BR112021001498A2 - vírus adeno-associado recombinante (raav), composição farmacêutica, polinucleotídeo, plasmídeo de raav, célula ex vivo, método de produção de um raav e métodos para tratar um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose tipo iva (mps iva) - Google Patents
vírus adeno-associado recombinante (raav), composição farmacêutica, polinucleotídeo, plasmídeo de raav, célula ex vivo, método de produção de um raav e métodos para tratar um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose tipo iva (mps iva) Download PDFInfo
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
VÍRUS ADENO-ASSOCIADO RECOMBINANTE (RAAV), COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, POLINUCLEOTÍDEO, PLASMÍDEO DE RAAV, CÉLULA EX VIVO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM RAAV E MÉTODOS PARA TRATAR UM SUJEITO HUMANO DIAGNOSTICADO COM MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IVA (MPS IVA).
Neste documento, são fornecidos métodos de terapia gênica para o tratamento de mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA) que envolvem o uso de vírus adeno-associados recombinantes (rAAVs) para distribuir N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase humana (hGALNS) ao osso de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA. São fornecidos também neste documento os rAAVs que podem ser usados nos métodos de terapia gênica e métodos de produção de tais rAAVs.
Description
[001] Este pedido reivindica o benefício dos Pedidos de Patente Provisórios US Nº 62/711.238, depositado em 27 de julho de 2018, 62/756.880, depositado em 07 de novembro de 2018 e 62/799.834, depositado em 01 de fevereiro de 2019, que são incorporados por referência neste documento em sua totalidade.
[002] Este aplicativo incorpora por referência uma Listagem de Sequências enviada com este pedido como um arquivo de texto intitulado “Sequence_Listing_12656-116-228.txt” criado em 22 de julho de 2019 e com um tamanho de 28.672 bytes.
1. CAMPO DA INVENÇÃO
[003] O campo refere-se ao tratamento da mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA). São fornecidos neste documento métodos e composições para o tratamento de MPS IVA envolvendo vírus adenoassociados recombinantes (rAAVs).
2. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] Mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA; Síndrome de Morquio A) é um distúrbio de armazenamento lisossomal autossômico recessivo causado pela deficiência de N- acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase (GALNS) (Khan, et al., Mol Genet Metab., 2017; 120(1-2):78-95). A deficiência da enzima resulta em um acúmulo progressivo de glicosaminoglicanos (GAGs),
6-sulfato de condroitina (C6S) e sulfato de queratana (KS), levando a uma displasia esquelética sistêmica e única com ossificação incompleta e desequilíbrio sucessivo de crescimento resultando em um curto pescoço e tronco, compressão da medula espinhal cervical, obstrução traqueal, pectus carinatum, frouxidão das articulações, cifoescoliose, coxa valga e genu valgo. Outras manifestações clínicas da doença podem incluir perda auditiva, envolvimento da válvula cardíaca e opacidade da córnea. Mais de 200 mutações diferentes foram identificadas em pacientes e a prevalência nos Estados Unidos é de aproximadamente 1 em 250.000.
[005] Pacientes com um tipo grave morrem de comprometimento das vias aéreas, complicações da medula espinhal cervical ou doença valvar cardíaca em seus 20 ou 30 anos se não tratados (Khan, et al., Mol Genet Metab., 2017; 120 (1-2): 78- 95); Tomatsu, S., et al. Mol. Genet. Metab. 2016; 117, 150-156; Montaño, A. M., et al. J. Inherit. Metab. Dis. 2007; 30, 165– 174; Tomatsu, S., et al. Res. Rep. Endocr. Disord. 2012; 2012, 65–77; Pizarro, C., et al. Ann. Thorac. Surg. 2016; 102, e329- 331). A terapia de reposição enzimática (TRE), o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) e várias intervenções cirúrgicas estão atualmente disponíveis como terapia de suporte para pacientes com MPS IVA na prática clínica. Em fevereiro de 2014, a FDA aprovou o uso de uma ERT (elosulfase-alfa) (Hendriksz, et al., J Inherit Metab Dis., 2014; 37 (6): 979– 990). ERT, o padrão de cuidados atual, resulta em melhora parcial na patologia dos tecidos moles e na atividade da vida diária (ADL) de pacientes com MPS IVA, no entanto, essas terapias fornecem impacto muito limitado no osso e na cartilagem devido ao caráter avascular dessas lesões. As limitações atuais da ERT incluem: i) são necessárias injeções semanais por 5-6 horas, ii) o medicamento é rapidamente eliminado da circulação, iii) o custo do tratamento é muito caro ($ 500.000 por ano por paciente) e v)
o medicamento mostra penetração limitada no osso (Algahim e Almassi, Ther Clin Risk Manag., 2013;9:45–53; Tomatsu et al., Curr Pharm Biotechnol., 2011;12:931–945). Para MPS IVA, a administração semanal de N-acetilgalactosamina-6-sulfatase humana recombinante (rhGALNS: Vimizim™, elosulfase alfa) atualmente não oferece impacto nas lesões ósseas e cartilaginosas de pacientes com MPS IVA. Embora o TCTH possa proporcionar um impacto melhor do que a ERT no osso, esta terapia baseada em células pode não ser aplicável a todos os pacientes por causa de doadores compatíveis limitados, o limite de idade para o tratamento eficaz, a falta de instalações bem treinadas, o risco de mortalidade do procedimento como doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD), infecção e outras complicações (Tomatsu et al., Drug Des Devel Ther., 2015; 9: 1937–1953). Neste sentido, uma nova droga para MPS IVA, em particular uma nova droga para o tratamento de displasia esquelética em pacientes com MPS IVA, é urgentemente necessário.
[006] A terapia genética tem o potencial de ser uma terapia permanente única. Muitos estudos pré-clínicos de transferência gênica usando vetores virais e não virais mostraram o potencial terapêutico dessa terapia em doenças de MPS. O vetor de vírus adenoassociado (AAV) é um veículo atraente para distribuir um gene terapêutico aos órgãos alvo, uma vez que os vetores fornecem uma expressão de longo prazo do produto transgene e um baixo risco de imunogenicidade. Devido a essas vantagens, os ensaios clínicos de terapia gênica mediada por AAV estão em andamento ou programados para MPS I, II, IIIA, IIIB e VI (ClinicalTrials.gov; Sawamoto et al., Expert Opin. Orphan Drugs, 2016; 4, 941-951). A distribuição de enzima suficiente nas lesões da cartilagem e na região da placa de crescimento tem o potencial de resolver a displasia esquelética em pacientes com MPS IVA. Nosso estudo anterior mostrou que a transferência do gene GALNS usando o vetor AAV2 forneceu o nível de enzima terapêutica nos tecidos (Alméciga-Díaz, CJ, et al. Pediatr. Res. 2018; 84, 545-551); no entanto, até agora não houve nenhum estudo demonstrando que a terapia gênica mediada por AAV corrige lesões esqueléticas do modelo de camundongo MPS IVA.
[007] Dvorak-Ewell e colegas demonstraram que 10 mg/kg de fluoróforo Alexa-488 conjugado com rhGALNS injetado por via intravenosa em camundongos do tipo selvagem cinco vezes, a cada dois dias, resultou na detecção da enzima na placa de crescimento e na cartilagem articular (Dvorak-Ewell, M., et al. PLoS One. 2010; 5, e12194). Esse achado indica que um alto nível de enzima circulante pode fornecer a penetração da enzima nas lesões da cartilagem. Os vetores AAV8 eficientes na transdução do fígado e uma eficiência 10-100 vezes maior na transferência de genes do fígado foram mostrados com o vetor AAV8 recombinante, em comparação com a geração inicial do vetor AAV2 (Gao, G. P., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2002; 99, 11854-11859). O uso de promotores específicos do fígado exibiu uma resposta imune do hospedeiro significativamente reduzida, uma vez que a terapia gênica de AAV dirigida ao fígado foi relatada como induzindo tolerância imunológica ao produto do transgene em comparação com promotores ubíquos (Mingozzi, F., et al. J. Clin. Invest. 2003; 111, 1347-1356; Ziegler, R. J., et al. Mol. Ther. 2004; 9, 231- 240; Dobrzynski, E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2006; 103, 4592-4597; Cao, O., et al. Blood 2007; 110, 1132–1140; Mingozzi, F., et al. Blood 2007; 110, 2334-2341). Essa resposta imune suprimida pode fornecer uma expressão de longo prazo do produto transgene (Wang, L., et al. Mol. Ther. 2000; 1, 154-158; Sondhi, D., et al. Gene Ther. 2005; 12, 1618-1632). O estudo anterior demonstrou que o vetor AAV8 recombinante em combinação com o promotor específico do fígado proporcionou maior impacto nas lesões esqueléticas do modelo de camundongo e felino em MPS VI (Tessitore, A., et al. Mol. Ther. 2008; 16, 30-37; Cotugno, G., et al. Mol. Ther. 2011; 19, 461-469).
[008] Pacientes com MPS IVA mostram as anormalidades esqueléticas mais graves em todos os tipos de MPS (Melbouci, M., et al. Mol. Genet. Metab. 2018; 124, 1-10), e uma estratégia de segmentação óssea poderia fornecer enzima suficiente para penetrar na região da cartilagem. Demonstramos anteriormente um direcionamento ao osso aprimorado ao anexar uma curta etiqueta de aminoácido ácido ao terminal N ou C de várias enzimas (Montaño, AM, et al Mol. Genet. Metab. 2008; 94, 178-189; Tomatsu, S ., et al. Mol. Ther. 2010; 18, 1094-1102). A hidroxiapatita (HA) é o principal componente inorgânico do osso e tem uma superfície carregada positivamente que contém íon de cálcio. A sialoproteína óssea e a osteopontina se ligam a HA e essas glicoproteínas ácidas fosforiladas têm sequências repetidas de aminoácidos ácidos carregados negativamente (Asp e Glu), que podem ser o alvo potencial para estratégia de segmentação óssea (Oldberg, A., et al. J. Biol Chem. 1988; 263, 19430-19432; Kasugai, S., et al., J. Bone Miner. Res. 2000; 15, 936–943).
[009] Devido ao seu perfil de segurança, versatilidade e capacidade de ser projetado para funções específicas, os rAAVs podem ser usados em uma ampla gama de aplicações de terapia gênica em muitas doenças (ver, por exemplo, Naso et al., BioDrugs. 2017; 31 (4): 317–334). Os ensaios clínicos usando a terapia gênica de AAV foram realizados para uma ampla gama de doenças genéticas, incluindo doenças neuromusculares, oculares e imunológicas (ver, por exemplo, Kumar et al., Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2016, 3: 16034).
[010] A citação de uma referência neste documento não deve ser interpretada como uma admissão de que tal é do estado da técnica em comparação com a presente divulgação.
3. SUMÁRIO
[011] Neste documento, são fornecidos métodos de terapia gênica para o tratamento de mucopolissacaridose tipo IVA (MPS
IVA) que envolvem o uso de vírus adenoassociados recombinantes (rAAVs) para distribuir N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase humana (hGALNS) ao osso de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA. Também são fornecidos neste documento os rAAVs que podem ser usados nos métodos de terapia gênica, métodos de produção de tais rAAVs, bem como polinucleotídeos, plasmídeos e células que podem ser usados para a produção de tais rAAVs.
[012] Em um aspecto, é fornecido neste documento um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) compreendendo: (a) um capsídeo de AAV (por exemplo, capsídeo de AAV8); e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de N- acetilgalactosamina-6-sulfatase (hGALNS) humana flanqueado por repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) (por exemplo, AAV8-ITRs), o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um transgene, como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido (por exemplo, D8). Em uma modalidade específica, o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. Em uma outra modalidade específica, o promotor específico do fígado é um promotor da globulina de ligação à tiroxina (TBG).
[013] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um rAAV compreendendo: (a) um capsídeo de AAV (por exemplo, capsídeo de AAV8); e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs (por exemplo, AAV8-ITRs), o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS. Em uma modalidade específica, o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
[014] Em outro aspecto, é fornecida neste documento uma composição farmacêutica que compreende um rAAV fornecido neste documento e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[015] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs (por exemplo, AAV8-ITRs), o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, tal como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundido a um oligopeptídeo ácido (por exemplo, D8). Em uma modalidade específica, o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. Em outra modalidade específica, o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
[016] Em outro aspecto, é proporcionado neste documento um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs (por exemplo, AAV8-ITRs), o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS. Em uma modalidade específica, o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
[017] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um plasmídeo rAAV compreendendo um polinucleotídeo fornecido neste documento.
[018] Em outro aspecto, é fornecida neste documento uma célula ex vivo compreendendo um polinucleotídeo fornecido neste documento ou um plasmídeo rAAV fornecido neste documento.
[019] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método de produção de um rAAV compreendendo a transfecção de uma célula ex vivo com um plasmídeo rAAV fornecido neste documento e um ou mais plasmídeos auxiliares compreendendo coletivamente as sequências de nucleotídeos dos genes de AAV Rep, Cap, VA, E2a e E4.
[020] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para tratar um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), que compreende a administração ao sujeito humano de um rAAV neste documento ou uma composição farmacêutica fornecida neste documento.
[021] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um transgene, tal como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundido a um oligopeptídeo ácido (por exemplo, D8), por administração ao sujeito humano de um rAAV fornecido neste documento. Em uma modalidade específica, o hGALNS é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado de uma célula do fígado.
[022] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão,
rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado, por administração ao sujeito humano de um rAAV fornecido neste documento.
[023] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido (por exemplo, D8), em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV (por exemplo, um genoma de AAV8 recombinante (ou seja, um genoma recombinante compreendendo a estrutura principal de um genoma AAV8)).
[024] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um transgene que codifica um transgene, tal como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido (por exemplo, D8), em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV (por exemplo, um genoma AAV8 recombinante (ou seja, um genoma recombinante compreendendo a estrutura principal de um genoma AAV8)) e é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido em e secretado de uma célula do fígado.
[025] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem,
ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é produzida a partir de um genoma de rAAV (por exemplo, um genoma de AAV8 recombinante (isto é, um genoma recombinante compreendendo a espinha dorsal de um genoma de AAV8)) e é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado por uma célula do fígado.
[026] Em certos aspectos e modalidades do método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou coração válvula do referido sujeito humano, a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma etapa de distribuição ao osso e/ou cartilagem.
[027] Em certos aspectos e modalidades do método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou coração válvula do referido sujeito humano, a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma distribuição de distribuição a (a) o osso e/ou cartilagem e (b) ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca.
3.1 Modalidades Ilustrativas (I)
1. Um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e
(b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase (hGALNS) flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido.
2. O rAAV do parágrafo 1, em que o oligopeptídeo ácido é D8.
3. O rAAV do parágrafo 1 ou 2, em que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
4. O rAAV do parágrafo 3, em que o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
5. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-4, em que o AAV é AAV8.
6. Um rAAV que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS.
7. O rAAV do parágrafo 6, em que o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
8. O rAAV do parágrafo 6 ou 7, em que o AAV é AAV8.
9. Uma composição farmacêutica que compreende o rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-8 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
10. Um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido.
11. O polinucleotídeo do parágrafo 10, em que o oligopeptídeo ácido é D8.
12. O polinucleotídeo do parágrafo 10 ou 11, em que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
13. O polinucleotídeo do parágrafo 12, em que o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
14. Um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS.
15. O polinucleotídeo do parágrafo 14, em que o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
16. O polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 10-15, em que o AAV é AAV8.
17. Um plasmídeo rAAV compreendendo o polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 10-16.
18. Uma célula ex vivo compreendendo o polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 10-16 ou o plasmídeo rAAV do parágrafo
17.
19. Um método de preparação de um rAAV, que compreende a transfecção de uma célula ex vivo com o plasmídeo rAAV do parágrafo 17 e um ou mais plasmídeos auxiliares, compreendendo coletivamente as sequências de nucleotídeos dos genes Rep, Cap, VA, E2a e E4 de AAV.
20. Um método para tratar um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), que compreende a administração ao sujeito humano do rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-8 ou da composição farmacêutica do parágrafo 9.
21. Um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, pela administração ao sujeito humano de um rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-5.
22. O método do parágrafo 21, em que o referido hGALNS é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado de uma célula do fígado.
23. Um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado, por administração ao sujeito humano de um rAAV de qualquer um dos parágrafos 6-8.
24. Um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV.
25. Um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado.
26. Um método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula hepática.
27. O método de qualquer um dos parágrafos 24-26, em que AAV é AAV8.
28. O método de qualquer um dos parágrafos 21-27, em que a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma etapa de distribuição ao osso e/ou cartilagem.
29. O método de qualquer um dos parágrafos 21-27, em que a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma etapa de distribuição a (a) o osso e/ou cartilagem e (b) ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca.
3.2 Modalidades Ilustrativas (II)
1. Um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase (hGALNS) flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, em que o referido transgene codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido.
2. O rAAV do parágrafo 1, em que o oligopeptídeo ácido é D8.
3. O rAAV do parágrafo 1 ou 2, em que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
4. O rAAV do parágrafo 3, em que o promotor específico do fígado: (a) é um promotor TBG; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou
(h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (m) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (n) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (o) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (p) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (q) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (r) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (s) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 15.
5. O rAAV do parágrafo 1 ou 2, em que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor, cuja sequência de nucleotídeos que codifica o promotor está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
6. O rAAV do parágrafo 5, em que o promotor é um promotor CAG.
7. O rAAV do parágrafo 5, em que o promotor é um promotor específico do fígado e músculo.
8. O rAAV do parágrafo 7, em que o promotor específico do fígado e músculo: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 16.
9. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-10, em que o AAV é AAV8.
10. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-10, em que o AAV é AAV9.
11. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-10, em que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão é otimizada por códons.
12. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-13, em que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão tem sítios CpG depletados.
13. Um rAAV que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS.
14. O rAAV do parágrafo 13Erro! Fonte de referência não encontrada., em que o promotor específico do fígado: (a) é um promotor TBG; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (m) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (n) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou
(o) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (p) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (q) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (r) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (s) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 15.
15. Um rAAV que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS e em que o promotor é um promotor CAG.
16. Um rAAV que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e do músculo e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS e em que o promotor específico do fígado e do músculo: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou
(b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 16.
17. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 13-18, em que o AAV é AAV8.
18. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 13-18, em que o AAV é AAV9.
19. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 13-18, em que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão é otimizada por códons.
20. O rAAV de qualquer um dos parágrafos 13-19, em que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão tem sítios CpG depletados.
21. Uma composição farmacêutica que compreende o rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-20 e um carreador farmaceuticamente aceitável.
22. Um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, em que o referido transgene codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido.
23. O polinucleotídeo do parágrafo 22, em que o oligopeptídeo ácido é D8.
24. O polinucleotídeo do parágrafo 22 ou 23, em que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
25. O polinucleotídeo do parágrafo 24, em que o promotor específico do fígado: (a) é um promotor TBG; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (m) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou
(n) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (o) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (p) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (q) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (r) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (s) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 15.
26. O polinucleotídeo do parágrafo 22 ou 23, em que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e do músculo, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado e do músculo está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
27. O polinucleotídeo do parágrafo 26, em que o promotor específico do fígado e músculo: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 16.
28. O polinucleotídeo do parágrafo 22 ou 23, em que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
29. O polinucleotídeo do parágrafo 28, em que o promotor é um promotor CAG.
30. Um polinucleotídeo que compreende um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que o promotor específico do fígado: (a) é um promotor TBG; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou
(j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (m) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (n) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (o) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (p) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (q) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (r) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (s) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 15.
31. Um polinucleotídeo que compreende um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que o promotor é um promotor CAG.
32. Um polinucleotídeo que compreende um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e do músculo e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado e do músculo é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que o promotor específico do fígado e do músculo: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 16.
33. O polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 22-32, em que o AAV é AAV8.
34. O polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 22-32, em que o AAV é AAV9.
35. Um plasmídeo rAAV compreendendo o polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 22-34.
36. Uma célula ex vivo compreendendo o polinucleotídeo de qualquer um dos parágrafos 22-34, ou plasmídeo rAAV do parágrafo
35.
37. Um método de preparação de um rAAV, que compreende a transfecção de uma célula ex vivo com o plasmídeo rAAV do parágrafo 35 e um ou mais plasmídeos auxiliares, compreendendo coletivamente as sequências de nucleotídeos dos genes Rep, Cap, VA, E2a e E4 de AAV.
38. Um método para tratar um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), que compreende a administração ao sujeito humano do rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-20 ou da composição farmacêutica do parágrafo 21.
39. Um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, pela administração ao sujeito humano de um rAAV de qualquer um dos parágrafos 1-5 e 7-12.
40. O método do parágrafo 39, em que o referido hGALNS é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado de uma célula do fígado.
41. Um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é glicosilada com manose- 6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado, por administração ao sujeito humano de um rAAV de qualquer um dos parágrafos 13-14 e 16-20.
42. Um método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV.
43. Um método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão,
rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado.
44. Um método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula hepática.
45. O método de qualquer um dos parágrafos 42-44, em que AAV é AAV8.
46. O método de qualquer um dos parágrafos 42-44, em que AAV é AAV9.
47. O método de qualquer um dos parágrafos 39-46, em que a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma etapa de distribuição ao osso e/ou cartilagem.
48. O método de qualquer um dos parágrafos 39-46, em que a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma etapa de distribuição para (a) ao osso e/ou cartilagem e (b) ao ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca.
49. Um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e
(b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase (hGALNS) flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, em que o referido transgene codifica hGALNS.
50. O rAAV do parágrafo 49, em que o AAV é AAV8.
51. O rAAV do parágrafo 49, em que o AAV é AAV9.
52. O rAAV do parágrafo 49, em que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS é otimizada por códons.
53. O rAAV do parágrafo 49, em que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS tem sítios CpG depletados.
4. ABREVIAÇÕES MPS IVA mucopolissacaridose tipo IVA GALNS N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase hGALNS N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase humana GAG glicosaminoglicano C6S 6-sulfato de condroitina KS sulfato de queratana ERT terapia de reposição enzimática TCTH transplante de células-tronco hematopoiéticas AAV vírus adenoassociado TBG globulina de ligação de tiroxina ITR repetições terminais invertidas D8 octapeptídeo de ácido aspártico ECM matriz extracelular ELISA ensaio de imunoabsorção enzimática HS sulfato de heparana IS padrão interno LC-MS/MS cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa OD densidade óptica PBS solução salina tamponada por fosfato RBG pA beta-globina de coelho poli A KO knockout
5. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[028] O precedente e outros objetos, características e vantagens serão evidentes a partir da seguinte descrição de modalidades particulares da invenção, conforme ilustrado nos desenhos anexos. As figuras não estão necessariamente em escala, em vez disso, a ênfase é colocada na ilustração dos princípios de várias modalidades da invenção.
[029] FIG. 1. Esquemas de genomas de rAAV.
[030] FIGS. 2A-2D. (A) A atividade enzimática intracelular foi determinada em células HuH-7 após a transfecção com o plasmídeo TBG-hGALNS, plasmídeo TBG-hGALNS-CoOpt, plasmídeo TBG-D8-hGALNS ou plasmídeo TBG-D8-hGALNS-CoOpt (n = 2). (B) Descrição de execuções individuais da atividade enzimática intracelular determinada em células HuH-7. (C) A atividade enzimática no meio foi determinada após as células HuH-7 serem transfectadas com o plasmídeo TBG-hGALNS, plasmídeo TBG-hGALNS-CoOpt, plasmídeo TBG-D8-hGALNS ou plasmídeo TBG-D8- hGALNS-CoOpt (n = 2). (D) Representação de execuções individuais da atividade enzimática em meio determinado em células HuH-7.
[031] FIG. 3. A atividade enzimática intracelular foi determinada em células HepG2 após a transfecção com o plasmídeo TBG-hGALNS, plasmídeo TBG-hGALNS-CoOpt, plasmídeo TBG-D8-hGALNS ou plasmídeo TBG-D8-hGALNS-CoOpt.
[032] FIG. 4. Cronograma do in vivo em que AAV8-TBG- hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS foram administrados a camundongos MPS IVA KO de 4 semanas de idade (galns -/-) e camundongos imunotolerantes (Galnstm(hC79S. mC76S)slu, Mtol). O cronograma do ensaio enzimático e do ensaio KS no sangue é mostrado. Ao descrever a dosagem, cópias de vetores por quilograma (vc/kg) e cópias de genes por quilograma (GC/kg) são usadas alternadamente.
[033] FIGS. 5A-5B . Atividade da enzima hGALNS ao longo do tempo medida em (A) glóbulos brancos (WBCs) e (B) plasma de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) após a administração com AAV8- TBG-hGALNS r ou AAV-TBG-D8-hGALNS.
[034] FIG. 6. Atividade da enzima hGALNS ao longo do tempo medida no plasma de camundongos Mtol após administração com AAV8- TBG-hGALNS (n = 4) ou AAV8-TBG-D8-hGALNS (n = 4).
[035] FIGS. 7A-7D. Atividade da enzima hGALNS medida em (A) o fígado de camundongos MPS IVA KO (galns -/-), (B) o fígado de camundongos Mtol, (C) o coração de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e o coração de camundongos Mtol e (D) o osso de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e o osso de camundongos Mtol.
[036] FIG. 8. Níveis monossulfatados de KS no plasma de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS.
[037] FIGS. 9A-9B. (A) Níveis monossulfatados de KS no plasma de camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8- TBG-D8-hGALNS ao longo do tempo em comparação com camundongos Mtol e WT não tratados. (B) Os níveis de KS monossulfatado no plasma de camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8- TBG-D8-hGALNS foram significativamente menores em comparação com os níveis de camundongos Mtol não tratados com 16 semanas de idade (n = 4-5 ; média ± DP; *p <0,05 vs. WT; #p < 0,05 vs. Não tratado; ANOVA unilateral).
[038] FIG. 10. Os níveis de diHS-0S no sangue medidos ao longo do tempo em camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS, tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS, não tratados ou camundongos WT.
[039] FIGS. 11A-11P. (A) Representação gráfica de pontuações de patologia óssea. A patologia óssea foi avaliada por análise histopatológica 12 semanas após a administração dos vetores AAV8-hGALNS ou AAV8-D8-hGALNS em camundongos MPS IVA KO (galns -/-). Histopatologia de (B) articulações do joelho (ligamento; M-menisco; F-fêmur; T-tíbia), (C-F) cartilagem articular do fêmur (aumento de 40x), (G-J) placa de crescimento do fêmur (aumento de 40x), (K) menisco (ampliação de 40x), (L) ligamento (lado da tíbia, ampliação de 40x), (M, N) base da válvula cardíaca (ampliação de 40x) e (O, P) válvula cardíaca (ampliação de 40x).
[040] FIGS. 12A-12C. (A) níveis de atividade da enzima hGALNS medidos no fígado de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, respectivamente, após a administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos Mtol não tratados e camundongos do tipo selvagem (n = 3-8; média ± DP). (B) níveis de atividade da enzima hGALNS medidos no baço de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e no baço de camundongos Mtol, respectivamente, após administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação para camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos Mtol não tratados e camundongos de tipo selvagem (n = 3-8; média ± DP). (C) níveis de atividade da enzima hGALNS medidos no pulmão de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e no pulmão de camundongos Mtol, respectivamente, após administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8- TBG-D8-hGALNS, em comparação para camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos Mtol não tratados e camundongos de tipo selvagem (n = 3-8; média ± DP).
[041] FIGS. 13A-13B. (A) níveis de atividade da enzima hGALNS medidos no osso de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e no osso de camundongos Mtol, respectivamente, após administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação para camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos Mtol não tratados e camundongos de tipo selvagem (n = 3-8; média
± DP). (B) níveis de atividade da enzima hGALNS medidos no coração de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e no coração de camundongos Mtol, respectivamente, após a administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação para camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos Mtol não tratados e camundongos de tipo selvagem (n = 3-8; média ± DP).
[042] FIG. 14. Níveis monossulfatados de KS no plasma de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-D8- hGALNS em comparação com camundongos MPS IVA KO não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados (n = 4-8; média ± SD).
[043] FIGS. 15A-15B. (A) Níveis monossulfatados de KS no plasma de camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8- TBG-D8-hGALNS ao longo do tempo em comparação com camundongos Mtol e WT não tratados. (B) Os níveis de KS monossulfatado no plasma de camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8- TBG-D8-hGALNS foram significativamente menores em comparação com os níveis de camundongos Mtol não tratados com 16 semanas de idade (n = 4-5 ; média ± DP; * p <0,05 vs. WT; #p < 0,05 vs. Não tratado; ANOVA unilateral).
[044] FIGS. 16A-16C. (A) Níveis monossulfatados de KS no fígado de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8- TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS em comparação com camundongos MPS IVA KO não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados . (B) Níveis monossulfatados de KS no pulmão de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS em comparação com camundongos MPS IVA KO não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados . (C) Níveis monossulfatados de KS no fígado de camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS em comparação com camundongos Mtol não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados. Para (A) - (C), n = 3-8; média ± DP; *p <0,05 vs. WT; #p < 0,05 vs. Não tratado; ANOVA unilateral.
[045] FIGS. 17A-17E. Histopatologia da placa de crescimento do fêmur (ampliação de 40x) em (A) camundongos do tipo selvagem (todos os condrócitos não estavam vacuolados e a estrutura da coluna estava bem organizada), (B) camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-) (todos os condrócitos estavam vacuolados e a estrutura da coluna estava amplamente desorganizada e distorcida), (C) camundongos Mtol não tratados (todos os condrócitos estavam vacuolados e a estrutura da coluna estava amplamente desorganizada e distorcida), (D) camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS (os condrócitos estavam moderadamente vacuolados, mas a estrutura da coluna foi melhor), e (E) camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS (os condrócitos estavam moderadamente vacuolados, mas a estrutura da coluna foi parcialmente recuperada).
[046] FIGS. 18A-18D. (A) Tamanho da célula de condrócitos medido na placa de crescimento do fêmur de camundongos do tipo selvagem não tratados, camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8-TBG-hGALNS (galns -/-) ou camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8- TBG-D8-hGALNS (galns -/-). (B) Tamanho da célula de condrócitos medido na placa de crescimento do fêmur de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos Mtol não tratados, camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS. (C) Tamanho da célula de condrócitos medido na placa de crescimento da tíbia de camundongos do tipo selvagem não tratados, camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8-TBG-hGALNS (galns -/-) ou camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS (galns -/-). (D) Tamanho da célula de condrócitos medido na placa de crescimento da tíbia de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos Mtol não tratados, camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos Mtol tratados com
AAV8-TBG-D8-hGALNS. Para (A) - (D), n = 4-6; média ± DP; *p <0,05 vs. WT; #p <0,05 vs. não tratado; ANOVA unilateral.
[047] FIG. 19. Histopatologia da válvula cardíaca (ampliação de 40x) em camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8- hGALNS, em comparação com camundongos não tratados.
[048] FIG. 20. Histopatologia do músculo cardíaco (ampliação de 40x) em camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG- hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos Mtol não tratados.
[049] FIGS. 21A-21D. (A) Pontuação de patologia do tecido da válvula cardíaca de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos MPS IVA KO (galns -/-), camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou MPS IVA KO (galns -/-) camundongos tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS. (B) Pontuação da patologia do tecido da válvula cardíaca de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos Mtol não tratados, camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS. (C) Pontuação de patologia do tecido muscular cardíaco de camundongos do tipo selvagem não tratados, camundongos MPS IVA KO (galns -/-), camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou MPS IVA KO (galns -/-) camundongos tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS. (D) Pontuação de patologia do tecido do músculo cardíaco para camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos Mtol não tratados, camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS. (Para FIGS. 21A-21D, n = 4-6; média ± DP; *p <0,05 vs. WT; #p <0,05 vs. Não tratado; ANOVA unilateral).
[050] FIG. 22. Atividade da enzima hGALNS ao longo do tempo medida no plasma de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) após administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV-TBG-D8-hGALNS (n = 4-7; média + SD).
[051] FIG. 23. Atividade da enzima hGALNS ao longo do tempo medida no plasma de camundongos Mtol após administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS (n = 4-5; média + DP).
[052] FIGS. 24A-24K. Atividade da enzima N- acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase (hGALNS) humana em sangue e tecido em camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. (A) Estrutura esquemática do genoma do vetor viral AAV8-TBG- hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS. Uma amostra de sangue foi coletada de camundongos MPS IVA a cada duas semanas até 16 semanas de idade e a atividade da enzima hGALNS do plasma foi medida em camundongos (B) knock-out (KO) e (C) tolerantes (MTOL). n = 4-
7. A amostra de tecido foi coletada de camundongos MPS IVA 12 semanas após a injeção de vetores AAV com ou sem sinal de direcionamento ao osso. A atividade da enzima hGALNS em tecidos incluindo (D) fígado, (E) baço, (F) pulmão, (G) rim, (H) coração e (I) osso (perna) foi medida em camundongos KO e MTOL (n = 3- 8; as estatísticas foram analisadas por ANOVA de um fator com o teste post-hoc de Bonferroni e os dados são apresentados como média ± DP. *p <0,05). Os níveis de atividade de hGALNS no fígado, baço, pulmão, rim, coração e ligação em camundongos MPS IVA KO 12 semanas após a distribuição IV de vetores AAV são mostrados em (J). Os níveis de atividade de hGALNS no fígado, baço, pulmão, rim, coração e ligação em camundongos MTOL 12 semanas após a distribuição IV de vetores AAV são mostrados em (K).
[053] FIGS. 25A-25D. Nível de glicosaminoglicano no sangue e tecido (GAG) em camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. Uma amostra de sangue foi coletada de camundongos MPS IVA a cada duas semanas até 16 semanas de idade, e o nível de KS monossulfatado no plasma foi medido em (A) camundongos knock- out (KO) e (B) tolerantes (MTOL). n = 4-8. A amostra de tecido foi coletada de camundongos MPS IVA 12 semanas após a injeção de vetores AAV com ou sem sinal de direcionamento ao osso. A quantidade de KS em tecidos incluindo (C) fígado e (D) pulmão foi medida em camundongos KO e MTOL. n = 4-8. As estatísticas foram analisadas por ANOVA de um fator com o teste post-hoc de Bonferroni. Os dados são apresentados como média ± DP. *p <0,05.
[054] FIGS. 26A-26C. Correção da patologia óssea em camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. A correção da vacuolização dos condrócitos foi avaliada por análise de coloração com azul de toluidina usando microscopia de luz de (A) placa de crescimento e (B) disco articular na articulação do joelho de camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. A patologia óssea em camundongos knock-out (KO) e tolerantes (MTOL) foram comparados com MPS IVA não tratada de tipo selvagem e MPS IVA tratada com vetores AAV8 com ou sem sinal de direcionamento ao osso. Barras de escala = 25 μm. (C) O tamanho das células de condrócitos em lesões da placa de crescimento do fêmur ou tíbia foi quantificado pelo software Image J. Os dados expressaram alteração dobrada do grupo de tipo selvagem. n = 4-
7. As estatísticas foram analisadas por ANOVA de um fator com o teste post-hoc de Bonferroni. Os dados são apresentados como média ± DP. *p <0,05.
[055] FIGS. 27A-27C. Correção de patologia cardíaca em camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. A correção da vacuolização foi avaliada por análise de coloração com azul de toluidina usando microscopia de luz de (A) válvula cardíaca e (B) músculo cardíaco de camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. Patologia cardíaca em camundongos knock-out (KO) e tolerantes (MTOL) foram comparados com MPS IVA não tratada de tipo selvagem e MPS IVA tratada com vetores AAV8 com ou sem sinal de direcionamento ao osso. As setas indicam a localização dos vacúolos relacionados à doença. Barras de escala = 25 μm.
[056] FIGS. 28. Circulação de títulos de anticorpos anti- hGALNS em camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. O plasma foi coletado de camundongos MPS IVA 12 semanas após a injeção de vetores AAV8 com ou sem sinal de direcionamento ao osso. Títulos de anticorpos circulantes anti-hGALNS foram detectados por ensaio ELISA indireto. Os valores de DO 405 foram medidos em um espectrofotômetro de microplaca. n = 4-8. As estatísticas foram analisadas por ANOVA de um fator com o teste post-hoc de Bonferroni. Os dados são apresentados como média ± DP. *p <0,05.
[057] FIGS. 29A-29B. Avaliação de hGALNS otimizado com ou sem sinal de direcionamento ao osso. As células Huh-7 foram transfectadas com o plasmídeo do vetor AAV8 que expressa hGALNS ou hGALNS otimizado por códon com ou sem sinal de direcionamento ao osso, respectivamente. Após 48 horas de transfecção, o sedimento celular e o meio foram coletados e a atividade de hGALNS foi medida. (A) A atividade enzimática intracelular foi determinada em células HuH-7 após a transfecção com o plasmídeo TBG-hGALNS, plasmídeo TBG-hGALNS-CoOpt, plasmídeo TBG-D8-hGALNS ou plasmídeo TBG-D8-hGALNS-CoOpt. (B) A atividade enzimática no meio foi determinada após as células HuH-7 serem transfectadas com o plasmídeo TBG-hGALNS, plasmídeo TBG-hGALNS-CoOpt, plasmídeo TBG-D8-hGALNS ou plasmídeo TBG-D8-hGALNS-CoOpt. Os dados são apresentados como média. n = 2.
[058] FIG. 30. Nível de sulfato de heparano (HS) no sangue em camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. Uma amostra de sangue foi coletada de camundongos MPS IVA e o nível de plasma diHS-0S foi medido em camundongos knock-out (KO) e tolerantes (MTOL) com 16 semanas de idade. Os dados são apresentados como média ± DP. AAV: vírus adenoassociado, TBG: globulina de ligação à tiroxina, hGALNS: N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase.
[059] FIG. 31. Nível de sulfato de heparina (HS) nos tecidos em camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. A amostra de tecido foi coletada de camundongos MPS IVA 12 semanas após a injeção de vetores AAV com ou sem sinal de direcionamento ao osso. A quantidade de diHS-0S em tecidos incluindo fígado,
baço, pulmão e rim foi medida em camundongos KO e MTOL. Os dados são apresentados como média ± DP.
[060] FIGS. 32A-32B. Correção da patologia óssea em camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. A correção da vacuolização dos condrócitos foi avaliada por análise de coloração com azul de toluidina usando microscopia de luz de (A) ligamento e (B) menisco na articulação do joelho de camundongos MPS IVA tratados com vetores AAV8. Patologia óssea em knock-out (KO) e camundongos tolerantes (MTOL) foram comparados com MPS IVA não tratada de tipo selvagem e MPS IVA tratada com vetores AAV8 com ou sem sinal de direcionamento ao osso. As setas indicam a localização dos vacúolos relacionados à doença (barras de escala = 25 μm).
[061] FIG. 33. Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MPSIVA KO administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS ou AAV8-CAG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[062] FIG. 34. Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MPSIVA KO administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[063] FIG. 35. Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MPSIVA KO administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[064] FIG. 36. Atividades da enzima hGALNS no fígado de camundongos MPSIVA KO administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS ou AAV8-CAG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[065] FIG. 37. Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MTOL administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[066] FIG. 38. Atividades da enzima hGALNS em camundongos MTOL do fígado administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[067] FIG. 39. Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MPSIVA KO administrados com 2 x 1014 GC/kg de peso corporal de AAV8-TBG-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[068] FIG. 40. Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MPSIVA KO administrados com 2 x 1014 GC/kg de peso corporal de AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[069] FIG. 41. Atividades da enzima hGALNS no fígado de camundongos MPSIVA KO administrados com 2 x 1014 GC/kg de peso corporal de AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
6. DESCRIÇÃO DETALHADA
[070] A presente invenção é pelo menos parcialmente baseada em uma descoberta surpreendente de que a administração de vírus adenoassociados recombinantes (rAAVs) compreendendo certos cassetes de expressão de hGALNS em modelos animais de mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA) manteve altos níveis de atividade enzimática de hGALNS ao longo do período de monitoramento e resultou em melhora em tecidos, incluindo osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e válvula cardíaca, exibindo uma melhora em relação ao que foi alcançado pela terapia de reposição enzimática (ERT).
[071] São descritos neste documento rAAVs para uso no tratamento de MPS IVA em um sujeito humano com necessidade de tratamento. Estes rAAVs compreendem um genoma de AAV recombinante que codifica hGALNS. O rAAV pode ser administrado a um paciente com MPS IVA resultando na síntese de hGALNS e na distribuição de hGALNS aos tecidos afetados, como osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, coração músculo e/ou válvula cardíaca, melhorando assim a patologia e prevenindo a progressão da doença.
[072] É fornecido um vírus adenoassociado recombinante (rAAV) compreendendo um capsídeo de AAV e um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por repetições terminais invertidas de AAV (ITRs). Em certas modalidades, o capsídeo do rAAV é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% idêntico ao capsídeo do sorotipo AAV8. Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos do capsídeo do rAAV é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% idêntica à SEQ ID: NO. 1. Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos do capsídeo do rAAV é 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-99% ou 99-99,9% idêntica à SEQ ID: NO. 1. Para obter mais detalhes sobre os capsídeos do rAAV, consulte a Seção 6.1.1. Em algumas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido. Em certas modalidades, o oligopeptídeo ácido é D8. Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado (por exemplo, um promotor globulina de ligação de tiroxina (TBG)). Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio poli A. Em outras modalidades, o cassete de expressão de hGALNS compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado (por exemplo, um promotor TBG) e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS. Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio poli A.
[073] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo um cassete de expressão de hGALNS conforme descrito neste documento. Além disso, são fornecidos plasmídeos e células (por exemplo, células hospedeiras ex vivo) compreendendo um polinucleotídeo fornecido neste documento para fazer os rAAVs para uso com os métodos e composições fornecidos neste documento.
[074] Além disso, são fornecidos neste documento métodos para fazer um rAAV descritos neste documento.
[075] Também são fornecidos neste documento métodos para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA). Em um aspecto, o método compreende a administração de um rAAV descrito neste documento ao sujeito humano. Em outro aspecto, o método compreende a distribuição de hGALNS glicosilado (por exemplo, hGALNS que é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado de uma célula do fígado) para o(s) tecido(s) afetado(s). Em outro aspecto, o método compreende a distribuição de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido ao(s) tecido(s) afetado(s). A proteína de fusão pode ser glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado.
[076] São fornecidos ainda neste documento composições farmacêuticas e kits compreendendo um rAAV descrito neste documento.
[077] Os rAAVs fornecidos neste documento são descritos na Seção 6.1, que inclui uma descrição dos capsídeos do rAAV na Seção 6.1.1 e uma descrição do cassete de expressão de hGALNS na Seção 6.1.2. Os métodos de produção de um rAAV fornecidos neste documento, bem como polinucleotídeos, plasmídeos e células que podem ser usados em tais métodos, são descritos na Seção 6.2. Métodos para tratar um sujeito humano com diagnóstico de MPS IVA, incluindo populações de pacientes alvo, vias de administração e regimes de dosagem são descritos na Seção 6.3. As terapias de combinação são descritas na Seção 6.4. Marcadores de doenças e métodos para avaliar os resultados clínicos são descritos na Seção 6.5. Exemplos ilustrativos não limitativos são fornecidos na Seção 7.
[078] Sem limitar-se pela teoria, a fabricação, composição e método de uso dos rAAVs podem ser modificados de modo que ainda resultem na distribuição da enzima hGALNS ao osso, cartilagem, ligamento, menisco e/ou válvula cardíaca de um sujeito humano como um tratamento para MPS IVA.
6.1 VÍRUS RECOMBINANTES ADENOASSOCIADOS (rAAVs)
[079] São fornecidos neste documento rAAVs úteis para o tratamento de MPS IVA em um sujeito humano em necessidade, cujos rAAVs compreendem um capsídeo de AAV e um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS.
[080] Em um aspecto, é fornecido neste documento um rAAV compreendendo: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, tal como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundido a um oligopeptídeo ácido. O cassete de expressão de hGALNS pode compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
[081] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um rAAV compreendendo: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS.
[082] De preferência, o cassete de expressão de hGALNS compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, de modo que a proteína hGALNS seja expressa no fígado, cuja proteína hGALNS, uma vez secretada pelas células do fígado, é translocada para outros tecidos, incluindo, mas não se limitando a, os órgãos gravemente afetados, como o osso, cartilagem e tecido associado e válvula cardíaca.
[083] Os diferentes componentes dos rAAVs fornecidos neste documento são descritos em detalhes abaixo.
6.1.1 Capsídeo
[084] O capsídeo é a casca da proteína de um vírus que empacota e protege o genoma viral enquanto interage com o ambiente do hospedeiro. De acordo com a invenção, um rAAV fornecido neste documento compreende um capsídeo de AAV. Em uma modalidade específica, um capsídeo de AAV é o capsídeo de um AAV encontrado naturalmente (por exemplo, o capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAV11). Em outra modalidade específica, um capsídeo de AAV é derivado do capsídeo de um AAV encontrado naturalmente (por exemplo, o capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAV11), para exemplo, por ter uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,9%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do capsídeo do AAV encontrado naturalmente.
[085] Em certas modalidades, os capsídeos variantes de AAV que podem ser usados de acordo com a invenção descrita neste documento incluem Anc80 ou Anc80L65, conforme descrito em Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12 (6): 1056-1068, que é incorporado por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, os capsídeos variantes de AAV que podem ser usados de acordo com a invenção descrita neste documento compreendem uma das seguintes inserções de aminoácidos: LGETTRP ou LALGETTRP, conforme descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nºs 9.193.956;
9.458.517; e 9.587.282 e a publicação do Pedido de Patente US Nº 2016/0376323, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, os capsídeos variantes de AAV que podem ser usados de acordo com a invenção descrita neste documento incluem AAV. 7m8, conforme descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nºs 9.193.956;
9.458.517; e 9.587.282 e a publicação do pedido de patente US Nº 2016/0376323, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, os capsídeos variantes de AAV que podem ser usados de acordo com a invenção descrita neste documento incluem qualquer AAV divulgado na Patente dos Estados Unidos Nº 9.585.971, tal como AAV-PHP.B. Em certas modalidades, os capsídeos variantes de AAV que podem ser usados de acordo com a invenção incluem, sem limitação, aqueles divulgados em qualquer uma das seguintes patentes e pedidos de patente, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade: Patente dos Estados Unidos Nºs 7.282.199; 7.906.111; 8.524.446; 8.906.675;
8.999.678; 8.628.966; 8.927.514; 8.734.809; US 9.284.357;
9.409.953; 9.169.299; 9.193.956; 9458517; 9.587.282; 9.737.618;
9.840.719; Nºs 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; e Pedidos de Patente Internacional Nºs PCT/US2002/033630; PCT/US2004/028817;
PCT/2002/033629; PCT/US2006/013375; PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335; PCT/US2016/042472; PCT/US2017/027392.
[086] Em certas modalidades, um AAV de fita simples (ssAAV) pode ser usado supra. Em certas modalidades, um vetor autocomplementar, por exemplo, scAAV, pode ser usado (ver, por exemplo, Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18 (2): 171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254; e Patentes US Nºs 6.596.535; 7.125.717; e 7.456.683, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade).
[087] Em modalidades preferidas, o capsídeo de AAV contido no rAAV é o capsídeo de AAV8 ou derivado do capsídeo de AAV8. AAV8 tem maior eficiência de transdução hepática do que outros sorotipos e baixa reatividade a anticorpos contra AAVs humanos. É importante ressaltar que regiões específicas do capsídeo de AAV8 contribuem para a alta transdução do fígado mediando a entrada nuclear e o desencapsulamento do capsídeo (Tenney et al., Virology, 2014, 454–455: 227-236; Nam et al., J Virol., 2007 81 (22): 12260–12271). Como resultado, AAV8 tem um tropismo para hepatócitos (Sands, M., Methods Mol Biol., 2011;807: 141–157). Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV contida no rAAV é idêntica à sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 1). Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV contida no rAAV é de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,9% idêntica à sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 1), embora retenha a capacidade do capsídeo de AAV8 de empacotar um genoma viral e, de preferência, também a capacidade do capsídeo de AAV8 para transduzir células do fígado com alta eficiência. Em certas modalidades, a sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV contida no rAAV é idêntica à sequência de aminoácidos do capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 1), exceto para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 resíduos de aminoácidos, enquanto retém a capacidade do capsídeo de AAV8 para empacotar um genoma viral e, de preferência, também a capacidade do capsídeo de AAV8 para transduzir células do fígado com uma alta eficiência. Em uma modalidade preferencial do método de tratamento descrito neste documento, AAV8 é usado para a expressão hepática direcionada da proteína hGALNS.
6.1.2 Cassete de Expressão de hGALNS
[088] AAV tem um genoma de DNA de fita simples linear (ssDNA) que contém duas repetições terminais invertidas (ITRs) nos terminais. O AAV entra nas células por endocitose (Meier e Greber, J Gene Med., 2004; 6 Supl 1: S152-63). Após a quebra do capsídeo, o genoma ssDNA é liberado e convertido em DNA de fita dupla (dsNDA), a partir do qual os genes codificados pelo genoma viral podem ser expressos (Ding et al., 2005, Gene Ther., 12: 873-880).
[089] De acordo com a invenção, um rAAV fornecido neste documento compreende um genoma de AAV recombinante. O genoma de AAV recombinante pode compreender a estrutura principal de um genoma de AAV ou sua variante (por exemplo, a estrutura principal de um genoma de AAV1, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAV11 ou sua variante). De preferência, o genoma de AAV recombinante pode compreender a estrutura principal de um genoma de AAV8 ou sua variante.
[090] De acordo com a invenção, o genoma de AAV recombinante compreende um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs. Em algumas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido. O cassete de expressão de hGALNS pode compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. Em outras modalidades, o cassete de expressão de hGALNS compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS. (a) hGALNS
[091] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a porção de hGALNS da proteína de fusão compreende a sequência de SEQ ID NO: 2 ou 3. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a porção de hGALNS da proteína de fusão é de pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 ou 3.
[092] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão compreende a sequência de SEQ ID NO: 4 ou 5. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87% pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência estabelecida na SEQ ID NO: 4 ou 5.
[093] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a porção hGALNS da proteína de fusão compreende a sequência de cDNA de hGALNS. Em certas modalidades,
a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a porção de hGALNS da proteína de fusão é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de cDNA de hGALNS.
[094] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão compreende a sequência de cDNA da proteína de fusão. Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão é de pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de cDNA da proteína de fusão.
[095] Em certas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão é otimizada por códons, por exemplo, por meio de qualquer técnica de otimização por códons conhecida por um versado na técnica (ver, por exemplo, revisão de Quax et al., 2015, Mol Cell 59: 149-161).
[096] Em certas modalidades, os sítios CpG são depletados na sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou na sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. (b) Oligopeptídeo Ácido
[097] Os oligopeptídeos ácidos têm altas afinidades de ligação para a hidroxiapatita, um componente importante dos ossos e cartilagens. O termo "oligopeptídeo ácido", tal como utilizado neste documento, refere-se a um oligopeptídeo com uma sequência de aminoácidos repetida de resíduos de ácido glutâmico (E) e/ou ácido aspártico (D). O número de resíduos de aminoácidos em um oligopeptídeo ácido pode ser, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em modalidades específicas, o número de resíduos de aminoácidos em um oligopeptídeo ácido é 4-8. Em modalidades específicas, o número de resíduos de aminoácidos em um oligopeptídeo ácido é 6-8. Em uma modalidade específica, o número de resíduos de aminoácidos em um oligopeptídeo ácido é 6. Em outra modalidade específica, o número de resíduos de aminoácidos em um oligopeptídeo ácido é 8.
[098] Em uma modalidade preferida, o oligopeptídeo ácido é D8 (isto é, um oligopeptídeo com uma sequência de aminoácidos de oito resíduos de ácido aspártico. Em outra modalidade, o oligopeptídeo ácido é E6 (isto é, um oligopeptídeo com uma sequência de aminoácidos de seis resíduos de ácido glutâmico. A sequência E6 é descrita em Tomatsu et al., 2010, Molecular Therapy, 18 (6): 11094-1102, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[099] Em uma modalidade preferida, o oligopeptídeo ácido é fundido ao terminal N de hGALNS. Em outra modalidade, o oligopeptídeo ácido é fundido ao C-terminal de hGALNS.
[0100] Em uma modalidade específica, o oligopeptídeo ácido é fundido diretamente a hGALNS, sem sequência de aminoácidos interveniente. Em outra modalidade específica, o oligopeptídeo ácido é fundido a hGALNS por meio de uma sequência de aminoácidos ligante (por exemplo, uma sequência de aminoácidos que tem 1-10, 2-8 ou 4-6 resíduos de aminoácidos de comprimento).
[0101] Em certas modalidades, a enzima hGALNS pode ser distribuída aos lisossomas na área do osso e da cartilagem para melhorar a patologia do osso e da cartilagem. (c) Promotores e Modificadores da Expressão de Gene:
[0102] Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS descrito neste documento compreende componentes que modulam a distribuição ou expressão de genes (por exemplo, "elementos de controle de expressão"). Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS descrito neste documento compreende componentes que modulam a expressão gênica. Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS descrito neste documento compreende componentes que influenciam a ligação ou direcionamento às células. Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS descrito neste documento compreende componentes que influenciam a localização de hGALNS dentro da célula após a absorção. Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS neste documento descrito compreende componentes que podem ser usados como marcadores detectáveis ou selecionáveis, por exemplo, para detectar ou selecionar células que tomaram o cassete de expressão de hGALNS. Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS descrito neste documento compreende sequência(s) de nucleotídeos que codificam um ou mais promotores, pelo menos um dos quais está operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido. Em certas modalidades, o promotor pode ser um promotor constitutivo. Em modalidades alternativas, o promotor pode ser um promotor induzível.
[0103] Em certas modalidades, o promotor é um promotor CAG.
[0104] Em certas modalidades, o promotor é um promotor específico do fígado.
[0105] O promotor específico do fígado pode ser, mas não está limitado a um promotor globulina de ligação de tiroxina (TBG) (ver, por exemplo, Yan et al., 2012, Gene, 506(2): 289- 94, incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[0106] Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 15.
[0107] Em certas modalidades, o promotor é um promotor específico do fígado e músculo.
[0108] Em certas modalidades, o promotor de fígado e músculo compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o promotor do fígado e do músculo é SEQ ID NO: 16.
[0109] Em certas modalidades, o promotor compreende um ou mais elementos que aumentam a expressão de hGALNS ou da proteína de fusão. Em certas modalidades, o promotor compreende uma caixa TATA.
[0110] Em certas modalidades, os um ou mais elementos promotores podem ser invertidos ou movidos em relação um ao outro. Em certas modalidades, os elementos do promotor podem ser posicionados para funcionar cooperativamente. Em certas modalidades, os elementos do promotor podem ser posicionados para funcionar de forma independente. Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS descrito neste documento compreende um ou mais promotores selecionados do grupo que consiste no promotor TBG específico do fígado, o promotor do gene precoce imediato do CMV humano, o promotor precoce SV40, a repetição de terminal longo do vírus do sarcoma de Rous (RS) e promotor insulina de rato. Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS fornecido neste documento compreende um ou mais promotores específicos de tecido. Em uma modalidade específica, o promotor específico do tecido é um promotor específico do fígado. Em uma modalidade específica, o promotor TBG tem a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO. 6.
[0111] Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS compreende um ou mais elementos de controle de expressão adicionais, que podem incluir uma sequência de nucleotídeos que codifica um potenciador (por exemplo, um potenciador alfa mic/bik), um repressor, uma sequência de nucleotídeos que codifica um íntron ou um íntron quimérico (por exemplo, primeiro íntron do gene da beta-actina de galinha) e/ou uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio poli A (por exemplo, um sítio poli A de globina de coelho). Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos que codifica o sítio poli A da globina de coelho tem a sequência de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos que codifica o íntron tem a sequência de SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos que codifica o potenciador alfa mic/bik tem a sequência de SEQ ID NO: 11.
[0112] Em uma modalidade específica, o cassete de expressão de hGALNS compreende um potenciador alfa mic/bik, uma sequência de nucleotídeos que codifica um íntron, uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor TBG, uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido (de preferência, D8), e uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio poli A de globina de coelho. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos que codifica o sítio poli A da globina de coelho tem a sequência de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos que codifica o íntron tem a sequência de SEQ ID NO: 10. Em uma modalidade específica, a sequência de nucleotídeos que codifica o potenciador alfa mic/bik tem a sequência de SEQ ID NO: 11. (d) Repetições Terminais Invertidas
[0113] De acordo com a invenção, o cassete de expressão de hGALNS descrito neste documento é flanqueado por duas repetições terminais invertidas de AAV (ITRs). As sequências ITR podem ser utilizadas para empacotar um cassete de expressão de gene recombinante no vírion (ver, por exemplo, Yan et al., 2005, J. Virol., 79 (1): 364-379; Patente US Nº 7.282.199 B2, Patente US Nº 7.790.449 B2, Patente US Nº 8.318.480 B2, Patente US Nº
8.962.332 B2 e Pedido de Patente Internacional Nº PCT/EP2014/076466, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Em uma modalidade específica, as ITRs de flanco são ITRs de AAV8. Em uma modalidade específica, a sequência ITR pode ter uma sequência de SEQ ID NO .: 7. Em uma modalidade específica, a sequência ITR pode ter uma sequência de SEQ ID NO.: 8. Em uma modalidade específica, a ITR 5' pode ter uma sequência de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade específica, a ITR 3' pode ter uma sequência de SEQ ID NO: 8. (e) Regiões Não Traduzidas
[0114] Em certas modalidades, o cassete de expressão de hGALNS descrito neste documento compreende uma ou mais regiões não traduzidas (UTRs), por exemplo, UTRs 3' e/ou 5'. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para o nível desejado de expressão de proteína. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a meia-vida do mRNA do hGALNS. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a estabilidade do mRNA do hGALNS. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a estrutura secundária do mRNA do hGALNS.
6.1.3 Kits e Composições Farmacêuticas
[0115] Em certas modalidades, são fornecidas neste documento composições farmacêuticas compreendendo um rAAV fornecido neste documento e um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser preparada como formas de dosagem de unidade única individuais. As composições farmacêuticas fornecidas neste documento podem ser formuladas para, por exemplo, administração parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intratecal ou transdérmica. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa. Um carreador farmaceuticamente aceitável adequado (por exemplo, para administração intravenosa e transdução em células do fígado) seria prontamente selecionado por um versado na técnica.
[0116] São fornecidos neste documento kits que compreendem uma composição farmacêutica descrita neste documento, contida em um ou mais recipientes. Os recipientes em que a composição farmacêutica pode ser embalada podem incluir, sem limitação, frascos, pacotes, ampolas, tubos, inaladores, sacos, frascos e recipientes. Em certas modalidades, o kit compreende instruções para administrar a administração farmacêutica. Em certas modalidades, o kit compreende dispositivos que podem ser usados para administrar a composição farmacêutica, incluindo, sem limitação, seringas, injetores sem agulha, sacos de gotejamento, adesivos e inaladores.
[0117] Também são fornecidos dispositivos e sistemas de circulação sanguínea que podem ser utilizados no tratamento de MPS IVA usando um rAAV descrito neste documento por terapia genética. Tais dispositivos e sistemas seriam prontamente selecionados por um versado na técnica.
6.2 MANUFATURA DE rAAVS
[0118] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo um cassete de expressão de hGALNS como descrito neste documento, plasmídeos e células que podem ser usados para gerar um rAAV fornecido neste documento e métodos de produção de um rAAV fornecidos neste documento.
6.2.1 Polinucleotídeos, Plasmídeos e Células
[0119] São fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo um cassete de expressão de hGALNS.
[0120] Em um aspecto, é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, tal como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundido a um oligopeptídeo ácido (por exemplo, D8). O cassete de expressão de hGALNS pode compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado (por exemplo, um promotor TBG), em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 15.
[0121] Em outro aspecto, é proporcionado neste documento um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado (por exemplo, um promotor TBG) e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS.
[0122] Em um aspecto, é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, tal como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundido a um oligopeptídeo ácido (por exemplo, D8). O cassete de expressão de hGALNS pode compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. Em certas modalidades, o promotor é um promotor CAG.
[0123] Em um aspecto, é fornecido neste documento um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, tal como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundido a um oligopeptídeo ácido (por exemplo, D8). O cassete de expressão de hGALNS pode compreender ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e músculo, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado e músculo está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. Em certas modalidades, o promotor específico de fígado e músculo compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO: 16.
[0124] Em outro aspecto, é proporcionado neste documento um polinucleotídeo compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS. Em certas modalidades, o promotor é um promotor CAG. Em certas modalidades, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO:
13. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO: 16.
[0125] O cassete de expressão hGALNS pode ser conforme descrito na Seção 6.1.2.
[0126] Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo está na forma de um ssDNA. Em outra modalidade específica, o polinucleotídeo está na forma de um dsDNA.
[0127] Também são fornecidos neste documento plasmídeos que compreendem um polinucleotídeo fornecido neste documento (doravante "plasmídeos de rAAV"). Em uma modalidade específica,
o plasmídeo de rAAV é um plasmídeo de ssDNA. Em outra modalidade específica, o plasmídeo de rAAV é um plasmídeo de dsDNA. Em algumas modalidades, o plasmídeo de rAAV está em uma forma circular. Em outras modalidades, o plasmídeo de rAAV está em uma forma linear.
[0127] Em uma determinada modalidade, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes (LSPX1): (1) repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) dois potenciadores Mik/BikE em conjunto, b) potenciador ApoE, c) promotor AAT humano, d) um sinal poli A, e) opcionalmente um íntron; (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco. Em uma modalidade específica, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) dois potenciadores Mik/BikE em conjunto, b) potenciador ApoE, c) promotor AAT humano, d) um sinal de poli A de globina de coelho e e) opcionalmente um íntron quimérico derivado de β-globina humana e cadeia pesada de Ig; e (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco.
[0128] Em uma determinada modalidade, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes (LSPX2): (1) repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) dois potenciadores de ApoE em conjunto, b) promotor AAT humano, c) um sinal poli A; e d) opcionalmente um íntron; e (3) sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco. Em uma modalidade específica, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) dois potenciadores de ApoE em conjunto, b) promotor AAT humano, c) um sinal poli A; e d) opcionalmente, um íntron quimérico derivado da β-globina humana e da cadeia pesada de Ig; e (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco.
[0129] Em uma determinada modalidade, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes (LTP1): (1) repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) dois potenciadores Mik/BikE em conjunto, b) promotor TBG, c) promotor AAT humano (ΔATG), d) um sinal poli A; e) opcionalmente um íntron; e (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco. Em uma modalidade específica, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) dois potenciadores Mik/BikE em conjunto, b) promotor TBG, c) promotor AAT humano (ΔATG), (d) um sinal de poli A de globina de coelho e e) opcionalmente um íntron quimérico derivado de β-globina humana e cadeia pesada de Ig; e (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco.
[0130] Em uma determinada modalidade, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes (LTP2): (1) repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) potenciador ApoE, b) dois potenciadores Mik/BikE em conjunto, c) promotor TBG, d) promotor AAT humano (ΔATG), e) um sinal poli A; e f) opcionalmente um íntron; e (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco. Em uma modalidade específica, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) dois potenciadores de ApoE em conjunto, b) promotor TBG, c) promotor
AAT humano (ΔATG), d) um sinal poli de A; e e) opcionalmente, um íntron quimérico derivado da β-globina humana e da cadeia pesada de Ig; e (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco.
[0131] Em uma determinada modalidade, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes (LMTP6): (1) repetições terminais invertidas de AAV (ITRs) que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) potenciador ApoE, b) três potenciadores MckE em conjunto, c) promotor CK, d) promotor AAT humano (ΔATG), e) um sinal poli A; e f) opcionalmente um íntron; e (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco. Em uma modalidade específica, os construtos descritos neste documento compreendem os seguintes componentes: (1) repetições terminais invertidas de AAV2 que flanqueiam o cassete de expressão; (2) elementos de controle, que incluem a) potenciador ApoE, b) três potenciadores MckE em conjunto, c) promotor CK, d) promotor AAT humano (ΔATG), e) um sinal poli A; e f) opcionalmente, um íntron quimérico derivado da β-globina humana e da cadeia pesada de Ig; e (3) uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou hGALNSco.
[0132] Além disso, são fornecidas neste documento células (de preferência células ex vivo) que expressam (por exemplo, de forma recombinante) um rAAV fornecido neste documento. Em certas modalidades, a célula (de preferência célula ex vivo) compreende um polinucleotídeo fornecido neste documento ou um plasmídeo rAAV fornecido neste documento. Em certas modalidades, a célula (de preferência célula ex vivo) compreende ainda polinucleotídeo(s) auxiliar(es) ou plasmídeos auxiliares fornecendo as funções Rep, Cap e Ad5 de AAV. A célula (de preferência células ex vivo) pode ser uma célula hospedeira de mamífero, por exemplo, HEK293, HEK293-T, A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa,
293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, fibroblastos primários, hepatócitos e células de mioblastos. A célula hospedeira de mamífero pode ser derivada de, por exemplo, humano, macaco, camundongo, rato, coelho ou hamster. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira de mamífero é uma célula de rim embrionário humano 293 (HEK293) ou célula HEK293-T.
6.2.2 Métodos de Fabricação de rAAVs
[0133] São fornecidos métodos para fazer um rAAV fornecido neste documento. Em certas modalidades, o método compreende a transfecção de uma célula (de preferência uma célula ex vivo) com um plasmídeo rAAV fornecido na Seção 6.2.1 e um ou mais plasmídeos auxiliares fornecendo coletivamente as funções AAV Rep, Cap e Ad5. Em certas modalidades, um ou mais plasmídeos auxiliares compreendem coletivamente as sequências de nucleotídeos dos genes Rep, Cap, VA, E2a e E4 de AAV.
[0134] A fabricação de um rAAV fornecido neste documento para aplicações de terapia gênica pode usar métodos conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito em Clement et al., 2016, Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 27: 16002, que é incorporado neste por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, a transfecção do DNA de plasmídeo é realizada usando precipitação de plasmídeo de fosfato de cálcio em células de rim embrionário humano 293 (HEK293) ou HEK293-T com o plasmídeo rAAV e o(s) plasmídeo(s) auxiliar(es) que também fornecem as funções Rep e Cap de AAV como os genes Ad5 (RNAs VA, E2a e E4), conforme descrito na técnica. Em certas modalidades, os genes Rep, Cap e Ad5 podem estar no mesmo plasmídeo auxiliar. Em certas modalidades, um método de dois auxiliares (ou transfecção tripla) é utilizado onde as funções Rep, Cap e Ad5 de AAV são fornecidas a partir de plasmídeos separados. Em certas modalidades, as células HEK293 podem ser adaptadas para crescer em suspensão em um componente animal e meio sem antibiótico.
[0135] Em certas modalidades, o rAAV pode ser fabricado usando empacotamento e linhagens de células produtoras. O rAAV fornecido neste documento pode ser fabricado usando células hospedeiras de mamíferos, por exemplo, A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, HEK293, HEK293- T, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, fibroblastos primários, hepatócitos e células de mioblastos. O rAAV fornecido neste documento pode ser fabricado usando células hospedeiras de humano, macaco, camundongo, rato, coelho ou hamster. Em certas modalidades, as linhagens celulares estáveis podem ser projetadas pela introdução dos meios de produção de vírus nas células hospedeiras, por exemplo, os genes de replicação e capsídeo (por exemplo, os genes rep e cap de AAV) e o plasmídeo rAAV fornecido neste documento. Em uma modalidade específica, o rAAV pode ser fabricado usando células HEK293. Em certas modalidades, o rAAV pode ser produzido em células de inseto Sf9 coinfectando três plasmídeos de baculovírus recombinantes com genes que codificam o gene rep, o gene cap e o genoma do rAAV.
[0136] As células podem ser cultivadas, transfectadas e coletadas de acordo com protocolos apropriados que seriam prontamente selecionados por um versado na técnica. Em certas modalidades, as células podem ser cultivadas em meio Eagle modificado de Dulbecco padrão (DMEM), incluindo, sem limitação, soro fetal de bezerro, glicose, penicilina, estreptomicina e 1- glutamina (McClure et al., J Vis Exp. 2011, (57): 3348; Shin et al., Methods Mol Biol. 2012, 798: 267-284). As células podem ser transfectadas em componentes que seriam facilmente selecionados por um versado na técnica. Em certas modalidades, a transfecção pode ocorrer em soluções de mídia, incluindo, sem limitação, DMEM e meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM). Em certas modalidades, o tempo de transfecção pode levar 46 h, 47 h, 48 h, 49 h, 50 h, 51 h, 52 h, 53 h, 54 h, 55 h, 56 h, 57 h, 58 h, 59 h, 60 h, 61 h, 62 h, 63 h, 64 h, 65 h, 66 h, 67 h, 68 h, 69 h,
70 h, 50-55 h, 55-60 h, 60-65 h, ou 65-70 horas. Após a transfecção, as células podem ser coletadas raspando as células para removê-las dos poços de cultura e lavando os poços para coletar todas as células transfectadas.
[0137] Para um método de produção de rAAV compreendendo capsídeos de AAV8, ver a Seção IV da Descrição Detalhada da Patente US Nº 7.282.199 B2, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Títulos de cópia do genoma dos referidos vetores podem ser determinados, por exemplo, por análise TAQMAN®. Os vírions podem ser recuperados, por exemplo, por sedimentação com CsCl2. Em uma modalidade específica, o rAAV descrito neste documento é um rAAV isolado ou purificado.
[0138] Múltiplos sorotipos de AAV foram identificados. Em certas modalidades, os rAAVs ou polinucleotídeos fornecidos neste documento compreendem um ou mais componentes derivados de um ou mais sorotipos de AAV. Em certas modalidades, os rAAVs ou polinucleotídeos fornecidos neste documento compreendem um ou mais componentes derivados de um ou mais de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAV11. Em uma determinada modalidade, os rAAVs ou polinucleotídeos fornecidos neste documento podem compreender um ou mais componentes de um ou mais dos sorotipos AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em uma modalidade preferida, os rAAVs ou polinucleotídeos fornecidos neste documento podem compreender um ou mais componentes do sorotipo AAV8. Sequências de ácido nucleico de componentes de AAV e métodos de produção de AAV recombinante e capsídeos de AAV são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Nº
7.282.199 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 7.790.449 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 8.318.480 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 8.962.332 B2 e Pedido de Patente Internacional Nº PCT/EP2014/076466, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na sua totalidade. Em modalidades específicas, são fornecidos neste documento rAAV8s que codificam hGALNS.
[0139] São descritos em certas modalidades rAAV8s compreendendo (i) um genoma recombinante compreendendo um cassete de expressão contendo o hGALNS ou a proteína de fusão que é hGALNS fundido a um oligopeptídeo ácido sob o controle de elementos reguladores e flanqueado por ITRs; e (ii) um capsídeo viral que tem a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo de AAV8 ou é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idêntica à sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo de AAV8 (SEQ ID NO: 1) ao mesmo tempo que retém a capacidade do capsídeo de AAV8 de empacotar um genoma viral e, de preferência, também a capacidade do capsídeo de AAV8 de transduzir células do fígado com alta eficiência. Em certas modalidades, o capsídeo de AAV8 tem a sequência da SEQ ID NO: 1 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácidos e reter a capacidade do capsídeo de AAV8 de empacotar um genoma viral e, de preferência, também a capacidade do capsídeo de AAV8 de transduzir células do fígado com alta eficiência.
6.2.3 Avaliação de Eficácia
[0140] Os ensaios in vitro, por exemplo, ensaios de cultura de células, podem ser usados para medir a expressão de hGALNS de um rAAV descrito neste documento, indicando assim, por exemplo, a potência do rAAV. As células utilizadas para o ensaio podem incluir, sem limitação, A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, HEK293, HEK293-T, HuH7, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, fibroblastos primários, hepatócitos e células de mioblastos. Em uma modalidade específica, as células utilizadas no ensaio de cultura de células compreendem células HuH7. Em certas modalidades, as células transfectadas com o rAAV podem ser analisadas quanto à atividade da enzima hGALNS.
[0141] Os modelos animais também podem ser usados para avaliar a expressão de hGALNS de um rAAV descrito neste documento e sua eficácia. Modelos de camundongo para MPS IVA foram descritos (ver, por exemplo, Tomatsu et al., 2003, Hum Mol Genet 12 (24): 3349-3358). O modelo de mouse para MPS IVA tem uma interrupção direcionada do Exon 2 de GALNS de camundongo. Esses camundongos não têm atividade da enzima GALNS detectável e níveis aumentados de GAGs são detectados na urina. Aos 2 meses de idade, o armazenamento aumentado de GAGs é visto nas células reticuloendoteliais, células de Kupffer e células sinusoidais que revestem o baço. Aos 12 meses de idade, a alteração vacuolar é observada nas células epiteliais viscerais dos glomérulos e nas células da base das válvulas cardíacas, mas não está presente nas células parenquimatosas, como hepatócitos e células epiteliais tubulares renais. O armazenamento lisossomal de GAGs é visto em neurônios do hipocampo e neocorticais, células meníngeas. O sulfato de queratana (KS) e o condroitina-6-sulfato (C6S) são aumentados nas células epiteliais da córnea deste modelo de camundongo em comparação com o tipo selvagem, no entanto, nenhuma indicação de esqueleto se tornou evidente no modelo de camundongo. Adicionalmente, um modelo de camundongo para MPS IVA que é tolerante a GALNS humano também foi descrito (ver, por exemplo, Tomatsu et al., 2005, Hum Mol Genet 14 (22): 3321-3335). Consulte os Exemplos na Seção 7 para ensaios exemplares para avaliar a expressão de hGALNS de um rAAV descrito neste documento e sua eficácia.
[0142] De acordo com algumas modalidades, os métodos incluem vetores de terapia gênica, por exemplo, a combinação de elementos reguladores e transgenes que fornecem expressão aumentada de uma proteína hGALNS funcional. Tal expressão pode ser medida 1) por vários ensaios de determinação de proteína (hGALNS) conhecidos do especialista, não limitados a ELISA sanduíche, Western Blot, coloração histológica e cromatografia líquida espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS); 2) por vários ensaios de atividade de proteínas, tais como ensaios enzimáticos ou ensaios funcionais; e/ou 3) por vários ensaios de detecção de substrato, não limitados a sulfato de queratana (KS), glicosaminoglicanos (CAG) e/ou detecção de condroitina-6-sulfato (C6S), e ser determinado como eficaz e adequado para tratamento humano (Hintze, JP et al, Biomarker Insights 2011: 6 69-78). A avaliação das propriedades quantitativas e funcionais de hGALNS usando tais estudos celulares, sanguíneos e de tecidos in vitro e in vivo mostraram se correlacionar com a eficácia de certas terapias (Hintze, JP et al, 2011, supra), e foram utilizados para avaliar resposta ao tratamento de terapia gênica de MPS IVA com os vetores descritos neste documento.
[0143] A invenção, portanto, fornece métodos e vetores de terapia gênica que aumentam a atividade da enzima hGALNS intracelular em células de tecido, por exemplo, incluindo células hepáticas, musculares, glóbulos brancos, rins, pulmões, baço cardíaco, osso ou cartilagem do sujeito em níveis comparados com os níveis de tipo selvagem, ou que aumentam a atividade da enzima hGALNS intracelular em cerca de 2 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, ou cerca de 5 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 10 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 25 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 40 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 50 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 60 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 70 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 75 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 80 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 85 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 90 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, cerca de 95 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem ou cerca de cerca de 100 vezes os níveis de atividade de hGALNS de tipo selvagem, conforme medido por um ensaio de atividade enzimática de hGALNS, por exemplo usando um formato de ensaio como descrito nos Exemplos 2, 3 e 8 neste documento, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em algumas modalidades, a terapia gênica fornece um método para aumentar os níveis de atividade de hGALNS no sujeito duas semanas após a administração da terapia gênica, em comparação com os níveis anteriores à administração ou os níveis médios nos sujeitos não tratados. Em algumas modalidades, a terapia gênica fornece um método para aumentar os níveis de atividade de hGALNS no sujeito duas semanas após a administração da terapia gênica. Em algumas modalidades, a terapia genética fornece um método para aumentar os níveis de atividade de hGALNS no sangue ou tecidos, por exemplo, fígado, músculo, rim, pulmão, baço, coração, osso ou cartilagem do sujeito duas semanas após a administração da terapia gênica. Em algumas modalidades, o aumento nos níveis de atividade de hGALNS no sujeito é medido dez semanas após a administração da terapia gênica.
[0144] A invenção também fornece métodos e vetores de terapia gênica que reduzem os níveis de sangue (por exemplo, plasma ou soro) ou os níveis de KS no sujeito em comparação com os níveis de KS em indivíduos de tipo selvagem não tratados, ou que reduzem os níveis de KS para cerca de 1,1 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, ou cerca de 1,2 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 1,3 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 1,4 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 1,5 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 1,6 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 1,7 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 1,8 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 1,9 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 2 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 2,5 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 3 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, cerca de 3,5 vezes os níveis de KS de tipo selvagem ou cerca de 4 vezes os níveis de KS de tipo selvagem, como medido por um ensaio KS, e usando um formato de ensaio como descrito nos Exemplos 2, 3 e 8 neste documento, ou um ensaio substancialmente semelhante. Em algumas modalidades, a terapia gênica fornece um método de redução dos níveis de KS no sujeito duas semanas após a administração da terapia gênica. Em algumas modalidades, a terapia gênica fornece um método de redução dos níveis de tecido de KS no sujeito duas semanas após a administração da terapia gênica. Em algumas modalidades, o ensaio de KS compreende a medição de KS monossulfatado no sangue ou tecido, e a terapia gênica fornece um método para reduzir os níveis de KS monossulfatados no sujeito duas semanas após a administração da terapia gênica.
6.3 MÉTODOS DE TRATAMENTO
[0145] São fornecidos neste documento métodos para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA.
[0146] Em um aspecto, o método compreende a administração ao sujeito humano de um rAAV descrito neste documento ou uma composição farmacêutica descrita neste documento.
[0147] Em outro aspecto, o método compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca (por exemplo, distribuição ao osso e/ou cartilagem) do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um transgene, tal como o transgene que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, por administração ao sujeito humano de um rAAV fornecido neste documento. Em uma modalidade específica, o referido hGALNS é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado de uma célula do fígado.
[0148] Em outro aspecto, o método compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, placa de crescimento, menisco, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca (por exemplo, distribuição ao osso e/ou cartilagem) do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é glicosilada com manose- 6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado, por administração ao sujeito humano de um rAAV fornecido neste documento.
[0149] Em outro aspecto, o método compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, placa de crescimento, menisco, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca (por exemplo, distribuição ao osso e/ou cartilagem) do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido (tal como um oligopeptídeo ácido descrito na Seção 6.1.2 (b), por exemplo, D8), em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV. O genoma do rAAV pode compreender um cassete de expressão de hGALNS, conforme descrito na Seção 6.1.2.
[0150] Em outro aspecto, o método compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, placa de crescimento, menisco, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca (por exemplo, distribuição ao osso e/ou cartilagem do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido (tal como um oligopeptídeo ácido descrito na Seção 6.1.2 (b), por exemplo, D8), em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado de uma célula do fígado. O genoma do rAAV pode compreender um cassete de expressão de hGALNS, conforme descrito na Seção 6.1.2. Numa concretização preferida, o genoma do rAAV compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
Em uma modalidade específica, o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor específico do fígado é SEQ ID NO: 15. Em outro aspecto, o método compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, placa de crescimento, menisco, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca (por exemplo, distribuir ao osso e/ou cartilagem do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido (tal como um oligopeptídeo ácido descrito na Seção 6.1.2 (b), por exemplo, D8), em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado de uma célula do fígado.
O genoma do rAAV pode compreender um cassete de expressão de hGALNS, conforme descrito na Seção 6.1.2. Em uma modalidade preferencial, o genoma do rAAV compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e músculo, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado e músculo está operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. Em certas modalidades, o promotor de fígado e músculo compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO: 16.
[0151] Em outro aspecto, o método compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, placa de crescimento, menisco, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca (por exemplo, distribuir ao osso e/ou cartilagem do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido (tal como um oligopeptídeo ácido descrito na Seção 6.1.2 (b), por exemplo, D8), em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilado com manose-6-fosfato por ter sido produzido e secretado de uma célula do fígado. O genoma do rAAV pode compreender um cassete de expressão de hGALNS, conforme descrito na Seção 6.1.2. Em uma modalidade preferencial, o genoma do rAAV compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor está operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão. Em certas modalidades, o promotor é um promotor CAG.
[0152] Em outro aspecto, o método compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, placa de crescimento, menisco, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca (por exemplo, distribuição ao osso e/ou cartilagem) do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado. O genoma do rAAV pode compreender um cassete de expressão de hGALNS, conforme descrito na Seção 6.1.2. Numa concretização preferida, o genoma do rAAV compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS. Em uma modalidade específica, o promotor específico do fígado é um promotor TBG.
[0153] Em outro aspecto, o método compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, placa de crescimento, menisco, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca (por exemplo, distribuição ao osso e/ou cartilagem) do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada de uma célula do fígado. O genoma do rAAV pode compreender um cassete de expressão de hGALNS, conforme descrito na Seção 6.1.2. Em uma modalidade preferencial, o genoma do rAAV compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor está operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS. Em certas modalidades, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, o promotor compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 16. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO: 13. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO:
14. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO: 15. Em certas modalidades, o promotor é SEQ ID NO: 16.
[0154] Em várias modalidades dos métodos de tratamento descritos neste documento, o rAAV ou genoma de rAAV compreende um ou mais componentes derivados de um ou mais sorotipos de AAV. Em certas modalidades, o rAAV ou genoma de rAAV compreende um ou mais componentes derivados de um ou mais de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou AAV11. Em uma determinada modalidade, o genoma do rAAV ou rAAV compreende um ou mais componentes de um ou mais dos sorotipos AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11. Em uma modalidade preferida, o rAAV ou genoma de rAAV compreende um ou mais componentes do sorotipo AAV8. Sequências de ácido nucleico de componentes de AAV e métodos de produção de AAV recombinante e capsídeos de AAV são descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Nº 7.282.199 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 7.790.449 B2, Patente dos Estados Unidos Nº
8.318.480 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 8.962.332 B2 e Pedido de Patente Internacional Nº PCT/EP2014/076466, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na sua totalidade.
[0155] Em várias modalidades dos métodos de tratamento descritos neste documento, a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma etapa de distribuir para (a) o osso e/ou cartilagem, e (b) ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca.
6.3.1 Populações de Pacientes Alvo
[0156] De acordo com a invenção, o sujeito humano ou paciente é um indivíduo que foi diagnosticado com MPS IVA (síndrome de Morquio A). Em modalidades específicas, o paciente tem um ou mais dos seguintes sintomas de MPS IVA: morfologia anormal da válvula cardíaca, dentes cariados, mielopatia cervical, subluxação cervical, excreção de sulfato de condroitina na urina, características faciais grosseiras, asas ilíacas contraídas, coxa valga, desproporcional tronco curto, baixa estatura, deformidades epifisárias dos ossos tubulares, dilatação da caixa torácica, genu valgo, esmalte acinzentado, deficiência auditiva, hepatomegalia, hiperlordose, hipoplasia do processo odontoide, hérnia inguinal, frouxidão articular, início juvenil, excreção de sulfato de queratina na urina, cifose, cotovelo largo, prognóstico mandibular, alargamento metafisário, opacificação do estroma corneano, osteoporose, corpos vertebrais ovoides, platispondilia, segundo a quinto metacarpo pontiagudo, estroma proeminente, infecção recorrente do trato respiratório superior, defeito ventilatório restritivo, escoliose, desvio ulnar do punho, boca larga e dentes amplamente espaçados.
[0157] Em certas modalidades, o paciente foi identificado como responsivo ao tratamento com hGALNS.
[0158] Em uma modalidade específica, o paciente tem uma forma de MPS IVA de início precoce grave e rapidamente progressiva. Em outra modalidade específica, o paciente tem uma forma de MPS IVA de início tardio lentamente progressiva.
[0159] Em uma modalidade específica, o paciente é um adulto (pelo menos 16 anos). Em outra modalidade específica, o paciente é um adolescente (de 12 a 15 anos). Em outra modalidade específica, o paciente é uma criança (com menos de 12 anos).
[0160] Em uma modalidade específica, o paciente é menor de 6 anos.
6.3.2 Administração e Dosagem
[0161] A via de administração de um rAAV descrita neste documento e a quantidade de rAAV a ser administrada ao paciente humano podem ser determinadas com base na gravidade da doença, condição do paciente humano e conhecimento do médico assistente. (a) Dosagem Terapêutica
[0162] Em modalidades preferidas, a quantidade de rAAV administrado a um sujeito humano é suficiente para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS ao tecido afetado (osso, cartilagem, ligamento, menisco e/ou válvula cardíaca).
[0163] Em certas modalidades, as dosagens são medidas pelo número de cópias do genoma administradas ao sujeito humano por meio de rAAVs fornecidos neste documento. Em uma modalidade específica, são administradas 1 x 1010 a 1 x 1016 cópias do genoma. Em outra modalidade específica, são administradas 1 x 1010 a 1 x 1011 cópias do genoma. Em outra modalidade específica, são administrados 1 x 1011 a 1 x 1012 cópias de genomas. Em outra modalidade específica, são administrados 1 x 1012 a 1 x 1013 cópias do genoma. Em outra modalidade específica, são administradas 1 x 1013 a 1 x 1014 cópias do genoma. Em outra modalidade específica, são administrados 1 x 1014 a 1 x 1015 cópias do genoma. Em outra modalidade específica, são administrados 1 x 1015 a 1 x 1016 cópias do genoma.
[0164] Sem estar limitado pela teoria, pelo menos 10% do rAAV administrado infecta o fígado do sujeito humano o qual foi administrado. Em certas modalidades, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25- 35%, 30-40%, 35-45%, 40-50%, 45-55%, 50-60%, 55 -65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% ou 90-100% do rAAV administrado infecta o fígado do sujeito humano.
[0165] Sem estar limitado pela teoria, pelo menos 10% da enzima hGALNS expressa a partir do genoma viral do rAAV é expressa nas células do fígado. Em certas modalidades, 10-15%,
15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40-50%, 45-55%, 50-60%, 55 -65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% ou 90- 100% da enzima hGALNS expressa a partir do genoma viral do rAAV é expresso nas células do fígado.
[0166] Sem estar limitado pela teoria, pelo menos 10% da enzima hGALNS expressa do genoma viral do rAAV atinge o tecido afetado (por exemplo, osso) do sujeito humano. Em certas modalidades, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40- 50%, 45-55%, 50-60%, 55 -65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% ou 90-100% da enzima hGALNS expressa a partir do genoma viral do rAAV atinge o tecido afetado (por exemplo, osso) do sujeito humano.
[0167] Sem estar limitado pela teoria, pelo menos 10% da enzima hGALNS expressa a partir do genoma viral rAAV é glicosilada por ter sido expressa e secretada pelas células do fígado. Em certas modalidades, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40-50%, 45-55%, 50-60%, 55-65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80-90%, 85-95% ou 90-100% da enzima hGALNS expressa a partir do genoma viral rAAV é glicosilado por ter sido expresso em e secretado pelas células do fígado.
[0168] Sem estar limitado pela teoria, pelo menos 10% da enzima hGALNS glicosilada nas células do fígado pode atingir o tecido afetado (por exemplo, osso) do sujeito humano. Em certas modalidades, 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-35%, 30-40%, 35-45%, 40- 50%, 45-55%, 50-60%, 55-65%, 60-70%, 65-75%, 70-80%, 75-85%, 80- 90%, 85-95% ou 90-100% da enzima hGALNS glicosilada de células do fígado pode atingir a tecido afetado (por exemplo, osso) do sujeito humano. (b) Vias de administração
[0169] Em uma modalidade específica, o rAAV pode estar presente em uma composição farmacêutica para ser administrado a um sujeito humano (ver Seção 6.1.3).
[0170] O rAAV pode ser administrado, por exemplo, por administração parenteral, subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intratecal ou transdérmica. Em uma modalidade específica, o rAAV é administrado por administração intravenosa.
6.4 TERAPIAS DE COMBINAÇÃO
6.4.1 Coterapia com imunossupressão
[0171] Embora a distribuição do rAAV deva minimizar as reações imunológicas, a fonte potencial mais clara de toxicidade relacionada à terapia gênica é gerar imunidade contra a proteína hGALNS expressa em sujeitos humanos que são geneticamente deficientes para hGALNS e, portanto, potencialmente não tolerantes à enzima ou ao rAAV. Assim, em uma determinada modalidade, é aconselhável cotratar o paciente com terapia de supressão imunológica - especialmente ao tratar pacientes com doença grave que têm níveis próximos de zero de hGALNS. Terapias de imunossupressão envolvendo um regime de tacrolimo ou rapamicina (sirolimo) em combinação com ácido micofenólico ou outros regimes de imunossupressão usados em procedimentos de transplante de tecidos podem ser empregadas. Tal tratamento de imunossupressão pode ser administrado durante o curso da terapia gênica e, em certas modalidades, o pré-tratamento com terapia de imunossupressão pode ser preferido. A terapia de imunossupressão pode ser continuada após o tratamento de terapia gênica, com base no julgamento do médico do tratamento, e pode, posteriormente, ser retirada quando a tolerância imunológica é induzida; por exemplo, após 180 dias.
[0172] Em certas modalidades, os métodos de tratamento fornecidos neste documento adicionalmente compreendem a administração ao paciente humano de um regime de imunossupressão compreendendo prednisolona, ácido micofenólico e tacrolimo. Em certas modalidades, os métodos de tratamento fornecidos neste documento adicionalmente compreendem a administração ao paciente humano de um regime de imunossupressão compreendendo prednisolona, ácido micofenólico e rapamicina (sirolimo). Em certas modalidades, os métodos de tratamento fornecidos neste documento adicionalmente compreendem a administração ao paciente humano de um regime de imunossupressão que não compreende tacrolimo. Em certas modalidades, os métodos de tratamento fornecidos neste documento adicionalmente compreendem a administração ao paciente humano de um regime de imunossupressão compreendendo um ou mais corticosteroides, como metilprednisolona e/ou prednisolona, bem como tacrolimo e/ou sirolimo. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão compreende a administração de uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, ou (b) rapamicina e ácido micofenólico ao referido sujeito antes ou simultaneamente ao tratamento com hGALNS e continuando depois disso. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão é retirada após 180 dias. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão é retirada após 30, 60, 90, 120, 150 ou 180 dias.
6.4.2 Coterapia com outros tratamentos
[0173] A terapia de combinação envolvendo a administração do rAAV, conforme descrito neste documento, ao sujeito humano, acompanhada pela administração de outros tratamentos disponíveis, está englobada pelos métodos da modalidade descrita. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou subsequentemente ao tratamento de terapia gênica. Os tratamentos disponíveis para MPS IVA que podem ser combinados com a terapia gênica da invenção incluem, mas não estão limitados a terapia de reposição enzimática (ERT) e/ou terapia de TCTH. Em uma modalidade específica, ERT pode ser realizado usando a enzima D8-hGALNS produzida em linhas de células humanas por tecnologia de DNA recombinante. As linhas de células humanas que podem ser usadas para essa produção de enzima incluem, mas não estão limitadas a
HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, células de rim embrionário humano 293 (HEK293), HEK293-T, fibrossarcoma HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7 e linhas celulares da retina, PER. C6 ou RPE (ver, por exemplo, Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 “Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives" que é incorporado por referência em sua totalidade.
6.5 MARCADORES DE DOENÇA E AVALIAÇÃO DE TRATAMENTO
[0174] Em certas modalidades, a eficácia de um método de tratamento conforme descrito neste documento pode ser monitorada medindo as reduções em biomarcadores de doença (como armazenamento de GAG, KS e C6S) e/ou aumento na atividade da enzima hGALNS no osso, cartilagem, ligamento, menisco, válvula cardíaca, urina e/ou soro. Sinais de inflamação e outros eventos de segurança também podem ser monitorados.
[0175] Em certas modalidades, a eficácia de um método de tratamento, conforme descrito neste documento, é monitorada medindo o nível de um biomarcador de doença no paciente. Em certas modalidades, o nível do biomarcador da doença é medido no soro do paciente. Em certas modalidades, o nível do biomarcador da doença é medido na urina do paciente. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é GAG. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é KS. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é C6S. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é a atividade da enzima hGALNS.
[0176] Em certas modalidades, a eficácia de um método de tratamento, conforme descrito neste documento, pode ser monitorada medindo as características físicas associadas à deficiência de armazenamento lisossomal no paciente. Em certas modalidades, as características físicas podem ser lesões de armazenamento. Em certas modalidades, a característica física pode ser pescoço e tronco curtos. Em certas modalidades, a característica física pode ser pectus carinatum. Em certas modalidades, a característica física pode ser a frouxidão das articulações. Em certas modalidades, a característica física pode ser cifoescoliose. Em certas modalidades, a característica física pode ser obstrução traqueal. Em certas modalidades, a característica física pode ser compressão da medula espinhal. Em certas modalidades, a característica física pode ser deficiência auditiva. Em certas modalidades, a característica física pode ser opacidade da córnea. Em certas modalidades, as características físicas podem ser deformidades ósseas e articulares. Em certas modalidades, a característica física pode ser doença da válvula cardíaca. Em certas modalidades, as características físicas podem ser vias aéreas restritivas/obstrutivas. Tais características físicas podem ser medidas por qualquer método conhecido por um versado na técnica.
7. EXEMPLOS
[0177] Certas modalidades fornecidas neste documento são ilustradas pelos seguintes exemplos não limitativos.
7.1 Exemplo 1. Projeto de plasmídeos que codificam genomas do rAAV e ensaios de transfecção in vitro
[0178] Para gerar genomas de AAV recombinantes contendo um cassete de expressão de hGALNS, que deveriam ser empacotados em capsídeos de AAV8, foram projetados plasmídeos que codificam os genomas de AAV recombinantes. Quatro plasmídeos foram projetados e gerados: TBG-hGALNS (o cassete de expressão de hGALNS contém uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, cuja expressão está sob a regulação do promotor TBG específico do fígado), TBG-hGALNS CoOpt (o cassete de expressão de hGALNS contém uma sequência de nucleotídeos otimizada por códon que codifica hGALNS, cuja expressão está sob a regulação do promotor TBG específico do fígado), TBG-D8-hGALNS (o cassete de expressão de hGALNS contém uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a D8, cuja regulação está sob a regulação do promotor TBG específico do fígado), ou TBG- D8-hGALNS CoOpt (o cassete de expressão de hGALNS contém uma sequência de nucleotídeos otimizada por códon que codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a D8, cuja regulação está sob a regulação do Promotor TBG específico do fígado). Os rAAVs resultantes se encaixam em duas categorias: (a) rAAVs compreendendo um genoma de AAV recombinante que contém um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por repetições terminais invertidas de AAV (ITRs), em que o cassete de expressão de hGALNS compreende uma sequência de cDNA de hGALNS operacionalmente ligada a sequência promotora TBG específica do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica um local poli A; e (b) rAAVs compreendendo um genoma de AAV recombinante que contém um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por repetições terminais invertidas de AAV (ITRs), em que o cassete de expressão de hGALNS compreende uma sequência de cDNA de D8-hGALNS operacionalmente ligada à sequência promotora TBG específica do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica um sítio poli A (Figura 1). D8 é um octapeptídeo de ácido aspártico que tem com direcionamento ósseo.
[0179] Em seguida, células de carcinoma hepatocelular humano (HuH7) foram transfectadas com um dos quatro plasmídeos usando o protocolo Lipofectamine-3000 para testar a expressão de hGALNS in vitro. Após uma incubação de 48 horas, as células HuH7 transfectadas e o sobrenadante foram recolhidos e analisados quanto à atividade da enzima GALNS em péletes celulares e meios. As células Huh7 transfectadas com um plasmídeo GFP foram utilizadas conforme controle. A atividade da enzima hGALNS intracelular foi aumentada igualmente por transfecção com o plasmídeo TBG-hGALNS ou TBG-hGALNS CoOpt (Figuras 2A e 2B). A atividade enzimática intracelular também foi aumentada após a transfecção com o plasmídeo TBG-D8-hGALNS ou TBG-D8-hGALNS CoOpt, embora em menor extensão do que a transfecção com o plasmídeo TBG-hGALNS ou TBG-hGALNS CoOpt (Figuras 2A e 2B). A atividade enzimática detectada no meio celular foi aumentada pela transfecção de qualquer um dos plasmídeos (Figuras 2C e 2D).
[0180] Da mesma forma, células de carcinoma de fígado humano (HepG2) foram transfectadas com um dos quatro plasmídeos usando o protocolo Lipofectamine-3000 para testar a expressão de hGALNS in vitro (Figura 3). Após uma incubação de 72 horas, as células HepG2 transfectadas foram recolhidas e analisadas quanto à atividade da enzima hGALNS em péletes celulares. A atividade da enzima hGALNS intracelular foi aumentada por transfecção com o plasmídeo TBG-hGALNS ou TBG-hGALNS CoOpt em comparação com a transfecção com o plasmídeo de controle. A transfecção com o plasmídeo TBG-D8-hGALNS ou TBG-D8-hGALNS CoOpt não conduziu ao aumento da atividade de hGALNS em comparação com o plasmídeo de controle.
7.2 Exemplo 2. Administração in vivo de rAAV a camundongos knock out para MPS IVA (galns -/-)
[0181] Foram gerados os rAAV8 que compreendem genomas virais capazes de expressar GALNS humano nativo (hGALNS) sob o promotor específico do fígado TBG (AAV8-TBG-hGALNS, também marcado como AAV8-hGALNS em algumas figuras) ou hGALNS com um octapeptídeo de ácido aspártico (D8) sob o promotor específico do fígado (AAV8-TBG-D8-hGALNS, também rotulado como AAV8-D8- hGALNS em algumas figuras). Os plasmídeos TBG-hGALNS CoOpt e TBG-D8-hGALNS CoOpt foram usados para gerar os genomas virais, respectivamente. Os dois tipos de vírus foram administrados por via intravenosa a camundongos knock-out (KO) de MPS IVA de 4 semanas de idade e camundongos imunotolerantes Mtol a uma dose de 5 x 1013 GC /kg de peso corporal. Os camundongos KO têm uma interrupção direcionada do Exon 2 de mGALNS e não têm atividade da enzima GALNS detectável. Os camundongos Mtol são tolerantes à proteína GALNS humana. Camundongos KO não tratados e camundongos do tipo selvagem (WT) serviram como controles. Esses camundongos foram monitorados durante 14 semanas após a injeção. O sangue foi coletado quinzenalmente e testado quanto à atividade de hGALNS e sulfato de queratana (KS). O cronograma de administração de rAAV, coleta de sangue, ensaio de enzima GALNS e ensaio de KS é mostrado na Figura 4. Na necropsia, a patologia óssea foi avaliada por análise histopatológica.
[0182] Conforme visto na Figura 5A, a atividade da enzima hGALNS aumentou nos glóbulos brancos (WBCs) de camundongos tratados com rAAV, atingindo níveis próximos aos de camundongos WT 10 semanas após o tratamento. Duas semanas após a administração de rAAV, a atividade da enzima hGALNS no plasma de todos os camundongos tratados com rAAV foi elevada em média 20 vezes em comparação com os níveis em camundongos WT (variando de 5-100 vezes em comparação com os níveis em camundongos WT) (Figura 5B) Este aumento foi mantido ao longo do período de monitoramento de 14 semanas (Figura 5B). Dados semelhantes são mostrados na Figura 22 Os níveis de atividade da enzima plasmática em camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS foram significativamente maiores do que os níveis nos camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS (Figura 6), mas os níveis de atividade enzimática de ambos os grupos tratados foram elevados acima de níveis de WT. Dados semelhantes são mostrados na Figura 23.
[0183] A atividade de hGALNS medida no fígado de camundongos KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8- TBG-D8-hGALNS foi comparada com a atividade de hGALNS do fígado de camundongos WT (Figura 7A). Os camundongos tratados com AAV8- TBG-hGALNS tinham níveis 40 vezes maiores de atividade de hGALNS no fígado em comparação com os níveis de WT, enquanto os camundongos tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS tinham 8 vezes mais atividade de hGALNS no fígado do que os níveis de WT. As atividades de hGALNS no fígado de camundongos Mtol tratados com
AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS foram elevadas em relação a camundongos Mtol não tratados (tratados com PBS) (Figura 7B). Os camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS tinham níveis 50 vezes maiores de atividade de hGALNS no fígado em comparação com camundongos não tratados, enquanto os camundongos tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS tinham 8 vezes mais atividade de hGALNS no fígado do que os camundongos Mtol não tratados. Ver a Figura 12A para obter mais dados sobre os níveis de atividade de hGALNS medidos no fígado de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, respectivamente, após administração com AAV8- TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos MPS IVA KO (galns -/-) não tratados, camundongos Mtol não tratados e camundongos do tipo selvagem (n= 3-8; média ± DP).
[0184] A atividade de hGALNS também foi medida no coração de (a) camundongos WT, (b) camundongos MPS IVA KO (galns -/-) não tratados, (c) camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS, (d) camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS, (e) camundongos Mtol não tratados, (f) camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS e (g) camundongos Mtol tratado com AAV8-TBG-D8-hGALNS (Figura 7C). Para ambos os camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, os camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS e os camundongos tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS tiveram níveis maiores de atividade de hGALNS no coração em comparação com os camundongos não tratados. Ver a Figura 13B para obter mais dados sobre os níveis de atividade de hGALNS medidos no coração de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, respectivamente, após a administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com os não tratados camundongos MPS IVA KO (galns -/-), camundongos Mtol não tratados e camundongos do tipo selvagem (n= 3-8; média ± DP).
[0185] Da mesma forma, a atividade de hGALNS foi medida no osso de (a) camundongos WT, (b) camundongos MPS IVA KO (galns
-/-) não tratados, (c) camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG- hGALNS, (d) camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS, (e) camundongos Mtol não tratados, (f) camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS, e (g) camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS (Figura 7D). Para ambos os camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, os camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS e os camundongos tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS tinham níveis maiores de atividade de hGALNS no osso em comparação com os camundongos não tratados. Ver a Figura 13A para obter mais dados sobre os níveis de atividade de hGALNS medidos no osso de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, respectivamente, após a administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com os camundongos MPS IVA KO (galns -/-) não tratados, camundongos Mtol não tratados e camundongos do tipo selvagem (n = 3-8; média ± DP).
[0186] Em ambos os camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, os níveis de atividade de hGALNS no fígado, coração e osso de camundongos tratados foram elevados após a entrega de vetores AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS. Além disso, houve uma correlação direta entre as atividades da enzima hGALNS no sangue e nos ossos.
[0187] Os níveis de atividade da enzima hGALNS também foram medidos no baço de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e no baço de camundongos Mtol, respectivamente, após administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos Mtol não tratados e camundongos de tipo selvagem (n = 3-8; média ± DP) (Figura 12B). Para ambos os camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, ambos os camundongos tratados com AAV8- TBG-hGALNS e os camundongos tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS tinham níveis maiores de atividade de hGALNS no baço em comparação com os camundongos não tratados.
[0188] Além disso, os níveis de atividade da enzima hGALNS também foram medidos no pulmão de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e no pulmão de camundongos Mtol, respectivamente, após administração com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos Mtol não tratados e camundongos de tipo selvagem (n = 3-8; média ± DP) (Figura 12C). Para ambos os camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol, ambos os camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS e os camundongos tratados com AAV8- TBG-D8-hGALNS tinham níveis maiores de atividade de hGALNS no pulmão em comparação com os camundongos não tratados.
[0189] Os níveis de sulfato de queratana (KS) no sangue foram medidos. Nos camundongos KO (galns -/-), o tratamento com rAAV em ambos os grupos resultou em uma redução dos níveis de sulfato de queratana monossulfatado (KS) no plasma para os níveis de WT duas semanas após a administração (Figura 8 e Figura 14). Esses níveis reduzidos no plasma de ambos os grupos tratados com rAAV foram mantidos até a necropsia 12 semanas após a injeção. Em contraste, os níveis de KS no plasma dos camundongos KO não tratados não diminuíram e permaneceram elevados durante o período de tempo monitorado. A administração de qualquer um dos rAAV em camundongos Mtol resultou em uma redução dos níveis de sulfato de queratana monossulfatado (KS) no plasma em comparação com os níveis de WT duas semanas após o tratamento e os níveis de KS no plasma foram significativamente reduzidos em comparação com Mtol não tratado camundongos (Figuras 9A-9B e Figuras 15A- 15B). Os níveis de diHS-0S no sangue, no entanto, não diferiram entre os grupos de camundongos WT não tratados, tratados com AAV8-TBG-hGALNS, tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS e WT (Figura 10).
[0190] Os níveis de KS monossulfatado foram medidos no fígado de camundongos MPS IVA KO (galns -/-), no fígado de camundongos Mtol e no pulmão de camundongos MPS IVA KO (galns -
/-), respectivamente, tratados com AAV8-TBG -hGALNS ou AAV8-TBG- D8-hGALNS, em comparação com camundongos MPS IVA KO não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados (Figuras 16A-16C). A administração de qualquer um dos rAAV resultou em uma redução significativa de KS monossulfatado no fígado e uma redução significativa de KS monossulfatado no pulmão em comparação com camundongos não tratados. Os níveis de KS no fígado e no pulmão de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol foram quase normalizados após a administração do vetor AAV.
[0191] A avaliação histopatológica do fígado dos camundongos KO tratados mostrou a depuração completa do armazenamento de GAG nas células do revestimento do seio da face e nas células de Kupffer.
[0192] A administração de AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG- D8-hGALNS manteve altos níveis de atividade enzimática nos modelos de camundongos KO e Mtol de plasma ao longo de do período de monitoramento. Esta presença contínua de enzima circulante reduziu o KS no plasma para níveis de WT, o que é uma melhoria significativa em relação ao que foi alcançado por ERT (Tomatsu et al., Human Molecular Genetics, 2008, 17 (6): 815-824). Enquanto os níveis de KS no plasma foram normalizados duas semanas após a administração de rAAV em ambos os modelos de camundongos e para AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS, em estudos anteriores onde os camundongos KO foram tratados com ERT, os níveis de KS em o plasma não foram normalizados mesmo após 12 semanas de infusões semanais (Tomatsu et al., Human Molecular Genetics, 2008, 17(6): 815-824). Além disso, os altos níveis de enzimas combinados com um tempo de circulação mais longo aumentaram a penetração no interior terapia óssea de cartilagem, melhorando assim o armazenamento nessas regiões.
[0193] Os camundongos foram sacrificados 12 semanas após o tratamento com rAAV e os tecidos foram coletados e avaliados quanto ao armazenamento de glicosaminoglicanos (GAGs). Os tecidos foram corados com azul de toluidina. A patologia óssea foi avaliada por análise histopatológica e as pontuações da patologia são apresentadas em uma representação gráfica para camundongos MPS IVA KO (galns -/-) (Figura 11A). A Figura 11B mostra imagens de coloração das articulações do joelho (camundongos MPS IVA KO (galns -/-)).
[0194] A Figura 11C mostra imagens de coloração ampliadas 40x da cartilagem articular do fêmur para camundongos MPS IVA KO (galns -/-). Nos camundongos não tratados (painel esquerdo), as células superficiais estavam desorganizadas e os condrócitos estavam balonados e vacuolados. Adicionalmente, a estrutura da coluna estava distorcida e desorganizada. Em contraste, o tecido dos camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS mostrou células superficiais organizadas, menos condrócitos vacuolados e a manutenção da estrutura da coluna (dois painéis à direita). Estes aspectos são mostrados em maior detalhe nas Figuras 11D- 11F.
[0195] A Figura 11G mostra imagens de coloração ampliadas 40x da placa de crescimento do fêmur de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) não tratados ou tratados com rAAV. Nos camundongos não tratados (painel esquerdo), os condrócitos estavam vacuolados e a estrutura da coluna estava amplamente desorganizada e distorcida. Os condrócitos em camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS (painel do meio) também estavam vacuolados, mas a estrutura da coluna estava apenas moderadamente distorcida. Em contraste, para o tecido dos camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-D8- hGALNS (painel direito), os condrócitos estavam moderadamente vacuolados e a estrutura da coluna estava mais organizada. Estes aspectos são mostrados em maior detalhe nas Figuras 11H-11J. As Figuras 17A-17E também mostram imagens de coloração ampliada 40x da placa de crescimento do fêmur em (A) camundongos do tipo selvagem (todos os condrócitos não foram vacuolados e a estrutura da coluna estava bem organizada), (B) camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-) ( todos os condrócitos foram vacuolados e a estrutura da coluna foi amplamente desorganizada e distorcida), (C) camundongos Mtol não tratados (todos os condrócitos foram vacuolados e a estrutura da coluna foi amplamente desorganizada e distorcida), (D) camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS (os condrócitos foram moderadamente vacuolados, mas a estrutura da coluna foi melhor), e (E) camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS (os condrócitos foram moderadamente vacuolados, mas a estrutura da coluna foi parcialmente recuperada).
[0196] A Figura 18A mostra o tamanho da célula de condrócitos medido na placa de crescimento do fêmur e da tíbia de camundongos do tipo selvagem não tratados, camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8-TBG-hGALNS (galns -/-), ou camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS (galns -/-). A Figura 18B mostra o tamanho da célula de condrócitos medido na placa de crescimento do fêmur de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos Mtol não tratados, camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8- hGALNS. A Figura 18C mostra o tamanho da célula de condrócitos medido na placa de crescimento do fêmur e da tíbia de camundongos do tipo selvagem não tratados, camundongos MPS IVA KO não tratados (galns -/-), camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8- TBG-hGALNS (galns -/-), ou camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS (galns -/-). A Figura 18D mostra o tamanho da célula de condrócitos medido na placa de crescimento da tíbia de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos Mtol não tratados, camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS.
[0197] O tamanho dos condrócitos e a estrutura da coluna na placa de crescimento em camundongos MPS IVA KO e camundongos Mtol foram ambos substancialmente melhorados após a transferência do gene AAV.
[0198] A Figura 11K mostra imagens de coloração ampliadas 40x do menisco de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) não tratados ou tratados com rAAV. Nos camundongos não tratados (painel esquerdo), a maioria das células estava balonada e vacuolada. Algumas células no menisco de camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS (painel do meio) foram vacuoladas. A maioria das células no tecido de camundongos tratados com AAV8-TBG-D8- hGALNS (painel direito) não foram vacuoladas.
[0199] A Figura 11L mostra imagens de coloração ampliadas 40x do ligamento na tíbia lateral de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) não tratados ou tratados com rAAV. Nos camundongos não tratados (painel esquerdo), a maioria das células estava vacuolada. Algumas células no ligamento de camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS (dois painéis à direita) permaneceram vacuoladas.
[0200] A Figura 11M mostra imagens de coloração ampliadas 40x da base da válvula cardíaca de camundongos MPS IVA KO (galns -/-) não tratados ou tratados com rAAV. Muitas dentre as células na base da válvula mitral nos camundongos não tratados (painel esquerdo) foram vacuoladas, enquanto nenhuma célula vacuolada foi vista na base do tecido da válvula mitral de camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS (painel do meio) ou AAV8-TBG-D8-hGALNS (painel direito). Estes aspectos do tecido de camundongo não tratado são mostrados em maior detalhe na Figura 11N. Resultados semelhantes foram observados no tecido da válvula cardíaca (Figura 11O). São mostrados resultados semelhantes para camundongos Mtol na Figura 19 (painel inferior). Muitas células da válvula cardíaca nos camundongos não tratados (painel esquerdo) foram vacuoladas, enquanto nenhuma célula vacuolada foi vista no tecido da válvula cardíaca de camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS (painel do meio) ou AAV8-TBG-D8-hGALNS (painel direito). Esses aspectos do tecido de camundongo não tratado são mostrados em maior detalhe na Figura 11P.
[0201] A Figura 20 mostra a histopatologia do músculo cardíaco (ampliação de 40x) em camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos Mtol não tratados.
[0202] A válvula cardíaca e o músculo cardíaco não tinham células vacuoladas óbvias em ambos os camundongos MPS IVA KO (galns -/-) e camundongos Mtol após a transferência do gene AAV.
[0203] A Figura 21A mostra a pontuação da patologia do tecido da válvula cardíaca de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos MPS IVA KO (galns -/-), camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS. A Figura 21B mostra a pontuação da patologia do tecido da válvula cardíaca de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos Mtol não tratados, camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS. A Figura 21C mostra a pontuação da patologia do tecido de músculo cardíaco de camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos MPS IVA KO (galns -/-), camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos MPS IVA KO (galns -/-) tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS. A Figura 21D mostra a pontuação da patologia do tecido do músculo cardíaco para camundongos de tipo selvagem não tratados, camundongos Mtol não tratados, camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou camundongos Mtol tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS.
[0204] A patologia óssea foi avaliada por análise histopatológica para camundongos Mtol também. O teste t não pareado foi usado para examinar as diferenças de pontuações de patologia entre os grupos não tratados e cada um dos grupos tratados (Pontuação: 0 (Normal) – 3 (Grave)), ver Tabela 1.
[0205] Tabela 1. Pontuação de patologia no osso de camundongos Mtol (n = 2-5, média ± DP) Não Tratado com Tratado com tratadas AAV8-TBG- AAV8-TBG-D8- hGALNS hGALNS Placa de Fêmur Vacuolização 2,90 ± 0,10 1,38 ± 0,34 * 1,41 ± 0,21 * crescimento Estrutura da 2,93 ± 0,11 1,44 ± 0,33 * 1,47 ± 0,16 * coluna Tíbia Vacuolização 2,85 ± 0,21 1,56 ± 0,26 * 1,50 ± 0,29 * Estrutura da 2,75 ± 0,31 1,63 ± 0,20 * 1,41 ± 0,33 * coluna Cartilagem Fêmur Vacuolização 2,48 ± 0,34 1,38 ± 0,18 * 1,16 ± 0,33 * articular Estrutura da 2,35 ± 0,44 1,38 ± 0,18 * 1,22 ± 0,19 * coluna Tíbia Vacuolização 2,53 ± 0,16 1,19 ± 0,14 * 1,27 ± 0,21 * Estrutura da 2,44 1,38 1,21 ± 0,26 coluna Ligamento 2,80 ± 0,26 1,72 ± 0,56 * 1,66 ± 0,26 * Menisco 2,73 ± 0,34 1,41 ± 0,33 * 1,34 ± 0,26 * * p<0,05 vs não tratado
[0206] Ambos os vírus reduziram o armazenamento de GAG na cartilagem articular, ligamentos e menisco ao redor da cartilagem articular e na região da placa de crescimento na tíbia e no fêmur. A redução do armazenamento de GAG observada no osso e na cartilagem foi comparativamente maior para os camundongos tratados com AAV-TBG-D8-hGALNS.
[0207] Os tecidos ósseos, placa de crescimento, cartilagem articular, menisco, ligamento e coração foram substancialmente melhorados em camundongos tratados com rAAV. Além disso, os camundongos tratados tiveram remissão quase completa em relação a defeitos na válvula cardíaca e na base da válvula cardíaca, e nenhuma célula vacuolada óbvia foi vista tanto na base da válvula cardíaca quanto na válvula cardíaca. Os resultados mostram uma melhoria significativa em relação à ERT, uma vez que os camundongos tratados com ERT não mostraram depuração de células vacuoladas na placa de crescimento, tinham estrutura de coluna desorganizada na placa de crescimento e tinham células vacuoladas substanciais na válvula cardíaca (Tomatsu et al., Human Molecular Genetics, 2008, 17 (6): 815- 824).
[0208] O fato de que o efeito terapêutico foi observado em tecidos diferentes do que o fígado (onde as proteínas hGALNS e D8-hGALNS foram produzidas) sugere que houve correção cruzada mediada pelo receptor de manose-6-fosfato.
7.3 Exemplo 3. A terapia gênica AAV8 direcionada ao fígado melhora a patologia esquelética e cardiovascular no modelo murino de mucopolissacaridose IVA
[0209] Este exemplo se refere aos experimentos descritos e realizados em outros exemplos descritos neste documento, incluindo os Exemplos 1-2 e apresenta dados adicionais dos Exemplos 1-2. Neste exemplo, os vetores AAV8 que expressam hGALNS com ou sem um sinal de direcionamento ósseo, sob o controle do promotor globulina ligante de tiroxina (TBG) específico do fígado são avaliados e a eficácia terapêutica desses vetores AAV8 recombinantes em lesões ósseas e cardíacas em ambos os modelos de camundongos da doença MPS IVA são estudados. Os ossos e o coração são os principais órgãos afetados nesse distúrbio.
7.3.1 Resultados (a) Atividade da enzima GALNS no sangue e tecidos: a entrega de AAV-hGALNS resulta em um aumento marcante da atividade de GALNS no plasma e em vários tecidos em modelos de camundongo de MPS IVA.
[0210] Dois modelos de camundongo (MPS IVA KO e MTOL) com MPS IVA recapitulam a doença humana em termos de deficiência de atividade de hGALNS, níveis aumentados de KS no sangue e tecidos e materiais de armazenamento (vacúolos) em vários tecidos, incluindo condrócitos, meniscos, ligamentos e músculo cardíaco e válvulas. Esses biomarcadores foram amplamente utilizados para avaliar a gravidade do fenótipo e a eficácia terapêutica de várias abordagens nestes modelos de camundongo (Tomatsu, S., et al., Hum. Mol. Genet., 2008, 17, 815-824; Tomatsu, S., et al., Hum. Mol. Genet., 2003, 12, 3349-3358; Tomatsu, S., et al., Hum. Mol. Genet., 2005, 14, 3321-3335; Tomatsu, S., et al., Mol. Ther., 2010, 18, 1094-1102). Para este estudo, entregamos AAV8-TBG-hGALNSco e AAV8-TBG-D8-hGALNSco (Figura 24A) por via intravenosa em camundongos MPS IVA KO e MTOL de 4 semanas de idade em uma dose uniforme de 5 x 1013 GC/kg de peso corporal. Os camundongos foram monitorados por 12 semanas após a injeção e amostras de sangue foram coletadas a cada duas semanas para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS. Além disso, na necropsia, amostras de tecido foram retiradas de diferentes órgãos para atividade enzimática e níveis de KS, bem como articulações do joelho e válvulas cardíacas para análise histopatológica.
[0211] A atividade da enzima plasmática em camundongos MPS IVA KO e MTOL é mostrada nas Figuras 24B-24C. Nenhuma atividade de hGALNS no plasma foi detectada em camundongos MPS IVA não tratados. Duas semanas após a injeção, a atividade plasmática de hGALNS em camundongos MPS IVA KO tratados com AAV8- TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS foi significativamente aumentada, em comparação com a de camundongos de tipo selvagem. A atividade enzimática de AAV8-TBG-D8-hGALNS foi maior do que a de AAV8-TBG-hGALNS 2 semanas após a injeção; no entanto, a atividade de hGALNS no plasma não foi diferente entre esses dois vetores AAV 12 semanas após a injeção. Em camundongos MTOL tratados com ambos os vetores AAV, a atividade de hGALNS no plasma foi significativamente aumentada em comparação com a de camundongos de tipo selvagem 2 semanas após a injeção. Os níveis de atividade enzimática de camundongos tratados com AAV8-TBG-
D8-hGALNS foram maiores do que aqueles de camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS ao longo de toda a duração do estudo, sugerindo que hGALNS com um sinal de direcionamento ósseo teve circulação sanguínea prolongada, em comparação ao hGALNS nativo possivelmente devido à absorção reduzida pelos tecidos. Estes resultados demonstraram que os níveis suprafisiológicos de atividade circulante de hGALNS foram alcançados após uma única injeção de AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS em ambos os modelos de camundongos MPS IVA e os altos níveis de atividades enzimáticas foram mantidos durante o estudo.
[0212] Os níveis de atividade de hGALNS no fígado 12 semanas após a entrega IV de vetores AAV são mostrados na Figura 24J e Figura 24K. Os níveis de atividade de hGALNS em todos os camundongos MPS IVA tratados foram significativamente maiores do que em camundongos MPS IVA não tratados. Os níveis médios de atividade enzimática em camundongos MPS IVA KO, tratados com AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS, foram 49 e 9 vezes, respectivamente, mais elevados do que os níveis observados em camundongos de tipo selvagem. Em camundongos MTOL tratados com AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS, a atividade de hGALNS foi 60 e 9 vezes maior do que os níveis encontrados em camundongos de tipo selvagem. As atividades de GALNS em fígados de camundongos KO e MTOL tratados com AAV8-TBG-D8-hGALNS foram significativamente menores do que aquelas em camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS.
[0213] Os níveis de atividade de hGALNS nos tecidos de camundongos MPS IVA foram examinados para avaliar a correção cruzada potencial da deficiência de hGALNS. A atividade de hGALNS foi observada em todos os tecidos examinados, incluindo baço, pulmão, rim, osso (perna) e coração em ambos os camundongos KO e MTOL após tratamentos AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS (Figuras 24J- 24K). As atividades enzimáticas foram semelhantes ou superiores ao nível do tipo selvagem no baço e no coração, e níveis ligeiramente inferiores de atividades foram observados no pulmão e nos rins. Notavelmente, 37% e 20% das atividades enzimáticas de tipo selvagem foram observadas no osso de camundongos KO tratados com AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG-D8- hGALNS, respectivamente. Além disso, 57% e 43% das atividades enzimáticas de tipo selvagem foram observadas em camundongos MTOL tratados com esses dois vetores AAV. Estes resultados sugerem que os níveis suprafisiológicos estáveis da enzima hGALNS contribuíram para a penetração da enzima em vários tecidos, incluindo o osso de camundongos MPS IVA, após a transferência do gene AAV. Os níveis de atividade de hGALNS no osso não foram estatisticamente diferentes entre AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS. (b) Os níveis de KS monossulfatado no sangue e tecido diminuíram como resultado da entrega de AAV-GALNS
[0214] Medimos o KS monossulfatado, que é o principal componente do KS, no plasma e tecidos de camundongos MPS IVA. Os níveis de KS monossulfatado de plasma em camundongos KO e MTOL são mostrados nas Figuras 25A-25B. Antes da administração de vetores AAV, os níveis KS plasmáticos em camundongos KO não tratados foram significativamente maiores do que em camundongos de tipo selvagem (média: 41,8 vs. 16,3 ng/ml). Duas semanas após a injeção, os níveis de KS monossulfatado no plasma foram completamente normalizados para ambos os vetores AAV, e este nível foi mantido por pelo menos mais 10 semanas (na necropsia). Os níveis de KS monossulfatado foram semelhantes em camundongos do tipo selvagem e camundongos MTOL não tratados com quatro semanas de idade. Os níveis de KS monossulfatado em camundongos do tipo selvagem foram mantidos em um nível constante ao longo do estudo; no entanto, os níveis de KS monossulfatado em camundongos MTOL não tratados aumentaram gradualmente com a idade. Os camundongos MTOL tratados com qualquer um dos vetores AAV mantiveram os níveis normais durante todo o período de estudo. Às 16 semanas de idade, os níveis de KS monossulfatados em camundongos MTOL tratados com vetores AAV foram significativamente diminuídos, quando comparados com aqueles em camundongos MTOL não tratados.
[0215] Os níveis de Mono-KS em tecidos de camundongos MPS IVA são medidos. Na necropsia, o armazenamento excessivo de GAG estava presente em ambos os tecidos de camundongos KO e MTOL. A quantidade de KS monossulfatado no fígado e pulmão dos camundongos KO e MTOL diminuiu significativamente 12 semanas após a injeção de qualquer um dos vetores AAV (Figuras 25C-25D). Para avaliar o efeito desses vetores AAV que expressam hGALNS em outros níveis de GAG, os níveis de sulfato de heparano (HS) foram analisados no sangue e tecidos de camundongos MPS IVS. Ambos KO e MTOL tinham níveis normais de diHS-0S no plasma, e os níveis não foram afetados após a injeção por vetores AAV (Figura 30). Os níveis de diHS-0S nos tecidos no fígado e no pulmão também não foram alterados entre todos os grupos 12 semanas após a injeção de vetores AAV (Figura 31). (c) A entrega de vetores AAV GALNS melhorou a patologia do osso e da cartilagem em camundongos MPS IVA
[0216] Tecidos incluindo osso (fêmur e tíbia) e coração (músculo e válvula) foram avaliados a partir de camundongos MPS IVA 12 semanas após a injeção de AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG- D8-hGALNS.
[0217] Camundongos MPS IVA KO e MTOL não tratados com 16 semanas de idade exibiram vacúolos de armazenamento de GAG na placa de crescimento do fêmur e tíbia (cartilagem hialina) (Figura 27A), disco articular (Figura 27B), ligamento ao redor da articulação do joelho (Figura 32A), e menisco (Figura 32B). A placa de crescimento também exibiu uma estrutura de coluna desorganizada com condrócitos balonados e vacuolados (Figura 27A-27B). Em camundongos KO tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, a placa de crescimento, cartilagem articular, ligamentos e menisco na articulação do joelho tiveram uma redução parcial do material de armazenamento e a estrutura da coluna de condrócitos foi melhorada, mas permaneceu desorganizada e distorcida. Em camundongos MTOL tratados com esses vetores AAV, a placa de crescimento, cartilagem articular, ligamentos e menisco na articulação do joelho tiveram maior redução observável de armazenamento, e a estrutura da coluna da placa de crescimento e cartilagem articular mostraram maior recuperação do que em camundongos MTOL não tratados.
[0218] Para avaliar objetivamente a melhora da vacuolização nas células da cartilagem da placa de crescimento, o tamanho das células dos condrócitos foi quantificado nas lesões da placa de crescimento de camundongos KO e MTOL (4C). Observamos uma redução moderada do tamanho dos condrócitos nessas lesões da placa de crescimento, que atingiu significância estatística nos camundongos MTOL. Os camundongos MPS IVA não tratados exibiram vacúolos de armazenamento de GAG em válvulas cardíacas e músculos. AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS forneceram depuração quase completa nestas lesões cardíacas de camundongos KO e MTOL tratados (Figura 27A-27B). (d) Circulação de anticorpos anti-hGALNS
[0219] No geral, a melhora da patologia óssea em camundongos KO foi menos notável quando comparada à de camundongos MTOL 12 semanas após a injeção de vetores AAV8. Para investigar a possibilidade de uma resposta humoral para hGALNS, os títulos de anticorpos para hGALNS foram medidos por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). O método ELISA indireto detectou anticorpos anti-hGALNS no plasma usando rhGALNS de comprimento total revestido na placa. O plasma de camundongos KO tratados com vetores AAV mostrou níveis significativamente mais elevados de anticorpos anti-hGALNS circulantes, em comparação com os de outros grupos (0,50 ± 0,38 ou 0,62 ± 0,43 unidade de densidade óptica (DO) para KO tratados com AAV8-TBG-hGALNS ou
AAV8-TBG-D8-hGALNS) (Figura 28). Os anticorpos circulantes anti- hGALNS não foram detectados em camundongos KO de tipo selvagem, não tratados e MTOL.
7.3.2 MATERIAIS E MÉTODOS (a) Desenvolvendo o cassete de expressão AAV hGALNS
[0220] Para desenvolver um vetor AAV8 com hGALNS, determinamos a sequência otimizada por códons de hGALNS. A sequência otimizada de 1569 bp, traduzida em 526 aminoácidos, sob o controle do promotor TBG específico do fígado, foi empacotada no capsídeo de AAV8. No plasmídeo de vetor com o sinal de direcionamento ósseo, uma sequência de octapeptídeo de ácido aspártico (D8) foi inserida após o peptídeo de sinal N-terminal de hGALNS, produzindo hGALNS de direcionamento ósseo com alta afinidade para a matriz óssea principal, hidroxiapatitas (Figura 24A). A produção de GALNS por estes plasmídeos de vetor AAV foi confirmada após a realização de experiências de transfecção com células Huh-7. Os níveis de atividade de hGALNS intra e extracelular da estrutura de leitura aberta otimizada por códon foram semelhantes aos produzidos pela sequência de codificação de hGALNS nativa (Figuras 29A-29B). (b) Projeto de cassete de expressão e produção de vetor AAV
[0221] Os cassetes de expressão contendo os transgenes GALNS contendo nativos e D8 foram concebidas para empacotamento no vector AAV8 (Figura 28). O sinal de direcionamento ósseo, uma sequência de octapeptídeo de ácido aspártico (D8), foi inserida após o peptídeo de sinal N-terminal de hGALNS. O projeto incluiu um promotor globulina de ligação de tiroxina (TBG) específico do fígado junto com uma cauda de poliadenilação de betaglobulina de coelho (polyA) Usamos uma sequência de hGALNS otimizada por códon para ambos os vetores para os estudos em camundongos. Confirmamos a atividade enzimática GALNS desses plasmídeos de cassete de expressão em um experimento de transfecção usando células Huh-7. Determinamos os níveis de atividade tanto no lisado celular quanto no sobrenadante 48 horas após a transfecção (Figuras 29A-29B). Os níveis de atividade de GALNS do construto otimizado por códon foram semelhantes aos produzidos pela sequência de codificação de hGALNS nativa.
[0222] Os vetores AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS foram gerados seguindo uma versão reduzida dos protocolos de produção de vetor GMP proprietários em REGENXBIO (Rockville, MD). Resumidamente, células HEK293 (RGX293) foram transfectadas triplamente com o plasmídeo auxiliar, plasmídeo de capsídeo de AAV8 e o plasmídeo transgene contendo o plasmídeo hGALNS/D8- hGALNS. Os vetores empacotados foram purificados a partir do sobrenadante da cultura de células usando cromatografia de afinidade e titulados usando o método Digital Droplet PCR (BioRad). (c) Modelos murinos e projeto de estudo in vivo
[0223] Testamos o potencial terapêutico de AAV8-TBG- hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS usando dois modelos murinos MPS IVA (Tomatsu et al., Hum Mol Genet 2003; 12(24):3349-3358; Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 2005; 14, 3321-3335). O primeiro tipo é um modelo de camundongo knock-out de Galns (KO: Galns -/-) com interrupção do gene ((Tomatsu et al., Hum Mol Genet 2003; 12(24):3349-3358). O segundo é um modelo murino (MTOL: Galnstm(hC79S.mC76S)slu) tolerante ao GALNS humano contendo um transgene expressando hGALNS no íntron 1 e uma mutação de sítio ativo (C76S) adjacente ao exon 2, introduzindo assim tanto a sequência de codificação de hGALNS inativo quanto a mutação de sítio ativo C79S e a mutação C76S no interior no gene Galns murino por mutagênese direcionada (Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 2005; 14, 3321-3335). Ambos os modelos não tinham atividade enzimática detectável no sangue e tecidos e mostraram o acúmulo de materiais de armazenamento principalmente nas células reticuloendoteliais de Kupffer, músculo cardíaco de válvulas do coração e condrócitos, incluindo placa de crescimento e cartilagem articular.
[0224] Tínhamos descrito anteriormente o desenvolvimento de dois modelos murinos MPS IVA, camundongo knockout MPS IVA (Galns-/-) (Tomatsu et al., Hum Mol Genet 2003; 12 (24):3349-3358) e camundongo MPS IVA tolerante a humanos Proteína GALNS (Galnstm(hC79S.mC76S)slu) (Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 2005; 14, 3321-3335) in no fundo C57BL/6. O modelo de camundongo knock-out para (KO: Galns-/-) foi desenvolvido pela interrupção direcionada do gene GALNS(Tomatsu et al., Hum Mol Genet 2003; 12(24):3349-3358). O modelo de camundongo tolerante a GALNS humano (MTOL:Galnstm (hC79S.mC76S)slu) contém um transgene que expressa hGALNS no íntron 1 e uma mutação de sítio ativo (C76S) adjacente ao exon 2, introduzindo assim a sequência de codificação de hGALNS inativa com mutação C79S de sítio ativo (Tomatsu et al., Hum. Mol. Genet. 2005; 14, 3321-3335). Ambos os modelos de camundongos não tinham atividade enzimática detectável no sangue e tecidos e mostraram o acúmulo de materiais de armazenamento principalmente no interior das células reticuloendoteliais de Kupffer, válvulas cardíacas e músculos e condrócitos, incluindo placa de crescimento e cartilagem articular.
[0225] A genotipagem para as coortes experimentais foi realizada por PCR no dia 14. Camundongos MPS IVA homozigotos com 4 semanas de idade foram tratados com o vetor AAV8, por via intravenosa, a uma dose uniforme de 5 x 1013 GC/kg. Outra coorte de camundongos MPS IVA, bem como companheiros de ninhada C57BL/6 não afetados, foram administrados com solução salina tamponada com fosfato (PBS). O volume total de administração da dose foi de aproximadamente 100 μl por camundongo. Todos os cuidados e experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children.
(d) Coleta de sangue e tecidos
[0226] Aproximadamente 100 μl de sangue foram coletados em tubos com EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) a cada duas semanas de todos os animais do estudo. O sangue foi centrifugado a 8. 000 rpm durante 10 min e o plasma separado foi mantido a - 20°C até a realização do ensaio da enzima GALNS e do ensaio GAG. Com 16 semanas de idade, os camundongos foram sacrificados em câmara de CO2 e perfundidos com 20 ml de solução salina a 0,9%. Fígado, rim, pulmão, baço, coração e articulação do joelho foram coletados e armazenados a -80°C até o processamento para o ensaio da enzima GALNS e ensaio GAG. Além disso, várias amostras de tecido foram coletadas e armazenadas em formalina tamponada neutra a 10% para análise histopatológica. (e) Ensaio de atividade GALNS
[0227] A atividade de GALNS no sangue e nos tecidos foi determinada conforme descrito anteriormente (Toietta, G., et al. Hum. Gene Ther. 2001; 12, 2007-2016). O tecido congelado foi homogeneizado com tampão de homogeneização consistindo em 25 mmol/l de Tris-HCl, pH 7,2 e 1 mmol/l de fluoreto de fenilmetilsulfonil usando um homogeneizador. Tecido lisado ou plasma, e 22 mM de 4-metilumbeliferil- -galactopiranosídeo-6- sulfato (Research Products International, Mount Prospect, IL, EUA) em NaCl a 0,1 M, acetato de sódio a 0,1 M, pH 4,3 foram incubados a 37°C durante 16 h. Em seguida, 10 mg/ml - galactosidase de Aspergillus oryzae (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em NaCl a 0,1 M, acetato de sódio a 0,1 M, pH 4,3, foi adicionado à amostra de reação, e a incubação adicional foi a 37°C durante 2 horas. A amostra foi transferida para a solução de parada (glicina a 1 M, NaOH, pH 10,5), e a placa foi lida em excitação 366 nm e emissão 450 nm em um leitor de placas Perkin Elmer Victor X4 (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). A atividade foi expressa como nanomoles de 4-metilumbeliferona liberada por hora por microlitro de plasma ou miligrama de proteína. A concentração de proteína foi determinada pelo kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). (f) Extração de GAG do tecido
[0228] A extração de GAG de vários tecidos de camundongo foi modificada a partir do desenvolvido por Mochizuki et al. (Mochizuki, H., et al. J. Biol. Chem. 2008; 283, 31237-31245). Resumidamente, os tecidos excisados foram congelados em nitrogênio líquido e homogeneizados com acetona usando um homogeneizador. O pó obtido foi seco sob vácuo de centrifugação. O pó de tecido desengordurado foi suspenso em NaOH a 0,5 M e incubado a 50°C durante 2 h para remover as cadeias GAG de sua proteína central. Após neutralização com HCl a 1 M, foi adicionado NaCl a uma concentração final de 3 M. Os materiais insolúveis foram removidos por centrifugação, e o pH do sobrenadante foi ajustado abaixo de 1,0 com HCl a 1 M. Os nucleotídeos precipitados foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi neutralizado com NaOH a 1M. O GAG bruto foi precipitado pela adição de dois volumes de etanol contendo 1,3% de acetato de potássio. Após centrifugação, o precipitado foi dissolvido em água destilada. (g) Ensaio GAG
[0229] O nível de GAG no sangue e no tecido foi medido por LC-MS/MS, conforme descrito anteriormente (Oguma, T., et al. Biomed. Chromatogr. 2007; 21, 356-362; Oguma, T., et al. Anal. Biochem. 2007; 368, 79-86; Shimada, T., et al. JIMD. Rep. 2014; 16, 15-24; Shimada, T., et al. JIMD. Rep. 2015; 21, 1-13; Kubaski, F., et al. J. Inherit. Metab. Dis. 2017; 40, 151-158). Resumidamente, Tris-HCl a 50 mM (pH 7,0) e a amostra foram colocados em uma placa de filtro ômega 10K de 96 poços (Pall Corporation, Port Washington, NY, EUA) em uma placa receptora de 96 poços. Amostras centrifugadas durante 15 min a 2.500 g. A placa de filtro foi transferida para uma nova placa receptora, e uma mistura de coquetel de Tris-HCl a 50 mM (pH 7,0), 5 μg/mL de condrosina como padrão interno (IS), 1 mU de heparitinase e 1 mU de queratanase II foi adicionada a placa de filtro. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37°C durante a noite. Em seguida, as amostras foram centrifugadas durante 15 min a
2.500 g. O aparelho consistia em um sistema 1290 Infinity LC com um espectrômetro de massa 6460 triplo quádruplo (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA). Os dissacarídeos foram separados em uma coluna Hypercarb (2,0 mm id 50 mm de comprimento; partículas de 5 μm; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), termostatizada a 60°C. A fase móvel foi uma eluição gradiente de acetato de amônio a 5 mM, pH 11,0 (solução A) a 100% de acetonitrila (solução B). A taxa de fluxo foi de 0,7 ml/min, e o gradiente foi o seguinte: 0 min 100% de solução A, 1 min 70% de solução A, 2 min 70% de solução A, 2,20 min 0% de solução A, 2,60 min 0% de solução A, 2,61 min 100% de solução A, 5 min 100% de solução A. O espectrômetro de massa foi operado com ionização por eletrospray no modo de íon negativo (tecnologia Agilent Jet Stream). Íons precursores e produtos específicos, m/z, foram usados para quantificar cada dissacarídeo, respectivamente (IS, 354,3→193,1; KS monossulfatado, 462→97; HS- 0S 378,3→175,1). O volume de injeção foi de 10 μl com um tempo de execução de 5 min por amostra. (h) Coloração com azul de toluidina e avaliação patológica
[0230] A coloração com azul de toluidina foi realizada conforme descrito anteriormente (Tomatsu, S., et al. Mol. Genet. 2005, 14, 3321-3335). Resumidamente, a articulação do joelho e a válvula cardíaca mitral foram coletadas de camundongos MPS IVA e WT com 16 semanas de idade para avaliar os níveis de grânulos de armazenamento por microscopia de luz. Os tecidos foram fixados em paraformaldeído a 2%, glutaraldeído a 4% em PBS e pós-fixados em tetróxido de ósmio e incorporado em resina de Spurr. Em seguida, foram examinadas seções coradas com azul de toluidina com 0,5 µm de espessura. Para avaliar o tamanho das células de condrócitos (vacuolização) na placa de crescimento do fêmur ou tíbia, aproximadamente 300 condrócitos na área proliferativa foram medidos em cada camundongo pelo software Image J, e os resultados foram expressos como mudança de dobra do grupo do tipo selvagem. (i) Detecção de anticorpos contra GALNS por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
[0231] Um método ELISA indireto foi usado para detectar anticorpos contra GALNS no plasma de camundongos tratados e não tratados, conforme descrito anteriormente (Tomatsu, S., et al. Murmurar. Mol. Genet. 2003; 12, 961-973). Resumidamente, a placa de microtitulação de 96 poços foi revestida durante a noite com 2 μg/ml de rhGALNS purificado (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA) em Na2CO3 a 15 mM, NaHCO3 a 35mM, NaN3 a 0,02%, pH 9,6. Os poços foram lavados três vezes com TBS-T (Tris a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 150 mM, TWEEN 20 a 0,05%) e, em seguida, bloqueados durante 1 h à temperatura ambiente com albumina de soro bovino a 3% em PBS (pH 7,2). Após lavagem três vezes com TBS-T, uma diluição de 100 vezes de plasma de camundongo em TBS-T foi adicionada aos poços e incubada a 37°C durante 2,5 h. Os poços foram lavados quatro vezes com TBS-T, em seguida, TBS-T contendo uma diluição 1:1.000 de IgG de cabra anticamundongo conjugado com peroxidase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) foi adicionado aos poços e incubado em temperatura ambiente durante 1 h. Os poços foram lavados três vezes com TBS-T e duas vezes com TBS (Tris a 10 mM, pH 7,5, NaCl a 150 mM). Substrato de peroxidase (solução ABTS, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foi adicionado (100 μl por poço), e as placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 30 min. A reação foi interrompida com a adição de SDS a 1% e as placas lidas em densidade ótica de 410 nm em um leitor de placas Perkin Elmer Victor X4 (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA).
(j) Análise estatística
[0232] Todos os dados foram expressos em média e desvio padrão (DP). Testes de comparação múltipla foram realizados por ANOVA de uma via com o teste post-hoc de Bonferroni usando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). A significância estatística da diferença foi considerada como p <0,05.
7.4 Exemplo 4. Avaliar o efeito da exposição prolongada à enzima na patologia óssea
[0233] Os estudos a seguir são conduzidos para avaliar o efeito da exposição prolongada às enzimas na patologia óssea. Para este estudo, AAV8-TBG-hGALNSco é administrado em camundongos MPSIVA KO de 4 semanas de idade em uma dose de 5 x 1013 GC/kg de peso corporal. Os grupos de controle são camundongos MPS IVA KO não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados da mesma idade. Três grupos de camundongos, 6-10 por grupo, são usados neste estudo. Os camundongos são monitorados por 24 ou 48 semanas e amostras de sangue são coletadas a cada duas semanas para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS. Além disso, na necropsia, amostras de tecido são retiradas de diferentes órgãos para atividade enzimática e níveis de KS, bem como articulações do joelho e válvulas cardíacas para análise histopatológica.
[0234] Da mesma forma, AAV8-TBG-hGALNSco é administrado em camundongos MTOL de 4 semanas de idade a uma dose de 5 x 1013 GC/kg de peso corporal. Os grupos de controle incluem camundongos MTOL não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados da mesma idade. Três grupos de camundongos, 6-10 por grupo, são usados neste estudo. Os camundongos são monitorados por 24 ou 48 semanas e amostras de sangue são coletadas a cada duas semanas para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS. Além disso, na necropsia, amostras de tecido são retiradas de diferentes órgãos para atividade enzimática e níveis de KS, bem como articulações do joelho e válvulas cardíacas para análise histopatológica.
7.5 Exemplo 5. Estudo neonatal: avaliar o efeito da intervenção anterior na patologia óssea
[0235] Os estudos a seguir são conduzidos em camundongos neonatais para avaliar o efeito da intervenção anterior na patologia óssea. Para este estudo, AAV8-TBG-hGALNSco é administrado em camundongos neonatais MPSIVA KO em uma dose de 5 x 1013 GC/kg de peso corporal. Os grupos de controle incluem camundongos MPS IVA KO não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados da mesma idade. Os camundongos são escarificados com 16 semanas de idade e amostras de sangue são coletadas a cada duas semanas para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS. Além disso, na necropsia, amostras de tecido são retiradas de diferentes órgãos para atividade enzimática e níveis de KS, bem como articulações do joelho e válvulas cardíacas para análise histopatológica.
[0236] Da mesma forma, administramos AAV8-TBG-hGALNSco em camundongos MTOL neonatais a uma dose de 5 x 1013 GC/kg de peso corporal. Os grupos de controle incluem camundongos MTOL não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados da mesma idade. Três grupos de camundongos, 6 por grupo, são usados neste estudo. Os camundongos são escarificados com 16 semanas de idade e amostras de sangue são coletadas a cada duas semanas para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS. Além disso, na necropsia, amostras de tecido são retiradas de diferentes órgãos para atividade enzimática e níveis de KS, bem como articulações do joelho e válvulas cardíacas para análise histopatológica.
7.6 Exemplo 6. Nova avaliação de cassete de expressão
[0237] Os estudos a seguir são conduzidos para avaliar construções de promotores otimizados para eficácia melhorada. Para este estudo, AAV8-TBG-hGALNSco, AAV8-CAG-hGALNSco, AAV8-
Promotor 1-hGALNSco, AAV8-Promotor 2-hGALNSco, AVV9-Promotor 2- hGALNSco são administrados em camundongos MPSIVA KO de 4 semanas de idade em uma dose de 1 x 1013 GC/kg de peso corporal (10 camundongos por grupo). Os grupos de controle incluem camundongos MPS IVA KO não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados da mesma idade. Os camundongos são monitorados por 12 ou 48 semanas e amostras de sangue são coletadas a cada duas semanas para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS. Além disso, na necropsia, amostras de tecido são retiradas de diferentes órgãos para atividade enzimática e níveis de KS, bem como articulações do joelho e válvulas cardíacas para análise histopatológica.
7.7 Exemplo 7. Estudo de terapia gênica AAV de estágio final
[0238] Os estudos a seguir são conduzidos para avaliar a eficácia da terapia gênica AAV em estágio avançado. Para este estudo, AAV-TBG-hGALNSco, AAV-CAG-hGALNSco, AAV-Promotor 1- hGALNSco, AAV-Promotor 2-hGALNSco, AVV-Promotor 2-hGALNSco são administrados em camundongos MPSIVA KO de 8-10 semanas de idade (5 camundongos por grupo). Camundongos MPS IVA KO não tratados são usados como controle. Os camundongos são monitorados por um período de tempo e amostras de sangue são coletadas a cada duas semanas para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS. Além disso, na necropsia, amostras de tecido são retiradas de diferentes órgãos para atividade enzimática e níveis de KS, bem como articulações do joelho e válvulas cardíacas para análise histopatológica.
[0239] Da mesma forma, AAV-TBG-hGALNSco, AAV-CAG- hGALNSco, AAV-Promotor 1-hGALNSco, AAV-Promotor 2-hGALNSco, AVV- Promotor 2-hGALNSco são administrados em camundongos MTOL de 8- 10 semanas de idade (5 camundongos por grupo). Camundongos MTOL não tratados são usados como controle. Os camundongos são monitorados por um período de tempo e amostras de sangue são coletadas a cada duas semanas para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS. Além disso, na necropsia, amostras de tecido são retiradas de diferentes órgãos para atividade enzimática e níveis de KS, bem como articulações do joelho e válvulas cardíacas para análise histopatológica.
7.8 Exemplo 8. Estudo de comparação sobre o efeito de AAV8- TBG-hGALNS, AAV8-TBG-D8-hGALNS AAV8-CAG-hGALNS e AAV8-CAG-D8- hGALNS em uma dose alta e uma dose baixa
[0240] Os seguintes estudos foram realizados para avaliar o efeito de AAV8-TBG-hGALNS, AAV8-TBG-D8-hGALNS, AAV8- CAG-hGALNS e AAV8-CAG-D8-hGALNS em uma dose alta e uma dose baixa.
[0241] Para este estudo, administramos por via intravenosa AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS em camundongos MPSIVA KO de 4 semanas de idade (n≥4 por grupo) em uma dose alta (2 x 1014 GC/kg de peso corporal), ou uma dose baixa (5 x 1013 GC/kg de peso corporal). Também administramos AAV8-CAG-hGALNS por via intravenosa e AAV8-CAG-D8-hGALNS em camundongos MPSIVA KO com 4 semanas de idade (n≥4 por grupo) em uma dose baixa (5 x 1013 GC/kg de peso corporal). Os grupos de controle incluem camundongos MPS IVA KO não tratados e camundongos de tipo selvagem não tratados da mesma idade. Os camundongos foram monitorados por 12 semanas e amostras de sangue (plasma) foram coletadas quinzenalmente para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS.
[0242] Para este estudo, administramos por via intravenosa AAV8-TBG-hGALNS e AAV8-TBG-D8-hGALNS em camundongos MTOL de 4 semanas de idade (n≥4 por grupo) em uma dose alta (2 x 1014 GC/kg de peso corporal), ou uma dose baixa (5 x 1013 GC/kg de peso corporal). Também administramos AAV8-CAG-hGALNS por via intravenosa e AAV8-CAG-D8-hGALNS em camundongos MTOL com 4 semanas de idade (n≥4 por grupo) em uma dose baixa (5 x 1013 GC/kg de peso corporal). Camundongos MTOL não tratados são usados como controle. Os camundongos foram monitorados por 12 semanas e amostras de sangue foram coletadas quinzenalmente para analisar a atividade enzimática e os níveis de KS.
7.8.1 Resultados (a) Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MPS IVA KO administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8- CAG-hGALNS ou AAV8-CAG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[0243] As atividades da enzima hGALNS plasmática em camundongos MPSIVA KO administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS ou AAV8-CAG-D8-hGALNS são mostradas nas FIGs. 33-35. Duas semanas após a injeção, atividades aumentadas de hGALNS no plasma foram detectadas em camundongos AAV8-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados . A atividade enzimática de AAV8-CAG-D8-hGALNS foi maior do que a de AAV8-CAG-hGALNS 2 semanas após a injeção. (b) Atividades da enzima hGALNS no fígado de camundongos MPS IVA KO administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8- CAG-hGALNS ou AAV8-CAG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[0244] As atividades da enzima hGALNS no fígado de camundongos MPSIVA KO administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS ou AAV8-CAG-D8-hGALNS são mostradas nas FIGs. 36. Atividades aumentadas de hGALNS do fígado foram detectadas em camundongos tratados com AAV8-D8-hGALNS e AAV8- hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados . (c) Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MTOL administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8- CAG-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[0245] As atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MTOL administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS são mostradas na FIG. 37.
(d) Atividades da enzima hGALNS no fígado de camundongos MTOL administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8- CAG-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[0246] As atividades da enzima GALNS no fígado de camundongos MTOL administrados com 5 x 1013 GC/kg de peso corporal de AAV8-CAG-hGALNS são mostradas na FIG. 38. Atividades aumentadas de hGALNS do fígado foram detectadas em camundongos tratados com AAV8-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados . (e) Atividades da enzima hGALNS no plasma de camundongos MPS IVA KO administrados com 2 x 1014 GC/kg de peso corporal de AAV8- TBG-hGALNS, ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[0247] As atividades da enzima hGALNS em camundongos MPSIVA KO administrados com 2x 1014 GC/kg de peso corporal de AAV8-TBG-hGALNS ou AAV8-TBG-D8-hGALNS são mostradas nas FIGs. 39-40. (f) Atividades da enzima hGALNS no fígado de camundongos MPS IVA KO administrados com 2 x 1014 GC/kg de peso corporal de AAV8- TBG-hGALNS, ou AAV8-TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados.
[0248] As atividades da enzima hGALNS no fígado de camundongos MPSIVA KO administrados com 2 x 1014 GC/kg de peso corporal de AAV8-TBG-hGALNS, ou AAV8-TBG-D8-hGALNS são mostradas nas FIGs. 41. Atividades aumentadas de hGALNS do fígado foram detectadas em camundongos tratados com AAV8-TBG-hGALNS, ou AAV8- TBG-D8-hGALNS, em comparação com camundongos de tipo selvagem não tratados .
8. TABELA DE SEQUÊNCIAS
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQK 1 Proteína do
QDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHD capsídeo de
KAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNL AAV8
YSEPRPIGTRYLTRNL 2 GALNS atggcggcggttgtcgcggcgacgaggtggtggcagct humano gttgctggtgctcagcgccgcggggatgggggcctcgg (hGALNS) gcgccccgcagccccccaacatcctgctcctgctcatg gacgacatgggatggggtgacctcggggtgtatggaga gccctccagagagaccccgaatttggaccggatggctg cagaagggctgcttttcccaaacttctattctgccaac cctctgtgctcgccatcgagggcggcactgctcacagg acggctacccatccgcaatggcttctacaccaccaacg
cccatgccagaaacgcctacacaccgcaggagattgtg ggcggcatcccagactcggagcagctcctgccggagct tctgaagaaggccggctacgtcagcaagattgtcggca agtggcatctgggtcacaggccccagttccaccccctg aagcacggatttgatgagtggtttggatcccccaactg ccactttggaccttatgacaacaaggccaggcccaaca tccctgtgtacagggactgggagatggttggcagatat tatgaagaatttcctattaatctgaagacgggggaagc caacctcacccagatctacctgcaggaagccctggact tcattaagagacaggcacggcaccacccctttttcctc tactgggctgtcgacgccacgcacgcacccgtctatgc ctccaaacccttcttgggcaccagtcagcgagggcggt atggagacgccgtccgggagattgatgacagcattggg aagatactggagctcctccaagacctgcacgtcgcgga caacaccttcgtcttcttcacgtcggacaacggcgctg ccctcatttccgcccccgaacaaggtggcagcaacggc ccctttctgtgtgggaagcagaccacgtttgaaggagg gatgagggagcctgccctcgcatggtggccagggcacg tcactgcaggccaggtgagccaccagctgggcagcatc atggacctcttcaccaccagcctggcccttgcgggcct gacgccgcccagcgacagggccattgatggcctcaacc tcctccccaccctcctgcagggccggctgatggacagg cctatcttctattaccgtggcgacacgctgatggcggc caccctcgggcagcacaaggctcacttctggacctgga ccaactcctgggagaacttcagacagggcattgatttc tgccctgggcagaacgtttcaggggtcacaactcacaa tctggaagaccacacgaagctgcccctgatcttccacc tgggacgggacccaggggagaggttccccctcagcttt gccagcgccgagtaccaggaggccctcagcaggatcac ctcggtcgtccagcagcaccaggaggccttggtccccg
cgcagccccagctcaacgtgtgcaactgggcggtcatg aactgggcacctccgggctgtgaaaagttagggaagtg tctgacacctccagaatccattcccaagaagtgcctct ggtcccactag 3 hGALNSco atggctgctgttgttgccgctaccagatggtggcagct (Otimizado gctgctggttctgtctgccgctggaatgggagcttctg por Códon ) gtgctccccagcctcctaacattctgctgctgctcatg gacgacatgggctggggcgatctgggagtgtatggcga gcctagcagagagacacccaacctggatagaatggccg ccgagggcctgctgttccccaatttctacagcgccaat cctctgtgcagcccctctagagctgctctgctgacagg cagactgcccatcagaaacggcttctacaccaccaacg ctcacgcccggaatgcctacacaccccaagagatcgtt ggcggcatccccgattctgagcagctcctgcctgagct gctgaagaaggccggctacgtcagcaagatcgtcggca aatggcacctgggccacagacctcagtttcaccctctg aagcacggcttcgacgagtggttcggcagccccaattg tcacttcggcccctacgacaacaaggccagacctaaca tccccgtgtacagagactgggagatggtcggacggtac tacgaggaattccccatcaacctgaaaaccggcgaggc caatctgacccagatctacctgcaagaggccctggact tcatcaagcggcaggccagacaccatcctttctttctg tactgggccgtcgacgccacacacgcccctgtgtatgc cagcaagccttttctgggcaccagccagcgtggcagat atggcgacgccgtgcgggaaatcgatgacagcatcggc aagatcctggaactgctgcaggatctgcacgtggccga caacaccttcgtgttcttcaccagcgacaacggcgctg ccctgatttctgctcctgagcaaggcggcagcaacggc ccatttctgtgtggcaagcagaccacctttgaaggcgg
catgagagagcctgctctggcttggtggcctggacatg tgacagccggacaagtgtctcaccagctgggcagcatc atggacctgtttaccacctctctggccctggccggact gacacctccatctgatagagccatcgacggcctgaacc tgctgcctacactgcttcagggcagactgatggacaga cccatcttctactaccggggcgacaccctgatggccgc tacactgggacagcacaaggcccacttttggacctgga ccaacagctgggagaacttccggcagggcatcgacttt tgccctggccagaatgtgtccggcgtgaccacacacaa tctggaagatcacaccaagctgcccctgatctttcacc tgggcagagatcccggcgagagattccctctgtctttt gccagcgccgagtaccaagaagccctgagcagaatcac ctccgtggtgcagcagcaccaagaggctctggttccag ctcagccccagctgaacgtgtgtaattgggccgtgatg aactgggcccctcctggatgtgaaaagctgggcaagtg tctgacccctcctgagagcatccccaagaaatgcctgt ggtcccactga 4 D8-hGALNS accgccatgcggggtccgagcggggctctgtggctgct cctggctctgcgcaccgtgctcggatcagatgatgatg atgatgatgatgatgccgaggcagaaaccggtgccccg cagccccccaacatcctgctcctgctcatggacgacat gggatggggtgacctcggggtgtatggagagccctcca gagagaccccgaatttggaccggatggctgcagaaggg ctgcttttcccaaacttctattctgccaaccctctgtg ctcgccatcgagggcggcactgctcacaggacggctac ccatccgcaatggcttctacaccaccaacgcccatgcc agaaacgcctacacaccgcaggagattgtgggcggcat cccagactcggagcagctcctgccggagcttctgaaga aggccggctacgtcagcaagattgtcggcaagtggcat
ctgggtcacaggccccagttccaccccctgaagcacgg atttgatgagtggtttggatcccccaactgccactttg gaccttatgacaacaaggccaggcccaacatccctgtg tacagggactgggagatggttggcagatattatgaaga atttcctattaatctgaagacgggggaagccaacctca cccagatctacctgcaggaagccctggacttcattaag agacaggcacggcaccacccctttttcctctactgggc tgtcgacgccacgcacgcacccgtctatgcctccaaac ccttcttgggcaccagtcagcgagggcggtatggagac gccgtccgggagattgatgacagcattgggaagatact ggagctcctccaagacctgcacgtcgcggacaacacct tcgtcttcttcacgtcggacaacggcgctgccctcatt tccgcccccgaacaaggtggcagcaacggcccctttct gtgtgggaagcagaccacgtttgaaggagggatgaggg agcctgccctcgcatggtggccagggcacgtcactgca ggccaggtgagccaccagctgggcagcatcatggacct cttcaccaccagcctggcccttgcgggcctgacgccgc ccagcgacagggccattgatggcctcaacctcctcccc accctcctgcagggccggctgatggacaggcctatctt ctattaccgtggcgacacgctgatggcggccaccctcg ggcagcacaaggctcacttctggacctggaccaactcc tgggagaacttcagacagggcattgatttctgccctgg gcagaacgtttcaggggtcacaactcacaatctggaag accacacgaagctgcccctgatcttccacctgggacgg gacccaggggagaggttccccctcagctttgccagcgc cgagtaccaggaggccctcagcaggatcacctcggtcg tccagcagcaccaggaggccttggtccccgcgcagccc cagctcaacgtgtgcaactgggcggtcatgaactgggc acctccgggctgtgaaaagttagggaagtgtctgacac
ctccagaatccattcccaagaagtgcctctggtcccac tagctcga 5 D8-GALNSco atgagaggaccatctggtgctctgtggctgctgctggc (Otimizado tctgagaacagtgctgggcagcgacgacgatgatgacg por Códon) atgacgacgccgaggctgaaacaggtgctccccagcct cctaacatcctgctgctgctcatggacgatatgggctg gggcgatctgggagtgtatggcgagcctagcagagaga cacccaacctggatagaatggccgccgagggcctgctg ttccccaatttctacagcgccaatcctctgtgcagccc ctctagagctgctctgctgacaggcagactgcccatca gaaacggcttctacaccaccaacgctcacgcccggaat gcctacacaccccaagagatcgttggcggcatccccga ttctgaacagctgctgcctgagctgctgaagaaggccg gctacgtcagcaagatcgtcggcaaatggcacctgggc cacagacctcagtttcaccctctgaagcacggcttcga cgagtggttcggcagccccaattgtcacttcggcccct acgacaacaaggccagaccaaacatccccgtgtacaga gactgggagatggtcggacggtactacgaggaattccc catcaacctgaaaaccggcgaggccaatctgacccaga tctacctgcaagaggccctggacttcatcaagcggcag gccagacaccatcctttctttctgtactgggccgtcga cgccacacacgcccctgtgtatgccagcaagccttttc tgggcaccagccagcgtggcagatatggcgacgccgtg cgggaaatcgatgacagcatcggcaagatcctggaact gctgcaggatctgcacgtggccgacaacaccttcgtgt tcttcaccagcgacaacggcgctgccctgatttctgct cctgagcaaggcggcagcaacggcccatttctgtgtgg caagcagaccacctttgaaggcggcatgagagagcctg ctctggcttggtggcctggacatgtgacagccggacaa
gtgtctcaccagctgggctccatcatggacctgtttac cacctctctggccctggccggactgacacctccatctg atagagccatcgacggcctgaacctgctgcctacactg cttcagggcagactgatggacagacccatcttctacta ccggggcgacaccctgatggccgctacactgggacagc acaaggcccacttttggacctggaccaacagctgggag aacttccggcagggcatcgacttttgccctggccagaa tgtgtccggcgtgaccacacacaatctggaagatcaca ccaagctgcccctgatctttcacctgggcagagatccc ggcgagagattccctctgtcttttgccagcgccgagta ccaagaagccctgagcagaatcaccagcgtggtgcagc agcaccaagaggctctggttccagctcagccccagctg aacgtgtgtaattgggccgtgatgaactgggcccctcc tggatgtgaaaagctgggcaagtgtctgacccctcctg agagcatccccaagaaatgcctgtggtcccactga 6 Promotor gggctggaagctacctttgacatcatttcctctgcgaa TBG tgcatgtataatttctacagaacctattagaaaggatc acccagcctctgcttttgtacaactttcccttaaaaaa ctgccaattccactgctgtttggcccaatagtgagaac tttttcctgctgcctcttggtgcttttgcctatggccc ctattctgcctgctgaagacactcttgccagcatggac ttaaacccctccagctctgacaatcctctttctctttt gttttacatgaagggtctggcagccaaagcaatcactc aaagttcaaaccttatcattttttgctttgttcctctt ggccttggttttgtacatcagctttgaaaataccatcc cagggttaatgctggggttaatttataactaagagtgc tctagttttgcaatacaggacatgctataaaaatggaa agat
7 5’ ITR ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaa gcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcag tgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactcc atcactaggggttcct 8 3’ ITR aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctg cgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggt cgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtga gcgagcgagcgcgcag 9 Beta- gatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcat globina de gaagccccttgagcatctgacttctggctaataaagga coelho poli aatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttg A tgtctctcactcg 10 Intron_1 gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagacca atagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgc gtttctgataggcacctattggtcttactgacatccac tttgcctttctctccacag 11 Alfa aggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggc mic/intensi ccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaa ficador de taatctcaggagcacaaacattcc bik 12 GALNS ATGGCTGCTGTGGTGGCTGCTACAAGATGGTGGCAACT (otimizado GCTGCTGGTGCTGTCTGCAGCTGGAATGGGAGCTTCTG por códon e GTGCCCCTCAGCCTCCTAATATCCTGCTGCTGCTGATG
CpG GCCTAGCAGAGAGACACCCAACCTGGATAGAATGGCTG depletado) CAGAGGGCCTGCTGTTCCCCAACTTCTACTCTGCCAAT
GGTCCCACTGA 13 Promotor AGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGC LSPX1 CCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAA
ACCACTGACCTGGGACAGT 14 Promotor AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTG LSPX2 CCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCT
GCACCACCACTGACCTGGGACAGT 15 Promotor AGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGC LTP1 CCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAA
GGCACCACCACTGACCTGGGACAGT 16 Promotor AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTG LMTP6 CCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCT
9. EQUIVALENTES E INCORPORAÇÕES POR REFERÊNCIA
[0249] Embora a invenção seja descrita em detalhes com referência a modalidades específicas da mesma, será entendido que variações que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção, além das mostradas e descritas neste documento, serão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição que precede e das figuras que acompanham. Tais modificações se destinam a permanecer dentro do escopo das reivindicações anexas. Aqueles versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de verificar o uso de não mais do que a experimentação de rotina e de muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descritas neste documento. Pretende-se abranger tais equivalentes pelas seguintes reivindicações.
[0250] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicada específica e individualmente para ser incorporada integralmente neste documento por referência.
Claims (53)
1. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV) caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase (hGALNS) flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, em que o referido transgene codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido.
2. rAAV, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo ácido é D8.
3. rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
4. rAAV, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o promotor específico do fígado: (a) é um promotor TBG; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou
(d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (m) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (n) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (o) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (p) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou
(q) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (r) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (s) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 15.
5. rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor, cuja sequência de nucleotídeos que codifica o promotor está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
6. rAAV, de acordo com a reivindicação5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor CAG.
7. rAAV, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor específico do fígado e do músculo.
8. rAAV, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o promotor específico do fígado e do músculo: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou
(e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 16.
9. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV8.
10. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 10, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV9.
11. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 10, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão é otimizada por códons.
12. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 13, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão tem sítios CpG depletivos.
13. rAAV caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS.
14. rAAV, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o promotor específico do fígado: (a) é um promotor TBG; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (m) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou
(n) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (o) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (p) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (q) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (r) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (s) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 15.
15. rAAV caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS e em que o promotor é um promotor CAG.
16. rAAV caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV-ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e do músculo e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS e em que o promotor específico do fígado e do músculo: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 16.
17. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13- 18, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV8.
18. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13- 18, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV9.
19. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13- 18, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão é otimizada por códons.
20. rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13- 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS ou a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão tem sítios CpG depletivos.
21. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
22. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV- ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, em que o referido transgene codifica uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido.
23. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o oligopeptídeo ácido é D8.
24. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
25. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o promotor específico do fígado: (a) é um promotor TBG; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou
(d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (m) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (n) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (o) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (p) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou
(q) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (r) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (s) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 15.
26. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e do músculo, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado e do músculo está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
27. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o promotor específico do fígado e do músculo: (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou
(l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 16.
28. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão de hGALNS compreende ainda uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor está operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica a proteína de fusão.
29. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor CAG.
30. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV- ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que o promotor específico do fígado: (a) é um promotor TBG; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou
(e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (g) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 13; ou (h) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (i) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (j) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (k) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (l) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (m) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 14; ou (n) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (o) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (p) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (q) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou
(r) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15; ou (s) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 15.
31. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV- ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que o promotor é um promotor CAG.
32. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão de hGALNS flanqueado por AAV- ITRs, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um promotor específico do fígado e do músculo e uma sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que a sequência de nucleotídeos que codifica o promotor específico do fígado e do músculo é operacionalmente ligada à sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS, em que o promotor específico do fígado e do músculo: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (b) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (c) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou
(d) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (e) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16; ou (f) compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 100% idêntica à SEQ ID NO: 16.
33. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-32, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV8.
34. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-32, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV9.
35. Plasmídeo de rAAV caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-34.
36. Célula ex vivo caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-34, ou plasmídeo de rAAV, de acordo com a reivindicação 35.
37. Método de produção de um rAAV caracterizado pelo fato de que compreende transfectar uma célula ex vivo com o plasmídeo de rAAV, de acordo com a reivindicação 35, e um ou mais plasmídeos auxiliares compreendendo coletivamente as sequências de nucleotídeos dos genes de AAV Rep, Cap, VA, E2a e E4.
38. Método para tratar um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose tipo IVA (MPS IVA), caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito humano o rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, ou a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21.
39. Método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, caracterizado pelo fato de que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, administrando ao sujeito humano um rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 e 7-
12.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a referida hGALNS é glicosilada com manose-6- fosfato por ter sido produzida e secretada a partir de uma célula do fígado.
41. Método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, caracterizado pelo fato de que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é glicosilada com manose-6- fosfato por ter sido produzida e secretada a partir de uma célula do fígado, administrando ao sujeito humano um rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-14 e 16-20.
42. Método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, caracterizado pelo fato de que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento,
fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV.
43. Método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, caracterizado pelo fato de que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão que é hGALNS fundida a um oligopeptídeo ácido, em que a proteína de fusão é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada a partir de uma célula do fígado.
44. Método para tratar um sujeito humano diagnosticado com MPS IVA, caracterizado pelo fato de que compreende distribuir ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de hGALNS que é produzida a partir de um genoma de rAAV e é glicosilada com manose-6-fosfato por ter sido produzida e secretada a partir de uma célula do fígado.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42-44, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV8.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42-44, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV9.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39-46, caracterizado pelo fato de que a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma etapa de distribuição ao osso e/ou cartilagem.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39-46, caracterizado pelo fato de que a etapa de distribuição ao osso, cartilagem, ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca é uma etapa de distribuição para (a) ao osso e/ou cartilagem e (b) ao ligamento, menisco, placa de crescimento, fígado, baço, pulmão, rim, traqueia, músculo cardíaco e/ou válvula cardíaca.
49. Vírus adeno-associado recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um capsídeo de AAV; e (b) um genoma de AAV recombinante compreendendo um cassete de expressão de N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase (hGALNS) flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV, o referido cassete de expressão de hGALNS compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene, em que o referido transgene codifica hGALNS.
50. rAAV, de acordo com as reivindicações 49, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV8.
51. rAAV, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o AAV é AAV9.
52. rAAV, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS é otimizada por códons.
53. rAAV, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos que codifica hGALNS tem sítios CpG depletivos.
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