KR20210027266A - 뮤코다당질축적증 ｉｖ ａ형의 치료를 위한 아데노관련 바이러스 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 리소좀 저장 장애(lysosomal storage disorder)의 치료, 특히 뮤코다당질축적증 IVA형(mucopolysaccharidosis type IVA) 또는 모르키오 A 증후군(Morquio A syndrome)의 치료를 위한, 새로운 폴리뉴클레오타이드 서열, 아데노-관련 바이러스-유래 벡터, 및 이를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

Description

뮤코다당질축적증 IV A형의 치료를 위한 아데노관련 바이러스 벡터
본 발명은 관심 단백질의 발현에 유용한 폴리뉴클레오타이드 서열 및 벡터, 그리고 유전자 치료법에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 뮤코다당질축적증(MPS; mucopolysaccharidoses)의 치료, 특히 뮤코다당질축적증 IVA형 또는 모르키오 A 증후군(Morquio A syndrome)의 치료에 유용한 벡터 및 핵산 서열에 관한 것이다.
리소좀은 50가지 초과의 하이드롤라제(hydrolase)를 함유하며 오래된(worn-out) 세포 구성요소의 재순환 동안 또는 바이러스 및 박테리아의 포식(engulfment) 후 생물분자를 분해하는, 동물 세포의 세포질에서 발견되는 소기관이다. 이러한 소기관은 프로테아제, 뉴클레아제, 글리코시다제, 리파제, 포스포리파제, 포스파타제 및 설파타제를 포함한 여러 유형의 가수분해 효소를 함유한다. 모든 효소는 산 하이드롤라제이다.
리소좀 저장병(LSD; Lysosomal storage disease)은 하나 이상의 리소좀 효소에 영향을 미치는 유전적 결함에 의해 야기된다. 이들 유전적 질병은 일반적으로, 리소좀에 존재하는 특정 효소 활성의 결핍으로 인한 것이다. 보다 적게는, 이들 질병은 리소좀 생물발생에 관여하는 단백질의 결핍으로 인한 것일 수 있다.
LSD는 개별적으로는 드물지만, 그룹으로서 이들 장애는 일반 대중에서 비교적 흔하다. LSD들의 합산 유병률은 출생아 5,000명 당 약 1명이다. 그러나, 일반 인구 내의 일부 그룹은 특히, LSD의 높은 발생률에 의해 피해를 입는다. 예를 들어, 중동부 유럽 유대인(아슈케나지(Ashkenazi)) 개체의 후손들 중에서 고셰병(Gaucher) 및 테이-삭스(Tay-Sachs)병의 유병률은 각각 600명 출생당 1명 및 3,900명 출생당 1명이다.
뮤코다당질축적증(MPS)은 글루코사미노글리칸(GAG: Glucosaminoglycan)의 대사에 관여하는 특정 리소좀 효소의 부재 또는 결핍을 특징으로 하는 7 가지의 LSD 질병의 그룹이다. 모든 MPS는, X 염색체 연관 유전을 갖는 MPSII(헌터병)를 제외하고는 상염색체 열성 유전 패턴을 갖는다.
7가지의 MPS 중에서, 뮤코다당질축적증 IV형(MPSIV 또는 모르키오 증후군)은 2가지 하위-유형, A 및 B를 갖는다. 모르키오 A 및 B는 둘 다 상염색체 열성 유전 질환이며, 남성 및 여성에게 동등하게 영향을 미친다. 모르키오 A 또는 MPSIVA는 희귀 질환이고, 유병률에 대한 기존의 데이터는 부족하고 변동이 심하다. 보고된 추정치는 북아일랜드에서 76,320명당 1명 내지 서호주에서 641,178명당 1명의 범위이다. MPSIVA는 GAG 케라탄 설페이트(KS) 및 콘드로이틴 6-설페이트(C6S)의 분해에 관여하는 효소 중 하나의 결핍에 의해 야기된다. 이 효소를 코딩하는 유전자는 식별되어 있으며, 다양한 돌연변이가 보고되어 왔다.
MPSIVA는 효소 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제(GALNS, EC 3.1.6.4)의 활성의 결핍에 의해 야기된다. GALNS는 콘드로이틴-6-설페이트(C6S)의 비환원 단부에서 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트의 설페이트 에스테르기 및 케라탄 설페이트(KS)의 비환원 단부에서 갈락토스-6-설페이트의 설페이트 에스테르기를 가수분해하는 리소좀 효소이다. 분해되지 않은 C6S 및 KS가 지속적으로 축적된 결과, 점진적인 세포 손상이 발생하여, 다체계적 질병(multisystemic disease)을 초래한다. 현재, GALNS 효소의 활성의 결핍을 유발하는 약 180가지의 상이한 돌연변이가 인간 GALNS 유전자에서 식별되었다.
대부분의 KS 및 C6S는 연골세포에 의해 생성되고, 따라서, 분해되지 않은 기질(substrate)은 연골의 세포 및 세포외 기질(extracellular matrix)에 주로 축적된다. 이는 연골 및 골 발달에 직접적인 영향을 주어, 전신 골격 이형성증(systemic skeletal dysplasia)을 유발한다. 모르키오 A를 갖는 환자에서, 연골 세포는 공포화(vacuolated)되고, 이는 비정상적인 연골형성 및/또는 연골내골화(endochondral ossification)를 초래한다. 대부분의 MPSIVA 환자는 겉보기에 건강하게 태어나고 증상이 점진적으로 발달한다. 초기 증상은 생후 1년 내지 3년차에 인식되고, 진단 시 평균 연령은 약 4.7세이다. 주요 골격 특징은 주향 짧은 몸통 왜소증(striking shot trunk dwarfism), 치아돌기 저형성증(odontoid hypoplasia), 새가슴(pectus carinatum), 척추후만증(kyphosis), 척추측만증(scoliosis), 외반슬(genu valgum), 외반고(coxa valga), 늑골 하단의 플레어링(flaring of the lower ribs), 과가동성 관절(hypermobile joint) 및 넘어질 경향이 있는 비정상적인 걸음걸이(abnormal gait with a tendency to fall)를 포함한다. 기타 다른 잠재적인 합병증은 폐손상(pulmonary compromise), 심장 판막 질병, 청력 소실, 간 비대(hepatomegaly), 미세한 각막 혼탁, 열등한 얼굴 특질(coarse facial feature) 및 비정상적으로 얇은 법랑질 및 빈번한 우식(caries)과 더불어 넓게 이격된 치아를 포함한다. MPSIVA 환자에서 지능은 보존되어 있다. 질병 진행 속도 및 존재하는 표현형 특질은 환자마다 다르다. MPSIVA 표현형은, 전연령에 걸쳐 최종 키가 120 cm인 경우 중증으로 정의되며, 최종 키가 120 cm 초과 140 cm 미만인 경우 중등도로 정의되고, 최종 키가 140 cm를 초과하는 경우 경증으로 정의된다. 보고된 기대 수명은 20세 내지 70세의 범위이다. 이러한 변동성은 돌연변이의 성질, 민족성 또는 환자가 받는 의료의 차이와 같은 다수의 인자들과 관련이 있을 수 있다.
최근까지, MPSIVA 증후군에 대해 질병-특이적으로 승인된 치료법은 없었다. 이용 가능한 치료는 대증적(symptomatic)이고, 질병 합병증의 예방 및 관리를 위해 광범위한 불특정 약물의 투여를 기반으로 했다. 그러나, 지난 몇년간 MPSIVA 환자에 대해 2가지 주요 치료적 옵션: 효소 대체 치료법(ERT) 및 조혈 줄기세포 이식(HSCT)이 이용 가능해졌다. 2가지 치료적 전략의 설계는, 정상 세포가 유의한 양의 만노스-6-포스페이트(M6P)-태깅(tagged) 가용성 리소좀 효소, 예컨대 GALNS를 분비하며 상기 효소는 후속적으로 세포외 구획으로부터 원형질막 상의 M6P 수용체를 통해 다른 세포에 의해 흡수되고 리소좀으로 표적화될 수 있다는 사실에 기반한 교차-상관의 가능성(cross-correction)에 의존한다. 게다가, 일반적으로 매우 낮은 잔여 효소 활성(residual enzymatic activity) 역치가 존재하고, 이 역치가 초과되면 세포가 기질 유입에 대응할 수 있고 질병이 대상체에게 영향을 미치지 않게 되므로, 이는 정상 활성의 회복이 임상적 경로를 변형시키기 위한 필요조건이 아님을 시사한다.
MPSIVA에 대해, ERT는 질병의 2가지 상이한 뮤린 마우스 모델에서 시험되어 왔다(문헌[Tomatsu et al., 2008, 2010a, 2015]). 이 연구에서, 250 U/g 용량의 재조합 뮤린 GALNS(rGALNS)가 0.5주령 및 12주령의 MPSIVA 마우스에게 매주 정맥내 또는 복강내 투여되었다. 마지막 투약 후 1주일차에, MPSIVA 마우스는 내장 기관, 골수, 심장 판막, 인대 및 결합 조직 내의 강 내벽 세포(sinus lining cell)에서 GAG 저장의 두드러진 감소, 및 혈중 KS 수준의 두드러진 감소를 보여주었고, rGALNS의 주입에 의한 체성 교정(somatic correction)을 입증하였다.
2014년에, 엘로설파제 알파(Elosulfase alfa), VIMIZIM®(BioMarin Pharmaceutical Inc)로서 시판된 재조합 인간 GALNS는 MPSIVA의 치료를 위해 미국 식품의약청(FDA) 및 유럽 의약품 기구(EMA)에 의해 승인을 받았다. 치료는 매주 2 mg/kg의 용량으로 정맥내 주입에 의해 투여되었으며, 평균 주입 기간은 3.5시간 내지 4.5시간이었다. 등록된 환자의 연령은 5세 내지 57세 범위였다. 기준선에서, 모든 등록된 환자는 6분 보행 검사(6MWT)에서 30 m 내지 325 m를 걸을 수 있었다(Sanford and Lo, 2014). 1차 종점은 치료 개시 후 24주차에 6MWT에서 걸은 거리의 기준선으로부터의 변화로서 설정되었다. 2차 종점은 24주차에 3분 계단 오르기(3MSCT) 속도와 소변내 KS 수준의 기준선으로부터의 변화를 포함하였다. 환자는 2개의 치료군: 매주 2 mg/kg 용량의 VIMIZIM®을 받는 군 및 격주 1회 2 mg/kg을 받는 군으로 나뉘었다. 매주 VIMIZIM® 2 mg/kg을 받는 환자에서, 6MWT에서 걸은 거리는 치료 개시 후 24주차에 위약 코호트와 비교하여 22.5 m까지 증가하였다. 그러나, VIMIZIM®을 받은 환자에서 계단 오르기 속도는 차이가 없었다. 더욱이, 처음 24주의 치료에 대해 보행 능력에서 추가 향상이 관찰되지 않았다. 한편, 격주 1회 VIMIZIM® 2 mg/kg을 받은 환자에서는 6MWT 및 3MSCT에서 위약군과 비교하여 차이가 없었다. 약력학적 효과의 척도인, 기준선으로부터 소변내 KS 수준의 감소는 모든 VIMIZIM® 치료군에서 더 컸다(2014). 처음에 위약-제어 시험에 포함된 환자는 이후에 오픈-라벨 연장 시험(open-label extension trial)(MOR-005)에서 VIMIZIM®의 치료를 시작하기에 적격이었다.
VIMIZIM®에 대한 가능한 과민증으로 인해, 제품 투여 동안 의료 지원을 받을 수 있다. 시험 동안, 기재된 가장 심각한 부작용은 아나필락시스 및 과민증 반응이었으며, 이들 부작용은 VIMIZIM® 주입 동안 또는 제품 투여 후 3시간까지 어느때나 나타날 수 있다. 급성 호흡기 병을 갖는 환자는 위험이 증가할 수 있고 추가 모니터링이 필요할 수 있다. 환자의 삶에 손상을 줄 수 있는 이들 아나필락시스 반응은 기침, 발진, 목 압박감, 두드러기, 홍조, 피부색 변화, 저혈압, 숨가쁨, 흉통, 및 위장 증후군, 예컨대 메스꺼움, 복통, 구역질 및 구토를 포함한다(http://vimizim.com). ERT의 다른 단점은 1) 소아 환자에서 3.5시간 내지 4.5시간의 정맥내 주입을 수행하는 어려움, 2) 주당 1회 VIMIZIM® 2 mg/kg으로 치료받은 환자의 100%가 4주 후 항-약물 항체를 발달시켰다는 사실, 3) 시험된 모든 환자가 시험 동안 약물이 만노스-6-포스페이트 수용체에 결합하는 것을 적어도 1회 억제할 수 있는 중화 항체를 발달시켰다는 점, 및 4) 높은 치료 비용(자택-간호 비용도 포함됨)(2014)을 포함한다.
골수-유래 줄기세포(골수 이식, BMT)를 사용하는 조혈 줄기세포 이식(HSCT)은 다른 MPS 환자들에서 체성 병태와 신경학적 병태 둘 다의 치료에서 효율적인 것으로 입증되었다. HSCT에 의한 표현형 교정의 주요 단점은, 상기 치료가 MPSIVA 환자의 성장에 미치는 영향이 미미하다는 점이다(Chinen et al., 2014; Wang et al., 2016; Yabe et al., 2016).
MPSIVA에 대한 현재의 치료적 옵션의 한계를 고려하여, 대안적인 접근법이 필요하다.
생체내 유전자 치료법은 평생 유익한 효과를 기대하며 MPSIVA 및 다른 유전 질병에 대한 1회 치료의 가능성을 제공한다.
모르키오 A 질병에 대한 유전자 치료법 예비임상 연구는 주로 γ-레트로바이러스-, 렌티바이러스-, 및 아데노-관련-유래 벡터의 투여를 기반으로 하였다.
인간 GALNS 유전자를 인코딩하는 γ-레트로바이러스-유래 벡터로 MPSIVA 인간 림프모구성 B 세포, 인간 각질형성세포, 뮤린 근모세포, 및 토끼 활막세포를 시험관내 형질도입하면, GALNS 효소적 활성의 증가를 초래하여 세포내 GAG 저장의 감소를 유발하였다(Toietta et al., 2001).
모르키오 A 피부 섬유모세포의 인간 GALNS cDNA를 코딩하는 렌티바이러스-유래 벡터의 투여가 비-형질도입 MPSIVA 섬유모세포의 효소 활성 수준보다 7.5-배 더 높은 효소 활성 수준을 보여주긴 하였지만, 인간의 건강한 섬유모세포의 효소 활성 수준보다는 더 낮았다. 렌티바이러스 벡터의 사용은 또한, β-헥소사미니다제 및 β-갈락토시다제 활성의 정상화를 유발하였으며, 이는 모르키오 A에 대한 2차 바이오마커인 것으로 보고되었다(Almeciga et al., 2013; Salazar et al., 2016).
특히, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터-매개 유전자 도입은 이들 벡터의 높은 형질도입 효율 및 병원성의 결여로 인해 많은 생체내 유전자 치료법 적용을 위해 선택되는 접근법으로서 급부상하고 있다. AAV 벡터는 유사분열 후 세포(post-mitotic cells)를 형질도입시킬 수 있고, 여러 예비-임상 및 임상 연구에서 다양한 질병에 대한 치료적 이식 유전자(transgene)의 지속된 발현을 효율적으로 이끌어 내기 위한 AAV 벡터-매개 유전자 도입의 잠재성을 실증하였다.
AAV 벡터의 사용은 효소 활성에 미치는 GALNS 및 설파타제 변형 인자 1(SUMF1)의 공동-발현의 효과를 평가할 수 있게 하였다. 이러한 공동-발현은 세포 배양물에서 효소 활성의 최대 4-배의 증가를 초래하였다(Almeciga-Diaz et al., 2010). 생체내에서, 모르키오 A 마우스 모델에서 AAV-GALNS 벡터의 투여는, 단일 정맥내 투여 후 12주차에 혈장 내 효소 활성이 야생형 수준의 최대 8.5%까지 회복된 한편, AAV-SUMF1 벡터의 공동-투여는 GALNS 활성을 야생형 수준의 최대 19%까지 증가시켰음을 보여주었다. GALNS 효소 활성은 또한, 심장 및 뼈 각각에서 야생형의 최대 30% 및 최대 33%까지 증가되었다(Almeciga Javier, Montano Adriana, Shunji Tomatsu, 2012).
GALNS 효소의 골(bone) 전달을 향상시키기 위해, 바이러스 캡시드 내에서 짧은 산성 아미노산 펩타이드를 운반하여 골 하이드록시아파타이트에 대한 바이러스의 친화도를 부여하도록 변형된 AAV 벡터가 개발되었다. 이러한 변형된 GALNS-인코딩 AAV 벡터는 MPSIVA 마우스 모델의 뼈에서 벡터 게놈 카피 및 이식 유전자 발현을 유의하게 증가시켰고, GALNS 활성 수준을 야생형의 42%로 유발하였다(Almeciga Javier, Montano Adriana, Shunji Tomatsu, 2012; Tomatsu et al., 2010b).
상기 언급된 접근법 중 어느 것도, 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성을 완전히 회복시키지 못했거나, 세포질내 봉입(inclusion)의 완전한 근절을 달성하지 못했거나, MPSIVA의 모든 임상적 징후를 교정하지 못했다. 그러므로, 더 양호한 효능 및 안전성 프로파일을 갖는 MPSIVA의 치료에 대한 신규 접근법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 뮤코다당질축적증, 특히 뮤코다당질축적증 IVA형 또는 모르키오 A 증후군의 치료를 위한 새로운 폴리뉴클레오타이드 서열 및 벡터를 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열과 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 새로운 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공하며, 상기 서열은 기능적 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제를 인코딩한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 지칭한다.
본 발명의 추가의 양태는 치료적 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 벡터를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 추가의 양태는 약제로서 사용하기 위한, 특히 뮤코다당질축적증 IVA형 또는 모르키오 A 증후군의 치료를 위한 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 벡터, 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 아데노-관련 바이러스 벡터의 생성 방법을 제공한다.
도 1. pAAV-CAG-hGALNS 및 AAV9-CAG-hGALNS의 생성이다. (a) 플라스미드 pAAV-CAG-hGALNS 및 이의 구성요소의 개략도이다. (b) hGALNS 코딩 서열을 함유하는 아데노-관련 벡터의 게놈의 개략도이다.
도 2. pAAV-CAG-ohGALNS-v1 및 AAV9-CAG-ohGALNS-v1의 생성이다. (a) 플라스미드 pAAV-CAG-ohGALNS-v1 및 이의 구성요소의 개략도이다. (b) ohGALNS-v1 코딩 서열을 함유하는 아데노-관련 벡터의 게놈의 개략도이다.
도 3. pAAV-CAG-ohGALNS-v2 및 AAV9-CAG-ohGALNS-v2의 생성이다. (a) 플라스미드 pAAV-CAG-ohGALNS-v2 및 이의 구성요소의 개략도이다. (b) ohGALNS-v2 코딩 서열을 함유하는 아데노-관련 벡터의 게놈의 개략도이다.
도 4. pAAV-CAG-ohGALNS-v3 및 AAV9-CAG-ohGALNS-v3의 생성이다. (a) 플라스미드 pAAV-CAG-ohGALNS-v3 및 이의 구성요소의 개략도이다. (b) ohGALNS-v3 코딩 서열을 함유하는 아데노-관련 벡터의 게놈의 개략도이다.
도 5. pAAV-CAG-omGalns, AAV9-CAG-omGalns 및 AAV8-CAG-omGalns의 생성이다. (a) 플라스미드 pAAV-CAG-omGalns 및 이의 구성요소의 개략도이다. (b) omGalns 코딩 서열을 함유하는 아데노-관련 벡터의 게놈의 개략도이다.
도 6. pAAV-hAAT-omGalns 및 AAV8-hAAT-omGalns의 생성이다. (a) 플라스미드 pAAV-hAAT-omGalns 및 이의 구성요소의 개략도이다. (b) omGalns 코딩 서열을 함유하는 아데노-관련 벡터의 게놈의 개략도이다.
도 7. 수컷 마우스로의 상이한 인간 Galns 버전을 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-hGalns, AAV9-CAG-ohGalns-v1, AAV9-CAG-ohGalns-v2, 및 AAV9-CAG-ohGalns-v3)의 정맥내 전달이다. 2월령에서 야생형 (건강한) 마우스(WT), 비치료된 Galns-/- 마우스 및 5 × 1010 vg의 각각의 벡터가 정맥내(IV) 주사를 통해 전신 투여된 Galns-/- 마우스의 (a) 간 및 (b) 혈청에서의 GALNS 활성이다. WT GALNS 활성은 100%인 것으로 설정되었다. 값은 그룹당 4마리 내지 5마리의 마우스의 평균 ± SEM이다.
도 8. 수컷 마우스로의 최적화된 뮤린 Galns를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-omGalns)의 정맥내 전달이다. 1월령에서 야생형 (건강한) 마우스(WT), 비치료된 Galns-/- 마우스 및 1 × 1012 vg의 AAV9-CAGomGalns가 정맥내(IV) 주사를 통해 전신 투여된 Galns-/- 마우스의 (a) 간, (b) 대퇴골, (c) 지방 조직에서의 GALNS 활성이다. (d) 동일한 코호트의 동물에서 상이한 주사 후 지점(point)에서의 혈청 내 GALNS 활성이다. WT GALNS 활성은 100%인 것으로 설정되었다. 값은 그룹당 4 마리 내지 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. * P < 0.05, **** P < 0.0001, vs. Galns-/- 비치료된 마우스.
도 9. 수컷 마우스로의 최적화된 뮤린 Galns를 코딩하는 AAV8 벡터(AAV8-CAG-omGalns)의 정맥내 전달이다. 1월령에서 야생형 (건강한) 마우스(WT), 비치료된 Galns-/- 마우스 및 1 × 1012 vg의 AAV8-CAGomGalns가 정맥내(IV) 주사를 통해 전신 투여된 Galns-/- 마우스의 (a) 간, (b) 대퇴골, (c) 지방 조직에서의 GALNS 활성이다. (d) 동일한 코호트의 동물에서 상이한 주사 후 지점에서 혈청 내 GALNS 활성이다. WT GALNS 활성은 100%인 것으로 설정되었다. 값은 그룹당 4 마리 내지 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. * P < 0.05, **** P < 0.0001, vs. Galns-/- 비치료된 마우스.
도 10. 수컷 마우스로의 최적화된 뮤린 Galns를 코딩하는 AAV8 벡터(AAV8-hAAT-omGalns)의 정맥내 전달이다. 1월령에서 야생형 (건강한) 마우스(WT), 비치료된 Galns-/- 마우스 및 1 × 1011 vg의 AAV8-hAAT-omGalns가 정맥내(IV) 주사를 통해 전신 투여된 Galns-/- 마우스의 (a) 간, (b) 대퇴골, (c) 지방 조직에서의 GALNS 활성이다. (d) 동일한 코호트의 동물에서 상이한 주사 후 지점에서 혈청 내 GALNS 활성이다. WT GALNS 활성은 100%인 것으로 설정되었다. 값은 그룹당 4 마리 내지 5 마리의 마우스의 평균 ± SEM이다. * P < 0.05, **** P < 0.0001, vs. Galns-/- 비치료된 마우스.
도 11. 수컷 마우스로의 최적화된 뮤린 Galns를 코딩하는 AAV9 및 AAV8 벡터(AAV9-CAG-omGalns, AAV8-CAG-omGalns 및 AAV8-hAATomGalns)의 정맥내 전달이다. (a) 간 및 (b) 혈청에서 LC-MS/MS 분석에 의한 케라탄 설페이트(KS)의 정량화이다. **** P < 0.0001, vs. Galns-/- 수컷 비치료된 마우스.
도 12. 수컷 마우스로의 최적화된 뮤린 Galns를 코딩하는 AAV9 및 AAV8 벡터(AAV9-CAG-omGalns, AAV8-CAG-omGalns 및 AAV8-hAATomGalns)의 정맥내 전달이다. 톨루이딘 블루로 염색된 절편에서 경골 골단 성장판(Tibial Epiphyseal Growth Plate)의 조직병리학이다. 원래의 배율 100x.
도 13. 수컷 Galns-/- 마우스로의 최적화된 뮤린 Galns를 코딩하는 AAV9 및 AAV8 벡터(AAV9-CAG-omGalns, AAV8-CAG-omGalns 및 AAV8-hAATomGalns)의 정맥내 전달이다. (a) 글리코사미노글리칸에 대한 모리 염색(Mowry's staining) 후 각막 상피에서 수득된 염색 강도의 정량화이다. (b) 야생형 (건강한) 마우스(WT), 비치료된 Galns-/- 마우스 및 정맥내(IV) 주사를 통해 전신 투여된 Galns-/- 마우스에서 톨루이딘 블루로 염색된 절편에서의 눈물샘의 조직병리학이다. 원래의 배율 40x. *** P < 0.001, **** P < 0.0001 vs. Galns-/- 수컷 비치료된 마우스.
도 14. 수컷 마우스로의 최적화된 뮤린 GALNS를 코딩하는 AAV9 벡터(AAV9-CAG-omGalns)의 정맥내 전달이다. 6월령의 건강한 WT 및 최적화된 뮤린 Galns를 코딩하는 벡터(AAV9-CAG-omGALNS) 1 × 1012 vg이 전신 투여된 Galns-/- 수컷으로부터 수합된 치아 이랑(dentate gyrus) 및 편도체의 초미세구조(ultrastructure)의 투과 전자 현미경에 의한 분석이다. 혈관주위 대식세포(치아 이랑), 뉴런주위 신경교세포(perineuronal glial cell) 및 내피 세포(편도체)에서의 확대된 리소좀은 화살표로 표시되어 있다.
플라스미드 pAAV-CAG-hGALNS(SEQ ID NO: 2), pAAV-CAG-ohGALNS-v1(SEQ ID NO: 4), pAAV-CAG-ohGALNS-v2(SEQ ID NO: 6) 및 pAAV-CAG-ohGALNS-v3(SEQ ID NO: 8)은 2018년 4월 19일에 DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraße 7 B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany에서 각각 수탁 번호 DSM 32791, DSM 32792, DSM 32793 및 DSM 32794 하에 기탁되었다.
정의
용어 "뉴클레오타이드 서열" 또는 "단리된 뉴클레오타이드 서열" 또는 "폴리뉴클레오타이드 서열" 또는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오타이드 서열"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 각각 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 함유하는 DNA 또는 RNA인 핵산 분자를 지칭한다. 핵산은 이중 가닥, 단일 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 둘 다의 일부를 함유할 수 있다.
용어 "서열 동일성 %", "동일성 %" 또는 "서열 상동성 %"는 최대 서열 동일성 %를 달성하기 위해 서열들을 정렬시킨 후, 기준 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산과 동일한 후보 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 서열 동일성은 2개의 주어진 SEQ ID NO의 전장 또는 이의 일부를 기반으로 계산된다. 서열 동일성 %는 당업계에서 확립된 임의의 방법 또는 알고리즘, 예컨대 ALIGN, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 문헌[Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977;25:3389-3402] 및 문헌[Altschul S, et al., J Mol Biol. 1990;215:403-410]을 참조한다.
본원에서, "서열 동일성 %", "동일성 %" 또는 "서열 상동성 %"는 기준 서열 및 후보 서열을 정렬시킨 후 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수를 기준 서열 내의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 총 수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 계산된다.
선택적으로, 아미노산 유사성 정도를 결정하는 데 있어서, 당업자는 또한, 당업자에게 자명할 바와 같이 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환성을 기반으로 한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신을 포함하며; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌을 포함하며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민을 포함하며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 포함하며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함하고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 본원에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는, 개시된 서열 내의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된 것들이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 천연 발생 아미노산에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala으로부터 Ser; Arg으로부터 Lys; Asn으로부터 Gln 또는 His; Asp으로부터 Glu; Cys으로부터 Ser 또는 Ala; Gln으로부터 Asn; Glu으로부터 Asp; Gly으로부터 Pro; His으로부터 Asn 또는 Gln; Ile으로부터 Leu 또는 Val; Leu으로부터 Ile 또는 Val; Lys으로부터 Arg; Gln으로부터 Glu; Met으로부터 Leu 또는 Ile; Phe으로부터 Met, Leu 또는 Tyr; Ser으로부터 Thr; Thr으로부터 Ser; Trp으로부터 Tyr; Tyr으로부터 Trp 또는 Phe; 및 Val으로부터 Ile 또는 Leu.
용어 "코딩하다(codify)" 또는 "코딩(coding)"은 뉴클레오타이드 서열이 폴리펩타이드 또는 단백질로 번역되는 방법을 결정하는 유전자 코드를 지칭한다. 서열에서 뉴클레오타이드의 순서는 폴리펩타이드 또는 단백질을 따라 아미노산의 순서를 결정한다.
용어 "단백질"은 아미노산 또는 폴리펩타이드의 하나 이상의 선형 사슬로 이루어진 거대분자를 지칭한다. 단백질은 시스테인 잔기로부터 3-옥소알라닌으로의 전환, 글리코실화 또는 금속 결합과 같은 번역-후 변형을 받을 수 있다. 단백질의 글리코실화는 아미노산 사슬에 공유 연결되는 상이한 탄수화물의 첨가이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전사 조절 영역"은 하나 이상의 유전자의 발현을 조절할 수 있는 핵산 단편을 지칭한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 조절 영역은 RNA 폴리머라제 결합을 돕고 발현을 촉진하기 위해 전사 인자에 결합하기 위한 프로모터, 플러스 반응 요소, 활성자 및 인핸서 서열, 및 RNA 폴리머라제 부착을 차단하고 발현을 방지하기 위해 억제자 단백질이 결합하는 작동자(operator) 또는 사일런서 서열을 포함할 수 있다.
용어 "프로모터"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 코딩 서열의 전사를 제어하는 작용을 하며, 폴리뉴클레오타이드 서열(들)의 5' 업스트림에 배치되고, DNA 의존적 RNA 폴리머라제에 대한 결합 부위, 전사 개시 부위, 및 비제한적으로 전사 인자, 억제자, 및 프로모터로부터 전사의 양을 조절하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 것으로 당업계에 알려진 임의의 다른 뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 부위의 존재에 의해 구조적으로 식별되는 핵산 단편으로서 이해되어야 한다.
프로모터는 적합한 검정법, 예컨대 RT-qPCR 또는 노던 블로팅(전사물의 검출)을 사용하여, 관심 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된(operably linked) 프로모터를 포함하는 유전자 작제물을 사용하여 발현 시스템에서 프로모터가 이에 작동 가능하게 연결된(operatively linked) 뉴클레오타이드 서열의 전사를 개시할 수 있는 경우 프로모터는 활성이거나 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현을 이끌어 낸다고 한다. 상기 프로모터의 활성은 또한, 인코딩된 단백질에 적합한 검정법, 예컨대 웨스턴 블로팅 또는 ELISA를 사용하여 단백질 수준에서 평가될 수 있다. 프로모터는 전사물이 검출될 수 있는 경우, 또는 상기 프로모터가 없다는 점만 상이한 작제물을 사용한 전사와 비교하여 전사물 또는 단백질 수준의 증가가 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1000%, 1500% 또는 2000%인 것으로 밝혀지는 경우 전사를 개시할 수 있다고 한다.
용어 "구성적" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달적 조건 하에 활성인 프로모터를 지칭한다. "유도적" 프로모터는 바람직하게는 생리학적 또는 발달적 조건에 따라 조절되는 프로모터이다. 유도적 프로모터는 약물 전달 또는 광 노출 후 활성이 될 수 있다. 따라서, "구성적" 프로모터는 "유도적" 프로모터의 측면에서 조절되지 않는다. "조직-특이적" 프로모터는 바람직하게는 특정 유형의 세포/조직에서 활성이다. 유비쿼터스(ubiquitous) 프로모터는 많은 조직(들)에서 또는 임의의 상이한 조직(들)에서 활성인 프로모터로서 정의될 수 있다. 통상, 이러한 맥락에서 "많은"은 5개 초과 또는 적어도 6, 10, 15, 20 또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 상이한 조직을 의미한다.
용어 "CAG" 프로모터는 닭 β-액틴 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 인핸서를 포함하는 프로모터를 지칭한다(문헌[Alexopoulou A. et al. BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11]). 더욱 정확하게는, 상기 CAG 프로모터는 (i) 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, (ii) 닭 베타-액틴 프로모터, (iii) 닭 베타-액틴 유전자의 제1 인트론, 및 (iv) 토끼 베타-글로빈 유전자의 인트론 2/엑손 3을 포함한다.
용어 "hAAT" 프로모터는 인간 α1-항트립신 프로모터 및 아포지질단백질 E로부터의 간세포 제어 영역(HCR) 인핸서의 3개 카피를 포함하는 하이브리드 프로모터를 지칭한다.
용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 관심 유전자에 대한 프로모터 서열의 기능적 관계 및 위치를 지칭한다(예를 들어 프로모터 또는 인핸서는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 주는 경우 상기 서열에 작동 가능하게 연결됨). 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 프로모터는 관심 서열에 인접해 있다. 그러나, 인핸서는 관심 서열의 발현을 제어하기 위해 상기 서열에 인접해 있지 않아야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전사-후 조절 영역"은 카세트 또는 생성된 유전자 생성물에 함유된 서열의 발현, 안정화 또는 국소화를 용이하게 하는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 전달하고 선택적으로 발현시킬 수 있는 작제물을 지칭한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 비포장(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 응축제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 소정의 진핵 세포, 예컨대 생성자 세포를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 벡터는 안정할 수 있고, 자가-복제성일 수 있다. 사용될 수 있는 벡터의 유형에 대해서는 제한이 없다. 벡터는 여러 이종성 유기체로 혼입되는 폴리뉴클레오타이드, 유전자 작제물 또는 발현 벡터를 증식(propagation)시키고 수득하기에 적합한 클로닝 벡터일 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터"는 세포에서 유전자 발현을 위해 디자인된 벡터를 지칭하며, 즉, 벡터는 특정 유전자를 표적 세포 내로 도입하여 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 생성하는 데 사용된다.
본 발명에 따른 벡터는, 인핸서 및/또는 프로모터 영역으로서 작용하고 발현 벡터 상에서 수행되는 유전자의 효율적인 전사를 유발하는 작용을 하는 조절 서열을 함유할 수 있다. 적합한 벡터는 원핵 발현 벡터(예를 들어 pUC18, pUC19, Bluescript 및 이들의 유도체), mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, 파지 및 셔틀 벡터(예를 들어 pSA3 및 pAT28), 및 바이러스 벡터를 기반으로 하는 진핵 발현 벡터(예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 뿐만 아니라 레트로바이러스 및 렌티바이러스), 뿐만 아니라 비-바이러스 벡터, 예컨대 pSilencer 4.1-CMV(Ambion®, Life Technologies Corp., 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL 및 pKSV-10, pBPV-l, pML2d 및 pTDTl을 포함한다.
용어 "재조합 플라스미드" 또는 "플라스미드"는 유전자 조작 기법을 통해 수득되며, 관심 유전적 물질을 세포로 이전시켜 표적 세포에서 상기 유전적 물질에 의해 인코딩된 생성물(예를 들어 단백질 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 기능적 RNA)의 생성을 초래할 수 있는 작고 원형이며 이중 가닥의 자가-복제성 DNA 분자를 지칭한다. 더욱이, 용어 "재조합 플라스미드" 또는 "플라스미드"는 또한, 유전자 조작 기법을 통해 수득되며, 재조합 벡터 게놈의 운반체로서의 바이러스 벡터의 제조 동안 사용되는 작고 원형이며 이중 가닥의 자가-복제성 DNA 분자를 지칭한다.
용어 "재조합 바이러스 벡터" 또는 "바이러스 벡터"는 유전자 조작 기법을 통해 천연 발생 바이러스로부터 수득되며, 관심 유전적 물질(예를 들어 DNA 또는 RNA)을 세포로 이전시킬 수 있어서 상기 유전적 물질에 의해 인코딩된 생성물(예를 들어 단백질 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 기능적 RNA)의 생성을 초래하는 제제를 지칭한다.
본원에서 동의어로서 사용되는 용어 "아데노-관련 바이러스", "AAV 바이러스", "AAV 비리온," "AAV 바이러스 입자" 및 "AAV 입자"는 AAV의 적어도 하나의 캡시드 단백질(바람직하게는 특정 AAV 혈청형의 모든 캡시드 단백질로 이루어짐) 및 AAV 게놈에 상응하는 캡슐화된 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 바이러스 입자를 지칭한다. 야생형 AAV는 파보바이러스(Parvoviridae) 과(family)의 데펜도바이러스(Dependovirus) 속(genus)에 속하는 바이러스를 지칭한다. 야생형 AAV 게놈은 길이가 대략 4.7 Kb이고 양성-센스(positive-sensed) 또는 음성-센스(negative-sensed)일 수 있는 단일 가닥 데옥시리보핵산(ssDNA)으로 구성된다. 야생형 게놈은 DNA 가닥의 양쪽 단부에 역위 말단 반복(ITR: inverted terminal repeat), 및 3개의 개방형 리딩 프레임(ORF)을 가진다. ORF rep는 AAV 생명 주기에 필요한 4개의 Rep 단백질을 인코딩한다. ORF cap은 캡시드 단백질: VP1, VP2 및 VP3을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 이들은 상호작용하여 정20면체 대칭의 캡시드를 형성한다. 마지막으로, Cap ORF와 중첩되는 AAP ORF는 캡시드 조립을 촉진하는 것으로 보이는 AAP 단백질을 인코딩한다. 입자가 AAV ITR의 측면에 있는 이종성 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈과 상이한 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 포유류 세포에 전달되는 이식 유전자)를 포함하는 경우, 상기 입자는 전형적으로 "AAV 벡터 입자" 또는 "AAV 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터"로서 알려진다. 본 발명은 또한, dsAAV 또는 scAAV라고도 하는 이중 가닥 AAV의 용도를 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아데노-관련 바이러스 ITR" 또는 "AAV ITR"은 AAV의 게놈의 DNA 가닥의 양쪽 단부에 존재하는 역위 말단 반복을 지칭한다. ITR 서열은 AAV 게놈의 효율적인 증배(multiplication)에 필요하다. 이들 서열의 또 다른 특성은 헤어핀을 형성하는 이들의 능력이다. 이러한 특징은 이들 서열의 자가-프라이밍(self-priming)에 기여하며, 상기 자가-프라이밍은 제2 DNA 가닥의 프리마제(primase)-독립적 합성을 가능하게 한다. ITR은 또한, 숙주 세포 게놈(예를 들어 혈청형 2 AAV에 대해 인간 19번 염색체에서) 내로의 야생형 AAV DNA의 통합과 이로부터의 구제(rescue), 뿐만 아니라 완전히 조립된 데옥시리보뉴클레아제-내성 AAV 입자 내로의 AAV DNA의 효율적인 캡시드화 둘 다에 필요한 것으로 나타났다. ITR 서열은 길이가 약 145 bp이다. 바람직하게는, ITR의 전체 서열이 AAV 바이러스 벡터의 게놈에 사용되긴 하지만, 이들 서열에서 어느 정도의 미미한 변형이 허용된다. 야생형 ITR 서열은 ITR이 요망되는 기능, 예를 들어 복제, 니킹(nicking), 바이러스 포장, 통합 및/또는 프로바이러스(provirus) 구제를 매개하는 한, 삽입, 결실 또는 절단에 의해 변경될 수 있다. 이들 ITR 서열을 변형시키는 절차는 당업계에 잘 알려져 있다. ITR은 비제한적으로 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 또는 알려져 있거나 이후에 발견되는 임의의 다른 AAV를 포함하는 임의의 야생형 AAV로부터 유래될 수 있다. AAV는 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 ITR을 포함한다. 나아가, 2개의 AAV ITR은 AAV 캡시드와 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있거나, 상이할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 5' 및 3' AAV ITR들은 AAVl, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8 및/또는 AAV9로부터 유래되고, 바람직하게는 ITR은 AAV2, AAV8 및/또는 AAV9로부터 유래되며, AAV2가 가장 바람직하다. 일 구현예에서, AAV2 ITR은 위형화된(pseudotyped) AAV(즉, 상이한 혈청형으로부터 유래된 캡시드 및 ITR을 갖는 AAV)를 생성시키도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "재조합 바이러스 게놈"은, 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드가 천연 발생 AAV 게놈 내로 삽입된 AAV 게놈을 지칭한다. 본 발명에 따른 AAV 게놈은 전형적으로, cis-작용적 5' 및 3' 역위 말단 반복 서열(ITR) 및 발현 카세트를 포함한다.
용어 "유전자 치료법"은 유전적 또는 후천적 질병 또는 질환을 치료하거나 예방하기 위해 세포 내로의 관심 유전적 물질(예를 들어 DNA 또는 RNA)의 이전을 지칭한다. 관심 유전적 물질은 생체내에서 이의 생성이 요망되는 생성물(예를 들어 단백질 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 기능적 RNA)을 인코딩한다. 예를 들어, 관심 유전적 물질은 치료적 가치가 있는 효소, 호르몬, 수용체 또는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질도입하다" 또는 "형질도입"은, 외래 뉴클레오타이드 서열이 바이러스 벡터를 통해 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형질주입(transfection)"은 정제된 핵산을 비-바이러스 방법에 의해 진핵 세포 내로 정교하게 도입하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 질병의 진행을 제어하기 위한 본 발명의 화합물 또는 조성물의 투여를 지칭한다. 질병 진행의 제어는 증상의 감소, 질병 기간의 감소, 병리학적 상태의 안정화(구체적으로는 추가 악화를 피하기 위해), 질병 진행의 지연, 병리학적 상태의 향상, 및 관해(부분 관해 및 완전 관해 둘 다)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 유익한 또는 요망되는 임상 결과의 달성으로서 이해된다. 질병 진행의 제어는 또한, 치료가 적용되지 않는 경우의 예상된 생존율과 비교하여 생존율의 연장을 수반한다.
용어 "유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 성분의 양을 지칭한다. 예를 들어, 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제(GALNS) 활성을 증가시키기 위한 AAV 벡터의 유효량은 글리코사미노글리칸 축적을 감소시키기에 충분한 양이다. 질병 또는 장애를 치료하기 위한 발현 벡터의 "치료적 유효량"은 질병 또는 장애의 신호 및 증상을 감소시키거나 근절하기에 충분한 발현 벡터의 양이다. 주어진 성분의 유효량은 성분의 성질, 투여 경로, 성분을 수용하는 동물의 체격 및 종, 및 성분을 제공하는 목적과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 각각의 개별적인 경우에서 유효량은 당업계에서 확립된 방법에 따라 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
용어 "개체"는 포유류, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 포유류, 더욱 바람직하게는 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 또는 영장류, 추가로 더욱 바람직하게는 인간을 지칭한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 뮤코다당질축적증, 특히 뮤코다당질축적증 IVA형 또는 모르키오 A 증후군의 치료를 위한 새로운 폴리뉴클레오타이드 서열 및 벡터를 제공한다.
그러므로, 제1 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열과 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열(이하 "본 발명의 폴리뉴클레오타이드"로 지칭됨)에 관한 것이며, 상기 서열은 기능적 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제를 인코딩한다.
상기 언급된 바와 같이, MPSIVA는 효소 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제(GALNS)의 활성의 결핍에 의해 야기된다. GALNS는 콘드로이틴-6-설페이트(C6S)의 비환원 단부에서 N-아세틸갈락토사민-6-설페이트의 설페이트 에스테르기 및 케라탄 설페이트(KS)의 비환원 단부에서 갈락토스-6-설페이트의 설페이트 에스테르기를 가수분해하는 리소좀 효소이다. 분해되지 않은 C6S 및 KS가 지속적으로 축적된 결과, 점진적인 세포 손상이 발생하여, 다체계적 질병을 초래한다.
본 발명자들은, 상이한 버전의 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제(GALNS) 발현 카세트를 함유하는 벡터의 생체내 투여가 MPSIVA 동물에서 측정된 수준을 능가하여 GALNS 활성의 실질적인 증가를 초래하였으며, 여기서 상기 GALNS 인코딩 서열은 GALNS 뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 야생형과 75% 내지 90% 동일성을 가짐을 보여주었다. 사실상, 야생형과 75% 내지 90% 동일성을 갖는 서열을 함유하는 발현 벡터로 도달된 인간 GALNS 활성의 수준은 야생형 서열을 함유하는 벡터에 의해 매개되는 수준보다 더 높았다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO: 1로 표시되는 같은 야생형 GALNS를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려하며, 상기 서열은 당업계에 알려진 기능적 인간 GALNS 변이체 및 단편을 인코딩한다. 그러므로, 본 발명은 GALNS의 기능적으로 동등한 변이체를 인코딩하는 DNA를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능적으로 동등한 변이체"는 GALNS의 폴리펩타이드 서열에 의해 인코딩되는 효소와 실질적으로 상동성이고 GALNS의 생물학적 활성을 보존하는 임의의 효소에 관한 것이다. 이러한 기능적으로 동등한 변이체의 서열은 GALNS의 서열로부터 하나 이상의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실에 의해 수득될 수 있고 GALNS의 생물학적 활성을 실질적으로 보존한다. 변이체가 네이티브(native) GALNS의 생물학적 활성을 보존하는지의 여부를 결정하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있고, 본 출원의 실험 부분에 사용된 임의의 검정법을 포함한다. 특히, 본 발명에 의해 포괄되는 GALNS의 기능적으로 동등한 변이체는 GALNS의 기능 중 적어도 하나를 가지며, 예컨대, 예를 들어 글리코사미노글리칸(GAG) 수준, 특히, C6S 및 KS 수준을 정상화시키거나 감소시킨다. 본 발명의 실시예 부문에서, 상기 GAG 수준을 감소시키거나 정상화시키는 기능적 GALNS 효소의 능력을 결정하기에 적합한 방법이 상술된다.
본 발명에 포함된 실시예에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 기능적 GALNS 효소를 인코딩한다. 상기 효소는 WT와 비교한 경우 증강된 활성을 보여준다. 그 결과는 벡터 투여 후 GALNS 활성의 회복을 보여주며, 이는 MPSIVA 동물에서 측정된 수준을 능가하여 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성의 실질적인 증가를 유발하였다. 본 발명에 포함된 실시예에서 나타난 바와 같이, GALNS 활성 수준은 간에서 WT 수준의 1500% 내지 2600% 범위였다.
바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드는, 상기 폴리펩타이드가 상기 언급된 바와 같은 기능에서 능력을 보여주는 경우, 특히 상기 폴리펩타이드가 GALNS 야생형 폴리펩타이드의 능력의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%로, 바람직하게는 GALNS 야생형 폴리펩타이드의 능력의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%로 글리코사미노글리칸 케라탄 설페이트(KS) 및 콘드로이틴-6-설페이트(C6S)를 분해할 수 있는 경우, GALNS 효소의 기능적으로 동등한 변이체인 것으로 간주된다.
GALNS의 기능적으로 동등한 변이체는 네이티브 GALNS와 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드이다. 용어 "실질적으로 상동성인"은, 단백질 서열이 GALNS 야생형 서열에 관하여 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일성 정도를 갖는 경우 상기 단백질 서열에 관한 것이다. 2개의 폴리펩타이드들 사이에서의 동일성 정도는 컴퓨터 알고리즘 및 당업자에게 널리 알려진 방법을 사용하여 결정된다. 2개의 아미노산 서열들 사이에서 동일성은 바람직하게는 BLASTP 알고리즘[BLAST Manual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)]을 사용하여 결정되지만, 다른 유사한 알고리즘이 또한 사용될 수 있다.
GALNS의 기능적으로 동등한 변이체는, GALNS를 생성하기 위해 사용될 숙주 세포에서 코돈 선호도(codon preference)를 고려하여 이의 코딩 폴리뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드를 대체함으로써 수득될 수 있다.
GALNS의 기능적으로 동등한 변이체는, 보존적 아미노산 변화를 만들고 생성된 변이체를 상기 기재된 기능적 검정법 또는 당업계에 알려진 다른 기능적 검정법 중 하나에서 시험함으로써 생성될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호 교환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이며; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 기는, 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 함유된 GALNS 단백질 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 75% 내지 90%의 동일성을 갖는다. 더욱 특정 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 80% 내지 85%의 동일성을 갖는다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 GALNS 단백질은 인간 GALNS(hGALNS) 및 마우스 GALNS(mGALNS), 바람직하게는 인간 GALNS(hGALNS)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 비제한적으로 적절한 전사 조절 서열(즉, 개시, 종결, 프로모터, 및 인핸서), 효율적인 RNA 프로세싱 신호(예를 들어 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호), 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 번역 효율을 증강시키는 서열(즉, 코작 컨센서스(Kozak consensus) 서열), 단백질 안정성을 증강시키는 서열, 및 요망된다면, 인코딩된 생성물의 분비를 증강시키는 서열을 포함하는 발현 제어 서열을 추가로 포함할 수 있다. 다수의 발현 제어 서열은 당업계에 알려져 있고, 본 발명에 따라 이용될 수 있다.
그러므로, 본 발명에 따르면, 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 GALNS를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된(operatively linked) 전사 조절 영역을 가진다. 본 발명의 특정 구현예에서, 상기 전사 조절 영역은 프로모터를 포함한다. 본 발명의 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 영역은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 인핸서를 추가로 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 혼입될 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다. 그러므로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 "본원에서 "본 발명의 벡터"로 지칭되는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 벡터는 플라스미드이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 벡터는 AAV 벡터이고, 상기 AAV 벡터는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스 게놈을 함유한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 맥락에서 개시되는 모든 구현예는 또한 본 발명의 벡터에 적용 가능하다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 AAV ITR의 측면에 존재한다. 더욱 특정 구현예에서, 상기 AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 전사-후 조절 영역을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전사-후 조절 영역"은 카세트 또는 생성된 유전자 생성물에 함유된 서열의 발현, 안정화 또는 국소화를 용이하게 하는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 전사-후 조절 영역은 비제한적으로, 우드척 간염(Woodchuck Hepatitis) 바이러스 전사-후 영역(WPRE)일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "우드척 간염 B 바이러스 조절-후 요소" 또는 "WPRE"는 전사된 경우, 유전자의 발현을 증강시킬 수 있는 3차 구조를 만드는 DNA 서열을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리아데닐화 신호를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리아데닐화 신호"는 mRNA의 3' 말단에 폴리아데닌 꼬리의 부착을 매개하는 핵산 서열에 관한 것이다. 적합한 폴리아데닐화 신호는 비제한적으로, SV40 초기 폴리아데닐화 신호, SV40 후기 폴리아데닐화 신호, HSV 티미딘 키나제 폴리아데닐화 신호, 프로타민 유전자 폴리아데닐화 신호, 아데노바이러스 5 Elb 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 인간 변이체 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호, 토끼 베타-글로빈 폴리 A 신호 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 토끼 베타-글로빈 폴리 A 신호 또는 이의 기능적 변이체 및 단편이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내로 혼입된다. 특정 구현예에서, 상기 벡터는 발현 벡터이다. 특정 구현예에서, 상기 발현 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 상기 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터, hAAT 프로모터 또는 CMV 프로모터로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 프로모터는 hAAT 프로모터이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 GALNS 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 인간 GALNS를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이며, 이 서열은 수탁 번호 NM_000512.4를 갖는 NCBI 데이터베이스의 서열에 상응하고, 더욱 특히 SEQ ID NO: 1이다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 인간 GALNS를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 변이체이다. 보다 구체적으로, 상기 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 75% 내지 90%의 동일성을 가진다. 더욱 특히, 상기 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 80% 내지 85%의 동일성을 가진다. 바람직하게는, 상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
더욱 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 SEQ ID NO: 4로 표시된 수탁 번호 DSM 32792를 갖는 플라스미드 pAAV-CAG-ohGALNS-v1, SEQ ID NO: 6으로 표시된 수탁 번호 DSM 32793를 갖는 플라스미드 pAAV-CAG-ohGALNS-v2, SEQ ID NO: 8로 표시된 수탁 번호 수탁 번호 DSM 32794를 갖는 pAAV-CAG-ohGALNS-v3으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 발현 벡터에 관한 것이다. 더욱 특히, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 AAV 벡터에 관한 것이며, 상기 AAV 벡터는 재조합 바이러스 게놈을 함유하고, 여기서 상기 재조합 바이러스 게놈은 GALNS를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 작동 가능하게 연결된 전사 조절 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명에 따른 AAV는 알려진 AAV 혈청형 중 임의의 혈청형을 포함한다. 일반적으로, 상이한 혈청형의 AAV는 유의한 상동성을 갖는 게놈 서열을 가져서 동일한 시리즈의 유전적 기능을 제공하며, 물리적 및 기능적 관점에서 본질적으로 동등한 비리온을 생성하고, 실제로 동일한 기전을 통해 복제되고 조립된다. 특히, 본 발명의 AAV는 혈청형 1의 AAV(AAV1), AAV2, AAV3(3A형 및 3B형 포함), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 및 임의의 다른 AAV에 속할 수 있다. 상이한 AAV 혈청형의 게놈의 서열의 예는 문헌에서 또는 공개 데이터베이스, 예컨대 GenBank에서 찾을 수 있다. GenBank 수탁 번호 AF028704.1(AAV6), NC006260(AAV7), NC006261(AAV8), 및 AX753250.1(AAV9)을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh10 혈청형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 상기 AAV 벡터는 혈청형 9, AAV9 또는 혈청형 8, AAV8의 것이다.
특정 구현예에서, 상기 AAV 벡터는 인간 또는 뮤린 GALNS 서열을 함유한다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 인간 GALNS를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하며, 이 서열은 수탁 번호 NM_000512.4를 갖는 NCBI 데이터베이스의 서열에 상응하고, 보다 구체적으로, SEQ ID NO: 1이다. 바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 인간 GALNS를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 변이체인 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 더욱 특히, 상기 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 75% 내지 90%의 동일성을 가진다. 더욱 특히, 상기 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 80% 내지 85%의 동일성을 가진다. 바람직하게는, 상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
또 다른 본 발명의 특정 구현예에서, AAV 벡터는 CAG 프로모터에 연결된 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 1을 함유하는 AAV9-CAG-hGALNS, SEQ ID NO: 12이다. 또 다른 구현예에서, AAV 벡터는 CAG 프로모터에 연결된 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 3을 함유하는 AAV9-CAG-ohGALNS-v1, SEQ ID NO: 13이다. 또 다른 구현예에서, AAV는 CAG 프로모터에 연결된 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 5를 함유하는 AAV9-CAG-ohGALNS-v2, SEQ ID NO: 14이다. 또 다른 구현예에서, AAV 벡터는 CAG 프로모터에 연결된 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 7을 함유하는 AAV9-CAG-ohGALNS-v3, SEQ ID NO: 15이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 AAV는 5'으로부터 3' 방향으로 (i) 5' AAV2 ITR, (ii) CMV 즉시-초기 인핸서, (iii) 닭 베타-액틴 프로모터, (iv) 닭 베타-액틴 유전자의 제1 인트론, (v) 토끼 베타-글로빈 유전자로부터의 인트론 2/엑손 3, (vi) GALNS cDNA 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체, (vii) 폴리 A 신호, 예컨대 토끼 베타-글로빈 폴리 A 신호, 및 (viii) 3' AAV2 ITR을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 게놈을 함유한다. 당업자는 벡터 게놈이 다른 서열(예를 들어 상기에서 구체적으로 기재된 서열들 사이의 개재(intervening) 서열)을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 구성요소 (i) 내지 (v)는 당업자에 의해 전형적으로 이해되는 의미를 가진다.
바람직한 구현예에서, 재조합 바이러스 게놈은 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 12를 포함한다. 구체적으로, 5' AAV2 ITR은 SEQ ID NO: 12의 뉴클레오타이드 1-131을 포함하며, CAG 프로모터는 SEQ ID NO: 12의 뉴클레오타이드 185-1707을 포함하며, 인간 GALNS cDNA는 SEQ ID NO: 12의 뉴클레오타이드 1918-3494를 포함하며, 토끼 베타-글로빈 폴리 A 신호는 SEQ ID NO: 12의 뉴클레오타이드 3520-4048을 포함하고, 3' AAV2 ITR은 SEQ ID NO: 12의 뉴클레오타이드 4107-4215를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 바이러스 게놈은 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 13을 포함한다. 구체적으로, 5' AAV2 ITR은 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오타이드 1-131을 포함하며, CAG 프로모터는 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오타이드 185-1707을 포함하며, 인간 GALNS cDNA는 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오타이드 1918-3494를 포함하며, 토끼 베타-글로빈 폴리 A 신호는 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오타이드 3520-4048을 포함하고, 3' AAV2 ITR은 SEQ ID NO: 13의 뉴클레오타이드 4107-4215를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 바이러스 게놈은 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 14를 포함한다. 구체적으로, 5' AAV2 ITR은 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 1-120을 포함하며, CMV 인핸서는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 194-557을 포함하며, 베타-액틴 프로모터는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 558-839를 포함하며, 닭 베타-액틴 유전자의 제1 인트론은 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 840-1804를 포함하며, 토끼 베타-글로빈 유전자로부터의 인트론 2/엑손 3은 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 1805-1906을 포함하며, 인간 GALNS cDNA는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 1934-3592를 포함하며, 토끼 베타-글로빈 폴리 A 신호는 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 3619-4147을 포함하고, 3' AAV2 ITR은 SEQ ID NO: 14의 뉴클레오타이드 4206-4313을 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 바이러스 게놈은 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO: 15를 포함한다. 구체적으로, 5' AAV2 ITR은 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오타이드 1-120을 포함하며, CMV 인핸서는 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오타이드 194-557을 포함하며, 베타-액틴 프로모터는 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오타이드 558-839를 포함하며, 닭 베타-액틴 유전자의 제1 인트론은 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오타이드 840-1804를 포함하며, 토끼 베타-글로빈 유전자로부터의 인트론 2/엑손 3은 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오타이드 1805-1906을 포함하며, 인간 GALNS cDNA는 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오타이드 1934-3592를 포함하며, 토끼 베타-글로빈 폴리 A 신호는 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오타이드 3619-4147을 포함하고, 3' AAV2 ITR은 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오타이드 4206-4313을 포함한다.
변형된 AAV 서열 또한, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 이러한 변형된 서열은 예를 들어, 알려져 있는 임의의 혈청형의 AAV ITR 또는 VP와 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열(예를 들어 약 75% 내지 99% 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 동일성을 갖는 서열)을 포함하고, 상기 구성요소의 기능을 유지시킨다. AAV ITR 또는 VP의 기능을 결정하기 위한 검정법은 당업계에 알려져 있다. 상기 변형된 서열은 야생형 AAV ITR 또는 VP 서열 대신에 사용될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 임의의 혈청형으로부터의 캡시드를 포함한다. 일반적으로, 상이한 AAV 혈청형은 아미노산 및 핵산 수준에서 유의한 상동성의 게놈 서열을 가져서, 동일한 세트의 유전적 기능을 제공하며, 물리적 및 기능적 관점에서 본질적으로 동등한 비리온을 생성하고, 실제로 동일한 기전을 통해 복제되고 조립된다. 특히, 본 발명의 AAV는 혈청형 1의 AAV(AAV1), AAV2, AAV3(3A형 및 3B형 포함), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 및 임의의 다른 AAV에 속할 수 있다. 상이한 AAV 혈청형의 게놈의 서열의 예는 문헌에서 또는 공개 데이터베이스, 예컨대 GenBank에서 찾을 수 있다. GenBank 수탁 번호 AF028704.1(AAV6), NC006260(AAV7), NC006261(AAV8), 및 AX753250.1(AAV9)을 참조한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 아데노-관련 바이러스 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh10 혈청형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 것이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 AAV 벡터는 AAV 혈청형 9, AAV9 또는 AAV 혈청형 8, AAV8의 것이다.
본 발명의 AAV 벡터의 게놈은 rep 및 cap 개방형 리딩 프레임이 결여되어 있다. 이러한 AAV 벡터는 rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 인코딩하고 발현하는 벡터로 형질주입되어 있는 숙주 세포에서만 복제되고 감염성 바이러스 입자로 포장될 수 있으며, 여기서, 숙주 세포는 아데노바이러스로부터의 단백질을 인코딩하고 발현하는 벡터로 형질주입되었다.
본 발명의 약학 조성물
본 발명의 발현 벡터의 폴리뉴클레오타이드는 종래의 방법에 의해 인간 또는 동물 신체에 투여될 수 있으며, 이러한 투여는 약학 조성물에서 이의 제형을 필요로 한다. 그러므로, 제2 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 약학 조성물(이하 "본 발명의 약학 조성물"로서 지칭됨)에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 벡터의 맥락에서 개시된 모든 구현예들은 또한 본 발명의 약학 조성물에 적용 가능하다.
용어 "치료적 유효량"은 요망되는 효과를 발휘하는 것으로 계산되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 AAV 벡터의 양을 지칭하고, 일반적으로 다른 이유들 중에서도, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 AAV 벡터 그 자체의 특질, 및 수득되고자 하는 치료 효과에 의해 결정될 것이다. 그러므로, 질병의 치료에서 효과적일 상기 양은 본원에 기재되어 있거나 다르게는 당업계에 알려진 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 투여 경로에 좌우될 것이다. 초기 용량은 당업계에 잘 알려진 기법을 사용하여 생체내 데이터(예를 들어 동물 모델)로부터 추정될 수 있다. 당업계에서 일상적인 경험을 가진 사람이라면 동물에서의 데이터에 기반하여 인간에게의 투여를 쉽게 최적화할 수 있다.
특정 구현예에서, 제형의 투여량은 바이러스 입자로서 또는 게놈 카피("GC")로서/바이러스 게놈("vg")으로서 측정되거나 계산될 수 있다.
당업계에 알려진 임의의 방법은 본 발명의 바이러스 조성물 밀리리터당 게놈 카피(GC) 수를 결정하는 데 사용될 수 있다. AAV GC 수 적정을 수행하기 위한 하나의 방법은 다음과 같다: 우선 정제된 AAV 벡터 샘플을 DNase로 처리하여 비-캡시드화된 AAV 게놈 DNA 또는 오염성 플라스미드 DNA를 생성 과정으로부터 제거한다. 그 후에, DNase 내성 입자를 열 처리하여, 캡시드로부터 게놈을 방출시킨다. 그 후에, 방출된 게놈을, 바이러스 게놈의 특정 영역을 표적화하는 프라미어/프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 정량화한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체," "약학적으로 허용 가능한 희석제," "약학적으로 허용 가능한 부형제", 또는 "약학적으로 허용 가능한 비히클"은 임의의 통상적인 유형의 무독성 고체, 반고체, 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질, 또는 제형 보조제를 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 이용되는 투여량 및 농도에서 수혜자에게 본질적으로 무독성이고, 제형의 다른 성분과 융화성이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 수 및 성질은 요망되는 투여 형태에 좌우된다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 알려져 있고, 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다.
약학 조성물은 인간에게 정맥내, 피하, 근육내, 뇌척수액내(CSF), 예를 들어 수조내(intracisternal) 또는 뇌실내(intra-cerebroventricular) 투여용으로 적응된 약학 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약학 조성물은 정맥내 또는 뇌척수액내(CSF) 투여를 위한 것이다. 더욱 바람직하게는, 약학 조성물은 정맥내 투여를 위한 것이다.
AAV 벡터는 주사에 의한(예를 들어 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입에 의한) 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가되는 보존제와 함께 단위 투약 형태(예를 들어 앰플에서 또는 단일-용량 또는 다중-용량 용기에서)로 제시될 수 있다. 바이러스 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화 제제, 예컨대 현탁, 안정화 또는 분산 제제를 함유할 수 있다. AAV 제형의 액체 조제물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예컨대 현탁제(예를 들어 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방), 유화제(예를 들어 레시틴 또는 아카시아), 비-수성 비히클(예를 들어 아몬드 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획화된 식물성 오일), 및 보존제(예를 들어 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 조제물은 또한, 완충염을 함유할 수 있다. 대안적으로, 조성물은 사용 전에 적합한 비히클(예를 들어 멸균 발열원-무함유 수(water))을 이용하여 구성되기 위한 분말 형태로 존재할 수 있다. 필요한 경우, 조성물은 또한, 주사 부위에서 통증을 완화하기 위해 리도카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 조성물을 침윤에 의해 투여하고자 하는 경우, 상기 조성물은 약학 품질의 물 또는 식염수 용액을 함유하는 침윤 병(infiltration bottle)에 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사 또는 멸균 식염수 용액용의 워터 바이얼이 제공될 수 있어서, 성분들은 투여 전에 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수 용액 및 세정제, 예컨대 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, Pluronic F68®이다.
본 발명의 조성물은 수의학 목적의 동물(예를 들어 가축(소, 돼지, 기타)), 및 다른 비-인간 포유류 대상체, 뿐만 아니라 인간 대상체에게 전달되도록 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유전자 도입 및 유전자 치료법 적용에 사용하기 위해 생리학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 AAV 벡터와 조합된 또는 이들과 혼합된 아쥬반트의 용도가 포괄된다. 고려되는 아쥬반트는 미네랄 염 아쥬반트 또는 미네랄 염 겔 아쥬반트, 미립자 아쥬반트, 미세미립자 아쥬반트, 점막 아쥬반트를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
아쥬반트는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 AAV 벡터와의 혼합물로서 대상체에게 투여되거나 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 약학 조성물은 세포가 형질도입되어야 하는 조직 또는 기관 근처에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 전신적으로 투여된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "전신적으로 투여되는" 및 "전신 투여"는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터, AAV 벡터 또는 조성물이 대상체에게 비-국소화된 방식으로 투여될 수 있음을 의미한다. 전신 투여는 대상체의 신체 전반에 걸쳐 여러 기관 또는 조직에 도달할 수 있거나, 대상체의 특정 기관 또는 조직에 도달할 수 있다. 예를 들어, 정맥내 투여는 대상체에서 하나 초과의 조직 또는 기관의 형질도입을 초래할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 본 발명의 특정 구현예에서, 치료 효과를 달성하기 위해 다중 용량(예를 들어 2, 3, 4 이상의 투여)이 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 단일 용량으로 투여되며, 즉, 상기 약학 조성물은 평생 1회만 투여된다.
그러므로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 의약에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 뮤코다당질축적증 IVA형 또는 모르키오 A 증후군의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, 상이한 버전의 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 발현 카세트를 함유하는 AAV 벡터는 2월령의 MPSIVA-유병(affected) 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 전달되었다. GALNS 활성 분석은, 모든 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제-함유 벡터에 의한 형질도입이 MPSIVA 동물에서 측정된 수준을 능가하여 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성의 실질적인 증가를 초래하였음을 보여주었다.
그러므로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성을 증가시키기 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터 또는 본 발명에 따른 약학 조성물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 뮤코다당질축적증 IVA형의 치료 및/또는 예방 방법을 이를 필요로 하는 대상체에서 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 약학 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다," "예방하는," 및 "예방"은 대상체에서 질병의 시작(inception)을 저해하거나 질병의 발생률을 저하시키는 것을 지칭한다. 예방은 완전적(예를 들어 대상체에서 병리학적 세포의 완전한 부재) 또는 부분적일 수 있다. 예방은 또한, 임상 질환에 대한 민감성 감소를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 질병의 임상 징후가 나타난 후 상기 질병의 진행을 제어하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터, AAV 벡터 또는 약학 조성물의 투여를 지칭한다. 질병 진행의 제어는 증상의 감소, 질병 기간의 감소, 병리학적 상태의 안정화(구체적으로는 추가 악화를 피하기 위해), 질병 진행의 지연, 병리학적 상태의 향상, 및 관해(부분 관해 및 완전 관해)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 유익한 또는 요망되는 임상 결과의 달성을 의미하는 것으로 이해된다. 질병 진행의 제어는 또한, 치료가 적용되지 않는 경우의 예상된 생존율과 비교하여 생존율의 연장을 수반한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 개체 또는 동물, 예컨대 인간, 비-인간 영장류(예를 들어 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종), 가축(예를 들어 조류, 어류, 소, 양, 돼지, 염소 및 말), 애완용 포유류(예를 들어 개 및 고양이), 또는 실험 동물(예를 들어 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니피그)을 지칭한다. 상기 용어는 임의의 연령 또는 성별의 대상체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 포유류, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 AAV를 수득하는 방법
본 발명은 또한, 본 발명의 AAV 벡터를 수득하는 방법에 관한 것이다. 상기 AAV 벡터는 Rep 및 Cap 단백질을 구성적으로 발현하는 세포 내로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 도입함으로써 수득될 수 있으며, 여기서 Rep 및 Cap 코딩 서열은 플라스미드 또는 벡터에 제공된다.
그러므로, 또 다른 양태에서, 본 발명은 AAV 벡터를 수득하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
(i) 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, AAV cap 단백질, AAV rep 단백질, 및 선택적으로, AAV가 복제를 위해 의존하는 바이러스 단백질을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
(ii) 상기 세포를 AAV의 조립에 적절한 조건 하에 유지시키는 단계, 및
(iii) 상기 세포에 의해 생성되는 아데노-관련 바이러스 벡터를 정제하는 단계
를 포함한다.
AAV 벡터를 생성할 수 있는 임의의 세포가 본 발명에 사용될 수 있다.
이 방법에 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 이전에 기재되었다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 맥락에서 개시된 임의의 구현예는 본 발명의 AAV를 수득하는 방법의 맥락에 적용 가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "cap 단백질"은 네이티브 AAV cap 단백질(예를 들어 VPl, VP2 및 VP3)의 적어도 하나의 기능적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. cap 단백질의 기능적 활성의 예는 캡시드의 형성을 유도하며, 단일 가닥 DNA의 축적을 용이하게 하며, 캡시드 내로의 AAV DNA 포장(즉, 캡시드화)을 용이하게 하며, 세포성 수용체에 결합하고, 숙주 세포 내로의 비리온의 진입을 용이하게 하는 능력을 포함한다. 원칙적으로, 임의의 cap 단백질은 본 발명의 맥락에 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, cap 단백질은 AAV8 또는 AAV9로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "캡시드"는 바이러스 게놈이 포장되는 구조물을 지칭한다. 캡시드는 단백질의 여러 올리고머성 구조적 하위단위로 구성된다. 예를 들어, AAV는 3개의 캡시드 단백질: VP1, VP2 및 VP3의 상호작용에 의해 형성되는 정20면체 캡시드를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "rep 단백질"은 네이티브 AAV rep 단백질의 적어도 하나의 기능적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. rep 단백질의 "기능적 활성"은 DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 니킹을 통한 DNA의 복제의 촉진뿐만 아니라 DNA 헬리카제(helicase) 활성을 포함하는 단백질의 생리학적 기능과 관련된 임의의 활성이다. 추가 기능은 AAV(또는 다른 이종성) 프로모터로부터의 전사 및 숙주 염색체 내로의 AAV DNA의 부위-특이적 통합의 조절을 포함한다. 특정 구현예에서, AAV rep 유전자는 혈청형 AAV2로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "AAV가 복제를 위해 의존하는 바이러스 단백질"은 AAV가 복제를 위해 의존하는 기능("즉, "헬퍼 기능")을 수행하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 상기 헬퍼 기능은 비제한적으로, AAV 유전자 전사, 단계(stage) 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 단백질의 합성, 및 AAV 캡시드 조립의 활성화에 필요한 기능들을 포함한다. 바이러스-기반 부속 기능은 임의의 유형의 알려진 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순 포진 바이러스 1형 이외의 헤르페스바이러스), 및 백시나 바이러스로부터 유래될 수 있다. 헬퍼 기능은 비제한적으로, 아데노바이러스 El, E2a, VA 및 E4, 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52 및 UL29, 및 헤르페스바이러스 폴리머라제를 포함한다.
헬퍼 기능을 제공하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 유전자 AAV rep, AAV cap 및 유전자는 상기 유전자를 예를 들어 플라스미드와 같은 벡터 내로 혼입하고 상기 벡터를 세포 내로 도입함으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자는 동일한 플라스미드 내로 또는 상이한 플라스미드 내로 혼입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 하나의 플라스미드에 혼입되며, AAV rep 및 cap 유전자는 또 다른 플라스미드 내로 혼입되고, 헬퍼 기능을 제공하는 유전자는 또 다른 플라스미드 내로 혼입된다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 AAV rep 및 cap 유전자 또는 헬퍼 기능을 제공하는 유전자를 함유하는 플라스미드는 당업계에 잘 알려진 임의의 적합한 방법을 사용함으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 형질주입 방법의 예는 칼슘 포스페이트를 이용한 공동-침전, DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 전기천공, 미세주사, 리포솜-매개 융합, 리포펙션, 레트로바이러스 감염 및 바이오리스틱(biolistic) 형질주입을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 형질주입은 칼슘 포스페이트를 이용한 공동-침전에 의해 수행된다. 세포가 AAV rep 및 cap 유전자 및 아데노바이러스 헬퍼 기능을 제공하는 유전자 중 임의의 유전자의 발현이 결여되어 있는 경우, 상기 유전자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 동시에 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 상기 유전자는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 도입 전에 또는 도입 후에 세포에 도입될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포는 3개의 플라스미드, i) 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드, ii) AAV rep 및 cap 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 iii) 헬퍼 기능을 제공하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 동시에 형질주입된다.
본 발명의 방법의 단계 (ii)는 AAV의 조립에 적절한 조건 하에 세포를 유지시키는 단계를 수반한다.
세포 배양 방법 및 AAV 벡터 입자의 방출, 예컨대 세포의 용해를 촉진하는 예시적인 조건은 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 생성자 세포는 AAV의 조립 및 배지 내로의 바이러스 벡터의 방출을 촉진하기 위해 적합한 시간 기간 동안 성장된다. 일반적으로, 배양 시간은 바이러스 생성 시점으로부터 측정된다. 예를 들어, AAV의 경우, 바이러스 생성은 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 적절한 생성자 세포에서 헬퍼 바이러스 기능을 공급할 때 시작된다.
본 발명의 방법의 단계 (iii)은 세포에 의해 생성된 AAV 벡터를 정제하는 단계를 수반한다.
상기 세포 또는 상기 배양 배지로부터 AAV를 정제하는 임의의 방법은 본 발명의 AAV를 수득하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 AAV는 폴리에틸렌 글리콜 침전 단계 및 2개의 연속적인 세슘 클로라이드(CsCl) 구배를 기반으로 하는 최적화된 방법에 따라 정제된다.
AAV의 생성에 사용하기에 적합한, 다양한 천연 발생 AAV 및 조작된 AAV, 이들의 인코딩 핵산, AAV cap 및 rep 단백질, 뿐만 아니라 이러한 AAV, 특히 이들의 캡시드를 단리하거나 생성시키며, 증식시키고 정제하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
나아가, 본 발명은 GALNS 단백질 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체를 인코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 세포를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 AAV 벡터 및 본 발명의 약학 조성물의 맥락에서 개시된 모든 구현예들은 본 발명의 치료 방법에 적용 가능하다.
일반적인 절차
1. 재조합 AAV 벡터
본원에 기재된 AAV 벡터는 삼중 형질주입에 의해 수득되었다. 벡터를 만드는 데 필요한 물질은 HEK293 세포(아데노바이러스 E1 유전자를 발현함), 아데노바이러스 기능을 제공하는 헬퍼 플라스미드, 혈청형 2로부터의 AAV rep 유전자 및 혈청형 8 또는 9(AAV8 또는 AAV9)로부터의 cap 유전자를 제공하는 플라스미드, 및 마지막으로 AAV2 ITR 및 관심 작제물을 갖는 백본 플라스미드였다.
갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제-발현 AAV 벡터를 생성시키기 위해, 인간 또는 뮤린 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제의 최적화된 코딩 서열 또는 비-최적화된 코딩 서열은 유비쿼터스 하이브리드 CAG 프로모터 또는 간-특이적 hAAT 프로모터의 제어 하에 AAV 백본 플라스미드 내로 클로닝되었다. 플라스미드의 대규모 생성은 EndoFree Plasmid Megaprep Kit(Qiagen)를 사용하여 수행되었다.
벡터는 변형을 갖는 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스-무함유 형질주입에 의해 생성되었다(Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). 세포는 롤러 병(RB: roller bottle)(Corning, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내의 10% FBS가 보충된 DMEM에서 70% 존재비(confluence)까지 배양된 다음, 1) 혈청형 2 AAV의 바이러스 ITR의 측면에 존재하는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드(상기 기재됨); 2) AAV rep2 및 cap8 또는 cap9 유전자를 운반하는 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드로 공동-형질주입되었다. 벡터는 이전에 기재된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제되었다(Ayuso et al., 2010). 벡터는 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석되며, 여과되며, qPCR에 의해 적정되고, 사용 시까지 -80℃에 보관되었다.
본 발명의 벡터는 당업계에 잘 알려진 분자생물학 기법에 따라 작제되었다.
2. 시험관내 형질주입 연구
HEK293 세포는 Lipofectamine® 2000(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 미국 캘리포니아 소재)을 제조업체의 설명에 따라 사용하여 4 ug의 pAAV-CAG-omGALNS, pAAV-hAAT-omGALNS, pAAV-CAG-hGALNS, pAAV-CAG-ohGALNS-v1, pAAV-CAG-ohGALNS-v2 또는 pAAV-CAG-ohGALNS-v3으로 형질주입되었다. 48시간 후, 세포 및 배양 배지는 수합되고, 단백질 추출을 위해 가공되었다.
단백질 추출물은 250 ul의 Mili-Q 수(water)에서 세포의 초음파처리에 의해 수득되고, 단백질 함량은 브래드포드 단백질 검정법(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)을 사용하여 정량화되었다. 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성은 1 ug의 세포 단백질 추출물 및 5 ul의 배양 배지에서 결정되었고, 이전에 기재된 바와 같이(van Diggelen et al., 1990) 4-메틸엄벨리페론-유래 형광원성(fluorogenic) 기질(Toronto Rerearch Chemicals Inc, 캐나다 온타리오 소재)을 이용하여 각각 단백질의 총 양 및 부피에 의해 정규화되었다.
3. 동물
국제 마우스 표현형 컨소시엄(IMPC, www.mousephenotype.org)를 통해 입수 가능한 Galns 유전자에서 리포터(LacZ) 유전자 태깅 삽입물을 운반하는 C57BL/6N-A/a 배아 줄기세포가 수득되었다. 클론은 바르셀로나 자치 대학교(UAB: Universitat Autonoma de Barcelona)의 동물 생명공학 및 유전자 치료법 센터의 유전자이식 동물 유닛(CBATEG)에서 C57BL/6JOlaHsd 배반포에 미세주사되고, 생성된 수컷 키메라는 C57Bl/6NTac 암컷과 함께 사육되어, Galns 넉-아웃 자손(MPSIVA 또는 Galns -/- 마우스)을 생성시켰다. 유전자형은, 꼬리-집게 샘플로부터의 게놈 DNA 상에서 표적화된 돌연변이를 포괄하는 서열을 증폭시키는 PCR 분석에 의해 결정되었다. 각각의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머의 서열은 다음과 같았다: 센스 프라이머: 5' CCA GGG AAT GTC CCA CCT ATT T 3'(SEQ ID NO: 20); 안티센스 프라이머: 5' GTC AGG TTG ACA CGA AGC TG 3'(SEQ ID NO: 21); 및 안티센스 프라이머 KO: 5' GGA ACT TCG GTT CCG GCG 3'(SEQ ID NO: 22). 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머는 WT 마우스의 유전자형 분석을 가능하게 한다. 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머 KO은 Galns -/- 마우스의 유전자형 분석을 가능하게 한다.
마우스는 표준 식이요법을 자유롭게 공급받았고(Harlan, Tekland), 12시간의 명암 주기(오전 9시에 라이트를 컴) 하에 유지되었다.
GALNS 활성의 결여로 인해 이들 동물은 1월령만큼 초기에, 대퇴골 및 경골로부터의 성장판의 상이한 영역에서 글리코사미노글리칸(GAG)의 축적 및 리소좀 구획의 확대를 포함한 MPSIVA 질병의 특징인 여러 병리학적 특질을 보여준다. 더욱이, 많은 이들 병리학적 발견은 동물이 노령화됨에 따라 악화되며, 이는 노령 동물에서의 병태의 악화를 시사한다. 마찬가지로, 동물이 노화됨에 따라 간, 심장 및 비장과 같은 말초 기관에서 GAG 축적이 또한 관찰된다. 그러나, Galns-/- 한배새끼(littermate)와 WT 한배새끼 사이의 수명에는 유의한 차이가 관찰되지 않는다.
4. 마우스로의 벡터 투여
AAV8-hAAT-omGALNS 벡터의 정맥내 벡터 전달을 위해, 총 1x1011 vg 용량을 3-4주령의 Galns -/- 동물의 꼬리 정맥을 통해 총 200 ul 부피로 마우스에게 주사하였다. 유사한 동물 코호트에게 1 × 1011 vg 대조군 비-코딩(AAV8-hAAT-null) 벡터가 주사되었다.
마우스로의 AAV8-CAG-omGALNS 벡터의 정맥내 벡터 전달을 위해, 총 1 × 1012 vg 용량을 3-4주령의 Galns -/- 동물의 꼬리 정맥을 통해 총 200 ul 부피로 마우스에게 주사하였다. 유사한 동물 코호트에게 1 × 1012 vg 대조군 비-코딩(AAV8-CGA-null) 벡터가 주사되었다.
마우스로의 AAV9-CAG-omGALNS 벡터의 정맥내 벡터 전달을 위해, 총 1 × 1012 vg 용량을 3-4주령의 Galns -/- 동물의 꼬리 정맥을 통해 총 200 ul 부피로 마우스에게 주사하였다. 유사한 동물 코호트에게 1 × 1012 vg 대조군 비-코딩(AAV9-CAG-null) 벡터가 주사되었다.
7월령에서, 벡터 투여 후 6개월차에, 마우스는 희생되었고 조직이 수합되었다.
정맥내 벡터 전달을 위해, 상이한 버전의 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 코딩 서열을 갖는 AAV9 벡터의 벡터 게놈 5 × 1010을 2월령의 Galns -/- 동물의 꼬리 정맥 주사를 통해 총 200 ul 부피로 마우스에게 전달하였다. WT 및 비-치료 Galns -/- 동물은 대조군으로서 사용되었다.
2.5월령에서, 벡터 투여 후 15일차에, 마우스는 희생되었고 조직이 수합되었다.
5. 샘플 수집
희생 시, 동물을 깊이 마취시킨 다음, 50 ml의 PBS로 경심 관류하여 조직으로부터 혈액을 완전히 제거하였다. 전체 뇌 및 다수의 체성 조직(간, 비장, 신장, 폐, 심장, 지방 조직, 눈, 눈물샘 및 뼈 포함)이 수집되고, 액체 질소에서 동결되며 -80℃에서 보관되거나 후속적인 조직학적 분석을 위해 포르말린에 침지되었다.
6. 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성 및 글리코사미노글리칸 정량화
간 및 지방 조직 샘플은 Mili-Q 수에서 초음파처리되고, 대퇴골 샘플은 25 mmol/l Tris-HCl, pH 7.2, 및 1 mmol/l 페닐메틸설포닐 플루오라이드로 구성된 균질화 완충액에서 균질화되었다. 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성은 이전에 기재된 바와 같이(van Diggelen et al., 1990) 4-메틸엄벨리페론-유래 형광원성 기질(Toronto Rerearch Chemicals Inc, 캐나다 온타리오 소재)을 이용하여 결정되었다. 간, 지방 조직 및 대퇴골 GALNS 활성 수준은 단백질의 총 양에 대해 정규화되고, 브래드포드 단백질 검정법(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 에르쿨레스 소재)을 사용하여 정량화되었다.
GAG 정량화를 위해, 조직 샘플을 칭량한 다음, 프로테이나제 K에 의해 분해하고, 추출물을 원심분리 및 여과에 의해 정제하였다. GAG 수준은 조직 추출물 및 혈청에서 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS/MS)에 의해 결정되었다. GAG의 수준은 습식 조직 중량으로 또는 분해된 샘플의 총 부피로 정규화되었다.
7. 조직학적 분석
조직을 포르말린에 12시간 내지 24시간 동안 고정하고, 파라핀에 포매하고, 절편화하였다.
각막 상피에서 GAG 저장 검출을 위해, 파라핀 절편에 모리 콜로이드 염색을 적용하였으며, 이 염색은 GAG를 청색으로 드러낸다. 눈물샘 및 경골 골단 성장판에서 GAG 저장 검출을 위해, 수지 절편에 톨루이딘 블루 염색을 적용하였으며, 이 염색은 GAG 저장을 백색으로 드러낸다.
NIS Elements Advanced Research 2.20 소프트웨어는, 모든 동물에 대해 동일한 신호 역치 설정을 사용하여 동물당 각각의 눈의 15개 내지 20개 이미지(원래의 배율, x40)에서 GAG+ 면적의 %를 정량화하는 데 사용되었다. 그 후에, 양성 면적, 즉, 이미지로부터 관심 영역 중 총 조직 면적에 걸친 양성 신호를 갖는 면적, 픽셀의 백분율이 계산되었다.
8. 투과 전자 현미경 분석
마우스를 과다용량의 이소플루란(Isoflo, Labs. Esteve, 스페인 바르셀로나 소재)으로 희생시키고, 하대정맥을 통해 1 ml의 2.5% 글루타르알데하이드 및 2% 파라포름알데하이드로 관류시켰다. 작은 비율(대략 1 mm3)의 치아 이랑 및 편도체를 절편화하고, 동일한 고정액에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 냉각 카코딜레이트(cacodylate) 완충액으로 세척한 후, 표본을 1% 오스뮴 테트록사이드에 후-고정(post-fix)하고, 수성 우라닐 아세테이트로 염색한 다음, 등급화된 에탄올 시리즈를 통해 탈수하고, 에폭시 수지에 포매하였다. 수지 블록으로부터의 초박(ultrathin) 절편(600 Å 내지 800 Å)을 납 시트레이트를 사용하여 염색하고, 투과 전자 현미경(H-7000; Hitachi, 일본 도쿄 소재)으로 검사하였다.
9. 통계학적 분석
모든 결과들은 평균 ± SEM으로 표현된다. 통계학적 비교는 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었다. 대조군과 치료군 사이의 다중 비교는 던넷 포스트-검정(Dunnett's post-test)을 사용하여 이루어졌고, 모든 그룹들 사이에서 터키 포스트-검정(Tukey's post-test)을 사용하여 이루어졌다. P가 0.05 미만인 경우 통계학적 유의성이 고려되었다.
실시예
실시예 1: pAAV-CAG-hGALNS의 작제
인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제에 대한 CDS(NCBI 기준 서열: NM_000512.4)를 출발 물질로서 사용하고, 이 목적을 위해 화학적으로 합성하였다(GeneArt; Life Technologies). CDS SEQ ID NO: 1은 5' 및 3'에서 각각 MluI 및 EcoRI 제한 부위들의 측면에 존재하는 플라스미드 pMK-RQ(KanR) 내로 클로닝되어 수령되었다.
MluI/EcoRI 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 CDS 단편을 pMK-RQ 플라스미드로부터 절개하고, 후속적으로 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 제한 부위와 EcoRI 제한 부위 사이에서 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-hGALNS(수탁 번호 DSM 32791)로 명명하였다. 도 1a 및 SEQ ID NO: 2를 참조한다.
본원에 사용된 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG는 이전에 생성되었었고, AAV2 게놈으로부터의 ITR, CAG 프로모터, 및 토끼 β-글로빈으로부터의 폴리A 신호, 뿐만 아니라 관심 CDR의 클로닝을 위한 다중클로닝 부위를 함유하였다. CAG 프로모터는 CMV 초기/중기 인핸서 및 닭 β-액틴 프로모터로 이루어진 하이브리드 프로모터이다. 이 프로모터는 강력한 발현을 유비쿼터스하게 이끌어 낼 수 있다.
실시예 2: pAAV-CAG-ohGALNS-v1의 작제
최적화된 버전의 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 cDNA 서열(ohGALNS)을 포함하는 발현 카세트를 디자인하고, 수득하였다. 증가된 RNA 안정성을 위해 크립틱 스플라이스(cryptic splice) 부위 및 RNA 불안정화 서열 요소의 제거, RNA 안정화 서열 요소의 첨가, 코돈 최적화 및 G/C 함량 적응, 다른 변화들 중에서도 안정한 RNA 2차 구조의 회피를 통해 인간에서 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 단백질 생성의 효율을 최대화하기 위해 서열 최적화를 수행하였다. 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제에 대한 CDS(NCBI 기준 서열: NM_000512.4)를 서열 최적화를 위한 출발점으로서 사용하였다.
최적화된 CDS SEQ ID NO: 3(GeneArt; Life Technologies)은 5' 및 3'에서 각각 MluI 및 EcoRI 제한 부위들의 측면에 존재하는 플라스미드 pMK-RQ(KanR) 내로 클로닝되어 수령되었다.
MluI/EcoRI 최적화된 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 CDS 단편을 pMK-RQ 플라스미드로부터 절개하고, 후속적으로 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 제한 부위와 EcoRI 제한 부위 사이에서 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-ohGALNS-v1(수탁 번호 DSM 32792)로 명명하였다. 도 2a 및 SEQ ID NO: 4를 참조한다.
실시예 3: pAAV-CAG-ohGALNS-v2의 작제
인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제에 대한 CDS(NCBI 기준 서열: NM_000512.4)를 서열 최적화(GenSript, Inc)시켰다. 최적화된 CDS SEQ ID NO: 5는 5' 및 3'에서 각각 MluI 및 EcoRI 제한 부위들의 측면에 존재하는 플라스미드 pUC57(AmpR) 내로 클로닝되어 수령되었다.
MluI/EcoRI 최적화된 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 CDS 단편을 pUC57 플라스미드로부터 절개하고, 후속적으로 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 제한 부위와 EcoRI 제한 부위 사이에서 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-ohGALNS-v2(수탁 번호 DSM 32793)로 명명하였다. 도 3a 및 SEQ ID NO: 6을 참조한다.
실시예 4: pAAV-CAG-ohGALNS-v3의 작제
인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제에 대한 CDS(NCBI 기준 서열: NM_000512.4)를 서열 최적화(DNA 2.0 Inc)시켰다. 최적화된 CDS SEQ ID NO: 7은 5' 및 3'에서 각각 MluI 및 EcoRI 제한 부위들의 측면에 존재하는 플라스미드 pj201(KanR) 내로 클로닝되어 수령되었다.
MluI/EcoRI 최적화된 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 CDS 단편을 pj201 플라스미드로부터 절개하고, 후속적으로 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 제한 부위와 EcoRI 제한 부위 사이에서 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-ohGALNS-v3(수탁 번호 DSM 32794)로 명명하였다. 도 4a 및 SEQ ID NO: 8을 참조한다.
실시예 5: pAAV-CAG-omGALNS의 작제
뮤린 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제에 대한 CDS(NCBI 기준 서열: NM_016722.4)를 서열 최적화(GeneArt; Life Technologies)시켰다. 최적화된 CDS SEQ ID NO: 9는 5' 및 3'에서 각각 MluI 및 EcoRI 제한 부위들의 측면에 존재하는 플라스미드 pMA-RQ-Bb(AmpR) 내로 클로닝되어 수령되었다.
MluI/EcoRI 최적화된 뮤린 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 CDS 단편을 pMA-RQ-Bb 플라스미드로부터 절개하고, 후속적으로 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG의 MluI 제한 부위와 EcoRI 제한 부위 사이에서 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-CAG-omGALNS로 명명하였다. 도 5a 및 SEQ ID NO: 10을 참조한다.
실시예 6: pAAV-hAAT-omGALNS의 작제
뮤린 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제에 대한 CDS(NCBI 기준 서열: NM_016722.4)를 SEQ ID NO: 9로 서열 최적화(GeneArt; Life Technologies)시켰다.
hAAT 프로모터(SEQ ID NO: 19)는 5' 및 3'에서 각각 BglII 및 MluI 제한 부위들의 측면에 존재하는 플라스미드 pGG2-hAAT(AmpR) 내로 클로닝되어 수령되었다.
CAG 프로모터(SEQ ID NO: 18)를 pAAV-CAG-omGALNS 플라스미드로부터 절개하고, 후속적으로 hAAT 프로모터에 의해 대체하였다. 생성된 플라스미드를 pAAV-hAAT-omGALNS로 명명하였다. 도 6a 및 SEQ ID NO: 11을 참조한다.
hAAT 프로모터는 인간 α1-항트립신 프로모터 및 아포지질단백질 E로부터의 간세포 제어 영역(HCR) 인핸서의 3개 카피로 이루어진 하이브리드 프로모터이다. 이 프로모터는 강력한 간-특이적 발현을 이끌어 낼 수 있다.
실시예 7: AAV9-CAG-hGALNS의 생성
변형을 갖는 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스-무함유 형질주입에 의해 벡터 AAV9-CAG-hGALNS(SEQ ID NO: 12)를 생성시켰다(Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). 세포를 롤러 병(RB)(Corning, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내의 10% FBS가 보충된 DMEM에서 70% 존재비까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 존재하는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드(pAAV-CAG-hGALNS; SEQ ID NO: 2); 2) AAV rep 및 AAV9 cap 유전자를 운반하는 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드로 공동-형질주입시켰다. 벡터를 이전에 기재된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다(Ayuso et al., 2010). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하며, 여과하며, qPCR에 의해 적정하고, 사용 시까지 -80℃에 보관하였다. 도 1b를 참조한다.
실시예 8: AV9-CAG-ohGALNS-v1의 생성
변형을 갖는 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스-무함유 형질주입에 의해 벡터 AAV9-CAG-ohGALNS-v1(SEQ ID NO: 13)을 생성시켰다(Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). 세포를 롤러 병(RB)(Corning, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내의 10% FBS가 보충된 DMEM에서 70% 존재비까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 존재하는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드(pAAV-CAG-ohGALNS-v1; SEQ ID NO: 4); 2) AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자를 운반하는 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드로 공동-형질주입시켰다. 벡터를 이전에 기재된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다(Ayuso et al., 2010). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하며, 여과하며, qPCR에 의해 적정하고, 사용 시까지 -80℃에 보관하였다. 도 2b를 참조한다.
실시예 9: AAV9-CAG-ohGALNS-v2의 생성
변형을 갖는 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스-무함유 형질주입에 의해 벡터 AAV9-CAG-ohGALNS-v2(SEQ ID NO: 14)를 생성시켰다(Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). 세포를 롤러 병(RB)(Corning, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내의 10% FBS가 보충된 DMEM에서 70% 존재비까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 존재하는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드(pAAV-CAG-ohGALNS-v2; SEQ ID NO: 6); 2) AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자를 운반하는 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드로 공동-형질주입시켰다. 벡터를 이전에 기재된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다(Ayuso et al., 2010). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하며, 여과하며, qPCR에 의해 적정하고, 사용 시까지 -80℃에 보관하였다. 도 3b를 참조한다.
실시예 10: AAV9-CAG-ohGALNS-v3의 생성
변형을 갖는 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스-무함유 형질주입에 의해 벡터 AAV9-CAG-ohGALNS-v3(SEQ ID NO: 15)을 생성시켰다(Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005). 세포를 롤러 병(RB)(Corning, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내의 10% FBS가 보충된 DMEM에서 70% 존재비까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 존재하는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드(pAAV-CAG-ohGALNS-v3; SEQ ID NO: 7); 2) AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자를 운반하는 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드로 공동-형질주입시켰다. 벡터를 이전에 기재된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다(Ayuso et al., 2010). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하며, 여과하며, qPCR에 의해 적정하고, 사용 시까지 -80℃에 보관하였다. 도 4b를 참조한다.
실시예 11: AAV9-CAG-omGALNS의 생성
변형을 갖는 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스-무함유 형질주입에 의해 벡터 AAV9-CAG-omGALNS(SEQ ID NO: 16)를 생성시켰다. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005)를 참조한다. 세포를 롤러 병(RB)(Corning, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내의 10% FBS가 보충된 DMEM에서 70% 존재비까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 존재하는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드(pAAV-CAG-omGALNS; SEQ ID NO: 10); 2) AAV2 rep 및 AAV9 cap 유전자를 운반하는 플라스미드(pREP2CAP9); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드로 공동-형질주입시켰다. 벡터를 이전에 기재된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다(Ayuso et al., 2010). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하며, 여과하며, qPCR에 의해 적정하고, 사용 시까지 -80℃에 보관하였다. 도 5b 및 SEQ ID NO: 16을 참조한다.
실시예 12: AAV8-CAG-omGALNS의 생성
변형을 갖는 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스-무함유 형질주입에 의해 벡터 AAV8-CAG-omGALNS(SEQ ID NO: 16)를 생성시켰다. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005)를 참조한다. 세포를 롤러 병(RB)(Corning, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내의 10% FBS가 보충된 DMEM에서 70% 존재비까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 존재하는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드(pAAV-CAG-omGALNS; SEQ ID NO: 10); 2) AAV2 rep 및 AAV8 cap 유전자를 운반하는 플라스미드(pREP2CAP8); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드로 공동-형질주입시켰다. 벡터를 이전에 기재된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다(Ayuso et al., 2010). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하며, 여과하며, qPCR에 의해 적정하고, 사용 시까지 -80℃에 보관하였다. 도 5b 및 SEQ ID NO: 16을 참조한다.
실시예 13: AAV8-hAAT-omGALNS의 생성
변형을 갖는 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 헬퍼 바이러스-무함유 형질주입에 의해 벡터 AAV8-hAAT-omGALNS(SEQ ID NO: 17)를 생성시켰다. (Matsushita et al., 1998; Wright et al., 2005)를 참조한다. 세포를 롤러 병(RB)(Corning, 미국 뉴욕주 코닝 소재) 내의 10% FBS가 보충된 DMEM에서 70% 존재비까지 배양한 다음, 1) AAV2 ITR의 측면에 존재하는 발현 카세트를 운반하는 플라스미드(pAAV-hAAT-omGALNS; SEQ ID NO: 11); 2) AAV2 rep 및 AAV8 cap 유전자를 운반하는 플라스미드(pREP2CAP8); 및 3) 아데노바이러스 헬퍼 기능을 운반하는 플라스미드로 공동-형질주입시켰다. 벡터를 이전에 기재된 바와 같은 최적화된 프로토콜을 사용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제하였다(Ayuso et al., 2010). 벡터를 PBS + 0.001% Pluronic® F68에 대해 투석하며, 여과하며, qPCR에 의해 적정하고, 사용 시까지 -80℃에 보관하였다. 도 6b 및 SEQ ID NO: 17을 참조한다.
실시예 14: MPSIVA 마우스로의 AAV9-CAG-hGALNS, AAV9-CAG-ohGALNS-v1, AAV9-CAG-ohGALNS-v2 또는 AAV9-CAG-ohGALNS-v3의 정맥내 주사
상이한 버전의 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 발현 카세트를 함유하는 AAV9-CAG-hGALNS, AAV9-CAG-ohGALNS-v1, AAV9-CAG-ohGALNS-v2 또는 AAV9-CAG-ohGALNS-v3의 5 × 1010 벡터 게놈의 총 용량을 2월령의 MPSIVA-유병 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내 전달하였다.
벡터 전달 후 2주차에 GALNS 활성 분석을 수행하였다. 모든 4가지 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제-함유 벡터에 의한 형질도입은 MPSIVA 동물에서 측정된 수준을 능가하여 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성의 실질적인 증가를 초래하였다. 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제 활성 수준은 간에서 WT 수준의 1500% 내지 2600% 범위였으며 혈청에서 WT의 55% 내지 99% 범위였다. 도 7a 및 도 7b를 참조한다. 간에서, 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제의 버전 2와 버전 3 둘 다 함유하는 발현 카세트로 도달된 활성 수준은 야생형 서열을 함유하는 벡터에 의해 매개된 활성 수준보다 더 높았다. 도 7a를 참조한다. 혈청에서, 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제의 버전 2와 버전 3 둘 다는 야생형 및 버전 1보다 효소적 활성의 더 높은 증가를 유발하였다. 도 7b를 참조한다.
실시예 15: MPSIVA 마우스로의 AAV9-CAG-omGALNS, AAV8-CAG-omGALNS 또는 AAV8-hAAT-omGALNS의 정맥내 전달
AAV9-CAG-omGALNS 벡터의 벡터 게놈 1 × 1012, AAV8-CAG-omGALNS 벡터의 벡터 게놈 1 × 1012 또는 AAV8-hAAT-omGALNS 벡터의 벡터 게놈 1 × 1011 총 용량을 총 부피 200 μl로 3주령 내지 4주령의 MPSIVA 동물의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 벡터 투여 후 4개월차 및 6개월차에, 동물을 희생시키고 추가 분석을 위해 샘플을 수집하였다.
AAV 치료 후 6개월차에, MPSIVA 치료를 받은 동물의 간, 대퇴골, 지방 조직 및 혈청에서 GALNS의 효소적 활성이 정상화되었으며, 이는 건강한 동물에서 관찰된 효소적 활성과 유사하거나 훨씬 더 높은 값에 도달하였다. 도 8, 도 9 및 도 10을 참조한다. GALNS 활성의 회복은, 야생형 대조군 및 치료를 받은 Galns -/- 마우스에서 유사한 케라탄 설페이트 농도에 의해 제시된 바와 같이, 간 및 혈청에서 질병의 특징인 기질 축적의 완전한 정상화를 유발하였다. 도 11을 참조한다.
혈류로의 상이한 벡터의 정맥내 투여는 다른 조직 및 기관들 중에서도 주로 간에서 형질도입된다(Ruzo et al., 2012). 이에 따라,상이한 벡터로 치료를 받은 MPSIVA 수컷 마우스의 간에서의 GALNS 활성은 건강한 동물에서 관찰된 활성보다 대략 25-배 더 높았다. 도 8a, 도 9a 및 도 10a를 참조한다.
간에서 과발현되는 경우, 가용성 리소좀 단백질은 혈류로 효율적으로 분비되어, 이 기관을 순환형 효소의 공급원이 되게 한다(Ruzo et al., 2012). 치료를 받은 MPSIVA 마우스의 혈청에서, GALNS 활성은 주사 후 대략 3개월차에 피크에 도달하였고, 이후 장기간 안정화되어 야생형 한배새끼보다 20배 내지 50배 더 높은 범위의 값을 가졌다. 도 8d, 도 9d 및 도 10d를 참조한다. 치료법의 체성 효능을 혈청 및 간에서 GAG 함량의 정량화를 통해 평가한 경우, 순환형 KS 수준 및 간 KS 수준의 완전 정상화가 관찰되었다. 도 11을 참조한다.
AAV 전달 후 4개월차에, MPSIVA 치료를 받은 마우스 유래의 경골 골단 성장판은 다수의 세포내 GAG 침착물의 존재에 의해 제시되는 세포내 GAG 축적의 뚜렷한 감소를 보여주었다. 도 12를 참조한다.
AAV-치료 동물은 또한, 세포내 GAG 침착물의 부재에 의해 제시된 바와 같이 눈물샘에서 GAG 축적의 완전한 정상화를 보여주었다. 도 13b를 참조한다. 마찬가지로, 모리 콜로이드 염색으로 염색된 각막 상피 절편에서 GAG 양성 면적의 신호 강도의 정량화는 AAV9-CAG-omGALNS 또는 AAV8-hAAT-omGALNS로 치료를 받은 Galns -/- 마우스에서 각막 상피의 표면에 걸친 GAG 침착 %의 감소가 GALNS-결핍 마우스에서 입증된 값을 능가하는 것을 나타내었다. 도 13a를 참조한다.
7월령 수컷 마우스의 치아 이랑 및 편도체의 투과 전자 현미경에 의한 초미세구조 분석은 비-치료 GALNS-결핍 마우스 유래 세포의 세포질에서 전기반투명(electrolucent) 성분을 함유하는 큰 공포(vacuole)의 존재를 나타내었다. 이들 세포는 치아 이랑에서 혈관주위 대식세포로서, 또는 편도체에서 뉴런주위 신경교세포 및 내피 세포로서 식별되었다. 저장 물질로 충전된 리소좀인 것으로 보이는 이들 소낭은 건강한 야생형 또는 AAV9-CAG-omGALNS로 치료를 받은 Galns -/- 동물의 샘플에서 완전히 확인되지 않았으며, 이는 유전자 도입 후 리소좀 구획이 정상적인 크기로 회복된 것을 확인시켜 주었다. 도 14를 참조한다.
SEQUENCE LISTING <110> ESTEVE PHARMACEUTICALS, S.A. Universitat Aut?oma de Barcelona <120> ADENOASSOCIATED VIRUS VECTORS FOR THE TREATMENT OF MUCOPOLYSACCHARIDOSES TYPE IV A <130> EP2212.10 <150> EP18382373.1 <151> 2018-05-30 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1577 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgccaccatg gcggcggttg tcgcggcgac gaggtggtgg cagctgttgc tggtgctcag 60 cgccgcgggg atgggggcct cgggcgcccc gcagcccccc aacatcctgc tcctgctcat 120 ggacgacatg ggatggggtg acctcggggt gtatggagag ccctccagag agaccccgaa 180 tttggaccgg atggctgcag aagggctgct tttcccaaac ttctattctg ccaaccctct 240 gtgctcgcca tcgagggcgg cactgctcac aggacggcta cccatccgca atggcttcta 300 caccaccaac gcccatgcca gaaacgccta cacaccgcag gagattgtgg gcggcatccc 360 agactcggag cagctcctgc cggagcttct gaagaaggcc ggctacgtca gcaagattgt 420 cggcaagtgg catctgggtc acaggcccca gttccacccc ctgaagcacg gatttgatga 480 gtggtttgga tcccccaact gccactttgg accttatgac aacaaggcca ggcccaacat 540 ccctgtgtac agggactggg agatggttgg cagatattat gaagaatttc ctattaatct 600 gaagacgggg gaagccaacc tcacccagat 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tgtgcagcga tgggggcggg 660 gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 720 gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 780 gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 840 gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 900 tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 960 agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc 1020 tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1080 tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg 1140 cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 1200 ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt 1260 gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc cctccccgag 1320 ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc gcggggctcg 1380 ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 1440 ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg 1500 cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt 1560 tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc 1620 gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt 1680 cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg ggggacggct 1740 gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta 1800 gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1860 tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat taattcgagc gaacgcgtgc 1920 caccatggct gcttgtacag ccgctcagca gctgctgctg gtgctgtctg ctctgggact 1980 gctggctgct ggcgctcctc agcctcctaa catcgtgctg ctgctgatgg acgacatggg 2040 ctggggcgat ctgggagtga acggcgagcc tagcagagag acacccaacc tggacagaat 2100 ggccgccgag ggcatgctgt tccccagctt ctacagcgcc aaccccctgt gcagcccttc 2160 tagagccgct ctgctgaccg gcagactgcc catcagaaac ggcttctaca ccaccaacgc 2220 ccacgccaga aacgcctaca caccccagga aatcatgggc ggcatcccca acagcgagca 2280 tctgctgcct gagctgctga agaaggccgg ctacaccaac aagatcgtgg gcaagtggca 2340 cctgggccac agaccccagt tccaccctct gaagcacggc ttcgacgagt ggttcggcag 2400 ccccaactgt cacttcggcc cctacgacaa caaggccaag cccaacatcc ccgtgtacag 2460 agactgggag atggtgggaa gattctacga agagttcccc atcaacagaa agaccggcga 2520 ggccaacctg acccagctgt acacacagga agccctggac ttcatccaga cccagcacgc 2580 cagacagagc cccttcttcc tgtactgggc catcgacgcc acacacgccc ctgtgtacgc 2640 cagcagacag ttcctgggca ccagcctgag aggcagatat ggcgacgccg tgcgcgagat 2700 cgacgactct gtgggcaaga tcctgtccct gctgcagaac ctgggcatca gcaagaacac 2760 cttcgtgttc ttcaccagcg acaacggcgc tgccctgatc agcgctccta atgagggcgg 2820 cagcaacggc ccattcctgt gcggcaagca gaccacattc gagggcggaa tgagagagcc 2880 cgctatcgct tggtggcctg gccatatcgc tgctggccag gtgtcacacc agctgggcag 2940 catcatggac ctgttcacca cctccctgag cctggccgga ctgaagcctc ctagcgacag 3000 agtgatcgac ggcctggacc tgctgcccac catgctgaag ggccagatga tggacagacc 3060 catcttctac tacagaggca acaccctgat ggccgtgacc ctgggccagt acaaggccca 3120 cctgtggacc tggaccaaca gctgggaaga gtttacccag ggcaccgatt tctgccctgg 3180 ccagaatgtg tccggcgtga ccacccacac ccaggaagaa cacaccgagc tgcccctgat 3240 cttccacctg ggaagggacc ccggcgagag attccctctg agcttccaca gcgacgagta 3300 ccaggacgcc ctgagcagaa ccacccaggt ggtgcaggaa caccagaaaa gcctggtgcc 3360 cggccagccc cagctgaacg tgtgtaacca ggccgtgatg aactgggccc ctcccggatg 3420 tgaaaagctg ggaaagtgcc tgaccccccc tgagagcgtg cccgagaagt gtttctgggc 3480 ccactgagaa ttcgagctcg gtacccggga atcaattcac tcctcaggtg caggctgcct 3540 atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca caaataccac tgagatcttt 3600 ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct 3660 aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg 3720 gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt 3780 tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc 3840 agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag 3900 gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt 3960 ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg 4020 tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gctgtagata agtagcatgg 4080 cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 4140 cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 4200 gcgcgcagc 4209 <210> 17 <211> 3849 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV8-hAAT-omGALNS <400> 17 gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctactc gacattgatt 180 attgactagg atctgatatc atcgatgaat tcgagctcgg tacccggccg cagatttagg 240 tgacactata gaatatgcat cactagtaag cttgcgaatt ccagtctaca gagaggtctc 300 tgacctctgc cccagctcca aggtcagcag gcagggaggg ctgtgtgttt gctgtttgct 360 gcttgcaatg tttgcccatt ttagggacat gagtaggctg aagtttgttc agtgtggact 420 tcagaggcag cacacaaaca gcaagcttgc gaattccagt ctacagagag gtctctgacc 480 tctgccccag ctccaaggtc agcaggcagg gagggctgtg tgtttgctgt ttgctgcttg 540 caatgtttgc ccattttagg gacatgagta ggctgaagtt tgttcagtgt ggacttcaga 600 ggcagcacac aaacagcaag cttgcgaatt ccagtctaca gagaggtctc tgacctctgc 660 cccagctcca aggtcagcag gcagggaggg ctgtgtgttt gctgtttgct gcttgcaatg 720 tttgcccatt ttagggacat gagtaggctg aagtttgttc agtgtggact tcagaggcag 780 cacacaaaca gcaagctttg ctctagactg gaattcgtcg acgagctccc tatagtgagt 840 cgtattagag gccgactgac ccggtacccg gggatcttgc taccagtgga acagccacta 900 aggattctgc agtgagagca gagggccagc taagtggtac tctcccagag actgtctgac 960 tcacgccacc ccctccacct tggacacagg acgctgtggt ttctgagcca ggtacaatga 1020 ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag gcaaagcgtc cgggcagcgt 1080 aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct gtttgctcct ccgataactg 1140 gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct 1200 taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg 1260 acagtgaatg tccccctgat ctgcggccgt gactctctta aggtagcctt gcagaagttg 1320 gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag gagaccaata 1380 gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct 1440 tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac tcccagttca attacagctc 1500 ttaaggctag agtacttaat acgactcact ataggctagc ctcgacctcg agacgcgtgc 1560 caccatggct gcttgtacag ccgctcagca gctgctgctg gtgctgtctg ctctgggact 1620 gctggctgct ggcgctcctc agcctcctaa catcgtgctg ctgctgatgg acgacatggg 1680 ctggggcgat ctgggagtga acggcgagcc tagcagagag acacccaacc tggacagaat 1740 ggccgccgag ggcatgctgt tccccagctt ctacagcgcc aaccccctgt gcagcccttc 1800 tagagccgct ctgctgaccg gcagactgcc catcagaaac ggcttctaca ccaccaacgc 1860 ccacgccaga aacgcctaca caccccagga aatcatgggc ggcatcccca acagcgagca 1920 tctgctgcct gagctgctga agaaggccgg ctacaccaac aagatcgtgg gcaagtggca 1980 cctgggccac agaccccagt tccaccctct gaagcacggc ttcgacgagt ggttcggcag 2040 ccccaactgt cacttcggcc cctacgacaa caaggccaag cccaacatcc ccgtgtacag 2100 agactgggag atggtgggaa gattctacga agagttcccc atcaacagaa agaccggcga 2160 ggccaacctg acccagctgt acacacagga agccctggac ttcatccaga cccagcacgc 2220 cagacagagc cccttcttcc tgtactgggc catcgacgcc acacacgccc ctgtgtacgc 2280 cagcagacag ttcctgggca ccagcctgag aggcagatat ggcgacgccg tgcgcgagat 2340 cgacgactct gtgggcaaga tcctgtccct gctgcagaac ctgggcatca gcaagaacac 2400 cttcgtgttc ttcaccagcg acaacggcgc tgccctgatc agcgctccta atgagggcgg 2460 cagcaacggc ccattcctgt gcggcaagca gaccacattc gagggcggaa tgagagagcc 2520 cgctatcgct tggtggcctg gccatatcgc tgctggccag gtgtcacacc agctgggcag 2580 catcatggac ctgttcacca cctccctgag cctggccgga ctgaagcctc ctagcgacag 2640 agtgatcgac ggcctggacc tgctgcccac catgctgaag ggccagatga tggacagacc 2700 catcttctac tacagaggca acaccctgat ggccgtgacc ctgggccagt acaaggccca 2760 cctgtggacc tggaccaaca gctgggaaga gtttacccag ggcaccgatt tctgccctgg 2820 ccagaatgtg tccggcgtga ccacccacac ccaggaagaa cacaccgagc tgcccctgat 2880 cttccacctg ggaagggacc ccggcgagag attccctctg agcttccaca gcgacgagta 2940 ccaggacgcc ctgagcagaa ccacccaggt ggtgcaggaa caccagaaaa gcctggtgcc 3000 cggccagccc cagctgaacg tgtgtaacca ggccgtgatg aactgggccc ctcccggatg 3060 tgaaaagctg ggaaagtgcc tgaccccccc tgagagcgtg cccgagaagt gtttctgggc 3120 ccactgagaa ttcgagctcg gtacccggga atcaattcac tcctcaggtg caggctgcct 3180 atcagaaggt ggtggctggt gtggccaatg ccctggctca caaataccac tgagatcttt 3240 ttccctctgc caaaaattat ggggacatca tgaagcccct tgagcatctg acttctggct 3300 aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctcactcg 3360 gaaggacata tgggagggca aatcatttaa aacatcagaa tgagtatttg gtttagagtt 3420 tggcaacata tgcccatatg ctggctgcca tgaacaaagg ttggctataa agaggtcatc 3480 agtatatgaa acagccccct gctgtccatt ccttattcca tagaaaagcc ttgacttgag 3540 gttagatttt ttttatattt tgttttgtgt tatttttttc tttaacatcc ctaaaatttt 3600 ccttacatgt tttactagcc agatttttcc tcctctcctg actactccca gtcatagctg 3660 tccctcttct cttatggaga tccctcgacc tgcagcccaa gctgtagata agtagcatgg 3720 cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 3780 cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga 3840 gcgcgcagc 3849 <210> 18 <211> 1674 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAG Promoter <400> 18 gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420 cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 480 tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 540 gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 600 cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 660 gagtcgctgc gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc 720 cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 780 ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 840 cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg 900 tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc ccggcggctg tgagcgctgc 960 gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc 1020 ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc 1080 gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg tcggtcgggc tgcaaccccc cctgcacccc 1140 cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtac ggggcgtggc 1200 gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg 1260 ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gcccccggag cgccggcggc 1320 tgtcgaggcg cggcgagccg cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag 1380 ggacttcctt tgtcccaaat ctgtgcggag ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc 1440 tctagcgggc gcggggcgaa gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc 1500 cttcgtgcgt cgccgcgccg ccgtcccctt ctccctctcc agcctcgggg ctgtccgcgg 1560 ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc 1620 ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acag 1674 <210> 19 <211> 1221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAAT Promoter <400> 19 gatctgatat catcgatgaa ttcgagctcg gtacccggcc gcagatttag gtgacactat 60 agaatatgca tcactagtaa gcttgcgaat tccagtctac agagaggtct ctgacctctg 120 ccccagctcc aaggtcagca ggcagggagg gctgtgtgtt tgctgtttgc tgcttgcaat 180 gtttgcccat tttagggaca tgagtaggct gaagtttgtt cagtgtggac ttcagaggca 240 gcacacaaac agcaagcttg cgaattccag tctacagaga ggtctctgac ctctgcccca 300 gctccaaggt cagcaggcag ggagggctgt gtgtttgctg tttgctgctt gcaatgtttg 360 cccattttag ggacatgagt aggctgaagt ttgttcagtg tggacttcag aggcagcaca 420 caaacagcaa gcttgcgaat tccagtctac agagaggtct ctgacctctg ccccagctcc 480 aaggtcagca ggcagggagg gctgtgtgtt tgctgtttgc tgcttgcaat gtttgcccat 540 tttagggaca tgagtaggct gaagtttgtt cagtgtggac ttcagaggca gcacacaaac 600 agcaagcttt gctctagact ggaattcgtc gacgagctcc ctatagtgag tcgtattaga 660 ggccgactga cccggtaccc ggggatcttg ctaccagtgg aacagccact aaggattctg 720 cagtgagagc agagggccag ctaagtggta ctctcccaga gactgtctga ctcacgccac 780 cccctccacc ttggacacag gacgctgtgg tttctgagcc aggtacaatg actcctttcg 840 gtaagtgcag tggaagctgt acactgccca ggcaaagcgt ccgggcagcg taggcgggcg 900 actcagatcc cagccagtgg acttagcccc tgtttgctcc tccgataact ggggtgacct 960 tggttaatat tcaccagcag cctcccccgt tgcccctctg gatccactgc ttaaatacgg 1020 acgaggacag ggccctgtct cctcagcttc aggcaccacc actgacctgg gacagtgaat 1080 gtccccctga tctgcggccg tgactctctt aaggtagcct tgcagaagtt ggtcgtgagg 1140 cactgggcag gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg 1200 cttgtcgaga cagagaagac t 1221 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 20 ccagggaatg tcccacctat tt 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer <400> 21 gtcaggttga cacgaagctg 20 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer KO <400> 22 ggaacttcgg ttccggcg 18

Claims (15)

  1. SEQ ID NO: 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 75% 내지 90%의 동일성을 갖는 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 상기 서열은 기능적 인간 갈락토사민 (N-아세틸)-6-설파타제를 인코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된 뉴클레오타이드 서열과 80% 내지 85%의 동일성을 갖는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 폴리뉴클레오타이드 서열.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하고, 상기 프로모터는 CAG 프로모터, hAAT 프로모터 또는 CMV 프로모터로부터 선택되는, 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 프로모터는 CAG 프로모터인, 발현 벡터.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 재조합 AAV 벡터인, 발현 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터는 AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAVrh10으로부터 선택되는, 발현 벡터.
  9. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 4로 표시되고, 수탁 번호 DSM 32792를 갖는 플라스미드 pAAV-CAG-ohGALNS-버전1, SEQ ID NO: 6으로 표시되고, 수탁 번호 DSM 32793을 갖는 플라스미드 pAAV-CAG-ohGALNS-버전2, 및 SEQ ID NO: 8로 표시되고, 수탁 번호 DSM 32794를 갖는 플라스미드 pAAV-CAG-ohGALNS-버전3으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 발현 벡터.
  10. 치료적 유효량의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 조성물은 평생 1회 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  13. 의약에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물.
  14. 뮤코다당질축적증 IVA형(mucopolysaccharidosis type IVA) 또는 모르키오 A 증후군(Morquio A syndrome)의 치료에 사용하기 위한, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물.
  15. 제7항 또는 제8항에 따른 벡터를 수득하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (i) 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, AAV cap 단백질, AAV rep 단백질, 및 선택적으로, AAV가 복제를 위해 의존하는 바이러스 단백질을 포함하는 세포를 제공하는 단계,
    (ii) 상기 세포를 AAV의 조립에 적절한 조건 하에 유지시키는 단계; 및
    (iii) 상기 세포에 의해 생성되는 아데노-관련 바이러스 벡터를 정제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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