KR20210056329A - 신규 cas12b 효소 및 시스템 - Google Patents

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KR20210056329A
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펑 장
조나단 스트레커
이안 슬레이메이커
사라 존스
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더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 개시는 핵산을 표적화하기 위한 시스템, 방법, 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 신규 RNA-표적화 Cas12b 이펙터 단백질 및 적어도 하나의 표적화 핵산 성분 예컨대 가이드 가이드 RNA 또는 crRNA를 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 RNA-표적화 시스템을 제공한다.

Description

신규 CAS12B 효소 및 시스템
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 8월 7일 출원된 미국 가출원 제62/715,640호, 2018년 10월 10일 출원된 미국 가출원 제62/744,080호, 2018년 10월 26일 출원된 미국 가출원 제62/751,196호, 2019년 1월 21일 출원된 미국 가출원 제62/794,929호, 및 2019년 4월 8일 출원된 미국 가출원 제62/831,028호의 우선권을 청구한다. 상기 확인된 출원의 전체 내용은 참조로 본 명세서에 완전히 편입된다.
주정부 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 수여하는 보조금 번호 MH110049, 및 HL141201 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 갖는다.
전자 서열 목록에 관한 참조
전자 서열 목록 ("BROD-2670_ST25.txt"; 크기는 879,558바이트이고 2019년 7월 25일에 생성되었음)의 내용은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
기술 분야
본 명세서에 개시된 주제는 일반적으로, CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), 및 이의 성분과 관련된 시스템, 방법, 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 일반적으로 대형 페이로드의 전달에 관한 것이고 대형 페이로드, 예컨대 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), CRISPR 단백질 (예를 들어, Cas, C2c1), CRISPR-Cas 또는 CRISPR 시스템 또는 CRISPR-Cas 복합체, 이의 성분, 핵산 분자, 예를 들어, 이들을 포함하는 벡터를 전달하는데 적합한, 특히 지질 및 바이러스 입자를 사용한 신규 전달 입자, 및 또한 신규 바이러스 캡시드, 및 다른 양상들 중에서도, 모든 전술한 것의 용도를 포함한다. 추가로, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템 기반 요법 또는 치료법을 개발하거나 또는 설계하기 위한 방법에 관한 것이다.
최근 게놈 시퀀싱 기법 및 분석 방법의 진보는 다양한 범위의 생물학적 기능 및 질환과 연관된 유전적 요인을 목록화하고 맵핑하는 능력을 상당히 가속화시켰다. 정밀한 게놈 표적화 기술은 합성 생물학, 생명공학 및 의학적 적용 분야를 진보시키기 위해서 뿐만 아니라, 개별 유전자 요소의 선택적 교란을 허용하여 인과적인 유전자 변이의 체계적인 역조작을 가능하게 하기 위해 필요하다. 게놈-편집 기술 예컨대 디자이너 징크 핑거, 전사 활성인자-유사 이펙터 (TALE; transcription activator-like effector), 또는 귀소성 메가뉴클레아제가 표적화된 게놈 교란을 일으키기 위해 이용가능하지만, 새로운 전략 및 분자 기전을 적용하고, 감당할만하고, 셋업이 용이하고, 규모확장가능하며, 진핵생물 게놈 내 복수개 위치의 표적화를 처리할 수 있는 신규한 게놈 조작 기술에 대한 필요성이 여전히 남아있다. 이것은 게놈 조작 및 생명공학의 새로운 적용분야에 주요한 자원을 제공하게 될 것이다.
박테리아 및 고세균의 적응 면역의 CRISPR-Cas 시스템은 단백질 조성 및 게놈 유전자좌 구조의 극단적인 다양성을 나타낸다. CRISPR-Cas 시스템 유전자좌는 50 개 초과의 유전자 패밀리를 가지며, 유전자좌 구조의 빠른 진화 및 극단적인 다양성을 나타내는 엄격한 보편적 유전자는 존재하지 않는다. 지금까지는, 다면적인 접근법을 채택하여, 93 개의 Cas 단백질에 대해 약 395 개의 프로파일의 포괄적인 cas 유전자 식별이 있다. 분류는 특징적인 유전자 프로파일 및 유전자좌 구성의 특징을 포함한다. CRISPR-Cas 시스템의 새로운 분류가 제안되어 있으며, 여기서 이들 시스템은 광범위하게 2 개의 부류, 즉 다수 서브유닛 이펙터 복합체를 가지는 클래스 1 및 Cas9 단백질로 예시되는 단일-서브유닛 이펙터 모듈을 가지는 클래스 2로 나뉜다. 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템과 연관된 신규 이펙터 단백질은 강력한 게놈 조작 도구로서 개발될 수 있으며, 추정상의 신규 이펙터 단백질 및 이의 조작 및 최적화의 예측이 중요하다. 신규 Cas12b 오솔로그 및 이의 용도가 바람직하다.
본 출원에서 임의의 문헌의 인용 또는 확인은 상기 문헌이 본 출원에 대한 선행 기술로서 이용가능하다는 인정이 아니다.
일 양상에서, 본 개시는 i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질, 및 ii) 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드를 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 시스템은 tracr RNA를 더 포함한다.
일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13, 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium), 및 라세이엘라 세디미니스 (Laceyella sediminis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다. 일부 구현예에서, tracr RNA는 직접 반복부의 5' 말단에서 crRNA와 융합된다. 일부 구현예에서, 시스템은 둘 이상의 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 원핵생물 세포 내 하나 이상의 표적 서열과 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 진핵생물 세포 내 하나 이상의 표적 서열과 하이브리드화한다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 촉매적으로 불활성이다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 하나 이상의 표적 서열을 절단한다. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은 하나 이상의 표적 서열의 전사 또는 번역을 변형시킨다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고, Cas12b 이펙터 단백질은 RuvC 및/또는 Nuc 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 함유하여서, 형성된 CRISPR 복합체가 표적 서열에서 또는 그에 인접하여 후생유전적 변형인자 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 아데노신 디아미나제 또는 시티딘 디아미나제와 회합된다. 일부 구현예에서, 시스템은 재조합 주형을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 주형은 상동성-지정 복구 (homology-directed repair) (HDR)에 의해 삽입된다.
다른 양상에서, 본 개시는 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트, 및 i) a) 가이드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트, 및 b) tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제3 조절 엘리먼트, 또는 ii) 가이드 서열 및 tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는, Cas12b 벡터 시스템을 제공한다.
일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, 시스템은 단일 벡터에 포함된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연합 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터를 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시는 Cas12b 이펙터 단백질 및 i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질, ii) 하나 이상의 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 3' 가이드 서열, 및 iii) tracr RNA를 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 조성물의 하나 이상의 핵산 성분을 전달하도록 구성된 전달 시스템을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 벡터 시스템은 하나 이상의 벡터, 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고, 하나 이상의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 분자는 Cas12b 이펙터 단백질 및 비-천연 발생 또는 조작된 조성물의 하나 이상의 핵산 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 시스템은 리포솜(들), 입자(들), 엑소솜(들), 미세소포(들), 유전자총, 또는 바이러스 벡터 (들)를 포함하는 전달 비히클을 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시는 치료적 치료 방법에서 사용을 위한, 본 명세서의 비천연 발생 또는 조작된 시스템, 본 명세서의 벡터 시스템, 또는 본 명세서의 전달 시스템을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 하나 이상의 관심 표적 서열을 변형시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 하나 이상의 표적 서열을 i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질, ii) 표적 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있는 3' 가이드 서열, 및 iii) tracr RNA를 포함하여서, crRNA 및 tracr RNA와 복합체형성된 Cas12b 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체가 형성된 것인 하나 이상의 비천연 발생 또는 조작된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 가이드 서열이 세포 내 하나 이상의 표적 서열과의 서열-특이적 결합을 유도하여, 하나 이상의 표적 서열의 발현이 변형된다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 발현의 변형은 하나 이상의 표적 서열의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 발현의 변형은 하나 이상의 표적 서열의 발현의 증가 또는 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 재조합 주형을 더 포함하고, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 재조합 주형 또는 이의 일부의 삽입을 포함한다. 일부 구현예예서, 하나 이상의 표적 서열은 원핵생물 세포 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 서열은 진핵생물 세포 내에 존재한다.
다른 양상에서, 본 개시는 하나 이상의 변형된 표적 서열을 포함하는 세포 또는 이의 자손, 임의로 치료적 T 세포 또는 항체-생산 B-세포를 제공하고, 여기서 하나 이상의 표적 서열은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 변형되었거나 또는 상기 세포는 식물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵생물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 하기의 결과를 야기시킨다: 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하는 세포; 적어도 하나의 유전자 산물의 발현이 증가된 것인, 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하는 세포; 적어도 하나의 유전자 산물의 발현이 감소된 것인, 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하는 세포; 내생성 또는 비내생성 생물학적 산물 또는 화학적 화합물을 생산 및/또는 분비하는 세포 또는 개체군. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포 또는 인간 세포이다. 다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서의 세포를 포함하는 세포주, 또는 이의 자손을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서의 하나 이상의 세포를 포함하는 다세포 유기체를 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서의 하나 이상의 세포를 포함하는 식물 또는 동물 모델을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서의 세포, 세포주, 유기체, 또는 식물, 또는 동물 모델로부터의 유전자 산물을 제공한다. 일부 구현예에서, 발현되는 유전자 산물의 양은 변경된 발현을 갖지 않는 세포로부터의 유전자 산물의 양을 초과하거나 또는 그 미만이다.
다른 양상에서, 본 개시는 표 1 또는 2로부터의 단리된 Cas12b 이펙터 단백질을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산은 DNA이고 crRNA 및 tracr RNA를 코딩하는 서열을 더 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서의 핵산 또는 Cas12b 단백질을 포함하는 단리된 진핵생물 세포를 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 mRNA, ii) 가이드 서열, 및 iii) tracr RNA를 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, tracr RNA는 직접 반복부의 5' 말단에서 crRNA에 융합된다.
다른 양상에서, 본 개시는 표적화 도메인 및 아데노신 디아미나제, 시티딘 디아미나제, 도는 이의 촉매 도메인을 포함하는 부위 지정 염기 편집을 위한 조작된 시스템을 제공하고, 여기서 표적화 도메인은 Cas12b 이펙터 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드-결합 활성을 유지하는 이의 단편 및 가이드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 촉매적으로 불활성이다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 하기 표 1 또는 2로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp. V3-13, 바실러스 히사시이, 렌티스파에리아 박테리움, 및 라세이엘라 세디미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다.
다른 양상에서, 본 개시는 하나 이상의 관심 표적 올리고뉴클레오티드 내 아데노신 또는 시티딘을 변형시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 상기 하나 이상의 표적 올리고뉴클레오티드로 본 명세서의 조성물을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예서, 병원성 T→C 또는 A→G 점 돌연변이를 함유하는 전사물에 의해 초래된 질환의 치료 또는 예방에서 사용을 위한다. 다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서의 방법으로부터 수득되고/되거나 본 명세서의 조성물을 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 진핵생물 세포, 바람직하게 인간 또는 비인간 동물 세포, 임의로 치료적 T 세포 또는 항체-생산 B-세포 또는 여기서 상기 세포는 식물 세포이다.
다른 양상에서, 본 개시는 상기 변형된 세포 또는 이의 자손을 포함하는 비인간 동물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 본 명세서의 변형된 세포를 포함하는 식물을 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 요법, 바람직하게 세포 요법에서 사용을 위한 변형된 세포를 제공한다.
다른 양상에서, 본 개시는 표적 올리고뉴클레오티드 내 아데닌 또는 시토신을 변형시키는 방법을 제공하고, 방법은 상기 표적 올리고뉴클레오티드로, 촉매적 불활성 Cas12b 단백질; 직접 반복부에 연결된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자; 및 아데노신 또는 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인을 전달하는 단계를 포함하고, 상기 아데노신 또는 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 전달 이후에 상기 촉매적 불활성 Cas12b 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되거나 또는 상기 가이드 분자는 그에 연결되도록 조정되고, 상기 가이드 분자는 상기 촉매적 불활성 Cas12b와 복합체를 형성하고 상기 복합체가 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 결합하도록 유도하며, 상기 가이드 서열은 상기 표적 올리고뉴클레오티드 서열 내 표적 서열과 하이브리드화할 수 있어서 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성한다.
일부 구현예에서, (A) 상기 시토신은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성하는 상기 표적 서열 밖에 존재하고, 상기 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 상기 RNA 듀플렉스 밖의 상기 시토신을 탈아민화시키거나, 또는 (B) 상기 시토신은 상기 RNA 듀플렉스를 형성하는 상기 표적 서열 내에 있고, 상기 가이드 서열은 상기 시토신에 상응하는 위치에 비-쌍형성 아데닌 또는 우라실을 포함하여 그 결과로 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스에 C-A 또는 C-U 미스매치를 야기시키고, 시토신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 비-쌍형성 아데닌 또는 우라실 반대쪽 올리고뉴클레오티드 듀플렉스 내 시토신을 탈아민화시킨다. 일부 구현예에서, 상기 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 올리고뉴클레오티드 듀플렉스 내 상기 아데닌 또는 시토신을 탈아민화시킨다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 하기 표 1 또는 2로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Cas12b 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp. V3-13, 바실러스 히사시이, 렌티스파에리아 박테리움, 및 라세이엘라 세디미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다.
다른 양상에서, 본 개시는 Cas12b 단백질; 표적 서열과 일정 정도의 상보성을 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함하고, Cas12b와 복합체를 형성하도록 설계된 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드; 및 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체를 포함하는, 하나 이상의 시험관내 샘플에서 핵산 표적 서열의 존재를 검출하기 위한 시스템을 제공하고, 여기서 Cas12b는 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 표적 서열에 의해 활성화될 때 올리고뉴클레오티드 기반 차폐성 구성체의 비표적 서열을 절단한다.
다른 양상에서, 본 개시는 Cas12b 단백질; 각각이 하나 이상의 표적 폴리펩티드 중 하나에 결합하도록 설계된 하나 이상의 검출 압타머로서, 각각은 차폐된 프로모터 결합 부위 또는 차폐된 프라이머 결합 부위 및 기폭제 서열 주형을 포함하는 것인 검출 압타머; 및 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체를 포함하는, 하나 이상의 시험관내 샘플에서 하나 이상의 표적 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 시스템을 제공한다.
일부 구현예에서, 시스템은 표적 서열 또는 기폭제 서열을 증폭시키기 위한 핵산 증폭 시약을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 증폭 시약은 등온 증폭 시약이다. 일부 구현예에서, Cas12b 단백질은 하기 표 1 또는 2로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp. V3-13, 바실러스 히사시이, 렌티스파에리아 박테리움, 및 라세이엘라 세디미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다.
다른 양상에서, 본 개시는 하나 이상의 시험관내 샘플에서 핵산 서열을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 하나 이상의 샘플을 i) Cas12b 단백질, ii) 표적 서열과 일정 정도의 상보성을 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함하고, Cas12b 단백질과 복합체를 형성하도록 설계된 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드; 및 iii) 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 Cas12b 단백질은 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 올리고뉴클레오티드 기반 차폐성 구성체의 비표적 서열을 절단한다.
일부 구현예에서, Cas12b 단백질은 하기 표 1 또는 2로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Cas12b 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp. V3-13, 바실러스 히사시이, 렌티스파에리아 박테리움, 및 라세이엘라 세디미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다. 다른 양상에서, 본 개시는 효소 또는 리포터 모이어티의 불활성 제1 부분에 연결된 Cas12b 단백질을 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 조성물을 제공하고, 효소 또는 리포터 모이어티는 효소 또는 리포터 모이어티의 상보성 부분과 접촉될 때 재구성된다. 일부 구현예에서, 효소 또는 리포터 모이어티는 단백질가수분해 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas12 단백질은 제1 Cas12b 단백질 및 효소 또는 리포터 모이어티의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 i) 제1 Cas12b 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 핵산의 제1 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 제1 가이드; 및 ii) 제2 Cas12b 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 표적 핵산 상의 제2 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 제2 가이드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 캐스파제를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 담배 식각 바이러스 (TEV)를 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시는 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포에서 단백질가수분해 활성을 제공하는 방법을 제공하고, 방법은 a) 세포 또는 세포 개체군을, i) 단백질가수분해 효소의 불활성 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질; ii) 단백질가수분해 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 단백질가수분해 효소의 단백질가수분해 활성은 단백질 가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 이펙터 단백질; iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 표적 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; 및 iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 표적 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드와 접촉시켜서, 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉하고 단백질가수분해 효소의 단백질가수분해 활성이 재구성되는 것인 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 캐스파제를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 TEV 프로테아제이고, TEV 프로테아제의 단백질가수분해 활성은 재구성되어서, TEV 기질이 절단되고 활성화된다. 일부 구현예에서, TEV 기질은 TEV 표적 서열을 함유하도록 조작된 프로캐스파제이고 그리하여 TEV 프로테아제에 의한 절단은 프로캐스파제를 활성화시킨다.
다른 양상에서, 본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포를 확인하는 방법을 제공하고, 방법은 세포 내 올리고뉴클레오티드를, i) 단백질가수분해 효소의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질; ii) 단백질가수분해 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 단백질가수분해 효소의 활성은 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉할 때 재구성되는 것인 이펙터 단백질; iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드; 및 v) 검출가능하게 절단되는 리포터를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 관심 올리고뉴클레오티드가 세포에 존재할 때 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉하고, 그리하여 단백질가수분해 효소의 활성이 재구성되고 리포터를 검출가능하게 절단한다.
다른 양상에서, 본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포를 확인하는 방법을 제공하고, 방법은 세포 내 올리고뉴클레오티드를, i) 리포터의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질; ii) 리포터의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 리포터의 활성은 리포터의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉할 때 재구성되는 것인 이펙터 단백질; iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드; 및 v) 리포터를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 관심 올리고뉴클레오티드가 세포에 존재할 때 리포터의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉하고, 그리하여 리포터의 활성이 재구성된다. 일부 구현예에서, 리포터는 형광성 단백질 또는 발광성 단백질이다.
예시 구현예의 이들 및 다른 양상, 목적, 특징 및 이점은 예시된 예시 구현예의 하기 상세한 설명을 고려하면 당업자에게 명백해 질 것이다.
본 발명의 특성 및 장점의 이해는 본 발명의 원리를 이용할 수 있는, 실례적인 구현예를 제시하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조로 하여 수득될 것이다:
도 1은 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) CRISPR-C2c1 유전자좌를 도시한다. 소형 RNAseq는 tracrRNA의 위치 및 성숙한 crRNA의 아키텍처를 밝혀주었다.
도 2A-2C 는 예상 tracrRNA (도 2A) (SEQ ID NO:1-11) 및 Tracer#1 (도 2B) 및 Tracer #5 (도 2C) (SEQ ID NO:12, 656, 및 13)에 대한 직접 반복부 (적색)와 tracer (녹색)의 듀플렉스의 예상 배수를 도시한다.
도 3A 는 Seqlogos에대한 PAM 스크린의 결과가 가장 느슨한 예상 PAM에 대해 제공된 것을 도시하고 도 3B 는 가장 엄격한 예상 PAM을 도시한다.
도 4 는 TTH (H = A, T 또는 C)로서 PhbC2c1 PAM의 생체내 확인을 도시한다. 세포는 인식가능한 프로토스페이서의 5'에 위치된 상이한 PAM 서열을 코딩하는 플라스미드 DNA로 형질전환되었다.
도 5 는 Cpf1 닉카제를 사용한 서열 특이적 닉카제 증폭을 도시한다.
도 6 은 압타머 발색을 예시한다.
도 7 은 플란크토마이세테스 (Planctomycetes) CRISPR-C2c1 유전자좌를 도시한다. 소형 RNAseq는 tracrRNA의 위치 및 성숙한 crRNA의 아키텍처를 밝혀주었다.
도 8A 는 Seqlogos에대한 PAM 결과가 가장 느슨한 예상 PAM에 대해 제공된 것을 도시하고 도 8B 는 가장 엄격한 예상 PAM을 도시한다 (B). 스크린은 플란크토리세테스 (Planctolycetes)에 대한 PAM가 TTR (R = G 또는 A)이라는 것을 도시한다.
도 9 는 TTR (R = G 또는 A)로서 C2c1 PAM의 생체내 확인을 도시한다. 세포는 인식가능한 프로토스페이서의 5'에 위치된 상이한 PAM 서열을 코딩하는 플라스미드 DNA로 형질전환되었다.
도 10 은 crRNA-tracrRNA 복합체와 C2c1의 단리를 위한 플라스미드의 예를 도시한다. 플라스미드는 PhyciC2c1 및/또는 tracrRNA 및/또는 CRISPR 어레이를 함유한다. 프로세스된 crRNA 및 tracrRNA는 C2c1과 복합체 형성하게 될 것이고 C2c1 단백질과 함께 동시-정제될 수 있다 (C2c1-RNA 복합체).
도 11A 는 단백질 풀다운 어세이에서 PhyciC2c1 및 PlancC2c1의 밴드를 도시한다. RNase 및 DNase 분해 실험을 수행하였고, 도 11B 에서 RNA가 PhysiC2c1 단백질에 존재한다는 것이 입증되었다 (PhyC2c1 단백질은 DNase 분해가 아니라 RNase 분해에 감수성이었음). PhysiC2c1 단백질 중 RNA의 존재는 도 11C 에서 더욱 확인되었다. 동시 정제된 RNA의 크기는 crRNA와 일치하지만 118 nt 예상 tracrRNA에 비해 더 크게 보인다.
도 12 는 시험관내 절단 실험의 조건 및 결과를 제공하며, 여기서 PhysiC2c1-RNA 복합체가 CRISPR 어세이의 제1 가이드와 매칭되는 프로토스페이서를 함유하는 DNA를 절단할 수 있다는 것이 입증되었다.
도 13 은 상이한 sgRNA를 도시한다. 이. 콜라이 (E.coli)에서 발현된 BhCas12b 유전자좌로부터의 소형 RNA-seq는 tracrRNA 및 crRNA를 밝혀주었다. sgRNA 변이체를 형성하기 위한 tracrRNA 및 crRNA의 융합의 다이아그램 (SEQ ID NO:14-29).
도 14 는 상이한 표적 부위에 대한, 플라스미드 형질감염 이후, 도 13의 상이한 sgRNA로 수득된 indel 백분율을 도시한다. 사용된 Cas12b는 바실리서 히사시이 (Bacillus hisashii) 균주 C4로부터의 것이었다. HEK293 세포에서 BhCas12b 및 sgRNA의 발현은 다중 게놈 부위에서 indel 돌연변이를 발생시킨다.
도 15A-15C 는 각각 Ls, Ak, 및 Bv로부터의 Cas12b 오솔로그를 사용한 정제된 단백질 및 RNA에 의한 PAM 발굴, 시험관내 절단을 도시한다 (도 15A - SEQ ID NO:30 및 657; 도 15B - SEQ ID NO:31 및 658; 도 15C - SEQ ID NO:32 및 659). 도 15D-15E 는 각각 Phyci 및 Planc로부터의 Cas12B 오솔로그를 사용한 정제된 단백질 RNA에 의한 시험관내 절단을 도시한다.
도 16 은 정제된 AmCas12b (AmC2C1) 단백질 및 소형 RNAseq로부터의 상이한 예상 tracr RNA에 의한 시험관내 절단 어세이를 도시한다.
도 17A-17E 는 AmC2C1에 대한 sgRNA 디자인을 도시한다. (도 17A - SEQ ID NO:33 및 660; 도 17B - SEQ ID NO:34 및 661; 도 17C - SEQ ID NO:35; 도 17D - SEQ ID NO:36; 도 17E - SEQ ID NO:37).
도 18 은 sgRNA 효율의 비교를 위한 AmC2C1에 의한 시험관내 절단을 도시한다.
도 19 는 AmC2C1 RuvC 돌연변이체의 활성을 도시한다.
도 20 은 시험관내 PAM 스크린에 의한 Cas12b 오솔로그에 대한 PAM의 결정을 도시한다.
도 21A 는 소형 RNAseq tracr 예상을 도시한다. 도 21B 는 시험관내 스크리닌으로부터 BhC2C1 (바실러스 히사시이 Cas12b) PAM을 도시한다. 도 21C 는 BhC2C1 단백질 정제를 도시한다. 도 21D 는 각각 37℃ 및 48℃에서 BhC2C1 단백질 및 예상 tracr RNA에 의한 시험관내 절단을 도시한다.
도 22A-22D 는 BhC2C1에 대한 sgRNA 디자인을 도시한다. (도 22A - SEQ ID NO:38 및 662; 도 22B - SEQ ID NO:39; 도 22C - SEQ ID NO:40; 도 22D - SEQ ID NO:41).
도 23 은 BhC2C1을 함유하는 예시적인 구성체의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 24 는 표 12의 상이한 표적 부위에 대한, 플라스미드 형질감염 이후, 표 12의 상이한 sgRNA로 수득된 indel 백분율을 도시한다. 사용된 Cas12b는 BvCas12b였다 (SEQ ID NO:42-47).
도 25 는 BvCas12b를 함유하는 예시적인 구성체의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 26 은 BhCas12b를 함유하는 예시적인 구성체의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 27 은 EbCas12b를 함유하는 예시적인 구성체의 플라스미드 맵을 도시한다.
도. 28 는 AkCas12b를 함유하는 예시적인 구성체의 플라스미드 맵을 도시한다.
도. 29 는 PhyciCas12b를 함유하는 예시적인 구성체의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 30 는 PlancCas12b를 함유하는 예시적인 구성체의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 31 는 BvCas12b를 함유하는 예시적인 구성체 pZ143-pcDNA3-BvCas12b의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 32 는 BvCas12b sgRNA 스캐폴드를 함유하는 예시적인 구성체 pZ147-BvCas12b-sgRNA-scaffold의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 33 는 BhCas12b sgRNA 스캐폴드를 함유하는 예시적인 구성체 pZ148-BhCas12b-sgRNA-scaffold의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 34 는 S893, K846, 및 E836에 돌연변이를 갖는 BhCas12b를 함유하는 예시적인 구성체 pZ149-BhCas12b-S893R-K846R-E836G의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 35 는 S893, K846, 및 E836에 돌연변이를 갖는 BhCas12b를 함유하는 예시적인 구성체 pZ150-pCDNA3-BhCas12b-S893R-K846R-E836K의 플라스미드 맵을 도시한다.
도 36 은 다양한 조건 하에서 BhCas12b에 대한 PAM 발굴 결과를 도시한다.
도 37 은 다양한 조건 하에서 BvCas12b에 대한 PAM 발굴 결과를 도시한다.
도 38 은 상이한 결합 부위에서 BhCas12b 변이체의 indel 백분율을 도시한다.
도 39 은 상이한 결합 부위에서 추가의 BhCas12b 변이체의 indel 백분율을 도시한다.
도 40A 는 DNMT1-1에서 BhCas12b (실시예 20의 변이체 4) 및 BvCas12b에 의한 절단에 따른 HDR을 도시한다 (SEQ ID NO:48-51). 도 40B 는 BhCas12b (실시예 20의 변이체 4) 및 BvCas12bat VEGFA-2 (SEQ ID No:52-55)에 의한 절단에 따른 HDR을 도시한다.
도 41A 는 TTTV PAM에서 AsCas12a 및 BhCas12b 변이체 4 및 BvCas12b ATTN PAMS의 indel 백분율의 비교를 도시한다. 도 41B 는 상이한 PAM 서열에서 BhCas12b 변이체 4 및 BvCas12b 활성의 붕괴를 도시한다.
도 42A 는 ssDNA 도너 (SEQ ID NO:56-59)와 함께 도입시키려는 바람직한 변화를 포함한 VEGFA 표적의 개략도를 도시한다. 도 42B 는 VEGFA 표적 부위에서 각 뉴클레아제의 indel 활성을 도시한다. 도 42C 는 VEGFA 부위에서 바람직한 편집 (2개 뉴클레오티드 치환)을 함유하는 세포의 백분율을 도시한다. 도 42D 는 ssDNA 도너 (SEQ ID No:60-63)와 함게 도입시키려는 바람직한 변화를 포함하는 DNMT1 표적의 개략도를 도시한다. 도 42E 는 DNMT1 표적 부위에서 각 뉴클레아제의 indel 활성을 도시한다. 도 42F 는 DNMT1 부위에서 바람직한 편집 (2개 뉴클레오티드 치환)을 함유하는 세포의 백분율을 도시한다.
도 43 - 좌측 패널은 CXCR4의 표적화된 엑손 및 각각 BhCas12b (v4) 및 BvCas12b (SEQ ID No:64-77)에 의해 표적화된 CXCR4 서열을 도시한다. 우측 패널은 2 도너로부터의 T 세포에서 CXCR4에 대한 BhCas12b (v4) 및 BvCas12b의 효과를 도시한 indel 백분율을 도시한다.
도 44A-44E. 중온성 Cas12b 뉴클레아제의 확인. 도 44A) Cas9, Cas12a, 및 Cas12b 뉴클레아제 간 편차를 강조한 유전자좌 개략도 및 단백질 도메인 구조. SpCas9 (PDB:4oo8), AsCas12a (PDB:5b43), 및 AacCas12b (PDB:5u30)의 결정 구조. 도 44B) 정제된 Cas12b 단백질 및 합성된 crRNA 및 RNA-Seq를 통해 확인된 tracrRNA를 갖는 Cas12b 시스템의 시험관내 재구성. 반응은 90분 동안 표시된 온도 및 250 nM Cas12b 단백질에서 수행되었다. 도 44C, 도 44D) 6종 sgRNA 변이체를 갖는 293T 세포에서 AkCas12b 및 BhCas12b indel 활성. 오차 막대는 n=4 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. sgRNA 서열의 경우 도 50B 및 50C 를 참조한다. 도 44E) BhCas12b sgRNA 구조 및 시험된 변이체 (SEQ ID No:78)의 위치의 개략도.
도 45A-45H. BhCas12b의 합리적 조작. 도 45A) 차등적으로 표지된 DNA 가닥과 시험관내 Cas12b 반응. 보다 느리게 이동하는 산물은 천연 PAGE 분리 동안 관찰되고 변성 PAGE에 의한 분리는 저온에서 비표적 가닥을 절단하기 위해 AkCas12b 및 BhCas12b에 대한 선호도를 밝혀준다. 도 45B) 표적 가닥 및 RuvC 활성 부위 (보라색) 사이 포켓 내 12개 시험된 잔기 중 10개의 위치. BhCas12b 잔기는 고도로 유사한 BthCas12b (PDB: 5wti)의 구조에 강조되어 있다. 도 45C) 야생형 (회색 기호)에 대해 정규화된 DNMT1 표적 4 및 VEGFA 표적 2에서 268 BhCas12b 돌연변이의 Indel 활성. 오차 막대는 n=2 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 45D) 글리신으로 돌연변이된 표면 노출된 잔기의 위치. 도 45E) 야생형 (회색 기호)에 대해 정규화된 IDNMT1 표적 4 및 VEGFA 표적 2에서 66 BhCas12b 돌연변이의 Indel 활성. 오차 막대는 n=2 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 45F) BhCas12b 초활성 변이체의 요약. 도 45G) 4 표적 부위에서 BhCas12b 변이체의 Indel 활성. 오차 막대는 n= 3- 6 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 45H) BhCas12b WT 및 v4 변이체의 농도 증가에 따른 시험관내 절단. 겔은 n=2 실험으로부터의 대표적인 영상이다.
도 46A-46G. BhCas12b v4 및 BvCas12b는 인간 세포주에서 게놈 편집을 매개한다. 도 46A) 28 TTTV 표적에서 AsCpf1, 33 ATTN 표적에서 BhCas12b v4, 및 37 ATTN 표적에서 BvCas12b의 293T 세포에서의 Indel 활성. 각각의 도트는 n=4 복제물로부터 평균낸 단일 표적 부위를 나타낸다. 도 46B) 30 활성 가이드로부터 평균낸 Cas12b 게놈 편집으로부터의 평균 indel 길이. 도 46C) SpCas9 및 Cas12a/b 뉴클레아제에 의해 표적화가능한 DNMT1 표적 부위 및 TG에서 CA로의 돌연변이 및 PAM 파괴 돌연변이를 함유하는 120 nt ssODN 도너 (SEQ ID No:79-83)의 개략도. 도 46D) 유전자좌에서 각 뉴클레아제의 Indel 활성. 오차 막대는 n=8 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 46E) 표적 가닥 (T) 또는 비표적 가닥 (NT) 도너를 사용한 상동성-지정 복구 (HDR)의 빈도. 회색 막대는 TG에서 CA로의 돌연변이의 빈도를 나타내는 한편, 붉은색 막대는 돌연변이가 없는 패널 c의 HDR 서열을 함유하는 완벽한 편집을 의미한다. 오차 막대는 n=6 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 46F) 30 활성 BhCas12b 가이드, 45 활성 AsCas12a 가이드, 및 39 활성 SpCas9 가이드에 의한 게놈 편집 동안 평균 indel 길이. 도 46G) BhCas12b v4 RNP 전달 후 CD4+ 인간 T 세포에서 Indel 활성. 각각의 도트는 개별 전기영동 (n=2)을 나타낸다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로서 제공된다.
도 47A-47B. BhCas12b v4 및 BvCas12b는 고도로 특이적인 뉴클레아제이다. 도 47A) Guide-Seq 분석을 위해 선택된 9 표적 부위에서 293T 세포에서 Indel 활성. 오차 막대는 n=4 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 47B) 각 뉴클레아제에 대한 검출된 절단 부위의 수 및 상대적 비율을 도시한 Guide-Seq 분석. 오프-표적은 연회색 웨지로 표시되는 반면 온-표적은 하기 표시된 온-표적 판독 분율과 함께 파란색으로 강조된다. 오프-표적은 오직 SpCas9에 의해 검출되었으며, 완전 분석의 경우 도 55 를 참조한다.
도 48A-48E Cas12b 오솔로그의 PAM 발굴. 도 48A) Cas12b 오솔로그의 정렬. 도 48B) 정렬 기반의 V-B 아형 이펙터 Cas12b 단백질의 계통수. 서열은 Genbank 단백질 수탁 번호 및 종 명칭으로 표시된다. 이 작업에서 실험적으로 연구된 단백질은 굵게 표시된다. 37C에서 강력한 편집 활성을 보여주고 상세하게 연구된 4개 단백질은 밑줄표시되어 있다. 도 48C) 이. 콜라이에서 PAM 발굴 어세이의 개략도. 도 48D) 고갈된 PAM은 이. 콜라이에서 12 Cas12b 시스템 중 오직 4종에서 검출되었다. 고갈 한계치는 2.32로 한계치 설정값을 갖는 CbCas12b를 제외하고 3.32의 -log2 비율 (점선)로 설정되었다. 고갈된 PAM은 서열 정보를 나타내는 제1 5' 염기에 대한 휠의 중간에서 시작하는 PAM 휠22 을 비롯하여 서열 모티프로서 도시된다. 도 48E) V-B 아형 이펙터 Cas12b 단백질의 계통수. 서열은 Genbank 단백질 수탁 번호 및 종 명칭으로 표시된다. 이 작업에서 실험적으로 연구된 단백질은 파란색으로 표시된다.
도 49A-49F. Cas12b RNA-Seq 및 시험관내 재구성. 도 49A-49D) AkCas12b, BhCas12b, EbCas12b, 및 LsCas12b에 대한 소형 RNA-Seq 판독치의 정렬. 절단 반응에서 사용된 tracrRNA의 위치는 노란색으로 강조되어 있다. 도 49E) 이 연구에서 사용된 정제된 Cas12b 단백질의 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔 및 상업적으로 제조된 AsCas12a (IDT). 도 49F) tracrRNA 및 crRNA를 v1 sgRNA 스캐폴드와 비교하는 AkCas12b 및 BhCas12b에 의한 시험관내 절단 반응.
도 50A-50E. 포유동물 세포에서 Cas12b sgRNA 최적화. 도 50A) 포유동물 세포에서 indel 활성에 대한 발현 구성체 및 어세이의 개략도. 도 50B) AkCas12b sgRNA 변이체 (SEQ ID NO:84-89). 도 50C) BhCas12b sgRNA 변이체 (SEQ ID NO:90-95). 도 50D) AkCas12b sgRNA 구조 및 시험된 변이체 (SEQ ID No:96)의 위치의 개략도. 도 50E) BhCas12b 및 다양한 스페이서 길이에 따른 293T 세포에서의 Indel 활성. 오차 막대는 n=2 복제물로부터의 s.d.로 표시된다.
도 51A-51J. BhCas12b의 합리적 조작. 도 51A) 293T 세포에서 BhCas12b 및 고도로 유사한 BthCas12b 간 indel 활성의 비교. 오차 막대는 n=2 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 51B- 도. 51E) DNMT1 표적 4 및 VEGFA 표적 2에서 BhCas12b 돌연변이체 조합의 Indel 활성. 오차 막대는 n=2 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 51F) Pymol (Schrodinger)을 사용한 BthCas12b의 구조로 모델링된 BhCas12b v4 돌연변이. 도 51G) 정제된 BhCas12b WT 및 v4 단백질의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔. 도 51H) BhCas12b WT 및 v4 변이체에 의한 시험관내 절단 시간-과정. 겔은 n=3 실험으로부터의 대표적인 영상이다. 도 51I, 도. 51J) 패널 h에 도시된 반응으로부터의 dsDNA 절단 산물 (도 51I) 및 상부 닉킹된 산물 (도 51J)의 정량. 오차 막대는 n=3 실험으로부터의 s.d.로 표시된다.
도 52A-52J. BvCas12b의 특징규명. 도 52A) 도 48C 및 48D에 기술된 바와 같은 PAM 발굴. 도 52B) BvCas12b에 대한 소형 RNA-Seq 판독의 정렬. 절단 반응에서 사용된 tracrRNA의 위치는 노란색으로 강조되어 있다. 도 52C-52D) 정제된 단백질 및 합성된 RNA 반응에 의한 BvCas12b의 시험관내 재구성은 90분 동안 표시된 온도 및 250 nM BvCas12b 단백질에서 수행되었다. 도. 52E) 정제된 BvCas12b의 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔. 도 52F) BvCas12b sgRNA 변이체 (SEQ ID NO:97-102). 도 52G) BvCas12b sgRNA 구조 및 시험된 변이체 (SEQ ID No:103)의 위치의 개략도. 도 52H) sgRNA 변이체를 갖는 293T 세포에서 BvCas12b indel 활성. 오차 막대는 n=4 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 52I) 57 표적에서 293T 세포에서 BvCas12b indel 활성. 각각의 도트는 n=4 복제물로부터 평균낸 단일 표적 부위를 나타낸다. 도 52J) 매치된 표적 부위에서 BhCas12b v4 및 BvCas12b 활성의 상관성. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로서 제공된다.
도 53A-53E. BvCas12b의 돌연변이유발. 도 53A) 강조된 위치에서 확인된 표적-가닥 중 BhCas12b 위치 및 BvCas12b의 그들 상응하는 아미노산의 정렬. 도 53B) 도 45A 에 기재된 바와 같이 차등적으로 표지된 DNA 가닥과 시험관내 BvCas12b 반응. 도 53C) 잔기 Q635, D748, R849, H896, T909, I914 및 I919를 표적화하는 79 BvCas12b 돌연변이의 Indel 활성. Indel은 야생형 (회색 기호)에 대해 정규화된 DNMT1 표적 6 및 VEGFA 표적 5에서 측정되었다. 오차 막대는 n=2 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 53D- 53E) DNMT1 표적 6 및 VEGFA 표적 5에서 BhCas12b 돌연변이의 Indel 활성. 오차 막대는 n=2 복제물로부터의 s.d.로 표시된다.
도 54A-54F. BhCas12b v4 및 BvCas12b는 인간 세포주에서 게놈 편집을 매개하였다. 도 54A) 56 표적에서 BhCas12b v4, 및 57 표적에서 BvCas12b의 293T 세포에서의 Indel 활성. 각각의 도트는 n=4 복제물로부터 평균낸 단일 표적 부위를 나타낸다. 도 54B) 매치된 표적 부위에서 BhCas12b v4 및 BvCas12b 활성의 상관성. 도 54C) 클래스 2 CRISPR-Cas 뉴클레아제에 대한 PAM 우세도의 분석. 비차폐된 인간 코딩 서열 내 각 염기로부터 가장 가까운 Cas9 또는 Cas12 절단 부위까지의 거리에 대한 확률 질량 함수. 도 54D) SpCas9 및 Cas12b 뉴클레아제에 의해 표적화가능한 VEGFA 표적 부위 및 TC에서 CA로의 돌연변이 및 PAM 파괴 돌연변이를 함유하는 120 nt ssODN 도너 (SEQ ID No:104-108)의 개략도. 도 54E) 유전자좌에서 각 뉴클레아제의 Indel 활성. 오차 막대는 n=3 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 54F) 표적 가닥 (T) 또는 비표적 가닥 (NT) 도너를 사용한 상동성-지정 복구 (HDR)의 빈도. 회색 막대는 TC에서 CA로의 돌연변이의 빈도를 나타내는 한편, 파란색 막대는 돌연변이가 없는 패널 d의 HDR 서열을 함유하는 완벽한 편집을 의미한다. 오차 막대는 n=3 복제물로부터의 s.d.로 표시된다.
도 55A-55C. BhCas12b v4 및 BvCas12b 미스매치 내성 및 특이성. 도 56A) 각 뉴클레아제에 대한 검출된 절단 부위의 수 및 상대적 비율을 도시한 비매치된 표적의 Guide-Seq 분석. 오프-표적은 연회색 웨지로 표시되는 반면 온-표적은 하기 표시된 온-표적 판독 분율과 함께 파란색으로 강조된다. 전체 분석에 대해 도. 57 을 참조한다. 도 55B-55C) 가이드 sgRNA 및 표적 DNA 사이에 미스매치가 존재할 때 293T 세포에서 Cas12b indel 활성. 미스매치는 표적 가닥을 매치시키기 위해서 sgRNA에 삽입되었다 (즉, C에서 G, A에서 T). BhCas12b v4는 DNMT1 표적 6 및 VEGFA 표적 2에서 시험되었고, 반면 BvCas12b는 DNMT1 표적 6 및 VEGFA 표적 5에서 시험되었다. 오차 막대는 n=4 복제물로부터의 s.d.로 표시된다.
도 56. 매치된 CRISPR-Cas 뉴클레아제 표적의 특이성 분석. 도 47B의 검출된 오프-표적의 전체 Guide-Seq 분석. 검출된 절단 부위 (표적 당 최대 20)의 목록이 작은 박스로 표시된 온-표적 부위와 함께 각 뉴클레아제에 대해 제시되어 있다. 가이드 서열에 대한 미스매치가 강조되어 있다. 표적 1:EMX1 (SEQ ID NO:109-130); 표적 2:EMX1 (SEQ ID NO:131-152); 표적 3:DNMT1 (SEQ ID NO:153-174); 표적 4:CXCR4 (SEQ ID NO:175-176); 표적 5:CXCR4 (SEQ ID NO:178-181); 표적 6:CXCR4 (SEQ ID NO:182-186); 표적 7:VEGFA (SEQ ID NO:187-209); 표적 8:GRIN2B (SEQ ID NO:210-215); 표적 9:CXCR4 (SEQ ID NO:216-221); 표적 10:HPRT1 (SEQ ID NO:222-225).
도 57. 비미스매치된 CRISPR-Cas 뉴클레아제 표적의 특이성 분석. 도 56 의 검출된 오프-표적의 전체 Guide-Seq 분석. 검출된 절단 부위 (표적 당 최대 20)의 목록이 작은 박스로 표시된 온-표적 부위와 함께 각 뉴클레아제에 대해 제시되어 있다. 가이드 서열에 대한 미스매치가 강조되어 있다. SpCas9 비매치 1:DNMT1 (SEQ ID NO:226); SpCas9 비매치 2:EMX1 (SEQ ID NO:227-246); SpCas9 비매치 3:VEGFA (SEQ ID NO:247-248); SpCas9 비매치 4:VEGFA (SEQ ID NO:249-268); SpCas9 비매치 5:VEGFA (SEQ ID NO:269-288); SpCas9 비매치 6:GRIN2B (SEQ ID NO:289-290); AsCas12a 비매치 1:DNMT1 (SEQ ID NO:291); AsCas12a 비매치 2:VEGFA (SEQ ID NO:292-293); AsCas12a 비매치 2:EMX1 (SEQ ID NO:294); AsCas12a 비매치 2:EMX1 (SEQ ID NO:295); SpCas9 비매치 7:VEGFA (SEQ ID NO:296-311); SpCas9 비매치 8:EMX1 (SEQ ID NO:312-320); SpCas9 비매치 9:GRIN2B (SEQ ID NO:321-322); SpCas9 비매치 10:TUBB (SEQ ID NO:323-334); BhCas12b v4 비매치 1:DNMT1-BvCas12b 비매치 8:DNMT1 (SEQ ID NO:335-353); BhCas12b v4 비매치 9:CXCR4-BvCas12b 비매치 14:VEGFA (SEQ ID NO:354-367).
도 58은 Cas12 내 구조적으로 예상되는 ssDNA 경로 (PDB 구조 5U30 기반)를 도시한다.
도 59 은 RESCUE 돌연변이체의 용량 반응이 T 모티프에 대해 시험되었다는 것을 도시한다.
도 60 은 RESCUE 돌연변이체의 용량 반응이 C 및 G 모티프에 대해 시험되었다는 것을 도시한다.
도 61 및 62 는 RESCUE v3, v6, v7, 및 v8에 의한 내생성 표적화를 도시한다.
도 63 은 RESCUE v9에 대한 돌연변이에 대한 스크리닝을 수행되었음을 도시한다.
도 64 는 RESCUEv9에 대한 잠재적 돌연변이가 확인되었음을 도시한다.
도 65 는 염기 플립 및 모티프 시험이 수행되었음을 도시한다.
도 66 은 RESCUEv9의 효과가 상이한 모티프 플립에 대해 시험되었음을 도시한다.
도 67 은 50 bp 가이드를 갖는 RESCUE v1 및 v8에 의한 B6 및 B12 간 비교를 도시한다.
도 68 은 30 bp 가이드를 갖는 RESCUE v1 및 v8에 의한 B6 및 B12 간 비교를 도시한다.
도 69 은 스크리닝된 RESCUE 돌연변이의 요약을 도시한다.
도 70 은 더 나은 베타 카테닌 돌연변이체가 선택된 실험의 결과를 예시하는 그래프이다.
도 71 은 RESCUE 라운드 12의 결과를 예시하는 그래프를 도시한다.
도 72 는 베타 카테닌 이동 어세이를 예시하는 개략도이다.
도 73 은 베타 카테닌에 의해 유도된 세포 이동 어세이의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 74 는 특이성 돌연변이가 A-I 오프-표적을 제거한 것을 예시한 그래프를 도시한다.
도 75 는 Stat1/3 인산화 부위 표적화가 신호전달을 감소시킨다는 것을 예시하는 그래프를 도시한다.
도 76 은 STAT1 비처리에 대한 결과를 도시한 도. 64A 및 STAT1 IFN 처리에 대한 결과를 도시한 도 64B와 함께, Stat1/3 인산화 부위 표적화가 신호전달을 감소시킨다는 것을 예시하는 그래프를 도시한다.
도 77 은 STAT3 IL6 활성화에 대한 결과를 도시한 도 65A 및 STAT3 비처리에 대한 결과를 도시한 도 65B와 함께, Stat1/3 인산화 부위 표적화가 신호전달을 감소시킨다는 것을 예시하는 그래프를 도시한다.
도 78 은 RESCUE 라운드 12의 결과를 예시하는 그래프를 도시한다.
도 79 은 RESCUE 라운드 13의 결과를 예시하는 그래프를 도시한다.
도 80 은 베타 카테닌에 의해 유도된 세포 이동 어세이의 결과를 도시하는 그래프이다.
도 81 - C에서 T 염기 편집 능력을 갖는 Bhv4 절두. 촉매적 불활성 Bhv4의 C-말단 142 아미노산 (dBhv4Δ143 - 불활성화 돌연변이 D574A, 새로운 크기 966 아미노산)의 제거 및 링커 및 래트 Apobec 도메인과 C-말단부의 융합 후에, C에서 T 염기 편집은 비표적 가닥 상의 가이드 염기쌍 위치에서 최대 10.95%의 빈도로 관찰된다. 6.97% 편집 효율이 가이드 위치 15에서 검출된다. 이 활성은 가이드 의존적이다. 존재하는 구성체와의 융합 또는 자유 발현을 통해서, 우라실-DNA 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인의 첨가는 이러한 C에서 T로의 전환을 증가시킬 것으로 예측된다. 열거된 가이드 서열 (대문자)은 HEK 293T 세포에서 GRIN2B 내부 영역을 표적으로 한다 (SEQ ID NO:368).
도 82A-82C- 도 82A) Guide-Seq 분석을 위해 선택된 9 표적 부위에서 293T 세포에서 Cas9, Cas12b, 및 Cas12a indel 활성의 비교 (3 TTTV PAM 부위에서만 시험된, Cas12a 제외). 오차 막대는 n=4 복제물로부터의 s.d.로 표시된다. 도 82B) 각 뉴클레아제에 대한 검출된 절단 부위의 수 및 상대적 비율을 도시한 Guide-Seq 분석. 오프-표적은 연회색 웨지로 표시되는 반면 온-표적은 하기 표시된 온-표적 판독 분율과 함께 보라색 (SpCas9 경우), 진한 파란색 (BhCas12b v4 경우), 또는 연한 파란색 (AsCas12a 경우)으로 강조된다. 오프-표적은 SpCas9에 의해서만 검출되었다. n.t., 미시험됨. 도 82C) 가이드 sgRNA 및 표적 DNA 사이에 미스매치가 존재할 때 293T 세포에서 BhCas12b indel 활성. 미스매치는 표적 가닥을 매치시키기 위해서 sgRNA에 삽입되었다 (즉, C에서 G, A에서 T). 오차 막대는 n=4 복제물로부터의 s.d.로 표시된다.
도 83 - Cas12 절두 및 APOBEC과 N-말단 및 C-말단 융합 및 이의 염기 편집 활성의 개략도를 제공한다.
도 84 - 일정 예의 구현예에 따른 Cas12 염기 편집 데이터를 제공한다 (SEQ ID NO:369-375).
도 85 - 일정 예의 구현예에 따른 Cas12 염기 편집 데이터를 제공한다.
도 86 - 일정 예의 구현예에 따른 가이드 상의 Cas12 염기 편집 데이터를 제공한다 (SEQ ID NO:376-377).
도 87 은 전체 길이 BhCas12b (SEQ ID No:378)를 사용한 예시적인 염기 편집 접근법을 도시한다.
도 88A-88C- 도 88A 는 BhCas12b v4 및 다른 오솔로그 AaCas12b의 indel 활성 간 비교를 도시한다. 도 88B 및 88C 는 BhCas12b v4 또는 BhCas12b를 발현하는 AAV1/2로 뉴런의 형질도입을 입증한다.
도 89A-89B- 도 89A 는 px602-bh-optimize-AAV의 맵을 도시한다. 도 89A 는 px602-bh-optimize-AAV의 맵을 도시한다.
본원에서 도면은 오직 예시의 목적을 위한 것이며, 반드시 척도에 따라 도시된 것은 아니다.
일반 정의
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학의 통상의 용어의 정의 및 기술은 다음의 문헌들에서 확인할 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) (Sambrook, Fritsch, and Maniatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition (2012) (Green and Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology (1987) (F.M. Ausubel et al. eds.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.): Antibodies, A Laboratory Manual (1988) (Harlow and Lane, eds.): Antibodies A Laboratory Manual, 2nd edition 2013 (E.A. Greenfield ed.); Animal Cell Culture (1987) (R.I. Freshney, ed.); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992); and Marten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2nd edition (2011).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형 표현은 문맥에서 달리 명확하게 명시하지 않는 한, 단수형 및 복수형 대상 둘 모두를 포함한다.
용어 "임의의" 또는 "임의로는"은 후술되는 사건, 상황 또는 치환기가 존재하지 않을 수도 있거나 또는 존재할 수도 있고, 그 설명은 사건 또는 상황이 일어나는 예 및 일어나지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다.
종료점에 의한 수치 범위의 설명은 언급된 종료점을 비롯하여, 각 범위 내에 포함된 모든 수 및 분수를 포함한다.
측정가능한 값 예컨대 매개변수, 양, 시간적 지속기간 등을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략" 은 명시된 값과 그로부터의 변동, 예컨대 그러한 변동이 개시된 발명에서 수행하기에 적절하다면, 명시된 값과 그로부터의 +/-10% 이하, +/-5% 이하, +/-1% 이하, 및 +/-0.1% 이하의 변동을 포괄한다는 것을 의미한다. 수식어 "약" 또는 "대략" 이 언급되는 값은 그 자체로 또한 특별히, 그리고 바람직하게 개시된다는 것이 이해될 것이다.
용어 "예시적인" 은 "예, 실례, 또는 예시의 역할을 하는 것" 을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다. "예시적인" 것으로서 본 명세서에서 설명된 임의의 양태 또는 설계는 다른 양태들 또는 설계들에 비해 반드시 선호되거나 유리한 것으로서 해석되지는 않아야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "생물학적 샘플"은 전체 세포 및/또는 생존 세포 및/또는 세포 찌꺼기를 함유할 수 있다. 생물학적 샘플은 "체액" 을 함유할 수 있다 (또는 그로부터 유래할 수 있다). 본 발명은 체액이 양수, 수양액, 유리체액, 담즙, 혈액 혈청, 유액, 뇌척수액, 이구 (귀지), 유미, 미즙, 내림프, 외림프, 삼출액, 대변, 여성 사출액, 위산, 위액, 림프, 점액 (비강 배액 및 점액질 포함), 심낭액, 복막액, 흉수, 고름, 점막분비물, 타액, 피지 (피부 유분), 정액, 객담, 활액, 땀, 눈물, 소변, 질 분비물, 토사물, 및 이의 하나 이상의 혼합물로부터 선택되는 구체예를 포괄한다. 생물학적 샘플은 세포 배양물, 체액, 체액 유래 세포 배양물을 포함한다. 체액은 예를 들어 천공, 또는 기타 수집 또는 샘플링 절차에 의해 포유동물 유기체로부터 수득할 수 있다.
용어 "대상체", "개체", 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게 포유동물, 보다 바람직하게 인간을 의미하고자 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 포유동물은 제한없이 쥣과동물, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 반려 동물을 포함한다. 생체 내에서 수득되거나 또는 시험관 내에서 배양된 생물학적 독립체의 조직, 세포 및 그들 자손이 또한 포괄된다.
이하 다양한 구현예를 기재한다. 특별한 구현예는 본 명세서에 논의되는 보다 넓은 양상에 대한 제한으로서 또는 완전한 설명으로서 의도되는 것이 아님을 유의해야 한다. 특정 구현예와 함께 기재되는 하나의 양태는 반드시 그 구현예로 제한되지 않으며 임의의 다른 구현예(들) 로 실시될 수 있다. 본 명세서 전반에서 "하나의 구현예", "한 구현예", "예시적 구현예" 에 대한 언급은 구현예와 함께 기재된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반의 다양한 위치에서 어구 "하나의 구현예에서", "한 구현예에서", 또는 "예시적 구현예에서" 의 출현은 반드시 모두 동일한 구현예를 언급하지 않지만, 그럴 수도 있다. 더 나아가서, 특정한 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서, 본 개시로부터 당업자에게 자명하게 되는 바와 같이, 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 더 나아가서, 본 명세서에 기술된 일부 구현예가 다른 구현예에 포함된 다른 특성이 아닌 일부를 포함하지만, 상이한 구현예의 특성의 조합이 본 발명의 범주 내에 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 첨부된 청구항에서, 임의의 청구된 구현예들은 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
본원에서 인용되는 모든 출판물, 공개 특허 문서, 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물, 공개 특허 문서, 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로서 특별히 개별적으로 표시한 바와 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다.
개요
일 양상에서, 본 명세서에 개시된 구현예는 조작되거나 또는 단리된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질 및 오솔로그에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 Cas12b 이펙터 단백질 및 오솔로그에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 Cas12b는 C2c1과 상호교환적으로 사용된다. 본 발명은 또한 이러한 오솔로그를 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 비롯하여, 이러한 오솔로그 또는 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이를 포함하는 벡터 또는 벡터 시스템 및 이를 포함하는 전달 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 Cas12b 단백질, CRISPR-Cas 시스템, 폴리핵산 서열, 벡터, 벡터 시스템, 전달 시스템을 포함하는 세포 또는 세포주 또는 유기체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 단백질, CRISPR-Cas 시스템, 폴리핵산 서열, 벡터, 벡터 시스템, 전달 시스템, 세포, 세포주 등의 의학 및 비의학 용도에 관한 것이다. 다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 구현예는 야생형에 비해서 결합 부위에 대한 CRISPR 복합체의 결합을 증강시키고/시키거나 편집 선호도를 변경시키는 비변형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질과 비교해 적어도 하나의 변형을 포함하는 조작된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질에 관한 것이다. 일정 구현예에서, CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 V형 이펙터 단백질, 바람직하게 V-B형이다. 일정한 다른 예의 구현예에서, V-B형 이펙터 단백질은 C2c1 이다. 본 명세서에 개시된 구현예에서 사용을 위해 적합한 예의 C2c1 단백질은 이하에 더욱 상세하게 논의된다. 다른 양상에서, 개시된 구현예는 조작된 가이드를 포함하는 조작된 CRISPR-Cas 시스템에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 CRISPR 이펙터 또는 CRISPR 단백질 또는 Cas (단백질 또는 이펙터)는 Cas12b 단백질 또는 이펙터와 상호교환적으로 사용되고 돌연변이 (예컨대 점 돌연변이(들) 및/또는 절두 포함)될 수 있거나 또는 야생형 단백질일 수 있다.
일부 예에서, 본 개시는 i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질, ii) a) 하나 이상의 표적 서열, 일정 구현예에서, 하나 이상의 표적 DNA 서열에 하이브리드화할 수 있는 3' 가이드 서열, 및 b) 5' 직접 반복부 서열을 포함하는 crRNA, 및 iii) tracr RNA를 포함하여서, crRNA 및 tracr RNA와 복합체 형성된 Cas12b 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체가 형성된 것인 비천연 발생 또는 조작된 시스템을 제공한다.
일부 예에서, 본 개시는 i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질, 및 ii) 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드를 포함하는 비천연 또는 조작된 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 시스템은 tracrRNA를 더 포함한다.
다른 양상에서, 본 명세서에 개시된 구현예는 C2c1을 포함하는, CRISPR-Cas 이펙터 단백질의 전달을 위한 벡터에 관한 것이다. 일정 예의 구현예에서, 벡터는 단일 벡터 내에서 CRISPR-Cas 이펙터 단백질의 패키징을 허용하도록 설계된다. 또한 표적화 전달 및 조직-특이성을 위해 더 큰 이식유전자를 패키징하고 따라서 발현시키기 위한 치밀한 프로모터의 디자인에 대한 관심이 증가하고 있다. 따라서, 다른 양상에서 본 명세서에 개시된 일정 구현예는 전신 전달을 위해 더 큰 유전자를 전달하는 전달 벡터, 구성체, 및 방법에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템을 개발 또는 설계하기 위한 방법에 관한 것이다. 다른 양상에서, 본 발명은 제한없이, 치료제 개발, 생물생성, 및 식물 및 농업 적용분야를 포함한, 광범위한 적용의, 최적화된 CRISPR-Cas 시스템을 개발하거나 또는 설계하기 위한 방법에 관한 것이다. 일정 기반 요법 또는 치료제에서. 본 발명은 특히 CRISPR-Cas 시스템, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 기반 요법 또는 치료제를 개선시키기 위한 방법에 관한 것이다. 성공적인 CRISPR-Cas 시스템, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 기반 요법 또는 치료제의 핵심 특징은 고특이성, 고효율성, 및 고안전성을 포함한다. 고특이성 및 고안전성은 특히 오프-표적 효과의 감소에 의해 달성될 수 있다. 유사하게 개선된 특이성 및 효율성은 식물 및 생물생성에서의 적용분야를 개선시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 기반 요법 또는 치료제의 특이성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 추가 양상에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 기반 요법 또는 치료제의 효율성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 추가 양상에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 기반 요법 또는 치료제의 안전성을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 추가 양상에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 기반 요법 또는 치료제의 특이성, 효율성, 및/또는 안전성, 바람직하게 전부를 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.
일정 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 CRISPR 이펙터를 포함한다.
본 발명의 방법은 본 명세서의 다른 곳에 더욱 기술된 바와 같이, CRISPR-Cas 시스템과 연관된 선택된 매개변수 또는 변수 및/또는 이의 기능성의 최적화를 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에서 CRISPR-Cas 시스템의 최적화는 표적(들), 예컨대 치료 표적 또는 치료 표적들, CRISPR-Cas 시스템 조절 방식 또는 유형, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 기반 치료 표적(들) 조절, 변형, 또는 조작을 비롯하여, CRISPR-Cas 시스템 성분의 전달에 따라 좌우될 수 있다. 하나 이상의 표적은 유전자형 분석 및/또는 표현형 분석 결과에 따라서, 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 치료 표적은 (유전자) 질환 병인론 또는 바람직한 치료 결과에 따라서 선택될 수 있다. (치료) 표적(들)은 단일 유전자, 유전자좌, 또는 다른 게놈 부위일 수 있거나, 또는 다수 유전자, 유전자좌, 또는 다른 게놈 부위일 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 단일 유전자, 유전자좌, 또는 다른 게놈 부위는 예컨대 다수 gRNA의 사용을 통해서, 1회 초과로 표적화될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템 활성, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 디자인은 표적 파괴, 예컨대 표적 돌연변이, 예컨대 유전자 녹아웃 초래를 포함할 수 있다. CRISPR-Cas 시스템 활성, 예컨대 CRISPR-Cas 시스템 디자인은 특정 표적 부위의 치환, 예컨대 표적 교정의 초래를 포함할 수 있다. CISPR-Cas 시스템 디자인은 특정 표적 부위의 제거, 예컨대 표적 결실의 초래를 포함할 수 있다. CRISPR-Cas 시스템 활성은 표적 부위 기능성, 예컨대 예를 들어 (전사 및/또는 후생유전적) 유전자 또는 게놈 영역 활성화 또는 유전자 또는 게놈 영역 침묵화를 초래하는, 표적 부위 활성 또는 접근성의 조절을 포함할 수 있다. 당업자는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 표적 부위 기능성의 조절이 CRISPR 이펙터 돌연변이 (예컨대 예를 들어 촉매적 불활성 CRISPR 이펙터의 발생) 및/또는 기능화 (예컨대 예를 들어 이종성 기능성 도메인, 예컨대 전사 활성인자 또는 억제인자와 CRISPR 이펙터의 융합)를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 다른 양상에서, 본 발명은 변형된 CRISPR 이펙터 단백질 및 기능성 도메인(들)을 포함하는 부위 지정 염기 편집을 위한 조작된 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, RNA 염기-편집이 존재한다. 본 발명의 일 구현예에서, DNA 염기-편집이 존재한다. 일정 구현예에서, 기능성 도메인은 시티딘 및 아데노신 디아미나제를 포함한, 디아미나제 또는 이의 촉매 도메인을 포함한다. 본 명세서에 개시된 구현예에서 사용을 위해 적합한 예의 기능성 도메인은 이하에 더욱 상세하게 논의된다.
일정 예의 구현예에서, CRISPR 복합체를 형성하도록 가이드 서열을 포함하는 핵산과 복합체를 형성하는 조작된 CRISPR-Cas 이펙터 단백질로서, CRISPR 복합체에서 핵산 분자는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 유전자좌를 표적으로 하고, 단백질은 야생형과 비교하여 편집 선호도를 변경시키고/시키거나 결합 부위에 대한 CRISPR 복합체의 결합을 증강시키는 비변형된 단백질과 비교하여 적어도 하나의 변형을 포함한다. 편집 선호도는 indel 형성과 관련될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 표적 유전자좌에서 하나 이상의 특이적 indel의 형성을 증가시킬 수 있다. CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 V형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질일 수 있다. 일정 예의 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 Cas12b로도 공지된, C2c1, 또는 이의 오솔로그이다.
본 발명은 관심 표적 유전자좌와 연관된 또는 상기 표적 유전자좌에서의 서열을 변형시키거나 게놈 편집하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 임의의 원하는 세포 유형, 원핵 또는 진핵생물 세포로 C2c1 이펙터 단백질 복합체를 도입하여 C2c1 이펙터 단백질 복합체가 효과적으로 진핵생물 또는 원핵생물 세포의 게놈 내로 DNA 삽입물을 통합시키는 작용을 하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포이고 게놈은 포유동물 게놈이다. 바람직한 구현예에서, DNA 삽입물의 통합은 비-상동성 말단 접합(non-homology end joining; NHEJ)-기반 유전자 삽입 메커니즘에 의해 촉진된다. 바람직한 구현예에서, DNA 삽입물은 외생성으로 도입된 DNA 주형 또는 복구 주형이다. 바람직한 일 구현예에서, 외생성으로 도입된 DNA 주형 또는 복구 주형은 복합체의 성분의 발현을 위하여 C2c1 이펙터 단백질 복합체 또는 하나의 성분 또는 폴리뉴클레오티드 벡터와 함께 전달된다. 더 바람직한 구현예에서, 진핵생물 세포는 비분할 세포(예를 들어 HDR을 통한 게놈 편집이 특히 어려운 비분열 세포)이다.
본 발명은 또한 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하고, 방법은 상기 유전자좌에 C2c1 유전자좌 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 조성물을 전달하는 단계를 포함하고, C2c1 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 상기 복합체가 관심 유전자좌에 결합시 이펙터 단백질은 관심 표적 유전자좌의 변형을 유도한다. 일 구현예에서, 변형은 가닥 파손의 도입이다. 가닥 파손은 비상동성 말단 접합이 후속될 수 있다. 다른 구현예에서, 복구 주형이 제공되고, 파손은 상동성 재조합이 후속된다.
본 발명에 따라서, 핵산을 변형시키는 효소가 제공된다. 이러한 일 구현예에서, DNA의 염기 편집이 존재한다. 다른 이러한 일 구현예에서, RNA의 염기 편집이 존재한다. 보다 특히, 본 발명은 세포에서 핵염기를 변형시킬 수 있는 디아미나제 및 디아미나제 변이체를 제공한다. 일 구현예에서, 디아미나제는 DNA/RNA 듀플렉스 내 미스매치를 표적으로 하고 표적의 미스매치된 DNA 염기를 편집한다. 다른 구현예에서, 디아미나제는 RNA/RNA 듀플렉스 내 미스매치를 표적으로 하고 표적 RNA 염기를 편집한다.
이러한 방법에서 관심 표적 유전자좌는 세포 내의 핵산 분자에 포함될 수 있다. 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 포유류 세포는 비-인간 영장류, 소, 돼지, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 세포는 비-포유류 진핵생물 세포 예컨대 가금류, 어류 또는 새우일 수 있다. 세포는 식물 세포일 수도 있다. 식물 세포는 작물 식물 예컨대 카사바, 옥수수, 수수, 밀 또는 쌀의 세포일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류, 수목 또는 채소의 세포일 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은, 세포 및 세포의 자손이 생물학적 생성물, 예컨대 항체, 전분, 알코올 또는 기타 다른 원하는 세포 산출물의 개선된 생성을 위하여 변경되도록 하는 것일 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은 세포 및 세포의 자손이 생성된 생물학적 생성물을 변화시키는 변경을 포함하도록 하는 것일 수 있다.
기재된 방법 중 임의의 것에서, 관심 표적 유전자좌는 관심 게놈 또는 후생유전체 유전자좌일 수 있다. 기재된 방법 중 임의의 것에서, 복합체는 다중화된 사용을 위하여 다수의 가이드와 함께 전달될 수 있다. 기재된 방법 중 임의의 것에서 하나 초과의 단백질(들)이 사용될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템
일반적으로, CRISPR 시스템은 전술한 문헌, 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)에서 사용된 대로 일 수 있고 Cas 유전자, 특히 C2c1 유전자를 코딩하는 서열, tracr (trans-activating CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "직접 반복부" 및 tracrRNA-프로세싱된 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "스페이서"라고도 함), 또는 이 용어가 본 명세서에서 사용되는 대로의 "RNA(들)" (예를 들어, 가이드 C2c1에 대한 RNA(들), 예를 들어, CRISPR RNA 및 트랜스활성화 (tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA) (키메라 RNA)) 또는 CRISPR 유전자좌 유래의 다른 서열 및 전사물을 포함하는, CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현 또는 그의 활성 유도에 관여하는 전사물 및 다른 엘리먼트를 집합적으로 의미한다.
일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우 프로토스페이서로도 지칭) 의 위치에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. CRISPR 복합체 형성의 맥락에서, "표적 서열" 은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. Cas12b 단백질을 포함하는 구현예에서 형성된 CRISPR 복합체는 본 명세서의 다른 곳에 기술된, crRNA 및 tracrRNA와의 복합체를 포함할 수 있다. 표적 서열에 대한 상보성이 절단 활성에 중요한 가이드 서열의 부분은 본 명세서에서 씨드 서열이라고 한다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치되고, 미토콘드리아, 세포기관, 소포, 리포솜 또는 세포 내에 존재하는 입자에서의 또는 이들로부터의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 특히 비-핵 용도를 위해, NLS 는 바람직하지 않다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 하나 이상의 핵 이출 신호 (NES)를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 하나 이상의 NLS 및 하나 이상의 NES 를 포함한다. 일부 구현예에서, 직접 반복부는 임의의 또는 전부의 하기 기준을 충족하는 반복 모티프에 대한 검색을 통해서 인 실리코에서 확인할 수 있다. 1. II형 CRISPR 유전자좌에 측접한 게놈 서열의 2 Kb 창에서 발견; 2. 20 내지 50 bp 범위; 및 3. 20 내지 50 bp 간격. 일부 구현예에서, 이들 기준 중 2 가지, 예를 들어 1 과 2, 2 와 3, 또는 1 과 3 이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3 가지 기준 모두가 사용될 수 있다.
일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 구성요소를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성 경우에, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인된 서열을 의미하고, 여기서 표적 DNA 서열과 가이드 서열 간 하이브리드화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다.
용어 "가이드 분자", "가이드 RNA" 및 "가이드"는 제한없이 CRISPR-Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 핵산 서열과 충분한 상보성을 갖는 가이드 서열을 포함하여 표적 핵산 서열과 하이브리드화하고 표적 핵산 서열과 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 RNA-기반 분자를 포함하여, 핵산-기반 분자를 의미하고자 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 가이드 분자 또는 가이드 RNA는 특별히 본 명세서에 기술된 바와 같이, (예를 들어, 2개의 리보뉴클레오티드를 화학적으로 연결하거나 또는 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드로 치환시켜서) 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 RNA-기반 분자를 포괄한다.
일정 구현예에서, 표적 서열은 PAM (protospacer adjacent motif) 또는 PFS (protospacer flanking sequence 또는 site), 다시 말해서, CRISPR 복합체에 의해 인식되는 짧은 서열과 회합되어야 한다. CRISPR-Cas 단백질의 성질에 따라서, 표적 서열은 DNA 듀플렉스 내 이의 상보성 서열 (본 명세서에서 비-표적 서열이라고도 함)이 PAM의 상류 또는 하류에 존재하도록 선택되어야 한다. CRISPR-Cas 단백질이 C2c1 단백질인 본 발명의 구현예에서, a 내 표적 서열의 상보성 서열은 PAM의 하류 또는 3'에 존재한다. PAM을 위한 정확한 서열 및 길이 요건은 사용되는 C2c1 단백질에 따라 상이하지만, PAM은 전형적으로 프로토스페이서 (즉, 표적 서열)에 인접한 25 염기쌍 서열이다. 상이한 C2c1 오솔로그에 대한 천연 PAM 서열의 예는 하기 본 명세서에서 제공하고 당업자는 소정 C2c1 단백질과 사용을 위한 추가 PAM 서열을 확인할 수 있을 것이다.
시스템은 하나 이상의 표적 서열의 변형을 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 세포 또는 세포 개체군에서). 변형은 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 야기시킬 수 있다. 일부 예들에서, 적어도 하나의 유전자 산물의 발현은 증가될 수 있다. 일부 예들에서, 적어도 하나의 유전자 산물의 발현은 감소될 수 있다.
일부 예에서, 변형은 세포 또는 세포의 개체군에서 만들 수 있고, 변형은 내생성 또는 비내생성 생물학적 산물 또는 화학적 화합물을 생산하고/하거나 분비하는 세포 또는 개체군을 야기시킬 수 있다. 화학적 화합물 또는 생물학적 산물은 저분자량 화합물을 포함할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 거대 화합물, 또는 변형 및 비변형 핵산 예컨대 안티센스 핵산, RNAi, 예컨대 siRNA 또는 shRNA, CRISPR-Cas 시스템, 펩티드, 펩티드모방체, 수용체, 리간드, 및 항체, 압타머, 폴리펩티드, 핵산 유사체 또는 이의 변이체를 포함하여, 소정 상황에서 효과적인 임의의 유기 또는 무기 분자일 수도 있다. 예에는 제한없이 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNAzyme, 당단백질, siRNA, 지단백질, 압타머, 및 이의 변형 및 조합을 포함한, 핵산, 아미노산, 또는 탄수화물의 올리고머를 포함한다. 작용제는 화학제; 소형 분자; 핵산 서열; 핵산 유사체; 단백질; 펩티드; 압타머; 항체; 또는 이의 단편을 포함한 군으로부터 선택될 수 있다. 핵산 서열은 RNA 또는 DNA일 수 있고, 단일 또는 이중 가닥일 수 있으며, 관심 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산 유사체, 예를 들어 펩티드 -핵산 (PNA), 슈도-상보성 PNA (pc-PNA), 잠김 핵산 (LNA), 변형된 RNA (mod-RNA), 단일 가이드 RNA 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 핵산 서열은 예를 들어, 제한없이, 예를 들어 전사 억제인자로서 작용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 안티센스 분자, 리보자임, 소형 억제성 핵산 서열, 예를 들어 제한없이, RNAi, shRNAi, siRNA, 마이크로 RNAi (mRNAi), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 특이적 DNA 표적 서열로 CRISPR 효소를 표적화하는 CRISPR 가이드 RNA 등을 포함한다. 단백질 및/또는 펩티드 또는 이의 단편은 임의의 관심 단백질, 예를 들어, 제한없이, 돌연변이된 단백질; 치료 단백질 및 절두 단백질일 수 있고, 여기서 단백질은 세포 내에서 정상적으로 부재하거나 또는 저 수준으로 발현된다. 단백질은 또한 돌연변이된 단백질, 유전자 조작된 단백질, 펩티드, 합성 펩티드, 재조합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 미니바디, 인간화 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 변형된 단백질 및 이의 단편을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 작용제는 세포로 핵산 서열의 도입 결과로서 세포 내에서 세포내일 수 있고 이의 전사는 세포 내에서 유전자의 단백질 조절인자 및/또는 핵산의 생산을 일으킬 수 있다. 일부 구현예에서, 작용제는 제한없이 합성 및 천연 발생 비단백질성 독립체를 포함한, 임의의 화확물, 독립체 또는 모이어티이다. 일정 구현예에서, 작용제는 화학 모이어티를 갖는 소형 분자이다. 작용제는 바람직한 활성 및/또는 속성을 갖는 것으로 알려진 것일 수 있거나, 또는 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
PAM의 결정
출원인은 PAM과 내성 유전자 둘 모두를 함유하는 플라스미드를 이종성 이. 콜라이 내로 도입하고, 이어서, 상응하는 항생제 상에서 플레이팅한다. 플라스미드의 DNA 절단이 있다면, 출원인은 생존 가능한 콜로니를 관찰하지 못한다. 추가 상세한 설명에서, 어세이는 DNA 표적에 대해 다음과 같다. 2 종의 이. 콜라이 균주가 본 어세이에서 사용된다. 하나는 박테리아 균주로부터 내생성 이펙터 단백질 유전자좌를 코딩하는 플라스미드를 운반한다. 다른 균주는 빈 플라스미드 (예를 들어, pACYC184, 대조군 균주)를 운반한다. 모든 가능한 7 또는 8 bp PAM 서열은 항생체 내성 플라스미드 (암피실린 내성 유전자를 갖는 pUC19) 상에 존재한다. PAM은 프로토-스페이서 1 (내생성 이펙터 단백질 유전자좌에서 제1 스페이서에 대한 DNA 표적)의 서열 다음에 위치된다. 2개의 PAM 라이브러리를 클로닝하였다. 하나는 프로토-스페이서의 5'에 8개의 무작위 bp를 갖는다 (예를 들어, 총 65536개의 상이한 PAM 서열 = 복잡성). 다른 라이브러리는 프로토-스페이서의 3'에 7개의 무작위 bp를 갖는다(예를 들어, 총 복잡성은 16384 상이한 PAM임). 라이브러리는 둘 모두 가능한 PAM 당 평균 500개의 플라스미드를 갖도록 클로닝되었다. 시험 균주 및 대조군 균주는 별개의 형질전환에서 5'PAM 및 3'PAM 라이브러리로 형질전환되었고, 형질전환된 세포는 암피실린 플레이트 상에서 별개로 플레이팅되었다. 플라스미드에 의한 인식 및 후속적 절단/간섭은 암피실린에 취약한 세포를 제공하며, 성장을 방지한다. 형질전환의 대략 12시간 후에, 채취한 시험 및 대조군 균주에 의해 형성되는 모든 콜로니 및 플라스미드 DNA가 단리되었다. 플라스미드 DNA는 PCR 증폭 및 후속적 심층 시퀀싱을 위한 주형으로서 사용되었다. 비형질전환 라이브러리에서 모든 PAM의 제시는 형질전환 세포에서 PAM의 예상되는 표현을 나타내었다. 대조군 균주에서 발견되는 모든 PAM의 표현은 실제 표현을 보였다. 시험 균주에서 모든 PAM의 표현은 PAM이 효소에 의해 인식되지 않으며 대조군 균주에 대한 비교가 감손된 PAM 서열의 추출을 허용한다는 것을 나타낸다.
지금까지 확인된 C2c1 오솔로그 경우에, 하기 PAM이 확인되었다: 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) ATCC 49025 C2c1p (AacC2c1)는 5' TTN PAM (여기서 N은 A, C, G, 또는 T이고, 보다 바람직하게 N은 A, G, 또는 T 임)이 선행하는 표적 부위를 절단할 수 있고; 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) 균주 B4166 C2c1p (BthC2c1)는 ATTN (여기서 N은 A/C/G 또는 T임)가 선행되는 부위를 절단할 수 있다.
코돈 최적화된 핵산 서열
이펙터 단백질이 핵산으로서 투여되는 경우에, 본 출원은 코돈-최적화된 CRISPR-Cas V형 단백질, 보다 특히 C2c1-코딩 핵산 서열 (및 임의로는 단백질 서열)의 사용을 예상한다. 코돈-최적화된 서열의 예로서 예를 들어 진핵생물, 예를 들어 인간 (즉, 인간에서 발현을 위해 최적화됨), 또는 다른 진핵생물의 경우에, 본 명세서에 논의된 바와 같은 동물 또는 포유동물에서의 발현을 위해 최적화된 서열이고; 예를 들어 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)의 SaCas9 인간 코돈-최적화된 서열을 코돈 최적화된 서열의 예로서 참조한다 (당업계 및 본 개시의 지식으로부터, 특히 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1)에 대한, 코돈 최적화 코딩 핵산 분자(들)는 당업자의 영역 내임). 이것이 바람직하지만, 다른 예가 가능하며, 인간 이외의 숙주 종에 대한 코돈 최적화 또는 특정 장기에 대한 코돈 최적화가 공지되어 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, DNA/RNA-표적화 Cas 단백질을 코딩하는 효소 코딩 서열은 특정 세포, 예컨대, 진핵생물 세포에서 발현에 대해 코돈 최적화된다. 진핵생물 세포는 특정 유기체, 예컨대, 제한없이 인간, 또는 비-인간 진핵생물 또는 본 명세서에서 논의되는 동물 또는 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축 또는 인간이외의 포유동물 또는 영장류를 포함하는, 포유동물 또는 식물의 것일 수 있거나 또는 그로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간의 생식 계통 유전적 동일성을 변형시키기 위한 과정 및/또는 사람 또는 동물, 및 이러한 과정으로부터 초래된 동물에 임의의 실질적인 의학적 이점 없이 그들에게 고통을 야기할 가능성이 있는 동물의 유전적 동일성을 변형시키는 과정은 배제될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 해당 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 숙주 세포에서 증강된 발현을 위한 핵산 서열을 변형시키는 한편, 천연 아미노산 서열을 유지시키는 과정을 의미한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 소정의 코돈에 대한 특정 편향성을 나타낸다. 코돈 편향성 (유기체 사이의 코돈 용법 차이)은 종종 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있는데, 이는 결국 특히 번역 중인 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존하는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세성은 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기반하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤될 수 있다. 코돈 용법 표는, 예를 들어, www.kazusa.orjp/codon/에서 이용 가능한 "코돈 용법 데이터베이스"에서 용이하게 이용 가능하며, 이들 표는 다수의 방법에서 적합하게 될 수 있다. 참조: Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000). 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화시키는 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용 가능하며, 예를 들어 Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA) 이 또한 이용가능하다. 일부 구현예에서, DNA/RNA-표적화 Cas 단백질을 코딩하는 서열에서 하나 이상의 코돈 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 대응한다 효모에서의 코돈 용법에 관해서, http://www.yeastgenome.org/community/codon_usage.shtml에서 입수가능한 온라인 Yeast Genome 데이타베이스 또는 [Codon selection in yeast, Bennetzen and Hall, J Biol Chem. 1982 Mar 25;257(6):3026- 31]를 참조한다. 조류를 포함한 식물에서 코돈 용법에 관해서, [Codon usage in higher plants, green algae, and cyanobacteria, Campbell and Gowri, Plant Physiol. 1990 Jan; 92(1): 1-11.]를 비롯하여, [Codon usage in plant genes, Murray et al, Nucleic Acids Res. 1989 Jan 25;17(2):477-98] 또는 [Selection on the codon bias of chloroplast and cyanelle genes in different plant and algal lineages, Morton BR, J Mol Evol. 1998 Apr;46(4):449-59]를 참조한다.
가이드 분자
본 명세서에서 사용되는 용어 V형 또는 VI 형 CRISPR-Cas 유전자좌 이펙터 단백질의 "crRNA" 또는 "가이드 RNA" 또는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA" 또는 "하나 이상의 핵산 성분"은 적합한 정렬 알고리즘을 사용해 최적으로 정렬 시, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상의 상보성 정도로, 표적 핵산 서열과 하이브리드화하고, 표적 핵산 서열과 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 최적 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있고, 이의 비제한적인 예는 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분취 (Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우스-윌러스 (Burrows-Wheeler) 전환 기반 알고리즘 (예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; www.novocraft.com에서 입수가능), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 입수가능), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 입수가능)을 포함한다. 표적 핵산 서열에 대한 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 (핵산-표적화 가이드 RNA 내의) 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 비롯한 핵산-표적화 복합체를 형성하는데 충분한 핵산-표적화 CRISPR 시스템의 성분은 상응하는 표적 핵산 서열을 갖는 숙주 세포에, 예컨대, 핵산-표적화 복합체 성분을 코딩하는 벡터에 의한 형질감염, 이후 표적 핵산 서열 내의 우선적인 표적화 (예를 들어, 절단) 평가에 의해, 예컨대, 본원에서 기재된 바와 같은 Surveyor 어세이에 의해 제공될 수 있다. 유사하게는, 표적 핵산 서열의 절단은 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 비롯한, 핵산-표적화 복합체 성분인 표적 핵산 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열과 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험 튜브에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하며, 당업자에게 떠오를 것이다. 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하기 위해 가이드 서열, 및 그에 따른 핵산-표적화 가이드가 선택될 수 있다. 표적 서열은 DNA 일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 메신저 RNA (mRNA), 프리-mRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 핵소체 RNA (snoRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 비-코딩 RNA (ncRNA), 긴 비-코딩 RNA (lncRNA), 및 소형 세포질 RNA (scRNA) 로 이루어지는 군에서 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA, 전-mRNA 및 rRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 ncRNA 및 lncRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 더 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 전-mRNA 분자 내의 서열일 수 있다. 본 발명에서, 디아미나제는 표적 핵산 서열을 접합시키거나 또는 표적 서열은 본 명세서에서 "표적 아데노신"이라고도 하는 탈아미노화되는 표적 아데노신을 포함하는 서열이다. 일부 구현예에서, 상기 본 명세서에 기술된 상보성은 의도된 미스매치, 예컨대 본 명세서에 기술된 dA-C 미스매치는 배제한다. 가이드 서열은 원핵생물 세포 내 표적 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있다. 가이드 서열은 진핵생물 세포 내 표적 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산-표적화 가이드는 핵산-표적화 가이드 내에서 2차 구조 정도를 감소시키도록 선택된다. 일부 구현예에서, 최적으로 폴딩될 때 핵산-표적화 가이드의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이하가 자기-상보성 염기 짝짓기에 참여한다. 최적의 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 깁스 (Gibbs) 자유 에너지의 계산을 기반으로 한다. 이러한 알고리즘의 예는 [Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)]에 기술된 바와 같은, mFold이다. 또 다른 폴딩 알고리즘의 예는 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여, 비엔나 대학의 이론 화학 연구소 (Institute for Theoretical Chemistry at the University of Vienna) 에서 개발한 온라인 웹서버 RNAfold 이다 (예를 들어, [A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24]; 및 [PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조).
일정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 crRNA 는 직접 반복 (DR) 서열 및 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있거나, 그로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 그로 이루어질 수 있다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 crRNA 는 가이드 서열 또는 스페이서 서열에 융합되거나 연결된 직접 반복 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 그로 이루어질 수 있거나, 그로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 상류 (즉, 5') 에 위치될 수 있다. 다른 구현예에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 하류 (즉, 3') 에 위치될 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 서열과 표적 서열 사이에 형성된 헤테로듀플렉스가 표적 서열 상에서 탈아미노화를 위해 표적 A에 마주보는 가이드 서열에서 짝짓지 않은 C를 포함하도록, 가이드 분자는 표적 서열과 적어도 하나의 미스매치를 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 이런 A-C 미스매치 이외에, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때, 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다.
일정 구현예에서, 가이드 분자의 가이드 서열 또는 스페이서 길이는 10 nt 내지 50 nt, 보다 특히 15 내지 35 nt 이다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA의 스페이서 길이는 적어도 15 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 스페이서 길이는 10 내지 15 nt, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 14, 15 내지 17 nt, 예를 들어, 15, 16, 또는 17 nt, 17 내지 20 nt, 예를 들어 17, 18, 19, 또는 20 nt, 20 내지 24 nt, 예를 들어, 20, 21, 22, 23, 또는 24 nt, 23 내지 25 nt, 예를 들어, 23, 24, 또는 25 nt, 24 내지 27 nt, 예를 들어, 24, 25, 26, 또는 27 nt, 27-30 nt, 예를 들어, 27, 28, 29, 또는 30 nt, 30-35 nt, 예를 들어, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 nt, 또는 35 nt 또는 그 이상의 길이이다. 일정 예의 구현예에서, 가이드 서열은 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100 nt이다.
CRISPR-Cas 시스템의 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 100% 이상일 수 있고; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA 는 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있거나; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA 는 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이일 수 있고; 유리하게는 tracr RNA 는 30 또는 50 개 뉴클레오티드 길이이다. 그러나, 본 발명의 양태는 오프-표적 상호작용을 감소시키는 것이고, 예를 들어 낮은 상보성을 갖는 표적 서열과 상호작용하는 가이드를 감소시키는 것이다. 실제로, 예에서, 80% 초과 내지 약 95% 상보성, 예를 들어, 83%-84% 또는 88-89% 또는 94-95% 상보성을 갖는 오프-표적 서열과 표적 서열을 구별할 수 있는 CRISPR-Cas 시스템을 생성시키는 돌연변이를 포함한다는 것을 보여준다 (예를 들어, 18 개 뉴클레오티드를 갖는 표적과 1, 2 또는 3 개 미스매치를 갖는 18 개 뉴클레오티드의 오프-표적을 구별함). 따라서, 본 발명의 상황에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 94.5% 또는 95% 또는 95.5% 또는 96% 또는 96.5% 또는 97% 또는 97.5% 또는 98% 또는 98.5% 또는 99% 또는 99.5% 또는 99.9%, 또는 100% 초과이다. 오프 표적은 서열과 가이드 사이에, 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 또는 94% 또는 93% 또는 92% 또는 91% 또는 90% 또는 89% 또는 88% 또는 87% 또는 86% 또는 85% 또는 84% 또는 83% 또는 82% 또는 81% 또는 80% 미만의 상보성이며, 오프 표적이 서열과 가이드 사이에, 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 의 상보성인 것이 유리하다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 구현예에서, 가이드 RNA (Cas를 표적 유전자좌로 가이드할 수 있음)는 (1) 진핵생물 세포에서 게놈 표적 유전자좌와 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열; (2) tracr 서열; 및 (3) tracr 메이트 서열을 포함할 수 있다. (1) 내지 (3)은 모두 단일 RNA, 즉, sgRNA (5'에서 3' 배향으로 배열됨)에 존재할 수 있거나, 또는 tracr RNA는 가이드 및 tracr 서열을 함유하는 RNA와 상이한 RNA일 수 있다. tracr은 tracr 메이트 서열에 하이브리드화하고, CRISPR/Cas 복합체를 표적 서열로 유도한다. tracr RNA가 가이드 및 tracr 서열을 함유하는 RNA와 상이한 RNA 상에 있는 경우에, 각각의 RNA의 길이는 그들의 각각의 천연 길이로부터 짧아지기에 최적화될 수 있고, 각각은 독립적으로 세포의 RNase에 의해 분해로부터 보호하도록 화학적으로 변형되거나 또는 달리 안정성을 증가시킬 수 있다.
"tracrRNA" 서열 또는 유사체라는 용어는 하이브리드화를 위해 crRNA 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 최적으로 정렬될 때 둘 중 더 짧은 것의 길이를 따라서 tracrRNA 서열과 crRNA 서열 사이의 상보성 정도는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 길이가 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, tracr 서열 및 crRNA 서열은, 둘 사이의 하이브리드화가 2차 구조, 예컨대 헤어핀을 갖는 전사물을 생성하도록 단일 전사물 내에 함유된다. 본 발명의 구현예에서, 전사물 또는 전사된 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 2개 이상의 헤어핀을 가진다. 바람직한 구현예에서, 전사물은 2, 3, 4 또는 5개의 헤어핀을 가진다. 본 발명의 추가적인 구현예에서, 전사물은 최대 5개의 헤어핀을 가진다. 헤어핀 구조에서, 최종 "N"의 서열 5' 부분 및 루프의 상류는 tracr 메이트 서열에 대응하고, 루프의 서열 3'의 부분은 tracr 서열에 대응한다. 일부 구현예에서, 시스템은 하나 이상의 crRNA를 포함한다. 예를 들어, 시스템은 둘 이상의 crRNA를 포함할 수 있다.
일반적으로, 상보성 정도는 두 서열 중 더 짧은 것의 길이를 따라서, 가이드 서열 및 tracr 서열의 최적의 정렬에 관한 것이다. 최적 정렬은 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있고, 이차 구조, 예컨대 sca 서열 또는 tracr 서열 내 자가-상보성에 대해 더욱 설명될 수 있다. 일부 구현예에서, 최적으로 정렬될 때 둘 중 더 짧은 것의 길이를 따라서 tracrRNA 서열과 crRNA 서열 사이의 상보성 정도는 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다.
본 발명의 한 측면에서, 가이드는 5'-핸들 및 씨드 영역 및 3'-말단을 추가로 포함하는 가이드 분절을 갖는, C2c1에 대한 변형된 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 가이드는 표 1 및 2에 열거된 오솔로그 중 어느 하나의 C2c1과 함께 사용될 수 있다.
변형된 가이드
일정 구현예에서, 본 발명의 가이드는 비-천연 발생 핵산 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 화학적 변형을 포함한다. 비-천연 발생 핵산은 예를 들어 천연 및 비-천연 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 비천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 리보스, 포스페이트, 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 가이드 핵산은 리보뉴클레오티드 및 비-리보뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 일 구현예에서, 가이드는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 가이드는 하나 이상의 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합이 있는 뉴클레오티드, 리보스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 브릿지를 포함하는 잠금 핵산(LNA) 뉴클레오티드, 펩티드 핵산 (PNA), 또는 브릿지된 핵산(BNA)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 다른 예는 2'-O-메틸 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2-티오우리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 또는 2'-플루오로 유사체를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 추가적인 예는 펩티드, 핵 국재화 서열(NLS), 펩티드 핵산(PNA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 트라이에틸렌 글리콜 또는 테트라에틸렌글리콜(TEG)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 2' 위치에서 화학적 모이어티의 결합을 포함한다. 변형된 염기의 추가의 예에는 2-아미노퓨린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘(5moU), 이노신, 7-메틸구아노신이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 가이드 RNA 화학적 변형의 예는 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트(MS), 포스포로티오에이트(PS), S-제약형 에틸 (cEt), 2'-O-메틸 3'-티오PACE(MSP) 또는 2'-O-메틸-3'-포스포노아세테이트 (MP)의 도입을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는, 온 (on)-표적 대 오프 (off)-표적 특이성이 예측가능하지 않지만, 비변형 가이드에 비해 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있다. (2015년 6월 29일자로 온라인 공개된, Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290; Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111; Allerson et al., J. Med. Chem. 2005, 48:901-904; Bramsen et al., Front. Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870-11875; Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989; Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066; Ryan et al., Nucleic Acids Res. (2018) 46(2): 792-803 참조).
일부 구현예에서, 가이드에 대한 변형은 화학적 변형, 삽입, 결실 또는 분할이다. 일부 구현예에서, 화학적 변형은 제한없이 2'-O-메틸 (M) 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2-티오우리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 2'-플루오로 유사체, 2-아미노푸린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU), 이노신, 7-메틸구아노신, 2'-O-메틸 -3'포스포로티오에이트 (MS), S-제약형 에틸(cEt), 포스포로티오에이트 (PS), 또는 2'-O-메틸 -3'-티오PACE (MSP), 또는 2'-O-메틸-3'-포스포노아세테이트 (MP)의 도입을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 가이드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 모든 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 일정 구현예에서, 씨드 영역 내 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일정 구현예에서, 3'-말단 내의 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일정 구현예에서, 5'-핸들에서 어떠한 뉴클레오티드 서열도 화학적으로 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, 씨드 영역에서의 화학적 변형은 작은 변형, 예컨대, 2'-플루오로 유사체의 도입이다. 특정 구현예에서, 씨드 영역의 하나의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 일부 구현예에서, 3'-말단에서 5 또는 10개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. Cpf1 CrRNA의 3'-말단에서의 이러한 화학적 변형은 유전자 절단 효율을 향상시킨다 (참조, Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066). 특정 구현예에서, 3'-말단 내의 5개의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 특정 구현예에서, 3'-말단 내의 10개의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 대체된다. 특이적 구현예에서, 3'-말단 내의 5 개 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (M) 유사체로 대체된다. 일부 구현예에서, 3' 및 5' 말단부 각각에서 3개의 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 구체적 구현예에서, 변형은 2'-O-메틸 또는 포스포로티오에이트 유사체를 포함한다. 구체적 구현예에서, 테트라루프에서 12개의 뉴클레오티드 및 줄기-루프 영역에서 16개의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 유사체로 대체된다. 이러한 화학적 변형은 생체내 편집 및 안정성을 개선시킨다(문헌[Finn et al., Cell Reports (2018), 22:2227-2235] 참조).
일부 구현예에서, 가이드 RNA 의 5' 및/또는 3' 말단은 형광 염료, 폴리에틸렌 글리콜, 콜레스테롤, 단백질 또는 검출 표지를 비롯한, 다양한 기능적 모이어티에 의해 변형된다 (Kelly et al., 2016, J. Biotech. 233:74-83). 특정 구현예에서, 가이드는 표적 DNA 에 결합하는 영역 내에 리보뉴클레오티드 및 Cas9, Cpf1, 또는 C2c1 에 결합하는 영역 내에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 조작된 가이드 구조, 예컨대, 제한 없이 5' 및/또는 3' 말단, 스템-루프 영역, 및 씨드 영역에 혼입된다. 특정 구현예에서, 변형은 스템-루프 영역의 5'-핸들에 있지 않다. 가이드의 스템-루프 영역의 5'-핸들에서의 화학적 변형은 그 기능을 소멸시킬 수 있다 (참조: Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066). 특정 구현예에서, 가이드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75개의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드의 3' 또는 5' 말단에서의 3-5 개 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 2'-F 변형과 같은 작은 변형 만이 씨드 영역에 도입된다. 일부 구현예에서, 2'-F 변형은 가이드의 3 '말단에 도입된다. 일정 구현예에서, 가이드의 5' 및/또는 3' 말단부에서 3 내지 5개의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸(M), 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트(MS), S-제약 에틸(cEt), 2'-O-메틸-3'-티오PACE(MSP) 또는 2'-O-메틸-3'-포스포노아세테이트(MP)로 화학적으로 변형된다. 이러한 변형은 게놈 편집 효율을 증강시킬 수 있다 (Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989; Ryan et al., Nucleic Acids Res. (2018) 46(2): 792-803 참조). 일정 구현예에서, 가이드의 모든 포스포디에스테르 결합은 유전자 파괴 수준을 향상시키기 위해 포스포로티오에이트 (PS)로 치환된다. 일정 구현예에서, 가이드의 5' 및/또는 3' 말단에서 5개 초과의 뉴클레오티드가 2'-O-Me, 2'-F 또는 S-제약형 에틸(cEt)로 화학적으로 치환된다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는 유전자 파괴의 증강된 수준을 매개할 수 있다 (Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111 참조). 본 발명의 일 구현예에서, 가이드는 이의 3' 및/또는 5' 말단에서 화학적 모이어티를 포함하도록 변형된다. 이러한 모이어티는 아민, 아자이드, 알카인, 티오, 다이벤조사이클로옥틴(DBCO), 로다민, 펩티드, 핵 국재화 서열(NLS), 펩티드 핵산(PNA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 트라이에틸렌 글리콜 또는 테트라에틸렌글리콜(TEG)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 화학적 모이어티는 링커, 예컨대, 알킬쇄에 의해 가이드에 접합된다. 일정 구현예에서, 변형된 가이드의 화학적 모이어티는 다른 분자, 예컨대, DNA, RNA, 단백질 또는 나노입자에 가이드를 부착시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는 CRISPR 시스템에 의해 유전자 편집된 세포를 동정하거나 또는 농축시키는 데 사용될 수 있다(문헌[Lee et al., eLife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554] 참조). 일부 구현예에서, 3' 및 5' 말단 각각에서 3개의 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 구체적 구현예에서, 변형은 2'-O-메틸 또는 포스포로티오에이트 유사체를 포함한다. 구체적 구현예에서, 테트라루프에서 12개의 뉴클레오티드 및 줄기-루프 영역에서 16개의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 유사체로 대체된다. 이러한 화학적 변형은 생체내 편집 및 안정성을 개선시킨다(문헌[Finn et al., Cell Reports (2018), 22:2227-2235] 참조). 일부 구현예에서, 가이드의 60 또는 70개 초과의 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 이 변형은 뉴클레오티드의 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 뉴클레오티드 유사체로의 대체 또는 포스포로다이에스터 결합의 포스포로티오에이트(PS) 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학적 변형은 CRISPR 복합체가 형성될 때 뉴클레아제 단백질 외부로 연장되는 가이드 뉴클레오티드의 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형 또는 가이드의 3'-말단의 20 내지 30개 이상의 뉴클레오티드의 PS 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 화학적 변형은 씨드 및 꼬리 영역에서 가이드 또는 2'-플루오로 유사체의 5' 말단부에서 2'-O-메틸 유사체를 추가로 포함한다. 이러한 화학적 변형은 뉴클레아제 분해에 대한 안정성을 개선시키고, 게놈-편집 활성 또는 효율을 유지하거나 향상시키지만, 모든 뉴클레아제의 변형은 가이드의 작용을 없앨 수 있다 (Yin et al., Nat. Biotech. (2018), 35(12):1179- 1187). 이러한 화학적 변형은 제한된 수의 뉴클레아제 및 RNA 2'-OH 상호작용의 지식을 비롯한, CRISPR 복합체 구조의 지식에 의해 가이드될 수 있다 (Yin et al., Nat. Biotech. (2018), 35(12):1179-1187). 일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 5'-말단부 꼬리/씨드 가이드 영역의 2, 4, 6, 8, 10 또는 12개까지의 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드로 대체된다. 일정 구현예에서, 3' 말단부에서 대다수의 가이드 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드로 대체된다. 특정 구현예에서, 3' 말단부에서 16개의 가이드 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드로 대체된다. 특정 구현예에서, 5'-말단부 꼬리/씨드 영역의 8개의 가이드 RNA 뉴클레오티드 및 3' 말단부에서 16개의 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드로 대체된다. 특정 구현예에서, CRISPR 복합체가 형성될 때 뉴클레아제 단백질 외부로 연장되는 가이드 RNA 뉴클레오티드는 DNA 뉴클레오티드로 대체된다. 다중 RNA 뉴클레오타이드의 DNA 뉴클레오타이드로의 이러한 대체는 감소된 오프-표적 활성이지만, 비변형 가이드에 비해 유사한 온-표적 활성을 야기하며; 그러나, 3' 말단에서 모든 RNA 뉴클레오타이드의 대체는 가이드 작용을 없앨 수 있다 (Yin et al., Nat. Chem. Biol. (2018) 14, 311-316). 이러한 변형은 제한된 수의 뉴클레아제 및 RNA 2'-OH 상호작용의 지식을 비롯한, CRISPR 복합체의 구조 지식에 의해 가이드될 수 있다 (Yin et al., Nat. Chem. Biol. (2018) 14, 311-316).
가이드 서열, 및 따라서 핵산-표적화 가이드 RNA는 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 표적 서열은 DNA일 수 있다. 표적 서열은 게놈 DNA일 수 있다. 표적 서열은 미토콘드리아 DNA일 수 있다. 클래스 2 V형 CRISPR-Cas 단백질의 가이드 분자 또는 가이드 RNA는 tracr-메이트 서열(내생성 CRISPR 시스템과 관련하여 "직접 반복부(direct repeat)"를 포함함) 및 가이드 서열(또한 내생성 CRISPR 시스템과 관련하여 "스페이서"로서 지칭됨)을 포함한다. 천연 Cas12b CRISPR-Cas 시스템은 tracr 서열을 적용한다.
일정 구현예에서, (표적 유전자좌로 C2c1을 가이드할 수 있는) 가이드 분자는 (1) 표적 유전자좌와 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열 및 (2) 직접 반복부 서열이 가이드 서열의 상류 (즉, 5')에 위치되는 것인 직접 반복부 서열 또는 tracr 메이트를 포함한다. 특정한 구현예에서, C2c1 가이드 서열의 씨드 서열 (즉, 표적 유전자좌에서 서열을 인식하고/하거나 하이브리드화하는데 결정적인 필수 서열)은 대략 가이드 서열의 처음 10개 뉴클레오티드 내에 존재한다. 특정 구현예에서, 씨드 서열은 가이드 서열의 5' 말단 상의 대략 처음 5 nt 내에 존재한다.
일부 구현예에서, 가이드의 5'-핸들의 루프가 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드의 5'-핸들의 루프는 결실, 삽입, 분할 또는 화학적 변형을 갖도록 변형된다. 일정 구현예에서, 변형된 루프는 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일정 구현예에서, 루프는 UCUU, UUUU, UAUU, 또는 UGUU의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있는 별개의 비공유적으로 연결된 서열을 갖는 스템루프를 형성한다.
스템 루프 & 헤어핀
핵산-표적화 복합체 또는 시스템과 관련하여 바람직하게, crRNA 서열 및 키메라 가이드 서열은 하나 이상의 스템 루프 또는 헤어핀을 포함할 수 있다. 압타머-변형된 가이드의 사용은 가이드에 어댑터-함유 단백질의 결합을 허용한다. 어댑터는 임의의 기능성 도메인에 융합될 수 있어서, 가이드에 기능성 도메인의 부착을 제공한다. 2종의 상이한 압타머의 사용은 2종 가이드에 의해 별도 표적화를 허용한다. 이러한 변형된 핵산-표적화 가이드 RNA의 다수, 예를 들어 10 개 또는 20 개 또는 30 개 등이 모두 동시에 사용될 수 있는 한편, 비교적 적은 수의 com 단백질 분자가 다수의 변형된 가이드와 함께 사용될 수 있으므로, 오직 하나 (또는 적어도 최소수)의 이펙터 단백질 분자가 전달되는 것이 필요하다. 어댑터 단백질과 기능성 도메인 예컨대 활성인자 또는 억제인자 간 융합은 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, GlySer 링커 GGGS가 사용될 수 있다. 그들은 필요에 따라, 적합한 길이를 제공하기 위해서, 3 (GGGGS)3 (SEQ ID NO:393) 또는 6 (SEQ ID NO:394), 9 (SEQ ID NO:395), 또는 심지어 12 (SEQ ID NO:396) 또는 그 이상의 반복부로 사용될 수 있다. 링커는 가이드 RNA와 기능적 도메인(활성화제 또는 억제제) 사이, 또는 핵산-표적화 Cas 단백질(Cas)과 기능적 도메인(활성화제 또는 억제제) 사이에서 사용될 수 있다. 사용자는 링커를 "기계적 유연성"의 적절한 양으로 조작한다.
특정 구현예에서, 스템은 상보성 X 및 Y 서열을 포함하는 적어도 약 4 bp를 포함하지만, 더 많거나, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개, 또는 더 적은, 예를 들어, 3, 2개 염기쌍의 스템이 또한 고려된다. 따라서, 예를 들어 X2-10 및 Y2-10 (여기서 X 및 Y는 뉴클레오티드의 임의의 상보성 세트를 나타냄)이 고려될 수 있다. 일 양상에서, 루프와 함께, X 및 Y 뉴클레오티드로 만들어진 스템은 전체 2차 구조에서 완전한 헤어핀을 형성하게 될 것이고, 이것은 유리할 수 있으며, 염기쌍의 양은 완전한 헤어핀을 형성하는 임의의 양일 수 있다. 일 양상에서, 임의의 상보성 X:Y 염기쌍 서열 (예를 들어, 길이에 대해)은 전체 가이드 분자의 2차 구조가 보존되는 한, 허용된다. 일 양상에서, X:Y 염기쌍으로 만들어진 스템을 연결시키는 루프는 가이드 분자의 전체 2차 구조를 파괴하지 않는 동일 길이 (예를 들어, 4 또는 5개 뉴클레오티드)이거나 또는 더 긴 임의 서열일 수 있다. 일 양상에서, 스템루프는 예를 들어, MS2 압타머를 더 포함할 수 있다. 일 양상에서, 스템은 상보성 X 및 Y 서열을 포함하는 약 5-7 bp를 포함하지만, 그 이상 또는 그 이하의 염기쌍의 스템도 고려된다. 일 양상에서, 달리 이러한 쌍형성이 일반적으로 그 위치에서 스템루프의 아키텍처를 보존하는 경우에, 비-왓슨 크릭 염기쌍이 고려된다.
특정 구현예에서, 가이드 분자의 천연 헤어핀 또는 스템-루프 구조는 연장되거나 또는 연장된 스템-루프에 의해 대체된다. 일부 경우에 스템의 연장은 CRISPR-Cas 단백질과 가이드 분자의 조립을 증강시킬 수 있다는 것이 입증되었다 (Chen et al. Cell. (2013); 155(7): 1479- 1491). 특정 구현예에서 스템루프의 스템은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 상보성 염기쌍 (즉, 가이드 분자 내 2, 4, 6, 8, 10개 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 첨가에 상응)만큼 연장된다. 특정 구현예에서 이들은 스템루프의 루프에 인접하는, 스템의 말단에 위치된다.
일부 구현예에서, 가이드 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있는 별개의 비공유적으로 연결된 서열과 스템 루프를 형성한다. 특정 실시형태에서, 가이드를 형성하는 서열은 표준 포스포르아미다이트 합성 프로토콜을 사용해 먼저 합성된다 (Herdewijn, P., ed., Methods in Molecular Biology Col 288, Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Humana Press, New Jersey (2012)). 일부 구현예에서, 이들 서열은 당업자에게 공지된 표준 프로토콜을 사용하여 결찰을 위한 적절한 작용기를 함유하도록 작용화될 수 있다 (Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (2013)). 작용기의 예는 제한없이 히드록실, 아민, 카르복실산, 카르복실산 할라이드, 카르복실산 활성 에스테르, 알데히드, 카르보닐, 클로로카르보닐, 이미다졸릴카르보닐, 히드로지드, 세미카르바지드, 티오 세미카르바지드, 티올, 말레이미드, 할로알킬, 술포닐, 알릴, 프로파르길, 디엔, 및 아지드를 포함한다. 이러한 서열이 작용화되면, 공유적 화학 결합 또는 연결부가 이러한 서열과 직접 반복부 서열 사이에 형성될 수 있다. 화학적 결합의 예는 제한없이 카바메이트, 에테르, 에스테르, 아미드, 이민, 아미딘, 아미노트리진, 히드로존, 디술피드, 티오에테르, 티오에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 술폰아미드, 술포네이트, 풀폰, 술폭시드, 우레아, 티오우레아, 히드라지드, 옥심, 트리아졸, 광불안정 연결부, C-C 결합 형성기 예컨대 딜스-알더 (Diels-Alder) 고리-부가 쌍 또는 고리-폐쇄 복분해 쌍, 및 마이클 (Michael) 반응 쌍을 기반으로 하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 이들 스템-루프 형성 서열이 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학 합성은 2'-아세톡시에틸 오르쏘에스테르 (2'-ACE) (Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3-18) 또는 2'-티오노카바메이트 (2'-TC) 화학 (Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. (2011) 133: 11540-11546; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33:985-989)을 사용하는 자동화, 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기계를 사용한다.
감소된 RNase 감수성
일부 구현예에서, RNA 절단, 예컨대 Cas12b에 의한 절단에 대한 가이드 분자의 감수성을 감소시키는 것에 관심을 갖는다. 따라서, 특정 구현예에서, 가이드 분자는 Cas12b 또는 다른 RNA-절단 효소에 의한 절단을 피하도록 조정된다.
특정 구현예에서, RNAse 또는 감소된 발현에 대한 가이드 분자의 감수성은 이의 기능에 영향을 미치지 않는 가이드 분자의 서열의 약간의 변형에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 전사물의 미성숙 종결, 예컨대 U6 Pol-III의 미성숙 전사는 가이드 분자 서열 내 추정의 Pol-III 종결자 (4개의 연속 U)를 변형시켜 제거될 수 있다. 이러한 서열 변형이 가이드 분자의 스템루프에서 필요한 경우에, 바람직하게는 염기쌍 플립에 의해 보장된다.
감소된 2차 구조
일부 구현예에서, 가이드 분자 (직접 반복부 및/또는 스페이서)의 서열은 가이드 분자 내 2차 구조 정도를 감소시키도록 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 가이드 RNA의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이하가 최적으로 폴딩되었을 때 자기-상보성 염기쌍에 참여한다. 최적 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘을 통해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 (Gibbs) 자유 에너지의 계산을 기반으로 한다. 이러한 알고리즘의 예는 [Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)]에 기술된 바와 같은, mFold이다. 또 다른 폴딩 알고리즘의 예는 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여, 비엔나 대학의 이론 화학 연구소 (Institute for Theoretical Chemistry at the University of Vienna) 에서 개발한 온라인 웹서버 RNAfold 이다 (예를 들어, [A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24]; 및 [PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조).
접합된 tracr 서열
일부 구현예에서, 가이드 분자는 비-포스포다이에스터 결합을 통해 화학적으로 연결되거나 또는 접합된 tracr 서열 및 tracr 메이트 서열을 포함한다. 일 양상에서, 가이드는 비-뉴클레오티드 루프를 통해 화학적으로 연결되거나 또는 접합된 tracr 서열 및 tracr 메이트 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 비-포스포다이에스터 공유 링커를 통해 결합된다. 공유 링커의 예는 카바메이트, 에터, 에스터, 아마이드, 이민, 아미딘, 아미노트라이진, 하이드로존, 이황화물, 티오에터, 티오에스터, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 설폰아마이드, 설포네이트, 풀폰, 설폭사이드, 유레아, 티오유레아, 하이드라자이드, 옥심, 트리아졸, 광 분해성 결합, C-C 결합 형성기, 예컨대, 딜스-알더(Diels-Alder) 고리 첨가 쌍 또는 고리-폐쇄 복분해 쌍, 및 마이클 반응(Michael reaction) 쌍에 기반한 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 표준 포스포르아미다이트 합성 프로토콜을 이용하여 처음 합성된다(Herdewijn, P., ed., Methods in Molecular Biology Col 288, Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications, Humana Press, New Jersey (2012)). 일부 구현예에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 당업계에 공지된 표준 프로토콜을 이용하여 결찰을 위한 적절한 작용기를 함유하도록 작용기화될 수 있다(Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press (2013)). 작용기의 예는 제한 없이, 히드록실, 아민, 카르복실산, 카르복실산 할라이드, 카르복실산 활성 에스테르, 알데히드, 카르보닐, 클로로카르보닐, 이미다졸릴카르보닐, 히드로지드, 세미카르바지드, 티오 세미카르바지드, 티올, 말레이미드, 할로알킬, 수포닐, 알릴, 프로파르길, 디엔, 알킨 및 아지드를 포함한다. 일단 tracr 및 tracr 메이트 서열이 작용기화되면, 두 올리고뉴클레오티드 사이에 공유 화학 결합 또는 연결이 형성될 수 있다. 화학적 결합의 예는 제한 없이, 카르바메이트, 에테르, 에스테르, 아미드, 이민, 아미드, 아미노트리진, 히드로존, 디설피드, 티오에테르, 티오에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 설폰아미드, 설포네이트, 풀폰, 설폭시드, 우레아, 티오우레아, 히드라지드, 옥심, 트리아졸, 광불안정성 결합, 딜스-알더 시클로-부가 쌍 또는 고리-폐쇄 복분해 쌍, 및 마이클 반응 쌍과 같은 C-C 결합 형성기를 기본으로 하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 화학적으로 합성될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학 합성은 2'-아세톡시에틸 오르쏘에스테르 (2'-ACE) (Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3-18) 또는 2'-티오노카바메이트 (2'-TC) 화학 (Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. (2011) 133: 11540-11546; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33:985-989)을 사용하는 자동화, 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기계를 사용한다.
일부 구현예에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 다양한 생체접합 반응, 루프, 브리지, 및 당, 뉴클레오티드간 포스포다이에스터 결합, 퓨린 및 피리미딘 잔기의 변형을 통한 비-뉴클레오티드 연결을 이용하여 공유적으로 연결될 수 있다. Sletten et al., Angew. Chem. Int. Ed. (2009) 48:6974-6998; Manoharan, M. Curr. Opin. Chem. Biol. (2004) 8: 570-9; Behlke et al., Oligonucleotides (2008) 18: 305-19; Watts, et al., Drug. Discov. Today (2008) 13: 842-55; Shukla, et al., ChemMedChem (2010) 5: 328-49.
일부 구현예에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 클릭 화학을 이용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 트리아졸 링커를 이용하여 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 알카인 및 아자이드를 수반하는 후이스겐(Huisgen) 1,3-쌍극자 첨가 환화 반응을 이용하여 공유적으로 연결되어 고도로 안정한 트리아졸 링커를 수득할 수 있다 (He et al., ChemBioChem (2015) 17:1809- 1812; WO 2016/186745). 일부 구현예에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 5'-헥신 tracrRNA 및 3'-아자이드 crRNA를 결찰시킴으로써 공유적으로 연결된다. 일부 실시형태에서, 5'-헥신 tracrRNA 및 3'-아자이드 crRNA 중 하나 또는 둘 다 다르마콘(Dharmacon) 프로토콜을 이용하여 후속적으로 제거될 수 있는 2'-아세톡시에틸 오쏘에스터(2'-ACE) 기로 보호될 수 있다 (Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3- 18).
일부 구현예에서, tracr 및 tracr 메이트 서열은 스페이서, 부착, 생체접착, 발색단, 리포터 기, 염료 표지된 RNA, 및 비천연유래 뉴클레오티드 유사체와 같은 모이어티를 포함하는, 링커(예를 들어, 비-뉴클레오티드 루프)를 통해 공유적으로 연결될 수 있다. 더 구체적으로는, 본 발명의 목적을 위한 적합한 스페이서는 폴리에터(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리알코올, 폴리프로필렌 글리콜 또는 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 혼합물), 폴리아민기(예를 들어, 스페닌, 스퍼미딘 및 이들의 중합체 유도체), 폴리에스터(예를 들어, 폴리(에틸 아크릴레이트)), 폴리포스포다이에스터, 알킬렌 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 부착은 링커에 추가적인 특성, 예컨대 이하로 제한되는 것은 아니지만, 형광 표지를 더하기 위해 링커에 부가되는 임의의 모이어티를 포함한다. 적합한 생체접합체는 펩티드, 글리코사이드, 지질, 콜레스테롤, 인지질, 다이아실 글리세롤 및 다이알킬 글리세롤, 지방산, 탄화수소, 효소 기질, 스테로이드, 바이오틴, 디곡시게닌, 탄수화물, 다당류를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 발색단, 리포터 기 및 염료 표지된 RNA는 형광 염료, 예컨대 플루오레세인 및 로다민, 화학발광, 전자화학발광 및 생체발광 마커 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 2개의 RNA 성분을 접합하는 예시적 링커의 설계는 또한 WO 2004/015075에 기재되어 있다.
링커(예를 들어, 비-뉴클레오티드 루프)는 임의의 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 약 0-16개 뉴클레오티드와 동등한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 링커는 약 0-8개 뉴클레오티드와 동등한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 링커는 약 0-4개 뉴클레오티드와 동등한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 링커는 약 2개 뉴클레오티드와 동등한 길이를 갖는다. 링커 디자인의 예는 또한 WO2011/008730에 기재되어 있다.
전형적인 Cas9 sgRNA는 (5'에서 3' 방향으로):가이드 서열, 폴리 U 트랙, 제1 상보성 스트레치 ("반복부"), 루프 (테트라루프), 제2 상보성 스트레치 ("안티-반복부"는 반복부에 상보성임), 스템 및 추가 스템 루프 및 스템 및 폴리 A(RNA에서 종종 폴리 U) 꼬리부 (종결자)를 포함한다. 전형적인 Cas12b sgRNA는 유사한 성분을 포함하지만, 반대 배향으로, 즉 3'에서 5' 방향으로 포함한다. 직접 반복부 (DR)는 tracrRNA와 하이브리드화하여서 crRNA:tracrRNA 듀플렉스를 형성하고, 이것은 Cas12b 상에 적재되어 DNA 인식 및 절단을 가이드한다. Cas12b는 DNA 간섭을 매개하도록 프로토스페이서 서열의 5' 말단에서 T-풍부 PAM을 인식한다. 일정 구현예에서, tracr 의 5' 말단은 스템-루프를 형성한다. 일정 구현예에서, tracrRNA 및 5' DR의 뉴클레오티드는 반복부;안티-반복부 듀플렉스를 형성한다. 일정 구현예에서, sgRNA 아키텍처는 [Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385-397]가 예측한 구조와 일치한다. 일정 구현예에서, sgRNA 아키텍처는 [Liu et al., 2017, Molecular Cell 65, 310-322]가 예측한 구조와 일치한다. 바람직한 구현예에서, 가이드 아키텍처의 소정의 양상은 보유되고, 가이드 아키텍처의 소정의 양상은, 예를 들어, 특징의 부가, 차감 또는 치환에 의해 변형될 수 있는 반면, 가이드 구조의 소정의 다른 양상은 유지된다. 삽입, 결실 및 치환을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 조작된 sgRNA 변형에 대한 바람직한 위치는 CRISPR 단백질 및/또는 표적, 예를 들어, 테트라루프 및/또는 루프 2와 복합체를 형성할 때, 노출되는 sgRNA의 가이드 말단 및 영역을 포함한다.
일정 구현예에서, 본 발명의 가이드는 (예를 들어, 융합 단백질을 통해) 하나 이상의 기능성 도메인을 포함할 수 있는 어댑터 단백질에 대한 특정 결합 부위(예를 들어, 어댑터)를 포함한다. 이러한 가이드가 CRISPR 복합체(즉, 가이드 및 표적에 결합하는 CRISPR 효소)를 형성할 때, 어댑터 단백질이 결합하며, 어댑터 단백질과 결합된 기능성 도메인은 결과된 기능이 유효하게 되는데 유리한 공간적 배향으로 위치된다. 예를 들어, 기능성 도메인이 전사 활성인자 (예를 들어, VP64 또는 p65)라면, 전사 활성인자는 표적의 전사에 영향을 미치도록 허용하는 공간적 배향으로 위치된다. 마찬가지로, 전사 억제인자는 표적의 전사에 영향을 미치도록 유리하게 위치될 것이며, 뉴클레아제(예를 들어, Fok1)는 표적을 절단하거나 또는 부분적으로 절단하도록 유리하게 위치될 것이다.
당업자는 어댑터 + 기능성 도메인의 결합을 가능하게 하는 가이드에 대한 변형을 이해할 것이지만, 어댑터 + 기능성 도메인의 적절하지 않은 위치화(예를 들어, CRISPR 복합체의 3차원 구조 내의 입체장애에 기인)는 의도되지 않은 변형이다. 하나 이상의 변형된 가이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 테트라 루프, 스템 루프 1, 스템 루프 2, 또는 스템 루프 3에서, 바람직하게는 테트라 루프 또는 스템 루프 2에서, 가장 바람직하게는 테트라 루프와 스템 루프 2 둘 모두에서 변형될 수 있다.
반복부:안티 반복부 이중가닥은 sgRNA의 2차 구조로부터 분명하게 될 것이다. 전형적인 Cas9 sgRNA에서, (5'에서 3' 방향으로) 폴리U 트랙 이후 및 테트라루프 앞에는 전형적으로 제1 상보성 스트레치일 것이고, (5'에서 3' 방향으로) 테트라루프 이후 및 폴리A 트랙 전에는 제2 상보성 스트레치일 것이다. 제1 상보성 스트레치("반복부")은 제2 상보성 스트레치("안티-반복부")에 상보성이다. 일정 구현예에서, Cas12b sgRNA의 아키텍처는 [Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385-397]이 예측한 구조와 일치한다. 일정 구현예에서, Cas12b sgRNA 아키텍처는 [Liu et al., 2017, Molecular Cell 65, 310-322]이 예측한 구조와 일치한다. 이와 같이, 그들 sRNA는 다른 것 상에서 역으로 폴딩될 때 dsRNA의 듀플렉스를 형성하도록 왓슨-크릭 염기쌍을 포함한다. 이와 같이, 안티-반복부 서열은 A-U 또는 C-G 염기쌍이라는 관점에서 뿐만 아니라, 안티-반복부가 스템-루프 또는 다른 아키텍처 특성에 기인하여 역배향이라는 사실의 관점에서, 안티-반복부 서열은 반복부의 상보성 서열이다.
본 발명의 구현예에서, 가이드 아키텍처의 변형은 스템루프 2에서 염기를 대체하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스템루프2에서 "actt"(RNA에서 "acuu") 및 "aagt"(RNA에서 "aagu") 염기는 "cgcc" 및 "gcgg"로 대체된다. 일부 구현예에서, 스템루프 2에서 "actt" 및 "aagt" 염기는 4개 뉴클레오티드의 상보성 GC-풍부 영역으로 대체된다. 일부 구현예에서, 4개 뉴클레오티드의 상보성 GC-풍부 영역은 "cgcc" 및 "gcgg"(둘 다 5'에서 3' 방향으로)이다. 일부 구현예에서, 4개의 뉴클레오티드의 상보성 GC-풍부 영역은 "gcgg" 및 "cgcc"(둘 다 5'에서 3' 방향으로)이다. 4개의 뉴클레오티드의 상보성 GC-풍부 영역에서 CCCC 및 GGGG를 비롯한 C와 G의 다른 조합이 자명해 질 것이다.
일 양상에서, 스템루프 2, 예를 들어, "ACTTgtttAAGT" (SEQ ID NO:397)는 임의의 "XXXXgtttYYYY" (SEQ ID NO:398)로 대체될 수 있으며, 예를 들어, 여기서 XXXX 및 YYYY는 줄기를 생성하기 위해 서로 함께 염기쌍이 되는 뉴클레오티드의 임의의 상보성 세트를 나타낸다.
일 양상에서, 상기 스템은, 더 많은, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 또는 더 적은 수, 예를 들어, 3, 2개의 염기쌍의 스템이 또한 상정되지만, 상보성 X 및 Y 서열을 포함하는 적어도 약 4bp를 포함한다. 따라서, 예를 들어 X2-12 및 Y2-12 (여기서 X 및 Y는 뉴클레오티드의 임의의 상보성 세트를 나타냄)이 고려될 수 있다. 일 양상에서, "gttt"와 함께, X 및 Y 뉴클레오티드로 만들어진 스템은 전체 2차 구조에서 완전한 헤어핀을 형성하게 될 것이고, 이것은 유리할 수 있으며, 염기쌍의 양은 완전한 헤어핀을 형성하는 임의의 양일 수 있다. 일 양상에서, 전체 sgRNA의 2차 구조가 보존된다면, 임의의 상보성 X:Y 염기쌍 서열이 (예를 들어, 길이에 대해) 용인된다. 일 양상에서, 스템은 DR:tracr 이중가닥, 및 3 스템루프를 가진다는 점에서 전체 sgRNA의 2차 구조를 방해하지 않는 X:Y 염기쌍의 형태일 수 있다. 일 양상에서, ACTT 및 AAGT(또는 X:Y 염기쌍으로 만들어진 임의의 대안의 줄기)를 연결하는 "gttt" 테트라루프는 sgRAN 분자의 전반적 2차 구조를 방해하지 않는 동일한 길이(예를 들어, 4개의 염기쌍) 또는 더 긴 임의의 서열일 수 있다. 일 양상에서, 스템루프는 스템루프2를 추가로 연장시키는 것일 수 있고, 예를 들어, MS2 압타머일 수 있다. 일 양상에서, 스템루프3 "GGCACCGagtCGGTGC" (SEQ ID NO:399)는 유사하게 "XXXXXXXagtYYYYYYY" (SEQ ID NO:400) 형태를 취할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 X7 및 Y7은 스템을 생성하도록 서로 함께 염기쌍을 형성하게 되는 뉴클레오티드의 임의의 상보성 세트를 나타낸다. 일 양상에서, 스템은 더 많은 또는 더 적은 염기쌍의 스템이 또한 상정된다고 해도, 상기 스템은 상보성 X 및 Y 서열을 포함하는 약 7 bp를 포함한다. 일 양상에서, "agt"와 함께 X 및 Y 뉴클레오티드로 이루어진 스템은 전반적인 2차 구조에서 완전한 헤어핀을 형성할 것이다. 일 양상에서, 전체 sgRNA의 2차 구조가 보존된다면, 임의의 상보성 X:Y 염기쌍 서열이 용인된다. 일 양상에서, 스템은 DR:tracr 이중가닥, 및 3개의 스템루프를 가진다는 점에서 전체 sgRNA의 2차 구조를 붕괴시키지 않는 X:Y 염기쌍의 형태일 수 있다. 일 양상에서, 스템루프 3의 "agt" 서열은 연장되거나 또는 압타머, 예를 들어, 스템루프3의 아키텍처를 달리 일반적으로 보존하는 MS2 압타머 또는 서열로 대체될 수 있다. 대안의 스템루프 2 및/또는 3에 대한 일 양상에서, 각각의 X 및 Y 쌍은 임의의 염기쌍을 지칭할 수 있다. 일 양상에서, 달리 이러한 쌍형성이 일반적으로 그 위치에서 스템루프의 아키텍처를 보존하는 경우에, 비-왓슨 크릭 염기쌍이 고려된다.
일 양상에서, DR:tracrRNA 이중가닥은 형태:gYYYYag(N)NNNNxxxxNNNN(AAN)uuRRRRu (SEQ ID NO:401) (뉴클레오티드에 대한 표준 IUPAC 명명법을 이용)로 대체될 수 있으며, (N) 및 (AAN)은 이중가닥에서의 벌지 부분을 나타내고, "xxxx"는 링커 서열을 나타낸다. tracrRNA의 대응하는 NNNN 부분과 염기쌍을 이룬다면, 직접 반복부 상의 NNNN은 임의의 것일 수 있다. 일 양상에서, DR:tracrRNA 이중가닥은 전반적 구조를 변경시키지 않는다면, 임의의 길이의 링커(xxxx...), 임의의 염기 조성물에 의해 연결될 수 있다.
일 양상에서, sgRNA 구조적 필요는 이중가닥 및 3개의 스템루프를 갖는 것이다. 대부분의 양상에서, 다수의 특정 염기 필요에 대한 실제 서열 필요는 lax이고, 즉, DR:tracrRNA 이중가닥의 아키텍처는 보존되어야 하지만, 아키텍처, 즉, 줄기, 루프, 벌지 등을 생성하는 서열은 변경될 수 있다.
제1 압타머/RNA-결합 단백질 쌍을 갖는 하나의 가이드는 활성인자에 연결되거나 또는 융합될 수 있는 반면, 제2 압타머/RNA-결합 단백질 쌍을 갖는 제2 가이드는 억제인자에 연결된거나 또는 융합될 수 있다. 가이드는 상이한 표적(유전자좌)을 위한 것이며, 따라서 이는 하나의 유전자가 활성화되고 하나는 억제되게 한다. 예를 들어, 다음의 도식은 이러한 접근을 나타낸다:
가이드 1 - MS2 압타머-------MS2 RNA-결합 단백질-------VP64 활성인자; 및
가이드 2 - PP7 압타머-------PP7 RNA-결합 단백질-------SID4x 억제인자.
본 발명은 또한 직교 PP7/MS2 유전자 표적화에 관한 것이다. 이런 예에서, 상이한 유전자좌를 표적화하는 sgRNA는 그들의 표적 유전자좌를 각각 활성화시키고 억제하는 MS2-VP64 또는 PP7-SID4X를 보충하기 위해 별개의 RNA 루프로 변형된다. PP7은 박테리오파지 슈도모나스(Pseudomonas)의 RNA-결합 외피 단백질이다. MS2 처럼, 이것은 특별한 RNA 서열 및 2차 구조에 결합된다. PP7 RNA-인식 모티프는 MS2와 별개이다. 결과적으로, PP7 및 MS2는 상이한 게놈 유전자좌에서 동시에 별개의 효과를 매개하도록 다중복합체화될 수 있다. 예를 들어, sgRNA 표적화 유전자좌 A는 MS2 루프로 변형되어, MS2-VP64 활성인자를 보충할 수 있는 반면, 다른 sgRNA 표적화 유전자좌 B는 PP7 루프로 변형되어, PP7-SID4X 억제인자 도메인을 보충할 수 있다. 동일한 세포에서, dC2c1은 직교, 유전자좌-특이적 변형을 매개할 수 있다. 이 원칙은 다른 직교 RNA-결합 단백질, 예컨대 Q-베타를 혼입하도록 연장될 수 있다.
직교 억제를 위한 대안의 선택은 (가이드 내에 통합된 MS2/PP7 루프와 유사한 위치에서 또는 가이드의 3' 말단에서) 가이드 내에 전사활성 억제 기능을 갖는 비암호 RNA를 혼입시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 가이드는 비암호 (그러나 억제성인 것으로 알려짐) RNA 루프 (예를 들어, 포유류 세포에서 RNA 중합효소 II를 방해하는 (RNA에서의) Alu 억제인자를 이용)로 설계된다. Alu RNA 서열은 본 명세서에서 사용된 바와 같은 MS2 RNA 서열 대신에 (예를 들어, 테트라루프 및/또는 줄기 루프 2에서); 및/또는 가이드의 3' 말단에 위치되었다. 이는 테트라루프 및/또는 스템루프 2 위치에서 MS2, PP7 또는 Alu의 가능한 조합뿐만 아니라, 선택적으로, (링커와 함께 또는 링커 없이) 가이드의 3' 말단부에서 Alu의 첨가를 제공한다.
두 상이한 압타머 (별개의 RNA)의 사용은 활성인자-어댑터 단백질 융합, 및 상이한 가이드를 갖는 사용될 억제인자-어댑터 단백질 융합을 가능하게 하여, 하나의 유전자의 발현을 활성화시키는 한편 다른 것은 억제한다. 상이한 가이드와 함께 그들은 다중복합 접근으로 함께 또는 실질적으로 함께 투여될 수 있다. 매우 다수의 이러한 변형된 가이드는 모두 동시에, 예를 들어, 10 또는 20 또는 30개 등이 사용될 수 있는 한편, 비교적 소수의 C2c1이 매우 다수의 변형된 가이드와 함께 사용됨에 따라, 오직 하나 (또는 적어도 최소 수)의 C2c1이 전달된다. 어댑터 단백질은 하나 이상의 활성인자 또는 하나 이상의 억제인자에 결합될 수 있다(바람직하게는 이에 연결되거나 또는 융합될 수 있다). 예를 들어, 어댑터 단백질은 제1 활성인자 및 제2 활성인자와 결합될 수 있다. 제1 활성인자 및 제2 활성인자는 동일할 수 있지만, 그들은 바람직하게는 상이한 활성인자이다. 예를 들어, 이들이 단지 예시적이고, 다른 전사 활성인자가 예상되지만, 하나는 VP64일 수 있는 반면, 다른 것은 p65일 수 있다. 3가지 이상 또는 심지어 4가지 이상의 활성인자(또는 억제인자)가 사용될 수 있지만, 패키지 크기는 숫자를 5개의 상이한 기능성 도메인보다 더 크게 제한할 수 있다. 링커는 바람직하게는 어댑터 단백질에 대한 직접 융합 이상으로 사용되며, 여기서 2 이상의 기능성 도메인은 어댑터 단백질과 결합된다. 적합한 링커는 GlySer 링커를 포함할 수 있다.
또한 전체로서 효소-가이드 복합체는 2 이상의 기능성 도메인과 결합될 수 있다는 것이 예상된다. 예를 들어, 효소와 결합된 2 이상의 기능성 도메인이 있을 수 있거나 또는 (하나 이상의 어댑터 단백질을 통해) 가이드와 결합된 2 이상의 기능성 도메인이 있을 수 있거나, 또는 효소와 결합된 하나 이상의 기능성 도메인 및 (하나 이상의 어댑터 단백질을 통해) 가이드와 결합된 하나 이상의 기능성 도메인이 있을 수 있다.
어댑터 단백질과 활성인자 또는 억제인자 사이의 융합은 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, GlySer 링커 GGGS가 사용될 수 있다. 이들은 3((GGGGS)3) 또는 6, 9 또는 심지어는 12 이상의 반복부로 사용되어, 필요에 따라 적합한 길이를 제공할 수 있다. 링커는 RNA-결합 단백질과 기능성 도메인(활성인자 또는 억제인자) 사이에, 또는 CRISPR 효소(C2c1)와 기능성 도메인(활성인자 또는 억제인자) 사이에 사용될 수 있다. 사용자는 링커를 "기계적 유연성"의 적절한 양으로 조작한다.
에스코트 & 유도성 가이드
바람직한 구현예에서, 직접 반복부는 변형되어 하나 이상의 단백질-결합 RNA 압타머를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 하나 이상의 압타머는 예컨대 최적 2차 구조의 일부분을 포함할 수 있다. 이러한 압타머는 본 명세서에서 더욱 상술되는 바와 같은 박테리오파지 외피 단백질에 결합할 수도 있다.
특정 구현예에서, 가이드는 에스코트 가이드이다. "에스코트"란 Cas12b CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체 또는 가이드가 세포 내에서 선택된 시간 또는 위치로 전달되어서, Cas12b CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체 또는 가이드의 활성이 공간적으로 또는 시간적으로 제어되는 것을 의미한다. 예를 들어, Cas12b CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체 또는 가이드의 활성 및 목적은 압타머 리간드, 예컨대 세포 표면 단백질 또는 다른 국재화된 세포 성분에 대해 결합 친화성을 갖는 에스코트 RNA 압타머 서열에 의해 제어될 수 있다. 대안적으로, 에스코트 압타머는 예를 들어 세포 상 또는 세포 내 압타머 이펙터, 예컨대 일시적 이펙터, 예컨대 특정한 시기에 세포에 적용되는 외부 에너지원에 반응성일 수 있다.
에스코트된 Cas12b CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체는 가이드 분자 구조, 아키텍처, 안정성, 유전자 발현, 또는 이의 임의 조합을 개선시키도록 디자인된 기능성 구조를 갖는 가이드 분자를 갖는다. 이러한 구조는 압타머를 포함할 수 있다.
압타머는 예를 들어 기하급수적 농축을 통한 리간드의 체계적 진화 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라고 불리는 기술을 사용하여, 다른 리간드에 단단하게 결합되도록 디자인되거나 또는 선택된 생물분자이다 (SELEX; Tuerk C, Gold L: "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase." Science 1990, 249:505- 510). 핵산 압타머는 예를 들어 생물의학적으로 관련된 광범위한 표적에 대해 높은 결합 친화성 및 특이성을 갖는, 무작위-서열 올리고뉴클레오티드의 풀로부터 선택할 수 있어서, 압타머에 대한 광범위한 치료적 활용성을 시사한다 (Keefe, Anthony D., Supriya Pai, and Andrew Ellington. "Aptamers as therapeutics." Nature Reviews Drug Discovery 9.7 (2010): 537- 550). 이들 특징은 또한 약물 전달 비히클로서 압타머에 대한 광범위한 용도를 시사한다 (Levy-Nissenbaum, Etgar, et al. "Nanotechnology and aptamers: applications in drug delivery." Trends in biotechnology 26.8 (2008): 442-449; and, Hicke BJ, Stephens AW. "Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy." J Clin Invest 2000, 106:923-928.). 압타머는 또한 녹색 형광 단백질의 활성을 모방하도록 형광단에 결합하는 RNA 압타머와 같이, 속성을 변화시켜 큐 (que)에 반응하는, 분자 스위치로서 기능하게 구축될 수 있다 (Paige, Jeremy S., Karen Y. Wu, and Samie R. Jaffrey. "RNA mimics of green fluorescent protein." Science 333.6042 (2011): 642- 646). 압타머는 예를 들어 세포 표면 단백질을 표적화하는, 표적화된 siRNA 치료제 전달 시스템의 성분으로서 사용될 수 있다는 것이 또한 제안되었다 (Zhou, Jiehua, and John J. Rossi. "Aptamer-targeted cell-specific RNA interference." Silence 1.1 (2010): 4).
따라서, 특정 구현예에서, 가이드 분자는 예를 들어 세포막을 통해서, 세포내 구획, 또는 핵으로의 전달을 포함하여, 가이드 분자 전달을 개선시키도록 디자인된 하나 이상의 압타머(들)를 통해 변형된다. 이러한 구조는 가이드 분자를 선택된 이펙터에 대해 전달가능하거나, 유도가능하거나 또는 반응성이도록 만들기 위해서, 하나 이상의 압타머(들)의 첨가 또는 이러한 하나 이상의 압타머(들), 모이어티(들)없이 포함될 수 있다. 따라서 본 발명은 제한없이 pH, 저산소, O2 농도, 온도, 단백질 농도, 효소 농도, 지질 구조, 광노출, 기계적 파괴 (예를 들어, 초음파), 자기장, 전기장 또는 전자기 방사선을 포함한 정상 또는 병적 생리학적 조건에 반응하는 가이드 분자를 이해한다.
유도성 시스템의 광 반응성은 크립토크롬-2 및 CIB1의 활성화 및 결합을 통해 획득될 수 있다. 파란색 빛 자극은 크립토크롬-2의 활성화 입체형태 변화를 유도하여서, 이의 결합 파트너 CIB1의 동원을 야기시킨다. 이러한 결합은 빠르고 가역적이어서, 펄스된 자극 후에 <15초의 포화를 획득하고 자극 종료 후 <15분에 기준치로 복귀된다. 이들 신속한 결합 동역학은 유도제의 흡수 및 청소보다는, 전사/번역 및 전사물/단백질 분해의 속도에 의해서만 시간적으로 제한되는 시스템을 야기시킨다. 크립토크롬-2 활성화는 또한 고도로 민감하여서, 낮은 및 강도 자극의 사용을 허용하고 광독성 위험성을 완화시킨다. 또한, 예컨대 온전한 포유동물 뇌의 경우에, 다양한 빛 광도를 사용하여 자극 영역의 크기를 제어하여서, 벡터 전달 단독으로 제공될 수 있는 것보다 더 큰 정밀도를 허용한다.
본 발명은 가이드를 유도시키기 위해서 에너지원, 예컨대 전자기 방사선, 소리 에너지 또는 열 에너지를 고려한다. 유리하게, 전자기 방사선은 가시광선의 성분이다. 바람직한 구현예에서, 빛은 약 450 내지 약 495 nm 파장의 파란색 빛이다. 특히 바람직한 구현예에서, 파장은 약 488 nm이다. 다른 바람직한 구현예에서, 광 자극은 펄스를 통한다. 광력은 약 0-9 mW/cm2의 범위일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 15초마다 0.25초 만큼 낮은 자극 파라다임이 최대 활성화를 야기시켜야 한다.
화학적 또는 에너지 민감성 가이드는 가이드로서 작용하고 C2c1 CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체 기능을 갖도록 허용하는 에너지 또는 화학적 소스에 의한 결합을 통한 유도 시에 입체형태적 변화를 겪을 수 있다. 본 발명은 가이드 기능 및 C2c1 CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체 기능을 갖도록 화학적 소스 또는 에너지를 인가하는 단계; 및 임의로는 게놈 유전자좌의 발현이 변경된다는 것을 결정하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
이 화학적 유도성 시스템의 몇몇 상이한 설계가 있다: 1. 아브시스산(ABA)에 의해 유도가능한 ABI-PYL 기반 시스템(예를 들어, stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/sigtrans;4/164/rs2 참조), 2. 라파마이신에 의해 유도가능한 FKBP-FRB 기반 시스템 (또는 라파마이신을 기반으로 한 관련 화학 물질)(예를 들어, 웹사이트 nature.com/nmeth/journal/v2/n6/full/nmeth763.html 참조), 3. 지베렐린(GA)에 의해 유도가능한 GID1-GAI 기반 시스템(예를 들어, www.nature.com/nchembio/journal/v8/n5/full/nchembio.922.html 참조).
화학적 유도성 시스템은 4-히드록시타목시펜 (4OHT) (예를 들어,www.pnas.org/content/104/3/1027.abstract 참조)에 의해 유도가능한 에스트로겐 수용체 (ER) 기반 시스템일 수 있다. ERT2라고 하는 에스트로겐 수용체의 돌연변이된 리간드-결합 도메인은 4-히드록시타목시펜의 결합 시 세포의 핵으로 전위된다. 본 발명의 추가 구현예에서, 임의의 핵 수용체, 갑상선 호르폼 수용체, 레티노산 수용체, 에스트로겐 수용체, 에스트로겐-관련 수용체, 글루코코티코이드 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체의 임의의 천연 유래 또는 조작된 유도체는 ER 기반 유도성 시스템에 유사한 유도성 시스템에서 사용될 수 있다.
다른 유도성 시스템은 에너지, 열 또는 전파에 의해 유도성인 일시적 수용체 전위(일시적 수용체 potential:TRP) 이온 통로 기반 시스템을 이용하는 설계에 기반한다(예를 들어, www.sciencemag.org/content/336/6081/604). 이들 TRP 패밀리 단백질은 빛과 열을 포함한, 상이한 자극에 반응한다. 이러한 단백질은 빛 또는 열에 의해 활성화될 때, 이온 채널이 열리게 되어 칼슘 이온과 같은 이온의 형질막으로의 진입을 허용한다. 이러한 이온 유입은 가이드 및 C2c1 CRISPR-Cas 복합체 또는 시스템의 다른 성분을 포함한 폴리펩티드에 연결된 세포내 이온 상호작용 파트너에 결합하게 될 것이고 이러한 결합은 폴리펩티드의 세포하 국재화의 변화를 유도하여, 전체 폴리펩티드가 세포의 핵으로 진입하게 한다. 핵 내부에 존재하게 되면, 가이드 단백질 및 C2c1 CRISPR-Cas 복합체의 다른 성분이 활성화되어 세포에서 표적 유전자 발현을 조절하게 될 것이다.
빛 활성화가 유리한 구현예일 수 있지만, 때때로 빛이 피부 또는 다른 장기를 침투할 수 없는 생체내 적용에서는 특히 불리할 수 있다. 이러한 예에서, 에너지 활성화의 다른 방법, 특히 유사한 효과를 갖는 전기장 에너지 및/또는 초음파가 고려된다.
전기장 에너지는 바람직하게는 생체내 조건 하에서 약 1 Volt/cm 내지 약 10 kVolts/cm의 하나 이상의 전기 펄스를 사용하여, 당분야에 기술된 바와 같이, 실질적으로 투여된다. 펄스 대신에 또는 그이외에도, 전기장은 연속적인 방식으로 전달될 수 있다. 전기 펄스는 1 μs 내지 500 밀리초, 바람직하게 1 μs 내지 100 밀리초 동안 인가될 수 있다. 전기장은 약 5분 동안 펄스식 방식으로 또는 연속적으로 인가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "전기장 에너지"는 세포가 노출되는 전기 에너지이다. 바람직하게, 전기장은 생체내 조건 하에서 약 1 Volt/cm 내지 약 10 kVolts/cm 이상의 강도를 갖는다 (WO97/49450 참조).
본 명세서에서 사용되는 용어 "전기장"은 가변 용량 및 전압에서 하나 이상의 펄스를 포함하고, 지수파 및/또는 사각파 및/또는 변조파 및/또는 변조 사각파 형태를 포함한다. 전기장 및 전기장은 세포 환경에서 전기적 전위차의 존재에 대한 참조를 포함하도록 언급되어야 한다. 이러한 환경은 당업계에 공지된 바와 같은 정전기, 교류 (AC), 직류 (DC)에 의해 셋업될 수 있다. 전기장은 균일, 비균일 등일 수 있으며, 시간 의존적 방식으로 강도 및/또는 방향이 다를 수 있다.
전기장의 단회 또는 다회 인가뿐만 아니라 초음파의 단회 또는 다회 인가는 임의의 순서로 그리고 임의의 조합으로 가능하다. 초음파 및/또는 전기장은 단회 또는 다회 연속 인가로서, 또는 펄스 (박동성 전달)로서 전달될 수 있다.
외래 물질을 살아있는 세포 내로 도입하기 위해 시험관내 절차와 생체내 절차 둘 모두에서 전기천공법이 사용되어 왔다. 시험관내 적용에 의해, 생존 세포의 샘플은 먼저 관심의 작용제와 혼합되고, 전극, 예컨대, 평행판 사이에 위치된다. 이어서, 전극은 전기장을 세포/이식 혼합물에 인가된다. 시험관내 전기천공법을 수행하는 시스템의 예는 Electro Cell Manipulator ECM600 제품, 및 Electro Square Porator T820를 포함하며, 이들은 Genetronics, Inc의 BTX Division에서 제조되었다 (미국 특허 제5,869,326호 참조).
공지된 전기천공법 기법은 (시험관내 및 생체내) 처리 영역 주변에 위치된 전극에 짧은 고전압 펄스를 인가함으로써 작용한다. 전극 사이에서 발생된 전기장은 세포막을 일시적으로 다공성이 되게 하여서, 그때에 관심 작용제의 분자가 세포로 진입한다. 공지된 전기천공법 적용에서, 전기장은 약 100 ㎲ 지속기간의, 1000V/㎝ 규모로 단일 사각파 펄스를 포함한다. 이러한 펄스는, 예를 들어, 일렉트로 스퀘어 포레이터 T820의 공지된 적용에서 생성될 수 있다.
바람직하게는, 전기장은 시험관내 조건 하에서 약 1V/㎝ 내지 약 10㎸/㎝의 강도를 가진다. 따라서, 전계는 1 V/cm, 2 V/cm, 3 V/cm, 4 V/cm, 5 V/cm, 6 V/cm, 7 V/cm, 8 V/cm, 9 V/cm, 10 V/cm, 20 V/cm, 50 V/cm, 100 V/cm, 200 V/cm, 300 V/cm, 400 V/cm, 500 V/cm, 600 V/cm, 700 V/cm, 800 V/cm, 900 V/cm, 1 kV/cm, 2 kV/cm, 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm, 50 kV/cm 이상의 강도를 가질 수 있다. 보다 바람직하게 시험관내 조건 하에서 약 0.5 kV/cm 내지 약 4.0 kV/cm. 바람직하게는 전기장은 생체내 조건 하에서 약 1 V/㎝ 내지 약 10 ㎸/㎝의 강도를 갖는다. 그러나, 표적 부위에 전달된 펄스 수가 증가되는 경우에 전기장 강도는 낮아질 수 있다. 따라서, 더 낮은 전기장 강도에서 전기장의 박동성 전달이 계획된다.
바람직하게는 전기장의 인가는 동일한 강도 및 용량의 이중 펄스 또는 다양한 강도 및/또는 용량의 순차적 펄스와 같은 다중 펄스 형태이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "펄스"는 가변 용량 및 전압에서 하나 이상의 전기적 펄스를 포함하고, 지수 및/또는 사각파 및/또는 변조파/사각파 형태를 포함한다.
바람직하게는 전기적 펄스는 지수 파형, 사각 파형, 변조 파형으로부터 선택된 파형으로서 전달된다.
바람직한 구현예는 저전압에서 직류를 사용한다. 따라서, 출원인은 1V/㎝ 내지 20V/㎝의 전기장 강도에서, 100 밀리초 이상, 바람직하게는 15분 이상의 기간 동안 세포, 조직 또는 조직 덩어리에 인가되는 전기장의 사용을 개시한다.
초음파는 유리하게는 약 0.05W/㎠ 내지 약 100W/㎠의 전력 수준으로 투여된다. 진단 또는 치료 초음파, 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "초음파"는 기계적 진동으로 이루어지고, 이의 주파수는 너무 높아서 인간 청력 범위 이상인 에너지의 형태를 의미한다. 초음파 스펙트럼의 하한 주파수는 일반적으로 약 20 kHz로서 취해질 수 있다. 초음파의 대부분의 진단적 적용은 1 내지 15 ㎒' 범위의 주파수를 사용한다 (Ultrasonics in Clinical Diagnosis, P. N. T. Wells, ed., 2nd. Edition, Publ. Churchill Livingstone [Edinburgh, London & NY, 1977]).
초음파는 진단 및 치료 적용분야 둘 모두에서 사용되었다. 진단 도구로서 사용될 때 ("진단적 초음파"), 최대 750 mW/㎠의 에너지 밀도가 사용되었지만, 초음파는 전형적으로 최대 약 100 mW/㎠ (FDA 권장사항)의 에너지 밀도 범위에서 사용된다. 물리치료에서, 초음파는 전형적으로 약 3 내지 4 W/㎠ (WHO 권장사항) 범위에서 에너지 공급원으로서 사용된다. 다른 치료적 적용분야에서, 더 높은 강도의 초음파는 단기간 동안, 예를 들어, 100 W/㎝ 내지 1 kW/㎠ (또는 훨씬 높은)에서의 HIFU가 적용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "초음파"는 진단, 치료 및 집속 초음파를 포함하는 것으로 의도된다.
집속 초음파 (Focused ultrasound: FUS)는 비침습 프로브 없이 열 에너지를 전달할 수 있게 한다 ([Morocz et al 1998 Journal of Magnetic Resonance Imaging Vol.8, No. 1, pp.136-142] 참조). 집속 초음파의 다른 형태는 [Moussatov et al in Ultrasonics (1998) Vol.36, No.8, pp.893-900] 및 [TranHuuHue et al in Acustica (1997) Vol.83, No.6, pp.1103-1106]에서 고찰된 고강도 집속 초음파 (high intensity focused ultrasound: HIFU)이다.
바람직하게는, 진단 초음파와 치료 초음파의 조합이 사용된다. 그러나, 이 조합은 제한하려는 의도가 아니고, 당업자는 초음파의 임의의 다양한 조합이 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 추가적으로, 에너지 밀도, 초음파 주파수 및 노출 시간은 변할 수 있다.
바람직하게는 초음파 에너지원에 대한 노출은 약 0.05 내지 약 100W㎝-2의 전력 밀도에서이다. 훨씬 더 바람직하게는, 초음파 에너지원에 대한 노출은 약 1 내지 약 15W㎝-2의 전력 밀도에서이다.
바람직하게는 초음파 에너지원에 대한 노출은 약 0.015 내지 약 10.0 ㎒의 주파수에서이다. 더 바람직하게는 초음파 에너지원에 대한 노출은 약 0.02 내지 약 5.0 ㎒ 또는 약 6.0 ㎒의 주파수에서이다. 가장 바람직하게는, 초음파는 3 ㎒의 주파수에서 인가된다.
바람직하게는 노출은 약 10 밀리초 내지 약 60분의 기간 동안이다. 바람직하게는 노출은 약 1초 내지 약 5분의 기간 동안이다. 더 바람직하게는, 초음파는 약 2분 동안 인가된다. 그러나, 붕괴하려는 특정 표적 세포에 따라서, 노출은 더 긴 지속기간, 예를 들어, 15분 동안일 수 있다.
유리하게, 표적 조직이 약 0.0 5W㎝-2 내지 약 10 W㎝-2의 음향 출력 밀도에서 약 0.015 내지 약 10㎒ 범위의 주파수로 초음파 에너지원에 노출된다 (WO 98/52609 참조). 그러나, 대안, 예를 들어, 100W㎝-2 초과의 음향 출력 밀도에서, 그러나 감소된 시간 기간 동안, 예를 들어, 밀리초 범위 이하의 기간 동안 1000W㎝-2에서 초음파 에너지에 대한 노출이 또한 가능하다.
바람직하게는 초음파의 인가는 다중 펄스 형태이고, 따라서, 지속파와 펄스파 (초음파 맥동성 전달)는 둘 모두 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 지속파 초음파, 다음에 펄스파 초음파 또는 그 반대로 적용될 수 있다. 이는 임의의 횟수, 임의의 순서 및 조합으로 반복될 수 있다. 펄스파 초음파는 지속파 초음파의 배경에 대해 적용될 수 있고, 임의의 펄스 수가 임의의 그룹 수에서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 초음파는 펄스파 초음파를 포함할 수 있다. 고도로 바람직한 구현예에서, 초음파는 지속파로서 0.7W㎝-2 또는 1.25W㎝-2의 출력 밀도로 적용된다. 펄스파 초음파가 사용된다면, 더 높은 출력 밀도가 사용될 수 있다.
초음파의 사용은 표적 상에서 정확하게 집속시킬 수 있기 때문에 빛만큼 유리하다. 게다가, 초음파는 빛과 달리 조직에 더 깊게 집속시킬 수 있기 때문에 유리하다. 따라서 전체 조직 침투 (예컨대, 이에 제한없이, 간엽) 또는 전체 장기 (예컨대, 제한없이, 전체 간 또는 전체 근육, 예컨대, 심장) 요법에 더 적합하게 된다. 다른 중요한 이점은 초음파가 매우 다양한 진단적 및 치료적 적용분야에서 사용되는 비침습성 자극이라는 것이다. 예로서, 초음파는 의학적 영상화 기법에서, 추가적으로 정형외과적 요법에서 잘 공지되어 있다. 더 나아가, 대상 척추동물에 대한 초음파의 적용에 적합한 기기가 널리 이용 가능하며, 그들의 용도는 당업계에 충분히 공지되어 있다.
본 발명의 빠른 전사 반응 및 내생성 표적화는 전사 역학 연구를 위한 이상적인 시스템에 도움이 된다. 예를 들어, 본 발명은 표적 유전자의 유도된 발현 시 변이체 생성 역학을 연구하는 데 사용될 수 있다. 전사 주기의 다른 마지막에, mRNA 분해 연구는 종종 과잉 유전자의 발현 수준 변화를 야기하는 강한 세포외 자극에 반응하여 수행된다. 본 발명은 내생성 표적의 전사를 역으로 유도하는 데 이용될 수 있으며, 이 시점 후에 자극은 중단될 수 있고, 독특한 표적의 분해 역학이 추적될 수 있다.
본 발명의 일시적 정확성은 실험적 개입과 관련하여 시간 유전적 조절에 대한 검증력을 제공할 수 있다. 예를 들어, 장기 상승 작용(long-term potentiation:LTP)에 연루되는 것으로 의심되는 표적은 세포의 정상 발생 방해를 피하기 위해, 기관형(organotypic) 또는 해리된 뉴런 배양물에서, 그러나 LTP를 유도하기 위한 자극 동안에만 조절될 수 있다. 유사하게, 질환 표현형을 나타내는 세포 모델에서, 특정 요법의 유효성에 연루되는 것으로 의심되는 표적은 치료 동안에만 조절될 수 있다. 대조적으로, 유전자 표적은 병원성 자극 동안에만 조절될 수 있다. 외부 실험 자극에 대한 유전적 신호 시기가 적절성을 갖는 다수의 실험은 본 발명의 효용이 잠재적으로 유리할 수 있다.
생체내 상황은 유전자 발현을 제어하기 위해 본 발명에 대한 동등하게 풍부한 기회를 제공한다. 광유도 능력은 공간적 정확성에 대한 잠재력을 제공한다. 광단자 기술 개발을 기회로 하여, 자극성 광섬유 리드는 뇌 영역에 위치될 수 있다. 이어서, 자극 영역 크기는 광 강도에 의해 조율될 수 있다. 이는 본 발명의 C2c1 CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체의 전달과 함께 행해질 수 있거나, 또는 유전자이식 C2c1 동물의 경우에, 본 발명의 가이드 RNA는 전달될 수 있고, 광단자 기술은 정확한 뇌 영역에서 유전자 발현을 조절을 가능하게 할 수 있다. 투과적 C2c1 발현 유기체는 그에 투여되는 본 발명의 가이드 RNA를 가질 수 있고, 이어서, 극도로 정확한 레이저 유도된 국소 유전자 발현 변화가 있을 수 있다.
숙주 세포의 배양을 위한 배양 배지는 조직 배양을 위해 일반적으로 사용되는 매질, 예컨대 특히 M199-얼(earle) 염기, 이글(Eagle) MEM(E-MEM), 둘베코 MEM(DMEM), SC-UCM102, UP-SFM(GIBCO BRL), EXCELL302(Nichirei), EX-CELL293-S(Nichirei), TFBM-01(Nichirei), ASF104를 포함한다. 특정 세포 유형에 대한 적합한 배양 배지는 미국 미생물 보존센터(ATCC) 또는 유럽 세포 배양물 보존센터(European Collection of Cell Cultures:ECACC)에서 찾을 수 있다. 배양 배지는 아미노산, 예컨대 L-글루타민, 염, 항진균제 또는 항균제 예컨대 Fungizone®, 페니실린-스트렙토마이신, 동물 혈청 등으로 보충될 수 있다. 세포 배양 배지는 선택적으로 무혈청일 수 있다.
본 발명은 또한 생체 내에서 소중한 시간적 정확도를 또한 제공할 수 있다. 본 발명은 특정 발생 단계 동안 유전자 발현을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 특정 실험창에 대한 유전적 신호의 시간 측정을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 학습에 연루된 유전자는 무손상 설치류 또는 영장류 뇌의 정확한 영역에서 학습 자극 동안에만 과발현되거나 또는 억제될 수 있다. 추가로, 본 발명은 질환 발생의 특정 단계 동안에만 유전자 발현 변화를 유도하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일단 종양이 특정 크기 또는 전이 단계에 도달된다면, 종양유전자는 단지 과발현될 수 있다. 역으로, 알츠하이머의 발생시 의심되는 단백질은 동물의 생애에서 규정된 시점에서, 특정 뇌 영역 내에서만 무너질 수 있다. 이들 예는 본 발명의 잠재적 적용을 철저하게 열거하지는 않지만, 그들은 본 발명이 강력한 기술일 수 있는 일부 영역을 강조한다.
보호된 가이드
특정 구현예에서, 가이드 분자는 CRISPR-Cas 시스템의 특이성을 증가시키기 위해 2차 구조에 의해 변형되고, 그 2차 구조는 엑소뉴클레아제 활성에 대해 보호될 수 있고, 본 명세서에서 또한 보호된 가이드 분자라고도 언급되는 가이드 서열에 대한 5' 첨가를 허용한다.
일 양상에서, 본 발명은 가이드 분자의 서열과 "보호자 RNA" 를 하이브리드화하기 위해 제공되고, 여기서 "보호자 RNA" 는 가이드 분자의 3' 말단에 상보성이어서 부분적으로 이중-가닥인 가이드 RNA를 생성시키는 RNA 가닥이다. 본 발명의 일 구현예에서, 완벽하게 상보성인 보호자 서열로 미스매치된 염기 (즉, 가이드 서열의 일부를 형성하지 않는 가이드 분자의 염기)를 보호하는 것은 3' 말단에서 미스매치된 염기쌍과 표적 DNA 결합 가능성을 감소시킨다. 본 발명의 특정 구현예에서, 연장된 길이를 포함하는 추가 서열은 가이드가 가이드 분자 내에 보호자 서열을 포함하도록 가이드 분자 내에 존재할 수 있다. 이러한 "보호자 서열" 은 가이드 분자가 "노출된 서열" (표적 서열과 하이브리드화되는 가이드 서열의 일부 포함) 이외에도 "보호된 서열" 을 포함하는 것을 보장한다. 특정 구현예에서, 가이드 분자는 2차 구조 예컨대 헤어핀을 포함하도록 보호자 가이드의 존재에 의해 변형된다. 유리하게, 보호된 서열, 가이드 서열 또는 둘 모두에 대해 상보성을 갖는 3 또는 4 내지 30 이상, 예를 들어 약 10 이상의 인접한 염기쌍이 존재한다. 보호된 부분은 이의 표적과 상호작용하는 CRISPR-Cas 시스템의 열역학을 방해하지 않는 것이 유리하다. 부분적으로 이중 가닥인 가이드 분자를 포함한 이러한 연장부를 제공하여, 가이드 분자가 보호되는 것을 고려하고 그 결과로 비활성을 유지하면서, CRISPR-Cas 복합체의 개선된 비결합을 야기시킨다.
게놈 표적에 매칭되는 가이드 RNA(gRNA) 연장은 gRNA 보호를 제공하고, 특이성을 향상시킨다. 개개 게놈 표적에 대한 스페이서 씨드의 말단부에 대해 원위인 매칭 서열에 의한 gRNA의 연장은 향상된 특이성을 제공하는 것으로 예상된다. 특이성을 향상시키는 매칭 gRNA 연장은 절단 없이 세포에서 관찰되었다. 이들 안정한 길이 연장을 수반하는 gRNA 구조의 예측은 안정한 형태가 보호 상태로부터 생긴다는 것을 나타내며, 여기서, 연장은 스페이서 연장 및 스페이서 종자에서의 상보성 서열에 기인하여 gRNA 종자를 갖는 폐쇄 루프를 형성한다. 이들 결과는 보호된 가이드 개념이 또한 20량체 스페이서-결합 영역의 게놈 표적 서열 원위에 매칭되는 서열을 포함한다는 것을 입증한다. 열역학적 예측은 보호된 gRNA 상태를 초래하는 완전히 매칭되거나 또는 부분적으로 매칭되는 가이드 연장을 예측하기 위해 사용될 수 있다. 이는 보호된 gRNA의 개념을 X와 Z 사이의 상호작용까지 연장시키며, 여기서 X는 일반적으로 길이가 17 내지 20nt이고, Z는 길이가 1 내지 30nt일 것이다. 열역학적 예측은 X 및 Z 간 보호된 입체형태의 형성을 촉진하기 위해서 Z에 적은 수의 미스매치를 잠재적으로 도입하는, Z에 대한 최적 연장 상태를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 출원 전반에서, 용어 " X" 및 씨드 길이 (SL)는 결합하는 표적 DNA에 대해 이용가능한 뉴클레오티드의 수를 의미하는 용어 노출된 길이 (EpL)과 상호교환적으로 사용되고; 용어 " Y" 및 보포자 길이 (PL)은 보호자의 길이를 나타내기 위해 상호교환적으로 사용되며; 용어 "Z", "E", " E" 및 "EL" 은 표적 서열이 연장된 뉴클레오티드의 수를 나타내는 용어 연장된 길이 (ExL)에 상응하게 상호교환적으로 사용된다.
연장된 길이 (ExL)에 상응하는 연장 서열은 보호된 가이드 서열의 3' 말단에서 가이드 서열에 선택적으로 직접 부착될 수 있다. 연장 서열은 길이가 2 내지 12개의 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직하게는 ExL은 길이가 0, 2, 4, 6, 8, 10 또는 12개의 뉴클레오티드로서 나타낼 수 있다. 바람직한 구현예에서, ExL은 길이가 0 또는 4개의 뉴클레오티드로서 나타낼 수 있다. 더 바람직한 구현예에서, ExL은 길이가 4개의 뉴클레오티드로서 나타낼 수 있다. 연장 서열은 표적 서열에 대해 상보성일 수도 있고 상보성이 아닐 수도 있다.
연장 서열은 보호된 가이드 서열의 5' 말단에서 가이드 서열에 또한 및 보호 서열의 3' 말단에 선택적으로 추가적으로 직접 부착될 수 있다. 그 결과, 연장 서열은 보호된 서열과 보호 서열 사이의 연결 서열로서 작용한다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 이러한 연결은 보호되니 서열에 대한 보호 서열의 개선된 결합을 위해 보호된 서열 근처에 보호 서열을 위치시킬 수 있다. 씨드, 보호자 및 연장의 상기 기재된 관계는 가이드의 원위 단부(즉, 표적화 단부)가 5' 말단부이고, 예를 들어, 작용하는 가이드가 Cas 시스템인 경우에 적용된다는 것이 이해될 것이다. 구현예에서, 가이드의 원위 단부는 3' 말단부이고, 관계는 반전될 것이다. 이러한 구현예에서, 본 발명은 가이드 서열에 "보호자 RNA" 를 하이브리드화시키도록 제공함으로써, 부분적으로 이중-가닥 gRNA를 생성하되, "보호자 RNA" 는 가이드 RNA(gRNA)의 3' 말단부에 상보성인 RNA 가닥이다.
gRNA의 원위 단부에 대한 gRNA 미스매치의 첨가는 향상된 특이성을 입증할 수 있다. Y에서 보호되지 않은 원위 미스매치의 도입 또는 원위 미스매치(Z)에 의한 gRNA의 연장은 향상된 특이성을 입증할 수 있다. 언급한 바와 같은 이런 개념은 보호된 gRNA에서 사용되는 X, Y 및 Z 성분에 묶여 있다. 보호되지 않은 미스매치 개념은 보호된 가이드 RNA에 대해 기재된 X, Y 및 Z의 개념에 대해 추가로 일반화될 수 있다.
tru-가이드
특정 구현예에서, 절단된 가이드 (tru-가이드), 즉 정규 가이드 서열 길이에 비해서 길이가 절단된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자가 이용된다. Nowak 등 (Nucliec Acids Res (2016) 44 (20): 9555- 9564)이 기술한 바와 같이, 이러한 가이드는 표적 DNA를 절단하지 않고 촉매적 활성 CRISPR-Cas 효소가 이의 표적에 결합할 수 있게 한다. 특정 구현예에서, 절단된 가이드는 CRISPR-Cas 효소의 닉카제 활성만을 보유하면서 표적의 결합을 허용하는 것이 사용된다.
특정 구현예에서 가이드 분자는 직접 반복부 서열에 연결된 가이드 서열, 또는 직접 반복부 서열 및 tracr 서열에 연결된 가이드 서열을 포함하고, 여기서 직접 반복부 서열, crRNA, 및/또는 tracr 서열은 하나 이상의 스템 루프 또는 최적화된 2차 구조를 포함한다. 특정 구현예에서, 직접 반복부는 16 nt의 최소 길이 및 단일 스템 루프를 갖는다. 추가 구현예에서, 직접 반복부는 16 nt 초과, 바람직하게 17 nt 초과의 길이를 가지고, 하나 초과의 스템 루프 또는 최적화된 2차 구조를 갖는다. 특정 구현예에서 가이드 분자는 천연 직접 반복부 서열의 전체 또는 일부에 연결된 가이드 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 전형적인 V-B형 C2c1/Cas12b 가이드 분자는 (3'에서 5' 방향으로) 가이드 서열 및 tracr의 3' 말단에 상보성인, 상보성 스트레치 ("반복부")를 포함한다. 반복부 및 tracr은 제2 상보성 스트레치 반복부에 상보성인 tracr의 "안티-반복부") 및 폴리 A (RNA에서는 종종 폴리U) 꼬리 (종결자)를 포함한, 스템-루프 (루프는 전형적으로 4 또는 5 뉴클레오티드 길이)를 형성하도록 설계된 영역을 포함한 키메라 가이드로 결합될 수 있다. 특정 구현예에서, 가이드 아키텍처의 일정 양상은 예를 들어 특성의 첨가, 차감, 또는 치환을 통해 변형될 수 있는 반면, 가이드 아키텍처의 일정한 다른 양상은 유지된다. 제한없이 삽입, 결실, 및 치환을 포함하는, 조작된 가이드 분자 변형을 위한 바람직한 위치는 C2c1 단백질 및/또는 표적과 복합체를 형성했을 때, 예를 들어 직접 반복부 서열의 스템루프를 노출시키는 가이드 분자의 영역 및 가이드 말단을 포함한다.
키메라 가이드
본 발명은 다양한 Cas12b 시스템 가이드를 제공한다. 일정 구현예에서, 가이드는 2개의 하이브리드화가능한 부분을 포함하고, 제1 부분의 3' 말단은 제2 부분의 5' 말단에 적어도 부분적으로 상보성이고 그와 하이브리드화할 수 있다. 일정 구현예에서, 2개 부분은 결합된다. 즉, 단일 가이드 ("키메라 가이드")는 Cas12b tracr 서열에 상응하는 3' 말단에서 제2 절편에 결합된, 천연 Cas12b 가이드의 직접 반복부 및 가이드 서열에 상응하는 5' 말단에 제1 절편을 포함하는 것이 적용될 수 있다. 2개 절편은 제1 절편의 3' 말단의 상보성 서열 및 제2 절편의 5' 말단이 예를 들어 스템-루프 구조로 하이브리드화할 수 있도록 결합된다.
데드 가이드
일 양상에서, 본 발명은 CRISPR 복합체의 형성 및 표적에 대한 성공적인 결합을 가능하게 하는 한편, 동시에 성공적인 뉴클레아제 활성을 가능하게 하지 않는 방식으로(즉, 뉴클레아제 활성 없이/indel 활성 없이) 변형된 가이드 서열을 제공한다. 설명을 위하여, 이러한 변형된 가이드 서열은 "데드 가이드" 또는 "데드 가이드 서열" 로 지칭된다. 이들 데드 가이드 또는 데드 가이드 서열은 뉴클레아제 활성에 관해 촉매적으로 비활성이거나 또는 입체배좌적으로 비활성인 것으로 생각될 수 있다. 뉴클레아제 활성은 당업계에서 통상적으로 사용되는 바와 같은 서베이어 분석 또는 심층 서열분석, 바람직하게는 서베이어 분석을 이용하여 측정될 수 있다. 유사하게는, 데드 가이드 서열은 촉매적 활성을 촉진시키거나 또는 온-표적 및 오프-표적 결합 활성을 구별하는 능력에 관해 생산적 염기 짝짓기에서 충분하게 관여하지 않을 수도 있다. 간략하게, 서베이어 분석은 유전자에 대해 CRISPR 표적 부위를 정제하고 증폭시키는 것 및 CRISPR 표적 부위를 증폭시키는 프라이머와의 헤테로듀플렉스을 형성하는 것을 수반한다. 재-어닐링 후에, 생성물을 제조처의 권고된 프로토콜에 따라 SURVEYOR 뉴클레아제 및 SURVEYOR 인핸서 S(Transgenomics)로 처리하고, 겔 상에서 분석하고, 상대적 밴드 세기에 기초하여 정량화시킨다.
따라서, 관련된 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 기능성 Cas12b 및 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 조성물 C2c1 CRISPR-Cas 시스템을 제공하되, gRNA는 데드 가이드 서열을 포함함으로써, Cas12b CRISPR-Cas 시스템이 서베이어 분석에 의해 검출된 바와 같은 시스템의 비돌연변이체 Cas12b 효소의 뉴클레아제 활성으로부터 초래된 검출 가능한 indel 활성 없이 세포에서 관심 대상의 게놈 유전자좌로 향하도록, gRNA는 표적 서열에 하이브리드화될 수 있다. 간략함의 목적을 위해, Cas12b CRISPR-Cas 시스템이 서베이어 분석에 의해 검출되는 바와 같은 시스템의 비돌연변이체 Cas12b 효소의 뉴클레아제 활성으로부터 초래되는 검출 가능한 indel 활성 없이 세포에서 관심 대상의 게놈 유전자좌로 향하도록, gRNA가 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는, 데드 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 "데드 gRNA" 로 지칭된다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 임의의 gRNA가 본 명세서에서 이하에 기재되는 바와 같은 데드 gRNA/데드 가이드 서열을 포함하는 gRNA로서 사용될 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 임의의 방법, 생성물, 조성물 및 용도는 이하에 추가로 상술하는 바와 같은 데드 gRNA/데드 가이드 서열을 포함하는 gRNA와 동일하게 적용 가능하다. 추가적인 가이드에 의해, 다음의 특정 양상 및 구현예가 제공된다.
표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는 데드 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 데드 가이드 서열을 포함하는, CRISPR 복합체를 형성하는 데 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 대응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에, 예컨대 CRISPR 서열 성분을 코딩하는 벡터에 의한 형질감염에 의해, 그 다음에 표적 서열 내의 우선적인 절단 평가, 예컨대 본 명세서에 기재된 바와 같은 서베이어 분석에 의해 제공될 수 있다. 유사하게는, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 시험될 데드 가이드 서열 및 시험 데드 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는, CRISPR 복합체의 성분인 표적 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열 반응과 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서 결합 또는 절단율을 비교함으로써, 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 분석이 가능하며, 당업자에게 일어날 것이다. 데드 가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포 게놈 내의 서열이다.
본 명세서에 추가로 설명하는 바와 같이, 몇몇 구조적 매개변수는 이러한 데드 가이드에서 적절한 프레임워크가 도달하는 것을 가능하게 한다. 데드 가이드 서열은 활성 Cas12b-특이적 indel 형성을 초래하는 각각의 가이드 서열보다 더 짧다. 데드 가이드는 동일한 Cas12b로 향하는 각각의 가이드보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 더 짧아서 활성 Cas12b-특이적 indel 형성을 야기한다.
하기에 설명되고, 해당 분야에 알려져 있는 바와 같이, gRNA - C2c1 특이성의 일 양태는 직접 반복부 서열이며, 이는 적절하게 이러한 가이드에 연결될 것이다. 특히, 이것은 직접 반복부 서열이 C2c1의 기원에 따라 설계되는 것을 암시한다. 따라서, 입증된 데드 가이드 서열에 이용가능한 구조적 데이타는 C2c1 특이적 균등물을 디자인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 C2c1 이펙터 단백질의 오솔로그 뉴클레아제 도메인 RuvC의 구조적 유사성을 사용하여 등가의 설계 데드 가이드를 전달할 수 있다. 따라서, 본원의 데드 가이드는 길이 및 서열을 적절하게 변형시켜, 이러한 C2c1 특이적 등가물을 반영하여, CRISPR 복합체의 형성 및 표적으로의 성공적인 결합을 가능하게 함과 동시에, 성공적인 뉴클레아제 활성을 허용하지 않을 수 있다.
본 명세서뿐만 아니라 당업계의 언급과 관련하여 데드 가이드의 사용은 시험관내, 생체외 및 생체내 적용에서 네트워크 생물학 및/또는 시스템 생물학을 위한 놀랍고도 예상되지 않은 플랫폼을 제공하여, 다중복합 유전자 표적화, 및 특히 양방향 다중복합 유전자 표적화를 가능하게 한다. 데드 가이드의 사용 전에, 다중 표적의 처리, 예를 들어, 유전자 활성의 활성화, 억제 및/또는 침묵은 도전되어 왔으며, 일부 경우에 가능하지 않다. 데드 가이드의 사용에 의해, 다중 표적 및 그에 따른 다중 활성은, 예를 들어, 동일한 세포에서, 동일한 동물에서, 또는 동일한 환자에서 처리될 수 있다. 이러한 다중복합은 동시에 일어나거나 또는 목적하는 시간틀 동안 시차를 둘 수 있다.
예를 들어, 데드 가이드는 이제 뉴클레아제 활성 결과 없이 유전자 표적화를 위한 수단으로서 gRNA를 사용하는 첫 시간을 가능하게 하는 한편, 동시에 활성화 또는 억제를 위해 지시 수단을 제공한다. 데드 가이드를 포함하는 가이드 RNA는 유전자 활성의 활성화 또는 억제를 허용하는 방식으로 요소, 특히, 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 단백질 어댑터(예를 들어, 압타머)를 추가로 포함하여, 유전자 이펙터(예를 들어, 유전자 활성의 활성인자 또는 억제인자)의 기능적 배치를 허용하도록 변형될 수 있다. 일 예는 본 명세서에 설명되는 바와 같이 그리고 당업계의 상태에서, 압타머의 혼입이다. 데드 가이드를 포함하는 gRNA를 조작하여, 단백질-상호작용 압타머(문헌[Konermann et al., "Genome-scale transcription 활성화by an engineered CRISPR-Cas9 complex," doi:10.1038/nature14136, incorporated herein by reference])를 혼입시킴으로써, 다수의 별개의 이펙터 도메인으로 이루어진 합성 전사 활성화 복합체를 조립할 수 있다. 이렇게 해서 천연 전사 활성화 과정 후에 모델링될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 (예를 들어, 활성인자 또는 억제인자; 활성인자 또는 억제인자와의 융합 단백질로서 이량체화된 MS2 박테리오파지 코트 단백질)에 선택적으로 결합하는 압타머, 또는 그 자체가 이펙터 (예를 들어, 활성인자 또는 억제인자)에 결합하는 단백질은 데드 gRNA 테트라루프 및/또는 스템-루프 2에 첨부될 수 있다. MS2의 경우에, 융합 단백질 MS2-VP64는 테트라루프 및/또는 줄기-루프 2에 결합하고, 결국, 예를 들어, Neurog2에 대해 전사 상향조절을 매개한다. 다른 전사 활성인자는 예를 들어, VP64. P65, HSF1 및 MyoD1이다. 단지 이 개념의 예로서, MS2 줄기-루프의 PP7-상호작용 줄기-루프로의 대체는 억제성 요소를 보충하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 일 양상은 데드 가이드를 포함하는 본 발명의 gRNA이되, gRNA는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 유전자 활성화 또는 억제를 제공하는 변형을 추가로 포함한다. 데드 gRNA는 하나 이상의 압타머를 포함할 수 있다. 압타머는 유전자 이펙터, 유전자 활성인자 또는 유전자 억제인자에 특이적일 수 있다. 대안적으로, 압타머는 단백질에 특이적일 수 있으며, 이는 차례로 특정 유전자 이펙터, 유전자 활성 인자 또는 유전자 억제인자에 특이적이고, 이를 동원/이에 결합한다. 활성인자 또는 억제인자 보충을 위한 다중 부위가 있다면, 부위는 활성인자 또는 억제인자 중 하나에 특이적인 것이 바람직하다. 활성인자 또는 억제인자 결합에 대한 다중 부위가 있다면, 부위는 동일 활성인자 또는 동일 억제인자에 특이적일 수 있다. 부위는 또한 상이한 활성인자 또는 상이한 억제인자에 특이적일 수 있다. 유전자 이펙터, 유전자 활성인자, 유전자 억제인자는 융합 단백질의 형태로 존재할 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 데드 gRNA 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 C2c1 CRISPR-Cas 복합체는 2 이상의 어댑터 단백질을 포함하는 천연 유래 또는 조작된 조성물을 포함하되, 각각의 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 결합되고, 어댑터 단백질은 데드 gRNA의 적어도 하나의 루프에 삽입된 별개의 RNA 서열(들)에 결합한다.
그리하여, 일 양상은 세포에서 관심 게놈 유전자좌의 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 데드 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 조성물을 제공하고, 여기서 데드 가이드 서열은 본 명세서에 정의된 바와 같이, 적어도 하나 이상의 핵 국재화 서열을 포함하는 C2c1이고, C2c1은 데드 gRNA의 적어도 하나의 루프가 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되는 것인 적어도 하나의 돌연변이를 임의로 포함하고, 어댑터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되거나; 또는 데드 gRNA는 적어도 하나의 비코딩 기능성 루프를 갖도록 변형되고, 조성물은 둘 이상의 어댑터 단백질을 포함하고, 각각의 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합된다.
일정 구현예에서, 어댑터 단백질은 기능성 도메인을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 융합 단백질은 선택적으로 어댑터 단백질과 기능성 도메인 사이에 링커를 포함하며, 링커는 선택적으로 GlySer 링커를 포함한다.
일정 구현예에서, 데드 gRNA의 적어도 하나의 루프는 2 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되지 않는다.
일정 구현예에서, 어댑터 단백질에 결합된 하나 이상의 기능성 도메인은 전사 활성화 도메인이다.
일정 구현예에서, 어댑터 단백질에 결합된 하나 이상의 기능성 도메인은 VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA 또는 SET7/9를 포함하는 전사 활성화 도메인이다.
일정 구현예에서, 어댑터 단백질에 결합된 하나 이상의 기능성 도메인은 전사 억제인자 도메인이다.
일정 구현예에서, 전사 억제인자 도메인은 KRAB 도메인이다.
일정 구현예에서, 전사 억제인자 도메인은 NuE 도메인, NcoR 도메인, SID 도메인 또는 SID4X 도메인이다.
일정 구현예에서, 어댑터 단백질에 결합된 하나 이상의 기능성 도메인 중 적어도 하나는 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, DNA 통합 활성 RNA 절단 활성, DNA 절단 활성 또는 핵산 결합 활성을 포함하는 한 가지 이상의 활성을 가진다.
일정 구현예에서, DNA 절단 활성은 Fok1 뉴클레아제에 기인한다.
일정 구현예에서, 데드 gRNA는 데드 gRNA가 어댑터 단백질에 결합하고 추가로 C2c1 및 표적에 결합하도록 변형되고, 기능성 도메인이 그의 기인하는 기능에서 작동하는 것을 가능하게 하는 공간적 배향이다.
일정 구현예에서, 데드 gRNA의 적어도 하나의 루프는 테트라 루프 및/또는 루프2이다. 일정 구현예에서, 데드 gRNA의 테트라 루프 및 루프 2는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형된다.
일정 구현예에서, 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입은 압타머 서열이다. 일정 구현예에서, 압타머 서열은 동일한 어댑터 단백질에 특이적인 2 이상의 압타머 서열이다. 일정 구현예에서, 압타머 서열은 상이한 어댑터 단백질에 특이적인 2 이상의 압타머 서열이다.
일정 구현예에서, 어댑터 단백질은 MS2, PP7, Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ΦCb5, ΦCb8r, ΦCb12r, ΦCb23r, 7s, PRR1을 포함한다.
일정 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포이다. 일정 구현예에서, 진핵생물 세포는 포유류 세포, 임의로 마우스 세포이다. 일정 구현예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다.
일정 구현예에서, 제1 어댑터 단백질은 p65 도메인과 결합되고, 제2 어댑터 단백질은 HSF1 도메인과 결합된다.
일정 구현예에서, 조성물은 적어도 3개의 기능성 도메인을 갖는 C2c1 CRISPR-Cas 복합체를 포함하며, 이 중 적어도 하나는 C2c1과 결합되고, 이 중 적어도 둘은 데드 gRNA와 결합된다.
일정 구현예에서, 조성물은 제2 gRNA를 추가로 포함하되, 제2 C2c1 CRISPR-Cas 시스템이 시스템의 C2c1 효소의 뉴클레아제 활성으로부터 초래된 제2 게놈 유전자좌에서 검출 가능한 indel 활성을 갖는 세포에서 관심 대상의 제2 게놈 유전자좌로 향하도록, 제2 gRNA는 제2 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 생 gRNA이다.
일정 구현예에서, 조성물은 복수의 데드 gRNA 및/또는 복수의 생 gRNA를 추가로 포함한다.
본 발명의 일 양태는 gRNA 스캐폴드의 모듈성 및 맞춤성을 이용하여, 직교 방식으로 별개의 유형의 이펙터를 동원하기 위한 상이한 결합 부위(특히 압타머)를 갖는 일련의 gRNA 스캐폴드를 확립하는 것이다. 다시, 더 넓은 개념의 예시 및 실례를 위하여, PP7-상호작용 스템-루프로의 MS2 스템-루프의 대체를 사용하여, 억제 요소를 결합/동원하여, 다중화된 양방향성 전사 제어를 가능하게 할 수 있다. 따라서, 일반적으로, 데드 가이드를 포함하는 gRNA는 다중복합 전사 제어 및 바람직한 양방향 전사 제어를 제공하는 데 사용될 수 있다. 이 전사 제어는 유전자에서 가장 바람직하다. 예를 들어, 데드 가이드(들)를 포함하는 하나 이상의 gRNA는 하나 이상의 표적 유전자의 활성화를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 동시에, 데드 가이드(들)를 포함하는 하나 이상의 gRNA는 하나 이상의 표적 유전자의 억제를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 서열은 다양한 상이한 조합으로 적용될 수 있으며, 예를 들어, 표적 유전자는 처음 억제되고, 이어서, 적절한 기간에 다른 표적이 활성화되거나, 또는 선택 유전자가 활성화되는 것과 동시에 선택 유전자가 억제되며, 추가 활성화 및/또는 억제가 이어진다. 그 결과, 하나 이상의 생물학적 시스템의 다중 성분은 유리하게 함께 처리될 수 있다.
양상에서, 본 발명은 데드 gRNA를 코딩하는 핵산 분자(들) 또는 C2c1 CRISPR-Cas 복합체 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 제공한다.
양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 데드 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 일정 구현예에서, 벡터 시스템은 C2c1을 코딩하는 핵산 분자(들)를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 벡터 시스템은 (생) gRNA를 코딩하는 핵산 분자(들)를 추가로 포함한다. 일정 구현예에서, 핵산 분자 또는 벡터는 가이드 서열(gRNA)을 코딩하는 핵산 분자 및/또는 C1c1을 코딩하는 핵산 분자 및/또는 선택적 핵 국재화 서열(들)에 작동적으로 연결된 진핵생물 세포에서 작동 가능한 조절 서열(들)을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, 또한, 구조적 분석을 사용하여 DNA 결합을 가능하게 하지만 DNA 절단을 가능하게 하지 않는 데드 가이드와 활성 C2c1 뉴클레아제 간의 상호작용을 연구할 수 있다. 이러한 방식으로 C2c1의 뉴클레아제 활성에 중요한 아미노산이 결정된다. 이러한 아미노산의 변형은 유전자 편집을 위해 사용되는 C2c1 효소의 개선을 허용한다.
추가적인 양상은 본 명세서에 설명될 뿐만 아니라 당업계에 공지된 바와 같은 CRISPR의 다른 적용과 본 명세서에 설명된 바와 같은 데드 가이드의 사용을 조합하는 것이다. 예를 들어, 표적화된 다중복합 유전자 활성화 또는 억제 또는 표적화된 다중복합 양방향 유전자 활성화/억제를 위해 데드 가이드(들)를 포함하는 gRNA는 본 명세서에 설명된 바와 같은 뉴클레아제 활성을 유지하는 가이드를 포함하는 gRNA와 조합될 수 있다. 뉴클레아제 활성을 유지하는 가이드를 포함하는 이러한 gRNA는 유전자 활성의 억제를 가능하게 하는 변형(예를 들어, 압타머)을 추가로 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수도 있다. 뉴클레아제 활성을 유지하는 가이드를 포함하는 이러한 gRNA는 유전자 활성의 활성화를 가능하게 하는 변형(예를 들어, 압타머)을 추가로 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수도 있다. 이러한 방식으로, 다중복합 유전자 제어를 위한 추가적인 수단이 도입된다(예를 들어, 뉴클레아제 활성 없이/indel 활성 없이, 다중복합 유전자 표적화된 활성화는 뉴클레아제 활성에 의한 유전자 표적화된 억제와 동시에 또는 이와 조합하여 제공될 수 있다).
예를 들어, 1) 하나 이상의 유전자를 표적화하는 데드 가이드(들)를 포함하고 유전자 활성인자의 동원을 위해 적절한 어댑터로 더욱 변형된 하나 이상의 gRNA (예를 들어, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 바람직하게 1-10, 보다 바람직하게 1-5)의 사용; 2) 하나 이상의 유전자를 표적화하는 데드 가이드(들)를 포함하고 유전자 억제인자의 동원에 적절한 압타머로 더욱 변형된 하나 이상의 gRNA (예를 들어, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 바람직하게 1-10, 보다 바람직하게 1-5)와 조합될 수 있다. 이어서, 1) 및/또는 2)는 3) 하나 이상의 유전자에 표적화된 하나 이상의 gRNA(예를 들어, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1 내지 5)와 조합될 수 있다. 이어서, 이 조합은 결국 1) + 2) + 3)과 함께 4) 하나 이상의 유전자에 표적화되고 유전자 억제인자의 동원을 위해 적절한 압타머로 추가로 변형된 하나 이상의 gRNA (예를 들어, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1 내지 5)로 수행될 수 있다. 이어서, 이 조합은 결국 1) + 2) + 3) + 4)와 함께 5) 하나 이상의 유전자에 표적화되고 유전자 억제인자의 동원을 위해 적절한 압타머로 추가로 변형된 하나 이상의 gRNA(예를 들어, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더 바람직하게는 1 내지 5)로 수행될 수 있다. 그 결과, 다양한 용도 및 조합이 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 조합 1) + 2); 조합 1) + 3); 조합 2) + 3); 조합 1) + 2) + 3); 조합 1) + 2) +3) +4); 조합 1) + 3) + 4); 조합 2) + 3) +4); 조합 1) + 2) + 4); 조합 1) + 2) +3) +4) + 5); 조합 1) + 3) + 4) +5); 조합 2) + 3) +4) +5); 조합 1) + 2) + 4) +5); 조합 1) + 2) +3) + 5); 조합 1) + 3) +5); 조합 2) + 3) +5); 조합 1) + 2) +5).
일 양상에서, 본 발명은 표적 유전자 좌위에 C2c1 CRISPR-Cas 시스템을 가이드하기 위해 데드 가이드 RNA 표적화 서열(데드 가이드 서열)을 설계하거나, 평가하거나 또는 선택하기 위한 알고리즘을 제공한다. 특히, 데드 가이드 RNA 특이성은 i) GC 함량 및 ii) 표적화 서열 길이에 관한 것이며, 이들을 변화시킴으로써 최적화될 수 있다는 것이 결정되었다. 양상에서, 본 발명은 데드 가이드 RNA의 비표적 결합 또는 상호작용을 최소화하는 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 설계하거나 또는 평가하기 위한 알고리즘을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 유기체 내 유전자 좌위로 CRISPR 시스템을 유도하기 위한 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 선택하기 위한 알고리즘은 a) 유전자 좌위 내 하나 이상의 CRISPR 모티프를 위치시키는 단계, i) 서열의 GC 함량을 결정하는 단계; ii) 유기체의 게놈에서 CRISPR 모티프에 가장 가까운 15 하류 뉴클레오티드의 오프-표적 매치가 존재하는지 여부를 결정하는 단계에 의해 각각의 CRISPR 모티프의 하류 20 nt 서열을 분석하는 단계, 및 c) 서열의 GC 함량이 70% 이하이고 오프-표적 매치가 확인되지 않으면 데드 가이드 RNA에서 사용을 위한 15 뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계를 포함한다. 구현예에서, GC 함량이 60% 이하라면, 서열은 표적화 서열에 대해 선택된다. 일정 구현예에서, GC 함량이 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하 또는 30% 이하라면, 서열은 표적화 서열을 위해 선택된다. 구현예에서, 유전자 좌위의 2 이상의 서열이 분석되며, 가장 낮은 GC 함량, 다음의 낮은 GC 함량 또는 다음의 낮은 GC 함량을 갖는 서열이 선택된다. 구현예에서, 오프-표적 매치가 유기체 게놈에서 동정되지 않는다면, 서열은 표적화 서열에 대해 선택된다. 구현예에서, 오프-표적 매치가 게놈의 조절 서열에서 확인되지 않는다면, 표적화 서열이 선택된다.
본 발명의 일 양상에서, 본 발명은 유기체 내 유전자 좌위로 기능화된 CRISPR 시스템을 유도하기 위한 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 선택하기 위한 방법을 제공하고, a) 유전자 좌위 내 하나 이상의 CRISPR 모티프를 위치시키는 단계, b) i) 서열의 GC 함량을 결정하는 단계; ii) 유기체의 게놈에서 서열의 제1 15 nt의 오프-표적 매치가 존재하는지 여부를 결정하는 단계에 의해 각각의 CRISPR 모티프의 하류 20 nt 서열을 분석하는 단계, 및 c) 서열의 GC 함량이 70% 이하이고 오프-표적 매치가 확인되지 않으면 가이드 RNA에서 사용을 위한 서열을 선택하는 단계를 포함한다. 구현예에서, GC 함량이 50% 이하라면, 서열은 선택된다. 구현예에서, GC 함량이 40% 이하라면, 서열은 선택된다. 구현예에서, GC 함량이 30% 이하라면, 서열은 선택된다. 구현예에서, 2 이상의 서열이 분석되고, 가장 낮은 GC 함량을 갖는 서열이 선택된다. 구현예에서, 오프-표적 매치가 유기체의 조절 서열에서 결정된다. 구현예에서, 유전자 좌위는 조절 영역이다. 양상은 앞서 언급한 방법에 따라 선택된 표적화 서열을 포함하는 데드 가이드 RNA를 제공한다.
양상에서, 본 발명은 유기체에서 작용화된 CRISPR 시스템을 유전자 좌위에 표적화하기 위한 데드 가이드 RNA를 제공한다. 본 발명의 구현예에서, 데드 가이드 RNA는 표적화 서열을 포함하되, 표적 서열의 GC 함량은 70% 이하이고, 표적화 서열의 처음 15 nt는 유기체에서 다른 유전자 좌위의 조절 서열 내 CRISPR 모티프로부터의 하류에 오프-표적 서열을 매칭하지 않는다. 일정 구현예에서, 표적화 서열의 GC 함량은 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하 또는 30% 이하이다. 일정 구현예에서, 표적화 서열의 GC 함량은 70% 내지 60% 또는 60% 내지 50% 또는 50% 내지 40% 또는 40% 내지 30%이다. 구현예에서, 표적화 서열은 유전자좌의 잠재적 표적화 서열 중에 가장 낮은 GC 함량을 가진다.
본 발명의 구현예에서, 데드 가이드의 처음 15 nt는 표적 서열에 매칭된다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 14 nt는 표적 서열에 매칭된다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 13 nt는 표적 서열에 매칭된다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 12 nt는 표적 서열에 매칭된다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 11 nt는 표적 서열에 매칭된다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 10 nt는 표적 서열에 매칭된다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 15 nt는 다른 유전자 좌위의 조절 영역에서 CRISPR 모티프로부터의 하류의 오프-표적 서열에 매칭되지 않는다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 14 nt, 또는 처음 13 nt, 또는 가이드의 처음 12 nt 또는 데드 가이드의 처음 11 nt 또는 데드 가이드의 처음 10 nt는 다른 유전자 좌위의 조절 영역에서 CRISPR 모티프로부터의 하류의 오프-표적 서열에 매칭되지 않는다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 15 nt, 또는 14 nt, 또는 13 nt, 또는 12 nt, 또는 11 nt는 게놈에서 CRISPR 모티프로부터의 하류의 오프-표적 서열에 매칭되지 않는다.
일정 구현예에서, 데드 가이드 RNA는 표적 서열과 일치하지 않는 3' 말단에 추가의 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, CRISPR 모티프의 하류의 처음 15 nt 또는 14 nt 또는 13 nt 또는 12 nt 또는 11 nt를 포함하는 데드 가이드 RNA는 3' 말단에서 길이가 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt 이상까지 연장될 수 있다.
본 발명은 데드 C2c1 (dC2c1) 또는 기능화된 C2c1 시스템(기능화된 C2c1 또는 기능화된 가이드를 포함할 수 있음)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 C2c1 CRISPR-Cas 시스템을 유전자 좌위로 보내는 방법을 제공한다. 양상에서, 본 발명은 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 선택하고, 작용화된 CRISPR 시스템을 유기체에서 유전자 좌위로 보내기 위한 방법을 제공한다. 양상에서, 본 발명은 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 선택하고 기능화된 C2c1 CRISPR-Cas 시스템에 의해 표적 유전자 좌위의 유전자 조절을 달성하는 방법을 제공한다. 일정 구현예에서, 상기 방법은 표적 유전자 조절을 달성하는 한편, 오프-표적 효과를 최소화하기 위해 사용된다. 양상에서, 본 발명은 2 이상의 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 선택하고 기능화된 C2c1 CRISPR-Cas 시스템에 의해 2 이상의 표적 유전자 좌위의 유전자 조절을 달성하는 방법을 제공한다. 일정 구현예에서, 상기 방법은 2 이상의 표적 유전자 좌위의 조절을 달성하는 한편, 오프-표적 효과를 최소화하기 위해 사용된다.
양상에서, 본 발명은 유기체의 유전자 좌위로 기능화된 C2c1을 유도시키기 위한 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 선택하는 방법을 제공하고, 방법은 a) 유전자 좌위에 하나 이상의 CRISPR 모티프를 위치시키는 단계; b) i) CRISPR 모티프에 인접한 10 내지 15 nt를 선택하는 단계, ii) 서열의 GC 함량을 결정하는 단계에 의해 각각의 CRISPR 모티프의 하류 서열을 분석하는 단계; 및 c) 서열의 GC 함량이 40% 이상이면 가이드 RNA에서 사용을 위한 표적화 서열로서 10 내지 15 nt 서열을 선택하는 단계를 포함한다. 구현예에서, GC 함량이 50% 이상이라면 서열은 선택된다. 구현예에서, GC 함량이 60% 이상이라면 서열은 선택된다. 구현예에서, GC 함량이 70% 이상이라면 서열은 선택된다. 구현예에서, 2 이상의 서열이 분석되고, 가장 높은 GC 함량을 갖는 서열이 선택된다. 일 실시형태에서, 방법은 CRISPR 모티프의 하류 서열과 매치되지 않는 선택된 서열의 3' 말단에 뉴클레오티드를 첨가하는 단계를 더 포함한다. 양상은 앞서 언급한 방법에 따라 선택된 표적화 서열을 포함하는 데드 가이드 RNA를 제공한다.
양상에서, 본 발명은 유기체에서 작용화된 CRISPR 시스템을 유전자 좌위로 보내기 위한 데드 가이드 RNA를 제공하되, 데드 가이드 RNA의 표적화 서열은 유전자 좌위의 CRISPR 모티프에 인접한 10 내지 15개의 뉴클레오티드로 이루어지고, 표적 서열의 CG 함량은 50% 이상이다. 일정 실시형태에서, 데드 가이드 RNA는 유전자 좌위의 CRISPR 모티프의 하류 서열과 매치되지 않는 표적화 서열의 3' 말단에 첨가된 뉴클레오티드를 더 포함한다.
양상에서, 본 발명은 하나 이상, 또는 둘 이상의 유전자 좌위로 유도되는 단일 이펙터를 제공한다. 일정 구현예에서, 이펙터는 C2c1과 회합되고, 하나 이상, 또는 둘 이상의 선택된 데드 가이드 RNA는 C2c1-회합된 이펙터를 하나 이상, 또는 둘 이상의 선택된 표적 유전자 좌위로 유도시키는데 사용된다. 일정 구현예에서, 이펙터는 하나 이상, 또는 둘 이상의 선택된 데드 가이드 RNA와 결합되고, C2c1 효소와 복합체화될 때 각각의 선택된 데드 가이드 RNA는 이의 회합된 이펙터가 데드 가이드 RNA 표적에 국재화되게 야기시킨다. 이러한 CRISPR 시스템의 한 가지 비제한적 예는 동일한 전사 인자에 의한 조절에 대해 하나 이상 또는 둘 이상의 유전자 좌위 대상의 활성을 조절한다.
양상에서, 본 발명은 하나 이상의 유전자 좌위로 유도되는 둘 이상의 이펙터를 제공한다. 일정 구현예에서, 둘 이상의 데드 가이드 RNA가 사용되며, 둘 이상의 이펙터 각각은 선택된 데드 가이드 RNA와 결합되고, 둘 이상의 이펙터 각각은 그의 데드 가이드 RNA의 선택된 표적으로 국소화된다. 이러한 CRISPR 시스템의 한 가지 비제한적 예는 상이한 전사 인자에 의한 조절에 대해 하나 이상, 또는 둘 이상의 유전자 좌위 대상을 조절한다. 따라서, 하나의 비제한적 구현예에서, 둘 이상의 전사 인자는 단일 유전자의 상이한 조절 서열로 국재화된다. 다른 비제한적 구현예에서, 둘 이상의 전사 인자가 상이한 유전자의 상이한 조절 서열로 국재화된다. 일정 구현예에서, 하나의 전사 인자는 활성인자이다. 일정 구현예에서, 하나의 전사 인자는 억제제이다. 일정 구현예에서, 하나의 전사 인자는 활성인자이고, 다른 전사 인자는 억제제이다. 일정 구현예에서, 동일한 조절 경로의 상이한 성분을 발현시키는 유전자 좌위가 조절된다. 일정 구현예에서, 상이한 조절 경로의 성분을 발현시키는 유전자 좌위가 조절된다.
양상에서, 본 발명은 또한 표적 DNA 절단 또는 표적 결합 및 활성 C2c1 CRISPR-Cas 시스템에 의해 매개되는 유전자 조절에 특이적인 데드 가이드 RNA를 설계하고 선택하기 위한 방법 및 알고리즘을 제공한다. 일정 구현예에서, C2c1 CRISPR-Cas 시스템은 하나의 유전자 좌위에서 표적 DNA를 절단하는 한편, 동시에 다른 유전자 좌위에 결합하고, 이의 조절을 촉진시키는 활성 C2c1을 이용하여 직교 유전자 제어를 제공한다.
양상에서, 본 발명은 절단 없이, 유기체에서 유전자 좌위로 기능화된 Cas12b를 유도시키기 위한 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 선택하는 방법을 제공한다,. 일정 구현예에서, 방법은 a) 유전자 좌위에 하나 이상의 CRISPR 모티프를 위치시키는 단계; b) i) CRISPR 모티프에 인접한 10 내지 15 nt를 선택하는 단계, ii) 서열의 GC 함량을 결정하는 단계에 의해 각각의 CRISPR 모티프 하류의 서열을 분석하는 단계, 및 c) 서열의 GC 함량이 30% 이상, 40% 이상이면 데드 가이드 RNA에서 사용하기 위한 표적화 서열로서 10 내지 15 nt 서열을 선택하는 단계를 포함한다. 일정 구현예에서, 표적화 서열의 GC 함량은 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 또는 70% 이상이다. 일정 구현예에서, 표적화 서열의 GC 함량은 30% 내지 40% 또는 40% 내지 50% 또는 50% 내지 60% 또는 60% 내지 70%이다. 본 발명의 구현예에서, 유전자 좌위에서 둘 이상의 서열이 분석되고, 가장 높은 GC 함량을 갖는 서열이 선택된다.
본 발명의 구현예에서, GC 함량이 평가되는 표적화 서열의 일부는 PAM에 가장 가까운 15개의 표적 뉴클레오티드의 10 내지 15개의 인접한 뉴클레오티드이다. 본 발명의 구현예에서, GC 함량이 고려되는 가이드의 일부는 PAM에 가장 가까운 15개의 뉴클레오티드 중 10 내지 11개의 뉴클레오티드 또는 11 내지 12개의 뉴클레오티드 또는 12 내지 13개의 뉴클레오티드 또는 13, 또는 14, 또는 15개의 인접한 뉴클레오티드이다.
일 양태에서, 본 발명은 기능적 활성화 또는 억제를 피하면서, CRISPR 시스템 유전자좌 절단을 촉진시키는 데드 가이드 RNA를 확인하기 위한 알고리즘을 추가로 제공한다. 16 내지 20개의 뉴클레오티드의 데드 가이드 RNA에서 증가된 GC 함량은 증가된 DNA 절단 및 감소된 기능성 활성화와 동시에 일어난다는 것이 관찰된다.
기능화된 Cas12b의 효율은 CRISPR 모티프 하류의 표적 서열과 매치되지 않는 가이드 RNA의 3' 말단부에 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 증가될 수 있다. 예를 들어, 길이가 11 내지 15 nt인 데드 가이드 RNA 중에서, 가이드가 짧을수록 표적 절단을 촉진시킬 가능성은 적을 수 있지만, 이는 또한 CRISPR 시스템 결합 및 기능성 제어의 촉진에서 덜 효율적이다. 특정 구현예에서, 데드 가이드 RNA의 3' 말단으로의 표적 서열과 매치되지 않는 뉴클레오티드의 첨가는 활성화 효율을 증가시키는 한편, 요망되지 않는 표적 절단을 증가시키지 않는다. 양상에서, 본 발명은 또한 DNA 결합 및 유전자 조절에서 CRISPRP 시스템을 효과적으로 촉진시키는 한편, DNA 절단을 촉진시키지 않는 개선된 데드 가이드 RNA를 확인하기 위한 방법 및 알고리즘을 제공한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 CRISPR 모티프의 하류의 처음 15 nt 또는 14 nt 또는 13 nt 또는 12 nt 또는 11 nt를 포함하며, 3' 말단에서 표적과 미스매치되는 뉴클레오티드에 의해 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt 이상으로 길이가 연장되는 데드 가이드 RNA를 제공한다.
양상에서, 본 발명은 선택적 직교 유전자 제어를 달성하기 위한 방법을 제공한다. 본 명세서의 개시내용으로부터 인식될 바와 같이, 가이드 길이 및 GC 함량을 고려하는 본 발명에 따른 데드 가이드 선택은, 예를 들어, 활성화 또는 저해에 의해 유전자 좌위의 전사를 조절하고 오프-표적 효과를 최소화하기 위해, 기능성 Cas12b CRISPR-Cas 시스템에 의한 효과적이고 선택적인 전사 제어를 제공한다. 따라서, 개개 표적 유전자좌의 효과적인 조절을 제공함으로써, 본 발명은 또한 둘 이상의 표적 유전자좌의 효과적인 직교 조절을 제공한다.
일정 구현예에서, 직교 유전자 제어는 둘 이상의 표적 유전자좌의 활성화 또는 저해에 의한다. 일정 구현예에서, 직교 유전자 제어는 하나 이상의 표적 유전자좌의 활성화 또는 저해 및 하나 이상의 표적 유전자좌의 절단에 의한다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 또는 알고리즘에 따라 개시되거나 또는 이루어진 하나 이상의 데드 가이드 RNA를 포함하는 비천연 발생 Cas12b CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 세포를 제공하되, 하나 이상의 유전자 산물의 발현은 변경되었다. 본 발명의 구현예에서, 둘 이상의 유전자 산물의 세포에서 발현이 변경되었다. 본 발명은 또한 이러한 세포로부터의 세포주를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 또는 알고리즘에 따라 개시되거나 또는 이루어진 하나 이상의 데드 가이드 RNA를 포함하는 비천연 발생 Cas12b CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함하는 다세포 유기체를 제공한다. 일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법 또는 알고리즘에 따라 개시되거나 또는 이루어진 하나 이상의 데드 가이드 RNA를 포함하는 비천연 발생 Cas12b CRISPR-Cas 시스템을 포함하는 세포, 세포주 또는 다세포 유기체로부터의 산물을 제공한다.
본 발명의 추가적인 양상은, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 또는 기술 상태에서 가이드(들)를 포함하는 gRNA와 조합하여, Cas12b의 과발현 또는 바람직하게는 녹인 Cas12b에 대해 조작된 시스템, 예를 들어, 세포, 유전자이식 동물, 유전자이식 마우스, 유도성 유전자이식 동물, 유도성 유전자이식 마우스와 조합하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 데드 가이드(들)를 포함하는 gRNA의 용도이다. 결과로서, 단일 시스템(예를 들어, 유전자이식 동물, 세포)는 시스템/네트워크 생물학에서 다중복합 유전자 변형에 대한 기준으로서 작용할 수 있다. 데드 가이드 때문에, 이는 이제 시험관내, 생체외와 생체내에서 가능하다.
예를 들어, 일단 Cas12b이 제공되면, 하나 이상의 데드 gRNA는 다중복합 유전자 조절, 바람직하게는 다중복합 양방향 유전자 조절을 보내도록 제공될 수 있다. 필요하거나 요망된다면 하나 이상의 데드 gRNA는 공간적으로 그리고 일시적으로 적절한 방식(예를 들어, Cas12b 발현의 조직 특이적 유도)으로 제공될 수 있다. 관심 대상의 세포, 조직, 동물에서 유전자이식/유도성 Cas12b가 제공되기 때문에(예를 들어, 발현됨) 데드 가이드를 포함하는 gRNA와 가이드를 포함하는 gRNA는 동일하게 효과적이다. 동일한 방식으로, 본 발명의 추가적인 양상은, 선택적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 또는 기술 상태에서 가이드(들)를 포함하는 gRNA와 조합하여, 녹아웃 Cas12b CRISPR-Cas를 위해 조작된 시스템(예를 들어, 세포, 유전자이식 동물, 유전자이식 마우스, 유도성 유전자이식 동물, 유도성 유전자이식 마우스)과 조합하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 데드 가이드(들)를 포함하는 gRNA의 용도이다.
그 결과, 본 명세서에 기재된 CRISPR 적용 및 당업계에 공지된 CRISPR 적용과 함께 본 명세서에 기재된 바와 같은 데드 가이드의 조합은 시스템의 다중복합 스크리닝을 위한 고도로 효율적이고 정확한 수단(예를 들어, 네트워크 생물학)을 초래한다. 이러한 스크리닝은, 예를 들어, 질환(예를 들어, 온/오프 조합), 특히 유전자 관련 질환을 초래하는 유전자를 동정하기 위한 유전자 활성의 구체적 조합의 확인을 허용한다. 이러한 스크리닝의 바람직한 적용은 암이다. 동일한 방식에서, 이러한 질환에 대한 치료를 위한 스크리닝이 본 발명에 포함된다. 세포 또는 동물은 비정상 병태에 노출되어 질환 또는 질환 유사 효과를 초래할 수 있다. 후보 조성물이 제공될 수 있으며, 목적하는 다중복합 환경에서의 효과에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 유전자 조합이 그들이 사망하는 것을 야기하는 환자의 암 세포가 스크리닝될 수 있으며, 이어서, 적절한 요법을 확립하기 위해 이 정보를 사용할 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 성분 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드를 갖거나 또는 가이드가 없는 본 명세서에 기재된 바와 같은 데드 가이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 구조적 정보는 표적 DNA 및 Cas12b와 데드 gRNA 상호작용의 질의를 가능하게 하여, 전체 Cas12b CRISPR-Cas 시스템의 작용성을 최적화하도록 데드 gRNA 구조의 조작 또는 변경을 허용한다. 예를 들어, 데드 gRNA의 루프는 RNA에 결합할 수 있는 어댑터 단백질의 삽입에 의한 Cas12b 단백질과의 충돌 없이 연장될 수 있다. 이들 어댑터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 이펙터 단백질 또는 융합을 추가로 보충할 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 기능성 도메인은 전사 활성화 도메인, 바람직하게는 VP64이다. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은 전사 억제 도메인, 바람직하게는 KRAB이다. 일부 구현예에서, 전사 억제 도메인은 SID, 또는 SID의 콘카타머(concatemer)(예를 들어, SID4X)이다. 일부 구현예에서, 후성적 변형 효소가 제공되도록, 기능성 도메인은 후성적 변형 도메인이다. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은 P65 활성화 도메인일 수 있는 활성화 도메인이다. 일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고; Cas12b 이펙터 단백질은 RuvC 및/또는 Nuc 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 함유하여서, 형성된 CRISPR 복합체가 후성적 변형자 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있다.
본 발명의 양상은 상기 요소가 단일 조성물에 포함되거나 또는 개개 조성물에 포함된다는 것이다. 이들 조성물은 게놈 수준에 대해 기능성 효과를 유발하기 위해 숙주에 유리하게 적용될 수 있다.
일반적으로, 데드 gRNA는 (예를 들어, 융합 단백질을 통해) 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 어댑터 단백질이 결합하는 특정 결합 부위(예를 들어, 압타머)를 제공하는 방식으로 변형된다. 일단 데드 gRNA가 CRISPR 복합체(즉, 데드 gRNA 및 표적에 결합하는 Cas12b)를 형성하도록 변형된 데드 gRNA는 변형되고, 어댑터 단백질이 결합하며, 어댑터 단백질 상의 기능성 도메인은 속성 작용이 유효하게 되는 것이 유리한 공간적 배향으로 위치된다. 예를 들어, 기능성 도메인이 전사 활성인자(예를 들어, VP64 또는 p65)라면, 전사 활성인자는 표적의 전사에 영향을 미치도록 허용하는 공간적 배향으로 위치된다. 마찬가지로, 전사 억제인자는 표적의 전사에 영향을 미치도록 유리하게 위치될 것이며, 뉴클레아제(예를 들어, Fok1)는 표적을 절단하거나 또는 부분적으로 절단하도록 유리하게 위치될 것이다.
당업자는 어댑터 + 기능성 도메인의 결합을 가능하게 하지만 어댑터 + 기능성 도메인의 적절한 위치화를 가능하게 하지 않는(예를 들어, CRISPR 복합체의 3차원 구조 내의 입체 장애에 기인) 데드 gRNA에 대한 변형은 의도되지 않은 변형이라는 것을 이해할 것이다.
본 명세서에서 설명된 바와 같이, 기능성 도메인은, 예를 들어, 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성, 및 분자 스위치(예를 들어, 광 유도성)로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 도메인일 수 있다. 일부 경우에, 추가적으로 적어도 하나의 NLS가 제공되는 것이 유리하다. 일부 예에서, N 말단에 NLS를 위치시키는 것이 유리하다. 하나 초과의 기능성 도메인이 포함될 때, 기능성 도메인은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
데드 gRNA는 동일 또는 상이한 어댑터 단백질에 특이적인 다중 결합 인식 부위(예를 들어, 압타머)를 포함하도록 설계될 수 있다. 데드 gRNA는 전사 개시 부위(즉, TSS) 상류의 프로모터 영역 -1000 - +1 핵산, 바람직하게는 -200 핵산에 결합하도록 설계될 수 있다. 이 위치화는 유전자 활성화(예를 들어, 전사 활성인자) 또는 유전자 저해(예를 들어, 전사 억제인자)에 영향을 미치는 기능성 도메인을 개선시킨다. 변형된 데드 gRNA는 조성물에 포함된 하나 이상의 표적 유전자좌(예를 들어, 적어도 1 gRNA, 적어도 2 gRNA, 적어도 5 gRNA, 적어도 10 gRNA, 적어도 20 gRNA, 적어도 30 gRNA, 적어도 50 gRNA)에 표적화된 하나 이상의 변형된 데드 gRNA일 수 있다.
일단 데드 gRNA가 CRISPR 복합체에 도입되었다면, 어댑터 단백질은 변형된 데드 gRNA에 도입되는 압타머 또는 인식 부위에 결합되고, 하나 이상의 기능성 도메인의 적절한 위치화를 가능하게 하여 속성 작용을 갖는 표적에 영향을 미치는 다수의 단백질일 수 있다. 본 출원에서 상세히 설명된 바와 같이, 이는 외피 단백질, 바람직하게는 박테리오파지 외피 단백질일 수 있다. (예를 들어, 융합 단백질의 형태로) 이러한 어댑터 단백질과 결합된 기능성 도메인은, 예를 들어, 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성 및 분자 스위치(예를 들어, 광 유도성)로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 도메인은 Fok1, VP64, P65, HSF1, MyoD1이다. 기능성 도메인이 전사 활성인자 또는 전사 억제인자인 사건에서, 추가적으로 적어도 NLS가 바람직하게는 N 말단에서 제공되는 것이 유리하다. 하나 초과의 기능성 도메인이 포함될 때, 기능성 도메인은 동일 또는 상이할 수 있다. 어댑터 단백질은 이러한 기능성 도메인에 부착되는 공지된 링커를 이용할 수 있다.
따라서, 변형된 데드 gRNA, (비활성화된) Cas12b(기능성 도메인이 있거나 또는 없음), 및 하나 이상의 기능성 도메인을 갖는 결합 단백질은 각각 개개로 조성물에 포함될 수 있고, 숙주에 개개로 또는 총괄적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들 성분은 숙주에 대한 투여를 위해 단일 조성물에서 제공될 수 있다. 숙주에 대한 투여는 숙주에 전달을 위해 당업자에게 공지되거나 또는 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터)를 통해 수행될 수 있다. 본 명세서에 설명된 바와 같이, 상이한 선택 마커(예를 들어, 렌티바이러스 gRNA 선택을 위함) 및 gRNA의 농도(예를 들어, 다중 gRNA가 사용되는지의 여부에 의존함)의 사용은 개선된 효과를 유발하는 데 유리할 수 있다.
이런 개념을 기초로, DNA 절단, 유전자 활성화 또는 유전자 탈활성화를 비롯한, 게놈 유전자좌 사건을 유발하는 것이 적절하다. 제공된 조성물을 이용하여, 당업자는 하나 이상의 게놈 유전자좌 사건을 유발하기 위해 동일 또는 상이한 기능성 도메인을 갖는 단일 또는 다중 유전자좌를 유리하게 그리고 특이적으로 표적화할 수 있다. 조성물은 세포 내 라이브러리에서의 스크리닝 및 생체내 기능성 모델링을 위한 매우 다양한 방법에 적용될 수 있다(예를 들어, lincRNA의 유전자 활성화 및 기능의 확인; 기능획득 모델링; 기능상실 모델링; 최적화 및 스크리닝 목적을 위해 세포주 및 유전자이식 동물을 확립하는 본 발명의 조성물의 용도).
본 발명은 본 발명 또는 적용 전에 믿어지지 않은 조건적 또는 유도성 CRISPR 유전자이식 세포/동물을 확립하고 이용하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 이해한다. 예를 들어, 표적 세포는 조건적으로 또는 유도성으로 (예를 들어, Cre 의존적 구성체의 형태로) Cas12b 및/또는 조건적으로 또는 유도성으로 어댑터 단백질을 포함하고, 표적 세포에 도입된 벡터의 발현에 대해, 벡터는 표적 세포에서 Cas12b 발현 및/또는 어댑터 발현의 조건을 유도하거나 또는 일으키는 것을 발현시킨다. CRISPR 복합체를 생성하는 공지된 방법으로 본 발명의 교시 및 조성물을 적용함으로써, 기능성 도메인에 의해 영향받은 유도성 게놈 사건은 또한 본 발명의 양상이다. 이의 일례는 CRISPR 녹인/조건적 유전자이식 동물(예를 들어, Lox-정지-폴리A-Lox(LSL) 카세트를 포함하는 마우스)의 생성 및 본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 변형된 데드 gRNA(예를 들어, 유전자 활성화 목적을 위한 관심 대상의 표적 유전자의 TSS에 대한 -200개의 뉴클레오티드)(예를 들어, 외피 단백질에 의해 인식되는 하나 이상의 압타머, 예를 들어, MS2를 갖는 변형된 데드 gRNA)를 제공하는 하나 이상의 조성물의 후속적 전달, 본 명세서에 기재되는 바와 같은 하나 이상의 압타머 단백질(하나 이상의 VP64에 연결된 MS2 결합 단백질) 및 조건적 동물을 유도하기 위한 수단(예를 들어, Cas12b 발현 유도성을 제공하기 위한 Cre 재조합효소)이다. 대안적으로, 어댑터 단백질은 스크리닝 목적을 위한 유효 모델을 제공하기 위해 조건적 또는 유도성 Cas12b를 갖는 조건적 또는 유도성 요소로서 제공될 수 있는데, 이는 유리하게는 단지 최소의 설계 및 다수의 적용을 위한 특정 데드 gRNA의 투여를 필요로 한다.
다른 양상에서, 데드 가이드는 특이성을 개선시키기 위해 추가로 변형된다. 보호된 데드 가이드가 합성될 수 있으며, 데드 가이드의 3' 말단부에 2차 구조가 도입되어 그의 특이성을 개선시킨다. 보호된 가이드 RNA(pgRNA)는 세포 및 보호자 가닥 내 관심 대상의 게놈 유전자좌에서 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열을 포함하되, 보호자 가닥은 선택적으로 가이드 서열에 대해 상보성이고, 가이드 서열은 보호자 가닥에 일부분 하이브리드화가능할 수 있다. pgRNA는 선택적으로 연장 서열을 포함한다. pgRNA-표적 DNA 하이브리드화의 열역학은 가이드 RNA와 표적 DNA 사이에서 상보성인 염기의 수에 의해 결정된다. '열역학 보호'를 사용함으로써, 데드 gRNA의 특이성은 보호자 서열을 더하는 것에 의해 개선될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 데드 gRNA 내에서 가이드 서열의 3' 말단부에 다양한 길이의 상보성 보호자 가닥을 더한다. 그 결과, 보호자 가닥은 데드 gRNA의 적어도 일부에 결합되고, 보호된 gRNA(pgRNA)를 제공한다. 결국, 본 명세서의 데드 gRNA 언급은 기재된 구현예를 이태 중 하나일 수 있다. 보호자 가닥은 별개의 RNA 전사체 또는 가닥 또는 데드 gRNA 가이드 서열의 3' 말단부에 결합된 키메라 형일 수 있다.
본 발명자들은 본 명세서에 정의된 바와 같은 CRISPR 효소가 활성을 상실하는 일 없이 하나 초과의 RNA 가이드를 사용할 수 있다는 것을 나타내었다. 이는 본 명세서에 정의된 바와 같은 단일 효소, 시스템 또는 복합체로 다중 DNA 표적, 유전자 또는 유전자 좌위를 표적화하기 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 CRISPR 효소, 시스템 또는 복합체의 사용을 가능하게 한다. 가이드 RNA는 직렬로 배열되고, 선택적으로 뉴클레오티드 서열, 예컨대 본 명세서에 정의된 바와 같은 직접 반복부에 의해 분리될 수 있다. 상이한 가이드 RNA의 위치는 활성에 영향을 미치지 않는 직렬이다.
다중복합 CRISPR-Cas 시스템
일 양상에서, 본 발명은 비천연 발생 또는 조작된 CRISPR 효소, 바람직하게는 클래스 2 CRISPR 효소, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 V 또는 VI형 CRISPR 효소, 예컨대 제한 없이, 직렬 또는 다중복합 표적화를 위해 사용되는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 Cas12b를 제공한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 CRISPR(또는 CRISPR-Cas 또는 Cas) 효소, 복합체 또는 시스템 중 어느 것이 이러한 접근에서 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 방법, 생성물, 조성물 및 용도 중 어느 것은 이하에 추가로 상술하는 다중복합 또는 직렬 표적화 접근과 동일하게 적용 가능하다. 추가적인 가이드에 의해, 다음의 특정 양상 및 구현예가 제공된다.
일 양상에서, 본 발명은 다중 유전자 좌위를 표적화하기 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 Cas12b 효소, 복합체 또는 시스템의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 이는 다중(직렬 또는 다중복합) 가이드 RNA (gRNA) 서열을 이용함으로써 확립될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 직렬 또는 다중복합 표적화를 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 Cas12b 효소, 복합체 또는 시스템의 하나 이상의 요소를 이용하는 방법을 제공하되, 상기 CRISP 시스템은 다중 가이드 RNA 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 gRNA 서열은 뉴클레오티드 서열, 예컨대 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 직접 반복부에 의해 분리된다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체는 다중 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키기 위한 효과적인 수단을 제공한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체는 세포 유형의 다중도에서 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것(예를 들어, 결실, 삽입, 전좌, 비활성화, 활성화)을 포함하는 매우 다양한 유용성을 가진다. 이렇게 해서, 본 발명의 본 명세서에 정의된 바와 같은 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체는 단일 CRISPR 시스템 내의 다중 유전자 좌위 표적화를 포함하는 광범위한 적용, 예를 들어, 유전자 요법, 약물 스크리닝, 질환 진단, 및 예후를 가진다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체, 즉, 이와 연관된 적어도 하나의 탈안정화 도메인을 갖는 Cas12b 단백질을 갖는 Cas12b CRISPR-Cas 복합체, 및 다중 핵산 분자, 예컨대 DNA 분자를 표적화하는 다중 가이드 RNA를 제공하고, 이에 의해 상기 다중 가이드 RNA의 각각은 그의 대응하는 핵산 분자, 예를 들어, DNA 분자를 특이적으로 표적화한다. 각각의 핵산 분자 표적, 예를 들어, DNA 분자는 유전자 산물을 암호화하거나 또는 유전자 좌위를 포함할 수 있다. 따라서 다중 가이드 RNA를 이용하는 것은 다중 유전자 좌위 또는 다중 유전자의 표적화를 가능하게 한다. 일부 구현예에서 Cas12b 효소는 그 유전자 생성물을 코딩하는 DNA 분자를 절단할 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자 산물의 발현은 변경된다. Cas12b 단백질 및 가이드 RNA는 자연적으로 함께 생기지 않는다. 본 발명은 직렬 배열된 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 이해한다. 본 발명은 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 Cas12b 단백질에 대한 암호 서열을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 진핵생물 세포는 포유류 세포, 식물 세포 또는 효모 세포이고, 더 바람직한 구현예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다. 유전자 산물의 발현은 감소될 수 있다. Cas12b 효소는 일련의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 25, 30 또는 30개 초과의 가이드 서열을 포함하는 직렬 배열된 가이드 RNA(gRNA)를 추가로 포함하는 CRISPR 시스템 또는 복합체의 일부를 형성할 수 있으며, 각각 세포 내 관심 대상의 게놈 유전자좌에서 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화할 수 있다. 일부 구현예에서, 기능성 Cas12b CRISPR 시스템 또는 복합체는 다중 표적 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 기능성 CRISPR 시스템 또는 복합체는 다중 표적 서열을 편집할 수 있으며, 예를 들어, 표적 서열은 게놈 유전자좌를 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, 유전자 발현의 변경이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 기능성 CRISPR 시스템 또는 복합체는 추가적인 기능성 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 다중 유전자 산물을 변경시키거나 또는 변형시키는 방법을 제공한다. 방법은 상기 표적 핵산, 예를 들어 DNA 분자를 함유하거나, 또는 표적 핵산, 예를 들어 DNA 분자를 함유하고 발현하는 세포로 도입시키는 단계를 포함할 수 있고; 예를 들어, 표적 핵산은 유전자 산물을 코딩할 수 있거나 또는 유전자 산물의 발현을 위해 제공될 수 있다 (예를 들어, 조절 서열).
바람직한 구현예에서, 다중복합 표적화를 위해 사용되는 CRISPR 효소는 Cas12b이거나, 또는 CRISPR 시스템 또는 복합체는 Cas12b를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중복합 표적화에 사용된 Cas12b 효소는 DNA의 가닥 모두를 절단하여 이중 가닥 파손(DSB)을 생성한다. 일부 구현예에서, 다중복합 표적화를 위해 사용되는 CRISPR 효소는 닉카제이다. 일부 구현예에서, 멀티플렉스 표적화에 사용된 Cas12b 효소는 이중 닉카제이다. 일부 구현예에서, 다중복합 표적화를 위해 사용되는 Cas12b 효소는 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 DD Cas12b 효소와 같은 Cas12b 효소이다.
일부 일반적 구현예에서, 다중복합 표적화를 위해 사용되는 Cas12b 효소는 하나 이상의 기능성 도메인과 결합된다. 일부 더 구체적인 구현예에서, 다중복합 표적화를 위해 사용되는 CRISPR 효소는 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 데드Cas12b이다.
양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중 표적화 또는 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드에서 사용하기 위한 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체를 전달하기 위한 수단을 제공한다. 이러한 전달 수단의 비제한적 예는, 예를 들어, 복합체의 성분(들)을 전달하는 입자(들), 본 명세서에 논의된 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는(예를 들어, CRISPR 효소를 암호화하고, CRISPR 복합체를 코딩하는 뉴클레오티드를 제공하는) 벡터(들)이다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 또는 렌티바이러스일 수 있다. 플라스미드에 의한, 예를 들어, HEK 세포 내로의 일시적 형질감염은 유리하며, 특히 AAV의 크기 제한을 제공할 수 있는 반면, Cas12b는 AAV에 꼭 들어맞고, 추가적인 가이드 RNA에 의해 상한에 도달할 수 있다.
또한 다중복합 표적화에서 사용하기 위한 본 명세서에 사용된 바와 같은 Cas12b 효소, 복합체 또는 시스템을 구성적으로 발현시키는 모델이 제공된다. 유기체는 유전자이식일 수 있고, 본 벡터로 형질감염될 수 있거나 또는 이렇게 형질감염된 유기체의 자손일 수 있다. 추가적인 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 CRISPR 효소, 시스템 및 복합체 또는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 Cas12b CRISPR 시스템 또는 다중 가이드 RNA를 포함하는 복합체가, 바람직하게는 직렬 배열된 형식으로 제공된다. 상기 상이한 가이드 RNA는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 직접 반복부에 의해 분리될 수 있다.
대상체, 예를 들어 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 이는 대상체를 Cas12b CRISPR 시스템 또는 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 명세서에 설명된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환시킴으로써 유전자 편집을 유도하고, 그를 대상체로 투여하는 것을 포함하는 방법이 또한 제공된다. 적합한 복구 주형이 또한 제공될 수 있으며, 예를 들어, 상기 복구 주형을 포함하는 벡터에 의해 전달된다. 또한 대상체를 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환시킴으로써 다중 표적 유전자 좌위의 전사 활성화 또는 억제를 유도하는 단계를 포함하는, 대상체, 예를 들어, 치료가 필요한 대상체의 치료 방법이 제공되되, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는, 바람직하게는 직렬 배열된 다중 가이드 RNA를 포함하는 Cas12b 효소, 복합체 또는 시스템을 암호화하거나 또는 포함한다. 임의의 치료가 생체 외, 예를 들어 세포 배양물에서 일어나는 경우, 이는 용어 '대상체'가 '세포 또는 세포 배양물'이라는 구절로 대체될 수 있음을 이해해야 할 것이다.
본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 치료 방법에서 사용하기 위한, 바람직하게는 직렬 배열된 다중 가이드 RNA를 포함하는 Cas12b 효소, 복합체 또는 시스템을 포함하는 조성물, 또는 바람직하게는 직렬 배열된 다중 가이드 RNA를 포함하는 상기 Cas12b 효소, 복합체 또는 시스템을 암호화하거나 또는 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 또한 제공된다. 이러한 조성물을 포함하는 부분의 키트가 제공될 수 있다. 이러한 치료 방법을 위한 의약의 제조에서 상기 조성물의 용도가 또한 제공된다. 스크리닝에서 Cas12b CRISPR 시스템의 용도, 예를 들어, 기능 획득 스크리닝이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 유전자를 과발현시키도록 인공적으로 힘이 가해진 세포는, 예를 들어, 음성 피드백 루프에 의해 시간에 따라 유전자를 하향조절할 수 있다(평형상태 재확립). 시간에 따라, 비조절 유전자가 다시 감소될 수 있도록 스크리닝을 시작한다. 유도성 Cas12b 활성인자를 이용하는 것은 스크리닝 바로 전에 전사를 유도하도록 하며, 따라서, 위음성 히트(false negative hit)의 기회를 최소화한다. 따라서, 스크리닝, 예를 들어, 기능 획득 스크리닝에서 본 발명의 사용에 의해, 위음성 기회 결과는 최소화될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 Cas12b 단백질 및 각각이 세포 내 유전자 산물을 코딩하는 DNA 분자를 특이적으로 표적화하는 다중 가이드 RNA를 포함하는 조작된, 비천연 발생 CRISPR 시스템을 제공하고, 이에 의해 다중 가이드 RNA는 각각이 유전자 산물을 코딩하는 그들의 특이적 DNA 분자를 표적화하고 Cas12b 단백질은 유전자 산물을 코딩하는 표적 DNA 분자를 절단하여서, 유전자 산물의 발현이 변경되고, CRISPR 단백질 및 가이드 RNA는 함께 천연적으로 발생되지 않는다. 본 발명은 바람직하게는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 직접 반복부에 의해 분리되고 선택적으로 tracr 서열에 융합된 다중 가이드 서열을 포함하는 다중 가이드 RNA를 이해한다. 본 발명의 구현예에서, CRISPR 단백질은 V형 또는 VI CRISPR-Cas 단백질이고, 더 바람직한 구현예에서 CRISPR 단백질은 Cas12b 단백질이다. 본 발명은 추가로 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 Cas12b 단백질을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 진핵생물 세포는 포유류 세포이고, 더 바람직한 구현예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 추가적인 구현예에서, 유전자 산물의 발현은 감소된다.
표적 서열의 변형
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 주형 DNA 서열을 삽입, 또는 " 녹-인" 시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, DNA 삽입은 적절한 배향으로 게놈에 통합되도록 설계된다. 바람직한 구현예에서, 관심 유전자좌는 비분열 세포에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형되고, 여기서 상동성 지정 복구 (HDR) 기전을 통한 게놈 편집이 특히 도전적이다 (Chan et al., Nucleic acids research. 2011;39:5955-5966). Maresca 등 (Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546)은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 Tale 뉴클레아제 (TALEN)를 사용해 적용가능한 부위 지정된, 정밀 삽입 방법을 기술하는데, 여기서 5' 오버행을 갖는 짧은, 이중-가닥 DNA가 상보성 말단에 결찰되어, 인간 세포주에서 한정된 유전자좌에서 15-kb 외생성 발현 카세트의 정밀한 삽입을 가능하게 하였다. He 등 (Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9))은 described CRISPR/Cas9-induced site-specific knock-in of a 4.6 kb 무프로모터 ires-eGFP 단편을 GAPDH 유전자좌에 CRISPR/Cas9-유도 부위-특이적 녹-인으로 체세포 LO2 세포에서 최대 20% GFP+ 세포를 산출하였고, NHEJ 경로에 의해 매개되는 인간 배아 줄기 세포에서 1.70% GFP+ 세포를 산출하였다고 기술하였으며, 또한 NHEJ-기반 녹-인이 조사된 모든 인간 세포 유형에서 HDR-매개 유전자 표적화에 비해 더 효율적이라고 보고하였다. C2c1이 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단을 생성시키기 때문에, 당업자는 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템을 사용해 관심 유전자좌에서 외생성 DNA 삽입을 발생시키기 위해서 Meresca 등 및 He 등에 기술된 것과 유사한 방법을 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM 서열의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 먼저 변형되고, PAM 서열 근처에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 더욱 변형되며 HDR을 통해 복구된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR을 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ를 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 3' 및 5' 말단 둘 모두 상에서 단일 가이드 DNA-PAM 서열이 측접된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 CRISPR-C2c1 절단 이후에 방출된다. 참조: Zhang et al., Genome Biology201718:35; He et al., Nucleic Acids Research, 44: 9, 2016.
주형
일부 구현예에서, 재조합 주형이 또한 제공된다. 재조합 주형은 본 명세서에 기재된 바와 같은 또 다른 벡터의 성분일 수 있으며, 별개의 벡터 내에 포함되거나, 별개의 폴리뉴클레오티드로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 주형은 상동성 재조합에서, 예컨대 핵산-표적화 복합체의 일부로서 핵산-표적화 이펙터 단백질에 의해 닉킹되거나 절단된 표적 서열 내에 또는 그 가까이에서 주형으로서의 역할을 하도록 설계된다. 일부 예에서, 시스템은 재조합 주형을 포함한다. 재조합 주형은 상동성-지정 복구 (HDR)에 의해 삽입될 수 있다.
일 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치의 서열을 변경시킨다. 일 구현예에서, 주형 핵산은 변형되거나 비-천연 발생 염기의 표적 핵산 내로의 혼입을 초래한다.
주형 서열은 표적 서열과의 파손 매개된 또는 촉매된 재조합 처리될 수 있다. 일 구현예에서, 주형 핵산은 C2c1 매개된 절단 사건에 의해 절단된 표적 서열 상에서의 부위에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 주형 핵산은 제1 C2c1 매개된 사건에서 절단된 표적 서열 상의 제1 부위, 및 제2 C2c1 매개된 사건에서 절단된 표적 서열 상의 제2 부위, 모두에 상응하는 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 주형 핵산은 번역된 서열의 코딩 서열 내에서의 변경을 초래하는 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 단백질 생성물 내에서 하나의 아미노산을 또 다른 것으로 치환, 예를 들어 돌연변이체 대립형질을 야생형 대립형질로 형질전환, 야생형 대립형질을 돌연변이체 대립형질로 형질전환, 및/또는 정지 코돈의 도입, 아미노산 잔기의 삽입, 아미노산 잔기의 결실, 또는 논센스 돌연변이를 초래하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 주형 핵산은 비-코딩 서열에서의 변경, 예를 들어 엑손에서의 변경 또는 5' 또는 3' 비-번역된 또는 비-전사된 영역을 초래하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 제어 요소, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 및 시스-작용 또는 트랜스-작용 제어 요소에서의 변경을 포함한다.
표적 유전자에서 표적 위치와의 상동성을 갖는 주형 핵산은 표적 서열의 구조를 변경시키는 데 사용될 수 있다. 주형 서열은 원하지 않는 구조, 예를 들어 원하지 않는 또는 돌연변이체 뉴클레오티드를 변경시키는 데 사용될 수 있다. 주형 핵산은 통합될 때, 양성 제어 엘리먼트의 활성 감소; 양성 제어 엘리먼트의 활성 증가; 음성 제어 엘리먼트의 활성 감소; 음성 제어 엘리먼트의 활성 증가; 유전자의 발현 감소; 유전자의 발현 증가; 질병 또는 질환에 대한 내성 증가; 바이러스 진입에 대한 내성 증가;돌연변이 교정 또는 유전자 산물의 생물학적 속성을 부여, 증가, 폐기 또는 감소시키는 원치 않는 아미노산 잔기의 변경, 예를 들어 효소의 효소 활성 증가, 또는 다른 분자와 상호작용하는 유전자 산물의 능력 증가를 야기시키는 서열을 포함할 수 있다.
주형 핵산은 표적 서열의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개 이상의 뉴클레오티드 서열에서의 변화를 초래하는 서열을 포함할 수 있다.
주형 폴리뉴클레오티드는 임의의 적합한 길이를 가질 수 있으며, 예컨대 길이가 약 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 이를 초과할 수 있다. 일 구현예에서, 주형 핵산은 길이가 20+/- 10, 30+/- 10, 40+/- 10, 50+/- 10, 60+/- 10, 70+/- 10, 80+/- 10, 90+/- 10, 100+/- 10, 1 10+/- 10, 120+/- 10, 130+/- 10, 140+/- 10, 150+/- 10, 160+/- 10, 170+/- 10, 1 80+/- 10, 190+/- 10, 200+/- 10, 210+/-10, 또는 220+/- 10 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일 구현예에서, 주형 핵산은 길이가 30+/-20, 40+/-20, 50+/-20, 60+/-20, 70+/-20, 80+/-20, 90+/-20, 100+/-20, 110+/-20, 120+/-20, 130+/-20, 140+/-20, 150+/-20, 160+/-20, 170+/-20, 180+/-20, 190+/-20, 200+/-20, 210+/-20, 또는 220+/-20 개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일 구현예에서, 주형 핵산은 길이가 10 내지 1,000, 20 내지 900, 30 내지 800, 40 내지 700, 50 내지 600, 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 50 내지 200, 또는 50 내지 100 개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 일부에 상보적이다. 최적으로 정렬된 경우, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 개 이상 또는 이를 초과하는 뉴클레오티드)와 중첩될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열 및 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 경우, 표적 서열로부터 주형 폴리뉴클레오티드의 최근접 뉴클레오티드는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 개 이상의 뉴클레오티드 내에 속한다.
외생의 폴리뉴클레오티드 주형은 통합될 서열(예를 들어, 돌연변이된 유전자)을 포함한다. 통합을 위한 서열은 세포에 대해 내생 또는 외생성 서열일 수 있다. 통합될 서열의 예로는 단백질 또는 비-코딩 RNA(예를 들어, 마이크로RNA)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 통합을 위한 서열은 적절한 제어 서열 또는 서열들에 작동적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 통합될 서열은 조절 작용을 제공할 수 있다.
상류 또는 하류 서열은 약 20 bp 내지 약 2500 bp, 예를 들어, 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 또는 2500 bp를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 예시적인 상류 또는 하류 서열은 약 200 bp 내지 약 2000 bp, 약 600 bp 내지 약 1000 bp, 또는 더욱 구체적으로는 약 700 bp 내지 약 1000 bp를 갖는다.
상류 또는 하류 서열은 약 20 bp 내지 약 2500 bp, 예를 들어, 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 또는 2500 bp를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 예시적인 상류 또는 하류 서열은 약 200 bp 내지 약 2000 bp, 약 600 bp 내지 약 1000 bp, 또는 더욱 구체적으로는 약 700 bp 내지 약 1000 bp를 갖는다.
일정 구현예에서, 하나 또는 2 개의 상동성 암 (arm)은 단축되어 특정 서열 반복 요소의 포함을 회피할 수 있다. 예를 들어, 5' 상동성 암은 단축되어 서열 반복 요소를 회피할 수 있다. 다른 구현예에서, 3' 상동성 암은 단축되어 서열 반복 요소를 회피할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 개의 상동성 암 모두는 특정 서열 반복 요소 포함을 회피하기 위하여 단축될 수 있다.
일부 방법에서, 외생성 폴리뉴클레오티드 주형은 마커를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 마커는 표적된 통합을 스크리닝하기 쉽게 만들 수 있다. 적합한 마커의 예로는 제한 부위, 형광 단백질 또는 선택성 마커를 포함한다. 본 발명의 외생성 RNA 주형은 재조합 기술을 이용하여 구축될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2001 및 Ausubel et al., 1996] 참조)
일정 구현예에서, 돌연변이 교정을 위한 주형 핵산은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드로서 사용을 위해 설계될 수 있다. 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 사용할 때, 5' 및 3' 상동성 암은 최대 약 200 염기쌍 (bp) 길이, 예를 들어 적어도 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 bp 길이 범위일 수 있다.
Suzuki 등은 CRISPR/Cas9 매개 상동성-독립적 표적화 통합을 통한 생체내 게놈 편집을 기술한다 (2016, Nature 540:144-149).
따라서, 본 명세서에서 CRISPR 시스템을 언급할 때, 일부 양상 또는 구현예에서, CRISPR 시스템은 (i) CRISPR 단백질 또는 CRISPR 이펙터 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (ii) CRISPR 복합체를 형성하도록 CRISPR 단백질과 복합체를 형성하고, 표적 서열과 복합체를 형성하도록 조작된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료제는 생체내 또는 생체외에서 진핵생물 세포에 전달 (또는 도포 또는 투여)을 위한다.
일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 표적 서열의 위치에서 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 유도하는 뉴클레아제이거나, 또는 CRISPR 단백질은 표적 서열의 위치에서 절단을 유도하는 닉카제이다.
일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 CRISPR-Cas 시스템 RNA 폴리뉴클레오티드 서열과 복합체 형성된 C2c1 단백질이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 a) 표적 HBV 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 RNA 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 직접 반복부 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 C2c1이고, 시스템은 I. CRISPR-Cas 시스템 RNA 폴리뉴클레오티드 서열로서, (a) 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 RNA 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 직접 반복부 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 서열, 및 II. 임의로 적어도 하나 이상의 핵 국재화 서열을 포함하는, C2c1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 직접 반복부 서열은 가이드 서열과 하이브리드화하여 표적 서열로 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도시키고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열과 하이브리드화하거나 또는 하이브리드화가능한 가이드 서열, 및 (2) 직접 반복부 서열과 복합체를 형성하는 CRISPR 단백질을 포함하고, CRISPR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA이다.
본 발명은 또한 임의의 본 명세서에 기술된 조작된 CRISPR 효소 (예를 들어, 조작된 Cas 이펙터 모듈), 조성물, 또는 임의의 본 명세서에 기술된 시스템 또는 벡터 시스템과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 관심 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하거나, 또는 세포는 세포 내에 존재하는 임의의 본 명세서에 기술된 CRISPR 복합체를 포함한다. 이러한 방법에서 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 바람직하게 진핵생물 세포일 수 있다. 이러한 방법에서, 유기체는 세포를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 유기체는 인간 또는 다른 동물이 아닐 수 있다. 일정 구현예에서, 세포는 A/T 풍부 게놈을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 게놈은 T-풍부 PAM을 포함한다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTN-3' 또는 5'-ATTN-3' 이다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTG-3' 이다. 특정 구현예에서, 세포는 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum) 세포이다.
일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 C2c1 단백질이다. C2c1은 Cas9에 의해 생성되는 PAM의 근위 말단에서의 절단과 대조적으로, PAM의 원위 말단에서 이중 가닥 파손을 생성시킨다 (Jinek et al., 2012; Cong et al., 2013). Cpf1 돌연변이된 표적 서열은 단일 gRNA에 의한 반복된 절단에 감수성일 수 있어서, HDR 매개 게놈 편집에서 Cpf1의 적용을 촉진한다고 제안된다 (Front Plant Sci. 2016 Nov 14;7:1683). Cpf1 및 C2c1은 둘 모두가 구조 유사성을 공유하는 V형 CRISPR-Cas 단백질이다. PAM의 원위 말단에서 블런트 (blunt) 절단부를 생성시키는 Cas9와 달리, Cpf1 및 C2c1은 PAM의 원위 말단에서 스태거드 절단부를 생성시킨다. 따라서, 일정 구현에에서, 관심 유전자좌는 상동성 지정 복구 (HR 또는 HDR)을 통해 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HR 독립적인 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일정 구현에에서, 관심 유전자좌는 비상동성 말단 결합 (NHEJ)을 통해 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다.
C2c1는 Cas9에 의해 생성되는 블런트 말단부와 대조적으로, 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부를 생성시킨다 (Garneau et al., Nature. 2010;468:67-71; Gasiunas et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:E2579-2586). 절단 산물의 이러한 구조는 포유동물 게놈으로 비상동성 말단 결합 (NHEJ)-기반 유전자 삽입을 촉진하기 위해 특이 유리할 수 있다 (Maresca et al., Genome research. 2013;23:539-546).
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 주형 DNA 서열을 삽입, 또는 " 녹-인" 시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, DNA 삽입은 적절한 배향으로 게놈에 통합되도록 설계된다. 바람직한 구현예에서, 관심 유전자좌는 비분열 세포에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형되고, 여기서는 상동성-지정 복구 (HDR) 기전을 통한 게놈 편집이 특히 도전이다 (Chan et al., Nucleic acids research. 2011;39:5955-5966). Maresca 등 (Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546)은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 Tale 뉴클레아제 (TALEN)를 사용해 적용가능한 부위 지정된, 정밀 삽입 방법을 기술하는데, 여기서 5' 오버행을 갖는 짧은, 이중-가닥 DNA가 상보성 말단에 결찰되어, 인간 세포주에서 한정된 유전자좌에서 15-kb 외생성 발현 카세트의 정밀한 삽입을 가능하게 하였다. He 등 (Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9))은 4.6 kb 무프로모터 ires-eGFP 단편을 GAPDH 유전자좌에 CRISPR/Cas9-유도 부위-특이적 녹-인으로 체세포 LO2 세포에서 최대 20% GFP+ 세포를 산출하였고, NHEJ 경로에 의해 매개되는 인간 배아 줄기 세포에서 1.70% GFP+ 세포를 산출하였다고 기술하였으며, 또한 NHEJ-기반 녹-인이 조사된 모든 인간 세포 유형에서 HDR-매개 유전자 표적화에 비해 더 효율적이라고 보고하였다. C2c1이 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단을 생성시키기 때문에, 당업자는 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템을 사용해 관심 유전자좌에서 외생성 DNA 삽입을 발생시키기 위해서 Meresca 등 및 He 등에 기술된 거소가 유사한 방법을 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM 서열의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 먼저 변형되고, PAM 서열 근처에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 더욱 변형되며 HDR을 통해 복구된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR을 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ를 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 3' 및 5' 말단 둘 모두 상에서 단일 가이드 DNA(sgDNA)-PAM 서열이 측접된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 CRISPR-C2c1 절단 이후에 방출된다. 참조: Zhang et al., Genome Biology201718:35; He et al., Nucleic Acids Research, 44: 9, 2016.
일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) ATCC 49025 또는 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) 균주 B4166 유래의 C2c1이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물에서 진핵생물 또는 진핵생물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명의 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 본 명세서에 기술된 임의의 C2c1이고 진핵생물 세포 또는 유기체, 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에서 언급된 이러한 세포 또는 유기체, 예를 들어, 제한없이, 마우스 세포, 래트 세포, 및 인간 세포 또는 인간이외 진핵생물 유기체, 예를 들어 식물을 포함하는, 효모 세포, 또는 포유동물 세포 또는 유기체에서 작동능을 위해 코돈 최적화된다.
일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 유기체의 세포의 핵에서 검출가능한 양으로 CRISPR 단백질의 축적을 구동시킬 수 있는 하나 이상의 핵 국재화 신호 (NLS)를 더 포함한다.
본 발명의 일정 구현예에서, 적어도 하나의 핵 국재화 신호(nuclear localization signal; NLS)가 C2c1 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 부착된다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나 이상의 C-말단 또는 N-말단 NLS 가 부착된다 (그리고 이에 따라 C2c1 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산 분자(들)는, 발현된 산물이 부착된 또는 연결된 NLS(들)를 갖도록 NLS(들)에 대한 코딩을 포함할 수 있다). 바람직한 구현예에서, C-말단 NLS는 진핵생물 세포, 바람직하게는 인간 세포에서 최적 발현 및 핵 표적화를 위해 부착된다. 바람직한 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 C2c1 이고, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 15 내지 35 nt 이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA의 스페이서 길이는 적어도 16 개의 뉴클레오티드, 예컨대 적어도 17 개의 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 스페이서 길이는 15 내지 17 nt, 17 내지 20 nt, 20 내지 24 nt, 예를 들어 20, 21, 22, 23, 또는 24 nt, 23 내지 25 nt, 예를 들어, 23, 24, 또는 25 nt, 24 내지 27 nt, 27-30 nt, 30-35 nt, 또는 35 nt 또는 그 이상이다. 본 발명의 일정 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 C2c1 이고, 가이드 RNA 의 직접 반복부 길이는 적어도 16 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 C2c1 이고, 가이드 RNA 의 직접 반복부 길이는 16 내지 20 nt, 예를 들어, 16, 17, 18, 19, 또는 20 개 뉴클레오티드이다. 일정 바람직한 구현예에서, 가이드 RNA 의 직접 반복부 길이는 19 개 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 촉매 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 가지며, 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인을 더 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 전달 시스템 내에, 임의로, 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 포함하고, 임의로 벡터는 하나 이상의 바이러스 벡터를 포함하며, 임의로 하나 이상의 바이러스 벡터는 하나 이상의 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연합 바이러스 (AAV) 벡터, 또는 입자 또는 지질 입자를 포함하고, 임의로 CRISPR 단백질은 폴리뉴클레오티드와 복합체를 형성하여 CRISPR 복합체를 형성한다.
일부 구현예에서, 시스템, 복합체, 또는 단백질은 관심 게놈 유전자좌의 표적 서열의 조작에 의해 유기체 또는 비인간 유기체를 변형시키는 방법에서 사용을 위한다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템을 코딩하거나 또는 제공하는 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 리포솜, 입자, 세포 침투 펩티드, 엑소솜, 미세소포, 또는 유전자-총을 통해 전달된다. 일부 구현예에서, 전달 시스템이 포함된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 조작된 폴리뉴클레오티드 및 CRISPR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 포함하고, 임의로 벡터는 하나 이상의 바이러스 벡터를 포함하며, 임의로 하나 이상의 바이러스 벡터는 CRISPR 시스템 또는 CRISPR 복합체를 함유하는, 하나 이상의 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연합 바이러스 (AAV) 벡터, 또는 입자 또는 지질 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합/복구 주형이 제공된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 방법은 본 명세서에 논의되는 바와 같은 벡터에 세포를 전달하는 단계를 포함하는 본 명세서에 논의된 바와 같은 진핵생물 세포에서(시험관내, 즉, 단리된 진핵생물 세포에서) 하나 이상의 돌연변이를 유도하는 것이 이해된다. 돌연변이(들)는 가이드(들) RNA(들) 또는 sgRNA(들)를 통해 각각의 표적 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 또는 sgRNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에서 1 내지 75개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 또는 sgRNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에서 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 또는 sgRNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에서 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 또는 sgRNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에서 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 또는 sgRNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에서 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 또는 75개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 또는 sgRNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에서 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
독성 및 오프-표적 효과의 최소화를 위해, 전달된 Cas mRNA 및 가이드 RNA의 농도를 제어하는 것이 중요할 수 있다. Cas mRNA 및 가이드 RNA의 최적의 농도는 세포의 또는 비인간 진핵동물 모델에서 상이한 농도를 시험함으로써 그리고 잠재적 오프-표적 게놈 유전자좌에서 변형 정도를 분석하는 심층 서열분석을 이용함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 독성 및 오프-표적 효과 수준을 최소화하기 위해, Cas 닉카제 mRNA(예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) Cas9)는 관심 대상 부위를 표적화하는 가이드 RNAn 쌍으로 전달될 수 있다. 독성 및 표적외 효과를 최소화하기 위한 가이드 서열 및 전략 표적은 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)에 기술된 바와 같이, 또는 본 명세서에서와 같은 돌연변이를 통해서일 수 있다.
전형적으로, 내생성 CRISPR 시스템과 관련하여, CRISPR 복합체(표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함)의 형성은 표적 서열에서 또는 근처에서 (예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 이상의 염기 내에서) 가닥 중 하나 또는 둘 다의 절단을 초래한다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 야생형 tracr 서열의 모두 또는 일부(예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 이상의 뉴클레오티드)를 포함하거나 또는 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한, 예컨대 tracr 서열의 적어도 일부를 따라서 가이드 서열에 작동적으로 연결된 tracr 메이트 서열의 모두 또는 일부에 대한 하이브리드화에 의해 CRISPR 복합체의 부분을 형성할 수 있다.
조작된 CRISPR-Cas 시스템
일반적으로, SPIDR(스페이서 산재된 직접 반복부)로도 알려진 CRISPR(클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부)은 통상 특정 박테리아 종에 특이적인 DNA 유전자좌의 패밀리를 구성한다. CRISPR 유전자좌는 대장균에서 인지되는 구별되는 계열의 산재된 짧은 서열 반복부(SSR)(Ishino et al., J. Bacteriol., 169:54295433 [1987]; 및 Nakata et al., J. Bacteriol., 171:35533556 [1989]) 및 관련 유전자를 포함한다. 유사한 산재된 SSR이 할로페락스 메디테라네이 (Haloferax mediterranei), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes), 아나바에나 (Anabaena) 및 마이코박테리움 튜베르큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis)에서 확인되었다(문헌[Groenen et al., Mol. Infect. Biophys. Microbiol., 17:8593 [1995]] 참조). CRISPR 유전자좌는 통상적으로 SRSR(규칙적으로 산재된 짧은 반복부(short regularly spaced repeat))로 명명된 반복부의 구조가 다른 SSR과 상이하다 (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]; 및 Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]). 일반적으로, 반복부는 실질적으로 고정된 길이를 갖는 독특한 개재 서열에 의해 규칙적으로 산재된 클러스터에 존재하는 짧은 요소이다(상기 문헌[Mojica et al., [2000]]). 반복 서열이 균주들 간에 고도로 보존되어 있지만, 산재된 반복부의 수와 스페이서 영역의 서열은 통상적으로 균주마다 상이하다 (van Embden et al., J. Bacteriol., 182:23932401 [2000]). CRISPR 유전자좌는 아에로피룸(Aeropyrum), 피로바쿨룸(Pyrobaculum), 술폴로부스(Sulfolobus), 아캐오글로부스(Archaeoglobus), 할로카르쿨라(Halocarcula), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노피러스(Methanopyrus), 피로코커스(Pyrococcus), 피크로필러스(Picrophilus), 써모플라스마(Thermoplasma), 코리네박테리움(Corynebacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아퀴펙스(Aquifex), 포르피로모나스(Porphyromonas), 클로로비움(Chlorobium), 써머스(Thermus), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 스타필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 마이코플라스마(Mycoplasma), 푸소박테리움(Fusobacterium), 아자쿠스(Azarcus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 게오박터(Geobacter), 믹소코커스(Myxococcus), 캄필로박터, 볼리넬라(Wolinella), 아시네토박터(Acinetobacter), 에르위니아(Erwinia), 에스케리키아, 레지오넬라(Legionella), 메틸로코커스(메틸ococcus), 파스퇴렐라(Pasteurella), 포토박테리움(Photobacterium), 살모넬라(Salmonella), 잔토모나스(Xanthomonas), 예르시니아(Yersinia), 트레포네마(Treponema) 및 써모토가(Thermotoga)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 40개 초과의 원핵생물에서 확인되었다 (참조, 예를 들어, Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565- 1575 [2002]; 및 Mojica et al., [2005]).
부차적 활성
Cas12 효소는 부차적 활성을 보유할 수 있는데, 즉 일정 환경에서 활성화된 Cas12 효소는 표적 서열과의 결합 이후에 활성인 채로 남아서 비표적 올리고뉴클레오티드를 비특이적으로 계속 절단하게 된다. 이러한 가이드 분자-프로그램된 부차적 절단 활성은 핀독치로서 제공될 수 있는 생체내 프로그램된 세포 사멸 또는 시험관내 비특이적 RNA 분해를 촉발시키는 특이적 표적 올리고뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위해 Cas12b 시스템을 사용하는 능력을 제공한다 (Abudayyeh et al. 2016; East-Seletsky et al, 2016).
RNA-가이드된 C2c1 의 프로그램 가능성, 특이성 및 부차적 활성은 또한 핵산의 비특이적 절단을 위한 이상적인 전환가능 뉴클레아제를 가능하게 한다. 일 구현예에서, C2c1 시스템은 ssDNA 같은, 핵산의 부차적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 또 다른 구현예에서, C2c1 시스템은 ssDNA 의 부차적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 따라서, 조작된 C2c1 시스템은 핵산 검출 및 전사체 조작, 및 세포 사멸 유도를 위한 플랫폼을 제공한다. C2c1 은 포유동물 전사물 녹다운 및 결합 도구로서 사용하기 위해 개발된다. C2c1 은 서열 특이적 표적화된 DNA 결합에 의해 활성화될 때 RNA 및 ssDNA 의 강건한 부차적인 절단을 가능하게 한다.
일정 구현예에서, C2c1은 시험관 내 시스템 또는 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 제공되거나 발현되고, 비-특이적으로 절단성 세포 핵산을 표적화하거나 또는 촉발시킨다. 일 구현예에서, C2c1은 ssDNA, 예를 들어 바이러스 ssDNA를 녹다운시키도록 조작된다. 다른 구현예에서, C2c1은 RNA를 녹 다운시키도록 조작된다. 녹다운이 세포 또는 시험관 내 시스템에 존재하는 표적 DNA에 의존하거나, 시스템 또는 세포에 표적 핵산의 첨가에 의해 촉발되도록 시스템을 고안할 수 있다.
한 구현예에서, C2c1 시스템은 비정상 DNA 서열의 존재에 의해 구별될 수 있는 세포의 서브세트에서 RNA 를 비-특이적으로 절단하도록, 예를 들어 비정상 DNA 의 절단이 불완전하거나 비효과적일 수 있도록 조작된다. 하나의 비-제한적인 예에서, 암 세포에 존재하고 세포 형질전환을 유도하는 DNA 전좌가 표적화된다. 염색체 DNA를 겪고 복구되는 세포의 소집단이 생존할 수 있는 반면, 비-특이적 부차적인 리보뉴클레아제 활성은 유리하게는 잠재적 생존자의 세포 사멸을 초래한다.
부차적인 활성은 많은 임상 진단에 유용한 SHERLOCK 으로 불리는 매우 민감하고 특이적인 핵산 검출 플랫폼에 최근 활용되었다 (Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438- 442 (2017)).
본 발명에 따르면, 조작된 C2c1 시스템은 DNA 또는 RNA 엔도뉴클레아제 활성에 최적화되어 있으며 포유동물 세포에서 발현될 수 있고 세포에서 리포터 분자 또는 전사체를 효과적으로 녹다운시키는 것을 목표로 한다.
등온 증폭에 의한 조작된 Cas13b의 부차적 효과는 높은 민감성 및 단일-염기 미스매치 특이성을 갖는 신속한 DNA 또는 RNA 검출을 제공하는 CRISPR-기반 진단을 제공한다. C2c1-기반 분자 검출 플랫폼은 바이러스의 특정 균주를 검출하고, 병원성 박테리아, 유전자형 인간 DNA를 구별하고, 무-세포 종양 DNA 돌연변이를 식별하는데 사용된다. 또한, 반응 시약은 저온-사슬 독립 및 장기 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 현장 적용을 위해 서류상 쉽게 재구성될 수 있다.
휴대용 플랫폼에서 높은 민감성 및 단일-염기 미스매치 특이성을 갖는 핵산을 신속하게 검출하는 능력은 질병 진단 및 모니터링, 역학 및 일반적인 실험실 작업에 도움이 될 수 있다. 핵산을 검출하기 위한 방법이 존재하지만, 민감성, 특이성, 단순성, 비용 및 속도간에 절충점이 있다.
미생물 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 CRISPR-연관 (CRISPR-Cas) 적응 면역 시스템은 CRISPR-기반 진단 (CRISPR-Dx)에 활용할 수 있는 프로그램가능한 엔도뉴클레아제를 포함한다. C2c1 (Cas12b라고도 알려짐)은 특이적 DNA 감지를 위한 플랫폼을 제공하기 위해 CRISPR RNA (crRNAs) 로 재프로그램될 수 있다. DNA 표적의 인식에 따라, 활성화된 C2c1은 근처의 비-표적 핵산 (즉, RNA 및/또는 ssDNA)의 " 부차적" 절단에 관여한다. 이러한 crRNA-프로그램된 부차적 절단 활성은 C2c1이 프로그램된 세포 사멸을 유발하거나 표지된 RNA 또는 ssDNA의 비특이적 분해에 의해 생체 내에서 특정 DNA의 존재를 검출할 수 있게 한다. 여기에 표적의 실시간 검출을 가능하게 하는, 상업적인 리포터 RNA의 핵산 증폭 및 C2c1-매개된 부차적 절단에 기초하여 높은 민감성을 갖는 시험관 내 핵산 검출 플랫폼이 기재되어 있다.
일정 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 오솔로그는 진단 조성물 및 어세이에서 단독으로, 또는 다른 Cas12 또는 Cas13 오솔로그와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 Cas12b 오솔로그는 표적 서열을 검출하기 위한 다중복합 어세이에서 사용될 수 있고, 올리고뉴클레오티드-기반 리포터의 비특이적 절단을 통해서, 검출가능한 신호를 발생시킨다.
리포터/차폐성 구성체
본 명세서에서 사용되는 "차폐성 구성체" 는 본 명세서에 기술된 활성화된 CRISPR 시스템 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있거나 또는 달리 탈활성화될 수 있는 분자를 의미한다. 용어 "차폐성 구성체" 는 또한 "검출 구성체" 로서 대체하여 언급될 수도 있다. CRISPR 이펙터 단백질의 뉴클레아제 활성에 의존하여, 차폐성 구성체는 RNA-기반 차폐성 구성체 또는 DNA-기반 차폐성 구성체일 수 있다. 핵산-기반 차폐성 구성체는 CRISPR 이펙터 단백질에 의해 절단가능한 핵산 엘리먼트를 포함한다. 핵산 엘리먼트의 절단은 작용제를 방출하거나 또는 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있게 하는 입체형태 변화를 일으킨다. 핵산 엘리먼트가 어떻게 사용되어서 검츨가능한 신호의 발생을 방지 또는 차폐할 수 있는지를 입증하는 예로서의 구성체는 하기에 기술되고 본 발명의 구현예는 이의 변이체를 포함한다. 절단 이전에, 또는 차폐성 구성체가 '활성' 상태일 때, 차폐성 구성체는 양성의 검출가능한 신호의 발생 또는 검출을 차단한다. 일정 예의 구현예에서 최소 배경 신호가 활성 차폐성 구성체의 존재 하에서 생성될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 양성 검출가능한 신호는 광학, 형광, 화학발광, 전기화학 또는 다른 당분야에 공지된 검출 방법을 사용해 검출될 수 있는 임의 신호일 수 있다. 용어 "양성의 검출가능한 신호" 는 차폐성 구성체의 존재 하에서 검출가능할 수 있는 다른 검출가능한 신호와 구별하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일정 구현예에서 제1 신호 (즉, 음성의 검출가능한 신호)는 차폐제가 존재할 때 검출될 수 있을 것이고, 이것은 이후 표적 분자의 검출 및 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 차폐제의 절단 또는 탈활성화 시에 제2 신호 (예를 들어, 양성의 검출가능한 신호)로 전환된다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 유전자 생성물의 발생을 억제할 수 있다. 유전자 생성물은 샘플에 첨가되는 리포터 구성체에 의해 코딩될 수 있다. 차폐성 구성체는 RNA 간섭 경로에 관여되는 간섭 RNA, 예컨대 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 소형 간섭 RNA (siRNA)일 수 있다. 차폐성 구성체는 또한 마이크로RNA (miRNA)를 포함할 수 있다. 존재하지만, 차폐성 구성체는 유전자 생성물의 발현을 억제한다. 유전자 생성물은 형광 단백질 또는 다른 RNA 전사물일 수 있거나 또는 달리 표지된 프로브, 압타머, 또는 항체에 의해 검출가능하지만 차폐성 구성체의 존재를 위한 단백질일 수 있다. 이펙터 단백질의 활성화 시에 차폐성 구성체는 절단되거나 또는 달리 침묵화되어서 양성 검출가능한 신호로서 유전자 생성물의 발현 및 검출이 가능하게 된다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 차폐성 구성체로부터 하나 이상의 시약의 방출이 검출가능한 양성 신호의 발생을 일으키도록 검출가능한 양성 신호를 발생시키는데 필요한 하나 이상의 시약을 격리시킬 수 있다. 하나 이상의 시약은 비색 신호, 화학 발광 신호, 형광 신호, 또는 임의의 다른 검출가능한 신호를 생성시키도록 조합될 수 있고 이러한 목적에 적합한 것으로 공지된 임의 시약을 포함할 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 하나 이상의 시약은 하나 이상의 시약에 결합하는 RNA 압타머에 의해 격리된다. 하나 이상의 시약은 표적 분자의 검출 시 이펙터 단백질이 활성화되고 RNA 또는 DNA 압타머가 분해될 때 방출된다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 개별 이산 부피 (하기에 더욱 정의됨) 내에 고형 기재 상에 고정화될 수 있고 단일 시약을 격리시킬 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정화 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 너무 확산되어 검출가능한 신호를 발생시키지 못하지만, 차폐성 구성체로부터 방출 시에 예를 들어 응집에 의해서 또는 용액 농도의 단순 증가에 의해서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 RNA- 또는 DNA-기반 압타머이다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 용액 중 고정화 시약에 결합하여서 용액 중에 유리된 별개의 표지된 결합 파트너에 결합하는 시약의 능력을 차단한다. 따라서, 샘플에 세척 단계의 적용 시, 표지된 결합 파트너는 표적 분자의 부재 하에서 샘플을 세척해 낼 수 있다. 그러나, 이펙터 단백질이 활성화되면, 차폐성 구성체는 시약에 결합하는 차폐성 구성체의 능력을 방해하기에 충분한 정도로 절단되어서 표지된 결합 파트너가 고정된 시약에 결합할 수 있게 한다. 따라서, 표지된 결합 파트너는 세척 단계 후에 남아서 샘플 중에 표적 분자의 존재를 의미한다. 일정한 양상에서, 고정화된 시약에 결합하는 차폐성 구성체는 DNA 또는 RNA 압타머이다. 고정된 시약은 단백질일 수 있고 표지된 결합 파트너는 표지된 항체일 수 있다. 대안적으로, 고정된 시약은 스트렙타비딘일 수 있고 표지된 결합 파트너는 표지된 바이오틴일 수 있다. 상기 구현예에서 사용되는 결합 파트너 상의 표지는 당분야에 공지된 임의의 검출가능한 표지일 수 있다. 또한, 다른 공지된 결합 파트너가 본 명세서에 기술된 전체 설계에 따라서 사용될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임은 촉매적 특성을 갖는 RNA 분자이다. 천연 및 조작 리보자임은 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의해 표적화될 수 있는, RNA를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 리보자임은 음성 검출가능한 신호를 발생시키거나 또는 양성 대조군 신호의 발생을 방지하는 반응을 촉매하도록 선택될 수 있거나 또는 조작될 수 있다. 활성화된 이펙터 단백질에 의한 리보자임의 탈활성화 시 음성의 대조군 신호를 발생시키거나, 또는 양성의 검출가능한 신호의 발생을 방지하는 반응은 제거되고 그리하여 양성의 검출가능한 신호가 발생될 수 있게 한다. 일례의 구현예에서, 리보자임은 용액이 제1 색상을 나타내게 하는 비색 반응을 촉매할 수 있다. 리보자임이 탈활성화될 때 그러면 용액이 제2 색상으로 변하게 되며, 제2 색상은 검출가능한 양성 신호이다. 리보자임이 비색 반응을 촉매하기 위해 어떻게 사용되는가의 예는 [Zhao et al. "Signal amplification of glucosamine-6-포스페이트 based on ribozyme glmS," Biosens Bioelectron. 2014; 16:337-42]에 기술되어 있고, 이러한 시스템이 본 명세서에 개시된 구현예의 맥락에서 작용하도록 어떻게 변형될 수 있는가의 예를 제공한다. 대안적으로, 리보자임은 존재하는 경우에, 예를 들어 RNA 전사물의 절단 생성물을 발생시킬 수 있다. 따라서, 양성 검출가능한 신호의 검출은 오직 리보자임의 부재 하에서만 발생되는 비절단된 RNA 전사물의 검출을 포함할 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 하나 이상의 시약은 단백질이 단백질에 하나 이상의 DNA 또는 RNA 압타머의 결합에 의해 검출가능한 신호를 발생시킬 수 없도록 억제되거나 또는 격리되는, 검출가능한 신호, 예컨대 비색, 화학발광 또는 형광발광 신호의 발생을 촉진할 수 있는, 단백질, 예컨대 효소이다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, DNA 또는 RNA 압타머는 그들이 더 이상 검출가능한 신호를 발생시키는 단백질의 능력을 억제하지 않는 정도까지 절단 또는 분해된다. 일정한 예의 구현예에서, 압타머는 트롬빈 억제제 압타머이다. 일정한 예의 구현예에서, 트롬빈 억제제 압타머는 GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC (SEQ ID NO: 439)의 서열을 갖는다. 이러한 압타머가 절단될 때, 트롬빈은 활성화될 것이고 펩티드 비색 또는 형광 기질을 절단할 것이다. 일정한 예의 구현예에서, 비색 기질은 트롬빈에 대한 펩티드 기질에 공유적으로 연결된 파라-니트로아닐리드 (pNA)이다. 트롬빈에 의해 절단 시, pNA가 방출되고 노란 색상이 되어 쉽게 육안으로 볼 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 형광 기질은 7-아미노-4-메틸쿠마린으로서 형광 검출기를 사용해 검출할 수 있는 파란색 형광단이다. 억제성 압타머가 또한 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 베타-갈락토시다제, 또는 송아지 알칼리 포스파타제 (CAP)에 대해 사용될 수 있고 상기 제시된 일반 원리에 속한다.
일정한 구현예에서, RNAse 또는 DNAse 활성은 효소-억제성 압타머의 절단을 통해 비색적으로 검출된다. DNase 또는 RNase 활성을 비색 신호로 전환시키는 하나의 잠재적인 방식은 비색 출력을 생성시킬 수 있는 효소의 재활성화와 DNA 또는 RNA 압타머의 절단을 커플링시키는 것이다. RNA 또는 DNA 절단의 부재 하에서, 온전한 압타머는 효소 표적에 결합하여 이의 활성을 억제하게 될 것이다. 이러한 판독 시스템의 장점은 효소가 추가 증폭 단계를 제공한다는 것이다: 부차적 활성 (예를 들어, C2c1 부차적 활성)을 통해서 압타머로부터 유리되면, 비색 효소는 비색 생성물을 계속 생성시켜서, 신호의 배가를 일으키게 될 것이다.
일정한 구현예에서, 비색 판독의 효소를 억제하는 현존 압타머가 사용된다. 비색 판독되는 몇몇 압타머/효소 쌍에는 예컨대 트롬빈, 단백질 C, 호중구 엘라스타제 및 서브스틸리신이 존재한다. 이들 프로테아제는 pNA를 기반으로 비색 기질을 가지며 상업적으로 입수가능하다. 일정한 구현예에서, 일반적인 비색 효소를 표적화하는 신규한 압타머가 사용된다. 일반적인 강건한 효소, 예컨대 베타-갈락토시다제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 송아지 장 알칼리 포스파타제는 선택 전략 예컨대 SELEX에 의해 디자인된 조작된 압타머에 의해 표적화될 수 있다. 이러한 전략은 나노몰 결합 효율로 압타머의 신속한 선택을 가능하게 하고 비색 판독을 위한 추가의 효소/압타머 쌍의 개발에 사용될 수 있다.
일정한 구현예에서, RNase 또는 DNase 활성은 RNA-테더드 억제제의 절단을 통해서 비색으로 검출된다. 많은 일반 비색 효소는 경쟁적, 가역적 억제제를 가지며, 예를 들어 베타-갈락토시다제는 갈락토스에 의해 억제될 수 있다. 많은 이들 억제제는 약하지만, 그들의 효과는 국소 농도를 증가시켜서 증가될 수 있다. 억제제의 국소 농도를 DNase 및/또는 RNAse 활성과 연결시킴으로써, 비색 효소 및 억제제 쌍은 DNase 및 RNAse 센서에 조작될 수 있다. 소형-분자 억제제를 기반으로 하는 비색 DNase 또는 RNAse 센서는 3종의 성분을 포함하는데, 비색 효소, 억제제, 및 억제제를 효소에 속박시키는, 억제제와 효소 둘 모두에 공유적으로 연결된 브릿징 RNA 또는 DNA이다. 미절단된 구성에서, 효소는 소형 분자의 증가된 국소 농도에 의해 억제되고, DNA 또는 RNA가 (예를 들어, Cas13 또는 Cas12 부차적 절단에 의해) 절단될 때, 억제제가 방출될 것이고 비색 효소가 활성화될 것이다.
일정한 구현예에서, RNAse 또는 Dnase 활성은 G-사중체의 형성 및/또는 활성화를 통해 비색적으로 검출된다. DNA의 G 사중체는 헴 (철 (III)-프로토포르피린 IX)과 복합체를 형성하여 퍼옥시다제 활성과 DNAzyme을 형성할 수 있다. 퍼옥시다제 기질 (예를 들어, ABTS: (2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염))이 공급될 때, 과산화수소의 존재 하에서 G-사중체-헴 복합체가 기질의 산화를 야기하고, 그 다음에 용액 중에서 녹색을 형성시킨다. G-사중체 형성 DNA 서열의 예는 GGGTAGGGCGGGTTGGGA (SEQ ID NO: 440)이다. DNA 압타머와, 본 명세서에서 " 스테이플 (staple)" 이라고 하는, 추가의 DNA 또는 RNA 서열의 하이브리드화에 의해서, G-사중체 구조의 형성은 제한될 것이다. 부차적 활성화 시, 스테이플은 절단되어 G 사중체를 형성할 수 있게 하고 헴이 결합할 수 있게 할 것이다. 이러한 전략은 부차적 활성화 이후에 추가 증폭이 존재한다는 것을 의미하는, 색상 형성이 효소적이기 때문에 특히 매력적이다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 개별 이산 부피 (하기에 더욱 정의됨) 내에 고형 기재 상에 고정화될 수 있고 단일 시약을 격리시킬 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정화 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 너무 확산되어 검출가능한 신호를 발생시키지 못하지만, 차폐성 구성체로부터 방출 시에 예를 들어 응집에 의해서 또는 용액 농도의 단순 증가에 의해서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 DNA- 또는 RNA-기반 압타머이다.
일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출제가 응집되는지 또는 용액에 분산되는지 여부에 따라서 생상을 변화시키는 검출제를 포함한다. 예를 들어, 일정한 나노입자, 예컨대 콜로이드 금은 그들이 응집물로부터 분산된 입자로 이동하면서 가시적인 보라색에서 붉은 색으로 색상 이동을 겪는다. 따라서, 일정한 예의 구현예에서, 이러한 검출제는 하나 이상의 브릿지 분자에 의해 응집물로 유지될 수 있다. 브릿지 분자의 적어도 일부분은 RNA 또는 DNA를 포함한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, 브릿지 분자의 RNA 또는 DNA 부분은 절단되어서 검출제가 분산될 수 있게 하고 색상의 상응하는 변화를 일으킬 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 검출제는 콜로이드 금속이다. 콜로이드 금속 재료는 액체, 히드로졸 또는 금속 졸에 분산된 수불용성 금속 입자 또는 금속 화합물을 포함할 수 있다. 콜로이드 금속은 주기율표의 그룹 IA, IB, IIB 및 IIIB의 금속을 비롯하여, 전이 금속, 특히 그룹 VIII의 것으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 금속은 금, 은, 알루미늄, 루테늄, 아연, 철, 니켈 및 칼슘을 포함한다. 다른 적합한 금속은 또한 모든 그들의 다양한 산화 상태의 하기의 것들을 포함한다: 리튬, 소듐, 마그네슘, 포타슘, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 구리, 갈륨, 스트론튬, 니오븀, 몰리브데늄, 팔라듐, 인듐, 주석, 텅스텐, 레늄, 플래티늄, 및 가돌리늄. 금속은 바람직하게 적절한 금속 화합물로부터 유래된 이온 형태, 예를 들어 A13+, Ru3+, Zn2+, Fe3+, Ni2+ 및 Ca2+ 이온으로 제공된다.
RNA 또는 DNA 브릿지가 활성화된 CRISPR 이펙터에 의해 절단될 때, 상기 언급된 색상 이동이 관찰된다. 일정 예의 구현예에서, 입자는 콜로이드 금속이다. 다른 일정 예의 구현예에서, 콜로이드 금속은 콜로이드 금이다. 일정 예의 구현예에서, 콜로이드 나노입자는 15 nm 금 나노입자 (AuNP)이다. 콜로이드 금 나노입자의 고유한 표면 성질 덕분에, 용액에서 완전히 분산되고 육안으로 붉은 색상이 나타날 때 520 nm에서 최대 흡광도가 관찰된다. AuNP의 응집 시, 그들은 최대 흡광도에서 붉은색-이동을 나타내고 색상이 더 진하게 나타나며, 궁극적으로 용액으로부터 진한 보라색 응집체로 침전된다. 일정 예의 구현예에서, 나노입자는 나노입자의 표면으로부터 연장된 DNA 링커를 포함하도록 변형된다. 개별 입자는 각 말단 상에서 DNA 링커의 적어도 일부분에 하이브리드화하는 단일 가닥 RNA (ssRNA) 또는 단일 가닥 DNA 브릿지에 의해 함께 연결된다. 따라서, 나노입자는 연결된 입자의 망을 형성하게 되고 응집하게 되어, 진한 침전물로서 나타나게 될 것이다. 본 명세서에 개시된 CRISPR 이펙터의 활성화 시, ssRNA 또는 ssDNA 브릿지는 절단될 것이고, 연결된 메시로부터 AU NPS를 방출하여 가시적인 붉은 색상을 생성시키게 된다. 예시적인 DNA 링커 및 브릿지 서열은 하기에 열거된다. DNA 링커의 말단 상에 티올 링커는 AuNPS와 표면 접합을 위해 사용될 수 있다. 다른 형태의 접합이 사용될 수도 있다. 일정 예의 구현예에서, 각 DNA 링커에 대해 하나씩, 2개 집단의 AuNP가 발생될 수 있다. 이것은 적절한 배향으로 ssRNA 가교의 적절한 결합을 촉진하도록 돕게 될 것이다. 일정 예의 구현예에서, 제1 DNA 링커는 3' 말단으로 접합되는 반면 제2 DNA 링커는 5' 말단으로 접합된다.
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일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출가능한 표지 및 그 검출가능한 표지의 차폐제가 부착되는 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 검출가능한 표지/차폐제 쌍의 예는 형광단 및 형광단의 소광제가 있다. 형광단의 소광은 형광단 및 다른 형광단 또는 비형광 분자 간 비형광성 복합체의 형성 결과로서 일어날 수 있다. 이러한 기전은 바닥-상태 복합체 형성, 정적 소광, 또는 접촉 소광으로서 알려져 있다. 따라서, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드는 형광단 및 소광제가 접촉 소광이 일어나도록 충분히 근접하도록 디자인될 수 있다. 형광단 및 그들의 동족 소광제는 당분야에 공지되어 있고, 당업자에 의해서 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다. 특정한 형광단/소광제 쌍은 본 발명의 상황에서 핵심적이지 않고, 오직 형광단/소광제 쌍의 선택이 형광단의 차폐를 보장한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고 그리하여 접촉 소광 효과를 유지하는데 필요한 형광단 및 소광제 간 근접성을 잘라낸다. 따라서, 형광단의 검출은 샘플 중 표적 분자의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 하나 이상의 금속 나노입자, 예컨대 금 나노입자가 부착되는 하나 이상의 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 차폐성 구성체는 닫힌 루프를 형성하는 다수의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드에 의해 가교된 다수의 금속 나노입자를 포함한다. 일 구현예에서, 차폐성 구성체는 닫힌 루프를 형성하는 3개의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드에 의해 교차된 3개의 금 나노입자를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질에 의한 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드의 절단은 금속 나노입자에 의해 생성되는 검출가능한 신호를 야기시킨다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 하나 이상의 퀀텀 도트가 부착되는 하나 이상의 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질에 의한 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드의 절단은 퀀텀 도트에 의해 생성되는 검출가능한 신호를 야기시킨다.
일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 퀀텀 도트를 포함할 수 있다. 퀀텀 도트는 표면에 부착되는 다수의 링커 분자를 가질 수 있다. 링커 분자의 적어도 일부분은 RNA 또는 DNA를 포함한다. 링커 분자는 한쪽 말단에서 퀀텀 도트에 부착되고 링커의 길이를 따라서 또는 말단부에서 하나 이상의 소광제에 부착되어서 소광제가 퀀텀 도트의 소광이 일어나도록 충분히 근접하게 유지된다. 링커는 분지될 수 있다. 상기처럼, 퀀텀 도트/소광제 쌍은 핵심적이지 않고, 오직 퀀텀 도트/소광제 쌍의 선택이 형광단의 차폐를 보장한다. 퀀텀 도트 및 그들의 동족 소광제는 당분야에 공지되어 있고 당업자에 의해서 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, 링커 분자의 RNA 또는 DNA 부분은 절단되어서 소광 효과를 유지하는데 필요한 퀀텀 도트와 하나 이상의 소광제 간 근접성을 제거시킨다. 일정 예의 구현예에서 퀀텀 도트는 스트렙타비딘 접합된다. RNA 또는 DNA는 바이오틴 링커를 통해서 부착되고 서열 /5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO: 444) 또는 /5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO: 445)을 갖는 소광 분자를 동원하며, 여기서 /5Biosg/는 바이오틴 태그이고 /3lAbRQSp/는 아이오와 블랙 소광제이다. 절단 시, 본 명세서에 개시된 활성화된 이펙터에 의해서 퀀텀 도트는 가시적으로 형광발광하게 될 것이다.
유사한 방식으로, 형광 에너지 전달 (FRET)은 검출가능한 양성 신호를 발생시키기 위해 사용될 수 있다. FRET는 에너지 여기된 형광단 (즉, "도너 형광단")으로부터의 광자가 다른 분자 (즉, "억셉터") 내 전자의 에너지 상태를 더 높은 진동 수준의 여기된 단일항 상태로 상승시키는 비복사 과정이다. 도너 형광단은 그 형광단의 특징적인 형광을 방출하지 않고 바닥 상태로 복귀된다. 억셉터는 다른 형광단일 수 있거나 또는 비형광성 분자일 수 있다. 억셉터가 형광단이면, 전달된 에너지는 그 형광단의 특징적인 형광으로서 발광된다. 억셉터가 비형광성 분자이면 흡수된 에너지는 열로서 소실된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구현예의 상황에서, 형광단/소광제 쌍은 올리고뉴클레오티드 분자에 부착된 도너 형광단/억셉터 쌍으로 교체된다. 온전할 때, 차폐성 구성체는 억셉터로부터 방출되는 열 또는 형광에 의해 검출되는 제1 신호 (음성 검출가능한 신호)를 발생시킨다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시 RNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고 FRET은 파괴되어서 도너 형광단의 형광이 이제 검출된다 (양성 검출가능한 신호).
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 짧은 뉴클레오티드로 긴 RNA 또는 DNA의 절단에 대응하여 그들 흡광도를 변화시키는 인터컬레이팅 염료의 사용을 포함한다. 몇몇 이러한 염료가 존재한다. 예를 들어, 파이로닌-Y는 RNA와 복합체를 형성하게 될 것이고, 572 nm에서 흡광도를 갖는 복합체를 형성하게 될 것이다. RNA의 절단은 그 결과로 흡광도의 소실 및 색상 변화를 일으킨다. 메틸렌 블루는 유사한 방식으로 사용될 수 있고, RNA 절단 시 688 nm에서의 흡광도가 변화한다. 따라서, 일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의한 RNA의 절단 시 흡광도를 변화시키는 RNA 및 인터컬레이팅 염료 복합체를 포함한다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 HCR 반응을 위한 개시제를 포함할 수 있다. 참조: Dirks and Pierce. PNAS 101, 15275-15728 (2004). HCR 반응은 2가지 헤어핀 종에서 위치 에너지를 이용한다. 헤어핀 중 하나의 상응하는 영역에 상보성인 부분을 갖는 단일 가닥 개시제가 이전에 안정된 혼합물로 방출될 때, 이것이 한 종의 헤어핀을 개방시킨다. 이어서 이 과정은 다른 종의 헤어핀을 개방시키는 단일 가닥 영역을 노출시킨다. 다음으로 이 과정은 본래 개시제와 동일한 단일 가닥 영역을 노출시킨다. 최종 연쇄 반응은 헤어핀 공급이 고갈될 때까지 성장하는 닉킹된 이중 나선의 형성을 일으킬 수 있다. 최종 생성물의 검출은 겔 상에서 또는 비색적으로 수행될 수 있다. 예로서 비색 검출 방법은 예를 들어, 하기 문헌들에 개시된 것들을 포함한다: Lu et al. " Ultra-sensitive colorimetric assay system based on the hybridization chain reaction-triggered enzyme cascade amplification ACS Appl Mater Interfaces, 2017, 9(1):167-175, Wang et al. " An enzyme-free colorimetric assay using hybridization chain reaction amplification and split aptamers" Analyst 2015, 150, 7657-7662, 및 Song et al. " Non covalent fluorescent labeling of hairpin DNA probe coupled with hybridization chain reaction for sensitive DNA detection." Applied Spectroscopy, 70(4): 686-694 (2016).
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 HCR 개시제 서열 및 개시제가 HCR 반응을 개시시키는 것을 방지하는 절단가능한 구조적 엘리먼트, 예컨대 루프 또는 헤어핀을 포함할 수 있다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 구조적 엘리먼트의 절단 시, 개시제는 방출되어 HCR 반응을 촉발시키고, 이의 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적의 존재를 의미한다. 일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 RNA 루프와 헤어핀을 포함한다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질이 RNA 루프를 절단할 때, 개시제는 방출되어 HCR 반응을 촉발시킬 수 있다.
표적 올리고뉴클레오티드의 증폭
일정 예의 구현예에서, 표적 RNA 및/또는 DNA는 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키기 전에 증폭될 수 있다. 임의의 적합한 RNA 또는 DNA 증폭 기술이 사용될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, RNA 또는 DNA 증폭은 등온 증폭이다. 특정 예시적 구현예에서, 등온 증폭은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나아제 중합효소 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카아제-의존적 증폭 (HDA), 또는 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR) 일 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 비-등온 증폭 방법은 PCR, 다중 전위 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM) 을 비제한적으로 포함하는 것이 사용될 수 있다.
특정 예시적 구현예에서, RNA 또는 DNA 증폭은 RNA/DNA 듀플렉스를 형성하기 위해 서열-특이적 역방향 프라이머에 의한 표적 RNA의 역전사에 의해 개시되는, NASBA 이다. 그 다음으로 RNase H는 RNA 주형을 분해하는데 사용되어서, 프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 함유하는 전방향 프라이머가 결합되어 상보성 가닥의 연장을 개시할 수 있고, 이중-가닥 DNA 생성물이 생성된다. DNA 주형의 RNA 중합효소 프로모터-매개 전사가 표적 RNA 서열의 카피를 생성시킨다. 중요한 것은, 신규 표적 RNA 각각이 가이드 RNA 에 의해 검출될 수 있고 그리하여 어세이의 감도를 더 증강시킬 수 있다는 것이다. 그런 다음, 가이드 RNA 에 의한 표적 RNA 의 결합이 CRISPR 이펙터 단백질의 활성화를 야기시키고 방법은 상기 약술된 대로 진행된다. NASBA 반응은 예를 들어 대략 41℃ 의 중간 등온 조건 하에서 진행될 수 있다는 추가의 장점을 가져서, 임상 실험실로부터 멀리 떨어진 현장에서 조기 및 직접 검출을 위해 배치된 시스템 및 장치에 적합하다.
일정한 다른 일례의 구현예에서, 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 반응은 표적 핵산을 증폭시키는데 사용될 수 있다. RPA 반응은 듀플렉스 DNA 의 상동성 서열과 서열-특이적 프라이머의 쌍을 형성할 수 있는 리콤비나아제를 이용한다. 표적 DNA 가 존재하면, DNA 증폭이 개시되고 다른 샘플 조작 예컨대 열 사이클 또는 화학적 용융이 필요하지 않다. 전체 RPA 증폭 시스템은 건조된 제제로서 안정하고 냉동 없이 안전하게 수송될 수 있다. RPA 반응은 또한 37-42℃ 의 최적 반응 온도로 등온 온도에서 실행될 수 있다. 서열 특이적 프라이머는 검출할 표적 핵산 서열을 포함하는 서열이 증폭되도록 설계된다. 특정 예시적 구현예에서, RNA 중합효소 프로모터, 예컨대 T7 프로모터는 프라이머 중 하나에 첨가된다. 그 결과로 표적 서열 및 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 증폭된 이중-가닥 DNA 생성물이 얻어진다. RPA 반응 이후, 또는 그 동안, RNA 중합효소가 첨가되어 이중-가닥 DNA 주형으로부터 RNA 를 생성시키게 될 것이다. 이어서, 증폭된 표적 RNA 가 그 다음으로 CRISPR 이펙터 시스템에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방식으로 표적 DNA 는 본원에 개시된 구현예를 사용하여 검출될 수 있다. RPA 반응은 또한 표적 RNA 를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 표적 RNA 는 먼저 역전사효소를 사용해 cDNA 로 전환되고, 그 다음으로 제 2 가닥 DNA 합성이 후속되며, 이 시점에 RPA 반응은 상기 약술된 대로 진행된다.
본 발명의 일 구현예에서, 니킹 효소는 CRISPR 단백질이다. 따라서, dsDNA로 닉의 도입은 프로그램가능할 수 있고 서열-특이적일 수 있다. 도 5는 dsDNA 표적의 반대 가닥을 표적화하도록 설계된 2개 가이드에서 시작되는 본 발명의 일 구현예를 도시한다. 본 발명에 따라서, 닉카제는 Cpf1, C°C와 함께 사용되는 C2c1 또는 C2c1일 수 있다. 다른 구현예에서, 등온 증폭의 온도는 상이한 온도에서 작동가능한 중합효소 (예를 들어, Bsu, Bst, Phi29, 클레노우 단편 등)를 선택하여 선택될 수 있다.
따라서, 닉킹 등온 증폭 기술은 (예를 들어, 닉킹 효소 증폭 반응 또는 NEAR에서) 고정된 서열 선호도를 갖는 닉킹 효소를 사용하여, 표적의 말단에 닉킹 기질을 첨가하는 프라이머의 어닐링 및 연장을 허용하기 위해 본래 dsDNA 표적의 변성을 필요로 하지만, 닉킹 부위가 가이드 RNA를 통해서 프로그램될 수 있는 것인 CRISPR 닉카제의 사용은 변성 단계를 필요로 하지 않아서, 전체 반응이 진짜로 등온성이게 된다는 것을 의미한다. 이것은 또한 닉킹 기질을 첨가하는 이들 프라이머가 이후 반응에서 사용되는 프라이머와 상이하기 때문에 반응을 단순화시키며, 이것은 NEAR이 2개 프라이머 세트 (즉, 4개 프라이머)를 필요로 하지만 C2c1 닉킹 증폭은 오직 하나의 프라이머 세트 (즉, 2개 프라이머)를 필요로 한다는 것을 의미한다. 이것은 변성 및 이후 등온 온도로 냉각을 수행하기 위해 복잡한 장비없이 작업하도록 닉킹 C2c1 증폭을 훨씬 더 단순하고 쉽게 만든다.
따라서, 일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템은 증폭 시약을 포함할 수 있다. 핵산의 증폭에 유용한 상이한 성분 또는 시약은 본 명세서에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 시약은 완충제, 예컨대 Tris 완충제를 포함할 수 있다. Tris 완충제는 예를 들어, 제한없이, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 1 M 등의 농도를 포함하여, 바람직한 적용 또는 용도에 적절한 임의 농도로 사용될 수 있다. 당업자는 완충제 예컨대 본 발명에서 사용을 위한 Tris의 적절한 농도를 결정할 수 있을 것이다.
염, 예컨대 마그네슘 클로라이드 (MgCl2), 포타슘 클로라이드 (KCl), 또는 소듐 클로라이드 (NaCl) 가 핵산 단편의 증폭을 개선시키기 위해서, 증폭 반응, 예컨대 PCR 에 포함될 수 있다. 염 농도가 특정한 반응 및 적용분야에 의존적일 것이지만, 일부 구현예에서, 특정한 크기의 핵산 단편은 특정한 염 농도에서 최적 결과를 생성시킬 수 있을 것이다. 바람직한 결과를 생성시키기 위해, 더 큰 생성물은 변경된 염 농도, 전형적으로 더 낮은 염을 요구할 수 있는 한편, 더 작은 생성물의 증폭은 더 높은 염 농도에서 보다 양호한 결과를 생성시킬 수 있다. 당업자는 염 농도의 변경과 함께, 염의 존재 및/또는 농도가 생물학적 또는 화학적 반응의 엄격도를 변경시킬 수 있고, 그러므로 본원에서 기재된 바와 같이 본 발명의 반응을 위해 적절한 조건을 제공하는 임의의 염을 사용할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다.
생물학적 또는 화학적 반응의 다른 성분은 세포 안의 물질의 분석을 위해 세포를 파쇄하거나 용해시키기 위해 세포 용해 성분을 포함할 수 있다. 세포 용해 성분은 세제, 상기 기재된 바와 같은 염, 예컨대 NaCl, KCl, 암모늄 술페이트 [(NH4)2SO4], 또는 다른 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 적절할 수 있는 세제는 Triton X-100, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 (NP-40)을 포함할 수 있다. 세제의 농도는 특정 적용분야에 의존적일 수 있고, 일부 경우에서 반응에 특이적일 수 있다. 증폭 반응은 예컨대 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM 등의 농도를 비제한적으로 포함하여, 본 발명에 적절한 임의 농도로 사용되는 dNTP 및 핵산 프라이머를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따라서 유용한 폴리머라아제는 Taq 폴리머라아제, Q5 폴리머라아제 등을 포함하는, 당분야에 공지되어 있고 본 발명에서 유용한 임의의 특이적이거나 일반적인 폴리머라아제일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같은 증폭 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절할 수 있다. 핫 스타트 증폭은 어댑터 분자 또는 올리고의 이량체화를 감소시키거나 제거시키기 위해서, 또는 달리 원치않는 증폭 생성물 또는 인공물을 방지하고 바람직한 생성물의 최적 증폭을 수득하기 위해서 일부 구현예에서 유리할 수 있다. 증폭에 사용하기 위한 본원에 기재된 많은 성분이 또한 핫-스타트 증폭에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절한 시약 또는 성분은 적절하다면 조성물 성분 중 하나 이상 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 또는 다른 시약은 특정한 온도 또는 다른 반응 조건에서 바람직한 활성을 나타내는 것이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용하기 위해 디자인되거나 최적화된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 중합효소는 전위 이후 또는 특정한 온도에 도달 이후에 활성화될 수 있다. 이러한 중합효소는 항체-기반 또는 압타머-기반일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 중합효소는 당분야에 공지되어 있다. 이러한 시약의 예는 제한없이, 핫-스타트 중합효소, 핫-스타트 dNTP, 및 광-케이징된 dNTP를 포함할 수 있다. 이러한 시약은 공지되어 있고 당분야에서 입수가능하다. 당업자는 개별 시약에 적절하게 최적 온도를 결정할 수 있을 것이다.
핵산의 증폭은 특별한 열 사이클 기계 또는 장비를 사용하여 수행될 수 있고, 단일 반응으로 또는 대량으로 수행될 수 있어, 임의의 바람직한 횟수의 반응이 동시에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭은 미세유체 또는 로봇식 장치를 사용하여 수행될 수 있거나, 바람직한 증폭을 달성하도록 온도의 수동 변경을 사용하여 수행될 수도 있다. 일부 구현예에서, 특정한 적용분야 또는 물질에 대한 최적 반응 조건을 수득하기 위해 최적화가 수행될 수 있다. 당업자는 충분한 증폭이 수득되도록 반응 조건을 이해하게 될 것이고 최적화시킬 수 있을 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법 또는 시스템에 의한 DNA 의 검출은 검출 전에 (증폭된) DNA 를 RNA 로 전사시키는 것을 필요로 한다.
본 발명의 검출 방법이 다양한 조합으로 핵산 증폭 및 검출 절차를 포함할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 검출하려는 핵산은 검출할 수 있는 중간 생성물을 제공하기 위한 임의의 적합한 방법에 의해 증폭될 수 있는, DNA 및 RNA 를 제한없이 포함하는, 임의의 천연 발생 또는 합성 핵산일 수 있다. 중간 생성물의 검출은 직접 또는 부차적 활성에 의해 검출가능한 신호 모이어티를 생성시키는 CRISPR 단백질의 결합 및 활성화를 제한없이 포함하는, 임의의 적합한 방법에 의한 것일 수 있다.
본 명세서에 개시된 시스템, 장치, 및 방법은 또한 특이적으로 구성된 폴리펩티드 검출 압타머의 도입을 통해서 핵산의 검출 이외에도 폴리펩티드 (또는 다른 분자)의 검출에 적합화될 수 있다. 폴리펩티드 검출 압타머는 상기 기술된 차폐성 구성체 압타머와 별개이다. 첫번째로, 압타머는 하나 이상의 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 디자인된다. 일례의 구현예에서 표적 분자는 표적 폴리펩티드이다. 다른 일례의 구현예에서 표적 분자는 표적 화학적 화합물, 예컨대 표적 치료 분자이다. 소정 표적에 대한 특이성으로 압타머를 디자인하고 선택하기 위한 방법, 예컨대 SELEX는 당분야에 공지되어 있다. 소정 표적에 대한 특이성이외에도, 압타머는 R중합효소 프로모터 결합 부위를 도입시키도록 더욱 설계된다. 일정한 예의 구현예에서, 중합효소 프로모터는 T7 프로모터이다. 표적에 압타머의 결합 전에, 중합효소 부위는 중합효소가 접근가능하거나, 또는 달리 인식가능하지 않다. 그러나, 압타머는 표적의 결합 시 압타머의 구조가 입체형태 변화를 겪어서 중합효소 프로모터가 노출되도록 구성된다. 중합효소 프로모터의 하류의 압타머 서열은 RNA 또는 DNA 중합효소에 의한 기폭제 올리고뉴클레오티드의 생성을 위한 주형으로서 작용한다. 따라서, 압타머의 주형 부분은 소정 압타머 및 이의 표적을 식별하는 바코드 또는 다른 식별 서열을 더 도입시킬 수 있다. 상기 기술된 바와 같은 가이드 RNA는 이들 특이적 기폭제 올리고뉴클레오티드 서열을 인식하도록 디자인될 수 있다. 기폭제 올리고뉴클레오티드에 가이드 RNA의 결합은 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키고, 이전에 기술된 바와 같이 차폐성 구성체를 탈활성화시켜서 양성 검출가능한 신호를 발생시키도록 진행된다.
따라서, 일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 샘플 또는 샘플의 세트를 개별 이산 부피의 세트에 분배시키는 단계로서, 각각의 개별 이산 부피는 펩티드 검출 압타머, CRISPR 이펙터 단백질, 하나 이상의 가이드 RNA, 차폐성 구성체를 포함하는 것인 단계, 및 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 표적 분자와 펩티드 검출 압타머의 결합을 허용하기 위해 충분한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 상응하는 표적에 대한 압타머의 결합은 중합효소 프로모터 결합 부위를 노출시켜서 RNA 중합효소 프로모터 결합 부위에 RNA 중합효소의 결합을 통해 기폭제 올리고뉴클레오티드의 합성이 개시되는 것인 단계의 추가 단계를 포함한다.
다른 일례의 구현예에서 압타머의 결합은 표적 폴리펩티드에 압타머의 결합 시 프라이머 결합 부위를 노출시킬 수 있다. 예를 들어, 압타머는 RPA 프라이머 결합 부위를 노출시킬 수 있다. 따라서, 프라이머의 첨가 또는 포함은 증폭 반응, 예컨대 상기 약술된 바와 같은 RPA 반응에 공급되어 질 것이다.
일정 예의 구현예에서, 압타머는 관심 표적에 결합 시, 2차 구조를 변화시켜서 단일-가닥 DNA의 새로운 영역을 노출시킬 수 있는, 입체형태-전환 압타머일 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 이들 단일-가닥 DNA의 새로운 영역은 결찰을 위한 기질로서 사용될 수 있어서, 압타머를 연장하고 더 긴 ssDNA 분자를 생성시켜서 이것이 본 명세서에 개시된 구현예를 사용해 특이적으로 검출될 수 있다. 압타머 디자인은 글루코스와 같은, 저-에피토프 표적의 검출을 위한 3원 복합체와 더 조합될 수 있다 (Yang et al. 2015: pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.5b01634). 예시적인 입체형태 이동 압타머 및 상응하는 가이드 RNA (crRNA)는 하기 표에 표시되어 있다.
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CRISPR 시스템의 사용 방법에 대한 일반 설명
특정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 하나 이상의 관심 폴리뉴클레오티드 표적을 표적화하는 단계를 포함할 수 있다. 관심 폴리뉴클레오티드 표적은 특별한 질환 또는 이의 치료와 관련되거나, 소정 관심 특성의 생성과 관련되거나, 또는 관심 분자의 생성과 관련된 표적일 수 있다. "폴리뉴클레오티드 표적" 의 표적화를 언급할 때, 이것은 코딩 영역, 인트론, 프로모터, 및 임의의 다른 5' 또는 3' 조절 영역 예컨대 종결 영역, 리보솜 결합 부위, 인핸서, 사일렌서 등 중 하나 이상을 표적화하는 것을 포함할 수 있다. 유전자는 임의의 관심 단백질 또는 RNA를 코딩할 수 있다. 따라서, 표적은 mRNA, tRNA, 또는 rRNA로 전사될 수 있는 코딩 영역일 수 있거나, 또한 이의 복제, 전사, 및 조절에 관여되는 단백질에 대한 인식 부위일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 하나 이상의 관심 유전자를 표적화하는 단계를 포함할 수 있고, 적어도 하나의 관심 유전자는 긴 비코딩 RNA (lncRNA)를 코딩한다. 한편 lncRNA는 세포 기능화에 결정적인 것으로 확인되었다. 필수적인 lncRNA가 각 세포 유형에서 상이한 것으로 확인되었으므로 (C.P. Fulco et al., 2016, Science, doi:10.1126/science.aag2445; N.E. Sanjana et al., 2016, Science, doi:10.1126/science.aaf8325), 본 명세서에 제공되는 방법은 관심 세포를 위한 세포 기능과 관련된 lncRNA를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
외생의 폴리뉴클레오티드 주형을 통합함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하기 위한 예시적인 방법에서, 이중 가닥 파손은 CRISPR 복합체에 의해 게놈 서열 내로 도입되고, 그 파손은 그 주형이 게놈 내로 통합되도록 하는 외생성 폴리뉴클레오티드 주형을 이용한 상동성 재조합을 통해 복구된다. 이중가닥 파손의 존재는 주형의 통합을 촉진한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 진핵생물 세포 내에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 변형하는 방법을 제공한다. 방법은 폴리뉴클레오티드와 결합하는 CRISPR 복합체를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한다.
일부 방법에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 비활성화되어 세포 내에서 발현의 변형을 일으킬 수 있다. 예를 들어, CRISPR 복합체의 세포 내의 표적 서열로의 결합시, 표적 폴리뉴클레오티드는 비활성화되어, 서열이 전사되지 않거나, 코딩된 단백질이 생산되지 않거나, 서열이 야생형 서열이 작용하는 것처럼 작용하지 않게 된다. 예를 들어, 단백질 또는 마이크로RNA 코딩 서열은 비활성화되어 단백질이 생산되지 않게 된다.
일부 방법에서, 제어 서열이 더 이상 조절 서열로서 기능하지 않도록 비활성화될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, "제어 서열" 은 핵산 서열의 전사, 번역, 또는 접근성에 영향을 미치는 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 제어 서열의 예들은 프로모터, 전사 종결자, 및 인핸서를 포함하며 이들이 제어 서열이다. 비활성화된 표적 서열은 결실 돌연변이(즉, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실), 삽입 돌연변이(즉, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입), 또는 논센스 돌연변이(즉, 정지 코돈이 도입되도록 하는, 하나의 뉴클레오티드의 또 다른 뉴클레오티드로의 치환)를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 표적 서열의 비활성화는 표적 서열의 "녹아웃" 을 초래한다.
본 명세서는 또한 복수의 조합 교란을 도입시켜 세포 상호작용을 확인하는 단계 및 관찰된 게놈, 유전자, 단백질체, 후성유전, 및/또는 표현형 효과를 " perturb-seq" 라고도 하는, 단일 세포에서 관찰된 교란과 상관짓는 단계를 포함하는 기능적 유전체학 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 이들 방법은 combine 단일-세포 RNA 시퀀싱 (RNA-seq) 및 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-기반 교란을 조합한다 (Dixit et al. 2016, Cell 167, 1853-1866; Adamson et al. 2016, Cell 167, 1867-1882). 일반적으로, 이들 방법은 세포 개체군 중 다수 세포로 다수의 조합 교란을 도입시키는 단계로서, 다수 세포의 각각의 세포는 적어도 1 교란을 받는 것인 단계, 임의의 교란을 받지 않은 하나 이상의 세포와 비교하여 단일 세포에서 게놈, 유전자, 단백질체, 후성유전, 및/또는 표현형 편차를 검출하는 단계, 및 단일 세포에서 교란(들)을 검출하는 단계; 및 측정된 편차에 대해 공변량을 처리하는 모델을 적용하여 교란과 관련된 측정된 편차를 결정하여, 세포간 및/또는 세포내 네트워크 또는 회로를 추론하는 것인 단계를 포함한다. 보다 특히, 단일 세포 시퀀싱은 세포 바코드를 포함하여서, 각 RNA의 기원 세포를 기록한다. 보다 특히, 단일 세포 시퀀싱은 고유 분자 식별자 (UMI)를 포함하여서, 단일 세포내에서, 전사물 카피수 또는 프로브 결합 사건같은, 측정된 신호의 포획률을 결정한다.
이들 방법은 세포 회로의 조합적 탐지, 세포 회로 해체, 분자 경로의 설명, 및/또는 치료제 개발을 위한 관련 표적의 확인을 위해 사용될 수 있다. 보다 특히, 이들 방법은 그들 분자 프로파일링을 기반으로 세포군을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 유기적 (예를 들어, 질환) 및 (예를 들어, 소형 분자에 의한) 유도적 상태 간 유전자-발현 프로파일의 유사성은 임상적으로 효과적인 요법을 확인할 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 치료 방법은 대상체로부터 단리된 세포 개체군에 대해서, 상기 기술된 바와 같은 perturb-seq를 사용하여, 최적 치료 표적 및/또는 치료제를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 구현에에서, 본 명세서의 다른 곳에 언급된 바와 같은 perturb-seq 방법은 단리된 세포 또는 세포주에서, 관심 분자의 생성에 영향을 미칠 수 있는 세포 회로를 결정하는데 사용된다.
추가의 CRISPR-Cas 개발 및 사용 고려사항
본 발명은 하기 문헌들에서 설명된 바와 같이, 특히 세포 및 생물에서 CRISPR 단백질 복합체의 전달 및 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제의 이용에 관한 것과 같이, CRISPR-Cas9 개발 및 이용의 양태를 기반으로 추가로 예시 및 연장될 수 있다:
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참조로 본 명세서에 편입되는 이들 각각은 본 발명의 실시에서 고려될 수 있고, 하기에 간략하게 설명한다:
▷문헌 [Cong et al.]은 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) Cas9와 또한 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) Cas9 둘 모두에 기반하여 진핵생물 세포에서 사용하기 위한 II형 CRISPR-Cas 시스템을 조작하였고, Cas9 뉴클레아제가 짧은 RNA에 의해 인간 및 마우스 세포에서 DNA의 정확한 절단을 유도하도록 지정될 수 있다는 것을 입증하였다. 이들의 연구는 닉킹 효소로 전환됨에 따라 Cas9 가 최소의 돌연변이유발 활성을 갖는 진핵생물 세포에서 상동성-유도된 복구을 촉진하는데 이용될 수 있음을 추가로 보여준다. 추가적으로, 그들의 연구는 포유류 게놈 내의 내생성 게놈 유전자좌 부위에서 몇몇의 자발적 편집을 가능하게 하기 위해 다중 가이드 서열이 단일 CRISPR 어레이로 암호화될 수 있다는 것을 입증하였는데, 이는 RNA-가이드된 뉴클레아제 기술의 용이한 프로그램 가능성(programmability) 및 넓은 적용 가능성을 입증하였다. 세포에서 서열 특이적 DNA 절단을 프로그램하기 위해 RNA를 사용하는 이런 능력은 새로운 부류의 게놈 조작 도구를 정하였다. 이들 연구는 다른 CRISPR 유전자좌가 포유동물 세포에 이식 가능하게 될 가능성이 있고, 또한 포유동물 게놈 절단을 매개할 수 있다는 것을 추가로 보여주었다. 중요하게는, CRISPR-Cas 시스템의 몇몇 양상은 그의 효율 및 융통성을 증가시키기 위해 더 개선될 수 있다는 것을 상정할 수 있다.
▷문헌 [Jiang et al.]은 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) 및 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli)의 게놈에서 정확한 돌연변이를 도입하기 위해 이중-RNA와 복합체화된 주기적 간격으로 분포하는, 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)-연관 Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하였다. 상기 접근법은 비돌연변이 세포를 사멸시키고 선택 가능한 마커 또는 반대-선택 시스템에 대한 필요를 피하기 위해 표적화된 게놈 부위에서 이중-RNA:Cas9-지정 절단에 의존한다. 상기 연구는 편집 주형 상에서 수행되는 단일- 및 다중뉴클레오티드 변화를 생성하기 위해 짧은 CRISPR RNA(crRNA) 서열을 변화시킴으로써 재프로그래밍 이중-RNA:Cas9 특이성을 보고하였다. 본 연구는 2개의 crRNA의 동시 사용이 다중복합 돌연변이유발을 가능하게 하였다는 것을 보여주었다. 또한, 상기 접근법이 리컴비니어링 (recombineering) 과 병용하여 이용된 경우, 스트렙토코커스 뉴모니애에서 기재된 접근법을 이용하여 회수된 세포의 거의 100% 가 요망되는 돌연변이를 함유했고, 에스케리키아 콜라이에서, 회수된 65%가 돌연변이를 함유했다.
▷문헌 [Wang et al (2013)]은 배아 줄기 세포에서의 순차적 재조합 및/또는 단일 돌연변이를 갖는 마우스의 시간-소모적 상호교잡 (intercrossing)에 의해 다중 단계에서 전통적으로 생성된 다중 유전자에서의 돌연변이를 운반하는 마우스의 1단계 생성을 위한 CRISPR-Cas 시스템을 사용하였다. CRISPR-Cas 시스템은 기능적으로 불필요한 유전자의 그리고 상위 유전자 상호작용의 생체내 연구를 크게 가속화시킬 것이다. CRISPR-Cas 시스템은 기능적으로 중복되는 유전자 및 상위 유전자 상호작용의 생체내 연구를 크게 가속화시킬 것이다.
▷문헌 [Konermann et al. (2013)]은 CRISPR Cas9 효소 및 또한 전사 활성체 유사 이펙터에 기반하여 DNA-결합 도메인의 광학적 그리고 화학적 조절을 가능하게 하는 다재다능하고 강한 기술에 대한 당업계의 요구를 해결하였다.
▷문헌 [Ran et al. (2013-A)]은 표적화된 이중-가닥 파괴를 도입하기 위해 짝지어진 가이드 RNA와 Cas9 닉카제 돌연변이체를 조합한 접근을 기재하였다. 이는 가이드 서열에 의해 특정 게놈 유전자좌로 표적화되는 미생물 CRISPR-Cas 시스템으로부터의 Cas9 뉴클레아제의 문제를 해결하는데, 이는 DNA 표적에 대한 소정의 미스매치를 용인하고 이에 의해 원치않는 오프-표적 돌연변이유발을 촉진시킬 수 있다. 게놈에서 개개의 틈은 높은 충실도로 복구되기 때문에, 적절하게 오프셋 가이드 RNA를 통한 동시 닉킹은 이중-가닥 파괴에 필요하고, 표적 절단을 위해 특이적으로 인식되는 염기의 수를 연장시킨다. 저자는 짝지어진 닉킹의 사용이 세포주에서 50배 내지 1,500배 만큼 오프-표적 활성을 감소시킬 수 있고 온-표적의 절단 효율을 희생시키지 않고 마우스 접합체에서 유전자 녹아웃을 용이하게 한다는 것을 입증하였다. 이 다재다능한 전략은 높은 특이성을 필요로 하는 매우 다양한 게놈 편집 적용을 가능하게 한다.
▷문헌 [Hsu et al. (2013)]은 표적 부위의 선택을 알아내기 위해 그리고 오프-표적 효과를 피하기 위해 인간 세포에서 SpCas9 표적화 특이성을 특징규명하였다. 연구는 293T 및 293FT 세포에서의 100개 초과의 예측된 게놈 오프-표적 유전자좌에서 700개 초과의 가이드 RNA 변이체 및 SpCas9-유도된 indel 돌연변이 수준을 평가하였다. 상기 저자는 SpCas9 가 미스매치의 수, 위치 및 분포에 민감한 서열-의존성 방식으로 상이한 위치에서 가이드 RNA 와 표적 DNA 사이의 미스매치를 용인하는 것을 보고했다. 상기 저자는 SpCas9-매개 절단이 DNA 메틸화에 의해 영향을 받지 않고, SpCas9 및 gRNA의 용량을 적정하여 오프-표적 변형을 최소화시킬 수 있음을 추가로 나타내었다. 또한, 포유류 게놈 조작 응용을 용이하게 하기 위해, 상기 저자는 표적 서열의 선택 및 확인 뿐만 아니라 오프-표적 분석을 안내하기 위해 웹-기반 소프트웨어 도구를 제공한 것을 보고했다.
▷문헌 [Ran et al. (2013-B)]은 포유동물 세포에서 비-상동성 말단 결합 (NHEJ) 또는 상동성-지정 복구 (HDR)뿐만 아니라 하류의 기능성 연구를 위해 변형된 세포주의 생성을 통한 Cas9-매개 게놈 편집을 위한 도구의 세트를 기재하였다. 오프-표적 절단을 최소화하기 위해, 저자들은 짝지워진 가이드 RNA와 함께 Cas9 닉카제 돌연변이체를 이용하는 이중-닉킹 전략을 추가로 기재하였다. 저자에 의해 제공되는 프로토콜은 표적 부위의 선택, 절단 효율의 평가 및 오프-표적 활성의 분석을 위한 가이드라인을 실험적으로 유도하였다. 상기 연구들은 표적 디자인에서 시작하여, 유전자 변형이 1 내지 2주 내에 달성될 수 있고, 변형된 클론 세포주가 2 내지 3주 내에 유도될 수 있다는 것을 보여주었다.
▷문헌 [Shalem et al.]은 게놈-와이드 규모에 대한 유전자 기능의 정보를 얻기 위한 새로운 방법을 기재하였다. 그들의 연구는 64,751개의 독특한 가이드 서열에 의해 18,080개의 유전자를 표적화한 게놈-규모 CRISPR-Cas9 녹아웃 (GeCKO) 라이브러리의 전달이 인간 세포에서 음성 스크리닝 및 양성 스크리닝 스크리닝 둘 모두를 가능하게 하였다는 것을 보여주었다. 처음에, 저자는 암 및 다능성 줄기 세포에서 세포 생존도에 필수적인 유전자를 식별하기 위한 GeCKO 라이브러리의 사용을 보여주었다. 다음으로, 흑색종 모델에서, 상기 저자는 유전자의 소실이 돌연변이 단백질 키나제 BRAF 를 억제하는 치료제인 베무라페닙 (vemurafenib) 에 대한 내성과 관련된 유전자를 스크리닝했다. 그들의 연구는 가장 높은 순위의 후보물질이 이전에 확인된 유전자 NF1 및 MED12 뿐만 아니라 새로운 히트 (hit) NF2, CUL3, TADA2B, 및 TADA1 을 포함한 것을 나타내었다. 저자들은 동일한 유전자를 표적화하는 독립적인 가이드 RNA 및 높은 비율의 히트 확증 간 높은 수준의 일관성을 관찰했고, 따라서, Cas9 에 의한 게놈 규모 스크리닝의 유망성을 입증했다.
▷문헌 [Nishimasu et al.]은 2.5 A° 분해능으로 sgRNA 및 그의 표적 DNA와의 복합체에서 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 결정 구조를 보고하였다. 상기 구조는 표적 인식 및 뉴클레아제 로브(lobe)로 구성된 바이로브(bilobed) 구조를 나타내었는데, 이는 그들의 계면에서 양으로 하전된 그루브에 sgRNA:DNA 헤테로듀플렉스를 수용한다. 인식 로브는 sgRNA 및 DNA의 결합에 필수적인 반면, 뉴클레아제 로브는 HNH 및 RuvC 뉴클레아제 도메인을 함유하는데, 이는 각각 표적 DNA의 상보성 및 비상보성 가닥의 절단을 위해 적절하게 위치된다. 뉴클레아제 로브는 또한 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)와의 상호작용을 초래하는 카복실-말단의 도메인을 함유한다. 이러한 고-해상도 구조 및 수반하는 기능 분석은 Cas9 에 의한 RNA-안내된 DNA 표적화의 분자 메카니즘을 나타내었고, 이에 따라 새로운 다능성 게놈-편집 기술의 합리적 디자인을 용이하게 한다.
▷ Wu 등은 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 에서 단일 가이드 RNA (sgRNA) 가 로딩된 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 촉매적 비활성 Cas9 (dCas9) 의 게놈-와이드 결합 자리를 맵핑했다. 저자들은 시험한 4개의 shRNA의 각각이 dCas9를 sgRNA 및 NGG 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)에서 5-뉴클레오티드 씨드 영역을 빈번하게 특징으로 하는, 수십 내지 수천개의 게놈 부위로 표적화한다는 것을 나타내었다. 염색질 비접근성은 일치하는 시드 서열과 다른 자리에 대한 dCas9 결합을 감소시키고, 따라서 70% 의 표적외 자리가 유전자와 연관되었다. 상기 저자는 촉매적 활성 Cas9 로 트랜스펙션된 mESC 내의 295 개의 dCas9 결합 자리의 표적화된 시퀀싱에 의해, 백그라운드 수준 초과로 돌연변이된 단지 하나의 자리가 확인된 것을 나타내었다. 상기 저자는 씨드 매치가 결합을 촉발하나, 표적 DNA 와의 광범위한 쌍형성이 절단에 필요한 Cas9 결합 및 절단을 위한 2-상태 모델을 제안했다.
▷문헌 [Platt et al.]은 Cre-의존적 Cas9 녹인 (knock in) 마우스를 확립하였다. 저자들은 뉴런, 면역 세포 및 내피 세포에서 가이드 RNA의 아데노-연합 바이러스(AAV)-, 렌티바이러스-, 또는 입자-매개 전달을 이용하는 생체내 및 생체외 게놈 편집을 입증하였다.
▷문헌 [Hsu et al. (2014)]은 세포의 유전자 스크리닝을 포함하여, 요거트에서부터 게놈 편집까지 CRISPR-Cas9 역사를 일반적으로 논의하는 리뷰 논문이다.
▷문헌 [Wang et al. (2014)]은 게놈-규모 렌티바이러스 단일 가이드 RNA (sgRNA) 라이브러리를 사용하는 양성 선택 및 음성 선별 둘 모두에 적합한 풀링된, 기능상실 유전자 스크리닝 접근법에 관한 것이다.
▷문헌 [Doench et al.]은 6개의 내생성 마우스 및 3개의 내생성 인간 유전자 패널의 모든 가능한 표적 부위에 걸쳐 타일링된 sgRNA의 풀을 생성하였고, 항체 염색 및 유세포분석에 의해 그들의 표적 유전자의 비대립유전자를 생성하는 그들의 능력을 정량적으로 평가하였다. 저자들은 PAM 개선된 활성의 최적화를 보였으며, sgRNA 의 디자인을 위한 온라인 도구를 또한 제공했다.
▷문헌 [Swiech et al.]은 AAV-매개 SpCas9 게놈 편집이 뇌에서 유전자 기능의 역 유전자 연구를 가능하게 할 수 있다는 것을 입증한다.
▷문헌 [Konermann et al. (2015)]은 링커 존재 및 부재로 스템 또는 테트라루프와 같은 가이드 상의 적절한 위치에서 다중 이펙터 도메인, 예를 들어, 전사 활성체, 기능성 및 후생적 조절자에 부착하는 능력을 논의한다.
▷문헌 [Zetsche et al.]은 Cas9 효소가 둘로 분할될 수 있고, 따라서 활성화를 위한 Cas9의 조립체가 제어될 수 있다는 것을 입증한다.
▷문헌 [Chen et al.]은 마우스에서의 게놈-와이드 생체내 CRISPR-Cas9 스크린이 폐 전이를 조절하는 유전자를 밝혀준다는 것을 입증한 다중복합 스크리닝에 관한 것이다.
▷문헌 [Ran et al. (2015)]은 SaCas9 및 게놈을 편집하는 그의 능력에 관한 것이며, 생화학적 분석으로부터 추론할 수 없다는 것을 입증한다.
▷문헌 [Shalem et al. (2015)]은 촉매적 불활성인 Cas9 (dCas9) 융합체를 합성적으로 발현을 억제 (CRISPRi) 또는 활성화 (CRISPRa)시키는데 사용하여, 전사 활성을 조절하는 전략 및 게놈 유전자좌를 불활성화시키는 정렬되고 풀링된 스크린, 녹아웃 접근법을 포함하여, 게놈-규모 스크린에 Cas9를 사용하는 장점을 보여주는 방식을 기술한다.
▷문헌 [Xu et al. (2015)]은 CRISPR-기반 스크리닝에서 단일 가이드 RNA (sgRNA) 효율에 기여하는 DNA 서열 특징을 평가하였다. 저자들은 CRISPR/Cas9 녹아웃 및 절단 자리에서 뉴클레오티드 선호성을 탐구했다. 저자들은 또한 CRISPRi/a 에 대한 서열 선호성이 CRISPR/Cas9 녹아웃에 대한 선호와 실질적으로 상이함을 발견했다.
▷문헌 [Parnas et al. (2015)]은 박테리아성 지질다당체 (LPS)에 의한 종양 괴사 인자 (Tnf)의 유도를 제어하는 유정자를 확인하기 위해 게놈-와이드 풀링된 CRISPR-Cas9 라이브러리를 수지상 세포 (DC) 내로 도입하였다. Tlr4 신호전달의 알려진 조절자 및 이전에 알려지지 않은 후보를 동정하였고, LPS에 대한 정규 반응에 대해 별개의 효과를 갖는 3개의 기능성 모듈로 분류하였다.
▷문헌 [Ramanan et al (2015)]은 감염 세포에서 바이러스 에피솜 DNA (cccDNA)의 절단을 입증하였다. HBV 게놈은 HBV 생활사에서 중요한 성분인 공유결합폐환형 DNA(covalently closed circular DNA:cccDNA)로 불리는 3.2kb의 이중-가닥 에피솜 DNA로서, 감염된 간세포의 핵에 존재하며, 이의 복제는 현재의 요법에 의해 저해되지 않는다. HBV 의 고도로 보존된 영역을 특이적으로 표적화하는 sgRNA 가 바이러스 복제 및 감손된 cccDNA 를 저해함을 보여주었다.
▷문헌 [Nishimasu et al. (2015)]은 5'-TTGAAT-3' PAM 및 5'-TTGGGT-3' PAM을 함유하는 단일 가이드 RNA (sgRNA) 및 그의 이중-가닥 DNA와의 복합체에서 SaCas9의 결정 구조를 보고하였다. SpCas9 와 SaCas9 의 구조 비교는 구조적 보존 및 다양성 모두에서 강조표시하였으며, 이는 그들의 구별되는 PAM 특이성 및 오솔로그 sgRNA 인식을 설명한다.
▷문헌 [Canver et al. (2015)]은 넌코딩 게놈 구성요소의 CRISPR-Cas9-기반 기능성 연구를 입증하였다. 저자들은 인핸서의 중요한 특징을 나타낸 인간과 마우스 BCL11A 인핸서의 인시추 포화 돌연변이유발을 수행하기 위해 풀링된 CRISPR-Cas9 가이드 RNA 라이브러리를 개발하였다.
▷문헌 [Zetsche et al. (2015)]은 Cas9와 별개의 특징을 갖는 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) U112로부터의 클래스 2 CRISPR 뉴클레아제인 Cas13의 특징규명을 보고하였다. Cpf1은 tracrRNA를 결여하는 단일 RNA-가이드 엔도뉴클레아제이고, T-풍부 프로토스페이서-인접 모티프를 이용하고, 스태거드 DNA 이중-가닥 파괴를 통해 DNA를 절단한다.
▷문헌 [Shmakov et al. (2015)]은 3종의 별개 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템을 보고하였다. 2종의 시스템 CRISPR 효소 (C2c1 및 C2c3)는 Cpf1과 멀리 관련된 RuvC-유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. Cpf1과 달리, C2c1은 DNA 절단을 위해 crRNA와 tracrRNA 둘 다에 의존한다. 제3 효소(C2c2)는 2개의 예측된 HEPN RNase 도메인을 함유하고, tracrRNA 독립적이다.
▷문헌[Slaymaker et al (2016)]은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9)의 특이성을 개선시키기 위한 구조-가이드 조작의 사용을 보고하였다. 저자들은 오프-표적 효과가 감소된 강한 표적 상의 절단이 유지된 " 향상된 특이성" SpCas9(eSpCas9) 변이체를 개발하였다.
본 명세서에 제공된 방법 및 도구는 tracrRNA를 이용하지 않는 II 형 뉴클레아제, C2c1을 예시한다. C2c1의 오솔로그는 본 명세서에 기재된 바와 같은 상이한 박테리아 종에서 동정되었다. 유사한 특성을 갖는 추가적인 II형 뉴클레아제는 당업계에 기재된 방법을 이용하여 동정될 수 있다 (Shmakov et al. 2015, 60:385- 397; Abudayeh et al. 2016, Science, 5;353(6299)). 특정 구현예에서, 신규한 CRISPR 이펙터 단백질을 동정하기 위한 이러한 방법은 CRISPR Cas 유전자좌의 존재를 동정하는 씨드를 코딩하는 데이터베이스로부터 서열을 선택하는 단계, 선택된 서열에서 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 10kb의 씨드 내에 위치된 유전자좌를 동정하는 단계, 이로부터, 단일 ORF만이 700개 초과의 아미노산 및 공지된 CRISPR 이펙터에 대해 90% 이하의 상동성을 갖는 신규한 CRISPR 이펙터를 코딩하는 ORF를 포함하는 유전자좌를 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 씨드는 CRISPR-Cas 시스템, 예컨대, Cas1에 대해 통상적인 단백질이다. 추가 구현예에서, CRISPR 어레이는 새로운 이펙터 단백질을 동정하기 위한 씨드로서 사용된다.
C2c1 및 crRNA를 포함하는 사전 조립된 재조합 CRISPR-C2c1 복합체는, 예를 들어 전기천공으로 형질감염되어, 높은 돌연변이율 및 검출 가능한 오프-표적 돌연변이의 부재를 초래한다. Hur, J.K. et al, Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins, Nat Biotechnol. 2016 Jun 6. doi: 10.1038/nbt.3596. [Epub ahead of print]. Cpf1을 사용하는 효율적인 다중복합 시스템은 본 발명의 tRNA를 함유하는 어레이로부터 가공된 gRNA를 사용하여 초파리에서 입증되었다. Port, F. et al, Expansion of the CRISPR toolbox in an animal with tRNA-flanked Cas9 and Cpf1 gRNAs. doi: dx.doi.org/10.1101/046417. Cpf1 및 C2c1은 둘 모두가 구조 유사성을 공유하는 V형 CRISPR 단백질이다. C2c1 처럼, Cpf1은 (PAM의 말단에 블런트 절단부를 생성하는 Cas9와 대조적으로) PAM의 원위 말단에 스태거드 이중 가닥 파손을 생성시킨다. 따라서, C2c1을 적용한 유사한 복합다중 시스템이 고려된다.
또한, ["Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome edit", Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014)]은 연장된 서열을 인식하고 인간 세포에서 고효율로 내생성 유전자를 편집할 수 있는 이량체 RNA-가이드 FokI 뉴클레아제에 관한 것이다.
양 및 제제에 대한 것을 포함하여, 방법, 재료, 전달 비히클, 벡터, 입자, AAB, 및 이의 제조 및 사용을 포함한, CRISPR-Cas 시스템, 이의 성분, 및 이러한 성분의 전달에 대한 일반 정보와 관련하여, 본 발명의 실시에 유용한 모든 것은 다음을 참조한다: US 특허 출원 번호 8,697,359, 8,771,945, 8,795,965, 8,865,406, 8,871,445, 8,889,356, 8,889,418, 8,895,308, 8,906,616, 8,932,814, 8,945,839, 8,993,233 및 8,999,641; US 공개 특허 출원 US 2014-0310830 (US 특허 출원 일련 번호 14/105,031), US 2014-0287938 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/213,991), US 2014-0273234 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/293,674), US2014-0273232 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/290,575), US 2014-0273231 (US 특허 출원 일련 번호 14/259,420), US 2014-0256046 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/226,274), US 2014-0248702 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/258,458), US 2014-0242700 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/222,930), US 2014-0242699 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/183,512), US 2014-0242664 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/104,990), US 2014-0234972 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/183,471), US 2014-0227787 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/256,912), US 2014-0189896 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/105,035), US 2014-0186958 (US 특허 출원 일련 번호 14/105,017), US 2014-0186919 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/104,977), US 2014-0186843 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/104,900), US 2014-0179770 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/104,837) 및 US 2014-0179006 A1 (US 특허 출원 일련 번호 14/183,486), US 2014-0170753 (특허 출원 일련 번호 14/183,429); US 2015-0184139 (US 특허 출원 일련 번호 14/324,960); 14/054,414 유럽 특허 출원 EP 2 771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6), 및 EP 2 784 162 (EP14170383.5); 및 PCT 공개 번호 WO 2014/093661 (PCT/US2013/074743), WO 2014/093694 (PCT/US2013/074790), WO 2014/093595 (PCT/US2013/074611), WO 2014/093718 (PCT/US2013/074825), WO 2014/093709 (PCT/US2013/074812), WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667), WO 2014/093635 (PCT/US2013/074691), WO 2014/093655 (PCT/US2013/074736), WO 2014/093712 (PCT/US2013/074819), WO 2014/093701 (PCT/US2013/074800), WO 2014/018423 (PCT/US2013/051418), WO 2014/204723 (PCT/US2014/041790), WO 2014/204724 (PCT/US2014/041800), WO 2014/204725 (PCT/US2014/041803), WO 2014/204726 (PCT/US2014/041804), WO 2014/204727 (PCT/US2014/041806), WO 2014/204728 (PCT/US2014/041808), WO 2014/204729 (PCT/US2014/041809), WO 2015/089351 (PCT/US2014/069897), WO 2015/089354 (PCT/US2014/069902), WO 2015/089364 (PCT/US2014/069925), WO 2015/089427 (PCT/US2014/070068), WO 2015/089462 (PCT/US2014/070127), WO 2015/089419 (PCT/US2014/070057), WO 2015/089465 (PCT/US2014/070135), WO 2015/089486 (PCT/US2014/070175), PCT/US2015/051691, PCT/US2015/051830. 또한 하기를 참조한다: 미국 가출원 61/758,468; 61/802,174; 61/806,375; 61/814,263; 61/819,803 및 61/828,130 (각각, 2013 년 1 월 30 일; 2013 년 3 월 15 일; 2013 년 3 월 28 일; 2013 년 4 월 20 일; 2013 년 5 월 6 일 및 2013 년 5 월 28 일에 출원됨). 또한 하기를 참조한다: 미국 가출원 61/836,123 (2013 년 6 월 17 일에 출원됨). 또한, 각각 2013년 6월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/835,931호, 제61/835,936호, 제61/835,973호, 제61/836,080호, 제61/836,101호, 및 제61/836,127호에 대하여 참조가 이루어진다. 또한 하기를 참조한다: 미국 가출원 61/862,468 및 61/862,355 (2013 년 8 월 5 일에 출원됨); 61/871,301 (2013 년 8 월 28 일에 출원됨); 61/960,777 (2013 년 9 월 25 일에 출원됨) 및 61/961,980 (2013 년 10 월 28 일에 출원됨). 또한 다음을 더욱 참조한다: PCT/US2014/62558 (2014년 10월 10일 출원), 및 US 가출원 일련 번호: 61/915,148, 61/915,150, 61/915,153, 61/915,203, 61/915,251, 61/915,301, 61/915,267, 61/915,260, 및 61/915,397 (각각 2013년 12월 12일 출원); 61/757,972 및 61/768,959 (2013년 1월 29일 및 2013년 2월 25일 출원); 62/010,888 및 62/010,879 (둘 모두 2014년 6월 11일 출원); 62/010,329, 62/010,439 및 62/010,441 (각각 2014년 6월 10일 출원); 61/939,228 및 61/939,242 (각각 2014년 2월 12일 출원); 61/980,012 (2014년 4월 15일 출원); 62/038,358 (2014년 8월 17일 출원); 62/055,484, 62/055,460 및 62/055,487 (각각 2014년 9월 25일 출원); 및 62/069,243 (2014년 10월 27일 출원). 또한 하기를 참조한다: PCT 출원, 특히, 미국 출원 번호 PCT/US14/41806 (2014 년 6 월 10 일에 출원됨). 하기를 참조한다: 미국 가출원 61/930,214 (2014 년 1 월 22 일에 출원됨). 또한 하기를 참조한다: PCT 출원, 특히, 미국 출원 번호 PCT/US14/41806 (2014 년 6 월 10 일에 출원됨).
또한 하기가 언급된다: 미국 출원 62/180,709, 17-Jun-15, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); 미국 출원 62/091,455, 출원일 12-Dec-14, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); 미국 출원 62/096,708, 24-Dec-14, PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS); 미국 출원 62/091,462, 12-Dec-14, 62/096,324, 23-Dec-14, 62/180,681, 17-Jun-2015, 및 62/237,496, 5-Oct-2015, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; 미국 출원 62/091,456, 12-Dec-14 및 62/180,692, 17-Jun-2015, ESCORTED AND FUNCTIONALIZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/091,461, 12-Dec-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS (HSCs); 미국 출원 62/094,903, 19-Dec-14, UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRAND BREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING; 미국 출원 62/096,761, 24-Dec-14, ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS FOR SEQUENCE MANIPULATION; 미국 출원 62/098,059, 30-Dec-14, 62/181,641, 18-Jun-2015, 및 62/181,667, 18-Jun-2015, RNA-TARGETING SYSTEM; 미국 출원 62/096,656, 24-Dec-14 및 62/181,151, 17-Jun-2015, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH DESTABILIZATION DOMAINS; 미국 출원 62/096,697, 24-Dec-14, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH AAV; 미국 출원 62/098,158, 30-Dec-14, ENGINEERED CRISPR COMPLEX INSERTIONAL TARGETING SYSTEMS; 미국 출원 62/151,052, 22-Apr-15, CELLULAR TARGETING FOR EXTRACELLULAR EXOSOMAL REPORTING; 미국 출원 62/054,490, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS; 미국 출원 61/939,154, 12-FEB-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/055,484, 25-Sep-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/087,537, 4-Dec-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/054,651, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; 미국 출원 62/067,886, 23-Oct-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; 미국 출원 62/054,675, 24-Sep-14 및 62/181,002, 17-Jun-2015, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN NEURONAL CELLS/TISSUES; 미국 출원 62/054,528, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN IMMUNE DISEASES OR DISORDERS; 미국 출원 62/055,454, 25-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING CELL PENETRATION PEPTIDES (CPP); 미국 출원 62/055,460, 25-Sep-14, MULTIFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; 미국 출원 62/087,475, 4-Dec-14 및 62/181,690, 18-Jun-2015, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/055,487, 25-Sep-14, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/087,546, 4-Dec-14 및 62/181,687, 18-Jun-2015, MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; 및 미국 출원 62/098,285, 30-Dec-14, CRISPR MEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS.
2015 년 6 월 18 일에 출원된 미국 출원 번호 62/181,659 및 2015 년 8 월 19 일에 출원된 번호 62/207,318 (ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS, ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS OF CAS9 ORTHOLOGS AND VARIANTS FOR SEQUENCE MANIPULATION) 가 언급된다. 2015 년 6 월 18 일에 출원된 미국 출원 번호 62/181,659 및 2015 년 8 월 19 일에 출원된 번호 62/207,318 (ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS, ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS OF CAS9 ORTHOLOGS AND VARIANTS FOR SEQUENCE MANIPULATION) 가 언급된다. 미국 출원 62/181,663, 18-Jun-2015 및 62/245,264, 22-Oct-2015, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, 미국 출원 62/181,675, 18-Jun-2015, 62/285,349, 22-Oct-2015, 62/296,522, 17-Feb-2016, 및 62/320,231, 8-Apr-2016, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS, 미국 출원 62/232,067, 24-Sep-2015, 미국 출원 14/975,085, 18-Dec-2015, 유럽 출원 번호 16150428.7, 미국 출원 62/205,733, 16-Aug-2015, 미국 출원 62/201,542, 5-Aug-2015, 미국 출원 62/193,507, 16-Jul-2015, 및 미국 출원 62/181,739, 18-Jun-2015 (발명의 명칭: NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS) 및 미국 출원 62/245,270, 22-Oct-2015, NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS 이 언급된다. 미국 출원 61/939,256, 12-Feb-2014, 및 WO 2015/089473 (PCT/US2014/070152), 12-Dec-2014 (발명의 명칭: ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED GUIDE COMPOSITIONS WITH NEW ARCHITECTURES FOR SEQUENCE MANIPULATION) 이 또한 언급된다. PCT/US2015/045504, 15-Aug-2015, 미국 출원 62/180,699, 17-Jun-2015, 및 미국 출원 62/038,358, 17-Aug-2014 (발명의 명칭: GENOME EDITING USING CAS9 NICKASES) 이 또한 언급된다.
또한, 계면활성제, 인지질, 생분해성 중합체, 지단백질 및 알콜을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 혼합물과 sgRNA 및 Cpf1 단백질 (및 임의로 HDR 주형)을 포함하는 혼합물을 혼합하는 단계를 포함하는 sgRNA-및-Cpf1 단백질을 제조하는 방법 및 이러한 방법에 의한 입자에 대해서, 다음의 문헌을 언급하고, 참조로 본 명세서에 편입된다: PCT 출원 PCT/US14/70057 (대리인 참조번호 47627.99.2060 및 BI-2013/107) (발명의 명칭: "DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS) (다음의 US 가출원 중 하나 이상 또는 전부의 우선권을 주장함: 62/054,490 (2014년 9월 24일 출원); 62/010,441 (2014년 6월 10일 출원); 및 61/915,118, 61/915,215 및 61/915,148 (각각 2013년 12월 12일 출원) ("the Particle Delivery PCT"), 및 PCT 출원 PCT/US14/70127 (대리인 참조 번호 47627.99.2091 및 Bi-2013/101)(발명의 명칭: "DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING") (다음의 US 가출원 중 하나 이상 또는 전부의 우선권을 주장함: 61/915,176; 61/915,192; 61/915,215; 61/915,107, 61/915,145; 61/915,148; 및 61/915,153 (각각 2013년 12월 12일 출원) ("the Eye PCT"). 예를 들어, Cpf1 단백질 및 sgRNA 는 적합하게, 예를 들어 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2 또는 1:1 의 몰비율로, 적합한 온도, 예를 들어 15-30℃, 예를 들어 20-25℃, 예를 들어 실온에서, 적합한 시간, 예를 들어 15 내지 45분, 예컨대 39 분간, 유리하게 멸균된, 뉴클레아제 무함유 완충액, 예를 들어 1×PBS 에서 함께 혼합되었다. 별도로, 하기와 같은 또는 하기를 포함하는 입자 성분: 계면활성제, 예를 들어, 양이온성 지질, 예를 들어, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP); 인지질, 예를 들어, 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC); 생분해성 중합체, 예컨대 에틸렌-글리콜 중합체 또는 PEG, 및 지단백질, 예컨대 저밀도 지단백질, 예를 들어 콜레스테롤과 같은 또는 이를 포함하는 입자 성분을 알콜, 유리하게 C1-6 알킬 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 예를 들어 100% 에탄올에 용해시켰다. 2 가지 용액을 함께 혼합하여 Cas9-sgRNA 복합체를 함유하는 입자를 형성시켰다. 따라서, sgRNA 는 입자에 전체 복합체를 제제화시키기 전에 Cpf1 단백질과 예비 복합체화될 수 있다. 제제는 세포로 핵산의 전달을 촉진하는 것으로 알려진 상이한 성분의 상이한 몰비로 제조될 수 있다 (예를 들어, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판 (DOTAP), 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 콜레스테롤). 예를 들어, DOTAP : DMPC : PEG : 콜레스테롤 몰비율은 DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0; 또는 DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, 콜레스테롤 0; 또는 DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, 콜레스테롤 5일 수 있다. DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0. 따라서 이 출원은 sgRNA, Cpf1 단백질 및 입자를 형성하는 성분을 혼합하는 것 뿐 아니라; 이러한 혼합으로부터의 입자로 이해된다. 본 발명의 측면은 예를 들어, 예로서 본 발명에서와 같은 sgRNA 및/또는 Cpf1 를 포함하는 혼합물 및 입자를 형성하는 성분을 혼합하여, 예를 들어 입자 전달 PCT에서 처럼, 입자를 형성하기 위한, 입자 전달 PCT의 것과 유사한 방법을 사용한 입자 및 그러한 혼합 유래의 입자 (또는 물론, 본 발명 에서와 같은 sgRNA 및/또는 Cpf1 를 포함하는 다른 입자) 를 포함할 수 있다. Cpf1 및 C2c1은 둘 모두가 구조 유사성을 공유하는 V형 CRISPR-Cas 단백질이다. PAM의 원위 말단에서 블런트 절단부를 생성시키는 Cas9와 달리, Cpf1 및 C2c1은 PAM의 원위 말단에서 스태거드 절단부를 생성시킨다. 따라서, C2c1을 사용한 유사한 시스템이 고려될 수 있다.
대상 발명은 결과 또는 데이터의 전송이 존재하는 것인 검색 프로그램의 일부로서 사용될 수 있다. 컴퓨터 시스템 (또는 디지털 장치)는 결과를 수신, 전송, 디스플레이 및/또는 저장하고, 데이터 및/또는 결과를 분석하고/하거나, 결과 및/또는 데이터 및/또는 분석의 보고서를 생성시키는데 사용될 수 있다. 컴퓨터 시스템은 임의로 고정 매체를 구비한 서버에 접속될 수 있는, 매체 (예를 들어, 소프트웨어) 및/또는 네트워크 포트 (예를 들어, 인터넷 유래)로부터의 명령어를 판독할 수 있는 논리적인 장비로서 이해될 수 있다. 컴퓨터 시스템은 하나 이상의 CPU, 디스크 드라이브, 입력 장치 예컨대 키보드 및/또는 마우스, 및 디스플레이 (예를 들어, 모니터)를 포함할 수 있다. 데이터 통신, 예컨대 명령어 또는 보고서의 전송은 로컬 또는 원격 위치에 서버로 통신 매체를 통해서 달성될 수 있다. 통신 매체는 전송 및/또는 수신 데이터의 임의 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 접속, 무선 접속, 또는 인터넷 접속일 수 있다. 이러한 접속은 월드 와이드 웹 상에서 통신을 위해 제공된다. 본 발명과 관련된 데이터는 수신자에 의한 접수 및/또는 고찰을 위해서 이러한 네트워크 또는 접속 (또는 제한없이 인쇄물같은 실물 보고서의 발송을 포함하여, 정보 전송을 위한 임의의 다른 적합한 수단)으로 전송할 수 있다는 것을 고려한다. 수신자는 개체, 또는 전자 시스템 (예를 들어, 하나 이상의 컴퓨터, 및/또는 하나 이상의 서버)일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 프로세스는 하나 이상의 컨트롤러, 계산 유닛, 및/또는 컴퓨터 시스템의 다른 유닛과 결합될 수 있거나, 또는 바람직하다면 펌웨어로 삽입될 수 있다. 소프트웨어로 구현되면, 루틴은 임의의 컴퓨터 판독가능 메모리 예컨대 RAM, ROM, 플래시 메모리, 자기 디스크, 레이저 디스크, 또는 다른 적합한 저장 매체에 저장될 수 있다. 유사하게, 이러한 소프트웨어는 예를 들어 통신 채널 예컨대 전화선, 인터넷, 무선 접속 등에서, 또는 운반가능 매체, 예컨대 컴퓨터 판독가능 디스크, 플래시 드라이브 등을 통하는 것을 포함하여, 임의의 기지 전달 방법을 통해 컴퓨터 장치로 전달될 수 있다. 다양한 단계들이 하드웨어, 펌웨어, 소프트웨어, 또는 하드웨어, 펌웨어 및/또는 소프트웨어의 이므이 조합에서 구현될 수 있는, 다양한 블록, 운영, 도구, 모듈, 및 기술로서 구현될 수 있다. 하드웨어로 구현될 때, 일부 또는 모든 블록, 운영, 기술 등은 예를 들어 주문 IC (integrated circuit), ASIC (application specific integrated circuit), FPGA (field programmable logic array), PLA (programmable logic array) 등에서 구현될 수 있다. 고객-서버, 관련 데이터베이스 아키텍처는 본 발명이 구현예에서 사용될 수 있다. 고객 서버 아키텍처는 네트워크 상의 각 컴퓨터 또는 프로세스가 고객 도는 서버인 네트워크 아키텍처이다. 서버 컴퓨터는 전형적으로 디스크 드라이브 (파일 서버), 프린터 (프린트 서버), 또는 네트워크 트래픽 (네트워크 서버)를 관리하도록 전용된 강력한 컴퓨터이다. 고객 컴퓨터는 사용자가 어플리케이션을 비롯하여, 본 명세서에 개시된 바와 같은 예시의 출력 장치를 실행하는 PC (개인 컴퓨터) 또는 단말기를 포함한다. 고객 컴퓨터는 리소스, 예컨대 파일, 장치, 및 심지어 프로세싱 파워를 위한 서버 컴퓨터에 의존한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 서버 컴퓨터는 모든 데이터베이스 기능성을 다룬다. 고객 컴퓨터는 모든 프론트-엔드 데이터 관리를 취급하고 또한 사용자로부터 데이터 입력을 수신할 수 있는 소프트웨어를 구비할 수 있다. 컴퓨터-실행가능한 코드를 포함한 기계 판독가능 매체는 제한없이, 유형 저장 매체, 반송파 매체, 또는 물리적 전송 매체를 포함하여, 많은 형태를 취할 수 있다. 비휘발성 저장 매체는 예를 들어 광학 또는 자기 디스크, 예컨대 임의 컴퓨터(들) 등의 임의의 저장 장치를 포함하고, 예컨대 도면에 도시된 데이터베이스 등을 구현하는데 사용될 수 있다. 휘발성 저장 매체는 이러한 컴퓨터 플랫폼의 주요 메모리같은, 동적 메모리를 포함한다. 유형 전송 매체는 컴퓨터 시스템 내에 버스를 포함하는 와이어를 포함하여, 동축 케이블; 구리 와이어 및 광섬유를 포함한다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 음향 또는 광파 예컨대 라디오 주파수 (RF) 또는 적외선 (IR) 데이터 통신 동안 발생되는 것의 형태를 취할 수 있다. 그러므로 컴퓨터-판독가능 매체의 통상의 형태는 예를 들어 플로피 디스크, 플렉시블 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자기 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 페이퍼 테이프, 폴 패턴을 갖는 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, FLASH-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 반송파 전송 데이터 또는 명령, 케이블 또는 링크 전송 예컨대 판송파, 또는 컴퓨터가 프로그램된 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있는 임의의 다른 매체를 포함한다. 많은 이들 형태의 컴퓨터 판독가능 매체는 실행을 위해 프로세서로 하나 이상의 명령의 하나 이상의 배열을 운반하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 논의된 임의 방법을 수행하고 그로부터의 데이터 및/또는 결과 및/또는 이의 분석을 비롯하여, 중간체를 포함하여 본 명세서에 논의된 임의 방법을 수행한 산물을 저장 및/또는 전송하는 것을 포괄한다.
Cas12b (C2c1)
본 발명은 C2c1 (V-B형; Cas12b) 이펙터 단백질 및 오솔로그를 제공한다. 용어 "오솔로그 (orthologue)" (본원에서 "오솔로그 (ortholog)" 로도 나타냄) 및 "상동체 (homologue)" (본원에서 "상동체 (homolog)" 로도 나타냄) 는 당업계에 널리 공지되어 있다. 추가 지침에 의해서, 본원에서 사용되는 단백질의 "상동체" 는 이의 상동체인 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 단백질의 "오솔로그" 는 이의 오솔로그인 단백질과 동일하거나 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 오솔로그성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 상동체 및 오솔로그는 상동체 모델링을 통해 확인할 수 있다 (참조: 예를 들어 Greer, Science vol. 228 (1985) 1055, 및 Blundell et al. Eur J Biochem vol 172 (1988), 513) 또는 "structural BLAST" (Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B. Toward a "structural BLAST" : using structural relationships to infer function. Protein Sci. 2013 Apr;22(4):359-66. doi: 10.1002/pro.2225.). 또한, CRISPR-Cas 유전자좌 분야에서 적용을 위한 [Shmakov et al. (2015)]를 참조한다. 그러나 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
C2c1 유전자는 여러 다양한 박테리아 게놈에서, 전형적으로는 cas1, cas2 및 cas4 유전자 및 CRISPR 카세트를 갖는 동일한 유전자좌에서 발견된다. 따라서, 이러한 추정 신규 CRISPR-Cas 시스템의 레이아웃은 II-B형의 경우와 유사한 것으로 나타난다. 또한 Cas9 와 유사하게, C2c1 단백질은 활성 RuvC-유사 뉴클레아제, 아르기닌-풍부 영역, 및 Zn 핑거 (Cas9 에 부재함) 를 함유한다.
본 발명은 V-A 아형으로서 나타내는 C2c1 유전자좌에서 유래하는, C2c1 (Cas12b) 이펙터 단백질의 용도를 포함한다. 여기서 이러한 이펙터 단백질은 또한 " C2c1p", 예를 들어 C2c1 단백질로서 지칭된다 (그리고 이러한 이펙터 단백질 또는 C2c1 단백질 또는 C2c1 유전자좌에서 유래하는 단백질은 또한 "CRISPR 효소" 로 불린다). 현재, V-B 아형 유전자좌는 cas1-Cas4 융합, cas2, C2c1 로 나타낸 별개의 유전자 및 CRISPR 어레이를 포함한다. C2c1 (CRISPR-연관 단백질 C2c1) 은 Cas9 의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터에 대응하는 부분과 함께 Cas9 의 해당하는 도메인에 상응하는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 거대 단백질 (약 1100 - 1300 개 아미노산) 이다. 그러나, C2c1 은 모든 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결핍되어 있고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9 와 달리 C2c1 서열에서 연속적이다. 따라서, 특정 구현예에서, CRISPR-Cas 효소는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인만을 포함한다.
C2c1 (Cas12b 로도 공지됨) 단백질은 RNA 가이드 뉴클레아제이다. 이의 절단은 tracr RNA 에 의존하여, 가이드 서열 및 직접 반복부를 포함하는 가이드 RNA 를 모집하는데, 여기서 가이드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하여 DNA/RNA 헤테로듀플렉스를 형성한다. 현재 연구를 기반으로 하여, C2c1 뉴클레아제 활성은 또한 PAM 서열의 인식에 의존을 요구한다. C2c1 PAM 서열은 T-풍부 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, PAM 서열은 5' TTC 3' 이다. 특정 구현예에서, PAM 은 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum) 의 서열 내에 있다.
C2c1 은 표적 유전자좌에서, 5' 오버행을 갖는 스태거드 (staggered) 절단부, 또는 표적 서열의 PAM 원위 측에서 " 스티키 말단 (sticky end)" 을 생성한다. 일부 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 참조: Lewis and Ke, Mol Cell. 2017 Feb 2;65(3):377-379.
본 발명은 또한 C2c1 이펙터 단백질의 사용을 포괄하는 CRISPR-C2c1 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 시스템은 I. CRISPR-Cas 시스템 RNA 폴리뉴클레오티드 서열로서, (a) 직접 반복부 폴리뉴클레오티드 및 (b) 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 서열; II. Tracr RNA 폴리뉴클레오티드; 및 III. 임의로 적어도 하나 이상의 핵 국재화 서열을 포함하는, C2c1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 직접 반복부 서열은 가이드 서열과 하이브리드화하여 표적 서열로 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도시키고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열과 하이브리드화하거나 또는 하이브리드화가능한 가이드 서열, 및 (2) 직접 반복부 서열과 복합체를 형성하는 CRISPR 단백질을 포함하고, CRISPR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA이다. Tracr은 crRNA에 융합될 수 있다. 예를 들어, tracr RNA는 직접 반복부의 5' 말단에서 crRNA와 융합될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 crRNA는 CRISPR RNA라고 하고 본 명세서에서 용어 gRNA 또는 가이드 RNA와 상호교환적으로 사용할 수 있다. Tracr은 gRNA의 crRNA에 융합될 때, 이는 단일 가이드 RNA 또는 합성 가이드 RNA (sgRNA)라고 할 수 있다.
C2c1은 Cas9에 의해 생성되는 PAM의 근위 말단에서의 절단과 대조적으로, PAM의 원위 말단에서 이중 가닥 파손을 생성시킨다 (Jinek et al., 2012; Cong et al., 2013). Cpf1 돌연변이된 표적 서열은 단일 gRNA에 의한 반복된 절단에 감수성일 수 있어서, HDR 매개 게놈 편집에서 Cpf1의 적용을 촉진한다고 제안된다 (Front Plant Sci. 2016 Nov 14;7:1683). Cpf1 및 C2c1은 둘 모두가 구조 유사성을 공유하는 V형 CRISPR Cas 단백질이다. C2c1 처럼, Cpf1은 (PAM의 근위 말단에 블런트 절단부를 생성하는 Cas9와 대조적으로) PAM의 원위 말단에 스태거드 이중 가닥 파손을 생성시키지만, Cpf1과 달리, C2c1 시스템은 tracrRNA를 적용한다. 따라서, 일정 구현에에서, 관심 유전자좌는 상동성 지정 복구 (HR 또는 HDR)을 통해 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HR 독립적인 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일정 구현에에서, 관심 유전자좌는 비상동성 말단 결합 (NHEJ)을 통해 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다.
C2c1는 Cas9에 의해 생성되는 블런트 말단부와 대조적으로, 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부를 생성시킨다 (Garneau et al., Nature. 2010;468:67-71; Gasiunas et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:E2579-2586). 절단 산물의 이러한 구조는 포유동물 게놈으로 비상동성 말단 결합 (NHEJ)-기반 유전자 삽입을 촉진하기 위해 특히 유리할 수 있다 (Maresca et al., Genome research. 2013;23:539-546).
특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로늄 (Desulfonatronum), 오피투타세 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 시트로박터 (Citrobacter), 엘루시마이크로비아 (Elusimicrobia), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카 (Omnitrophica), 피시스페레 (Phycisphaerae), 플랑크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코마이크로비아세아에 (Verrucomicrobiaceae), 렌티스파에리아 (Lentisphaeria), 라세이엘라 (Laceyella) 를 포함하는 속으로부터의 유기체 유래 또는 그로부터 기원하는 C2c1 이펙터 단백질이다.
추가 특정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리시클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로늄 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1 또는 genbank 수탁 번호 WP_031386437), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5 또는 genbank 수탁 번호 WP_009513281, 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 (Bacillus) sp. NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734 또는 genbanck 수탁 번호 WP_028326052), 알리시클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060 또는 genbank 수탁 번호 WP_043747912), 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis) (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_067936067), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13 (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_101661451), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium) (예를 들어, DCFZ01000012 유래), 라세이엘라_ 세디미니스 (Laceyella_sediminis) (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_106341859)에서 선택되는 종으로부터 유래하거나 또는 기원한다.
일정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스, 바실러스, 데술파티랍디움, 데술포나트로늄, 렌티스파에리아, 라세이엘라, 메틸로박테리움, 또는 오피투타세아에 속으로부터 선택되는 종으로부터 유래되거나 또는 기원한다.
일정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp._V3-13, 데술파티랍디움 부티라티보란스, 데술포나트로늄 티오디스뮤탄스, 렌티스파에리아 박테리움, 라세이엘라 세디미니스, 메틸로박테리움 노둘란스, 또는 오피투타세아에 박테리움으로부터 선택된 종으로부터 유래하거나 또는 기원한다.
일정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 야생형 서열이 WP_067936067의 서열에 상응하는 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 야생형 서열이 Wp_101661451의 서열에 상응하는 바실러스 sp._V3-13, 야생형 서열이 Wp_028326052의 서열에 상응하는 데술파티랍디움 부티라티보란스, 야생형 서열이 Wp_031386437의 서열에 상응하는 데술포나트로늄 티오디스뮤탄스, 야생형 서열이 DCFZ01000012의 서열에 상응하는 렌티스파에리아 박테리움, 야생형 서열이 Wp_106341859의 서열에 상응하는 라세이엘라 세디미니스, 야생형 서열이 Wp_043747912의 서열에 상응하는 메틸로박테리움 노둘란스, 또는 야생형 서열이 Wp_009513281의 서열에 상응하는 오피투타세아에 박테리움으로부터 선택되는 종으로부터 유래하거나 또는 기원한다.
일정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 표 1로부터 선택되는 종으로부터 유래하거나 또는 기원하고 표 1에 표시된 바와 같은 야생형 서열을 갖는다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 돌연변이되거나 또는 절두된 Cas12b 단백질은 표시된 서열로부터 벗어날 수 있다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
일정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 렌티스파에리아 또는 라세이엘라 속으로부터 선택되는 종으로부터 유래하거나 또는 기원한다.
일정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp._V3-13, 렌티스파에리아 박테리움, 또는 라세이엘라 세디미니스로부터 선택되는 종으로부터 유래하거나 또는 기원한다.
일정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 야생형 서열이 WP_067936067의 서열에 상응하는 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 야생형 서열이 Wp_101661451의 서열에 상응하는 바실러스 sp._V3-13, 야생형 서열이 DCFZ01000012의 서열에 상응하는 렌티스파에리아 박테리움, 또는 야생형 서열이 WP_106341859의 서열에 상응하는 라세이엘라 세디미니스로부터 선택되는 종으로부터 유래하거나 또는 기원한다.
일정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 표 2로부터 선택되는 종으로부터 유래하거나 또는 기원하고 표 2에 표시된 바와 같은 야생형 서열을 갖는다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 돌연변이되거나 또는 절두된 Cas12b 단백질은 표시된 서열로부터 벗어날 수 있다는 것을 이해할 것이다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
이펙터 단백질은 제1 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1) 오솔로그로부터의 제1 단편 및 제2 이펙터 (예를 들어, C2c1) 단백질 오솔로그로부터의 제2 단편을 포함하는 키메라 이펙터 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 제1 이펙터 단백질 오솔로그와 제2 이펙터 단백질 오솔로그는 상이하다. 제1 및 제2 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1) 오솔로그 중 적어도 하나는 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로늄 (Desulfonatronum), 오피투타세아에 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia), 시트로박터 (Citrobacter), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카이 (Omnitrophicai), 피시스파에라에 (Phycisphaerae), 플란크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 베루코미크로비아세아에 (Verrucomicrobiaceae), 렌티스파에리아 (Lentisphaeria) 또는 라세이엘라 (Laceyella)를 포함하는 유기체로부터 유래하거나 또는 기원하는 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1)을 포함할 수 있고; 예를 들어, 키메라 이펙터 단백질은 제1 단편 및 제2 단편을 포함하며 여기서 각각의 제1 및 제2 단편은 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로늄 (Desulfonatronum), 오피투타세아에 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia), 시트로박터 (Citrobacter), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카이 (Omnitrophicai), 피시스파에라에 (Phycisphaerae), 플란크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코미크로비아세아에 (Verrucomicrobiaceae), 렌티스파에리아 (Lentisphaeria) 또는 라세이엘라 (Laceyella)를 포함하는 유기체의 C2c1로부터 선택되고, 제1 단편 및 제2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니고; 예를 들어 키메라 이펙터 단백질은 제1 단편 및 제2 단편을 포함하며, 여기서 각각의 제1 및 제2 단편은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리시클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로늄 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1 또는 genbank 수탁 번호 WP_031386437), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5 또는 genbank 수탁 번호 WP_009513281, 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp.(Brevibacillus sp.)CF112, 바실러스 sp.(Bacillus sp.)NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734 또는 genbank 수탁 번호 WP_028326052), 알리시클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060 또는 genbank 수탁 번호 WP_043747912), 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis) (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_067936067), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13 (예를 들어, genbank 수탁 뻔호 WP_101661451), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium) (예를 들어, DCFZ01000012 유래), 라세이엘라_세디미니스 (Laceyella_sediminis) (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_106341859)의 C2c1로부터 선택되고, 여기서 제1 및 제2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니다. 본 명세서에서 사용시, Cas12 단백질 (예를 들어, Cas12b)가 종으로부터 기원할 때, 종의 야생형 Cas12 단백질, 또는 종의 야생형 Cas12 단백질의 상동체일 수 있다. 종의 야생형 Cas12 단백질의 상동체인 Cas12 단백질은 야생형 Cas12 단백질의 하나 이상의 변이 (예를 들어, 돌연변이, 절두 등)을 포함할 수 있다.
보다 바람직한 구현예에서, C2c1b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리시클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1 또는 genbank 수탁 번호WP_031386437), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5 또는 genbank 수탁 번호 WP_009513281, 피시스파에라에 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 (Bacillus) sp. NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734 또는 genbanck 수탁 번호 WP_028326052), 알리시클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060 또는 genbank 수탁 번호 WP_043747912), 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis) (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_067936067), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13 (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_101661451), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium) (예를 들어, DCFZ01000012 유래), 라세이엘라_ 세디미니스 (Laceyella_sediminis) (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_106341859)에서 선택되는 박테리아 종으로부터 유래하거나 또는 기원한다. 특정 구현예에서, C2c1p 는 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975)에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다.
특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. C2c1 이 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우 (돌연변이됨), 본원에서 나타내는 바와 같은 상기 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 돌연변이된 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, C2c1 단백질은 제한없이 알리시클로바실러스, 데술포비브리오, 데술포나트로늄, 오피투타세아에, 투베리바실러스, 바실러스, 브레비바실러스, 칸디다투스, 데술파티랍디움, 엘루시미크로비아, 시트로박터, 메틸로박테리움, 옴니트로피카이, 피시스파에라에, 플란크토마이세테스, 스피로카에테스, 베루코미크로비아세아에, 렌티스파에리아 또는 라세이엘라를 포함하는 속의 유기체의 오솔로그일 수 있고; 특정 구현예에서, V형 Cas 단벡질은 제한없이, 알리시클로바실러스 아시도테레스트리스 (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (예를 들어, DSM 17975), 알리시클로바실러스 마크로스포란지이더스 (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시이 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로늄 티오디스뮤탄스 (예를 들어, 균주 MLF-1 또는 genbank 수탁 번호 WP_031386437), 엘루시미크로비아 박테리움 RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 RIFCSPHIGHO2, 오피투타세아에 박테리움 TAV5 또는 genbank 수탁 번호 WP_009513281, 피시스파에라에 박테리움 ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 GWB1_27_13, 베루코미크로비아세아에 박테리움 UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. CF112, 바실러스 sp. NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (예를 들어, DSM 18734 또는 genbank 수탁 번호 WP_028326052), 알리시클로바실러스 허바리우스 (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프루운디이 (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (예를 들어, ORS 2060 또는 genbank 수탁 번호 WP_043747912), 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_067936067), 바실러스 sp. V3-13 (예를 들어, genbank 수탁 번호 WP_101661451), 렌티스파에리아 박테리움 (예를 들어, DCFZ01000012 유래), 라세이엘라_세디미니스 (예를 들어, Genbank 수탁 번호 WP_106341859), 바실러스 sp. V3-13 (예를 들어, GenBank 수탁 번호 Wp_101661451)를 포함한 종의 유기체의 오솔로그일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 언급되는 C2c1의 상동체 또는 오솔로그는 본 명세서에 개시된 C2c1 서열 중 하나 이상과 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 AacC2c1 또는 BthC2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 C2c1 단백질은 AacC2c1 또는 BthC2c1 과 적어도 60%, 보다 특히 적어도 70, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 단백질은 야생형 AacC2c1 과 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 보다 특히 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95% 의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 C2c1 단백질은 AacC2c1 과 60% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 당업자는 이것이 C2c1 단백질의 절두 형태를 포함하고, 이에 의해 절두 형태의 길이에 대해 서열 동일성이 결정된다는 것을 이해할 것이다.
일정 예의 구현예에서, Cas12b 오솔로그는 예를 들어 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 또는 약 50°C의 온도에서 활성 (예를 들어, 핵산 (예컨대 RNA 또는 DNA) 절단 활성)을 가질 수 있다. 소정 Cas12b 오솔로그는 예를 들어 30℃ 내지 50℃, 30℃ 내지 48℃, 37℃ 내지 42℃, 또는 37℃ 내지 48℃의 온도 범위에서 이의 최적 활성을 가질 수 있다 일부 예에서, BvCas12b는 약 37℃에서 활성을 가질 수 있다. 일부 예에서, BhCas12b (예를 들어, 본 명세서에 개시된 변이체 4)는 약 37℃에서 활성을 가질 수 있다. 일부 예에서, AkCas12b는 약 48℃에서 활성을 가질 수 있다. 활성은 진핵생물 세포에서 Cas12b 오솔로그의 활성일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 활성은 원핵생물 세포에서 오솔로그의 활성일 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 활성은 최적 활성일 수 있다.
변형된 C2c1 효소
특정 구현예에서, 본 명세서에 정의한 바와 같은 조작된 C2c1 단백질, 예컨대, C2c1을 사용하게 하는 데 관심이 있고, 여기서 단백질은 RNA를 포함하는 핵산 분자와 복합체를 형성하여 CRISPR 복합체를 형성하고, CRISPR 복합체에서, 핵산 분자가 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌를 표적화할 때, 단백질은 비변형 C2c1 단백질에 비해 적어도 하나의 변형을 포함하고, 변형된 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체는 비변형 C2c1 단백질을 포함하는 복합체에 비해 변경된 활성을 갖는다. 본 명세서에서 CRISPR "단백질"을 말할 경우, C2c1 단백질은 바람직하게, 예컨대 C2c1(이로 제한되지 않음) 변형된 CRISPR 효소(예를 들어, 증가되거나 감소된 효소 활성을 가짐(또는 효소 활성을 가지지 않음))이다. 용어 "CRISPR 단백질"은, 야생형 CRISPR 단백질에 비하여, CRISPR 단백질이 변경된 효소 활성, 예컨대 증가되거나 감소된 효소 활성(또는 효소 활성을 가지지 않음)을 가지는지 여부와 무관하게, "CRISPR 효소" 와 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
상기 기술된 돌연변이이외에도, CRISPR-Cas 단백질은 추가적으로 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, CRISPR-Cas 단백질에 대한 용어 "변형된" 은 일반적으로 그것이 유래된 야생형 Cas 단백질과 비교하여 하나 이상의 변형 또는 돌연변이 (점 돌연변이, 절단, 삽입, 결실, 키메라, 융합 단백질 등 포함)를 갖는 CRISPR-Cas 단백질을 의미한다. 유래된 이란 유래된 효소가 대체로 높은 서열 상동성 정도를 갖는다는 의미에서, 야생형 효소를 기반으로 하지만, 당분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 일부 방식으로 돌연변이 (변형)되었다는 것을 의미한다.
CRISPR-Cas 단백질의 추가적인 변형은 변경된 작용성을 야기할 수도 있고 야기하지 않을 수도 있다. 예로서 그리고 특히 CRISPR-Cas 단백질에 관해, 변경된 작용성을 야기하지 않는 변형은, 예를 들어, 특정 숙주 내로의 발현을 위한 코돈 최적화, 또는 (예를 들어, 시각화를 위해) 특정 마커를 갖는 뉴클레아제를 제공하는 것을 포함한다. 변경된 작용기를 초래할 수 있는 변형은 또한 점 돌연변이, 삽입, 결실, 절단(분할 뉴클레아제를 포함) 등을 포함하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어, 이종성 도메인 또는 기능성 도메인(예를 들어, 국소화 신호, 촉매적 도메인 등)과의 융합을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일정 구현예에서, 다양한 상이한 변형은 조합될 수 있다(예를 들어, 촉매적으로 비활성이고, 추가로 기능성 도메인에 융합되고, 예컨대, 예를 들어, DNA 메틸화 또는, 예컨대, 파손(예를 들어, 상이한 뉴클레아제(도메인)에 의함), 돌연변이, 결실, 삽입, 대체, 결찰, 분해, 파손 또는 재조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다른 핵산 변형을 유도하는, 돌연변이된 뉴클레아제). 본 명세서에서 사용되는 "변경된 기능성" 은 제한없이 변경된 특이성 (예를 들어, 변경된 표적 인식, 증가 (예를 들어, "증강된" Cas 단백질) 또는 감소된 특이성, 또는 변경된 PAM 인식), 변경된 활성 (예를 들어, 촉매적으로 불활성인 뉴클레아제 또는 닉카제를 포함하는 증가 또는 감소된 촉매 활성), 및/또는 변경된 안정성 (예를 들어, 탈안정화 도메인과 융합)을 포함한다. 적합한 이종성 도메인은 제한없이 뉴클레아제, 리가제, 복구 단백질, 메틸트랜스퍼라제, (바이러스) 인테그라제, 리콤비나제, 트랜스포사제, 아르고노트, 시티딘 디아미나제, 레트론, 그룹 II 인트론, 포스파타제, 포스포릴라제, 술프퓨릴라제, 키나제, 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 등을 포함한다. 모든 이들 변형의 예는 당업계에 공지되어 있다. 본 명세서에서 언급되는 "변형된" 뉴클레아제, 특히 "변형된" Cas 또는 "변형된" CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체는 바람직하게는 (예를 들어, 가이드 분자와 복합체인) 폴리핵산과 상호작용하거나 또는 그와 결합하는 능력을 여전히 갖는다는 것을 이해하게 될 것이다. 이러한 변형된 Cas 단백질은 본 명세서에 기술된 바와 같은 디아미나제 단백질 또는 이의 활성 도메인과 조합될 수 있다.
일정 실시형태에서, CRISPR-Cas 단백질은 예컨대 표적화 또는 비표적화 가닥을 안정화시키는 돌연변이된 잔기를 포함하여, 증강된 활성 및/또는 특이성을 야기시키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, [eCas9; "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity" , Slaymaker et al. (2016), Science, 351(6268):84-88] 참조). 일정 구현예에서, 조작된 CRISPR 단백질의 변경 또는 변형 활성은 증가된 표적화 효율 또는 감소된 오프-표적 결합을 포함한다. 일정 구현예에서, 조작된 CRISPR 단백질의 변경된 활성은 변형된 절단 활성을 포함한다. 일정 구현예에서, 변경된 활성은 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 증가된 변형된 절단 활성을 포함한다. 일정 구현예에서, 변경된 활성은 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 감소된 변형된 절단 활성을 포함한다. 일정 구현예에서, 변경된 활성은 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 감소된 변형된 절단 활성을 포함한다. 일정 구현예에서, 변형된 뉴클레아제의 변경 또는 변형된 활성은 변경된 헬리카제 동역학을 포함한다. 일정 구현예에서, 변형된 뉴클레아제는 RNA (Cas 단백질의 경우)를 포함하는 핵산 분자, 또는 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌의 가닥, 또는 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌의 가닥과 단백질의 회합을 변경시키는 변형을 포함한다. 본 발명의 일 양상에서, 조작된 CRISPR 단백질은 CRISPR 복합체의 형성을 변경시키는 변형을 포함한다. 일정 구현예에서, 변경된 활성은 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 증가된 변형된 절단 활성을 포함한다. 따라서, 일정 구현예에서, 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌와 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대한 증가된 특이성이 존재한다. 다른 구현예에서, 오프-표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌와 비교하여 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌에 대해 감소된 특이성이 존재한다. 일정 구현예에서, 돌연변이는 예컨대 Cas 단백질이 예를 들어 표적과 가이드 RNA 간 미스매치에 대해 낮아진 내성이 야기된 경우에, 감소된 오프-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 속성, 활성, 또는 동역학)를 야기한다. 다른 돌연변이는 증가된 오프-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 성질, 활성 또는 동역학)를 야기시킬 수 있다. 다른 돌연변이는 증가되거나 또는 감소된 온-표적 효과 (예를 들어, 절단 또는 결합 성질, 활성 또는 동역학)를 야기시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 돌연변이는 기능성 뉴클레아제 복합체 (예를 들어, CRISPR-Cas 복합체)의 변경 (예를 들어, 증가 또는 감소)된 헬리카제 활성, 회합 또는 형성을 야기시킨다. 일정 구현예에서, 상기 기술된 바와 같이, 돌연변이는 변경된 PAM 인식을 야기시키며, 즉 상이한 PAM이, 비변형된 Cas 단백질과 비교하여, (추가로 또는 대안적으로) 인식될 수 있다. 특히 바람직한 돌연변이는 특이성을 증강시키기 위해서 양으로 하전된 잔기 및/또는 (진화적으로) 보존된 잔기, 예컨대 보존된 양으로 하전된 잔기를 포함한다. 일정 구현예에서, 이러한 잔기는 비하전된 잔기, 예컨대 알라닌으로 돌연변이될 수 있다.
C2c1의 결정 구조는 다른 V형 Cas 단백질, Cpf1 (Cas12a라고도 알려짐)과 유사성을 밝혀준다. C2c1 및 Cpf1 둘 모두는 α-나선형 인식 로브 (REC) 및 뉴클레아제 로브 (NUC)로 이루어진다. NUC 로브는 온전한 3D C2c1 구조를 형성하기 위한 구조적 셔플링 및 폴딩으로, 올리고뉴클레오티드-결합 (WED/OBD) 도메인, RuvC 도메인, Nuc 도메인, 및 브릿지 헬릭스 (Bh)를 더 함유한다 (Liu et al. Mol. Cell 65, 310-322). Nuc 도메인 내 일정 돌연변이 (예를 들어, AsCpf1의 R1226A, BvCas12b의 R894A)는 Cpf1을 비표적 가닥 절단을 위한 닉카제가 되게 한다. RuvC 도메인의 촉매 잔기의 돌연변이 (예를 들어, AsCpf1의 D908, E933, D1263에서의 돌연변이)는 뉴클레아제로서 Cpf1의 촉매 활성을 없앤다. 또한, Cpf1의 PAM 상호작용 (PI) 도메인의 돌연변이 (예를 들어, AsCpf1의 S542, K548, N522, 및 K607의 돌연변이)는 Cpf1 특이성을 변경시켜서, 잠재적으로 오프-표적 절단을 증가 또는 감소시키는 것으로 확인되었다 (참조: Gao et al. Cell Research (2016) 26, 901-913 (2016); Gao et al. Nature Biotechnology 35, 789-792 (2017)). 또한 C2c1의 결정 구조는 C2c1이 식별가능한 PI 도메인이 결여된 것을 밝혀주었는데, 정확히 말해서, C2c1이 PAM 인식 및 R-루프 형성을 위해 PAM 근위 이중 가닥 DNDA의 결합을 수용하도록 입체형태 조정을 겪는다는 것을 시사하고; C2c1은 아마도 큰홈 및 작은홈 측면 둘 모두로부터 PAM 듀플렉스를 인식하기 위해서 알파 헬릭스 도메인 및 WED/OBD를 관여시키는 듯 하다 (Yang et al, Cell 167, 1814-1828 (2016)).
본 발명에 따라서, 효소의 불활성화를 야기하거나 또는 닉카제 활성으로 이중 가닥 뉴클레아제를 변형시키거나, 또는 C2c1의 PAM 인식 특이성을 변경시키는 돌연변이체가 생성될 수 있다. 일정 구현예에서, 이러한 정보는 오프-표적 효과가 감소된 효소를 개발하는데 사용된다..
일정 예의 구현예에서, 편집 선호도는 표적 영역 내 특이적 삽입 또는 결실을 위한 것이다. 일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 하나 이상의 특이적 indel의 형성을 증가시킨다. 일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 C-말단 RuvC 유사 도메인, NUC 도메인, N-말단 알파-헬릭스 영역, 혼합 알파 및 베타 영역, 또는 이의 조합에 존재한다. 일정 예의 구현예에서, 변경된 편집 선호도는 indel 형성이다. 일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 하나 이상의 특이적 삽입의 형성을 증가시킨다.
일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 하나 이상의 특이적 삽입의 형성을 증가시킨다. 일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 표적 영역 내 A, T, G, 또는 C에 인접한 A의 삽입을 야기시킨다. 일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 표적 영역 내 A, T, G, 또는 C에 인접한 T의 삽입을 야기시킨다. 일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 표적 영역 내 A, T, G, 또는 C에 인접한 G의 삽입을 야기시킨다. 일정 예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 표적 영역 내 A, T, G, 또는 C에 인접한 C의 삽입을 야기시킨다. 삽입은 인접한 뉴클레오티드에 대해 5' 또는 3' 일 수 있다. 일례의 구현예에서, 하나 이상의 변형은 존재하는 T에 인접한 T의 삽입을 유도한다. 일정 예의 구현예에서, 존재하는 T는 가이드 서열의 결합 영역 내 4번째 위치에 상응한다. 일정 예의 구현예에서, 하나 이상의 변형은 상기 기술된 것과 같은, 보다 정확한 1-염기 삽입 또는 결실을 보장하는 효소를 야기시킨다. 보다 특히, 하나 이상의 변형은 효소에 의한 다른 유형의 indel의 형성을 감소시킬 수 있다. 1-염기 삽입 또는 결실을 생성시키는 능력은 다수의 적용분야, 예컨대 작은 결실에 의해 초래되는 질환에서 유전자 돌연변이체의 교정, 보다 특히 HDR이 불가능한 경우에 흥미로울 수 있다. 예를 들어, 낭성 섬유증의 가장 일반적인 유전자형인, 3개 T의 삽입을 유도하는 3개 sRNA의 전달을 통한 CFTR의 F508del 돌연변이의 교정, 또는 뇌의 CDKL5에서 Alia Jafar의 단일 뉴클레오티드 결실의 교정. 편집 방법이 오직 NHEJ만을 요구하므로, 편집은 뇌같은 유사분열 후 세포에서 가능하다. 1 염기쌍 삽입/결실을 생성시키는 능력은 또한 게놈-와이드 CRISPR-Cas 음성 선별 스크린에서 유용할 수 있다. 일정예의 구현예에서, 적어도 하나의 변형은 돌연변이이다. 일정한 다른 예의 구현예에서, 하나 이상의 변형은 결합 특이성을 증가시키고/시키거나 오프-표적 효과를 감소시키기 위해서 변형을 포함하는 하기 기술된 돌연변이 또는 하나 이상의 추가 변형과 조합될 수 있다.
일정 예의 구현에예서, 야생형과 비교하여 편집 선호도를 변경시키는 적어도 하나의 변형을 포함하는 조작된 CRISPR-cas 이펙터는 RNA 또는 표적 폴리펩티드 유전자좌를 포함하는 핵산 분자에 대한 결합 속성을 변경시키거나, 핵산 분자 또는 표적 분자 또는 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 결합 동역학을 변경시키거나, 또는 핵산 분자에 대한 결합 특이성을 변경시키는 하나 이상의 추가 변형을 더 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예는 하기 문단에서 요약한다. 상기 정보에 기반하여, 효소의 불활성화를 야기하거나 또는 닉카제 활성으로 이중 가닥 뉴클레아제를 변형시키는 돌연변이체가 생성될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 이러한 정보는 오프-표적 효과가 감소된 효소를 개발하는데 사용된다.
변형된 닉카제
돌연변이는 뉴클레아제 활성에 참여하는 아미노산의 이웃 잔기에서 만들어 질 수 있다. 일부 구현예에서, 오직 RuvC 도메인만이 불활성화되고, 다른 구현예에서는, 다른 추정의 뉴클레아제 도메인이 불활성화되며, 여기서 이펙터 단백질 복합체는 닉카제로 기능하고 오직 하나의 DNA 가닥만을 절단한다. 일부 구현예에서, 2 가지 C2c1 변이체(각각 상이한 닉카제)는 특이성을 증가시키는 데 사용되고, 2 가지 닉카제 변이체는 표적(여기서 2 가지 닉카제는 모두, 1 개의 DNA 가닥만이 절단되고 이어서 복구되는 오프-표적 변형을 최소화하거나 제거하면서, DNA 가닥을 절단함)에서 DNA를 절단하는 데 사용된다. 바람직한 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 2 가지 C2c1 이펙터 단백질 분자를 포함하는 동형이량체로서 관심 표적 유전자좌와 연관되거나 관심 표적 유전자좌에서 서열을 절단한다. 바람직한 구현예에서, 동종이량체는 그들 개별 RuvC 도메인에 상이한 돌연변이를 포함하는 2종의 C2c1 이펙터 단백질 분자를 포함할 수 있다.
본 발명은 둘 이상의 닉카제를 사용하는 방법, 특히 듀얼 또는 이중 닉카제 접근법을 고려한다. 일부 양상 및 구현예에서, 단일 유형의 C2c1 닉카제, 예를 들어 변형된 C2c1 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 C2c1이 전달될 수 있다. 이는 표적 DNA가 2 개의 C2c1 닉카제에 의해 결합되게 한다. 추가적으로 또한, 상이한 오솔로그, 예를 들어 DNA의 하나의 가닥(예를 들어, 코딩 가닥) 상에 C2c1 닉카제, 그리고 비-코딩 또는 반대 DNA 가닥 상에 오솔로그가 사용될 수 있다고 예상된다. 오솔로그는 제한없이 Cas9 닉카제 예컨대 SaCas9 닉카제 또는 SpCas9 닉카제일 수 있다. 상이한 PAM을 요구하고 또한 상이한 가이드 요건을 가져서, 사용자에게 훨씬 더 많은 제어를 허용하는 2종의 상이한 오솔로그를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 일정 구현예에서, DNA 절단은 적어도 4 가지 유형의 닉카제를 수반할 것이며, 여기서 각각의 유형은 상이한 서열의 표적 DNA로 가이드되고, 각각의 쌍은 하나의 DNA 가닥 내로 제1 닉을 도입하고 둘째는 제2 DNA 가닥 내로 닉을 도입한다. 이러한 방법에서, 단일 가닥 파손의 적어도 2 개의 쌍이 표적 DNA 내로 도입되고, 여기서 단일-가닥 파손의 제1 및 제2 쌍의 도입 시, 단일-가닥 파손의 제1 및 제2 쌍 사이의 표적 서열은 절단된다. 특정 구현예에서, 오솔로그의 하나 또는 둘 모두는 제어가능하며, 즉 유도성이다.
본 발명에 따른 일정 방법에서, CRISPR-Cas 단백질은 바람직하게는 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이되어서 돌연변이된 CRISPR-Cas 단백질이 표적 서열을 함유하는 표적 유전자좌의 한쪽 또는 양쪽 DNA 가닥을 절단하는 능력이 결여된다. 특정 구현예에서, C2c1 단백질의 하나 이상의 촉매 도메인은 표적 서열의 오직 하나의 DNA 가닥을 절단하는 돌연변이된 Cas 단백질을 생성시키도록 돌연변이된다.
본 명세서에서 제공되는 방법의 일정 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 오직 하나의 DNA 가닥을 절단하는 돌연변이된 CRISPR-Cas 단백질, 즉 닉카제이다. 보다 특히, 본 발명에서, 닉카제는 비-표적 서열, 즉 표적 서열의 반대쪽 DNA 가닥 상에 있고 PAM 서열의 3'에 있는 서열 내에서 절단을 보장한다. 추가 지침으로서, 제한없이, 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) 유래 C2c1의 Nuc 도메인에서 아르기닌 대 아르기닌 (arginine-to-alanine) 치환 (R911A)은 C2C1을 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 (단일 가닥을 절단하는) 닉카제로 전환시킨다. 효소가 AacC2c1이 아닌 경우에, 돌연변이는 상응하는 위치 내 잔기에서 만들어질 수 있다는 것을 당업자는 이해하게 될 것이다.
일정 구현예에서, C2c1 단백질은 Nuc 도메인에 돌연변이를 포함하는 C2c1 닉카제이다. 일부 구현예에서, C2c1 닉카제는 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1의 아미노산 위치 R911, R1000, 또는 R1015에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 닉카제는 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1의 R911A, R1000A, 또는 R1015A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, C2c1 닉카제는 바실러스 sp. V3-13 C2c1 의 R894A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일정 구현예에서, C2c1 단백질은 단백질의 비돌연변이 또는 비변형된 형태와 비교하여 증가되거나 또는 감소된 특이성으로 PAM을 인식한다. 일부 구현예에서, C2c1 단백질은 단백질의 비돌연변이 또는 비변형된 형태와 비교하여 변경된 PAM을 인식한다.
탈활성화/불활성화 C2c1 단백질
C2c1 단백질이 뉴클레아제 활성을 갖는 경우에, 이 단백질은 야생형 효소와 비교하여 감소된 뉴클레아제 활성, 예를 들어 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97% 또는 100%의 뉴클레아제 불활성화를 갖도록 변형될 수 있거나, 또는 다른 방식으로 C2c1 효소는 유리하게 비돌연변이 또는 야생형 C2c1 효소 또는 CRISPR 효소의 뉴클레아제 활성의 약 0%를 갖거나, 또는 비돌연변이 또는 야생형 C2c1 효소의 뉴클레아제 활성의 약 3% 또는 약 5% 또는 약 10%를 넘지 않는다. 일부 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 효소의 비돌연변이된 DNA 절단 활성의 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 이하일 때 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 간주되고, 예로는 돌연변이된 형태의 DNA 절단 활성이 비돌연변이된 형태와 비교하여 무시할만하거나 또는 전무한 경우일 수 있다. 이들 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 포괄적인 DNA 결합 단백질로서 사용된다. 이것은 돌연변이를 C2c1 및 이의 오솔로그의 뉴클레아제 도메인 내로 도입시켜 가능하다.
특정 구현예에서, CRISPR 효소는 조작되어 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
일정 구현예에서, C2c1 단백질은 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 촉매적 불활성 C2c1이다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1 내 아미노산 위치 D570, E848, 또는 D977에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1 내 D570A, E848A, 또는 D977A에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적 불활성 C2c1 단백질은 바실러스 히사시이 C2c1의 아미노산 위치 D574, E828, 또는 D952에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 바실러스 히사시이 C2c1 내 D574A, E828A, 또는 D952A에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적 불활성 C2c1 단백질은 바실러스 sp. V3-13 C2c1의 아미노산 위치 D567, E831, 또는 D963에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 바실러스 sp. V3-13 C2c1 내 D567A, E831A, 또는 D963A에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일정 구현예에서, C2c1 단백질은 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 촉매적 불활성 C2c1이다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1 내 아미노산 위치 D570, E848, 또는 D977에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1 내 D570A, E848A, 또는 D977A에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적 불활성 C2c1 단백질은 바실러스 히사시이 C2c1의 아미노산 위치 D574, E828, 또는 D977에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 바실러스 히사시이 C2c1 내 D574A, E828A, 또는 D977A에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적 불활성 C2c1 단백질은 바실러스 sp. V3-13 C2c1의 아미노산 위치 D567, E831, 또는 D963에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 바실러스 sp. V3-13 C2c1 내 D567A, E831A, 또는 D963A에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
일정 구현예에서, C2c1 단백질은 Nuc 도메인에 돌연변이를 포함하는 C2c1 닉카제이다. 일부 구현예에서, C2c1 닉카제는 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1의 아미노산 위치 R911, R1000, 또는 R1015에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 닉카제는 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1의 R911A, R1000A, 또는 R1015A에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, C2c1 닉카제는 바실러스 sp. V3-13 C2c1에 상응하는 돌연변이 R894A를 포함한다. 일정 구현예에서, C2c1 단백질은 단백질의 비돌연변이 또는 비변형된 형태와 비교하여 증가되거나 또는 감소된 특이성으로 PAM을 인식한다. 일부 구현예에서, C2c1 단백질은 단백질의 비돌연변이 또는 비변형된 형태와 비교하여 변경된 PAM을 인식한다.
일부 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 효소의 비돌연변이된 DNA 절단 활성의 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 이하일 때 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 간주되고, 예로는 돌연변이된 형태의 DNA 절단 활성이 비돌연변이된 형태와 비교하여 무시할만하거나 또는 전무한 경우일 수 있다. 이들 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 포괄적인 DNA 결합 단백질로서 사용된다. 돌연변이는 인공적으로 도입된 돌연변이일 수 있거나 또는 기능 획득 또는 기능 상실 돌연변이일 수 있다.
상기 기재한 돌연변이에 추가로, CRISPR-Cas 단백질은 추가적으로 변형될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, CRISPR-Cas 단백질에 대한 용어 " 변형된" 은 일반적으로 그것이 유래된 야생형 Cas 단백질과 비교하여 하나 이상의 변형 또는 돌연변이 (점 돌연변이, 절단, 삽입, 결실, 키메라, 융합 단백질 등 포함)를 갖는 CRISPR-Cas 단백질을 의미한다. 유래된 이란 유래된 효소가 대체로 높은 서열 상동성 정도를 갖는다는 의미에서, 야생형 효소를 기반으로 하지만, 당분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 일부 방식으로 돌연변이 (변형)되었다는 것을 의미한다.
비활성화된 C2c1 CRISPR 효소는, 예를 들어 디아미나제 활성 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, 핵산 결합 활성 및 분자 스위치 (예를 들어, 광 유도성)를 포함하거나, 또는 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 군으로부터의 하나 이상의 도메인을 포함하여, (예를 들어, 융합 단백질을 통해) 회합된 하나 이상의 기능적 도메인을 가질 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용을 위해 적합한 링커는 당업자에게 충분히 공지되어 있고 제한없이, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 복소환 탄소 링커, 또는 펩티드 링커를 포함한다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 링커는 또한 공유 결합 (탄소-탄소 결합 또는 탄소-이종원자 결합)일 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 단백질이 그의 필요한 기능적 특성을 보유하는 것을 보장하는 데 충분한 거리만큼 표적화 도메인 및 아데노신 디아미나제를 분리시키기 위해 링커가 사용된다. 바람직한 펩티드 링커 서열은 가요성의 연장된 입체배좌를 채택하고, 정돈된 2차 구조를 발생시키는 경향을 나타내지 않는다. 일정 구현예에서, 링커는 단량체, 이량체, 다량체 또는 중합체일 수 있는 화학적 모이어티일 수 있다. 바람직하게는, 링커는 아미노산을 포함한다. 가요성 링커 내 전형적인 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 링커는 Gly, Asn 및 Ser 아미노산 중 하나 이상의 조합물을 포함한다. 다른 근처의 중성 아미노산, 예컨대, Thr 및 Ala은 또한 링커 서열에서 사용될 수 있다. 예시적인 링커는 [Maratea et al. (1985), Gene 40: 39-46]; [Murphy et al. (1986) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83: 8258-62]; 미국 특허 출원 번호 4,935,233; 및 미국 특허 출원 번호 4,751,180에 개시된다. 예를 들어, GlySer 링커 GGS, GGGS (SEQ ID NO:402) 또는 GSG가 사용될 수 있다. GGS, GSG, GGGS 또는 GGGGS (SEQ ID NO:403) 링커는 적합한 길이를 제공하기 위해서, 3 (예컨대 (GGS)3 (SEQ ID NO:404), (GGGGS)3 (SEQ ID NO:393) 또는 5 (SEQ ID NO:405), 6 (SEQ ID NO:394), 7 (SEQ ID NO:406), 9 (SEQ ID NO:395) 또는 심지어 12 (SEQ ID NO:396) 또는 그 이상의 반복부로 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, (GGGGS)3과 같은 링커가 바람직하게 본 명세서에서 사용된다. (GGGGS)6 (GGGGS)9 또는 (GGGGS)12가 바람직하게는 대안으로서 사용될 수 있다. 다른 바람직한 대안은 (GGGGS)1 (SEQ ID NO:403), (GGGGS)2 (SEQ ID NO:407), (GGGGS)4 (SEQ ID NO:408), (GGGGS)5 (SEQ ID NO:405), (GGGGS)7 (SEQ ID NO:406), (GGGGS)8 (SEQ ID NO:409), (GGGGS)10 (SEQ ID NO:410), 또는 (GGGGS)11 (SEQ ID NO:411)이다. 또한 추가 구현예에서, LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR (SEQ ID NO:412)은 링커로서 사용된다. 또한 추가적인 구현예에서, 링커는 XTEN 링커이다. 추가로, N- 및 C-말단의 NLS는 또한 링커(예를 들어, PKKKRKVEASSPKKRKVEAS (SEQ ID NO:413)로서 작용할 수 있다.
링커의 예는 하기 표에 표시된다.
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예시적인 기능성 도메인은 아데노신 디아미나제 도메인 함유 (ADAD) 패밀리 멤버, Fok1, VP64, P65, HSF1, MyoD1이다. 디아미나제가 제공되는 사건에서, 가이드 서열은 가이드 서열과 표적 서열 사이에 형성된 RNA 듀플렉스 또는 RNA/DNA 헤테로듀플렉스에 하나 이상의 미스매치를 도입시키도록 설계되는 것이 유리하다. 특정 구현에예서, 가이드 서열과 표적 서열 사이의 듀플렉스는 A-C 미스매치를 포함한다. Flk1이 제공되는 사건에서, 다수의 Fok1 기능성 도메인이 제공되어 기능성 이량체를 허용하고 gRNA는 [Tsai et al. Nature Biotechnology, Vol. 32, Number 6, June 2014]에 특별히 기술된 바와 같이 기능적 사용 (Fok1)을 위한 적절한 공간을 제공하도록 설계되는 것이 유리하다. 어댑터 단백질은 이러한 기능성 도메인에 부착되는 공지된 링커를 이용할 수 있다. 일부 경우에, 추가적으로 적어도 하나의 NLS가 제공되는 것이 유리하다. 일부 예에서, N 말단에 NLS를 위치시키는 것이 유리하다. 하나 초과의 기능성 도메인이 포함될 때, 기능성 도메인은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
일반적으로, 비활성화된 C2c1 효소 상에의 하나 이상의 기능적 도메인의 위치 선정은 기능적 도메인이 귀속된 작용 효과로 표적에 작용하도록 공간 배향을 수정하는 것을 가능하게 하는 것이다. 예를 들어, 기능적 도메인이 전사 활성화제(예를 들어, VP64 또는 p65)인 경우, 전사 활성화제는, 표적의 전사에 작용하도록 하는 공간 배향으로 위치된다. 마찬가지로, 전사 억제인자는 표적의 전사에 영향을 미치도록 유리하게 위치될 것이며, 뉴클레아제(예를 들어, Fok1)는 표적을 절단하거나 또는 부분적으로 절단하도록 유리하게 위치될 것이다. 이는 CRISPR 효소의 N-말단/C-말단 외의 위치를 포함할 수 있다. 기능성 도메인은 표적 DNA 서열의 전사 또는 번역을 변형시킨다.
일부 구현예에서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고; Cas12b 이펙터 단백질은 RuvC 및/또는 Nuc 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 함유하여서, 형성된 CRISPR 복합체가 후성적 변형자 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있다.
일정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 CRISPR-Cas 시스템은 자가-불활성화 시스템이고 Cas 이펙터 단백질은 일시적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 시스템은 바이러스 벡터 예컨대 AAV 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 시스템은 내생성 표적 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 97%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 동일성을 공유하는 DNA 서열을 포함한다. 일부 구현예예서, 자가-불활성화 시스템은 둘 이상의 벡터 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 시스템은 단일 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 시스템은 내생성 DNA 표적 서열 및 Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 벡터 서열을 동시에 표적화하는 Cas 이펙터 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-불활성화 시스템은 내생성 DNA 표적 서열 및 Cas 이펙터 단백질을 코딩하는 벡터 서열을 순차적으로 표적화하는 Cas 이펙터 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 이펙터를 코딩하는 뉴클레오티드 및 가이드 서열은 단일 벡터 상의 개별 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결된다. 일부 구현예예서, Cas 이펙터를 코딩하는 뉴클레오티드 및 가이드 서열은 개별 벡터 상에서 개별 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결된다. 일부 실시형태들에서, 조절 엘리먼트는 항상성이다. 일부 실시형태들에서, 조절 엘리먼트는 유도성이다.
탈안정화된 C2c1
일 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 이펙터 단백질 (CRISPR 효소; C2c1)은 탈안정화 도메인 (DD)과 회합되거나 또는 융합된다. 일부 구현예에서, DD은 ER50이다. 이 DD에 대한 상응하는 안정화 리간드는, 일부 구현예에서, 4HT이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 DD 중 하나는 ER50이고 이의 안정화 리간드는 4HT 또는 CMP8이다. 일부 실시형태에서, DD는 DHFR50이다. 이 DD에 대한 상응하는 안정화 리간드는, 일부 구현예에서, TMP이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 DD 중 하나는 DHFR50이고, 이의 안정화 리간드는 TMP이다. 일부 실시형태에서, DD는 ER50이다. 이 DD에 대한 상응하는 안정화 리간드는, 일부 구현예에서, CMP8이다. 그러므로, CMP8은 ER50 시스템에서 4HT에 대한 대안적인 안정화 리간드일 수 있다. CMP8 및 4HT가 경쟁적 방식으로 사용될 수 있고/사용되어야 하는 것이 가능할 수 있지만, 일부 세포 유형은 이들 2개 리간드 중 하나 또는 다른 하나에 더 감수성일 수 있으며, 본 개시 및 당분야의 지식으로부터 당업자는 CMP8 및/또는 4HT를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 또는 2개의 DD는 CRISPR 효소의 N-말단에 융합될 수 있고, 하나 또는 2개의 DD는 CRISPR 효소의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 DD는 CRISPR 효소와 회합되고 DD는 동일한 DD이고, 즉 DD는 상동성이다. 따라서, DD 둘 모두 (또는 둘 이상)은 ER50 DD일 수 있다. 이는 일부 구현예에서 바람직하다. 대안적으로, DD 둘 모두 (또는 둘 이상)은 DHFR50 DD일 수 있다. 이는 또한 일부 구현예에서 바람직하다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 DD는 CRISPR 효소와 회합되고 DD는 상이한 DD이며, 즉 DD는 이종성이다. 따라서, DD 중 하나는 ER50일 수 있는 한편 DD 중 하나 이상 또는 임의의 다른 DD는 DHFR50일 수 있다. 더 높은 수준의 분해 제어도를 제공하므로 이종성인 2 이상의 DD를 갖는 것이 유리할 수 있다. N 또는 C-말단에서 하나 초과의 DD의 탠덤 융합은 분해를 향상시킬 수 있으며; 이러한 탠덤 융합은 예를 들어 ER50-ER50-C2c1 일 수 있다. 이는, 어느 하나의 안정화 리간드 부재시 높은 수준의 분해가 발생할 것이며, 하나의 안정화 리간드 부재 및 기타 다른(또는 다른) 안정화 리간드의 존재시 중간 수준의 분해가 발생할 것인 한편, 2 개(또는 둘 이상)의 모든 안정화 리간드의 존재 하에서 낮은 수준의 분해가 발생할 것임이 생각된다. 또한 N-말단 ER50 DD 및 C-말단 DHFR50 DD를 가져서 제어성이 부여될 수 있다.
일부 구현예에서, DD와 CRISPR 효소의 융합은 DD와 CRISPR 효소 사이에 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 GlySer 링커이다. 일부 구현예에서, DD-CRISPR 효소는 적어도 하나의 핵 이출 신호 (NES)를 더 포함한다. 일부 구현예에서, DD-CRISPR 효소는 둘 이상의 NES를 포함한다. 일부 구현예에서, DD-CRISPR 효소는 적어도 하나의 핵 국재화 신호(NLS)를 포함한다. 이는 NES에 추가적일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 CRISPR 효소 및 DD 사이의 링커로서, 또는 링커의 일부로서 국재화 (핵 이입 또는 이출) 신호를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진다. HA 또는 Flag 태그는 또한 링커로서 본 발명의 영역 내에 있다. 출원인은 링커로서 NLS 및/또는 NES를 사용하고, 또한 GS 내지 (GGGGS)3 정도로 짧은 글리신 세린 링커를 사용한다.
탈안정화 도메인은 광범위한 단백질에 불안정성을 부여하는데 일반적인 유용성을 가지며, 예를 들어 참조로 본 명세서에 편입되는 [Miyazaki, J Am Chem Soc. Mar 7, 2012; 134(9): 3942-3945]을 참조한다. CMP8 또는 4-히드록시탐옥시펜은 탈안정화 도메인일 수 있다. 보다 일반적으로, N-말단 규칙에 의한 탈안정화 잔기, 포유동물 DHFR의 온도-감수성 돌연변이체 (DHFRts)는 허용되는 온도에서는 안정하지만, 37℃에서는 불안정한 것으로 확인되었다. DHFRts를 발현하는 세포에, 포유동물 DHFR에 대한 고-친화성 리간드, 메토트렉세이트의 첨가는 단백질의 분해를 부분적으로 억제하였다. 이는 소형 분자 리간드가, 그렇지 않으면 세포 내에서 분해를 위해 표적화될 단백질을 안정화할 수 있다는 중요한 설명이었다. 라파마이신 유도체를 사용하여 mTOR (FRB*)의 FRB 도메인의 불안정 돌연변이체를 안정화시켰고 융합된 키나제, GSK-3β.6,7의 기능을 복원시켰다. 이 시스템은 리간드-의존적 안정성이 복잡한 생물학적 환경에서 특이적 단백질의 기능을 조절하기 위한 매력적인 전략을 의미하였다는 것을 입증하였다. 단백질 활성을 제어하기 위한 시스템은 유비퀴틴 상보성이, FK506-결합 단백질 및 FKBP12의 라파마이신 유도된 이량체에 의해 발생하는 경우, 기능적이게 되는 DD를 수반할 수 있다. 인간 FKBP12 또는 ecDHFR 단백질의 돌연변이체는 이의 고친화성 리간드, 실드(Shield)-1 또는 트리메토프림(TMP) 각각의 부재 하에서 대사적으로 불안정하도록 조작될 수 있다. 이들 돌연변이체는 본 발명의 실시에 유용한 가능한 탈안정화 도메인(DD)의 일부이며, CRISPR 효소와의 융합물로서 DD의 불안정성이 프로테아솜에 의한 전체 융합 단백질의 CRISPR 단백질 분해에 부여된다. 실드-1 및 TMP는 용량-의존적 방식으로 DD에 결합하고 이를 안정화시킨다. 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ERLBD, ERS1의 잔기 305-549)는 또한 탈안정화 도메인으로서 조작될 수 있다. 에스트로겐 수용체 신호전달 경로가 다양한 질환 예컨대 유방암에 관여되므로, 그 경로는 폭넓게 연구되었고 에스트로겐 수용체의 수많은 효현제 및 길항제가 개발되었다. 따라서, ERLBD와 약물의 상용성 쌍이 알려져 있다. 돌연변이체에 결합하지만 ERLBD의 야생 형태에는 결합하지 않는 리간드가 존재한다. 3 개의 돌연변이를 코딩하는 이들 돌연변이체 도메인들 (L384M, M421G, G521R)12 중 하나를 사용함으로써, 내생성 에스트로겐-민감성 네트워크를 동요시키지 않는 리간드를 사용하여 ERLBD-유도된 DD의 안정성을 조절하는 것이 가능하다. 추가적인 돌연변이(Y537S)가 도입되어 ERLBD를 추가로 불안정화시키고, 잠재적 DD 후보물로서 이를 구성할 수 있다. 이러한 테트라-돌연변이체는 유리한 DD 개발이다. 돌연변이체 ERLBD는 CRISPR 효소에 융합될 수 있고, 이의 안정성은 리간드를 사용하여 조절 또는 동요될 수 있으며, 이로 인해 CRISPR 효소는 DD를 갖는다. 다른 DD는 쉴드-1 리간드에 의해 안정화된 돌연변이된 FKBP 단백질을 기반으로 12-kDa (107-아미노산) 태그일 수 있으며, 예를 들어, 문헌 [Nature Methods 5, (2008)]을 참조한다. 예를 들어, DD는 합성된, 생물학적으로 불활성인 소형 분자, 쉴드-1에 결합하여 그에 의해 가역적으로 안정화되는 변형된 FK506 결합 단백질 12 (FKBP12)일 수 있다; 예를 들어, 참조: Banaszynski LA, Chen LC, Maynard-Smith LA, Ooi AG, Wandless TJ. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 2006;126:9951004; Banaszynski LA, Sellmyer MA, Contag CH, Wandless TJ, Thorne SH. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nat Med. 2008;14:11231127; Maynard-Smith LA, Chen LC, Banaszynski LA, Ooi AG, Wandless TJ. A directed approach for engineering conditional protein stability using biologically silent small molecules. The Journal of biological chemistry. 2007;282:2486624872; 및 Rodriguez, Chem Biol. 391398 - 이들 모두는 본 명세서에 참고로서 포함되어 있으며, 본 발명의 실시에서 CRISPR 효소와 회합시키기 위해 선택된 DD에서 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 확인할 수 있는 바와 같이, 당분야의 지식은 수많은 DD를 포함하고, DD는 유리하게 링커와 함께, CRISPR 효소와 회합, 예를 들어 융합되고, 그리하여 DD는 리간드의 존재 하에서 안정화될 수 있고 이의 부재시에 DD는 탈안정화될 수 있고, 그리하여 CRISPR 효소가 전체적으로 탈안정화되거나, 또는 DD가 리간드의 부재 하에서 안정화될 수 있고 리간드가 존재하는 경우 DD는 탈안정화될 수 있으며, DD는 CRISPR 효소 및 그에 따라 CRISPR-Cas 복합체 또는 시스템이 조절되거나 또는 제어될 수 있어서, 말하자면 켜지거나 또는 꺼질 수 있어서, 그렇게 함으로써 예를 들어 생체내 또는 시험관 환경에서 시스템의 조절 또는 제어를 위한 수단을 제공할 수 있다. 예를 들어, 관심 단백질이 DD 태그를 이용하여 융합물로서 발현된 경우, 이는 세포 내에서, 예를 들어 프로테아솜에 의해 탈안정화되고 신속히 분해된다. 따라서, 안정화 리간드의 부재는 분해되는 D 연합된 Cas를 초래한다. 새로운 DD가 관심 단백질에 융합된 경우, 이의 불안정성이 관심 단백질에 부여되어, 전체 융합 단백질의 신속한 분해를 초래한다. Cas에 대한 피크 활성도는 때때로 표적외 효과를 감소시키는 데 유익하다. 따라서, 높은 활성의 짧은 파열이 바람직하다. 본 발명은 이러한 피크를 제공할 수 있다. 일부 의미에서, 시스템은 유도성이다. 일부 기타 다른 의미에서, 안정화 리간드의 부재 하에서 시스템은 억제되고, 안정화 리간드의 존재 하에서 탈-억제된다.
분할 디자인
C2c1은 또한 강력한 핵산 검출을 할 수 있게 한다. 일정 구현예에서, C2c1은 이의 뉴클레아제 활성의 불활성화를 통해서 핵산 결합 단백질 ("데드 C2c1; dC2c1)로 전환된다. 핵산 결합 단백질로 전환될 때, C2c1은 서열 의존적 방식으로 표적 핵산으로 다른 기능성 성분을 국재화시키는데 유용하다. 성분은 천연일 수 있거나 또는 합성일 수 있다. 본 발명에 따라서, dC2c1은 (i) 대규모 스크리닝, 합성 조절 회로의 구축 및 다른 목적을 위해 사용할 수 있는, 기능 또는 전사를 조절하기 위해 특이적 핵산으로 이펙터 모듈을 가져하고; (ii) 그들 수송 및/또는 국재화를 가시화시키기 위해 특이적 핵산을 형광적으로 태그화하고; (iii) 특이적 세포하 구획에 대한 친화성을 갖는 도메인을 통해 핵산 국재화를 변경시키고; (iv) RNA 및 단백질을 포함한, 근위 분자 파트너에 대해 농축시키기 위해 특이적 핵산을 (dC2c2의 직접 풀다운 또는 바이오틴 리가제 활성 국재화를 위한 dC2c2의 사용을 통해) 포획하는데 사용된다. dC2c1은 i) 세포의 성분을 조직화시키고, ii) 세포의 성분 또는 활성을 켜거나 또는 끄고, iii) 세포에 존재하는 특이적 전사물의 존재 또는 양을 기반으로 세포 상태를 제어하는데 사용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 발명은 분할 효소 및 리포터 분자를 제공하고, 이들의 일부는 핵산-결합 CRISPR 이펙터, 예컨대 제한없이 C2c1을 포함하는 하이브리드 분자로 제공된다. 세포 내 핵산의 존재에 가까워질 때, 분할 리포터 또는 효소의 활성은 재구성되고 활성을 측정할 수 있게 된다. 이러한 방식으로 재구성된 분할 효소는 제한없이 내생성 성분 또는 경로, 또는 외생성 성분 또는 경로를 포함하여, 세포 성분 및/또는 경로에 대해 검출가능하게 작용할 수 있다. 이러한 방식으로 재구성된 분할 리포터는 검출가능한 신호, 예컨대 제한없이 형광 또는 다른 검출가능한 모이어티를 제공할 수 있다. 일정 구현예에서, 분할 단백질가수분해 효소는 검출가능한 방식으로 하나 이상의 성분 (내생성 또는 외생성)에 작용할 때 제공된다. 예시적인 일 구현예에서, 세포 내 핵산 종의 검출 시 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 방법이 제공된다. 이러한 방법이 어떻게 예를 들어 세포 내 바이러스의 존재를 기반으로, 세포 개체군을 제거하는데 사용될 수 있는가는 자명해질 것이다.
본 발명에 따라서, 관심 핵산을 함유하는 세포에서 세포 사멸을 유도하는 방법을 제공하고, 방법은 세포 내 핵산을, 세포 사멸을 유도할 수 있는 단백질가수분해 효소의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 CRISPR 단백질, 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 CRISPR 단백질로서, 단백질 가수분해 효소의 효소 활성은 단백질의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 단백질, 및 제1 CRISPR 단백질에 결합하고 핵산의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드, 및 제2 CRISPR 단백질에 결합하고 핵산의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 관심 표적 핵산이 존재할 때, 단백질가수분해 효소의 제1 및 제2 부분이 접촉되고 효소의 단백질가수분해 활성이 재구성되어 세포 사멸을 유도한다. 본 발명의 일 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 캐스파제이다. 다른 이러한 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 TEV 프로테아제이고, TEV 프로테아제의 단백질가수분해 활성이 재구성될 때, TEV 프로테아제 기질이 절단되고/되거나 활성화된다. 본 발명의 일 구현예에서, TEV 프로테아제 기질은 TEV 프로테아제가 재구성될 때, 프로캐스파제가 절단되고 활성화되어서, 아폽토시스가 발생되게 하는 조작된 프로캐스파제이다. 본 발명의 일 구현예에서, 단백질가수분해적으로 절단가능한 전사 인자는 " 전사-커플링된" 리포터 시스템을 생산하기 위한 임의의 선택된 하류 리포터 유전자와 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 분할 프로테아제는 검출가능한 기질로부터 데그론을 절단하거나 또는 노출시키는데 사용된다.
본 발명에 따라서, 관심 핵산을 함유하는 세포를 마킹하거나 또는 확인하는 방법을 제공하고, 방법은 세포 내 핵산을, 단백질가수분해 효소의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 CRISPR 단백질, 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 CRISPR 단백질로서, 단백질 가수분해 효소의 효소 활성은 단백질의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 단백질, 및 제1 CRISPR 단백질에 결합하고 핵산의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드, 제2 CRISPR 단백질에 결합하고 핵산의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드, 및 재구성된 단백질가수분해 효소에 의해 검출가능하게 절단되는 지시자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 단백질가수분해 효소의 제1 및 제2 부분은 관심 핵산이 세포에 존재할 때 접촉되고, 그리하여 단백질가수분해 효소의 활성이 재구성되고 지시자가 검출가능하게 절단된다. 이러한 일 구현예에서, 검출가능한 지시자는 형광 단백질, 예컨대, 제한없이 녹색 형광 단백질이다. 이러한 다른 구현예에서, 검출가능한 지시자는 발광 단백질, 예컨대, 제한없이 루시퍼라제이다. 일 구현예에서, 분할 리포터는 레닐라 레니포르미스 (Renilla reniformis) 루시퍼라제 (Rluc)의 분할 단편의 재구성을 기반으로 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 분할 리포터는 노란색 형광 단백질 (YFP)의 2개 비형광 단편 간 상보성을 기반으로 한다.
전사 및 조절
일 양상에서, 본 발명은 세포 또는 조직 내 특정 핵산의 존재 또는 수준을 기반으로 세포 또는 조직의 상태를 확인, 측정, 및/또는 조절하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 선택된 관심 핵산 종의 존재를 기반으로, 천연 또는 합성 시스템 또는 성분일 수 있는, 세포 시스템 또는 성분의 존재 및/또는 활성을 조절하도록 설계된 CRISPR-기반 제어 시스템을 제공한다. 일반적으로, 제어 시스템은 선택된 관심 핵산 종이 존재할 때 재구성되는 불활성화된 단백질, 효소, 또는 활성을 특징으로 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 불활성화된 단백질, 효소, 또는 활성의 재구성은 불활성 성분을 함께 집합시켜 활성 복합체를 조립시키는 것을 포함한다.
분할 아폽토시스 구성체
특별한 세포 유형의 역할을 연구하기 위한 기초 생물학 적용분야 또는 암 또는 감염된 세포 제거같은 치료적 적용분야를 위해서, 이상 내생성 또는 외래 DNA의 존재를 기반으로 세포를 고갈 또는 사멸시키는 것이 종종 바람직하다 (Baker, D.J., Childs, B.G., Durik, M., Wijers, M.E., Sieben, C.J., Zhong, J., Saltness, R.A., Jeganathan, K.B., Verzosa, G.C., Pezeshki, A., et al. (2016). Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature 530, 184-189.). 이러한 표적화된 세포 사멸은 DNA와의 결합시 표적화된 유전자 또는 유전자 세트를 특이적으로 발현하는 세포의 사멸을 초래하는, C2c1 단백질에 분할 아폽토시스 도메인의 융합을 통해서 달성될 수 있다. 일정 구현예에서, 아폽토시스 도메인은 분할 캐스파제 3일 수 있다 (Chelur, D.S., and Chalfie, M. (2007). Targeted cell killing by reconstituted caspases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 2283-2288.). 다른 가능성은 2개 캐스파제 8 (Pajvani, U.B., Trujillo, M.E., Combs, T.P., Iyengar, P., Jelicks, L., Roth, K.A., Kitsis, R.N., and Scherer, P.E. (2005). Fat apoptosis through targeted activation of caspase 8: a new mouse model of inducible and reversible lipoatrophy. Nat. Med. 11, 797-803.) 또는 캐스파제 9 (Straathof, K.C., Pul, M.A., Yotnda, P., Dotti, G., Vanin, E.F., Brenner, M.K., Heslop, H.E., Spencer, D.M., and Rooney, C.M. (2005). An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood 105, 4247-4254.) 이펙터를 C2c1 결합을 통해 가깝게 오게하는, 캐스파제의 어셈블리이다. 전사물 상에서 C2c1 결합을 통해서 분할 TEV를 재구성시키는 것도 가능하다 (Gray, D.C., Mahrus, S., and Wells, J.A. (2010). activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activation protease. Cell 142, 637-646.). 이러한 분할 TEV는 발광 및 형광 판독을 포함한, 다양한 판독에서 사용될 수 있다 (Wehr, M.C., Laage, R., Bolz, U., Fischer, T.M., Grunewald, S., Scheek, S., Bach, A., Nave, K.-A., and Rossner, M.J. (2006). Monitoring regulated protein-protein interactions using split TEV. Nat. Methods 3, 985-993.). 일 구현예는 세포 사멸을 야기하는, 변형된 프로-캐스파제 3 또는 프로-캐스파제 7을 절단하기 위한 이러한 분할 TEV의 재구성을 포함한다 (Gray, D.C., Mahrus, S., and Wells, J.A. (2010). activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activation protease. Cell 142, 637-646).
유도성 아폽토시스. 본 발명에 따라서, 가이드는 아폽토시스를 유도하기 위해 기능성 도메인을 보유하는 C2c1 복합체를 위치시키는데 사용될 수 있다. C2c1은 임의의 오솔로그일 수 있다. 한 구현예에서 기능성 도메인은 단백질의 C-말단에서 융합된다. C2c1은 예를 들어 뉴클레아제 활성을 녹아웃시키는 돌연변이를 통해 촉매적으로 불활성이다. 시스템의 적응성은 표적 핵산을 따라 가이드 공간의 최적화, 및 캐스파제 활성화의 다양한 방법을 적용하여 입증할 수 있다. 캐스파제 8 및 캐스파제 9 ("개시제" 캐스파제라고도 함) 활성은 C2c1과 회합된 캐스파제 8 또는 캐스파제 9 효소를 집합시키도록 C2c1 복합체 형성을 사용해 유도될 수 있다. 대안적으로, 캐스파제 3 및 캐스파제 7 ("이펙터" 캐스파제라고도 함) 활성은 담배 식각 바이러스 (TEV) N-말단 및 C-말단 부분 ("스니퍼")을 보유하는 C2c1 복합체가 가깝게 유지될 때 유도될 수 있어서, TEV 프로테아제 활성을 활성화시키고 캐스파제 3 또는 캐스파제 7 프로-단백질의 절단 및 활성화를 야기시킨다. 시스템은 분할 캐스파제 3을 적용할 수 있는데, 표적 핵산에 결합된 C2c1 복합체에 부착에 의해 캐스파제 3 부분이 이종이량체화된다. 예시적인 아폽토시스 성분은 하기 표 3에 기재된다.
Figure pct00018
Figure pct00019
분할-검출 구성체
본 발명의 시스템은 세포 또는 조직에 존재할 수 있는 관심 전사물 상에서 연결된 효소 부분을 갖는 CRISPR 단백질을 국재화시키기 위한 가이드를 더 포함한다. 따라서, 시스템은 제1 CRISPR 단백질에 결합하고 관심 전사물에 하이브리드화하는 제1 가이드 및 제2 CRISPR 단백질에 결합하고 관심 핵산에 하이브리드화하는 제2 가이드를 포함한다. 대부분의 구현예에서, 제1 및 제2 가이드는 인접한 위치에서 관심 핵산에 하이브리드화하는 것이 바람직하다. 위치는 직접 인접할 수 있거나 또는 소수 뉴클레오티드에 의해 이격되고, 예컨대 1 nt, 2 nt, 3 nt, 4 nt, 5 nt, 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt 이상 만큼 이격될 수 있다. 일정 구현예에서, 제1 및 제2 가이드는 예상 스템 루프에 의해 핵산 상에서 이격된 위치에 결합될 수 있다. 선형 핵산을 따라 이격되지만, 핵산은 가이드 표적 서열이 가깝게 근접되게 하는 2차 구조를 취할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 캐스파제를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 개시제 캐스파제, 예컨대 제한없이 캐스파제 8 또는 캐스파제 9를 포함한다. 개시제 캐스파제는 일반적으로 단량체로서 불활성이고 동종이량체화시 활성을 획득한다. 본 발명의 일 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 이펙터 캐스파제, 예컨대 제한없이 캐스파제 3 또는 캐스파제 7를 포함한다. 이러한 개시제 캐스파제는 단편으로 절단될 때까지 정상적으로 불활성이다. 절단되면 단편은 회합되어 활성 효소를 형성한다. 예시적인 일 구현예에서, 단백질가수분해 효소의 제1 부분은 캐스파제 3 p12를 포함하고 단백질가수분해 효소의 상보성 부분은 캐스파제 3 p17을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 단백질가수분해 효소는 특정 아미노산 서열을 표적화하도록 선택되고 그에 따라 기질이 선택되거나 또는 조작된다. 이러한 프로테아제의 비제한적인 예는 담배 식각 바이러스 (TEV) 프로테아제이다. 따라서, 일부 구현예에서, 절단가능하게 조작된 TEV 프로테아제에 의해 절단가능한 기질은 프로테아제에 의해 작용되는 시스템 성분으로서 제공된다. 일 구현예에서, NEV 프로테아제 기질은 프로캐스파제 및 하나 이상의 TEV 절단 부위를 포함한다. 프로캐스파제는 예를 들어 재구성된 TEV 프로테아제에 의해 절단가능하도록 조작된 캐스파제 3 또는 캐스파제 7일 수 있다. 절단되면, 프로캐스파제 단편은 활성 입체형태를 취하도록 유리된다.
본 발명의 일 구현예에서, TEV 기질은 형광 단백질 및 TEV 절단 부위를 포함한다. 다른 구현예에서, TEV 기질은 발광 단백질 및 TEV 절단 부위를 포함한다. 일정 구현예에서, TEV 절단 부위는 기질 단백질의 형광 또는 발광 속성이 절단 시에 상실되도록 기질의 절단을 제공한다. 일정 구현예에서, 형공 또는 발광 단백질은 예를 들어 TEV 프로테아제가 재구성될 때 절단되는 형광 또는 발광을 방해하는 모이어티를 첨부하여, 변형될 수 있다.
본 발명에 따라서, 관심 핵산을 함유하는 세포에서 단백질가수분해 활성을 제공하는 방법을 제공하고, 방법은 세포 내 핵산을, 단백질가수분해 효소의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 CRISPR 단백질, 및 단백질가수분해 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 CRISPR 단백질로서, 단백질 가수분해 효소의 활성은 단백질의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 단백질, 및 제1 CRISPR 단백질에 결합하고 핵산의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드, 및 제2 CRISPR 단백질에 결합하고 핵산의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 관심 표적 핵산이 존재할 때, 단백질가수분해 효소의 제1 및 제2 부분이 접촉되고 효소의 단백질가수분해 활성이 재구성되어 효소의 기질이 절단된다.
분할-형광단 구성체는 전사물과 2개 C2c1 단백질의 결합 시 분할 형광단의 재구성을 통해 배경이 감소된 영상화에 유용하다. 이들 분할 단백질은 iSplit (Filonov, G.S., and Verkhusha, V.V. (2013). A near-infrared BiFC reporter for in vivo imaging of protein-protein interactions. Chem. Biol. 20, 1078-1086.), Split Venus (Wu, B., Chen, J., and Singer, R.H. (2014). Background free imaging of single mRNAs in live cells using split fluorescent proteins. Sci. Rep. 4, 3615.), 및 분할 초양성 GFP (Blakeley, B.D., Chapman, A.M., and McNaughton, B.R. (2012). Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. Biosyst. 8, 2036-2040.)를 포함한다. 이러한 단백질은 하기 표 4 에 기재된다.
Figure pct00020
dCas로 표적 농축
일정한 예의 구현예에서, 표적 RNA 또는 DNA는 먼저 표적 RNA 또는 DNA의 검출 또는 증폭 전에 농축될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 이러한 농축은 CRISPR 이펙터 시스템에 의한 표적 핵산의 결합에 의해 획득될 수 있다.
현재의 표적-특이적 농축 프로토콜은 프로브와의 하이브리드화 이전에 단일-가닥 핵산을 필요로 한다. 다양한 장점 중에서, 본 발명의 구현예는 이러한 단계를 생략할 수 있고 이중 가닥 (부분 또는 완전 이중 가닥) DNA를 직접 표적화할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 개시된 구현예는 등온 농축을 허용하는 보다 빠른 운동학 및 보다 용이한 작업흐름을 제공하는 효소-구동 표적화 방법이다. 일정 예의 구현예에서, 농축은 20-37℃ 정도로 낮은 온도에서 일어날 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 상이한 표적 핵산에 대한 가이드 RNA의 세트가 단일 어세이에서 사용되어, 다수의 표적 및/또는 단일 표적의 다수 변이체의 검출을 가능하게 한다.
일정한 예의 구현예에서, 데드 CRISPR 이펙터 단백질은 용액 중에서 표적 핵산에 결합할 수 있고 그 이후에 상기 용액으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산에 결합된 데드 CRISPR 이펙터 단백질은 데드 CRISPR 이펙터 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 다른 분자, 예컨대 압타머를 사용해 용액으로부터 단리될 수 있다.
다른 일례의 구현예에서, 데드 CRISPR 이펙터 단백질은 고형 기재에 결합될 수 있다. 고정된 기재는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 부착에 적절하거나 또는 적절하도록 변형될 수 있는 임의 재료를 의미할 수 있다. 가능한 기재는 제한없이, 유리 및 변형된 기능성 유리, 플라스틱 (아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, Teflon™ 등 포함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 세라믹, 레진, 규소 및 변형 규소를 포함하는 실리카 또는 실리카-기반 재료, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 광학 섬유 번들 및 다양한 다른 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 규칙적인 패턴으로 분자의 고정에 적합한 패턴화된 표면을 포함한다. 일정 구현예에서, 패턴화된 표면은 고형 지지체의 노출된 층 내 또는 그 위의 상이한 영역의 배열을 의미한다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 표면의 웰 또는 오목부의 어레이를 포함한다. 고형 지지체의 조성 및 기하학적 구조는 이의 용도에 따라 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 평면 구조 예컨대 슬라이드, 칩, 마이크로칩 및/또는 어레이이다. 이와 같이, 기재의 표면은 평면층의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 플로우셀의 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 " 플로우셀" 은 하나 이상의 유체 시약이 흐를 수 있는 고형 표면을 포함하는 챔버를 의미한다. 본 개시의 방법에서 쉽게 사용할 수 있는 예시적인 플루우셀 및 관련 유체 시스템 및 검출 플랫폼은 예를 들어, [Bentley et al. Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/0918497, U.S. 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; U.S. 7,405,281, 및 US 2008/0108082에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 고형 지지체 또는 이의 표면은 비평면, 예컨대 튜브 또는 용기의 내부 또는 외부 표면이다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 미세구 또는 비드를 포함한다. "미세구", "비드", "입자" 는 제한없이, 플라스틱, 세라믹, 유리 및 폴리스티렌을 포함하는 다양한 재료로 만들어진 소형 개별 입자를 의미하는 것으로 고형 기재의 상황 내에서 의미하고자 한다. 일정 구현예에서, 미세구는 자성 미세구 또는 비드이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 비드는 다공성일 수 있다. 비드 크기는 나노미터, 예를 들어 100 nm에서 밀리미터, 예를 들어 1 mm의 범위이다.
다음으로, 표적 핵산을 함유하거나, 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 기재에 노출시켜서 결합된 데드 CRISPR 이펙터 단백질에 표적 핵산이 결합할 수 있게 할 수 있다. 비-표적 분자는 세척해 버릴 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 이후에, 표적 핵산은 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 추가 검출을 위해 CRISPR 이펙터 단백질/가이드 RNA 복합체로부터 방출될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 표적 핵산은 본 명세서에 기술된 바와 같이 먼저 증폭될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, CRISPR 이펙터는 결합 태그로 표지될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, CRISPR 이펙터는 화학적으로 태그화될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 이펙터는 화학적으로 바이오틴화될 수 있다. 다른 일례의 구현예에서 CRISPR 이펙터에 융합체를 코딩하는 추가 서열을 첨가하여 융합체를 생성시킬 수 있다. 이러한 융합체의 일례는 고유한 15개 아미노산 펩티드 태그 상에 단일 바이오틴의 고도로 표적화된 효소 접합을 적용하는 AviTag™ 이다. 일정 구현예에서, CRISPR 이펙터는 포획 태그 예컨대, 제한없이, GST, Myc, 헤마글루티닌 (HA), 녹색 형광성 단백질 (GFP), flag, His 태그, TAP 태그, 및 Fc 태그로 표지될 수 있다. 결합 태그는 융합체, 화학적 태그, 또는 포획 태그인지 여부와 무관하게, 표적 핵산에 결합되면 CRISPR 이펙터 시스템을 풀다운하거나 또는 고형 기재 상에 CRISPR 이펙터 시스템을 고정시키는데 사용될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 가이드 RNA는 결합 태그로 표지될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 전체 가이드 RNA는 하나 이상의 바이오틴화된 뉴클레오티드, 예컨대, 바이오틴화된 우라실을 도입시킨 시험관내 전사 (IVT)를 사용하여 표지될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오틴은 화학적으로 또는 효소적으로 가이드 RNA에 첨가될 수 있고, 예컨대 가이드 RNA의 3' 말단에 하나 이상의 바이오틴 기의 첨가일 수 있다. 결합 태그는 예를 들어, 가이드 RNA/표적 핵산을 스트렙타비딘 코팅된 고형 기재에 노출시켜서, 결합이 발생된 이후 가이드 RNA/표적 핵산 복합체를 풀다운하는데 사용될 수 있다.
절두
일정 예의 구현예에서, Cas12 단백질은 절두될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 절두형태는 탈활성화 또는 데드 Cas12 단백질일 수 있다. Cas12 단백질은 N-말단, C-말단, 또는 둘 모두 상에서 변형될 수 있다. 일례의 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150개 아미노산이 N-말단, C-말단, 또는 이의 조합으로부터 제거된다. 다른 예의 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150개 아미노산이 C-말단으로부터 제거된다. 일정 예의 구현예에서, 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, 1-100, 1-110, 1-120, 1-130, 1-140, 1-150, 1-160, 1-170, 1-180, 1-190, 1-200, 1-220, 1-230, 1-240, 1-250, 200-250, 100-200, 110-200, 120-200, 130-200, 140-200, 150-200, 160-200, 170-200, 180-200, 190-200, 10-100, 20-100, 30-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 80-100, 90-100, 또는 150-250개 아미노산은 N-말단, C-말단, 또는 이의 조합으로부터 제거된다. 일정 예의 구현예에서, 아미노산 위치는 BhCas12의 것 또는 이에 상응하는 오솔로그의 아미노산이다. 일정 예의 구현예에서, 절두체는 뉴클레오티드 디아미나제에 융합되거나 또는 달리 부착될 수 있고 이하 더욱 상세히 개시하는 염기 편집 구현예에서 사용될 수 있다.
염기 편집
일정 예의 구현예에서, Cas12b, 예를 들어 dCas12는 염기 편집 목적을 위해 아데노신 디아미나제 또는 시티딘 디아미나제와 융합될 수 있다.
아데노신 디아미나제
본 명세서에서 사용되는 용어 "아데노신 디아미나제" 또는 "아데노신 디아미나제 단백질"은 이하에 표시된 바와 같이, 아데닌 (또는 분자의 아데닌 모이어티)을 하이포잔틴 (또는 분자의 하이포잔틴 모이어티)으로 전환시키는 가수분해 탈아미노화 반응을 촉매할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 기능성 도메인(들)에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 아데닌-함유 분자는 아데노신(A)이고, 하이포잔틴-함유 분자는 이노신(I)이다. 아데닌-함유 분자는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)일 수 있다.
Figure pct00021
본 공개에 따르면, 본 공개와 관련하여 사용될 수 있는 아데노신 디아미나제는 RNA (ADAR) 에 대해 작용하는 아데노신 디아미나제로서 알려진 효소 패밀리의 일원, tRNA (ADAT) 에 대해 작용하는 아데노신 디아미나제로서 알려진 효소 패밀리의 일원, 및 다른 아데노신 디아미나제 도메인-함유 (ADAD) 패밀리 일원을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 본 공개에 따르면, 아데노신 디아미나제는 RNA/DNA 및 RNA 듀플렉스에서 아데닌을 표적화할 수 있다. 실제로, Zheng 등 (Nucleic Acids Res. 2017, 45(6): 3369- 3377)은 ADAR이 RNA/DNA 및 RNA/RNA 듀플렉스 상에서 아데노신의 이노신 편집 반응을 수행할 수 있다는 것을 입증한다. 특정 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 본 명세서에서 이하에 상술하는 바와 같이 RNA 듀플렉스의 RNA/DNA 헤테로듀플렉스에서 DNA를 편집하는 그의 능력을 증가시키도록 변형되었다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 포유동물, 조류, 개구리, 오징어, 어류, 파리 및 벌레를 포함하나 그에 제한되지 않는 하나 이상의 후생동물 종에서 유래한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 인간, 오징어 또는 초파리 아데노신 디아미나제이다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR1, hADAR2, hADAR3 을 포함하는 인간 ADAR 이다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 ADR-1 및 ADR-2 를 포함하는 예쁜꼬마선충 (Caenorhabditis elegans) ADAR 단백질이다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 dAdar 를 포함하는 초파리 ADAR 단백질이다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 sqADAR2a 및 sqADAR2b 를 포함하는 오징어 롤리고 페알레이 (Loligo pealeii) ADAR 단백질이다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 인간 ADAT 단백질이다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 초파리 ADAT 단백질이다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 TENR (hADAD1) 및 TENRL (hADAD2) 을 포함하는 인간 ADAD 단백질이다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 TadA 단백질, 예컨대, 이.콜라이 (E. coli) TadA이다. 참조: Kim et al., Biochemistry 45:64076416 (2006); Wolf et al., EMBO J. 21:38413851(2002). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 마우스 ADA이다. 참조: Grunebaum et al., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 13:630-638 (2013). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 인간 ADAT2이다. 참조: Fukui et al., J. Nucleic Acids 2010:260512 (2010). 일부 구현예에서, 디아미나제 (예를 들어, 아데노신 또는 시티딘 디아미나제)는 하기 문헌들에 기술된 것들 중 하나 이상이다: Cox et al., Science. 2017, November 24; 358(6366): 1019-1027; Komore et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4; 및 Gaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제 단백질은 이중-가닥 핵산 기질에서 하나 이상의 표적 아데노신 잔기(들)을 인지하고 이노신 잔기(들)로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 핵산 기질은 RNA-DNA 하이브리드 듀플렉스이다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제 단백질은 이중-가닥 기질 상에서 결합창을 인식한다. 일부 구현예에서, 결합창은 적어도 하나의 표적 아데노신 잔기(들)를 함유한다. 일부 구현예에서, 결합창은 약 3 bp 내지 약 100 bp 범위이다. 일부 구현예에서, 결합창은 약 5 bp 내지 약 50 bp 범위이다. 일부 구현예에서, 결합창은 약 10 bp 내지 약 30 bp 범위이다. 일부 구현예에서, 결합창은 약 1 bp, 2 bp, 3 bp, 5 bp, 7 bp, 10 bp, 15 bp, 20 bp, 25 bp, 30 bp, 40 bp, 45 bp, 50 bp, 55 bp, 60 bp, 65 bp, 70 bp, 75 bp, 80 bp, 85 bp, 90 bp, 95 bp, 또는 100 bp 이다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제 단백질은 하나 이상의 디아미나제 도메인을 포함한다. 특정 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하지는 않지만, 디아미나제 도메인은 이중가닥 핵산 기질에 함유된 하나 이상의 표적 아데노신(A) 잔기(들)을 인식하고, 이를 이노신(I) 잔기(들)로 전환시키는 작용을 하는 것으로 상정된다. 일부 구현예에서, 디아미나제 도메인은 활성 중심을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성 중심은 아연 이온을 포함한다. 일부 구현예에서, A>I 편집 과정 동안, 표적 아데노신 잔기에서 염기쌍이 붕괴되며, 표적 아데노신 잔기는 아데노신 디아미나제에 의해 접근 가능하게 되도록 이중 나선 밖으로 " 플립(flipped)" 된다. 일부 구현예에서, 활성 중심 내 또는 근처의 아미노산 잔기는 표적 아데노신 잔기에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드(들) 5'과 상호작용한다. 일부 구현예에서, 활성 중심 내 또는 근처의 아미노산 잔기는 표적 아데노신 잔기에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드(들) 3'과 상호작용한다. 일부 구현예에서, 활성 중심에서의 또는 그 근처의 아미노산 잔기는 또한 맞은편 가닥의 표적 아데노신 잔기에 상대적인 뉴클레오티드와 상호작용한다. 일부 구현예에서, 아미노산 잔기는 뉴클레오티드의 2' 히드록실 기와 수소 결합을 형성한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 인간 ADAR2 전체 단백질 (hADAR2) 또는 그의 디아미나제 도메인 (hADAR2-D) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2 또는 hADAR2-D 에 상동성인 ADAR 패밀리 일원이다.
특히, 일부 구현예에서, 상동성 ADAR 단백질은 인간 ADAR1 (hADAR1) 또는 그의 디아미나제 도메인 (hADAR1-D) 이다. 일부 구현예에서, hADAR1-D의 글리신 1007은 글리신487 hADAR2-D에 상응하고, hADAR1-D의 글루탐산1008은 hADAR2-D의 글루탐산488에 상응한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 야생형 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, hADAR2-D의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도가 특정 필요에 따라 변화되도록, 아데노신 데아미나제는 hADAR2-D 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
hADAR1 및 hADAR2 단백질의 소정의 돌연변이는 하기 문헌들에 기술되었으며, 그 각각은 참조로 그 전문이 본 명세서에 편입된다: Kuttan et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2012) 109(48):E3295-304; Want et al. ACS Chem Biol. (2015) 10(11):2512-9; and Zheng et al. Nucleic Acids Res. (2017) 45(6):3369-337.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 글리신336 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 336번 위치의 글리신 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다 (G336D).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 글리신487, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 487번 위치에서 글리신 잔기는 비교적 소형 측쇄를 갖는 비극성 아미노산 잔기로 치환된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 487번 위치에서 글리신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (G487A). 일부 구현예에서, 487번 위치에서 글리신 잔기는 발린 잔기로 치환된다 (G487V). 일부 구현예에서, 487번 위치에서 글리신 잔기는 비교적 큰 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 487번 위치에서 글리신 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (G487R). 일부 구현예에서, 487번 위치에서 글리신 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (G487K). 일부 구현예에서, 487번 위치에서 글리신 잔기는 트립토판 잔기로 치환된다 (G487W). 일부 구현예에서, 487번 위치에서 글리신 잔기는 티로신 잔기로 치환된다 (G487Y).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 글루탐산488, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 글루타민 잔기로 치환된다(E488Q). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 히스티딘 잔기로 치환된다(E488H). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 알기닌 잔기로 치환된다(E488R). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 라이신 잔기로 치환된다(E488K). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 아스파라긴 잔기로 치환된다(E488N). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(E488A). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 메티오닌 잔기로 치환된다(E488M). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 세린 잔기로 치환된다(E488S). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 페닐알라닌 잔기로 치환된다(E488F). 일부 구현예에서, 488번 위치에서 글루탐산 잔기는 라이신 잔기로 치환된다(E488L). 일부 구현예에서, 위치 488 에서의 글루탐산 잔기는 트립토판 잔기로 치환된다 (E488W).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 트레오닌490, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다 (T490C). 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환된다(T490S). 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(T490A). 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 페닐알라닌 잔기로 치환된다(T490F). 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 타이로신 잔기로 치환된다(T490Y). 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환된다(T490R). 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(T490K). 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 페닐알라닌 잔기로 치환된다(T490P). 일부 구현예에서, 490번 위치에서 트레오닌 잔기는 타이로신 잔기로 치환된다(T490E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 발린493, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 493번 위치에서 발린 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (V493A). 일부 구현예에서, 493번 위치에서 발린 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (V493S). 일부 구현예에서, 위치 493 에서의 발린 잔기는 트레오닌 잔기로 치환된다 (V493T). 일부 구현예에서, 위치 493 에서의 발린 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (V493R). 일부 구현예에서, 위치 493 에서의 발린 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다 (V493D). 일부 구현예에서, 위치 493 에서의 발린 잔기는 프롤린 잔기로 치환된다 (V493P). 일부 구현예에서, 위치 493 에서의 발린 잔기는 글라이신 잔기로 치환된다 (V493G).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 알라닌589, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 589번 위치에서 알라닌 잔기는 발린 잔기로 치환된다 (A589V).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 아스파라긴597, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 597번 위치에서 아스파라긴 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (N597K). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 597번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 597번 위치에서 아스파라긴 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (N597R). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 597번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 597번 위치에서 아스파라긴 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (N597A). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 597번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 597번 위치에서 아스파라긴 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (N597E). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 597번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 597번 위치에서 아스파라긴 잔기는 히스티딘 잔기로 치환된다 (N597H). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 597번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 597 에서의 아스파라긴 잔기는 글라이신 잔기로 치환된다 (N597G). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 597번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 597 에서의 아스파라긴 잔기는 티로신 잔기로 치환된다 (N597Y). 일부 구현예에서, 위치 597 에서의 아스파라긴 잔기는 페닐알라닌 잔기로 치환된다 (N597F). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597V를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597M를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597P를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597T를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597W를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N597D를 포함한다. 일정 예시적 구현예에서, 상기 기재한 N597에서의 돌연변이는 E488Q 배경 상황에서 추가로 만들어 진다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 세린599, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 599번 위치에서 세린 잔기는 트레오닌 잔기로 치환된다 (S599T).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 아스파라긴613, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 613번 위치에서 아스파라긴 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (N613K). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 613번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 613번 위치에서 아스파라긴 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (N613R). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 613번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 613번 위치에서 아스파라긴 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(N613A) 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 야생형 서열에서 아스파라긴 잔기를 갖는 아미노산 서열의 613번 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 613번 위치에서 아스파라긴 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (N613E). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613V를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613M를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613P를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613T를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613Y를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613W를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613H를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N613D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재한 N613에서의 돌연변이는 E488Q 돌연변이와 조합하여 추가로 생성된다.
일부 실시형태에서, 편집 효율을 개선하기 위해서, 아데노신 데아미나아제는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다: G336D, G487A, G487V, E488Q, E488H, E488R, E488N, E488A, E488S, E488M, T490C, T490S, V493T, V493S, V493A, V493R, V493D, V493P, V493G, N597K, N597R, N597A, N597E, N597H, N597G, N597Y, A589V, S599T, N613K, N613R, N613A, N613E (hADAR2-D 의 아미노산 서열 위치 기반), 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질에서의 돌연변이.
일부 실시형태에서, 편집 효율을 감소시키기 위해서, 아데노신 데아미나아제는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다: E488F, E488L, E488W, T490A, T490F, T490Y, T490R, T490K, T490P, T490E, N597F (hADAR2-D 의 아미노산 서열 위치 기반), 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질에서의 돌연변이. 특정한 구현예에서, 오프-표적 효과를 감소시키기 위해서 효율이 감소된 아데노신 디아미나제 효소를 사용하는 것이 흥미로울 수 있다.
일부 실시형태에서, 오프-표적 효과를 감소시키기 위해서, 아데노신 데아미나아제는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다: R348, V351, T375, K376, E396, C451, R455, N473, R474, K475, R477, R481, S486, E488, T490, S495, R510 (hADAR2-D 의 아미노산 서열 위치에 기초함) 에서의 돌연변이, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질에서의 돌연변이. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 E488 에서 및 R348, V351, T375, K376, E396, C451, R455, N473, R474, K475, R477, R481, S486, T490, S495, R510 로부터 선택되는 하나 이상의 부가적 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 T375, 및 임의로는 하나 이상의 추가 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 N473, 및 임의로는 하나 이상의 추가 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 V351, 및 임의로는 하나 이상의 추가 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 E488 및 T375, 및 임의로는 하나 이상의 추가 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 E488 및 N473, 및 임의로는 하나 이상의 추가 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 E488 및 V351 에서, 및 임의로 하나 이상의 부가적 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 E488 에서 및 T375, N473, 및 V351 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 오프-표적 효과를 감소시키기 위해서, 아데노신 데아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, R348E, V351L, T375G, T375S, R455G, R455S, R455E, N473D, R474E, K475Q, R477E, R481E, S486T, E488Q, T490A, T490S, S495T, 및 R510E로부터 선택되는 돌연변이, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질 내 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 E488Q, 및 R348E, V351L, T375G, T375S, R455G, R455S, R455E, N473D, R474E, K475Q, R477E, R481E, S486T, T490A, T490S, S495T 및 R510E로부터 선택되는 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375G 또는 T375S, 및 임의로 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N473D, 및 임의로는 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351L, 및 임의로는 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 E488Q, 및 T375G 또는 T375G, 및 임의로 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 E488Q 및 N473D, 및 임의로 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 E488Q 및 V351L, 및 임의로 하나 이상의 추가 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 E488Q 및 T375G/S, N473D 및 V351L 중 하나 이상을 포함한다.
일정 예에서, 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 hADAR2-D 아미노산의 E488에 돌연변이, 바람직하게 E488Q, 또는 상동성 ADAR 단백질의 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하도록 변형되었고/되었거나, 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 hDAR2-D 아미노산 서열의 T375에 돌연변이, 바람직하게 T375G, 또는 상동성 ADAR 단백질의 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일정 예에서, 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 hADAR1d 아미노산 서열의 E1008에 돌연변이, 바람직하게 E1008Q, 또는 상동성 ADAR 단백질의 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하도록 변형되었다.
듀플렉스 RNA에 결합된 인간 ADAR2 디아미나제 도메인의 결정 구조는 변형 부위의 5' 측면 상에서 RNA에 결합하는 단백질 루프를 밝혀준다. 이러한 5' 결합 루프는 ADAR 패밀리 멤버 간 기질 특이성 편차에 대한 하나의 원인 인자이다. [Wang et al., Nucleic Acids Res., 44(20):98729880 (2016)]을 참조하고, 이의 내용은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다. 또한, ADAR2-특이적RNA-결합 루프가 효소 활성 부위 근처에서 확인되었다. [Mathews et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 23(5):426- 33 (2016)]을 참조하고, 이의 내용은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 편집 특이성 및/또는 효율을 개선시키도록 RNA 결합 루프 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 알라닌454, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 454의 알라닌은 세린 잔기로 치환된다 (A454S). 일부 구현예에서, 위치 454의 알라닌 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다 (A454C). 일부 구현예에서, 위치 454의 알라닌 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다 (A454D).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 아르기닌455, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 455의 아르기닌 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (R455A). 일부 구현예에서, 위치 455의 아르기닌 잔기는 발린 잔기로 치환된다 (R455V). 일부 구현예에서, 위치 455의 아르기닌 잔기는 히스티딘 잔기로 치환된다 (R455H). 일부 구현예에서, 위치 455의 아르기닌 잔기는 글리신 잔기로 치환된다 (R455G). 일부 구현예에서, 위치 455의 아르기닌 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (R455S). 일부 구현예에서, 위치 455의 아르기닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (R455E). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455K를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455M를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455N를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455W를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455P를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455Y를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R455D를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재한 R455에서의 돌연변이는 E488Q 돌연변이와 조합하여 추가로 생성된다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 이소류신456, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 456의 이소류신 잔기는 발린 잔기로 치환된다 (I456V). 일부 구현예에서, 위치 456의 이소류신 잔기는 류신 잔기로 치환된다 (I456L). 일부 구현예에서, 위치 456의 이소류신 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다 (I456D).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 페닐알라닌457, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 457번 위치에서 페닐알라닌 잔기는 타이로신 잔기로 치환된다(F457Y). 일부 구현예에서, 457번 위치에서 페닐알라닌 잔기는 알기닌 잔기로 치환된다(F457R). 일부 구현예에서, 457번 위치에서 페닐알라닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다(F457E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 세린458, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 458의 세린 잔기는 발린 잔기로 치환된다 (S458V). 일부 구현예에서, 위치 458의 세린 잔기는 페닐알라닌 잔기로 치환된다 (S458F). 일부 구현예에서, 위치 458의 세린 잔기는 프롤린 잔기로 치환된다 (S458P). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458M를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458T를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458Y를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458W를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458N를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458H를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458K를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458R를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재한 S458에서의 돌연변이는 E488Q 돌연변이와 조합하여 추가로 생성된다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 프롤린459, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 459의 프롤린 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다 (P459C). 일부 구현예에서, 위치 459의 프롤린 잔기는 히스티딘 잔기로 치환된다 (P459H). 일부 구현예에서, 위치 459의 프롤린 잔기는 트립토판 잔기로 치환된다 (P459W).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 히스티딘460, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 460의 히스티딘 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (H460R). 일부 구현예에서, 위치 460의 히스티딘 잔기는 이소류신 잔기로 치환된다 (H460I). 일부 구현예에서, 위치 460의 히스티딘 잔기는 프롤린 잔기로 치환된다 (H460P). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460V를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460M를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460T를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460Y를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460W를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460N를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 H460K를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재한 H460에서의 돌연변이는 E488Q 돌연변이와 조합하여 추가로 생성된다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 프롤린462, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 462의 프롤린 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (P462S). 일부 구현예에서, 위치 462의 프롤린 잔기는 트립토판 잔기로 치환된다 (P462W). 일부 구현예에서, 위치 462의 프롤린 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (P462E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 아스파르트산469, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 469의 아스파르트산 잔기는 글루타민 잔기로 치환된다 (D469Q). 일부 구현예에서, 위치 469의 아스파르트산 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (D469S). 일부 구현예에서, 위치 469의 아스파르트산 잔기는 티로신 잔기로 치환된다 (D469Y).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 아르기닌470, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 470의 아르기닌 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (R470A). 일부 구현예에서, 470번 위치에서 알기닌 잔기는 아이소류신 잔기로 치환된다 (R470I). 일부 구현예에서, 470번 위치에서 알기닌 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다 (R470D).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 히스티딘471, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 471의 히스티딘 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (H471K). 일부 구현예에서, 위치 471의 히스티딘 잔기는 트레오닌 잔기로 치환된다 (H471T). 일부 구현예에서, 위치 471의 히스티딘 잔기는 발린 잔기로 치환된다 (H471V).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 프롤린472, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 472의 프롤린 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (P472K). 일부 구현예에서, 위치 472의 프롤린 잔기는 트레오닌 잔기로 치환된다 (P472T). 일부 구현예에서, 위치 472의 프롤린 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다 (P472D).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 아스파라긴473, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 473의 아스파라긴 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (N473R). 일부 구현예에서, 위치 473의 아스파라긴 잔기는 트립토판 잔기로 치환된다 (N473W). 일부 구현예에서, 위치 473의 아스파라긴 잔기는 프롤린 잔기로 치환된다 (N473P). 일부 구현예에서, 위치 473의 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다 (N473D).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 아르기닌 474, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 474의 아르기닌 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (R474K). 일부 구현예에서, 위치 474의 아르기닌 잔기는 글리신 잔기로 치환된다 (R474G). 일부 구현예에서, 위치 474의 알기닌 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다(R474D). 일부 구현예에서, 위치 474의 아르기닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (R474E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 리신475, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 475의 리신 잔기는 글루타민 잔기로 치환된다 (K475Q). 일부 구현예에서, 위치 475의 리신 잔기는 아스파라긴 잔기로 치환된다 (K475N). 일부 구현예에서, 위치 475의 리신 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환된다 (K475D).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 알라닌476, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 476의 알라닌은 세린 잔기로 치환된다 (A476S). 일부 구현예에서, 위치 476의 알라닌 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (A476R). 일부 구현예에서, 위치 476의 알라닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (A476E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 아르기닌477, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 477의 아르기닌 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (R477K). 일부 구현예에서, 위치 477의 아르기닌 잔기는 트레오닌 잔기로 치환된다 (R477T). 일부 구현예에서, 위치 477의 아르기닌 잔기는 페닐알라닌 잔기로 치환된다 (R477F). 일부 구현예에서, 위치 474의 아르기닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (R477E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 글리신478, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 478의 글리신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (G478A). 일부 구현예에서, 위치 478의 글리신 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (G478R). 일부 구현예에서, 478번 위치에서 글리신 잔기는 티로신 잔기로 치환된다 (G478Y). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478V를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478M를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478P를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478T를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478W를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478N를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478H를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478K를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재한 G478에서의 돌연변이는 E488Q 돌연변이와 조합하여 추가로 생성된다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 글루타민479에서, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 479의 글루타민 잔기는 아스파라긴 잔기로 치환된다 (Q479N). 일부 구현예에서, 위치 479의 글루타민 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (Q479S). 일부 구현예에서, 위치 479번의 글루타민 잔기는 프롤린 잔기로 치환된다(Q479P).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열에서 아르기닌348, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 348의 아르기닌 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (R348A). 일부 구현예에서, 위치 348의 아르기닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (R348E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 발린351, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 351의 발린 잔기는 류신 잔기로 치환된다 (V351L). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351Y를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351M를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351T를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351H를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351P를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351K를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351N를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351W를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 V351R를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재한 V351에서의 돌연변이는 E488Q 돌연변이와 조합하여 추가로 생성된다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 트레오닌375에서, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 대응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 375의 트레오닌 잔기는 글리신 잔기로 치환된다 (T375G). 일부 구현예에서, 위치 375의 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (T375S). 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375H를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375C를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375N를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375M를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375W를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375V를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375R를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375K를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375I를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375P를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375Y를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 기재된 T375Y에서의 돌연변이는 추가로 E488Q 돌연변이와 조합하여 생성된다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 Arg481, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 481의 아르기닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (R481E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 Ser486, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 486의 세린 잔기는 트레오닌 잔기로 치환된다 (S486T).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 Thr490, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 490의 트레오닌 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (T490A). 일부 구현예에서, 위치 490의 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (T490S).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 Ser495, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 495의 세린 잔기는 트레오닌 잔기로 치환된다 (S495T).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 Arg510, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 510의 아르기닌 잔기는 글루타민 잔기로 치환된다 (R510Q). 일부 구현예에서, 위치 510의 아르기닌 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (R510A). 일부 구현예에서, 위치 510의 아르기닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (R510E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 Gly593, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 593의 글리신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (G593A). 일부 구현예에서, 위치 593의 글리신 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (G593E).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 Lys594, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 594의 리신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (K594A).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 위치 A454, R455, I456, F457, S458, P459, H460, P462, D469, R470, H471, P472, N473, R474, K475, A476, R477, G478, Q479, R348, R510, G593, K594, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치 중 임의의 하나 이상에 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 돌연변이 A454S, A454C, A454D, R455A, R455V, R455H, I456V, I456L, I456D, F457Y, F457R, F457E, S458V, S458F, S458P, P459C, P459H, P459W, H460R, H460I, H460P, P462S, P462W, P462E, D469Q, D469S, D469Y, R470A, R470I, R470D, H471K, H471T, H471V, P472K, P472T, P472D, N473R, N473W, N473P, R474K, R474G, R474D, K475Q, K475N, K475D, A476S, A476R, A476E, R477K, R477T, R477F, G478A, G478R, G478Y, Q479N, Q479S, Q479P, R348A, R510Q, R510A, G593A, G593E, K594A, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치 내 돌연변이 중 임의의 하나 이상을 포함한다.
일정 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 활성이 시티딘 디아미나제로 전환되도록 돌연변이된다. 따라서, 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 E396, C451, V351, R455, T375, K376? S486, Q488, R510, K594, R348, G593, S397, H443, L444, Y445, F442, E438, T448, A353, V355, T339, P539, T339, P539, V525 I520, P462 및 N579로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 특정한 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 V351, L444, V355, V525 및 I520으로부터 선택되는 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, E488, V351, S486, T375, S370, P462, N597에서의 돌연변이, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질 내 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, 돌연변이: E488Q, V351G, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, S661T, 및 상기 상응하는 상동성 ADAR 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 명세서는 돌연변이된 디아미나제, 예를 들어, 데드 Cas12b 단백질 또는 Cas12 닉카제와 융합된, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, S661T의 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 아데노신 디아미나제를 포함하여, 제공한다. 특정 예에서, 본 발명은 돌연변이된 아데노신 디아미나제, 예를 들어 데드 Cas12b 단백질 또는 Cas12 닉카제와 융합된, E488Q, V351G, S486A, T375S, S370C, P462A, N597I, L332I, I398V, K350I, M383L, D619G, S582T, V440I, S495N, K418E, 및 S661T를 포함하는 아데노신 디아미나제를 포함하여, 제공한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488에서의 돌연변이와 조합하여, hADAR2-D 아미노산 서열의 위치 T375, V351, G478, S458, H460, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치 중 어느 하나 이상에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488Q와 조합하여, T375G, T375C, T375H, T375Q, V351M, V351T, V351Y, G478R, S458F, H460I로부터 선택된 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488Q와 조합하여, T375H, T375Q, V351M, V351Y, H460P로부터 선택된 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488Q와 조합하여, 돌연변이 T375S 및 S458F를 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488에서의 돌연변이와 조합하여, hADAR2-D 아미노산 서열의 위치 T375, N473, R474, G478, S458, P459, V351, R455, R455, T490, R348, Q479, 또는 상동성 ADAR 단백질의 상응하는 위치 중 둘 이상에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488Q와 조합하여, T375G, T375S, N473D, R474E, G478R, S458F, P459W, V351L, R455G, R455S, T490A, R348E, Q479P로부터 선택된 돌연변이 중 둘 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375G 및 V351L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375G 및 R455G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375G 및 R455S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375G 및 T490A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375G 및 R348E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375S 및 V351L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375S 및 R455G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375S 및 R455S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375S 및 T490A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T375S 및 R348E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N473D 및 V351L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N473D 및 R455G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N473D 및 R455S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N473D 및 T490A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 N473D 및 R348E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R474E 및 V351L를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R474E 및 R455G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R474E 및 R455S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R474E 및 T490A를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 R474E 및 R348E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458F 및 T375G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458F 및 T375S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458F 및 N473D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458F 및 R474E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 S458F 및 G478R를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478R 및 T375G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478R 및 T375S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478R 및 N473D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 G478R 및 R474E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 P459W 및 T375G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 P459W 및 T375S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 P459W 및 N473D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 P459W 및 R474E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 P459W 및 G478R를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 P459W 및 S458F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 Q479P 및 T375G를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 Q479P 및 T375S를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 Q479P 및 N473D를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 Q479P 및 R474E를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 Q479P 및 G478R를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 Q479P 및 S458F를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 Q479P 및 P459W를 포함한다. 본 단락에 기재된 모든 돌연변이는 또한 추가로 E488Q 돌연변이와 조합하여 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488에서의 돌연변이와 조합하여, hADAR2-D 아미노산 서열의 위치 K475, Q479, P459, G478, S458, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 대응하는 위치 중 어느 하나 이상에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488Q와 조합하여, K475N, Q479N, P459W, G478R, S458P, S458F로부터 선택된 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488에서의 돌연변이와 조합하여, hADAR2-D 아미노산 서열의 위치 T375, V351, R455, H460, A476, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치 중 어느 하나 이상에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 임의로 E488Q와 조합하여, T375G, T375C, T375H, T375Q, V351M, V351T, V351Y, R455H, H460P, H460I, A476E로부터 선택된 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다.
일정 구현예에서, 편집의 개선 및 오프-표적 변형의 감소는 gRNA의 화학적 변형에 의해 달성된다. 문헌 [Vogel et al. (2014), Angew Chem Int Ed, 53:6267- 6271, doi:10.1002/anie.201402634 (본 명세서에 전문이 참고로 편입됨)]에 예시된 바와 같이 화학적으로 변형된 gRNA는 오프-표적 활성을 감소시키고, 온-표적 효율을 개선시킨다. 2'-O-메틸 및 포스포티오에이트 변형된 가이드 RNA 는 일반적으로 세포에서 편집 효율을 개선한다.
ADAR 은 편집된 A 의 양측에서 이웃 뉴클레오티드에 대한 선호도를 입증하는 것으로 알려졌다 (www.nature.com/nsmb/journal/v23/n5/full/nsmb.3203.html, Matthews et al. (2017), Nature Structural Mol Biol, 23(5): 426433, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다). 따라서, 일정 구현예에서, gRNA, 표적, 및/또는 ADAR 은 모티프 선호도에 대해 최적화되도록 선택된다.
의도적 미스매치는 시험관내에서 비-선호 모티프의 편집을 허용한다는 것이 입증되었다 (참조: 참조로 전문이 본 명세서에 편입되는, academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gku272; Schneider et al (2014), Nucleic Acid Res, 42(10):e87); Fukuda et al. (2017), Scientific Reports, 7, doi:10.1038/srep41478). 따라서, 특정 구현예에서, 바람직하지 않은 5' 또는 3' 이웃 염기에 대한 RNA 편집 효율을 향상시키기 위해서, 이웃 염기에 의도적 미스매치가 도입된다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 tRNA-특이적 아데노신 디아미나제 또는 이의 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: W23L, W23R, R26G, H36L, N37S, P48S, P48T, P48A, I49V, R51L, N72D, L84F, S97C, A106V, D108N, H123Y, G125A, A142N, S146C, D147Y, R152H, R152P, E155V, I156F, K157N, K161T, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: D108N, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, A142N, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, A142N, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, W23R, P48A, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, W23R, P48A, A142N, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, W23R, P48A, R152P, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 이. 콜라이 TadA의 아미노산 서열 위치를 기반으로 돌연변이: A106V, D108N, D147Y, E155V, L84F, H123Y, I156F, H36L, R51L, S146C, K157N, P48S, W23R, P48A, R152P, A142N, 및 상기에 상응하는 상동성 디아미나제 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
결과는 ADAR 디아미나제 도메인의 표적화 창에서 A의 대항 C가 다른 염기보다 우선적으로 편집된다는 것을 시사한다. 추가로, 표적화된 염기의 소수 염기 내 U와 염기-쌍형성된 A는 Cas12b-ADAR 융합에 의한 낮은 수준의 편집을 보여서, 효소가 다수 A를 편집하는데 유연성이 있음을 시사한다. 이들 2가지 관찰은 Cas12b-ADAR 융합체의 활성창에서 다수 A는 편집하려는 모든 A를 C와 미스매치시켜서 편집을 위해 지정할 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 일정 구현예에서, 활성창의 다수 A:C 미스매치는 다수 A:I 편집을 생성하도록 설계된다. 일정 구현예에서, 활성 창에서 잠재적 비표적 편집을 억제하기 위해, 비-표적 A는 A 또는 G와 짝지어진다.
용어 " 편집 특이성" 및 " 편집 선호도" 는 이중가닥 기질 내 특정 아데노신 부위에서 A-대-I 편집 정도를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 호환 가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 기질 편집 선호도는 표적 아데노신 잔기의 5' 가장 가까운 이웃 및/또는 3' 가장 가까운 이웃에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 U>A>C>G(" >" 는 더 큰 선호도를 나타냄)으로 순위매겨지는, 기질의 5' 가장 가까운 이웃에 대한 선호도를 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 G>C~A>U(" >" 는 더 큰 선호도를 나타냄; " ~" 는 유사한 선호도를 나타냄)로서 순위매겨지는, 기질의 3' 가장 가까운 이웃에 대해 선호도를 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 G>C>U~A (" >" 는 더 큰 선호도를 나타냄; " ~" 는 유사한 선호도를 나타냄)로서 순위매겨지는, 기질의 3' 가장 가까운 이웃에 대해 선호도를 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 G>C>A>U (" >" 는 더 큰 선호도를 나타냄)로서 순위매겨지는, 기질의 3' 가장 가까운 이웃에 대해 선호도를 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 C~G~A>U (" >" 는 더 큰 선호도를 나타냄; " ~" 는 유사한 선호도를 나타냄)로서 순위매겨지는, 기질의 3' 가장 가까운 이웃에 대해 선호도를 갖는다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 TAG>AAG>CAC>AAT>GAA>GAC (" >" 는 더 큰 선호도를 나타냄)(중심 A는 표적 아데노신 잔기임)로서 순위매겨지는, 표적 아데노신 잔기를 함유하는 삼중 서열에 대한 선호도를 갖는다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제의 기질 편집 선호도는 아데노신 디아미나제 단백질에서의 핵산 결합 도메인의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받는다. 일부 구현예에서, 기질 편집 선호도를 조정하기 위해서, 디아미나제 도메인은 이중-가닥 RNA 결합 도메인 (dsRBD) 또는 이중-가닥 RNA 결합 모티프 (dsRBM) 와 연결된다. 일부 구현예에서, dsRBD 또는 dsRBM 은 ADAR 단백질, 예컨대 hADAR1 또는 hADAR2 로부터 유래할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 dsRBD 및 디아미나제 도메인을 포함하는 전장 ADAR 단백질이 사용된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 dsRBM 또는 dsRBD 은 디아미나제 도메인의 N-말단에 있다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 dsRBM 또는 dsRBD 은 디아미나제 도메인의 C-말단에 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제의 기질 편집 선호도는 효소의 활성 중심에서의 또는 그 근처의 아미노산 잔기에 의해 영향을 받는다. 일부 실시형태에서, 기질 편집 선호도를 조정하기 위해서, 아데노신 데아미나아제는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다: G336D, G487R, G487K, G487W, G487Y, E488Q, E488N, T490A, V493A, V493T, V493S, N597K, N597R, A589V, S599T, N613K, N613R (hADAR2-D 의 아미노산 서열 위치에 기초함), 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질에서의 돌연변이.
특히, 일부 구현예에서, 편집 특이성을 감소시키기 위해서 아데노신 디아미나제는 하기 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다: E488Q, V493A, N597K, N613K (hADAR2-D 의 아미노산 서열 위치에 기초함), 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질에서의 돌연변이. 일부 구현예에서, 편집 특이성을 증가시키기 위해서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 T490A 를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 바로 5' G를 갖는 표적 아데노신(A), 예컨대, 삼중 서열 GAC를 포함하는 기질(중심 A는 표적 아데노신 잔기임)에 대한 편집 선호도를 증가시키기 위해, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D의 아미노산 서열 위치에 기반한 돌연변이 G336D, E488Q, E488N, V493T, V493S, V493A, A589V, N597K, N597R, S599T, N613K, N613R, 및 상기에 대응하는 상동성 ADAR 단백질에서의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
특히, 일부 실시형태에서, 하기 삼중 서열을 포함하는 기질을 편집하기 위해 아데노신 데아미나아제는 돌연변이 E488Q 또는 상동성 ADAR 단백질에서의 상응하는 돌연변이를 포함한다: GAC, GAA, GAU, GAG, CAU, AAU, UAC (중심 A 는 표적 아데노신 잔기이다).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR1-D의 야생형 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아데노신 데아미나아제는 하나 이상의 돌연변이를 hADAR1-D 서열에 포함하여, hADAR1-D 의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도는 특별한 필요에 따라 변화된다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR1-D 아미노산 서열의 글리신1007, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 비교적 소형 측쇄를 갖는 비극성 아미노산 잔기로 치환된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (G1007A). 일부 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 발린 잔기로 치환된다 (G1007V). 일부 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 비교적 큰 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (G1007R). 일부 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (G1007K). 일부 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 트립토판 잔기로 치환된다 (G1007W). 일부 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 티로신 잔기로 치환된다 (G1007Y). 부가적으로, 다른 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 류신 잔기로 치환된다 (G1007L). 다른 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 트레오닌 잔기로 치환된다 (G1007T). 다른 구현예에서, 위치 1007의 글리신 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (G1007S).
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR1-D 아미노산 서열의 글루탐산1008, 또는 상동성 ADAR 단백질에서의 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 상대적으로 큰 측쇄를 갖는 극성 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 글루타민 잔기로 치환된다 (E1008Q). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 히스티딘 잔기로 치환된다 (E1008H). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (E1008R). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 리신 잔기로 치환된다 (E1008K). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 비극성 또는 소형 극성 아미노산 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 페닐알라닌 잔기로 치환된다 (E1008F). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 트립토판 잔기로 치환된다 (E1008W). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 글라이신 잔기로 치환된다 (E1008G). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 이소류신 잔기로 치환된다 (E1008I). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 발린 잔기로 치환된다 (E1008V). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 프롤린 잔기로 치환된다 (E1008P). 일부 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 세린 잔기로 치환된다 (E1008S). 다른 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 아스파라긴 잔기로 치환된다 (E1008N). 다른 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (E1008A). 다른 구현예에서, 위치 1008의 글루탐산 잔기는 메티오닌 잔기로 치환된다 (E1008M). 일부 구현예에서, 위치 1008번의 글루탐산 잔기는 류신 잔기로 치환된다 (E1008L).
일부 실시형태에서, 편집 효율을 개선하기 위해서, 아데노신 디아미나아제는 hADAR1-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, 돌연변이: E1007S, E1007A, E1007V, E1008Q, E1008R, E1008H, E1008M, E1008N, E1008K, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질에서의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 편집 효율을 개선하기 위해서, 아데노신 디아미나아제는 hADAR1-D의 아미노산 서열 위치를 기반으로, 돌연변이: E1007R, E1007K, E1007Y, E1007L, E1007T, E1008G, E1008I, E1008P, E1008V, E1008F, E1008W, E1008S, E1008N, E1008K, 및 상기에 상응하는 상동성 ADAR 단백질에서의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제의 기질 편집 선호도, 효율 및/또는 선택성은 효소의 활성 중심에서의 또는 그 근처의 아미노산 잔기에 의해 영향을 받는다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 hADAR1-D 서열의 글루탐산 1008 위치, 또는 상동성 ADAR 단백질에서의 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 E1008R, 또는 상동성 ADAR 단백질에서의 상응하는 돌연변이이다. 일부 구현예에서, E1008R 돌연변이체는 맞은편 가닥에 미스매치되는 G 잔기를 갖는 표적 아데노신 잔기에 대해 증가된 편집 효율을 갖는다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 핵산 기질을 인지하고 그에 결합하기 위해 아데노신 디아미나제 단백질은 하나 이상의 이중-가닥 RNA (dsRNA) 결합 모티프 (dsRBM) 또는 도메인 (dsRBD) 을 추가로 포함하거나 또는 그에 연결된다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제와 이중-가닥 기질 사이의 상호작용은 CRISPR/CAS 단백질 인자를 포함하는 하나 이상의 부가적 단백질 인자(들)에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제와 이중-가닥 기질 사이의 상호작용은 가이드 RNA 를 포함하는 하나 이상의 핵산 성분(들)에 의해 추가로 매개된다.
C에서 U로 탈아미노화 활성을 갖는 변형된 아데노신 디아미나제
일정한 예의 구현예에서, 지정된 진화는 아데닌의 하이포잔틴으로의 탈아미노화 이외의 추가적인 반응을 촉매할 수 있는 변형된 ADAR 단백질을 설계하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 ADAR 단백질은 시티딘의 우라실로의 탈아미노화를 촉매할 수 있다. 특정 이론으로 구속되지는 않지만, C에서 U로의 활성을 개선시키는 돌연변이는 더 작은 시티딘 염기를 더 잘 받을 수 있도록 결합 포켓의 형상을 변경시킬 수 있다.
일부 구현예에서, C에서 U로의 탈아미노화 활성을 갖는 변형된 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 아미노산 서열의 위치 V351, T375, R455 및 E488, 또는 상동성 ADAR 단백질 내 대응하는 위치 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 E488Q를 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 V351I, V351L, V351F, V351M, V351C, V351A, V351G, V351P, V351T, V351S, V351Y, V351W, V351Q, V351N, V351H, V351E, V351D, V351K, V351R, T375I, T375L, T375V, T375F, T375M, T375C, T375A, T375G, T375P, T375S, T375Y, T375W, T375Q, T375N, T375H, T375E, T375D, T375K, T375R, R455I, R455L, R455V, R455F, R455M, R455C, R455A, R455G, R455P, R455T, R455S, R455Y, R455W, R455Q, R455N, R455H, R455E, R455D, R455K로부터 선택된 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제는 돌연변이 E488Q를 포함하고, 추가로 V351I, V351L, V351F, V351M, V351C, V351A, V351G, V351P, V351T, V351S, V351Y, V351W, V351Q, V351N, V351H, V351E, V351D, V351K, V351R, T375I, T375L, T375V, T375F, T375M, T375C, T375A, T375G, T375P, T375S, T375Y, T375W, T375Q, T375N, T375H, T375E, T375D, T375K, T375R, R455I, R455L, R455V, R455F, R455M, R455C, R455A, R455G, R455P, R455T, R455S, R455Y, R455W, R455Q, R455N, R455H, R455E, R455D, R455K로부터 선택된 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다.
C에서 U로의 탈아미노화 활성을 갖는 앞서 언급한 변형된 ADAR 단백질과 관련하여, 본 명세서에 기재된 발명은 또한 표적 RNA 또는 DNA에 본 명세서에 개시된 AD-작용화된 조성물을 전달하는 단계를 포함하는, 관심 대상의 표적 RNA 서열에서 C를 탈아미노화시키는 방법에 관한 것이다.
소정의 예시적 실시형태에서, 표적 RNA 서열에서 C를 탈아미노화시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 표적 RNA로, (a) 촉매적으로 비활성인 (데드) Cas; (b) 직접 반복부 서열에 연결된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자; 및 (c) C-대-U 탈아미노화 활성을 갖는 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매적 도메인을 전달하는 단계를 포함하고, 상기 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매적 도메인은 상기 데드 Cas 단백질 또는 상기 가이드 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되거나 또는 전달 후에 이에 연결되기에 적합하게 되고; 가이드 분자는 상기 데드 Cas 단백질과 복합체를 형성하고, 상기 복합체가 상기 관심 대상의 표적 RNA 서열에 결합하도록 지시하며; 상기 가이드 서열은 상기 C를 포함하는 표적 서열과 하이브리드화하여 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있고; 선택적으로, 상기 가이드 서열은 상기 C에 대응하는 위치에서 비쌍형성 A 또는 U를 포함하고 형성된 RNA 듀플렉스에 미스매치를 초래하며; 상기 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매적 도메인은 상기 RNA 듀플렉스의 상기 C를 탈아미노화시킨다.
C-대-U 탈아미드화 활성을 갖는 상기 언급된 변형된 ADAR 단백질과 관련하여, 본 명세서에 기술된 방법은 또한 (a) 직접 반복부 서열에 연결된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자, 또는 상기 가이드 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (b) 촉매적으로 불활성인 Cas13 단백질, 또는 상기 촉매적으로 불활성인 Cas13 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (c) C-대-U 탈아미드화 활성을 갖는 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매 도메인, 또는 상기 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는, 관심 표적 유전자좌에서 C를 탈아미드화시키는데 적합한 조작된, 비천연 발생 시스템에 관한 것으로서, 상기 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 상기 Cas12 단백질 또는 상기 가이드 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되거나 또는 전달 후 이에 연결되도록 조정되며; 상기 가이드 서열은 RNA 듀플렉스를 형성하도록 C를 포함하는 표적 RNA 서열과 하이브리드화할 수 있고, 임의로는, 상기 가이드 서열은 형성된 RNA 듀플렉스에 미스매치를 초래하는 상기 C에 상응하는 위치에 비쌍형성 A 또는 U를 포함하고, 임의로, 시스템은 (a) 상기 가이드 서열을 포함하는 상기 가이드 분자를 코딩하는 뉴 클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트, (b) 상기 촉매적 불활성 Cas13 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트; 및 (c) 상기 1 또는 제2 조절 엘리먼트 하에 있거나 또는 제3 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결된 C-대-U 탈아미드화 활성을 갖는 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템이고; 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매 도메인을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이 제3 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결되면, 상기 변형된 ADAR 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 발현 이후에 상기 가이드 분자 또는 상기 Cas12에 연결되도록 조정되고, 성분 (a), (b), 및 (c)는 시스템의 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치하고, 임의로는 상기 제1, 제2, 및/또는 제3 조절 엘리먼트는 유도성 프로모터이다.
본 발명의 일 구현예에서, 아데노신 디아미나제의 기질은 이의 DNA 표적에 대한 가이드 분자의 결합 시 형성된 RNA/DNA 헤테로듀플렉스이며, 이어서, CRISPR-Cas 효소와 CRISPR-Cas 복합체를 형성한다. RNA/DNA 또는 DNA/RNA 헤테로듀플렉스는 또한 본 명세서에서 "RNA/DNA 하이브리드", "DNA/RNA 하이브리드" 또는 "이중가닥 기질" 로서 지칭된다.
본 발명에 따르면, 아데노신 디아미나제의 기질은 가이드 분자가 그것의 DNA 표적 (이는 그 후 CRISPR-Cas 효소와 CRISPR-Cas 복합체를 형성한다) 에 결합시 형성되는 RNA/DNAn RNA 듀플렉스이다. 아데노신 디아미나제의 기질은 또한 가이드 분자가 그의 DNA 표적에 결합 시 형성된 RNA/RNA 듀플렉스일 수 있고, 이어서, CRISPR-Cas 효소와의 CRISPR-Cas 복합체를 형성한다. RNA/DNA 또는 DNA/RNAn RNA 듀플레스는 또한 본 명세서에서 "RNA/DNA 하이브리드", "DNA/RNA 하이브리드" 또는 "이중-가닥 기질" 로서 지칭된다. 가이드 분자 및 CRISPR-Cas 효소의 특정 특징이 이하에 상술된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "편집 선택성" 은 아데노신 디아미나제에 의해 편집된 이중가닥 기질 상의 모든 부위의 분율을 지칭한다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 아데노신 디아미나제의 편집 선택성은 이중가닥 기질의 길이 및 2차 구조, 예컨대, 미스매치된 염기, 벌지(bulge) 및/또는 내부 루프의 존재에 의해 영향받는다는 것이 상정된다.
일부 구현예에서, 기질이 50 bp 초과의 완벽히 염기 쌍을 이룬 듀플렉스일 때, 아데노신 디아미나제는 듀플렉스 내의 복수의 아데노신 잔기 (예를 들어, 모든 아데노신 잔기의 50%) 를 탈아미노화할 수 있다. 일부 구현예에서, 기질이 50 bp 보다 짧을 때, 아데노신 디아미나제의 편집 선택성은 표적 아데노신 자리에서의 미스매치의 존재에 의해 영향을 받는다. 특히, 일부 구현예에서, 맞은편 가닥에 미스매치되는 시티딘 (C) 잔기를 갖는 아데노신 (A) 잔기는 높은 효율로 탈아미노화된다. 일부 구현예에서, 맞은편 가닥에 미스매치되는 구아노신 (G) 잔기를 갖는 아데노신 (A) 잔기는 편집 없이 건너뛰어 진다.
특정 구현예에서, 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 세포로 전달되거나 또는 별개 단백질로서 세포 내에서 발현되지만, C2c1 단백질 또는 가이드 분자에 연결될 수 있도록 변형된다. 특정한 구현예에서, 이것은 다양한 박테리오파지 외피 단백질 내에 존재하는 직교성 RNA-결합 단백질 또는 어댑터 단백질/압타머 조합의 사용에 의해 보장된다. 이러한 외피 단백질의 예는 제한없이 MS2, Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ΦCb5, ΦCb8r, ΦCb12r, ΦCb23r, 7s 및 PRR1을 포함한다. 압타머는 천연 발생일 수 있거나 또는 특이적 표적에 결합하도록 시험관내 스크리닝 또는 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)의 반복 라운드를 통해서 조작된 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
특정 구현에에서, 가이드 분자는 어댑터 단백질을 동원할 수 있는 하나 이상의 별개의 RNA 루프(들) 또는 별개의 서열(들)이 제공된다. 가이드 분자는 별개 RNA 루프(들) 또는 별개 서열(들)에 결합할 수 있는 어댑터 단백질을 동원할 수 있는 별개 RNA 루프(들) 또는 별개 서열(들)의 삽입에 의해 C2c1 단백질과 충돌없이 연장될 수 있다. 변형된 가이드 및 C2c1 복합체로 이펙터 도메인을 동원시키는데서 그들의 용도가 문헌 [Konermann (Nature 2015, 517(7536): 583- 588)]에 제공된다. 특정 구현예에서, 압타머는 포유동물 세포에서 이량체화된 MS2 박테리오파지 외피 단백질에 선택적으로 결합하고, 가이드 분자, 예컨대 스템루프 및/또는 테트라루프 내에 도입되는 최소 헤어핀 압타머이다. 이들 구현예에서, 아데노신 디아미나제 단백질은 MS2에 융합된다. 아데노신 디아미나제 단백질은 CRISPR-Cas 단백질 및 상응하는 가이드 RNA와 함께 공동-전달된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 C2c1-ADAR 염기 편집 시스템은 (a) 촉매적 불활성 또는 닉카제인 C2c1 단백질; (b) 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자; 및 (c) 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매적 도메인을 포함하고, 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매적 도메인은 C2c1 단백질 또는 가이드 분자에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되거나 또는 전달 후에 이에 연결되도록 적합화되고; 가이드 서열은 표적 서열에 실질적으로 상보성이지만, 탈아미노화를 위해 표적화되는 A에 상응하는 비쌍형성 C를 포함하여, 가이드 서열 및 표적 서열에 의해 형성된 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스에 A-C 미스매치를 초래한다. 진핵생물 세포에서 적용을 위해, C2c1 단백질 및/또는 아데노신 디아미나제는 바람직하게 NLS-태그화된다.
일부 구현예에서, 성분 (a), (b) 및 (c)는 리보핵단백질 복합체로서 세포로 전달된다. 리보핵단백질 복합체는 하나 이상의 지질 나노입자를 통해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 성분 (a), (b) 및 (c)는 하나 이상의 RNA 분자, 예컨대 하나 이상의 가이드 RNA 및 C2c1 단백질, 아데노신 디아미나제 단백질, 및 임의로는 어댑터 단백질을 코딩하는 하나 이상의 mRNA 분자로서 세포로 전달된다. RNA 분자는 하나 이상의 지질 나노입자를 통해서 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 성분 (a), (b) 및 (c)는 하나 이상의 DNA 분자로서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 DNA 분자는 하나 이상의 벡터 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV) 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 DNA 분자는 C2c1 단백질, 가이드 분자, 및 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인을 발현하도록 작동적으로 구성된 하나 이상의 조절 엘리먼트를 포함하고, 임의로는 하나 이상의 조절 엘리먼트는 유도성 프로모터를 포함한다.
일부 구현에에서 가이드 분자는 표적 유전자좌에서 제1 DNA 가닥 또는 RNA 가닥 내에 탈아미드화되는 아데닌을 포함하는 표적 서열과 하이브리드화할 수 있어서 상기 아데닌에 대항한 비쌍형성 시토신을 포함하는 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스를 형성한다. 듀플렉스 형성 시, 가이드 분자는 C2c1 단백질과 복합체를 형성하고, 관심 표적 유전자좌에서 상기 복합체가 상기 제1 DNA 가닥 또는 상기 RNA 가닥에 결합하도록 유도한다. C2c1-ADAR 염기 편집 시스템의 가이드의 양상에 대한 상세 설명은 하기 본 명세서에서 제공된다.
일부 구현에에서, 정규 길이 (예를 들어, AsCas13의 경우 약 20 nt)를 갖는 C2c1 가이드 RNA는 표적 DNA 또는 RNA와 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스를 형성시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, 정규 길이보다 긴 (예를 들어, AsCas13의 경우 >20 nt) C2c1 가이드 분자는 C2c1-가이드 RNA-표적 DNA 복합체의 외부를 포함하는 표적 DNA 또는 RNA와 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스를 형성시키는데 사용된다. 일정 예의 구현예에서, 가이드 서열은 상기 표적 서열과 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스를 형성할 수 있는 약 29 내지 53 nt의 길이를 갖는다. 일정 예의 다른 구현예에서, 가이드 서열은 상기 표적 서열과 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스를 형성할 수 있는 약 40 내지 50 nt의 길이를 갖는다. 일정 예의 구현예에서, 상기 가이드 서열의 5' 말단과 상기 비-쌍형성 C 사이의 거리는 20-30개 뉴클레오티드이다. 일정 예의 구현예에서, 상기 가이드 서열의 3' 말단과 상기 비-쌍형성 C 사이의 거리는 20-30개 뉴클레오티드이다.
적어도 제1 디자인에서, C2c1-ADAR 시스템은 (a) C2c1 단백질에 융합 또는 연결된 아데노신 디아미나제로서, C2c1 단백질은 촉매적으로 불활성이거나 또는 닉카제인 것인 아데노신 디아미나제, 및 (b) 가이드 서열과 표적 서열 간에 형성된 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스에 A-C 미스매치를 도입시키도록 설계된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 단백질 및/또는 아데노신 디아미나제는 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 모두 상에서, NLS-태그화된다.
적어도 제2 디자인에서, C2c1-ADAR 시스템은 (a) 촉매적으로 불활성이거나 또는 닉카제인 C2c1 단백질, (b) 가이드 서열 및 표적 서열 간에 형성된 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스에 A-C 미스매치를 도입시키기 위해 디자인된 가이드 서열, 및 어댑터 단백질 (예를 들어, MS2 외피 단백질 또는 PP7 외피 단백질)에 결합할 수 있는 압타머 서열 (예를 들어, MS2 RNA 모티프 또는 PP7 RNA 모티프)를 포함하는 가이드 분자, 및 (c) 어댑터 단백질에 융합 또는 연결된 아데노신 디아미나제로서, 압타머와 어댑터 단백질의 결합이 A-C 미스매치의 A에서 표적화된 탈아미노화를 위해 가이드 서열과 표적 서열 간에 형성된 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스로 아데노신 디아미나제를 동원하는 것인 아데노신 디아미나제를 포함한다. 일부 구현예에서, 어댑터 단백질 및/또는 아데노신 디아미나제는 N-말단 또는 C-말단 또는 둘 모두 상에서, NLS-태그화된다. C2c1 단백질은 또한 NLS-태그화될 수 있다.
상이한 압타머 및 상응하는 어댑터 단백질의 사용은 또한 직교성 유전자 편집을 제공할 수 있게 한다. 아데노신 디아미나제를 직교성 유전자 편집/탈아미노화를 위해 시티딘 디아미나제와 조합하여 사용하는 일례에서, 상이한 유전자좌를 표적화하는 sgRNA는 각각 MS2-아데노신 디아미나제 및 PP7-시티딘 디아미나제 (또는 PP7-아데노신 디아미나제 및 MS2-시티딘 디아미나제)를 동원하기 위해 별개의 RNA 루프에 의해 변형되어서, 각각 관심 표적 유전자좌에서 A 또는 C의 직교성 탈아미노화를 일으킨다. PP7은 박테리오파지 슈도모나스(Pseudomonas)의 RNA-결합 외피 단백질이다. MS2 처럼, 이것은 특별한 RNA 서열 및 2차 구조에 결합된다. PP7 RNA-인식 모티프는 MS2와 별개이다. 결과적으로, PP7 및 MS2는 상이한 게놈 유전자좌에서 동시에 별개의 효과를 매개하도록 다중복합체화될 수 있다. 예를 들어, 유전자좌 A를 표적화하는 sgRNA는 MS2 루프에 의해 변형되어서, MS2-아데노신 디아미나제를 동원하는 한편, 유전자좌 B를 표적화하는 다른 sgRNA는 PP7 루프에 의해 변형되어, PP7-시티딘 디아미나제를 동원한다. 따라서 동일한 세포에서, 직교성, 유전자좌-특이적 변형을 인지한다. 이러한 원리는 다른 직교성 RNA-결합 단백질을 도입시키기 위해 확대될 수 있다.
적어도 제3 디자인에서, C2c1-ADAR CRISPR 시스템은 (a) C2c1 단백질의 내부 루프 또는 비구조화 영역에 삽입된 아데노신 디아미나제로서, C2c1 단백질은 촉매적으로 불활성이거나 또는 닉카제인 아데노신 디아미나제, 및 (b) 가이드 서열 및 표적 서열 간에 형성된 DNA-RNA 또는 RNA-RNA 듀플렉스에 A-C 미스매치를 도입하도록 설계된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자를 포함한다.
아데노신 디아미나제의 삽입에 적합한 C2c1 단백질 분할 부위는 결정 구조의 도움으로 확인될 수 있다. 예를 들어, AacC2c1 돌연변이체의 경우에, 예를 들어 서열 정렬을 위한 상응하는 위치가 무엇인지 쉽게 이해될 것이다. 다른 C2c1 단백질의 경우에 오솔로그와 의도하는 C2c1 단백질 간에 비교적 높은 정도의 상동성이 존재하면 오솔로그의 결정 구조를 사용할 수 있다.
분할 위치는 영역 또는 루프 내에 위치될 수 있다. 바람직하게, 분할 위치는 아미노산 서열의 파괴가 구조적 특성 (예를 들어, 알파-나선 또는 베타-시트)의 부분 또는 완전 파괴를 초래하지 않는 곳에서 발생된다. 비구조화된 영역 (이들 영역이 결정 내에서 "동결" 되기에 충분하게 구조화되지 않기 때문에 결정 구조에서 나타나지 않는 영역)이 종종 바람직한 선택사항이다. C2c1의 표면 상에 노출된 모든 비구조적 영역에서 분할은 본 발명의 실시에서 계획된다. 비구조화된 영역 또는 외부 루프 내 위치는 정확하게 상기 제공된 번호일 필요는 없지만, 분할 위치가 루프 외부의 비구조화된 영역 내에 여전히 위치되는 한, 루프의 크기에 따라서, 상기 제공된 위치의 양쪽 측면에서 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산에 따라 다양할 수 있다.
본 명세서에 기재된 C2c1-ADAR CRISPR 시스템은 탈아미노화를 위해 DNA 서열 내에서 특정 아데닌을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 가이드 분자는 C2c1 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 관심 대상의 표적 유전자좌에서 복합체가 표적 서열에 결합하도록 지시한다. 가이드 서열이 비쌍형성 C를 갖도록 설계되기 때문에, 가이드 서열과 표적 서열 사이에 형성된 헤테로듀플렉스은 아데노신 디아미나제가 비쌍형성 C와 마주보는 A와 접촉하여 탈아미노화시키고, 이를 이노신 (I)으로 전환시키도록 지시하는, A-C 미스매치를 포함한다. 이노신 (I) 염기는 C 와 쌍을 이루고 세포 과정에서 G 와 같이 기능하므로, 본원에 기재된 A 의 표적화된 탈아미노화는 원하지 않는 G-A 및 C-T 돌연변이의 보정, 뿐만 아니라 바람직한 A-G 및 T-C 돌연변이의 수득에 유용하다.
염기 절제 복구 억제제
일부 구현예에서, AD-작용화된 CRISPR 시스템은 염기 절제 복구 (base excision repair: BER) 억제제를 추가로 포함한다. 임의의 특정 이론에 국한하고 싶지 않지만, I:T 쌍형성의 존재에 대한 세포의 DNA-복구 반응은 세포 내 핵염기 편집 효율의 감소를 초래할 수 있다. 알킬아데닌 DNA 글리코실라제 (또한 DNA-3-메틸아데닌 글리코실라제, 3-알킬아데닌 DNA 글리코실라제, 또는 N-메틸퓨린 DNA 글리코실라제로서 알려짐)는 세포에서 DNA로부터 하이포잔틴의 제거를 촉매하는데, 이는 결과로서 I:T 쌍의 A:T 쌍으로의 반전과 함께 염기 절제 복구를 개시한다.
일부 구현예에서, BER 억제제는 알킬아데닌 DNA 글리코실라제의 억제제이다. 일부 구현예에서, BER 억제제는 인간 알킬아데닌 DNA 글리코실라제의 억제제이다. 일부 구현예에서, BER 억제제는 폴리펩티드 억제제이다. 일부 구현예에서, BER 억제제는 하이포잔틴에 결합하는 단백질이다. 일부 구현예에서, BER 억제제는 DNA에서 하이포잔틴에 결합하는 단백질이다. 일부 구현예에서, BER 억제제는 촉매적 불활성인 알킬아데닌 DNA 글리코실라제 단백질 또는 이의 결합 도메인이다. 일부 구현예에서, BER 억제제는 DNA로부터 하이포잔틴을 절단하지 않는 촉매적 불활성인 알킬아데닌 DNA 글리코실라제 단백질 또는 이의 결합 도메인이다. 알킬아데닌 DNA 글리코실라제 염기-절단 복구 효소를 억제할 수 있는 (예를 들어, 입체적으로 차단하는) 다른 단백질은 본 개시내용의 범주 내이다. 추가적으로, 염기-절단 복구를 차단 또는 억제하는 임의의 단백질은 본 개시내용의 범주 내이다.
임의의 특정 이론으로 구속되는 일 없이, 염기 절제 복구sms 편집된 가닥에 결합하고/하거나, 편집 염기를 차단하고/하거나, 알킬아데닌 DNA 글리코실라제를 억제하고/하거나, 염기 절제 복구를 억제하고/하거나, 편집 염기를 보호하고/하거나 비편집 가닥의 고정을 촉진시키는 분자에 의해 억제될 수 있다. 본 명세서에 기재된 BER 억제제의 사용은 A의 I로의 변화를 촉매할 수 있는 아데노신 디아미나제의 편집 효율을 증가시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
따라서, 상기 논의한 AD-작용화된 CRISPR 시스템의 제1 디자인에서, CRISPR-Cas 단백질 또는 아데노신 디아미나제는 BER 억제제(예를 들어, 알킬아데닌 DNA 글리코실라제의 억제제)에 융합되거나 또는 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, BER 억제제는 하기 구조 중 하나로 포함될 수 있다 (nC2c1=C2c1 닉카제; dC2c1=데드 C2c1):[AD]-[선택적 링커]-[nC2c1/dC2c1]-[선택적 링커]-[BER 억제제]; [AD]-[선택적 링커]-[BER 억제제]-[선택적 링커]-[nC2c1/dC2c1]; [BER 억제제]-[선택적 링커]-[AD]-[선택적 링커]-[nC2c1/dC2c1]; [BER 억제제]-[선택적 링커]-[nC2c1/dC2c1]-[선택적 링커]-[AD]; [nC2c1/dC2c1]-[선택적 링커]-[AD]-[선택적 링커]-[BER 억제제]; [nC2c1/dC2c1]-[선택적 링커]-[BER 억제제]-[선택적 링커]-[AD].
유사하게는, 상기 논의한 AD-작용화된 CRISPR 시스템의 제2 디자인에서, CRISPR-Cas 단백질, 아데노신 디아미나제 또는 어댑터 단백질이 BER 억제제 (예를 들어, 알킬아데닌 DNA 글리코실라제의 억제제)에 융합되거나 또는 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, BER 억제제는 하기 구조 중 하나로 포함될 수 있다 (nC2c1=C2c1 닉카제; dC2c1=데드 C2c1):[nC2c1/dC2c1]-[선택적 링커]-[BER 억제제]; [BER 억제제]-[선택적 링커]-[nC2c1/dC2c1]; [AD]-[선택적 링커]-[어댑터]-[선택적 링커]-[BER 억제제]; [AD]-[선택적 링커]-[BER 억제제]-[선택적 링커]-[어댑터]; [BER 억제제]-[선택적 링커]-[AD]-[선택적 링커]-[어댑터]; [BER 억제제]-[선택적 링커]-[어댑터]-[선택적 링커]-[AD]; [어댑터]-[선택적 링커]-[AD]-[선택적 링커]-[BER 억제제]; [어댑터]-[선택적 링커]-[BER 억제제]-[선택적 링커]-[AD].
상기 논의한 AD-작용화된 CRISPR 시스템의 제3 디자인에서, BER 억제제는 CRISPR-Cas 단백질의 내부 루프 또는 비구조화된 영역에 삽입될 수 있다.
시티딘 디아미나제
일부 구현예에서, 디아미나제는 시티딘 디아미나제이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "시티딘 디아미나제" 또는 "시티딘 디아미나제 단백질" 은 이하에 표시된 바와 같이, 시토신 (또는 분자의 시토신 모이어티)을 우라실 (또는 분자의 우라실 모이어티)으로 전환시키는 가수분해 탈아미노화 반응을 촉매할 수 있는 단백질, 폴리펩티드, 또는 단백질 또는 폴리펩티드의 하나 이상의 기능성 도메인(들)에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 시토신-함유 분자는 시티딘(C)이고, 우라실-함유 분자는 우리딘(U)이다. 시토신-함유 분자는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있다.
Figure pct00022
본 개시에 따라서, 본 개시와 함께 사용할 수 있는 시티딘 디아미나제는 제한없이 아포리포단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 디아미나제로서 알려진 효소 패밀리의 멤버, 활성화-유도된 디아미나제 (AID), 또는 시티딘 디아미나제 1 (CDA1)을 포함한다. 특정 구현예에서, 디아미나제는 APOBEC1 디아미나제, APOBEC2 디아미나제, APOBEC3A 디아미나제, APOBEC3B 디아미나제, APOBEC3C 디아미나제, 및 APOBEC3D 디아미나제, APOBEC3E 디아미나제, APOBEC3F 디아미나제, APOBEC3G 디아미나제, APOBEC3H 디아미나제, 또는 APOBEC4 디아미나제이다.
본 발명의 방법 및 시스템에서, 시티딘 디아미나제는 DNA 단일 가닥의 시토신을 표적화할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 결합 성분, 예를 들어 결합된 Cas13의 외부에 존재하는 단일 가닥 상에서 편집할 수 있다. 다른 예의 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 국재된 버블, 예컨대 표적 편집 부위이지만 가이드 서열에서 미스매치에 의해 형성된 국재된 버블에서 편집할 수 있다. 일정 예의 구현예에서 시티딘 디아미나제는 [Kim et al., Nature Biotechnology (2017) 35(4):371-377 (doi:10.1038/nbt.3803]에 개시된 것과 같은 국소 활성을 돕는 돌연변이를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 포유동물, 조류, 개구리, 오징어, 어류, 파리 및 벌레를 포함하지만, 제한없이, 1종 이상의 후생동물 종으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 인간, 영장류, 소, 개, 래트, 또는 마우스 시티딘 디아미나제이다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 hAPOBEC1 또는 hAPOBEC3을 포함한 인간 POBEC이다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 인간 AID이다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제 단백질은 RNA 듀플렉스의 단일 가닥 버블의 하나 이상의 표적 시토신 잔기(들)를 인식하여 우라실 잔기(들)로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제 단백질은 RNA 듀플렉스의 단일 가닥 버블 상의 결합창을 인식한다. 일부 구현예에서, 결합창은 적어도 하나의 표적 시토신 잔기(들)를 함유한다. 일부 구현예에서, 결합창은 약 3 bp 내지 약 100 bp 범위이다. 일부 구현예에서, 결합창은 약 5 bp 내지 약 50 bp 범위이다. 일부 구현예에서, 결합창은 약 10 bp 내지 약 30 bp 범위이다. 일부 구현예에서, 결합창은 약 1 bp, 2 bp, 3 bp, 5 bp, 7 bp, 10 bp, 15 bp, 20 bp, 25 bp, 30 bp, 40 bp, 45 bp, 50 bp, 55 bp, 60 bp, 65 bp, 70 bp, 75 bp, 80 bp, 85 bp, 90 bp, 95 bp, 또는 100 bp 이다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제 단백질은 하나 이상의 디아미나제 도메인을 포함한다. 특정 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하지는 않지만, 디아미나제 도메인은 RNA 듀플렉스 단일-가닥 버블에 함유된 하나 이상의 표적 시토신 (C) 잔기(들)를 인식하고, 이를 우라실 (U) 잔기(들)로 전환시키는 작용을 하는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 디아미나제 도메인은 활성 중심을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성 중심은 아연 이온을 포함한다. 일부 구현예에서, 활성 중심 내 또는 근처의 아미노산 잔기는 표적 시토신 잔기에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드(들) 5'과 상호작용한다. 일부 구현예에서, 활성 중심 내 또는 근처의 아미노산 잔기는 표적 시토신 잔기에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드(들) 3'과 상호작용한다.
일부 실시형태에서, 아데노신 디아미나제는 인간 APOBEC1 완전 단백질(hAPOBEC1) 또는 이의 디아미나제 도메인(hAPOBEC1-D) 또는 C-말단 절두된 버전 (hAPOBEC-T)을 포함한다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 hAPOBEC1, hAPOBEC-D 또는 hAPOBEC-T에 상동성인 APOBEC 패밀리 멤버이다. 일부 실시형태에서, 시티딘 디아미나제는 인간 AID1 완전 단백질(hAID) 또는 이의 디아미나제 도메인(hAID-D) 또는 이의 C-말단 절두 형태 (hAID-T)를 포함한다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 hAID, hAID-D 또는 hAID-T에 상동성인 AID 패밀리 멤버이다. 일부 구현예에서, hAID-T는 약 20개 아미노산이 C-말단 절두된 hAID이다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 시토신 디아미나제의 야생형 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 시토신 디아미나제의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도가 특정 필요에 따라 변화되도록, 시토신 디아미나제 서열에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
APOBEC1 및 APOBEC3 단백질의 일정 돌연변이는 [Kim et al., Nature Biotechnology (2017) 35(4):371-377 (doi:10.1038/nbt.3803)]; 및 [Harris et al. Mol. Cell (2002) 10:1247-1253]에 기술되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
일구 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 인간 APOBEC3G에서 W285, R313, D316, D317X, R320, 또는 R326에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 래트 APOBEC1, 또는 APOBEC3G 디아미나제의 W90, R118, H121, H122, R126, 또는 R132에 상응하는 아미노산 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 APOBEC1 디아미나제이다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 래트 APOBEC1 아미노산 서열의 트립토판90, 또는 상동성 APOBEC 단백질 내 상응하는 위치, 예컨대 APOBEC3G의 트립토판 285에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 90의 트립토판 잔기는 티로신 또는 페닐알라닌 잔기 (W90Y 또는 W90F)로 치환된다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 래트 APOBEC1 아미노산 서열의 아르기닌 118, 또는 상동성 APOBEC 단백질의 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 118의 아르기닌 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다 (R118A).
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 래트 APOBEC1 아미노산 서열의 히스티딘121, 또는 상동성 APOBEC 단백질의 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 121의 히스티딘 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (H121R).
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 래트 APOBEC1 아미노산 서열의 히스티딘122, 또는 상동성 APOBEC 단백질의 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 122의 히스티딘 잔기는 아르기닌 잔기로 치환된다 (H122R).
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 래트 APOBEC1 아미노산 서열의 아르기닌126, 또는 상동성 APOBEC 단백질의 상응하는 위치, 예컨대 APOBEC3G의 아르기닌320에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 126의 아르기닌 잔기는 알라닌 잔기 (R126A) 또는 글루탐산 (R126E)으로 치환된다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 APOBEC1 아미노산 서열의 아르기닌132, 또는 상동성 APOBEC 단백질의 상응하는 위치에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 132의 아르기닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환된다 (R132E).
일부 구현예에서, 편집창의 너비를 좁히기 위해서, 시티딘 디아미나제는 래트 APOBEC1의 아미노산 서열 위치를 기반으로, 돌연변이: W90Y, W90F, R126E 및 R132E, 및 상기에 상응하는 상동성 APOBEC 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 편집 효율을 감소시키기 위해서, 시티딘 디아미나제는 래트 APOBEC1의 아미노산 서열 위치를 기반으로, 돌연변이: W90A, R118A, R132E, 및 상기에 상응하는 상동성 APOBEC 단백질의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, 오프-표적 효과를 감소시키기 위해서 효율이 감소된 시티딘 디아미나제 효소를 사용하는 것이 흥미로울 수 있다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 야생형 래트 APOBEC1 (rAPOBEC1, 또는 이의 촉매 도메인이다. 일부 구현예에서, rAPOBEC1의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도가 특정 필요에 따라 변화되도록, 아데노신 디아미나제는 rAPOBEC1 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
rAPOBEC1:
Figure pct00023
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 야생형 인간 APOBEC1 (hAPOBEC1), 또는 이의 촉매 도메인이다. 일부 구현예에서, hAPOBEC1의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도가 특정 필요에 따라 변화되도록, 시티딘 디아미나제는 hAPOBEC1 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
APOBEC1:
Figure pct00024
Figure pct00025
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 야생형 인간 APOBEC3G (hAPOBEC3G), 또는 이의 촉매 도메인이다. 일부 구현예에서, hAPOBEC3G의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도가 특정 필요에 따라 변화되도록, 시티딘 디아미나제는 hAPOBEC3G 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
hAPOBEC3G:
Figure pct00026
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 야생형 페트로마이존 마리너스 (Petromyzon marinus) CDA1 (pmCDA1), 또는 이의 촉매 도메인이다. 일부 구현예에서, pmCDA1의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도가 특정 필요에 따라 변화되도록, 시티딘 디아미나제는 pmCDA1 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
pmCDAl:
Figure pct00027
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 야생형 인간 AID (hAID), 또는 이의 촉매 도메인이다. 일부 구현예에서, pmCDA1의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도가 특정 필요에 따라 변화되도록, 시티딘 디아미나제는 pmCDA1 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
hAID:
Figure pct00028
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 hAID의 절두 형태 (hAID-DC), 또는 이의 촉매 도메인이다. 일부 구현예에서, hADAR2-D의 편집 효율, 및/또는 기질 편집 선호도가 특정 필요에 따라 변화되도록, 아데노신 디아미나제는 hADAR2-D 서열에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
hAID-DC:
Figure pct00029
시티딘 디아미나제의 추가 구현예는 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 발명의 명칭: "Nucleobase Editor and Uses Thereof" 의 WO2017/070632에 개시된다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 탈아미노화 편집에 감수성인 뉴클레오티드를 포함하는 효율적인 탈아미노화 창을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, "편집 창 폭" 은 시티딘 디아미나제의 편집 효율이 표적 부위에 대하여 반수-최대 값을 초과하는 주어진 표적 부위에서의 뉴클레오티드 위치의 수를 말한다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 약 1 내지 약 6 개의 범위의 뉴클레오티드의 편집 창 폭을 갖는다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제의 편집 창 폭은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 뉴클레오티드이다.
이론에 국한하려는 의도는 아니나, 일부 구현예에서, 링커 서열의 길이가 편집 창 폭에 영향을 미치는 것으로 고려된다. 일부 구현예에서, 편집 창 폭은 링커 길이가 연장되면서 (예를 들어, 약 3 내지 약 21개 아미노산), 증가된다 (예를 들어, 약 3 내지 약 6개 뉴클레오티드). 비제한적인 예에서, 16-잔기 링커는 약 5개 뉴클레오티드의 효율적인 탈아미노화 창을 제공한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 길이는 편집 창 폭에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 단축은 시티딘 디아미나제의 좁은 효율적인 탈아미노화 창을 야기한다.
일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제에 대한 돌연변이는 편집 창 폭에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, CD-기능화된 CRISPR 시스템의 시티딘 디아미나제 성분은 디아미나제가 DNA 결합 사건 당 다수 시티딘의 탈아미노화를 방지하도록, 시티딘 디아미나제의 촉매 효율을 삼소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, APOBEC1의 잔기 90에서의 트립토판(W90) 또는 상동성 서열에서의 상응하는 트립토판 잔기가 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 촉매적 불활성화 Cas13은 W90Y 또는 W90F 돌연변이를 포함하는 APOBEC1 돌연변이체에 융합 또는 연결된다. 일부 구현예에서, APOBEC3G의 잔기 285의 트립토판(W285) 또는 상동성 서열에서의 상응하는 트립토판 잔기가 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 촉매적 불활성화 Cas13은 W285Y 또는 W285F 돌연변이를 포함하는 APOBEC3G 돌연변이체에 융합 또는 연결된다.
일부 구현예에서, Cd-기능화된 CRISPR 시스템의 시티딘 디아미나제 성분은 디아미나제 활성 부위에 시티딘의 비최적 제시에 대한 내성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 디아미나제 활성 부위의 기질 결합 활성을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 인식되고, 디아미나제 활성 부위에 의해 결합될 DNA의 입체형태를 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 디아미나제 활성 부위에 대한 기질 접근 가능성을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, APOBEC1의 잔기 126의 아르기닌(R126) 또는 상동성 서열에서의 상응하는 아르기닌 잔기가 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 촉매적 불활성화 Cas13은 R126A 또는 R126E 돌연변이를 포함하는 APOBEC1 돌연변이체에 융합 또는 연결된다. 일부 구현예에서, APOBEC3G의 잔기 320의 트립토판(R320) 또는 상동성 서열에서의 상응하는 아르기닌 잔기가 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 촉매적 불활성화 Cas13은 R320A 또는 R320E 돌연변이를 포함하는 APOBEC3G 돌연변이체에 융합 또는 연결된다. 일부 구현예에서, APOBEC1의 잔기 132의 아르기닌(R132) 또는 상동성 서열에서의 상응하는 아르기닌 잔기가 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 촉매적 불활성화 Cas13은 R132E 돌연변이를 포함하는 APOBEC1 돌연변이체에 융합 또는 연결된다.
일부 구현예에서, CD-기능화된 CRISPR 시스템의 APOBEC1 도메인은 W90Y, W90F, R126A, R126E, 및 R132E로부터 선택된 하나, 둘, 또는 3개 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, APOBEC1 도메인은 W90Y 및 R126E의 이중 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, APOBEC1 도메인은 W90Y 및 R132E의 이중 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, APOBEC1 도메인은 R126E 및 R132E의 이중 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, APOBEC1 도메인은 W90Y, R126E 및 R132E의 3개의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 시티딘 디아미나제의 하나 이상의 돌연변이는 편집 창 폭을 약 2 개의 뉴클레오티드로 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 시티딘 디아미나제의 하나 이상의 돌연변이는 편집 창 폭을 약 1 개의 뉴클레오티드로 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 시티딘 디아미나제의 하나 이상의 돌연변이는 효소의 편집 효율에 오직 최소로 또는 중등으로 영향을 미치면서, 편집 창 폭을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 시티딘 디아미나제의 하나 이상의 돌연변이는 효소의 편집 효율을 감소시키지 않고, 편집 창 폭을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 시티딘 디아미나제의 하나 이상의 돌연변이는 다르게 시티딘 디아미나제에 의하여 유사한 효율로 편집될 이웃 시티딘 뉴클레오티드의 식별을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, 아데노신 디아미나제 단백질은 이중 가닥 핵산 기질을 인식하고 결합하기 위해서 하나 이상의 이중 가닥 RNA (dsRNA) 결합 모티프 (dsRBM) 또는 도메인 (dsRBD)를 더 포함하거나 또는 그에 연결된다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제 및 기질 간 상호작용은 CRISPR/CAS 단백질 인자를 포함하여, 하나 이상의 추가 단백질 인자(들)에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제 및 기질 간 상호작용은 가이드 RNA를 포함하여, 하나 이상의 핵산 성분(들)에 의해 더욱 매개된다.
본 발명에 따라서, 시티딘 디아미나제의 기질은 CRISPR-Cas 효소와 CRISPR-Cas 복합체를 형성하게 되는 이의 DNA 표적과 가이드 분자의 결합 시 시티딘 디아미나제에 접근가능하게 만든, 관심 시토신을 포함하는 RNA 듀플렉스의 DNA 단일 가닥 버블이고, 그리하여 시토신 디아미나제는 CRISPR-Cas 복합체의 하나 이상의 성분, 즉 CRISPR-Cas 효소 및/또는 가이드 분자에 융합되거나 또는 결합될 수 있다. 가이드 분자 및 CRISPR-Cas 효소의 특별한 특색은 아래에 상세히 기재되어 있다.
염기 편집 가이드 분자 디자인 고려사항
일부 구현예에서, 가이드 서열은 10 내지 50 nt 길이, 보다 특히 약 20-30 nt, 유리하게 약 20 nt, 23-25 nt 또는 24 nt의 RNA 서열이다. 염기 편집 구현예에서, 가이드 서열은 탈아미노화되는 아데노신을 포함하는 표적 서열과의 하이브리드화를 보장하도록 선택된다. 이것은 하기에 보다 상술된다. 선택은 탈아미노화의 효율 및 특이성을 증가시키는 단계를 더 포괄한다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 20 nt 내지 약 30 nt 길이이고 표적 DNA 가닥과 하이브리드화하여 표적 아데노신 부위에서 dA-C 미스매치를 갖는 것을 제외하고는, 거의 완벽하게 일치되는 듀플렉스를 형성한다. 특히, 일부 구현예에서, dA-C 미스매치는 표적 서열의 중심 (따라서 표적 서열과 가이드 서열의 하이브리드화 시 듀플렉스의 중심에 가깝게 위치되어서, 아데노신 디아미나제를 협소한 편집창 (예를 들어, 약 4 bp 너비)으로 제한시킨다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 탈아미노화하려는 하나 초과의 표적 아데노신을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서 표적 서열은 표적 아데노신 부위의 3'에 하나 이상의 dA-C 미스매치를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열 내 의도하지 않은 아데닌 부위에서 오프-표적 편집을 피하기 위해서, 가이드 서열은 일정 아데노신 디아미나제 예컨대 ADAR1 및 ADAR2에 대해 촉매적으로 비호의적인, dA-G 미스매치를 도입시키기 위해 상기 의도하지 않은 아데닌에 상응하는 위치에 비-쌍형성 구아닌을 포함하도록 디자인될 수 있다. 본 명세서에 그 전문이 참조로 편입되는 [Wong et al., RNA 7:846858 (2001)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 정규 길이를 갖는 Cas12b 가이드 서열(예를 들어, AsCpf1에 대해 약 20 nt)을 사용하여 표적 DNA를 갖는 헤테로듀플렉스을 형성한다. 일부 구현예에서, 정규 길이 보다 긴 Cas12b 가이드 분자(예를 들어, AsCpf1에 대해 >20 nt)를 사용하여 Cas12b-가이드 RNA-표적 DNA 복합체 바깥을 포함하는 표적 DNA와 헤테로듀플렉스을 형성한다. 이것은 소정 스트레치의 뉴클레오티드 내 하나 초과의 아데닌의 탈아미노화에 관심있을 때 특히 흥미로울 수 있다. 대안적인 구현예에서, 정규 가이드 서열 길이의 제한성을 유지시키는 것이 흥미롭다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 Cas12b 가이드의 정규 길이 외부에 dA-C 미스매치를 도입시키도록 디자인되어서, 이것은 아데노신 디아미나제 및 dA-C 미스매치 간 접촉 빈도를 증가시키고 Cas13에 의한 입체 방해를 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 미스매치된 핵염기(예를 들어, 시티딘)의 위치는 PAM이 DNA 표적 상에 있는 경우에 계산된다. 일부 구현예에서, 미스매치된 핵염기는 PAM으로부터 12 내지 21nt, 또는 PAM으로부터 13 내지 21nt, 또는 PAM으로부터 14 내지 21nt, 또는 PAM으로부터 14 내지 20nt, 또는 PAM으로부터 15 내지 20nt, 또는 PAM으로부터 16 내지 20nt, 또는 PAM으로부터 14 내지 19nt, 또는 PAM으로부터 15 내지 19nt, 또는 PAM으로부터 16 내지 19nt, 또는 PAM으로부터 17 내지 19nt, 또는 PAM으로부터 약 20nt, 또는 PAM으로부터 약 19nt, 또는 PAM으로부터 약 18nt, 또는 PAM으로부터 약 17nt, 또는 PAM으로부터 약 16nt, 또는 PAM으로부터 약 15nt, 또는 PAM으로부터 약 14nt에 위치된다. 바람직한 구현예에서, 미스매치된 핵염기는 PAM으로부터 17 내지 19nt 또는 18nt에 위치된다.
미스매치 거리는 Cas12b 스페이서의 3' 말단과 미스매치된 핵염기(예를 들어, 시티딘) 사이의 염기 수이되, 미스매치된 염기는 미스매치 거리 계산의 부분으로서 포함된다. 일부 구현예에서, 미스매치 거리는 1 내지 10nt, 또는 1 내지 9nt, 또는 1 내지 8nt, 또는 2 내지 8nt, 또는 2 내지 7nt, 또는 2 내지 6nt, 또는 3 내지 8nt, 또는 3 내지 7nt, 또는 3 내지 6nt, 또는 3 내지 5nt, 또는 약 2nt, 또는 약 3nt, 또는 약 4nt, 또는 약 5nt, 또는 약 6nt, 또는 약 7nt, 또는 약 8 nt이다. 바람직한 구현예에서, 미스매치 거리는 3 내지 5 nt 또는 4 nt이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 Cas12b-ADAR 시스템의 편집창은 PAM으로부터 12 내지 21nt, 또는 PAM으로부터 13 내지 21nt, 또는 PAM으로부터 14 내지 21nt, 또는 PAM으로부터 14 내지 20nt, 또는 PAM으로부터 15 내지 20nt, 또는 PAM으로부터 16 내지 20nt, 또는 PAM으로부터 14 내지 19nt, 또는 PAM으로부터 15 내지 19nt, 또는 PAM으로부터 16 내지 19nt, 또는 PAM으로부터 17 내지 19nt, 또는 PAM으로부터 약 20nt, 또는 PAM으로부터 약 19nt, 또는 PAM으로부터 약 18nt, 또는 PAM으로부터 약 17nt, 또는 PAM으로부터 약 16nt, 또는 PAM으로부터 약 15nt, 또는 PAM으로부터 약 14 nt이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 Cas12b-ADAR 시스템의 편집창은 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 1 내지 10nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 1 내지 9nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 1 내지 8nt, 또는 Cpf1 스페이서의 3' 말단부로부터 2 내지 8nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 2 내지 7nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 2 내지 6nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 3 내지 8nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 3 내지 7nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 3 내지 6nt, 또는Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 3 내지 5nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 약 2nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 약 3nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 약 4nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 약 5nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 약 6nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 약 7nt, 또는 Cas12b 스페이서의 3' 말단부로부터 약 8 nt이다.
벡터
일반적으로, 그리고 본원에서, 용어 "벡터" 는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 또는 코스미드로, 또 다른 DNA 절편이 그 안에 삽입될 수 있어서, 삽입된 절편의 복제를 유발한다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 엘리먼트와 관련되었을 때 복제가 가능하다.
일부 구현예에서, 본 개시는 CRISPR-Cas 시스템의 하나 이상의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트, 및 i) a) crRNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트, 및 b) tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제3 조절 엘리먼트, 또는 ii) 가이드 서열 및 tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는, Cas12b 벡터 시스템이다. 일부 경우에서, 벡터 시스템은 단일 벡터를 포함한다. 대안적으로, 벡터 시스템은 복수 벡터를 포함한다. 벡터(들)는 바이러스 벡터(들)일 수 있다.
벡터는 제한 없이, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하는, 자유 말단을 포함하지 않는 (예 : 환형) 핵산 분자; DNA, RNA 또는 둘 다를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 다른 종류의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편이 예를 들어, 표준 분자 클로닝 기술에 의해 삽입될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 종류는 바이러스 벡터로서, 바이러스-유래된 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스에 봉입되는 벡터에 존재한다(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스(AAV)). 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내로의 트랜스펙션을 위한, 바이러스가 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그것이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 " 발현 벡터" 로 지칭된다. 진핵생물 세포에서의 발현을 위한 벡터 및 이를 초래하는 벡터는 본 명세서에서 "진핵세포 발현 벡터" 로 지칭될 수 있다. 재조합 DNA 기술에 유용한 통상적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있는데, 이는 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 엘리먼트를 포함하는 것을 의미하며, 하나 이상의 조절 엘리먼트는 발현에 사용될 숙주 세포에 기반하여 선택될 수 있고, 발현될 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동적으로 연결된"은 대상 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 내에서, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 엘리먼트(들)에 연결된 것을 의미하는 의도이다. 유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-연합 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 세포 유형을 표적화하도록 선택된다.
재조합 및 클로닝 방법에 관해, 미국 특허 제20040171156 A1호로서 2004년 9월 2일자로 공개된 미국 특허 출원 제10/815,730호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
용어 "조절 엘리먼트" 는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 다른 발현 제어 엘리먼트 (예를 들어, 전사 종결 신호, 예컨대, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하도록 의도된다. 이와 같은 조절 엘리먼트는, 예를 들어 문헌 [Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다. 조절 엘리먼트는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 장기(예를 들어, 간, 췌장)와 같은 요망되는 관심 조직, 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 유도할 수 있다. 조절 엘리먼트는 시간-의존적 방식으로, 예컨대 세포-주기 의존적 또는 발생 단계 의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있으며, 이것은 조직 특이적이거나 세포-유형 특이적일 수 있거나, 또한 그렇지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 pol I 프로모터), 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. pol II 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서를 가짐), 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서를 가짐)[예를 들어, 문헌 [Boshart et al, Cell, 41:521530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한 용어 "조절 엘리먼트"는 인핸서 엘리먼트, 예컨대 WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR의 R-U5' 절편 (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988); SV40 인핸서; 및 토끼β-글로빈의 엑손 2 및 3 사이의 인트론 서열 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981)을 포괄한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환시키려는 숙주 세포의 선택, 바람직한 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것은 당업자가 이해하게 될 것이다. 벡터는 숙주 세포로 도입될 수 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산에 의해 코딩되는, 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하여, 전사물, 단백질, 또는 펩티드 (예를 들어, CRISPR 전사물, 단백질, 효소, 이의 돌연변이체 형태, 이의 융합 단백질 등)를 생산할 수 있다. 조절 서열에 관해, 미국 특허 출원 제10/491,026호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입된다. 프로모터에 관해, 국제 특허 출원 WO 2011/028929 및 미국 특허 출원 제12/511,940호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-연합 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 세포 유형을 표적화하도록 선택된다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 및 (임의로 변형 또는 돌연변이된) CRISPR 효소 (예를 들어, C2c1)를 위한 바이시스트론 벡터가 이용된다. 가이드 RNA 및 (임의로 변형 또는 돌연변이된) CRISPR 효소에 대한 바이시스트론 발현 벡터가 바람직하다. 일반적으로 특히 이 구현예에서, (임의로 변형 또는 돌연변이된) CRISPR 효소는 바람직하게 CBh 프로모터에 의해서 구동된다. RNA는 바람직하게는 Pol III 프로모터, 예컨대, U6 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 이상적으로는 2개가 조합된다.
벡터는 원핵 또는 진핵생물 세포에서 CRISPR 전사물 (예를 들어, 핵산 전사물, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사물은 박테리아 세포, 예컨대, 에스케리치아 콜라이, 곤충 세포 (배큘로바이러스 발현 벡터를 이용), 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 [Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)] 에 추가로 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.
벡터는 원핵생물 또는 원핵 세포에 도입되고 증식될 수 있다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 진핵생물 세포 내로 도입될 벡터의 복제물을 증식시키기 위해 또는 진핵생물 세포 내로 도입될 벡터 생성에서의 중간 벡터로서 사용된다 (예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 부분으로서 플라스미드를 증폭시킴). 일부 구현예에서, 원핵생물은 벡터의 복제물을 증폭시키기 위해 그리고, 예컨대, 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 전달을 위한 하나 이상의 단백질 공급원을 제공하기 위해 하나 이상의 핵산을 발현시키기 위해 사용된다. 원핵생물 내 단백질의 발현은 융합 또는 비융합 단백질 중 하나의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터로 에스케리치아 콜라이에서 가장 흔히 수행된다. 융합 벡터는 그 안에서 코딩되는 단백질에, 예컨대, 재조합 단백질의 아미노 말단에 다수의 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 하나 이상의 목적, 예컨대: (i) 재조합 단백질 발현을 증가시키고; (ii) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고; (iii) 친화도 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제에 도움을 주는 작용을 할 수 있다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질 절단 부위는 융합 모이어티 및 재조합 단백질의 접합부에 도입되어 융합 단백질의 후속 정제를 위해 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소, 및 그들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다. 예시적 융합 발현 벡터는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 융합시키는, pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31- 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다. 적합한 유도성 비융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301- 315) 및 pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60- 89)를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerivisae)에서 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), 및 picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충 세포에서 단백질 발현을 유도한다. 배양된 곤충 세포 (예를 들어, SF9 세포)에서 단백질의 발현에 이용가능한 배큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈 (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 포유동물 발현 벡터를 이용하여 포유동물 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) 및 pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 전형적으로 하나 이상의 조절 엘리먼트에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마바이러스, 아데노바이러스 2, 거대세포바이러스, 유인원 바이러스 40, 및 본 명세서에 개시되고 당업계에 공지된 다른 것으로부터 유래된다. 원핵생물 및 진핵생물 세포 둘 모두를 위한 다른 적절한 발현 시스템에 대하여, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 16 및 17장을 참조한다.
일부 구현예에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 핵산의 발현을 우선적으로 유도할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 엘리먼트는 핵산을 발현시키기 위해 사용된다). 조직-특이적 조절 엘리먼트는 당업계에 공지되어 있다. 적절한 조직-특이적 프로모터의 비제한적인 예는 알부민 프로모터 (간-특이적; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), 림프구-특이적 프로모터 (Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), 특히 T 세포 수용체 (Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) 및 면역글로불린 (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)의 프로모터, 뉴론-특이적 프로모터 (예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), 췌장-특이적 프로모터 (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), 및 유선-특이적 프로모터 (예를 들어, 밀크 웨이 프로모터; U.S. 특허 출원 번호 4,873,316 및 유럽 공개 특허 출원 번호 264,166)를 포함한다. 발생-조절 프로모터, 예를 들어 쥣과 hox 프로모터 (Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) 및 α-페토단백질 프로모터 (Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)가 포괄된다. 이들 원핵 및 진핵 벡터에 대해, 미국 특허 제6,750,059호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다. 본 발명의 다른 구현예는 바이러스 벡터의 용도에 관한 것일 수 있으며, 미국 특허 출원 제13/092,085호가 언급되고, 이의 내용은 본 명세서에 전문이 참고로 편입된다. 조직-특이적 조절 엘리먼트는 당업계에 공지되어 있고, 이와 관련하여, 미국 특허 제7,776,321호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에서 그들의 전문이 참고로 편입된다. 일부 구현예에서, 조절 엘리먼트는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하기 위해 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소에 작동적으로 연결된다.
핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터는 핵산-표적화 시스템의 구성요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 핵산-표적화 복합체의 형성을 유도하도록 숙주 세포에 도입된다. 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 효소 및 핵산-표적화 가이드 RNA 및/또는 tracr은 별개의 벡터 상에서 별개의 조절 엘리먼트에 각각 작동적으로 연결될 수 있다. 핵산-표적화 시스템의 RNA(들)는 유전자이식 핵산-표적화 이펙터 단백질 동물 또는 포유동물, 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 단백질을 구성적으로 또는 유도적으로 또는 조건적으로 발현시키는 동물 또는 포유동물; 또는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 달리 발현시키거나 또는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 함유하는 세포를 갖는 동물 또는 포유동물에, 예컨대, 생체내 핵산-표적화 이펙터 단백질을 코딩하고 이를 발현시키는 벡터 또는 벡터들의 사전 투여에 의해 전달될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 또는 상이한 조절 엘리먼트로부터 발현되는 둘 이상의 엘리먼트는 단일 벡터에 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가 벡터가 제1 벡터에 포함되지 않은 핵산-표적화 시스템의 임의 성분을 제공한다. 단일 벡터에 조합되는 핵산-표적화 시스템은 임의의 적합한 배향으로 정렬될 수 있는데, 예컨대 한 엘리먼트는 제2 엘리먼트에 대해 5' ("상류") 또는 3' ("하류")에 위치된다. 한 구성요소의 코딩 서열은 제2 구성요소의 코딩 서열의 동일하거나 또는 반대쪽 가닥 상에 위치되고, 동일 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 프로모터는 하나 이상의 인트론 서열 내에 (예를 들어, 상이한 인트론에 각각, 적어도 하나의 인트론에 2 이상, 또는 단일 인트론에 모두) 함입된 핵산-표적화 이펙터 단백질 및 핵산-표적화 가이드 RNA를 코딩하는 전사체의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 이펙터 단백질 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 동일한 프로모터에 작동적으로 연결되고 동일한 프로모터로부터 발현될 수 있다. 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 위한 전달 비히클, 벡터, 입자, 나노입자, 제형 및 이들의 성분은 앞서 언급한 문헌, 예컨대, WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)에서 사용되는 바와 같다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예컨대, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 (또한 "클로닝 부위" 라고도 함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 삽입 부위)가 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 구성요소의 상류 및/또는 하류에 위치된다. 다중의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 세포 내에서 다중의 상이한, 상응하는 표적 서열에 대해 핵산-표적화 활성을 표적화하기 위해 단일 발현 구성체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 이러한 가이드-서열-함유 벡터가 제공될 수 있으며, 선택적으로 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 벡터는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 코딩하는 효소-코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 엘리먼트를 포함한다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 또는 핵산-표적화 가이드 RNA 또는 RNA(들)은 개별적으로 전달될 수 있고, 유리하게 이들 중 적어도 하나는 입자 복합체를 통해 전달된다. RNA-표적화 이펙터 단백질 mRNA는 핵산-표적화 이펙터 단백질이 발현되는 시간을 제공하기 위하여 RNA-표적화 가이드 RNA 이전에 전달될 수 있다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA는 핵산-표적화 가이드 RNA의 투여 전에 1 내지 12시간 (바람직하게는 대략 2 내지 6시간)에 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 함께 투여될 수 있다. 유사하게는, 가이드 RNA의 제2 부스터 용량은 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA + 가이드 RNA의 초기 투여 후 1 내지 12시간 (바람직하게는 대략 2 내지 6시간)에 투여될 수 있다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA 및/또는 가이드 RNA의 추가 투여는 게놈 변형의 가장 효율적인 수준을 달성하는 데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 핵 국재화 서열(NLS), 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상의 NLS를 포함하는 CRISPR 효소를 코딩한다. 보다 특히, 벡터는 C2c1 이펙터 단백질에 천연적으로 존재하지 않는 하나 이상의 NLS를 포함한다. 가장 특히, NLS는 C2c1 이펙터 단백질 서열의 벡터 5' 및/또는 3'에 존재한다. 일부 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 아미노-말단 또는 그 근처에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 이를 초과하는 NLS, 카르복시-말단 또는 그 근처에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 이를 초과하는 NLS, 또는 이들의 조합(예를 들어 아미노-말단에서 0 개 또는 적어도 1 개 이상의 NLS, 그리고 카르복시 말단에서 0 개 또는 적어도 1 개 이상의 NLS)을 포함한다. 1 개 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 단일의 NLS가 1 개 초과의 복제물로 존재하고/존재하거나 1 개 이상의 복제물로 존재하는 1 개 이상의 기타 다른 NLS와 조합될 수 있도록, 다른 것들로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, NLS의 가장 가까운 아미노산이 N-말단 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드를 따라서 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 아미노산 내에 있을 때, NLS는 N-말단 또는 C-말단 근처에서 고려된다. NLS의 비제한적 예는 하기로부터 유래된 NLS 서열을 포함한다: 아미노산 서열 PKKKRKV (SEQ ID No. 462)을 갖는, SV40 바이러스 거대 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO:463)을 갖는 뉴클레오플라스민 이분형 NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD (SEQ ID NO:464) 또는 RQRRNELKRSP (SEQ ID NO:465)을 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO:466)을 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파 유래 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:467); 근종 T 단백질의 서열 VSRKRPRP (SEQ ID NO:468) 및 PPKKARED (SEQ ID NO:469); 인간 p53의 서열 PQPKKKPL (SEQ ID NO:470); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO:471); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR (SEQ ID NO:472) 및 PKQKKRK (SEQ ID NO:473); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL (SEQ ID NO:474); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR (SEQ ID NO:475); 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO:476); 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO:477). 일반적으로, 하나 이상의 NLS는 진핵생물 세포의 핵에서 검출 가능한 양의 DNA/RNA-표적화 Cas 단백질의 축적을 유도하기에 충분한 세기의 것이다. 일반적으로, 핵 국재화 활성의 세기는 핵산-표적화 이펙터 단백질 내 NLS의 수, 사용되는 특정 NLS(들), 또는 이들 인자의 조합으로부터 유래할 수 있다. 핵에서의 축적의 검출은 임의의 적합한 기법에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커는, 세포 내의 위치가 시각화될 수 있도록, 예컨대, 핵 위치를 검출하기 위한 수단 (예를 들어, DAPI와 같은 핵에 특이적인 염색)과 조합하여, 핵산-표적화 단백질에 융합될 수 있다. 세포핵은 또한 세포로부터 단리될 수 있으며, 이어서, 이의 함량은 단백질을 검출하기 위한 임의의 적합한 공정, 예컨대, 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 또는 효소 활성 분석에 의해 분석될 수 있다. 핵 내 축적은 또한 간접적으로, 예컨대 핵산-표적화 복합체 형성의 효과에 대한 어세이 (예를 들어, 표적 세포에서 DNA 또는 RNA 절단 또는 돌연변이를 위한 어세이, 또는 DNA 또는 RNA-표적화 복합체 형성 및/또는 DNA 또는 RNA-표적화 Cas 단백질 활성에 의해 영향받는 변경된 유전자 발현 활성을 위한 어세이)를 통해서, 핵산-표적화 Cas 단백질 또는 핵산-표적화 복합체에 노출되지 않았거나, 또는 하나 이상의 NLS가 결여된 핵산-표적화 Cas 단백질에 노출된 대조군과 비교하여 결정할 수 있다. 본 명세서에 기재된 C2c1 이펙터 단백질 복합체의 바람직한 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 단백질의 C-말단에 부착된 NLS를 포함한다. 일정 구현예에서, 다른 국재화 태그는 예컨대 제한없이 Cas를 세포의 특정 부위, 예컨대 세포내 소기관, 예컨대 미토콘드리아, 색소체, 엽록체, 소포, 골지 (핵 또는 세포) 막, 리보솜, 핵소체, ER, 세포골격, 액포, 센트로솜, 뉴클레오솜, 과립, 중심립 등에 국재화시키기 위해 Cas 단백질에 융합될 수 있다.
본 발명은 또한 치료의 치료적 방법에서 사용을 위한 비천연 발생 또는 조작된 조성물, 또는 상기 조성물의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 조성물의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 치료적 처리 방법은 유전자 또는 게놈 편집, 또는 유전자 요법을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료의 치료적 방법은 표적 유기체의 개체군에서 요법 또는 치료제를 기반으로 설계된 가이드 서열을 포함하는 CRISPR-Cas 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유기체 개체군은 적어도 1000 개체, 예컨대 적어도 5000 개체, 예컨대 적어도 10000 개체, 예컨대 적어도 50000 개체를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체곤 전반에서 최소 서열 변이를 갖는 표적 부위는 개체군의 적어도 99%, 바람직하게 적어도 99.9%, 보다 바람직하게 적어도 99.99%에서 서열 변이의 부재를 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 일배체형 (반수체 유전자형)은 단일 부모로부터 함께 유전된 유기체에서의 유전자 그룹이다. 본 명세서에서 사용되는 일배체형 빈도 추정 ("단계화" 라고도 함)은 유전자형 데이터로부터 일배체형의 통계 추정 과정을 의미한다. Toshikazu 등 (Am J Hum Genet. 2003 Feb; 72(2): 384-398)은 개시된 본 발명에서 사용할 수 있는 일배체형 빈도의 추정 방법을 기술한다.
본 명세서에 기재된 핵산-표적화 시스템, 벡터 시스템, 벡터 및 조성물은 다양한 핵산-표적화 응용, 유전자 산물, 예컨대 단백질의 합성 변경 또는 변형, 핵산 절단, 핵산 편집, 핵산 스플라이싱; 표적 핵산의 트래피킹, 표적 핵산의 추적, 표적 핵산의 단리, 표적 핵산의 시각화 등에 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서 전반에서, 용어 "벡터" 는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 제한 없이, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하는, 자유 말단을 포함하지 않는 (예 : 환형) 핵산 분자; DNA, RNA 또는 둘 다를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 다른 종류의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 절편이 예를 들어, 표준 분자 클로닝 기술에 의해 삽입될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 다른 종류는 바이러스 벡터로서, 바이러스-유래된 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스에 봉입되는 벡터에 존재한다(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스(AAV)). 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내로의 형질감염을 위해 바이러스가 운반하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그것이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터" 로 지칭된다. 진핵생물 세포에서의 발현을 위한 벡터 및 이를 초래하는 벡터는 본 명세서에서 "진핵생물 발현 벡터" 로 지칭될 수 있다. 재조합 DNA 기술에 유용한 통상적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
일정 구현예에서, 벡터 시스템은 역 방향으로 프로모터-가이드 발현 카세트를 포함한다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있는데, 이는 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 엘리먼트를 포함하는 것을 의미하며, 하나 이상의 조절 엘리먼트는 발현에 사용될 숙주 세포에 기반하여 선택될 수 있고, 발현될 핵산 서열에 작동적으로 연결된다.
유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-연합 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 세포 유형을 표적화하도록 선택된다.
핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터는 핵산-표적화 시스템의 구성요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 핵산-표적화 복합체의 형성을 유도하도록 숙주 세포에 도입된다. 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 모듈 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 별개의 벡터 상에서 별개의 조절 엘리먼트에 각각 작동적으로 연결될 수 있다. 핵산-표적화 시스템의 RNA(들)는 유전자이식 핵산-표적화 이펙터 모듈 동물 또는 포유동물, 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 단백질을 구성적으로 또는 유도적으로 또는 조건적으로 발현시키는 동물 또는 포유동물; 또는 핵산-표적화 이펙터 모듈을 달리 발현시키거나 또는 핵산-표적화 이펙터 모듈을 함유하는 세포를 갖는 동물 또는 포유동물에, 예컨대, 생체내 핵산-표적화 이펙터 모듈을 코딩하고 이를 발현시키는 벡터 또는 벡터들의 사전 투여에 의해 전달될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 또는 상이한 조절 엘리먼트로부터 발현되는 둘 이상의 엘리먼트는 단일 벡터에 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가 벡터가 제1 벡터에 포함되지 않은 핵산-표적화 시스템의 임의 성분을 제공한다. 단일 벡터에 조합되는 핵산-표적화 시스템은 임의의 적합한 배향으로 정렬될 수 있는데, 예컨대 한 엘리먼트는 제2 엘리먼트에 대해 5' ("상류") 또는 3' ("하류")에 위치된다. 한 구성요소의 코딩 서열은 제2 구성요소의 코딩 서열의 동일하거나 또는 반대쪽 가닥 상에 위치되고, 동일 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 프로모터는 하나 이상의 인트론 서열 (예를 들어, 각각 상이한 인트론, 적어도 한 인트론에 둘 이상, 또는 단일 인트론에 전부)에 내포된, 핵산-표적화 이펙터 모듈 및 핵산-표적화 가이드 RNA를 코딩하는 전사물의 발현을 구동한다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 이펙터 모듈 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 동일한 프로모터에 작동적으로 연결되고 동일한 프로모터로부터 발현될 수 있다.
본 발명은 또한 다수의 핵산 성분을 전달하기 위한 방법을 포함하며, 여기서 각각의 핵산 성분은 상이한 대상 표적 유전자좌에 특이적이고, 이에 의해 다수의 대상 표적 유전자좌를 변형시킨다. 복합체의 핵산 성분은 하나 이상의 단백질-결합 RNA 압타머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 압타머는 박테리오파지 외피 단백질에 결합할 수 있다. 박테리오파지 외피 단백질은 Qβ, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, ΦCb5, ΦCb8r, ΦCb12r, ΦCb23r, 7s 및 PRR1을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리오파지 외피 단백질은 MS2 이다. 본 발명은 또한 30 개 이상, 40 개 이상 또는 50 개 이상 뉴클레오티드 길이의 복합체의 핵산 성분을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공하고, 하나 이상의 벡터는 a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 조작된 CRISPR 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트; 및 임의로 b) 가이드 서열, 직접 반복부 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하고, 임의로 성분 (a) 및 (b)는 동일하거나 또는 상이한 벡터에 존재한다.
본 발명은 또한 a) 본 발명의 구성체 중 어느 하나의 비천연 발생 CRISPR 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트; 및 b) 하나 이상의 가이드 RNA로서, 가이드 서열을 포함하는 것인 가이드 서열, 직접 반복부 서열을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된, 비천연 발생 CRISPR (Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats)-CRISPR 연관 (Cas 이펙터 모듈) (CRISPR-Cas 이펙터 모듈) 벡터 시스템을 제공하고, 성분 (a) 및 (b)은 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치되고, CRISPR 복합체가 형성되며; 가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오티드 유전자좌를 표저고하하고 효소는 폴리뉴클레오티드 유전자좌를 변경시키고, CRISPR 복합체의 효소는 비변형된 효소와 비교하여 하나 이상의 오프-표적 유전자좌를 변경시키는 능력이 감소되고/되거나 그리하여 CRISPR 복합체의 효소는 비변형된 효소와 비교하여 하나 이상의 표적 유전자좌를 변형시키는 능력이 증가되었다.
본 명세서에서 사용되는 CRISPR Cas 이펙터 모듈 또는 CRISPR 이펙터 모듈은 C2c1을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, CRISPR-Cas 이펙터 모듈은 조작될 수 있다.
이러한 시스템에서, 성분 (I)은 가이드 서열, 직접 반복부 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트를 포함할 수 있고, 성분 (II)는 CRISPR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함할 수 있다. 이러한 시스템에서, 적용가능한 경우에 가이드 RNA는 키메라 RNA를 포함할 수 있다.
이러한 시스템에서, 성분 (I)은 가이드 서열 및 직접 반복부 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트를 포함할 수 있고, 성분 (II)은 CRISPR 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 하나 초과의 가이드 RNA를 포함할 수 있고, 각각의 가이드 RNA는 상이한 표적을 가져서 다중복합화가 존재한다. 성분 (a) 및 (b)는 동일 벡터 상에 있을 수 있다.
벡터를 포함하는 임의의 이러한 시스템에서, 하나 이상의 벡터는 하나 이상의 바이러스 벡터, 예컨대 하나 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스를 포함할 수 있다.
조절 엘리먼트를 포함하는 임의의 이러한 시스템에서, 상기 조절 엘리먼트 중 적어도 하나는 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 포유동물 혈액 세포, 포유동물 간 세포, 또는 포유동물 눈에서 발현을 유도할 수 있다.
임의의 상기 기술된 조성물 또는 시스템에서, 직접 반복부 서열은 하나 이상의 단백질-상호작용 RNA 압타머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 압타머는 테트라루프에 위치될 수 있다. 하나 이상의 압타머는 MS2 박테리오파지 외피 단백질에 결합할 수 있다.
임의의 상기 기술된 조성물 또는 시스템에서 세포는 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포일 수 있고, CRISPR 복합체는 세포에서 작동가능하고, 그리하여 CRISPR 복합체의 효소는 비변형된 효소와 비교하여 세포의 하나 이상의 오프-표적 유전자좌를 변형시키는 능력이 감소되었고/되었거나 그리하여 CRISPR 복합체의 효소는 비변형된 효소와 비교하여 하나 이상의 표적 유전자좌를 변형시키는 능력이 증가되었다.
본 발명은 또한 임의의 상기 기술된 조성물 또는 임의의 상기 기술된 시스템의 CRISPR 복합체를 제공한다.
본 발명은 또한 임의의 본 명세서에 기술된 조작된 CRISPR 효소 (예를 들어, 조작된 Cas 이펙터 모듈), 조성물, 또는 임의의 본 명세서에 기술된 시스템 또는 벡터 시스템과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 관심 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하거나, 또는 세포는 세포 내에 존재하는 임의의 본 명세서에 기술된 CRISPR 복합체를 포함한다. 이러한 방법에서 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 바람직하게 진핵생물 세포일 수 있다. 이러한 방법에서, 유기체는 세포를 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 유기체는 인간 또는 다른 동물이 아닐 수 있다.
일정 구현예에서, 본 발명은 또한 비천연 발생, 조작된 조성물 (예를 들어, AAV 벡터에 맞춰질 수 있는 C2c1 또는 임의의 Cas 단백질)을 제공한다. 또한 사용할 수 있는 다른 단백질에 대한 목록 및 지침을 제공하기 위해서 참조로 본 명세서에 편입된 US 8,697,359의 도 19A, 19B, 19C, 19D, 및 20A-F를 참조한다.
임의의 이러한 방법은 생체외 또는 시험관내일 수 있다.
일정 구현예에서, 적어도 하나의 상기 가이드 RNA 또는 C2c1 이펙터 모듈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 관심 유전자의 프로모터를 포함하는 조절 엘리먼트와 세포에서 작동적으로 연결되어서, 적어도 하나의 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 시스템 성분의 발현이 관심 유전자의 프로모터에 의해 구동된다. "작동적으로 연결된" 은 가이드 RNA 및/또는 Cas 이펙터 모듈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 역시 본 명세서의 다른 곳에 언급된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 엘리먼트(들)에 연결된 것을 의미하고자 한다. 용어 "조절 엘리먼트" 는 본 명세서의 다른 곳에서 기술된다. 본 발명에 따라서, 조절 엘리먼트느 관심 유전자의 프로모터, 예컨대 바람직하게 관심 내생성 유전자의 프로모터를 포함한다. 일정 구현예에서, 프로모터는 이의 내생성 게놈 위치에 있다. 이러한 구현예에서, CRISPR 및/또는 Cas를 코딩하는 핵산은 이의 천연 게놈 위치에서 관심 유전자의 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 일정 다른 구현예에서, 프로모터는 (개별) 핵산 분자, 예컨대 벡터 또는 플라스미드, 또는 다른 염색체외 핵산 상에 제공되고, 다시 말해 프로모터는 이의 천연 게놈 위치에서 제공되지 않는다. 일정 구현예에서, 프로모터는 비천연 게놈 위치에서 게놈에 통합된다.
본 발명은 또한 세포를 본 명세서에 기술된 조작된 CRISPR 효소 (예를 들어, 조작된 Cas 이펙터 모듈), 조성물, 시스템 또는 CRISPR 복합체와 접촉시켜서 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 (벡터)를 전달하고 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체가 형성되어 표적에 결합할 수 있게 하는 단계, 게놈 유전자좌의 발현이 변경, 예컨대 증가 또는 감소된 발현, 또는 유전자 산물의 변경 여부를 결정하는 단계를 포함하는 포유동물 세포에서 관심 게놈 유전자좌의 발현을 변경시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명에 따라서 Cas 이펙터 모듈 또는 CRISPR 효소의 오솔로그인 돌연변이 또는 변형된 Cas 이펙터 모듈에 돌연변이를 만드는 방법을 제공하고, 방법은 오솔로그가 가깝게 근접할 수 있거나 또는 핵산 분자, 예를 들어 DNA, RNA, gRNA 등을 접촉할 수 있는 아미노산(들), 및/또는 변형 및/또는 돌연변이를 위해서 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 CRISPR 효소의 본 명세서에서 확인된 아미노산(들)과 유사하거나 또는 상응하는 아미노산(들)을 확인하는 단계, 및 변형(들) 및/또는 돌연변이(들)를 포함하거나, 그로 이루어지거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 오솔로그를 합성 또는 제조 발현시키거나 또는 본 명세서에 논의된 바와 같이, 중성 아미노산을 하전, 예를 들어 양으로 하전된 아미노산 예를 들어 알라닌으로 돌연변이, 예를 들어 변형, 예를 들어 변화 또는 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 이렇게 변형된 오솔로그는 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 시스템에서 사용할 수 있고; 이를 발현하는 핵산 분자(들)는 본 명세서에 논의된 바와 같은 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 시스템 성분을 코딩하는 분자를 전달하는 벡터 시스템에서 사용할 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 성분 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 벡터 시스템 및 키트를 이용하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 시스템은 (a) 직접 반복부 서열 및 DR 서열의 하류에 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트로서, 발현될 때, 가이드 서열이 진핵생물 세포에서 표적 서열에 대한 Cas13 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하고, CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체는 (1) 표적 서열에 하이브리드화된 가이드 서열, (2) DR 서열, 및 (3) tracr 서열과 복합체를 형성한 Cas 이펙터 모듈을 포함하는 것인 제1 조절 엘리먼트; 및/또는 (b) 핵 국재화 서열을 포함하는 상기 Cas 이펙터 모듈을 코딩하는 효소-코딩 서열에에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하고, 유리하게 이것은 분할 Cas 이펙터 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 시스템의 동일하거나 또는 상이한 벡터 상에 위치된 성분 (a) 및 (b)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결된 둘 이상의 가이드 서열을 더 포함하고, 발현될 때, 둘 이상의 가이드 서열 각각은 진핵생물 세포의 상이한 표적 서열과 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체의 서열 특이적 결합을 유도한다. tracr은 가이드 (스페이서) 및 직접 반복부 서열과 (코딩되는) 동일한 폴리뉴클레오티드 상에서 융합될 수 있거나 또는 융합되지 않을 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 진핵생물 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있게 하여서 상기 폴리뉴클레오티드의 절단을 실시하여 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 단계를 포함하고, CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열에 하이브리드화된 가이드 서열과 복합체 형성하는 Cas 이펙터 모듈을 포함하고, 상기 가이드 서열은 직접 반복부 서열에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 상기 Cas 이펙터 모듈에 의해 표적 서열의 위치에서 1 또는 2개의 가닥을 절단하는 단계를 포함하고, 이것은 분할 Cas 이펙터 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 표적 유전자의 감소된 전사를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 외생성 주형 폴리뉴클레오티드와의 상동성 재조합에 의해 상기 절단된 표적 폴리뉴클레오티드를 복구하는 단계를 더 포함하며, 상기 복구은 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터 발현된 단백질에서 하나 이상의 아미노산 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 벡터를 상기 진핵생물 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 하나 이상의 벡터는 Cas 이펙터 모듈, 및 DR 서열에 연결된 가이드 서열 중 하나 이상의 발현을 구동한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 대상체에서 진핵생물 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 세포 배양물에서 상기 진핵생물 세포에서 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 변형 전에 대상체로부터 상기 진핵생물 세포를 단리시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 상기 진핵생물 세포 및/또는 이로부터 유래된 세포를 상기 대상체에게 복귀시키는 단계를 더 포함한다. 일 양상에서, 본 발명은 진핵생물 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형 또는 편집시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있게 하여서 DNA 염기 편집을 실시하는 단계를 포함하고, CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열에 하이브리드화된 가이드 서열과 복합체 형성하는 Cas 이펙터 모듈을 포함하고, 상기 가이드 서열은 직접 반복부 서열에 연결된다. 일부 구현예에서, Cas 이펙터 모듈은 촉매적으로 불활성인 CRISPR-Cas 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 표적 서열과 가이드 서열 간에 형성된 DNA/RNA 헤테로듀플렉스에 하나 이상의 미스매치를 도입시키도록 설계된다. 특정 구현예에서, 미스매치는 A-C 미스매치이다. 일부 구현예에서, Cas 이펙터는 하나 이상의 기능성 도메인과 (예를 들어, 융합 단백질 또는 적합한 링커를 통해) 회합될 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 가수분해적 탈아미드화를 통해 내생성 편집을 매개하는 하나 이상의 시티딘 또는 아데노신 디아미나제를 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 진핵생물 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체가 폴리뉴클레오티드와 결합될 수 있게 하여서 상기 결합이 상기 폴리뉴클레오티드의 증가되거나 또는 감소된 발현을 초래하게 하는 단계를 포함하고, CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열과 하이브리드화된 가이드 서열과 복합체 형성된 Cas 이펙터 모듈을 포함하고, 상기 가이드 서열은 분할 Cas 이펙터 모듈을 포함할 수 있는, 직접 반복부 서열에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 벡터를 상기 진핵생물 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서, 하나 이상의 벡터는 DR 서열에 연결된 가이드 서열, 및 Cas 이펙터 모듈 중 하나 이상의 발현을 구동시킨다.
일 양상에서, 본 발명은 진핵생물 세포에서 표적 전사물을 변형 또는 편집시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있게 하여서 RNA 염기 편집을 실시하는 단계를 포함하고, CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열에 하이브리드화된 가이드 서열과 복합체 형성하는 Cas 이펙터 모듈을 포함하고, 상기 가이드 서열은 직접 반복부 서열에 연결된다. 일부 구현예에서, Cas 이펙터 모듈은 촉매적으로 불활성인 CRISPR-Cas 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 표적 서열과 가이드 서열 간에 형성된 RNA/RNA 듀플렉스에 하나 이상의 미스매치를 도입시키도록 설계된다. 특정 구현예에서, 미스매치는 A-C 미스매치이다. 일부 구현예에서, Cas 이펙터는 하나 이상의 기능성 도메인과 (예를 들어, 융합 단백질 또는 적합한 링커를 통해) 회합될 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 가수분해적 탈아미드화를 통해 내생성 편집을 매개하는 하나 이상의 시티딘 또는 아데노신 디아미나제를 포함한다. 특정 구현예에서, 이펙터 도메인은 효소의 RNA (ADAR) 패밀리에 작용하는 아데노신 디아미나제를 포함한다. 특정 구현예에서, 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매적 도메인은 RNA에서 아데노신 또는 시토신을 탈아미노화시킬 수 있거나 또는 RNA 특이적 아데노신 디아미나제이고/이거나 박테리아, 인간, 두족류 또는 초파리 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매적 도메인, 바람직하게는 TadA, 더 바람직하게는 ADAR, 임의로 huADAR, 임의로 (hu)ADAR1 또는 (hu)ADAR2, 바람직하게는 huADAR2 또는 이의 촉매적 도메인이다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 인간, 래트, 또는 램프리 시티딘 디아미나제이다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 아포리포단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 디아미나제, 활성화-유도된 디아미나제 (AID), 또는 시티딘 디아미나제 1 (CDA1)이다.
본 출원은 관심 표적 DNA 서열을 변형시키는 것에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 양상은 예방적 또는 치료적 치료에서 사용하기 위해 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 방법 및 조성물에 관한 것으로서, 바람직하게 상기 관심 표적 유전자좌는 인간 또는 동물 내에 있는 것인 방법 및 조성물, 및 상기 표적 DNA에, 상기 본 명세서에 기술된 바와 같은 조성물을 전달하는 단계를 포함하는, 관심 표적 DNA 서열의 아데닌 또는 시티딘을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, CRISPR 시스템 및 아데노신 디아미나제, 또는 이의 촉매적 도메인은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자로서, 리보핵단백질 복합체로서, 임의로 입자, 소포, 또는 하나 이상의 바이러스 벡터를 통해 전달된다. 특정 구현예에서, 조성물은 병원성 G→A 또는 C→T 점 돌연변이를 함유하는 전사체에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 따라서 본 발명은 요법에서 사용하기 위한 조성물을 포함한다. 이는 방법이 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 수행될 수 있다는 것을 나타낸다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 동물 또는 인간 신체의 치료 방법 또는 인간 세포의 생식 계열 유전적 동일성을 변형시키기 위한 방법이 아니다. 특정 구현예에서, 방법을 수행할 때, 표적 RNA는 인간 또는 동물 세포 내에 포함되지 않는다. 특정한 구현예에서, 표적이 인간 또는 동물 표적일 때, 방법은 생체외 또는 시험관내에서 수행된다.
본 발명의 추가적인 양상은 예방적 또는 치료적 치료에서 사용하기 위해 본 명세서에서 예상되는 방법으로서, 바람직하게는 상기 관심 표적은 인간 또는 동물 내에 있는 것인 방법, 및 상기 표적 RNA에 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같은 조성물을 전달하는 단계를 포함하는, 관심 표적 DNA 서열의 아데닌 또는 시티딘을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, CRISPR 시스템 및 아데노신 디아미나제, 또는 이의 촉매적 도메인은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자로서, 리보핵단백질 복합체로서, 임의로 입자, 소포, 또는 하나 이상의 바이러스 벡터를 통해 전달된다. 특정 구현예에서, 조성물은 병원성 G→A 또는 C→T 점 돌연변이를 함유하는 전사체에 의해 야기되는 질환의 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 따라서 본 발명은 요법에서 사용하기 위한 조성물을 포함한다. 이는 방법이 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 수행될 수 있다는 것을 나타낸다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 동물 또는 인간 신체의 치료 방법 또는 인간 세포의 생식 계열 유전적 동일성을 변형시키기 위한 방법이 아니다. 특정 구현예에서, 방법을 수행할 때, 표적 RNA는 인간 또는 동물 세포 내에 포함되지 않는다. 특정한 구현예에서, 표적이 인간 또는 동물 표적일 때, 방법은 생체외 또는 시험관내에서 수행된다.
본 발명은 또한 변이체를 야기하는 질환 또는 표적화된 탈아미드화를 통해 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, A의 탈아미노화는 병원성 G→A 또는 C→T 점 돌연변이를 함유하는 전사체에 의해 야기되는 질환을 치유할 수 있다. 본 발명에 의해 치료되거나 또는 예방될 수 있는 질환의 예는 암, 메이어-고린 증후군, 시클 증후군 4, 주버트 증후군 5, 레버 선천성 흑암시 10; 샤르코마리 투스병, 2형; 샤르코마리 투스병, 2형; 어셔 증후군, 2C형; 유전성 실조증 28; 유전성 실조증 28; 유전성 실조증 28; 긴 QT 증후군 2; 쇼그렌-라르손 증후군; 유전성 과당뇨증; 유전성 과당뇨증; 신경아세포종; 신경아세포종; 칼만 증후군 1; 칼만 증후군 1; 칼만 증후군 1; 이염성 백질디스트로피를 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 돌연변이된 질환 유전자를 포함하는 모델 진핵생물 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질환 유전자는 질환을 갖거나 또는 질환이 발생할 위험의 증가와 연관된 임의의 유전자이다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 하나 이상의 벡터를 진핵 세포에 도입하는 단계로서, 하나 이상의 벡터는 Cas 이펙터 모듈, 및 직접 반복부 서열에 연결된 가이드 서열 중 하나 이상의 발현을 유도하는 것인 단계; 및 (b) CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하여 상기 질환 유전자 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 실시할 수 있게 하는 단계로서, CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체는 (1) 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열과 하이브리드화하는 가이드 서열, (2) DR 서열, 및 (3) tracr 서열과 복합체 형성하는 Cas 이펙터 모듈을 포함하여서, 돌연변이된 질환 유전자를 포함하는 모델 진핵생물 세포를 생성시키는 것인 단계를 포함하고, 이것은 분할 Cas 이펙터 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 상기 Cas 이펙터 모듈에 의해 표적 서열의 위치에서 1 또는 2개의 가닥을 절단하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 가닥 파손은 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부이다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 표적 유전자의 감소된 전사를 초래한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 외생성 주형 폴리뉴클레오티드와의 상동성 재조합에 의해 상기 절단된 표적 폴리뉴클레오티드를 복구하는 단계를 더 포함하며, 상기 복구은 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터의 단백질 발현에서 하나 이상의 아미노산 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, 모델 진핵생물 세포는 돌연변이된 질환 유전자를 포함하고, 돌연변이는 5' 오버행을 갖는 스태거드 이중 가닥 파손에 의해 도입된다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, 모델 진핵생물 세포는 돌연변이된 질환 유전자를 포함하고, 돌연변이는 HDR을 통해서 스태거드 5' 오버행에서 DNA 삽입에 의해 도입된다. 일부 구현예에서, 모델 진핵생물 세포는 돌연변이된 질환 유전자를 포함하고, 돌연변이는 NHEJ를 통해서 스태거드 5' 오버행에서 DNA 삽입에 의해 도입된다. 일부 구현예에서, 모델 진핵생물 세포는 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 도입된 외생성 DNA 서열 삽입을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 및 3' 말단 둘 모두 상에서 가이드 서열이 측접된 외생성 DNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 모델 진핵생물 세포는 돌연변이된 질환 유전자를 포함하고, 돌연변이 c는 특정 구현예에서 스태거드 5' 오버행에서 DNA 삽입에 의해 도입되고, Cas 이펙터 모듈은 C2c1 단백질, 또는 이의 촉매 도메인, 및 PAM 서열, T-풍부 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTN 또는 5'-ATTN 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTG 이다. 특정 구현예에서, 모델 진핵생물 세포는 암과 연관된 돌연변이된 유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 모델 진핵생물 세포는 자궁경부 상피내 종양 (CIN)에서 인간 파필로마바이러스 (HPV) 구동된 발암과 연관된 돌연변이된 질환 유전자를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 모델 진핵생물 세포는 파킨슨병, 낭성 섬유증, 심근병증, 및 허혈성 심장 질환과 연관된 돌연변이된 질환 유전자를 포함한다.
일 양상에서 본 발명은 하나 이상의 세포(들)에서 유전자에 하나 이상의 돌연변이를 도입시켜 하나 이상의 세포(들)를 선택하는 방법을 제공하고, 방법은 하나 이상의 벡터를 세포(들)에 도입시키는 단계로서, 하나 이상의 벡터가 Cas 이펙터 모듈, 직접 반복부 서열에 연결된 가이드 서열, 및 편집 주형 중 하나 이상의 발현을 구동시키고, 편집 주형은 Cas 이펙터 모듈 절단을 없애는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 단계; 세포(들)에서 표적 폴리뉴클레오티드와 편집 주형의 상동성 재조합을 선택할 수 있게 하는 단계; CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있게 하여서 상기 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 실시하는 단계로서, CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체는 (1) 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열과 하이브리드화하는 가이드 서열, 및 (2) 직접 반복부 서열과 복합체 형성하는 Cas 이펙터 모듈을 포함하고, Cas 이펙터 모듈 CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드와의 결합은 세포 사멸을 유도시켜서 하나 이상의 돌연변이가 도입된 하나 이상의 세포(들)를 선택할 수 있게 하는 단계를 포함하고, 이것은 분할 Cas 이펙터 모듈을 포함한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 선택되는 세포는 진핵생물 세포일 수 있다. 본 발명의 양상은 선택 마커를 필요로 하는 일 없이 특정 세포의 선택 또는 계수기-선택 시스템을 포함할 수 있는 2단계 공정을 가능하게 한다.
일 양상에서, 본 발명은 변형 또는 편집된 유전자를 포함하는 진핵생물 세포를 생성시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 변형 또는 편집된 유전자는 질환 유전자이다. 일부 구현예에서, 방법은 (a) 하나 이상의 벡터를 진핵생물 세포에 도입시키는 단계로서, 하나 이상의 벡터는 Cas 이펙터 모듈, 및 직접 반복부 서열에 연결된 가이드 서열 중 하나 이상의 발현을 구동시키고, Cas 이펙터 모듈은 염기 편집을 매개하는 하나 이상의 이펙터 도메인을 회합하는 것인 단계, 및 (b) CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있게 하여 상기 질환 유전자 내 표적 폴리뉴클레오티드의 염기 편집을 실시하는 것인 단계로서, CRISPR-Cas 이펙터 모듈 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 내 표적 서열에 하이브리드화하는 가이드 서열과 복합체 형성하는 Cas 이펙터 모듈을 포함하고, 가이드 서열은 가이드 서열 및 표적 서열 간에 형성된 DNA/RNA 헤테로듀플렉스 또는 RNA/RNA 듀플렉스 사이에 하나 이상의 미스매치를 도입하도록 디자인될 수 있는 것인 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 미스매치는 A-C 미스매치이다. 일부 구현예에서, Cas 이펙터는 하나 이상의 기능성 도메인과 (예를 들어, 융합 단백질 또는 적합한 링커를 통해) 회합될 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 가수분해적 탈아미드화를 통해 내생성 편집을 매개하는 하나 이상의 시티딘 또는 아데노신 디아미나제를 포함한다. 특정 구현예에서, 이펙터 도메인은 효소의 RNA (ADAR) 패밀리에 작용하는 아데노신 디아미나제를 포함한다. 특정 구현예에서, 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매적 도메인은 RNA에서 아데노신 또는 시토신을 탈아미노화시킬 수 있거나 또는 RNA 특이적 아데노신 디아미나제이고/이거나 박테리아, 인간, 두족류 또는 초파리 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매적 도메인, 바람직하게는 TadA, 더 바람직하게는 ADAR, 임의로 huADAR, 임의로 (hu)ADAR1 또는 (hu)ADAR2, 바람직하게는 huADAR2 또는 이의 촉매적 도메인이다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 인간, 래트, 또는 램프리 시티딘 디아미나제이다. 일부 구현예에서, 시티딘 디아미나제는 아포리포단백질 B mRNA-편집 복합체 (APOBEC) 패밀리 디아미나제, 활성화-유도된 디아미나제 (AID), 또는 시티딘 디아미나제 1 (CDA1)이다.
추가적인 양상은 상기 기재된 방법으로부터 얻어지거나 또는 얻을 수 있고/있거나 상기 기재된 조성물을 포함하는 단리된 세포 또는 상기 변형된 세포의 자손에 관한 것이되, 바람직하게는 상기 세포는 상기 방법을 실시하지 않은 대응하는 세포에 비해 관심 대상의 상기 표적 RNA에서 상기 아데닌 대신 하이포잔틴 또는 구아닌을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 동물 세포, 선택적으로 치료적 T 세포 또는 항체-생성 B-세포이거나 또는 상기 세포는 식물 세포이다. 추가적인 양상은 상기 변형된 세포 또는 이의 자손을 포함하는 비인간 동물 또는 식물을 제공한다. 또한 추가적인 양상은 요법, 바람직하게는 세포 요법에서 사용하기 위해 본 명세서에서 상기 기재한 바와 같은 변형된 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 변형된 세포는 치료적 T 세포, 예컨대 CAR-T 요법에 적합한 T 세포이다. 변형은 제한없이, 면역 체크포인트 수용체 (예를 들어, PDA, CTLA4)의 감소된 발현, HLA 단백질 (예를 들어, B2M, HLA-A)의 감소된 발현, 및 내생성 TCR의 감소된 발현을 포함하여, 치료적 T 세포에서 하나 이상의 바람직한 특성을 일으킬 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 변형된 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 세포 요법을 위한 방법에 관한 것이며, 변형된 세포의 존재는 환자에서 질환을 치료한다. 하나의 구현예에서, 세포 요법을 위한 변형된 세포는 종양 세포를 인지 및/또는 공격할 수 있는 CAR-T 세포이다. 다른 구현예에서, 세포 요법을 위한 변형된 세포는 줄기 세포, 예컨대 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 또는 iPSC 세포이다.
본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 치료 방법에서 사용하기 위한, 바람직하게는 직렬 배열된 다중 가이드 RNA를 포함하는 Cas 이펙터 모듈, 복합체 또는 시스템을 포함하는 조성물, 또는 바람직하게는 직렬 배열된 다중 가이드 RNA를 포함하는 상기 Cas 이펙터 모듈, 복합체 또는 시스템을 코딩하거나 또는 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 또한 제공된다. 이러한 조성물을 포함하는 부분의 키트가 제공될 수 있다. 이러한 치료 방법을 위한 의약의 제조에서 상기 조성물의 용도가 또한 제공된다. 스크리닝에서 Cas 이펙터 모듈 CRISPR 시스템의 용도, 예를 들어, 기능 획득 스크리닝이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 유전자를 과발현시키도록 인공적으로 힘이 가해진 세포는, 예를 들어, 음성 피드백 루프에 의해 시간에 따라 유전자를 하향조절할 수 있다(평형상태 재확립). 시간에 따라, 비조절 유전자가 다시 감소될 수 있도록 스크리닝을 시작한다. 유도성 Cas 이펙터 모듈 활성인자를 이용하는 것은 스크리닝 바로 전에 전사를 유도하도록 하며, 따라서, 위음성 히트(false negative hit)의 기회를 최소화한다. 따라서, 스크리닝, 예를 들어, 기능 획득 스크리닝에서 본 발명의 사용에 의해, 위음성 기회 결과는 최소화될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 유전자 산물을 코딩하는 DNA 분자를 각각 특이적으로 표적화하는 다중 Cas12b CRISPR 시스템 가이드 RNA에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트 및 CRISPR 단백질에 대한 암호에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는, 조작된, 비천연 발생 벡터 시스템을 제공한다. 조절 엘리먼트는 둘 다 시스템의 동일한 벡터 상에 또는 상이한 벡터 상에 위치될 수 있다. 다중 가이드 RNA는 세포에서 다중 유전자 산물을 코딩하는 다중 DNA 분자를 표적화하고, CRISPR 단백질은 유전자 산물을 코딩하는 다중 DNA 분자를 절단할 수 있고 (이는 가닥 중 하나 또는 둘 다를 절단할 수 있거나 또는 뉴클레아제 활성이 실질적으로 없을 수 있음), 그리하여 다중 유전자 산물의 발현이 변경되고, CRISPR 단백질 및 다중 가이드 RNA는 천연적으로 함께 존재하지 않는다. 바람직한 구현예에서, CRISPR 단백질은 선택적으로 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된 Cas12b 단백질이다. 바람직한 구현예에서, 진핵생물 세포는 포유류 세포, 식물 세포 또는 효모 세포이고, 더 바람직한 구현예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 추가적인 구현예에서, 다중 유전자 산물 각각의 발현은 변경되며, 바람직하게는 감소된다.
일 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 (a) 직접 반복 서열 및 직접 반복 서열의 상류 또는 하류에(어느 쪽이든 적용 가능함) 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동적으로 연결된 제1 조절 서열로서, 발현될 때, 하나 이상의 가이드 서열(들)이 진핵 세포에서 하나 이상의 표적 서열(들)에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하고, CRISPR 복합체는 하나 이상의 표적 서열(들)에 혼성화된 하나 이상의 가이드 서열(들)과 복합체화된 Cas12b 효소를 포함하는, 상기 제1 조절 엘리먼트; 및 (b) 바람직하게는 적어도 하나의 핵 국소화 서열 및/또는 적어도 하나의 NES를 포함하는, 상기 Cas12b 효소를 코딩하는 효소-암호화 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하되; 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일 또는 상이한 벡터 상에 위치된다. 적절한 경우, tracr 서열이 또한 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결된 2 이상의 가이드 서열을 추가로 포함하되, 발현될 때, 2 이상의 가이드 서열 각각은 진핵생물 세포에서 상이한 표적 서열에 대한 Cas12b CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시한다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체는 진핵생물 세포에서 핵 내에서 또는 핵 밖에서 검출 가능한 양으로 상기 Cas12b CRISPR 복합체의 축적을 유도하는데 충분한 강도의 하나 이상의 핵 국재화 서열 및/또는 하나 이상의 NES를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조절 엘리먼트는 중합효소 III 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 조절 엘리먼트는 중합효소 II 프로모터이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열의 각각은 길이가 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 25개의 뉴클레오티드, 또는 16 내지 30, 또는 16 내지 25 또는 16 내지 20개의 뉴클레오티드이다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중 표적화에서 사용하기 위한 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용될 숙주 세포에 기반하여 선택될 수 있는, 즉, 발현될 핵산 서열에 작동적으로 연결되는 하나 이상의 조절 엘리먼트를 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동적으로 연결된" 은 대상 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 내에서, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 엘리먼트(들)에 연결된 것을 의미하는 의도이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중 표적화에서 사용하기 위한 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비일시적으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에서 자연적으로 발생되면서 형질감염된다. 일부 구현예에서, 형질감염된 세포가 대상체로부터 취해진다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 취한 세포, 예컨대 세포주로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서의 다른 곳에 예시되어 있다. 세포주는 당업자에게 공지된 다양한 공급원으로부터 입수 가능하다(예를 들어, 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection:ATCC)(버지니아주 매너서스에 소재)). 일부 구현예에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중 표적화에서 사용하기 위한 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 하나 이상의 벡터-유래 서열을 포함하는 새로운 세포주를 확립하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중 표적화에서 사용하기 위한 Cas12b CRISPR 시스템 또는 복합체의 성분으로 일시적으로 형질감염된 세포(예컨대 하나 이상의 벡터의 일시적 형질감염, 또는 RNA에 의한 형질감염에 의함), Cas12b CRISPR 시스템 또는 복합체의 활성을 통해 변형된 세포는 변형을 함유하지만, 임의의 다른 외생성 서열을 결여하는 세포를 포함하는 새로운 세포주를 확립하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 다중 표적화에서 사용하기 위한 Cas12b 효소, 시스템 또는 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비일시적으로 형질감염된 세포, 또는 이러한 세포로부터 유래된 세포주는 하나 이상의 시험 화합물을 평가하는 데 사용된다.
용어 "조절 엘리먼트" 는 본 명세서의 다른 부분에서 정의된 바와 같다.
유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-연합 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 세포 유형을 표적화하도록 선택된다.
일 양상에서, 본 발명은 (a) 직접 반복부 서열의 (적용가능하면 어느 쪽이든) 상류 또는 하류에 하나 이상의 까이드 RNA를 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위 및 직접 반복부 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트로서, 발현될 때, 가이드 서열(들)은 진핵생물 세포의 개별 표적 서열(들)과 Cas12b CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도시키고, Cas12b CRISPR 복합체는 개별 표적 서열(들)과 하이브리드화하는 하나 이상의 가이드 서열(들)과 복합체 형성되는 Cas12b 효소를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 바람직하게 적어도 하나의 핵 국재화 서열 및/또는 NES를 포함하는 상기 Cas12b 효소를 코딩하는 효소-코딩 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하는 진핵생물 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 성분 (a) 및 (b)를 포함한다. 적용가능한 경우에, tracr 서열이 또한 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 성분 (a), 성분 (b), 또는 성분 (a) 및 (b)는 숙주 진핵생물 세포의 게놈 내로 안정하게 통합된다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 엘리먼트에 작동적으로 연결되고, 선택적으로 직접 반복부에 의해 분리되는 2 이상의 가이드 서열을 추가로 포함하되, 발현될 때, 2 이상의 가이드 서열의 각각은 진핵생물 세포 내 상이한 표적 서열에 대한 Cas12b CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시한다. 일부 구현예에서, Cas12b 효소는 진핵생물 세포 핵 내 및/또는 밖에서 검출 가능한 양으로 상기 CRISPR 효소의 축적을 유도하는 데 충분한 강도의 하나 이상의 핵 국재화 서열 및/또는 핵 유출 서열 또는 NES를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 분자는 편집하려는 적어도 하나의 표적 아데노신 잔기를 포함하는 표적 DNA 가닥과 듀플렉스를 형성한다. 표적 DNA 가닥에 대한 가이드 RNA 분자의 하이브리드화 시, 아데노신 디아미나제는 이중가닥에 결합하고, DNA-RNA 이중가닥 내에 포함된 하나 이상의 표적 아데노신 잔기의 탈아미노화를 촉매한다.
추가로, PAM 상호작용 (PI) 도메인의 조작은 PAM 특이성의 프로그래밍을 가능하게 할 수 있고, 표적 부위 인식 신뢰성을 개선시킬 수 있으며, 예를 들어 [Kleinstiver BP et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5. doi: 10.1038/nature14592]의 Cas9에 대해 기술된 바와 같이, CRISPR-Cas 단백질의 다재다능성을 증가시킨다. 본 명세서에서 더욱 상술하는 바와 같이, 당업자는 C2c1 단백질을 유사하게 변형시킬 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다.
특정 구현예에서, 가이드 서열은 탈아미노화시키려는 아데닌에 대한 디아미나제의 최적 효율을 보장하기 위해 선택된다. C2c1 닉카제의 절단 부위에 대해서 표적 가닥 내 아데닌의 위치를 고려할 수 있다. 특정 구현예에서 닉카제는 비-표적 가닥 상에서, 탈아미노화시키려는 아데닌 부근에서 작용할 것임을 보장하는 것에 관심있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, Cas12b 닉카제는 PAM의 하류의 비표적화 가닥을 절단하고 이것은 탈아미드화시키려는 아데닌에 상응하는 시토신이 상응하는 비표적 가닥의 서열 내 닉카제 절단 부위의 상류 또는 하류 10 bp 이내에 가이드 서열에 위치하는 것인 가이드를 설계하는 것이 흥미로울 수 있다.
전달
일부 구현예에서, CrISPR-Cas 시스템의 성분은 다양한 형태, 예컨대 DNA/RNA 또는 RNA/RNA 또는 단백질 RNA의 조합으로 전달될 수 있다. 예를 들어, C2c1 단백질은 DNA-코딩 폴리뉴클레오티드 또는 RNA-코딩 폴리뉴클레오티드로서 또는 단백질로서 전달될 수 있다. 가이드는 DNA-코딩 폴리뉴클레오티드 또는 RNA로서 전달될 수 있다. 혼합된 전달 형태를 포함하여, 모든 가능한 조합이 고려된다.
일부 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 벡터, 이의 하나 이상의 전사물, 및/또는 그로부터 전사되는 하나 이상의 단백질을 숙주 세포에 전달하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
전달 비히클로서 벡터
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있는데, 이는 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 엘리먼트를 포함하는 것을 의미하며, 하나 이상의 조절 엘리먼트는 발현에 사용될 숙주 세포에 기반하여 선택될 수 있고, 발현될 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동적으로 연결된" 은 대상 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 내에서, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 엘리먼트(들)에 연결된 것을 의미하는 의도이다. 유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-연합 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 세포 유형을 표적화하도록 선택된다.
재조합 및 클로닝 방법에 관해, 미국 특허 제20040171156 A1호로서 2004년 9월 2일자로 공개된 미국 특허 출원 제10/815,730호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
용어 "조절 엘리먼트" 는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 및 다른 발현 제어 구성요소 (예를 들어, 전사 종결 신호, 예컨대, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하도록 의도된다. 이와 같은 조절 엘리먼트는, 예를 들어 문헌 [Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기재되어 있다. 조절 엘리먼트는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 장기(예를 들어, 간, 췌장)와 같은 요망되는 관심 조직, 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 유도할 수 있다. 조절 엘리먼트는 시간-의존적 방식으로, 예컨대 세포-주기 의존적 또는 발생 단계 의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있으며, 이것은 조직 특이적이거나 세포-유형 특이적일 수 있거나, 또한 그렇지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 pol I 프로모터), 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. pol II 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서를 가짐), 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서를 가짐)[예를 들어, 문헌 [Boshart et al, Cell, 41:521530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한 용어 " 조절 엘리먼트" 는 인핸서 엘리먼트, 예컨대 WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR의 R-U5' 절편 (Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988); SV40 인핸서; 및 토끼β-글로빈의 엑손 2 및 3 사이의 인트론 서열 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981)을 포괄한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환시키려는 숙주 세포의 선택, 바람직한 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것은 당업자가 이해하게 될 것이다. 벡터는 숙주 세포로 도입될 수 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산에 의해 코딩되는, 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하여, 전사물, 단백질, 또는 펩티드 (예를 들어, CRISPR 전사물, 단백질, 효소, 이의 돌연변이체 형태, 이의 융합 단백질 등)를 생산할 수 있다. 조절 서열에 관해, 미국 특허 출원 제10/491,026호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에 그의 전문이 참고로 편입된다. 프로모터에 관해, 국제 특허 출원 WO 2011/028929 및 미국 특허 출원 제12/511,940호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다.
유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-연합 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 세포 유형을 표적화하도록 선택된다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA 및 아데노신 데아미나제에 융합된 (임의로 변형 또는 돌연변이된) CRISPR-Cas 단백질에 대해 바이시스트론 벡터가 사용된다. 가이드 RNA 및 아데노신 디아미나제에 융합된 (임의로 변형 또는 돌연변이된) CRISPR-Cas 단백질에 대한 바이시스트론 발현 벡터가 바람직하다. 일반적으로 특히 본 구현예에서, 아데노신 디아미나제에 융합된 (임의로 변형 또는 돌연변이된) CRISPR-Cas 단백질은 바람직하게는 CBh 프로모터에 의해 구동된다. RNA는 바람직하게는 Pol III 프로모터, 예컨대, U6 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 이상적으로는 2개가 조합된다.
벡터는 원핵 또는 진핵생물 세포에서 CRISPR 전사물 (예를 들어, 핵산 전사물, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사물은 박테리아 세포, 예컨대, 에스케리치아 콜라이, 곤충 세포 (배큘로바이러스 발현 벡터를 이용), 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 [Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)] 에 추가로 논의된다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.
벡터는 원핵생물 또는 원핵 세포에 도입되고 증식될 수 있다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 진핵생물 세포 내로 도입될 벡터의 복제물을 증식시키기 위해 또는 진핵생물 세포 내로 도입될 벡터 생성에서의 중간 벡터로서 사용된다 (예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 부분으로서 플라스미드를 증폭). 일부 구현예에서, 원핵생물은 벡터의 복제물을 증폭시키기 위해 그리고, 예컨대, 숙주 세포 또는 숙주 유기체에 전달을 위한 하나 이상의 단백질 공급원을 제공하기 위해 하나 이상의 핵산을 발현시키기 위해 사용된다. 원핵생물 내 단백질의 발현은 융합 또는 비융합 단백질 중 하나의 발현을 지시하는 항상성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터로 에스케리치아 콜라이에서 가장 흔히 수행된다. 융합 벡터는 그 안에서 코딩되는 단백질, 예컨대, 재조합 단백질의 아미노 말단에 다수의 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 하나 이상의 목적, 예컨대: (i) 재조합 단백질 발현을 증가시키고; (ii) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고; (iii) 친화도 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제에 도움을 주는 작용을 할 수 있다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질 절단 부위는 융합 모이어티 및 재조합 단백질의 접합부에 도입되어 융합 단백질의 후속 정제를 위해 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소, 및 그들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다. 예시적 융합 발현 벡터는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 융합시키는, pGEX(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31- 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) 및 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다. 적합한 유도성 비융합 이. 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69:301- 315) 및 pET 11d (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60- 89)를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerivisae)에서 발현을 위한 벡터의 예는 pYepSec1 (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.), 및 picZ (InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 곤충 세포에서 단백질 발현을 유도한다. 배양된 곤충 세포 (예를 들어, SF9 세포)에서 단백질의 발현에 이용가능한 배큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈 (Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) 및 pVL 시리즈 (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 포유동물 발현 벡터를 이용하여 포유동물 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예는 pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) 및 pMT2PC (Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)를 포함한다. 포유동물 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 전형적으로 하나 이상의 조절 엘리먼트에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마바이러스, 아데노바이러스 2, 거대세포바이러스, 유인원 바이러스 40, 및 본 명세서에 개시되고 당업계에 공지된 다른 것으로부터 유래된다. 원핵생물 및 진핵생물 세포 둘 모두를 위한 다른 적절한 발현 시스템에 대하여, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 16 및 17장을 참조한다.
일부 구현예에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 핵산의 발현을 우선적으로 유도할 수 있다 (예를 들어, 조직-특이적 조절 엘리먼트는 핵산을 발현시키기 위해 사용된다). 조직-특이적 조절 엘리먼트는 당업계에 공지되어 있다. 적절한 조직-특이적 프로모터의 비제한적인 예는 알부민 프로모터 (간-특이적; Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277), 림프구-특이적 프로모터 (Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275), 특히 T 세포 수용체 (Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) 및 면역글로불린 (Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)의 프로모터, 뉴론-특이적 프로모터 (예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), 췌장-특이적 프로모터 (Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916), 및 유선-특이적 프로모터 (예를 들어, 밀크 웨이 프로모터; U.S. 특허 출원 번호 4,873,316 및 유럽 공개 특허 출원 번호 264,166)를 포함한다. 발생-조절 프로모터, 예를 들어 쥣과 hox 프로모터 (Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379) 및 α-페토단백질 프로모터 (Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)가 포괄된다. 이들 원핵 및 진핵 벡터에 대해, 미국 특허 제6,750,059호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에 그들의 전문이 참고로 편입된다. 본 발명의 다른 구현예는 바이러스 벡터의 용도에 관한 것일 수 있으며, 미국 특허 출원 제13/092,085호가 언급되고, 이의 내용은 본 명세서에 전문이 참고로 편입된다. 조직-특이적 조절 엘리먼트는 당업계에 공지되어 있고, 이와 관련하여, 미국 특허 제7,776,321호가 언급되며, 이의 내용은 본 명세서에서 그들의 전문이 참고로 편입된다. 일부 구현예에서, 조절 엘리먼트는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동하기 위해 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소에 작동적으로 연결된다.
핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터는 핵산-표적화 시스템의 구성요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 핵산-표적화 복합체의 형성을 유도하도록 숙주 세포에 도입된다. 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 효소 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 별개의 벡터 상에서 별개의 조절 엘리먼트에 각각 작동적으로 연결될 수 있다. 핵산-표적화 시스템의 RNA(들)는 유전자이식 핵산-표적화 이펙터 단백질 동물 또는 포유동물, 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 단백질을 구성적으로 또는 유도적으로 또는 조건적으로 발현시키는 동물 또는 포유동물; 또는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 달리 발현시키거나 또는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 함유하는 세포를 갖는 동물 또는 포유동물에, 예컨대, 생체내 핵산-표적화 이펙터 단백질을 코딩하고 이를 발현시키는 벡터 또는 벡터들의 사전 투여에 의해 전달될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 또는 상이한 조절 엘리먼트로부터 발현되는 둘 이상의 엘리먼트는 단일 벡터에 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가 벡터가 제1 벡터에 포함되지 않은 핵산-표적화 시스템의 임의 성분을 제공한다. 단일 벡터에 조합되는 핵산-표적화 시스템은 임의의 적합한 배향으로 정렬될 수 있는데, 예컨대 한 엘리먼트는 제2 엘리먼트에 대해 5' ("상류") 또는 3' ("하류")에 위치된다. 한 구성요소의 코딩 서열은 제2 구성요소의 코딩 서열의 동일하거나 또는 반대쪽 가닥 상에 위치되고, 동일 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 프로모터는 하나 이상의 인트론 서열 내에 (예를 들어, 상이한 인트론에 각각, 적어도 하나의 인트론에 2 이상, 또는 단일 인트론에 모두) 함입된 핵산-표적화 이펙터 단백질 및 핵산-표적화 가이드 RNA를 코딩하는 전사체의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 이펙터 단백질 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 동일한 프로모터에 작동적으로 연결되고 동일한 프로모터로부터 발현될 수 있다. 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 구성요소의 발현을 위한 전달 비히클, 벡터, 입자, 나노입자, 제형 및 이들의 성분은 앞서 언급한 문헌, 예컨대, WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)에서 사용되는 바와 같다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예컨대, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 (또한 "클로닝 부위" 라고도 함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 삽입 부위)가 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 구성요소의 상류 및/또는 하류에 위치된다. 다중의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 세포 내에서 다중의 상이한, 상응하는 표적 서열에 대해 핵산-표적화 활성을 표적화하기 위해 단일 발현 구성체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 이러한 가이드-서열-함유 벡터가 제공될 수 있으며, 선택적으로 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, 벡터는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 코딩하는 효소-코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 엘리먼트를 포함한다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 또는 핵산-표적화 가이드 RNA 또는 RNA(들)은 개별적으로 전달될 수 있고, 유리하게 이들 중 적어도 하나는 입자 복합체를 통해 전달된다. RNA-표적화 이펙터 단백질 mRNA는 핵산-표적화 이펙터 단백질이 발현되는 시간을 제공하기 위하여 RNA-표적화 가이드 RNA 이전에 전달될 수 있다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA는 핵산-표적화 가이드 RNA의 투여 전에 1 내지 12시간 (바람직하게는 대략 2 내지 6시간)에 투여될 수 있다. 대안적으로, 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 함께 투여될 수 있다. 유사하게는, 가이드 RNA의 제2 부스터 용량은 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA + 가이드 RNA의 초기 투여 후 1 내지 12시간 (바람직하게는 대략 2 내지 6시간)에 투여될 수 있다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA 및/또는 가이드 RNA의 추가 투여는 게놈 변형의 가장 효율적인 수준을 달성하는 데 유용할 수 있다.
통상적인 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 포유동물 세포 또는 표적 조직에서 핵산을 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 배양물에서 또는 숙주 세포 유기체에서 세포에 핵산-표적화 시스템의 성분을 코딩하는 핵산을 투여하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA (예를 들어, 본 명세서에 기재된 벡터의 전사체), 나형 핵산, 및 전달 비히클, 예컨대, 리포솜과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 세포에 전달 후에 에피솜 또는 통합 게놈 중 하나를 갖는 DNA 및 RNA 바이러스를 포함한다. 유전자 요법 절차의 검토를 위해, 다음의 문헌들을 참조한다: Anderson, Science 256:808813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167175 (1993); Miller, Nature 357:455460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):11491154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):3144 (1995); Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (eds) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주입, 바이오리스틱스, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 콘쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제-향상 흡수를 포함한다. 리포펙션은 예를 들어 미국 특허 번호 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다 (예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적절한 양이온 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424; WO 91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포 (예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직 (예를 들어, 생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
플라스미드 전달은 CRISPR-Cas 단백질 발현 플라스미드 내로 가이드 RNA의 클로닝 및 세포 배양물에서의 DNA 형질감염에 의해 수행된다. 플라스미드 골격은 상업적으로 입수 가능하며, 특정 장비가 필요하지 않다. 그들은 상이한 크기의 CRISPR-Cas 코딩 서열 (더 큰 크기의 단백질을 코딩하는 것을 포함)뿐만 아니라 선택 마커를 운반할 수 있는 모듈의 이점을 갖는다. 플라스미드의 이점은 둘 모두 그들이 일시적이지만, 지속적 발현을 보장할 수 있다는 것이다. 그러나, 플라스미드의 전달은 간단하지 않으므로, 생체내 효율이 종종 낮아진다. 지속 발현은 또한 오프-표적 편집을 증가시킬 수 있다는 점에서 불리할 수 있다. 추가로, CRISPR-Cas 단백질의 과량의 증강은 세포에 대해 독성이 될 수 있다. 마지막으로, 플라스미드는 보다 특히 이중-가닥 파괴가 생성된다는 관점에서 (온 및 오프-표적), 숙주 게놈 내에서 dsDNA의 무작위 통합 위험성을 항상 보유한다.
면역지질 복합체 같은 표적화 리포솜을 포함하여, 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 충분히 공지되어 있다 (참조: 예를 들어 Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 출원 번호 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787). 이는 이하에서 더욱 상세하게 논의된다.
핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 체내 특정 세포에 대해 바이러스를 표적화하고 핵에 바이러스 페이로드를 수송하는 고도로 진화된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 (생체내) 직접적으로 투여될 수 있거나 또는 그들은 시험관내에서 세포를 처리하는 데 사용될 수 있고, 변형된 세포는 선택적으로 환자에게 (생체외) 투여될 수 있다. 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위해 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있었다. 숙주 게놈 내 통합은 종종 삽입 이식유전자의 장기간 발현을 초래하는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-연합 바이러스 유전자 전달 방법에 의해 가능하다. 추가적으로, 다수의 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.
레트로바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 혼입시켜, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킴으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분화 세포를 형질도입 또는 감염시키고 전형적으로 고 바이러스 역가를 생성하는 레트로바이러스 벡터이다. 따라서 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6 내지 10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 능력을 갖는 시스-작용성 긴 말단 반복부를 포함한다. 최소 시스-작용성 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이어서, 표적 세포 내로 치료 유전자를 통합시키기 위해 사용되어 영구 이식유전자 발현을 제공한다. 널리 사용된 레트로바이러스 벡터는 쥐과 백혈병 바이러스(MuLV), 기본 유인원(gibbon ape) 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이들의 조합을 기반으로 한 벡터를 포함한다 (참조: 예를 들어, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).
일시적 발현이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 다수의 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가능하게 하고, 세포 분할을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터에 의해, 높은 발현 역가 및 수준이 얻어졌다. 이 벡터는 상대적으로 단순한 시스템에서 다량으로 생성될 수 있다. 아데노-연관 바이러스(" AAV") 벡터는 또한, 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관 내 생산에서, 그리고 생체내 및 생체 외 유전자 치료법 과정을 위해 세포를 표적 핵산으로 세포 형질도입시키는 데 사용될 수 있다 (참조: 예를 들어, West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. 특허 번호 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). 재조합 AAV 벡터의 구축은 다음의 문헌들을 포함한, 다수 공개물에 기술되어 있다: US 특허 번호 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).
본 발명은 CRISPR 시스템을 코딩하는 외생성 핵산 분자, 예를 들어, 프로모터, CRISPR-연관(Cas) 단백질 (추정 뉴클레아제 또는 헬리카제 단백질), 예를 들어, C2c1를 코딩하는 핵산 분자 및 종결자를 포함하거나 또는 본질적으로 그로 이루어진 제1 카세트, 및 하나 이상의, 유리하게는 벡터의 패키징 크기 한계까지, 예를 들어, 총 (제1 카세트를 포함) 5개의, 프로모터, 가이드 RNA(gRNA)를 코딩하는 핵산 분자 및 종결자를 포함하는 카세트 (예를 들어, 프로모터-gRNA1-종결자, 프로모터-gRNA2-종결자 ... 프로모터-gRNA(N)-종결자로서 개략적으로 나타내는 각각의 카세트, 여기서 N은 벡터의 패키징 크기 제한의 상한에서 삽입될 수 있는 수임)를 포함하거나 또는 이루어진 다수의 카세트를 함유하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 AAV, 또는 각각이 CRISPR 시스템의 하나 또는 하나 초과의 카세트를 함유하는 둘 이상의 개별 rAAV, 예를 들어, 프로모터, Cas, 예를 들어, Cas(C2c1)를 코딩하는 핵산 분자 및 종결자를 포함하거나 또는 본질적으로 이루어진 제1 카세트를 함유하는 제1 rAAV, 프로모터, 가이드 RNA(gRNA)를 코딩하는 핵산 분자 및 종결자를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어진 하나 이상의 카세트를 함유하는 제2 rAAV(예를 들어, 각각의 카세트는 프로모터-gRNA1-종결자, 프로모터-gRNA2-종결자 ... 프로모터-gRNA(N)-종결자로서 개략적으로 나타내며, 여기서 N은 벡터의 패키징 크기 한계의 상한으로 삽입될 수 있는 수이다)를 제공한다. 대안적으로, C2c1이 그 자체의 crRNA/gRNA를 프로세싱하기 때문에, 단일 crRNA/gRNA 어레이가 다중복합 유전자 편집에 사용될 수 있다. 그러한 이유로, gRNA를 전달하기 위한 다수 카세트를 포함하는 대신에, rAAV는 프로모터, 다수의 crRNA/gRNA, 및 종결자를 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지는 단일 카세트를 함유할 수도 있다 (예를 들어, 개략적으로 프로모터-gRNA1-종결자, 프로모터-gRNA2-종결자...프로모터-gRNA(N)-종결자로 표시되고, 여기서 N은 벡터의 패키징 크기 한계의 상한치에서 삽입될 수 있는 개수임). 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, [Zetsche et al Nature Biotechnology 35, 3134 (2017)]를 참조한다. rAAV가 DNA 바이러스이므로, AAV 또는 rAAV에 관해 본 명세서에서 논의되는 핵산 분자는 유리하게는 DNA이다. 프로모터는 일부 구현예에서, 유리하게 인간 시냅신 I 프로모터 (hSyn)이다. 세포에게 핵산의 전달을 위한 추가 방법은 당업자에게 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 공개 특허 출원 제20030087817호를 참조한다.
다른 구현예에서, 코칼 베시쿨로바이러스 (Cocal vesiculovirus) 외피 위형 레트로바이러스 벡터 입자가 고려된다 (참조: 예를 들어, 미국 프레드 허친슨 암 연구 센터(Fred Hutchinson Cancer Research Center)에 양도된 미국 특허 공개 제20120164118호). 코칼 바이러스는 베시쿨로바이러스 속이며, 포유동물에서 수포성 구내염의 원인 물질이다. 코컬 바이러스는 원래 트리니다드에서 진드기로부터 분리되었고(문헌[Jonkers et al., Am. Res. 25:236242 (1964)]), 트리니다드, 브라질 및 아르헨티나에서, 곤충, 소 및 말에서 감염이 확인되었다. 포유동물를 감염시키는 베시쿨로바이러스 중 다수는 자연적으로 감염된 절지동물로부터 단리되었는데, 이는 그들이 매개체 감염이라는 것을 시사한다. 베시쿨로바이러스에 대한 항체는 바이러스가 풍토성이고 실험실 획득된 시골 지역에 살고 있는 사람들 중에서는 일반적이고; 인간에서의 감염은 보통 인플루엔자-유사 증상을 초래한다. 코칼 바이러스 외피 당단백질은 아미노산 수준을 VSV-G 인디애나와 71.5% 동일성으로 공유하며, 베시쿨로바이러스의 외피 유전자의 계통 발생론적 비교는 코칼 바이러스가 베시쿨로바이러스 중에서도 VSV-G 인디애나 균주와 혈청학적으로 별개이지만, 가장 밀접하게 관련된다는 것을 나타낸다. Jonkers et al., Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964) 및 Travassos da Rosa et al., Am. J. Tropical Med. & Hygiene 33:999-1006 (1984). 코칼 베시쿨로바이러스 외피 유사형 레트로바이러스 벡터 입자는, 예를 들어, 레트로바이러스 Gag, Pol, 및/또는 하나 이상의 부속 단백질(들) 및 코칼 베시쿨로바이러스 외피 단백질을 포함할 수 있는 렌티바이러스, 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 및 엡실론레트로바이러스 벡터 입자를 포함할 수 있다. 이들 구현예의 소정의 양상 내에서, Gag, Pol, 및 부속 단백질은 렌티바이러스 및/또는 감마레트로바이러스이다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비일시적으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 세포는 선택적으로 세포에 재도입될 대상체에서 자연적으로 발생함에 따라 형질감염된다. 일부 구현예에서, 형질감염된 세포가 대상체로부터 취해진다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 취한 세포, 예컨대 세포주로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주는 당업계에 공지되어 있다. 세포주의 예는 C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 원숭이 신장 상피, BALB/ 3T3 마우스 배아 섬유아세포, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 인간 태아 섬유아세포; 10.1 마우스 섬유아세포, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1 세포, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY 세포, K562 세포, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 148, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN / OPCT 세포주, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2 세포, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1 세포주, U373, U87, U937, VCaP, Vero 세포, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, 및 이들의 유전자이식 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 세포주는 당업자에게 공지된 다양한 공급원으로부터 입수 가능하다 (예를 들어, 미국 미생물 보존 센터 (American Type Culture Collection)(ATCC)(Manassus, Va.)).
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템 성분 중 하나 이상의 일시적 발현 및/또는 존재는, 예컨대, 오프-표적 효과를 감소시키는 데 관심이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 하나 이상의 벡터-유래 서열을 포함하는 새로운 세포주를 확립하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템의 성분으로 (예컨대, 하나 이상의 벡터의 일시적 형질감염, 또는 RNA에 의한 형질감염에 의해) 일시적으로 형질감염되고 CRISPR 복합체 활성을 통해 변형된 세포는 변형을 함유하지만 임의의 다른 외생성 서열을 결여하는 세포를 포함하는 새로운 세포주를 확립하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터, 또는 이러한 세포주로부터 유래된 세포주로 일시적으로 또는 비일시적으로 형질감염된 세포는 하나 이상의 시험 화합물을 평가하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, RNA 및/또는 단백질을 숙주 세포에 직접적으로 도입하는 것이 계획된다. 예를 들어, CRISPR-Cas 단백질은 시험관내 전사된 가이드 RNA와 함께 코딩 mRNA로서 전달될 수 있다. 이러한 방법은 CRISPR-Cas 단백질의 효과를 보장하기 위한 시간을 감소시키고, 추가로 CRISPR 시스템 성분의 장기간 발현을 방지할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNA 분자는 리포솜 또는 리포펙틴 제형 등으로 전달되고, 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 5,593,972, 5,589,466, 및 5,580,859에 기술되어 있다. 포유동물 세포로 siRNA의 증강되고 개선된 전달을 특별히 목적으로 하는 전달 시스템이 개발되었고 (참조: 예를 들어, Shen et al FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-10; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 및 Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724), 본 발명에 적용할 수 있다. siRNA는 최근에 영장류에서의 유전자 발현의 억제를 위해 성공적으로 사용되었다 (참조: 예를 들어, Tolentino et al., Retina 24(4):660 (본 발명에 또한 적용할 수 있음 ).
사실, RNA 전달은 유용한 생체내 전달 방법이다. 리포솜 또는 입자를 이용하여 세포 내로 CcC1, 아데노신 디아미나제, 및 가이드 RNA를 전달하는 것이 가능하다. 따라서, CRISPR-Cas 단백질, 예컨대, C2c1의 전달, 아데노신 디아미나제 (CRISPR-Cas 단백질 또는 어댑터 단백질에 융합될 수 있음)의 전달, 및/또는 본 발명의 RNA 전달은 RNA 형태로 그리고 미세소포, 리포솜 또는 입자 또는 나노입자들을 통할 수 있다. 예를 들어, C2c1 mRNA, 아데노신 디아미나제 mRNA, 및 가이드 RNA는 생체내 전달을 위해 리포솜 입자 내로 패키징될 수 있다. 리포솜 형질감염 시약, 예컨대, Life Technologies의 Lipofectamine 및 시판 중인 다른 시약은 RNA 분자를 간 내로 효과적으로 전달할 수 있다.
또한 바람직한 RNA의 전달 수단은 입자 (Cho, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R. and Anderson, D., Lipid-like nanoparticle for small interfering RNA delivery to epithelial cells, Advanced Functional Materials, 19: 3112- 3118, 2010) 또는 엑소솜 (Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R., and Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641)을 통한 RNA의 전달을 포함한다. 사실, 엑소솜은 CRISPR 시스템에 일부 병행하는 시스템인 전달 siRNA에서 특히 유용한 것으로 나타났다. 예를 들어, El-Andaloussi S 등 ("Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo." Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 Nov 15.)은 어떻게 엑소솜이 상이한 생물학적 장벽을 넘어 약물 전달을 위한 유망한 도구이고 시험관내 또는 생체내에서 siRNA의 전달을 활용될 수 있는가를 기술한다. 그들의 접근은 펩티드 리간드와 융합된 엑소솜 단백질을 포함하는, 발현 벡터의 형질감염을 통해 표적화된 엑소솜을 생성하는 것이다. 이어서, 엑소솜은 형질감염된 세포 상청액을 정제하고 이로부터 특징규명되며, 이어서, RNA는 엑소솜에 로딩된다. 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 엑소솜, 특히, 제한없이, 뇌에 의해 수행될 수 있다. 비타민 E (α-토코페롤)는 CRISPR Cas와 접합될 수 있고, 뇌에 고밀도 리포단백질 (HDL)과 함께, 예를 들어, 뇌에 짧은-간섭 RNA (siRNA)를 전달하기 위해 문헌 [Uno et al. (HUMAN GENE THERAPY 22:711- 719 (June 2011))]에 의해 행해지는 것과 동일한 방식으로 전달될 수 있다. 포스페이트-완충 염수 (PBS) 또는 유리 TocsiBACE 또는 Toc-siBACE/HDL을 추전시키고 뇌 Infusion 키트 3 (Alzet)와 연결된 삼투압 미니펌프 (model 1007D; Alzet, Cupertino, CA)를 통해 마우스에 주입된다. 뇌-주입 캐뉼라는 배측 제3 뇌실 내로 주입을 위해 정중선에서 브레그마 뒤쪽 약 0.5㎜에 놓인다. Uno 등은 HDL과 함께 3 n㏖ 정도로 적은 Toc-siRNA가 동일한 ICV 주입 방법에 의해 비슷한 정도로 표적 감소를 유도할 수 있었다는 것을 발견하였다. α-토코페롤에 접합되고, 뇌에 표적화된 HDL과 공동 투여되는 CRISPR Cas의 유사한 용량이 본 발명의 인간에 대해 고려될 수 있으며, 예를 들어, 약 3 n㏖ 내지 약 3 μ㏖의 뇌에 표적화되는 CRISPR Cas가 고려될 수 있다. Zou 등 ((HUMAN GENE THERAPY 22:465- 475 (April 2011))은 래트의 척수에서 침묵화된 생체내 유전자에 대해 PKCγ를 표적화하는 짧은-헤어핀 RNA의 렌티바이러스-매개 전달 방법을 기재한다. Zou 등은 척수강내 카테터에 의해 1×109개의 형질도입 유닛 (TU)/㎖의 역가를 갖는 약 10 ㎕의 재조합 렌티바이러스를 투여하였다. 뇌에 표적화된 렌티바이러스 벡터에서 발현되는 유사한 투약량의 CRISPR Cas가 본 발명에서 인간에 대해 상정될 수 있으며, 예를 들어, 1×109개의 형질도입 단위(TU)/㎖의 역가를 갖는 렌티바이러스에서 뇌에 표적화된 약 10 내지 50㎖의 CRISPR Cas가 상정될 수 있다.
벡터의 용량
일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 관심 조직에, 예를 들어, 근육내 주사에 의해 전달되는 한편, 다른 시기에 정맥내, 경피, 비강내, 경구, 점막 또는 다른 전달 방법을 통해 전달된다. 이러한 전달은 단일 용량 또는 다수 용량을 통할 수 있다. 당업자는 본 명세서에서 전달하려는 실제 용량이 다양한 인자, 예컨대, 벡터 선택, 표적 세포, 유기체, 또는 조직, 치료하려는 대상체의 일반적 병태, 추구되는 형질전환/변형 정도, 투여 경로, 투여 방식, 추구되는 형질전환/변형 유형 등에 따라 크게 다를 수 있다는 것을 이해한다.
이러한 용량은, 예를 들어, 담체 (물, 식염수, 에탄올, 글리세롤, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참깨유 등), 희석제, 약학적으로 허용가능한 담체 (예를 들어, 포스페이트-완충 식염수), 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 당업계에 공지된 다른 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 용량은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 염 예컨대, 예를 들어, 미네랄산 염 예컨대 히드로크롤라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산의 염 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 더 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질, 겔 또는 겔화 재료, 풍미제, 착색제, 미세구, 중합체, 현탁제 등이 또한 본 명세서에서 존재할 수 있다. 추가로, 특히 제형이 재구성 가능한 형태라면, 1종 이상의 다른 통상적인 약제 성분, 예컨대, 보존제, 습윤제, 현탁제, 계면활성제, 항산화제, 고결방지제, 충전제, 킬레이트제, 코팅제, 화학적 안정제 등이 또한 제공될 수 있다. 적합한 예시적 성분은 미정질 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 소듐, 폴리솔베이트 80, 페닐에틸 알콜, 클로로부탄올, 솔브산칼륨, 솔브산, 이산화황, 갈산프로필, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀, 젤라틴, 알부민 및 이들의 조합물을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 완전한 논의는 참조로 본 명세서에 편입되는, [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 입수가능하다.
본 명세서의 일 구현예에서, 전달은 아데노바이러스를 통한 것으로, 이는 적어도 1×105 개의 입자(입자 단위, pu로서도 지칭됨)의 아데노바이러스 벡터를 함유하는 단일 부스터 용량일 수 있다. 본 명세서의 구현예에서, 용량은 바람직하게는 적어도 약 1 x 106 개 입자(예를 들어, 약 1 x 106-1 x 1012 개 입자), 더 바람직하게는 적어도 약 1 x 107 개 입자, 더 바람직하게는 적어도 약 1 x 108 개 입자(예를 들어, 약 1 x 108-1 x 1011 개 입자 또는 약 1 x 108-1 x 1012 개 입자), 및 가장 바람직하게는 적어도 약 1 x 100 개 입자(예를 들어, 약 1 x 109-1 x 1010 개 입자 또는 약 1 x 109-1 x 1012 개 입자), 또는 심지어 적어도 약 1 x 1010 개 입자(예를 들어, 약 1 x 1010-1 x 1012 개 입자)의 아데노바이러스 벡터이다. 대안적으로, 용량은 1 x 1014 개 이하의 입자, 바람직하게는 약 1 x 1013 개 이하의 입자, 훨씬 더 바람직하게는 약 1 x 1012 개 이하의 입자, 훨씬 더 바람직하게는 약 1 x 1011 개 이하의 입자, 및 가장 바람직하게는 약 1 x 1010 개 이하의 입자(예를 들어, 약 1 x 109 개 이하의 입자)를 포함한다. 따라서, 용량은, 예를 들어 약 1 x 106 개 입자 단위(pu), 약 2 x 106 pu, 약 4 x 106 pu, 약 1 x 107 pu, 약 2 x 107 pu, 약 4 x 107 pu, 약 1 x 108 pu, 약 2 x 108 pu, 약 4 x 108 pu, 약 1 x 109 pu, 약 2 x 109 pu, 약 4 x 109 pu, 약 1 x 1010 pu, 약 2 x 1010 pu, 약 4 x 1010 pu, 약 1 x 1011 pu, 약 2 x 1011 pu, 약 4 x 1011 pu, 약 1 x 1012 pu, 약 2 x 1012 pu, 또는 약 4 x 1012 pu의 아데노바이러스 벡터에 의한 단일 용량의 아데노바이러스 벡터를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 편입된 2013년 6월 4일자로 등록된 Nabel 등의 미국 특허 제8,454,972 B2호의 아데노바이러스 벡터; 및 이의 29 칼럼, 36 내지 58 라인의 용량을 참조한다. 본 명세서의 구현예에서, 아데노바이러스는 다수 용량을 통해 전달된다.
본 명세서의 구현예에서, 상기 전달은 AAV를 통한다. 인간에 대한 AAV의 생체내 전달을 위한 치료적 유효량은 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1010 기능성 AAV/ml 용액을 함유하는 식염수 용액의 약 20 내지 약 50 ml의 범위에 있는 것으로 믿어진다. 투약량은 임의의 부작용에 대해 치료적 이점의 균형을 맞추도록 조절될 수 있다. 본 명세서의 구현예에서, AAV 용량은 일반적으로 약 1 x 105 내지 1 x 1050 개 게놈 AAV, 약 1 x 108 개 내지 1 x 1020 개 게놈 AAV, 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1016 개 게놈, 또는 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1016 개 게놈 AAV의 농도 범위에 있다. 인간 투약량은 약 1 x 1013 개 게놈 AAV일 수 있다. 이러한 농도는 약 0.001 ㎖ 내지 약 100 ㎖, 약 0.05 내지 약 50 ㎖, 또는 약 10 내지 약 25 ㎖의 담체 중에 전달될 수 있다. 다른 유효 용량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적 시행을 통해 당업자에 의해 용이하게 확립될 수 있다. 예를 들어, 2013년 3월 26일자로 등록된 Hajjar 등의 미국 특허 제8,404,658 B2호, 27 칼럼, 45 내지 60행 참조한다.
본 명세서의 구현예에서, 전달은 플라스미드를 통한다. 이러한 플라스미드 조성물에서, 용량은 반응을 유발하는 충분한 양의 플라스미드이어야 한다. 예를 들어, 플라스미드 조성물 내 적합한 양의 플라스미드 DNA는 70 kg 개체당 약 0.1 ㎎ 내지 약 2 ㎎, 또는 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎍일 수 있다. 본 발명의 플라스미드는 일반적으로 (i) 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 CRISPR-Cas 단백질을 코딩하는 서열; (iii) 선택 가능한 마커; (iv) 복제 기원; 그리고 (v) (ii)의 하류에 작동적으로 연결된 전사 종결자를 포함할 것이다. 플라스미드는 또한 CRISPR 복합체의 RNA 성분을 코딩할 수 있지만, 이들 중 하나 이상은 대신에 상이한 벡터 상에서 코딩될 수 있다.
본 명세서의 용량은 평균 70 kg의 개체를 기준으로 한다. 투여 빈도는 의학 또는 수의학 종사자(예를 들어, 의사, 수의사) 또는 당업계의 숙련된 과학자의 영역 내이다. 또한 실험에서 사용되는 마우스는 전형적으로 약 20g이고, 마우스 실험으로부터 70 kg까지의 개체로 확대될 수 있다는 것이 주목된다.
본 명세서에 제공되는 조성물에 대해 사용되는 용량은 반복된 투여 또는 반복 용량을 위한 용량을 포함한다. 특정 구현예에서, 투여는 몇 주, 몇 개월 또는 몇 년의 기간 내에 반복된다. 적합한 어세이는 최적의 용량 요법을 얻기 위해 수행될 수 있다. 반복 투여는 오프-표적 변형에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있는 더 낮은 용량의 사용을 허용할 수 있다.
RNA 전달
특정 구현예에서, RNA 기반 전달이 사용된다. 이들 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질의 mRNA, 아데노신 디아미나제의 mRNA(CRISPR-Cas 단백질 또는 어댑터에 융합될 수 있음)는 시험관내 전사된 가이드 RNA와 함께 전달된다. Liang 등은 RNA 기반 전달을 이용하는 효율적인 게놈 편집을 기재한다 (단백질 Cell. 2015 May; 6(5): 363- 372). 일부 구현예에서, C2c1 및/또는 아데노신 디아미나제를 코딩하는 mRNA(들)는 화학적으로 변형될 수 있는데, 이는 플라스미드-코딩된 C2c1 및/또는 아데노신 디아미나제에 비해 개선된 활성을 야기할 수 있다. 예를 들어, mRNA(들)에서 우리딘은 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU)으로 부분적으로 또는 완전히 치환될 수 있다. 문헌 [Li et al., Nature Biomedical Engineering 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066 (2017)]을 참조하며, 이의 전문은 본 명세서에 참고로 편입된다.
전달 접근법의 예
RNP
특정 구현예에서, 사전-복합체화된 가이드 RNA, CRISPR-Cas 단백질 및 아데노신 디아미나제 (CRISPR-Cas 단백질 또는 어댑터에 융합될 수 있음)는 리보핵단백질 (RNP)로서 전달된다. RNP는 RNA 방법보다 훨씬 더 빠른 편집 효과를 야기한다는 장점을 갖는데, 이 과정이 전사에 대한 필요를 피하기 때문이다. 중요한 이점은 RNP 전달이 둘 모두 일시적이어서, 오프-표적 효과 및 독성 문제를 감소시킨다는 것이다. 상이한 세포 유형에서 효율적인 게놈 편집은 Kim et al. (2014, Genome Res. 24(6):1012-9), Paix et al. (2015, Genetics 204(1):47-54), Chu et al. (2016, BMC Biotechnol. 16:4), 및 Wang et al. (2013, Cell. 9;153(4):910-8)가 관찰하였다.
특정 구현예에서, 리보핵단백질은 WO2016161516에 기재된 바와 같은 폴리펩티드-기반 셔틀 작용제의 방법에 의해 전달된다. WO2016161516은 세포 침투성 도메인 (CPD)에, 히스티딘-풍부 도메인 및 CPD에 작동적으로 연결된 엔도솜 누출 도메인 (ELD)을 포함하는 합성 펩티드를 이용하는 폴리펩티드 카고의 효율적인 형질도입을 기재한다. 유사하게, 이들 폴리펩티드는 진핵생물 세포에서 CRISPR-이펙터 기반 RNP의 전달을 위해 사용될 수 있다.
입자
일부 양상 또는 구현예에서, 전달 입자 제형을 포함하는 조성물이 사용될 수 있다. 일부 양상 또는 구현예에서, 제형은 CRISPR 복합체를 포함하며, 상기 복합체는 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하는 가이드 및 CRISPR 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 입자는 지질계 입자, 선택적으로 지질 나노입자, 또는 양이온성 지질 및 선택적으로 생분해성 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판 (DOTAP)을 포함한다. 일부 구현예에서, 친수성 중합체는 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 입자는 지질단백질, 바람직하게는 콜레스테롤을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 입자는 직경이 500 ㎚ 미만, 선택적으로 직경이 250 ㎚ 미만, 선택적으로 직경이 100 ㎚ 미만, 선택적으로 직경이 약 35 ㎚ 내지 약 60 ㎚이다.
입자 전달 시스템 및/또는 제형의 몇몇 유형은 다양한 범위의 생의학적 적용에서 유용한 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 입자는 그의 수송 및 특성에 관해 전체 단위로서 거동하는 소형 물체로서 정의된다. 입자는 추가로 직경에 따라 분류된다. 조악한 입자는 2,500 내지 10,000 나노미터 범위를 포괄한다. 미세한 입자는 크기가 100 내지 2,500 나노미터이다. 초미세 입자, 또는 나노입자는 일반적으로 크기가 1 내지 100 나노미터이다. 100 ㎚ 한계 기준은 벌크 물질을 입자와 구별하는 신규 성질이 전형적으로 100 nm 이하의 임계 길이 규모에서 발생된다는 사실이다.
본 명세서에서 사용되는 입자 전달 시스템/제형은 본 발명에 따른 입자를 포함하는 임의의 생물학적 전달 시스템/제형으로서 정의된다. 본 발명에 따른 입자는 100 마이크론 (㎛) 미만의 최고 치수 (즉, 직경)을 갖는 임의의 독립체이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 10 ㎛ 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 2000 나노미터 (㎚) 미만의 최고 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 1000 나노미터 (㎚) 미만의 최고 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 900 ㎚, 800 ㎚, 700 ㎚, 600 ㎚, 500 ㎚, 400 ㎚, 300 ㎚, 200 ㎚, 또는 100 ㎚ 미만의 최고 치수를 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 입자는 500 ㎚ 이하의 최고 치수 (예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 250 ㎚ 이하의 최고 치수 (예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 200 ㎚ 이하의 최고 치수 (예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 150 ㎚ 이하의 최고 치수 (예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 100 ㎚ 이하의 최고 치수 (예를 들어, 직경)를 갖는다. 예를 들어, 50 nm 이하의 최고 치수를 갖는 보다 작은 입자가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 25㎚ 내지 200㎚의 범위의 최고 치수를 갖는다.
본 발명에 관해, 나노입자 또는 지질 외피를 이용하여 전달되는 CRISPR 복합체, 예를 들어, CRISPR-Cas 단백질 또는 mRNA, 또는 아데노신 디아미나제 (CRISPR-Cas 단백질 또는 어댑터에 융합될 수 있음) 또는 mRNA, 또는 가이드 RNA 중 하나 이상의 성분을 갖는 것이 바람직하다. 다른 전달 시스템 또는 벡터가 본 발명의 입자 측면과 함께 사용될 수 있다.
일반적으로, "나노입자" 는 1000 ㎚ 미만의 직경을 갖는 입의의 입자를 의미한다. 바람직한 일정 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 500 ㎚ 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 25 ㎚ 내지 200 ㎚ 범위의 가장 큰 치수를 갖는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 100 ㎚ 이하의 가장 큰 치수를 갖는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 35 ㎚ 내지 60 ㎚ 범위의 가장 큰 치수를 갖는다. 입자 또는 나노입자에 대한 언급은 적절한 경우, 상호 호환 가능할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
입자의 크기는 로딩 전에 측정되는지 또는 로딩 후에 측정되는지에 따라 상이하다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 용어 " 나노입자" 는 로딩 전 입자에 대해서만 적용될 수 있다.
본 발명에 포함된 입자는 상이한 형태, 예를 들어 고체 입자(예를 들어, 금속, 예컨대 은, 금, 철, 티타늄), 비-금속, 지질-기반 고체, 중합체), 입자의 현탁액, 또는 이들의 조합물로 제공될 수 있다. 금속, 유전체, 및 반도체 입자뿐만 아니라 하이브리드 구조(예를 들어, 코어-쉘 입자)가 제조될 수 있다. 반도체 물질로 제조된 입자는 또한 이들이 전자 에너지 수준의 양자화가 발생하기에 충분히 작은(통상적으로, 10 nm 이하) 경우 양자점으로 표지화될 수 있다. 이러한 나노규모 입자는 약물 담체 또는 영상화 작용제로서 생물의학 응용에서 사용되며, 본 발명에서 유사한 목적을 위해 적합하게 될 수 있다.
반고체 및 연성 입자가 제조되었고, 이들은 본 발명의 범주 내에 속한다. 반고체 성질의 프로토타입 입자는 리포솜이다. 다양한 유형의 리포솜 입자가 항암 약물 및 백신을 위한 전달 시스템으로서 현재 임상적으로 사용된다. 절반이 친수성이고, 나머지 절반이 소수성인 입자는 야누스 입자로 명명되며, 에멀젼을 안정화시키는데 특히 효과적이다. 이들은 물/오일 계면에서 자가-조립되며, 고체 계면활성제로 작용할 수 있다.
입자 특징규명 (예를 들어, 형태, 치수 등의 특징규명을 포함)은 다양한 상이한 기법을 사용하여 행해진다. 통상적인 기법은 전자 현미경 (TEM, SEM), 원자력 현미경 (AFM), 동적광산란 (DLS), X-선 광전자 분광법 (XPS), 분말 X-선 회절 (XRD), 푸리에 변환 적외선 분광법 (FTIR), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 시간 비행 질량분석법 (MALDI-TOF), 자외선-가시광선 분광학, 이중 극성화 간섭계법 및 핵자기공명 (NMR)이다. 특징규명 (치수 측정)은 본 발명의 임의의 시험관내 생체외 및/또는 생체내 적용을 위해서 전달을 위한 최적 크기의 입자를 제공하기 위해, 천연 입자 (즉, 로딩 전)로서 또는 카고의 로딩 이후 (여기서 카고는 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템 중 하나 이상의 성분, 예를 들어, CRISPR-Cas 단백질 또는 mRNA, 아데노신 디아미나제 (CRISPR-Cas 단백질 또는 어댑터에 융합될 수 있음) 또는 mRNA, 또는 가이드 RNA, 또는 이들의 임의의 조합물을 의미하고, 추가 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있음)에 수행될 수 있다. 바람직한 일정 구현예에서, 입자 치수 (예를 들어, 직경) 특징규명은 동적 레이저 산란 (DLS)을 이용하는 측정에 기반한다. 입자, 그들의 제조 및 사용 방법 및 이의 측정에 관해서, US 특허 번호 8,709,843; US 특허 번호 6,007,845; US 특허 번호 5,855,913; US 특허 번호 5,985,309; US 특허 번호 5,543,158; 및 [James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014)의 공개물 (2014년 5월 11일 온라인 공개), doi:10.1038/nnano.2014.84를 참조한다.
본 발명의 범주 내의 입자 전달 시스템은 고체, 반고체, 에멀션 또는 콜로이드 입자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어, 지질-기반 시스템, 리포솜, 마이셀, 미세소포, 엑소솜, 또는 유전자 총을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 임의의 전달 시스템은 본 발명의 범주 내에서 입자 전달 시스템으로서 제공될 수 있다.
CRISPR-Cas 단백질 mRNA, 아데노신 디아미나제 (CRISPR-Cas 단백질 또는 어댑터에 융합될 수 있음) 또는 mRNA, 및 가이드 RNA는 입자 또는 지질 외피를 이용하여 동시에 전달될 수 있고; 예를 들어, 본 발명의 CRISPR-Cas 단백질 및 RNA는, 예를 들어, 복합체로서, Dahlman 등의 WO2015089419 A2 및 이에 인용된 문헌에서와 같은 입자, 예컨대, 7C1 (예를 들어, 문헌 [James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014)] 참조, 2014년 5월 11일자에 공개, doi:10.1038/nnano.2014.84)을 통해 전달될 수 있고, 예를 들어, 전달 입자는 지질 또는 리피도이드 및 친수성 중합체, 예를 들어, 양이온성 지질 및 친수성 중합체를 포함하고, 예를 들어 여기서 양이온성 지질은 1,2-이올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP) 또는 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC)을 포함하고/하거나 친수성 중합체는 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하고/하거나, 입자는 콜레스테롤 (예를 들어, 제제 1의 입자 = DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0; 제제 번호 2 = DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, 콜레스테롤 0; 제제 번호 3 = DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, 콜레스테롤 5)을 더 포함하고, 입자는 효율적인, 다단계 과정을 사용해 형성되는데, 먼저, 이펙터 단백질 및 RNA는, 예를 들어, 1:1 몰비로, 예를 들어, 실온에서, 예를 들어, 30분 동안, 예를 들어, 멸균, 뉴클레아제 무함유 1X PBS에서 함께 혼합되고, 별개로, 제제에 적용가능하다면 DOTAP, DMPC, PEG, 및 콜레스테롤은 알콜, 예를 들어, 100% 에탄올에 용해되어서, 2개 용액을 함께 혼합하여 복합체를 함유하는 입자를 형성시킨다).
핵산-표적화 이펙터 단백질 (예를 들어, V형 단백질, 예컨대, C2c1) mRNA 및 가이드 RNA는 입자 또는 지질 외피를 이용하여 동시에 전달될 수 있다. 적합한 입자의 예는 미국 특허 제9,301,923호에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
예를 들어, 문헌[Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ (" In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles" Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):77487. Epub 2011 Apr 1)]은 인지질 이중층 쉘에 의해 둘러싸인 폴리(β-아미노 에스테르)(PBAE) 코어를 지니는 생분해성 코어-쉘 구조의 나노입자를 기재한다. 이들은 생체내 mRNA 전달을 위해 개발되었다. pH-반응성 PBAE 성분은 엔도솜 하괴를 촉진하도록 선택되었고, 반면 지질 표면층은 다가양이온 코어의 독성을 최소화하도록 선택되었다. 그러므로, 이것은 본 발명의 RNA 전달에 바람직하다.
일 구현예에서, 모두 뇌에 대한, 펩티드의 경구 전달, 펩티드의 정맥내 전달 및 펩티드의 비강 전달에 적용할 수 있는, 자기 조립형 생체부착 중합체 기반 입자/나노입자가 고려된다. 다른 구현예, 예컨대, 경구 흡수 및 소수성 약물의 안구 전달이 또한 고려된다. 분자 엔벨로프 기술은 보호되고 질환 부위에 전달되는 조작된 중합체를 포함한다 (참조: 예를 들어, Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026; Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1):14-28; Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012. 161(2):523-36; Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6):1665-80; Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6):1764-74; Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6):458-68; Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5):681-688; Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7:S423-33; Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5):629-40; Qu, X.,et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9 및 Uchegbu, I.F., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199). 표적 조직에 따라 단일 또는 다수 용량으로, 약 5㎎/㎏의 용량이 고려된다.
일 구현예에서, MIT의 단 앤더슨 랩(Dan Anderson's lab)에 의해 개발된 종양 성장을 중단시키기 위해 암 세포에 RNA를 전달할 수 있는 입자/나노입자가 사용되고/되거나 본 발명의 AD-작용화된 CRISPR-Cas 시스템에 적합하게 될 수 있다. 특히, 앤더슨 랩은 새로운 생체물질 및 나노제형의 합성, 정제, 특성규명 및 제형화를 위한 완전히 자동화된, 조합 시스템을 개발하였다. 참조, 예를 들어, Alabi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 6;110(32):12881-6; Zhang et al., Adv Mater. 2013 Sep 6;25(33):4641-5; Jiang et al., Nano Lett. 2013 Mar 13;13(3):1059-64; Karagiannis et al., ACS Nano. 2012 Oct 23;6(10):8484-7; Whitehead et al., ACS Nano. 2012 Aug 28;6(8):6922-9 및 Lee et al., Nat Nanotechnol. 2012 Jun 3;7(6):389-93.
미국 공개 특허 출원 제20110293703호는 본 발명의 AD-기능화된 CRISPR-Cas 시스템을 전달하는 데 적용될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 투여에 특히 유용한 리피도이드 화합물에 관한 것이다. 일 양상에서, 아미노알콜 리피도이드 화합물은 세포 또는 대상체에 전달하려는 작용제와 조합되어 미세입자, 나노입자, 리포솜 또는 마이셀을 형성한다. 입자, 리포솜 또는 마이셀에 의해 전달하려는 작용제는 기체, 액체 또는 고체의 형태일 수 있고, 작용제는 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드 또는 소형 분자일 수 있다. 아미노알콜 리피도이드 화합물은 다른 아미노알콜 리피도이드 화합물, 중합체 (합성 또는 천연), 계면활성제, 콜레스테롤, 탄수화물, 단백질, 지질 등과 조합되어 입자를 형성할 수 있다. 이어서, 이들 입자는 선택적으로 약학 부형제와 조합되어 약학 조성물을 형성할 수 있다.
미국 공개 특허 출원 제20110293703호는 또한 아미노알콜 리피도이드 화합물의 제조 방법을 제공한다. 아민의 하나 이상의 등가물은 적합한 조건 하에 에폭시드-종결 화합물의 하나 이상의 등가물과 반응되어 본 발명의 아미노알콜 리피도이드 화합물을 형성한다. 일정 구현예에서, 아민의 모든 아미노기는 에폭시드-종결 화합물과 완전히 반응되어 3차 아민을 형성한다. 다른 구현예에서, 아민의 모든 아미노기는 에폭시드-종결 화합물과 완전히 반응되지 않아서 3차 아민을 형성하고, 이에 의해 아미노알콜 리피도이드 화합물에서 1차 또는 2차 아민을 초래한다. 이들 1차 또는 2차 아민은 그대로 남아있거나 또는 상이한 에폭시드-종결 화합물과 같은 다른 친핵체와 반응될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 과량 미만의 에폭시드-종결 화합물과 아민의 반응은 다양한 수의 꼬리부를 갖는 복수의 상이한 아미노알콜 리피도이드 화합물을 생성시키게 될 것이다. 일정 아민은 2개의 에폭시드-유래 화합물 꼬리부에 의해 완전히 작용화될 수 있는 반면, 다른 분자는 에폭시드-유래 화합물 꼬리부에 의해 완전히 작용화되지 않을 것이다. 예를 들어, 디아민 또는 폴리아민은 분자의 다양한 아미노 모이어티로부터 1, 2, 3 또는 4개의 에폭시드-유래 화합물 꼬리부를 포함하여, 1차, 2차 및 3차 아민을 초래할 수 있다. 일정 구현예에서, 모든 아미노기는 완전히 작용화되지 않는다. 일정 구현예에서, 2종의 동일한 유형의 에폭시드-종결된 화합물이 사용된다. 다른 구현예에서, 2종 이상의 상이한 에폭시드-종결된 화합물이 사용된다. 아미노알콜 리피도이드 화합물의 합성은 용매와 함께 또는 용매 없이 수행되고, 합성은 30 내지 100℃, 바람직하게는 대략 50 내지 90℃ 범위의 고온에서 수행될 수 있다. 제조된 아미노알콜 리피도이드 화합물은 임의로 정제될 수 있다. 예를 들어, 아미노알콜 리피도이드 화합물의 혼합물은 정제되어 특정 수의 에폭시드-유래 화합물 꼬리부를 갖는 아미노알콜 리피도이드 화합물을 수득할 수 있다. 또는 혼합물은 정제되어 특정 입체- 또는 위치이성질체를 수득할 수 있다. 아미노알콜 리피도이드 화합물은 또한 알킬 할로겐화물 (예를 들어, 메틸 아이오다이드) 또는 다른 알킬화제를 이용하여 알킬화될 수 있고/있거나 그들은 아실화될 수 있다.
미국 특허 공개 제20110293703호는 또한 본 발명의 방법에 의아 제조된 아미노알콜 리피도이드 화합물의 라이브러리를 제공한다. 이들 아미노알콜 리피도이드 성분은 액체 취급기, 로봇, 마이크로타이터 플레이트, 컴퓨터 등을 포함한 고속-대용량 기술을 사용해 제조 및/또는 스크리닝될 수 있다. 일정 구현예에서, 아미노알콜 리피도이드 화합물은 세포로 폴리뉴클레오티드 또는 다른 작용제 (예를 들어, 단백질, 펩티드, 소형 분자)를 전달하는 그들 능력에 대해 스크리닝된다.
미국 특허 공개 제20130302401호는 조합적 중합화를 사용하여 제조된 폴리(베타-아미노 알코올)(PBAA)의 부류에 관한 것이다. 본 발명의 PBAA는 생체기법 및 생의학적 적용분야에서 코팅 (예컨대, 의학적 장치 또는 이식물에 대한 필름의 코팅 또는 다중층 필름), 첨가제, 물질, 부형제, 비-바이오파울링제 (non-biofouling agent), 미세패턴화제 및 세포의 캡슐화제로서 사용될 수 있다. 표면 코팅제로서 사용될 때, 이들 PBAA는 그들의 화학 구조에 따라서 시험관내와 생체내 둘 모두에서 상이한 염증 수준을 유발하였다. 이 부류의 물질의 더 큰 화학적 다양성은 본 발명자들이 시험관내 거대세포 활성화를 억제하는 중합체 코팅을 확인할 수 있게 하였다. 더 나아가, 이들 코팅은 염증 세포의 동원을 감소시키고, 카복실화된 폴리스티렌 미세입자의 피하 이식 후에 섬유증을 감소시킨다. 이들 중합체는 세포 캡슐화를 위해 다가전해질 복합체 캡슐을 형성하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 다수의 다른 생물학적 적용분야, 예컨대, 항미생물 코팅, DNA 또는 siRNA 전달 및 줄기 세포 조직 조작을 가질 수 있다. 미국 공개 특허 출원 제20130302401호의 교시는 본 발명의 AD-기능화된 CRISPR-Cas 시스템에 적용될 수 있다.
C2c1, (C2c1 또는 어댑터 단백질에 융합될 수 있는) 아데노신 디아미나제, 및 가이드 RNA를 포함하는 사전 조립된 재조합 CRISPR-Cas 복합체는 예를 들어 전기천공에 의해 형질감염되어, 높은 돌연변이율 및 검출 가능한 오프-표적 돌연변이의 부재를 초래한다. Hur, J.K. et al, Targeted mutagenesis in mice by electroporation of C2c1 ribonucleoproteins, Nat Biotechnol. 2016 Jun 6. doi: 10.1038/nbt.3596.
뇌로의 국소 전달과 관련하여, 이것은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 재료는 선조체내로, 예를 들어, 주사를 통해 전달될 수 있다. 주사는 개두술을 통해 정위적으로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 당-기반 입자, 예를 들어 GalNAc은 본 명세서에 기재된 바와 같이 사용될 수 있으며, 특히 전달에 관해 WO2014118272(본 명세서에 참고로 편입됨) 및 문헌 [Nair, JK et al., 2014, Journal of the American Chemical Society 136 (49), 16958-16961)] 및 본 명세서의 교시를 참고로 하여 달리 명확하지 않다면, 모든 입자에 적용된다. 이는 당-기반 입자인 것으로 고려될 수 있고, 다른 입자 전달 시스템 및/또는 제형에 대한 추가적인 상세한 설명이 본 명세서에 제공된다. 그러므로, GalNAc는 본 명세서에 기술된 다른 입자의 의미에서 입자라고 간주될 수 있어서, 일반적인 용도 및 다른 고려사항, 예를 들어 상기 입자의 전달이 역시 GalNAc 입자에 적용된다. 5'-헥실아미노 변형된 올리고뉴클레오티드(5'-HA ASO, 분자량 대략 8000Da; 문헌[ et al., Bioconjugate Chem., 2015, 26 (8), pp 1451-1455])에 대해 PFP(펜타플루오로페닐) 에스터로서 활성화된, 예를 들어, 3안테나 GalNAc 클러스터(분자량 대략 2000)를 부착하기 위하여 용액상 접합 전략이 사용될 수 있다. 유사하게, 생체내 핵산 전달을 위한 폴리(아크릴레이트) 중합체가 기술된 바 있다 (참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013158141 참조). 추가적인 대안의 구현예에서, CRISPR 나노 입자 (또는 단백질 복합체)와 천연 발생 혈청 단백질의 사전 혼합이 전달을 개선시키기 위해 사용될 수 있다 (Akinc A et al, 2010, Molecular Therapy vol. 18 no. 7, 13571364).
나노클루 (Nanoclew)
또한, CRISPR-C2c1 시스템은 예를 들어, 하기 문헌 들에 기술된 나노클루를 사용해 전달될 수 있다: Sun W et al, Cocoon-유사 self-degradable DNA nanoclew for anticancer drug delivery., J Am Chem Soc. 2014 Oct 22;136(42):14722-5. doi: 10.1021/ja5088024. Epub 2014 Oct 13.; 또는 Sun W et al, Self-Assembled DNA Nanoclews for the Efficient Delivery of CRISPR-Cas9 for Genome Editing., Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Oct 5;54(41):12029-33. doi: 10.1002/anie.201506030. Epub 2015 Aug 27.
지질 입자
일부 구현예에서, 전달은 지질 입자, 예컨대, LNP에 C2c1 단백질 또는 mRNA 형태의 캡슐화에 의한다. 따라서, 일부 구현예에서, 지질 나노입자 (LNP)가 고려된다. 안티트랜스타이레틴 짧은 간섭 RNA는 지질 나노입자에 캡슐화되었고, 인간에게 전달되며 (예를 들어, 문헌 [Coelho et al., N Engl J Med 2013;369:81929] 참조), 이러한 시스템은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 적합하고, 적용될 수 있다. 정맥내로 투여되는 kg 체중당 약 0.01 내지 약 1 ㎎의 용량이 고려된다. 주입-관련 반응 위험을 감소시키기 위한 약물이 고려되고, 예컨대, 덱사메타손, 아세트암피노펜, 다이펜하이드라민 또는 세티리진 및 라니티딘이 고려된다. 5회 용량의 경우 4주마다 킬로그램 당 약 0.3 ㎎의 다수 용량이 또한 고려된다.
LNP는 간에 siRNA를 전달하는 데 고도로 효과적인 것으로 확인되었고 (예를 들어, 문헌 [Tabernero et al., Cancer Discovery, April 2013, Vol. 3, No. 4, pages 363-470 참조), 그러므로 CRISPR Cas를 코딩하는 RNA를 간에 전달하는 것이 고려된다. 2주마다 6 ㎎/㎏의 LNP의 약 4회 용량의 용량이 고려될 수 있다. Tabernero 등은 0.7 ㎎/㎏ 용량의 LNP의 최초 2회 주기 이후에 종양 퇴행이 관찰되었고, 6회 주기의 종료까지, 환자는 림프절 전이의 완전한 퇴행 및 간 종양의 실질적 축소로 부분 반응을 달성하였다는 것을 입증하였다. 이 환자에서 40 용량 이후에 완전 반응이 수득되었고, 환자는 26개월 동안 용량을 받은 후에 관해 및 완전 치료된 채로 남았다. VEGF 경로 억제제에 의한 사전 요법 후에 진행된 신장, 폐 및 림프절을 포함하여 간외 질환 부위 및 RCC를 갖는 2명 환자는 대략 8개월 내지 12개월 동안 모든 부위에서 안정한 질환을 가졌고, PNET 및 간 전이를 갖는 환자는 안정한 질환을 가진채로 18개월 (36회 용량) 동안 계속 연장 연구되었다.
그러나, LNP의 전하가 고려되어야만 한다. 양이온성 지질이 음으로 하전된 지질과 조합되어 세포내 전달을 용이하게 하는 비이중층 구조를 유도하기 때문이다. 하전된 LNP는 정맥내 주사 후 순환으로부터 빠르게 제거되기 때문에, pKa 값이 7 미만인 이온화 가능한 양이온성 지질이 발생되었다 (예를 들어, 문헌 [Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011] 참조). 음으로 하전된 중합체, 예컨대, RNA는 이온화가능한 지질이 양전하를 나타내는 낮은 pH 값 (예를 들어, pH 4)에서 LNP에 로딩될 수 있다. 그러나, 생리적 pH 값에서, LNP는 더 긴 순환 시간과 상용성인 낮은 표전 전하를 나타낸다. 이온화 가능한 양이온성 지질의 4가지 종, 즉, 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레일옥시-케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DLinKDMA) 및 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLinKC2-DMA)에 집중하였다. 이들 지질을 함유하는 LNP siRNA 시스템은 생체내 간세포에서 현저하게 상이한 유전자 침묵 특성을 나타내며, 역가는 인자 VII 유전자 침묵 모델을 적용하는 시리즈 DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP에 따라 다양하다 (예를 들어, 문헌 [Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 12862200, Dec. 2011] 참조). 특히 DLinKC2-DMA를 함유하는 제형에 대하여, 1 ㎍/㎖의 투여량의 LNP 또는 LNP 중의 또는 이와 연합된 CRISPR Cas RNA가 고려될 수 있다.
LNP 및 CRISPR Cas 캡슐화의 제조는 문헌 [Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, p 12862200, Dec. 2011]로부터 사용되고/되거나 개조될 수 있다. 양이온성 지질 1,2-다이리네오일-3-다이메틸암모늄-프로판(DLinDAP), 1,2-다이리놀레일옥시-3-N,N-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레일옥시케토-N,N-다이메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA), 1,2-다이리놀레일-4-(2-다이메틸아미노에틸)-[1,3]-다이옥솔란(DLinKC2-DMA), (3-o-[2"-(메톡시폴리에틸렌글리콜 2000) 석시노일]-1,2-다이미리스토일-sn-글리콜(PEG-S-DMG) 및 R-3-[(ω-메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)2000) 카바모일]-1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-아민 (PEG-C-DOMG)은 Tekmira Pharmaceuticals (캐나다 밴쿠버에 소재)에 의해 제공되거나 또는 합성될 수 있다. 콜레스테롤은 Sigma (St Louis, MO)로부터 구입할 수 있다. 특정 CRISPR Cas RNA는 DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA, 및 DLinKC2-DMA (40:10:40:10 몰비의 양이온성 지질:DSPC:CHOL: PEGS-DMG 또는 PEG-C-DOMG)을 함유하는 LNP에 캡슐화될 수 있다. 필요하다면, 0.2% SP-DiOC18 (Invitrogen, Burlington, Canada)은 세포 흡수, 세포내 전달 및 생체분포를 평가하기 위해 혼입될 수 있다. 캡슐화는 에탄올에 양이온성 지질:DSPC:콜레스테롤:PEG-c-DOMG (40:10:40:10 몰비)를 포함하는 지질 혼합물을 10 m㏖/ℓ 의 최종 지질 농도로 용해시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 지질의 에탄올 용액을 50 m㏖/ℓ 시트레이트, pH 4.0에 적가하여 다층판 소포체를 형성하여 30% 에탄올 vol/vol의 최종 농도를 생성할 수 있다. 압출기(캐나다 밴쿠버에 소재한 노던 리피즈(Northern Lipids))를 이용하여 2개의 적층된 80㎚ 뉴클레포어(Nuclepore) 폴리카보네이트 필터를 통해 다층판 소포의 압출 후 거대 단층판 소포가 형성될 수 있다. 30% 에탄올 vol/vol 적가물 pH 4.0을 함유하는 50m㏖/ℓ 시트르산염에서 2㎎/㎖로 용해시킨 RNA를 압출 수행된 거대 단층판 소포에 첨가함으로써 그리고 0.06/1 wt/wt의 최종 RNA/지질 중량 비로 일정하게 혼합하면서 31℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 캡슐화가 달성될 수 있다. Spectra/Por 2 재생된 셀룰로스 투석막을 이용하여 16시간 동안 인산염-완충 식염수(PBS), pH 7.4에 대한 투석에 의해 에탄올의 제거 및 제형 완충제의 중화가 수행되었다. NICOMP 370 입도 분석기, 소포체/강도 모드 및 가우시안 적합도 (Nicomp Particle Sizing, Santa Barbara, CA)를 이용하는 동적광산란에 의해 나노입자 크기 분포를 결정할 수 있다. 모든 3가지의 LNP 시스템에 대한 입자 크기는 ∼70 ㎚의 직경일 수 있다. RNA 캡슐화 효율은 투석 이전 및 이후에 수집된 샘플로부터 VivaPureD MiniH 컬럼 (Sartorius Stedim Biotech)을 사용해 유리 RNA를 제거하여 결정할 수 있다. 캡슐화된 RNA는 용리된 입자로부터 추출되고, 260 nm에서 정량화될 수 있다. RNA 대 지질비는 Wako Chemicals USA(Richmond, VA)의 콜레스테롤 E 효소 어세이를 이용하여 소포체 내 콜레스테롤 함량 측정에 의해 결정되었다. 본 명세서에서 논의된 LNP 및 PEG 지질과 함께, PEG화된 리포솜 또는 LNP가 역시 CRISPR-Cas 시스템 또는 이의 성분의 전달에 적합하다.
지질 사전혼합 용액 (20.4 ㎎/㎖의 총 지질 농도)은 DLinKC2-DMA, DSPC 및 콜레스테롤을 50:10:38.5 몰비로 함유하는 에탄올 중에서 제조될 수 있다. 소듐 아세테이트는 0.75:1 (소듐 아세테이트:DLinKC2-DMA)의 몰비로 지질 사전혼합물에 첨가될 수 있다. 지질은 후속하여 격렬하게 교반시키면서 혼합물을 1.85 부피의 시트레이트 완충제 (10 m㏖/ℓ, pH 3.0)와 조합하여 수하될 수 있어서, 그 결과로 35% 에탄올을 함유하는 수성 완충액 중에 자발적 리포솜 형성을 야기시킨다. 리포솜 용액은 입자 크기의 시간-의존적 증가를 가능하게 하기 위해 37℃에서 인큐베이션될 수 있다. 동적광산란 (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, UK)에 의한 리포솜 크기 변화를 조사하기 위해 인큐베이션 동안 다양한 시간에 분취액을 제거할 수 있다. 목적 입자 크기가 얻어지면, 수성 PEG 지질 용액 (스톡 = 35% (vol/vol) 에탄올 중 10 ㎎/㎖ PEG-DMG)을 리포솜 혼합물에 첨가하여 3.5% 총 지질의 최종 PEG 몰농도가 산출될 수 있다. PEG-지질의 첨가 시, 리포솜은 그들의 크기를 조절하여 추가 성장을 효과적으로 중단시켜야 한다. 이어서, RNA는 대략 1:10 의 RNA 대 총 지질 비율 (wt:wt))로 빈 리포솜에 첨가된 후에, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션되어 로딩된 LNP가 형성될 수 있다. 혼합물은 후속적으로 PBS에서 밤새 투석될 수 있고, 0.45 ㎛ 시린지 필터로 여과될 수 있다.
구형 핵산 (SNA™) 구성체 및 다른 나노 입자 (특히 금 나노입자)는 또한 의도된 표적에 CRISPR-Cas 시스템을 전달하기 위한 수단으로서 고려된다. 유의한 데이터는 핵산-작용화된 금 나노입자에 기반한 AuraSense Therapeutics의 구형 핵산(SNA™) 구성체가 유용하다는 것을 보여준다.
본 명세서의 교시와 함께 적용될 수 있는 문헌은 다음을 포함한다: Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257, Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162, Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970, Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391, Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71, Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80, Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638 Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691, Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16, Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630, Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152 (2013) 및 Mirkin, et al., Small, 10:186-192.
RNA를 갖는 자가 조립 입자는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 원위 말단에 부착된 Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드 리간드로 PEG화된 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 작제될 수 있다. 이러한 시스템은, 예를 들어 인테그린을 발현하는 종양 신생혈관을 표적화하고, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGF R2) 발현을 억제하는 siRNA를 전달하여, 이에 의해, 종양 혈관형성을 달성하기 위한 수단으로 사용된다(참조, 예를 들어, Schiffelers et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 19). 2 내지 6 범위의 순 몰 과량의 이온화가능한 질소 (중합체) 대 포스페이트 (핵산)를 제공하도록 동일 부피의 양이온 중합체 수용액 및 핵산을 혼합하여 나노플렉스를 제조할 수 있다. 양이온성 중합체와 핵산 사이의 정전기적 상호작용은 본 명세서에서 나노플렉스라고 하는 약 100 nm의 평균 입자 크기 분포를 갖는 폴리플렉스의 형성을 야기시킨다. 약 100 내지 200 ㎎ 용량의 CRISPR Cas가 Schiffelers 등의 자가-조립 입자로의 전달을 위해 계획된다.
Bartlett 등의 나노플렉스 (PNAS, September 25, 2007,vol. 104, no. 39)가 또한 본 발명에 적용될 수 있다. Bartlett 등의 나노플렉스는 동일 부피의 양이온성 중합체 및 핵산의 수용액을 혼합함으로써 제조되어 2 내지 6의 범위에 걸쳐 인산염(핵산)에 대한 순 몰 과량의 이온화 가능한 질소(중합체)를 제공한다. 양이온성 중합체와 핵산 간의 정전기적 상호작용은 약 100 nm의 평균 입자 크기를 지니는 다중복합체 형성을 야기하며, 따라서 본 명세서에서 나노복합체로서 지칭된다. Bartlett 등의 DOTA-siRNA는 다음과 같이 합성되었다: 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노(N-하이드록시숙신이미드 에스테르)(DOTA-NHS에스테르)를 Macrocyclics(미국 텍사스주 달라스 소재)에서 주문하였다. 카보네이트 완충액 (pH 9) 중 100배 몰 과량의 DOTA-NHS-에스테르로 아민 변형된 RNA 센스 가닥을 미세원심분리 튜브에 첨가하였다. 내용물은 4시간 동안 실온에서 교반시켜 반응시켰다. DOTA-RNA센스 접합체를 에탄올 침전시키고 나서, 물에서 재현탁시킨 후, 비변형 안티센스 가닥에 어닐링시켜서 DOTA-siRNA를 산출하였다. 모든 액체는 Chelex-100(Bio-Rad, Hercules, CA)로 전처리하여 미량의 금속 오염물을 제거하였다. Tf-표적화 및 비표적화 siRNA 입자를 사이클로덱스트린-함유 다가양이온을 사용함으로써 형성할 수 있다. 통상적으로, 입자를 전하비 3(+/-) 및 siRNA 농도 0.5 g/리터로 수 중에서 형성하였다. 표적화된 입자의 표면 상의 아다만탄-PEG 분자의 1%를 Tf로 변형시켰다(아다만탄-PEG-Tf). 입자를 주사용 5%(wt/vol) 글루코스 담체 용액 중에서 현탁화시켰다.
Davis 등(Nature, Vol 464, 15 April 2010)은 표적화된 나노입자-전달 시스템을 사용하는 RNA 임상 시험 (임상 시험 등록 번호 NCT00689065)을 수행한다. 표준 치료 요법에 대해 난치성인 고형암을 갖는 환자에게 21일 주기 중 1일, 3일, 8일 및 10일에 30분 정맥내 주입으로 표적화된 나노입자의 용량을 투여한다. 나노입자는 (1) 선형, 시클로덱스트린계 중합체 (CDP), (2) 암 세포 표면 상에서 TF 수용체(TFR)와 맞물리도록 나노입자 외부에 제시되는 리간드 표적화 인간 트랜스페린 단백질 (TF), (3) 친수성 중합체 (생물학적 유체에서 나노입자 안정성을 촉진시키기 위해 사용되는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)), 및 (4) RRM2의 발현을 감소시키도록 디자인된 siRNA (임상에서 사용되는 서열은 이전에 표시된siR2B+5임)를 함유하는 합성 전달 시스템으로 이루어진다. TFR은 악성 세포에서 상향조절되는 것으로 오랫동안 알려져있었고, RRM2는 확립된 항암 표적이다. 이들 나노입자(CALAA-01로서 정의된 임상 형태)는 비-인간 영장류에서의 다회 투약 연구에서 잘 용인되는 것으로 나타났다. 만성 골수성 백혈병을 갖는 단일 환자에게 리포솜 전달에 의해 siRNA가 투여되었지만, Davis 등의 임상 시험은 표적화된 전달 시스템으로 siRNA를 전신에 전달하고 고형암을 갖는 환자를 치료하기 위한 초기 인간 시험이다. 표적화된 전달 시스템이 인간 종양에 기능성 siRNA의 효과적인 전달을 제공하는지의 여부를 확인하기 위해, Davis 등은 3종의 상이한 투약 코호트로부터 3명의 환자로서, 모두 전이성 흑색종을 갖고 각각 18, 24 및 30 ㎎ m-2 siRNA의 CALAA-01 용량을 받은 환자 A, B 및 C로부터의 생검을 조사하였다. 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 대해 유사한 용량이 또한 고려될 수 있다. 본 발명의 전달은 선형, 사이클로덱스트린-기반 중합체(CDP), 암세포의 표면 상의 TF 수용체(TFR)에 맞물리는 입자 외부에 나타나는 인간 트랜스페린 단백질(TF) 표적화 리간드 및/또는 친수성 중합체(예를 들어, 생물학적 유체 중에서 입자 안정성을 촉진하기 위해 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 함유하는 입자에 의해 달성될 수 있다.
참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 8,709,843은 조직, 세포, 및 세포내 구획으로의 치료제-함유 입자의 표적화된 전달을 위한 약물 전달 시스템을 제공한다. 상기 발명은 계면활성제, 친수성 중합체 또는 지질에 접합된 중합체를 포함하는 포함하는 표적화된 입자를 제공한다. 참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 6,007,845는 다작용성 화합물과 하나 이상의 소수성 중합체 및 하나 이상의 친수성 중합체를 공유적으로 연결시킴으로써 형성된 멀티블록 공중합체의 코어를 갖고, 생물학적으로 활성인 물질을 함유하는 입자를 제공한다. 본 명세서에 참고로 편입된 미국 특허 제5,855,913호는 탭 밀도가 0.4 g/㎤ 미만이고 평균 직경이 5 ㎛ 내지 30 ㎛이며, 폐 시스템에 약물 전달을 위해 표면 상에 계면활성제를 혼입시키는 공기역학적 광 입자를 갖는 미립자 조성물을 제공한다. 참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 5,985,309는 폐기관계로의 전달을 위한 계면활성제 및/또는 양으로 또는 음으로 하전된 치료제 또는 진단제 및 반대 전하로 하전된 분자의 친수성 또는 소수성 복합체가 혼입된 입자를 제공한다. 참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 5,543,158은 표면 상에 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티 및 생물학적 활성 물질을 함유하는 생분해성 고체 코어를 갖는 생분해성 주사가능한 입자를 제공한다. 본 명세서에 참고로 편입된 WO2012135025(또한 미국 특허 제20120251560호로서 공개됨)는 접합된 폴리에틸렌이민(PEI) 중합체 및 접합된 아자-거대고리(총괄적으로 "접합 리포머" (lipomer) 또는 "리포머" 로서 지칭됨)를 기재한다. 일정 구현예에서, 이러한 접합 리포머는 단백질 발현의 조율을 비롯한 유전자 발현을 변형시키는 시험관내, 생체외 및 생체내 게놈 동요를 달성하기 위해 CRISPR-Cas 시스템과 관련하여 사용될 수 있다는 것이 고려될 수 있다.
일 실시형태에서, 입자는 에폭시드-변형된 지질-중합체, 유리하게는 7C1일 수 있다 (예를 들어, 2014년 5월 11일자로 온라인 상에서 공개된 [James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014)], doi:10.1038/nnano.2014.84] 참조). C71을 14:1의 몰비로 C15 에폭시드-말단 지질과 PEI600을 반응시킴으로써 합성하였고, 적어도 40 일 동안 PBS 용액에서 안정적인 입자(35 nm 내지 60 nm의 직경)를 생성시키기 위해 C14PEG2000과 함께 제형화하였다.
에폭시드-변형된 지질-중합체는 폐, 심장 또는 신장 세포에 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템을 전달하기 위해 이용될 수 있지만, 당업자는 다른 표적 기관에 전달하도록 시스템을 개조할 수 있다. 약 0.05 내지 약 0.6 ㎎/㎏ 범위의 용량이 계획된다. 수 일 또는 수 주 동안 용량이 또한 고려되고 총 용량은 약 2 ㎎/㎏이다.
일부 구현예에서, RNA 분자를 전달하기 위한 LNP는 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 본 명세서에 참고로 편입된 WO 2005/105152 (PCT/EP2005/004920), WO 2006/069782 (PCT/EP2005/014074), WO 2007/121947 (PCT/EP2007/003496), 및 WO 2015/082080 (PCT/EP2014/003274)에 기재된 것에 의해 제조된다. 포유류 세포 내로 siRNA의 향상된 그리고 개선된 전달 시 특이적으로 목적으로 하는 LNP는, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 편입되고, 본 기술에 적용될 수 있는, 하기 문헌들에 기술되어 있다: Aleku et al., Cancer Res., 68(23): 9788-98 (Dec. 1, 2008), Strumberg et al., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 50(1): 76-8 (Jan. 2012), Schultheis et al., J. Clin. Oncol., 32(36): 4141-48 (Dec. 20, 2014), 및 Fehring et al., Mol. Ther., 22(4): 811-20 (Apr. 22, 2014)
일부 구현예에서, LNP는 WO 2005/105152 (PCT/EP2005/004920), WO 2006/069782 (PCT/EP2005/014074), WO 2007/121947 (PCT/EP2007/003496) 및 WO 2015/082080 (PCT/EP2014/003274)에 개시된 임의의 LNP를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 화학식 I의 구조를 갖는 적어도 하나의 지질을 포함한다:
Figure pct00030
(화학식 I)
식 중, R1 및 R2는 각각 그리고 독립적으로 알킬을 포함하는 기로부터 선택되고, n은 1 내지 4의 임의의 정수이며, R3은 하기 화학식 II에 따른 라이실, 오르니틸, 2,4-다이아미노뷰티릴, 히스티딜 및 아실 모이어티를 포함하는 군으로부터 선택된 아실이고:
Figure pct00031
(화학식 II)
식 중, m은 1 내지 3의 임의 정수이고, Y- 는 약학적으로 허용가능한 음이온이다. 일부 구현예에서, 화학식 I에 따른 지질은 적어도 2개의 비대칭 C 원자를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 I의 거울상 이성질체는 제한없이 R-R; S-S; R-S 및 S-R 거울상 이성질체를 포함한다.
일부 구현예에서, R1은 라우릴이고 R2는 미리스틸이다. 다른 구현예에서, R1은 팔미틸이고 R2는 올레일이다. 일부 구현예에서, m은 1 또는 2이다. 일부 구현예에서, Y-는 할로게니드, 아세테이트 또는 트리플루오로아세테이트로부터 선택된다.
일부 구현예에서, LNP는 하기로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함한다:
-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 (화학식 III):
Figure pct00032
(화학식 III)
-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 (화학식 IV):
Figure pct00033
(화학식 IV); 및
-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 (화학식 V):
Figure pct00034
(화학식 V).
일부 구현예에서, LNP는 또한 구성성분을 포함한다. 예로서, 제한없이,일부 구현예에서, 구성성분은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 또는 이들의 조합물로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 구성성분은 항체, 예를 들어, 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 구성성분은, 예를 들어, 리보자임, 압타머, 스피에겔머 (spiegelmer), DNA, RNA, PNA, LNA, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 핵산이다. 일부 구현예에서, 핵산은 가이드 RNA 및/또는 mRNA이다.
일부 구현예에서, LNP의 구성성분은 CRIPSR-Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP의 구성성분은 II형 또는 V형 CRIPSR-Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP의 구성성분은 아데노신 디아미나제 (CRISPR-Cas 단백질 또는 어댑터 단백질에 융합될 수 있음)를 코딩하는 mRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, LNP의 구성성분은 추가로 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 혈관내피에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 폐 내피에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 간에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 폐에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 심장에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 비장에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 신장에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 췌장에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 뇌에 전달하도록 구성된다. 일부 구현예에서, LNP는 앞서 언급된 mRNA 및 가이드 RNA를 대식세포에 전달하도록 구성된다.
일부 구현예에서, LNP는 또한 적어도 하나의 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 인지질 및 스테로이드로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 인지질은 인산의 디에스테르 및/또는 모노에스테르이다. 일부 구현예에서, 인지질은 포스포글리세라이드 및/또는 스핑고지질이다. 일부 구현예에서, 스테로이드는 부분적으로 수소화된 사이클로펜타[a]페난트렌에 기반한 천연 유래 및/또는 합성 화합물이다. 일부 구현예에서, 스테로이드는 21 내지 30개의 C 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE), 세라미드, 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 헬퍼 지질은 PEG 모이어티, HEG 모이어티, 폴리히드록시에틸 전분 (폴리HES) 모이어티 및 폴리프로필렌 모이어티를 포함하는 군으로부터 선택된 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 모이어티는 분자량이 약 500 내지 10,000 Da 또는 약 2,000 내지 5,000 Da이다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3 포스포에탄올아민, 1,2-디알킬-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 및 세라미드-PEG로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티는 분자량이 약 500 내지 10,000 Da 또는 약 2,000 내지 5,000 Da이다. 일부 구현예에서, PEG 모이어티는 분자량이 2,000 Da이다.
일부 구현예에서, 헬퍼 지질은 조성물의 총 지질 함량의 약 20 mol% 내지 80 mol%이다. 일부 구현예에서, 헬퍼 지질 성분은 LNP의 총 지질 함량의 약 35 mol% 내지 65 mol%이다. 일부 구현예에서, LNP는 LNP의 총 지질 함량의 50 mol%의 지질 및 50 mol%의 헬퍼 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 DPhyPE와 조합하여 -3-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, -아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 또는 -아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 중 임의의 것을 포함하고, 여기서 DPhyPE의 함량은 LNP의 전체 지질 함량의 약 80 mol%, 65 mol%, 50 mol% 및 35 mol%이다. 일부 구현예에서, LNP는 -아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-파니틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 (지질) 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (헬퍼 지질)을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드(지질), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (제1 헬퍼 지질), 및 1,2-다이스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG2000 (제2 헬퍼 지질)을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 헬퍼 지질은 총 지질 함량의 약 0.05 mol% 내지 4.9 mol% 또는 약 1 mol% 내지 3 mol%이다. 일부 구현예에서, LNP는 총 지질 함량의 약 45 mol% 내지 50 mol%의 지질, 총 지질 함량의 약 45 mol% 내지 50 mol%의 제1 헬퍼 지질을 포함하며, 단 총 지질 함량 중 약 0.1 mol% 내지 5 mol%, 약 1 mol% 내지 4 mol%, 또는 약 2 mol%의 PEG화된 제2 헬퍼 지질이 존재하고, 지질, 제1 헬퍼 지질 및 제2 헬퍼 지질 함량의 총합은 총 지질 함량의 100 mol%이고, 제1 헬퍼 지질과 제2 헬퍼 지질의 합은 총 지질 함량의 50 mol%이다. 일부 실시형태에서, LNP는: (a) 50 mol%의 -아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, 48 mol%의 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민; 및 2 mol% 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG2000; 또는 (b) 50 mol%의 -아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, 49 mol% 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민; 및 1 mol% N(카보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로3-포스포에탄올아민, 또는 이의 소듐 염을 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP는 핵산을 함유하고, 핵산 골격 포스페이트 대 양이온성 지질 질소 원자의 전하비는 약 1: 1.5 내지 7 또는 약 1:4이다.
일부 구현예에서, LNP는 또한 생체내 조건 하에 지질로부터 제거 가능한 차폐 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 생물학적 불활성 화합물이다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 그의 표면 상에서 또는 이러한 분자 상에서 임의의 전하를 운반하지 않는다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 하이드록시에틸글루코스(HEG) 기반 중합체, 폴리하이드록시에틸 전분(폴리HES) 및 폴리프로필렌이다. 일부 구현예에서, PEG, HEG, 폴리HES 및 폴리프로필렌은 약 500 내지 10,000Da 또는 약 2000 내지 5000Da의 무게가 나간다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은은 PEG2000 또는 PEG5000이다.
일부 구현예에서, LNP는 생체내 조건 하에 지질로부터 제거 가능한 적어도 하나의 지질, 제1 헬퍼 지질 및 차폐 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 또한 제2 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 헬퍼 지질은 세라미드이다. 일부 구현예에서, 제2 헬퍼 지질은 세라미드이다. 일부 구현예에서, 세라미드는 6 내지 10개의 탄소 원자의 적어도 하나의 짧은 탄소쇄 치환체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세라미드는 8개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 세라미드에 부착된다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 세라미드에 부착된다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 세라미드에 공유 부착된다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 LNP에서 핵산에 부착된다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 핵산에 공유 부착된다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 링커에 의해 핵산에 부착된다. 일부 구현예에서, 링커는 생리적 조건 하에 절단된다. 일부 구현예에서, 링커는 ssRNA, ssDNA, dsRNA, dsDNA, 펩티드, S-S-링커 및 pH 민감성 링커로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 링커 모이어티는 핵산의 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 pH-민감성 링커 또는 pH-민감성 모이어티를 포함한다. 일 구현예에서, pH-민감성 링커 또는 pH-민감성 모이어티는 음이온성 링커 또는 음이온성 모이어티이다. 일부 구현예에서, 음이온성 링커 또는 음이온성 모이어티는 산성 환경에서 덜 음이온성이거나 또는 중성이다. 일부 구현예에서, pH-민감성 링커 또는 pH-민감성 모이어티는 올리고 (글루탐산), 올리고페놀레이트(들) 및 디에틸렌 트리아민 펜타 아세트산으로부터 선택된다.
앞 단락의 임의의 LNP 구현예에서, LNP는 약 50 내지 600 밀리오스몰 (mosmole)/㎏, 약 250 내지 350 밀리오스몰/㎏, 또는 약 280 내지 320 밀리오스몰/㎏의 삼투질 농도를 가질 수 있고/있거나, 지질 및/또는 1 또는 2종의 헬퍼 지질 및 차폐 화합물에 의해 형성되는 LNP는 약 20 내지 200 ㎚, 약 30 내지 100 ㎚, 또는 약 40 내지 80 ㎚의 입자 크기를 갖는다.
일부 구현예에서, 차폐 화합물은 더 긴 생체내 순환 시간을 제공하고, 핵산 함유 LNP의 더 양호한 생체 분포를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 LNP가 투여되는 다른 체액 또는 세포질 막, 예를 들어, 혈관구조 내피벽의 세포질 막의 혈청 화합물 또는 화합물과 LNP의 즉각적인 상호작용을 방지한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 또한 LNP와의 상호작용 직후로부터 면역계의 요소를 막는다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 항-옵소닌 작용 화합물로서 작용한다. 임의의 메커니즘 또는 이론에 의해 구속되는 일 없이, 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 그의 환경과의 상호작용을 위해 이용 가능한 LNP의 표면적을 감소시키는 커버 또는 외피를 형성한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 차폐 화합물은 LNP의 전반적인 전하를 차폐한다.
다른 구현예에서, LNP는 하기 화학식 VI을 갖는 적어도 하나의 양이온성 지질을 포함한다:
Figure pct00035
(화학식 VI)
식 중, n은 1, 2, 3, 또는 4이고, m은 1, 2, 또는 3이고, 여기서 Y- 는 양이온이고, 각각의 R1 및 R2 는 선형 C12-C18 알킬 및 선형 C12-C18 알케닐, 스테롤 화합물로 이루어진 군으로부터 개별적으로, 독립적으로 선택되고, 여기서 스테롤 화합물은 콜레스테롤 및 스티그마스테롤, 및 PEG화 지질로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 PEG화 지질은 PEG 모이어티를 포함하며, 여기서 PEG화 지질은
하기 화학식 VII의 PEG화 포스포에탄올아민:
Figure pct00036
(화학식 VII)
(식에서, R3 및 R4 는 개별적으로, 그리고 독립적으로 선형 C13-C17 알킬이고, p는 15 내지 130의 임의 정수이다.)
하기 화학식 VIII의 PEG화 세라미드:
Figure pct00037
(화학식 VIII)
식에서, R5 는 선형 C7-C15 알킬이고, q는 15 내지 130의 임의 수이다.
하기 화학식 IX의 PEG화 디아실글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00038
(화학식 IX)
식에서, 각각의 R6 및 R7 은 개별적으로 그리고 독립적으로 선형 C11-C17 알킬이고, r은 15 내지 130의 임의 정수이다.
일부 구현예에서, R1 및 R2 서로 상이하다. 일부 구현예에서, R1은 팔미틸이고, R2는 올레일이다. 일부 구현예에서, R1은 라우릴이고 R2는 미리스틸이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 는 동일하다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 개개로 그리고 독립적으로 C12 알킬, C14 알킬, C16 알킬, C18 알킬, C12 알케닐, C14 알케닐, C16 알케닐 및 C18 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, C12 알케닐, C14 알케닐, C16 알케닐 및 C18 알케닐의 각각은 1 또는 2개의 이중 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, C18 알케닐은 C9와 C10 사이에 하나의 이중 결합과 함께 C18 알케닐이다. 일부 구현예에서, C18 알케닐은 시스-9-옥타데실이다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 X의 화합물이다:
Figure pct00039
(화학식 X)
일부 구현예에서, Y- 는 할로게니드, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 하기 화학식 III의 -아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드이다:
Figure pct00040
(화학식 III).
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 IV의 -아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드이다:
Figure pct00041
(화학식 IV)
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 V의 -아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드이다:
Figure pct00042
(화학식 V).
일부 구현예에서, 스테롤 화합물은 콜레스테롤이다. 일부 구현예에서, 스테롤 화합물은 스티그마스테린이다.
일부 구현예에서, PEG화 지질의 PEG 모이어티는 약 800 내지 5,000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, PEG화 지질의 PEG 모이어티의 분자량은 약 800 Da이다. 일부 구현예에서, PEG화 지질의 PEG 모이어티의 분자량은 약 2,000 Da이다. 일부 구현예에서, PEG화 지질의 PEG 모이어티의 분자량은 약 5,000 Da이다. 일부 구현예에서, PEG화 지질은 화학식 VII의 PEG화 포스포에탄올아민이고, 여기서 각각의 R3 및 R4 는 개별적으로, 그리고 독립적으로 선형 C13-C17 알킬이고, p는 18, 19 또는 20, 또는 44, 45 또는 46 또는 113, 114 또는 115의 임의 정수이다. 일부 구현예에서, R3 및 R4 는 동일하다. 일부 구현예에서, R3 및 R4 는 상이하다. 일부 구현예에서, 각각의 R3 및 R4 는 개별적으로 C13 알킬, C15 알킬 및 C17 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 화학식 VII 의 PEG화 포스포에탄올아민은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (암모늄 염)이다:
Figure pct00043
(화학식 XI).
일부 구현예에서, 화학식 VII의 PEG화 포스포에탄올아민은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000] (암모늄 염)이다:
Figure pct00044
(화학식 XII)
일부 구현예에서, PEG화 지질은 화학식 VIII의 PEG화 세라미드이고, 여기서 R5 는 선형 C7-C15 알킬이고, q는 18, 19 또는 20, 또는 44, 45 또는 46 또는 113, 114 또는 115의 임의 정수이다. 일부 구현예에서, R5 는 선형 C7 알킬이다. 일부 구현예에서, R5 는 선형 Cl5 알킬이다. 일부 구현예에서, 화학식 VIII의 PEG화 세라미드는 N-옥타노일-스핀고신-1- {숙시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]}이다:
Figure pct00045
(화학식 VIII)
일부 구현예에서, 화학식 VIII의 PEG화 세라미드는 N-팔미토일-스핀고신-1- {숙시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]}이다:
Figure pct00046
(화학식 XIV)
일부 구현예에서, PEG화 지질은 화학식 IX의 PEG화 디아실글리세롤이고, 여기서 각각의 R6 및 R7 은 개별적으로, 그리고 독립적으로 선형 C11-C17 알킬이고, r은 18, 19 또는 20, 또는 44, 45 또는 46 또는 113, 114 또는 115의 임의 정수이다. 일부 구현예에서, R6 및 R7 은 동일하다. 일부 구현예에서, R6 및 R7 은 상이하다. 일부 구현예에서, 각각의 R6 및 R7 은 개별적으로, 선형 C17 알킬, 선형 C15 알킬 및 선형 C13 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 화학식 IX 의 PEG화 디아실글리세롤은 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤 [메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]이다:
Figure pct00047
(화학식 XV)
일부 구현예에서, 화학식 IX 의 PEG화 디아실글리세롤은 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤 [메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]이다:
Figure pct00048
(화학식 XVI).
일부 구현예에서, 화학식 IX의 PEG화 디아실글리세롤은 다음과 같다:
Figure pct00049
(화학식 XVII)
일부 구현예에서, LNP는 화학식 III, IV 및 V로부터 선택된 적어도 하나의 양이온성 지질, 콜레스테롤 및 스티그마스테린으로부터 선택된 적어도 하나의 스테롤 화합물을 포함하되, 페길화된 지질은 화학식 XI 및 XII로부터 선택된 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, LNP는 화학식 III, IV 및 V로부터 선택된 적어도 하나의 양이온성 지질, 콜레스테롤 및 스티그마스테린로부터 선택된 적어도 하나의 스테롤 화합물을 포함하고, 여기서 PEG화 지질은 화학식 XIII 및 XIV로부터 선택된 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, LNP는 화학식 III, IV 및 V로부터 선택된 적어도 하나의 양이온성 지질, 콜레스테롤 및 스티그마스테린로부터 선택된 적어도 하나의 스테롤 화합물을 포함하고, 여기서 PEG화 지질은 화학식 XV 및 XIV로부터 선택된 적어도 하나이다. 일부 구현예에서, LNP는 화학식 III의 양이온성 지질, 스테롤 화합물로서 콜레스테롤을 포함하고, 여기서 PEG화 지질은 화학식 XI이다.
이전 단락에서 임의의 LNP 구현예에서, 양이온성 지질 조성물의 함량은 약 65 mole% 내지 75 mole%이고, 스테롤 화합물의 함량은 약 24 mole% 내지 34 mole%이고, PEG화 지질의 함량은 약 0.5 mole% 내지 1.5 mole%이고, 지질 조성물에 대해 양이온성 지질, 스테롤 화합물 및 PEG화 지질의 함량의 총합은 100 mole%이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질의 함량은 약 70 mole%이고, 스테롤 화합물의 함량은 약 29 mole%이고 PEG화 지질의 함량은 약 1 mole%이다. 일부 구현예에서, LNP는 70 mole%의 화학식 III, 29 mole%의 콜레스테롤, 및 1 mole%의 화학식 XI이다.
엑소솜
엑소솜은 RNA 및 단백질을 수송하고, 뇌 및 다른 표적 기관에 RNA를 전달할 수 있는, 내생성 나노-소포체이다. 면역원성을 감소시키기 위해, 문헌 [Alvarez-Erviti et al. (2011, Nat Biotechnol 29: 341)]은 엑소솜 생산을 위한 자가-유래 수지상 세포를 사용하였다. 뇌에 대한 표적화는 뉴런-특이적 RVG 펩티드에 융합된 엑소솜 막 단백질인 Lamp2b를 발현시키기 위해 수지상 세포를 조작함으로써 달성되었다. 정제된 엑소솜은 전기천공법에 의해 외생성 RNA와 함께 부하되었다. 정맥내로 주사된 RVG-표적화된 엑소솜은 뇌에서 뉴런, 미세아교세포, 희돌기교세포에 GAPDH siRNA를 특이적으로 전달하여, 특이적 유전자 녹다운을 초래한다. RVG 엑소솜에 대한 사전 노출은 녹다운을 약화시키지 않았고, 다른 조직에서의 비-특이적 흡수는 관찰되지 않았다. 엑소솜-매개 siRNA 전달의 치료적 잠재력은 알츠하이머병에서의 치료적 표적인 BACE1의 강한 mRNA(60%) 및 단백질(62%) 녹다운에 의해 입증되었다.
면역학적으로 불활성인 엑소솜의 풀을 얻기 위해, Alvarez-Erviti 등은 균질한 주요 조직적합 복합체 (주요 조직적합성 복합체: MHC) 단상형을 갖는 근친교배 C57BL/6 마우스로부터 골수를 채취하였다. 미성숙 수지상 세포는 T-세포 활성체, 예컨대, MHC-II 및 CD86가 결여된 다량의 엑소솜을 생성하는데, Alvarez-Erviti 등은 7일 동안 과립구/대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 갖는 수지상 세포를 선택하였다. 엑소솜은 충분히 확립된 초원심분리 프로토콜을 사용하여 다음날에 배양 상청역으로부터 정제하였다. 생성된 엑소솜은 물리적으로 균질하였고, 크기 분포는 입자 추적 분석(NTA) 및 전자 현미경에 의해 결정하였을 때, 직경 80 nm에서 최고였다. Alvarez-Erviti 등은 106개의 세포당 6 내지 12 ㎍의 엑소솜을 얻었다 (단백질 농도 기반으로 측정).
다음에, Alvarez-Erviti 등은 나노규모 적용분야에 적합한 전기천공법 프로토콜을 이용하여 외생성 카고를 변형된 엑소솜에 로딩하는 가능성을 조사하였다. 나노미터 규모에서 막 입자에 대한 전기천공법은 잘 특징규명되고 있지 않기 때문에, 전기천공법 프로토콜의 경험적 최적화를 위해 비특이적 Cy5-표지 RNA가 사용되었다. 엑소솜의 초원심분리 및 용해 후에 캡슐화된 RNA의 양이 분석되었다.엑소솜의 초원심분리 및 용해 후에 캡슐화된 RNA의 양이 분석되었다. 400 V 및 125μF에서 전기천공은 RNA의 최고 체류를 초래하였고, 모든 후속 실험을 위해 사용되었다.
Alvarez-Erviti은 150 ㎍의 RVG 엑소솜에 캡슐화된 150 ㎍의 각각의 BACE1 siRNA를 정상 C57BL/6 마우스에 투여하였고, 녹다운 효율은 4종의 대조군: 비처리 마우스, RVG 엑소솜 단독 주사된 마우스, 생체내 양이온성 리포솜 시약과 복합체화된 BACE1 siRNA를 주사한 마우스 및 RVG-9R에 복합체화된 BACE1 siRNA를 주사한 마우스와 비교하였고, RVG 펩티드는 siRNA에 정전기적으로 결합되는 9 D-아르기닌에 접합된 것이다. 피질 조직 샘플은 투여 후 3일에 분석되었고, siRNA-RVG-9R-처리 마우스와 siRNARVG 엑소솜-처리 마우스 둘 모두에서 유의한 단백질 녹다운 (45%, P < 0.05, 대 62%, P < 0.01)이 관찰되었는데, 이는 BACE1 mRNA 수준의 상당한 감소를 초래하였다 (각각 66% [+ 또는 -] 15%, P < 0.001 및 61% [+ 또는 -] 13%, P < 0.01). 게다가, 출원인들은 RVG-엑소솜-처리 동물에서 알츠하이머 병리에서 아밀로이드 플라크의 주된 성분인 총 [베타]-아밀로이드 142 수준의 유의한 감소 (55%, P < 0.05)를 입증하였다. 관찰된 감소는 BACE1 억제제의 심실내 주사 후에 정상 마우스에서 입증된 β-아밀로이드 140 감소보다 더 컸다. Alvarez-Erviti외 다수는 BACE1 절단 생성물에 대해 cDNA 말단의 5'-신속한 증폭(RACE)을 수행하였는데, 이는 siRNA에 의한 RNAi-매개 녹다운의 증거를 제공하였다.
최종적으로, Alvarez-Erviti 등은 IL-6, IP-10, TNFα 및 IFN-α 혈청 농도를 평가함으로써 RNA-RVG 엑소솜이 생체내 면역 반응을 유도하는지의 여부를 연구하였다. 엑소솜 처리 후에, 모든 사이토카인의 유의하지 않은 변화는 IL-6 분비를 강하게 자극한 siRNA-RVG-9R와 대조적으로 siRNA-형질감염 시약 처리와 유사하게 나타나서, 엑소솜 처리의 면역학적 불활성 프로파일을 확증하였다. 엑소솜이 20%의 siRNA만을 캡슐화한다는 것을 고려하면, RVG-엑소솜에 의한 전달은 비슷한 mRNA 녹다운으로서 RVG-9R 전달보다 더 효율적인 것으로 나타나고, 상응하는 면역 자극 수준 없이 5배 더 적은 siRNA에 의해 더 큰 단백질 녹다운이 달성되었다. 이 실험은 신경퇴행성 질환과 관련된 유전자의 장기간 침묵에 잠재적으로 적합한 RVG-엑소솜 기술의 치료 가능성을 입증하였다. Alvarez-Erviti 등의 엑소솜 전달 시스템은 본 발명의 AD-기능화된 CRISPR-Cas 시스템을 치료적 표적, 특히 신경퇴행성 질환에 전달하기 위해 적용될 수 있다. 약 100 내지 1000 ㎎의 RVG 엑소솜에 캡슐화된 약 100 내지 1000㎎의 CRISPR Cas의 용량이 본 발명에서 고려될 수 있다.
El-Andaloussi 등 (Nature Protocols 7,2112-2126(2012))은 배양 세포로부터 유래된 엑소솜이 시험관내 및 생체내 RNA의 전달을 위해 이용될 수 있는 방법을 개시한다. 이 프로토콜은 먼저 펩티드 리간드에 융합된 엑소솜 단백질을 포함하는, 발현 벡터의 형질감염을 통해 표적화된 엑소솜의 생성을 기재한다. 다음에, El-Andaloussi 등은 형질감염 세포 상청액으로부터 엑소솜을 정제하고 특징규명하는 방법을 설명한다. 다음에, El-Andaloussi 등은 RNA를 엑소솜에 로딩하기 위한 중요한 단계를 상술한다. 최종적으로, El-Andaloussi 등은 마우스 뇌에서 시험관내 및 생체내에서 RNA를 효율적으로 전달하기 위해 엑소솜을 이용하는 방법을 약술한다. 엑소솜-매개 RNA 전달이 기능성 분석 및 영상화에 의해 평가된 예상 결과의 예가 또한 제공된다. 전체 프로토콜은 약 3 주가 걸린다. 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 자가-유래 수지상 세포로부터 생성된 엑소솜을 이용하여 수행될 수 있다. 본 명세서의 교시로부터, 이는 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, Wahlgren 등의 혈장 엑소솜 (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130)이 고려된다. 엑소솜은 수지상 세포 (DC), B 세포, T 세포, 비만 세포, 상피 세포 및 종양 세포를 비롯한 다수의 세포 유형에 의해 생성된 나노-크기 소포체 (크기가 30 내지 90 ㎚)이다. 이들 소포체는 후기 엔도솜의 내향 버딩 (inward budding)에 의해 형성되고, 이어서, 혈장막과의 융합 시 세포외 환경으로 방출된다. 엑소솜은 세포 사이에서 RNA를 자연적으로 운반하기 때문에, 이 특성은 유전자 요법에서 유용할 수 있고, 본 개시내용으로부터 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다.
혈장을 단리시키기 위해 900g에서 20분 동안 버피코트의 원심분리 다음에 세포 상청액을 채취하고, 세포를 제거하기 위해 300g에서 10분 동안 그리고 16 500g에서 30분 동안 원심분리시킨 후 0.22 ㎜ 필터를 통해 여과시킴으로써 혈장으로부터의 엑소솜을 제조할 수 있다. 엑소솜은 70분 동안 120,000 g에서 초원심분리를 통해 펠렛화된다. 엑소솜으로 siRNA의 화학적 형질감염은 RNAi Human/마우스 Starter Kit (Quiagen, Hilden, Germany)의 제조사 설명서에 따라 수행된다. siRNA는 2 mmol/mL의 최종 농도로 100 mL PBS에 첨가된다. HiPerFect 형질감염 시약을 첨가한 후에, 혼합물은 10분 동안 실온에서 인큐베이션된다. 과량의 마이셀을 제거하기 위해, 엑소솜은 알데히드/설페이트 라텍스 비드를 이용하여 재단리된다. 엑소솜 내로 CRISPR Cas의 화학적 형질감염은 siRNA와 유사하게 수행될 수 있다. 엑소솜은 건강한 공혈자의 말초 혈액으로부터 단리된 단핵구 및 림프구와 함께 공동배양될 수 있다. 따라서, CRISPR Cas를 함유하는 엑소솜이 인간의 단핵구 및 림프구에 도입될 수 있고, 인간에 자가적으로 재도입될 수 있다는 것이 고려될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 혈장 엑소솜을 이용하여 수행될 수 있다.
리포솜
본 발명에 따른 전달 또는 투여는 리포솜에 의해 수행될 수 있다. 리포솜은 내부 수성 구획을 둘러싸며 친유성의 인지질 이중층 밖에서 상대적으로 불침투성인 단층판 또는 다층판 지질 이중층으로 구성된 구형 소포체 구조이다. 리포솜은 이들이 생체적합성, 비독성이기 때문에 약물 전달 담체로서 상당한 관심을 얻었고, 친수성과 친지성 약물 분자를 둘 다 전달할 수 있으며, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 전달할 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679 참조).
리포솜은 여러 가지 다른 유형의 지질로 만들 수 있다; 그러나 인지질이 약물 담체로서 리포솜을 생성하는데 가장 일반적으로 사용된다. 지질막이 수용액과 혼합될 때 리포솜 형성은 자발적이지만, 이는 또한 균질기, 초음파분쇄기, 또는 압출 장치를 이용하여 진탕 형태로 힘을 적용함으로써 신속히 처리될 수 있다 (예를 들어, 고찰을 위해 [Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
몇몇 다른 첨가제가 리포솜에 첨가되어 이의 구조 및 특성을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 콜레스테롤 또는 스핀고미엘린 중 하나가 리포솜 혼합물에 첨가되어 리포솜 구조를 안정화시키고 리포솜 내부의 수송물 누출을 방지할 수 있다. 추가로, 리포솜은 수소화된 에그 포스파티딜콜린 또는 에그 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 다이세틸 포스페이트로부터 제조되며, 그들의 평균 소포체 크기는 약 50 내지 100 nm로 조절되었다. (예를 들어, 고찰을 위해 문헌 [Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
리포솜 제제는 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핀고미엘린, 에그 포스파티딜콜린 및 모노시알로강글리오시드로 구성될 수 있다. 이 제제는 인지질만으로 구성되기 때문에, 리포솜 제제는 많은 도전과 접하게 되었는데, 이 중 하나는 혈장에서의 불안정성이다. 이들 도전을 극복하기 위한 몇몇 시도가, 특히 지질막의 조작에서 만들어졌다. 이들 시도 중 하나는 콜레스테롤의 조작에 중점을 두었다. 통상적인 제제에 대한 콜레스테롤의 첨가는 혈장내로 캡슐화된 생활성 화합물의 빠른 방출을 감소시키거나 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)은 안정성을 증가시킨다 (예를 들어, 고찰을 위해 문헌 [Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
특히 유리한 실시형태에서, 트로이 목마 (Trojan Horse) 리포솜 (또한 분자 트로이 목마로도 공지됨)가 바람직하며, 프로토콜은 cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long에서 확인할 수 있다. 이들 입자는 혈관내 주사 후에 전체 뇌에 대한 이식유전자 전달을 허용한다. 이론에 의해 국한하지 않고, 표면에 접합된 특정 항체를 갖는 중성 지질 입자는 세포내이입을 통해 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것으로 여겨진다. 트로이 목마 리포솜은 혈관내 주사를 통해 뇌에 뉴클레아제의 CRISPR 패밀리를 전달하는 데 사용될 수 있는데, 이는 이는 배아 조작에 대한 필요 없이 전체 뇌 유전자이식 동물을 허용한다. 약 1 내지 5g의 DNA 또는 RNA는 리포솜으로 생체내 투여가 고려될 수 있다.
다른 구현예에서, AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템 또는 이의 성분은 리포솜, 예컨대, 안정한 핵산-지질 입자(SNALP)로 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005] 참조). SNALP에서 표적화된 약 1, 3 또는 5 ㎎/㎏/일의 특정 CRISPR Cas의 1일 정맥내 주사가 고려된다. 1일 처리는 약 3일 동안일 수 있고, 그 다음으로 약 5주 동안 매주일 수 있다. 다른 구현예에서, 약 1 또는 2.5㎎/㎏ 용량으로 정맥내 주사에 의해 투여되는 특정 CRISPR Cas 캡슐화 SNALP가 또한 고려된다 (예를 들어, 문헌 [Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006] 참조). SNALP 제형은 지질 3-N-[(w-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 2000) 카바모일]-1,2-다이미리스틸옥시-프로필아민 (PEG-C-DMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 콜레스테롤을 2:40:10:48 몰 백분율 비로 함유할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006] 참조).
다른 구현예에서, 안정한 핵산-지질 입자 (SNALP)는 고도로 혈관화된 HepG2-유래 간 종양에 대한 효과적인 전달 분자가 되지만, 불량하게 혈관화된 HCT-116 유래 간 종양에서는 그렇지 않은 것으로 증명되었다 (예를 들어, 문헌 [Li, Gene Therapy (2012) 19, 775-780] 참조). SNALP 리포솜은 콜레스테롤/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA의 48/40/10/2 몰비 및 25:1 지질/siRNA 비율을 사용하여 D-Lin-DMA 및 PEG-C-DMA와 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 siRNA를 함께 제제화하여 제조될 수 있다. 얻어진 SNALP 리포솜은 크기가 약 80 내지 100 ㎚이다.
또 다른 실시형태에서, SNALP는 합성 콜레스테롤 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 디팔미토일포스파티딜콜린 (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA), 3-N-[(w-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-1,2-디미레스틸옥시프로필아민, 및 양이온성 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N-디메틸아미노프로판 (예를 들어, 문헌 [Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896- 905] 참조)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 용량 당 약 2 ㎎/㎏의 총 CRISPR Cas 용량이 고려될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, SNALP는 합성 콜레스테롤 (Sigma-Aldrich), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-cDMA, 및 1,2-디리놀레일옥시-3-(N;N-디메틸)아미노프로판 (DLinDMA)을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Judge, J. Clin. Invest. 119:661-673 (2009)] 참조). 생체내 연구를 위해 사용되는 제형은 약 9:1의 최종 지질/RNA 질량비를 포함할 수 있다.
RNAi 나노메디신의 안전성 프로파일은 Alnylam Pharmaceuticals의 Barros 및 Gollob에 의해 검토되었다 (예를 들어, 문헌 [Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1730-1737] 참조). 안정한 핵산 지질 입자 (SNALP)는 4가지의 상이한 지질로 구성된다 - 낮은 pH에서 양이온성인 이온화 가능한 지질 (DLinDMA), 중성 헬퍼 지질, 콜레스테롤, 및 확산성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질. 입자는 직경이 대략 80 ㎚이고, 생리적 pH에서 전하-중성이다. 제제화 동안에, 이온화 가능한 지질은 입자 형성 동안 음이온성 RNA와 지질을 축합시키는 역할을 한다. 점차적으로 산성인 엔도솜 조건 하에서 양으로 하전될 때, 이온화 가능한 지질은 또한 엔도솜 막과 SNALP의 융합을 매개하여 RNA이 세포질 내로 방출되는 것을 가능하게 한다. PEG-지질은 입자를 안정화시키고, 제제화 동안 응집을 감소시키며, 후속적으로 약물동태학적 특성을 개선시키는 외부의 중성 친수성을 제공한다.
지금까지, RNA를 갖는 SNALP 제형을 이용하여 두 임상 프로그램이 개시되었다. Tekmira Pharmaceuticals는 LDL 콜레스테롤이 상승된 성인에서 SNALP-ApoB의 I상 단일-용량 연구를 최근에 완료하였다. ApoB는 간 및 공장에서 우세하게 발현되며, VLDL 및 LDL의 조립 및 분비에 필수적이다. 17명의 대상체는 SNALP-ApoB의 단일 용량을 받았다 (7회 용량 수준에 걸쳐 용량 상승). 간 독성의 증거는 없었다 (전임상 연구에 기반하여 잠재적 용량 제한 독성으로서 예상됨). 최고 용량의 (2명 중) 1명 대상체는 면역계 자극과 일관되게 감기-유사 증상을 경험하였고, 시험을 결론내리기 위해 결정되었다.
Alnylam Pharmaceuticals는 유사하게 진행된 ALN-TTR01을 갖는데, 이는 상기 기재한 SNALP 기술을 사용하며 돌연변이체와 야생형 TTR 둘 모두의 간세포 생성을 표적화하여 TTR 아밀로이드증 (ATTR)을 치료하였다. 3가지 ATTR 증후군이 기재되었다: 가족성 아밀로이드증성 말초신경병증 (FAP) 및 가족성 아밀로이드증성 심장근육병증 (FAC) - (둘 모두 TTR에서의 상염색체 우성 돌연변이에 의해 야기); 및 야생형 TTR에 의해 야기되는 노인성 전신 아밀로이드증 (SSA). ALN-TTR01의 위약-대조, 단일 용량-상승 I상 시험은 ATTR을 갖는 환자에서 최근에 완료되었다. ALN-TTR01은 0.01 내지 1.0 ㎎/㎏ (siRNA에 기반)의 용량 범위 내에서 31명의 환자 (23명은 연구 약물이고, 8명은 위약임)에게 15분 IV 주입으로서 투여되었다. 간 기능 검사에서의 유의한 증가 없이 치료는 충분히 내성이 있었다. 주입-관련 반응은 0.4 mg/kg 이상에서 23 명의 환자 중 3 명에서 관찰되었으며; 모두 주입 속도가 느려지는 것에 반응했으며 모두 연구를 계속했다. 2명의 환자에서 혈청 사이토카인 IL-6, IP-10 및 IL-1ra의 최소 및 일시적 상승이 1 ㎎/㎏의 최고 용량에서 확인되었다 (전임상 및 NHP 연구로부터 예상). 혈청 TTR이 저하되면서, ALN-TTR01의 예상되는 약력학적 효과가 1㎎/㎏에서 관찰되었다.
또 다른 구현예에서, 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질을, 예를 들어, 에탄올에서, 예를 들어, 각각 40:10:40:10의 몰비로 가용화함으로써 SNALP가 생성될 수 있다 (문헌 [Semple et al., Nature Niotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177] 참조). 지질 혼합물은 최종 에탄올과 30% (vol/vol) 및 6.1 ㎎/㎖ 농도의 지질에 각각 혼합하여 수성 완충제 (50 mM 시트레이트, pH 4)에 첨가되었고, 압출 전에 22℃에서 2분 동안 평형 상태가 되게 하였다. 동적광산란 분석에 의해 결정하여 70 내지 90 ㎚의 소포체 직경이 얻어질 때까지, 수화된 지질을 Lipex Extruder (Northern Lipids)를 이용하여 22℃에서 2 적층 80 ㎚ 포어-크기 필터 (Nuclepore)를 통해 압출시켰다. 이는 일반적으로 1 내지 3회의 통과를 필요로 하였다. siRNA (50 mM 시트레이트에서 가용화됨, 30% 에탄올을 함유하는 pH 4 수용액)을 혼합하면서 ∼5 mL/분의 속도로 사전 평형화시킨(35℃) 소포체에 첨가하였다. 0.06 (wt/wt)의 최종 표적 siRNA/지질 비에 도달된 후에, 혼합물은 추가 30분 동안 35℃에서 인큐베이션되어 siRNA의 소포체 재조직화 및 캡슐화를 허용한다. 이어서, 에탄올이 제거되고, 외부 완충제는 투석 또는 접선유동 정용여과 중 하나에 의해 PBS (155mM NaCl, 3mM Na2HPO4, 1mM KH2PO4, pH 7.5)로 대체된다. siRNA는 제어된 단계식 희석 방법 과정을 사용해 SNALP에 캡슐화되었다. KC2-SNALP의 지질 성분은 57.1:7.1:34.3:1.4의 몰비로 사용된 DLin-KC2-DMA (양이온 지질), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC; Avanti Polar Lipids), 합성 콜레스테롤 (Sigma) 및 PEG-C-DMA였다. 로딩된 입자의 형성시, SNALP를 PBS에 대해 투석하였고, 사용 전 0.2 μm 필터를 통해 멸균여과시켰다. 평균 입자 크기는 75 내지 85 ㎚이었고, siRNA의 90 내지 95%는 지질 입자 내에서 캡슐화되었다. 생체내 시험을 위해 사용되는 제형에서의 최종 siRNA/지질 비는 ∼0.15 (wt/wt)이었다. 인자 VII siRNA를 함유하는 LNP-siRNA 시스템은 사용 직전에 멸균 PBS에서 적절한 농도로 희석되었고, 제형은 10 mL/㎏의 총 용적으로 옆쪽 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여되었다. 이 방법 및 이들 전달 시스템은 본 발명의 AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템에 대해 추론될 수 있다.
기타 지질
기타 다른 양이온성 지질, 예컨대 아미노 지질 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA)은 예를 들어, siRNA와 유사한 CRISPR Cas 또는 이의 성분 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)를 캡슐화하기 위해 이용될 수 있으며 (참조: 예를 들어, Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529 -8533), 그러한 이유로 본 발명의 실시에서 적용될 수 있다. 다음의 지질 조성물을 이용하여 사전 형성한 소포가 고려될 수 있다:40/10/40/10의 몰비 및 대략0.05(w/w) FVII siRNA/총 지질비로 각각 아미노지질, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 (R)-2,3-비스(옥타데실옥시) 프로필-1-(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)프로필카바메이트(PEG-지질). 70 내지 90 ㎚ 범위의 좁은 입자 크기 분포 및 0.11±0.04 (n=56)의 낮은 다분산 지수를 보장하기 위해, 입자는 가이드 RNA 첨가 전에 80 ㎚ 막을 통해 3회까지 압출될 수 있다. 고도로 강한 아미노 지질 16(생체내 활성을 활성화하도록 추가로 최적화될 수 있는 4 가지 지질 구성성분 16, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질의 몰비(50/10/38.5/1.5))을 함유하는 입자가 사용될 수 있다.
Michael S D Kormann 등 (" Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volume:29, Pages: 154- 157 (2011))은 RNA를 전달하기 위한 지질 외피의 사용을 기재한다. 지질 외피의 사용은 또한 본 발명에서 바람직하다.
다른 구현예에서, 지질은 본 발명의 AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)로 제제화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성할 수 있다. 지질은 DLin-KC2-DMA4, C12-200 및 코리피드 디스테로일포스파티딜 콜린, 콜레스테롤을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, PEG-DMG는 자발적 소포체 형성 절차를 이용하여 siRNA 대신에 CRISPR Cas로 제제화될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acid (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3] 참조). 성분 몰비는 약 50/10/38.5/1.5 (DLin-KC2-DMA 또는 C12-200/디스테로일포스파티딜 콜린/콜레스테롤/PEG-DMG)일 수 있다. 최종 지질:siRNA 중량비는 각각 DLin-KC2-DMA 및 C12-200 지질 나노입자 (LNP)의 경우에 대략 12:1 내지 9:1일 수 있다. 제제는 평균 입자 직경이 ∼80 ㎚이고 포획 효율이 90% 초과일 수 있다. 3 mg/kg 용량이 고려될 수 있다.
Tekmira는 LNP 및 LNP 제제의 다양한 양태와 관련된 미국 및 해외에서의 대략 95 개의 특허 패밀리의 포트폴리오를 가지며 (참조: 예를 들어, 미국 특허 번호 7,982,027; 7,799,565; 8,058,069; 8,283,333; 7,901,708; 7,745,651; 7,803,397; 8,101,741; 8,188,263; 7,915,399; 8,236,943 및 7,838,658 및 유럽 특허 번호 1766035; 1519714; 1781593 및 1664316), 이들 모두는 본 발명에 대해 사용되고/사용되거나 적합하게 될 수 있다.
AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템 또는 이의 성분 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)는 단백질, 단백질 전구체를 코딩하거나, 또는 단백질 또는 단백질 전구체의 부분적으로 또는 완전히 가공된 형태를 코딩할 수 있는 변형된 핵산 분자를 포함하는 조성물의 제형의 양상에 관한 미국 특허 출원 공개 제20130252281호 및 제20130245107호 및 제20130244279호 (Moderna Therapeutics에게 양도)에 추가로 기재되는 것과 같이 PLGA 미세구에서 캡슐화되어 전달될 수 있다. 제제는 몰비 50:10:38.5:1.5 내지 3.0 (양이온성 지질:융합유도성 (fusogenic) 지질:콜레스테롤:PEG 지질)을 가질 수 있다. PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG로부터 선택되지만, 이들로 제한되지 않을 수 있다. 융합생성 지질은 DSPC일 수 있다. 또한 스크럼(Schrum) 등의 미국 특허 출원 공개 제20120251618호(발명의 명칭:Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids) 참조.
나노머 기술은 저분자량 소수성 약물, 펩티드 및 핵산 기반 치료제(플라스미드, siRNA, miRNA)를 비롯한 광대한 범위의 치료제에 대한 생체 이용 가능성 도전을 처리한다. 기술이 분명한 이점을 입증한 특정 투여 경로는 경구 경로, 뇌-혈관-장벽을 가로지르는 수송, 고형 종양뿐만 아니라 눈에 대한 전달을 포함한다. 참조: 예를 들어 SMazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 Feb 26;7(2):1016-26; Uchegbu and Siew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10 및 Lalatsa et al., 2012, J Control Release. 2012 Jul 20; 161(2):523-36.
미국 공개 특허 출원 번호 20050019923은 폴리뉴클레오티드 분자, 펩티 및 폴리펩티드 및/또는 약학제)와 같은 생활성 분자를 포유류 신체에 전달하기 위한 양이온성 덴드리머를 기재한다. 덴드리머는, 예를 들어, 간, 비장, 폐, 신장 또는 심장 (또는 심지어 뇌)에 대한 생활성 분자의 전달을 표적화하는 데 적합하다. 덴드리머는 단순 분지형 단량체 단위로부터 단계식-방식으로 제조되는 합성 3-차원 거대분자로서, 이의 성질 및 기능성은 쉽게 제어할 수 있으며 다양할 수 있다. 덴드리머는 다작용성 코어에 대해 (합성에 대한 분기적 접근), 또는 다작용성 코어를 향한 (합성에 대한 수렴적 접근) 빌딩 블록의 반복 첨가로부터 합성되고, 빌딩 블록의 3차원 껍질의 각각의 첨가는 더 높은 세대의 덴드리머의 형성을 야기한다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 디아미노부탄 코어로부터 시작되는데, 이에 대해 1차 아민에 대한 아크릴로나이트릴의 이중 마이클 첨가에 의해 2배의 아민 기 수가 첨가된 후에, 나이트릴의 수소화가 이어진다. 이는 아민 기의 배가를 초래한다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 100% 양성자화 가능한 질소 및 64개까지의 말단 아미노 기 (5 세대, DAB 64)를 함유한다. 양성자화 가능한 기는 보통 중성 pH에서 양성자를 받아들일 수 있는 아민 기이다. 유전자 전달제로서 덴드리머의 사용은 대체로 유전자 전달을 위해 저급 세대 폴리프로필렌이민 덴드리머의 사용에 대한 작업이 보고되지 않은, 각각 접합 유닛으로서 아민/아미드 또는 N--P(O2)S의 혼합물을 갖는 인 함유 화합물, 및 폴리아미도아민의 사용에 집중되었다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 또한 주변 아미노 기에 의해 화학적으로 변형될 때 게스트 분자의 그들 캡슐화 및 약물 절단을 위한 pH 민감성 제어 방출 시스템으로서 연구되었다. 폴리프로필렌이민 덴드리머의 DNA와의 상호작용 및 세포독성을 비롯하여 DAB 64의 형질감염 효능이 또한 연구되었다.
미국 공개 특허 출원 번호 20050019923은 보다 앞선 보고와 대조적으로, 양이온성 덴드리머, 예컨대, 폴리프로필렌이민 덴드리머가 생활성 분자, 예컨대, 유전자 물질의 표적화된 전달에서 사용하기 위한 적합한 특성, 예컨대, 특이적 표적화 및 저독성을 나타낸다는 관찰에 기반하였다. 추가로, 양이온성 덴드리머의 유도체는 또한 생활성 분자의 표적화된 전달을 위한 적합한 특성을 나타낸다. 또한 미국 공개 특허 출원 번호 20080267903의 생활성 중합체를 참조하는데, 여기서는 " 양이온성 폴리아민 중합체 및 덴드리머 중합체를 비롯한 다양한 중합체가 항증식 활성을 갖는 것으로 나타나며, 따라서 원치않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 예컨대, 신생물 및 종양, 염증 장애(자가면역 장애를 포함), 건선 및 죽상동맥경화증의 치료에 유용할 수 있다. 중합체는 단독으로 활성제로서, 또는 다른 치료제, 예컨대, 유전자 요법을 위한 약물 분자 또는 핵산에 대한 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 중합체 자체의 고유한 항종양 활성은 전달될 제제의 활성을 보완할 수 있다" 는 것을 개시한다. 이들 특허 공보의 개시내용은 AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템(들) 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달을 위해 본 명세서에서 함께 사용될 수 있다.
초전하 단백질
초전하 단백질은 보통 높은 순 이론적 양전하 또는 음전하를 갖는 조작되거나 또는 천연 발생인 단백질의 부류이고, AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템(들) 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달에서 사용될 수 있다. 초음전하 단백질과 초양전하 단백질은 둘 모두 열적으로 또는 화학적으로 유도된 응집을 견뎌내는 현저한 능력을 나타낸다. 초양전하 단백질은 또한 포유동물 세포에 침투할 수 있다. 이들 단백질, 예컨대, 플라스미드 DNA, RNA, 또는 다른 단백질과 카고의 회합은 시험관내와 생체내 포유동물 세포 둘 모두에서 이들 거대분자의 기능적 전달을 가능하게 할 수 있다. 초전하 단백질의 생성 및 특징규명은 2007년에 보고되었다 (Lawrence et al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112).
포유동물 세포 내로 RNA 및 플라스미드 DNA의 비바이러스 전달은 연구와 치료적 적용 둘 모두에 가치 있다 (Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. 26, 561- 569). 정제된 +36 GFP 단백질 (또는 다른 초양전하 단백질)은 적절한 무혈청 배지에서 RNA와 혼합되고, 세포에 첨가 전에 복합체를 형성되게 한다. 이 단계에서 혈청의 포함은 초하전 단백질-RNA 복합체의 형성을 억제하고, 치료 유효성을 감소시킨다. 다양한 세포주에 대해 다음의 프로토콜이 유효한 것으로 확인되었다 (McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116) (그러나, 단백질 및 RNA 용량을 달리한 파일럿 실험은 특정 세포주에 대한 절차를 최적화하기 위해 수행되어야 한다): (1) 치료 1일 전에, 48-웰 플레이트에서 웰 당 1×105개의 세포를 플레이팅한다. (2) 치료일에, 무혈청 배지 내 정제된 +36 GFP 단백질을 최종 농도 200 nM로 희석시킨다. 50 nM의 최종 농도로 RNA를 첨가한다. 혼합물을 교반시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션시킨다. (3) 인큐베이션 동안, 세포로부터 배지를 흡입하고 PBS로 1회 세척한다. (4) +36 GFP 및 RNA의 인큐베이션 후에, 단백질-RNA 복합체를 세포에 첨가함. (5) 37℃에서 4 시간 동안 복합체와 세포를 인큐베이션시킴. (6) 인큐베이션 후에, 배지를 흡입하고, 20 U/㎖ 헤파린 PBS로 3 회 세척함. 활성에 대한 어세이에 따라 추가 48 시간 또는 그 이상 동안 혈청-함유 배지와 세포를 인큐베이션시킴. (7) 세포를 면역블롯, qPCR, 표현형 분석 또는 기타 다른 적절한 방법에 의해 분석함.
+36 GFP는 다양한 세포에서 효과적인 플라스미드 전달 시약인 것이 추가로 확인되었다. 플라스미드 DNA는 siRNA보다 더 큰 카고이기 때문에, 비례적으로 더 많은 +36 GFP 단백질이 효과적으로 복잡한 플라스미드에 필요하다. 효과적인 플라스미드 전달을 위해, 출원인들은 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 단백질로부터 유래된 공지된 엔도솜-붕괴 펩티드인 C-말단의 HA2 펩티드 태그를 보유하는 +36 GFP의 변이체를 개발하였다. 다음의 프로토콜은 다양한 세포에서 효과적이었지만, 상기와 같이 플라스미드 DNA 및 초하전 단백질 용량이 특정 세포주 및 전달 응용분야를 위해 최적화되는 것이 권장된다: (1) 치료 1일 전에, 48-웰 플레이트에서 웰 당 1×105개의 세포를 플레이팅한다. 2) 처리일에, 무혈청 배지 내 þ36 GFP 단백질을 최종 농도 2 mM로 희석시킨다. 1㎎의 플라스미드 DNA를 첨가한다. 혼합물을 교반시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션시킨다. (3) 인큐베이션 동안, 세포로부터 배지를 흡입하고 PBS로 1회 세척한다. (4) þ36 GFP와 플라스미드 DNA의 인큐베이션 후에, 단백질-DNA 복합체를 세포에 부드럽게 첨가한다. (5) 37℃에서 4시간 동안 세포를 복합체와 인큐베이션시킨다. (6) 인큐베이션 후에, 배지를 흡입하고 나서, PBS로 세척한다. 혈청-함유 배지에서 세포를 인큐베이션시키고 나서, 추가 24 내지 48시간 동안 인큐베이션시킨다. (7) 적절하다면, 플라스미드 전달을 (예를 들어, 플라스미드-유도 유전자 발현에 의해) 분석한다.
참조: 예를 들어, McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116 (2009); Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752 (2010); Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838 (2011); Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319 (2012); Thompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831-843 (2012). 초전하 단백질 방법이 사용되고/되거나 본 발명의 AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템의 전달에 적합화될 수 있다. 본 명세서의 교시와 함께 이들 시스템은 AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템(들) 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달에서 사용될 수 있다.
세포 침투성 펩티드(CPP)
또 다른 구현예에서, AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템의 전달을 위한 세포 침투성 펩티드(CPP)가 고려된다. CPP는 다양한 분자 수송물(나노크기 입자로부터 작은 화학적 분자 및 DNA의 거대 단편까지)의 세포 흡수를 용이하게 하는 짧은 펩티드이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "카고" 는 치료제, 진단 프로브, 펩티드, 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 단백질, 입자(나노입자를 포함), 리포솜, 발색단, 소형 분자 및 방사성 물질로 이루어진 군을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 양상에서, 카고는 또한 AD-기능화된 CRISPR Cas 시스템 또는 전체 AD-기능화된 기능성 CRISPR Cas 시스템의 임의의 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 양상은 하기 단계들을 포함하는, 목적하는 카고를 대상체에 전달하는 방법을 추가로 제공한다: (a) 본 발명의 세포 침투성 펩티드 및 목적하는 카고를 포함하는 복합체를 준비하는 단계, 및 (b) 대상체에 복합체를 경구로, 관절내로, 복강내로, 초내로, 동맥내로, 비강내로, 실질세포내로, 피하로, 근육내로, 정맥내로, 피내로, 직장내로, 또는 국소로 투여하는 단계. 카고는 공유 결합을 통한 화학적 결합 또는 비-공유 상호작용을 통해 펩티드와 연합된다.
CPP의 기능은 카고를 세포에 전달하는 것으로서, 살아있는 포유동물 세포의 엔도솜에 전달되는 카고에 의한 세포내 이입을 통해 통상적으로 일어나는 과정이다. 세포-침투성 펩티드는 상이한 크기, 아미노산 서열 및 전하를 가지지만, 모든 CPP는 한가지 구별되는 특징을 갖는데, 그것은 혈장막을 전좌하고 세포질 또는 유기체에 다양한 분자 카고의 전달을 용이하게 하는 능력이다. CPP 전좌는 3가지 주요 유입 메커니즘으로 분류될 수 있다: 막 내 직접 침투, 세포내 이입-매개 유입 및 전이 구조의 형성을 통한 전좌. CPP는 암 및 바이러스 억제제를 비롯한 상이한 질환의 치료에서의 약물 전달제뿐만 아니라 세포 표지를 위한 조영제로서 의학에서의 수많은 용도가 발견되었다. 후자의 예는 GFP에 대한 담체, MRI 조영제, 또는 양자점으로서의 작용을 포함한다. CPP는 연구 및 의학에서 사용하기 위한 시험관내 및 생체내 전달 벡터로서 큰 가능성을 보유한다. CPP는 전형적으로 라이신 또는 알기닌과 같은 양으로 하전된 아미노산의 높은 상대적 존재비를 함유하거나 또는 극성/하전 아미노산 및 비극성의 소수성 아미노산의 교번의 패턴을 함유하는 서열을 갖는, 아미노산 조성물을 가진다. 이들 두 유형의 구조는 각각 다양이온 또는 양쪽성으로서 지칭된다. CPP의 제3 부류는 낮은 순전하를 갖는 비극성 잔기만을 함유하는 소수성 펩티드이거나 또는 세포 흡수에 중요한 소수성 아미노산 기를 가진다. 발견된 초기 CPP 중 하나는 배양물 내 수많은 세포 유형에 의해 주변 배지로부터 효율적으로 취해지는 것으로 발견된 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1)로부터의 전사 촉진성 전사 활성인자(Tat)였다. 이후로, 공지된 CPP의 수는 상당히 확장되며 더 효과적인 단백질 형질도입 특성을 갖는 소분자 합성 유사체가 생성되었다. CPP는 페네트라틴 (Penetratin), Tat (48-60), 트랜스포탄 (Transportan) 및 (R-AhX-R4)(Ahx=아미노헥사노일)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
미국 특허 제8,372,951호는 고도의 세포 침투성 효율 및 낮은 독성을 나타내는 호산구 양이온성 단백질 (ECP)로부터 유래된 CPP를 제공한다. CPP와 이의 카고를 척추동물 대상체에 전달하는 양태가 또한 제공된다. CPP 및 그들의 전달의 추가적인 양태는 미국 특허 제8,575,305호; 제8;614,194호 및 제8,044,019호에 기재되어 있다. CPP는 AD-기능화된 CRISPR-Cas 시스템 또는 이의 성분을 전달하는 데 사용될 수 있다. CPP가 CRISPR-Cas 시스템 또는 이의 성분을 전달하기 위해 이용될 수 있는 것은 또한 본원에 전체가 참고로 포함된, Suresh Ramakrishna, Abu-Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor 등에 의한 ["Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA", Genome Res. 2014 Apr 2.]의 원고에서 제공되며, 여기에서 CPP-접합된 재조합 Cas9 단백질 및 CPP-복합체화 가이드 RNA를 이용한 치료가 인간 세포주에서의 내생성 유전자 파괴를 이끌어냄이 입증되었다. 이 논문에서 Cas9 단백질은 티오에스테르 결합을 통해 CPP에 콘쥬게이트되는 반면, 가이드 RNA는 CPP와 복합체화되어, 축합된 양으로 하전된 입자를 형성한다. 변형된 Cas9 및 가이드 RNA에 의한, 배아 줄기 세포, 진피 섬유아세포, HEK293T 세포, HeLa 세포 및 배아 암종 세포를 포함하는 인간 세포의 동시 및 후속적 처리는 플라스미드 형질감염에 비해 감소된 오프-표적 돌연변이를 갖는 효율적인 유전자 붕괴를 야기하는 것으로 나타났다.
에어로졸 전달
폐 질환에 대해 치료된 대상체는, 예를 들어 자발적으로 호흡하면서 폐에 대해 기관지내삽관으로 전달되는 약학적 유효량의 에어로졸화된 AAV 벡터 시스템을 받을 수 있다. 이와 같이, 일반적으로 AAV 전달에 에어로졸화된 전달이 바람직하다. 전달을 위해 아데노바이러스 또는 AAV 입자가 사용될 수 있다. 각각 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 적합한 유전자 구성체는 전달 벡터에 클로닝될 수 있다.
패키징 및 프로모터
CRISPR-Cas 단백질 및 임의로 기능성 도메인 (예를 들어, 아데노신 데아미나제) 코딩 핵산 분자 발현을 구동시키기 위해 사용되는 프로모터는 AAV ITR을 포함할 수 있고, 이것이 프로모터로서 작용할 수 있다. 이는 추가 프로모터 구성요소 (벡터 내 공간을 차지할 수 있음)의 필요를 제거하는데 유리하다. 추가의 공간 개방은 추가 구성요소 (gRNA 등)의 발현을 구동하는데 사용될 수 있다. 또한, ITR 활성은 상대적으로 더 약하며, 따라서 Cas13의 과발현에 기인하여 잠재적 독성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
편재성 발현을 위해서, 사용할 수 있는 프로모터는 CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등을 포함한다.뇌 또는 다른 CNS 발현을 위해서, 시냅신I이 모든 뉴런에 대해 사용될 수 있고, CaMKII알파는 흥분성 뉴런에 대해 사용될 수 있고, GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT는 GABA성 뉴런에 사용될 수 있다. 간 발현에 대해, 알부민 프로모터가 사용될 수 있다. 폐 발현에 대해, SP-B가 사용될 수 있다. 내피 세포에 대해, ICAM이 사용될 수 있다. 조혈 세포에 대해, IFN베타 또는 CD45가 사용될 수 있다. 골아세포에 대해, OG-2가 사용될 수 있다.
가이드 RNA를 구동시키는데 사용되는 프로모터는 Pol III 프로모터, 예컨대, U6 또는 H1을 비롯하여, Pol II 프로모터의 사용 및 가이드 RNA의 발현을 위한 인트론 카세트를 포함할 수 있다.
일정 구현예에서, CRISPR-Cas 시스템은 아데노 연관 바이러스 (AAV), 백혈병 바이러스 (MuMLV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 사용해 전달된다.
아데노 연관 바이러스 (AAV)
CRISPR-Cas 단백질, 아데노신 디아미나제, 및 하나 이상의 가이드 RNA는 아데노 연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 이용하여, 특히, 예를 들어, 미국 특허 제8,454,972호 (제제, 아데노바이러스에 대한 용량), 제8,404,658호 (제제, AAV에 대한 용량) 및 제5,846,946호 (제제, DNA 플라스미드에 대한 용량)으로부터의 용량, 및 임상 시험 및 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험에 관한 간행물로부터의 용량을 이용하여, 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,454,972호와 같고, AAV를 수반하는 임상 시험과 같을 수 있다. 아데노바이러스에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,404,658호와 같고 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험과 같을 수 있다. 플라스미드 전달을 위해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제5,846,946호에서와 같고 플라스미드를 수반하는 임상 연구에서와 같을 수 있다. 용량은 평균 70 kg 개체(예를 들어, 남성 성인 인간)에 기반하거나 또는 이에 대해 추론될 수 있고, 상이한 체중 및 종의 환자, 대상체, 포유동물에 대해 조절될 수 있다. 투여 빈도는 환자 또는 대상체의 연령, 성별, 일반적 건강상태, 다른 병태 및 처리될 특정 병태 또는 증상을 비롯한 보통의 인자에 따라서, 의학적 또는 수의학적 실행자 (예를 들어, 의사, 수의사)의 영역 내이다. 바이러스 벡터는 관심 조직 내로 주사될 수 있다. 세포 유형 특이적 게놈 변형을 위해, C2c1 및 아데노신 디아미나제의 발현은 세포 유형 특이적 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 예를 들어, 간-특이적 발현은 알부민 프로모터를 사용하고, 뉴런-특이적 발현은 (예를 들어, CNS 장애 표적화를 위해) 시냅신 I 프로모터를 사용할 것이다.
생체 전달과 관련하여, AAV는 몇가지 이유때문에 다른 바이러스 벡터에 비해 유리하다: 낮은 독성 (이는 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 세포 입자의 초원심분리를 필요로 하지 않는 정제 방법에 기인할 수 있음); 및 숙주 게놈 내로 통합되지 않기 때문에 삽입 돌연변이유발을 야기할 낮은 가능성.
AAV는 4.5 또는 4.75 Kb의 패키징 한계를 갖는다. 이것은 Cas13뿐만 아니라 프로모터 및 전사 종결자가 동일한 바이러스 벡터에 모두 적합하게 될 것임 의미한다. 4.5 또는 4.75 Kb보다 더 큰 구성체는 상당히 감소된 바이러스 생성을 야기할 것이다. SpCas9는 상당히 크며, 유전자 그 자체는 4.1 Kb인데, 이는 AAV에 패키징되는 것을 어렵게 만든다. 따라서, 본 발명의 구현예는 더 짧은 Cas13의 상동체를 이용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 캡시드는 VP1, VP2, VP3 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다.
AAV에 대해, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 표적화하려는 세포에 대한 AAV의 AAV를 선택할 수 있으며; 예를 들어, 뇌 또는 뉴런 세포를 표적화하기 위해 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합을 선택할 수 있고; 심장 조직을 표적화하기 위해 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간에 대한 전달에 유용하다. 본 명세서의 프로모터 및 벡터는 개개로 바람직하다. 이들 세포에 대한 소정의 AAV 혈청형의 표는 다음과 같다 (참조: Grimm, D. et al, J. Virol. 82:5887- 5911(2008)):
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렌티바이러스
렌티바이러스는 유사분열 세포와 유사분열 후 세포 둘 모두에서 그들의 유전자를 감염시키고 발현시키는 능력을 갖는 복잡한 레트로바이러스이다. 가장 통상적으로 알려진 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)인데, 이는 매우 다양한 세포 유형을 표적화하기 위해 다른 바이러스의 외피 당단백질을 사용한다.
렌티바이러스는 다음과 같이 제조될 수 있다. pCasES10(렌티바이러스 전달 플라스미드 골격을 함유함)을 클로닝시킨 후에, 10% 소 태아 혈청이 있고 항생제가 없는 DMEM에서의 형질감염 전달에 낮은 계대로(p=5) HEK293FT를 T-75 플라스크에서 50% 합류점(confluence)으로 파종시켰다. 20시간 후에, 배지를 옵티멤(OptiMEM)(무혈청) 배지로 바꾸고 나서, 4시간 후에 형질감염을 행하였다. 세포를 10 ㎍의 렌티바이러스 전달 플라스미드(pCasES10) 및 다음의 패키징 플라스미드: 5 ㎍의 pMD2.G (VSV-g 위형) 및 7.5 ㎍의 psPAX2(gag/pol/rev/tat)로 형질감염시켰다. 4㎖ OptiMEM에서 양이온성 지질 전달제(50uL 피포펙타민 2000 및 100㎕ 플러스 시약)를 이용하여 형질감염을 행하였다. 6시간 후에, 배지를 10% 소 태아 혈청이 있는 무항생제 DMEM으로 바꾸었다. 이들 방법은 세포 배양 동안 혈청을 사용하지만, 무혈청 방법이 바람직하다.
렌티바이러스는 다음과 같이 정제될 수 있다. 48시간 후에 바이러스 상청액이 채취되었다. 상청액은 처음에 파편이 클리어런스되고, 0.45㎛ 저 단백질 결합(PVDF) 필터를 통해 여과된다. 이어서, 24,000 rpm에서 2시간 동안 초원심분리로 교반되었다. 바이러스 펠렛은 밤새 4℃에서 50ul의 DMEM 중에서 재현탁된다. 이어서, 그들은 분취되어, 즉시 -80℃에 냉동되었다.
다른 실시형태에서, 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV)에 기반한 최소 비영장류 렌티바이러스 벡터가 또한 특히 안구 유전자 요법에 대해 고려된다 (참조: 예를 들어, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 -285). 다른 구현예에서, 노인성 황반 변성의 그물망 형태 치료를 위해 망막하 주사를 통해 전달되는 혈관억제 단백질 엔도스타틴 및 앤지오스타틴을 발현시키는 말 전염성 빈혈 바이러스-기반 렌티바이러스 유전자 요법 벡터, RetinoStat®가 또한 고려되며 (예를 들어, 문헌 [Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980991(September 2012)] 참조), 이 벡터는 본 발명의 AD-기능화된 CRISPR-Cas 시스템에 대해 변형될 수 있다.
또 다른 구현예에서, HIV tat/rev에 의해 공유된 일반 엑손을 표적화하는 siRNA, 핵소체-국소화 TAR 유인체(decoy), 및 항-CCR5-특이적 망치머리형 리보자임을 갖는 자가-비활성화 렌티바이러스성 벡터 (예를 들어, 문헌 [DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43] 참조)가 사용되고/거나 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템에 대해 조정될 수 있다. 최소 2.5 × 106개의 CD34+ 세포/킬로그램 환자 체중이 수집되고, 2 μ㏖/L-글루타민, 줄기 세포 인자(100ng/㎖), Flt-3 리간드(Flt-3L) (100ng/㎖), 및 트롬보포이에틴(10ng/㎖)(셀제닉스(CellGenix))을 2 × 106개의 세포/㎖의 밀도로 함유하는 X-VIVO 15 배지(론자(Lonza)) 배지에서 16 내지 20시간 동안 사전자극하였다. 사전 자극된 세포는 피브로넥틴 (25 ㎎/㎠)(RetroNectin, Takara Bio Inc.)으로 코팅한 75-㎠ 조직 배양 플라스크에서 16 내지 24시간 동안 5의 감염 다중도로 렌티바이러스를 형질도입시킬 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 파킨슨병에 대한 치료에 대해 개시되어 있고, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제20120295960호 및 미국 특허 제7303910호 및 7351585호를 참조한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 안질환의 치료용으로 개시되었으며, 예를 들어 미국 특허 공개 20060281180, 20090007284, US20110117189; US20090017543; US20070054961, US20100317109 참고. 렌티바이러스 벡터는 또한 뇌로의 전달을 위해 개시되어 있다, 참조, 예를 들어, 미국 특허 공개번호 US20110293571; US20110293571, US20040013648, US20070025970, US20090111106 및 미국 특허 US7259015.
중합체-기반 입자
본 명세서의 시스템 및 조성물은 중합체-기반 입자 (예를 들어, 나노입자)를 사용해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체-기반 입자는 막 융합의 바이러스 기전을 모방할 수 있다. 중합체-기반 입자는 인플루엔자 바이러스 기구의 합성 카피일 수 있고 산성 구획의 형성을 포함하는 과정인, 엔도시토시스 경로를 통해 세포가 흡수하는 다양한 유형의 핵산 (siRNA, miRNA, 플라스미드 DNA, 또는 shRNA, mRNA)과 형질감염 복합체를 형성한다. 후기 엔도솜의 저 pH는 화학 스위치로서 작용하여 입자 표면을 소수성으로 만들어서 막 크로싱을 촉진한다. 시토졸로 들어가면, 입자는 세포 작용을 위해 이의 페이로드를 방출한다. 이러한 활성 엔도솜 탈출 기술은 안전하고 천연 흡수 경로를 사용하므로 형질감염 효율을 최대화시킨다. 일부 구현예에서, 중합체-기반 입자는 알킬화 및 카르복시알킬화 분지형 폴리에틸렌이민을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 중합체-기반 입자는 VIROMER, 예를 들어, VIROMER RNAi, VIROMER RED, VIROMER mRNA, VIROMER CRISPR이다. 본 명세서에서 시스템 및 조성물을 전달하는 예시적인 방법은 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다; Bawage SS et al., Synthetic mRNA expressed Cas13a mitigates RNA virus infections, www.biorxiv.org/content/10.1101/370460v1.full doi: doi.org/10.1101/370460, Viromer® RED, a powerful tool for transfection of 케라틴ocytes. doi: 10.13140/RG.2.2.16993.61281, Viromer® Transfection - Factbook 2018: technology, product overview, users' data., doi:10.13140/RG.2.2.23912.16642.
일반 적용분야
본 개시는 본 명세서의 성분 및 시스템으로 표적 핵산 (예를 들어, DNA), 또는 하나 이상의 표적 핵산의 발현을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 본 명세서의 하나 이상의 비천연 발생 또는 조작된 조성물과 표적 핵산을 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 개시는 관심 표적 서열을 변형시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 표적 DNA를, i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질, ii) a) 표적 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있는 3' 가이드 서열, 및 b) 5' 직접 반복부 서열을 포함하는 crRNA, 및 iii) tracr RNA를 포함하여서, crRNA 및 tracr RNA와 복합체형성된 Cas12b 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체가 형성되는 것인 하나 이상의 비천연 발생 또는 조작된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 가이드 서열이 세포 내 표적 DNA와의 서열-특이적 결합을 유도하여, 관심 표적 유전자좌의 발현이 변형된다.
방법은 표적 유전자의 발현을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 변형은 시스템 또는 조성물에 의한 처리없이 또는 그 전에 표적 유전자의 발현과 비교하여 표적 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 변형은 시스템 또는 조성물에 의한 처리없이 또는 그 전에 표적 유전자의 발현과 비교하여 표적 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 변형은 시스템 또는 조성물에 의한 처리없이 또는 그 전에 표적 유전자의 발현과 비교하여 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 표적 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 염기 (예를 들어, 아데닌 또는 시토신)을 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 표적 올리고뉴클레오티드로 본 명세서의 염기 편집자의 하나 이상의 성분을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 본 개시는 상기 표적 올리고뉴클레오티드에, 촉매적 불활성 Cas12b 단백질; 직접 반복부에 연결된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자; 및 아데노신 또는 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인을 전달하는 단계를 포함하고, 상기 아데노신 또는 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 전달 이후에 상기 촉매적 불활성 Cas12b 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되거나 또는 상기 가이드 분자는 그에 연결되도록 조정되고, 상기 가이드 분자는 상기 촉매적 불활성 Cas12b와 복합체를 형성하고 상기 복합체가 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 결합하도록 유도하며, 상기 가이드 서열은 상기 표적 올리고뉴클레오티드 서열 내 표적 서열과 하이브리드화할 수 있어서 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성한다. 일부 구현예에서, 시토신은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성하는 상기 표적 서열 밖에 존재하고, 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 RNA 듀플렉스 밖의 시토신을 탈아민화시키거나, 또는 (B) 시토신은 RNA 듀플렉스를 형성하는 표적 서열 내에 있고, 가이드 서열은 시토신에 상응하는 위치에 비-쌍형성 아데닌 또는 우라실을 포함하여 그 결과로 RNA 듀플렉스에 C-A 또는 C-U 미스매치를 야기시키고, 시토신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 비-쌍형성 아데닌 또는 우라실 반대쪽 RNA 듀플렉스 내 시토신을 탈아민화시킨다. 가이드 분자는 상기 CRISPR 이펙터 단백질과 복합체를 형성하고 상기 복합체가 관심 표적 올리고뉴클레오티드 서열에 결합하도록 유도하고, 가이드 서열은 아데닌 또는 시토신을 포함하는 표적 서열과 하이브리드화할 수 있어 RNA 듀플렉스를 형성하고, 아데닌 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 RNA 듀플렉스의 아데닌 또는 시토신을 탈아미드화시킨다.
일부 구현예에서, 방법 및 시스템은 하나 이상의 샘플 중 핵산 표적 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시험관내 샘플에서 핵산 표적 서열의 존재를 검출하기 위한 시스템은 Cas12b 단백질; 표적 서열과 일정 정도의 상보성을 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함하고, Cas12b와 복합체를 형성하도록 설계된 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드; 및 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체를 포함하고, Cas12b는 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 표적 서열에 의해 활성화될 때 올리고뉴클레오티드 기반 차폐성 구성체의 비표적 서열을 절단한다. 일정 구현예에서, Cas12b 단백질; 각각이 하나 이상의 표적 폴리펩티드 중 하나에 결합하도록 설계된 하나 이상의 검출 압타머로서, 각각은 차폐된 프로모터 프롬프터 결합 부위 또는 차폐된 프라이머 결합 부위 및 기폭제 서열 주형을 포함하는 것인 검출 압타머; 및 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체를 포함하는, 하나 이상의 시험관내 샘플에서 하나 이상의 표적 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 시스템을 제공한다. 하나 이상의 시험관내 샘플에서 핵산 서열을 검출하기 위한 방법은 하나 이상의 샘플을 i) Cas12b 이펙터 단백질, ii) 표적 서열과 일정 정도의 상보성을 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함하고, Cas12b 이펙터 단백질과 복합체를 형성하도록 설계된 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드; 및 iii) 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 상기 Cas12b 이펙터 단백질은 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 올리고뉴클레오티드 기반 차폐성 구성체의 비표적 서열을 절단한다.
다른 양상에서, 본 개시는 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포에서 효소적 (예를 들어, 단백질가수분해적) 활성을 제공하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 효소의 불활성 부분에 연결된 제1 Cas 단백질, 및 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas 단백질을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 효소의 활성은 효소의 불활성 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성된다. 일부 구현예에서, 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포에서 단백질가수분해 활성을 제공하는 방법은 a) 세포 또는 세포 개체군을, i) 단백질가수분해 효소의 불활성 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질; ii) 단백질가수분해 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 단백질가수분해 효소의 단백질가수분해 활성은 단백질 가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 이펙터 단백질; iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 RNA의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; 및 iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 RNA의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드와 접촉시켜서, 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉하고 단백질가수분해 효소의 단백질가수분해 활성이 재구성되는 것인 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 개시는 관심 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 리포터의 불활성 부분에 연결된 제1 Cas 단백질, 및 리포터의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas 단백질을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 리포터의 활성은 리포터의 불활성 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성된다. 일부 구현예에서, 관심 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포를 확인하는 방법을 제공하고, 방법은 세포 내 올리고뉴클레오티드를, i) 리포터의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질; ii) 리포터의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 리포터의 활성은 리포터의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉할 때 재구성되는 것인 이펙터 단백질; iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드; 및 v) 리포터를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 관심 올리고뉴클레오티드가 세포에 존재할 때 리포터의 제1 부분 및 제2 부분이 접촉하고, 그리하여 리포터의 활성이 재구성된다. 일부 예에서, 리포터는 형광성 단백질 또는 발광성 단백질이다
비동물 유기체에서의 적용
C2c1-CRISPR 시스템의 식물 및 효모에의 적용
일반적으로, 용어 " 식물" 은 세포 분할에 의해 특징적으로 성장하고, 엽록체를 함유하며 셀룰로스로 구성된 세포벽을 갖는, 식물계 (kingdom Plantae)의 임의의 다양한 광합성, 진핵, 단세포 또는 다세포 유기체에 관한 것이다. 용어 식물은 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 구체적으로, 식물은 제한없이 속씨식물 및 겉씨식물, 예컨대, 아카시아, 알팔파, 아마란스, 사과, 살구, 아티초크, 물푸레나무, 아스파라거스, 아보카도, 바나나, 보리, 콩, 비트, 자작나무, 너도밤나무, 블랙베리, 블루베리, 브로콜리, 양배추, 캐비지, 카놀라, 칸탈루프, 당근, 카사바, 콜리플라워, 삼나무, 곡류, 셀러리, 밤나무, 체리, 차이니즈 캐비지, 감귤류, 귤, 클로버, 커피, 옥수수, 목화, 동부, 오이, 사이프러스, 가지, 느릅나무, 엔다이브, 유칼립투스, 펜넬, 무화과, 전나무, 제라늄, 포도, 자몽, 땅콩, 꽈리, 솔송나무, 히코리, 케일, 키위, 콜라비, 낙엽송, 상추, 리크, 레몬, 라임, 로커스트, 소나무, 공작고사리, 메이즈, 망고, 단풍나무, 멜론, 낱알 곡물, 버섯, 겨자, 견과, 오크, 귀리, 기름야자, 오크라, 양파, 오렌지, 관상용 식물 또는 꽃 또는 나무, 파파야, 야자나무, 파슬리, 파스닙, 완두콩, 복숭아, 땅콩, 배, 피트(peat), 후추, 감나무, 피젼피, 소나무, 파인애플, 플랜틴, 자두, 석류, 감자, 호박, 라디치오, 무, 유채, 라즈베리, 벼, 호밀, 수수, 잇꽃, 갯버들, 대두, 시금치, 가문비나무, 스쿼시, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 고구마, 단옥수수, 탄저린, 찻잎, 담배, 토마토, 나무, 라이밀, 잔디풀, 순무, 덩굴, 호두, 물냉이, 수박, 밀, 참마, 주목나무, 및 주키니를 포함하고자 한다. 용어 식물은 또한 뿌리, 잎 및 보다 고등 식물의 특징이 되는 다 기관의 결여에 의해 일차적으로 통합되는 광독립영양생물인 조류를 포함한다.
본 명세서에 설명된 바와 같은 C2c1 시스템을 이용하는 게놈 편집 방법은 바람직한 특성을 본질적으로 임의의 식물에 수여하는데 사용될 수 있다. 광범위한 종류의 식물 및 식물 세포 시스템은, 본 개시 내용의 핵산 구조물과 상기 언급된 각종 형질전환 방법을 이용하여 본 명세서에 설명된 바람직한 생리학적 및 작물학적 특징들에 대해, 조작될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조작을 위한 표적 식물 및 식물 세포는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예컨대, 곡물 (예를 들어, 밀, 메이즈, 벼, 낱알 곡물, 보리), 과일 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 뿌리 식물 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 잎줄기채소 작물 (예를 들어, 상추, 시금치); 개화 식물 (예를 들어, 페튜니아, 장미, 국화), 송백류 및 소나무 (예를 들어, 소나무 전나무, 가문비나무); 식물 환경 정화에서 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속 축적 식물); 기름 작물(예를 들어, 해바라기, 평지씨) 및 실험 목적으로 사용되는 식물 (예를 들어, 애기장대)를 포함하는 작물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, 방법 및 CRISPR-Cas 시스템은 매우 다양한 식물, 예컨대, 마그니오랄레스(Magniolales), 일리시알레스(Illiciales), 라우랄레 스(Laurales), 피페랄레스(Piperales), 아리스토치알레스(Aristochiales), 님파에알레스(Nymphaeales), 라눈쿠 랄레스(Ranunculales), 파페베랄레스(Papeverales), 사라세니아케아이(Sarraceniaceae), 트로코덴드랄레스(Trochodendrales), 하마멜리달레스(Hamamelidales), 유코미알레스(Eucomiales), 레이트네리알레스(Leitneriales), 미리칼레스(Myricales), 파갈레스(Fagales), 카수아리날레스(Casuarinales), 카리오필랄레스(Caryophyllales), 바탈레스(Batales), 폴리고날레스(Polygonales), 플룸바지날레스(Plumbaginales), 딜레니알 레스(Dilleniales), 테알레스(Theales), 말발레스(Malvales), 우르티칼레스(Urticales), 레시티달레스(Lecythidales), 비올랄레스(Violales), 살리칼레스(Salicales), 카파랄레스(Capparales), 에리칼레스(Ericales), 디아펜살레스(Diapensales), 에베날레스(Ebenales), 프리무랄레스(Primulales), 로살레스(Rosales), 파발레스(Fabales), 포도스테말레스(Podostemales), 할로라갈레스(Haloragales), 미르탈레스(Myrtales), 코르날레스(Cornales), 프로테알레스(Proteales), 산탈레스(Santales), 라플레시알레스(Rafflesiales), 셀라스트랄레스(Celastrales), 유포르비알레스(Euphorbiales), 람날레스(Rhamnales), 사핀달 레스(Sapindales), 유글란달레스(Juglandales), 게라니알레스(Geraniales), 폴리갈랄레스(Polygalales), 움벨랄레스(Umbellales), 겐티아날레스(Gentianales), 폴레모니알레스(Polemoniales), 라미알레스(Lamiales), 플란타지날레스(Plantaginales), 스크로풀라리알레스(Scrophulariales), 캄파누랄레스(Campanulales), 루비알레스(Rubiales), 딥사칼레스(Dipsacales) 및 아스테랄레스(Asterales) 목에 속하는 쌍자엽 식물에 대해 사용될 수 있고; 상기 방법 및 CRISPR-Cas 시스템은 알리스마탈레스(Alismatales), 히드로차리탈레스(Hydrocharitales), 나자달레스(Najadales), 트리우리달레스(Triuridales), 콤멜리날레스(Commelinales), 에리오카우랄레스(Eriocaulales), 레스티오날레스(Restionales), 포알레스(Poales), 준칼레스(Juncales), 시페랄레스(Cyperales), 티팔레스(Typhales), 브로멜리알레스(Bromeliales), 진기베랄레스(Zingiberales), 아레칼레스(Arecales), 시클란탈레스(Cyclanthales), 판다날레스(Pandanales), 아랄레스(Arales), 릴리알레스(Lilliales) 및 오르치달레스(Orchidales) 목에 속하는 것과 같은 단자옆식물, 또는 겉씨식물문, 예를 들어 피날레스(Pinales), 징코알레스(Ginkgoales), 시카달레스(Cycadales) 및 네탈레스(Gnetales)에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 CRISPR-C2c1 시스템 및 사용 방법은 이하의 쌍자엽, 단자엽 또는 겉씨씩물 속의 비제한적 열거에 포함되는 광범위한 식물 종에 걸쳐 사용될 수 있다: 아트로파 (Atropa), 알세오다프네 (Alseodaphne), 아나카르디움 (Anacardium), 아라치스 (Arachis), 벨리쉬 미에디아 (Beilschmiedia), 브라시카 (Brassica), 카르타무스 (Carthamus), 코쿠루스 (Cocculus), 크로톤 (Croton), 쿠쿠미스 (Cucumis), 시트러스 (Citrus), 시트룰루스 (Citrullus), 캅시쿰 (Capsicum), 카타란투스 (Catharanthus), 코코스 (Cocos), 코페아 (Coffea), 쿠쿠르비타 (Cucurbita), 다우쿠스 (Daucus), 두구에티아 (Duguetia), 에스크스 콜지아 (Eschscholzia), 피쿠스 (Ficus), 프라가리아 (Fragaria), 글라우시움 (Glaucium), 글리신 (글리신), 고시 피움 (Gossypium), 헬리안투스 (Helianthus), 헤베아 (Hevea), 히오시아무스 (Hyoscyamus), 락투카 (Lactuca), 란돌피아 (Landolphia), 리눔 (Linum), 리트세아 (Litsea), 리코페르시콘 (Lycopersicon), 루피누스 (Lupinus), 마니호트 (Manihot), 마조라나 (Majorana), 말루스 (Malus), 메디카고 (Medicago), 니코티아나 (Nicotiana), 올레아 (Olea), 파르테니움 (Parthenium), 파파베르 (Papaver), 페르세아 (Persea), 파세올루스 (Phaseolus), 피스타치아 (Pistacia), 피숨 (Pisum), 피루스 (Pyrus), 프루누스 (Prunus), 라파누스 (Raphanus), 리치누스 (Ricinus), 세네치오 (Senecio), 시노메니움 (Sinomenium), 스테파니아 (Stephania), 시나피스 (Sinapis), 솔라눔 (Solanum), 테오브로마 (Theobroma), 트리폴리움 (Trifolium), 트리고넬라 (Trigonella), 비키아 (Vicia), 빈카 (Vinca), 비티스 (Vitis) 및 비그나 (Vigna); 및 알리움 (Allium), 안드로포곤 (Andropogon), 아라그로스티스 (Aragrostis), 아스파라거스 (Asparagus), 아베나 (Avena), 시노돈 (Cynodon), 엘라에리스 (Elaeis), 페스투카 (Festuca), 페스투로리움 (Festulolium), 헤테로칼리스 (Heterocalis), 호르데움 (Hordeum), 렘나 (Lemna), 롤리움 (Lolium), 무사 (Musa), 오리자 (Oryza), 파니쿰 (Panicum), 판네세툼 (Pannesetum), 플레움 (Phleum), 포아 (Poa), 세칼레 (Secale), 소르굼 (Sorghum), 트리티쿰 (Triticum) 및 제아(Zea) 속 외떡잎식물; 또는 아비에스 (Abies), 쿤닝하미아 (Cunninghamia), 피세아 (Picea), 피누스 (Pinus) 및 프세우도추가 (Pseudotsuga).
CRISPR-C2c1 시스템 및 사용 방법은 또한, 예를 들어, 홍조식물 (Rhodophyta) (홍조류), 녹색식물문 (Chlorophyta) (녹조류), 갈조식물문 (Phaeophyta) (갈조류), 규조문 (Bacillariophyta) (규조류), 유스티그마토피타 (Eustigmatophyta) 및 와편모류 (dinoglagellates) 를 포함하는 몇몇 진핵생물문뿐만 아니라 원핵생물문 남세균 (cyanobacteria) (청-녹조류)로부터 선택된 조류를 비롯한, 광범위한 "조류" 또는 "조류 세포" 에 대해 사용될 수 있다. 용어 "조류"는 예를 들어, 암포라 (Amphora), 아나바나 (Anabaena), 아니크스트로데스미스 (Anikstrodesmis), 보트리오코커스 (Botryococcus), 차에토세로스 (Chaetoceros), 클라미도모나스 (Chlamydomonas), 클로렐라 (Chlorella), 클로로코쿰 (Chlorococcum), 시클로텔라 (Cyclotella), 실린드로테카 (Cylindrotheca), 두날리엘라 (Dunaliella), 에밀리아나 (Emiliana), 유글레나 (Euglena), 헤마토코커스 (Hematococcus), 이소크리시스 (Isochrysis), 모노크리시스 (Monochrysis), 모노라피디움 (Monoraphidium), 나노클로리스 (Nannochloris), 나노클로롭시스 (Nannnochloropsis), 나비쿨라 (Navicula), 네프로클로리스 (Nephrochloris), 네프로셀미스 (Nephroselmis), 니츠키아 (Nitzschia), 노둘라리아 (Nodularia), 노스톡 (Nostoc), 오크로모나스 (Oochromonas), 우시스티스 (Oocystis), 오실라르토리아 (Oscillartoria), 파블로바 (Pavlova), 파에오닥틸룸 (Phaeodactylum), 플라이트모나스 (Playtmonas), 플레우로크리시스 (Pleurochrysis), 포르히라 (Porhyra), 슈도아나바나 (Pseudoanabaena), 피라미모나스 (Pyramimonas), 스티코코커스 (Stichococcus), 시네코코커스 (Synechococcus), 시네코시스티스 (Synechocystis), 테트라셀미스 (Tetraselmis), 탈라시오시라 (Thalassiosira) 및 트리코데스뮴 (Trichodesmium)으로부터 선택된 조류를 포함한다.
식물의 부분, 즉 "식물 조직" 은 본 발명의 방법에 따라 처리되어 개선된 식물을 생산할 수 있다. 식물 조직은 또한 식물 세포를 포함한다.본 명세서에서 사용되는 용어 "식물 세포" 는 무손상 전체 세포에서 또는 시험관내 조직 배양으로부터 성장된 단리 형태로, 배지 또는 한천 상에서, 성장 배지 내 현탁액 또는 완충제에서 또는 더 고등의 조직 단위의 일부, 예컨대, 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물로서의, 살아있는 식물의 개개 단위를 의미한다.
"원형질" 이라는 용어는, 예를 들어 기계적 또는 효소적 수단을 이용하여 그의 보호성 세포 벽이 완전히 또는 부분적으로 제거된 식물 세포를 지칭하며, 그 결과 살아있는 식물의 온전한 생화학 컴피턴트 단위가 결과로서 초래되며, 이는 적절한 성장 조건 하에서 그의 세포 벽을 재형성하고, 번식 및 재생하여 전체 식물로 성장할 수 있다.
용어 "형질전환" 은 식물 숙주가 아그로박테리아에 의해서 또는 다양한 화학적 또는 물리적 방법 중 하나에 의해서 DNA의 도입에 의해 유전자 변형되는 과정을 광범위하게 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 " 식물 숙주" 는 식물의 임의의 세포, 조직, 기관 또는 자손을 포함하는 식물을 의미한다. 다수의 적합한 식물 조직 또는 식물 세포는 형질전환될 수 있고, 원형질체, 체성 배아, 화분, 잎, 묘목, 줄기, 캘러스, 주근, 미세괴경 및 순을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 식물 조직은 또한 이러한 식물, 종자, 자손, 유성 또는 무성 생식이건 간에 번식체, 및 이들 중 어느 것의 후손, 예컨대, 꺾꽂이 순 또는 종자의 임의의 클론을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환된" 은 외래 DNA 분자, 예컨대, 구성체가 도입되는 세포, 조직 또는 유기체를 의미한다. 도입된 DNA 분자가 후속 자손으로 전달되도록, 도입된 DNA 분자는 수용 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 게놈 DNA에 통합될 수 있다. 이들 구현예에서, "형질전환된" 또는 "유전자이식" 세포 또는 식물은 또한 교배에서 모체로서 이러한 형질전환된 식물을 사용하고 도입된 DNA 분자의 존재로부터 초래되는 변경된 표현형을 나타내는 육종 프로그램으로부터 생성된 자손 또는 세포 또는 식물의 자손을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유전자이식 식물은 생식력이 있으며, 도입된 DNA가 성적 번식을 통해 자손에게 전달될 수 있다.
용어 "자손", 예컨대, 유전자이식 식물의 자손은 식물 또는 유전자이식 식물로부터 기인하거나, 야기되거나 또는 유래되는 것이다. 도입된 DNA 분자는 또한 도입된 DNA 분자가 후속 자손에 의해 유전되지 않고, 따라서 "유전자이식" 으로 고려되지 않도록 수용 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는, "비-유전자이식" 식물 또는 식물 세포는 게놈 내로 안정하게 통합된 외래 DNA를 함유하지 않는 식물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "식물 프로모터" 는 식물 유래이건 그렇지 않건 간에 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 예시적인 적합한 식물 프로모터는 식물 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 식물, 식물 바이러스 및 박테리아, 예컨대, 아그로박테리움 또는 리조비움 (Rhizobium)으로부터 얻어지는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "진균 세포" 는 진균류 내의 임의의 유형의 진행 세포를 의미한다. 진균류 내의 문은 아스코미코타 (Ascomycota), 바시디오마이코타 (Basidiomycota), 블라스토클라디오마이코타 (Blastocladiomycota), 키트리디오마이코타 (Chytridiomycota), 글로메로마이코타 (Glomeromycota), 마이크로스포리디아 (Microsporidia), 및 네오칼리마스티고마이코타 (Neocallimastigomycota)를 포함한다. 진균 세포는 효모, 곰팡이 및 사상성진균을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 진균 세포는 효모 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "효모 세포" 는 아스코미코타 및 바시디오마이코타 문 내의 임의의 진균 세포를 의미한다. 효모 세포는 출아 효모 세포, 분열 효모 세포 및 곰팡이 세포를 포함할 수 있다. 이들 유기체로 제한되지 않지만, 실험실 및 산업 환경에서 사용되는 다수 유형의 효모는 아스코미코타 문의 일부이다. 일부 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비지아에 (S. cerervisiae), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 또는 아사켄키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis) 세포이다. 다른 효모 세포는 칸디다 종 (Candida spp.)(예를 들어, 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)), 야로위아 종 (Yarrowia spp.) (예를 들어, 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)), 피키아 종 (Pichia spp.)(예를 들어, 피키아 파스토리스 (Phichia pastoris), 클루이베로마이세스 종 (Kluyveromyces spp.) (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스), 뉴로스포라 종 (Neurospora spp.) (예를 들어, 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)), 푸사리움 종 (Fusarium spp.) (예를 들어, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)), 및 이사켄키아 종 (Issatchenkia spp.) (예를 들어, 아사켄키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis) (피키아 쿠드리아베제비 (Pichia kudriavzevii)라고도 함) 및 칸디다 아시도써모필룸 (Candida acidothermophilum))을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 진균 세포는 사상 진균 세포이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "사상 진균 세포" 는 필라멘트, 즉, 균사 또는 균사체로 성장하는 임의의 유형의 진균 세포를 지칭한다. 섬유성 균류 세포의 예로는 이로 제한되지 않지만, 누룩곰팡이 종 (Aspergillus spp.)(예를 들어, 아스페르길루스 나이거(Aspergillus niger)), 트리코더마 종(Trichoderma spp.)(예를 들어, 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)), 리조푸스 종(Rhizopus spp.)(예를 들어, 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)), 및 모르티에렐라 종(Mortierella spp.)(예를 들어, 모르티에렐라 이사벨리나)가 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 균류 세포는 산업용 균주이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "산업용 균주" 는 산업적 공정, 예를 들어 상업적 또는 산업적 규모에서의 생성물의 생산으로부터 사용 또는 분리된 균주 세포의 임의의 균주를 지칭한다. 산업용 균주는 산업적 공정에서 통상적으로 사용되는 균류 종을 지칭할 수 있거나, 비-산업적 목적에도 사용될 수 있는(예를 들어, 실험실 연구) 균류 종의 분리물을 지칭할 수 있다. 산업적 공정의 예는 (예를 들어, 식품 또는 음료 제품의 생산에서) 발효, 증류, 생물연료 생산, 화합물의 생산 및 폴리펩티드의 생산을 포함할 수 있다. 산업용 균주의 예는 제한 없이, JAY270 및 ATCC4124를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 균류 세포는 배수체 세포이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "배수체" 세포는 그의 게놈이 하나 초과의 복사물로 존재하는 임의의 세포를 지칭할 수 있다. 배수체 세포는 자연에서 배수체 상태로 발견되는 세포의 유형을 지칭할 수 있거나, 배수체 상태로 존재하도록 유도된 세포를 지칭할 수 있다(예를 들어, 특이적 조절, 변경, 비활성화, 활성화, 또는 감수분열의 변형, 세포질 분열, 또는 DNA 복제를 통해). 배수체 세포는 그의 전체 게놈이 배수체인 세포를 지칭할 수 있거나, 특정한 관심 게놈 유전자좌 내 배수체인 세포를 지칭할 수 있다. 이론에 한정하고자 하지는 않지만, 가이드 RNA의 존재비는 반수체 세포보다 배수체 세포의 게놈 조작에서 종종 더욱 속도-제한적인 성분일 수 있고, 따라서 본 명세서에 기술된 C2c1 CRISPR 시스템을 사용하는 방법은 일정 진균류 세포 유형을 사용하는 것을 활용할 수 있다.
일부 구현예에서, 균류 세포는 이배체 세포이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "이배체" 세포는 그의 게놈이 두 개의 복사물로 존재하는 임의의 세포를 지칭할 수 있다. 이배체 세포는 이배체 상태에서 자연적으로 발견되는 세포 유형을 지칭할 수 있거나, 또는 (예를 들어, 특정 조절, 변경, 불활성화, 활성화 또는 감수분열, 세포질분열 또는 DNA 복제의 변형을 통해) 이배체 상태로 존재하도록 유도된 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아 균주 S228C는 반수체 또는 이배체 상태에서 유지될 수 있다. 이배체 세포는 전체 게놈이 이배체인 세포를 지칭할 수 있거나, 또는 관심 특정 게놈 유전자좌에서 이배체인 세포를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 균류 세포는 반수체 세포이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "반수체" 세포는 그의 게놈이 하나의 복사물로 존재하는 임의의 세포를 지칭할 수 있다. 반수체 세포는 자연에서 반수체 상태로 발견되는 세포의 유형을 지칭할 수 있거나, 반수체 상태로 존재하도록 유도된 세포를 지칭할 수 있다 (예를 들어, 특이적 조절, 변경, 비활성화, 활성화, 또는 감수분열의 변형, 세포질 분열, 또는 DNA 복제를 통해). 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시에 균주 S228C는 반수체 또는 이배체 상태로 유지될 수 있다. 반수체 세포는 그의 전체 게놈이 반수체인 세포를 지칭할 수 있거나, 특정한 관심 게놈 유전자좌 내 반수체인 세포를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "효모 발현 벡터" 는 RNA 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 서열을 함유하는 핵산을 지칭하며, 핵산(들)의 발현을 제어하는 임의의 바람직한 요소뿐만 아니라, 효모 세포 내부의 발현 벡터의 복제 및 유지를 가능하게 하는 임의의 요소를 추가로 함유할 수 있다. 다수의 적합한 효모 발현 벡터 및 이의 특징은 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 다양한 벡터 및 기법은 문헌 [Yeast Protocols, 2nd edition, Xiao, W., ed. (Humana Press, 뉴욕, 2007)] 및 [Buckholz, R.G. and Gleeson, M.A. (1991) Biotechnology (NY) 9(11): 1067- 72]에 예시되어 있다. 효모 벡터는 제한 없이, 동원체 (CEN) 서열, 자율 증식 서열 (ARS), 프로모터, 예컨대, 관심 서열 또는 유전자에 작동적으로 연결된, RNA 폴리머라제 III 프로모터, RNA 폴라머라제 III 종결자와 같은 종결자, 복제 기원, 및 마커 유전자 (예를 들어, 영양요구성, 항생성, 또는 다른 선별 마커)를 함유할 수 있다. 효모에서의 이용을 위한 발현 벡터의 예로는, 플라스미드, 효모 인공 염색체, 2μ 플라스미드, 효모 편입형 플라스미드, 효모 자가증식형 플라스미드, 셔틀 벡터, 및 에피솜 유사 플라스미드를 포함할 수 있다.
식물 및 식물 세포의 게놈 내 CRISPR-C2c1 시스템 성분의 안정한 통합
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템의 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물 세포의 게놈 내로 안정한 통합을 위해 도입되는 것이 고려된다. 이들 구현예에서, 형질전환 벡터 또는 발현 시스템의 설계는, 가이드 RNA 및/또는 C2c1 유전자가 언제, 어디에서 어떤 조건에서 발현되는지에 따라 조절될 수 있다.
특정 구현예에서, 식물 세포의 게놈 DNA 내로 CRISPR-C2c1 시스템의 성분을 안정하게 도입하는 것이 계획된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 식물 세포기관, 예컨대, 제한없이, 색소체, 미토콘드리아 또는 엽록체의 DNA 내로 안정한 통합을 위해 CRISPR-C2c1 시스템 성분을 도입하는 것이 고려된다.
식물 세포 게놈 내로 안정한 통합을 위한 발현 시스템은 다음의 구성요소 중 하나 이상을 함유할 수 있다: 식물 세포에서 RNA 및/또는 C2c1 효소를 발현시키기 위해 사용될 수 있는 프로모터 구성요소; 발현을 증강시키기 위한 5' 비번역 영역; 소정의 세포, 예컨대, 단자엽 세포에서 발현을 추가로 증강시키는 인트론 구성요소; 가이드 RNA 및/또는 융합 단백질 및 C2c1 유전자 서열 및 다른 목적하는 요소를 삽입하기 위한 편리한 제한 부위를 제공하기 위한 다중 클로닝 부위; 및 발현된 전사체의 효율적인 종결을 제공하기 위한 3' 비번역 영역.
발현 시스템의 요소는 플라스미드 또는 형질전환 벡터와 같은 환형, 또는 선형 이중 가닥 DNA와 같은 비-환형 중 어느 하나인 하나 이상의 발현 구축물 상에 있을 수 있다.
특정 구현예에서, C2c1 CRISPR 발현 시스템은 적어도, 식물에서 표적 서열과 하이브리드화하는 가이드 RNA(gRNA)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 가이드 RNA는 가이드 서열 및 직접 반복부 서열을 포함하는 서열, tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 C2c1 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 성분 (a) 또는 성분 (b) 또는 (c)는 동일하거나 상이한 구축물 상에 위치되며, 이로 인해 상이한 뉴클레오티드 서열은 식물 세포 내에서 동일하거나 상이한 조절 엘리먼트의 제어 하에 있을 수 있다. Tracr은 가이드 RNA에 융합될 수 있다.
CRISPR-C2c1 시스템의 성분, 및, 적용 가능한 경우, 주형 서열을 함유하는 DNA 구성체(들)는 다양한 통상적인 기법에 의해 식물, 식물 부분 또는 식물 세포 게놈 내로 도입될 수 있다. 프로세스는 일반적으로 적합한 숙주 세포 또는 숙주 조직을 선택하는 단계, 구축물(들)을 숙주 세포 또는 숙주 조직 내로 도입하는 단계, 식물 세포 또는 그로부터의 식물을 재생하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, DNA 구축물은, 이로 제한되지는 않지만 예컨대 식물 세포 원형질체의 전기천공, 미세주입, 에어로졸 빔 주사 기술을 이용하여 식물 세포 내로 도입될 수 있거나, DNA 구축물은 DNA 유전자 총(particle bombardment)과 같은 바이오리스틱 방법을 이용하여 식물 조직에 직접 도입될 수 있다(참조: Fu et al., Transgenic Res. 2000 Feb;9(1):11-9) 유전자 총의 기준은 입자에 의한 원형질의 침투 및 전형적으로 게놈 내로의 안정한 통합을 초래하는, 세포에 대해 관심 유전자로 코팅된 입자의 가속도이다. (참조: Klein et al, Nature (1987), Klein et ah, Bio/Technology (1992), Casas et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993).).
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템의 성분을 함유하는 DNA 구성체는 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 식물 내로 도입될 수 있다. DNA 구성체는 적합한 T-DNA 측접 영역과 합쳐지고, 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터 내로 도입될 수 있다. 외래 DNA는 식물을 감염시킴으로써 또는 하나 이상의 Ti (종양-유도성) 플라스미드를 함유하는 식물 원형질체를 아그로박테리움 박테리아와 함께 인큐베이션시킴으로써 게놈 내로 혼입될 수 있다. (참조: 예를 들어, Fraley et al., (1985), Rogers et al., (1987), 및 미국 특허 번호 5,563,055).
식물 프로모터
식물 세포에서 적절한 발현을 보장하기 위해, 본 명세서에 기재된 CRISPR-C2c1 시스템의 성분은 전형적으로 식물 프로모터, 즉, 식물 세포에서 작동가능한 프로모터의 제어 하에 위치된다. 상이한 유형의 프로모터들의 이용이 고려된다.
항상성 식물 프로모터는 식물의 모든 또는 거의 모든 발생 단계 동안 모든 또는 거의 모든 식물 조직에서 제어되는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 발현 ("항상성 발현" 이라함)시킬 수 있는 프로모터이다. 항상성 프로모터의 한 가지 비제한적 예는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터이다. "조절된 프로모터" 는 항성성이 아니지만, 시간적으로 및/또는 공간적으로 조절된 방식으로 유전자 발현을 지시하는 프로모터를 지칭하고, 조직-특이적, 조직-선호성 및 유도성 프로모터를 포함한다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 유형에서 또는 상이한 발생 단계 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자 발현을 지정할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 C2c1 CRISPR 성분은 구조적 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어 하에 발현된다. 조직-선호된 프로모터는 특정 식물 조직 내에서 소정의 세포 유형 내, 예를 들어, 잎 또는 뿌리 내의 맥관 세포 또는 씨드의 특정 세포 내 증진된 발현을 표적화하는데 사용될 수 있다. CRISPR-C2c1 시스템에서 사용하기 위한 특정 프로모터의 예는 문헌 [Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792803]; [Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:25565]; [Hire et al, (1992) Plant Mol Biol 20:20718], [Kuster et al, (1995) Plant Mol Biol 29:75972], 및 [Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681 -91]에서 확인된다.
유도성이며, 유전자 편집 또는 유전자 발현의 시공적 제어를 가능하게 하는 프로모터의 예는 에너지 형태를 사용할 수 있다. 에너지 형태는 소리 에너지, 전자기 복사, 화학적 에너지 및/또는 열 에너지를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 유도성 시스템의 예는 테트라사이클린 유도성 프로모터 (Tet-온 또는 Tet-오프), 소형 분자 2-하이브리드 전사 활성화 시스템 (FKBP, ABA 등), 또는 광 유도성 시스템 (피토크롬, LOV 도메인 또는 크립토크롬), 예컨대, 서열-특이적 방식으로 전사 활성의 변화를 지시하는 광 유도성 전사 이펙터 (LITE)를 포함한다. 광 유도성 시스템의 성분은 C2c1 CRISPR 효소, 광-반응성 시토크롬 이형이량체(예를 들어, 애기장대로부터), 및 전사 활성화/억제 도메인을 포함할 수 있다. 유도성 DNA 결합 단백질 및 이들의 사용 방법의 추가적인 예는 본 명세서에 전문이 참고로 편입된 US 61/736465 및 US 61/721,283에서 제공된다.
특정 구현예에서, 일시적 또는 유도성 발현은, 예를 들어, 화학적-조절 프로모터를 이용함으로써 달성될 수 있고, 즉, 이에 의해 외생성 화학물질의 적용은 유전자 발현을 유도한다. 유전자 발현의 조절은 또한 화학물질-억제 프로모터에 의해 얻어질 수 있으며, 화학물질의 적용은 유전자 발현을 억제한다. 화학물질-유도성 프로모터는 벤젠 설폰아미드 제초제 약해 경감제에 의해 활성화되는 메이즈 ln2-2 프로모터 (De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:56877), 발아전 제초제로서 사용되는 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화되는 메이즈 GST 프로모터 (GST-ll-27, WO93/01294), 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1 프로모터 (Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:8037)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항생제에 의해 조절되는 프로모터, 예컨대, 테트라사이클린-유도성 및 테트라사이클린-억제성 프로모터 (문헌 [Gatz et al., (1991) Mol Gen Genet 227:22937]; 미국 특허 제5,814,618호 및 제5,789,156호 참조)가 또한 본 명세서에서 사용될 수 있다.
특별한 식물 세포소기관에서 전좌 및/또는 발현
발현 시스템은 특별한 식물 세포소기관으로의 전좌 및/또는 그에서의 발현을 위한 구성요소를 포함할 수 있다.
엽록체 표적화 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 엽록체 유전자를 특이적으로 변형시키기 위해 또는 엽록체에서의 발현을 보장하기 위해 사용되는 것이 고려된다. 이러한 목적을 위해, 엽록체 형질전환 방법 또는 C2c1 CRISPR 시스템 성분의 엽록체로의 구획화를 이용한다. 예를 들어, 색소체 게놈 내 유전적 변형의 도입은 화분을 통한 유전자 흐름과 같은 생물안전성 문제를 감소시킬 수 있다.
엽록체 형질전환 방법은 해당 기술 분야에 알려져 있으며, 유전자 총법, PEG 처리, 및 미세주입을 포함한다. 추가적으로, 핵 게놈으로부터 색소체로의 형질전환 카세트 전좌를 수반하는 방법은 WO2010061186에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
대안적으로, 하나 이상의 C2c1 CRISPR 시스템 성분을 식물 엽록체로 표적화하는 것이 고려된다. 이는 발현 구성체 내로, C2c1 단백질을 코딩하는 서열의 5' 영역에 작동적으로 연결된, 엽록체 이동 펩티드 (CTP) 또는 색소체 이동 펩티드를 코딩하는 서열을 통합시킴으로써 달성된다. CTP는 엽록체 내로의 전좌 동안 가공 단계에서 제거된다. 발현된 단백질의 엽록체 표적화는 숙련자에게 공지이다(참조: 예를 들어, Protein Transport into Chloroplasts, 2010, Annual Review of Plant Biology,Vol. 61: 157-180). 이러한 구현예에서, 또한 식물 엽록체에 대해 가이드 RNA를 표적화하는 것이 바람직하다. 엽록체 국소화 서열에 의해 엽록체에 가이드 RNA를 전좌시키기 위해 사용될 수 있는 방법 및 구성체는, 예를 들어, 본 명세서에 참고로 편입된 US 20040142476에 기재되어 있다. 구성체의 그러한 변이는 본 발명의 발현 시스템 내로 통합되어 C2c1-가이드 RNA를 효율적으로 전위시킬 수 있다.
CRISPR-C2c1 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조류 세포 내 도입
유전자이식 조류(또는 유채와 같은 다른 식물)는 채소유 또는 생물연료 예컨대 알코올(특히 메탄올 및 에탄올) 또는 다른 생성물의 생산에서 특히 유용할 수 있다. 이들은 오일 또는 생체연료 산업에서 사용을 위한 고수준의 오일 또는 알코올을 발현 또는 과발현시키도록 유전자조작될 수 있다.
US 8945839호는 Cas9를 이용하여 미세조류(클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포) 종을 조작하는 방법을 설명한다. 유사한 도구를 이용하여, 본 명세서에 기재된 CRISPR-C2c1 시스템의 방법은 클라미도모나스 (Chlamydomonas) 종 및 다른 조류에 적용될 수 있다. 특정 구현예에서, C2c1 및 가이드 RNA는, Hsp70A-Rbc S2 또는 베타2 -튜불린과 같은 구조 프로모터의 제어 하에서 C2c1을 발현하는 벡터를 사용하여 발현된 조류 내에 도입된다. 가이드 RNA는 T7 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 선택적으로 전달된다. 대안적으로, C2c1 mRNA 및 시험관내 전사된 가이드 RNA는 조류 세포에 전달될 수 있다. 전기천공법 프로토콜, 예컨대, GeneArt Chlamydomonas Engineering kit로부터의 표준 권장 프로토콜은 당업자가 이용 가능하다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 엔도뉴클레아제는 분할 C2c1 효소이다. 분할 C2c1 효소는 WO 2015086795에 Cas9에 대하여 기재된 바와 같은 표적된 게놈 변형을 위한 조류 내에서 우선적으로 사용된다. C2c1 분할 시스템의 이용은 게놈 표적화의 유도 방법에 특히 적합하며, 조류 세포 내 C2c1 과잉발현의 잠재적인 독성 효과를 회피한다. 특정 구현예에서, 상기 C2c1 분할 도메인(RuvC 및 HNH 도메인)은 동시에 또는 순차적으로 세포 내로 도입될 수 있어서, 상기 분할 C2c1 도메인(들)은 조류 세포 내에서 표적 핵산 서열을 가공한다. 야생형 C2c1에 비하여 분할 C2c1의 감소된 크기는 CRISPR 시스템의 세포로 전달하는 다른 방법들, 예컨대 본 명세서에 설명된 바와 같은 세포 침투 펩티드의 이용을 가능하게 한다. 이 방법은 유전적으로 변형된 조류를 생성하는데 특히 유익하다.
효모 세포 내에서 C2c1 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입
특정 구현예에서, 본 발명은 효모 세포의 게놈 편집을 위한 CRISPR-C2c1 시스템의 용도에 관한 것이다. CRISPR-C2c1 시스템 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는데 사용될 수 있는 효모 세포를 형질전환하는 방법은 당업자에게 공지이며, 다음의 문헌에서 검토된다: Kawai et al., 2010, Bioeng Bugs. 2010 Nov-Dec; 1(6): 395-403. 비제한적 예는 리튬 아세테이트 처리 (담체 DNA 및 PEG 처리를 추가로 포함할 수 있음), 유전자 총 또는 전기천공법에 의한 효모 세포의 형질전환을 포함한다.
식물 및 식물 세포 내에서 C2c1 CRISP 시스템 성분의 일시적 발현
특정 구현예에서, 가이드 RNA 및/또는 C2c1 유전자는 식물 세포 내에서 일시 발현된다고 생각된다. 이들 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은, 가이드 RNA 및 C2c1 단백질 모두가 세포 내에 존재하는 때에만 표적 유전자의 변형을 보장할 수 있어서, 게놈 변형은 추가로 제어될 수 있다. C2c1 효소의 발현이 일시적임에 따라, 그러한 식물 세포로부터 생성된 식물은 통상적으로 외래 DNA를 함유하지 않는다. 특정 구현예에서 C2c1 효소는 식물 세포에 의해 안정하게 발현되고, 가이드 서열이 일시적으로 발현된다.
특정 실시형태에서, CRISPR-기능화된 CRISPR 시스템 성분은 식물 바이러스 벡터를 이용하여 식물 세포에 도입될 수 있다 (Scholthof et al. 1996, Annu Rev Phytopathol. 1996;34:299- 323). 추가의 특정 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 DNA 바이러스로부터의 벡터이다. 예를 들어, 제미니바이러스 (예를 들어, 캐비지 잎 말림 바이러스, 콩 누른오갈병 바이러스, 밀 오갈병 바이러스, 토마토 잎 말림 바이러스, 메이즈 도말 바이러스, 담배 잎 말림 바이러스, 또는 토마토 골든 모자이크 바이러스) 또는 나노바이러스 (예를 들어, 잠두 괴사성 황화 바이러스). 다른 특정 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 RNA 바이러스 유래 벡터이다. 예를 들어, 토브라바이러스 (예를 들어, 담배 얼룩 바이러스 (tobacco rattle virus), 담배 모자이크 바이러스), 포텍스바이러스 (예를 들어, 감자 바이러스 X) 또는 호르데이바이러스 (예를 들어, 보리 줄무늬병 모자이크 바이러스). 식물 바이러스의 복제 게놈은 비통합 벡터이다.
특정 구현예에서, C2c1 CRISPR 구성체의 일시적 발현을 위해 사용되는 벡터는, 예를 들어, 원형질체에서 아그로박테리움-매개 일시적 발현에 대해 맞춤된 pEAQ 벡터이다 (Sainsbury F. et al., Plant Biotechnol J. 2009 Sep;7(7):682-93). CRISPR 효소를 발현시키는 안정한 유전자이식 식물에서 gRNA를 발현시키기 위해 변형된 양배추 잎 말림 바이러스(CaLCuV) 벡터를 이용하는 게놈 위치의 정확한 표적화가 입증되었다 (Scientific Reports 5, Article number: 14926 (2015), doi:10.1038/srep14926).
특정 구현예에서, 가이드 RNA 및/또는 C2c1 유전자를 코딩하는 이중-가닥 DNA 단편은 식물 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있다. 이러한 구현예에서, 도입된 이중-가닥 DNA 단편은 세포를 변형시키기 위한 충분량으로 제공되지만, 통과된 시간의 고려되는 기간 후에 또는 1회 이상의 세포 분열 후에 지속되지 않는다. 식물에서 직접 DNA 전달 방법은 당업자에게 알려져 있다(참조: 예를 들어, Davey et al. Plant Mol Biol. 1989 Sep;13(3):273-85.)
다른 구현예에서, C2c1단백질을 코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드가 식물 세포 내로 도입되고, 이는 이후 번역되고 숙주 세포에 의해 가공되어(하나 이상의 가이드 RNA 존재 하에서) 세포를 변형시키기에는 충분한 양이지만 고려된 기간이 지나거나 일 회 이상의 세포 분열 후에는 지속되지 않는 양의 단백질을 생성한다. 일시적 발현을 위해 식물 원형질체에 mRNA를 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (참조: 예를 들어, Gallie, Plant Cell Reports (1993), 13;119122).
상기 설명된 상이한 방법들의 조합이 또한 고려된다.
C2c1 CRISPR 성분의 식물 세포로의 전달
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템의 하나 이상의 성분을 직접적으로 식물 세포에 전달하는 데 관심이 있다. 이는 특히, 비-유전자이식 식물의 생성에서 흥미롭다 (이하 참조). 특정 구현예에서, 하나 이상의 C2c1 성분이 식물 또는 식물 세포 외부에서 제조되고 세포로 전달된다. 예를 들어 특정 구현예에서, C2c1 단백질은 식물 세포로의 도입 전에 시험관 내에서 제조된다. C2c1 단백질은 당업자에게 알려진 각종 방법에 의해 제조될 수 있으며, 재조합 생산을 포함한다. 발현 후, C2c1 단백질이 분리되고, 필요에 따라 재접힘되고, 정제 및 선택적으로 처리되어 임의의 정제 태그, 예컨대 His-태그를 제거할수 있다. 조질의, 부분적으로 정제된, 또는 더욱 완전하게 정제된 C2c1 단백질이 일단 수득되면, 단백질은 식물 세포로 도입될 수 있다.
특정 구현예에서, C2c1 단백질은 관심 유전자를 표적화하는 가이드 RNA와 혼합되어 사전-조립된 리보뉴클레오단백질을 형성한다.
개별적인 성분 또는 사전-조립된 리보뉴클레오단백질은 전기 천공을 통해, C2c1-연관된 유전자 생성물 코팅된 입자를 이용한 충격에 의해, 화학적 트랜스펙션에 의해, 또는 세포막을 지나 운송하기 위한 일부 다른 수단에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 사전-조립된 CRISPR 리보뉴클레오단백질을 이용한 식물 원형질체의 트랜스펙션은, 식물 게놈이 표적된 변형을 보장하는 것으로 증명되었다(Woo et al. Nature Biotechnology, 2015; DOI: 10.1038/nbt.3389에 의해 기술된 바와 같음).
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템 성분은 입자를 이용하여 식물 세포 내로 도입된다. 단백질 또는 핵산으로서, 또는 이의 조합 중 어느 하나인 성분은 입자 위에 업로드되거나, 입자 내에 패키지되고, 식물에 적용될 수 있다(예를 들어, WO 2008042156 및 US 20130185823에 설명된 것과 같음). 특히, 본 발명의 구현예는, WO2015089419에 설명된 바와 같이, C2c1 단백질을 코딩하는 DNA 분자(들), 가이드 RNA 및/또는 분리된 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 분자로 업로드된 또는 그로 패킹된 입자를 포함한다.
식물 세포에 CRISPR-C2c1 시스템의 하나 이상의 성분을 도입하는 추가적인 수단은 세포 침투성 펩티드 (CPP)를 이용하는 것에 의한다. 따라서, 특히 본 발명에서 구현예는 C2c1 단백질에 연결된 세포 침투 펩티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, C2c1 단백질 및/또는 가이드 RNA는 식물 원형질체 내부로 그들을 효과적으로 수송하기 위해 하나 이상의 CPP와 커플링되며, 또한 다음의 문헌을 참조한다: Ramakrishna (20140 Genome Res. 2014 Jun; 24(6):1020-7 for Cas9 in human cells). 다른 구현예에서, C2c1 유전자 및/또는 가이드 RNA는 식물 원형질체 전달을 위한 하나 이상의 CPP에 커플링되는 하나 이상의 원형 또는 비원형 DNA 분자(들)에 의해 코딩된다. 식물 원형질체는 이후 식물 세포로, 그리고 추가로 식물에 재생된다. CPP는, 단백질로부터 유도된 또는 수용체 독립적인 방식으로 세포막을 지나 생물분자를 운송할 수 있는 키메라 서열로부터 유도된 어느 하나인, 일반적으로 35 개 미만의 아미노산의 짧은 펩티드로서 설명된다. CPP는 양이온성 펩티드, 소수성 서열을 갖는 펩티드, 양극성 펩티드, 프롤린-풍부 및 항-미생물 서열을 갖는 펩티드, 및 키메라 또는 이분 펩티드일 수 있다 (Pooga and Langel 2005). CPP는 생물학적 막에 침투할 수 있고, 이렇게 해서, 세포막을 가로질러서 세포질 내로 다양한 생체분자의 이동을 촉발시키고, 그들의 세포내 경로를 개선시켜서, 생체분자와 표적과의 상호작용을 용이하게 한다. CPP의 예는 특히 하기를 포함한다: HIV 타입 1 에 의한 바이러스 복제에 필요한 핵 전사 활성화제 단백질인 Tat, 페네트라틴, 카포시 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 신호 펩티드 서열, 인테그린 β3 신호 펩티드 서열; 폴리아르기닌 펩티드 Args 서열, 구아닌 풍부-분자 수송체, 스위트 화살표 펩티드 등.
유전자 변형된 비유전자이식 식물의 제조를 위한 CRISPR-C2c1 시스템의 용도
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 식물 게놈에서 외래 DNA의 존재를 피하기 위해 CRISPR 성분을 코딩하는 것을 포함하는, 임의의 외래 유전자의 식물 게놈 내로의 영구한 도입 없이 내생성 유전자를 변형시키거나 또는 그들의 발현을 변형시키기 위해 사용된다. 이것은 비유전자이식 식물에 대한 조절 요건이 덜 엄격하기 때문에 흥미로울 수 있다.
특정 구현예에서, 이는 C2c1 CRISPR 성분의 일시적 발현에 의해 보장된다. 특정 구현예에서 하나 이상의 CRISPR 성분은, 본 명세서에서 설명된 방법에 따른 관심 유전자의 변형을 일관되고 꾸준히 보장하기에 충분한 C2c1 단백질 및 가이드 RNA를 생산하는 하나 이상의 바이러스 벡터 상에서 발현된다.
특정 구현예에서, C2c1 CRISPR 구성체의 일시 발현은 식물 원형질체 내에서 보장되며, 이에 따라 게놈 내로 통합되지는 않는다. 제한된 발현 창은 CRISPR-C2c1 시스템이 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 유전자의 변형을 보장하도록 하기에 충분할 수 있다.
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템의 상이한 성분은 별개로 또는 혼합물로, 본 명세서에서 상기 기재한 바와 같은 입자 또는 CPP 분자와 같은 미립자 전달 분자의 도움에 의해, 식물 세포, 원형질체 또는 식물 조직에 도입된다.
C2c1 CRISPR 성분의 발현은, C2c1 뉴클레아제 및 선택적으로 주형 DNA의 도입의 직접 활성에 의해 또는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템을 이용하여 표적된 유전자의 변형 중 어느 하나에 의해 게놈의 표적된 변형을 유도할 수 있다. 본 명세서에 상기 설명된 상이한 전략은, C2c1 CRISPR 성분의 식물 게놈 내로의 도입을 필요로 하지 않으면서 C2c1-매개된 표적된 게놈 편집을 가능하게 한다. 식물 세포 내로 일시적으로 도입된 성분은 전형적으로 교배 시 제거된다.
식물 게놈-선별 마커에서의 변형 검출
특정 구현예에서, 방법이 식물 게놈의 내생성 표적 유전자의 변형을 수반하는 경우, 식물, 식물 일부 또는 식물 세포가 CRISPR-C2c1 시스템으로 감염 또는 트랜스펙션된 후, 유전자 표적화 또는 표적된 돌연변이 유발이 표적 부위에서 발생했는지의 여부를 확인하는 임의의 적합한 방법이 사용된다. 방법이 이식유전자의 도입을 수반하는 경우, 형질전환된 식물 세포, 캘러스(callus), 조직 또는 식물은, 이식유전자의 존재에 대해 또는 이식유전자에 의해 코딩된 형질에 대해 조작된 식물 재료를 선택 또는 스크리닝함으로써 확인 및 분리될 수 있다. 물리적 및 생화학적 방법을, 삽입된 유전자 구성체 또는 내생성 DNA 변형을 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체를 확인하는데 사용할 수 있다. 이들 방법은 제한없이, 1) 재조합 DNA 삽입물 또는 변형된 내생성 유전자의 구조를 검출 및 결정하기 위한 써던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구성체의 RNA 전사물을 검출 및 조사하기 위한 노던 블롯, S1 Rnase 보호, 프라이머-연장 또는 역전하효소-PCR 증폭; 3) 효소 또는 리보자임 활성 검출을 위한 효소 어세이로서, 이러한 유전자 산물은 유전자 구성체에 의해 코딩되거나 또는 발현은 유전자 변형에 의해 영향받는 것인, 검출; 4) 유전자 구성체 또는 내생성 유전자 산물이 단백질인 경우, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전, 또는 효소-연결 면역어세이를 포함한다. 추가의 기술, 예컨대 현장 하이브리드화, 효소 염색, 및 면역염색 또한 재조합 구성체의 발현이 존재 또는 발현을 검출 또는 특정 식물 기관 및 조직 내 내생성 유전자의 변형을 검출하는데 사용될 수 있다. 이들 모든 분석의 실시 방법은 당업자에게 공지이다.
추가적으로(또는 대안적으로), C2c1 CRISPR 성분을 코딩하는 발현 시스템은, 초기 단계에서 및 대규모에서, CRISPR-C2c1 시스템을 함유 및/또는 그에 의해 변형된 세포를 분리 또는 효율적으로 선택하는 수단을 제공하는, 통상적으로 하나 이상의 선택가능한 또는 검출가능한 마커를 포함하도록 설계된다.
아그로박테리움-매개된 형질전환의 경우, 마커 카세트는 측부배치되는 T-DNA 경계들에 인접하거나 그 사이에 있을 수 있으며, 바이너리 벡터 내에 함유될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 마커 카세트는 T-DNA의 외부에 있을 수 있다. 선별 마커 카세트는 발현 카세트로서 동일한 T-DNA 경계 내에 또는 그에 인접할 수 있거나, 바이너리 벡터 상의 제2 T-DNA 내 어느 부분엔가 있을 수 있다(예를 들어, 2 T-DNA 시스템).
유전자 총법의 경우 또는 원형질체 형질전환과 함께, 발현 시스템은 하나 이상의 분리된 선형 단편을 포함할 수 있거나, 세균 복제 요소, 세균 선별 마커 또는 다른 검출가능한 요소를 함유할 수 있는 더욱 큰 구성체의 일부일 수 있다. 가이드 및/또는 C2c1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 카세트(들)은 마커 카세트에 물리적으로 연결될 수 있거나, 마커 카세트를 코딩하는 제2 핵산 분자와 함께 혼합될 수 있다. 마커 카세트는 형질전환된 세포의 효율적인 선발을 가능하게 하는 검출가능한 또는 선별 마커를 발현하는데 필수적인 요소들로 구성된다.
선별 마커에 기초한 세포에 대한 선택 절차는 마커 유전자의 성질에 따라 달라질 것이다. 특정 구현예에서, 선별 마커, 즉 마커의 발현을 기초로 한 세포의 직접 선택을 가능하게 하는 마커가 이용된다. 선별 마커는 양성 또는 음성 선택을 부여할 수 있으며, 외부 기재의 존재에 대해 조건적 또는 비-조건적이다(Miki et al. 2004, 107(3): 193-232). 가장 흔하게는, 항생제 또는 제초제 저항성 유전자가 마커로서 사용되며, 이로 인해 선택은 마커 유전자가 그에 대한 저항성을 부여하는 항생제 또는 제초제의 억제량을 함유하는 매질 상에서 조작된 식물 재료를 성장시킴으로서 수행된다. 그러한 유전자의 예로는, 하이그로마이신(hpt) 및 카나마이신(nptII)와 같은 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자, 및 포스피노트리신(bar) 및 클로로설푸론(als)과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자이다.
형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한 가시성 마커, 통상적으로 착색된 기재 (예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, B 또는 C1 유전자)를 가공할 수 있는 효소의 활성을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 그러한 선택 및 스크리닝 방법은 당업자에게 공지이다.
식물 배양 및 재생
특정 구현예에서, 변형된 게놈을 갖고 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 생성되거나 또는 얻어지는 식물 세포는 형질전환되거나 또는 변형된 유전자형을 갖는 전체 식물 및 그에 따라 목적하는 표현형을 재생하기 위해 배양될 수 있다. 통상적인 재생 기법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 재생 기법의 특정 예는 조직 배양 성장 배지에서 소정의 식물 호르몬의 조작에 의존하며, 전형적으로 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 항생제 및/또는 제초제 마커에 의존한다. 추가의 특정 구현예에서, 식물 재생은 배양된 원형질체, 식물 캘러스, 외식편(explant), 기관, 화분, 배아, 또는 그의 일부로부터 수득된다 (참조: 예를 들어, (Evans et al. (1983), Handbook of Plant Cell Culture, Klee et al (1987) Ann. Rev. of Plant Phys.).
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 형질전환되거나 또는 개선된 식물은 본 발명의 동형접합적 개선 식물 (DNA 변형에 대해 동형접합적)에 대한 종자를 제공하도록 자가수분되거나 또는 이형접합적 식물에 대한 종자를 제공하도록 비유전자이식 식물 또는 상이한 개선 식물과 교배될 수 있다. 재조합 DNA가 식물 세포 내로 도입되는 경우에, 이러한 교배로 얻어진 식물은 재조합 DNA 분자에 이형접합적인 식물이다. 개선된 식물로부터의 교배 그리고 유전자 변형의 포함 (재조합 DNA일 수 있음)에 의해 얻어지는 이러한 동형접합적 식물과 이형접합적 식물은 둘 모두 본 명세서에서 "자손" 로서으로서 지칭된다. 자손 식물은 본래의 유전자이식 식물로부터의 자손이 되고 본 명세서에 제공된 방법에 의해 도입되는 게놈 변형 또는 재조합 DNA 분자를 함유하는 식물이다. 대안적으로, 유전적으로 변형된 식물은 Cpf1 효소를 이용하여 앞서 설명된 방법들 중 하나에 의해 수득될 수 있으며, 이에 의해 외래의 DNA가 게놈 내로 통합되지 않는다. 추가적인 육종에 의해 얻어지는 이러한 식물의 자손은 또한 유전자 변형을 함유할 수 있다.. 육종은 상이한 작물에 대해 통상적으로 사용되는 임의의 육종 방법에 의해 수행된다 (예를 들어, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 5098 (1960)).
증강된 작물학적 형질을 갖는 식물의 생성
본 명세서에 제공된 C2c1 기반 CRISPR 시스템은, 표적된 이중-가닥 또는 단일-가닥 파손을 도입 및/또는 유전자 활성화제 및/또는 억제제 시스템을 도입하는데 사용될 수 있고, 제한없이 유전자 표적화, 유전자 대체, 표적된 돌연변이유발, 표적된 결실 또는 삽입, 표적된 역전 및/또는 표적된 전위에 사용될 수 있다. 단일 세포에서 다중 변형을 달성하도록 지시된 다중 표적화 RNA의 공동발현에 의해, 다중복합 게놈 변형이 보장될 수 있다. 이 기술은 증강된 영양 품질, 질환에 대해 증가된 내성 및 항생제 및 비항생제 스트레스에 대한 내성, 및 상업적으로 가치있는 식물 제품 또는 이종성 화합물의 증가된 생산을 비롯한 개선된 형질을 갖는 식물의 높은 정확도 조작에 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 내생성 DNA 서열에서 표적된 이중-가닥 파손(DSB)을 도입하는데 사용된다. DSB는 세포 DNA 복구 경로를 활성화하고, 이는 파손 부위 가까이에서 바람직한 DNA 서열을 달성하도록 매일 수 있다. 내생성 유전자의 비활성화가 바람직한 형질을 부여 또는 그에 기여할 수 있는 경우 이는 유익하다. 특정 구현예에서, 주형 서열을 갖는 상동성 재조합은 관심 유전자를 도입하기 위하여, DSB의 부위에서 촉진된다. 일부 구현예에서, HR-독립적 재조합은 스태거드 DSB에서 관심 서열 또는 유전자를 도입시키기 위해서 DSB의 부위에서 촉진된다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 스태거드 DSB를 생성시킨다. 일정한 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가이드 서열에 삽입 주형 서열을 포함하고 스태거드 DSB에 특이적 DNA 삽입을 도입시킨다.
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은, 내생성 식물 유전자의 활성화 및/또는 억제를 위한 작용 도메인에 융합 또는 그에 작동적으로 연결되는, 일반적인 핵산 결합 단백질로서 사용될 수 있다. 예시적인 기능성 도메인은 제한없이 RNA 또는 DNA 디아미나제, 번역 개시인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 뉴클레아제, 특히 리보뉴클레아제, 스플라이시오솜, 비드, 광 유도성/제어성 도메인 또는 화학 유도성/제어성 도메인을 포함할 수 있다. 통상적으로 이들 구현예에서, C2c1 단백질은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하여, 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 C2c1 단백질의 5% 이하의 활성을 갖게 하고, 가이드 RNA는 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법은 일반적으로 그들이 야생형 식물에 비교되는 하나 이상의 바람직한 형질을 갖는다는 점에서 "개선된 식물" 의 생성을 초래한다. 특정 구현예에서, 얻어진 식물, 식물 세포 또는 식물 부분은 식물 세포의 모두 또는 일부에 혼입된 외생성 DNA 서열을 포함하는 유전자이식 식물이다. 특정 구현예에서, 비-유전자이식 유전자 변형 식물, 식물 일부 또는 세포가 얻어지며, 즉, 외생성 DNA 서열은 식물의 식물 세포 중 어느 것의 게놈에 혼입된다. 이러한 구현예에서, 개선된 식물은 비-유전자이식이다. 내생성 유전자의 변형만이 보장되고, 외래 유전자는 식물 게놈에서 도입 또는 유지되지 않는 경우에, 얻어진 유전자 변형된 작물은 외래 유전자를 함유하지 않으며, 따라서 기본적으로 비유전자이식으로 간주될 수 있다. 식물 게놈 편집을 위한 CRISPR-C2c1 시스템의 상이한 응용이 하기에서 더욱 상세하게 설명된다:
농업적 관심 형질을 부여하는 하나 이상의 외래 유전자의 도입
본 발명은 게놈 편집 또는 관심의 표적 유전자좌에서 또는 그에 연관된 서열을 변형하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 C2c1 이펙터 단백질 복합체를 식물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이로 인해 C2c1 이펙터 단백질 복합체는 효과적으로 작용하여, 예를 들어 외래 관심 유전자를 코딩하는, DNA 삽입물을 식물 세포의 게놈 내로 통합시킨다. 일부 구현예에서, DNA 삽입물의 통합은 외생적으로 도입된 DNA 주형 또는 복구 주형을 갖는 HR에 의해 촉진된다. 일부 바람직한 구현예에서, DNA 삽입물의 통합은 HR-독립적 통합 (예를 들어, NHEJ)에 의해 촉진된다. 통상적으로 외생적으로 도입된 DNA 주형 또는 복구 주형은, C2c1 이펙터 단백질 복합체 또는 일 성분 또는 복합체의 성분의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 벡터와 함께 전달된다.
본 명세서에서 제공된 CRISPR-C2c1 시스템은 표적화된 유전자 전달을 가능하게 한다. 관심 유전자 발현의 효율은 게놈 내로의 통합의 위치에 의해 큰 정도로 결정된다는 것이 더욱 명백하게 되었다. 본 방법은 외래 유전자의 게놈 내 바람직한 위치로의 표적된 통합을 가능하게 한다. 위치는 이전에 생성된 이벤트의 정보에 기초하여 선택될 수 있거나, 본 명세서에 어느 부분에서 개시된 방법에 의해 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 (a) 직접 반복부 및 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 C2c1 CRISPR 복합체를 세포에 도입시키는 단계로서, 가이드 서열은 식물 세포에 내생성인 표적 서열에 하이브리드화하는 것인 단계; (b) 가이드 서열이 표적 서열과 하이브리드화하고 가이드 서열이 표적화되는 서열 또는 그 근처에 이중 가닥 파손을 유도할 때 가이드 RNA와 복합체 형성하는 C2c1 이펙터 분자를 식물 세포에 도입시키는 단계; 및 (c) 관심 유전자를 코딩하고 HDR의 결과로서 DS 파손의 위치로 도입되는 HDR 복구 주형을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 세포에 도입시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 도입 단계는 C2c1 이펙터 단백질, 가이드 RNA 및 복구 주형을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 식물 세포로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 바이러스 (예를 들어, 제미니바이러스) 또는 RNA 바이러스 (예를 들어, 토브라바이러스)에 의해 세포 내로 전달된다. 특정 구현예에서, 도입 단계는 복구 주형, 가이드 RNA 및 C2c1 이펙터 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 T-DNA를 식물 세포로 전달하는 것을 포함하며, 여기서 전달은 아그로박테리움을 통한 것이다. C2c1 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 프로모터, 예컨대 구조적 프로모터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터) 또는 세포 특이적 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 미세투사 유전자 총에 의해 도입된다. 특정 구현예에서, 본 방법은 도입 단계 후, 본 방법은 복구 주형, 즉 관심 유전자가 도입되었는지의 여부를 결정하기 위하여, 식물 세포를 스크리닝하는 것을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 방법은 유전적으로 요망되는 식물 계통을 얻기 위해 식물을 교배육종시키는 단계를 포함한다. 관심 형질을 코딩하는 외래 유전자의 예가 하기 열거된다.
농업적 관심 형질 부여하는 내생성 유전자의 편집
본 발명은 게놈 편집 또는 관심의 표적 유전자좌에서 또는 그에 연관된 서열을 변형하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 C2c1 이펙터 단백질 복합체를 식물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 이로 인해 C2c1 복합체는 식물의 내생성 유전자의 발현을 변형시킨다. 이는 상이한 방식으로 전달될 수 있으며, 특정 구현예에서, 내생성 유전자의 발현의 제거가 바람직하고, 유전자 발현을 변형시키기 위하여 C2c1 CRISPR 복합체는 내생성 유전자를 표적화하고 절단하는데 사용된다. 이들 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 (a) 직접 반복부 및 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 C2c1 CRISPR 복합체를 세포에 도입시키는 단계로서, 가이드 서열은 식물 세포의 게놈의 관심 유전자 내 표적 서열에 하이브리드화하는 것인 단계; (b) 표적 서열에 하이브리드화하는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA에 결합 시, 가이드 서열이 표적화되는 서열 또는 그 근처에 이중 가닥 파손을 보장하는 C2c1 이펙터 단백질을 세포에 도입시키는 단계를 포함하고; 특정 구현예에서, 도입 단계는 C2c1 이펙터 단백질 및 가이드 RNA를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 식물 세포에 전달하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 바이러스 (예를 들어, 제미니바이러스) 또는 RNA 바이러스 (예를 들어, 토브라바이러스)에 의해 세포 내로 전달된다. 특정 구현예에서, 도입 단계는 가이드 RNA 및 C2c1 이펙터 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 T-DNA를 식물 세포로 전달하는 것을 포함하며, 여기서 전달은 아그로박테리움을 통한 것이다. CRISPR-C2c1 시스템의 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터, 예컨대, 항상성 프로모터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터), 또는 세포 특이적 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 미세투사 유전자 총에 의해 도입된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 관심 대상 유전자의 발현이 변형되었는지의 여부를 결정하기 위한 단계들을 도입한 후에 식물 세포를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 방법은 유전적으로 요망되는 식물 계통을 얻기 위해 식물을 교배육종시키는 단계를 포함한다.
상기 기재된 방법의 특정 구현예에서, 질환 감수성 유전자 또는 식물 방어 유전자의 조절자를 코딩하는 유전자(예를 들어, Mlo 유전자)의 표적화된 돌연변이에 의해 질환 내성 작물이 얻어진다. 특정 구현예에서, 아세토락테이트 신타제(ALS) 및 프로토포르피리노겐 옥시다제(PPO)를 코딩하는 것과 같은 식물 유전자에서 특정 뉴클레오티드의 표적화된 치환에 의해 제초제-내성 작물이 생성된다. 특정 구현예에서, 항생제 스트레스 내성의 음성 조절자를 코딩하는 유전자의 표적화된 돌연변이에 의한 가뭄 및 염 내성 작물, Waxy 유전자의 표적화된 돌연변이에 의한 저 아밀로스 곡물, 벼 또는 호분층에서의 주요 리파제 유전자의 표적화된 돌연변이에 의해 산패가 감소된 다른 곡물 등. 특정 구현예에서. 관심 특성을 코딩하는 내생성 유전자의 보다 광범위한 목록이 하기에 열거된다.
농업적 관심 특성을 부여하는 CRISPR-C2c1 시스템에 의한 내생성 유전자의 조절
본 명세서는 또한, 본 명세서에서 제공된 C2c1 단백질을 이용하여 내생성 유전자 발현을 조절(즉, 활성화 또는 억제)하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 C2c1 복합체에 의해 식물 게놈으로 표적되는 구별된 RNA 서열(들)을 이용한다. 더욱 특히, 별개 RNA 서열(들)은 둘 이상의 어댑터 단백질(예를 들어, 압타머)에 결합하고, 이에 의해 각각의 어댑터 단백질은 하나 이상의 작용 도메인과 회합되고, 어댑터 단백질과 회합된 하나 이상의 기능성 도메인 중 적어도 하나는 디아미나제 활성, 메틸라제 활성, 디메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, DNA 통합 활성 RNA 절단 활성, DNA 절단 활성 또는 핵산 결합 활성을 포함하는 하나 이상의 활성을 가지고; 기능성 도메인은 바람직한 특성을 수득하도록 내생성 식물 유전자의 발현을 조절하는데 사용된다. 통상적으로, 이들 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 가져서, 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않는 C2c1 이펙터 단백질의 뉴클레아제 활성의 5% 미만을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 (a) tracr RNA, 직접 반복부 및 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 C2c1 CRISPR 복합체를 세포에 도입시키는 단계로서, 가이드 서열은 식물 세포에 내생성인 표적 서열에 하이브리드화하는 것인 단계; (b) 가이드 서열이 표적 서열과 하이브리드화할 때 가이드 RNA와 복합체를 형성하는 C2c1 이펙터 분자를 식물 세포에 도입시키는 단계를 포함하고, 가이드 RNA는 기능성 도메인에 결합하는 별개 RNA 서열 (압타머)를 포함하도록 변형되고/되거나 C2c1 이펙터 단백질은 기능성 도메인에 연결되게 변형된다. 특정 구현예에서, 도입 단계는 (변형된) 가이드 RNA 및 (변형된) C2c1 이펙터 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 식물 세포로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 이들 방법에서의 이용을 위한 CRISPR-C2c1 시스템의 성분의 상세한 내용은 본 명세서 어느 부분에서 설명되어 있다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA 바이러스 (예를 들어, 제미니바이러스) 또는 RNA 바이러스 (예를 들어, 토브라바이러스)에 의해 세포 내로 전달된다. 특정 구현예에서, 도입 단계는 가이드 RNA 및 C2c1 이펙터 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 T-DNA를 식물 세포로 전달하는 것을 포함하며, 여기서 전달은 아그로박테리움을 통한 것이다. CRISPR-C2c1 시스템의 하나 이상의 성분을 코딩하는 핵산 서열은 프로모터, 예컨대 구조적 프로모터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터) 또는 세포 특이적 또는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 미세투사 유전자 총에 의해 도입된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 관심 대상 유전자의 발현이 변형되었는지의 여부를 결정하기 위한 단계들을 도입한 후에 식물 세포를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 식물 세포로부터 식물을 재생시키는 단계를 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 방법은 유전적으로 요망되는 식물 계통을 얻기 위해 식물을 교배육종시키는 단계를 포함한다. 관심 특성을 코딩하는 내생성 유전자의 보다 광범위한 목록이 하기에 열거된다.
배수체 식물을 변형하기 위한 C2c1의 용도
다수의 식물은 배수체인데, 이는 그들이 게놈 복제물의 2배 (때때로 밀에서와 같이 6배만큼)를 운반한다는 것을 의미한다. C2c1 CRISPR 이펙터 단백질을 이용하는, 본 발명에 따른 방법은 "다중화된" 것이어서 유전자의 모든 카피에 영향을 미치거나 수십 개의 유전자를 한번에 표적할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 질환에 대해 방어를 억제하는 것을 초래하는 상이한 유전자에서 기능 상실 돌연변이를 동시에 보장하기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 밀 식물이 백분병균에 내성이라는 것을 보장하기 위해 밀 식물 세포에서 TaMLO-Al, TaMLO-Bl 및 TaMLO-Dl 핵산 서열의 발현을 동시에 억제하고 이로부터 밀 식물을 재생하는 데 사용된다 (또한 WO2015109752 참조).
작물학적 형질을 부여하는 예시적인 유전자
본 명세서에서 상기 설명된 것과 같이 특정 구현예에서, 본 발명은, 하나 이상의 식물 발현성 유전자(들)을 포함하는 관심 DNA의 삽입을 위해 본 명세서에서 설명된 것과 같은 CRISPR-C2c1 시스템의 이용을 포괄한다. 추가의 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 바와 같은 C2c1 시스템을 하나 이상의 식물 발현된 유전자(들)의 부분적 또는 완전한 결실을 위해 사용하는 도구 및 방법을 포함한다. 다른 추가의 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이, 치환, 삽입에 의해 하나 이상의 식물 발현된 유전자들의 변형을 보장하기 위하여 본 명세서에서 설명된 바와 같은 C2c1 시스템을 사용하는 도구 및 방법을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 식물 발현된 유전자의 발현을 유도하는 하나 이상의 조절 엘리먼트의 특정 변형에 의해 하나 이상의 상기 유전자의 발현의 변형을 보장하기 위하여 본 명세서에서 설명된 것과 같은 CRISPR-C2c1 시스템의 이용을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 외생성 유전자 및/또는 내생성 유전자의 표적화 및 예컨대 하기 열거되는 이들의 조절 엘리먼트의 도입을 수반하는 방법을 포함한다:
1. 해충 또는 질환에 내성을 부여하는 유전자:
식물 질환 내성 유전자. 식물은 특정 병원성 균주에 대해 내성이 있는 식물을 조작하기 위해 클로닝된 내성 유전자로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jones et al., Science 266:789 (1994)](클라도스포륨 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 내성을 위한 토마토 Cf-9 유전자의 클로닝); 문헌 [Martin et al., Science 262:1432 (1993)](슈도모나스 시링가에 (Pseudomonas syringae) pv에 대한 내성을 위한 토마토 Pto 유전자. 토마토는 단백질 키나제를 코딩함); 문헌 [Mindrinos et al., Cell 78:1089 (1994)](아라비돕스는 슈도모나스 시링가에 대한 내성을 위한 RSP2 유전자일 수 있음). 병원균 감염 동안 상향 또는 하향 조절되는 식물 유전자는 병원균 내성을 위해 조작될 수 있다. 참조: 예를 들어, Thomazella et al., bioRxiv 064824; doi: doi.org/10.1101/064824 Epub. July 23, 2016 (병원체 감염 동안 정상적으로 상향조절되는 SIDMR6-1에 결실을 갖는 토마토 식물).
해충, 예컨대, 대두 시스트 선충에 대한 내성을 부여하는 유전자. 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 96/30517; 국제 특허 출원 WO 93/19181 참조.
바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 단백질, 예를 들어, 문헌 [Geiser et al., Gene 48:109 (1986)]을 참조한다.
렉틴, 예를 들어, Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994. 참조.
비타민-결합 단백질, 예컨대, 아비딘, 국제 특허 출원 US93/06487을 참조하고, 해충에 대한 살유충제로서 아비딘 및 아비딘 상동체의 용도를 교시한다.
효소 억제제, 예컨대, 프로테아제 또는 프로테이나제 억제제 또는 아밀라제 억제제. 참조, 예를 들어 Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987), Huub et al., Plant Molec. Biol. 21:985 (1993)), Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993) 및 US 특허 번호 5,494,813.
곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예컨대, 에크디스테로이드 또는 유약 호르몬, 이의 변이체, 이에 기반한 모방체 또는 이들의 길항제 또는 효현제. 예를 들어, 문헌[Hammock et al., Nature 344:458 (1990)] 참조.
발현 시 영향받는 해충의 생리를 붕괴시키는 곤충-특이적 펩티드 또는 신경펩티드. 예를 들어, Regan, J. Biol. Chem. 269:9 (1994) 및 Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (1989). 또한, 미국 특허 번호 5,266,317을 참조한다.
뱀, 말벌 또는 임의의 다른 유기체에 의해 자연에서 생성되는 곤충-특이적 독. 예를 들어, [Pang et al., Gene 116: 165 (1992)]를 참조한다.
모노터펜, 세스퀴터펜, 스테로이드, 하이드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살충 활성을 갖는 다른 비단백질 분자의 과축적을 초래하는 효소.
생물학적 활성 분자; 예를 들어, 천연 또는 합성이건, 해당 효소, 단백질 분해 효소, 지방분해 효소, 뉴클레아제, 사이클라제, 트랜스아미나제, 에스터라제, 가수분해효소, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 중합효소, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제의 번역후 변형을 포함하는, 변형에 관여되는 효소. 국제 특허 출원 WO93/02197, 문헌[Kramer et al., Insect Biochem.. Biol. 23:691(1993)] 및 [Kawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21 :673 (1993)]을 참조한다.
신호 전달을 자극하는 분자. 예를 들어, 문헌 [Lamb et al.,. Biol.:757 (1994)] 및 [Toubart et al., Plant J.:1467 (1994)]을 참조한다.
바이러스-침입성 단백질 또는 그로부터 유도된 복합 독소. 문헌[Beachy et al., Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (1990)을 참조한다.
병원균 또는 기생충에 의해 자연에서 생성된 발생-저지 단백질. 문헌 [Lamb et al., Bio/Technology 10:1436 (1992)] 및 [Toubart et al., Plant J. 2:367 (1992)]을 참조한다.
식물에 의해 자연계에서 생성되는 발생-저지 단백질. 예를 들어, 문헌 [Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992)]을 참조한다.
식물에서, 병원균은 종종 숙주-특이적이다. 예를 들어, 일부 푸사리움 종은 토마토 시들음을 야기할 것이지만, 토마토만을 공격하고, 다른 푸사리움 종은 밀만을 공격한다. 식물은 대부분의 병원균에 저항하는 기존의 유도된 방어성을 갖는다. 식물 생성에 걸친 돌연변이 및 재조합 사건은 감수성을 일으키는 유전자 가변성을 야기하는데, 특히 병원균이 식물보다 더 빈번하게 재생되기 때문이다. 식물에서, 비숙주 내성일 수 있고, 예를 들어, 숙주 및 병원균은 비적합하거나 또는 전형적으로 다수의 유전자에 의해 제어되는 모든 품종의 병원균에 대해 부분적 내성일 수 있고/있거나 일부 품종의 병원균에 대해서는 완전한 내성이지만 다른 품종에 대해서는 그렇지 않을 수 있다. 이러한 내성은 전형적으로 소수의 유전자에 의해 제어된다. CRISP-C2c1 시스템의 성분 및 방법을 이용하여, 새로운 도구가 이제 존재하여 여기서 예측되는 특정 돌연변이를 유도한다. 따라서, 내성 유전자의 공급원 게놈을 분석할 수 있고, 목적하는 특징 또는 형질을 갖는 식물에서, 내성 유전자 상승을 유도하기 위해 CRISPR-C2c1 시스템의 방법 및 성분을 사용할 수 있다. 본 시스템은 이전의 돌연변이유발제보다 더 정확성을 가질 수 있고, 따라서 식물 육종 프로그램을 가속화시키고 개선시킨다.
2. 식물 질환 관여 유전자
식물 질환 관여 유전자 식물은 특이적 병원체 균주에 내성인 식물을 조작하기 위해 질환 감수성 또는 관련 유전자를 변형시키는 CRISPR-C2c1 시스템으로 형질전환될 수 있다. 예를 들어, 추정 당 수송체를 코딩하는 식물 SWEET 유전자는 벼-병원성 잔토모나스 오리자에 (Xanthomonas oryzae) 유래의 TAL 이펙터에 의해 유도되어서, 병원체 감염의 증강된 확산을 초래하는 것으로 알려져 있다. 참조: Streubel et al, New Phytologist, 2013 Nov;200(3):808-19. doi: 10.1111/nph.12411. Epub 2013 Jul 24. 시트러스의 CsLOB는 시트러스 질환, 예컨대 시트러스 동고병에 관여하는 TAL 이펙터에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 또한 임의의 본 명세서에 기술된 조작된 CRISPR 효소 (예를 들어, 조작된 Cas 이펙터 모듈), 조성물, 또는 임의의 본 명세서에 기술된 시스템 또는 벡터 시스템과 식물 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 관심 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하거나, 또는 세포는 세포 내에 존재하는 임의의 본 명세서에 기술된 CRISPR 복합체를 포함한다. 일정 구현예에서, 식물 세포는 A/T 풍부 게놈을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 게놈은 T-풍부 PAM을 포함한다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTN-3' 또는 5'-ATTN-3' 이다. 특정 구현예에서, 변형된 유전자좌는 식물 질환과 관련된다. 특정 구현예에서, 식물 질환은 병원체 감수성과 관련된다. 특정 구현예에서, 변형된 유전자좌는 SWEET 유전자좌 또는 CsLOB 유전자좌를 포함한다. 특정 구현예에서, 식물 질환은 시트러스 동고병 또는 벼 병충해 질환이다. 일부 구현예에서, 세포 게놈은 T-풍부 PAM을 포함한다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTN-3' 또는 5'-ATTN-3' 이다. 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas 시스템은 CRISPR- C2c1 시스템이다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부를 도입시켜 C2c1 이펙터 단백질에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 단일 뉴클레오티드 결실 또는 돌연변이에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 50 nt 미만의 결실 또는 돌연변이에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR로 CRISPR-C2c1 시스템을 도입하여 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ로 CRISPR-C2c1 시스템을 도입하여 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템을 도입한 후, HDR에 의해 복구하여, 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR로 5' 오버행에서 CRISPR-C2c1 시스템을 도입하여 외생성 Dna 서열의 삽입에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR로 5' 오버행에서 CRISPR-C2c1 시스템을 도입하여 외생성 Dna 서열의 삽입에 의해 변형된다.
식물 질환에 관여하는 유전자, 예컨대 WO 2013046247에 열거된 것들:
벼 병해: 마그나포르테 그리세아 (Magnaporthe grisea), 코클리오볼루스 미야베아누스 (Cochliobolus miyabeanus), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani) 및 지베렐라 푸지쿠로이 (Gibberella fujikuroi); 밀의 병해: 에리시페 그라미니스 (Erysiphe graminis), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸사리움 아베나세움 (F. avenaceum), 푸사리움 쿨모룸 (F. culmorum), 마이크로도키움 니발레 (Microdochium nivale), 푸치니아 스트리이포르미스 (Puccinia striiformis), 푸치니아 그라미니스 (P. graminis), 푸치니아 레콘디타 (P. recondita), 마이크로넥트리엘라 니발레 (Micronectriella nivale), 티풀라 종 (Typhula sp.), 우스틸라고 트리티시 (Ustilago tritici), 틸레티아 카리에스 (Tilletia caries), 슈도세르코스포렐라 헤르포트리코이데스 (Pseudocercosporella herpotrichoides), 미코스파에렐라 그라미니콜라 (Mycosphaerella graminicola), 스타고노스포라 노도룸 (Stagonospora nodorum), 피레노포라 트리티 시레펜티스 (Pyrenophora tritici-repentis); 보리의 병해: 에리시페 그라미니스 (Erysiphe graminis), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸사리움 아베나세움 (F. avenaceum), 푸사리움 쿨모룸 (F. culmorum), 마이크로도키움 니발레 (Microdochium nivale), 푸치니아 스트리이포르미스 (Puccinia striiformis), 피. 그라미니스 (P. graminis), 피. 호르데이 (P. hordei), 우스틸라고 누다 (Ustilago nuda), 린코스포륨 세칼리스(Rhynchosporium secalis), 피레노포라 테레스(Pyrenophora teres), 코킬로볼루스 사비투스 (Cochliobolus sativus), 피레노포라 그라라미네아 (Pyrenophora graminea), 및 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani); 메이즈 병해: 우스틸라고 메이디스 (Ustilago maydis), 코킬로볼루스 헤테로스트로푸스 (Cochliobolus heterostrophus), 글로에오세르코스포라 소르기 (Gloeocercospora sorghi), 푸치니아 폴리소라 (Puccinia polysora), 세르코스포라 자에-메이디스 (Cercospora zeae-maydis), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani);
감귤 병해: 디아포르테 시트리 (Diaporthe citri), 엘시노에 파우세티 (Elsinoe fawcetti), 페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum), 피. 이탈리쿰 (P. italicum); 피토프토라 파라시티카 (Phytophthora parasitica), 피토프토라 시트로프토라 (Phytophthora citrophthora); 사과 병해: 모닐리니아 말리 (Monilinia mali), 발사 세라토스페르마 (Valsa ceratosperma), 포도스파에라 류코트리차 (Podosphaera leucotricha), 알테르나리아 알테르나타 사과 병원형 (Alternaria alternata apple pathotype), 벤투리아 이나에쿠 알리스 (Venturia inaequalis), 콜레토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum) 및 피토프토라 칵토룸 (Phytophtora cactorum);
배 병해: 벤투리아 나시콜라 (Venturia nashicola), 벤투리아 피리나 (V. pirina), 알테르나리아 알테르나타 일본 배 병원형 (Alternaria alternata Japanese pear pathotype), 짐노스포란지움 하라에아눔 (Gymnosporangium haraeanum) 및 피토프토라 칵토룸 (Phytophtora cactorum);
복숭아 병해: 모닐리니아 프룩티콜라 (Monilinia fructicola), 클라도스포리움 카르포 필룸 (Cladosporium carpophilum) 및 포몹시스 종 (Phomopsis sp.);
포도 병해: 엘시노에 암펠리나 (Elsinoe ampelina), 글로메렐라 신구라타 (Glomerella cingulata), 운시눌라 네카토르 (Uncinula necator), 파콥소라 암펠롭시디스 (Phakopsora ampelopsidis), 구이그나르디아 비드웰리이 (Guignardia bidwellii), 및 플라스모파라 비티콜라 (Plasmopara viticola);
감 병해: 글로에오스포리움 카키 (Gloeosporium kaki) 및 세르코스포라 카키 (Cercospora kaki), 미코스파에렐라 나웨 (Mycosphaerella nawae);
박 병해: 콜레토트리쿰 라제나리움 (Colletotrichum lagenarium), 스파에로테카 풀리지네아 (Sphaerotheca fuliginea), 미코스파에렐라 멜로니스 (Mycosphaerella melonis), 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 슈도페로노스포라 쿠벤시스 (Pseudoperonospora cubensis), 피토프토라 종 (Phytophthora sp.) 및 피티움 종 (Pythium sp.);
토마토 병해: 알테르나리아 솔라니 (Alternaria solani), 클라도스포리움 풀붐 (Cladosporium fulvum) 및 피토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans); 슈도모나스 시링가에 pv. 토마토; 피토프토라 카프시시 (Phytophthora capsici); 잔토모나스 (Xanthomonas)
가지 병해; 포모프시스 벡산스 (Phomopsis vexans), 에리시페 시코라세아럼 (Erysiphe cichoracearum); 겨자과 식물 병해: 알테르나리아 자포니카 (Alternaria japonica), 세르코스포렐라 브라시카에 (Cercosporella brassicae), 플라스모디오포라 브라시카에 (Plasmodiophora brassicae), 페로노스포라 파라시티카 (Peronospora parasitica);
웰시 양파 병해: 푸치니아 알리이 (Puccinia allii) 및 페로노스포라 데스트럭터 (Peronospora destructor);
대두 병해: 세르코스포라 키쿠치이 (Cercospora kikuchii), 엘시노에 글리시네스 (Elsinoe 글리신s), 디아포르테 파세오로룸 변이체 소자에 (Diaporthe phaseolorum var. sojae), 셉토리아 글리신스 (Septoria 글리신s), 세르코스포라 소지나 (Cercospora sojina), 파콥소라 파치리지 (Phakopsora pachyrhizi), 피토프토라 소자에 (Phytophthora sojae), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 코르니스포라 카시콜라 (Corynespora cassiicola), 및 스클레로니티아 스클레오티오룸 (Sclerotinia sclerotiorum);
강낭콩 병해: 콜레토트리쿰 린뎀티아눔 (Colletotrichum lindemthianum);
땅콩 병해: 세르코스포라 페르소나타 (Cercospora personata), 세르코스포라 아라키디콜라 (Cercospora arachidicola) 및 스클레로티움 롤프시 (Sclerotium rolfsii);
완두 병해: 에리시페 피시 (Erysiphe pisi);
감자 병해: 알테르나리아 솔라니 (Alternaria solani) 및 피토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans), 피토프토라 에리스로셉티카 (), 및 스폰고스포라 서브터란네안 피토프토라 종 서브터라네안 f. 종 서브터라네안 (Spongospora subterranean f. sp. Subterranean);
딸기 병해: 스파에로테카 후물리 (Sphaerotheca humuli) 및 글로메렐라 신구라타 (Glomerella cingulata);
차 병해: 엑소바시디움 레티쿨라툼 (Exobasidium reticulatum), 엘시노에 류코스필라 (Elsinoe leucospila), 페스탈로티옵시스 종 (Pestalotiopsis sp) 및 콜레토트리쿰 테아에시넨시스 (Colletotrichum theaesinensis);
담배 병해: 알테르나리아 론지페스 (Alternaria longipes), 에리시페 시초라세아룸 (Erysiphe cichoracearum), 콜레토트리쿰 타바쿰 (Colletotrichum tabacum), 페로노스포라 타바시나 (Peronospora tabacina) 및 피토프토라 니코티아나에 (Phytophthora nicotianae);
유채 병해: 스클레로티니아 스클레로티오룸 (Sclerotinia sclerotiorum), 및 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani);
면화 병해: 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani);
사탕무 병해: 세르코스포라 베티콜라 (Cercospora beticola), 타나테포루스 쿠쿠메리스 (Thanatephorus cucumeris), 타나테포루스 쿠쿠메리스 (Thanatephorus cucumeris) 및 아파니데르마툼 코클리오이데스 (Aphanidermatum cochlioides);
장미 병해: 디플로카르폰 로사에 (Diplocarpon rosae), 스파에로테카 판노사 (Sphaerotheca pannosa) 및 페로노스포라 스파르사 (Peronospora sparsa);
국화 및 국화과 병해: 브레미아 락투카에 (Bremia lactucae), 셉토리아 크리산테미-인디시 (Septoria chrysanthemi-indici) 및 푸치니아 호리아나 (Puccinia horiana);
다양한 식물의 병해: 피티움 아파니데르마툼 (Pythium aphanidermatum), 피티움 데바리아눔 (Pythium debarianum), 피티움 그라미니콜라 (Pythium graminicola), 피티움 이레굴라레 (Pythium irregulare), 및 피티움 울티뭄 (Pythium ultimum), 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 및 스클레로티니아 스클레로티오룸 (Sclerotinia sclerotiorum);
왜무 병해: 알테르나리아 브라시키콜라 (Alternaria brassicicola);
잔디 병해: 스클레로티니아 호메오카르파 (Sclerotinia homeocarpa), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani);
바나나 병해: 미코스파에렐라 피지엔시스 (Mycosphaerella fijiensis), 미코스파에렐라 무시콜라 (Mycosphaerella musicola);
해바라기 병해: 플라스모파라 할스테디 (Plasmopara halstedii);
아스퍼질러스 종, 페니실룸 종 (Penicillium spp.), 푸사리움 종, 지베렐라 종 (Gibberella spp.), 트리코더마 종, 티엘라비옵시스 종 (Thielaviopsis spp.), 리조푸스 종, 무코르 종 (Mucor spp.), 코르티시움 종 (Corticium spp.), 로마 종 (Rhoma spp.), 리족토니아 종 (Rhizoctonia spp.) 또는 디플로디아 종 (Diplodia spp.)에 의해 초래되는 다양한 식물의 초기 성장 단계에서의 병해 또는 종자 병해;
폴릭시마 종 (Polymixa spp.) 또는 올피디움 종 (Olpidium spp.) 등에 의해 매개되는 다양한 식물의 바이러스병 등.
3. 제초제 내성을 부여하는 유전자의 예 :
성장점 또는 분열조직을 저해하는 제초제에 대한 내성, 예컨대, 이미다졸리논 또는 설포닐유리아, 예를 들어, 각각 문헌[Lee et al., EMBO J. 7:1241(1988), 및 Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)].
글리포세이트 내성 (예를 들어, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 비리디크로모게네스 (Streptomyces viridichromogenes)를 비롯한 스트렙토마이세스 종으로부터의 각각 돌연변이체 5-엔올파이루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSP) 유전자, aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제(GAT) 유전자에 의해 부여되는 내성), 또는 다른 포스포노 화합물, 예컨대, 글루포시네이트 (포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT) 유전자에 대한 내성), 및 ACCase 억제제-코딩 유전자에 의한 피리딘옥시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손에 대한 내성. 참조: 예를 들어 U.S. 특허 번호 4,940,835 및 U.S. 특허 6,248,876 , U.S. 특허 번호 4,769,061 , EP 번호 0 333 033 및 U.S. 특허 번호 4,975,374. 참조: 또한 EP 번호 0242246, DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989), Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992), WO 2005012515 to Castle et. al. 및 WO 2005107437.
광합성을 억제하는 제조체에 대한 내성, 예컨대, 문헌 [Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)], 미국 특허 번호 4,810,648, 및 문헌 [Hayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992)]의 트라이아진(psbA 및 gs+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자), 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제.
제초제를 해독하는 효소 또는 저해에 내성이 있는 돌연변이체 글루타민 합성효소를 암호화하는 유전자, 예를 들어, 미국 특허 출원 제11/760,602호. 또는 해독 효소는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 효소 (예컨대, 스트렙토마이세스 종으로부터의 bar 또는 pat 단백질)이다. 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제는 예를 들어 U.S. 특허 번호 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 5,273,894; 5,637,489; 5,276,268; 5,739,082; 5,908,810 및 7,112,665에 기술된다.
히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD) 억제제, 천연 발생 HPPD 내성 유전자, 또는 WO 96/38567, WO 99/24585, 및 WO 99/24586, WO 2009/144079, WO 2002/046387, 또는 미국 특허 제6,768,044호에 기재된 바와 같은 돌연변이 또는 키메라 HPPD 효소를 코딩하는 유전자.
4. 항생제 스트레스 내성에 관여된 유전자의 예 :
WO 00/04173 또는 WO/2006/045633에 기재된 바와 같은 식물 세포 또는 식물에서의 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 유전자의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 이식유전자.
WO 2004/090140에 기재된 바와 같은, 식물 또는 식물 세포의 유전자를 코딩하는 PARG의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 이식유전자.
예를 들어, 유럽 특허 제04077624.7호, WO 2006/133827, PCT/EP07/002,433, 유럽 특허 제1999263호 또는 WO 2007/107326에 기재된 바와 같은 니코틴아미다제, 니코티네이트 포스포리보실트랜스퍼라제, 니코틴산 모노뉴클레오티드 아데닐 트랜스퍼라제, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오티드 합성효소 또는 니코틴 아마이드 포스포리보실트랜스퍼라제를 비롯한 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오티드 샐비지 합성(salvage synthesis) 경로의 식물-기능성 효소를 코딩하는 이식유전자.
탄수화물 합성에 관여되는 효소는 예를 들어 하기 문헌에 기술된 것들을 포함한다: EP 0571427, WO 95/04826, EP 0719338, WO 96/15248, WO 96/19581, WO 96/27674, WO 97/11188, WO 97/26362, WO 97/32985, WO 97/42328, WO 97/44472, WO 97/45545, WO 98/27212, WO 98/40503, WO99/58688, WO 99/58690, WO 99/58654, WO 00/08184, WO 00/08185, WO 00/08175, WO 00/28052, WO 00/77229, WO 01/12782, WO 01/12826, WO 02/1059, WO 03/071860, WO 2004/056999, WO 2005/030942, WO 2005/030941, WO 2005/095632, WO 2005/095617, WO 2005/095619, WO 2005/095618, WO 2005/123927, WO 2006/018319, WO 2006/103107, WO 2006/108702, WO 2007/009823, WO 00/22140, WO 2006/063862, WO 2006/072603, WO 02/034923, EP 06090134.5, EP 06090228.5, EP 06090227.7, EP 07090007.1, EP 07090009.7, WO 01/14569, WO 02/79410, WO 03/33540, WO 2004/078983, WO 01/19975, WO 95/26407, WO 96/34968, WO 98/20145, WO 99/12950, WO 99/66050, WO 99/53072, U.S. 특허 번호 6,734,341, WO 00/11192, WO 98/22604, WO 98/32326, WO 01/98509, WO 01/98509, WO 2005/002359, U.S. 특허 번호 5,824,790, U.S. 특허 번호 6,013,861, WO 94/04693, WO 94/09144, WO 94/11520, WO 95/35026 또는 WO 97/20936 또는 EP 0663956, WO 96/01904, WO 96/21023, WO 98/39460, 및 WO 99/24593에 개시된 바ㅣ와 같은 폴리프룩토스, 특히 인슐린 및 레반-유형의 생산에 관여하는 효소, WO 95/31553, US 2002031826, U.S. 특허 번호 6,284,479, U.S. 특허 번호 5,712,107, WO 97/47806, WO 97/47807, WO 97/47808 및 WO 00/14249에 개시된 알파-1,4-글루칸의 생산, WO 00/73422에 개시된 바와 같은, 알파-1,6 분지형 알파-1,4-글루칸의 생산, 예를 들어 WO 00/47727, WO 00/73422, EP 06077301.7, U.S. 특허 번호 5,908,975 및 EP 0728213에 개시된 바와 같은 알테르난의 생산, 예를 들어 WO 2006/032538, WO 2007/039314, WO 2007/039315, WO 2007/039316, JP 2006304779, 및 WO 2005/012529에 개시된 바와 같은 히알루로난의 생산.
가뭄 내성을 개선시키는 유전자. 예를 들어, WO 2013122472는 기능성 유비퀴틴 단백질 리가제 단백질(UPL) 단백질, 보다 특히, UPL3의 부재 또는 감소된 수준이 물에 대한 감소된 필요 또는 상기 식물의 가뭄에 대한 개선된 내성을 야기한다는 것을 개시한다. 증가된 가뭄 내성을 갖는 유전자이식 식물의 다른 예는, 예를 들어, 미국 특허 제2009/0144850호, 미국 특허 제2007/0266453호 및 WO 2002/083911에 개시되어 있다. 미국 특허 제2009/0144850호는 DR02 핵산의 변경된 발현에 기인하여 가뭄 내성 표현형을 나타낸 식물을 기재한다. 미국 특허 제2007/0266453호는 DR03 핵산의 변경된 발현에 기인하여 가뭄 내성 표현형을 나타내는 식물을 기재하고, WO 2002/083911호는 가드 세포에서 발현되는 ABC 수송체의 감소된 활성에 기인하여 가뭄 스트레스에 대해 증가된 내성을 갖는 식물을 기재한다. 다른 예는 유전자이식 식물에서 DREB1 A를 코딩하는 cDNA의 과발현이 정상 성장 조건 하에 많은 스트레스 내성 유전자의 발현을 활성화시키고 가뭄, 염 로딩 및 결빙에 대한 개선된 내성을 초래한다는 것을 기재하는 Kasuga와 그의 공저자 (1999)에 의한 작업이다. 그러나, DREB1A의 발현은 또한 정상 성장 조건 하에 몇몇 성장 지연을 초래하였다 (Kasuga (1999) Nat Biotechnol 17(3) 287291).
추가 특정 구현예에서, 작물 식물은 특정 식물 형질에 영향을 미침으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 살충제-내성 식물의 개발, 식물에서 질환 내성의 개선, 식물 곤충 및 선충 개성의 개선, 기생충 잡초에 대한 식물 내성의 개선, 식물 가뭄 내성의 개선, 식물 영양가의 개선, 식물 스트레스 내성, 자기-수분 회피, 식물 사료 소화흡수율 생물량, 곡물 수확률 등의 개선에 의함. 소수의 특정 비제한적 예를 본 명세서에서 이하에 제공한다.
단일한 유전자의 표적된 돌연변이에 추가하여, 다수의 유전자의 표적된 돌연변이, 염색체 단편의 결실, 이식유전자의 부위-특이적 통합, 생체 내 부위-유도된 돌연변이 및 식물에서 정밀 유전자 치환 또는 대립 형질 교체를 가능하게 하도록 C2c1 CrISPR 복합체가 설계될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 유전자 발견 및 확인, 돌연변이 및 동종 유전자이식(cisgenic) 육종, 및 잡종 육종에서 광범위하게 적용된다. 이들 출원은 다양한 개선된 작물학적 형질, 예컨대, 제초제 내성, 질환 내성, 항생제 스트레스 내성, 고수율 및 우수한 품질을 갖는 유전자 변형된 작물의 새로운 생성의 생산을 용이하게 한다.
웅성불임 식물의 창출을 위한 C2c1 유전자의 이용
잡종 식물은 전형적으로 근친교배 식물에 비해 유리한 작물학적 형질을 갖는다. 그러나, 자기-수분 식물에 대해, 잡종의 생성은 도전 중일 수 있다. 상이한 식물 유형에서, 식물 생식력, 보다 특히, 수컷 생식력에 중요한 유전자가 동정되었다. 예를 들어, 메이즈에서, 생식력에 중요한 둘 이상의 유전자가 확인되었다(Amitabh Mohanty International Conference on New Plant Breeding Molecular Technologies Technology Development And Regulation, Oct 9-10, 2014, Jaipur, India; Svitashev et al. Plant Physiol. 2015 Oct;169(2):931-45; Djukanovic et al. Plant J. 2013 Dec;76(5):888-99). 본 명세서에 제공된 방법은, 쉽게 교배하여 잡종을 생성할 수 있는 웅성 불임 식물을 생산하기 위하여 웅성 생식력에 요구되는 유전자를 표적화하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 CRISPR-C2c1 시스템은 사이토크롬 P450-유사 유전자 (MS26) 또는 메가뉴클레아제 유전자 (MS45)의 표적화된 돌연변이유발을 위해 사용되며, 이에 의해 메이즈 식물에 대한 웅성 불임성을 부여한다. 이렇게 해서 유전자가 변경된 메이즈 식물은 잡종 육종 프로그램에서 사용될 수 있다.
식물에서 수정 단계의 증가
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은, 벼와 같은 식물의 생식력을 연장시키는데 사용된다. 예를 들어, 벼 생식 단계 유전자, 예컨대, Ehd3은 유전자에서 돌연변이를 생성하기 위해 표적화될 수 있고, 소식물체는 연장된 재생 식물 생식 단계를 위해 선택될 수 있다 (CN 104004782에 기재된 바와 같음).
관심 작물에서 유전적 변이를 생성하기 위한 C2c1의 용도
작물 식물에서 야생 생식질 및 유전자 변형의 이용 가능성은 작물 개선 프로그램에서 중요하지만, 작물 식물로부터의 생식질에서 이용 가능한 다양성은 제한되어 있다. 본 발명은 관심 생식질에서 유전자 변형의 다양성을 생성하기 위한 방법을 계획한다. CRISPR-C2c1 시스템의 이러한 적용에서, 식물 게놈에서의 상이한 위치를 표적화하는 가이드 RNA의 라이브러리가 제공되고, 이는 C2c1 이펙터 단백질과 함께 식물 세포 내로 도입된다. 이 방법에서, 게놈-규모 점 돌연변이 및 유전자 녹아웃의 컬렉션이 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 이렇게 얻어진 세포로부터 식물 부분 또는 식물을 생성하는 단계 및 관심 형질에 대해 세포를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 표적 유전자는 코딩 영역과 넌코딩 영역을 둘 모두 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 형질은 스트레스 내성이며, 상기 방법은 스트레스-내성 작물 변종의 생성을 위한 방법이다.
과일-숙성에 영향을 미치는 C2c1의 용도
숙성은 과일 및 채소의 성숙 과정에서의 정상적 단계이다. 이를 시작하고 며칠만에 과일 또는 채소는 먹을 수 없게 된다. 이 과정은 농부와 소비자 둘 모두에게 상당한 손실을 가져온다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 에틸렌 생성을 감소시키는 데 사용된다. 이는 다음 중 하나 이상을 보장함으로써 보장된다: a. ACC 신타제 유전자 발현의 억제. ACC(1-아미노시클로프로판-1-카복실산) 신타제는 S-아데노실메티오닌(SAM)의 ACC로의 전환을 담당하는 효소이고; 에틸렌 생합성의 두번째 단계에서 마지막 단계이다. 효소 발현은 안티센스(" 거울상") 또는 신타제 유전자의 절단된 복제물이 식물 게놈에 삽입될 때 입체방해된다; b. ACC 디아미나제 유전자의 삽입. 효소를 코딩하는 유전자는 공통 비병원성 토양 박테리아인 슈도모나스 클로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis)로부터 얻어진다. 이것은 ACC를 상이한 화합물로 전환시킴으로써 에틸렌 생성에 이용 가능한 ACC의 양을 감소시킨다; c. SAM 가수분해효소 유전자의 삽입. 이 접근은 ACC 디아미나제와 유사한데, 여기서 에틸렌 생성은 이의 전구체 대사물질의 양이 감소될 때 방해되며; 이 경우에 SAM이 호모세린으로 전환된다. 효소를 코딩하는 유전자는 이. 콜라이 T3 박테리오파지로부터 얻어진다. 그리고 d. ACC 옥시다제 유전자 발현의 억제. ACC 옥시다제는 에틸렌 생합성 경로에서의 마지막 단계인 ACC의 에틸렌으로의 산화를 촉매하는 효소이다. 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여, ACC 옥시다제 유전자의 하향 조절은 에틸렌 생성의 억제를 초래하고, 이에 의해 과일 숙성을 지연시킨다. 특정 구현예에서, 상기 기재한 변형에 추가적으로 또는 대안적으로, 본 명세서에 기재된 방법은 과일에 의해 얻어지는 에틸렌 신호를 방해하기 위해 에틸렌 수용체를 변형시키는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 에틸렌 결합 단백질을 코딩하는 ETR1 유전자의 발현은 변형되며, 보다 특히, 억제된다. 특정 구현예에서, 상기 기재한 변형에 추가적으로 또는 대안적으로, 본 명세서에 기재된 방법은 식물 세포벽의 완전성을 유지하는 물질인 펙틴의 분해를 초래하는 효소인 폴리갈락투로나제 (PG)를 코딩하는 유전자의 발현을 변형시키기 위해 사용된다. 펙틴 분해는 과일의 연화를 야기하는 숙성 과정의 시작 시 일어난다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 생성된 PG 효소의 양을 감소시킴으로써 펙틴 분해를 지연시키기 위해 PG 유전자에 돌연변이를 도입하거나 또는 PG 유전자의 활성화를 억제하기 위해 사용된다.
따라서 특정 구현예에서, 상기 방법은 상기 기재한 바와 같은 식물 세포 게놈의 하나 이상의 변형을 보장하고 이로부터 식물을 재생하기 위한 CRISPR-C2c1 시스템의 용도를 포함한다. 특정 구현예에서, 식물은 토마토 식물이다.
식물 저장 수명의 증가
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 식물 또는 식물 부분의 저장 수명에 영향을 미치는 화합물의 생성에 관여되는 유전자를 변형시키기 위해 사용된다. 보다 특히, 변형은 감자 괴경에서 환원당 축적을 방지하는 유전자에서의 변형이다. 고고온 처리 시, 이들 환원당은 유리 아미노산과 반응하여 갈색의, 쓴 맛이 나는 생성물 및 잠재적 발암 물질인 아크릴아미드의 상승된 수준을 초래한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은, 수크로오스를 글루코오스와 프룩토오스로 분해시키는 단백질을 코딩하는, 액포성 인버타제 유전자 (VInv)의 발현을 감소 또는 저해시키는데 사용된다(Clasen et al. DOI: 10.1111/pbi.12370).
가치 부가 형질을 보장하기 위한 CRISPR-C2c1 시스템의 용도
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 영양적으로 개선된 농업 작물을 생산하는데 사용된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 " 기능성 식품" , 즉, 그것이 함유하는 전통적 영양소 이상으로 건강상 이득을 제공할 수 있는 변형 식품 또는 식품 성분 및 또는 " 뉴트라슈티컬 (nutraceutical)" , 즉, 식품 또는 식품의 부분으로 고려되고 질환의 예방 및 치료를 비롯한 건강상 이익을 제공할 수 있는 물질을 생산하는 데 적합하다. 특정 구현예에서, 뉴트라슈티컬은 암, 당뇨병, 심혈관 질환 및 고혈압 중 하나 이상의 예방 및/또는 치료에서 유용하다.
영양적으로 개선된 작물의 예는 하기를 포함한다 (Newell-McGloughlin, Plant Physiology, July 2008, Vol. 147, pp. 939-953):
변형된 단백질 품질, 함량 및/또는 아미노산 조성이 예컨대 바히아그라스(Bahiagrass) (문헌 [Luciani et al. 2005, Florida Genetics Conference Poster]), 카놀라 (Roesler et al., 1997, Plant Physiol 113 75?81), 메이즈 (문헌 [Cromwell et al, 1967, 1969 J Anim Sci 26 1325-1331, O’Quin et al. 2000 J Anim Sci 78 21442149, Yang et al. 2002, Transgenic Res 11 1120, Young et al. 2004, Plant J 38 910922]), 감자 (문헌 [Yu J and Ao, 1997 Acta Bot Sin 39 329334; (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 37243729, Enfissi et al. 2001, Chin Sci Bull 46 482484]), 쌀 (문헌 [Katsube et al. 1999, Plant Physiol 120 10631074]), 대두 (문헌 [Dinkins et al. 2001, Rapp 2002, In Vitro Cell Dev Biol Plant 37 742747]), 고구마 (문헌 [Egnin and Prakash 1997, In Vitro Cell Dev Biol 33 52A])에 대해 설명되었다.
필수 아미노산 함량이, 예컨대, 카놀라 (문헌 [Falco et al. 1995, Bio/Technology 13 577582]), 루핀(Lupin) (문헌 [White et al. 2001, J Sci Food Agric 81 147154]), 메이즈 (문헌 [Lai and Messing, 2002, Agbios 2008 GM crop database (March 11, 2008)]), 감자 (문헌 [Zeh et al. 2001, Plant Physiol 127 792802]), 수수 (문헌 [Zhao et al. 2003, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 413416]), 대두 (문헌 [Falco et al. 1995 Bio/Technology 13 577-582; Galili et al. 2002 Crit Rev Plant Sci 21 167204])에 대해 설명되었다.
오일 및 지방산 예컨대 카놀라 (문헌 [Dehesh et al. (1996) Plant J 9 167-172 [PubMed] ; Del Vecchio (1996) INFORM International News on Fats, Oils and Related Materials 7 230-243; Roesler et al. (1997) Plant Physiol 113 75-81 [PMC free article] [PubMed]; Froman and Ursin (2002, 2003) Abstracts of Papers of the American Chemical Society 223 U35; James et al. (2003) Am J Clin Nutr 77 1140-1145 [PubMed]; Agbios (2008, above); cotoan (Chapman et al. (2001) . J Am Oil Chem Soc 78 941-947; Liu et al. (2002) J Am Coll Nutr 21 205S-211S [PubMed]; O'Neill (2007) Australian Life Scientist. www.biotechnews.com.au/index.php/id;866694817;fp;4;fpid;2 (June 17, 2008), 아마인 (Abbadi et al., 2004, Plant Cell 16: 2734-2748), 메이즈 (Young et al., 2004, Plant J 38 910-922), 팜유 (Jalani et al. 1997, J Am Oil Chem Soc 74 1451-1455; Parveez, 2003, AgBiotechNet 113 1-8), 벼 (Anai et al., 2003, Plant Cell Rep 21 988-992), 대두 (Reddy and Thomas, 1996, Nat Biotechnol 14 639-642; Kinney and Kwolton, 1998, Blackie Academic and Professional, London, pp 193-213), 해바라기 (Arcadia, Biosciences 2008)
탄수화물, 예컨대 치커리에 대해 설명된 프룩탄(Fructans) (문헌 [Smeekens (1997) Trends Plant Sci 2 286287, Sprenger et al.(1997) FEBS Lett 400 355358, Sevenier et al.(1998) Nat Biotechnol 16 843846]), 메이즈 (문헌 [Caimi et al.(1996) Plant Physiol 110 355363]), 감자 (문헌 [Hellwege et al.,1997 Plant J 12 10571065]), 사탕무 (문헌 [Smeekens et al. 1997, 상기]), 감자에 대해 설명된 것과 같은, 이눌린 (문헌 [Hellewege et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97 86998704]), 쌀에 대해 설명된 것과 같은, 전분 (문헌 [Schwall et al.(2000) Nat Biotechnol 18 551554, Chiang et al.(2005) Mol Breed 15 125143]),
카놀라 (문헌 [Shintani and DellaPenna (1998) Science 282 20982100]), 메이즈 (문헌 [Rocheford et al.(2002). J Am Coll Nutr 21 191S-198S, Cahoon et al.(2003) Nat Biotechnol 21 10821087, Chen et al.(2003) Proc Natl Acad Sci USA 100 35253530]), 겨자씨 (문헌 [Shewmaker et al.(1999) Plant J 20 401412]), 감자 (문헌 [Ducreux et al., 2005, J Exp Bot 56 8189]), 쌀 (문헌 [Ye et al.(2000) Science 287 303305]), 딸기 (문헌 [Agius et al.(2003), Nat Biotechnol 21 177181]), 토마토 (문헌 [Rosati et al.(2000) Plant J 24 413419, Fraser et al.(2001) J Sci Food Agric 81 822827, Mehta et al.(2002) Nat Biotechnol 20 613618, Diaz de la Garza et al.(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101 1372013725, Enfissi et al.(2005) Plant Biotechnol J 3 1727, DellaPenna (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104 36753676])에 대해 설명된 것과 같은, 비타민 및 카로티노이드.
사과 (스틸벤(stilbene), 문헌 [Szankowski et al. (2003) Plant Cell Rep 22: 141-149), 알팔파 (레스베라트롤, Hipskind and Paiva (2000) Mol Plant Microbe Interact 13 551-562), 키위 (resveratrol, Kobayashi et al.(2000) Plant Cell Rep 19 904910]), 메이즈 및 대두 (플라보노이드, Yu et al.(2000) Plant Physiol 124 781794), 감자 (안토시아닌 및 알칼로이드 글리코시드, 문헌 [Lukaszewicz et al.(2004) J Agric Food Chem 52 15261533]), 쌀 (플라보노이드 & 레스베라트롤, 문헌 [Stark-Lorenzen et al.(1997) Plant Cell Rep 16 668673, Shin et al.(2006) Plant Biotechnol J 4 303315]), 토마토 (+레스베라트롤, 클로로겐산, 플라보노이드, 스틸벤; Rosati et al.(2000) 상기, Muir et al.(2001) Nature 19 470474, Niggeweg et al.(2004) Nat Biotechnol 22 746754, Giovinazzo et al.(2005) Plant Biotechnol J 3 5769]), 밀 (카페인산 및 페룰산, 레스베라트롤;United Press International (2002)); 및
알팔파 (피타제(phytase), 문헌 [Austin-Phillips et al. (1999) www.molecularfarming.com/nonmedical.html), 상추 (iron, Goto et al.(2000) Theor Appl Genet 100 658664]), 쌀 (철, 문헌 [Lucca et al.(2002) J Am Coll Nutr 21 184S-190S]), 메이즈, 대두 및 밀 (피타제, [Drakakaki et al.(2005) Plant Mol Biol 59 869880, Denbow et al.(1998) Poult Sci 77 878881, Brinch-Pedersen et al.(2000) Mol Breed 6 195206])에 설명된 것과 같은 무기질 이용성.
특정 구현예에서, 가치-부가된 형질은 식물에 존재하는 화합물의 생각되는 건강상의 이점에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 가치-부가된 작물은 다음의 화합물 중 하나 이상의 변형을 보장하거나 또는 다음의 화합물 중 하나 이상의 합성을 유도/증가시키기 위해 본 발명의 방법을 적용함으로써 얻어진다:
카로테노이드, 예컨대, 세포에 대한 손상을 야기할 수 있는 유리 라디칼을 중화시키는 당근에 존재하는 α-카로텐 또는 유리 라디칼을 중화시키는 다양한 과일 및 채소에 존재하는 β-카로텐.
건강한 시력의 유지에 기여하는 녹색 채소에 존재하는 루테인.
전립선 암의 위험을 감소시키는 것으로 여겨지는, 토마토 및 토마토 생성물에 존재하는 라이코펜.
건강한 시력의 유지에 기여하는 감귤류 및 메이즈에 존재하는 제아잔틴.
유방 및/또는 결장암의 위험을 감소시킬 수 있는 밀겨에 존재하는 불용성 섬유질과 같은 식이섬유 및 귀리에 존재하는 β-글루칸, 심혈관 질환(CVD)의 위험을 감소시키는 금불초 및 전체 곡류에 존재하는 가용성 섬유질.
지방산, 예컨대, CVD 위험을 감소시키고 정신 및 시각 기능을 개선시키는 ω-3 지방산, 신체 조성을 개선시킬 수 있고, 특정 암의 위험을 감소시킬 수 있는 접합된 리놀렌산 및 암 및 CVD의 염증 위험을 감소시킬 수 있고, 신체 조성을 개선시킬 수 있는 GLA.
플라보노이드, 예컨대, 항산화제-유사 활성을 갖고, 퇴행성 질환의 위험을 감소시킬 수 있는, 밀에 존재하는 하이드록시신나메이트, 자유 라디칼을 중화시키고 암 위험을 감소시킬 수 있는 과일 및 채소에 존재하는 플라보놀, 카테신.
글루코시놀레이트, 인돌, 아이소티오시아네이트, 예컨대, 자유 라디칼을 중화시키고, 암 위험을 감소시킬 수 있는, 십자화과 채소(브로콜리, 케일), 겨자무에 존재하는 설포라판.
페놀 수지류, 예컨대, 퇴행성 질환, 심장병 및 암 위험을 감소시킬 수 있고, 장기간의 효과를 가질 수 있는 포도에 존재하는 스틸벤 및 항산화제-유사 활성을 갖고, 퇴행성 질환, 심장병, 및 눈병 위험을 감소시킬 수 있는 채소 및 감귤류에 존재하는 카페인산 및 페룰산, 및 항산화제-유사 활성을 갖고, 퇴행성 질환 및 심장병의 위험을 감소시킬 수 있는 카카오에 존재하는 에피카테킨.
혈액 콜레스테롤 수준을 낮춤으로써 관상동맥 심장병의 위험을 감소시키는 메이즈, 콩, 밀 및 목재 오일에 존재하는 식물 스탄올/스테롤.
위장 건강을 개선시킬 수 있는 예루살렘 아티초크, 샬롯, 양파 분말에 존재하는 프럭탄, 이눌린, 프럭토-올리고당.
LDL 콜레스테롤을 낮출 수 있는 대두에 존재하는 사포닌.
심장병 위험을 감소시킬 수 있는 대두에 존재하는 대두 단백질.
식물성 에스트로겐, 예컨대, 폐경기 증상, 예컨대, 일과성 열감을 감소시킬 수 있고, 골다공증 및 CVD를 감소시킬 수 있는 대두에 존재하는 아이소플라본, 및 심장병 및 일부 암에 대해 보호할 수 있고, LDL 콜레스테롤, 총 콜레스테롤을 낮출 수 있는 아마, 호밀 및 채소에 존재하는 리그난.
설파이드 및 티올, 예컨대, 양파, 마늘, 올리브, 리크 및 스캘런에 존재하는 다이알릴 설파이드 및 LDL 콜레스테롤을 낮출 수 있고 건강한 면역계를 유지하도록 하는 십자화과 채소에 존재하는 알릴 메틸 트라이설파이드, 다이티올티온.
탄닌, 예컨대, 요로 건강상태를 개선시킬 수 있고, CVD 및 고혈압 위험을 감소시킬 수 있는 체키, 코코아에 존재하는 프로안토시아니딘.
추가로, 본 발명의 방법은 또한 단백질/전분 작용성, 저장 수명, 맛/미관, 섬유 품질, 및 알레르겐, 항영양소 (antinutrient) 및 독소 감소 형질의 변형을 계획한다.
따라서, 본 발명은 영양적 가치가 더해진 식물을 생산하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템을 이용하여 영양적 가치가 더해진 성분의 생산에 관여되는 유전자를 코딩하는 유전자를 식물 세포 내로 도입하는 단계 및 상기 식물 세포로부터 식물을 재생하는 단계를 포함하고, 상기 식물은 영양적 가치가 더해진 상기 성분의 발현 증가를 특징으로 한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은, 예를 들어, 본 화합물의 대사를 제어하는 하나 이상의 전사 인자를 변형시킴으로써, 이들 화합물의 내생성 합성을 간접적으로 변형시키는 데 사용된다. 식물 세포 내로 관심 유전자를 도입하고/하거나 CRISPR-C2c1 시스템을 이용하여 내생성 유전자를 변형시키는 방법은 본 명세서에서 상기에 기재되어 있다.
가치-부가된 형질을 부여하도록 변형된 식물에서 변형의 일부 특정 예는 식물의 스테아르산 함량을 증가시키도록 스테아릴-ACP 불포화효소의 안티센스 유전자로 식물을 형질전환시켜서 지방산 대사작용이 변형된 식물이다. 문헌 [Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (1992)]을 참조한다. 다른 예는 예를 들어 저수준의 피트산을 특징으로 하는 메이즈 돌연변이체의 원인일 수 있는 단일 대립유전자와 연관된 DNA를 클로닝하여 재도입시킴으로써, 피테이트 함량을 감소시키는 것을 포함한다. 문헌 [Raboy et al, Maydica 35:383 (1990)] 참조한다.
유사하게, 강력 프로모터의 제어 하에서 메이즈 호분층 내 플라보노이드의 생산을 조절하는 메이즈 (제아 메이스 (Zea mays)) Tfs C1 및 R의 발현은 아마도 전체 경로를 활성화시킴으로써, 애기장대 (아라비돕시스 탈리아나)에서 안토시아닌의 높은 축적률을 일으켰다 (Bruce et al., 2000, Plant Cell 12:6580). DellaPenna (Welsch et al., 2007 Annu Rev Plant Biol 57: 711- 738)는 Tf RAP2.2 및 그의 상호작용 상대 SINAT2가 애기장대 잎에서 카로텐 발생을 증가시켰다는 것을 발견하였다. Tf Dof1의 발현은 탄소 골격 생성을 위한 효소를 코딩하는 유전자의 상향조절, 아미노산 함량의 현저한 증가 및 유전자이식 애기장대에서 Glc 수준의 감소 (Yanagisawa, 2004 Plant Cell Physiol 45: 386- 391), 및 애기장대에서의 글루코시놀레이트 생합성 경로의 DOF Tf AtDof1.1(OBP2) 상향조절된 모든 단계를 유도하였다 (Skirycz et al., 2006 Plant J 47: 10-24).
식물에서 알레르겐의 감소
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법은 알레르겐 수준이 감소된 식물을 생성하여, 소비자에 대해 그들을 더 안전하게 만들기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 식물 알레르겐을 생성을 초래하는 하나 이상의 유전자 발현을 변형시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 방법은 식물 세포, 예컨대, 독보리 식물 세포에서 Lol p5 유전자의 발현을 하향 조절하기 위해 CRISPR-C2c1 시스템을 전달하는 단계 및 상기 식물의 화분의 알레르기 항원성을 감소시키기 위해 그들로부터 식물을 재생시키는 단계를 포함한다 (Bhalla et al. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96: 11676- 11680). 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 Lol p5 유전자에 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 Lol p5를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 Lol p5 유전자에 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 Lol p5 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
일반적으로 땅콩 알레르기 및 콩과 식물에 대한 알레르기는 실제로 심각한 건강상의 문제이다. 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템은 이러한 콩과의 알레르겐성 단백질을 코딩하는 유전자를 확인 및 이후 편집 또는 침묵화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 유전자 및 단백질에 관해 제한없이, Nicolaou 등은 땅콩, 대두, 렌틸콩, 완두콩, 루핀, 그린 빈스, 및 녹두에서의 알레르기 단백질을 동정하였다. 문헌 [Nicolaou et al., Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2011;11(3):222)]을 참조한다.
관심 내생성 유전자에 대한 스크리닝 방법
본 명세서에 제공된 방법은 식물 종, 식물 문 및 식물계 전체에서, 영양적 부가 가치 성분의 생산에 관여되는 효소를 코딩하는 가치있는 유전자 또는 일반적으로 관심 작물적 형질에 영향을 미치는 유전자의 동정을 더욱 허용한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템을 이용하여 식물에서 대사 경로의 효소를 코딩하는 유전자를 선택적으로 표적화함으로써, 식물의 소정의 영양학적 양상을 초래하는 유전자가 동정될 수 있다. 유사하게는, 바람직한 작물학적 형질에 영향을 미치는 유전자를 선택적으로 표적화함으로써, 적절한 유전자가 동정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 특정 영양학적 가치 및/또는 작물학적 형질을 갖는 화합물의 생성에 관여되는 효소를 코딩하는 유전자에 대한 스크리닝 방법을 포함한다.
생물연료 생산에서 CRISPR-C2c1 시스템의 용도
본 명세서에서 설명된 것과 같은 용어 "생물연료(biofuel)" 는 식물 및 식물-유도된 자원으로부터 제조된 대안적인 연료이다. 재생성 생물연료는 에너지가 탄소 고정 방법을 통해 얻어지거나 또는 생물량의 사용 또는 전환을 통해 제조되는 유기 물질로부터 추출될 수 있다. 이러한 생물량은 생물연료에 대해 직접적으로 사용될 수 있거나 또는 열전환, 화학적 전환 및 생화학적 전환에 의해 물질을 함유하는 편리한 에너지로 전환될 수 있다. 이 생물량 전환은 고체, 액체 또는 기체 형태로 연료를 생성할 수 있다. 2가지 유형의 생물연료가 있다: 바이오에탄올 및 바이오디젤. 바이오에탄올은 대부분 메이즈 및 사탕수수로부터 유래된 셀룰로스 (전분)의 당 발효 공정에 의해 주로 생산된다. 반면에 바이오디젤은 주로 유채, 야자나무 및 대두와 같은 기름 작물로부터 생산된다. 생물연료는 주로 수송을 위해 사용된다.
생물연료 생산을 위한 식물 속성 증강
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템을 이용하는 방법은 발효를 위한 당의 더 효율적인 방출을 위해 중요한 가수분해제에 의한 접근을 용이하게 하기 위하여 세포벽의 특성을 변경시키는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 셀룰로오스 및/또는 리그닌의 생합성이 변형된다. 셀룰로오스는 세포벽의 주 성분이다. 셀룰로오스 및 리그닌의 생합성은 공동조절된다. 식물에서 리그닌의 비를 감소시킴으로써 셀룰로오스의 비가 증가될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 설명된 방법은, 발효가능한 탄수화물을 증가시키기 위하여 식물에서 리그닌 생합성을 하향조절하는데 사용된다. 보다 특히, 본 명세서에 기재된 방법은 WO 2008064289 A2에 개시된 바와 같이 4-쿠마레이트 3-히드록실라제 (C3H), 페닐알라닌 암모니아-리아제 (PAL), 신남에이트 4-히드록실라제 (C4H), 히드록시신남오일 트랜스퍼라제 (HCT), 카페인산 O-메틸트랜스퍼라제 (COMT), 카페오일 CoA 3-O-메틸트랜스퍼라제 (CCoAOMT), 페룰레이트 5-히드록실라제 (F5H), 신남일 알콜 디히드로게나제 (CAD), 신남오일 CoA-리덕타제 (CCR), 4-쿠마레이트-CoA 리가제 (4CL), 모노리그놀-리그닌-특이적 글리코실트랜스퍼라제, 및 알데히드 디히드로게나제 (ALDH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 첫 번째의 리그닌 생합성 유전자를 하향조절하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 발효 동안 더 낮은 아세트산 수준을 생성하는 식물 매스 (mass)를 생산하는 데 사용된다 (또한 WO 2010096488 참조). 보다 특히, 본 명세서에 개시된 방법은 다당 아세틸화를 감소시키기 위해 CaslL에 대한 상동체에서 돌연변이를 생성하는 데 사용된다.
생물연료 생산을 위한 효모 변형
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 C2c1 효소는 재조합 미생물에 의한 바이오에탄올 생산에 사용된다. 예를 들어, C2c1은 미생물, 예컨대 효모를 조작하여 발효성 당으로부터의 생물연료 또는 생체고분자를 생성하고, 선택적으로 발효성 당 공급원으로서 농업 폐기물로부터 유도된 식물-유래 리그노셀룰로오스를 분해시키는데 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은, C2c1 CRISPR 복합체가 생물연료 생산에 요구되는 외래 유전자를 미생물 내로 도입 및/또는 생물연료 합성을 방해할 수 있는 원인의 내생성 유전자를 변형시키는데 사용되는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 방법은 피루베이트의 에탄올 또는 또 다른 관심 생성물로의 전환에 관련된 효소를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 효모와 같은 미생물 내로 도입하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서 본 방법은, 미생물이 셀룰로오스를 분해하는 것을 허용하는 하나 이상의 효소, 예컨대 셀룰라아제의 도입을 보장하도록 한다. 추가의 구현예에서, C2c1 CRISPR 복합체는 생물연료 생산 경로와 경쟁하는 내생성 대사 경로를 변형하는데 사용된다.
따라서, 더욱 구체적인 구현예에서, 본 명세서에서 설명된 방법은 다음과 같이 미생물을 변형시키는데 사용된다:
상기 미생물이 상기 핵산을 발현, 상기 식물 세포벽 분해 효소를 생산 및 분해할 수 있도록, 하나 이상의 이종성 핵산을 도입 또는 식물 세포벽 분해 효소를 코딩하는 하나 이상의 내생성 핵산의 발현을 증가;
상기 숙주 세포가 상기 핵산을 발현할 수 있도록 하는, 하나 이상의 이종성 핵산을 도입 또는 아세트알데히드를 에탄올로 전환시키는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종성 핵산과 선택적으로 조합된, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 효소를 코딩하는 하나 이상의 내생성 핵산의 발현을 증가; 및/또는
상기 숙주 세포 내 대사 경로에서 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 변형시키고, 여기서 상기 경로는 피루베이트로부터 아세트알데히드 또는 아세트알데히드로부터 에탄올 외의 대사산물을 생산하고, 여기서 상기 변형은 상기 대사산물의 감소된 생산울 결과로서 초래하거나, 또는 상기 효소의 억제제를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드를 도입.
식물성 오일 또는 생물연료의 생산을 위한 조류 및 식물의 변형
유전자이식 조류 또는 다른 식물, 예컨대, 유채는, 예를 들어, 식물성 오일 또는 생물연료, 예컨대, 알콜(특히 메탄올 및 에탄올)의 생산에 특히 유용할 수 있다. 이들은 오일 또는 생체연료 산업에서 사용을 위한 고수준의 오일 또는 알코올을 발현 또는 과발현시키도록 유전자조작될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, CRISPR-C2c1 시스템은 생물연료 생산에서 유용한 지질-풍부 규조류를 생성하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 식물에 의해 생산되는 생물량 생산과 관련된 유전자를 특별히 변형시키는 것이 고려된다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 테오신 분지된 (tb) 유전자 또는 이의 상동체를 표적화하여 높은 생물량 식물을 생성시키는데 사용된다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 tb 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 tb 유전자에 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 tb 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다. 일정한 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 tb 유전자 또는 이의 상동체에 단일 뉴클레오티드 돌연변이를 도입시키기 위해서 (예를 들어, 융합 단백질 또는 적합한 링커를 통해) 아데노신 또는 시티딘 디아미나제같은 기능성 도메인에 회합된 촉매적으로 불활성화된 C2c1 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 tb1a 및 tb1b 유전자를 표적화하고 단일 뉴클레오티드 돌연변이를 도입시켜 높은 생물량 지팽이풀 식물을 생성시키는데 사용된다. 참조: Liu et. al, Plant Biotechnology Journal (doi:10.1111/pbi.12778).
특정 구현예에서, 조류 세포에 의해 생성된 지질의 양 및/또는 지질의 질의 변형에 연루된 유전자를 특이적으로 변형시키는 것으로 예상된다. 지방산 합성 경로에 연루된 유전자 코딩 효소의 예는, 예를 들어, 아세틸-CoA 카복실라제, 지방산 신타제, 3-케토아실_아실- 캐리어 단백질 신타제 III, 글리세롤-3-인산 디히드로게나제 (G3PDH), 엔오일-아실 캐리어 단백질 리덕타제 (엔오일-ACP-리덕타제), 글리세롤-3-포스페이트 아실트랜스퍼라제, 리소포스파티드 아실 트랜스퍼라제 또는 다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제, 인지질:다이아실글리세롤 아실트랜스퍼라제, 포스파티데이트 포스파타제, 지방산 티오에스터라제, 예컨대, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 또는 말산 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. 추가 구현예에서, 지질 축적이 증가된 규조류를 생성시키는 것이 계획된다. 이는 지질 이화작용을 감소시키는 유전자를 표적화시킴으로써 달성될 수 있다. 특히, 트리아실글리세롤 및 유리 지방산 둘 모두의 활성화에 관여되는 유전자뿐만 아니라 지방산, 예컨대, 아실-CoA 신타제, 3-케토아실-CoA 티올라제, 아실-CoA 옥시다제 활성 및 포스포글루코뮤타제의 β-산화에 직접적으로 관여되는 유전자에 본 발명의 방법에서의 사용에 대한 관심이 있다. 본 명세서에 기재된 CRISPR-C2c1 시스템 및 방법은 그들의 지질 함량을 증가시키기 위해 규조류에서 이러한 유전자를 특이적으로 활성화시키는 데 사용될 수 있다.
유기체, 예컨대, 미세조류는 합성 생물학을 위해 널리 사용된다. Stovicek 등 (Metab. Eng. Comm., 2015; 2:13]은 산업적 생산을 위해 강한 균주를 효율적으로 생산하기 위한 산업적 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비시애의 게놈 편집을 기재한다. Stovicek은 내생성 유전자의 대립유전자와 이종성 유전자에서의 녹아웃을 둘 모두를 동시에 붕괴시키는 효모에 대해 코돈-최적화된 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하였다. Cas9 및 gRNA는 게놈 또는 에피좀 2μ-기반 벡터 위치로부터 발현되었따. 저자는 또한, 유전자 파괴 효율이 Cas9 및 gRNA 발현 수준의 최적화에 의해 개선될 수 있음을 나타내었다. Hlavovaa 등 (Biotechnol. Adv. 2015)은 삽입 돌연변이유발 및 스크리닝을 위해 핵 및 엽록체 유전자를 표적화하는 CRISPR와 같은 기법을 사용하여 미세조류의 종 또는 균주의 발생을 논의한다. Stovicek 및 Hlavovaa의 방법은 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다. CRISPR-C2c1 시스템과 관련하여, 일부 구현에에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'의 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 Lol p5 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
US 8,945,839호는 Cas9를 이용하여 미세조류 (클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포) 종을 조작하는 방법을 설명한다. 유사한 도구를 이용하여, 본 명세서에 기재된 CRISPR-C2c1 시스템의 방법은 클라미도모나스 (Chlamydomonas) 종 및 다른 조류에 적용될 수 있다. 특정 구현예에서, C2c1 및 가이드 RNA는, Hsp70A-Rbc S2 또는 베타2 -튜불린과 같은 구조 프로모터의 제어 하에서 C2c1을 발현하는 벡터를 사용하여 발현된 조류 내에 도입된다. 가이드 RNA는 T7 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 것이다. 대안적으로, C2c1 mRNA 및 시험관내 전사된 가이드 RNA는 조류 세포에 전달될 수 있다. 전기천공법 프로토콜은 GeneArt 클라미도모나스 조작 키트로부터의 표준 권고 프로토콜을 따른다. US 8,945,839의 방법은 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다. CRISPR-C2c1 시스템과 관련하여, 일부 구현에에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'의 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
지방산 생산이 가능한 미생물의 생성에서 C2c1의 용도
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 지방 에스테르, 예컨대, 지방산 메틸 에스테르 ("FAME") 및 지방산 에틸 에스테르 ("FAEE")를 생산할 수 있는 유전자 조작된 미생물의 생성을 위해 사용된다.
전형적으로, 숙주 세포는 티오에스터라제를 코딩하는 유전자, 아실-CoA 신타제를 코딩하는 유전자, 및 에스테르 신타제를 코딩하는 유전자의 발현 또는 과발현에 의해 배지에 존재하는 탄소 공급원, 예컨대, 알콜로부터의 지방 에스터를 생산하도록 조작될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 방법은 티오에스터라제 유전자, 아실-CoA 신타제를 코딩하는 유전자, 및 에스테르 신타제를 코딩하는 유전자를 과발현시키거나 또는 도입하기 위해 미생물을 변형하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 티오에스터라제 유전자는 tesA, 'tesA, tesB, fatB, fatB2, fatB3, fatAl 또는 fatA로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 아실-CoA 신타제를 코딩하는 유전자는 fadDJadK, BH3103, pfl-4354, EAV15023, fadDl, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa39, 또는 동일한 특성을 갖는 효소를 코딩하는 동정된 유전자로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 에스테르 신타제를 코딩하는 유전자는 심몬드시아 키넨시스 (Simmondsia chinensis), 아시네토박터 종 (Acinetobacter sp.) ADP, 알카니보락스 보르쿠멘시스 (Alcanivorax borkumensis), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 펀디박터 자덴시스 (Fundibacter jadensis), 아라비돕시스 탈리아나 또는 알칼리게네스 유트로푸스 (Alkaligenes eutrophus) 유래의 신타제/아실-CoA:다이아실글리세릴 아실트랜스퍼라제 또는 이의 변이체를 코딩하는 유전자이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 명세서에 제공된 방법은 상기 미생물에서 아실-CoA 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 외막 단백질 수용체를 코딩하는 유전자, 및 지방산 생합성의 전사 조절제를 코딩하는 유전자 중 적어도 하나의 발현을 감소시키도록 사용된다. 특정 구현예에서, 이들 유전자 중 하나 이상은, 예컨대, 돌연변이의 도입에 의해 비활성화된다. 특정 구현예에서, 아실-CoA 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 fadE이다. 특정 구현예에서, 지방산 생합성의 전사 조절자를 코딩하는 유전자는 DNA 전사 억제인자, 예를 들어, fabR을 암호화한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 상기 미생물은 파이루베이트 포메이트 리아제를 코딩하는 유전자, 락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자, 또는 둘 다 중 적어도 하나의 발현을 감소시키도록 변형된다. 특정 구현예에서, 파이루베이트 포메이트 리아제를 코딩하는 유전자는 pflB이다. 특정 구현예에서, 락테이트 탈수소효소를 코딩하는 유전자는 IdhA이다. 특정 구현예에서, 이들 유전자 중 하나 이상은, 예컨대, 그에 대한 돌연변이의 도입에 의해 비활성화된다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5'-오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
특정 구현예에서, 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 바실러스, 락토바실러스, 로도코커스(Rhodococcus), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코이스티스(Synechoystis), 슈도모나스, 아스퍼질러스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 푸사리움(Fusarium), 휴미콜라(Humicola), 리조무코르(Rhizomucor), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 무코르(Mucor), 마이실리오프토라(Myceliophtora), 페니실리움(Penicillium), 파네로카에테(Phanerochaete), 플레우로투스(Pleurotus), 트라메테스(Trametes), 크리소스포리움(Chrysosporium), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스테노트로파모나스(Stenotrophamonas), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로위아(Yarrowia) 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로부터 선택된다.
유기산 생산을 할 수 있는 미생물의 생성에서 C2c1의 용도
본 명세서에 제공된 방법은 유기산을, 보다 특히, 펜토스 또는 헥소스 당으로부터 생산할 수 있는 미생물을 조작하기 위해 추가로 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 미생물에 외생성 LDH 유전자를 도입하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 미생물에서의 유기산 생산은 관심 유기산 이외의 대사산물을 생성하는 내생성 대사 경로에 관여된 단백질을 코딩하는 내생성 유전자를 불활성화함으로써 추가적으로 또는 대안적으로 증가되고/되거나, 여기서 내생성 대사 경로는 유기산을 소비한다. 특정 구현예에서, 변형은 관심 유기산 이외의 대사물질의 생성이 감소된다는 것을 보장한다. 특정 구현예에 따르면, 상기 방법은 적어도 하나의 조작된 유전자 결실 및/또는 유기산이 소비되는 내생성 경로의 불활성화 또는 관심 유기산 이외의 대사물질을 생성하는 내생성 경로에 관여된 생성물을 코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용된다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 조작된 유전자 결실 또는 불활성화는 피루베이트 데카복실라제 (pdc), 푸마레이트 리덕타제, 알콜 디히드로게나제 (adh), 아세트알데히드 디히드로게나제, 포스포엔올피루베이트 카복실라제(ppc), D-락테이트 디히드로게나제 (d-ldh), L-락테이트 디히드로게나제 (l-ldh), 락테이트 2-모노옥시게나제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자에 존재한다. 추가 구현예에서, 적어도 하나의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화는 피루베이트 데카복실라제(pdc)를 코딩하는 내생성 유전자에 존재한다.
추가 구현예에서, 미생물은 락트산을 생성하도록 조작되고, 적어도 하나의 조작된 유전자 결실 및/또는 불활성화는 락테이트 디히드로게나제를 코딩하는 내생성 유전자에 존재한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 미생물은 시토크롬-의존적 락테이트 디히드로게나제, 예컨대, 시토크롬 B2-의존적 L-락테이트 디히드로게나제를 코딩하는 내생성 유전자의 적어도 하나의 조작된 유전자 결실 또는 불활성화를 포함한다.
효모 균주를 활용하여 개선된 자일로스 또는 셀로비오스의 재생에서 C2c1의 용도
특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 효모 균주를 이용하는 개선된 자일로스 또는 셀로비오스를 선택하기 위해 적용될 수 있다. 오류 유발 PCR은 자일로스 이용 또는 셀로비오스 이용 경로에 관여되는 하나 (이상의) 유전자를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 자일로스 활용 경로 및 셀로비오스 활용 경로에 관련된 유전자들의 예로는, 이로 제한됨이 없이, 문헌 [Ha, S.J., et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(2):5049 및 Galazka, J.M., et al. (2010) Science 330(6000):846]에 기재된 것들을 포함한다. 이러한 선택 유전자 내에 무작위 돌연변이를 각각 포함하는, 이중 가닥 DNA 분자의 최종 라이브러리는 효모 균주 (예를 들어, S288C)를 CRISPR-C2c1 시스템의 성분과 공동 형질전환시킬 수 있고, WO2015138855에 기재된 바와 같은 증강된 자일로스 또는 셀로비오스 이용 능력을 갖는 균주가 선택될 수 있다.
이소프레노이드 생합성에서의 이용을 위한 개선된 효모 균주의 생성에서 C2c1의 용도
Tadas Jakociunas 등은 빵 효모인 사카로마이세스 세레비시에에서 하나의 형질전환 단계에서 5 개에 달하는 상이한 게놈 유전자좌의 게놈 조적을 위한 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템의 성공적인 적용을 설명하였으며 (문헌 [Metabolic Engineering Volume 28, March 2015, Pages 213-222]), 이는 산업적으로 중요한 이소프레노이드 생합성 경로를 위한 열쇠인, 높은 메발로네이트 생산을 갖는 균주를 결과로서 초래한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 아이소프레노이드 합성에서 사용하기 위한 추가적인 높은 생성 효모 균주를 동정하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 다중복합 게놈 조작 방법에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, 일부 구현에에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 7-nt 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
효모 균주를 생산하는 락트의 생성에서 C2c1의 용도
다른 구현예에서, 복합다중 CRISPR-C2c1 시스템의 성공적인 적용이 포함된다. Vratislav Stovicek 등 (Metabolic Engineering Communications, Volume 2, December 2015, Pages 13-22)과 유사하게, 개선된 락트산-생산 균주가 설계될 수 있고, 단일 형질전환 이벤트에서 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 이종성 락테이트 탈수소효소 유전자를 삽입하는 동시에 두 개의 내생성 유전자 PDC1 및 PDC5 유전자 붕괴하는데 사용된다. C2c1 단백질과 관련하여, 일부 구현에에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 PDC1 또는 PD5 유전자에 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 PDC1 또는 PDC5 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
식물에서 CRISPR-C2c1 시스템의 추가 적용
특정 구현예에서, CRISPR 시스템, 및 바람직하게는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 유전적 요소 동력학의 시각화에 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 이미징은 반복적 또는 비반복적 게놈 서열을 시각화, 텔로미어 길이 변화 및 텔로미어 이동의 보고, 및 세포 주기에 걸친 유전자좌의 동력학을 감독할 수 있다(Chen et al., Cell, 2013). 이들 방법은 또한 식물에 적용될 수 있다.
CRISPR 시스템, 및 바람직하게는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템의 기타 응용은 시험관 내 및 생체 내 표적된 유전자 붕괴 양성-선택 스크리닝이다(Malina et al., Genes and Development, 2013). 이들 방법은 또한 식물에 적용될 수 있다.
특정 구현예에서, 비활성 C2c1 엔도뉴클레아제의 히스톤-변형 효소와의 융합은 복합체 후생유전자에서의 사용자 변경을 도입할 수 있다 (Rusk et al., Nature Methods, 2014). 이들 방법은 또한 식물에 적용될 수 있다.
특정 구현예에서, CRISPR 시스템, 및 바람직하게는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 염색질의 특이적 부분을 정제하고, 연관된 단백질을 확인하기 위하여 사용될 수 있으며, 이에 따라 전사에서 이들의 조절 역할을 해명한다(Waldrip et al., Epigenetics, 2014). 이들 방법은 또한 식물에 적용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 바이러스 DNA 및 RNA를 모두 절단할 수 있음에 따라, 식물체에서 바이러스 제거를 위한 치료법으로서 사용될 수 있다. 인간 시스템에서 이전 연구들은 단일 가닥 RNA 바이러스, C형 간염 바이러스 (A. Price, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 2015)를 비롯하여, 이중 가닥 DNA 바이러스, B형 간염 바이러스 (V. Ramanan, et al., Sci. Rep, 2015)를 표적화하는데서 CRISPR을 이용한 성공을 입증하였다. 이들 방법은 또한 식물에서 CRISPR-C2c1 시스템을 이용하여 조정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 게놈 복잡성을 변경하는데 사용될 수 있다. 추가의 특정 구현예에서, CRISPR 시스템, 및 바람직하게는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 염색체 수를 붕괴 또는 변경시키는데 사용될 수 있으며, 하나의 부모로부터의 염색체만을 함유할 수 있는 반수체 식물을 재생할 수 있다. 그러한 식물은 염색체 이중복제되도록 유도되어, 단지 동형접합성 대립형질만을 함유하는 이배체 식물로 전환될 수 있다 (Karimi-Ashtiyani et al., PNAS, 2015; Anton et al., Nucleus, 2014). 이들 방법은 또한 식물에 적용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 설명된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 자가-절단에 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, C2c1 효소 및 gRNA의 프로모터는 구조적 프로모터일 수 있으며, 제2 gRNA는 동일한 형질전환 카세트 내로 도입되지만, 유도성 프로모터에 의해 제어된다. 이러한 제2 gRNA는 비기능성 C2c1을 생성하기 위하여 C2c1 유전자에서 부위-특이적 절단을 유도하도록 지정될 수 있다. 추가의 특정 구현예에서, 제2 gRNA는 형질전환 카세트의 양 말단 상에서의 절단을 유도하며, 숙주 게놈으로부터의 카세트의 제거를 결과로서 초래한다. 이 시스템은 Cas 효소에 대한 세포 노출의 제어된 기간을 제공하며, 추가로 표적외 편집을 최소화한다. 나아가, CRISPR/Cas 카세트의 양 말단의 절단은 2-대립유전자 돌연변이를 갖는 이식유전자-무함유 T0 식물을 생성하는데 사용될 수 있다 (Cas9에 대하여 기재된 바와 같음, 예를 들어, Moore et al., Nucleic Acids Research, 2014; Schaeffer et al., Plant Science, 2015). Moore 등의 방법은 본 명세서에서 설명된 CRISPR-C2c1 시스템에 적용될 수 있다.
Sugano 등 (Plant Cell Physiol. 2014 Mar;55(3):475-81. doi: 10.1093/pcp/pcu014. Epub 2014 Jan 18)은 육상 식물 진화를 연구하기 위한 모델 종으로서 떠오른, 우산이끼 마르찬티아 폴리모파 L(Marchantia polymorpha L.)에서의 표적화된 돌연변이유발에 CRISPR-Cas9의 적용을 보고한다. 마르찬티아 폴리모파의 U6 프로모터가 확인되고, 클로닝되어 gRNA를 발현하였다. gRNA의 표적 서열은 마르찬티아 폴리모파에서 옥신 반응 인자 1(ARF1)을 코딩하는 유전자를 파괴하도록 설계되었다. 아그로박테리움-매개 형질전환을 사용하여, Sugano외 다수는 마르찬티아 폴리모파의 배우체 생성에서 안정적인 돌연변이체를 분리하였다. 생체내에서 CRISPR-Cas9-기반 부위-특이적 돌연변이유발은, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 또는 마르찬티아 폴리모파 EF1α 프로모터 중 어느 하나를 사용하여 Cas9를 발현하도록 달성되었다. 옥신-내성 표현형을 나타내는 분리된 돌연변이체 개체는 키메라가 아니었다. 나아가, 안정적인 돌연변이체는 T1 식물의 무성 생식에 의해 생산되었다. 복수 arf1 대립유전자는 CRIPSR-Cas9-기반의 표적화된 돌연변이유발을 사용하여 용이하게 수립되었다. Sugano외 다수의 방법은 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다.
Kabadi 등 (Nucleic Acids Res. 2014 Oct 29;42(19):e147. doi: 10.1093/nar/gku749. Epub 2014 Aug 13)은 편리한 골든 게이트 클로닝 방법에 의하여 벡터 내로 혼입된 독립된 RNA 중합효소 III 프로모터로부터, Cas9 변이체, 리포터 유전자 및 최대 4 개의 sgRNA를 발현시키기 위하여 단일 렌티바이러스 시스템을 개발하였다. 각각의 sgRNA는 효율적으로 발현되었고, 불사화된 일차 인간 세포에서 멀티플렉스 유전자 편집 및 지속된 전사 활성화를 매개할 수 있다. Kabadi 등의 방법은 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다.
Ling 등 (BMC Plant Biology 2014, 14:327)은 gRNA 뿐만 아니라, pGreen 또는 pCAMBIA 골격을 기반으로 CRISPR-Cas9 이원 벡터를 개발하였다. 이러한 툴키트는 한번의 클로닝 단계로 높은 효율로 하나 이상의 gRNA 및 메이즈-코돈 최적화된 Cas9를 보유한 최종 구성체를 생성시키기 위해 BsaI 이외에 제한 효소를 요구하지 않는다. 툴키트는 메이즈 원형질, 유전자이식 메이즈 계통, 및 유전자이식 아라비돕시스 계통을 사용하여 검증되었으며, 높은 효율 및 특이성을 보이는 것으로 나타났다. 더욱 중요하게는, 이러한 툴키트를 사용하여, 3 개의 아라비돕시스 유전자의 표적화된 돌연변이가 T1 세대의 유전자이식 묘목에서 검출되었다. 또한, 다중-유전자 돌연변이가 그 다음 세대로 유전될 수 있었다. 식물에서 멀티플렉스 게놈 편집을 위한 툴키트로서, (가이드 RNA) 모듈 벡터 세트. Lin 등의 툴박스가 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다.
CRISPR-C2c1을 통한 표적화된 식물 게놈 편집의 프로토콜은 또한 [Methods in Molecular Biology pp 239-255 10 February 2015] 시리즈의 1284권에 CRISPR-Cas9 시스템에 대해 개시된 것을 기반으로 이용가능하다. 모델 세포 시스템으로서 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 및 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana) 원형질체를 사용하여 식물 코돈 최적화된 Cas9 (pcoCas9) 매개 게놈 편집을 위한 이중 gRNA의 디자인, 구성, 및 평가를 위한 상세한 절차를 기술한다. 전체 식물에서의 표적화된 게놈 변형의 생성에 CRISPR-Cas9 시스템을 적용하는 전략 또한 논의된다. 그 장에 기재된 프로토콜이 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다.
상기 언급된 방법 및 프로토콜에서 C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Ma 등 (Mol Plant. 2015 Aug 3;8(8):1274-84. doi: 10.1016/j.molp.2015.04.007) 단자엽 및 쌍자엽 식물에서 편리하며 고효율 멀티플렉스 게놈 편집을 위해, 식물 코돈 최적화된 Cas9 유전자를 이용한, 강력한 CRISPR-Cas9 벡터 시스템을 보고한다. Ma 등은 골든 게이트 결찰 또는 깁슨 조립에 의한 일 회전의 클로닝에서 바이너리 CRISPR-Cas9 벡터 내로 조립될 수 있는, 다중 sgRNA 발현 카세트를 신속히 생성하기 위한 PCR-기반 절차를 설계하였다. 시스템을 이용하여, Ma외 다수는 평균 돌연변이율 85.4%로, 대개 이중대립유전자 및 동형접합성 상태로, 벼에서 46 개의 표적 부위를 편집하였다. Ma 등은 유전자 패밀리의 다수의(최대 8 개) 멤버, 생합성 경로에서의 다수의 유전자, 또는 단일 유전자에서 다수의 부위의 동시 표적화에 의해 T0 쌀 및 T1 아라비돕시스 식물에서 기능 손실 유전자 돌연변이의 예를 제공한다. Ma 등의 방법은 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Lowder 등 (Plant Physiol. 2015 Aug 21. pii: pp.00636.2015)은 또한, 멀티플렉스 게놈 편집 및 식물에서 발현된, 침묵화된, 또는 비-코딩 유전자의 전사 조절을 가능하게 하는 CRISPR-Cas9 툴박스를 개발하였다. 이 툴박스는 골든 게이트 및 게이트웨이 클로닝 방법을 사용하여 단자엽 및 쌍자엽에 대한 빠르고 효율적인 조립 작용 CRISPR-Cas9 T-DNA 구성체에 대한 프로토콜 및 시약을 연구자에게 제공한다. 이는 다중화된 유전자 편집 및 식물 내생성 유전자의 전사 활성화 또는 억제를 포함하는, 능력들의 완전한 세트가 함께 제공된다. T-DNA 기반 형질전환 기술은 현대 식물 생명공학, 유전학, 분자 생물학 및 생리학의 기초가 된다. 이와 같이, C2c1 (WT, 닉카제 또는 dC2c1) 및 gRNA(들)는 관심 T-DNA 목적지-벡터 내로의 조립 방법을 개발하였다. 조립 방법은 골든 게이트 조립 및 멀티사이트 게이트웨이 재조합 모두를 기초로 한다. 3 개의 모듈이 조립에 요구된다. 제1 모듈은 C2c1 진입 벡터로, 이는 attL1 및 attR5 부위에 측접된 무-프로모터 C2c1 또는 이의 유도체 유전자를 함유한다. 제2 모듈은 gRNA 진입 벡터로, 이는 attL5 및 attL2 부위에 측접된 진입 gRNA 발현 카세트를 함유한다. 제3 모듈은 C2c1 발현을 위해 선택된 프로모터를 제공하는 attR1-attR2-함유 목적지 T-DNA 벡터를 포함한다. Lower외 다수의 도구 박스는 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Wang 등 (bioRxiv 051342; doi: doi.org/10.1101/051342; Epub. May 12, 2016)은 단일 프로모터의 제어 하에서 몇개 gRNA-tRNA 유닛을 갖는 다중복합 유전자 편집 구성체를 사용해 육배체 밀에서 중요한 농경 형질에 영향을 미치는 4개 유전자의 동종 카피의 편집을 입증하였다.
유리한 구현예에서, 식물은 나무일 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개시된 CRISPR Cas 시스템을 초본경에 이용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Belhaj et al., Plant Methods 9:39] 및 [Harrison et al., Genes & Development 28:18591872] 참조). 특히 유리한 구현예에서, 본 발명의 CRISPR Cas 시스템은 나무에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 표적화할 수 있다(예를 들어, 문헌[Zhou et al., New Phytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298301, October 2015] 참조). Zhou 등의 실험에서, 저자는 사례 연구로서 4-쿠마레이트:CoA 리가제 (4CL) 유전자 패밀리를 사용하여 목재질 다년생 포풀러(Populus)에서 CRISPR Cas 시스템을 적용하여 표적화된 2개 4CL 유전자에 대해 100% 돌연변이 효율을 달성하였으며, 조사된 모든 형질전환체가 이중대립유전자 변형을 보유하였다. Zhou 등의 연구에서, CRISPR-Cas9 시스템은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 대해 고도로 민감하였으며, 제3의 4CL 유전자에 대한 절단은 표적 서열 내 SNP로 인해 삭제되었다. 이러한 방법은 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Zhou 등의 방법(문헌[New Phytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298301, October 2015])은 본 발명에 다음과 같이 적용될 수 있다. 리그닌 및 플라보노이드 생합성에 연관된, 2 개의 4CL 유전자, 즉 4CL1 및 4CL2는 각각 CRISPR-Cas9 편집에 대해 표적화된다. 형질전환에 일상적으로 사용되는 포퓰러스 트레뮬라 (Populus tremula) × alba 클론 717-1B4는 게놈-시퀀싱된 포퓰러스 트리코카르파(Populus trichocarpa)로부터 분기된다. 따라서, 기준 게놈으로부터 설계된 4CL1 및 4CL2 gRNA는 인-하우스 717 RNA-Seq 데이터로 질의되어 Cas 효율을 제한할 수 있는 SNP의 부재를 보장한다. 4CL1의 게놈 복제물인, 4CL5에 대해 설계된 제3 gRNA 또한 포함된다. 상응하는 717 서열은 PAM 가까이/내의 각각의 대립형질에서 하나의 SNP를 포함하며, 이들 모두는 4CL5-gRNA에 의한 표적화를 제거하는 것으로 예상된다. 세 개의 gRNA 표적 부위 모두는 제1 엑손 내에 위치된다. 717 형질전환의 경우, gRNA는 바이너리 벡터 내 CaMV 35S 프로모터의 제어 하에, 인간 코돈-최적화된 Cas와 함께 개자리(Medicago) U6.6 프로모터로부터 발현된다. Cas-만의 벡터를 이용한 형질전환은 대조군으로서 제공될 수 있다. 무작위로 선택된 4CL1 및 4CL2 계통은 앰플리콘-시퀀싱 처리된다. 그 데이터는 이후 가공되고, 이중대립형질 돌연변이는 모든 경우에서 확인된다. 이러한 방법은 본 발명의 C2c1 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
식물에서, 병원균은 종종 숙주-특이적이다. 예를 들어, 푸사리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum) f. sp. 리코페르시시 (lycopersici)는 토마토 시듬을 초래하지만 오직 토마토만을 공격하고, 에프. 옥시스포럼 (F. oxysporum) f. 디안티이 푸시니아 그라미니스 (dianthii Puccinia graminis) f. sp. 트리티시 (tritici)는 오직 밀만을 공격한다. 식물은 대부분의 병원균에 저항하는 기존의 유도된 방어성을 갖는다. 식물 생성에 걸친 돌연변이 및 재조합 사건은 감수성을 일으키는 유전자 가변성을 야기하는데, 특히 병원균이 식물보다 더 빈번하게 재생되기 때문이다. 식물에서는, 비-숙주 저항성이 존재할 수 있으며, 예를 들어 숙주 및 병원균은 비양립성이다. 통상적으로 많은 유전자에 의해 제어되는, 수평 저항성, 예를 들어 병원균의 모든 종족에 대하여 부분 저항성, 및 통상적으로 몇몇 유전자에 의해 제어되는, 수직 저항성, 예를 들어 다른 종족은 아니지만 일부 종족의 병원균에 대해 완전한 저항성이 또한 존재할 수 있다. 유전자 대 유전자 수준에서, 식물 및 병원균은 함께 진화하며, 하나의 균형에서의 유전적 변화는 다른 하나에서 변화를 일으킨다. 따라서, 자연적 변동성을 사용하여, 품종 개량자는, 산출량, 품질, 균일성, 강인성(hardiness), 저항성에 대해 가장 유용한 유전자를 조합한다. 저항성 유전자 공급원은 천연 또는 외래의 변종들, 토종(Heirloom Varieties), 야생 근연 식물, 및 유도된 돌연변이, 예를 들어 돌연변이원성 제제를 이용한 식물 재료 처리를 포함한다. 본 발명을 사용하여, 식물 품종 개량자는 돌연변이를 유도하는 새로운 도구를 제공받는다. 따라서, 당업자는 저항성 유전자의 게놈을 분석할 수 있고, 원하는 특징 또는 특성을 갖는 변종들에서, 이전의 돌연변이원성 제제보다 더욱 정확하고, 이에 따라 식물 품종 개량 프로그램을 가속화하고 개선하는 저항성 유전자의 증가를 유도하기 위하여 본 발명을 이용할 수 있다.
하기 표는 CRISPR-Cas 복합체, 변형된 이펙터 단백질, 시스템, 및 최적화 방법이 생물생산을 개선시키는데 사용될 수 있는 관련 분야 및 추가 참조를 제공한다. 일부 구현예에서, CRISPR-Cas 복합체는 tracrRNA, 직접 반복부에 연결된 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA와 복합체를 형성하는 C2c1 단백질 또는 이의 촉매 도메인을 포함하고, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화된다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
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개선된 식물 및 효모 세포
본 발명은 또한 본 명세서에 제공된 방법에 의해 얻을 수 있고 얻어진 식물 및 효모 세포를 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 얻어진 개선된 식물은, 예를 들어, 식물 해충, 제초제, 가뭄 또는 저온 또는 고온, 과량의 물 등에 대한 내성을 보장하는 유전자의 발현을 통해 식품 또는 사료 생산에서 유용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 수득되는 개선된 식물은, 특히 작물 및 조류이고, 예를 들어, 야생형에서 정상적으로 보이는 것보다 더 높은 단백질, 탄수화물, 영양소 또는 비타민 수준의 발현을 통해 식품 또는 사료 생산에서 유용할 수 있다. 이와 관련하여, 개선된 식물, 특히 두류 및 괴경이 바람직하다.
개선된 조류 또는 다른 식물, 예컨대, 유채는, 예를 들어, 식물성 오일 또는 생물연료, 예컨대, 알콜 (특히 메탄올 및 에탄올)의 생산에서 특히 유용할 수 있다. 이들은 오일 또는 생체연료 산업에서 사용을 위한 고수준의 오일 또는 알코올을 발현 또는 과발현시키도록 유전자조작될 수 있다.
본 발명은 또한 식물의 개선된 부분을 위해 제공된다. 식물 부분은 이로 제한되지는 않지만, 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 종자, 배젖, 배주, 및 화분을 포함한다. 여기서 고려되는 식물 부분은 자생성, 비자생성, 재생성, 및/또는 비재생성일 수 있다.
일 구현예에서, Soyk 등 (Nat Genet. 2017 Jan;49(1):162-168)은 조기 수확 토마토를 생산하기 위해서 토마토의 개화 억제인자 SP5G를 표적화하는 CRISPR-Cas9 매개된 돌연변이를 사용하였고, 본 발명에 개시된 바와 같은 CRISPR-Cas 시스템을 위해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 C2c1이고, 시스템은 I. CRISPR-Cas 시스템 RNA 폴리뉴클레오티드 서열로서, (a) 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 RNA 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 직접 반복부 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 서열, 및 II. 임의로 적어도 하나 이상의 핵 국재화 서열을 포함하는, C2c1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 직접 반복부 서열은 가이드 서열과 하이브리드화하여 표적 서열로 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도시키고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열과 하이브리드화하거나 또는 하이브리드화가능한 가이드 서열, 및 (2) 직접 반복부 서열과 복합체를 형성하는 CRISPR 단백질을 포함하고, CRISPR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA이다. 일부 구현예에서, 식물 세포 게놈은 T-풍부 PAM을 포함한다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTN-3' 또는 5'-ATTN-3' 이다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTG-3' 이다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 C2c1 단백질이다. C2c1은 Cas9에 의해 생성되는 PAM의 근위 말단에서의 절단과 대조적으로, PAM의 원위 말단에서 이중 가닥 파손을 생성시킨다 (Jinek et al., 2012; Cong et al., 2013). Cpf1 돌연변이된 표적 서열은 단일 gRNA에 의한 반복된 절단에 감수성일 수 있어서, HDR 매개 게놈 편집에서 Cpf1의 적용을 촉진한다고 제안된다 (Front Plant Sci. 2016 Nov 14;7:1683). Cpf1 및 C2c1은 둘 모두가 구조 유사성을 공유하는 V형 CRISPR 단백질이다. C2c1 처럼, Cpf1은 (PAM의 근위 말단에 블런트 절단부를 생성하는 Cas9와 대조적으로) PAM의 원위 말단에 스태거드 이중 가닥 파손을 생성시킨다. 따라서, 일정 구현에에서, 관심 유전자좌는 상동성 지정 복구 (HR 또는 HDR)을 통해 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HR 독립적인 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일정 구현에에서, 관심 유전자좌는 비상동성 말단 결합 (NHEJ)을 통해 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다.
또한 본 발명의 방법에 따라 생성된 식물 세포 및 식물을 제공하는 것으로 본 명세서에 포함된다. 전통적인 육종 방법에 의해 생성되는 유전자 변형을 포함하는 식물의 배우체, 종자, 배아, 접합체 또는 체세포 중 하나, 자손 또는 잡종은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이러한 식물은 표적 서열에 또는 표적 서열 대신에 삽입되는 이종성 또는 외래 DNA 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 이러한 식물은 하나 이상의 뉴클레오티드에서의 변경(돌연변이, 결실, 삽입, 치환)만을 함유할 수 있다. 이렇게 해서, 이러한 식물은 단지 특정 변형의 존재에 의해 그들의 조상 식물과 다를 것이다.
따라서, 본 발명은 본 방법 또는 이의 자손에 의해 생성되는 식물, 동물 또는 세포를 제공한다. 자손은 생성된 식물 또는 동물의 클론일 수 있거나 또는 그들의 새끼에 추가적인 바람직한 형질을 이용하기 위해 동일 종의 다른 개체와 교배시킴으로써 유성생식으로부터 초래될 수 있다. 세포는 다세포 유기체, 특히 동물 또는 식물의 경우에 생체내 또는 생체외일 수 있다.
매우 다양한 식물, 조류, 진균, 효모 등 및 식물 조류, 진균, 효모 세포 또는 조직 시스템이 본 개시의 핵산 구성체 및 상기 언급한 다양한 형질전환 방법을 사용하여 본 명세서에 기술된 바람직한 생리적 및 작물학적 특징을 위해 조작될 수 있다. 매우 다양한 식물, 조류, 진균, 효모 등 및 식물 조류, 진균, 효모 세포 또는 조직 시스템이 본 개시의 핵산 구성체 및 상기 언급한 다양한 형질전환 방법을 사용하여 본 명세서에 기술된 바람직한 생리적 및 작물학적 특징을 위해 조작될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 식물 게놈 내 외래 DNA의 존재를 피하기 위해, CRISPR 성분을 코딩하는 것을 포함하는, 임의의 외래 유전자의 식물 게놈, 조류, 진균, 효모 등으로의 영구적인 도입 없이, 내생성 유전자를 변형시키거나 또는 그들의 발현을 변형시키기 위해 사용된다. 이것은 비유전자이식 식물에 대한 조절 요건이 덜 엄격하기 때문에 흥미로울 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 기능성 도메인은 디아미나제, 바람직하게 아데노신 디아미나제를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
본 명세서에 제공된 CRISPR 시스템은, 표적된 이중-가닥 또는 단일-가닥 파손을 도입 및/또는 유전자 활성화제 및/또는 억제제 시스템을 도입하는데 사용될 수 있고, 제한없이 유전자 표적화, 유전자 대체, 표적된 돌연변이유발, 표적된 결실 또는 삽입, 표적된 역전 및/또는 표적된 전위에 사용될 수 있다. 단일 세포에서 다중 변형을 달성하도록 지시된 다중 표적화 RNA의 공동발현에 의해, 다중복합 게놈 변형이 보장될 수 있다. 이 기술은 증강된 영양 품질, 질환에 대해 증가된 내성 및 항생제 및 비항생제 스트레스에 대한 내성, 및 상업적으로 가치있는 식물 제품 또는 이종성 화합물의 증가된 생산을 비롯한 개선된 형질을 갖는 식물의 높은 정확도 조작에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법은 일반적으로 야생형 식물에 비해 하나 이상의 바람직한 형질을 가진다는 점에서 "개선된 식물, 조류, 진균, 효모 등" 의 생성을 초래한다. 특정 구현예에서, 얻어진 식물, 조류, 진균, 효모 등, 세포 또는 부분은 식물 세포의 전부 또는 일부의 게놈에 혼합된 외생성 DNA 서열을 포함하는 유전자이식 식물이다. 특정 구현예에서, 비-유전자이식 유전자 변형 식물, 조류, 진균, 효모 등, 부분 또는 세포가 얻어지며, 즉, 외생성 DNA 서열 중 어떤 것도 식물의 임의 세포의 게놈에 혼입되지 않는다. 이러한 구현예에서, 개선된 식물, 조류, 진균, 효모 등은 비-유전자이식이다. 내생성 유전자의 변형만이 보장되고, 외래 유전자 중 어떤 것도 식물, 조류, 진균, 효모 등의 게놈에 도입되거나 또는 유지되지 않는 경우에, 얻어진 유전자 변형 작물은 외래 유전자를 함유하지 않으며, 따라서 기본적으로 비유전자이식으로 간주될 수 있다. 식물, 조류, 진균, 효모 등 게놈 편집을 위한 CRISPR-C21 시스템의 상이한 적용은 제한없이, 관심 농업적 형질을 부여하는 하나 이상의 외래 유전자의 도입; 관심 농업적 형질을 부여하는 내생성 유전자의 편집; 관심 농업적 형질을 부여하도록 CRISPR-C2c1 시스템에 의한 내생성 유전자의 조절을 포함한다. C2c1 단백질이 표적 부위에 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)를 생성시키기 때문에, 외생성 DNA 서열은 상동성 지정 복구 (HR) (예를 들어, NHEJ를 통함)에 의해 또는 없이 도입되거나, 또는 녹-인될 수 있다. 작물학적 형질을 부여하는 예시적인 유전자는 해충 또는 병해에 내성을 부여하는 유전자; 식물 질환에 관여되는 유전자, 예컨대, WO 2013046247에 열거된 것; 제초제, 살진균제 등에 대한 내성을 부여하는 유전자; (항생제) 스트레스 내성에 관여되는 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. CCRISPR-Cas 시스템의 사용의 다른 양상은 (웅성) 불임 식물의 생성; 식물/조류 등에서 생식 단계의 증가; 관심 작물에서의 유전자 변형의 생성; 과일-숙성에 대한 영향; 식물/조류 등의 저장 수명 증가; 식물/조류 등에서 알레르겐의 감소; 형질(예를 들어, 영양적 개선)이 더해진 가치의 보장; 관심 내생성 유전자에 대한 스크리닝 방법; 생물연료, 지방산, 유기산 등의 생성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
C2c1 이펙터 단백질 복합체는 비동물 유기체, 예컨디 식물, 조류, 진균, 효모 등에서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 C2c1 시스템을 사용한 게놈 편집을 위한 방법은 본질적으로 임의의 식물, 조류, 진균, 효모 등에 바람직한 형질을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 매우 다양한 식물, 조류, 진균, 효모 등 및 식물 조류, 진균, 효모 세포 또는 조직 시스템이 본 개시의 핵산 구성체 및 상기 언급한 다양한 형질전환 방법을 사용하여 본 명세서에 기술된 바람직한 생리적 및 작물학적 특징을 위해 조작될 수 있다.
갈변 방지 흰단추 버섯 (아리쿠스 비스포러스 (Aaricus bisporus)) 품종은 PEG 형질전환을 통해 버섯 세포로 전달된, 가이드 RNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 CRISPR-Cas9 시스템으로 폴리페놀 옥시다제 유전자에 1-14 nt 결실을 도입하여 개발되었다. 참조: Yang et al. (news.psu.edu/story/432734/2016/10/19/academics/penn-state-developer-gene-edited-mushroom-wins-best-whats-new). 본 명세서에 기술된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 Yang 등의 방법으로 사용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부의 PAM 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 닉카제이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 관심 유전자좌를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 식물 게놈 내 외래 DNA의 존재를 피하기 위해, CRISPR 성분을 코딩하는 것을 포함하는, 임의의 외래 유전자의 식물 게놈, 조류, 진균, 효모 등으로의 영구적인 도입 없이, 내생성 유전자를 변형시키거나 또는 그들의 발현을 변형시키기 위해 사용된다. 이것은 비유전자이식 식물에 대한 조절 요건이 덜 엄격하기 때문에 흥미로울 수 있다.
본 명세서에 제공된 CRISPR 시스템은, 표적된 이중-가닥 또는 단일-가닥 파손을 도입 및/또는 유전자 활성화제 및/또는 억제제 시스템을 도입하는데 사용될 수 있고, 제한없이 유전자 표적화, 유전자 대체, 표적된 돌연변이유발, 표적된 결실 또는 삽입, 표적된 역전 및/또는 표적된 전위에 사용될 수 있다. 단일 세포에서 다중 변형을 달성하도록 지시된 다중 표적화 RNA의 공동발현에 의해, 다중복합 게놈 변형이 보장될 수 있다. 이 기술은 증강된 영양 품질, 질환에 대해 증가된 내성 및 항생제 및 비항생제 스트레스에 대한 내성, 및 상업적으로 가치있는 식물 제품 또는 이종성 화합물의 증가된 생산을 비롯한 개선된 형질을 갖는 식물의 높은 정확도 조작에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법은 일반적으로 야생형 식물에 비해 하나 이상의 바람직한 형질을 가진다는 점에서 "개선된 식물, 조류, 진균, 효모 등" 의 생성을 초래한다. 특정 구현예에서, 얻어진 식물, 조류, 진균, 효모 등, 세포 또는 부분은 식물 세포의 전부 또는 일부의 게놈에 혼합된 외생성 DNA 서열을 포함하는 유전자이식 식물이다. 특정 구현예에서, 비-유전자이식 유전자 변형 식물, 조류, 진균, 효모 등, 부분 또는 세포가 얻어지며, 즉, 외생성 DNA 서열 중 어떤 것도 식물의 임의 세포의 게놈에 혼입되지 않는다. 이러한 구현예에서, 개선된 식물, 조류, 진균, 효모 등은 비-유전자이식이다. 내생성 유전자의 변형만이 보장되고, 외래 유전자 중 어떤 것도 식물, 조류, 진균, 효모 등의 게놈에 도입되거나 또는 유지되지 않는 경우에, 얻어진 유전자 변형 작물은 외래 유전자를 함유하지 않으며, 따라서 기본적으로 비유전자이식으로 간주될 수 있다. 식물, 조류, 진균, 효모 등 게놈 편집을 위한 CRISPR-C21 시스템의 상이한 적용은 제한없이, 관심 농업적 형질을 부여하는 하나 이상의 외래 유전자의 도입; 관심 농업적 형질을 부여하는 내생성 유전자의 편집; 관심 농업적 형질을 부여하도록 CRISPR-C2c1 시스템에 의한 내생성 유전자의 조절을 포함한다. 작물학적 형질을 부여하는 예시적인 유전자는 해충 또는 병해에 내성을 부여하는 유전자; 식물 질환에 관여되는 유전자, 예컨대, WO 2013046247에 열거된 것; 제초제, 살진균제 등에 대한 내성을 부여하는 유전자; (항생제) 스트레스 내성에 관여되는 유전자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. CCRISPR-Cas 시스템의 사용의 다른 양상은 (웅성) 불임 식물의 생성; 식물/조류 등에서 생식 단계의 증가; 관심 작물에서의 유전자 변형의 생성; 과일-숙성에 대한 영향; 식물/조류 등의 저장 수명 증가; 식물/조류 등에서 알레르겐의 감소; 형질(예를 들어, 영양적 개선)이 더해진 가치의 보장; 관심 내생성 유전자에 대한 스크리닝 방법; 생물연료, 지방산, 유기산 등의 생성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
비인간 동물에서 적용
일 양상에서, 본 발명은 임의의 기재된 구현예에 따라 진핵생물 숙주 세포를 포함하는, 비-인간 진핵생물 유기체; 바람직하게는 다세포 진핵생물 유기체를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은진핵 유기체; 바람직하게는 기재된 구현예 중 어느 것에 따른 진핵 숙주 세포를 포함하는 다세포 진핵 유기체를 제공한다. 이들 양상의 일부 구현예에서 유기체는 동물; 예를 들어, 포유류일 수 있다. 또한, 유기체는 절지동물, 예컨대 곤충일 수 있다. 본 발명은 또한 다른 농업 적용분야, 예를 들어, 농장 및 생산 동물로 확대될 수 있다. 예를 들어, 돼지는 그들을 생의학적 모델, 특히 재생 의학으로서 매력있는 많은 특징을 갖는다. 특히, 중증 합병성 면역결핍 (SCID)을 갖는 돼지는 재생의학, 이종장기이식 (또한 본 명세서의 다른 곳에서 논의됨) 및 종양 발생에 유용한 모델을 제공할 수 있으며, 인간 SCID 환자를 위한 요법 개발에 도움을 줄 수 있다. Lee 등 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 May 20;111(20):72605)은 대립유전자 둘 모두에 영향을 미치는 일부를 포함하여, 체세포에서 고효율로 재조합 활성 유전자 (RAG) 2의 표적화된 변형을 생성시키기 위해 리포터-가이드된 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 시스템을 이용하였다. C2c1 이펙터 단백질은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Lee 등 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 May 20;111(20):72605)의 방법은 다음과 유사하게 본 발명에 적용될 수 있다. 돌연변이된 돼지는 태아 섬유아세포에서 RAG2의 표적화 변형에 후속하여 SCNT 및 배아 전달을 통해 생산된다. CRISPR Cas 및 리포터를 코딩하는 구성체는 태아-유래 섬유아세포에 전기천공된다. 48시간 후에, 녹색 형광 단백질을 발현시키는 형질감염 세포는 웰당 단일 세포의 추정 희석으로 96-웰 플레이트의 개개 웰로 분류된다. RAG2의 표적화 변형은 임의의 CRISPR Cas 절단 부위가 측접된 게놈 DNA 단편을 증폭시킨 후에 PCR 산물을 시퀀싱하여 스크리닝된다. 스크리닝 및 오프-부위 (off-site) 돌연변이 확인 후, RAG2의 표적화 변형을 보유한 세포를 SCNT에 사용한다. 난모세포의 인접한 세포질의 일부분과 함께, 아마도 중기 II 플레이트를 함유하는 극체는 제거되고, 도너 세포가 위란강에 위치된다. 재구축된 배아는 이후에 전기적으로 천공되어 도너 세포를 난모세포와 융합시키고, 화학적으로 활성화된다. 활성화된 배아는 14시간 내지 16시간 동안 0.5 μM 스크립타이드 (S7817; Sigma-Aldrich)가 존재하는 돼지 접합자 배지 3 (PZM3)에서 인큐베이션된다. 그 다음으로 배아는 스크립타이드를 제거하기 위해 세척되고 그들이 대리모 돼지의 난관에 전달될 때까지 PZM3에서 배양된다. C2c1 이펙터 단백질은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
본 발명은 동물, 일부 구현예에서 포유류, 일부 구현예에서 인간의 질환 또는 장애를 모델링하기 위한 플랫폼을 생성하는 데 사용된다. 일정 구현예에서, 이러한 모델 및 플랫폼은, 비제한적 예에서 래트 또는 마우스에 기반한 설치류이다. 이러한 모델 및 플랫폼은 근친교배 설치류 균주 중에서의 차이 그리고 이들 간의 비교를 이용할 수 있다. 일정 구현예에서, 이러한 모델 및 플랫폼은 영장류, 말, 소, 양, 염소, 돼지, 개, 고양이 또는 조류를, 예를 들어, 이러한 동물의 질환 및 장애를 직접적으로 모델링하기 위해 또는 이러한 동물의 변형되고/되거나 개선된 계통을 생성하기 위해 이용한다. 유사하게는, 일정 구현예에서, 동물 기반 플랫폼 또는 모델은 인간 질환 또는 장애를 모방하기 위해 생성된다. 예를 들어, 돼지와 인간의 유사성은 돼지를 인간 질환을 모델링하기 위한 이상적인 플랫폼으로 만든다. 설치류 모델에 비해, 돼지 모델의 개발은 비용이 들며 시간 집약적이었다. 반면에, 돼지 및 다른 동물은 유전적으로, 해부학적으로, 생리적으로 그리고 병리생리학적으로 인간과 훨씬 더 유사하다. 본 발명은 이러한 동물 플랫폼 및 모델에서 사용될 표적화된 유전자 및 게놈 편집, 유전자 및 게놈 변형 및 유전자 및 게놈 조절을 위한 고효율 플랫폼을 제공한다. 윤리적 표준이 인간 모델 그리고 다수의 사례에서 비인간 영장류에 기반한 모델의 개발을 차단하지만, 본 발명은 세포 배양 시스템, 3차원 모델 및 시스템, 및 모방을 위한 오가노이드(organoids)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 시험관내 시스템과 함께 사용되고, 인간의 구조, 기관 및 시스템의 유전자, 해부학, 생리학 및 병리생리학을 모델링하고 연구한다. 플랫폼 및 모델은 단일 및 다중 표적의 조작을 제공한다.
소정의 실시형태에서, 본 발명은 Schomberg 등 (FASEB Journal, April 2016; 30(1):Suppl 571.1)]과 유사한 질환 모델에 적용 가능하다. 유전성 질환 섬유종증 1형(NF-1) 숌버그(Schomberg)의 모델링은 돼지 배아 내로 CRISPR/Cas9 성분의 사이토졸 미량주사법에 의해 돼지 뉴로피브로민 1 유전자에서 돌연변이를 도입하기 위해 CRISPR-Cas9를 사용하였다. Cas9에 의한 표적화된 절단을 위해 유전자 내의 엑손의 상류와 하류 둘 다의 부위를 표적화하는 영역에 대해 CRISPR 가이드 RNA(gRNA)가 생성되었고, 2500 bp 결실을 도입하기 위해 특정 단일-가닥 올리고데옥시 뉴클레오티드(ssODN) 주형에 의해 수선이 매개되었다. CRISPR-Cas 시스템은 또한 특정 NF-1 돌연변이 또는 돌연변이의 클러스터를 갖는 돼지를 조작하기 위해 사용되었고, 주어진 인간 개체에 특이적이거나 또는 주어진 인간 개체를 나타내는 돌연변이를 조작하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 인간 다유전자 질환의 돼지 모델을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 동물 모델을 개발하기 위해 유사하게 사용된다. 본 발명에 따르면, 하나의 유전자에서 또는 다중 유전자에서의 다중 유전자 좌위는 다중복합 가이드 및 선택적으로 하나 또는 다중 주형을 이용하여 동시에 표적화된다.
본 발명은 또한 다른 동물, 예컨대, 소의 SNP를 변형시키는 것에 적용 가능하다. Tan 등 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Oct 8; 110(41): 16526- 16531)은 플라스미드, rAAV 및 올리고뉴클레오티드 주형을 이용하여 전사 활성인자-유사(TAL) 이펙터 뉴클레아제(TALEN)- 및 주기적 간격으로 분포하는, 짧은 회문구조 반복부 (CRISPR)/Cas9-자극된 상동성-지정 복구 (HDR)를 포함하도록 가축 유전자 편집 툴박스 (toolbox)를 확장시켰다. 유전자 특이적 gRNA 서열은 그들 방법에 따라서 Church lab gRNA 벡터 (Addgene ID: 41824)에 클로닝하였다 (Mali P, et al. (2013) RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339(6121):823-826). Cas9 뉴클레아제는 RCIScript-hCas9로부터 합성된 mRNAh 또는 Cas9 플라스미드 (Addgene ID: 41815)의 공동형질감염에 의해 제공되었다. 이러한 RCIScript-hCas9는 hCas9 플라스미드 (hCas9 cDNA를 포함)로부터의 XbaI-AgeI 단편을 RCIScript 플라스미드로 서브클로닝하여 구축되었다. C2c1 이펙터 단백질은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 일부 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물의 SNP 위치에서 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Heo 등 (Stem Cells Dev. 2015 Feb 1;24(3):393-402. doi: 10.1089/scd.2014.0278. Epub 2014 Nov 3)은 소 다능성 세포 및 주기적 간격으로 분포하는, 짧은 회문구조 반복부(CRISPR)/Cas9 뉴클레아제를 이용하는 소 게놈에서의 고도로 효율적인 유전자 표적화를 보고하였다. 첫째로, Heo 등은 야마나카 인자의 이소성 발현 및 GSK3β 및 MEK 억제제(2i) 처리에 의해 소 체세포 섬유아세포로부터 유도만능줄기세포(iPSC)를 생성한다. Heo 등은 이들 소 iPSC가 기형종에서의 유전자 발현 및 발생 잠재력에 관해 미경험 다능성 줄기 세포와 고도로 유사하다는 것을 관찰하였다. 게다가, 소 NANOG 유전자좌에 특이적인 CRISPR-Cas9 뉴클레아제는 소 iPSC 및 배아에서 소 게놈의 고도로 효율적인 편집을 나타내었다. C2c1 이펙터 단백질은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 NANOG 유전자좌 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 NANOG 유전자좌를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 NANOG 유전자좌에 상응하는 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Igenity®는 소와 같은 동물의 프로파일 분석을 제공하여, 경제적으로 중요한 경제적 특성들의 특성, 예컨대 도체 조성, 도체 품질, 모계 및 번식 특성, 및 평균 일일 체중증가를 수행 및 전송한다. 종합적 Igenity® 프로파일의 분석은 DNA 마커 (가장 흔하게는 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 SNP)의 발굴에서 시작된다. Igenity® 프로파일 배후의 모든 마커는 대학교, 연구 기관 및 USDA와 같은 정부 기관을 포함한, 연구 시설에서 독립 과학자에 의해 발굴되었다. 이어서, 마커는 검증 개체군에서 Igenity®로 분석된다. Igenity®는, 흔하게 이용가능하지 않은 표현형을 수집하기 위해 종축, 소-송아지, 가축사육장 및/또는 소고기 산업 포장 부문의 산업 파트너와 종종 함께 작업하여, 다양한 생산 환경 및 생물학적 유형을 대표하는 다수 자원 집단을 이용한다. 소 게놈 데이터베이스는 널리 이용 가능하며, 예를 들어, NAGRP 소 게놈 협응 프로그램 (Cattle Genome Coordination Program) (www.animalgenome.org/cattle/maps/db.html)을 참조한다. 따라서, 본 발명은 소 SNP를 표적화하는 데 적용될 수 있다. 당업자는 SNP를 표적화하기 위해 상기 프로토콜을 이용할 수 있으며, 그들에, 예를 들어, Tan 등 또는 Heo 등이 기재한 바와 같이 소 SNP를 적용할 수 있다.
Qingjian Zou 등 (Journal of Molecular Cell Biology Advance Access published October 12, 2015)은 개 미오스타틴 (MSTN) 유전자 (골격근량의 음성 조절자)의 제1 엑손을 표적화함으로써 개에서의 증가된 근육량을 입증하였다. 먼저, sgRNA의 효율은 개 배아 섬유아세포 (CEF)로 Cas9 벡터와 MSTN 표적화 sgRNA의 공동형질감염을 이용하여, 입증되었다. 이후에, Cas9 mRNA와 MSTN sgRNA 혼합물에 의한 정상 형태를 갖는 배아의 미량주사 및 동일한 암컷 개의 수란관 내로 접합체의 자가이식에 의해 MSTN KO 개가 생성되었다. 녹아웃 강아지는 야생형 한배새끼 자매에 비해 넓적다리에 대해 분명한 근육 표현형을 나타내었다. 이는 또한 본 명세서에 제공된 CRISPR-C2c1 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
가축
가축에서 바이러스 표적은, 일부 구현예에서, 예를 들어 돼지 마크로파지상의 돼지 CD163을 포함할 수 있다. CD163은 PRRSv (돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, arterivirus)에 의한 감염과 관련된다 (바이러스 세포 진입을 통한 것으로 여겨짐). 특히 돼지 폐포 마크로파지 (폐에 존재)의 PRRSv에 의한 감염은 사육 돼지에서의 번식 장애, 체중 손실 및 높은 폐사율을 포함하여, 고통을 초래하는 사전 치유불가의 돼지 증후군 ("미확인 돼지 질환" 또는 "청색귀 질환")을 야기한다. 기회감염, 예컨대, 유행성 폐렴, 뇌수막염 및 귀 부종은 종종 마크로파지 활성 상실을 통한 면역 결핍에 기인하는 것으로 보인다. 또한 증가된 항생제 사용 및 재정 손실 (연간 $660m로 추정)로 인해 상당한 경제적 및 환경적 영향을 받는다.
미주리 유니버시티에서 그리고 제너스 plc(Genus Plc)과의 공동작업으로 크리스틴 엠 휘트워스(Kristin M Whitworth) 및 랜달 프라터 박사(Dr Randall Prather) 등(Nature Biotech 3434 published online 07 December 2015)에 의해 보고된 바와 같이, CD163은 CRISPR-Cas9를 이용하여 표적화되었고 편집된 돼지의 새끼는 PRRSv에 노출되었을 때 내성이 있었다. 모두 CD163의 엑손 7에서 돌연변이를 갖는 한 마리의 파운더 (founder) 수컷과 한 마리의 파운더 암컷을 새끼를 생산하도록 육종되었다. 파운더 수컷은 하나의 대립유전자 상의 엑손 7에서 11-bp 결실을 가졌는데, 이는 프레임 시프트 돌연변이 및 도메인 5 내 아미노산 45에서의 미스센스 번역 및 아미노산 64에서 후속적인 조기 정지 코돈을 초래한다. 다른 대립유전자는 선행 인트론에서의 엑손 7 및 377-bp 결실에서 2bp 첨가를 갖는데, 이는 도메인 5의 처음 49개 아미노산의 발현을 초래하고, 그 다음에 아미노산 85에서 조기 정지 코돈을 초래하는 것으로 예측되었다. 암퇘지는 번역되었을 때 도메인 5의 처음 48개 아미노산, 아미노산 70에서 조기 정지 코돈을 발현시키는 하나의 대립유전자에서 7 bp 첨가를 가진다. 암퇘지의 다른 대립유전자는 증식 가능하지 않다. 선택된 새끼는 비대립(null) 동물(CD163-/-), 즉, CD163 녹아웃인 것으로 예측되었다.
따라서, 일부 구현예에서, 돼지 꽈리 대식세포는 CRISPR 단백질에 의해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 돼지 CD163은 CRISPR 단백질에 의해 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 돼지 CD163은 DSB의 유도를 통해, 또는 삽입 또는 결실, 예를 들어, 상기 기재한 것 중 하나 이상을 포함하는, 엑손 7의 표적화 결실 또는 변형, 또는 유전자의 다른 영역, 예를 들어 엑손 5의 결실 또는 변형을 통해 녹아웃될 수 있다.
편집된 돼지 및 그의 자손, 예를 들어 CD163 녹아웃 돼지가 또한 고려된다. 이는 가축, 육종 또는 모델링 목적 (즉, 돼지 모델)을 위한 것일 수 있다. 유전자 녹아웃을 포함하는 정액이 또한 제공된다.
CD163은 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 (SRCR) 슈퍼패밀리의 멤버이다. 단백질의 SRCR 도메인 5 시험관내 연구는 바이러스 게놈의 패키징 해체 (unpackagin) 및 방출을 초래하는 도메인에 기반한다. 이와 같이, SRCR 슈퍼패밀리의 다른 멤버은 또한 다른 바이러스에 대한 내성을 평가하기 위해 표적화될 수 있다. PRRSV는 또한 또한 쥐과 락테이트 디히드로게나제-상승 바이러스, 유인원 출혈열 바이러스 및 말 동맥염 바이러스를 포함하는 포유동물 아테리바이러스 그룹의 멤버이다. 아테리바이러스는 마크로파지 향성 및 중증 질환 및 지속적 감염을 유발하는 능력을 포함하는, 중요한 병원성 특성을 공유한다. 따라서, 아테리바이러스, 및 특히 쥐과 락테이트 디히드로게나제-상승 바이러스, 유인원 출혈열 바이러스 및 말 동맥염 바이러스는, 예를 들어, 돼지 CD163 또는 다른 종의 이의 상동체를 통해 표적화될 수 있고, 및 쥐과, 유인원 및 말 모델 및 녹아웃이 또한 제공된다.
사실, 이 접근은 인간에 전염될 수 있는 다른 가축 질환을 야기하는 바이러스 또는 박테리아, 예컨대, 인플루엔자 C 및 H1N1, H1N2, H2N1, H3N1, H3N2 및 H2N3으로서 알려진 인플루엔자 A의 아형을 포함하는 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 균주뿐만 아니라 상기 언급된 폐렴, 뇌수막염 및 부종에까지 확대될 수 있다.
C2c1 이펙터 단백질은 상기 기술된 바와 같은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부의 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 CD163 유전자좌에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 CD163을 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축의 게놈을 변형시키지 않고 CD163 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
UCP1 (언커플링 단백질 1)은 내부 미토콘드리아 막 상에 위치하고 내막을 가로지르는 양자 수송으로부터 ATP 합성을 탈결합시켜서 열을 발생시킨다. UCP1은 비오한 열생산의 핵심 요소이고 신체 지방과다의 조절에서 아마도 중요한 듯 하다. 기능성 UCP1 유전자가 결여된 돼지 (Artiodactyl family Suidae)는 부실한 체온조절을 겪어서 추위에 취약하다. 돼지의 지방 축적은 또한 그들의 UCP1 결여와 연관될 수 있으므로, 돼지 생산 효율에 영향을 미칠 수 있다. Zheng 등은 돼지 내생성 UCP1 유 전자좌로 마우스 아디포넥틴-UCP1을 효율적으로 삽입시키기 위해 CRISPR/Cas9-매개, 상동성 재조합 (HR)-독립적 접근법의 적용을 보고하였다
UCP1 녹-인 (KI) 돼지는 극심한 저온 노출 동안 체온을 유지하는 개선된 능력을 보였지만, 신체 활동 수준 또는 총 일일 에너지 소비 (DEE)에 변경은 없었다. 백색 지방 조직 (WAT)에서 이소성 UCP1 발현은 지방 축적을 4.89% (P < 0.01) 까지 극적으로 감소시켜서, 결과적으로 도체 살코기 비율이 증가된다 (CLP; P < 0.05). 기전 연구는 WAT에서 UCP1 활성화 시 지방 손실이 상승된 지방분해와 연관되었다는 것을 의미하였다. 본 발명에서 개시된 CRISPR-C2c1 시스템은 Zheng 등이 기술한 바와 같은 유사한 시스템에 적용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 도입시킨다. 일부 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 HR 독립 기전, 예컨대 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시키는데 사용될 수 있다.
Niu 등 (DOI: 10.1126/science.aan4187)은 CRISPR-Cas9 시스템으로 체세포 핵 전달을 통해 돼지 내생성 레트로바이러스 (PERV) 불활성화된 돼지 가축을 보고하였다. 이종이식은 인간 이식을 위한 장기 부족을 완화시키기 위한 유망한 전략이다. 돼지에게 무해한 돼지 내생성 레트로바이러스 (PERV)의 종간 전달의 주요 위험 하나는 인간에게 치명적일 수 있다는 것이다. CRISPR-Cas9를 사용한 불멸화 돼지 세포주에서 PERV 활성의 불활성화 및 체세포 핵 전달을 통한 PERV-불활성화된 돼지의 생성이 기술되어 있다. Wu 등 (Scientific Reports 7, Article number: 10487 (2017) doi:10.1038/s41598-017-08596-5)은 키메라-적능 인간 다능성 줄기 세포와 조합했을 때 돼지의 장기 및 인간 조직의 이종-생성을 위한 적합한 플랫폼으로서 제공될 수 있는, PDX1 유전자를 표적화하는 이중 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 접합체 동시-전달을 통한 돼지 배아에서 췌장형성의 효율적인 불능화를 보고하였다. Zhou 등 (Hum Mutat 37:110-118, 2016)은 80%로 높은 효율로 주형으로서 단일 가닥 DNA를 사용하여 돼지 접합자에서 CRISPR-Cas9 유도된 HDR을 통한 정밀한 오솔로그 인간 돌연변이 (Sox 10 c.A325>T )를 보유한 유전자-변형된 돼지를 보고하였다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 돼지 가축을 생산하기 위해서 Niu 등, Wu 등, Zhou 등이 기술한 바와 유사한 시스템에 적용될 수 있다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 바이러스 내성 관련 유전자를 변형시킨다. 부정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 질환 관련 유전자를 변형시킨다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축 생물량 관련 유전자를 변형시킨다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축 형질 관련 유전자를 변형시킨다. 특정 구현예에서, 형질 관련 유전자는 지방 과다의 조절에 관여된다. 일부 구현예에서, 형질 관련 유전자는 특별한 단백질의 발현 조절에 관여되고, 이러한 단백질은 음식 알레르기와 관련된다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 UCP1 유전자좌를 변형시킨다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부의 PAM 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 관심 유전자좌를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축의 게놈을 변형시키지 않고 관심 표적 유전자좌의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Gao 등 (Genome Biology 201718:13, doi:10.1186/s13059-016-1144-4)은 소의 선택된 유전자좌에서 유전자 삽입을 유도하기 위해 단일 CRISPR-Cas9 닉카제 (Cas9n)을 사용한 결핵 (TB) 내성 소 가축을 보고하였다. 촉매적 불활성 Cas9 단백질의 주요 결합 부위는 염색질 면역침전 시퀀싱 (ChIP-seq)를 사용하여 소 태아 섬유아세포 (BFF)에서 결정하였다. 후속하여, CRISPR-Cas9n-유도된 단일-가닥 파손을 사용하여 자연 내성-연관 마크로파지 단백질-1 (NRAMP1) 유전자의 삽입을 자극시켰다. TB 내성 가축은 체세포 핵 전달을 통해 수득되었다. Carlson 등 (Nat Biotechnol. 2016 May 6;34(5):479-81. doi: 10.1038/nbt.3560)은 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)을 사용해 소 배아 섬유아세포의 게놈에 POLLED 유전자의 대립유전자를 삽입시키고 나서 체세포 핵 전달을 후속하여 유전자 조작된 세포주를 클로닝하고 수령체 소에게 배아를 이식한 무뿔 젖소 가축을 보고하였다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 소 가축 생산에서 Gao 등 및 Carlson 등에서 기술된 바와 유사한 시스템에 적용될 수 있다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 바이러스 내성 관련 유전자를 변형시킨다. 부정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 질환 관련 유전자를 변형시킨다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축 생물량 관련 유전자를 변형시킨다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축 형질 관련 유전자를 변형시킨다. 일부 구현예에서, 형질 관련 유전자는 특별한 단백질의 발현 조절에 관여되고, 이러한 단백질은 음식 알레르기와 관련된다.특정 구현예에서, 형질 관련 유전자는 지방 과다의 조절에 관여된다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부의 PAM 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 닉카제이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 관심 유전자좌를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축의 게놈을 변형시키지 않고 관심 표적 유전자좌의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
2종의 닭 유전자 오브알부민 (OVA) 및 오보뮤코이드 (OVM)은 계란 흰자 알레르기와 관련된 것으로 확인되었다. OVA 및 OVM의 유전자 파괴는 계란에서 낮은 알레르기원성을 생성시킬 잠재성을 가져서, 계란 흰자-함유 식제품 및 백신같은 항목에 민감한 개체에서 면역 반응을 감소시킨다. Oishi 등 (Scientific Reports 6, Article number: 23980 (2016) doi:10.1038/srep23980)은 닭에서 CRISPR/Cas9-매개 유전자 표적화를 보고하였다. 2종의 계란 흰자 유전자, 오브알부민 및 오보뮤코이드는 Cas9, 단일 가이드 RNA, 및 약물 내성을 코딩하는 유전자를 코딩하는 원형 플라스미드의 형질감염에 이어서 일시적 항생제 선별에 의해 배양된 닭 원시 생식 세포 (PGC)에서 효율적으로 (> 90%) 돌연변이유발되었다. CRISPR-유도된 돌연변이체-오보뮤코이드 PGC는 수령체 닭 배아로 이식되었고 3종의 배선 키메라 수탉 (G0)을 확립하였다. 모든 수탁은 도너-유래 돌연변이체-오보뮤코이드 정자를 가졌고 높은 전파율의 도너-유래 생식체를 갖는 둘은 다음 세대 (G1)에서 그들 도너-유래 자손의 약 절반만큼 이형접합 돌연변이체 오보뮤코이드 닭을 생산하였다. 오보뮤코이드 동형접합 돌연변이체 자손 (G2)는 G1 돌연변이체 닭을 교배하여 생성시켰다.
전통적인 조류의 트랜스제네시스 방법은 배반엽의 레트로바이러스 감염 또는 원시 생식 세포 (PGC)의 생체외 조작에 이어 수령체 배아로 세포의 역 주입을 포함한다. 포유동물 시스템과 달리, 조류 배아 PGC는 그들이 정자 또는 난자 생산 세포가 되는 생식샘으로의 그들 경로 상의 혈관구조를 통한 이동을 겪는다. Tyack 등 (Transgenic Res. 2013 Dec;22(6):1257-64. doi: 10.1007/s11248-013-9727-2)은 트랜스포존에 운반되는 리포터 유전자를 발현시키는 생체내 생성 유전자이식 자손에서 PGC를 안정하게 형질전환시키기 위해 Tol2 트랜스포존 및 트랜스포사제 플라스미드와 복합체 형성된 리포펙타민 2000을 사용한 PGC의 형질전환 방법을 기술하였다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRISPR-C2c1 시스템은 가금류 가축 생산에서 Oishi 등에서 기술된 바와 유사한 시스템에 적용될 수 있다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 바이러스 내성 관련 유전자를 변형시킨다. 부정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 질환 관련 유전자를 변형시킨다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축 생물량 관련 유전자를 변형시킨다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축 형질 관련 유전자를 변형시킨다. 일부 구현예에서, 형질 관련 유전자는 특별한 단백질의 발현 조절에 관여되고, 이러한 단백질은 음식 알레르기와 관련된다. 특정 구현예에서, 형질 관련 유전자는 지방 과다의 조절에 관여된다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부의 PAM 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 닉카제이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 관심 유전자좌를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축의 게놈을 변형시키지 않고 관심 표적 유전자좌의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
동물 모델
본 발명은 생체내, 생체외 및 시험관내에서 동물 모델 및 세포 모델을 개발하는데 사용할 수 있는 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다.
Niu 등 (Cell. 2014 Feb 13;156(4):836-43. doi: 10.1016/j.cell.2014.01.027)은 인간 질환을 연구하고 치료 전략을 개발하기 위해서 중요한 모델 종으로서 제공될 수 있는 원숭이 모델을 개발하였지만, 생물의학 연구에서 원숭이의 적용은 CRISPR/Cas9 시스템을 적용하여 바람직한 표적 부위에서 유전자 변형된 동물을 생성시키는데 어려움으로 인해 상당히 방해받았다. 시스템은 1 단계에서 2개 표적 유전자 (Ppar-γ 및 Rag1)의 동시 파괴를 가능하게 하고, 오프-표적 돌연변이유발이 종합 분석을 통해 검출되지 않았다.
Wang 등 (Cell. 2013;153(4):910-8)은 Cas9 mRNA 및 sgRNA의 수정된 접합체로의 직접 주사를 사용하여 단일 (95%) 또는 이중 돌연변이체 (70-80%) 마우스를 생산하기 위해 고효율로 배아 줄기 세포 (ESC) 형질감염 모델의 생산을 기술하였다. 마우스 접합체 세포에서 다양한 마우스 모델은 하기 문헌에 기술되었다: yen et al, Dev Biol. 2014;393(1):3-9, Aida et al. Biol. 2015;16(1):87, Inui et al., Sci Rep. 2014;4:5396, Yang et al. Cell. 2013;154(6):1370-9. 줄기 세포의 생체외 변형을 포함하는 이식 질환 모델은 예를 들어, Eμ-Myc 림프종에서 p53을 표적화하는 sgRNA를 사용해, 배선 돌연변이를 생성시키기 위한 대안을 제공한다. 참조: Heckl et al, Nat Biotechnol. 2014;32(9):941-946, Chen et al. Cell. 2015;160(6):1246-1260.
일 양상에서, 본 발명은 특히 1형 신경섬유종증 (NF1) 신경유전 병태에 의해 유도되는 중추신경계의 종양의 치료를 제공한다. NF1을 갖는 개체는 NF1 유전자에 배선 돌연변이를 갖고 태어나지만, 자폐증 및 주의력 결핍부터 뇌 및 말초 신경초 종양의 범위에 걸쳐서, 수많은 개별 신경학적 문제가 발생될 수 있다. 본 발명은 환자-특이적 질환 모델을 개발하고 동질유전자 배경에서 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 질환 관련 세포를 연구하기 위해 사용될 수 있다. 유도 만능 줄기 세포 또는 iPSC로도 알려진, 배아 줄기 세포 (ESC)-유사 세포는 성인 환자의 피부 또는 혈액 세포로부터 생성될 수 있다. 최근의 연구 노력은 NF1 환자에 영향을 미치는 중추 및 말초 신경계 (CNS 및 PNS)에서 다양한 세포 유형으로 iPSC를 분화시키는 배양 프로토콜을 개발하기 위해 시작되었다. 본 발명의 CRISPR C2c1 시스템은 현존 돌연변이체 유전자를 복구하거나 또는 새로운 돌연변이를 창출하여 특이적 질환 유전자를 유전자 편집하는데 사용될 수 있다. NF1 연구의 최전선에 자리잡기 위해서, 국립 아동 의료 센터 (Children's National Medical Center)의 길버트 가족 신경섬유종증 연구소 (Gilbert Family Neurofibromatosis Institute) (GFNI)는 이들 최근의 흥미로운 연구 개발을 조사하고, 환자-특이적 인간 NF1 질환 모델을 체계적으로 개발하고, 개별 NF 환자에 대한 약물 스크리닝 및 평가를 위한 도구를 제공하는 것이 중요할 것이다.
일 양상에서, 본 발명은 유도가능한 질화나 모델을 개발하는 방바ㅓㅂ을 제공한다.
Platt 등 (Cell. 2014;159(2):440-55.) 은 Cre-의존적 CAGs-LSL-Cas9 녹인 이식유전자를 개발하였지만, '올-인-원', 독소시클린 (dox)-유도성 구성체가 동물의 배선에서 sgRNA 및 Cas9 둘 모두를 제공하기 위해 생성되었다. Cre-의존적 모델은 현행 Cre-구동 시스템으로 CRISPR-매개 표적화의 단순 도입을 가능하게 하고, 강력한 CAG 프로모터의 하류에서 강력하고 광범위한 Cas9 발현을 제공한다. dox-유도성 모델은 개체 또는 다수 조직에서 표적화를 가능하게 하고, 외생성 sgRNA를 전달하는 능력에 의해 제한되지 않으며, 유전자 변형 후 Cas9 발현을 없애는 수단을 제공한다. 양쪽 접근법은 다수 조직에서 단일 또는 다중 유전자 변형의 극도로 높은 효율을 보이고, 전통적인 유전자 녹아웃에서 보이느 표현형 결과를 요약한다. 각각은 외생적으로 또는 동물의 배선을 통해서 sgRNA의 전달에 적합하지만, 중요하게, 게놈 내 Cas9의 안정한 통합은 크기 제한적 바이러스 카세트로 거대 Cas9 cDNA 패키징의 복잡성을 피한다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집에 의한 인간 질환의 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP) 모델의 창출은 이제 설치류에서 일반적이다. 이들 모델은 인간 유전학에 기능적 통찰력을 이끌어주고 잠재적인 새로운 요법의 개발을 허용한다. 예를 들어, 인간 GWAS는 인간에서 혈소판 분비의 조절인자인, STXBP5 유전자에서 잠재적 병리성 SNP (rs1039084 A;>G)를 확인하였다. 이 돌연변이를 거의 동일한 혈전증 표현형을 갖는 마우스에서 CRISPR을 통해 재현하여 인간에서 이 SNP의 인과관계를 확인하였다 (Zhu et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017;37:264-270). 유사하게, 전체-게놈 시퀀싱을 사용하여 에스토니아의 개체군-기반 바이오뱅크에서 GWAS를 수행하였다. 수많은 잠재적 인과적 변이체 및 기초 기전을 확인하였다. 그들 중 하나는 호염기구 생산에 필수적인 조절 요소로서, 전사 인자 CEBPA의 발현을 조절하는 이러한 과정 동안 특이적으로 작용한다. 이러한 인핸서는 조혈 줄기 및 전구 세포에서 CRISPR/Cas9에 의해 교란되어서 호염기구 분화 동안 CEBPA 발현을 특이적으로 조절한다는 것을 입증한다 (Guo et al. Proc Natl Acad Sci. 2016;114:E327-E336. doi: 10.1073/pnas.1619052114).
본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템은 Zhu 등, Niu 등, 및 Wang 등에 기술된 바와 같은 교란 및 파괴 시스템에 기술된 방법과 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 동물 모델은 비-인간 진핵생물 세포이다. 일부 실시형태에서, 동물 모델은 비인간 포유동물 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 동물 모델은 영장류 세포를 포함한다. 일정 구현예예서, 동물 모델은 어류, 제브라 피쉬, 유인원, 침팬지, 마카크 원숭이, 마우스, 토끼, 래트, 개, 소, 양, 염소 또는 돼지 세포를 포함한다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부의 PAM 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 닉카제이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 관심 유전자좌를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축의 게놈을 변형시키지 않고 관심 표적 유전자좌의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
치료적 응용
명백할 것이지만, 본 시스템은 임의의 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 표적화하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 비-천연 발생 또는 조작된 조성물, 또는 상기 조성물의 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 생체내, 생체외 또는 시험관내 표적 세포를 변형하는 데 사용하기 위한 상기 조성물 성분을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 벡터 또는 전달 시스템을 제공하고, 일단 변형되면, CRISPR 변형된 세포의 자손 또는 세포주는 변형된 표현형을 보유하도록 세포를 변경시키는 방식으로 수행될 수 있다. 변형된 세포 및 자손은 다중 세포 유기체, 예컨대, 목적하는 세포 유형에 대한 CRISPR 시스템의 생체외 또는 생체내 적용을 갖는 식물 또는 동물의 일부분일 수 있다. CRISPR 발명은 치료적 처치 방법일 수 있다. 치료적 처리 방법은 유전자 또는 게놈 편집, 또는 유전자 치료법을 포함할 수 있다.
박테리아, 균류 및 기생 병원균과 같은 병원균의 치료
본 발명은 박테리아, 균류 및 기생 병원균을 처리하는데 적용될 수도 있다. 대부분의 연구 노력은 새로운 항생제의 개발에 집중하며, 일단 개발되면, 그럼에도 불구하고 이는 약물 저항성의 동일한 문제의 대상이 될 것이다. 본 발명은 그러한 어려움들을 극복하는 신규 CRISPR-기반 대안을 제공한다. 나아가, 기존의 항생제와 달리, CRISPR-기반 치료는 병원균 특이적으로 제조될 수 있어서, 유익한 박테리아는 회피하면서 표적 병원균의 박테리아 세포 사멸을 유도한다.
Jiang외 다수(문헌["RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems", Nature Biotechnology vol. 31, p. 2339, March 2013])는, CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 S. 뉴모니아에 및 에스케리키아 콜라이를 돌연변이 또는 사멸시킨다. 정확한 돌연변이를 게놈 내로 도입한 이 작업은 돌연변이되지 않은 세포를 사멸시키기 위하여 표적화된 게놈 부위에서의 이중-RNA:Cas9-유도된 절단에 의존하였으며, 선별 마커 또는 대항-선택 시스템에 대한 필요를 피하였다. CRISPR 시스템은 항생제 저항성을 역전하고, 균주들 간의 저항성의 전달을 제거하는 데 사용되었다. Bickard 등은, 독성 유전자를 표적하도록 재프로그램화된 Cas9가 독성인 S. 아우레우스를 사멸시키지만, 비독성 S. 아우레우스는 사멸시키지 않았음을 보였다. 항생제 저항성 유전자를 표적화하는 뉴클레아제의 재프로그램화는, 항생제 저항성 유전자를 품은 스태필로코커스 플라스미드를 파괴하고, 플라스미드-유래 저항성 유전자의 확산에 대해 면역화되었다. (참조: Bikard et al., "Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials," Nature Biotechnology vol. 32, 1146-1150, doi:10.1038/nbt.3043, published online 05 October 2014.) Bikardss는, CRISPR-Cas9 항균제가 마우스 피부 콜로니화 모델에서 S. 아우레우스를 사멸시키도록 생체 내에서 작용함을 보였다. 유사하게, Yosef외 다수는 CRISPR 시스템을 사용하여 β-락탐 항생제에 대한 저항성을 수여하는 효소를 인코딩하는 유전자를 표적화하였다 (see Yousef et al., "Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 112, p. 7267-7272, doi: 10.1073/pnas.1500107112 published online May 18, 2015).
CRISPR 시스템은 기타 다른 유전학적 접근에 대해 저항성인 기생충의 게놈을 편집하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR-Cas9 시스템은 플라스모듐 요엘리(Plasmodium yoelii) 게놈 내로 이중-가닥 파손을 도입하는 것을 나타내었다(참조: Zhang et al., "Efficient Editing of Malaria Parasite Genome Using the CRISPR/Cas9 System," mBio. vol. 5, e01414-14, Jul-Aug 2014). Ghorbal 등 (" 'Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparumusing the CRISPR-Cas9 system," Nature Biotechnology, vol. 32, p. 819-821, doi: 10.1038/nbt.2925, published online June 1, 2014)은 각각 아르테미시닌에 대한 내성 출현 및 유전자 침묵화에서 추정 역할을 갖는, 2개 유전자, orc1 및 kelch13의 서열을 변형시켰다. 적절한 부위에서 변경된 기생충은 변형에 대한 직접 선택은 없음에도 불구하고 매우 높은 효율로 회수되어, 중립성 또는 심지어는 유해한 돌연변이가 이 시스템을 사용하여 생성될 수 있음을 나타낸다. CRISPR-Cas9는 또한 톡소플라스마 곤디를 포함한, 다른 병원성 기생충의 게놈을 변형시키는데 사용된다 (참조: Shen et al., "Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii using CRISPR/CAS9," mBio vol. 5:e01114-14, 2014; and Sidik et al., "Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9," PLoS One vol. 9, e100450, doi: 10.1371/journal.pone.0100450, published online June 27, 2014).
Vyas 등 ("A Candida albicans CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families," Science Advances, vol. 1, e1500248, DOI: 10.1126/sciadv.1500248, April 3, 2015) 은 CRISPR 시스템을 이용하여 C. 알비칸스에서의 유전적 조작에 대한 오랜 장애를 극복하였으며, 몇몇 상이한 유전자의 두 개의 카피 모두를 단일 실험에서 효율적으로 돌연변이시켰다. 몇몇 메카니즘이 약물 저항성에 기여하는 유기체에서, Vyas는 부모의 임상적 분리물 Can90에 의해 나타나는 플루코나졸 또는 시클로헥시미드에 대한 초저항성을 더 이상 나타내지 않는 동형접합성 이중 돌연변이체를 생산하였다. Vyas는 조건적 대립형질을 만듬으로써 C. 알비칸스의 필수 유전자에서의 동형접합성 기능 손실 돌연변이를 또한 수득하였다. 리보솜 RNA 가공에 대해 요구되는 DCR1의 널 대립형질은 저온에서 치명적이지만 고온에서는 생존성이다. Vyas는 논센스 돌연변이를 도입하고, 16℃에서 성장하는 데 실패한 dcr1/dcr1 돌연변이체를 분리한 복구 주형을 사용하였다.
염색체 유전자좌의 파괴에 의해 피.팔시파럼에서 사용을 위한 본 발명의 CRISPR 시스템. Ghorbal 등 (문헌 ["Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system" , Nature Biotechnology, 32, 819821 (2014), DOI:10.1038/nbt.2925, 2014년 6월 1일)은 CRISPR 시스템을 사용하여 특정 유전자 녹아웃 및 단일-뉴클레오티드 치환을 말라리아 게놈에서 도입하였다. 피. 팔시파럼에 CRISPR-Cas9 시스템을 적합화시키기 위해서, Ghorbal 등은 DSM1에 대한 내성을 부여하는, 약물-선별 마커 ydhodh, 피. 팔시파럼 디히드로오로테이트 디히드로게나제 (PfDHODH) 억제제를 보유하고, sgRNA의 전사를 위해, 동일한 플라스미드, pL7 상에서 상동성 재조합 복구를 위한 도너 DNA 주형 및 가이드 RNA를 위치시킨 피. 팔시파럼 U6 소형 핵 (sn)RNA 조절 엘리먼트를 보유하는 pUF1-Cas9 에피솜의 플라스모듐 조절 엘리먼트의 조절 하의 발현 벡터를 생성시킨다. 참조: Zhang C. et al. ("Efficient editing of malaria parasite genome using the CRISPR/Cas9 system", MBio, 2014 Jul 1; 5(4):E01414-14, doi: 10.1128/MbIO.01414-14) 및 Wagner et al. ("Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum, Nature Methods 11, 915-918 (2014), DOI: 10.1038/nmeth.3063).
일 양상에서, 본 발명은 A/T 풍부 게놈을 갖는 유기체 예컨대 피. 팔시파럼의 염색체 유전자좌를 파괴하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR 시스템은 CRISPR-C2c1 시스템을 포함하고, C2c1 단백질은 표적 부위에서 7-nt 스태거드 절단부를 생성시키고, PAM 서열은 T-풍부 서열이다 (Gardner et al., Nature. 2002;419:531-534). 당업자는 Jiang 등, Bikard 등, Yosef 등, Vyas 등, Ghober 등, Zhang 등 및 Wagner 등에 기술된 방법을 A/T 풍부 게놈에서 서열 파괴를 도입시키기 위해 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템과 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 주형 DNA 서열을 삽입, 또는 "녹-인" 시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, DNA 삽입은 적절한 배향으로 게놈에 통합되도록 설계된다. 바람직한 구현예에서, 관심 유전자좌는 비분열 세포에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형되고, 여기서 상동성 지정 복구 (HDR) 기전을 통한 게놈 편집이 특히 도전적이다 (Chan et al., Nucleic acids research. 2011;39:5955-5966). Maresca 등 (Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546)은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 Tale 뉴클레아제 (TALEN)를 사용해 적용가능한 부위 지정된, 정밀 삽입 방법을 기술하는데, 여기서 5' 오버행을 갖는 짧은, 이중-가닥 DNA가 상보성 말단에 결찰되어, 인간 세포주에서 한정된 유전자좌에서 15-kb 외생성 발현 카세트의 정밀한 삽입을 가능하게 하였다. He 등 (Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9))은 4.6 kb 무프로모터 ires-eGFP 단편을 GAPDH 유전자좌에 CRISPR/Cas9-유도 부위-특이적 녹-인으로 체세포 LO2 세포에서 최대 20% GFP+ 세포를 산출하였고, NHEJ 경로에 의해 매개되는 인간 배아 줄기 세포에서 1.70% GFP+ 세포를 산출하였다고 기술하였으며, 또한 NHEJ-기반 녹-인이 조사된 모든 인간 세포 유형에서 HDR-매개 유전자 표적화에 비해 더 효율적이라고 보고하였다. C2c1이 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단을 생성시키기 때문에, 당업자는 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템을 사용해 관심 유전자좌에서 외생성 DNA 삽입을 발생시키기 위해서 Meresca 등 및 He 등에 기술된 거소가 유사한 방법을 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM 서열의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 먼저 변형되고, PAM 서열 근처에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 더욱 변형되며 HDR을 통해 복구된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR을 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ를 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 3' 및 5' 말단 둘 모두 상에서 단일 가이드 DNA(sgDNA)-PAM 서열이 측접된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 CRISPR-C2c1 절단 이후에 방출된다.
HIV와 같은 바이러스 병원균같은 병원균의 치료
Cas-매개된 게놈 편집은 체세포 조직 내로 보호성 돌연변이를 도입하여 비유전적 또는 복합 질병과 싸우는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 림프구에서 CCR5 수용체의 NHEJ-매개 불활성화 (Lombardo et al., Nat Biotechnol. 2007 Nov; 25(11):1298-306)는 HIV 감염을 회피하기 위한 실용적인 전략일 수 있는 한편, PCSK9의 결필 (Cohen et al., Nat Genet. 2005 Feb; 37(2):161-5) 오란지오포이어틴 (Musunuru et al., N Engl J Med. 2010 Dec 2; 363(23):2220-7)은 스타틴 내성 고콜레스테롤혈증 도는 고지혈증에 대한 치료 효과를 제공할 수 있다. 이들 표적은 siRNA-매개된 단백질 녹아웃을 이용하여 다루어질 수도 있으며, NHEJ-매개된 유전자 비활성화의 독특한 장점은 치료를 지속할 필요 없이 영구 치료 이익을 달성하는 능력이다. 모든 유전자 치료에서처럼, 각각의 제안된 치료적 이용이 양호한 이익-위험 비율을 갖도록 수립되는 것이 물론 중요할 것이다.
복구 주형과 함께 가이드 RNA 및 Cas9를 코딩하는 플라스미드 DNA의 티로신혈증의 성체 마우스 모델의 간 내로의 유체역학적 전달은 돌연변이체 Fah 유전자를 수정할 수 있고, 250 개의 세포 중 약 1 개의 야생형 Fah 단백질의 발현을 구제할 수 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):5513] 참조). 추가적으로, 임상 시험은 CCR5 수용체의 생체 외 녹아웃에 의해 HIV 감염과 싸우기 위해 ZF 뉴클레아제를 성공적으로 사용하였다. 모든 환자에서, HIV DNA 수준은 감소하였으며, 4 명의 환자 중 한 명에서 HIV RNA는 검출가능하지 않게 되었다 (문헌 [Tebas et al., N Engl J Med. 2014 Mar 6;370(10):90110]에서 이용 가능한 온라인 효모 게놈 데이터베이스가 언급될 수 있다. 이들 둘 모두의 결과는 신규 치료 플랫폼으로서 프로그램가능한 뉴클레아제의 가능성을 증명하였다. C2c1 이펙터 단백질은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
또 다른 구현예에서, HIV tat/rev에 의해 공유된 일반 엑손을 표적화하는 siRNA, 핵소체-국소화 TAR 유인체(decoy), 및 항-CCR5-특이적 망치머리형 리보자임을 갖는 자가-비활성화 렌티바이러스성 벡터 (예를 들어, 문헌 [DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43] 참조)가 사용되고/거나 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템에 대해 조정될 수 있다. 최소 2.5 × 106개의 CD34+ 세포/킬로그램 환자 체중이 수집되고, 2 μ㏖/L-글루타민, 줄기 세포 인자(100ng/㎖), Flt-3 리간드(Flt-3L) (100ng/㎖), 및 트롬보포이에틴(10ng/㎖)(CellGenix)을 2 × 106개의 세포/㎖의 밀도로 함유하는 X-VIVO 15 배지(Lonza) 배지에서 16 내지 20시간 동안 사전자극하였다. 사전 자극된 세포는 피브로넥틴(25㎎/㎠)(레트로넥틴(RetroNectin), 타카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.))로 코팅한 75-㎠ 조직 배양 플라스크에서 16 내지 24시간 동안 5의 감염 다중도로 렌티바이러스로 형질도입될 수 있다. C2c1 이펙터 단백질은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
해당 기술 분야의 지식 및 본 개시 내용의 교시를 이용하여, 숙련자는 CCR5를 표적화하고 녹아웃하는 CRISPR-C2c1 시스템과 HSC를 접촉시키는 것을 포함하는 HIV/AIDS와 같은 면역결핍 상태에 관련된 HSC를 수정할 수 있다. CCR5-및 C2c1 단백질 함유 입자를 표적화하고 녹아웃시키는 가이드 RNA (및 유리하게 이중 가이드 접근법, 예를 들어 상이한 가이드 RNA의 쌍; 예를 들어, 초대 인간 CD4+ T 세포 및 CD34+ 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSSPC)에서, 두 개의 임상적으로 관련된 유전자인 B2M 및 CCR5의 가이드 RNA 표적화)는 HSC와 접촉된다. 이렇게 접촉된 세포를 투여할 수 있고; 임의로 치료 /확장된다; cf. Cartier. 참조: Kiem, "Hematopoietic stem cell-based gene therapy for HIV disease, "Cell Stem Cell. Feb 3, 2012; 10(2): 137-147 (이의 인용 문헌들과 함께 참조로 본 명세서에 편입됨); Mandal et al, "Efficient Ablation of Genes in Human Hematopoietic Stem and Effector Cells using CRISPR/Cas9," Cell Stem Cell, Volume 15, Issue 5, p643-652, 6 November 2014 (이의 인용 문헌들과 함께 참조로 본 명세서에 편입됨). CRISPR-C2c1 시스템을 이용하여 HIV/AIDS와 싸우기 위한 또 다른 수단으로서, 문헌 ([Ebina, "CRISPR/Cas9 system to suppress HIV-1 expression by editing HIV-1 integrated proviral DNA" SCIENTIFIC REPORTS | 3 :2510 | DOI:10.1038/srep02510, 그에 언급된 문헌과 함께 본 명세서에 참고로서 포함됨])이 또한 언급될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
HIV 치료를 위한 게놈 편집에 대한 근거는, 바이러스에 대한 세포성 공동-수용체인, CCR5에서 기능 손실 돌연변이에 대해 동형접합성인 개인들이 감염에 대해 고도로 저항성이며, 그렇지 않으면 건강하다는 관찰로부터 유래되며, 이는 게놈 편집을 이용한 이러한 돌연변이의 모방은 안전하며 효과적인 치료 전략일 수 있음을 제안한다 (문헌 [Liu, R., et al. Cell 86, 367377 (1996)]). 이러한 아이디어는, HIV 감염된 환자가 CCR5 돌연변이의 기능 손실에 대해 동형접합성인 공여자로부터 동종이계성(allogeneic) 골수 이식을 받은 경우, 검출가능하지 않은 수준의 HIV 및 정상 CD4 T-세포 수의 회복을 결과로서 초래한다는 것을 임상적으로 입증하였다 (문헌 [Hutter, G., et al. The New England journal of medicine 360, 692698 (2009)]). 비용 및 잠재적인 이식편 대 숙주 질병으로 인해, 골수 이식은 대부분의 HIV 환자에게 현실적인 치료 전략은 아니지만, 환자 자신의 T-세포를 CCR5로 전환하는 HIV 치료는 바람직하다.
HIV의 인간화 마우스 모델에서 CCR5를 녹아웃하기 위한 ZFNs 및 NHEJ를 이용하는 초기 연구는, CCR5 편집된 CD4 T세포의 장기이식이 개선된 바이러스 부하 및 CD4 T-세포 수를 개선하였음을 보였다 (문헌 [Perez, E.E., et al. Nature biotechnology 26, 808816 (2008)]). 중요하게는, 이들 모델은 또한 HIV 감염이 CCR5 널 세포의 선택하는 결과를 초래하였음을 나타내어, 편집이 적합성 장점을 수여함을 제안하며, 적은 수의 편집된 세포들이 치료 효과를 내는 것을 잠재적으로 가능하게 한다.
이러한 및 다른 유망한 임상전 연구의 결과로서, 환자 T 세포 내에서 CCR5를 녹아웃하는 게놈 편집 치료는 이제 인간에서 시험되었다 (문헌 [Holt, N., et al. Nature biotechnology 28, 839847 (2010), Li, L., et al. Molecular therapy :the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 12591269 (2013)]). 최근 임상 시험 제 I기에서, HIV를 갖는 환자로부터의 CD4+ T 세포는 제거되고, CCR5 유전자를 녹아웃하도록 설계된 ZFN을 이용하여 편집되어, 환자 내로 다시 자가이식되었다 (문헌 [Tebas, P., et al. The New England journal of medicine 370, 901910 (2014)]).
또 다른 연구 (문헌 [Mandal et al., Cell Stem Cell, Volume 15, Issue 5, p643-652, 6 November 2014])에서, CRISPR-Cas9는, 인간 CD4+ T 세포 및 CD34+ 조혈성 줄기 및 선조 세포 (HSPCs)에서 두 개의 임상 관련 유전자 B2M 및 CCR5를 표적하였다. 단일 RNA 가이드의 이용은 HSPC에서 매우 효율적인 돌연변이 유발을 이끌었으나 T 세포에서는 그렇지 않았다. 이중 가이드 시도는 두 세포 유형 모두에서 개선된 유전자 결실 효능을 시도하였다. CRISPR-Cas9를 이용하여 게놈 편집 처리된 HSPC는 다혈통(multilineage) 능을 보유하였다. 예측된 표적상 및 표적외 돌연변이는 HSPC에서 표적 포착 시퀀싱을 통해 검사되었으며, 낮은 수준의 표적외 돌연변이유발이 단지 하나의 부위에서 관찰되었다. 이들은 CRISPR-Cas9가 최소의 표적외 돌연변이유발을 이용하여 HSPC에서 유전자를 효율적으로 제거할 수 있음을 증명하며, 이는 조혈 세포-기반 치료에 대한 넓은 적용성을 갖는다.
Wang et al. (PLoS One. 2014 Dec 26;9(12):e115987 doi: doi:10.1371/journal.pone.0115987])은 Cas9 및 CCR5 가이드 RNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여, CRISPR 연관 단백질 9 (Cas9) 및 단일 가이드 RNA (가이드 RNA)를 통해 CCR5를 침묵화하였다. Wang 등은 Cas9 및 CCR5 가이드 RNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 HIV-1 민감성 인간 CD4+ 세포 내로의 일 회전 형질도입은 높은 빈도의 CCR5 유전자 붕괴를 산출함으로 나타내었다. CCR5 유전자-붕괴된 세포는 전달된/파운더 (T/F) HIV-1 분리물을 포함하는, R5-지향성 HIV-1에 저항성일 뿐만 아니라, R5-지향성 HIV-1 감염 동안 CCR5 유전자-붕괴되지 않은 세포에 대해 선택적인 장점을 또한 갖는다. 형질도입 후 84일이 지나서도 안정하게 형질도입된 세포 내에서 이들 CCR5 가이드 RNA에 대해 고도로 상동성인 잠재적인 표적외 부위에서의 게놈 돌연변이는 T7 엔조뉴클레아제 I 분석에 의해 검출되지 않았다.
Fine 등 (Sci Rep. 2015 Jul 1;5:10777 doi. doi:10.1038/srep10777])은, 세포 내에서 함께 스플라이스되어 부위-특이적 DNA 절단이 가능한 작용성 단백질을 형성하는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 (SpCas9)의 일부를 발현하는 2-카세트 시스템을 확인하였다. 특정 CRISPR 가이드 가닥을 이용하여, Fine 등은 단일 Cas9로서 및 Cas9 닉카제의 쌍으로서 인간 HEK-293T 세포에서 HBB와 CCR5 유전자를 절단하는데 있어서 본 시스템의 효능을 증명하였다. 트랜스-스플라이스된 SpCas9 (tsSpCas9)는 표준 트랜스펙션 도스에서 야생형 SpCas9 (wtSpCas9)와 비교시 뉴클레아제 활성의 약 35%를 나타내었지만, 더 낮은 수준에서 실질적으로 더 감소된 활성을 가졌다. wtSpCas9에 비하여 tsSpCas9의 크게 감소된 오픈 리딩 프레임 길이는 잠재적으로 더욱 복잡하고 긴 유전 요소가, 조직-특이적 프로모터, 다중화된 가이드 RNA 발현, 및 SpCas9에 대한 이펙터 도메인 융합물을 포함하는 AAV 벡터 내로 패키지되는 것을 가능하게 한다.
Li 등 (J Gen Virol. 2015 Aug;96(8):2381-93. doi: 10.1099/vir.0.000139. Epub 2015 Apr 8])은 CRISPR-Cas9가 세포주 내에서 CCR5 유전자좌의 편집을 효율적으로 매개할 수 있어서, 세포 표면 상에서 CCR5의 녹아웃을 결과로서 초래함을 증명하였다. 다음세대 시퀀싱은 각종 돌연변이가 CCR5의 예측된 절단 부위 주위에 도입되었음을 밝혀주었다. 세 개의 가장 효과적인 가이드 RNA 각각의 경우, 현저한 표적외 효과는 15 개의 최고-점수 가능 부위에서 검출되지 않았다. CRISPR-Cas9 성분을 운반하는 키메라 Ad5F35 아데노바이러스를 구축함으로써, Li 등은 일차적인 CD4+ T-림프구를 효율적으로 형질도입하였으며, CCR 발현을 붕괴시키고, 양성으로 형질도입된 세포는 HIV-1 저항성을 받았다.
당업자는 본 발명의 CRISPR Cas 시스템으로 CCR5를 표적하기 위하여, 예를 들어, 문헌 [Holt, N., et al. Nature biotechnology 28, 839847 (2010), Li, L., et al. Molecular therapy :the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 12591269 (2013), Mandal et al., Cell Stem Cell, Volume 15, Issue 5, p643-652, 6 November 2014, Wang et al. (PLoS One. 2014 Dec 26;9(12):e115987 doi: 10.1371/journal.pone.0115987), Fine et al. (Sci Rep. 2015 Jul 1;5:10777 doi. 10.1038/srep10777) 및 Li et al. (J Gen Virol. 2015 Aug;96(8):2381-93. doi: 10.1099/vir.0.000139. Epub 2015 Apr 8)]의 상기 연구들을 활용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 특히, T-풍부 PAM은 비분열 세포 및 조직에서 본 발명의 적용을 허용한다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
바이러스성 병원균, 예컨대 HBV와 같은 병원균의 치료
본 발명은 또한 간염 B 바이러스 (HBV)를 치료하기 위하여 적용될 수 있다. 그러나, CRISPR Cas 시스템은 RNAi의 결점, 예컨대 내생성 작은 RNA 경로를 예를 들어 용량 및 서열을 최적화함으로써 과포화하는(oversatring) 위험을 회피하도록 조정되어야만 한다 (예를 들어, 문헌 [Grimm et al., Nature vol. 441, 26 May 2006) 참조). 예를 들어, 인간에 대해서 약 110 x 1014 입자와 같은 적은 용량이 고찰된다. 다른 구현예에서, CRISPR Cas 시스템 또는 이의 성분은 리포솜, 예컨대, 안정한 핵산-지질 입자(SNALP)로 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Morrissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005] 참조). SNALP 내 HBV RNA로 표적되는 CRISPR Cas의 약 1, 3 또는 5 mg/kg/일의 일일 정맥내 투여가 고려된다. 1일 처리는 약 3일 동안일 수 있고, 그 다음으로 약 5주 동안 매주일 수 있다. 또 다른 구현예에서, Chen 등의 시스템 (문헌 [Gene Therapy (2007) 14, 1119])은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 이용 및/또는 조정될 수 있다. Chen 등은 shRNA를 전달하기 위해 이중-가닥 아데노연관 바이러스 8-위형(pseudotyped) 벡터 (dsAAV2/8)를 이용한다. HBV-특이적 shRNA를 갖는, dsAAV2/8 벡터의 단일 투여 (마우스 당 1×1012 벡터 게놈)는 HBV 유전자이식 마우스의 간에서 HBV 단백질, mRNA 및 복제형 DNA의 꾸준한 수준을 효과적으로 저해하여, 순환에서 HBV 로드에서의 23 log10 이하에 달하는 감소를 초래한다. 현저한 HBV 저해는 벡터 투여 후 적어도 120일 동안 유지되었다. shRNA의 치료 효과는 표적 서열 의존성이었으며, 인터페론의 활성화를 수반하지 않았다. 본 발명의 경우, HBV를 향한 CRISPR Cas 시스템은 AAV 벡터, 예컨대 dsAAV2/8 내로 클로닝되고, 예를 들어 인간 당 약 1×1015 벡터 게놈 내지 약 1×1016 벡터 게놈의 용량으로 인간에게 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, Wooddell 등의 방법 (Molecular Therapy vol. 21 no. 5, 973-985 May 2013)은 본 발명의 CRISPR Cas 시시ㅡ템에 사용될 수 있고/조정될 수 있다. Woodell 등은 간세포-표적화된, N-아세틸갈락토사민-콘쥬게이트 멜리틴-유사 펩티드 (NAG-MLP)와 응고인자 VII (F7)을 표적화하는 간-향성 콜레스테롤-콘쥬게이트 siRNA (chol-siRNA) 의 간단한 동시주사가 임상 화학의 변화나 사이토카인의 유도 없이 마우스 및 비-인간 영장류에서 효과적인 F7 녹다운을 가져온다는 것을 나타낸다. HBV 감염의 일시 및 이식유전자 마우스 모델을 이용하여, Wooddell 등은 강한 chol-siRNA 표적화 보존된 HBV 서열과 NAG-MLP의 단일 공동 주입이 긴 기간의 효과를 갖는 바이러스 RNA, 단백질, 및 바이러스 DNA의 멀티로그(multilog) 억제를 결과로서 초래하였음을 보여준다. 예를 들어, 약 6 mg/kg의 NAG-MLP 및 6 mg/kg의 HBV 특이적 CRISPR Cas의 정맥내 공동주입이 본 발명을 위해 고려될 수 있다. 대안적으로, 약 3 mg/kg의 NAG-MLP 및 3 mg/kg의 HBV 특이적 CRISPR Cas가 1일에 전달될 수 있고, 이어서 2주 후 약 약 2-3 mg/kg의 NAG-MLP 및 2-3 mg/kg의 HBV 특이적 CRISPR Cas의 투여가 뒤따른다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 HBV 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 에피솜 바이러스 핵산 분자를 조작하기 위해서 유기체의 게놈으로 통합되지 않은 에피솜 바이러스 핵산 분자에 포함된다. 일부 구현예에서, 에피솜 핵산 분자는 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드 분자이거나 또는 공유적으로 폐쇄된 원형 DNA (cccDNA)이다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체는 복합체 제공이 부재하는 유기체의 세포에서 에피솜 바이러스 핵산 분자의 양과 비교하여 유기체의 세포에서 에피솜 바이러스 핵산 분자의 양을 감소시킬 수 있거나, 또는 에피솜 핵산 분자의 분해를 촉진하기 위해서 에피솜 바이러스 핵산 분자를 조작할 수 있다. 일부 구현예예서, 표적 HBV 서열은 유기체의 게놈으로 통합된다. 일부 구현예에서, 세포 내에서 형성될 때, CRISPR 복합체는 유기체의 게놈으로부터 표적 HBV 핵산의 전체 또는 일부의 절제를 촉진하기 위해 통합된 핵산을 조작할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 표적 HBV 핵산은 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드 cccDNA 분자 및/또는 유기체의 게놈으로 통합된 바이러스 DNA에 포함되고, CRISPR 복합체는 바이러스 cccDNA 및/또는 통합된 바이러스 DNA를 절단하기 위해서 적어도 하나의 표적 HBV 핵산을 조작한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 바이러스 cccDNA 및/또는 통합된 바이러스 DNA에 도입된 하나 이상의 이중 가닥 파손(들), 임의로 적어도 두개의 이중 가닥 파손(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 바이러스 cccDNA 및/또는 통합된 바이러스 DNA에 도입된 하나 이상의 단일 가닥 파손(들), 임의로 적어도 두개의 단일 가닥 파손(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 이중 가닥 파손(들) 또는 상기 하나 이상의 단일 가닥 파손(들)은 바이러스 cccDNA 서열 및/또는 통합된 바이러스 DNA 서열에 하나 이상의 삽입 또는 결실 돌연변이 (INDEL)의 형성을 초래한다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Lin 등 (Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Aug 19;3:e186. doi: 10.1038/mtna.2014.38)은 유전자형 A의 HBV에 대한 8종 gRNA를 설계하였다. HBV-특이적 gRNA를 이용하여, CRISPR-Cas9 시스템은 HBV-발현 벡터로 트랜스펙션된 Huh-7 세포에서 HBV 코어 및 표면 단백질의 생산을 현저히 감소시켰다. 8 개의 스크리닝된 gRNA들 중, 두 개의 효과적인 것들을 확인하였다. 보존된 HBV 서열을 표적화하는 하나의 gRNA는 상이한 유전형에 대하여 작용하였다. 유체역학-HBV 지속 마우스 모델을 이용하여, Lin 등은 이 시스템이 간 내 HBV 게놈-함유 플라스미드를 절단하고, 그의 생체 내 소제(clearance)를 촉진하여, 혈청 표면 항원 수준의 감소를 결과로서 초래함을 추가로 증명하였다. 이들 데이터는, CRISPR-Cas9 시스템이 시험관 내 생체 내 모두에서 HBV-발현 주형을 붕괴시킬 수 있음을 제안하며, 지속적인 HBV 감염을 근절하는 그의 능력을 표시한다.
Dong 등 (Antiviral Res. 2015 Jun;118:110-7. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.015. Epub 2015 Apr 3)은 HBV 게놈을 표적화하고 HBV 감염을 효율적으로 억제하기 위해서 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하였다. Dong 등은 HBV의 보존된 영역을 표적화하는 4종의 단일 가이드 RNA (가이드 RNA)를 합성하였다. Cas9와 이들 가이드 RNA의 발현은 Huh7 세포를 비롯하여 HBV-복제 세포 HepG2.2.15에서 바이러스 생산을 감소시켰다. Dong 등은 CRISPR-Cas9가 절단을 유도하고 형질감염된 세포의 HBV cccDNA에서 절단-매개 돌연변이유발이 발생되었다는 것을 더욱 입증하였다. HBV cccDNA를 보유하는 마우스 모델에서, 신속한 꼬리 정맥을 통한 가이드 RNA-Cas9 플라스미드의 주사는 낮은 수준의 cccDNA 및 HBV 단백질을 초래하였다.
Liu 등 (J Gen Virol. 2015 Aug;96(8):2252-61. doi: 10.1099/vir.0.000159. Epub 2015 Apr 22])은 상이한 HBV 유전형의 보존된 영역을 표적한 8 개의 가이드 RNA(gRNA)를 설계하였으며, 이는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 HBV 복제를 현저히 저해시켜 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HBV DNA 주형을 붕괴시키는 가능성을 조사할 수 있었다. HBV-특이적 gRNA/C2c1 시스템은 세포 내에서 상이한 유전형의 HBV의 복제를 저해할 수 있을 것이며, 바이러스성 DNA는 단일 gRNA/C2c1 시스템에 의해 현저히 감소되었으며, 상이한 gRNA/C2c1 시스템의 조합에 의해 소제되었다.
Wang 등 (World J Gastroenterol. 2015 Aug 28;21(32):9554-65. doi: 10.3748/wjg.v21.i32.9554)은 유전자형 A-D의 HBV에 대해 15 gRNA를 설계하였다. HBV의 조절 영역을 포괄하는 2종의 상기 gRNA (이중-gRNA)의 11 조합이 선택되었다. HBV (유전형 A-D) 복제의 저해에 대한 각각의 gRNA 및 11 개의 이중-gRNA의 효율은 배양물 상등액 내 HBV 표면 항원 (HBsAg) 또는 e 항원 (HBeAg)의 측정에 의해 검사하였다. HBV-발현 벡터의 파괴는 이중-gRNA 및 HBV-발현 벡터로 공동-트랜스펙션된 HuH7 세포 내에서 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 시퀀싱 방법을 이용하여 검사되었으며, cccDNA의 파괴는 KCl 제조, 플라스미드-안전 ATP-의존성 DNase (PSAD) 소화, 회전환 증폭 및 정량 PCR 조합된 방법을 이용하여 HepAD38 세포에서 검사되었다. 이들 gRNA의 세포독성은 미토콘드리아 테트라졸륨 분석에 의해 평가되었다. 모든 gRNA는 배양물 상등액 내 HBsAg 또는 HBeAg 생산을 현저히 감소시킬 수 있었으며, 이는 gRNA가 맞서는 영역에 따라 좌우되었다. 이중 gRNA는 모두 유전형 A-D의 HBV에 대해 HBsAg 및/또는 HBeAg 생산을 효율적으로 억제하였으며, HBsAG 및/또는 HBeAg 생산 저해에 있어 이중 gRNAdml 효능은, 단일 gRNA를 단독으로 사용한 것에 비하여 현저히 증가되었다. 추가로, PCR 직접 시퀀싱에 의해, 출원인은 이들 이중 gRNA가 gRNA를 사용한 두 개의 절단 부위 사이의 단편을 제거함으로써 HBV 발현 주형을 특이적으로 파괴할 수 있었음을 확인하였다. 가장 중요하게는, gRNA-5 및 gRNA-12 조합은 HBsAg 및/또는 HBeAg 생산을 효율적으로 저해할 수 있었을 뿐 아니라, HepAD38 세포 내에서 cccDNA 저장소를 파괴할 수 있었다.
Karimova 등 (Sci Rep. 2015 Sep 3;5:13734. doi: doi:10.1038/srep13734])은 Cas9 닉카제에 의한 특이적이고 효과적인 절단에 대해 표적된 HBV 게놈의 S 및 X 영역에서 교차-유전형 보존된 HBV 서열을 확인하였다. 이러한 시도는 리포터 세포주에서 에피좀성 cccDNA 및 염색체로 통합된 HBV 표적 부위 뿐만 아니라, 만성적으로 및 신규 감염된 간암 세포주 내 HBV 복제를 방해하였다.
당업자는 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 사용해 HBV를 표적화하기 위해서 예를 들어, 다음의 연구들을 이용할 수 있다: Lin et al. (Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Aug 19;3:e186. doi: 10.1038/mtna.2014.38), Dong et al. (Antiviral Res. 2015 Jun;118:110-7. doi: 10.1016/j.antiviral.2015.03.015. Epub 2015 Apr 3), Liu et al. (J Gen Virol. 2015 Aug;96(8):2252-61. doi: 10.1099/vir.0.000159. Epub 2015 Apr 22), Wang et al. (World J Gastroenterol. 2015 Aug 28;21(32):9554-65. doi: 10.3748/wjg.v21.i32.9554) 및 Karimova et al. (Sci Rep. 2015 Sep 3;5:13734. doi: 10.1038/srep13734). C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
만성 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염은 우세하게, 치명적이고, 감염된 세포에서 바이러스 에피솜 DNA (cccDNA)의 지속성으로 인해 거의 치유되지 않는다. Ramanan 등 (Ramanan V, Shlomai A, Cox DB, Schwartz RE, Michailidis E, Bhatta A, Scott DA, Zhang F, Rice CM, Bhatia SN, .Sci Rep. 2015 Jun 2;5:10833. doi: 10.1038/srep10833, published online 2nd June 2015.)은 showed that the CRISPR/Cas9 시스템이 HBV 게놈 내 보존된 영역을 특이적으로 표적화하여 절단할 수 있어서, 바이러스 유전자 발현 및 복제의 강력한 억제를 야기시킨다는 것을 보여주었다. Cas9 및 적절하게 선택된 가이드 RNA의 지속적인 발현 시, 그들은 Cas9에 의한 cccDNA의 절단 및 cccDNA 및 바이러스 유전자 발현과 복제의 다른 매개변수의 극적인 감소를 입증하였다. 따라서, 그들은 바이러스 에피솜 DNA의 직접 표적화가 바이러스를 제어하고 아마도 환자를 치유하는 신규 치료 접근법이라는 것을 보여주었다. 이것은 또한 WO2015089465 A1 (The Broad Institute 등의 출원인)에 기술되어 있고, 이의 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
이와 같이 HBV의 바이러스 에피솜 DNA의 표적화가 일부 구현예에서 바람직하다.
본 발명은 또한 병원균, 예를 들어 박테리아, 균류 및 기생 병원균을 처리하는 데 적용될 수 있다. 대부분의 연구 노력은 새로운 항생제의 개발에 집중하며, 일단 개발되면, 그럼에도 불구하고 이는 약물 저항성의 동일한 문제의 대상이 될 것이다. 본 발명은 그러한 어려움들을 극복하는 신규 CRISPR-기반 대안을 제공한다. 나아가, 기존의 항생제와 달리, CRISPR-기반 치료는 병원균 특이적으로 제조될 수 있어서, 유익한 박테리아는 회피하면서 표적 병원균의 박테리아 세포 사멸을 유도한다.
본 발명은 또한 C형 간염 바이러스(HCV)를 치료하기 위해서 적용될 수도 있다. Roelvinki 등의 방법 (Molecular Therapy vol. 20 no. 9, 1737-1749 Sep 2012)은 CRISPR Cas 시스템에 적용될 수 있다. 예를 들어, AAV8과 같은 AAV 벡터가 고찰된 벡터일 수 있으며, 예를 들어 킬로그램 체중 당 약 1.25 × 1011 내지 1.25 × 1013 벡터 게놈 (vg/kg)의 용량이 고찰될 수 있다. 본 발명은 또한 병원균, 예를 들어 박테리아, 균류 및 기생 병원균을 처리하는 데 적용될 수 있다. 대부분의 연구 노력은 새로운 항생제의 개발에 집중하며, 일단 개발되면, 그럼에도 불구하고 이는 약물 저항성의 동일한 문제의 대상이 될 것이다. 본 발명은 그러한 어려움들을 극복하는 신규 CRISPR-기반 대안을 제공한다. 나아가, 기존의 항생제와 달리, CRISPR-기반 치료는 병원균 특이적으로 제조될 수 있어서, 유익한 박테리아는 회피하면서 표적 병원균의 박테리아 세포 사멸을 유도한다. 일부 구현예예서, CRISPR-C21 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Jiang 등 (문헌[" RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems", Nature Biotechnology vol. 31, p. 2339, March 2013])은, CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 S. 뉴모니아에 및 에스케리키아 콜라이를 돌연변이 또는 사멸시킨다. 정확한 돌연변이를 게놈 내로 도입한 이 작업은 돌연변이되지 않은 세포를 사멸시키기 위하여 표적화된 게놈 부위에서의 이중-RNA:Cas9-유도된 절단에 의존하였으며, 선별 마커 또는 대항-선택 시스템에 대한 필요를 피하였다. CRISPR 시스템은 항생제 저항성을 역전하고, 균주들 간의 저항성의 전달을 제거하는 데 사용되었다. Bickard 등은, 독성 유전자를 표적하도록 재프로그램화된 Cas9가 독성인 S. 아우레우스를 사멸시키지만, 비독성 S. 아우레우스는 사멸시키지 않았음을 보였다. 항생제 저항성 유전자를 표적화하는 뉴클레아제의 재프로그램화는, 항생제 저항성 유전자를 품은 스태필로코커스 플라스미드를 파괴하고, 플라스미드-유래 저항성 유전자의 확산에 대해 면역화되었다. (참조: Bikard et al., " Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials," Nature Biotechnology vol. 32, 1146-1150, doi:10.1038/nbt.3043, published online 05 October 2014.) Bikardss는, CRISPR-Cas9 항균제가 마우스 피부 콜로니화 모델에서 S. 아우레우스를 사멸시키도록 생체 내에서 작용함을 보였다. 유사하게, Yosef외 다수는 CRISPR 시스템을 사용하여 β-락탐 항생제에 대한 저항성을 수여하는 효소를 인코딩하는 유전자를 표적화하였다 (see Yousef et al., "Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 112, p. 7267-7272, doi: 10.1073/pnas.1500107112 published online May 18, 2015).
본 발명은 노로바이러스 감염에 대한 치료 개발에 적용될 수도 있다. 노로바이러스는 안전하지 않은 음식물로 인간 설사 질환의 원인이 되는 가장 일반적인 병원체 중 하나이다. 또한 음식 매개 감염에서 어린이와 성인 치사율의 주요 원인이다. 노로바이러스는 단지 식중독만이 아니다. 최근의 메타 분석에서 노로 바이러스는 산발적 및 유행병 상황의 급성 위장염의 모든 원인 (개인간 전파 포함)의 거의 5분의 1을 차지하고 모든 연령군에 영향을 미친다. 분명하게, 노로바이러스는 개발도상국 및 선진국 모두에서 중요한 공중 보건 문제이다. 노로바이러스 병리학을 더욱 잘 이해하기 위한 연구 노력이 표적화 중재술을 위해 필요할 것이다. 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스부터 지카 바이러스까지, 바이러스 감염을 매개하는데 중요한 숙주 인자를 동정하기 위한 노력은 항상 연구 우선순위였다. 이러한 정보는 항바이러스 중재술에서 잠재적 치료 표적에 빛을 밝혀줄 것이다. 노로바이러스 바이러스-숙주 상호작용 연구는 지난 20여년간 강력한 세포 배양 모델의 결여로 인해 방해되었다. 2016년에, 노로바이러스는 결국 엔테로이드 또는 미니-내장이라고 하는 줄기 세포-유래 3차원 인간 내장-유사 구조에서 성공적으로 배양되었다. Chan 등은 참가자로부터 채취한 십이지장 생검에서 단리된 장 줄기 세포를 사용하였고, 미니-내장에서 분화시켰다. 녹아웃 CRISPR 및 기능 획득 CRISPR SAM은 노로바이러스 감염에 관여된 유전자의 최종 후보를 동정하는데 사용되었다. 본 발명에서 개시된 C2c1- CRISPR 시스템은 Chan 등이 기술한 바와 같은 유사한 시스템에 적용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
본 발명은 또한 인간 파필로마바이러스 (HPV) 관련 악성 신생물 및 HVP 유도 자궁경부암을 치료하는데 적용될 수 있다. 자궁경부암은 전세계적으로 여성에서 2번째로 가장 흔한 암이다. 고위험 인간 파필로마바이러스 (HR-HPV), 특히 HPV16 및 HPV18이 자궁경부암의 주요 유발원으로 여겨진다. 종양유전자 E6 및 E7은 HVP 감염의 초기 단계에 발현되고, 그들 기능은 정상 세포 주기를 파괴하고 형질전환된 악성 표현형을 유지시키는 것이다. 예를 들어, C7 단백질은 쿨린 2 유비퀴틴 리가제 복합체에 결합하여 레티노블라스토마 (pRb) 종양 억제인자의 유비퀴틴화 및 분해를 초래한다.
Hu 등 (Biomed Res Int. 2014;2014:612823. doi: 10.1155/2014/61283)은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 HPV 양성 세포주에서 HPV16-E7 DNA를 표적화하였고 showed that HPV16-E7 단일-가이드 RNA (sgRNA) 가이드된 CRISPR/Cas 시스템이 특이적 부위에서 HPV16-E7 DNA를 파괴할 수 있어서, HPV 양성 SiHa 및 Caski 세포에서 아폽토시스 및 성장 억제를 유도하지만, HPV 음성 C33A 및 HEK293 세포에서는 그렇지 않았다는 것을 보여주었다. 게다가, E7 DNA의 파괴는 E7 단백질의 하향 조절 및 종양 억제인자 단백질 pRb의 상향조절을 직접적으로 유도한다. HPV16-E7을 표적화하는 gRNA는 Mali 등의 프로토콜에 따라 설계되었고 그들은 Genewiz Company (China)에서 합성되었다. SSA 루시퍼라제 리포터 pSSA Rep3-1은 CRISPR 시스템의 전달의 리포팅 시스템으로서 사용되었다. 세포는 23-웰 플레이트 중에서 0.8 μg 의 Cas9 플라스미드 및 0.2 μg 의 gRNA 플라스미드와 함께 공동 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에, 그들을 회수하였고, 제조사 설명서에 따라서 아넥신 V-FITC 아폽토시스 검출 키트 (KeyGen BioTech)를 사용해 플루오레세인 이소티오시아테이트- (FITC-) 접합된 아넥신 V (아넥신 V-FITC) 및 프로피듐 아이오다이드 (PI)로 이중 염색하였다. 모든 4종 CRISPR/Cas 시스템 처리된 세포주의 아폽토시스는 유도된 세포 사멸을 계산하기 위해서 FACS Calibur (BD Bioscience)를 사용해 분석하였다. 데이터는 BD Cell Quest 소프트웨어를 사용해 분석하였다. 시험관내 세포 증식은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Beyotime)을 사용해 결정하였다. gRNA-4/Cas9 플라스미드로 1 × 104 세포/웰을 형질감염시켰고, 형질감염 후 24시간에 세포를 트립신처리하고 96웰 플레이트 상에 파종하였다. 96웰 플레이트 상에 파종한 후 0시간, 24시간, 48시간, 72시간, 및 96시간에, 10μL CCK-8 용액을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2.5시간 인큐베이션하였다. 본 발명에서 개시된 CRISPR- C2c1 시스템은 시스템에서 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'인 PAM 서열을 인식할 수 있고, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
CRISPR 시스템은 기타 다른 유전학적 접근에 대해 저항성인 기생충의 게놈을 편집하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, CRISPR-Cas9 시스템은 플라스모듐 요엘리(Plasmodium yoelii) 게놈 내로 이중-가닥 파손을 도입하는 것을 나타내었다(참조: Zhang et al., "Efficient Editing of Malaria Parasite Genome Using the CRISPR/Cas9 System," mBio. vol. 5, e01414-14, Jul-Aug 2014). Ghorbal 등 (" 'Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparumusing the CRISPR-Cas9 system," Nature Biotechnology, vol. 32, p. 819-821, doi: 10.1038/nbt.2925, published online June 1, 2014)은 각각 아르테미시닌에 대한 내성 출현 및 유전자 침묵화에서 추정 역할을 갖는, 2개 유전자, orc1 및 kelch13의 서열을 변형시켰다. 적절한 부위에서 변경된 기생충은 변형에 대한 직접 선택은 없음에도 불구하고 매우 높은 효율로 회수되어, 중립성 또는 심지어는 유해한 돌연변이가 이 시스템을 사용하여 생성될 수 있음을 나타낸다. CRISPR-Cas9은 또한 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii )를 포함한 다른 병원성 기생충의 게놈을 변형시키는데 사용될 수 있다 (참조: Shen et al., "Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii using CRISPR/CAS9," mBio vol. 5:e01114-14, 2014; 및 Sidik et al., "Efficient Genome Engineering of Toxoplasma gondii Using CRISPR/Cas9," PLoS One vol. 9, e100450, doi: 10.1371/journal.pone.0100450, published online June 27, 2014). C2c1 이펙터 단백질은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Vyas 등 ("A Candida albicans CRISPR system permits genetic engineering of essential genes and gene families," Science Advances, vol. 1, e1500248, DOI: 10.1126/sciadv.1500248, April 3, 2015) 은 CRISPR 시스템을 이용하여 C. 알비칸스에서의 유전적 조작에 대한 오랜 장애를 극복하였으며, 몇몇 상이한 유전자의 두 개의 카피 모두를 단일 실험에서 효율적으로 돌연변이시켰다. 몇몇 메카니즘이 약물 저항성에 기여하는 유기체서, Vyas는 부모의 임상적 분리물 Can90에 의해 나타나는 플루코나졸 또는 시클로헥시미드에 대한 초저항성을 더 이상 나타내지 않는 동형접합성 이중 돌연변이체를 생산하였다. Vyas는 조건적 대립형질을 만듬으로써 C. 알비칸스의 필수 유전자에서의 동형접합성 기능 손실 돌연변이를 또한 수득하였다. 리보솜 RNA 가공에 대해 요구되는 DCR1의 무효 대립형질은 저온에서 치명적이지만 고온에서는 생존성이다. Vyas는 논센스 돌연변이를 도입하고, 16℃에서 성장하는 데 실패한 dcr1/dcr1 돌연변이체를 분리한 복구 주형을 사용하였다. C2c1 이펙터 단백질은 유사한 시스템에 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 DCR1의 전사물에 도입시킨다. 일부 구현예에서, 복구 주형은 PAM 서열을 포함하지 않는다.
유전적 또는 후생적 양태를 갖는 질병의 치료
본 발명의 CRISPR-Cas 시스템은 TALEN 및 ZFN를 사용해 제한적인 성공으로 이전에 시도되었던 유전자 돌연변이를 교정하는데 사용될 수 있고, Gluckmann 등의 WO 2015/048577 CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS; Glucksmann 등의 WO 2015/070083 CRISPR-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS WITH GOVERNING gRNAS를 포함하여, 유전자 요법으로 질환을 치료적으로 해결하기 위해 표적 유전자좌로 Cas9 시스템을 이용하기 위한 방법을 설명하는 Editas Medicine의 공개 출원을 포함하여, Cas9 시스템에 대한 잠재적 표적으로서 동정되었다; 일부 구현예에서, 원발성 개방각 녹내장 (POAG)의 치료, 예방 또는 진단이 제공된다. 표적은 바람직하게 MYOC 유전자이다. 이것은 Wo2015153780에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다.
Maeder 등의 WO2015/134812 CRISPR/CAS-RELATED METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING USHER SYNDROME AND 망막 색소변성증를 참조한다. 본 명세서의 교시를 통해서 본 발명은 본 명세서의 교시와 함께 적용되는 이들 문헌의 재료 및 방법을 이해한다. 안구 및 청각 유전자 요법의 양상에서, 어셔 증후군 및 망막 색소 변성증을 치료하기 위한 방법 및 조성물은 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템에 대해 적합화될 수 있다 (참조: 예를 들어 WO 2015/134812). 일 구현예에서, WO 2015/134812는 USH2A 유전자의 위치 2299에서 구아닌 결실을 교정하기 위해 (예를 들어, USH2A 유전자의 위치 2299에서 결실된 구아닌 잔기 치환) 예를 들어 CRISPR-Cas9 매개 방법을 사용하는, 유전자 편집에 의해 IIA형 어셔 증후군 (USH2A, USH11A) 및 망막 색소변성증 39 (Rp39)의 개시 또는 진행의 치료 또는 지연을 포함한다.유사한 효과가 C2c1로 획득될 수 있다. 관련 양상에서, 예를 들어, 점 돌연변이 (예를 들어, 단일 뉴클레오티드, 예를 들어 구아닌, 결실)을 교정하는 도너 주형으로 HDR을 유도하기 위해서, 하나 이상의 뉴클레아제, 하나 인상의 닉카제, 또는 이의 조합으로 절단을 통해 돌연변이를 표적화한다. 돌연변이체 USH2A 유전자의 변경 또는 교정은 임의 기전으로 매개될 수 있다. 돌연변이체 HSH2A 유전자의 변경 (예를 들어, 교정)과 연관될 수 있는 예시적인 기전은 제한없이 비상동성 말단 연결, 미세상동성-매개 말단 연결 (MMEJ), 상동성-지정 복구 (예를 들어, 내생성 도너 주형 매개), SDSA (합성 의존적 가닥 어닐링), 단일 가닥 어닐링, 또는 단일 가닥 침입을 포함한다. 일 구현예에서, 어셔 증후군 및 망막 색소변성증을 치료하기 위해 사용되는 방법은 예를 들어 USH2A 유전자의 적절한 부분을 시퀀싱하여, 대상체가 보유하는 돌연변이의 지식을 획득하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 망막 색소변성증의 치료, 예방 또는 진단이 제공된다. RP1, RP2 등과 같은 다수의 상이한 유전자가 망막 색소변성증과 연관되거나 또는 그를 초래하는 것으로 알려져 있다. 이들 유전자는 일부 구현예에서 표적화되고 적합한 주형의 제공을 통해 녹아웃되거나 또는 복구된다. 일부 구현예에서, 눈에 전달은 주사에 의한다.
하나 이상의 망막 색소변성증 유전자는 일부 구현예에서, 하기로부터 선택될 수 있다: RP1 (망막 색소변성증-1), RP2 (망막 색소변성증-2), RPGR (망막 색소변성증-3), PRPH2 (망막 색소변성증-7), RP9 (망막 색소변성증-9), IMPDH1 (망막 색소변성증-10), PRPF31 (망막 색소변성증-11), CRB1 (망막 색소변성증-12, 상염색체 열성), PRPF8 (망막 색소변성증-13), TULP1 (망막 색소변성증-14), CA4 (망막 색소변성증-17), HPRPF3 (망막 색소변성증-18), ABCA4 (망막 색소변성증-19), EYS (망막 색소변성증-25), CERKL (망막 색소변성증-26), FSCN2 (망막 색소변성증-30), TOPORS (망막 색소변성증-31), SNRNP200 (망막 색소변성증 33), SEMA4A (망막 색소변성증-35), PRCD (망막 색소변성증-36), NR2E3 (망막 색소변성증-37), MERTK (망막 색소변성증-38), USH2A (망막 색소변성증-39), PROM1 (망막 색소변성증-41), KLHL7 (망막 색소변성증-42), CNGB1 (망막 색소변성증-45), BEST1 (망막 색소변성증-50), TTC8 (망막 색소변성증 51), C2orf71 (망막 색소변성증 54), ARL6 (망막 색소변성증 55), ZNF513 (망막 색소변성증 58), DHDDS (망막 색소변성증 59), BEST1 (망막 색소변성증, 동심), PRPH2 (망막 색소변성증, 이유전자), LRAT (망막 색소변성증, 소아), SPATA7 (망막 색소변성증, 소아, 상염색체 열성), CRX (망막 색소변성증, 후기 발병 우성), 및/또는 RPGR (망막 색소변성증, X-연관, 및 부비동 감염, 난청 동반 또는 비동반).
일부 구현예에서, 망막 색소변성증 유전자는 MERTK (망막 색소변성증-38) 또는 USH2A (망막 색소변성증-39)이다.
또한 WO 2015/138510을 언급하며 본 명세서의 교시를 통해서 본 발명 (CRISPR-Cas9 시스템 사용)은 레버 선천성 흑암시 10 (LCA 10)의 치료 또는 개시 또는 진행의 지연을 제공함을 이해한다. LCA 10은 CEP290 유전자 내 돌연변이, 예를 들어 인트론 26에 크립틱 슬라이스 부위를 발생시키는 CEP290 유전자내, 아데닌에서 구아닌으로의 돌연변이, a c.2991+1655에 의해 초래된다. 이것은 CEP290의 인트론 26의 뉴클레오티드 1655에서의 돌연변이, 예를 들어 A에서 G로의 돌연변이이다. CEP290은 CT87; MKS4; POC3; rd16; BBS14; JBTS5; LCAJO; NPHP6; SLSN6; 및 3H11Ag로도 공지되어 있다 (참조: 예를 들어 WO 2015/138510). 유전자 요법의 양상에서, 본 발명은 CEP290 유전자의 적어도 하나의 대립유전자에서 LCA 표적 위치 (예를 들어, c.2991 + 1655; A에서 G)의 부위 근처에 하나 이상의 파손을 도입시키는 것을 포함한다. LCA10 표적 위치의 변경은 refers to (1) 밀접하게 근접하여 indel의 파손-유도 도입 (본 명세서에서는 또한 indel의 NHEJ-매개 도입이라고도 함) 또는 LCA10 표적 위치 (예를 들어, c.2991+1655A to G) 도입, 또는 (2) LCA10 표적 위치 (예를 들어, c.2991+1655A에서 G)에 돌연변이를 포함하는 게놈 서열의 파손-유도 결실 (본 명세서에서는 또한 NHEJ-매개 결실이라고도 함)이라고 하낟. 양쪽 접근법은 LCA 10 표적 위치에 돌연변이로 인한 크립틱 스플라이스 부위의 소실 또는 파괴를 일으킨다. 따라서, LCA의 치료에서 C2c1의 사용이 특히 고려된다.
연구자들은 유전자 치료를 광범위한 질병을 치료하는데 사용할 수 있는지의 여부를 숙고하고 있다. C2c1 이펙터 단백질을 기반으로 한 본 발명의 CRISPR 시스템은 추가의 예시된 표적된 영역 및 하기 전달 방법들에 제한되지만 이들을 포함하는, 그러한 치료적 이용을 고려한다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다. 본 시스템을 이용하여 유용하게 치료될 수 있는 증상 또는 질병의 일부 예는 본 명세서에 포함된 유전자 및 참고문헌의 예에 포함되고, 또한 그러한 증상들과 현재 연관된 것들도 또한 거기 제공된다. 예시된 유전자 및 증상은 빠짐없이 완전한 것은 아니다.
순환계 질병 치료
본 발명은 또한 본 명세서에 설명된 신규 CRISPR-Cas 시스템, 구체적으로 CRISPR 이펙터 단백질 시스템을 혈액 또는 조혈 줄기 세포로 전달하는 것을 고려한다. Wahlgren 등 (Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130)의 혈장 엑소솜은 이전에 기술되었고 혈액으로 CRISPR Cas 시스템을 전달하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 핵산-표적화 시스템은 지중해빈혈 및 겸상 세포 질병과 같은 이상헤모글로빈증의 치료를 또한 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 의해 표적될 수 있는 잠재적 표적에 대한, 국제 특허 공개 WO 2013/126794호를 참조한다.
Drakopoulou의 문헌 ["Review Article, The Ongoing Challenge of Hematopoietic Stem Cell-Based Gene Therapy for β-Thalassemia," Stem Cells International, Volume 2011, Article ID 987980, 10 pages, doi:10.4061/2011/987980]은 전체를 명시된 것 같은 그가 언급하는 문헌들과 함께 본 명세서에 참고문헌으로 통합되며, 이는 β-글로빈 또는 γ-글로빈에 대한 유전자를 전달하는 렌티바이러스를 이용하여 HSC를 변형시키는 것을 논의한다. 렌티바이러스 이용에 대조적으로, 해당 분야의 지식 및 본 개시 내용에서의 교시를 이용하여, 숙련자는 β-지중해빈혈에 대하여 돌연변이를 표적화하고 수정하는 CRISPR-Cas 시스템을 이용하여 HSC를 교정할 수 있고 (예를 들어, β-글로빈 또는 γ-글로빈, 유리하게는 비-겸상적혈구화 β-글로빈 또는 γ-글로빈에 대한 코딩 서열을 전달하는 적합한 HDR 주형을 이용); 특히, 가이드 RNA는 β-지중해빈혈을 야기시키는 돌연변이를 표적화할 수 있고, HDR은 β-글로빈 또는 γ-글로빈의 적절한 발현을 위한 코딩을 제공할 수 있다. 돌연변이-및-Cas 단백질 함유 입자를 표적화하는 가이드 RNA는 돌연변이를 운반하는 HSC와 접촉된다. 또한 입자는 β-글로빈 또는 γ-글로빈의 적절한 발현을 위해 돌연변이를 교정하기 위해 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이렇게 접촉된 세포를 투여할 수 있고; 임의로 치료 /확장된다; cf. Cartier. 이와 관련하여 다음을 언급할 수 있다: In this regard mention is made of: Cavazzana, "Outcomes of Gene Therapy for β-Thalassemia Major via Transplantation of Autologous Hematopoietic Stem Cells Transduced Ex Vivo with a Lentiviral βA-T87Q-Globin Vector." tif2014.org/abstractFiles/Jean%20Antoine%20Ribeil_Abstract.pdf; Cavazzana-Calvo, "Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human β-thalassaemia", Nature 467, 318-322 (16 September 2010) doi:10.1038/nature09328; Nienhuis, "Development of Gene Therapy for Thalassemia, Cold Spring Harbor Perpsectives in Medicine, doi: 10.1101/cshperspect.a011833 (2012), LentiGlobin BB305, a lentiviral vector containing an engineered β-globin gene (βA-T87Q); 및 Xie et al., "Seamless gene correction of β-thalassaemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyback" Genome Research gr.173427.114 (2014) www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.173427.114 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); 이것은 인간 β-지중해빈혈을 포함한 Cavazzana 작업의 주제이고, Xie 작업의 주제이며, 이에 인용되거나 이와 연관된 모든 문헌들과 함께, 모두 참조로 본 명세서에 편입된다. 본 발명에서, HDR 주형은 HSC가 조작된 β-글로빈 유전자 (예를 들어, βA-T87Q), 또는 Xie에서와 같이 β-글로빈을 발현하도록 제공될 수 있다.
Xu 등 (Sci Rep. 2015 Jul 9;5:12065 doi. doi:10.1038/srep12065])은 TALEN 및 CRISPR-Cas9를 설계하여 글로빈 유전자 내에서 인트론2 돌연변이 부위인 IVS2-654를 직접 표적한다. Xu 등은 IVS2-654 유전자좌에서 TALEN 및 CRISPR-Cas9를 이용하여 이중-가닥 파손 (DSB)의 상이한 빈도를 관찰하였으며, TALEN은 돼지Bac 트랜스포손 공여자와 조합된 경우 CRISPR-Cas9에 비교하여 더욱 높은 상동성 유전자 표적화 효율을 매개하였다. 추가적으로, 더욱 명백한 표적외 이벤트는 TALEN에 비하여 CRISPR-Cas9의 경우에 관찰되었다. 최종적으로, TALEN-수정된 iPSC 클론이 OP9 공동-배양 시스템을 이용하여 적혈모세포 분화를 위해 선택되었고, 미수정된 세포 외에 HBB의 상대적으로 더욱 높은 전사를 검출하였다.
Song 등 (Stem Cells Dev. 2015 May 1;24(9):1053-65. doi: 10.1089/scd.2014.0347. Epub 2015 Feb 5)은 CRISPR/Cas9를 사용해 β-Thal iPSC를 교정하였고; 유전자-교정 세포는 정상 핵형을 나타내며 인간 배아 줄기 세포 (hESC)로서 완전한 다능성은 오프-표적화 효과를 보이지 않았다. 그 다음, Song 등은 유전자-수정된 β-Thal iPSC의 분화 효율을 평가하였다. Song 등은 조혈성 분화 동안, 유전자-수정된 β-Thal iPSC가 증가된 배양체 비율 및 각종 조혈성 선조 세포 퍼센트를 나타내었음을 발견하였다. 더욱 중요하게는, 유전자-수정된 β-Thal iPSC 계통이 HBB 발현을 복구하고, 수정되지 않은 기에 비하여 반응성 산소 종을 감소시켰다. Song 등의 연구는 β-Thal iPSC의 조혈성 분화가, CRISPR-Cas9 시스템에 의해 일단 수정되면, 크게 개선됨을 제안하였다. 여기 설명된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질을 포함하는 시스템을 활용하여 유사한 방법들이 수행될 수 있다.
겸상 적혈구성 빈혈은 적혈 세포가 낫-모양이 되는 상염색체 열성 유전 질병이다. 이는 β-글로빈 유전자에서 염색체 11의 단완에 위치하는 단일 염기 치환에 의해 생성한다. 결과로서, 발린은 겸상 헤모글로빈 (HbS)의 생산을 발생시키는 글루탐산 대신 발린이 생산된다. 이는 왜곡된 형태의 적혈구의 형성을 야기한다. 비정상적인 모양에 의해, 작은 혈관이 차단되어, 뼈, 비장 및 피부 조직에 심각한 손상을 발생시킨다. 이는 통증의 에피소드, 빈번한 감염 및 손-발 증후군 또는 심지어는 다수 기관 부전을 이끌어낼 수 있다. 왜곡된 적혈구는 또한 용혈에 더 민감하여, 심각한 빈혈증을 이끌어낸다. β-지중해빈혈의 경우에서와 같이, 겸상 적혈구 빈혈증은 CRISPR-Cas 시스템으로 HSC를 변형시켜 편집될 수 있다. 시스템은 이의 DNA를 절단한 후 이를 자체 복구하도록 하여 세포의 게놈의 특이적 편집을 가능하게 한다. Cas 단백질은 돌연변이 점으로 RNA 가이드에 의해 삽입되고 유도된 후 이 지점에서 DNA를 절단한다. 동시에, 건강한 버전의 서열이 삽입된다. 이 서열은 세포 자신의 복구 시스템에 의해 사용되어 유도된 절단을 고친다. 이 방식에서, CRISPR-Cas는 이전에 수득된 줄기 세포에서 돌연변이의 편집을 가능하게 한다. 당 분야의 지식 및 이 내용에서의 기재를 이용하여, 숙련자는 (예를 들어, β-글로빈, 유리하게는 비-겸상 β-글로빈에 대한 코딩 서열을 전달하는 적합한 HDR 주형을 가지고) 돌연변이를 표적화하고 편집하는 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 겸상 적혈구 빈혈증에 관한 HSC를 편집할 수 있으며; 돌연변이-및-Cas 단백질 함유 입자를 표적화하는 가이드 RNA는 돌연변이를 운반하는 HSC와 접촉된다. 또한 입자는 β-글로빈 또는 글로빈의 적절한 발현을 위해 돌연변이를 교정하기 위해 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이렇게 접촉된 세포를 투여할 수 있고; 임의로 치료 /확장된다; cf. Cartier. HDR 주형은 HSC가 조작된 β-글로빈 유전자 (예를 들어, βA-T87Q), 또는 Xie에서와 같이 β-글로빈을 발현하도록 제공할 수 있다.
전체로 기재된 대로, 인용된 문헌들과 함께 참조로 본 명세서에 편입되는, [Williams, "Broadening the Indications for Hematopoietic Stem Cell Genetic Therapies," Cell Stem Cell 13:263-264 (2013)]은 리소솜 저장 질환 이염성 백질 이영양증 (MLD), 신경 탈수초를 초래하는 아릴술파타제 A 결핍 (ARSA)으로 야기된 유전병 환자로부터의 HSC/P 세포로 렌티바이러스-매개 유전자 전달; 및 위스코트-알드리치 증후군 (WAS) 환자 (혈액 세포 계통에서 세포골격 기능을 조절하는 소형 GTPase CDC42의 이펙터인 WAS 단백질이 결핍된 환자로서, 재발성 감염 동반 면역 결핍, 자가면역 증후군, 및 과다 출혈을 초래하는 비정상적으로 작고 이상기능인 혈소판 존재로 백혈병 및 림프종의 위험성이 증가되는 혈소판 감소증을 앓게됨)의 HSC로 렌티바이러스-매개 유전자 전달을 보고한다. 렌티바이러스의 사용과 달리, 당 분야에서의 지식 및 본원 상세한 설명에서의 개시를 가지고, 숙련자는 (예를 들어, ARSA에 대한 코딩 서열을 전달하는 적절한 HDR 주형으로) 돌연변이 (아실술파타제 A (ARSA)의 결핍)를 표적으로 하고 편집하는 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 MLD (아실술파타제 A (ARSA)의 결핍)에 관하여 HSC를 편집할 수 있다; 특별히, 가이드 RNA는 MLD (결핍 ARSA)를 발생시킨 돌연변이를 표적으로 할 수 있고 ARSA의 적절한 발현을 위한 코딩을 제공할 수 있다. 돌연변이-및-Cas 단백질 함유 입자를 표적화하는 가이드 RNA는 돌연변이를 운반하는 HSC와 접촉된다. 또한 입자는 ARSA 글로빈 또는 글로빈의 적절한 발현을 위해 돌연변이를 교정하기 위해 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이렇게 접촉된 세포를 투여할 수 있고; 임의로 치료 /확장된다; cf. Cartier. 렌티바이러스의 사용과 달리, 당 분야에서의 지식 및 본원 상세한 설명에서의 개시를 가지고, 숙련자는 (예를 들어, WAS 단백질에 대한 코딩 서열을 전달하는 적절한 HDR 주형으로) 돌연변이 (WAS 단백질 결핍)를 표적으로 하고 교정하는 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 WAS에 관하여 HSC를 교정할 수 있고; 특히, 가이드 RNA는 WAS (결핍 WAS 단백질)를 발생시킨 돌연변이를 표적으로 할 수 있고 WAS 단백질의 적절한 발현을 위한 코딩을 제공할 수 있다. 돌연변이-및-C2c1 단백질 함유 입자를 표적화하는 가이드 RNA는 돌연변이를 운반하는 HSC와 접촉된다. 또한 입자는 WAS 글로빈 또는 글로빈의 적절한 발현을 위해 돌연변이를 교정하기 위해 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이렇게 접촉된 세포를 투여할 수 있고; 임의로 치료 /확장된다; cf. Cartier.
완전히 기재된 바와 같이, 인용된 문헌과 함께 참조로 본 명세서에 편입되는, [Watts, "Hematopoietic Stem Cell Expansion and Gene Therapy" Cytotherapy 13(10):1164-1171.doi:10.3109/14653249.2011.620748 (2011)]은 혈액학적 질환, HIV/AIDS를 포함하는 면역결핍, 및 SCID-X1, ADA-SCID, β-지중해빈혈, X-관련 CGD, 위스코트-알드리치 증후군, 판코니 빈혈증, 부신백질이영양증 (ALD), 및 이염성 백질 이영양증 (MLD)을 포함하는, 리소솜 축적병과 같은 그외 유전 장애를 포함하는 많은 장애에 대한 매우 매력적인 치료 옵션으로서 조혈 줄기 세포 (HSC) 유전자 치료, 예를 들어, 바이러스-매개 조혈 줄기 세포 (HSC) 유전자 치료법을 논의한다.
Cellectis로 양도된 미국 특허 공개 제20110225664호, 제20110091441호, 제20100229252호, 제20090271881호 및 제20090222937호는 CREI 변이체에 관한 것으로, 여기서 2 개의 I-CreI 단량체 중 적어도 하나는 적어도 2 개의 치환을 가지고 있으며, LAGLIDADG (SEQ ID NO: 26) 코어 도메인의 2 개의 작용성 서브도메인 각각에서의 하나는 I-CreI의 위치 26 내지 40 및 44 내지 77에 각각 위치하며, 상기 변이체는 공동 사이토카인 수용체 감마 사슬 유전자 또는 감마 C 유전자로도 명명된 인간 인터루킨-2 수용체 감마 사슬(IL2RG) 유전자으로부터 DNA 표적 서열을 절단할 수 있다. 표적 서열 미국 특허 공개 제20110225664호, 제20110091441호, 제20100229252호, 제20090271881호 및 제20090222937호에서 확인된 표적 서열이 본 발명의 핵산-표적화 시스템에서 사용될 수 있다.
중증 복합형 면역 결핍증 (SCID)은 림프구 B에서의 작용성 결함과 항상 관련되는 림프구 T 성숙에서의 결함으로부터 야기한다 (문헌 [Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). 전체 발생은 75 000명의 출생 중 1명으로 평가된다. 치료되지 않은 SCID를 갖는 환자는 다수의 기회적 미생물 감염이 걸릴수 있으며, 일반적으로 1년 이후 생존하지 않는다. SCID는 가족 기증자로부터 동종 이계 조혈 줄기 세포 이송에 의해 치료될 수 있다. 기증자와의 조직적합성은 광범위하게 변할 수 있다. SCID 형태 중 하나인 아데노신 디아미나제(Deaminase:ADA) 결핍증의 경우에, 환자는 재조합 아데노신 디아미나제 효소의 주사에 의해 치료될 수 있다.
ADA 유전자가 SCID 환자에서 돌연변이 된 것으로 보여진 이후로 (문헌 [Giblett et al., Lancet, 1972, 2, 10671069]), SCID와 관련된 여러 다른 유전자가 확인되었다 (문헌 [Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). SCID에 대한 4 개의 주요 원인이 있다:(i) SCID의 가장 빈번한 형태인, SCID-X1 (X-관련 SCID 또는 X-SCID)은 IL2RG 유전자에서의 돌연변이에 의해 발생하며, 이는 성숙 T 림프구 및 NK 세포의 부재를 야기한다. IL2RG는 적어도 5 개 인터루킨 수용체 복합체의 공통 성분인 감마 C 단백질을 코딩한다 (문헌 [Noguchi, et al., Cell, 1993, 73, 147157]). 이들 수용체는 JAK3 키나제를 통해 몇몇 표적을 활성화시키는데 (Macchi et al., Nature, 1995, 377, 65-68), 이의 불활성화는 감마 C 불활성화와 동일한 증후군을 초래하고; (ii) ADA 유전자의 돌연변이는 림프종 전구체에 치명적이어서, 이후 B, T, 및 NK 세포의 유사 부재를 야기시키는 푸린 물질대사의 결함을 야기하고; (iii) V(D)J 재조합은 면역글로불린 및 T 림프구 수용체 (TCR)의 성숙화에서 필수 단계이다. 이러한 과정에 관여되는 3개 유전자, 재조합 활성화 유전자 1 및 2 (RAG1 및 RAG2) 및 Artemis 내 돌연변이는 성숙한 T 및 B 림프구의 부재를 야기하고; (iv) T 세포 특이적 신호전달에 관여하는, CD45 같은 다른 유전자 내 돌연변이가 또하나 보고되었지만, 그들은 소수 사례를 대표한다 (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). 그들의 유전적 기반이 확인된 때로부터, 상이한 SCID 형태는 두가지 주요 이유로 인해 유전자 치료 시도에 대한 통상적인 예가 된다 (문헌 [Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). 첫번째로는, 모든 혈액 질환에서와 같이, 생체 외 치료가 고려될 수 있다. 조혈성 줄기 세포 (HSC)는 골수로부터 회복될 수 있으며, 그의 다능성 특성을 수 회의 세포 분열 동안 유지한다. 따라서, 이들은 시험관 내에서 처리될 수 있으며, 이후 환자에게 다시 주사될 수 있어서, 여기서 이들은 골수를 다시 채운다. 두번째로, 림프구의 성숙은 SCID 환자에서 손상되기 때문에, 편집된 세포는 선택적 장점을 갖는다. 따라서, 적은 수의 편집된 세포가 작용성 면역계를 회복할 수 있다. 이러한 가정은 (i) SCID 환자에서 돌연변이 반전과 연관된 면역 기능의 부분적 복원 (Hirschhorn et al., Nat. Genet., 1996, 13, 290-295; Stephan et al., N. Engl. J. Med., 1996, 335, 1563-1567; Bousso et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 2000, 97, 274-278; Wada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 8697-8702; Nishikomori et al., Blood, 2004, 103, 4565-4572), (ii) 조혈 세포에서 시험관 내 SCID-X1 결핍의 교정 (Candotti et al., Blood, 1996, 87, 3097-3102; Cavazzana-Calvo et al., Blood, 1996, Blood, 88, 3901-3909; Taylor et al., Blood, 1996, 87, 3103-3107; Hacein-Bey et al., Blood, 1998, 92, 4090-4097), (iii) SCID-X1 (Soudais et al., Blood, 2000, 95, 3071-3077; Tsai et al., Blood, 2002, 100, 72-79), JAK-3 (Bunting et al., Nat. Med., 1998, 4, 58-64; Bunting et al., Hum. Gene Ther., 2000, 11, 2353-2364) 및 RAG2 (Yates et al., Blood, 2002, 100, 3942-3949) 결핍의 동물 모델에서 생체내 교정 및 (iv) 유전자 요법 임상 시험의 결과 (Cavazzana-Calvo et al., Science, 2000, 288, 669-672; Aiuti et al., Nat. Med., 2002; 8, 423-425; Gaspar et al., Lancet, 2004, 364, 2181-2187)에 의해 수차례 검증되었다.
Children's Medical Center Corporation 및 President and Fellows of Harvard College에 의해 양도된 미국 특허 공개 제20110182867호는 RNAi 및 항체와 같은 BCL11A 발현 또는 활성의 억제제를 통해 조혈 전구체 세포에서 태아 헤모글로빈 발현(HbF)을 조절하는 방법 및 용도에 관한 것이다. BCL11a와 같은 미국 특허 공개 제20110182867호에 개시된 표적은 태아 헤모글로빈 발현을 조절하기 위한 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 의해 표적될 수 있다. 또한 추가의 BCL11A 표적에 대해 다음을 참조한다: Bauer et al. (Science 11 October 2013: Vol. 342 no. 6155 pp. 253-257) 및 Xu et al. (Science 18 November 2011: Vol. 334 no. 6058 pp. 993-996).
해당 분야의 지식 및 본 개시 내용의 교시를 이용하여, 당업자는 본 명세서에 개시된 C2c1-CRISPR 시스템 및 상기 기술된 바와 같은 CrISPR-Cas 시스템을 사용해 유전적 조혈 장애, 예를 들어, β-지중해빈혈, 혈우병, 또는 유전적 리소좀 축적병에 대해 HSC를 편집할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
HSC - 조혈 줄기 세포로의 전달 및 이의 편집; 및 특정 병태
용어 "조혈 줄기 세포" 또는 " HSC" 는 HSC, 예를 들어 모든 다른 혈액 세포를 발생시키고 중간엽으로부터 유래되고; 대부분의 뼈 중심에 함유된 적색 골수에 위치하는, 혈액 세포로 간주되는 광범위한 세포를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 HSC는 소형 크기, 계통 결여 (lin) 마커, 및 CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, 및 또한 c-kit, - 줄기 세포 인자의 수용체와 같은, 분화 시리즈의 클러스터에 속하는 마커로 확인되는, 조혈 줄기 세포의 표현형을 갖는 세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포는 계통 관련성의 검출에 사용되는 마커에 음성이고, 따라서, Lin- 라고 하며; FACS에 의한 그들 정제 동안, 다수의 최대 14개의 상이한 성숙한 혈액-계통 마커, 예를 들어 인간의 경우에, 골수에 대한 CD13 & CD33, 적혈구에 대한 CD71, B 세포에 대한 CD19, 거핵세포에 대한 CD61; 및 B 세포에 대한 B220 (쥐과 CD45), 단핵구에 대한 Mac-1 (CD11b/CD18), 과립구에 대한 Gr-1, 적혈 세포에 대한 Ter119, T 세포에 대한 Il7Ra, CD3, CD4, CD5, CD8 등, 마우스 HSC 마커: CD34lo/-, SCA-1+, Thy1.1+/lo, CD38+, C-kit+, lin-, 및 인간 HSC 마커: CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD117+, 및 lin- 가 있다. HSC는 마커를 통해 확인된다. 그러므로 본 명세서에 논의된 구현예에서, HSC는 CD34+ 세포일 수 있다. HSC는 또한 CD34-/CD38- 인 조혈 줄기 세포이다. HSC로서 작용하는 것으로 간주되는 세포 표면 상의 c-kit가 결여될 수 있는 줄기 세포는 본 발명의 영역 내에 있을뿐만 아니라, 유사하게 CD133+ 세포도 당분야에서 HSC로 간주한다.
CRISPR-Cas (eg C2c1) 시스템은 HSC에서 유전자 좌위 또는 좌위들을 표적으로 삼도록 조작될 수 있다. 유리하게, 진핵생물 세포 및 특히 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포, 예를 들어, HSC에 대해 코돈-최적화된 Cas (eg C2c1) 단백질, 및 HSC의 유전자좌 또는 유전자좌들, 예를 들어, 유전자 EMX1을 표적화하는 sgRNA가 제조될 수 있다. 이들은 입자를 통해 전달될 수 있다. 입자는 Cas (eg C2c1) 단백질 및 gRNA를 혼합하여 형성될 수 있다. gRNA 및 Cas (eg C2c1) 단백질 혼합물은 예를 들어 계면활성제, 인지질, 생분해성 중합체, 지단백질, 및 알콜을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 이루어진 혼합물과 혼합될 수 있고, 그리하여 gRNA 및 Cas (eg C2c1) 단백질을 함유하는 입자가 형성될 수 있다. 본 발명은 이렇게 만든 입자 및 이러한 방법에 의한 입자를 비롯하여 이의 용도를 이해한다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
보다 일반적으로, 입자는 효과적인 방법을 사용해 형성될 수 있다. 첫째로, Cas (eg C2c1) 단백질 및 유전자 EMX1을 표적화하는 gRNA 또는 대조군 유전자 EMX1 또는 대조군 유전자 LacZ는 적절하게, 예를 들어 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2 또는 1:1 몰비율로, 적절한 온도, 예를 들어 15-30C, 예를 들어, 20-25C, 예를 들어, 실온에서, 적절한 시간, 예를 들어 5-45, 예컨대 30분 동안, 유리하게 멸균, 뉴클레아제 무함유 완충액, 예를 들어 1X PBS 중에서 함께 혼합될 수 있다. 별도로, 하기와 같은 또는 하기를 포함하는 입자 성분: 계면활성제, 예를 들어, 양이온성 지질, 예를 들어, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP); 인지질, 예를 들어, 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC); 생분해성 중합체, 예컨대 에틸렌-글리콜 중합체 또는 PEG, 및 지단백질, 예컨대 저밀도 지단백질, 예를 들어 콜레스테롤과 같은 또는 이를 포함하는 입자 성분을 알콜, 유리하게 C1-6 알킬 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 예를 들어 100% 에탄올에 용해시켰다. 2 가지 용액을 함께 혼합하여 Cas (예를 들어, C2c1)-gRNA 복합체를 함유하는 입자를 형성시킬 수 있다. 일정 구현예에서, 입자는 HDR 주형을 함유할 수 있다. 그것은 gRNA+Cas (eg C2c1) 단백질-함유 입자와 동시-투여되는 입자일 수 있거나, 또는 다시 말해서, HSC를 gRNA+Cas (eg C2c1) 단백질-함유 입자와 접촉시키는 것 이외에도, HSC를 HDR 주형을 함유하는 입자와 접촉시키거나, 또는 HSC는 모든 gRNA, Cas (eg C2c1) 및 HDR 주형을 함유하는 입자와 접촉된다. HDR 주형은 개별 벡터로 투여될 수 있는데, 그리하여 제1 예에서 입자는 HSC 세포르 투과하고 개별 벡터가 또한 세포를 투과하며, 여기서 HSC 게놈은 gRNA+Cas (eg C2c1)에 의해 변형되고 HDR 주형이 또한 존재하며, 그리하여 게놈 유전자좌는 HDR에 의해 변형되며; 예를 들어 이러한 결과로 돌연변이가 교정될 수 있다.
입자 형성 후에, 96웰 플레이트 내 HSC는 웰 당 15 ug Cas (eg C2c1) 단백질이 형질감염될 수 있다. 형질감염 후 3일에, HSC를 수확할 수 있고, EMX1 유전자좌에서 삽입 및 결실 (indel)의 수를 정량할 수 있다.
이것은 HSC가 HSC 내 관심 게놈 유전자좌 또는 유전자좌들을 표적으로 하는 CRISPR-Cas (eg C2c1)을 사용해 어떻게 변형될 수 있는가를 예시한다. 변형시키려는 HSC는 생체내일 수 있고, 즉 유기체, 예를 들어 인간 또는 비인간 진핵생물, 예를 들어 동물, 예컨대 어류, 예를 들어 제브라 피쉬, 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어, 유인원, 침팬지, 마카크 원숭이, 설치류, 예를 들어 마우스, 토끼, 래트, 개, 개과 또는 개, 가축 (소/소과, 양/양과, 염소 또는 돼지), 새 또는 가금류, 예를 들어 닭일 수 있다. 변형시키려는 HSC는 시험관내, 즉 이러한 유기체 밖일 수 있다. 그리고, 변형된 HSC는 생체외에서 사용할 수 있고, 즉 이러한 유기체의 하나 이상의 HSC는 유기체로부터 수득 또는 단리될 수 있고, 임의로 HSC(들)는 확장될 수 있으며, HSC(들)는 예를 들어, HSC(들)를 조성물과 접촉시켜서, HSC 내 유전자 좌위 또는 좌위들을 표적으로 하는 CRISPR-Cas (eg C2c1)을 포함하는 조성물에 의해 변형되고, 예를 들어, 여기서 조성물은 CRISPR 효소 및 HSC의 유전자 좌위 또는 좌위들을 표적으로 하는 하나 이상의 gRNA를 함유하는 입자를 포함하고, 이러한 입자는 계면활성제, 인지질, 생분해성 중합체, 지단백질, 및 알콜을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 혼합물과 gRNA (하나 이상의 gRNA는 HSC의 유전자 좌위 또는 유전자좌를 표적으로 함) 및 Cas (eg C2c1) 단백질 혼합물과 혼합하여 수득되거나 또는 수득가능하고, 임의로 최종 변형된 HSC를 확장시키고 유기체에게 최종 변형된 HSC를 투여한다. 일부 예에서, 단리 또는 수득된 HSC는 제1 유기체, 예컨대 제2 유기체와 동일한 종으로부터의 유기체 유래일 수 있고, 제2 유기체는 최종 변형된 HSC가 투여되는 유기체일 수 있으며, 예를 들어 제1 유기체는 제2 유기체에 대한 도너 (예컨대 부모 또는 형제같은 친척)일 수 있다. 변형된 HSC는 개체 또는 대상체 또는 환자의 질환 증상 또는 병태 상태를 해결하거나 또는 완화시키거나 또는 감소시키기 위해 유전자 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 제2 유기체에 대한 제1 유기체 도너의 예에서, 변형된 HSC는 HSC가 하나 이상의 단백질, 예를 들어 제2 유기체의 것과 같은 표면 마커 또는 단백질을 갖도록 유전자 변형을 가질 수 있다. 변형된 HSC는 개체 또는 대상체 또는 환자의 질환 또는 병태 상태를 모의하도록 유전자 변형을 가질 수 있고 동물 모델을 준비하기 위해 비인간 유기체에게 재투여될 수 있다. HSC의 확장은 본 개시 및 당업자의 지식을 통해 당업자의 영역 내이며, 예를 들어, 다음을 참조한다: Lee, "Improved ex vivo expansion of adult hematopoietic stem cells by overcoming CUL4-mediated degradation of HOXB4." Blood. 2013 May 16;121(20):4082-9. doi: 10.1182/blood-2012-09-455204. Epub 2013 Mar 21.
활성을 개선시키기 위해 표시된 바와 같이, sgRNA 는 입자에 전체 복합체를 제제화시키기 전에, Cas (eg C2c1) 단백질과 사전 복합체 형성될 수 있다. 제제는 세포로 핵산의 전달을 촉진하는 것으로 알려진 상이한 성분의 상이한 몰비로 제조될 수 있다 (예를 들어, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄프로판 (DOTAP), 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 콜레스테롤). 예를 들어, DOTAP : DMPC : PEG : 콜레스테롤 몰비율은 DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0; 또는 DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, 콜레스테롤 0; 또는 DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, 콜레스테롤 5. DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0일 수 있다. 따라서 본 발명은 gRNA, Cas (eg C2c1) 단백질 및 입자를 형성하는 성분을 혼합하는 것 뿐 아니라; 이러한 혼합으로부터의 입자로 이해된다.
바람직한 구현예에서, Cas (eg C2c1)-gRNA 복합체를 함유하는 입자는 Cas (eg C2c1) 단백질 및 하나 이상의 gRNA를 함께, 바람직하게 1:1 몰비율의 효소: 가이드 RNA로 혼합하여 형성될 수 있다. 개별적으로, 핵산의 전달을 촉진한다고 알려진 상이한 성분 (예를 들어, DOTAP, DMPC, PEG, 및 콜레스테롤)은 바람직하게 에탄올에 용해된다. 2 가지 용액을 함께 혼합하여 Cas (예를 들어, C2c1)-gRNA 복합체를 함유하는 입자를 형성시킨다. 입자가 형성된 후에, Cas (eg C2c1)-gRNA 복합체가 세포 (예를 들어, HSC)가 세포를 형질감염시킬 수 있다. 바코드가 적용될 수 있다. 입자, Cas 및/또는 gRNA는 바코드화될 수 있다.
본 발명은 gRNA 및 Cas (eg C2c1) 단백질 혼합물을 계면활성제, 인지질, 생분해성 중합체, 지단백질, 및 알콜을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로이루어진 혼합물과 혼합하는 단계를 포함하는 gRNA-및-Cas (eg C2c1) 단백질 함유 입자를 제조하는 방법을 포괄한다. 구현예는 방법으로부터의 gRNA-및-Cas (eg C2c1) 단백질 함유 입자를 포괄한다. 일 구현예에서 본 발명은 gRNA가 관심 게놈 유전자좌를 표적으로 하는 것인, 입자와 관심 게놈 유전자좌를 함유하는 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 관심 게놈 유전자좌에서 표적 서열의 조작에 의한, 관심 게놈 유전자좌, 또는 유기체 또는 비인간 유기체를 변형시키는 방법; 또는 gRNA 가 관심 게놈 유전자좌를 표적화하는 것인, 입자와 관심 게놈 유전자좌를 함유하는 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 관심 게놈 유전자좌의 표적 서열의 조작에 의한 관심 게놈 유전자좌, 또는 유기체 또는 비인간 유기체의 변형 방법에서, 입자의 용도를 포괄한다. 이들 구현예에서, 관심 게놈 유전자좌는 유리하게 HSC 내 게놈 유전자좌이다.
치료적 적용에서 고려사항: 게놈 편집 요법에서 고려사항은 서열-특이적 뉴클레아제, 예컨대 C2c1 뉴클레아제의 선택이다. 각각의 뉴클레아제 변이체는 그 자신의 고유한 세트의 강점 및 약점을 보유할 수 있고, 많은 이들은 치료적 이득을 극대화하기 위해 치료 상황에서 균형을 맞춰야만 한다. 따라서, 뉴클레아제를 사용하는 2개의 치료 편집 접근법은 유전자 파괴 및 유전자 교정이라는 상당한 유망성을 보여주었다. 유전자 파괴는 유전자 엘리먼트에서 표적화된 indel을 생성시키도록 NHEJ의 자극을 포함하고, 종종 환자에게 유리한 기능 상실 돌연변이를 생성시킨다. 대조적으로, 유전자 교정은 교정된 엘리먼트의 생리적 조절을 보존하면서 질환 초래 돌연변이를 직접적으로 반전시켜 기능을 복구하기 위해 HDR을 사용한다. HDR은 또한 잃어버린 유전자 기능을 회복하기 위해서 게놈 내 정해진 ‘세이프 하버’ 유전자좌로 치료적 이식유전자를 삽입시키는데 사용될 수 있다. 특별한 편집 요법이 효과적이기 위해서, 충분하게 높은 수준의 변형이 질환 증상을 반전시키기 위해 표적 세포 개체군에서 달성되어야만 한다. 이러한 치료적 변형 ‘한계치’는 치료 후 편집된 세포의 피트니스 및 증상을 반전시키는데 필요한 유전자 산물의 양에 의해 결정된다. 피트니스와 관련하여, 편집은 그들의 미편집 대응부에 대해서 치료된 세포에 대해 3가지 잠재적인 결과: 증가, 중화, 또는 감소 피트니스를 일으킨다. 증가된 적합화 경우에, 예를 들어 SCID-X1의 치료에서, 변형된 조혈 전구체 세포는 그들의 미편집된 대응부에 비해서 선택적으로 확장된다. SCID-X1는 그 기능이 조혈 림프구 계통의 적절한 발생에 필요한, IL2RG 유전자 내 돌연변이로인해 초래된 질환이다 [Leonard, W.J., et al. Immunological reviews 138, 61-86 (1994); Kaushansky, K. & Williams, W.J. Williams hematology, (McGraw-Hill Medical, 뉴욕, 2010)]. SCID-X1, 및 SCID-X1 돌연변이의 자발적 교정의 희귀 예에 대한 바이러스 유전자 요법을 받은 환자의 임상 시험에서, 교정된 조혈 전구체 세포는 이러한 발생 차단을 극복할 수 있고 요법을 매개하도록 그들 질환 대응물에 대해 확장된다 [Bousso, P., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 274-278 (2000); Hacein-Bey-Abina, S., et al. The New England journal of medicine 346, 1185-1193 (2002); Gaspar, H.B., et al. Lancet 364, 2181-2187 (2004)]. 이러한 경우에, 편집된 세포가 선택적 장점을 보유하는 경우에, 비록 작은 수의 편집된 세포가 확장을 통해 증폭될 수 있어도, 환자에게 치료적 이득을 제공한다. 대조적으로, 만성 육아종성 장애 (CGD) 같은 다른 조혈 질환을 위한 편집은 편집된 조혈 전구체 세포에 대한 적합화의 변화를 유도하지 않아서, 치료적 변형 한계치를 증가시킨다. CGD는 병원체를 사멸시키는 반응성 산소종을 발생시키기 위해 호중구에 의해 정상적으로 사용되는, 대식세포 옥시다제 단백질을 코딩하는 유전자 내 돌연변이로 인해 초래된다 [Mukherjee, S. & Thrasher, A.J. Gene 525, 174-181 (2013)]. 이들 유전자의 이상기능이 조혈 전구체 세포 피트니스 또는 발생에 영향을 미치지 않지만, 오직 감염과 싸우는 성숙한 조혈 세포 유형의 능력에 영향을 미치므로, 이러한 질환에서 편집된 세포의 우선적 확장은 아마도 없을 것이다. 실제로, CGD에서 유전자 교정된 세포에 대한 선택적 장점이 유전자 요법 시험에서 관찰되지 않았고, 장기간 세포 생착의 어려움을 야기시켰다 [Malech, H.L., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 12133-12138 (1997); Kang, H.J., et al. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 19, 2092-2101 (2011)]. 이와 같이, 유의하게 더 높은 수준의 편집이 CGD같은 질환을 치료하는데 요구되고, 여기서 편집은 편집이 표적 세포에 대해 증가된 피트니스를 생성시키는 질환에 비해서, 중성 피트니스 장점을 생성시킨다. 편집이 피트니스 단점을 부여하면, 암 세포에서 종양 억제인자 유전자에 기능을 복원시키기 위한 경우에서 처럼, 변형된 세포는 그들 질환 대응물이 능가하여, 편집 비율에 비해 치료 이득이 낮아지게 된다. 이러한 후자 부류의 질환은 게놈 편집 요법으로 치료하는데 특히 어렵다.
세포 피트니스 이외에도, 질환을 치료하는데 필요한 유전자 산물의 양이 또한 증상을 반전시키기 위해 획득되어야 하는 치료적 게놈 편집의 최소 수준에 영향을 미친다. 혈우병 B는 유전자 산물 수준의 작은 변화가 임상 결과에 상당한 변화를 일으킬 수 있는 질환 중 하나이다. 이러한 질환은 응고 캐스캐이드의 성분으로서 기능하고, 정상적으로 간에 의해 혈액으로 분배되는 단백질인 인자 IX를 코딩하는 유전자 내 돌연변이로 인해 초래된다. 혈우병 B의 임상 중증도는 인자 IX 활성량과 관련된다. 중증 질환이 1% 미만의 정상 활성과 연관되는 반면, 경증 형태의 질환은 1% 초과의 인자 IX 활성과 연관된다 [Kaushansky, K. & Williams, W.J. Williams hematology, (McGraw-Hill Medical, 뉴욕, 2010); Lofqvist, T., et al. Journal of internal medicine 241, 395-400 (1997)]. 이것은 적은 비율의 간세포로라도 인자 IX 발현을 복원할 수 있는 편집 요법은 임상 결과에 큰 영향을 미칠 수 있다는 것을 의미한다. 탄생 직후 혈우병 마우스 모델을 교정하기 위해 ZFN을 사용한 연구는 3-7% 교정이 질환 증상을 반전시키는데 충분하였고, 이러한 가설을 위한 전임상 증거를 제공하였음을 입증하였다 [Li, H., et al. Nature 475, 217-221 (2011)].
유전자 산물 수준의 작은 변화가 임상 결과에 영향을 미치는 장애 및 편집된 세포에 피트니스 장점이 존재하는 질환은 게놈 편집 요법을 위한 이상적인 표적인데, 치료 변형 한계치가 현행 기술을 고려하여 높은 성공 기회를 허용하기에 충분히 낮기 때문이다. 이들 질환의 표적화는 이제 전임상 수준 및 I상 임상 시험에서 편집 요법에 의한 성공을 이끌었다. 편집된 세포에 대해 중성 피트니스 장점을 갖는 질환, 또는 많은 양의 유 전자 산물이 치료에 필요한 경우까지 이러한 유망한 결과를 확장시키는데 DSB 복구 경로 조작 및 뉴클레아제 전달의 개선이 필요하다. 하기 표 6은 치료 모델에 대한 게놈 편집 적용의 일부 예를 보여주고, 하기 표 6의 참조 및 그들 참조에 인용된 문헌들은 완전히 기재된 바와 같이 참조로 본 명세서에 편입된다.
Figure pct00052
유리하게 본 명세서에서와 같은 전달 시스템, 예를 들어 입자 전달 시스템을 통한, 돌연변이의 HDR-매개 교정, 또는 교정된 유전자 서열의 HDR-매개 삽입에 의해 표적에 대해 CRISPR-Cas (eg C2c1) 시스템을 사용하여, 전술한 표의 각 병태의 해결은 본 시 및 당분야의 지식을 통해 당업자의 영역 내이다. 따라서, 일 구현예는 혈우병 B, SCID (예를 들어, SCID-X1, ADA-SCID) 또는 유전적 티로신혈증 돌연변이-보유 HSC와 혈우병 B, SCID (예를 들어, SCID-X1, ADA-SCID) 또는 유전적 티로신혈증에 대한 관심 게놈 유전자좌를 표적화하는 입자를 함유하는 gRNA-및-Cas (eg C2c1) 함유 입자를 접촉시키는 단계를 포괄한다 (Li, Genovese or Yin). 또한 입자는 돌연변이를 교정하기 위해 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이와 관련하여, 혈우병 B는 응고 캐스캐이드의 핵심 성분인, 인자 Ix를 코딩하는 유전자 내 기능 상실 돌연변이로 인해 초래되는 X-연결 열성 장애라는 것을 언급한다. 중증 발병 개체에서 이의 수준의 1% 이상까지 인자 IX 활성의 회복은 질환을 상당히 더 경증의 형태로 전환시킬 수 있는데, 이러한 수준을 달성하기 위해 어린 나이부터 예방적으로 이러한 환자에게 재조합 인자 Ix의 주입이 대체로 임상 합병증을 완화시키기 때문이다. 당분야의 지식 및 본 개시의 교시를 통해서, 당업자는 돌연변이를 표적화하고 교정하는 CRISPR-Cas (eg C2c1) 시스템을 사용하여 혈우병 B (인자 IX를 코딩하는 유전자 내 기능 상실 돌연변이로 초래된 X-연관 열성 장애)에 대해서 (예를 들어, 인자 Ix에 대한 코디이 서열을 전달하는 적합한 HDR 주형을 사용해) HSC를 교정할 수 있고; 특히 gRNA는 혈우병 B을 발생시키는 돌연변이를 표적화할 수 있고, HDR은 인자 XI의 적절한 발현을 위한 코딩을 제공할 수 있다. 돌연변이-및-Cas (eg C2c1) 단백질 함유 입자를 표적화하는 가이드 RNA는 돌연변이를 운반하는 HSC와 접촉된다. 또한 입자는 인자 의 적절한 발현을 위해 돌연변이를 교정하기 위해 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이렇게 접촉된 세포를 투여할 수 있고; 임의로 치료 /확장된다; 본 명세서에 논의된, Cartier 참조.
전체로 기재된 바와 같이, 인용하는 문헌과 함께 참조로 본 명세서에 편입되는, [Cartier, "MINI-SYMPOSIUM: X-Linked Adrenoleukodystrophypa, Hematopoietic Stem Cell Transplantation and Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy in X-Linked Adrenoleukodystrophy," Brain Pathology 20 (2010) 857-862]에서, 동종이계 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)이 후를러 질환 환자의 뇌로 정상 리소솜 효소를 전달하기 위해 이용되었다는 인식, 및 ALD를 치료하기 위한 HSC 유전자 요법의 논의가 존재한다. 2명 환자에서, 말초 CD34+ 세포를 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 고정 후 수집하였고 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실, dl587rev 프라이머 결합 부위 치환된 (MND)-ALD 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 환자로부터의 CD34+ 세포는 저농도로 사이토카인의 존재 하에서 16시간 동안 MND-ALD 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입된 CD34+ 세포는 특히 3회 복제-적격 렌티바이러스 (RCL) 어세이에 포함된 다양한 안전성 시험을 5%의 세포에 대해 수행하기 위해 형질도입 후 냉동시켰다. CD34+ 세포의 형질도입 효율은 35% 내지 50% 범위이고 평균 렌티바이러스 통합 카피수는 0.65 내지 0.70이었다. 형질도입된 CD34+ 세포의 해동 후, 환자는 부설판 및 사이클로포스파미드로 완전 골수절제 후 4.106 초과의 CD34+ 세포/kg가 재주입되었다. 환자의 HSC는 유전자-교정된 HSC의 생착에 유리하도록 절제되었다. 2명 환자의 경우에 혈액학적 회복은 13일 내지 15일에 발생되었다. 거의 완전한 면역학적 회복이 제1 환자의 경우에 12개월에 일어났고 제2 환자는 9개월에 일어났다. 렌티바이러스 사용과 대조적으로, 당분야의 지식 및 본 개시의 교시에 따라서, 당업자는 (예를 들어, 적합한 HDR 주형을 사용해) 돌연변이를 표적화 및 교정하는 CRISPR-Cas (C2c1) 시스템을 사용해 ALD에 대해 HSC를 교정할 수 있고; 특히 gRNA는 퍼옥시솜 막 수송체 단백질, ALD를 코딩하는 X 염색체 상에 존재하는 유전자인, ABCD1 내 돌연변이를 표적화할 수 있고, HDR은 단백질의 적절한 발현을 위한 코딩을 제공한다. 돌연변이-및-Cas (C2c1) 단백질 함유 입자를 표적화하는 가이드 RNA는 Cartier에서 처럼, HSC, 예를 들어 돌연변이를 운반하는 CD34+ 세포와 접촉된다. 또한 입자는 퍼옥시솜 막 수송체 단백질의 발현을 위해 돌연변이를 교정하도록 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이렇게 접촉된 세포는 임의로 Cartier에서 처럼 처치될 수 있다. 이렇게 접촉된 세포는 임의로 Cartier에서 처럼 투여될 수 있다.
WO 2015/148860을 언급하며, 본 명세서의 교시를 통해서 본 발명은 본 명세서의 교시와 함께 적용되는 이들 문헌의 재료 및 방법을 이해한다. 혈액-관련 질환의 양상에서, 베타 지중해 빈혈을 치료하기 위한, 유전자 요법, 방법, 및 조성물은 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템에 대해 적합화될 수 있다 (참조: 예를 들어 WO 2015/148860). 일 구현예에서, WO 2015/148860은 예를 들어 B-세포 CLL/림프종11A (BCL11A)에 대한 유전자를 변경시킴으로써, 베타 지중해 빈혈 또는 이의 증상의 치료 또는 예방을 포함한다. BCL11A 유전자는 또한 B-세포 CLL/림프종 11A, BCL11A -L, BCL11A -S, BCL11AXL, CTIP 1, HBFQTL5 및 ZNF로서 알려져 있다. BCL11A는 글로빈 유전자 발현의 조절에 관여하는 아연-핑거 단백질을 코딩한다. BCL11A 유전자 (예를 들어, BCL11A 유전자의 한쪽 또는 양쪽 대립유전자)를 변경시켜서, 감마 글로빈의 수준을 증가시킬 수 있다. 감마 글로빈은 헤모글로빈 복합체의 베타 글로빈을 치환시킬 수 있고 효과적으로 산소를 조직으로 운반하여서, 베타 지중해 빈혈 질환 표현형을 완화시킨다.
WO 2015/148863을 언급하며, 본 명세서의 교시를 통해서 본 발명은 본 명세서의 CRISPR-Cas 시스템에 적합화될 수 있는 이들 문헌의 방법 및 재료를 포괄한다. 유전적 혈액학적 질환인, 겸상 적혈구 질환의 치료 및 예방의 일 양상에서, WO 2015/148863은 BCL11A 유전자의 변경을 포괄한다. BCL11A 유전자 (예를 들어, BCL11A 유전자의 한쪽 또는 양쪽 대립유전자)를 변경시켜서, 감마 글로빈의 수준을 증가시킬 수 있다. 감마 글로빈은 헤모글로빈 복합체의 베타 글로빈을 치환시킬 수 있고 효과적으로 산소를 조직으로 운반하여서, 겸상 적혈구 질환 표현형을 완화시킨다.
본 발명의 일 양상에서, 표적 핵산 서열의 편집, 또는 표적 핵산 서열의 발현 조절을 포함한 방법 및 조성물, 및 암 면역요법과 관련하여 이의 적용이 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템을 적합화하여 포괄된다. 하나 이상의 T-세포 발현된 유전자, 예를 들어 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 및/또는 TRBC 유전자 중 하나 이상을 변경시켜서, T-세포 증식, 생존, 및/또는 기능에 영향을 미치는데 사용될 수 있는 방법 및 조성물을 포함하는 WO 2015/161276에서의 유전자 요법의 적용을 참조한다. 관련 양상에서, T-세포 증식은 하나 이상의 T-세포 발현된 유전자, 예를 들어 CBLB 및/또는 PTPN6 유전자, FAS 및/또는 BID 유전자, CTLA4 및/또는 PDCDI 및/또는 TRAC 및/또는 TRBC 유전자를 변경시켜 영향받을 수 있다.
키메라 항원 수용체 (CAR)19 T-세포는 환자 악성종에서 항-백혈병 효과를 나타낸다. 그러나, 백혈병 환자는 종종 수집하기에 충분한 T-세포를 갖지 않는데, 치료가 도너로부터의 변형된 T 세포를 포함시켜야한다는 것을 의미한다. 따라서, 도너 T-세포 은행의 확립에 관심이 존재한다. Qasim 등 ("First Clinical Application of Talen Engineered Universal CAR19 T Cells in B-ALL" ASH 57th Annual Meeting and Exposition, Dec. 5-8, 2015, Abstract 2046 (ash.confex.com/ash/2015/webprogram/Paper81653.html published online November 2015)은 T-세포 수용체 발현의 파괴 및 CD52 표적화를 통해 이식편 대 숙주 질환의 위험성을 제거하기 위한 CAR19 T 세포의 변형을 논의한다. 더 나아가서, CD52 세포는 알렘투주맙메 불감성이 되도록 표적화되었고, 따라서 알렘투주맙이 인간 백혈구 항원 (HLA) 미스매치된 CAR19 T-세포의 숙주-매개 거부를 예방할 수 있게 한다. 연구자는 RQR8에 연결된 4g7 CAR19 (CD19 scFv-4-1BB-CD3ζ)를 코딩하는 3세대 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 사용하였고, 그 다음으로 T-세포 수용체 (TCR) 알파 불변 사슬 유전자좌 및 CD52 유전자좌 둘 모두에 대한 다중 표적화를 위해 2쌍의 TALEN mRNA로 세포를 전기천공시켰다. 생체외 확장 이후에도 여전히 TCR을 발현하는 세포는 CliniMacs α/β TCR 고갈을 사용해 고갈시켜서, < 1% TCR 발현의 T-세포 산물 (UCART19)을 산출하였는데, 이의 85%는 CAR19를 발현하였고, 64%는 CD52 음성이 되었다. 변형된 CAR19 T 세포는 환자의 재발성 급성 림프아구성 백혈병을 치료하기 위해 투여되었다. 본 명세서에서 제공되는 교시는 제한없이 T 세포, B 세포, 단핵구, 마크로파지, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 수지상 세포, 및 거핵세포 또는 혈소판, 자연 살해 세포 및 그들 전구체 및 선구체를 포함하여, 골수 및 림프 계통의 혈액 세포를 포함해, 변형된 조혈 줄기 세포 및 이의 자손을 제공하는 효과적인 방법을 제공한다. 이러한 세포는 상기 기술된 바와 같이, 예를 들어 CD52, 및 다른 표적, 예컨대, 제한없이, CXCR4 및 Pd-1을 제거 또는 조절하기 위해서, 표적을 녹아웃, 녹인, 또는 달리 조절하여 변형될 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물, 세포, 및 방법은 면역 반응을 조절하고, 제한없이, 환자에게 T 세포 또는 다른 세포의 투여의 변형과 함께, 악성종, 바이러스 감염, 및 면역 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
WO 2015/148670을 언급하며, 본 명세서의 교시를 통해서 본 발명은 본 명세서의 교시와 함께 적용되는 이들 문헌의 재료 및 방법을 이해한다. 면역 요법의 양상에서 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)와 관련하여 또는 그와 함께 표적 서열의 편집을 위한 방법 및 조성물이 포괄된다. 관련 양상에서, 본 명세서에 기술된 방법은 C-C 케모카인 수용체 5형 (CCR5)에 대한 유전자에 하나 이상의 돌연변이의 도입에 의한, HIV 감염 및 AIDS의 예방 및 치료를 포괄한다. CCR5 유전자는 또한 CKR5, CCR-5, CD195, CKR-5, CCCKR5, CMKBR5, IDDM22, 및 CC-CKR-5로도 공지되어 있다. 추가 양상에서, 본 명세서에 기술되니 방법은 HIV 감염의 예방 또는 감소 및/또는 예를 들어, 이미 감염된 대상체의 숙주 세포로 진입하는 HIV의 능력의 예방 및/또는 감소를 위해 제공된다. HIV에 대한 예시적인 숙주 세포는 제한없이, CD4 세포, T 세포, 내장 연관 림프성 조직 (GALT), 마크로파지, 수지상 세포, 골수 전구 세포, 및 미세아교세포를 포함한다. 숙주 세포로 바이러스 진입은 바이러스 당단백질 gp41 및 gp12과 CD4 수용체 및 공수용체, 예를 들어 CCR5 둘 모두와의 상호작용을 필요로 한다. 공수용체, 예를 들어 CCR5가 숙주 세포의 표면에 존재하지 않으면, 바이러스는 결합할 수 없고 숙주 세포로 들어갈 수 없다. 따라서 질환의 진행이 방해된다. 예를 들어, 보호적 돌연변이 (예컨대 CCR5 델타 32 돌연변이)를 도입시켜, 숙주 세포의 CCR5를 녹아웃 또는 녹다운시켜서, 숙주 세포로 HIV 바이러스의 진입을 예방한다.
X-연관 만성 육아종성 질환 (CGD)는 대식세포 NADPH 옥시다제의 부재 또는 감소된 활성으로 인한 숙주 방어의 유전적 장애이다. (예를 들어, 대식세포 NADPH 옥시다제에 대한 코딩 서열을 전달하는 적합한 HDR 주형을 사용하여) 돌연변이 (대식세포 NADPH 옥시다제의 부재 또는 감소된 활성)를 표적화하고 교정하는 CRISPR-Cas (C2c1)를 사용하고; 특히 gRNA는 CGD (대식세포 NADPH 옥시다제 결핍)를 발생시키는 돌연변이를 표적화하고, HDR은 대식세포 NADPH 옥시다제의 적절한 발현을 위한 코딩을 제공할 수 있다. 돌연변이-및-Cas (C2c1) 단백질 함유 입자를 표적화하는 가이드 RNA는 돌연변이를 운반하는 HSC와 접촉된다. 또한 입자는 대식세포 NADPH 옥시다제의 적절한 발현을 위해 돌연변이를 교정하기 위해 적합한 HDR 주형을 함유할 수 있거나; 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이렇게 접촉된 세포를 투여할 수 있고; 임의로 치료 /확장된다; cf. Cartier.
판코니 빈혈: 적어도 15개 유전자의 돌연변이 (FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1/BRCA2, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ/BACH1/BRIP1, FANCL/PHF9/POG, FANCM, FANCN/PALB2, FANCO/Rad51C, 및 FANCP/SLX4/BTBD12)가 판코니 빈혈을 초래할 수 있다. 이들 유전자로부터 생산된 단백질은 FA 경로로 알려진 세포 과정에 관여된다. FA 경로는 DNA 복제라고 하는 새로운 DNA 카피를 만드는 과정이 DNA 손상으로 인해 차단될 때 켜진다 (활성화된다). FA 경로는 손상 영역으로 소정 단백질을 보내서, DNA 복구가 촉발되어서 DNA 복제가 계속될 수 있다. FA 경로는 가닥간 교차-연결 (ICL)로 알려진 일정 유형의 DNA 손상에 특히 반응한다. ICL은 DNA의 반대 가닥 상의 2개 DNA 빌딩 블록 (뉴클레오티드)가 비정상적으로 함께 부착 또는 연결되어 DNA 복자 과정이 중지될 때 발생된다. ICL은 일정 암 요법 약물에 의한 치료 또는 체내에서 생산되는 독성 물질의 축적으로 초래될 수 있다. 8개 단백질이 함께 판코니 빈혈 그룹과 연관되어서 FA 코어 복합체로 알려진 복합체를 형성한다. FA 코어 복합체는 FANCD2 및 FANCI라고 하는 2개 단백질을 활성화시킨다. 이들 2개 단백질의 활성화는 DNA 복구 단백질을 ICL의 영역으로 가져가서 교차-연결을 제거할 수 있고 DNA 복제가 계속될 수 있다. FA 코어 복합체. 보다 특히, FA 코어 복합체는 FANCA, FANCB, FANCC, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, 및 FANCM로 이루어진 핵 다중단백질 복합체이고, E3 유비퀴틴 리가제로서 기능하며, FANCD2 및 FANCI로 구성된 이종이량체인, ID 복합체의 활성화를 매개한다. 모노유비퀴틴화되면, FANCD1/BRCA2, FANCN/PALB2, FANCJ/BRIP1, 및 FANCO/Rad51C를 포함한 FA 경로의 하류에 고전적인 종양 억제인자와 상호작용하여서, 상동성 재조합 (Hr)을 통한 DNA 복구에 기여한다. FA 사려의 80 내지 90%가 FANCA, FANCC, 및 FANCG의 3개 유전자 중 하나의 돌연변이로 인한 것이다. 이들 유전자는 FA 코어 복합체의 성분을 생산하기 위한 명령을 제공한다. FA 코어 복합체와 연관된 이러한 유전자의 돌연변이는 복합체를 비기능성이게 만들고 전체 FA 경로를 파괴하게 될 것이다. 그 결과로, DNA 손상은 효율적으로 복구되지 않고 시간 경과에 따라 ICL이 축적된다. [Geiselhart, " Review Article, Disrupted Signaling through the Fanconi Anemia 경로 Leads to Dysfunctional Hematopoietic Stem Cell Biology: Underlying Mechanisms and Potential Therapeutic Strategies," Anemia Volume 2012 (2012), Article ID 265790, dx.doi.org/10.1155/2012/265790]는 생체내에서 HSC의 교정을 야기시킨 FANCC 유전자를 코딩하는 렌티바이러스의 대퇴부내 주사를 포함한 동물 실험 및 FA를 고찰한다. FA와 연관된 하나 이상의 돌연변이를 표적화하는 CRISPR-Cas (C2c1) 시스템, 예를 들어, gRNA(들) 및 HDR 주형(들)을 갖는 CRISPR-Cas (C2c1) 시스템을 사용하여, 각각 FA를 발생시키는 FANCA, FANCC, 또는 FANCG의 하나 이상의 돌연변이를 표적화하고 FANCA, FANCC 또는 FANCG 중 하나 이상의 교정된 발현을 제공하고, 예를 들어 gRNA는 FANCC에 대한 돌연변이를 표적화하고, HDR은 FANCC의 적절한 발현을 위한 코딩을 제공할 수 있다. 돌연변이(들)(예를 들어, Fa에 관여하는 하나 이상, 예컨대 FANCA, FANCC 또는 FANCG 중 어느 하나 이상에 대한 돌연변이(들))를 표적화하는 gRNA-및-Cas (C2c1) 단백질 함유 입자는 돌연변이(들)를 보유하는 HSC와 접촉한다. 또한 입자는 Fa에 관여하는 하나 이상의 단백질, 예컨대 FANCA, FANCC, 또는 FANCG 중 어느 하나 이상의 적절한 발현을 위해 돌연변이를 교정하도록 적합한 HDR 주형(들)을 함유할 수 있거나, 또는 HSC는 HDR 주형을 함유하거나 또는 전달하는 제2 입자 또는 벡터와 접촉할 수 있다. 이렇게 접촉된 세포를 투여할 수 있고; 임의로 치료 /확장된다; cf. Cartier.
(예를 들어, gRNA(들) 및 Cas(C2c1), 임의로 HDR 주형(들), 또는 HDR 주형(들)을 포함하는 것에 관하여; 예를 들어, 혈우병 B, SCID, SCID-X1, ADA-SCID, 유전성 티로신혈증, β-지중해빈혈, X-연관 CGD, 위스코트-알드리치 증후군, 판코니 빈혈, 부신백질이영양증 (ALD), 이염성 백질이영양증 (MLD), HIV/AIDS, 면역결핍 장애, 혈액 병태, 또는 유전성 리소솜 저장 질환에 대해) 본 명세서에 논의된 입자는 유리하게 gRNA(들) 및 Cas(C2c1) 단백질 혼합물 (임의로 HDR 주형(들)을 함유하거나 또는 이러한 혼합물은 주형(들)에 대해 별개 입자가 바람직할 때 HDR 주형(들)만을 함유)을, 계면활성제, 인지질, 생분해성 중합체, 지단백질 및 알콜을 포함하거나 또는 그로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 혼합물과 혼합하여 수득하거나 또는 수득가능하다 (여기서 하나 이상의 gRNA는 HSC에서 유전자 좌위 또는 좌위들을 표적화함).
실제로, 본 발명은 특히 게놈 편집으로 조혈 유전 장애, 및 면역결핍 장애, 예컨대 유전적 면역결핍 장애를 특히 본 명세서에 논의된 입자의 사용을 통해 치료하는데 적합하다. 유전성 면역결핍은 본 발명의 게놈 편집 중재술이 성공적일 수 있는 질환이다. 그 이유는 면역 세포의 서브세트인 조혈 세포가 치료적으로 접근하다는 것을 포함한다. 그들은 신체로부터 제거될 수 있고 자가 또는 동종으로 이식될 수 있다. 또한, 일정 유전성 면역결핍 예를 들어, 중증 복합 면역결핍 (SCID)는 면역 세포의 증식성 단점을 생성시킨다. 희귀한, 자발적 ‘역’ 돌연변이에 의해 SCID를 초래하는 유전자 병변의 교정은 심지어 하나의 림프구 전구체의 교정이라도 환자에서 면역 기능을 회복하는데 충분할 수 있음을 의미한다.../../../Users/t_kowalski/AppData/Local/Microsoft/Windows/Temporary Internet Files/Content.Outlook/GA8VY8LK/Treating SCID for Ellen.docx - _ENREF_1 참조: Bousso, P., et al. Diversity, functionality, and stability of the T cell repertoire derived in vivo from a single human T cell precursor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 274-278 (2000). 편집된 세포에 대한 선택적 장점은 낮은 수준의 편집에서도 치료적 효과를 일으키게 한다. 본 발명의 이러한 효과는 헤모글로빈 결핍이 적혈구 전구체의 피트니스에 부정적으로 영향을 미치는 알파- 및 베타-지중해 빈혈같은 다른 조혈 장애를 포함하여, 본 명세서에 언급된 SCID, 위스코트-알드리치 증후군 및 다른 병태에서 확인할 수 있다.
NHEJ 및 HDR DSB 복구의 활성은 세포 유형 및 세포 상태에 따라 유의하게 다양하다. NHEJ는 세포 주기에 의해 고도로 조절되지 않고 세포 유형에 걸쳐 효율적이어서, 접근가능한 표적 세포 개체군에서 높은 수준의 유전자 파괴를 허용한다. 대조적으로, HDR은 S/G2 시기 동안 주로 작용하고, 그러므로 활동적으로 분열하는 세포에 제한되어서, 정확한 게놈 변형을 요구하는 치료를 유사분열 세포에 국한시킨다 [Ciccia, A. & Elledge, S.J. Molecular cell 40, 179-204 (2010); Chapman, J.R., et al. Molecular cell 47, 497-510 (2012)]. 특히, C2c1 단백질을 포함하는 CRISPR-C2c1 시스템은 표적 부위에서 스태거드 절단부를 생성시킨다. 그러므로, 본 발명에서 표적 서열의 절단, 변형, 및/또는 복구는 HDR 의존적이거나 또는 독립적일 수 있다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 NHEJ를 통해 스태거드 DSB 복구를 도입시킨다. 일정한 특정 구현예에서, 본 발명의 CRISPR-C2c1 시스템은 뉴런 같은 비분열 세포에서 NHEJ를 통해 스태거드 DSB 복구를 도입시킨다.
HDR을 통한 교정의 효율은 후생적 상태 또는 표적화된 유전자좌의 서열, 또는 사용되는 특이적 복구 주형 구성 (단일 대 이중 가닥, 장형 대 단형 상동성 팔부)에 의해 제어될 수 있다[Hacein-Bey-Abina, S., et al. The New England journal of medicine 346, 1185-1193 (2002); Gaspar, H.B., et al. Lancet 364, 2181-2187 (2004); Beumer, K.J., et al. G3 (2013)]. 표적 세포에서 NHEJ 및 HDR 기구의 상대적 활성이 또한 이들 경로가 DSB를 분해하기 위해 경쟁할 수 있으므로, 유전자 교정 효율에 영향을 미칠 수 있다 [Beumer, K.J., et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 19821-19826 (2008)]. HDR은 또한 뉴클레아제 및 복구 주형의 동시 전달을 요구하므로, NHEJ 전략에서 보이지 않은 전달 도전을 부여한다. 실제로, 이들 제한은 치료적으로 관련된 세포 유형에서 낮은 수준의 HDR을 이끌었다. 그러므로 임상적 해석은 질환을 치료하기 위해 대체로 NHEJ 전략에 집중되었지만, 개념 증명 전임상 HDR 치료가 이제 혈우병 B 및 유전성 티로신혈증의 마우스 모델에 대해 설명되었다 [Li, H., et al. Nature 475, 217-221 (2011); Yin, H., et al. Nature biotechnology 32, 551-553 (2014)].
임의의 소정 게놈 편집 적용은 단백질, 소형 RNA 분자, 및/또는 복구 주형의 조합을 포함할 수 있고, 이들 다수 부분의 전달을 소형 분자 치료제에 비해 실질적으로 더욱 도전적이게 만든다. 게놈 편집 도구의 전달을 위한 주요 2가지 전략, 생체외 및 생체내가 개발되었다. 생체외 치료에서, 질환 세포는 신체에서 제거되어, 편집된 후에 다시 환자에게 이식된다. 생체외 편집은 표적 세포 개체군을 충분히 한정되게 하고 특별한 용량의 치료 분자가 특정된 세포에게 전달되게 하는 장점을 갖는다. 후자의 고려사항은 뉴클레아제의 양 적정이 이러한 돌연변이를 감소시킬 수 있으므로, 오프-표적 변형이 문제일 때 특히 중요하다 (Hsu et al., 2013). 생체외 접근법의 다른 장점은 전형적으로 연구 및 유전자 요법 적용을 위해 배양 세포로 단백질 및 핵산을 위한 효율적인 전달 시스템의 개발로 인해, 달성될 수 있는 것보다 높은 편집율이다.
소수 질환에 적용에 제한된다는 것이 생체외 접근법의 단점일 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 체외 조작에서 생존할 수 있어야 한다. 뇌와 같은 많은 조직의 경우, 신체 밖에서 세포의 배양은 주요한 도전인데, 세포가 생존에 실패하거나, 또는 생체내 그들 기능에 필요한 성질을 상실하기 때문이다. 따라서, 본 개시 및 당분야의 지식 관점에서, 생체외 배양 및 조작을이 가능한 성체 줄기 세포 개체군의 조직에 대한, CRISPR-Cas (C2c1)에 의한 생체외 요법이 이용가능하다. [Bunn, H.F. & Aster, J. Pathophysiology of blood disorders, (McGraw-Hill, 뉴욕, 2011)]
생체내 게놈 편집은 그들 천연 조직 내 세포 유형에게 편집 시스템의 직접 전달을 포함한다. 생체내 편집은 질환 세포 개체군이 생체외 조작으로 처리할 수 없는 질환을 치료할 수 있게 한다. 더 나아가서, 인시츄로 세포에 뉴클레아제 전달은 다수 조직 및 세포 유형의 치료를 허용한다. 이들 성질은 아마도 생체외 요법에 비해 더 광범위한 질환에 생체내 치료를 적용할 수 있게 한다.
지금가지, 생체내 편집은 대체로 한정된, 조직-특이적 향성을 갖는 바이러스 벡터의 사용을 통해 달성되었다. 이러한 벡터는 현재 카고 운반 능력 및 향성 관점에서 제한적이어서, 임상적으로 유용한 벡터에 의한 형질도입이 효율적인 장기 시스템, 예컨대 간, 근육, 및 눈으로 이러한 방식의 요법을 제한한다 [Kotterman, M.A. & Schaffer, D.V. Nature reviews. Genetics 15, 445-451 (2014); Nguyen, T.H. & Ferry, N. Gene therapy 11 Suppl 1, S76-84 (2004); Boye, S.E., et al. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 21, 509-519 (2013)].
생체내 전달을 위한 잠재적인 장벽은 치료에 필요한 대량의 바이러스에 반응하여 생성될 수 있는 면역 반응이지만, 이러한 현상은 게놈 편집에만 고유한 것이 아니고 다른 바이러스 기반 유전자 요법에서도 관찰된다 [Bessis, N., et al. Gene therapy 11 Suppl 1, S10-17 (2004)]. 또한 편집 뉴클레아제로부터의 펩티드는 그 자체가 MHC 클래스 I 분자 상에 제시되어 면역 만응을 자극시키는 것이 가능하지만, 전임상 수준에서 이러한 해프닝을 뒷받침할 증거가 적다. 이러한 방식의 요법에서 다른 주요한 어려움은 예측이 어려울 수 있는 오프-표적 돌연변이 프로파일을 야기시키는, 분포 및 결과적으로 생체내 게놈 편집 뉴클레아제의 용량의 제어이다. 그러나, 암의 치료에서 사용되는 바이러스- 및 입자-기반 요법의 사용을 포함하여, 당분야의 지식 및 본 개시의 관점에서, 예를 들어 입자 또는 바이러스에 의한 전달에 의한 HSC의 생체내 변형이 당업자의 영역 내에 있다.
생체외 편집 요법: 조혈 세포의 정제, 배양, 및 이식에 대한 장기간의 임상 전문 지식은 혈액 시스템에 영향을 미치는 질환 예컨대 SCID, 판코니 빈혈, 위스코트-알드리치 증후군 및 겸상 적혈구 빈혈을 생체외 편집 요법의 주목을 받게 하였다. 조혈 세포에 주목하는 다른 이유는 혈액 장애에 대한 유전자 요법을 설계하려는 이전 노력 덕분에, 비교적 고효율의 전달 시스템이 이미 존재한다는 것이다. 이러한 장점으로, 이러한 요법 방식은 편집된 세포가 피트니스 장점을 보유하는 질환에 적용될 수 있어서, 적은 수의 생착되고, 편집된 세포를 확장시킬 수 있고 질환을 치료할 수 있다. 이러한 질환 중 하나가 HIV이며, 이 감염은 CD4+ T 세포에 피트니스 단점을 야기시킨다.
생체외 편집 요법은 현재 유전자 교정 전략을 포함시키기 위해 확대되었다. 생체외 HDR에 대한 장벽은 Genovese와 그 동료들의 최근 논문에서 극복되었는데, 그들은 SCID-X1를 앓는 환자로부터 수득된 조혈 줄기 세포 (HSC)에서 돌연변이된 IL2RG 유전자의 유전자 교정을 달성하였다[Genovese, P., et al. Nature 510, 235-240 (2014)]. Genovese 등은 다중모드 전략을 사용해 HSC에서 유전자 교정을 수행하였다. 먼저, HSC는 IL2RG에 대한 치료적 cDNA를 코딩하는 HDR 주형을 함유하는 통합-결핍 렌티바이러스를 사용해 형질도입되었다. 형질도입 이후에, 세포는 HDR 기반 유전자 교정을 자극하기 위해 IL2RG 내 돌연변이 하스폿을 표적으로 하는 ZFN을 코딩하는 mRNA로 전기천공시켰다. HDR 비율을 증가시키기 위해서, 배양 조건은 HSC 분열을 북돋기 위해 소형 분자로 최적화시켰다. 최적 배양 조건, 뉴클레아제 및 HDR 주형을 사용해 SCID-X1 환자로부터 유전자 교정된 HSC가 치료적으로 관련된 비율로 배양으로 수득되었다. 동일한 유전자 교정 절차를 겪은 비질환 개체로부터의 HSC는 HSC 기능에 대한 금본위로서, 마우스에서 장기간 조혈작용을 지속시킬 수 있었다. HSC는 모든 조혈 세포 유형을 발생시킬 수 있고 자가 이식될 수 있어서, 그들을 모든 조혈 유전 장애에 대한 매우 가치있는 세포 개체군으로 만들었다 [Weissman, I.L. & Shizuru, J.A. Blood 112, 3543-3553 (2008)]. 유전자 교정된 HSC는 원칙적으로 광범위한 유전성 혈액 장애를 치료하는데 사용될 수 있어서, 이 연구를 치료적 게놈 편집을 위한 흥미로운 돌파구로 만들었다.
생체내 편집 요법: 생체내 편집은 유리하게 본 개시 및 당분야의 지식으로부터 사용될 수 있다. 전달이 효율적인 장기 시스템의 경우에, 수많은 흥미로운 전잉ㅁ상 치료 성공이 이미 존재하였다. 성공적인 생체내 편집 요법의 첫번째 예는 혈우병 B의 마우스 모델에서 입증되었다 [Li, H., et al. Nature 475, 217-221 (2011)]. 앞서 언급한 바와 같이, 혈우병 B는 응고 캐스캐이드의 핵심 성분인, 인자 IX를 코딩하는 유전자 내 기능 상실 돌연변이로 인해 초래되는 X-연관 열성 장애이다. 중증 발병 개체에서 이의 수준의 1% 이상까지 인자 IX 활성의 회복은 질환을 상당히 더 경증의 형태로 전환시킬 수 있는데, 이러한 수준을 달성하기 위해 어린 나이부터 예방적으로 이러한 환자에게 재조합 인자 Ix의 주입이 대체로 임상 합병증을 완화시키기 때문이다 [Lofqvist, T., et al. Journal of internal medicine 241, 395-400 (1997)]. 따라서, 오직 낮은 수준의 HDR 유전자 교정이 환자에 대한 임상 결과를 변 화시키는데 필수적이다. 또한, 인자 Ix는 편집 시스템을 코딩하는 바이러스 벡터에 의해 효율적으로 형질도입된 장기인 간에서 합성되고 분비된다.
ZNF 및 교정 HDR 주형을 코딩하는 간친화성 아데노-연관 바이러스 (AAV) 혈청형을 사용하여, 쥐과 간에서 돌연변이된, 인간화 인자 IX 유전자의 최대 7%의 유전자 교정이 달성되었다 [Li, H., et al. Nature 475, 217-221 (2011)]. 이것은 응고 캐스캐이드의 기능 척도로서, 응괴 형성 운동학의 개선을 야기하여서, 최초로 생체내 편집 요법이 실현가능하고 또한 효율적임을 입증하였다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 당업자는 기능 상실 돌연변이를 반전시키기 위해서 X-연관 열성 장애의 돌연변이를 표적으로 하는 HDR 주형 및 CRISPR-Cas (C2c1) 시스템을 함유하는 입자를 사용해, 혈우병 B를 해결하기 위해, 당분야의 지식, 예를 들어, Li 및 본 명세서에 교시를 이용한다.
이 연구를 기반으로, 다른 그룹들은 최근에 CRISPR-Cas에 의한 간의 생체네 게놈 편집을 사용하여 유전성 티로신혈증의 마우스 모델을 치료하였고 심혈관 질환에 대한 보호성을 제공하는 돌연변이를 생성시켰다. 이들 구별되는 2개 적용은 간 이상기능을 포함한 장애에 대한 이 접근법의 다재다능성을 입증한다 [Yin, H., et al. Nature biotechnology 32, 551-553 (2014); Ding, Q., et al. Circulation research 115, 488-492 (2014)]. 다른 장기 시스템에 생체내 편집의 적용은 이 전략이 광범위하게 적용가능하다는 것을 입증하는 것이 필요하다. 최근에, 이러한 방식의 요법으로 치료할 수 있는 장애의 범위를 확장시키기 위해 바이러스 및 비바이러스 벡터를 최적화하려는 노력이 진행 중이다 [Kotterman, M.A. & Schaffer, D.V. Nature reviews. Genetics 15, 445-451 (2014); Yin, H., et al. Nature reviews. Genetics 15, 541-555 (2014)]. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 당업자는 돌연변이를 표적으로 하는 HDR 주형 및 CRISPR-Cas (C2c1) 시스템을 함유하는 입자를 사용해, 유전성 티로신혈증을 해결하기 위해, 당분야의 지식, 예를 들어, Yin 및 본 명세서에 교시를 이용한다.
표적화된 결실, 치료적 적용: 유전자의 표적화된 결실이 바람직할 수 있다. 그러므로, 면역결핍 장애, 혈액 병태, 또는 유전성 리소솜 저장 질환, 예를 들어 혈우병 B, SCID, SCID-X1, ADA-SCID, 유전성 티로신혈증, β-지중해빈혈, X-연관 CGD, 위스코트-알드리치 증후군, 판코니 빈혈, 부신백질이영양증 (ALD), 이염성 백질이영양증 (MLD), HIV/AIDS, 다른 대사 장애에 관여되는 유전자, 질환에 관여되는 미스폴딩된 단백질을 코딩하는 유전자, 질환에 관여된 기능 상실을 초래하는 유전자가; 일반적으로 유리하다고 간주되는 입자 시스템과, 임의의 본 명세서에 논의된 전달 시스템을 사용하여, HSC에서 표적화할 수 있는 돌연변이가 바람직하다.
본 발명에서, 특히 CRISPR 효소의 면역원성은 에리트로포이에틴에 관해 문헌[Tangri et al]에서 처음 제시된 접근에 따라 감소될 수 있고, 후속적으로 발행될 수 있다. 따라서, 방향 진화(directed evolution) 또는 합리적 설계는 숙주 종(인간 또는 다른 종)에서 CRISPR 효소(예를 들어, C2c1)의 면역원성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
게놈 편집: 본 발명의 CRISPR/Cas (C2c1) 시스템은 본 명세서에서 논의된 거을 포함하여, TALEN 및 ZFN 및 렌티바이러스를 사용하여 제한된 성공을 지니는 이전에 시도한 유전자 돌연변이를 고정하기 위해 사용될 수 있다; 참조: WO2013163628. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
뇌, 중추 신경 및 면역 체계 질병의 치료
본 발명은 또한 CRISPR-Cas 시스템의 뇌 또는 뉴런으로의 전달을 고려한다. 일부 실시형태에서, CRISPR-Cas 시스템은 C2c1 단백질을 포함한다. 일부 구현예예서, CRISPR-C21 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 바람직한 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ, 바람직하게 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다. 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi)는 헌팅톤병의 질환-야기 유전자인, HTT (참조: 예를 들어 McBride et al., Molecular Therapy vol. 19 no. 12 Dec. 2011, pp. 2152-2162)의 발현을 감소시켜 이 장애에 대한 치료 잠재성을 제공하며, 그러므로 출원인은 CRISPR-Cas 시스템에 사용하고/하거나 조정할 수 있다고 상정한다. CRISPR-Cas 시스템은 알고리즘을 이용하여 생성되어 안티센스 서열의 표적외 부위를 표적화하는 능을 감소시킬 수 있다. CRISPR-Cas 서열은 마우스, 붉은털 원숭이(rhesus) 또는 인간 헌팅턴의 엑손 52에서의 서열 중 하나를 표적화하고, AAV와 같은 바이러스 벡터 내에서 발현될 수 있다. 인간을 포함하여, 동물은 반구 당 약 3 회의 미세주입을 이용하여 주사될 수 있다 (총 6회 주사):첫번째는 두측에서 (rostral) 전교련 (anterior commissure)에 대해 1 mm (12 ㎕)이고, 남은 두 주사 (각각, 12 ㎕ 및 10 ㎕)는 첫번째 주사에 대해 미측으로 3 및 6 mm 간격으로, 약 1 ㎕/분의 속도로 AAV 1e12 vg/ml를 이용하며, 바늘은 추가의 5분 동안 제자리에 두어 주입물이 바늘 끝으로부터 분산되는 것을 허용하였다.
DiFiglia 등 (PNAS, October 23, 2007, vol. 104, no. 43, 17204-17209) 은 Htt를 표적화하는 siRNA의 성인 선조체 내로의 단일 투여는 돌연변이체 Htt를 사일런스시키고, 뉴런성 병리학을 약화시키고, HD의 신속한-발병, 바이러스 유전자이식 마우스 모델에서 관찰된 비정상의 거동 표현형을 지연시킬 수 있음을 관찰하였다. DiFiglia는 10μM로, 2 ㎕의 Cy3-표지된 cc-siRNA-Htt 또는 컨쥬게이트되지 않은 siRNA-Htt를 마우스의 선조체 내로 주사하였다. Htt로 표적된 CRISPR Cas의 유사한 용량이 본 발명에서 인간의 경우 고려될 수 있으며, 예를 들어 Htt로 표적된 10 μM CRISPR Cas의 약 5-10 ml가 선조체 내로 주사될 수 있다.
다른 예에서, Boudreau 등 (Molecular Therapy vol. 17 no. 6 June 2009])은 htt-특이적 RNAi 바이러스를 발현하는 재조합 AAV 혈청형 2/1 벡터 5 ㎕ (4×1012의 바이러스 게놈/ml)를 선조체 내로 주사한다. Htt로 표적된 CRISPR Cas의 유사한 용량이 본 발명에서 인간의 경우에 고려될 수 있으며, 예를 들어 약 10-20 ml의 (4×1012의 바이러스 게놈/ml) Htt로 표적된 CRISPR Cas가 선조체 내로 주사될 수 있다.
또 다른 예에서, HTT로 표적된 CRISPR Cas는 연속 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Yu et al., Cell 150, 895908, August 31, 2012] 참조). Yu 등은 삼투압 펌프를 이용하여 ss-siRNA 또는 인산염 완충 식염수 (PBS) (Sigma Aldrich)를 28일 동안 300 mg/일 전달하기 위하여 0.25 ml/시간 (Model 2004)를 전달하고, 0.5 ㎕/시간 (Model 2002)을 전달하도록 설계된 펌프를 사용하여 14 일 동안 75 mg/일의 양성 대조구 MOE ASO를 전달하는데 사용하였다. 펌프 (Durect Corporation)는 멸균 PBS 내에서 희석된 ss-siRNA 또는 MOE로 충전되었으며, 이후 임플랜테이션(implantation) 전 37℃에서 24 시간 또는 48 시간 (Model 2004) 인큐베이션하였다. 마우스들을 2.5% 이소플루오란으로 마취시키고, 두개골의 기부에 중간선 절단을 하였다. 정위법 가이드를 이용하여, 삽입관을 우측 뇌실 내로 임플랜트하고, Loctite 접착제로 고정시켰다. Alzet 삼투압 미니 펌프에 부착된 카테테르를 삽입관에 부착시키고, 펌프를 중간견갑골 영역에 피하에 위치시켰다. 절단은 5.0 나일론 봉합사를 이용하여 밀폐되었다. 유사한 용량의 Htt로 표적된 CRISPR Cas가 본 발명에서 인간의 경우에 대해 고려될 수 있으며, 예를 들어, 약 500 내지 1000 g/일의 Htt로 표적된 CRISPR Cas가 투여될 수 있다.
연속 주입의 또 다른 예에서, Stiles 등 (문헌 [Experimental Neurology 233 (2012) 463471])은 티타늄 바늘 끝을 이용하여 뇌실질내 카테테르를 우측 피곡(putamen) 내로 임플랜트하였다. 카테터는 복부에 피하 이식된 SynchroMed® II 펌프(Medtronic Neurological, Minneapolis, MN)에 연결되었다. 6 μL/일의 인산염 완충 식염수 주입 7일 후, 펌프를 시험 물품으로 다시 충전하고 7일 동안 연속 전달을 위해 프로그램하였다. 약 2.3 내지 11.52 mg/d의 siRNA를 약 0.1에서 0.5 μL/분의 가변 주입 속도로 주입시켰다. 유사한 용량의 Htt로 표적된 CRISPR Cas가 본 발명에서 인간의 경우에 대해 고려될 수 있으며, 예를 들어, 약 20 내지 200 mg/일의, Htt로 표적된 CRISPR Cas가 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, Sangamo에게 수여된 미국 특허 공개 20130253040은 또한 헌팅턴병을 치료하기 위해 TALES로부터 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 대하여 적합화될 수 있다.
다른 예에서, Sangamo에 양도된 미국 특허 공개 제20130253040의 방법이 또한 헌팅턴병의 치료를 위해서 TALES로부터 CRISPR Cas 시스템에 맞게 개조될 수 있다.
참조로 본 명세서에 개시된, The Broad Institute 등의 출원인의 WO2015089354 A1는 헌팅톤병 (Hp)에 대한 표적을 기술한다. 헌팅톤병에 관한 CRISPR 복합체의 가능한 표적 유전자는 PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; 및 TGM2이다. 따라서, PRKCE; IGF1; EP300; RCOR1; PRKCZ; HDAC4; and TGM2 중 하나 이상은 본 발명의 일부 구현예에서 헌팅톤병에 대한 표적으로서 선택될 수 있다.
다른 트리뉴클레오티드 반복 질환. 이들은 임의의 하기를 포함할 수 있다: 범주 I은 헌팅톤병 (HD) 및 척수소뇌 운동실조증을 포함하고; 확장 범주 I는 일잔적으로 작은 규모로 이종성 확장이 있는 표현형적으로 다양하며, 또한 유전자의 엑손에서도 존재하고; 범주 III은 취약 X 증후군, 근긴장성 이영양증, 척수소뇌 운동실조증의 2, 소아 근대 간질, 및 프리드리히 실조증을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 라포라 질병(Lafora disease)과 관련이 있는 것으로 확인된 EMP2A 및 EMP2B 유전자의 결함을 교정하기 위하여 CRISPR-Cas 시스템을 사용하는 것에 관한 것이다. 라포라병은 청소년기에 간질성 발작으로서 시작할 수 있는 진행성 마이오클로누스 간질을 특징으로 하는 상염색체 열성 질환이다. 질병의 몇몇 경우에서 아직 확인되지 않은 유전자의 돌연변이에 의해 초래될 수 있다. 질병은 발작, 근경련, 걷기 어려움, 치매, 및 결국 사망을 초래한다. 질병의 진행에 대해 효과적으로 주어지는 치료법은 현재 없다. 간질과 연관된 다른 유전 이상은 또한 CRISPR-Cas 시스템에 의해 표적화될 수 있으며 근본적인 유전학은 문헌 [Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies, edited by Giuliano Avanzini, Jeffrey L. Noebels, Mariani Foundation Paediatric Neurology:20; 2009]에 더욱 기술되어 있다.
T 세포 수용체(TCR) 유전자를 불활성화시키는 데 관련된, Sangamo BioSciences, Inc.로 양도된 미국 특허 공개 제20110158957호의 방법은 또한 본 발명의 CRISPR Cas 시스템으로 변형될 수 있다. 다른 예에서, Sangamo BioSciences, Inc.로 양도된 미국 특허 공개 제20100311124호 및 Cellectis로 양도된 미국 특허 공개 제20110225664호의 방법은 둘 다 글루타민 합성효소 유전자 발현 유전자를 불활성화시키는 데 관련된 것으로서, 또한 본 발명의 CRISPR Cas 시스템으로 변형될 수 있다.
뇌에 대한 전달 선택사항은 리포솜 내로 DNA 또는 RNA 중 하나 형태로 CRISPR 효소 및 가이드 RNA의 캡슐화 및 트랜스-혈액뇌장벽(BBB) 전달을 위한 분자 트로이목마에 대한 컨쥬게이팅을 포함한다. 분자 트로이목마는 비인간 영장류의 뇌 내로 B-gal 발현 벡터의 전달에 효과적인 것으로 나타났다. 동일한 접근이 CRISPR 효소 및 가이드 RNA를 함유하는 벡터를 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Xia CF 및 Boado RJ, Pardridge WM ("Antibody-mediated targeting of siRNA via the human 인슐린 수용체 using avidin-biotin technology." Mol Pharm. doi:10.1021/mp800194)은 배양물에서 및 생체내에서 세포에 대한 짧은 간섭 RNA(siRNA)의 전달 방법이 수용체-특이적 단클론성 항체(mAb) 및 아비딘-바이오틴 기술의 조합된 사용에 의해 가능하다는 것을 기재한다. 저자는 또한 표적화 mAb와 siRNA 간의 결합이 아비딘-바이오틴 기술에 의해 안정하기 때문에, 뇌와 같은 먼 부위에서 RNAi 효과가 표적화된 siRNA의 정맥내 투여 후 생체내에서 관찰되었다는 것을 보고한다.
Zhang 등 (Mol Ther.2003 Jan;7(1):118.))은 루시퍼라제와 같은 리포터를 코딩하는 발현 플라스미드가 인간 인슐린 수용체(HIR)에 대해 단클론성 항체(MAb)를 지니는 생체내 레서스 원숭이 뇌에 대해 표적화된, 85 nm 페길화 면역리포솜을 포함하는 " 인공 바이러스" 의 내부에서 캡슐화되는 방법을 기재한다. HIRMAb는 리포솜이 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 통과세포배출 및 정맥내 주사 후 신경 혈장막을 가로지르는 내포작용을 겪는 외생성 유전자를 운반하는 것을 가능하게 한다. 뇌에서 루시퍼라제 유전자 발현의 수준은 래트와 비교하여 레서스 원숭이에서 50 배 더 높았다. 영장류 뇌에서 베타-갈락토시다제 유전자의 널리 퍼진 신경 발현은 조직화학과 공초점 현미경 둘 다에 의해 입증되었다. 저자는 이 접근이 24 시간에 가역적 성체 유전자이식을 실현가능하게 만든다는 것을 나타낸다. 따라서, 면역리포솜의 사용이 바람직하다. 이들은 특이적 표적 또는 세포 표면 단백질을 표적화하는 항체와 함께 사용될 수 있다.
알츠하이머병
미국 특허 공개 제20110023153호는 알츠하이머병과 연관된 세포, 동물 및 단백질을 유전적으로 변형시키기 위해 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 것을 기재한다. 일단 변형된 세포 및 동물은 AD의 연구에 통상 사용되는 척도를 사용하여 AD의 발생 및/또는 진행에 대한 표적화된 돌연변이의 영향을 연구하기 위한 공지된 방법을 사용하여 더 시험될 수 있으며, 이들은 제한은 아니지만 예컨대 학습 및 기억, 불안, 우울감, 중독, 및 감각 운동 기능뿐만 아니라 행동, 기능, 병리, 대사 및 생화학적 기능을 측정하는 분석 등이다.
본 개시는 AD 와 관련된 단백질을 코딩하는 어떤 염색체 서열의 편집을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 개시된 시스템은 C2c1 - CRISPR 시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예예서, CRISPR-C21 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 AD 관련 유전자에 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 AD 관련 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다. AD-관련 단백질은 전형적으로 AD-관련 단백질과 AD 장애의 실험적 연관성에 기초하여 선택된다. 예를 들어, AD-관련 단백질의 혈중 농도나 생성 비율은 AD 장애를 결여한 집단에 비해 AD 장애를 가진 집단에서 상승되거나 억제될 수 있다. 단백질 수준에서의 차이는 웨스턴 블롯, 면역 조직화학적 염색, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 및 질량 분석을 포함하는 프로테오믹스 기술을 사용하여 평가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는 달리, AD-관련 단백질은, 제한은 아니지만, DNA 마이크로어레이 분석, 연속 유전자 발현 분석 (SAGE), 및 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (Q-PCR)을 포함하는 게놈 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 얻음으로써 확인될 수 있다.
알츠하이머병 관련 단백질의 예는 예를 들어, VLDLR 유전자에 의해 코딩되는 극저밀도 리포단백질 수용체 단백질(VLDLR), UBA1 유전자에 의해 코딩되는 유비퀴틴-유사 변형 활성화 효소(UBA1) 또는 UBA3 유전자에 의해 코딩되는 NEDD8-활성화 효소 E1 촉매 서브유닛 단백질(UBE1C)을 포함할 수 있다.
비제한적 예로서, AD와 관련된 단백질은 제한은 아니지만 다음에 열거된 단백질들을 포함한다:염색체 서열 암호화된 단백질 ALAS2 델타-아미노레불리네이트 신타제 2(ALAS2) ABCA1 ATP-결합 카세트 수송인자(ABCA1) ACE 안지오텐신 I-전환 효소 (ACE) APOE 아포지방단백질 E 전구체 (APOE) APP 아밀로이드 전구체 단백질(APP) AQP1 아쿠아포린 1 단백질(AQP1) BIN1 Myc 박스-의존성-상호작용 단백질 1 또는 브릿지 통합인자 1 단백질(BIN1) BDNF 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF) BTNL8 부티로필린-유사 단백질 8 (BTNL8) C1ORF49 염색체 1 오픈 리딩 프레임 49 CDH4 캐드헤린-4 CHRNB2 뉴런 아세틸콜린 수용체 서브유닛 베타-2 CKLFSF2 CKLF-유사 MARVEL 경막 도메인-함유 단백질 2(CKLFSF2) CLEC4E C-타입 렉틴 도메인 패밀리 4, 멤버 (CLEC4E) CLU 클러스테린 단백질(아포지방단백질 J로도 알려져 있다) CR1 적혈구 보체 수용체 1(CR1, CD35, C3b/C4b 수용체 및 면역 부착 수용체라고도 한다) CR1L 적혈구 보체 수용체 1(CR1L) CSF3R 과립구 콜로니-자극 인자 3 수용체 (CSF3R) CST3 시스타틴 C 또는 시스타틴 3 CYP2C 시토크롬 P450 2C DAPK1 사망-관련 단백질 키나제 1 (DAPK1) ESR1 에스트로겐 수용체 1 IgA의 FCAR Fc 단편 수용체 (FCAR, CD89라고도 한다) IgG의 FCGR3B Fc 단편, 저 친화성 IIIb, 수용체 (FCGR3B 또는 CD16b) FFA2 자유 지방산 수용체 2(FFA2) FGA 피브리노겐 (인자 I) GAB2 GRB2-관련-결합 단백질 2(GAB2) GAB2 GRB2-관련-결합 단백질 2(GAB2) GALP 갈라닌-유사 펩티드 GAPDHS 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 정자형성 (GAPDHS) GMPB GMBP HP 햅토글로빈 (HP) HTR7 5-하이드록시 트립타민 (세로토닌) 수용체 7 (아데닐레이트 시클라제-결합) IDE 인슐린 분해 효소 IF127 IF127 IFI6 인터페론, 알파-유도성 단백질 6 (IFI6) IFIT2 인터페론-유도 단백질 테트라트리코펩티드 반복부 2(IFIT2) IL1RN 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1RA) IL8RA 인터루킨 8 수용체, 알파 (IL8RA 또는 CD181) IL8RB 인터루킨 8 수용체, 베타 (IL8RB) JAG1 재그드 1 (JAG1) KCNJ15 칼륨 내부-정류 채널, 서브패밀리 J, 멤버 15 (KCNJ15) LRP6 저밀도 지방단백질 수용체-관련 단백질 6 (LRP6) MAPT 미세소관-관련 단백질 tau (MAPT) MARK4 MAP/미세소관 친화성-조절 키나제 4 (MARK4) MPHOSPH1 M-상 포스포단백질 1 MTHFR 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원효소 MX2 인터페론-유도 GTP-결합 단백질 Mx2 NBN 니브린, NBN NCSTN 니카스트린이라고도 함 NIACR2 니아신 수용체 2(NIACR2, GPR109B라고도 함) NMNAT3 니코틴아미드 뉴클레오티드 아데닐일트랜스페라제 3 NTM 뉴로트리민 (또는 HNT) ORM1 오로스뮤코이드 1 (ORM1) 또는 알파-1-산 글리코단백질 1 P2RY13 P2Y 퓨리노셉터 13 (P2RY13) PBEF1 니코틴아미드 포스포리보실트랜스페라제(NAmPRTase 또는 Nampt) 프레-B-세포 콜로니-증진 인자 1 (PBEF1) 또는 비스파틴 PCK1 포스포엔올피루베이트 카복시 키나제라고도 함 PICALM 포스파티딜이노시톨 결합 클라스린 조립체 단백질(PICALM) PLAU Uro키나제-타입 플라스미노겐 활성인자(PLAU) PLXNC1 플렉신 C1 (PLXNC1) PRNP 프리온 단백질 PSEN1 프레세닐린 1 단백질(PSEN1) PSEN2 프레세닐린 2 단백질(PSEN2) PTPRA 단백질 티로신 포스파타제 수용체 타입 A 단백질(PTPRA) RALGPS2 Ral GEF PH 도메인 및 SH3 결합 모티프 2(RALGPS2) RGSL2 조절인자 G-단백질 신호화 유사 2(RGSL2) SELENBP1 셀레늄 결합 단백질 1 (SELNBP1) SLC25A37 미토페린-1 SORL1 소틸린-관련 수용체 L(DLR 부류) A 반복부-함유 단백질(SORL1) TF 트랜스페린 TFAM 미토콘드리아 전사 인자 A TNF 종양 괴사 인자 TNFRSF10C 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 10C (TNFRSF10C) TNFSF10 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, (TRAIL) 멤버 10a (TNFSF10) UBA1 유비퀴틴-유사 변형인자 활성화 효소 1 (UBA1) UBA3 NEDD8-활성화 효소 E1 촉매 서브유닛 단백질(UBE1C) UBB 유비퀴틴 B 단백질(UBB) UBQLN1 유비퀼린-1 UCHL1 유비퀴틴 카복실-말단 에스테라제 L1 단백질(UCHL1) UCHL3 유비퀴틴 카복실-말단 하이드롤라제 이소엔자임 L3 단백질(UCHL3) VLDLR 초저밀도 지방단백질 수용체 단백질(VLDLR).
예시적인 구현예에서, 염색체 서열이 편집된 AD와 관련된 단백질은 VLDLR 유전자에 의해서 암호화된 초저밀도 지방단백질 수용체 단백질(VLDLR), UBA1 유전자에 의해서 암호화된 유비퀴틴-유사 변형인자 활성화 효소 1(UBA1), UBA3 유전자에 의해서 암호화된 NEDD8-활성화 효소 E1 촉매 서브유닛 단백질(UBE1C), AQP1 유전자에 의해서 암호화된 아쿠아포린 1 단백질(AQP1), UCHL1 유전자에 의해서 암호화된 유비퀴틴 카복실-말단 에스테라제 L1 단백질(UCHL1), UCHL 3 유전자에 의해서 암호화된 유비퀴틴 카복실-말단 하이드롤라제 이소엔자임 L3 단백질(UCHL3), UBB 유전자에 의해서 암호화된 유비퀴틴 B 단백질(UBB), MAPT 유전자에 의해서 암호화된 미세소관-관련 단백질 tau (MAPT), PTPRA 유전자에 의해서 암호화된 단백질 티로신 포스파타제 수용체 타입 A 단백질(PTPRA), PICALM 유전자에 의해서 암호화된 포스파티딜이노시톨 결합 클라스린 조립체 단백질(PICALM), CLU 유전자에 의해서 암호화된 클러스테린 단백질(아포지방단백질 J로도 알려져 있다), PSEN1 유전자에 의해서 암호화된 프레세닐린 1 단백질, PSEN2 유전자에 의해서 암호화된 프레세닐린 2 단백질, SORL1 유전자에 의해서 암호화된 소틸린-관련 수용체 L (DLR 부류) A 반복부-함유 단백질(SORL1) 단백질, APP 유전자에 의해서 암호화된 아밀로이드 전구체 단백질(APP), APOE 유전자에 의해서 암호화된 아포지방단백질 E 전구체 (APOE), 또는 BDNF 유전자에 의해서 암호화된 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 유전자 변형된 동물은 래트이며, AD와 관련된 단백질을 암호화하는 편집된 염색체 서열은 다음과 같다: APP 아밀로이드 전구체 단백질(APP) NM_019288 AQP1 아쿠아포린 1 단백질(AQP1) NM_012778 BDNF 뇌-유래 신경영양 인자 NM_012513 CLU 클러스터린 단백질(NM_053021 아포지방단백질 J로도 알려져 있다) MAPT 미세소관-관련 단백질 NM_017212 tau (MAPT) PICALM 포스파티딜이노시톨 결합 NM_053554 클라스린 조립체 단백질(PICALM) PSEN1 프레세닐린 1 단백질(PSEN1) NM_019163 PSEN2 프레세닐린 2 단백질(PSEN2) NM_031087 PTPRA 단백질 티로신 포스파타제 NM_012763 수용체 타입 A 단백질(PTPRA) SORL1 소틸린-관련 수용체 L(DLR NM_053519, 부류) A 반복부-함유 XM_001065506, 단백질(SORL1) XM_217115 UBA1 유비퀴틴-유사 변형인자 활성화 NM_001014080 효소 1 (UBA1) UBA3 NEDD8-활성화 효소 E1 NM_057205 촉매 서브유닛단백질(UBE1C) UBB 유비퀴틴 B 단백질(UBB) NM_138895 UCHL1 유비퀴틴 카복실-말단 NM_017237 에스테라제 L1 단백질(UCHL1) UCHL3 유비퀴틴 카복실-말단 NM_001110165 하이드롤라제 이소엔자임 L3 단백질(UCHL3) VLDLR 초저밀도 지방단백질 NM_013155 수용체 단백질(VLDLR).
동물 또는 세포는 AD와 관련된 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 파괴된 염색체 서열 및 AD와 관련된 파괴된 단백질을 코딩하는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 염색체 통합 서열을 포함할 수 있다.
편집된 또는 통합된 염색체 서열은 AD와 관련된 변경된 단백질을 암호화하도록 변형될 수 있다. AD-관련 염색체 서열에서 다수의 돌연변이가 AD와 관련되었다. 예를 들어, APP에서 V7171(즉, 위치 717에서 발린이 이소류신으로 변화됨) 미스센스 돌연변이는 가족성 AD를 야기한다. 프레세닐린-1 단백질에서의 다중 돌연변이, 예컨대 H163R (즉, 위치 163에서 히스티딘이 아르기닌으로 변화됨), A246E (즉, 위치 246에서 알라닌이 글루타메이트로 변화됨), L286V(즉, 위치 286에서 류신이 발린으로 변화됨) 및 C410Y (즉, 위치 410에서 시스테인이 티로신으로 변화됨)는 가족성 알츠하이머병 타입 3을 야기한다. 프레세닐린-2 단백질에서의 돌연변이, 예컨대 N141 I(즉, 위치 141에서 아스파라긴이 이소류신으로 변화됨), M239V (즉, 위치 239에서 메티오닌이 발린으로 변화됨), 및 D439A (즉, 위치 439에서 아스파르테이트가 알라닌으로 변화됨)는 가족성 알츠하이머 타입 4를 야기한다. AD-관련 유전자 및 질환에서 유전자 변이체의 다른 관련성도 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Waring et al. (2008) Arch. Neurol. 65:329334]를 참조하며, 이것의 개시는 그 전체가 여기 참고로 포함된다.
세크레타제 장애
미국 특허 공개 제20110023146호는 세크레타제-연관 장애와 연관된 세포, 동물 및 단백질을 유전적으로 변형시키기 위해 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 것을 기재한다. 세크레타제는 프리-단백질을 그들 생물학적 활성 형태로 프로세싱하는데 필수적이다. 당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 미국 특허 공개 제20110023146호의 것과 유사한 시스템에서 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
세크레타제 경로의 다양한 구성성분에서 결함은 많은 장애들, 특히 특징적 아밀로이드형성 또는 아밀로이드반을 가진 것들, 예컨대 알츠하이머병 (Ad)의 원인이 된다.
세크레타제 장애 및 이들 장애와 관련된 단백질은 수많은 장애에 대한 감수성, 장애의 존재, 장애의 중증도, 또는 이들의 어떤 조합에 영향을 미치는 다양한 세트의 단백질이다. 본 개시는 세크레타제 장애와 관련된 단백질을 코딩하는 어떤 염색체 서열의 편집을 포함한다. 세크레타제 장애와 관련된 단백질은 전형적으로 세크레타제-관련 단백질과 세크레타제 장애의 발생의 실험적 연관성에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 세크레타제 장애와 연관된 단백질의 생산 속도 또는 순환 농도는 세크레타제 장애가 없는 개체군에 비해서 세크레타제 장애를 갖는 개체군에서 상승 또는 억제될 수 있다. 단백질 수준에서의 차이는 웨스턴 블롯, 면역 조직화학적 염색, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 및 질량 분석을 포함하는 프로테오믹스 기술을 사용하여 평가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 세크레타제 장애와 연관된 단백질은 제한없이 DNA 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR)을 포함한 게놈 기술을 사용해 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 수득하여 확인할 수 있다.
비제한적인 예로서, 세크레타제 장애와 연관된 단백질은 다음을 포함한다: PSENEN (프레세닐린 인핸서 2 상동쳬 (예쁜 꼬마 선충 (C. elegans)), CTSB (카텝신 B), PSEN1 (프레세닐린 1), APP (아밀로이드 베타 (A4) 전구체 단백질), APH1B (앞인두 결핍 1 상동체 B (예쁜 꼬마 서충), PSEN2 (프레세닐린 2 (알츠하이머병 4)), BACE1 (베타_부위 APP-절단 효소 1), ITM2B (통합 막 단백질 2B), CTSD (카텝신 D), NOTCH1 (Notch 상동체 1, 전좌-연관 (초파리 (Drosophila)), TNF (종양 괴사 인자 (TNF 수퍼패밀리, 멤버 2)), INS (인슐린), DYT10 (근긴장 이상 10), ADAM17 (ADAM 메탈로펩티다제 도메인 17), APOE (아포리포단백질 E), ACE (안지오텐신 I 전환 효소 (펩티딜-디펩티다제 A) 1), STN (스타틴), TP53 (종양 단백질 p53), IL6 (인터루킨 6 (인터페론, 베타 2)), NGFR (신경 성장 인자 수용체 (TNFR 수퍼패밀리, 멤버 16)), IL1B (인터루킨 1, 베타), ACHE (아세틸콜린에스터라제 (Yt 혈액군)), CTNNB1 (카테닌 (카데린-연관 단백질), 베타 1, 88kDa), IGF1 (인슐린-유사 성장 인자 1 (소마토메딘 C)), IFNG (인터페론, 감마), NRG1 (뉴레굴린 1), CASP3 (캐스파제 3, 아폽토시스-관련 시스테인 펩티다제), MAPK1 (미토겐-활성화된 단백질 키나제 1), CDH1 (카데린 1, 1형, E-카데린 (상피)), APBB1 (아밀로이드 베타 (A4) 전구체 단백질-결합, 패밀리 B, 멤버 1 (Fe65)), HMGCR (3-히드록시-3-메틸글루타릴-보조효소A 리덕타제), CREB1 (cAMP 반응성 엘리먼트 결합 단백질 1), PTGS2 (프로스타글란딘-엔도퍼옥시다제 신타제 2 (프로스타글란딘 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제)), HES1 (스플릿 1의 모발 및 인헨서, (초파리)), CAT (카탈라제), TGFB1 (형질전환 성장 인자, 베타 1), ENO2 (에놀라제 2 (감마, 신경원)), ERBB4 (v-erb-a 적아세포 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 4 (조류)), TRAPPC10 (수송 단백질 입자 복합체 10), MAOB (모노아민 옥시다제 B), NGF (신경 성장 인자 (베타 폴리펩티드)), MMP12 (매트릭스 메탈로펩티다제 12 (마크로파지 엘라스타제)), JAG1 (jagged 1 (알라질 증후군)), CD40LG (CD40 리간드), PPARG (퍼옥시솜 증식인자-활성화된 수용체 감마), FGF2 (섬유아세포 성장 인자 2 (basic)), IL3 (인터루킨 3 (콜로니-자극 인자, 다수)), LRP1 (저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1), NOTCH4 (Notch 상동체 4 (초파리)), MAPK8 (미토겐-활성화된 단백질 키나제 8), PREP (프롤릴 엔도펩티다제), NOTCH3 (Notch 상동체 3 (초파리)), PRNP (프라이온 단백질), CTSG (카텝신 G), EGF (상피 성장 인자 (베타-우로가스트론)), REN (레닌), CD44 (CD44 분자 (인도 혈액군)), SELP (셀렉틴 P (과립 막 단백질 140 kDa, 항원 CD62)), GHR (성장 호르몬 수용체), ADCYAP1 (아데닐레이트 시클라제 활성화 폴리펩티드 1 (뇌하수체)), INSR (인슐린 수용체), GFAP (아교세포 섬유 산성 단백질), MMP3 (매트릭스 메탈로펩티다제 3 (스트로멜리신 1, 프로젤라티나제)), MAPK10 (미토겐-활성화된 단백질 키나제 10), SP1 (Sp1 전사 인자), MYC (v-myc 골수구종증 바이러스 종양 유전자 상동체 (조류)), CTSE (카텝신 E), PPARA (퍼옥시솜 증식인자-활성화된 수용체 알파), JUN (jun 종양유전자), TIMP1 (TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1), IL5 (인터루킨 5 (콜로니-자극 인자, 호산구)), IL1A (인터루킨 1, 알파), MMP9 (매트릭스 메탈로펩티다제 9 (젤라티나제 B, 92 kDa 젤라티나제, 92 kDa IV형 콜라게나제)), HTR4 (5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 4), HSPG2 (헤파란 술페이트 프로테오글리칸 2), KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체), CYCS (시토크롬 c, 체세포), SMG1 (SMG1 상동체, 포스파티딜이노시톨 3-키나제-관련 키나제 (예쁜 꼬마 선충)), IL1R1 (인터루킨 1 수용체, I형), PROK1 (프로키네티신 1), MAPK3 (미토겐-활성화된 단백질 키나제 3), NTRK1 (신경영양성 티로신 키나제, 수용체, 1형), IL13 (인터루킨 13), MME (막 메탈로-엔도펩티다제), TKT (트랜스케톨라제), CXCR2 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 2), IGF1R (인슐린-유사 성장 인자 1 수용체), RARA (레티노산 수용체, 알파), CREBBP (CREB 결합 단백질), PTGS1 (프로스타글란딘-엔도퍼옥시드 신타제 1 (프로스타글란딘 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제)), GALT (갈락토스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제), CHRM1 (콜린성 수용체, 무스카린성 1), ATXN1 (아탁신 1), PAWR (PRKC, 아폽토시스, WT1, 조절인자), NOTCH2 (Notch 상동체 2 (초파리)), M6PR (만노스-6-포스페이트 수용체 (양이온 의존적)), CYP46A1 (시토크롬 P450, 패밀리 46, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 1), CSNK1 D (카세인 키나제 1, 델타), MAPK14 (미토겐-활성화된 단백질 키나제 14), PRG2 (프로테오글리칸 2, 골수 (자연 살해 세포 활성인자, 호산구 과립 주요 염기 단백질)), PRKCA (단백질 키나제 C, 알파), L1 CAM (L1 세포 부착 분자), CD40 (CD40 분자, TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 5), NR1I2 (핵 수용체 서브패밀리 1, 그룹 I, 멤버 2), JAG2 (jagged 2), CTNND1 (카테닌 (카데린_연관 단백질), 델타 1), CDH2 (카데린 2, 1형, N-카데린 (신경원)), CMA1 (키마제 1, 비만 세포l), SORT1 (솔틸린 1), DLK1 (델타-유사 1 상동체 (초파리)), THEM4 (티오에스터라제 수퍼패밀리 멤버 4), JUP (접합 플라코글로빈), CD46 (CD46 분자, 보체 조절 단백질), CCL11 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11), CAV3 (카베올린 3), RNASE3 (리보뉴클레아제, RNase A 패밀리, 3 (호산구 양이온 단백질)), HSPA8 (열충격 70kDa 단백질 8), CASP9 (캐스파제 9, 아폽토시스-관련 시스테인 펩티다제), CYP3A4 (시토크롬 P450, 패밀리 3, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 4), CCR3 (케모카인 (C-C 모티프) 수용체 3), TFAP2A (전사 인자 AP-2 알파 (활성화 인핸서 결합 단백질 2 알파)), SCP2 (스테롤 캐리어 단백질 2), CDK4 (시클린-독립 키나제 4), HIF1A (저산소증 유도성 인자 1, 알파 서브유닛 (염기성 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자)), TCF7L2 (전사 인자 7-유사 2 (T-세포 특이적, HMG-박스)), IL1R2 (인터루킨 1 수용체, II형), B3GALTL (베타 1,3-갈락토실트랜스퍼라제-유사), MDM2 (Mdm2 p53 결합 단백질 상동체 (마우스)), RELA (v-rel 세망내피증 바이러스 종양 유전자 상동체 A (조류)), CASP7 (캐스파제 7, 아폽토시스-관련 시스테인 펩티다제), IDE (인슐린-분해 효소), FABP4 (지방산 결합 단백질 4, 지방세포), CASK (칼슘/칼모듈린-의존적 세린 단백질 키나제 (MAGUK 패밀리)), ADCYAP1R1 (아데틸레이트 시클라제 활성화 폴리펩티드 1 (뇌하수체) 수용체 I형), ATF4 (활성화 전사 인자 4 (tax-반응성 인핸서 엘리먼트 B67)), PDGFA (혈소판-유래 성장 인자 알파 폴리펩티드), C21 또는 f33 (염색체 21 오픈 리딩 프레임 33), SCG5 (세크레토그라닌 V (7B2 단백질)), RNF123 (링 핑거 단백질 123), NFKB1 (B-세포의 카파 경쇄 폴리펩티드 유전자 인핸서의 핵인자 1), ERBB2 (v-erb-b2 적아세포 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 2, 신경/교아세포종 유래 종양유전자 상동체 (조류)), CAV1 (카베올린 1, 카베올라 단백질, 22 kDa), MMP7 (매트릭스 메탈로펩티다제 7 (마트릴신, 자궁)), TGFA (형질전환 성장 인자, 알파), RXRA (레티노이드 X 수용체, 알파), STX1A (신탁신 1A (뇌)), PSMC4 (프로테아솜 (프로솜, 마크로파인) 26S 서브유닛, ATPase, 4), P2RY2 (푸린성 수용체 P2Y, G-단백질 커플링, 2), TNFRSF21 (종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 21), DLG1 (discs, 거대 상동체 1 (초파리)), NUMBL (numb 상동체 (초파리)-유사), SPN (시알로포린), PLSCR1 (인지질 스크램블라제 1), UBQLN2 (유비퀼린 2), UBQLN1 (유비퀼린 1), PCSK7 (프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 7형), SPON1 (스폰딘 1, 세포외 매트릭스 단백질), SILV (은 상동체 (마우스)), QPCT (글루타미닐-펩티드 시클로트랜스퍼라제), HESS (스플릿 5의 모발 및 인핸서 (초파리)), GCC1 (GRIP 및 코일드-코일 도메인 함유 1), 및 이의 임의 조합.
유전자 변형된 동물 또는 세포는 세크레타제 장애와 관련된 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 파괴된 염색체 서열 및 세크레타제 장애와 관련된 파괴된 단백질을 코딩하는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 염색체 통합 서열을 포함할 수 있다.
ALS
예를 들어, 미국 특허 공개 제20110023144호는 근위축성 측삭경화증 (ALS) 질환과 관련된 세포, 동물 및 단백질을 유전자 변형시키기 위한 징크 핑거 뉴클레아제의 사용을 설명한다. ALS는 수의 운동에 수반되는 뇌 피질, 뇌 줄기, 및 척수에서 특정 신경 세포의 점진적인 꾸준한 변성을 특징으로 한다. 당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 미국 특허 공개 제20110023144호의 것과 유사한 시스템에서 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 바람직한 구현예에서, 스태거드 DSB는 HR 독립적 기전, 예컨대 NHEJ를 통해 복구된다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 비분열 세포이다. 특정한 실시형태에서, 표적 항원은 운동 뉴런이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
운동 뉴런 장애 및 이들 장애와 관련된 단백질은 운동 뉴런 장애 발생에 대한 감수성, 운동 뉴런 장애의 존재, 운동 뉴런 장애의 중증도, 또는 이들의 어떤 조합에 영향을 미치는 다양한 세트의 단백질이다. 본 개시는 특정한 운동 뉴런 장애인 ALS 질환과 관련된 단백질을 코딩하는 어떤 염색체 서열의 편집을 포함한다. ALS와 관련된 단백질은 전형적으로 ALS-관련 단백질과 ALS의 실험적 연관성에 기초하여 선택된다. 예를 들어, ALS 와 관련된 단백질의 혈중 농도나 생성 비율이 ALS가 없는 집단에 비해 ALS를 가진 집단에서 상승되거나 억제될 수 있다. 단백질 수준에서의 차이는 웨스턴 블롯, 면역 조직화학적 염색, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 및 질량 분석을 포함하는 프로테오믹스 기술을 사용하여 평가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, ALS 와 관련된 단백질은, 제한은 아니지만, DNA 마이크로어레이 분석, 연속 유전자 발현 분석 (SAGE), 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR)을 포함하는 게놈 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 얻음으로써 확인될 수 있다.
비제한적인 예로서, ALS와 연관된 단백질은 제한없이 다음을 포함한다: SOD1 수퍼옥시드 디스뮤타제 1, ALS3 근위축성 축삭 가용 경화증 3 SETX 세나탁틴 ALS5 근위축성 축삭 경화증 5 육종 ALS7 근위축성 축삭 경화증 7에 융합된 FUS ALS2 근위축성 축삭 DPP6 디펩티딜-펩티다제 6 경화증 2 NEFH 뉴로필라멘트, 중 PTGS1 프로스타글란틴- 폴리펩티드 엔도퍼옥시다제 신타제 1 SLC1A2 용질 운반체 패밀리 1 TNFRSF10B 종양 괴사 인자 (신경교 고친화성 수용체 수퍼패밀리, 글루타메이트 수송체), 멤버 10b 멤버 2 PRPH 페리페린 HSP90AA1 열충격 단백질 90 kDa 알파 (시토졸), 클래스 A 멤버 1 GRIA2 글루타메이트 수용체, IFNG 인터페론, 감마 이온성, AMPA 2 S100B S100 칼슘 결합 FGF2 섬유아세포 성장 인자 2 단백질 B AOX1 알데히드 옥시다제 1 CS 시트레이트 신타제 TARDBP TAR DNA 결합 단백질 TXN 티오레독신 RAPH1 Ras 연합 MAP3K5 미토겐-활성화 단백질 (RaIGDS/AF-6) 및 키나제 5 플레크스트린 상동성 도메인 1 NBEAL1 뉴로베아킨-유사 1 GPX1 글루타티온 퍼옥시다제 1 ICA1L 섬 세포 자기항원 RAC1 ras-관련 C3 보툴리늄 1.69 kDa-유사 독소 기질 1 MAPT 마이크로튜불-연관 ITPR2 이노시톨 1,4,5- 단백질 tau 트리포스페이트 수용체, 2형 ALS2CR4 근위축성 축삭 GLS 글루타미나제 경화증 2 (소아) 염색체 영역, 후보 4 ALS2CR8 근위축성 축삭 CNTFR 섬모 향신경성 인자 경화증 2 (소아) 수용체 염색체 영역, 후보 8 ALS2CR11 근위축성 축삭 FOLH1 폴레이트 히드롤라제 1 경화증 2 (소아) 염색체 영역, 서열 P4HB 프롤릴 4-히드롤라제를 갖는 후보 11 FAM117B 패밀리, 유사성 117, 멤버 B 베타 폴리펩티드 CNTF 섬모 향신경성 인자 SQSTM1 시퀘스토솜 1 STRADB STE20-관련 키나제 NAIP NLR 패밀리, 아폽토시스 어댑터 베타 억제성 단백질 YWHAQ 티로신 3- SLC33A1 용질 운반체 패밀리 33 모노옥시게나제/트립토프 (아세틸-CoA 수송체), 5-모노옥시게나제 멤버 1 활성화단백질, 쎄타 폴리펩티드 TRAK2 수송 단백질, 상동체, SAC1 키네신 결합 2 지질 포스파타제 도메인 함유 NIF3L1 NIF3 NGG1 상호작용 INA 인터넥신 신경 인자3-유사 1 중간 필라멘트 단백질, 알파 PARD3B par-3 분획화 COX8A 시토크롬 c 옥시다제 결핍 3 상동체 B 서브유닛 VIIIA CDK15 사이클린-의존적 키나제 HECW1 HECT, C2 및 WW 15 도메인 함유 E3 유비퀴틴 단백질 리가제 1 NOS1 산화질소 신타제 1 MET met 프로토-종양 유전자 SOD2 수퍼옥시드 디스뮤타제 2, HSPB1 열충격 27 kDa 미토콘드리아 단백질 1 NEFL 뉴로필라멘트, 경 CTSB 카텝신 B 폴리펩티드 ANG 안지오게닌, HSPA8 열충격 70 kDa 리보뉴클레아제, RNase A 단백질 8 패밀리, 5 VAPB VAMP (소포- ESR1 에스트로겐 수용체 1 연관 막단백질)-연관 단백질 B 및 C SNCA 시누클레인, 알파 HGF 간세포 성장 인자 CAT 카탈라제 ACTB 액틴, 베타 NEFM 뉴로필라멘트, 중간 TH 티로신 히드롤라제 폴리펩티드 BCL2 B-세포 CLL/림프종 2 FAS Fas (TNF 수용체 수퍼패밀리, 멤버 6) CASP3 캐스파제 3, 아폽토시스- CLU 클러스테린 관련 시스테인 펩티다제 SMN1 모터 뉴런의 생존 G6PD 글루코스-6-포스페이트 1, 텔로머 디히드로게나제 BAX BCL2-연관 X HSF1 열충격 전사 단백질 인자 1 RNF19A 링 핑거 단백질 19A JUN jun 종양 유전자 ALS2CR12 근위축성 축삭 HSPA5 열충격 70 kDa 경화증 2 (소아) 단백질 5 염색체 영역, 후보 12 MAPK14 미토겐-활성화 단백질 IL10 인터루킨 10 키나제 14 APEX1 APEX 뉴클레아제 TXNRD1 티오레독신 리덕타제 1 (다기능 DNA 복구 효소) 1 NOS2 산화질소 신타제 2, TIMP1 TIMP 메탈로펩티다제 유도성 억제제 1 CASP9 캐스파제 9, 아폽토시스- XIAP 관련 시스테인 아폽토시스 펩티다제의 X-연관 억제제 GLG1 골지 당단백질 1 EPO 에리쓰로포이어틴 VEGFA 혈관 내피 ELN 엘라스틴 성장 인자 A GDNF 신경교 세포 유래 NFE2L2 핵 인자 (적혈구-신경영양 인자 유래 2)-유사 2 SLC6A3 용질 운반체 패밀리 6 HSPA4 열충격 70 kDa (신경전달인자 단백질 4 수송체, 도파민), 멤버 3 APOE 아포지단백질 E PSMB8 프로테오솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 8 DCTN1 디낙틴 1 TIMP3 TIMP 메탈로펩티다제 억제제 3 KIFAP3 키네신-연관 SLC1A1 용질 운반체 패밀리 1 단백질 3 (신경원/상피 고친화성 글루타메이트 수송체, 시스템 Xag), 멤버 1 SMN2 모터 뉴런의 생존 CCNC 사이클린 C 2, 동심체 MPP4 막단백질, STUB1 STIP1 상동성 및 U- 팔미토일화4 박스 함유 단백질 1 ALS2 아밀로이드 베타 (A4) PRDX6 퍼옥시리독신 6 전구체 단백질 SYP 시냅토피신 CABIN1 칼시뉼린 결합 단백질 1 CASP1 캐스파제 1, 아폽토시스- GART 포스포리보실글리신아미드 관련 시스테인 포르밀트랜스퍼라제, 펩티다제 포스포리보실글리신아미드 신써타제, 포스포리보실아미노이미다졸 신써타제 CDK5 사이클린-의존적 키나제 5 ATXN3 아탁신 3 RTN4 레티큘론 4 C1QB 보체 성분 1, q 서브성분, B 사슬 VEGFC 신경 성장 인자 HTT 헌팅틴 수용체 PARK7 파킨슨병 7 XDH 잔틴 디히드로게나제 GFAP 신경교 섬유질 산성 MAP2 마이크로튜불-연관 단백질 단백질 2 CYCS 시토크롬 c, IgG의 체세포 FCGR3B Fc 단편, 저친화성 IIIb, UBL5 유비퀴틴-유사 5 수퍼옥시드 디스뮤타제용 CCS 구리 샤페론 MMP9 매트릭스 메탈로펩티다제 SLC18A3 용질 운반체 패밀리 18 9 ( (소포 아세틸콜린), 멤버 3 TRPM7 일시적 수용체 HSPB2 열충격 27 kDa 잠재적 양이온 채널, 단백질 2 서브패밀리 M, 멤버 7 AKT1 v-akt 쥐과 흉선종 DERL1 Der1-유사 도메인 패밀리, 바이러스 종양유전자 상동체 1 멤버 1 CCL2 케모카인 (C--C 모티프) NGRN 뉴그린, 뉴라이트 리간드 2 과성장 연관 GSR 글루타티온 리덕타제 TPPP3 튜불린 중합-촉진 단백질 패밀리 멤버 3 APAF1 아폽토시스 펩티다제 BTBD10 BTB (POZ) 도메인 활성화 인자 1 함유 10 GLUD1 글루타메이트 CXCR4 케모카인 (C--X--C 모티프) 디히드로게나제 1 수용체 4 SLC1A3 용질 운반체 패밀리 1 FLT1 fms-관련 티로신 (신경교 고친화성 글루타메이트 수송체), 멤버 3 키나제 1 PON1 파라옥소나제 1 AR 안드로겐 수용체 LIF 백혈병 억제성 인자 ERBB3 v-erb-b2 적아세포 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체 3 LGALS1 렉틴, 갈락토시드- CD44 CD44 분자 결합, 가용성, 1 TP53 종양 단백질 p53 TLR3 toll-유사 수용체 3 GRIA1 글루타메이트 수용체, GAPDH 글리세르알데히드-3- 이온성, AMPA 1 포스페이트 디히드로게나제 GRIK1 글루타메이트 수용체, DES 데스민 이온성, 카이네이트 1 CHAT 콜린 아세틸트랜스퍼라제 FLT4 fms-관련 티로신 키나제 4 CHMP2B 크로마틴 변형 BAG1 BCL2-연관 단백질 2B 아타노겐 MT3 메탈로티오테인 3 CHRNA4 콜린성 수용체, 니코틴성, 알파 4 GSS 글루타티온 신써타제 BAK1 BCL2-길항제/킬러 1 KDR 키나제 삽입 도메인 GSTP1 글루타티온 S-트랜스퍼라제 수용체 (III형 pi 1 수용체 티로신 키나제) OGG1 8-옥소구아닌 DNA IL6 인터루킨 6 (인터페론, 글리코실라제 베타 2).
동물 또는 세포는 ALS 와 관련된 단백질을 코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 파괴된 염색체 서열 및 ALS 와 관련된 파괴된 단백질을 코딩하는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 염색체 통합 서열을 포함할 수 있다. ALS와 관련된 바람직한 단백질은 SOD1 (수퍼옥사이드 디스뮤타제 1), ALS2(근위축성 측삭경화증 2), FUS (육종 융합형), TARDBP (TAR DNA 결합 단백질), VAGFA(혈관 내피 성장인자 A), VAGFB(혈관 내피 성장인자 B), 및 VAGFC(혈관 내피 성장인자 C), 및 이들의 어떤 조합을 포함한다.
자폐증
미국 특허 공개 제20110023145호는 자폐 범주성 장애 (ASD)와 연관된 세포, 동물 및 단백질을 유전적으로 변형시키기 위해 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 것을 기재한다. 자폐 범주성 장애(ASD)는 사회적 상호작용 및 소통의 정량적 손상, 및 제한된 반복적이며 정형화된 행동, 관심 및 활동 패턴을 특징으로 하는 일군의 장애이다. 세 가지 장애, 즉 자폐, 아스퍼거 증후군(AS) 및 비전형 전반적 발달 장애(PDD-NOS)가 중증도의 정도, 관련된 지적 기능 및 의학적 상태가 다른 연속된 동일한 장애이다. ASD는 대개 유전적으로 결정되는 장애이며, 유전성은 약 90%이다.
US 특허 공개 제 20110023145호는 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 적용될 수 있는 ASD와 관련된 단백질을 코딩하는 어떤 염색체 서열의 편집을 포함한다. ASD와 관련된 단백질은 전형적으로 ASD와 관련관 단백질과 ASD의 유발 또는 징후의 실험적 연관성에 기초하여 선택된다. 예를 들어, ASD와 관련된 단백질의 혈중 농도나 생성 비율은 ASD를 결여한 집단에 비해 ASD를 가진 집단에서 상승되거나 억제될 수 있다. 단백질 수준에서의 차이는 웨스턴 블롯, 면역 조직화학적 염색, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 및 질량 분석을 포함하는 프로테오믹스 기술을 사용하여 평가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, ASD 와 관련된 단백질은, 제한은 아니지만, DNA 마이크로어레이 분석, 연속 유전자 발현 분석 (SAGE), 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR)을 포함하는 게놈 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 얻음으로써 확인될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 미국 특허 공개 제20110023145호의 것과 유사한 시스템에서 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
ASD와 관련된 단백질과 관련될 수 있는 질환 상태 또는 장애의 비제한적 예들은 자폐, 아스퍼거 증후군(AS), 비전형 전반적 발달 장애(PDD-NOS), 레트 증후군, 결절성 경화증, 페닐케톤뇨증, 스미스-렘리-오피츠 증후군 및 취약 X 증후군을 포함한다. 비제한적 예로서, ASD와 관련된 단백질은 제한은 아니지만 다음의 단백질들을 포함한다:ATP10C 아미노인지질-MET MET 수용체 수송 ATP 분해효소 티로신 키나제(ATP10C) BZRAP1 MGLUR5(GRM5) 대사성 글루타메이트 수용체 5(MGLUR5) CDH10 캐드헤린-10 MGLUR6(GRM6) 대사성 글루타메이트 수용체 6(MGLUR6) CDH9 캐드헤린-9 NLGN1 뉴로리긴-1 CNTN4 컨택틴-4 NLGN2 뉴로리긴-2 CNTNAP2 컨택틴-관련 SEMA5A 뉴로리긴-3 단백질-유사 2(CNTNAP2) DHCR7 7-디하이드로콜레스테롤 NLGN4X 뉴로리긴-4 X- 환원효소(DHCR7) 결합 DOC2A 이중 C2-유사 도메인-NLGN4Y 뉴로리긴-4 Y-함유 단백질 알파 결합 DPP6 디펩티딜 NLGN5 뉴로리긴-5 아미노펩티다제-유사 단백질 6 EN2 분절형 2(EN2) NRCAM 뉴런 세포 부착 분자(NRCAM) MDGA2 취약 X 지적 장애 NRXN1 뉴렉신-11(MDGA2) FMR2(AFF2) AF4/FMR2 패밀리 멤버 2 OR4M2 올팩토리 수용체(AFF2) 4M2 FOXP2 포크헤드 박스 단백질 P2 OR4N4 올팩토리 수용체(FOXP2) 4N4 FXR1 취약 X 정신 OXTR 옥시토신 수용체 발달지연, 상염색체(OXTR) 상동체 1 (FXR1) FXR2 취약 X 정신 PAH 페닐알라닌 발달지연, 상염색체 하이드록실라제(PAH) 상동체 2(FXR2) GABRA1 감마-아미노부티르산 PTEN 포스파타제 및 수용체 서브유닛 알파-1 텐신 상동성 (GABRA1)(PTEN) GABRA5 GABAA(.감마.-아미노부티르 PTPRZ1 수용체-타입 산) 수용체 알파 5 티로신-단백질 서브유닛 (GABRA5) 포스파타제 제타(PTPRZ1) GABRB1 감마-아미노부티르산 RELN 렐린 수용체 서브유닛 베타-1(GABRB1) GABRB3 GABAA(.감마.-아미노부티르 RPL10 60S 리보솜 산) 수용체 .베타.3 서브유닛 단백질 L10(GABRB3)GABRG1 감마-아미노부티르산 SEMA5A 세마포린-5A 수용체 서브유닛 감마-1(SEMA5A) (GABRG1) HIRIP3 HIRA-상호작용 단백질 3 SEZ6L2 발작 관련 6 상동체(마우스)-유사 2 HOXA1 호메오박스 단백질 Hox-A1 SHANK3 SH3 및 다중 (HOXA1) 안키린 반복부 도메인 3(SHANK3) IL6 인터루킨-6 SHBZRAP1 SH3 및 다중 안키린 반복부 도메인 3(SHBZRAP1) LAMB1 라미닌 서브유닛 베타-1 SLC6A4 세로토닌 (LAMB1) 수송인자(SERT) MAPK3 미토겐-활성화 단백질 TAS2R1 테이스트 수용체 키나제 3 타입 2 멤버 1 TAS2R1 MAZ Myc-관련 징크 핑거 TSC1 결절성 경화증 단백질 단백질 1 MDGA2 MAM 도메인 함유 TSC2 결절성 경화증 글리코실포스파티딜이노시톨 단백질 2 앵커 2(MDGA2) MECP2 메틸 CpG 결합 UBE3A 유비퀴틴 단백질 단백질 2(MECP2) 리가아제 E3A (UBE3A) MECP2 메틸 CpG 결합 WNT2 무익기형-타입 단백질 2(MECP2) MMTV 통합 부위 패밀리, 멤버 2(WNT2).
염색체 서열이 편집된 ASD와 관련된 단백질의 동일성은 다양할 수 있으며 다양할 것이다. 바람직한 구현예에서, 염색체 서열이 편집된 ASD와 관련된 단백질은 BZRAP 1 유전자에 의해서 암호화된 벤조디아자핀 수용체(말초) 관련 단백질 1 (BZRAP1), AFF2 유전자에 의해서 암호화된 AF4/FMR2 패밀리 멤버 2 단백질(AFF2) (MFR2라고도 한다), FXR1 유전자에 의해서 암호화된 취약 X 지적 장애 상염색체 상동체 1 단백질(FXR1), FXR2 유전자에 의해서 암호화된 취약 X 지적 장애 상염색체 상동체 2 단백질(FXR2), MDGA2 유전자에 의해서 암호화된 MAM 도메인 함유 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 2 단백질(MDGA2), MECP2 유전자에 의해서 암호화된 메틸 CpG 결합 단백질 2(MECP2), MGLUR5-1 유전자에 의해서 암호화된 대사성 글루타메이트 수용체 5 (MGLUR5) (GRM5라고도 한다), NRXN1 유전자에 의해서 암호화된 뉴렉신 1 단백질, 또는 SEMA5A 유전자에 의해서 암호화된 세마포린-5A 단백질(SEMA5A)일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 유전자 변형된 동물은 래트이며, ASD와 관련된 단백질을 암호화하는 편집된 염색체 서열은 아래 열거된 것과 같다:BZRAP1 벤조디아자핀 수용체 XM_002727789, (말초) 관련 XM_213427, 단백질 1 (BZRAP1) XM_002724533, XM_001081125 AFF2(FMR2) AF4/FMR2 패밀리 멤버 2 XM_219832, (AFF2) XM_001054673 FXR1 취약 X 정신 NM_001012179 발달지연, 상염색체 상동체 1 (FXR1) FXR2 취약 X 정신 NM_001100647 발달지연, 상염색체 상동체 2(FXR2) MDGA2 MAM 도메인 함유 NM_199269 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 2(MDGA2) MECP2 메틸 CpG 결합 NM_022673 단백질 2(MECP2) MGLUR5 대사성 글루타메이트 NM_017012(GRM5) 수용체 5 (MGLUR5) NRXN1 뉴렉신-1 NM_021767 SEMA5A 세마포린-5A (SEMA5A) NM_001107659
트리뉴클레오티드 반복 확장 장애
미국 특허 공개 제20110016540호는 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애와 연관된 세포, 동물 및 단백질을 유전적으로 변형시키기 위해 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 것을 기재한다. 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애는 발생 신경생물학과 관련되고 종종 인지뿐만 아니라 감각 운동 기능에 영향을 미치는 복합, 진행성 장애이다. 당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 미국 특허 공개 제20110016540호의 것과 유사한 시스템에서 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
트리뉴클레오티드 반복 확장 단백질은 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애가 발생할 감수성, 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애의 존재, 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애의 중증도 또는 이들의 임의의 조합과 연관된 다양한 세트의 단백질이다. 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애는 반복 유형에 의해 결정되는 2 가지 범주로 나누어진다. 가장 통상적인 반복은, 유전자의 암호 영역에서 존재할 때 아미노산 글루타민(Q)에 대해 암호화나는 트리플렛 CAG이다. 그러므로, 이들 장애는 폴리글루타민 (폴리Q) 장애라고 하고 하기 질환을 포함한다: 헌팅톤병 (HD); 척수구근 근위축증 (SBMA); 척수소뇌 운동실조증 (SCA 유형 1, 2, 3, 6, 7, 및 17); 및 DRPLA (Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy). 남아있는 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애는 CAG 트리플렛을 수반하지 않거나 또는 CAG 트리플렛은 유전자의 암호 영역에 있지 않고, 따라서 비 폴리글루타민 장애로서 지칭된다. 비-폴리글루타민 장애는 취약 X 증후군 (FRAXA); 취약 XE 정신 지체증 (FRAXE); 프리드리히 운동실조증 (FRDA); 근긴장성 이영양증 (DM); 및 척수소뇌 운동실조증 (SCA 유형 8, 및 12)을 포함한다.
트리뉴클레오티드 반복 확장 장애와 관련된 단백질은 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애에 대한 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애와 연관된 단백질의 실험적 연관에 기반하여 전형적으로 선택된다. 예를 들어, 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애와 연관된 단백질의 생성 속도 또는 순환 농도는 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애가 없는 집단에 비해 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애를 갖는 집단에서 상승 또는 억제될 수 있다. 단백질 수준에서의 차이는 웨스턴 블롯, 면역 조직화학적 염색, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 및 질량 분석을 포함하는 프로테오믹스 기술을 사용하여 평가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 트리뉴클레오티드 반복 확장 장애와 연관된 단백질은 DNA 마이크로어레이 분석, 일련 분석 유전자 발현(SAGE), 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(Q-PCR)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 게놈 기법을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 얻음으로써 확인될 수 있다.
트리뉴클레오티드 반복부 확장 장애와 연관된 단백질의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: AR (안드로겐 수용체), FMR1 (취약 X 정신 지체 1), HTT (헌팅틴), DMPK (근긴장 이상증-단백질 키나제), FXN (프라탁신), ATXN2 (아탁신 2), ATN1 (아트로핀 1), FEN1 (플랍 구조-특이적 엔도뉴클레아제 1), TNRC6A (트리뉴클레오티드 반복 함유 6A), PABPN1 (폴리(A) 결합 단백질, 핵 1), JPH3 (정토필린 3), MED15 (매개인자 복합체 서브유닛 15), ATXN1 (아탁신 1), ATXN3 (아탁신 3), TBP (TATA 박스 결합 단백질), CACNA1A (칼슘 채널, 전압-의존적, P/Q 유형, 알파 1A 서브유닛), ATXN80S (ATXN8 반대 가닥 (비-단백질 코딩)), PPP2R2B (단백질 포스파타제 2, 조절 서브유닛 B, 베타), ATXN7 (아탁신 7), TNRC6B (트리뉴클레오티드 반복 함유 6B), TNRC6C (트리뉴클레오티드 반복 함유 6C), CELF3 (CUGBP, Elav-유사 패밀리 멤버 3), MAB21L1 (mab-21-유사 1 (예쁜 꼬마 선충)), MSH2 (mutS 상동체 2, 결장암, 비용종증 1형 (이. 콜라이)), TMEM185A (경막 단백질 185A), SIX5 (SIX 호메오박스 5), CNPY3 (카노피 3 상동체 (제브라피쉬)), FRAXE (취약 부위, 폴산 유형, 희귀, fra(X)(q28) E), GNB2 (구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질), 베타 폴리펩티드 2), RPL14 (리보솜 단백질 L14), ATXN8 (아탁신 8), INSR (인슐린 수용체), TTR (트랜스타이레틴), EP400 (E1A 결합 단백질 p400), GIGYF2 (GRB10 상호작용 GYF 단백질 2), OGG1 (8-옥소구아닌 DNA 글리코실라제), STC1 (스탄니오칼신 1), CNDP1 (카르노신 디펩티다제 1 (메탈로펩티다제 M20 패밀리)), C10orf2 (염색체 10 오픈 리딩 프레임 2), MAML3 마스터민드-유사 3 (초파리), DKC1 (선천성 이각화증 1, 디스케린), PAXIP1 (PAX 상호작용 (전사-활성화도메인) 단백질 1), CASK (칼슘/칼모듈린-의존적 세린 단백질 키나제 (MAGUK 패밀리)), MAPT (마이크로튜불-연관 단백질 tau), SP1 (Sp1 전사 인자), POLG (중합효소 (DNA 지정), 감마), AFF2 (AF4/FMR2 패밀리, 멤버 2), THBS1 (트롬보스폰딘 1), TP53 (종양 단백질 p53), ESR1 (에스트로겐 수용체 1), CGGBP1 (CGG 트리플릿 반복 결합 단백질 1), ABT1 (기본 전사의 활성인자 1), KLK3 (칼리크레인-관련 펩티다제 3), PRNP (프라이온 단백질), JUN (jun 종양 유전자), KCNN3 (포타슘 중간체/소형 컨덕턴스 칼슘-활성화된 채널, 서브패밀리 N, 멤버 3), BAX (BCL2-연관 X 단백질), FRAXA (취약 부위, 폴산 유형, 희귀, fra(X)(q27.3) A (거대고환, 정신 지체)), KBTBD10 (kelch 반복 및 BTB (POZ) 도메인 함유 10), MBNL1 (머슬블라인드-유사 (초파리)), RAD51 (RAD51 상동체 (RecA 상동체, 이. 콜라이) (에스. 세레비지아)), NCOA3 (핵 수용체 공활성화제 3), ERDA1 (확장 반복 도메인, CAG/CTG 1), TSC1 (결절성 경화증 1), COMP (연골 올리고머 매트릭스 단백질), GCLC (글루타메이트-시스테인 리가제, 촉매 서브유닛), RRAD (Ras-관련 당뇨병 연관), MSH3 (mutS 상동체 3 (이. 콜라이)), DRD2 (도파민 수용체 D2), CD44 (CD44 분자 (인도 혈액군)), CTCF (CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)), CCND1 (사이클린 D1), CLSPN (클라스핀 상동체 (제노푸스 라에비스 (Xenopus laevis)), MEF2A (근세포 인핸서 인자 2A), PTPRU (단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형, U), GAPDH (글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제), TRIM22 (3원 모티프-함유 22), WT1 (빌름스 종양 1), AHR (아릴 탄화수소 수용체), GPX1 (글루타티온 퍼옥시다제 1), TPMT (티오푸린 S-메틸트랜스퍼라제), NDP (노리에병 (가신경교종)), ARX (아리스탈레스 (aristaless) 관련 호메오박스), MUS81 (MUS81 엔도뉴클레아제 상동체 (에스. 세레비지아에)), TYR (티로시나제 (눈피부 백색증 IA)), EGR1 (초기 성장 반응 1), UNG (우라실-DNA 글리코실라제), NUMBL (numb 상동체 (초파리)-유사), FABP2 (지방산 결합 단백질 2, 장), EN2 (엔그레일드 (engrailed) 호메오박스 2), CRYGC (크리스탈린, 감마 C), SRP14 (신호 인식 입자 14 kDa (상동성 Alu RNA 결합 단백질)), CRYGB (크리스탈린, 감마 B), PDCD1 (프로그램된 세포 사멸1), HOXA1 (호메오박스 A1), ATXN2L (아탁신 2-유사), PMS2 (PMS2 감수분열후 분리 증가 2 (에스. 세레비지아에)), GLA (갈락토시다제, 알파), CBL (Cas-Br-M (쥐과) 동종숙주 레트로바이러스 형질전환 서열), FTH1 (페리틴, 헤비 폴리펩티드 1), IL12RB2 (인터루킨 12 수용체, 베타 2), OTX2 (오르토덴티클 호메오박스 2), HOXA5 (호메오박스 A5), POLG2 (중합효소 (DNA 지정), 감마 2, 보조 서브유닛), DLX2 (디스탈-리스 (distal-less) 호메오박스 2), SIRPA (신호-조절 단백질 알파), OTX1 (오르토덴티클 호메오박스 1), AHRR (아릴-탄화수소 수용체 억제인자), MANF (중쇄 성상세포-유래 신경영양 인자), TMEM158 (경막 단백질 158 (유전자/가유전자)), 및 ENSG00000078687.
트리뉴클레오티드 반복 확장 장애와 연관된 바람직한 단백질은 HTT(헌팅틴), AR(안드로겐 수용체), FXN(프라탁신), Atxn3(아탁신), Atxn1(아탁신), Atxn2(아탁신), Atxn7(아탁신), Atxn10(아탁신), DMPK(근긴장성 이영양증-단백질 키나제), Atn1(아트로핀 1), CBP(creb 결합 단백질), VLDLR(매우 저밀도 지단백질 수용체), 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
청각 질병의 치료
본 발명은 또한 하나 또는 두 귀로 CRISPR-Cas 시스템을 전달하는 것을 고려한다.
연구자는 유전자 치료가 현재 난청 치료-즉, 달팽이관 이식을 원조하기 위해 사용될 수 있는지를 조사하였다. 난청은 종종 청각 뉴런으로 신호를 전달할 수 없는 손실되거나 손상된 모세포에 의해 발생된다. 이러한 경우에서, 달팽이관 이식은 신경 세포로 소리에 대한 반응 및 전기 신호 전달을 위해 사용될 수 있다. 그러나 더 적은 성장 인자가 손상된 모세포에 의해 방출되므로 달팽이관으로부터 이들 뉴런이 종종 악화되고 철회된다.
미국 특허 출원 제20120328580호는 예를 들어, 주사기, 예를 들어, 단일-용량 주사기를 사용하여 약학적 조성물을 귀(예를 들어, 귀 투여), 예컨대 달팽이관의 관내강(luminae)으로(예를 들어, 중앙계, Sc 정전계(vestibulae), 및 고실계) 주입을 기재한다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물은 고막내 주입(예를 들어, 중이 내로), 및/또는 외이, 중이 및/또는 내이 내로 주입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 인간 귀로 스테로이드 및 항체의 투여를 위해 당 분야에서 관례적으로 사용된다. 주입은 예를 들어, 귀의 내창 또는 달팽이관 캡슐을 통해 실시될 수 있다. 다른 내이 투여 방법이 당 분야에서 공지되었다 (예를 들어, 문헌 [Salt and Plontke, Drug Discovery Today, 10:1299-1306, 2005]).
다른 모드의 투여에서, 약학적 조성물은 카테터 또는 펌프를 통해 원 위치 투여될 수 있다. 카테터 또는 펌프는, 예를 들어, 달팽이관 관내강 또는 귀의 내창 및/또는 결장의 루멘으로 약학적 조성물을 향하게 한다. 본원에서 기재된 하나 이상의 화합물을 귀, 예를 들어 인간 귀로 투여하기 위해 적합한 예시적인 약물 전달 장치 및 방법이 McKenna 등의 문헌(미국 공개 번호 제2006/0030837호) 및 Jacobsen 등의 문헌(미국 특허 제7,206,639호)에 기재되어 있다. 몇몇 구현예에서, 카테터 또는 펌프는 수술 과정 동안, 예를 들어, 환자의 귀 (예를 들어, 외이, 중이, 및/또는 내이)에 위치될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 카테터 또는 펌프는 수술 과정 필요 없이, 예를 들어, 환자의 귀 (예를 들어, 외이, 중이, 및/또는 내이)에 위치될 수 있다.
대안적으로 또는 더하여, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물이 달팽이관 이식 또는 외이에 착용하는 보청기와 같은 기계 장치와의 조합으로 투여될 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 예시적인 달팽이관 이식은 Edge 등의 문헌에 의해 설명된다(미국 공개 번호 제2007/0093878호).
몇몇 구현예에서, 상기 기재된 투여 모드는 임의의 순서로 조합될 수 있으며 동시에 또는 배치될 수 있다.
대안적으로 또는 더하여, 본 발명은 예를 들어, CDER Data Standards Manual, 버전 넘버 004(fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm에서 이용 가능함)에 기재된 바와 같은, 임의의 미국 식품의약국(Food and Drug Administration) 승인 방법에 따라 투여될 수 있다.
일반적으로, 미국 특허 출원 제20120328580호에 기재된 세포 치료 방법이 실험관내 내이의 성숙 세포 유형(예를 들어, 모세포)에 대해 또는 이를 향해 세포의 완전한 부분적 분화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 방법으로부터 야기된 세포는 이러한 치료가 필요한 환자에게 이식되거나 주입될 수 있다. 적합한 세포 유형을 확인하고 스크리닝하기 위한 방법을 포함하는 이들 방법을 실시하기 위해 요구되는 세포 배양 방법, 선택된 세포의 완전한 또는 부분적 분화를 촉진하는 방법, 완전히 또는 부분적으로 분화된 세포 유형을 확인하기 위한 방법, 및 완전히 또는 부분적으로 분화된 세포를 이식하는 방법이 하기에 기재된다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 세포는, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물과 예를 들어 실험관내 접촉했을 때, 내이의 성숙 세포, 예를 들어, 모세포(예를 들어, 내부 및/또는 외부 모세포) 내로 완전하게 또는 부분적으로 분화딜 수 있는 세포를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 모세포로 분화될 수 있는 예시적인 세포는 줄기 세포(예를 들어, 내이 줄기 세포, 성인 줄기 세포, 골수 유래 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 피부 줄기 세포, iPS 세포, 및 지방 유래 줄기 세포), 선조 세포(예를 들어, 내이 선조 세포), 지지 세포(예를 들어, 다이테르스 세포, 주상 세포, 내부 지골 세포, 덮개(tectal) 세포 및 헨젠 세포), 및/또는 생식 세포를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 내이 감각 세포의 대체를 위한 줄기 세포의 사용은 Li 등(미국 특허 공개 제2005/0287127호) 및 Li 등(미국 특허 출원 제11/953,797호)에 기재되어 있다. 내이 감각 세포의 치환을 위한 골수 유래 줄기 세포의 용도는 [Edge et al., PCT/US2007/084654]에 기술된다. iPS 세포는 예를 들어, 하기 문헌에 기술된다: Takahashi et al., Cell, Volume 131, Issue 5, Pages 861-872 (2007); Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-76 (2006); Okita et al., Nature 448, 260-262 (2007); Yu, J. et al., Science 318(5858):1917-1920 (2007); Nakagawa et al., Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); 및 Zaehres and Scholer, Cell 131(5):834-835 (2007). 이러한 적합한 세포는 하나 이상의 조직 특이 유전자의 존재를 분석(예를 들어, 정성적 또는 정량적)하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현은 하나 이상의 조직-특이적 유전자의 단백질 산물을 탐지하여 탐지될 수 있다. 단백질 탐지 기술은 적절한 항원에 대한 항체를 사용하는 염색 단백질(예를 들어, 세포 추출물 또는 전체 세포를 사용함)을 수반한다. 이러한 경우에서, 적절한 항원은 조직-특이적 유전자 발현의 단백질 산물이다. 원칙적으로 제1 항체(즉, 항원에 결합하는 항체)가 표지될 수 있지만, 제1 항체(예를 들어, 항-IgG)로 향하는 제2 항체를 사용하는 것이 좀더 일반적(및 시각화를 개선함)이다. 이러한 제2 항체는 형광 색소 또는 비색 반응을 위한 적절한 효소 또는 (전자 현미경을 위한) 금 비드 또는 비오틴-아비딘 시스템과 컨쥬게이트되어, 1차 항체의 위치가 인식될 수 있으므로 항원이 인식될 수 있다.
본 발명의 CRISPR Cas 분자는 미국 공개 출원, 제20110142917호로부터 변형된 조성물을 가지고, 외이로 약학적 조성물을 직접 적용하여 귀로 전달될 수 있다. 몇몇 구현예에서 약학적 조성물은 이도(ear canal)에 적용된다. 귀로의 전달은 또한 청각 또는 귀 전달으로서 언급될 수 있다.
당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 상기 논의된 특허 공개의 것과 유사한 시스템에서 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNA 분자는 리포솜 또는 리포펙틴 제형 등으로 전달되고, 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 참조로 본 명세서에 편입되는, 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 5,593,972, 5,589,466, 및 5,580,859에 기술되어 있다.
포유동물 세포로 siRNA의 증강되고 개선된 전달을 특별히 목적으로 하는 전달 시스템이 개발되었고 (참조: 예를 들어, Shen et al FEBS Let. 2003, 539:111-114; Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-10; Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216; Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766; Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108 및 Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724), 본 발명에 적용할 수 있다. siRNA는 최근에 영장류에서의 유전자 발현의 억제를 위해 성공적으로 사용되었다 (참조: 예를 들어, Tolentino et al., Retina 24(4):660 (본 발명에 또한 적용할 수 있음 ).
Qi 등은 본 발명의 핵산 표적화 시스템에 적용될 수 있는 신규한 단백질 전달 기술에 의해 온전한 내창을 통해 내이로 효율적인 siRNA 트랜스펙션을 위한 방법을 기재했다(예를 들어, 문헌[Qi et al., Gene Therapy (2013), 19]을 참조). 특히, 온전한 내창 투과를 통해 내부 및 외부 모세포, 팽대부릉(crista ampullaris), 난형낭반 및 구형낭반을 포함하는 내이의 세포 내로 Cy3-표지 siRNA를 트랜스펙션시킬 수 있는, TAT 이중 가닥 RNA-결합 도메인(TAT-DRBDs)이 다양한 내이 질병의 치료 및 청각 기능의 보존을 위한 생체내 이중 가닥 siRNA 전달에 성공적이었다. 10 mM RNA의 약 40㎕가 귀에 투여하기 위한 용량으로서 고려될 수 있다.
Rejali 등 (Hear Res. 2007 Jun;228(1-2):180-7)에 따르면, 달팽이관 이식 기능은 이식물에 의한 전기적 자극의 표적인 나선청신경절 뉴런의 양호한 보정에 의해 개선될 수 있으며, 뇌 유래 신경성장 인자(brain derived neurotrophic factor:BDNF)는 실험적으로 청각을 잃은 귀에서 나선청신경절 생존을 향상시키는 것으로 이전에 나타났다. Rejali 등은 BDNF 유전자 삽입을 갖는 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 섬유아세포의 코팅을 포함하는 달팽이관 이식 전극의변형된 설계를 시험했다. 이 유형의 생체외 유전자 이송을 완수하기 위해, Rejali 등은 BDNF 유전자 카세트 삽입을 갖는 아데노바이러스로 기니아피그 섬유아세포를 형질도입시키고, 이 세포들이 BDNF를 분비하는 것을 밝힌 후 BDNF-분비 세포를 아가로스 겔을 통해 달팽이관 이식 전극에 부착시키고 고실계에 전극을 이식했다. Rejali 등은 BDNF 발현 전극이 대조 전극과 비교했을 때 이식 48일 후에 달팽이관의 기저 회전에서 상당히 많은 나선 신경절 뉴런을 보존할 수 있었음을 밝혔으며 나선 신경절 뉴런 생존을 증강시키기 위해 생체외 유전자 이송과 달팽이관 이식 치료법을 조합하는 가능성을 밝혔다. 이러한 시스템은 귀로의 전달을 위한 본 발명의 핵산 표적화 시스템에 적용될 수 있다.
Mukherjea 등(Antitoxidants & Redox Signaling, Volume 13, Number 5, 2010)은 손상으로부터 OHC의 보호에 의해 입증되는 바와 같이 짧은 간섭 (si) RNA를 사용하는 NOX3의 녹다운이 시스플라틴 이독성(ototoxicity)을 없애며 청성뇌간반응(auditory brainstem response:ABR)에서 역치 이동을 감소시켰다는 것을 기록하였다. 상이한 용량의 siNOX3 (0.3, 0.6, 및 0.9 ㎍)이 래트에 투여되고 NOX3 발현이 실시간 RT-PCR로 평가됐다. 사용된 NOX3 siRNA의 가장 낮은 용량(0.3 ㎍)은 스크램블드 siRNA의 고막투과 투여 또는 비처리된 달팽이관과 비교했을 때 NOX3 mRNA의 임의의 저해를 보이지 않았다. 그러나, 고용량의 NOX3 siRNA (0.6 및 0.9 ㎍)의 투여는 대조 스크램블드 siRNA에 비하여 NOX3 발현을 감소시켰다. 이러한 시스템은 인간으로의 투여를 위해 약 2 mg 내지 약 4 mg 용량의 CRISPR Cas를 고막투과 투여하기 위한 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 적용될 수 있다.
Jung 등은 iRNA의 적용 후 소낭에서의 Hes5 수준이 감소하고 이러한 소낭에서의 다수의 모세포가 대조 치료 후보다 상당히 더 큰 것을 입증했다(문헌 [Molecular Therapy, vol. 21 no. 4, 834841 apr. 2013]). 데이터는 siRNA 기술이 내이에서의 복구 및 재생을 유도하는데 유용할 수 있고 Notch 신호화 경로가 특이 유전자 발현 저해에 대한 잠재적으로 유용한 표적임을 제시한다. Jung 등은 8 ㎍의 Hes5 siRNA를 2 ㎕ 부피로 주입했으며, 이는 귀의 전정 상피에 대한 동결건조된 siRNA에 멸균된 일반 식염수를 첨가하여 제조되었다. 이러한 시스템은 인간으로의 투여를 위한 약 1 내지 약 30 mg 용량으로 CRISPR Cas을 귀의 전정 상피에 투여하기 위해 본 발명의 핵산 표적화 시스템에 적용될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 상기 논의된 특허 공개의 것과 유사한 시스템에서 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
비분열 세포 (뉴런 및 근육)에서 유전자 표적화
비분열 (비분열, 완전 분화) 세포 유형은 예를 들어 상동성 재조합 (Hr)이 일반적으로 G1 세포-주기 시기에서 억제되기 때문에, 유전자 표적화 또는 게놈 조작에 문제를 제기한다. 그러나, 세포가 정상 DNA 복구를 조절하는 기전을 연구하면서, Durocher는 비분열 세포에서 HR을 " 끔" 로으로 유지시키는 이전에 알려지지 않은 스위치를 발견하였고 이러한 스위치를 다시 켜는 전략을 고안하였다. Orthwein 등 (Daniel Durocher’s lab at the Mount Sinai Hospital in Ottawa, Canada)의 최근 보고 (Nature 16142, published online 9 Dec 2015)는 HR의 억제가 해제될 수 있고 유전자 표적화가 신장 (293T) 및 골육종 (U2OS) 세포에서 성공적이라고 결론내렸다. 종양 억제인자, BRCA1, PALB2 및 BRAC2는 Hr에 의한 DNA DSB 복구를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 그들은 PALB2 -BRAC2와 BRCA1의 복합체의 형성이 PALB 상의 유비퀴틴 부위에 의해 지배되어서, E3 유비퀴틴 리가제에 의한 부위상의 작용을 확인하였다. 이러한 E3 유비퀴틴 리가제는 쿨린-3 (CUL3)-RBX1과의 복합체에 KEAP1 (PALB2 -상호작용 단백질)로 구성된다 PALB2 유비퀴틴화는 BRCA1과 이의 상호작용을 억제하고 그 자체로 세포 주기 제어 하에 있는, 디유비퀴틸라제 USP11에 의해 대항된다. DNA-말단 절제의 활성화되 조합된 BRCA1-PALB2 상호작용의 복원은 (pX459 벡터로부터 발현된) USP11 또는 KEAP1에서 지정된 CRISPR-Cas9-기반 유전자-표적화 어세이를 포함한 수많은 방법으로 측정하여, G1에서 상동성 재조합을 유도하기에 충분하다. 그러나, BRCA1-PALB2 상호작용이 KEAP1 고갈 또는 PALB2-KR 돌연변이체의 발현을 사용한 절제-적격 G1 세포에서 복원되었을 때, 유전자-표적화 사건에서 강력한 증가가 검출되었다.
따라서, 세포, 특히 비분열, 완전 분화 세포 유형에서 HR의 재활성화가 일부 구현예에서, 바람직하다. 일부 구현예에서, BRCA1-PALB2 상호작용이 일부 구현예에서, 바람직하다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 비분열 세포이다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 뉴런 또는 근육 세포이다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 생체 내에서 표적화된다. 일부 구현예에서, 세포는 G1 이고 HR은 억제된다. 일부 구현예에서, KEAP1 고갈의 사용, 예를 들어, KEAP1 활성의 발현 억제가 바람직하다. KEAP1 고갈은 예를 들어 Orthwein 등이 확인한 바와 같이, siRNA를 통해 달성될 수 있다. 대안적으로, PALB2-KR 돌연변이체 (BRCA1-상호작용 도메인 내 모든 8개 Lys의 결여)의 발현이 KEAP1 고갈과 조합하여 또는 단독으로 바람직하다. PALB2-KR은 세포 주기 위치와 무관하게, BRCA1과 상호작용한다. 따라서, 특히 G1 세포에서, BRCA1-PALB2 상호작용의 촉진 또는 복원은 일부 경우에, 특히 표적 세포가 비분열하는 경우, 또는 제거 및 복귀 (생체외 유전자 표적화)가 문제가 되는 경우, 예를 들어 뉴런 또는 근육 세포에서 바람직하다. KEAP1 siRNA는 ThermoFischer로부터 입수가능하다. 일부 구현예에서, BRCA1-PALB2 복합체가 G1 세포에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, PALB2 탈유비퀴틴화는 예를 들어 디유비퀴틸라제 USP11의 증가된 발현에 의해 촉진될 수 있어서, 구성체가 디유비퀴틸라제 USP 11의 발현 또는 활성을 촉진시키거나 또는 상향조절시키는데 제공될 수 있다는 것을 고려한다.
안질환의 치료
본 발명은 또한 하나 또는 두 눈으로 CRISPR-Cas 시스템을 전달하는 것을 고려한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, CRISPR-Cas 시스템은 문헌 [Genetic Diseases of the Eye, Second Edition, edited by Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012]에 추가 기재된 여러 유전적 돌연변이로부터 발생한 안구 결함을 편집하기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 치료 또는 표적화되는 병태는 눈 장애이다. 일부 구현예에서, 눈 장애는 녹내장을 포함할 수 있다. . 일부 구현예에서, 눈 장애는 망막 변성 질환을 포함한다. 일부 구현예에서, 망막 변성 질환은 스타르가르트병, 바르뎃-비들 증후군, 베스트병, 파란색 원추 단색형 색각, 맥락막결손, 원뿔-막대 세포 이영양증, 선천성 고정형 야맹증, 증대 S-추체 증후군, 소아 X-연관 망막분리증, 레버 선천성 흑내장, 말라티아 레벤티네세 (Malattia Leventinesse), 노리에병 또는 X-연관 가족삼출유리체망막병증, 패턴 이영양증, 소르스비 이영양증, 어셔 증후군, 망막색소변성증, 완전색맹 또는 황반 이영양증 또는 변성, 망막색소변성증, 완전색맹, 및 나이 관련 황반 변성으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 망막 퇴행성 질환은 레버 선천성 흑내장 (LCA) 또는 망막 색소변성증이다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 임의로 유리체내 주사 또는 망막하 주사를 통해 눈에 전달된다.
눈으로의 투여에서, 렌티바이러스 벡터, 상세하게는 말 전염성 빈혈증 바이러스(EIAV)가 특히 바람직하다.
다른 실시형태에서, 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV/ jgm.845)에 기반한 최소 비영장류 렌티바이러스 벡터가 또한 특히 안구 유전자 요법에 대해 고려된다 (참조: 예를 들어, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 -285). 벡터는 표적 유전자의 발현을 구동하는 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터를 갖는 것이 고려된다. 전방내, 망막하, 안구내, 및 유리체내 주사가 모두 고려된다 (참조: 예를 들어, Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 -285, Published online 21 November 2005 in Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). 안내 주입은 수술 현미경의 도움으로 실행될 수 있다. 망막하 및 유리체내 주입에서, 눈은 온화한 손가락 압력에 의해 탈출될 수 있으며 기반부는 현미경용 유리 슬라이드 커버슬립으로 덮인 각막 상에 커플링 배지 용액을 떨어뜨리는 것으로 구성된 콘텍트 렌즈 시스템을 사용하여 시각화되었다. 망막하 주입에서, 5-㎕ 해밀턴 주사기에 고정된 10-mm 34-게이지 바늘의 끝부분이, 망막하 공간에서 바늘의 구멍이 보일 때까지, 우세한 적도 공막(equatorial sclera)을 통해 접선으로 후두극을 향해 직접 시각화 하에서 진전될 수 있다. 그런 다음, 2 ㎕의 벡터 상청액을 주입하여 우세한 수포성 망막 분리를 생성할 수 있으며, 따라서 이는 망막하 벡터 투여를 확인하는 것이다. 이러한 접근법은 RPE에 의해 흡수될 때까지, 일반적으로 48시간의 과정 내에 벡터 상청액이 망막하 공간에서 보유되도록 하는 자가-밀봉 공막절단을 창출한다. 이 과정은 하위 망막 분리를 생성하기 위해 하위 반구에서 반복될 수 있다. 이 기술은 벡터 현탁액으로 대략 70% 의 감각신경 망막 및 RPE의 노출을 야기한다. 유리체내 주입에서, 바늘 끝은 공막을 통해 각공막 경계 1 mm 뒤로 전진될 수 있으며 2 ㎕의 벡터 현탁액은 유리체강으로 주입된다. 전방내 주입에서, 바늘 끝은 각공막 경계 천자를 통해, 중앙 각막을 향해 진전될 수 있으며, 2 ㎕의 벡터 현탁액이 주입될 수 있다. 전방내 주입에서, 바늘 끝은 각공막 경계 천자를 통해, 중앙 각막을 향해 진전될 수 있으며, 2 ㎕의 벡터 현탁액이 주입될 수 있다. 이들 벡터는 1.01.4×1010 또는 1.01.4×109 형질도입 유닛(TU)/ml의 역가로 주입될 수 있다.
다른 구현예에서, 망 형태의 노인성 황반변성의 치료를 위한 망막하 주입을 통해 전달되는 혈관형성 억제 단백질 엔도스타틴 및 안지오스타틴을 발현하는 단백질 말 전염성 빈혈증 바이러스-기반 렌티바이러스 유전자 치료 벡터인 RetinoStat®이 또한 고려된다 (예를 들어, 문헌[Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980991 (September 2012)] 참조). 이러한 벡터는 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템을 위해 변형될 수 있다. 각각의 눈은 총 100 ㎕의 부피로 눈 당 1.1 x 105 형질도입 유닛(TU/eye)의 용량의 RetinoStat®으로 치료될 수 있다.
다른 구현예에서, E1-제거, 부분적 E3-제거, E4-제거 아데노바이러스 벡터가 눈으로의 전달을 위해 고려될 수 있다. 진행된 신생혈관 노인성 황반변성(AMD)을 지니는 28 명의 환자에게 E1-, 부분적 E3-, E4-결실 아데노바이러스 벡터 발현 인간 색소 상피-유래 인자(AdPEDF.ll)의 단일 유리체강내 주사를 제공하였다(예를 들어, 문헌[Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167176 (February 2006)] 참조). 106 내지 109.59.5 입자 유닛(PU) 범위의 용량이 조사되었으며 AdPEDF.ll에 관련된 심각한 부작용 및 용량-제한 독성이 없었다(예를 들어, 문헌[Campochiaro et al., Human Gene Therapy 17:167176 (February 2006)]을 참조하라). 아데노바이러스 벡터-매개 안구 유전자 이송이 안구 장애의 치료를 위해 실행가능한 접근법을 나타낼 수 있으며 CRISPR Cas 시스템에 적용될 수 있다.
다른 구현예에서, RXi Pharmaceuticals의 sd-rxRNA® 시스템이 눈으로의 CRISPR Cas의 전달을 위해 사용되고 그리고/또는 조정될 수 있다. 이 시스템에서, 3 ㎍의 sd-rxRNA의 단일 유리체내 투여는 14일 동안 PPIB mRNA 수준의 서열-특이적 감소를 야기한다. sd-rxRNA® 시스템이 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 적용될 수 있으며, 인간에게 투여된 약 3 내지 20 mg 용량의 CRISPR을 고려하는 것이다.
Millington-Ward 등 (Molecular Therapy, vol. 19 no. 4, 642649 apr. 2011)은 RNAi 표적 부위 상의 변성 위치에서 뉴클레오티드 변경에 기인한 억제에 저항하는 RNA 간섭 (RNAi)-기반 로돕신 억제제 및 코돈-변형 로돕신 대체 유전자를 전달하기 위해 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 기재한다. 6.0 x 108 vp 또는 1.8 x 1010 vp의 AAV의 주입이 Millington-Ward 등에 의해 눈으로 망막하 주입된다. Millington-Ward 등의 AAV 벡터는 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 적용될 수 있으며, 인간에게 약 2 x 1011내지 약 6 x 1013 vp 용량으로 투여되는 것을 고려한 것이다.
Dalkara 등(Sci Transl Med 5, 189ra76 (2013))은 또한 눈의 유리체액 내로 손상없는 주사 후에 망막을 통해 결함있는 유전자의 야생형 형태를 전달하는 AAV 벡터를 생성하는 생체내 관련 진화에 관한 것이다. Dalkara는 AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 및 9로부터 cap 유전자의 DNA 셔플링에 의해 작제된 칠량체 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 AAV 라이브러리를 기재한다. CAG 또는 Rho 프로모터 하에서 GFP를 발현하는 rcAAV 라이브러리 및 rAAV 벡터는 패키징되었으며 디옥시리보뉴클레아제-저항 게놈 역가는 정량 PCR을 통해 수득된다. 라이브러리가 풀링되었으며, 두 라운드의 진화가 실행되었으며, 각각 초기 라이브러리 다양화 및 그 이후의 3 개의 생체내 스크리닝 단계로 구성된다. 각각의 이러한 단계에서, P30 rho-GFP 마우스에게 약 1×1012 vg/ml의 게놈 역가를 갖는 2 ml의 이오딕사놀-정제된, 인산염-완충 식염수(PBS)-투석 라이브러리로 유리체내로 주입되었다. Dalkara 등의 AAV 벡터는 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 적용될 수 있으며, 약 1 × 1015 내지 약 1 × 1016 vg/ml의 용량으로 인간에게 투여하는 것을 고려하는 것이다.
또 다른 구현예에서, 로돕신 유전자는 색소성 망막염 (RP)의 치료를 위해 표적화될 수 있으며, Sangamo BioSciences, Inc.로 양도된 미국 특허 공개 제20120204282호의 시스템은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 따라 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 인간 로돕신 유전자로부터 표적 서열을 절단하는 방법에 대한, Cellectis로 양도된 미국 특허 공개 제20130183282호의 방법은 또한 본 발명의 핵산-표적화 시스템으로 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 레버 선천성 흑내장 10 (Lca10)을 치료하기 위한 CRISPR-Cas 관련 방법 및 조성물에 관한, Editas Medicine에 양도된 US 공개 번호 20150252358의 방법은 또한 본 발명을 위한 핵산-표적화 시스템에 대해 변형될 수 있다.
다른 구현예에서, 어셔 증후군 및 망막색소변성증을 치료하기 위한 CRISPR-Cas 관련 방법 및 조성물에 관한, Editas Medicine에 양도된 US 공개 번호 20170073674의 방법은 또한 본 발명을 위한 핵산-표적화 시스템에 대해 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 C2c1이고, 시스템은 I. CRISPR-Cas 시스템 RNA 폴리뉴클레오티드 서열로서, (a) tracr RNA 폴리뉴클레오티드 및 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 RNA 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 직접 반복부 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 서열, 및 II. 임의로 적어도 하나 이상의 핵 국재화 서열을 포함하는, C2c1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 직접 반복부 서열은 가이드 서열과 하이브리드화하여 표적 서열로 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도시키고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열과 하이브리드화하거나 또는 하이브리드화가능한 가이드 서열, 및 (2) 직접 반복부 서열과 복합체를 형성하는 CRISPR 단백질을 포함하고, CRISPR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA이다.
일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 T-풍부 PAM을 인식한다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTN-3' 또는 5'-ATTN-3' 이다. 일정 구현예에서, MPS I와 관련된 관심 유전자좌는 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부를 생성시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, 스태거드 절단은 NHEJ 또는 HDR에 후속한다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 주형 DNA 서열을 삽입, 또는 " 녹-인" 시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, DNA 삽입은 적절한 배향으로 게놈에 통합되도록 설계된다. Maresca 등 (Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546)은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 Tale 뉴클레아제 (TALEN)를 사용해 적용가능한 부위 지정된, 정밀 삽입 방법을 기술하는데, 여기서 5' 오버행을 갖는 짧은, 이중-가닥 DNA가 상보성 말단에 결찰되어, 인간 세포주에서 한정된 유전자좌에서 15-kb 외생성 발현 카세트의 정밀한 삽입을 가능하게 하였다. He 등 (Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9))은 4.6 kb 무프로모터 ires-eGFP 단편을 GAPDH 유전자좌에 CRISPR/Cas9-유도 부위-특이적 녹-인으로 체세포 LO2 세포에서 최대 20% GFP+ 세포를 산출하였고, NHEJ 경로에 의해 매개되는 인간 배아 줄기 세포에서 1.70% GFP+ 세포를 산출하였다고 기술하였으며, 또한 NHEJ-기반 녹-인이 조사된 모든 인간 세포 유형에서 HDR-매개 유전자 표적화에 비해 더 효율적이라고 보고하였다. C2c1이 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단을 생성시키기 때문에, 당업자는 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템을 사용해 관심 유전자좌에서 외생성 DNA 삽입을 발생시키기 위해서 Meresca 등 및 He 등에 기술된 거소가 유사한 방법을 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM 서열의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 먼저 변형되고, PAM 서열 근처에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 더욱 변형되며 HDR을 통해 복구된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR을 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ를 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 3' 및 5' 말단 둘 모두 상에서 단일 가이드 DNA(sgDNA)-PAM 서열이 측접된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 CRISPR-C2c1 절단 이후에 방출된다.
Wu(Cell Stem Cell,13:659-62, 2013)는 DNA 절단을 유발한 경우 마우스에서 백내장을 야기하는 단일 염기쌍 돌연변이에 Cas9를 안내하는 가이드 RNA를 설계하였다. 그런 다음, 다른 야생형 대립 형질 또는 올리고를 사용하여 돌연변이체 마우스에서 파손된 대립 형질의 서열을 고치고 백내장-발생 유전 결함을 고치는 접합체 복구 메커니즘이 주어졌다.
미국 특허 공개 제20120159653호는 황반변성(MD)과 연관된 세포, 동물 및 단백질을 유전적으로 변형시키기 위해 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하는 것을 기재한다. 황반변성(MD)은 노인의 시각 장애의 일차 원인이나, 또한 유아기와 같이 어린 발명 연령을 갖는 스타르가르트 질병, 소르스비 기저부(Sorsby fundus), 및 치명적인 소아 신경병성 질병과 같은 소아 질병의 특정 증상이기도 하다. 황반변성은 망막으로의 손상 때문에 시계 중심의 시야 손실(망막황반)을 야기한다. 현재 존재하는 동물 모델은 인간에서 관찰된 바와 같은 질병의 주요 특징을 나타내지 않는다. MD와 연관된 단백질을 코딩하는 돌연변이 유전자를 포함하는 가능한 동물 모델은 또한 매우 다양한 표현형을 생산하며, 이는 인간 질병 및 치료법 개발로 번역되어 문제가 생기게 한다.
미국 특허 공개 제20120159653호의 일 양태는 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 적용될 수 있는 MD와 연관된 단백질을 코딩하는 임의의 염색체 서열의 편집에 관한 것이다. MD와 연관된 단백질은 통상적으로 MD 장애에 대한 MD와 연관된 단백질의 실험적 연관성에 근거하여 선택된다. 예를 들어, MD와 연관된 단백질의 생산 비율 또는 순환 농도가 MD 장애가 결여된 집단에 비하여 MD 장애를 갖는 집단에서 상승하거나 저해될 수 있다. 단백질 수준에서의 차이는 웨스턴 블롯, 면역 조직화학적 염색, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 및 질량 분석을 포함하는 프로테오믹스 기술을 사용하여 평가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, MD 와 관련된 단백질은, 제한은 아니지만, DNA 마이크로어레이 분석, 연속 유전자 발현 분석 (SAGE), 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (Q-PCR)을 포함하는 게놈 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 얻음으로써 확인될 수 있다.
비-제한적인 예로서, MD와 연관된 단백질은 하기 단백질을 포함하나, 이로 제한되지 않는다:(ABCA4) ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 A (ABC1), 멤버 4 ACHM1 색맹 (간상체 적색맹) 1 ApoE 아포지단백질 E (ApoE) C1QTNF5 (CTRP5) C1q 및 종양 괴사 인자 관련 단백질 5 (C1QTNF5) C2 보체 성분 2 (C2) C3 보체 성분 (C3) CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2 (CCL2) CCR2 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 2 (CCR2) CD36 분화 클러스터 36 CFB 보체 인자 B CFH 보체 인자 CFH H CFHR1 보체 인자 H-관련 1 CFHR3 보체 인자 H-관련3 CNGB3 환형 뉴클레오티드 게이트 채널 베타 3 CP 세룰로플라스민 (CP) CRP C 반응성 단백질 (CRP) CST3 시스타틴 C 또는 시스타틴 3 (CST3) CTSD 카텝신 D (CTSD) CX3CR1 케모카인 (C-X3-C 모티프) 수용체 1 ELOVL4 (매우 긴 지방산 4의 신장) ERCC6 (절제 복구 교차-상보) 설치류 복구 결핍, FBLN5 피불린-5 FBLN5 피불린 5 FBLN6 피불린 6 FSCN2 파신(fascin) (FSCN2) HMCN1 헤미센트린 1 HMCN1 헤미센틴 1 HTRA1 HtrA 세린 펩티다아제 1 (HTRA1) HTRA1 HtrA 세린 펩티다아제 1 IL-6 인터루킨 6 IL-8 인터루킨 8 LOC387715 가설 단백질 PLEKHA1 플레크스트린 상동성 도메인-함유 패밀리 A 멤버 1 (PLEKHA1) PROM1 프로미닌 1(PROM1 또는 CD133) PRPH2 페리페린-2 RPGR 색소성 망막염 GTPase 조절자 세르핀G1 세르핀 펩티다아제 저해제, 클레이드 G, 멤버 1 (C1-저해제) TCOF1 트리클 TIMP3 메탈로프로테이나아제 저해제 3 (TIMP3) TLR3 톨-유사 수용체 3.
염색체 서열이 편집된 ASD와 관련된 단백질의 동일성은 다양할 수 있으며 다양할 것이다. 바람직한 구현예에서, 염색체 서열이 편집된 MD와 연관된 단백질은 ATP-결합 카세트, ABCR 유전자에 의해 코딩되는 서브-패밀리 A (ABC1) 멤버 4 단백질 (ABCA4), APOE 유전자에 의해 코딩되는 아포지단백질 E 단백질 (APOE), CCL2 유전자에 의해 코딩되는 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2 단백질 (CCL2), CCR2 케모카인 (C-C 모티프) 수용체 2 단백질 (CCR2), CP 유전자에 의해 코딩되는 세룰로플라스민 단백질 (CP), CTSD 유전자에 의해 코딩되는 카텝신 D 단백질 (CTSD), 또는 TIMP3 유전자에 의해 코딩되는 메탈로프로테이나아제 억제제 3 단백질 (TIMP3)일 수 있다. 예시적인 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 래트이며, MD 와 연관된 단백질을 인코딩하는 편집된 염색체 서열은 하기 것일 수 있다:(ABCA4) ATP 결합 카세트, NM_000350 서브-패밀리 A (ABC1), 멤버 4 APOE 아포지단백질 E NM_138828 (APOE) CCL2 케모카인 (C-C NM_031530 모티프) 리간드 2 (CCL2) CCR2 케모카인 (C-C NM_021866 모티프) 수용체 2 (CCR2) CP 세룰로플라스민 (CP) NM_012532 CTSD 카텝신 D (CTSD) NM_134334 TIMP3 메탈로프로테이나아제 NM_012886 저해제 3 (TIMP3). 동물 또는 세포는 MD와 연관된 단백질을 인코딩하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 방해된 염색체 서열 및 MD와 연관된 방해된 단백질을 인코딩하는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 이상의 염색체 통합된 서열을 포함할 수 있다.
편집되거나 통합된 염색체 서열은 MD와 관련된 변경된 단백질을 암호화하도록 변형될 수 있다. MD-관련 염색체 서열에서의 여러 돌연변이는 MD와 연관되었다. MD와 연관된 염색체 서열 내 돌연변이의 비제한적인 예는 ABCR 단백질에서, E471K (즉, 위치 471의 글루타메이트가 리신으로 변화), R1129L (즉, 위치 1129의 아르기닌이 류신으로 변화), T1428M (즉, 위치 1428의 트레오닌이 메티오닌으로 변화), R1517S (즉, 위치 1517의 아르기닌이 세린으로 변화), I1562T (즉, 위치 1562의 이소류신이 트레오닌으로 변화), 및 G1578R (즉, 위치 1578의 글리신이 아르기닌으로 변화); CCR2 단백질에서, V64I (즉, 위치 192의 발린이 이소류신으로 변화); CP 단백질에서, G969B (즉, 위치 969의 글리신이 아스파라긴 또는 아스파테이트로 변화); TIMP3 단백질에서, S156C (즉, 위치 156의 세린이 시스테인으로 변화), G166C (즉, 위치 166의 글리신이 시스테인으로 변화), G167C (즉, 위치 167의 글리신이 시스테인으로 변화), Y168C (즉, 위치 168의 티로신이 시스테인으로 변화), S170C (즉, 위치 170의 세린이 시스테인으로 변화), Y172C (즉, 위치 172의 티로신이 시스테인으로 변화) 및 S181C (즉, 위치 181의 세린이 시스테인으로 변화)를 포함하는, MD를 초래할 수 있는 것들을 포함한다. MD-관련 유전자 및 질환에서 유전자 변이체의 다른 관련성도 본 분야에 잘 알려져 있다.
CRISPR 시스템은 상염색체 열성 유전자로 인한 질환을 교정하는데 유용하다. 예를 들어, CRISPR/Cas9는 눈에서 수용체 상실을 초래하는 상염색체 열성을 제거하는데 사용되었다. Bakondi, B. et al., In Vivo CRISPR/Cas9 Gene Editing Corrects 망막 Dystrophy in the S334ter-3 Rat Model of Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa. Molecular Therapy, 2015; DOI: 10.1038/mt.2015.220.
당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 상기 논의된 특허 공개의 것과 유사한 시스템에서 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
순환 및 근육 질병의 치료
본 발명은 본 명세서에 설명된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질 시스템을 심장에 전달하는 것을 또한 고려한다. 심장에서, 선호되는 유전자 이송을 보이는 심근 열대성 아데나-연관 바이러스(AAVM), 특히 AAVM41이 바람직하다(예를 들어, Lin-Yanga et al., PNAS, March 10, 2009, vol. 106, no. 10). 투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다. 약 1-10 x 1014 용량의 벡터 게놈이 전신성 투여를 위해 고려된다. 참조: Eulalio et al. (2012) Nature 492: 376 및 Somasuntharam et al. (2013) Biomaterials 34: 7790.
예를 들어, 미국 특허 공개 제20110023139호는 세포, 동물 및 심혈관 질병에 연관된 단백질을 유전적으로 변형시키기 위한 아연 핑거 뉴클레아제의 사용을 기재한다. 심혈관 질환은 일반적으로 고혈압, 심장마비, 심부전, 및 뇌졸중 및 TIA를 포함한다. 심혈관 질병에 관련된 임의의 염색체 서열 또는 심혈관 질병에 관련된 임의의 염색체 서열에 의해 코딩된 단백질은 본 기재에서 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 심혈관-관련 단백질은 통상적으로 심혈관 질병의 발병에 대한 심혈관-관련 단백질의 실험 연관성에 근거하여 스크리닝된다. 예를 들어, 심혈관-관련 단백질의 생산 비율 또는 순환 농도는 심혈관 장애가 결여된 집단에 비하여 심혈관 장애를 갖는 집단에서 상승되거나 감소될 수 있다. 단백질 수준에서의 차이는 웨스턴 블롯, 면역 조직화학적 염색, 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA), 및 질량 분석을 포함하는 프로테오믹스 기술을 사용하여 평가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, 심혈관-관련 단백질은 DNA 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석(SAGE), 및 정량 실시간 폴리머라제 캐스케이드(Q-PCR)을 포함하는 게놈 기술을 사용하여 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 발현 프로파일을 수득함으로써 식별될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예로서, 염색체 서열은 제한없이, 다음을 포함할 수 있다: IL1B (인터루킨 1, 베타), XDH (잔틴 디히드로게나제), TP53 (종양 단백질 p53), PTGIS (프로스타글란틴 12 (프로스타사이클린) 신타제), MB (미오글로빈), IL4 (인터루킨 4), ANGPT1 (안지오포이어틴 1), ABCG8 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 G (WHITE), 멤버 8), CTSK (카텝신 K), PTGIR (프로스타글란틴 12 (프로스타사이클린) 수용체 (IP)), KCNJ11 포타슘 내향성 채널, 서브패밀리 J, 멤버 11), INS (인슐린), CRP (C-반응성 단백질, 펜트락신-관련), PDGFRB (혈소판-유래 성장 인자 수용체, 베타 폴리펩티드), CCNA2 (사이클린 A2), PDGFB (혈소판-유래 성장 인자 베타 폴리펩티드 (원숭이 육종 바이러스 (v-sis) 종양 유전자 상동체)), KCNJ5 포타슘 내향성 채널, 서브패밀리 J, 멤버 5), KCNN3 (포타슘 중간체/소형 컨덕턴스 칼슘-활성화된 채널, 서브패밀리 N, 멤버 3), CAPN10 (칼파인 10), PTGES (프로스타글란틴 E 신타제), ADRA2B (아드레날린성, 알파-2B-, 수용체), ABCG5 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 G (WHITE), 멤버 5), PRDX2 (퍼옥시리독신 2), CAPN5 (칼파인 5), PARP14 (폴리 (ADP-리보스) 중합효소 패밀리, 멤버 14), MEX3C (mex-3 상동체 C (예쁜 꼬마 선충)), ACE 안지오텐신 I 전환 효소 (펩티딜-디펩티다제 A) 1), TNF (종양 괴사 인자 (TNF 수퍼패밀리, 멤버 2)), IL6 (인터루킨 6 (인터페론, 베타 2)), STN (스타틴), SERPINE1 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 E (넥신, 플라스미노겐 활성인자 억제제 1형), 멤버 1), ALB (알부민), ADIPOQ (아디포넥틴, C1Q 및 콜라겐 도메인 함유), APOB (아포지단백질 B (Ag(x) 항원 포함)), APOE (아포지단백질 E), LEP (렙틴), MTHFR (5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 (NADPH)), APOA1 (아포지단백질 A-I), EDN1 (엔도텔린 1), NPPB (나트륨뇨설 펩티드 전구체 B), NOS3 (산화질소 신타제 3 (내피 세포)), PPARG (퍼옥시솜 증식인자-활성화 수용체 감마), PLAT (플라스미노겐 활성인자, 조직), PTGS2 (프로스타글란틴-엔도퍼옥시다제 신타제 2 (프로스타글란틴 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제)), CETP (콜레스테릴 에스테르 전달 단백질, 혈장), AGTR1 (안지오텐신 II 수용체, 1형), HMGCR (3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A 리덕타제), IGF1 (인슐린-유사 성장 인자 1 (소마토메딘 C)), SELE (셀렉틴 E), REN (레닌), PPARA (퍼옥시솜 증식인자-활성화 수용체 알파), PON1 (파라옥소나제 1), KNG1 (키니노겐 1), CCL2 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2), LPL (지단백질 리파제), VWF (폰 빌레브란트 인자), F2 (응고 인자 II (트롬빈)), ICAM1 (세포내 부착 분자 1), TGFB1 (형질전환 성장 인자, 베타 1), NPPA (나트륨뇨설 펩티드 전구체 A), IL10 (인터루킨 10), EPO (에리쓰로포이어틴), SOD1 (수퍼옥시드 디스뮤타제 1, 가용성), VCAM1 (혈관 세포 부착 분자 1), IFNG (인터페론, 감마), LPA (지단백질, Lp(a)), MPO (미엘로퍼옥시다제), ESR1 (에스트로겐 수용체 1), MAPK1 (미토겐-활성화 단백질 키나제 1), HP (하프토글로빈), F3 (응고 인자 III (트롬보플라스틴, 조직 인자)), CST3 (시스타틴 C), COG2 (올리고머 골지 복합체의 성분 2), MMP9 (매트릭스 메탈로펩티다제 9 (젤라티나제 B, 92 kDa 젤라티나제, 92 kDa IV형 콜라게나제)), SERPINC1 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 C (항트롬빈), 멤버 1), F8 (응고 인자 VIII, 응혈촉진 성분), HMOX1 (헴 옥시게나제 (디사이클링) 1), APOC3 (아포지단백질 C-III), IL8 (인터루킨 8), PROK1 (프로키네티신 1), CBS (시스타티오닌-베타-신타제), NOS2 (산화질소 신타제 2, 유도성), TLR4 (toll-유사 수용체 4), SELP (셀렉틴 P (과립 막단백질 140 kDa, 항원 CD62)), ABCA1 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 A (ABC1), 멤버 1), AGT (안지오텐시노겐 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 A, 멤버 8)), LDLR (저밀도 지단백질 수용체), GPT (글루탐산-피루베이트 트랜사미나제 (알라닌 아미노트랜스퍼라제)), VEGFA (혈관 내피 성장 인자 A), NR3C2 (핵 수용체 서브패밀리 3, 그룹 C, 멤버 2), IL18 (인터루킨 18 (인터페론-감마-유도 인자)), NOS1 (산화질소 신타제 1 (신경원)), NR3C1 (핵 수용체 서브패밀리 3, 그룹 C, 멤버 1 (글루코코르티코이드 수용체)), FGB (피브리노겐 베타 사슬), HGF (간세포 성장 인자 (헤파포이어틴 A; 산란 인자)), IL1A (인터루킨 1, 알파), RETN (레시스틴), AKT1 (v-akt 쥐과 흉선종 바이러스 종양유전자 상동체 1), LIPC (리파제, 간), HSPD1 (열충격 60 kDa 단백질 1 (샤페로닌)), MAPK14 (미토겐-활성화 단백질 키나제 14), SPP1 (분비형 인단백질 1), ITGB3 (인테그린, 베타 3 (혈소판 당단백질 111a, 항원 CD61)), CAT (카탈라제), UTS2 (우로텐신 2), THBD (트롬보모듈린), F10 (응고 인자 X), CP (세룰로플라스민 (페록시다제)), TNFRSF11B (종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 11b), EDNRA (엔도텔린 수용체 A형), EGFR (상피 성장 인자 수용체 (적아세포 백혈병 바이러스 (v-erb-b) 종양 유전자 상동체, 조류)), MMP2 (매트릭스 메탈로펩티다제 2 (젤라티나제 A, 72 kDa 젤라티나제, 72 kDa IV형 콜라게나제)), PLG (플라스미노겐), NPY (뉴로펩티드 Y), RHOD (ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 D), MAPK8 (미토겐-활성화 단백질 키나제 8), MYC (v-myc 골수구종증 바이러스 종양유전자 상동체 (조류)), FN1 (피브로넥틴 1), CMA1 (카이마제 1, 비만 세포), PLAU (플라스미노겐 활성인자, 우로키나제), GNB3 (구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질), 베타 폴리펩티드 3), ADRB2 (아드레날린성, 베타-2-, 수용체, 표면), APOA5 (아포지단백질 A-V), SOD2 (수퍼옥시드 디스뮤타제 2, 미토콘드리아), F5 (응고 인자 V (프로악세렐린, 불안정 인자)), VDR (비타민 D (1,25-디히드록시비타민 D3) 수용체), ALOX5 (아라키도네이트 5-리폭시게나제), HLA-DRB1 (주요 조직적합성 복합체, 클래스 II, DR 베타 1), PARP1 (폴리 (ADP-리보스) 중합효소 1), CD40LG (CD40 리간드), PON2 (파라옥소나제 2), AGER (진행성 글리코실화 최종 산물-특이적 수용체), IRS1 (인슐린 수용체 기질 1), PTGS1 (프로스타글란틴-엔도퍼옥시다제 신타제 1 (프로스타글란틴 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제)), ECE1 (엔도텔린 전환 효소 1), F7 (응고 인자 VII (혈청 프로트롬비니 전환 가속인자)), URN (인터루킨 1 수용체 길항제), EPHX2 (에폭시드 히드롤라제 2, 세포질), IGFBP1 (인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 1), MAPK10 (미토겐-활성화 단백질 키나제 10), FAS (Fas (TNF 수용체 수퍼패밀리, 멤버 6)), ABCB1 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 B (MDR/TAP), 멤버 1), JUN (jun 종양 유전자), IGFBP3 (인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3), CD14 (CD14 분자), PDE5A (포스포디에스터라제 5A, cGMP-특이적), AGTR2 (안지오텐신 II 수용체, 2형), CD40 (CD40 분자, TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 5), LCAT (레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제), CCR5 (케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5), MMP1 (매트릭스 메탈로펩티다제 1 (간질 콜라게나제)), TIMP1 (TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1), ADM (아드레노메둘린), DYT10 (근긴장이상 10), STAT3 (신호 전달인자 및 전사 활성인자 3 (급성기 반응 인자)), MMP3 (매트릭스 메탈로펩티다제 3 (스트로멜리신 1, 프로젤라티나제)), ELN (엘라스틴), USF1 (상류 전사 인자 1), CFH (보체 인자 H), HSPA4 (열충격 70 kDa 단백질 4), MMP12 (매트릭스 메탈로펩티다제 12 (마크로파지 엘라스타제)), MME (막 메탈로엔도펩티다제), F2R (응고 인자 II (트롬빈) 수용체), SELL (셀렉틴 L), CTSB (카텝신 B), ANXA5 (아넥신 A5), ADRB1 (아드레날린성, 베타-1-, 수용체), CYBA (시토크롬 b-245, 알파 폴리펩티드), FGA (피브리노겐 알파 사슬), GGT1 (감마-글루타미트랜스퍼라제 1), LIPG (리파제, 상피), HIF1A (저산소증 유도성 인자 1, 알파 서브유닛 (염기성 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자)), CXCR4 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 4), PROC (단백질 C (응고 인자 Va 및 VIIIa의 불활성인자)), SCARB1 (스캐빈저 수용체 클래스 B, 멤버 1), CD79A (CD79a 분자, 면역글로불린-연관 알파), PLTP (인지질 전달 단백질), ADD1 (아두신 1 (알파)), FGG (피브리노겐 감마 사슬), SAA1 (혈청 아밀로이드 A1), KCNH2 (포타슘 전압-게이팅 채널, 서브패밀리 H (eag-관련), 멤버 2), DPP4 (디펩티딜-펩티다제 4), G6PD (글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제), NPR1 (나트륨뇨설 펩티드 수용체 A/구아닐레이트 시클라제 A (심방나트륨이뇨 펩티드 수용체 A)), VTN (비트로넥틴), KIAA0101 (KIAA0101), FOS (FBJ 쥐과 골육종 바이러스 종양유전자 상동체), TLR2 (toll-유사 수용체 2), PPIG (펩티딜프롤릴 이소머라제 G (사이클로필린 G)), IL1R1 (인터루킨 1 수용체, I형), AR (안드로겐 수용체), CYP1A1 (시토크롬 P450, 패밀리 1, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 1), SERPINA1 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 A (알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신), 멤버 1), MTR (5-메틸테트라히드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제), RBP4 (레티놀 결합 단백질 4, 혈장), APOA4 (아포지단백질 A-IV), CDKN2A (사이클린-의존적 키나제 억제제 2A (골수종, p16, 억제 CDK4)), FGF2 (섬유아세포 성장 인자 2 (염기성)), EDNRB (엔도텔린 수용체 B형), ITGA2 (인테그린, 알파 2 (CD49B, 알파 2 서브유닛 of VLA-2 수용체)), CABIN1 (칼시뉼린 결합 단백질 1), SHBG (성 호르몬-결합 globulin), HMGB1 (고-이동성 그룹 박스 1), HSP90B2P (열충격 단백질 90 kDa 베타 (Grp94), 멤버 2 (가유전자)), CYP3A4 (시토크롬 P450, 패밀리 3, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 4), GJA1 (간극 연접 단백질, 알파 1, 43 kDa), CAV1 (카베올린 1, 카베올라 단백질, 22 kDa), ESR2 (에스트로겐 수용체 2 (ER 베타)), LTA (림포톡신 알파 (TNF 수퍼패밀리, 멤버 1)), GDF15 (성장 분화 인자 15), BDNF (뇌-유래 신경영양 인자), CYP2D6 (시토크롬 P450, 패밀리 2, 서브패밀리 D, 폴리펩티드 6), NGF (신경 성장 인자 (베타 폴리펩티드)), SP1 (Sp1 전사 인자), TGIF1 (TGFB-유도 인자 호메오박스 1), SRC (v-src 육종 (슈미트-루핀 A-2) 바이러스 종양유전자 상동체 (조류)), EGF (상피 성장 인자 (베타-우로가스트론)), PIK3CG (포스포이노시티드-3-키나제, 촉매성, 감마 폴리펩티드), HLA-A (주요 조직적합성 복합체, 클래스 I, A), KCNQ1 (포타슘 전압-게이팅 채널, KQT-유사 서브패밀리, 멤버 1), CNR1 (칸나비노이드 수용체 1 (뇌)), FBN1 (피브릴린 1), CHKA (콜린 키나제 알파), BEST1 (베스트로핀 1), APP (아밀로이드 베타 (A4) 전구체 단백질), CTNNB1 (카테닌 (카데린-연관 단백질), 베타 1, 88 kDa), IL2 (인터루킨 2), CD36 (CD36 분자 (트롬보스폰딘 수용체)), PRKAB1 (단백질 키나제, AMP-활성화, 베타 1 비촉매 서브유닛), TPO (갑상선 퍼옥시다제), ALDH7A1 (알데히드 디히드로게나제 7 패밀리, 멤버 A1), CX3CR1 (케모카인 (C-X3-C 모티프) 수용체 1), TH (티로신 히드롤라제), F9 (응고 인자 IX), GH1 (성장 호르몬 1), TF (트랜스페린), HFE (혈색소증), IL17A (인터루킨 17A), PTEN (포스파타제 및 텐신 상동체), GSTM1 (글루타티온 S-트랜스퍼라제 mu 1), DMD (디스트로핀), GATA4 (GATA 결합 단백질 4), F13A1 (응고 인자 XIII, A1 폴리펩티드), TTR (트랜스타이레틴), FABP4 (지방산 결합 단백질 4, 지방세포), PON3 (파라옥소나제 3), APOC1 (아포지단백질 C-I), INSR (인슐린 수용체), TNFRSF1B (종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 1B), HTR2A (5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 2A), CSF3 (콜로니 자극 인자 3 (과립구)), CYP2C9 (시토크롬 P450, 패밀리 2, 서브패밀리 C, 폴리펩티드 9), TXN (티오레독신), CYP11B2 (시토크롬 P450, 패밀리 11, 서브패밀리 B, 폴리펩티드 2), PTH (부갑상선 호르몬), CSF2 (콜로니 자극 인자 2 (과립구-마크로파지)), KDR (키나제 삽입 도메인 수용체 (III형 수용체 티로신 키나제)), PLA2G2A (포스포리파제 A2, 그룹 IIA (혈소판, 활액)), B2M (베타-2-마이크로글로불린), THBS1 (트롬보스폰딘 1), GCG (글루카곤), RHOA (ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 A), ALDH2 (알데히드 디히드로게나제 2 패밀리 (미토콘드리아)), TCF7L2 (전사 인자 7-유사 2 (T-세포 특이적, HMG-박스)), BDKRB2 (브라디키닌 수용체 B2), NFE2L2 (핵 인자 (적혈구-유래 2)-유사 2), NOTCH1 (Notch 상동체 1, 전좌연관 (초파리)), UGT1A1 (UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1 패밀리, 폴리펩티드 A1), IFNA1 (인터페론, 알파 1), PPARD (퍼옥시솜 증식인자-활성화 수용체 델타), SIRT1 (실투인 (침묵 교잡 유형 정보 조절 2 상동체) 1 (에스. 세레비지아에)), GNRH1 (고나도트로핀-방출 호르몬 1 (황체-방출 호르몬)), PAPPA (임신-연관 혈장 단백질 A, 파파리신 1), ARR3 (어레스틴 3, 망막 (X-어레스틴)), NPPC (나트륨뇨설 펩티드 전구체 C), AHSP (알파 헤모글로빈 안정화 단백질), PTK2 (PTK2 단백질 티로신 키나제 2), IL13 (인터루킨 13), MTOR (라파마이신의 기계론적 표적 (세린/트레오닌 키나제)), ITGB2 (인테그린, 베타 2 (보체 성분 3 수용체 3 및 4 서브유닛)), GSTT1 (글루타티온 S-트랜스퍼라제 쎄타 1), IL6ST (인터루킨 6 신호 전달인자 (gp130, 온코스타틴 M 수용체)), CPB2 (카르복시 펩티다제 B2 (혈장)), CYP1A2 (시토크롬 P450, 패밀리 1, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 2), HNF4A (간세포 핵 인자 4, 알파), SLC6A4 (용질 운반체 패밀리 6 (신경전달인자 수송체, 세로토닌), 멤버 4), PLA2G6 (포스포리파제 A2, 그룹 VI (시토졸, 칼슘-독립적)), TNFSF11 (종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리, 멤버 11), SLC8A1 (용질 운반체 패밀리 8 (소듐/칼슘 교환체), 멤버 1), F2RL1 (응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 1), AKR1A1 (알도-케토 리덕타제 패밀리 1, 멤버 A1 (알데히드 리덕타제)), ALDH9A1 (알데히드 디히드로게나제 9 패밀리, 멤버 A1), BGLAP (뼈 감마-카르복시글루타메이트 (gla) 단백질), MTTP (마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질), MTRR (5-메틸테트라히드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 리덕타제), SULT1A3 (슬포트랜스퍼라제 패밀리, 시토졸, 1A, 페놀-선호, 멤버 3), RAGE (신장 종양 항원), C4B (보체 성분 4B (키도 혈액군), P2RY12 (푸린성 수용체 P2Y, G-단백질 커플링, 12), RNLS (레날라제, FAD-의존적 아민 옥시다제), CREB1 (cAMP 반응성 엘리먼트 결합 단백질 1), POMC (프로오피오멜라노코르틴), RAC1 (ras-관련 C3 보툴리늄 독소 기질 1 (rho 패밀리, 소형 GTP 결합 단백질 Rac1)), LMNA (라민 NC), CD59 (CD59 분자, 보체 조절 단백질), SCN5A (소듐 채널, 전압-게이팅, V형, 알파 서브유닛), CYP1B1 (시토크롬 P450, 패밀리 1, 서브패밀리 B, 폴리펩티드 1), MIF (마크로파지 이동 억제성 인자 (글리코실화-억제 인자)), MMP13 (매트릭스 메탈로펩티다제 13 (콜라게나제 3)), TIMP2 (TIMP 메탈로펩티다제 억제제 2), CYP19A1 (시토크롬 P450, 패밀리 19, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 1), CYP21A2 (시토크롬 P450, 패밀리 21, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 2), PTPN22 (단백질 티로신 포스파타제, 비수용체 유형 22 (림프구)), MYH14 (미오신, 중쇄 14, 비근육), MBL2 (만노스-결합 렉틴 (단백질 C) 2, 가용성 (옵소닉 결함)), SELPLG (셀렉틴 P 리간드), AOC3 (아민 옥시다제, 구리 함유 3 (혈관 부착 단백질 1)), CTSL1 (카텝신 L1), PCNA (증식 세포 핵 항원), IGF2 (인슐린-유사 성장 인자 2 (소마토메딘 A)), ITGB1 (인테그린, 베타 1 (피브로넥틴 수용체, 베타 폴리펩티드, 항원 CD29는 MDF2, MSK12 포함)), CAST (칼파스타틴), CXCL12 (케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (기질 세포-유래 인자 1)), IGHE (면역글로불린 중쇄 불변 엡실론), KCNE1 (포타슘 전압-게이팅 채널, Isk-관련 패밀리, 멤버 1), TFRC (트랜스페린 수용체 (p90, CD71)), COL1A1 (콜라겐, I형, 알파 1), COL1A2 (콜라겐, I형, 알파 2), IL2RB (인터루킨 2 수용체, 베타), PLA2G10 (포스포리파제 A2, 그룹 X), ANGPT2 (안지오포이어틴 2), PROCR (단백질 C 수용체, 상피 (EPCR)), NOX4 (NADPH 옥시다제 4), HAMP (헵시디니 항미생물성 펩티드), PTPN11 (단백질 티로신 포스파타제, 비수용체 유형 11), SLC2A1 (용질 운반체 패밀리 2 (촉진성 글루코스 수송체), 멤버 1), IL2RA (인터루킨 2 수용체, 알파), CCL5 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5), IRF1 (인터페론 조절 인자 1), CFLAR (CASP8 및 FADD-유사 아폽토시스 조절제), CALCA (칼시토닌-관련 폴리펩티드 알파), EIF4E (진핵생물 번역 개시 인자 4E), GSTP1 (글루타티온 S-트랜스퍼라제 pi 1), JAK2 (Janus 키나제 2), CYP3A5 (시토크롬 P450, 패밀리 3, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 5), HSPG2 (헤파란 술페이트 프로테오글리칸 2), CCL3 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3), MYD88 (골수 분화 1차 반응 유전자 (88)), VIP (혈관작용성 장 펩티드), SOAT1 (스테롤 O-아실트랜스퍼라제 1), ADRBK1 (아드레날린성, 베타, 수용체 키나제 1), NR4A2 (핵 수용체 서브패밀리 4, 그룹 A, 멤버 2), MMP8 (매트릭스 메탈로펩티다제 8 (호중구 콜라게나제)), NPR2 (나트륨뇨설 펩티드 수용체 B/구아닐레이트 시클라제 B (심방나트륨이뇨 펩티드 수용체 B)), GCH1 (GTP 시클로히드롤라제 1), EPRS (글루타밀-프롤릴-tRNA 신써타제), PPARGC1A (퍼옥시솜 증식인자-활성화 수용체 감마, 공활성인자 1 알파), F12 (응고 인자 XII (하게만 인자)), PECAM1 (혈소판/내피 세포 부착 분자), CCL4 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 4), SERPINA3 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 A (알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신), 멤버 3), CASR (칼슘-감지 수용체), GJA5 (간극 연접 단백질, 알파 5, 40 kDa), FABP2 (지방산 결합 단백질 2, 장), TTF2 (전사 종결 인자, RNA 중합효소 II), PROS1 (단백질 S (알파)), CTF1 (카디오트로핀 1), SGCB (사르코글리칸, 베타 (43 kDa 디스트로핀-연관 당단백질)), YME1L1 (YME1-유사 1 (에스. 세레비지아에)), CAMP (카텔리시딘 항미생물성 펩티드), ZC3H12A (아연 핑거 CCCH-유형 함유 12A), AKR1B1 (알도-케토 리덕타제 패밀리 1, 멤버 B1 (알도스 리덕타제)), DES (데스민), MMP7 (매트릭스 메탈로펩티다제 7 (마트릴리신, 자궁)), AHR (아릴 탄화수소 수용체), CSF1 (콜로니 자극 인자 1 (마크로파지)), HDAC9 (히스톤 디아세틸라제 9), CTGF (결합 조직 성장 인자), KCNMA1 (포타슘 거대 컨덕턴스 칼슘-활성화 채널, 서브패밀리 M, 알파 멤버 1), UGT1A (UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1 패밀리, 폴리펩티드 A 복합 유전자좌), PRKCA (단백질 키나제 C, 알파), COMT (카테콜-.베타.-메틸트랜스퍼라제), S100B (S100 칼슘 결합 단백질 B), EGR1 (초기 성장 반응 1), PRL (프로락틴), IL15 (인터루킨 15), DRD4 (도파민 수용체 D4), CAMK2G (칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II 감마), SLC22A2 (용질 운반체 패밀리 22 (유기 양이온 수송체), 멤버 2), CCL11 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11), PGF (B321 태반 성장 인자), THPO (트롬보포이어틴), GP6 (당단백질 VI (혈소판)), TACR1 (타카이키닌 수용체 1), NTS (뉴로텐신), HNF1A (HNF1 호메오박스 A), SST (소마토스타틴), KCND1 (포타슘 전압-게이팅 채널, Shal-관련 서브패밀리, 멤버 1), LOC646627 (포스포리파제 억제제), TBXAS1 (트롬복산 A 신타제 1 (혈소판)), CYP2J2 (시토크롬 P450, 패밀리 2, 서브패밀리 J, 폴리펩티드 2), TBXA2R (트롬복산 A2 수용체), ADH1C (알콜 디히드로게나제 1C (클래스 I), 감마 폴리펩티드), ALOX12 (아라키도네이트 12-리폭시게나제), AHSG (알파-2-HS-당단백질), BHMT (베타인-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제), GJA4 (간극 연접 단백질, 알파 4, 37 kDa), SLC25A4 (용질 운반체 패밀리 25 (미토콘드리아 캐리어; 아데닌 뉴클레오티드 운반체), 멤버 4), ACLY (ATP 시트레이트 리아제), ALOX5AP (아라키도네이트 5-리폭시게나제-활성화 단백질), NUMA1 (핵 유사분열 장비 단백질 1), CYP27B1 (시토크롬 P450, 패밀리 27, 서브패밀리 B, 폴리펩티드 1), CYSLTR2 (시스테이닐 류코트리엔 수용체 2), SOD3 (수퍼옥시드 디스뮤타제 3, 세포외), LTC4S (류코트리엔 C4 신타제), UCN (우로코르틴), GHRL (그렐린/오베스타틴 프리프로펩티드), APOC2 (아포지단백질 C-II), CLEC4A (C-type 렉틴 도메인 패밀리 4, 멤버 A), KBTBD10 (kelch 반복 및 BTB (POZ) 도메인 함유 10), TNC (테나신 C), TYMS (티미딜레이트 신써타제), SHCl (SHC (Src 상동성 2 도메인 함유) 형질전환 단백질 1), LRP1 (저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1), SOCS3 (사이토카인 신호전달의 억제인자 3), ADH1B (알콜 디히드로게나제 1B (클래스 I), 베타 폴리펩티드), KLK3 (칼리크레인-관련 펩티다제 3), HSD11B1 (히드록시스테로이드 (11-베타) 디히드로게나제 1), VKORC1 (비타민 K 에폭시드 리덕타제 복합체, 서브유닛 1), SERPINB2 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 B (오발부민), 멤버 2), TNS1 (텐신 1), RNF19A (링 핑거 단백질 19A), EPOR (에리쓰로포이어틴 수용체), ITGAM (인테그린, 알파 M (보체 성분 3 수용체 3 서브유닛)), PITX2 (쌍형성-유사 호메오도메인 2), MAPK7 (미토겐-활성화 단백질 키나제 7), FCGR3A (IgG의 Fc 단편, 저친화성 111a, 수용체 (CD16a)), LEPR (렙틴 수용체), ENG (엔도글린), GPX1 (글루타티온 퍼옥시다제 1), GOT2 (글루타믹-옥살로아세틱 트랜스아미나제 2, 미토콘드리아 (아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 2)), HRH1 (히스타민 수용체 H1), NR112 (핵 수용체 서브패밀리 1, 그룹 I, 멤버 2), CRH (코르티코트로핀 방출 호르몬), HTR1A (5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 1A), VDAC1 (전압-의존적 음이온 채널 1), HPSE (헤파라나제), SFTPD (계면활성제 단백질 D), TAP2 (수송체 2, ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 B (MDR/TAP)), RNF123 (링 핑거 단백질 123), PTK2B (PTK2B 단백질 티로신 키나제 2 베타), NTRK2 (신경영양성 티로신 키나제, 수용체, 2형), IL6R (인터루킨 6 수용체), ACHE (아세틸콜린스테라제 (Yt 혈액군)), GLP1R (글루카곤-유사 펩티드 1 수용체), GHR (성장 호르몬 수용체), GSR (글루타티온 리덕타제), NQO1 (NAD(P)H 디히드로게나제, 퀴논 1), NR5A1 (핵 수용체 서브패밀리 5, 그룹 A, 멤버 1), GJB2 (간극 연접 단백질, 베타 2, 26 kDa), SLC9A1 (용질 운반체 패밀리 9 (소듐/수소 교환체), 멤버 1), MAOA (모노아민 옥시다제 A), PCSK9 (프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 9형), FCGR2A (IgG의 Fc 단편, 저친화성 IIa, 수용체 (CD32)), SERPINF1 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 F (알파-2 안티플라스민, 피그먼트 상피 유래 인자), 멤버 1), EDN3 (엔도텔린 3), DHFR (디히드로폴레이트 리덕타제), GAS6 (성장 정지-특이적 6), SMPD1 (스핀고미엘린 포스포디에스터라제 1, 산 리소솜), UCP2 (언커플링 단백질 2 (미토콘드리아, 양자 캐리어)), TFAP2A (전사 인자 AP-2 알파 (활성화 인핸서 결합 단백질 2 알파)), C4BPA (보체 성분 4 결합 단백질, 알파), SERPINF2 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 F (알파-2 안티플라스민, 피그먼트 상피 유래 인자), 멤버 2), TYMP (티미딘 포스포릴라제), ALPP (알칼리 포스파타제, 태반 (Regan 이소자임)), CXCR2 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 2), SLC39A3 (용질 운반체 패밀리 39 (아연 수송체), 멤버 3), ABCG2 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 G (WHITE), 멤버 2), ADA (아데노신 디아미나제), JAK3 (Janus 키나제 3), HSPA1A (열충격 70 kDa 단백질 1A), FASN (지방산 신타제), FGF1 (섬유아세포 성장 인자 1 (산성)), F11 (응고 인자 XI), ATP7A (ATPase, Cu++ 수송, 알파 폴리펩티드), CR1 (보체 성분 (3b/4b) 수용체 1 (Knops 혈액군)), GFAP (신경교 섬유질 산성 단백질), ROCK1 (Rho-연관, 코일드-코일 함유 단백질 키나제 1), MECP2 (메틸 CpG 결합 단백질 2 (레트 증후군)), MYLK (미오신 경쇄 키나제), BCHE (부티릴콜린스테라제), LIPE (리파제, 호르몬-감응성), PRDX5 (퍼옥시리독신 5), ADORA1 (아데노신 A1 수용체), WRN (베르너 증후군, RecQ 헬리카제-유사), CXCR3 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3), CD81 (CD81 분자), SMAD7 (SMAD 패밀리 멤버 7), LAMC2 (라미닌, 감마 2), MAP3K5 (미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 키나제 5), CHGA (크로모그라닌 A (부갑상선 분비 단백질 1)), IAPP (섬 아밀로이드 폴리펩티드), RHO (로돕신), ENPP1 (엑토뉴클레오티드 파이로포스파타제/포스포디에스터라제 1), PTHLH (부갑상선 호르몬-유사 호르몬), NRG1 (뉴레굴린 1), VEGFC (혈관 내피 성장 인자 C), ENPEP (글루타밀 아미노펩티다제 (아미노펩티다제 A)), CEBPB (CCAAT/인핸서 결합 단백질 (C/EBP), 베타), NAGLU (N-아세틸글루코사미니다제, 알파-), F2RL3 (응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 3), CX3CL1 (케모카인 (C-X3-C 모티프) 리간드 1), BDKRB1 (브라디키닌 수용체 B1), ADAMTS13 (트롬보스폰딘 1형 모티프 존재의 ADAM 메탈로펩티다제, 13), ELANE (엘라스타제, 호중구 발현), ENPP2 (엑토뉴클레오티드 파이로포스파타제/포스포디에스터라제 2), CISH (사이토카인 유도성 SH2-함유 단백질), GAST (가스트린), MYOC (미오실린, 섬유주대 유도성 글루코코르티코이드 반응), ATP1A2 (ATPase, Na+/K+ 수송, 알파 2 폴리펩티드), NF1 (뉴로피브로민 1), GJB1 (간극 연접 단백질, 베타 1, 32 kDa), MEF2A (근세포 인핸서 인자 2A), VCL (빈큘린), BMPR2 (뼈 형태형성성 단백질 수용체, II형 (세린/트레오닌 키나제)), TUBB (튜불린, 베타), CDC42 (세포 분열 주기 42 (GTP 결합 단백질, 25 kDa)), KRT18 (케라틴 18), HSF1 (열충격 전사 인자 1), MYB (v-myb 골수아구증 바이러스 종양유전자 상동체 (조류)), PRKAA2 (단백질 키나제, AMP-활성화, 알파 2 촉매 서브유닛), ROCK2 (Rho-연관, 코일드-코일 함유 단백질 키나제 2), TFPI (조직 인자 경로 억제제 (지단백질-연관 응고 억제제)), PRKG1 (단백질 키나제, cGMP-의존성, I형), BMP2 (뼈 형태형성성 단백질 2), CTNND1 (카테닌 (카데린-연관 단백질), 델타 1), CTH (시스타티오나제 (시스타티오닌 감마-리아제)), CTSS (카텝신 S), VAV2 (vav 2 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자), NPY2R (뉴로펩티드 Y 수용체 Y2), IGFBP2 (인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2, 36 kDa), CD28 (CD28 분자), GSTA1 (글루타티온 S-트랜스퍼라제 알파 1), PPIA (펩티딜프롤릴 이소머라제 A (사이클로필린 A)), APOH (아포지단백질 H (베타-2-당단백질 I)), S100A8 (S100 칼슘 결합 단백질 A8), IL11 (인터루킨 11), ALOX15 (아라키도네이트 15-리폭시게나제), FBLN1 (피불린 1), NR1H3 (핵 수용체 서브패밀리 1, 그룹 H, 멤버 3), SCD (스테아로일-CoA 데사투라제 (델타-9-데사투라제)), GIP (위 억제성 폴리펩티드), CHGB (크로모그라닌 B (세크레토그라닌 1)), PRKCB (단백질 키나제 C, 베타), SRD5A1 (스테로이드-5-알파-리덕타제, 알파 폴리펩티드 1 (3-옥소-5 알파-스테로이드 델타 4-디히드로게나제 알파 1)), HSD11B2 (히드록시스테로이드 (11-베타) 디히드로게나제 2), CALCRL (칼시토닌 수용체-유사), GALNT2 (UDP-N-아세틸-알파-D-갈락토사민:폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제 2 (GalNAc-T2)), ANGPTL4 (안지오포이어틴-유사 4), KCNN4 (포타슘 중간체/소형 컨덕턴스 칼슘-활성화된 채널, 서브패밀리 N, 멤버 4), PIK3C2A (포스포이노시티드-3-키나제, 클래스 2, 알파 폴리펩티드), HBEGF (헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자), CYP7A1 (시토크롬 P450, 패밀리 7, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 1), HLA-DRB5 (주요 조직적합성 복합체, 클래스 II, DR 베타 5), BNIP3 (BCL2/아데노바이러스 E1B 19 kDa 상호작용 단백질 3), GCKR (글루코키나제 (헥소키나제 4) 조절제), S100A12 (S100 칼슘 결합 단백질 A12), PADI4 (펩티딜 아르기닌 디이미나제, IV형), HSPA14 (열충격 70 kDa 단백질 14), CXCR1 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 1), H19 (H19, 각인된 모성 발현 전사물 (비-단백질 코딩)), KRTAP19-3 (케라틴 연관 단백질 19-3), IDDM2 (인슐린-의존성 진성 당뇨병 2), RAC2 (ras-관련 C3 보툴리늄 독소 기질 2 (rho 패밀리, 소형 GTP 결합 단백질 Rac2)), RYR1 (리아노딘 수용체 1 (골격)), 시계 (시계 상동체 (마우스)), NGFR (신경 성장 인자 수용체 (TNFR 수퍼패밀리, 멤버 16)), DBH (도파민 베타-히드롤라제 (도파민 베타-모노옥시게나제)), CHRNA4 (콜린성 수용체, 니코틴성, 알파 4), CACNA1C (칼슘 채널, 전압-의존적, L형, 알파 1C 서브유닛), PRKAG2 (단백질 키나제, AMP-활성화, 감마 2 비촉매 서브유닛), CHAT (콜린 아세틸트랜스퍼라제), PTGDS (프로스타글란틴 D2 신타제 21 kDa (뇌)), NR1H2 (핵 수용체 서브패밀리 1, 그룹 H, 멤버 2), TEK (TEK 티로신 키나제, 상피), VEGFB (혈관 내피 성장 인자 B), MEF2C (근세포 인핸서 인자 2C), MAPKAPK2 (미토겐-활성화 단백질 키나제-활성화 단백질 키나제 2), TNFRSF11A (종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 11a, NFKB 활성인자), HSPA9 (열충격 70 kDa 단백질 9 (몰탈린)), CYSLTR1 (시스테이닐 류코트리엔 수용체 1), MAT1A (메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 I, 알파), OPRL1 (오피에이트 수용체-유사 1), IMPA1 (이노시톨(myo)-1(or 4)-모노포스파타제 1), CLCN2 (클로라이드 채널 2), DLD (디히드로리포아미드 디히드로게나제), PSMA6 (프로테오솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 알파형, 6), PSMB8 (프로테오솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 8 (거대 다기능 펩티다제 7)), CHI3L1 (키티나제 3-유사 1 (연골 당단백질-39)), ALDH1B1 (알데히드 디히드로게나제 1 패밀리, 멤버 B1), PARP2 (폴리 (ADP-리보스) 중합효소 2), STAR (스테로이드성 급성 조절 단백질), LBP (지다당류 결합 단백질), ABCC6 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 C(CFTR/MRP), 멤버 6), RGS2 (G-단백질 신호전달 조절제 2, 24 kDa), EFNB2 (에프린-B2), GJB6 (간극 연접 단백질, 베타 6, 30 kDa), APOA2 (아포지단백질 A-II), AMPD1 (아데노신 모노포스페이트 디아미나제 1), DYSF (디스펠린, 지대형 근이영양증 2B (상염색체 열성)), FDFT1 (파르네실-디포스페이트 파르네실트랜스퍼라제 1), EDN2 (엔도텔린 2), CCR6 (케모카인 (C-C 모티프) 수용체 6), GJB3 (간극 연접 단백질, 베타 3, 31 kDa), IL1RL1 (인터루킨 1 수용체-유사 1), ENTPD1 (엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포히드롤라제 1), BBS4 (프라뎃-비들 증후군 4), CELSR2 (카데린, EGF LAG 7-경로 G-유형 수용체 2 (프라민고 상동체, 초파리)), F11R (F11 수용체), RAPGEF3 (Rap 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF) 3), HYAL1 (히아루로노글루코사미니다제 1), ZNF259 (아연 핑거 단백질 259), ATOX1 (ATX1 항산화제 단백질 1 상동체 (효모)), ATF6 (활성화 전사 인자 6), KHK (케토헥소키나제 (프룩토키나제)), SAT1 (스퍼미딘/스퍼민 N1-아세틸트랜스퍼라제 1), GGH (감마-글루타밀 히드롤라제 (콘쥬가제, 폴릴폴리감마글루타밀 히드롤라제)), TIMP4 (TIMP 메탈로펩티다제 억제제 4), SLC4A4 (용질 운반체 패밀리 4, 소듐 바이카보네이트 공수송체, 멤버 4), PDE2A (포스포디에스터라제 2A, cGMP-자극), PDE3B (포스포디에스터라제 3B, cGMP-억제), FADS1 (지방산 데사투라제 1), FADS2 (지방산 데사투라제 2), TMSB4X (티모신 베타 4, X-linked), TXNIP (티오레독신 상호작용 단백질), LIMS1 (LIM 및 노화 세포 항원-유사 도메인 1), RHOB (ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 B), LY96 (림프구 항원 96), FOXO1 (포크헤드 박스 O1), PNPLA2 (파타틴-유사 포스포리파제 도메인 함유 2), TRH (트로트로핀-방출 호르몬), GJC1 (간극 연접 단백질, 감마 1, 45 kDa), SLC17A5 (용질 운반체 패밀리 17 (음이온/당 수송체), 멤버 5), FTO (지방량 및 비만 연관), GJD2 (간극 연접 단백질, 델타 2, 36 kDa), PSRC1 (프롤린/세린-풍부 코일드-코일 1), CASP12 (캐스파제 12 (유전자-가유전자)), GPBAR1 (G 단백질-커플링 담즙산 수용체 1), PXK (PX 도메인 함유 세린/트레오닌 키나제), IL33 (인터루킨 33), TRIB1 (tribbles 상동체 1 (초파리)), PBX4 (프리-B-세포 백혈병 호메오박스 4), NUPR1 (핵 단백질, 전사 조절제, 1), 15-Sep(15 kDa 셀레노단백질), CILP2 (연골 중간층 단백질 2), TERC (텔로머라제 RNA 성분), GGT2 (감마-글루타미트랜스퍼라제 2), MT-CO1 (미토콘드리아 코딩 시토크롬 c 옥시다제 I), 및 UOX (우레이트 옥시다제, 가유전자). 임의의 이들 서열은 예를 들어 돌연변이를 처리하기 위해서, CRISPR-Cas 시스템에 대한 표적일 수 있다.
추가 구현예에서, 염색체 서열은 Pon1(파라옥소나제 1), LDLR (LDL 수용체), ApoE(아포지방단백질 E), Apo B-100(아포지방단백질 B-100), ApoA (아포지방단백질(a)), ApoA1(아포지방단백질 A1), CBS(시스타티온 B-신타제), 글리코단백질 IIb/IIb, MTHRF(5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원효소(NADPH), 및 이들의 조합으로부터 추가로 선택될 수 있다. 일 반복에서, 심혈관 질환에 연루된 염색체 서열, 및 염색체 서열에 의해 암호화된 단백질은 CRISPR-Cas 시스템에 대한 표적으로서 Cacna1C, Sod1, Pten, Ppar(알파), Apo E, 렙틴, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 상기 기술된 바와 같은 방법과 유사한 시스템에서 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
간 및 신장 질병의 치료
본 발명은 본 명세서에서 설명된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질 시스템을 간 및/또는 신장으로의 전달을 또한 고려한다. 치료적 핵산의 세포 취득을 유도하기 전달 전략은 바이러스-기반, 지질-기반 또는 복합체-기반 전달과 같은 벡터 시스템 또는 물리력, 또는 나노캐리어를 포함한다. 적은 가능성의 임상 관련성을 갖는 초기 적용으로부터, 유체역학적 고압 주사를 이용하여 핵산이 체계적으로 신세포에 어드레스된 경우, 넓은 범위의 유전자 치료적 바이러스 및 비-바이러스 캐리어가 생체 내에서 상이한 동물 신장 질병 모델에서 전사 후 이벤트를 표적하도록 이미 적용된 바 있다 (Csaba Revesz and Peter Hamar (2011). Delivery Methods to Target RNAs in the Kidney, Gene Therapy Applications, Prof. Chunsheng Kang (Ed.), ISBN: 978-953-307-541-9, InTech, Available from: www.intechopen.com/books/gene-therapy-applications/delivery-methods-to-target-rnas-inthe-kidney). 신장으로의 전달 방법은 아라키돈산 대사의 12/15-리폭시게나아제 (12/15-LO) 경로를 표적화하는 작은 간섭 RNA (siRNA)의 생체 내 전달이 제1형 당뇨병의 스트렙토조토신 주사된 당뇨성 신경병증 (DN) 및 신손상을 개선할 수 있는지의 여부를 연구한, 문헌 ([Yuan et al.(Am J Physiol Renal Physiol 295:F605-F617, 2008])에 포함된 것들을 포함할 수 있다. 신장에서 더욱 큰 생체 내 접근 및 siRNA 발현을 달성하기 위하여, Yuan 등은 콜레스테롤과 컨쥬게이트된 이중가닥 12/15-LO siRNA 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 약 400 ㎍의 siRNA를 마우스 내로 피하 주사하였다. Yuang 등의 방법이, 콜레스테롤과 컨쥬게이트된 CRISPR Cas의 1-2g을 신장으로의 전달을 위해 인간으로의 피하 주사를 고려하여 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 적용될 수 있다.
Molitoris 등 (문헌 [J Am Soc Nephrol 20:1754-1764, 2009])은 신장 내에서 올리고뉴클레오티드 재흡수 부위로서, 근위요세관 세포 (PTC)를 이용하여 세포사멸 경로에서 중추적 단백질인, p53으로 표적된 신손상을 방지하기 위한 siRNA의 효능을 시험하였다. 허혈 손상 후 4시간에 정맥주사된 p53으로의 네이키드 합성 siRNA는 PTC 및 신장 작용을 최대로 보호하였다. Molitoris 등의 데이터는 siRNA의 근위요세관 세포로의 신속한 전달이 정맥 투여에 뒤따름을 나타낸다. 용량-반응 분석의 경우, 래트는 동일한 4회 시점에 제공된, siP53, 0.33; 1, 3, 또는 5mg/kg의 용량으로 주사되었고, 각각 1.32; 4, 12, 및 20 mg/kg의 누적 용량을 야기하였다. 시험된 모든 siRNA 용량은 더욱 높은 용량을 이용하여 1일에 SCr 감소 효과를 생산하였으며, PBS-처리된 허혈성 대조구 래트에 비하여 대략 5 일에 걸쳐 유효하였다. 12 및 20 mg/kg 누적 용량은 최고의 보호 효과를 제공하였다. Molitoris 등의 방법은 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 적용될 수 있으며, 이는 신장으로의 전달을 위해 인간에게 12 및 20 mg/kg의 누적 용량을 고려한다.
Thompson 등 (문헌 [Nucleic Acid Therapeutics, Volume 22, Number 4, 2012])은 설치류 및 비인간 영장류에서 정맥 투여에 뒤이은 합성의 작은 간섭 RNA I5NP의 독성학적 및 약물역학적 특성을 보고한다. 15NP는 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 통해 작용하도록 설계되어 세포사멸 전구 단백질인 p53의 발현을 일시적으로 억제시키고, 주요 심장 외과 수술 동안 발생할 수 있는 급성 신장 손상과 같은 급성 허혈/재관류 손상으로부터 세포를 보호하도록 개발되고 있으며, 신장 이식 후에 발생할 수 있는 이식편 작용을 지연시킬 수 있다. 설치류에서 800mg/kg I5NP, 및 비인간 영장류에서 1,000 mg/kg I5NP의 용량은 이상 반응을 유발하는데 필요로 되었는데, 원숭이에서 상보체의 무증상 활성화 및 약간 증가된 응고 시간을 포함하는 혈액에 대한 효과를 지시하도록 단리되었다. 래트에서, I5NP의 래트 유사체를 이용시 관찰된 추가의 부작용은 없었으며, 이는 그 효과가 I5NP의 의도된 약물학적 활성에 관련된 독성이라기보다는 합성 RNA 이중나선의 클래스 효과를 나타내기 쉬움을 표시한다. 이들을 합하여, 이들 데이터는 급성 허혈/재관류 손상 후에 신장 작용의 보존을 위해 I5NP의 정맥 내 투여의 임상 시험을 지지한다. 원숭이에서 이상 반응이 관찰되지 않은 수준(no observed adverse effect level:NOAEL)은 500 mg/kg이었다. 심혈관, 호흡 및 신경학적 파라미터에 대한 효과는, 25 mg/kg 이하의 용량 수준으로 정맥 내 투여 후에 원숭이에서 관찰되지 않았다. 따라서, 인간 신장으로의 CRISPR Cas의 정맥 내 투여에 대해 유사한 용량이 고려될 수 있다.
Shimizu 등 (문헌 [J Am Soc Nephrol 21:622-633, 2010])은 폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(L-리신)-기반 비히클을 통해 siRNA의 신사구체로의 전달을 표적화하는 시스템을 개발하였다. siRNA/나노캐리어 복합체는, 유창 내피를 지나 이동하여 메산지움(mesangium)으로의 그의 접근을 가능하게 할 수 있는 크기인, 대략적으로 직경 10 내지 20 nm였다. 형광-표지된 siRNA/나노캐리어 복합체의 복강내 주사 후, Shimizu 등은 연장된 기간 동안 혈액 순환 내 siRNA를 검출하였다. 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 1 (MAPK1) siRNA/나노캐리어 복합체의 반복된 복강내 투여는 사구체 신염의 마우스 모델에서 사구체 MAPK1 mRNA 및 단백질 발현을 저해하였다. siRNA 축적의 연구를 위해, PIC 나노캐리어와 복합체화된 Cy5-표지된 siRNA (0.5 ml, 5 nmol의 siRNA 함량), 네이키드 Cy5-표지된 siRNA (0.5 ml, 5 nmol), 또는 HVJ-E 내에 캡슐화된 Cy5-표지된 siRNA (0.5 ml, 5 nmol의 siRNA 함량)를 BALBc 마우스들에게 투여하였다. Shimizu 등의 방법은 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 적용될 수 있으며, 이는 인간으로의 복강내 투여 및 신장으로의 전달을 위해 약 1-2 리터 내에서 나노캐리어와 복합체화된 CRISPR Cas의 약 10-20 μmol 도스를 고려한다.
당업자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 C2c1-CRISPR 시스템으로 Shimizu 등, Thompson 등, 및 Molitoris 등에서 기술된 바와 같은 방법과 함께 본 명세서에 개시된 방법을 사용할 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
신장에 대한 전달 방법은 하기와 같이 요약된다:
Figure pct00053
Figure pct00054
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간 또는 간 세포 표적화
간 세포의 표적화를 제공한다. 이것은 시험관내일 수 있거나 또는 생체내일 수 있다. 간세포가 바람직하다. 본 명세서의 CRISPR 단백질, 예컨대 C2c1의 전달은 바이러스 벡터, 특히 AAV (특히 AAV2/6) 벡터를 통할 수 있다. 이들은 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.
시험관이거나 또는 생체내이건 무관하게, 간에 대한 바람직한 표적은 알부민 유전자이다. 이것은 알부민이 매우 높은 수준으로 발현되므로 소위 '세이프 하버 (safe harbor)' 라고 하며 그래서 성공적인 유전자 편집 후 알부민 생산의 감소는 견딜만 하다. 간세포의 오직 소분획이 편집되더라도 알부민 프로모터/인핸서로부터 확인되는 높은 수준의 발현은 유용한 수준의 교정 또는 이식유전자 생산 (삽입된 도너 주형으로부터)이 획득되게 하므로 또한 바람직하다.
알부민의 인트론 1은 적합한 표적 부위인 것으로 Wechsler 등 (reported at the 57th Annual Meeting and Exposition of the American Society of Hematology - abstract available online at ash.confex.com/ash/2015/webprogram/Paper86495.html and presented on 6th December 2015)에 의해 확인되었다. 그들 작업은 이러한 표적 부위에서 DNA를 절단하기 위해 Zn 핑거를 사용하였고, 적합한 가이드 서열은 CRISPR 단백질에 의해 동일 부위에서 가이드 절단으로 생성될 수 있다.
알부민같은 고도로 발현된 유전자 (고도로 활성인 인핸서/프로모터를 갖는 유전자) 내 표적의 사용은 또는 Wechsler 등이 보고한 바와 같이, 프로모터 무함유 도너 주형을 사용할 수 있게 하고, 또한 이것은 간 표적화 밖에서 광범위하게 적용가능하다. 고도로 발현된 유전자의 다른 예가 공지되어 있다.
간의 다른 질환
특정 구현예에서, 본 발명의 CRISPR 단백질은 간 장애 예컨대 트랜스타이레틴 아밀로이드증 (ATTR), 알파-1-안티트립신 결핍증, 및 다른 간-기반 선천성 대사 오류의 치료에서 사용된다. FAP는 트랜스타이레틴 (TTR)을 코딩하는 유전자의 돌연변이로 인해 초래된다. 상염색체 우성 질환이지만, 모든 캐리어가 질환을 발생시키지 않는다. TTR 유전자 내 100개가 넘는 돌연변이가 질환과 연관된 것으로 알려져 있다. 공통 돌연변이의 예는 V30M을 포함한다. 유전자 침묵화를 기반으로 하는 TTR의 치료 원리는 iRNA를 사용한 연구로 입증되었다 (Ueda et al. 2014 Transl Neurogener. 3:19). 윌슨병 (WD)은 오로지 간세포에서 발견되는 ATP7B를 코딩하는 유전자 내 돌연변이로 인해 초래된다. WD와 연관된 500개가 넘는 돌연변이가 존재하고, 동아시아같은 특정 지역에서 유병률이 높다. 다른 예는 A1ATD (SERPINA1 유전자 내 돌연변이로 인해 초래되는 상염색체 열성 질환) 및 PKU (페닐알라닌 히드록실라제 (PAH) 유전자 내 돌연변이로 인해 초래되는 상염색체 열성 질환)이다.
일 양상에서, 본 발명은 간 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 세포에, tracrRNA와 복합체를 형성하는 C2c1-CRISPR, 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA 및 직접 반복부를 포함하는 C2c1-CRISPR 시스템을 전달하는 단계를 포함하고, 가이드 서열은 간 질환에 관여하는 유전자의 표적 서열과 하이브리드화하고, C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
간-연관 혈액 장애, 특히 혈우병 및 특히 혈우병 B
간세포의 성공적인 유전자 편집은 마우스 (시험관내 및 생체내 모두) 및 인간외 영장류 (생체내)에서 획득되었는데 간세포에서 유전자 편집/게놈 조작을 통한 혈액 장애의 치료가 실현가능함을 보여준다. 특히, 간세포에서 인간 F9 (hF9)의 발현은 인간에서 혈우병 B을 위한 치료를 의미하는 인간외 영장류에서 확인하였다. 일 양상에서, 본 발명은 간-연관 혈액 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 세포에, tracrRNA와 복합체를 형성하는 C2c1-CRISPR, 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA 및 직접 반복부를 포함하는 C2c1-CRISPR 시스템을 전달하는 단계를 포함하고, 가이드 서열은 간 질환에 관여하는 유전자의 표적 서열과 하이브리드화하고, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
Wechsler 등은 그들이 생체내 유전자 편집을 통해서 인간회 영장류에서 간세포로부터 인간 F9 (hF9)를 성공적으로 발현시켰다는 것을 [57th Annual Meeting and Exposition of the American Society of Hematology (abstract presented 6th December 2015 and available online at ash.confex.com/ash/2015/webprogram/Paper86495.html)]에서 보고하였다. 이것은 1) 알부민 유전자좌의 인트론 1을 표적화하는 2개 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 및 2) 인간 F9 도너 주형 구성체를 사용해 획득되었다. ZFN 및 도너 주형은 정맥내로 주사되어, 일정 비율의 간 세포에서 알부민 유전자좌로 hF9 유전자의 교정되니 카피의 표적화된 삽입을 일으키는, 별개 간친화성 아데노-연관 바이러스 혈청형 2/6 (AAV2/6) 상에서 코딩되었다.
알부민 유전자좌는 이러한 가장 풍부한 혈장 단백질의 생산이 10 g/일을 넘기 때문에 "세이프 하버" 로서 선택되었고, 이들 수준의 중등도 감소는 충분히 견딘다. 게놈 편집된 간세포는 고도의 활성 알부민 인핸서/프로모터에 의해 구동된, 알부민보다는 치료적 분량으로 정상 hFIX (hF9)를 생산하였다. 알부민 유전자좌에서 hF9 이식유전자의 표적화된 통합 및 이 유전자의 알부민 전사물로의 스플라이싱이 확인되었다.
마우스 연구: C57BL/6 마우스는 꼬리 정맥 주사를 통해서 1.0 x1013 벡터 게놈 (vg)/kg으로 마우스 대리 시약을 코딩하는 AAV2/6 벡터 (n=25) 또는 비히클 (n=20)이 투여되었다. 처치된 마우스에서 혈장 hFIX의 ELISA 분석은 6-개월 연구 지속기간 동안 지속되는 50-1053 ng/mL의 피크 수준을 보였다. 마우스 혈장으로부터의 FIX 활성의 분석은 발현도와 일관된 생활성을 확인하였다.
비인간 영장류 (NHP) 연구: 1.2x1013 vg/kg (n=5/그룹)으로 NHP 표적화된 알부민-특이적 ZFN 및 인간 F9 도너를 코딩하는 AAV2/6 벡터의 단일 정맥내 공-주입은 이러한 대형 동물 모델에서 >50 ng/mL (정상의 >1%)을 야기시켰다. 더 높은 AAV2/6 용량 (최대 1.5x1014 vg/kg)의 사용은 연구 기간 (3개월) 동안, 몇몇 동물에서 최대 1000 ng/ml (또는 정상의 20%), 그리고 단일 동물에서 최대 2000 ng/ml (또는 정상의 50%)로 hFIX 수준을 산출하였다.
치료는 마우스 및 NHP에서 충분히 내성이었고 치료 용량에서 양쪽 종에서 AAV2/6+ 도너 치료와 관련하여 유의한 독성학적 발견이 없었다. Sangamo (CA, USA)가 FDA에 신청하였고, 생체내 게놈 편집 적용을 위한 세계 최초의 인간 임상 시험을 수행할 허가를 부여받았다. 이것은 지단백질 리파제 결핍증의 Glybera 유전자 요법 치료의 EMEA의 승인 이후에 후속된다.
따라서, 일부 구현예에서, 하기 중 어느 하나 또는 전부가 사용되는 것이 바람직하다: 바람직하게 정맥내 주사로 투여되는, AAV (특히 AAV2/6); 특히 알부민의 인트론 1에서, 이식유전지/주형의 유전자 편집/삽입을 위한 표적으로서 알부민; 인간 F9 도너 주형; 및/또는 무프로모터 도너 주형.
혈우병 B
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 혈우병 B를 치료하는데 사용되는 것이 바람직하다. 이와 같이 F9 (인자 IX)가 적합한 가이드 RNA의 제공을 통해 표적화되는 것이 바람직하다. 효소 및 가이드는 F9가 생산되는 간에서 이상적으로 표적화하지만, 그들인 함께 또는 별개로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 주형이 제공되고, 이것인 인간 F9 유전자이다. hF9 주형은 hF9의 wt 또는 ‘교정’ 형태를 포함하여서 치료가 효과적이라는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 2-벡터 시스템이 사용될 수 있는데 하나는 C2c1용 벡터이고 다른 한 벡터는 복구 주형(들)용이다. 복구 주형은 둘 이상의 복구 주형, 예를 들어 상이한 포유동물 종으로부터의 2개의 F9 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 마우스 및 인간 F9 서열 둘 모두가 제공된다. 이것인 마우스에게 전달될 수 있다. 제58회 미국 혈액학 학회 (Annual American Society of Hematology Meeting) (Nov 2016), Yang Yang, John White, McMenamin Deirdre, 및 Peter Bell, PhD는 이것이 역가 및 정확도를 증가시킨다는 보고서를 발표하였다. 제2 벡터는 인자 IX의 인간 서열을 마우스 게놈에 삽입하였다. 일부 구현예에서, 표적화된 삽입은 키메라 초활성 인자 IX 단백질의 발현을 야기시켰다. 일부 구현예에서, 이것은 천연 마우스 인자 IX 프로모터의 제어 하에 있다. 증가 용량으로 신생 및 성체 " 녹아웃" 마우스에게 2-성분 시스템 (벡터 1 및 벡터 2)의 주입은 4개월 동안 정상 (또는 그 이상)의 수준으로 안정한 인자 IX 활성의 발현 및 활성을 야기시켰다. 인간 치료 사례에서, 천연 인간 F9 프로모터가 대신 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, wt 표현형이 복원된다.
대안적인 구현예에서, F9의 혈우병 B 형태는 모델 유기체, 세포, 또는 세포주 (예를 들어, 쥐과 또는 비인간 영장류 모델 유기체, 세포, 또는 세포주)를 생성시키기 위해 전달될 수 있으며, 모델 유기체, 세포, 또는 세포주는 혈우병 B 표현형, 즉 wt F9 생산 불능을 가지거나 또는 보유한다.
혈우병 A
일부 구현예에서, F9 (인자 IX) 유전자는 상기 설명된 F8 (인자 VIII) 유전자에 의해 치환될 수 있어서, 혈우병A의 치료 (교정 F8 유전자의 제공을 통해) 및/또는 혈우병 A 모델 유기체, 세포 또는 세포주의 창출 (F8 유전자의 비교정, 혈우병 A 형태의 제공을 통해)을 이끈다.
혈우병 C
일부 구현예에서, F9 (인자 IX) 유전자는 상기 설명된 F11 (인자 XI)에 의해 치환될 수 있어서, 혈우병 C의 치료 (교정 F11 유전자의 제공을 통해) 및/또는 혈우병 C 모델 유기체, 세포 또는 세포주의 창출 (F11 유전자의 비교정, 혈우병 C 형태의 제공을 통해)을 이끈다.
트랜스타이레틴 아밀로이드증
트랜스타이레틴은 타이록신 호르몬 및 레티놀 (비타민 A)에 결합된 레티놀 결합 단백질을 운반하는 혈청 CSF에 존재하는, 간에서 주로 생산되는 단백질이다. 120개가 넘는 상이한 돌연변이가 유전적 유전자 장애인 트랜스타이레틴 아밀로이드증 (ATTR)을 초래하며, 이 단백질의 돌연변이체 형태는 조직, 특히 말초 신경계에서 응집되어, 다발신경병증을 초래한다. 가족 아밀로이드 다발신경병증 (FAP)가 가장 일반적인 TTR 장애이고, 2014년에 유럽에서 100,000명 당 47명이 발병된 것으로 여겨졌다. Val30Met의 TTR 유전자 내 돌연변이가 가장 일반적인 돌연변이로 여겨지며, FAP 사례의 대략 50%를 초래한다. 지금까지 유일하게 알려진 치유법인, 간 이식 부재 하에서, 이 질환은 일반적으로 진단 후 10년 내에 사망한다. 대부분의 사례가 단성유전자이다.
ATTR의 마우스 모델에서, TTR 유전자는 CRISPR/Cas9의 전달에 의해 용량 의존적 방식으로 편집될 수 있다. 일부 구현예에서, C2c1은 mRNa로서 제공된다. 일부 구현예에서, C2c1 mRNA 및 가이드 RNA는 LNP에 패키징된다. LNP에 패키징된 C2c1 mRNA 및 가이드 RNA를 포함하는 시스템은 간에서 최대 60% 편집 효율을 달성하였으며, 혈청 TTR 수준은 최대 80% 까지 감소되었다. 그러므로, 일부 구현예에서, 트랜스타이레틴은 특히 Val30Met 돌연변이를 교정하기 위해 표적화된다. 그러므로, 일부 실시형태에서, ATTR이 치료된다.
알파-1 항트립신 결핍증
알파-1 항트립신 (A1AT)는 폐에서, 결합 조직을 분해하는 효소인, 호중구 엘라스타제의 활성을 감소시키는 기능을 주로 하는 간에서 생산되는 단백질이다. 알피-1 항트립신 결핍증 (ATTD)는 A1AT를 코딩하는, SERPINA1 유전자의 돌연변이에 의해 초래되는 질환이다. A1AT의 손상된 생산은 폐의 결합 조직의 점진적 분해를 초래해 결과적으로 기종 유사 증상을 일으킨다.
몇몇 돌연변이가 ATTD를 초래할 수 있지만, 가장 일반적인 돌연변이는 Glu342Lys (Z 대립유전자라고함, 야생형은 M이라고 함) 또는 Glu264Val (S 대립유전자라고함)이고, 각각의 대립유전자는 동등하게 질환 상태에 기여하며, 2개의 영향받는 대립유전자는 보다 현저한 병태생리를 일으킨다. 이들 결과는 민감한 장기, 예컨대 폐의 결합 조직의 분해를 일으킬뿐만 아니라, 간 내 돌연변이체의 축적은 단백질 독성을 일으킬 수 있다. 현재 치료는 기증 인간 혈장으로부터 회수된 단백질의 주사에 의한 A1AT의 대체에 집중한다. 중증 사례에서 폐 및/또는 간 이식이 고려될 수 있다.
이 질환의 일반적인 변이체는 역시 단성 유전자이다. 일부 구현예에서, SERPINA1 유전자가 표적화된다. 일부 구현예에서, Glu342Lys 돌연변이 (Z 대립유전자라고 함, 야생형은 M이라고 함), 또는 Glu264Val 돌연변이 (S 대립유전자라고 함)가 교정된다. 그러므로, 일부 구현예에서, 부실 유전자는 야생형 기능성 유전자로의 대체를 요구한다. 일부 구현예에서, 녹아웃 및 복구 접근법이 필요하여서, 복구 주형이 제공된다. 이중-대립유전자 돌연변이의 경우에, 일부 구현예에서, 오직 하나의 가이드 RNA가 동형접합 돌연변이에 필요하지만, 이형접합 돌연변이 경우에 2개 가이드 RNA가 필요할 수 있다. 일부 구현에예서, 폐 또는 간으로 전달된다.
선천성 대사 이상
선천성 대사 이상 (IEM)은 대사 과정에 영향을 미치는 질환의 우산 그룹이다. 일부 구현예서, IEM이 치료된다. 대부분의 이들 질환은 본질적으로 단성유전자 (예를 들어, 페닐케톤뇨증)이고 병태생리는 선천적으로 독성인 물질의 비정상적 축적, 또는 필수 물질의 합성 불능을 일으키는 돌연변이로 인한다. IEM의 성질에 따라서, CRISPR/C2c1은 단독으로, 또는 복구 주형을 통한 부실 유전자의 대체와 조합하여, 녹아웃을 촉진하는데 사용될 수 있다. CRISPR/C2c1 기술로 이득을 얻을 수 있는 예시적인 질환을 일부 구현예에서, 원발성 과옥살산뇨증 1형 (PH1), 아르기노숙신산 리아제 결핍증, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍증, 페닐케톤뇨증, 또는 PKU, 및 메이플 시럽 소변 질환이다.
상피 및 폐 질병의 치료
본 발명은 또한 본 명세서에 설명된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질 시스템을 하나 또는 둘 모두의 폐에 전달하는 것을 고려한다.
AAV-2-기반 벡터가 CF 기도로 CFTR 전달을 위해 원래 제안되었지만, AAV-1, AAV-5, AAV-6, 및 AAV-9와 같은 다른 혈청형이 다양한 폐 상피 모델에서 개선된 유전자 이송 효율을 나타낸다(예를 들어, Li et al., Molecular Therapy, vol. 17 no. 12, 2067-2077 Dec 2009). 생체내 AAV-1 형질도입된 쥐과 기관 기도가 AAV-5와 동일한 효율을 갖지만, 내피 AAV-1 실험관내 형질도입 인간 기도 상피 세포에서 AAV-2 및 AAV-5보다 100배까지 더 효율적일 수 있음이 입증되었다. 다른 연구는 실험관내 인간 기도 상피(HAE)로의 유전자 전달에서 AAV-5가 AAV-2보다 50배 더 효율적이고 생체내 마우스 폐 기도 상피에서는 상당히 더 효율적임을 보였다. AAV-6은 또한 실험관내 인간 기도 상피 세포 및 생체내 쥐과 기도에서 AAV-2보다 더 효율적임을 보였다. 더 최근의 분리체인 AAV-9는 9개월에 걸쳐 탐지된 유전자 발현을 갖는 생체내 쥐과 코 및 치조 상피에서 AAV-5보더 더 우수한 유전자 이송 효율을 나타냄을 보였으며, 이는 AAV가 CFTR 유전자 전달 벡터를 위해 요망되는 특성인 생체내 장기간 유전자 발현이 가능하게 할 수 있음을 제안한다. 더욱이, AAV-9는 CFTR 발현의 손실 및 최소 면역 결과를 갖는 쥐과 폐로 재투여될 수 있음을 입증하였다. CF 및 비-CF HAE 배양은 몇 시간 동안 100 μl의 AAV 벡터가 정점 표면 상에 접종될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Li et al., Molecular Therapy, vol. 17 no. 12, 20672077 Dec 2009]을 참조하라). MOI는 바이러스 농도 및 실험 목적에 의존하여 1 x 103 내지 4 x 105 벡터 게놈/세포로 변한다. 상기 인용된 벡터는 본 발명의 전달 및/또는 투여를 위해 고려된다.
Zamora 등은 RNA 간섭 치료제의 인간 감염 질병의 치료 및 또한 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)-감염 폐 이식 수령인에서 항바이러스 약물의 무작위 시험으로의 적용의 예를 보고했다(Am J Respir Crit Care Med Vol 183. pp 531538, 2011). Zamora 등은 RSV 호흡관 감염을 갖는 LTX 수령자에서 임의, 이중-맹검, 플라시보조절 시험을 실시했다. 환자는 RSV에 대해 표준 관리를 받았다. 에어로졸화 ALN-RSV01 (0.6 mg/kg) 또는 위약이 3일 동안 매일 투여됐다. 이 연구는 RSV를 표적화하는 RNAi 치료제가 RSV 감염을 갖는 LTX 수령자에 안전하게 투여될 수 있음을 입증한다. ALN-RSV01의 3회 일일 용량은 호흡관 증상 또는 폐 기능의 장애의 임의의 악화를 야기하지 않았으며 사이토카인 또는 CRP의 유도와 같은 임의의 전신성 염증전 효과를 나타내지 않았다. 약동학은 흡인 후 낮은 일시적인 전신성 노출만을 보였으며, 이는 정맥내 또는 흡입으로 투여된 ALN-RSV01이 엑소뉴클레아제 매개 소화 및 신장 배출을 통해 순환으로부터 신속하게 청소됨을 보이는 임상전 동물 데이터와 일치하는 것이다. Zamora 등의 방법은 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 적용될 수 있으며 에어로졸화 CRISPR Cas는 예를 들어, 0.6 mg/kg의 용량으로, 본 발명에 대해 고려될 수 있다.
폐 질환에 대해 치료된 대상체는, 예를 들어 자발적으로 호흡하면서 폐에 대해 기관지내삽관으로 전달되는 약학적 유효량의 에어로졸화된 AAV 벡터 시스템을 받을 수 있다. 이와 같이, 일반적으로 AAV 전달에 에어로졸화된 전달이 바람직하다. 전달을 위해 아데노바이러스 또는 AAV 입자가 사용될 수 있다. 각각 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결된 적합한 유전자 구성체는 전달 벡터에 클로닝될 수 있다. 이러한 에에서, 하기 구성체가 예로서 제공된다: Cas (C2c1)에 대해 Cbh 또는 EF1a 프로모터, 가이드 RNA)에 대해 U6 또는 H1 프로모터,: 바람직한 배열은 CFTR델타508 표적화 가이드, 델타F508 돌연변이에 대한 복구 주형 및 코돈 최적화된 C2c1 효소와, 임의로 하나 이상의 핵 국재화 신호 또는 서열 (들) (NLS(들)), 예를 들어, 2개 (2) NLS를 사용하는 것이다. NLS가 없는 구성체가 또한 고려된다.
근육계의 질병 치료
본 발명은 또한 근육(들)에 본 명세서에 기재된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질 시스템을 전달하는 것을 고려한다.
Bortolanza 등(Molecular Therapy vol. 19 no. 11, 2055-2064 Nov. 2011) 은 안면견갑상완근 이영양증 (FSHD)의 발병 후 FRG1 마우스에서의 RNA 간섭 발현 카세트의 전신 전달이 독성의 징조 없이 용량-의존성 장기간 FRG1 녹다운을 이끌어냄을 보였다. Bortolanza 등은 5 x 1012 vg의 rAAV6-sh1fRG1의 단일 정맥내 주입이 FRG1 마우스의 근육 조직병리학 및 근육 기능을 구제함을 발견했다. 상세하게는, 200 μl 생리학적 용액 중 2 x 1012 또는 5 x 1012 vg의 벡터가 25-게이지 Terumo 주사기를 사용하여 꼬리 정맥으로 주입되었다. Bortolanza 등의 방법은 AAV 발현 CRISPR Cas에 적용될 수 있으며, 약 2 × 1015 또는 2 × 1016 vg의 벡터의 용량으로 인간에게 주사될 수 있다.
Dumonceaux 등은 미오스타틴 수용체 AcvRIIb mRNA(sh-AcvRIIb)에 대한 RNA 간섭의 기술을 사용하여 미오스타틴 경로를 저해한다(Molecular Therapy vol. 18 no. 5, 881887 May 2010). 유사-디스트로핀의 복구는 벡터화 U7 엑손-스키핑 기술(U7-DYS)에 의해 매개되었다. sh-AcvrIIb 구성체 단독, U7-DYS 구성체 단독, 또는 두 구성체의 조합을 운반하는 아데노-관련 벡터는 이영양증 mdx 마우스의 전경골근(TA) 근육으로 주입되었다. 주입은 1011 AAV 바이러스 게놈으로 실행되었다. Dumonceaux 등의 방법은 AAV 발현 CRISPR Cas에 적용될 수 있으며, 약 1014 또는 약 1015 vg의 벡터의 용량으로 인간에게 주사될 수 있다.
Kinouchi 등은 아텔로콜라겐(ATCOL)을 갖는 화학적으로 비변형된 siRNA의 입자 형성을 통해 정상 또는 질병에 걸린 마우스의 골격으로의 생체내 siRNA 전달의 효능을 보고한다(Gene Therapy (2008) 15, 11261130). 마우스 골격근 또는 정맥내로 골격근 성장의 음성 조절자인 미오스타틴을 표적화하는 siRNA의 ATCOL-매개 국소 적용은 적용 몇 주 후 내에 근육량의 증가를 초래했다. 이들 결과는 siRNA의 ATCOL-매개 적용이 근위축증을 포함하는 질병에 대한 미래의 치료적 용도를 위한 강력한 도구임을 시사한다. MstsiRNA(최종 농도, 10 mM)는 제조업자의 지시에 따라 ATCOL(국소 투여를 위한 최종 농도, 0.5%)(AteloGene, Kohken, Tokyo, Japan)와 혼합되었다. 넴부탈(25mg/kg, i.p.)로 마우스(20-주령 수컷 C57BL/6)를 마취한 후, Mst-siRNA/ATCOL 복합체가 교근 및 대퇴이두근 근육에 주사되었다. Kinouchi 등의 방법은 CRISPR Cas에 적용될 수 있으며 인간에게, 예를 들어, 40 μM 용액의 약 500 내지 1000 ml의 용량으로 근육에 주입된다. Hagstrom 등은 포유류의 다리 근육을 통해 근육 세포(근섬유)로 핵산의 유효하고 반복가능한 전달이 가능한 혈관내, 비바이러스 방법을 기재한다(Molecular Therapy Vol. 10, No. 2, August 2004). 과정은 지혈대 또는 혈압 측정용 커프스에 의해 일시적으로 분리된 다리의 말단 정맥으로 네이키드 플라스미드 DNA 또는 siRNA의 주입을 포함한다. 근섬유로의 핵산 전달은 근육 조직으로 핵산 용액이 유출되기에 충분한 부피로 이의 신속한 주입을 가능하게 한다. 골력근에서의 높은 수준의 트랜스유전자 발현은 최소 독성을 갖는 작은 동물 및 큰 동물 모두에서 달성된다. 다리 근육으로의 siRNA 전달 증거 또한 수득되었다. 레서스 원숭이에 플라스미드 DNA 정맥내 주사를 위해서, 3방향 스톱콕이 각각이 단일 시린지에 로딩된, 2 개의 주사기 펌프(Model PHD 2000; Harvard Instruments)에 연결되었다. 파파베린 주사 후 5 분 뒤에 pDNA (40-100ml 식염수 중 15.5 내지 25.7 mg)가 1.7 또는 2.0 ml/s의 속도로 주사되었다. 이는 본 발명의 CRISPR Cas를 발현하는 플라스미드 DNA를 위해 인간에 대해 800 내지 2000 ml 식염수 약 300 내지 500 mg의 주입으로 규모가 커질 수 있다. 래트로의 아데노바이러스 벡터 주입에서, 2 x 109 전염성 입자는 3 ml의 생리 식염수(NSS)로 주입되었다. 이는 본 발명의 CRISPR Cas를 발현하는 플라스미드 DNA를 위해 인간에 대해 10 리터의 NSS로 주입되는 약 1 x 1013 전염성 입자의 주입으로 규모가 커질 수 있다. siRNA에서, 래트는 12.5 μg의 siRNA로 대복재 정맥에 주입되었으며 영장류는 대복재 정맥에 750 μg의 siRNA가 주입되었다. 이는 본 발명의 CRISPR Cas를 위해 예를 들어, 인간의 대복재 정맥으로 약 15 내지 약 50 mg의 주입으로 규모가 커질 수 있다.
또한, 예를 들어, 듀크대의 공개된 출원 WO2013163628 A2호 (돌연변이된 유전자의 유전적 편집(Genetic Correction of Mutated Genes))를 참조하며, 이는 예를 들어 디스트로핀 유전자에서의 돌연변이로 인한 근육 변성을 결과로서 일으키는 열성의 치명적인 X-관련 장애인, 뒤시엔느 근 이영양증 ("DMD")의 원인이 되는 것들과 같은, 뉴클레아제 매개된 비-상동성 말단 접합을 통해 편집될 수 있는 절단된 유전자 생성물 및 때이른 정지 코돈을 유발하는 예를 들어 프레임시프트 돌연변이를 편집하고자 하는 노력을 설명한다. DMD를 유발하는 디스트로핀 돌연변이의 대다수는 리딩 프레임을 방해하고, 디스트로핀 유전자에서 때이른 번역 종료를 유발하는 엑손의 결실이다. 디스트로핀은 근세포 온전성 및 작용을 조절하는데 원인이 되는 세포막의 디스트로글리칸 복합체에 구조 안정성을 제공하는 세포질성 단백질이다. 본 명세서에서 상호가능하게 사용된 바와 같은 디스트로핀 유전자 또는 "DMD 유전자" 는 유전자좌 Xp21에서 2.2 메가염기이다. 일차 전사는 약 14 kb인 성숙 mRNA를 이용하여 약 2,400 kb로 측정된다. 79 엑손은 3500 개가 넘는 아미노산인 단백질을 코딩한다. 엑손 51은 DMD 환자에서 종종 프레임-방해 결실에 인접하며, 올리고뉴클레오티드-기반 엑손 스키핑(skipping)에 대한 임상 시험에서 표적된다. 엑손 51 스키핑 화합물 에테플러센(eteplirsen)에 대한 임상 시험은 최근에 48주에 걸쳐 상당한 기능적 이점을 보고하였고, 기준에 비해 평균 47% 디스트로핀 양성 섬유를 지녔다. 엑손 51에서 돌연변이는 NHEJ-기반 게놈 편집에 의해 영구 편집에 이상적으로 적합화된다.
Cellectis에게 수여된 미국 특허 제20130145487호의 방법은, 인간 디스트로핀 유전자 (DMD)로부터의 표적 서열을 절단하는 메가뉴클레아제 변이체에 관한 것으로, 이는 또한 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 대해 변형될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산 표적화 시스템은 CRISPR-C2c1 시스템을 포함한다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
피부병의 치료
본 발명은 또한 피부로의 본 명세서에 기재된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질 시스템의 전달을 고려한다.
Hickerson 등(Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e129)은 인간 및 쥐과 피부에 자체-전달 (sd)-siRNA를 전달하기 위한 동력화된 마이크로니들 어레이 피부 전달 장치에 관한 것이다. siRNA-기반 피부 치료제가 임상으로 바뀌기 위한 주된 도전은 효과적인 전달 시스템의 개발이다. 다양한 피부 전달 기술에서의 상당한 노력이 쏟아졌으나 제한된 성공만을 거두었다. 피부가 siRNA로 치료되는 임상 연구에서, 피하 주사 주입과 연관된 강렬한 통증이 추가 환자의 등록을 불가능하게 하였으며, 이는 개선되며 좀더 "환자-친화적인" (즉, 적은 통증 또는 무통증) 전달 접근법에 대한 요구를 강조하는 것이다. 마이크로니들은 초기 장벽인 각질층을 거쳐 siRNA를 포함하는 대전하 카고를 전달하는 효과적인 방식을 대표하며, 일반적으로 통상적인 피하 주사보다 통증이 덜한 것으로 간주된다. Hickerson 등에 의해 사용된 동력화 마이크로니들 어레이(MMNA) 장치를 포함하는, 동력화 "스탬프 유형" 마이크로니들 장치는 무모 마우스 연구에서 안전함을 보였으며 (i) 미용 산업에서의 광범위한 사용 및 (ii) 모든 지원자들이 독감 예방주사보다 훨씬 적은 통증으로 장치를 사용함을 발견한 제한된 시험에 의해 입증된 바와 같이 적은 통증 또는 무통증을 초래하며, 이는 이 장치를 사용하는 siRNA 전달이 피하 주사 주입을 사용한 이전 임상 시험에 경험했던 것보다 훨씬 더 적은 통증을 야기할 수 있음을 제안하는 것이다. MMNA 장치 (Triple-M 또는 Tri-M으로 Bomtech Electronic Co, Seoul, South Korea가 시판)는 마우스 및 인간 피부에 siRNA의 전달을 위해 조정되었다. sd-siRNA 용액 (최대 300 μl의 0.1 mg/ml RNA) 이 0.1 mm 깊이로 설정된 1회용 Tri-M 바늘 카트리지의 챔버 (Bomtech)에 도입되었다. 인간 피부를 치료하기 위해서, (수술 직후 수득된) 비식별된 피부를 손으로 펼쳐서 처치 전에 코크 플랫폼에 고정시켰다. 모든 피내 주입은 28-게이지 0.5-인치 바늘을 갖는 인슐린 주사기를 사용해 실행되었다. Hickerson 등의 MMNA 장치 및 방법은 본 발명의 CRISPR Cas, 예를 들어, 피부에 300 μl까지의 용량으로 0.1 mg/ml CRISPR Cas를 전달하기 위해 사용되고 그리고/또는 적응될 수 있다.
Leachman 등의 문헌 (Molecular Therapy, vol. 18 no. 2, 442446 Feb. 2010)은 피부에 제1 짧은 간섭 RNA(siRNA)-기반 치료제를 사용하여 장애성 발바닥 각피증을 포함하는 상염색체 우성 증후군인 흔하지 않은 피부 장애 선천성 경조증(PC)의 치료를 위한 Ib상 임상 시험에 관한 것이다. TD101로 명명된 이 siRNA는 야생형 K6a mRNA 없이 케라틴 6a(K6a) N171K 돌연변이체 mRNA를 특이적으로 그리고 강력하게 표적화한다.
Zheng 등 (PNAS, July 24, 2012, vol. 109, no. 30, 1197511980)은 구형의 핵산 나노입자 접합체(SNA-NCs)인 고도로 지향적인 공유적으로 고정화된 siRNA의 밀집된 쉘로 싸인 금 코어는 적용 후 몇 시간 내에 실험관내 각질세포, 마우스 피부 및 인간 표피를 거의 100% 자유롭게 투과함을 보였다. Zheng 등은 60 h 동안 25 nM 표피성장인자 수용체 (EGFR) SNA-NC의 단일 적용이 인간 피부에서 효과적인 유전자 녹아웃을 나타낸다는 것을 증명했다. 유사한 용량이 피부로의 투여를 위해 SNA-NC에 고정된 CRISPR Cas에 대해 고려될 수 있다. Zheng 등, Leachman 등, 및 Hickerson 등의 방법은 또한 본 발명의 핵산-표적화 시스템을 위해 변형될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산 표적화 시스템은 CRISPR- C2c1 시스템을 포함한다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
암
일부 구현예에서, 암의 치료, 예방 또는 진단이 제공된다. 표적은 FAS, BID, CTLA4, PDCD1, CBLB, PTPN6, TRAC 또는 TRBC 유전자 중 하나 이상이다. 암은 림프종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병 (B-ALL), 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프구 (NHL), 미만성 거대 세포 림프종 (DLCL), 다발성 골수종, 신장 세포 암종 (RCC), 신경아세포종, 직결장암, 거세 저항성 전립선 암, 전이성 신장 세포 암종, 전이성 비소세포 폐암, 유방암, 방광암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암, 및 수모세포종 중 하나 이상일 수 있다. 이것은 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포로 구현될 수 있다. 이것은 WO2015161276에 기술되어 있고, 이의 개시는 참조로 본 명세서에 편입되고, 하기 본 명세서에 기술된다.
PD-1 녹아웃 T 세포를 생성시켜 CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 식도암, 침윤성 방광암, 호르몬 불응성 전립선 암, 전이성 신장 세포 암종, 전이성 비소세포 폐암, IV기 위 암종, IV 기 비인두 암종, IV 기 t-세포 암종, 및 엡스테인-바 바이러스 연관 악성종을 포함하느 다수 암의 치료가 제안되고 기술되었다. 참조: Niu et al. Cell 2014, 156(4): 836-43; Rosenberg et al, Science 2015, 348 (6230): 62-8; Sharma et al, Cell 2015, 161(2): 205-14; Bidnur et al, Bladder Cancer, 2016, 2(1): 15-25; Kim et al, Investig Clin Urol. 2016, 57 Suppl 1: S98-S105; Argon-Ching et al, Future Oncol., 2016, 12(17): 2049-58; Festino et al, Drugs 2016, 76(9): 925-45; Zibelman et al, Future Oncl., 2016, 12(19): 2227-42; Doni et al., J. Urol., 2017 197(1): 14-22; Yi et al, Biochim Biophys Acta., 2016, 1866(2): 197-207; Taube et al, Oncoimmunology, 2014, 3(11)L e963413; Yatsuda et al, Nihon Rinsho, 2014, 72(12): 2174-8; Modena et al. Oncol Rev. 2016, 10(1): 293; Bishop et al. Oncotarget, 2015, 6(1): 234-42; Gandini et al, Crit Rev Oncol Hematol. 2016, 100:88-98; Koshikin et al, Expert Opin Pharmacother. 2016 17(9):1225-32; Hofmann et al., Eur J Cancer. 2016, 60:190-209; Gunturi et al, Curr Treat Options Oncol. 2014, 15(1):137-46; Bockorny et al., Expert Opin Biol Ther. 2013, 13(6):911-25; Garon et al, N Engl J Med 2015, 372(21)L 2018-28; Brahmer et al, N Eng J Med, 2015 373(2): 123-35; Borghaei et al, N Engl JH Med 2015, 373(17): 1627-39; Kim et al, Gastroenterology, 2015 148(1): 137-147; Quan et al, PloS One, 2015, 10(9): 30136476; Louis et al, J Immunother., 2010, 33(9): 983-90; Lloyd et al., Frot Immunol., 2013, 4:221; Su et al, Sci Rep. 2016, 6: 20070. 말초 혈액 림프구를 채취하였고 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PDCD1) 유전자를 실험실에서 CRISPR Cas9를 통해 녹아웃시킬 것이다 (PD-1 녹아웃 T-세포). 림프구를 선택하고 생체외에서 확장시키고 환자에게 다시 주입시킨다. 총 2 x 10^7/kg의 PD-1 녹아웃 T 세포가 1회 사이클로 주입된다. 각 사이클은 3회 투여로 나뉘며, 제1 투여는 20% 주입되고, 제2 투여에서 30%, 나머지 50%는 제3 투여이다. 후기 식도암 및 침윤성 방광암의 경우, 20 mg/kg의 사이클로포스파미드의 단일 용량이 세포 주입 전 3일에 i.v로 투여된다. 5일 후에, 720000 국제 단위 (IU)/kg/일 (내성이면)의 인터루킨-2 (Il-2)가 투여된다. 환자는 총 2, 3, 4, 사이클의 치료를 받는다.
암의 치료 또는 예방에 적합한 표적 유전자는 일부 구현에에서, 그 개시가 참조로 본 명세서에 편입되는 Wo2015048577에 기술된 것들을 포함할 수 있다. WO2015161276 및 WO2015048577의 방법이 또한 본 발명의 핵산-표적화 시스템이 변형시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템은 암 치료에서 상기 기술된 방법과 적용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산 표적화 시스템은 CRISPR- C2c1 시스템을 포함한다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다. C2c1은 Cas9에 의해 생성되는 PAM의 근위 말단에서의 절단과 대조적으로, PAM의 원위 말단에서 이중 가닥 파손을 생성시킨다 (Jinek et al., 2012; Cong et al., 2013). C2c1 돌연변이된 표적 서열은 단일 gRNA에 의한 반복된 절단에 감수성일 수 있어서, HDR 매개 게놈 편집에서 C2c1의 적용을 촉진한다고 제안된다 (Front Plant Sci. 2016 Nov 14;7:1683). 일정 구현에에서, 관심 유전자좌는 상동성 지정 복구 (HR 또는 HDR)를 통해 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HR 독립적인 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일정 구현에에서, 관심 유전자좌는 비상동성 말단 결합 (NHEJ)을 통해 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다.
C2c1는 Cas9에 의해 생성되는 블런트 말단부와 대조적으로, 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부를 생성시킨다 (Garneau et al., Nature. 2010;468:67-71; Gasiunas et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:E2579-2586). 절단 산물의 이러한 구조는 포유동물 게놈으로 비상동성 말단 결합 (NHEJ)-기반 유전자 삽입을 촉진하기 위해 특이 유리할 수 있다 (Maresca et al., Genome research. 2013;23:539-546). 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 DNA 서열을 도입시킨다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 주형 DNA 서열을 삽입, 또는 "녹-인" 시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, DNA 삽입은 적절한 배향으로 게놈에 통합되도록 설계된다. 바람직한 구현예에서, 관심 유전자좌는 비분열 세포에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형되고, 여기서 상동성 지정 복구 (HDR) 기전을 통한 게놈 편집이 특히 도전적이다 (Chan et al., Nucleic acids research. 2011;39:5955-5966). Maresca 등 (Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546)은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 Tale 뉴클레아제 (TALEN)를 사용해 적용가능한 부위 지정된, 정밀 삽입 방법을 기술하는데, 여기서 5' 오버행을 갖는 짧은, 이중-가닥 DNA가 상보성 말단에 결찰되어, 인간 세포주에서 한정된 유전자좌에서 15-kb 외생성 발현 카세트의 정밀한 삽입을 가능하게 하였다. He 등 (Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9))은 4.6 kb 무프로모터 ires-eGFP 단편을 GAPDH 유전자좌에 CRISPR/Cas9-유도 부위-특이적 녹-인으로 체세포 LO2 세포에서 최대 20% GFP+ 세포를 산출하였고, NHEJ 경로에 의해 매개되는 인간 배아 줄기 세포에서 1.70% GFP+ 세포를 산출하였다고 기술하였으며, 또한 NHEJ-기반 녹-인이 조사된 모든 인간 세포 유형에서 HDR-매개 유전자 표적화에 비해 더 효율적이라고 보고하였다. C2c1이 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단을 생성시키기 때문에, 당업자는 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템을 사용해 관심 유전자좌에서 외생성 DNA 삽입을 발생시키기 위해서 Meresca 등 및 He 등에 기술된 거소가 유사한 방법을 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM 서열의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 먼저 변형되고, PAM 서열 근처에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 더욱 변형되며 HDR을 통해 복구된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR을 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ를 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 3' 및 5' 말단 둘 모두 상에서 단일 가이드 DNA(sgDNA)-PAM 서열이 측접된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 CRISPR-C2c1 절단 이후에 방출된다. 참조: Zhang et al., Genome Biology201718:35; He et al., Nucleic Acids Research, 44: 9, 2016.
어셔 증후군 및 망막 색소변성증-39
일부 구현예에서, 어셔 증후군 또는 망막 색소변성증-39의 치료, 예방 또는 진단이 제공된다. 표적은 바람직하게 USH2A 유전자이다. 일부 구현예에서, 위치 2299에서 G 결실 (2299delG)의 교정이 제공된다. 이것은 WO2015134812A1에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
자가면역 및 염증성 장애
일부 구현예에서, 자가면역 및 염증성 장애가 치료된다. 이들은 예를 들어 다발성 경화증 (MS) 또는 류마티스성 관절염 (RA)을 포함한다.
낭성 섬유증 (CF)
일부 구현예에서, 낭성 섬유증의 치료, 예방 또는 진단이 제공된다. 표적은 바람직하게 SCNN1A 또는 CFTR 유전자이다. 이것은 WO2015157070에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다.
Schwank 등 (문헌 [Cell Stem Cell, 13:65358, 2013])은 인간 줄기 세포에서 낭포성 섬유증과 연관된 결함을 편집하기 위해 CRISPR-Cas9를 사용하였다. 이 팀의 표적은 이온 채널을 위한 유전자인, 낭포성 섬유증 막투과 전도체 수용체(CFTR). CFTR에서의 결실은 낭포성 섬유증 환자에서 단백질의 미스폴딩을 발생시킨다. 낭포성 섬유증을 갖는 2명의 아동으로부터의 세포 시료로부터 발생된 배양된 장 줄기 세포를 사용하여, Schwank 등은 삽입될 복구 서열을 함유하는 공여 플라스미드와 함께 CRISPR을 사용하여 편집할 수 있었다. 그런 다음, 연구자들은 세포를 장 "오르가노이드," 또는 소형 소화관으로 성장시켰으며, 이들이 정상적으로 작용함을 보였다. 이러한 경우에서, 클론성 오르가노이드의 대략 절반이 적절한 유전 편집을 겪었다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 낭성 섬유증이 치료된다. 그러므로 폐로의 전달이 바람직하다. F508 돌연변이 (델타-F508, 명칭 CFTRΔF508 또는 F508del-CFTR) 가 바람직하게 교정된다. 일부 구현예에서, 표적은 ABCC7, CF 또는 MRP7일 수 있다.
다른 구현에에서, 낭성 섬유증의 치료를 위한 Crispr-Cas 관련 방법 및 조성물에 관한, Editas medicine에게 양도된 특허 공개 US20170022507의 방법은 본 발명에 개시된 CRISPR-Cas 시스템에 대해 변형될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
뒤센 근이영양증
뒤센 근이영양증 (DMD)은 출생시 남성 5000명 중 대략 1명에서 발병되는 열성, 성-연관 근 소모 질환이다. 디스트로핀 유전자의 돌연변이가 골격근에서 디스트로핀의 부재를 초래하는데, 이것은 정상적으로는 근육 섬유의 세포골격을 기저층에 연결시키는 기능을 한다. 이들 돌연변이로인한 디스트로핀의 부재는 체세포로 과도한 칼슘 유입을 초래하여 미토콘드리아를 파열시켜, 세포를 파괴하게 된다. 현재 치료는 DMD의 증상을 완화시키는데 집중하며 평균 기대 수명은 대략 26세이다.
일정 유형의 DMD에 대한 치료로서 CRISPR/Cas9 효능은 마우스 모델에서 입증되었다. 이러한 한 연구에서, 근이영양증 표현형은 돌연변이체 엑손을 녹아웃시켜 마우스에서 부분적으로 교정되어 기능성 단백질이 생성되었다 (참조: Nelson et al. (2016) Science, Long et al. (2016) Science, and Tabebordbar et al. (2016) Science).
일부 구현예에서, DMD를 치료하는 Crispr 관련 방법과 관련된, Editas Medine에 양도된 특허 공개 WO2016161380의 방법이 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템의 적용을 위해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, DMD가 치료된다. 일부 구현예에서, 주사에 의해 근육으로 전달된다. 일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 C2c1이고, 시스템은 I. CRISPR-Cas 시스템 RNA 폴리뉴클레오티드 서열로서, (a) tracr RNA 폴리뉴클레오티드 및 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 RNA 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 직접 반복부 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 서열, 및 II. 임의로 적어도 하나 이상의 핵 국재화 서열을 포함하는, C2c1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 직접 반복부 서열은 가이드 서열과 하이브리드화하여 표적 서열로 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도시키고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열과 하이브리드화하거나 또는 하이브리드화가능한 가이드 서열, 및 (2) 직접 반복부 서열과 복합체를 형성하는 CRISPR 단백질을 포함하고, CRISPR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA이다.
일부 구현예에서, CRISPR- C2c1 단백질은 T-풍부 PAM을 인식한다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTN-3' 또는 5'-ATTN-3' 이다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 주형 DNA 서열을 삽입, 또는 " 녹-인" 시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, DNA 삽입은 적절한 배향으로 게놈에 통합되도록 설계된다. Maresca 등 (Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546)은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 Tale 뉴클레아제 (TALEN)를 사용해 적용가능한 부위 지정된, 정밀 삽입 방법을 기술하는데, 여기서 5' 오버행을 갖는 짧은, 이중-가닥 DNA가 상보성 말단에 결찰되어, 인간 세포주에서 한정된 유전자좌에서 15-kb 외생성 발현 카세트의 정밀한 삽입을 가능하게 하였다. He 등 (Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9))은 4.6 kb 무프로모터 ires-eGFP 단편을 GAPDH 유전자좌에 CRISPR/Cas9-유도 부위-특이적 녹-인으로 체세포 LO2 세포에서 최대 20% GFP+ 세포를 산출하였고, NHEJ 경로에 의해 매개되는 인간 배아 줄기 세포에서 1.70% GFP+ 세포를 산출하였다고 기술하였으며, 또한 NHEJ-기반 녹-인이 조사된 모든 인간 세포 유형에서 HDR-매개 유전자 표적화에 비해 더 효율적이라고 보고하였다. C2c1이 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단을 생성시키기 때문에, 당업자는 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템을 사용해 관심 유전자좌에서 외생성 DNA 삽입을 발생시키기 위해서 Meresca 등 및 He 등에 기술된 것과 유사한 방법을 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM 서열의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 먼저 변형되고, PAM 서열 근처에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 더욱 변형되며 HDR을 통해 복구된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR을 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ를 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 3' 및 5' 말단 둘 모두 상에서 단일 가이드 DNA(sgDNA)-PAM 서열이 측접된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 CRISPR-C2c1 절단 이후에 방출된다.
1a 포함, 당원축적병
1a 당원축적병은 글루코스-6-포스파타제 효소의 결핍으로 인한 유전 질환이다. 이러한 결핍은 글리코겐 및 글루코스 신생 합성으로 유리 글루코스를 생성시키는 간의 능력을 손상시킨다. 일부 구현예에서, 글루코스-6-포스파타제를 코딩하는 유전자가 표적이 된다. 일부 구현예에서, 당원 축적병이 치료된다. 일부 구현예에서, 지질 입자, 예컨대, LNP에 C2c1 (단백질 또는 mRNA 형태)의 캡슐화에 의해 간에 전달된다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
일부 구현예에서, 1a를 포함한, 당원축적병이 표적이 되고, 바람직하게, 예를 들어 병태/질환/감염과 연관된 폴리뉴클레오티드를 표적으로 하여 치료된다. 연관된 폴리뉴클레오티드는 유전자를 포함할 수 있는, DNA를 포함한다 (여기서 유전자는 임의의 코딩 서열 및 조절 엘리먼트 예컨대 인핸서 또는 프로모터를 포함). 일부 구현예에서, 연관된 폴리뉴클레오티드는 SLC2A2, GLUT2, G6PC, G6PT, G6PT1, GAA, LAMP2, LAMPB, AGL, GDE, GBE1, GYS2, PYGL, 또는 PFKM 유전자를 포함할 수 있다.
후를러 증후군
후를러 증후군은 또한 I형 점액다당류증 (MPS I)이라고도 알려져 있고, 후를러 질환은 리소솜 내 점액다당류의 분해를 담당하는 효소인, 알파-L-이두로니다제의 결핍으로 인한 글리코사미노글리칸 (이전에 뮤코폴리사카라이드라고 알려짐)의 축적을 야기시키는 유전 장애이다. 후를러 증후군은 종종 리소솜 저장 질환으로 분류되고 헌터 증후군과 임상적으로 관련된다. 헌터 증후군은 X-연관된 반면 후를러 증후군은 상염색체 열성이다. MPS I은 증상의 중증도를 기반으로 3개 아형으로 분류된다. 모든 3개 유형은 효소 α-L-이두로니다제의 부재, 또는 불충분한 수준에 의해 초래된다. MPS I H 또는 후를러 증후군은 MPS I 아형 중 가장 중증이다. 다른 2개 유형은 MPS I S 또는 샤이에 증후군 및 MPS I H-S 또는 후를러-샤이에 증후군이다. MPS I 부모에게 태어난 아이는 염색체 4의 4p16.3 부위로 맵핑된 결함성 IDUA 유전자를 보유한다. 이의 이두로니다제 효소 단백질 산물때문에 이 유전자는 IDUA라고 명명된다. 2001년 현재, IDUA 유전자 내 52개의 상이한 돌연변이가 후를러 증후군을 야기하는 것으로 확인되었다. 레트로바이러스, 렌티바이러스, AAV, 및 심지어 비바이러스 벡터를 통한 이두로니다제 유전자의 전달에 의한 MPS I의 마우스, 개, 및 고양이 모델의 성공적 치료.
일부 구현예에서, α-L-이두로니다제 유전자가 표적이 되고 복구 주형이 바람직하게 제공된다. 일부 구현예에서, CRISPR 단백질은 C2c1이고, 시스템은 I. CRISPR-Cas 시스템 RNA 폴리뉴클레오티드 서열로서, (a) 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 RNA 폴리뉴클레오티드, 및 (b) 직접 반복부 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 서열, 및 II. 임의로 적어도 하나 이상의 핵 국재화 서열을 포함하는, C2c1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 직접 반복부 서열은 가이드 서열과 하이브리드화하여 표적 서열로 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도시키고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열과 하이브리드화하거나 또는 하이브리드화가능한 가이드 서열, 및 (2) 직접 반복부 서열과 복합체를 형성하는 CRISPR 단백질을 포함하고, CRISPR 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA이다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 T-풍부 PAM을 인식한다. 특정 구현예에서, PAM은 5'-TTN-3' 또는 5'-ATTN-3' 이다. 일정 구현예에서, MPS I와 관련된 관심 유전자좌는 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단부를 생성시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, 스태거드 절단은 NHEJ 또는 HDR에 후속한다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 주형 DNA 서열을 삽입, 또는 " 녹-인" 시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, DNA 삽입은 적절한 배향으로 게놈에 통합되도록 설계된다. Maresca 등 (Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546)은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 Tale 뉴클레아제 (TALEN)를 사용해 적용가능한 부위 지정된, 정밀 삽입 방법을 기술하는데, 여기서 5' 오버행을 갖는 짧은, 이중-가닥 DNA가 상보성 말단에 결찰되어, 인간 세포주에서 한정된 유전자좌에서 15-kb 외생성 발현 카세트의 정밀한 삽입을 가능하게 하였다. He 등 (Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9))은 4.6 kb 무프로모터 ires-eGFP 단편을 GAPDH 유전자좌에 CRISPR/Cas9-유도 부위-특이적 녹-인으로 체세포 LO2 세포에서 최대 20% GFP+ 세포를 산출하였고, NHEJ 경로에 의해 매개되는 인간 배아 줄기 세포에서 1.70% GFP+ 세포를 산출하였다고 기술하였으며, 또한 NHEJ-기반 녹-인이 조사된 모든 인간 세포 유형에서 HDR-매개 유전자 표적화에 비해 더 효율적이라고 보고하였다. C2c1이 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단을 생성시키기 때문에, 당업자는 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템을 사용해 관심 유전자좌에서 외생성 DNA 삽입을 발생시키기 위해서 Meresca 등 및 He 등에 기술된 것과 유사한 방법을 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM 서열의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 먼저 변형되고, PAM 서열 근처에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 더욱 변형되며 HDR을 통해 복구된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR을 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ를 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 3' 및 5' 말단 둘 모두 상에서 단일 가이드 DNA(sgDNA)-PAM 서열이 측접된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 CRISPR-C2c1 절단 이후에 방출된다.
HIV 및 AIDS
일부 구현예에서, HIV 및 AIDS의 치료, 예방 또는 진단이 제공된다. 표적은 바람직하게 HIV 내 CCR5 유전자이다. 이것은 WO2015148670A1에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
베타 지중해 빈혈 및 겸상 적혈구 질환 (SCD)
일부 구현예에서, 베타 지중해 빈혈의 치료, 예방 또는 진단을 제공한다. 표적은 바람직하게 BCL11A 유전자이다. 이것은 WO2015148860에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
일부 구현예에서, 겸상 적혈구 질환 (SCD)의 치료, 예방 또는 진단이 제공된다. 표적은 바람직하게 HBB 또는 BCL11A 유전자이다. 이것은 WO2015148863에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 주형 DNA 서열을 삽입, 또는 " 녹-인" 시켜서 CRISPR-C2c1 복합체에 의해 변형된다. 특정 구현예에서, DNA 삽입은 적절한 배향으로 게놈에 통합되도록 설계된다. 바람직한 구현예에서, 관심 유전자좌는 비분열 세포에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형되고, 여기서 상동성 지정 복구 (HDR) 기전을 통한 게놈 편집이 특히 도전적이다 (Chan et al., Nucleic acids research. 2011;39:5955-5966). Maresca 등 (Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546)은 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 및 Tale 뉴클레아제 (TALEN)를 사용해 적용가능한 부위 지정된, 정밀 삽입 방법을 기술하는데, 여기서 5' 오버행을 갖는 짧은, 이중-가닥 DNA가 상보성 말단에 결찰되어, 인간 세포주에서 한정된 유전자좌에서 15-kb 외생성 발현 카세트의 정밀한 삽입을 가능하게 하였다. He 등 (Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9))은 4.6 kb 무프로모터 ires-eGFP 단편을 GAPDH 유전자좌에 CRISPR/Cas9-유도 부위-특이적 녹-인으로 체세포 LO2 세포에서 최대 20% GFP+ 세포를 산출하였고, NHEJ 경로에 의해 매개되는 인간 배아 줄기 세포에서 1.70% GFP+ 세포를 산출하였다고 기술하였으며, 또한 NHEJ-기반 녹-인이 조사된 모든 인간 세포 유형에서 HDR-매개 유전자 표적화에 비해 더 효율적이라고 보고하였다. C2c1이 5' 오버행을 갖는 스태거드 절단을 생성시키기 때문에, 당업자는 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템을 사용해 관심 유전자좌에서 외생성 DNA 삽입을 발생시키기 위해서 Meresca 등 및 He 등에 기술된 것과 유사한 방법을 사용할 수 있다.
일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 PAM 서열의 원위 말단에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 먼저 변형되고, PAM 서열 근처에서 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 더욱 변형되며 HDR을 통해 복구된다. 일정 구현예에서, 관심 유전자좌는 HDR을 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 관심 유전자좌는 NHEJ를 통한 외생성 DNA 서열의 삽입, 결실, 또는 돌연변이를 도입시켜 CRISPR-C2c1 시스템에 의해 변형된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 3' 및 5' 말단 둘 모두 상에서 단일 가이드 DNA(sgDNA)-PAM 서열이 측접된다. 바람직한 구현예에서, 외생성 DNA는 CRISPR-C2c1 절단 이후에 방출된다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 1 및 2
헤르페스바이러스과는 75-200개 유전자를 갖는 선형 이중 가닥 DNA 게놈으로 구성된 바이러스 패밀리이다. 유전자 편집 목적을 위해서, 가장 일반적으로 연구되는 패밀리는 헤르페스 심플렉서 바이러스 -1 (HSV-1)로서, 다른 바이러스 벡터에 비해 구별되는 다수의 장점을 갖는 바이러스이다 (고찰: Vannuci et al. (2003)). 따라서, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 HSV 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, HSV 바이러스 벡터는 HSV-1이다.
HSV-1은 대락 152 kb의 이중 가닥 DNA의 거대 게놈을 갖는다. 이러한 게놈은 80개 초과의 유전자로 구성되고, 이의 많은 것들은 치환 또는 제거될 수 있어서, 30-150 kb의 유전자 삽입을 허용한다. HSV-1로부터 유래된 바이러스 벡터는 일반적으로 3개 그룹으로 분리된다: 복제-적격 약독화 벡터, 복제-부적격 재조합 벡터, 및 앰플리콘으로 알려진 결함성 헬퍼-의존적 벡터. 벡터로서 HSV-1을 사용하는 유전자 전달은 이전에, 예를 들어, 신경병증성 동통 (참조: 예를 들어, Wolfe et al. (2009) Gene Ther) 및 류마티스성 관절염 (참조: 예를 들어, Burton et al. (2001) Stem Cells)의 경우에 입증되었다.
따라서, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 HSV 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, HSV 바이러스 벡터는 HSV-1이다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 CRISPR 성분의 전달을 위해 사용된다. C2c1 및 하나 이상의 가이드 RNA, 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 이상의 가이드 RNA의 전달에 특히 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 다중복합 시스템에서 유용하다. 일부 구현예에서, 전달은 신경병증성 동통 또는 류마티스성 관절염의 치료를 위한 것이다.
일부 구현예에서, HSV-1 (헤르페스 심플렉스 바이러스 1)의 치료, 예방, 또는 진단이 제공된다. 표적은 바람직하게 HSV-1의 UL19, UL30, UL48 또는 UL50 유전자이다. 이것은 WO2015153789에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다.
다른 구현예에서, HSV-2 (헤르페스 심플렉스 바이러스 2)의 치료, 예방, 또는 진단이 제공된다. 표적은 바람직하게 HSV-2의 UL19, UL30, UL48 또는 UL50 유전자이다. 이것은 WO2015153791에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다.
일부 구현예에서, 원발성 개방각 녹내장 (POAG)의 치료, 예방 또는 진단이 제공된다. 표적은 바람직하게 MYOC 유전자이다. 이것은 WO2015153780에 기술되어 있고, 이 개시는 참조로 본 명세서에 편입된다. 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 방법과 함께 적용될 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여 CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
양자 세포 요법
본 발명은 또한 양자 요법을 위해 세포를 변형시키기 위해서, 본 명세서에 설명된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질 시스템의 사용을 고려한다.
본 명세서에서 사용되는, " ACT" , " 양자 세포 요법" 및 " 양자 세포 전달" 은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일정 구현예에서, 양자 세포 요법 (ACT)은 세포의 생착에 의해 새로운 숙주에게 기능성 및 특징을 전달하려는 목적으로 환자에게 세포의 전달을 의미한다 (참조: Mettananda et al., Editing an α-globin enhancer in primary human hematopoietic stem cells as a treatment for β-thalassemia, Nat Commun. 2017 Sep 4;8(1):424). 본 명세서에서 사용되는 용어 "생착 (engraft, 또는 engraftment)"은 조직의 존재하는 세포와 접촉츨 통해 생체내에서 관심 조직으로 세포 도입의 과정을 의미한다. 양자 세포 요법 (ACT)는 세포, 가장 일반적으로 면역-유래 세포를 동일한 환자에게 다시 역으로 또는 새로운 숙주에게 면역학적 기능성 및 특징을 전달하려는 목적으로 새로운 수령체 숙주에게 전달하는 것을 의미한다. 가능하다면, 자기유래 세포의 사용이 GVHD 문제를 최소화하여 수령체를 돕는다. 자기유래 종양 침윤성 림프구 (TIL) (Besser et al., (2010) Clin. Cancer Res 16 (9) 2646-55; Dudley et al., (2002) Science 298 (5594): 850-4; and Dudley et al., (2005) Journal of Clinical Oncology 23 (10): 2346-57.) 또는 유전적으로 재지정된 말초 혈액 단핵 세포 (Johnson et al., (2009) Blood 114 (3): 535-46; and Morgan et al., (2006) Science 314(5796) 126-9)의 양자 전달이 흑색종 및 직결장 암종을 포함한 후기 고형 종양 환자를 비롯하여, CD19-발현 혈액학적 악성종 환자 (Kalos et al., (2011) Science Translational Medicine 3 (95): 95ra73)를 성공적으로 치료하는데 사용되었다. 일정 구현예에서, 동종 세포 면역 세포가 전달된다 (참조: 예를 들어, Ren et al., (2017) Clin Cancer Res 23 (9) 2255-2266). 본 명세서에서 더욱 기술된 바와 같이, 동종 세포는 동종이식편 반응을 감소시키고 이식편 대 숙주 질환을 예방하기 위해 편집될 수 있다. 따라서, 동종 세포의 사용은 건강한 도너로부터 세포를 수득할 수 있게 하고 진단 후 환자로부터 자기유래 세포를 제조하는 것이 아니라 환자에서 사용을 위해 준비하게 한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 방법은 양자 면역요법의 방법에 관한 것으로서, T 세포가 CRISPR에 의해 생체외에서 편집되어 적어도 하나의 유전자를 조절하고 이후에 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, CRISPR 편집은 편집된 T 세포의 적어도 하나의 표적 유전자의 발현의 녹아웃 또는 녹다운을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 조절 이외에도, T 세포는 또한 (1) 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR)을 코딩하는 외생성 유전자의 녹인, (2) 면역 체크포인트 수용체의 발현의 녹아웃 또는 녹다운, (3) 내생성 TCR의 발현의 녹아웃 또는 녹다운, (4) 인간 백혈구 항원 클래스 I (HLA-I) 단백질의 발현의 녹아웃 또는 녹다운, 및/또는 (5) 외생성 CAR 또는 TCR에 의해 표적화된 항원을 코딩하는 내생성 유전자의 발현의 녹아웃 또는 녹다운을 위해서 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다.
일부 구현예에서, T 세포는 CRISPR 이펙터 단백질, 및 표적 서열에 하이브리드화하는 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 메이트 서열과 하이브리드화할 수 있는 tracr 서열을 포함하는 가이드 분자를 코딩하는 아데노-연관 바이러스 (AAV)와 생체외에서 접촉한다. 일부 구현예에서, T 세포는 가이드 분자와 복합체 형성하는 CRISPR 이펙터 단백질을 포함하는 리보핵단백질 (RNP)와 (예를 들어, 전기천공을 통해) 생체외에서 접촉하고, 가이드 분자는 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열, tracr 메이트 서열, 및 tracr 메이트 서열과 하이브리드화할 수 있는 tracr 서열을 포함한다. 참조: Rupp et al., Scientific Reports 7:737 (2017); Liu et al., Cell Research 27:154-157 (2017). 일부 구현예에서, T 세포는 CRISPR 이펙터 단백질, 및 표적 서열에 하이브리드화하는 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 메이트 서열과 하이브리드화할 수 있는 Tracr 서열을 포함하는 가이드 분자를 코딩하는 mRNA와 (예를 들어, 전기천공을 통해) 생체외에서 접촉한다. 참조: Eyquem et al., Nature 543:113-117 (2017). 일부 구현예에서, T 세포는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터와 생체외에서 접촉하지 않는다.
일부 구현예에서, 방법은 CAR을 코딩하는 외생성 유전자를 녹인시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 T 세포를 편집하여서, 편집된 T 세포가 세포 표면 상에 위치된 특이적 단백질의 발현을 기반으로 암 세포를 인식할 수 있게 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 TCR을 코딩하는 외생성 유전자를 녹인시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 편집되어서, 편집된 T 세포가 암 세포의 표면 또는 내부로부터 유래된 단백질을 인식할 수 있게 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 CRISPR 가이드 서열에 의해 표적화되는 게놈 유전자좌로 상동성-지정 복구 (HDR)을 통해 통합될 수 있는, 도너 서열로서 외생성 CAR-코딩 또는 TCR-코딩 서열을 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 내생성 TCR α 불변 (TRAC) 유전자좌로 외생성 CAR 또는 TCR의 표적화는 토닉 CAR 신호전달을 감소시킬 수 있고 항원에 단일 또는 반복 노출 후에 CAR의 효과적인 내재화 및 재발현을 촉진하여 이펙터 T-세포 분화 및 고갈을 지연시킨다. 참조: Eyquem et al., Nature 543:113-117 (2017).
일부 구현예에서, 방법은 암 세포에 의한 면역억제를 감소시키기 위해 하나 이상의 면역 체크포인트 수용체를 차단하도록 CRISPR에 의해 생체외에서 T 세포를 편집하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 프로그램된 사멸-1 (PD-1) 신호전달 경로, 예컨대 PD-1 및 PD-L1에 관여되는 내생성 유전자의 녹아웃 또는 녹다운을 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다. 일부 구현예에서, T 세포는 Pdcd1 유전자좌 또는 CD274 유전자좌를 돌연변이시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다. 일부 구현예에서, T 세포는 PD-1의 제1 엑손을 표적화하는 하나 이상의 가이드 서열을 사용하는 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다. 참조: Rupp et al., Scientific Reports 7:737 (2017); Liu et al., Cell Research 27:154-157 (2017).
일부 구현예에서, 방법은 동종이계 양자 전달을 허용하도록 잠재적 동종이식편 반응성 TCR을 제거하기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 T 세포를 편집하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)를 피하기 위해서 TCR (예를 들어, αβ TCR)을 코딩하는 내생성 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다. 일부 구현예에서, T 세포는 TRAC를 돌연변이시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다. 일부 구현예에서, T 세포는 TRAC 의 제1 엑손을 표적화하는 하나 이상의 가이드 서열을 사용하는 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다. 참조: Liu et al., Cell Research 27:154-157 (2017). 일부 구현예에서, 방법은 내생성 TCR (예를 들어, CAR cDNA 이후 자가-절단 P2A 펩티드를 코딩하는 도너 서열로)을 동시에 녹아웃시키면서, TRAC 유전자좌로 CAR 또는 TCR을 코딩하는 외생성 유전자를 녹인시키기 위한 CRISPR의 사용을 포함한다. 참조: Eyquem et al., Nature 543:113-117 (2017). 일부 구현예에서, 외생성 유전자는 내생성 TCR 프로모터의 하류에서 작동적으로 삽입된 프로모터-무함유 CAR-코딩 또는 TCR-코딩 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 편집된 T 세포의 면역원성을 최소화시키기 위해서 HLA-I 단백질을 코딩하는 내생성 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 T 세포를 편집하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 베타-2 마크로글로불린 (B2M) 유전자좌를 돌연변이시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다. 일부 구현예에서, T 세포는 B2M의 제1 엑손을 표적화하는 하나 이상의 가이드 서열을 사용하는 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다. 참조: Liu et al., Cell Research 27:154-157 (2017). 일부 구현예에서, 방법은 내생성 B2M (예를 들어, CAR cDNA 이후 자가-절단 P2A 펩티드를 코딩하는 도너 서열로)을 동시에 녹아웃시키면서, B2M 유전자좌로 CAR 또는 TCR을 코딩하는 외생성 유전자를 녹인시키기 위한 CRISPR의 사용을 포함한다. 참조: Eyquem et al., Nature 543:113-117 (2017). 일부 구현예에서, 외생성 유전자는 내생성 B2M 프로모터의 하류에서 작동적으로 삽입된 프로모터-무함유 CAR-코딩 또는 TCR-코딩 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 외생성 CAR 또는 TCR에 의해 표적화된 항원을 코딩하는 내생성 유전자를 녹아웃 또는 녹다운시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 T 세포를 편집하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서비빈, 마우스 이중 미니트 2 상동체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B 1 (CYP1B), HER2/neu, 빌름스 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, 알파펙토단백질 (AFP), 암배 상원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (DI)으로부터 선택된 종양 항원의 발현을 녹아웃 또는 녹다운시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다 (참조: WO2016/011210). 일부 구현예에서, T 세포는 B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 경막 활성인자 및 CAML 인터액터 (TACI), 또는 B-세포 활성 인자 수용체 (BAFF-R), CD38, CD138, CS-1, CD33, CD26, CD30, CD53, CD92, CD100, CD148, CD150, CD200, CD261, CD262, 또는 Cd362로부터 선택된 항원의 발현을 녹아웃 또는 녹다운시키기 위해 CRISPR에 의해 생체외에서 편집된다 (참조: WO2017/011804).
따라서 본 발명의 양상은 선택된 항원, 예컨대, 종양 연관 항원에 특이적인 면역 시스템 세포, 예컨대, T 세포의 양자 전달을 수반한다 (하기의 문헌들 참조: Maus et al., 2014, Adoptive Immunotherapy for Cancer 또는 Viruses, Annual Review of Immunology, Vol. 32: 189-225; Rosenberg and Restifo, 2015, Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer, Science Vol. 348 no. 6230 pp. 62- 68; 및, Restifo et al., 2015, Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell Response. Nat. Rev. Immunol. 12(4): 269-281; 및 Jenson and Riddell, 2014, Design and implementation of adoptive therapy with chimeric antigen receptor-modified T cells. Immunol Rev. 257(1): 127- 144). 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR)의 특이성을 변경시킴으로써, 예를 들어 선택된 펩티드 특이성을 갖는 새로운 TCR α 및 β 쇄를 도입함으로써 T 세포를 유전자 변형시키는 다양한 전략이 사용될 수 있다 (미국 특허 제8,697,854호; 국제 특허 출원 공개: WO2003020763, WO2004033685, WO2004044004, WO2005114215, WO2006000830, WO2008038002, WO2008039818, WO2004074322, WO2005113595, WO2006125962, WO2013166321, WO2013039889, WO2014018863, WO2014083173; 미국 특허 제8,088,379호 참조).
TCR 변형에 대한 대안으로서 또는 추가로, 기술되었던 매우 다양한 수용체 키메라 구성체를 사용하여, 악성 세포와 같은, 선택 표적에 특이적인 면역반응성 세포, 예컨대, T 세포를 생성하기 위해 키메라 항원 수용체 (CAR)가 사용될 수 있다 (미국 특허 제5,843,728호; 제5,851,828호; 5,912,170호; 제6,004,811호; 제6,284,240호; 제6,392,013호; 제6,410,014호; 제6,753,162호; 제8,211,422호; 및 국제 특허 출원 공개 WO9215322). B 세포 상의 CD19 같은 백혈병 항원에 대한 키메라 항원 수용체 (CAR)을 발현시키도록 조작된 자기유래 T 세포는 재발성 또는 난치성 B-세포 악성종의 치료를 위해 유망한 결과를 보였다. 그러나, 암 환자의 서브세트, 특히 심하게 전처리된 암 환자는 확장 실패때문에 이러한 고도의 능동 요법을 수용할 수 없을 수 있다. 게다가, 그들의 작은 혈액 부피로 인해 소아 암 환자에 대해 효과적인 치료 산물을 제작하는 것이 여전히 도전이 된다. 다른 한편으로, 개인맞춤 자기유래 T 세포 제작 및 광범위하게 "분산된" 접근법을 포함하여 자기유래 CAR-T 세포 요법의 고유한 특징은 자기유래 CAR-T 세포 요법의 산업화에 어려움을 초래한다. 하나 이상의 건강한 미관련 도너로부터 유래되지만, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 피할 수 있고 그들 면역원성을 최소화시킨, 보편적 Cd19-특이적 CAR-T 세포 (UCART019)는 의심할 바 없이 상기 언급된 문제를 해결하기 위한 대안적 옵션이다. 대안적인 CAR 구성체는 연속 세대에 속하는 것으로 특징규명될 수 있다. 제1-세대 CAR은 전형적으로 항원에 특이적인 항체의 단일쇄 가변 단편으로 이루어지는데, 예를 들어 가요성 링커에 의해, 예를 들어, CD8α 힌지 도메인 및 CD8α 막관통 도메인에 의해, CD3ζ 또는 FcRγ 중 하나의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결되는 특정 항체의 VH에 연결된 VL을 포함한다 (scFv-CD3ζ 또는 scFv-FcRγ; 미국 특허 제7,741,465호; 미국 특허 제5,912,172호; 미국 특허 제5,906,936호 참조). 제2-세대 CAR은 엔도도메인 내에 하나 이상의 공자극 분자, 예컨대, CD28, OX40 (CD134), 또는 4-1BB(CD137)의 세포내 도메인을 혼입시킨다 (예를 들어 scFv-CD28/OX40/ 4--CD3ζ; 미국 특허 제8,911,993호; 제8,916,381호; 제8,975,071호; 제9,101,584호; 제9,102,760호; 제9,102,761호 참조). 제3-세대 CAR은 CD3ζ-사슬, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB, 또는 CD28 신호전달 도메인 (예를 들어, scFv-CD28-4-1BB-CD3ζ 또는 scFv-CD28-OX40-CD3ζ; 참조: U.S 특허 제8,906,682호; U.S. 특허 제8,399,645호; U.S. 특허 제5,686,281호; PCT 공개 번호 WO2014134165; PCT 공개 번호 WO2012079000)같은 공자극성 엔도도메인의 조합을 포함한다. 대안적으로, 공자극은 그들의 천연 αβTCR의 맞물림 후, 예를 들어 전문적 항원-제시 세포 상에서 항원에 의해, 수반하는 공자극으로 활성화되고 확장될 수 있도록 선택되는 항원-특이적 T 세포에서 CAR을 발현시킴으로써 조직될 수 있다. 추가로, 추가의 조작된 수용체가 예를 들어 T-세포 공격의 표적화를 개선시키기 위해 그리고/또는 부작용을 최소화하기 위해 면역반응성 세포 상에 제공될 수 있다. Han 등 (clinicaltrials, A Study Evaluating UCART019 in Patients with Relapsed or Refactory CD19+ Lukemia and Lymphoma)은 내생성 TCR 및 B2M 유전자를 동시에 파괴하기 위해 CAR의 렌티바이러스 전달 및 CRISPR RNA 전기천공을 조합하여 유전자-파괴된 동종이계 CD19-지정 BBζ CAR-T 세포 (UCART019라고 함)를 생성시켰고 숙주-매개 면역을 피하고 GVHD 없이 항백혈병 효과를 전달할 수 있는지 여부가 시험될 것이다.
표적 면역반응성 세포를 형질전환시키기 위해 대안의 기법, 예컨대, 원형질체 융합, 리포펙션, 형질감염 또는 전기천공법이 사용될 수 있다. 매우 다양한 벡터, 예컨대, 레트로바가러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연합 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 트랜스포존, 예컨대, 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty) 트랜스포존이 사용될 수 있고 (미국 특허 제6,489,458호; 제7,148,203호; 제7,160,682호; 제7,985,739호; 제8,227,432호 참조), 예를 들어 CD3ζ 및 CD28 또는 CD137 중 하나를 통해 2세대 항원-특이적 CAR 신호전달을 이용하여 CAR을 도입시키는데 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는, 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV에 기반한 벡터를 포함할 수 있다.
형질전환을 위해 표적화된 세포는, 예를 들어 T 세포, 자연살해 (NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 종양-침윤성 림프구(TIL) 또는 림구 세포가 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함할 수 있다. 목적하는 CAR을 발현시키는 T 세포는, 예를 들어, 암 항원 및 공자극 분자를 공동발현시키는 γ-조사된 활성화 및 증식 세포 (AaPC)와 함께 공배양을 통해 선택될 수 있다. 조작된 CAR T-세포는 가용성 인자, 예컨대, IL-2 및 IL-21의 존재 하에 AaPC에 대한 공동 배양에 의해, 확장될 수 있다. 이러한 확장은, 예를 들어, 기억 CAR+ T 세포를 제공하기 위해 수행될 수 있다 (예를 들어, 비효소적 디지털 어레이 및/또는 다중-패널 유세포 분석기에 의해 평가될 수 있음). 이러한 방식으로, 항원-보유 종양에 대해 (선택적으로 목적하는 케모카인, 예컨대, 인터페론-γ의 생성과 함께) 특이적 세포독성 활성을 갖는 CAR T 세포가 제공될 수 있다. 이런 종류의 CAR T 세포는, 예를 들어, 동물 모델에서, 예를 들어 종양 이종이식을 위협하기 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, CAR은 세포외 도메인, 경막 도메인, 및 세포내 도메인으로 구성되고, 세포외 도메인은 사전결정된 표적에 특이적인 항원-결합 도메인을 포함한다. CAR의 항원-결합 도메인이 종종 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 단쇄 가변 단편, scFv)이지만, 결합 도메인은 이것이 표적의 특이적 인식을 야기시키는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항원-결합 도메인은 수용체를 포함할 수 있어서, CAR은 수용체의 리간드에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항원-결합 도메인은 리간드를 포함할 수 있어서, CAR은 그 리간드의 내생성 수용체에 결합할 수 있다.
CAR의 항원-결합 도메인을 일반적으로 힌지 또는 스페이서에 의해 경막 도메인으로부터 이격된다. 스페이서는 또한 특별히 제한되지 않으며, CAR에 가요성을 부여하도록 설계된다. 예를 들어, 스페이서 도메인은 CH3 도메인의 일부분을 포함하여, 인간 Fc 도메인의 일부, 또는 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 또는 이의 변이체의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 더 나아가서, 힌지 영역은 FcR 또는 다른 잠재적 간섭 객체에 의한 오프-표적 결합을 방지하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 힌지는 FcR에 결합을 감소시키기 위해서 S228P, L235E, 및/또는 N297Q 돌연변이 (카밧 번호매김에 따름)가 존재하거나 또는 없는 IgG4 Fc를 포함할 수 있다. 추가 스페이서/힌지는 제한없이 CD4, CD8 및 CD28 힌지 영역을 포함한다.
CAR의 경막 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래할 수 있다. 공급원이 천인 경우, 도메인은 임의의 막 결합 또는 경막 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 개시에서 특별한 용도의 경막 영역은 CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 경막 도메인은 합성일 수 있고, 이러한 경우에 류신 및 발린 같은 소수성 잔기를 주로 포함하게 될 것이다. 바람직하게, 페닐알라닌, 트립토판, 및 발린의 트리플릿이 합성 경막 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 임의로, ㅤ짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게 2 내지 10개 아미노산 길이인 것이 CAR의 세포질 신호전달 도메인 및 경막 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블릿이 특히 적합한 링커를 제공한다.
대안적인 CAR 구성체는 연속 세대에 속하는 것으로 특징규명될 수 있다. 제1-세대 CAR은 전형적으로 항원에 특이적인 항체의 단일쇄 가변 단편으로 이루어지는데, 예를 들어 가요성 링커에 의해, 예를 들어, CD8α 힌지 도메인 및 CD8α 막관통 도메인에 의해, CD3ζ 또는 FcRγ 중 하나의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결되는 특정 항체의 VH에 연결된 VL을 포함한다 (scFv-CD3ζ 또는 scFv-FcRγ; 미국 특허 제7,741,465호; 미국 특허 제5,912,172호; 미국 특허 제5,906,936호 참조). 제2-세대 CAR은 엔도도메인 내에 하나 이상의 공자극 분자, 예컨대, CD28, OX40 (CD134), 또는 4-1BB(CD137)의 세포내 도메인을 혼입시킨다 (예를 들어 scFv-CD28/OX40/ 4-1BB-CD3ζ; 미국 특허 제8,911,993호; 제8,916,381호; 제8,975,071호; 제9,101,584호; 제9,102,760호; 제9,102,761호 참조). 제3-세대 CAR은 Cd3ζ-사슬, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB, CD2, CD7, LIGHT, LFA-1, NKG2C, B7-H3, CD30, CD40, PD-1, 또는 CD28 신호전달 도메인 (예를 들어, scFv-CD28-4-1BB-CD3ζ 또는 scFv-CD28-OX40-CD3ζ; 참조: U.S. 특허 번호 8,906,682; U.S. 특허 번호 8,399,645; U.S. 특허 번호 5,686,281; PCT 공개 번호 WO2014134165; PCT 공개 번호 WO2012079000) 같은 공자극성 엔도도메인의 조합을 포함한다. 일정 구현예에서, 주요 신호전달 도메인은 CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, 공통 FcR 감마 (FCERIG), FcR 베타 (Fc 엡실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc 감마 RIIa, DAP10, 및 DAP12로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일정 바람직한 구현예에서, 주요 신호전달 도메인은 CD3ζ 또는 FcRγ의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극성 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, CD4, CD8 알파, CD8 베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, 및 NKG2D로 이루어진 군으로부터, 각각 독립적으로 선택된 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 공자극성 신호전달 도메인은 4-1BB, CD27 및 CD28로 이루어진 군으로부터 서로 독립적으로 선택된 단백질의 기능성 신호전달 도메인을 포함한다. 일정 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 U.S. 특허 번호 7,446,190에 기술된 바와 같이, CD3ζ 사슬의 세포내 도메인 (예컨대 US 7,446,190의 SEQ ID NO: 14로 표시된, 인간 CD3 제타 사슬의 아미노산 잔기 52-163), CD28 유래 신호전달 영역 및 항원-결합 엘리먼트 (또는 부분 또는 도메인; 예컨대 scFv)을 포함하는, 디자인을 가질 수 있다. CD28 부분은 제타 사슬 부분 및 항원-결합 엘리먼트 사이일 때, CD28의 경막 및 신호전달 도메인을 적합하게 포함할 수 있다 (예컨대 SEQ ID NO: 10의 아미노산 잔기 114-220, US 7,446,190의 SEQ ID NO: 6로 표시된 전체 서열; 이들은 Genbank 식별자 NM_006139 (서열 버전 1, 2 또는 3로 기재된 CD28의 하기 부분을 포함할 수 있음): IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS) (SEQ ID NO:478). 대안적으로, CD28 서열 및 항원-결합 엘리먼트 사이에 제타 서열이 놓일 때, CD28의 세포내 도메인이 단독으로 사용될 수 있다 (예컨대 US 7,446,190의 SEQ ID NO: 9로 표시된 아미노산 서열). 그런 이유로, 일정 구현예는 (a) 인간 CD3ζ 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 제타 사슬 부분, (b) 공자극성 신호전달 영역, 및 (c) 항원-결합 엘리먼트 (또는 부분 또는 도메인)를 포함하는 CAR를 적용하고, 공자극성 신호전달 영역은 US 7,446,190의 SEQ ID NO: 6에 의해 코딩되는 아미노산을 포함한다.
대안적으로, 공자극은 그들의 천연 αβTCR의 맞물림 후, 예를 들어 전문적 항원-제시 세포 상에서 항원에 의해, 수반하는 공자극으로 활성화되고 확장될 수 있도록 선택되는 항원-특이적 T 세포에서 CAR을 발현시킴으로써 조직될 수 있다. 추가로, 추가의 조작된 수용체가 예를 들어 T-세포 공격의 표적화를 개선시키기 위해 그리고/또는 부작용을 최소화하기 위해 면역반응성 세포 상에 제공될 수 있다.
예로서 제한없이, [Kochenderfer et al., (2009) J Immunother. 32 (7): 689-702]은 항-CD19 키메라 항원 수용체 (CAR)를 기술한다. FMC63-28Z CAR은 FMC63 마우스 하이브리도마로부터 유래된 CD19를 인식하는 단쇄 가변 영역 모이어티 (scFv) (Nicholson et al., (1997) Molecular Immunology 34: 1157-1165), 인간 CD28 분자의 일부, 및 인간 TCR-ζ 분자의 세포내 성분을 함유하였다. FMC63-CD828BBZ CAR은 FMC63 scFv, CD8 분자의 힌지 및 경막 영역, CD28 및 4-1Bb의 세포질 도메인, 및 TCR-ζ 분자의 세포질 성분을 함유하였다. FMC63-28Z CAR에 포함된 CD28 분자의 정확한 서열은 Genbank 식별자 NM_006139에 상응하였고; 서열은 아미노산 서열 IEVMYPPPY로 출발한 모든 아미노산을 포함하였고 단백질의 카르복시-말단까지 모든 방식으로 계속된다. 벡터의 항-CD19 scFv 성분을 코딩하기 위해서 저자는 이전에 공기된 CAR의 일부를 기반으로 DNA 서열을 설계하였다 (Cooper et al., (2003) Blood 101: 1637-1644). 이 서열은 5' 말단에서 3' 말단으로 인프레임으로 하기 성분들을 코딩하였다: XhoI 부위, 인간 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 수용체 α-사슬 신호 서열, FMC63 경쇄 가변 영역 (Nicholson et al., supra), 링커 펩티드 (Cooper et al., supra), FMC63 중쇄 가변 영역 (Nicholson et al., supra), 및 NotI 부위. 이러한 서열을 코딩하는 플라스미드를 XhoI 및 NotI로 분해하였다. MSGV-FMC63-28Z 레트로바이러스 벡터를 형성하기 위해서, FMC63 scFv를 코딩하는 XhoI 및 NotI-분해 단편은 인간 CD28의 세포외 부분의 일부, 인간 CD28의 전체 경막 및 세포질 부분, 및 인간 TCR-ζ 분자의 세포질 부분을 비롯하여, MSGV 레트로바이러스 골격 (Hughes et al., (2005) Human Gene Therapy 16: 457-472)을 코딩하는 제2의 XhoI 및 NotI-분해 단편으로 결찰시켰다 (Maher et al., 2002) Nature Biotechnology 20: 70-75). FMC63-28Z CAR은 특히 재발성/난치성 공격적 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 환자의 치료를 위해서, Kite Pharma, Inc.에서 개발한 KTE-C19 (axicabtagene ciloleucel) 항-CD19 CAR-T 요법 제품에 포함된다. 그리하여, 일정 구현예에서, 앙자 세포 요법에 의도되는 세포, 보다 특히 면역반응성 세포 예컨대 T 세포는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-결합 엘리먼트 (또는 부분 또는 도메인; 예컨대 scFv), CD3ζ 사슬의 세포내 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 및 CD28의 신호전달 도메인을 포함하는 공자극성 신호전달 영역을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다. 바람직하게, CD28 아미노산 서열은 Genbank 식별자 NM_006139 (서열 버전 1, 2 또는 3)로 기재된 바와 같고 아미노산 서열 IEVMYPPPY에서 출발하여 모든 방식으로 단백질의 카르복시-말단까지 계속된다. 서열은 본 명세서에서 복제한다: IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO:479).
추가 항-CD19 CAR은 Wo2015187528에 더욱 기술된다. 보다 특히, 본 명세서에 참조로 편입되는 WO2015187528의 실시예 1 및 표 1은 완전한 인간 항-CD19 단일클론 항체 (47G4, US20100104509에 기술됨) 및 쥐과 항-CD19 단일클론 항체 (Nicholson 등이 기술하고, 상기 설명됨)를 기반으로 항-CD19 CAR의 생성을 입증하였다. 신호 서열 (인간 CD8-알파 또는 GM-CSF 수용체), 세포외 및 경막 영역 (인간 CD8-알파) 및 세포내 T-세포 신호전달 도메인 (CD28-CD3ζ; 4-1BB-CD3ζ; CD27-CD3ζ; CD28-CD27-CD3ζ, 4-1BB-CD27-CD3ζ; CD27-4-1BB-CD3ζ; CD28-CD27-FceRI 감마 사슬; 또는 CD28-FceRI 감마 사슬)의 다양한 조합이 개시되었다. 그리하여, 일정 구현예에서, 양자 세포 요법에 의도되는 세포, 보다 특히 면역반응성 세포 예컨대 T 세포는 항원에 특이적으로 결합하는 세포외-항원 결합 엘리먼트, WO2015187528의 표 1에 기재된 바와 같은 세포외 및 경막 영역, 및 WO201518752의 표 1에 기재된 바와 같은 세포내 T-세포 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 포함할 수 있다. 바람직하게, 항원은 CD19이고, 보다 바람직하게 항원-결합 엘리먼트는 항-CD19 scFv, 보다 더 바람직하게는 WO2015187528의 실시예 1에 기술된 바와 같은 마우스 또는 인간 항-CD19 scFv이다. 일정 구현예에서, CAR은 WO2015187528의 표 1에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진다.
예로서 제한없이 CD70 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체는 WO2012058460A2에 기술되어 있다 (참조: Park et al., CD70 as a target for chimeric antigen receptor T cells in head and neck squamous cell carcinoma, Oral Oncol. 2018 Mar;78:145-150; 및 Jin et al., CD70, a novel target of CAR T-cell therapy for gliomas, Neuro Oncol. 2018 Jan 10;20(1):55-65). CD70은 미만성 거대 B-세포 및 여포성 림프종 및 또한 호지킨 림프종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 및 다발성 골수종, 및 HTLV-1- 및 EBV-연관 악성종의 악성 세포에 의해 발현된다 (Agathanggelou et al. Am.J.Pathol. 1995;147: 1152-1160; Hunter et al., Blood 2004; 104:4881. 26; Lens et al., J Immunol. 2005;174:6212-6219; Baba et al., J Virol. 2008;82:3843-3852.). 또한, CD70은 신장 세포 암종 및 교모세포종 같은 비혈액학적 악성종에 의해 발현된다 (Junker et al., J Urol. 2005;173:2150-2153; Chahlavi et al., Cancer Res 2005;65:5428-5438). 생리적으로, CD70 발현은 일시적이고 고도로 활성화된 T, B, 및 수지상 세포의 서브세트에 제한된다.
예로서 제한없이, BCMA를 인식하는 키메라 항원 수용체가 기술되었다 (참조: 예를 들어 US20160046724A1; WO2016014789A2; WO2017211900A1; WO2015158671A1; US20180085444A1; WO2018028647A1; US20170283504A1; 및 WO2013154760A1).
본 명세서에 개시된 CRISPR 시스템은 양자 세포 요법에서 표적화하려는 항원을 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 일정 구현예에서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 TIL, CAR, 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원 (예컨대 종양 항원)은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: B 세포 성숙화 항원 (BCMA) (참조: Friedman et al., Effective Targeting of Multiple BCMA-Expressing Hematological Malignancies by Anti-BCMA CAR T Cells, Hum Gene Ther. 2018 Mar 8; Berdeja JG, et al. Durable clinical Responses in heavily pretreated patients with relapsed/refractory multiple myeloma: updated results from a multicenter study of bb2121 anti-Bcma CAR T cell therapy. Blood. 2017;130:740; and Mouhieddine and Ghobrial, Immunotherapy in Multiple Myeloma: The Era of CAR T Cell Therapy, Hematologist, May-June 2018, Volume 15, issue 3); PSA (전립선-특이적 항원); 전립선-특이적 막 항원 (PSMA); PSCA (전립선 줄기 세포 항원); 티로신-단백질 키나제 경막 수용체 ROR1; 섬유아세포 활성화단백질 (FAP); 종양-연관 당단백질 72 (TAG72); 암배 항원 (CEA); 상피 세포 부착 분자 (EPCAM); 메소테린; 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (ERBB2 (Her2/neu)); 프로스타제; 프로스타트산 포스파타제 (PAP); 연장 인자 2 돌연변이체 (ELF2M); 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 (IGF-1R); gplOO; BCR-ABL (브레이크포인트 클러스터 영역-아벨슨); 티로시나제; 뉴욕 식도 편평 세포 암종 1 (NY-ESO-1); κ-경쇄, LAGE (L 항원); MAGE (골수종 항원); 골수종-연관 항원 1 (MAGE-A1); MAGE A3; MAGE A6; 레구마인; 인간 파필로마마이러스 (HPV) E6; HPV E7; 프로스테린; 서비빈; PCTA1 (갈렉틴 8); 멜란-A/MART-1; Ras 돌연변이체; TRP-1 (티로시나제 관련 단백질 1, 또는 gp75); 티로시나제-관련 단백질 2 (TRP2); TRP-2/INT2 (TRP-2/인트론 2); RAGE (신장 항원); 진행성 당화 최종 산물에 대한 수용체 1 (RAGE1); 신장 편재성 1, 2 (RU1, RU2); 장 카르복실 에스터라제 (iCE); 열충격 단백질 70-2 (HSP70-2) 돌연변이체; 갑상선 자극 호르몬 수용체 (TSHR); CD123; CD171; CD19; CD20; CD22; CD26; CD30; CD33; CD44v7/8 (분화 클러스터 44, 엑손 7/8); CD53; CD92; CD100; CD148; CD150; CD200; CD261; CD262; CD362; CS-1 (CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24); C-유형 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1); 강글리오시드 GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); Tn 항원 (Tn Ag); Fms-유사 티로신 키나제 3 (FLT3); CD38; CD138; CD44v6; B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2 (IL-13Ra2); 인터루킨 11 수용체 알파 (IL-11Ra); 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA); 프로테아제 세린 21 (PRSS21); 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타 (PDGFR-베타); 단계-특이적 배아 항원-4 (SSEA-4); 뮤신 1, 세포 표면 연관 (MUC1); 뮤신 16 (MUC16); 상피 성장 인자 수용체 (EGFR); 상피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII); 신경 세포 부착 분자 (NCAM); 카본산 언히드라제 IX (CAIX); 프로테오솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 9 (LMP2); 에프린 A형 수용체 2 (EphA2); 에프린 B2; 푸코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자 (sLe); 강글리오시드 GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); TGS5; 고분자량-골수종-연관 항원 (HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드 (OAcGD2); 폴레이트 수용체 알파; 폴레이트 수용체 베타; 종양 상피 마커 1 (TEM1/CD248); 종양 상피 마커 7-관련 (TEM7R); 클라우딘 6 (CLDN6); G 단백질-커플링 수용체 클래스 C 그룹 5, 멤버 D (GPRC5D); 염색체 X 오픈 리딩 프레임 61 (CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제 (ALK); 폴리시알산; 태반-특이적 1 (PLAC1); globoH 글리코세라미드의 헥사사카라이드 부분 (GloboH); 유선 분화 항원 (NY-BR-1); 우로플라킨 2 (UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1 (HAVCR1); 아드레노셉터 베타 3 (ADRB3); 판넥신 3 (PANX3); G 단백질-커플링 수용체 20 (GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9 (LY6K); 후각 수용체 51E2 (OR51E2); TCR 감마 교대식 리딩 프레임 단백질 (TARP); 빌름스 종양 단백질 (WT1); ETS 전좌 변이체 유전자 6, located on 염색체 12p 상에 위치 (ETV6-AML); 정자 단백질 17 (SPA17); X 항원 패밀리, 멤버 1A (XAGE1); 안지오포이어틴-결합 세포 표면 수용체 2 (Tie 2); CT (암/고환 (항원)); 골수종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 골수종 암 고환 항원-2 (MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; p53; p53 돌연변이체; 역 텔로머라제 역전사효소 (hTERT); 육종 전좌 브레이크포인트; 아폽토시스의 골수종 억제제 (ML-IAP); ERG (경막 프로테아제, 세린 2 (TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코사미닐-트랜스퍼라제 V (NA17); 쌍형성 박스 단백질 Pax-3 (PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; 사이클린 D1; v-myc 조류 골수구종증 바이러스 종양 유전자 신경아세포종 유래 상동체 (MYCN); Ras 상동체 패밀리 멤버 C (RhoC); 시토크롬 P450 1B1 (CYP1B1); CCCTC-결합 인자 (아연 핑거 단백질)-유사 (BORIS); T 세포-1 또는 3에 의해 인식된 편평 세포 암종 항원 (SART1, SART3); 쌍형성 박스 단백질 Pax-5 (PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32 (OY-TES1); 림프구-특이적 단백질 티로신 키나제 (LCK); A 키나제 앵커 단백질 4 (AKAP-4); 활액 육종, X 브레이크포인트-1, -2, -3 또는 -4 (SSX1, SSX2, SSX3, SSX4); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-연관 면역글로불린-유사 수용체 1 (LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편 (FCAR); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 서브패밀리 A 멤버 2 (LILRA2); CD300 분자-유사 패밀리 멤버 f (CD300LF); C-type 렉틴 도메인 패밀리 12 멤버 A (CLEC12A); 골수 기질 세포 항원 2 (BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2 (EMR2); 림프구 항원 75 (LY75); 글리피칸-3 (GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 마우스 이중 미니트 2 상동체 (MDM2); 리빈; 알파페토단백질 (AFP); 경막 활성인자 및 CAML 인터랙터 (TACI); B-세포 활성화 인자 수용체 (BAFF-R); V-Ki-ras2 커스텐 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체 (KRAS); 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1 (IGLL1); 707-AP (707 알라닌 프롤린); ART-4 (T4 세포에 의해 인식된 선암종 항원); BAGE (B 항원; b-카테닌/m, b-카테닌/돌연변이됨); CAMEL (골수종 상의 CTL-인식된 항원); CAP1 (암배 항원 펩티드 1); CASP-8 (캐스파제-8); CDC27m (세포-분열 주기 27 돌연변이됨); CDK4/m (사이클린-의존성 키나제 4 돌연변이됨); Cyp-B (사이클로필린 B); DAM (분화 항원 골수종); EGP-2 (상피 당단백질 2); EGP-40 (상피 당단백질 40); Erbb2, 3, 4 (적아세포 백혈병 바이러스 종양유전자 상동체-2, -3, 4); FBP (폴레이트 결합 단백질); fAchR (태아 아세틸콜린 수용체); G250 (당단백질 250); GAGE (G 항원); GnT-V (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 V); HAGE (헬리코스 항원); ULA-A (인간 백혈구 항원-A); HST2 (인간 시그넷 링 종양 2); KIAA0205; KDR (키나제 삽입 도메인 수용체); LDLR/FUT (저밀도 지질 수용체/GDP L-푸코스: b-D-갈락토시다제 2-a-L 푸코실트랜스퍼라제); L1CAM (L1 세포 부착 분자); MC1R (멜라노코르틴 1 수용체); 미오신/m (미오신 돌연변이됨); MUM-1, -2, -3 (골수종 편재성 돌연변이 1, 2, 3); NA88-A (환자 M88의 NA cDNA 클론); KG2D (자연 살해 그룹 2, 멤버 D) 리간드; 종양태아 항원 (h5T4); p190 마이너 bcr-abl (190KD bcr-abl의 단백질); Pml/RARa (전골수구성 백혈병/레티노산 수용체 a); PRAME (골수종의 우선 발현 항원); SAGE (육종 항원); TEL/AML1 (전좌 Ets-패밀리 백혈병/급성 골수성 백혈병 1); TPI/m (트리오스포스페이트 이소머라제 돌연변이됨); CD70; 세포영양막 당단백질 (TPBG); ανβo 인테그린, B7-H3; B7-H6; CD20; CD44; 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), bDGalpNAc(l-4)[aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)]bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer (GD2), aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(l-4)bDGlcp(l-l)Cer (GD3); 인간 백혈구 항원 Al MAGE 패밀리 멤버 Al (HLA-A1+MAGEA1); 인간 백혈구 항원 A2 MAGE 패밀리 멤버 Al (HLA-A2+MAGEA1); 인간 백혈구 항원 A3 MAGE 패밀리 멤버 Al (HLA-A3+MAGEA1); MAGEA1; 인간 백혈구 항원 Al 뉴욕 식도 편평 세포 암종 1 (FILA-Al+NY-ESO-l); 인간 백혈구 항원 A2 뉴욕 식도 편평 세포 암종 1 (HLA-A2+NY-ESO-l), 람다 경쇄, 카파 경쇄, 종양 상피 마커 5 (TEM5), 종양 상피 마커 7 (TEM7), 종양 상피 마커 8 (TEM8), TEM5, TEM7, TEM8, IFN-유도성 p78, 멜라노트랜스페린 (p97), 인간 칼리크레인 (huK2), Axl, ROR2, FKBP11, KAMP3, ITGA8, FCRL5, LAGA-1, CD133, cD34, EBV 핵 항원-1 (EBNA1), 잠복 막단백질 1 (LMPl) 및 LMP2A, CD75, gp100, MICA, MICB, MART1, 암배 항원, CA-125, MAGEC2, CTAG2, CTAG1, pd-l2, CLA, CD142, CD73, CD49c, CD66c, CD104, CD318, TSPAN8, CLEC14, 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1) 역전사효소 (RT), Cd16, BLTA, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21,IL-12, CCR4, CCR2b, 헤파라나제, CD137L, LEM, 및 Bcl-2, Msln, Cd8, IL-15, 4-1BBL, OX40L, 4- IBB, cd95, cd27, HVENM, CXCR4; 및 이의 조합. 일부 예에서, 표적화하려는 항원은 CXCR일 수 있다. 일부 예에서, 표적화하려는 항원은 PD-1일 수 있다.
일정 구현예예서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원은 종양-특이적 항원 (TSA)이다.
일정 구현예예서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원은 네오항원이다.
일정 구현예예서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원은 종양-연관 항원 (TAA)이다.
일정 구현예예서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원은 유니버설 종양 항원이다. 일부 바람직한 구현예에서, 유니버설 종양 항원은 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서비빈, 마우스 이중 미니트 2 상동체 (MDM2), 시토크롬 P450 1B 1 (CYP1B), HER2/neu, 빌름스 종양 유전자 1 (WT1), 리빈, 알파펙토단백질 (AFP), 암배 상원 (CEA), 뮤신 16 (MUC16), MUC1, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), p53 또는 사이클린 (Di), 및 이의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일정 구현예에서, 질환 (예컨대 특히 종양 또는 암)의 양자 세포 요법 (예컨대 특히 CAR 또는 TCR T-세포 요법)에서 표적화하려는 항원 (예컨대 종양 항원)은 CD19, BCMA, CD70, CLL-1, MAGE A3, MAGE A6, HPV E6, HPV E7, WT1, CD22, CD171, ROR1, MUC16, 및 SSX2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일정한 바람직한 구현예에서, 항원은 CD19일 수 있다. 예를 들어, CD19는 혈액학적 악성종, 예컨대 림프종, 보다 특히 B-세포 림프종, 예컨대 제한없이 미만성 거대 B-세포 림프종, 원발성 종격동 B-세포 림프종, 형질전환 여포성 림프종, 변연부 림프종, 맨틀 세포 림프종, 성인 및 소아 ALL을 포함한 급성 림프아구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 무통성 비호지킨 림프종, 또는 만성 림프구성 백혈병에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, BCMA는 다발성 골수종 또는 형질 세포 백혈병에서 표적화될 수 있다 (참조: 2018 American Association for Cancer Research (AACR) Annual meeting Poster: Allogeneic Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting B Cell Maturation 항원). 예를 들어, CLL1은 급성 골수성 백혈병에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, MAGE A3, MAGE A6, SSX2, 및/또는 KRAS는 고형 종양에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, HPV E6 및/또는 HPV E7은 자궁경부암 또는 두경부암에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, WT1은 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수이형성 증후군 (MDS), 만성 골수성 백혈병 (CML), 비소세포 폐암, 유방, 췌장, 난소 또는 직결장 암, 또는 중피종에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, CD22는 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 또는 급성 림프아구성 백혈병을 포함한, B 세포 악성종에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, CD171은 신경모세포종, 교모세포종, 또는 폐, 췌장, 또는 난소 암에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, ROR1은 비소세포 폐암, 삼중 음성 유방암, 췌장암, 전립선암, ALL, 만성 림프구성 백혈병, 또는 맨틀 세포 림프종을 포함한, ROR1+ 악성종에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, MUC16은 MUC16ecto+ 상피 난소, 나팔관 또는 원발성 복막 암에서 표적화될 수 있다. 예를 들어, CD70은 혈액학적 악성종뿐만 아니라 고형암 예컨대 신장 세포 암종 (RCC), 신경교종 (예를 들어, GBM), 및 두경부암 (HNSCC)에서 표적화될 수 있다. CD70은 혈액학적 종양과 고형암 둘 모두에서 발현되지만, 정상 조직에서 이의 발현은 림프구 세포 유형의 서브세트에 제한된다 (참조: 2018 American Association for Cancer Research (AACR) Annual meeting Poster: Allogeneic CRISPR Engineered Anti-CD70 CAR-T Cells Demonstrate Potent Preclinical Activity Against Both Solid and Hematological Cancer Cells).
일부 구현예에서, 표적 항원은 바이러스 항원이다. 많은 바이러스 항원 표적은 HIV, HTLV 및 다른 바이러스의 바이러스 게놈으로부터 유래된 펩티드를 포함한 것들이 동정되고 공지되어 있다 (참조: Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321; Tsomides et al. (1994) J Exp Med, 180, 1283-93; Utz et al. (1996) J Virol, 70, 843-51). 예시적인 바이러스 항원은 제한없이 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 (예를 들어, HBV 코어 및 표면 항원 (HBVc, HBVs)), C형 간염 바이러스 (HCV), 엡스테인-바 바이러스 (예를 들어, EBVA), 인간 파필로마마이러스 (HPV; 예를 들어 E6 및 E7), 인간 면역결핍 1형 바이러스 (HIV1), 카포시 육종 헤르페스 바이러스 (KSHV), 인간 파필로마 바이러스 (HPV), 인플루엔자 바이러스, 라싸 바이러스, HTLN-i, HIN-1, HIN-IL CMN, EBN 또는 HPN을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 단백질은 박테리아 항원 또는 다른 병원성 항원, 예컨대 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis) (MT) 항원, 트리파노솜 (trypanosome), 예를 들어, 티판소마 크루지 (Tiypansoma cruzi) (T. cruzi), 항원예컨대 표면 항원 (TSA), 또는 말라리아 항원이다. 특이적 바이러스 항원 또는 에피토프 또는 다른 병원성 항원 또는 펩티드 에피토프는 공지되어 있다 (참조: Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321; Anikeeva et al. (2009) Clin Immunol, 130, 98-109). 일부 구현예에서, 항원은 암과 연관된 바이러스, 예컨대 종양원성 바이러스로부터 유래된 항원이다. 예를 들어, 종양원성 바이러스는 일정 바이로스로부터의 감염이 상이한 유형의 암의 발생을 초래하는 것, 예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 파필로마 바이러스 (HPV), 간염 바이러스 감염, 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 인간 헤르페스 바이러스 8 (HHV-8), 인간 T-세포 백혈병 바이러스-1 (HTLV- 1), 인간 T-세포 백혈병 바이러스-2 (HTLV-2), 또는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 항원이다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 일부 경우에 자궁경부 및/또는 두경부 암을 발생시킬 더 큰 위험성을 초래하는 HPV 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 HPV-16 항원, 및 HPV-18 항원, 및 HPV-31 항원, HPV-33 항원 또는 HPV-35 항원이다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HPV-16 항원 (예를 들어, HPV-16 의 El, E2, E6 또는 E7 단백질의 혈청반응성 영역, 예를 들어, U.S. Pat. No. 6,531, 127 참고) 또는 HPV-18 항원 (예를 들어, U.S. Pat. No. 5,840,306 에 기재된 바와 같은, HPV-18 의 LI 및/또는 L2 단백질의 혈청반응성 영역) 이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 일부 경우에서, HBV 또는 HCV 음성 대상체에 비해서 간암이 발생될 더 큰 위험성을 초래할 수 있는 HBV 또는 HCV 항원이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종성 항원은 HBV 항원, 예컨대 B형 간염 바이러스 코어 항원 또는 B형 간염 바이러스 엔벨로프 항원이다 (US2012/0308580).
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 일부 경우에서 EBV 음성 대상체에 비해서 버킷 림프종, 비인두 암종 및 비호지킨 질환을 발생시킬 더 큰 위험성을 초래할 수 있는 EBV 항원이다. 예를 들어, EBV는 인간 헤르페스 바이러스로서, 일부 경우에 다양한 조직 기원의 수많은 인간 종양과 연관된 것으로 확인된다. 주로 무증상성 감염으로 발견되지만, EBV-양성 종양은 바이러스 유전자 산물, 예컨대 EBNA-1, LMP-1 및 LMP-2A의 활발한 발현을 특징으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 항원은 엡스타인-바 핵 항원 (EBNA)-l, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-리더 단백질 (EBNA- LP), 잠복 막 단백질 LMP- 1, LMP-2A 및 LMP-2B, EBV-EA, EBV-MA 또는 EBV- VCA를 포함할 수 있는 EBV 항원이다. 일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HTLV-1 또는 HTLV-2 음성 대조군에 비해서 T-세포 백혈병을 발생시킬 더 큰 위험성을 초래할 수 있는, HTLV-1 또는 HTLV-2 항원이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종성 항원은 HTLV- 항원, 예컨대 TAX이다.
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 HHV-8 음성 대상체에 비해서 카포시 육종을 발생시킬 더 큰 위험성을 초래할 수 있는, HHV-8 항원이다. 일부 구현예에서, 이종성 항원은 CMV 항원, 예컨대 pp65 또는 pp64 (참조: U.S. 특허 번호 8361473).
일부 구현예에서, 바이러스 항원은 바이러스-특이적 표면 항원 예컨대 HIV-특이적 항원 (예컨대 HIV gp120); EBV-특이적 항원, CMV-특이적 항원, HPV-특이적 항원, 라싸 바이러스-특이적 항원, 인플루엔자 바이러스-특이적 항원을 비롯하여 이들 표면 마커의 임의 유도체 또는 변이체이다.
일 양상에서, 본 발명은 특히 1형 신경섬유종증 (NF1) 신경유전 병태에 의해 유도되는 중추신경계의 종양의 치료를 제공한다. NF1을 갖는 개체는 NF1 유전자에 배선 돌연변이를 갖고 태어나지만, 자폐증 및 주의력 결핍부터 뇌 및 말초 신경초 종양의 범위에 걸쳐서, 수많은 개별 신경학적 문제가 발생될 수 있다. 본 발명은 환자-특이적 질환 모델을 개발하고 동질유전자 배경에서 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 질환 관련 세포를 연구하기 위해 사용될 수 있다. 유도 만능 줄기 세포 또는 iPSC로도 알려진, 배아 줄기 세포 (ESC)-유사 세포는 성인 환자의 피부 또는 혈액 세포로부터 생성될 수 있다. 최근의 연구 노력은 NF1 환자에 영향을 미치는 중추 및 말초 신경계 (CNS 및 PNS)에서 다양한 세포 유형으로 iPSC를 분화시키는 배양 프로토콜을 개발하기 위해 시작되었다. 본 발명의 CRISPR C2c1 시스템은 현존 돌연변이체 유전자를 복구하거나 또는 새로운 돌연변이를 창출하여 특이적 질환 유전자를 유전자 편집하는데 사용될 수 있다. NF1 연구의 최전선에 자리잡기 위해서, 국립 아동 의료 센터 (Children's National Medical Center)의 길버트 가족 신경섬유종증 연구소 (Gilbert Family Neurofibromatosis Institute) (GFNI)는 이들 최근의 흥미로운 연구 개발을 조사하고, 환자-특이적 인간 NF1 질환 모델을 체계적으로 개발하고, 개별 NF 환자에 대한 약물 스크리닝 및 평가를 위한 도구를 제공하는 것이 중요할 것이다.
앞서 언급한 것과 같은 접근은 선택된 항원에 결합하는 수용체를 인식하는 항원을 포함하는 유효량의 면역반응성 세포를 투여함으로써, 질환, 예컨대, 신생물을 갖는 대상체를 치료하고/하거나 생존을 증가시키는 방법을 제공하는 데 적합할 수 있으며, 여기서 결합은 면역반응성 세포를 활성화시켜서, 질환 (예컨대, 신생물, 병원균 감염, 자가면역 장애 또는 동종이계 이식 반응)을 치료하거나 또는 예방한다. CAR T 세포 요법에서 용량은, 예를 들어, 림프구고갈 과정의 존재 또는 부재로, 예를 들어 시클로포스파미드 존재에서, 106 내지 109개의 세포/㎏의 투여를 수반할 수 있다.
당업자는 상기 기술된 바와 유사한 시스템에서 본 발명에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템일 수 있다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부 서열인 PAM 서열을 인식할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 표적 유전자에 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 유전자의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
일 구현예에서, 치료는 면역억제 치료를 겪는 환자에게 투여될 수 있다. 세포 또는 세포 개체군은 이러한 면역억제제에 대한 수용체를 코딩하는 유전자의 불활성화에 기인하여 적어도 하나의 면역억제제에 대해 내성될 수 있다. 이론에 국한하지 않지만, 면역억제 치료는 환자 내에서 본 발명에 따른 면역억제 또는 T 세포의 선택 및 확장에 도움을 주어야 한다.
본 발명에 따른 세포 또는 세포 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식 주입 또는 이식을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 수행될 수 있다. 세포 또는 세포 개체군은 환자에게 피하로, 피내로, 종양내로, 낭내로, 척수내로, 근육내로, 정맥내로 또는 림프내 주사로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다.
세포 또는 세포 개체군의 투여는 104 내지 109 세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105 내지 106 세포/㎏ 체중 (해당 범위 내에서 세포의 모든 정수 값을 포함함)의 투여로 이루어질 수 있다. CAR T 세포 요법에서 용량은, 예를 들어, 림프구고갈 과정의 존재 또는 부재로, 예를 들어 시클로포스파미드 존재에서, 106 내지 109개의 세포/㎏의 투여를 수반할 수 있다. 세포 또는 세포 개체군은 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 유효량의 세포는 단일 용량으로서 투여된다. 다른 구현예에서, 유효량의 세포는 일정 기간에 걸쳐 1회 초과로서 투여된다. 투여 시기는 담당 의사의 판단 내이고, 환자의 임상적 병태에 의존한다. 세포 또는 세포 개체군은 임의의 공급원, 예컨대, 혈액 은행 또는 공혈자로부터 얻을 수 있다. 각각의 요구가 다르지만, 특정 질환 또는 병태에 대해 유효량의 주어진 세포 유형의 최적 범위의 결정은 당업자의 기술 내이다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이득을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 용량은 연령, 수용자의 건강상태 및 체중, 있다면 병용 치료의 종류, 치료 빈도 및 목적하는 효과의 특성에 따를 것이다.
다른 구현예에서, 해당 세포를 포함하는 유효량의 세포 또는 조성물은 비경구로 투여된다. 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 투여는 종양 내에서 주사에 의해 직접적으로 행해질 수 있다.
가능한 유해 반응에 대해 보호하기 위해, 조작된 면역반응성 세포는 특정 신호에 대한 노출에 취약한 세포를 제공하는 이식유전자의 형태로 유전자이식 안전성 스위치를 구비할 수 있다. 예를 들어, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(TK) 유전자가 이 방법에서, 줄기 세포 이식 후 공여자 림프구 주입으로서 사용되는 동종이계 T 림프구 내로 도입에 의해 사용될 수 있다 (Greco, et al., Improving the safety of cell therapy with the TK-suicide gene. Front. Pharmacol. 2015; 6: 95). 이러한 세포에서, 뉴클레오시드 프로드러그, 예컨대, 간시클로비어 또는 아시클로비어의 투여는 세포 사멸을 야기한다. 대안의 안전성 스위치 구성체는, 예를 들어 활성 효소를 형성하는 2개의 비기능성 icasp9 분자와 함께 소형 분자 이량체의 투여에 의해 촉발되는 유도성 카파제 9를 포함한다. 세포 증식 제어를 구현하기 위한 광범위하게 다양한 대안이 기술되었다 (참조: U.S. 특허 출원 공개 번호 20130071414; PCT 특허 공개 WO2011146862; PCT 특허 공개 WO2014011987; PCT 특허 공개 WO2013040371; Zhou et al. BLOOD, 2014, 123/25:3895 - 3905; Di Stasi et al., The New England Journal of Medicine 2011; 365:1673-1683; Sadelain M, The New England Journal of Medicine 2011; 365:1735-173; Ramos et al., Stem Cells 28(6):1107-15 (2010)).
양자 요법의 추가적인 개선에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 기능화된 CRISPR-Cas 시스템에 의한 게놈 편집은, 예를 들어 편집 CAR T 세포를 제공하는 대안적인 실행을 위해 면역반응성 세포를 재단하는데 사용될 수 있다 (Poirot et al., 2015, Multiplex genome edited T-cell manufacturing platform for " off-the-shelf" adoptive T-cell immunotherapies, Cancer Res 75 (18): 3853). 예를 들어, 면역반응성 세포는 HLA II형 및/또는 I형 분자 부류의 일부 또는 모두의 발현을 결실시키도록 또는 목적하는 면역 반응, 예컨대, PD1 유전자를 억제할 수 있는 선택 유전자를 녹아웃시키도록 편집될 수 있다.
세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 CRISPR 시스템 및 이의 사용 방법을 사용해 편집될 수 있다. CRISPR 시스템은 임의의 본 명세서에 기재된 방법에 의해 면역 세포에 전달될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 생체외에서 편집되고, 이를 필요로 하는 대상체에게 전달된다. 면역 반응성 세포 세포, CAR-T 세포 또는 양자 세포 전달을 위해 사용되는 임의의 세포는 편집될 수 있다. 편집은 잠재적인 동종반응성 T-세포 수용체 (TCR)를 제거하기 위해, 화학치료제의 표적을 붕괴시키기 위해, 면역 체크포인트를 차단하기 위해, T 세포를 활성화시키기 위해 및/또는 기능적으로 감손되거나 또는 기능장애 CD8+ T-세포의 분화 및/또는 증식을 증가시키기 위해 수행될 수 있다 (국제 특허 출원 공개: WO2013176915, WO2014059173, WO2014172606, WO2014184744 및 WO2014191128). 편집은 유전자의 불활성화를 초래할 수 있다.
유전자를 불활성화시켜서, 관심 유전자가 기능성 단백질 형태로 발현되지 않게 의도한다. 특정 구현예에서, CRISPR 시스템은 특히 하나의 표적화된 유전자에서 절단을 촉매하여 상기 표적화된 유전자를 불활성화시킨다. 초래된 핵산 가닥 파손은 일반적으로 상동성 재조합 또는 비상동성 말단 연결 (NHEJ)의 별개 기전을 통해 복구된다. 그러나, NHEJ는 종종 절단 부위에서 DNA 서열에 변화를 초래하는 불완전한 복구 과정이다. 비상동성 말단 연결 (NHEJ)를 통한 복구가 종종 작은 삽입 또는 결실 (Indel)을 야기시키고 특이적 유전자 녹아웃의 생성에 사용될 수 있다. 절단 유도된 돌연변이유발 사건이 발생된 세포는 당분야에 충분히 공지된 방법으로 확인 및/또는 선택할 수 있다.
T 세포 수용체(TCR)는 항원 제시에 반응하는 T 세포의 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체이다. TCR은 일반적으로, 이형이량체를 형성하도록 조립되고 세포 표면 상에 제시되는 T 세포 수용체 복합체를 형성하기 위해 CD3-형질도입 서브유닛과 회합하는 2개의 쇄, 즉, α 및 β로 이루어진다. TCR의 각각의 α 및 β 쇄는 면역글로불린-유사 N-말단의 가변 (V) 및 불변 (C) 영역, 소수성 막관통 도메인 및 짧은 세포질 영역으로 이루어진다. 면역글로불린 분자에 대해서와 같이, α 및 β 쇄의 가변 영역은 V(D)J 재조합에 의해 생성되어, T 세포 개체군 내에서 매우 다양한 항원 특이성을 생성시킨다. 그러나, 온전한 항원을 인식하는 면역글로불린과 대조적으로, T 세포는 MHC 분자와 회합되는 가공된 펩티드 단편에 의해 활성화되어, MHC 제한으로서 알려진 T 세포에 의한 항원 인식에 대해 여분의 차원을 도입한다. T 세포 수용체를 통한 도너와 수용자 사이의 MHC의 인식 차이는 T 세포 증식 및 이식편 대 숙주 반응 (GVHD)의 잠재적 발생을 야기한다. TCRα 또는 TCRβ의 불활성화는 T 세포 표면으로부터 TCR의 제거를 초래하여 동종항원의 인식을 방지하고 그에 따라 GVHD를 방지할 수 있다. 그러나, TCR 붕괴는 일반적으로 CD3 신호전달 성분의 제거를 초래하고 추가적인 T 세포 확장 수단을 변경시킨다.
동종이계 세포는 숙주 면역계에 의해 빠르게 거부된다. 비-방사선조사 혈액 생성물에 존재하는 동종이계 백혈구는 5 내지 6일 이하 동안 지속된다는 것이 입증되었다 (Boni, Muranski et al. 2008 Blood 1;112(12):4746- 54). 따라서, 동종이계 세포의 거부를 방지하기 위해, 숙주의 면역계는 일반적으로 어느 정도까지는 억제되어야 한다. 그러나, 양자 세포 전달의 경우에, 면역억제 약물의 사용이 또한 도입된 치료적 T 세포에 대해 해로운 효과를 갖는다. 그러므로, 이들 조건에서 양자 면역요법 접근을 효과적으로 사용하기 위해, 도입된 세포는 면역억제 치료에 내성일 필요가 있을 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은, 바람직하게는 면역억제제에 대한 표적을 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 불활성화에 의해, T 세포를 면역억제제에 내성이 되도록 변형시키는 단계를 추가로 포함한다. 면역억제제는 몇몇 작용 메커니즘 중 하나에 의해 면역 기능을 억제하는 작용제이다. 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 라파마이신의 표적, 인터루킨-2 수용체 α-쇄 차단제, 이노신 일인산 디히드로게나제의 억제제, 다이하이드로엽산 리덕타제의 억제제, 코티코스테로이드 또는 면역억제성 항대사물질일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명은 T 세포 내 면역억제제의 표적을 불활성화시킴으로써 면역요법을 위해 T 세포에 면역억제 내성을 부여하도록 허용한다. 비제한적 예로서, 면역억제제에 대한 표적은 면역억제제, 예컨대: CD52, 글루코코티코이드 수용체(GR), FKBP 패밀리 유전자 멤버 및 시클로필린 패밀리 유전자 멤버에 대한 수용체일 수 있다.
면역 체크포인트는 면역반응을 늦추거나 중단시키고, 면역 세포의 제어되지 않은 활성으로부터의 과도한 조직 손상을 방지하는 억제 경로이다. 일정 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 프로그램된 사멸-1 (PD-1 또는 CD279) 유전자 (PDCD1)이다. 다른 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 세포독성 T-림프구-연관 항원 (CTLA-4)이다. 추가의 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 CD28 및 CTLA4 Ig 수퍼패밀리의 다른 멤버 예컨대 BTLA, LAG3, ICOS, PDL1 또는 KIR이다. 더욱 추가의 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 TNFR 수퍼패밀리의 멤버 예컨대 CD40, OX40, CD137, GITR, CD27 또는 TIM-3 이다.
추가적인 면역 체크포인트는 Src 상동성 2 도메인-함유 단백질 티로신 포스파타제 1 (SHP-1)을 포함한다 (Watson HA, et al., SHP-1: the next checkpoint target for cancer immunotherapy? Biochem Soc Trans. 2016 Apr 15;44(2):356- 62). SHP-1은 널리 발현되는 억제성 단백질 티로신 포스파타제 (PTP)이다. T-세포에서, 이는 항원-의존적 활성화 및 증식의 음성 조절자이다. 이는 시토졸 단백질이고, 따라서 항체-매개 요법을 받을 수 없지만, 활성화 및 증식에서 이의 역할은 양자 전달 전략, 예컨대, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포에서 유전자 조작을 위한 매력적인 표적이 되게 한다. 면역관문은 또한 Ig 및 ITIM 도메인(TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9) 및 VISTA를 갖는 T 세포 면역수용체를 포함할 수 있다 (Le Mercier I, et al., (2015) Beyond CTLA-4 and PD-1, the generation Z of negative checkpoint regulators. Front. Immunol. 6:418).
WO2014172606은 고갈된 CD8+ T-세포의 증식 및/또는 활성을 증가시키기 위해서, 그리고 CD8+ T-세포 고갈을 감소 (예를 들어, 기능적으로 고갈되거나 또는 비반응성인 CD8+ 면역 세포를 감소)시키기 위해 MT1 및/또는 MT1 억제제의 사용에 관한 것이다. 일정 구현예에서, 메탈로티오네인은 양자 전달된 T 세포 내 유전자 편집에 의해 표적화된다.
일정 구현예에서, 유전자 편집의 표적은 면역 체크포인트 단백질의 발현에 관여되는 적어도 하나의 표적화된 유전자좌일 수 있다. 이러한 표적은 CTLA4, PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, PDCD1, ICOS (CD278), PDL1, KIR, LAG3, HAVCR2, BTLA, CD160, TIGIT, CD96, CRTAM, LAIR1, SIGLEC7, SIGLEC9, CD244 (2B4), TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, VISTA, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3, MT1, MT2, CD40, OX40, CD137, GITR, CD27, SHP-1, TIM-3, CEACAM-1, CEACAM-3, 또는 CEACAM-5을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 구현예에서, PD-1 또는 CTLA-4 유전자의 발현에 관여되는 유전자의 유전자좌가 표적화된다. 다른 바람직한 구현예에서, 유전자의 조합은, 예컨대, PD-1 및 TIGIT로 표적화되지만, 이들로 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 적어도 2개의 유전자가 편집된다. 유전자의 쌍은 PD1과 TCRα, PD1과 TCRβ, CTLA-4와 TCRα, CTLA-4와 TCRβ, LAG3과 TCRα, LAG3과 TCRβ, Tim3과 TCRα, Tim3과 TCRβ, BTLA와 TCRα, BTLA와 TCRβ, BY55와 TCRα, BY55와 TCRβ, TIGIT와 TCRα, TIGIT와 TCRβ, B7H5와 TCRα, B7H5와 TCRβ, LAIR1과 TCRα, LAIR1과 TCRβ, SIGLEC10과 TCRα, SIGLEC10과 TCRβ, 2B4와 TCRα, 2B4와 TCRβ를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
T 세포의 유전자 변형 이전이건 또는 이후이건 간에, T 세포는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,232,566호; 제7,175,843; 5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 제7,572,631호에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화 및 확장될 수 있다. T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 확장될 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 통상의 기술을 사용한다. 참조: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989) (Sambrook, Fritsch and Maniatis); MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 4th edition (2012) (Green and Sambrook); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1987) (F. M. Ausubel, et al. eds.); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds.); ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (1988) (Harlow and Lane, eds.); ANTIBODIES A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (2013) (E.A. Greenfield ed.); 및 ANIMAL CELL CULTURE (1987) (R.I. Freshney, ed.).
본 발명의 실시는 달리 표시하지 않으면 유전자 변형 마우스의 생성을 위해 통상의 기술을 적용한다. 참조: Marten H. Hofker and Jan van Deursen, TRANSGENIC MOUSE METHODS AND PROTOCOLS, 2nd edition (2011).
CRISPR 시스템을 이용하는 스크리닝/진단/치료
암
본 발명의 방법 및 조성물은 세포의 약물 내성 및 지속성과 연관된 세포 상태, 성분 및 메커니즘을 확인하는 데 사용될 수 있다. Terai 등 (Cancer Research, 19-Dec-2017, doi: 10.1158/0008- 5472.CAN-17-1904)]은 에를로티닙/THZ1 상승효과가 향상된 다중 유전자뿐만 아니라 상승효과를 억제하는 성분 및 경로를 확인하기 위해 에를로티닙 + THZ1(CDK7/12 저해제) 병용 요법으로 처리된 EGFR-의존적 폐암 PC9 세포에서의 게놈-와이드 CRISPR/Cas9 인핸서/억제자 선별을 보고하였다. Wang 등 (Cell Rep. 2017 Feb 7;18(6):1543- 1557. doi: 10.1016/j.celrep.2017.01.031.; Krall et al., Elife. 2017 Feb 1;6. pii: e18970. doi: 10.7554/eLife.18970)]은 MAPK 저해제에 대한 내성의 매개체를 확인하기 위한 게놈-와이드 CRISPR 기능 상실 선별의 사용을 보고하였다. Donovan 등 (PLoS One. 2017 Jan 24;12(1):e0170445. doi: 10.1371/journal.pone.0170445. eCollection 2017)]은 MAPK 신호전달 경로 유전자의 신규한 기능획득 및 약물 내성 대립유전자를 동정하기 위해 돌연변이유발에 대한 CRISPR-매개 접근을 사용하였다. Wang 등 (Cell. 2017 Feb 23;168(5):890-903.e15. doi: 10.1016/j.cell.2017.01.013. Epub 2017 Feb 2)은 종양유전자 Ras와 합성의 치명적 상호작용 및 유전자 네트워크를 확인하기 위해 게놈-와이드 CRISPR 스크린을 사용하였다. Chow 등 (Nat Neurosci. 2017 Oct;20(10):1329- 1341. doi: 10.1038/nn.4620. Epub 2017 Aug 14)]은 교아세포종에서 기능성 억제자를 확인하기 위해 교아세포종에서 아데노-연관 바이러스-매개, 자생종 유전자 CRISPR 선별을 개발하였다. Xue 등 (Nature. 2014 Oct 16;514(7522):380-4. doi: 10.1038/nature13589. Epub 2014 Aug 6)은 마우스 간에서 암의 유전자의 CRISPR-매개 직접 돌연변이를 적용하였다.
Chen 등 (J Clin Invest. 2017 Dec 4. pii: 90793. doi: 10.1172/JCI90793. [Epub ahead of print])은 EZH2에 대한 MYCN-증폭된 신경아세포종 의존성을 확인하기 위해 CRISPR-기반 스크린을 사용하였다. MYCN-증식 신경아세포종을 갖는 환자에서 EZH2 억제제의 시험을 뒷받침한다.
Vijai 등 (Cancer Discov. 2016 Nov;6(11):1267- 1275. Epub 2016 Sep 21)]은 유방암의 위험을 평가하기 위해 유방 상피 세포주에서 이형접합적 돌연변이를 생성하는 CRISPR의 사용을 보고하였다.
Chakraborty 등 (Sci Transl Med. 2017 Jul 12;9(398). pii: eaal5272. doi: 10.1126/scitranslmed.aal5272)]은 투명 세포 신세포 암종을 치료하기 위한 잠재적 표적으로서 EZH1을 동정하기 위해 CRISPR-기반 선별을 사용하였다.
대사 질환
본 발명의 방법 및 조성물은 가족성 과콜레스테롤혈증, 혈우병, 오르니틴 트랜스 카비미라제 결핍증, 유전성 티로신혈증 1형, 및 알파-1 항트립신 결핍증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 간의 유전성 대사 질환 치료에서 통상적인 유전자 요법 이상의 이점을 제공한다. 참조: Bryson et al., Yale J. Biol. Med. 90(4):553-566, 19-Dec-2017.
Bompada 등 (Int J Biochem Cell Biol. 2016 Dec;81(Pt A):82- 91. doi: 10.1016/j.biocel.2016.10.022. Epub 2016 Oct 29)]은 히스톤 아세틸화가 TXNIP 유전자 발현에서 글루코스-유도 증가 및 이에 의한 당독성-유도 아폽토시스의 중요한 조절자로서 작용한다는 것을 입증하기 위해 췌장 베타 세포에서 히스톤 아세틸트랜스퍼라제를 녹아웃시키기 위한 CRISPR의 사용을 기재하였다.
눈
본 발명은 망막의 유전성 및 후천성 안질환의 효율적인 치료를 제공한다. Holmgaard 등 (Mol. Ther. Nucleic Acids 9:89- 99, 15-Dec-2017 doi:10.1016/j.omtn.2017.08.016. Epub 2017 Sep 21)]은 Vegfa에 표적화된 SpCas9를 암호화하는 렌티바이러스 벡터(LV)에 의해 SpCas9가 전달될 때 고빈도의 삽입결실과, 형질도입 세포에서 VEGFA의 상당한 감소가 있었다는 것을 보고하였다. Duan 등 (J Biol Chem. 2016 Jul 29;291(31):16339-47. doi: 10.1074/jbc.M116.729467. Epub 2016 May 31)은 인간 초대 망막 색소 상피 세포에서 MDM2 게놈 유전자좌를 표적으로 하기 위한 CRISPR의 용도를 기술한다.
본 발명의 방법 및 조성물은 노인성 황반 변성을 포함하는 안질환의 치료에 유사하게 적용 가능하다.
Huang 등 (Nat Commun. 2017 Jul 24;8(1):112. doi:10.1038/s41467-017-00140-3]은 혈관신생-연관 질환을 치료하기 위해 VEGFR2를 편집하는 데 CRISPR를 사용하였다.
청력
Gao 등 (Nature. 2017 Dec 20. doi:10.1038/nature25164. [Epub ahead of print])]은 마우스에서 Tmc1 유전자를 표적화하고 진행성 청력상실 및 귀먹음을 감소시키기 위해 CRISPR-Cas9를 이용하는 게놈 편집을 보고하였다.
근육
Provenzano 등 (Mol Ther Nucleic Acids. 9:337- 348. 15-Dec-2017;. doi: 10.1016/j.omtn.2017.10.006. Epub 2017 Oct 14)은 근긴장성 이영양증 1 환자로부터의 근원성 세포에서 CTG 확장 및 정상 표현형으로의 영구한 전환의 CRISPR/Cas9-매개 결실을 보고하였다. 본 발명의 방법 및 조성물은 CTG 확장으로 제한되지 않는 뉴클레오티드 반복 장애에 유사하게 적용 가능하다. Tabebordbar 등 (2016 Jan 22;351(6271):407- 411. doi: 10.1126/science.aad5177. Epub 2015 Dec 31)]은 DMD에서 파괴적 돌연변이를 보정하기 위해 Dmd 엑손 23 좌위를 편집하는 CRISPR의 사용을 보고한다. Tabebordbar는 프로그램 가능한 CRISPR 복합체가 신생 및 성체 마우스에서 말단으로 분화된 골격근 섬유 및 심장 근육 세포뿐만 아니라 근위성 세포에 국소로 그리고 전신으로 전달될 수 있으며, 그들이 표적화된 유전자 변형을 매개하는 경우에, 디스트로핀 발현을 회복시키고, 이영양성 근육의 기능성 결핍증을 부분적으로 회복시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 참조: Nelson et al., (Science. 2016 Jan 22;351(6271):403-7. doi: 10.1126/science.aad5143. Epub 2015 Dec 31).
감염성 질환
Sidik 등 (Cell. 2016 Sep 8;166(6):1423-1435.e12. doi: 10.1016/j.cell.2016.08.019. Epub 2016 Sep 2) 및 Patel 등 (Nature. 2017 Aug 31;548(7669):537-542. doi: 10.1038/nature23477. Epub 2017 Aug 7)은 톡소플라스마에서 CRISPR 스크린 및 항기생충 중재술의 확장을 기술한다.
숙주-병원균 상호작용의 근간을 이루는 성분 및 과정을 확인하기 위한 게놈-와이드 CRISPR 스크리닝의 몇몇 보고가 있다. 예에는 다음의 문헌들이 포함된다: Blondel et al. (Cell Host Microbe. 2016 Aug 10;20(2):226-37. doi: 10.1016/j.chom.2016.06.010. Epub 2016 Jul 21), Shapiro et al. (Nat Microbiol. 2018 Jan;3(1):73-82. doi: 10.1038/s41564-017-0043-0. Epub 2017 Oct 23) 및 Park et al. (Nat Genet. 2017 Feb;49(2):193-203. doi: 10.1038/ng.3741. Epub 2016 Dec 19).
Ma 등 (Cell Host Microbe. 2017 May 10;21(5):580- 591.e7. doi: 10.1016/j.chom.2017.04.005)]은 치료적 개입을 위한 바이러스 형질전환-유도 합성 치사 표적을 확인하기 위해 게놈-와이드 CRISPR 기능 상실 선별을 사용하였다.
심혈관 질환
CRISPR 시스템은 혈관 질환과 연관된 유전자 또는 유전자 변이체를 동정하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 이는 잠재적인 치료 또는 예방 표적을 동정하는 데 유용하다. Xu 등 (Atherosclerosis, 2017 Sep. 21 pii: S0021-9150(17)31265-0. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2017.08.031. [Epub ahead of print])은 LDL-C의 혈장 수준 조절에서 ANGPTL3의 역할을 확인하기 위해서 ANGPTl3을 녹아웃시키기 위한 CRISPR의 용도를 보고한다. Gupta 등 (Cell. 2017 Jul 27;170(3):522-533.e15. doi: 10.1016/j.cell.2017.06.049)은 혈관 질환과 연관된 유전자 변이체를 동정하기 위해 줄기 세포-유래 내피 세포를 편집하기 위한 CRISPR의 용도를 보고한다. Beaudoin 등 (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2015 Jun;35(6):1472-1479. doi: 10.1161/ATVBAHA.115.305534. Epub 2015 Apr 2)은 유전자좌에서 전사 인자 MEF2의 결합을 파괴하기 위한 CRISPR 게놈 편집의 용도를 보고한다. 혈관내피에서 PHACTR1 기능이 관상동맥 질환이 영향을 미치는 방법을 연구하는 단계를 설정한다. Pashos 등 (Cell Stem Cell. 2017 Apr 6;20(4):558- 570.e10. doi: 10.1016/j.stem.2017.03.017.)]은 기능성 변이체 및 지질 기능성 유전자를 동정하기 위해 다능성 줄기 세포 및 간세포-유사 세포를 표적화하는 CRISPR 기술을 이용하는 것을 보고한다.
표적을 동정하기 위한 도구로서 사용되는 것에 추가로, CRISPR 시스템은 공지된 표적에 대해 심혈관 질환을 치료하거나 또는 예방하기 위해 직접적으로 사용될 수 있다. Khera 등 (Nat Rev Genet. 2017 Jun;18(6):331- 344. doi:10.1038/nrg.2016.160. Epub 2017 Mar 13)]은 새로운 치료의 생물학 연구의 기저를 이루는 원인 위험 인자의 더 양호한 이해를 용이하게 하기 위해 사용되는 관상동맥 위험에 대략 60개의 유전자 좌위를 연결하는 통상적인 변이체 연관 연구를 기재하였다. Khera는, 예를 들어 PCSK9에서의 비활성화 돌연변이가 순환 LDL 콜레스테롤 수준을 감소시키고, PCSK9 억제제 개발에서 강력한 관심을 야기하는 CAD의 위험을 감소시켰다는 것을 설명한다. 추가로, APOC3 또는 LPA에서 보호적 돌연변이를 모방하도록 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 트라이글리세라이드 수준의 대략 70% 감소 및 순환 지질단백질(a) 수준의 80% 감소를 각각 입증하였다. 또한, Wang 등 (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2016 May;36(5):783-6. doi: 10.1161/ATVBAHA.116.307227. Epub 2016 Mar 3) and Ding et al. (Circ Res. 2014 Aug 15;115(5):488-92. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.115.304351. Epub 2014 Jun 10.)은 심혈관 질환의 예방을 위해 유전자 Pcsk9를 표적화하기 위한 CRISPR의 용도를 보고한다.
본 발명은 신경학적 질환 및 장애를 연구하고 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. Nakayama 등 (Am J Hum Genet. 2015 May 7;96(5):709- 19. doi:10.1016/j.ajhg.2015.03.003. Epub 2015 Apr 9)]은 인간 CNS 발생에서 PYCR2의 역할을 연구하기 위한 그리고 소두증 및 수초형성부전증에 대한 잠재적 표적을 확인하기 위한 CRISPR의 사용을 보고한다. Swiech 등 (Nat Biotechnol. 2015 Jan;33(1):102- 6. doi:10.1038/nbt.3055. Epub 2014 Oct 19)]은 생체내에서 성체 마우스 뇌에서의 단일(Mecp2)뿐만 아니라 다중 유전자(Dnmt1, Dnmt3a 및 Dnmt3b)를 표적화하기 위한 CRISPR의 사용을 보고한다. Shin 등 (Hum Mol Genet. 2016 Oct 15;25(20):4566- 4576. doi:10.1093/hmg/ddw286)]은 헌팅톤병 돌연변이를 비활성화시키기 위한 CRISPR의 사용을 보고한다. Platt 등 (Cell Rep. 2017 Apr 11;19(2):335- 350. doi: 10.1016/j.celrep.2017.03.052)]은 자폐 스펙트럼 장애에서 Chd8의 역할을 확인하기 위한 CRISPR 녹인 마우스의 사용을 보고한다. Seo 등 (J Neurosci. 2017 Oct 11;37(41):9917-9924. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0621-17.2017. Epub 2017 Sep 14)은 신경퇴행성 장애의 모델을 생성시키기 위한 CRISPR의 용도를 기 술한다. Petersen 등 (Neuron. 2017 Dec 6;96(5):1003- 1012.e7. doi: 10.1016/j.neuron.2017.10.008. Epub 2017 Nov 2)]은 재수초화되지 않는 질환에 대한 잠재적 표적을 동정하기 위해 희소돌기교세포 전구 세포에서의 액티빈 A 수용체 I형의 CRISPR 녹아웃을 입증한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 유사하게 적용 가능하다.
CRISPR 기술의 다른 적용분야
Renneville 등 (Blood. 2015 Oct 15;126(16):1930-9. doi: 10.1182/blood-2015-06-649087. Epub 2015 Aug 28)]은 태아 헤모글로빈 발현에서 EHMT1 및 EMHT2의 역할을 연구하기 위한 그리고 SCD에 대한 신규한 치료적 표적을 동정하기 위한 CRISPR의 사용을 보고한다.
Tothova 등 (Cell Stem Cell. 2017 Oct 5;21(4):547-555.e8. doi: 10.1016/j.stem.2017.07.015)은 인간 골수성 질환의 모델을 생성시키기 위한 조혈 줄기 및 전구체 세포에서 CRISPR의 용도를 보고한다.
Giani 등 (Cell Stem Cell. 2016 Jan 7;18(1):73- 78. doi: 10.1016/j.stem.2015.09.015. Epub 2015 Oct 22)]은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 게놈 편집에 의한 SH2B3의 비활성화는 보존된 분화에 의한 향상된 적혈구 세포 확장을 허용하였다는 것을 보고한다.
Wakabayashi 등 (Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 19;113(16):4434-9. doi: 10.1073/pnas.1521754113. Epub 2016 Apr 4)은 인간 적혈구 장애에서 넌코딩 변이체의 병원성을 조사하고 GATA1 전사 활성에 관한 통찰력을 획득하기 위해 CRISPR을 적용하였다.
Mandal 등 (Cell Stem Cell. 2014 Nov 6;15(5):643- 52. doi: 10.1016/j.stem.2014.10.004. Epub 2014 Nov 6)]은 1차 인간 CD4+ T 세포 및 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에서 2가지의 임상적으로 적절한 유전자, 즉, B2M 및 CCR5의 CRISPR/Cas9 표적화를 기재한다.
Polfus 등 (Am J Hum Genet. 2016 Sep 1;99(3):785. doi: 10.1016/j.ajhg.2016.08.002. Epub 2016 Sep 1)]은 조혈 세포주를 편집하고, 후속적으로 1차 인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 표적화된 녹다운 실험을 하고, 인간 조혈에서 GFI1B 변이체의 역할을 연구하기 위해 CRISPR을 사용하였다.
Najm 등 (Nat Biotechnol. 2017 Dec 18. doi: 10.1038/nbt.4048. [Epub ahead of print])]은 MAPK 경로 유전자 및 세포자멸사 유전자를 포함하는 다중 세포유형에 걸쳐 합성 치사 및 완충 유전자 쌍을 확인하기 위해 고-복잡성 풀링 이중-녹아웃 라이브러리를 생성하는 이중 표적화를 달성하기 위한 SaCas9와 SpCas9 쌍을 갖는 CRISPR 복합체의 사용을 보고한다.
Manguso 등 (Nature. 2017 Jul 27;547(7664):413-418. doi: 10.1038/nature23270. Epub 2017 Jul 19.)은 신규한 면역요법 표적의 동정 및/또는 확증을 위한 CRISPR 스크린의 용도를 보고한다. 참조: Roland et al. (Proc Natl Acad Sci USA. 2017 Jun 20;114(25):6581-6586. doi: 10.1073/pnas.1701263114. Epub 2017 Jun 12.); Erb et al. (Nature. 2017 Mar 9;543(7644):270-274. doi: 10.1038/nature21688. Epub 2017 Mar 1.); Hong et al., (Nat Commun. 2016 Jun 22;7:11987. doi: 10.1038/ncomms11987); Fei et al., (Proc Natl Acad Sci USA. 2017 Jun 27;114(26):E5207-E5215. doi: 10.1073/pnas.1617467114. Epub 2017 Jun 13.); Zhang et al., (Cancer Discov. 2017 Sep 29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-17-0532. [Epub ahead of print]).
Joung 등 (Nature. 2017 Aug 17;548(7667):343-346. doi: 10.1038/nature23451. Epub 2017 Aug 9.)은 긴 넌코딩 RNA (lncRNA)를 분석하기 위해 게놈-와이드 스크리닝의 용도를 보고한다; 참조: Zhu et al., (Nat Biotechnol. 2016 Dec;34(12):1279-1286. doi: 10.1038/nbt.3715. Epub 2016 Oct 31); Sanjana et al., (Science. 2016 Sep 30;353(6307):1545-1549).
Barrow 등 (Mol Cell. 2016 Oct 6;64(1):163-175. doi: 10.1016/j.molcel.2016.08.023. Epub 2016 Sep 22.)은 미토콘드리아 질환에 대한 치료 표적을 검색하기 위한 게놈-와이드 CRISPR 스크린의 용도를 보고한다. 참조: Vafai et al., (PLoS One. 2016 Sep 13;11(9):e0162686. doi: 10.1371/journal.pone.0162686. eCollection 2016).
Guo 등 (Elife. 2017 Dec 5;6. pii: e29329. doi: 10.7554/eLife.29329)]은 인간 성장을 위한 생물학적 메커니즘을 설명하기 위해 인간 연골세포를 표적화하는 CRISPR의 사용을 보고한다.
Ramanan 등 (Sci Rep. 2015 Jun 2;5:10833. doi: 10.1038/srep10833)]은 HBV 게놈에서 보존된 영역을 표적화하고 절단하는 CRISPR의 사용을 보고한다.
유전자 구동
본 발명은 예를 들어, PCT 출원 공개 WO 2015/105928에 기술된 유전자 구동과 유사한 시스템에서, RNA-가이드된 유전자 구동을 제공하기 위해서, 본 명세서에 기술된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질 시스템의 용도를 포괄한다. 이러한 종류의 시스템은 예를 들어 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 및 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 배선 세포로 도입시켜서, 진핵생물 배선 세포를 변경시키기 위한 방법을 제공할 수 있다. 가이드 RNA는 배선 세포의 게놈 DNA 상의 하나 이상의 표적 위치에 상보성이도록 설계될 수 있다. RNA 가이드된 DNA 뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열 및 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열은 측접된 서열 사이에 구성체 상에 제공될 수 있고, 프로모터는 배선 세포가 또한 측접 서열 사이에 위치된 임의의 바람직한 카고-코딩 서열과 함께, RNA 가이드된 DNA 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 발현할 수 있도록 배열된다. 측접 서열은 전형적으로 선택된 표적 염색체 상의 상응하는 서열과 동일한 서열을 포함하게 될 것이고, 그래서 측접 서열은 배선 세포를 외래 핵산 서열에 동형접합이게 만들기 위해서, 상동성 재조합같은 기전에 의해 표적 절단 부위에서 게놈 DNA로 외래 핵산 구성체 서열의 삽입을 촉진하도록 구성체에 의해 코딩되는 성분과 함께 작용한다. 이러한 방식으로, 유전자-구동 시스템은 번식 개체군 전체에서 바람직한 카고 유전자를 이입시킬 수 있다 (Gantz et al., 2015, Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi, PNAS 2015, published ahead of print November 23, 2015, doi:10.1073/pnas.1521077112; Esvelt et al., 2014, Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations eLife 2014;3:e03401). 일부 구현예에서, 본 발명은 곤충의 번식 개체군 전체에서 바람직한 카고 융전지를 이입시키는 유전자-구동 시스템에 의해, 말라리아, 지카 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 및 뎅기 바이러스를 포함한 곤충 매개 질환을 통제하기 위한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 유전자-구동 시스템은 CRISPR- C2c1 시스템이다. 특정 구현예에서, 곤충은 모기이다. 선택 구현예예서, 표적 서열은 게놈 내 소수의 잠재적 오프-표적 부위를 갖는 것이 선택될 수 있다. 다중 가이드 RNA를 사용하여, 표적 유전자좌 내 다중 부위의 표적화는 절단 빈도를 증가시킬 수 있고, 구동 내성 대립유전자의 진화를 방해할 수 있다. 절두된 가이드 RNA는 오프-표적 절단을 감소시킬 수 있다. 쌍형성 닉카제는 특이성을 더 증가시키기 위해, 단일 뉴클레아제 대신에 사용될 수 있다. 유전자 구동 구성체는 예를 들어 상동성 재조합 유전자를 활성화시키고/시키거나 비상동성 말단-연결을 억제하기 위해, 전사 조절인자를 코딩하는 카고 서열을 포함할 수 있다. 표적 부위는 필수 유전자 내에서 선택되어서, 비상동성 말단-연결 사건이 구동-내성 대립유전자를 생성하는 대신에 치사성을 초래할 수 있다. 유전자 구동 구성체는 다양한 온도 범위에서 다양한 숙주에서 기능하도록 조작될 수 있다 (Cho et al. 2013, Rapid and Tunable Control of Protein Stability in Caenorhabditis elegans Using a Small Molecule, PLoS ONE 8(8): e72393. doi:10.1371/journal.pone.0072393). 본 명세서에 개시된 CRISPR-C2c1 시스템은 Ganz 등 및 Cho 등이 기술한 바와 유사한 구동 구성체 및 시스템에 적용될 수 있고, 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 번식 조절에 관여되는 유전자를 변형시킨다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 질환 관련 유전자를 변형시킨다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축 생물량 관련 유전자를 변형시킨다. 일정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축 형질 관련 유전자를 변형시킨다. 일부 구현예에서, 형질 관련 유전자는 해충 및 진균 감염 감수성에 관여된다. 특정 구현에예서, CRISPR-C2c1 시스템은 곤충 세포에 전달된다. 특정 구현예에서, 곤충 세포는 꿀벌 세포이다. 일부 구현에예서, CRISPR-C2c1 시스템은 동물 세포에 전달된다. 일부 구현에예서, CRISPR-C2c1 시스템은 비동물 포유동물 세포에 전달된다. 특정 구현예에서, 형질 관련 유전자는 지방 과다의 조절에 관여된다. C2c1 단백질과 관련하여, CRISPR-C2c1 시스템은 T-풍부의 PAM 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3' 이며, 여기서 N 은 임의의 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 5' 오버행을 갖는 하나 이상의 스태거드 이중 가닥 파손 (DSB)을 도입시킨다. 특정 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt 이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 HR 또는 NHEJ를 통해서 스태거드 DSB에서 외생성 주형 DNA 서열을 도입시킨다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 닉카제이다. 일부 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 표적 관심 유전자좌를 변형시키는 기능성 도메인과 연관된 촉매적으로 불활성화된 C21 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 단일 돌연변이를 도입시킨다. 다른 특정 구현예에서, CRISPR-C2c1 시스템은 가축의 게놈을 변형시키지 않고 관심 표적 유전자좌의 전사물에 단일 뉴클레오티드 변형을 도입시킨다.
이종이식
본 발명은 또한 이식을 위해 변형된 조직을 제공하는데 사용하도록 적합화된 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 제공하기 위해서, 본 명세서에 기술된 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어 C2c1 이펙터 단백질 시스템의 용도를 고려한다. 예를 들어, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제는 예를 들어 인간 면역계에 의해 인식되는 에피토프를 코딩하는 유전자, 즉 이종항원 유전자의 발현을 파괴하여, 유전자이식 돼지 (예컨대 인간 헴 옥시게나제-1 유전자이식 돼지 품종) 같은 동물에서 선택된 유전자를 녹아웃, 녹다운 또는 파괴시키는데 사용될 수 있다. 파괴를 위한 후보 돼지 유전자는 예를 들어 α(l,3)-갈락토실트랜스퍼라제 및 시티딘 모노포스페이트-N-아세틸뉴라민산 히드록실라제 유전자를 포함할 수 있다 (참조; PCT 공개 출원 WO 2014/066505). 또한, 내생성 레트로바이러스를 코딩하는 유전자는 예를 들어, 모든 돼지 내생성 레트로바이러스를 코딩하는 유전자를 파괴할 수 있다 (참조: Yang et al., 2015, Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs), Science 27 November 2015: Vol. 350 no. 6264 pp. 1101-1104). 또한, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제는 초급성 거부에 대한 보호성을 제공하기 위해 인간 CD55 유전자같은, 이종이식 도너 동물에서 추가 유전자의 통합을 위한 부위를 표적화하는데 사용될 수 있다.
일반적 유전자 치료 고려사항
질병-연관 유전자 및 폴리뉴클레오티드 및 질병 특이 정보의 예는 월드 와이드 웹 상에서 입수 가능한 존스홉킨스대학교(Johns Hopkins University)(미국 메릴랜드주 볼티모어 소재)의 맥쿠식-네이선스 유전의학 연구소(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine) 및 국립 생명 기술 정보 센터(National Center for Biotechnology Information), 국립 의학 도서관(National Library of Medicine)(미국 메릴랜드주 베데스다 소재)로부터 입수할 수 있다.
이들 유전자 및 경로에서의 돌연변이는 작용에 영향을 미치는 부적절한 양의 단백질 또는 부적절한 단백질의 생산을 초래할 수 있다. 유전자, 질병 및 단백질의 추가 예는 2012년 12월 12일 출원된 US 가출원 61/736,527로부터 참고로 본 명세서에 포함다. 이러한 유전자, 단백질 및 경로는 본 발명의 CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 질환-연관 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 표 7 및 8에 열거되어 있다. 신호전달 생화학 경로-관련 유전자 및 폴리뉴클레오티드의 예는 표 9에 열거되어 있다.
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또한, 본 발명의 구현예는 유전자의 녹아웃, 유전자의 증폭 및 DNA 반복부 불안정성 및 신경계 장애와 관련된 특정 돌연변이의 복구에 관한 방법 및 조성물에 관한 것이다(문헌[Robert D.Wells, Tetsuo Ashizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, Second Edition, Academic Press, Oct 13, 2011 - Medical). 탠덤 반복 서열의 특이적 양태는 20 개 초과의 인간 질병에 원인임이 발견되었다(문헌[New insights into repeat instability:role of RNA·DNA hybrids.McIvor EI, Polak U, Napierala M. RNA Biol. 2010 Sep-Oct;7(5):551-8). 본 발명의 이펙터 단백질 시스템은 게놈 불안정성의 이들 결함을 편집하기 위해 활용될 수 있다.
본 발명의 여러 추가 양태는 국립 보건원의 웹사이트에서 토픽 서브섹션 유전 장애(Genetic Disorders)(웹사이트 health.nih.gov/topic/GeneticDisorders) 하에 추가 기재된 광범위한 유전 질병과 연관된 결함을 편집하는 것에 관한 것이다. 유전 뇌 질병은 부신백질 이영양증, 뇌량의 무발육, 에카르디 증후군, 알퍼스 병, 알츠하이머병, 바쓰 증후군, 바텐병, CADASIL, 소뇌 변성, 파브리병, 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커병, 헌팅턴병 및 기타 다른 트리플릿 반복 장애, 라이병, 레시-니한 증후군, 멘케스병, 미토콘드리아 근병증 및 NINDS 거대후두각을 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 이들 질병은 국립보건원의 웹사이트에서 서브섹션 유전 뇌 장애 하에 추가 기재되어 있다.
본 개시 전반에서 CRISPR 또는 CRISPR-Cas 복합체 또는 시스템을 언급하였다. CRISPR 시스템 또는 복합체는 핵산 분자를 표적화할 수 있고, 예를 들어 CRISPR-C2c1 복합체는 표적 DNA 분자를 표적화하고 절단하거나 또는 닉킹하거나 또는 단순히 자리잡을 수 있다 (C2c1이 닉카제 또는 "데드" 가 되게하는 돌연변이를 갖는지에 따라서). 이러한 시스템 또는 복합체는 후보 질환 유전자의 조직-특이적 및 일시적으로 제어된 표적화된 결실을 달성할 수 있다. 예들은 콜레스테롤 및 지방산 대사, 아밀로이드 질환, 우성 음성 질환, 잠복 바이러스 감염에 수반되는 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 이러한 시스템 또는 복합체에 대한 표적 서열이 후보 질환 유전자에 있을 수 있다, eg.:
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따라서, 본 발명은 CRISPR 또는 CRISPR-Cas 복합체와 관련하여, 조혈 장애의 교정을 고려한다. 예를 들어, 중증 복합형 면역 결핍증 (SCID)은 림프구 B에서의 작용성 결함과 항상 관련되는 림프구 T 성숙에서의 결함으로부터 야기한다 (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). SCID 형태 중 하나인 아데노신 디아미나제(Deaminase:ADA) 결핍증의 경우에, 환자는 재조합 아데노신 디아미나제 효소의 주사에 의해 치료될 수 있다. ADA 유전자가 SCID 환자에서 돌연변이 된 것으로 보여진 이후로 (Giblett et al., Lancet, 1972, 2, 1067-1069), SCID와 관련된 여러 다른 유전자가 확인되었다 (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). SCID에 대한 4 개의 주요 원인이 있다:(i) SCID의 가장 빈번한 형태인, SCID-X1 (X-관련 SCID 또는 X-SCID)은 IL2RG 유전자에서의 돌연변이에 의해 발생하며, 이는 성숙 T 림프구 및 NK 세포의 부재를 야기한다. IL2RG는 적어도 5 개 인터루킨 수용체 복합체의 공통 성분인 감마 C 단백질을 코딩한다 (문헌 [Noguchi, et al., Cell, 1993, 73, 147157]). 이들 수용체는 JAK3 키나제를 통해 몇몇 표적을 활성화시키는데 (Macchi et al., Nature, 1995, 377, 65-68), 이의 불활성화는 감마 C 불활성화와 동일한 증후군을 초래하고; (ii) ADA 유전자의 돌연변이는 림프종 전구체에 치명적이어서, 이후 B, T, 및 NK 세포의 유사 부재를 야기시키는 푸린 물질대사의 결함을 야기하고; (iii) V(D)J 재조합은 면역글로불린 및 T 림프구 수용체 (TCR)의 성숙화에서 필수 단계이다. 이러한 과정에 관여되는 3개 유전자, 재조합 활성화 유전자 1 및 2 (RAG1 및 RAG2) 및 Artemis 내 돌연변이는 성숙한 T 및 B 림프구의 부재를 야기하고; (iv) T 세포 특이적 신호전달에 관여하는, CD45 같은 다른 유전자 내 돌연변이가 또하나 보고되었지만, 그들은 소수 사례를 대표한다 (Cavazzana-Calvo et al., Annu. Rev. Med., 2005, 56, 585-602; Fischer et al., Immunol. Rev., 2005, 203, 98-109). 본 발명의 양상에서, CRISPR 또는 CRISPR-Cas 복합체 고려 시스템과 관련하여, 본 발명은 문헌 [Genetic Diseases of the Eye, Second Edition, edited by Elias I. Traboulsi, Oxford University Press, 2012]에 추가 기재된 여러 유전적 돌연변이로부터 발생한 안구 결함을 교정할 수 있는데 사용할 수 있다고 고려한다. 교정하려는 안구 결함의 비제한적인 예는 황반 변성 (MD), 망막색소변성증 (RP)을 포함한다. 안구 결함과 연관된 유전자 및 단백질의 비제한적 예로서, MD와 관련된 단백질은 다음의 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:(ABCA4) ATP-결합 카세트, 서브 패밀리 A(ABC1), 멤버 4 ACHM1 완전색맹(간상체 전색맹) 1 ApoE 아포지방단백질 E(ApoE) C1QTNF5(CTRP5) C1q 및 종양 괴사 인자 관련 단백질 5(C1QTNF5) C2 상보체 구성성분 2(C2) C3 상보체 구성성분(C3) CCL2 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2(CCL2) CCR2 케모카인(C-C 모티프) 수용체 2(CCR2) 분화 36의 CD36 클러스터 CFB 상보체 인자 B CFH 상보체 인자 CFH H CFHR1 상보체 인자 H-관련 1 CFHR3 상보체 인자 H-관련 3 CNGB3 사이클릭 뉴클레오티드화된 채널 베타 3 CP 셀룰로플라스민(CP) CRP C 반응 단백질(CRP) CST3 시스타틴 C 또는 시스타틴 3(CST3) CTSD 카텝신 D(CTSD) CX3CR1 케모카인(C-X3-C 모티프) 수용체 1 ELOVL4 매우 장쇄 지방산 4 의 신장 ERCC6 절단 수선 교차 상보성 설치류 수선 결함, 상보체화 그룹 6 FBLN5 피불린-5 FBLN5 피불린 5 FBLN6 피불린 6 FSCN2 파신(FSCN2) HMCN1 헤미센트린 1 HMCN1 헤미센트린 1 HTRA1 HtrA 세린 펩티다제 1(HTRA1) HTRA1 HtrA 세린 펩티다제 1 IL-6 인터루킨 6 IL-8 인터루킨 8 LOC387715 가설 단백질 PLEKHA1 플렉스트린 상동성 도메인-함유 패밀리 A 멤버 1 (PLEKHA1) PROM1 프로미닌 1(PROM1 또는 CD133) PRPH2 페리페린-2 RPGR 망막색소변성증 GTPase 조절자 세르핀G1 세르핀 펩티다제 저해제, 클레이트 G, 멤버 1(C1- 저해제) TCOF1 트리클 TIMP3 메탈로프로테이나제 저해제 3 (TIMP3) TLR3 Toll-유사 수용체 3 본 발명은 CRISPR 또는 CRISPR-Cas 복합체와 관련하여, 심장으로 전달을 고려한다. 심장에서, 선호되는 유전자 이송을 보이는 심근 열대성 아데나-연관 바이러스(AAVM), 특히 AAVM41이 바람직하다 (참조: Lin-Yanga et al., PNAS, March 10, 2009, vol. 106, no. 10). 예를 들어, 미국 특허 공개 제20110023139호는 세포, 동물 및 심혈관 질병에 연관된 단백질을 유전적으로 변형시키기 위한 아연 핑거 뉴클레아제의 사용을 기재한다. 심혈관 질환은 일반적으로 고혈압, 심장마비, 심부전, 및 뇌졸중 및 TIA를 포함한다. 예로서, 염색체 서열은 제한없이 다음을 포함할 수 있다: IL1B (인터루킨 1, 베타), XDH (잔틴 디히드로게나제), TP53 (종양 단백질 p53), PTGIS (프로스타글란틴 12 (프로스타사이클린) 신타제), MB (미오글로빈), IL4 (인터루킨 4), ANGPT1 (안지오포이어틴 1), ABCG8 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 G (WHITE), 멤버 8), CTSK (카텝신 K), PTGIR (프로스타글란틴 12 (프로스타사이클린) 수용체 (IP)), KCNJ11 (포타슘 내향성 채널, 서브패밀리 J, 멤버 11), INS (인슐린), CRP (C-반응성 단백질, 펜트락신-관련), PDGFRB (혈소판-유래 성장 인자 수용체, 베타 폴리펩티드), CCNA2 (사이클린 A2), PDGFB (혈소판-유래 성장 인자 베타 폴리펩티드 (원숭이 육종 바이러스 (v-sis) 종양 유전자 상동체)), KCNJ5 포타슘 내향성 채널, 서브패밀리 J, 멤버 5), KCNN3 (포타슘 중간체/소형 컨덕턴스 칼슘-활성화된 채널, 서브패밀리 N, 멤버 3), CAPN10 (칼파인 10), PTGES (프로스타글란틴 E 신타제), ADRA2B (아드레날린성, 알파-2B-, 수용체), ABCG5 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 G (WHITE), 멤버 5), PRDX2 (퍼옥시리독신 2), CAPN5 (칼파인 5), PARP14 (폴리 (ADP-리보스) 중합효소 패밀리, 멤버 14), MEX3C (mex-3 상동체 C (예쁜 꼬마 선충)), ACE 안지오텐신 I 전환 효소 (펩티딜-디펩티다제 A) 1), TNF (종양 괴사 인자 (TNF 수퍼패밀리, 멤버 2)), IL6 (인터루킨 6 (인터페론, 베타 2)), STN (스타틴), SERPINE1 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 E (넥신, 플라스미노겐 활성인자 억제제 1형), 멤버 1), ALB (알부민), ADIPOQ (아디포넥틴, C1Q 및 콜라겐 도메인 함유), APOB (아포지단백질 B (Ag(x) 항원 포함)), APOE (아포지단백질 E), LEP (렙틴), MTHFR (5,10-메틸렌테트라히드로폴레이트 리덕타제 (NADPH)), APOA1 (아포지단백질 A-I), EDN1 (엔도텔린 1), NPPB (나트륨뇨설 펩티드 전구체 B), NOS3 (산화질소 신타제 3 (내피 세포)), PPARG (퍼옥시솜 증식인자-활성화 수용체 감마), PLAT (플라스미노겐 활성인자, 조직), PTGS2 (프로스타글란틴-엔도퍼옥시다제 신타제 2 (프로스타글란틴 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제)), CETP (콜레스테릴 에스테르 전달 단백질, 혈장), AGTR1 (안지오텐신 II 수용체, 1형), HMGCR (3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A 리덕타제), IGF1 (인슐린-유사 성장 인자 1 (소마토메딘 C)), SELE (셀렉틴 E), REN (레닌), PPARA (퍼옥시솜 증식인자-활성화 수용체 알파), PON1 (파라옥소나제 1), KNG1 (키니노겐 1), CCL2 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2), LPL (지단백질 리파제), VWF (폰 빌레브란트 인자), F2 (응고 인자 II (트롬빈)), ICAM1 (세포내 부착 분자 1), TGFB1 (형질전환 성장 인자, 베타 1), NPPA (나트륨뇨설 펩티드 전구체 A), IL10 (인터루킨 10), EPO (에리쓰로포이어틴), SOD1 (수퍼옥시드 디스뮤타제 1, 가용성), VCAM1 (혈관 세포 부착 분자 1), IFNG (인터페론, 감마), LPA (지단백질, Lp(a)), MPO (미엘로퍼옥시다제), ESR1 (에스트로겐 수용체 1), MAPK1 (미토겐-활성화 단백질 키나제 1), HP (하프토글로빈), F3 (응고 인자 III (트롬보플라스틴, 조직 인자)), CST3 (시스타틴 C), COG2 (올리고머 골지 복합체의 성분 2), MMP9 (매트릭스 메탈로펩티다제 9 (젤라티나제 B, 92 kDa 젤라티나제, 92 kDa IV형 콜라게나제)), SERPINC1 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 C (항트롬빈), 멤버 1), F8 (응고 인자 VIII, 응혈촉진 성분), HMOX1 (헴 옥시게나제 (디사이클링) 1), APOC3 (아포지단백질 C-III), IL8 (인터루킨 8), PROK1 (프로키네티신 1), CBS (시스타티오닌-베타-신타제), NOS2 (산화질소 신타제 2, 유도성), TLR4 (toll-유사 수용체 4), SELP (셀렉틴 P (과립 막단백질 140 kDa, 항원 CD62)), ABCA1 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 A (ABC1), 멤버 1), AGT (안지오텐시노겐 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 A, 멤버 8)), LDLR (저밀도 지단백질 수용체), GPT (글루탐산-피루베이트 트랜사미나제 (알라닌 아미노트랜스퍼라제)), VEGFA (혈관 내피 성장 인자 A), NR3C2 (핵 수용체 서브패밀리 3, 그룹 C, 멤버 2), IL18 (인터루킨 18 (인터페론-감마-유도 인자)), NOS1 (산화질소 신타제 1 (신경원)), NR3C1 (핵 수용체 서브패밀리 3, 그룹 C, 멤버 1 (글루코코르티코이드 수용체)), FGB (피브리노겐 베타 사슬), HGF (간세포 성장 인자 (헤파포이어틴 A; 산란 인자)), IL1A (인터루킨 1, 알파), RETN (레시스틴), AKT1 (v-akt 쥐과 흉선종 바이러스 종양유전자 상동체 1), LIPC (리파제, 간), HSPD1 (열충격 60 kDa 단백질 1 (샤페로닌)), MAPK14 (미토겐-활성화 단백질 키나제 14), SPP1 (분비형 인단백질 1), ITGB3 (인테그린, 베타 3 (혈소판 당단백질 111a, 항원 CD61)), CAT (카탈라제), UTS2 (우로텐신 2), THBD (트롬보모듈린), F10 (응고 인자 X), CP (세룰로플라스민 (페록시다제)), TNFRSF11B (종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 11b), EDNRA (엔도텔린 수용체 A형), EGFR (상피 성장 인자 수용체 (적아세포 백혈병 바이러스 (v-erb-b) 종양 유전자 상동체, 조류)), MMP2 (매트릭스 메탈로펩티다제 2 (젤라티나제 A, 72 kDa 젤라티나제, 72 kDa IV형 콜라게나제)), PLG (플라스미노겐), NPY (뉴로펩티드 Y), RHOD (ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 D), MAPK8 (미토겐-활성화 단백질 키나제 8), MYC (v-myc 골수구종증 바이러스 종양유전자 상동체 (조류)), FN1 (피브로넥틴 1), CMA1 (카이마제 1, 비만 세포), PLAU (플라스미노겐 활성인자, 우로키나제), GNB3 (구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질), 베타 폴리펩티드 3), ADRB2 (아드레날린성, 베타-2-, 수용체, 표면), APOA5 (아포지단백질 A-V), SOD2 (수퍼옥시드 디스뮤타제 2, 미토콘드리아), F5 (응고 인자 V (프로악세렐린, 불안정 인자)), VDR (비타민 D (1,25-디히드록시비타민 D3) 수용체), ALOX5 (아라키도네이트 5-리폭시게나제), HLA-DRB1 (주요 조직적합성 복합체, 클래스 II, DR 베타 1), PARP1 (폴리 (ADP-리보스) 중합효소 1), CD40LG (CD40 리간드), PON2 (파라옥소나제 2), AGER (진행성 글리코실화 최종 산물-특이적 수용체), IRS1 (인슐린 수용체 기질 1), PTGS1 (프로스타글란틴-엔도퍼옥시다제 신타제 1 (프로스타글란틴 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제)), ECE1 (엔도텔린 전환 효소 1), F7 (응고 인자 VII (혈청 프로트롬비니 전환 가속인자)), URN (인터루킨 1 수용체 길항제), EPHX2 (에폭시드 히드롤라제 2, 세포질), IGFBP1 (인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 1), MAPK10 (미토겐-활성화 단백질 키나제 10), FAS (Fas (TNF 수용체 수퍼패밀리, 멤버 6)), ABCB1 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 B (MDR/TAP), 멤버 1), JUN (jun 종양 유전자), IGFBP3 (인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3), CD14 (CD14 분자), PDE5A (포스포디에스터라제 5A, cGMP-특이적), AGTR2 (안지오텐신 II 수용체, 2형), CD40 (CD40 분자, TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 5), LCAT (레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제), CCR5 (케모카인 (C-C 모티프) 수용체 5), MMP1 (매트릭스 메탈로펩티다제 1 (간질 콜라게나제)), TIMP1 (TIMP 메탈로펩티다제 억제제 1), ADM (아드레노메둘린), DYT10 (근긴장이상 10), STAT3 (신호 전달인자 및 전사의 활성인자 3 (급성기 반응 인자)), MMP3 (매트릭스 메탈로펩티다제 3 (스트로멜리신 1, 프로젤라티나제)), ELN (엘라스틴), USF1 (상류 전사 인자 1), CFH (보체 인자 H), HSPA4 (열충격 70 kDa 단백질 4), MMP12 (매트릭스 메탈로펩티다제 12 (마크로파지 엘라스타제)), MME (막 메탈로엔도펩티다제), F2R (응고 인자 II (트롬빈) 수용체), SELL (셀렉틴 L), CTSB (카텝신 B), ANXA5 (아넥신 A5), ADRB1 (아드레날린성, 베타-1-, 수용체), CYBA (시토크롬 b-245, 알파 폴리펩티드), FGA (피브리노겐 알파 사슬), GGT1 (감마-글루타미트랜스퍼라제 1), LIPG (리파제, 상피), HIF1A (저산소증 유도성 인자 1, 알파 서브유닛 (염기성 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자)), CXCR4 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 4), PROC (단백질 C (응고 인자 Va 및 VIIIa의 불활성인자)), SCARB1 (스캐빈저 수용체 클래스 B, 멤버 1), CD79A (CD79a 분자, 면역글로불린-연관 알파), PLTP (인지질 전달 단백질), ADD1 (아두신 1 (알파)), FGG (피브리노겐 감마 사슬), SAA1 (혈청 아밀로이드 A1), KCNH2 (포타슘 전압-게이팅 채널, 서브패밀리 H (eag-관련), 멤버 2), DPP4 (디펩티딜-펩티다제 4), G6PD (글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제), NPR1 (나트륨뇨설 펩티드 수용체 A/구아닐레이트 시클라제 A (심방나트륨이뇨 펩티드 수용체 A)), VTN (비트로넥틴), KIAA0101 (KIAA0101), FOS (FBJ 쥐과 골육종 바이러스 종양유전자 상동체), TLR2 (toll-유사 수용체 2), PPIG (펩티딜프롤릴 이소머라제 G (사이클로필린 G)), IL1R1 (인터루킨 1 수용체, I형), AR (안드로겐 수용체), CYP1A1 (시토크롬 P450, 패밀리 1, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 1), SERPINA1 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 A (알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신), 멤버 1), MTR (5-메틸테트라히드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제), RBP4 (레티놀 결합 단백질 4, 혈장), APOA4 (아포지단백질 A-IV), CDKN2A (사이클린-의존적 키나제 억제제 2A (골수종, p16, CDK4 억제)), FGF2 (섬유아세포 성장 인자 2 (염기성)), EDNRB (엔도텔린 수용체 B형), ITGA2 (인테그린, 알파 2 (CD49B, VLA-2 수용체의 알파 2 서브유닛)), CABIN1 (칼시뉼린 결합 단백질 1), SHBG (성 호르몬-결합 글로불린), HMGB1 (고-이동성 그룹 박스 1), HSP90B2P (열충격 단백질 90 kDa 베타 (Grp94), 멤버 2 (가유전자)), CYP3A4 (시토크롬 P450, 패밀리 3, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 4), GJA1 (간극 연접 단백질, 알파 1, 43 kDa), CAV1 (카베올린 1, 카베올라 단백질, 22 kDa), ESR2 (에스트로겐 수용체 2 (ER 베타)), LTA (림포톡신 알파 (TNF 수퍼패밀리, 멤버 1)), GDF15 (성장 분화 인자 15), BDNF (뇌-유래 신경영양 인자), CYP2D6 (시토크롬 P450, 패밀리 2, 서브패밀리 D, 폴리펩티드 6), NGF (신경 성장 인자 (베타 폴리펩티드)), SP1 (Sp1 전사 인자), TGIF1 (TGFB-유도 인자 호메오박스 1), SRC (v-src 육종 (슈미트-루핀 A-2) 바이러스 종양유전자 상동체 (조류)), EGF (상피 성장 인자 (베타-우로가스트론)), PIK3CG (포스포이노시티드-3-키나제, 촉매성, 감마 폴리펩티드), HLA-A (주요 조직적합성 복합체, 클래스 I, A), KCNQ1 (포타슘 전압-게이팅 채널, KQT-유사 서브패밀리, 멤버 1), CNR1 (칸나비노이드 수용체 1 (뇌)), FBN1 (피브릴린 1), CHKA (콜린 키나제 알파), BEST1 (베스트로핀 1), APP (아밀로이드 베타 (A4) 전구체 단백질), CTNNB1 (카테닌 (카데린-연관 단백질), 베타 1, 88 kDa), IL2 (인터루킨 2), CD36 (CD36 분자 (트롬보스폰딘 수용체)), PRKAB1 (단백질 키나제, AMP-활성화, 베타 1 비촉매 서브유닛), TPO (갑상선 퍼옥시다제), ALDH7A1 (알데히드 디히드로게나제 7 패밀리, 멤버 A1), CX3CR1 (케모카인 (C-X3-C 모티프) 수용체 1), TH (티로신 히드롤라제), F9 (응고 인자 IX), GH1 (성장 호르몬 1), TF (트랜스페린), HFE (혈색소증), IL17A (인터루킨 17A), PTEN (포스파타제 및 텐신 상동체), GSTM1 (글루타티온 S-트랜스퍼라제 mu 1), DMD (디스트로핀), GATA4 (GATA 결합 단백질 4), F13A1 (응고 인자 XIII, A1 폴리펩티드), TTR (트랜스타이레틴), FABP4 (지방산 결합 단백질 4, 지방세포), PON3 (파라옥소나제 3), APOC1 (아포지단백질 C-I), INSR (인슐린 수용체), TNFRSF1B (종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 1B), HTR2A (5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 2A), CSF3 (콜로니 자극 인자 3 (과립구)), CYP2C9 (시토크롬 P450, 패밀리 2, 서브패밀리 C, 폴리펩티드 9), TXN (티오레독신), CYP11B2 (시토크롬 P450, 패밀리 11, 서브패밀리 B, 폴리펩티드 2), PTH (부갑상선 호르몬), CSF2 (콜로니 자극 인자 2 (과립구-마크로파지)), KDR (키나제 삽입 도메인 수용체 (a type III 수용체 티로신 키나제)), PLA2G2A (포스포리파제 A2, 그룹 IIA (혈소판, 활액)), B2M (베타-2-마이크로글로불린), THBS1 (트롬보스폰딘 1), GCG (글루카곤), RHOA (ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 A), ALDH2 (알데히드 디히드로게나제 2 패밀리 (미토콘드리아)), TCF7L2 (전사 인자 7-유사 2 (T-세포 특이적, HMG-box)), BDKRB2 (브라디키닌 수용체 B2), NFE2L2 (핵 인자 (적혈구-유래 2)-유사 2), NOTCH1 (Notch 상동체 1, 전좌연관 (초파리)), UGT1A1 (UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1 패밀리, 폴리펩티드 A1), IFNA1 (인터페론, 알파 1), PPARD (퍼옥시솜 증식인자-활성화 수용체 델타), SIRT1 (실투인 (침묵 교잡 유형 정보 조절 2 상동체) 1 (에스. 세레비지아에)), GNRH1 (고나도트로핀-방출 호르몬 1 (황체-방출 호르몬)), PAPPA (임신-연관 혈장 단백질 A, 파파리신 1), ARR3 (어레스틴 3, 망막 (X-어레스틴)), NPPC (나트륨뇨설 펩티드 전구체 C), AHSP (알파 헤모글로빈 안정화 단백질), PTK2 (PTK2 단백질 티로신 키나제 2), IL13 (인터루킨 13), MTOR (라파마이신의 기계론적 표적 (세린/트레오닌 키나제)), ITGB2 (인테그린, 베타 2 (보체 성분 3 수용체 3 및 4 서브유닛)), GSTT1 (글루타티온 S-트랜스퍼라제 쎄타 1), IL6ST (인터루킨 6 신호 전달인자 (gp130, 온코스타틴 M 수용체)), CPB2 (카르복시 펩티다제 B2 (혈장)), CYP1A2 (시토크롬 P450, 패밀리 1, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 2), HNF4A (간세포 핵 인자 4, 알파), SLC6A4 (용질 운반체 패밀리 6 (신경전달인자 수송체, 세로토닌), 멤버 4), PLA2G6 (포스포리파제 A2, 그룹 VI (시토졸, 칼슘-독립적)), TNFSF11 (종양 괴사 인자 (리간드) 수퍼패밀리, 멤버 11), SLC8A1 (용질 운반체 패밀리 8 (소듐/칼슘 교환체), 멤버 1), F2RL1 (응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 1), AKR1A1 (알도-케토 리덕타제 패밀리 1, 멤버 A1 (알데히드 리덕타제)), ALDH9A1 (알데히드 디히드로게나제 9 패밀리, 멤버 A1), BGLAP (뼈 감마-카르복시글루타메이트 (gla) 단백질), MTTP (마이크로솜 트리글리세리드 전달 단백질), MTRR (5-메틸테트라히드로폴레이트-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제 리덕타제), SULT1A3 (슬포트랜스퍼라제 패밀리, 시토졸, 1A, 페놀-선호, 멤버 3), RAGE (신장 종양 항원), C4B (보체 성분 4B (키도 혈액군), P2RY12 (푸린성 수용체 P2Y, G-단백질 커플링, 12), RNLS (레날라제, FAD-의존적 아민 옥시다제), CREB1 (cAMP 반응성 엘리먼트 결합 단백질 1), POMC (프로오피오멜라노코르틴), RAC1 (ras-관련 C3 보툴리늄 독소 기질 1 (rho 패밀리, 소형 GTP 결합 단백질 Rac1)), LMNA (라민 NC), CD59 (CD59 molecule, 보체 조절 단백질), SCN5A (소듐 채널, 전압-게이팅, V형, 알파 서브유닛), CYP1B1 (시토크롬 P450, 패밀리 1, 서브패밀리 B, 폴리펩티드 1), MIF (마크로파지 이동 억제성 인자 (글리코실화-억제 인자)), MMP13 (매트릭스 메탈로펩티다제 13 (콜라게나제 3)), TIMP2 (TIMP 메탈로펩티다제 억제제 2), CYP19A1 (시토크롬 P450, 패밀리 19, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 1), CYP21A2 (시토크롬 P450, 패밀리 21, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 2), PTPN22 (단백질 티로신 포스파타제, 비수용체 유형 22 (림프구)), MYH14 (미오신, 중쇄 14, 비근육), MBL2 (만노스-결합 렉틴 (단백질 C) 2, 가용성 (옵소닉 결함)), SELPLG (셀렉틴 P 리간드), AOC3 (아민 옥시다제, 구리 함유 3 (혈관 부착 단백질 1)), CTSL1 (카텝신 L1), PCNA (증식 세포 핵 항원), IGF2 (인슐린-유사 성장 인자 2 (소마토메딘 A)), ITGB1 (인테그린, 베타 1 (피브로넥틴 수용체, 베타 폴리펩티드, 항원 CD29은 MDF2, MSK12 포함)), CAST (칼파스타틴), CXCL12 (케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (기질 세포-유래 인자 1)), IGHE (면역글로불린 중쇄 불변 엡실론), KCNE1 (포타슘 전압-게이팅 채널, Isk-관련 패밀리, 멤버 1), TFRC (트랜스페린 수용체 (p90, CD71)), COL1A1 (콜라겐, I형, 알파 1), COL1A2 (콜라겐, I형, 알파 2), IL2RB (인터루킨 2 수용체, 베타), PLA2G10 (포스포리파제 A2, 그룹 X), ANGPT2 (안지오포이어틴 2), PROCR (단백질 C 수용체, 상피 (EPCR)), NOX4 (NADPH 옥시다제 4), HAMP (헵시디니 항미생물성 펩티드), PTPN11 (단백질 티로신 포스파타제, 비수용체 유형 11), SLC2A1 (용질 운반체 패밀리 2 (촉진성 글루코스 수송체), 멤버 1), IL2RA (인터루킨 2 수용체, 알파), CCL5 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5), IRF1 (인터페론 조절 인자 1), CFLAR (CASP8 및 FADD-유사 아폽토시스 조절제), CALCA (칼시토닌-관련 폴리펩티드 알파), EIF4E (진핵생물 번역 개시 인자 4E), GSTP1 (글루타티온 S-트랜스퍼라제 pi 1), JAK2 (Janus 키나제 2), CYP3A5 (시토크롬 P450, 패밀리 3, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 5), HSPG2 (헤파란 술페이트 프로테오글리칸 2), CCL3 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 3), MYD88 (골수 분화 1차 반응 유전자 (88)), VIP (혈관작용성 장 펩티드), SOAT1 (스테롤 O-아실트랜스퍼라제 1), ADRBK1 (아드레날린성, 베타, 수용체 키나제 1), NR4A2 (핵 수용체 서브패밀리 4, 그룹 A, 멤버 2), MMP8 (매트릭스 메탈로펩티다제 8 (호중구 콜라게나제)), NPR2 (나트륨뇨설 펩티드 수용체 B/구아닐레이트 시클라제 B (심방나트륨이뇨 펩티드 수용체 B)), GCH1 (GTP 시클로히드롤라제 1), EPRS (글루타밀-프롤릴-tRNA 신써타제), PPARGC1A (퍼옥시솜 증식인자-활성화 수용체 감마, 공활성인자 1 알파), F12 (응고 인자 XII (하게만 인자)), PECAM1 (혈소판/내피 세포 부착 분자), CCL4 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 4), SERPINA3 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 A (알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신), 멤버 3), CASR (칼슘-감지 수용체), GJA5 (간극 연접 단백질, 알파 5, 40 kDa), FABP2 (지방산 결합 단백질 2, 장), TTF2 (전사 종결 인자, RNA 중합효소 II), PROS1 (단백질 S (알파)), CTF1 (카디오트로핀 1), SGCB (사르코글리칸, 베타 (43 kDa 디스트로핀-연관 당단백질)), YME1L1 (YME1-유사 1 (에스. 세레비지아에)), CAMP (카텔리시딘 항미생물성 펩티드), ZC3H12A (아연 핑거 CCCH-유형 함유 12A), AKR1B1 (알도-케토 리덕타제 패밀리 1, 멤버 B1 (알도스 리덕타제)), DES (데스민), MMP7 (매트릭스 메탈로펩티다제 7 (마트릴리신, 자궁)), AHR (아릴 탄화수소 수용체), CSF1 (콜로니 자극 인자 1 (마크로파지)), HDAC9 (히스톤 디아세틸라제 9), CTGF (결합 조직 성장 인자), KCNMA1 (포타슘 거대 컨덕턴스 칼슘-활성화 채널, 서브패밀리 M, 알파 멤버 1), UGT1A (UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1 패밀리, 폴리펩티드 A 복합 유전자좌), PRKCA (단백질 키나제 C, 알파), COMT (카테콜-.베타.-메틸트랜스퍼라제), S100B (S100 칼슘 결합 단백질 B), EGR1 (초기 성장 반응 1), PRL (프로락틴), IL15 (인터루킨 15), DRD4 (도파민 수용체 D4), CAMK2G (칼슘/칼모듈린-의존적 단백질 키나제 II 감마), SLC22A2 (용질 운반체 패밀리 22 (유기 양이온 수송체), 멤버 2), CCL11 (케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11), PGF (B321 태반 성장 인자), THPO (트롬보포이어틴), GP6 (당단백질 VI (혈소판)), TACR1 (타카이키닌 수용체 1), NTS (뉴로텐신), HNF1A (HNF1 호메오박스 A), SST (소마토스타틴), KCND1 (포타슘 전압-게이팅 채널, Shal-관련 서브패밀리, 멤버 1), LOC646627 (포스포리파제 억제제), TBXAS1 (트롬복산 A 신타제 1 (혈소판)), CYP2J2 (시토크롬 P450, 패밀리 2, 서브패밀리 J, 폴리펩티드 2), TBXA2R (트롬복산 A2 수용체), ADH1C (알콜 디히드로게나제 1C (클래스 I), 감마 폴리펩티드), ALOX12 (아라키도네이트 12-리폭시게나제), AHSG (알파-2-HS-당단백질), BHMT (베타인-호모시스테인 메틸트랜스퍼라제), GJA4 (간극 연접 단백질, 알파 4, 37 kDa), SLC25A4 (용질 운반체 패밀리 25 (미토콘드리아 캐리어; 아데닌 뉴클레오티드 운반체), 멤버 4), ACLY (ATP 시트레이트 리아제), ALOX5AP (아라키도네이트 5-리폭시게나제-활성화 단백질), NUMA1 (핵 유사분열 장비 단백질 1), CYP27B1 (시토크롬 P450, 패밀리 27, 서브패밀리 B, 폴리펩티드 1), CYSLTR2 (시스테이닐 류코트리엔 수용체 2), SOD3 (수퍼옥시드 디스뮤타제 3, 세포외), LTC4S (류코트리엔 C4 신타제), UCN (우로코르틴), GHRL (그렐린/오베스타틴 프리프로펩티드), APOC2 (아포지단백질 C-II), CLEC4A (C-type 렉틴 도메인 패밀리 4, 멤버 A), KBTBD10 (kelch 반복 및BTB (POZ) 도메인 함유 10), TNC (테나신 C), TYMS (티미딜레이트 신써타제), SHCl (SHC (Src 상동성 2 도메인 함유) 형질전환 단백질 1), LRP1 (저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1), SOCS3 (사이토카인 신호전달의 억제인자 3), ADH1B (알콜 디히드로게나제 1B (클래스 I), 베타 폴리펩티드), KLK3 (칼리크레인-관련 펩티다제 3), HSD11B1 (히드록시스테로이드 (11-베타) 디히드로게나제 1), VKORC1 (비타민 K 에폭시드 리덕타제 복합체, 서브유닛 1), SERPINB2 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 B (오발부민), 멤버 2), TNS1 (텐신 1), RNF19A (링 핑거 단백질 19A), EPOR (에리쓰로포이어틴 수용체), ITGAM (인테그린, 알파 M (보체 성분 3 수용체 3 서브유닛)), PITX2 (쌍형성-유사 호메오도메인 2), MAPK7 (미토겐-활성화 단백질 키나제 7), FCGR3A (IgG의 Fc 단편, 저친화성 111a, 수용체 (CD16a)), LEPR (렙틴 수용체), ENG (엔도글린), GPX1 (글루타티온 퍼옥시다제 1), GOT2 (글루타믹-옥살로아세틱 트랜스아미나제 2, 미토콘드리아 (아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 2)), HRH1 (히스타민 수용체 H1), NR112 (핵 수용체 서브패밀리 1, 그룹 I, 멤버 2), CRH (코르티코트로핀 방출 호르몬), HTR1A (5-히드록시트립타민 (세로토닌) 수용체 1A), VDAC1 (전압-의존적 음이온 채널 1), HPSE (헤파라나제), SFTPD (계면활성제 단백질 D), TAP2 (수송체 2, ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 B (MDR/TAP)), RNF123 (링 핑거 단백질 123), PTK2B (PTK2B 단백질 티로신 키나제 2 베타), NTRK2 (신경영양성 티로신 키나제, 수용체, 2형), IL6R (인터루킨 6 수용체), ACHE (아세틸콜린스테라제 (Yt 혈액군)), GLP1R (글루카곤-유사 펩티드 1 수용체), GHR (성장 호르몬 수용체), GSR (글루타티온 리덕타제), NQO1 (NAD(P)H 디히드로게나제, 퀴논 1), NR5A1 (핵 수용체 서브패밀리 5, 그룹 A, 멤버 1), GJB2 (간극 연접 단백질, 베타 2, 26 kDa), SLC9A1 (용질 운반체 패밀리 9 (소듐/수소 교환체), 멤버 1), MAOA (모노아민 옥시다제 A), PCSK9 (프로단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 9형), FCGR2A (IgG의 Fc 단편, 저친화성 IIa, 수용체 (CD32)), SERPINF1 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 F (알파-2 안티플라스민, 피그먼트 상피 유래 인자), 멤버 1), EDN3 (엔도텔린 3), DHFR (디히드로폴레이트 리덕타제), GAS6 (성장 정지-특이적 6), SMPD1 (스핀고미엘린 포스포디에스터라제 1, 산 리소솜), UCP2 (언커플링 단백질 2 (미토콘드리아, 양자 캐리어)), TFAP2A (전사 인자 AP-2 알파 (활성화 인핸서 결합 단백질 2 알파)), C4BPA (보체 성분 4 결합 단백질, 알파), SERPINF2 (세르핀 펩티다제 억제제, 클레이드 F (알파-2 안티플라스민, 피그먼트 상피 유래 인자), 멤버 2), TYMP (티미딘 포스포릴라제), ALPP (알칼리 포스파타제, 태반 (Regan 이소자임)), CXCR2 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 2), SLC39A3 (용질 운반체 패밀리 39 (아연 수송체), 멤버 3), ABCG2 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 G (WHITE), 멤버 2), ADA (아데노신 디아미나제), JAK3 (Janus 키나제 3), HSPA1A (열충격 70 kDa 단백질 1A), FASN (지방산 신타제), FGF1 (섬유아세포 성장 인자 1 (산성)), F11 (응고 인자 XI), ATP7A (ATPase, Cu++ 수송, 알파 폴리펩티드), CR1 (보체 성분 (3b/4b) 수용체 1 (Knops 혈액군)), GFAP (신경교 섬유질 산성 단백질), ROCK1 (Rho-연관, 코일드-코일 함유 단백질 키나제 1), MECP2 (메틸 CpG 결합 단백질 2 (레트 증후군)), MYLK (미오신 경쇄 키나제), BCHE (부티릴콜린스테라제), LIPE (리파제, 호르몬-감응성), PRDX5 (퍼옥시리독신 5), ADORA1 (아데노신 A1 수용체), WRN (베르너 증후군, RecQ 헬리카제-유사), CXCR3 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3), CD81 (CD81 molecule), SMAD7 (SMAD 패밀리 멤버 7), LAMC2 (라미닌, 감마 2), MAP3K5 (미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 키나제 5), CHGA (크로모그라닌 A (부갑상선 분비 단백질 1)), IAPP (섬 아밀로이드 폴리펩티드), RHO (로돕신), ENPP1 (엑토뉴클레오티드 파이로포스파타제/포스포디에스터라제 1), PTHLH (부갑상선 호르몬-유사 호르몬), NRG1 (뉴레굴린 1), VEGFC (혈관 내피 성장 인자 C), ENPEP (글루타밀 아미노펩티다제 (아미노펩티다제 A)), CEBPB (CCAAT/인핸서 결합 단백질 (C/EBP), 베타), NAGLU (N-아세틸글루코사미니다제, 알파-), F2RL3 (응고 인자 II (트롬빈) 수용체-유사 3), CX3CL1 (케모카인 (C-X3-C 모티프) 리간드 1), BDKRB1 (브라디키닌 수용체 B1), ADAMTS13 (트롬보스폰딘 1형 모티프 존재의 ADAM 메탈로펩티다제, 13), ELANE (엘라스타제, 호중구 발현), ENPP2 (엑토뉴클레오티드 파이로포스파타제/포스포디에스터라제 2), CISH (사이토카인 유도성 SH2-함유 단백질), GAST (가스트린), MYOC (미오실린, 섬유주대 유도성 글루코코르티코이드 반응), ATP1A2 (ATPase, Na+/K+ 수송, 알파 2 폴리펩티드), NF1 (뉴로피브로민 1), GJB1 (간극 연접 단백질, 베타 1, 32 kDa), MEF2A (근세포 인핸서 인자 2A), VCL (빈큘린), BMPR2 (뼈 형태형성성 단백질 수용체, II형 (세린/트레오닌 키나제)), TUBB (튜불린, 베타), CDC42 (세포 분열 주기 42 (GTP 결합 단백질, 25 kDa)), KRT18 (케라틴 18), HSF1 (열충격 전사 인자 1), MYB (v-myb 골수아구증 바이러스 종양유전자 상동체 (조류)), PRKAA2 (단백질 키나제, AMP-활성화, 알파 2 촉매 서브유닛), ROCK2 (Rho-연관, 코일드-코일 함유 단백질 키나제 2), TFPI (조직 인자 경로 억제제 (지단백질-연관 응고 억제제)), PRKG1 (단백질 키나제, cGMP-의존성, I형), BMP2 (뼈 형태형성성 단백질 2), CTNND1 (카테닌 (카데린-연관 단백질), 델타 1), CTH (시스타티오나제 (시스타티오닌 감마-리아제)), CTSS (카텝신 S), VAV2 (vav 2 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자), NPY2R (뉴로펩티드 Y 수용체 Y2), IGFBP2 (인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2, 36 kDa), CD28 (CD28 분자), GSTA1 (글루타티온 S-트랜스퍼라제 알파 1), PPIA (펩티딜프롤릴 이소머라제 A (사이클로필린 A)), APOH (아포지단백질 H (베타-2-당단백질 I)), S100A8 (S100 칼슘 결합 단백질 A8), IL11 (인터루킨 11), ALOX15 (아라키도네이트 15-리폭시게나제), FBLN1 (피불린 1), NR1H3 (핵 수용체 서브패밀리 1, 그룹 H, 멤버 3), SCD (스테아로일-CoA 데사투라제 (델타-9-데사투라제)), GIP (위 억제성 폴리펩티드), CHGB (크로모그라닌 B (세크레토그라닌 1)), PRKCB (단백질 키나제 C, 베타), SRD5A1 (스테로이드-5-알파-리덕타제, 알파 폴리펩티드 1 (3-옥소-5 알파-스테로이드 델타 4-디히드로게나제 알파 1)), HSD11B2 (히드록시스테로이드 (11-베타) 디히드로게나제 2), CALCRL (칼시토닌 수용체-유사), GALNT2 (UDP-N-아세틸-알파-D-갈락토사민:폴리펩티드 N-아세틸갈락토사미닐트랜스퍼라제 2 (GalNAc-T2)), ANGPTL4 (안지오포이어틴-유사 4), KCNN4 (포타슘 중간체/소형 컨덕턴스 칼슘-활성화된 채널, 서브패밀리 N, 멤버 4), PIK3C2A (포스포이노시티드-3-키나제, 클래스 2, 알파 폴리펩티드), HBEGF (헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자), CYP7A1 (시토크롬 P450, 패밀리 7, 서브패밀리 A, 폴리펩티드 1), HLA-DRB5 (주요 조직적합성 복합체, 클래스 II, DR 베타 5), BNIP3 (BCL2/아데노바이러스 E1B 19 kDa 상호작용 단백질 3), GCKR (글루코키나제 (헥소키나제 4) 조절제), S100A12 (S100 칼슘 결합 단백질 A12), PADI4 (펩티딜 아르기닌 디이미나제, IV형), HSPA14 (열충격 70 kDa 단백질 14), CXCR1 (케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 1), H19 (H19, 각인된 모성 발현 전사물 (비-단백질 코딩)), KRTAP19-3 (케라틴 연관 단백질 19-3), IDDM2 (인슐린-의존성 진성 당뇨병 2), RAC2 (ras-관련 C3 보툴리늄 독소 기질 2 (rho 패밀리, 소형 GTP 결합 단백질 Rac2)), RYR1 (리아노딘 수용체 1 (골격)), 시계 (시계 상동체 (마우스)), NGFR (신경 성장 인자 수용체 (TNFR 수퍼패밀리, 멤버 16)), DBH (도파민 베타-히드롤라제 (도파민 베타-모노옥시게나제)), CHRNA4 (콜린성 수용체, 니코틴성, 알파 4), CACNA1C (칼슘 채널, 전압-의존적, L형, 알파 1C 서브유닛), PRKAG2 (단백질 키나제, AMP-활성화, 감마 2 비촉매 서브유닛), CHAT (콜린 아세틸트랜스퍼라제), PTGDS (프로스타글란틴 D2 신타제 21 kDa (뇌)), NR1H2 (핵 수용체 서브패밀리 1, 그룹 H, 멤버 2), TEK (TEK 티로신 키나제, 상피), VEGFB (혈관 내피 성장 인자 B), MEF2C (근세포 인핸서 인자 2C), MAPKAPK2 (미토겐-활성화 단백질 키나제-활성화 단백질 키나제 2), TNFRSF11A (종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리, 멤버 11a, NFKB 활성인자), HSPA9 (열충격 70 kDa 단백질 9 (몰탈린)), CYSLTR1 (시스테이닐 류코트리엔 수용체 1), MAT1A (메티오닌 아데노실트랜스퍼라제 I, 알파), OPRL1 (오피에이트 수용체-유사 1), IMPA1 (이노시톨(myo)-1(or 4)-모노포스파타제 1), CLCN2 (클로라이드 채널 2), DLD (디히드로리포아미드 디히드로게나제), PSMA6 (프로테오솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 알파형, 6), PSMB8 (프로테오솜 (프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형, 8 (거대 다기능 펩티다제 7)), CHI3L1 (키티나제 3-유사 1 (연골 당단백질-39)), ALDH1B1 (알데히드 디히드로게나제 1 패밀리, 멤버 B1), PARP2 (폴리 (ADP-리보스) 중합효소 2), STAR (스테로이드성 급성 조절 단백질), LBP (지다당류 결합 단백질), ABCC6 (ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 C(CFTR/MRP), 멤버 6), RGS2 (G-단백질 신호전달 조절제 2, 24 kDa), EFNB2 (에프린-B2), GJB6 (간극 연접 단백질, 베타 6, 30 kDa), APOA2 (아포지단백질 A-II), AMPD1 (아데노신 모노포스페이트 디아미나제 1), DYSF (디스펠린, 지대형 근이영양증 2B (상염색체 열성)), FDFT1 (파르네실-디포스페이트 파르네실트랜스퍼라제 1), EDN2 (엔도텔린 2), CCR6 (케모카인 (C-C 모티프) 수용체 6), GJB3 (간극 연접 단백질, 베타 3, 31 kDa), IL1RL1 (인터루킨 1 수용체-유사 1), ENTPD1 (엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포히드롤라제 1), BBS4 (프라뎃-비들 증후군 4), CELSR2 (카데린, EGF LAG 7-경로 G-유형 수용체 2 (프라민고 상동체, 초파리)), F11R (F11 수용체), RAPGEF3 (Rap 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF) 3), HYAL1 (히아루로노글루코사미니다제 1), ZNF259 (아연 핑거 단백질 259), ATOX1 (ATX1 항산화제 단백질 1 상동체 (효모)), ATF6 (활성화 전사 인자 6), KHK (케토헥소키나제 (프룩토키나제)), SAT1 (스퍼미딘/스퍼민 N1-아세틸트랜스퍼라제 1), GGH (감마-글루타밀 히드롤라제 (콘쥬가제, 폴릴폴리감마글루타밀 히드롤라제)), TIMP4 (TIMP 메탈로펩티다제 억제제 4), SLC4A4 (용질 운반체 패밀리 4, 소듐 바이카보네이트 공수송체, 멤버 4), PDE2A (포스포디에스터라제 2A, cGMP-자극), PDE3B (포스포디에스터라제 3B, cGMP-억제), FADS1 (지방산 데사투라제 1), FADS2 (지방산 데사투라제 2), TMSB4X (티모신 베타 4, X-연관), TXNIP (티오레독신 상호작용 단백질), LIMS1 (LIM 및 노화 세포 항원-유사 도메인 1), RHOB (ras 상동체 유전자 패밀리, 멤버 B), LY96 (림프구 항원 96), FOXO1 (포크헤드 박스 O1), PNPLA2 (파타틴-유사 포스포리파제 도메인 함유 2), TRH (트로트로핀-방출 호르몬), GJC1 (간극 연접 단백질, 감마 1, 45 kDa), SLC17A5 (용질 운반체 패밀리 17 (음이온/당 수송체), 멤버 5), FTO (지방량 및 비만 연관), GJD2 (간극 연접 단백질, 델타 2, 36 kDa), PSRC1 (프롤린/세린-풍부 코일드-코일 1), CASP12 (캐스파제 12 (유전자-가유전자)), GPBAR1 (G 단백질-커플링 담즙산 수용체 1), PXK (PX 도메인 함유 세린/트레오닌 키나제), IL33 (인터루킨 33), TRIB1 (tribbles 상동체 1 (초파리)), PBX4 (pre-B-세포 백혈병 호메오박스 4), NUPR1 (핵 단백질, 전사 조절제, 1), 15-Sep(15 kDa 셀레노단백질), CILP2 (연골 중간층 단백질 2), TERC (텔로머라제 RNA 성분), GGT2 (감마-글루타미트랜스퍼라제 2), MT-CO1 (미토콘드리아 코딩 시토크롬 c 옥시다제 I), and UOX (우레이트 옥시다제, 가유전자). 추가 구현예에서, 염색체 서열은 Pon1(파라옥소나제 1), LDLR (LDL 수용체), ApoE(아포지방단백질 E), Apo B-100(아포지방단백질 B-100), ApoA (아포지방단백질(a)), ApoA1(아포지방단백질 A1), CBS(시스타티온 B-신타제), 글리코단백질 IIb/IIb, MTHRF(5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 환원효소(NADPH), 및 이들의 조합으로부터 추가로 선택될 수 있다. 일 반복에서, 심혈관 질환에 연루된 염색체 서열, 및 염색체 서열에 의해 암호화된 단백질은 Cacna1C, Sod1, Pten, Ppar(알파), Apo E, 렙틴, 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 따라서 본 명세서의 내용은 CRISPR 또는 CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체에 관한 예시적인 표적을 제공한다.
면역 직교 오솔로그
일부 구현예에서, CRISPR 효소가 대상체에서 발현되거나 또는 투여되는 것이 필요할 때, CRISPR 효소의 면역원성은 대상체에게 CRISPR 효소의 면역 직교 오솔로그를 순차적으로 발현 또는 투여하여 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "면역 직교 오솔로그" 는 유사하거나 또는 실질적으로 동일한 기능 또는 활성을 갖지만, 서로에 의해 생성된 면역 반응과 교차-반응성은 거의 없거나 또는 전혀 없는 오솔로그 단백질을 의미한다. 이러한 오솔로그의 순차적 발현 또는 투여는 강력하거나 또는 임의의 부수적 면역 반응을 유발시키지 않을 것이다. 면역 직교 오솔로그는 현존 항체에 의한 중화를 피할 수 있다. 오솔로그를 발현하는 세포는 숙주의 면역계 (예를 들어, 활성화된 CTL)에 의한 제거를 피할 수 있다. 일부 예에서, 상이한 종으로부터의 CRISPR 효소 오솔로그가 면역 직교 오솔로그일 수 있다.
면역 직고 오솔로그는 후보 오솔로그 세트의 서열, 구조, 및 면역원성을 분석하여 동정될 수 있다. 예시적 방법에서, 면역 직교 오솔로그 세트는 a) 서열 유사성이 낮거나 또는 전혀 없는 후보물의 서브세트를 확인하기 위해서 후보 오솔로그 세트 (예를 들어, 상이한 종 유래 오솔로그)의 서열을 비교하는 단계; b) 면역 중복이 없거나 또는 낮은 후보물을 확인하기 위해 후보물의 서브세트의 멤버 중에 면역 중복을 평가하는 단계에 의해 동정될 수 있다. 일부 경우에서, 후보물 간 면역 중복은 후보 오솔로그 및 MHC (예를 들어, MHC I형 및/또는 MHC II) 간 결합을 결정하여 평가할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 후보물간 면역 중복은 후보 오솔로그의 B-세포 에피토프를 결정하여 평가될 수 있다. 일 예에서, 면역 직교 오솔로그는 [Moreno AM et al., BioRxiv ](2018년 1월 10일 온라인 공개, doi: doi.org/10.1101/245985)에 기술된 방법을 사용해 동정될 수 있다.
본 출원은 또한 하기 번호 표시된 문장에 기재된 바와 같은 양상 및 구현예를 제공한다:
1. i) 표 1 또는 2로 부터의 Cas12b 이펙터 단백질, ii) 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드를 포함하는, 비천연 발생 또는 조작된 시스템.
2. 문장 1의 시스템에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13, 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium), 및 라세이엘라 세디미니스 (Laceyella sediminis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다.
3. 문장 1 또는 2의 시스템에 있어서, tracr RNA는 직접 반복부 서열의 5' 말단에서 crRNA에 융합된다.
4. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 2종의 상이한 표적 서열 또는 동일 표적 서열의 상이한 영역에 하이브리드화할 수 있는 둘 이상의 가이드 서열을 포함한다.
5. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 가이드 서열은 원핵생물 세포 내 하나 이상의 표적 서열에 하이브리드화한다.
6. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 가이드 서열은 진핵생물 세포 내 하나 이상의 표적 서열에 하이브리드화한다.
7. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함한다.
8. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 촉매적으로 불활성이다.
9. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합된다.
10. 문장 9의 시스템에 있어서, 하나 이상의 기능성 도메인은 하나 이상의 표적 서열을 절단한다.
11. 문장 10의 시스템에 있어서, 기능성 도메인은 하나 이상의 표적 서열의 전사 또는 번역을 변형시킨다.
12. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고; Cas12b 이펙터 단백질은 RuvC 및/또는 Nuc 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 함유하여서, 형성된 CRISPR 복합체는 표적 서열에서 또는 그에 인접하여 후성적 변형자 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있다.
13. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 아데노신 디아미나제 또는 시티딘 디아미나제와 회합된다.
14. 전술한 문장 중 어느 하나의 시스템에 있어서, 재조합 주형을 더 포함한다.
15. 제14항의 시스템에 있어서, 재조합 주형은 상동성-지정 복구 (HDR)에 의해 삽입된다.
16. 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트, 및 i) a) 가이드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트, 및 b) tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제3 조절 엘리먼트, 또는 ii) 가이드 서열 및 tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는, Cas12b 벡터 시스템.
17. 문장 16의 벡터 시스템에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.
18. 문장 16 또는 17의 벡터 시스템에 있어서, 단일 벡터에 포함된다.
19. 문장 17 내지 18 중 어느 하나의 벡터 시스템에 있어서, 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다.
20. 문장 17 내지 19 중 어느 하나의 벡터 시스템에 있어서, 하나 이상의 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터를 포함한다.
21. i) 표 1 또는 2로부터 선택된 Cas12b 이펙터 단백질, ii) 하나 이상의 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열, 및 iii) tracr RNA를 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 조성물의 하나 이상의 핵산 성분 및 Cas12b 이펙터 단백질을 전달하도록 구성된 전달 시스템.
22. 문장 21의 전달 시스템에 있어서, 하나 이상의 벡터, 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고, 하나 이상의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 분자는 비천연 발생 또는 조작된 조성물의 하나 이상의 핵산 성분 및 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.
23. 문장 21 또는 22의 전달 시스템에 있어서, 리포솜(들), 입자(들), 엑소솜(들), 미세소포(들), 유전자총, 또는 바이러스 벡터(들)를 포함하는 전달 비히클을 포함한다.
24. 치료적 치료 방법에서 사용을 위한 문장 1 내지 15 중 어느 하나의 비천연 발생 또는 조작된 시스템, 문장 16 내지 20 중 어느 하나의 벡터 시스템, 또는 문장 21 내지 23 중 어느 하나의 전달 시스템.
25. 하나 이상의 관심 표적 서열을 변형시키는 방법으로서, 방법은 하나 이상의 표적 서열을 i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질, ii) 하나 이상의 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열, 및 iii) tracr RNA를 포함하는 하나 이상의 비천연 발생 또는 조작된 조성물과 접촉시켜서, crRNA 및 tracr RNA와 복합체를 형성하는 Cas12b 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체가 형성되는 것인 단계를 포함하고, 가이드 서열은 세포에서 하나 이상의 표적 서열과의 서열-특이적 결합을 유도하여서, 하나 이상의 표적 서열의 발현이 변형된다.
26. 문장 25의 방법에 있어서, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 표적 DNA의 절단을 포함한다.
27. 문장 25 또는 26의 방법에 있어서, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 하나 이상의 표적 서열의 발현 증가 또는 감소를 포함한다.
28. 문장 25 내지 27 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물은 재조합 주형을 더 포함하고, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 재조합 주형 또는 이의 부분의 삽입을 포함한다.
29. 문장 25 내지 28 중 어느 하나의 방법에 있어서, 표적 유전자는 원핵생물 세포에 존재한다.
30. 문장 25 내지 29 중 어느 하나의 방법에 있어서, 하나 이상의 표적 서열은 진핵생물 세포에 존재한다.
31. 변형된 관심 표적을 포함하는 세포 또는 이의 자손으로서, 하나 이상의 표적 서열은 문장 25 내지 30 중 어느 하나에 따른 방법으로 변형되었고, 임의로 치료적 T 세포 또는 항체-생성 B-세포이거나 또는 상기 세포는 식물 세포이다.
32. 문장 31의 세포에 있어서, 세포는 원핵생물 세포이다.
33. 문장 31의 세포에 있어, 세포는 진핵생물 세포이다.
34. 문장 31 내지 33 중 어느 하나에 따른 세포에 있어서, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하는 세포; 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하고, 적어도 하나의 유전자 산물의 발현이 증가된 것인 세포; 또는 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하고, 적어도 하나의 유전자 산물의 발현이 감소된 것인 세포; 또는 내생성 또는 비내생성 생물학적 산물 또는 화학적 화합물을 생산 및/또는 분비하는 세포 또는 개체군을 초래한다.
35. 문장 31 또는 34에 따른 진핵생물 세포에 있어서, 세포는 포유동물 세포 또는 인간 세포이다.
36. 문장 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 세포를 포함하는 세포주, 또는 이의 자손.
37. 문장 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 다세포 유기체.
38. 문장 31 내지 35 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 식물 또는 동물 모델.
39. 문장 31 내지 35 중 어느 하나의 세포로부터의 유전자 산물 또는 문장 36의 세포주 또는 문장 37의 유기체 또는 문장 38의 식물 또는 동물 모델.
40. 문장 39의 유전자 산물로서, 발현된 유전자 산물의 양은 변경된 발현을 갖지 않는 세포로부터의 유전자 산물의 양을 초과하거나 또는 그 미만이다.
41. 표 1 또는 2로부터의 단리된 Cas12b 이펙터 단백질.
42. 문장 41의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
43. 문장 42에 따른 단리된 핵산으로서, DNA이고 crRNA 및 tracr RNA를 코딩하는 서열을 더 포함한다.
44. 문장 42 또는 43에 따른 핵산 또는 문장 41의 Cas12b를 포함하는 단리된 진핵생물 세포.
45. i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 mRNA, ii) 가이드 서열, 및 iii) tracr RNA를 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 시스템.
46. 문장 45에 따른 비천연 발생 또는 조작된 시스템으로서, tracr RNA는 직접 반복부의 5' 말단에서 crRNA에 융합된다.
47. 표적화 도메인 및 아데노신 디아미나제, 시티딘 디아미나제, 또는 이의 촉매 도메인을 포함하는 부위 지정 염기 편집을 위한 조작된 조성물로서, 표적화 도메인은 Cas12b 이펙터 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드-결합 활성을 보유한 이의 단편, 및 가이드 분자를 포함한다.
48. 문장 47의 조성물로서, Cas12b 이펙터 단백질은 촉매적으로 불활성이다.
49. 문장 47 또는 48의 조성물로서, Cas12b 이펙터 단백질은 표 1 또는 2로부터 선택된다.
50. 문장 47-49 중 어느 하나의 조성물로서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp. V3-13, 바실러스 히사시이, 렌티스파에리아 박테리움, 및 라세이엘라 세디미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다.
51. 하나 이상의 관심 표적 올리고뉴클레오티드의 아데노신 또는 시티딘을 변형시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 표적 올리고뉴클레오티드에 문장 47 내지 50 중 어느 하나에 따른 조성물을 전달하는 단계를 포함한다.
52. 문장 51의 방법에 있어서, 병원성 T→C 또는 A→G 점 돌연변이를 함유하는 전사물에 의해 초개된 질환의 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
53. 문장 51 또는 52 중 어느 하나의 방법으로 수득되고/되거나 문장 47-50 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 단리된 세포.
54. 문장 53의 세포 또는 이의 자손에 있어서, 상기 진핵생물 세포는, 바람직하게 인간 또는 비인간 동물 세포, 임의로 치료적 T 세포 또는 항체-생성 B-세포이거나 또는 상기 세포는 식물 세포이다.
55. 문장 53 또는 54의 상기 변형된 세포 또는 이의 자손을 포함하는 비인간 동물.
56. 문장 54의 상기 변형된 세포를 포함하는 식물.
57. 요법, 바람직하게 세포 요법에서 사용을 위한 문장 53 또는 54에 따른 변형된 세포.
58. 표적 올리고뉴클레오티드의 아데닌 또는 시토신을 변형시키는 방법으로서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드에: 촉매적 불활성 Cas12b 단백질; 직접 반복부에 연결된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자; 및 아데노신 또는 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인을 전달하는 단계를 포함하고; 상기 아데노신 또는 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 상기 촉매적 불활성 Cas12b 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되거나 또는 상기 가이드 분자는 전달 후에 이에 연결되도록 적합화되고; 상기 가이드 분자는 상기 촉매적 불활성 Cas12b와 복합체를 형성하고 상기 복합체가 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 결합하도록 유도하며, 상기 가이드 서열은 상기 표적 올리고뉴클레오티드 내 표적 서열과 하이브리드할 수 있어서 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성한다.
59. 문장 58의 방법에 있어서, (A) 상기 시토신은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성하는 상기 표적 서열 밖에 존재하고, 상기 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스 밖의 상기 시토신을 탈아미노화시키거나, 또는 (B) 상기 시토신은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성하는 상기 표적 서열 내에 존재하고, 상기 가이드 서열은 상기 시토신에 상응하는 위치에서 비쌍형성 아데닌 또는 우라실을 포함하여 상기 RNA 듀플렉스에 C-A 또는 C-U 미스매치를 생성시키고, 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 비쌍형성 아데닌 또는 우라실 반대쪽 올리고뉴클레오티드 듀플렉스 내 시토신을 탈아미노화시킨다.
60. 문장 58 또는 59의 방법에 있어서, 상기 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스 내 상기 아데닌 또는 시토신을 탈아미노화시킨다.
61. 문장 58-60 중 어느 하나의 방법에 있어서, Cas12b 단백질은 표 1 또는 2로부터 선택된다.
62. 문장 61의 방법에 있어서, Cas12b 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp. V3-13, 바실러스 히사시이, 렌티스파에리아 박테리움, 및 라세이엘라 세디미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다.
63. 하나 이상의 시험관내 샘플에서 핵산 올리고뉴클레오티드 표적 서열의 존재를 검출하기 위한 시스템으로서, Cas12b 단백질; 하나 이상의 표적 서열과 일정 정도의 상보성을 갖도로 설계된 가이드 서열을 포함하고, Cas12b 단백질과 복합체를 형성하도록 설계된 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드; 및 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체를 포함하고; Cas12b 단백질은 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 하나 이상의 표적 서열에 의해 활성화되면 올리고뉴클레오티드 기반 차폐성 구성체의 비표적 서열을 절단한다.
64. 하나 이상의 시험관내 샘플에서 표적 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 시스템으로서, Cas12b 단백질; 하나 이상의 검출 압타머로서, 각각 하나 이상의 표적 폴리펩티드 중 하나에 결합하도록 설계되고, 각각의 검출 압타머는 차폐된 프로모터 결합 부위 또는 차폐된 프라이머 결합 부위 및 기폭제 서열 주형을 포함하는 것인 하나 이상의 압타머; 및 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체를 포함한다.
65. 문장 64 또는 65의 시스템에 있어서, 표적 서열 또는 기폭제 서열을 증폭시키기 위한 핵산 증폭 시약을 더 포함한다.
66. 문장 652의 시스템에 있어서, 핵산 증폭 시약은 등온 증폭 시약이다.
67. 문장 63 내지 66 중 어느 하나의 시스템에 있어서, Cas12b 단백질은 표 1 또는 2로부터 선택된다.
68. 문장 67의 시스템에 있어서, Cas12b 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp. V3-13, 바실러스 히사시이, 렌티스파에리아 박테리움, 및 라세이엘라 세디미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다.
69. 하나 이상의 시험관내 샘플에서 하나 이상의 서열을 검출하기 위한 방법에 있어서, 하나 이상의 샘플을 i) Cas12b 이펙터 단백질, ii) 하나 이상의 표적 서열과 일정 정도의 상보성을 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함하고, Cas12b 이펙터 단백질과 복합체를 형성하도록 설계된 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드; 및 iii) 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 Cas12 이펙터 단백질은 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체의 비표적 서열을 절단한다.
70. 문장 69의 방법에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 표 1 또는 2로부터 선택된다.
71. 문장 70의 방법에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스, 바실러스 sp. V3-13, 바실러스 히사시이, 렌티스파에리아 박테리움, 및 라세이엘라 세디미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원한다.
72. 효소 또는 리포터 모이어티의 불활성 제1 부분에 연결된 Cas12b 단백질을 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 조성물로서, 효소 또는 리포터 모이어티는 효소 또는 리포터 모이어티의 상보성 부분과 접촉될 때 재구성된다.
73. 문장 72의 조성물에 있어서, 효소 또는 리포터 모이어티는 단백질가수분해 효소를 포함한다.
74. 문장 72 또는 73의 조성물에 있어서, Cas12 단백질은 제1 Cas12b 단백질 및 효소 또는 리포터 모이어티의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 단백질을 포함한다.
75. 문장 72-74 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 제1 Cas12b 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 핵산의 제1 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 제1 가이드; 및 ii) 제2 Cas12b 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 표적 핵산의 제2 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 제2 가이드를 더 포함한다.
76. 문장 72-75 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 효소는 캐스파제를 포함한다.
77. 문장 72-75 중 어느 하나의 조성물에 있어서, 효소는 담배 식각 바이러스 (TEV)를 포함한다.
78. 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포에서 단백질가수분해 활성을 제공하는 방법으로서, a) 세포 또는 세포 개체군을, i) 단백질가수분해 효소의 불활성 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질; ii) 단백질가수분해 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 단백질가수분해 효소의 단백질가수분해 활성은 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 이펙터 단백질; iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 표적 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; 및 iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 표적 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드와 접촉시켜서, 단백질 가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉하고 단백질가수분해 효소의 단백질가수분해 활성이 재구성되는 것인 단계를 포함한다.
79. 문장 78의 방법에 있어서, 단백질가수분해 효소는 캐스파제이다.
80. 문장 79의 방법에 있어서, 단백질가수분해 효소는 TEV 프로테아제이고, TEV 프로테아제의 단백질가수분해 활성은 재구성되어서, TEV 기질이 절단되고 활성화된다.
81. 문장 80의 방법에 있어서, TEV 기질은 TEV 표적 서열을 함유하도록 조작된 프로캐스파제여서, TEV 프로테아제에 의한 절단은 프로캐스파제를 활성화시킨다.
82. 관심 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포를 확인하는 방법으로서, 방법은 세포 내 올리고뉴클레오티드를, i) 단백질가수분해 효소의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질; ii) 단백질가수분해 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 단백질가수분해 효소의 활성은 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 이펙터 단백질; iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드; 및 v) 검출가능하게 절단되는 리포터를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분은 관심 올리고뉴클레오티드가 세포에 존재할 때 접촉하여서, 단백질가수분해 효소의 활성이 재구성되고 리포터를 검출가능하게 절단한다.
83. 관심 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포를 확인하는 방법으로서, 바아법은 세포 내 올리고뉴클레오티드를, i) 리포터의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질; ii) 리포터의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 리포터의 활성은 리포터의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 이펙터 단백질; iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드; 및 v) 리포터를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 리포터의 제1 부분 및 상보성 부분은 관심 올리고뉴클레오티드가 세포에 존재할 때 접촉하여서, 리포터의 활성이 재구성된다.
84. 문장 82 또는 83에 있어서, 리포터는 형광 단백질 또는 발광 단백질이다.
본 발명은 청구항에 기술된 본 발명의 범주를 제한하지 않는, 하기 실시예에서 더욱 설명된다.
실시예:
실시예 1:
표 11은 예시적인 C2c1 오솔로그의 아미노산 서열을 표시한다.
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
표 13은 추가의 예시적인 Cas12b 오솔로그를 표시한다.
Figure pct00089
Figure pct00090
실시예 2 - 아데노신 디아미나제의 선택 및 디자인:
다수의 AD를 사용하고, 각각은 다양한 수준의 활성을 가질 것이다. 이들 AD는 하기를 포함한다:
1. 인간 ADAR(hADAR1, hADAR2, hADAR3)
2. 오징어 롤리고 페아레이 (Loligo pealeii) ADAR(sqADAR2a, sqADAR2b)
3. ADAT (인간 ADAT, 초파리 ADAT)
DNA-RNA 헤테로듀플렉스에 대한 ADAR 반응 활성을 증가시키기 위해 돌연변이를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 ADAR 유전자에 대해, hADAR1d(E1008Q) 또는 hADAR2d(E488Q) 돌연변이를 사용하여 DNA-RNA 표적에 대한 그들의 활성을 증가시킨다.
각각의 ADAR은 다양한 수준의 서열 내용 요건을 가진다. 예를 들어, hADAR1d(E1008Q)에 대해, tAg 및 aAg 부위는 효율적으로 탈아미노화되는 반면, aAt 및 cAc는 덜 효율적으로 편집되고, gAa 및 gAc는 훨씬 더 적게 편집된다. 그러나, ADAR이 다르면, 내용 요건은 다를 것이다.
시스템의 한 형태를 나타내는 개략도를 도 1에 제공한다. 예시적인 Cpf1-AD 융합 단백질의 아미노산 서열을 도 2 내지 도 4에 제공한다.
실시예 3 - 피시스파에라에 박테리움 ST-NAGAB-D1로부터의 C2c1 (Cas12b)의 특징규명
이. 콜라이 (stbl3)을 피시스파에라에 박테리움 CRISPR-C2c1 유전자좌의 내생성 게놈 서열의 일부를 함유하는 저카피수 플라스미드 (pACYC184)로 형질전환시켰다. 전체 RNA는 14시간 동안 배양된 세포로부터 추출하였고 RNA를 준비하고 소형 RNA 시퀀싱으로 분석하였다. 방법은 [Zetsche et al. 2015]가 기술된 대로 하였다.
소형 RNAseq는 tracer RNA의 위치 및 성숙한 crRNA의 아키텍처를 밝혀주었다. 성숙한 crRNA는 아마도 14 nt의 직접 반복부와 이어서 20-24 nt의 가이드 서열인 듯 하다. 높은 판독수를 갖는 잠재적 tracr 서열은 도 2에 도시되어 있고 서열은 표 12에 표시되어 있다. RNA 폴딩 예측을 기반으로 직접 반복부 (DR)를 갖는 tracrRNA 듀플렉스의 구조는 도 2에 도시된다.
PAM 스크리닝은 [Zetsche et al., 2015] 대로 수행하였다. 특히, Stbl3 이 콜라이는 인식가능한 프로토스페이서의 5'에 위치된 상이한 PAM 서열을 코딩하는 10 ng 플라스미드 DNA로 형질전환시켰고, 콜로니 계측을 수행하였다. 감소된 콜로니 형성이 TTH PAM (H = A, T, C)의 경우에 확인되었다.
실시예 4 - 비색 검출
DNA 사중체가 생물분자 피분석물 검출에 사용될 수 있다 (도 6). 한 경우에, OTA-압타머 (파란색)는 OTA를 인식하여, 입체형태 변화를 초래해 사중체 (빨간색)를 노출시켜 헤민에 결합되게 한다. 헤민-사중체 복합체는 퍼옥시다제 활성을 가져서, TMB 기질을 유색 형태 (일반적으로 용액 중에서 파란색)로 산화시킬 수 있다. 따라서, 사중체는 본 명세서에 기술된 CRISPR 부차적 활성에 의해 분해될 수 있다. 출원인은 또한 본 명세서에 기술된 CRISPR 부차적 활성의 일부로서 분해할 수 있는 이들 사중체의 RNA 형태를 생성시켰다. 분해는 RNA 압타머의 손실을 초래하여서, 핵산 표적 존재 하에서 색상 신호의 손실을 초래한다. 예시적인 2개 디자인을 하기에 예시한다.
1) rUrGrGrGrUrUrGrGrGrUrUrGrGrGrUrUrGrGrGrA (SEQ ID NO:514)
2) rUrGrGrGrUrUrUrGrGrGrUrUrUrGrGrGrUrUrUrGrGrGrA (SEQ ID NO:515)
구아닌은 사중체 구조를 생성하는 핵심 염기쌍을 형성하고 이것이 헤민 분자에 결합한다. 출원인은 디-뉴클레오티드 데이터가 구아닌이 불충분하게 분해된다는 것을 보여주므로 사중체의 분해를 허용하도록 우리딘 (굵은체로 표시)과 구아닌의 세트를 배치하였다.
비색 어세이는 본 명세서에 기술된 바와 같은 진단 어세이에서 사용을 위해 적용가능하다. 일 구현예에서, 적절한 사중체를 시험 샘플 및 Cas12 시스템과 인큐베이션시킨다. 다른 구현예에서, 적절한 사중체를 시험 샘플 및 Cas13 시스템과 인큐베이션시킨다. 예를 들어, 표적 서열의 Cas13 식별을 허용하고 부차적 활성에 의한 압타머의 분해를 위한 인큐베이션 기간 이후에, 기질을 첨가할 수 있다. 그러고 나서 흡광도를 측정할 수 있다. 다른 구현예에서, 기질을 사중체 및 CRISPR Cas9, Cas12, 또는 Cas13 시스템과 함께 어세이에 포함시킨다.
실시예 5
도 13 은 상이한 sgRNA를 도시한다. 도 14 는 상이한 표적 부위에 대한, 플라스미드 형질감염 이후, 도 13의 상이한 sgRNA로 수득된 indel 백분율을 도시한다. 사용된 Cas12b는 바실러스 히사시이 균주 C4로부터의 것이었다.
실시예 6
표 14는 Cas12b의 예시적인 오솔로그를 표시한다.
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
표 15는 표 14에 표시된 Ls, Ak, Bv, Phyci, 및 Planc의 Cas12b 오솔로그에 대한 crRNa, tracrRNA 및 sgRNA의 예시적인 서열을 표시한다. 도15A-15C 는 PAM 발굴, 각각 Ls, Ak 및 Bv에서 Cas12b 오솔로그를 사용한 정제된 단백질 및 RNA에 의한 시험관내 절단을 도시한다. 도 15D-15E 는 각각 Phyci 및 Planc의 Cas12B 오솔로그를 사용한 정제된 단백질 및 RNA에 의한 시험관내 절단을 도시한다.
표 15
Figure pct00118
Figure pct00119
실시예 7
알리시클로바실러스 마크로스포란지이더스 Cas12b에 대한 예시적인 직접 반복부 서열, crRNA 서열, tracrRNA 서열 및 sgRNA가 하기 표 16에 표시된다.
표 16
Figure pct00120
도 16 은 정제된 AmCas12b (AmC2C1) 단백질 및 소형 RNAseq로부터의 상이한 예상 tracr RNA에 의한 시험관내 절단 어세이를 도시한다. 우리는 TTA가 이 시점에 C2c1에 대한 공통 PAM이므로 TTTA PAM을 사용하였다.
다양한 sgRNA 디자인이 도 17A-17E에 도시된다. 도 17은 tracr RNA (붉은색)에 어닐링된 전장 AmC2C1 직접 반복부 서열 (녹색)을 도시한다. Tracr은 소형 RANseq로 예측되었고 시험관내에서 확인되었다. 파란색 원형 = 5' 말단; 붉은색 원형 = 3' 말단. 도 17B는 tracr RNA (붉은색)에 어닐링된 21 nt의 AmC2C1 직접 반복부 서열 (녹색)을 도시한다. Tracr은 소형 RANseq로 예측되었고 시험관내에서 확인되었다. 파란색 원형 = 5' 말단; 붉은색 원형 = 3' 말단. 도 17C는 전장 직접 반복부 및 tracr과 CTA 루프의 융합을 도시한다. 도 17D는 29nt의 직접 반복부 및 tracr과 CTA 루프를 도시한다. 도 17E는 21nt의 직접 반복부 및 tracr과 CTA 루프를 도시한다.
도 18 은 sgRNA 효율의 비교를 위한 AmC2C1에 의한 시험관내 절단을 도시한다.
AmC2C1 RuvC의 돌연변이체를 생성시켰고 그들 활성은 HEK 세포 용해물을 사용해 시험하였다 (도 19).
Cas12b 오솔로그에 대한 PAM은 시험관내 PAM 스크린으로 결정하였다. 간략하게, Cas12b 단백질 및 sgRNa는 PAM 라이브러리 플라스미드오 인큐베이션시켰다. 결과를 도 20 에 나타낸다.
실시예 8
바실러스 히사시이 Cas12b (BhC2C1)를 정제하였고 이의 활성을 상이한 온도에서 시험하였다. 도 21A-21D는 소형 RNAseq tracr 예측, 생체내 스크린으로부터의 BhC2C1 (바실러스 히사시이 Cas12b) PAM, BhC2C1 단백질 정제, 각각 37℃ 및 48℃에서 BhC2c1 단백질 및 예측 tracrRNA에 의한 시험관내 절단을 도시한다.
도 2A-22D는 BhC2C1 sgRNA 디자인을 도시한다. 예를 들어, 도 22A는 20 nt 직접 반복부 (녹색) 및 예측 tracr RNA (붉은색)를 도시한다.
BhC2C1의 직접 반복부 서열, tracr RNA 서열, 및 sgRNA 서열은 하기 표 17에 표시된다.
표 17
Figure pct00121
BhC2c1을 플라스미드에 클로닝하였다. 플라스미드의 맵은 도 23에 도시된다. 스캐폴드는 다음과 같았다:
GTTCTGTCTTTTGGTCAGGACAACCGTCTAGCTATAAGTGCTGCAGGGTGTGAGAAACTCCTATTGCTGGACGACGCCTCTTACGAGGCGTTAGCACn23_spacer (SEQ ID NO:565).
실시예 9
도 24 는 상이한 표적 부위에 대한, 플라스미드 형질감염 이후, 상이한 sgRNA로 수득된 indel 백분율을 도시한다. 사용된 Cas12b는 바실러스 V3-13 (Wp_101661451)로부터의 것이었다. 단백질 서열, sgRNA 서열, 및 표적화 부위는 하기 표 18에 표시된다.
표 18
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
실시예 10
BvCas12b (바실러스 sp. V3-13 Cas12b)는 플라스미드 (pcDNA3-BvCas12b)에 클로닝하였다. 플라스미드의 맵은 도 25에 도시된다. 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 19 에 제시되어 있다.
표 19
Figure pct00125
Figure pct00126
Figure pct00127
Figure pct00128
Figure pct00129
Figure pct00130
실시예 11
BhCas12b (바실러스 히사시이 Cas12b)는 플라스미드 (pcDNA3-BhCas12b)에 클로닝하였다. 플라스미드의 맵은 도 26에 도시된다. 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 20 에 제시되어 있다.
표 20
Figure pct00131
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
실시예 12
EbCas12b (엘루시미크로비아 박테리움 Cas12b)는 플라스미드 (pcDNA3-EbCas12b)에 클로닝하였다. 플라스미드의 맵은 도 27에 도시된다. 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 21 에 제시되어 있다.
표 21
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
실시예 13
AkCas12b (알리시클로바실러스 카케가웬시스 Cas12b)는 플라스미드 (pcDNA3-AkCas12b)에 클로닝하였다. 플라스미드의 맵은 도 28에 도시된다. 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 22 에 제시되어 있다.
표 22
Figure pct00142
Figure pct00143
Figure pct00144
Figure pct00145
실시예 14
PhyciCas12b (피시스파에라에 박테리움 Cas12b)는 플라스미드 (pcDNA3-PhyciCas12b)에 클로닝하였다. 플라스미드의 맵은 도 29에 도시된다. 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 23 에 제시되어 있다.
표 23
Figure pct00146
Figure pct00147
Figure pct00148
실시예 15
PlancCas12b (플란크토마이세테스 박테리움 Cas12b)는 플라스미드 (pcDNA3-PlancCas12b)에 클로닝하였다. 플라스미드의 맵은 도 30에 도시된다. 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 24 에 제시되어 있다.
표 24
Figure pct00149
Figure pct00150
Figure pct00151
실시예 16
BvCas12b를 함유하는 플라스미드 pZ143-pcDNA3-BvCas12b를 생성시켰다. 플라스미드의 맵은 도 31에 표시되고 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 25에 제시된다.
표 25
Figure pct00152
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
BvCas12b sgRNA 스캐폴드를 함유하는 플라스미드 pZ147-BvCas12b-sgRNA-scaffold를 생성시켰다. 플라스미드의 맵은 도 32에 표시되고 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 26에 제시된다.
표 26
Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
실시예 17
BhCas12b sgRNA 스캐폴드를 함유하는 플라스미드 pZ148-BhCas12b-sgRNA-scaffold를 생성시켰다. 플라스미드의 맵은 도 33에 표시되고 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 27에 제시된다.
표 27
Figure pct00159
Figure pct00160
S893, K846, 및 E836에 돌연변이를 갖는 BhCas12b를 함유하는 플라스미드 pZ149-BhCas12b-S893R-K846R-E836G를 생성시켰다. 플라스미드의 맵은 도 34에 표시되고 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 28에 제시된다.
표 28
Figure pct00161
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
S893, K846, 및 E836에 돌연변이를 갖는 BhCas12b를 함유하는 플라스미드 pZ150- pCDNA3-BhCas12b-S893R-K846R-E836K를 생성시켰다. 플라스미드의 맵은 도 35에 표시되고 클로닝된 구성체의 서열은 하기 표 29에 제시된다.
표 29
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
Figure pct00169
실시예 18
BhCas12b에 대한 이. 콜라이 PAM은 다양한 조건 하에서 시험관내 PAM 스크린으로 결정하였다. 결과를 도 36 에 제시된다.
실시예 19
BvCas12b에 대한 이. 콜라이 PAM은 다양한 조건 하에서 시험관내 PAM 스크린으로 결정하였다. 결과를 도 37 에 제시된다.
실시예 20
BhCas12b의 변이체를 생성시켰다. 돌연변이는 아래의 표 30 에 도시된다.
표 30
Figure pct00170
변이체의 활성은 상이한 결합 부위에서 indel 백분율을 시험하여 평가하였다. 시험의 결과가 표 38 에 제시되어 있다.
실시예 21
BhCas12b의 추가 변이체를 생성시켰고 그들 활성을 시험하였으며 실시예 20에서 생성된 변이체와 비교하였다.
추가 변이체는 돌연변이 S893R 및 K846R을 함유하였고, 돌연변이 E837H, E837K, E837N, E837L, E837I, D533G, N644K, D680P, L741Q, L792Q, F881L, V895A, V980E, T984A, K1022E, 또는 M1073I를 더 함유하였다. 변이체의 활성은 상이한 결합 부위에서 indel 백분율을 시험하여 평가하였다. 시험의 결과가 표 39 에 제시되어 있다.
실시예 22
BhCas12b (실시예 20의 변이체 4) 및 야생형 BvCas12b에 의한 절단에 의한 HDR은 상이한 부위에서 시험하였다. DNMT1-1에서 HDR의 결과는 도 40A에 도시되고 VEGFA-2에서의 HDR은 도 40B에 도시된다.
실시예 23
이 실시예는 ssODN 도너로 수행된 실험을 비롯하여 Cas12b 오솔로그의 활성 접근 상이한 PAM을 시험하기 위해 293T 세포에서 수행된 실험을 도시한다.
도 41A 는 TTTV PAM에서 AsCas12a 및 BhCas12b 변이체 4 및 BvCas12b ATTN PAMS의 indel 백분율의 비교를 도시한다. 도 41B 는 상이한 PAM 서열에서 BhCas12b 변이체 4 및 BvCas12b 활성의 붕괴를 도시한다.
도 42A 는 ssDNA 도너와 함께 도입시키려는 바람직한 변화를 포함한 VEGFA 표적의 개략도를 도시한다. 도 42B 는 VEGFA 표적 부위에서 각 뉴클레아제의 indel 활성을 도시한다. 도 42C 는 VEGFA 부위에서 바람직한 편집 (2개 뉴클레오티드 치환)을 함유하는 세포의 백분율을 도시한다. 도 42D 는 ssDNA 도너와 함께 도입시키려는 바람직한 변화를 포함한 DNMT1 표적의 개략도를 도시한다. 도 42E 는 DNMT1 표적 부위에서 각 뉴클레아제의 indel 활성을 도시한다. 도 42E 는 DNMT1 부위에서 바람직한 편집 (2개 뉴클레오티드 치환)을 함유하는 세포의 백분율을 도시한다. 도 42C 및 42E의 경우, 완벽한 편집은 파란색으로 도시되었고 붉은색 막대는 바람직한 2개 뉴클레오티드 치환, 및 추가 돌연변이없는 양쪽 PAM의 돌연변이를 포함하는 개략도에서 표시된 바와 같이 완벽하게 교정된 유전자좌를 함유하는 세포의 백분율을 표시한다.
실시예 24
CXCR4 유전자를 표적화하는 sgRNA와 BhCas12b (v4) 및 BvCas12b 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 시험관내에서 조립하였고 Lonza 4D-Nucleofector를 사용해 인간 CD4+ T 세포를 전기천공시켰다. 인간 CD4+ T 세포는 2명의 다른 도너로부터 획득하였다. RNP는 3 μM 최종 농도로 3x105 세포에 전달되었다. 전기천공된 세포는 48시간 후에 회수하였고 indel 돌연변이는 표적화 심층 시퀀싱으로 판독하였다. 도 43의 좌측 패널은 CXCR4의 표적화된 엑손 및 각각 BhCas12b (v4) 및 BvCas12b에 의해 표적화된 CXCR4 서열을 도시한다. 도 43의 우측 패널은 2명 도너로부터의 T 세포에서 CXCR4에 대한 BhCas12b (v4) 및 BvCas12b의 효과를 도시한 indel 백분율을 도시한다.
실시예 25 - CRISPR-Cas12b를 사용한 게놈 편집
V형 CRISPR 이펙터 Cas12b (C2c1로도 알려짐)는 적어도 부분적으로 특징규명된 패밀리 멤버의 고온 요구성으로 인해, 인간 세포에서 게놈 편집을 위해 개발하는 것이 도전이었다. 여기서 출원인은 다양한 Cas12b 패밀리를 조사하였고 바실러스 히사시이로부터 인간 유전자 편집을 위한 예시적인 유망한 후보물 BhCas12b를 확인하였다. 37℃에서, 야생형 BhCas12b는 이중 가닥 파손을 형성하는 대신에 비표적 DNA 가닥을 우선적으로 닉킹하여서, 낮은 편집 효율을 초래한다. 접근법의 조합들을 사용하여, 출원인은 이러한 한계를 극복한 BhCas12b에 대한 기능 획득 돌연변이를 동정하였다. 돌연변이체 BhCas12b는 인간 세포주 및 생체외 초대 인간 T 세포에서 강력한 게놈 편집을 촉진하였고, 에스. 피오게네스 Cas9와 비교해 더 큰 특이성을 나타냈다. 이러한 작업은 인간 세포에서 게놈 편집을 위해, Cas9 및 Cpf1/Cas12a 이외에도, 제3의 RNA-가이드된 뉴클레아제 플랫폼을 확립한다.
여기서 출원인은 중온성 Cas12b 효소를 검색하였고 37℃에서 비표적 DNA 가닥을 우선적으로 닉킹시키는, 바실러스 히사시이로부터의 유망한 후보물, BhCas12b를 동정하였다. 접근법의 조합을 사용하여, 출원인은 이러한 한계를 극복하고 37℃에서 양쪽 DNA 가닥을 절단하는 BhCas12b 변이체를 조작하였다. 출원인은 또한, 조작된 BhCas12b 변이체를 자연적으로 모방한, 바이킹 우주선이 조립된2 청정실에서 단리된 샘플로부터 시퀀싱된 제2 바실러스 sp. 오솔로그, BvCas12b를 동정하였다. 양쪽 특징규명된 Cas12b 뉴클레아제는 인간 세포에서 효율적인 게놈-편집을 촉진하였고 Cas9와 비교하여 더 높은 특이성을 나타냈다. 따라서, BhCas12b 및 BvCas12b의 특징규명 및 조작은 인간 세포에서 고도로 특이적인 게놈 편집을 위한 새로운 도구를 제공하여, CRISPR-Cas 시스템의 이러한 신규 클래스의 잠재성을 열어준다.
게놈 편집 도구는 재프로그램가능하고 고도로 특이적인 것이 바람직할 수 있고, 원핵생물 CRISPR 및 CRISPR-연관 단백질 (CRISPR-Cas) 시스템은 자연적으로 이들 성질을 부여한다3,4. 현행 게놈 편집 기술은 게놈 절단을 위한 단일-단백질 이펙터 뉴클레아제를 함유하는, 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템에 집중하고 있지만, 클래스 2 뉴클레아제의 오직 하기 2개 패밀리가 지금까지 인간 세포에서 게놈 편집을 위해 이용되었다: tracrRNA7 와 기능할 수 있고 HNH 및 RuvC 뉴클레아제 도메인8,9을 함유하는, Cas95,6 및 짧은 crRNA를 사용하고 단일 RuvC 도메인을 함유하는 Cas12a10. 여기서 출원인은 단일 RuvC 도메인을 함유하고 tracrRNA11 를 요구하는 클래스 2 엔도뉴클레아제의 제3 패밀리, Cas12b에 집중하였다 (도 44a). Cas12b 단백질이 종종 Cas9 및 Cas12a에 비해 작고 게놈 편집에 잠재적으로 유망하게 보이지만, 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) 유래의 최고로 특징규명된 Cas12b 뉴클레아제 (AacCas12b)는 48℃1에서 최적 DNA 절단 활성을 나타낸다. 충분히 특징규명된 패밀리10,12 내에서 Cas 이펙터의 다양한 성질을 고려하면, 출원인은 저온에서 활성이 있는 Cas12b 패밀리 멤버을 동정하고자 하였고 따라서 인간 게놈 편집을 위해 적합화시킬 수 있었다.
질문으로서 이전에 검출된 Cas12b 단백질을 사용한 최신 서열 데이터베이스의 BLAST 검색은 V-B형 유전자좌 내에서 코딩되는 약 25개 멤버의 Cas12b 패밀리를 동정하였다. V-B형 시스템은 박테리아 간에 광범위하게 산재되어 있고, Cas12b의 계통수 형태 (도 48a)는 일반적인 박테리아 분류법을 따르지 않아서, 광대한 수평 이동을 시사한다. 그러나, 특히, 계통수에서 강력하게 뒷받침되는 분기군을 형성하는 V-B형 유전자좌의 대략 절반은 바실라레스 (Bacillales) 박테리아 목의 멤버에서 확인된다. 출원인은 실험 연구를 위해 다양한 박테리아로부터 14개의 비규명된 Cas12b 유전자를 선택하여, 고온균으로 인식된 것들과 이전에 기술된 멤버은 피하였다. 모든 공지된 클래스 2 DNA-표적화 CRISPR-Cas 뉴클레아제는 DNA 절단을 위해 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM)8,10 를 필요로 하고, Cas12b 패밀리의 초기 특징규명은 표적 부위1의 5' 면 상의 PAM을 밝혀주었다. 확인된 유전자좌가 기능성 CRISPR-Cas 시스템이라는 것을 확증하고 그들의 PAM을 확인하기 위해서, 14개 후보 각각에 대해서, 출원인은 이. 콜라이에서 그들의 천연 측접 서열과 인간 코된 최적화된 Cas12b를 발현시켰고 무작위화된 5' PAM 라이브러리로 형질전환된 세포를 챌린지시킨 후에 심층 시퀀싱을 수행하였다 (도 48b 및 48c). 출원인은 14개의 시험된 Cas12b 시스템 (AkCas12b, BhCas12b, EbCas12b, 및 LsCas12b) 중 4개에서 결실을 검출하여 이종성 숙주에서 기능성 DNA 간섭을 시사하였다. 고갈된 PAM은 스페이서 상류의 1-4 bp 위치에서 T-풍부하여, 이전에 연구된 Cas12b 멤버11에서 관찰된 선호도와 일관되었다. 출원인은 필요한 RNA 성분을 확인하기 위해 이. 콜라이 용해물 상에서 소형 RNA-Seq을 수행하였고 Cas12b 및 CRISPR 어레이 사이 영역에 대해 맵핑된 추정 tracrRNA를 확인하였다 (도 49a-49d).
Cas12b를 생화학적으로 특징규명하기 위해서, 출원인은 확인된 PAM을 함유하는 표적 상에서, 정제된 Cas12b 단백질 및 예상 tracrRNA 및 crRNA로 시험관내 활성에 대해 시험하였다 (도 44b, 도 49e). 출원인은 EbCas12b 및 LsCas12b로 오직 최소의 활성을 관찰하였지만, AkCas12b 및 BhCas12b 둘 모두는 37℃에서 강력한 절단을 나타내서, 인간 세포에서 추가 연구를 타당하게 한다. 세포에서 게놈 편집이 단일 가이드 RNA (sgRNA)13에 의해 더 효율적이라는 것을 고려하여, 출원인은 AkCas12b 및 BhCas12b에 대한 sgRNA를 설계하였고 시험관내에서 그들 활성을 검증하였다 (도 49f). 출원인은 U6 프로모터에 의해 구동되는 NLS-태그화 Cas12b 및 sgRNA를 발현하는 플라스미드로 293T 세포를 형질감염시켰고 표적화 심층 시퀀싱을 통해 삽입 또는 결실 (indel) 돌연변이의 형성을 통해 뉴클레아제 활성을 모니터링하였다. 양쪽 Cas1b 단백질에 대해 관찰된 indel 비율은 검출가능하였지만 1% 이하였다 (도 44c 및 44d). 효율을 증가시키기 위해서, 출원인은 tracrRNA 및 crRNA를 변경시키고, 헤어핀 미스매치를 제거하고, 5' 출발 부위 및 스페이서 길이를 변형시켜서 sgRNA 스캐폴드 내 변화 효과를 시험하였다 (도 44c-44e, 도 50). AkCas12b sgRNA 내 변경이 적은 효과를 갖지만, BhCas12b sgRNA의 5-nt 5' 절두는 다수 표적에 걸쳐서 실질적으로 활성을 개선시켰다.
출원인은 빈번하게 시험관내 절단 반응의 겔 전기영동 동안, 가장 특히 AkCas12b에서, 더 느린 이동을 관찰하였으며, Cas12b가 이중 가닥 DNA (dsDNA) 기질을 닉킹할 수 있다는 것을 의미한다 (도 44b). 차등적으로 표지된 DNA 가닥과의 반응은 AkCas12b 및 BhCas12b가 비표적 가닥을 우선적으로 절단하고, 이러한 거동은 저온에서 보다 현저하다는 것을 밝혔다 (도 45a). 표적-가닥을 절단하는 불능성은 게놈 편집 도구로서 BhCas12b의 가능성을 감소시키므로, 출원인은 단백질 조작을 통해 이러한 한계를 해결하고자 하였다.
표적-가닥은 BhCas12b의 RuvC 활성 부위에 충분치 않게 접근가능할 수 있다. 출원인은 BhCas12b 내 이러한 포켓의 성질이 표적-가닥 접근성 및 DNA 절단을 개선시킬 수 있는지 여부를 시험하였다. 출원인은 AacCas12b와의 정렬을 통해서 확인된 12 BhCas12b 잔기를 돌연변이시켰고, 이 잔기는 또한 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) 유래의 거의 동일한 Cas12b (BthCas12b)의 구조에서 관찰되었다 (BthCas12b는 또한 세포에서 활성을 나타냈지만, BhCas12b 만큼 효율적이지는 않음 도 51a)15. 출원인은 총 268 BhCas12b 단일 돌연변이체로 2개 표적 부위에서 indel 활성을 측정하였고 K846R 및 S893R을 포함한 몇몇 돌연변이에서 증가된 활성을 확인하였으며, 이중 돌연변이체로서 가산적 효과를 나타냈다 (도 45b 및 45c, 도 51b 및 51c). 양으로 하전된 아르기닌 측쇄는 종종 핵산의 골격과 상호작용하므로16, 돌연변이체의 증가된 DNA-결합 친화성은 표적-가닥을 RuvC 활성 부위를 향해 당겨서 DNA 절단을 촉진하는 것을 돕는게 가능하다.
직교적 접근법으로서, 출원인은 표적-가닥 절단의 온도-의존성을 해결하고자 하였다. 출원인은 66 표면 노출 잔기에서 글리신 치환을 생성시키고 다시 2개 표적 부위에서 indel 활성을 시험하였다. 현저하게, 출원인은 E837G 변이체를 갖는 야생형에 비해서 2배 이상 개선을 관찰하였고, 이 위치는 가이드 RNA:DNA 듀플렉스 및 RuvC 활성 부위 사이에 위치된다 (도 45d 및 45e). 돌연변이의 조합 시험은 점진적으로 활성 변이체를 야기시켰는데, K846R/S893R/E837G를 함유하는 최종 BhCas12b v4 변이체가 다수 표적에 걸쳐 최고 활성을 나타냈다 (도 45f 및 45g). 인간 세포에서 이들 결과와 일관되게, 정제된 BhCas12b v4 단백질은 37℃에서 증가된 dsDNA 절단 활성 및 닉킹된 dsDNA의 분명한 감소를 나타냈다 (도 45h, 도 51g-51j).
출원인의 Cas12b 효소의 초기 선택은 스크리닝된 변이체의 다양성을 증가시키기 위해 동일 종으로부터의 오솔로그는 피하였다. 그러나, BhCas12b에 의한 긍정적인 게놈 편집 결과를 고려하여, 출원인은 바실러스 sp.멤버을 재논의하였고, 바이킹 우주선이 조립된 청정실에서 단리된, 바실러스 sp. V3-13 로부터 최근에 기탁된 게놈에서 코딩되는 Cas12b 오솔로그 (BhCas12b와 41% 서열 동일성)를 찾았다2. 출원인은 이 단백질을 특징규명하였고, 본 명세서에서 BvCas12b라고 하며, BvCas12b가 37℃에서 ATTN PAM을 갖는 표적 DNA를 효율적으로 절단한다는 것을 발견하였다 (도 52). 흥미롭게도, BhCas12b v4 돌연변이 K846R 및 S893R은 각각 BvCas12b의 R849 및 H896에 상응하고 (도 53a), BvCas12b가 자연적으로 최적 dsDNA 절단 활성을 진화시켰다는 것을 시사한다. 이러한 아이디어와 일관되게, 출원인은 시험관내에서 BvCas12b로 임의의 닉킹 산물을 검출하지 않았다 (도 53b). 또한, 글리신 치환이 BhCas12b E837G에 상응하므로, BvCas12b의 표적 가닥 포켓 내 표적화 돌연변이는 모두 활성을 감소시켰다 (도 53c-53e).
강력한 게놈 편집 도구는 표적 범위에 걸쳐 효과적이고 특이적인 것이 바람직할 수 있다. 출원인은 이전에 연구된 Cas 뉴클레아제와 비교하여 보다 철저하게 Cas12b를 조사하였다. 출원인은 293T 세포에서 5개 유전자에 걸쳐 56개 표적에서 BhCas12b v4 및 BvCas12b를 시험하였고 양성 대조군으로서 ATTN PAM에서 AsCas12a를 사용해 ATTN PAM에서 강력한 절단을 발견하였다 (도 46a). Cas12b에 의해 형성된 indel 패턴의 분석은 우세한 5-15bp 결실을 밝혀주었다 (도 46b). 출원인은 TTTN 및 GTTN PAM의 서브세트에서 높은 Cas12b 활성을 관찰하였지만, 이러한 활성은 덜 강력하였다 (도 54a). 출원인은 매치되는 부위에서 BhCas12b v4 및 BvCas12b의 활성 사이에 약한 상관성만을 관찰하였고 (R2=0.48), 수많은 표적이 2개 뉴클레아제 중 하나에 의해 보다 효율적으로 절단되었다 (도 54b). 이들 발견은 다수 오솔로그의 이득을 강조하고 계속적으로 Cas 뉴클레아제의 표적화 규칙을 철저하게 조사할 필요가 있었다. 인간 게놈에서 ATTN 출현율의 분석은 Cas12b 효소에 대한 유사한 표적가능성을 밝혀주었다 (도 54c). SpCas9 및 AsCas12a와 대조적으로, BhCas12b에 의해 형성된 indel 패턴의 분석은 5-15 bp의 두드러지게 더 큰 결실을 밝혀주었다 (도 46f). 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 (ssODN) 도너와 Cas12b 뉴클레아제의 공동 형질감염은 TTTC PAM 표적에서 SpCas9 및 AsCas12a와 비슷한 편집 효율을 야기시켰고 (도 46c-46e), ATTC PAM 표적에서 더 높은 편집 효율을 야기시켰다 (도 54d-54f). 인간 세포에서 BhCas12b v4의 효율을 더욱 평가하기 위해서, 출원인은 초대 인간 T 세포를 편집하는 Cas12b 리보핵단백질 (RNP)의 능력을 시험하였다. 출원인은 BhCas12b v4-sgRNA 복합체를 생성시켰고 그들을 전기천공을 통해서 인간 CD4+ T 세포로 전달하였다. BhCas12b v4 RNP는 3개 시험된 표적에 걸쳐서 32-49%의 indel 비율을 나타냈다 (도 46g). 함께, 이들 데이터는 BhCas12 v4 및 BvCas12b는 치료적으로 관련된 인간 세포 유형을 포함하여, 다양한 게놈 편집 상황에서 기능성의 프로그램가능한 뉴클레아제로서 이용될 수 있다는 것을 시사한다.
다음으로 출원인은 세포에서 Cas12b 특이성을 결정하고자 하였다. 출원인은 상이한 Cas 뉴클레아제 간에 비슷한 indel 활성을 갖는 9개 표적 부위를 선택하였고 (도 47a), 이들 표적으로 Guide-Seq 분석을 수행하였다19. 출원인은 Cas12b 뉴클레아제 및 AsCas12a 둘 모두에 대해 임의의 오프-표적 부위를 검출하지 않았는데 반해서, SpCas9는 9개 시험된 가이드 중 6개에서 현저한 오프-표적 절단을 초래하여 (도 47b, 도 55), 이의 기지의 혼잡성과 일관된다13,20. 예를 들어, 표적 3의 경우에, 출원인은 SpCas9로 101개 삽입 부위를 검출하였고, 판독치의 오직 10%만이 표적 부위로 맵핑되었으며, 2개 Cas12b 효소 중 어느 것에서도 오프-표적 부위는 없었다. 비매치된 부위에서 추가의 가이드-Seq 실험은 BhCas12b v4의 경우에 14개 부위 중 오직 2개에서, 그리고 BvCas12b의 경우에 15개 부위 중 1개에서 유의한 오프-표적 절단이 검출되었다 (도 56a, 57). 이들 발견과 일관되게, 출원인은 위치 1-20에서 가이드 RNA 및 표적 DNA 간에 이중 미스매치로 제한된 indel 활성을 관찰하였고 심지어 단일 미스매치에 대해 낮은 내성이 관찰되었다 (도 56b 및 56c). 이들 결과는 시험관내에서 AacCas12b의 보고된 특이성과 일관되고21, 세포에서 관찰된 낮은 오프-표적 활성에 대해 분자 기전을 제공한다.
여기서 출원인은 인간 세포에서 게놈 편집에 적합한 V형 CRISPR Cas12b 패밀리의 처음 2개 멤버을 기술한다. 많은 Cas12b 뉴클레아제가 고온에서 강력한 선호도를 보이지만, 우리의 광범위한 스크리닝은 37℃에서 고도로 활성인 이러한 패밀리의 멤버의 동정을 야기시켰다. 더 나아가서, BhCas12b의 우리의 조작은 dsDNA 절단의 효율에서 실질적인 증가를 야기시켰고 게놈 편집 도구로서 다른 Cas12b 뉴클레아제의 가능성을 열어주는 프레임워크를 제공한다. BhCas12b 및 BvCas12b 둘 모두는 비교적 조밀한 단백질 (각각 약 1100개 아미노산)이므로, 아데노-연관 바이러스 (AAV)로 효율적인 패키징에 적합하다. 그들의 높은 표적 특이성과 조합하여, 이들 Cas12b 효소는 생체내 게놈 편집을 위한 유망한 신규 도구이다.
보충 정보
Cas12b 패밀리 단백질의 다중 정렬
서열은 수탁 번호로 표시된다. 바실러스 sp V3-13 (WP 101661451.1) 및 바실러스 히사시이 (WP_095142515.1)의 서열은 붉은색으로 강조된다. 이 작업에서 돌연변이된 12개 잔기는 비. 히사시이 (WP_095142515.1) 서열에서 붉게 강조하여 표시된다. 치환이 BhCas12 v4 돌연변이체에서 DNA 절단 효율에 실질적으로 영향을 미친 잔기는 붉은색 강조되고, 노란색으로 표시된다.
재료 및 방법
Cas12b 서열 정렬 및 계통수 재구성
정렬은 MUSCLE 프로그램 (v 3.7)23을 사용해 구성되었다. 정렬은 하기 아미노산 그룹에 대한 100% 일치에 따라서 www.bioinformatics.org/sms2/color_align_cons.htm 서버를 사용해 착색하였다: GAVLI, FYW, CM, ST, KRH, DENQ, P. 50% 초과의 갭을 갖는 위치는 계통수 재구성을 위해 사용된 정렬로부터 폐기하였다. PHYML 프로그램 (v. 20120412)24을 사용하여 최대-가능성 뿌리없는 계통수를 생성시켰다. 동일한 프로그램을 통한 사용하여, 선택된 분지에 대해 표시된, 부트스트랩 값을 산출하였다.
Cas12b 발현 플라스미드의 생성
Cas12b 유전자좌를 합성하였고 이. 콜라이에서 발현을 위해 pACYC184 (Genewiz)에 클로닝하였다. Cas12b 오픈 리딩 프레임 (ORF)는 인간 발현을 위해 코돈 최적화하였디만 ORF 측접된 상류 및 하류 서열은 변화시키지 않고 남겨두었다. CRISPR 어레이는 3 직접 반복부로 단축시켰고 제1 내생성 스페이서는 FnCpf1 프로토스페이서 1 (FnPSP1) 서열 (GAGAAGTCATTTAATAAGGCCACTGTTAAAA) (SEQ ID No:591)로 치환하였다.
PAM 발굴
PAM의 동정은 이전에 기술된 대로 수행하였다10. 간략하게, pACYC184-Cas12b 시스템을 발현하는 이. 콜라이 세포는 Z-competent kit (Zymo Research)로 적격하게 만들었다. pACYC184-Cas12b 또는 빈 pACYC184를 발현하는 세포는 FnPSP1 표적 부위의 5' 측면 상에 무작위 8N 서열을 갖는 PAM 라이브러리로 형질전환시켰고, 16시간 동안 밤새 성장시켰다. 플라스미드 DNA를 단리하였고, 라이브러리는 75-cycle NextSeq kit (Illumina)를 사용해 시퀀싱하였다. 라이브러리 내 PAM 표시는 고객 Python 스크립트를 사용해 결정하였고 2개 독립 복제물로 대조군과 Cas12b를 비교하였다. 서열 모티프는 Weblogo tool (weblogo.berkeley.edu)을 사용해 생성시켰다. PAM 휠은 Krona plots (github.com/marbl/Krona/wiki)22을 사용해 생성시켰다.
박테리아 RNA 시퀀싱
소형 RNA-Seq는 이전에 기술된 대로 수행하였다1,10. 간략하게, RNA는 TRIzol을 사용해 이. 콜라이 용해물로부터 제조한 후에 BeadBeater (BioSpec Products)를 사용해 균질화시켰다. rRNA는 Ribo-Zero kit (Illumina)를 사용해 제거하였고 라이브러리는 NEBNext Small RNA Library Kit for Illumina (NEB)를 사용해 제조하였다. 라이브러리는 2x150 쌍형성-말단 MiSeq run (Illumina)으로 시퀀싱하였고 판독치를 정렬하고 Geneious R9 (Biomatters)로 분석하였다.
Cas12b 단백질의 정제
Cas12b 유전자는 박테리아 발현 플라스미드 (T7-TwinStrep-SUMO-NLS-Cas12b-NLS-3xHA)에 클로닝하였고 BL21(DE3) 세포 (Novagen #70956의 pLysS-tRNA 플라스미드 함유 NEB #C2527H)에서 발현시켰다. 세포는 중간 대수기까지 Terrific 액체배지에서 성장시켰고 온도를 20℃로 낮추었다. 발현은 수확전에 0.6 OD에서 0.25 mM IPTG를 사용해 16-20시간 동안 유도시켰고 -80℃에 세포를 냉동시켰다. 세포 페이스트를 EDTA-무함유 완전 프로테아제 억제제 (Roche)가 보충된 용해 완충액 (50 mM TRIS pH 8, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 1 mM DTT)에 재현탁시켰다. 세포는 LM20 미세유동기 장치 (Microfluidics)를 사용해 용해시켰고 Strep-Tactin Superflow Plus 레진 (Qiagen)에 결합된 용해물을 제거하였다. 레진은 용해 완충액으로 세척하였고 Cas12b 단백질은 5 mM 데스티오바이오틴이 보충된 용해 완충액으로 용리하였다. TwinStrep-SUMO 태그는 홈메이드 SUMO 프로테아제 Ulp1를 사용해 1:100의 프로테아제 대 Cas12b의 중량비로 4℃에서 밤새 분해하여 제거하였다. 절단된 Cas12b는 200 mM NaCl 까지 희석하였고 200 mM-1 M NaCl 농도구배로 AKTA Pure 25 L (GE Healthcare Life Sciences) 상에서 HiTrap Heparin HP 컬럼을 사용해 정제하였다. Cas12b를 사용하는 분획을 모았고 농축하였으며 25 mM TRIS pH 8, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, 1 mM DTT의 최종 저장 완충액을 사용해 Superdex 200 Increase 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences) 상에 로딩하였다. 정제된 Cas12b 단백질을 5 uM 또는 73 uM 스톡으로 농축하였고, -80℃에 저장 전에 액체 질소에서 급속 냉동시켰다.
시험관내 RNA 합성
모든 RNA는 짧은 T7 올리고뉴클레오티드와 바람직한 RNA의 역상보체를 함유하는 DNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링시켜 생성시켰다. 시험관내 전사는 HiScribe T7 High Yield RNA 합성 키트 (NEB)를 사용해 37℃에서 8-12시간 동안 수행하였고 RNA는 Agencourt AMPure RNA Clean beads (Beckman Coulter)를 사용해 정제하였다.
시험관내 절단 반응
DNA 기질은 FnPSP1 표적 부위를 함유하는 pUC19 플라스미드의 PCR 증폭으로 생성시켰다. 전형적인 반응물은 100 ng의 DNA 기질, 250 nM의 Cas12b 단백질, 500 nM의 RNA 및 20 mM TRIS pH 6.5, 6 mM MgCl2의 최종 1x 반응 완충액을 함유하였다. 반응은 20 mM EDTA로 켄칭하였고, RNA는 5 ug RNAse A (Qiagen)로 37℃에서 5분 동안 분해시켰으며, DNA 산물은 PCR cleanup kit (Qiagen)를 사용해 정제하였다. 반응물을 Novex 10% TBE PAGE 겔 상에서 1x TBE 완충액 (Thermo Fisher Scientific) 중에 러닝하였고 SYBR Gold (Thermo Fisher Scientific)로 염색하였다. 표지된 DNA 기질은 IR700 및 IR800 접합된 DNA 올리고뉴클레오티드 (IDT)로 생성시켰다. 변성 겔의 경우, DNA는 동일 부피의 100% 포름아미드와 혼합하고 나서 95℃에서 5분 동안 열변성시켰다. 산물은 60℃로 예열시킨 1x TBE 완충액 중에 Novex Urea-PAGE 겔 (Thermo Fisher Scientific) 상에서 분리하였고 Odyssey CLx 장치 (LI-COR) 상에서 이미지화시켰다. 적용가능한 경우에, DNA 절단 또는 닉킹의 정량은 식, 100 x (1 - sqrt(1 - (b+c)/(a+b+c)))으로 결정하였고, 여기서 a는 미분해 산물의 통합 강도이고, b 및 c는 각 절단 또는 닉킹 산물의 통합 강도이다.
포유동물 발현 구성체 및 돌연변이유발
Cas12b 유전자는 그들의 상응하는 pACYC184 플라스미드로부터 증폭시켰고 N- 및 C-말단 NLS 태그 및 C-말단 3xHa 태그를 함유하는 pCDNA3.1에 클로닝시켰다. 가이드 발현 플라스미드는 U6 프로모터 뒤에 2개의 인버티드 BsmBI IIS형 제한효소 부위를 함유하는 sgRNA 스캐폴드를 클로닝하여 생성시켰다. 가이드는 2개의 어닐링된 상보성 올리고뉴클레오티드와 골든 게이트 조립을 통해 스캐폴드에 클로닝하였다. 표시하지 않으면, 모든 가이드는 23-nt 길이였다. 바람직한 Cas12b 돌연변이는 Gibson Assembly Master Mix (NEB)를 사용하여 조립시킨 2개의 중복 Cas12b PCR 산물을 생성시키도록 올리고뉴클레오티드 상에 정렬시켰다. 사용된 가이드 서열은 하기 표 31에 표시된다.
표 31
Figure pct00171
Figure pct00172
세포 배양 및 형질감염
HEK293T 세포 (ATCC)는 고 글루코스, 소듐 피루베이트, 및 GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), 1x 페니실린-스트렙토마이신 (Thermo Fisher Scientific), 및 10% 태아 소 혈청 (Seradigm)이 존재하는 둘베코의 변형 이글 배지에서 배양하였다. 세포는 90% 이하의 융합점으로 유지시켰고 MycoAlert detection kit (Lonza)를 사용해 마이코플라스마 음성을 시험하였다. Indel 분석을 위해서, 96웰 플레이트는 형질감염 시 대략 75%의 융합점을 위해 형질감염 전에 대략 16시간 동안 17,500 세포/웰이 파종되었다. 각각의 96-웰은 20 uL의 Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific)과 0.6 uL의 TransIt-LT1 형질감염 시약 (Mirus) 중 100 ng의 가이드 플라스미드 및 100 ng의 뉴클레아제 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포는 QuickExtract DNA 추출 용액 (Lucigen)으로 형질감염 후 72시간에 수확하였다.
HDR 실험을 위해서, 100 ng의 뉴클레아제, 100 ng의 가이드 및 100 ng의 ssODN가 96웰 당 0.9 uL의 TransIt-LT1 형질감염 시약 (Mirus)으로 형질감염되었다. ssODN는 Ultramer DNA 올리고뉴클레오티드 (IDT)로서 주문하였고 각 말단에 3 포스포로티오에이트 변형을 함유하였다.
Indel 돌연변이의 심층 시퀀싱
표적화된 indel 분석은 Illumina P5 어댑터 및 고유한 샘플-특이적 바코드를 첨가하기 위해 2-라운드 PCR 전략을 사용해 NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix (NEB)로 관심 게놈 영역을 증폭시켜 수행하였다. 라이브러리는 1x200 cycle MiSeq runs (Illumina)로 시퀀싱하였다. Indel 비율은 Outknocker 225를 사용해 측정하였다.
(www.outknocker.org/outknocker2.htm).
오프-표적 분석
오프-표적 절단 부위는 변형 라이브러리 제조로 가이드-Seq를 사용해 확인하였다. 간략하게, 세포는 0.5 uL GeneJuice 형질감염 시약 (Millipore) 존재의 50 uL Opti-MEM 중 75 ng 뉴클레아제 플라스미드, 25 ng 가이드 플라스미드, 및 100 ng 어닐링된 dsDNA 올리고를 사용해 96웰 플레이트에서 형질감염시켰다.
F: /5phos/G*T*TGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACGCCTCTCTCCCAGCGACT*A*T (SEQ ID NO:644)
R: /5phos/A*T*AGTCGCTGGGAGAGAGGCGTTATCCTCCTCGCCCTTGCTCACA*A*C (SEQ ID NO:645)
세포는 72시간 후에 회수하였고 각 실험에 대해 10 웰을 모았다. 1E6 세포를 용해시켰고 게놈 DNA를 Tn5로 태그화시킨 후에 플라스미드 미니-프렙 컬럼 (Qiagen)을 사용해 정제하였다. 라이브러리는 Tn5 어댑터-특이적 프라이머 및 DNA 도너 내 네스티드 프라이머를 사용해 KOD Hot Start DNA 중합효소 (Millipore)로 2 라운드의 PCR 증폭을 사용해 제조하였다. 라이브러리는 75-cycle NextSeq 키트 (Illumina)로 시퀀싱하였다. 판독치는 BrowserGenome.org26를 사용해 인간 게놈 (hg38)에 대해 맵핑하였다.
T 세포 배양
인간 CD4+ T 세포 (STEMCELL Technologies)는 5mM HEPES, pH 8.0 (Gibco), 50 ug/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco), 50 uM 2-머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich), 5 mM MEM 불필수 아미노산 (Gibco), 5 mM 소듐 피루베이트 (Gibco) 및 10% FBS (Seradigm)가 보충된 RMPI 1640 (Glutamax Supplement, Gibco)에서 배양하였다. 세포는 10 ug/mL의 항-CD3 (UCHT1, eBioscience, Invitrogen) 및 항-CD28 (CD28.2, eBioscience, Invitrogen) 단일클론 항체가 코팅된 디쉬 상에서 2일 마다 플레이팅하여 해동 후 5-7일 동안 활성화시켰다.
RNP 복합체화 및 전달
BhCas12b sgRNA는 3' 말단에 3개 2'O-메틸 변형을 갖게 합성하였다 (Integrated DNA Technologies). RNP는 10 mg/mL 단백질과 50 uM의 어닐링된 RNA를 1:1 몰비율로, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켜 형성시켰다. RNP는 전기영동까지 얼음 상에 저장하였다.
세포는 Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit (Lonza)를 사용해 전기천공시켰다. 반응 당, 3 x 105 자극된 CD4+ T 세포를 펠렛화시켰고 20uL의 P3 완충액에 재현탁시켰다. crRNA 및 tracrRNA와 사전복합체 형성된, 4.5 uM Cas9 또는 Cas12b 단백질을 첨가하였고 혼합몰을 전기천공 큐벳으로 옮겼다. 세포는 프로그램 Eh-115를 사용하여 Amaxa 4D-Nucleofector (Lonza) 상에서 전기천공하였다. 80 uL의 예열된 완전 배지를 즉시 펄스 후 세포에 첨가하였고 세포를 큐벳에서 회수하기 위해서 30분 동안 37 C에 인큐베이션시켰다. 회수 후, 50 uL의 세포 현탁액을 40 IU/mL Il-2의 최종 농도로 80 IU/mL IL-2 (STEMCELL Technologies)가 더해진 50 uL의 완전 배지에 첨가하였다. 세포는 CD3/CD28 사전코팅된 96웰 플레이트 상에 플레이팅하였다. 세포는 indel 분석을 위해 48시간 후에 회수하였다.
참조문헌
Figure pct00173
Figure pct00174
Figure pct00175
실시예 26
도 58은 Cas12b (C2c1) 구조를 도시한다 (PDB 구조 5U30 기반). 도면은 구조적으로 예측된 ssDNA 경로, 및 추가 ssDNA에 접근하기 위해, 부분적으로 또는 전체로, 제거될 수 있는 도메인을 도시한다.
실시예 27
ADAR 활성에 영향을 미치는 ADAR 내 돌연변이는 효모 스크리닝을 사용하여 스크리닝하였다. 스크린은 다수 라운드로 수행되었다. 각 라운드의 스크리닝은 한 세트의 후보 돌연변이를 산출하였다. 그 다음으로 후보 돌연변이는 포유동물 세포에서 검증하였다. 상위-수행 돌연변이를 마지막 형태의 돌연변이에 첨가하였고 재스크리닝하였다. 10라운드에서 스크리닝된 돌연변이는 하기 표 32에 표시되어 있다. n 라운드에서 동정된 돌연변이체는 " RESCUE vn-1" 로 표시하였다. 본 명세서에서 논의되는 바와 같이 RESCUE는 아데노신 디아미나제 활성을 시티딘 디아미나제 활성으로 전환시킨 돌연변이를 의미한다.
표 32
Figure pct00176
Figure pct00177
RESCUE 돌연변이체의 용량 반응은 T 모티프 (도 59) 및 C 및 G 모티프 (도 60) 상에서 시험되었다. RESCUE v3, v6, v7, 및 v8로 내생성 표적화를 시험하였다 (도 61 및 62).
RESCUE v9에 대한 돌연변이에 대한 스크리닝을 수행하였다 (도 63). RESCUEv9에 대한 잠재적 돌연변이를 확인하였다 (도 64). 염기 플립 및 모티프 시험을 수행하였다 (도 65). RESCUEv9의 효과는 상이한 모티프 플립에서 수행되었다 (도 66). 데이터는 v9가 C-플립 가이드에서 더 양호하게 작동한다는 것을 시사한다. RESCUE v1 및 v8에 의한 B6 및 B12 간 비교는 50 bp 가이드 (도 67) 및 30 bp 가이드 (도 68)로 수행하였다.
실시예 28
이 실시예는 RESCUE 라운드 1-12의 결과를 요약한다 (도 69-80 참조). 시험된 추가 표현형은 PCSK9, Stat3, IRS1, 및 TFEB를 포함하였다. PCSK9는 클로닝이 프로모터를 개선시켰음을 보여주었다. Stat3은 부위 상에서 ~10% 편집을 보였다. 신호전달의 억제는 루시퍼라제 리포터로 시험하였다. IRS1의 경우, 합성 부위의 표적화는 전-지방세포 이동 전에 시험될 것이다. TFEB의 경우, 표적화는 전사 인자 -> 오토파지의 전좌를 초래하게 설계될 수 있다. 또한, 12개 내생성 포스포사이트 표적 및 48개 합성 표적의 패널이 시험될 것이다. 효모에서 스크리닝은 S22P 존재의 V11 배경에서 계속될 것이다. 상위 히트는 V13에 대해 V12에서 스크리닝되었고 새로운 라운드의 효모 히트를 평가하였다. 루피퍼라제에 대한 수백개 추가 스크린 히트를 평가할 것이고 Ade2 편집은 특이성 스크리닝을 위해 검증될 것이다. 유전자 셔플링이 또한 라이브러리 복잡성 및 상이한 효모 리포터에 대해 시험될 것이다.
실시예 29
이 실시예는 Cas12b 및 이의 변이체 및 디아미나제를 사용한 염기 편집을 위한 예시적인 접근법을 입증한다.
도 81, 83-86은 C에서 T 염기 편집 능력을 갖는 Cas12b Bhv4 절두체를 도시한다. 촉매적 불활성 Bhv4의 C-말단 142 아미노산 (dBhv4Δ142- 불활성화 돌연변이 D574A, 새로운 크기 966 아미노산)의 제거 및 링커 및 래트 Apobec 도메인과 C-말단부의 융합 후에, C에서 T 염기 편집은 비표적 가닥 상의 가이드 염기쌍 위치 14에서 최대 10.95%의 빈도로 관찰되었다. 6.97% 편집 효율이 가이드 위치 15에서 검출되었다. 이 활성은 가이드 의존적이었다. 존재하는 구성체와의 융합 또는 자유 발현을 통해서, 우라실-DNA 글리코실라제 억제제 (UGI) 도메인의 첨가는 이러한 C에서 T로의 전환을 증가시킨다. 열거된 가이드 서열 (대문자)은 HEK 293T 세포에서 GRIN2B 내부의 영역을 표적으로 한다.
도 87 은 전체 길이 BhCas12b 를 사용한 예시적인 염기 편집 접근법을 도시한다. 제2 NLS 서열은 도메인들이 서로 거리를 두도록 N-말단 rApobec을 첨가하였다.
실시예 30
도 88A는 BhCas12b v4 및 다른 오솔로그 AaCas12b의 indel 활성 간 비교를 도시한다 ([Teng F. et al., Repurposing CRISPR-Cas12b for mammalian genome engineering in HEK293T cells]에 기술된 바와 같음). 도 88B 및 88C는 BhCas12b v4 또는 BhCas12b를 발현하는 AAV1/2로 뉴런의 형질도입을 입증한다. 이러한 디자인은 inde 활성으로 측정시 더 높은 활성을 나타내었다. 폴리A 서열은 최적화된 서열에서 길어졌고 U6 프로모터 및 sgRNA 스캐폴드는 반대 가닥으로 이동하였다.
이 연구에서의 서열은 하기 표 33 에 나타냈다. px602-bh-optimize-AAV의 맵은 도 89A에 도시되어 있고, px602-bv-optimize-AAV의 맵은 도 89B에 도시되어 있다.
표 33
Figure pct00178
Figure pct00179
Figure pct00180
Figure pct00181
Figure pct00182
Figure pct00183
Figure pct00184
Figure pct00185
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본 발명의 기재된 방법, 약학 조성물 및 키트의 다양한 변형 및 이형은 본 발명의 범주 및 취지를 벗어나지 않고 당업자에게 분명해질 것이다. 본 발명이 특별한 구현예와 함께 기재되어 있지만, 더욱 변형될 수 있고 청구되는 본 발명이 이러한 특별한 구현예에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하게 될 것이다. 실제로, 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 본 발명의 임의의 변형, 용도, 또는 개조를 포괄하는 것으로 의도되고 본 개시물로부터의 이러한 이탈의 포함은 본 발명이 속하는 분야 내에서 공지의 통상적인 관례 내이며 이전에 기재된 본원의 본질적인 특성에 적용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Zhang, Feng Strecker, Jonathan Slaymaker, Ian Jones, Sara <120> Novel CAS12B Enzymes and Systems <130> BROD-2670US <150> 62/715,640 <151> 2018-08-07 <150> 62/744,080 <151> 2018-10-10 <150> 62/751,196 <151> 2018-10-26 <150> 62/794,929 <151> 2019-01-21 <150> 62/831,028 <151> 2019-04-08 <150> PCT/US2019/045582 <151> 2019-08-07 <160> 663 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 188 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 cgccuaucag ccaacaugcu cgcuuugcga aggcugacgg cccgcucuca uuuggcauug 60 ccgggagccg gaguuuucgg aagagagugu cgacgacugc ugaucuccgc auccgcgucc 120 uguucgccag gccgggucgg guguacggau caugcuggca gcagucuacg ccgagaacau 180 ucgcuuuu 188 <210> 2 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 cggaagagag ugucgacgac ugcugaucuc cgcauccgcg uccuguucgc caggccgggu 60 <210> 3 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 ccaacaugcu 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tcactcctgc tcggcaaatt tagctc 36 <210> 63 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 63 gagctaaatt tgccgagcag gagtgagggg aacggc 36 <210> 64 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 64 accatctact ccatcatctt cttaactggc attgtgggca atggattggt catcctggtc 60 atgggttacc agaagaaact gagaagcatg acggacaagt acaggct 107 <210> 65 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 65 agcctgtact tgtccgtcat gcttctcagt ttcttctggt aacccatgac caggatgacc 60 aatccattgc ccacaatgcc agttaagaag atgatggagt agatggt 107 <210> 66 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 66 Thr Ile Tyr Ser Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu 1 5 10 15 Val Ile Leu Val Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp 20 25 30 Lys Tyr Arg Leu 35 <210> 67 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 67 gcacctgtca gtggccgacc tcctctttgt catcacgctt cccttctggg cagttgatgc 60 cgtggcaaac tggtactttg ggaacttcct atgcaaggca gtccatg 107 <210> 68 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 68 catggactgc cttgcatagg aagttcccaa agtaccagtt tgccacggca tcaactgccc 60 agaagggaag cgtgatgaca aagaggaggt cggccactga caggtgc 107 <210> 69 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 69 His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp 1 5 10 15 Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys 20 25 30 Ala Val His 35 <210> 70 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 70 tcatctacac agtcaacctc tacagcagtg tcctcatcct ggccttcatc agtctggacc 60 gctacctggc catcgtccac gccaccaaca gtcagaggcc aaggaag 107 <210> 71 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 71 cttccttggc ctctgactgt tggtggcgtg gacgatggcc aggtagcggt ccagactgat 60 gaaggccagg atgaggacac tgctgtagag gttgactgtg tagatga 107 <210> 72 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 72 Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala Phe 1 5 10 15 Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser Gln 20 25 30 Arg Pro Arg Lys 35 <210> 73 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 73 ctgttggctg aaaaggtggt ctatgttggc gtctggatcc ctgccctcct gctgactatt 60 cccgacttca tctttgccaa cgtcagtgag gcagatgaca gatatat 107 <210> 74 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 74 atatatctgt catctgcctc actgacgttg gcaaagatga agtcgggaat agtcagcagg 60 agggcaggga tccagacgcc aacatagacc accttttcag ccaacag 107 <210> 75 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 75 Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val Trp Ile Pro Ala Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn Val Ser Glu Ala Asp 20 25 30 Asp Arg Tyr Ile 35 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 76 ccgacttcat ctttgccaac gtc 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 77 tgggcaatgg attggtcatc ctg 23 <210> 78 <211> 122 <212> RNA <213> Bacillus hisashii <220> <221> misc_feature <222> (103)..(122) <223> n is a, c, g, or u <400> 78 acgagguucu gucuuuuggu caggacaacc gucuagcuau aagugcugca gggugugaga 60 aacuccuauu gcuggacgau gucucuuacg aggcauuagc acnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nn 122 <210> 79 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 79 gccgtttccc tcactcctgc tcggtgaatt tggctc 36 <210> 80 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 80 gagccaaatt caccgagcag gagtgaggga aacggc 36 <210> 81 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 81 gccgttcccc tcactcctgc tcggcaaatt tagctc 36 <210> 82 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 82 gccgttcccc tcactcctgc tcggcaaatt tagctc 36 <210> 83 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 83 gagctaaatt tgccgagcag gagtgagggg aacggc 36 <210> 84 <211> 115 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 84 gucgucuaua ggacggcgag gacaacggga agugccaaug ugcucuuucc aagagcaaac 60 accccguugg cuucaagaug accgcucgaa aacgagcggu cugagaagug gcacu 115 <210> 85 <211> 113 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 85 gucgucuaua ggacggcgag gacaacggga agugccaaug ugcucuuucc aagagcaaac 60 accccguugg cuucucagac cgcucgaaaa cgagcggucu gagaaguggc acu 113 <210> 86 <211> 118 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 86 acagucgucu auaggacggc gaggacaacg ggaagugcca augugcucuu uccaagagca 60 aacaccccgu uggcuucaag augaccgcuc gaaaacgagc ggucugagaa guggcacu 118 <210> 87 <211> 112 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 87 gucuauagga cggcgaggac aacgggaagu gccaaugugc ucuuuccaag agcaaacacc 60 ccguuggcuu caagaugacc gcucgaaaac gagcggucug agaaguggca cu 112 <210> 88 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 88 gucgucuaua ggacggcgag gacaacgggg ugccaaugug cucuuuccaa gagcaaacac 60 cccguuggcu ucucagaccg cucgaaaacg agcggucuga gaaguggcac u 111 <210> 89 <211> 105 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 89 gucgucuaua ggacggcgag gacaacggga agugccaaug ugcucuuucc aagagcaaac 60 accccguugg cuucucagac cgaaaacggu cugagaagug gcacu 105 <210> 90 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 90 acgagguucu gucuuuuggu caggacaacc gucuagcuau aagugcugca gggugugaga 60 aacuccuauu gcuggacgau gucucuuacg aggcauuagc ac 102 <210> 91 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 91 guucugucuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60 cuauugcugg acgaugucuc uuacgaggca uuagcac 97 <210> 92 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 92 guucugucuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60 cuauugcugg acgacgccuc uuacgaggcg uuagcac 97 <210> 93 <211> 95 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 93 guucugucuu uuggucagga caaccgucua gcuauaagug cugcagggug ugagaaacuc 60 cuauugcugg acgacgccuu acgaggcguu agcac 95 <210> 94 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 94 guucugucuu uuggucagga caaccgucca gcuauaagug cugcagggug cagaaacucc 60 uauugcugga cgacgccuua cggcguuagc ac 92 <210> 95 <211> 115 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 95 guucugucuu uuggucagga caaccgucca gcuauaagug cugcagggug cagaaacucc 60 uauugcugga cgacgccuca uuuauuucaa aagaaauguu acgaggcguu agcac 115 <210> 96 <211> 135 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (116)..(135) <223> n is a, c, g, or u <400> 96 gucgucuaua ggacggcgag gacaacggga agugccaaug ugcucuuucc aagagcaaac 60 accccguugg cuucaagaug accgcucgaa aacgagcggu cugagaagug gcacunnnnn 120 nnnnnnnnnn nnnnn 135 <210> 97 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 97 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggauuaucuu auuucugcaa aagcagaaau aagaugauug gcac 104 <210> 98 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 98 ggugaccuau agggucaaug aaucugugcg ugugccauaa guaauuaaaa auuacccaac 60 acaggauuau cuuauuucug caaaagcaga aauaagauga uuggcac 107 <210> 99 <211> 101 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 99 cuauaggguc aaugaaucug ugcgugugcc auaaguaauu aaaaauuacc caccacagga 60 uuaucuuauu ucugcaaaag cagaaauaag augauuggca c 101 <210> 100 <211> 88 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 100 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggaucaucuu aaaaaagaug auuggcac 88 <210> 101 <211> 98 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 101 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggaucaucuu auuucaaaag aaauaagaug auuggcac 98 <210> 102 <211> 88 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 102 gaccuauagg gucaaugaau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggagcaccug aaaacaggug cuuggcac 88 <210> 103 <211> 124 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (105)..(124) <223> n is a, c, g, or u <400> 103 gaccuauagg gucaaaguau cugugcgugu gccauaagua auuaaaaauu acccaccaca 60 ggauuaucuu auuucugcaa aagcagaaau aagaugauug gcacnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnn 124 <210> 104 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 104 ccaaattctt ctcccctggg aagcatccct ggacac 36 <210> 105 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 105 gtgtccaggg atgcttccca ggggagaaga atttgg 36 <210> 106 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <400> 106 nnccaaatcc ttctcccctg ggaagcacac ctcgacacnn 40 <210> 107 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 107 ccaaatcctt ctcccctggg aagcacacct cgacac 36 <210> 108 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 108 gtgtcgaggt gtgcttccca ggggagaagg atttgg 36 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 109 agagcactgg catggggatg ngg 23 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 110 ggaacactgg catggagatg ngg 23 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 111 agaacagtgg catggggatg ngg 23 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 112 tgaacactgg catggggaag ngg 23 <210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 113 gaagcactgc catgggaatg ngg 23 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 114 agagcactgg aatgggaatg ngg 23 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 115 ggagcgctgg catggggact ngg 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 116 tgaacactgg catggggctg ngg 23 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 117 agagcactgg caggaggatg ngg 23 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 118 ggagcactgg catgggatgt nga 23 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 119 gagcccctgg catggggatg ngg 23 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 120 caggcactgg catggggacc ngg 23 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 121 aggatacagg caggggaatg ngg 23 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 122 agaatactgg catgggaatg ngg 23 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 123 gaaggactgg cacggggatg ngg 23 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 124 ggagcactgg tagggggatg ngg 23 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 125 agagaactgc catgggaatg ngg 23 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 126 aaagcactgg ccatgggatg ngg 23 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 127 gaggcactgg catgggggtg ngg 23 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 128 agagcacggg catgaggatc ngg 23 <210> 129 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 129 attntagagc actggcatgg ggatggg 27 <210> 130 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 130 attntagagc actggcatgg ggatggg 27 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 131 tgctccagag gccccccttg ngg 23 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 132 ggctccagag gctccccttg nga 23 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 133 tgctccagag gctccccttg ngg 23 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 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<221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 185 attnagaggc ggagggcggc gtgcctg 27 <210> 186 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 186 attnagaggc ggagggcggc gtgcctg 27 <210> 187 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 187 agtgtccagg gatgcttccc ngg 23 <210> 188 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 188 catccccagg gaagcatccc ngg 23 <210> 189 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 189 agtggctagg gatgcttccc ngg 23 <210> 190 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 190 atagtccagg gatgcttcct ngg 23 <210> 191 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 191 cgtgaccagg gatgcttctc ngg 23 <210> 192 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 192 gctccccggg gaagcttccc nga 23 <210> 193 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 193 catgtccaga aatgcttccc ngg 23 <210> 194 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 194 agtgtccagg gatgcttccc nag 23 <210> 195 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 195 tcggtccagg gatgcttccc ntg 23 <210> 196 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 196 caagtccatg gatgcttccc ngg 23 <210> 197 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 197 ccagtccagg aaagcatccc ngg 23 <210> 198 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 198 cctggcctgg ggagcatccc nga 23 <210> 199 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 199 tgtgtgcagg gatgcttcct ngg 23 <210> 200 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 200 agactccagg gaagcttccc ngg 23 <210> 201 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 201 agggtccagg cacgcttccc ngg 23 <210> 202 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 202 tgtttccagg aatgcttccc ngg 23 <210> 203 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 203 agagtccagg aatgcttccc nga 23 <210> 204 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 204 atgtcacagg gattcttccc ngg 23 <210> 205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 205 caagtccaga gatgcttcct ngg 23 <210> 206 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 206 agtgtccagg gaagcttcgc ngg 23 <210> 207 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 207 tttnggaagt gtccagggat gcttccc 27 <210> 208 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 208 tttnggaagt gtccagggat gcttccc 27 <210> 209 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 209 tttnggaagt gtccagggat gcttccc 27 <210> 210 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 210 ttcagcccaa gaacagtaca ngg 23 <210> 211 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 211 aacagtccaa gaacagtaca ngg 23 <210> 212 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 212 tatagctcaa gaacagtaca ngg 23 <210> 213 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 213 tttncttcag cccaagaaca gtacaag 27 <210> 214 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 214 tttncttcag cccaagaaca gtacaag 27 <210> 215 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 215 tttncttcag cccaagaaca gtacaag 27 <210> 216 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 216 gtgagtcgag gagaaacgac ngg 23 <210> 217 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 217 atgagccaag gagagacgaa ngg 23 <210> 218 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 218 atgagtagag gagaaaagac ngg 23 <210> 219 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 219 tttntctgtg agtcgaggag aaacgac 27 <210> 220 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 220 tttntctgtg agtcgaggag aaacgac 27 <210> 221 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 221 tttntctgtg agtcgaggag aaacgac 27 <210> 222 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 222 gggtgtgtta aaagtgacca ngg 23 <210> 223 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 223 tttncttggg tgtgttaaaa gtgacca 27 <210> 224 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 224 tttncttggg tgtgttaaaa gtgacca 27 <210> 225 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 225 tttncttggg tgtgttaaaa gtgacca 27 <210> 226 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 226 tcactcctgc tcggtgaatt ngg 23 <210> 227 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 227 gctacaggca gagacaaagg cgg 23 <210> 228 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 228 aggacaggca gagacaaagg cgg 23 <210> 229 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 229 agaacaggca gagacaaaga cgg 23 <210> 230 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 230 aagacaggca gagacaaagt cgg 23 <210> 231 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 231 gctagaggta gagacaaagg cgg 23 <210> 232 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 232 agaacaggca gagacaaagg cag 23 <210> 233 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 233 aggacaggca gagacaaagg cgg 23 <210> 234 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 234 aggacaggca gagacaaagt cgg 23 <210> 235 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 235 cggacaggca gagacaaagg cgg 23 <210> 236 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 236 acaacagcca gagacaaagg cgg 23 <210> 237 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 237 agaacaggca gagacaaagt cgg 23 <210> 238 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 238 cctagaggca gagacaaagt cgg 23 <210> 239 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 239 gctacagaca gagacaaagg cag 23 <210> 240 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 240 gctacaggca gagacaaagg cgg 23 <210> 241 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 241 actacaaaca gagacaaaga cgg 23 <210> 242 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 242 tctacagtca gagacaaagg cga 23 <210> 243 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 243 aagataggca gagacaaagg cgg 23 <210> 244 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 244 cctataggca gagacaaagc cgg 23 <210> 245 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 245 aagacaggca gagacaaagt cgg 23 <210> 246 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 246 aggacaggca gagacaaagg cag 23 <210> 247 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 247 aggtcagaaa tagggggtcc ngg 23 <210> 248 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 248 agggcacaaa taggaggtcc ngg 23 <210> 249 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 249 caggctgtga accttggtgg cgg 23 <210> 250 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 250 ctggctgtga actttggtgg cgg 23 <210> 251 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 251 aggactgtag accttggtgg cgg 23 <210> 252 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 252 atagctgtga acctaggtgg cgg 23 <210> 253 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 253 caggctgtga accttggtga cgg 23 <210> 254 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 254 cctgctatga accttggtgt cgg 23 <210> 255 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 255 ggggctgcgg accttggtgg cgg 23 <210> 256 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 256 aaagctgaga accttggtgg cgg 23 <210> 257 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 257 cttgctggga accttggtgg cgg 23 <210> 258 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 258 caggctgaga cccttggtgg cgg 23 <210> 259 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 259 caggctgtgc actttggtgg cgg 23 <210> 260 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 260 attgctgcaa accttggtgt cgg 23 <210> 261 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 261 taggctgtaa aacttggtgg cgg 23 <210> 262 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 262 aaagctggga accttggtgg cgg 23 <210> 263 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 263 aggcctgaga accttggtgg cag 23 <210> 264 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 264 caggctttga actttggtag cgg 23 <210> 265 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 265 caggctgtta cccttggtgg cgg 23 <210> 266 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 266 gcagcctgta gccttggtgg cgg 23 <210> 267 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 267 agggatgtga accttggtag cag 23 <210> 268 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 268 cctgctgcaa accttggtgt cgg 23 <210> 269 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 269 gaccccctcc accccgcctc ngg 23 <210> 270 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 270 ctgccccccc accccgccac ngg 23 <210> 271 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 271 gcccccaccc accccgcctc ngg 23 <210> 272 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 272 gcttccctcc accccgcatc ngg 23 <210> 273 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 273 tgcccctccc accccgcctc ngg 23 <210> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 339 attnttcatg gagaaaatat tcagaat 27 <210> 340 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 340 attnttcatg aagaaaatat tcaggaa 27 <210> 341 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 341 attngcagct acaggcagag acaaagg 27 <210> 342 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 342 attncctgga aaccatccag gccttgt 27 <210> 343 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 343 attnggtcag ctgttaacat cagtacg 27 <210> 344 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 344 attncccttc agctaaaata aaggagg 27 <210> 345 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 345 attnggctca gcaggcacct gcctcag 27 <210> 346 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 346 attngggact ggagttgctt catgtac 27 <210> 347 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 347 attntctcca tgaaaaatac tggggtc 27 <210> 348 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 348 attntctcca taaaaaatac tagaaaa 27 <210> 349 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 349 attnttcatg gagaaaatat tcagaat 27 <210> 350 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 350 attnttcatg aagaaaatat tcagaaa 27 <210> 351 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 351 attngcagct acaggcagag acaaagg 27 <210> 352 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 352 attncctgga aaccatccag gccttgt 27 <210> 353 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 353 attnggtcag ctgttaacat cagtacg 27 <210> 354 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 354 attntcttca cggaaacagg gttcctt 27 <210> 355 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 355 attntcttcg cggaagcagg gttccgg 27 <210> 356 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 356 tttntggttg cccaccctag tcattgg 27 <210> 357 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 357 tttngatggc gacttcaggc acaggat 27 <210> 358 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 358 attntgcaga gcaaatacca gagataa 27 <210> 359 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 359 attntgtaca taaaatatca aagtaca 27 <210> 360 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 360 tttncctcac tcctgctcgg tgaattt 27 <210> 361 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 361 attntcttca cggaaacagg gttcctt 27 <210> 362 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 362 attntcttcg cggaagcagg gttccgg 27 <210> 363 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 363 tttntggttg cccaccctag tcattgg 27 <210> 364 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 364 tttngatggc gacttcaggc acaggat 27 <210> 365 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 365 attntgcaga gcaaatacca gagataa 27 <210> 366 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 366 attnctgacc tcccaaacag ctacata 27 <210> 367 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 367 attntcagag ggacacactg tggcccc 27 <210> 368 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 368 tctctcattc tgcagagcaa ataccagaga taagagagta ggct 44 <210> 369 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 369 tctccatgaa aaatactggg gtc 23 <210> 370 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 370 cctggaaacc atccaggcct tgt 23 <210> 371 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 371 gcagctacag gcagagacaa agg 23 <210> 372 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 372 tgcagagcaa ataccagaga taa 23 <210> 373 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 373 ggtcagctgt taacatcagt acg 23 <210> 374 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 374 tcagagggac acactgtggc ccc 23 <210> 375 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 375 tctctcattc tgcagagcaa ataccagaga taagagagta ggct 44 <210> 376 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 376 tctctcattc tgcagagcaa ataccagaga taagagagta ggct 44 <210> 377 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 377 tggcacattg tcagagggac acactgtggc ccctgtgccc agcc 44 <210> 378 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 378 gctgtcattt cctggaaacc atccaggcct tgtagcctgc cctc 44 <210> 379 <211> 1147 <212> PRT <213> Alicyclobacillus kakegawensis <400> 379 Met Ala Val Lys Ser Ile Lys Val Lys Leu Arg Leu Ser Glu Cys Pro 1 5 10 15 Asp Ile Leu Ala Gly Met Trp Gln Leu His Arg Ala Thr Asn Ala Gly 20 25 30 Val Arg Tyr Tyr Thr Glu Trp Val Ser Leu Met Arg Gln Glu Ile Leu 35 40 45 Tyr Ser Arg Gly Pro Asp Gly Gly Gln Gln Cys Tyr Met Thr Ala Glu 50 55 60 Asp Cys Gln Arg Glu Leu Leu Arg Arg Leu Arg Asn Arg Gln Leu His 65 70 75 80 Asn Gly Arg Gln Asp Gln Pro Gly Thr Asp Ala Asp Leu Leu Ala Ile 85 90 95 Ser Arg Arg Leu Tyr Glu Ile Leu Val Leu Gln Ser Ile Gly Lys Arg 100 105 110 Gly Asp Ala Gln 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gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg 4740 ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta 4800 ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta 4860 tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac ctgcccattc 4920 gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc 4980 gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg 5040 ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg 5100 ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt 5160 gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga agagcttggc 5220 ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc 5280 atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga 5340 ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg 5400 aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg 5460 atctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 5520 aataaagcaa tagcatcaca 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cctgagagtg atgagcatcg acctgggaca gagacaggcc gctgccgcct ctattttcga 2520 ggtggtggat cagaagcccg acatcgaagg caagctgttt ttcccaatca agggcaccga 2580 gctgtatgcc gtgcacagag ccagcttcaa catcaagctg cccggcgaga cactggtcaa 2640 gagcagagaa gtgctgcgga aggccagaga ggacaatctg aaactgatga accagaagct 2700 caacttcctg cggaacgtgc tgcacttcca gcagttcgag gacatcaccg agagagagaa 2760 gcgggtcacc aagtggatca gcagacaaga gaacagcgac gtgcccctgg tgtaccagga 2820 tgagctgatc cagatccgcg agctgatgta caagccttac aaggactggg tcgccttcct 2880 gaagcagctc cacaagagac tggaagtcga gatcggcaaa gaagtgaagc actggcggaa 2940 gtccctgagc gacggaagaa agggcctgta cggcatctcc ctgaagaaca tcgacgagat 3000 cgatcggacc cggaagttcc tgctgagatg gtccctgagg cctaccgaac ctggcgaagt 3060 gcgtagactg gaacccggcc agagattcgc catcgaccag ctgaatcacc tgaacgccct 3120 gaaagaagat cggctgaaga agatggccaa caccatcatc atgcacgccc tgggctactg 3180 ctacgacgtg cggaagaaga aatggcaggc taagaacccc gcctgccaga tcatcctgtt 3240 cgaggatctg agcaactaca acccctacga ggaaaggtcc cgcttcgaga acagcaagct 3300 catgaagtgg tccagacgcg agatccccag acaggttgca ctgcagggcg agatctatgg 3360 cctgcaagtg ggagaagtgg gcgctcagtt cagcagcaga ttccacgcca agacaggcag 3420 ccctggcatc agatgtagcg tcgtgaccaa agagaagctg caggacaatc ggttcttcaa 3480 gaatctgcag agagagggca gactgaccct ggacaaaatc gccgtgctga aagagggcga 3540 tctgtaccca gacaaaggcg gcgagaagtt catcagcctg agcaaggatc ggaagtgcgt 3600 gaccacacac gccgacatca acgccgctca gaacctgcag aagcggttct ggacaagaac 3660 ccacggcttc tacaaggtgt actgcaaggc ctaccaggtg gacggccaga ccgtgtacat 3720 ccctgagagc aaggaccaga agcagaagat catcgaagag ttcggcgagg gctacttcat 3780 tctgaaggac ggggtgtacg aatgggtcaa cgccggcaag ctgaaaatca agaagggcag 3840 ctccaagcag agcagcagcg agctggtgga tagcgacatc ctgaaagaca gcttcgacct 3900 ggcctccgag ctgaaaggcg aaaagctgat gctgtacagg gaccccagcg gcaatgtgtt 3960 ccccagcgac aaatggatgg ccgctggcgt gttcttcgga aagctggaac gcatcctgat 4020 cagcaagctg accaaccagt actccatcag caccatcgag gacgacagca gcaagcagtc 4080 tatgaaaagg ccggcggcca cgaaaaaggc cggccaggca aaaaagaaaa agggatccta 4140 cccatacgat gttccagatt acgcttatcc ctacgacgtg cctgattatg catacccata 4200 tgatgtcccc gactatgcct aagaattcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct 4260 tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 4320 gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 4380 tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagag 4440 aatagcaggc atgctgggga cggccaaaaa aagagaccat atatggtctc cgtgctaatg 4500 cctcgtaaga gacatcgtcc agcaatagga gtttctcaca ccctgcagca cttatagcta 4560 gacggttgtc ctgaccaaaa gacagaaccg gtgtttcgtc ctttccacaa gatatataaa 4620 gccaagaaat cgaaatactt tcaagttacg gtaagcatat gatagtccat tttaaaacat 4680 aattttaaaa ctgcaaacta cccaagaaat tattactttc tacgtcacgt attttgtact 4740 aatatctttg tgtttacagt caaattaatt ccaattatct ctctaacagc cttgtatcgt 4800 atatgcaaat atgaaggaat catgggaaat aggccctcgc ggccgcagga acccctagtg 4860 atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 4920 gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 4980 ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5040 atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 5100 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 5160 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 5220 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 5280 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 5340 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 5400 cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 5460 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 5520 ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 5580 caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 5640 ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 5700 cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 5760 tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 5820 ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 5880 aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 5940 tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6000 atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6060 agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 6120 tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 6180 tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 6240 atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 6300 ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 6360 tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 6420 acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 6480 ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 6540 aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 6600 ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 6660 cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 6720 gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 6780 actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 6840 agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 6900 cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 6960 tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7020 agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7080 tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 7140 acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 7200 ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 7260 gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 7320 gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 7380 gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 7440 tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 7500 caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 7560 tttgctggcc ttttgctcac atgt 7584 <210> 655 <211> 7495 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 655 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct gcggcctcta gactcgaggg gctggaagct acctttgaca tcatttcctc 180 tgcgaatgca tgtataattt ctacagaacc tattagaaag gatcacccag cctctgcttt 240 tgtacaactt tcccttaaaa aactgccaat tccactgctg tttggcccaa tagtgagaac 300 tttttcctgc tgcctcttgg tgcttttgcc tatggcccct attctgcctg ctgaagacac 360 tcttgccagc atggacttaa acccctccag ctctgacaat cctctttctc ttttgtttta 420 catgaagggt ctggcagcca aagcaatcac tcaaagttca aaccttatca ttttttgctt 480 tgttcctctt ggccttggtt ttgtacatca gctttgaaaa taccatccca gggttaatgc 540 tggggttaat ttataactaa gagtgctcta gttttgcaat acaggacatg ctataaaaat 600 ggaaagatac cggtgccacc atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag 660 tcccagcagc cgccatccgg tccatcaagc tgaagatgaa gaccaacagc ggcaccgaca 720 gcatctacct gagaaaagcc ctgtggcgga cccaccagct gatcaatgag ggaatcgcct 780 actacatgaa cctgctgacc ctgtaccggc aagaggccat cggcgacaag accaaagaag 840 cctatcaggc cgagctgatt aacatcatcc ggaaccagca gcggaacaac ggcagctctg 900 aggaacacgg ctccgaccaa gaaattctgg ccctgctgag acagctgtac gagctgatca 960 tccccagcag catcggcgaa tctggcgacg ctaatcagct gggcaacaag tttctgtacc 1020 ctctggtgga ccccaacagc cagtctggca agggcacatc taacgccggc agaaagccca 1080 gatggaagcg gctgaaagag gaaggcaacc ccgactggga actcgagaag aagaaggacg 1140 aggaacgcaa ggccaaggat cccaccgtga agatctttga caacctgaac aaatacggcc 1200 tgctgcctct gttcccactg ttcaccaaca tccagaaaga catcgagtgg ctgcccctgg 1260 gcaagagaca gtctgtgcgg aagtgggaca aagacatgtt catccaggcc atcgagagac 1320 tgctgagctg ggagagctgg aacagaagag tggccgacga gtacaaacag ctgaaagaaa 1380 agaccgagag ctactacaaa gagcacctga caggcggcga ggaatggatc gagaagatcc 1440 ggaagttcga gaaagaacgg aacatggaac tggaaaagaa cgccttcgct cccaacgacg 1500 gctacttcat caccagcaga cagatcagag gctgggacag agtgtacgag aagtggtcca 1560 agctgcccga gtctgctagc cctgaggaac tgtggaaagt ggtggccgag cagcagaaca 1620 agatgtccga aggcttcggc gaccccaagg tgttcagctt cctggccaac agagagaacc 1680 gggacatttg gagaggccac agcgagcgga tctaccacat tgccgcctac aacggcctgc 1740 agaagaagct gagccggacc aaagagcagg ccaccttcac actgcctgac gccattgaac 1800 accctctgtg gatcagatac gagagccctg gcggcaccaa cctgaatctg ttcaagctgg 1860 aagagaaaca gaaaaagaac tactacgtga ccctgagcaa gatcatctgg cccagcgagg 1920 aaaagtggat tgagaaagag aacatcgaga tccctctggc tcccagcatc cagttcaacc 1980 ggcagattaa gctgaagcag cacgtgaagg gcaagcaaga gatcagcttc agcgactaca 2040 gcagccggat cagcctggat ggtgttctcg gcggcagcag aatccagttt aatcggaagt 2100 acatcaagaa ccacaaagag ctgctcggag agggcgacat cggccccgtg ttctttaacc 2160 tggtggtgga tgtggcccct ctgcaagaaa ccagaaacgg cagactgcag agccccatcg 2220 gcaaggccct gaaagtgatc agcagcgact tctccaaagt gatcgactac aagccgaaag 2280 aactcatgga ttggatgaat accggcagcg ccagcaacag ctttggagtg gcttctctgc 2340 tggaaggcat gagagtgatg agcatcgaca tgggccagag aaccagcgcc tccgtgtcca 2400 tcttcgaggt cgtgaaagaa ctgcccaagg atcaagagca gaagctgttc tacagcatca 2460 acgacaccga gctgttcgcc atccacaagc ggagctttct gctgaacctg cctggcgagg 2520 tggtcaccaa gaacaacaag cagcagcggc aagagcggcg gaaaaagcgg cagtttgtgc 2580 ggagccagat cagaatgctg gccaacgtgc tgcggctgga aacaaagaaa acccctgacg 2640 agcggaagaa ggccattcac aagctgatgg aaatcgtgca gagctacgac agctggaccg 2700 ccagccagaa agaagtgtgg gagaaagagc tgaatctcct gaccaacatg gccgccttca 2760 atgacgagat ctggaaagaa agcctggtgg aactgcacca ccggatcgag ccttacgtgg 2820 gacagatcgt gtccaagtgg cggaagggcc tgtctgaggg cagaaagaat ctggccggca 2880 tcagcatgtg gaacatcgac gaactggaag ataccaggcg gctgctgatt tcctggtcca 2940 agagaagcag aaccccaggc gaggccaaca ggatcgaaac cgatgagcct ttcggcagca 3000 gcctgctcca gcacattcag aacgtgaagg acgacagact gaagcagatg gccaacctga 3060 tcatcatgac agccctgggc tttaagtacg acaaagagga aaaggaccgg tacaagcggt 3120 ggaaagagac ataccccgcc tgccagatca tcctgttcga gaacctgaac cgctacctgt 3180 tcaacctcga ccggtccaga cgcgagaaca gcagactgat gaagtgggcc catcggagca 3240 tccccagaac cgtgtctatg cagggcgaga tgttcggcct gcaagtgggc gacgttcgga 3300 gcgagtacag ctccagattc cacgccaaaa caggcgcccc tggcatcaga tgtcacgccc 3360 tgactgaaga ggatctgaag gccggcagca acaccctgaa gagactgatc gaggacggct 3420 tcatcaatga gagcgagctg gcctacctga agaagggcga tatcatccct agccaaggcg 3480 gcgaactgtt cgtgacactg tccaagcggt acaagaagga cagcgacaac aacgagctga 3540 ccgtgatcca cgccgacatc aacgccgctc agaatctgca gaagcggttt tggcagcaaa 3600 acagcgaggt gtacagagtg ccctgtcagc tggccagaat gggcgaagat aagctgtaca 3660 tccccaagag ccagaccgag acaatcaaga agtatttcgg caagggctcc ttcgtgaaga 3720 acaataccga acaagaggtc tacaagtggg agaagtccga gaaaatgaag atcaagacgg 3780 acaccacctt cgacctgcaa gacctggatg gcttcgagga catcagcaag accattgagc 3840 tggcacaaga gcagcaaaag aaatacctga ccatgttcag ggaccccagc ggctactttt 3900 tcaacaatga gacatggcgg cctcaaaaag aatactggtc catcgtgaac aacatcatca 3960 agagctgcct caagaagaag atcctgagca acaaggtcga gctgaaaagg ccggcggcca 4020 cgaaaaaggc cggccaggca aaaaagaaaa agggatccta cccatacgat gttccagatt 4080 acgcttatcc ctacgacgtg cctgattatg catacccata tgatgtcccc gactatgcct 4140 aagaattcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 4200 tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 4260 ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 4320 tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagag aatagcaggc atgctgggga 4380 cggccaaaaa aagagaccat atatggtctc cgtgccaagc acctgttttc aggtgctcct 4440 gtggtgggta atttttaatt acttatggca cacgcacaga ttcattgacc ctataggtcc 4500 ggtgtttcgt cctttccaca agatatataa agccaagaaa tcgaaatact ttcaagttac 4560 ggtaagcata tgatagtcca ttttaaaaca taattttaaa actgcaaact acccaagaaa 4620 ttattacttt ctacgtcacg tattttgtac taatatcttt gtgtttacag tcaaattaat 4680 tccaattatc tctctaacag ccttgtatcg tatatgcaaa tatgaaggaa tcatgggaaa 4740 taggccctcg cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 4800 tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 4860 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct 4920 ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc 4980 tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 5040 gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 5100 ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 5160 cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 5220 tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 5280 ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt 5340 ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 5400 tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 5460 gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 5520 tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 5580 cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 5640 tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 5700 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 5760 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 5820 attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 5880 gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 5940 ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 6000 cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 6060 gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 6120 tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 6180 gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 6240 ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 6300 tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 6360 gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 6420 caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 6480 cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg aagccgcggt 6540 atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 6600 gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 6660 attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 6720 cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 6780 atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 6840 tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 6900 ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 6960 ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 7020 cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 7080 gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 7140 gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 7200 acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 7260 gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 7320 agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 7380 tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 7440 agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgt 7495 <210> 656 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 656 ccgcgaaugg acac 14 <210> 657 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 657 tagatgaatt aaatgtgatt agcac 25 <210> 658 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 658 agcgagcggt ctgagaagtg gcact 25 <210> 659 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 659 gcagaaataa tgatgattgg cac 23 <210> 660 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 660 gucggaucgu ugagcgggcg aucugagaag uggcac 36 <210> 661 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 661 gggcgaucug agaaguggca c 21 <210> 662 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 662 augauacgag gcauuagcac 20 <210> 663 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Peptide <400> 663 Ser Gly Val Asp Asp Asp Met Ala Cys His Lys Ile Pro Val Glu Ala 1 5 10 15 Asp Phe Leu Tyr Ala Tyr Ser Thr Ala Pro Gly Tyr Tyr Ser Trp Arg 20 25 30 Asn Ser Lys Asp Gly Ser Trp Phe Ile Gln Ser Leu Cys Ala Met Leu 35 40 45 Lys Gln Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Phe Met His Ile Leu Thr Arg Val 50 55 60 Asn Arg Lys Val Ala Thr Glu Phe Glu Ser Phe Ser Phe Asp Ala Thr 65 70 75 80 Phe His Ala Lys Lys Gln Ile Pro Cys Ile Val Ser Met Leu Thr Lys 85 90 95 Glu Leu Tyr Phe Tyr His 100

Claims (85)

  1. i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질, 및
    ii) 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드
    를 포함하는, 비천연 발생 또는 조작된 시스템.
  2. 제1항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13, 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium), 및 라세이엘라 세디미니스 (Laceyella sediminis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원하는 것인 시스템.
  3. 제1항에 있어서, tracr RNA는 직접 반복부 서열의 5' 말단에서 crRNA에 융합되는 것인 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 2종의 상이한 표적 서열 또는 동일한 표적 서열의 상이한 영역에 하이브리드화할 수 있는 둘 이상의 가이드 서열을 포함하는 것인 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 가이드 서열은 원핵생물 세포 내 하나 이상의 표적 서열에 하이브리드화하는 것인 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 가이드 서열은 진핵생물 세포 내 하나 이상의 표적 서열에 하이브리드화하는 것인 시스템.
  7. 제1항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는 것인 시스템.
  8. 제1항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 촉매적으로 불활성인 시스템.
  9. 제1항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되는 것인 시스템.
  10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 기능성 도메인은 하나 이상의 표적 DNA 서열을 절단하는 것인 시스템.
  11. 제10항에 있어서, 기능성 도메인은 하나 이상의 표적 서열의 전사 또는 번역을 변형시키는 것인 시스템.
  12. 제1항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고; Cas12b 이펙터 단백질은 RuvC 및/또는 Nuc 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함하여서, 형성된 CRISPR 복합체는 표적 서열로 또는 인접하여 후성적 변형자 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있는 것인 시스템.
  13. 제1항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 아데노신 디아미나제 또는 시티딘 디아미나제와 회합되는 것인 시스템.
  14. 제1항에 있어서, 재조합 주형을 더 포함하는 것인 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 재조합 주형은 상동성-지정 복구 (HDR)에 의해 삽입되는 것인 시스템.
  16. 제1항에 있어서, tracr RNA를 더 포함하는 것인 시스템.
  17. 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제1 조절 엘리먼트, 및
    i) a) 가이드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트, 및
    b) tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제3 조절 엘리먼트; 또는
    ii) 가이드 서열 및 tracr RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 제2 조절 엘리먼트
    를 포함하는, 하나 이상의 벡터를 포함하는, Cas12b 벡터 시스템.
  18. 제17항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 진핵생물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 것인 벡터 시스템.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 단일 벡터에 포함되는 것인 벡터 시스템.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 벡터 시스템.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터를 포함하는 것인 벡터 시스템.
  22. 비천연 발생 또는 조작된 조성물의 하나 이상의 핵산 성분 및 Cas12b 이펙터 단백질을 전달하도록 구성된 전달 시스템으로서,
    i) 표 1 또는 2로부터 선택된 Cas12b 이펙터 단백질,
    ii) 하나 이상의 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열, 및
    iii) tracr RNA
    를 포함하는, 전달 시스템.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 벡터, 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고, 하나 이상의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 분자는 비천연 발생 또는 조작된 조성물의 하나 이상의 핵산 성분 및 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 것인 전달 시스템.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 리포솜(들), 입자(들), 엑소솜(들), 미세소포(들), 유전자총, 또는 바이러스 벡터(들)를 포함하는 전달 비히클을 포함하는 것인 전달 시스템.
  25. 치료적 치료 방법에서 사용을 위한, 제1항 내지 제16항의 비천연 발생 또는 조작된 시스템, 제17항 내지 제21항의 벡터 시스템, 또는 제22항 내지 제24항의 전달 시스템.
  26. 하나 이상의 관심 표적 서열을 변형시키는 방법으로서, 방법은 하나 이상의 표적 서열을
    i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질,
    ii) 하나 이상의 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 가이드 서열, 및
    iii) tracr RNA
    를 포함하는 하나 이상의 비천연 발생 또는 조작된 조성물과 접촉시켜서,
    crRNA 및 tracr RNA과 복합체 형성된 Cas12b 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체가 형성되는 것인 단계를 포함하고,
    가이드 서열은 세포 내 하나 이상의 표적 서열과 서열-특이적 결합을 유도하여, 하나 이상의 표적 서열의 발현이 변형되는 것인, 변형 방법.
  27. 제26항에 있어서, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 하나 이상의 표적 서열의 절단을 포함하는 것인 변형 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 하나 이상의 표적 서열의 발현의 증가 또는 감소를 포함하는 것인 변형 방법.
  29. 제28항에 있어서, 조성물은 재조합 주형을 더 포함하고, 하나 이상의 표적 서열의 변형은 재조합 주형 또는 이의 부분의 삽입을 포함하는 것인 변형 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 서열은 원핵생물 세포에 존재하는 것인 변형 방법.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 서열은 진핵생물 세포에 존재하는 것인 변형 방법.
  32. 하나 이상의 변형된 표적 서열을 포함하는 세포 또는 이의 자손으로서, 하나 이상의 표적 서열은 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 따라 변형되었고, 임의로 치료적 T 세포 또는 항체-생성 B-세포이거나 또는 상기 세포는 식물 세포인 세포 또는 이의 자손.
  33. 제32항에 있어서, 세포는 원핵생물 세포인 세포.
  34. 제32항에 있어서, 세포는 진핵생물 세포인 세포.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 표적 서열의 변형은
    적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하는 세포;
    적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하는 것으로서, 적어도 하나의 유전자 산물의 발현이 증가된 것인 세포;
    적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 발현을 포함하는 것으로서, 적어도 하나의 유전자 산물의 발현이 감소된 것인 세포; 또는
    내생성 또는 비내생성 생물학적 산물 또는 화학적 화합물을 생산 및/또는 분비하는 세포 또는 개체군
    을 야기시키는 것인 세포.
  36. 제32항 또는 제35항에 있어서, 세포는 포유동물 세포 또는 인간 세포인 진핵생물 세포.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 이의 자손을 포함하는 또는 이의 세포주.
  38. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 다세포 유기체.
  39. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 식물 또는 동물 모델.
  40. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 세포, 또는 제37항의 세포주, 또는 제38항의 유기체, 또는 제39항의 식물 또는 동물 모델로부터의 유전자 산물.
  41. 제40항에 있어서, 발현되는 유전자 산물의 양은 변경된 발현을 갖지 않는 세포로부터의 유전자 산물의 양을 초과하거나 또는 그 미만인 유전자 산물.
  42. 표1 또는 2로부터의 단리된 Cas12b 이펙터 단백질.
  43. 제42항의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  44. 제43항에 있어서, DNA이고 crRNA 및 tracr RNA를 코딩하는 서열을 더 포함하는 것인 단리된 핵산.
  45. 제43항 또는 제44항에 따른 핵산 또는 제42항의 Cas12b를 포함하는 단리된 진핵생물 세포.
  46. i) 표 1 또는 2로부터의 Cas12b 이펙터 단백질을 코딩하는 mRNA,
    ii) 가이드 서열, 및
    iii) tracr RNA
    를 포함하는, 비천연 발생 또는 조작된 시스템.
  47. 제46항에 있어서, tracr RNA는 직접 반복부의 5' 말단에서 crRNA에 융합되는 것인 비천연 발생 또는 조작된 시스템.
  48. 표적화 도메인 및 아데노신 디아미나제, 시티딘 디아미나제, 또는 이의 촉매 도메인을 포함하는 부위 지정 염기 편집을 위한 조작된 조성물로서, 표적화 도메인은 Cas12b 이펙터 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드-결합 활성을 유지하는 이의 단편, 및 가이드 분자를 포함하는 것인 조작된 조성물.
  49. 제48항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 촉매적으로 불활성인 조성물.
  50. 제48항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 표 1 또는 2로부터 선택되는 것인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13, 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium), 및 라세이엘라 세디미니스 (Laceyella sediminis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원하는 것인 조성물.
  52. 하나 이상의 관심 표적 올리고뉴클레오티드 내 아데노신 또는 시티딘을 변형시키는 방법으로서, 상기 하나 이상의 표적 올리고뉴클레오티드에, 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 전달하는 단계를 포함하는 것인, 변형 방법.
  53. 제52항에 있어서, 병원성 T→C 또는 A→G 점 돌연변이를 함유하는 전사물에 의해 초래된 질환의 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것인 변형 방법.
  54. 제48항 또는 제49항 중 어느 한 항의 방법으로 수득되고/되거나 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 단리된 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 진핵생물 세포, 바람직하게 인간 또는 비인간 동물 세포, 임의로 치료적 T 세포 또는 항체-생성 B-세포이거나 또는 상기 세포는 식물 세포인 세포 또는 이의 자손.
  56. 제50항 또는 제51항의 상기 변형된 세포 또는 이의 자손을 포함하는 비인간 동물.
  57. 제56항의 상기 변형된 세포를 포함하는 식물.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 요법, 바람직하게 세포 요법에서 사용을 위한 것인 변형된 세포.
  59. 표적 올리고뉴클레오티드 내 아데닌 또는 시토신을 변형시키는 방법으로서, 상기 표적 올리고뉴클레오티드에:
    (a) 촉매적 불활성 Cas12b 단백질;
    (b) 직접 반복부에 연결된 가이드 서열을 포함하는 가이드 분자; 및
    (c) 아데노신 또는 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인
    을 전달하는 단계를 포함하고;
    상기 아데노신 또는 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 상기 촉매적 불활성 Cas12b 단백질에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되거나 또는 상기 가이드 분자는 전달 후 이에 연결되거나 적합화되고;
    상기 가이드 분자는 상기 촉매적 불활성 Cas12b와 복합체를 형성하고 상기 복합체가 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 결합하도록 유도하며, 상기 가이드 서열은 상기 표적 올리고뉴클레오티드 내 표적 서열과 하이브리드화할 수 있어서 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성하는 것인, 변형 방법.
  60. 제59항에 있어서, (A) 상기 시토신은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성하는 상기 표적 서열 밖에 존재하고, 상기 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스 밖의 상기 시토신을 탈아미드화시키거나, 또는 (B) 상기 시토신은 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 형성하는 상기 표적 서열 내에 존재하고, 상기 가이드 서열은 상기 시토신에 상응하는 위치에 비쌍형성 아데닌 또는 우라실을 포함하여서 상기 올리고뉴클레오티드 듀플렉스에 C-A 또는 C-U 미스매치를 야기시키고, 시티딘 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 비쌍형성 아데닌 또는 우라실의 반대쪽 올리고뉴클레오티드 듀플렉스 내 시토신을 탈아미드화시키는 것인 변형 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 아데노신 디아미나제 단백질 또는 이의 촉매 도메인은 올리고뉴클레오티드 듀플렉스 내 상기 아데닌 또는 시토신을 탈아미드화시키는 것인 변형 방법.
  62. 제59항에 있어서, Cas12b 단백질은 표 1 또는 2로부터 선택되는 것인 변형 방법.
  63. 제62항에 있어서, Cas12b 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13, 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium), 및 라세이엘라 세디미니스 (Laceyella sediminis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원하는 것인 변형 방법.
  64. 하나 이상의 시험관내 샘플에서 하나 이상의 표적 서열의 존재를 검출하기 위한 시스템으로서,
    Cas12b 단백질;
    하나 이상의 표적 서열과 일정 정도의 상보성을 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함하고, Cas12b 단백질과 복합체를 형성하도록 설계된 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드; 및
    비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체
    를 포함하고,
    Cas12b 단백질은 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 하나 이상의 표적 서열에 의해 활성화되면 올리고뉴클레오티드 기반 차폐성 구성체의 비표적 서열을 절단하는 것인, 시스템.
  65. 하나 이상의 시험관내 샘플에서 표적 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 시스템으로서,
    Cas12b 단백질;
    각각이 하나 이상의 표적 폴리펩티드 중 하나에 결합하도록 설계된, 하나 이상의 검출 압타머로서, 각각의 검출 압타머는 차폐된 프로모터 결합 부위 또는 차폐된 프라이머 결합 부위 및 기폭제 서열 주형을 포함하는 것인 검출 압타머; 및
    비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체
    를 포함하는 것인 시스템.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 표적 서열 또는 기폭제 서열을 증폭시키기 위한 핵산 증폭 시약을 더 포함하는 것인 시스템.
  67. 제66항에 있어서, 핵산 증폭 시약은 등온 증폭 시약인 시스템.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, Cas12b 단백질은 표 1 또는 2로부터 선택되는 것인 시스템.
  69. 제68항에 있어서, Cas12b 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13, 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium), 및 라세이엘라 세디미니스 (Laceyella sediminis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원하는 것인 시스템.
  70. 하나 이상의 시험관내 샘플에서 하나 이상의 표적 서열을 검출하기 위한 방법으로서,
    하나 이상의 샘플을
    i) Cas12b 이펙터 단백질
    ii) 하나 이상의 표적 서열과 일정 정도의 상보성을 갖도록 설계된 가이드 서열을 포함하고, Cas12b 이펙터 단백질과 복합체를 형성하도록 설계된 적어도 하나의 가이드 폴리뉴클레오티드; 및
    iii) 비표적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체
    와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 Cas12 이펙터 단백질은 부차적 뉴클레아제 활성을 나타내고 올리고뉴클레오티드-기반 차폐성 구성체의 비표적 서열을 절단하는 것인, 검출 방법.
  71. 제70항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 표 1 또는 2로부터 선택되는 것인 검출 방법.
  72. 제71항에 있어서, Cas12b 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 카케가웬시스 (Alicyclobacillus kakegawensis), 바실러스 (Bacillus) sp. V3-13, 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii), 렌티스파에리아 박테리움 (Lentisphaeria bacterium), 및 라세이엘라 세디미니스 (Laceyella sediminis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 기원하는 것인 검출 방법.
  73. 효소 또는 리포터 모이어티의 불활성 제1 부분에 연결된 Cas12b 단백질을 포함하는 비천연 발생 또는 조작된 조성물로서, 효소 또는 리포터 모이어티는 효소 또는 리포터 모이어티의 상보성 부분과 접촉할 때 재구성되는 것인 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 효소 또는 리포터 모이어티는 단백질가수분해 효소를 포함하는 것인 조성물.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, Cas12b 단백질은 효소 또는 리포터 모이어티의 상보성 부분에 연결된 제1 Cas12b 단백질 및 제2 Cas12b 단백질을 포함하는 것인 조성물.
  76. 제73항에 있어서,
    i) 제1 Cas12b 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 표적 핵산의 제1 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 제1 가이드; 및
    ii) 제2 Cas12b 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, 표적 핵산의 제2 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 제2 가이드
    를 더 포함하는 것인 조성물.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 캐스파제를 포함하는 것인 조성물.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 담배 식각 바이러스 (TEV)를 포함하는 것인 조성물.
  79. 표적 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포에서 단백질가수분해 활성을 제공하는 방법으로서,
    a) 세포 또는 세포 개체군을
    i) 단백질가수분해 효소의 불활성 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질;
    ii) 단백질가수분해 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 단백질가수분해 효소의 단백질가수분해 활성은 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 제2 Cas12b 이펙터 단백질;
    iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 표적 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드; 및
    iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 표적 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드
    와 접촉시켜서,
    단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉하고 단백질가수분해 효소의 단백질 가수분해 활성이 재구성되는 것인 단계를 포함하는, 제공 방법.
  80. 제79항에 있어서, 효소는 캐스파제인 제공 방법.
  81. 제80항에 있어서, 단백질가수분해 효소는 TEV 프로테아제이고, TEV 프로테아제의 단백질가수분해 활성은 재구성되어서, TEV 기질이 절단되고 활성화되는 것인 제공 방법.
  82. 제81항에 있어서, TEV 기질은 TEV 표적 서열을 함유하도록 조작된 프로캐스파제여서 TEV 프로테아제에 의한 절단은 프로캐스파제를 활성화시키는 것인 제공 방법.
  83. 관심 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포를 확인하기 위한 방법으로서, 방법은 세포 내 올리고뉴클레오티드를,
    i) 단백질가수분해 효소의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질;
    ii) 단백질가수분해 효소의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 단백질가수분해 효소의 활성은 단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉될 때 재구성되는 것인 제2 Cas12b 이펙터 단백질;
    iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드;
    iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드; 및
    v) 검출가능하게 절단되는 리포터
    를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
    단백질가수분해 효소의 제1 부분 및 상보성 부분은 관심 올리고뉴클레오티드가 세포에 존재할 때 접촉되어서, 단백질가수분해 효소의 활성은 재구성되고 리포터를 검출가능하게 절단하는 것인, 확인 방법.
  84. 관심 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포를 확인하는 방법으로서, 방법은 세포 내 올리고뉴클레오티드를
    i) 리포터의 불활성 제1 부분에 연결된 제1 Cas12b 이펙터 단백질;
    ii) 리포터의 상보성 부분에 연결된 제2 Cas12b 이펙터 단백질로서, 리포터의 활성은 리포터의 제1 부분 및 상보성 부분이 접촉할 때 재구성되는 것인 제2 Cas12b 이펙터 단백질;
    iii) 제1 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 하이브리드화하는 제1 가이드;
    iv) 제2 Cas12b 이펙터 단백질에 결합하고 올리고뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 하이브리드화하는 제2 가이드; 및
    v) 리포터
    를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
    리포터의 제1 부분 및 상보성 부분은 관심 올리고뉴클레오티드가 세포에 존재할 때 접촉되어서, 리포터의 활성이 재구성되는 것인, 확인 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 리포터는 형광 단백질 또는 발광 단백질인 확인 방법.
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