CN113791207A

CN113791207A - 高灵敏度的免疫检测方法及其应用

Info

Publication number: CN113791207A
Application number: CN202110904027.3A
Authority: CN
Inventors: 蒋兴宇; 徐晓建; 牟磊
Original assignee: Southwest University of Science and Technology
Current assignee: Southwest University of Science and Technology; Southern University of Science and Technology
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2021-12-14

Abstract

本发明公开了高灵敏度的免疫检测方法及其应用，该免疫检测方法包括以下步骤：提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，捕获抗体偶联于固态基质，检测抗体标记有核酸探针；将待测样本、捕获抗体、检测抗体混合反应，使待测样本中的待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体形成免疫复合物；将免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切核酸探针，并诱导产生对报告核酸的非特异性剪切，根据报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。该免疫检测方法在将CRISPR技术、免疫分析技术以及液滴微流控技术三者相结合，可以达到更显著的级联放大效果，降低了检出限，提高了灵敏度。

Description

高灵敏度的免疫检测方法及其应用

技术领域

本申请涉及分子检测技术领域，尤其是涉及高灵敏度的免疫检测方法及其应用。

背景技术

自上世纪60年代发明以来，免疫测试在实验和临床研究中发挥了很重要的作用。免疫分析几乎可以用于检测分析所有的生物分子，包括蛋白质、核酸、囊泡、小分子，甚至可以分析整个细胞。酶联免疫吸附分析(ELISA)从1971年第一次提出至今，已成为免疫学实验和临床研究最广泛使用的技术。ELISA基本原理和方法是将目标分子的特异性抗体固定到固体基质(微量反应板、微球、磁珠等)上，通过抗原抗体免疫吸附作用捕获目标分子，再连接酶标记的检测抗体用于催化后续检测反应产生颜色。通过酶促信号放大步骤，ELISA的检出限(LOD)可以达到0.01-50ng/mL水平(pM-nM)。凭借着酶促反应的信号放大，ELISA在常规诊断中发挥着很大的作用，然而，对于一些在人体中含量很低的生物标志物，例如跟癌症、心血管疾病、神经退行性疾病以及某些传染病早期诊断相关的生物标志物，ELISA就会暴露出其灵敏度不够的缺点，难以准确地检测出这些生物分子。另外，ELISA方法采用抗原抗体的特异性结合来识别捕获目标分子，再通过检测抗体的酶促反应来进行目标物的检测。但并非所有的抗体都适合进行酶标记。因此，有必要提供一种具有更高灵敏度的免疫检测方法。

规律间隔成簇短回文重复序列及其关联蛋白(CRISPR/Cas)体系是微生物在对抗外来病毒入侵的过程中形成的自适应免疫系统，该系统包含有可以编程的核酸内切酶，这使得CRISPR体系可以应用于疾病诊断领域。CRISPR体系在检测到目标DNA或RNA序列后，会将目标核酸分子附近的RNA或DNA序列剪切掉。根据这一原理，CRISPR体系在核酸检测中有着广泛的应用。而在免疫测定领域，虽然已有研究人员进行了初步探索，但检测的灵敏度仍然有待提高。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种具有更高高灵敏度的免疫检测方法。

本申请的目的还在于提供一种免疫检测试剂盒。

本申请的第一方面，提供免疫检测方法，该免疫检测方法包括以下步骤：

提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，捕获抗体偶联于固态基质，检测抗体标记有核酸探针；

将待测样本、捕获抗体、检测抗体混合反应，使待测样本中的待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体形成免疫复合物；

将免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切核酸探针，并诱导产生对报告核酸的非特异性剪切，根据报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。

根据本申请实施例的免疫检测方法，至少具有如下有益效果：

本申请实施例所提供的免疫检测方法将CRISPR技术、免疫分析技术以及液滴微流控技术三者相结合，利用捕获抗体捕获待测样本中的待检目标，再与标记核酸探针的检测抗体通过抗原抗体特异性结合形成免疫复合物，并作为单个的反应体系分散到液滴中去，以单独的液滴作为CRSIPR/Cas系统剪切反应的反应器，各个反应器相互隔离，以便后续对反应结果进行检测。通过这种方式，本申请实施例所提供的免疫检测方法可以达到更显著的级联放大效果，降低了待检目标的检出限，提高了检测灵敏度，有利于在临床中的应用。

其中，待检目标是指通过免疫检测方法检测待测样本时所需检测的目标物质，其非限制性实例包括生物大分子(如多肽、蛋白质)、细胞、微生物(如细菌、真菌、病毒)等。捕获抗体是指能够与待检目标发生抗原抗体特异性结合，从而将待检目标捕获的抗体。检测抗体是指同样能够与待检目标发生抗原抗体特异性结合，并通过标记的核酸探针进行检测的抗体。以此双抗夹心的反应方式得到待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体的免疫复合物。可以理解的是，捕获抗体与检测抗体针对于待检目标的不同表位，以避免发生竞争性结合。CRSIPR/Cas系统蛋白是指规律间隔成簇短回文重复序列及其关联蛋白，其非限制性实例包括二类Ⅴ型、Ⅵ型的CRISPR/Cas系统如Cas12(例如Cas12a～Cas12e)、Cas13(例如Cas13a～Cas13d)、Cas14(例如Cas14a～Cas14c)蛋白，这些蛋白不仅具有剪切特异靶标序列的顺式核酸酶活性，还有剪切非特异单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)的反式核酸酶活性。核酸探针是指包含CRSIPR/Cas系统蛋白对应的特异靶标序列的核酸分子。报告核酸是指在ssDNA或ssRNA上偶联有检测标记的核酸分子，能够通过CRSIPR/Cas系统蛋白的非特异性剪切而产生检测信号，其非限制性实例可以是在ssDNA或ssRNA上偶联荧光基团和淬灭基团，淬灭基团和荧光基团在报告核酸未发生非特异性剪切时距离较为接近，淬灭基团能够吸收荧光基团的荧光信号，从而抑制荧光基团产生荧光。而在报告核酸发生CRSIPR/Cas系统蛋白的非特异性剪切后，荧光基团和淬灭基团相互分离，荧光信号得以释放。

在本申请的一些实施方式中，液滴的体积为(1～100)×10^-15L。通过将CRSIPR/Cas系统蛋白的剪切反应体系限制在飞升左右大小的液滴内，从而将检测标记的信号或检测标记经反应产生的信号进一步浓缩为可直接检测的信号，以进一步降低其检测限，极大地提高了反应的灵敏度。

在本申请的一些实施方式中，检测抗体偶联于微球，微球上标记有多个核酸探针。通过多个核酸探针的标记，达到级联放大的效果，进一步降低了待检目标的检出限。同时，将核酸探针标记到微球上以避免位阻效应而影响后续的检测。

在本申请的一些实施方式中，固态基质为磁性粒子。通过磁性粒子与捕获抗体形成偶联物作为探针去捕获待测样本中的待检目标，再和检测抗体与核酸探针的复合物通过检测抗体与待检目标的抗原抗体特异性结合形成免疫复合物，并作为单个的反应体系分散到液滴中去，达到隔离的目的，以便后续基于荧光液滴的检测。磁性粒子的非限制性实例包括磁珠、磁性微球等。

在本申请的一些实施方式中，CRSIPR/Cas系统蛋白为Cas13a蛋白。Cas13a具有特异性很强的RNA识别剪切能力，因而在选择RNA分子作为核酸探针时，选用Cas13a蛋白可以将反应体系的检测灵敏度降低至飞摩尔(fM)水平。

在本申请的一些实施方式中，液滴的封装方法包括以下步骤：提供油相、免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白及报告核酸的混合液；以油相为流动相，以混合液为分散相，在压力和/或剪切力的作用下封装形成油包水的液滴。该封装方法利用油相的毛细作用剪切混合液，使得分散相被流动相所截断、形成将CRSIPR剪切体系封装在内的液滴。

在本申请的一些实施方式中，油相还包括表面活性剂。通过在油相内加入表面活性剂使得形成的液滴更加稳定。

在本申请的一些实施方式中，根据报告核酸的非特异性剪切结果进行检测的方式为：根据封装有磁珠复合体的液滴数量，分析得到待测样本中待测核酸片段的浓度。在表面活性剂的保护下，反应过程中液滴不会发生融合和物质交换，最终保持完整独立的液滴形态，因而无需设计对应液滴大小的微孔结构将液滴沉入其中，而可以直接进行检测。而且，由于不需要设计微孔结构进行分割隔离，检测区的液滴的尺寸可以更加均匀且具有更大的密度从而方便检测。

本申请的第二方面，提供免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：

捕获抗体，捕获抗体偶联于固态基质，捕获抗体用于特异性结合待检目标；

检测抗体，检测抗体标记有核酸探针，检测抗体用于特异性结合待检目标，且捕获抗体与检测抗体针对待检目标的不同表位；

报告核酸；

CRSIPR/Cas系统蛋白，CRSIPR/Cas系统蛋白用于特异性识别切割核酸探针，并产生非特异性剪切特性切割报告核酸。

在本申请的一些实施方式中，还包括微流控芯片。整个检测过程中，液滴的生成、混合和成像均在微流控芯片中完成，减少了手动操作和复杂的仪器使用。同时，基于液滴微流控的高通量特点，可以用于多重待检目标的联检。

在本申请的一些实施方式中，微流控芯片还包括液滴形成区，液滴形成区用于形成(1～100)×10^-15L体积的液滴。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的一个实施例的免疫复合物的示意图。

图2是本申请的一个实施例的CRSIPR/Cas系统蛋白的剪切反应示意图。

图3是本申请的一个实施例的微流控芯片的结构示意图。

图4是本申请的图3中A位置的局部放大图。

图5是本申请的图4中的出口在不同流速情况下液滴生成区产生液滴的CCD摄像机拍摄的图片。

图6是本申请的一个实施例的微流控芯片的检测原理图。

图7是本申请的实施例1中不同浓度样品的荧光图像。

图8是本申请的实施例1中不同浓度标准品绘制得到的标准曲线。

附图标记：固态基质100、捕获抗体110、待检目标120、检测抗体130、生物素140、链霉亲和素150、核酸探针160、微球170、CRSIPR/Cas系统蛋白210、REC叶片211、NUC叶片212、crRNA 213、报告核酸220、荧光基团221、淬灭基团222、液滴生成区310、第一进液口311、第二进液口312、第三进液口313、混合反应区320、反应流道321、检测区330、检测室331、第一油相入口410、第二油相入口420、水相入口430、出口440、液滴450。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

参考图1，示出了本申请的一个实施例的免疫检测方法中所产生的免疫复合物的结构示意图，该免疫复合物包括固态基质100、捕获抗体110、待检目标120、检测抗体130和核酸探针160。其中，捕获抗体110偶联于固态基质100上，核酸探针160标记在检测抗体130上。在上述实施例中，待检目标120是指待测样本中进行检测的目标物质，其非限制性实例包括生物大分子，如多肽、蛋白质等，具体可以是浓度很低的癌症、心血管疾病、神经性疾病以及传染病等早期诊断相关的生物标志物，其它也包括细胞以及微生物，如细菌、真菌、病毒等。捕获抗体110是指能够与待检目标120发生抗原抗体特异性结合，从而将待检目标120捕获的抗体。检测抗体130是指与捕获抗体110针对于待检目标120的不同表位，同样能够与待检目标120发生抗原抗体特异性结合的抗体。核酸探针160是指一种核酸分子，能够被CRSIPR/Cas系统蛋白特异性识别切割，并最终使得CRSIPR/Cas系统蛋白产生非特异性剪切活性。

在其中一些具体实施方式中，检测抗体130偶联于微球170，核酸探针160标记于微球170上，并且在微球170上标记有多条核酸探针160。通过多个核酸探针160的标记，达到级联放大的效果，进一步降低了待检目标120的检出限。同时，将核酸探针160标记到微球170上以避免位阻效应而影响后续的检测。在其中一些优选的实施方式中，检测抗体130偶联于微球170的方式为通过链霉亲和素150和生物素140的连接方式而偶联。

在其中一些具体实施方式中，固态基质100为磁性粒子。通过磁性粒子与捕获抗体110形成偶联物作为探针去捕获待测样本中的待检目标120，再和检测抗体130与核酸探针160的复合物通过检测抗体130与待检目标120的抗原抗体特异性结合形成免疫复合物，并作为单个的反应体系分散到液滴中去，达到隔离的目的，以便后续基于荧光液滴的检测。其中，磁性粒子的非限制性实例包括磁珠、磁性微球等。

参考图2，示出了本申请的一个具体实施例的CRSIPR/Cas系统蛋白的剪切原理。CRSIPR/Cas系统蛋白210的非限制性实例包括Cas12蛋白，如Cas12a～Cas12e；Cas13蛋白，如Cas13a～Cas13d以及Cas14蛋白，如Cas14a～Cas14c等。在其中一些具体实施方式中，CRSIPR/Cas系统蛋白210包括REC叶片211和NUC叶片212，CRSIPR/Cas系统蛋白210上还结合有crRNA 213。报告核酸220包括核酸分子以及在核酸分子上偶联的荧光基团221和淬灭基团222。在将免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白210以及报告核酸220混合反应时，crRNA213识别免疫复合物中的核酸探针160并与其结合形成双链，双链的形成引起CRSIPR/Cas系统蛋白210的构象变化从而激活其非特异剪切的特性，并进而对报告核酸220进行剪切，使得荧光基团221和淬灭基团222相互分离，从而发出荧光信号。在其中一些优选的方式中，CRSIPR/Cas系统蛋白210为Cas13a蛋白。Cas13a具有特异性很强的RNA识别剪切能力，因而在选择RNA分子作为核酸探针时，选用Cas13a蛋白可以将反应体系的检测灵敏度降低至飞摩尔(fM)水平。

参考图3，示出了本申请的一个实施例中封装以及检测过程中所使用的微流控芯片的结构示意图。该微流控芯片具有流道层，在其中一些具体实施方式中，流道层包括液滴生成区310、混合反应区320和检测区330。液滴生成区310设有第一进液口311和第二进液口312，第一进液口311和第二进液口312分别通过相连的流道在A处交汇并与混合反应区320相连通。其中，第一进液口311用于向液滴生成区310内通入免疫复合物的水溶液，而第二进液口312用于向液滴生成区310内通入油相。混合反应区320内设有反应流道321形成的反应室，在液滴生成区310内生成的液滴进入反应流道321内，其中的反应原料相互发生反应。反应结束后，液滴以及包裹在液滴内的免疫复合物被送入检测区330的检测室331中分散并进行检测。在其中一些具体的实施方式中，还包括第三进液口313，第三进液口313与第一进液口311相靠近，用于向液滴生成区310内通入其它参与反应的原料，如CRSIPR/Cas系统蛋白210以及报告核酸220等。在其中一些实施方式中，第三进液口313与第一进液口311在A处前已完成汇合，形成水相的混合液参与液滴的形成。检测结束后，废弃物由与检测室331相连接的废液口332向外排出，其中的磁珠可以经外界磁场进行分离、清洗从而完成回收。

参考图4，示出了本申请的图3中A位置的局部的放大图。结合图3，与第二进液口312相连通的流道在此处形成第一油相入口410和第二油相入口420，而与第一进液口311相连通的连通在此处形成水相入口430，第一油相入口410和第二油相入口420相对设置并与水相入口430相互连通形成交汇区域并形成出口440，从第二进液口312送入的油相由第一油相入口410和第二油相入口420注入到交汇区域，而免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白210以及报告核酸220等由水相入口430注入，在交汇区域内，油相在压力和剪切力的作用下将流动的免疫复合物的混合溶液截断，并包裹这些截断的混合溶液部分而形成油包水的液滴450，随后在压力作用下由出口440送入反应室320内。

在其中一些具体实施方式中，液滴的体积被控制在(1～100)×10^-15L。免疫复合物在被限制到飞升左右大小的液滴内后，报告核酸的信号浓缩为可以直接进行检测的信号，能够进一步降低其检测限，提高检测的灵敏度和准确性。在微流控芯片中，控制液滴大小的方式可以是调节各个入口的液体的流速和水相和油相中组分以及配比的不同，或者也可以通过调节出口的尺寸来调节生成的液滴的大小，其它也可以采用改性方式调节流道内壁的亲疏水性等方法。参考图5，从a～c分别是油相和水相在不同流速下产生液滴大小的示意图，其中，a～c中水相流速均为0.05mL/h，不同在于，a中油相流速0.5mL/h，b中油相流速0.3mL/h，c中油相流速0.2mL/h。从图中可以看出，通过调节液相和油相的流速可以调节产生的液滴的大小。

参考图6，示出了本申请实施例中微流控芯片检测的原理图。其中，a表示移入到检测室中均匀排列的液滴，由于液滴的体积较小，单一液滴中仅能包裹一个磁珠。另外，这些液滴可以分为包含免疫复合物的液滴和不包含免疫复合物的磁珠液滴。在包含免疫复合物的液滴中(图中带有点状标记的圆圈)，包含免疫复合物以及CRISPR/Cas系统蛋白以及报告核酸。而其它液滴中则不包括免疫复合物。b表示a中液滴的显色结果图。包含免疫复合物的液滴中CRISPR/Cas系统蛋白非特异性剪切报告核酸使其发出荧光；相比而言，其它液滴中没有免疫复合物，也就没有核酸探针，即便存在CRISPR/Cas系统蛋白也无法发出荧光。c表示对b中对应的结果的定量计数。由于液滴体积较小，一个液滴中仅包裹有一个磁珠，这样可以直接对检测室中发光的液滴进行统计计数，将发光的液滴记为1，可以进一步与液滴的总数进行比较，从而得到样本中待测核酸片段的含量。

在其中一些具体实施方式中，采用连续流的设计方式，将液滴的生成、混合与反应和液滴成像通过微流道连接起来，发挥微流控芯片试剂消耗小、检测效率高的优点，极大降低分析检测成本和人为干扰。在液滴的混合反应区，通过在流道中设计多个混合单元并搭配螺旋状的流道从而对生成的液滴进行充分混合，最终在检测区内对液滴进行成像。

本实施例提供一种免疫检测方法，该免疫检测方法包括以下步骤：提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，捕获抗体偶联于固态基质，检测抗体标记有核酸探针；将待测样本、捕获抗体、检测抗体混合反应，使待检目标同时结合捕获抗体和检测抗体形成免疫复合物；将免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切免疫复合物的核酸探针，并诱导产生对报告核酸的非特异性剪切，根据报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。该免疫检测方法将CRISPR技术、免疫分析技术以及液滴微流控技术三者相结合，利用捕获抗体捕获待测样本中的待检目标，再与标记核酸探针的检测抗体通过抗原抗体特异性结合形成免疫复合物，并作为单个的反应体系分散到液滴中去，以单独的液滴作为CRSIPR/Cas系统剪切反应的反应器，各个反应器相互隔离，以便后续对反应结果进行检测。通过这种方式，本申请实施例所提供的免疫检测方法可以达到更显著的级联放大效果，降低了待检目标的检出限，提高了检测灵敏度，有利于在临床中的应用。

在其中一些具体实施方式中，液滴的体积为(1～100)×10^-15L。通过将CRSIPR/Cas系统蛋白的剪切反应体系限制在飞升左右大小的液滴内，从而将检测标记的信号或检测标记经反应产生的信号进一步浓缩为可直接检测的信号，以进一步降低其检测限，极大地提高了反应的灵敏度。

在其中一些具体实施方式中，检测抗体偶联于微球，微球上标记有多个核酸探针。通过多个核酸探针的标记，达到级联放大的效果，进一步降低了待检目标的检出限。同时，将核酸探针标记到微球上以避免位阻效应而影响后续的检测。

在其中一些具体实施方式中，液滴的封装方法包括以下步骤：提供油相、免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白及报告核酸的混合液；以油相为流动相，以混合液为分散相，在压力和/或剪切力的作用下封装形成油包水的液滴。其中，油相可以是液态的烃、酯等，具体如氟油、硅油、矿物油、植物油、石油醚等。在其中一些优选的实施方式中，油相还包括表面活性剂，表面活性剂的非限制性实例可以是司盘、曲拉通、EM 90、氟碳表面活性剂等。通过在油相中加入表面活性剂使得形成的液滴更加稳定，从而在后续的反应过程中液滴不会发生融合和物质交换，始终保持完整独立的液滴形态。因此，在检测时，无需设计对应液滴大小的微孔结构并通过磁力等方式将液滴沉入其中，而是可以直接进行检测。同时，由于无需微孔结构进行分割隔离，检测区的液滴的尺寸可以更加均匀且具有更大的密度，能够方便检测并提供更高的通量。

在其中一些具体实施方式中，检测中使用的磁珠的直径为1μm以下，液滴的直径为1～50μm。使用直径在1μm以下的磁珠可以有效避免位阻效应的影响。

下面以具体的实施例对本申请进行说明。

实施例1

本实施例提供一种免疫检测试剂盒，该免疫检测试剂盒中的微流控芯片如上文所述。该试剂盒还包括捕获抗体溶液、检测抗体溶液、CRISPR/Cas13a蛋白与报告核酸的混合溶液。其中，捕获抗体溶液为20μL的浓度10mg/mL、粒径为1μm的标记有IL-6捕获抗体的磁珠的悬液。检测抗体溶液为10μL的浓度为1μg/mL的IL-6检测抗体溶液，IL-6检测抗体通过微球标记有多条CRISPR/Cas13a蛋白靶向序列的核酸探针。另外，含有待测核酸片段的待测样本的体积为1mL。

本实施例还提供一种免疫检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)将捕获抗体溶液、检测抗体溶液以及待测样本混合孵育5min，得到免疫复合物的混合液。

(2)将混合液从第一进液口注入微流控芯片，同时将CRISPR/Cas13a蛋白与报告核酸的混合溶液从第三进液口注入微流控芯片，将氟油HFE7500(氟碳表面活性剂FSA，1wt％)从第二进液口注入微流控芯片，第一进液口、第二进液口和第三进液口的流速分别为0.05mL/h、0.2mL/h和0.05mL/h，混合反应，形成液滴。

(3)液滴在开始进入到检测室20分钟后，通过荧光显微镜对检测室进行成像。

在上述检测方法中，控制流速最终形成的液滴的体积为1×10^-14L左右。

在上述检测方法中，使用纯化后的IL-6作为标准品形成标准曲线。IL-6的浓度从50pg/mL开始，按5倍进行梯度稀释。将发光液滴占视场中总液滴数的分数作为计算IL-6浓度的输出信号。根据得到的显微镜图像，绘制该免疫检测法检测IL-6的标准曲线。

结果见图7和图8，其中，图7是实施例1中不同浓度样品的荧光图像，a～e中浓度梯度分别为0.08pg/mL、0.4pg/mL、2pg/mL、10pg/mL、50pg/mL。图8是不同浓度标准品绘制得到的标准曲线。结合图8，检测范围为50pg/mL～0.08pg/mL，线性关系为Y＝0.0048X+0.0752，R²＝0.968。因此，该实施例所提供的检测方法具有超高灵敏度，相较于常规的ELISA方法检测灵敏度高出2-3个数量级。

从上述实施例可以看出，本申请的方案将CRISPR技术与免疫分析相结合，并与液滴数字微流控技术相结合，开发了基于液滴的CRISPR免疫分析技术，通过把常规生化反应压缩在飞升级的微液滴反应器中，对微小的生化信号进行浓缩，使得不易被检测的信号能更容易被检测到。液滴数字微流控分析的灵敏度比传统方法要高几个数量级。同时，CRISPR/Cas13a系统具有很高的RNA识别剪切特异性，具有很高的RNA检测灵敏度，甚至可以进行单分子RNA检测。除此之外，通过增加微球上标记的核酸探针的数量增加了用于CRISPR识别的核酸探针的浓度，进一步提高了灵敏度。将这些与免疫分析结合，极大提高了检测灵敏度，可以实现对人体内丰度很低的生物分子的检测。通过连续流微流控芯片进行液滴产生、液滴混合和液滴成像。与其他方法相比，连续流微流控芯片比传统方法具有更少的操作。同时，优化了芯片的结构和流速，可以在五分钟内生成二十万个液滴，并完全覆盖整个成像区域，在即时医疗应用中具有潜力。同时，微流控芯片法具有检测时间短的优势，整个检测过程可以控制在30分钟以内，便于快速诊断。另外，除了通过对微球进行编码，还可以采用不同的Cas蛋白，实现对多个待检目标的同时检测。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供待测样本、捕获抗体和检测抗体，所述捕获抗体偶联于固态基质，所述检测抗体标记有核酸探针；

将所述待测样本、所述捕获抗体、所述检测抗体混合反应，使所述待测样本中的待检目标同时结合所述捕获抗体和所述检测抗体形成免疫复合物；

将所述免疫复合物与CRSIPR/Cas系统蛋白、报告核酸混合，封装形成液滴，所述CRSIPR/Cas系统蛋白识别剪切所述核酸探针，并诱导产生对所述报告核酸的非特异性剪切，根据所述报告核酸的非特异性剪切结果进行检测。

2.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述液滴的体积为(1～100)×10^-15L。

3.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述检测抗体偶联于微球，所述微球上标记有多个所述核酸探针。

4.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述固态基质为磁性粒子。

5.根据权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述CRSIPR/Cas系统蛋白为Cas13a蛋白。

6.根据权利要求1至5任一项所述的免疫检测方法，其特征在于，所述液滴的封装方法包括以下步骤：

提供油相、所述免疫复合物与所述CRSIPR/Cas系统蛋白及所述报告核酸的混合液；

以所述油相为流动相，以所述混合液为分散相，在压力和/或剪切力的作用下封装形成油包水的所述液滴。

7.根据权利要求6所述的免疫检测方法，其特征在于，所述油相还包括表面活性剂。

8.免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：

捕获抗体，所述捕获抗体偶联于固态基质，所述捕获抗体用于特异性结合待检目标；

检测抗体，所述检测抗体标记有核酸探针，所述检测抗体用于特异性结合所述待检目标，且所述捕获抗体与所述检测抗体针对所述待检目标的不同表位；

报告核酸；

CRSIPR/Cas系统蛋白，所述CRSIPR/Cas系统蛋白用于特异性识别切割所述核酸探针，并产生非特异性剪切特性切割所述报告核酸。

9.根据权利要求8所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括微流控芯片。

10.根据权利要求9所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片包括液滴形成区，所述液滴形成区用于形成(1～100)×10^-15L体积的液滴。