒト対象の肝臓に感染する。特定の実施形態では、投与したｒＡＡＶの１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３５％、３０〜４０％、３５〜４５％、４０〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、７５〜８５％、８０〜９０％、８５〜９５％または９０〜１００％が、そのヒト対象の肝臓に感染する。
理論に拘束される訳ではないが、そのｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも１０％が、肝細胞で発現する。特定の実施形態では、そのｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３５％、３０〜４０％、３５〜４５％、４０〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、７５〜８５％、８０〜９０％、８５〜９５％または９０〜１００％が、肝細胞で発現する。
理論に拘束される訳ではないが、そのｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも１０％が、そのヒト対象の罹患組織（例えば骨）に到達する。特定の実施形態では、そのｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３５％、３０〜４０％、３５〜４５％、４０〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、７５〜８５％、８０〜９０％、８５〜９５％または９０〜１００％が、そのヒト対象の罹患組織（例えば骨）に到達する。
理論に拘束される訳ではないが、そのｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも１０％が、肝細胞で発現して、その細胞から分泌されることによって糖化される。特定の実施形態では、そのｒＡＡＶウイルスゲノムから発現するｈＧＡＬＮＳ酵素の１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３５％、３０〜４０％、３５〜４５％、４０〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、７５〜８５％、８０〜９０％、８５〜９５％または９０〜１００％が、肝細胞で発現して、その細胞から分泌されることによって糖化される。
理論に拘束される訳ではないが、肝細胞により糖化されたｈＧＡＬＮＳ酵素の少なくとも１０％が、そのヒト対象の罹患組織（例えば骨）に到達できる。特定の実施形態では、肝細胞により糖化されたｈＧＡＬＮＳ酵素の１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３５％、３０〜４０％、３５〜４５％、４０〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５５〜６５％、６０〜７０％、６５〜７５％、７０〜８０％、７５〜８５％、８０〜９０％、８５〜９５％または９０〜１００％が、そのヒト対象の罹患組織（例えば骨）に到達できる。
（ｂ）投与経路
具体的な実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、ヒト対象に投与する目的で、医薬組成物に存在できる（６．１．３項を参照されたい）。
本発明のｒＡＡＶは、例えば、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、髄腔内投与または経皮投与を行うことができる。具体的な実施形態では、本発明のｒＡＡＶは、静脈内投与を行う。
６．４ 併用療法
６．４．１ 免疫抑制との併用療法
ｒＡＡＶの送達の際には、免疫反応を最小限に抑える必要があるが、ｈＧＡＬＮＳ遺伝子を欠損しているため、その酵素または本発明のｒＡＡＶに対する寛容性が潜在的にないヒト対象においては、遺伝子療法に関連する最も明白な潜在的な毒性源が、発現したｈＧＡＬＮＳタンパク質に対して免疫を発動させる。したがって、特定の実施形態では、その患者においては、特に、ｈＧＡＬＮＳのレベルがゼロに近い重篤な疾患である患者を治療するときには、免疫抑制療法との併用治療を行うのが得策である。ミコフェノール酸と組み合わせたタクロリムスもしくはラパマイシン（シロリムス）のレジメンを伴う免疫抑制療法、または組織移植術で用いられるその他の免疫抑制レジメンを使用することができる。このような免疫抑制治療剤は、遺伝子療法を行っている最中に投与してもよく、特定の実施形態では、免疫抑制療法による前治療が好ましい場合もある。免疫抑制療法は、治療する医師の判断に基づき、遺伝子療法による治療後にも継続することができ、その後、免疫寛容が誘導されたら、例えば１８０日後に、中止してよい。
特定の実施形態では、本発明で提供する治療方法は、ヒト患者に、プレドニゾロン、ミコフェノール酸及びタクロリムスを含む免疫抑制レジメンを行うことをさらに含む。特定の実施形態では、本発明で提供する治療方法は、ヒト患者に、プレドニゾロン、ミコフェノール酸及びラパマイシン（シロリムス）を含む免疫抑制レジメンを行うことをさらに含む。特定の実施形態では、本発明で提供する治療方法は、ヒト患者に、タクロリムスを含まない免疫抑制レジメンを行うことをさらに含む。特定の実施形態では、本発明で提供する治療方法は、ヒト患者に、メチルプレドニゾロン及び／またはプレドニゾロンのような１つ以上の副腎皮質ステロイド、ならびにタクロリムス及び／またはシロリムスを含む免疫抑制レジメンを行うことをさらに含む。特定の実施形態では、その免疫抑制療法は、（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、または（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸を組み合わせたものを前記対象に、ｈＧＡＬＮＳによる治療の前またはその治療と同時に投与し、その後に継続することを含む。特定の実施形態では、その免疫抑制療法は、１８０日後に中止する。特定の実施形態では、その免疫抑制療法は、３０日後、６０日後、９０日後、１２０日後、１５０日後または１８０日後に中止する。
６．４．２ その他の治療との併用療法
本明細書に記載されているようなｒＡＡＶをヒト対象に投与するのに付随して、他の利用可能な治療を実施する併用療法は、記載されている実施形態の方法に含まれる。その追加の治療は、遺伝子療法による治療の前、その治療と同時、またはその治療の後に行ってよい。ＭＰＳ ＩＶＡに利用可能な治療であって、本発明の遺伝子療法と組み合わせることができる治療としては、酵素補充療法（ＥＲＴ）及び／またはＨＳＣＴ療法が挙げられるが、これらに限らない。具体的な実施形態では、ＥＲＴは、組み換えＤＮＡ技術によって、ヒト細胞株で産生させたＤ８−ｈＧＡＬＮＳ酵素を用いて行うことができる。このような酵素を産生させるのに用いることができるヒト細胞株としては、ＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、ＲｅＮｃｅｌｌ ＶＭ、ヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３細胞）、ＨＥＫ２９３−Ｔ、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ、ＨｕＨ−７及び網膜細胞株のＰＥＲ．Ｃ６またはＲＰＥが挙げられるが、これらに限らない（例えば、Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３６（６）：１１１０−１１２２“Ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（参照により、その全体が援用される）を参照されたい）。
６．５ 疾患マーカー及び治療評価
特定の実施形態では、本明細書に記載されているような治療方法の有効性は、骨、軟骨、靭帯、半月板、心臓弁、尿及び／または血清において、疾患のバイオマーカー（ＧＡＧ、ＫＳ及びＣ６Ｓの貯蔵）の減少、及び／またはｈＧＡＬＮＳ酵素活性の向上を測定することによってモニタリングしてよい。炎症及びその他の安全性事象の徴候もモニタリングしてよい。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているような治療方法の有効性は、患者において、疾患バイオマーカーのレベルを測定することによってモニタリングする。特定の実施形態では、その疾患バイオマーカーのレベルは、患者の血清で測定する。特定の実施形態では、その疾患バイオマーカーのレベルは、患者の尿で測定する。特定の実施形態では、その疾患バイオマーカーは、ＧＡＧである。特定の実施形態では、その疾患バイオマーカーは、ＫＳである。特定の実施形態では、その疾患バイオマーカーは、Ｃ６Ｓである。特定の実施形態では、その疾患バイオマーカーは、ｈＧＡＬＮＳ酵素活性である。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているような治療方法の有効性は、患者において、リソソーム貯蔵障害に伴う身体的特徴を測定することによってモニタリングできる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、貯蔵病変であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、短頸及び短躯であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、鳩胸であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、関節弛緩であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、脊柱後側弯であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、気管閉塞であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、脊髄圧迫であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、聴覚障害であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、角膜混濁であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、骨及び関節の変形であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、心臓弁疾患であることができる。特定の実施形態では、その身体的特徴は、気道の拘束／閉塞であることができる。このような身体的特徴は、当業者に知られているいずれかの方法によって測定してよい。
７．実施例
下記の非限定的な実施例によって、本明細書に示されている特定の実施形態を例示する。
７．１ 実施例１．ｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミド及びｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションアッセイのデザイン
ｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、ＡＡＶ８キャプシドに包まれるようになる組み換えＡＡＶゲノムを作製するために、その組み換えＡＡＶゲノムをコードするプラスミドをデザインした。ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ（そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、その発現は、肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの調節下で行われる）、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔ（そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、ｈＧＡＬＮＳをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含み、その発現は、肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの調節下で行われる）、ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ（そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｄ８に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その調節は、肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの調節下で行われる）、またはＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔ（そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットは、Ｄ８に融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含み、その発現は、肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの調節下で行われる）という４つのプラスミドをデザイン及び作製した。得られたｒＡＡＶは、（ａ）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶであって、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的なＴＢＧプロモーター配列に機能可能に連結されたｈＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡ配列と、ポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶと、（ｂ）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶであって、そのｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的なＴＢＧプロモーター配列に機能可能に連結されたＤ８−ｈＧＡＬＮＳ ｃＤＮＡ配列と、ポリＡ部位をコードするヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶという２つのカテゴリーに属する（図１）。Ｄ８は、骨ターゲティング型のアスパラギン酸オクタペプチドである。
次に、ｈＧＡＬＮＳの発現をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−３０００のプロトコールを用いて、ヒト肝細胞癌（ＨｕＨ７）細胞に、その４つのプラスミドのうちの１つをトランスフェクションした。４８時間のインキュベーション後、そのトランスフェクションしたＨｕＨ７細胞と上清を回収し、細胞ペレット及び培地におけるＧＡＬＮＳ酵素活性について解析した。ＧＦＰプラスミドをトランスフェクションしたＨｕＨ７細胞をコントロールとして使用した。ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションしたところ、細胞内のｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、同程度向上した（図２Ａ及び２Ｂ）。ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションした後にも、細胞内酵素活性は向上したが、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションした場合よりも程度は低かった（図２Ａ及び２Ｂ）。細胞培地で検出された酵素活性は、いずれのプラスミドをトランスフェクションした場合でも向上した（図２Ｃ及び２Ｄ）。
同様に、ｈＧＡＬＮＳの発現をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−３０００のプロトコールを用いて、ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）に、上記の４つのプラスミドのうちの１つをトランスフェクションした（図３）。７２時間のインキュベーション後、そのトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞を回収し、細胞ペレットにおけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性について解析した。ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションしたところ、細胞内のｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、コントロールのプラスミドをトランスフェクションした場合と比べて向上した。ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳプラスミドまたはＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドをトランスフェクションしたところ、ｈＧＡＬＮＳ活性は、コントロールのプラスミドとよりも向上しなかった。
７．２ 実施例２．ＭＰＳ ＩＶＡノックアウト（ｇａｌｎｓ−／−）マウスへのｒＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏ投与
肝臓特異的プロモーターＴＢＧの制御下で天然型のヒトＧＡＬＮＳ（ｈＧＡＬＮＳ）を発現できるウイルスゲノムを含むｒＡＡＶ８（ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ。いくつかの図では、ＡＡＶ８−ｈＧＡＬＮＳとしても示されている）、または肝臓特異的プロモーターの制御下で、アスパラギン酸オクタペプチド（Ｄ８）を有するｈＧＡＬＮＳを発現できるウイルスゲノムを含むｒＡＡＶ８（ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ。いくつかの図では、ＡＡＶ８−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳとしても示されている）を作製した。それぞれ、ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミド及びＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ ＣｏＯｐｔプラスミドを用いて、ウイルスゲノムを作製した。その２種類のウイルスをそれぞれ、４週齢のＭＰＳ ＩＶＡノックアウト（ＫＯ）マウス及びＭｔｏｌ免疫寛容マウスに、体重１ｋｇ当たり５ｘ１０１３ＧＣの用量で静脈内投与した。ＫＯマウスは、ｍＧＡＬＮＳのエキソン２が標的破壊されており、検出可能なＧＡＬＮＳ酵素活性が見られない。Ｍｔｏｌマウスは、ヒトＧＡＬＮＳタンパク質に対して免疫寛容状態になっている。未処置のＫＯマウス及び野生型（ＷＴ）マウスをコントロールとした。これらのマウスは、注射後、１４週間モニタリングした。血液を週に２回採取し、ｈＧＡＬＮＳ活性及びケラタン硫酸（ＫＳ）についてアッセイした。ｒＡＡＶの投与、血液採取、ＧＡＬＮＳ酵素アッセイ及びＫＳアッセイのスケジュールは、図４に示されている。検死時に、骨の病態を組織病理学的解析によって評価した。
図５Ａで見られるように、ｒＡＡＶ処置マウスの白血球（ＷＢＣ）において、ｈＧＡＬＮＳ酵素活性が向上し、治療から１０週間後に、ＷＴマウスのレベル近くに達した。ｒＡＡＶの投与から２週間後、すべてのｒＡＡＶ処置マウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、ＷＴマウスにおけるレベルと比べて、平均で２０倍（ＷＴマウスにおけるレベルと比べて５〜１００倍の範囲）上昇した（図５Ｂ）。この上昇は、１４週間のモニタリング期間にわたって維持された（図５Ｂ）。同様のデータが図２２に示されている。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスにおける血漿中の酵素活性レベルは、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスにおけるレベルよりも有意に高かった（図６）が、いずれの処置群の酵素活性レベルも、ＷＴのレベルよりも上昇した。同様のデータが図２３に示されている。
ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの肝臓で測定したｈＧＡＬＮＳ活性をＷＴマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性と比較した（図７Ａ）。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスは、肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、ＷＴのレベルと比べて４０倍高かったのに対して、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスは、肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性が、ＷＴのレベルよりも８倍高かった。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性は、未処置のＭｔｏｌマウス（ＰＢＳ処置マウス）よりも上昇した（図７Ｂ）。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスは、肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、未処置のマウスと比べて５０倍高かったのに対して、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスは、肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性が、未処置のＭｔｏｌマウスよりも８倍高かった。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与後、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）及びＭｔｏｌマウスの肝臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳの活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較したものに関するさらなるデータについては、図１２Ａを参照されたい（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）。
ｈＧＡＬＮＳ活性は、（ａ）ＷＴマウス、（ｂ）未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、（ｃ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、（ｄ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、（ｅ）未処置のＭｔｏｌマウス、（ｆ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス及び（ｇ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心臓でも測定した（図７Ｃ）。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方とも、心臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性レベルが、未処置のマウスと比べて高かった。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与後に、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）及びＭｔｏｌマウスの心臓でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスの場合と比較したものに関するさらなるデータについては、図１３Ｂを参照されたい（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）。
同様に、ｈＧＡＬＮＳ活性を（ａ）ＷＴマウス、（ｂ）未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、（ｃ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、（ｄ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、（ｅ）未処置のＭｔｏｌマウス、（ｆ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス及び（ｇ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの骨で測定した（図７Ｄ）。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方とも、骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、未処置のマウスと比べて高かった。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与後、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）及びＭｔｏｌマウスの骨でそれぞれ測定したｈＧＡＬＮＳ活性レベルを未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較したものに関するさらなるデータについては、図１３Ａを参照されたい（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）。
ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、処置マウスの肝臓、心臓及び骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性レベルは、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳベクターまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳベクターの送達後に上昇した。加えて、血液におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性と骨におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性に、直接的な相関関係が見られた。
ｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルは、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与後、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の脾臓及びＭｔｏｌマウスの脾臓でも、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較した形で、それぞれ測定した（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）（図１２Ｂ）。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方とも、脾臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、未処置のマウスと比べて高かった。
加えて、ｈＧＡＬＮＳ酵素活性レベルは、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与後、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の肺及びＭｔｏｌマウスの肺でも、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、未処置のＭｔｏｌマウス及び野生型マウスと比較した形で、それぞれ測定した（ｎ＝３〜８、平均±標準偏差）（図１２Ｃ）。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方とも、肺におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、未処置のマウスと比べて高かった。
血中ケラタン硫酸（ＫＳ）レベルを測定した。ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスでは、いずれの群でも、ｒＡＡＶによる治療により、投与から２週間後に、血漿中のモノ硫酸化ケラタン硫酸（ＫＳ）レベルが、ＷＴのレベルまで低下した（図８及び図１４）。いずれのｒＡＡＶ処置群でのこれらの血漿中レベルの低下は、注射から１２週間後の検死時まで維持された。対照的に、未処置のＫＯマウスの血漿中のＫＳレベルは低下せず、モニタリングした期間にわたって上昇したままであった。ＭｔｏｌマウスにおいてｒＡＡＶのいずれを投与した場合も、血漿中のモノ硫酸化ケラタン硫酸（ＫＳ）レベルは、治療から２週間後、ＷＴのレベルと比べて低下し、その血漿中ＫＳレベルは、未処置のＭｔｏｌマウスと比べて有意に低下した（図９Ａ〜９Ｂ及び図１５Ａ〜１５Ｂ）。しかしながら、血中ｄｉＨＳ−０Ｓレベルは、未処置のマウス群、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス群、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス群及びＷＴマウス群で、差は見られなかった（図１０）。
モノ硫酸化ＫＳレベルをＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の肝臓、Ｍｔｏｌマウスの肝臓及びＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の肺で、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスと比較する形で、それぞれ測定した（図１６Ａ〜１６Ｃ）。ｒＡＡＶのいずれを投与した場合も、未処置のマウスと比べて、肝臓におけるモノ硫酸化ＫＳが有意に低下したとともに、肺におけるモノ硫酸化ＫＳが有意に低下した。ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）及びＭｔｏｌマウスの肝臓及び肺におけるＫＳレベルは、ＡＡＶベクターの投与後、ほぼ正常化した。
これらの処置ＫＯマウスの肝臓の組織病理学的評価により、洞内皮細胞及びクッパー細胞におけるＧＡＧ貯蔵が完全に解消されたことが示された。
ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳの投与により、モニタリング期間にわたり、ＫＯマウスモデル及びＭｔｏｌマウスモデルの血漿において、高レベルの酵素活性が維持された。このように循環酵素が継続的に存在することにより、血漿中のＫＳがＷＴのレベルまで低下し、そのレベルは、ＥＲＴによって得られる改善よりも有意な改善である（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，１７（６）：８１５−８２４）。血漿中ＫＳレベルは、いずれのマウスモデルでも、かつＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳのいずれでも、ｒＡＡＶの投与から２週間後に正常化したが、ＫＯマウスをＥＲＴで処置した以前の研究では、血漿中ＫＳレベルは、週に１回注入してから１２週間後でも正常化しなかった（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，１７（６）：８１５−８２４）。加えて、高い酵素レベルが、循環時間の長期化と相まって、骨及び軟骨への浸透を高めたことによって、これらの領域における貯蔵性が改善した。
ｒＡＡＶによる処置から１２週間後にマウスを安楽死させ、組織を摘出し、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の貯蔵について評価した。組織をトルイジンブルーで染色した。骨の病態を組織病理学的解析によって評価したが、病理スコアは、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスについてグラフ図で表されている（図１１Ａ）。図１１Ｂは、膝関節（ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス）の染色画像を示している。
図１１Ｃは、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの大腿関節軟骨の４０倍に拡大した染色画像を示している。その未処置のマウス（左パネル）では、表層細胞が破壊され、軟骨細胞が風船様になり、空胞化していた。さらに、そのカラム構造は歪み、崩壊していた。対照的に、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳのいずれかで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの組織では、表層細胞は組織化されており、軟骨細胞の空胞化の程度は小さく、カラム構造は維持されていた（右の２つのパネル）。これらの様相は、図１１Ｄ〜１１Ｆにさらに詳細に示されている。
図１１Ｇは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスまたはｒＡＡＶで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの大腿骨成長板の４０倍に拡大した染色画像を示している。その未処置のマウス（左パネル）では、軟骨細胞は空胞化し、そのカラム構造は大部分が崩壊し、歪んでいた。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの軟骨細胞（中央パネル）も空胞化していたが、カラム構造の歪みは中度に過ぎなかった。対照的に、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの組織（右パネル）では、軟骨細胞の空胞化は中度であり、カラム構造は、より組織化されていた。これらの様相は、図１１Ｈ〜１１Ｊにさらに詳細に示されている。図１７Ａ〜１７Ｅにも、（Ａ）野生型マウス（いずれの軟骨細胞も空胞化しておらず、カラム構造は充分に組織化されていた）、（Ｂ）未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）（軟骨細胞はいずれも空胞化し、カラム構造は、大部分が崩壊し、歪んていた）、（Ｃ）未処置のＭｔｏｌマウス（軟骨細胞はいずれも空胞化し、カラム構造は、大部分が崩壊し、乱れていた）、（Ｄ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス（軟骨細胞の空胞化は中度であったが、カラム構造は、良質であった）、及び（Ｅ）ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウス（軟骨細胞の空胞化は中度であったが、カラム構造は部分的に回復していた）の大腿骨成長板の４０倍に拡大した染色画像が示されている。
図１８Ａは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）またはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の大腿骨及び脛骨の成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズを示している。図１８Ｂは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの大腿骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズを示している。図１８Ｃは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）またはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス（ｇａｌｎｓ−／−）の脛骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズを示している。図１８Ｄは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの脛骨成長板で測定した軟骨細胞の細胞サイズを示している。
ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及びＭｔｏｌマウスの成長板における軟骨細胞のサイズ及びカラム構造はいずれも、ＡＡＶによる遺伝子移入後に実質的に改善した。
図１１Ｋは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスまたはｒＡＡＶで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの半月板の４０倍に拡大した染色画像を示している。その未処置のマウス（左パネル）では、その細胞の大半が風船様になり、空胞化していた。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの半月板の細胞の一部（中央パネル）は空胞化していた。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの組織の細胞の大半（右パネル）は、空胞化していなかった。
図１１Ｌは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスまたはｒＡＡＶで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの脛骨側の靭帯の４０倍に拡大した染色画像を示している。その未処置のマウス（左パネル）では、その細胞の大半が空胞化していた。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの靭帯の細胞の一部（右の２つのパネル）は、空胞化したままであった。
図１１Ｍは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスまたはｒＡＡＶで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの心臓弁の基部の４０倍に拡大した染色画像を示している。未処置のマウス（左パネル）の僧帽弁基部の細胞の多くは空胞化していたが、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス（中央パネル）またはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス（右パネル）の僧帽弁組織の基部には、空胞化した細胞は見られなかった。未処置のマウスの組織のこれらの様相は、図１１Ｎにさらに詳細に示されている。心臓弁の組織で、同様の結果が見られた（図１１Ｏ）。Ｍｔｏｌマウスにおける同様の結果は、図１９（下パネル）に示されている。未処置のマウス（左パネル）の心臓弁細胞の多くは、空胞化していたが、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス（中央パネル）またはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス（右パネル）の心臓弁組織では、空胞化した細胞は見られなかった。未処置のマウスの組織のこれらの様相は、図１１Ｐにさらに詳細に示されている。
図２０は、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心筋（４０倍拡大画像）の組織病態を未処置のＭｔｏｌマウスと比較したものを示している。
心臓弁及び心筋では、ＡＡＶによる遺伝子移入後、ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス及びＭｔｏｌマウスのいずれでも、明らかに空胞化した細胞は見られなかった。
図２１Ａは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの心臓弁組織の病理スコアを示している。図２１Ｂは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心臓弁組織の病理スコアを示している。図２１Ｃは、未処置の野生型マウス、未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ（ｇａｌｎｓ−／−）マウスの心筋組織の病理スコアを示している。図２１Ｄは、未処置の野生型マウス、未処置のＭｔｏｌマウス、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭｔｏｌマウスの心筋組織の病理スコアを示している。
Ｍｔｏｌマウスでも、骨の病態を組織病理学的解析によって評価した。独立ｔ検定を用いて、未処置群と各処置群との病理スコアの差について調べた（スコア：０（正常）〜３（重度））。表１を参照されたい。
表１．Ｍｔｏｌマウスの骨の病理スコア（ｎ＝２〜５、平均±標準偏差）
Figure 2021531044
 ＊未処置群に対するｐ＜０．０５
いずれのウイルスも、関節軟骨、関節軟骨周辺の靭帯及び半月板、ならびに脛骨及び大腿骨の成長板領域におけるＧＡＧ貯蔵を低下させた。骨及び軟骨で観察された、ＧＡＧ貯蔵の低下は、ＡＡＶ−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスにおいて比較的大きかった。
ｒＡＡＶで処置したマウスでは、骨、成長板、関節軟骨、半月板、靭帯及び心臓組織は、実質的に改善した。加えて、処置マウスでは、心臓弁及び心臓弁基部の異常に関して、ほぼ完全寛解が得られ、心臓弁基部及び心臓弁のいずれにおいても、明らかに空胞化した細胞は見られなかった。これらの結果から、ＥＲＴよりも有意な改善が示されている。ＥＲＴ処置マウスでは、成長板において、空胞化した細胞の消失が見られず、成長板において、カラム構造が崩壊しており、心臓弁において、実質的に空胞化した細胞が見られたからである（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，１７（６）：８１５−８２４）。
肝臓以外の組織で治療効果が観察された（ｈＧＡＬＮＳタンパク質及びＤ８−ｈＧＡＬＮＳタンパク質が産生された）ことから、マンノース−６−リン酸受容体がクロスコレクションを媒介したことが示唆されている。
７．３ 実施例３．肝臓を標的としたＡＡＶ８による遺伝子療法は、ムコ多糖症ＩＶＡマウスモデルにおいて、骨格及び心血管の病態を改善する
この実施例は、本明細書に記載されている他の実施例（実施例１〜２を含む）で説明及び実施された実験に関連するものであり、実施例１〜２の追加データを提供する。この実施例では、肝臓特異的なサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターの制御下で、ｈＧＡＬＮＳを、骨ターゲティングシグナルとともに、または骨ターゲティングシグナルなしに発現するＡＡＶ８ベクターを評価し、ＭＰＳ ＩＶＡの疾患の両方のマウスモデルの骨及び心臓の病変において、これらの組み換えＡＡＶ８ベクターの治療有効性を試験する。骨及び心臓のいずれも、この障害で影響を受ける主要器官である。
７．３．１ 結果
（ａ）血液及び組織におけるＧＡＬＮＳ酵素活性：ＡＡＶ−ｈＧＡＬＮＳを送達すると、ＭＰＳ ＩＶＡのマウスモデルの血漿及び各種組織において、ＧＡＬＮＳ活性が顕著に向上する。
ＭＰＳ ＩＶＡである２つのマウスモデル（ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ及びＭｔｏｌ）では、ｈＧＡＬＮＳ活性の欠損、血液及び組織におけるＫＳレベルの上昇、ならびに各種組織（軟骨細胞、半月板、靭帯、心筋及び心臓弁を含む）内の貯蔵物質（小胞）に関して、ヒトＭＰＳ ＩＶＡが再現される。これらのバイオマーカーは、これらのマウスモデルにおいて、表現型の重症度及びいくつかのアプローチの治療有効性を評価する目的で広く用いられている（Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００８，１７，８１５−８２４、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００３，１２，３３４９−３３５８、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，１４，３３２１−３３３５、Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１０，１８，１０９４−１１０２）。この試験では、我々は、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏ及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳｃｏ（図２４Ａ）を４週齢のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯ及びＭＴＯＬマウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣという均一な用量で静脈内送達した。それらのマウスを、注射後１２週間にモニタリングし、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析した。加えて、検死時に、酵素活性及びＫＳレベルのために、組織試料を異なる器官から採取し、組織病理解析のために、膝関節及び心臓弁も摘出した。
ＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの血漿中酵素活性は、図２４Ｂ〜２４Ｃに示されている。未処置のＭＰＳ ＩＶＡマウスでは、血漿中のｈＧＡＬＮＳ活性は検出されなかった。注射から２週間後、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスにおける血漿中のｈＧＡＬＮＳ活性は、野生型マウスにおける活性と比べて、有意に向上した。注射から２週間後、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳに由来する酵素活性は、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳに由来する活性よりも高かったが、注射から１２週間後には、これらの２つのＡＡＶベクターにおいて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ活性に差は見られなかった。いずれのＡＡＶベクターで処置したＭＴＯＬマウスでも、血漿中のｈＧＡＬＮＳ活性は、注射から２週間後に、野生型マウスにおける活性と比べて、有意に向上した。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの酵素活性のレベルは、試験期間全体を通じて、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの活性よりも高かったことから、骨ターゲティングシグナルを有するｈＧＡＬＮＳは、おそらく、組織への取り込みの低下により、天然型のｈＧＡＬＮＳと比べて、血液循環が長くなったことが示唆された。これらの結果により、いずれのＭＰＳ ＩＶＡマウスモデルにおいても、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳの１回注射後に、超生理学的レベルの循環ｈＧＡＬＮＳ活性が得られたとともに、試験中、高レベルの酵素活性が維持されたことが示された。
ＡＡＶベクターのＩＶ送達から１２週間後の肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ活性のレベルが、図２４Ｊ及び図２４Ｋに示されている。すべての処置ＭＰＳ ＩＶＡマウスにおけるｈＧＡＬＮＳの活性レベルは、未処置のＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける活性よりも有意に高かった。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスにおける平均酵素活性レベルは、野生型マウスで観察されたレベルよりも４９倍高く、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスにおける平均酵素活性レベルは、９倍高かった。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスでは、ｈＧＡＬＮＳ活性は、野生型マウスで見られたレベルよりも６０倍高く、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＭＴＯＬマウスでは、９倍高かった。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの肝臓におけるＧＡＬＮＳ活性は、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスにおける活性よりも有意に低かった。
ＭＰＳ ＩＶＡマウスの組織において、組織中のｈＧＡＬＮＳ活性のレベルを調べて、ｈＧＡＬＮＳ欠損の潜在的クロスコレクションを評価した。ＫＯマウスＭＴＯＬマウスの両方において、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳによる処置後いずれも、脾臓、肺、腎臓、骨（肢骨）及び心臓を含め、調べたすべての組織で、ｈＧＡＬＮＳ活性が観察された（図２４Ｊ〜２４Ｋ）。その酵素活性は、脾臓及び心臓において、野生型レベルと同程度以上であったとともに、肺及び腎臓では、多少低いレベルの活性が観察された。とりわけ、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯマウスの骨では、野生型酵素活性の３７％の活性が観察され、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯマウスの骨では、野生型酵素活性の２０％の活性が観察された。また、これらの２つのＡＡＶベクターで処置したＭＴＯＬマウスでは、野生型酵素活性の５７％の活性及び４３％の活性が観察された。これらの結果から、ＡＡＶによる遺伝子移入後、安定した超生理学的レベルのｈＧＡＬＮＳ酵素が、ＭＰＳ ＩＶＡマウスの骨を含む各種組織内へのその酵素の浸透に寄与することが示唆されている。骨におけるｈＧＡＬＮＳ活性レベルは、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳとＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳにおいて、統計的な差は見られなかった。
（ｂ）ＡＡＶ−ＧＡＬＮＳを送達した結果、血液及び組織におけるモノ硫酸化ＫＳのレベルは低下した
我々は、ＫＳの主成分であるモノ硫酸化ＫＳをＭＰＳ ＩＶＡマウスの血漿及び組織において測定した。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスにおける血漿中のモノ硫酸化ＫＳのレベルは、図２５Ａ〜２５Ｂに示されている。ＡＡＶベクターを投与する前、未処置のＫＯマウスにおける血漿中ＫＳレベルは、野生型マウスにおけるレベルよりも有意に高かった（平均：１６．３ｎｇ／ｍｌに対して４１．８ｎｇ／ｍｌ）。注射から２週間後、両方のＡＡＶベクターにおいて、血漿中のモノ硫酸化ＫＳレベルは完全に正常化し、このレベルは、少なくともさらに１０週間（検死時）維持された。モノ硫酸化ＫＳレベルは、４週齢の野生型マウス及び未処置のＭＴＯＬマウスにおいて同程度であった。野生型マウスにおけるモノ硫酸化ＫＳレベルは、試験全体を通じて一定レベルに維持されたが、未処置のＭＴＯＬマウスにおけるモノ硫酸化ＫＳのレベルは、加齢に伴って徐々に上昇した。上記のＡＡＶベクターのいずれかで処置したＭＴＯＬマウスは、試験期間全体を通じて、正常レベルを維持した。１６週齢では、ＡＡＶベクターで処置したＭＴＯＬマウスにおけるモノ硫酸化ＫＳレベルは、未処置のＭＴＯＬマウスにおけるレベルと比べて、有意に低下した。
ＭＰＳ ＩＶＡマウスの組織におけるモノＫＳレベルを測定する。検死時に、ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの両方の組織に、ＧＡＧの過剰貯蔵が見られた。ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの肝臓及び肺におけるモノ硫酸化ＫＳの量は、いずれのＡＡＶベクターを注射した１２週間後にも、有意に減少した（図２５Ｃ〜２５Ｄ）。ｈＧＡＬＮＳを発現するこれらのＡＡＶベクターが他のＧＡＧレベルに及ぼす作用を評価するために、ＭＰＳ ＩＶＳマウスの血液及び組織において、ヘパラン硫酸（ＨＳ）のレベルを解析した。ＫＯマウス及びＭｔｏｌマウスのいずれも、血漿中のｄｉＨＳ−０Ｓが正常レベルであったとともに、そのレベルは、ＡＡＶベクターの注射後に影響を受けなかった（図３０）。その肝臓及び肺の組織中のｄｉＨＳ−０Ｓレベルも、ＡＡＶベクターの注射から１２週間後、すべての群の間で、変化は見られなかった（図３１）。
（ｃ）ＡＡＶ ＧＡＬＮＳベクターの送達によって、ＭＰＳ ＩＶＡマウスにおける骨及び軟骨の病態が改善した
ＭＰＳ ＩＶＡマウスにおいて、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳの注射から１２週間後に、骨（大腿骨及び脛骨）ならびに心臓（心筋及び心臓弁）を含む組織を評価した。
１６週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスで、ＧＡＧ貯蔵小胞が、大腿骨及び脛骨の成長板（硝子軟骨）（図２７Ａ）、関節円板（図２７Ｂ）、膝関節周辺の靭帯（図３２Ａ）及び半月板（図３２Ｂ）に見られた。その成長板では、崩壊したカラム構造とともに、風船様になり、空胞化した軟骨細胞も見られた（図２７Ａ〜２７Ｂ）。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯマウスでは、膝関節における成長板、関節軟骨、靭帯及び半月板は、貯蔵物質が部分的に減少し、軟骨細胞のカラム構造は改善したが、依然として、崩壊し、乱れた状態のままであった。これらのＡＡＶベクターで処置したＭＴＯＬマウスでは、膝関節における成長板、関節軟骨、靭帯及び半月板は、貯蔵が観察可能な程度を上回る程度減少し、成長板及び関節軟骨のカラム構造では、未処置のＭＴＯＬマウスよりも大きな回復が見られた。
その成長板の軟骨細胞における空胞化の改善を客観的に評価するために、ＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの成長板病変において、軟骨細胞の細胞サイズを定量した（４Ｃ）。我々は、これらの成長板病変において、軟骨細胞サイズの中度の減少を観察し、その減少は、ＭＴＯＬマウスにおいて、統計学的に有意な状態に達した。未処置のＭＰＳ ＩＶＡマウスでは、心臓弁及び心筋でＧＡＧ貯蔵小胞が見られた。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳは、処置したＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスの上記の心臓病変をほぼ完全に消失させた（図２７Ａ〜２７Ｂ）。
（ｄ）抗ｈＧＡＬＮＳ抗体の循環
全体として、ＡＡＶ８ベクターの注射から１２週間後、ＫＯマウスにおける骨の病態の改善は、ＭＴＯＬマウスにおける改善と比べて顕著ではなかった。ｈＧＡＬＮＳに対する液性応答の可能性を調べるために、ｈＧＡＬＮＳに対する抗体力価を酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。プレート上にコーティングした完全長ｒｈＧＡＬＮＳを用いることによって、間接ＥＬＩＳＡ法によって、血漿中の抗ｈＧＡＬＮＳ抗体を検出した。ＡＡＶベクターで処置したＫＯマウスに由来する血漿では、循環抗ｈＧＡＬＮＳ抗体のレベルが、他の群に由来するレベルと比べて有意に高かった（ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したＫＯにおいて、光学密度（ＯＤ）単位は０．５０±０．３８または０．６２±０．４３であった）（図２８）。循環抗ｈＧＡＬＮＳ抗体は、野生型マウス、未処置のＫＯマウス及びＭＴＯＬマウスでは検出されなかった。
７．３．２ 材料及び方法
（ａ）ＡＡＶ ｈＧＡＬＮＳ発現カセットの開発
ｈＧＡＬＮＳを含むＡＡＶ８ベクターを開発するために、我々は、ｈＧＡＬＮＳの最適化コドン配列を決定した。肝臓特異的なＴＢＧプロモーターの制御下で、５２６個のアミノ酸に翻訳されるその１５６９ｂｐの最適化配列をＡＡＶ８キャプシドにパッケージングした。骨ターゲティングシグナルを含むベクタープラスミドでは、アスパラギン酸オクタペプチド（Ｄ８）配列をｈＧＡＬＮＳのＮ末端シグナルペプチドの後に挿入し、主要骨基質であるヒドロキシアパタイトに対する親和性の高い骨ターゲティングｈＧＡＬＮＳを作製した（図２４Ａ）。Ｈｕｈ−７細胞へのトランスフェクション実験を行った後、これらのＡＡＶベクタープラスミドによるＧＡＬＮＳの産生を確認した。そのコドン最適化オープンリーディングフレームに由来する細胞内及び細胞外のｈＧＡＬＮＳの活性レベルは、天然型のｈＧＡＬＮＳコード配列によって産生されるレベルと同程度であった（図２９Ａ〜２９Ｂ）。
（ｂ）発現カセットのデザイン及びＡＡＶベクターの作製
ＡＡＶ８ベクターにパッケージングする目的で、天然型のＧＡＬＮＳ及びＤ８を含むＧＡＬＮＳの導入遺伝子を含む発現カセットをデザインした（図２８）。骨ターゲティングシグナルであるアスパラギン酸オクタペプチド（Ｄ８）配列は、ｈＧＡＬＮＳのＮ末端シグナルペプチドの後に挿入した。そのデザインには、肝臓特異的なサイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターをウサギβグロブリンポリアデニル化テール（ポリＡ）とともに含めた。我々は、そのマウス試験用の両方のベクターに、コドン最適化ｈＧＡＬＮＳ配列を使用した。我々は、Ｈｕｈ−７細胞を用いたトランスフェクション実験で、これらの発現カセットプラスミドのＧＡＬＮＳ酵素活性を確認した。我々は、トランスフェクションから４８時間後に、細胞溶解物及び上清の両方で、活性レベルを求めた（図２９Ａ〜２９Ｂ）。そのコドン最適化コンストラクトから得られたＧＡＬＮＳ活性レベルは、天然型のｈＧＡＬＮＳコード配列によって産生されるレベルと同程度であった。
ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）独自のＧＭＰベクター作製プロトコールをスケールダウンしたものに従って、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳベクター及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳベクターを作製した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞（ＲＧＸ２９３）に、ヘルパープラスミド、ＡＡＶ８キャプシドプラスミド、及びｈＧＡＬＮＳ／Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳプラスミドを含む導入遺伝子プラスミドをトリプルトランスフェクションした。アフィニティークロマトグラフィーを用いて、そのパッケージングしたベクターを細胞培養上清から精製し、Ｄｉｇｉｔａｌ Ｄｒｏｐｌｅｔ ＰＣＲ（ＢｉｏＲａｄ）法を用いて、力価の測定を行った。
（ｃ）マウスモデル及びｉｎ ｖｉｖｏ試験デザイン
我々は、２つのＭＰＳ ＩＶＡマウスモデルを用いることによって、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳの潜在的な治療能力を試験した（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（２４）：３３４９−３３５８、Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５；１４，３３２１−３３３５）。第１のタイプは、ｇａｌｎｓ遺伝子が破壊されたＧａｌｎｓノックアウトマウスモデル（ＫＯ：Ｇａｌｎｓ−／−）である（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（２４）：３３４９−３３５８）。第２のタイプは、ヒトＧＡＬＮＳに対する寛容性を有するマウスモデルであって、イントロン１に、ｈＧＡＬＮＳを発現する導入遺伝子を含むとともに、エキソン２に隣接して、活性部位の変異（Ｃ７６Ｓ）を含むことで、標的変異誘発によって、そのマウスＧａｌｎｓ遺伝子に、その不活性なｈＧＡＬＮＳコード配列が、Ｃ７９Ｓという活性部位の変異とＣ７６Ｓという変異とともに導入されるマウスモデル（Ｍｔｏｌ：Ｇａｌｎｓｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ）である（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５；１４，３３２１−３３３５）。いずれのモデルでも、血液及び組織において、検出可能な酵素活性は見られず、主に、細網内皮系クッパー細胞、心臓弁、心筋、ならびに成長板及び関節軟骨を含む軟骨細胞内で、貯蔵物質の蓄積が見られた。
我々は以前、２つのＭＰＳ ＩＶＡマウスモデルの開発について説明したが、それは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＭＰＳ ＩＶＡノックアウトマウス（Ｇａｌｎｓ−／−）（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（２４）：３３４９−３３５８）及びヒトＧＡＬＮＳタンパク質に対する寛容性を有するＭＰＳ ＩＶＡマウス（ｇａｌｎｓｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ）（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ． Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５；１４，３３２１−３３３５）である。そのＧＡＬＮＳノックアウトマウスモデル（ＫＯ：Ｇａｌｎｓ−／−）は、ＧＡＬＮＳ遺伝子の標的破壊によって開発した（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００３；１２（２４）：３３４９−３３５８）。ヒトＧＡＬＮＳに対する寛容性を有するマウスモデル（Ｍｔｏｌ：ｇａｌｎｓｔｍ（ｈＣ７９Ｓ．ｍＣ７６Ｓ）ｓｌｕ）は、イントロン１に、ｈＧＡＬＮＳを発現する導入遺伝子を含むとともに、エキソン２に隣接して、活性部位の変異（Ｃ７６Ｓ）を含むことによって、その不活性なｈＧＡＬＮＳコード配列が、Ｃ７９Ｓという活性部位の変異とともに導入される（Ｔｏｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５；１４，３３２１−３３３５）。いずれのマウスモデルでも、血液及び組織において、検出可能な酵素活性は見られず、主に、細網内皮系クッパー細胞、心臓弁及び心筋、ならびに成長板及び関節軟骨を含む軟骨細胞内で、貯蔵物質の蓄積が見られた。
１４日目に、実験コホートのジェノタイピングをＰＣＲによって行った。４週齢のホモ接合型ＭＰＳ ＩＶＡマウスをいずれかのＡＡＶ８ベクターで、５×１０１３ＧＣ／ｋｇの均一な用量で静脈内処置した。別のコホートのＭＰＳ ＩＶＡマウスと、罹患していないＣ５７ＢＬ／６同腹子に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を投与した。総投与体積は、マウス１匹当たり約１００μｌであった。マウスの取り扱い及び実験はすべて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｎｅｍｏｕｒｓ／Ａｌｆｒｅｄ Ｉ．ｄｕＰｏｎｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｃｈｉｌｄｒｅｎから許可を得た。
（ｄ）血液及び組織の採取
約１００μｌの血液をＥＤＴＡ入りのチューブ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に、１週間おきに、試験におけるすべてのマウスから採取した。その血液を８，０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、ＧＡＬＮＳ酵素アッセイ及びＧＡＧアッセイを行うまで、分離した血漿を−２０℃に保持した。１６週齢時に、マウスをＣＯ２チャンバーで安楽死させ、２０ｍｌの０．９％生理食塩水でかん流した。肝臓、腎臓、肺、脾臓、心臓及び膝関節を摘出し、ＧＡＬＮＳ酵素アッセイ及びＧＡＧアッセイに備えて処理するまで、−８０℃で保存した。加えて、各種組織の試料を採取し、組織病理解析に備えて、１０％中性緩衝ホルマリンで保存した。
（ｅ）ＧＡＬＮＳ活性アッセイ
以前に説明されたようにして（Ｔｏｉｅｔｔａ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１；１２，２００７−２０１６）、血液及び組織中のＧＡＬＮＳ活性を求めた。ホモジナイザーを用いることによって、２５ｍｍｏｌ／ｌのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）及び１ｍｍｏｌ／ｌのフェニルメチルスルホニルフルオリドからなるホモジナイズバッファーで、凍結した組織をホモジナイズした。組織溶解物または血漿と、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．３）中の２２ｍＭの４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトピラノシド−６−硫酸（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ，ＩＬ，ＵＳＡ）を３７℃で１６時間インキュベートした。続いて、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．３）中の、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに由来する１０ｍｇ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を反応試料に加え、追加のインキュベーションを３７℃で２時間行った。その試料を反応停止液（１Ｍのグリシン、ＮａＯＨ、ｐＨ１０．５）に移し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４というプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、そのプレートを３６６ｎｍの励起光及び４５０ｎｍの発光で読み取った。活性は、１時間当たり、血漿１マイクロリットルまたはタンパク質１ミリグラム当たりに放出される４−メチルウンベリフェロンの量（ナノモル）として表した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって求めた。
（ｆ）組織からのＧＡＧの抽出
各種マウス組織からのＧＡＧの抽出法は、Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉらの開発した方法（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８；２８３，３１２３７−３１２４５）を改変したものであった。簡潔に述べると、摘出した組織を液体窒素で凍結し、ホモジナイザーを用いて、アセトンでホモジナイズした。得られた粉末を遠心真空乾燥した。その脱脂組織粉末を０．５ＭのＮａＯＨに懸濁し、５０℃で２時間インキュベートして、そのコアタンパク質からＧＡＧ鎖を切り離した。１ＭのＨＣｌで中和後、ＮａＣｌを終濃度３Ｍになるまで加えた。不溶物質を遠心分離によって除去し、その上清のｐＨを１ＭのＨＣｌによって１．０未満に調整した。沈殿したヌクレオチドを遠心分離によって除去し、その上清を１ＭのＮａＯＨで中和した。１．３％酢酸カリウムを含む２倍量のエタノールを加えることによって、その粗ＧＡＧを沈殿させた。遠心分離後、その沈殿物を蒸留水に溶解させた。
（ｇ）ＧＡＧアッセイ
以前に説明されたようにして（Ｏｇｕｍａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２００７；２１，３５６−３６２、Ｏｇｕｍａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７；３６８，７９−８６、Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．ＪＩＭＤ．Ｒｅｐ．２０１４；１６，１５−２４、Ｓｈｉｍａｄａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．ＪＩＭＤ．Ｒｅｐ．２０１５；２１，１−１３、Ｋｕｂａｓｋｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２０１７；４０，１５１−１５８）、血液及び組織中のＧＡＧレベルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定した。簡潔に述べると、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）と試料を９６ウェルレシーバープレート上の９６ウェルオメガ１０Ｋフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）に入れた。試料を１５分、２，５００ｇで遠心分離した。そのフィルタープレートを新しいレシーバープレートに移し、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、内部標準（ＩＳ）としての５μｇ／ｍＬのコンドロシン、１ｍＵのヘパリチナーゼ及び１ｍＵのケラタナーゼＩＩのカクテル混合物をそのフィルタープレートに加えた。試料を３７℃のウォーターバスで一晩インキュベートした。続いて、その試料を１５分、２，５００ｇで遠心分離した。その装置は、６４６０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄという質量分析計とともに、１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から構成されていた。６０℃に恒温したＨｙｐｅｒｃａｒｂというカラム（内径２．０ｍｍ、長さ５０ｍｍ、粒子５μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で二糖を分離した。その移動相は、５ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ１１．０）（溶出液Ａ）→１００％アセトニトリル（溶出液Ｂ）というグラジエント溶出相であった。その流速は０．７ｍｌ／分で、そのグラジエントは、１００％溶出液Ａで０分、７０％溶出液Ａで１分、７０％溶出液Ａで２分、０％溶出液Ａで２．２０分、０％溶出液Ａで２．６０分、１００％溶出液Ａで２．６１分、１００％溶出液Ａで５分であった。その質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化法を用いて、ネガティブイオンモードで作動させた（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊｅｔ Ｓｔｒｅａｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。特定のプリカーサーイオン及びプロダクトイオンのｍ／ｚを用いて、各二糖をそれぞれ定量した（ＩＳ：３５４．３→１９３．１、モノ硫酸化ＫＳ：４６２→９７、ＨＳ−０Ｓ３７８．３→１７５．１）。注入体積は１０μｌで、実行時間は１試料当たり５分であった。
（ｈ）トルイジンブルー染色及び病理学的評価
以前に説明されたようにして（Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００５，１４，３３２１−３３３５）、トルイジンブルー染色を行った。簡潔に述べると、１６週齢のＭＰＳ ＩＶＡマウス及びＷＴマウスから、膝関節及び僧帽弁を摘出して、貯蔵顆粒のレベルを光学顕微鏡観察によって評価した。組織をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド及び４％グルタルアルデヒドで固定し、四酸化オスミウムで後固定し、Ｓｐｕｒｒレジンに包埋した。続いて、トルイジンブルー染色した厚さ０．５μｍの切片を検査した。大腿骨または脛骨の成長板における軟骨細胞の細胞サイズ（空胞化）を評価するために、各マウスにおいて、増殖区域内の約３００個の軟骨細胞をＩｍａｇｅ Ｊというソフトウェアによって測定し、結果を野生型群からの変化倍率として表した。
（ｉ）酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）による、ＧＡＬＮＳに対する抗体の検出
以前に説明されたようにして（Ｔｏｍａｔｓｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２００３；１２，９６１−９７３）、間接ＥＬＩＳＡ法を用いて、処置マウス及び未処置マウスの血漿において、ＧＡＬＮＳに対する抗体を検出した。簡潔に述べると、１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、０．０２％のＮａＮ３（ｐＨ９．６）中の２μｇ／ｍｌの精製ｒｈＧＡＬＮＳ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）で、９６ウェルマイクロタイタープレートを一晩コーティングした。そのウェルをＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）で３回洗浄してから、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の３％ウシ血清アルブミンで１時間、室温でブロックした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、マウス血漿の、ＴＢＳ−Ｔによる１００倍希釈液をそのウェルに加え、３７℃で２．５時間インキュベートした。そのウェルをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄してから、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の１：１，０００希釈液を含むＴＢＳ−Ｔをそのウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。そのウェルをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＢＳ（１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質（ＡＢＴＳ溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を加え（１ウェル当たり１００μｌ）、プレートを室温で３０分インキュベートした。１％ＳＤＳを加えて、その反応を停止させ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４というプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、そのプレートを４１０ｎｍの光学密度で読み取った。
（ｊ）統計解析
すべてのデータは、平均及び標準偏差（ＳＤ）として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ボンフェローニのポストホックテストを伴う一元ＡＮＯＶＡによって、多重比較検定を行った。その統計学的に有意な差は、ｐ＜０．０５とした。
７．４ 実施例４．酵素への長期間の暴露が骨の病態に及ぼす作用を評価する
下記の試験は、酵素への長期間の暴露が骨の病態に及ぼす作用を評価する目的で行う。この試験では、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏを４週齢のＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣの用量で投与する。コントロール群は、同じ週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスである。この試験では、３群のマウス（１群当たり６〜１０匹）を使用する。注射から２４週間後または４８週間後のいずれかに、それらのマウスをモニタリングし、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検死時に、組織試料を、酵素活性及びＫＳレベルのために、異なる器官から摘出するとともに、組織病理解析のために、膝関節及び心臓弁から摘出する。
同様に、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏを４週齢のＭＴＯＬマウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣの用量で送達する。コントロール群には、同じ週齢の未処置のＭＴＯＬマウス及び未処置の野生型マウスが含まれる。この試験では、３群のマウス（１群当たり６〜１０匹）を使用する。注射から２４週間後または４８週間後のいずれかに、それらのマウスをモニタリングし、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検死時に、組織試料を、酵素活性及びＫＳレベルのために、異なる器官から摘出するとともに、組織病理解析のために、膝関節及び心臓弁から摘出する。
７．５ 実施例５．新生仔試験：早期介入が骨の病態に及ぼす作用を評価する
下記の試験を新生仔マウスで行って、早期介入が骨の病態に及ぼす作用を評価する。この試験では、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏをＭＰＳＩＶＡ ＫＯ新生仔マウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣの用量で投与する。コントロール群には、同じ週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスが含まれる。それらのマウスを１６週齢に殺処分し、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検死時に、組織試料を、酵素活性及びＫＳレベルのために、異なる器官から摘出するとともに、組織病理解析のために、膝関節及び心臓弁から摘出する。
同様に、我々は、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏを新生仔ＭＴＯＬマウスに、体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣの用量で送達した。コントロール群には、同じ週齢の未処置のＭＴＯＬマウス及び未処置の野生型マウスが含まれる。この試験では、３群のマウス（１群当たり６匹）を使用する。それらのマウスを１６週齢に殺処分し、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検死時に、組織試料を、酵素活性及びＫＳレベルのために、異なる器官から摘出するとともに、組織病理解析のために、膝関節及び心臓弁から摘出する。
７．６ 実施例６．新規な発現カセットの評価
下記の試験を行って、最適化プロモーターコンストラクトを、有効性の改善について評価する。この試験では、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ８−プロモーター１−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ８−プロモーター２−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＶＶ９−プロモーター２−ｈＧＡＬＮＳｃｏを４週齢のＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスに、体重１ｋｇ当たり１×１０１３ＧＣの用量で投与する（１群当たり１０匹のマウス）。コントロール群には、同じ週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスが含まれる。１２週間または４８週間のいずれかで、それらのマウスをモニタリングし、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検死時に、組織試料を、酵素活性及びＫＳレベルのために、異なる器官から摘出するとともに、組織病理解析のために、膝関節及び心臓弁から摘出する。
７．７ 実施例７．後期ＡＡＶ遺伝子療法試験
下記の試験を行って、後期ＡＡＶ遺伝子療法の有効性を評価する。この試験では、ＡＡＶ−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ−プロモーター１−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ−プロモーター２−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＶＶ−プロモーター２−ｈＧＡＬＮＳｃｏを８〜１０週齢のＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウス（１群当たり５匹のマウス）に投与する。未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスをコントロールとして使用する。ある期間にわたり、それらのマウスをモニタリングし、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検死時に、組織試料を、酵素活性及びＫＳレベルのために、異なる器官から採取し、組織病理解析のために、膝関節及び心臓弁から採取する。
同様に、ＡＡＶ−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ−プロモーター１−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＡＶ−プロモーター２−ｈＧＡＬＮＳｃｏ、ＡＶＶ−プロモーター２−ｈＧＡＬＮＳｃｏを８〜１０週齢のＭＴＯＬマウス（１群当たり５匹のマウス）に投与する。未処置のＭＴＯＬマウスをコントロールとして使用する。ある期間にわたり、それらのマウスをモニタリングし、血液試料を１週間おきに採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析する。加えて、検死時に、組織試料を、酵素活性及びＫＳレベルのために、異なる器官から摘出するとともに、組織病理解析のために、膝関節及び心臓弁から摘出する。
７．８ 実施例８．高用量及び低用量におけるＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳの作用に関する比較試験
下記の試験を行って、高用量及び低用量におけるＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳ、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳの作用を評価した。
この試験では、我々は、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを４週齢のＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウス（１群当たりｎ≧４）に、高用量（体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣ）または低用量（体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣ）で静脈内送達した。我々は、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳも、４週齢のＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウス（１群当たりｎ≧４）に、低用量（体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣ）で静脈内送達した。コントロール群には、同じ週齢の未処置のＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウス及び未処置の野生型マウスを含めた。それらのマウスを１２週間モニタリングし、血液試料（血漿）を週に２回採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析した。
同様に、我々は、ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを４週齢のＭＴＯＬマウス（１群当たりｎ≧４）に、高用量（体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣ）または低用量（体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣ）で静脈内送達した。我々は、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳ及びＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳも、４週齢のＭＴＯＬマウス（１群当たりｎ≧４）に、低用量（体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣ）で静脈内送達した。未処置のＭＴＯＬマウスをコントロールとして使用する。それらのマウスを１２週間モニタリングし、血液試料を週に２回採取して、酵素活性及びＫＳレベルを解析した。
７．８．１ 結果
（ａ）体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの血漿におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性と、未処置の野生型マウスの場合との比較
体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスにおける血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、図３３〜３５に示されている。注射から２週間後、ＡＡＶ８−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳマウスでは、未処置の野生型マウスと比べて、血漿中のｈＧＡＬＮＳ活性の向上が検出された。注射から２週間後には、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳに由来する酵素活性は、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳに由来する活性よりも高かった。
（ｂ）体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性と、未処置の野生型マウスの場合との比較
体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、図３６に示されている。ＡＡＶ８−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウス及びＡＡＶ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスの両方において、未処置の野生型マウスと比べて、肝臓中のｈＧＡＬＮＳ活性の向上が検出された。
（ｃ）体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＴＯＬマウスの血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性と、未処置の野生型マウスの場合との比較
体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＴＯＬマウスの血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、図３７に示されている。
（ｄ）体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＴＯＬマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性と、未処置の野生型マウスの場合との比較
体重１ｋｇ当たり５×１０１３ＧＣのＡＡＶ８−ＣＡＧ−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＴＯＬマウスの肝臓におけるＧＡＬＮＳ酵素活性は、図３８に示されている。ＡＡＶ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスにおいて、未処置の野生型マウスと比べて、肝臓中のｈＧＡＬＮＳ活性の向上が検出された。
（ｅ）体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣのＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性と、未処置の野生型マウスの場合との比較
体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣのＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスにおける血漿中のｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、図３９〜４０に示されている。
（ｆ）体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣのＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳ ＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性と、未処置の野生型マウスの場合との比較
体重１ｋｇ当たり２×１０１４ＧＣのＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳを投与したＭＰＳＩＶＡ ＫＯマウスの肝臓におけるｈＧＡＬＮＳ酵素活性は、図４１に示されている。ＡＡＶ８−ＴＢＧ−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスまたはＡＡＶ８−ＴＢＧ−Ｄ８−ｈＧＡＬＮＳで処置したマウスのいずれにおいても、未処置の野生型マウスと比べて、肝臓中のｈＧＡＬＮＳ活性の向上が検出された。
８．配列表
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９．均等物及び参照による援用
本発明の具体的な実施形態を参照しながら、本発明について詳細に説明されているが、機能的に均等である変形形態が、本発明の範囲内であることは分かるであろう。実際、上記の説明及び添付の図面から、当業者には、本明細書に示されているとともに説明されている形態に加えて、本発明の様々な修正形態が明らかになるであろう。このような修正形態は、添付の請求項の範囲内に含まれるように意図されている。当業者は、常法に過ぎない実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはそれらを突き止めることができるであろう。このような均等物は、下記の請求項に含まれるように意図されている。
本明細書で言及されている刊行物、特許及び特許出願はいずれも、個々の刊行物、特許及び特許出願が参照により、その全体として援用されることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、参照により、本明細書に援用される。

Claims (53)

  1. （ａ）ＡＡＶキャプシドと、
    （ｂ）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記導入遺伝子が、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする前記組み換えＡＡＶゲノムと、
    を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  2. 前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  3. 前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
  4. 前記肝臓特異的プロモーターが、
    （ａ）ＴＢＧプロモーターであるか、
    （ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｃ）配列番号１３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｄ）配列番号１３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｅ）配列番号１３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｆ）配列番号１３と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｇ）配列番号１３と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｈ）配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｉ）配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｊ）配列番号１４と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｋ）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｌ）配列番号１４と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｍ）配列番号１４と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｎ）配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｏ）配列番号１５と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｐ）配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｑ）配列番号１５と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｒ）配列番号１５と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｓ）配列番号１５と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
    請求項３に記載のｒＡＡＶ。
  5. 前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
  6. 前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーターである、請求項５に記載のｒＡＡＶ。
  7. 前記プロモーターが、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターである、請求項５に記載のｒＡＡＶ。
  8. 前記肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターが、
    （ａ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｂ）配列番号１６と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｃ）配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｄ）配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｅ）配列番号１６と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｆ）配列番号１６と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
    請求項７に記載のｒＡＡＶ。
  9. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
  10. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
  11. 前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
  12. 前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列において、ＣｐＧ部位が除去されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
  13. （ａ）ＡＡＶキャプシドと、
    （ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、前記肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている前記組み換えＡＡＶゲノムと、
    を含むｒＡＡＶ。
  14. 前記肝臓特異的プロモーターが、
    （ａ）ＴＢＧプロモーターであるか、
    （ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｃ）配列番号１３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｄ）配列番号１３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｅ）配列番号１３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｆ）配列番号１３と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｇ）配列番号１３と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｈ）配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｉ）配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｊ）配列番号１４と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｋ）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｌ）配列番号１４と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｍ）配列番号１４と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｎ）配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｏ）配列番号１５と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｐ）配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｑ）配列番号１５と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｒ）配列番号１５と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｓ）配列番号１５と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
    請求項１３に記載のｒＡＡＶ。
  15. （ａ）ＡＡＶキャプシドと、
    （ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、前記プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーターである前記組み換えＡＡＶゲノムと、
    を含むｒＡＡＶ。
  16. （ａ）ＡＡＶキャプシドと、
    （ｂ）ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、前記プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、前記肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターが、
    （ａ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｂ）配列番号１６と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｃ）配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｄ）配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｅ）配列番号１６と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｆ）配列番号１６と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
    前記組み換えＡＡＶゲノムと、
    を含むｒＡＡＶ。
  17. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
  18. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
  19. 前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
  20. 前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列において、ＣｐＧ部位が除去されている、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
  21. 請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶと、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  22. ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記導入遺伝子が、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド。
  23. 前記酸性オリゴペプチドが、Ｄ８である、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  24. 前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記肝臓特異的プロモーターが、
    （ａ）ＴＢＧプロモーターであるか、
    （ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｃ）配列番号１３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｄ）配列番号１３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｅ）配列番号１３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｆ）配列番号１３と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｇ）配列番号１３と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｈ）配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｉ）配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｊ）配列番号１４と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｋ）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｌ）配列番号１４と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｍ）配列番号１４と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｎ）配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｏ）配列番号１５と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｐ）配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｑ）配列番号１５と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｒ）配列番号１５と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｓ）配列番号１５と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
    請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターが、
    （ｇ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｈ）配列番号１６と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｉ）配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｊ）配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｋ）配列番号１６と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｌ）配列番号１６と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
    請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
  28. 前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されている、請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーターである、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  30. ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、前記肝臓特異的プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、前記肝臓特異的プロモーターが、
    （ａ）ＴＢＧプロモーターであるか、
    （ｂ）配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｃ）配列番号１３と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｄ）配列番号１３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｅ）配列番号１３と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｆ）配列番号１３と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｇ）配列番号１３と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｈ）配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｉ）配列番号１４と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｊ）配列番号１４と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｋ）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｌ）配列番号１４と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｍ）配列番号１４と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｎ）配列番号１５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｏ）配列番号１５と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｐ）配列番号１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｑ）配列番号１５と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｒ）配列番号１５と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｓ）配列番号１５と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
    前記ポリヌクレオチド。
  31. ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、プロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、前記プロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーターである前記ポリヌクレオチド。
  32. ＡＡＶ−ＩＴＲに挟まれたｈＧＡＬＮＳ発現カセットを含むポリヌクレオチドであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列と、ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列を含み、前記肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターをコードするヌクレオチド配列が、前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結されており、前記肝臓及び筋肉に特異的なプロモーターが、
    （ｇ）配列番号１６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｈ）配列番号１６と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｉ）配列番号１６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｊ）配列番号１６と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含むか、
    （ｋ）配列番号１６と少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含むか、または
    （ｌ）配列番号１６と少なくとも１００％同一であるヌクレオチド配列を含む、
    前記ポリヌクレオチド。
  33. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  34. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 請求項２２〜３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶプラスミド。
  36. 請求項２２〜３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３５に記載のｒＡＡＶプラスミドを含むｅｘ ｖｉｖｏ細胞。
  37. ｒＡＡＶの作製方法であって、請求項３５に記載のｒＡＡＶプラスミドと、ＡＡＶのＲｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、ＶＡ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子及びＥ４遺伝子のヌクレオチド配列を合わせて含む１つ以上のヘルパープラスミドとを、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞にトランスフェクションすることを含む前記方法。
  38. ムコ多糖症ＩＶＡ型（ＭＰＳ ＩＶＡ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象に、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは請求項２１に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
  39. ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象に、請求項１〜５及び７〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することによって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む前記方法。
  40. 前記ｈＧＡＬＮＳが、肝細胞で産生されて、前記細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される、請求項３９に記載の方法。
  41. ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象に、請求項１３〜１４及び１６〜２０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することによって、肝細胞で産生されて、前記細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む前記方法。
  42. ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含み、前記融合タンパク質が、ｒＡＡＶゲノムから産生される前記方法。
  43. ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、酸性オリゴペプチドに融合されたｈＧＡＬＮＳである融合タンパク質を治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含み、前記融合タンパク質が、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、前記細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化される前記方法。
  44. ＭＰＳ ＩＶＡと診断されたヒト対象の治療方法であって、ｒＡＡＶゲノムから産生されるとともに、肝細胞で産生されて、前記細胞から分泌されることによって、マンノース−６−リン酸で糖化されるｈＧＡＬＮＳを治療有効量、前記ヒト対象の骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達することを含む前記方法。
  45. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程が、前記骨及び／または軟骨に送達する工程である、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記骨、軟骨、靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程が、（ａ）前記骨及び／または軟骨、ならびに（ｂ）前記靭帯、半月板、成長板、肝臓、脾臓、肺、腎臓、気管、心筋及び／または心臓弁に送達する工程である、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  49. （ａ）ＡＡＶキャプシドと、
    （ｂ）ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ｈＧＡＬＮＳ）発現カセットを含む組み換えＡＡＶゲノムであって、前記ｈＧＡＬＮＳ発現カセットが、導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含み、前記導入遺伝子が、ｈＧＡＬＮＳをコードする前記組み換えＡＡＶゲノムと、
    を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
  50. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８である、請求項４９に記載のｒＡＡＶ。
  51. 前記ＡＡＶが、ＡＡＶ９である、請求項４９に記載のｒＡＡＶ。
  52. 前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項４９に記載のｒＡＡＶ。
  53. 前記ｈＧＡＬＮＳをコードするヌクレオチド配列において、ＣｐＧ部位が除去されている、請求項４９に記載のｒＡＡＶ。
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