TW202039857A

TW202039857A - 黏多醣病iva之治療

Info

Publication number: TW202039857A
Application number: TW108126686A
Authority: TW
Inventors: 戸松俊治; 澤本和輝; 蘇哈卡路姆賽爾梅雷賽爾; 奧利斐爾達諾斯
Original assignee: 美商銳進科斯生物股份有限公司; 美商內莫爾基金會
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2020-11-01
Also published as: AU2019312301A1; KR20210040984A; EP3829619A4; SG11202100781VA; US20210292789A1; CA3107800A1; BR112021001498A2; IL280343A; JP2021531044A; CO2021002505A2; WO2020023857A1; EP3829619A1

Abstract

本發明提供用於治療IVA型黏多醣病(MPS IVA)之基因療法，其涉及使用重組腺相關病毒(rAAVs)以將人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(hGALNS)傳遞至經診斷患有MPS IVA之人類個體之骨骼。本發明亦提供可用於基因療法之rAAVs及製造此rAAVs之方法。

Description

黏多醣病IVA之治療

本發明係關於IVA型黏多醣病(MPS IVA)之治療。本發明提供用於治療MPS IVA之方法及組合物，其包含重組腺相關病毒(rAAV)。

IVA型黏多醣病(MPS IVA；莫耳丘A症候群(Morquio A Syndrome))係一種由缺乏N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(GALNS)而導致之常染色體隱性溶酶體貯積症(Khan等人，Mol Genet Metab., 2017；120(1-2):78-95)。缺乏該酶導致葡糖胺聚糖(GAG)、軟骨素6-硫酸鹽(C6S)及角質素硫酸鹽(KS)漸進式積聚，從而導致一種伴有骨化不全和連續生長不平衡的全身性且獨特的骨骼發育不良，產生短頸和軀幹、頸脊髓壓迫、氣管阻塞、雞胸、關節鬆弛、脊柱後側彎、髖外翻及膝外翻。疾病的其他臨床表現可包括聽力損失、心瓣膜介入及角膜混濁。在患者中已識別出200種以上不同突變，且在美國之發病率大約為1/250,000。

酶替代療法(ERT)、造血幹細胞移植(HSCT)及各種手術介入目前在臨床實踐中可作為對MPS IVA患者之支持性療法。在2014年2月，FDA批准使用ERT(依洛硫酸酯酶-α (elosulfase-alpha))(Hendriksz等人，J Inherit Metab Dis., 2014；37(6): 979-990)。ERT係目前之標準治療，對MPS IVA患者之軟組織病理及日常生活活動能力(ADL)產生部分改良，然而，由於該等病變之無血管特徵，該等療法對骨骼及軟骨提供極為有限之影響。目前ERT之侷限之處包括：i)需要每週注射5-6小時，ii)藥物自循環中快速清除，iii)治療成本極為昂貴(每位患者每年500,000美元)及v)藥物展示有限滲透至骨骼中(Algahim及Almassi, Ther Clin Risk Manag., 2013; 9:45-53；Tomatsu等人，Curr Pharm Biotechnol., 2011;12:931-945)。對於MPS IVA而言，每週投與重組人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(rhGALNS：Vimizim™，依洛硫酸酯酶α)目前對MPS IVA患者之骨骼及軟骨病變不產生影響。儘管HSCT可比ERT對骨骼產生更佳之影響，但該種基於細胞之療法由於匹配供體有限、有效治療之年齡限制、缺少精良設備、手術之死亡風險(諸如移植體抗宿主疾病，GVHD)、感染及其他併發症而無法適用於所有患者(Tomatsu等人，Drug Des Devel Ther., 2015；9: 1937-1953)。就此意義而言，急需一種用於MPS IVA之新穎藥物，特定而言，一種用於治療MPS IVA患者骨骼發育不良之新穎藥物。

rAAV因其安全特性、多功能性及能夠經設計用於特定功能而可用於多種疾病之多種基因療法應用中(參見，例如Naso等人，BioDrugs. 2017；31(4): 317-334)。已對包括神經肌肉疾病、眼科疾病及免疫性疾病之多種遺傳性疾病進行使用AAV基因療法之臨床試驗(參見，例如Kumar等人，Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2016, 3:16034)。

本文引用之參考案不應理解為承認其為本發明之先前技術。

本發明提供用於治療IVA型黏多醣病(MPS IVA)之基因療法，其包含使用重組腺相關病毒(rAAV)將人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(hGALNS)傳遞至經診斷患有MPS IVA之人類個體之骨骼。本發明亦提供可用於基因療法之rAAV、製備該等rAAV之方法以及可用於製備該等rAAV之聚核苷酸、質體及細胞。

在一個態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含：(a) AAV衣殼(例如，AAV8衣殼)；及(b)包含側接AAV-反向末端重複序列(ITR)之人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(hGALNS)表現卡匣之重組AAV基因組(例如，AAV8-ITR)，該hGALNS表現卡匣包含編碼轉基因之核苷酸序列，諸如編碼融合蛋白之轉基因，該融合蛋白為與酸性寡肽(例如，D8)融合之hGALNS。在一個特定實施例中，hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。在另一個特定實施例中，肝特異性啟動子為甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子。

在另一個態樣中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼(例如，AAV8衣殼)；及(b)包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組(例如，AAV8-ITR)，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。在一個特定實施例中，肝特異性啟動子為TBG啟動子。

在另一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明提供之rAAV及醫藥學上可接受之載劑。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸(例如，AAV8-ITR)，該hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽(例如，D8)融合之hGALNS。在一個特定實施例中，hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。在另一個特定實施例中，肝特異性啟動子為TBG啟動子。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸(例如，AAV8-ITR)，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。在一個特定實施例中，肝特異性啟動子為TBG啟動子。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含本發明提供之聚核苷酸的rAAV質體。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含本發明提供之聚核苷酸或本發明提供之rAAV質體的離體細胞。

在另一個態樣中，本發明提供一種製備rAAV之方法，其包含以本發明提供之rAAV質體及一或多種總體上包含AAV基因Rep、Cap、VA、E2a及E4之核苷酸序列之輔助質體轉染離體細胞。

在另一個態樣中，本發明提供一種治療經診斷患有IVA型黏多醣病(MPS IVA)之人類個體之方法，其包含向該人類個體投與本發明提供之rAAV或本發明提供之醫藥組合物。

在另一個態樣中，本發明提供一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含藉由向該人類個體投與本發明提供之rAAV來向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽(例如，D8)融合之hGALNS。在一個特定實施例中，hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。

在另一個態樣中，本發明提供一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含藉由向該人類個體投與本發明提供之rAAV來向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS，該hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。

在另一個態樣中，本發明提供一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽(例如，D8)融合之hGALNS，其中該融合蛋白由rAAV基因組(例如，重組AAV8基因組(亦即，包含AAV8基因組主鏈之重組型基因組))產生。

在另一個態樣中，本發明提供一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽(例如，D8)融合之hGALNS，其中該融合蛋白由rAAV基因組(例如，重組AAV8基因組(亦即，包含AAV8基因組主鏈之重組型基因組))產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。

在另一個態樣中，本發明提供一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS，該hGALNS由rAAV基因組(例如，重組AAV8基因組(亦即，包含AAV8基因組主鏈之重組型基因組))產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。

在包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞的治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法的某些態樣及實施例中，向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟為向骨骼及/或軟骨傳遞之步驟。

在包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞的治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法的某些態樣及實施例中，向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟為向(a)骨骼及/或軟骨以及(b)韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟。3.1 說明性實施例 (I) 1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含： (a) AAV衣殼；及 (b)包含側接AAV-反向末端重複序列(ITR)之人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(hGALNS)表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。 2. 段落1之rAAV，其中該酸性寡肽為D8。 3. 段落1或2之rAAV，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中該編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。 4. 段落3之rAAV，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。 5. 段落1-4中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV8。 6. 一種rAAV，其包含： (a) AAV衣殼；及 (b)包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。 7. 段落6之rAAV，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。 8. 段落6或7之rAAV，其中該AAV為AAV8。 9. 一種醫藥組合物，其包含段落1-8中任一項之rAAV及醫藥學上可接受之載劑。 10. 一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。 11. 段落10之聚核苷酸，其中該酸性寡肽為D8。 12. 段落10或11之聚核苷酸，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。 13. 段落12之聚核苷酸，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。 14. 一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。 15. 段落14之聚核苷酸，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。 16. 段落10-15中任一項之聚核苷酸，其中該AAV為AAV8。 17. 一種rAAV質體，其包含段落10-16中任一項之聚核苷酸。 18. 一種離體細胞，其包含段落10-16中任一項之聚核苷酸或段落17之rAAV質體。 19. 一種製備rAAV之方法，其包含以段落17之rAAV質體及一或多種總體上包含AAV基因Rep、Cap、VA、E2a及E4之核苷酸序列之輔助質體轉染離體細胞。 20. 一種治療經診斷患有IVA型黏多醣病(MPS IVA)之人類個體之方法，其包含向該人類個體投與段落1-8中任一項之rAAV或段落9之醫藥組合物。 21. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含藉由向該人類個體投與段落1-5中任一項之rAAV來向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。 22. 段落21之方法，其中該hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。 23. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含藉由向該人類個體投與段落6-8中任一項之rAAV來向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS，該hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。 24. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS，其中該融合蛋白係由rAAV基因組產生。 25. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS，其中該融合蛋白由rAAV基因組產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。 26. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS，該hGALNS係由rAAV基因組產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。 27. 段落24-26中任一項之方法，其中該AAV為AAV8。 28. 段落21-27中任一項之方法，其中向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟為向骨骼及/或軟骨傳遞之步驟。 29. 段落21-27中任一項之方法，其中向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟為向(a)骨骼及/或軟骨及(b)韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟。3.2 說明性實施例 (II) 1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含： (a) AAV衣殼；及 (b)包含側接AAV-反向末端重複序列(ITR)之人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(hGALNS)表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。 2. 段落1之rAAV，其中該酸性寡肽為D8。 3. 段落1或2之rAAV，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與可編碼融合蛋白之核苷酸序列操作性連接。 4. 段落3之rAAV，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。 5. 段落1或2之rAAV，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼啟動子之核苷酸序列，該編碼啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。 6. 段落5之rAAV，其中該啟動子係選自由以下組成之群： a. CAG啟動子， b. 與SEQ ID NO:13呈80%一致； c. 與SEQ ID NO:13呈85%一致； d. 與SEQ ID NO:13呈90%一致； e. 與SEQ ID NO:13呈95%一致； f. 與SEQ ID NO:13呈98%一致； g. SEQ ID NO:13， h. 與SEQ ID NO:14呈80%一致； i. 與SEQ ID NO:14呈85%一致； j. 與SEQ ID NO:14呈90%一致； k. 與SEQ ID NO:14呈95%一致； l. 與SEQ ID NO:14呈98%一致； m. SEQ ID NO:14， n. 與SEQ ID NO:15呈80%一致； o. 與SEQ ID NO:15呈85%一致； p. 與SEQ ID NO:15呈90%一致； q. 與SEQ ID NO:15呈95%一致； r. 與SEQ ID NO:15呈98%一致； s. SEQ ID NO:15， t. 與SEQ ID NO:16呈80%一致； u. 與SEQ ID NO:16呈85%一致； v. 與SEQ ID NO:16呈90%一致； w. 與SEQ ID NO:16呈95%一致； x. 與SEQ ID NO:16呈98%一致；及 y. SEQ ID NO:16。 7. 段落1-6中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV8。 8. 段落1-6中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV9。 9. 段落1-8中任一項之rAAV，其中編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼融合蛋白之核苷酸序列係經密碼子優化的。 10. 段落1-9中任一項之rAAV，其中編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼融合蛋白之核苷酸序列缺失CpG位點。 11. 一種rAAV，其包含： (a) AAV衣殼；及 (b)包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。 12. 段落11之rAAV，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。 13. 一種rAAV，其包含： (a) AAV衣殼；及 14. (b)包含側接AAV-ITRs之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼啟動子之核苷酸序列可操作地連接至編碼hGALNS之核苷酸序列，且其中該啟動子係選自由以下組成之群： a. CAG啟動子， b. 與SEQ ID NO:13呈80%一致； c. 與SEQ ID NO:13呈85%一致； d. 與SEQ ID NO:13呈90%一致； e. 與SEQ ID NO:13呈95%一致； f. 與SEQ ID NO:13呈98%一致； g. SEQ ID NO:13， h. 與SEQ ID NO:14呈80%一致； i. 與SEQ ID NO:14呈85%一致； j. 與SEQ ID NO:14呈90%一致； k. 與SEQ ID NO:14呈95%一致； l. 與SEQ ID NO:14呈98%一致； m. SEQ ID NO:14， n. 與SEQ ID NO:15呈80%一致； o. 與SEQ ID NO:15呈85%一致； p. 與SEQ ID NO:15呈90%一致； q. 與SEQ ID NO:15呈95%一致； r. 與SEQ ID NO:15呈98%一致； s. SEQ ID NO:15， t. 與SEQ ID NO:16呈80%一致； u. 與SEQ ID NO:16呈85%一致； v. 與SEQ ID NO:16呈90%一致； w. 與SEQ ID NO:16呈95%一致； x. 與SEQ ID NO:16呈98%一致；及 y. SEQ ID NO:16。 15. 段落11-14中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV8。 16. 段落11-14中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV9。 17. 段落11-16中任一項之rAAV，其中編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼融合蛋白之核苷酸序列係經密碼子優化的。 18. 段落1-9中任一項之rAAV，其中編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼融合蛋白之核苷酸序列缺失CpG位點。 19. 一種醫藥組合物，其包含段落1-17中任一項之rAAV及醫藥學上可接受之載劑。 20. 一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。 21. 段落20之聚核苷酸，其中該酸性寡肽為D8。 22. 段落20或21之聚核苷酸，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。 23. 段落22之聚核苷酸，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。 24. 段落20或21之聚核苷酸，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼啟動子之核苷酸序列，其中編碼啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。 25. 段落24之聚核苷酸，其中該啟動子係選自由以下組成之群： a. CAG啟動子， b. 與SEQ ID NO:13呈80%一致； c. 與SEQ ID NO:13呈85%一致； d. 與SEQ ID NO:13呈90%一致； e. 與SEQ ID NO:13呈95%一致； f. 與SEQ ID NO:13呈98%一致； g. SEQ ID NO:13， h. 與SEQ ID NO:14呈80%一致； i. 與SEQ ID NO:14呈85%一致； j. 與SEQ ID NO:14呈90%一致； k. 與SEQ ID NO:14呈95%一致； l. 與SEQ ID NO:14呈98%一致； m. SEQ ID NO:14， n. 與SEQ ID NO:15呈80%一致； o. 與SEQ ID NO:15呈85%一致； p. 與SEQ ID NO:15呈90%一致； q. 與SEQ ID NO:15呈95%一致； r. 與SEQ ID NO:15呈98%一致； s. SEQ ID NO:15， t. 與SEQ ID NO:16呈80%一致； u. 與SEQ ID NO:16呈85%一致； v. 與SEQ ID NO:16呈90%一致； w. 與SEQ ID NO:16呈95%一致； x. 與SEQ ID NO:16呈98%一致；及 y. SEQ ID NO:16。 26. 一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。 27. 段落26之聚核苷酸，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。 28. 一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接，其中該啟動子係選自由以下組成之群： a. CAG啟動子， b. 與SEQ ID NO:13呈80%一致； c. 與SEQ ID NO:13呈85%一致； d. 與SEQ ID NO:13呈90%一致； e. 與SEQ ID NO:13呈95%一致； f. 與SEQ ID NO:13呈98%一致； g. SEQ ID NO:13， h. 與SEQ ID NO:14呈80%一致； i. 與SEQ ID NO:14呈85%一致； j. 與SEQ ID NO:14呈90%一致； k. 與SEQ ID NO:14呈95%一致； l. 與SEQ ID NO:14呈98%一致； m. SEQ ID NO:14， n. 與SEQ ID NO:15呈80%一致； o. 與SEQ ID NO:15呈85%一致； p. 與SEQ ID NO:15呈90%一致； q. 與SEQ ID NO:15呈95%一致； r. 與SEQ ID NO:15呈98%一致； s. SEQ ID NO:15， t. 與SEQ ID NO:16呈80%一致； u. 與SEQ ID NO:16呈85%一致； v. 與SEQ ID NO:16呈90%一致； w. 與SEQ ID NO:16呈95%一致； x. 與SEQ ID NO:16呈98%一致；及 y. SEQ ID NO:16。 29. 段落26-28中任一項之聚核苷酸，其中該AAV為AAV8。 30. 段落26-28中任一項之聚核苷酸，其中該AAV為AAV9。 31. 一種rAAV質體，其包含段落26-30中任一項之聚核苷酸。 32. 一種離體細胞，其包含段落20-30中任一項之聚核苷酸或段落31之rAAV質體。 33. 一種製備rAAV之方法，其包含以段落31之rAAV質體及一或多種總體上包含AAV基因Rep、Cap、VA、E2a及E4之核苷酸序列之輔助質體來轉染離體細胞。 34. 一種治療經診斷患有IVA型黏多醣病(MPS IVA)之人類個體之方法，其包含向該人類個體投與段落1-30中任一項之rAAV或段落19之醫藥組合物。 35. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含藉由向該人類個體投與段落1-10中任一項之rAAV來向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。 36. 段落35之方法，其中該hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。 37. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含藉由向該人類個體投與段落11-18中任一項之rAAV來向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS，該hGALNS係藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。 38. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS，其中該融合蛋白係由rAAV基因組產生。 39. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS，其中該融合蛋白係由rAAV基因組產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。 40. 一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS，該hGALNS係由rAAV基因組產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。 41. 段落38-40中任一項之方法，其中該AAV為AAV8。 42. 段落38-40中任一項之方法，其中該AAV為AAV9。 43. 段落35-42中任一項之方法，其中向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟係向骨骼及/或軟骨傳遞之步驟。 44. 段落35-42中任一項之方法，其中向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟係向(a)骨骼及/或軟骨，及(b)韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟。縮寫 MPS IVA IVA型黏多醣病 GALNS N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶 hGALNS 人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶 GAG 葡糖胺聚糖 C6S 軟骨素6-硫酸鹽 KS 角質素硫酸鹽 ERT 酶替代療法 HSCT 造血幹細胞移植 AAV 腺相關病毒 TBG 甲狀腺素結合球蛋白 ITR 反向末端重複序列

相關申請之交叉引用

本申請主張2018年7月27日申請之美國臨時專利申請第62/711,238號、2018年11月07日申請之美國臨時專利申請第62/756,880號及2019年2月01日申請之美國臨時專利申請第62/799,834號之權利，該等申請以全文引用之方式併入本文中。

本發明至少部分係基於以下驚人發現，即在IVA型黏多醣病(MPS IVA)動物模型中投與包含某些hGALNS表現卡匣之重組腺相關病毒(rAAV)在整個監測期間保持高水準之hGALNS酶促活性，且引起包括骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及心瓣膜在內之組織得以改良，展示出優於酶替代療法(ERT)所達成之改良。

本發明描述在需要治療之人類個體中用於治療MPS IVA之rAAV。該等rAAV包含編碼hGALNS之重組AAV基因組。可將rAAV投與MPS IVA患者，引起合成hGALNS且將hGALNS傳遞至受影響組織，諸如骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜，由此改良病理學且阻止疾病之發展。

提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV衣殼及包含側接AAV-反向末端重複序列(ITR)之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組。在某些實施例中，啟動子為CAG啟動子。在某些實施例中，rAAV衣殼與血清AAV8衣殼至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%一致。在某些實施例中，rAAV衣殼之胺基酸序列與SEQ ID: NO. 1至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%一致。在某些實施例中，rAAV衣殼之胺基酸序列與SEQ ID: NO. 1呈80-85%、85-90%、90-95%、95-99%或99-99.9%一致。關於rAAV衣殼之更多詳情，參見章節6.1.1。在一些實施例中，hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。在某些實施例中，酸性寡肽為D8。在某些實施例中，hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子(例如，甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子)之核苷酸序列。在某些實施例中，hGALNS表現卡匣額外包含編碼poly A位點之核苷酸序列。在其他實施例中，hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子(例如，TBG啟動子)之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。在某些實施例中，hGALNS表現卡匣額外包含編碼poly A位點之核苷酸序列。

本發明亦提供包含如本文所述之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸。進一步提供質體及細胞(例如，離體宿主細胞)，其包含本發明提供之用於製備用於本發明提供之方法及組合物之rAAV的聚核苷酸。

本發明進一步提供用於製備本文所述之rAAV之方法。

本發明亦提供治療經診斷患有IVA型黏多醣病(MPS IVA)之人類個體之方法。在一個態樣中，該方法包含向人類個體投與本文所述之rAAV。在另一個態樣中，該方法包含向受影響組織傳遞糖基化hGALNS (例如，藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化之hGALNS)。在另一個態樣中，該方法包含向受影響組織傳遞融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。融合蛋白可藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。

本發明進一步提供包含本文所述之rAAV之醫藥組合物及套組。

本發明提供之rAAV係在章節6.1中描述，包括章節6.1.1中關於rAAV衣殼之描述及章節6.1.2中關於hGALNS表現卡匣之描述。章節6.2中描述製備本發明提供之rAAV之方法以及可用於該等方法中之聚核苷酸、質體及細胞。章節6.3中描述治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，包括目標患者群體、投藥途徑及給藥方案。章節6.4中描述組合療法。章節6.5中描述用於評估臨床結果之疾病標記及方法。章節7中提供非限制性說明實例。

不受理論約束，rAAVs之製造、組合物及使用方法可修改以便其仍可致使將hGALNS酶傳遞至人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板及/或心瓣膜以作為對MPS IVA之治療。6.1 重組腺相關病毒 (rAAVs)

本發明提供適用於有需要之人類個體中治療MPS IVA之rAAVs，該等rAAV包含AAV衣殼及包含hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組。

在一個態樣中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼；及(b)包含側接AAV-ITRs之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼hGALNS與酸性寡肽融合之融合蛋白之核苷酸序列。hGALNS表現卡匣可進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列可操作地連接至編碼該融合蛋白之核苷酸序列。

在另一個態樣中，本發明提供一種rAAV，其包含：(a) AAV衣殼；及(b)包含側接AAV-ITRs之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列可操作地連接至編碼hGALNS之核苷酸序列。

較佳地，hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，以使得在肝中表現hGALNS蛋白，該hGALNS蛋白在自肝細胞分泌後，即易位至其他組織，包括(但不限於)嚴重受影響之器官，諸如骨骼、軟骨及相關組織以及心瓣膜。

下文中詳細描述本發明提供之rAAV之不同組分。6.1.1 衣殼

衣殼為封裝且保護病毒基因組，同時與宿主環境相互作用之病毒蛋白殼。根據本發明，本發明提供之rAAV包含AAV衣殼。在一個特定實施例中，AAV衣殼為天然存在之AAV之衣殼(例如， AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAV11之衣殼)。在另一個特定實施例中，AAV衣殼源自天然存在之AAV之衣殼(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAV11之衣殼)，例如，藉由具有與天然存在的AAV之衣殼之胺基酸序列至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.9%或100%一致之胺基酸序列。

在某些實施例中，根據本文所述本發明可使用之AAV變異體衣殼包括Anc80或Anc80L65，如Zinn等人，2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068中所述，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，根據本文所述本發明可使用之AAV變異體衣殼包含以下胺基酸插入中之一者：LGETTRP或LALGETTRP，如美國專利第9,193,956號、第9,458,517號及第9,587,282號以及美國專利申請公開案第2016/0376323號中所述，其各自以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，根據本文所述本發明可使用之AAV變異體衣殼包括AAV.7m8，如美國專利第9,193,956號、第9,458,517號及第9,587,282號以及美國專利申請公開案第2016/0376323號中所述，其各自以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，根據本文所述本發明可使用之AAV變異體衣殼包括美國專利第9,585,971號中所揭示之任何AAV，諸如AAV-PHP.B。在某些實施例中，根據本發明可使用之AAV變異體衣殼包括(但不限於)以下專利及專利申請中任一者所揭示之彼等，該等專利及專利申請各自以全文引用之方式併入本文中：美國專利第7,282,199號、第7,906,111號、第8,524,446號、第8,906,675號、第8,999,678號、第8,628,966號、第8,927,514號、第8,734,809號、US 9,284,357、第9,409,953號、第9,169,299號、第9,193,956號、第9458517號、第9,587,282號、第9,737,618號、第9,840,719號；美國專利申請公開案第2015/0374803號、第2015/0126588號、第2017/0067908號、第2013/0224836號、第2016/0215024號、第2017/0051257號；及國際專利申請第PCT/US2002/033630號、第PCT/US2004/028817號、第PCT/2002/033629號、第PCT/US2006/013375號、第PCT/US2015/034799號、第PCT/EP2015/053335號、第PCT/US2016/042472號、第PCT/US2017/027392號。

在某些實施例中，前文可使用單股AAV(ssAAV)。在某些實施例中，可使用自身互補型載體，例如scAAV(參見，例如Wu，2007，Human Gene Therapy，18(2):171-82，McCarty等人，2001，Gene Therapy，第8卷，第16期，第1248-1254頁；及美國專利第6,596,535號、第7,125,717號及第7,456,683號，其各自以全文引用之方式併入本文中)。

在較佳實施例中，rAAV中所含之AAV衣殼為AAV8之衣殼或源自AAV8之衣殼。AAV8比其他血清型具有更大之肝轉導效率，且對針對人類AAV之抗體具有低反應性。重要的是，AAV8衣殼之特定區域藉由介導入核及衣殼脫殼而有助於肝之高轉導(Tenney等人，Virology，2014, 454-455: 227-236；Nam等人，J Virol.，2007 81(22): 12260-12271)。因此，AAV8具有肝細胞向性(Sands, M.，Methods Mol Biol.，2011；807:141-157)。在某些實施例中，rAAV中所含AAV衣殼之胺基酸序列與AAV8衣殼之胺基酸序列(SEQ ID NO:1)一致。在某些實施例中，rAAV中所含AAV衣殼之胺基酸序列與AAV8衣殼之胺基酸序列(SEQ ID NO:1)至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.9%一致，同時保留AAV8衣殼封裝病毒基因組之能力，且較佳亦保留AAV8衣殼高效轉導肝細胞之能力。在某些實施例中，rAAV中所含AAV衣殼之胺基酸序列為AAV8衣殼之胺基酸序列(SEQ ID NO:1)一致，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸殘基以外，同時保留AAV8衣殼封裝病毒基因組之能力，且較佳亦保留AAV8衣殼高效轉導肝細胞之能力。在本文所述治療方法之一個較佳實施例中，AAV8係用於hGALNS蛋白之靶向肝表現。6.1.2 hGALNS 表現卡匣

AAV具有在末端含有兩個反向末端重複序列(ITR)之線性單股DNA (ssDNA)基因組。AAV藉由內飲作用進入細胞(Meier及Greber，J Gene Med.，2004；6增刊1:S152-63)。衣殼分解時，ssDNA基因組經釋放且轉化為雙股DNA (dsNDA)，由此可表現由病毒基因組編碼之基因(Ding等人，2005，Gene Ther.，12: 873-880)。

根據本發明，本發明提供之rAAV包含重組AAV基因組。重組AAV基因組可包含AAV基因組或其變異體之主鏈(例如，AAV1、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAV11基因組或其變異體之主鏈)。重組AAV基因組較佳可包含AAV8基因組或其變異體之主鏈。

根據本發明，重組AAV基因組包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣。在一些實施例中，hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。hGALNS表現卡匣可進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。在其他實施例中，hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。(a) hGALNS

在某些實施例中，編碼hGALNS或融合蛋白之hGALNS部分之核苷酸序列包含SEQ ID NO:2或3之序列。在某些實施例中，編碼hGALNS或融合蛋白之hGALNS部分之核苷酸序列與SEQ ID NO:2或3中所述之序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。

在某些實施例中，編碼融合蛋白之核苷酸序列包含SEQ ID NO:4或5之序列。在某些實施例中，編碼融合蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO:4或5中所述之序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。

在某些實施例中，編碼hGALNS或融合蛋白之hGALNS部分之核苷酸序列包含hGALNS之cDNA序列。在某些實施例中，編碼hGALNS或融合蛋白之hGALNS部分之核苷酸序列與hGALNS之cDNA序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。

在某些實施例中，編碼融合蛋白之核苷酸序列包含融合蛋白之cDNA序列。在某些實施例中，編碼融合蛋白之核苷酸序列與融合蛋白之cDNA序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致。

在某些實施例中，編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼融合蛋白之核苷酸序列係例如經由熟習此項技術者已知之任何密碼子優化技術進行密碼子優化(參見，例如Quax等人之綜述，2015，Mol Cell 59:149-161)。

在某些實施例中，編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼融合蛋白之核苷酸序列中缺失CpG位點。(b) 酸性寡肽

酸性寡肽對骨骼及軟骨之主要組分羥基磷灰石具有高結合親和力。如本文所用之術語「酸性寡肽」係指具有麩胺酸(E)及/或天冬胺酸(D)殘基之重複胺基酸序列之寡肽。酸性寡肽中之胺基酸殘基數量例如可為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在特定實施例中，酸性寡肽中之胺基酸殘基數量為4-8。在特定實施例中，酸性寡肽中之胺基酸殘基數量為6-8。在一個特定實施例中，酸性寡肽中之胺基酸殘基數量為6。在另一個特定實施例中，酸性寡肽中之胺基酸殘基數量為8。

在一個較佳實施例中，酸性寡肽為D8(亦即，具有八個天冬胺酸殘基之胺基酸序列的寡肽)。在另一實施例中，酸性寡肽為E6(亦即，具有六個麩胺酸殘基之胺基酸序列的寡肽)。E6序列描述於Tomatsu等人，2010, Molecular Therapy, 18(6):11094-1102中，其以全文引用之方式併入本文中。

在一個較佳實施例中，酸性寡肽與hGALNS之N末端融合。在另一實施例中，酸性寡肽與hGALNS之C末端融合。

在一個特定實施例中，酸性寡肽與hGALNS直接融合，無插入之胺基酸序列。在另一個特定實施例中，酸性寡肽經由連接子胺基酸序列(例如，長度為1-10個、2-8個或4-6個胺基酸殘基之胺基酸序列)與hGALNS融合。

在某些實施例中，hGALNS酶可傳遞至骨骼及軟骨區域中之溶酶體中以改良骨骼及軟骨之病理。(c) 基因表現之啟動子及修飾子：

在某些實施例中，本文所述之hGALNS表現卡匣包含調節基因傳遞或基因表現之組分(例如，「表現控制元件」)。在某些實施例中，本文所述之hGALNS表現卡匣包含調節基因表現之組分。在某些實施例中，本文所述之hGALNS表現卡匣包含影響與細胞結合或靶向細胞之組分。在某些實施例中，本文所述之hGALNS表現卡匣包含影響在吸收後hGALNS在細胞內之位置的組分。在某些實施例中，本文所述之hGALNS表現卡匣包含可用作例如用於偵測或選擇已吸收hGALNS表現卡匣之細胞之可偵測或可選標記的組分。在某些實施例中，本文所述之hGALNS表現卡匣包含編碼一或多個啟動子之核苷酸序列，其中至少一者與編碼hGALNS或融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。在某些實施例中，啟動子可為組成性啟動子。在替代實施例中，啟動子可為誘導性啟動子。

在某些實施例中，啟動子為肝特異性啟動子。

在某些實施例中，啟動子為CAG啟動子。

在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:15具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:16具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:13。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:14。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:15。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:16。

肝特異性啟動子可為(但不限於)甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子(參見，例如Yan等人，2012，Gene，506(2):289-94，其以全文引用之方式併入本文中)。

在某些實施例中，啟動子包含一或多個增強hGALNS或融合蛋白之表現之元件。在某些實施例中，啟動子包含TATA盒。

在某些實施例中，一或多個啟動子元件可相對於彼此反向或移動。在某些實施例中，啟動子元件可定位為合作作用。在某些實施例中，啟動子元件可定位為獨立作用。在某些實施例中，本文所述之hGALNS表現卡匣包含一或多個選自由以下組成之群之啟動子：肝特異性TBG啟動子、人類CMV即刻早期基因啟動子、SV40早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RS)長末端重複序列及大鼠胰島素啟動子。在某些實施例中，本文提供之hGALNS表現卡匣包含一或多種組織特異性啟動子。在一個特定實施例中，組織特異性啟動子為肝特異性啟動子。在一個特定實施例中，TBG啟動子具有SEQ ID NO. 6之核苷酸序列。

在某些實施例中，hGALNS表現卡匣包含一或多種其他表現控制元件，其可包括編碼強化子(例如，α mic/bik強化子)之核苷酸序列、抑制因子、編碼內含子或嵌合內含子(例如，雞β-肌動蛋白基因之第一個內含子)之核苷酸序列及/或編碼poly A位點(例如，兔球蛋白poly A位點)之核苷酸序列。在一個特定實施例中，編碼兔球蛋白poly A位點之核苷酸序列具有SEQ ID NO:9之序列。在一個特定實施例中，編碼內含子之核苷酸序列具有SEQ ID NO:10之序列。在一個特定實施例中，編碼α mic/bik 強化子之核苷酸序列具有SEQ ID NO:11之序列。

在一個特定實施例中，hGALNS表現卡匣包含α mic/bik強化子、編碼內含子之核苷酸序列、編碼TBG啟動子之核苷酸序列、編碼hGALNS之核苷酸序列或、融合蛋白(即，與酸性寡肽(較佳為D8)融合之hGALNS)及編碼兔球蛋白poly A位點之核苷酸序列。在一個特定實施例中，編碼兔球蛋白poly A位點之核苷酸序列具有SEQ ID NO:9之序列。在一個特定實施例中，編碼內含子之核苷酸序列具有SEQ ID NO:10之序列。在一個特定實施例中，編碼α mic/bik 強化子之核苷酸序列具有SEQ ID NO:11之序列。(d) 反向末端重複序列

根據本發明，本文所述之hGALNS表現卡匣側接兩個AAV-反向末端重複序列(ITR)。ITR序列可用於將重組型基因表現卡匣封裝於病毒粒子中(參見，例如Yan等人，2005，J. Virol.，79(1):364-379；美國專利第7,282,199 B2號、美國專利第7,790,449 B2號、美國專利第8,318,480 B2號、美國專利第8,962,332 B2號及國際專利申請第PCT/EP2014/076466號，其各自以全文引用之方式併入本文中)。在一個特定實施例中，側接之ITR為AAV8 ITR。在一個特定實施例中，ITR序列可具有SEQ ID NO.:7之序列。在一個特定實施例中，ITR序列可具有SEQ ID NO.:8之序列。在一個特定實施例中，5' ITR可具有SEQ ID NO.:7之序列。在一個特定實施例中，3' ITR可具有SEQ ID NO.:8之序列。(e) 非轉譯區

在某些實施例中，本文所述之hGALNS表現卡匣包含一或多個非轉譯區(UTR)，例如3'及/或5' UTR。在某些實施例中，優化UTR用於所需水準之蛋白表現。在某些實施例中，優化UTR用於hGALNS之mRNA半衰期。在某些實施例中，優化UTR用於hGALNS之mRNA之穩定性。在某些實施例中，優化UTR用於hGALNS之mRNA之次級結構。6.1.3 醫藥組合物及套組

在某些實施例中，本發明提供包含本發明提供之rAAV及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。醫藥組合物可製備成個別之單一單位劑型。本發明提供之醫藥組合物可經調配為例如用於非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、腹膜內、鼻內、鞘內或經皮投藥。在一個特定實施例中，醫藥組合物經調配為用於靜脈內投藥。合適之醫藥學上可接受之載劑(例如，用於靜脈內投藥及在肝細胞中轉導)將易於由熟習此項技術者選擇。

本發明提供包含本文所述之醫藥組合物包含在一或多個容器中之套組。可封裝醫藥組合物之容器可包括(但不限於)瓶、藥包、安瓿、管、吸入器、袋、小瓶及容器。在某些實施例中，套組包含關於投與醫藥投藥之說明。在某些實施例中，套組包含可用於投與醫藥組合物之裝置，包括(但不限於)注射器、無針注射器、滴袋、貼片及吸入器。

亦提供在藉由基因療法使用本文所述之rAAV治療MPS IVA時可使用之裝置及血液循環系統。該等裝置及系統將易於由熟習此項技術者選擇。6.2 rAAV 之製造

本發明亦提供包含如本文所述之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸、可用於產生本發明提供之rAAV之質體及細胞以及製造本發明提供之rAAV之方法。6.2.1 聚核苷酸、質體及細胞

本發明提供包含hGALNS表現卡匣之聚核苷酸。

在一個態樣中，本發明提供一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽(例如，D8)融合之hGALNS。hGALNS表現卡匣可進一步包含編碼肝特異性啟動子(例如，TBG啟動子)之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子(例如，TBG啟動子)之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。

在一個態樣中，本發明提供一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與酸性寡肽(例如，D8)融合之hGALNS。hGALNS表現卡匣可進一步包含編碼啟動子之核苷酸序列，其中編碼啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。在某些實施例中，啟動子為CAG啟動子。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:15具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:16具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:13。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:14。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:15。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:16。

在另一個態樣中，本發明提供一種包含側接AAV-ITR之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中編碼啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:15具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:16具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:13。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:14。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:15。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:16。

hGALNS表現卡匣可如章節6.1.2中所述。

在一個特定實施例中，聚核苷酸為ssDNA之形式。在另一個特定實施例中，聚核苷酸為dsDNA之形式。

本發明亦提供包含本發明提供之聚核苷酸之質體(下文稱為「rAAV質體」)。在一個特定實施例中，rAAV質體為ssDNA質體。在另一個特定實施例中， rAAV質體為dsDNA質體。在一些實施例中，rAAV質體為圓型。在其他實施例中，rAAV質體為線型。

本發明進一步提供(例如，重組性)表現本發明提供之rAAV之細胞(較佳為離體細胞)。在某些實施例中，細胞(較佳為離體細胞)包含本發明提供之聚核苷酸或本發明提供之rAAV質體。在某些實施例中，細胞(較佳為離體細胞)進一步包含提供AAV Rep、Cap及Ad5功能之輔助聚核苷酸或輔助質體。細胞(較佳為離體細胞)可來自哺乳動物宿主細胞，例如HEK293、HEK293-T、A549 、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、原代纖維母細胞、肝細胞及肌纖維母細胞。哺乳動物宿主細胞可源自例如人類、猴、小鼠、大鼠、兔或倉鼠。在一個特定實施例中，哺乳動物宿主細胞為人類胚胎腎293(HEK293)細胞或HEK293-T細胞。6.2.2 製造 rAAV 之方法

提供製造本發明提供之rAAV之方法。在某些實施例中，該方法包含以在章節6.2.1中提供之rAAV質體及一或多種總體上提供AAV Rep、Cap及Ad5功能之輔助質體轉染細胞(較佳為離體細胞)。在某些實施例中，該一或多種輔助質體總體上包含AAV基因Rep、Cap、VA、E2a及E4之核苷酸序列。

製造本發明提供之用於基因療法應用之rAAV可使用此項技術中已知之方法，例如，如Clement等人，2016, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development, 27:16002中所述，其以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，如此項技術中所述，在人類胚胎腎293細胞(HEK293)或HEK293-T上使用磷酸鈣質體沈澱，以rAAV質體及提供AAV Rep及Cap功能以及Ad5基因(VA RNA、E2a及E4)之輔助質體進行質體DNA之轉染。在某些實施例中，Rep、Cap及Ad5基因可位於同一輔助質體上。在某些實施例中，使用雙輔助方法(或三重轉染)，其中由不同質體提供AAV Rep、Cap及Ad5功能。在某些實施例中，HEK293細胞可適合於在動物組分及無抗生素培養基中之懸浮液中生長。

在某些實施例中，rAAV可使用封裝及生產細胞株來製造。本發明提供之rAAV可使用哺乳動物宿主細胞，例如A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293-T、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、原代纖維母細胞、肝細胞及肌纖維母細胞來製造。本發明提供之rAAV可使用來自人類、猴、小鼠、大鼠、兔或倉鼠之宿主細胞來製造。在某些實施例中，穩定細胞株可藉由在宿主細胞中引入產生病毒之方式來工程設計，例如複製及衣殼基因(例如，AAV之rep及cap基因)及本發明提供之rAAV質體。在一個特定實施例中，rAAV可使用HEK293細胞來製造。在某些實施例中，可藉由以編碼rep基因、cap基因及rAAV基因組之基因共同感染三種重組桿狀病毒質體而在Sf9昆蟲細胞中產生rAAV。

可根據熟習此項技術者易於選擇之適當方案來培養、轉染及收穫細胞。在某些實施例中，可將細胞培養在標準之杜貝卡氏經改良伊格培養基(Dulbecco's modified Eagle medium；DMEM)中，包括(但不限於)胎牛血清、葡萄糖、青黴素、鏈黴素及l-麩醯胺酸(McClure等人，J Vis Exp. 2011, (57): 3348；Shin等人，Methods Mol Biol. 2012, 798: 267-284)。可在易於由熟習此項技術者易於選擇之組分中轉染細胞。在某些實施例中，可在包括(但不限於)DMEM及伊斯科夫氏經改良之杜貝卡氏培養基(Iscove's modified Dulbecco's medium；IMDM)之培養基溶液中進行轉染。在某些實施例中，轉染時間可耗時46 hr、47 hr、48 hr、49 hr、50 hr、51 hr、52 hr、53 hr、54 hr、55 hr、56 hr、57 hr、58 hr、59 hr、60 hr、61 hr、62 hr、63 hr、64 hr、65 hr、66 hr、67 hr、68 hr、69 hr、70 hr、50-55 hr、55-60 hr、60-65 hr或65-70 hr。轉染後，可藉由刮擦細胞使其自培養孔中移除且洗滌該等孔來收穫細胞，從而收集所有經轉染之細胞。

關於產生包含AAV8衣殼之rAAV之方法，參見美國專利第7,282,199 B2號之實施方式之IV部分，其以全文引用之方式併入本文中。例如可藉由TAQMAN®分析來確定該等載體之基因組複本效價。例如可藉由CsCl₂ 沈降來回收病毒粒子。在一個特定實施例中，本文所述之rAAV為經分離或純化之rAAV。

已識別多種AAV血清型。在某些實施例中，本發明提供之rAAV或聚核苷酸包含源自AAV之一或多種血清型之一或多種組分。在某些實施例中，本發明提供之rAAV或聚核苷酸包含源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAV11中一或多者之一或多種組分。在某些實施例中，本發明提供之rAAV或聚核苷酸可包含源自AAV8、AAV9、AAV10或AAV11血清型中一或多者之一或多種組分。在一個較佳實施例中，本發明提供之rAAV或聚核苷酸可包含源自AAV8血清型之一或多種組分。AAV組分之核酸序列及製備重組AAV與AAV衣殼之方法例如在美國專利第7,282,199 B2號、美國專利第7,790,449 B2號、美國專利第8,318,480 B2號、美國專利第8,962,332 B2號及國際專利申請第PCT/EP2014/076466號中描述，其各自以全文引用之方式併入本文中。在特定實施例中，本發明提供編碼hGALNS之rAAV8。

在某些實施例中，描述rAAV8，其包含(i)包含在調節元件控制下含有hGALNS或融合蛋白(該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS)且側接ITR之表現卡匣的重組型基因組；及(ii)具有AAV8衣殼蛋白之胺基酸序列或與AAV8衣殼蛋白(SEQ ID NO:1)之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或99.9%一致，同時保留AAV8衣殼封裝病毒基因組之能力，且較佳亦保留AAV8衣殼高效轉導肝細胞之能力的病毒衣殼。在某些實施例中，AAV8衣殼具有SEQ ID NO:1之序列，其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸取代且保留AAV8衣殼封裝病毒基因組之能力，且較佳亦保留AAV8衣殼高效轉導肝細胞之能力。6.2.3 功效評估

可使用活體外分析法，例如細胞培養分析法來量測來自本文所述之rAAV之hGALNS表現，由此指示例如rAAV之效能。用於分析法之細胞可包括(但不限於)A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293-T、HuH7、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、原代纖維母細胞、肝細胞及肌纖維母細胞。在一個特定實施例中，用於細胞培養分析法之細胞包含HuH7細胞。在某些實施例中，可分析經rAAV轉染之細胞之hGALNS酶活性。

亦可使用動物模型來評估由本文所述之rAAV表現hGALNS及其功效。已描述用於MPS IVA之小鼠模型(參見，例如Tomatsu等人, 2003, Hum Mol Genet 12(24):3349-3358)。用於MPS IVA之小鼠模型中小鼠GALNS之外顯子2受到靶向干擾。該等小鼠無可偵測之GALNS酶活性且在尿液中偵測到GAG之含量增加。在2個月大時，在與脾排成一行之網狀內皮細胞、庫弗細胞(Kupffer cell)及肝竇細胞中可見GAG之儲量增加。在12個月大時，在腎小球之髒層上皮細胞及心瓣膜基底處之細胞中觀察到液泡變化，但在諸如肝細胞之實質性細胞及腎小管上皮細胞中不存在液泡變化。在海馬及新皮質神經元、腦膜細胞中可見GAG之溶酶體儲存。與野生型相比，該小鼠模型之角膜上皮細胞中之角質素硫酸鹽(KS)及軟骨素-6-硫酸鹽(C6S)增加，然而在小鼠模型中無明顯之骨架適應症。另外，亦已描述對人類GALNS耐受之MPS IVA小鼠模型(參見，例如Tomatsu等人，2005, Hum Mol Genet 14(22):3321-3335)。參見章節7中用於評估由本文所述之rAAV進行hGALNS表現及評估其功效之例示性分析法的實例。6.3 治療方法

本發明提供用於治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法。

在一個態樣中，該方法包含向人類個體投與本文所述之rAAV或本文所述之醫藥組合物。

在另一個態樣中，該方法包含藉由向人類個體投與本發明提供之rAAV，向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞(例如，向骨骼及/或軟骨傳遞)治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽融合之hGALNS。在一個特定實施例中，該hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。

在另一個態樣中，該方法包含藉由向人類個體投與本發明提供之rAAV，向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、生長板、半月板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞(例如，向骨骼及/或軟骨傳遞)治療有效量之hGALNS，該hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。

在另一個態樣中，該方法包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、生長板、半月板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞(例如，向骨骼及/或軟骨傳遞)治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽(諸如，章節6.1.2 (b)中所述之酸性寡肽，例如D8)融合之hGALNS，其中該融合蛋白由rAAV基因組產生。rAAV基因組可包含如章節6.1.2中所述之hGALNS表現卡匣。

在另一個態樣中，該方法包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、生長板、半月板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞(例如，向骨骼及/或軟骨傳遞)治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽(諸如章節6.1.2(b)中所述之酸性寡肽，例如D8)融合之hGALNS，其中該融合蛋白由rAAV基因組產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。rAAV基因組可包含如章節6.1.2中所述之hGALNS表現卡匣。在一個較佳實施例中，rAAV基因組包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。在一個較佳實施例中，肝特異性啟動子為TBG啟動子。

在另一個態樣中，該方法包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、生長板、半月板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞(例如，向骨骼及/或軟骨傳遞)治療有效量之融合蛋白，該融合蛋白為與酸性寡肽(諸如章節6.1.2(b)中所述之酸性寡肽，例如D8)融合之hGALNS，其中該融合蛋白由rAAV基因組產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。rAAV基因組可包含如章節6.1.2中所述之hGALNS表現卡匣。在一個較佳實施例中，rAAV基因組包含編碼啟動子之核苷酸序列，其中編碼啟動子之核苷酸序列與編碼融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接。在某些實施例中，啟動子為CAG啟動子。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:15具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:16具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:13。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:14。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:15。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:16。

在另一個態樣中，該方法包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、生長板、半月板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞(例如，向骨骼及/或軟骨傳遞)治療有效量之hGALNS，該hGALNS由rAAV基因組產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。rAAV基因組可包含如章節6.1.2中所述之hGALNS表現卡匣。在一個較佳實施例中，rAAV基因組包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。在一個較佳實施例中，肝特異性啟動子為TBG啟動子。

在另一個態樣中，該方法包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、生長板、半月板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞(例如，向骨骼及/或軟骨傳遞)治療有效量之hGALNS，該hGALNS由rAAV基因組產生且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。rAAV基因組可包含如章節6.1.2中所述之hGALNS表現卡匣。在一個較佳實施例中，rAAV基因組包含編碼啟動子之核苷酸序列，其中編碼啟動子之核苷酸序列與編碼hGALNS之核苷酸序列可操作地連接。在某些實施例中，啟動子為CAG啟動子。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:15具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO:16具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核苷酸序列。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:13。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:14。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:15。在某些實施例中，啟動子為SEQ ID NO:16。

在本文所述治療方法之各種實施例中，rAAV或rAAV基因組包含源自AAV之一或多種血清型之一或多種組分。在某些實施例中，rAAV或rAAV基因組包含源自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAV11中一或多者之一或多種組分。在某一實施例中，rAAV或rAAV基因組包含源自AAV8、AAV9、AAV10或AAV11血清型中一或多者之一或多種組分。在一個較佳實施例中，rAAV或rAAV基因組包含源自AAV8血清型之一或多種組分。AAV組分之核酸序列及製備重組AAV與AAV衣殼之方法例如美國專利第7,282,199 B2號、美國專利第7,790,449 B2號、美國專利第8,318,480 B2號、美國專利第8,962,332 B2號及國際專利申請第PCT/EP2014/076466號中所述，其各自以全文引用之方式併入本文中。

在本文所述治療方法之各種實施例中，向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟為向(a)骨骼及/或軟骨以及(b)韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟。6.3.1 靶患者群體

根據本發明，人類個體或患者為經診斷患有MPS IVA(莫耳丘A症候群)之個體。在特定實施例中，患者具有MPS IVA之一或多種以下症狀：心瓣膜形態異常、齲齒、頸椎病、頸椎半脫位、尿液排泄軟骨素硫酸鹽、面部特徵粗糙、髂骨翼狹窄、髖外翻、軀幹矮小不成比例、身材矮小、管狀骨骺畸形、胸腔外擴、膝外翻、牙釉質發灰、聽力損失、肝腫大、脊柱前凸過度、齒狀突發育不全、腹股溝疝、關節鬆弛、青少年發病、尿液排泄角蛋白硫酸鹽、脊柱隆凸、肘部大塊、下頜前突、幹骺端寬大、角膜基質混濁、骨質疏鬆症、卵形椎體、扁平椎、第二至第五掌骨指端接近、胸骨突出、復發性上呼吸道感染、限制性通氣功能障礙、脊柱側凸、手腕尺骨偏斜、大嘴巴及牙齒稀疏。

在某些實施例中，患者經識別對hGALNS治療有反應。

在一個特定實施例中，患者患有嚴重且快速進行性早期發作形式之MPS IVA。在另一個特定實施例中，患者患有緩慢進行性晚期發作形式之MPS IVA。

在一個特定實施例中，患者為成人(至少16歲)。在另一個特定實施例中，患者為青少年(12-15歲)。在另一個特定實施例中，患者為兒童(12歲以下)。6.3.2 投藥與劑量

本文所述之rAAV之投藥途徑及投與人類患者之rAAV之量可基於疾病之嚴重程度、人類患者之病況及主治醫師之知識來確定。 (a) 治療劑量

在較佳實施例中，投與人類個體之rAAV之量足以向受影響組織(骨骼、軟骨、韌帶、半月板及/或心瓣膜)提供治療有效量之hGALNS。

在某些實施例中，藉由經由本發明提供之rAAV向人類個體投與之基因組複本之數量來量測劑量。在一個特定實施例中，投與1 × 10¹⁰ 至1 x 10¹⁶ 個基因組複本。在另一個特定實施例中，投與1 × 10¹⁰ 至1 × 10¹¹ 個基因組複本。在另一個特定實施例中，投與1 × 10¹¹ 至1 × 10¹² 個基因組複本。在另一個特定實施例中，投與1 × 10¹² 至1 × 10¹³ 個基因組複本。在另一個特定實施例中，投與1 × 10¹³ 至1 × 10¹⁴ 個基因組複本。在另一個特定實施例中，投與1 × 10¹⁴ 至1 × 10¹⁵ 個基因組複本。在另一個特定實施例中，投與1 × 10¹⁵ 至1 × 10¹⁶ 個基因組複本。

不受理論約束，所投與rAAV之至少10%感染其所投藥之人類個體之肝。在某些實施例中，所投與rAAV之10-15%、15-20%、20-25%、25-35%、30-40%、35-45%、40-50%、45-55%、50-60%、55-65%、60-70%、65-75%、70-80%、75-85%、80-90%、85-95%或90-100%感染人類個體之肝。

不受理論約束，由rAAV病毒基因組表現之hGALNS酶之至少10%在肝細胞中得以表現。在某些實施例中，由rAAV病毒基因組表現之hGALNS酶之10-15%、15-20%、20-25%、25-35%、30-40%、35-45%、40-50%、45-55%、50-60%、55-65%、60-70%、65-75%、70-80%、75-85%、80-90%、85-95%或90-100%在肝細胞中得以表現。

不受理論約束，由rAAV病毒基因組表現之hGALNS酶之至少10%到達人類個體之受影響組織(例如，骨骼)。在某些實施例中，由rAAV病毒基因組表現之hGALNS酶之10-15%、15-20%、20-25%、25-35%、30-40%、35-45%、40-50%、45-55%、50-60%、55-65%、60-70%、65-75%、70-80%、75-85%、80-90%、85-95%或90-100%到達人類個體之受影響組織(例如，骨骼)。

不受理論約束，由rAAV病毒基因組表現之hGALNS酶之至少10%藉由在肝細胞中表現且由肝細胞分泌而糖基化。在某些實施例中，由rAAV病毒基因組表現之hGALNS酶之10-15%、15-20%、20-25%、25-35%、30-40%、35-45%、40-50%、45-55%、50-60%、55-65%、60-70%、65-75%、70-80%、75-85%、80-90%、85-95%或90-100%藉由在肝細胞中表現且由肝細胞分泌而糖基化。

不受理論約束，肝細胞糖基化hGALNS酶之至少10%可到達人類個體之受影響組織(例如，骨骼)。在某些實施例中，肝細胞糖基化hGALNS酶之10-15%、15-20%、20-25%、25-35%、30-40%、35-45%、40-50%、45-55%、50-60%、55-65%、60-70%、65-75%、70-80%、75-85%、80-90%、85-95%或90-100%可到達人類個體之受影響組織(例如，骨骼)。 (b) 投藥途徑

在一個特定實施例中，rAAV可存在於醫藥組合物中以供投與人類個體(參見章節6.1.3)。

rAAV可例如藉由非經腸、皮下、肌肉內、靜脈內、腹膜內、鼻內、鞘內或經皮投藥來投與。在一個特定實施例中，rAAV藉由靜脈內投藥來投與。6.4 組合療法 6.4.1 與免疫抑制之共同療法

儘管rAAV之傳遞應使免疫反應最小化，但與基因療法相關之毒性之最明顯潛在來源正對遺傳上hGALNS不足且因此可能對酶或rAAV不耐受之人類個體中表現之hGALNS蛋白產生免疫。因此，在某一實施例中，可建議與免疫抑制療法共同治療患者--尤其在治療hGALNS含量接近零之嚴重疾病患者時。可採用包含他克莫司(tacrolimus)或雷帕黴素(rapamycin，西羅莫司(sirolimus))方案與黴酚酸或在組織移植手術中使用之其他免疫抑制方案組合之免疫抑制療法。該種免疫抑制治療可在基因療法過程期間投與，且在某些實施例中，由免疫抑制療法進行預治療可為較佳的。基於主治醫師之判斷，免疫抑制療法在基因療法治療後可繼續，且隨後在誘發免疫耐受性時可撤回；例如在180天之後。

在某些實施例中，本發明提供之治療方法進一步包含向人類患者投與包含潑尼松龍(prednisolone)、黴酚酸及他克莫司之免疫抑制方案。在某些實施例中，本發明提供之治療方法進一步包含向人類患者投與包含潑尼松龍、黴酚酸及雷帕黴素(西羅莫司)之免疫抑制方案。在某些實施例中，本發明提供之治療方法進一步包含向人類患者投與不包含他克莫司之免疫抑制方案。在某些實施例中，本發明提供之治療方法進一步包含向人類患者投與包含諸如甲潑尼龍(methylprednisolone)及/或潑尼松龍之一或多種皮質類固醇以及他克莫司及/或西羅莫司之免疫抑制方案。在某些實施例中，免疫抑制療法包含在hGALNS治療之前或與此同時向該個體投與(a)他克莫司與黴酚酸或(b)雷帕黴素與黴酚酸之組合且在hGALNS治療之後繼續進行。在某些實施例中，在180天之後撤回免疫抑制療法。在某些實施例中，在30、60、90、120、150或180天之後撤回免疫抑制療法。6.4.2 與其他治療之共同療法

所述實施例之方法涵蓋包含向人類個體投與如本文所述之rAAV，同時伴以投與其他可用治療之組合療法。可在基因療法治療之前、與此同時或在此之後投與其他治療。可與本發明之基因療法組合之用於MPS IVA之可用治療包括(但不限於)酶替代療法(ERT)及/或HSCT療法。在一個特定實施例中，可藉由重組型DNA技術使用在人類細胞株中產生之D8-hGALNS酶進行ERT。可用於該種酶產生之人類細胞株包括(但不限於)HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11、ReN細胞VM、人類胚胎腎293細胞(HEK293)、HEK293-T、纖維肉瘤HT-1080、HKB-11、CAP、HuH-7及視網膜細胞株、PER.C6或RPE (參見，例如Dumont等人，2016，Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122 「Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives」，其以全文引用之方式併入本文中)。6.5 疾病標記及治療評估

在某些實施例中，可藉由量測骨骼、軟骨、韌帶、半月板、心瓣膜、尿液及/或血清中之疾病生物標記減少(諸如GAG、KS及C6S儲量)及/或hGALNS酶活性增加來監控如本文所述治療方法之功效。亦可監控發炎徵象及其他安全事件。

在某些實施例中，藉由量測患者體內疾病生物標記之含量來監控如本文所述治療方法之功效。在某些實施例中，量測患者血清中疾病生物標記之含量。在某些實施例中，量測患者尿液中疾病生物標記之含量。在某些實施例中，疾病生物標記為GAG。在某些實施例中，疾病生物標記為KS。在某些實施例中，疾病生物標記為C6S。在某些實施例中，疾病生物標記為hGALNS酶活性。

在某些實施例中，可藉由量測患者體內與溶酶體儲存不足相關之物理特徵來監控如本文所述治療方法之功效。在某些實施例中，物理特徵可為儲存損傷。在某些實施例中，物理特徵可為頸部及軀幹短小。在某些實施例中，物理特徵可為雞胸。在某些實施例中，物理特徵可為關節鬆弛。在某些實施例中，物理特徵可為脊柱後側彎。在某些實施例中，物理特徵可為氣管阻塞。在某些實施例中，物理特徵可為脊髓壓迫。在某些實施例中，物理特徵可為聽力損失。在某些實施例中，物理特徵可為角膜混濁。在某些實施例中，物理特徵可為骨骼及關節畸形。在某些實施例中，物理特徵可為心瓣膜疾病。在某些實施例中，物理特徵可為氣管受限/阻塞。該等物理特徵可藉由熟習此項技術者已知之任何方法來量測。7. 實例

藉由以下非限制性實例說明本發明提供之某些實施例。7.1 實例 1. 設計編碼 rAAV 基因組之質體及活體外轉染分析法

為產生將封裝在AAV8衣殼中之含有hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組，設計編碼重組AAV基因組之質體。設計且產生四種質體：TBG-hGALNS (hGALNS表現卡匣含有編碼hGALNS之核苷酸序列，其表現係在肝特異性TBG啟動子之調節下)、TBG-hGALNS CoOpt (hGALNS表現卡匣含有編碼hGALNS之密碼子優化核苷酸序列，其表現係在肝特異性TBG啟動子之調節下)、TBG-D8-hGALNS (hGALNS表現卡匣含有編碼融合蛋白之核苷酸序列，該融合蛋白為與D8融合之hGALNS，其表現係在肝特異性TBG啟動子之調節下)或TBG-D8-hGALNS CoOpt (hGALNS表現卡匣含有編碼融合蛋白之密碼子優化核苷酸序列，該融合蛋白為與D8融合之hGALNS，其表現係在肝特異性TBG啟動子之調節下)。所得rAAV分為兩類：(a)包含含有側接AAV-反向末端重複序列(ITR)之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組之rAAV，其中該hGALNS表現卡匣包含與肝特異性TBG啟動子序列可操作連接之hGALNS cDNA序列及編碼poly A位點之核苷酸序列；及(b)包含含有側接AAV-反向末端重複序列(ITR)之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組之rAAV，其中該hGALNS表現卡匣包含與肝特異性TBG啟動子序列可操作連接之D8-hGALNS cDNA序列及編碼poly A位點之核苷酸序列(圖1)。D8為骨靶向天冬胺酸八肽。

接著，使用脂染胺-3000方案以四種質體之一轉染人類肝細胞癌(HuH7)細胞以測試hGALNS之活體外表現。培育48小時後，收集經轉染之HuH7細胞及上清液且在細胞集結粒及培養基中分析GALNS酶活性。使用經GFP質體轉染之Huh7細胞作為對照物。藉由以TBG-hGALNS或TBG-hGALNS CoOpt質體轉染，同樣使細胞內hGALNS酶活性增加(圖2A及2B)。在以TBG-D8-hGALNS或TBG-D8-hGALNS CoOpt質體轉染後，細胞內酶活性亦增加，儘管程度上小於經TBG-hGALNS或TBG-hGALNS CoOpt質體轉染(圖2A及2B)。藉由經任意種質體轉染，均增加在細胞培養基中偵測之酶活性(圖2C及2D)。

類似地，使用脂染胺-3000方案以四種質體之一轉染人類肝癌細胞(HepG2)以測試hGALNS之活體外表現(圖3)。培育72小時後，收集經轉染之HepG2細胞且在細胞集結粒中分析hGALNS酶活性。與經對照質體轉染相比，經TBG-hGALNS或TBG-hGALNS CoOpt質體轉染使細胞內hGALNS酶活性增加。與對照質體相比，經TBG-D8-hGALNS或TBG-D8-hGALNS CoOpt質體轉染並未導致hGALNS活性增加。7.2 實例 2. 向 MPS IVA 基因剔除 (galns -/-) 小鼠活體內投與 rAAV

產生包含在肝特異性啟動子TBG下能夠表現原生人類GALNS (hGALNS)(AAV8-TBG-hGALNS，在某些圖中亦標記為AAV8-hGALNS)或在肝特異性啟動子下能夠表現具有天冬胺酸八肽(D8)之hGALNS(AAV8-TBG-D8-hGALNS，在某些圖中亦標記為AAV8-D8-hGALNS)之病毒基因組的rAAV8。分別使用TBG-hGALNS CoOpt及TBG-D8-hGALNS CoOpt質體產生病毒基因組。以每公斤體重5 × 10¹³ GC之劑量經靜脈內向4週大之MPS IVA基因剔除(KO)小鼠及Mtol免疫耐受型小鼠各自投與兩種類型之病毒。KO小鼠中mGALNS之外顯子2受到靶向破壞且不具有可偵測之GALNS酶活性。Mtol小鼠對人類GALNS蛋白耐受。未經治療之KO小鼠及野生型(WT)小鼠充當對照物。在注射後對該等小鼠進行監控歷時14週。每兩週收集一次血液且分析hGALNS活性及角質素硫酸鹽(KS)。rAAV投藥、血液收集、GALNS酶分析法及KS分析法之時程展示於圖4中。在屍體剖檢時，藉由組織病理學分析評估骨骼病理。

如圖5A中可見，經rAAV治療之小鼠之白血球(WBC)中之hGALNS酶活性增加，在治療10週後達到接近WT小鼠水準。在投與rAAV兩週後，所有經rAAV治療之小鼠血漿中之hGALNS酶活性與WT小鼠中之水準相比平均上升20倍(與WT小鼠中之水準相比在5-100倍範圍內)(圖5B)。在14週監控期期間保持此增加(圖5B)。類似資料展示於圖22中。經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠中之血漿酶活性水準顯著高於經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠中之水準(圖6)，但兩治療組之酶活性水準均上升至高於WT水準。類似資料展示於圖23中。

將在經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之KO (galns -/-)小鼠之肝中量測之hGALNS活性與WT小鼠之肝hGALNS活性相比(圖7A)。經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠之肝中具有比WT水準高40倍之hGALNS活性水準，而經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠具有比WT水準高8倍之肝hGALNS活性。經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠肝中之hGALNS活性上升至高於未經治療之Mtol小鼠(經PBS治療)(圖7B)。經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠肝中之hGALNS活性水準比未經治療之小鼠高50倍，而經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠具有比未經治療之Mtol小鼠高8倍之肝hGALNS活性。關於在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，分別在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)及Mtol小鼠之肝中量測之hGALNS活性水準與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠(n = 3-8；平均值 ± SD)相比之更多資料，參見圖12A。

亦量測(a)WT小鼠、(b)未經治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、(c)經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、(d)經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、(e)未經治療之Mtol小鼠、(f)經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠及(g)經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之心臟中之hGALNS活性(圖7C)。對於MPS IVA KO (galns -/-)小鼠及Mtol小鼠而言，經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠及經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠兩者心臟中之hGALNS活性水準均比未經治療之小鼠更大。關於在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，分別在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)及Mtol小鼠之心臟中量測之hGALNS活性水準與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠(n = 3-8；平均值 ± SD)相比之更多資料，參見圖13B。

類似地，量測(a)WT小鼠、(b)未經治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、(c)經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、(d)經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、(e)未經治療之Mtol小鼠、(f)經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠及(g)經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之骨骼中之hGALNS活性(圖7D)。對於MPS IVA KO (galns -/-)小鼠及Mtol小鼠兩者而言，經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠及經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠骨骼中之hGALNS活性水準均比未經治療之小鼠更大。關於在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，分別在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)及Mtol小鼠之骨骼中量測之hGALNS活性水準與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠(n = 3-8；平均值 ± SD)相比之更多資料，參見圖13A。

在MPS IVA KO (galns -/-)小鼠及Mtol小鼠兩者中，在傳遞AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS載體後評估經治療小鼠之肝、心臟及骨骼中之hGALNS活性水準。另外，血液與骨骼中之hGALNS酶活性之間具有直接關聯。

在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，亦分別量測MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之脾中及Mtol小鼠之脾中與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠(n = 3-8；平均值 ± SD)相比之hGALNS酶活性水準(圖12B)。對於MPS IVA KO (galns -/-)小鼠及Mtol小鼠兩者而言，經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠及經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠兩者之脾中均具有比未經治療之小鼠更大之hGALNS活性水準。

另外，在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，亦分別量測MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之肺中及Mtol小鼠之肺中與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠(n = 3-8；平均值 ± SD)相比之hGALNS酶活性水準(圖12C)。對於MPS IVA KO (galns -/-)小鼠及Mtol小鼠兩者而言，經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠及經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠兩者之肺中均具有比未經治療之小鼠更大之hGALNS活性水準。

量測血液角質素硫酸鹽(KS)含量。在KO (galns -/-)小鼠中，兩組中之rAAV治療在投藥兩週後均引起血漿中之單硫酸化角質素硫酸鹽(KS)含量減少至WT含量(圖8及圖14)。保持經rAAV治療之兩組血漿中之該等減少之含量直至在注射後12週時進行屍體剖檢。相反，未經治療之KO小鼠血漿中之KS含量在監控期期間未減少且保持升高。在Mtol小鼠中投與任一rAAV在治療兩週後引起血漿中之單硫酸化角質素硫酸鹽(KS)含量與WT含量相比減少，且血漿中之KS含量與未經治療之Mtol小鼠相比顯著減少(圖9A-9B及圖15A-15B)。然而，未經治療、經AAV8-TBG-hGALNS治療、經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療及WT小鼠組之間之血液diHS-0S含量並無差異(圖10)。

分別量測與未經治療之MPS IVA KO小鼠及未經治療之野生型小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之肝中、Mtol小鼠之肝中及MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之肺中之單硫酸化KS含量(圖16A-16C)。與未經治療之小鼠相比，投與任一rAAV導致肝中之單硫酸化KS顯著減少及肺中之單硫酸化KS顯著減少。在投與AAV載體後，MPS IVA KO小鼠(galns -/-)及Mtol小鼠之肝及肺中之KS含量幾乎標準化。

對來自經治療KO小鼠之肝之組織病理學評估展示完全清除竇黏膜細胞及庫弗細胞中儲存之GAG。

投與AAV8-TBG-hGALNS及AAV8-TBG-D8-hGALNS在監控期期間維持血漿KO及Mtol小鼠模型中之高水準酶促活性。循環酶之該種持續存在使血漿中之KS減少至WT含量，此係對由ERT所達成結果之顯著改良(Tomatsu等人，Human Molecular Genetics, 2008, 17(6): 815-824)。儘管在小鼠模型中且對於AAV8-TBG-hGALNS及AAV8-TBG-D8-hGALNS而言，在投與rAAV兩週後，血漿中之KS含量均標準化，但在以ERT治療KO小鼠之先前研究中，即使在每週輸注歷時12週後，血漿中之KS含量仍未標準化(Tomatsu等人, Human Molecular Genetics, 2008, 17(6): 815-824)。另外，高酶含量連同較長之循環時間相組合使得增加滲透至骨骼及軟骨療法中，由此改良在該等區域中之儲量。

在rAAV治療12週後，對小鼠處以安樂死，且收集組織並評估葡糖胺聚糖(GAG)之儲量。以甲苯胺藍對組織染色。藉由組織病理學分析來評估骨骼病理且將MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之病理學記分以圖形表示呈現(圖11A)。圖11B展示膝關節(MPS IVA KO (galns -/-)小鼠)之染色影像。

圖11C展示MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之股骨關節軟骨之40倍放大染色影像。在未經治療之小鼠中(左圖)，淺表細胞係混亂的(disorganized)，且軟骨細胞係氣球狀且有液泡。此外，柱狀結構係扭曲且混亂的。相反地，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之組織顯示有序(organized)之淺表細胞、較少液泡之軟骨細胞且維持柱狀結構(右側兩圖)。該等態樣更詳細地展示於圖11D-11F中。

圖11G展示未經治療或經rAAV治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之股骨生長板之40倍放大染色影像。在未經治療之小鼠中(左圖)，軟骨細胞係有液泡的且柱狀結構很混亂且扭曲。經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠之軟骨細胞(中圖)亦有液泡，但柱狀結構僅稍扭曲。相反地，經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之組織(右圖)，軟骨細胞稍有液泡且柱狀結構較有序。該等態樣更詳細地顯示於圖11H-11J中。圖17A-17E亦展示股骨生長板之40倍放大染色影像，於(A)野生型小鼠(所有軟骨細胞無液泡且柱狀結構組織有序)、(B)未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)(所有軟骨細胞有液泡且柱狀結構很混亂且扭曲)、(C)未經治療之Mtol小鼠(所有軟骨細胞有液泡且柱狀結構很混亂且扭曲)、(D)經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠(軟骨細胞稍有液泡，但柱狀結構較佳)，及(E)經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠(軟骨細胞稍有液泡，但柱狀結構部分恢復)。

圖18A展示在未經治療之野生型小鼠、未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之股骨及脛骨生長板中量測之軟骨細胞之細胞大小。圖18B展示在未經治療之野生型小鼠、未經治療之Mtol小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之股骨生長板中量測之軟骨細胞之細胞大小。圖18C展示在未經治療之野生型小鼠、未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之脛骨生長板中量測之軟骨細胞之細胞大小。圖18D展示在未經治療之野生型小鼠、未經治療之Mtol小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之脛骨生長板中量測之軟骨細胞之細胞大小。

MPS IVA KO小鼠及Mtol小鼠之生長板中之軟骨細胞大小及柱狀結構兩者在AAV基因轉移後均實質性改良。

圖11K展示未經治療或經rAAV治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之半月板之40倍放大染色影像。在未經治療之小鼠中(左圖)，大部分細胞係鼓起且有液泡的。經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠之半月板中之一些細胞(中圖)係有液泡的。經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠之組織中之大部分細胞(右圖)係無液泡的。

圖11L展示未經治療或經rAAV治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之脛骨側上之韌帶之40倍放大染色影像。在未經治療之小鼠中(左圖)，大部分細胞係有液泡的。經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠之韌帶中之一些細胞(右側兩圖)仍為有液泡的。

圖11M展示未經治療或經rAAV治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之心瓣膜基底之40倍放大染色影像。未經治療之小鼠之二尖瓣基底處之許多細胞(左圖)係有液泡的，而在經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠(中圖)或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠(右圖)之二尖瓣組織基底處未見有液泡之細胞。未經治療之小鼠組織之該等態樣更詳細地展示於圖11N中。在心瓣膜組織中可見類似結果(圖11O)。關於Mtol小鼠之類似結果展示於圖19(下圖)中。未經治療之小鼠之許多心瓣膜細胞(左圖)係有液泡的，而在經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠(中圖)或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠(右圖)之心瓣膜組織中未見有液泡之細胞。未經治療之小鼠組織之該等態樣更詳細地展示於圖11P中。

圖20展示與未經治療之Mtol小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠中之心肌之組織病理學(40倍放大率)。

在AAV基因轉移後，MPS IVA KO (galns -/-)小鼠及Mtol小鼠兩者之心瓣膜及心肌均無明顯之有液泡細胞。

圖21A展示未經治療之野生型小鼠、未經治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之心瓣膜組織之病理學記分。圖21B展示未經治療之野生型小鼠、未經治療之Mtol小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之心瓣膜組織之病理學記分。圖21C展示未經治療之野生型小鼠、未經治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之心肌組織之病理學記分。圖21D展示未經治療之野生型小鼠、未經治療之Mtol小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之心肌組織之病理學記分。

亦藉由組織病理學分析來評估Mtol小鼠之骨骼病理學。使用非配對t測試來檢驗未經治療組與每一治療組之間之病理學記分差異(記分：0(正常)- 3(嚴重))，參見表1。

表 1. Mtol小鼠骨骼中之病理學記分(n = 2-5，平均值 ± SD)

			未經治療	經AAV8-TBG-hGALNS治療	經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療
生長板	股骨	形成液泡	2.90 ± 0.10	1.38 ± 0.34 *	1.41 ± 0.21 *
		柱狀結構	2.93 ± 0.11	1.44 ± 0.33 *	1.47 ± 0.16 *
	脛骨	形成液泡	2.85 ± 0.21	1.56 ± 0.26 *	1.50 ± 0.29 *
		柱狀結構	2.75 ± 0.31	1.63 ± 0.20 *	1.41 ± 0.33 *
關節軟骨	股骨	形成液泡	2.48 ± 0.34	1.38 ± 0.18 *	1.16 ± 0.33 *
		柱狀結構	2.35 ± 0.44	1.38 ± 0.18 *	1.22 ± 0.19 *
	脛骨	形成液泡	2.53 ± 0.16	1.19 ± 0.14 *	1.27 ± 0.21 *
		柱狀結構	2.44	1.38	1.21 ± 0.26
韌帶			2.80 ± 0.26	1.72 ± 0.56 *	1.66 ± 0.26 *
半月板			2.73 ± 0.34	1.41 ± 0.33 *	1.34 ± 0.26 *

*p ＜ 0.05相對於未經治療

兩種病毒均使脛骨及股骨中之關節軟骨、韌帶及關節軟骨與生長板區域周圍之半月板中之GAG儲量減少。對於經AAV-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠而言，在骨骼及軟骨中觀測之GAG儲量減少相對較大。

經rAAV治療之小鼠中之骨骼、生長板、關節軟骨、半月板、韌帶及心臟組織均實質性改良。另外，經治療小鼠之心瓣膜及心瓣膜基底中之缺陷已完全緩解，且在心瓣膜基底及心瓣膜中未見明顯有液泡之細胞。結果展示優於ERT之顯著改良，因為經ERT治療之小鼠展示未清除生長板中有液泡之細胞、生長板中具有混亂之柱狀結構且心瓣膜中具有實質上有液泡之細胞(Tomatsu等人, Human Molecular Genetics, 2008, 17(6): 815-824)。

在除肝(此處產生hGALNS及D8-hGALNS蛋白)以外之組織中觀測到治療作用之事實表明，存在由甘露糖-6-磷酸鹽受體介導之交叉校正。7.3 實例 3. 肝靶向 AAV8 基因療法改善 IVA 型黏多醣病鼠模型中之骨骼及心血管病理學

在此實例中，評估在肝特異性甲狀腺素-結合球蛋白(TBG)啟動子控制下具有或不具有骨靶向信號之表現hGALNS之AAV8載體且研究該等重組AAV8載體在MPS IVA疾病之兩種小鼠模型之骨骼及心臟病變中之治療功效。骨骼及心臟係此病症中受影響之主要器官。7.3.1 結果 (a)血液及組織中之GALNS酶活性：AAV-hGALNS傳遞導致在MPS IVA小鼠模型之血漿及各種組織中產生GALNS活性。

MPS IVA疾病之小鼠模型就血液及組織中hGALNS活性減小或無hGALNS活性、GAG、尤其角質素硫酸鹽之含量及在軟骨細胞及骨細胞中之儲量增加而言概述人類疾病。該等生物標記已廣泛用於評估各種方式在該等小鼠模型中之治療功效。對於此研究而言，吾人以每公斤體重1 × 10¹³ GC之均一劑量經靜脈內向4週齡之MPS IVA KO及MTOL小鼠模型傳遞AAV8-TBG-hGALNSco及AAV8-TBG-D8-hGALNSco (圖24A)。注射後監控小鼠歷時12週且每隔一週收集血液樣品以分析酶促活性及KS含量。另外，在屍體剖檢時，自不同器官獲取組織樣品以確定酶促活性及KS含量，以及自膝關節及心瓣膜獲取組織樣品以用於組織病理學分析。

MPS IVA KO及MTOL小鼠中之血漿酶活性展示於圖24B-24C中。在未經治療之小鼠中未偵測到血漿hGALNS活性。注射兩週後，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO中之血漿hGALNS活性與野生型小鼠中之血漿hGALNS活性相比顯著增加。注射2週後，來自AAV8-TBG-D8-hGALNS之酶活性高於來自AAV8-TBG-hGALNS之酶活性；然而，注射12週後，該等AAV載體之間之血漿hGALNS活性並無差異。在經兩種AAV載體治療之MTOL小鼠中，血漿hGALNS活性在注射2週後與野生型小鼠中之血漿hGALNS活性相比顯著增加。在整個研究持續期間，來自經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠之酶活性水準高於來自經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠之酶活性水準，表明具有骨靶向信號之hGALNS蛋白與原生hGALNS相比血液循環延長，此可能係由於減少吸收至組織中。該等結果證實，在兩種MPS IVA小鼠模型中單次注射AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS後達成超生理水準之循環hGALNS活性，且在研究持續期間維持該等高之酶水準。

靜脈內傳遞AAV載體後12週時肝中之HGALNS活性水準展示於圖24D中。所有經治療之MPS IVA小鼠中之hGALNS活性水準均顯著高於未經治療之MPS IVA小鼠中之hGALNS活性水準。經治療之MPS IVA KO小鼠中之平均酶活性水準分別比在野生型小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS及AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠中觀測之水準高出49倍及9倍。在經治療之MTOL小鼠中，hGALNS活性在傳遞AAV8-TBG-hGALNS及AAV8-TBG-D8-hGALNS後分別比在野生型小鼠中發現之水準高出60倍及9倍。經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之小鼠之GALNS活性與KO及MTOL小鼠之肝中經AAV8-TBG-hGALNS治療之小鼠中之酶活性相比顯著較低。在進行轉染後，Huh-7細胞中之細胞內hGALNS活性展示來自具有骨靶向信號之AAV載體質體之酶活性與來自未修飾AAV載體質體之酶活性相比之低水準，而在該等AAV載體質體之間，細胞外hGALNS活性不變(圖29A-29B)，表明具有骨靶向信號之hGALNS蛋白與原生hGALNS相比未有效自循環吸收至組織中。

檢驗組織hGALNS活性水準以闡明對MPS IVA小鼠組織中hGALNS不足之潛在交叉校正。在注射AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS後12週，在KO及MTOL小鼠之脾、肺、腎、骨骼(腿)及心臟中觀測hGALNS活性(圖24E-24I)。脾及心臟中之酶活性與野生型水準類似或高於野生型水準，且在肺及腎中觀測到低水準之活性。顯著地，在經AAV8-TBG-hGALNS及AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之KO小鼠之骨骼中分別觀測到37%及20%之野生型酶活性。又，在經該等AAV載體治療之MTOL小鼠中觀測到57%及43%之野生型酶活性。該等結果表明，hGALNS酶之穩定超生理含量歸因於在AAV基因轉移後，酶滲透至MPS IVA小鼠之骨骼中。骨骼中之hGALNS活性水準在AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之間不變。 (b) 血液及組織中之葡糖胺聚糖含量：血液及組織中之KS含量由於AAV-GALNS傳遞而減少

吾人量測MPS IVA小鼠之血漿及組織中之單硫酸化KS，其為KS之主要組分之一。KO及MTOL中之血漿單硫酸化KS之含量展示於圖25A-25B中。在投與AAV載體之前，未經治療之KO小鼠中之血漿KS含量高於野生型小鼠中之血漿KS含量(平均值：41.8相對於16.3 ng/ml)。注射兩週後，對於兩種AAV載體而言，血漿中之KS含量均完全標準化，且此含量至少再維持10週。4週齡之野生型小鼠及未經治療MTOL小鼠中之KS含量類似。野生型小鼠中之KS含量在整個研究期間維持在恆定水準(在X與Y之間)；然而，未經治療之MTOL小鼠中之KS含量隨年齡而逐漸增加。經任一AAV載體治療之MTOL小鼠在整個研究期間維持野生型含量。在16週齡時，經AAV載體治療之MTOL小鼠中之KS含量與未經治療之MTOL小鼠中之KS含量相比顯著減少。

量測MPS IVA小鼠組織中之單-KS含量。在屍體剖檢時，KO及MTOL小鼠之組織中存在過量之GAG儲量。在注射任一AAV載體12週後，KO及MTOL小鼠之肝及肺中之單-KS之量標準化(圖25C-25D)。為評估表現hGALNS之該等AAV載體對其他GAG含量之作用，分析MPS IVS小鼠之血液及組織中之類肝素硫酸鹽(HS)含量。KO及MTOL兩者之血漿具有標準含量之diHS-0S，且該等含量在注射AAV載體後不受影響(圖30A-30B)。在注射AAV載體12週後，所有組之間之肝及肺中之組織diHS-0S含量亦不變(圖31)。 (c)傳遞AAV GALNS載體改良MPS IVA小鼠之骨骼及軟骨病理學

評估來自經注射AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS後12週之MPS IVA小鼠之組織，包括骨骼(股骨及脛骨)及心臟(心肌及心瓣膜)。

16週齡之未經治療之MPS IVA KO及MTOL小鼠在股骨及脛骨之生長板(透明軟骨)(圖27A)、關節盤(圖27B)、膝關節周圍之韌帶(圖32A)及半月板(圖32B)中展現GAG儲存液泡。生長板亦展現混亂之柱狀結構以及鼓起且有液泡之軟骨細胞(圖27A-27B)。在經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之KO小鼠中，膝關節中之生長板、關節軟骨、韌帶及半月板中儲存之物質部分減少，且軟骨細胞之柱狀結構得以改良，但仍係混亂且扭曲的。在經該等AAV載體治療之MTOL小鼠中，膝關節中之生長板、關節軟骨、韌帶及半月板具有更為顯著之儲量減少，且生長板及關節軟骨之柱狀結構與未經治療之MTOL小鼠相比展示更大之恢復。

為客觀地評估對生長板軟骨細胞中形成液泡之改良，定量KO及MTOL小鼠之生長板病變中之軟骨細胞細胞大小(4C)。吾人觀測到該等生長板病變中之軟骨細胞大小適度減小，其在MTOL小鼠中達成統計顯著性。未經治療之MPS IVA小鼠在心瓣膜及心肌中展現GAG儲存液泡。AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS在經治療之KO及MTOL小鼠之該等心臟病變中提供接近完全之清除(圖27A-27B)。 (d)抗hGALNS抗體之循環

總之，對KO小鼠骨骼病理學之改良與在注射AAV8載體12週後MTOL小鼠中之骨骼病理學改良相比較不明顯。為研究對hGALNS之體液反應之可能性，藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)量測對hGALNS之抗體效價。間接ELISA方法藉由使用塗佈於板上之全長rhGALNS偵測血漿中之抗hGALNS抗體。來自經AAV載體治療之KO小鼠之血漿展示比來自其他組之血漿顯著更高含量之循環抗hGALNS抗體(對於經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之KO而言為0.50 ± 0.38或0.62 ± 0.43光學密度(OD)單位)(圖28)。在野生型、未經治療之KO及MTOL小鼠中未偵測到循環抗hGALNS抗體。 7.3.2 材料及方法 (a) 研發AAV hGALNS表現卡匣

為研發具有hGALNS之AAV8載體，吾人測定hGALNS之優化密碼子序列。將在肝特異性TBG啟動子控制下轉譯至526個胺基酸中之優化1569 bp序列封裝於AAV8衣殼中。在具有骨靶向信號之載體質體中，在hGALNS之N-末端信號肽之後插入天冬胺酸八肽(D8)序列，產生對主要骨骼基質羥基磷灰石具有高親和力之骨靶向hGALNS(圖24A)。在以Huh-7細胞進行轉染實驗後證明由該等AAV載體質體產生GALNS。來自密碼子優化開放閱讀框架之細胞內及細胞外hGALNS活性水準與由原生hGALNS編碼序列產生之hGALNS活性水準類似(圖29A-29B)。 (b)表現卡匣設計及AAV載體產生

將載有原生GALNS轉基因及含D8之GALNS轉基因之表現卡匣設計為封裝於AAV8載體中(圖28)。在hGALNS之N-末端信號肽之後插入骨靶向信號天冬胺酸八肽(D8)序列。該設計包括肝特異性甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子以及兔β球蛋白聚腺苷酸化尾(poly A)。吾人使用密碼子優化hGALNS序列用於小鼠研究之兩種載體。吾人藉由使用Huh-7細胞之轉染實驗證明該等表現卡匣質體之GALNS酶促活性。吾人在轉染後48小時測定細胞溶解物及上清液中之活性水準(圖29A-29B)。來自密碼子優化構築體之GALNS活性水準與由原生hGALNS編碼序列產生之GALNS活性水準類似。

根據REGENXBIO (Rockville, MD)之專有GMP載體產生方案之縮小版產生AAV8-TBG-hGALNS及AAV8-TBG-D8-hGALNS載體。簡而言之，以輔助質體、AAV8衣殼質體及含有hGALNS/D8-hGALNS質體之轉基因質體三重轉染HEK293細胞(RGX293)。使用親和層析法自細胞培養上清液純化經封裝之載體且使用數位微滴式PCR (Digital Droplet PCR)(BioRad)方法進行滴定。 (c)鼠模型及活體內研究設計

吾人藉由使用兩種MPS IVA鼠模型測試AAV8-TBG-hGALNS及AAV8-TBG-D8-hGALNS之治療潛能(Tomatsu等人，Hum Mol Genet 2003；12(24):3349-3358；Tomatsu等人，Hum. Mol. Genet. 2005；14, 3321-3335)。第一種類型為基因受到破壞之Galns 基因剔除小鼠模型(KO:Galns -/-)((Tomatsu等人，Hum Mol Genet 2003；12(24):3349-3358)。第二種類型為對人類GALNS耐受之鼠模型(MTOL：Galns^tm ^{(hC79S.mC76S)slu} )，其含有位於內含子1中之表現hGALNS之轉基因及與外顯子2相鄰之活性位點突變(C76S)，由此藉由靶向突變將具有C79S活性位點突變及C76S突變之非活性hGALNS編碼序列引入鼠Galns 基因中(Tomatsu等人，Hum. Mol. Genet. 2005；14, 3321-3335)。兩種模型之血液及組織中均未偵測到酶活性且展示儲存物質主要積聚在網狀內皮庫弗細胞、心瓣膜、心肌及包括生長板及關節軟骨之軟骨細胞中。

吾人先前已描述以C57BL/6為背景研發兩種MPS IVA鼠模型，MPS IVA基因剔除小鼠(Galns-/- )(Tomatsu等人，Hum Mol Genet 2003；12(24):3349-3358)及對人類GALNS蛋白耐受之MPS IVA小鼠(Galns^{tm(hC79S.mC76S)slu} )(Tomatsu等人，Hum. Mol. Genet. 2005；14, 3321-3335)。藉由靶向破壞GALNS基因研發GALNS基因剔除小鼠模型(KO：Galns -/-)(Tomatsu等人，Hum Mol Genet 2003；12(24):3349-3358)。對人類GALNS耐受之小鼠模型(MTOL：Galns^{tm(hC79S.mC76S)slu} )含有在內含子1中表現hGALNS之轉基因及與外顯子2相鄰之活性位點突變(C76S)，由此引入非活性之hGALNS編碼序列及C79S活性位點突變(Tomatsu等人，Hum. Mol. Genet. 2005；14, 3321-3335)。兩種小鼠模型之血液及組織中均未偵測到酶活性且展示儲存物質主要積聚在網狀內皮庫弗細胞、心瓣膜及心肌以及包括生長板及關節軟骨之軟骨細胞中。

在第14天藉由PCR對實驗定群進行基因型分型。以每公斤5 × 10¹³ GC之均一劑量經靜脈內以任一種AAV8載體治療4週大之同種接合MPS IVA小鼠。對另一定群之MPS IVA小鼠以及未受影響之C57BL/6同窩仔畜投與磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。投藥之總劑量體積為每隻小鼠約100 μl。所有動物護理及實驗均得到內穆爾·阿爾弗雷德·杜邦兒童醫院動物保護和利用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children)之批准。 (d)血液及組織收集

每隔一週自研究中之所有動物收集約100 μl血液在具有EDTA之管中(BD，Franklin Lakes，NJ, USA)。將血液以8,000 rpm離心10 min且將分離之血漿保持在-20℃下直至進行GALNS酶分析法及GAG分析法。在16週齡時，將小鼠在CO₂ 腔室中處以安樂死且灌注20 ml之0.9%鹽水。收集肝、腎、肺、脾、心臟及膝關節且儲存在-80℃下直至進行GALNS酶分析法及GAG分析法。另外，收集各種組織樣品且儲存在10%之中性緩衝福馬林(formalin)中以用於組織病理學分析。 (e) GALNS活性分析法

如前文所述測定血液及組織之GALNS活性(Toietta, G.等人，Hum. Gene Ther. 2001；12 , 2007-2016)。藉由使用均質機將冷凍組織以由25 mmol/l Tris-HCl (pH 7.2)及1 mmol/l苯基甲基磺醯氟組成之均質化緩衝劑均質化。將組織溶解物或血漿及22 mM 4-甲基香豆素基-β-哌喃半乳糖苷-6-硫酸鹽(Research Products International, Mount Prospect, IL, USA)在0.1 M NaCl、0.1 M乙酸鈉(pH 4.3)中在37℃下培育16 h。隨後，向反應樣品中添加在0.1 M NaCl、0.1 M乙酸鈉(pH 4.3)中之10 mg/ml來自米麴菌(Aspergillus oryzae)之β-半乳糖苷酶(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)，且在37℃下再培育2小時。將樣品轉移至停止溶液(1 M甘胺酸、NaOH，pH 10.5)中，且在Perkin Elmer Victor X4培養板閱讀器(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)上以366 nm之激發及450 nm之發射讀取培養板。活性表述為每微升血漿或每毫克蛋白每小時釋放之4-甲基繖酮之奈莫耳數。藉由BCA蛋白分析法套組(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)測定蛋白濃度。 (f) 自組織中提取GAG

自各種小鼠組織中提取GAG係對Mochizuki等人所研發進行修改而得(Mochizuki, H.等人 J. Biol. Chem. 2008；283 , 31237-31245)。簡而言之，將切除之組織冷凍於液氮中且使用均質機由丙酮均質化。將獲得之粉末在離心真空下乾燥。將脫脂之組織粉末懸浮於0.5 M NaOH中且在50℃下培育2 h以自其核心蛋白移除GAG鏈。在以1 M HCl中和後，添加NaCl至最終濃度為3 M。藉由離心移除不溶性物質，且以1 M HCl將上清液之pH調節至低於1.0。藉由離心移除沈澱之核苷酸且以1 M NaOH中和上清液。藉由添加2體積含有1.3%乙酸鉀之乙醇使粗GAG沈澱。離心後，將沈澱物溶解於蒸餾水中。 (g) GAG分析法

藉由如先前所述之LC-MS/MS量測血液及組織之GAG含量(Oguma, T.等人 Biomed. Chromatogr. 2007；21 , 356-362；Oguma, T.等人 Anal. Biochem. 2007；368 , 79-86；Shimada, T.等人 JIMD. Rep. 2014；16 , 15-24；Shimada, T.等人 JIMD. Rep. 2015；21 , 1-13；Kubaski, F.等人 J. Inherit. Metab. Dis. 2017；40 , 151-158)。簡而言之，將50 mM Tris-HCl(pH 7.0)及樣品置於96孔接收板上之96孔omega 10K過濾板(Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)中。將樣品以2,500 g離心15 min。將過濾板轉移至新的接收板，且向過濾板中添加由50 mM Tris-HCl (pH 7.0)、作為內標(IS)之5 μg/mL軟骨膠糖、1 mU乙醯肝素酶及1 mU角質素酶II組成之混合物。將樣品在37℃水浴中培育隔夜。隨後，將樣品以2,500 g離心15 min。該裝置由1290 Infinity LC系統與6460三重四極桿質譜儀組成(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)。在Hypercarb管柱上(2.0 mm內徑，50 mm長度；5 μm粒度；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)分離雙醣，恆溫在60℃。移動相為5 mM乙酸銨(pH 11.0，溶液A)梯度溶離至100%乙腈(溶液B)。流動速率為0.7 ml/min，且梯度如下：0 min 100%溶液A、1 min 70%溶液A、2 min 70%溶液A、2.20 min 0%溶液A、2.60 min 0%溶液A、2.61 min 100%溶液A、5 min 100%溶液A。以陰離子模式藉由電噴霧電離來操作質譜儀(Agilent Jet Stream 技術)。分別使用特定之前驅體與產物離子m/z來定量每種雙醣(IS，354.3→193.1；單硫酸化KS，462→97；HS-0S 378.3→175.1)。注射體積為10 μl，每種樣品之運行時間為5 min。 (h) 甲苯胺藍染色及病理學評估

如前文所述進行甲苯胺藍染色(Tomatsu, S.等人 Mol. Genet. 2005, 14, 3321-3335)。簡而言之，自16週齡之MPS IVA及WT小鼠收集膝關節及二尖瓣心瓣膜以藉由光顯微技術評估儲存顆粒之含量。將組織固定在2%多聚甲醛、PBS中4%之戊二醛中且後固定於四氧化鋨中，並嵌埋於Spurr樹脂中。隨後檢驗經甲苯胺藍染色之0.5-µm厚之切片。為評估股骨或脛骨生長板中之軟骨細胞細胞大小(形成液泡)，藉由Image J軟體量測每隻小鼠增殖區域中之約300個軟骨細胞，且將結果表述為與野生型組相比之倍數變化。 (i) 藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)偵測對抗GALNS之抗體

如前文所述使用一種間接ELISA方法來偵測在經治療及未經治療之小鼠血漿中對抗GALNS之抗體(Tomatsu, S.等人 Hum. Mol. Genet. 2003；12 , 961-973)。簡而言之，以在15 mM Na₂ CO₃ 、35 mM NaHCO₃ 、0.02% NaN₃ (pH 9.6)中2 μg/ml之純化rhGALNS (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)將96孔微量滴定盤塗佈隔夜。將孔以TBS-T (10 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl、0.05% TWEEN 20)洗滌三次，且隨後在室溫下以PBS中3%之牛血清白蛋白(pH 7.2)阻斷1 h。在以TBS-T洗滌三次後，將在TBS-T中稀釋100倍之小鼠血漿添加至孔中且在37℃下培育2.5 h。將孔以TBS-T洗滌四次，隨後向孔中添加含有1:1,000稀釋之過氧化酶結合之山羊抗小鼠IgG (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)之TBS-T，且在室溫下培育1 h。將孔以TBS-T洗滌三次且以TBS (10 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl)洗滌兩次。添加過氧化酶受質(ABTS溶液，Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)(每孔100 μl)且將培養板在室溫下培育30 min。藉由添加1% SDS停止反應，且在Perkin Elmer Victor X4培養板閱讀器(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)上以410 nm之光學密度讀取培養板。 (j) 統計分析

所有資料均表述為平均值及標準偏差(SD)。使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)，藉由邦弗朗尼事後測試之單因子ANOVA來進行多重比較測試。認為統計顯著性之差值為p ＜ 0.05。7. 4 實例 4. 評估延長酶暴露對骨骼病理學之作用

進行以下研究來評估延長酶暴露對骨骼病理學之作用。對於此研究而言，以每公斤體重5 × 10¹³ GC之劑量向4週齡之MPSIVA KO小鼠投與AAV8-TBG-hGALNSco。對照組為相同年齡之未經治療MPS IVA KO小鼠及未經治療野生型小鼠。此研究中使用三組小鼠，每組6隻。在注射後24週或48週內監控小鼠，且每隔一週至另一週收集血液樣品來分析酶促活性及KS含量。另外，在屍體剖檢時，自不同器官獲取組織樣品以確定酶促活性及KS含量，以及自膝關節及心瓣膜獲取組織樣品以用於組織病理學分析。

類似地，以每公斤體重5 × 10¹³ GC之劑量向4週齡之MTOL小鼠投與AAV8-TBG-hGALNSco。對照組包括相同年齡之未經治療MTOL小鼠及未經治療野生型小鼠。此研究中使用三組小鼠，每組6隻。在注射後24週或48週內監控小鼠，且每隔一週至另一週收集血液樣品來分析酶促活性及KS含量。另外，在屍體剖檢時，自不同器官獲取組織樣品以確定酶促活性及KS含量，以及自膝關節及心瓣膜獲取組織樣品以用於組織病理學分析。7.5 實例 5. 新生兒研究：評估更早期介入對骨骼病理學之作用

對新生小鼠進行以下研究來評估更早期介入對骨骼病理學之作用。對於此研究而言，以每公斤體重5 × 10¹³ GC之劑量向MPSIVA KO新生小鼠投與AAV8-TBG-hGALNSco。對照組包括相同年齡之未經治療MPS IVA KO小鼠及未經治療野生型小鼠。將小鼠在16週齡時處死，且每隔一週至另一週收集血液樣品來分析酶促活性及KS含量。另外，在屍體剖檢時，自不同器官獲取組織樣品以確定酶促活性及KS含量，以及自膝關節及心瓣膜獲取組織樣品以用於組織病理學分析。

類似地，以每公斤體重5 × 10¹³ GC之劑量向新生MTOL小鼠投與AAV8-TBG-hGALNSco。對照組包括相同年齡之未經治療MTOL小鼠及未經治療野生型小鼠。此研究中使用三組小鼠，每組6隻。將小鼠在16週齡時處死，且每隔一週至另一週收集血液樣品來分析酶促活性及KS含量。另外，在屍體剖檢時，自不同器官獲取組織樣品以確定酶促活性及KS含量，以及自膝關節及心瓣膜獲取組織樣品以用於組織病理學分析。7.6 實例 6. 新表現卡匣評估

進行以下研究來評估用於改良功效之優化啟動子構築體。對於此研究而言，以每公斤體重1 × 10¹³ GC之劑量向4週齡之MPSIVA KO小鼠投與AAV8-TBG-hGALNSco、AAV8-CAG-hGALNSco、AAV8-啟動子1-hGALNSco、AAV8-啟動子2-hGALNSco、AVV9-啟動子2-hGALNSco (每組10隻小鼠)。對照組包括相同年齡之未經治療MPS IVA KO小鼠及未經治療野生型小鼠。監控小鼠歷時12週或48週，且每隔一週至另一週收集血液樣品來分析酶促活性及KS含量。另外，在屍體剖檢時，自不同器官獲取組織樣品以確定酶促活性及KS含量，以及自膝關節及心瓣膜獲取組織樣品以用於組織病理學分析。7.7 實例 7. 晚期 AAV 基因療法研究

進行以下研究來評估晚期AAV基因療法功效。對於此研究而言，向8-10週齡之MPSIVA KO小鼠投與AAV-TBG-hGALNSco、AAV-CAG-hGALNSco、AAV-啟動子1-hGALNSco、AAV-啟動子2-hGALNSco、AVV-啟動子2-hGALNSco (每組3隻小鼠)。使用未經治療之MPS IVA KO小鼠作為對照物。監控小鼠一段時間且每隔一週至另一週收集血液樣品來分析酶促活性及KS含量。另外，在屍體剖檢時，自不同器官獲取組織樣品以確定酶促活性及KS含量，以及自膝關節及心瓣膜獲取組織樣品以用於組織病理學分析。

類似地，向8-10週齡之MTOL小鼠投與AAV-TBG-hGALNSco、AAV-CAG-hGALNSco、AAV-啟動子1-hGALNSco、AAV-啟動子2-hGALNSco、AVV-啟動子2-hGALNSco (每組3隻小鼠)。使用未經治療之MTOL小鼠作為對照物。監控小鼠一段時間且每隔一週至另一週收集血液樣品來分析酶促活性及KS含量。另外，在屍體剖檢時，自不同器官獲取組織樣品以確定酶促活性及KS含量，以及自膝關節及心瓣膜獲取組織樣品以用於組織病理學分析。7.8 實例 8. 對高劑量及低劑量 AAV8-TBG-hGALNS 、 AAV8-TBG-D8-hGALNS 、 AAV8-CAG-hGALNS 及 AAV8-CAG-D8-hGALNS 之作用之比較研究

進行以下研究來評估高劑量及低劑量AAV8-TBG-hGALNS、AAV8-TBG-D8-hGALNS、AAV8-CAG-hGALNS及AAV8-CAG-D8-hGALNS之作用。

對於此研究而言，吾人以高劑量(每公斤體重5 × 10¹⁴ GC)、中等劑量(每公斤體重2 × 10¹⁴ GC)或低劑量(每公斤體重5 × 10¹³ GC)經靜脈內向4週齡之MPSIVA KO小鼠傳遞AAV8-TBG-hGALNS、AAV8-TBG-D8-hGALNS、AAV8-CAG-hGALNS及AAV8-CAG-D8-hGALNS (每組n ≥ 4)。對照組包括相同年齡之未經治療MPS IVA KO小鼠及未經治療野生型小鼠。監控小鼠歷時12週，且每兩週收集一次血液樣品(血漿)來分析酶促活性及KS含量。

類似地，吾人以高劑量(每公斤體重5 × 10¹⁴ GC)、中等劑量(每公斤體重2 × 10¹⁴ GC)或低劑量(每公斤體重5 × 10¹³ GC)經靜脈內向4週齡之MTOL小鼠傳遞AAV8-TBG-hGALNS、AAV8-TBG-D8-hGALNS、AAV8-CAG-hGALNS及AAV8-CAG-D8-hGALNS(每組n ≥ 4)。使用未經治療之MTOL小鼠作為對照物。監控小鼠歷時12週且每兩週收集一次血液樣品來分析酶促活性及KS含量。 7.8.1 結論 (a) 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS或AAV8-CAG-D8-hGALNS之MPS IVA KO小鼠血漿中之hGALNS酶活性。

以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS或AAV8-CAG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之血漿hGALNS酶活性展示於圖33-35中。注射兩週後，與未經治療之野生型小鼠相比，在AAV8-D8-hGALNS小鼠中偵測到增加之血漿hGALNS活性。在注射2週後，來自AAV8-CAG-D8-hGALNS之酶活性高於來自AAV8-CAG-hGALNS之酶活性。 (b) 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS或AAV8-CAG-D8-hGALNS之MPS IVA KO小鼠肝中之hGALNS酶活性。

以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS或AAV8-CAG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之肝中的hGALNS酶活性展示於圖36中。與未經治療之野生型小鼠相比，在經AV8-D8-hGALNS及AAV8-hGALNS治療之小鼠中均偵測到增加之肝hGALNS活性。 (c) 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS之MTOL小鼠之血漿中的hGALNS酶活性。

以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS之MTOL小鼠之血漿中的hGALNS酶活性展示於圖37中。 (d) 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS之MTOL小鼠肝中之hGALNS酶活性。

以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS之MTOL小鼠肝中之GALNS酶活性展示於圖38中。與未經治療之野生型小鼠相比，在經AAV8-hGALNS治療之小鼠中偵測到增加之肝hGALNS活性。 (e) 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與2 × 10¹⁴ GC之AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之MPS IVA KO小鼠血漿中之hGALNS酶活性。

以每公斤體重投與2 × 10¹⁴ GC之AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之血漿hGALNS酶活性展示於圖39-40中。 (f) 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與2 × 10¹⁴ GC之AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之MPS IVA KO小鼠肝中之hGALNS酶活性。

以每公斤體重投與2 × 10¹⁴ GC之AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠肝中之hGALNS酶活性展示於圖41中。與未經治療之野生型小鼠相比，在經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之兩種小鼠中均偵測到增加之肝hGALNS活性。8. 序列表

SEQ ID NO.	描述	序列
1	AAV8衣殼蛋白	MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
2	人類GALNS (hGALNS)	atggcggcggttgtcgcggcgacgaggtggtggcagctgttgctggtgctcagcgccgcggggatgggggcctcgggcgccccgcagccccccaacatcctgctcctgctcatggacgacatgggatggggtgacctcggggtgtatggagagccctccagagagaccccgaatttggaccggatggctgcagaagggctgcttttcccaaacttctattctgccaaccctctgtgctcgccatcgagggcggcactgctcacaggacggctacccatccgcaatggcttctacaccaccaacgcccatgccagaaacgcctacacaccgcaggagattgtgggcggcatcccagactcggagcagctcctgccggagcttctgaagaaggccggctacgtcagcaagattgtcggcaagtggcatctgggtcacaggccccagttccaccccctgaagcacggatttgatgagtggtttggatcccccaactgccactttggaccttatgacaacaaggccaggcccaacatccctgtgtacagggactgggagatggttggcagatattatgaagaatttcctattaatctgaagacgggggaagccaacctcacccagatctacctgcaggaagccctggacttcattaagagacaggcacggcaccacccctttttcctctactgggctgtcgacgccacgcacgcacccgtctatgcctccaaacccttcttgggcaccagtcagcgagggcggtatggagacgccgtccgggagattgatgacagcattgggaagatactggagctcctccaagacctgcacgtcgcggacaacaccttcgtcttcttcacgtcggacaacggcgctgccctcatttccgcccccgaacaaggtggcagcaacggcccctttctgtgtgggaagcagaccacgtttgaaggagggatgagggagcctgccctcgcatggtggccagggcacgtcactgcaggccaggtgagccaccagctgggcagcatcatggacctcttcaccaccagcctggcccttgcgggcctgacgccgcccagcgacagggccattgatggcctcaacctcctccccaccctcctgcagggccggctgatggacaggcctatcttctattaccgtggcgacacgctgatggcggccaccctcgggcagcacaaggctcacttctggacctggaccaactcctgggagaacttcagacagggcattgatttctgccctgggcagaacgtttcaggggtcacaactcacaatctggaagaccacacgaagctgcccctgatcttccacctgggacgggacccaggggagaggttccccctcagctttgccagcgccgagtaccaggaggccctcagcaggatcacctcggtcgtccagcagcaccaggaggccttggtccccgcgcagccccagctcaacgtgtgcaactgggcggtcatgaactgggcacctccgggctgtgaaaagttagggaagtgtctgacacctccagaatccattcccaagaagtgcctctggtcccactag
3	hGALNSco(密碼子優化)	atggctgctgttgttgccgctaccagatggtggcagctgctgctggttctgtctgccgctggaatgggagcttctggtgctccccagcctcctaacattctgctgctgctcatggacgacatgggctggggcgatctgggagtgtatggcgagcctagcagagagacacccaacctggatagaatggccgccgagggcctgctgttccccaatttctacagcgccaatcctctgtgcagcccctctagagctgctctgctgacaggcagactgcccatcagaaacggcttctacaccaccaacgctcacgcccggaatgcctacacaccccaagagatcgttggcggcatccccgattctgagcagctcctgcctgagctgctgaagaaggccggctacgtcagcaagatcgtcggcaaatggcacctgggccacagacctcagtttcaccctctgaagcacggcttcgacgagtggttcggcagccccaattgtcacttcggcccctacgacaacaaggccagacctaacatccccgtgtacagagactgggagatggtcggacggtactacgaggaattccccatcaacctgaaaaccggcgaggccaatctgacccagatctacctgcaagaggccctggacttcatcaagcggcaggccagacaccatcctttctttctgtactgggccgtcgacgccacacacgcccctgtgtatgccagcaagccttttctgggcaccagccagcgtggcagatatggcgacgccgtgcgggaaatcgatgacagcatcggcaagatcctggaactgctgcaggatctgcacgtggccgacaacaccttcgtgttcttcaccagcgacaacggcgctgccctgatttctgctcctgagcaaggcggcagcaacggcccatttctgtgtggcaagcagaccacctttgaaggcggcatgagagagcctgctctggcttggtggcctggacatgtgacagccggacaagtgtctcaccagctgggcagcatcatggacctgtttaccacctctctggccctggccggactgacacctccatctgatagagccatcgacggcctgaacctgctgcctacactgcttcagggcagactgatggacagacccatcttctactaccggggcgacaccctgatggccgctacactgggacagcacaaggcccacttttggacctggaccaacagctgggagaacttccggcagggcatcgacttttgccctggccagaatgtgtccggcgtgaccacacacaatctggaagatcacaccaagctgcccctgatctttcacctgggcagagatcccggcgagagattccctctgtcttttgccagcgccgagtaccaagaagccctgagcagaatcacctccgtggtgcagcagcaccaagaggctctggttccagctcagccccagctgaacgtgtgtaattgggccgtgatgaactgggcccctcctggatgtgaaaagctgggcaagtgtctgacccctcctgagagcatccccaagaaatgcctgtggtcccactga
4	D8-hGALNS	accgccatgcggggtccgagcggggctctgtggctgctcctggctctgcgcaccgtgctcggatcagatgatgatgatgatgatgatgatgccgaggcagaaaccggtgccccgcagccccccaacatcctgctcctgctcatggacgacatgggatggggtgacctcggggtgtatggagagccctccagagagaccccgaatttggaccggatggctgcagaagggctgcttttcccaaacttctattctgccaaccctctgtgctcgccatcgagggcggcactgctcacaggacggctacccatccgcaatggcttctacaccaccaacgcccatgccagaaacgcctacacaccgcaggagattgtgggcggcatcccagactcggagcagctcctgccggagcttctgaagaaggccggctacgtcagcaagattgtcggcaagtggcatctgggtcacaggccccagttccaccccctgaagcacggatttgatgagtggtttggatcccccaactgccactttggaccttatgacaacaaggccaggcccaacatccctgtgtacagggactgggagatggttggcagatattatgaagaatttcctattaatctgaagacgggggaagccaacctcacccagatctacctgcaggaagccctggacttcattaagagacaggcacggcaccacccctttttcctctactgggctgtcgacgccacgcacgcacccgtctatgcctccaaacccttcttgggcaccagtcagcgagggcggtatggagacgccgtccgggagattgatgacagcattgggaagatactggagctcctccaagacctgcacgtcgcggacaacaccttcgtcttcttcacgtcggacaacggcgctgccctcatttccgcccccgaacaaggtggcagcaacggcccctttctgtgtgggaagcagaccacgtttgaaggagggatgagggagcctgccctcgcatggtggccagggcacgtcactgcaggccaggtgagccaccagctgggcagcatcatggacctcttcaccaccagcctggcccttgcgggcctgacgccgcccagcgacagggccattgatggcctcaacctcctccccaccctcctgcagggccggctgatggacaggcctatcttctattaccgtggcgacacgctgatggcggccaccctcgggcagcacaaggctcacttctggacctggaccaactcctgggagaacttcagacagggcattgatttctgccctgggcagaacgtttcaggggtcacaactcacaatctggaagaccacacgaagctgcccctgatcttccacctgggacgggacccaggggagaggttccccctcagctttgccagcgccgagtaccaggaggccctcagcaggatcacctcggtcgtccagcagcaccaggaggccttggtccccgcgcagccccagctcaacgtgtgcaactgggcggtcatgaactgggcacctccgggctgtgaaaagttagggaagtgtctgacacctccagaatccattcccaagaagtgcctctggtcccactagctcga
5	D8-GALNSco (密碼子優化)	atgagaggaccatctggtgctctgtggctgctgctggctctgagaacagtgctgggcagcgacgacgatgatgacgatgacgacgccgaggctgaaacaggtgctccccagcctcctaacatcctgctgctgctcatggacgatatgggctggggcgatctgggagtgtatggcgagcctagcagagagacacccaacctggatagaatggccgccgagggcctgctgttccccaatttctacagcgccaatcctctgtgcagcccctctagagctgctctgctgacaggcagactgcccatcagaaacggcttctacaccaccaacgctcacgcccggaatgcctacacaccccaagagatcgttggcggcatccccgattctgaacagctgctgcctgagctgctgaagaaggccggctacgtcagcaagatcgtcggcaaatggcacctgggccacagacctcagtttcaccctctgaagcacggcttcgacgagtggttcggcagccccaattgtcacttcggcccctacgacaacaaggccagaccaaacatccccgtgtacagagactgggagatggtcggacggtactacgaggaattccccatcaacctgaaaaccggcgaggccaatctgacccagatctacctgcaagaggccctggacttcatcaagcggcaggccagacaccatcctttctttctgtactgggccgtcgacgccacacacgcccctgtgtatgccagcaagccttttctgggcaccagccagcgtggcagatatggcgacgccgtgcgggaaatcgatgacagcatcggcaagatcctggaactgctgcaggatctgcacgtggccgacaacaccttcgtgttcttcaccagcgacaacggcgctgccctgatttctgctcctgagcaaggcggcagcaacggcccatttctgtgtggcaagcagaccacctttgaaggcggcatgagagagcctgctctggcttggtggcctggacatgtgacagccggacaagtgtctcaccagctgggctccatcatggacctgtttaccacctctctggccctggccggactgacacctccatctgatagagccatcgacggcctgaacctgctgcctacactgcttcagggcagactgatggacagacccatcttctactaccggggcgacaccctgatggccgctacactgggacagcacaaggcccacttttggacctggaccaacagctgggagaacttccggcagggcatcgacttttgccctggccagaatgtgtccggcgtgaccacacacaatctggaagatcacaccaagctgcccctgatctttcacctgggcagagatcccggcgagagattccctctgtcttttgccagcgccgagtaccaagaagccctgagcagaatcaccagcgtggtgcagcagcaccaagaggctctggttccagctcagccccagctgaacgtgtgtaattgggccgtgatgaactgggcccctcctggatgtgaaaagctgggcaagtgtctgacccctcctgagagcatccccaagaaatgcctgtggtcccactga
6	TBG啟動子	gggctggaagctacctttgacatcatttcctctgcgaatgcatgtataatttctacagaacctattagaaaggatcacccagcctctgcttttgtacaactttcccttaaaaaactgccaattccactgctgtttggcccaatagtgagaactttttcctgctgcctcttggtgcttttgcctatggcccctattctgcctgctgaagacactcttgccagcatggacttaaacccctccagctctgacaatcctctttctcttttgttttacatgaagggtctggcagccaaagcaatcactcaaagttcaaaccttatcattttttgctttgttcctcttggccttggttttgtacatcagctttgaaaataccatcccagggttaatgctggggttaatttataactaagagtgctctagttttgcaatacaggacatgctataaaaatggaaagat
7	5' ITR	ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct
8	3' ITR	aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag
9	兔球蛋白poly A	gatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcg
10	內含子_1	gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag
11	αmic/bik強化子	aggttaatttttaaaaagcagtcaaaagtccaagtggcccttggcagcatttactctctctgtttgctctggttaataatctcaggagcacaaacattcc
12	GALNS (密碼子優化及CpG缺失)	ATGGCTGCTGTGGTGGCTGCTACAAGATGGTGGCAACTGCTGCTGGTGCTGTCTGCAGCTGGAATGGGAGCTTCTGGTGCCCCTCAGCCTCCTAATATCCTGCTGCTGCTGATGGATGACATGGGCTGGGGAGATCTGGGAGTGTATGGGGAGCCTAGCAGAGAGACACCCAACCTGGATAGAATGGCTGCAGAGGGCCTGCTGTTCCCCAACTTCTACTCTGCCAATCCTCTGTGCAGCCCCTCTAGAGCTGCACTGCTTACAGGCAGACTGCCCATCAGAAATGGCTTCTACACCACAAATGCCCATGCCAGAAATGCCTACACACCCCAAGAGATAGTTGGAGGCATCCCTGACTCTGAACAGCTGCTGCCTGAGCTGCTGAAGAAAGCTGGCTATGTGTCCAAGATAGTTGGCAAGTGGCACCTGGGCCACAGACCTCAGTTTCACCCTCTGAAACATGGCTTTGATGAGTGGTTTGGCAGCCCCAACTGCCACTTTGGCCCCTATGATAACAAGGCCAGACCTAACATCCCTGTGTACAGAGACTGGGAGATGGTTGGAAGGTACTATGAAGAGTTCCCCATCAACCTGAAAACAGGGGAAGCCAATCTGACCCAGATCTACCTGCAAGAGGCCCTGGACTTCATCAAGAGACAGGCCAGACACCATCCTTTCTTTCTGTACTGGGCTGTTGATGCCACACATGCCCCTGTGTATGCCAGCAAGCCTTTTCTGGGCACCAGCCAGAGGGGCAGATATGGGGATGCTGTCAGAGAAATTGATGACAGCATTGGCAAGATCCTGGAACTGCTGCAGGACCTGCATGTGGCTGACAACACCTTTGTGTTCTTCACCTCTGACAATGGGGCAGCCCTGATCTCTGCCCCTGAGCAAGGTGGCAGCAATGGCCCATTTCTGTGTGGCAAGCAGACCACCTTTGAAGGTGGCATGAGAGAGCCTGCTCTGGCCTGGTGGCCTGGACATGTTACAGCTGGACAAGTGTCTCACCAGCTGGGCAGCATCATGGACCTGTTTACCACATCTCTGGCCCTGGCTGGACTGACCCCTCCATCTGATAGAGCCATTGATGGCCTGAACCTGCTGCCTACACTTCTGCAGGGCAGACTGATGGACAGACCCATCTTCTACTACAGAGGTGACACCCTGATGGCTGCCACACTGGGACAGCACAAGGCCCACTTTTGGACCTGGACCAACAGCTGGGAGAACTTCAGACAGGGCATTGATTTCTGCCCTGGCCAGAATGTGTCTGGGGTCACCACTCACAACCTGGAAGATCACACCAAGCTGCCCCTCATCTTCCACCTGGGAAGAGATCCTGGGGAGAGATTCCCTCTGAGCTTTGCCTCTGCTGAGTACCAAGAAGCCCTGAGCAGAATCACATCTGTGGTGCAGCAGCATCAAGAGGCTCTGGTTCCAGCTCAGCCCCAGCTGAATGTGTGCAACTGGGCAGTGATGAATTGGGCCCCACCTGGCTGTGAAAAGCTGGGCAAATGTCTGACCCCACCTGAGAGCATCCCTAAAAAGTGCCTGTGGTCCCACTGA
13	LSPX1啟動子	AGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCAGATCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCAGATCCGGCGCGCCAGGGCTGGAAGCTACCTTTGTCTAGAAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGT
14	LSPX2啟動子	AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGTCTAGAAGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGT
15	LTP1啟動子	AGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCAGATCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCAGATCCGGCGCGCCAGGGCTGGAAGCTACCTTTGACATCATTTCCTCTGCGAATGCATGTATAATTTCTACAGAACCTATTAGAAAGGATCACCCAGCCTCTGCTTTTGTACAACTTTCCCTTAAAAAACTGCCAATTCCACTGCTGTTTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGCTGCCTCTTGGTGCTTTTGCCTATGGCCCCTATTCTGCCTGCTGAAGACACTCTTGCCAGCATGGACTTAAACCCCTCCAGCTCTGACAATCCTCTTTCTCTTTTGTTTTACATGAAGGGTCTGGCAGCCAAAGCAATCACTCAAAGTTCAAACCTTATCATTTTTTGCTTTGTTCCTCTTGGCCTTGGTTTTGTACATCAGCTTTGAAAATACCATCCCAGGGTTAATGCTGGGGTTAATTTATAACTAAGAGTGCTCTAGTTTTGCAATACAGGACATGCTATAAAAATGGAAAGATGTTGCTTTCTGAGAGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAGTGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGT
16	LMTP6啟動子	AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGCCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCCTGCATGCGAAGATCTTCGAACAAGGCTGTGGGGGACTGAGGGCAGGCTGTAACAGGCTTGGGGGCCAGGGCTTATACGTGCCTGGGACTCCCAAAGTATTACTGTTCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAGCGTCGAGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAGTGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGT

9. 等效物及以引用方式併入

儘管本發明已參考其特定實施例詳細描述，但應瞭解功能等效之變化在本發明之範疇內。實際上，除本文所示及描述以外，本發明之各種修改均將為熟習此項技術者由以上描述及附圖顯而易見。該等修改欲在隨附申請專利範圍之範疇內。熟習此項技術者將意識到，或可確定使用不超出常規實驗對本文所述本發明之特定實施例之多種等效物。該等等效物欲涵蓋於以下之申請專利範圍中。

本說明書中提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本說明書中，其程度如同每一個別公開案、專利或專利申請案均特定地且個別地以全文引用之方式併入本文中一般。

如附圖所說明，以上及其他目標、特徵及優勢將由本發明之特定實施例之以下描述顯而易見。圖式未必按比例，而是強調說明本發明之各種實施例之原則。

圖 1. rAAV基因組之示意圖。

圖 2A-2D. (A)在以TBG-hGALNS質體、TBG-hGALNS-CoOpt質體、TBG-D8-hGALNS質體或TBG-D8-hGALNS-CoOpt質體(n=2)轉染後，在HuH-7細胞中測定細胞內酶活性。(B)描繪在HuH-7細胞中測定細胞內酶活性之個別運行。(C)在以TBG-hGALNS質體、TBG-hGALNS-CoOpt質體、TBG-D8-hGALNS質體或TBG-D8-hGALNS-CoOpt質體(n=2)轉染HuH-7細胞之後，測定培養基中之酶活性。(D)描繪在HuH-7細胞中測定培養基中之酶活性之個別運行。

圖 3. 在以TBG-hGALNS質體、TBG-hGALNS-CoOpt質體、TBG-D8-hGALNS質體或TBG-D8-hGALNS-CoOpt質體轉染後，在HepG2細胞中測定細胞內酶活性。

圖 4. 向4週齡之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)及免疫耐受小鼠(Galns^{tm(hC79S.mC76S)slu} ，Mtol)投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之活體內研究之進程。展示血液中之酶分析法及KS分析法之進程。在描述劑量時，載體複本/千克(vc/kg)與基因複本/千克(GC/kg)可互換使用。

圖 5A-5B. 在投與AAV8-TBG-hGALNS r或AAV-TBG-D8-hGALNS後，在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之(A)白血球(WBC)及(B)血漿中量測之隨時間變化之hGALNS酶活性。

圖 6. 在投與AAV8-TBG-hGALNS (n=4)或AAV8-TBG-D8-hGALNS (n=4)後，在Mtol小鼠之血漿中量測之隨時間變化之hGALNS酶活性。

圖 7A-7D. 在(A)MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之肝、(B)Mtol小鼠之肝、(C)MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之心臟及Mtol小鼠之心臟，及(D)MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之骨骼及Mtol小鼠之骨骼中量測之hGALNS酶活性。

圖 8. 在經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之血漿中之單硫酸化KS含量。

圖 9A-9B. (A)與未經治療之Mtol及WT小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之血漿中隨時間變化之單硫酸化KS含量。(B)在16週齡時，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之血漿中之單硫酸化KS含量與未經治療之Mtol小鼠含量相比顯著較小(n = 4-5；平均值 ± SD；相對於WT而言，*p ＜ 0.05；相對於未經治療而言，#p ＜ 0.05；單因子ANOVA)。

圖 10. 在經AAV8-TBG-hGALNS治療、經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療、未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)中或WT小鼠中量測之隨時間變化之血液diHS-0S含量。

圖 11A-11P. (A)骨骼病理學記分之圖形表示。在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)中投與載體AAV8-hGALNS或AAV8-D8-hGALNS後12週，藉由組織病理學分析評估骨骼病理。(B)膝關節(Lig-韌帶；M-半月板；F-股骨；T-脛骨)、(C-F)股骨關節軟骨(40倍放大率)、(G-J)股骨生長板(40倍放大率)、(K)半月板(40倍放大率)、(L)韌帶(脛骨側面、40倍放大率)、(M、N)心瓣膜基底(40倍放大率)及(O、P)心瓣膜(40倍放大率)之組織病理。

圖 12A-12C. (A)在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠相比(n = 3-8；平均值 ± SD)，分別在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)及Mtol小鼠之肝中量測之hGALNS酶活性水準。(B)在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠相比(n = 3-8；平均值 ± SD)，分別在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之脾及Mtol小鼠之脾中量測之hGALNS酶活性水準。(C)在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠相比(n = 3-8；平均值 ± SD)，分別在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之肺及Mtol小鼠之肺中量測之hGALNS酶活性水準。

圖 13A-13B. (A)在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠相比(n = 3-8；平均值 ± SD)，分別在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之骨骼及Mtol小鼠之骨骼中量測之hGALNS酶活性水準。(B)在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，與未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、未經治療之Mtol小鼠及野生型小鼠相比(n = 3-8；平均值 ± SD)，分別在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之心臟及Mtol小鼠之心臟中量測之hGALNS酶活性水準。

圖 14. 與未經治療之MPS IVA KO小鼠及未經治療之野生型小鼠相比(n = 4-8；平均值 ± SD)，經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之血漿中之單硫酸化KS含量。

圖 15A-15B. (A)與未經治療之Mtol及WT小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之血漿中隨時間變化之單硫酸化KS含量。(B)在16週齡時，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之血漿中之單硫酸化KS含量與未經治療之Mtol小鼠含量相比顯著較小(n = 4-5；平均值 ± SD；相對於WT而言，*p ＜ 0.05；相對於未經治療而言，#p ＜ 0.05；單因子ANOVA)。

圖 16A-16C. (A)與未經治療之MPS IVA KO小鼠及未經治療之野生型小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之肝中之單硫酸化KS含量。(B)與未經治療之MPS IVA KO小鼠及未經治療之野生型小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之肺中之單硫酸化KS含量。(C)與未經治療之Mtol小鼠及未經治療之野生型小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之肝中之單硫酸化KS含量。對於(A)-(C)而言，n = 3-8；平均值 ± SD；相對於WT而言，*p ＜ 0.05；相對於未經治療而言，#p ＜ 0.05；單因子ANOVA。

圖 17A-17E. (A)野生型小鼠(所有軟骨細胞係無液泡的且柱狀結構係組織有序的)、(B)未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)(所有軟骨細胞係有液泡的且柱狀結構在很大程度上係混亂且扭曲的)、(C)未經治療之Mtol小鼠(所有軟骨細胞係有液泡的且柱狀結構在很大程度上係混亂且扭曲的)、(D)經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠(軟骨細胞係適度有液泡的，但柱狀結構更佳)及(E)經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠(軟骨細胞係適度有液泡的，但柱狀結構部分恢復)之股骨生長板之組織病理學(40倍放大率)。

圖 18A-18D. (A)在未經治療之野生型小鼠、未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之股骨生長板中量測之軟骨細胞細胞大小。(B)在未經治療之野生型小鼠、未經治療之Mtol小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之股骨生長板中量測之軟骨細胞細胞大小。(C)在未經治療之野生型小鼠、未經治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)、經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之脛骨生長板中量測之軟骨細胞細胞大小。(D)在未經治療之野生型小鼠、未經治療之Mtol小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之脛骨生長板中量測之軟骨細胞細胞大小。對於(A)-(D)而言，n = 4-6；平均值 ± SD；相對於WT而言，*p ＜ 0.05；相對於未經治療而言，#p ＜ 0.05；單因子ANOVA。

圖 19. 與未經治療之小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO小鼠(galns -/-)及Mtol小鼠中之心瓣膜的組織病理學(40倍放大率)。

圖 20. 與未經治療之Mtol小鼠相比，經AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之心肌的組織病理學(40倍放大率)。

圖 21A-21D. (A)未經治療之野生型小鼠、未經治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之心瓣膜組織之病理學記分。(B)未經治療之野生型小鼠、未經治療之Mtol小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之心瓣膜組織之病理學記分。(C)未經治療之野生型小鼠、未經治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之MPS IVA KO (galns -/-)小鼠之心肌組織之病理學記分。(D)未經治療之野生型小鼠、未經治療之Mtol小鼠、經AAV8-TBG-hGALNS治療之Mtol小鼠或經AAV8-TBG-D8-hGALNS治療之Mtol小鼠之心肌組織之病理學記分。(對於圖21A-21D而言，n = 4-6；平均值 ± SD；相對於WT而言，*p ＜0.05；相對於未經治療而言，#p ＜ 0.05；單因子ANOVA)。

圖 22. 在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV-TBG-D8-hGALNS之後，在MPS IVA KO小鼠(galns -/-)之血漿中量測之隨時間變化之hGALNS酶活性(n = 4-7；平均值 + SD)。

圖 23. 在投與AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之後，在Mtol小鼠之血漿中量測之隨時間變化之hGALNS酶活性(n = 4-5；平均值 + SD)。

圖 24A-24I. 經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠中之血液及組織人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(hGALNS)酶活性。(A)AAV8-TBG-hGALNS及AAV8-TBG-D8-hGALNS病毒載體基因組之示意性結構。每隔一週自MPS IVA小鼠收集血液樣品直至16週齡，且量測(B)基因剔除(KO)及(C)耐受型(MTOL)小鼠中之血漿 hGALNS酶活性。n = 4-7。在注射具有或不具有骨靶向信號之AAV載體後12週，自MPS IVA小鼠收集組織樣品。量測KO及MTOL小鼠中包括(D)肝、(E)脾、(F)肺、(G)腎、(H)心臟及(I)骨骼(腿)在內之組織中的hGALNS酶活性。n = 3-8。藉由邦弗朗尼事後測試(Bonferroni's post-hoc test)之單因子ANOVA來分析統計學。資料呈現為平均值 ± SD。*p ＜ 0.05。AAV：腺相關病毒，ITR：反向末端重複序列，TBG：甲狀腺素-結合球蛋白，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶，RBG pA：兔β-球蛋白poly A。

圖 25A-25D. 經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠中之血液及組織葡糖胺聚糖(GAG)含量。每隔一週自MPS IVA小鼠收集血液樣品直至16週齡，且量測(A)基因剔除(KO)及(B)耐受型(MTOL)小鼠中之血漿單硫酸化KS含量。n = 4-8。在注射具有或不具有骨靶向信號之AAV載體後12週，自MPS IVA小鼠收集組織樣品。量測KO及MTOL小鼠中包括(C)肝及(D)肺在內之組織中之KS的量。n = 4-8。藉由邦弗朗尼事後測試之單因子ANOVA來分析統計學。資料呈現為平均值 ± SD。*p ＜ 0.05。KS：角質素硫酸鹽。AAV：腺相關病毒。AAV：腺相關病毒，TBG：甲狀腺素-結合球蛋白，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶，KS：角質素硫酸鹽。

圖 26A-26C. 對經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠之骨骼病理學的校正。藉由甲苯胺藍染色分析，對經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠之膝關節中之(A)生長板及(B)關節盤使用光顯微技術來評估對軟骨細胞形成液泡之校正。將基因剔除(KO)及耐受型(MTOL)小鼠之骨骼病理學與野生型、未經治療之MPS IVA及經具有或不具有骨靶向信號之AAV8載體治療之MPS IVA進行比較。比例尺 = 25 μm。(C)藉由Image J軟體來量化股骨或脛骨之生長板病變中之軟骨細胞細胞大小。資料表述與野生型組相比之倍數變化。n = 4-7。藉由邦弗朗尼事後測試之單因子ANOVA來分析統計學。資料呈現為平均值 ± SD。*p ＜ 0.05。AAV：腺相關病毒，TBG：甲狀腺素-結合球蛋白，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶。

圖 27A-27C. 對經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠之心臟病理學的校正。藉由甲苯胺藍染色分析，對經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠之(A)心瓣膜及(B)心肌使用光顯微技術來評估對形成液泡之校正。將基因剔除(KO)及耐受型(MTOL)小鼠之心臟病理學與野生型、未經治療之MPS IVA及經具有或不具有骨靶向信號之AAV8載體治療之MPS IVA進行比較。箭頭指示疾病相關液泡之位置。比例尺 = 25 μm。AAV：腺相關病毒，TBG：甲狀腺素-結合球蛋白，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶。

圖 28. 經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠中之抗-hGALNS 抗體效價之循環。在注射具有或不具有骨靶向信號之AAV8載體後12週，自MPS IVA小鼠收集血漿。藉由間接ELISA分析法偵測循環之snit-hGALNS抗體效價。由微定量盤式分光光度計來量測OD 405值。n = 4-8。藉由邦弗朗尼事後測試之單因子ANOVA來分析統計學。資料呈現為平均值 ± SD。*p ＜ 0.05。AAV：腺相關病毒，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶，ELISA：酶聯結免疫吸附劑分析法，TBG：甲狀腺素-結合球蛋白，OD：光學密度。

圖 29A-29B. 評估具有或不具有骨靶向信號之優化hGALNS。以具有或不具有骨靶向信號之表現hGALNS或密碼子優化hGALNS之AAV8載體質體分別轉染Huh-7細胞。48 hr轉染後，收集細胞集結粒及培養基，且量測hGALNS活性。(A)在以TBG-hGALNS質體、TBG-hGALNS-CoOpt質體、TBG-D8-hGALNS質體或TBG-D8-hGALNS-CoOpt質體轉染後，測定HuH-7細胞之細胞內酶活性。(B)在以TBG-hGALNS質體、TBG-hGALNS-CoOpt質體、TBG-D8-hGALNS質體或TBG-D8-hGALNS-CoOpt質體轉染HuH-7細胞後，測定培養基中之酶活性。資料呈現為平均值。n = 2。AAV：腺相關病毒，TBG：甲狀腺素-結合球蛋白，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶。

圖 30A-30B. 經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠中之血液類肝素硫酸鹽(HS)含量。自MPS IVA小鼠收集血液樣品且量測16週齡之(A)基因剔除(KO)及(B)耐受型(MTOL)小鼠中之血漿diHS-0S含量。資料呈現為平均值 ± SD。AAV：腺相關病毒，TBG：甲狀腺素-結合球蛋白，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶。

圖 31. 經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠中之組織肝素硫酸鹽(HS)含量。在注射具有或不具有骨靶向信號之AAV載體後12週，自MPS IVA小鼠收集組織樣品。量測KO及MTOL小鼠中包括肝、脾、肺及腎在內之組織中之diHS-0S的量。資料呈現為平均值 ± SD。AAV：腺相關病毒，TBG：甲狀腺素-結合球蛋白，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶。

圖 32A-32B. 對經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠之骨骼病理學的校正。藉由甲苯胺藍染色分析，對經AAV8載體治療之MPS IVA小鼠之膝關節中之(A)韌帶及(B)半月板使用光顯微技術來評估對軟骨細胞形成液泡之校正。將基因剔除(KO)及耐受型小鼠(MTOL)之骨骼病理學與野生型、未經治療之MPS IVA及經具有或不具有骨靶向信號之AAV8載體治療之MPS IVA進行比較。箭頭指示疾病相關液泡之位置。比例尺 = 25 μm。AAV：腺相關病毒，hGALNS：N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶。

圖 33. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS或AAV8-CAG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之血漿中的hGALNS酶活性。

圖 34. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之血漿中的hGALNS酶活性。

圖 35. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之血漿中的hGALNS酶活性。

圖 36. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS或AAV8-CAG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之肝中的hGALNS酶活性。

圖 37. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS之MTOL小鼠之血漿中的hGALNS酶活性。

圖 38. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與5 × 10¹³ GC之AAV8-CAG-hGALNS之MTOL小鼠之肝中的hGALNS酶活性。

圖 39. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與2 × 10¹⁴ GC之AAV8-TBG-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之血漿中的hGALNS酶活性。

圖 40. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與2 × 10¹⁴ GC之AAV8-TBG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之血漿中的hGALNS酶活性。

圖 41. 與未經治療之野生型小鼠相比，以每公斤體重投與2 × 10¹⁴ GC之AAV8-TBG-hGALNS或AAV8-TBG-D8-hGALNS之MPSIVA KO小鼠之肝中的hGALNS酶活性。

Claims

一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含： (a) AAV衣殼；及 (b) 包含側接AAV-反向末端重複序列(ITRs)之人類N-乙醯半乳胺糖-6-硫酸鹽硫酸酯酶(hGALNS)表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼hGALNS與酸性寡肽融合之融合蛋白之核苷酸序列。
如請求項1之rAAV，其中該酸性寡肽為D8。
如請求項1或2之rAAV，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中該編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列可操作地連接至編碼該融合蛋白之核苷酸序列。
如請求項3之rAAV，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。
如請求項1或2之rAAV，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼啟動子之核苷酸序列，該編碼啟動子之核苷酸序列可操作地連接至編碼該融合蛋白之核苷酸序列。
如請求項5之rAAV，其中該啟動子係選自由以下組成之群： a. CAG啟動子， b. 80%與SEQ ID NO:13一致； c. 85%與SEQ ID NO:13一致； d. 90%與SEQ ID NO:13一致； e. 95%與SEQ ID NO:13一致； f. 98%與SEQ ID NO:13一致； g. SEQ ID NO:13， h. 80%與SEQ ID NO:14一致； i. 85%與SEQ ID NO:14一致； j. 90%與SEQ ID NO:14一致； k. 95%與SEQ ID NO:14一致； l. 98%與SEQ ID NO:14一致； m. SEQ ID NO:14， n. 80%與SEQ ID NO:15一致； o. 85%與SEQ ID NO:15一致； p. 90%與SEQ ID NO:15一致； q. 95%與SEQ ID NO:15一致； r. 98%與SEQ ID NO:15一致； s. SEQ ID NO:15， t. 80%與SEQ ID NO:16一致； u. 85%與SEQ ID NO:16一致； v. 90%與SEQ ID NO:16一致； w. 95%與SEQ ID NO:16一致； x. 98%與SEQ ID NO:16一致；及 y. SEQ ID NO:16。
如請求項1至6中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV8。
如請求項1至6中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV9。
如請求項1至8中任一項之rAAV，其中該編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼該融合蛋白之核苷酸序列係密碼子優化。
如請求項1至9中任一項之rAAV，其中該編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼該融合蛋白之核苷酸序列缺失(depleted) CpG位點。
一種rAAV，其包含： (a) AAV衣殼；及 (b)包含側接AAV-ITRs之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中該編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列可操作地連接至該編碼hGALNS之核苷酸序列。
如請求項11之rAAV，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。
一種rAAV，其包含： (a) AAV衣殼；及 (b)包含側接AAV-ITRs之hGALNS表現卡匣之重組AAV基因組，該hGALNS表現卡匣包含編碼啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中該編碼啟動子之核苷酸序列可操作地連接至該編碼hGALNS之核苷酸序列，且其中該啟動子係選自由以下組成之群： a. CAG啟動子， b. 80%與SEQ ID NO:13一致； c. 85%與SEQ ID NO:13一致； d. 90%與SEQ ID NO:13一致； e. 95%與SEQ ID NO:13一致； f. 98%與SEQ ID NO:13一致； g. SEQ ID NO:13， h. 80%與SEQ ID NO:14一致； i. 85%與SEQ ID NO:14一致； j. 90%與SEQ ID NO:14一致； k. 95%與SEQ ID NO:14一致； l. 98%與SEQ ID NO:14一致； m. SEQ ID NO:14， n. 80%與SEQ ID NO:15一致； o. 85%與SEQ ID NO:15一致； p. 90%與SEQ ID NO:15一致； q. 95%與SEQ ID NO:15一致； r. 98%與SEQ ID NO:15一致； s. SEQ ID NO:15， t. 80%與SEQ ID NO:16一致； u. 85%與SEQ ID NO:16一致； v. 90%與SEQ ID NO:16一致； w. 95%與SEQ ID NO:16一致； x. 98%與SEQ ID NO:16一致；及 y. SEQ ID NO:16。
如請求項11至13中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV8。
如請求項11至13中任一項之rAAV，其中該AAV為AAV9。
如請求項11至15中任一項之rAAV，其中該編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼該融合蛋白之核苷酸序列係密碼子優化。
如請求項1至9中任一項之rAAV，其中該編碼hGALNS之核苷酸序列或編碼該融合蛋白之核苷酸序列缺失CpG位點。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至17中任一項之rAAV及醫藥學上可接受之載劑。
一種包含側接AAV-ITRs之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼hGALNS與酸性寡肽融合之融合蛋白之核苷酸序列。
如請求項19之聚核苷酸，其中該酸性寡肽為D8。
如請求項19或20之聚核苷酸，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列，其中該編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列可操作地連接至編碼該融合蛋白之核苷酸序列。
如請求項21之聚核苷酸，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。
如請求項19或20之聚核苷酸，其中該hGALNS表現卡匣進一步包含編碼啟動子之核苷酸序列，其中該編碼啟動子之核苷酸序列可操作地連接至編碼該融合蛋白之核苷酸序列。
如請求項23之聚核苷酸，其中該啟動子係選自由以下組成之群： a. CAG啟動子， b. 80%與SEQ ID NO:13一致； c. 85%與SEQ ID NO:13一致； d. 90%與SEQ ID NO:13一致； e. 95%與SEQ ID NO:13一致； f. 98%與SEQ ID NO:13一致； g. SEQ ID NO:13， h. 80%與SEQ ID NO:14一致； i. 85%與SEQ ID NO:14一致； j. 90%與SEQ ID NO:14一致； k. 95%與SEQ ID NO:14一致； l. 98%與SEQ ID NO:14一致； m. SEQ ID NO:14， n. 80%與SEQ ID NO:15一致； o. 85%與SEQ ID NO:15一致； p. 90%與SEQ ID NO:15一致； q. 95%與SEQ ID NO:15一致； r. 98%與SEQ ID NO:15一致； s. SEQ ID NO:15， t. 80%與SEQ ID NO:16一致； u. 85%與SEQ ID NO:16一致； v. 90%與SEQ ID NO:16一致； w. 95%與SEQ ID NO:16一致； x. 98%與SEQ ID NO:16一致；及 y. SEQ ID NO:16。
一種包含側接AAV-ITRs之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中該編碼肝特異性啟動子之核苷酸序列可操作地連接至該編碼hGALNS之核苷酸序列。
如請求項25之聚核苷酸，其中該肝特異性啟動子為TBG啟動子。
一種包含側接AAV-ITRs之hGALNS表現卡匣之聚核苷酸，該hGALNS表現卡匣包含編碼啟動子之核苷酸序列及編碼hGALNS之核苷酸序列，其中該編碼啟動子之核苷酸序列可操作地連接至該編碼hGALNS之核苷酸序列，其中該啟動子係選自由以下組成之群： a. CAG啟動子， b. 80%與SEQ ID NO:13一致； c. 85%與SEQ ID NO:13一致； d. 90%與SEQ ID NO:13一致； e. 95%與SEQ ID NO:13一致； f. 98%與SEQ ID NO:13一致； g. SEQ ID NO:13， h. 80%與SEQ ID NO:14一致； i. 85%與SEQ ID NO:14一致； j. 90%與SEQ ID NO:14一致； k. 95%與SEQ ID NO:14一致； l. 98%與SEQ ID NO:14一致； m. SEQ ID NO:14， n. 80%與SEQ ID NO:15一致； o. 85%與SEQ ID NO:15一致； p. 90%與SEQ ID NO:15一致； q. 95%與SEQ ID NO:15一致； r. 98%與SEQ ID NO:15一致； s. SEQ ID NO:15， t. 80%與SEQ ID NO:16一致； u. 85%與SEQ ID NO:16一致； v. 90%與SEQ ID NO:16一致； w. 95%與SEQ ID NO:16一致； x. 98%與SEQ ID NO:16一致；及 y. SEQ ID NO:16。
如請求項25至27中任一項之聚核苷酸，其中該AAV為AAV8。
如請求項25至27中任一項之聚核苷酸，其中該AAV為AAV9。
一種rAAV質體，其包含如請求項25至29中任一項之聚核苷酸。
一種離體(ex vivo)細胞，其包含如請求項19至29中任一項之聚核苷酸或如請求項30之rAAV質體。
一種製備rAAV之方法，其包含用如請求項30之rAAV質體及一或多種總體上包含AAV基因Rep、Cap、VA、E2a及E4之核苷酸序列之輔助質體轉染離體細胞。
一種治療經診斷患有IVA型黏多醣病(MPS IVA)之人類個體之方法，其包含向該人類個體投與如請求項1至29中任一項之rAAV或如請求項18之醫藥組合物。
一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含藉由向該人類個體投與如請求項1至10中任一項之rAAV來向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS與酸性寡肽融合之融合蛋白。
如請求項34之方法，其中該hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。
一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含藉由向該人類個體投與如請求項11至17中任一項之rAAV來向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS，該hGALNS藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。
一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS與酸性寡肽融合之融合蛋白，其中該融合蛋白係由rAAV基因組產生。
一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS與酸性寡肽融合之融合蛋白，其中該融合蛋白係由rAAV基因組產生，且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。
一種治療經診斷患有MPS IVA之人類個體之方法，其包含向該人類個體之骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞治療有效量之hGALNS，該hGALNS係由rAAV基因組產生，且藉由在肝細胞中產生且由肝細胞分泌而由甘露糖-6-磷酸鹽糖基化。
如請求項37至39中任一項之方法，其中該AAV為AAV8。
如請求項37至39中任一項之方法，其中該AAV為AAV9。
如請求項34至41中任一項之方法，其中該向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟係向骨骼及/或軟骨傳遞之步驟。
如請求項34至41中任一項之方法，其中該向骨骼、軟骨、韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜傳遞之步驟係向以下傳遞之步驟：(a)骨骼及/或軟骨，及(b)韌帶、半月板、生長板、肝、脾、肺、心肌及/或心瓣膜。