BR112020004740A2 - sistemas de diagnóstico baseados em crispr multi-efetor - Google Patents

Abstract

As modalidades reveladas no presente documento utilizaram efetores de direcionamento de RNA para fornecer um diagnóstico robusto baseado em CRISPR com sensibilidade attomolar. Modalidades reveladas no presente documento podem detectar DNA e RNA com níveis comparáveis de sensibilidade e podem diferenciar alvos de não alvos com base em diferenças de pares de bases únicas. Além disso, as modalidades reveladas no presente documento podem ser preparadas em formato seco por congelamento para distribuição conveniente e aplicações de ponto de atendimento (POC). Tais modalidades são úteis em vários cenários na saúde humana, incluindo, por exemplo, detecção viral, tipagem de cepas bacterianas, genotipagem sensível e detecção de DNA livre de células associadas à doença.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “SISTEMAS DE DIAGNÓSTICO BASEADOS EM CRISPR MULTI-EFETOR” Referência cruzada a pedidos relacionados

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório no US 62/556,408, depositado em 9 de setembro de 2017; Pedido Provisório no US 62/610,121, depositado em 22 de dezembro de 2017; e Pedido Provisório no US 62/630,808, depositado em 14 de fevereiro de 2018. Todo o conteúdo dos pedidos acima identificados é aqui incorporado integralmente a título de referência.

Declaração sobre pesquisa patrocinada pelo governo federal

[0002] Esta invenção foi concebida com apoio do governo sob o número de concessão MH110049 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos na invenção.

Campo da técnica

[0003] A matéria aqui revelada é geralmente direcionada a diagnósticos rápidos relacionados ao uso de sistemas efetores CRISPR.

Antecedentes

[0004] Os ácidos nucléicos são uma assinatura universal de informações biológicas. A capacidade de detectar rapidamente ácidos nucleicos com alta sensibilidade e especificidade de base única em uma plataforma portátil tem o potencial de revolucionar o diagnóstico e o monitoramento de muitas doenças, fornecer informações epidemiológicas valiosas e servir como uma ferramenta científica generalizável. Embora muitos métodos tenham sido desenvolvidos para a detecção de ácidos nucléicos (Du et al., 2017; Green et al., 2014; Kumar et al., 2014; Pardee et al., 2014; Pardee et al., 2016; Urdea et al., 2006), os mesmos inevitavelmente sofrem trocas entre sensibilidade, especificidade, simplicidade e velocidade. Por exemplo, as abordagens de qPCR são sensíveis, mas são caras e dependem de instrumentação complexa, limitando a usabilidade a operadores altamente treinados em ambientes de laboratório. Outras abordagens, como novos métodos que combinam a amplificação isotérmica de ácido nucleico com plataformas portáteis (Du et al., 2017; Pardee et al., 2016), oferecem alta especificidade de detecção em um ambiente de ponto de atendimento (POC), mas têm alguma aplicações limitadas devido à baixa sensibilidade. À medida que o diagnóstico de ácidos nucléicos se torna cada vez mais relevante para uma variedade de aplicações na área da saúde, as tecnologias de detecção que fornecem alta especificidade e sensibilidade a baixo custo seriam de grande utilidade em ambientes de pesquisa clínica e básica.

Sumário

[0005] Em um aspecto, a presente invenção fornece um sistema de detecção de ácido nucleico que compreende: um sistema CRISPR de detecção que compreende: uma proteína efetora, um ou mais RNAs guia projetados para se ligarem às moléculas alvo correspondentes e um ou mais proteínas efetoras CRISPR de amplificação de sinal; e um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA.

[0006] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um sistema de detecção de polipeptídeo que compreende: um sistema CRISPR de detecção que compreende: uma proteína efetora, um ou mais RNAs guia projetados para se ligarem a um RNA gatilho e uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de amplificação de sinal; um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA; e um ou mais aptâmeros de detecção que compreendem um sítio de ligação ao promotor da RNA polimerase mascarado ou um sítio de ligação ao primer mascarado.

[0007] Em certas modalidades, a uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de amplificação de sinal compreendem uma proteína CRISPR de Tipo IIIa. A proteína CRISPR do tipo III pode ser uma proteína Csm6. A proteína Csm6 pode ser selecionada dentre EiCsm6 e LsCsm6.

[0008] Em certas modalidades, a uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de amplificação de sinal compreendem Csx28 ou Csx27.

[0009] Em certas modalidades, a uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de amplificação de sinal compreendem um ou mais dentre Csm6, Csx28, Csx27 ou qualquer combinação dos mesmos.

[0010] Em certas modalidades, o sistema compreende adicionalmente reagentes de amplificação de ácido nucleico.

[0011] Em certas modalidades, a molécula alvo é um DNA alvo e o sistema compreende adicionalmente um primer que liga o DNA alvo e compreende um promotor de RNA polimerase.

[0012] Em certas modalidades, a proteína efetora do sistema CRISPR é uma proteína efetora direcionada ao RNA. A proteína efetora direcionada ao RNA pode compreender um ou mais domínios HEPN. O um ou mais domínios HEPN podem compreender uma sequência de motivos RxxxxH. O motivo RxxxH pode compreender uma sequência R{N/H/K]X1X2X3H. X1 pode ser R, S, D, E, Q, N, G, ou Y, e X2 pode ser, independentemente, I, S, T, V, ou G, e X3 pode ser, independentemente, L, M, N, Y, V, I, S, D, E ou A.

[0013] Em certas modalidades, a proteína efetora direcionada ao RNA CRISPR é C2c2. A C2c2 pode estar dentro de 20 kb de um gene Cas 1. A proteína efetora C2c2 pode ser de um organismo de um gênero selecionado do grupo que consiste em: Leptotriquia. Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium,

Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides,

Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum,

Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum,

Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter e

Lachnospira.

A proteína efetora C2c2 ou Casl3b pode ser de um organismo selecionado do grupo que consiste em:

Leptotrichia shahii; Leptotrichia wadei (Lw2); Listeria seeligeri; Lachnospiraceae bacterium MA2020;

Lachnospiraceae bacterium NK4A179; [Clostridium]

aminophilum DSM 10710; Carnobacterium gallinarum DSM 4847;

Carnobacterium gallinarum DSM 4847 (segundo loci de

CRISPR); Paludibacter propionicigenes WB4; Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317; Listeriaceae bacterium FSL

M6-0635; Leptotrichia wadei F0279; Rhodobacter capsulatus

SB 1003; Rhodobacter capsulatus R121; Rhodobacter capsulatus DE442; Leptotrichia buccalis C-1013-b; Herbinix hemicellulosilytica; [Eubacterium] rectale; Eubacteriaceae bacterium CHKCI004; Blautiasp.

Marseille-P2398;

Leptotrichia sp. cepa 879 de táxon oral F0557;

Lachnospiraceae bacterium NK4A144; Chloroflexus aggregans;

Demequina aurantiaca; Thalassospira sp.

TSL5-1;

Pseudobutyrivibrio sp.

OR37; Butyrivibrio sp.

YAB3001;

Blautia sp.

Marseille-P2398; Leptotrichia sp.

Marseille-

P3007; Bacteroides ihuae; Porphyromonadaceae bacterium

KH3CP3RA; Listeria riparia; e Insolitispirillum peregrinum.

A proteína efetora C2c2 pode ser uma proteína efetora wadei F0279 ou L. wadei F0279 (Lw2) C2c2.

[0014] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA suprimem a geração de um sinal positivo detectável.

[0015] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA podem suprimir a geração de um sinal positivo detectável, por meio do mascaramento do sinal positivo detectável ou por meio da geração de um sinal negativo detectável.

[0016] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA podem compreender um RNA de silenciamento que suprime a geração de um produto genético codificado por um construto de relatório, em que o produto genético gera o sinal positivo detectável quando expresso.

[0017] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA podem ser uma ribozima que gera o sinal detectável negativo e em que o sinal detectável positivo é gerado quando a ribozima é desativada. A ribozima pode converter um substrato em uma primeira cor e em que o substrato converte em uma segunda cor quando a ribozima é desativada.

[0018] Em certas modalidades, o agente de mascaramento baseado em RNA é um aptâmero de RNA e/ou compreende um inibidor amarrado a RNA.

[0019] O aptâmero ou inibidor amarrado a RNA pode sequestrar uma enzima, em que a enzima gera um sinal detectável após a liberação do aptâmero ou inibidor amarrado a RNA, por meio da atuação sobre um substrato. O aptâmero pode ser um aptâmero inibidor que inibe uma enzima e impede a enzima de catalisar a geração de um sinal detectável de um substrato ou em que o inibidor amarrado a RNA inibe uma enzima e impede a enzima de catalisar a geração de um sinal detectável de um substrato. A enzima pode ser trombina, proteína C, elastase de neutrófilos, subtilisina, peroxidase de rábano silvestre, beta- galactosidase ou fosfatase alcalina de bezerro. A enzima pode ser trombina e o substrato pode ser para-nitroanilida covalentemente ligado a um substrato peptídico para trombina ou 7-amino-4-metilcumarina covalentemente ligado a um substrato peptídico para trombina.

[0020] Em certas modalidades, o aptâmero sequestra um par de agentes que, quando liberados dos aptâmeros, se combinam para gerar um sinal detectável.

[0021] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem um oligonucleotídeo de RNA ao qual um ligante detectável e um componente de mascaramento estão ligados.

[0022] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem uma nanopartícula mantida em agregado por moléculas de ponte, em que pelo menos uma porção das moléculas de ponte compreende RNA e em que a solução sofre uma mudança de cor quando a nanopartícula é desembolsada em solução. A nanopartícula pode ser um metal coloidal. O metal coloidal pode ser ouro coloidal.

[0023] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem um ponto quântico ligado a uma ou mais moléculas inibidoras por uma molécula de ligação, em que pelo menos uma porção da molécula de ligação compreende RNA.

[0024] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem RNA em complexo com um agente intercalante, em que o agente intercalante altera a absorvância após a clivagem do RNA. O agente de intercalação pode ser pironina-Y ou azul de metileno.

[0025] Em certas modalidades, o ligante detectável é um fluoróforo e o componente de mascaramento é uma molécula inibidora.

[0026] Em certas modalidades, o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA podem ser clivados pela proteína efetora de direcionamento de RNA

CRISPR e pela proteína CRISPR do tipo IIIa.

Em outras palavras, o agente de mascaramento baseado em RNA pode ser um único construto que pode ser clivado pela proteína efetora de direcionamento de RNA CRISPR e pela proteína do

Tipo IIIa CRISPR ou mais do que um construto que pode ser clivado por ambos, ou mais de um construto que pode ser clivado por um ou outro.

O um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA podem compreender um construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína efetora de direcionamento de RNA CRISPR.

O um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA podem compreender um construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína CRISPR do Tipo IIIa.

O um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA podem compreender um construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína efetora direcionada ao RNA

CRISPR e um construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína CRISPR do Tipo IIIa.

O construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína CRISPR do Tipo IIIa pode compreender

A ou C-RNA homopolimérico.

[0027] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia projetados para se ligarem às moléculas alvo correspondentes compreendem uma incompatibilidade (sintética). A incompatibilidade pode estar a montante ou a jusante de um SNP ou outra variação de nucleotídeo único na dita molécula alvo.

[0028] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para detectar um único polimorfismo de nucleotídeo em um RNA ou DNA alvo ou em uma variante de splice de um transcrito de RNA.

[0029] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para detectar uma molécula alvo ou desencadear RNA que produz hexadenilatos contendo uma extremidade de fosfato cíclico 2’3’ quando clivados pela proteína efetora direcionada ao RNA CRISPR. O um ou mais RNAs guia podem ser projetados para detectar uma molécula alvo ou desencadear RNA que compreende um trecho poli A.

[0030] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo que são diagnósticas para um estado de doença. O estado da doença pode ser câncer. O estado da doença pode ser uma doença autoimune. O estado da doença pode ser uma infecção.

[0031] Em certas modalidades, a infecção é causada por um vírus, uma bactéria, um fungo, um protozoário ou um parasita.

[0032] Em certas modalidades, a infecção pode ser uma infecção viral. A infecção viral pode ser causada por um vírus de DNA. O vírus do DNA pode ser um Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae (incluindo vírus do herpes humano e vírus Varicella Zoster), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ampovaviridae, Cicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, polydnaviruses, Polyomaviridae (incluindo vírus Simian 40, vírus JC, vírus BK), Poxviridae (incluindo varíola bovina e varíola), Sphaerolipoviridae, Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus, Rhizidovirus. A infecção viral pode ser causada por um vírus de RNA de fita dupla, um vírus de RNA senso positivo, um vírus de RNA senso negativo, um retrovírus ou uma combinação dos mesmos. A infecção viral pode ser causada por um vírus Coronaviridae, um vírus Picornaviridae, um vírus Caliciviridae, um vírus Flaviviridae, um vírus Togaviridae, um Bornaviridae, um

Filoviridae, um Paramyxoviridae, um Pneumoviridae, um Rhabdoviridae, um Arenaviridae, um Arenavire ou um Deltavirus. A infecção viral pode ser causada por coronavírus, SARS, poliovírus, rinovírus, hepatite A, vírus Norwalk, vírus da febre amarela, vírus do Nilo Ocidental, vírus da hepatite C, vírus da dengue, vírus da zika, vírus da zika, vírus da rubéola, vírus do rio Ross, vírus de Sindbis, Vírus Chikungunya, vírus da doença de Borna, vírus do Ebola, vírus de Marburg, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus de Nipah, vírus de Hendra, vírus de doença de Newcastle, vírus sincicial respiratório humano, vírus da raiva, vírus de Lassa, Hantavírus, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, influenza ou vírus da hepatite D.

[0033] Em certas modalidades, a infecção é uma infecção bacteriana. A bactéria que causa a infecção bacteriana pode ser uma espécie de Acinetobacter, uma espécie de Actinobacillus, uma espécie de Actinomycetes, uma espécie de Actinomyces, uma espécie de Aerococcus, uma espécie de Aeromonas, uma espécie de Anaplasma espécie, uma espécie de Alcaligenes, uma espécie de Bacillus, uma espécie de Bacteriodes, uma espécie de Bartonella, uma espécie de Bifidobacterium, uma espécie de Bordetella, uma espécie de Borrelia, uma espécie de Brucella, uma espécie de Burkholderia, uma espécie de Campylobacter, uma espécie de Capnocytophaga, uma espécie de Chlamydia, uma espécie de

Citrobacter, uma espécie de Coxiella, uma espécie de

Corynbacterium, uma espécie de Clostridium, uma espécie de

Eikenella e uma espécie de Enterobacter, uma espécie de

Escherichia, uma espécie de Enterococcus, uma espécie de

Ehlichia, uma espécie de Epidermophyton, uma espécie de

Erysipelothrix espécie, uma espécie de Eubacterium, uma espécie de Francisella, uma espécie de Fusobacterium, uma espécie de Gardnerella, uma espécie de Gemella, uma espécie de Haemophilus, uma espécie de Helicobacter, uma espécie de

Kingella, uma espécie de Klebsiella, uma espécie de

Lactobacillus, uma espécie de Lactococcus, uma espécie de L espécies de Isteria, uma espécie de Leptospira, uma espécie de Legionella, uma espécie de Leptospira, uma espécie de

Leuconostoc, uma espécie de Mannheimia, uma espécie de

Microsporum, uma espécie de Micrococcus, uma espécie de

Moraxella, uma espécie de Morganell, uma espécie de

Mobiluncus, uma espécie de Micrococcus, uma espécie de

Mycobacterium, uma espécie de Mycoplasma, uma espécie de

Nocardia, uma espécie de Neisseria, uma espécie de

Pasteurelaa, uma espécie de Pediococcus, uma espécie de

Peptostreptococcus, uma espécie de Pityrosporum, uma espécie de Plesiomonas, uma espécie de Prevotella, uma espécie de Porphyromonas, uma espécie de Proteus, uma espécie de Providencia, uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Propionibacteriums, uma espécie de Rhodococcus, uma espécie de Rickettsia, uma espécie de Rhodococcus, uma espécie de Serratia, uma espécie de Stenotrophomonas, uma espécie de Salmonella, uma espécie de Serratia, uma espécie de Shigella, uma espécie de Staphylococcus, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Spirillum, uma espécie de Espécies de Streptobacillus, uma espécie de Treponema, uma espécie de Tropheryma, uma espécie de Trichophyton, uma espécie de Ureaplasma, uma espécie de Veillonella, uma espécie de Vibrio, uma espécie de Yersinia, uma espécie de Xanthomonas ou combinação das mesmas.

[0034] Em certas modalidades, a infecção é causada por um fungo. O fungo pode ser Aspergillus, Blastomyces, Candidíase, Coccidiodomicose, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gatti, sp. Histoplasma sp. (como Histoplasma capsulatum), Pneumocystis sp. (como Pneumocystis carinii), Stachybotrys (como Stachybotrys chartarum), Mucroymcosis, Sporothrix, micose de infecções oculares fúngicas, Exserohilum, Cladosporium, Geotrichum, Saccharomyces, uma espécie de Hansenula, uma espécie de Candida, uma espécie de Kluyveromyces, uma espécie de Debaryomyces, uma espécie de Pichia, uma espécie de Penicillium, uma espécie de Cladosporium, uma espécie de Byssochlamys ou uma combinação das mesmas.

[0035] Em certas modalidades, a infecção é causada por um protozoário. O protozoário pode ser Euglenozoa, um Heterolobosea, um Diplomonadida, um Amebozoa, um Blastocystic, um Apicomplexa, ou combinação dos mesmos.

[0036] Em certas modalidades, a infecção é causada por um parasita. O parasita pode ser Trypanosoma cruzi (doença de Chagas), T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L. infantum, L.

mexicana, L. major, L. tropica, L. donovani, Naegleria fowleri, Giardia intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis), canthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica, Blastocystic hominis, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e Toxoplasma gondii, ou uma combinação dos mesmos.

[0037] Em certas modalidades, os reagentes para amplificar moléculas de RNA alvo compreendem amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), amplificação de polimerase de recombinase (RPA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), helicase amplificação dependente (HDA), reação de amplificação de enzima nicking (NEAR), PCR, amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), amplificação de círculo rolante (RCA),

reação em cadeia da ligase (LCR) ou método de amplificação de ramificação (RAM).

[0038] Em certas modalidades, o sistema compreende adicionalmente um sistema CRISPR de enriquecimento, em que o sistema CRISPR de enriquecimento é projetado para ligar as moléculas alvo correspondentes antes da detecção pelo sistema CRISPR de detecção. O sistema CRISPR de enriquecimento pode compreender uma proteína efetora CRISPR cataliticamente inativa. A proteína efetora CRISPR cataliticamente inativa pode ser uma C2c2 cataliticamente inativa. A proteína efetora de CRISPR de enriquecimento pode compreender adicionalmente um marcador, em que o marcador é usado para eliminar o sistema efetor de CRISPR de enriquecimento ou para ligar o sistema CRISPR de enriquecimento a um substrato sólido. O substrato sólido pode ser uma célula de fluxo.

[0039] Em certas modalidades, a incompatibilidade sintética no dito RNA guia está na posição 3, 4, 5 ou 6 do espaçador, preferencialmente na posição 3. A incompatibilidade no dito RNA guia pode estar na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 do espaçador, de preferência na posição 5. A incompatibilidade pode ser de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos a montante ou a jusante, preferencialmente 2 nucleotídeos, preferencialmente a jusante do dito SNP ou outro variação nucleotídica no dito RNA guia.

[0040] Em certas modalidades, o RNA guia pode compreender um espaçador que é truncado em relação a um espaçador do tipo selvagem. Em certas modalidades, o RNA guia compreende um espaçador que compreende menos de 28 nucleotídeos, preferencialmente entre e incluindo 20 a 27 nucleotídeos. O RNA guia pode compreender um espaçador que consiste em 20 a 25 nucleotídeos ou 20 a 23 nucleotídeos, como preferencialmente 20 ou 23 nucleotídeos.

[0041] Em certas modalidades, o construto de mascaramento compreende um oligonucleotídeo de RNA projetado para ligar uma sequência de formação de G- quadruplex, em que uma estrutura G-quadruplex é formada pela sequência de formação de G-quadruplex após a clivagem do construto de mascaramento, e em que a estrutura quadruplex-G gera um sinal positivo detectável.

[0042] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um dispositivo de diagnóstico que compreende um ou mais volumes discretos individuais, em que cada volume discreto individual compreende um sistema CRISPR de qualquer modalidade no presente documento.

[0043] Em certas modalidades, cada volume discreto individual pode compreender adicionalmente um ou mais aptâmeros de detecção que compreendem um sítio de ligação ao promotor de RNA polimerase mascarado ou um sítio de ligação ao primer mascarado.

[0044] Em certas modalidades, cada volume discreto individual compreende adicionalmente reagentes de amplificação de ácido nucleico.

[0045] Em certas modalidades, a molécula alvo é um DNA alvo e os volumes discretos individuais compreendem adicionalmente um primer que liga o DNA alvo e compreende um promotor de RNA polimerase.

[0046] Em certas modalidades, os volumes discretos individuais são gotículas.

[0047] Em certas modalidades, os volumes discretos individuais são definidos em um substrato sólido. Os volumes discretos individuais podem ser micropoços. Os volumes discretos individuais podem ser pontos definidos em um substrato. O substrato pode ser um substrato de materiais flexíveis. O substrato de materiais flexíveis pode ser um substrato de papel ou um substrato flexível à base de polímero.

[0048] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar ácidos nucleicos alvo em amostras, que compreende: distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes discretos individuais, em que os volumes discretos individuais compreendem um sistema CRISPR como descrito no presente documento; incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais

RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo; ativar a proteína efetora CRISPR via ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína efetora CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra.

[0049] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar polipeptídeos em amostras, que compreende: distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um conjunto de volumes discretos individuais, em que os volumes discretos individuais compreendem aptâmeros de detecção de peptídeos, um sistema CRISPR como descrito no presente documento; incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação dos aptâmeros de detecção de peptídeo a uma ou mais moléculas alvo, em que a ligação do aptâmero a uma molécula alvo correspondente expõe o sítio de ligação à RNA polimerase ou o sítio de ligação ao primer, resultando na geração de um RNA gatilho; ativar a proteína efetora de RNA via ligação de um ou mais RNAs guia ao RNA gatilho, em que a ativação da proteína efetora de RNA resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja produzido; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo em uma amostra.

[0050] Em certas modalidades, a molécula alvo é um DNA alvo e o método compreende adicionalmente a ligação do DNA alvo a um primer que compreende um sítio de RNA polimerase.

[0051] Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente a amplificação do RNA da amostra ou do RNA gatilho. O RNA amplificador pode compreender a amplificação por NASBA. O RNA amplificador pode compreender a amplificação por RPA.

[0052] Em certas modalidades, a amostra é uma amostra biológica ou uma amostra ambiental. A amostra biológica pode ser sangue, plasma, soro, urina, fezes, escarro, mucosa, líquido linfático, líquido sinovial, bile, ascite, derrame pleural, seroma, saliva, líquido cefalorraquidiano, humor aquoso ou vítreo ou qualquer secreção corporal, um transudato, um exsudato (por exemplo, fluido obtido de um abscesso ou qualquer outro local de infecção ou inflamação) ou fluido obtido de uma articulação (por exemplo, uma articulação normal ou uma articulação afetada por uma doença, como artrite reumatoide, osteoartrite), gota ou artrite séptica) ou uma amostra de cotonete da superfície da pele ou da membrana mucosa. A amostra ambiental pode ser obtida de uma amostra de alimento, superfície de papel, um tecido, uma superfície de metal, uma superfície de madeira, uma superfície de plástico, uma amostra de solo, uma amostra de água doce, uma amostra de água residual, uma amostra de água residual, uma amostra de água salina ou uma combinação dos mesmos.

[0053] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para detectar um único polimorfismo de nucleotídeo em um RNA ou DNA alvo ou em uma variante de splice de um transcrito de RNA.

[0054] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo que são diagnósticas para um estado de doença.

[0055] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligarem a ácidos nucleicos livres de células.

[0056] Em certas modalidades, o estado da doença é uma infecção, uma doença de órgão, uma doença do sangue, uma doença do sistema imunológico, um câncer, uma doença do cérebro e do sistema nervoso, uma doença endócrina, uma doença relacionada à gravidez ou ao parto, uma doença hereditária ou adquirida ambientalmente. O estado da doença pode ser caracterizado pela presença ou ausência de um gene ou transcrito ou polipeptídeo ou de resistência a antibióticos ou fármacos, de preferência em um patógeno ou célula. A molécula alvo pode ser um gene ou transcrição ou polipeptídeo ou resistência a antibióticos ou medicamentos.

[0057] Em certas modalidades, o método pode compreender adicionalmente a comparação do sinal positivo detectável com um sinal padrão (sintético).

[0058] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar um ácido nucleico alvo em uma amostra, que compreende: entrar em contato com uma amostra com um sistema de detecção de ácido nucleico, como descrito no presente documento; e aplicar a dita amostra contatada a um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral.

O sistema de detecção de ácido nucleico pode compreender um construto de mascaramento baseado em RNA que compreende uma primeira e uma segunda molécula, e em que o dito ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral compreende a detecção das ditas primeira e segunda molécula, preferencialmente em locais de detecção discretos em uma tira de fluxo lateral.

A primeira molécula e a dita segunda molécula podem ser detectadas ligando-se a um anticorpo que reconhece a dita primeira ou segunda molécula e detectando a dita molécula ligada, preferencialmente com anticorpos em sanduíche. A tira de fluxo lateral pode compreender um primeiro anticorpo a montante direcionado contra a dita primeira molécula e um segundo anticorpo a jusante direcionado contra a dita segunda molécula, e em que o construto de mascaramento baseado em RNA não clivado é ligado pelo dito primeiro anticorpo se o ácido nucleico alvo não estiver presente na dita amostra e em que o construto de mascaramento baseado em RNA clivado é ligado tanto pelo dito primeiro anticorpo como pelo segundo anticorpo se o ácido nucleico alvo estiver presente na dita amostra.

Breve descrição dos desenhos

[0059] Figura 1 - Demonstra ativação de Csm6 por oligos poli-A.

[0060] Figura 2 - Fornece preferência de clivagem de três ortólogos Csm6. EiCsm6 mostra atividade mais forte com preferência de nucleotídeo C ou A. LsCsm6 mostra atividade com preferência de nucleotídeo A.

[0061] Figura 3 - Fornece um gel mostrando extremidades de clivagem de RNAs clivados por Prevotella sp. MA2016 Casl3 (“Casl3b5”) e L. wadei Casl3a. Sem a fosfatase alcalina, apenas os fragmentos que têm um hidroxil 5’ podem ser marcados com corante e aparecer no gel, como visto nas faixas 3 e 7.

[0062] Figura 4 - Fornece gráficos demonstrando que a detecção Casl3b5 do alvo da Dengue é significativamente aumentada pela retroalimentação positiva do Csm6. A detecção Casl3b5 do ssRNA da Dengue é suplementada com LsCsm6 ou tt Csm6, juntamente com oligos poli-A de 6 ou 7 nucleotídeos de comprimento. Esses oligos são cortados por

Casl3b5 e acabam tendo fosfato 2,3 cíclico na extremidade 3’, que tem a capacidade de ativar Csm6 para a clivagem de um construto repórter FAM-poly-A-quencher.

[0063] Figura 5 - Purificação de proteínas de ortólogos Csx28. Cromatogramas de cromatografia de troca iônica (IEC) para PinCsx28, PauCsx28 e PguCsx28 usados neste estudo. A absorvância UV medida (mAU) é mostrada contra o volume de eluição (ml). A linha vermelha mostra a crescente concentração de NaCl usada para a eluição da proteína. SDS PAGE de ortólogos Csx28 concentrados é mostrada para PinCsx28, PauCsx28 e PguCsx28.

[0064] Figura 6 - Efeitos da co-incubação de Csx28 na atividade de clivagem de Casl3. (A) Atividade de clivagem de PinCasl3b co-incubada com PinCsx28, PauCsx28, PguCsx28 ou sem Csx28. (B) Atividade de clivagem de PsmCasl3b co-incubada com PinCsx28, PauCsx28, PguCsx28 ou sem Csx28. (C) Atividade de clivagem de PauCasl3b co- incubada com PinCsx28, PauCsx28, PguCsx28 ou nenhum Csx28.

(D) Atividade de clivagem de CcaCasl3b co-incubada com PinCsx28, PauCsx28, PguCsx28 ou sem Csx28. (E) Atividade de clivagem de PguCasl3b co-incubada com PinCsx28, PauCsx28, PguCsx28 ou sem Csx28. (F) Atividade de clivagem de LwaCasl3a co-incubada com PinCsx28, PauCsx28, PguCsx28 ou sem Csx28.

[0065] Figura 7 - Sinal SHERLOCK aprimorado por meio de retroalimentação positiva Csm6. (A) Esquema para detecção de extremidades de fosfato cíclico 2,3 por meio de marcação PNK e eletroforese em gel. (B) Gel de eletroforese demonstrando extremidades de fosfato 2,3 cíclico geradas pela clivagem de LwaCasl3a ou PsmCasl3b do ssRNA alvo 2

(alças de homopolímeros). A enzima Casl3 é incubada com o crRNA apropriado visando o alvo ssRNA e os produtos de clivagem são marcados em 5’ com um corante IR800 com ou sem tratamento com fosfatase alcalina. (C) Esquema da retroalimentação positiva mediado por Csm6 em uma reação

SHERLOCK. (D) Ativação de dois ortólogos Csm6 via oligômeros de adenina terminados com fosfato 2,3 cíclico de diferentes comprimentos.

A clivagem Csm6 é medida com o uso de um sensor de RNA que consiste em hexa-homopolímeros A,

C, G ou U com extremidades marcadas com fluoróforo e silenciador. (E) Ativação de dois ortólogos Csm6 via clivagem de LwaCasl3a de ativadores de adenina-uridina com diferentes extensões de extensão de adenina.

O LwaCasl3a visa o sRNA sintético da dengue. (F) Análise por espectrometria de massa de produtos de digestão a partir da clivagem colateral de LwaCasl3a (esquerda) ou ativador de fosfato cíclico 2,3 sozinho (direita). Os picos dominantes são rotulados com massa e estrutura correspondente. (G)

Esquema da tela de constatação de preferência de motivo de clivagem para ortólogos Csm6. (H) Mapa de calor dos motivos preferenciais de 3 bases para a atividade de clivagem EiCsm6. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada base 3 em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log 2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente. (I) Logo de sequência do motivo de sequência preferencial para a atividade de clivagem EiCsm6.

(J) Sinal de LwaCasl3a e EiCsm6 combinado para concentrações crescentes de (A) 6-(L)5 ativador de detecção 20 nM de ssRNA da Dengue. (K) Detecção SHERLOCK de LwaCasl3a, melhorada por EiCsm6, do alvo sintético de P.

aeruoginosa aciltransferase em combinação com LwaCasl3a.

(L) Cinética da detecção LwaCasl3a SHERLOCK aprimorada por EiCsm6 do alvo sintético de P. aeruoginosa aciltransferase.

(M) detecção de fluxo lateral aprimorada por EiCsm6 do RNA sintético da dengue em combinação com LwaCasl3a sem pré- amplificação por RPA. A quantificação da intensidade da banda é mostrada à direita. (N) SHERLOCK de fluxo lateral melhorada por EiCsm6 do gene da aciltransferase de P.

aeruoginosa em combinação com LwaCasl3a. A quantificação da intensidade da banda é mostrada à direita.

[0066] Figura 8 - Purificação de proteínas de ortólogos Csm6. (A) Cromatogramas de cromatografia de exclusão por tamanho para EiCsm6, TtCsm6, LsCsm6 e Sa Csm6 usados neste estudo. A absorvância UV medida (mAU) é mostrada contra o volume de eluição (ml). (B) gel SDS-PAGE das frações EiCsm6, TtCsm6 e LsCsm6 antes da cromatografia de exclusão por tamanho. As frações mostram o sobrenadante bacteriano do lisado (1) após a incubação da estreptactina, as resinas da estreptactina após a clivagem com a protease SUMO (2), bem como a proteína Csm6 não marcada e liberada (3). (C) SDS-PAGE final de proteínas Csm6 concentradas após cromatografia de exclusão por tamanho. A curva padrão da BSA (esquerda) é usada para quantificar as proteínas Csm6 (direita). São mostradas cinco diluições de BSA e duas diluições de EiCsm6, TtCsm6 e LsCsm6.

[0067] Figura 9 - Preferência básica da clivagem de TtCsm6 com o uso de ativadores de diferentes comprimentos com extremidades de fosfato cíclico 3’ 2,3.

[0068] Figura 10 - Avaliação da atividade de EiCsm6, TtCsm6 e LsCsm6 com o uso de ativadores de diferentes comprimentos e diferentes grupos de extremidade 3’. (A) Avaliação da atividade de clivagem EiCsm6, TtCsm6 e LsCsm6 com o uso de oligômeros de adenina de 5 a 7 nucleotídeos de comprimento com extremidades de fosfato 3’ OH ou 3’. A atividade de clivagem é medida com o uso do sensor de alerta fluorescente da RNase. (B) Preferência básica de EiCsm6 e LsCsm6 estimulada com oligômeros de adenina 3 ‘OH de comprimento 5nt e 6nt, respectivamente. Os sensores de homopolímeros fluorescentes usados para a detecção da atividade da RNase têm 5nt de comprimento.

[0069] Figura 11 - Análise de tamanho e representação de vários motivos após a clivagem Csm6. (A) Traçados do bioanalisador para amostras de EiCsm6 mostrando alterações no tamanho da biblioteca após a atividade da RNase que depende do ativador. (B) Gráficos de caixas mostrando a distribuição de motivos de razões alvo/não alvo para Csm6, Csm6 com ativador, Csm6 com ativador e rNTPs ou biblioteca de segundo plano em pontos de tempo de 5 e 60 minutos. (C) Número de motivos esgotados para Csm6, Csm6 com ativador, Csm6 com ativador e rNTPs ou biblioteca de segundo plano no período de tempo de 60 minutos.

[0070] Figura 12 - Preferências de uma ou duas bases das condições Csm6 determinadas pela tela da biblioteca de motivos aleatórios. (A) Mapas de calor mostrando preferências de base única para Csm6, Csm6 com ativador e Csm6 com ativador e rNTPs no tempo de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem aleatória da biblioteca de motivos. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada base única em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente. (B) Mapas de calor mostrando preferências de duas bases para Csm6, Csm6 com ativador e Csm6 com ativador e rNTPs no tempo de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem aleatória da biblioteca de motivos. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada duas bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente.

[0071] Figura 13 - Preferências de três bases das condições Csm6 determinadas pela tela da biblioteca de motivos aleatórios. (A) Mapas de calor mostrando preferências de três bases para Csm6 no período de tempo de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem da biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada três bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente. (B) Mapas de calor mostrando preferências de três bases para o Csm6 com ativador no período de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem da biblioteca de motivos aleatórios.

Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada três bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente. (C) Mapas de calor mostrando preferências de três bases para o Csm6 com ativador e rNTPs no período de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem da biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada três bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente.

[0072] Figura 14 - Preferências de uma e duas bases das condições Csm6 determinadas pela tela da biblioteca de motivos aleatórios. (A) Mapas de calor mostrando preferências de quatro bases para Csm6 no período de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem da biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada quatro bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente. (B) Mapas de calor mostrando preferências de quatro bases para Csm6 com ativador no período de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem aleatória da biblioteca de motivos.

Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada quatro bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente. (C) Mapas de calor mostrando preferências de quatro bases para o Csm6 com ativador e rNTPs no período de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem da biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada quatro bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente.

[0073] Figura 15 - Detecção de PsmCasl3b e LwaCasl3a aprimorada em Csm6 para aplicações agrícolas.

Aprimoramento de EiCsm6 da detecção de PsmCasl3b em vários comprimentos de ativadores poli-A.

[0074] Figura 16 - Análise por espectrometria de massa de extremidades de clivagem de LwaCasl3a. (A) Traços cromatográficos mostrando perfis de eluição para o ativador digerido com LwaCasl3a (em cima) ou ativador fosfato 2,3 cíclico (em baixo). Os picos destacados em azul foram analisados quanto à espectrometria de massa na Figura 5.

(B) Tabela de abundâncias para diferentes compostos detectados por espectrometria de massa em amostras de ativador digerido com LwaCasl3a (à esquerda) ou de ativador de fosfato cíclico 2,3 (à direita) (SEQ ID NO: 137)

[0075] A Figura 17 - Efeito das otimizações de repórter e ativador no aprimoramento do Csm6 da atividade do LwaCasl3a. (A) Esquema de diferentes projetos de ativador para aprimoramento da atividade de Casl3a por Csm6 (SEQ ID NO: 137, 138 e 139). (B) Desempenho de aprimoramento de EiCsm6 de detecção de LwaCasl3a para diferentes modelos de ativadores.

[0076] Figura 18 - Efeito das concentrações de repórter e ativador no aprimoramento por Csm6 da atividade de LwaCasl3a. (A) Aprimoramento de EiCsm6 de detecção de LwaCasl3a em várias razões de repórteres poli A e poli U.

(B) Aprimoramento de EiCsm6 de detecção de LwaCasl3a a várias concentrações de (A)6-(L)5 ativador.

[0077] Figura 19 - Detecção de PsmCasl3b e LwaCasl3a aprimorada por Csm6 para aplicações agrícolas.

(A) Detecção aprimorada por Csm6 do gene de resistência a herbicida CP4-EPSPS ou Lectina em extrato bruto de soja pronto para uso ou WT com LwaCasl3a. (B) Cinética de detecção aprimorada por Csm6 do gene de resistência ao herbicida CP4-EPSPS ou Lectina no extrato bruto de soja pronto para uso ou WT com LwaCasl3a.

[0078] Figura 20 - (A) - (D) Csm6 aprimora o sinal das enzimas CcaCasl3b que clivam em U.

[0079] Figura 21 - Efeito dos componentes de transcrição in vitro na atividade Csm6. (A) Atividade de EiCsm6 na presença de componentes de IVT, com e sem ativador de fosfato cíclico 2,3. Os componentes incluem MgC12 adicional de 3 mM, mistura de rNTP 1 mM, polimerase de 30U T7. (B) EiCsm6 atividade e LwaCasl3a com (A) 6 - (L) 5 ativador e poli-A repórter na presença de várias concentrações de ribonucleidos. (C) Atividade combinada de EiCsm6 e LwaCasl3a com a combinação de ativador (A6-(U)5 e repórter poli-A/RNaseAlert na presença de várias concentrações de ribonucleotídeos. (D) Atividade combinada de EiCsm6 e LwaCasl3a com a combinação de ativador (A6-(U)5 e repórter poli-A/5x RNaseAlert na presença de várias concentrações de ribonucleotídeos. (E) Atividade combinada de EiCsm6 e LwaCasl3a com combinação de ativador 5x (A6- (U)5 e repórter poli-A/RNaseAlert na presença de várias concentrações de ribonucleotídeos. (F) Atividade combinada de EiCsm6 e LwaCasl3a com combinação de ativador de fosfato cíclico e repórter poli-A/RNaseAlert na presença de várias concentrações de ribonucleotídeos.

[0080] Figura 22 - Inibição da atividade Csm6 por vários rNTPs. Atividade de RNase de EiCsm6 com fosfato cíclico 2,3 na presença de vários ribonucleotídeos ImM, ou na ausência de uma mistura de rNTP em ImM cada um.

[0081] Figura 23 - Detecção SHERLOCK em três etapas dos genes de resistência a herbicidas. Atividade de RNase de EiCsm6 com fosfato cíclico 2,3 na presença de vários ribonucleotídeos ImM, ou na ausência de uma mistura de rNTP na ImM cada um.

[0082] Figura 24 - SHERLOCK aprimorada com fluxo Csm6 com combinação diferente de repórter. (A) Detecção de fluxo lateral de SHERLOCK aprimorada com Csm6 com vários projetos de repórter. sA: sensor poli-A curto; 1A: sensor longo poli A; sC: sensor poli C curto; 1C: sensor longo poli C; sA/C: sensor poli-A/C curto; 1A/C: sensor longo de poli-A/C; M: sensor misto de alerta RNase. (B)

Quantificação da intensidade da banda a partir da detecção em (A).

[0083] Figura 25 - Quantificação de molécula única e sinal aprimorado com SHERLOCK e Csm6. (A) Representação esquemática do esquema de reação do DNA para quantificação do DNA sintético de P. aeruginosa. (B) Quantificação do DNA sintético de P. aeruginosa em várias concentrações de primers RPA. Os valores representam correlação média +/- SEM (C) da concentração de DNA sintético de P. aeruginosa com fluorescência detectada. Os valores representam +/- S.E.M. média. (D) Esquema da leitura independente da atividade de clivagem LwaCasl3a e Csm6 com repórteres ortogonais. (E) Ativação de EiCsm6 por clivagem por LwaCasl3a de ativadores de adenina-uridina 332 com diferentes extensões de faixas de adenina. O LwaCasl3a está alvejando ssRNA sintético de DENV. Os valores representam +/- S.E.M. média. (F) O sinal de LwaCasl3a e EiCsm6 combinado para concentrações crescentes do ativador (A6- (U)5 que detecta 20nM de ssRNA de DENV. Os valores representam S.E.M. +/- média. (G) Cinética da detecção SHERLOCK de LwaCasl3a aprimorada por EiCsm6 de alvo sintético de aciltransferase de P. aeruoginosa.

[0084] Figura 26 – Adaptação de SHERLOCK para detecção de fluxo lateral. A) Esquema da detecção de fluxo lateral com SHERLOCK. (B) Detecção de ssRNA de ZIKV sintético usando SHERLOCK de fluxo lateral com 1 hora de reação de LwaCasl3a. (C) Quantificação da intensidade da banda a partir da detecção em (B). (D) Esquema da detecção de fluxo lateral de mutações EGFR terapeuticamente relevantes a partir de amostras de biópsia líquida de pacientes. (E) Detecção da mutação EGFR L858R em amostras de DNA sem células derivadas de pacientes com mutações de câncer L858R ou WT.

Os valores representam S.E.M. +/-

média. (F) Detecção do fluxo lateral da mutação EGFR L858R em amostras de DNA sem células derivadas do paciente com alelos L858R ou WT. (G) Quantificação da intensidade da banda a partir da detecção em (E). (H) Detecção da mutação de deleção do exon 19 do EGFR em amostras de DNA sem células derivadas do paciente com deleção do exon 19 ou alelos WT.

Os valores representam S.E.M. +/- média. (I)

Detecção do fluxo lateral da mutação na deleção do exon 19 do EGFR em amostras de DNA sem células derivadas do paciente com deleção do exon 19 ou alelos WT. (J)

Quantificação da intensidade da banda a partir da detecção em (H). (K) Esquema da leitura do fluxo lateral da detecção de LwaCasl3a aprimorada por EiCsm6 do ssRNA de DENV. (L)

Detecção de fluxo lateral aprimorada por EiCsm6 do RNA DENV sintético em combinação com LwaCasl3a sem pré-amplificação por RPA.

A quantificação da intensidade da banda é mostrada à direita.

[0085] Figura 27 - Preferências di-nucleotídicas das enzimas Casl3a/b. (A) Mapa de calor da preferência da base de dinucleotídeos de 10 ortólogos Casl3a/b direcionados ao ssRNA 1, a menos que indicado de outra forma, com repórteres consistindo em um di-nucleotídeo de bases de RNA A, C, G ou LT (x) representam ortólogos subtraídos sem fundo com alta atividade em segundo plano.

(B) Mapa de calor da preferência da base de dinucleotídeos dos ortólogos de alta atividade de fundo LbuCasl3a e PinCasl3b testados nos alvos indicados. (C) Atividade de clivagem de LbuCasl3a no motivo de dinucleotídeo ALT com e sem o alvo 20nM de ssNN de DENV testado com diferentes comprimentos de espaçador. (D) Atividade de clivagem de LbuCasl3a no motivo de di-nucleotídeo UG com e sem o alvo 20nM de ssNNA de DENV testado com diferentes comprimentos de espaçador.

[0086] Figura 28 - Perfilagem de extremidades de clivagem geradas por LwaCasl3a e PsmCasl3b. (A) Esquema para detecção de extremidades de fosfato cíclico 2,3 por meio de marcação PNK e eletroforese em gel. (B) Gel de eletroforese demonstrando extremidades de fosfato 2,3 cíclico geradas pela clivagem LwaCasl3a ou PsmCasl3b do ssRNA alvo 2 ou 3 (loops de homopolímeros). A enzima Casl3 é incubada com o crRNA apropriado visando o alvo ssRNA e os produtos de clivagem são marcados em 5’ com um corante IR800 com ou sem tratamento com fosfatase alcalina.

[0087] A Figura 29 - Purificação de proteínas de ortólogos Csm6. (A) Cromatogramas de cromatografia de exclusão por tamanho para EiCsm 6, TtCsm6, LsCsm6 e Sa Csm6 usados neste estudo. A absorvância UV medida (mAU) é mostrada contra o volume de eluição (ml). (B) Gel de SDS- PAGE das frações EiCsm6, TtCsm6 e LsCsm6 antes da cromatografia de exclusão por tamanho. As frações mostram o sobrenadante bacteriano do lisado (1) após a incubação da estreptactina, as resinas da estreptactina após a clivagem com a protease SUMO (2), bem como a proteína Csm6 não marcada e liberada (3). (C) SDS-PAGE final de proteínas Csm6 concentradas após cromatografia de exclusão por tamanho. A curva padrão da BSA (esquerda) é usada para quantificar as proteínas Csm6 (direita). São mostradas cinco diluições de BSA e duas diluições de EiCsm6, TtCsm6 e LsCsm6.

[0088] Figura 30 - Preferência básica e ativação de ortólogos Csm6. (A) Esquema para retroalimentação positiva mediado por Csm6 em uma reação SHERLOCK. (B) Ativação de EiCsm6 por oligômeros de adenina terminados em fosfato cíclico 2’, 3’ de diferentes comprimentos. A clivagem de Csm6 é medida usando um repórter de RNA consistindo em homopolímero A, C, G ou U com extremidades marcadas com um fluoróforo e silenciador. (C) Preferência básica da clivagem de LsCsm6 ativada por oligômeros de adenina terminados em fosfato 2’, 3’. (D) Preferência básica da clivagem de TtCsm6 ativada por oligômeros de adenina terminados em fosfato 2’, 3’.

[0089] Figura 31 - Análise de tamanho e representação de vários motivos após a clivagem do Csm6.

(A) Esquema da tela de descoberta de preferência de motivo de clivagem para ortólogos Csm6. (B) Traçados do bioanalisador para amostras de EiCsm6 mostrando alterações no tamanho da biblioteca após a atividade da RNase que é dependente do ativador. (C) Gráficos de caixas mostrando a distribuição de motivos de razões alvo/não alvo para Csm6, Csm6 com ativador, Csm6 com ativador e rNTPs ou biblioteca de segundo plano em pontos de tempo de 5 e 60 minutos. (D) Número de motivos esgotados para Csm6, Csm6 com ativador, Csm6 com ativador e rNTPs ou biblioteca de segundo plano no período de tempo de 60 minutos.

[0090] Figura 32 - Preferências de uma e duas bases para condições Csm6 determinadas pela tela da biblioteca de motivos aleatórios. (A) Logo de sequência do motivo de sequência preferencial para a atividade de clivagem EiCsm6.

(B) Mapas de calor mostrando preferências de base única para Csm6, Csm6 com ativador e Csm6 com ativador e rNTPs no tempo de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem aleatória da biblioteca de motivos.

Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada base única em todos os motivos esgotados.

Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo)

estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente. (C) Mapas de calor mostrando preferências de duas bases para Csm6, Csm6 com ativador e Csm6 com ativador e rNTPs no tempo de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem aleatória da biblioteca de motivos.

Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada duas bases em todos os motivos esgotados.

Os motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo)

estiver acima de 0,5. No valor - log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino, respectivamente. (D) Mapa de calor dos motivos preferenciais de 3 bases para a atividade de clivagem EiCsm6. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada base 3 em todos os motivos esgotados.

Os motivos são considerados esgotados se o valor

- log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 0,5. No valor - log2

(alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de destino e sem destino,

respectivamente. (E) Atividade de clivagem do EiCsm6 nas sequências repórteres superiores derivadas da tela da biblioteca de motivos aleatórios. (F) Ativação de LsCsm6 por clivagem de LwaCasl3a de ativadores de adenina-uridina com diferentes extensões de extensão de adenina. O LwaCasl3a está alvejando ssRNA sintético de DENV.

[0091] Figura 33 - Análise por espectrometria de massa de extremidades de clivagem de LwaCasl3a. (A) Esquema da digestão com LwaCasl3a e análise espectrométrica de massa para verificar produtos de clivagem. (B) Análise por espectrometria de massa de produtos de digestão a partir da clivagem colateral de LwaCasl3a (esquerda) ou ativador de fosfato cíclico 2,3 sozinho (direita). Os picos dominantes são rotulados com massa e estrutura correspondente. (C) Traços cromatográficos mostrando perfis de eluição para o ativador digerido com LwaCasl3a (em cima) ou ativador de fosfato 2,3 cíclico (fundo). (D) Tabela de abundâncias para diferentes compostos detectados por espectrometria de massa em amostras de ativador digerido com LwaCasl3a (esquerda) ou ativador de fosfato 2,3 cíclico (direita).

[0092] Figura 34 - Efeito das otimizações de repórter e ativador no aprimoramento por Csm6 da atividade do LwaCasl3a. (A) Esquema de diferentes projetos de ativadores para o aprimoramento por Csm6 da atividade de Casl3a. (B) Desempenho de aprimoramento de EiCsm6 de detecção de LwaCasl3a para diferentes modelos de ativadores.

[0093] Figura 35 - Efeito das concentrações de repórter e ativador no aprimoramento por Csm6 da atividade de LwaCasl3a. (A) Aprimoramento de EiCsm6 de detecção de LwaCasl3a em várias proporções de um poli e repórteres U poli. (B) Aprimoramento de EiCsm6 de detecção de LwaCasl3a a várias concentrações de (A)6-(L)5 ativador.

[0094] Figura 36 - Efeito dos componentes de transcrição in vitro na atividade Csm6. (A) Atividade de EiCsm6 na presença de componentes de IVT, com e sem ativador de fosfato cíclico 2,3. Os componentes incluem MgC12 adicional de 3 mM, mistura de rNTP ImM, polimerase de 30U T7. (B) EiCsm6 atividade e LwaCasl3a com (A)6-(L)5 ativador e repórter poli-A na presença de várias concentrações de ribonucleidos. (C) Atividade combinada de EiCsm6 e LwaCasl3a com a combinação de ativador (A6-(U)5 e repórter poli-A/RNaseAlert na presença de várias concentrações de ribonucleotídeos. (D) Atividade combinada de EiCsm6 e LwaCasl3a com a combinação de ativador (A6-(U)5 e repórter poli-A/5x RNaseAlert na presença de várias concentrações de ribonucleotídeos. (E) Atividade combinada de EiCsm6 e LwaCasl3a com combinação de ativador 5x (A6- (U)5 e repórter poli-A/RNaseAlert na presença de várias concentrações de ribonucleotídeos. (F) Atividade combinada de EiCsm6 e LwaCasl3a com combinação de ativador de fosfato cíclico e repórter poli-A/RNaseAlert na presença de várias concentrações de ribonucleotídeos.

[0095] Figura 37 - SHERLOCK aprimorada por fluxo lateral Csm6 com diferentes combinações de repórteres. (A) Detecção de fluxo lateral de SHERLOCK aprimorada com Csm6 com vários projetos de repórter. sA: sensor poli-A curto; 1A: sensor longo poli A; sC: sensor poli C curto; 1C: sensor longo poli C; sA/C: sensor poli-A/C curto; 1A/C: sensor longo de poli-A/C; M: sensor misto de alerta RNase.

(B) Quantificação da intensidade da banda a partir da detecção em (A). (C) Esquema da leitura do fluxo lateral da detecção SHERLOCK de LwaCasl3a aprimorada por EiCsm6 do ssDNA da aciltransferase com etapas RPA e IVT separadas.

(D) SHERLOCK de fluxo lateral aprimorada por EiCsm6 do gene de aciltransferase de P. aeruoginosa em combinação com LwaCasl3a. A quantificação da intensidade da banda é mostrada à direita.

[0096] Figura 38 - Tabela de ativadores Csm6 usados no estudo. Mostradas são SEQ ID NO: 140 (sondas Csm6 poliA poliU para cortadores U 5 As), SEQ ID NO: 141 (sondas Csm6 poliA poliU para cortadores U 6 As), SEQ ID NO: 142 (sondas Csm6 poliA poliU para cortadores U 7 As), SEQ ID NO: 143 (sonda 5’ poli U/poliA 6A fosfato cíclico 2,3) e SEQ ID NO: 144 (sonda 5’ poli A/poli U/poliA 6A 2,3 fosfato cíclico).

As sequências restantes nesta tabela são menores que 10 nucleotídeos e não foram designados identificadores de sequência.

[0097] Figura 39 - Tabela de proteínas Cast 3 e Csm6 purificadas no estudo.

[0098] Figura 40 - Tabela de crRNAs usados no estudo. São mostradas a SEQ ID NO: 145-519, com a SEQ ID NO: 145-147 representando a sequência completa de crRNA, espaçador e repetição direta, respectivamente, para ssRNA/ssDNA 1 crRNA2. Os demais identificadores de sequência seguem o mesmo padrão.

[0099] Figura 41 - Tabela de alvos de RNA e DNA usados no estudo. São mostradas a SEQ ID NO: 520-533.

[0100] Figura 42 - Tabela de primers RPA usados no estudo. São mostradas a SEQ ID NO: 534- 563, com a SEQ ID NO: 534-536 representando a sequência iniciadora direta, a sequência iniciadora direta (com o promotor T7 RNAP) e a sequência iniciadora reversa, respectivamente, para DENV ssRNA. Os demais identificadores de sequência seguem o mesmo padrão.

[0101] Figura 43 - Tabela de repórteres de clivagem usados no estudo. São mostradas a SEQ ID NO: 564 (repórter de fluxo lateral com FAM/Biotina), SEQ ID NO: 565 (biblioteca de motivos de RNA para rastreamento de preferências de base), SEQ ID NO: 566 (ligante de nanopartículas de ouro), SEQ ID NO: 567 (magnético oligo conjugado de esferas), SEQ ID NO: 568 (poli A longo para fluxo lateral), SEQ ID NO: 569 (poli C longo para fluxo lateral) e SEQ ID NO: 570 (poli A/C longo para fluxo lateral). As demais sequências listadas nesta tabela são menores que 10 nucleotídeos e não foram designados identificadores de sequência.

Descrição detalhada das modalidades exemplificadoras Definições gerais

[0102] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que geralmente é entendido por um versado na técnica a qual esta revelação se refere. As definições dos termos e técnicas em biologia molecular podem ser encontradas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edição (1989) (Sambrook, Fritsch, e Maniatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4 a edição (2012) (Green e Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology (1987) (FM Ausubel et al. Eds.); a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995) (MJ MacPherson, BD Hames e GR Taylor eds.): Antibodies, A Laboratory Manual (1988) (Harlow e Lane, eds): Antibodies A Laboratory manual, 2a edição 2013 (EA Greenfield ed);. Animal Cell Culture (1987) (RI Freshney, ed.); Benjamin Lewin, Genes IX, publicado por Jones e

Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2ª ed., J. Wiley & Sons (Nova York, NY 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4a ed., John Wiley & Sons (Nova York, NY 1992); e Marten H. Hofker e Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2ª edição (2011).

[0103] Como usadas no presente documento, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referentes singulares e plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[0104] O termo “opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento, circunstância ou substituinte subsequente descrito pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui instâncias em que o evento ou circunstância ocorre e instâncias em que não ocorre.

[0105] A recitação de intervalos numéricos por pontos finais inclui todos os números e frações incluídos nos respectivos intervalos, bem como os pontos finais recitados.

[0106] Os termos “cerca de” ou “aproximadamente”, usado no presente documentos, quando se referem a um valor mensurável, como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e similares, destinam-se a abranger variações de e a partir do valor especificado, como variações de +/- 10% ou menos, +/- 5% ou menos, +/- 1% ou menos e +/- 0,1% ou menos de e do valor especificado, na medida em que tais variações sejam apropriadas para desempenho em a invenção revelada. Deve ser entendido que o valor ao qual o modificador “cerca de” ou “aproximadamente” se refere também é específico e preferencialmente revelado.

[0107] A referência ao longo deste relatório descritivo a “uma (1) modalidade”, “uma modalidade”, “uma modalidade exemplificadora” significa que um recurso, estrutura ou característica específica descritos em conexão com a modalidade estão incluídos em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, as aparências das frases “em uma (1) modalidade”, “em uma modalidade” ou “uma modalidade exemplificadora” em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não são necessariamente todas referentes à mesma modalidade, mas podem. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada, como seria aparente para um versado na técnica a partir desta revelação, em uma ou mais modalidades. Além disso, enquanto algumas modalidades descritas no presente documento incluem algumas, mas não outras, características incluídas em outras modalidades, combinações de características de diferentes modalidades devem estar dentro do escopo da invenção. Por exemplo, nas reivindicações anexas, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.

[0108] Todas as publicações, documentos de patentes publicados e pedidos de patentes aqui mencionados são incorporados a título de referência na mesma medida em que cada publicação individual, documento de patente publicado ou pedido de patente foi indicado específica e individualmente como sendo incorporado a título de referência.

Visão geral

[0109] As modalidades reveladas fornecem composições, sistemas e métodos de detecção de ácido nucleico. Em certas modalidades, uma composição de detecção de ácido nucleico compreende pelo menos duas proteínas CRISPR. Em certas modalidades exemplificadoras, as composições e sistemas compreendem uma ou mais proteínas de detecção e mais uma proteína de amplificação de sinal. A proteína de detecção é ativada por ligação, com uma sequência guia correspondente, a uma sequência alvo, a dita ativação resultando finalmente na geração de um sinal detectável. A proteína de amplificação de sinal é ativada através da atividade da proteína de detecção e amplifica ainda mais o sinal detectável. Em certas modalidades exemplificadoras, a composição de detecção de ácido nucleico compreende pelo menos uma.

[0110] Em um aspecto, as modalidades reveladas no presente documento são direcionadas a uma composição de detecção de ácido nucleico. A composição compreende pelo menos uma proteína efetora de detecção de CRISPR e pelo menos uma proteína efetora de amplificação de sinal de CRISPR. Em uma modalidade exemplificadora, a proteína efetora de detecção de CRISPR é uma proteína efetora de CRISPR do Tipo VI. Em um exemplo de modalidade, a proteína efetora CRISPR do Tipo VI é uma proteína efetora Casl3a. Em outro exemplo de modalidade, a proteína efetora CRISPR do Tipo VI é uma proteína efetora Casl3b. Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína de amplificação de sinal CRISPR é uma proteína CRISPR do Tipo III. Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína CRISPR do Tipo III é uma proteína Csm6. Em certas modalidades exemplificadoras, as composições compreendem adicionalmente uma ou mais sequências guia para a proteína efetora de detecção CRISPR, em que a sequência guia é projetada para se ligar a uma ou mais sequências alvo. Em certas modalidades exemplificadoras, a composição pode compreender adicionalmente uma sequência de ativação que ativa a proteína CRISPR de amplificação de sinal. A sequência de ativação é distinta da sequência guia e da sequência alvo.

Em certas modalidades exemplificadoras, a sequência de ativação é uma sequência de nucleotídeos poli-A. A sequência nucleotídica poli-A pode ter comprimentos variáveis, dependendo do tipo de proteína efetora de amplificação de sinal CRISPR usada. Em certas modalidades exemplificadoras, a sequência de ativação poli-A pode ser 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades exemplificadoras, a composição compreende uma sequência guia e uma sequência de ativação. Em certas modalidades exemplificadoras, a composição pode compreender adicionalmente um construto repórter como descrito em mais detalhes abaixo.

[0111] Em certos outros aspectos, as modalidades reveladas no presente documento são direcionadas a sistemas que compreendem pelo menos uma proteína efetora de detecção de CRISPR e pelo menos uma proteína de detecção de CRISPR de amplificação de sinal, uma ou mais sequências guia, uma ou mais sequências guia de ativação e um ou mais construtos repórter. Cada um dos elementos acima é descrito em mais detalhes abaixo.

[0112] Em certos outros aspectos, as composições e sistemas descrito no presente documentos podem ser dispositivos incorporados. Plataformas de dispositivos adequadas são descritas em mais detalhes abaixo.

[0113] Em certos outros aspectos, as modalidades reveladas no presente documento são direcionadas a métodos para detectar sequências de ácidos nucleicos alvo e/ou proteínas em certas modalidades exemplificadoras, com o uso das composições, sistemas e dispositivos revelados no presente documento.

[0114] Para facilitar a referência, as modalidades reveladas no presente documento também podem ser ditas como SHERLOCK (Destravamento de Repórter Enzimático de Alta Sensibilidade Específico).

Proteínas efetoras de detecção Crispr

[0115] Em geral, um sistema CRISPR-Cas ou CRISPR como usado no presente documento e em documentos, como o documento WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667), se refere coletivamente a transcritos e outros elementos envolvidos na expressão ou na direção da atividade de genes associados ao CRISPR (“Cas”), incluindo sequências que codificam um gene Cas, uma sequência tracr (CRISPR de ativação trans) (por exemplo, tracrRNA ou um tracrRNA parcial ativo), uma sequência tracr-mate (que inclui uma “repetição direta 23” e uma repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema CRISPR endógeno), uma sequência guia (também chamada de “espaçador” no contexto de um sistema CRISPR endógeno) ou “RNA(s)”, como esse termo é usado no presente documento (por exemplo, RNA(s) para guiar Cas, como Cas9, por exemplo, RNA CRISPR e RNA transativador (tracr) ou um único RNA guia (sgRNA) (RNA quimérico)) ou outras sequências e transcritos de um locus CRISPR. Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR no local de uma sequência alvo (também chamado de protoespaçador no contexto de um sistema CRISPR endógeno). Quando a proteína CRISPR é uma proteína C2c2, não é necessário um tracrRNA.

C2c2 foi descrito em Abudayyeh et al. (2016) “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”; Ciência; DOI: 10.1126/science.aaf5573; e Shmakov et al. (2015) “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems”, Molecular Cell, DOI: dx.doi.Org/10.1016/j.molcel.2015.10.008; que são incorporados ao presente documento na sua totalidade a título de referência. O Cas 13b foi descrito em Smargon et al. (2017) “Cas 13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA- Guided RNases Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28”, Molecular Cell. 65, 1-13; dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023., que é incorporado ao presente documento na sua totalidade a título de referência.

[0116] Em certas modalidades, um motivo adjacente ao protoespaçador (PAM) ou motivo similar ao PAM direciona a ligação do complexo de proteínas efetoras, como aqui revelado, ao local de interesse do alvo. Em algumas modalidades, o PAM pode ser um 5’ PAM (isto é, localizado a montante da extremidade 5’ do protoespaçador). Em outras modalidades, o PAM pode ser um 3’ PAM (isto é, localizado a jusante da extremidade 5’ do protoespaçador). O termo “PAM” pode ser usado de forma intercambiável com o termo “PFS” ou “sítio de flanqueamento de protoespaçador” ou “sequência de flanqueamento de protoespaçador”.

[0117] Em uma modalidade preferencial, a proteína efetora CRISPR pode reconhecer um 3’ PAM. Em certas modalidades, a proteína efetora CRISPR pode reconhecer um 3’ PAM que é 5’H, em que H é A, C ou U. Em certas modalidades, a proteína efetora pode ser C2c2p de Leptotrichia shahii, mais preferencialmente DSM 19757 C2c2 de Leptotrichia shahii, e o 3 'PAM é um 5’ H.

[0118] No contexto da formação de um complexo CRISPR, “sequência alvo” se refere a uma sequência na qual uma sequência guia é projetada para ter complementaridade, em que a hibridização entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR.

Uma sequência alvo pode compreender polinucleotídeos de RNA. O termo “RNA alvo” se refere a um polinucleotídeo de RNA que é ou compreende a sequência alvo. Por outras palavras, o RNA alvo pode ser um polinucleotídeo de RNA ou uma parte de um polinucleotídeo de RNA ao qual uma parte do gRNA, isto é, a sequência guia, é projetada para ter complementaridade e à qual a função efetiva mediada pelo complexo que compreende proteína efetora CRISPR e um gRNA deve ser direcionado. Em algumas modalidades, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula.

[0119] A molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína efetora CRISPR, em particular C2c2, é vantajosamente uma proteína efetora CRISPR otimizada para códons. Um exemplo de uma sequência otimizada de códon é, neste caso, uma sequência otimizada para expressão em eucariotos, por exemplo, seres humanos (isto é, sendo otimizados para expressão em seres humanos) ou para outro eucariota, animal ou mamífero, como aqui discutido; consulte, por exemplo, sequência otimizada de códon humano SaCas9 em WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667). Embora isso seja preferencial, será apreciado que outros exemplos são possíveis e é conhecida a otimização de códons para uma espécie hospedeira que não seja humana, ou para a otimização de códons para órgãos específicos. Em algumas modalidades, uma sequência de codificação enzimática que codifica uma proteína efetora CRISPR é um códon otimizado para expressão em células específicas, como células eucarióticas.

As células eucarióticas podem ser aquelas de ou derivadas de um organismo específico, como uma planta ou um mamífero, incluindo, sem limitação, eucariotas ou animais ou mamíferos humanos ou não humanos, como aqui discutido, por exemplo, camundongo, rato, coelho, cão, gado ou mamífero ou primata não humano.

Em algumas modalidades,

processos para modificar a identidade genética da linha germinativa de seres humanos e/ou processos para modificar a identidade genética de animais que provavelmente os causarão sofrimento sem qualquer benefício médico substancial para o homem ou animal, e também animais resultantes de tais processos, podem ser excluídos.

Em geral, a otimização de códons se refere a um processo de modificação de uma sequência de ácidos nucleicos para expressão melhorada nas células hospedeiras de interesse,

substituindo pelo menos um códon (por exemplo,

aproximadamente ou mais que 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25,

50 ou mais códons) da sequência nativa com códons que são usados com mais ou mais frequência nos genes dessa célula hospedeira enquanto mantém a sequência de aminoácidos nativa.

Várias espécies exibem viés particular para certos códons de um aminoácido particular.

O viés de códon

(diferenças no uso de códons entre organismos) geralmente se correlaciona com a eficiência da tradução do RNA mensageiro (mRNA), que por sua vez se acredita depender de, entre outras coisas, as propriedades dos códons que estão sendo traduzidos e a disponibilidade de determinadas informações de moléculas de RNA de transferência (RNAt). A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados com mais frequência na síntese de peptídeos. Por conseguinte, os genes podem ser adaptados para a expressão ótima de genes em um determinado organismo com base na otimização de códons. As tabelas de uso do códon estão prontamente disponíveis, por exemplo, no “Banco de Dados de Uso de Códon” disponível em kazusa.orjp/codon/e essas tabelas podem ser adaptadas de várias maneiras. Veja Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28: 292 (2000).

Também estão disponíveis algoritmos de computador para o códon que otimiza uma sequência específica para expressão em uma célula hospedeira específica, como Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA). Em algumas modalidades, um ou mais códons (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 ou mais, ou todos os códons) em uma sequência que codifica um Cas corresponde ao códon mais frequentemente usado para um aminoácido específico. A invenção é ainda descrita nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

[0120] Em um exemplo de modalidade, a proteína efetora de detecção compreende um ou mais domínios HEPN que compreende uma sequência de motivos RxxxxH. A sequência do motivo RxxxxH pode ser, sem limitação, de um domínio HEPN descrito no presente documento ou um domínio HEPN conhecido na técnica. As sequências de motivos RxxxxH incluem ainda sequências de motivos criadas pela combinação de partes de dois ou mais domínios HEPN. Conforme observado, as sequências de consenso podem ser derivadas das sequências dos ortólogos reveladas no Pedido de Patente Provisória n o US 62/432,240, intitulado “Novel CRISPR Enzymes and Systems,”, Pedido de Patente Provisória no US 62/471,710, intitulado “Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems”, depositado em 15 de março de 2017 e o Pedido Provisório de Patente no US intitulado “Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems”, rotulado como número do dossiê do advogado 47627-05-2133 e depositado em 12 de abril de 2017.

[0121] Em uma modalidade da invenção, um domínio HEPN compreende pelo menos um motivo RxxxxH que compreende a sequência de R{N/H/K}X1X2X3H (SEQ ID NO: 571). Em uma modalidade da invenção, um domínio HEPN compreende um motivo RxxxxH que compreende a sequência de R {N/H} X1X2X3H (SEQ ID NO: 572). Em uma modalidade da invenção, um domínio

HEPN compreende a sequência de R{N/K}X1X2X3H (SEQ ID NO: 573). Em certas modalidades, X1 é R, S, D, E, Q, N, G, Y, ou H. Em certas modalidades, X2 é I, S, T, V, ou L. Em certas modalidades, X 3 é L, F, N, Y, V, I, S, D, E ou A.

[0122] Efetores adicionais para uso de acordo com a invenção podem ser identificados por sua proximidade com os genes casl, por exemplo, sem limitação, dentro da região 20 kb desde o início do gene casl e 20 kb a partir do final do gene casl. Em certas modalidades, a proteína efetora compreende pelo menos um domínio HEPN e pelo menos 500 aminoácidos, e em que a proteína efetora C2c2 está naturalmente presente em um genoma procariótico dentro de 20 kb a montante ou a jusante de um gene Cas ou de uma matriz CRISPR. Exemplos não limitativos de proteínas Cas incluem Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csnl e Csxl2), Cas 10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx 10, Cx Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos das mesmas ou versões modificadas das mesmas. Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora C2c2 está naturalmente presente em um genoma procariótico dentro de 20kb a montante ou a jusante de um gene Cas1. Os termos “ortólogo” (também aqui referido como “ortólogo”) e “homólogo” (também aqui referido como

“homólogo”) são bem conhecidos na técnica. Por meio de orientações adicionais, um “homólogo” de uma proteína como usado no presente documento é uma proteína da mesma espécie que desempenha a mesma função ou uma função similar à da proteína de que é um homólogo. As proteínas homólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.

Um “ortólogo” de uma proteína como usado no presente documento é uma proteína de uma espécie diferente que desempenha a mesma função ou uma função similar à da qual é um ortólogo. As proteínas ortólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.

[0123] Em modalidades particulares, a proteína efetora de detecção de CRISPR é uma enzima Cas direcionada a RNA do Tipo VI. Em certas modalidades exemplificadoras, a enzima Cas direcionada a RNA do Tipo VI é Cas 13a, também aqui dita como C2c2. Em outras modalidades exemplificadoras, a enzima Cas direcionada a RNA do Tipo VI é Cas 13b. Em modalidades particulares, o homólogo ou ortólogo de uma proteína do Tipo VI, como C2c2, tem uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60% ou pelo menos pelo menos 70% ou pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com uma proteína do tipo VI como C2c2 (por exemplo, com base no tipo selvagem sequência de qualquer uma das bactérias C2c2 de Leptotrichia shahii, C2c2 de

Lachnospiraceae bacterium MA2020, C2c2 de Lachnospiraceae bacterium NK4A179, C2c2 de Clostridium aminophilum (DSM

10710), C2c2 de Carnobacterium gallinarum (DSM 4847), C2c2 de Listeriaceae bacterium (FSL M6-0635), C2c2 de Listeria newyorkensis (FSL M6-0635), C2c2 de Leptotrichia wadei

(F0279), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (SB 1003), C2c2 de

Rhodobacter capsulatus (R121), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (R121), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (R121),

C2c2 de Leptotrichia wadei (Lw2) ou C2c2 de Listeria seeligeri). Em outras modalidades, o homólogo ou ortólogo de uma proteína do Tipo VI, como C2c2, conforme referido no presente documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60% ou pelo menos pelo menos 70% ou pelo menos 80%,

mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com o tipo selvagem C2c2 (por exemplo, com base na sequência do tipo selvagem de qualquer de C2c2 de

Leptotrichia shahii, C2c2 de Lachnospiraceae bacterium

MA2020, C2c2 de Lachnospiraceae bacterium NK4A179 C2c2,

C2c2 de Clostridium aminophilum (DSM 10710), C2c2 de

Carnobacterium gallinarum (DSM 4847), C2c2 de Paludibacter propionicigenes (WB4), C2c2 de Listeria weihenstephanensis (FSL R9-0317), C2c2 de Listeriaceae bacterium (FSL M6- 0635), C2c2 de Listeria newyorkensis (FSL M6-0635), C2c2 de Leptotrichia wadei (F0279), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (SB 1003), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (R121), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (DE442), C2c2 de Leptotrichia wadei (Lw2) ou C2c2 de Listeria seeligeri).

[0124] Em certas outras modalidades exemplificadoras, a proteína efetora CRISPR é uma nuclease C2c2. A atividade de C2c2 pode depender da presença de dois domínios HEPN. Demonstrou-se que são domínios RNase, isto é, RNA cortante de nuclease (em particular uma endonuclease). O C2c2 HEPN também pode ter como alvo DNA ou potencialmente DNA e/ou RNA. Com base no fato de que os domínios HEPN de C2c2 têm pelo menos a capacidade de se ligar e, na sua forma selvagem, cortar RNA, é preferencial que a proteína efetora de C2c2 tenha a função RNase. Em relação aos sistemas C2c2 CRISPR, é feita referência ao documento Provisório no US 62/351,662, depositado em 17 de junho de 2016 e Provisório no US 62/376,377, depositado em 17 de agosto de 2016. Também é feita referência ao documento Provisório no US 62/351,803, depositado em 17 de junho de 2016. Também é feita referência ao documento Provisório no US, intitulado “Novel Crispr Enzymes and

Systems”, depositado em 8 de dezembro de 2016, com o Broad Institute no 10035.PA4 e a procuração n o 47627.03.2133.

Também é feita referência a East-Seletsky et al. “Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection” Nature doi: 10/1038/nature 19802 e Abudayyeh et al. “C2c2 is a singlecomponent programmable RNA-guided RNA targeting CRISPR effector” bioRxiv doi: 10.1101/054742.

[0125] A função RNase em sistemas CRISPR é conhecida, por exemplo, o direcionamento de mRNA foi relatado para certos sistemas CRISPR-Cas do tipo III (Hale et al., 2014, Genes Dev, vol. 28, 2432-2443; Halec/a/., 2009, Cell, vol. 139, 945 a 956; Peng et al., 2015, Nucleic acid research, vol. 43, 406 a 417) e fornece vantagens significativas. No sistema Staphylococcus epidermis tipo III-A, a transcrição entre os alvos resulta na clivagem do DNA alvo e de seus transcritos, mediados por locais ativos independentes dentro do complexo de proteínas efetoras de ribonucleoproteínas Cas 10- Csm (consulte Samai et al., 2015, Cell 151, 1.164 a 1.174). É assim fornecido um sistema CRISPR-Cas, composição ou método visando o RNA através das presentes proteínas efetoras.

[0126] Em uma modalidade, a proteína Cas pode ser um ortólogo C2c2 de um organismo de um gênero que inclui, sem limitação, Leptotriquia, Listeria, Corynebacter,

Sutterella, Legionella, Treponema, Filifator, Eubacterium, Streptococcus, Lactob acillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Micoplasma e Campylobacter.

As espécies de organismos desse gênero podem ser discutidas no presente documento.

[0127] Alguns métodos para identificar ortólogos das enzimas do sistema CRISPR-Cas podem envolver a identificação de sequências tracr em genomas de interesse.

A identificação de sequências tracr pode estar relacionada às seguintes etapas: pesqusiar as repetições diretas ou sequências tracr mate em um banco de dados para identificar uma região CRISPR que compreende uma enzima CRISPR.

Procurar sequências homólogas na região CRISPR que flanqueiam a enzima CRISPR nas direções senso e antissentido. Procurar terminadores de transcrição e estruturas secundárias. Identificar qualquer sequência que não seja uma sequência de repetição direta ou tracr mate, mas que tenha mais de 50% de identidade com a sequência de repetição direta ou tracr mate como uma sequência potencial de tracr. Pegar a sequência tracr potencial e analisar as sequências terminadoras da transcrição associadas à mesma.

[0128] Será apreciado que qualquer uma das funcionalidades aqui descritas pode ser manipulada em enzimas CRISPR de outros ortólogos, incluindo enzimas quiméricas que compreende fragmentos de múltiplos ortólogos. Exemplos de tais ortólogos são descritos em outras partes deste documento. Assim, as enzimas quiméricas podem compreender fragmentos de ortólogos da enzima CRISPR de um organismo que inclui, mas não se limitam a, Leptotriquia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifator, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flobi, Flavi Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Micoplasma e Campylobacter. Uma enzima quimérica pode compreender um primeiro fragmento e um segundo fragmento, e os fragmentos podem ser de ortólogos da enzima CRISPR de organismos de gêneros aqui mencionados ou de espécies aqui mencionadas; vantajosamente os fragmentos são de ortólogos da enzima CRISPR de diferentes espécies.

[0129] Em modalidades, a proteína C2c2 como aqui dita também abrange uma variante funcional de C2c2 ou um homólogo ou um ortólogo da mesma. Uma “variante funcional” de uma proteína como aqui usada se refere a uma variante dessa proteína que retém pelo menos parcialmente a atividade dessa proteína. As variantes funcionais podem incluir mutantes (que podem ser de inserção, exclusão ou mutantes de substituição), incluindo polimorfos, etc.

Também estão incluídas nas variantes funcionais produtos de fusão dessa proteína com outro ácido nucleico, proteína, polipeptídeo ou peptídeo, geralmente não relacionado. As variantes funcionais podem ocorrer naturalmente ou podem ser provocadas pelo homem. Modalidades vantajosas podem envolver proteínas efetoras direcionadas a RNA do Tipo VI de ocorrência não natural ou manipulado.

[0130] Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico que codificam C2c2 ou um ortólogo ou homólogo da mesma, podem ser otimizadas por códon para expressão em uma célula eucariótica. Um eucariota pode ser como aqui discutido. As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas ou não naturais.

[0131] Em uma modalidade, C2c2 ou um ortólogo ou homólogo da mesma podem compreender uma ou mais mutações (e, portanto, as moléculas de ácido nucleico que codificam para o mesmo podem ter mutação (ou mutações). As mutações podem ser mutações introduzidas artificialmente e podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em um domínio catalítico. Exemplos de domínios catalíticos com referência a uma enzima Cas9 podem incluir, sem limitação, domínios RuvC I, RuvC II, RuvC III e HNH.

[0132] Em uma modalidade, C2c2 ou um ortólogo ou homólogo da mesma podem compreender uma ou mais mutações.

As mutações podem ser mutações introduzidas artificialmente e podem incluir, sem limitação, uma ou mais mutações em um domínio catalítico. Exemplos de domínios catalíticos com referência a uma enzima Cas podem incluir, sem limitação, domínios HEPN.

[0133] Em uma modalidade, C2c2 ou um ortólogo ou homólogo da mesma podem ser usados como uma proteína genérica de ligação de ácido nucleico com fusão a ou estando operacionalmente ligada a um domínio funcional. Os domínios funcionais exemplificativos podem incluir, sem limitação, primer de tradução, ativador de tradução, repressor de tradução, nucleases, em particular ribonucleases, um spliceossoma, pérolas, um domínio leve induzível/controlável ou um domínio quimicamente induzível/controlável.

[0134] Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora C2c2 pode ser de um organismo selecionado do grupo que consiste em: Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma e Campylobacter.

[0135] Em certas modalidades, a proteína efetora pode ser uma C2c2p de Listeria sp., preferencialmente C2c2p de Listeria seeligeria, mais preferencialmente C2c2p de cepa l/2b SLCC3954 de Listeria seeligeria serovar e a sequência de crRNA podem ter 44 a 47 nucleotídeos de comprimento, com uma repetição direta 5’ 29-nt (DR) e um espaçador de 15 a 18 nt.

[0136] Em certas modalidades, a proteína efetora pode ser uma C2c2p de Leptotrichia sp., preferencialmente C2c2p de Leptotrichia shahii, mais preferencialmente DSM 19757 C2c2p de Leptotrichia shahii e a sequência de crRNA podem ter 42 a 58 nucleotídeos de comprimento, com uma repetição direta de 5’ de pelo menos 24 nt, como uma repetição direta de 5’ 24-28-nt (DR) e um espaçador de pelo menos 14 nt, como um espaçador de 14 a 28 nt, ou um espaçador de pelo menos 18 nt, como 19, 20, 21, 22 ou mais nt, como 18-28, 19-28, 20-28, 21-28 ou 22-28 nt.

[0137] Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora pode ser uma Leptotrichia sp., F0279 de Leptotrichia wadei ou uma Listeria sp., de preferência FSL M6-0635 de Listeria newyorkensis.

[0138] Em certas modalidades exemplificadoras, as proteínas efetoras C2c2 da invenção incluem, sem limitação, as seguintes 21 espécies de ortólogos (incluindo vários locais CRISPR: Leptotrichia shahii; Leptotrichia wadei (Lw2); Listeria seeligeri; MA2020 de Lachnospiraceae bacterium; NK4A179 de Lachnospiraceae bacterium; DSM 10710 de [Clostridium] aminophilum; DSM 4847 de Carnobacterium gallinarum; DSM 4847 de Carnobacterium gallinarum (segundos loci de CRISPR); WB4 de Paludibacter propionicigenes; FSL RO-OSH de Listeria weihenstephanensis; FSL RO- OSH de Listeriaceae; FSL M6-0635 de Listeriaceae bacterium; R121 de Rhodobacter capsulatus; DE442 de Rhodobacter capsulatus; C-1013-b de Leptotrichia buccalis; Herbinix hemicellulosilytica; [Eubacterium] retale; CHKCI004 de Eubacteriaceae bacterium; Blautia sp. Marselha-P2398; e Leptotrichia sp., Táxon oral 1279). Outros exemplos não limitativos são: NK4A144 de Lachnospiraceae bacterium; Chloroflexus aggregans; Demequina aurantiaca; TSL5-1 de Thalassospira sp.; OR37 de Pseudobutyrivibrio sp.; YAB3001 de Butyrivibrio sp.; Blautia sp. Marselha- P2398; Leptotrichia sp. Marselha-P3007; Bacteroides ihuae; KH3CP3RA de Porphyromonadaceae bacterium; Listeria riparia; e Insolitispirillum peregrinum.

[0139] Em certas modalidades, a proteína C2c2 de acordo com a invenção é ou é derivada de um dos ortólogos, conforme descrito na tabela abaixo, ou é uma proteína quimérica de dois ou mais dos ortólogos, como descrito na tabela abaixo, ou é um mutante ou variante de um dos ortólogos, conforme descrito na tabela abaixo (ou um mutante ou variante quimérica), incluindo C2c2 morta, C2c2 dividida, C2c2 desestabilizada, etc., conforme definido aqui em outro lugar, com ou sem fusão com um heterólogo/domínio funcional.

[0140] Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora C2c2 é selecionada na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 Ortólogo C2c2 Código Múltiplas Letras Leptotrichia shahii C2-2 Lsh L. wadei F0279 (Lw2) C2-3 Lw2 Listeria seeligeri C2-4 Lse Lachnospiraceae C2-5 LbM bacterium MA2020 Lachnospiraceae C2-6 LbNK179 bacterium NK4A179 Clostridium aminophilum C2-7 Ca DSM 10710 Carnobacterium C2-8 CG gallinarum DSM 4847 Carnobacterium C2-9 Cg2 gallinarum DSM 4847 Paludibacter C2-10 Pp propionicigenes WB4 Listeria C2-11 Lwei weihenstephanensis FSL R9-0317 Listeriaceae bacterium C2-12 LbFSL FSL M6-0635 Leptotrichia wadei F0279 C2-13 Lw Rhodobacter capsulatus C2-14 Rc SB 1003 Rhodobacter capsulatus C2-15 Rc R121 Rhodobacter capsulatus C2-16 Rc DE442 Leptotrichia buccalis C- C2-17 LbuC2c2 1013-b

Ortólogo C2c2 Código Múltiplas Letras Herbinix C2-18 HheC2c2 hemicellulosilytics Eubacterium rectale C2-19 EreC2c2 Eubacteriaceae bacterium C2-20 EbaC2c2 CHKC1004 Blautia sp. Marselha- C2-21 BsmC2c2 P2398 Leptotrichia sp. táxon C2-22 LspC2c2 oral 879 cepa F0557 Lachnospiraceae bacterium NK4al44 Agregadores de cloroflexo Demequina aurantiaca Thalassospira sp. TSL5-1 Pseudobutyrivibrio sp. OR37 Butyrivibrio sp. YAB3001 Blautia sp. Marselha- P2398 Leptotrichia sp. Marselha-P300 Bacteroides ihuae Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA Listeria riparia Insoliti spirillum peregrinum Tabela 2

[0141] As sequências de proteínas do tipo selvagem das espécies acima estão listadas na Tabela 2 abaixo. Em certas modalidades, é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína C2c2.

L. shahii (Lsh) (SEQ ID NO: C2c2-2 1) c2c2-3 L. wadei (Lw2) (SEQ ID NO: 2) Listeria seeligeri (SEQ ID c2c2-4 NO: 3) MA2020 de Lachnospiraceae c2c2-5 1 bacterium (SEQ.

ID No. 4) NK4A179 de Lachnospiraceae c2c2-6 2 bacterium (SEQ ID NO: 5) DSM 10710 de Clostridium c2c2-7 3 aminophilum (SEQ ID NO: 6) DSM 4847 de Carnobacterium c2c2-8 5 gallinarum (SEQ ID NO: 7) DSM 4847 de Carnobacterium c2c2-9 6 gallinarum (SEQ ID NO: 8) WB4 de Paludibacter c2c2-10 7 propionicigenes (SEQ ID NO: 9) FSL R9-0317 de Listeria c2c2-ll 9 weihenstephanensis (SEQ ID NO: 10) c2c2-12 10 FSL M6-0635 de Listeriaceae bacterium = FSL M6-0635 de Listeria newyorkensis (SEQ ID NO: 11) F0279 de Leptotrichia wadei c2c2-13 12 (SEQ ID NO: 12) SB 1003 de Rhodobacter c2c2-14 15 capsulatus (SEQ.

ID N ° 13) R121 de Rhodobacter c2c2-15 16 capsulatus (SEQ ID NO: 14) DE442 de Rhodobacter c2c2-16 17 capsulatus (SEQ ID NO: 15) C-1013-b de Leptorichia LbuC2c2 buccalis (SEQ ID NO: 16) Herbinix hemicellulosilytica HheC2c2 (SEQ ID NO: 17) Eubacterium retale (SEQ ID EreC2c2 NO: 18) EbaC2C2 CHKCI004 de Eubacteriaceae bacterium (SEQ ID NO: 19) C2c2 NK4A144 de Lachnospiraceae NK4A144 bacterium (SEQ ID NO: 20) Proteína de ligação ao RNA SI C2c2 Chloroflexus aggregans (SEQ Chloroagg ID NO: 21) C2c2 Demequina aurantiaca (SEQ ID DemAur NO: 22) C2c2 Thalassospira sp. TSL5-1 (SEQ Thal_Sp_TSL5 ID NO: 23) C2c2 Pseudobutyrivibrio sp. OR37 Pseudosp (SEQ ID NO: 24) C2c2_Buty_sp Butyrivibrio sp. YAB3001 (SEQ ID NO: 25) Blautia sp. Marselha-P2398 C2c2_Blautia_ sp (SEQ ID NO: 26) C2c2_Lepto_s Leptotrichia sp. Marselha- p_Marseille P3007 (SEQ ID NO: 27) C2c2_Bacteroi Bacteroides ihuae (SEQ ID NO: desihuae 28) KH3CP3RA de C2c2_Porph_b Porphyromonadaceae bacterium (SEQ ID NO: 29) acterium C2c2_Listeria_ Listeria riparia (SEQ ID NO: riparia 30) C2c2_insolite Insolitispirillum peregrinum _peregrina (SEQ ID NO: 31)

[0142] Em uma modalidade da invenção, é fornecida uma proteína efetora que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de homologia com a sequência do tipo selvagem de qualquer uma dentre C2c2 de Leptotrichia shahii, C2c2 de Lachnospiraceae bacterium MA2020, C2c2 de Lachnospiraceae bacterium NK4A179, C2c2 de

Clostridium aminophilum (DSM 10710), C2c2 de Carnobacterium gallinarum (DSM 4847), C2c2 de Paludibacter propionicigenes (WB4), C2c2 de Listeria weihenstephanensis (FSL R9-0317), C2c2 de Listeriaceae bacterium (FSL M6-0635), C2c2 de Listeria newyorkensis (FSL M6-0635), C2c2 de Leptotrichia wadei (F0279), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (SB 1003), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (R121), C2c2 de Rhodobacter capsulatus (DE442), C2c2 de Leptotrichia wadei (Lw2) ou C2c2 de Listeria seeligeri.

[0143] Em uma modalidade da invenção, a proteína efetora compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia de sequência com uma sequência de consenso de proteínas efetoras do Tipo VI, incluindo, sem limitação, uma sequência de consenso aqui descrita. De acordo com a invenção, uma sequência de consenso pode ser gerada a partir de vários ortólogos C2c2, que podem auxiliar na localização de resíduos de aminoácidos conservados e motivos, incluindo, entre outros, resíduos catalíticos e motivos HEPN em ortólogos C2c2 que mediam a função C2c2. Uma dessas sequências de consenso, geradas a partir dos 33 ortólogos mencionados acima, usando o alinhamento Geneious, é a SEQ ID NO: 32.

[0144] Em outro exemplo não limitativo, uma ferramenta de alinhamento de sequência para auxiliar na geração de uma sequência de consenso e identificação de resíduos conservados é a ferramenta de alinhamento MUSCLE (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/). Por exemplo, usando MUSCLE, os seguintes locais de aminoácidos conservados entre os ortólogos C2c2 podem ser identificados em C2c2 de Leptotrichia wadei: K2; K5; V6; E301; L331; 1335; N341; G351; K352; E375; L392; L396; D403; F446; 1466; 1470; R474 (HEPN); H475; H479 (HEPN), E508; P556; L561; 1595; Y596; F600; Y669; 1673; F681; L685; Y761; L676; L779; Y782; L836; D847; Y863; L869; 1872; K879; 1933; L954; 1958; R961; Y965; E970; R971; D972; R1046 (HEPN), H1051 (HEPN), Y1075; D1076; K1078; K1080; 11083; 11090.

[0145] Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora direcionada ao RNA é uma proteína efetora do Tipo VI-B, como as proteínas Cast3b e Grupo 29 ou Grupo 30 ou 30. Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora de direcionamento de RNA compreende um ou mais domínios HEPN. Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora de direcionamento de RNA compreende um domínio HEPN C-terminal, um domínio HEPN N-terminal ou ambos. Em relação ao exemplo de proteínas efetoras do Tipo VI-B que podem ser usadas no contexto desta invenção, é feita referência ao Pedido no US 15/331,792, intitulado “Novel CRISPR Enzymes and Systems” e depositado em 21 de outubro de 2016, Pedido Internacional de Patente no PCT/US2016/058302, intitulado “Novel CRISPR Enzymes and

Systems”, depositado em 21 de outubro de 2016, e Smargon et al. “Casl3b is a Type VI-B CRISPR-associated RNA-Guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28”Molecular Cell, 65, 1-13 (2017); dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023, e pedido provisório no US a ser designado, intitulado “Novel Casl3b Orthologues CRISPR Enzymes and System” depositado em 15 de março de 2017. Em modalidades particulares, a enzima Casl3b é derivado de Bergeyella zoohelcum. Em certas outras modalidades exemplificadoras, a proteína efetora de detecção é ou compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências listadas na Tabela 3.

Tabela 3 Bergeyella zoohelcum 1 (SEQ ID NO: 33) Prevotella intermedia 2 (SEQ ID NO: 34) Prevotella buccae 3 (SEQ ID NO: 35) Porphyromonas gingivalis 4 (SEQ ID NO: 36) Bacteroides pyogenes 5 (SEQ ID NO: 37) Alistipes sp. ZOR0009 6 (SEQ ID NO: 38) Prevotella sp. MA2016 7a (SEQ ID NO: 39) Prevotella sp. MA2016 7b (SEQ ID NO: 40) Riemerella anatipestifer 8 (SEQ ID NO: 41) Prevotella aurantiaca 9 (SEQ ID NO: 42) Prevotella saccharolytica 10 (SEQ ID NO: 43) HMPREF9712 03108 [Myroides 11 (SEQ ID NO: 44) odoratimimus CCUG 10230] Prevotella intermedia 12 (SEQ ID NO: 45)

Capnocytophaga canimorsus 13 (SEQ ID NO: 46) Porphyromonas gulae 14 (SEQ ID NO: 47) Prevotella sp.

P5-125 15 (SEQ ID NO: 48) Flavobacterium branchiophilum 16 (SEQ ID NO: 49) Myroides odoratimimus 17 (SEQ ID NO: 50) Flavobacterium columnare 18 (SEQ ID NO: 51) Porphyromonas gingivalis 19 (SEQIDNO: 52) Porphyromonas sp.

COT-052 OH4946 20 (SEQ ID NO: 53) Prevotella intermedia 21 (SEQIDNO: 54) PIN17 0200 [Prevotella intermedia 17] AFJ07523 (SEQ ID NO: 55) Prevotella intermedia BAU18623 (SEQ ID NO: 56) HMPREF6485 0083 [Prevotella EFU31981 (SEQ ID NO: 57) buccae ATCC 33574] HMPREF9144 1146 [Prevotella EGQ18444 (SEQ ID NO: 58) pallens ATCC 700821] HMPREF9714 02132 [Myroides EHO08761 (SEQIDNO: 59) odoratimimus CCUG 12901] HMPREF9711 00870 [Myroides EKB06014 (SEQ ID NO: 60) odoratimimus CCUG 3837] HMPREF9699 02005 [Bergeyella EKB54193 (SEQ ID NO: 61) zoohelcum ATCC 43767] HMPREF915101387 [Prevotella EKY00089 (SEQ ID NO: 62) saccharolytica F0055] A343 1752 [Porphyromonas gingivalis JCVI SC001] EOA10535 (SEQ ID NO: 63) HMPREF1981 03090 [Bacteroides pyogenes F0041] ERI81700 (SEQ ID NO: 64) HMPREF1553 02065 [Porphyromonas ERJ65637 (SEQ ID NO: 65) gingivalis F0568] HMPREF1988 01768 [Porphyromonas ERJ81987 (SEQ ID NO: 66) gingivalis F0185] HMPREF1990 01800 [Porphyromonas ERJ87335 (SEQ ID NO: 67) gingivalis W4087] M573 117042 [Prevotella intermedia ZT] KJJ86756 (SEQ ID NO: 68) A2033_10205 [bactéria OFX18020.1 (SEQ ID NO: bacteroideta 69)

GWA2 31 9] SAMN05421542_0666 SDI27289.1 (SEQ ID NO: [Chryseobacterium jejuense] 70) SAMN05444360_l 1366 [Chryseobacterium SHM52812.1 (SEQ ID NO: carnipullorum] 71) S AMN05421786 1011119 SIS70481.1 (SEQ ID NO: [Chryseobacterium 72) ureilyticum] Prevotella buccae WP_004343581 (SEQ ID NO: 73) Porphyromonas gingivalis WP_005873511 (SEQ ID NO: 74) Porphyromonas gingivalis WP_005874195 (SEQ ID NO: 75) Prevotella pallens WP_006044833 (SEQ ID NO: 76) Myroides odoratimimus WP_006261414 (SEQ ID NO: 77) Myroides odoratimimus WP_006265509 (SEQ ID NO: 78) Prevotella sp.

MSX73 WP_007412163 (SEQ ID NO: 79) Porphyromonas gingivalis WP 012458414 (SEQ ID NO: 80) Paludibacter propionicigenes WP_013446107 (SEQ ID NO: 81) Porphyromonas gingivalis WP_013816155 (SEQ ID NO: 82) Flavobacterium columnare WP_014165541 (SEQ ID NO: 83) Psychroflexus torquis WP_015024765 (SEQ ID NO: 84) Riemerella anatipestifer WP_015345620 (SEQ ID NO: 85) Prevotella pleuritidis WP_021584635 (SEQ ID NO: 86) Porphyromonas gingivalis WP 021663197 (SEQ ID NO: 87)

Porphyromonas gingivalis WP 021665475 (SEQ ID NO: 88) Porphyromonas gingivalis WP 021677657 (SEQ ID NO: 89) Porphyromonas gingivalis WP 021680012 (SEQ ID NO: 90) Porphyromonas gingivalis WP_023 846767 (SEQ ID NO: 91) Prevotella falsenii WP_036884929 (SEQ ID NO: 92) Prevotella pleuritidis WP_036931485 (SEQ ID NO: 93) [Porphyromonas gingivalis WP_039417390 (SEQ ID NO: 94) Porphyromonas gulae WP_039418912 (SEQ ID NO: 95) Porphyromonas gulae WP 03 9419792 (SEQ ID NO: 96) Porphyromonas gulae WP 03 9426176 (SEQ ID NO: 97) Porphyromonas gulae WP 03 9431778 (SEQ ID NO: 98) Porphyromonas gulae WP_039437199 (SEQ ID NO: 99) Porphyromonas gulae WP 03 9442171 (SEQ ID NO: 100) Porphyromonas gulae WP_039445055 (SEQ ID NO: 101) Capnocytophaga cynodegmi WP_0419895 81 (SEQ ID NO: 102) Prevotella sp.

P5-119 WP_042518169 (SEQ ID NO: 103) Prevotella sp.

P4-76 WP_044072147 (SEQ ID NO: 104) Prevotella sp.

P5-60 WP_044074780 (SEQ ID NO: 105) Phaeodactylibacter xiamenensis WP 044218239 (SEQ ID NO: 106) Flavobacterium sp. 316 WP_045968377 (SEQ ID NO:

107) Porphyromonas gulae WP_046201018 (SEQ ID NO: 108) WP_047431796 Chryseobacterium sp. YR477 (SEQ ID NO: 109) Riemerella anatipestifer WP_0493 54263 (SEQ ID NO: 110) Porphyromonas gingivalis WP_052912312 (SEQ ID NO: 111) Porphyromonas gingivalis WP_058019250 (SEQ ID NO: 112) Flavobacterium columnare WP_060381855 (SEQ ID NO: 113) Porphyromonas gingivalis WP 061156470 (SEQ ID NO: 114) Porphyromonas gingivalis WP 061156637 (SEQ ID NO: 115) Riemerella anatipestifer WP_061710138 (SEQ ID NO: 116) Flavobacterium columnare WP 063 744070 (SEQ ID NO: 117) Riemerella anatipestifer WP_064970887 (SEQ ID NO: 118) Sinomicrobium oceani WP_072319476.1 (SEQ ID NO: 119) Reichenbachiella agariperforans WP_073124441.1 (SEQ ID NO: 120) Sequências guia

[0146] Como usado no presente documento, o termo “crRNA” ou “RNA guia” ou “RNA guia único”, “gRNA” se refere a um polinucleotídeo que compreende qualquer sequência de polinucleotídeo que tem complementaridade suficiente com uma sequência de ácido nucleico alvo para hibridizar com o nucleico alvo sequência de ácido e para direcionar a ligação específica de sequência de um complexo de direcionamento de RNA que compreende o gRNA e uma proteína efetora de CRISPR à sequência de ácido nucleico alvo.

Em geral, um gRNA pode ser qualquer sequência polinucleotídica

(i) com a capacidade formar um complexo com uma proteína efetora CRISPR e (ii) compreender uma sequência com complementaridade suficiente com uma sequência polinucleotídica alvo para hibridizar com a sequência alvo e com a sequência direta específica ligação de um complexo

CRISPR à sequência alvo.

Como usado no presente documento,

o termo “com capacidade de formar um complexo com a proteína efetora CRISPR” se refere ao RNAm que tem uma estrutura que permite a ligação específica da proteína efetora CRISPR ao RNAm, de modo que um complexo é formado e com capacidade de se ligar a um alvo RNA de uma maneira específica de sequência e que pode exercer uma função no dito RNA alvo.

Os componentes estruturais do gRNA podem incluir repetições diretas e uma sequência guia (ou espaçador). A ligação específica da sequência ao RNA alvo é mediada por uma parte do gRNA, a “sequência guia”, sendo complementar ao RNA alvo.

Nas modalidades da invenção, o termo RNA guia, isto é, RNA capaz de guiar Cas a um local alvo, é usado como nos documentos citados acima, como o documento WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667). Como usado no presente documento, o termo “em que a sequência guia é capaz de hibridizar” se refere a uma subseção do gRNA com complementaridade suficiente com a sequência alvo para hibridizar à mesma e mediar a ligação de um complexo CRISPR ao RNA alvo.

Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência polinucleotídica que tem complementaridade suficiente com uma sequência polinucleotídica alvo para hibridizar com a sequência alvo e direcionar a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo.

Em algumas modalidades, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência alvo correspondente, quando idealmente alinhado usando um algoritmo de alinhamento adequado, é de cerca de 50%, 60%,

75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais.

O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para alinhar sequências, exemplos não limitativos dos quais incluem o algoritmo Smith-Waterman, o algoritmo

Needleman-Wunsch, algoritmos baseados na Transformação

Burrows-Wheeler (por exemplo, o Burrows Wheeler Aligner),

ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft

Technologies; disponível em novocraft.com), ELAND

(Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net).

[0147] Em certas modalidades, o sistema CRISPR conforme aqui fornecido pode fazer uso de um crRNA ou polinucleotídeo análogo que compreende uma sequência guia, em que o polinucleotídeo é um RNA, um DNA ou uma mistura de RNA e DNA e/ou em que o polinucleotídeo compreende um ou mais análogos de nucleotídeo. A sequência pode compreender qualquer estrutura, incluindo, sem limitação, uma estrutura de um crRNA nativo, como uma protuberância, um gancho de cabelo ou uma estrutura de loop de haste. Em certas modalidades, o polinucleotídeo que compreende a sequência guia forma um duplex com uma segunda sequência polinucleotídica que pode ser uma sequência de RNA ou DNA.

[0148] Em certas modalidades, é feito uso de RNAs guia quimicamente modificados. Exemplos de modificações químicas de RNA guia incluem, sem limitação, incorporação de 2’-O-metil (M), 2’-O-metil 3'fosforotioato (MS) ou 2’-O- metil 3'thioPACE (MSP) em um ou mais nucleotídeos terminais. Esses RNAs guia quimicamente modificados podem compreender maior estabilidade e atividade aumentada em comparação com os RNAs guia não modificados, embora a especificidade no alvo versus fora do alvo não seja previsível. (Consulte Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33 (9): 985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, publicado on-line em 29 de junho de 2015). Os RNAs guia quimicamente modificados incluem ainda, sem limitação, RNAs com ligações fosforotioato e nucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA) que compreendem uma ponte de metileno entre os carbonos 2’ e 4’ do anel ribose.

[0149] Em algumas modalidades, uma sequência guia é de aproximadamente ou mais de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ou mais nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, uma sequência guia é menor que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento. Preferencialmente, a sequência guia tem 10 a 30 nucleotídeos. A capacidade de uma sequência guia para direcionar a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado. Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR suficientes para formar um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira com a sequência alvo correspondente, como por transfecção com vetores que codificam os componentes da sequência CRISPR, seguido de uma avaliação da clivagem preferencial na sequência de destino, como no ensaio Surveyor. Da mesma forma, a clivagem de um RNA alvo pode ser avaliada em um tubo de ensaio, fornecendo a sequência alvo, componentes de um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente da sequência guia de teste e comparando a ligação ou taxa de clivagem na sequência alvo entre as reações da sequência guia de teste e controle. Outros ensaios são possíveis e ocorrerão para os versados na técnica.

[0150] Uma sequência guia e, portanto, um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico pode ser selecionada para direcionar qualquer sequência de ácido nucleico alvo.

No contexto da formação de um complexo CRISPR, “sequência alvo” se refere a uma sequência na qual uma sequência guia é projetada para ter complementaridade, em que a hibridização entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. Uma sequência alvo pode compreender polinucleotídeos de RNA. O termo “RNA alvo” se refere a um polinucleotídeo de RNA que é ou compreende a sequência alvo. Em outras palavras, o RNA alvo pode ser um polinucleotídeo de RNA ou uma parte de um polinucleotídeo de RNA ao qual uma parte do gRNA, isto é, a sequência guia, é projetada para ter complementaridade e à qual a função efetiva mediada pelo complexo que compreende o efetor CRISPR proteína e um gRNA deve ser direcionado. Em algumas modalidades, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula. A sequência alvo pode ser DNA. A sequência alvo pode ser qualquer sequência de RNA. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em RNA mensageiro (mRNA), pré-mRNA, RNA ribossômico (rRNA), transferência R NA (tRNA), micro-RNA (miRNA), RNA interferente pequeno (siRNA), RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA nuclear pequeno (snoRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), RNA não codificante (ncRNA), RNA não codificante longo (IncRNA) e RNA citoplasmático pequeno (scRNA). Em algumas modalidades preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em mRNA, pré-mRNA e rRNA.

Em algumas modalidades preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em ncRNA e IncRNA. Em algumas modalidades mais preferenciais, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de mRNA ou uma molécula pré-mRNA.

[0151] Em algumas modalidades, um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico é selecionado para reduzir o grau de estrutura secundária dentro do RNA guia de direcionamento de RNA. Em algumas modalidades, cerca de ou menos de 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% ou menos dos nucleotídeos da segmentação por ácidos nucleicos O RNA-guia participa do emparelhamento de bases auto- complementares quando dobrado de maneira ideal. A dobragem ideal pode ser determinada por qualquer algoritmo de dobragem de polinucleotídeo adequado. Alguns programas são baseados no cálculo da energia livre mínima de Gibbs. Um exemplo de um desses algoritmos é o mFold, como descrito por Zuker e Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133 a 148). Outro exemplo de algoritmo de dobragem é o servidor on-line RNAfold, desenvolvido no Instituto de Química Teórica da Universidade de Viena, usando o algoritmo de previsão de estrutura centroide (consulte, por exemplo, AR Gruber et al., 2008, Cell 106 (1): 23-24; e PA Carr e GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27 (12): 1151-62).

[0152] Em certas modalidades, um RNA guia ou crRNA pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma sequência de repetição direta (DR) e uma sequência guia ou sequência espaçadora. Em certas modalidades, o RNA guia ou o crRNA pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma sequência de repetição direta fundida ou ligada a uma sequência guia ou sequência espaçadora. Em certas modalidades, a sequência de repetição direta pode estar localizada a montante (isto é, 5’) da sequência guia ou sequência espaçadora. Em outras modalidades, a sequência de repetição direta pode estar localizada a jusante (isto é, 3’) da sequência guia ou sequência espaçadora.

[0153] Em certas modalidades, o crRNA compreende um loop de haste, preferencialmente um loop de haste único. Em certas modalidades, a sequência de repetição direta forma um loop de haste, preferencialmente um loop de haste único.

[0154] Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de 15 a 35 nt. Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de pelo menos 15 nucleotídeos, de preferência pelo menos 18 nt, como pelo menos 19, 20, 21, 22 ou mais nt. Em certas modalidades, o comprimento do espaçador é de 15 a 17 nt, por exemplo, 15, 16 ou 17 nt, de 17 a 20 nt, por exemplo, 17, 18, 19 ou 20 nt, de 20 a 24 nt, por exemplo, 20, 21, 22, 23 ou 24 nt, de 23 a 25 nt, por exemplo, 23, 24 ou 25 nt, de 24 a 27 nt, por exemplo, 24, 25, 26 ou 27 nt, de 27 a 30 nt, por exemplo, 27, 28, 29 ou 30 nt, de 30-35 nt, por exemplo, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 nt, ou 35 nt ou mais.

[0155] Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é inferior a 28 nucleotídeos. Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de pelo menos 18 nucleotídeos e menos de 28 nucleotídeos.

Em certas modalidades, o comprimento espaçador do RNA guia está entre 19 e 28 nucleotídeos. Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia está entre 19 e 25 nucleotídeos. Em certas modalidades, o comprimento espaçador do RNA guia é de 20 nucleotídeos. Em certas modalidades, o comprimento espaçador do RNA guia é de 23 nucleotídeos. Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de 25 nucleotídeos.

[0156] Em sistemas CRISPR-Cas clássicos, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência alvo correspondente pode ser de aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 ou 95 %, 97,5%, 99% ou 100%; um guia ou RNA ou sgRNA pode ter cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ou mais nucleotídeos de comprimento; ou guia ou RNA ou sgRNA pode ser menor que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento. No entanto, um aspecto da invenção é reduzir interações fora do alvo, por exemplo, reduzir o guia que interage com uma sequência alvo com baixa complementaridade. De fato, nos exemplos, é mostrado que a invenção envolve mutações que resultam no sistema CRISPR- Cas sendo capaz de distinguir entre sequências alvo e fora do alvo que têm mais de 80% a cerca de 95% de complementaridade, por exemplo, 83% de complementaridade de 84% ou 88 a 89% ou 94 a 95% (por exemplo, distinguir entre um alvo com 18 nucleotídeos e um alvo fora de 18 nucleotídeos com 1, 2 ou 3 incompatibilidades). Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência alvo correspondente é superior a 94,5% ou 95% ou 95,5% ou

96% ou 96% ou 96,5% ou 97% ou 97,5% ou 98% ou 98,5 % ou 99% ou 99,5% ou 99,9% ou 100%. O objetivo fora do alcance é inferior a 100% ou 99,9% ou 99,5% ou 99% ou 99% ou 98,5% ou 98% ou 97,5% ou 97% ou 96,5% ou 96% ou 95,5% ou 95% ou 94,5% ou 94% ou Complementaridade de 93% ou 92% ou 91% ou 90% ou 89% ou 88% ou 87% ou 86% ou 85% ou 84% ou 83% ou 82% ou 81% ou 80% entre a sequência e o guia, com é vantajoso que a meta fora seja complementaridade de 100% ou 99,9% ou 99,5% ou 99% ou 99% ou 98,5% ou 98% ou 97,5% ou 97% ou 96,5% ou 96,5% ou 96,5% ou 95,5% ou 95% ou 94,5% entre a sequência e o guia.

[0157] Em certas modalidades, modulações da eficiência da clivagem podem ser exploradas pela introdução de incompatibilidades, por exemplo, 1 ou mais incompatibilidades, como 1 ou 2 incompatibilidades entre a sequência espaçadora e a sequência alvo, incluindo a posição da incompatibilidade ao longo do espaçador/alvo.

Quanto mais central (ou seja, não 3’ ou 5’), por exemplo, uma incompatibilidade dupla, maior a eficiência da clivagem é afetada. Por conseguinte, escolhendo uma posição de incompatibilidade ao longo do espaçador, a eficiência da clivagem pode ser modulada. Por meio de exemplo, se for desejada uma clivagem inferior a 100% dos alvos (por exemplo, em uma população de células), 1 ou mais, de preferência 2 incompatibilidades entre espaçador e sequência alvo, podem ser introduzidas nas sequências espaçadoras. Quanto mais central ao longo do espaçador da posição de incompatibilidade, menor a porcentagem de clivagem.

[0158] Em certas modalidades exemplificadoras, a eficiência da clivagem pode ser explorada para projetar guias únicos que podem distinguir dois ou mais alvos que variam por um único nucleotídeo, como um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), variação ou mutação (pontual). O efetor CRISPR pode ter sensibilidade reduzida a SNPs (ou outras variações de nucleotídeo único) e continuar a clivar alvos de SNP com um certo nível de eficiência. Assim, para dois alvos, ou um conjunto de alvos, um RNA guia pode ser projetado com uma sequência de nucleotídeos que é complementar a um dos alvos, ou seja, o SNP no alvo. O RNA guia é ainda projetado para ter uma incompatibilidade sintética. Como usado no presente documento, uma “incompatibilidade sintética” se refere a uma incompatibilidade não natural que é introduzida a montante ou a jusante do SNP de ocorrência natural, como no máximo 5 nucleotídeos a montante ou a jusante, por exemplo 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeo a montante ou a jusante, preferencialmente no máximo 3 nucleotídeos a montante ou a jusante, mais preferencialmente no máximo 2 nucleotídeos a montante ou a jusante, mais preferencialmente 1 nucleotídeo a montante ou a jusante (isto é, adjacente ao SNP). Quando o efetor CRISPR se liga ao SNP no alvo, apenas uma única incompatibilidade será formada com a incompatibilidade sintética e o efetor CRISPR continuará a ser ativado e um sinal detectável será produzido. Quando o RNA guia hibridiza com um SNP fora do alvo, duas incompatibilidades são formadas, a incompatibilidade do SNP e a sintética e nenhum sinal detectável será gerado. Assim, os sistemas revelados no presente documento podem ser projetados para distinguir SNPs dentro de uma população. Por exemplo, os sistemas podem ser usados para distinguir cepas patogênicas que diferem por um único SNP ou detectam certos SNPs específicos da doença, como, sem limitação, SNPs associados a doenças, como, sem limitação, SNPs associados a câncer.

[0159] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’).

Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado nas posições 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado nas posições 3, 4, 5 ou 6 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado na posição 3 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’).

[0160] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade (por exemplo, incompatibilidade sintética, isto é, uma mutação adicional além de um SNP) esteja localizada nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada nas posições 4, 5, 6 ou 7 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada na posição 5 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’).

[0161] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada

2 nucleotídeos a montante do SNP (isto é, um nucleotídeo interveniente).

[0162] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada 2 nucleotídeos a jusante do SNP (isto é, um nucleotídeo interveniente).

[0163] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada na posição 5 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5’) e o SNP está localizado na posição 3 da sequência espaçadora (iniciando na extremidade 5’).

[0164] As modalidades descritas no presente documento compreendem a indução de uma ou mais modificações nucleotídicas em uma célula eucariótica (in vitro, isto é, em uma célula eucariótica isolada), como aqui discutido, que compreende entregar à célula um vetor como aqui discutido. A mutação (ou mutações) pode incluir a introdução, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos em cada sequência alvo de célula (ou células) através do RNA (ou RNAs) guia. As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 1 a 75 nucleotídeos em cada sequência alvo da dita célula (ou células) através do RNA (ou RNAs) guia. As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,

28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência alvo da dita célula (ou células) através do RNA (ou RNAs) guia. As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência alvo da dita célula (ou células) através do RNA (ou RNAs) guia. As mutações incluem a introdução, deleção ou substituição de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência alvo da dita célula (ou células) através do RNA (ou RNAs) guia. As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência alvo de dita célula (ou células) através do RNA (ou RNAs) guia. As mutações podem incluir a introdução, deleção ou substituição de 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos em cada sequência alvo da dita célula (ou células) através do RNA (ou RNAs) guia.

[0165] Tipicamente, no contexto de um sistema CRISPR endógeno, a formação de um complexo CRISPR (que compreende uma sequência-guia hibridizada com uma sequência alvo e complexada com uma ou mais proteínas Cas) resulta em clivagem em ou próximo (por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 ou mais pares de bases da) a sequência alvo, mas pode depender, por exemplo, de estrutura secundária, em particular no caso de alvos de RNA.

Proteínas efetoras crispr de amplificação de sinal

[0166] Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora CRISPR de amplificação de sinal é uma proteína efetora do sistema CRISPR-Cas de Tipo III-A. Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora CRISPR-Cas do Tipo III-A é Csm6. O Csm6 funciona com o complexo efetor multiproteína Csm, mas não faz parte do complexo (consulte, por exemplo, US20170198286 Al; W02016035044A1; M. Kazlauskiene et al., Science

10.1126/science.aao0100 (2017); e Niewoehner et al. 2017, A pré-impressão do bioRxiv foi publicada pela primeira vez on-line em 23 de junho de 2017; doi: dx.doi.org/10.1101/153262).

[0167] Em Staphylococcus epidermidis, o complexo Csm (SeCsm) é composto pelas proteínas Cas 10, Csm2, Csm3, Csm4 e Csm5. Demonstrou-se que o sistema CRISPR-Cas do tipo III-A tem atividade de clivagem de RNA in vitro e na célula usando o complexo Csm para Streptococcus thermophilus (St) (consulte, por exemplo, US20170198286 Al).

[0168] Sistemas do tipo III-A CRISPR-cas incluem Streptococcus thermophilus (GenBank KM222358), DGCC7710 (GenBank AWVZ01000003), LMD-9 (GenBank NC008532),

Staphylococcus epidermidis RP62A (GenBank NC002976), Enterococcus italicus DSM15952 (GenBank AEPV01000074), Lactococcus Zac/zs DGCC7167 (GenBank JX524189) e Sulfolobus solfataricus P2 (GenBank AE006641). O sistema Tipo III-A do DGCC8004 contém 10 genes cas que flanqueiam o conjunto CRISPR2 e inclui os genes cast, cas2, cas6, cas 10, csm2, csm3, csm4, csm5, csm6 e csm6’. O locus DGCC8004 CRISPR2 compartilha um arranjo de 46 genes similar ao de DGCC7710 (GenBank AWVZ00000000, (Horvath e Barrangou, 2010)) e LMD-9 (GenBank NC_008532 (Makarova et al., 2006)). A principal diferença é um gene csm6’ adicional no DGCC8004. A proteína Csm6 'no DGCC8004 é composta por 386 aa e mostra 34% de identidade de aminoácidos à proteína 428 aa Csm6, sugerindo um possível evento antigo de duplicação de genes seguido por divergência de sequência. Por outro lado, o DGCC7710 contém apenas um ORF curto de 117 nt na frente do csm6. As proteínas Cas/Csm associadas ao CRISPR2 em DGCC8004 são homólogas às proteínas correspondentes em DGCC7710 e LMD-9 (mais de 90% de uma identidade aa, exceto a proteína Csm2, que compartilha ~70% de identidade). Outros sistemas Tipo III-A experimentalmente caracterizados, incluindo S.

epidermidis RP62a (GenBank NC002976, (Marraffini e Sontheimer, 2008)), Enterococcus italicus DSM15952 (GenBank AEPV01000074, (Millen et al., 2012)) e Lactococcus lactis DGCC7167 (GenBank J18), (Millen et al., 2012)) compartilham com o DGCC8004 um arranjo conservado do agrupamento de genes casl0-csm2-csm3-csm4-csm5-csm6, enquanto a posição dos genes cas6 e cast/cas2 diferem em algumas linhagens. O locus CRISPR-Cas tipo III-A em S. solfataricus P2 (GenBank AE006641) tem organização genética diferente e mostra baixa similaridade de sequência de proteínas aos ortólogos Cas/Csm em DGCC8004. Vale ressaltar que a proteína Csm3 é mais conservada entre as proteínas Cas/Csm em diferentes cepas e 5 cópias dos paralelos Csm3 estão presentes em S.

solfataricus. As sequências repetidas em S. epidermidis, E.

italicus e L. lactis têm o mesmo comprimento (36 nt), no entanto, a conservação de nucleotídeos é limitada às partes palindrômicas e à extremidade 3’ terminal das repetições. A sequência 8-nt 3’-terminal da repetição, que pode contribuir para a alça do crRNA 5’, mostra um consenso de ACGRRAAC entre S. thermophilus, S. epidermidis, E. italicus e L. lactis, mas difere daquela de S solfataricus (AUUGAAG (Rouillon et al., 2013)).

[0169] Csm6 demonstrou ser uma endoribonuclease específica de ssRNA e a base estrutural para esta atividade foi determinada (Niewoehner e Jinek, 2016, Structural basis for the endoribonuclease activity of the type III-A CRISPR- associated protein Csm6. RNA 22 318 a 329).

[0170] Em algumas modalidades, um ou mais elementos de um sistema de direcionamento de ácidos nucleicos da presente invenção são derivados de um organismo particular que compreende um sistema de direcionamento de RNA CRISPR endógeno. Em certas modalidades, o sistema de direcionamento de RNA CRISPR compreende uma proteína Csm6, ortólogo Csm6 ou proteína similar a Csm6. Como usado no presente documento, a discussão de Csm6 também se refere a proteínas Csm6, ortólogos de Csm6 ou proteínas do tipo Csm6. Os ortólogos Csm6 podem ser encontrados em organismos como descrito no presente documento e conhecido na técnica (consulte, por exemplo, W02016035044A1 e Niewoehner e Jinek, 2016). Ortólogos exemplares de Csm6 incluem, entre outros, T. thermophilus (TtCsm6, GE55978335), S.

epidermidis (Se Csm6, GE488416649), S. mutans (Sm Csm6, GE24379650), S. thermophiles (St Csm6, GE585230687) e S.

thermophilus P. furiosus Csxl (PfCsxl, GI: 33359545). Em certas modalidades, as proteínas Csm6 úteis para a presente invenção compreendem pelo menos um domínio CARF do terminal N (dobra de Rossman associado ao CRISPR) e pelo menos um domínio HEPN do terminal C (domínio de ligação a nucleotídeos eucariotas e procariotas superiores). Em certas modalidades, as proteínas Csm6 formam dímeros. Em certas modalidades, a dimerização dos domínios HEPN leva à formação de um sítio ativo de ribonuclease. Em certas modalidades, a interface dímero dos domínios CARF compreende uma bolsa eletropositiva. Sem limitar-se a uma teoria, a bolsa pode funcionar como um sítio de ligação ao ligante para o controle alostérico da atividade da ribonuclease.

[0171] Em certas modalidades exemplificadoras, os sistemas de detecção baseados em CRISPR descrito no presente documentos compreendem uma proteína Csm6 que compreende pelo menos um domínio HEPN, incluindo, sem limitação, os domínios HEPN descrito no presente documentos, domínios HEPN conhecidos na técnica (Niewoehner e Jinek, 2016) e domínios reconhecidos como domínios HEPN por comparação com motivos de sequência de consenso. Vários desses domínios são fornecidos aqui. Em um exemplo não limitativo, uma sequência de consenso pode ser derivada das sequências de ortólogos C2c2 ou Cast3b aqui fornecidos. Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína Csm6 compreende um único domínio HEPN. Em certas outras modalidades exemplificadoras, a proteína Csm6 compreende dois domínios HEPN.

[0172] Em um exemplo de modalidade, a proteína Csm6 compreende um ou mais domínios HEPN que compreendem uma sequência de motivos RxxxxH. A sequência do motivo RxxxxH pode ser, sem limitação, de um domínio HEPN descrito no presente documento ou um domínio HEPN conhecido na técnica.

As sequências de motivos RxxxxH incluem ainda sequências de motivos criadas pela combinação de partes de dois ou mais domínios HEPN. Como observado, as sequências de consenso podem ser derivadas das sequências dos ortólogos revelados no presente documento. Em certas modalidades, o domínio HEPN compreende um motivo R-X4-6-H conservado (Anantharaman et al., Biol Direct. 15 de junho de 2013; 8:15; e Kim et al., Proteins. 2013 fev; 81 (2) 261-70).

[0173] Em uma modalidade da invenção, um domínio HEPN compreende pelo menos um motivo RxxxxH que compreende a sequência de R{N/H/K}X1X2X3H (SEQ ID NO: 571). Em uma modalidade da invenção, um domínio HEPN compreende um motivo RxxxxH que compreende a sequência de R {N/H} X1X2X3H (SEQ ID NO: 572). Em uma modalidade da invenção, um domínio HEPN compreende a sequência de R{N/K}X1X2X3 H (SEQ ID NO: 573). Em certas modalidades, X1 é R, S, D, E, Q, N, G, Y ou H. Em certas modalidades, X2 é I, S, T, V ou L. Em certas modalidades, X3 é L, F, N, Y, V, I, S, D, E ou A.

[0174] Os domínios CARF e sequências de consenso para domínios CARF foram descritos (consulte, por exemplo, Makarova et al., Front Genet. 2014; 5: 102). Em certas modalidades, Csm6 compreende pelo menos um domínio CARF que compreende um domínio central que compreende uma dobra similar a Rossmann de seis fios com a cadeia central 5 e a cadeia 6 formando um grampo em P. As principais regiões de conservação de sequência estão associadas à cadeia 1 e à cadeia 4 do domínio principal. Em certas modalidades, a extremidade da cadeia 1 é caracterizada por um resíduo polar, tipicamente com uma cadeia lateral alcoólica (S/T).

Em certas modalidades, imediatamente a jusante da cadeia-4 é um resíduo básico altamente conservado (K/R), preferencialmente associado a uma assinatura [DN] X [ST] XXX [RK] (SEQ ID NO: 574). Em certas modalidades, o Csm6 é truncado para remover o domínio CARF do terminal N (por exemplo, aminoácidos 1-190 de TtCsm6 ou os resíduos equivalentes nas proteínas ortólogas Csm6).

[0175] Em certas modalidades, o Csm6 compreende pelo menos um domínio 6H (Niewoehner e Jinek, 2016). O domínio 6H da cadeia polipeptídica TtCsm6 (resíduos 191- 292) consiste em cinco hélices a e forma um domínio solenoide destro. Sem limitar-se a uma teoria, uma vez que alguns ortólogos podem não ter um domínio 6H, este domínio não é necessário para a atividade da proteína Csm6 da presente invenção.

[0176] Foi demonstrado que o Csm6 contribui para a interferência, funcionando como uma ribonuclease autônoma que degrada os transcritos de RNA invasor. As proteínas Csm6 são ativadas através de um segundo mensageiro gerado pelo complexo de interferência do tipo III. Após a ligação do RNA alvo pelo complexo de interferência do tipo III, a subunidade Cas 10 converte ATP em um produto oligoadenilato cíclico, que ativa alostericamente Csm6 por ligação ao seu domínio CARF. As mutações no domínio CARF que abolem a ativação alostérica inibem a atividade do Csm6 in vivo e as mutações na perda de fenocópia do domínio Cas 10 Palm de Csm6 (M. Kazlauskiene et al., 2017; e Niewoehner et al.

2017).

[0177] Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora CRISPR de amplificação de sinal é ativada quando a proteína de detecção CRISPR ativada cliva uma sequência de ativação. As sequências de ativação são descritas em mais detalhes abaixo. O produto de clivagem da sequência de ativação ativa uma atividade separada da proteína efetora CRISPR de amplificação de sinal, como uma atividade de nuclease de RNA. Por exemplo, o Csm6, uma vez ativado, cliva o RNA indiscriminadamente similar ao efeito colateral das enzimas Casl3. Assim, além da modificação efetiva de detecção dos construtos repórter, a proteína efetora CRISPR de amplificação de sinal ativada também modifica os construtos repórteres para melhorar ainda mais a geração do sinal. Em certas modalidades, o Csm6 é ativado quando fornecido em conjunto com outra enzima CRISPR (por exemplo, Casl3). Em certas modalidades, o Csm6 pode gerar um efeito sinérgico quando usado em conjunto com o Casl3, de modo que a atividade colateral do Casl3 seja bastante aumentada. Não estando vinculado por uma teoria, a concentração de Elenco 3 pode ser bastante reduzida em um teste quando o Csm6 também é incluído no teste (por exemplo, teste de ponto de atendimento). Assim, a adição de Csm6 a um teste de diagnóstico Casl3 pode ser usada para aumentar a sensibilidade do teste e diminuir o custo.

[0178] Em certas modalidades exemplificadoras, a uma ou mais proteínas efetoras de amplificação de sinal são selecionadas na Tabela 4.

Tabela 4 EiCsm 6 (SEQIDNO: Enterococcus WP_007208953.1 121) italicus TtCsm6 (SEQIDNO: Thermus WP_011229148.1 122] thermophilus StCs m6 (SEQIDNO: WP_000865879.1 Staphylococcus 123] ShCs m6 (SEQIDNO: Staphylococcus WP_085050120.1 124] haemolyticus PtCs m6 (SEQIDNO: WP_078807318.1 Pilibacter termitis 125] Staphylococcus SaCs m6 (SEQ ID EHO90787.1 aureus subsp. NO: 126] aureus 21252 Th Csm6 (SEQIDNO: Tetragenococcus WP_094243908.1 127] halophilus Fs Csm6 (SEQIDNO: WP_069876671.1 Fusibacter sp. 3D3 128] La Cs m6 Lactobacillus WP_056988115.1 (SEQIDNO: 129] acidipiscis LsCsm6 (SEQIDNO: Lactobacillus WP_081509150.1 130] salivarius Sequências de ativação

[0179] As sequências de ativação são usadas em conjunto com a proteína efetora de amplificação de sinal

CRISPR.

Em certas modalidades exemplificadoras, as sequências de ativação são clivadas pela proteína efetora de detecção de CRISPR uma vez que a proteína efetora de detecção de CRISPR é ativada.

A clivagem da sequência de ativação resulta em fragmentos de clivagem que ativam a proteína efetora de amplificação de sinal CRISPR.

Como observado acima, em certas modalidades exemplificadoras, a ativação da proteína efetora de amplificação de sinal

CRISPR leva à geração sinérgica de um sinal detectável.

Em certas modalidades exemplificadoras, a sequência de ativação é um oligonucleotídeo de 50 homopolímeros.

Em certas modalidades exemplificadoras, a clivagem do oligonucleotídeo homopolímero gera pelo menos um produto de clivagem com um fosfato cíclico 3’ 2,3 que estimula a ativação da proteína efetora de amplificação de sinal

CRISPR.

Em certas modalidades exemplificadoras, o homopolímero é um oligonucleotídeo poli-A.

Em certas modalidades exemplificadoras, a sequência de ativação é 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,

22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento.

Em certas modalidades exemplificadoras, a sequência de ativação tem entre 5 e 10 nucleotídeos de comprimento, 5 e 15 nucleotídeos de comprimento, 5 e 20 nucleotídeos de comprimento, 5 e 25 nucleotídeos de comprimento, 5 e 25 nucleotídeos de comprimento, 5 e 30 nucleotídeos de comprimento, 10 e 15 nucleotídeos de comprimento, 10 e 20 nucleotídeos de comprimento, 10 e 25 nucleotídeos de comprimento, 10 e 30 nucleotídeos de comprimento, 15 e 20 nucleotídeos de comprimento, 15 e 25 nucleotídeos de comprimento, 15 e 25 nucleotídeos de comprimento, 15 e 30 nucleotídeos de comprimento, 20 e 25 nucleotídeos de comprimento, 20 e 30 nucleotídeos de comprimento, ou 25 e 30 nucleotídeos de comprimento.

[0180] As sequências de ativação de exemplo são mostradas na Tabela 5.

Tabela 5 rArArArArA 5A-3OH arArArArA/3Phos/ 5A-3P rArArArArArA 6A-3OH rArArArArA/3Phos/ 6A-3P rArArArArArArA 7A-3OH rArArArArArA/3Phos/ 7A-3P Construtos repórter

[0181] Como usado no presente documento, um “construto repórter” se refere a uma molécula que pode ser clivada ou desativada por uma proteína efetora do sistema CRISPR ativada aqui descrita. O termo “construtor repórter” também pode ser referido alternativamente como “construto de detecção” ou “construto de mascaramento”. Em certas modalidades exemplificadoras, a construto repórter é um construto repórter baseado em RNA. O construto repórter é configurado para que a geração ou detecção de um sinal detectável positivo não seja alcançada, a menos que o sistema efetor CRISPR esteja ativado. Um sinal detectável positivo pode ser qualquer sinal que possa ser detectado usando métodos de detecção ópticos, fluorescentes, quimioluminescentes, eletroquímicos ou outros métodos de detecção conhecidos na técnica. O construto repórter pode impedir a geração de um sinal positivo detectável ou mascarar a presença de um sinal positivo detectável até que a construto repórter seja modificado pela atividade da proteína efetora CRISPR. O termo “sinal detectável positivo” é usado para diferenciar de outros sinais detectáveis que podem ser detectáveis na presença do construto repórter. Por exemplo, em certas modalidades, um primeiro sinal pode ser detectado quando um construto repórter não modificada está presente (ou seja, um sinal detectável negativo), que então se converte em um segundo sinal (por exemplo, o sinal detectável positivo) após modificação do construto repórter pela ativação Proteína efetora CRISPR.

[0182] Em certas modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento pode suprimir a geração de um produto genético. O produto do gene pode ser codificado por um construto repórter que é adicionado à amostra. O construto de mascaramento pode ser um RNA interferente envolvido em uma via de interferência de RNA, como um shRHN ou siRNA. O construto de mascaramento também pode compreender microRNA (miRNA). Enquanto presente, o construto de mascaramento suprime a expressão do produto do gene. O produto do gene pode ser uma proteína fluorescente ou outro transcrito ou proteína de RNA que, de outro modo, seria detectável por uma sonda ou anticorpo marcado, mas pela presença do construto de mascaramento. Após a ativação da proteína efetora, o construto de mascaramento é clivado ou silenciado de outro modo, permitindo a expressão e a detecção do produto do gene como o sinal detectável positivo.

[0183] Em certas modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento pode sequestrar um ou mais reagentes necessários para gerar um sinal positivo detectável, de modo que a liberação de um ou mais reagentes do construto de mascaramento resulte na geração do sinal positivo detectável. O um ou mais reagentes podem combinar para produzir um sinal colorimétrico, um sinal quimioluminescente, um sinal fluorescente ou qualquer outro sinal detectável e podem compreender quaisquer reagentes conhecidos por serem adequados para essa finalidade. Em certas modalidades exemplificadoras, o um ou mais reagentes são sequestrados por aptâmeros de RNA que se ligam a um ou mais reagentes. O um ou mais reagentes são liberados quando a proteína efetora é ativada após a detecção de uma molécula alvo. Em certas modalidades exemplificadoras, o um ou mais reagentes é uma proteína, como uma enzima, capaz de facilitar a geração de um sinal detectável, como um sinal colorimétrico, quimioluminescente ou fluorescente, que é inibido ou sequestrado, de modo que a proteína não pode gerar o sinal detectável pela ligação de um ou mais aptâmeros de RNA à proteína. Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, os aptâmeros de RNA são clivados ou degradados na medida em que não inibem mais a capacidade da proteína de gerar o sinal detectável.

Em certas modalidades exemplificadoras, o aptâmero é um aptâmero inibidor de trombina. Em certas modalidades exemplificadoras, o inibidor de trombina aptâmero tem uma sequência de GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC (SEQ ID NO: 131).

Quando esse aptâmero é clivado, a trombina se torna ativa e cliva um substrato colorimétrico ou fluorescente do peptídeo. Em certas modalidades exemplificadoras, o substrato colorimétrico é para-nitroanilida (pNA) covalentemente ligado ao substrato peptídico da trombina.

Após a clivagem pela trombina, o pNA é liberado e fica amarelo e facilmente visível aos olhos. Em certas modalidades exemplificadoras, o substrato fluorescente é 7- amino-4-metilcumarina, um fluoróforo azul que pode ser detectado usando um detector de fluorescência. Aptâmeros inibitórios também podem ser usados para peroxidase de rábano silvestre (HRP), beta-galactosidase ou fosfatase alcalina de bezerro (CAP) dentro dos princípios gerais descritos acima.

[0184] Em certas modalidades, a atividade de RNAse é detectada colorimetricamente via clivagem de aptâmeros inibidores de enzima. Um modo potencial de converter a atividade de RNAse em um sinal colorimétrico é acoplar a clivagem de um aptâmero de RNA com a reativação de uma enzima capaz de produzir uma saída colorimétrica. Na ausência de clivagem de RNA, o aptâmero intacto se ligará ao alvo da enzima e inibirá sua atividade. A vantagem deste sistema de leitura é que a enzima fornece uma etapa de amplificação adicional: uma vez liberada de um aptâmero por meio de atividade colateral (por exemplo, atividade colateral Casl3a), a enzima colorimétrica continuará produzindo produto colorimétrico, levando a uma multiplicação de sinal.

[0185] Em certas modalidades, um aptâmero existente que inibe uma enzima com uma leitura colorimétrica é usado.

Existem vários pares aptâmero/enzima com leituras colorimétricas, como trombina, proteína C, elastase de neutrófilos e subtilisina. Estas proteases têm substratos colorimétricos baseados em pNA e estão comercialmente disponíveis. Em certas modalidades, é usado um novo aptâmero visando uma enzima colorimétrica comum. Enzimas comuns e robustas, como beta-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina intestinal de bezerro, podem ser alvo de aptâmeros projetados por estratégias de seleção como o SELEX. Tais estratégias permitem a seleção rápida de aptâmeros com eficiência de ligação nanomolar e podem ser usadas para o desenvolvimento de pares enzima/aptâmero adicionais para leitura colorimétrica.

[0186] Em certas modalidades, a atividade de RNAse é detectada colorimetricamente via clivagem de inibidores amarrados a RNA. Muitas enzimas colorimétricas comuns têm inibidores competitivos reversíveis: por exemplo, a beta- galactosidase pode ser inibida pela galactose. Muitos desses inibidores são fracos, mas seu efeito pode ser aumentado pelo aumento da concentração local. Ao vincular a concentração local de inibidores à atividade de RNAse, os pares de enzima colorimétrica e inibidor podem ser modificados nos sensores de RNAse. O sensor RNAse colorimétrico baseado em inibidores de pequenas moléculas envolve três componentes: a enzima colorimétrica, o inibidor e um RNA ponte que está covalentemente ligado ao inibidor e à enzima, amarrando o inibidor à enzima. Na configuração não clivada, a enzima é inibida pelo aumento da concentração local da molécula pequena; quando o RNA é clivado (por exemplo, por clivagem colateral Casl3a), o inibidor será liberado e a enzima colorimétrica será ativada.

[0187] Em certas modalidades, a atividade de RNAse é detectada colorimetricamente através da formação e/ou ativação de G-quadruplexos. Os quadruplexos G no DNA podem se complexar com o heme (ferro (III)-proporoporfirina IX) para formar uma enzima de DNA com atividade da peroxidase.

Quando fornecido com um substrato de peroxidase (por exemplo, ABTS: (ácido 2,2’-Azinobis [3-etilbenzotiazolina- 6-sulfônico]- sal de diamônio)), o complexo G-quadruplex- heme na presença de peróxido de hidrogênio causa oxidação do substrato, que forma uma cor verde em solução. Um exemplo de sequência de DNA que forma G-quadruplex é: GGGTAGGGCGGGTTGGGA (SEQ ID NO: 132). Mediante a hibridização de uma sequência de RNA com este aptâmero de DNA, a formação da estrutura G-quadruplex será limitada.

Após a ativação colateral do RNAse (por exemplo, ativação colateral do complexo C2c2), o grampo do RNA será clivado, permitindo que o quadruplex G se forme e o heme se ligue.

Essa estratégia é particularmente atraente devido ao fato de que a formação de cores é enzimática, o que significa que há amplificação adicional além da ativação do RNAse.

[0188] Em certas modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento pode ser imobilizado em um substrato sólido em um volume discreto individual (definido mais abaixo) e sequestrar um único reagente. Por exemplo, o reagente pode ser um a microesfera que compreende um corante. Quando sequestradas pelo reagente imobilizado, as microesferas individuais são muito difusas para gerar um sinal detectável, mas após a liberação do construto de mascaramento são capazes de gerar um sinal detectável, por exemplo, por agregação ou aumento simples na concentração da solução. Em certas modalidades exemplificadoras, o agente de mascaramento imobilizado é um aptâmero à base de RNA que pode ser clivado pela proteína efetora ativada após a detecção de uma molécula alvo.

[0189] Em certas outras modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento se liga a um reagente imobilizado em solução, bloqueando assim a capacidade do reagente de se ligar a um parceiro de ligação marcado separado que está livre em solução. Assim, após a aplicação de uma etapa de lavagem a uma amostra, o parceiro de ligação marcado pode ser lavado para fora da amostra na ausência de uma molécula alvo. No entanto, se a proteína efetora for ativada, o construto de mascaramento é clivado a um grau suficiente para interferir com a capacidade do construto de mascaramento de se ligar ao reagente,

permitindo assim que o parceiro de ligação marcado se ligue ao reagente imobilizado. Assim, o parceiro de ligação marcado permanece após a etapa de lavagem, indicando a presença da molécula alvo na amostra. Em certos aspectos, o construto de mascaramento que liga o reagente imobilizado é um aptâmero de RNA. O reagente imobilizado pode ser uma proteína e o parceiro de ligação marcado pode ser um anticorpo marcado. Alternativamente, o reagente imobilizado pode ser uma estreptavidina e o parceiro de ligação marcado pode ser marcado como biotina. O rótulo no parceiro de ligação usado nas modalidades acima pode ser qualquer rótulo detectável conhecido na técnica. Além disso, outros parceiros de ligação conhecidos podem ser usados de acordo com o projeto geral descrito no presente documento.

[0190] Em certas modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento pode compreender uma ribozima. As ribozimas são moléculas de RNA com propriedades catalíticas. As ribozimas, tanto naturais quanto manipuladas, compreendem ou consistem em RNA que pode ser direcionado pelas proteínas efetoras reveladas no presente documento. A ribozima pode ser selecionada ou manipulada para catalisar uma reação que gera um sinal detectável negativo ou impede a geração de um sinal de controle positivo. Após a desativação da ribozima pela molécula de proteína efetora ativada, a reação gerando um sinal de controle negativo ou impedindo a geração de um sinal detectável positivo é removida, permitindo assim que um sinal detectável positivo seja detectado. Em um exemplo de modalidade, a ribozima pode catalisar uma reação colorimétrica fazendo com que uma solução apareça como uma primeira cor. Quando a ribozima é desativada, a solução muda para uma segunda cor, a segunda cor sendo o sinal positivo detectável. Um exemplo de como as ribozimas podem ser usadas para catalisar uma reação colorimétrica é descrito em Zhao et al. “Signal amplification of glucosamine-6- phosphate based on ribozyme glmS”, Biosens Bioelectron. 2014; 16: 337-42, e fornece um exemplo de como esse sistema pode ser modificado para funcionar no contexto das modalidades reveladas no presente documento.

Alternativamente, as ribozimas, quando presentes, podem gerar produtos de clivagem, por exemplo, transcritos de RNA. Assim, a detecção de um sinal detectável positivo pode compreender a detecção de transcritos de RNA não clivados que são gerados apenas na ausência da ribozima.

[0191] Em um exemplo de modalidade, o construto de mascaramento compreende um agente de detecção que muda de cor dependendo se o agente de detecção é agregado ou disperso em solução. Por exemplo, certas nanopartículas, como o ouro coloidal, passam por uma visível mudança de cor púrpura para vermelha à medida que passam de agregados para partículas dispersas.

Por conseguinte, em certas modalidades exemplificadoras, esses agentes de detecção podem ser mantidos agregados por uma ou mais moléculas de ponte.

Pelo menos uma porção da molécula ponte compreende

RNA.

Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, a porção de RNA da molécula da ponte é clivada, permitindo que o agente de detecção se disperse e resultando na alteração correspondente na cor.

Em certas modalidades exemplificadoras, a molécula ponte é uma molécula de RNA.

Em certas modalidades exemplificadoras, o agente de detecção é um metal coloidal.

O material metálico coloidal pode incluir partículas metálicas insolúveis em água ou compostos metálicos dispersos em um líquido, um hidrossol ou um sol metálico.

O metal coloidal pode ser selecionado dentre os metais dos grupos IA, IB, IIB e IIIB da tabela periódica, bem como os metais de transição,

especialmente os do grupo VIII.

Os metais preferenciais incluem ouro, prata, alumínio, rutênio, zinco, ferro,

níquel e cálcio.

Outros metais adequados também incluem os seguintes em todos os seus vários estados de oxidação:

lítio, sódio, magnésio, potássio, escândio, titânio,

vanádio, cromo, manganês, cobalto, cobre, gálio, estrôncio,

nióbio, molibdênio, paládio, índio, estanho, tungstênio,

rênio, platina e gadolínio.

Os metais são preferencialmente fornecidos na forma iônica, derivados de um composto metálico apropriado, por exemplo, os íons A13+, Ru3+, Zn2+, Fe3+, Ni2+ e Ca2+.

[0192] Em certas outras modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento pode compreender um oligonucleotídeo de RNA ao qual está ligado um rótulo detectável e um agente de mascaramento desse rótulo detectável. Um exemplo desse par de marcador/agente de mascaramento detectável é um fluoróforo e um inibidor do fluoróforo. A têmpera do fluoróforo pode ocorrer como resultado da formação de um complexo não fluorescente entre o fluoróforo e outro fluoróforo ou molécula não fluorescente. Esse mecanismo é conhecido como formação de complexo no estado fundamental, resfriamento estático ou resfriamento por contato. Por conseguinte, o oligonucleotídeo de RNA pode ser projetado de modo que o fluoróforo e o silenciador estejam suficientemente próximos para que ocorra o resfriamento por contato. Os fluoróforos e seus inibidores de cognatos são conhecidos na técnica e podem ser selecionados para esse fim por alguém com habilidade na técnica. O par fluoróforo/silenciador específico não é crítico no contexto desta invenção, apenas que a seleção dos pares fluoróforo/silenciador garante o mascaramento do fluoróforo. Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, o oligonucleotídeo de RNA é clivado, cortando assim a proximidade entre o fluoróforo e o silenciador necessário para manter o efeito de extinção de contato. Por conseguinte, a detecção do fluoróforo pode ser usada para determinar a presença de uma molécula alvo em uma amostra.

[0193] Em certas outras modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento pode compreender um ou mais oligonucleotídeos de RNA aos quais estão ligados uma ou mais nanopartículas de metal, como nanopartículas de ouro. Em algumas modalidades, o construto de mascaramento compreende uma pluralidade de nanopartículas de metal reticuladas por uma pluralidade de oligonucleotídeos de RNA formando um loop fechado. Em uma modalidade, o construto de mascaramento compreende três nanopartículas de ouro reticuladas por três oligonucleotídeos de RNA formando um loop fechado. Em algumas modalidades, a clivagem dos oligonucleotídeos de RNA pela proteína efetora CRISPR leva a um sinal detectável produzido pelas nanopartículas de metal.

[0194] Em certas outras modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento pode compreender um ou mais oligonucleotídeos de RNA aos quais estão ligados um ou mais pontos quânticos. Em algumas modalidades, a clivagem dos oligonucleotídeos de RNA pela proteína efetora CRISPR leva a um sinal detectável produzido pelos pontos quânticos.

[0195] Em um exemplo de modalidade, o construto de mascaramento pode compreender um ponto quântico.

O ponto quântico pode ter várias moléculas de ligação ligadas à superfície.

Pelo menos uma porção da molécula ligante compreende RNA.

A molécula do ligante é anexada ao ponto quântico em uma extremidade e a um ou mais silenciadores ao longo do comprimento ou nas extremidades terminais do ligante, de modo que os silenciadores sejam mantidos em proximidade suficiente para que ocorra o efeito do ponto quântico.

O ligante pode ser ramificado.

Como acima, o par de ponto quântico/silenciador não é crítico, apenas que a seleção do par de ponto quântico/silenciador garante o mascaramento do fluoróforo.

Os pontos quânticos e seus inibidores cognatos são conhecidos na técnica e podem ser selecionados para esse fim por um versado na técnica.

Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, a porção de RNA da molécula ligante é clivada,

eliminando assim a proximidade entre o ponto quântico e um ou mais inibidores necessários para manter o efeito de inibição.

Em certas modalidades exemplificadoras, o ponto quântico é conjugado com estreptavidina.

Os RNAs são conectados por meio de ligantes de biotina e recrutam moléculas de extinção com as sequências

/5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/(SEQ ID NO: 133) ou

/5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/(SEQ ID NO: 134),

em que /5Bin é/5Bin tag e/31AbRQSp/é um silenciador preto Iowa. Após a clivagem pelos efetores ativados revelados no presente documento, o ponto quântico irá fluorescer visivelmente.

[0196] De maneira similar, a transferência de energia de fluorescência (FRET) pode ser usada para gerar um sinal positivo detectável. FRET é um processo não radiativo pelo qual um fóton de um fluoróforo energicamente excitado (ou seja, “fluoróforo doador”) eleva o estado de energia de um elétron em outra molécula (ou seja, “o aceitador”) para níveis vibracionais mais altos do estado singleto excitado. O fluoróforo doador retorna ao estado fundamental sem emitir uma característica de fluorescência desse fluoróforo. O aceitador pode ser outro fluoróforo ou molécula não fluorescente. Se o aceitador for um fluoróforo, a energia transferida é emitida como característica de fluorescência desse fluoróforo. Se o aceitador for uma molécula que não resida no fluido, a energia absorvida é perdida como calor. Assim, no contexto das modalidades reveladas no presente documento, o par fluoróforo/inibidor é substituído por um par doador fluoróforo/aceitador anexado à molécula de oligonucleotídeo. Quando intacta, o construto de mascaramento gera um primeiro sinal (sinal detectável negativo) como detectado pela fluorescência ou calor emitido pelo aceitador. Após a ativação das proteínas efetoras reveladas no presente documento, o oligonucleotídeo de RNA é clivado e a FRET é interrompida de modo que a fluorescência do fluoróforo doador seja agora detectada (sinal detectável positivo).

[0197] Em certas modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento compreende o uso de corantes intercalantes que alteram sua absorvância em resposta à clivagem de RNAs longos em nucleotídeos curtos. Existem vários desses corantes. Por exemplo, a pironina-Y se complexa com o RNA e forma um complexo com absorvância a 572 nm. A clivagem do RNA resulta em perda de absorvância e mudança de cor. O azul de metileno pode ser usado de maneira similar, com alterações na absorvância a 688 nm após a clivagem do RNA. Por conseguinte, em certas modalidades exemplificadoras, o construto de mascaramento compreende um complexo de RNA e corante intercalante que altera a absorvância na clivagem do RNA pelas proteínas efetoras reveladas no presente documento.

Amplificação

[0198] Em certas modalidades exemplificadoras, RNAs e/ou DNAs alvo podem ser amplificados antes da ativação da proteína efetora CRISPR. Qualquer técnica de amplificação de RNA ou DNA adequada pode ser usada. Em certas modalidades exemplificadoras, a amplificação de RNA ou DNA é uma amplificação isotérmica. Em certas modalidades exemplificadoras, a amplificação isotérmica pode ser amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA), amplificação de polimerase de recombinase (RPA), amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação dependente de helicase (HDA) ou reação de amplificação enzimática de corte (NEAR). Em certas modalidades exemplificadoras, métodos de amplificação não isotérmica podem ser usados, que incluem, entre outros, PCR, amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), amplificação de círculo rolante (RCA), reação em cadeia da ligase (LCR) ou método de amplificação de ramificação (RAM).

[0199] Em certas modalidades exemplificadoras, a amplificação baseada em sequência de ácido nucleico de amplificação de RNA ou DNA é NASBA, que é iniciada com a transcrição reversa do RNA alvo por um primer reverso específico da sequência para criar um duplex de RNA/DNA. A RNase H é, então, usada para degradar o molde de RNA, permitindo que um primer direto contendo um promotor, como o promotor T7, se ligue e inicie o alongamento da fita complementar, gerando um produto de DNA de fita dupla. A transcrição do modelo de DNA mediada pelo promotor da RNA polimerase cria cópias da sequência de RNA alvo. É importante ressaltar que cada um dos novos RNAs alvo pode ser detectado pelos RNAs guia, melhorando ainda mais a sensibilidade do ensaio. A ligação dos RNAs alvo pelos RNAs guia leva à ativação da proteína efetora CRISPR e os métodos prosseguem conforme descrito acima. A reação da NASBA tem a vantagem adicional de poder prosseguir em condições isotérmicas moderadas, por exemplo, a aproximadamente 41 °C, tornando a mesma adequada para sistemas e dispositivos implantados para detecção precoce e direta em campo e longe de laboratórios clínicos.

[0200] Em certas outras modalidades exemplificadoras, uma reação de amplificação por recombinase polimerase (RPA) pode ser usada para amplificar os ácidos nucleicos alvo. As reações de RPA empregam recombinases que são capazes de emparelhar primers específicos de sequência com sequências homólogas em DNA dúplex. Se o DNA alvo estiver presente, a amplificação do DNA é iniciada e nenhuma outra manipulação de amostra, como ciclagem térmica ou fusão química, é necessária. Todo o sistema de amplificação RPA é estável como uma formulação seca e pode ser transportado com segurança sem refrigeração. As reações RPA também podem ser realizadas a temperaturas isotérmicas com uma temperatura ótima de reação de 37 a 42 °C. Os primers específicos da sequência são projetados para amplificar uma sequência que compreende a sequência de ácido nucleico alvo a ser detectada. Em certas modalidades exemplificadoras, um promotor de RNA polimerase, como um promotor T7, é adicionado a um dos primers. Isso resulta em um produto amplificado de DNA de cadeia dupla que compreende a sequência alvo e um promotor de RNA polimerase. Após, ou durante a reação RPA, é adicionada uma RNA polimerase que produzirá RNA a partir dos modelos de DNA de fita dupla. O RNA alvo amplificado pode então ser detectado pelo sistema efetor CRISPR. Desta maneira, o DNA alvo pode ser detectado usando as modalidades reveladas no presente documento. As reações RPA também podem ser usadas para amplificar o RNA alvo. O RNA alvo é primeiro convertido em cDNA usando uma transcriptase reversa, seguida pela síntese de DNA da segunda fita, momento em que a reação RPA prossegue conforme descrito acima.

[0201] Por conseguinte, em certas modalidades exemplificadoras, os sistemas revelados no presente documento podem incluir reagentes de amplificação.

Diferentes componentes ou reagentes úteis para amplificação de ácidos nucleicos são descritos aqui. Por exemplo, um reagente de amplificação como descrito no presente documento pode incluir um tampão, como um tampão Tris. Um tampão Tris pode ser usado em qualquer concentração apropriada para a aplicação ou uso desejado, por exemplo, incluindo, entre outros, uma concentração de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 1 M ou similares. Um versado na técnica será capaz de determinar uma concentração apropriada de um tampão, como Tris, para uso com a presente invenção.

[0202] Um sal, como cloreto de magnésio (MgCL), cloreto de potássio (KC1) ou cloreto de sódio (NaCl), pode ser incluído em uma reação de amplificação, como PCR, a fim de melhorar a amplificação de fragmentos de ácidos nucleicos. Embora a concentração de sal dependa da reação e aplicação particulares, em algumas modalidades, fragmentos de ácido nucleico de um tamanho específico podem produzir resultados ótimos em concentrações específicas de sal. Os produtos maiores podem exigir concentrações alteradas de sal, normalmente menos sal, para produzir os resultados desejados, enquanto a amplificação de produtos menores pode produzir melhores resultados em concentrações mais elevadas de sal. Um versado na técnica entenderá que a presença e/ou concentração de um sal, juntamente com a alteração das concentrações de sal, podem alterar o rigor de uma reação biológica ou química e, portanto, qualquer sal pode ser usado que forneça as condições apropriadas para uma reação da presente invenção e como descrito no presente documento.

[0203] Outros componentes de uma reação biológica ou química podem incluir um componente de lise celular para romper ou lisar uma célula para análise dos materiais contidos na mesma.

Um componente de lise celular pode incluir, sem limitação, um detergente, um sal, como descrito acima, como NaCl, KC1, sulfato de amônio [(NH^SCU]

ou outros.

Detergentes que podem ser apropriados para a invenção podem incluir Triton X-100, dodecilsulfato de sódio (SDS), CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-l-

propanossulfonato), brometo de etil trimetil amônio,

nonilfenoxipolietoxietanol (NP-40). As concentrações de detergentes podem depender da aplicação específica e, em alguns casos, pode ser específico para a reação.

As reações de amplificação podem incluir dNTPs e primers de ácido nucleico usados em qualquer concentração apropriada para a invenção, como a inclusão, entre outros, de uma concentração de 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM,

750 nM, 800 nM, 850 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 mM, 2 mM,

3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 25 0 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM ou similares.

Da mesma forma, uma polimerase útil de acordo com a invenção pode ser qualquer polimerase específica ou geral conhecida na técnica e útil para a invenção,

incluindo polimerase Taq, polimerase Q5 ou similares.

[0204] Em algumas modalidades, os reagentes de amplificação como descrito no presente documentos podem ser apropriados para uso em amplificação de partida a quente. A amplificação de partida a quente pode ser benéfica em algumas modalidades para reduzir ou eliminar a dimerização de moléculas ou oligos adaptadores, ou para impedir produtos ou artefatos de amplificação indesejados e obter amplificação ideal do produto desejado. Muitos componentes descritos no presente documentos para uso em amplificação também podem ser usados em amplificação de partida a quente. Em algumas modalidades, reagentes ou componentes apropriados para uso com amplificação de partida a quente podem ser usados no lugar de um ou mais dos componentes da composição, conforme apropriado. Por exemplo, uma polimerase ou outro reagente pode ser usado que exibe uma atividade desejada a uma temperatura específica ou outra condição de reação. Em algumas modalidades, podem ser usados reagentes que são projetados ou otimizados para uso em amplificação de partida a quente, por exemplo, uma polimerase pode ser ativada após a transposição ou após atingir uma temperatura específica. Tais polimerases podem ser baseadas em anticorpos ou baseadas em aptâmeros. As polimerases como aqui descritas são conhecidas na técnica.

Exemplos de tais reagentes podem incluir, sem limitação, polimerases de partida a quente, dNTPs de partida a quente e dNTPs de fotoenvelhecimento. Tais reagentes são conhecidos e estão disponíveis na técnica. Um versado na técnica será capaz de determinar as temperaturas ótimas conforme apropriado para reagentes individuais.

[0205] A amplificação de ácidos nucleicos pode ser realizada com o uso de máquinas ou equipamentos de ciclo térmico específico, e pode ser realizada em reações únicas ou em batelada, de modo que qualquer número desejado de reações possa ser realizado simultaneamente. Em algumas modalidades, a amplificação pode ser realizada com o uso de dispositivos microfluídicos ou robóticos, ou pode ser realizada com o uso de alteração manual nas temperaturas para alcançar a amplificação desejada. Em algumas modalidades, a otimização pode ser realizada para obter as condições de reação ideais para a aplicação ou materiais específicos. Um versado na técnica compreenderá e poderá otimizar as condições de reação para obter amplificação suficiente.

[0206] Em certas modalidades, a detecção de DNA com os métodos ou sistemas da invenção requer a transcrição do DNA (amplificado) para o RNA antes da detecção.

Amplificação de sinal baseada na geração de alvo e liberação guia

[0207] Em certas modalidades exemplificadoras, as composições, sistemas e métodos revelados no presente documento podem compreender adicionalmente a adição de um alvo secundário. O alvo secundário é distinto do alvo primário e pode ser genérico entre os ensaios. O alvo secundário pode ser adicionado a cada ensaio em alta concentração. Uma sequência guia correspondente ao alvo secundário é incluída em cada volume de ensaio. A sequência guia do alvo secundário seria protegida de tal forma que não teria a capacidade de se ligar ao alvo secundário ou a uma proteína efetora de detecção CRISPR, como uma proteína Casl3. O grupo ou estrutura de proteção é configurado de modo que possa ser clivado após a ativação da proteína efetora de detecção CRISPR. Uma vez que o grupo ou estrutura protetora é removido, a sequência guia liberada tem a capacidade de formar um complexo com proteínas efetoras CRISPR de detecção em solução e desencadear uma ativação adicional da proteína efetora de CRISPR de detecção e, assim, levar à geração adicional de um sinal detectável por modificação do construtos repórter.

[0208] Alternativamente, a sequência guia secundária pode ser adicionada a cada volume de ensaio junto com um alvo protegido. A clivagem do grupo ou estrutura protetora do alvo por detecção da proteína efetora CRISPR ativada permitiria a formação de complexos adicionais da proteína efetora CRISPR/sequência guia/sequência alvo secundária, aumentando ainda mais o efeito colateral.

[0209] Em certas modalidades exemplificadoras, o grupo ou estrutura de proteção pode ser um loop de estrutura secundária de bloqueio que é separado por atividade colateral.

[0210] Em outro aspecto, o efeito colateral ativado pode clivar um primer protegido ou circularizado, que seria liberado para realizar uma reação de amplificação em um modelo para a sequência guia, sequência alvo ou ambas. Em certas modalidades exemplificadoras, a reação de amplificação é uma reação de amplificação isotérmica, como uma amplificação de polimerase de recombinase ou amplificação de círculo rolante. A transcrição subsequente do modelo amplificado produziria mais sequência guia e/ou alvo, permitindo uma detecção adicional de ativação da proteína efetora CRISPR.

Enriquecimento de rna/dna alvo

[0211] Em certas modalidades exemplificadoras, o RNA ou DNA alvo pode primeiro ser enriquecido antes da detecção ou amplificação do RNA ou DNA alvo. Em certas modalidades exemplificadoras, esse enriquecimento pode ser alcançado pela ligação dos ácidos nucleicos alvo por um sistema efetor CRISPR.

[0212] Os protocolos atuais de enriquecimento específico para o alvo requerem ácido nucleico de fita simples antes da hibridização com sondas. Entre várias vantagens, as presentes modalidades podem pular essa etapa e permitir o direcionamento direto para o DNA de fita dupla (parcial ou completamente de fita dupla). Além disso, as modalidades reveladas no presente documento são métodos de direcionamento acionados por enzimas que oferecem cinética mais rápida e fluxo de trabalho mais fácil, permitindo o enriquecimento isotérmico. Em certas modalidades exemplificadoras, o enriquecimento pode ocorrer entre 20 a 37 °C. Em certas modalidades exemplificadoras, um conjunto de RNAs guia para diferentes ácidos nucleicos alvo é usado em um único ensaio, permitindo a detecção de múltiplos alvos e/ou múltiplas variantes de um único alvo.

[0213] Em certas modalidades exemplificadoras, a proteína efetora CRISPR morta pode se ligar ao ácido nucleico alvo em solução e, em seguida, ser isolada da dita solução. Por exemplo, a proteína efetora CRISPR morta ligada ao ácido nucleico alvo pode ser isolada da solução com o uso de um anticorpo ou outra molécula, como um aptâmero, que se liga especificamente à proteína efetora CRISPR morta.

[0214] Em outras modalidades exemplificadoras, a proteína efetora CRISPR morta pode ser ligada a um substrato sólido.

Um substrato fixo pode se referir a qualquer material que seja apropriado ou possa ser modificado para ser apropriado para a ligação de um polipeptídeo ou um polinucleotídeo.

Os possíveis substratos incluem, entre outros, vidro e vidro funcionalizado modificado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno,

polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon™, etc.),

polissacarídeos, náilon ou nitrocelulose, cerâmica,

resinas, sílica ou materiais à base de sílica, incluindo silício e silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, plásticos, feixes de fibras ópticas e uma variedade de outros polímeros.

Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma superfície padronizada adequada para imobilização de moléculas em um padrão ordenado.

Em certas modalidades, uma superfície padronizada se refere a um arranjo de diferentes regiões dentro ou sobre uma camada exposta de um suporte sólido.

Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma matriz de poços ou depressões em uma superfície.

A composição e a geometria do suporte sólido podem variar com o seu uso.

Em algumas modalidades, o suporte de sólidos é uma estrutura plana, como uma lâmina, chip, microchip e/ou matriz.

Como tal, a superfície do substrato pode estar na forma de uma camada plana.

Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma ou mais superfícies de uma célula de fluxo.

O termo “célula de fluxo”, conforme usado no presente documento, se refere a uma câmara que compreende uma superfície sólida através da qual um ou mais reagentes de fluido podem ser escoados. Células de fluxo de exemplo e sistemas fluídicos relacionados e plataformas de detecção que podem ser facilmente usados nos métodos da presente revelação são descritos, por exemplo, em Bentley et al.

Nature 456: 53 a 59 (2008), WO 04/0918497, US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281 e US 2008/0108082. Em algumas modalidades, o suporte sólido ou sua superfície é não plana, como a superfície interna ou externa de um tubo ou vaso. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende microesferas ou contas. “Microesferas”, “contas”, “partículas” pretendem significar, no contexto de um substrato sólido, pequenas partículas discretas feitas de vários materiais, incluindo, sem limitação, plásticos, cerâmicas, vidro e poliestireno. Em certas modalidades, as microesferas são contas ou microesferas magnéticas.

Alternativa ou adicionalmente, as contas podem ser porosas.

Os tamanhos das contas variam de nanômetros, por exemplo, 100 nm, a milímetros, por exemplo, 1 mm.

[0215] Uma amostra contendo, ou suspeita de conter, os ácidos nucleicos alvo pode então ser exposta ao substrato para permitir a ligação dos ácidos nucleicos alvo à proteína efetora CRISPR morta ligada. Moléculas não alvo podem então ser lavadas. Em certas modalidades exemplificadoras, os ácidos nucleicos alvo podem então ser liberados a partir do complexo de proteína/RNA guia efetor do CRISPR para detecção adicional com o uso dos métodos revelados no presente documento. Em certas modalidades exemplificadoras, os ácidos nucleicos alvo podem primeiro ser amplificados como descrito no presente documento.

[0216] Em certas modalidades exemplificadoras, o efetor CRISPR pode ser marcado com uma etiqueta de ligação.

Em certas modalidades exemplificadoras, o efetor CRISPR pode ser quimicamente marcado. Por exemplo, o efetor CRISPR pode ser quimicamente biotinilado. Em outro exemplo de modalidade, uma fusão pode ser criada adicionando sequência adicional que codifica uma fusão ao efetor CRISPR. Um exemplo dessa fusão é o AviTag™, que emprega uma conjugação enzimática altamente direcionada de uma única biotina em um único marcador peptídico de 15 aminoácidos. Em certas modalidades, o efetor CRISPR pode ser marcado com uma etiqueta de captura, como, sem limitação, GST, Myc, hemaglutinina (HA), proteína verde fluorescente (GFP), bandeira, etiqueta His, etiqueta TAP e etiqueta Fc. A etiqueta de ligação, seja uma etiqueta de fusão, química ou de captura, pode ser usada para puxar o sistema efetor

CRISPR uma vez que ele tenha ligado um ácido nucleico alvo ou para fixar o sistema efetor CRISPR no substrato sólido.

[0217] Em certas modalidades exemplificadoras, o RNA guia pode ser marcado com uma etiqueta de ligação. Em certas modalidades exemplificadoras, o RNA guia inteiro pode ser marcado com o uso da transcrição in vitro (IVT) incorporando um ou mais nucleotídeos biotinilados, como uracil biotinilado. Em algumas modalidades, a biotina pode ser adicionada química ou enzimaticamente ao RNA guia, como a adição de um ou mais grupos de biotina na extremidade 3’ do RNA guia. A etiqueta de ligação pode ser usada para eliminar o complexo RNA guia/ácido nucleico alvo após a ligação ter ocorrido, por exemplo, expondo o RNA guia/ácido nucleico alvo a um substrato sólido revestido com estreptavidina.

[0218] Por conseguinte, em certas modalidades exemplificadoras, um efetor de CRISPR projetado ou não natural pode ser usado para fins de enriquecimento. Em uma modalidade, a modificação pode compreender a mutação de um ou mais resíduos de aminoácidos da proteína efetora. As uma ou mais mutações podem estar em um ou mais domínios cataliticamente ativos da proteína efetora. A proteína efetora pode ter atividade de nuclease reduzida ou abolida em comparação com uma proteína efetora sem as ditas uma ou mais mutações. A proteína efetora pode não direcionar a clivagem da fita de RNA no local de interesse do alvo. Em uma modalidade preferencial, a uma ou mais mutações podem compreender duas mutações. Em uma modalidade preferencial, o um ou mais resíduos de aminoácidos são modificados em uma proteína efetora C2c2, por exemplo, uma proteína efetora ou C2c2 modificada ou não natural. Em modalidades particulares, o um ou mais resíduos de aminoácidos modificados ou mutados são um ou mais mangueiras em C2c2 correspondentes a R597, H602, R1278 e H1283 (com referência aos aminoácidos Lsh C2c2), como as mutações R597A, H602A, R1278A e H1283 A, ou os resíduos de aminoácidos correspondentes nos ortólogos de Lsh C2c2.

[0219] Em modalidades particulares, o um ou mais resíduos de aminoácidos modificados ou mutados são um ou mais daqueles em C2c2 correspondentes a K2, K39, V40, E479, L514, V518, N524, G534, K535, E580, L597, V602, D630, F676, L709,1713, R717 (HEPN), N718, H722 (HEPN), E773, P823, V828,1879, Y880, F884, Y997, L1001, F1009, L1013, Y1093, L1099, LI 111, Y1114, L1203, D1222, Y1244, L1250, L1253, K1261,11334, L1355, L1359, R1362, Y1366, E1371, R1372, D1373, R1509 (HEPN), H1514 (HEPN), Y1543, D1544, K1546, KI548, VI551,11558 de acordo com a numeração de consenso C2c2. Em certas modalidades, o um ou mais resíduos de aminoácidos modificados ou mutados são um ou mais daqueles em C2c2 correspondentes a R717 e R1509. Em certas modalidades, o um ou mais resíduos de aminoácidos modificados ou mutados são um ou mais daqueles em C2c2 correspondentes a K2, K39, K535, KI261, R1362, R1372, KI546 e KI548. Em certas modalidades, as ditas mutações resultam em uma proteína com uma atividade alterada ou modificada.

Em certas modalidades, as ditas mutações resultam em uma proteína com uma atividade reduzida, como especificidade reduzida. Em certas modalidades, as ditas mutações resultam em uma proteína que não tem atividade catalítica (isto é, C2c2 “morta”). Em uma modalidade, os ditos resíduos de aminoácidos correspondem aos resíduos de aminoácidos Lsh C2c2 ou os resíduos de aminoácidos correspondentes de uma proteína C2c2 de uma espécie diferente. Dispositivos que podem facilitar essas etapas.

[0220] Os sistemas de enriquecimento acima também podem ser usados para esgotar uma amostra de certos ácidos nucleicos. Por exemplo, os RNAs guia podem ser projetados para ligar RNAs não alvo para remover os RNAs não alvo da amostra. Em uma modalidade exemplificadora, os RNAs guia podem ser projetados para ligar ácidos nucleicos que carregam uma variação particular de ácido nucleico. Por exemplo, em uma determinada amostra, pode ser esperado um número de cópias mais alto de ácidos nucleicos não variantes. Por conseguinte, as modalidades reveladas no presente documento podem ser usadas para remover os ácidos nucleicos não variantes de uma amostra, para aumentar a eficiência com a qual o sistema efetor de detecção CRISPR pode detectar as sequências variantes alvo em uma determinada amostra.

Detecção de proteínas

[0221] Os sistemas, dispositivos e métodos revelados no presente documento podem ser adaptados para a detecção de polipeptídeos (ou outras moléculas), além da detecção de ácidos nucleicos, via incorporação de um aptâmero de detecção de polipeptídeo configurado especificamente. Os aptâmeros de detecção de polipeptídeo são distintos dos aptâmeros do construto de mascaramento discutidos acima. Primeiro, os aptâmeros são projetados para se ligarem especificamente a uma ou mais moléculas alvo. Em um exemplo de modalidade, a molécula alvo é um polipeptídeo alvo. Em outro exemplo de modalidade, a molécula alvo é um composto químico alvo, como uma molécula terapêutica alvo. Os métodos para projetar e selecionar aptâmeros com especificidade para um determinado alvo, como SELEX, são conhecidos na técnica. Além da especificidade para um determinado alvo, os aptâmeros são ainda projetados para incorporar um sítio de ligação ao promotor da RNA polimerase. Em certas modalidades exemplificadoras, o promotor da RNA polimerase é um promotor T7. Antes da ligação a um alvo, o sítio da RNA polimerase não é acessível ou reconhecível de outra forma por uma RNA polimerase. No entanto, o aptâmero é configurado para que, após a ligação de um alvo, a estrutura do aptâmero sofra uma alteração conformacional de modo que o promotor da RNA polimerase seja exposto. Uma sequência de aptâmero a jusante do promotor de RNA polimerase atua como um modelo para a geração de um oligonucleotídeo de RNA de gatilho por uma RNA polimerase. Assim, a porção de modelo do aptâmero pode ainda incorporar um código de barras ou outra sequência de identificação que identifique um determinado aptâmero e seu alvo. Os RNAs guia, como descrito acima, podem então ser projetados para reconhecer essas sequências oligonucleotídicas desencadeadoras específicas. A ligação dos RNAs guia aos oligonucleotídeos de gatilho ativa as proteínas efetoras CRISPR, que procedem à desativação dos construtos de mascaramento e geram um sinal detectável positivo, como descrito anteriormente.

[0222] Por conseguinte, em certas modalidades exemplificadoras, os métodos revelados no presente documento compreendem a etapa adicional de distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um conjunto de volumes discretos individuais, em que cada volume discreto individual compreende aptâmeros de detecção de peptídeo, uma proteína efetora CRISPR, uma ou mais RNAs guia, um construto de mascaramento e incubação da amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação dos aptâmeros de detecção de peptídeo a uma ou mais moléculas alvo, em que a ligação do aptâmero a um alvo correspondente expôs a ligação do promotor do sítio da RNA polimerase que resulta na síntese de um RNA gatilho via ligação de uma RNA polimerase ao sítio de ligação do promotor da RNA polimerase.

[0223] Em outro exemplo de modalidade, a ligação do aptâmero pode expor um sítio de ligação do primer após a ligação do aptâmero a um polipeptídeo alvo. Por exemplo, o aptâmero pode expor um sítio de ligação ao primer RPA.

Assim, a adição ou inclusão do primer irá então alimentar uma reação de amplificação, como a reação RPA, conforme descrito acima.

Dispositivos

[0224] Os sistemas descritos no presente documento podem ser incorporados em dispositivos de diagnóstico. Um número de substratos e configurações de dispositivos com a capacidade de definir vários volumes discretos individuais dentro do dispositivo pode ser usado. Como usado no presente documento, “volume discreto individual” se refere a um espaço discreto, como um recipiente, receptáculo ou outro volume ou espaço definido arbitrariamente que pode ser definido por propriedades que impedem e/ou inibem a migração de moléculas alvo, por exemplo, um volume ou espaço definido por propriedades físicas, como paredes, por exemplo, as paredes de um poço, tubo ou superfície de uma gota, que pode ser impermeável ou semipermeável, ou como definido por outros meios, como químicos, taxa de difusão limitada, eletromagnética, ou iluminação da luz, ou qualquer combinação das mesmas que possa conter uma molécula alvo e um identificador de ácido nucleico indexável (por exemplo, código de barras de ácido nucleico). Por “taxa de difusão limitada” (por exemplo, volumes definidos por difusão) entende-se espaços acessíveis apenas a determinadas moléculas ou reações, devido ao fato de que as restrições de difusão definem efetivamente um espaço ou volume, como seria o caso de duas correntes laminares paralelas em que a difusão limitará a migração de uma molécula alvo de uma corrente para a outra.

Por volume ou espaço definido “químico” entende-se espaços em que apenas certas moléculas alvo podem existir devido às suas propriedades químicas ou moleculares, como tamanho, em que, por exemplo, esferas de gel podem excluir certas espécies de entrar nas esferas, mas não outras, como por carga superficial, tamanho da matriz ou outras propriedades físicas da microesfera que podem permitir a seleção de espécies que podem entrar no interior da microesfera. Por volume ou espaço definido “eletromagneticamente” entende-se espaços em que as propriedades eletromagnéticas das moléculas alvo ou seus suportes, como propriedades de carga ou magnéticas, podem ser usadas para definir determinadas regiões em um espaço, como capturar partículas magnéticas dentro de um campo magnético ou diretamente em ímãs. Por volume definido “opticamente” entende-se qualquer região do espaço que possa ser definida iluminando-a com comprimentos de onda visíveis, ultravioleta, infravermelho ou outros comprimentos de onda, de modo que apenas moléculas alvo dentro do espaço ou volume definido possam ser rotuladas.

Uma vantagem do uso de volumes discretos sem paredes ou semipermeáveis é que alguns reagentes, como tampões, ativadores químicos ou outros agentes, podem passar pelo volume discreto, enquanto outros materiais, como moléculas alvo, podem ser mantidos no volume ou espaço discreto.

Tipicamente, um volume discreto incluirá um meio fluido (por exemplo, uma solução aquosa, um óleo, um tampão e/ou um meio com a capacidade de suportar o crescimento celular) adequado para a marcação da molécula alvo com o identificador de ácido nucleico indexável sob condições que permitem a rotulagem. Exemplos de volumes ou espaços discretos úteis nos métodos revelados incluem gotículas (por exemplo, gotículas microfluídicas e/ou gotículas de emulsão), contas de hidrogel ou outras estruturas poliméricas (por exemplo contas de diacrilato de polietilenoglicol ou contas de agarose), lâminas de tecido

(por exemplo, lâminas fixas de tecido embebidas em parafina de formalina com regiões, volumes ou espaços específicos definidos por meios químicos, ópticos ou físicos), lâminas de microscópio com regiões definidas pelo depósito de reagentes em matrizes ordenadas ou padrões aleatórios, tubos (como tubos de centrifugação, microcentrífuga) tubos, tubos de ensaio, cubetas, tubos cônicos e similares), garrafas (como garrafas de vidro, garrafas plásticas, garrafas de cerâmica, frascos de Erlenmeyer, frascos de cintilação e similares), poços (como poços em um prato), placas, pipetas ou pontas de pipetas, entre outros. Em certas modalidades, o compartimento é uma gota aquosa em uma emulsão de água em óleo. Em modalidades específicas, qualquer uma das aplicações, métodos ou sistemas descritos no presente documento que exijam volumes exatos ou uniformes pode empregar o uso de um dispensador de líquido acústico.

[0225] Em certas modalidades exemplificadoras, o dispositivo compreende um substrato de material flexível no qual vários pontos podem ser definidos. Os materiais de substrato flexíveis adequados para uso em diagnóstico e biossensibilidade são conhecidos na técnica. Os materiais de substrato flexível podem ser feitos de fibras derivadas de plantas, como fibras celulósicas, ou podem ser feitas de polímeros flexíveis, como filmes de poliéster flexíveis e outros tipos de polímeros.

Dentro de cada ponto definido,

os reagentes do sistema descrito no presente documento são aplicados aos pontos individuais.

Cada ponto pode conter os mesmos reagentes, exceto um RNA guia diferente ou um conjunto de RNAs guia, ou, quando aplicável, um aptâmero de detecção diferente para rastrear vários alvos ao mesmo tempo.

Assim, os sistemas e dispositivos deste documento podem ser capazes de rastrear amostras de várias fontes

(por exemplo, várias amostras clínicas de indivíduos diferentes) quanto à presença do mesmo alvo, ou um número limitado de alvos ou alíquotas de uma única amostra (ou várias amostras da mesma fonte) para a presença de vários destinos diferentes na amostra.

Em certas modalidades exemplificadoras, os elementos dos sistemas descritos no presente documento são liofilizados no substrato de papel ou pano.

Exemplos de substratos à base de material flexível que podem ser usados em certos dispositivos de exemplo são revelados em Pardee et al.

Cell. 2016, 165(5): 1255-66 e

Pardee et al.

Cell. 2014, 159(4): 950-54. Substratos à base de material flexível adequados para uso com fluidos biológicos, incluindo sangue, são revelados na Publicação de Pedido de Patente Internacional no WO/2013/071301,

intitulada “Paper based diagnostic test”, de Shevkoplyas et al.

A publicação do pedido de patente no US 2011/0111517 intitulada “Paper-based microfluidic systems” de Siegel et al. e Shafiee et al. “Paper and Flexible Substrates as Materials for Biosensing Platforms to Detect Multiple Biotargets” Scientific Reports 5:8719 (2015). Outros materiais de base flexível, incluindo aqueles adequados para uso em dispositivos de diagnóstico vestíveis, são revelados em Wang et al. “Flexible Substrate-Based Devices for Point-of-Care Diagnostics” Cell 34(ll): 909-21 (2016).

Outros materiais de base flexível podem incluir nitrocelulose, policarbonato, metiletilcelulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF), poliestireno ou vidro (consulte, por exemplo, o documento US20120238008). Em certas modalidades, volumes discretos são separados por uma superfície hidrofóbica, como, sem limitação, cera, foto- resistência ou tinta sólida.

[0226] Em algumas modalidades, pode ser fornecido um dosímetro ou crachá que serve como sensor ou indicador, de modo que o usuário seja notificado da exposição a certos micróbios ou outros agentes. Por exemplo, os sistemas descritos no presente documentos podem ser usados para detectar um patógeno específico. Da mesma forma, as modalidades baseadas no aptâmero reveladas acima podem ser usadas para detectar tanto o polipeptídeo quanto outros agentes, como agentes químicos, aos quais um aptâmero específico pode se ligar. Esse dispositivo pode ser útil para a vigilância de soldados ou outros militares, assim como clínicos, pesquisadores, funcionários do hospital e afins, a fim de fornecer informações relacionadas à exposição a micróbios potencialmente perigosos o mais rápido possível, por exemplo, para produtos biológicos. ou detecção de agentes de guerra química. Em outras modalidades, esse crachá de vigilância pode ser usado para impedir a exposição a micróbios ou patógenos perigosos em pacientes imunocomprometidos, pacientes queimados, pacientes submetidos à quimioterapia, crianças ou indivíduos idosos.

[0227] As fontes de amostras que podem ser analisadas usando os sistemas e dispositivos descritos no presente documentos incluem amostras biológicas de um indivíduo ou amostras ambientais. As amostras ambientais podem incluir superfícies ou fluidos. As amostras biológicas podem incluir, sem limitação, saliva, sangue, plasma, soros, fezes, urina, escarro, mucosa, linfa, líquido sinovial, líquido espinal, líquido cefalorraquidiano, um cotonete da pele ou membrana mucosa ou combinação disso. Em uma modalidade exemplificadora, a amostra ambiental é retirada de uma superfície sólida, como uma superfície usada na preparação de alimentos ou outras composições e materiais sensíveis.

[0228] Em outras modalidades exemplificadoras, os elementos dos sistemas descritos no presente documentos podem ser colocados em um substrato de uso único, como cotonete ou pano que é usado para esfregar uma superfície ou amostra de fluido. Por exemplo, o sistema poderia ser usado para testar a presença de um patógeno em um alimento limpando a superfície de um produto alimentar, como uma fruta ou vegetal. Da mesma forma, o substrato de uso único pode ser usado para esfregar outras superfícies para a detecção de certos micróbios ou agentes, como para uso na triagem de segurança. Os substratos de uso único também podem ter aplicações forenses, em que os sistemas CRISPR são projetados para detectar, por exemplo, a identificação de SNPs de DNA que podem ser usados para identificar um suspeito, ou certos marcadores de tecido ou célula para determinar o tipo de matéria biológica presente em uma amostra. Da mesma forma, o substrato de uso único pode ser usado para coletar uma amostra de um paciente - como uma amostra de saliva da boca - ou uma amostra de cotonete da pele. Em outras modalidades, uma amostra ou zaragatoa pode ser colhida de um produto de carne para detectar a presença de ausência de contaminantes no produto de carne ou dentro do mesmo.

[0229] São necessários diagnósticos microbianos quase em tempo real para ambientes alimentares, clínicos, industriais e outros ambientes ambientais (consulte, por exemplo, Lu TK, Bowers J e Koeris MS., Trends Biotechnol.

Trends Biotechnol. 2013 Jun; 31 (6):325-7). Em certas modalidades, a presente invenção é usada para detecção rápida de patógenos de origem alimentar usando RNAs guia específicos de um patógeno (por exemplo, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Salmonella spp., Escherichia coli, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Shigella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcal enteritis, Streptococcus, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis, Brucella spp., Corynebacterium ulcerans, Coxiella burnetii, ou Piesiomonas shigelloides).

[0230] Em certas modalidades, o dispositivo é ou compreende uma tira de fluxo. Por exemplo, uma tira de fluxo lateral permite a detecção de RNAse (por exemplo, C2c2) por cor. O repórter de RNA é modificado para ter uma primeira molécula (como, por exemplo, FITC) ligada à extremidade 5’ e uma segunda molécula (como, por exemplo, biotina) ligada à extremidade 3’ (ou vice-versa). A tira de fluxo lateral é projetada para ter duas linhas de captura com anticorpos anti-primeira molécula (por exemplo, anti- FITC) hibridizados na primeira linha e anticorpos anti- segunda molécula (por exemplo, anti-biotina) na segunda linha a jusante. À medida que a reação SHERLOCK flui pela tira, o repórter não clivado se liga aos anticorpos anti-

primeira molécula na primeira linha de captura, enquanto os repórteres clivados liberam a segunda molécula e permitem a ligação da segunda molécula na segunda linha de captura. Os anticorpos sanduíche da segunda molécula, por exemplo, conjugados com nanopartículas, como nanopartículas de ouro, ligam qualquer segunda molécula na primeira ou na segunda linha e resultam em uma leitura/sinal forte (por exemplo, cor). À medida que mais repórter é clivado, mais sinal se acumula na segunda linha de captura e menos sinal aparece na primeira linha. Em certos aspectos, a invenção se refere ao uso de uma tira de fluxo como descrito no presente documento para a detecção de ácidos nucleicos ou polipeptídeos. Em certos aspectos, a invenção se refere a um método para detectar ácidos nucleicos ou polipeptídeos com uma tira de fluxo como aqui definido, por exemplo, testes de fluxo (lateral) ou ensaios imunocromatográficos de fluxo (lateral).

[0231] Em certas modalidades exemplificadoras, o dispositivo é um dispositivo microfluídico que gera e/ou mescla gotículas diferentes (isto é, volumes discretos individuais). Por exemplo, um primeiro conjunto de gotículas pode ser formado contendo amostras a serem rastreadas e um segundo conjunto de gotículas formadas contendo os elementos dos sistemas descritos no presente documentos. Os primeiro e segundo conjuntos de gotículas são, então, mesclados e, em seguida, os métodos de diagnóstico descritos aqui são realizados no conjunto de gotículas mescladas. Os dispositivos microfluídicos revelados no presente documento podem ser chips à base de silicone e podem ser fabricados usando uma variedade de técnicas, incluindo, entre outras, estampagem a quente, moldagem de elastômeros, moldagem por injeção, LIGA, litografia macia, fabricação de silício e técnicas de processamento de filmes finos relacionadas. Os materiais adequados para a fabricação dos dispositivos microfluídicos incluem, sem limitação, copolímero de olefina cíclica (COC), policarbonato, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) e poli (metilacrilato) (PMMA). Em uma modalidade, a litografia macia em PDMS pode ser usada para preparar os dispositivos microfluídicos. Por exemplo, um molde pode ser produzido com o uso de fotolitografia que define a localização de canais de fluxo, válvulas e filtros dentro de um substrato.

O material do substrato é derramado em um molde e permitido a criação de um carimbo. O selo é, então, vedado em um suporte sólido, como, sem limitação, vidro. Devido à natureza hidrofóbica de alguns polímeros, como o PDMS, que absorve algumas proteínas e pode inibir certos processos biológicos, pode ser necessário um agente passivador (Schoffner et al. Nucleic Acids Research, 1996, 24:375 a 379). Os agentes passivadores adequados são conhecidos na técnica e incluem, entre outros, silanos, parileno, n- dodecil-bD-matosídeo (DDM), plurônico, Tween-20, outros surfactantes similares, polietileno glicol (PEG), albumina, colágeno e outras proteínas e peptídeos similares.

[0232] Em certas modalidades exemplificadoras, o sistema e/ou dispositivo podem ser adaptados para conversão em uma leitura de citometria de fluxo e/ou permitir medições sensíveis e quantitativas de milhões de células em uma única experiência e aprimorar os métodos baseados em fluxo existentes, como o ensaio PrimeFlow. Em certas modalidades exemplificadoras, as células podem ser moldadas em gotículas contendo monômero de gel não polimerizado, que podem então ser moldadas em gotículas de célula única adequadas para análise por citometria de fluxo. Um construto de detecção que compreende um marcador detectável fluorescente pode ser lançado na gota que compreende monômero de gel não polimerizado após polimerização do monômero de gel para formar uma esfera dentro de uma gota.

Como a polimerização em gel ocorre através da formação de radicais livres, o repórter fluorescente fica covalentemente ligado ao gel. O construto de detecção pode ser ainda modificado para compreender um ligante, como uma amina. Um silenciador pode ser adicionado à formação pós- gel e se ligará através do ligante ao construto repórter.

Assim, o silenciador não está ligado ao gel e é livre para se difundir quando o repórter é clivado pela proteína efetora CRISPR. A amplificação do sinal em gotículas pode ser alcançada por meio do acoplamento do construto de detecção de uma amplificação de reação em cadeia de hibridização (primers de HCR). Grampos de cabelo híbridos de DNA/RNA podem ser incorporados no gel, o que pode compreender um laço em gancho de cabelo que tem um domínio sensível à RNase. Mediante a proteção de um deslocamento da fita para dentro de um laço em gancho de cabelo que tem um domínio sensível à RNase, os primers de HCR podem ser desprotegidos seletivamente após a clivagem do laço em gancho de cabelo pela proteína efetora CRISPR. Após a desproteção dos primers de HCR através do deslocamento da cadeia mediada, os monómeros de HCR fluorescentes podem ser lavados no gel para permitir a amplificação do sinal em que os primers são desprotegidos.

[0233] Um exemplo de um dispositivo microfluídico que pode ser usado no contexto da invenção é descrito em Hou et al. “Direct Dectection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics” Lap Chip. 15 (10):2.297 a 2.307 (2016).

[0234] Os sistemas descritos no presente documento podem ainda ser incorporados a dispositivos médicos vestíveis que avaliam amostras biológicas, como fluidos biológicos, de um indivíduo fora do ambiente clínico e relatam o resultado do ensaio remotamente a um servidor central acessível por um profissional de assistência médica. O dispositivo pode incluir a capacidade de auto- amostrar sangue, como os dispositivos revelados na Publicação do Pedido de Patente no US 2015/0342509, intitulada “Needle-free Blood Draw” de Peeters et al., Publicação do Pedido de Patente no US 2015/0065821, intitulada “Nanoparticle Phoresis”, de Andrew Conrad.

[0235] Em certas modalidades exemplificadoras, o dispositivo pode compreender poços individuais, como poços de microplacas. O tamanho dos poços da microplaca pode ser o tamanho dos poços de tamanho padrão 6, 24, 96, 384, 1536, 3456 ou 9600. Em certas modalidades exemplificadoras, os elementos dos sistemas descritos no presente documento podem ser liofilizados e aplicados à superfície do poço antes da distribuição e uso.

[0236] Os dispositivos revelados no presente documento podem compreender adicionalmente orifícios de entrada e saída, ou aberturas, que por sua vez podem ser conectadas a válvulas, tubos, canais, câmaras e seringas e/ou bombas para a introdução e extração de fluidos dentro e do dispositivo. Os dispositivos podem ser conectados a atuadores de fluxo de fluido que permitem o movimento direcional de fluidos dentro do dispositivo microfluídico.

Exemplos de atuadores incluem, sem limitação, bombas de seringa, bombas de recirculação acionadas mecanicamente, bombas eletroosmóticas, bulbos, foles, diafragmas ou bolhas destinadas a forçar o movimento de fluidos. Em certas modalidades exemplificadoras, os dispositivos são conectados a controladores com válvulas programáveis que trabalham juntas para mover fluidos através do dispositivo.

Em certas modalidades exemplificadoras, os dispositivos são conectados aos controladores discutidos em mais detalhes abaixo. Os dispositivos podem ser conectados a atuadores de fluxo, controladores e dispositivos de carregamento de amostras por tubos que terminam em pinos de metal para inserção nas portas de entrada do dispositivo.

[0237] Como mostrado aqui, os elementos do sistema são estáveis quando liofilizados, portanto, modalidades que não requerem um dispositivo de suporte também são contempladas, ou seja, o sistema pode ser aplicado a qualquer superfície ou fluido que suporte as reações reveladas no presente documento e permita para detecção de um sinal detectável positivo dessa superfície ou solução.

Além da liofilização, os sistemas também podem ser armazenados de forma estável e usados de forma peletizada.

Os polímeros úteis na formação de formas peletizadas adequadas são conhecidos na técnica.

[0238] Em certas modalidades, a proteína efetora CRISPR é ligada a cada volume discreto no dispositivo. Cada volume discreto pode compreender um RNA guia diferente, específico para uma molécula alvo diferente. Em certas modalidades, uma amostra é exposta a um substrato sólido que compreende mais de um volume discreto cada um que compreende um RNA guia específico para uma molécula alvo.

Sem limitar-se a uma teoria, cada RNA guia capturará sua molécula alvo da amostra e a amostra não precisará ser dividida em ensaios separados. Assim, uma amostra valiosa pode ser preservada. A proteína efetora pode ser uma proteína de fusão que compreende um marcador de afinidade.

As tags de afinidade são bem conhecidas na técnica (por exemplo, tag HA, tag Myc, tag Flag, tag His, biotina). A proteína efetora pode estar ligada a uma molécula de biotina e os volumes discretos podem compreender estreptavidina. Em outras modalidades, a proteína efetora CRISPR é ligada por um anticorpo específico para a proteína efetora. Os métodos de ligação a uma enzima CRISPR foram descritos anteriormente (consulte, por exemplo, o documento US20140356867A1).

[0239] Os dispositivos revelados no presente documento também podem incluir elementos de dispositivos de ponto de atendimento (POC) conhecidos na técnica para analisar amostras por outros métodos. Veja, por exemplo, St John e Price, “Existing and Emerging Technologies for

Point-of-Care Testing” (Clin Biochem Rev. agosto de 2014; 35 (3): 155 a 167).

[0240] A presente invenção pode ser usada com um sistema de sensor de diagnóstico sem fio de laboratório em chip (LOC) (consulte, por exemplo, a Patente no US 9,470,699 “Diagnostic radio frequency identification sensors and applications thereof”). Em certas modalidades, a presente invenção é realizada em um LOC controlado por um dispositivo sem fio (por exemplo, um telefone celular, um assistente digital pessoal (PDA), um tablet) e os resultados são relatados ao dito dispositivo.

[0241] Os sistemas de etiquetas de identificação por radiofrequência (RFID) incluem uma etiqueta RFID que transmite dados para recepção por um leitor de RFID (também conhecido como interrogador). Em um sistema RFID típico, objetos individuais (por exemplo, mercadoria da loja) são equipados com uma etiqueta relativamente pequena que contém um transponder. O transponder tem um chip de memória que recebe um código eletrônico de produto exclusivo. O leitor RFID emite um sinal ativando o transponder dentro da etiqueta através do uso de um protocolo de comunicação. Por conseguinte, o leitor RFID tem a capacidade de ler e gravar dados na etiqueta. Além disso, o leitor de etiquetas RFID processa os dados de acordo com o aplicativo do sistema de etiquetas RFID. Atualmente, existem tags RFID do tipo passivo e ativo. A etiqueta RFID do tipo passivo não contém uma fonte de energia interna, mas é alimentada por sinais de radiofrequência recebidos do leitor RFID. Como alternativa, a etiqueta RFID do tipo ativo contém uma fonte de energia interna que permite que a etiqueta RFID do tipo ativo possua maiores faixas de transmissão e capacidade de memória. O uso de uma etiqueta passiva versus uma etiqueta ativa depende da aplicação específica.

[0242] A tecnologia Lab-on-the-chip está bem descrita na literatura científica e consiste em vários canais microfluídicos, poços de entrada ou químicos. As reações nos poços podem ser medidas usando a tecnologia de identificação por radiofrequência (RFID), uma vez que os condutores do chip eletrônico RFID podem ser ligados diretamente a cada um dos poços de teste. Uma antena pode ser impressa ou montada em outra camada do chip eletrônico ou diretamente na parte traseira do dispositivo. Além disso, os fios, a antena e o chip eletrônico podem ser incorporados ao chip LOC, evitando assim o curto-circuito dos eletrodos ou eletrônicos. Como o LOC permite análises e separação complexas de amostras, essa tecnologia permite que os testes LOC sejam realizados independentemente de um leitor complexo ou caro. Em vez disso, um dispositivo sem fio simples, como um telefone celular ou um PDA, pode ser usado. Em uma modalidade, o dispositivo sem fio também controla a separação e o controle dos canais microfluídicos para análises LOC mais complexas. Em uma modalidade, um LED e outros dispositivos eletrônicos de medição ou detecção estão incluídos no chip LOC-RFID. Não estando limitada por uma teoria, essa tecnologia é descartável e permite que testes complexos que exijam separação e mistura sejam realizados fora de um laboratório.

[0243] Em modalidades preferenciais, o LOC pode ser um dispositivo microfluídico. O LOC pode ser um chip passivo, em que o chip é alimentado e controlado através de um dispositivo sem fio. Em certas modalidades, o LOC inclui um canal microfluídico para reter reagentes e um canal para introdução de uma amostra. Em certas modalidades, um sinal do dispositivo sem fio fornece energia ao LOC e ativa a mistura da amostra e dos reagentes de ensaio.

Especificamente, no caso da presente invenção, o sistema pode incluir um agente de mascaramento, proteína efetora CRISPR e RNAs guia específicos para uma molécula alvo. Após a ativação do LOC, o dispositivo microfluídico pode misturar a amostra e reagir o ensaio. Após a mistura, um sensor detecta um sinal e transmite os resultados para o dispositivo sem fio. Em certas modalidades, o agente desmascarador é uma molécula de RNA condutora. A molécula de RNA condutor pode ser ligada ao material condutor. As moléculas condutoras podem ser nanopartículas condutoras,

proteínas condutoras, partículas de metal que estão ligadas à proteína ou ao látex ou a outras esferas condutoras. Em certas modalidades, se DNA ou RNA for usado, as moléculas condutoras podem ser conectadas diretamente às fitas de DNA ou RNA correspondentes. A liberação das moléculas condutoras pode ser detectada através de um sensor. O ensaio pode ser um processo de uma etapa.

[0244] Como a condutividade elétrica da área da superfície pode ser medida com precisão, são possíveis resultados quantitativos nos eletroensaios de RFID sem fio descartáveis. Além disso, a área de teste pode ser muito pequena, permitindo que mais testes sejam feitos em uma determinada área e, portanto, resultando em economia de custos. Em certas modalidades, sensores separados, cada um associado a uma proteína efetora CRISPR diferente e o RNA guia imobilizado em um sensor, são usados para detectar múltiplas moléculas alvo. Sem limitar-se a uma teoria, a ativação de diferentes sensores pode ser diferenciada pelo dispositivo sem fio.

[0245] Além dos métodos condutivos descritos no presente documentos, podem ser usados outros métodos que dependem de RFID ou Bluetooth como plataforma básica de comunicação e energia de baixo custo para um ensaio de RFID descartável. Por exemplo, meios ópticos podem ser usados para avaliar a presença e o nível de uma dada molécula alvo. Em certas modalidades, um sensor óptico detecta o desmascaramento de um agente de mascaramento fluorescente.

[0246] Em certas modalidades, o dispositivo da presente invenção pode incluir dispositivos portáteis para leitura de diagnóstico de um ensaio (consulte, por exemplo, Vashist et al., Commercial Smartphone-Based Devices and Smart Applications for Personalized Healthcare Monitoring and Management, Diagnostics 2014, 4 (3), 104 a 128; mReader do Mobile Assay; e Holomic Rapid Diagnostic Test Reader).

[0247] Como observado no presente documento, certas modalidades permitem a detecção via alteração colorimétrica que tem certos benefícios associados quando as modalidades são usadas em situações de POC e ou em ambientes com poucos recursos, em que o acesso a equipamentos de detecção mais complexos para ler o sinal pode ser limitado. No entanto, modalidades portáteis reveladas no presente documento também podem ser acopladas a espectrofotômetros portáteis que permitem a detecção de sinais fora da faixa visível. Um exemplo de um dispositivo espectrofotômetro portátil que pode ser usado em combinação com a presente invenção é descrito em Das et al. “Ultra-portable, wireless smartphone spectrophotometer for rapid, non-destructive testing of fruit ripeness”. Nature Scientific Reports. 2016, 6: 32504, DOI: 10.1038/srep32504. Finalmente, em certas modalidades que utilizam construtos de mascaramento baseados em pontos quânticos, uma luz UV portátil ou outro dispositivo adequado, pode ser usado com sucesso para detectar um sinal devido ao rendimento quântico quase completo fornecido por pontos quânticos.

Métodos e aplicações exemplificadores

[0248] O baixo custo e a adaptabilidade da plataforma de teste se prestam a várias aplicações, incluindo (i) quantificação geral de RNA/DNA/proteína, (ii) detecção rápida e multiplexada de expressão de RNA/DNA e proteína e (iii) sensibilidade e detecção de ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas alvo em amostras clínicas e ambientais. Além disso, os sistemas revelados no presente documento podem ser adaptados para detecção de transcritos dentro de configurações biológicas, como células. Dada a natureza altamente específica dos efetores de CRISPR descrito no presente documentos, pode ser possível rastrear a expressão específica alélica de transcritos ou mutações associadas a doenças em células vivas.

[0249] Em certas modalidades exemplificadoras, um único RNA guia específico para um único alvo é colocado em volumes separados. Cada volume pode então receber uma amostra ou alíquota diferente da mesma amostra. Em certas modalidades exemplificadoras, o RNA guia múltiplo, cada um para separar o alvo, pode ser colocado em um único poço, de modo que vários alvos possam ser rastreados em um poço diferente. A fim de detectar vários RNAs guia em um único volume, em certas modalidades exemplificadoras, várias proteínas efetoras com diferentes especificidades podem ser usadas. Por exemplo, diferentes ortólogos com diferentes especificidades de sequência podem ser usados. Por exemplo, um ortólogo pode preferencialmente cortar A, enquanto outros preferencialmente cortam C, U ou T.

Consequentemente, podem ser gerados RNAs guia que são todos, ou compreendem uma porção substancial, de um único nucleotídeo, cada um com um fluoróforo diferente. Dessa maneira, até quatro alvos diferentes podem ser rastreados em um único volume discreto individual.

[0250] Como demonstrado aqui, os sistemas efetores CRISPR são capazes de detectar concentrações atomolares de moléculas alvo. Consulte, por exemplo, os exemplos descritos abaixo. Devido à sensibilidade dos ditos sistemas, várias aplicações que requerem detecção rápida e sensível podem se beneficiar das modalidades reveladas no presente documento e são contempladas como estando dentro do escopo da invenção. Os ensaios e aplicações de exemplo são descritos em mais detalhes abaixo.

Aplicações microbianas

[0251] Em certas modalidades exemplificadoras, os sistemas, dispositivos e métodos revelados no presente documento são direcionados à detecção da presença de um ou mais agentes microbianos em uma amostra, como uma amostra biológica obtida de um indivíduo. Em certas modalidades exemplificadoras, o micróbio pode ser uma bactéria, um fungo, uma levedura, um protozoário, um parasita ou um vírus. Por conseguinte, os métodos revelados no presente documento podem ser adaptados para uso em outros métodos (ou em combinação) com outros métodos que requerem identificação rápida de espécies de micróbios, monitorando a presença de proteínas microbianas (antígenos), anticorpos, genes de anticorpos, detecção de certos fenótipos (por exemplo, resistência bacteriana), monitoramento da progressão da doença e/ou surto e triagem de antibióticos. Devido às capacidades de diagnóstico rápidas e sensíveis das modalidades reveladas no presente documento, detecção do tipo de espécie de micróbio, até uma diferença de nucleotídeo único e a capacidade de ser implantada como um dispositivo POC, as modalidades reveladas no presente documento podem ser usadas como esquemas terapêuticos guia, como a seleção do antibiótico ou antiviral apropriado. As modalidades reveladas no presente documento também podem ser usadas para rastrear amostras ambientais (ar, água, superfícies, alimentos, etc.) quanto à presença de contaminação microbiana.

[0252] É revelado um método para identificar espécies microbianas, como espécies bacterianas, virais,

fúngicas, leveduras ou parasitas, ou similares. Modalidades particulares reveladas no presente documento descrevem métodos e sistemas que identificarão e distinguirão espécies microbianas em uma única amostra ou em várias amostras, permitindo o reconhecimento de muitos micróbios diferentes. Os presentes métodos permitem a detecção de patógenos e a distinção entre duas ou mais espécies de um ou mais organismos, por exemplo, bactérias, vírus, leveduras, protozoários e fungos ou uma combinação dos mesmos, em uma amostra biológica ou ambiental, detectando a presença de uma sequência alvo de ácido nucleico na amostra. Um sinal positivo obtido da amostra indica a presença do micróbio. Múltiplos micróbios podem ser identificados simultaneamente com o uso dos métodos e sistemas da invenção, por meio do emprego do uso de mais de uma proteína efetora, em que cada proteína efetora tem como alvo uma sequência alvo microbiana específica. Dessa maneira, uma análise multinível pode ser realizada para um indivíduo em particular no qual qualquer número de micróbios pode ser detectado ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, a detecção simultânea de múltiplos micróbios pode ser realizada com o uso de um conjunto de sondas que podem identificar uma ou mais espécies microbianas.

[0253] A análise multiplexada de amostras permite a detecção em larga escala de amostras, reduzindo o tempo e o custo das análises. No entanto, análises multiplex são frequentemente limitadas pela disponibilidade de uma amostra biológica. De acordo com a invenção, no entanto, alternativas à análise multiplex podem ser realizadas de modo que múltiplas proteínas efetoras possam ser adicionadas a uma única amostra e cada construto de mascaramento pode ser combinado com um corante silenciador separado. Nesse caso, podem ser obtidos sinais positivos de cada corante silenciador separadamente para detecção múltipla em uma única amostra.

[0254] São revelados aqui métodos para distinguir entre duas ou mais espécies de um ou mais organismos em uma amostra. Os métodos também são passíveis de detectar uma ou mais espécies de um ou mais organismos em uma amostra.

Detecção de micróbios

[0255] Em algumas modalidades, é fornecido um método para detectar micróbios em amostras que compreende distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes discretos individuais, em que os volumes discretos individuais compreendem um sistema CRISPR conforme descrito no presente documento; incubar a amostra ou conjunto de amostras em condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia 77 a um ou mais alvos específicos de micróbios; ativar a proteína efetora CRISPR via ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína efetora CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra. As uma ou mais moléculas alvo podem ser mRNA, gDNA (codificador ou não codificador), trRNA ou RNA que compreende uma sequência de maré de nucleotídeo alvo que pode ser usada para distinguir duas ou mais espécies/cepas microbianas umas das outras. Os RNAs guia podem ser projetados para detectar sequências alvo. As modalidades reveladas no presente documento também podem utilizar certas etapas para melhorar a hibridização entre o RNA guia e as sequências de RNA alvo. Os métodos para aprimorar a hibridização com ácido ribonucleico são revelados no documento WO 2015/085194, intitulado “Enhanced Methods of Ribonucleic Acid Hybridization”, que é incorporado ao presente documento a título de referência. O alvo específico do micróbio pode ser RNA ou DNA ou uma proteína. Um método de DNA pode compreender adicionalmente o uso de primers de DNA que introduzem um promotor de RNA polimerase como descrito no presente documento. Se o alvo for uma proteína, o método utilizará aptâmeros e etapas específicas para a detecção de proteínas aqui descritas.

Detecção de variantes de nucleotídeo único

[0256] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências alvo identificadas podem ser detectadas com o uso de RNAs guia que são específicos e se ligam à sequência alvo, conforme descrito no presente documento. Os sistemas e métodos da presente invenção podem distinguir até mesmo polimorfismos de nucleotídeo único presentes entre diferentes espécies microbianas e, portanto, o uso de vários RNAs guia de acordo com a invenção pode expandir ainda mais ou melhorar o número de sequências alvo que podem ser usadas para distinguir entre espécies. Por exemplo, em algumas modalidades, o um ou mais RNAs guia podem distinguir entre micróbios nas espécies, gênero, família, ordem, classe, filo, reino ou fenótipo, ou uma combinação dos mesmos.

Detecção baseada em sequências de rrna

[0257] Em certas modalidades exemplificadoras, os dispositivos, sistemas e métodos revelados no presente documento podem ser usados para distinguir várias espécies microbianas em uma amostra. Em certas modalidades exemplificadoras, a identificação pode ser baseada em sequências de RNA ribossômico, incluindo as subunidades 16S, 23S e 5S. Os métodos para identificar sequências relevantes de rRNA são revelados na Publicação de Pedido de Patente no US 2017/0029872. Em certas modalidades exemplificadoras, um conjunto de RNAs guia pode ser projetado para distinguir cada espécie por uma região variável que é única para cada espécie ou cepa. Os RNAs guia também podem ser projetados para direcionar genes de RNA que distinguem micróbios nos gêneros, família, ordem, classe, filo, níveis de reino ou uma combinação dos mesmos.

Em certas modalidades exemplificadoras em que a amplificação é usada, um conjunto de primers de amplificação pode ser projetado para flanquear regiões constantes da sequência de RNA ribossômico e um RNA guia pode ser projetado para distinguir cada espécie por uma região interna variável. Em certas modalidades exemplificadoras, os primers e os RNAs guia podem ser projetados para regiões conservadas e variáveis na subunidade 16S respeitosamente. Outros genes ou regiões genômicas que são exclusivamente variáveis entre espécies ou um subconjunto de espécies como a família de genes RecA, subunidade RNA polimerase P, também podem ser usados.

Outros marcadores filogenéticos adequados, e métodos para identificar os mesmos, são discutidos, por exemplo, em Wu et al. arX1v: 1307.8690 [q-bio.GN].

[0258] Em certas modalidades exemplificadoras, um método ou diagnóstico é projetado para rastrear micróbios através de múltiplos níveis filogenéticos e/ou fenotípicos ao mesmo tempo. Por exemplo, o método ou diagnóstico pode compreender o uso de vários sistemas CRISPR com diferentes

RNAs guia. Um primeiro conjunto de RNAs guia pode distinguir, por exemplo, entre micobactérias, bactérias gram-positivas e gram-negativas. Essas classes gerais podem ser subdivididas ainda mais. Por exemplo, os RNAs guia podem ser projetados e usados no método ou diagnóstico que distingue entérico e não entérico nas bactérias gram- negativas. Um segundo conjunto de RNAs guia pode ser projetado para distinguir micróbios no nível de gênero ou espécie. Assim, uma matriz pode ser produzida identificando todas as micobactérias, gram-positivas e gram-negativas (divididas em entéricas e não entéricas) com cada gênero de espécies de bactérias identificadas em uma determinada amostra que se enquadram em uma dessas classes. O precedente é apenas para fins de exemplo. Outros meios para classificar outros tipos de micróbios também são contemplados e seguiriam a estrutura geral descrita acima.

Triagem para resistência a medicamentos

[0259] Em certas modalidades exemplificadoras, os dispositivos, sistemas e métodos revelados no presente documento podem ser usados para rastrear genes microbianos de interesse, por exemplo, genes de resistência a antibióticos e/ou antivirais. Os RNAs guia podem ser projetados para distinguir entre genes de interesse conhecidos. Amostras, incluindo amostras clínicas, podem então ser rastreadas usando as modalidades reveladas no presente documento para detecção de tais genes. A capacidade de rastrear a resistência a medicamentos no POC traria tremendo benefício na seleção de um regime de tratamento apropriado. Em certas modalidades exemplificadoras, os genes de resistência a antibióticos são carbapenemases incluindo KPC, NDM1, CTX-M15, OXA-48.

Outros genes de resistência a antibióticos são conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, no banco de dados abrangente de resistência a antibióticos (Jia et al. “CARD 2017: expansion and model-centric curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database.” Nucleic Acids Research, 45, D566-573)

[0260] A ribavirina é um antiviral eficaz que atinge vários vírus de RNA. Vários vírus clinicamente importantes evoluíram com resistência à ribavirina, incluindo o vírus da febre aftosa doi: 10.1128/JVI.03594- 13; vírus da poliomielite (Pfeifer e Kirkegaard. PNAS, 100 (12):7.289 a 7.294, 2003); e vírus da hepatite C (Pfeiffer e Kirkegaard, J. Virol. 79 (4):2.346 a 2.355, 2005). Vários outros vírus de RNA persistentes, como hepatite e HIV, desenvolveram resistência a medicamentos antivirais existentes: vírus da hepatite B (lamivudina, tenofovir, entecavir) doi: 10/1002/hep22900; vírus da hepatite C (telaprevir, BILN2061, ITMN-191, SCh6, boceprevir, AG- 021541, ACH-806) doi: 10.1002/hep.22549; e HIV (muitas mutações de resistência a medicamentos) hivb.standford.edu.

As modalidades reveladas no presente documento podem ser usadas para detectar essas variantes entre outras.

[0261] Além da resistência ao medicamento, há várias mutações clinicamente relevantes que podem ser detectadas com as modalidades reveladas no presente documento, como infecção persistente versus aguda no LCMV (doi: 10.1073/pnas. 1019304108) e aumento da infectividade do Ebola (Diehl et al., Cell. 2016, 167 (4):1.088 a 1.098.

[0262] Como descrito no presente documento em outro lugar, espécies microbianas intimamente relacionadas (por exemplo, tendo apenas uma única diferença de nucleotídeo em uma determinada sequência alvo) podem ser distinguidas pela introdução de uma incompatibilidade sintética no RNAm.

Definir abordagens de cobertura

[0263] Em modalidades particulares, é projetado um conjunto de RNAs guia que pode identificar, por exemplo, todas as espécies microbianas dentro de um conjunto definido de micróbios. Tais métodos são descritos em certas modalidades exemplificadoras, os métodos para gerar RNAs guia, como descrito no presente documentos, podem ser comparados aos métodos revelados no documento WO 2017/040316, incorporado ao presente documento a título de referência. Como descrito no documento WO 2017040316, uma solução de cobertura de conjunto pode identificar o número mínimo de sequências alvo, sondas ou RNAs guia necessários para cobrir uma sequência alvo inteira ou um conjunto de sequências alvo, por exemplo, um conjunto de sequências genômicas. As abordagens de cobertura de conjuntos foram usadas anteriormente para identificar primers e/ou sondas de microarrays, normalmente na faixa de 20 a 50 pares de bases. Consulte, por exemplo, Pearson et al., Cs.virginia.edu/~robins/papers/primers_damll_final.pdf, Jabado et al. Nucleic Acids Res. 2006 34 (22):6605-11, Jabado et al. Nucleic Acids Res. 2008, 36 (l):e3 doil0.1093/nar/gkmll06, Duitama et al. Nucleic Acids Res.

2009, 37 (8):2.483 a 2.492, Phillippy et al. BMC Bioinformtics. 2009, 10: 293 doi: 10.1186/1471-2105-10-293.

No entanto, essas abordagens geralmente envolviam o tratamento de cada primer/problema como k-mers e a busca de correspondências exatas ou a permissão de correspondências inexatas usando matrizes de sufixos. Além disso, os métodos geralmente adotam uma abordagem binária para detectar a hibridização, selecionando primers ou sondas, de modo que cada sequência de entrada precise apenas ser ligada por um primer ou sonda e a posição dessa ligação ao longo da sequência é irrelevante. Métodos alternativos podem dividir um genoma alvo em janelas predefinidas e tratar efetivamente cada janela como uma sequência de entrada separada sob a abordagem binária - ou seja, os mesmos determinam se uma determinada sonda ou RNA guia se liga a cada janela e exigem que todas as janelas sejam ligadas pelo estado de alguma sonda ou RNA guia. Efetivamente, essas abordagens tratam cada elemento do “universo” no problema de cobertura do conjunto como sendo uma sequência de entrada inteira ou uma janela predefinida de uma sequência de entrada, e cada elemento é considerado “coberto” se o início de uma sonda ou O RNA guia se liga ao elemento. Essas abordagens limitam a fluidez à qual diferentes projetos de sonda ou RNA guia são permitidos para cobrir uma determinada sequência alvo.

[0264] Em contraste, as modalidades reveladas no presente documento são direcionadas para detectar comprimentos de RNA de sonda ou guia mais longos, por exemplo, na faixa de 70 pb a 200 pb que são adequados para o sequenciamento de seleção híbrido. Além disso, os métodos revelados no presente documento podem ser aplicados para adotar uma abordagem de sequência de pantarget capaz de definir uma sonda ou definir conjuntos de RNA que podem identificar e facilitar o sequenciamento de detecção de todas as espécies e/ou sequências de cepa em uma sequência alvo grande e/ou variável conjunto. Por exemplo, os métodos revelados no presente documento podem ser usados para identificar todas as variantes de um determinado vírus ou vários vírus diferentes em um único ensaio. Além disso, o método aqui revelado trata cada elemento do “universo” no problema de cobertura de conjunto como sendo um nucleotídeo de uma sequência alvo, e cada elemento é considerado “coberto” desde que uma sonda ou RNA guia se ligue a algum segmento de um genoma alvo que inclui o elemento. Esses tipos de métodos de cobertura de conjunto podem ser usados em vez da abordagem binária dos métodos anteriores, os métodos revelados no presente documento melhoram como uma sonda ou RNA guia pode hibridizar com uma sequência alvo.

Em vez de apenas perguntar se uma determinada sequência de RNA guia se liga ou não a uma determinada janela, essas abordagens podem ser usadas para detectar um padrão de hibridização - ou seja, quando uma determinada sonda ou RNA guia se liga a uma sequência ou sequências alvo - e depois determina a partir desses padrões de hibridização o número mínimo de sondas ou RNAs guia necessários para cobrir o conjunto de sequências alvo em um grau suficiente para permitir o enriquecimento de uma amostra e o sequenciamento de toda e qualquer sequência alvo. Esses padrões de hibridização podem ser determinados pela definição de certos parâmetros que minimizam uma função de perda, permitindo a identificação de conjuntos mínimos de sonda ou RNA guia de uma maneira que permita que os parâmetros variem para cada espécie, por exemplo, reflitam a diversidade de cada espécie, bem como de uma maneira computacionalmente eficiente que não pode ser alcançada usando uma aplicação direta de uma solução de cobertura definida, como as aplicadas anteriormente na sonda ou no contexto de design do RNA guia.

[0265] A capacidade de detectar várias abundâncias de transcrição pode permitir a geração de assinaturas microbianas únicas indicativas de um fenótipo específico.

Várias técnicas de aprendizado de máquina podem ser usadas para derivar as assinaturas de genes. Por conseguinte, os RNAs de guia dos sistemas CRISPR podem ser usados para identificar e/ou quantificar níveis relativos de biomarcadores definidos pela assinatura do gene, a fim de detectar certos fenótipos. Em certas modalidades exemplificadoras, a assinatura do gene indica suscetibilidade a um antibiótico, resistência a um antibiótico ou uma combinação dos mesmos.

[0266] Em um aspecto da invenção, um método compreende a detecção de um ou mais patógenos. Dessa maneira, a diferenciação entre infecção de um indivíduo por micróbios individuais pode ser obtida. Em algumas modalidades, essa diferenciação pode permitir a detecção ou diagnóstico por um clínico de doenças específicas, por exemplo, diferentes variantes de uma doença.

Preferencialmente, a sequência do patógeno é um genoma do patógeno ou um fragmento do mesmo. O método pode compreender adicionalmente determinar a evolução do patógeno. A determinação da evolução do patógeno pode compreender a identificação de mutações de patógenos, por exemplo, deleção de nucleotídeos, inserção de nucleotídeos, substituição de nucleotídeos. Entre os últimos, há substituições não sinônimas, sinônimas e não codificadoras.

Mutações são mais frequentemente não sinônimas durante um surto. O método pode compreender adicionalmente determinar a taxa de substituição entre duas sequências de patógenos analisadas como descrito acima. Se as mutações são deletérias ou mesmo adaptativas exigiria análise funcional, no entanto, a taxa de mutações não sinônimas sugere que a progressão contínua dessa epidemia poderia oferecer uma oportunidade para a adaptação de patógenos, ressaltando a necessidade de contenção rápida. Assim, o método pode compreender adicionalmente a avaliação do risco de adaptação viral, em que o número de mutações não sinônimos é determinado (Gire, et al., Science 345, 1369, 2014).

Monitorando surtos de micróbios

[0267] Em algumas modalidades, um sistema CRISPR ou métodos de uso dos mesmos, conforme descrito no presente documento, podem ser usados para determinar a evolução de um surto de patógeno. O método pode compreender a detecção de uma ou mais sequências alvo de uma pluralidade de amostras de um ou mais indivíduos, em que a sequência alvo é uma sequência de um micróbio que causa os surtos. Esse método pode compreender adicionalmente determinar um padrão de transmissão de patógenos ou um mecanismo envolvido em um surto de doença causado por um patógeno.

[0268] O padrão de transmissão de patógenos pode compreender novas transmissões continuadas do reservatório natural do patógeno ou transmissões de indivíduo a indivíduo (por exemplo, transmissão de homem para homem) após uma única transmissão do reservatório natural ou uma mistura de ambos. Em uma modalidade, a transmissão de patógenos pode ser transmissão bacteriana ou viral; nesse caso, a sequência alvo é preferencialmente um genoma microbiano ou seus fragmentos. Em uma modalidade, o padrão da transmissão de patógenos é o padrão inicial da transmissão de patógenos, isto é, no início do surto de patógenos. A determinação do padrão da transmissão de patógenos no início do surto aumenta a probabilidade de interromper o surto o mais cedo possível, reduzindo assim a possibilidade de disseminação local e internacional.

[0269] A determinação do padrão da transmissão de patógenos pode compreender a detecção de uma sequência de patógenos de acordo com os métodos descritos no presente documentos. A determinação do padrão da transmissão do patógeno pode compreender adicionalmente a detecção de variações compartilhadas intra-hospedeiro da sequência de patógenos entre os sujeitos e a determinação se as variações compartilhadas intra-hospedeiro mostram padrões temporais. Padrões na variação intra-hospedeiro e inter- hospedeiro observados fornecem informações importantes sobre transmissão e epidemiologia (Gire, etal., 2014).

[0270] A detecção de variações compartilhadas intra-hospedeiro entre os indivíduos que mostram padrões temporais é uma indicação de links de transmissão entre indivíduos (em particular entre seres humanos), devido ao fato de que pode ser explicada pela infecção de várias fontes (superinfecção), mutações recorrentes na contaminação da amostra. (com ou sem seleção de equilíbrio para reforçar mutações) ou co-transmissão de vírus ligeiramente divergentes que surgiram por mutação mais cedo na cadeia de transmissão (Park, et al., Cell 161 (7):1.516 a 1526, 2015). A detecção de variações intra-hospedeiro compartilhadas entre indivíduos pode compreender a detecção de variantes intra-hospedeiro localizadas em posições comuns de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). A detecção positiva de variantes intra-hospedeiro localizadas em posições comuns (SNP) é indicativa de superinfecção e contaminação como explicações primárias para as variantes intra-hospedeiro. A superinfecção e a contaminação podem ser divididas com base na frequência do SNP que aparece como variantes inter-hospedeiros (Park, et al., 2015). Caso contrário, a superinfecção e a contaminação podem ser descartadas. Neste último caso, a detecção de variações compartilhadas intra-hospedeiro entre indivíduos pode compreender adicionalmente avaliar as frequências de variantes sinônimas e não sinônimas e comparar a frequência de variantes sinônimas e não sinônimas entre si. Uma mutação não sinônima é uma mutação que altera o aminoácido da proteína, provavelmente resultando em uma mudança biológica no micróbio que está sujeita à seleção natural. A substituição sinônima não altera uma sequência de aminoácidos. A frequência igual de variantes sinônimas e não sinônimas é indicativa de que as variantes intra- hospedeiros evoluíram de maneira neutra. Se as frequências de variantes sinônimas e não sinônimas forem divergentes, é provável que as variantes intra-hospedeiro sejam mantidas pelo balanceamento da seleção. Se as frequências de variantes sinônimas e não sinônimas forem baixas, isso é indicativo de mutação recorrente. Se as frequências de variantes sinônimas e não sinônimas forem altas, isso é indicativo de co-transmissão (Park, et al., 2015).

[0271] Como o vírus Ebola, o vírus Lassa (LASV) pode causar febre hemorrágica com altas taxas de mortalidade. Andersen et al. gerou um catálogo genômico de quase 200 sequências de LASV a partir de amostras clínicas e de reservatórios de roedores (Andersen, et al., Cell

Volume 162, Edição 4, páginas 738 a 750, 13 de agosto de 2015). Andersen et al. mostram que, enquanto a epidemia de EVD 2013-2015 é alimentada por transmissões de homem para homem, as infecções por LASV resultam principalmente de infecções de reservatório para seres humanos. Andersen et al. elucidaram a disseminação do LASV na África Ocidental e mostram que essa migração foi acompanhada por mudanças na abundância do genoma do LASV, nas taxas de fatalidade, na adaptação do códon e na eficiência da tradução. O método pode compreender adicionalmente comparar filogeneticamente uma primeira sequência de patógenos com uma segunda sequência de patógenos e determinar se existe uma ligação filogenética entre as primeira e segunda sequências de patógenos. A segunda sequência de patógenos pode ser uma sequência de referência anterior. Se houver uma ligação filogenética, o método pode compreender adicionalmente o enraizamento da filogenia da primeira sequência de patógenos para a segunda sequência de patógenos. Assim, é possível construir a linhagem da primeira sequência de patógenos (Park, et al., 2015).

[0272] O método pode compreender adicionalmente determinar se as mutações são deletérias ou adaptativas.

Mutações deletérias são indicativas de vírus com transmissão comprometida e infecções sem saída e, portanto, normalmente estão presentes apenas em um indivíduo.

Mutações exclusivas de um indivíduo são aquelas que ocorrem nos ramos externos da árvore filogenética, enquanto mutações nos ramos internos são aquelas presentes em várias amostras (isto é, em vários indivíduos). Maior taxa de substituição não sinônima é uma característica dos ramos externos da árvore filogenética (Park, et al., 2015).

[0273] Nos ramos internos da árvore filogenética, a seleção teve mais oportunidade de filtrar mutantes deletérios. As ramificações internas, por definição, produziram várias linhagens descendentes e, portanto, são menos propensas a incluir mutações com custos de condicionamento físico. Assim, menor taxa de substituição não sinônima é indicativa de ramificações internas (Park, et al., 2015).

[0274] Mutações sinônimas, que provavelmente têm menos impacto no condicionamento físico, ocorreram em frequências mais comparáveis nos ramos interno e externo (Park, et al., 2015).

[0275] Ao analisar a sequência alvo sequenciada, como os genomas virais, é possível constatar os mecanismos responsáveis pela gravidade do episódio epidêmico, como durante o surto de Ebola em 2014. Por exemplo, Gire et al.

fez uma comparação filogenética dos genomas do surto de 2014 com todos os 20 genomas de surtos anteriores, o que sugere que o vírus da África Ocidental de 2014 provavelmente se espalhou da África central na última década. O enraizamento da filogenia usando divergência de outros genomas de ebolavírus foi problemático. No entanto, o enraizamento da árvore no surto mais antigo revelou uma forte correlação entre a data da amostra e a distância da raiz às pontas, com uma taxa de substituição de 8 x 10-4 por local por ano. Isso sugere que as linhagens dos três surtos mais recentes divergiram de um ancestral comum aproximadamente ao mesmo tempo, por volta de 2004, o que apoia a hipótese de que cada surto representa um evento zoonótico independente da mesma população viral geneticamente diversa em seu reservatório natural. Eles também constataram que o surto de EBOV de 2014 pode ser causado por uma única transmissão do reservatório natural, seguida pela transmissão de homem para homem durante o surto. Seus resultados também sugeriram que o episódio epidêmico na Serra Leoa pode resultar da introdução de dois vírus geneticamente distintos da Guiné na mesma época (Gire, et al., 2014).

[0276] Também foi possível determinar como o vírus Lassa se espalhou a partir de seu ponto de origem, em particular graças à transmissão de humano a humano e até mesmo refazer a história desse espalhamento há 400 anos (Andersen, et al., Cell 162 (4): 738-50, 2015).

[0277] Em relação ao trabalho necessário durante o surto de EBOV 2013-2015 e as dificuldades encontradas pela equipe médica no local do surto, e de maneira mais geral, o método da invenção permite realizar o sequenciamento usando menos sondas selecionadas de modo que o sequenciamento possa ser acelerado, reduzindo assim o tempo necessário desde a coleta de amostras até a obtenção de resultados.

Além disso, kits e sistemas podem ser projetados para serem utilizáveis em campo, de modo que os diagnósticos de um paciente possam ser facilmente realizados sem a necessidade de enviar ou enviar amostras para outra parte do país ou do mundo.

[0278] Em qualquer método descrito acima, o sequenciamento da sequência alvo ou fragmento da mesma pode usar qualquer um dos processos de sequenciamento descritos acima. Além disso, o sequenciamento da sequência alvo ou fragmento da mesma pode ser um sequenciamento quase em tempo real. O sequenciamento da sequência alvo ou fragmento da mesma pode ser realizado de acordo com métodos descritos anteriormente (Experimental Procedures: Matranga et al., 2014; e Gire, et al., 2014). Sequenciar a sequência alvo ou fragmento da mesma pode compreender sequenciação paralela de uma pluralidade de sequências alvo. Sequenciar a sequência alvo ou fragmento da mesma pode compreender sequenciação de Illumina.

[0279] A análise da sequência alvo ou fragmento da mesma que hibridiza com uma ou mais das sondas selecionadas pode ser uma análise de identificação, em que a hibridização de uma sonda selecionada com a sequência alvo ou um fragmento da mesma indica a presença da sequência alvo na amostra.

[0280] Atualmente, o diagnóstico primário é baseado nos sintomas que um paciente apresenta. No entanto, várias doenças podem compartilhar sintomas idênticos, de modo que o diagnóstico depende muito das estatísticas. Por exemplo, a malária desencadeia sintomas similares aos da gripe: dor de cabeça, febre, tremores, dor nas articulações, vômitos, anemia hemolítica, icterícia, hemoglobina na urina, danos na retina e convulsões. Esses sintomas também são comuns para septicemia, gastroenterite e doenças virais. Entre os últimos, a febre hemorrágica do Ebola apresenta os seguintes sintomas: febre, dor de garganta, dores musculares, dores de cabeça, vômitos, diarreia, erupção cutânea, função diminuída do fígado e rins, hemorragia interna e externa.

[0281] Quando um paciente é apresentado a uma unidade médica, por exemplo, na África tropical, o diagnóstico básico termina com a malária, devido ao fato de que estatisticamente, a malária é a doença mais provável nessa região da África. Consequentemente, o paciente é tratado de malária, embora possa realmente não ter contraído a doença e acabe não sendo tratado corretamente.

Essa falta de tratamento correto pode ser fatal, principalmente quando a doença contraída pelo paciente apresenta uma evolução rápida. Pode ser tarde demais para que a equipe médica perceba que o tratamento dado ao paciente é ineficaz e chegue ao diagnóstico correto e administre o tratamento adequado ao paciente.

[0282] O método da invenção fornece uma solução para esta situação. De fato, como o número de RNAs guia pode ser reduzido drasticamente, isso possibilita fornecer, em um único chip, sondas selecionadas divididas em grupos, em que cada grupo é específico para uma doença, de modo que uma pluralidade de doenças, como infecção viral, possa ser diagnosticada ao mesmo tempo. Graças à invenção, mais de 3 doenças podem ser diagnosticadas em um único chip, de preferência mais de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 doenças ao mesmo tempo, preferencialmente as doenças que ocorrem mais comumente na população de uma determinada área geográfica. Como cada grupo de sondas selecionadas é específico para uma das doenças diagnosticadas, um diagnóstico mais preciso pode ser realizado, diminuindo o risco de administrar o tratamento errado ao paciente.

[0283] Em outros casos, uma doença como uma infecção viral pode ocorrer sem nenhum sintoma ou causar sintomas, mas desapareceu antes que o paciente seja apresentado à equipe médica. Nesses casos, o paciente não procura assistência médica ou o diagnóstico é complicado devido à ausência de sintomas no dia da apresentação.

[0284] A presente invenção também pode ser usada em conjunto com outros métodos de diagnóstico de doenças, identificando patógenos e otimizando o tratamento com base na detecção de ácidos nucléicos, como o mRNA em amostras brutas e não purificadas.

[0285] O método da invenção também fornece uma ferramenta poderosa para resolver esta situação. De fato, uma vez que uma pluralidade de grupos de RNAs guia selecionados, sendo cada grupo específico para uma das doenças mais comuns que ocorrem na população de uma determinada área, é composta por um único diagnóstico, a equipe médica só precisa entrar em contato com uma amostra biológica retirado do paciente com o chip. A leitura do chip revela as doenças que o paciente contraiu.

[0286] Em alguns casos, o paciente é apresentado à equipe médica para o diagnóstico de sintomas específicos. O método da invenção torna possível não apenas identificar qual doença causa esses sintomas, mas ao mesmo tempo determinar se o paciente sofre de outra doença da qual não estava ciente.

[0287] Essas informações podem ser de extrema importância ao procurar os mecanismos de um surto. De fato, grupos de pacientes com vírus idênticos também mostram padrões temporais sugerindo links de transmissão de indivíduo a indivíduo.

Triagem de perturbações genéticas microbianas

[0288] Em certas modalidades exemplificadoras, os sistemas CRISPR revelados no presente documento podem ser usados para rastrear perturbações genéticas microbianas.

Tais métodos podem ser úteis, por exemplo, para mapear vias microbianas e redes funcionais. As células microbianas podem ser geneticamente modificadas e depois rastreadas sob diferentes condições experimentais. Como descrito acima, as modalidades reveladas no presente documento podem rastrear múltiplas moléculas alvo em uma única amostra ou um único alvo em um único volume discreto individual de uma maneira multiplex. Micróbios geneticamente modificados podem ser modificados para incluir uma sequência de código de barras de ácido nucleico que identifica a modificação genética específica realizada por uma célula microbiana específica ou população de células microbianas. Um código de barras é uma sequência curta de nucleotídeos (por exemplo, DNA, RNA ou combinações dos mesmos) que é usada como um identificador.

Um código de barras de ácido nucleico pode ter um comprimento de 4 a 100 nucleotídeos e ser de cadeia simples ou dupla.

Os métodos para identificar células com códigos de barras são conhecidos na técnica.

Por conseguinte, os RNAs de guia dos sistemas efetores CRISPR descrito no presente documentos podem ser usados para detectar o código de barras.

A detecção do sinal detectável positivo indica a presença de uma modificação genética específica na amostra.

Os métodos revelados no presente documento podem ser combinados com outros métodos para detectar genótipos complementares ou leituras fenotípicas indicando o efeito da modificação genética sob as condições experimentais testadas.

As modificações genéticas a serem rastreadas podem incluir, sem limitação um knockin de gene,

um knockout de gene, inversões, translocações,

transposições ou uma ou mais inserções, deleções,

substituições, mutações ou adição de ácidos nucleicos que codificam um epítopo com uma consequência funcional, como alteração da estabilidade ou detecção de proteínas.

De maneira similar, os métodos descritos no presente documentos podem ser usados em aplicações de biologia sintética para rastrear a funcionalidade de arranjos específicos de elementos reguladores de genes e módulos de expressão de genes.

[0289] Em certas modalidades exemplificadoras, os métodos podem ser usados para rastrear hipomorfos. Geração de hipomorfos e seu uso na identificação dos principais genes funcionais bacterianos e na identificação de novas terapêuticas com antibióticos, conforme revelado no documento PCT/US2016/060730, intitulado “Multiplex High- Resolution Detection of Micro-organism Strains, Related Kits, Diagnostic Methods and Screening Assays”, depositado em novembro 4 de 2016, que é aqui incorporado a título de referência.

[0290] As diferentes condições experimentais podem compreender a exposição das células microbianas a diferentes agentes químicos, combinações de agentes químicos, diferentes concentrações de agentes químicos ou combinações de agentes químicos, diferentes durações de exposição a agentes químicos ou combinações de agentes químicos, diferentes parâmetros físicos ou ambos. Em certas modalidades exemplificadoras, o agente químico é um antibiótico ou antiviral. Diferentes parâmetros físicos a serem rastreados podem incluir diferentes temperaturas, pressões atmosféricas, diferentes concentrações atmosféricas e não atmosféricas de gases, diferentes níveis de pH, diferentes composições de meios de cultura ou uma combinação dos mesmos.

Triagem de amostras ambientais

[0291] Os métodos revelados no presente documento também podem ser usados para rastrear amostras ambientais de contaminantes, detectando a presença de ácido nucleico ou polipeptídeos alvo. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção fornece um método para detectar micróbios, que compreende: expor um sistema CRISPR como descrito no presente documento a uma amostra; ativar uma proteína efetora de RNA via ligação de um ou mais RNAs guia a um ou mais RNAs alvo específicos de micróbios ou a um ou mais RNAs de gatilho, de modo que um sinal positivo detectável seja produzido. O sinal positivo pode ser detectado e é indicativo da presença de um ou mais micróbios na amostra.

Em algumas modalidades, o sistema CRISPR pode estar em um substrato como descrito no presente documento, e o substrato pode ser exposto à amostra. Em outras modalidades, o mesmo sistema CRISPR e/ou um sistema CRISPR diferente pode ser aplicado a vários locais discretos no substrato. Em outras modalidades, o sistema CRISPR diferente pode detectar um micróbio diferente em cada local. Como descrito em mais detalhes acima, um substrato pode ser um substrato de materiais flexíveis, por exemplo, incluindo, entre outros, um substrato de papel, um substrato de tecido ou um substrato flexível à base de polímero.

[0292] De acordo com a invenção, o substrato pode ser exposto à amostra passivamente, por meio da imersão temporária do substrato em um fluido a ser amostrado, por meio da aplicação de um fluido a ser testado no substrato ou entrando em contato com uma superfície a ser testada com o substrato. Qualquer meio de introdução da amostra no substrato pode ser usado conforme apropriado.

[0293] Como descrito no presente documento, uma amostra para uso com a invenção pode ser uma amostra biológica ou ambiental, como uma amostra de alimentos (frutas ou vegetais frescos, carnes), uma amostra de bebidas, uma superfície de papel, uma superfície de tecido, um metal superfície, uma superfície de madeira, uma superfície de plástico, uma amostra de solo, uma amostra de água doce, uma amostra de águas residuais, uma amostra de água salina, exposição ao ar atmosférico ou a outra amostra de gás ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, superfícies domésticas/comerciais/industriais fabricadas de qualquer material, incluindo, sem limitação, metal, madeira, plástico, borracha ou similares, podem ser esfregadas e testadas quanto a contaminantes. As amostras de solo podem ser testadas quanto à presença de bactérias ou parasitas patogênicos ou outros micróbios, tanto para fins ambientais quanto para testes em humanos, animais ou plantas. Amostras de água, como amostras de água doce,

amostras de águas residuais ou amostras de água salina, podem ser avaliadas quanto à limpeza e segurança e/ou potabilidade, para detectar a presença de, por exemplo, Cryptosporidium parvum, Giardia lamhlia ou outra contaminação microbiana. Em outras modalidades, uma amostra biológica pode ser obtida de uma fonte incluindo, mas não se limitando a, uma amostra de tecido, saliva, sangue, plasma, soros, fezes, urina, escarro, mucosa, linfa, fluido sinovial, líquido cefalorraquidiano, ascite, derrame pleural, seroma, pus ou zaragatoa de pele ou superfície da membrana mucosa. Em algumas modalidades particulares, uma amostra ambiental ou amostras biológicas podem ser amostras brutas e/ou a uma ou mais moléculas alvo não podem ser purificadas ou amplificadas a partir da amostra antes da aplicação do método. A identificação de micróbios pode ser útil e/ou necessária para qualquer número de aplicações e, portanto, qualquer tipo de amostra de qualquer fonte considerada apropriada por um versado na técnica pode ser usada de acordo com a invenção.

[0294] Em algumas modalidades, verificação de contaminação de alimentos por bactérias, como E. colt. em restaurantes ou outros fornecedores de alimentos; superfícies de alimentos; testando água para patógenos como Salmonella, Campylobacter ou E. coir, também verificando a qualidade dos alimentos pelos fabricantes e reguladores para determinar a pureza das fontes de carne; identificar contaminação do ar com patógenos como legionella; verificar se a cerveja está contaminada ou estragada por patógenos como Pediococcus e Lactobacillus; contaminação de queijo pasteurizado ou não pasteurizado por bactérias ou fungos durante a fabricação.

[0295] Um micróbio de acordo com a invenção pode ser um micróbio patogênico ou um micróbio que resulta em deterioração de alimentos ou produtos consumíveis. Um micróbio patogênico pode ser patogênico ou indesejável para seres humanos, animais ou plantas. Para fins humanos ou animais, um micróbio pode causar uma doença ou resultar em doença. As aplicações animais ou veterinárias da presente invenção podem identificar animais infectados com um micróbio. Por exemplo, os métodos e sistemas da invenção podem identificar animais de companhia com patógenos, incluindo, entre outros, tosse do canil, vírus da raiva e vermes do coração. Em outras modalidades, os métodos e sistemas da invenção podem ser usados para testes de parentesco para fins de melhoramento. Um micróbio de planta pode resultar em danos ou doenças a uma planta, redução no rendimento ou alterar características como cor, sabor, consistência e odor. Para fins de contaminação de alimentos ou consumíveis, um micróbio pode afetar adversamente o sabor, odor, cor, consistência ou outras propriedades comerciais do alimento ou produto consumível. Em certas modalidades exemplificadoras, o micróbio é uma espécie bacteriana. As bactérias podem ser um psicrotrófico, um coliforme, uma bactéria láctica ou uma bactéria formadora de esporos. Em certas modalidades exemplificadoras, a bactéria pode ser qualquer espécie bacteriana que causa doença ou enfermidade ou resulta em um produto ou característica indesejável. As bactérias de acordo com a invenção podem ser patogênicas para seres humanos, animais ou plantas.

Tipos de amostra

[0296] As amostras apropriadas para uso nos métodos revelados no presente documento incluem qualquer amostra biológica convencional obtida de um organismo ou parte do mesmo, como uma planta, animal, bactéria e similares. Em modalidades particulares, a amostra biológica é obtida de um indivíduo animal, como um indivíduo humano. Uma amostra biológica é qualquer amostra sólida ou líquida obtida, excretada ou secretada por qualquer organismo vivo, incluindo, sem limitação, organismos unicelulares, como bactérias, leveduras, protozoários e amebas, entre outros, organismos multicelulares (como plantas ou animais, incluindo amostras de um indivíduo humano saudável ou aparentemente saudável ou de um paciente humano afetado por uma condição ou doença a ser diagnosticada ou investigada,

como uma infecção por um micro-organismo patogênico, como uma bactéria ou vírus patogênico). Por exemplo, uma amostra biológica pode ser um fluido biológico obtido de, por exemplo, sangue, plasma, soro, urina, fezes, escarro, mucosa, líquido linfático, líquido sinovial, bile, ascite, derrame pleural, seroma, saliva, cerebrospinal humor fluido, aquoso ou vítreo ou qualquer secreção corporal, transudato, exsudato (por exemplo, fluido obtido de um abscesso ou qualquer outro local de infecção ou inflamação) ou fluido obtido de uma articulação (por exemplo, uma articulação normal ou uma articulação afetada pela doença, como artrite reumatoide, osteoartrite, gota ou artrite séptica) ou um cotonete da superfície da pele ou da membrana mucosa.

[0297] Uma amostra também pode ser uma amostra obtida de qualquer órgão ou tecido (incluindo uma biópsia ou amostra de autópsia, como uma biópsia de tumor) ou pode incluir uma célula (seja uma célula primária ou célula cultivada) ou um meio condicionado por qualquer célula, tecido ou órgão. Exemplos de amostras incluem, sem limitação, células, lisados celulares, esfregaços de sangue, preparações de citocentrífugas, esfregaços de citologia, fluidos corporais (por exemplo, sangue, plasma, soro, saliva, escarro, urina, lavagem broncoalveolar, sêmen etc.), biópsias de tecidos por exemplo, biópsias de tumores), aspirados com agulha fina e/ou seções de tecido (por exemplo, seções de tecido de criostato e/ou seções de tecido embebidas em parafina). Em outros exemplos, a amostra inclui células tumorais circulantes (que podem ser identificadas por marcadores de superfície celular). Em exemplos particulares, as amostras são usadas diretamente (por exemplo, frescas ou congeladas), ou podem ser manipuladas antes do uso, por exemplo, por fixação (cg, usando formalina) e/ou embebidas em cera (como em parafina fixada em formalina) (FFPE) amostras de tecido). Será apreciado que qualquer método de obtenção de tecido de um indivíduo possa ser usado e que a seleção do método usado dependerá de vários fatores, como tipo de tecido, idade do sujeito ou procedimentos disponíveis para o praticante.

Técnicas padrão para aquisição de tais amostras estão disponíveis na técnica. Consulte, por exemplo, Schluger et al., J. Exp. Med. 176: 1327-33 (1992); Bigby et al. Rev.

Respir. Dis. 133: 515-18 (1986); Kovacs et al., NEJM 318: 589-93 (1988); e Ognibene et al., Am. Rev. Respir. Dis.

129: 929-32 (1984).

[0298] Em outras modalidades, uma amostra pode ser uma amostra ambiental, como água, solo ou uma superfície como superfície industrial ou médica. Em algumas modalidades, métodos como os revelados na Publicação de Patente no US 2013/0190196 podem ser aplicados para a detecção de assinaturas de ácidos nucleicos, especificamente níveis de RNA, diretamente de amostras celulares brutas com um alto grau de sensibilidade e especificidade. As sequências específicas para cada patógeno de interesse podem ser identificadas ou selecionadas comparando as sequências de codificação do patógeno de interesse com todas as sequências de codificação em outros organismos pelo software BLAST.

[0299] Várias modalidades da presente revelação envolvem o uso de procedimentos e abordagens conhecidas na técnica para fracionar com sucesso amostras de sangue clínicas. Ver, por exemplo, o procedimento descrito em Han Wei Hou et al., Microfluidic Devices for Blood Fractionation, Micromachines 2011, 2, 319-343; Ali Asgar S.

Bhagat et al., Dean Flow Fractionation (DFF) Isolation of Circulating Tumor Cells (CTCs) from Blood, 15a Conferência Internacional sobre sistemas miniaturizados para Química e Ciências da Vida, 2-6 outubro de 2011, Seattle, WA; e Publicação de Patente Internacional no WO2011109762, cujas revelações são aqui incorporadas a título de referência na sua totalidade. As amostras de sangue são comumente expandidas em cultura para aumentar o tamanho da amostra para fins de teste. Em algumas modalidades da presente invenção, sangue ou outras amostras biológicas podem ser usadas em métodos como descrito no presente documentos sem a necessidade de expansão em cultura.

[0300] Além disso, várias modalidades da presente revelação envolvem o uso de procedimentos e abordagens conhecidas na técnica para isolar com sucesso patógenos do sangue total usando microcanal em espiral, conforme descrito em Han Wei Hou et al., Isolamento de patógenos de sangue total usando espiral Microchannel, Case No. 15995 JR, Massachusetts Institute of Technology, manuscrito em preparação, cuja revelação é aqui incorporada a título de referência na sua totalidade.

[0301] Devido ao aumento da sensibilidade das modalidades reveladas no presente documento, em certas modalidades exemplificadoras, os ensaios e métodos podem ser executados em amostras brutas ou amostras em que as moléculas alvo a serem detectadas não são mais fraccionadas ou purificadas da amostra.

Micróbios exemplificadores

[0302] A modalidade revelada no presente documento pode ser usada para detectar um número de diferentes micróbios. O termo micróbio como usado no presente documento inclui bactérias, fungos, protozoários, parasitas e vírus.

Bactérias

[0303] A seguir, é fornecida uma lista de exemplos dos tipos de micróbios que podem ser detectados com o uso das modalidades reveladas no presente documento. Em certas modalidades exemplificadoras, o micróbio é uma bactéria.

Exemplos de bactérias que podem ser detectadas de acordo com os métodos revelados incluem, sem limitação, qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de) Acinetobacter haumanii. Actinobacillus sp., Actinomycetes, Actinomyces sp. (como Actinomyces israelii e Actinomyces naeshindii), Aeromonas sp. (como Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria (Aeromonas sobria) e Aeromonas caviae), Anaplasma phagocy tophilum, Anaplasma marginale Alcaligenes xylosoxidans, Acinetobacter baumanii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacillus sp. (como Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis e Bacillus stearothermophilus), Bacteroides sp. (como Bacteroides fragilis), Bartonella sp. (como Bartonella bacilliformis e Bartonella henselae, Bifidobacterium sp., Bordetella sp. (como Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis e Bordetella hronchiseptica), Borrelia sp. (como Borrelia recurrentis e Borrelia burgdorferi), Brucella sp. (como Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melintensis e Brucella suis), Burkholderia sp. (como Burkholderia pseudomallei e Burkholderia cepacia), Campylobacter sp. (como

Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari e Campylobacter fetus), Capnocytophaga sp., Cardiobacterium hominis, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Citrobacter sp. Coxiella burnetii, Corynebacterium sp.

(como Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium jeikeum e Corynebacterium), Clostridium sp. (como Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum e Clostridium tetani), Eikenella corrodens, Enterobacter sp.

(como Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae e Escherichia coli, incluindo Escherichia coli oportunista, como E. coli enterotoxigênica, E. coli enteroinvasiva, E. coli enteropatogênica, E. coli enterohemorrágica, E. coli enteroagregativa e E. coli uropatogênica) Enterococcus sp.

(como Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium) Ehrlichia sp. (como Ehrlichia chafeensia e Ehrlichia canis), Epidermophyton floccosum, Erysipelothrix rhusiopathiae, Eubacterium sp., Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Gemella morbillorum, Haemophilus sp. (como Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus haemolyticus e Haemophilus parahaemolyticus, Helicobacter sp. (por exemplo, Helicobacter pylori, Helicobacter cinaedi e Helicobacter fennelliae), Kingella kingii, Klebsiella sp. (por exemplo, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella granulomatis e Klebsiella oxytoca), Lactobacillus sp., Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Peptostreptococcus sp., Mannheimia hemolytica, Microsporum canis, Moraxella catarrhalis, Morganella sp., Mobiluncus sp. (como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, e Mycobacterium marinum), Mycoplasma sp. (como Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis, e Mycoplasma genitalium), Nocardia sp. (como Nocardia asteroides, Nocardia cyriacigeorgica a nd Nocardia brasiliensis), Neisseria sp.

(como Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis), Pasteurella multocida, Pityrosporum orbiculare (Malassezia furfur), Plesiomonas shigelloides. Prevotella sp., Porphyromonas sp., Prevotella melaninogenica, Proteus sp.

(como Proteus vulgaris e Proteus mirabilis), Providencia sp. (como Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri e Providencia stuartii), Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes, Rhodococcus equi, Rickettsia sp.

(como Rickettsia rickettsii, Rickettsia akari e Rickettsia prowazekii, Orientia tsutsugamushi (anteriormente: Rickettsia tsutsugamushi) e Rickettsia typhi), Rhodococcus sp., Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia,

Salmonella sp. (como Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis e Salmonella typhimurium), Serratia sp. (como Serratia marcesans e Serratia liquifaciens), Shigella sp.

(como Shigella dysenteriae, Shigella jlexneri, Shigella boydii e Shigella sonnei), Staphylococcus sp. (como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus, Staphylococcus saprophyticus), Streptococcus sp. (como Streptococcus pneumoniae (por exemplo, sorotipo 4 resistente ao cloranfenicol, Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à espectinomicina 6B Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à estreptomicina 9V Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à eritromicina 14, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, sorotipo 18C resistente a Streptococcus pneumoniae, sorotipo 19F resistente à tetraciclina Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à penicilina 19F Streptococcus pneumoniae e sorotipo resistente a trimetoprim 23F Streptococcus pneumoniae, sorotipo 4 resistente ao cloranfenicol, sertreína 6 de Streptococcus pneumoniae, estreptococo pneumoniae Streptococcus pneumoniae sorotipo 9V Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à optocina 14 Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à rifampicina 18C Streptococcus pneumoniae,

sorotipo resistente à penicilina 19F Streptococcus pneumoniae ou sorotipo 2 resistente ao trimetoprim 3F Streptococcus pneumoniae), Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, estreptococos do grupo A, Streptococcus pyogenes, estreptococos do grupo B, Streptococcus agalactiae, grupo C streptococci, Streptococcus anginosus, Streptococcus equismilis, Grupo D estreptococos, Streptococcus bovis, Grupo F de estreptococos, e Streptococcus anginosus (estreptococos do grupo G), Spirillum minus, Streptobacillus moniliformi, Treponema sp. como Treponema carateum, Treponema petenue, Treponema pallidum e Treponema endemicum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Tropheryma whippelii, Ureaplasma urealyticum, Veillonella sp., Vibrio sp. (como Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio hollisae, Vibrio fluvialis, Vibrio metchnikovii, Vibrio damsela e Vibrio furnish), Yersinia sp. (como Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis e Yersinia pseudotuberculosis) e Xanthomonas maltophilia, entre outros.

Fungos

[0304] Em certas modalidades exemplificadoras, o micróbio é um fungo ou uma espécie de fungo. Exemplos de fungos que podem ser detectados de acordo com os métodos revelados incluem, sem limitação, qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de), Aspergillus, Blastomyces, Candidíase, Coccidiodomicose, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gatti, sp. Histoplasma sp. (como Histoplasma capsulatum), Pneumocystis sp. (como Pneumocystis jirovecii), Stachybotrys (como Stachybotrys chartarum), mucroimicose, Sporothrix, infecções oculares por fungos micose, Exserohilum, Cladosporium.

[0305] Em certas modalidades exemplificadoras, o fungo é uma levedura. Exemplos de leveduras que podem ser detectadas de acordo com os métodos revelados incluem, sem limitação, uma ou mais de (ou qualquer combinação de) espécies de Aspergillus (como Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus e Aspergillus clavatus), Cryptococcus sp. (como Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Cryptococcus Laurentii e Cryptococcus albidus), uma espécie de Geotrichum, uma espécie de Saccharomyces, uma espécie de Hansenula, uma espécie de Candida (como Candida albicans), uma espécie de Kluyveromyces, uma espécie de Debaryomyces, uma espécie de Pichia ou combinação das mesmas. Em certas modalidades exemplificadoras, o fungo é um mofo. Exemplos de mofos incluem, sem limitação, uma espécie de Penicillium, uma espécie de Cladosporium, uma espécie de Byssochlamys ou uma combinação das mesmas.

Protozoários

[0306] Em certas modalidades exemplificadoras, o micróbio é um protozoário. Exemplos de protozoários que podem ser detectados de acordo com os métodos e dispositivos revelados incluem, sem limitação, qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de), Euglenozoa, Heterolobosea, Diplomonadida, Amoebozoa, Blastocystic e Apicomplexa. Exemplo Euglenoza inclui, entre outros, Trypanosoma cruzi (doença de Chagas), T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L.

infantum, L. mexicana, L. major, L. tropica e L. donovani.

Exemplo Heterolobosea inclui, sem limitação, Naegleria fowleri. Exemplo Diplomonadid inclui, sem limitação, Giardia intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis). Exemplo Os amebozoários incluem, sem limitação, Acanthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica.

Exemplo Blastocystis incluem, sem limitação, Blastocystic hominis. Exemplo Apicomplexa incluem, sem limitação, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. vivax, P.

ovale, P. malariae e Toxoplasma gondii.

Parasitas

[0307] Em certas modalidades exemplificadoras, o micróbio é um parasita. Exemplos de parasitas que podem ser detectados de acordo com os métodos revelados incluem, sem limitação, um ou mais de (ou qualquer combinação de), uma espécie de Onchocerca e uma espécie de Plasmodium.

Vírus

[0308] Em certas modalidades exemplificadoras, os sistemas, dispositivos e métodos revelados no presente documento são direcionados à detecção de vírus em uma amostra. As modalidades reveladas no presente documento podem ser usadas para detectar infecção viral (por exemplo, de um indivíduo ou planta) ou determinação de uma cepa viral, incluindo cepas virais que diferem por um único polimorfismo de nucleotídeo. O vírus pode ser um vírus de DNA, um vírus de RNA ou um retrovírus. Exemplos não limitativos de vírus úteis com a presente invenção incluem, sem limitação Ebola, sarampo, SARS, Chikungunya, hepatite, Marburg, febre amarela, MERS, Dengue, Lassa, influenza, rabdovírus ou HIV. Um vírus da hepatite pode incluir hepatite A, hepatite B ou hepatite C. Um vírus da influenza pode incluir, por exemplo, influenza A ou influenza B. Um HIV pode incluir HIV 1 ou HIV 2. Em certas modalidades exemplificadoras, a sequência viral pode ser vírus respiratório humano sincicial, vírus ebola do Sudão, vírus Bundibugyo, vírus ebola da Tai Forest, vírus Reston ebola, Achimota, flavivírus Aedes, vírus Aguacate, vírus Akabane, reptarenavírus aletinofídeo, vírus Allmarhuophida, vírus almarinofídico, vírus Allpahuayo mammaren, vírus Amapari mmarena, vírus Andes, vírus Apoi, vírus Aravan, vírus Aroa,

Arumwot virus, Paramyoxivírus do salmão do Atlântico,

lyssavírus de morcego australiano, bornavírus aviário,

metapneumovírus aviário, paramyoxvírus aviários, vírus do pinguim ou das Ilhas Malvinas, poliomavírus BK, vírus

Bagaza, vírus Banna, vírus Banna, vírus do bastão,

sapovírus do bastão, vírus da mamona Bearil, vírus Beilong,

Betacoronoavirus, Betapapillomavirus 1-6, Bhanja virus,

Bokeloh bat lyssavirus, Borna disease, Bourbon virus,

Bovine hepacivirus, Bovine parainfluenza virus 3, Bo vírus sincicial respiratório da videira, vírus Brazoran, vírus

Bunyamwere, vírus Caliciviridae.

Vírus da encefalite da

Califórnia, vírus Candiru, vírus da cinomose canina,

pneumovírus de Canaína, vírus do cedro, vírus do agente de fusão celular, morbillivírus de cetáceos, vírus de

Chandipura, vírus de Chaoyang, mammarenavírus de Chapare,

vírus de Chikungunya, papilomavírus de macaco Colobus,

vírus da febre do carrapato do Colorado, vírus da febre do carrapato, vírus da varíola bovina, vírus da febre hemorrágica do Congo, flavivírus Culex, vírus

Mammarenavírus Cupixi, vírus da Dengue, vírus Dobrava-

Belgrado, vírus Donggang, vírus Dugbe, vírus Duvenhage,

vírus da encefalite equina do leste, vírus do morcego

Entebbe, Enterovírus AD, lyssavírus morcego europeu 1-2,

vírus Eyach, Morbillivírus felino, Paramyxovírus Fer-de-

Lance, Vírus do rio Fitzroy, Vírus Flaviviridae,

Mammarenavírus Flexal, Vírus GB C, Gairo, Vírus

Gemycircular, Paramyoxiviurs de ganso SF02, Vírus Great

Island, Guanarito mammarenavírus, Vírus Hantaan, Hantavirus

Z10, vírus Coração V10 Hendra, Hepatite A/B/C/E, Vírus da hepatite delta, Bocavírus humano, Coronavírus humano,

Retrovírus endógeno K humano, Cólon entérico humano vírus,

vírus de DNA circular associado a fatores humanos 1,

herpesvírus humano 1-8, vírus de imunodeficiência humana

1/2, mastadenovírus Huan AG, papilomavírus humano, vírus da parainfluenza humana 1-4, paraechovírus humano,

picobirnavírus humano, smacovírus humano, lyssavírus Ikoma,

Vírus de Ilheus, Influenza AC, mammarenavírus Ippy, vírus

Irkut, J-vírus, poliomavírus JC, vírus da Japanses encephalitis virus, mammarenavírus Junin, poliomavírus KI,

vírus Kadipiro, vírus Kamiti River, vírus Kedougou, vírus

Khujand, Kokobera, doença da floresta Kyasanur, Vírus do morcego de Lagos, vírus Langat, vírus de Lassa mammarenavírus, mammarenavírus latino, vírus de Leopards

Hill, vírus de Liao ning, vírus de Ljungan, vírus de

Lloviu, vírus de Louping, vírus de mamário de Lujo,

mammarenavírus Luna, vírus de Lunk, coromenomeningite linfocítica mammarenavírus, Lyssavírus Ozerno.225,

mammarenavírus machupo, mamastrovírus 1, vírus Manzanilla,

vírus Mapuera, vírus Marburg, vírus Mayaro, vírus sarampo,

vírus Menangle, vírus Mercadeo, célula Merkel poliomavírus,

coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio,

vírus de Mobala mammarenavírus, vírus Modoc, vírus de

Moijang, vírus de Mokolo, vírus de Monkeypox, vírus de

Montana myotis leucoencefalite, vírus de Mopeia lassa reassortant 29, vírus de Mopeia lassa reassortant 29, vírus de Mopeia mammarenavírus, vírus de Morogoro, vírus de

Mossman, vírus de caxumba, vírus de pneumonia murina, Vírus da encefalite do vale Murray, vírus Nariva, vírus da doença de Newcastle, vírus Nipah, vírus Norwalk, hepacivírus de ratos na Noruega, vírus Ntaya, vírus O'nyong-nyong,

mammarenavírus Oliveros, vírus de febre hemorrágica Omsk,

vírus Oropouche, vírus Parainfluenza 5, vírus mamário paranaense, Vírus Parramatta River, vírus Peste-des-petits-

ruminantes, Pichande mammarenavirus, vírus Picornaviridae,

Mamital vírus-pirital, Piscihepevirus A, vírus parainfluenza porcino 1, rubulavírus porcino, vírus

Powassan, vírus linfotrópico T-prima 1-2, vírus eritropoide

1-2, Primate erythroparv Vírus Toro, vírus Puumala, vírus

Quang Binh, vírus Raiva, vírus Razdan, vírus réptil born1,

Rhinovirus AB, vírus da febre do Vale do Rift, Vírus

Rinderpest, Vírus Rio Bravo, Vírus Roedor Torque Teno,

Hepacivírus roedor, Vírus Ross River, Rotavirus AI, Vírus

Royal Farm, Vírus Rubéola, Sabia mammarenavírus, Vírus

Salem, Vírus da Febre de flebotomíneo de Nápoles, Vírus da

Febre de flebotomíneo da Sicília, Sapporo, Sathuperi vírus,

anellovírus de selo, vírus da floresta de Semliki, vírus de

Sendai, vírus de Seul, vírus de Sepik, coronavírus relacionado à síndrome respiratória aguda grave, febre grave com vírus da síndrome de trombocitopenia, vírus de

Shamonda, vírus de morcego Shimoni, vírus de Shuni, vírus de Simbu, vírus de torque teno simiano, Vírus Simian 40-41,

vírus Sin Nombre, vírus Sindbis, anellovírus pequeno, vírus

Sosuga, vírus da encefalite de cabra espanhola, vírus

Spondweni, vírus da encefalite de St.

Louis, vírus da luz do sol, mini-vírus similar ao TTV, Tacaribe mammarenavírus,

vírus Taila, vírus Tamana vírus do morcego, vírus Tammar mammarenavírus, vírus Tembusu, vírus Thogoto, vírus

Thottapalayam, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, vírus Tioman, vírus Togaviridae, vírus Torque teno canis, vírus Torque teno canis, vírus Torque teno douroucouli, Vírus Torque teno felis, vírus Torque teno midi, vírus Torque teno sus, vírus Torque teno tamarin,

vírus Torque teno, vírus Torque teno zalophus, vírus

Tuhoko, vírus Tula, vírus Tupaia paramyxovirus, vírus

Usutu, vírus Uukuniemi, vírus Vaccinia, vírus Variola,

Vírus da encefalite equina venezuelana, vírus da estomatite vesicular Indiana, vírus WU Polyomavirus, vírus

Wesselsbron, vírus morcego do Cáucaso Ocidental, vírus do

Nilo Ocidental, vírus da encefalite equina ocidental,

mammarenavírus Whitewater Arroyo, vírus da febre amarela, vírus Yokose, vírus Yug Bogdanovac, vírus Zaire ebolavírus, vírus Zika, ou sequência viral Z do vírus Zygosaccharomyces bailii. Exemplos de vírus de RNA que podem ser detectados incluem um ou mais de (ou qualquer combinação de) vírus Coronaviridae, vírus Picornaviridae, vírus Caliciviridae, vírus Flaviviridae, vírus Togaviridae, Bornaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Pneumoviridae, um Rhabdoviridae, um Arenaviridae, um Bunyaviridae, um Orthomyxoviridae ou um Deltavírus. Em certas modalidades exemplificadoras, o vírus é Coronavírus, SARS, Poliovírus, Rinovírus, Hepatite A, vírus Norwalk, vírus da febre amarela, vírus do Nilo Ocidental, vírus da hepatite C, vírus da dengue, vírus Zika, vírus Rubéola, vírus Ross River, vírus Sindbis, Vírus Chikungunya, vírus da doença de Boma, vírus do Ebola, vírus de Marburg, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus de Nipah, vírus de Hendra, vírus da doença de Newcastle, vírus sincicial respiratório humano, vírus da raiva, vírus de Lassa, Hantavírus, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, Gripe ou vírus da hepatite D.

[0309] Em certas modalidades exemplificadoras, o vírus pode ser um vírus de planta selecionado do grupo que compreende o vírus do mosaico do tabaco (TMV), o vírus da murcha do tomate (TSWV), o vírus do mosaico do pepino (CMV), o vírus da batata Y (PVY), o Vírus RT Vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), Vírus da ameixa (PPV), Vírus do mosaico Brome (BMV), Vírus da batata X (PVX), Vírus da tristeza cítrica (CTV), Vírus do nanismo amarelo da cevada

(BYDV), Vírus da folha de batata (PLRV), Vírus do congestionamento do tomate (TBSV), vírus esférico do arroz tungro (RTSV), vírus da mancha amarela do arroz (RYMV),

vírus da folha branca do arroz (RHBV), vírus do milho raiado fino (MRFV), vírus do mosaico anão do milho (MDMV),

vírus do mosaico da cana de açúcar (SCMV), vírus do mosquito da batata doce (SPFMV), vírus da fechadura das veias afundadas da batata doce (SPSVV), vírus da videira fanleaf da videira (GFLV), vírus da videira A (GVA), vírus da videira A (GVA), vírus da videira B (GVB), vírus da mancha de videira (GFkV), vírus-1, -2 e -3 associado ao leafroll da videira (GLRaV-1, -2 e -3), vírus do mosaico de

Arabis (ArMV) ou vírus associados à picada de rupestris vi rus (RSPaV). Em uma modalidade preferencial, a molécula de

RNA alvo é parte do dito patógeno ou transcrita a partir de uma molécula de DNA do dito patógeno.

Por exemplo, a sequência alvo pode estar compreendida no genoma de um vírus de RNA.

É ainda preferencial que a proteína efetora

CRISPR hidrolise a dita molécula de RNA alvo do dito patógeno na dita planta se o dito patógeno infectar ou infectar a dita planta.

Portanto, é preferencial que o sistema CRISPR tenha a capacidade de separar a molécula de

RNA alvo do patógeno da planta quando o sistema CRISPR (ou partes necessárias para sua conclusão) for aplicado terapeuticamente, ou seja, após a infecção ou profilaticamente, ou seja, antes da infecção.

[0310] Em certas modalidades exemplificadoras, o vírus pode ser um retrovírus. Exemplos de retrovírus que podem ser detectados usando as modalidades reveladas no presente documento incluem um ou mais de ou qualquer combinação de vírus do Gênero Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Lentivirus, Spumavirus ou Família Metaviridae, Pseudoviridae e HIV Retroviridae (incluindo Retroviridae)), Hepadnaviridae (incluindo o vírus da hepatite B) e Caulimoviridae (incluindo o vírus do mosaico da couve-flor).

[0311] Em certas modalidades exemplificadoras, o vírus é um vírus de DNA. Exemplos de vírus de DNA que podem ser detectados usando as modalidades reveladas no presente documento incluem um ou mais (ou qualquer combinação de) vírus da Família Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae (incluindo vírus do herpes humano e vírus Varicella Zoster), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfarviridae (incluindo vírus da peste suína Africano), Baculoviridae, Cicaudaviridae,

Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, Polidnavírus, Polyomaviridae (incluindo vírus Simian 40, vírus JC, vírus BK), Poxviridae (incluindo varíola e varíola), Sphaerolipoviridae, Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus, Rhizidovirus.

Em algumas modalidades, um método para diagnosticar uma infecção bacteriana específica da espécie em um indivíduo suspeito de ter uma infecção bacteriana é descrito como a obtenção de uma amostra que compreende ácido ribonucleico ribossômico bacteriano do indivíduo; entrar em contato com a amostra com uma ou mais das sondas descritas e detectar a hibridização entre a sequência bacteriana do ácido ribossômico ribonucleico presente na amostra e a sonda, em que a detecção da hibridização indica que o indivíduo está infectado com Escherichia coH, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Candida albicans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus mirabilis, Staphylococcus agalactiae ou Staphylococcus maltophilia ou uma combinação dos mesmos.

Detecção e monitoramento de malária

[0312] A malária é uma patologia transmitida por mosquitos causada por parasitas do Plasmodium. Os parasitas são transmitidos às pessoas através das picadas de mosquitos fêmeas infectados de Anopheles. Cinco espécies de Plasmodium causam malária em humanos: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae e Plasmodium knowlesi. Entre eles, segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), o Plasmodium falciparum e o Plasmodium vivax são responsáveis pela maior ameaça. P.

falciparum é o parasita da malária mais prevalente no continente africano e é responsável pela maioria das mortes relacionadas à malária em todo o mundo. P. vivax é o parasita dominante da malária na maioria dos países fora da África Subsaariana.

[0313] Em 2015, 91 países e áreas mantinham transmissão contínua da malária. Segundo as últimas estimativas da OMS, houve 212 milhões de casos de malária em 2015 e 429.000 mortes. Em áreas com alta transmissão de malária, crianças menores de 5 anos são particularmente suscetíveis a infecções, doenças e morte; mais de dois terços (70%) de todas as mortes por malária ocorrem nessa faixa etária. Entre 2010 e 2015, a taxa de mortalidade por malária abaixo de 5 anos caiu 29% em todo o mundo. No entanto, a malária continua sendo a principal causa de morte de crianças menores de cinco anos, tirando a vida de uma criança a cada dois minutos.

[0314] Conforme descrito pela OMS, a malária é uma doença febril aguda. Em um indivíduo não imune, os sintomas aparecem 7 dias ou mais após a picada do mosquito infectada. Os primeiros sintomas - febre, dor de cabeça, calafrios e vômitos - podem ser leves e difíceis de reconhecer como malária; no entanto, se não for tratada dentro de 24 horas, a malária por P. falciparum pode progredir para uma doença grave, muitas vezes levando à morte.

[0315] Crianças com malária grave frequentemente desenvolvem um ou mais dos seguintes sintomas: anemia grave, dificuldade respiratória em relação à acidose metabólica ou malária cerebral. Nos adultos, o envolvimento de múltiplos órgãos também é frequente. Nas áreas endêmicas da malária, as pessoas podem desenvolver imunidade parcial, permitindo a ocorrência de infecções assintomáticas.

[0316] O desenvolvimento de testes diagnósticos rápidos e eficientes é de alta relevância para a saúde pública. De fato, o diagnóstico e o tratamento precoces da malária não apenas reduzem a doença e previnem as mortes, mas também contribuem para reduzir a transmissão da malária. De acordo com as recomendações da OMS, todos os casos de suspeita de malária devem ser confirmados usando testes de diagnóstico baseados em parasitas (principalmente usando um teste de diagnóstico rápido) antes da administração do tratamento (consulte “WHO Guidelines for the treatment of malaria”, terceira edição, publicada em abril de 2015)

[0317] A resistência a terapias antimaláricas representa um problema crítico de saúde que reduz drasticamente as estratégias terapêuticas. De fato, conforme relatado no site da OMS, a resistência de P.

falciparum às gerações anteriores de medicamentos, como a cloroquina e sulfadoxina/pirimetamina (SP), tornou-se generalizada nas décadas de 1950 e 1960, minando os esforços de controle da malária e revertendo os ganhos na sobrevivência infantil. Assim, a OMS recomenda o monitoramento rotineiro da resistência aos medicamentos antimaláricos. De fato, o diagnóstico preciso pode evitar tratamentos inadequados e limitar a extensão da resistência aos medicamentos antimaláricos.

[0318] Nesse contexto, a Estratégia Técnica Global da OMS para a malária 2016-2030 - adotada pela Assembleia Mundial da Saúde em maio de 2015 - fornece uma estrutura técnica para todos os países endêmicos da malária. Destina- se a orientar e apoiar programas regionais e nacionais, enquanto trabalham para o controle e eliminação da malária.

A estratégia estabelece metas globais ambiciosas, mas alcançáveis, incluindo: ● Reduzir a incidência de casos de malária em pelo menos 90% até 2030.

● Reduzir as taxas de mortalidade por malária em pelo menos 90% até 2030.

● Eliminar a malária em pelo menos 35 países até

2030.

● Prevenir o ressurgimento da malária em todos os países livres da malária.

[0319] Essa estratégia foi o resultado de um extenso processo consultivo que durou 2 anos e envolveu a participação de mais de 400 versados técnicos de 70 Estados-Membros. É baseado em 3 eixos principais: ● garantir acesso universal à prevenção, diagnóstico e tratamento da malária; ● acelerar os esforços para a eliminação e obtenção do status de livre de malária; e ● transformar a vigilância da malária em uma intervenção central.

[0320] Os tratamentos contra o Plasmodium incluem álcoois aril-amino, como quinino ou derivados de quinino, como cloroquina, amodiaquina, mefloquina, piperaquina, lumefantrina, primaquina; análogo lipofílico da hidroxinaftoquinona, como atovaquona; fármacos antifolatos,

como os fármacos sulfa sulfadoxina, dapsona e pirimetamina; proguanil; a combinação de atovaquona/proguanil; fármacos atemisinas; e combinações dos mesmos.

[0321] Sequências alvo que são diagnósticas para a presença de um patógeno transmitido por mosquitos incluem sequências que são diagnósticas para a presença de Plasmodium, especialmente espécies de Plasmodia que afetam seres humanos como Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae e Plasmodium knowlesi, incluindo sequências dos seus genomas.

[0322] Sequências alvo que são diagnósticas para monitorar a resistência aos medicamentos contra o tratamento contra Plasmodium, especialmente espécies de Plasmodia que afetam seres humanos como Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malarias e Plasmodium knowlesi.

[0323] Outras sequências alvo incluem moléculas alvo/moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas envolvidas em processos biológicos essenciais para o parasita Plasmodium e, notadamente, proteínas transportadoras, como proteínas da família transportadora de fármacos/metabolitos, a proteína cassete de ligação ao ATP (ABC) envolvida na translocação do substrato, como a subfamília do transportador ABC ou o trocador Na +/H+, glutationa de membrana S-transferase; proteínas envolvidas na via do folato, como a di-hidropteroato-sintase, a atividade de di-hidrofolato-redutase ou a di-hidrofolato- redutase-timidilato-sintase; e proteínas envolvidas na translocação de prótons através da membrana mitocondrial interna e principalmente do complexo do citocromo b. Alvos adicionais também podem incluir o gene (ou genes) que codifica a polimerase do heme.

[0324] Outras sequências alvo incluem moléculas alvo/moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas envolvidas em processos biológicos essenciais que podem ser selecionados do gene transportador de resistência à cloroquina de P. falciparum (pfcrf), transportador 1 de resistência a múltiplas fármacos de P. falciparum (pfmdrl), o gene da proteína associada à resistência a múltiplos fármacos de P. falciparum (Pfmrp), o gene permutador de Na+/H+ de P. falciparum (pfnhe), o gene que codifica a proteína 1 exportada de P. falciparum, a ATPase 6 que transporta Ca2+ de P. falciparum (pfat p6), os genes de P.

falciparum di-hidropteroato sintase (pfdhps), atividade de di-hidrofolato redutase (pfdhpf) e diidrofolato redutase- timidilato-sintetase (pfdhfr), o gene do citocromo b, a GTP ciclo-hidrolase e o gene funcional Kelell3 (KI 3) em outras espécies de Plasmodium.

[0325] Inúmeras mutações, notadamente mutações de ponto único, foram identificadas nas proteínas que são os alvos dos tratamentos atuais e associadas a fenótipos de resistência específicos. Por conseguinte, a invenção permite a detecção de vários fenótipos de resistência de parasitas transmitidos por mosquitos, como o plasmodium.

[0326] A invenção permite detectar uma ou mais mutações e, notavelmente, um ou mais polimorfismos de nucleotídeo único em ácidos nucleicos/moléculas alvo. Por conseguinte, qualquer uma das mutações abaixo, ou sua combinação, pode ser usada como um marcador de resistência ao medicamento e pode ser detectada de acordo com a invenção.

[0327] Mutações de ponto único em P. falciparum KI3 incluem as seguintes mutações de ponto único nas posições 252, 441, 446, 449, 459, 458, 493, 539, 543, 5 53, 561, 568, 574, 578, 580, 675, 476, 469, 481, 522, 537, 538, 579, 584 e 719 e, a saber, as mutações E252Q, P441L, F446I, G449A, N458Y, Y493H, R539T, I543T, P553L, R561H, V568G, P574L, A578S, C575 M476I; C469Y; A481V; S522C; N537I; N537D; G538V; M579I; D584V; e H719N. Essas mutações geralmente estão associadas aos fenótipos de resistência aos medicamentos com artemisinina (resistência à terapia combinada à base de artemisinina e artemisinina, abril de 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5).

[0328] Na di-hidrofolato redutase de P. falciparum (DHFR) (E/DHFR-TS, PFD0830w), polimorfismos importantes incluem mutações nas posições 108, 51, 59 e 164, notadamente 108 D, 164L, 511 e 59R, que modulam a resistência à pirimetamina. Outros polimorfismos também incluem 437G, 581G, 540E, 436A e 613S, os quais estão associados à resistência à sulfadoxina. Mutações observadas adicionais incluem Serl08Asn, Asn51Ile, Cys59Arg, Ilel64Leu, Cys50Arg, Ilel64Leu, Asnl88Lys, Serl89Arg e Val213Ala, Serl08Thr e Alal6Val. As mutações Serl08Asn, Asn51Ile, Cys59Arg, Ilel64Leu, Cys50Arg, Ilel64Leu estão notavelmente associadas à terapia baseada em pirimetamina e/ou resistências à terapia combinada de cloroguanina- dapsona. A resistência ao cicloguanil parece estar associada às mutações duplas Serl08Thr e Alal6Val. A amplificação de dhfr também pode ser de alta relevância para a resistência à terapia, notadamente a resistência à pirimetamina.

[0329] Na di-hidropteroato sintase de P. falciparum (DHPS) (E/DHPS, PF08 0095), polimorfismos importantes incluem mutações nas posições 436, 437, 581 e 613 Ser436Ala/Phe, Ala437Gly, Lys540Glu, Ala581Gly e Ala613Thr/Ser. O polimorfismo na posição 581 e/ou 613 também tem sido associado à resistência às terapias à base de sulfadoxina-pirimetamina.

[0330] No transportador de resistência à cloroquina por P. falciparum (E/CRT), o polimorfismo na posição 76, a saber, a mutação Lys76Thr, está associado à resistência à cloroquina. Outros polimorfismos incluem Cys72Ser, Met74Ile, Asn75Glu, Ala220Ser, Gln271Glu, Asn326Ser, Ile356Thr e Arg371Ile que podem estar associados à resistência à cloroquina. O PfCRT também é fosforilado nos resíduos S33, S411 e T416, que podem regular a atividade de transporte ou a especificidade da proteína.

[0331] No transportador de resistência a múltiplos fármacos de P. falciparum 1 (E/MDR I) (PFE1150w), polimorfismos nas posições 86, 184, 1034, 1042, principalmente Asn86Tyr, Tyrl84-Phe, Ser 10 34Cys, Asn 1042Asp e Aspl246Tyr foram identificados e relataram influenciar a suscetibilidade à lumefantrina, artemisinina, quinina, mefloquina, halofantrina e cloroquina. Além disso, a amplificação de PfMDRl está associada à susceptibilidade reduzida à lumefantrina, artemisinina, quinina, mefloquina e halofantrina e desamplificação de PfMDRl leva a um aumento na resistência à cloroquina. A amplificação de pfmdrl também pode ser detectada. O status de fosforilação do PfMDR também é de alta relevância.

[0332] Na proteína associada à resistência a múltiplos fármacos de P. falciparum (P/MRP) (referência de gene PFA0590w), polimorfismos nas posições 191 e/ou 437, como Y191H e A437S, foram identificados e associados a fenótipos de resistência à cloroquina.

[0333] No permutador de Na+/H+ de P. falciparum (pf NHE) (ref PF13 0019), o aumento da repetição do DNNND no microssatélite ms4670 pode ser um marcador para a resistência à quinina.

[0334] Mutações que alteram o sítio de ligação ao ubiquinol da proteína do citocromo b codificado pelo gene be do citocromo (cytb, mal_mito_3) estão associadas à resistência ao atovaquona. Mutações nas posições 26, 268, 276, 133 e 280 e principalmente Tyr26Asn, Tyr268Ser, M1331 e G280D podem estar associadas à resistência a atovaquona.

[0335] Por exemplo, em P Vivax, mutações em PvMDRl, o homólogo de Pf MDR1 foram associadas à resistência à cloroquina, notadamente um polimorfismo na posição 976, como a mutação Y976F.

[0336] As mutações acima são definidas em termos de sequências de proteínas. No entanto, o versado na técnica é capaz de determinar as mutações correspondentes, incluindo SNPS, a serem identificadas como uma sequência alvo de ácido nucleico.

[0337] Outros marcadores de resistência a medicamentos identificados são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em “Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs (1996--2004) f WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance (Abril de 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5); “Drug-

resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health” FEBSLett. 6 de junho de 2011;585(1 l):I551-62. doi:10.I0I6/j.febslet.20Il.04.042. Epub 23 de abril de 2011. Review. PubMed PMID: 21530510, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência.

[0338] Quanto aos polipeptídeos que podem ser detectados de acordo com a presente invenção, produtos gênicos de todos os genes aqui mencionados podem ser usados como alvos. Correspondentemente, está contemplado que tais polipeptídeos possam ser usados para identificação de espécies, tipificação e/ou detecção de resistência a fármacos.

[0339] Em certas modalidades exemplificadoras, os sistemas, dispositivos e métodos revelados no presente documento são direcionados à detecção da presença de um ou mais parasitas transmitidos por mosquitos em uma amostra, como uma amostra biológica obtida de um indivíduo. Em certas modalidades exemplificadoras, o parasita pode ser selecionado das espécies Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae ou Plasmodium knowlesi. Por conseguinte, os métodos revelados no presente documento podem ser adaptados para uso em outros métodos (ou em combinação) com outros métodos que requerem identificação rápida de espécies de parasitas, monitorando a presença de parasitas e formas de parasitas (por exemplo,

correspondendo a vários estágios de infecção e ciclo de vida do parasita, como ciclo exo-eritrocítico, ciclo eritrocítico, ciclo esporpogônico; formas de parasitas, incluindo merozoítos, esporozoítos, esquizontes, gametócitos); detecção de certos fenótipos (por exemplo, resistência a agentes patogênicos), monitoramento da progressão da doença e/ou surto e triagem de tratamento (fármacos). Além disso, no caso da malária, pode decorrer um longo tempo após a picada infecciosa, ou seja, um longo período de incubação, durante o qual o paciente não apresenta sintomas. Da mesma forma, os tratamentos profiláticos podem atrasar o aparecimento dos sintomas, e longos períodos assintomáticos também podem ser observados antes de uma recaída. Tais atrasos podem facilmente causar erros de diagnóstico ou atraso no diagnóstico e, assim, prejudicar a eficácia do tratamento.

[0340] Devido às capacidades de diagnóstico rápidas e sensíveis das modalidades reveladas no presente documento, detecção do tipo de parasita, até uma única diferença de nucleotídeo e a capacidade de ser implantada como um dispositivo POC, as modalidades reveladas no presente documento podem ser usadas para orientar terapêuticas esquemas, como a seleção do curso de tratamento apropriado. As modalidades reveladas no presente documento também podem ser usadas para rastrear amostras ambientais (população de mosquitos, etc.) quanto à presença e à tipificação do parasita. As modalidades também podem ser modificadas para detectar parasitas transmitidos por mosquitos e outros patógenos transmitidos por mosquitos simultaneamente. Em alguns casos, a malária e outros patógenos transmitidos por mosquitos podem apresentar inicialmente sintomas similares. Assim, a capacidade de distinguir rapidamente o tipo de infecção pode orientar importantes decisões de tratamento. Outros patógenos transmitidos por mosquitos que podem ser detectados em conjunto com a malária incluem dengue, vírus do Nilo Ocidental, chikungunya, febre amarela, filariose, encefalite japonesa, encefalite de Saint Louis, encefalite equina ocidental, encefalite equina oriental, encefalite equina venezuelana, encefalite La Crosse, e zika.

[0341] Em certas modalidades exemplificadoras, os dispositivos, sistemas e métodos revelados no presente documento podem ser usados para distinguir várias espécies de parasitas transmitidas por mosquitos em uma amostra. Em certas modalidades exemplificadoras, a identificação pode ser baseada em sequências de RNA ribossômico, incluindo as subunidades 18S, 16S, 23 S e 5S. Em certas modalidades exemplificadoras, a identificação pode ser baseada em sequências de genes que estão presentes em várias cópias no genoma, como genes mitocondriais como CYTB. Em certas modalidades exemplificadoras, a identificação pode ser baseada em sequências de genes que são altamente expressos e/ou altamente conservados, como GAPDH, Histona H2B, enolase ou LDH. Os métodos para identificar sequências relevantes de rRNA são revelados na Publicação de Pedido de Patente no US 2017/0029872. Em certas modalidades exemplificadoras, um conjunto de RNAs guia pode ser projetado para distinguir cada espécie por uma região variável que é única para cada espécie ou cepa. Os RNAs guia também podem ser projetados para direcionar genes de RNA que distinguem micróbios nos gêneros, família, ordem, classe, filo, níveis de reino ou uma combinação dos mesmos.

Em certas modalidades exemplificadoras em que a amplificação é usada, um conjunto de primers de amplificação pode ser projetado para flanquear regiões constantes da sequência de RNA ribossômico e um RNA guia projetado para distinguir cada espécie por uma região interna variável. Em certas modalidades exemplificadoras, os primers e os RNAs guia podem ser projetados para regiões conservadas e variáveis na subunidade 16S respeitosamente.

Outros genes ou regiões genômicas que são exclusivamente variáveis entre espécies ou um subconjunto de espécies como a família de genes RecA, subunidade RNA polimerase P, também podem ser usados. Outros marcadores filogenéticos adequados, e métodos para identificar os mesmos, são discutidos, por exemplo, em Wu et al. arX1v: 1307.8690 [q- bio.GN],

[0342] Em certas modalidades exemplificadoras, a identificação de espécies pode ser realizada com base em genes que estão presentes em várias cópias no genoma, como genes mitocondriais como CYTB. Em certas modalidades exemplificadoras, a identificação de espécies pode ser realizada com base em genes altamente expressos e/ou altamente conservados, como GAPDH, Histona H2B, enolase ou LDH.

[0343] Em certas modalidades exemplificadoras, um método ou diagnóstico é projetado para rastrear parasitas transmitidos por mosquitos em vários níveis filogenéticos e/ou fenotípicos ao mesmo tempo. Por exemplo, o método ou diagnóstico pode compreender o uso de vários sistemas CRISPR com diferentes RNAs guia. Um primeiro conjunto de RNAs guia pode distinguir, por exemplo, entre Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. Essas classes gerais podem ser subdivididas ainda mais. Por exemplo, os RNAs guia podem ser projetados e usados no método ou diagnóstico que distingue cepas resistentes a medicamentos, em geral ou com relação a um medicamento específico ou combinação de medicamentos. Um segundo conjunto de RNAs guia pode ser projetado para distinguir micróbios no nível da espécie.

Assim, uma matriz pode ser produzida identificando todas as espécies ou subespécies de parasitas transmitidas por mosquitos, divididas ainda mais de acordo com a resistência aos medicamentos. O disposto acima é apenas para fins de exemplo. Outros meios para classificar outros tipos de parasitas transmitidos por mosquitos também são contemplados e seguiriam a estrutura geral descrita acima.

[0344] Em certas modalidades exemplificadoras, os dispositivos, sistemas e métodos revelados no presente documento podem ser usados para rastrear genes de interesse de parasitas transmitidos por mosquitos, por exemplo, genes de resistência a fármacos. Os RNAs guia podem ser projetados para distinguir entre genes de interesse conhecidos. Amostras, incluindo amostras clínicas, podem então ser rastreadas com o uso das modalidades reveladas no presente documento para detecção de um ou mais desses genes. A capacidade de rastrear a resistência a medicamentos no POC traria tremendo benefício na seleção de um regime de tratamento apropriado. Em certas modalidades exemplificadoras, os genes de resistência a fármacos são genes que codificam proteínas como proteínas transportadoras, como proteínas da família de transportadores de fármacos/metabolitos, a proteína cassete de ligação a ATP (ABC) envolvida na translocação de substrato, como a subfamília transportadora ABC ou o trocador Na+/H+; proteínas envolvidas na via do folato, como a di-hidropteroato-sintase, a atividade de di-hidrofolato- redutase ou a di-hidrofolato-redutase-timidilato-sintase; e proteínas envolvidas na translocação de prótons através da membrana mitocondrial interna e principalmente do complexo do citocromo b. Alvos adicionais também podem incluir o gene (ou genes) que codificam a polimerase do heme. Em certas modalidades exemplificadoras, os genes de resistência a fármacos são selecionados a partir do gene transportador de resistência à cloroquina de P. falciparum (pfcrf), o transportador de resistência a múltiplos fármacos de P. falciparum 1 (pfmdrPy), o gene da proteína associada à resistência a múltiplos fármacos de P.

falciparum (Pfrnrpf), o gene trocador Na+/H+ de P.

falciparum (pfnhe), Ca2+ de P. falciparum que transporta ATPase 6 (pfatp6), a di-hidropteroato sintase de P.

falciparum (pfdhps), a atividade de di-hidrofolato redutase (pfdhpf) e os di-hidrofolatos redutase-timidilfosfase, citocromo b, GTP ciclo-hidrolase e o gene Kelchl3 (KI3), bem como seus genes heterólogos funcionais em outras espécies de Plasmodium. Outros marcadores de resistência a medicamentos são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em “Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs (1996-2004)”, OMS; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance (Abril de 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5); “Drug-resistant malaria:

molecular mechanisms and implications for public health” FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11): 1551-62. doi: 10.1016/j .febslet.2011.04.042. Epub 23 de abril de 2011. Review.

PubMed PMID: 21530510; cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência.

[0345] Em algumas modalidades, um sistema CRISPR, sistema de detecção ou métodos de uso dos mesmos, conforme descrito no presente documento, pode ser usado para determinar a evolução de um surto de parasita transmitido por mosquito. O método pode compreender a detecção de uma ou mais sequências alvo de uma pluralidade de amostras de um ou mais sujeitos, em que a sequência alvo é uma sequência de um parasita transmitido por mosquito que se espalha ou causa os surtos. Esse método pode compreender adicionalmente determinar um padrão de transmissão de parasitas transmitidos por mosquitos ou um mecanismo envolvido em um surto de doença causado por um parasita transmitido por mosquitos. As amostras podem ser derivadas de um ou mais seres humanos e/ou derivadas de um ou mais mosquitos.

[0346] O padrão de transmissão de patógenos pode compreender novas transmissões continuadas a partir do reservatório natural do parasita transmitido por mosquitos ou outras transmissões (por exemplo, através de mosquitos) após uma única transmissão a partir do reservatório natural ou uma mistura de ambos. Em uma modalidade, a sequência alvo é preferencialmente uma sequência dentro do genoma do parasita transmitido por mosquitos ou fragmentos do mesmo.

Em uma modalidade, o padrão da transmissão de parasitas transmitida por mosquitos é o padrão inicial da transmissão de parasitas transmitida por mosquitos, isto é, no início do surto de parasitas transmitido por mosquitos. A determinação do padrão da transmissão de parasitas transmitidos por mosquitos no início do surto aumenta a probabilidade de interromper o surto o mais cedo possível, reduzindo assim a possibilidade de disseminação local e internacional.

[0347] A determinação do padrão da transmissão de parasitas transmitidos por mosquitos pode compreender a detecção de uma sequência de parasitas transmitidos por mosquitos de acordo com os métodos descritos no presente documentos. A determinação do padrão da transmissão de patógenos pode compreender adicionalmente a detecção de variações compartilhadas intra-hospedeiro da sequência de parasitas transmitidas por mosquitos entre os indivíduos e determinar se as variações compartilhadas intra-hospedeiro mostram padrões temporais. Padrões na variação intra- hospedeiro e inter-hospedeiro observados fornecem informações importantes sobre transmissão e epidemiologia (Gire, etal., 2014).

[0348] Além de outros tipos de amostra revelados no presente documento, a amostra pode ser derivada de um ou mais mosquitos, por exemplo, a amostra pode compreender saliva de mosquito.

Detecção de biomarcadores

[0349] Em certas modalidades exemplificadoras, os sistemas, dispositivos e métodos revelados no presente documento podem ser usados para detecção de biomarcadores.

Por exemplo, os sistemas, dispositivos e métodos revelados no presente documento podem ser usados para detecção de SNP e/ou genotipagem. Os sistemas, dispositivos e métodos revelados no presente documento também podem ser usados para a detecção de qualquer estado ou distúrbio de doença caracterizado pela expressão gênica aberrante. A expressão gênica aberrante inclui aberração no gene expresso, localização da expressão e nível de expressão. Vários transcritos ou marcadores de proteínas relacionados a doenças cardiovasculares, imunológicas e câncer, entre outras doenças, podem ser detectados. Em certas modalidades exemplificadoras, as modalidades reveladas no presente documento podem ser usadas para detecção de DNA sem células de doenças que envolvem lise, como fibrose hepática e doença pulmonar restritiva/obstrutiva. Em certas modalidades exemplificadoras, as modalidades podem ser usadas para detecção mais rápida e portátil para teste pré-

natal de DNA sem células. As modalidades reveladas no presente documento podem ser usadas para rastrear painéis de diferentes SNPs associados a, entre outros, saúde cardiovascular, assinaturas lipídicas/metabólicas, identificação de etnia, correspondência de paternidade, ID humana (por exemplo, correspondência de suspeito a um banco de dados criminal de assinaturas de SNP). As modalidades reveladas no presente documento também podem ser usadas para detecção de DNA livre de células de mutações relacionadas a e liberadas de tumores de câncer. As modalidades reveladas no presente documento também podem ser usadas para detecção da qualidade da carne, por exemplo, fornecendo detecção rápida de diferentes fontes animais em um determinado produto de carne. Modalidades reveladas no presente documento também podem ser usadas para a detecção de OGM ou edição de genes relacionados ao DNA. Como descrito no presente documento em outro lugar, genótipos/alelos ou biomarcadores intimamente relacionados (por exemplo, tendo apenas uma única diferença de nucleotídeo em uma determinada sequência alvo) podem ser distinguidos pela introdução de uma incompatibilidade sintética no gRNA.

[0350] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para detectar ácidos nucleicos alvo em amostras, que compreende:

distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes discretos individuais, que compreende os volumes discretos individuais um sistema CRISPR de acordo com a invenção, como descrito no presente documento; incubar a amostra ou conjunto de amostras em condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo; ativar a proteína efetora CRISPR via ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína efetora CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra.

Tipos de amostra de biomarcador

[0351] A sensibilidade dos ensaios descrito no presente documentos é bem adequada para a detecção de ácidos nucleicos alvo em uma ampla variedade de tipos de amostras biológicas, incluindo tipos de amostras nos quais o ácido nucleico alvo é diluído ou para o qual o material da amostra é limitado. A triagem de biomarcadores pode ser realizada em vários tipos de amostras, incluindo, entre outros, saliva, urina, sangue, fezes, escarro e líquido cefalorraquidiano. As modalidades reveladas no presente documento também podem ser usadas para detectar a regulação positiva ou negativa de genes. Por exemplo, uma amostra pode ser diluída em série de modo que apenas genes superexpressos permaneçam acima do limiar de detecção do teste.

[0352] Em certas modalidades, a presente invenção fornece etapas para obter uma amostra de fluido biológico (por exemplo, urina, plasma ou soro sanguíneo, escarro, fluido espinhal cerebral) e extrair o DNA. A sequência nucleotídica mutante a ser detectada, pode ser uma fração de uma molécula maior ou pode estar presente inicialmente como uma molécula discreta.

[0353] Em certas modalidades, o DNA é isolado do plasma/soro de um paciente com câncer. Para comparação, amostras de DNA isoladas de tecido neoplásico e uma segunda amostra podem ser isoladas de tecido não neoplásico do mesmo paciente (controle), por exemplo, linfócitos. O tecido não neoplásico pode ser do mesmo tipo que o tecido neoplásico ou de uma fonte de órgão diferente. Em certas modalidades, as amostras de sangue são coletadas e o plasma imediatamente separado das células sanguíneas por centrifugação. O soro pode ser filtrado e armazenado congelado até a extração do DNA.

[0354] Em certas modalidades exemplificadoras, os ácidos nucleicos alvo são detectados diretamente de uma amostra bruta ou não processada, como sangue, soro, saliva, líquido cefalorraquidiano, escarro ou urina. Em certas modalidades exemplificadoras, o ácido nucleico alvo é o DNA sem células.

Células tumorais circulantes

[0355] Em uma modalidade, as células circulantes (por exemplo, células tumorais circulantes (CTC)) podem ser analisadas com a presente invenção. Pode ser realizado o isolamento de células tumorais circulantes (CTC) para uso em qualquer um dos métodos descritos no presente documentos. Tecnologias exemplares que alcançam detecção e captura específica e sensível de células circulantes que podem ser usadas na presente invenção foram descritas (Mostert B, et al., Circular cell tumor cells (CTCs): detection methods and their clinical relevance in breast cancer. Cancer Treat Rev. 2009; 35: 463 a 474; e Talasaz AH, et al., Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106: 3.970 a 3.975). Uma quantidade menor que um CTC pode ser encontrada no fundo de 105-106 células mononucleares do sangue periférico (Ross AA, et al., Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques. Blood.

1993, 82: 2.605 a 2.610). A plataforma CellSearch® utiliza microesferas imunomagnéticas revestidas com anticorpos para a Molécula de Adesão Celular Epitelial (EpCAM) para enriquecer as células epiteliais que expressam EPCAM, seguida por imunocoloração para confirmar a presença de coloração por citoqueratina e a ausência do marcador de leucócitos CD45 para confirmar que as células capturadas são células tumorais epiteliais (Momburg F, et al., Immunohistochemical study of the expression of a Mr 34,000 human epithelium-specific surface glycoprotein in normal and malignant tissues. Cancer Res. 1987; 47: 2.883 a 2.891; e Allard WJ, et al., Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. (Clin Cancer Res. 2004; 10: 6897-6904). O número de células capturadas foi demonstrado prospectivamente como tendo significado prognóstico para pacientes com câncer de mama, colorretal e de próstata com doença avançada (Cohen SJ, et al., J Clin Oncol. 2008; 26: 3.213 a 3.221; Cristofanilli M, et al. N Engl J Med. 2004; 351: 781 a 791; Cristofanilli M, et al., J Clin Oncol. 2005; 23: 1.420 a 1.430; e de Bono JS, et al. Clin Cancer Res. 2008; 14: 6.302 a 6.309).

[0356] A presente invenção também fornece isolamento de CTCs com a tecnologia CTC-Chip. O CTC-Chip é um dispositivo de captura de CTC microfluídico, no qual o sangue flui através de uma câmara contendo milhares de micropostos revestidos com anticorpos anti-EpCAM aos quais os CTC se ligam (Nagrath S, et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 2007; 450: 1.235 a 1.239). O CTC-Chip fornece um aumento significativo na contagem e pureza do CTC em comparação com o sistema CellSearch® (Maheswaran S, et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung- cancer cells, N Engl J Med. 2008; 359: 366 a 377), ambas as plataformas podem ser usadas para análises moleculares a jusante.

Cromatina livre de células

[0357] Em certas modalidades, fragmentos de cromatina sem células são isolados e analisados de acordo com a presente invenção. Os nucleossomos podem ser detectados no soro de indivíduos saudáveis (Stroun et al., Annals da Academia de Ciências de Nova York 906: 161-168 (2000)), bem como indivíduos afetados por um estado de doença. Além disso, a concentração sérica de nucleossomos é consideravelmente maior em pacientes que sofrem de doenças benignas e malignas, como câncer e doenças autoimunes (Holdenrieder et al (2001) Int J Cancer 95, 114 a 120, Trejo-Becerril et al (2003). Int J Cancer 104, 663 a 668; Kuroi et al 1999 Breast 6, 361 a 364; Kuroi et al (2001) Int j Oncology 19, 143 a 148; Amouraetal (1997) Arth Rheum

40, 2217-2225; Williams et al (2001) J. Rheumatol 28, 81 a 94). Sem limitar-se a uma teoria, a alta concentração de nucleossomos em pacientes portadores de tumores deriva da apoptose, que ocorre espontaneamente em tumores em proliferação. Os nucleossomos que circulam no sangue contêm histonas exclusivamente modificadas. Por exemplo, a Publicação de Patente no US 2005/0069931 (31 de março de 2005) se refere ao uso de anticorpos direcionados contra modificações específicas no terminal N da histona como indicadores de diagnóstico da doença, empregando esses anticorpos específicos para a histona para isolar nucleossomos de um sangue ou amostra de soro de um paciente para facilitar a purificação e análise do DNA acompanhante para fins de diagnóstico/triagem. Por conseguinte, a presente invenção pode usar DNA ligado à cromatina para detectar e monitorar, por exemplo, mutações tumorais. A identificação do DNA associado às histonas modificadas pode servir como um marcador diagnóstico de doenças e defeitos congênitos.

[0358] Assim, em outra modalidade, fragmentos de cromatina isolados são derivados da cromatina em circulação, preferencialmente mono e oligonucleossomos em circulação. Fragmentos isolados de cromatina podem ser derivados de uma amostra biológica. A amostra biológica pode ser de um indivíduo ou paciente com necessidade. A amostra biológica pode ser soros, plasma, linfa, sangue, frações sanguíneas, urina, líquido sinovial, líquido espinhal, saliva, células tumorais circulantes ou mucosas.

DNA livre de células (cfdna)

[0359] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para detectar DNA livre de células (cfDNA).

O DNA livre de células no plasma ou no soro pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico não invasiva. Por exemplo, o DNA fetal livre de células foi estudado e otimizado para testar fatores RhD não compatíveis, determinação de sexo para desordens genéticas ligadas ao X, teste para desordens de um único gene, identificação de pré-eclâmpsia. Por exemplo, o sequenciamento da fração de células fetais do cfDNA no plasma materno é uma abordagem confiável para detectar alterações no número de cópias associadas à aneuploidia do cromossomo fetal. Por outro exemplo, o cfDNA isolado de pacientes com câncer tem sido usado para detectar mutações em genes-chave relevantes para as decisões de tratamento.

[0360] Em certas modalidades exemplificadoras, a presente revelação fornece a detecção de cfDNA diretamente de uma amostra de paciente. Em outra modalidade de outro exemplo, a presente revelação fornece cfDNA enriquecedor por meio do uso das modalidades de enriquecimento reveladas acima e antes da detecção do cfDNA alvo.

Exossomos

[0361] Em uma modalidade, os exossomos podem ser testados com a presente invenção. Exossomos são pequenas vesículas extracelulares que demonstraram conter RNA. O isolamento de exossomos por ultracentrifugação, filtração, precipitação química, cromatografia de deleção de tamanho e microfluídica é conhecido na técnica. Em uma modalidade, os exossomos são purificados com o uso de um biomarcador de exossomos. O isolamento e a purificação de exossomos de amostras biológicas podem ser realizados por meio de quaisquer métodos conhecidos (consulte, por exemplo, o documento WO2016172598A1).

DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DE SNP

[0362] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para detectar a presença de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) em uma amostra biológica. Os SNPs podem estar relacionados ao teste de maternidade (por exemplo, determinação do sexo, defeitos fetais). Os mesmos podem estar relacionados a uma investigação criminal. Em uma modalidade, um suspeito em uma investigação criminal pode ser identificado pela presente invenção. Não estar vinculado a uma teoria forense baseada em evidências forenses pode exigir o ensaio mais sensível disponível para detectar o material genético de um suspeito ou vítima,

devido ao fato de que as amostras testadas podem ser limitativas.

[0363] Em outras modalidades, os SNPs associados a uma doença são abrangidos pela presente invenção. Os SNPs associados a doenças são bem conhecidos na técnica e um versado na técnica pode aplicar os métodos da presente invenção para projetar RNAs guias adequados (consulte, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=human%5Borgn % 5D).

[0364] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para genotipagem, como a genotipagem de SNP, que compreende: distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes discretos individuais, que compreende os volumes discretos individuais um sistema CRISPR de acordo com a invenção, como descrito no presente documento; incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo; ativar a proteína efetora CRISPR via ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína efetora CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo características para um genótipo específico na amostra.

[0365] Em certas modalidades, o sinal detectável é comparado a (por exemplo, por comparação da intensidade do sinal) um ou mais sinais padrão, preferencialmente um sinal padrão sintético. Em certas modalidades, o padrão é ou corresponde a um genótipo específico. Em certas modalidades, o padrão compreende um SNP particular ou outra variação de nucleotídeo (único). Em certas modalidades, o padrão é um padrão de genótipo (amplificado por PCR). Em certas modalidades, o padrão é ou compreende DNA. Em certas modalidades, o padrão é ou compreende RNA. Em certas modalidades, o padrão é ou compreende RNA que é transcrito a partir do DNA. Em certas modalidades, o padrão é ou compreende DNA que é transcrito reversamente a partir do RNA. Em certas modalidades, o sinal detectável é comparado a um ou mais padrões, em que cada um dos mesmos corresponde a um genótipo conhecido, como um SNP ou outra variação de nucleotídeo (única). Em certas modalidades, o sinal detectável é comparado a um ou mais sinais padrão e a comparação compreende análise estatística, como por análise estatística paramétrica ou não paramétrica, como por ANOVA de uma ou duas vias, etc. Em certas modalidades, o sinal detectável é comparado a um ou mais sinais padrão e quando o sinal detectável não se desvia (estatisticamente) significativamente do padrão, o genótipo é determinado como o genótipo correspondente ao referido padrão.

[0366] Em outras modalidades, a presente invenção permite genotipagem rápida para farmacogenômica de emergência. Em uma modalidade, um único teste de ponto de atendimento pode ser usado para genotipar um paciente trazido para a sala de emergência. Pode-se suspeitar que o paciente tenha um coágulo sanguíneo e um médico de emergência precise decidir uma dosagem de diluente para administrar. Em modalidades exemplificadoras, a presente invenção pode fornecer orientação para a administração de anticoagulantes durante infarto do miocárdio ou tratamento de acidente vascular cerebral com base na genotipagem de marcadores como VKORC1, CYP2C9 e CYP2C19. Em uma modalidade, o diluente do sangue é a anticoagulante varfarina (Holford, NH (dezembro de 1986).

“Pharmacokinetics Clinical and Pharmacodynamics of Warfarin Understanding the Dose-Effect Relationship”. Clinical Pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics Clínica.

Springer International Publishing. 11 (6): 483 a 504) Os genes associados à coagulação sanguínea são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, o documento US20060166239A1; Litin SC, Gastineau DA (1995) “Current concepts in anticoagulant therapy”. Mayo Clin. Proc. 70 (3): 266-72; e Rusdiana et al.., Responsiveness to low-dose warfarin associated with genetic variants of VKORC1, CYP2C9, CYP2C19, and CYP4F2 in an Indonesian population.

Eur J Clin Pharmacol. março de 2013; 69(3): 395 a 405).

Especificamente, no polimorfismo de singlenucleotídeo VKORC1 1639 (ou 3673), o alelo G comum (“do tipo selvagem”) é substituído pelo alelo A. As pessoas com um alelo A (ou o “haplótipo A”) produzem menos VKORC1 do que as pessoas com o alelo G (ou o “haplótipo não A”). A prevalência dessas variantes também varia de acordo com a raça, com 37% dos caucasianos e 14% dos africanos portando o alelo A. O resultado final é um número reduzido de fatores de coagulação e, portanto, uma capacidade diminuída de coagulação.

[0367] Em certas modalidades exemplificadoras, a disponibilidade de material genético para a detecção de um SNP em um paciente permite detectar SNPs sem amplificação de uma amostra de DNA ou RNA. No caso de genotipagem, a amostra biológica testada é facilmente obtida. Em certas modalidades exemplificadoras, o tempo de incubação da presente invenção pode ser reduzido. O ensaio pode ser realizado em um período de tempo necessário para que ocorra uma reação enzimática. Um versado na técnica pode realizar reações bioquímicas em 5 minutos (por exemplo, 5 minutos de ligação). A presente invenção pode usar um dispositivo de extração de DNA automatizado para obter DNA do sangue. O DNA pode então ser adicionado a uma reação que gera uma molécula alvo para a proteína efetora. Imediatamente após a geração da molécula alvo, o agente de mascaramento pode ser cortado e um sinal detectado. Em modalidades exemplificadoras, a presente invenção permite um diagnóstico rápido de POC para determinar um genótipo antes de administrar um medicamento (por exemplo, diluente de sangue). No caso em que uma etapa de amplificação é usada, todas as reações ocorrem na mesma reação em um processo de uma etapa. Em modalidades preferenciais, o ensaio POC pode ser realizado em menos de uma hora, preferencialmente 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos ou 50 minutos.

[0368] Em certas modalidades, os sistemas, dispositivos e métodos revelados no presente documento podem ser usados para detectar a presença ou o nível de expressão de RNAs não codificadores longos (IncRNAs). A expressão de certos IncRNAs está associada ao estado da doença e/ou resistência ao medicamento. Em particular, certos IncRNAs (por exemplo, TCONS_OOOH252, NR_034078, TCONS_00010506, TCONS_00026344, TCONS_00015940, TCONS_00028298, TCONS_00026380, TCONS_0009861, TCONS_00026521, TCONS_00016127, NRONS_00016127, como resistência a um ou mais silenciadores de BRAF (por exemplo, Vemurafenibe, Dabrafenibe, Sorafenibe, GDC-0879, PLX-4720 e LGX818) para o tratamento de melanoma (por exemplo, melanoma nodular, lentigo maligno, melanoma lentigo maligno, melanoma acral lentiginoso, disseminação superficial) melanoma, melanoma da mucosa, melanoma polipóide, melanoma desmoplásico, melanoma amelanótico e melanoma de tecidos moles). A detecção de IncRNAs usando as várias modalidades descritas no presente documento pode facilitar o diagnóstico da doença e/ou seleção de opções de tratamento.

[0369] Em uma modalidade, a presente invenção pode orientar terapias direcionadas a DNA ou RNA (por exemplo, CRISPR, TALE, proteínas dos dedos de zinco, RNAi), particularmente em locais em que a administração rápida da terapia é importante para os resultados do tratamento.

Detecção de Loh

[0370] As células cancerígenas sofrem uma perda de material genético (DNA) quando comparadas às células normais. Essa exclusão do material genético pelo qual quase todos, se não todos, os cânceres é chamada de “perda de heterozigosidade” (LOH). A perda de heterozigosidade (LOH) é um evento cromossômico grave que resulta na perda de todo o gene e da região cromossômica circundante. A perda de heterozigosidade é uma ocorrência comum no câncer, em que pode indicar a ausência de um gene supressor de tumor funcional na região perdida. No entanto, uma perda pode ser silenciosa devido ao fato de que ainda existe um gene funcional no outro cromossomo do par de cromossomos. A cópia restante do gene supressor de tumor pode ser inativada por uma mutação pontual, levando à perda de um gene supressor de tumor. A perda de material genético das células cancerígenas pode resultar na perda seletiva de um dos dois ou mais alelos de um gene vital para a viabilidade celular ou crescimento celular em um locus específico no cromossomo.

[0371] Um “marcador LOH” é o DNA de um locus microssatélites, uma exclusão, alteração ou amplificação na qual, quando comparado às células normais, está associado a câncer ou outras doenças. Um marcador LOH está frequentemente associado à perda de um gene supressor de tumor ou de outro gene, geralmente relacionado ao tumor.

[0372] O termo “microssatélites” se refere a pequenas sequências repetitivas de DNA que são amplamente distribuídas no genoma humano. Um microssatélite é um trato de motivos de DNA repetidos em tandem (ou seja, adjacentes) que variam em comprimento de dois a cinco nucleotídeos e são tipicamente repetidos de 5 a 50 vezes. Por exemplo, a sequência TATATATATA (SEQ ID NO: 135) é um microssatélite de dinucleotídeo e GTCGTCGTCGTCGTC (SEQ ID NO: 136) é um microssatélite de trinucleotídeo (com A sendo Adenina, G

Guanina, C Citosina e T Timina). Alterações somáticas no comprimento de repetição de tais microssatélites demonstraram representar uma característica dos tumores. Os RNAs guia podem ser projetados para detectar esses microssatélites. Além disso, a presente invenção pode ser usada para detectar alterações no comprimento da repetição, bem como amplificações e deleções com base na quantificação do sinal detectável. Certos microssatélites estão localizados em regiões reguladoras de flanqueamento ou intrônicas de genes, ou diretamente em códons de genes.

Mutações microssatélites nesses casos podem levar a alterações e doenças fenotípicas, principalmente em doenças de expansão tripla, como a síndrome do X frágil e a doença de Huntington.

[0373] A perda frequente de heterozigosidade (LOH) em regiões cromossômicas específicas tem sido relatada em muitos tipos de malignidades. As perdas alélicas em regiões cromossômicas específicas são as alterações genéticas mais comuns observadas em uma variedade de neoplasias, portanto, análises microssatélites foram aplicadas para detectar DNA de células cancerígenas em amostras de fluidos corporais, como escarro para câncer de pulmão e urina para câncer de bexiga. (Rouleau, et al. Nature 363, 515 a 521 (1993); e Latif, et al. Science 260, 1.317 a 1.320 (1993)). Além disso, foi estabelecido que concentrações marcadamente aumentadas de DNA solúvel estão presentes no plasma de indivíduos com câncer e algumas outras doenças, indicando que soro ou plasma livre de células pode ser usado para detectar DNA de câncer com anormalidades microssatélites.

(Kamp et al. Science 264, 436-440 (1994); e Steck et al.

Nat Genet. 15 (4), 356 a 362 (1997)). Dois grupos relataram alterações microssatélites no plasma ou soro de um número limitado de pacientes com câncer de pulmão de pequenas células ou câncer de cabeça e pescoço. (Hahn et al. Science 271, 350 a 353 (1996); e Miozzo et al. Cancer Res. 56, 2.

285 a 2.288 (1996)). A detecção de perda de heterozigosidade em tumores e soro de pacientes com melanoma também foi mostrada anteriormente (consulte, por exemplo, Patente no US6465177B1).

[0374] Assim, é vantajoso detectar marcadores LOH em um indivíduo que sofra de ou em risco de câncer. A presente invenção pode ser usada para detectar LOH em células tumorais. Em uma modalidade, as células tumorais em circulação podem ser usadas como uma amostra biológica. Em modalidades preferenciais, o DNA sem células obtido a partir de soro ou plasma é usado para detectar e/ou monitorizar de forma não invasiva a LOH. Em outras modalidades, a amostra biológica pode ser qualquer amostra aqui descrita (por exemplo, uma amostra de urina para câncer de bexiga). Sem limitar-se a uma teoria, a presente invenção pode ser usada para detectar marcadores LOH com sensibilidade aprimorada em comparação com qualquer método anterior, fornecendo assim a detecção precoce de eventos mutacionais. Em uma modalidade, LOH é detectado em fluidos biológicos, em que a presença de LOH está associada à ocorrência de câncer. O método e os sistemas descritos aqui representam um avanço significativo em relação às técnicas anteriores, como PCR ou biópsia de tecido, fornecendo um método não invasivo, rápido e preciso para detectar LOH de alelos específicos associados ao câncer. Assim, a presente invenção fornece métodos e sistemas que podem ser usados para rastrear populações de alto risco e monitorar pacientes de alto risco submetidos a quimioprevenção, quimioterapia, imunoterapia ou outros tratamentos.

[0375] Como o método da presente invenção requer apenas extração de DNA de fluidos corporais, como sangue, ele pode ser realizado a qualquer momento e repetidamente em um único paciente. O sangue pode ser coletado e monitorado para LOH antes ou após a cirurgia; antes, durante e após o tratamento, como quimioterapia, radioterapia, terapia genética ou imunoterapia; ou durante o exame de acompanhamento após o tratamento para progressão, estabilidade ou recorrência da doença. Sem limitar-se a uma teoria, o método da presente invenção também pode ser usado para detectar presença ou recorrência subclínica de doença com um marcador LOH específico para esse paciente, uma vez que os marcadores LOH são específicos para o tumor de um paciente individual. O método também pode detectar se várias metástases podem estar presentes usando marcadores LOH específicos do tumor.

Detecção de modificações epigenéticas

[0376] Variantes de histonas, modificações de DNA e modificações de histonas indicativas de câncer ou progressão do câncer podem ser usadas na presente invenção.

Por exemplo, a publicação da patente US 20140206014 descreve que as amostras de câncer apresentaram níveis elevados de nucleossomo H2AZ, macroH2Al.l, 5-metilcitosina, P-H2AX (Serl39) em comparação com indivíduos saudáveis. A presença de células cancerígenas em um indivíduo pode gerar um nível mais alto de nucleossomos livres de células no sangue como resultado do aumento da apoptose das células cancerígenas. Em uma modalidade, um anticorpo direcionado contra marcas associadas à apoptose, como H2B Ser 14 (F), pode ser usado para identificar nucleossomos únicos que foram liberados a partir de células neoplásicas apoptóticas. Assim, o DNA resultante de células tumorais pode ser vantajosamente analisado de acordo com a presente invenção com alta sensibilidade e precisão.

Triagem pré-natal

[0377] Em certas modalidades, o método e os sistemas da presente invenção podem ser usados na triagem pré-natal. Em certas modalidades, o DNA sem células é usado em um método de triagem pré-natal. Em certas modalidades, o DNA associado a nucleossomos únicos ou oligonucleossomos pode ser detectado com a presente invenção. Em modalidades preferenciais, a detecção de DNA associado a nucleossomos únicos ou oligonucleossomos é usada para triagem pré-natal.

Em certas modalidades, fragmentos de cromatina sem células são usados em um método de triagem pré-natal.

[0378] O diagnóstico pré-natal ou a triagem pré- natal se refere ao teste de doenças ou condições em um feto ou embrião antes de nascer. O objetivo é detectar defeitos congênitos, como defeitos do tubo neural, síndrome de Down, anormalidades cromossômicas, distúrbios genéticos e outras condições, como espinha bífida, fenda palatina, doença de Tay Sachs, anemia falciforme, talassemia, fibrose cística, distrofia muscular e síndrome do X frágil. A triagem também pode ser usada para discernimento sexual pré-natal. Os procedimentos de teste comuns incluem amniocentese, ultrassonografia, incluindo ultrassonografia de translucência nucal, teste de marcadores séricos ou triagem genética. Em alguns casos, os testes são administrados para determinar se o feto será abortado, embora médicos e pacientes também considerem útil diagnosticar gestações de alto risco mais cedo, para que o parto possa ser agendado em um hospital terciário, em que o bebê possa receber os cuidados adequados.

[0379] Foi percebido que existem células fetais que estão presentes no sangue da mãe e que essas células apresentam uma fonte potencial de cromossomos fetais para o diagnóstico pré-natal baseado em DNA. Além disso, o DNA fetal varia de cerca de 2 a 10% do DNA total no sangue materno. Os testes genéticos pré-natais atualmente disponíveis geralmente envolvem procedimentos invasivos.

Por exemplo, a amostragem das vilosidades coriônicas (CVS) realizada em uma mulher grávida entre 10 e 12 semanas após a gravidez e a amniocentese realizada entre 14 e 16 semanas envolvem procedimentos invasivos para obter a amostra para testar anormalidades cromossômicas em um feto. As células fetais obtidas através desses procedimentos de amostragem são geralmente testadas para anormalidades cromossômicas usando análises citogenéticas ou de hibridização fluorescente in situ (FISH). Demonstrou-se que o DNA fetal sem células existe no plasma e soro de mulheres grávidas desde a sexta semana de gestação, com concentrações aumentando durante a gravidez e atingindo o pico antes do parto. Como essas células aparecem muito cedo na gravidez, elas podem formar a base de um teste preciso e não invasivo do primeiro trimestre. Sem limitar-se a uma teoria, a presente invenção fornece sensibilidade sem precedentes na detecção de pequenas quantidades de DNA fetal. Sem ater-se a uma teoria, quantidades abundantes de DNA materno são geralmente recuperadas concomitantemente junto com o DNA fetal de interesse, diminuindo assim a sensibilidade na quantificação do DNA fetal e na detecção de mutações. A presente invenção supera esses problemas pela inesperadamente alta sensibilidade do ensaio.

[0380] A classe de histonas H3 consiste em quatro tipos diferentes de proteínas: os principais tipos, H3.1 e H3.2; o tipo de substituição, H3.3; e a variante específica do testículo, H3t. Embora H3.1 e H3.2 estejam intimamente relacionados, diferindo apenas no Ser96, o H3.1 difere do H3.3 em pelo menos 5 posições de aminoácidos. Além disso, o H3.1 é altamente enriquecido no fígado fetal, em comparação com a sua presença em tecidos adultos, incluindo fígado, rim e coração. No tecido humano adulto, a variante H3.3 é mais abundante que a variante H3.1, enquanto o inverso é verdadeiro para o fígado fetal. A presente invenção pode usar essas diferenças para detectar nucleossomos fetais e ácido nucleico fetal em uma amostra biológica materna que compreende células fetais e maternas e/ou ácido nucleico fetal.

[0381] Em uma modalidade, nucleossomos fetais podem ser obtidos a partir de sangue. Em outras modalidades, os nucleossomos fetais são obtidos a partir de uma amostra de muco cervical. Em certas modalidades, uma amostra de muco cervical é obtida por swab ou lavagem de uma mulher grávida no início do segundo trimestre ou no final do primeiro trimestre da gravidez. A amostra pode ser colocada em uma incubadora para liberar o DNA preso no muco. A incubadora pode ser ajustada em 37 °C. A amostra pode ser agitada por aproximadamente 15 a 30 minutos. O muco pode ser ainda dissolvido com uma mucinase com a finalidade de liberar DNA. A amostra também pode ser submetida a condições, como tratamento químico e similares, como bem conhecido na técnica, para induzir apoptose para liberar nucleossomos fetais. Assim, uma amostra de muco cervical pode ser tratada com um agente que induz apoptose, pela qual os nucleossomos fetais são liberados. Em relação ao enriquecimento do DNA fetal circulante, faz-se referência às publicações de patente no US 20070243549 e 20100240054.

A presente invenção é especialmente vantajosa ao aplicar os métodos e sistemas à triagem pré-natal, em que apenas uma pequena fração de nucleossomos ou DNA pode ser de origem fetal.

[0382] A triagem pré-natal de acordo com a presente invenção pode ser para uma doença incluindo, mas não se limitando a Trissomia 13, Trissomia 16, Trissomia 18, síndrome de Klinefelter (47, XXY), (47, XYY) e (47, XXX),

Síndrome de Turner, síndrome de Down (Trissomia 21), fibrose cística, doença de Huntington, talassemia beta, distrofia miotônica, anemia falciforme, porfiria, síndrome do X frágil, translocação Robertsoniana, síndrome de Angelman, síndrome de DiGeorge e síndrome de Wolf- Hirschhorn.

[0383] Vários aspectos adicionais da invenção estão relacionados ao diagnóstico, prognóstico e/ou tratamento de defeitos associados a uma ampla gama de doenças genéticas, que são descritas mais detalhadamente no site dos Institutos Nacionais de Saúde sob o tópico subseção Transtornos genéticos (site na área de saúde.nih.gov/topic/Distúrbios genéticos).

Câncer e detecção de resistência a fármacos contra câncer

[0384] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para detectar genes e mutações associadas ao câncer. Em certas modalidades, mutações associadas à resistência são detectadas. A amplificação de células tumorais resistentes ou o aparecimento de mutações resistentes em populações clonais de células tumorais podem surgir durante o tratamento (consulte, por exemplo, Burger JA, et al., Clonal evolution in patients with chronic lymphocytic leukaemia developing resistance to BTK inhibition. Nat Commun. 2016 20 de maio; 7: 11589; Landau

DA, et al., Mutations driving CLL and their evolution in progression and relapse. Nature. 22 de out de 2015; 526 (7574): 525-30; Landau DA, et al., Clonal evolution in hematological malignancies and therapeutic implications.

Leukemia. jan de 2014; 28 (l): 34 a 43; e Landau DA, et al., Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukemia. Cell. 14 de fev de 2013; 152 (4): 714 a 26). Consequentemente, a detecção de tais mutações requer ensaios altamente sensíveis e o monitoramento requer biópsia repetida. Biópsias repetidas são inconvenientes, invasivas e caras. Mutações resistentes podem ser difíceis de detectar em uma amostra de sangue ou em outra amostra biológica não invasiva coletada (por exemplo, sangue, saliva, urina) com o uso dos métodos anteriores conhecidos na técnica. Mutações resistentes podem se referir a mutações associadas à resistência a quimioterapia, terapia direcionada ou imunoterapia.

[0385] Em certas modalidades, mutações ocorrem em cânceres individuais que podem ser usadas para detectar a progressão do câncer. Em uma modalidade, mutações relacionadas à atividade citolítica de células T contra tumores foram caracterizadas e podem ser detectadas pela presente invenção (consulte, por exemplo, Rooney et al., Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity, Cell. 15 de janeiro de

2015; 160(1-2): 48 a 61). Terapias personalizadas podem ser desenvolvidas para um paciente com base na detecção dessas mutações (consulte, por exemplo, o documento WO2016100975A1). Em certas modalidades, mutações específicas do câncer associadas à atividade citolítica podem ser uma mutação em um gene selecionado do grupo que consiste em CASP8, B2M, PIK3CA, SMC1A, ARID5B, TET2, ALPK2, COL5A1, TP53, DNER, NCOR1, M0RC4, CIC, IRF6, MYOCD, ANKLE1, CNKSR1, NF1, S0S1, ARID2, CUL4B, DDX3X, FUBP1, TCP11L2, HLA-A, B ou C, CSNK2A1, MET, ASXL1, PD-L1, PD-L2, IDO1, IDO2, ALOX12B e ALOX15B, ou ganho de número de cópias, excluindo eventos de cromossomos inteiros, afetando qualquer uma das seguintes bandas cromossômicas: 6ql6.1- q21, 6q22.31-q24.1, 6q25.1-q26, 7pl 1.2-ql 1.1, 8p23.1, 8pl

1.23 - pl 1.21 (contendo IDO1, IDO2), 9p24.2-p23 (contendo PDL1, PDL2), 10pl5.3, 10pl5.1-pl3, llpl4.1, 12pl3.32-pl3.2, 17pl3.1 (contendo ALOX12B, ALOX15B) e 22ql 1,1-ql 1,21.

[0386] Em certas modalidades, a presente invenção é usada para detectar uma mutação de câncer (por exemplo, mutação de resistência) durante o curso de um tratamento e após o término do tratamento. A sensibilidade da presente invenção pode permitir a detecção não invasiva de mutações clonais que surgem durante o tratamento e pode ser usada para detectar uma recorrência na doença.

[0387] Em certas modalidades exemplificadoras, a detecção de microRNAs (miRNA) e/ou assinaturas de miRNA de miRNA diferencialmente expresso, pode ser usada para detectar ou monitorar a progressão de um câncer e/ou detectar resistência a medicamentos para uma terapia contra câncer. Como exemplo, Nadal et al. (Nature Scientific Reports, (2015) doi: 10.1038/srep 12464) descrevem assinaturas de mRNA que podem ser usadas para detectar câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

[0388] Em certas modalidades exemplificadoras, a presença de mutações de resistência nas subpopulações clonais de células pode ser usada na determinação de um regime de tratamento. Em outras modalidades, terapias personalizadas para o tratamento de um paciente podem ser administradas com base em mutações tumorais comuns. Em certas modalidades, mutações comuns surgem em resposta ao tratamento e levam à resistência ao medicamento. Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada no monitoramento de pacientes para células que adquirem uma mutação ou amplificação de células que abrigam essas mutações resistentes a medicamentos.

[0389] O tratamento com vários agentes quimioterapêuticos, particularmente com terapias direcionadas, como inibidores de tirosina quinase, frequentemente leva a novas mutações nas moléculas alvo que resistem à atividade da terapêutica. Múltiplas estratégias para superar essa resistência estão sendo avaliadas, incluindo o desenvolvimento de terapias de segunda geração que não são afetadas por essas mutações e o tratamento com múltiplos agentes, incluindo aqueles que atuam a jusante da mutação de resistência. Em uma modalidade exemplificadora, uma mutação comum ao ibrutinib, uma molécula direcionada à tirosina quinase de Bruton (BTK) e usada para CLL e certos linfomas, é uma alteração de cisteína para serina na posição 481 (BTK/C481S). O erlotinib, que tem como alvo o domínio tirosina-quinase do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), é comumente usado no tratamento de câncer de pulmão e tumores resistentes invariavelmente se desenvolvem após a terapia. Uma mutação comum encontrada em clones resistentes é uma mutação de treonina para metionina na posição 790.

[0390] Mutações não silenciosas compartilhadas entre populações de pacientes com câncer e mutações resistentes comuns que podem ser detectadas com a presente invenção são conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, o documento WO/2016/187508). Em certas modalidades, mutações de resistência a fármacos podem ser induzidas por tratamento com ibrutinib, erlotinib, imatinib, gefitinib, crizotinib, trastuzumab, vemurafenib, RAF/MEK, terapia de bloqueio de ponto de verificação ou terapia antiestrogênica. Em certas modalidades, as mutações específicas do câncer estão presentes em um ou mais genes que codificam uma proteína selecionada do grupo que consiste no ligante de morte programado 1 (PD-L1), receptor de androgênio (AR), tirosina quinase de Bruton (BTK), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), BCR- Abl, c-kit, PIK3CA, HER2, EML4-ALK, KRAS, ALK, ROS1, AKT1, BRAF, MEK1, MEK2, NRAS, RAC1 e ESRI.

[0391] Os pontos de verificação imunes são vias inibitórias que retardam ou interrompem as reações imunes e previnem danos excessivos nos tecidos resultantes da atividade descontrolada das células imunes. Em certas modalidades, o ponto de verificação imune alvejado é o gene programado morte-1 (PD-1 ou CD279) (PDCD1). Em outras modalidades, o ponto de verificação imune alvejado é o antígeno citotóxico associado a linfócitos T (CTLA-4). Em modalidades adicionais, o ponto de verificação imune alvejado é outro membro da superfamília CD28 e CTLA4 Ig, como BTLA, LAG3, ICOS, PDL1 ou KIR. Em outras modalidades adicionais, o ponto de verificação imune alvejado é um membro da superfamília TNFR, como CD40, 0X40, CD137, GITR, CD27 ou TIM-3.

[0392] Recentemente, a expressão gênica em tumores e seus microambientes foi caracterizada no nível de uma célula (consulte, por exemplo, Tirosh, et al.) Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single cell RNA-seq. Science 352, 189 a 196, doi:

10.1126/science.aad0501 (2016)); Tirosh et al., Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 10 de novembro de 2016; 539(7628): 309 a 313. Doi: 10.1038/nature20123. Epub 2 de novembro de 2016; e publicação internacional de patente número de série WO2017004153 Al). Em certas modalidades, assinaturas de genes podem ser detectadas usando a presente invenção. Em uma modalidade, os genes do complemento são monitorados ou detectados em um microambiente de tumor. Em uma modalidade, os programas MITF e AXL são monitorados ou detectados. Em uma modalidade, uma célula-tronco específica de tumor ou assinatura de célula progenitora é detectada.

Tais assinaturas indicam o estado de uma resposta imune e o estado de um tumor. Em certas modalidades, o estado de um tumor em termos de proliferação, resistência ao tratamento e abundância de células imunes pode ser detectado.

[0393] Assim, em certas modalidades, a invenção fornece painéis de detecção de câncer de baixo custo, rápidos e multiplexados para DNA circulante, como DNA de tumor, particularmente para monitorar a recorrência de doenças ou o desenvolvimento de mutações de resistência comuns.

Aplicações de imunoterapia

[0394] As modalidades reveladas no presente documento também podem ser úteis em outros contextos de imunoterapia. Por exemplo, em algumas modalidades, métodos de diagnóstico, prognóstico e/ou estadiamento de uma resposta imune em um indivíduo compreendem detectar um primeiro nível de expressão, atividade e/ou função de um ou mais biomarcadores e comparar o nível detectado com um nível de controle em que uma diferença no nível detectado e no nível de controle indica a presença de uma resposta imune no indivíduo.

[0395] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para determinar disfunção ou ativação de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL). Os TILs podem ser isolados de um tumor usando métodos conhecidos. Os TILs podem ser analisados para determinar se devem ser usados em terapias adotivas de transferência de células. Além disso, as células T do receptor de antígeno quimérico (células T CAR) podem ser analisadas para uma assinatura de disfunção ou ativação antes de administrá-las a um indivíduo.

Assinaturas exemplares para células T disfuncionais e ativadas foram descritas (consulte, por exemplo, Singer M, et al., A Distinct Gene Module for Dysfunction Uncoupled from Activation in Tumor-Infiltrating T Cells. Cell. 8 de setembro de 2016; 166(6): 1500- 1511.e9 doi:

10.1016/j.cell.2016.08.052).

[0396] Em algumas modalidades, C2c2 é usada para avaliar esse estado de células imunes, como células T (por exemplo, células T CD8+ e/ou CD4+). Em particular, a ativação e/ou disfunção das células T podem ser determinadas, por exemplo, com base em genes ou assinaturas de genes associados a um ou mais dos estados das células T.

Dessa maneira, C2c2 pode ser usada para determinar a presença de uma ou mais subpopulações de células T.

[0397] Em algumas modalidades, C2c2 pode ser usada em um ensaio de diagnóstico ou pode ser usado como um método para determinar se um paciente é adequado para administrar uma imunoterapia ou outro tipo de terapia. Por exemplo, a detecção de assinaturas de genes ou biomarcadores pode ser realizada via C2c2 para determinar se um paciente está respondendo a um determinado tratamento ou, se o paciente não está respondendo, se isso pode ocorrer devido à disfunção das células T. Essa detecção é informativa sobre os tipos de terapia que o paciente é mais adequado para receber. Por exemplo, se o paciente deve receber imunoterapia.

[0398] Em algumas modalidades, os sistemas e ensaios revelados no presente documento podem permitir que os médicos identifiquem se a resposta de um paciente a uma terapia (por exemplo, uma terapia de transferência de células adotiva (ACT)) é devida à disfunção celular e, se houver, níveis de a regulação positiva e negativa na assinatura do biomarcador permitirá que os problemas sejam resolvidos. Por exemplo, se um paciente que recebe ACT não responde, as células administradas como parte do ACT podem ser analisadas por um ensaio aqui revelado para determinar o nível relativo de expressão de uma assinatura de biomarcador conhecida por estar associada à ativação celular e/ou estados de disfunção. Se um determinado receptor ou molécula inibidora é regulado para cima nas células ACT, o paciente pode ser tratado com um inibidor desse receptor ou molécula. Se um determinado receptor ou molécula estimulante for desregulado nas células do TCA, o paciente poderá ser tratado com um agonista desse receptor ou molécula.

[0399] Em certas modalidades exemplificadoras, os sistemas, métodos e dispositivos descritos no presente documento podem ser usados para rastrear assinaturas de genes que identificam um tipo de célula, fenótipo celular ou estado celular específico. Da mesma forma, através do uso de métodos como detecção compactada, as modalidades reveladas no presente documento podem ser usadas para detectar transcriptomas. Os dados de expressão gênica são altamente estruturados, de modo que o nível de expressão de alguns genes é preditivo do nível de expressão de outros. O conhecimento de que os dados de expressão gênica são altamente estruturados permite supor que o número de graus de liberdade no sistema seja pequeno, o que permite supor que a base para o cálculo da abundância relativa de genes seja escassa.

É possível fazer várias suposições biologicamente motivadas que permitem aas Requerentes recuperar os termos de interação não linear durante a subamostragem sem ter nenhum conhecimento específico de quais genes provavelmente interagirão.

Em particular, se as

Requerentes assumirem que as interações genéticas são de baixa classificação, esparsas ou uma combinação das mesmas,

o número real de graus de liberdade é pequeno em relação à expansão combinatória completa, o que permite que as

Requerentes deduzam toda a paisagem não linear com um número relativamente pequeno de perturbações.

Para contornar essas premissas, teorias analíticas de conclusão da matriz e detecção compactada podem ser usadas para projetar experimentos de perturbação combinatória subamostrados.

Além disso, uma estrutura de aprendizado de núcleo pode ser usada para empregar subamostragem,

construindo funções preditivas de perturbações combinatórias sem aprender diretamente qualquer coeficiente de interação individual.

A detecção compactada fornece uma maneira de identificar o número mínimo de transcritos alvo a serem detectados, a fim de obter um perfil abrangente de expressão gênica.

Os métodos para detecção compactada são revelados no documento PCT/US2016/059230 “Systems and Methods for Determining Relative Abundances of Biomolecules”, depositado em 27 de outubro de 2016, que é aqui incorporado a título de referência. Tendo usado métodos como sensor comprimido para identificar um conjunto mínimo de alvos de transcrição, um conjunto de RNAs guia correspondentes pode então ser projetado para detectar os ditos transcritos. Por conseguinte, em certas modalidades exemplificadoras, um método para obter um perfil de expressão gênica de uma célula compreende detectar, com o uso das modalidades reveladas no presente documento, um conjunto mínimo de transcritos que fornece um perfil de expressão gênica de uma célula ou população de células.

Detectando itens marcados com ácido nucleico

[0400] Alternativamente, as modalidades descritas no presente documento podem ser usadas para detectar identificadores de ácido nucleico. Identificadores de ácido nucleico são ácidos nucleicos não codificadores que podem ser usados para identificar um artigo específico. Exemplos de identificadores de ácidos nucleicos, como marcas d'água de DNA, são descritos em Heider e Barnekow. “DNA watermarks: A proof of concept” BMC Molecular Biology 9:40 (2008). Os identificadores de ácido nucleico também podem ser um código de barras de ácido nucleico. Um código de barras baseado em ácido nucleico é uma sequência curta de nucleotídeos (por exemplo, DNA, RNA ou combinações dos mesmos) que é usada como um identificador para uma molécula associada, como uma molécula alvo e/ou ácido nucleico alvo.

Um código de barras de ácido nucleico pode ter um comprimento de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucleotídeos e podem estar na forma de fita simples ou dupla. Um ou mais códigos de barras de ácido nucleico podem ser anexados ou “marcados” a uma molécula alvo e/ou ácido nucleico alvo.

Essa ligação pode ser direta (por exemplo, ligação covalente ou não covalente do código de barras à molécula alvo) ou indireta (por exemplo, através de uma molécula adicional, por exemplo, um agente de ligação específico, como um anticorpo (ou outra proteína) ou um adaptador de recebimento de código de barras (ou outra molécula de ácido nucleico). A molécula alvo e/ou os ácidos nucleicos alvo podem ser marcados com vários códigos de barras de ácidos nucleicos de maneira combinatória, como um concorrente de código de barras de ácidos nucleicos. Normalmente, um código de barras de ácidos nucleicos é usado identificar uma molécula alvo e/ou ácidos nucleicos alvo como pertencentes a um compartimento específico (por exemplo, um volume discreto), tendo uma propriedade física particular (por exemplo, afinidade, comprimento, sequência, etc.) ou tendo sido submetidas a certas condições de tratamento.

Moléculas alvo e/ou ácidos nucleicos alvo podem ser associados a vários códigos de barras de ácidos nucleicos para fornecer informações sobre todos esses recursos (e mais). Métodos para gerar códigos de barras de ácido nucleico são revelados, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente Internacional no WO/2014/047561.

Enzimas

[0401] O pedido fornece ainda ortólogos de C2c2 que demonstram atividade robusta, tornando os mesmos particularmente adequados para diferentes aplicações de clivagem e detecção de RNA. Essas aplicações incluem, sem limitação, aqueles descritos aqui. Mais particularmente, um ortólogo que demonstrou ter uma atividade mais forte que os outros testados é o ortólogo C2c2 identificado a partir do organismo Leptotrichia wadei (LwC2c2). A aplicação fornece, assim, métodos para modificar um locus alvo de interesse, que compreende entregar ao referido locus uma composição não natural ou manipulada que compreende uma proteína efetora C2c2, mais particularmente uma proteína efetora C2c2 com atividade aumentada, como descrito no presente documento e um ou mais ácidos nucleicos componentes, em que pelo menos o um ou mais componentes de ácido nucleico são manipulados, o um ou mais componentes de ácido nucleico direciona o complexo para o alvo de interesse e a proteína efetora forma um complexo com o um ou mais componentes de ácido nucleico e o complexo se liga ao locus de interesse do alvo. Em modalidades particulares, o locus alvo de interesse compreende RNA. O pedido ainda prevê o uso das proteínas efetoras C2c2 com atividade aumentada na interferência específica da sequência de RNA, regulação gênica específica da sequência de RNA, triagem de produtos de RNA ou RNA ou lincRNA ou RNA não codificante ou RNA nuclear ou mRNA, mutagênese, hibridização in situ de fluorescência, ou criação.

Exemplos Exemplo 1 - aumentando a atividade de cas13 com proteínas adicionais associadas a crispr

[0402] Os efetores CRISPR geralmente interagem com componentes adicionais para modular a atividade, e as Requerentes procuraram alavancar essas interações para aumentar a sensibilidade e a velocidade de SHERLOCK. Os sistemas CRISPR do tipo VI-B geralmente abrigam as proteínas moduladoras de interferência Csx27 e Csx28, e a co-expressão de Csx28 demonstrou aumentar a atividade de interferência das proteínas Cast3b in vivo, implicando que as mesmas podem ter a capacidade de aumentar a atividade de endonuclease de Cast3b in vitro. Como o Csx28 era instável em nossas mãos, as Requerentes purificaram as proteínas de fusão Csx28-Sumo de três sistemas Tipo VI-B (Figura 5A) e testaram se a suplementação com Csx28 aumentava a atividade das proteínas Cast 3a e Cast 3b. As requerentes constataram que as proteínas Csx28 diminuíram a atividade de Cast3 ou aumentaram a clivagem independente do alvo (Figura 6A-F).

Exemplo 2 - caracterização da atividade de clivagem de csm6

[0403] Intrigadas com estudos recentes que demonstraram a ativação alostérica à base de ácido nucléico da nuclease efetora CRISPR tipo III Csm6, as Requerentes se perguntaram se a atividade endonucleolítica de Casl3 tem a capacidade de gerar ativadores Csm6 potentes compostos por adenilatos de RNA lineares com 2,3 fosfatos cíclicos (Figura 7C, 7D). As requerentes procuraram, portanto, caracterizar a química da extremidade do RNA dos produtos de clivagem derivados de Casl3, realizando ensaios de clivagem Casl3 in vitro em loop de homopolímero A ou U contendo ssRNA 2 sintético (Figura 7A). A marcação fluorescente pós-clivagem da reação de clivagem in vitro demonstrou que LwCasl3a e PsmCasl3b produzem produtos de clivagem com extremidades de RNA fosfato cíclico 5’hidroxilado e 2’3’ (Figura 7B). Esse resultado levou a expressar e purificar os ortólogos Csm6 novos e conhecidos para explorar o uso do Csm6 em conjunto com o Cast3 para amplificação do sinal de retroalimentação positiva (Figuras 7C e 8). Ao testar o adenilato de RNA com diferentes comprimentos e modificações nas extremidades 3’, as Requerentes constataram que EiCsm6 e LsCsm6 são ativados com eficiência por hexadenilatos contendo uma extremidade fosfato cíclica 2’3’ (Figuras 7D e 10). Além disso, as Requerentes constataram que os ortólogos Csm6 têm uma forte preferência de clivagem pelos sensores de RNA homopoliméricos A e C (Figura 7D). A fim de obter uma visão mais abrangente da especificidade de clivagem do Csm6, as Requerentes realizaram o ensaio de clivagem in vitro e o sequenciamento de RNA na mesma biblioteca repórter de RNA degenerada de 6-mer usada para Casl3. Surpreendentemente, a análise de motivos de sequência esgotada revelou uma forte preferência pela guanosina (Figuras 7F-7G e 12 a 14), um resultado que os requerentes não anteciparam devido ao corte ineficiente do sensor de RNA-G homopolimérico. No entanto, dada a forte atividade de clivagem em sensores A- RNA homopoliméricos, as Requerentes usaram esse projeto para futuras experiências com Csm6, o que também permite medir independentemente LwCasl3a e EiCsm6 devido à sua preferência de clivagem.

Exemplo 3 - amplificação do sinal de retroalimentação positiva com crispr-csm6

[0404] Para acoplar a atividade do Cast3 à ativação do Csm6, as Requerentes projetaram ativadores de RNA que produziriam a estimulação ideal do Csm6 após a clivagem do

Cast3. As requerentes incubaram o PsmCasl3b com ativadores de poli-A mais longos que seriam reduzidos em comprimento a partir da clivagem para gerar ativadores curtos com terminação de fosfato cíclico. A digestão de ativadores por PsmCasl3b resultou em aumentos modestos na atividade de LsCsm6 (Figura 14A), possivelmente devido a uma variedade de subativadores gerados a partir da clivagem.

[0405] As Requerentes aprimoraram essa abordagem projetando ativadores de RNA que continham duas identidades de base: um trecho de poli-A de comprimento ideal do ativador, seguido por um trecho poli-U que poderia ser clivado por uma enzima Cast3 direcionada a U. As Requerentes constataram que, após a adição do alvo, o LwaCasl3a teve a capacidade de digerir esses ativadores e gerar os ativadores ideais para EiCsm6 e LsCsm6, e que essa ativação exigia o comprimento correto de poli-A (Figura 7H). Com o uso de espectrometria de massa, as Requerentes verificaram que LwaCasl3a estava produzindo os produtos terminados em fosfato cíclico esperados para ativação de Csm6 (Figuras 71 e 16A, B). A ativação foi mais eficaz para projetos com proteção de 3’ com poli U, pois outros projetos de ativação, incluindo proteção de 5’ com tratos poli-U e poli-U internos, foram menos eficazes na ativação do Csm6 apenas na presença de RNA alvo (Figura 17A, B).

Combinando repórteres para Csm6 e Cast3 na mesma reação, as

Requerentes foram capazes de analisar as atividades de clivagem combinada das duas enzimas. As Requerentes constataram que o aumento da concentração do ativador aumentou o benefício sinérgico do Csm6 ativado por Casl3 (Figura 7J) e que o aumento do repórter poliA específico do Csm6 também aumentou o sinal do Csm6, levando a um aumento maior com a adição do ativador (Figura 18A, B). LwaCasl3a aprimorado com Csm6 aumentou o sinal geral e a cinética dos genes sintéticos da acetiltransferase, bem como a resistência a herbicidas do DNA genômico da soja (Figuras 7K, L e 19A, B). Csm6 também pode melhorar o sinal das enzimas CcaCasl3b que clivam em U (Figura 20A-D).

[0406] Como a combinação do aprimoramento do Csm6 com a pré-amplificação do RPA aumentaria o sinal, as Requerentes testaram o Csm6 quanto à atividade na presença de componentes de transcrição in vitro necessários para a combinação com o RPA. As requerentes constataram que o rNTP livre de magnésio e livre reduziu a atividade de nuclease de Csm6 na presença de um ativador de fosfato cíclico (Figura 21A). A redução da quantidade de rNTP na solução reduziu a quantidade de RNA transcrito e, portanto, teve um efeito negativo na atividade Csm6 de Casl3a (Figura 21B-E), mesmo na presença de um repórter ou ativador aumentado.

Correspondendo a esses dois fatores concorrentes, condições do ativador de fosfato cíclico, reduzindo o sinal específico de Csm6 restaurado com rNTP (Figura 2IF). Todas as espécies de rNTP testadas resultaram em inibição de Csm6, indicando que as soluções de Csm6 e rNTP precisariam ser realizadas em diferentes reações (Figura 22). As requerentes, portanto, separaram a etapa de transcrição em uma reação separada, permitindo amplificação suficiente enquanto diluíam o rNTP resultante na reação Csm6, e essa reação separada teve a capacidade de detectar com robustez os genes de resistência a herbicidas (Figura 23).

[0407] As Requerentes levantaram a hipótese de que combinar Csm6 com detecção de Cast3 no fluxo lateral poderia reduzir o fundo da leitura visual empregando uma combinação de repórteres, impedindo a clivagem de uma única sequência de repórter e leitura de falso positivo. As Requerentes testaram repórteres de fluxo lateral de várias sequências e comprimentos na presença de Csm6 e ativador e constataram que um repórter de A/C longo poderia ter sinal, mas manter a ortogonalidade de LwaCasl3 (Figura 24A, B). As requerentes usaram esse repórter em combinação com o repórter RNaseAlert para detectar amostra de dengue na ausência de amplificação de RPA e apenas na presença de Csm6 (Figura 7M). As requerentes posteriormente combinaram RPA, Csm6 e fluxo lateral para detectar um alvo da aciltransferase e constataram que o Csm6 era necessário para a detecção quando uma sonda mista era usada, e esse cenário foi reduzido. (Figura 7N). No geral, essa combinação de tecnologias leva a uma detecção visual rápida e robusta.

Exemplo 4 - lwacas13a aprimorado com csm6 para aumentar o sinal de detecção de gene da aciltransferase sintética

[0408] Para amplificar o sinal de detecção, as Requerentes utilizaram a nuclease efetora CRISPR tipo III Csm6, que é ativada por moléculas de adenilato cíclico ou homopolímeros lineares de adenina terminados com um fosfato cíclico 2’, 3’. A atividade colateral de LwaCasl3a e PsmCasl3b gera produtos de clivagem com extremidades 5’ hidroxiladas e extremidades de fosfato cíclico 2’ e 3’ (Figura 28), sugerindo que a atividade colateral Casl3 poderia gerar espécies ativadoras Csm6, o que permitiria a detecção amplificada de sinais no ensaio SHERLOCK. Por meio do teste de moléculas de adenilato de RNA de diferentes comprimentos e modificações nas extremidades 3’ (Figuras 29 e 30A; Figura 38), as Requerentes constataram que Csm6 de Enterococcus italicus (EiCsm6) e Csm6 de Lactobacillus salivarius (LsCsm6) foram ativados de forma eficiente por hexadenilatos contendo extremidades de fosfato cíclico 2’, 3’ (Figura 30B-C). Além disso, EiCsm6, LsCsm6 e Csm6 de Thermus thermophilus (TtCsm6) demonstraram uma forte preferência de clivagem por sensores ricos em A e C com base na triagem de sensores, permitindo medições independentes da atividade de clivagem LwaCasl3a e Csm6 em canais separados (Figuras 25D e 30B-D, Figura 3, Figura 32A-E).

[0409] Para acoplar a atividade do Cast3 à ativação do Csm6, as Requerentes projetaram ativadores de RNA protegidos que continham um trecho poli-A seguido de um trecho poli-U protetor que poderia ser clivado por uma uracila que preferisse a enzima Cast3, com a lógica de que LwaCasl3a poderia degradar todas as uridinas até o trecho homopolimérico A, uma vez que tinha atividade robusta nos motivos de duas bases UU e AU (Figura 27). As Requerentes constataram que, após a adição do alvo e do complexo LwaCasl3a-crRNA, o EiCsm6 e o LsCsm6 foram ativados pelo ativador (A6-(U)5, consistente com a constatação de que o ativador AÓ é ideal para a ativação do Csm6 e confirmado por espectrometria de massa (Figuras 25E e 32F, Figura 33 e Figura 34). As Requerentes combinaram os repórteres de Csm6 e Cast3 na mesma reação no mesmo canal de fluorescência e constataram que o aumento da concentração do ativador aumentou a ativação sinérgica de Csm6 por Casl3 para detecção de DENV ssRNA (Figura 25F) e que aumentou o Csm6 - um repórter poliA específico também aumentou o sinal Csm6, levando a um aumento maior no sinal após a adição do ativador (Figura 35A-B). Após a otimização (Figura 36), as

Requerentes constataram que o LwaCasl3a aprimorado por Csm6 aumentou o sinal geral e a cinética da detecção do gene da aciltransferase sintética por SHERLOCK (Figura 25G).

[0410] Para melhorar a robustez da detecção e reduzir a probabilidade de leitura de falso positivo, as Requerentes combinaram o Csm6 com a detecção de Casl3 no fluxo lateral (Figura 26K). As Requerentes testaram os repórteres de fluxo lateral de várias sequências e comprimentos na presença de Csm6 e ativador e constataram que um repórter de CA longo demonstrava um forte sinal de clivagem (Figura 37A-B). As requerentes usaram esse repórter em combinação com o repórter de fluxo lateral Casl3 para detecção rápida de ssRNA de DENV, contando apenas com Csm6 para amplificação (isto é, na ausência de RPA) (Figura 26L). As requerentes posteriormente combinaram a leitura de RPA, Casl3/Csm6 e fluxo lateral para detectar um alvo de aciltransferase e constataram que o aumento no sinal conferido por Csm6 permitia uma detecção mais rápida por fluxo lateral (Figura 37C-D) com fundo reduzido.

Materiais e métodos Expressão e purificação de proteínas de ortólogos casl3 e csm6

[0411] A expressão e purificação de LwaCasl3a foram realizadas como descrito anteriormente com pequenas modificações e é detalhado abaixo. Os ortólogos LbuCasl3a,

LbaCasl3a, Casl3b e Csm6 foram expressos e purificados com um protocolo modificado. Em resumo, os vetores de expressão bacteriana foram transformados em células competentes RosettaTM 2 (DE3) µl ysS Singles (Millipore). Uma cultura inicial de 12,5 ml foi cultivada durante a noite em meio de crescimento Terrific Broth 4 (Sigma) (TB), que foi usado para inocular 4 l de TB para crescimento a 37 °C e 300 RPM até OD600 de 0,5. Nesse momento, a expressão proteica foi induzida por suplementação com IPTG (Sigma) até uma concentração final de 500 µM, e as células foram resfriadas a 18 °C por 16 h para expressão proteica. As células foram então centrifugadas a 5.000 g por 15 min a 4 °C. O sedimento celular foi colhido e armazenado a -80 °C para posterior purificação.

[0412] Todas as etapas subsequentes da purificação de proteínas foram realizadas a 4 °C. O sedimento celular foi esmagado e ressuspenso em tampão de lise (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, NaCl 500 mM, DTT 1 mM, pH 8,0) suplementado com inibidores de protease (tabletes livres de EDTA Complete Ultra), lisozima (500 pg/lml) e benzonase, seguidos de rompimento celular de alta pressão usando o sistema de microfluidizador LM20 a 27.000 PSI. O lisado foi eliminado por centrifugação por 1 hora a 4 °C a 10.000 g. O sobrenadante foi aplicado a 5 ml de StrepTactin Sepharose (GE) e incubado com rotação por 1 hora seguido de lavagem da resina StrepTactin ligada à proteína três vezes em tampão de lise. A resina foi ressuspensa em tampão de digestão SUMO (Tris-HC1 30 mM, NaCl 500 mM, 1 mM DTT, Igepal 0,15% (NP-40), pH 8,0) juntamente com 250 unidades de protease SUMO (250 mg/ml) e incubada durante a noite a 4 °C com rotação. A suspensão foi aplicada a uma coluna para eluição e separação da resina por fluxo de gravidade. A resina foi lavada duas vezes com 1 volume de coluna de tampão Lysis para maximizar a eluição da proteína. O eluto foi diluído em tampão de troca catiônica (HEPES 20 mM, DTT 1 mM, glicerol a 5%, pH 7,0; pH 7,5 para LbuCasl3a, LbaCasl3a, EiCsm6, LsCsm6, TtCsm6) para diminuir a concentração de sal em preparação para a cromatografia de troca catiônica para 250 mM.

[0413] Para troca de cátions e purificação por filtração em gel, a proteína foi carregada em uma coluna de troca de cátions HiTrap SP HP de 5 ml (GE Healthcare Life Sciences) via FPLC (AKTA PURE, GE Healthcare Life Sciences) e eluída sobre um gradiente de sal de 250 mM para NaCl 2M em tampão de eluição (HEPES 20 mM, DTT 1 mM, glicerol a 5%, pH 7,0; pH 7,5 para LbuCasl3a, LbaCasl3a). As frações resultantes foram testadas quanto à presença de proteína recombinante por SDS-PAGE, e as frações contendo a proteína foram reunidas e concentradas através de uma Unidade de Filtro Centrífuga (Millipore 50MWCO) a 1 ml em tampão S200

(HEPES 10 mM, NaCl 1 M, MgC125 mM, DTT 2 mM, pH 7,0). A proteína concentrada foi carregada em uma coluna de filtração em gel (Superdex® 200 Aumento 10/300 GL, GE Healthcare Life Sciences) via FPLC. As frações resultantes da filtração em gel foram analisadas por SDS-PAGE e as frações contendo proteínas foram reunidas e trocadas de tampão para o tampão de armazenamento (NaCl 600 mM, Tris- HCl 50 mM pH 7,5, glicerol a 5%, DTT 2 mM) e congeladas a - 80 °C para armazenamento.

[0414] Os números de acesso e mapas de plasmídeos para todas as proteínas purificadas neste estudo estão disponíveis na Figura 39 Alvo do ácido nucleico e preparação de crRNA

[0415] Os alvos de ácido nucleico para Cast2a e a detecção de DNA genômico foram amplificados por PCR com a mistura principal NEBNext PCR, extraídos em gel e purificados com o uso do kit de extração em gel MinElute (Qiagen). Para a detecção baseada em RNA, cdDNA purificado foi incubado com polimerase de T7 durante a noite a 30 °C com o uso do kit T7 HiScribe Breve High Yield Synthesis RNA (New England Biolabs) e o RNA foi purificado com o kit de transcrição MEGAclear Clean-up (Thermo Fisher).

[0416] A preparação de crRNA foi realizada como descrito anteriormente com pequenas modificações e é detalhada abaixo. Para a preparação de crRNAs, os construtos foram ordenados como DNA de ultrâmero (Integrated DNA Technologies) com uma sequência promotora T7 anexada. DNA crRNA foi emparelhado com um primer de T7 curta (concentração final 10 uM) e incubou-se com polimerase de T7 durante a noite a 37 °C com o uso do kit T7 HiScribe Breve High Yield Synthesis RNA (New England Biolabs). Os crRNAs foram purificados com o uso de microesferas limpas de RNAXP (Beckman Coulter) na proporção 2x de microesferas para o volume de reação, com uma suplementação adicional de 1,8x de isopropanol (Sigma).

[0417] Todas as sequências de crRNA usadas neste estudo estão disponíveis na Figura 40. Todas as sequências alvo de DNA e RNA usadas neste estudo estão disponíveis na Figura 41

[0418] Os primers para RPA foram projetados com o uso de NCBI Primer-BLAST com o uso de parâmetros padrão, com exceção do tamanho do amplicon (entre 100 e 140 nt), temperaturas de fusão do primer (entre 54 °C e 67 °C) e tamanho do primer (entre 30 e 35 nt). Os primers foram, então, solicitados como DNA (Integrated DNA Technologies).

[0419] As reações RPA e RT-RPA executadas foram conforme as instruções do TwistAmp® Basic ou TwistAmp® Basic RT (TwistDx), respectivamente, com exceção do aumento de 280 mM de MgAc antes do modelo de entrada. As reações foram realizadas com 1 µl de entrada por 1 hora a 37 °C, a menos que descrito de outra forma.

[0420] Para a quantificação de SHERLOCK de ácido nucleico, a concentração do primer RPA foi testada na concentração padrão (480 nM final) e mais baixa (240 nM, 120 nM, 60 nM, 24 nM) para encontrar a concentração ideal.

As reações RPA foram realizadas ainda por 20 minutos.

[0421] Quando múltiplos alvos foram amplificados com RPA, a concentração do primer foi ajustada para uma concentração final de 480 nM. Ou seja, foram adicionados 120 nM de cada primer para dois pares de primers para detecção duplex.

[0422] Todos os primers RPA usados neste estudo estão disponíveis na Figura 42 Ensaio de clivagem fluorescente

[0423] Os ensaios de detecção foram realizados como descrito anteriormente com pequenas modificações e o procedimento é detalhado abaixo. Os ensaios de detecção foram realizados com Casl3 purificado a 45 nM, crRNA 22,5 nM, repórter de RNA fluorescente extinto (125nM RNAse Alert v2, Thermo Scientific, repórteres de homopolímeros e di- nucleotídeos (IDT); 250 nM para repórter poliA Trilink), silenciador de 0,5 µl de RNase murina (New England Biolabs), 25 ng de RNA humano total de fundo (purificado a partir da cultura HEK293FT) e quantidades variadas de alvo de ácido nucleico de entrada, a menos que indicado de outra forma, no tampão de ensaio de nuclease (HEPES 20 mM, NaCl 60 mM, NaCl 60 mM, MgC12 6 mM, pH 6,8). Para reações de clivagem fluorescente Csm6, a proteína foi usada na concentração final de 10 nM, juntamente com 500nM de oligoadenilato de fosfato cíclico 2’, 3’, 250nM de repórter fluorescente e 0,5 µl de inibidor de RNase murina em tampão de ensaio de nuclease (HEPES 20 mM, NaCl 60 mM, MgC12 6 mM, pH 6,8). As reações foram deixadas prosseguir durante 1 a 3 horas a 37 °C (a menos que indicado de outro modo) em um leitor de placa fluorescente (BioTek) com uma cinética fluorescentes medida a cada 5 min. Nas reações envolvendo AsCasl2a, 45nM AsCasl2a foi incluído usando a proteína recombinante da IDT. No caso de reações multiplexadas, 45 nM de cada proteína e 22,5 nM de cada crRNA foram usados na reação.

[0424] Todos os repórteres de clivagem usados neste estudo estão disponíveis na Figura 43 Detecção de ácido nucleico de Sherlock

[0425] Os ensaios de detecção foram realizados com Casl3 purificado a 45 nM, crRNA 22,5 nM, repórter de RNA fluorescente extinto (125nM RNAse Alert v2, Thermo Scientific, repórteres de homopolímeros e di-nucleotídeos (IDT), 250nM para repórter poliA Trilink), 0,5 µl de murino Inibidor de RNase (New England Biolabs), 25 ng de RNA humano total de fundo (purificado a partir da cultura HEK293FT) e 1 µl de reação RPA em tampão de ensaio de nuclease (HEPES 20 mM, HEPES 20 mM, NaCl 60 mM, MgC12 6 mM, pH 6,8), rNTP mistura (final 1 mM, NEB), 0,6 µl de polimerase T7 (Lucigen) e MgC12 3 mM. As reações foram deixadas prosseguir durante 1 a 3 horas a 37 °C (a menos que indicado de outro modo) em um leitor de placa fluorescente (BioTek) com uma cinética fluorescentes medida a cada 5 min.

[0426] Para detecção de ácido nucleico de uma panela, o ensaio de detecção foi realizado como descrito anteriormente, com pequenas modificações. Um única ensaio de reação combinado de 100 µl consistiu em primer de avanço 0,48 µM, primer inverso 0,48 µM, lx tampão de reidratação RPA, quantidades variáveis de entrada de DNA, proteína recombinante LwCasl3a45 nM, crRNA22,5 nM, 125 ng de fundo de RNA total humano, 125 nM de substrato repórter (RNase alert v2), 2,5 µl de inibidor de RNase murina (New England Biolabs), ATP2 mM, GTP2 mM, UTP2 mM, CTP2 mM, 1 µl de mistura de polimerase T7 (Lucigen), MgC12 5 mM e MgAc14 mM.

As reações foram deixadas prosseguir durante 1 a 3 horas a 37 °C (a menos que indicado de outra forma) sobre uma placa fluorescente leitor (BioTek) com uma cinética fluorescente medida a cada 5 min. Para a leitura do fluxo lateral, foram adicionados 20 µl da reação combinada a 100 µl de tampão de ensaio HybriDetect 1 (Milenia) e executados em tiras de fluxo lateral HybriDetect 1 (Milenia).

Marcação de ácido nucleico para análise de fragmentos de clivagem

[0427] O RNA alvo foi transcrito in vitro a partir de um modelo de dsDNA e purificado como descrito acima. A reação de clivagem in vitro foi realizada como descrito acima para a reação de clivagem por fluorescência com as seguintes modificações. O repórter de fluorescência foi substituído pelo alvo de RNA de Ipg e nenhum RNA de fundo foi usado. A reação de clivagem foi realizada por 5 minutos (LwaCasl3a) ou 1 hora (PsmCasl3b) a 37 °C. A reação de clivagem foi purificada com o uso do kit RNA clean & concentrator-5 (Zymo Research) e eluída em 10 µl de água UltraPure (Gibco). A reação de clivagem foi ainda marcada com 10 pg de maleimida IRDye 800CW (Licor), seguindo o protocolo do kit de reação de marcação 5’ EndTag (Vector Laboratories). Para determinar a extremidade 5’ produzida pela clivagem Cast3, o protocolo foi modificado para realizar um tratamento com fosfatase alcalina (AP) ou substituir com água UltraPure para rotular apenas espécies de RNA contendo 5’-OH, enquanto espécies de RNA trifosforiladas (PPP) não digeridas são marcado somente quando o tratamento da PA é realizado.

Espectrometria de massa para análise de fragmentos de clivagem de alta resolução

[0428] Para determinar as extremidades de clivagem produzidas pela atividade de RNase colateral de Cast3 por Espectrometria de Massa, uma reação de clivagem in vitro foi realizada como descrito acima com as seguintes modificações. O alvo de RNA Cast3 foi usado na concentração final 1 nM, o ativador Csm6 na concentração final 3 µM e nenhum RNA de fundo foi usado. Para reações de controle, o alvo Casl3 foi substituído por água UltraPure ou a reação de clivagem padrão in vitro foi incubada com hexaadenilato contendo um ativador de fosfato cíclico 2’, 3’ na ausência do alvo Cast3, proteína Cast3 e CRRNA Cast3. As reações de clivagem foram realizadas por 1 h a 37 °C e purificadas com o uso do protocolo de purificação de siRNA da New England Biolabs. Em resumo, um décimo do volume de NaOAc 3 M, 2 µl de glicolato sem RNase (termofisher) e três volumes de etanol 95% frio foram adicionados, colocados a -20 °C por 2 horas e centrifugados por 15 minutos a 14.000 g. O sobrenadante foi removido e dois volumes de 80% de EtOH foram adicionados e incubados por 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi decantado e as amostras centrifugadas por 5 minutos a 14.000 g. Após a secagem do pellet ao ar, 50 µl de água UltraGrade foram adicionados e enviados em gelo seco para análise por espectrometria de massa.

[0429] Para análise por espectrometria de massa, as amostras foram diluídas 1:1 com água UltraGrade e analisadas no espectrômetro de massa q-TOF Bruker Impact II no modo de íon negativo acoplado a uma HPLC Agilent 1290.

10 µl foram injetados em uma coluna PLRP-S (50 mm, tamanho de partícula de 5 um, coluna PLRP-S com tamanho de poro de

1.000 angstrom, 2,1 mm ID) com o uso de hidróxido de amônio 0,1% em volume em água como fase móvel A e acetonitrila como móvel fase B. O caudal foi mantido constante ao longo de 0,3 ml/minuto. A composição da fase móvel começou em 0% de B e foi mantida nos primeiros 2 minutos. Após esse ponto, a composição foi alterada para 100% B nos próximos 8 minutos e mantida por um minuto. A composição foi então retornada a 0% de B ao longo de 0,1 minuto e depois mantida pelos 4,9 minutos a seguir para permitir que a coluna se reequilibre às condições iniciais. O espectrômetro de massa foi ajustado para íons MW grandes e os dados foram adquiridos entre 400 a 5.000 m/z. Todo o conjunto de dados do espectrômetro de massa foi calibrado por m/z com o uso de uma injeção de formato de sódio. Os dados foram analisados com o uso da Análise de Dados Bruker Compass 4.3 com uma licença para o algoritmo de deconvolução MaxEnt para gerar um espectro de massa neutro calculado a partir dos dados de íons carregados negativamente.

Extração de DNA genômico da saliva humana

[0430] A extração do DNA da saliva foi realizada como descrito anteriormente, com pequenas modificações e é detalhado abaixo. Foram coletados 2 ml de saliva de voluntários que foram impedidos de consumir alimentos ou bebidas 30 minutos antes da coleta. As amostras foram então processadas com o uso no Mini Kit QIAamp® DNA Blood (Qiagen), conforme recomendado pelo protocolo do kit. Para amostras de saliva fervida, 400 µl de solução salina tamponada com fosfato (Sigma) foram adicionados a 100 µl de saliva voluntária e centrifugados por 5 minutos a 1.800 g.

O sobrenadante foi decantado e o sedimento foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100 a 0,2% (Sigma) antes da incubação a 95 °C por 5 min. 1 µl da amostra foi usado como entrada direta nas reações RPA.

Quantificação de pcr digital de gotículas

[0431] A quantificação de ddPCR foi realizada como descrito anteriormente com pequenas modificações e é detalhada abaixo. Para confirmar a concentração das diluições alvo, realizou-se PCR de doppler digital (ddPCR).

Para quantificação do DNA, as gotículas foram produzidas com o uso de ddPCR Supermix for Probes (sem dUTP) (BioRad) com sondas qPCR PrimeTime/ensaios de primer (IDT)

projetados para a sequência alvo. Para quantificação do RNA, as gotículas foram produzidas com o uso do kit RT- ddPCR de uma etapa para sondas com sondas qPCR PrimeTime/ensaios de primer projetados para a sequência alvo. Gotículas foram geradas em ambos os casos com o uso do gerador de gotículas QX200 (BioRad) e transferidas para uma placa de PCR. A amplificação baseada em gotículas foi realizada em um termociclador, como descrito no protocolo do kit, e as concentrações de ácido nucleico foram subsequentemente determinadas por medição em um leitor de gotículas QX200.

Ensaio de clivagem fluorescente de Casl3-csm6

[0432] Os ensaios de clivagem fluorescente combinada de Casl3-Csm6 foram realizados conforme descrito para reações padrão de clivagem fluorescente de Casl3 com as seguintes modificações. A proteína Csm6 foi adicionada à concentração final 10 nM, 400 nM de repórter fluorescente Csm6 e ativador Csm6500 nM, a menos que indicado de outra forma. Para distinguir Casl3 da atividade de RNase colateral Csm6, foram usados dois fluoróforos distintos para detecção de fluorescência (FAM e HEX). Devido à interferência de rNTPs na atividade Csm6, a IVT foi realizada na etapa de pré-amplificação de RPA e, em seguida, 1 µl dessa reação foi adicionado como entrada no ensaio de clivagem Casl3-Csm6.

[0433] No caso em que testamos um ensaio de clivagem Casl3-Csm6 em três etapas, o RPA foi realizado normalmente como discutido acima por períodos variados e, em seguida, usado como entrada para uma reação normal de IVT por períodos variados. Então, 1 µl da IVT foi usado como entrada para a reação Casl3-Csm6 descrita no parágrafo anterior. Todos os ativadores Csm6 usados neste estudo estão disponíveis na Figura 38.

Triagem de revelação de motivos com biblioteca

[0434] Para rastrear a preferência de clivagem Casl3, uma reação de clivagem de RNA in vitro foi estabelecida como descrito acima com as seguintes modificações. O alvo Cast3 foi usado a 20 nM, o repórter fluorescente foi substituído por 1 µM de oligonucleotídeo de DNA-RNA (IDT) que contém um trecho de 6-mer de ribonucleotídeos randomizados, flanqueados por alças de DNA para a preparação da biblioteca NGS. As reações foram realizadas por 60 minutos (a menos que indicado de outra forma) a 37 °C. As reações foram purificadas com o kit Zymo oligo-clean e concentrator-5 (pesquisa Zymo) e 15 µl de água UltraPure foram usados para eluição. Foi usado 1 µl de reação purificada para a transcrição reversa com o uso de um primer específico de gene que se liga ao manuseio de DNA.

[0435] A transcrição reversa (RT) foi realizada por 45 minutos a 42 °C, de acordo com o protocolo qScript Flex cDNA-kit (quantabio). Para avaliar a eficiência da clivagem e a pureza do produto, as reações de RT foram diluídas 1:10 em água e carregadas em um kit Small RNA e executadas em um Bioanalyzer 2100 (Agilent). Quatro microlitros de reação de RT foram usados para a primeira rodada da preparação da biblioteca NGS. O NEBNext (NEB) foi usado para amplificar o cDNA da primeira fita com uma mistura de primers de avanço no final de 625 nM e um primer reverso para 625 nM por 15 ciclos com desnaturação inicial de 3 minutos a 98 °C, desnaturação do ciclo de 10 s a 98 °C, 10 s recozimento a 63 °C, extensão de 20 s 72 °C e extensão final de 2 minutos a 72 °C.

[0436] Dois microlitros de reação de PCR do primeiro ciclo foram usados para amplificação do segundo ciclo para anexar índices compatíveis com Illumina (NEB) para o sequenciamento NGS. O mesmo protocolo de PCR NEBNext foi usado para amplificação. O produto de PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose (sistema Sybr Gold E-Gel Invitrogen a 2%) e foram reunidos 5 µl de cada reação. As amostras reunidas foram extraídas em gel, quantificadas com kit de alta sensibilidade Qubit DNA 2.0 DNA e normalizadas para concentração final de 4 nM. A biblioteca final foi diluída para 2 µM e sequenciada em um sistema NextSeq 500 Illumina com o uso de um kit de 75 ciclos.

Análise de triagem de motivos

[0437] Para analisar a depleção de motivos preferenciais da triagem aleatória da biblioteca de motivos, regiões 6-mer foram extraídas dos dados da sequência e normalizadas para a contagem geral de leitura para cada amostra. As contagens de leitura normalizadas foram usadas para gerar razões de log, com ajuste de pseudocontagem, entre condições experimentais e controles correspondentes. Para experimentos Casl3, os controles correspondentes não tiveram o RNA alvo adicionado; para experimentos com Csm6 e RNase A, os controles pareados não possuíam enzima. O formato da distribuição da razão de toras foi usado para determinar pontos de corte para motivos enriquecidos. Motivos enriquecidos foram então usados para determinar a ocorrência de combinações de 1, 2 ou 3 nucleotídeos. Os logotipos de motivos foram gerados usando o Weblogo3.

Análise filogenética da proteína casl3 e repetições diretas de crRNA

[0438] Para estudar o agrupamento de ortólogos, múltiplos alinhamentos de sequência foram gerados com as sequências de proteínas Casl3a e Casl3b em Geneious com MUSCLE e, em seguida, agrupadas com o uso da distância euclidiana em R com a função heatmap.2. Para estudar o agrupamento direto de repetições, foram gerados vários alinhamentos de sequência com as sequências de repetição direta Cast3a e Cast3b no Geneious com o uso do algoritmo Geneious e, em seguida, agrupadas com o uso da distância euclidiana em R com a função heatmap.2. Para estudar o agrupamento de ortólogos com base na preferência de motivo de nucleotídeos, a matriz de atividade de clivagem foi agrupada com o uso da distância euclidiana em R usando a função heatmap.2.

Colorimetria de nanopartículas de ouro

[0439] Um RNA oligo foi sintetizado a partir do IDT com tióis nas extremidades 5’ e 3’ (Figura 43 para a sequência). A fim de desproteger os grupos tiol, o oligo a uma concentração final de 20 mM foi reduzido em tampão de fosfato de sódio 150 mM contendo DTT 100 mM por 2 horas à temperatura ambiente. Os oligo foram então purificados usando colunas de sephadex NAP-5 (GE Healthcare) até um volume final de 700 µl de água. Como descrito anteriormente, o oligo reduzido a 10 µM foi adicionado a um volume de 280 µl a 600 µl de nanopartículas de 2,32 nM de ouro e 15 nm (Ted Pella), que é uma razão de 2.000:1 entre oligo e nanopartículas. Posteriormente, 10 µl de Tris-HCl 1 M a pH 8,3 e 90 µl de NaCl 1M foram adicionados à mistura de oligonopartículas e incubados por 18 horas à temperatura ambiente com rotação. Após 18 horas, foi adicionado Tris- HCl 1 M adicional (5 µl a pH 8,3) com NaCl 5M (50 µl) e isso foi incubado durante 15 horas adicionais à temperatura ambiente com rotação. Após a incubação, a solução final foi centrifugada por 25 min a 22.000 g. O sobrenadante foi descartado e as nanopartículas conjugadas foram ressuspensas em 50 µl de NaCl 200 mM.

[0440] As nanopartículas foram testadas quanto à sensibilidade à RNase com o uso de um ensaio de RNase A.

Quantidades variáveis de RNase A (Thermo Fischer) foram adicionadas ao tampão lx RNase e 6 µl de nanopartículas conjugadas em um volume total de reação de 20 µl. A absorvância a 520 nm foi monitorada a cada 5 minutos durante 3 horas com o uso de um espectrofotômetro de placa.

Leitura do fluxo lateral da atividade casl3 com o uso de repórteres de fam-biotina

[0441] Para o fluxo lateral baseado na clivagem de um repórter FAM-RNA-biotina, as reações não RPA LwaCasl3a ou SHERLOCK-LwaCasl3a foram executadas por 1 hora, a menos que indicado de outra forma, com concentração final 1 uM de repórter FAM-RNA-biotina. Após a incubação, foram adicionados 20 µl de sobrenadante das reações LwaCasl3a a 100 µl de tampão de ensaio HybriDetect 1 (Milenia) e corridos em tiras de fluxo laterais HybriDetect 1 (Milenia).

Clonagem de construtos de reparo. Transfecção de células de mamíferos, isolamento de rna e preparação de biblioteca de ngs para reparo

[0442] Construtos para simular a reversão de mutações APC e construtos guia para REPAIR foram clonados como descrito anteriormente. Resumidamente, foram projetadas sequências de 96 nt centradas na APC: c.l262G> Uma mutação e a porta dourada foi clonada sob um vetor de expressão, e as sequências guia correspondentes foram as portas douradas clonadas nos vetores de expressão U6 para os guias PspCasl3b. Para simular amostras de pacientes, 300 ng de vetor de expressão de APC mutante ou de tipo selvagem foram transfectados para células HEK293FT com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e dois dias após a transfecção de DNA foram colhidos com Qiamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. 20 ng de DNA foram usados como entrada nas reações SHERLOCK-LwaCasl3a.

[0443] A correção do RNA com o uso do sistema REPAIR foi realizada conforme descrito anteriormente: 150 ng de dPspCasl3b-ADAR (DD) E488Q, 200 ng de vetor guia e 30 ng de vetor de expressão APC foram co-transfectados e RNA de dois dias após a transfecção foi co-transfectado colhidos com o Mini Kit RNeasy Plus (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. 30 ng de RNA foram usados como entrada nas reações SHERLOCK-LwaCasl3a.

[0444] As frações de edição de RNA foram determinadas independentemente por NGS, como descrito anteriormente. O RNA foi transcrito reversamente com o kit qScript Flex (Quanta Biosciences) com um primer específico da sequência. O cDNA da primeira cadeia foi amplificado com o NEBNext High Fidelity 2X PCR Mastermix (New England Biosciences) com uma mistura de primers de avanço na final de 625 nM e um primer reverso para 625 nM por 15 ciclos com desnaturação inicial de 3 minutos a 98 °C, desnaturação de 10 segundos a 98 °C, recozimento de 30 segundos a 65 °C, extensão de 30 segundos a 72 °C e extensão final de 2 minutos a 72 °C. Dois microlitros da reação de PCR do primeiro ciclo foram usados para a amplificação do segundo ciclo de PCR para anexar índices compatíveis com Illumina para NGS sequenciamento, com NEBNext, usando o mesmo protocolo com 18 ciclos. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose (2% Sybr Gold E-Gel Invitrogen) e 5 µl de cada reação foram reunidos. As amostras reunidas foram extraídas em gel, quantificadas com o kit de alta sensibilidade Qubit DNA 2.0 DNA e normalizadas para concentração final de 4nM e lidas com um kit MiSeq de 300 ciclos v2 (Illumina).

Análise de dados de fluorescência Sherlock

[0445] A análise de fluorescência SHERLOCK foi realizada como descrito anteriormente com pequenas modificações e é detalhada abaixo. Para calcular os dados de fluorescência subtraídos em segundo plano, a fluorescência inicial das amostras foi subtraída para permitir comparações entre diferentes condições. A fluorescência para condições de fundo (sem entrada ou sem condições de crRNA) foi subtraída das amostras para gerar fluorescência subtraída de fundo.

[0446] As razões de crRNA para discriminação de SNP foram calculadas para ajustar a variação geral de amostra para amostra da seguinte maneira: em que Ai e Bi se referem aos valores de intensidade SHERLOCK para a replicação técnica i dos crRNAs que detectam o alelo A ou alelo B, respectivamente, para um determinado indivíduo. Como normalmente temos quatro réplicas técnicas por crRNA, m e n são iguais a 4 e o denominador é equivalente à soma de todos os oito valores de intensidade do crRNA SHERLOCK para um determinado locus e indivíduo SNP. Como existem dois crRNAs, a média da proporção de crRNA em cada um dos crRNAs de um indivíduo sempre será soma a dois. Portanto, no caso ideal de homozigose, a proporção média de crRNA para o alelo positivo crRNA será dois e a proporção média de crRNA para o alelo negativo crRNA será zero. No caso ideal de heterozigosidade, a proporção média de crRNA para cada um dos dois crRNAs será um. Devido ao fato de que em SHERLOCKv2, pode-se realizar genotipagem por medição Ai e Bi em canais de cores diferentes, que dimensionado o canal de 530 cores por 6 para combinar os valores de intensidade no canal de 480 cores.

Clivagem promíscua de ortólogos casl3 na ausência do alvo

[0447] Alguns membros da família Cast3, como PinCasl3b e LbuCasl3a, demonstram clivagem promíscua na presença ou ausência de alvo, e essa atividade de segundo plano é dependente do repórter di-nucleotídeo. Essa atividade de segundo plano também era dependente de espaçador para LbuCasl3a. Em alguns repórteres, as preferências de base U e A agruparam-se dentro da similaridade de proteína ou DR. Curiosamente, as preferências de nucleotídeos identificadas aqui não correspondiam às famílias Cast3 agrupadas a partir de similaridade de repetição direta ou similaridade de proteínas.

Caracterização de projetos de crRNA para psmcasl3b e ccacasl3b

[0448] Para identificar o crRNA ideal para detecção com PsmCasl3b e CcaCasl3b, testaram-se comprimentos de espaçador de crRNA de 34 a 12 nt e contatou-se que

PsmCasl3b tinha uma sensibilidade de pico no comprimento de espaçador de 30, enquanto CcaCasl3b tinha sensibilidade equivalente acima dos comprimentos de 28nt, justificando o uso de espaçadores de 30nt para avaliar a atividade do Casl3. Para explorar ainda mais a robustez do direcionamento de CcaCasl3b e PsmCasl3b em comparação com o LwaCasl3a, projetaram-se onze crRNAs diferentes espaçados uniformemente pelo ssRNA 1 e constatou-se que a atividade colateral do LwaCasl3a era robusta para o design do crRNA, enquanto o CcaCasl3b e o PsmCasl3b mostravam mais variabilidade na atividade em diferentes crRNAs.

[0449] Triagem aleatória de motivos de biblioteca para motivos ortogonais adicionais. Para explorar ainda mais a diversidade de preferências de clivagem dos ortólogos Cast3a e Cast3b, desenvolveu-se uma abordagem baseada em biblioteca para caracterizar motivos preferenciais para a atividade de endonuclease colateral.

Utilizou-se um repórter degenerado de RNA de 6-mero, flanqueado por constantes punhos de DNA, o que permitiu amplificação e leitura de sequências não clivadas. Incubar essa biblioteca com enzimas Cast 3 resultou em padrões de clivagem detectáveis que dependiam da adição do RNA alvo, e o sequenciamento de motivos esgotados dessas reações revelou um aumento na inclinação da biblioteca ao longo do tempo de digestão, indicativo de uma população de motivos preferenciais de clivagem. Logotipos de sequência e preferências de base pareada de motivos altamente esgotados reproduzem a preferência U observada para LwaCasl3a e CcaCasl3b e a preferência A de PsmCasl3b. Sintetizou-se repórteres dos principais motivos, conforme determinado na tela para validar as descobertas, e constatou-se que LwaCasl3a, CcaCasl3a e PsmCasl3b clivavam seus motivos mais preferenciais). Também foram reveladas várias sequências que mostraram clivagem para apenas um ortólogo, mas não para outras, o que poderia permitir uma leitura ortogonal alternativa de motivos di-nucleotídicos. O LwaCasl3a incubado com diferentes alvos produziu preferências similares de motivos de clivagem, indicando que a preferência básica da atividade colateral é constante, independentemente da sequência do alvo.

Validação de produtos ativadores por clivagem lwacasl3a

[0450] Com o uso de espectrometria de massa, verificou-se que a digestão com LwaCasl3a produziu os produtos terminados com fosfato cíclico esperados para a ativação do Csm6. A ativação foi mais eficaz para projetos com proteção de 3’ com poli U, pois outros projetos de ativação, incluindo proteção de 5’ com tratos poli-U e poli-U internos, foram menos eficazes na ativação do Csm6 exclusivamente na presença de RNA alvo (provavelmente devido ao fato de que LwaCasl3a tem pouca atividade nos motivos de UA e a proteção de 5’ é ineficaz na prevenção da ativação do Csm6).

Otimização para combinar reações rpa e csm6

[0451] Como a combinação do aprimoramento do Csm6 com a pré-amplificação do RPA aumentaria o sinal e a sensibilidade, testou-se Csm6 quanto à atividade na presença de componentes de transcrição in vitro necessários para a combinação com o RPA. Constatou-se que o rNTP livre de magnésio e livre reduziu a atividade nuclease de Csm6 na presença de um ativador de fosfato cíclico. A redução da quantidade de rNTP em solução reduziu a quantidade de RNA transcrito e, portanto, teve um efeito negativo na ativação de Csm6 por Cast3a, mesmo na presença de concentrações aumentadas de repórter ou ativador.

[0452] A invenção é descrita adicionalmente pelos seguintes parágrafos numerados:

1. Uma composição que compreende uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de detecção e uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de amplificação de sinal.

2. A composição do parágrafo 1, em que a uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de detecção é uma proteína efetora CRISPR do Tipo VI.

3. A composição do parágrafo 2, em que a proteína efetora do Tipo VI CRISPR é um Cast3a, Cast3b ou ambos.

4. A composição de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que a uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de amplificação de sinal são proteínas CRISPR do Tipo IIIa.

5. A composição do parágrafo 4, em que a proteína CRISPR do Tipo III é uma proteína Csm6.

6. A composição de qualquer um dos parágrafos anteriores, que compreende adicionalmente uma ou mais sequências guia projetadas para se ligar às moléculas alvo correspondentes.

7. A composição do parágrafo 7, que compreende adicionalmente uma ou mais sequências de ativação projetadas para ativar uma ou mais proteínas efetoras CRISPR de amplificação de sinal após a clivagem das sequências de ativação.

8. A composição de qualquer um dos parágrafos anteriores que compreende adicionalmente um construto repórter.

9. A composição de qualquer um dos parágrafos anteriores que compreende adicionalmente uma sequência guia secundária protegida e uma sequência alvo secundária, em que a sequência guia secundária é projetada para ligar a sequência alvo secundária após a remoção de um elemento de proteção na sequência guia secundária protegida.

10. A composição de qualquer um dos parágrafos anteriores, que compreende adicionalmente uma sequência alvo secundária protegida e uma sequência guia secundária, em que a sequência guia secundária é projetada para se ligar à sequência alvo secundária após a remoção de um elemento de proteção no alvo secundário protegido sequência.

11. A composição de qualquer um dos parágrafos anteriores, que compreende adicionalmente um primer protegido ou circularizado e uma sequência guia de codificação de modelo e/ou sequência alvo, em que o primer protegido ou circularizado é projetado para iniciar uma reação de amplificação do modelo após remoção de um elemento de proteção ou clivagem do primer circularizado.

12. A composição de qualquer um dos parágrafos anteriores que compreende adicionalmente reagentes de amplificação.

13. Dispositivo de diagnóstico que compreende a composição de qualquer um dos parágrafos 1 a 12.

14. Método para detectar moléculas alvo em amostras, que compreende; distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes discretos individuais, que compreende os volumes discretos individuais uma composição de qualquer um dos parágrafos 8 a 12;

incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação de uma ou mais sequências guia a uma ou mais moléculas alvo; ativar a proteína efetora de detecção CRISPR através da ligação de uma ou mais sequências guia às uma ou mais moléculas alvo, em que ativar a proteína efetora de detecção CRISPR resulta na clivagem da sequência de ativação, de modo que a proteína efetora CRISPR de amplificação de sinal seja ativada, e em que tanto a proteína efetora CRISPR de detecção ativada quanto a proteína efetora CRISPR de amplificação de sinal ativada modificam a construto repórter de modo que seja gerado sinal positivo detectável; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra.

[0453] Várias modificações e variações dos métodos descritos, composições farmacêuticas e kits da invenção serão evidentes para os versados na técnica sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas, será entendido que tem a capacidade de modificações adicionais e que a invenção, conforme reivindicada, não deve ser indevidamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção que são óbvias para os versados na técnica devem estar dentro do escopo da invenção.

Este pedido destina-se a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção, seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente revelação,

estão dentro da prática costumeira conhecida na técnica à qual a invenção pertence e pode ser aplicado aos recursos essenciais aqui mencionados antes.

Claims (110)

REIVINDICAÇÕES

1. Sistema de detecção de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende: a) um sistema CRISPR de detecção que compreende: i. uma proteína efetora, ii. um ou mais RNAs guia projetados para se ligarem às moléculas-alvo correspondentes, e iii. uma ou mais proteínas efetoras de CRISPR de amplificação de sinal; e b) um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA.

2. Sistema de detecção de polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende: a) um sistema CRISPR de detecção que compreende: i. uma proteína efetora, ii. um ou mais RNAs guia projetados para se ligarem a um RNA gatilho, e iii. uma ou mais proteínas efetoras de CRISPR de amplificação de sinal; b) um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA; e c) um ou mais aptâmeros de detecção que compreendem um sítio de ligação ao promotor de RNA polimerase mascarado ou um primeiro sítio de ligação mascarado.

3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que envolve uma ou mais proteínas efetoras de CRISPR de amplificação de sinal que compreendem uma proteína CRISPR do Tipo IIIa.

4. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a proteína CRISPR do tipo III é uma proteína Csm6.

5. Sistema, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a proteína Csm6 é selecionada dentre EiCsm6 e LsCsm6.

6. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que uma ou mais proteínas efetoras de CRISPR de amplificação de sinal compreendem Csx28 ou Csx27.

7. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais proteínas efetoras de CRISPR de amplificação de sinal compreendem um ou mais dentre Csm6, Csx28, Csx27 ou qualquer combinação dos mesmos.

8. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda reagentes de amplificação de ácido nucleico.

9. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula-alvo é um DNA-alvo e o sistema compreende ainda um primer que se liga ao DNA- alvo e compreende um promotor de RNA polimerase.

10. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína efetora de sistema CRISPR é uma proteína efetora direcionada ao RNA.

11. Sistema, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteína efetora direcionada ao RNA compreende um ou mais domínios HEPN.

12. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o um ou mais domínios HEPN compreendem uma sequência de motivos RxxxxH.

13. Sistema, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o motivo RxxxH compreende uma sequência RN/H/K]X1X2X3H.

14. Sistema, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que Xi é R, S, D, E, Q, N, G, ou Y, e X2 representa independentemente I, S, T, V, ou G, e X3 é Independentemente L, F, N, Y, V, I, S, D, E ou A.

15. Sistema, de acordo qualquer uma das reivindicações 14, caracterizado pelo fato de que a proteína efetora direcionada ao RNA CRISPR é C2c2.

16. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que C2c2 está dentro de 20 kb de um gene Cas1.

17. Sistema, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a proteína efetora C2c2 é de um organismo de um gênero selecionado do grupo que consiste em: Leptotriquia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter, e Lachnospira.

18. Sistema, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a proteína efetora C2c2 ou Casl3b é de um organismo selecionado do grupo que consiste em: Leptotrichia shahii; Leptotrichia wadei (Lw2); Listeria seeligeri; Lachnospiraceae bacterium MA2020; Lachnospiraceae bacterium NK4A179; [Clostridium] aminophilum DSM10710; Carnobacterium gallinarum DSM 4847; Carnobacterium gallinarum DSM 4847 (second CRISPR Loci); Paludibacterpropionicigenes WB4; Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317; Listeriaceae bacterium FSL M6-0635; Leptotrichia wadei F0279; Rhodobacter capsulatus SB 1003; Rhodobacter capsulatus R121; Rhodobacter capsulatus DE442; Leptotrichia buccalis C-1013-b; Herbinix hemicellulosilytica; [Eubacterium] rectale; Eubacteriaceae bacterium CHKCI004; Blautiasp. Marseille-P2398; Leptotrichia sp. oral taxon 879 str. F0557; Lachnospiraceae bacterium NK4A144; Chloroflexus aggregans; Demequina aurantiaca; Thalassospira sp. TSL5-1; Pseudobutyrivibrio sp. OR37; Butyrivibrio sp. YAB3001; Blautia sp. Marseille-P2398; Leptotrichia sp. Marseille-P3007; Bacteroides ihuae; Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA; Listeria riparia; andInsolitispirillumperegrinum.

19. Sistema, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a proteína efetora C2c2 é uma proteína efetora C2c2 de L. wadei F0279 ou L. wadei F0279 (Lw2).

20. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA suprimem a geração de um sinal positivo detectável.

21. Sistema, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA suprimem a geração de um sinal positivo detectável por meio do mascaramento do sinal positivo detectável, ou da geração de um sinal negativo detectável.

22. Sistema, de acordo a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem um RNA de silenciamento que suprime a geração de um produto de gene codificado por um construto de relatório, em que o produto de gene gera o sinal positivo detectável quando expresso.

23. Sistema, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA são uma ribozima que gera o sinal detectável negativo, e em que o sinal detectável positivo é gerado quando a ribozima é desativada.

24. Sistema, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a ribozima converte um substrato em uma primeira cor e em que o substrato converte em uma segunda cor quando a ribozima é desativada.

25. Sistema, de acordo a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o agente de mascaramento baseado em RNA é um aptâmero de RNA e/ou compreende um inibidor amarrado a RNA.

26. Sistema, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o aptâmero ou inibidor amarrado a RNA sequestra uma enzima, em que a enzima gera um sinal detectável após a liberação do aptâmero ou inibidor amarrado a RNA por meio da atuação sobre um substrato.

27. Sistema, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o aptâmero é um aptâmero inibidor que inibe uma enzima e impede que a enzima catalise a geração de um sinal detectável de um substrato ou em que o inibidor amarrado a RNA inibe uma enzima e impede que a enzima catalise a geração de um sinal detectável de um substrato.

28. Sistema, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a enzima é trombina, proteína C, elastase de neutrófilos, subtilisina, peroxidase de rábano silvestre, beta-galactosidase ou fosfatase alcalina de vitelo.

29. Sistema, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a enzima é trombina e o substrato é para-nitroanilida covalentemente ligado a um substrato peptídico para trombina ou 7-amino-4-metilcumarina covalentemente ligado a um substrato peptídico para trombina.

30. Sistema, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o aptâmero sequestra um par de agentes que, quando liberados dos aptâmeros, se combinam para gerar um sinal detectável.

31. Sistema, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem um oligonucleotídeo de RNA ao qual estão ligados um ligante detectável e um componente de mascaramento.

32. Sistema, de acordo a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem uma nanopartícula mantida em agregado por moléculas de ponte, em que pelo menos uma porção das moléculas de ponte compreende RNA e, em que a solução sofre uma mudança de cor quando as nanopartículas são desembolsadas em solução.

33. Sistema, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula é um metal coloidal.

34. Sistema, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o metal coloidal é ouro coloidal.

35. Sistema, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem um ponto quântico ligado a uma ou mais moléculas arrefecedoras por uma molécula de ligação, em que pelo menos uma porção da molécula de ligação compreende RNA.

36. Sistema, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem RNA em complexo com um agente intercalante, em que o agente intercalante altera a absorvância mediante a clivagem do RNA.

37. Sistema, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o agente intercalante é pironina-Y ou azul de metileno.

38. Sistema, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o ligante detectável é um fluoróforo e o componente de mascaramento é uma molécula arrefecedora.

39. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA podem ser clivados pela proteína efetora direcionada ao RNA CRISPR e pela proteína CRISPR do Tipo IIIa.

40. Sistema, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem um construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína efetora direcionada ao RNA CRISPR.

41. Sistema, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem um construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína CRISPR do Tipo IIIa.

42. Sistema, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o um ou mais construtos de mascaramento baseados em RNA compreendem um construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína efetora direcionada ao RNA CRISPR e um construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína CRISPR do Tipo IIIa.

43. Sistema, de acordo a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o construto de mascaramento baseado em RNA que pode ser clivado pela proteína CRISPR Tipo IIIa compreende A ou C-RNA homopolimérico.

44. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais RNAs guia projetados para se ligar às moléculas-alvo correspondentes, compreende uma incompatibilidade (sintética).

45. Sistema, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a dita incompatibilidade está a montante ou a jusante de um SNP ou outra variação de nucleotídeo único na dita molécula-alvo.

46. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais RNAs guia é projetado para detectar um polimorfismo de nucleotídeo único em um RNA ou DNA-alvo ou em uma variante de splice de um transcrito de RNA.

47. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais RNAs guia são projetados para detectar uma molécula-alvo ou desencadear RNA que produz hexadenilatos contendo uma extremidade de fosfato cíclico 2’3’ quando clivado pela proteína efetora direcionada ao RNA CRISPR.

48. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o um ou mais RNAs guia são projetados para detectar uma molécula-alvo ou desencadear RNA que compreende um trecho poli A.

49. Sistema, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligar a uma ou mais moléculas-alvo que são diagnósticas para um estado de doença.

50. Sistema, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o estado da doença é câncer.

51. Sistema, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o estado da doença é uma doença autoimune.

52. Sistema, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o estado da doença é uma infecção.

53. Sistema, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um vírus, uma bactéria, um fungo, um protozoário ou um parasita.

54. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção viral.

55. Sistema, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada por um vírus de DNA.

56. Sistema, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o vírus de DNA é um Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae (incluindo vírus da herpes humana, e vírus da varicela zoster), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfarviridae (incluindo vírus da febre suína africana), Baculoviridae, Cicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, polydnaviruses, Polyomaviridae (incluindo vírus Simian 40, vírus JC, vírus BK), Poxviridae (incluindo varíola bovina e varíola), Sphaerolipoviridae, Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus, Rhizidovirus.

57. Sistema, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a infecção virai é causada por um vírus de RNA de dupla cadeia, um vírus de RNA senso positivo, vírus de RNA senso negativo, um retrovírus, ou uma combinação dos mesmos.

58. Sistema, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada por vírus Coronaviridae, vírus Picornaviridae, vírus Caliciviridae, vírus Flaviviridae, vírus Togaviridae,

Bornaviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Pneumoviridae, Rhabdoviridae, um Arenaviridae, um Bunyaviridae, um Orthomyxoviridae ou um Deltavírus.

59. Sistema, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada por coronavírus, SARS, poliovírus, rinovírus, hepatite A, vírus Norwalk, vírus da febre amarela, vírus do Nilo Ocidental, vírus da hepatite C, vírus da dengue, vírus do zika, vírus da rubéola, Vírus Ross River, Vírus Sindbis, Vírus Chikungunya, Vírus da doença de Borna, Vírus Ebola, Vírus de Marburg, Vírus do sarampo, Vírus da caxumba, Vírus de Nipah, Vírus de Hendra, Vírus da doença de Newcastle, Vírus respiratório sincicial humano, Vírus da raiva, Vírus de Lassa, Hantavírus, Vírus da febre hemorrágica da Crimeia- Congo, influenza ou vírus da hepatite D.

60. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção bacteriana.

61. Sistema, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a bactéria que causa a infecção bacteriana é das espécie Acinetobacter, uma espécie de Actinobacillus, uma espécie de Actinomycetes, uma espécie de Actinomyces, uma espécie de Aerococcus e uma de espécie Aeromonas, uma espécie de Anaplasma, uma espécie de Alcaligenes, uma espécie de Bacillus, uma espécie de

Bacteriodes, uma espécie de Bartonella, uma espécie de

Bifidobacterium, uma espécie de Bordetella, uma espécie de

Borrelia, uma espécie de Brucella, uma espécie de

Burkholderia, uma espécie de Campylobacter, uma espécie de

Capnocytophaga, uma espécie de Chlamydia, uma espécie de

Citrobacter, uma espécie de Coxiella, uma espécie de

Corynbacterium, uma espécie de Clostridium, uma espécie de

Eikenella, uma espécie de Enterobacter, uma espécie de

Escherichia, uma espécie de Enterococcus, uma espécie de

Ehlichia, uma espécie de Epidermophyton, uma espécie de

Erysipelothrix, uma espécie de Eubacterium, uma espécie de

Francisella, uma espécie de Fusobacterium, uma espécie de

Gardnerella, uma espécie de Gemella, uma espécie de

Haemophilus, uma espécie de Helicobacter, uma espécie de

Kingella, uma espécie de Klebsiella, uma espécie de

Lactobacillus, uma espécie de Lactococcus, uma espécie de

Listeria, uma espécie de Leptospira, uma espécie de

Legionella, uma espécie de Leptospira, uma espécie de

Leuconostoc, uma espécie de Mannheimia, uma espécie de

Microsporum, uma espécie de Micrococcus, uma espécie de

Moraxella, uma espécie de Morganell, uma espécie de

Mobiluncus, uma espécie de Micrococcus, uma espécie de

Mycobacterium, uma espécie de Mycoplasm, uma espécie de

Nocardia, uma espécie de Neisseria, uma espécie de

Pasteurelaa, uma espécie de Pediococcus, uma espécie de

Peptostreptococcus, uma espécie de Pityrosporum, uma espécie de Plesiomonas, uma espécie de Prevotella, uma espécie de Porphyromonas, uma espécie de Proteus, uma espécie de Proteus, uma espécie de Providencia, uma espécie de Pseudomonas, uma espécie de Propionibacteriums, uma espécie de Rhodococcus, uma espécie de Rickettsia, uma espécie de Rhodococcus, uma espécie de Serratia, uma espécie de Stenotrophomonas, uma espécie de Salmonella, uma espécie de Serratia, uma espécie de Shigella, uma espécie de Staphylococcus, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Spirillum, uma espécie de Streptobacillus, uma espécie de Treponema, uma espécie de Tropheryma, uma espécie de Trichophyton, uma espécie de Ureaplasma, uma espécie de Veillonella, uma espécie de Vibrio, uma espécie de Yersinia, uma espécie de Xanthomonas ou combinação das mesmas.

62. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um fungo.

63. Sistema, de acordo com a reivindicação 62, referente ao fungo é Aspergillus, Blastomyces, Candidíase, Coccidiodomicose, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gatti, sp. Histoplasma sp. (como Histoplasma capsulatum), Pneumocystis sp. (como Pneumocystis jiroveci), Stachybotrys (como Stachybotrys chartarum), Mucroymcosis, Sporothrix, micose de infecções fúngicas do olho, Exserohilum,

Cladosporium, Geotrichum, Saccharomyces, uma espécie de Hansenula, uma espécie de Candida, uma espécie de Kluyveromyces, uma espécie de Debaryomyces, uma espécie de Pichia, uma espécie de Penicillium, uma espécie de Cladosporium, uma espécie de Byssochlamys ou uma combinação dos mesmos.

64. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um protozoário.

65. Sistema, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o protozoário é Euglenozoa, para Heterolobosea, para Diplomonadida, um Amebozoa, um Blastocystic, um Apicomplexa ou combinação dos mesmos.

66. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um parasita.

67. Sistema, de acordo com a reivindicação 66, referente ao parasita, é Trypanosoma cruzi (doença de Chagas), T.

brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L. infantum, L. mexicana, L. major, L. tropica, L. donovani, Naegleria fowleri, Giardia intestinalis (G.

lamblia, G. duodenalis), canthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica, Blastocystic hominis, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P.

malariae, e Toxoplasma gondii, ou combinação dos mesmos.

68. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato de que os reagentes para amplificar moléculas de RNA alvo que compreendem amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA), amplificação de recombinase polimerase (RPA), amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP), deslocamento de cadeia amplificação (SDA), amplificação dependente de helicase (HDA), reação de amplificação de enzima de nicking (NEAR), PCR, amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), amplificação de círculo rolante (RCA), reação em cadeia da ligase (LCR) ou método de amplificação de ramificação (RAM)

69. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 68, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um sistema CRISPR de enriquecimento, em que o sistema CRISPR de enriquecimento é projetado para ligar as moléculas-alvo correspondentes antes da detecção pelo sistema CRISPR de detecção.

70. Sistema, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o sistema CRISPR de enriquecimento compreende uma proteína efetora CRISPR cataliticamente inativa.

71. Sistema, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a proteína efetora CRISPR cataliticamente inativa é uma C2c2 cataliticamente inativo.

72. Sistema, de acordo qualquer uma das reivindicações 69 a 71, caracterizado pelo fato de que a proteína efetora de enriquecimento CRISPR compreende ainda uma etiqueta, em que a etiqueta é usada para eliminar o sistema efetor CRISPR de enriquecimento ou para ligar o sistema CRISPR de enriquecimento a um substrato sólido.

73. Sistema, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o substrato sólido é uma célula de fluxo.

74. Dispositivo de diagnóstico caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais volumes discretos individuais, em que cada volume discreto individual compreende um sistema CRISPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

73.

75. Dispositivo de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que cada volume discreto individual compreende ainda um ou mais aptâmeros de detecção que compreendem um sítio de ligação ao promotor de RNA polimerase mascarado ou um primeiro sítio de ligação mascarado.

76. Dispositivo, de acordo com as reivindicações 74 ou 75, caracterizado pelo fato de que cada volume discreto individual compreende ainda reagentes de amplificação de ácido nucleico.

77. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a molécula-alvo é um DNA-alvo e os volumes discretos individuais compreendem ainda um primer que liga o DNA-alvo e compreende um promotor de RNA polimerase.

78. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo fato de que os volumes discretos individuais são gotículas.

79. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 78, caracterizado pelo fato de que os volumes discretos individuais são definidos em um substrato sólido.

80. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que os volumes discretos individuais são micropoços.

81. Dispositivo de diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 78, caracterizado pelo fato de que os volumes discretos individuais são manchas definidas em um substrato.

82. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o substrato é um substrato de materiais flexíveis.

83. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que o substrato de materiais flexíveis é um substrato de papel ou um substrato flexível à base de polímero.

84. Método para detectar ácidos nucleicos alvo em amostras caracterizado pelo fato de que compreende: distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes discretos individuais, em que os volumes discretos individuais compreendem um sistema CRISPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 73; incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas-alvo; ativar a proteína efetora CRISPR através de ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas-alvo, em que a ativação da proteína efetora CRISPR resulta em modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas-alvo na amostra.

85. Método para detectar polipeptídeos em amostras caracterizado pelo fato de que compreende: distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um conjunto de volumes discretos individuais, em que os volumes discretos individuais compreendem aptâmeros de detecção de peptídeos, um sistema CRISPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 73; incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação dos aptâmeros de detecção de peptídeo a uma ou mais moléculas-alvo, em que a ligação do aptâmero a uma molécula-alvo correspondente expõe o sítio de ligação de RNA polimerase ou o primeiro sítio de ligação, resultando na geração de um RNA de gatilho; ativar a proteína efetora de RNA através da ligação do um ou mais RNAs guia ao RNA de gatilho, em que a ativação da proteína efetora de RNA resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja produzido; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas-alvo em uma amostra.

86. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a molécula-alvo é um DNA-alvo e o método compreende ainda a ligação do DNA-alvo a um primer que compreende um sítio de RNA polimerase.

87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 86, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a amplificação do RNA de amostra ou do RNA de gatilho.

88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a amplificação do RNA compreende a amplificação por NASBA.

89. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a amplificação do RNA compreende a amplificação por RPA.

90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 89, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra biológica ou ambiental.

91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é um sangue, plasma, soro, urina, fezes, escarro, mucosa, líquido linfático, líquido sinovial, bile, ascite, derrame pleural, seroma, saliva, líquido cefalorraquidiano, aquoso ou humor vítreo ou qualquer secreção corporal, um transudato, um exsudato (por exemplo, fluido obtido de um abscesso ou qualquer outro local de infecção ou inflamação) ou fluido obtido de uma articulação (por exemplo, uma articulação normal ou uma articulação afetada pela doença, como artrite reumatoide, osteoartrite, gota ou artrite séptica) ou um cotonete da superfície da pele ou da membrana da mucosa.

92. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que a amostra ambiental é obtida a partir de uma amostra de alimento, superfície de papel, tecido, superfície de metal, superfície de madeira,

superfície de plástico, amostra de solo, amostra de água doce, amostra de água residual, uma amostra de água salina ou uma combinação dos mesmos.

93. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 ou 86 a 92, caracterizado pelo fato de que o um ou mais RNAs guia são projetados para detectar um polimorfismo de nucleotídeo único em um RNA ou DNA-alvo, ou uma variante de splice de um transcrito de RNA.

94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 a 93, caracterizado pelo fato de que o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligar a uma ou mais moléculas-alvo que são diagnósticas para um estado de doença.

95. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 94, caracterizado pelo fato de que o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligar a ácidos nucleicos livres de células.

96. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que o estado da doença é uma infecção, uma doença de órgão, uma doença do sangue, uma doença do sistema imune, um câncer, uma doença do cérebro e do sistema nervoso, uma doença endócrina, uma doença relacionada à gravidez ou ao parto, uma doença herdada ou uma doença adquirida ambientalmente.

97. Sistema, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o dito estado de doença se distingue pela presença ou ausência de um gene ou transcrito ou polipeptídeo de susceptibilidade ou de resistência a antibióticos ou fármacos, de preferência em um patógeno ou célula.

98. Sistema, de acordo a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que a dita molécula-alvo é um gene ou transcrito ou polipeptídeo de susceptibilidade ou resistência a antibióticos ou fármacos.

99. Sistema, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a incompatibilidade sintética no dito RNA guia está na posição 3, 4, 5 ou 6 do espaçador, de preferência, na posição 3.

100. Sistema, de acordo com a reivindicação 45, 46 ou 100, caracterizado pelo fato de que a dita incompatibilidade no dito RNA guia está na posição 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 do espaçador, de preferência, na posição 5.

101. Sistema, de acordo com a reivindicação 46 ou 100, caracterizado pelo fato de que a incompatibilidade está 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos a montante ou a jusante, de preferência 2 nucleotídeos, de preferência a jusante do dito SNP ou outra variação de nucleotídeo único no dito RNA guia.

102. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74 ou 98 a 102, caracterizado pelo fato de que o dito RNA guia compreende um espaçador que é truncado em relação a um espaçador do tipo selvagem.

103. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74 ou 98 a 103, caracterizado pelo fato de que o dito RNA guia compreende um espaçador que compreende menos de 28 nucleotídeos, de preferência entre e incluindo 20 e 27 nucleotídeos.

104. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74 ou 98 a 104, caracterizado pelo fato de que o dito RNA guia compreende um espaçador que consiste em 20 a 25 nucleotídeos ou 20 a 23 nucleotídeos, como de preferência 20 ou 23 nucleotídeos.

105. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74 ou 98 a 105, caracterizado pelo fato de que o dito construto de mascaramento compreende um oligonucleotídeo de RNA projetado para ligar uma sequência de formação de G-quadruplex, em que que uma estrutura G- quadruplex é formada pela sequência de formação de G- quadruplex mediante a clivagem do construto de mascaramento, e em que a estrutura G-quadruplex gera um sinal positivo detectável.

106. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 97, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a comparação do sinal positivo detectável com um sinal padrão (sintético).

107. Método para detectar um ácido nucleico alvo em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreende:

colocar uma amostra em contato com um sistema de detecção de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74; e aplicar a dita amostra contatada a um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral.

108. Método, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que o dito sistema de detecção de ácido nucleico compreende um construto de mascaramento baseado em RNA que compreende uma primeira e uma segunda molécula, e em que o dito ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral compreende detectar as ditas primeira e segunda moléculas, preferencialmente em sítios de detecção discretos em uma tira de fluxo lateral.

109. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que a dita primeira molécula e a dita segunda molécula são detectadas por meio da ligação a um anticorpo que reconhece a dita primeira ou segunda molécula e da detecção da dita molécula ligada, preferencialmente com anticorpos em sanduíche.

110. Método, de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizado pelo fato de que a dita tira de fluxo lateral compreende um primeiro anticorpo a montante direcionado contra a dita primeira molécula, e um segundo anticorpo a jusante direcionado contra a dita segunda molécula, e em que o construto de mascaramento baseado em RNA não clivado é ligado pelo dito primeiro anticorpo se o ácido nucleico alvo não estiver presente na dita amostra, e em que o construto de mascaramento baseado em RNA clivada é ligado tanto pelo dito primeiro anticorpo como pelo segundo anticorpo se o ácido nucleico alvo estiver presente na dita amostra.