CN111108220A - 用于病毒检测的基于crispr效应系统的诊断 - Google Patents

用于病毒检测的基于crispr效应系统的诊断 Download PDF

Info

Publication number
CN111108220A
CN111108220A CN201880032672.7A CN201880032672A CN111108220A CN 111108220 A CN111108220 A CN 111108220A CN 201880032672 A CN201880032672 A CN 201880032672A CN 111108220 A CN111108220 A CN 111108220A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
virus
sample
target
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880032672.7A
Other languages
English (en)
Inventor
O·阿布达耶
J·戈滕贝格
E·S·兰德
P·萨贝蒂
C·A·弗雷杰
C·梅尔沃德
J·J·柯林斯
F·张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Original Assignee
Harvard College
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College, Massachusetts Institute of Technology, Broad Institute Inc filed Critical Harvard College
Publication of CN111108220A publication Critical patent/CN111108220A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本文提供了一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括：CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA；基于RNA的掩蔽构建体；以及任选地，用以扩增样品中的靶RNA分子的核酸扩增试剂。在另一个方面，实施方案提供了一种多肽检测系统，所述多肽检测系统包括：CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合触发RNA的向导RNA；基于RNA的掩蔽构建体；以及一种或多种检测适体，所述一种或多种检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点。在一些实施方案中，所述系统可以用于检测样品中的病毒。

Description

用于病毒检测的基于CRISPR效应系统的诊断
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月15日提交的美国临时申请号62/471,931、2017年4月12日提交的美国临时申请62/484,857、2017年7月7日提交的美国临时申请62/530,086、2017年10月5日提交的美国临时申请62/568,315、2017年11月17日提交的美国临时申请U.S.62/588,138和2017年12月8日提交的美国临时申请62/596,735的优先权。以上确认的申请的全部内容特此以引用的方式完全并入本文中。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在政府支持下根据国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号MH100706、MH110049、AI110818和国防威胁降低局(Defense ThreatReduction Agency)授予的授权号HDTRA1-14-1-0006进行。政府对本发明具有某些权利。
技术领域
本文所公开的主题大体上关于与CRISPR效应系统的使用相关的快速诊断。
背景技术
核酸是生物信息的通用标识。在便携平台上以高灵敏度和单碱基特异性快速检测核酸的能力具有以下潜力：为许多疾病的诊断和监测带来革新，提供有价值的流行病学信息，并且用作可泛化的科学工具。尽管已经开发许多方法用于检测核酸(Du等,2017；Green等,2014；Kumar等,2014；Pardee等,2014；Pardee等,2016；Urdea等,2006)，但其不可避免地在灵敏度、特异性、简易性和速度当中有所权衡。举例来说，qPCR方法是灵敏但昂贵的并且依赖复杂的仪器，这限制了在实验室设置中训练有素的操作者的可用性。其它方法，例如组合等温核酸扩增与便携平台的新方法(Du等,2017；Pardee等,2016)，在定点护理(POC)设置中提供高检测特异性，但归因于低灵敏度而具有稍受限制的应用。因为核酸诊断对于多种保健应用变得日益相关，所以在低成本下提供高特异性和灵敏度的检测技术将在临床与基础研究设置中具有很大效用。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括：CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA；基于RNA的掩蔽构建体；以及任选地，用以扩增样品中的靶RNA分子的核酸扩增试剂。在另一个方面，实施方案提供了一种多肽检测系统，所述多肽检测系统包括：CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合触发RNA的向导RNA；基于RNA的掩蔽构建体；以及一种或多种检测适体，所述一种或多种检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点。
在其它实施方案中，系统还可以包含核酸扩增试剂。核酸扩增试剂可以包括包含RNA聚合酶启动子的引物。在某些实施方案中，扩增样品核酸以获得包含RNA聚合酶启动子的DNA模板，借此通过转录可以产生靶RNA分子。核酸可以是DNA并且通过本文所描述的任何方法扩增。核酸可以是RNA并且通过如本文所描述的逆转录方法扩增。在引物结合位点的去掩蔽之后可以扩增适体序列，借此从扩增的DNA产物转录触发RNA。靶分子可以是靶DNA，并且系统还可以包含结合靶DNA并且包含RNA聚合酶启动子的引物。
在一个示例性实施方案中，CRISPR系统效应蛋白是RNA靶向效应蛋白。示例性RNA靶向效应蛋白包括C2c2(现称为Cas13a)、Cas13b和Cas13a。将了解，术语“C2c2”在本文中与“Cas13a”可互换使用。在另一个示例性实施方案中，RNA靶向效应蛋白是C2c2。在其它实施方案中，C2c2效应蛋白来自选自由以下组成的组的属类的生物体：纤毛菌属(Leptotrichia)、李斯特菌属(Listeria)、棒杆菌属(Corynebacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、军团菌属(Legionella)、密螺旋体属(Treponema)、产线菌属(Filifactor)、真杆菌属(Eubacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、支原体属(Mycoplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、弗维菌属(Flaviivola)、黄杆菌属(Flavobacterium)、单丝壳属(Sphaerochaeta)、固氮螺菌属(Azospirillum)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Roseburia)、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、硝酸盐裂解菌属(Nitratifractor)、支原体属、弯曲杆菌属(Campylobacter)和毛螺菌属(Lachnospira)，或C2c2效应蛋白是选自由以下组成的组的生物体：沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)、韦德纤毛菌(Leptotrichiawadei)、斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、嗜氨基梭菌(Clostridium aminophilum)、鸡肉杆菌(Carnobacterium gallinarum)、普根沼杆菌(Paludibacter propionicigenes)、维森李斯特菌(Listeria weihenstephanensis)，或C2c2效应蛋白是韦德纤毛菌(L.wadei)F0279或韦德纤毛菌F0279(Lw2)C2C2效应蛋白。在另一个实施方案中，一种或多种向导RNA被设计成检测单核苷酸多态性、转录物的剪接变体或者靶RNA或DNA中的框移突变。
在其它实施方案中，一种或多种向导RNA被设计成结合至一种或多种作为疾病病况的诊断的靶分子。在其它实施方案中，疾病病况是感染、器官疾病、血液疾病、免疫系统疾病、癌症、脑和神经系统疾病、内分泌疾病、妊娠或分娩相关疾病、遗传性疾病或环境获得性疾病。在其它实施方案中，疾病病况是癌症或自身免疫疾病或感染。
在其它实施方案中，一种或多种向导RNA被设计成结合至一种或多种包含癌症特异性体细胞突变的靶分子。癌症特异性突变可以赋予抗药性。抗药性突变可以由依鲁替尼(ibrutinib)、埃罗替尼(erlotinib)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、克唑替尼(crizotinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、威罗菲尼(vemurafenib)、RAF/MEK、检查点阻断疗法或抗雌激素疗法的治疗来诱导。癌症特异性突变可以存在于一种或多种编码选自由以下组成的组的蛋白质的基因中：程序性死亡配体1(PD-L1)、雄激素受体(AR)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton's Tyrosine Kinase)(BTK)、表皮生长因子受体(EGFR)、BCR-Abl、c-kit、PIK3CA、HER2、EML4-ALK、KRAS、ALK、ROS1、AKT1、BRAF、MEK1、MEK2、NRAS、RAC1和ESR1。癌症特异性突变可以是选自由以下组成的组的基因中的突变：CASP8、B2M、PIK3CA、SMC1A、ARID5B、TET2、ALPK2、COL5A1、TP53、DNER、NCOR1、MORC4、CIC、IRF6、MYOCD、ANKLE1、CNKSR1、NF1、SOS1、ARID2、CUL4B、DDX3X、FUBP1、TCP11L2、HLA-A、B或C、CSNK2A1、MET、ASXL1、PD-L1、PD-L2、IDO1、IDO2、ALOX12B和ALOX15B，或拷贝数增加，不包括影响以下染色体带中的任一个的全染色体事件：6q16.1-q21、6q22.31-q24.1、6q25.1-q26、7p11.2-q11.1、8p23.1、8p11.23-p11.21(含有IDO1、IDO2)、9p24.2-p23(含有PDL1、PDL2)、10p15.3、10p15.1-p13、11p14.1、12p13.32-p13.2、17p13.1(含有ALOX12B、ALOX15B)和22q11.1-q11.21。
在其它实施方案中，一种或多种向导RNA可以被设计成结合至一种或多种包含杂合性丢失(LOH)标志的靶分子。
在其它实施方案中，一种或多种向导RNA可以被设计成结合至一种或多种包含单核苷酸多态性(SNP)的靶分子。疾病可以是心脏病并且靶分子可以是VKORC1、CYP2C9和CYP2C19。
在其它实施方案中，疾病病况可以是妊娠或分娩相关疾病或遗传性疾病。样品可以是血液样品或粘液样品。疾病可以选自由以下组成的组：三体型13、三体型16、三体型18、克氏综合征(Klinefeltersyndrome)(47，XXY)、(47，XYY)和(47，XXX)、特纳综合征(Turnersyndrome)、唐氏综合征(Down syndrome)(三体型21)、囊性纤维化、亨廷顿氏病(Huntington's Disease)、β型地中海贫血、肌强直性营养不良、镰状细胞性贫血、卟啉症、脆性X综合征、罗伯逊易位(Robertsonian translocation)、安格尔曼综合征(Angelmansyndrome)、迪乔治综合征(DiGeorge syndrome)和沃尔夫-赫斯霍恩综合征(Wolf-Hirschhorn Syndrome)。
在其它实施方案中，感染由病毒、细菌或真菌引起，或感染是病毒感染。在特定实施方案中，病毒感染由双链RNA病毒、正义RNA病毒、反义RNA病毒、逆转录病毒或其组合引起，或病毒感染由以下引起：冠状病毒科(Coronaviridae)病毒、小RNA病毒科(Picornaviridae)病毒、杯状病毒科(Caliciviridae)病毒、黄病毒科(Flaviviridae)病毒、披膜病毒科(Togaviridae)病毒、玻那病毒科(Bornaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺泡病毒科(Pneumoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)或丁型病毒(Deltavirus)，或病毒感染由以下引起：冠状病毒、SARS、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、甲型肝炎、诺瓦克病毒(Norwalk virus)、黄热病病毒、西尼罗河病毒(West Nile virus)、丙型肝炎病毒、登革热病毒(Dengue fever virus)、寨卡病毒(Zika virus)、风疹病毒、罗斯河病毒(Ross River virus)、辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、博尔纳病病毒(Borna disease virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendra virus)、新城疫病毒、人呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、拉沙病毒(Lassa virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、流感或丁型肝炎病毒。
在本发明的其它实施方案中，基于RNA的掩蔽构建体抑制可检测的阳性信号的产生，或基于RNA的掩蔽构建体通过掩蔽可检测的阳性信号或替代地产生可检测的阴性信号来抑制可检测的阳性信号的产生，或基于RNA的掩蔽构建体包含抑制由报告构建体编码的基因产物的产生的沉默RNA，其中所述基因产物当表达时产生可检测的阳性信号。
在其它实施方案中，基于RNA的掩蔽构建体是产生阴性可检测信号的核糖酶，并且其中当使核糖酶失活时产生阳性可检测信号，或核糖酶使底物转变成第一种颜色并且其中当使核糖酶失活时底物转变成第二种颜色。
在其它实施方案中，基于RNA的掩蔽剂是RNA适体，或适体螯合酶，其中所述酶在从适体释放后通过作用于底物而产生可检测信号，或适体螯合一对剂，所述剂当从适体释放时组合产生可检测信号。
在另一个实施方案中，基于RNA的掩蔽构建体包含可检测配体和掩蔽组分所附接的RNA寡核苷酸。在另一个实施方案中，可检测配体是荧光团并且掩蔽组分是淬灭剂分子，或用以扩增靶RNA分子的试剂，例如(但不限于)NASBA或RPA试剂。
在另一个方面，本发明提供了一种包括一个或多个个别离散容积的诊断装置，每个个别离散容积包含CRISPR效应蛋白、一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA、基于RNA的掩蔽构建体，并且任选地还包含核酸扩增试剂。
在另一个方面，本发明提供了一种包括一个或多个个别离散容积的诊断装置，每个个别离散容积包含CRISPR效应蛋白、一种或多种被设计成结合至触发RNA的向导RNA、一种或多种包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点的检测适体，并且任选地还包含核酸扩增试剂。
在一些实施方案中，个别离散容积是微滴，或个别离散容积界定于固体衬底上，或个别离散容积是微孔，或个别离散容积是界定于例如纸衬底的衬底上的斑点。
在某些其它示例性实施方案中，核酸检测系统被设计成检测一种或多种病毒标靶并且与抗病毒治疗剂联合使用。在某些示例性实施方案中，抗病毒治疗剂是2类、VI型基于CRISPR的抗病毒系统。举例来说，对于感染特定患者或在给定的爆发中流行的病毒株的抗药性或易感性，核酸检测系统可以与抗病毒系统一起使用以选择适当治疗剂。这包括诊断系统，其可以检测在疗法过程中产生的新颖突变以及已知所产生的导致抵抗治疗的突变。本文所公开的此类诊断系统实施方案可以用作抗病毒治疗剂的伴随诊断以选择适当初始抗病毒疗法，并且还对可能出现的抗性突变体作出反应来修改抗病毒疗法。在抗病毒剂是2类、VI型基于CRISPR的抗病毒治疗剂的示例性实施方案中，本文所公开的诊断系统实施方案可以用于选择和/或修改由2类、VI型基于CRISPR的抗病毒治疗剂使用的向导序列以引导效应蛋白针对靶病毒剂核酸序列。
在一个实施方案中，RNA靶向效应蛋白是CRISPR VI型RNA靶向效应蛋白，例如C2c2、Cas13b或Cas13c。在某些示例性实施方案中，C2c2效应蛋白来自选自由以下组成的组的生物体：纤毛菌属、李斯特菌属、棒杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、弗维菌属、黄杆菌属、单丝壳属、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、硝酸盐裂解菌属、支原体属和弯曲杆菌属，或C2c2效应蛋白选自由以下组成的组：沙氏纤毛菌、韦德纤毛菌、斯氏李斯特菌、毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)、嗜氨基梭菌、鸡肉杆菌、普根沼杆菌、维森李斯特菌、李斯特菌科细菌(Listeriaceae bacterium)和荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)，C2c2效应蛋白是韦德纤毛菌F0279或韦德纤毛菌F0279(Lw2)C2c2效应蛋白。在另一个实施方案中，一种或多种向导RNA被设计成结合至一种或多种作为疾病病况的诊断的靶RNA序列。
在某些示例性实施方案中，基于RNA的掩蔽构建体抑制可检测的阳性信号的产生，或基于RNA的掩蔽构建体通过掩蔽可检测的阳性信号或替代地产生可检测的阴性信号来抑制可检测的阳性信号的产生，或基于RNA的掩蔽构建体包含抑制由报告构建体编码的基因产物的产生的沉默RNA，其中所述基因产物当表达时产生可检测的阳性信号。
在另一个示例性实施方案中，基于RNA的掩蔽构建体是产生阴性可检测信号的核糖酶，并且其中当使核糖酶失活时产生阳性可检测信号。在一个示例性实施方案中，核糖酶使底物转变成第一种颜色并且其中当使核糖酶失活时底物转变成第二种颜色。在另一个示例性实施方案中，基于RNA的掩蔽剂是螯合酶的适体，其中所述酶在从适体释放后通过作用于底物而产生可检测信号，或适体螯合一对剂，所述剂当从适体释放时组合产生可检测信号。
在另一个示例性实施方案中，基于RNA的掩蔽构建体包含可检测配体寡核苷酸和掩蔽组分所附接的RNA寡核苷酸。在某些示例性实施方案中，可检测配体是荧光团并且掩蔽组分是淬灭剂分子。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中的靶RNA的方法，所述方法包括：将样品或样品组分配至一个或多个个别离散容积中，所述个别离散容积包括包含效应蛋白、一种或多种向导RNA的CRISPR系统、基于RNA的掩蔽构建体；在足以允许一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子的条件下孵育样品或样品组；经由一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子来活化CRISPR效应蛋白，其中活化CRISPR效应蛋白得以修饰基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及检测可检测的阳性信号，其中检测到可检测的阳性信号指示样品中一种或多种靶分子的存在。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中的肽的方法，所述方法包括：将样品或样品组分配至一组个别离散容积中，所述个别离散容积包含肽检测适体、包含效应蛋白、一种或多种向导RNA的CRISPR系统、基于RNA的掩蔽构建体，其中所述肽检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶位点并且被构造成结合一种或多种靶分子；在足以允许肽检测适体结合至一种或多种靶分子的条件下孵育样品或样品组，其中适体结合至相应靶分子暴露RNA聚合酶结合位点，促成触发RNA的RNA合成；经由一种或多种向导RNA结合至触发RNA来活化CRISPR效应蛋白，其中活化CRISPR效应蛋白得以修饰基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及检测可检测的阳性信号，其中检测到可检测的阳性信号指示样品中一种或多种靶分子的存在。
在某些示例性实施方案中，此类方法还包括扩增样品RNA或触发RNA。在其它实施方案中，扩增RNA包括通过NASBA或RPA扩增。
在某些示例性实施方案中，CRISPR效应蛋白是CRISPR VI型RNA靶向效应蛋白，例如C2c2或Cas13b。在其它示例性实施方案中，C2c2效应蛋白来自选自由以下组成的组的生物体：纤毛菌属、李斯特菌属、棒杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、弗维菌属、黄杆菌属、单丝壳属、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、硝酸盐裂解菌属、支原体属和弯曲杆菌属，或C2c2效应蛋白选自由以下组成的组：沙氏纤毛菌、韦德纤毛菌、斯氏李斯特菌、毛螺菌科细菌、嗜氨基梭菌、鸡肉杆菌、普根沼杆菌、维森李斯特菌、李斯特菌科细菌和荚膜红细菌，在特定实施方案中，C2c2效应蛋白是韦德纤毛菌F0279或韦德纤毛菌F0279(Lw2)C2C2效应蛋白。
在某些示例性实施方案中，一种或多种向导RNA被设计成结合至一种或多种作为疾病病况的诊断的靶分子。在某些其它示例性实施方案中，疾病病况是感染、器官疾病、血液疾病、免疫系统疾病、癌症、脑和神经系统疾病、内分泌疾病、妊娠或分娩相关疾病、遗传性疾病或环境获得性疾病、癌症，或真菌感染、细菌感染、寄生虫感染或病毒感染。
在某些示例性实施方案中，基于RNA的掩蔽构建体抑制可检测的阳性信号的产生，或基于RNA的掩蔽构建体通过掩蔽可检测的阳性信号或替代地产生可检测的阴性信号来抑制可检测的阳性信号的产生，或基于RNA的掩蔽构建体包含抑制由报告构建体编码的基因产物的产生的沉默RNA，其中所述基因产物当表达时产生可检测的阳性信号，或基于RNA的掩蔽构建体是产生阴性可检测信号的核糖酶，并且其中当使核糖酶灭活时产生阳性可检测信号。在其它示例性实施方案中，核糖酶使底物转变至第一种状态并且其中当使核糖酶灭活时底物转变至第二种状态，或基于RNA的掩蔽剂是适体，或适体螯合酶，其中所述酶在从适体释放后通过作用于底物而产生可检测信号，或适体螯合一对剂，所述剂当从适体释放时组合产生可检测信号。在其它实施方案中，基于RNA的掩蔽构建体包含在RNA寡核苷酸的第一端上具有可检测配体并且在RNA寡核苷酸的第二端上具有掩蔽组分的RNA寡核苷酸，或可检测配体是荧光团并且掩蔽组分是淬灭剂分子。
在某些示例性实施方案中，本文所公开的方法、系统和装置可以用于检测与胎儿脑过小相关联的SNP。可以使用本文所公开的实施方案检测的示例性胎儿脑过小突变在Yuan等Science10.1126/science.aam7120(2017)中公开。
示例性实施方案的这些和其它方面、目标、特征和优点在考虑所说明的示例性实施方案的以下详细描述后对于本领域普通技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1-是示例性基于C2c2的CRISPR效应系统的示意图。
图2-提供了(A)来自韦德纤毛菌的CRISPR/C2c2基因座的示意图。示出了来自LwC2c2和LshC2c2系统的代表性crRNA结构。(SEQ.I.D.No.142和143)(B)C2c2活性的体内细菌测定的示意图。在氨苄西林(ampicillin)抗性质粒中的β-内酰胺酶基因上游克隆原间隔区，并且使这种构建体转化至表达与靶向或非靶向间隔区联合的C2c2的大肠杆菌(E.coli)中。对成功的转化体进行计数以定量活性。(C)LwC2c2和LshC2c2体内活性的定量。(n＝2个生物性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(D)LwC2c2的最终尺寸排阻凝胶过滤。(E)LwC2c2逐步纯化的考马斯蓝(Coomassie blue)染色的丙烯酰胺凝胶。(F)针对不同PFS标靶的LwC2c2的活性。LwC2c2靶向具有侧接间隔区的可变3'PFS的荧光RNA，并且反应产物在变性凝胶上显现。LwC2c2显示略微偏向于G PFS。
图3-6-示出了在不同稀释度下使用1μg、100ng、10ng和1ng标靶以4种不同量的蛋白质/crRNA(1:4、1:16、1:32、1:64)用2个crRNA库、无crRNA条件对示例性掩蔽构建体的检测，技术性重复，在(96+48)*2＝288个反应中，经过3小时以5分钟时间间隔测量。
图7-提供了根据某些示例性实施方案，使用掩蔽构建体和CRISPR效应蛋白的示例性检测方案的示意图。
图8-提供了示出当使用向导RNA的不同库检测标靶时荧光随时间的变化的一组图。
图9-提供了示出在不同浓度的CRISPR效应蛋白下跨越不同稀释度的靶RNA检测的标准化荧光的图。
图10-是示出NASBA扩增反应的一般步骤的示意图。
图11-提供了示出通过NASBA用三种不同引物组扩增并且然后经受使用淬灭的荧光探针的C2c2附带检测的核酸靶ssRNA 1的检测的图。(n＝2个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)
图12-提供了示出附带效应可以用于检测慢病毒靶RNA的存在的图。
图13-提供了展示附带效应和NASBA可以检测aM浓度下的物质的图。
图14-提供了展示附带效应和NASBA快速辨别低浓度样品的图。
图15-示出了在特定时间点的标准化荧光预测样品输入浓度。在无扩增的情况下来自Cas13a检测的荧光测量值与输入RNA浓度相关。(n＝2个生物性重复；条形表示平均值±s.e.m.)
图16-提供了RPA反应的示意图，其示出参与反应的组分。
图17-SHERLOCK的示意图；提供了示出经由相应地并入RPA或RT-RPA步骤对DNA或RNA标靶的检测的示意图。在靶RNA识别后，附带效应促使C2c2切割裂解报告子，产生荧光。可以经由重组酶聚合酶扩增(RPA)使单分子量的RNA或DNA扩增成DNA并且转录产生RNA，然后由C2c2检测。
图18-提供了经由C2c2附带检测所检测的ssRNA标靶的示意图(SEQ.I.D.No.144和145)。
图19-提供了展示使用RPA的单分子DNA检测的一组图(即，在C2c2添加的15分钟内)。
图20-提供了展示将T7聚合酶混合至RPA反应中会不利地影响DNA检测的一组图。
图21-提供了展示将聚合酶混合至RPA反应中不会不利地影响DNA检测的一组图。
图22-提供了展示当同时孵育时RPA、T7转录和C2c2检测反应是相容的并且达成单分子检测的图。(n＝2个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)
图23-提供了展示快速RPA-RNA时间孵育的功效的一组图。
图24-提供了展示增加T7聚合酶量增强RPA-RNA的灵敏度的一组图。
图25-提供了示出来自使用1.5x酶的一锅式反应的RPA-DNA检测测定的结果的一组图。单分子(2aM)检测早在30分钟即达成。
图26-提供了展示RPA-DNA一锅式反应证实相对于输入浓度的荧光定量减少的一组图。拟合曲线揭示标靶输入浓度与输出荧光之间的关系。
图27-提供了一组图，其展示(A)在无扩增的情况下RNA的C2c2检测可以检测浓度低至50fM的ssRNA标靶。(n＝2个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)，以及(B)RPA-C2c2反应能够进行单分子DNA检测。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)。
图28-提供了展示根据某些示例性实施方案产生的C2c2信号可以检测纸衬底上的20pM标靶的一组图。
图29-提供了示出特异性RNA酶抑制剂能够去除纸上的背景信号的图。
图30是示出在玻璃纤维衬底上使用根据某些示例性实施方案的系统的检测的一组图。
图31-提供了一组图，其提供(A)根据某些示例性实施方案的Zia RNA检测的示意图。用通过C2c2附带检测靶向的寨卡RNA或同源登革RNA片段包封慢病毒。48小时后收集培养基并且经受热裂解、RT-RPA和C2c2检测。(B)RT-RAP-C2c2检测能够进行寨卡慢病毒颗粒的高度灵敏检测(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验(Student t-test)；*****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)(C)根据某些示例性实施方案，使用纸上冷冻干燥的C2c2的寨卡RNA检测的示意图。(D)基于纸的测定能够进行寨卡慢病毒颗粒的高度灵敏检测(n-4个技术性重复，双尾司徒登t检验；****，p<0.0001；**，p<0.01，条形表示平均值±s.e.m.)
图32-提供了一组图，其展示(A)从人血清分离的寨卡RNA的C2c2检测的示意图。血清中的寨卡RNA经受逆转录、RNA的RNA酶H降解、cDNA的RPA以及C2c2检测。(B)C2c2能够进行人寨卡血清样品的高度灵敏检测。通过qPCR验证所示出的寨卡RNA的浓度。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)
图33-提供了一组图，其展示(A)冷冻干燥的C2c2能够进行低飞摩尔范围内的ssRNA 1的灵敏检测。C2c2能够进行纸上呈液体形式(B)或冷冻干燥(C)的200pM ssRNA 1标靶的快速检测。反应能够进行在溶液中(D)(n＝3)及呈冷冻干燥形式(E)(n＝3)的经过合成的寨卡RNA片段的灵敏检测。(F)示出输入浓度与所检测的荧光之间的显著相关的人寨卡cDNA检测的定量曲线。(G)在不同量的人血清存在下进行的ssRNA 1的C2c2检测。(除非另有注释，否则n＝2个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)。
图34-提供了(A)使用通用V3 RPA引物组对来自细菌基因组的16S rRNA基因的C2c2检测的示意图，以及(B)使用根据某些示例性实施方案进行的测定达成大肠杆菌或绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)gDNA的灵敏和特异性检测的能力。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)。Ec，大肠杆菌(Escherichiacoli)；Kp，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)；Pa，绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)；Mt，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；Sa，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
图35-提供了一组图，其展示(A)来自肺炎克雷伯菌的四种不同临床分离株的两种不同碳青霉烯(carbapenem)抗性基因(KPC和NDM-1)的检测，以及(B)碳青霉烯抗性基因的检测(部分A)标准化为KPC与NDM-1crRNA测定之间的信号比。(n＝2个技术性重复，双尾司徒登t检验；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)
图36-提供了一组图，其展示(A)C2c2对于单错配不灵敏，但可以区分当加载有具有额外错配的crRNA时标靶中的单核苷酸差异。用11个crRNA检测ssRNA标靶1-3，其中10个间隔区含有在crRNA中的各个位置处的合成错配。错配的间隔区并不显示标靶1的降低的裂解，但显示错配标靶2和3的受抑制的裂解(SEQ.I.D.No.146至159)。(B)示出具有合成错配的单碱基特异性间隔区的合理设计的过程的示意图。合成错配接近于所关注的SNP或碱基放置。(SEQ.I.D.No.160至164)(C)株系SNP的高度特异性检测允许使用具有截短(23个核苷酸)crRNA的C2c2检测来区别仅相差一个核苷酸的寨卡非洲对美洲RNA标靶。(n＝2个技术性重复，单尾司徒登t检验；*，p<0.05；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)。
图37-提供了一组图，其展示：(A)用于检测的寨卡株系标靶区和crRNA序列的示意图。(SEQ.I.D.No.165至170)标靶中的SNP用红色或蓝色突出显示并且向导序列中的合成错配涂红色。(B)株系SNP的高度特异性检测允许使用SHERLOCK来区别寨卡非洲对美洲RNA标靶。(n＝2个技术性重复，双尾司徒登t检验；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)(SEQ.I.D.No.171至176)(C)用于检测的登革株系标靶区和crRNA序列的示意图。标靶中的SNP用红色或蓝色突出显示并且向导序列中的合成错配涂红色。(D)株系SNP的高度特异性检测允许使用SHERLOCK来区别登革株系1对株系3RNA标靶。(n＝2个技术性重复，双尾司徒登t检验；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)(图37)
图38-提供了一组图，其示出(A)示出用C2c2检测的人SNP的位置的圆环图。(B)根据某些示例性实施方案进行的测定可以区分人SNP。SHERLOCK可以在人基因组中的四个不同SNP位点处对四个不同个体进行正确基因分型。在每个图的下方标注每个个体的基因型和等位基因传感crRNA的身份。(n＝4个技术性重复；双尾司徒登t检验；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)。(C)根据某些示例性实施方案对cfDNA的检测(例如癌症突变的无细胞DNA检测)的过程的示意图。(D)用于检测EGFRL858R和BRAF V600E的示例性crRNA序列。(SEQ.I.D.No.177至182)。对于无细胞DNA中的癌症突变所测定的两个基因组基因座的序列。示出了具有用蓝色突出显示的SNP的靶基因组序列和具有涂红色的合成错配的突变体/野生型传感crRNA序列。
图39-提供了一组图，其展示C2c2可以检测来自EGFR L858R(C)或BRAF V600E(B)次要等位基因的仿制无细胞DNA样品中的突变体次要等位基因。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；*，p<0.05；**，p<0.01，****，P<0.0001；条形表示±s.e.m.)
图40-提供了一组图，其展示(A)测定可以区分rs5082处的基因型。(n＝4个技术性重复；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)(B)测定可以区分直接来自离心、变性和煮沸的唾液的gDNA中的rs601338处的基因型。(n＝3个技术性重复；*，p<0.05；条形表示平均值±s.e.m.)
图41-提供了(A)在与ssDNA 1仅相差单错配的标靶的背景中对ssDNA 1进行的示例性实施方案的示意图。(B)测定达成在错配的背景(与ssDNA仅相差单错配的标靶)存在下ssDNA 1的单核苷酸特异性检测。各种浓度的靶DNA与背景过量的具有一个错配的DNA组合并且通过测定来检测。
图42是示出具有不同染料Cy5的掩蔽构建体也允许有效检测的图。
图43是基于比色的金纳米颗粒测定的示意图。使用DNA连接子与RNA桥的组合使AuNP聚集。添加RNA酶活性后，ssRNA桥裂解并且释放AuNP，促使特征性颜色朝向红色偏移。
图44是示出检测在520nm下分散的纳米颗粒的红色偏移的能力的图。纳米颗粒是基于图43中所示的示例性实施方案并且使用不同浓度的RNA酶A的添加而分散。
图45是示出RNA酶比色测试是定量的图。
图46是示出分散的纳米颗粒的颜色偏移在视觉上可检测的微孔板的照片。
图47是展示比色偏移在纸衬底上可见的照片。测试在37℃下在玻璃纤维934-AH上进行10分钟。
图48是用于蛋白质或小分子检测的根据某些示例性实施方案的构象转换适体的示意图。接合产物(B)用作RNA靶向效应物的完整标靶，所述效应物无法检测未接合的输入产物。(SEQ.ID.No.202和424)。
图49是示出基于适体的接合可以建立RPA可检测底物的凝胶的图像。将适体与各种水平的凝血酶一起孵育，然后与探针接合。接合的构建体用作3分钟RPA反应的模板。500nM凝血酶具有比背景显著更高水平的扩增标靶。
图50示出了所选C2c2直系同源物的HEPN结构域的氨基酸序列。(SEQ.ID.No.204-233)
图51使用RPA扩增(SHERLOCK)对RNA的Cas13a检测可以检测浓度降至约2aM的ssRNA标靶，比单独的Cas13a更灵敏。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)
图52-Cas13a检测可以用于传感病毒和细菌病原体。(A)从人临床样品分离的ZIKVRNA的SHERLOCK检测的示意图。(B)SHERLOCK能够进行人ZIKV阳性血清(S)或尿液(U)样品的高度灵敏检测。所示出的ZIKV RNA的近似浓度通过qPCR确定。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.；n.d.，未检出)
图53-通过使用引物组2的NASBA(图11)和SHERLOCK对ssRNA 1的检测的比较。(n＝2个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)
图54使用RPA和单反应SHERLOCK的核酸扩增。(A)用于图1C中所用的稀释液的ssRNA 1的数字微滴PCR定量。基于ddPCR结果的稀释液的调整浓度示于条形图上方。(B)用于图1D中所用的稀释液的ssDNA 1的数字微滴PCR定量。基于ddPCR结果的稀释液的调整浓度示于条形图上方。(C)当同时孵育时RPA、T7转录和Cas13a检测反应是相容的并且达成DNA2的单分子检测。(n＝3个技术性重复，双尾司徒登t检验；n.s.，不显著；**，p<0.01；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.)
图55-SHERLOCK与其它灵敏核酸检测工具的比较。(A)使用数字微滴PCR对ssDNA 1稀释系列的检测分析。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；n.s.，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.0001；红线表示平均值，条形表示平均值±s.e.m。所测量的拷贝/微升低于10-1的样品未示出。)(B)使用定量PCR对ssDNA 1稀释系列的检测分析。(n＝16个技术性重复，双尾司徒登t检验；n.s.，不显著；**，p<0.01；****，p<0.0001；红线表示平均值，条形表示平均值±s.e.m。相对信号低于10-10的样品未示出。)(C)使用具有SYBR Green II的RPA对ssDNA 1稀释系列的检测分析。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；*，p<0.05；**，p<0.01；红线表示平均值，条形表示平均值±s.e.m。相对信号低于100的样品未示出。)(D)使用SHERLOCK对ssDNA 1稀释系列的检测分析。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；**，p<0.01；****，p<0.0001；红线表示平均值，条形表示平均值±s.e.m。相对信号低于100的样品未示出。)(E)一系列ssDNA 1稀释液对于四种类型的检测方法的百分比变异系数。(F)6e2、6e1、6e0和6e-1ssDNA 1稀释液对于四种类型的检测方法的平均百分比变异系数。(条形表示平均值±s.e.m.)图56-临床细菌分离株的碳青霉烯抗性的检测。来自肺炎克雷伯菌的五种临床分离株和大肠杆菌对照的两种不同碳青霉烯抗性基因(KPC和NDM-1)的检测。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；****，p<0.0001；条形表示平均值±s.e.m.；n.d.，未检出)
图57-对靶序列中的截短间隔区和单错配的LwCas13a灵敏度的表征。(A)用于(B)-(G)中的截短间隔区crRNA的序列(SEQ.ID.No.425-436)。还示出了ssRNA 1和2的序列，其具有用红色突出显示的单碱基对差异。含有合成错配的crRNA用涂红色的错配位置来展示。(B)在位置1-7处具有合成错配的28nt间隔区crRNA对ssRNA 1和2的附带裂解活性。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(C)在(B)中测试的crRNA的特异性比率。特异性比率以中靶RNA(ssRNA1)附带裂解与脱靶RNA(ssRNA 2)附带裂解的比率计算。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(D)在位置1-7处具有合成错配的23nt间隔区crRNA对ssRNA 1和2的附带裂解活性。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(E)在(D)中测试的crRNA的特异性比率。特异性比率以中靶RNA(ssRNA 1)附带裂解与脱靶RNA(ssRNA2)附带裂解的比率计算。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(F)在位置1-7处具有合成错配的20nt间隔区crRNA对ssRNA 1和2的附带裂解活性。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(G)在(F)中测试的crRNA的特异性比率。特异性比率以中靶RNA(ssRNA 1)附带裂解与脱靶RNA(ssRNA 2)附带裂解的比率计算。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)
图58.-靶序列中相对于突变的理想合成错配位置的鉴别。(A)用于评估理想合成错配位置以检测ssRNA 1与ssRNA 2之间的突变的序列(SEQ.ID.No.437-462)。在每个标靶上，测试在涂色(红色)位置处具有合成错配的crRNA。设计每一组合成错配crRNA以使得突变位置相对于间隔区的序列发生位置偏移。设计间隔区以使得在间隔区内的位置3、4、5和6处评估突变。(B)在不同位置处具有合成错配的crRNA对ssRNA 1和2的附带裂解活性。存在四组crRNA，其在间隔区:标靶双链体区内的任一位置3、4、5或6处具有突变。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(C)在(B)中测试的crRNA的特异性比率。特异性比率以中靶RNA(ssRNA 1)附带裂解与脱靶RNA(ssRNA 2)附带裂解的比率计算。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)
图59-使用SHERLOCK在额外基因座处的基因分型和从煮沸的唾液的直接基因分型。SHERLOCK可以区分直接来自离心、变性和煮沸的唾液的基因组DNA中的rs601338SNP位点处的基因型。(n＝4个技术性重复，双尾司徒登t检验；**，p<0.01；****，p<0.001；条形表示平均值±s.e.m.)
图60-用以对人SNP进行准确基因分型的合成基因分型标准的开发。(A)与PCR扩增的基因型标准相比，使用SHERLOCK在rs601338SNP位点处对四个个体中的每一个进行的基因分型。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(B)与PCR扩增的基因型标准相比，使用SHERLOCK在rs4363657SNP位点处对四个个体中的每一个进行的基因分型。(n＝4个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)(C)每个个体的SHERLOCK结果与rs601338SNP位点处的合成标准之间的计算p值的热图。示出了等位基因传感crRNA中的每一个的热图。将热图色表加标度以使得非显著性(p>0.05)呈红色并且显著性(p<0.05)呈蓝色。(n＝4个技术性重复，单因素ANOVA)。(D)每个个体的SHERLOCK结果与rs4363657SNP位点处的合成标准之间的计算p值的热图。示出了等位基因传感crRNA中的每一个的热图。将热图色表加标度以使得非显著性(p>0.05)呈红色并且显著性(p<0.05)呈蓝色。(n＝4个技术性重复，单因素ANOVA)(E)用于理解SHERLOCK基因分型的p值热图结果的指南。通过选择对应于在个体与等位基因合成标准之间的p值>0.05的等位基因可以容易地调用基因分型。红色区块对应于合成标准与个体的SHERLOCK结果之间的非显著差异并且因此是基因型阳性结果。蓝色区块对应于合成标准与个体的SHERLOCK结果之间的显著差异并且因此是基因型阴性结果。
图61-作为小部分的错配背景标靶的ssDNA 1的检测。在人基因组DNA的背景下ssDNA 1的稀释系列的SHERLOCK检测。应注意，在所检测的ssDNA 1标靶与背景基因组DNA之间不应存在序列相似性。(n＝2个技术性重复；条形表示平均值±s.e.m.)
图62-来自具有寨卡病毒的患者的尿液(A)或血清(B)样品在95℃(尿液)或65℃(血清)下热灭活5分钟。根据示例性实施方案，1微升灭活的尿液或血清用作2小时RPA反应继之以3小时C2c2/Cas13a检测反应的输入。误差条指示基于检测反应的n＝4个技术性重复的1SD。
图63-来自具有寨卡病毒的患者的尿液样品在95℃下热灭活5分钟。根据示例性实施方案，1微升灭活的尿液用作30分钟RPA反应继之以3小时(A)或1小时(B)C2c2/Cas13检测反应的输入。误差条指示基于检测反应的n＝4个技术性重复的1SD。
图64-来自具有寨卡病毒的患者的尿液样品在95℃下热灭活5分钟。1微升灭活的尿液用作20分钟RPA反应继之以1小时C2c2/Cas13a检测反应的输入。健康人尿液用作阴性对照。误差条指示基于n＝4个技术性重复或检测反应的1SD。
图65-来自具有寨卡病毒的患者的尿液样品在95℃下热灭活5分钟。1微升灭活的尿液用作20分钟RPA反应继之以在存在或不存在向导RNA的情况下1小时C2c2/Cas13a检测反应的输入。通过从含有向导的检测反应中扣除无向导检测反应的平均荧光值而使数据标准化。健康人尿液用作阴性对照。误差条指示基于检测反应的n＝4个技术性重复的1SD。
图66-示出了根据示例性实施方案，使用四种不同向导RNA设计对两种疟疾特异性标靶的检测。(SEQ.ID.No.463-474)。
图67-示出了经过设计的向导RNA沿着分段LCMV基因组的定位。向导RNA S1-S6与MCMV S RNA互补(其中S1和S6分别结合至5'UTR和3'UTR)。向导RNA L1-L6与MCMV L RNA互补(其中L1和L6分别结合至5'UTR和3'UTR)。所有向导RNA都结合至编码链。
图68-Cas13a和LCMV特异性向导RNA表达减少细胞培养中的LCMV复制。A)用表达Cas13a的质粒和靶向LCMV的单向导RNA或非靶向对照转染HEK293FT细胞。转染后24小时，用LCMV以5的MOI感染细胞，且感染后48小时使用培养上清液中的病毒RNA的RT-qPCR测量病毒滴度。B)病毒复制的抑制。空载体、脱靶#1和脱靶#2被视为阴性对照。S1-S5和L1-L6靶向LCMV基因组的各个区。误差条指示基于n＝3-6个生物性重复的1个标准偏差。
图69-病毒复制的抑制。用所指示的C2c2和向导质粒转染LCMV感染的哺乳动物293FT细胞。图表示每微升基因组当量的RT-qPCR值，其中条形代表每个转染的向导质粒。空载体、脱靶#1和脱靶#2被视为阴性对照。S1-S5和L1-L6靶向LCMV基因组的各个区。误差条指示基于n＝6个生物性重复的1个标准偏差。
图70-多种向导的组合增强Cas13a介导的对LCMV复制的抑制。用表达Cas13a的质粒和一种或多种靶向LCMV的向导RNA或非靶向对照转染HEK293FT细胞。转染后24小时以5的MOI进行LCMV感染，且感染后48小时使用培养上清液中的病毒RNA的RT-qPCR测量病毒滴度。空载体、脱靶#1和脱靶#2被视为阴性对照。误差条指示基于n＝6个生物性重复的1个标准偏差。
图71-减少病毒复制的向导的分数。对于所有向导从3个重复计算LCMV感染后48小时的平均GFP荧光。每个LCMV靶向向导的倍数变化以对照向导对比LCMV靶向向导的平均荧光的比率计算。使用双尾、非成对t检验来计算p值。靶向向导被视为p值小于或等于0.05并且倍数变化(FC)大于或等于2的任何向导。饼形图标绘表格中所展示的数据，其中楔形对应于LCMV的4种蛋白质的非编码区和编码区。其余向导是未通过p值和FC临界值的那些LCMV靶向向导。
图72-靶向向导的靶向效率的分布。通过0.05的p值临界值的向导的GFP荧光(对照向导对比LCMV靶向向导)的倍数变化的分布。这个图中未示出，GFP荧光减少大于50倍的8个向导(*8个向导显示减少>50倍)。
图73-图解了与对照(空向导载体)相比靶向L(#104)的编码区的向导的GFP(即，LCMV复制)减少的代表性图像(每个向导有3个重复)。LCMV感染后48小时以4x放大率获取图像。倍数变化2.72，p值0.047。
图74-对于通过0.05的p值临界值和2的倍数变化临界值的所有向导，对照向导对比LCMV靶向向导的感染后48小时的GFP荧光的倍数变化。x轴上的每个位置是在LCMV全基因组筛选中测试的向导。未通过这个临界值的任何向导标绘为1。对于荧光小于背景或处于背景下的任何向导，倍数变化设定为所观测的最大倍数变化。
图75-基于Cas13a的诊断可以灵敏地检测寨卡病毒核酸。将寨卡病毒cDNA在健康人尿液和水中连续稀释，使内源人RNA酶灭活，并且使用SHERLOCK方案来定量病毒cDNA(a)。还从患者尿液或血清测试若干cDNA样品(b)，并且向导RNA的组合用于区分在寨卡病毒爆发期间从不同国家收集的患者样品(c)。误差条指示1个标准偏差。缩写：DOM＝多米尼加共和国，DOMUSA＝多米尼加共和国/美国，HND＝洪都拉斯，USA＝美国。
图76-提供了示出根据某些示例性实施方案的寨卡的单拷贝检测的图。
图77-图解了使用具有寨卡病毒特异性RPA引物和寨卡病毒特异性crRNA的SHERLOCK方法的寨卡cDNA(a)、RNA(b)和病毒颗粒(c)的检测限。误差条表示3个技术性重复的1S.D.。无输入是将不含核酸酶的水添加至水或尿液中。
图78-板块A是检测病毒样品中的单核苷酸变体的示意图。板块B是展示通过SHERLOCK方法测试的3种SNP的基因组位置的示意图。板块C示出了表示在2015年寨卡病毒爆发期间出现的SNP与出现SNP的位置的图。板块D表示在1小时时间点处突变体cRNA对比野生型cRNA之间的荧光比。板块E示出了展示对于针对每个crRNA的每个样品经过log2变换的图78D中所示的荧光比的热图。值大于0指示突变型变体的存在。板块F是示出S139N变体的数据的图。深色阴影的条形表示当S139N靶向crRNA用于检测反应中时测量的荧光，并且较浅色的条形表示当使用N139S靶向crRNA时测量的荧光。误差条表示3个技术性重复的1S.D.。
图79-板块A示出了表示多血清型登革SHERLOCK板块如何工作的示意图。在板块B中，x轴上的每个记号表示用作SHERLOCK反应的输入的gblock模板。每个紫色阴影指定血清型特异性crRNA。误差条表示3个技术性重复的1S.D.。板块C示出了以log10标度的荧光的(b)中的条形图的替代性表示。
图80-表示黄病毒SHERLOCK板块如何工作的示意图在板块A中示出。在板块B中，x轴上的每个记号表示用作SHERLOCK反应的输入的gblock模板。在板块C中，x轴上的每个记号表示用作SHERLOCK反应的输入的两个gblock模板以模拟SHERLOCK检测共感染的能力。在每个交替的白色和灰色区块内，每个条形是由按每个区块中保留的ZIKV crRNA、WNVcrRNA、DENV crRNA和YFV crRNA的次序测试的向导产生的荧光。在板块B和C中，每种颜色指定病毒特异性crRNA。误差条表示3个技术性重复的1S.D.。
图81-板块A和B分别示出了图80B和80C的条形图中表示的所测量荧光的替代性表示。梯度是在3小时处log10标度的荧光。
图82-来自临床样品和蚊库的灵敏ZIKV检测。(A)应用于临床样品的SHERLOCK的示意图。从临床样品中提取核酸并且通过重组酶聚合酶扩增(RPA)来扩增靶分子。在RPA之前对RNA样品进行逆转录(RT)。使用含有T7 RNA聚合酶(用于dsDNA RPA产物的体外转录)的反应检测RPA产物，纯化Cas13a、crRNA以及当裂解时发荧光的RNA报告子。(B)对2016年ZIKV爆发期间收集的40个样品测试SHERLOCK。使用20分钟RPA反应和1小时Cas13a检测对cDNA进行SHERLOCK。蓝色虚线指代ZIKV存在或不存在的临界值(关于细节参见方法)。(C)SHERLOCK荧光与扩增子PCR产量的比较。对(B)中所示的40个ZIKV cDNA样品进行SHERLOCK和扩增子PCR。扩增子PCR产量是使用拼贴ZIKV基因组的引物库的2个独立扩增反应的最小浓度(ng/μL)。虚线指代用于确定ZIKV存在或不存在的临界值：蓝色代表SHERLOCK，红色代表扩增子PCR。维恩图(Venn diagram)示出了通过每种方法的这些临界值的样品数。在一些情况下，数据点几乎重叠，由括号中的数字指示。N.D.：未检出。
图83-来自尿液的ZIKV cDNA、RNA和颗粒的直接检测。(A)使用SHERLOCK对未处理的健康人尿液(红色)中稀释的ZIKV cDNA的检测。(B)使用SHERLOCK对未处理(红色)或处理(蓝色)的健康人尿液中稀释的ZIKV RNA的检测。(C)使用SHERLOCK对PBS(灰色)或未处理的健康人尿液(红色)中稀释的ZIKV颗粒的检测。未稀释的病毒储备液以黑色示出。示出了在3小时处最稀样品和无输入的荧光(插图)。在所有板块中，用TCEP/EDTA处理样品并且在稀释后立即加热以使病毒与RNA酶均灭活。热处理的时长在示意图中指示。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图84-SHERLOCK板块可以区别病毒种类和血清型。(A)使用SHERLOCK对4种相关黄病毒的检测。(B)在条形图与热图中对于针对每种病毒的每种crRNA示出了在3小时处的标靶特异性荧光。(C)当单个样品中存在两种病毒标靶时示出了在3小时处的标靶特异性荧光。(D)使用SHERLOCK对DENV血清型1-4的检测。(E)对于针对DENV血清型中的每一种的血清型特异性crRNA示出了在3小时处的标靶特异性荧光。标靶特异性荧光是针对crRNA的每种标靶的荧光相对于无输入的crRNA的荧光。在所有板块中，误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图85-来自爆发的适应性和功能性ZIKV突变的鉴别。(A)示出如何设计SHERLOCK测定用于SNP鉴别的示意图。使用浅色指代祖先型crRNA并且使用深色指代衍生型crRNA。(B)来自2016年ZIKV爆发的3种SNP的SHERLOCK测定。申请者示出每种SNP的基因组位置和描述其演变关系的简化系统发生树。(C)使用合成标靶测试SNP鉴别。对于3种区域特异性SNP中的每一种示出了衍生型crRNA(深色)和祖先型crRNA(浅色)的荧光值。(D)来自2016年ZIKV爆发的样品中的区域特异性SNP的鉴别。使用三种SNP鉴别测定来评估来自多米尼加共和国(DOM)、美国(USA)和洪都拉斯(HND)的cDNA样品。申请者示出每种SNP和每种样品的荧光比(衍生型crRNA荧光除以祖先型crRNA荧光)。(E)以热图对经过log2变换的来自(D)的数据的显现。(F)与小头畸形相关联的ZIKV SNP的鉴别。如同(C)中一样，深色指代衍生型crRNA并且浅色指代祖先型crRNA。在所有板块中，误差条指示基于3个技术性重复的1 S.D.。
图86-SHERLOCK可以在高灵敏度下检测ZIKV cDNA。申请者示出在对ZIKV cDNA的连续稀释液的20分钟RPA和1小时检测之后的SHERLOCK荧光值。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。在这个实验中，RNA酶Alert v1(IDT)用作RNA报告子。
图87-(A-D)来自2016年ZIKV爆发的40个cDNA样品在1小时处的SHERLOCK荧光数据。样品名称指示来源国、样品收集年份，继之以样品名称和样品类型。样品类型如下指示：PLA：血浆样品，SER：血清样品，URI：尿液样品，MOS：蚊库。来源国使用以下缩写指示：HND：洪都拉斯，DOM：多米尼加共和国，USA：美国。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。每个图中所示的阳性对照(紫色)是培养的病毒种子储备液(PE243)。阴性对照以橙色示出。
图88-扩增子PCR引物库数据和临界值。(A)来自对于每个cDNA样品的2个扩增子PCR引物库中的每一个的ng/μL浓度(由Agilent电泳工作平台(tapestation)测量)的散点图。在一些情况下，数据点几乎重叠，由括号中的数字指示。N.D.：未检出。阳性对照(紫色十字形)是培养的病毒种子储备液(PE243)，并且阴性对照(橙色x)包括1个无输入对照和4个单供体健康尿液样品。(B)来自最新寨卡测序工作(Metsky等2017)的扩增子PCR产量(ng/μl)对基因组覆盖率的散点图。扩增子PCR产量定义为两个扩增子PCR库的最小扩增子DNA浓度(由Agilent电泳工作平台测量)。基因组覆盖率标准化至1。测序文库的技术性重复以独立的圆形示出。(C)申请者示出对于不同扩增子PCR产量临界值的精确率(真阳性除以真阳性和假阳性的和)、召回率(灵敏度)和F0.5统计。选择扩增子PCR产量的临界值以使F0.5统计最大化。
图89-使用热和化学处理的RNA酶灭活。用TCEP和EDTA分别以100mM和1mM的最终浓度处理RNA酶A(1μg/ml)或健康人尿液的连续1:4稀释液。在95℃下孵育样品10分钟，然后将RNA酶Alert v1(IDT)添加至每个样品中，并且监测荧光以确定核酸酶活性。在37℃下孵育后1小时示出荧光值。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图90-(A)尿液的预处理允许使用SHERLOCK的灵敏RNA检测。申请者示出对在水中稀释的RNA(蓝色)和在95℃下用100mM TCEP和1mM EDTA预处理10分钟的尿液中稀释的RNA(浅红色)检测1小时后的荧光数据。(B)载体RNA并不改善SHERLOCK灵敏度。申请者在存在或不存在100ng载体RNA的情况下在部分灭活的健康人尿液中稀释ZIKV RNA(关于细节参见方法章节)。如同(A)中一样，使用1小时检测。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图91-在较低温度下的RNA酶灭活。申请者测试两步热灭活方案，其中将健康人尿液在50℃下孵育20分钟，继而在95℃下孵育5分钟。在50℃步骤之后但在95℃步骤之前在尿液中稀释RNA。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图92-黄病毒板块时程。每个板块示出了经过3小时时程针对每种黄病毒标靶和无输入对照的病毒特异性crRNA的背景校正荧光，每5分钟进行荧光测量。误差条是基于3个技术性重复的1S.D.。
图93-黄病毒板块共感染时程。每个板块示出了经过3小时时程针对具有两种黄病毒标靶的样品的所有crRNA的背景校正荧光，每5分钟进行荧光测量。每个板块还包括对于针对无输入对照的每种crRNA所观测的背景校正荧光。误差条是基于3个技术性重复的1S.D.。
图94-登革板块时程。每个板块示出了经过3小时时程针对所有DENV血清型和无输入对照的DENV血清型特异性crRNA的背景校正荧光，每5分钟进行荧光测量。误差条是基于3个技术性重复的1 S.D.。
图95-SNP设计时间线。申请者示出设计、创建和测试基于SHERLOCK的SNP鉴别测定所需的步骤。总周转时间小于1周。
图96-使用替代性crRNA设计的ZIKV小头畸形相关SNP辨别。SNP在crRNA的第7个位置处，并且不存在引入crRNA中的合成错配。深色指代衍生型crRNA并且浅色指代祖先型crRNA。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图97-可以鉴别HIV逆转录酶中的6种抗药性突变的SHERLOCK测定。申请者示出通过采用衍生型模板的荧光比除以祖先型模板的荧光比而计算的SNP鉴别指数(关于细节参见方法章节)。如果不存在区分祖先型与衍生型等位基因的能力，那么这个指数等于1，并且随着辨别两种等位基因的能力增加而增加。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图98-图解了SHERLOCK可以在高灵敏度下检测ZIKV cDNA。示出了在对ZIKV cDNA的连续稀释液的20分钟RPA和1小时检测之后的SHERLOCK荧光值。0.9aM的灵敏度等效于2aM＝1cp/μl的单拷贝灵敏度，并且2μl样品用作输入。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图99-示出了来自患者样品和临床分离株的ZIKV和DENV检测。(A)SHERLOCK的示意图。从临床样品中提取核酸，并且通过RPA使用RNA或DNA作为输入(分别是RT-RPA或RPA)来扩增标靶。在含有T7 RNA聚合酶、Cas13、标靶特异性crRNA以及当裂解时发荧光的RNA报告子的反应中检测RPA产物。我们对(B)来源于2015-2016年ZIKV流行期间收集的37个患者样品的cDNA以及(C)来自使用Altona RealStar寨卡病毒RT-PCR测定头对头比较的16个患者样品的cDNA测试SHERLOCK。+：ZIKV种子储备液cDNA(3x102 cp/μl)和×：无输入。(D)对从24个DENV阳性患者样品和临床分离株中提取的RNA的SHERLOCK。蓝色虚线：ZIKV或DENV存在或不存在的临界值(参见方法)。
图100-示出了SHERLOCK与其它核酸扩增测试之间的比较。示出了比较以下的结果的维恩图：(A)SHERLOCK对Altona RealStar寨卡病毒RT-PCR测定，以及(B)SHERLOCK对Altona RealStar寨卡病毒RT-PCR测定和Hologic Aptima寨卡病毒测定。
图101-通过SHERLOCK和其它诊断方法靶向的ZIKV基因组区域的示意图。PCR扩增子拼贴整个ZIKV基因组，而SHERLOCK ZIKV测定仅靶向具有较短扩增子的ZIKV基因组的一个区域。Altona RealStar RT-PCR测定和Hologic Aptima TMA测定还靶向ZIKV基因组中的个别短扩增子(这些扩增子的位置和大小是专有的并且因此在示意图中未示出)。有可能使临床样品具有无法由PCR引物(其具有约400nt的产物长度)扩增的高度片段化RNA。相反地，有可能使临床样品具有不含约120nt SHERLOCK扩增子的部分ZIKV基因组。
图102-示出了图解对来自4种DENV血清型的RNA的泛登革SHERLOCK的检测限的图。(A-D)在对来源于合成模板的DENV RNA的连续稀释液的20分钟RPA和1小时检测之后的SHERLOCK荧光值。1μl样品用作输入。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图103-图解了应用于患者样品和临床分离株的泛登革SHERLOCK。(A)从24个样品和由DENV血清型指代的4个种子储备液中提取的RNA的泛登革SHERLOCK荧光。(B-D)在Cas13检测的1小时处从14个人血清样品(B)、在1小时处从10个培养的临床分离株(C)以及在1小时处从4个DENV种子储备液(D)中提取的RNA的泛登革SHERLOCK荧光。
图104-使用HUDSON和SHERLOCK对体液中的ZIKV和DENV的直接检测。(A)使用HUDSON和SHERLOCK的直接病毒检测的示意图。(B-C)在健康人血清(粉色，B)或健康人唾液(蓝色，C)中稀释的颗粒中的ZIKV RNA的检测。因为实验一起进行，所以在A和B中使用相同PBS对照。(D)在健康人尿液(黄色)中稀释的颗粒中的ZIKV RNA的检测。黑色：未稀释的病毒储备液。灰色：PBS中的稀释液。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。(E-F)直接来自患者血清(E)和唾液样品(F)的DENV RNA的检测。(G)来自(E-F)中所示的样品的DENV的侧流检测。在加热之前用TCEP/EDTA处理所有样品。
图105-示出了图解使用SHERLOCK对直接来自血液产物的ZIKV cDNA的检测的图，其中ZIKV cDNA在健康人全血(红色)、健康人血浆(紫色)、健康人血清(粉色)或水(灰色)中稀释。在稀释后立即，用100mM TCEP和1mM EDTA在50℃下处理体液5分钟，继而在64℃下处理5分钟。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图106-示出了图解使用SHERLOCK对直接来自唾液的ZIKV cDNA的检测的图，其中ZIKV cDNA在健康人唾液(蓝色)或水(灰色)中稀释。在稀释后立即，用100mM TCEP和1mMEDTA在50℃下处理体液5分钟，继而在64℃下处理5分钟。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图107-示出了图解全血、血浆和尿液的快速RNA酶灭活的图。如所指示稀释健康人全血、血浆和尿液，并且用100mM TCEP和1mM EDTA在50℃下灭活5分钟。在37℃下孵育1小时后在2U/μl鼠类RNA酶抑制剂(NEB)存在下使用RNase Alert v2(Thermo)测量RNA酶活性。对于每种条件示出两个技术性重复(橙色和黑色条形)。
图108-图解在全血中稀释的寨卡病毒的检测的图。检测1小时后在健康人全血(红色)中稀释的颗粒中的ZIKV RNA的检测。将样品与100mM TCEP和1mM EDTA一起在50℃下加热5分钟加上在64℃下加热5分钟。因为实验一起进行，所以在图104A和图104B中使用相同PBS对照。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图109-图解体液的体温热灭活的图。如所指示稀释健康人全血、血清、唾液和尿液，并且用100mM TCEP和1mM EDTA在37℃下灭活20分钟。在37℃下孵育1小时后在2U/μl鼠类RNA酶抑制剂(NEB)存在下使用RNase Alert v2(Thermo)测量RNA酶活性。对于每种条件示出两个技术性重复(橙色和黑色条形)。
图110-图解在全血、血清和唾液中稀释的登革病毒(dengue virus)的检测的图。检测1小时后在健康人全血(红色，A)、血清(粉色，B)或健康人唾液(蓝色，C)中稀释颗粒中的DENV RNA的检测。将样品与100mM TCEP和1mM EDTA一起在37℃下加热20分钟加上在64℃下加热5分钟。因为实验一起进行，所以在所有板块中使用相同PBS对照。指示每毫升病灶形成单位(FFU/ml)的DENV滴度。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图111-示出了登革临床样品RNA血清型的条形图。(A-D)区别使用从1个DENV1样品(A)、2个DENV2样品和2个存在DENV2和DENV3的样品(B)、4个DENV3样品(C)以及3个DENV4样品(D)中提取的RNA测试的血清型的SHERLOCK DENV板块。在Cas13检测3小时后示出荧光值。误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图112-图解了适应性和功能性ZIKV突变的鉴别。(A)用于SNP鉴别的SHERLOCK测定。深色：衍生型crRNA，浅色：祖先型crRNA。(B-C)使用合成标靶(104cp/μl)和病毒种子储备液cDNA(3x102cp/μl)测试的来自2015-2016年ZIKV流行的三种区域特异性SNP，包括SNP的基因组位置和简化系统发生树。(D-E)来自多米尼加共和国(DOM)、美国(USA)和洪都拉斯(HND)的ZIKV cDNA样品中的区域特异性SNP的鉴别。每种样品中的每种SNP的荧光比(衍生型crRNA荧光除以祖先型crRNA荧光)在条形图中示出(热图中经过log2变换的数据)。(F)开发SHERLOCK测定用于新SNP的时间线(更多细节在图113中)。(G-H)通过荧光和比色检测对小头畸形相关ZIKV突变(PrM S139N)的鉴别。在所有板块中，误差条指示基于3个技术性重复的1S.D.。
图113-图解了SNP设计时间线。我们示出设计、创建和测试基于SHERLOCK的SNP鉴别测定所需的步骤，连同每个步骤所需的实际时间。总周转时间小于1周。
图114-图解了使用目视读出对尿液中稀释的寨卡病毒的侧流检测。我们示出在尿液中稀释的寨卡病毒的侧流检测(图104C)。上部色带是测试色带并且下部色带是对照色带。检测1小时后在PBS与尿液稀释液中以10个拷贝/微升可见暗淡的色带。
具体实施方式
一般定义
除非另有规定，否则本文所用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。常用术语的定义和分子生物学中的技术可以在以下文献中找到：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)(Sambrook,Fritsch和Maniatis)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)(Green和Sambrook)；Current Protocols in Molecular Biology(1987)(F.M.Ausubel等编)；the seriesMethods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(1995)(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编):Antibodies,A Laboraotry Manual(1988)(Harlow和Lane编):Antibodies A Laboraotry Manual,第2版2013(E.A.Greenfield编)；Animal Cell Culture(1987)(R.I.Freshney编)；Benjamin Lewin,Genes IX,由Jones和Bartlet公布,2008(ISBN 0763752223)；Kendrew等(编),The Encyclopedia of MolecularBiology,由Blackwell Science Ltd.公布,1994(ISBN 0632021829)；Robert A.Meyers(编),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCHPublishers,Inc.公布,1995(ISBN 9780471185710)；Singleton等,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994),3月,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版,JohnWiley&Sons(New York,N.Y.1992)；以及Marten H.Hofker和Jan van Deursen,TransgenicMouse Methods and Protocols,第2版(2011)。
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。
术语“任选的”或“任选地”意指后续描述的事件、情形或替代物可能发生或可能不发生，并且描述包括事件或情形发生的情况和不发生的情况。
由端点对数值范围的叙述包括归入相应范围内的所有数值和分数，以及所叙述的端点。
如本文所用的术语“约”或“近似”当涉及例如参数、量、时距等可测量的值时，有意涵盖指定值的变化和从指定值的变化，例如指定值和从指定值+/-10％或更小、+/-5％或更小、+/-1％或更小和+/-0.1％或更小的变化，只要此类变化适于在所公开的发明中执行即可。应了解，修饰语“约”或“近似”所涉及的值本身也特定地并优选地公开。
在本说明书通篇提及“一个实施方案”、“实施方案”、“示例性实施方案”意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括于本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇各处出现短语“在一个实施方案中”、“在实施方案中”或“示例性实施方案”不一定全部涉及同一实施方案，但可能如此。此外，如本领域技术人员从本公开将显而易见，在一个或多个实施方案中，特定特征、结构或特性可以按任何适合的方式组合。此外，虽然本文所描述的一些实施方案包括其它实施方案中所包括的一些特征而非其它特征，但不同实施方案的特征的组合有意处于本发明的范围内。举例来说，在随附权利要求书中，所要求的实施方案中的任一个可以按任何组合形式使用。
本文所引用的所有公布、公布的专利文献、和专利申请特此以引用的方式并入，引用程度如同每个个别公布、公布的专利文献、或专利申请特定地并个别地指示以引用的方式并入一样。
综述
微生物成簇的规律间隔的短回文重复(Microbial Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)和CRISPR相关(CRISPR-Cas)适应性免疫系统含有可编程的核酸内切酶，例如Cas9和Cpf1(Shmakov等,2017；Zetsche等,2015)。尽管Cas9与Cpf1均靶向DNA，但单效应物RNA导向的RNA酶最近已经被发现(Shmakov等,2015)和表征(Abudayyeh等,2016；Smargon等,2017)，包括C2c2，这提供了用于特异性RNA传感的平台。可以使用CRISPR RNA(crRNA)容易地并且便利地对RNA导向的RNA酶进行重新编程以使靶RNA裂解。不同于仅使DNA标靶裂解的DNA核酸内切酶Cas9和Cpf1，RNA导向的RNA酶，如C2c2，在使其RNA标靶裂解后保持活性，引起附近的非靶向RNA的“附带”裂解(Abudayyeh等,2016)。这种crRNA编程的附带RNA裂解活性使得有机会使用RNA导向的RNA酶通过触发可以充当读出的体内程序性细胞死亡或体外非特异性RNA降解来检测特异性RNA的存在(Abudayyeh等,2016；East-Seletsky等,2016)。
本文所公开的实施方案利用RNA靶向效应物以提供具有渺摩尔灵敏度的稳固的基于CRISPR的诊断。本文所公开的实施方案可以在可比水平的灵敏度下检测肉汤DNA和RNA并且可以基于单碱基对差异区别标靶与非标靶。此外，本文所公开的实施方案可以按冷冻干燥格式制备用于便利的分配和定点护理(POC)应用。此类实施方案适用于人健康的多种情形，包括例如病毒检测、菌株分型、灵敏基因分型和疾病相关的无细胞DNA的检测。
为了诊断全世界的感染性微生物，需要快速、灵敏、低成本、使用者友好以及可快速适应于检测新鉴别剂的测定。本文所公开的实施方案展示基于Cas13的SHERLOCK平台可以在单拷贝灵敏度下检测临床样品和蚊库中的寨卡病毒(ZIKV)，并且显示其可以在<2小时内检测直接来自尿液的ZIKV。申请者进一步开发测定以同时检测4种黄病毒，区别登革病毒血清型1-4，以及使用区域特异性变体区分来自2016年爆发的ZIKV的株系。最后，申请者开发测定并进行测试以在其公布1周内鉴别与胎儿小头畸形相关联的ZIKV变体。这展示了SHERLOCK可以检测直接来自体液的病毒，区分多种病原性病毒，并且可以快速更新以鉴别造成临床上重要的表型的突变。
在一个方面，本文所公开的实施方案涉及一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括CRISPR系统、一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA、掩蔽构建体，以及任选的用以扩增样品中的靶核酸分子的扩增试剂。在某些示例性实施方案中，系统还可以包含一种或多种检测适体。一种或多种检测适体可以包含RNA聚合酶位点或引物结合位点。一种或多种检测适体特异性地结合一种或多种靶多肽并且被构造成使得仅在检测适体结合至靶肽后才暴露RNA聚合酶位点或引物结合位点。RNA聚合酶位点的暴露有助于使用适体序列作为模板产生触发RNA寡核苷酸。因此，在此类实施方案中，一种或多种向导RNA被构造成结合至触发RNA。
在另一个方面，本文所公开的实施方案涉及一种诊断装置，所述诊断装置包括多个个别离散容积。每个个别离散容积包含CRISPR效应蛋白、一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA，和掩蔽构建体。在某些示例性实施方案中，RNA扩增试剂可以预加载至个别离散容积中，或在将样品添加至每个个别离散容积中的同时或之后添加至个别离散容积中。装置可以是基于微流体的装置、穿戴式装置，或包括个别离散容积界定于上面的柔性材料衬底的装置。
在另一个方面，本文所公开的实施方案涉及一种用于检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括将样品或样品组分配至一组个别离散容积中，每个个别离散容积包含CRISPR效应蛋白、一种或多种被设计成结合至一种靶寡核苷酸的向导RNA，和掩蔽构建体。然后将样品组维持于足以允许一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子的条件下。一种或多种向导RNA结合至靶核酸继而活化CRISPR效应蛋白。一旦活化，CRISPR效应蛋白然后使掩蔽构建体失活，例如，通过使掩蔽构建体裂解以便去掩蔽、释放或产生可检测的阳性信号。个别离散容积中检测到阳性可检测信号指示靶分子的存在。
在又一个方面，本文所公开的实施方案涉及一种用于检测多肽的方法。检测多肽的方法类似于上文所描述的检测靶核酸的方法。然而，还包括肽检测适体。肽检测适体如上文所描述发挥功能并且有助于在结合至靶多肽后产生触发寡核苷酸。向导RNA被设计成识别触发寡核苷酸，从而活化CRISPR效应蛋白。由活化的CRISPR效应蛋白使掩蔽构建体失活促成可检测的阳性信号的去掩蔽、释放或产生。
CRISPR效应蛋白
一般来说，如本文中和例如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)的文献中所用的CRISPR-Cas或CRISPR系统共同地涉及CRISPR相关的(“Cas”)基因的表达中所涉及或引导所述基因的活性的转录物和其它元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(在内源CRISPR系统的情形中涵盖“正向重复”和tracrRNA加工的部分正向重复)、向导序列(在内源CRISPR系统的情形中也称作“间隔区”)，或如本文所用的那个术语“一种或多种RNA”(例如用以导向Cas，例如Cas9的一种或多种RNA，例如CRISPR RNA和反式活化(tracr)RNA或单向导RNA(sgRNA)(嵌合RNA))，或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。一般来说，CRISPR系统由促进在靶序列的位点处CRISPR复合物形成的元件表征(在内源CRISPR系统的情形中也称作原间隔区)。当CRISPR蛋白质是C2c2蛋白质时，不需要tracrRNA。C2c2已经在以下文献中描述：Abudayyeh等(2016)"C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targetingCRISPR effector"；Science；DOI:10.1126/science.aaf5573；以及Shmakov等(2015)"Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2CRISPR-CasSystems",Molecular Cell,DOI:dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008；所述文献以全文引用的方式并入本文中。Cas13b已经在以下文献中描述：Smargon等(2017)"Cas13bIs a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNases Differentially Regulatedby Accessory Proteins Csx27 and Csx28",Molecular Cell.65,1-13；dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023.，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在某些实施方案中，原间隔区邻近基序(PAM)或PAM样基序引导如本文所公开的效应蛋白复合物结合至所关注的靶基因座。在一些实施方案中，PAM可以是5'PAM(即，位于原间隔区的5'端上游)。在其它实施方案中，PAM可以是3'PAM(即，位于原间隔区的5'端下游)。术语“PAM”可以与术语“PFS”或“原间隔区侧接位点”或“原间隔区侧接序列”互换使用。
在优选实施方案中，CRISPR效应蛋白可以识别3'PAM。在某些实施方案中，CRISPR效应蛋白可以识别3'PAM，其为5'H，其中H是A、C或U。在某些实施方案中，效应蛋白可以是沙氏纤毛菌C2c2p，更优选沙氏纤毛菌DSM 19757C2c2，并且3'PAM是5'H。
在形成CRISPR复合物的情形中，“靶序列”是指向导序列被设计成与其具有互补性的序列，其中靶序列与向导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含RNA多核苷酸。术语“靶RNA”是指作为靶序列或包含靶序列的RNA多核苷酸。换句话说，靶RNA可以是gRNA的一部分，即，向导序列被设计成与其具有互补性并且由包含CRISPR效应蛋白和gRNA的复合物介导的效应功能所针对的RNA多核苷酸或RNA多核苷酸的一部分。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。
编码CRISPR效应蛋白，尤其C2c2的核酸分子有利地是密码子优化的CRISPR效应蛋白。在这种情况下，密码子优化的序列的一个实例是对于在真核生物中表达而优化的序列，例如人(即，对于在人中表达而优化)，或对于如本文所论述的另一种真核生物、动物或哺乳动物；参见例如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中的SaCas9人密码子优化的序列。虽然这是优选的，但将了解，其它实例可能存在，并且对于除人以外的宿主物种的密码子优化或对于特定器官的密码子优化是已知的。在一些实施方案中，编码CRISPR效应蛋白的酶编码序列对于在特定细胞，例如真核细胞中表达进行密码子优化。真核细胞可以是特定生物体的那些或来源于特定生物体，例如植物或哺乳动物，包括但不限于人，或如本文所论述的非人真核生物或动物或哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、犬、家畜或非人哺乳动物或灵长类动物。在一些实施方案中，可以排除有可能不会对人或动物带来任何实质性医学效益的修改人的种系遗传身份的过程和/或修改动物的遗传身份的过程，以及由此类过程产生的动物。一般来说，密码子优化是指修饰核酸序列用于增强在所关注的宿主细胞中的表达的过程，这个过程是通过用在宿主细胞的基因中较频繁或最频繁使用的密码子置换原生序列的至少一个密码子(例如约或大于约1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个或更多个密码子)，同时维持原生氨基酸序列。各个物种对特定氨基酸的某些密码子展现特定偏性。密码子偏性(生物体之间密码子使用的差异)常常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，据信所述效率继而尤其取决于所翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中所选tRNA的主导性一般反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可以基于密码子优化来调整基因用于给定的生物体中最佳基因表达。密码子使用表可容易得到，例如，在kazusa.orjp/codon/上可得的“密码子使用数据库(Codon Usage Database)”中，并且这些表可以按许多方式进行改编。参见Nakamura,Y.等"Codon usage tabulated from theinternational DNA sequence databases:status for the year 2000"Nucl.AcidsRes.28:292(2000)。对于在特定宿主细胞中表达对特定序列进行密码子优化的计算机算法也可得到，例如Gene Forge(Aptagen；Jacobus,PA)也可得到。在一些实施方案中，编码Cas的序列中的一个或多个密码子(例如1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个或更多个或所有密码子)对应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
在某些实施方案中，如本文所描述的方法可以包括提供Cas转基因细胞，尤其C2c2转基因细胞，其中提供或引入编码一种或多种向导RNA的一种或多种核酸，其在细胞中与包含所关注的一种或多种基因的启动子的调控元件可操作地连接。如本文所用的术语“Cas转基因细胞”是指细胞，例如真核细胞，其中Cas基因已经在基因组上整合。细胞的性质、类型或来源根据本发明并无特别限制。而且，Cas转基因引入细胞中的方式可以有变化并且可以是如本领域中已知的任何方法。在某些实施方案中，通过将Cas转基因引入分离的细胞中来获得Cas转基因细胞。在某些其它实施方案中，通过从Cas转基因生物体中分离细胞来获得Cas转基因细胞。通过实例并且不受限制，如本文所提及的Cas转基因细胞可以来源于Cas转基因真核生物，例如Cas敲入真核生物。参考WO 2014/093622(PCT/US13/74667)，以引用的方式并入本文中。可以修改针对靶向Rosa基因座的转让给Sangamo BioSciences,Inc.的美国专利公布号20120017290和20110265198的方法以利用本发明的CRISPR Cas系统。还可以修改针对靶向Rosa基因座的转让给Cellectis的美国专利公布号20130236946的方法以利用本发明的CRISPR Cas系统。通过另一个实例，参考Platt等(Cell；159(2):440-455(2014))，其描述了Cas9敲入小鼠，以引用的方式并入本文中。Cas转基因还可以包含Lox-Stop-polyA-Lox(LSL)盒，从而促成由Cre重组酶可诱导的Cas表达。或者，可以通过将Cas转基因引入分离的细胞中来获得Cas转基因细胞。用于转基因的递送系统在本领域中是众所周知的。通过实例，可以借助于如本文别处也描述的载体(例如AAV、腺病毒、慢病毒)和/或颗粒和/或纳米颗粒递送将Cas转基因递送于例如真核细胞中。
技术人员将了解，如本文所提及的细胞，例如Cas转基因细胞除了具有整合的Cas基因或当与能够将Cas导向靶基因座的RNA复合时由Cas的序列特异性作用产生的突变以外还可以包含基因组改变。
在某些方面，本发明涉及例如用于将Cas和/或能够将Cas导向靶基因座的RNA(即，向导RNA)递送至或引入细胞中以及用于繁殖这些组分(例如在原核细胞中)的载体。如本文所用的“载体”是允许或有助于实体从一种环境转移至另一种环境的工具。载体是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其中可以插入另一个DNA区段以达成所插入的区段的复制。一般来说，载体当与适当控制元件相关联时能够复制。一般来说，术语“载体”是指核酸分子，其能够转运已经与其连接的另一个核酸。载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个自由端、无自由端(例如环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或两者的核酸分子；以及本领域中已知的多核苷酸的其它种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以插入额外DNA区段，例如通过标准分子克隆技术。另一种类型的载体是病毒载体，其中载体中存在源自病毒的DNA或RNA序列用于包封至病毒(例如逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒(AAV))中。病毒载体还包括由病毒携带的多核苷酸用于转染至宿主细胞中。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体，和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中之后整合至宿主细胞的基因组中，并且从而连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导其操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。在重组DNA技术中有效用的常用表达载体常常呈质粒的形式。
重组表达载体可以包含本发明的核酸，其呈适合于在宿主细胞中表达核酸的形式，这意指重组表达载体包括一个或多个调控元件，其可以在有待用于表达的宿主细胞的基础上选择，操作性地连接至有待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”意图指所关注的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中或当将载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)的方式连接至一个或多个调控元件。关于重组和克隆方法，提及2004年9月2日以US 2004-0171156 A1公布的美国专利申请10/815,730，其内容以全文引用的方式并入本文中。因此，本文所公开的实施方案还可以包括包含CRISPR效应系统的转基因细胞。在某些示例性实施方案中，转基因细胞可以充当个别离散容积。换句话说，可以将包含掩蔽构建体的样品递送至细胞中，例如在适合的递送囊泡中，并且如果递送囊泡中存在标靶，那么活化CRISPR效应物并且产生可检测信号。
一个或多个载体可以包括一个或多个调控元件，例如一个或多个启动子。一个或多个载体可以包含Cas编码序列和/或单个，但可能还可以包含至少3个或8个或16个或32个或48个或50个向导RNA(例如sgRNA)编码序列，例如1-2个、1-3个、1-4个、1-5个、3-6个、3-7个、3-8个、3-9个、3-10个、3-8个、3-16个、3-30个、3-32个、3-48个、3-50个RNA(例如sgRNA)。在单个载体中，可以存在每个RNA(例如sgRNA)的启动子，有利地当存在至多约16个RNA时；并且当单个载体提供多于16个RNA时，一个或多个启动子可以驱动多于一个RNA的表达，例如当存在32个RNA时，每个启动子可以驱动两个RNA的表达，并且当存在48个RNA时，每个启动子可以驱动三个RNA的表达。通过简单的算术和完善的克隆方案和本公开中的教义，本领域技术人员可以关于适合的例示性载体(例如AAV)的一个或多个RNA和例如U6启动子的适合启动子来容易地实施本发明。举例来说，AAV的包封限度为约4.7kb。单个U6-gRNA(加上用于克隆的限制性位点)的长度为361bp。因此，技术人员可以容易地将约12-16个，例如13个U6-gRNA盒装配至单个载体中。这可以通过任何适合的方式组装，例如用于TALE组装的金门策略(genome-engineering.org/taleffectors/)。技术人员还可以使用串联向导策略以使U6-gRNA的数目增加约1.5倍，例如，从12-16个，例如13个增加至约18-24个，例如约19个U6-gRNA。因此，本领域技术人员可以在单个载体，例如AAV载体中容易地达到约18-24个，例如约19个启动子-RNA，例如U6-gRNA。用于增加载体中启动子和RNA的数目的进一步方式是使用单个启动子(例如U6)以表达由可裂解序列分离的RNA阵列。并且，用于增加载体中启动子-RNA的数目的更进一步方式是在编码序列或基因的内含子中表达由可裂解序列分离的启动子-RNA阵列；并且在这种情况下，有利的是使用聚合酶II启动子，其可以具有增加的表达并且能够以组织特异性方式转录长RNA。(参见例如nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short和nature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.html)。在有利的实施方案中，AAV可以包封靶向至多约50个基因的U6串联gRNA。因此，从本领域中的知识和本公开中的教义，技术人员可以容易地制造和使用一个或多个载体，例如单个载体，其在控制下表达多个RNA或向导或者操作性地或功能性地连接至一个或多个启动子-尤其关于本文所论述的RNA或向导的数目，而不存在任何不当实验。
向导RNA编码序列和/或Cas编码序列可以功能性地或操作性地连接至一个或多个调控元件，并且因此一个或多个调控元件驱动表达。一个或多个启动子可以是一个或多个组成性启动子和/或一个或多个条件性启动子和/或一个或多个诱导性启动子和/或一个或多个组织特异性启动子。启动子可以选自由以下组成的组：RNA聚合酶、pol I、pol II、polIII、T7、U6、H1、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)LTR启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。有利的启动子是启动子U6。
在一些实施方案中，核酸靶向系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR RNA靶向系统的特定生物体。在某些示例性实施方案中，效应蛋白CRISPR RNA靶向系统包含至少一个HEPN结构域，包括但不限于本文所描述的HEPN结构域、本领域中已知的HEPN结构域，和通过与共有序列基序相比而被识别为HEPN结构域的结构域。本文中提供若干此类结构域。在一个非限制性实例中，共有序列可以来源于本文所提供的C2c2或Cas13b直系同源物的序列。在某些示例性实施方案中，效应蛋白包含单个HEPN结构域。在某些其它示例性实施方案中，效应蛋白包含两个HEPN结构域。
在一个示例性实施方案中，效应蛋白包含一个或多个包含RxxxxH基序序列的HEPN结构域。RxxxxH基序序列可以但不限于来自本文所描述的HEPN结构域或本领域中已知的HEPN结构域。RxxxxH基序序列还包括通过组合两个或更多个HEPN结构域的部分而建立的基序序列。正如所指出，共有序列可以来源于以下文献中所公开的直系同源物的序列：题为"Novel CRISPR Enzymes and Systems"的美国临时专利申请62/432,240，2017年3月15日提交的题为"Novel Type VI CRISPR Orthologs and Systems"的美国临时专利申请62/471,710，和以代理人案号47627-05-2133标注并且2017年4月12日提交的题为"Novel Type VICRISPR Orthologs and Systems"的美国临时专利申请。
在本发明的实施方案中，HEPN结构域包含至少一个包含序列R{N/H/K}X1X2X3H的RxxxxH基序。在本发明的实施方案中，HEPN结构域包括包含序列R{N/H}X1X2X3H的RxxxxH基序。在本发明的实施方案中，HEPN结构域包含序列R{N/K}X1X2X3H。在某些实施方案中，X1是R、S、D、E、Q、N、G、Y或H。在某些实施方案中，X2是I、S、T、V或L。在某些实施方案中，X3是L、F、N、Y、V、I、S、D、E或A。
根据本发明使用的额外效应物可以通过其与cas1基因的接近性来鉴别，例如但不限于在距cas1基因的始端20kb和距cas1基因的末端20kb的区域内。在某些实施方案中，效应蛋白包含至少一个HEPN结构域和至少500个氨基酸，并且其中C2c2效应蛋白天然存在于Cas基因或CRISPR阵列上游或下游20kb内的原核基因组中。Cas蛋白质的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰型式。在某些示例性实施方案中，C2c2效应蛋白天然存在于Cas 1基因上游或下游20kb内的原核基因组中。术语“直系同源物(orthologue)”(本文中也称作“直系同源物(ortholog)”)和“同源物(homologue)”(本文中也称作“同源物(homolog)”)在本领域中是众所周知的。通过进一步指导，如本文所用的蛋白质的“同源物”是与作为其同源物的蛋白质发挥相同或类似功能的相同种类的蛋白质。同源蛋白质可以但不需要结构上相关，或仅部分结构上相关。如本文所用的蛋白质的“直系同源物”是与作为其直系同源物的蛋白质发挥相同或类似功能的不同种类的蛋白质。直系同源蛋白质可以但不需要结构上相关，或仅部分结构上相关。
在特定实施方案中，VI型RNA靶向Cas酶是C2c2。在其它示例性实施方案中，VI型RNA靶向Cas酶是Cas 13b。在特定实施方案中，如本文所提及的VI型蛋白质，例如C2c2的同源物或直系同源物与VI型蛋白质，例如C2c2(例如基于以下任一种的野生型序列：沙氏纤毛菌C2c2、毛螺菌科细菌MA2020 C2c2、毛螺菌科细菌NK4A179 C2c2、嗜氨基梭菌(DSM 10710)C2c2、鸡肉杆菌(DSM 4847)C2c2、普根沼杆菌(WB4)C2c2、维森李斯特菌(FSL R9-0317)C2c2、李斯特菌科细菌(FSL M6-0635)C2c2、纽约李斯特菌(Listeria newyorkensis)(FSLM6-0635)C2c2、韦德纤毛菌(F0279)C2c2、荚膜红细菌(SB 1003)C2c2、荚膜红细菌(R121)C2c2、荚膜红细菌(DE442)C2c2、韦德纤毛菌(Lw2)C2c2或斯氏李斯特菌C2c2)具有至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％，例如至少95％的序列同源性或同一性。在其它实施方案中，如本文所提及的VI型蛋白质，例如C2c2的同源物或直系同源物与野生型C2c2(例如基于以下任一种的野生型序列：沙氏纤毛菌C2c2、毛螺菌科细菌MA2020 C2c2、毛螺菌科细菌NK4A179C2c2、嗜氨基梭菌(DSM 10710)C2c2、鸡肉杆菌(DSM 4847)C2c2、普根沼杆菌(WB4)C2c2、维森李斯特菌(FSL R9-0317)C2c2、李斯特菌科细菌(FSL M6-0635)C2c2、纽约李斯特菌(FSLM6-0635)C2c2、韦德纤毛菌(F0279)C2c2、荚膜红细菌(SB 1003)C2c2、荚膜红细菌(R121)C2c2、荚膜红细菌(DE442)C2c2、韦德纤毛菌(Lw2)C2c2或斯氏李斯特菌C2c2)具有至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％，例如至少95％的序列同一性。
在某些其它示例性实施方案中，CRISPR系统效应蛋白是C2c2核酸酶。C2c2的活性可以取决于两个HEPN结构域的存在。这些已经显示为RNA酶结构域，即，切割RNA的核酸酶(尤其核酸内切酶)。C2c2 HEPN还可以靶向DNA，或潜在地DNA和/或RNA。在C2c2的HEPN结构域至少能够结合至RNA并且以其野生型形式切割RNA的基础上，则优选的是C2c2效应蛋白具有RNA酶功能。关于C2c2 CRISPR系统，参考2016年6月17日提交的美国临时案62/351,662和2016年8月17日提交的美国临时案62/376,377。还参考2016年6约17日提交的美国临时案62/351,803。还参考2016年12月8日提交的题为"Novel Crispr Enzymes and Systems"的美国临时案，带有博德研究所(Broad Institute)编号10035.PA4和代理人案号47627.03.2133。还参考East-Seletsky等"Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection"Nature doi:10/1038/nature19802和Abudayyeh等"C2c2 is a single-component programmable RNA-guidedRNA targeting CRISPR effector"bioRxiv doi:10.1101/054742。
CRISPR系统中的RNA酶功能是已知的，例如，对于某些III型CRISPR-Cas系统已经报道mRNA靶向(Hale等,2014,Genes Dev,第28卷,2432-2443；Hale等,2009,Cell,第139卷,945-956；Peng等,2015,Nucleic acids research,第43卷,406-417)并且提供显著优点。在表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)III-A型系统中，跨标靶的转录使得靶DNA和其转录物裂解，这是由Cas10-Csm核糖核蛋白效应蛋白复合物内的独立活性位点介导(参见Samai等,2015,Cell,第151卷,1164-1174)。由此提供CRISPR-Cas系统、组合物或经由本发明效应蛋白靶向RNA的方法。
在实施方案中，Cas蛋白质可以是以下属类的生物体的C2c2直系同源物：包括但不限于纤毛菌属、李斯特菌属、棒杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、弗维菌属、黄杆菌属、单丝壳属、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、硝酸盐裂解菌属、支原体属和弯曲杆菌属。此种属类的生物体的种类可以如本文其它方面所论述。
鉴别CRISPR-Cas系统酶的直系同源物的一些方法可以涉及鉴别所关注的基因组中的tracr序列。tracr序列的鉴别可以涉及以下步骤：在数据库中搜索正向重复或tracr配对序列以鉴别包含CRISPR酶的CRISPR区。在正义与反义方向上侧接CRISPR酶的CRISPR区中搜索同源序列。寻找转录终止子和二级结构。鉴别不是正向重复或tracr配对序列，但与正向重复或tracr配对序列具有大于50％同一性的任何序列作为潜在tracr序列。获取潜在tracr序列并且分析与其相关联的转录终止子序列。
将了解，本文所描述的任何功能性可以工程改造至来自其它直系同源物的CRISPR酶中，包括包含来自多种直系同源物的片段的嵌合酶。此类直系同源物的实例在本文别处描述。因此，嵌合酶可以包含以下生物体的CRISPR酶直系同源物的片段：包括但不限于纤毛菌属、李斯特菌属、棒杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、弗维菌属、黄杆菌属、单丝壳属、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、硝酸盐裂解菌属、支原体属和弯曲杆菌属。嵌合酶可以包含第一片段和第二片段，并且片段可以是本文所提及的属类或本文所提及的种类的生物体的CRISPR酶直系同源物的片段；有利地，片段来自不同种类的CRISPR酶直系同源物。
在实施方案中，如本文所提及的C2c2蛋白质还涵盖C2c2或其同源物或直系同源物的功能变体。如本文所用的蛋白质的“功能变体”是指此种蛋白质的变体，其至少部分保留所述蛋白质的活性。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或置换突变体)，包括多形体等。功能变体还包括此种蛋白质与另一种通常无关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然产生的或可以是人造的。有利的实施方案可以涉及工程改造或非天然产生的VI型RNA靶向效应蛋白。
在实施方案中，编码C2c2或其直系同源物或同源物的一个或多个核酸分子可以对于在真核细胞中表达进行密码子优化。真核生物可以如本文所论述。一个或多个核酸分子可以是工程改造或非天然产生的。
在实施方案中，C2c2或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变，并且因此编码其的一个或多个核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。关于Cas9酶的催化结构域的实例可以包括但不限于RuvC I、RuvC II、RuvC III和HNH结构域。
在实施方案中，C2c2或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。关于Cas酶的催化结构域的实例可以包括但不限于HEPN结构域。
在实施方案中，C2c2或其直系同源物或同源物可以用作与功能结构域融合或可操作地连接至功能结构域的通用核酸结合蛋白。例示性功能结构域可以包括但不限于翻译引发剂、翻译活化剂、翻译阻遏剂、核酸酶(尤其核糖核酸酶)、剪接体、珠粒、光可诱导/可控制结构域或化学可诱导/可控制结构域。
在某些示例性实施方案中，C2c2效应蛋白可以来自选自由以下组成的组的生物体：纤毛菌属、李斯特菌属、棒杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、弗维菌属、黄杆菌属、单丝壳属、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、硝酸盐裂解菌属、支原体属和弯曲杆菌属。
在某些实施方案中，效应蛋白可以是李斯特菌属种(Listeria sp.)C2c2p，优选斯氏李斯特菌C2c2p，更优选斯氏李斯特菌血清变型1/2b str.SLCC3954 C2c2p，并且crRNA序列的长度可以是44至47个核苷酸，其具有5'29-nt正向重复(DR)和15-nt至18-nt间隔区。
在某些实施方案中，效应蛋白可以是纤毛菌属种(Leptotrichia sp.)C2c2p，优选沙氏纤毛菌C2c2p，更优选沙氏纤毛菌DSM 19757C2c2p，并且crRNA序列的长度可以是42至58个核苷酸，其具有至少24nt的5'正向重复，例如5'24-28-nt正向重复(DR)，和至少14nt的间隔区，例如14-nt至28-nt间隔区，或至少18nt的间隔区，例如19、20、21、22或更多nt，例如18-28、19-28、20-28、21-28或22-28nt。
在某些示例性实施方案中，效应蛋白可以是纤毛菌属，韦德纤毛菌F0279，或李斯特菌属，优选纽约李斯特菌FSL M6-0635。
在某些示例性实施方案中，本发明的C2c2效应蛋白包括但不限于以下21种直系同源物种类(包括多个CRISPR基因座)：沙氏纤毛菌；韦德纤毛菌(Lw2)；斯氏李斯特菌；毛螺菌科细菌MA2020；毛螺菌科细菌NK4A179；嗜氨基[梭菌]DSM 10710；鸡肉杆菌DSM 4847；鸡肉杆菌DSM 4847(第二CRISPR基因座)；普根沼杆菌WB4；维森李斯特菌FSL R9-0317；李斯特菌科细菌FSL M6-0635；韦德纤毛菌F0279；荚膜红细菌SB 1003；荚膜红细菌R121；荚膜红细菌DE442；颊纤毛菌(Leptotrichia buccalis)C-1013-b；解半纤维素赫氏菌(Herbinixhemicellulosilytica)；直肠[真杆菌]([Eubacterium]rectale)；真杆菌科细菌(Eubacteriaceae bacterium)CHKCI004；布劳特氏菌属种(Blautia sp.)马赛-P2398；以及纤毛菌属口腔泰肯菌(oral taxon)879str.F0557。十二(12)个其它非限制性实例是：毛螺菌科细菌NK4A144；凝集绿屈挠菌(Chloroflexus aggregans)；桔红色脱甲基菌(Demequinaaurantiaca)；海旋菌属种(Thalassospira sp.)TSL5-1；假丁酸弧菌属种(Pseudobutyrivibrio sp.)OR37；丁酸弧菌属种(Butyrivibrio sp.)YAB3001；布劳特氏菌属马赛-P2398；纤毛菌属马赛-P3007；伊华拟杆菌(Bacteroides ihuae)；紫单孢菌科细菌(Porphyromonadaceae bacterium)KH3CP3RA；河岸李斯特菌(Listeria riparia)；以及陌生非适应螺菌(Insolitispirillum peregrinum)。
在某些实施方案中，根据本发明的C2c2蛋白质是或来源于如下表中所描述的直系同源物中的一种，或是如下表中所描述的直系同源物中的两种或更多种的嵌合蛋白，或是如下表中所描述的直系同源物中的一种的突变体或变体(或嵌合突变体或变体)，包括如本文别处所定义的死C2c2、脱落C2c2、去稳定C2c2等，其与或不与异源/功能结构域融合。
在某些示例性实施方案中，C2c2效应蛋白选自下表1。(还包括SEQ.ID.No.600-615)
表1
Figure BDA0002275597970000501
Figure BDA0002275597970000511
Figure BDA0002275597970000521
上述种类的野生型蛋白质序列在下表2中列出。在某些实施方案中，提供了编码C2c2蛋白质的核酸序列。
表2
Figure BDA0002275597970000522
Figure BDA0002275597970000531
Figure BDA0002275597970000541
在本发明的实施方案中，提供了效应蛋白，所述效应蛋白包含与以下细菌中的任一种的野生型序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列：沙氏纤毛菌C2c2、毛螺菌科细菌MA2020 C2c2、毛螺菌科细菌NK4A179 C2c2、嗜氨基梭菌(DSM 10710)C2c2、鸡肉杆菌(DSM4847)C2c2、普根沼杆菌(WB4)C2c2、维森李斯特菌(FSL R9-0317)C2c2、李斯特菌科细菌(FSL M6-0635)C2c2、纽约李斯特菌(FSL M6-0635)C2c2、韦德纤毛菌(F0279)C2c2、荚膜红细菌(SB 1003)C2c2、荚膜红细菌(R121)C2c2、荚膜红细菌(DE442)C2c2、韦德纤毛菌(Lw2)C2c2或斯氏李斯特菌C2c2。
在本发明的实施方案中，效应蛋白包含与VI型效应蛋白共有序列具有至少80％序列同源性的氨基酸序列，所述共有序列包括但不限于本文所描述的共有序列。
根据本发明，共有序列可以从多种C2c2直系同源物产生，其可以帮助定位保守氨基酸残基和基序，包括但不限于C2c2直系同源物中介导C2c2功能的催化残基和HEPN基序。使用Geneious比对从上文所提及的33种直系同源物产生的一种此类共有序列是SEQ IDNO:325。
在另一个非限制性实例中，用以帮助共有序列产生和保守残基鉴别的序列比对工具是MUSCLE比对工具(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)。举例来说，使用MUSCLE，可以在韦德纤毛菌C2c2中鉴别在C2c2直系同源物当中保守的以下氨基酸位置：K2；K5；V6；E301；L331；I335；N341；G351；K352；E375；L392；L396；D403；F446；I466；I470；R474(HEPN)；H475；H479(HEPN)；E508；P556；L561；I595；Y596；F600；Y669；I673；F681；L685；Y761；L676；L779；Y782；L836；D847；Y863；L869；I872；K879；I933；L954；I958；R961；Y965；E970；R971；D972；R1046(HEPN)；H1051(HEPN)；Y1075；D1076；K1078；K1080；I1083；I1090。
显示高度保守残基的HEPN结构域的例示性序列比对在图50中示出
在某些示例性实施方案中，RNA靶向效应蛋白是VI-B型效应蛋白，例如Cas13b和第29组或第30组蛋白质。在某些示例性实施方案中，RNA靶向效应蛋白包含一个或多个HEPN结构域。在某些示例性实施方案中，RNA靶向效应蛋白包含C端HEPN结构域、N端HEPN结构域或这两个结构域。关于在本发明的情形中可以使用的示例性VI-B型效应蛋白，参考题为"Novel CRISPR Enzymes and Systems"并且2016年10月21日提交的美国申请号15/331,792，题为"Novel CRISPR Enzymes and Systems"并且2016年10月21日提交的国际专利申请号PCT/US2016/058302，和Smargon等"Cas13b is a Type VI-B CRISPR-associatedRNA-Guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 andCsx28"Molecular Cell,65,1-13(2017)；dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023，以及2017年3月15日提交的题为"Novel Cas13b Orthologues CRISPR Enzymes and System"的有待转让的美国临时申请号。在特定实施方案中，Cas13b酶来源于动物溃疡伯格菌(Bergeyella zoohelcum)。在某些其它示例性实施方案中，效应蛋白是或包含与表3中所列序列中的任一个具有至少80％序列同源性的氨基酸序列。(还涉及SEQ.ID.No.479-566)
表3
Figure BDA0002275597970000551
Figure BDA0002275597970000561
Figure BDA0002275597970000571
Figure BDA0002275597970000581
Figure BDA0002275597970000591
Figure BDA0002275597970000601
在某些示例性实施方案中，2类VI型CRISPR系统是Cas13c系统。在某些示例性实施方案中，Cas13c直系同源物选自下表4，其包含用于在哺乳动物细胞中表达的Cas13c直系同源物。
表4
Figure BDA0002275597970000602
在某些示例性实施方案中，RNA靶向效应蛋白是如2017年6月26日提交的美国临时专利申请号62/525,165和2017年8月16日提交的PCT申请号US 2017/047193中所公开的Cas13c效应蛋白。Cas13c的示例性野生型直系同源物序列在下表5中提供。
表5
名称
EHO19081(SEQ.ID.No.567)
WP_094899336(SEQ.ID.No.568)
WP_040490876(SEQ.ID.No.569)
WP_047396607(SEQ.ID.No.570)
WP_035935671(SEQ.ID.No.571)
WP_035906563(SEQ.ID.No.572)
WP_042678931(SEQ.ID.No.573)
WP_062627846(SEQ.ID.No.574)
WP_005959231(SEQ.ID.No.575)
WP_027128616(SEQ.ID.No.576)
WP_062624740(SEQ.ID.No.577)
WP_096402050(SEQ.ID.No.578)
向导RNA
如本文所用的术语“crRNA”或“向导RNA”或“单向导RNA”、“gRNA”是指包含与靶核酸序列具有足够互补性的任何多核苷酸序列的多核苷酸以与靶核酸序列杂交并且引导包含gRNA和CRISPR效应蛋白的RNA靶向复合物序列特异性结合至靶核酸序列。一般来说，gRNA可以是以下任何多核苷酸序列：(i)能够与CRISPR效应蛋白形成复合物，以及(ii)包含与靶多核苷酸序列具有足够互补性的序列以与靶序列杂交并且引导CRISPR复合物序列特异性结合至靶序列。如本文所用的术语“能够与CRISPR效应蛋白形成复合物”是指gRNA具有允许由CRISPR效应蛋白特异性结合至gRNA的结构以便形成能够以序列特异性方式结合至靶RNA并且可以对所述靶RNA发挥功能的复合物。gRNA的结构性组分可以包括正向重复和向导序列(或间隔区)。序列特异性结合至靶RNA是由与靶RNA互补的gRNA的一部分，“向导序列”介导。在本发明的实施方案中，术语向导RNA，即，能够将Cas导向靶基因座的RNA如前面引用的文献，例如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中使用。如本文所用的术语“其中向导序列能够杂交”是指gRNA的子部分与靶序列具有足够互补性以杂交至所述靶序列并且介导CRISPR复合物结合至靶RNA。一般来说，向导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性的任何多核苷酸序列以与靶序列杂交并且引导CRISPR复合物序列特异性结合至靶序列。在一些实施方案中，当使用适合的比对算法最佳比对时，向导序列与其相应靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更大。最佳比对可以借助于用于比对序列的任何适合算法来确定，其非限制性实例包括史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)、尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)、基于巴罗斯-维勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如巴罗斯-维勒比对仪(BurrowsWheeler Aligner))、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies；在novocraft.com上可得)、ELAND(Illumina,San Diego,CA)、SOAP(在soap.genomics.org.cn上可得)和Maq(在maq.sourceforge.net上可得)。
在某些实施方案中，如本文所提供的CRISPR系统可以利用包含向导序列的crRNA或类似多核苷酸，其中多核苷酸是RNA、DNA或RNA与DNA的混合物，和/或其中多核苷酸包含一种或多种核苷酸类似物。序列可以包含任何结构，包括但不限于原生crRNA的结构，例如凸环、发夹或茎环结构。在某些实施方案中，包含向导序列的多核苷酸与可以是RNA或DNA序列的第二多核苷酸序列形成双链体。
在某些实施方案中，利用化学修饰的向导RNA。向导RNA化学修饰的实例包括但不限于在一个或多个末端核苷酸处并入2'-O-甲基(M)、2'-O-甲基3'硫代磷酸酯(MS)，或2'-O-甲基3'硫代PACE(MSP)。此类化学修饰的向导RNA与未修饰的向导RNA相比可以包含增加的稳定性和增加的活性，不过中靶对脱靶特异性不可预测。(参见Hendel,2015,NatBiotechnol.33(9):985-9,doi:10.1038/nbt.3290,2015年6月29日在线公布)。化学修饰的向导RNA还包括但不限于具有硫代磷酸酯键的RNA和在核糖环的2'与4'碳之间包含亚甲基桥的锁核酸(LNA)核苷酸。
在一些实施方案中，向导序列的长度为约或大于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多核苷酸。在一些实施方案中，向导序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少核苷酸。优选地，向导序列长度为10至30个核苷酸。向导序列引导CRISPR复合物序列特异性结合至靶序列的能力可以通过任何适合的测定来评价。举例来说，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括有待测试的向导序列，可以提供给具有相应靶序列的宿主细胞，例如通过用编码CRISPR序列的组分的载体转染，继而评价靶序列内的优先裂解，例如通过Surveyor测定。类似地，可以在试管中通过提供靶序列、CRISPR复合物的组分(包括有待测试的向导序列)和不同于测试向导序列的对照向导序列，以及在测试与对照向导序列反应之间对靶序列比较结合或裂解速率来评估靶RNA的裂解。其它测定可能存在，并且将为本领域技术人员所想到。
可以选择向导序列并且因此选择核酸靶向向导RNA以靶向任何靶核酸序列。在形成CRISPR复合物的情形中，“靶序列”是指向导序列被设计成与其具有互补性的序列，其中靶序列与向导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含RNA多核苷酸。术语“靶RNA”是指作为靶序列或包含靶序列的RNA多核苷酸。换句话说，靶RNA可以是gRNA的一部分，即，向导序列被设计成与其具有互补性并且由包含CRISPR效应蛋白和gRNA的复合物介导的效应功能所针对的RNA多核苷酸或RNA多核苷酸的一部分。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。靶序列可以是DNA。靶序列可以是任何RNA序列。在一些实施方案中，靶序列可以是选自由以下组成的组的RNA分子内的序列：信使RNA(mRNA)、前体mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小细胞核RNA(snRNA)、小细胞核RNA(snoRNA)、双链RNA(dsRNA)、非编码RNA(ncRNA)、长非编码RNA(lncRNA)和小细胞质RNA(scRNA)。在一些优选实施方案中，靶序列可以是选自由mRNA、前体mRNA和rRNA组成的组的RNA分子内的序列。在一些优选实施方案中，靶序列可以是选自由ncRNA和lncRNA组成的组的RNA分子内的序列。在一些更优选实施方案中，靶序列可以是mRNA分子或前体mRNA分子内的序列。
在一些实施方案中，选择核酸靶向向导RNA以降低RNA靶向向导RNA内的二级结构程度。在一些实施方案中，当最佳折叠时，核酸靶向向导RNA的约或小于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的核苷酸参与自身互补碱基配对。最佳折叠可以通过任何适合的多核苷酸折叠算法来确定。一些程序是基于计算最小吉布斯自由能(Gibbs free energy)。一种此类算法的实例是如Zuker和Stiegler(Nucleic Acids Res.9(1981),133-148)所描述的mFold。另一个示例性折叠算法是维也纳大学(University ofVienna)的理论化学研究所(Institute for Theoretical Chemistry)开发的使用质心结构预测算法的在线网络服务器RNAfold(参见例如A.R.Gruber等,2008,Cell 106(1):23-24；以及PA Carr和GM Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62)。
在某些实施方案中，向导RNA或crRNA可以包含正向重复(DR)序列和向导序列或间隔区序列，基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，向导RNA或crRNA可以包含融合或连接至向导序列或间隔区序列的正向重复序列，基本上由其组成，或由其组成。在某些实施方案中，正向重复序列可以位于向导序列或间隔区序列上游(即，5')。在其它实施方案中，正向重复序列可以位于向导序列或间隔区序列下游(即，3')。
在某些实施方案中，crRNA包含茎环，优选单个茎环。在某些实施方案中，正向重复序列形成茎环，优选单个茎环。
在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度为15至35nt。在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度为至少15个核苷酸，优选地至少18nt，例如至少19、20、21、22nt或更多nt。在某些实施方案中，间隔区长度为15至17nt，例如15、16或17nt；17至20nt，例如17、18、19或20nt；20至24nt，例如20、21、22、23或24nt；23至25nt，例如23、24或25nt；24至27nt，例如24、25、26或27nt；27-30nt，例如27、28、29或30nt；30-35nt，例如30、31、32、33、34或35nt；或35nt或更长。
在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度小于28个核苷酸。在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度为至少18个核苷酸并且小于28个核苷酸。在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度在19个与28个核苷酸之间。在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度在19个与25个核苷酸之间。在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度为20个核苷酸。在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度为23个核苷酸。在某些实施方案中，向导RNA的间隔区长度为25个核苷酸。
在典型CRISPR-Cas系统中，向导序列与其相应靶序列之间的互补程度可以为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或100％；向导或RNA或sgRNA的长度可以为约或大于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多核苷酸；或者，向导或RNA或sgRNA的长度可以小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少核苷酸。然而，本发明的一个方面是减少脱靶相互作用，例如，减少向导与具有低互补性的靶序列相互作用。确实，在实例中显示，本发明涉及使得CRISPR-Cas系统能够区分靶序列与具有大于80％至约95％互补性，例如83％-84％或88-89％或94-95％互补性的脱靶序列(例如，区分具有18个核苷酸的标靶与具有1个、2个或3个错配的18个核苷酸的脱靶)的突变。因此，在本发明的情形中，向导序列与其相应靶序列之间的互补程度大于94.5％或95％或95.5％或96％或96.5％或97％或97.5％或98％或98.5％或99％或99.5％或99.9％，或100％。脱靶小于100％或99.9％或99.5％或99％或99％或98.5％或98％或97.5％或97％或96.5％或96％或95.5％或95％或94.5％或94％或93％或92％或91％或90％或89％或88％或87％或86％或85％或84％或83％或82％或81％或80％的序列与向导之间的互补性，有利的是，脱靶为100％或99.9％或99.5％或99％或99％或98.5％或98％或97.5％或97％或96.5％或96％或95.5％或95％或94.5％的序列与向导之间的互补性。
在某些实施方案中，可以通过在间隔区序列与靶序列之间，包括沿着间隔区/标靶的错配位置引入错配，例如1个或多个错配，例如1个或2个错配来探索裂解效率的调节。举例来说，双重错配越处于中心(即，不是3'或5')，裂解效率越受影响。因此，通过选择沿着间隔区的错配位置，可以调节裂解效率。通过实例，如果需要小于100％的标靶裂解(例如在细胞群体中)，那么可以在间隔区序列中引入1个或多个，例如优选2个在间隔区与靶序列之间的错配。错配位置沿着间隔区越处于中心，裂解百分比越低。
在某些示例性实施方案中，可以探索裂解效率以设计单向导，所述单向导可以区分两种或更多种因单核苷酸，例如单核苷酸多态性(SNP)、变异或(点)突变而变化的标靶。CRISPR效应物可能对SNP(或其它单核苷酸变异)具有降低的灵敏度并且继续以某一效率水平使SNP标靶裂解。因此，对于两种标靶或一组标靶，向导RNA可以被设计成具有与标靶中的一种，即，中靶SNP互补的核苷酸序列。向导RNA被进一步设计成具有合成错配。如本文所用的“合成错配”是指非天然产生的错配，其在天然产生的SNP上游或下游，例如上游或下游至多5个核苷酸，例如上游或下游4个、3个、2个或1个核苷酸，优选地上游或下游至多3个核苷酸，更优选地上游或下游至多2个核苷酸，最优选地上游或下游1个核苷酸(即，邻近SNP)处引入。当CRISPR效应物结合至中靶SNP时，仅单错配将与合成错配一起形成，并且将继续活化CRISPR效应物并产生可检测信号。当向导RNA杂交至脱靶SNP时，将形成两个错配，来自SNP的错配和合成错配，并且不产生可检测信号。因此，本文所公开的系统可以被设计成区分群体内的SNP。举例来说，系统可以用于区分因单个SNP而不同的病原性株系或检测某些疾病特异性SNP，例如但不限于疾病相关SNP，例如但不限于癌症相关SNP。
在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得SNP位于间隔区序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30(以5'端为起点)上。在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得SNP位于间隔区序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8或9(以5'端为起点)上。在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得SNP位于间隔区序列的位置2、3、4、5、6或7(以5'端为起点)上。在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得SNP位于间隔区序列的位置3、4、5或6(以5'端为起点)上。在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得SNP位于间隔区序列的位置3(以5'端为起点)上。
在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得错配(例如合成错配，即，除SNP以外的额外突变)位于间隔区序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30(以5'端为起点)上。在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得错配位于间隔区序列的位置1、2、3、4、5、6、7、8或9(以5'端为起点)上。在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得错配位于间隔区序列的位置4、5、6或7(以5'端为起点)上。在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得错配位于间隔区序列的位置5(以5'端为起点)上。
在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得错配位于SNP上游2个核苷酸(即，一个间插核苷酸)。
在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得错配位于SNP下游2个核苷酸(即，一个间插核苷酸)。
在某些实施方案中，向导RNA被设计成使得错配位于间隔区序列的位置5(以5'端为起点)上并且SNP位于间隔区序列的位置3(以5'端为起点)上。
本文所描述的实施方案涵盖在如本文所论述的真核细胞中(体外，即，在分离的真核细胞中)诱导一个或多个核苷酸修饰，其包括向细胞递送如本文所论述的载体。一个或多个突变可以包括经由一个或多个向导RNA在细胞的每个靶序列处一个或多个核苷酸的引入、缺失或取代。突变可以包括经由一个或多个向导RNA在所述一个或多个细胞的每个靶序列处1-75个核苷酸的引入、缺失或取代。突变可以包括经由一个或多个向导RNA在所述一个或多个细胞的每个靶序列处1、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或75个核苷酸的引入、缺失或取代。突变可以包括经由一个或多个向导RNA在所述一个或多个细胞的每个靶序列处5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或75个核苷酸的引入、缺失或取代。突变包括经由一个或多个向导RNA在所述一个或多个细胞的每个靶序列处10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或75个核苷酸的引入、缺失或取代。突变可以包括经由一个或多个向导RNA在所述一个或多个细胞的每个靶序列处20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或75个核苷酸的引入、缺失或取代。突变可以包括经由一个或多个向导RNA在所述一个或多个细胞的每个靶序列处40、45、50、75、100、200、300、400或500个核苷酸的引入、缺失或取代。
通常，在内源CRISPR系统的情形中，CRISPR复合物(包含杂交至靶序列并且与一种或多种Cas蛋白质复合的向导序列)的形成使得靶序列中或附近(例如距其1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对以内)裂解，但可以取决于例如二级结构，尤其在RNA标靶的情况下。
基于RNA的掩蔽构建体
如本文所用的“掩蔽构建体”是指可以由本文所描述的活化的CRISPR系统效应蛋白裂解或以其它方式失活的分子。术语“掩蔽构建体”还可以替代地称作“检测构建体”。在某些示例性实施方案中，掩蔽构建体是基于RNA的掩蔽构建体。掩蔽构建体防止阳性可检测信号的产生或检测。阳性可检测信号可以是使用本领域中已知的光学、荧光、化学发光、电化学或其它检测方法可以检测的任何信号。掩蔽构建体可以防止可检测的阳性信号的产生或掩蔽可检测的阳性信号的存在，直至将掩蔽构建体去除或以其它方式沉默。术语“阳性可检测信号”用于区别于可以在掩蔽构建体的存在下可检测的其它可检测信号。举例来说，在某些实施方案中，当掩蔽剂存在时可以检测第一信号(即，阴性可检测信号)，然后在检测靶分子并且由活化的CRISPR效应蛋白使掩蔽剂裂解或失活后转变成第二信号(例如阳性可检测信号)。
在某些示例性实施方案中，掩蔽构建体可以抑制基因产物的产生。基因产物可以由添加至样品中的报告子构建体编码。掩蔽构建体可以是RNA干扰途径中所涉及的干扰RNA，例如shRHN或siRNA。掩蔽构建体还可以包含微小RNA(miRNA)。当存在时，掩蔽构建体抑制基因产物的表达。基因产物可以是假若不存在掩蔽构建体，将由标记的探针或抗体以其它方式可检测的荧光蛋白或其它RNA转录物或蛋白质。在效应蛋白活化后，使掩蔽构建体裂解或以其它方式沉默，从而允许作为阳性可检测信号对基因产物进行表达和检测。
在某些示例性实施方案中，掩蔽构建体可以螯合一种或多种产生可检测的阳性信号所需的试剂，以使得一种或多种试剂从掩蔽构建体释放促使可检测的阳性信号产生。一种或多种试剂可以组合产生比色信号、化学发光信号、荧光信号或任何其它可检测信号，并且可以包含已知适合于此种目的的任何试剂。在某些示例性实施方案中，一种或多种试剂是由结合所述一种或多种试剂的RNA适体螯合。当在检测靶分子后活化效应蛋白时释放一种或多种试剂。在某些示例性实施方案中，一种或多种试剂是能够有助于产生可检测信号，例如比色、化学发光或荧光信号的蛋白质，例如酶，其受抑制或螯合以使得所述蛋白质无法通过一种或多种RNA适体结合至蛋白质而产生可检测信号。在本文所公开的效应蛋白活化后，使RNA适体裂解或降解至其不再抑制蛋白质产生可检测信号的能力的程度。在某些示例性实施方案中，适体是凝血酶抑制剂适体。在某些示例性实施方案中，凝血酶抑制剂适体具有序列GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC(SEQ ID NO:414)。当使这种适体裂解时，凝血酶将变得有活性并且将使肽比色或荧光底物裂解。在某些示例性实施方案中，比色底物是共价连接至凝血酶的肽底物的对硝基酰苯胺(pNA)。在由凝血酶裂解后，pNA被释放并且颜色变成黄色并且对眼睛轻易可见。在某些示例性实施方案中，荧光底物是可以使用荧光检测器检测的7-氨基-4-甲基香豆素蓝色荧光团。在上文所列出的一般原理内，抑制性适体还可以用于辣根过氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶或小牛碱性磷酸酶(CAP)。
在某些实施方案中，经由酶抑制适体的裂解以比色法检测RNA酶活性。使RNA酶活性转变成比色信号的一种潜在模式是使RNA适体的裂解与能够产生比色输出的酶的再活化相结合。在不存在RNA裂解的情况下，完整适体将结合至酶标靶并且抑制其活性。这种读出系统的优点是酶提供额外扩增步骤：一旦经由附带活性(例如Cas13a附带活性)从适体释放，比色酶将继续产生比色产物，引起信号倍增。
在某些实施方案中，使用具有比色读出的抑制酶的现有适体。具有比色读出的若干适体/酶对存在，例如凝血酶、蛋白质C、中心粒细胞弹性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶(substilisin)。这些蛋白酶具有基于pNA的比色底物并且商购可得。在某些实施方案中，使用靶向常用比色酶的新颖适体。常用和稳固的酶，例如β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或小牛肠碱性磷酸酶，可以由通过例如SELEX的选择策略而设计的工程改造的适体靶向。此类策略允许快速选择具有纳摩尔结合效率的适体并且可以用于开发额外酶/适体对以供比色读出。
在某些实施方案中，经由RNA限定的抑制剂的裂解以比色法检测RNA酶活性。许多常用比色酶具有竞争性、可逆性抑制剂：例如，β-半乳糖苷酶可以由半乳糖抑制。许多这些抑制剂是弱的，但其作用可以通过局部浓度的增加而增加。通过使抑制剂的局部浓度与RNA酶活性相关联，比色酶和抑制剂对可以工程改造至RNA酶传感器中。基于小分子抑制剂的比色RNA酶传感器涉及三种组分：比色酶、抑制剂，以及共价连接至抑制剂与酶，从而将抑制剂限定于酶的桥连RNA。在未裂解的构造中，由小分子的局部浓度增加来抑制酶；当使RNA裂解(例如通过Cas13a附带裂解)时，抑制剂将释放并且将活化比色酶。
在某些实施方案中，经由G-四链体的形成和/或活化以比色法检测RNA酶活性。DNA中的G四链体可以与亚铁血红素(铁(III)-原卟啉IX)复合以形成具有过氧化物酶活性的DNAzyme。当与过氧化物酶底物(例如ABTS：(2,2'-连氮基双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐))一起提供时，G-四链体-亚铁血红素复合物在过氧化氢存在下使底物氧化，然后在溶液中形成绿色。示例性G-四链体形成DNA序列是：GGGTAGGGCGGGTTGGGA(SEQ.ID.No.415)。通过使RNA序列杂交至这种DNA适体，将限制G-四链体结构的形成。RNA酶附带活化(例如C2c2-复合物附带活化)后，将使RNA钉裂解，从而允许G四链体形成并且亚铁血红素结合。这种策略尤其有吸引力，这是因为颜色形成是酶促的，意味着存在除RNA酶活化以外的额外扩增。
在某些示例性实施方案中，掩蔽构建体可以固定于固体衬底上的个别离散容积(下文进一步定义)中并且螯合单一试剂。举例来说，试剂可以是包含染料的珠粒。当由固定的试剂螯合时，个别珠粒太过分散而无法产生可检测信号，但从掩蔽构建体释放后能够产生可检测信号，例如通过溶液浓度的聚集或简单增加。在某些示例性实施方案中，固定的掩蔽剂是基于RNA的适体，其可以在检测靶分子后由活化的效应蛋白裂解。
在某些其它示例性实施方案中，掩蔽构建体结合至溶液中固定的试剂，从而阻断试剂结合至溶液中游离的单独标记的结合伴侣的能力。因此，在将洗涤步骤应用于样品后，可以在不存在靶分子的情况下从样品中洗去标记的结合伴侣。然而，如果活化效应蛋白，那么掩蔽构建体裂解至足以干扰掩蔽构建体结合试剂的能力的程度，从而允许标记的结合伴侣结合至固定的试剂。因此，标记的结合伴侣在洗涤步骤之后保留，指示样品中靶分子的存在。在某些方面，结合固定的试剂的掩蔽构建体是RNA适体。固定的试剂可以是蛋白质，并且标记的结合伴侣可以是标记的抗体。或者，固定的试剂可以是抗生物素蛋白链菌素，并且标记的结合伴侣可以是标记的生物素。用于上述实施方案中的结合伴侣上的标记可以是本领域中已知的任何可检测标记。另外，可以根据此处所描述的总体设计使用其它已知结合伴侣。
在某些示例性实施方案中，掩蔽构建体可以包含核糖酶。核糖酶是具有催化特性的RNA分子。天然与工程改造的核糖酶均包含RNA或由RNA组成，其可以由本文所公开的效应蛋白靶向。可以选择或工程改造核糖酶以催化产生阴性可检测信号或防止阳性对照信号产生的反应。在由活化的效应蛋白分子使核糖酶失活后，去除产生阴性对照信号或防止阳性可检测信号产生的反应，从而允许检测阳性可检测信号。在一个示例性实施方案中，核糖酶可以催化比色反应，使得溶液呈现第一种颜色。当使核糖酶失活时，溶液然后变成第二种颜色，第二种颜色是可检测的阳性信号。核糖酶可以如何用于催化比色反应的实例在Zhao等"Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS",Biosens Bioelectron.2014；16:337-42中描述，并且提供了可以如何修饰此种系统以在本文所公开的实施方案的情形中起作用的实例。或者，核糖酶当存在时可以产生例如RNA转录物的裂解产物。因此，阳性可检测信号的检测可以包括仅在不存在核糖酶的情况下产生的非裂解RNA转录物的检测。
在一个示例性实施方案中，掩蔽构建体包含取决于检测剂在溶液中聚集还是分散而变色的检测剂。举例来说，某些纳米颗粒，例如胶体金，当其从聚集体移动至分散的颗粒时经历可见的紫色至红色的颜色偏移。因此，在某些示例性实施方案中，此类检测剂可以由一个或多个桥连分子保持呈聚集体。参见例如图43。桥连分子的至少一部分包含RNA。在本文所公开的效应蛋白活化后，使桥连分子的RNA部分裂解，从而允许检测剂分散并且引起颜色的相应变化。参见例如图45。在某些示例性实施方案中，桥连分子是RNA分子。在某些示例性实施方案中，检测剂是胶体金属。胶体金属材料可以包括分散于液体、水溶胶或金属溶胶中的非水溶性金属颗粒或金属化合物。胶体金属可以选自周期表的IA、IB、IIB和IIIB族金属，以及过渡金属，尤其VIII族的那些。优选金属包括金、银、铝、钌、锌、铁、镍和钙。其它适合的金属还包括以下所有的其各种氧化态：锂、钠、镁、钾、钪、钛、钒、铬、锰、钴、铜、镓、锶、铌、钼、钯、铟、锡、钨、铼、铂和钆。金属优选地以来源于适当金属化合物的离子形式提供，例如A13+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+和Ca2+离子。
当由活化的CRISPR效应物切割RNA桥时，观测到前述颜色偏移。在某些示例性实施方案中，颗粒是胶体金属。在某些其它示例性实施方案中，胶体金属是胶体金。在某些示例性实施方案中，胶体纳米颗粒是15nm金纳米颗粒(AuNP)。归因于胶体金纳米颗粒的独特表面特性，当完全分散于溶液中时在520nm下观测到最大吸光度并且肉眼看来颜色呈红色。AuNP聚集后，其展现最大吸光度的红色偏移并且呈现更深的颜色，最终以深紫色聚集体从溶液中沉淀。在某些示例性实施方案中，对纳米颗粒进行修饰以包括从纳米颗粒的表面延伸的DNA连接子。个别颗粒由在RNA的每一端杂交至DNA连接子的至少一部分的单链RNA(ssRNA)桥连接在一起。因此，纳米颗粒将形成连接的颗粒和聚集体的网，呈现为深色沉淀物。本文所公开的CRISPR效应物活化后，将使ssRNA桥裂解，从连接的网格释放AU NP并且产生可见的红色。下文列出示例性DNA连接子和RNA桥序列。在DNA连接子末端的硫醇连接子可以用于表面缀合至AuNP。可以使用其它形式的缀合。在某些示例性实施方案中，可以产生的AuNP的两个群体，每个DNA连接子有一个。这将帮助促进具有适当定向的ssRNA桥的适当结合。在某些示例性实施方案中，第一DNA连接子由3'端缀合，而第二DNA连接子由5'端缀合。
表6
Figure BDA0002275597970000741
在一些实施方案中，核酸靶向系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR RNA靶向系统的特定生物体。在某些实施方案中，CRISPR RNA靶向系统在真杆菌属和瘤胃球菌属(Ruminococcus)中发现。在某些实施方案中，效应蛋白包含靶向和附带的ssRNA裂解活性。在某些实施方案中，效应蛋白包含双重HEPN结构域。在某些实施方案中，效应蛋白缺乏与Cas13a的螺旋-1结构域的配对物。在某些实施方案中，效应蛋白小于中值大小为928aa的先前表征的2类CRISPR效应物。这个中值大小为190aa(17％)，小于Cas13c的中值大小；大于200aa(18％)，小于Cas13b的中值大小；并且大于300aa(26％)，小于Cas13a的中值大小。在某些实施方案中，效应蛋白对侧接序列无要求(例如PFS、PAM)。
在某些实施方案中，效应蛋白基因座结构包括含有WYL结构域的辅助蛋白(因此在这些结构域的原始鉴别组中保守的三个氨基酸之后指示；参见例如WYL结构域IPR026881)。在某些实施方案中，WYL结构域辅助蛋白包含至少一个螺旋-转角-螺旋(HTH)或飘带-螺旋-螺旋(RHH)DNA结合结构域。在某些实施方案中，含有WYL结构域的辅助蛋白增加RNA靶向效应蛋白的靶向与附带的ssRNA裂解活性。在某些实施方案中，含有WYL结构域的辅助蛋白包含N端RHH结构域，以及主要疏水性保守残基的模式，包括对应于原始WYL基序的不变酪氨酸-亮氨酸双联体。在某些实施方案中，含有WYL结构域的辅助蛋白是WYL1。WYL1是主要与瘤胃球菌属相关联的单WYL结构域蛋白质。
在其它示例性实施方案中，VI型RNA靶向Cas酶是Cas 13d。在某些实施方案中，Cas13d是惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)DSM15702(EsCas13d)或瘤胃球菌属N15.MGS-57(RspCas13d)(参见例如Yan等,Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPREffector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein,Molecular Cell(2018),doi.org/10.1016/j.molcel.2018.02.028)。RspCas13d和EsCas13d并无侧接序列要求(例如PFS、PAM)。
在某些其它示例性实施方案中，掩蔽构建体可以包含可检测标记和那个可检测标记的掩蔽剂所附接的RNA寡核苷酸。此种可检测标记/掩蔽剂对的实例是荧光团和荧光团淬灭剂。荧光团的淬灭可以作为荧光团与另一荧光团或非荧光分子之间形成非荧光复合物的结果而发生。已知这种机制是基态复合物形成、静态淬灭或接触淬灭。因此，RNA寡核苷酸可以被设计成使得荧光团和淬灭剂足够接近以使接触淬灭发生。荧光团和其相关淬灭剂在本领域中是已知的并且可以出于此种目的由本领域普通技术人员来选择。特定荧光团/淬灭剂对在本发明的情形中不是关键的，只要荧光团/淬灭剂对的选择确保荧光团的掩蔽。本文所公开的效应蛋白活化后，使RNA寡核苷酸裂解，从而切断维持接触淬灭效应所需的荧光团与淬灭剂之间的接近性。因此，荧光团的检测可以用于确定样品中靶分子的存在。
在某些其它示例性实施方案中，掩蔽构建体可以包含一个或多个金属纳米颗粒，例如金纳米颗粒所附接的一个或多个RNA寡核苷酸。在一些实施方案中，掩蔽构建体包含由多个RNA寡核苷酸交联形成闭合环的多个金属纳米颗粒。在一个实施方案中，掩蔽构建体包含由三个RNA寡核苷酸交联形成闭合环的三个金纳米颗粒。在一些实施方案中，由CRISPR效应蛋白对RNA寡核苷酸的裂解使得由金属纳米颗粒产生可检测信号。
在某些其它示例性实施方案中，掩蔽构建体可以包含一个或多个量子点所附接的一个或多个RNA寡核苷酸。在一些实施方案中，由CRISPR效应蛋白对RNA寡核苷酸的裂解使得由量子点产生可检测信号。
在一个示例性实施方案中，掩蔽构建体可以包含量子点。量子点可以具有多个附接至表面的连接子分子。连接子分子的至少一部分包含RNA。连接子分子在一端附接至量子点并且沿着连接子的长度或在末端附接至一个或多个淬灭剂以使得淬灭剂维持足够接近以使量子点的淬灭发生。连接子可以是分支的。如上所述，量子点/淬灭剂对不是关键的，只要量子点/淬灭剂对的选择确保荧光团的掩蔽。量子点和其相关淬灭剂在本领域中是已知的并且可以出于此种目的由本领域普通技术人员来选择。本文所公开的效应蛋白活化后，使连接子分子的RNA部分裂解，从而消除维持淬灭效应所需的量子点与一个或多个淬灭剂之间的接近性。在某些示例性实施方案中，量子点是缀合的抗生物素蛋白链菌素。RNA经由生物素连接子附接并且募集具有序列/5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/(SEQ ID NO:416)或/5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/(SEQ ID NO:417)的淬灭分子，其中/5Biosg/是生物素标签并且/3lAbRQSp/是Iowa黑色淬灭剂。由本文所公开的活化的效应物裂解后，量子点将可见地发荧光。
以类似方式，荧光能量转移(FRET)可以用于产生可检测的阳性信号。FRET是无辐射过程，通过这个过程，来自能量激发的荧光团(即，“供体荧光团”)的光子使另一个分子(即，“接受体”)中的电子能态提升至激发单重态的更高振动能级。供体荧光团返回至基态而不发射那个荧光团的特征荧光。接受体可以是另一个荧光团或非荧光分子。如果接受体是荧光团，那么转移的能量作为那个荧光团的特征荧光而发射。如果接受体是非荧光分子，那么吸收的能量作为热量而损失。因此，在本文所公开的实施方案的情形中，荧光团/淬灭剂对用附接至寡核苷酸分子的供体荧光团/接受体对替换。当完整时，掩蔽构建体产生如由从接受体发射的荧光或热量检测的第一信号(阴性可检测信号)。本文所公开的效应蛋白活化后，使RNA寡核苷酸裂解并且破坏FRET以使得现在检测供体荧光团的荧光(阳性可检测信号)。
在某些示例性实施方案中，掩蔽构建体包含对长RNA裂解成短核苷酸作出反应而使吸光度变化的嵌入染料的使用。若干此类染料存在。举例来说，焦宁-Y(pyronine-Y)将与RNA复合并且形成在572nm下具有吸光度的复合物。RNA的裂解使吸光度损失和颜色变化。亚甲基蓝可以按类似方式使用，在RNA裂解后688nm下的吸光度变化。因此，在某些示例性实施方案中，掩蔽构建体包含RNA和嵌入染料复合物，在由本文所公开的效应蛋白使RNA裂解后其吸光度变化。
扩增
在某些示例性实施方案中，在活化CRISPR效应蛋白之前可以扩增靶RNA和/或DNA。可以使用任何适合的RNA或DNA扩增技术。在某些示例性实施方案中，RNA或DNA扩增是等温扩增。在某些示例性实施方案中，等温扩增可以是基于核酸序列的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)或切口酶扩增反应(NEAR)。在某些示例性实施方案中，可以使用非等温扩增方法，包括但不限于PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)或分枝扩增方法(RAM)。
在某些示例性实施方案中，RNA或DNA扩增是基于核酸序列的扩增NASBA，其通过序列特异性反向引物对靶RNA的逆转录起始以建立RNA/DNA双链体。RNA酶H然后用于使RNA模板降解，从而允许含有启动子，例如T7启动子的正向引物结合互补链并起始互补链的延长，产生双链DNA产物。RNA聚合酶启动子介导的DNA模板转录然后建立靶RNA序列的拷贝。重要的是，新靶RNA中的每一个可以由向导RNA检测，由此进一步增强测定的灵敏度。靶RNA由向导RNA结合然后使得CRISPR效应蛋白活化并且方法如上文所概述继续进行。NASBA反应具有能够在适度等温条件下，例如在约41℃下继续进行的额外优点，使其适合于用于在实地和远离临床实验室的早期和直接检测而部署的系统和装置。
在某些其它示例性实施方案中，重组酶聚合酶扩增(RPA)反应可以用于扩增靶核酸。RPA反应采用能够使序列特异性引物与双链体DNA中的同源序列配对的重组酶。如果存在靶DNA，那么起始DNA扩增并且不需要其它样品操作，例如热循环或化学熔融。整个RPA扩增系统呈干燥的配方而稳定并且无需冷冻即可以安全地运输。RPA反应还可以在等温温度下进行，其中最佳反应温度为37-42℃。序列特异性引物被设计成扩增包含有待检测的靶核酸序列的序列。在某些示例性实施方案中，将RNA聚合酶启动子，例如T7启动子添加至引物中的一个。这得到包含靶序列和RNA聚合酶启动子的扩增的双链DNA产物。在RPA反应之后或期间，添加RNA聚合酶，这将从双链DNA模板产生RNA。然后继而可以由CRISPR效应系统检测扩增的靶RNA。以这种方式，可以使用本文所公开的实施方案检测靶DNA。RPA反应还可以用于扩增靶RNA。首先使用逆转录酶使靶RNA转变成cDNA，继之以第二链DNA合成，届时RPA反应如上文所概述继续进行。
因此，在某些示例性实施方案中，本文所公开的系统可以包括扩增试剂。本文描述了适用于核酸扩增的不同组分或试剂。举例来说，如本文所描述的扩增试剂可以包括缓冲剂，例如Tris缓冲剂。Tris缓冲剂可以在适于所需应用或用途的任何浓度下使用，例如包括但不限于1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、25mM、50mM、75mM、1M等浓度。本领域技术人员将能够确定用于本发明的缓冲剂(例如Tris)的适当浓度。
扩增反应，例如PCR中可以包括盐，例如氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)或氯化钠(NaCl)，以改善核酸片段的扩增。尽管盐浓度将取决于特定反应和应用，但在一些实施方案中，特定大小的核酸片段在特定盐浓度下可能产生最佳结果。较大产物可能需要改变的盐浓度，通常是较低盐，以产生所需结果，而较小产物的扩增在较高盐浓度下可能产生较佳结果。本领域技术人员将了解，盐的存在和/或浓度以及盐浓度的改变可以改变生物或化学反应的严格度，并且因此可以使用为本发明和如本文所描述的反应提供适当条件的任何盐。
生物或化学反应的其它组分可以包括细胞裂解组分以使细胞破开或溶解以供分析其中的物质。细胞裂解组分可以包括但不限于洗涤剂；如上文所描述的盐，例如NaCl、KCl、硫酸铵[(NH4)2SO4]；或其它。可以适于本发明的洗涤剂可以包括Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲铵基]-1-丙磺酸盐)、乙基三甲基溴化铵、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)。洗涤剂的浓度可以取决于特定应用，并且在一些情况下可以特定针对反应。扩增反应可以包括在适于本发明的任何浓度下使用的dNTP和核酸引物，例如包括但不限于100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM等浓度。同样地，根据本发明适用的聚合酶可以是本领域中已知并且适用于本发明的任何特异性或一般聚合酶，包括Taq聚合酶、Q5聚合酶等。
在一些实施方案中，如本文所描述的扩增试剂可以适用于热启动扩增中。热启动扩增在一些实施方案中可以有益于减少或消除衔接分子或寡核苷酸的二聚，或以其它方式防止不合需要的扩增产物或人造物并且获得所需产物的最佳扩增。用于扩增中的本文所描述的许多组分也可以用于热启动扩增中。在一些实施方案中，视情况而定，适用于热启动扩增的试剂或组分可以替代组成组分中的一种或多种而使用。举例来说，可以使用在特定温度或其它反应条件下展现所需活性的聚合酶或其它试剂。在一些实施方案中，可以使用经过设计或优化以用于热启动扩增中的试剂，例如，在转座之后或在达到特定温度之后可以使聚合酶活化。此类聚合酶可以基于抗体或基于适体。如本文所描述的聚合酶在本领域中是已知的。此类试剂的实例可以包括但不限于热启动聚合酶、热启动dNTP和光笼化dNTP。此类试剂在本领域中是已知和可得的。本领域技术人员将能够确定适于个别试剂的最佳温度。
核酸扩增可以使用特定热循环机器或设备进行，并且可以在单个反应中或成批进行，以便可以同时进行任何所需数目的反应。在一些实施方案中，扩增可以使用微流体或机器人装置进行，或可以使用温度的手动改变来进行以达成所需扩增。在一些实施方案中，可以进行优化以获得用于特定应用或材料的最佳反应条件。本领域技术人员将了解并且能够优化反应条件以获得足够的扩增。
在某些实施方案中，使用本发明的方法或系统的DNA检测需要在检测之前(扩增的)DNA转录成RNA。
靶RNA/DNA富集
在某些示例性实施方案中，在靶RNA或DNA的检测或扩增之前可以首先富集靶RNA或DNA。在某些示例性实施方案中，通过靶核酸由CRISPR效应系统结合来达成这种富集。
当前标靶特异性富集方案需要在与探针杂交之前的单链核酸。作为各种优点之一，本发明实施方案可以跳过这个步骤并且能够直接靶向双链DNA(部分或完全双链)。另外，本文所公开的实施方案是酶驱动的靶向方法，其提供更快的动力学和更简单的动作流程，从而允许等温富集。在某些示例性实施方案中，富集可以在20-37℃之间发生。在某些示例性实施方案中，在单个测定中使用一组针对不同靶核酸的向导RNA，从而允许检测多个标靶和/或单个标靶的多个变体。
在某些示例性实施方案中，死CRISPR效应蛋白可以结合溶液中的靶核酸并且随后从所述溶液中分离。举例来说，可以使用特异性地结合死CRISPR效应蛋白的抗体或其它分子，例如适体从溶液中分离结合至靶核酸的死CRISPR效应蛋白。
在其它示例性实施方案中，死CRISPR效应蛋白可以结合至固体衬底。固定衬底可以指适于附接多肽或多核苷酸或可以被修饰成适于附接多肽或多核苷酸的任何材料。可能的衬底包括但不限于玻璃和改性功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯以及苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM等)、多糖、尼龙或硝化纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、光纤束和多种其它聚合物。在一些实施方案中，固体支撑体包括适合于分子按有序图案固定的图案化表面。在某些实施方案中，图案化表面是指不同区在固体支撑体的暴露层中或上的排列。在一些实施方案中，固体支撑体包括表面中的孔或凹处的阵列。固体支撑体的组成和几何形状可以随着其用途而改变。在一些实施方案中，固体支撑体是平面结构，例如载片、芯片、微芯片和/或阵列。因而，衬底的表面可以呈平面层的形式。在一些实施方案中，固体支撑体包括流动池的一个或多个表面。如本文所用的术语“流动池”是指包括固体表面的腔室，一种或多种流体试剂可以跨越所述固体表面流动。可以易于在本公开的方法中使用的示例性流动池和相关流体系统和检测平台例如在以下文献中描述：Bentley等Nature456:53-59(2008)；WO 04/0918497；U.S.7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；U.S.7,405,281；以及US 2008/0108082。在一些实施方案中，固体支撑体或其表面是非平面的，例如管或容器的内表面或外表面。在一些实施方案中，固体支撑体包括微球或珠粒。“微球”、“珠粒”、“颗粒”意图指在固体衬底的情形内由包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃和聚苯乙烯的各种材料制成的平均小离散颗粒。在某些实施方案中，微球是磁性微球或珠粒。替代地或另外，珠粒可以是多孔的。珠粒大小在纳米(例如100nm)至毫米(例如1mm)的范围内。
含有或疑似含有靶核酸的样品然后可以暴露于衬底以允许靶核酸结合至已结合的死CRISPR效应蛋白。然后可以洗去非靶分子。在某些示例性实施方案中，然后可以从CRISPR效应蛋白/向导RNA复合物释放靶核酸用于使用本文所公开的方法的进一步检测。在某些示例性实施方案中，如本文所描述可以首先扩增靶核酸。
在某些示例性实施方案中，CRISPR效应物可以用结合标签作标记。在某些示例性实施方案中，CRISPR效应物可以用化学方式加标签。举例来说，CRISPR效应物可以用化学方式生物素化。在另一个示例性实施方案中，可以通过将编码融合物的额外序列添加至CRISPR效应物来建立融合物。此种融合物的一个实例是AviTagTM，其采用独特的15个氨基酸肽标签上的单个生物素的高度靶向酶促缀合。在某些实施方案中，CRISPR效应物可以用捕获标签作标记，例如但不限于GST、Myc、血球凝集素(HA)、绿色荧光蛋白(GFP)、flag、His标签、TAP标签和Fc标签。结合标签，无论是融合物、化学标签还是捕获标签，一旦其已经结合靶核酸或用以将CRISPR效应系统固定于固体衬底上，可以用于拉下CRISPR效应系统。
在某些示例性实施方案中，向导RNA可以用结合标签作标记。在某些示例性实施方案中，整个向导RNA可以使用合并一个或多个生物素化核苷酸，例如生物素化尿嘧啶的体外转录(IVT)作标记。在一些实施方案中，可以将生物素用化学方式或酶促方式添加至向导RNA，例如，将一个或多个生物素基团添加至向导RNA的3'端。在结合已经发生，例如通过使向导RNA/靶核酸暴露于抗生物素蛋白链菌素涂布的固体衬底之后，结合标签可以用于拉下向导RNA/靶核酸复合物。
因此，在某些示例性实施方案中，工程改造或非天然产生的CRISPR效应物可以用于富集目的。在实施方案中，修饰可以包括效应蛋白的一个或多个氨基酸残基的突变。一个或多个突变可以在效应蛋白的一个或多个催化活性结构域中。效应蛋白与缺乏所述一个或多个突变的效应蛋白相比可以具有降低或消除的核酸酶活性。效应蛋白可能不引导所关注的靶基因座处RNA链的裂解。在优选实施方案中，一个或多个突变可以包括两个突变。在优选实施方案中，在C2c2效应蛋白，例如工程改造或非天然产生的效应蛋白或C2c2中修饰一个或多个氨基酸残基。在特定实施方案中，一个或多个修饰的突变氨基酸残基是C2c2中对应于R597、H602、R1278和H1283(涉及Lsh C2c2氨基酸)的那些残基中的一个或多个，例如突变R597A、H602A、R1278A和H1283A，或Lsh C2c2直系同源物中的相应氨基酸残基。
在特定实施方案中，一个或多个修饰的突变氨基酸残基是C2c2中对应于以下的那些残基中的一个或多个：根据C2c2一致编号，K2、K39、V40、E479、L514、V518、N524、G534、K535、E580、L597、V602、D630、F676、L709、I713、R717(HEPN)、N718、H722(HEPN)、E773、P823、V828、I879、Y880、F884、Y997、L1001、F1009、L1013、Y1093、L1099、L1111、Y1114、L1203、D1222、Y1244、L1250、L1253、K1261、I1334、L1355、L1359、R1362、Y1366、E1371、R1372、D1373、R1509(HEPN)、H1514(HEPN)、Y1543、D1544、K1546、K1548、V1551、I1558。在某些实施方案中，一个或多个修饰的突变氨基酸残基是C2c2中对应于R717和R1509的那些残基中的一个或多个。在某些实施方案中，一个或多个修饰的突变氨基酸残基是C2c2中对应于K2、K39、K535、K1261、R1362、R1372、K1546和K1548的那些残基中的一个或多个。在某些实施方案中，所述突变使得蛋白质具有改变或修饰的活性。在某些实施方案中，所述突变使得蛋白质具有降低的活性，例如降低的特异性。在某些实施方案中，所述突变使得蛋白质不具有催化活性(即，“死”C2c2)。在实施方案中，所述氨基酸残基对应于Lsh C2c2氨基酸残基，或来自不同种类的C2c2蛋白质的相应氨基酸残基。可以促进这些步骤的装置。
上述富集系统还可以用于耗尽某些核酸的样品。举例来说，向导RNA可以被设计成结合非靶RNA以从样品中去除非靶RNA。在一个示例性实施方案中，向导RNA可以被设计成结合确实携带特定核酸变异的核酸。举例来说，在给定的样品中，可以预期非变体核酸的较高拷贝数。因此，本文所公开的实施方案可以用于从样品中去除非变体核酸，以增加检测CRISPR效应系统可以检测给定样品中的靶变体序列的效率。
蛋白质检测
本文所公开的系统、装置和方法经由合并特异性构造的多肽检测适体可以适应于除核酸检测以外的多肽(或其它分子)的检测。多肽检测适体不同于上文所论述的掩蔽构建体适体。首先，适体被设计成特异性地结合至一种或多种靶分子。在一个示例性实施方案中，靶分子是靶多肽。在另一个示例性实施方案中，靶分子是靶化合物，例如靶治疗分子。设计和选择对给定标靶具有特异性的适体的方法，例如SELEX，在本领域中是已知的。除了对给定标靶的特异性以外，适体被进一步设计成合并RNA聚合酶启动子结合位点。在某些示例性实施方案中，RNA聚合酶启动子是T7启动子。在结合至标靶之前，RNA聚合酶位点对RNA聚合酶是不可及的或以其它方式不可识别。然而，适体被构造成使得在结合标靶后，适体的结构经历构象变化以便暴露RNA聚合酶启动子。在RNA聚合酶启动子下游的适体序列充当模板用于由RNA聚合酶产生触发RNA寡核苷酸。因此，适体的模板部分还可以合并鉴别给定适体和其标靶的条形码或其它鉴别序列。如上文所描述的向导RNA然后可以被设计成识别这些特异性触发寡核苷酸序列。向导RNA结合至触发寡核苷酸会活化CRISPR效应蛋白，其继而使掩蔽构建体失活并且产生如先前所描述的阳性可检测信号。
因此，在某些示例性实施方案中，本文所公开的方法包括以下额外步骤：将样品或样品组分配至一组个别离散容积中，每个个别离散容积包含肽检测适体、CRISPR效应蛋白、一种或多种向导RNA、掩蔽构建体；以及在足以允许肽检测适体结合至一种或多种靶分子的条件下孵育样品或样品组，其中适体结合至相应标靶暴露RNA聚合酶启动子结合位点，使得经由RNA聚合酶结合至RNA聚合酶启动子结合位点来合成触发RNA。
在另一个示例性实施方案中，在适体结合至靶多肽后，适体的结合可以暴露引物结合位点。举例来说，适体可以暴露RPA引物结合位点。因此，引物的添加或包括然后将送入扩增反应中，例如上文所概述的RPA反应。
在某些示例性实施方案中，适体可以是构象转换适体，其在结合至所关注的标靶后可以改变二级结构并且暴露单链DNA的新区域。在某些示例性实施方案中，单链DNA的这些新区域可以用作接合的衬底，从而延长适体并且建立使用本文所公开的实施方案可以特异性检测的更长ssDNA分子。适体设计可以与三元复合物进一步组合用于低表位标靶，例如葡萄糖的检测(Yang等2015:http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ acs.analchem.5b01634)。示例性构象转变适体和相应向导RNA(crRNA)在下表7中示出。
表7
Figure BDA0002275597970000851
Figure BDA0002275597970000861
装置
本文所描述的系统可以在诊断装置上体现。可以使用能够在装置内界定多个个别离散容积的装置的许多衬底和构造。如本文所用的“个别离散容积”是指离散空间，例如容器、接受器，或由防止和/或抑制靶分子迁移的特性界定的其它任意界定的容积或空间，例如，由物理特性界定的容积或空间，例如壁，例如孔、管的壁或微滴的表面，其可以是非渗透性或半渗透性的，或如由其它方式，例如化学、扩散率限制、电磁或光照明界定，或可以含有靶分子和可加索引的核酸标识符(例如核酸条形码)的其任何组合。“扩散率限制”(例如扩散界定的容积)意指仅对某些分子或反应可及的空间，这是因为扩散约束有效地界定空间或容积，对于两个平行层流的情况将是如此，其中扩散将限制靶分子从一个流迁移至另一个流。“化学”界定的容积或空间意指仅某些靶分子由于其化学或分子特性(例如大小)而可以存在的空间，其中例如凝胶珠粒可以排除某些物质进入珠粒而不排除其它，例如通过可以允许选择可以进入珠粒内部的物质的珠粒的表面电荷、矩阵大小或其它物理特性。“电磁”界定的容积或空间意指靶分子或其支撑体的电磁特性，例如电荷或磁性特性可以用于界定空间中的某些区域，例如在磁场内或直接在磁体上捕获磁性颗粒的空间。“光学”界定的容积意指可以通过用可见、紫外、红外或其它波长的光照明以使得界定的空间或容积内仅靶分子可以作标记的空间的任何区域。一种使用非壁或半渗透性离散容积的优点在于一些试剂，例如缓冲剂、化学活化剂或其它剂可以穿过离散容积，而其它材料，例如靶分子可以维持于离散容积或空间中。通常，离散容积将包括流体介质(例如水溶液、油、缓冲剂和/或能够支持细胞生长的培养基)，其适合于在允许标记的条件下用可加索引的核酸标识符对靶分子作标记。适用于所公开的方法中的例示性离散容积或空间尤其包括微滴(例如微流体微滴和/或乳液微滴)、水凝胶珠粒或其它聚合物结构(例如聚乙二醇二丙烯酸酯珠粒或琼脂糖珠粒)、组织载片(例如，具有由化学、光学或物理方式界定的特定区域、容积或空间的固定福尔马林石蜡包埋组织载片)、具有通过将试剂以有序阵列或随机图案沉积而界定的区域的显微镜载片、管(例如离心管、微量离心管、试管、比色皿、锥形管等)、瓶(例如玻璃瓶、塑料瓶、陶瓷瓶、爱伦美氏烧瓶(Erlenmeyer flask)、闪烁小瓶等)、孔(例如板中的孔)、板、吸液管或吸液头。在某些实施方案中，区室是油包水乳液中的水性微滴。在特定实施方案中，需要精确或均匀容积的本文所描述的应用、方法或系统中的任一个可以采取使用声学液体分配器。
在某些示例性实施方案中，装置包括上面可以界定许多斑点的柔性材料衬底。适合用于诊断和生物传感中的柔性衬底材料在本领域内是已知的。柔性衬底材料可以由植物来源的纤维，例如纤维素纤维制成，或可以由柔性聚合物，例如柔性聚酯膜和其它聚合物类型制成。在每个界定的斑点内，将本文所描述的系统的试剂施加至个别斑点。每个斑点可以含有除了不同向导RNA或向导RNA组或在适用情况下用以一次筛选多个标靶的不同检测适体之外都相同的试剂。因此，本文中的系统和装置可以能够针对相同标靶或有限数目的标靶的存在筛选来自多个来源的样品(例如来自不同个体的多个临床样品)，或针对样品中多个不同标靶的存在筛选单个样品(或来自相同来源的多个样品)的等分试样。在某些示例性实施方案中，将本文所描述的系统的成分冷冻干燥至纸或布衬底上。可以用于某些示例性装置中的示例性的基于柔性材料的衬底在Pardee等Cell.2016,165(5):1255-66和Pardee等Cell.2014,159(4):950-54中公开。用于包括血液的生物流体的适合的基于柔性材料的衬底在Shevkoplyas等的题为"Paper based diagnostic test"的国际专利申请公布号WO/2013/071301、Siegel等的题为"Paper-based microfluidic systems"的美国专利申请公布号2011/0111517和Shafiee等"Paper and Flexible Substrates as Materials forBiosensing Platforms to Detect Multiple Biotargets"Scientific Reports 5:8719(2015)中公开。其它基于柔性的材料，包括适合用于穿戴式诊断装置中的那些在Wang等"Flexible Substrate-Based Devices for Point-of-Care Diagnostics"Cell 34(11):909-21(2016)中公开。其它基于柔性的材料可以包括硝化纤维素、聚碳酸酯、甲基乙基纤维素、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚苯乙烯或玻璃(参见例如US20120238008)。在某些实施方案中，离散容积由疏水性表面，例如但不限于蜡、光刻胶或固体油墨隔离。
在一些实施方案中，可以提供计量箱或剂量计，其充当传感器或指示器以便向穿戴者通报暴露于某些微生物或其它剂。举例来说，本文所描述的系统可以用于检测特定病原体。同样地，上文所公开的基于适体的实施方案可以用于检测特异性适体可以结合的多肽以及其它剂，例如化学剂。此种装置可以适用于军人或其它军事人员以及临床医师、研究者、医务人员等等的监视，以尽可能快地提供关于暴露于潜在危险的微生物的信息，例如用于生物或化学战剂检测。在其它实施方案中，此种监视剂量计可以用于防止免疫受损患者、烧伤患者、经历化学疗法的患者、儿童或老年个体暴露于危险的微生物或病原体。
可以使用本文所描述的系统和装置分析的样品来源包括受试者的生物样品或环境样品。环境样品可以包括表面或流体。生物样品可以包括但不限于唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰液、粘液、淋巴、滑液、脊髓液、脑脊髓液、来自皮肤或粘膜的拭子，或其组合。在示例性实施方案中，环境样品取自固体表面，例如食物或其它敏感组合物和材料的制备中所用的表面。
在其它示例性实施方案中，本文所描述的系统的成分可以放置于一次性衬底上，例如用于拭抹表面或样品流体的拭子或布。举例来说，系统可以用于通过拭抹食物产品，例如水果或蔬菜的表面来测试食物上病原体的存在。类似地，一次性衬底可以用于拭抹其它表面用于检测某些微生物或剂，例如用于安全筛检。一次性衬底还可以具有取证中的应用，其中CRISPR系统被设计成检测例如鉴别DNA SNP，其可以用于鉴别可疑或确实的组织或细胞标志以确定样品中存在的生物物质的类型。同样地，一次性衬底可以用于收集来自患者的样品-例如来自口腔的唾液样品-或皮肤的拭子。在其它实施方案中，样品或拭子可以从肉产品取出以检测肉产品上或肉产品内污染物的存在或不存在。
需要近实时微生物诊断用于食物、临床、工业和其它环境设置(参见例如Lu TK,Bowers J和Koeris MS.,Trends Biotechnol.2013年6月；31(6):325-7)。在某些实施方案中，本发明用于使用对病原体(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、沙门氏菌属种(Salmonella spp.)、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、志贺氏菌属种(Shigella spp.)、金黄色葡萄球菌、葡萄球菌性肠炎(Staphylococcal enteritis)、链球菌属、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)和假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)、布鲁氏菌属种(Brucella spp.)、溃疡棒杆菌(Corynebacterium ulcerans)、贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)或类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides))具有特异性的向导RNA进行食源性病原体的快速检测。
在某些实施方案中，装置是流动条带或包括流动条带。举例来说，侧流条带允许由颜色进行RNA酶(例如C2c2)检测。修饰RNA报告子以具有附接至5'端的第一分子(例如FITC)和附接至3'端的第二分子(例如生物素)(或反之亦然)。侧流条带被设计成具有两个捕获线路，其中抗第一分子(例如抗FITC)抗体在第一线路杂交并且抗第二分子(例如抗生物素)抗体在第二下游线路。随着SHERLOCK反应物从条带流下，未裂解的报告子将在第一捕获线路结合至抗第一分子抗体，而裂解的报告子将在第二捕获线路释放第二分子并允许第二分子结合。第二分子夹心抗体，例如缀合至纳米颗粒，例如金纳米颗粒，将在第一线路或第二线路结合任何第二分子并且产生强读出/信号(例如颜色)。随着更多报告子裂解，更多信号将在第二捕获线路积累并且更少信号将在第一线路出现。在某些方面，本发明涉及使用如本文所描述的跟踪条带用于检测核酸或多肽。在某些方面，本发明涉及一种使用如本文所定义的流动条带检测核酸或多肽的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。
在某些示例性实施方案中，装置是产生和/或汇合不同微滴(即，个别离散容积)的微流体装置。举例来说，可以形成含有待筛选的样品的第一组微滴并且形成含有本文所描述的系统的成分的第二组微滴。然后汇合第一组和第二组微滴，然后对汇合的微滴组进行如本文所描述的诊断方法。本文所公开的微流体装置可以是基于硅酮的芯片并且可以使用多种技术制造，包括但不限于热压印、弹性体成型、注塑成型、LIGA、软刻蚀、硅制造和相关薄膜加工技术。用于制造微流体装置的适合材料包括但不限于环烯烃共聚物(COC)、聚碳酸酯、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)和聚(丙烯酸甲酯)(PMMA)。在一个实施方案中，PDMS中的软刻蚀可以用于制备微流体装置。举例来说，可以使用界定衬底内流道、阀门和过滤器的位置的光刻来制成模具。将衬底材料倾倒至模具中并且允许凝固以建立印模。然后将印模密封至固体支撑体，例如但不限于玻璃。归因于吸收一些蛋白质并且可以抑制某些生物过程的一些聚合物，例如PDMS的疏水性质，钝化剂可能是必需的(Schoffner等Nucleic AcidsResearch,1996,24:375-379)。适合的钝化剂在本领域中是已知的并且包括但不限于硅烷、聚对二甲苯、正十二烷基-b-D-麦芽糖苷(DDM)、普朗尼克(pluronic)、Tween-20、其它类似表面活性剂、聚乙二醇(PEG)、白蛋白、胶原蛋白，以及其它类似蛋白质和肽。
在某些示例性实施方案中，系统和/或装置可以适应于转换成流式细胞术读出或允许在单个实验中数百万细胞的所有灵敏和定量测量并且改善现有的基于流的方法，例如PrimeFlow测定。在某些示例性实施方案中，可以将细胞铸型于含有未聚合凝胶单体的微滴中，然后可以铸型至适合于通过流式细胞术分析的单细胞微滴中。可以将包含荧光可检测标记的检测构建体铸型至包含未聚合凝胶单体的微滴中。凝胶单体聚合后在微滴内形成珠粒。因为凝胶聚合是通过自由基形成，所以荧光报告子变成共价结合至凝胶。可以进一步修饰检测构建体以包含连接子，例如胺。淬灭剂可以在凝胶形成后添加并且将经由连接子结合至报告子构建体。因此，当由CRISPR效应蛋白使报告子裂解时，淬灭剂不结合至凝胶并且自由扩散开。可以通过使检测构建体与杂交链反应(HCR引发剂)扩增相结合来达成微滴中的信号扩增。可以将DNA/RNA杂交发夹并入凝胶中，所述凝胶可以包含具有RNA酶敏感结构域的发夹环。通过保护具有RNA酶敏感结构域的发夹环内的链置换支点，在由CRISPR效应蛋白使发夹环裂解之后可以将HCR引发剂选择性地去保护。在经由支点介导的链置换将HCR引发剂去保护之后，可以将荧光HCR单体冲洗至凝胶中以能够在引发剂去保护的情况下进行信号扩增。
在本发明的情形中可以使用的微流体装置的实例在Hou等"Direct Dectectionand drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics"LapChip.15(10):2297-2307(2016)中描述。
在本文所描述的系统中，可以进一步并入穿戴式医疗装置，其在临床设置外评价受试者的生物样品，例如生物流体并且向医疗护理专业人员可及的中心服务器远程报告测定的结果。装置可以包括对血液自行取样的能力，例如Peeters等的题为"Needle-freeBlood Draw"的美国专利申请公布号2015/0342509、Andrew Conrad的题为"NanoparticlePhoresis"的美国专利申请公布号2015/0065821中所公开的装置。
在某些示例性实施方案中，装置可以包括个别孔，例如微板孔。微板孔的大小可以是标准6、24、96、384、1536、3456或9600号孔的大小。在某些示例性实施方案中，可以将本文所描述的系统的成分冷冻干燥并且在分配和使用之前施加至孔的表面。
本文所公开的装置还可以包括入口端和出口端或开口，其继而可以连接至阀门、管道、通道、腔室和注射器和/或泵用于将流体引入装置中和从装置中提取出。装置可以连接至允许流体在微流体装置内定向移动的流体流动致动器。示例性致动器包括但不限于意图迫使流体移动的注射器泵、机械致动的再循环泵、电渗泵、球管、波纹管、隔膜或鼓泡器。在某些示例性实施方案中，装置连接至具有可编程阀门的控制器，所述阀门一起工作以使流体移动通过装置。在某些示例性实施方案中，装置连接至下文进一步详细论述的控制器。装置可以由终止于金属管脚以供插入装置上的入口端中的管道连接至流动致动器、控制器和样品加载装置。
如本文所示，系统的成分当冷冻干燥时是稳定的，因此还涵盖不需要支撑装置的实施方案，即，系统可以施加至任何表面或流体，其将支持本文所公开的反应并且允许从那个表面或溶液检测阳性可检测信号。除冷冻干燥以外，系统还可以稳定地储存并且以成团形式利用。适用于形成适合的成团形式的聚合物在本领域中是已知的。
在某些实施方案中，CRISPR效应蛋白被束缚至装置中的每个离散容积。每个离散容积可以包含对不同靶分子具有特异性的不同向导RNA。在某些实施方案中，样品暴露于包括多于一个离散容积的固体衬底，每个离散容积包含对靶分子具有特异性的向导RNA。不受理论束缚，每个向导RNA将从样品捕获其靶分子并且样品不需要分成单独的测定。因此，可以保存有价值的样品。效应蛋白可以是包含亲和标签的融合蛋白。亲和标签在本领域中是众所周知的(例如HA标签、Myc标签、Flag标签、His标签、生物素)。效应蛋白可以连接至生物素分子并且离散容积可以包含抗生物素蛋白链菌素。在其它实施方案中，CRISPR效应蛋白由对效应蛋白具有特异性的抗体结合。结合CRISPR酶的方法先前已有描述(参见例如US20140356867A1)。
本文所公开的装置还可以包括本领域中已知的用于通过其它方法分析样品的定点护理(POC)装置的元件。参见例如St John和Price,“Existing and EmergingTechnologies for Point-of-Care Testing”(Clin Biochem Rev.2014年8月；35(3):155-167)。
本发明可以与无线芯片实验室(LOC)诊断传感器系统一起使用(参见例如美国专利号9,470,699"Diagnostic radio frequency identification sensors andapplications thereof")。在某些实施方案中，本发明在由无线装置(例如手机、个人数字助理(PDA)、平板电脑)控制的LOC中进行并且向所述装置报告结果。
射频鉴别(RFID)标签系统包括传输数据以供RFID读取器(也称作询问器)接收的RFID标签。在典型RFID系统中，个别的物体(例如储存商品)配备有含有转发器的相对小的标签。转发器具有给定独特的电子产品代码的存储芯片。RFID读取器发射信号，从而经由使用通信协议激活标签内的转发器。因此，RFID读取器能够读取数据并写入标签。另外，RFID标签读取器根据RFID标签系统应用来处理数据。当前存在被动型和主动型RFID标签。被动型RFID标签不含内部电源，但由从RFID读取器接收的射频信号供电。或者，主动型RFID标签含有内部电源，其能够使主动型RFID标签具有更大传播范围和存储容量。被动标签对主动标签的使用取决于特定应用。
芯片实验室技术在科学文献中很好地描述并且由多个微流体通道、输入或化学孔组成。可以使用射频鉴别(RFID)标签技术测量孔中的反应，这是因为来自RFID电子芯片的导电导线可以直接连接至测试孔中的每一个。天线可以印刷或安装在电子芯片的另一个层中或直接在装置的背面。此外，导线、天线和电子芯片可以嵌入LOC芯片中，从而防止电极或电子设备短路。因为LOC允许复杂的样品制备和分析，所以这种技术允许LOC测试独立于复杂或昂贵的读取器而完成。相反可以使用简单的无线装置，例如手机或PDA。在一个实施方案中，无线装置还控制微流体通道的分离和控制用于更复杂的LOC分析。在一个实施方案中，LOC-RFID芯片中包括LED和其它电子测量或传感装置。不受理论束缚，这种技术是可任意使用的并且允许需要在实验室外进行分离和混合的复杂测试。
在优选实施方案中，LOC可以是微流体装置。LOC可以是被动芯片，其中所述芯片经由无线装置供电和控制。在某些实施方案中，LOC包括用于容纳样品的微流体通道和用于引入样品的通道。在某些实施方案中，来自无线装置的信号将电力递送至LOC并且激活样品与测定试剂的混合。具体地说，在本发明的情况下，系统可以包括掩蔽剂、CRISPR效应蛋白和对靶分子具有特异性的向导RNA。在LOC激活后，微流体装置可以混合样品与测定试剂。在混合后，传感器检测信号并且将结果传输至无线装置。在某些实施方案中，去掩蔽剂是导电RNA分子。导电RNA分子可以附接至导电材料。导电分子可以是导电纳米颗粒、导电蛋白质、附接至蛋白质或乳胶的金属颗粒，或其它导电珠粒。在某些实施方案中，如果使用DNA或RNA，那么导电分子可以直接附接至匹配的DNA或RNA链。可以跨越传感器检测导电分子的释放。测定可以是一步过程。
因为可以精确地测量表面区域的电导率，所以在可任意使用的无线RFID电测定上可能得到定量结果。此外，测试区域可以极小，从而允许在给定的区域中完成更多测试并且因此节约成本。在某些实施方案中，各自与固定至传感器的不同CRISPR效应蛋白和向导RNA相关联的单独传感器用于检测多个靶分子。不受理论束缚，不同传感器的激活可以由无线装置区分。
除了本文所描述的导电方法以外，可以使用其它方法，其依赖于RFID或Bluetooth作为基本的低成本通信和电力平台用于可任意使用的RFID测定。举例来说，光学构件可以用于评价给定的靶分子的存在和水平。在某些实施方案中，光学传感器检测荧光掩蔽剂的去掩蔽。
在某些实施方案中，本发明的装置可以包括用于测定的诊断读取的手持式便携装置(参见例如Vashist等,Commercial Smartphone-Based Devices and SmartApplications for Personalized Healthcare Monitoring and Management,Diagnostics 2014,4(3),104-128；来自移动式测定的mReader；以及Holomic快速诊断测试读取器)。
如本文所注释，当实施方案在POC情形中和或在获取更复杂的检测设备以读出信号可能受限的资源贫乏环境中利用时，某些实施方案允许经由比色变化进行检测，其具有某些伴随效益。然而，本文所公开的便携实施方案还可以与能够在可见范围外检测信号的手持式分光光度计相结合。可以与本发明组合使用的手持式分光光度计装置的实例在Das等"Ultra-portable,wireless smartphone spectrophotome ter for rapid,non-destructive testing of fruit ripeness."Nature Scient ific Reports.2016,6:32504,DOI:10.1038/srep32504中描述。最后，在利用基于量子点的掩蔽构建体的某些实施方案中，手持式紫外光或其它适合装置的使用可以成功地用于检测信号，这归因于由量子点提供的接近完全的量子产率。
示例性方法和测定
测定平台的低成本和适应性适用于许多应用，包括(i)一般RNA/DNA/蛋白质定量，(ii)快速、多元化RNA/DNA和蛋白质表达检测，以及(iii)临床样品与环境样品中靶核酸、肽和蛋白质的灵敏检测。另外，本文所公开的系统可以适应于生物设置，例如细胞内转录物的检测。给出本文所描述的CRISPR效应物的高度特异性性质，有可能追踪活细胞中转录物或疾病相关突变的等位基因特异性表达。
在某些示例性实施方案中，将对单个标靶具有特异性的单向导RNA放置于单独的容积中。每个容积然后可以接受不同样品或相同样品的等分试样。在某些示例性实施方案中，可以将各自针对单独标靶的多个向导RNA放置于单个孔中以使得在不同孔中可以筛选多个标靶。为了在单个容积中检测多个向导RNA，在某些示例性实施方案中，可以使用具有不同特异性的多个效应蛋白。举例来说，可以使用具有不同序列特异性的不同直系同源物。举例来说，一种直系同源物可以优先切割A，而其它优先切割C、U或T。因此，可以产生全部是单核苷酸或包含单核苷酸的实质部分的向导RNA，其各自具有不同荧光团。以这种方式，在单个个别离散容积中可以筛选至多四种不同标靶。
如本文所展示，CRISPR效应系统能够检测低至渺摩尔浓度的靶分子。参见例如图13、14、19、22和下文所描述的实施例。归因于所述系统的灵敏度，需要快速和灵敏检测的许多应用可以得益于本文所公开的实施方案，并且预期处于本发明的范围内。示例性测定和应用在下文进一步详细描述。
微生物应用
在某些示例性实施方案中，本文所公开的系统、装置和方法涉及检测样品，例如获自受试者的生物样品中一种或多种微生物剂的存在。在某些示例性实施方案中，微生物可以是细菌、真菌、酵母、原生动物、寄生虫或病毒。因此，本文所公开的方法可以适应于在其它方法中与其它方法一起(或组合)使用，所述其它方法需要微生物种类的快速鉴别，监测微生物蛋白质(抗原)、抗体、抗体基因的存在，检测某些表型(例如细菌抗性)，监测疾病进展和/或爆发，以及抗生素筛选。因为此处所公开的实施方案的快速和灵敏诊断能力、低至单核苷酸差异的微生物种类类型的检测和作为POC装置部署的能力，所以本文所公开的实施方案可以用于指导治疗方案，例如适当抗生素或抗病毒剂的选择。本文所公开的实施方案还可以用于针对微生物污染的存在筛选环境样品(空气、水、表面、食物等)。
公开了一种用以鉴别微生物种类，例如细菌、病毒、真菌、酵母或寄生虫种类等的方法。本文所公开的特定实施方案描述了将鉴别和区分单个样品内或跨越多个样品的微生物种类的方法和系统，从而允许识别许多不同微生物。本发明方法通过检测样品中靶核酸序列的存在而允许检测病原体和区分生物或环境样品中一种或多种生物体的两个或更多个种类，例如细菌、病毒、酵母、原生动物和真菌或其组合。获自样品的阳性信号指示微生物的存在。可以使用本发明的方法和系统，通过采取使用多于一种效应蛋白，其中每种效应蛋白靶向特异性微生物靶序列来同时鉴别多种微生物。以这种方式，对特定受试者可以进行多水平分析，其中可以一次检测许多微生物。在一些实施方案中，使用可以鉴别一种或多种微生物种类的一组探针可以进行多种微生物的同时检测。
样品的多元分析能够进行样品的大规模检测，从而减少分析的时间和成本。然而，多元分析常常受生物样品的可用性限制。根据本发明，然而，可以进行多元分析的替代方案以使得可以将多个效应蛋白添加至单个样品中并且每个掩蔽构建体可以与单独的淬灭剂染料组合。在这种情况下，对于单个样品中的多个检测可以单独地从每个淬灭剂染料获得阳性信号。
本文公开了区分样品中一种或多种生物体的两个或更多个种类的方法。所述方法还适用于检测样品中一种或多种生物体的一个或多个种类。
微生物检测
在一些实施方案中，提供了一种用于检测样品中的微生物的方法，所述方法包括将样品或样品组分配至一个或多个个别离散容积中，所述个别离散容积包含如本文所描述的CRISPR系统；在足以允许一种或多种向导RNA结合至一种或多种微生物特异性标靶的条件下孵育样品或样品组；经由一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子来活化CRISPR效应蛋白，其中活化CRISPR效应蛋白得以修饰基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及检测可检测的阳性信号，其中检测到可检测的阳性信号指示样品中一种或多种靶分子的存在。一种或多种靶分子可以是包含靶核苷酸序列的mRNA、gDNA(编码或非编码)、trRNA或RNA，其可以用于相互区分两种或更多种微生物种类/株系。向导RNA可以被设计成检测靶序列。本文所公开的实施方案还可以利用某些步骤以改善向导RNA与靶RNA序列之间的杂交。增强核糖核酸杂交的方法在题为"Enhanced Methods of Ribonucleic AcidHybridization"的WO 2015/085194中公开，其以引用的方式并入本文中。微生物特异性标靶可以是RNA或DNA或蛋白质。DNA方法还可以包括使用引入如本文所描述的RNA聚合酶启动子的DNA引物。如果标靶是蛋白质，那么方法将利用特定针对本文所描述的蛋白质检测的适体和步骤。
单核苷酸变体的检测
在一些实施方案中，可以使用对如本文所描述的靶序列具有特异性并且结合至所述靶序列的向导RNA检测一种或多种鉴别的靶序列。本发明的系统和方法甚至可以区分在不同微生物种类当中存在的单核苷酸多态性，并且因此根据本发明的多种向导RNA的使用可以进一步扩展或改善可以用于区分种类的靶序列的数目。举例来说，在一些实施方案中，一种或多种向导RNA可以在种、属、族、目、类、门、界或表型或其组合上区分微生物。
基于rRNA序列的检测
在某些示例性实施方案中，本文所公开的装置、系统和方法可以用于区分样品中的多个微生物种类。在某些示例性实施方案中，鉴别可以基于核糖体RNA序列，包括16S、23S和5S亚单位。鉴别相关rRNA序列的方法在美国专利申请公布号2017/0029872中公开。在某些示例性实施方案中，一组向导RNA可以被设计成由对于每个种类或株系独特的可变区来区分每个种类。向导RNA还可以被设计成靶向在属、族、目、类、门、界的水平或其组合上区分微生物的RNA基因。在使用扩增的某些示例性实施方案中，一组扩增引物可以被设计成侧接核糖体RNA序列的恒定区并且向导RNA被设计成由可变内区来区分每个种类。在某些示例性实施方案中，引物和向导RNA可以分别被设计成16S亚单位中的保守区和可变区。同样可以使用跨越种类或种类的子组，例如RecA基因家族RNA聚合酶β亚单位独特可变的其它基因或基因组区域。其它适合的系统发生标志和其鉴别方法在例如Wu等arXiv:1307.8690[q-bio.GN]中论述。
在某些示例性实施方案中，方法或诊断被设计成同时跨越多个系统发生和/或表型水平筛选微生物。举例来说，方法或诊断可以包括使用多个具有不同向导RNA的CRISPR系统。第一组向导RNA可以区分例如分枝杆菌、革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。这些一般类别甚至可以进一步细分。举例来说，可以设计向导RNA并且用于区分革兰氏阴性细菌内的肠道菌和非肠道菌的方法或诊断中。第二组向导RNA可以被设计成在属或种的水平上区分微生物。因此，可以产生鉴别所有分枝杆菌、革兰氏阳性、革兰氏阴性(进一步分成肠道菌和非肠道菌)的矩阵，其中在给定样品中鉴别的细菌种类的每个属属于那些类别之一。前述内容仅用于示例性目的。还涵盖用于归类其它微生物类型的其它方式并且将遵循上文所描述的一般结构。
抗药性筛选
在某些示例性实施方案中，本文所公开的装置、系统和方法可以用于筛选所关注的微生物基因，例如抗生素和/或抗病毒抗性基因。向导RNA可以被设计成区分所关注的已知基因。然后可以使用本文所公开的用于检测此类基因的实施方案筛选样品，包括临床样品。在POC下筛选抗药性的能力将在选择适当治疗方案中具有巨大的效益。在某些示例性实施方案中，抗生素抗性基因是碳青霉烯酶(carbapenemase)，包括KPC、NDM1、CTX-M15、OXA-48。其它抗生素抗性基因是已知的并且可以在例如综合抗生素抗性数据库(ComprehensiveAntibiotic Resistance Database)(Jia等"CARD 2017:expansion and model-centriccuration of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database."Nucleic AcidsResearch,45,D566-573)中找到。
病毒唑(ribavirin)是针对许多RNA病毒的有效抗病毒剂。若干临床上重要的病毒已经演变出病毒唑抗性，包括口蹄疫病毒doi:10.1128/JVI.03594-13；脊髓灰质炎病毒(Pfeifer和Kirkegaard.PNAS,100(12):7289-7294,2003)；以及丙型肝炎病毒(Pfeiffer和Kirkegaard,J.Virol.79(4):2346-2355,2005)。许多其它持久性RNA病毒，例如肝炎和HIV，已经演变出对现有抗病毒药物的抗性：乙型肝炎病毒(拉米夫定(lamivudine)、替诺福韦(tenofovir)、恩替卡韦(entecavir))doi:10/1002/hep22900；丙型肝炎病毒(特拉匹韦(telaprevir)、BILN2061、ITMN-191、SCh6、波普瑞韦(boceprevir)、AG-021541、ACH-806)doi:10.1002/hep.22549；以及HIV(许多抗药性突变)hivb.standford.edu。本文所公开的实施方案尤其可以用于检测此类变体。
除抗药性以外，存在许多可以用本文所公开的实施方案检测的临床上相关的突变，例如LCMV中的持久性对急性感染(doi:10.1073/pnas.1019304108)，和增加的埃博拉感染力(Diehl等Cell.2016,167(4):1088-1098)。
如本文别处所描述，可以通过在gRNA中引入合成错配来区分密切相关的微生物种类(例如在给定的靶序列中仅具有单核苷酸差异)。
组覆盖方法(Set Cover Approach)
在特定实施方案中，设计一组向导RNA，其可以鉴别例如一组规定微生物内的所有微生物种类。描述了此类方法。在某些示例性实施方案中，可以将如本文所描述的产生向导RNA的方法与以引用的方式并入本文中的WO 2017/040316中公开的方法相比较。如WO2017040316中所描述，组覆盖解决方案可以鉴别覆盖整个靶序列或一组靶序列，例如一组基因组序列所需的最小数目的靶序列探针或向导RNA。组覆盖方法先前已经用于鉴别引物和/或微阵列探针，通常在20个至50个碱基对的范围内。参见例如Pearson等,cs.virginia.edu/～robins/papers/primers_dam11_final.pdf.；Jabado等NucleicAcids Res.2006 34(22):6605-11；Jabado等Nucleic Acids Res.2008,36(1):e3doi10.1093/nar/gkm1106；Duitama等Nucleic Acids Res.2009,37(8):2483-2492；Phillippy等BMC Bioinformatics.2009,10:293 doi:10.1186/1471-2105-10-293。然而，此类方法一般涉及将每个引物/探针处理成k-mer以及搜索精确匹配或允许使用后缀阵列搜索不精确匹配。另外，方法一般采用二元方法以通过选择引物或探针以使得每个输入序列仅需要由一个引物或探针结合并且这个结合沿着序列的位置是无关的来检测杂交。替代性方法可以将靶基因组分成预定义窗口并且在二元方法下将每个窗口有效处理成单独的输入序列-即，其确定给定的探针或向导RNA是否在每个窗口内结合并且是否需要所有窗口都由某个探针或向导RNA结合。有效地，这些方法将组覆盖问题中“通用”的每个元件处理成整个输入序列或输入序列的预定义窗口，并且如果探针或向导RNA的起点在元件内结合，那么每个元件被视为“覆盖的”。这些方法限制了允许不同探针或向导RNA设计覆盖给定的靶序列的流动性。
相比之下，本文所公开的实施方案涉及检测更长的探针或向导RNA长度，例如在70bp至200bp的范围内，其适合于杂交体选择测序。另外，本文中可以应用WO 2017/040316所公开的方法以采用能够定义探针或向导RNA组的泛靶序列方法，所述探针或向导RNA组可以鉴别和促进大型和/或可变靶序列组中所有种类和/或株系序列的检测测序。举例来说，本文所公开的方法可以用于在单个测定中鉴别给定病毒或多个不同病毒的所有变体。此外，本文所公开的方法将组覆盖问题中“通用”的每个元件处理成靶序列的核苷酸，并且每个元件被视为“覆盖的”，只要探针或向导RNA结合至包括元件的靶基因组的某个区段即可。这些类型的组覆盖方法可以替代先前方法的二元方法使用，本文所公开的方法将探针或向导RNA可以如何杂交至靶序列较好地建模。胜过仅询问给定的向导RNA序列是否结合至给定的窗口，此类方法可以用于检测杂交模式-即，在给定的探针或向导RNA结合至一个或多个靶序列的情况下-然后从那些杂交模式确定覆盖靶序列组至足以能够从样品富集并且对任何和所有靶序列进行测序的程度所需的最小数目的探针或向导RNA。这些杂交模式可以通过定义某些参数来确定，所述参数使损失功能降至最低，从而能够以允许参数对于每个种类有变化，例如以反映每个种类的多样性的方式，以及以使用组覆盖解决方案的简单应用，例如在探针或向导RNA设计情形中先前应用的那些无法达成的计算有效方式鉴别最小探针或向导RNA组。
检测多个转录物丰度的能力可以允许产生指示特定表型的独特微生物标识。各种机器学习技术可以用于导出基因标识。因此，CRISPR系统的向导RNA可以用于鉴别和/或定量由基因标识定义的生物标志的相对水平以检测某些表型。在某些示例性实施方案中，基因标识指示对抗生素的易感性、对抗生素的抗性，或其组合。
在本发明的一个方面，方法包括检测一种或多种病原体。以这种方式，可以获得个别微生物对受试者的感染之间的区别。在一些实施方案中，此种区别能够由临床医师检测或诊断特定疾病，例如疾病的不同变体。优选地，病原体序列是病原体的基因组或其片段。方法还可以包括确定病原体的演变。确定病原体的演变可以包括鉴别病原体突变，例如核苷酸缺失、核苷酸插入、核苷酸取代。在后者当中，存在非同义、同义和非编码取代。突变在爆发期间更频繁地是非同义的。方法还可以包括确定如上文所描述而分析的两个病原体序列之间的取代率。突变是有害的还是甚至适应性的将需要功能性分析，然而，非同义突变率表明这种流行病的持续进展可能为病原体适应提供机会，强调了快速遏制的需要。因此，方法还可以包括评价病毒适应的风险，其中确定非同义突变的数目。(Gire等,Science 345,1369,2014)。
监测微生物爆发
在一些实施方案中，如本文所描述的CRISPR系统或其使用方法可以用于确定病原体爆发的演变。方法可以包括检测来自一个或多个受试者的多个样品的一个或多个靶序列，其中靶序列是来自引起爆发的微生物的序列。此种方法还可以包括确定病原体传播的模式，或由病原体引起的疾病爆发中所涉及的机制。
病原体传播的模式可以包括从病原体的天然储库的持续新传播或在从天然储库的单个传播之后受试者与受试者之间的传播(例如人与人之间的传播)，或两种的混合情况。在一个实施方案中，病原体传播可以是细菌或病毒传播，在此种情况下，靶序列优选地是微生物基因组或其片段。在一个实施方案中，病原体传播的模式是病原体传播的早期模式，即，在病原体爆发开始时。在爆发开始时确定病原体传播的模式增加了在最早可能的时间阻止爆发的可能性，从而降低本地和国际蔓延的可能性。
确定病原体传播的模式可以包括根据本文所描述的方法检测病原体序列。确定病原体传播的模式还可以包括检测受试者之间的病原体序列的共享宿主内变异以及确定共享宿主内变异是否显示时序模式。所观测的宿主内和宿主间变异中的模式提供了关于传播和流行病学的重要见解(Gire等,2014)。
显示时序模式的在受试者之间的共享宿主内变异的检测是受试者之间(特别是人之间)的传播链路的指示，这是因为其可以由来自多个来源的受试者感染(超感染)、样品污染重现性突变(在存在或不存在平衡选择以加强突变的情况下)或在传播链中较早由突变产生的略有分歧病毒的共传播来解释(Park等,Cell 161(7):1516-1526,2015)。受试者之间的共享宿主内变异的检测可以包括位于共同单核苷酸多态性(SNP)位置处的宿主内变体的检测。位于共同(SNP)位置处的宿主内变体的阳性检测指示超感染和污染作为关于宿主内变体的主要解释。超感染和污染可以在作为宿主间变体出现的SNP频率的基础上分开(Park等,2015)。其它方式的超感染和污染可以排除在外。在这种后者的情况下，受试者之间的共享宿主内变异的检测还可以包括评价同义和非同义变体的频率以及相互比较同义和非同义变体的频率。非同义突变是改变蛋白质的氨基酸的突变，这可能引起经受自然选择的微生物中的生物变化。同义取代不改变氨基酸序列。同义和非同义变体的同等频率指示中性演变的宿主内变体。如果同义和非同义变体的频率有分歧，那么宿主内变体可能通过平衡选择来维持。如果同义和非同义变体的频率很低，那么这指示重现性突变。如果同义和非同义变体的频率很高，那么这指示共传播(Park等,2015)。
如同埃博拉病毒一样，拉沙病毒(LASV)可以导致具有高病例致死率的出血热。Andersen等生成了来自临床和啮齿动物储库样品的将近200个LASV序列的基因组目录(Andersen等,Cell第162卷,第4期,第738-750页,2015年8月13日)。Andersen等显示，尽管2013-2015年EVD流行病由人与人之间的传播推动，但LASV感染主要由储库与人之间的感染引起。Andersen等阐明LASV跨越西非的扩散并且显示这种迁移伴有LASV基因组丰度、致死率、密码子适应和翻译效率的变化。方法还可以包括在系统发生上比较第一病原体序列与第二病原体序列，以及确定第一病原体序列与第二病原体序列之间是否存在系统发生关联。第二病原体序列可以是较早参考序列。如果存在系统发生关联，那么方法还可以包括针对第二病原体序列追溯第一病原体序列的系统发生的根源。因此，有可能构建第一病原体序列的谱系。(Park等,2015)。
方法还可以包括确定突变是有害的还是适应性的。有害突变指示传播受损病毒和终端感染，因此通常仅在个别受试者中存在。一个个别受试者独有的突变是系统发生树的外枝上出现的那些，而内枝突变是多个样品中(即，多个受试者中)存在的那些。较高非同义取代率是系统发生树的外枝的特征(Park等,2015)。
在系统发生树的内枝中，选择已经有更多机会来滤除有害突变体。根据定义，内枝已经产生多个派生谱系并且因此不太可能包括具有适合度代价的突变。因此，较低非同义取代率指示内枝(Park等,2015)。
可能对适合度具有较少影响的同义突变在内枝和外枝上以更可比的频率出现(Park等,2015)。
通过分析测序的靶序列，例如病毒基因组，有可能发现造成例如在2014年埃博拉爆发期间流行病发作的严重性的机制。举例来说，Gire等作出2014年爆发的基因组与来自较早爆发的全部20种基因组的系统发生比较，表明2014年西非病毒可能在过去十年内从中非扩散。使用与其它埃博拉病毒基因组的分歧追溯系统发生的根源是成问题的(6、13)。然而，追溯树的最早爆发的根源揭示样品日期与根部至尖端距离之间的强相关性，其中每年每个地点的取代率为8×10-4(13)。这表明三次最新爆发的谱系全部在大致相同的时间，即，2004年左右从共同祖先分出，这提出了以下假设：每次爆发表示来自天然储库中的相同遗传多样性病毒群体的独立人畜共患事件。还发现，2014年EBOV爆发可能由从天然储库的单个传播引起，继而在爆发期间在人与人之间传播。其结果还表明，塞拉利昂的流行病发作可能起源于大约在相同时间从几内亚引入两种遗传上截然不同的病毒(Gire等,2014)。
还已经有可能确定拉沙病毒如何从其起源点扩散开，尤其归功于人与人之间的传播并且甚至回溯到400年前这种扩散的历史(Andersen等,Cell 162(4):738-50,2015)。
与在2013-2015年EBOV爆发期间所需的工作和在爆发地点医疗人员所遭遇的困难相关，并且更一般来说，本发明的方法使得有可能使用较少选择的探针进行测序以便可以加速测序，由此缩短从获取样品至取得结果所需的时间。此外，试剂盒和系统可以被设计成实地可用以便可以容易地进行患者的诊断而无需将样品发送或运送至国家或世界的另一个地区。
在上文所描述的任何方法中，对靶序列或其片段进行测序可以使用上文所描述的测序过程中的任一种。此外，对靶序列或其片段进行测序可以是近实时测序。对靶序列或其片段进行测序可以根据先前所描述的方法进行(Experimental Procedures:Matranga等,2014；以及Gire等,2014)。对靶序列或其片段进行测序可以包括多个靶序列的平行测序。对靶序列或其片段进行测序可以包括Illumina测序。
分析杂交至所选探针中的一个或多个的靶序列或其片段可以是鉴别分析，其中所选探针杂交至靶序列或其片段指示样品内靶序列的存在。
当前，主要诊断是基于患者所具有的症状。然而，各种疾病可能共享相同的症状，使得诊断太依赖于统计。举例来说，疟疾触发类流感症状：头痛、发热、寒颤、关节疼痛、呕吐、溶血性贫血、黄疸、尿液中的血红蛋白、视网膜损伤和惊厥。这些症状对于败血病、胃肠炎和病毒性疾病也是常见的。在后者当中，埃博拉出血热具有以下症状：发热、咽喉痛、肌肉疼痛、头痛、呕吐、腹泻、皮疹、肝和肾功能下降、内出血和外出血。
当将患者递交给医疗单位时，例如在热带非洲，基础诊断将推断为疟疾，这是因为在统计上，疟疾是在非洲的那个地区内最可能的疾病。因此针对疟疾治疗患者，不过患者可能实际上并未染上这种疾病并且患者未得到正确治疗而死亡。正确治疗的这种缺乏可能是威胁生命的，尤其当患者所染上的疾病呈现出快速演变时。在医疗人员认识到给予患者的治疗是无效的并且获得正确诊断并向患者施用足够的治疗之前可能为时已晚。
本发明的方法提供了这种情况的解决方案。确实，因为向导RNA的数目可以显著减少，所以这使得有可能在单个芯片上提供分成组的所选探针，每组对一种疾病具有特异性，以便可以同时诊断多种疾病，例如病毒感染。归功于本发明，在单个芯片上可以同时诊断多于3种疾病，优选地多于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种疾病，优选地在给定的地理区域的群体内最常出现的疾病。因为每组所选探针对诊断的疾病中的一种具有特异性，所以可以进行更准确诊断，由此减少向患者施用错误治疗的风险。
在其它情况下，例如病毒感染的疾病可能在无任何症状下发生，或已经引起症状，但在将患者递交给医疗人员之前症状消散。在此类情况下，患者不寻求任何医疗救助或在递交当天归因于症状的缺乏而使诊断变得复杂。
本发明还可以与诊断疾病、鉴别病原体以及基于核酸，例如未纯化粗样品中的mRNA的检测优化治疗的其它方法相配合使用。
本发明的方法还提供了一种用以处理这种情况的强有力工具。确实，因为在单个诊断内包括多组所选向导RNA，每组对在给定区域的群体内出现的最常见疾病具有特异性，所以医疗人员仅需要使获自患者的生物样品与芯片接触。读取芯片揭示患者已染上的疾病。
在一些情况下，将患者递交给医疗人员用于特定症状的诊断。本发明的方法使得有可能不仅鉴别哪种疾病引起这些症状，而且同时确定患者是否罹患其未察觉的另一种疾病。
当探索爆发的机制时，这种信息可能至关重要。确实，具有相同病毒的患者组还显示时序模式，表明受试者与受试者之间的传播链路。
在一些实施方案中，如本文所描述的CRISPR系统或其使用方法可以用于预测罹患病毒性疾病的患者的疾病结果。在特定实施方案中，此类病毒性疾病可以包括但不一定限于拉沙热(Lassa fever)。与拉沙热疾病结果相关的特定因素可以包括但不一定限于年龄、肾损伤程度和/或CNS损失。
筛选微生物遗传扰动
在某些示例性实施方案中，本文所公开的CRISPR系统可以用于筛选微生物遗传扰动。此类方法可以适用于例如制定出微生物途径和功能网络。可以对微生物细胞进行遗传修饰，然后在不同实验条件下筛选。如上文所描述，本文所公开的实施方案可以按多元方式筛选单个样品中的多个靶分子或单个个别离散容积中的单个标靶。可以对遗传修饰的微生物进行修饰以包括鉴别由特定微生物细胞或微生物细胞群体携带的特定遗传修饰的核酸条形码序列。条形码是用作标识符的核苷酸(例如DNA、RNA或其组合)的短序列。核酸条形码可以具有4-100个核苷酸的长度并且是单链或双链的。用条形码鉴别细胞的方法在本领域中是已知的。因此，本文所描述的CRISPR效应系统的向导RNA可以用于检测条形码。检测到阳性可检测信号指示样品中特定遗传修饰的存在。本文所公开的方法可以与检测互补基因型或表型读出的其它方法组合，指示在所测试的实验条件下遗传修饰的作用。有待筛选的遗传修饰可以包括但不限于基因敲入、基因敲除、倒位、易位、转座，或一个或多个核苷酸插入、缺失、取代、突变，或具有功能结果的编码表位的核酸的添加，所述功能结果例如改变蛋白质稳定性或检测。以类似方式，本文所描述的方法可以用于合成生物学应用中以筛选基因调控元件和基因表达模块的特定排列的功能性。
在某些示例性实施方案中，方法可以用于筛选亚等位基因。亚等位基因的产生和其鉴别关键细菌功能性基因的用途以及新抗生素治疗剂的鉴别如2016年11月4日提交的题为"Multiplex High-Resolution Detection of Micro-organism Strains,RelatedKits,Diagnostic Methods and Screening Assays"的PCT/US2016/060730中公开，其以引用的方式并入本文中。
不同实验条件可以包括微生物细胞暴露于不同化学剂、化学剂组合、不同浓度的化学剂或化学剂组合、暴露于化学剂或化学剂组合的不同持续时间、不同物理参数，或两者。在某些示例性实施方案中，化学剂是抗生素或抗病毒剂。有待筛选的不同物理参数可以包括不同温度、大气压、不同大气气体和非大气气体浓度、不同pH水平、不同培养基组成，或其组合。
筛选环境样品
本文所公开的方法还可以用于通过检测靶核酸或多肽的存在针对污染物筛选环境样品。举例来说，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于检测微生物的方法，所述方法包括：使如本文所描述的CRISPR系统暴露于样品；经由一种或多种向导RNA结合至一种或多种微生物特异性靶RNA或一种或多种触发RNA来活化RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号。可以检测阳性信号并且指示样品中一种或多种微生物的存在。在一些实施方案中，CRISPR系统可以在如本文所描述的衬底上，并且衬底可以暴露于样品。在其它实施方案中，可以将相同CRISPR系统和/或不同CRISPR系统施加至衬底上的多个离散位置。在其它实施方案中，不同CRISPR系统可以检测每个位置处的不同微生物。如上文进一步详细描述，衬底可以是柔性材料衬底，例如包括但不限于纸衬底、织物衬底或基于柔性聚合物的衬底。
根据本发明，通过将衬底短暂浸入有待取样的流体中，通过将有待测试的流体施加至衬底，或通过使有待测试的表面与衬底接触，可以使衬底被动暴露于样品。视情况而定，可以使用将样品引入衬底的任何方式。
如本文所描述，用于本发明的样品可以是生物或环境样品，例如食物样品(新鲜水果或蔬菜、肉)、饮料样品、纸表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于大气或其它气体样品，或其组合。举例来说，可以拭抹由包括但不限于金属、木材、塑料、橡胶等的任何材料制成的家用/商业/工业表面并测试污染物。可以针对病原性细菌或寄生虫或者其它微生物的存在测试土壤样品，用于环境目的和/或用于人、动物或植物疾病测试。可以评估例如淡水样品、废水样品或盐水样品的水样品的清洁度和安全性和/或可饮用性，以检测例如微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)或其它微生物污染的存在。在其它实施方案中，生物样品可以获自以下来源：包括但不限于组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰液、粘液、淋巴、滑液、脑脊髓液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓液，或皮肤或粘膜表面的拭子。在一些特定实施方案中，环境样品或生物样品可以是粗样品和/或在应用方法之前一种或多种靶分子可能未从样品纯化或扩增。微生物的鉴别可以适用于许多应用和/或为许多应用所需，并且因此可以根据本发明使用本领域技术人员认为适当的来自任何来源的任何类型的样品。
在一些实施方案中，在餐馆或其它食物提供方、食物表面检查细菌，例如大肠杆菌对食物的污染；测试水的病原体，如沙门氏菌属、弯曲杆菌属或大肠杆菌；以及为制造商和监管方检查食物质量以确定肉源的纯净度；鉴别受病原体，例如军团菌属的空气污染；检查啤酒是否受病原体，如片球菌属(Pediococcus)和乳杆菌属污染或腐败；在制造期间细菌或真菌对巴式灭菌或未巴式灭菌的奶酪的污染。
根据本发明的微生物可以是病原性微生物或者引起食物或可消耗产品腐败的微生物。病原性微生物可能对于人、动物或植物是病原性的或以其它方式不合乎需要。对于人或动物来说，微生物可以引起疾病或导致疾患。本发明的动物或兽医应用可以鉴别受微生物感染的动物。举例来说，本发明的方法和系统可以鉴别具有病原体，包括但不限于犬窝咳、狂犬病病毒和犬恶丝虫的伴侣动物。在其它实施方案中，本发明的方法和系统可以出于育种目的用于亲缘测试。植物微生物可以导致对植物的伤害或疾病、产量减少，或改变性状，例如颜色、口味、稠度、气味。对于食物或可消耗的污染来说，微生物可以不利地影响食物或可消耗产品的口味、气味、颜色、稠度或其它商业特性。在某些示例性实施方案中，微生物是细菌种类。细菌可以是兼性嗜冷菌(psychrotroph)、大肠菌、乳酸菌或形成芽孢的细菌。在某些示例性实施方案中，细菌可以是引起疾病或疾患，或以其它方式导致不合需要的产物或性状的任何细菌种类。根据本发明的细菌可能对于人、动物或植物是病原性。
样品类型
用于本文所公开的方法中的适当样品包括获自生物体或其一部分，例如植物、动物、细菌等的任何常规生物样品。在特定实施方案中，生物样品获自动物受试者，例如人受试者。生物样品是获自以下任何活生物体、由其排泄或分泌的任何固体或流体样品：包括但不限于单细胞生物体，尤其例如细菌、酵母、原生动物和阿米巴虫；多细胞生物体(例如植物或动物，包括来自健康或表观健康人受试者或受有待诊断或研究的状况或疾病影响的人患者的样品，所述状况或疾病例如受病原性微生物，例如病原性细菌或病毒感染)。举例来说，生物样品可以是获自以下的生物流体：例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊髓液、水状液或玻璃体液，或任何身体分泌物、渗出物、流出物(例如获自脓肿或任何其它感染或发炎部位的流体)，或获自关节(例如正常关节或受例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或化脓性关节炎的疾病影响的关节)的流体，或皮肤或粘膜表面的拭子。
样品还可以是获自任何器官或组织的样品(包括活检或尸检样本，例如肿瘤活检体)，或可以包括细胞(无论是初级细胞还是培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。例示性样品包括但不限于细胞、细胞裂解产物、血液涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰液、尿液、支气管肺泡灌洗液、精液等)、组织活检体(例如肿瘤活检体)、细针抽吸液，和/或组织切片(例如冷冻组织切片和/或石蜡包埋组织切片)。在其它实例中，样品包括循环肿瘤细胞(其可以由细胞表面标志鉴别)。在特定实例中，样品直接使用(例如新鲜或冷冻的)，或可以在使用前例如通过固定(例如使用福尔马林)和/或包埋于蜡中(例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品)来操作。将了解，可以利用从受试者获得组织的任何方法，并且所用方法的选择将取决于各种因素，例如组织类型、受试者年龄或从业者可用的程序。用于获得此类样品的标准技术在本领域中是可用的。参见例如Schluger等,J.Exp.Med.176:1327-33(1992)；Bigby等,Am.Rev.Respir.Dis.133:515-18(1986)；Kovacs等,NEJM 318:589-93(1988)；以及Ognibene等,Am.Rev.Respir.Dis.129:929-32(1984)。
在其它实施方案中，样品可以是环境样品，例如水、土壤或表面，例如工业或医学表面。在一些实施方案中，例如美国专利公布号2013/0190196中所公开的方法可以应用于在高度灵敏度和特异性下检测直接来自粗细胞样品的核酸标识，特别是RNA水平。对所关注的每个病原体具有特异性的序列可以通过由BLAST软件比较来自所关注的病原体的编码序列与其它生物体中的所有编码序列来鉴别或选择。
本公开的若干实施方案涉及使用本领域中已知的程序和方法以将临床血液样品成功分级。参见例如以下文献中所描述的程序：Han Wei Hou等,Microfluidic Devicesfor Blood Fractionation,Micromachines 2011,2,319-343；Ali Asgar S.Bhagat等,Dean Flow Fractionation(DFF)Isolation of Circulating Tumor Cells(CTCs)fromBlood,15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry andLife Sciences,2011年10月2日-6日,Seattle,WA；以及国际专利公布号WO2011109762，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。血液样品通常在培养物中扩充以增加用于测试目的的样品大小。在本发明的一些实施方案中，血液或其它生物样品可以用于如本文所描述的方法中而无需在培养物中扩充。
此外，本公开的若干实施方案涉及使用本领域中已知的程序和方法以使用螺旋形微通道从全血中成功分离病原体，如Han Wei Hou等,Pathogen Isolation from WholeBlood Using Spiral Microchannel,案号15995JR,Massachusetts Institute ofTechnology(原稿在准备中)所描述，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
归因于本文所公开的实施方案的灵敏度增加，在某些示例性实施方案中，测定和方法可以在粗样品或有待检测的靶分子未从样品进一步分级或纯化的样品上运作。
示例性微生物
本文所公开的实施方案可以用于检测许多不同微生物。如本文所用的术语微生物包括细菌、真菌、原生动物、寄生虫和病毒。
细菌
以下提供了可能使用本文所公开的实施方案检测的微生物类型的示例性清单。在某些示例性实施方案中，微生物是细菌。可以根据所公开的方法检测的细菌的实例包括但不限于以下任何一种或多种(或其任何组合)：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、放线杆菌属种(Actinobacillus sp.)、放线菌(Actinomycetes)、放线菌属种(Actinomycessp.)(例如伊氏放线菌(Actinomyces israelii)和内氏放线菌(Actinomycesnaeslundii))、气单胞菌属种(Aeromonas sp.)(例如嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、凡隆气单胞菌温和生物型(Aeromonas veronii biovar sobria)(温和气单胞菌(Aeromonas sobria))和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae))、嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum)、边缘无浆体(Anaplasma marginale)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、鲍曼不动杆菌、伴放线菌放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)、芽孢杆菌属种(Bacillus sp.)(例如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))、拟杆菌属种(Bacteroides sp.)(例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis))、巴尔通体属种(Bartonella sp.)(例如杆菌状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)和汉氏巴尔通体(Bartonella henselae))、双歧杆菌属种(Bifidobacterium sp.)、博德特氏菌属种(Bordetella sp.)(例如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica))、疏螺旋体属种(Borrelia sp.)(例如回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)和伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属种(Brucella sp.)(例如流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucellamelintensis)和猪布鲁氏菌(Brucella suis))、伯克氏菌属种(Burkholderia sp.)(例如类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)和洋葱伯克氏菌(Burkholderiacepacia))、弯曲杆菌属种(Campylobacter sp.)(例如空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus))、二氧化碳嗜纤维菌属种(Capnocytophaga sp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、柠檬酸杆菌属种(Citrobacter sp.)、贝氏柯克斯体、棒杆菌属种(Corynebacterium sp.)(例如白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeum)和棒杆菌(Corynebacterium))、梭菌属种(Clostridium sp.)(例如产气荚膜梭菌、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani))、啮蚀艾肯菌(Eikenella corrodens)、肠杆菌属种(Enterobactersp.)(例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、聚团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和大肠杆菌，包括机会大肠杆菌，例如肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌和尿道致病性大肠杆菌)、肠球菌属种(Enterococcus sp.)(例如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium))、埃立克体属种(Ehrlichia sp.)(例如恰菲埃立克体(Ehrlichia chafeensia)和犬埃立克体(Ehrlichiacanis))、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、真杆菌属种(Eubacterium sp.)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis)、麻疹双球菌(Gemella morbillorum)、嗜血杆菌属种(Haemophilus sp.)(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、溶血嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)和副溶血嗜血杆菌(Haemophilusparahaemolyticus))、螺杆菌属种(Helicobacter sp.)(例如幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)和芬纳尔螺杆菌(Helicobacterfennelliae))、金氏金氏菌(Kingella kingii)、克雷伯菌属种(Klebsiella sp.)(例如肺炎克雷伯菌、肉芽肿克雷伯菌(Klebsiella granulomatis)和产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca))、乳杆菌属种(Lactobacillus sp.)、单核细胞增多性李斯特菌、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体、消化链球菌属种(Peptostreptococcus sp.)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia hemolytica)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、摩根氏菌属种(Morganella sp.)、动弯杆菌属种(Mobiluncus sp.)、微球菌属种(Micrococcus sp.)、分枝杆菌属种(Mycobacterium sp.)(例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum))、支原体属种(Mycoplasm sp.)(例如肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人支原体(Mycoplasmahominis)和生殖支原体(Mycoplasma genitalium))、诺卡氏菌属种(Nocardia sp.)(例如星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、奶牛乳房炎性诺卡氏菌(Nocardiacyriacigeorgica)和巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis))、奈瑟氏菌属种(Neisseriasp.)(例如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis))、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、糠秕孢子菌(Pityrosporumorbiculare)(糠秕马拉色菌(Malassezia furfur))、类志贺邻单胞菌、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、产黑普雷沃菌(Prevotella melaninogenica)、变形杆菌属种(Proteus sp.)(例如普通变形杆菌(Proteus vulgaris)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、普罗威登斯菌属种(Providencia sp.)((例如产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)和斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii))、绿脓假单胞菌、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、马红球菌(Rhodococcus equi)、立克次体属种(Rickettsia sp.)(例如立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、小蛛立克次体(Rickettsia akari)和普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)(原名：恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi))和伤寒立克次体(Rickettsia typhi))、红球菌属种(Rhodococcus sp.)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、沙门氏菌属种(Salmonella sp.)(例如肠沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholerasuis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属种(Serratia sp.)(例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)和液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens))、志贺氏菌属种(Shigella sp.)(例如痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内志贺氏菌(Shigella sonnei))、葡萄球菌属种(Staphylococcus sp.)(例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus))、链球菌属种(Streptococcus sp.)(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(例如氯霉素(chloramphenicol)抗性血清型4肺炎链球菌、壮观霉素(spectinomycin)抗性血清型6B肺炎链球菌、链霉素(streptomycin)抗性血清型9V肺炎链球菌、红霉素(erythromycin)抗性血清型14肺炎链球菌、奥普托欣(optochin)抗性血清型14肺炎链球菌、利福平(rifampicin)抗性血清型18C肺炎链球菌、四环素(tetracycline)抗性血清型19F肺炎链球菌、青霉素(penicillin)抗性血清型19F肺炎链球菌和甲氧苄啶(trimethoprim)抗性血清型23F肺炎链球菌、氯霉素抗性血清型4肺炎链球菌、壮观霉素抗性血清型6B肺炎链球菌、链霉素抗性血清型9V肺炎链球菌、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌、青霉素抗性血清型19F肺炎链球菌或甲氧苄啶抗性血清型23F肺炎链球菌))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A群链球菌(Group A streptococci)、化脓链球菌、B群链球菌(Group B streptococci)、无乳链球菌、C群链球菌(Group C streptococci)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、类马链球菌(Streptococcus equismilis)、D群链球菌(Group D streptococci)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、F群链球菌(Group F streptococci)和咽峡炎链球菌G群链球菌(Group G streptococci))、小螺菌(Spirillum minus)、念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformi)、密螺旋体属种(Treponema sp.)(例如斑点密螺旋体(Treponemacarateum)、细弱密螺旋体(Treponema petenue)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)和地方性密螺旋体(Treponema endemicum))、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、须癣毛癣菌(T.mentagrophytes)、惠普尔养障体(Tropheryma whippelii)、解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum)、韦荣氏球菌属种(Veillonella sp.)、弧菌属种(Vibrio sp.)(例如霍乱弧菌、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)、创伤弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、河流孤菌(Vibrio fluvialis)、麦奇尼科夫氏弧菌(Vibrio metchnikovii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)和弗氏弧菌(Vibrio furnisii))、耶尔森菌属种(Yersinia sp.)(例如小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森菌)以及嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)。
真菌
在某些示例性实施方案中，微生物是真菌或真菌种类。可以根据所公开的方法检测的真菌的实例包括但不限于以下任何一种或多种(或其任何组合)：曲霉(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、念珠菌(Candidiasis)、球孢子菌(Coccidiodomycosis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus gatti)、组织胞浆菌属种(sp.Histoplasma sp.)(例如荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum))、肺孢子菌属种(Pneumocystis sp.)(例如耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii))、葡萄穗霉(Stachybotrys)(例如黑葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum))、毛霉菌(Mucroymcosis)、孢子丝菌(Sporothrix)、眼真菌感染环癣、突脐蠕孢(Exserohilum)、枝孢霉(Cladosporium)。
在某些示例性实施方案中，真菌是酵母。可以根据所公开的方法检测的酵母的实例包括但不限于以下一种或多种(或其任何组合)：曲霉属(例如烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)和棒曲霉(Aspergillus clavatus))、隐球菌属种(Cryptococcus sp.)(例如新型隐球菌、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)、罗伦隐球菌(Cryptococcus laurentii)和浅白隐球菌(Cryptococcus albidus))、地霉(Geotrichum)属、酵母(Saccharomyces)属、汉逊酵母(Hansenula)属、念珠菌(Candida)属(例如白色念珠菌(Candida albicans))、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属或其组合。在某些示例性实施方案中，真菌是霉菌。示例性霉菌包括但不限于青霉(Penicillium)属、枝孢霉属、丝衣霉(Byssochlamys)属或其组合。
原生动物
在某些示例性实施方案中，微生物是原生动物。可以根据所公开的方法和装置检测的原生动物的实例包括但不限于以下任何一种或多种(或其任何组合)：眼虫动物界(Euglenozoa)、异叶足纲(Heterolobosea)、双滴虫目(Diplomonadida)、变形虫界(Amoebozoa)、芽囊原虫属(Blastocystic)和顶复亚门(Apicomplexa)。示例性眼虫动物界包括但不限于克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)(查加斯病(Chagas disease))、布氏冈比亚锥虫(T.brucei gambiense)、布氏罗得西亚锥虫(T.brucei rhodesiense)、巴西利什曼原虫(Leishmania braziliensis)、婴儿利什曼原虫(L.infantum)、墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)、大型利什曼原虫(L.major)、热带利什曼原虫(L.tropica)和杜氏利什曼原虫(L.donovani)。示例性异叶足纲包括但不限于福氏耐格里变形虫(Naegleria fowleri)。示例性双滴虫目包括但不限于肠贾第虫(Giardia intestinalis)(兰伯氏贾第虫(G.lamblia)、十二指肠贾第虫(G.duodenalis))。示例性变形虫界包括但不限于卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)、狒狒巴拉姆希阿米巴(Balamuthia madrillaris)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)。示例性芽囊原虫属包括但不限于人芽囊原虫(Blastocystic hominis)。示例性顶复亚门包括但不限于微小巴贝虫(Babesia microti)、微小隐孢子虫、卡耶他环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.malariae)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小巴贝虫、微小隐孢子虫、卡耶他环孢子虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和刚地弓形虫。
寄生虫
在某些示例性实施方案中，微生物是寄生虫。可以根据所公开的方法检测的寄生虫的实例包括但不限于以下一种或多种(或其任何组合)：盘尾丝虫(Onchocerca)属和疟原虫(Plasmodium)属。
病毒
在某些示例性实施方案中，本文所公开的系统、装置和方法涉及检测样品中的病毒。本文所公开的实施方案可以用于检测病毒感染(例如受试者或植物的病毒感染)，或确定病毒株，包括因单核苷酸多态性而不同的病毒株。病毒可以是DNA病毒、RNA病毒或逆转录病毒。适用于本发明的病毒的非限制性实例包括但不限于埃博拉、麻疹、SARS、基孔肯雅、肝炎、马尔堡、黄热病、MERS、登革、拉沙、流感、棒状病毒或HIV。肝炎病毒可以包括甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎。流感病毒可以包括例如甲型流感或乙型流感。HIV可以包括HIV 1或HIV 2。在某些示例性实施方案中，病毒序列可以是人呼吸道合胞病毒、苏丹埃博拉病毒(Sudan ebola virus)、本迪布焦病毒(Bundibugyo virus)、大森林埃博拉病毒(TaiForest ebola virus)、雷斯顿埃博拉病毒(Reston ebola virus)、阿基莫塔(Achimota)、伊蚊黄病毒、艾顾凯特病毒(Aguacate virus)、阿卡班病毒(Akabane virus)、阿德非德瑞塔沙粒病毒(Alethinophid reptarenavirus)、阿帕华约哺乳类沙粒病毒(Allpahuayomammarenavirus)、阿马帕里沙粒病毒(Amapari mmarenavirus)、安第斯病毒(Andesvirus)、阿波依病毒(Apoi virus)、阿拉万病毒(Aravan virus)、阿罗阿病毒(Aroavirus)、阿莫瓦病毒(Arumwot virus)、大西洋鲑鱼副粘病毒(Atlantic salmonparamyoxivirus)、澳洲蝙蝠狂犬病病毒(Australian bat lyssavirus)、禽波纳病毒(Avian bornavirus)、禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus)、禽副粘病毒(Avianparamyoxvirus)、企鹅或福克兰群岛病毒(penguin or Falkland Islandsvirus)、BK多瘤病毒、巴加扎病毒(Bagaza virus)、版纳病毒(Banna virus)、蝙蝠戊型肝炎病毒(Bathepevirus)、蝙蝠札幌病毒(Bat sapovirus)、熊佳农哺乳类沙粒病毒(Bear Canonmammarenavirus)、北龙病毒(Beilong virus)、贝塔康诺病毒(Betacoronoavirus)、贝塔乳头瘤病毒1-6(Betapapillomavirus 1-6)、班杰病毒(Bhanja virus)、博克洛蝙蝠狂犬病病毒(Bokeloh bat lyssavirus)、博尔纳病病毒、波本病毒(Bourbon virus)、牛丙型肝炎病毒(Bovine hepacivirus)、牛副流感病毒3、牛呼吸道合胞病毒、巴宗病毒(Brazoranvirus)、本雅威病毒(Bunyamwere virus)、杯状病毒科病毒、加利福尼亚脑炎病毒(California encephalitis virus)、坎迪鲁病毒(Candiru virus)、犬瘟热病毒(Caninedistemper virus)、犬肺病毒(Canaine pneumovirus)、松湾病毒(Cedar virus)、细胞融合因子病毒(Cell fusing agent virus)、鲸麻疹病毒(Cetacean morbillivirus)、金迪普拉病毒(Chandipura virus)、朝阳病毒(Chaoyang virus)、查帕雷哺乳类沙粒病毒(Chaparemammarenavirus)、基孔肯雅病毒、疣猴乳头瘤病毒(Colobus monkey papillomavirus)、科罗拉多蜱传热病毒(Colorado tick fever virus)、牛痘病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、库蚊黄病毒、库皮科斯哺乳类沙粒病毒(Cupixi mammarenavirus)、登革病毒、多布拉瓦-贝尔格莱德病毒(Dobrava-Belgrade virus)、东港病毒(Donggang virus)、杜贝病毒(Dugbevirus)、杜文海格病毒(Duvenhage virus)、东方马脑炎病毒(Eastern equineencephalitis virus)、恩德培蝙蝠病毒(Entebbe bat virus)、肠病毒A-D、欧洲蝙蝠狂犬病病毒1-2、依埃契病毒(Eyach virus)、猫麻疹病毒(Feline morbillivirus)、矛头蛇副粘病毒(Fer-de-Lance paramyxovirus)、费茨罗伊河病毒(Fitzroy River virus)、黄病毒科病毒、弗萊克索哺乳类沙粒病毒(Flexal mammarenavirus)、GB病毒C、加伊若病毒(Gairovirus)、戈麦环状病毒(Gemycircularvirus)、鹅副粘病毒SF02、大岛病毒(Great Islandvirus)、瓜纳瑞托哺乳类沙粒病毒(Guanarito mammarenavirus)、汉坦病毒(Hantaanvirus)、汉坦病毒Z10、哈特兰德病毒(Heartland virus)、亨德拉病毒、甲型/乙型/丙型/戊型肝炎、丁型肝炎病毒(Hepatitis delta virus)、人博卡病毒(Human bocavirus)、人冠状病毒、人内源逆转录病毒K、人肠道冠状病毒、人生殖器相关环状DNA病毒-1、人疱疹病毒1-8、人免疫缺陷病毒1/2、人哺乳动物腺病毒A-G(Huan mastadenovirus A-G)、人乳头瘤病毒、人副流感病毒1-4、人副肠孤病毒(Human paraechovirus)、人小双节RNA病毒(Humanpicobirnavirus)、人斯马可病毒(Human smacovirus)、艾克马狂犬病病毒(Ikomalyssavirus)、伊列乌斯病毒(Ilheus virus)、甲型-丙型流感、伊皮哺乳类沙粒病毒(Ippymammarenavirus)、伊尔库特病毒(Irkut virus)、J-病毒、JC多瘤病毒、日本脑炎病毒、胡宁哺乳类沙粒病毒(Junin mammarenavirus)、KI多瘤病毒、卡迪皮罗病毒(Kadipiro virus)、卡密河病毒(Kamiti River virus)、凯杜古病毒(Kedougou virus)、库贾德病毒(Khujandvirus)、科科贝拉病毒(Kokobera virus)、科萨努尔森林病病毒(Kyasanur forestdisease virus)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus)、兰加特病毒(Langat virus)、拉沙哺乳类沙粒病毒(Lassa mammarenavirus)、拉丁哺乳类沙粒病毒(Latinomammarenavirus)、罗帕德山病毒(Leopards Hill virus)、辽宁病毒(Liao ning virus)、永安河病毒(Ljungan virus)、拉洛维病毒(Lloviu virus)、跳跃病病毒(Louping illvirus)、卢约哺乳类沙粒病毒(Lujo mammarenavirus)、卢纳哺乳类沙粒病毒(Lunamammarenavirus)、伦卡病毒(Lunk virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎哺乳类沙粒病毒(Lymphocytic choriomeningitis mammarenavirus)、欧泽诺尔狂犬病病毒(LyssavirusOzernoe)、MSSI2\.225病毒、马丘波哺乳类沙粒病毒(Machupo mammarenavirus)、哺乳动物星状病毒1(Mamastrovirus 1)、曼萨尼亚病毒(Manzanilla virus)、马普埃拉病毒(Mapuera virus)、马尔堡病毒、马雅罗病毒(Mayaro virus)、麻疹病毒、梅南高病毒(Menangle virus)、摩西卡迪病毒(Mercadeo virus)、梅克尔细胞多瘤病毒(Merkel cellpolyomavirus)、中东呼吸综合征冠状病毒、莫巴拉哺乳类沙粒病毒(Mobalamammarenavirus)、摩多克病毒(Modoc virus)、莫江病毒(Moijang virus)、莫科洛病毒(Mokolo virus)、猴痘病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠脑白质炎病毒(Montana myotisleukoenchalitis virus)、莫佩亚拉沙病毒重排体29(Mopeia lassa virus reassortant29)、莫佩亚哺乳类沙粒病毒(Mopeia mammarenavirus)、莫罗戈罗病毒(Morogoro virus)、莫斯曼病毒(Mossman virus)、腮腺炎病毒、鼠类肺炎病毒、墨累山谷脑炎病毒(MurrayValley encephalitis virus)、纳里瓦病毒(Nariva virus)、新城疫病毒、尼帕病毒、诺瓦克病毒、挪威鼠丙型肝炎病毒(Norway rat hepacivirus)、恩塔亚病毒(Ntaya virus)、奥尼昂-尼昂病毒(O'nyong-nyong virus)、奥利韦罗斯哺乳类沙粒病毒(Oliverosmammarenavirus)、鄂木斯克出血热病毒(Omsk hemorrhagic fever virus)、奥罗普切病毒(Oropouche virus)、副流感病毒5、巴拉那哺乳类沙粒病毒(Parana mammarenavirus)、帕拉马塔河病毒(Parramatta River virus)、小型反刍动物瘟疫病毒(Peste-des-petits-ruminants virus)、毕赤德哺乳类沙粒病毒(Pichande mammarenavirus)、小RNA病毒科病毒、皮里陶哺乳类沙粒病毒(Pirital mammarenavirus)、鱼戊型肝炎病毒A(Piscihepevirus A)、猪副流感病毒1、猪腮腺炎病毒(porcine rubulavirus)、波瓦桑病毒(Powassan virus)、灵长类动物T-嗜淋巴细胞病毒1-2、灵长类动物红系细小病毒1(Primate erythroparvovirus 1)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro virus)、普马拉病毒(Puumala virus)、广平病毒(Quang Binh virus)、狂犬病病毒、拉兹丹病毒(Razdanvirus)、爬行动物博尔纳病毒(Reptile bornavirus 1)、鼻病毒A-B、里夫特山谷热病毒(Rift Valley fever virus)、牛瘟病毒、热伯维病毒(Rio Bravo virus)、啮齿动物细环病毒(Rodent Torque Teno virus)、啮齿动物丙型肝炎病毒(Rodent hepacivirus)、罗斯河病毒、轮状病毒A-I、皇家农场病毒(Royal Farm virus)、风疹病毒、萨比亚哺乳类沙粒病毒(Sabia mammarenavirus)、塞勒姆病毒(Salem virus)、那不勒斯白蛉热病毒(Sandflyfever Naples virus)、西西里白蛉热病毒(Sandfly fever Sicilian virus)、札幌病毒(Sapporo virus)、萨苏伯里病毒(Sathuperi virus)、海豹指环病毒(Seal anellovirus)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、仙台病毒(Sendai virus)、汉城病毒(Seoulvirus)、塞皮克病毒(Sepik virus)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒、严重发热伴血小板减少综合征病毒、沙门达病毒(Shamonda virus)、希莫尼蝙蝠病毒(Shimoni batvirus)、舒尼病毒(Shuni virus)、西姆布病毒(Simbu virus)、猿猴细环病毒(Simiantorque teno virus)、猿猴病毒40-41、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus)、辛德毕斯病毒、小指环病毒(Small anellovirus)、索素佳病毒(Sosuga virus)、西班牙山羊脑炎病毒(Spanish goat encephalitis virus)、斯庞德温尼病毒(Spondweni virus)、圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis virus)、森夏恩病毒(Sunshine virus)、TTV样微小病毒(TTV-like mini virus)、塔卡里伯哺乳类沙粒病毒(Tacaribe mammarenavirus)、台依病毒(Taila virus)、塔玛纳蝙蝠病毒(Tamana bat virus)、塔米埃米哺乳类沙粒病毒(Tamiami mammarenavirus)、坦布苏病毒(Tembusu virus)、托高土病毒(Thogoto virus)、索托帕拉雅病毒(Thottapalayam virus)、蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitisvirus)、刁曼病毒(Tioman virus)、披膜病毒科病毒、犬细环病毒(Torque teno canisvirus)、夜猴细环病毒(Torque teno douroucouli virus)、猫细环病毒(Torque tenofelis virus)、中细环病毒(Torque teno midi virus)、猪细环病毒(Torque teno susvirus)、狨猴细环病毒(Torque teno tamarin virus)、细环病毒(Torque teno virus)、海狮细环病毒(Torque teno zalophus virus)、吐霍克病毒(Tuhoko virus)、图拉病毒(Tulavirus)、树鼩副粘病毒、乌苏图病毒(Usutu virus)、尤库尼米病毒(Uukuniemi virus)、痘苗病毒、天花病毒、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、印第安纳水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus)、WU多瘤病毒、韦塞尔斯布朗病毒(Wesselsbron virus)、西高加索蝙蝠病毒(West Caucasian bat virus)、西尼罗河病毒、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)、怀特沃特阿罗约哺乳类沙粒病毒(Whitewater Arroyo mammarenavirus)、黄热病病毒、横须贺病毒(Yokose virus)、尤格波格丹诺夫奇病毒(Yug Bogdanovac virus)、扎伊尔埃博拉病毒(Zaireebolavirus)、寨卡病毒或拜氏接合酵母病毒Z病毒序列(Zygosaccharomyces bailiivirus Z viral sequence)。可以检测的RNA病毒的实例包括以下一种或多种(或其任何组合)：冠状病毒科病毒、小RNA病毒科病毒、杯状病毒科病毒、黄病毒科病毒、披膜病毒科病毒、玻那病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科、肺泡病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、正粘病毒科或丁型病毒。在某些示例性实施方案中，病毒是冠状病毒、SARS、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、甲型肝炎、诺瓦克病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、风疹病毒、罗斯河病毒、辛德毕斯病毒、基孔肯雅病毒、博尔纳病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、新城疫病毒、人呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、拉沙病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、流感或丁型肝炎病毒。
在某些示例性实施方案中，病毒可以是选自包括以下的组的植物病毒：烟草花叶病毒(TMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、RT病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)、李痘病毒(PPV)、雀麦草花叶病毒(BMV)、马铃薯病毒X(PVX)、柑橘衰退病毒(CTV)、大麦黄矮病毒(BYDV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、番茄丛矮病毒(TBSV)、水稻东格鲁球状病毒(rice tungro spherical virus)(RTSV)、水稻黄斑驳病毒(RYMV)、水稻白叶病毒(RHBV)、玉米雷亚朵非纳病毒(maize rayado fino virus)(MRFV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯凹脉黄化丝状病毒(sweetpotato sunken vein closterovirus)(SPSVV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)、葡萄病毒A(GVA)、葡萄病毒B(GVB)、葡萄斑点病毒(GFkV)、葡萄卷叶相关病毒-1、葡萄卷叶相关病毒-2和葡萄卷叶相关病毒-3(GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3)、南芥菜花叶病毒(ArMV)或沙地葡萄茎痘相关病毒(RSPaV)。在优选实施方案中，靶RNA分子是所述病原体的一部分或从所述病原体的DNA分子转录。举例来说，靶序列可以包含在RNA病毒的基因组中。进一步优选的是，如果所述病原体感染或已经感染所述植物，那么CRISPR效应蛋白水解所述植物中所述病原体的所述靶RNA分子。因此优选的是，当治疗性地，即，在感染已经发生之后，或预防性地，即，在感染已经发生之前应用CRISPR系统(或其完成所需的部分)时，CRISPR系统能够使靶RNA分子从植物病原体裂解。
在某些示例性实施方案中，病毒可以是逆转录病毒。可以使用本文所公开的实施方案检测的示例性逆转录病毒包括以下病毒中的一种或多种或任何组合：α逆转录病毒属、β逆转录病毒属、γ逆转录病毒属、δ逆转录病毒属、ε逆转录病毒属、慢病毒属、泡沫病毒属(Spumavirus)，或转座病毒科(Metaviridae)、假病毒科(Pseudoviridae)和逆转录病毒科(Retroviridae)(包括HIV)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(包括乙型肝炎病毒)和花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)(包括花椰菜花叶病毒)。
在某些示例性实施方案中，病毒是DNA病毒。可以使用本文所公开的实施方案检测的示例性DNA病毒尤其包括来自以下科的病毒中的一种或多种(或其任何组合)：肌病毒科(Myoviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、长尾病毒科(Siphoviridae)、异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(包括人疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒)、马洛疱疹病毒科(Malocoherpesviridae)、脂毛病毒科(Lipothrixviridae)、小杆状病毒科(Rudiviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、瓶状病毒科(Ampullaviridae)、囊泡病毒科(Ascoviridae)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)(包括非洲猪瘟病毒)、杆状病毒科(Baculoviridae)、西坎达病毒科(Cicaudaviridae)、棒状病毒科(Clavaviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、微小纺锤形病毒科(Fuselloviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、滴状病毒科(Guttaviridae)、肥大唾腺炎病毒科(Hytrosaviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、马赛病毒科(Maseilleviridae)、拟菌病毒科(Mimiviridae)、裸病毒科(Nudiviridae)、线形病毒科(Nimaviridae)、潘多拉病毒科(Pandoraviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)、原质病毒科(Plasmaviridae)、多DNA病毒(Polydnavirus)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)(包括猿猴病毒40、JC病毒、BK病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(包括牛痘和天花)、球脂状病毒科(Sphaerolipoviridae)、复层病毒科(Tectiviridae)、图里病毒科(Turriviridae)、地诺DNA病毒(Dinodnavirus)、盐末端蛋白病毒(Salterprovirus)、瑞兹病毒(Rhizidovirus)。在一些实施方案中，一种诊断疑似具有细菌感染的受试者中的种类特异性细菌感染的方法被描述为从受试者获得包含细菌核糖体核糖核酸的样品；使样品与所描述的探针中的一个或多个接触；以及检测样品中存在的细菌核糖体核糖核酸序列与探针之间的杂交，其中杂交的检测指示受试者受以下细菌感染：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、白色念珠菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、奇异变形杆菌、无乳葡萄球菌(Staphylococcus agalactiae)或嗜麦芽葡萄球菌(Staphylococcus maltophilia)或其组合。
在某些示例性实施方案中，病毒是下表8中所列的病毒，或所指示的属/科的病毒。
表8
Figure BDA0002275597970001271
Figure BDA0002275597970001281
Figure BDA0002275597970001291
Figure BDA0002275597970001301
Figure BDA0002275597970001311
Figure BDA0002275597970001321
Figure BDA0002275597970001331
Figure BDA0002275597970001341
Figure BDA0002275597970001351
在某些实施方案中，病毒是下表中所列的病毒。
Figure BDA0002275597970001352
Figure BDA0002275597970001361
在某些实施方案中，病毒是下表9中所列的病毒。
表9
Figure BDA0002275597970001362
Figure BDA0002275597970001371
在某些实施方案中，病毒是抗药性病毒。通过实例并且不受限制，病毒可以是病毒唑抗性病毒。病毒唑是针对许多RNA病毒的极有效抗病毒剂。以下是已经演变出病毒唑抗性的数种重要病毒。口蹄疫病毒：doi:10.1128/JVI.03594-13。脊髓灰质炎病毒：www.pnas.org/cont ent/100/12/7289.full.pdf。丙型肝炎病毒：jvi.asm.org/content/79/4/2346.full。许多其它持久性RNA病毒，例如肝炎和HIV，已经演变出对现有抗病毒药物的抗性。乙型肝炎病毒(拉米夫定、替诺福韦、恩替卡韦)：doi:10.1002/hep.22900。丙型肝炎病毒(特拉匹韦、BILN2061、I TMN-191、SCH6、波普瑞韦、AG-021541、ACH-806)：doi:10.1002/hep.22549。HIV具有许多抗药性突变，关于更多信息参见hivdb.stan ford.edu/。除抗药性以外，存在许多可以用如本文所描述的根据本发明的CRISPR系统靶向的临床上相关的突变。举例来说，LCMV中的持久性对急性感染：doi:10.1073/pnas.1019304108；或增加的埃博拉感染力：http://doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.014和http://doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.013。
疟疾检测和监测
疟疾是由疟原虫寄生虫引起的蚊传病状。寄生虫经由受感染的雌性疟蚊(Anopheles)的叮咬传播给人。五种疟原虫种类引起人的疟疾：恶性疟原虫、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)和诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)。在这些当中，根据世界卫生组织(WorldHealth Organization)(WHO)，恶性疟原虫和间日疟原虫造成最大威胁。恶性疟原虫(P.falciparum)是非洲大陆最普遍存在的疟疾寄生虫并且造成全球大多数疟疾相关死亡。间日疟原虫是在撒哈拉以南非洲外的大多数国家的主要疟疾寄生虫。
在2015年，91个国家和地区具有持续的疟疾传播。根据最近的WHO估计，在2015年存在2.12亿疟疾病例和429000例死亡。在疟疾高度传播的地区，5岁以下儿童尤其易受感染、疾患和死亡；所有疟疾死亡中超过三分之二(70％)在这个年龄组中发生。在2010年与2015年之间，全球5岁以下疟疾死亡率下降29％。然而，疟疾仍然是五岁以下儿童的主要杀手，每两分钟夺走一名儿童的生命。
如WHO所描述，疟疾是急性发热疾患。在非免疫个体中，症状在感染性蚊叮咬后7天或更长时间出现。首发症状-发热、头痛、寒冷和呕吐-可能是轻微的并且难以识别为疟疾，然而，如果在24小时内未治疗，那么恶性疟原虫疟疾可以进展至严重疾患，常常导致死亡。
患有严重疟疾的儿童频繁发展出以下症状中的一种或多种：严重贫血、与代谢性酸中毒相关的呼吸窘迫，或脑型疟疾。在成人中，多器官受累也频繁出现。在疟疾流行区，人可能发展出部分免疫，从而允许无症状感染发生。
快速和有效诊断测试的发展与公共卫生高度相关。确实，疟疾的早期诊断和治疗不仅减轻疾病并防止死亡，而且有助于减少疟疾传播。根据WHO推荐，疑似疟疾的所有病例在施用治疗之前应使用基于寄生虫的诊断测试(特别是使用快速诊断测试)来确认(参见"WHO Guidelines for the treatment of malaria",第三版,2015年4月公布)。
对抗疟疾疗法的抗性表现出关键的健康问题，这大大减少了治疗策略。确实，如WHO网站所报道，恶性疟原虫对前代药物，例如氯喹(chloroquine)和磺胺多辛/乙胺嘧啶(sulfadoxine/pyrimethamine)(SP)的抗性在1950年代和1960年代变得普遍存在，削弱了疟疾控制的努力并且逆转了儿童存活率的增加。因此，WHO推荐抗疟疾药抗性的常规监测。确实，准确诊断可以避免非适当治疗并且限制对抗疟疾药物的抗性的扩展。
在这种情形中，2016-2030年WHO全球疟疾技术策略-在2015年5月由世界卫生大会(World Health Assembly)正式通过-提供了对于所有疟疾流行国家的技术框架。其意图指导和支持致力于疟疾控制和消除的地区和国家规划。策略设定了宏大的但可达成的全球目标，包括：
·截至2030年使疟疾病例发病率降低至少90％。
·截至2030年使疟疾死亡率降低至少90％。
·截至2030年消除至少35个国家的疟疾。
·防止无疟疾的所有国家的疟疾再起。
这种策略是跨越2年并且涉及来自70个成员国的超过400名技术专家的参与的广泛协商过程的结果。这是基于3个关键轴：
·确保全面普及疟疾预防、诊断和治疗；
·加速对消除和达到无疟疾状态的努力；以及
·将疟疾监视转变成核心干预。
对疟原虫的治疗包括芳基-氨基醇，例如奎宁(quinine)或奎宁衍生物，例如氯喹、阿莫地喹(amodiaquine)、甲氟喹(mefloquine)、哌喹(piperaquine)、苯芴醇(lumefantrine)、伯氨喹(primaquine)；亲脂性羟基萘醌类似物，例如阿托伐醌(atovaquone)；抗叶酸药物，例如磺胺类药物磺胺多辛、氨苯砜(dapsone)和乙胺嘧啶；氯胍(proguanil)；阿托伐醌/氯胍的组合；青蒿素(atemisins)药物；以及其组合。
作为蚊传病原体存在的诊断的靶序列包括作为疟原虫，特别是影响人的疟原虫(Plasmodia)种类，例如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫存在的诊断的序列，包括来自其基因组的序列。
作为监测对疟原虫，特别是影响人的疟原虫种类，例如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和诺氏疟原虫的治疗的抗药性的诊断的靶序列。
其它靶序列包括序列，所述序列包括编码以下蛋白质的靶分子/核酸分子：疟原虫寄生虫的基本生物过程中所涉及的蛋白质并且特别是转运蛋白，例如来自药物/代谢物转运子家族的蛋白质；底物易位中所涉及的ATP结合盒(ABC)蛋白质，例如ABC转运子C亚家族或Na+/H+交换子、膜谷胱甘肽S-转移酶；叶酸途径中所涉及的蛋白质，例如二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸还原酶活性或二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶；以及跨越线粒体内膜的质子易位中所涉及的蛋白质并且特别是细胞色素b复合物。额外标靶还可以包括编码亚铁血红素聚合酶的一个或多个基因。
其它靶序列包括编码基本生物过程中所涉及的蛋白质的靶分子/核酸分子，其可以选自恶性疟原虫氯喹抗性转运基因(pfcrt)、恶性疟原虫多抗药性转运子1(pfmdr1)、恶性疟原虫多抗药性相关蛋白基因(Pfmrp)、恶性疟原虫Na+/H+交换基因(pfnhe)、编码恶性疟原虫输出蛋白1的基因、恶性疟原虫Ca2+转运ATPase 6(pfatp6)；恶性疟原虫二氢蝶酸合成酶(pfdhps)、二氢叶酸还原酶活性(pfdhpr)和二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(pfdhfr)基因、细胞色素b基因、gtp环化水解酶和Kelch13(K13)基因，以及其在其它疟原虫种类中的功能性异源基因。
许多突变，特别是单点突变，已经在作为当前治疗的标靶并且与特异性抗性表型相关联的蛋白质中鉴别到。因此，本发明允许检测蚊传寄生虫，例如疟原虫的各种抗性表型。
本发明允许检测靶核酸/分子中的一个或多个突变并且特别是一个或多个单核苷酸多态性。因此，以下任一个突变或其组合可以用作抗药性标志并且可以根据本发明检测。
恶性疟原虫K13中的单点突变包括以下位置处的单点突变：252、441、446、449、458、493、539、543、553、561、568、574、578、580、675、476、469、481、522、537、538、579、584和719，并且特别是突变E252Q、P441L、F446I、G449A、N458Y、Y493H、R539T、I543T、P553L、R561H、V568G、P574L、A578S、C580Y、A675V、M476I、C469Y、A481V、S522C、N537I、N537D、G538V、M579I、D584V和H719N。这些突变一般与青蒿素药物抗性表型相关联(Artemisininand artemisinin-based combination therapy resistance,2016年4月WHO/HTM/GMP/2016.5)。
在恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(DHFR)(PfDHFR-TS，PFD0830w)中，重要的多态性包括位置108、51、59和164处的突变，特别是调节对乙胺嘧啶的抗性的108D、164L、51I和59R。其它多态性还包括与对磺胺多辛的抗性相关联的437G、581G、540E、436A和613S。额外观测的突变包括Ser108Asn、Asn51Ile、Cys59Arg、Ile164Leu、Cys50Arg、Ile164Leu、Asn188Lys、Ser189Arg和Val213Ala、Ser108Thr和Ala16Val。突变Ser108Asn、Asn51Ile、Cys59Arg、Ile164Leu、Cys50Arg、Ile164Leu与基于乙胺嘧啶的疗法和/或氯鸟嘌呤-氨苯砜组合疗法抗性显著相关联。环氯胍(cycloguanil)抗性似乎与双重突变Ser108Thr和Ala16Val相关联。dhfr的扩增也可能与疗法抗性，特别是乙胺嘧啶抗性高度相关。
在恶性疟原虫二氢蝶酸合成酶(DHPS)(PfDHPS，PF08_0095)中，重要的多态性包括位置436、437、581和613处的突变Ser436Ala/Phe、Ala437Gly、Lys540Glu、Ala581Gly和Ala613Thr/Ser。位置581和/或613处的多态性还已经与对磺胺多辛-乙胺嘧啶基础疗法的抗性相关联。
在恶性疟原虫氯喹抗性转运子(PfCRT)中，位置76处的多态性，特别是突变Lys76Thr，与对氯喹的抗性相关联。其它多态性包括可能与氯喹抗性相关联的Cys72Ser、Met74Ile、Asn75Glu、Ala220Ser、Gln271Glu、Asn326Ser、Ile356Thr和Arg371Ile。PfCRT也在残基S33、S411和T416处磷酸化，这可以调控蛋白质的转运活性或特异性。
在恶性疟原虫多抗药性转运子1(PfMDR1)(PFE1150w)中，位置86、184、1034、1042处的多态性，特别是Asn86Tyr、Tyr184-Phe、Ser1034Cys、Asn1042Asp和Asp1246Tyr已经被鉴别和报道为影响对苯芴醇、青蒿素、奎宁、甲氟喹(mefloquine)、卤泛群(halofantrine)和氯喹的易感性。另外，PfMDR1的扩增与对苯芴醇、青蒿素、奎宁、甲氟喹和卤泛群的易感性降低相关联，并且PfMDR1的解除扩增(deamplification)导致氯喹抗性的增加。还可以检测到pfmdr1的扩增。PfMDR1的磷酸化状态也高度相关。
在恶性疟原虫多抗药性相关蛋白(PfMRP)(基因参照PFA0590w)中，已经鉴别到位置191和/或437处的多态性，例如Y191H和A437S并且与氯喹抗性表型相关联。
在恶性疟原虫NA+/H+交换子(PfNHE)(参照PF13_0019)中，微卫星ms4670中DNNND的重复增加可以是奎宁抗性的标志。
改变由细胞色素be基因(cytb，mal_mito_3)编码的细胞色素b蛋白的泛醇结合位点的突变与阿托伐醌抗性相关联。位置26、268、276、133和280处的突变并且特别是Tyr26Asn、Tyr268Ser、M1331和G280D可能与阿托伐醌抗性相关联。
举例来说，在间日疟原虫中，Pf MDR1的同源物PvMDR1中的突变已经与氯喹抗性相关联，特别是位置976处的多态性，诸如突变Y976F。
上述突变是依据蛋白质序列来定义。然而，技术人员能够确定有待鉴别为核酸靶序列的相应突变，包括SNP。
其它所鉴别的抗药性标志在本领域中是已知的，例如以下文献中所描述："Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs(1996-2004)"；WHO；Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance(2016年4月WHO/HTM/GMP/2016.5)；"Drug-resistant malaria:molecular mechanisms andimplications for public health"FEBS Lett.2011年6月6日；585(11):1551-62.doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042.Epub 2011年4月23日.Review.PubMed PMID:21530510；其内容以引用的方式并入于此。
关于可以根据本发明检测的多肽，本文所提及的所有基因的基因产物都可以用作标靶。相应地，预期此类多肽可以用于抗药性的种类鉴别、分型和/或检测。
在某些示例性实施方案中，本文所公开的系统、装置和方法涉及检测样品，例如获自受试者的生物样品中一种或多种蚊传寄生虫的存在。在某些示例性实施方案中，寄生虫可以选自以下种类：恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫或诺氏疟原虫。因此，本文所公开的方法可以适应于在其它方法中与其它方法一起(或组合)使用，所述其它方法需要寄生虫种类的快速鉴别，监测寄生虫和寄生虫形式的存在(例如对应于感染和寄生虫生命周期的各个阶段，例如红细胞外期、红细胞内期、孢子生殖期；寄生虫形式包括裂殖子、子孢子、分裂体、配子体)；某些表型(例如病原体抗药性)的检测，疾病进展和/或爆发的监测，以及治疗(药物)筛选。此外，在疟疾的情况下，在感染性叮咬之后可能流逝很长时间，即，长孵育时段，在此期间患者不显示出症状。类似地，预防性治疗可以延迟症状的出现，并且在复发之前还可以观测到很长的无症状时段。此类延迟可以容易引起误诊或延迟诊断，并且因此削弱治疗的有效性。
因为此处所公开的实施方案的快速和灵敏诊断能力、低至单核苷酸差异的寄生虫类型的检测和作为POC装置部署的能力，所以本文所公开的实施方案可以用于指导治疗方案，例如适当疗程的选择。本文所公开的实施方案还可以用于针对寄生虫的存在和分型筛选环境样品(蚊群等)。还可以修改实施方案以同时检测蚊传寄生虫和其它蚊传病原体。在一些情况下，疟疾和其它蚊传病原体可能最初呈现出类似的症状。因此，快速区分感染类型的能力可以指导重要的治疗决策。可以与疟疾共同检测的其它蚊传病原体包括登革、西尼罗河病毒、基孔肯雅、黄热病、丝虫病、日本脑炎、圣路易斯脑炎、西方马脑炎、东方马脑炎、委内瑞拉马脑炎、拉克罗斯脑炎(La Crosse encephalitis)和寨卡。
在某些示例性实施方案中，本文所公开的装置、系统和方法可以用于区分样品中的多个蚊传寄生虫种类。在某些示例性实施方案中，鉴别可以基于核糖体RNA序列，包括18S、16S、23S和5S亚单位。在某些示例性实施方案中，鉴别可以基于基因组中的多个拷贝中所存在的基因的序列，例如线粒体基因，如CYTB。在某些示例性实施方案中，鉴别可以基于高度表达和/或高度保守的基因的序列，例如GAPDH、组蛋白H2B、烯醇酶或LDH。鉴别相关rRNA序列的方法在美国专利申请公布号2017/0029872中公开。在某些示例性实施方案中，一组向导RNA可以被设计成由对于每个种类或株系独特的可变区来区分每个种类。向导RNA还可以被设计成靶向在属、族、目、类、门、界的水平或其组合上区分微生物的RNA基因。在使用扩增的某些示例性实施方案中，一组扩增引物可以被设计成侧接核糖体RNA序列的恒定区并且向导RNA被设计成由可变内区来区分每个种类。在某些示例性实施方案中，引物和向导RNA可以分别被设计成16S亚单位中的保守区和可变区。同样可以使用跨越种类或种类的子组，例如RecA基因家族RNA聚合酶β亚单位独特可变的其它基因或基因组区域。其它适合的系统发生标志和其鉴别方法在例如Wu等arXiv:1307.8690[q-bio.GN]中论述。
在某些示例性实施方案中，种类鉴别可以基于基因组中的多个拷贝中所存在的基因，例如线粒体基因，如CYTB来进行。在某些示例性实施方案中，种类鉴别可以基于高度表达和/或高度保守基因，例如GAPDH、组蛋白H2B、烯醇酶或LDH来进行。
在某些示例性实施方案中，方法或诊断被设计成同时跨越多个系统发生和/或表型水平筛选蚊传寄生虫。举例来说，方法或诊断可以包括使用多个具有不同向导RNA的CRISPR系统。第一组向导RNA可以区分例如恶性疟原虫或间日疟原虫。这些一般类别甚至可以进一步细分。举例来说，可以设计向导RNA并且用于一般性地或关于特定药物或药物组合来区分抗药性株系的方法或诊断中。第二组向导RNA可以被设计成在种类的水平上区分微生物。因此，可以产生鉴别所有蚊传寄生虫种类或亚种的矩阵，根据抗药性进一步划分。前述内容仅用于示例性目的。还涵盖用于归类其它蚊传寄生虫类型的其它方式并且将遵循上文所描述的一般结构。
在某些示例性实施方案中，本文所公开的装置、系统和方法可以用于筛选所关注的蚊传寄生虫基因，例如抗药性基因。向导RNA可以被设计成区分所关注的已知基因。然后可以使用本文所公开的用于检测一个或多个此类基因的实施方案筛选样品，包括临床样品。在POC下筛选抗药性的能力将在选择适当治疗方案中具有巨大的效益。在某些示例性实施方案中，抗药性基因是编码以下蛋白质的基因：例如转运蛋白，例如来自药物/代谢物转运子家族的蛋白质；底物易位中所涉及的ATP结合盒(ABC)蛋白质，例如ABC转运子C亚家族或Na+/H+交换子；叶酸途径中所涉及的蛋白质，例如二氢蝶酸合成酶、二氢叶酸还原酶活性或二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶；以及跨越线粒体内膜的质子易位中所涉及的蛋白质并且特别是细胞色素b复合物。额外标靶还可以包括编码亚铁血红素聚合酶的一个或多个基因。在某些示例性实施方案中，抗药性基因选自恶性疟原虫氯喹抗性转运基因(pfcrt)、恶性疟原虫多抗药性转运子1(pfmdr1)、恶性疟原虫多抗药性相关蛋白基因(Pfmrp)、恶性疟原虫Na+/H+交换基因(pfnhe)、恶性疟原虫Ca2+转运ATPase 6(pfatp6)、恶性疟原虫二氢蝶酸合成酶(pfdhps)、二氢叶酸还原酶活性(pfdhpr)和二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(pfdhfr)基因、细胞色素b基因、gtp环化水解酶和Kelch13(K13)基因，以及其在其它疟原虫种类中的功能性异源基因。其它所鉴别的抗药性标志在本领域中是已知的，例如以下文献中所描述："Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs(1996-2004)"；WHO；Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance(2016年4月WHO/HTM/GMP/2016.5)；"Drug-resistant malaria:molecular mechanismsand implications for public health"FEBS Lett.2011年6月6日；585(11):1551-62.doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042.Epub 2011年4月23日.Review.PubMed PMID:21530510；其内容以引用的方式并入于此。
在一些实施方案中，如本文所描述的CRISPR系统、检测系统或其使用方法可以用于确定蚊传寄生虫爆发的演变。方法可以包括检测来自一个或多个受试者的多个样品的一个或多个靶序列，其中靶序列是来自蚊传寄生虫扩散或引起爆发的序列。此种方法还可以包括确定蚊传寄生虫传播的模式，或由蚊传寄生虫引起的疾病爆发中所涉及的机制。样品可以来源于一个或多个人，和/或来源于一个或多个蚊。
病原体传播的模式可以包括从蚊传寄生虫的天然储库的持续新传播或在从天然储库的单个传播之后的其它传播(例如在蚊之间)，或两种的混合情况。在一个实施方案中，靶序列优选地是蚊传寄生虫基因组内的序列或其片段。在一个实施方案中，蚊传寄生虫传播的模式是蚊传寄生虫传播的早期模式，即，在蚊传寄生虫爆发开始时。在爆发开始时确定蚊传寄生虫传播的模式增加了在最早可能的时间阻止爆发的可能性，从而降低本地和国际蔓延的可能性。
确定蚊传寄生虫传播的模式可以包括根据本文所描述的方法检测蚊传寄生虫序列。确定病原体传播的模式还可以包括检测受试者之间的蚊传寄生虫序列的共享宿主内变异以及确定共享宿主内变异是否显示时序模式。所观测的宿主内和宿主间变异中的模式提供了关于传播和流行病学的重要见解(Gire等,2014)。
除了本文所公开的其它样品类型以外，样品可以来源于一个或多个蚊，例如，样品可以包括蚊唾液。
生物标志检测
在某些示例性实施方案中，本文所公开的系统、装置和方法可以用于生物标志检测。举例来说，本文所公开的系统、装置和方法可以用于SNP检测和/或基因分型。本文所公开的系统、装置和方法还可以用于由异常基因表达表征的任何疾病病况或病症的检测。异常基因表达包括所表达的基因、表达的位置和表达的水平中的异常。可以检测与心血管、免疫病症和癌症以及其它疾病相关的多个转录物或蛋白质标志。在某些示例性实施方案中，本文所公开的实施方案可以用于涉及溶解的疾病，例如肝纤维化和限制性/阻塞性肺病的无细胞DNA检测。在某些示例性实施方案中，实施方案可以用于无细胞DNA的产前测试的更快速和更便携检测。本文所公开的实施方案可以用于筛选尤其与心血管健康、脂质/代谢标识、种族鉴别、父权匹配、人ID(例如匹配嫌疑犯与SNP标识的罪犯数据库)相关联的不同SNP的板块。本文所公开的实施方案还可以用于与癌症肿瘤相关并且从癌症肿瘤释放的突变的无细胞DNA检测。本文所公开的实施方案还可以用于肉质量的检测，例如，通过提供给定的肉产品中不同动物来源的快速检测。本文所公开的实施方案还可以用于与DNA相关的GMO或基因编辑的检测。如本文别处所描述，可以通过在gRNA中引入合成错配来区分密切相关的基因型/等位基因或生物标志(例如在给定的靶序列中仅具有单核苷酸差异)。
在一个方面，本发明涉及一种用于检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：
将样品或样品组分配至一个或多个个别离散容积中，所述个别离散容积包含如本文所描述的根据本发明的CRISPR系统；
在足以允许一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子的条件下孵育样品或样品组；
经由一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子来活化CRISPR效应蛋白，其中活化CRISPR效应蛋白得以修饰基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及
检测可检测的阳性信号，其中检测到可检测的阳性信号指示样品中一种或多种靶分子的存在。
生物标志样品类型
本文所描述的测定的灵敏度非常适合于多种生物样品类型，包括靶核酸是稀释的或样品材料受限制的样品类型中靶核酸的检测。生物标志筛选可以对许多样品类型进行，包括但不限于唾液、尿液、血液、粪便、痰液和脑脊髓液。本文所公开的实施方案还可以用于检测基因的上调和/或下调。举例来说，可以连续稀释样品以使得仅过度表达的基因保持高于测定的检测限临界值。
在某些实施方案中，本发明提供了获得生物流体(例如尿液、血液血浆或血清、痰液、脑脊髓液)的样品以及提取DNA的步骤。有待检测的突变体核苷酸序列可以是较大分子的一部分或可以最初作为离散分子存在。
在某些实施方案中，从癌症患者的血浆/血清中分离DNA。为作比较，从赘生组织中分离DNA样品，并且可以从来自同一患者的非赘生组织中分离第二样品，例如淋巴细胞。非赘生组织可以与赘生组织类型相同或来自不同器官来源。在某些实施方案中，收集血液样品并且立即通过离心从血液细胞中分离血浆。可以将血清过滤并冷冻储存直至DNA提取。
在某些示例性实施方案中，检测直接来自粗的或未加工的样品，例如血液、血清、唾液、脑脊髓液、痰液或尿液的靶核酸。在某些示例性实施方案中，靶核酸是无细胞DNA。
循环肿瘤细胞
在一个实施方案中，可以用本发明测定循环细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))。可以进行用于本文所描述的任何方法中的循环肿瘤细胞(CTC)的分离。可以用于本发明中的达成循环细胞的特异性和灵敏检测和捕获的例示性技术已有描述(Mostert B等,Circulating tumor cells(CTCs):detection methods and their clinical relevancein breast cancer.Cancer Treat Rev.2009；35:463-474；以及Talasaz AH等,Isolatinghighly enriched populations of circulating epithelial cells and other rarecells from blood using a magnetic sweeper device.Proc Natl Acad Sci U SA.2009；106:3970-3975)。在105-106个外周血单核细胞的背景下可以发现少至一个CTC(Ross A A等,Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stemcell collections from breast cancer patients using immunocytochemical andclonogenic assay techniques.Blood.1993,82:2605-2610)。
Figure BDA0002275597970001501
平台使用免疫磁性珠粒，所述珠粒涂布有针对上皮细胞粘附分子(EpCAM)的抗体以富集表达EPCAM的上皮细胞，继之以免疫染色以确认细胞角蛋白染色的存在和白细胞标志CD45的不存在来确认所捕获的细胞是上皮肿瘤细胞(Momburg F等,Immunohistochemical study of theexpression of a Mr 34,000 human epithelium-specific surface glycoprotein innormal and malignant tissues.Cancer Res.1987；47:2883-2891；以及Allard WJ等,Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but notin healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.Clin CancerRes.2004；10:6897-6904)。所捕获的细胞数目已经预期地展示对患有晚期疾病的乳癌、结肠直肠癌和前列腺癌患者的预后意义(Cohen SJ等,J Clin Oncol.2008；26:3213-3221；Cristofanilli M等,N Engl J Med.2004；351:781-791；Cristofanilli M等,J ClinOncol.2005；23:1420-1430；以及de Bono JS等,Clin Cancer Res.2008；14:6302-6309)。
本发明还提供了用CTC-芯片技术分离CTC。CTC-芯片是基于微流体的CTC捕获装置，其中血液流过腔室，所述腔室含有数千个涂布有CTC所结合的抗EpCAM抗体的微柱(Nagrath S等,Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients bymicrochip technology.Nature.2007；450:1235-1239)。CTC-芯片与
Figure BDA0002275597970001502
系统相比提供CTC计数和纯度的显著增加(Maheswaran S等,Detection of mutations in EGFRin circulating lung-cancer cells,N Engl J Med.2008；359:366-377)，这两个平台均可以用于下游分子分析。
无细胞染色质
在某些实施方案中，根据本发明分离和分析无细胞染色质片段。可以在健康个体(Stroun等,Annals of the New York Academy of Sciences 906:161-168(2000))以及患有疾病病况的个体的血清中检测核小体。此外，核小体的血清浓度在罹患良性和恶性疾病，例如癌症和自身免疫疾病的患者中明显较高(Holdenrieder等(2001)Int J Cancer 95,114-120；Trejo-Becerril等(2003)Int J Cancer 104,663-668；Kuroi等1999BreastCancer 6,361-364；Kuroi等(2001)Int j Oncology 19,143-148；Amoura等(1997)ArthRheum 40,2217-2225；Williams等(2001)J Rheumatol 28,81-94)。不受理论束缚，带有肿瘤的患者中核小体的高浓度来源于在增生性肿瘤中自发发生的凋亡。在血液中循环的核小体含有独特修饰的组蛋白。举例来说，美国专利公布号2005/0069931(2005年3月31日)涉及使用针对特异性组蛋白N端修饰的抗体作为疾病的诊断指示剂，采用此类组蛋白特异性抗体从患者的血液或血清样品中分离核小体以促进伴随DNA的纯化和分析用于诊断/筛选目的。因此，本发明可以使用染色质结合的DNA以检测和监测例如肿瘤突变。与修饰的组蛋白相关联的DNA的鉴别可以充当疾病和先天性缺陷的诊断标志。
因此，在另一个实施方案中，分离的染色质片段来源于循环染色质，优选循环单核小体和寡核小体。分离的染色质片段可以来源于生物样品。生物样品可以来自有需要的受试者或患者。生物样品可以是血清、血浆、淋巴、血液、血液部分、尿液、滑液、脊髓液、唾液、循环肿瘤细胞或粘液。
无细胞DNA(cfDNA)
在某些实施方案中，本发明可以用于检测无细胞DNA(cfDNA)。血浆或血清中的无细胞DNA可以用作非侵入性诊断工具。举例来说，已经研究和优化无细胞胎儿DNA用于对相容RhD因子的测试、X连锁遗传病症的性别确定、单基因病症的测试、子痫前期的鉴别。举例来说，对母体血浆中cfDNA的胎儿细胞部分进行测序是检测与胎儿染色体非整倍性相关联的拷贝数的可靠方法。另举一例，从癌症患者中分离的cfDNA已经用于检测与治疗决策相关的关键基因中的突变。
在某些示例性实施方案中，本公开提供了检测直接来自患者样品的cfDNA。在某一其它示例性实施方案中，本公开提供了使用上文所公开的富集实施方案并且在检测靶cfDNA之前富集cfDNA。
核外体
在一个实施方案中，可以用本发明测定核外体。核外体是已经显示含有RNA的小细胞外囊泡。通过超离心、过滤、化学沉淀、尺寸排阻色谱法和微流体分离核外体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用核外体生物标志纯化核外体。核外体从生物样品中的分离和纯化可以通过任何已知方法进行(参见例如WO2016172598A1)。
SNP检测和基因分型
在某些实施方案中，本发明可以用于检测生物样品中单核苷酸多态性(SNP)的存在。SNP可以与产科测试相关(例如性别确定、胎儿缺陷)。SNP可以与刑事侦查相关。在一个实施方案中，可以由本发明鉴别刑事侦查中的嫌疑犯。不受理论束缚，基于核酸的法庭证据可能需要可用于检测嫌疑犯或受害者的遗传物质的最灵敏测定，这是因为所测试的样品可能有限。
在其它实施方案中，本发明涵盖与疾病相关联的SNP。与疾病相关联的SNP在本领域中是众所周知的，并且本领域技术人员可以应用本发明方法来设计适合的向导RNA(参见例如www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar？term＝human％5Borgn％5D)。
在一个方面，本发明涉及一种用于基因分型，例如SNP基因分型的方法，所述方法包括：
将样品或样品组分配至一个或多个个别离散容积中，所述个别离散容积包含如本文所描述的根据本发明的CRISPR系统；
在足以允许一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子的条件下孵育样品或样品组；
经由一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子来活化CRISPR效应蛋白，其中活化CRISPR效应蛋白得以修饰基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及
检测可检测的阳性信号，其中检测到可检测的阳性信号指示样品中对于特定基因型所特有的一种或多种靶分子的存在。
在某些实施方案中，将可检测信号与一种或多种标准信号，优选合成标准信号相比较(例如通过比较信号强度)，例如，图60的实施方案中所说明。在某些实施方案中，标准是特定基因型或对应于特定基因型。在某些实施方案中，标准包含特定SNP或其它(单)核苷酸变异。在某些实施方案中，标准是(PCR扩增的)基因型标准。在某些实施方案中，标准是DNA或包含DNA。在某些实施方案中，标准是RNA或包含RNA。在某些实施方案中，标准是从DNA转录的RNA或包含从DNA转录的RNA。在某些实施方案中，标准是从RNA逆转录的DNA或包含从RNA逆转录的DNA。在某些实施方案中，将可检测信号与一种或多种标准相比较，所述标准中的每一种对应于已知的基因型，例如SNP或其它(单)核苷酸变异。在某些实施方案中，将可检测信号与一种或多种标准信号相比较并且比较包括统计分析，例如通过参数和非参数统计分析，例如通过单因素或两因素ANOVA等。在某些实施方案中，将可检测信号与一种或多种标准信号相比较，并且当可检测信号并不(统计上)显著偏离标准时，将基因型确定为对应于所述标准的基因型。
在其它实施方案中，本发明允许用于急诊药物基因组学的快速基因分型。在一个实施方案中，单点护理测定可以用于对进入急诊室的患者进行基因分型。患者可能疑似具有血液凝块并且急诊医师需要决定血液稀释剂施用的剂量。在例示性实施方案中，本发明可以在心肌梗塞或中风治疗期间基于例如VKORC1、CYP2C9和CYP2C19的标志的基因分型来提供关于施用血液稀释剂的指导。在一个实施方案中，血液稀释剂是抗凝血剂华法林(warfarin)(Holford,NH(1986年12月)."Clinical Pharmacokinetics andPharmacodynamics of Warfarin Understanding the Dose-Effect Relationship".Clinical Pharmacokinetics.Springer International Publishing.11(6):483-504)。与血液凝结相关联的基因在本领域中是已知的(参见例如US20060166239A1；Litin SC,Gastineau DA(1995)"Current concepts in anticoagulant therapy".MayoClin.Proc.70(3):266-72；以及Rusdiana等,Responsiveness to low-dose warfarinassociated with genetic variants of VKORC1,CYP2C9,CYP2C19,and CYP4F2 in anIndonesian population.Eur J Clin Pharmacol.2013年3月；69(3):395-405)。具体地说，在VKORC1 1639(或3673)单核苷酸多态性中，常见(“野生型”)G等位基因由A等位基因置换。具有A等位基因(或“A单体型”)的人相比具有G等位基因(或“非A单体型”)的那些人产生较少VKORC1。这些变体的流行率也因种族而异，其中37％的高加索人和14％的非洲人携带A等位基因。最终结果是凝结因子的数目减少并且因此凝结的能力降低。
在某些示例性实施方案中，用于检测患者中的SNP的遗传物质的可用性允许在DNA或RNA样品无扩增的情况下检测SNP。在基因分型的情况下，容易获得所测试的生物样品。在某些示例性实施方案中，可以缩短本发明的孵育时间。可以在酶促反应发生所需的时间段内进行测定。本领域技术人员可以在5分钟内进行生物化学反应(例如5分钟接合)。本发明可以使用自动化DNA提取装置以从血液获得DNA。然后可以将DNA添加至产生效应蛋白的靶分子的反应中。在产生靶分子后立即可以切断掩蔽剂并且检测信号。在例示性实施方案中，本发明允许POC快速诊断用于在施用药物(例如血液稀释剂)之前确定基因型。在使用扩增步骤的情况下，所有反应都在一步过程中在同一反应中发生。在优选实施方案中，可以在小于一小时，优选10分钟、20分钟、30分钟、40分钟或50分钟内进行POC测定。
在某些实施方案中，本文所公开的系统、装置和方法可以用于检测长非编码RNA(lncRNA)的存在或表达水平。某些lncRNA的表达与疾病病况和/或抗药性相关联。特别地，某些lncRNA(例如TCONS_00011252、NR_034078,TCONS_00010506、TCONS_00026344、TCONS_00015940、TCONS_00028298、TCONS_00026380、TCONS_0009861、TCONS_00026521、TCONS_00016127、NR_125939、NR_033834、TCONS_00021026、TCONS_00006579、NR_109890和NR_026873)与以下相关联：对癌症治疗的抗性，例如，对用于治疗黑素瘤(例如结节性黑素瘤、恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、粘膜黑素瘤、息肉状黑素瘤、促结缔组织增生性黑素瘤、无黑色素性黑素瘤和软组织黑素瘤)的一种或多种BRAF抑制剂(例如威罗菲尼、达拉菲尼(Dabrafenib)、索拉非尼(Sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720和LGX818)的抗性。使用本文所描述的各种实施方案检测lncRNA可以有助于疾病诊断和/或治疗选项的选择。
在一个实施方案中，本发明可以指导DNA或RNA靶向的疗法(例如CRISPR、TALE、锌指蛋白、RNAi)，特别是在疗法的快速施用对治疗结果很重要的设置中。
LOH检测
癌细胞当与正常细胞相比时经历遗传物质(DNA)的损失。几乎所有(如果并非全部)癌症所经历的这种遗传物质缺失被称作“杂合性损失”(LOH)。杂合性损失(LOH)是引起整个基因和周围染色体区的损失的总染色体事件。杂合性损失在癌症中常发生，在此其可以指示损失的区域中不存在功能性肿瘤抑制基因。然而，损失可能是沉默的，这是因为仍然有一个功能性基因保留在染色体对的另一个染色体上。肿瘤抑制基因的剩余拷贝可以通过点突变而灭活，导致肿瘤抑制基因的损失。遗传物质从癌细胞损失可以引起在染色体上特定基因座处对于细胞存活力或细胞生长至关重要的基因的两个或更多个等位基因中的一个的选择性损失。
“LOH标志”是来自微卫星基因座的DNA，当与正常细胞相比时，其中的缺失、改变或扩增与癌症或其它疾病相关联。LOH标志常常与肿瘤抑制基因或另一个通常是肿瘤相关基因的损失相关联。
术语“微卫星”是指广泛分布于人基因组中的DNA的短重复序列。微卫星是少量串联重复(即，邻近)的DNA基序，其长度在两个至五个核苷酸的范围内，并且通常重复5-50次。举例来说，序列TATATATATA(SEQ.ID.No.418)是二核苷酸微卫星，并且GTCGTCGTCGTCGTC(SEQ.ID.No.419)是三核苷酸微卫星(其中A是腺嘌呤，G是鸟嘌呤，C是胞嘧啶，并且T是胸腺嘧啶)。此类微卫星的重复长度的体细胞改变已经显示出代表肿瘤的特有特征。向导RNA可以被设计成检测此类微卫星。此外，本发明可以用于检测重复长度的改变，以及基于可检测信号的定量的扩增和缺失。某些微卫星位于基因的调控性侧接或内含子区中，或直接在基因的密码子中。微卫星突变在此类情况下可以导致表型变化和疾病，特别是三联体扩张疾病，例如脆性X综合征和亨廷顿氏病。
特定染色体区上的频繁杂合性损失(LOH)已经在许多种类的恶性病中有报道。特定染色体区上的等位基因损失是在多种恶性病中观测到的最常见的遗传改变，因此，微卫星分析已经应用于检测来自体液，例如肺癌的痰液和膀胱癌的尿液的样本中的癌细胞的DNA。(Rouleau等,Nature 363,515-521(1993)；以及Latif等,Science 260,1317-1320(1993))。此外，已经确立了在患有癌症和一些其它疾病的个体的血浆中存在浓度明显增加的可溶性DNA，指示无细胞血清或血浆可以用于检测具有微卫星异常的癌症DNA。(Kamp等,Science264,436-440(1994)；以及Steck等,Nat Genet.15(4),356-362(1997))。两个小组已经报道了患有小细胞肺癌或头颈癌的有限数目的患者的血浆或血清中的微卫星改变。(Hahn等,Science 271,350-353(1996)；以及Miozzo等,Cancer Res.56,2285-2288(1996))。先前也已经显示了黑素瘤患者的肿瘤和血清中杂合性损失的检测(参见例如美国专利号US6465177B1)。
因此，有利的是检测罹患癌症或处于癌症风险下的受试者中的LOH标志。本发明可以用于检测肿瘤细胞中的LOH。在一个实施方案中，循环肿瘤细胞可以用作生物样品。在优选实施方案中，获自血清或血浆的无细胞DNA用于非侵入性地检测和/或监测LOH。在其它实施方案中，生物样品可以是本文所描述的任何样品(例如膀胱癌的尿液样品)。不受理论束缚，本发明可以用于在与任何先前方法相比改善的灵敏度下检测LOH标志，由此提供了突变事件的早期检测。在一个实施方案中，在生物流体中检测LOH，其中LOH的存在与癌症的发生相关联。本文所描述的方法和系统通过提供用于检测与癌症相关联的特异性等位基因的LOH的非侵入性、快速和准确方法而表现出优于先前技术，例如PCR或组织活检的重大进步。因此，本发明提供了可以用于筛选高风险群体和监测经历化学预防、化学疗法、免疫疗法或其它治疗的高风险患者的方法和系统。
因为本发明的方法仅需要从例如血液的体液中提取DNA，所以其可以在任何时间和对单个患者重复进行。可以在手术之前或之后；在治疗，例如化学疗法、放射疗法、基因疗法或免疫疗法之前、期间和之后；或在治疗之后对疾病进展、稳定性或复发进行跟踪检查期间获取血液并监测LOH。不受理论束缚，本发明的方法还可以用于使用对那个患者具有特异性的LOH标志检测亚临床疾病的存在或复发，这是因为LOH标志对个别患者的肿瘤具有特异性。方法还可以使用肿瘤特异性LOH标志检测多发性转移是否可能存在。
表观遗传修饰的检测
指示癌症或癌症进展的组蛋白变体、DNA修饰和组蛋白修饰可以用于本发明中。举例来说，美国专利公布20140206014描述了癌症样品与健康受试者相比具有提高的核小体H2AZ、macroH2A1.1、5-甲基胞嘧啶、P-H2AX(Ser139)水平。个体中癌细胞的存在由于癌细胞的凋亡增加可以产生血液中较高水平的无细胞核小体。在一个实施方案中，针对与凋亡相关联的标志，例如H2B Ser 14(P)的抗体可以用于鉴别已经从凋亡性赘生细胞中释放的单个核小体。因此，可以根据本发明在高灵敏度和准确度下有利地分析由肿瘤细胞产生的DNA。
产前筛选
在某些实施方案中，本发明的方法和系统可以用于产前筛选中。在某些实施方案中，无细胞DNA用于产前筛选的方法中。在某些实施方案中，可以用本发明检测与单个核小体或寡核小体相关联的DNA。在优选实施方案中，与单个核小体或寡核小体相关联的DNA的检测用于产前筛选。在某些实施方案中，无细胞染色质片段用于产前筛选的方法中。
产前诊断或产前筛选是指测试在出生之前胎儿或胚胎的疾病或状况。目的是检测出生缺陷，例如神经管缺陷、唐氏综合征、染色体异常、遗传病症和其它状况，例如脊柱裂、颚裂、泰萨氏病(Tay Sachs disease)、镰状细胞性贫血、地中海贫血、囊性纤维化、肌营养不良和脆性X综合征。筛选还可以用于产前性别甄别。常用测试程序包括羊膜穿刺、超声波检查(包括颈半透明度超声波)、血清标志测试或遗传筛选。在一些情况下，施用测试以确定胎儿是否将被流产，不过医师和患者还发现其适用于早期诊断高风险妊娠以便可以在三级护理医院安排分娩，在此婴儿可以接受适当护理。
已经认识到母亲的血液中存在胎儿细胞，并且这些细胞提供用于产前基于DNA的诊断的胎儿染色体的潜在来源。另外，胎儿DNA在母体血液中的总DNA的约2-10％的范围内。当前可用的产前遗传测试通常涉及侵入性程序。举例来说，对妊娠约10-12周的孕妇进行的绒毛膜绒毛取样(CVS)和约14-16周进行的羊膜穿刺全部含有侵入性程序以获得样品用于测试胎儿中的染色体异常。经由这些取样程序获得的胎儿细胞通常使用细胞遗传学或荧光原位杂交(FISH)分析来测试染色体异常。无细胞胎儿DNA已经显示早在孕六周就存在于孕妇的血浆和血清中，在妊娠期间浓度升高并且在分娩之前达到峰值。因为这些细胞在妊娠很早期出现，所以其可以构成准确、非侵入性、孕早期测试的基础。不受理论束缚，本发明在检测少量的胎儿DNA中提供前所未有的灵敏度。不受理论束缚，大量的母体DNA一般与所关注的胎儿DNA一起伴随地发现，由此降低胎儿DNA定量和突变检测的灵敏度。本发明由出乎意料的高测定灵敏度克服了此类问题。
组蛋白的H3类别由四种不同蛋白质类型组成：主要类型H3.1和H3.2；替换类型H3.3；以及睾丸特异性变体H3t。尽管H3.1和H3.2密切相关，仅在Ser96处不同，但H3.1在至少5个氨基酸位置处不同于H3.3。此外，H3.1与其在包括肝、肾和心的成人组织中的存在相比在胎儿的肝中高度富集。在成人组织中，H3.3变体比H3.1变体更丰富，而对于胎儿的肝正相反。本发明可以使用这些差异以检测包含胎儿与母体细胞和/或胎儿核酸的母体生物样品中的胎儿核小体和胎儿核酸。
在一个实施方案中，胎儿核小体可以获自血液。在其它实施方案中，胎儿核小体获自宫颈粘液样品。在某些实施方案中，在妊娠的孕中期早期或孕早期后期通过对孕妇拭抹或灌洗来获得宫颈粘液样品。可以将样品放置在孵育箱中以释放截留于粘液中的DNA。孵育箱可以设定为37℃。可以将样品摇晃约15至30分钟。可以用粘蛋白酶进一步溶解粘液用于达成释放DNA的目的。样品还可以经受如本领域中众所周知的条件，例如化学处理等，以诱导凋亡来释放胎儿核小体。因此，可以用诱导凋亡剂处理宫颈粘液样品，借此释放胎儿核小体。关于循环胎儿DNA的富集，参考美国专利公布号20070243549和20100240054。当将方法和系统应用于仅小部分的核小体或DNA可能源于胎儿的产前筛选时，本发明尤其有利。
根据本发明的产前筛选可以用于以下疾病：包括但不限于三体型13、三体型16、三体型18、克氏综合征(47，XXY)、(47，XYY)和(47，XXX)、特纳综合征、唐氏综合征(三体型21)、囊性纤维化、亨廷顿氏病、β型地中海贫血、肌强直性营养不良、镰状细胞性贫血、卟啉症、脆性X综合征、罗伯逊易位、安格尔曼综合征、迪乔治综合征和沃尔夫-赫斯霍恩综合征。
本发明的若干其它方面涉及诊断、预后和/或治疗与大范围的遗传疾病相关联的缺陷，所述遗传疾病在国家卫生研究院的网站上在主题分部遗传病症(GeneticDisorders)下进一步描述(网站health.nih.gov/topic/Genetic Disorders)。
癌症和癌症抗药性检测
在某些实施方案中，本发明可以用于检测与癌症相关联的基因和突变。在某些实施方案中，检测与抗性相关联的突变。在肿瘤细胞的克隆群体中抗性肿瘤细胞的扩增或抗性突变的出现在治疗期间可能会发生(参见例如Burger JA等,Clonal evolution inpatients with chronic lymphocytic leukaemia developing resistance to BTKinhibition.Nat Commun.2016年5月20日；7:11589；Landau DA等,Mutations driving CLLand their evolution in progression and relapse.Nature.2015年10月22日；526(7574):525-30；Landau DA等,Clonal evolution in hematological malignancies andtherapeutic implications.Leukemia.2014年1月；28(1):34-43；以及Landau DA等,Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocyticleukemia.Cell.2013年2月14日；152(4):714-26)。因此，检测此类突变需要高度灵敏测定并且监测需要重复活检。重复活检是不便利的、侵入性的和高成本的。使用本领域中已知的先前方法可能难以在血液样品或其它非侵入性收集的生物样品(例如血液、唾液、尿液)中检测抗性突变。抗性突变可以指与对化学疗法、靶向疗法或免疫疗法的抗性相关联的突变。
在某些实施方案中，突变在个别癌症中出现，其可以用于检测癌症进展。在一个实施方案中，与针对肿瘤的T细胞细胞裂解活性相关的突变已经得到表征并且可以由本发明检测(参见例如Rooney等,Molecular and genetic properties of tumors associatedwith local immune cytolytic activity,Cell.2015年1月15日；160(1-2):48-61)。可以基于这些突变的检测开发用于患者的个性化疗法(参见例如WO2016100975A1)。在某些实施方案中，与细胞裂解活性相关联的癌症特异性突变可以是选自由以下组成的组的基因中的突变：CASP8、B2M、PIK3CA、SMC1A、ARID5B、TET2、ALPK2、COL5A1、TP53、DNER、NCOR1、MORC4、CIC、IRF6、MYOCD、ANKLE1、CNKSR1、NF1、SOS1、ARID2、CUL4B、DDX3X、FUBP1、TCP11L2、HLA-A、B或C、CSNK2A1、MET、ASXL1、PD-L1、PD-L2、IDO1、IDO2、ALOX12B和ALOX15B，或拷贝数增加，不包括影响以下染色体带中的任一个的全染色体事件：6q16.1-q21、6q22.31-q24.1、6q25.1-q26、7p11.2-q11.1、8p23.1、8p11.23-p11.21(含有IDO1、IDO2)、9p24.2-p23(含有PDL1、PDL2)、10p15.3、10p15.1-p13、11p14.1、12p13.32-p13.2、17p13.1(含有ALOX12B、ALOX15B)和22q11.1-q11.21。
在某些实施方案中，本发明用于在疗程期间和在治疗完成之后检测癌症突变(例如抗性突变)。本发明的灵敏度可以允许在治疗期间出现的克隆突变的非侵入性检测并且可以用于检测疾病的复发。
在某些示例性实施方案中，差异表达的微小RNA(miRNA)的miRNA和/或miRNA标识的检测可以用于检测或监测癌症的进展和/或检测对癌症疗法的抗药性。举例来说，Nadal等(Nature Scientific Reports,(2015)doi:10.1038/srep12464)描述了可以用于检测非小细胞肺癌(NSCLC)的mRNA标识。
在某些示例性实施方案中，细胞的克隆亚群中抗性突变的存在可以用于确定治疗方案。在其它实施方案中，可以基于常见肿瘤突变施用用于治疗患者的个性化疗法。在某些实施方案中，常见突变对治疗作出反应而产生并且导致抗药性。在某些实施方案中，本发明可以用于针对获得突变的细胞或带有此类抗药性突变的细胞的扩增来监测患者。
用各种化学治疗剂，尤其用例如酪氨酸激酶抑制剂的靶向疗法治疗频繁导致靶分子中抵抗治疗剂活性的新突变。用以克服这种抗性的多种策略正在评估中，包括不受这些突变影响的第二代疗法的开发和用多种剂，包括作用于抗性突变下游的那些剂的治疗。在例示性实施方案中，针对依鲁替尼，一种靶向布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)并且用于CLL和某些淋巴瘤的分子的常见突变是在位置481处的半胱氨酸至丝氨酸变化(BTK/C481S)。靶向表皮生长因子受体(EGFR)的酪氨酸激酶结构域的埃罗替尼通常用于肺癌治疗，并且在疗法之后总是发展出抗性肿瘤。抗性克隆体中发现的常见突变是在位置790处的苏氨酸至甲硫氨酸突变。
在癌症患者的群体之间共享的非沉默突变和可以用本发明检测的常见抗性突变在本领域中是已知的(参见例如WO/2016/187508)。在某些实施方案中，可以通过用依鲁替尼、埃罗替尼、伊马替尼、吉非替尼、克唑替尼、曲妥珠单抗、威罗菲尼、RAF/MEK、检查点阻断疗法或抗雌激素疗法治疗来诱导抗药性突变。在某些实施方案中，癌症特异性突变存在于一种或多种编码选自由以下组成的组的蛋白质的基因中：程序性死亡配体1(PD-L1)、雄激素受体(AR)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)、表皮生长因子受体(EGFR)、BCR-Ab1、c-kit、PIK3CA、HER2、EML4-ALK、KRAS、ALK、ROS1、AKT1、BRAF、MEK1、MEK2、NRAS、RAC1和ESR1。
免疫检查点是减慢或阻止免疫反应的抑制性途径并且防止因免疫细胞的不受控活性所致的过度组织损伤。在某些实施方案中，所靶向的免疫检查点是程序性死亡-1(PD-1或CD279)基因(PDCD1)。在其它实施方案中，所靶向的免疫检查点是细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)。在额外实施方案中，所靶向的免疫检查点是CD28和CTLA4 Ig超家族的另一个成员，例如BTLA、LAG3、ICOS、PDL1或KIR。在其它额外实施方案中，所靶向的免疫检查点是TNFR超家族的成员，例如CD40、OX40、CD137、GITR、CD27或TIM-3。
最近，已经在单细胞水平上表征肿瘤和其微环境中的基因表达(参见例如Tirosh等Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by singlecell RNA-seq.Science 352,189-196,doi:10.1126/science.aad0501(2016))；Tirosh等,Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in humanoligodendroglioma.Nature.2016年11月10日；539(7628):309-313.doi:10.1038/nature20123.Epub 2016年11月2日；以及国际专利公布序列号WO 2017004153 A1)。在某些实施方案中，可以使用本发明检测基因标识。在一个实施方案中，在肿瘤微环境中监测或检测补体基因。在一个实施方案中，监测或检测MITF和AXL程序。在一个实施方案中，检测肿瘤特异性干细胞或祖细胞标识。此类标识指示了免疫反应的状态和肿瘤的状态。在某些实施方案中，可以在增殖、对治疗的抗性和免疫细胞的丰度方面检测肿瘤的状态。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了用于循环DNA，例如肿瘤DNA的低成本、快速、多元化癌症检测板块，尤其用于监测疾病复发或常见抗性突变的发展。
免疫疗法应用
本文所公开的实施方案还可以适用于其它免疫疗法情形。举例来说，在一些实施方案中，对受试者中的免疫反应进行诊断、预后和/或分段的方法包括检测一种或多种生物标志的表达、活性和/或功能的第一水平以及将所检测的水平与对照水平相比较，其中所检测的水平与对照水平的差异指示受试者中免疫反应的存在。
在某些实施方案中，本发明可以用于确定肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的功能障碍或活化。可以使用已知方法从肿瘤中分离TIL。可以分析TIL以确定其是否应该用于过继细胞转移疗法中。另外，嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)在施用于受试者之前可以针对功能障碍或活化的标识进行分析。功能障碍和活化的T细胞的例示性标识已有描述(参见例如Singer M等,A Distinct Gene Module for Dysfunction Uncoupled from Activationin Tumor-Infiltrating T Cells.Cell.2016年9月8日；166(6):1500-1511.e9.doi:10.1016/j.cell.2016.08.052)。
在一些实施方案中，C2c2用于评估免疫细胞，例如T细胞(例如CD8+和/或CD4+T细胞)的状态。特别地，可以例如基于与一种或多种T细胞状态相关联的基因或基因标识来确定T细胞活化和/或功能障碍。以这种方式，c2c2可以用于确定T细胞的一个或多个亚群的存在。
在一些实施方案中，C2c2可以用于诊断测定中或可以用作确定患者是否适合于施用免疫疗法或另一种类型的疗法的方法。举例来说，可以经由c2c2进行基因或生物标志标识的检测以确定患者是否对给定的治疗有反应，或如果患者无反应，那么这可能归因于T细胞功能障碍。此种检测提供关于患者最适于接受的疗法类型的信息。举例来说，患者是否应该接受免疫疗法。
在一些实施方案中，本文所公开的系统和测定可以允许临床医师鉴别患者对疗法(例如过继细胞转移(ACT)疗法)的反应是否归因于细胞功能障碍，并且如果是这样的话，跨越生物标志标识的上调和下调的水平将允许解决问题。举例来说，如果接受ACT的患者是无反应的，那么可以通过本文所公开的测定来测定作为ACT的一部分施用的细胞以确定已知与细胞活化和/或功能障碍状态相关联的生物标志标识的相对表达水平。如果特定抑制性受体或分子在ACT细胞中上调，那么可以用受体或分子的抑制剂治疗患者。如果特定刺激性受体或分子在ACT细胞中下调，那么可以用受体或分子的激动剂治疗患者。
在某些示例性实施方案中，本文所描述的系统、方法和装置可以用于筛选鉴别特定细胞类型、细胞表型或细胞状态的基因标识。同样地，经由使用例如压缩传感的方法，本文所公开的实施方案可以用于检测转录组。基因表达数据是高度结构化的，使得一些基因的表达水平预测其它基因的表达水平。基因表达数据是高度结构化的认知允许假设系统中的自由度数是很小的，这允许假设相对基因丰度的计算基础是稀疏的。有可能作出若干生物学上推动的假设，其允许申请者在欠取样下恢复非线性相互作用项而无需具有基因可能相互作用的任何特定认知。特别地，如果申请者假设遗传相互作用是低秩的、稀疏的或这些的组合，那么真正的自由度数相对于完全组合扩展是很小的，这使申请者能够推断具有相对小的扰动数的完整非线性景观。围绕这些假设工作，矩阵补全和压缩传感的分析理论可以用于设计欠取样的组合扰动实验。另外，核学习框架可以用于通过创建组合扰动的预测功能而不直接学习任何个别相互作用系数来采用欠取样。压缩传感提供了用以鉴别有待检测的靶转录物的最小数目的方式以获得综合基因表达型态。压缩传感的方法在2016年10月27日提交的PCT/US2016/059230"Systems and Methods for Determining RelativeAbundances of Biomolecules"中公开，其以引用的方式并入本文中。使用如压缩传感的方法鉴别最小转录物标靶组，然后可以设计一组相应的向导RNA以检测所述转录物。因此，在某些示例性实施方案中，获得细胞的基因表达型态的方法包括使用本文所公开的实施方案检测提供细胞或细胞群体的基因表达型态的最小转录物组。
检测核酸标记的项目
或者，本文所描述的实施方案可以用于检测核酸标识符。核酸标识符是可以用于鉴别特定物品的非编码核酸。示例性核酸标识符，例如DNA水印，在Heider和Barnekow."DNAwatermarks:A proof of concept"BMC Molecular Biology 9:40(2008)中描述。核酸标识符还可以是核酸条形码。基于核酸的条形码是核苷酸(例如DNA、RNA或其组合)的短序列，其用作相关分子，例如靶分子和/或靶核酸的标识符。核酸条形码可以具有至少例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个核苷酸的长度，并且可以呈单链或双链形式。一个或多个核酸条形码可以附接或“标记”至靶分子和/或靶核酸。这种附接可以是直接的(例如条形码与靶分子的共价或非共价结合)或间接的(例如经由额外分子，例如特异性结合剂，例如抗体(或其它蛋白质)，或条形码接收衔接子(或其它核酸分子))。靶分子和/或靶核酸可以用多个核酸条形码以组合方式，例如核酸条形码多联体作标记。通常，核酸条形码用于将靶分子和/或靶核酸鉴别为来自特定区室(例如离散容积)，具有特定物理特性(例如亲和力、长度、序列等)，或已经经受某些治疗条件。靶分子和/或靶核酸可以与多个核酸条形码相关联以提供关于所有这些特征(和更多特征)的信息。产生核酸条形码的方法在例如国际专利申请公布号WO/2014/047561中公开。
酶
本申请进一步提供了展示稳固活性的C2c2直系同源物，使其特别适合于RNA裂解和检测的不同应用。这些应用包括但不限于本文所描述的那些。更特别地，展示比所测试的其它具有更强活性的直系同源物是从生物体韦德纤毛菌(LwC2c2)鉴别的C2c2直系同源物。本申请因此提供了修饰所关注的靶基因座的方法，所述方法包括向所述基因座递送非天然产生的或工程改造的组合物，所述组合物包含C2c2效应蛋白，更特别是如本文所描述的具有增加的活性的C2c2效应蛋白和一种或多种核酸组分，其中至少一种或多种核酸组分经过工程改造，一种或多种核酸组分将复合物引导至所关注的标靶，并且效应蛋白与一种或多种核酸组分形成复合物并且所述复合物结合至所关注的靶基因座。在特定实施方案中，所关注的靶基因座包含RNA。本申请进一步提供了在RNA序列特异性干扰、RNA序列特异性基因调控、RNA或RNA产物或lincRNA或非编码RNA或细胞核RNA或mRNA的筛选、诱变、荧光原位杂交或育种中使用具有增加的活性的Cc2效应蛋白。
本文所公开的实施方案还可以使用侧流测定进行，例如美国临时申请号62/568,309、62/610,144和62/623,529中以及Gootenberg等(Science doi:10.1126/science.aaq0179(2018))中所公开。
本发明的其它实施方案在以下编号的段落中描述。
1.一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括：
CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA；以及
基于RNA的掩蔽构建体。
2.一种多肽检测系统，所述多肽检测系统包括：
CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至触发RNA的向导RNA；
基于RNA的掩蔽构建体；以及
一种或多种检测适体，所述一种或多种检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点。
3.如段落1或2所述的系统，其还包含核酸扩增试剂。
4.如段落1所述的系统，其中所述靶分子是靶DNA并且所述系统还包含结合所述靶DNA并且包含RNA聚合酶启动子的引物。
5.如段落1至4中任一段所述的系统，其中所述CRISPR系统效应蛋白是RNA靶向效应蛋白。
6.如段落5所述的系统，所述RNA靶向效应蛋白包含一个或多个HEPN结构域。
7.如段落6所述的系统，其中所述一个或多个HEPN结构域包含RxxxxH基序序列。
8.如段落7所述的系统，其中所述RxxxH基序包含R{N/H/K]X1X2X3H序列。
9.如段落8所述的系统，其中X1是R、S、D、E、Q、N、G或Y，并且X2独立地是I、S、T、V或L，并且X3独立地是L、F、N、Y、V、I、S、D、E或A。
10.如段落1至9中任一段所述的系统，其中所述CRISPR RNA靶向效应蛋白是C2c2。
11.如段落6所述的系统，其中所述CRISPR RNA靶向效应蛋白是C2c2。
12.如段落11所述的系统，其中所述C2c2在Cas 1基因的20kb内。
13.如段落12所述的系统，其中所述C2c2效应蛋白来自选自由以下组成的组的属类的生物体：纤毛菌属、李斯特菌属、棒杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、弗维菌属、黄杆菌属、单丝壳属、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、硝酸盐裂解菌属、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。
14.如段落13所述的系统，其中所述C2c2效应蛋白来自选自由以下组成的组的生物体：沙氏纤毛菌；韦德纤毛菌(Lw2)；斯氏李斯特菌；毛螺菌科细菌MA2020；毛螺菌科细菌NK4A179；嗜氨基[梭菌]DSM 10710；鸡肉杆菌DSM 4847；鸡肉杆菌DSM 4847(第二CRISPR基因座)；普根沼杆菌WB4；维森李斯特菌FSL R9-0317；李斯特菌科细菌FSL M6-0635；韦德纤毛菌F0279；荚膜红细菌SB 1003；荚膜红细菌R121；荚膜红细菌DE442；颊纤毛菌C-1013-b；解半纤维素赫氏菌；直肠[真杆菌]；真杆菌科细菌CHKCI004；布劳特氏菌属马赛-P2398；以及纤毛菌属口腔泰肯菌879str.F0557。十二(12)个其它非限制性实例是：毛螺菌科细菌NK4A144；凝集绿屈挠菌；桔红色脱甲基菌；海旋菌属TSL5-1；假丁酸弧菌属OR37；丁酸弧菌属YAB3001；布劳特氏菌属马赛-P2398；纤毛菌属马赛-P3007；伊华拟杆菌；紫单孢菌科细菌KH3CP3RA；河岸李斯特菌；以及陌生非适应螺菌。
15.如段落14所述的系统，其中所述C2c2效应蛋白是韦德纤毛菌F0279或韦德纤毛菌F0279(Lw2)C2c2效应蛋白。
16.如段落1至15中任一段所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽构建体抑制可检测的阳性信号的产生。
17.如段落16所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽构建体通过掩蔽所述可检测的阳性信号或替代地产生可检测的阴性信号来抑制可检测的阳性信号的产生。
18.如段落16所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽构建体包含抑制由报告构建体编码的基因产物的产生的沉默RNA，其中所述基因产物当表达时产生所述可检测的阳性信号。
19.如段落16所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽构建体是产生阴性可检测信号的核糖酶，并且其中当使所述核糖酶失活时产生所述阳性可检测信号。
20.如段落19所述的系统，其中所述核糖酶使底物转变成第一种颜色并且其中当使所述核糖酶失活时所述底物转变成第二种颜色。
21.如段落16所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽剂是RNA适体和/或包含RNA限定的抑制剂。
22.如段落21所述的系统，其中所述适体或RNA限定的抑制剂螯合酶，其中所述酶在从所述适体或RNA限定的抑制剂释放后通过作用于底物而产生可检测信号。
23.如段落21所述的系统，其中所述适体是抑制酶并且防止所述酶催化从底物产生可检测信号的抑制性适体，或其中所述RNA限定的抑制剂抑制酶并且防止所述酶催化从底物产生可检测信号。
24.如段落23所述的系统，其中所述酶是凝血酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或小牛碱性磷酸酶。
25.如段落24所述的系统，其中所述酶是凝血酶并且所述底物是共价连接至凝血酶的肽底物的对硝基酰苯胺，或共价连接至凝血酶的肽底物的7-氨基-4-甲基香豆素。
26.如段落21所述的系统，其中所述适体螯合一对剂，所述剂当从所述适体释放时组合产生可检测信号。
27.如段落16所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽构建体包含可检测配体和掩蔽组分所附接的RNA寡核苷酸。
28.如段落16所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽构建体包含由桥连分子保持呈聚集体的纳米颗粒，其中所述桥连分子的至少一部分包含RNA，并且其中当所述纳米颗粒分散于溶液中时所述溶液经历颜色偏移。
29.如段落28所述的系统，其中所述纳米颗粒是胶体金属。
30.如段落29所述的系统，其中所述胶体金属是胶体金。
31.如段落16所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽构建体包含由连接分子连接至一个或多个淬灭剂分子的量子点，其中所述连接分子的至少一部分包含RNA。
32.如段落16所述的系统，其中所述基于RNA的掩蔽构建体包含与嵌入剂复合的RNA，其中所述嵌入剂在所述RNA裂解后改变吸光度。
33.如段落32所述的系统，其中所述嵌入剂是焦宁-Y或亚甲基蓝。
34.如段落16所述的系统，其中所述可检测配体是荧光团并且所述掩蔽组分是淬灭剂分子。
35.如段落16所述的系统，其中所述掩蔽构建体包含被设计成结合G-四链体形成序列的RNA寡核苷酸，其中G-四链体结构在所述掩蔽构建体裂解后由所述G-四链体形成序列形成，并且其中所述G-四链体结构产生可检测的阳性信号。
36.如段落1至35中任一段所述的系统，其中所述一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA包含合成错配。
37.如段落36所述的系统，其中所述错配在所述靶分子中的SNP或其它单核苷酸变异的上游或下游。
38.如段落36或37所述的检测系统，其中所述向导RNA中的所述合成错配或其它单核苷酸变异在间隔区的位置3、4、5或6，优选位置3处。
39.如段落36至38中任一段所述的检测系统，其中所述向导RNA中的所述合成错配在间隔区的位置1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选位置5处。
40.如段落36至39中任一段所述的检测系统，其中所述合成错配是在所述向导RNA中的所述SNP或其它单核苷酸变异的上游或下游1、2、3、4或5个核苷酸，优选2个核苷酸，优选下游。
41.如段落36至40中任一段所述的检测系统，其中所述向导RNA包含相对于野生型间隔区截短的间隔区。
42.如段落41所述的检测系统，其中所述向导RNA包含间隔区，所述间隔区包含小于28个核苷酸，优选地在20个至27个核苷酸之间并且包括20个和27个核苷酸。
43.如段落42所述的检测系统，其中向导RNA包含间隔区，所述间隔区由20-25个核苷酸或20-23个核苷酸组成，例如优选20或23个核苷酸。
44.如段落1至43中任一段所述的检测系统，其中所述一种或多种向导RNA被设计成检测靶RNA或DNA中的单核苷酸多态性或RNA转录物的剪接变体。
45.一种用于检测样品中的病毒的方法，所述方法包括：
将样品或样品组分配至一个或多个个别离散容积中，所述个别离散容积包含如段落1至44中任一段所述的CRISPR系统；
在足以允许所述一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子的条件下孵育所述样品或样品组；
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种靶分子来活化所述CRISPR效应蛋白，其中活化所述CRISPR效应蛋白得以修饰所述基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中一种或多种病毒的存在。
46.如段落45所述的方法，其中所述样品包含两种或更多种病毒，并且其中所述方法区分所述两种或更多种病毒。
47.如段落45或46所述的方法，其中所述向导RNA检测所述一种或多种病毒的单核苷酸变体。
48.如段落47所述的方法，其中所述向导RNA还包含一个或多个合成错配。
49.如段落45至47中任一段所述的方法，其中所述一种或多种CRISPR系统的所述向导RNA包含检测一组病毒中的每种病毒和/或病毒株的泛病毒向导RNA组。
50.如段落49所述的方法，其中所述向导RNA是使用组覆盖方法得到。
51.一种用于检测病毒的方法，所述方法包括：
使如段落1至36中任一段所述的CRISPR系统暴露于样品；
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种微生物特异性靶RNA或所述一种或多种触发RNA来活化所述RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中一种或多种病毒的存在。
52.如段落51所述的方法，其中所述CRISPR系统在衬底上，并且其中使所述衬底暴露于所述样品。
53.如段落52所述的方法，其中将相同或不同CRISPR系统施加至所述衬底上的多个离散位置。
54.如段落53所述的方法，其中将相同或不同CRISPR系统施加至所述衬底上的多个离散位置。
55.如段落52至54中任一段所述的方法，其中所述衬底是柔性材料衬底。
56.如段落55所述的方法，其中所述柔性材料衬底是纸衬底、织物衬底或基于柔性聚合物的衬底。
57.如段落54所述的方法，其中所述不同CRISPR系统检测每个位置处的不同微生物。
58.如段落55所述的方法，其中通过将所述衬底短暂浸入有待取样的流体中，通过将有待测试的流体施加至所述衬底，或通过使有待测试的表面与所述衬底接触，使所述衬底被动暴露于所述样品。
59.如段落58所述的方法，其中所述样品是生物或环境样品。
60.如段落59所述的方法，其中所述环境样品获自食物样品、饮料样品、纸表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于大气或其它气体样品，或其组合。
61.如段落59所述的方法，其中所述生物样品获自组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰液、粘液、淋巴、滑液、脑脊髓液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓液，或皮肤或粘膜表面的拭子。
62.如段落59至61中任一段所述的方法，其中所述环境样品或生物样品是粗样品和/或其中在应用所述方法之前所述一种或多种靶分子未从所述样品纯化或扩增。
63.一种用于监测病毒性疾病爆发和/或演变的方法，所述方法包括：
使如段落1至36中任一段所述的CRISPR系统暴露于样品；
经由所述一种或多种向导RNA结合至一种或多种包含非同义病毒突变的靶序列来活化所述RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中存在的病毒株的类型。
64.如段落63所述的方法，其中暴露所述CRISPR系统包括使一种或多种CRISPR系统定位于一个或多个个别离散容积内以及将样品或样品等分试样添加至所述一个或多个个别离散容积中。
65.一种用于针对病毒抗原和/或病毒特异性抗体筛选样品的方法，所述方法包括：
使如段落2至36中任一段所述的CRISPR系统暴露于样品，其中所述一种或多种适体结合至一种或多种病毒抗原或一种或多种病毒特异性抗体，并且其中所述适体编码鉴别所述一种或多种适体所结合的所述一种或多种病毒抗原或所述一种或多种病毒特异性抗体的条形码，并且其中所述向导RNA被设计成检测所述条形码；
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种微生物特异性靶RNA或所述一种或多种触发RNA来活化所述RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中一种或多种病毒抗原或一种或多种病毒特异性抗体的存在。
66.如段落45至65中任一段所述的方法，其中所述病毒是DNA病毒。
67.如段落66所述的方法，其中所述DNA病毒是肌病毒科、短尾病毒科、长尾病毒科、异疱疹病毒科、疱疹病毒科(包括人疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒)、马洛疱疹病毒科、脂毛病毒科、小杆状病毒科、腺病毒科、瓶状病毒科、囊泡病毒科、非洲猪瘟病毒科(包括非洲猪瘟病毒)、杆状病毒科、西坎达病毒科、棒状病毒科、覆盖噬菌体科、微小纺锤形病毒科、球状病毒科、滴状病毒科、肥大唾腺炎病毒科、虹彩病毒科、马赛病毒科、拟菌病毒科、裸病毒科、线形病毒科、潘多拉病毒科、乳头瘤病毒科、藻类DNA病毒科、原质病毒科、多DNA病毒、多瘤病毒科(包括猿猴病毒40、JC病毒、BK病毒)、痘病毒科(包括牛痘和天花)、球脂状病毒科、复层病毒科、图里病毒科、地诺DNA病毒、盐末端蛋白病毒、瑞兹病毒，或其组合。
68.如段落45至65中任一段所述的方法，其中病毒感染是由双链RNA病毒、正义RNA病毒、反义RNA病毒、逆转录病毒或其组合引起。
69.如段落68所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒科病毒、小RNA病毒科病毒、杯状病毒科病毒、黄病毒科病毒、披膜病毒科病毒、玻那病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科、肺泡病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、正粘病毒科或丁型病毒。
70.如段落68所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒、SARS、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、甲型肝炎、诺瓦克病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、风疹病毒、罗斯河病毒、辛德毕斯病毒、基孔肯雅病毒、博尔纳病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、新城疫病毒、人呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、拉沙病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、流感或丁型肝炎病毒。
71.一种用于检测样品中的一种或多种微生物的方法，所述方法包括：
使样品与如段落1至44中任一段所述的核酸检测系统接触；以及
将所述经过接触的样品应用于侧流免疫色谱测定。
72.如段落71所述的方法，其中所述核酸检测系统包括包含第一分子和第二分子的基于RNA的掩蔽构建体，并且其中所述侧流免疫色谱测定包括优选地在侧流条带上的离散检测位点处，检测所述第一分子和第二分子。
73.如段落72所述的方法，所述第一分子和所述第二分子是通过结合至识别所述第一分子或第二分子的抗体以及优选地用夹心抗体检测所述结合的分子来检测。
74.如段落72或73所述的方法，其中所述侧流条带包括针对所述第一分子的上游第一抗体和针对所述第二分子的下游第二抗体，并且其中如果所述样品中不存在所述靶核酸，那么未裂解的基于RNA的掩蔽构建体由所述第一抗体结合，并且其中如果所述样品中存在所述靶核酸，那么裂解的基于RNA的掩蔽构建体由所述第一抗体与所述第二抗体结合。
75.一种用于检测病毒的方法，所述方法包括：
从受试者获得样品，其中所述样品是尿液、血清、血液或唾液；
扩增所述样品的RNA；
将所述样品与效应蛋白、一种或多种被设计成结合至相应病毒特异性靶分子的向导RNA和基于RNA的掩蔽构建体组合，
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种病毒特异性靶RNA来活化所述RNA效应蛋白，其中活化所述CRISPR效应蛋白得以修饰所述基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述信号，其中检测到所述信号指示所述病毒的存在；并且
其中所述方法不包括从所述样品中提取RNA的步骤。
76.如段落75所述的方法，其中所述扩增步骤的持续时间选自由以下组成的组：2小时、1小时、30分钟、20分钟和10分钟。
77.如段落75所述的方法，其中所述检测步骤的持续时间选自由以下组成的组：3小时、2小时、1小时、30分钟、20分钟和10分钟。
78.如段落75所述的方法，其中检测所需的样品体积是100μl至1μl。
79.如段落75所述的方法，其中所述病毒是寨卡病毒。
80.如段落75所述的方法，其中所述样品包含两种或更多种病毒，并且其中所述方法区分所述两种或更多种病毒。
81.如段落75所述的方法，其中所述基于RNA的掩蔽构建体包含
实施例
实施例1-一般方案
存在两种方式来进行DNA和RNA的C2c2诊断测试。在递送检测适体之后，这种方案还可以与蛋白质检测变体一起使用。第一种是两步反应，其中扩增和C2c2检测独立地完成。第二种是所有物质组合在一个反应中并且这被称为两步反应。重要的是谨记扩增对于较高浓度样品可能不是必需的，所以很好的是具有单独的C2c2方案，其并不内嵌有扩增。
表10.仅CRISPR效应物-无扩增：
组分 体积(μL)
蛋白质(最终44nM) 2
crRNA(最终12nM) 1
背景标靶(总共100ng) 1
靶RNA(可变) 1
RNA传感器探针(125nM) 4
MgCl<sub>2</sub>(最终6mM) 2
反应缓冲液10x 2
RNA酶抑制剂(鼠类，来自NEB) 2
H<sub>2</sub>O 5
总计 20
反应缓冲液是：40mM Tris-HCl、60mM NaCl，pH 7.3
在37℃下进行这个反应20分钟至3小时。在激发：485nm/20nm，发射：528nm/20nm下读出。可以在20分钟开始检测单分子灵敏度的信号，但过程灵敏度的信号对于较长反应时间是较高的。
两步反应：
表11.RPA扩增混合物
Figure BDA0002275597970001791
Figure BDA0002275597970001801
将这种反应物混合在一起，然后再悬浮于冷冻干燥的酶混合物的两个至三个管中。将5μL 280mM MgAc添加至混合物中以开始反应。进行反应10-20分钟。每个反应是20μL，因此这足够用于至多五个反应。
表12.C2c2检测混合物
组分 体积(μL)
蛋白质(最终44nM) 2
crRNA(最终12nM) 1
背景标靶(总共100ng) 1
RPA反应物 1
RNA传感器探针(125nM) 4
MgCl<sub>2</sub>(最终6mM) 2
反应缓冲液10x 2
RNA酶抑制剂(鼠类，来自NEB) 2
H<sub>2</sub>O 5
总计 20
反应缓冲液是：40mM Tris-HCl、60mM NaCl，pH 7.3
进行这个反应20分钟至3小时。最小检测时间为约20分钟以观察单分子灵敏度。进行反应更长时间仅增强灵敏度。
表13.一锅式反应：
组分 体积(μL)
引物A(100μM) 0.48
引物B(100μM) 0.48
RPA缓冲液 59
MgAc 5
Lw2C2c2(最终44nM) 2
crRNA(最终12nM) 2
背景RNA(来自250ng/μL) 2
RNA酶alert底物(再悬浮于20μL中之后) 5
来自NEB的鼠类RNA酶抑制剂 10
标靶(可变浓度) 5
ATP(100μM，来自NEB试剂盒) 2
GTP(100μM，来自NEB试剂盒) 2
UTP(100μM，来自NEB试剂盒) 2
CTP(100μM，来自NEB试剂盒) 2
T7聚合酶(来自NEB试剂盒) 2
H<sub>2</sub>O 4
总计 104.96
所提及的NEB试剂盒是HighScribe T7高产量试剂盒。为使缓冲液再悬浮，使用1.5x浓度：使59μL缓冲液再悬浮于冷冻干燥底物的三个管中并且使用上述混合物。每个反应是20μL，因此这足够用于5个反应。早在30-40分钟就观测到这个反应的单分子灵敏度。
实施例2-来自韦德纤毛菌的C2C2介导DNA和RNA的高度灵敏和特异性检测
快速、便宜和灵敏的核酸检测可以帮助定点护理病原体检测、基因分型和疾病监测。RNA导向的RNA靶向CRISPR效应物Cas13a(先前称为C2c2)在标靶识别后展现混杂RNA酶活性的“附带效应”。我们将Cas13a的附带效应与等温扩增组合以确立基于CRISPR的诊断(CRISPR-Dx)，从而提供具有渺摩尔灵敏度和单碱基错配特异性的快速DNA或RNA检测。我们使用这个基于Cas13a的分子检测平台，称为SHERLOCK(特异性高灵敏度酶促报告子解锁(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing))，以检测寨卡和登革病毒的特异性株系、区分病原性细菌、对人DNA进行基因分型以及鉴别无细胞肿瘤DNA突变。此外，为了不依赖于冷链和长期储存可以冻干SHERLOCK反应试剂，并且易于在纸上复原用于实地应用。
在便携平台上在高灵敏度和单碱基特异性下快速检测核酸的能力可以帮助诊断和监测、流行病学和一般实验室任务。尽管方法是用于检测核酸(1-6)，但其在灵敏度、特异性、简易性、成本和速度当中有所权衡。微生物成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)和CRISPR相关(CRISPR-Cas)适应性免疫系统含有可编程的核酸内切酶，其可以支持用于基于CRISPR的诊断(CRISPR-Dx)。虽然一些Cas酶靶向DNA(7、8)，但单效应RNA导向的RNA酶，例如Cas13a(先前称为C2c2)(8)可以用CRISPR RNA(crRNA)重新编程(9-11)以提供用于特异性RNA传感的平台。在识别其RNA标靶后，活化的Cas13a参与附近非靶向的RNA的“附带”裂解(10)。这种crRNA编程的附带裂解活性允许Cas13a在体内通过触发程序性细胞死亡(10)或体外通过标记的RNA的非特异性降解(10、12)来检测特异性RNA的存在。此处，我们描述了SHERLOCK(特异性高灵敏度酶促报告子解锁)、基于核酸扩增的具有渺摩尔灵敏度的体外核酸检测平台和3Cas13a介导的商业报告子RNA的附带裂解(12)，从而允许标靶的实时检测(图17)。
方法
克隆用于表达的C2c2基因座和蛋白质
对于细菌体内效率测定，将来自韦德纤毛菌F0279和沙氏纤毛菌的C2c2蛋白质预定为用于哺乳动物表达的密码子优化的基因(Genscript,Jiangsu,China)，并且与侧接β-内酰胺酶靶向或非靶向间隔区的相应正向重复一起克隆至pACYC184骨架中。由J23119启动子驱动间隔区表达。
对于蛋白质纯化，将哺乳动物密码子优化的C2c2蛋白质克隆至用于蛋白质纯化的细菌表达载体(6x His/Twin Strep SUMO，从Ilya Finkelstein作为馈赠接受的基于pET的表达载体)中。
细菌体内C2c2效率测定
将LwC2c2和LshC2c2体内效率质粒和先前描述的β-内酰胺酶质粒(Abudayyeh2016)分别以90ng和25ng共转化至NovaBlue Singles感受态细胞(Millipore)中。转化之后，将细胞的稀释液涂于氨苄西林和氯霉素LB-琼脂板上并且在37C下孵育过夜。次日对菌落进行计数。
核酸标靶和crRNA制备
用KAPA Hifi热启动器(Kapa Biosystems)对核酸标靶进行PCR扩增，使用MinElute凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行凝胶提取和纯化。使用HiScribe T7快速高产量RNA合成试剂盒(New England Biolabs)在30℃下将纯化的dsDNA与T7聚合酶一起孵育过夜，并且用MEGAclear转录清洁试剂盒(Thermo Fisher)纯化RNA。
对于crRNA制备，将构建体预定为具有附加T7启动子序列的DNA(Integrated DNATechnologies)。将crRNA DNA粘接至短T7引物(最终浓度10uM)，并且使用HiScribe T7快速高产量RNA合成试剂盒(New England Biolabs)在37℃下与T7聚合酶一起孵育过夜。使用RNAXP清洁珠粒(Beckman Coulter)以珠粒与反应体积的2x比率纯化crRNA，额外补充1.8x异丙醇(Sigma)。
NASBA等温扩增
NASBA反应的细节在[Pardee 2016]中描述。对于20μL总反应体积，在4℃下组装6.7μL反应缓冲液(Life Sciences,NECB-24)、3.3μL核苷酸混合物(Life Sciences,NECN-24)、0.5μL不含核酸酶的水、0.4μL 12.5μM NASBA引物、0.1uL RNA酶抑制剂(Roche,03335402001)和4μL RNA扩增子(或水用于阴性对照)，并且在65℃下孵育2分钟，然后在41℃下孵育10分钟。将5μL酶混合物(Life Sciences,NEC-1-24)添加至每个反应中，并且在41℃下孵育反应混合物2小时。所使用的NASBA引物是5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGATCCTCTAGAAATATGGATT-3'(SEQ ID NO:16)和5'-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3'(SEQ ID NO:17)，并且加下划线部分指示T7启动子序列。
重组酶聚合酶扩增
使用NCBI Primer blast(Ye等,BMC Bioinformaics 13,134(2012)，除了扩增子大小(在100nt与140nt之间)、引物熔融温度(在54C与67C之间)和引物大小(在30nt与35nt之间)以外使用默认参数来设计用于RPA的引物。然后将引物预定为DNA(Integrated DNATechnologies)。
除了在输入模板之前添加280mM MgAc以外，分别如
Figure BDA0002275597970001841
Basic或
Figure BDA0002275597970001842
Basic RT(TwistDx)所指示来运作RPA和RT-RPA反应。除非另有描述，否则在37C下用1uL输入运作反应2小时。
LwC2c2蛋白质纯化
将C2c2细菌表达载体转化至RosettaTM 2(DE3)pLysS Singles感受态细胞(Millipore)中。使16mL起子培养物在特级肉汤4生长培养基(12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母提取物、9.4g/L K2HPO、2.2g/L KH2PO4，Sigma)(TB)中生长，用于接种4L TB，将其在37C、300RPM下孵育直至OD600达到0.6。此时，通过用IPTG(Sigma)补充至500uM最终浓度来诱导蛋白质表达，将细胞冷却至18C持续16小时用于蛋白质表达。然后在4C下将细胞以5200g离心15分钟。收集细胞团块并且储存于-80C下用于稍后纯化。
在4C下进行蛋白质纯化的所有后续步骤。将细胞团块压碎并且再悬浮于补充有蛋白酶抑制剂(Complete Ultra无EDTA片剂)、溶菌酶和全能核酸酶(benzonase)的溶解缓冲液(20mM Tris-Hcl、500mM NaCl、1mM DTT，pH 8.0)中，继之以超声波处理(Sonifier 450,Branson,Danbury,CT)，使用以下条件：1秒上和2秒下的振幅100，超声波处理总时间10分钟。通过在4C下以10,000g离心1小时使溶解产物变洁净，并且经Stericup 0.22微米过滤器(EMD Millipore)过滤上清液。将过滤的上清液施加至StrepTactin琼脂糖(GE)并且在旋转下孵育1小时，继而将蛋白质结合的StrepTactin树脂在溶解缓冲液中洗涤三次。使树脂与250个单位的SUMO蛋白酶(ThermoFisher)一起再悬浮于SUMO消化缓冲液(30mM Tris-HCl、500mM NaCl、1mM DTT、0.15％Igepal(NP-40)，pH 8.0)中并且在4C下在旋转下孵育过夜。通过SDS-PAGE和考马斯蓝(Commassie Blue)染色确认消化，并且通过使树脂快速离心来分离蛋白质洗脱物。经由FPLC(AKTA PURE,GE Healthcare Life Sciences)将蛋白质加载至5mLHiTrap SP HP阳离子交换柱(GE Healthcare Life Sciences)上，并且在洗脱缓冲液(20mMTris-HCl、1mM DTT、5％甘油，pH 8.0)中在130mM至2M NaCl的盐梯度上洗脱。通过SDS-PAGE针对LwC2c2的存在测试所得部分，并且汇集含有蛋白质的部分，并且经由离心过滤器单元在S200缓冲液(10mM HEPES、1M NaCl、5mM MgCl2、2mM DTT，pH 7.0)中浓缩至1mL。经由FPLC将浓缩的蛋白质加载至凝胶过滤柱(
Figure BDA0002275597970001851
200 Increase 10/300 GL,GEHealthcare Life Sciences)上。通过SDS-PAGE分析来自凝胶过滤的所得部分，并且汇集含有LwC2c2的部分，并且将缓冲液换成储存缓冲液(600mM NaCl、50mM Tris-HCl pH 7.5、5％甘油、2mM DTT)并在-80C下冷冻以供储存。
LwC2c2附带检测
除非另有指示，否则在核酸酶测定缓冲液(40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mMMgCl2，pH 7.3)中用45nM纯化的LwC2c2、22.5nM crRNA、125nM底物报告子(ThermoScientific RNAse Alert v2)、2μL鼠类RNA酶抑制剂、100ng背景总RNA和不同量的输入核酸标靶进行检测测定。如果输入是来自RPA反应的包括T7启动子的扩增DNA，那么修改上述C2c2反应以包括1mM ATP、1mM GTP、1mM UTP、1mM CTP和0.6μL T7聚合酶混合物(NEB)。在荧光板读取器(BioTek)上在37℃下使反应进行1-3小时(除非另有指示)，每5分钟测量荧光动力学。
通过将上述反应条件与RPA扩增混合物整合来进行组合RPA-DNA扩增、DNA至RNA的T7聚合酶转变和C2c2检测的一锅式反应。简单地说，50μL一锅式测定由以下组成：0.48μM正向引物、0.48μM反向引物、1x RPA再水合缓冲液、不同量的DNA输入、45nM LwC2c2重组蛋白质、22.5nM crRNA、250ng背景总RNA、200nM底物报告子(RNase alert v2)、4uL RNA酶抑制剂、2mM ATP、2mM GTP、2mM UTP、2mM CTP、1μL T7聚合酶混合物、5mM MgCl2和14mM MgAc。
使用TaqMan探针的定量PCR(qPCR)分析
为比较SHERLOCK定量与其它已确立的方法，对ssDNA 1的稀释系列进行qPCR。针对ssDNA 1设计TaqMan探针和引物组(序列如下)并且用IDT合成。使用TaqMan快速高级主混合物(Thermo Fisher)进行测定并且在Roche LightCycler 480上测量。
表14.qPCR引物/探针序列.
Figure BDA0002275597970001861
Figure BDA0002275597970001871
使用SYBR Green II的实时RPA
为比较SHERLOCK定量与其它已确立的方法，我们对ssDNA 1的稀释系列进行RPA。为实时定量DNA的积累，我们将1x SYBR Green II(Thermo Fisher)添加至上文所描述的典型RPA反应混合物中，这提供了与核酸的量相关的荧光信号。在荧光板读取器(BioTek)上在37℃下使反应进行1小时，每5分钟测量荧光动力学。
慢病毒制备和加工
慢病毒制备和加工是基于先前已知的方法。简单地说，使用HeBS-CaCl2方法将10μg包括寨卡或登革RNA片段的pSB700衍生物、7.5μg psPAX2和2.5μg pMD2.G转染至HEK293FT细胞(Life Technologies,R7007)。更换补充有10％FBS、1％青霉素-链霉素和4mMGlutaMAX(ThermoFisher Scientific)的DMEM培养基之后28小时，使用0.45μm针筒式过滤器过滤上清液。ViralBind慢病毒纯化试剂盒(Cell Biolabs,VPK-104)和Lenti-X浓缩器(Clontech,631231)用于从上清液纯化和制备慢病毒。使用QuickTiter慢病毒试剂盒(CellBiolabs,VPK-112)定量病毒浓度。将病毒样品外加至7％人血清(Sigma,H4522)中，加热至95℃持续2分钟并且用作RPA的输入。
寨卡人血清样品的分离和cDNA纯化
用AVL缓冲液(Qiagen)使可疑寨卡阳性人血清或尿液样品灭活，并且用QIAamp病毒RNA小型试剂盒(Qiagen)达成RNA的分离。通过混合随机引物、dNTP和样品RNA，继而在70℃下热变性7分钟使分离的RNA转变成cDNA。然后与Superscript III(Invitrogen)一起在22-25℃下孵育10分钟，在50℃下孵育45分钟，在55℃下孵育15分钟并且在80℃下孵育10分钟来逆转录变性的RNA。然后在37℃下将cDNA与RNA酶H(New England Biolabs)一起孵育20分钟以破坏RNA:cDNA杂交体中的RNA。
从人唾液中提取基因组DNA
从收集前30分钟限制消耗食物或饮料的志愿者收集2mL唾液。然后如试剂盒方案所推荐，使用
Figure BDA0002275597970001881
DNA血液小型试剂盒(Qiagen)加工样品。对于煮沸的唾液样品，将400μL磷酸盐缓冲盐水(Sigma)添加至100μL志愿者唾液中并且以1800g离心5分钟。倾析上清液并且使团块与0.2％Triton X-100(Sigma)一起再悬浮于磷酸盐缓冲盐水中，随后在95℃下孵育5分钟。1μL样品用作RPA反应的直接输入。
冷冻干燥和纸沉积
将玻璃纤维滤纸(Whatman,1827-021)用高压釜处理90分钟(ConsolidatedStills and Sterilizers,MKII)并且在5％不含核酸酶的BSA(EMD Millipore,126609-10GM)中阻断过夜。用不含核酸酶的水(Life technologies,AM9932)将纸冲洗一次后，在60℃下将其与4％RNAsecureTM(Life technologies,AM7006)一起孵育20分钟，并且用不含核酸酶的水再冲洗三次。使用前，在80℃下在热板(Cole-Parmer,IKA C-Mag HS7)上将处理的纸干燥20分钟。将1.8μL如早先所指示的C2c2反应混合物置于放置在黑色透明底384孔板(Corning,3544)中的圆盘(2mm)上。对于冷冻干燥的测试，将含有反应混合物圆盘的板在液氮中急速冷冻，并且如Pardee等(2)所描述冷冻干燥过夜。将RPA样品在不含核酸酶的水中以1:10稀释，并且将1.8μL混合物加载至纸圆盘上，并且使用板读取器(BioTek Neo)在37℃下孵育。
细菌基因组DNA提取
对于涉及CRE检测的实验，使细菌培养物在溶菌肉汤(LB)中生长至对数中期，然后成团并且视情况而定，使用制造商用于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌的方案，使用QiagenDNeasy血液和组织试剂盒进行gDNA提取和纯化。通过Quant-It dsDNA测定在Qubit荧光计上定量gDNA，并且经由200-300nm吸收光谱在Nanodrop分光光度计上评价其质量。
对于辨别大肠杆菌与绿脓假单胞菌的实验，使细菌培养物在鲁里亚-贝塔尼(Luria-Bertani，LB)肉汤中生长至静止期早期。使用便携的PureLyse细菌gDNA提取试剂盒(Claremont BioSolutions)加工1.0mL大肠杆菌与绿脓假单胞菌。将1X结合缓冲液添加至细菌培养物中，随后穿过电池供电的溶解筒持续三分钟。含0.5X结合缓冲液的水用作洗涤溶液，随后用150μL水洗脱。
数字微滴PCR定量
为确认图1C中所用的ssDNA 1和ssRNA 1标准稀释液的浓度，我们进行数字微滴PCR(ddPCR)。对于DNA定量，使用被设计成靶向ssDNA 1序列的PrimeTime qPCR探针/引物测定，使用用于探针的ddPCR超级混合物(无dUTP)制成微滴。对于RNA定量，使用被设计成靶向ssRNA 1序列的PrimeTime qPCR探针/引物测定，使用用于探针的一步RT-ddPCR试剂盒制成微滴。在任一种情况下使用QX200微滴产生器(BioRad)产生微滴并且转移至PCR板。如试剂盒的方案中所描述在热循环仪上进行基于微滴的扩增，随后经由在QX200微滴读取器上测量来确定核酸浓度。
用于人基因分型的合成标准
为建立用于人样品基因型的准确调用的标准，我们围绕SNP标靶设计引物以扩增来自人基因组DNA的约200bp区域，其代表两个纯合基因型中的每一个。然后通过将纯合标准以1:1比率混合来制成杂合标准。然后将这些标准稀释至等效基因组浓度(约0.56fg/μL)并且与真正的人样品一起用作SHERLOCK的输入。
肿瘤突变体无细胞DNA(cfDNA)的检测
模拟实际患者cfDNA样品的仿制cfDNA标准购自商业销售商(Horizon DiscoveryGroup)。这些标准对于BRAF V600E与EGFR L858R突变体以四个等位基因分数(100％WT以及0.1％、1％和5％突变体)提供。将3μL这些标准作为输入提供给SHERLOCK。
荧光数据的分析
为计算背景扣除荧光数据，扣除样品的初始荧光以允许在不同条件之间比较。从样品扣除背景条件(无输入或无crRNA条件)的荧光以产生背景扣除荧光。
通过用每种向导除以向导值的和来计算用于SNP或株系辨别的向导比率，以调整样品与样品之间的总体变化。如下计算用于SNP或株系辨别的crRNA比率以调整样品与样品之间的总体变化：
Figure BDA0002275597970001901
其中Ai和Bi分别是指对于给定的个体，传感等位基因A或等位基因B的crRNA的技术性重复i的SHERLOCK强度值。因为我们通常每种crRNA具有四个技术性重复，所以m和n等于4并且分母等效于对于给定的SNP基因座和个体的全部八个crRNA SHERLOCK强度值的和。因为存在两种crRNA，所以对于个体跨越crRNA中的每一种的crRNA比率平均值将始终和是2。因此，在纯合性的理想情况下，阳性等位基因crRNA的平均crRNA比率将是2并且阴性等位基因crRNA的平均crRNA比率将是0。在杂合性的理想情况下，两种crRNA的每一种的平均crRNA比率将是1。
LwCas13a裂解需求的表征
原间隔区侧接位点(PFS)是对于Cas13a的稳固核糖核酸酶活性所需的在靶位点附近存在的特异性基序。PFS位于靶位点的3'端并且先前由我们的小组对LshCas13a表征为H(不是G)(1)。尽管这个基序类似于原间隔区邻近基序(PAM)，一种用于DNA靶向2类系统的序列限制，但这个基序功能上是不同的，这是因为其并不涉及于防止内源系统中的CRISPR基因座的自靶向。Cas13a的未来结构研究将可能阐明PFS对Cas13a:crRNA靶复合物形成和裂解活性的重要性。
我们从大肠杆菌纯化重组LwCas13a蛋白质(图2D-E)并且测定其使具有每个可能的原间隔区侧接位点(PFS)核苷酸(A、U、C或G)的173-nt ssRNA裂解的能力(图2F)。类似于LshCas13a，LwCas13a可以使具有A、U或C PFS的标靶稳固地裂解，对具有G PFS的ssRNA的活性较小。尽管我们观察到对具有G PFS的ssRNA 1的活性较弱，但我们仍然观察到对于具有GPFS基序的两个靶位点(表3；rs601338 crRNA和寨卡靶向crRNA 2)的稳固检测。有可能在每种情况下不需要H PFS并且在许多情况下用G PFS可以达成强裂解或附带活性。
重组酶聚合酶扩增(RPA)和其它等温扩增策略的论述
重组酶聚合酶扩增(RPA)是由以下三种基本酶组成的等温扩增技术：重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换聚合酶。RPA克服了其它扩增策略，尤其聚合酶链反应(PCR)中存在的许多技术困难，这是因为酶全部在约37℃的恒定温度下操作，所以不需要温度调控。RPA将用于双链模板的总熔融和引物粘接的温度循环替换为由体内DNA复制和修复启示的酶促方法。重组酶-引物复合物扫描双链DNA并且有助于在互补位点处的链交换。链交换由SSB稳定，从而允许引物保持结合。重组酶的自发解体在其ADP结合状态中发生，从而允许链置换聚合酶侵入并延长引物，允许在定点护理和实地设置中不可用的复杂仪器不存在的情况下扩增。在37-42℃的温度范围内这个过程的循环重复引起指数性DNA扩增。所公布的原始配方使用枯草芽孢杆菌Pol I(Bsu)作为链置换聚合酶，T4 uvsX作为重组酶，以及T4gp32作为单链DNA结合蛋白(2)，不过尚不明确哪些组分在本研究中所用的由TwistDx出售的当前配方中。
另外，RPA具有许多限制：
1)尽管Cas13a检测是定量的(图15)，但实时RPA定量可能有困难，这是因为当重组酶使用所有可用的ATP时其快速饱和。虽然实时PCR由于其循环扩增的能力是定量的，但RPA不具有严密控制扩增速率的机制。可以作出某些调整以减小扩增速度，例如减小可用的镁或引物浓度，降低反应温度，或设计无效引物。尽管我们观察到定量SHERLOCK的一些情况，例如在图31、32和52中，但情况并不总是如此并且取决于模板。
2)RPA效率可能对引物设计是灵敏的。制造商通常推荐设计较长引入以确保在平均GC含量(40-60％)下的有效重组酶结合并且筛选至多100个引物对以发现高度灵敏引物对。我们在SHERLOCK下已经发现，我们仅必须设计两个引物对来达成具有单分子灵敏度的渺摩尔测试。这种稳固性可能是归因于由组成上活性的Cas13a附带活性对信号的额外扩增，这抵消了扩增子扩增中的任何无效性。这种质量对于图34中我们的细菌病原体鉴别尤为重要。扩增高度结构化区域，例如细菌基因组中的16S rRNA基因位点经历了问题，这是因为不存在RPA中所涉及的熔融步骤。因此，引物中的二级结构变成问题，限制了扩增效率并且因此限制灵敏度。尽管有这些RPA特定的问题，但由于来自Cas13a的额外信号扩增，因而相信本文所公开的实施方案是成功的。
3)扩增序列长度对于有效RPA必须是短的(100-200bp)。对于大多数应用，这并不是重大问题并且甚至可能是有利的(例如，平均片段大小是160bp的cfDNA检测)。有时，大扩增子长度是重要的，例如当需要通用引物用于细菌检测并且用于辨别的SNP散布在大片区域上时。
SHERLOCK的模块性允许在T7转录和Cas13a检测之前使用任何扩增技术，甚至是非等温方法。这种模块性能够由单个反应中T7和Cas13a步骤的相容性来达成，从而允许对具有T7启动子的任何扩增的DNA输入进行检测。在使用RPA之前，尝试基于核酸序列的扩增(NASBA)(3、4)用于我们的检测测定(图10)。然而，NASBA并不大大改善Cas13a的灵敏度(图11和53)。在检测之前可以采用的其它扩增技术包括PCR、环介导的等温扩增(LAMP)(5)、链置换扩增(SDA)(6)、解旋酶依赖性扩增(HDA)(7)和切口酶扩增反应(NEAR)(8)。互换任何等温技术的能力允许SHERLOCK克服任一种扩增技术的特定限制。
工程改造的错配的设计
我们先前显示，当标靶:crRNA双链体中存在两个或更多个错配时LshCas13a标靶裂解减少，但相对不受单错配影响，这是我们确认LwCas13a附带裂解的观测结果(图36A)。我们假定，通过将额外突变引入crRNA间隔区序列中，我们将使针对具有额外错配(总共两个错配)的标靶的附带裂解不稳定，同时保留仅在单错配的情况下将存在的中靶附带裂解。为测试工程改造增加的特异性的可能性，我们设计了多个靶向ssRNA 1的crRNA并且在crRNA的长度上包括错配(图36A)以优化中靶附带裂解并且使因单错配而不同的标靶的附带裂解降至最低。我们观测到这些错配并不减少ssRNA 1的附带裂解，但显著减小包括额外错配的标靶(ssRNA 2)的信号。最好地区分ssRNA 1和2的所设计的crRNA包括接近于ssRNA 2错配的合成错配，实际上在杂交的RNA中形成“气泡”或变形。由标靶中存在的合成错配和额外错配的配合(即，双重错配)引起的灵敏度损失与LshCas13a和LwCas13a对连续或附近的双重错配的灵敏度一致，并且提出了能够实现单核苷酸区别的crRNA的合理设计的基础(图36B)。
对于ZIKV和DENV株系的错配检测，我们的全长crRNA含有两个错配(图37A、B)。归因于株系之间的高序列分歧，我们不能发现在两个基因组之间仅具有单核苷酸差异的28nt连续段。然而，我们预测较短crRNA将仍然是功能性的，并且设计针对两个ZIKV株系中的标靶的较短23nt crRNA，所述株系包括间隔区序列中的合成错配和靶序列中的仅一个错配。这些crRNA仍然可以区分ZIKV的非洲和美洲株系(图36C)。23nt和20nt crRNA的后续测试显示，间隔区长度的减小降低活性，但维持或增强辨别单错配的能力(图57A-G)。为了更好地理解可以如何引入合成错配以有助于单核苷酸突变的辨别，我们跨越间隔区的最初七个位置在以下三种不同间隔区长度下拼贴合成错配：28nt、23nt和20nt(图57A)。在第三个位置处具有突变的标靶上，当合成错配在间隔区的位置5处时LwCas13a显示最大特异性，在较短间隔区长度下具有改善的特异性，但具有较低水平的中靶活性(图57B-G)。我们还使靶突变跨越位置3-6偏移并且拼贴间隔区中围绕突变的合成错配(图58)。
通过SHERLOCK使用合成标准的基因分型
从SNP基因座的PCR扩增建立的合成标准的评估允许基因型的准确鉴别(图60A、B)。通过在个体的样品与合成标准的SHERLOCK结果之间计算所有比较(ANOVA)，可以通过发现具有最相似的SHERLOCK检测强度的合成标准来鉴别每个个体的基因型(图60C、D)。这种SHERLOCK基因分型方法可普及至任何SNP基因座(图60E)。
SHERLOCK是可负担的、可适应的CRISPR-Dx平台
对于SHERLOCK的成本分析，省略确定成本可忽略不计的试剂，包括用于crRNA合成的DNA模板、RPA中所用的引物、常用缓冲液(MgCl2、Tris HCl、甘油、NaCl、DTT)、玻璃微纤维滤纸和RNAsecure试剂。对于DNA模板，来自IDT的超聚体(ultramer)合成提供了用于40个体外转录反应的物质(每个足够用于约10,000个反应)，花费约70美元，这为crRNA合成增添可忽略不计的成本。对于RPA引物，花费约10美元可以购买25nmol IDT合成的30nt DNA引物，提供了足够用于5000个SHERLOCK反应的物质。花费0.50美元/张可得到玻璃微纤维纸，这足以用于数千个SHERLOCK反应。4％RNAsecure试剂成本是7.20美元/毫升，这足以用于500个测试。
另外，对于所有实验，除了基于纸的测定外，使用384孔板(Corning 3544)，成本是0.036美元/反应。由于可忽略不计的成本，这不包括于总成本分析中。另外，SHERLOCK-POC不需要使用塑料容器，这是因为其可以在纸上容易地进行。本文所用的SHERLOCK的读出方法是配备有过滤器组或单色器的板读取器。作为资本投资，读取器的成本不包括于计算中，这是因为成本随着更多反应在仪器上运作而急剧降低并且可忽略不计。对于POC应用，可以使用更便宜和便携的替代品，例如手持式分光光度计(9)或便携电子读取器(4)，这使仪器的成本降至<200美元。虽然这些更便携的解决方案与更庞大的仪器相比将降低读出的速度和简易性，但其允许更广泛的使用。
结果
本文所描述的测定和系统一般可以包括扩增和检测的两步过程。在第一步期间，例如通过等温扩增来扩增核酸样品RNA或DNA。在第二步期间，将扩增的DNA转录至RNA中，随后与CRISPR效应物，例如C2c2一起孵育，并且对crRNA进行编程以检测靶核酸序列的存在。为能够进行检测，将已经用淬灭的荧光团作标记的报告子RNA添加至反应中。报告子RNA的附带裂解引起荧光团的解淬灭(un-quenching)并且允许核酸标靶的实时检测(图17A)。
为达成稳固的信号检测，从生物体韦德纤毛菌(LwC2c2)鉴别并评估C2c2的直系同源物。通过将LwC2c2蛋白质与合成CRISPR阵列一起在大肠杆菌中表达并且对其进行编程以使β-内酰胺酶mRNA内的靶位点裂解，使得在氨苄西林选择下细菌死亡来评估所述蛋白质的活性(图2B)。LwC2c2基因座相比LshC2c2基因座观测到较少存活的大肠杆菌菌落，展示LwC2c2直系同源物的较高裂解活性(图2C)。然后从大肠杆菌纯化人密码子优化的LwC2c2蛋白质(图2D-E)，并且使用不同原间隔区侧接位点(PFS)核苷酸测定其使173-nt ssRNA裂解的能力(图2F)。LwC2c2能够使可能四个PFS标靶中的每一个裂解，对具有G PFS的ssRNA的活性略小。
使用可商购的RNA荧光板读取器测量LwC2c2 RNA酶附带活性的实时测量(图17A)。为确定LwC2c2活性的基线灵敏度，将LwC2c2与ssRNA标靶1(ssRNA 1)和与ssRNA标靶内的位点互补的crRNA以及RNA传感器探针一起孵育(图18)。这得到约50fM的灵敏度(图27A)，尽管这比其它新近核酸检测技术(Pardee等,2014)更灵敏，但对于需要亚飞摩尔检测性能的许多诊断应用不够灵敏(Barletta等,2004；Emmadi等,2011；Rissin等,2010；Song等,2013)。
为增加灵敏度，在与LwC2c2一起孵育之前增添等温扩增步骤。将LwC2c2介导的检测与先前所用的等温扩增方法，例如基于核酸序列的扩增(NASBA)(Compton,1991；Pardee等,2016)相结合在一定程度上改善灵敏度(图11)。测试替代性等温扩增方法重组酶聚合酶扩增(RPA)(Piepenburg等,2006)，其可以用于在不足两小时内以指数方式扩增DNA。通过将T7 RNA聚合酶启动子添加至RPA引物上，可以使扩增的DNA转变成RNA用于由LwC2c2进行后续检测(图17)。因此，在某些示例性实施方案中，测定包括通过RPA扩增、DNA至RNA的T7 RNA聚合酶转变和通过来自淬灭的报告子的荧光的C2c2解锁对RNA的后续检测的组合。
对ssRNA 1的合成的DNA型式使用示例性方法，有可能达成在每个反应1-10个分子的范围内的渺摩尔灵敏度(图27B，左侧)。为验证检测的准确度，使用数字微滴PCR限定输入DNA的浓度并且确认最低可检测的标靶浓度(2aM)是每微升的单分子浓度。通过添加逆转录步骤，RPA还可以将RNA扩增成dsDNA形式，允许达成对ssRNA1的渺摩尔灵敏度(27B，右侧)。类似地，通过数字微滴PCR确认RNA标靶的浓度。为评估示例性方法用作POC诊断测试的可行性，测试所有组分-RPA、T7聚合酶扩增和LwC2c2检测-在单个反应中起作用的能力并且发现一锅式测定型式的渺摩尔灵敏度(图22)。
测定能够在液体中或在纸上进行灵敏病毒检测
接下来确定测定是否将在需要高灵敏度并且可以得益于便携诊断的传染病应用中有效。为测试模型系统中的检测，产生带有寨卡病毒基因组和相关黄病毒登革的RNA片段的慢病毒(Dejnirattisai等,2016)并且定量病毒颗粒的数目(图31A)。所检测的仿制病毒的水平低至2aM。同时，还有可能在含有寨卡和登革RNA片段的这些代理病毒之间显示出明确的辨别(图31B)。为确定测定是否将与冷冻干燥相容以消除对用于分配的冷链的依赖性，将反应组分冷冻干燥。使用样品再水合冻干的组分之后，检测20fM ssRNA 1(图33A)。因为资源贫乏和POC设置将得益于易于可用的纸测试，所以还评估在玻璃纤维纸上C2c2检测的活性并且发现纸上点斑的C2c2反应能够靶向检测(图33B)。以组合形式，对C2c2检测反应进行冷冻干燥和纸上点斑促成ssRNA 1的灵敏检测(图33C)。在溶液中的LwC2c2与冷冻干燥的LwC2c2之间对于合成寨卡病毒RNA片段的检测也观测到类似水平的灵敏度，展示冷冻干燥的SHERLOCK的稳固性和快速POC寨卡病毒诊断的潜力(图33D-E)。为此目的，对测定的POC变体的能力进行测试以确定辨别寨卡RNA与登革RNA的能力(图31C)。虽然纸上点斑和冻干略微降低读出的绝对信号，但与具有登革对照序列的仿制病毒的检测相比，测定仍然显著检测到浓度低至20aM的仿制寨卡病毒(图31D)。
已经报道了人中的寨卡病毒RNA水平低至患者唾液中的3x106个拷贝/毫升(4.9fM)和患者血清中的7.2x105个拷贝/毫升(1.2fM)(Barzon等,2016；Gourinat等,2015；Lanciotti等,2008)。从所获得的患者样品，观测到低至1.25x103个拷贝/毫升(2.1aM)的浓度。为评估测定是否能够进行低滴度临床分离株的寨卡病毒检测，从患者中提取病毒RNA并且进行逆转录，并且所得cDNA用作测定的输入(图32A)。在低至1.25个拷贝/微升(2.1aM)的浓度下观测到对寨卡人血清样品的显著检测(图32B)。此外，来自患者样品的信号预测寨卡病毒RNA拷贝数并且可以用于预测病毒负荷(图31F)。为测试对于核酸纯化不可用的疾病情况的广泛应用性，测试外加至人血清中的ssRNA 1的检测，并且确定测定在低于2％的血清水平下活化(图33G)。
细菌病原体区别和基因区别
为确定测定是否可以用于区分细菌病原体，选择16S V3区作为初始标靶，这是因为保守侧接区允许跨越细菌种类使用通用RPA引物，并且可变内区允许区别种类。设计一组5个可能的靶向crRNA用于病原性株系以及分离的大肠杆菌和绿脓假单胞菌gDNA(图34A)。测定能够区分大肠杆菌或绿脓假单胞菌gDNA并且对于其它种类的crRNA显示出低背景信号(图34A、B)。
测定还可以适应于快速检测和区分所关注的细菌基因，例如抗生素抗性基因。碳青霉烯抗性肠道菌(CRE)是重大的新兴公共卫生挑战(Gupta等,2011)。评估测定用以检测碳青霉烯抗性基因的能力，以及测试是否可以区分不同碳青霉烯抗性基因。从带有肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)或新德里金属-β-内酰胺酶1(NDM-1)抗性基因的临床分离株获得肺炎克雷伯菌，并且设计crRNA以区分基因。所有CRE具有比缺乏这些抗性基因的细菌显著的信号(图35A)，并且我们可以显著区分KPC与NDM-1抗性株系(图35B)。
CRISPR RNA导向的RNA酶的单碱基错配特异性
已经显示，某些CRISPR RNA导向的RNA酶直系同源物，例如LshC2c2并不容易区分单碱基错配(Abudayyeh等,2016)。如本文所展示，LwC2c2也共享这种特征(图37A)。为增加LwC2c2裂解的特异性，开发用于将合成错配引入crRNA:标靶双链体中的系统，其增加对错配的总灵敏度并且能够实现单碱基错配灵敏度。设计标靶1的多个crRNA并且在crRNA的长度上包括错配(图37A)以优化中靶裂解并且使因单错配而不同的标靶的裂解降至最低。这些错配并不降低ssRNA标靶1的裂解效率，但显著减小包括额外错配的标靶(ssRNA标靶2)的信号。最好地区分标靶1和2的所设计的crRNA包括接近于标靶2错配的合成错配，实际上形成“气泡”。由标靶中存在的合成错配和额外错配的配合(即，双重错配)引起的灵敏度损失与LshC2c2对连续或附近的双重错配的灵敏度一致(Abudayyeh等,2016)，并且提出了能够实现单核苷酸区别的crRNA的合理设计的格局(图37B)。
在已经展示可以工程改造C2c2以识别单碱基错配下，确定这种工程改造的特异性是否可以用于区分密切相关的病毒病原体。多个crRNA被设计成检测寨卡病毒的非洲或美洲株系(图37A)和登革病毒的株系1或3(图37C)。这些crRNA包括间隔区序列中的合成错配，当与中靶株系呈双链体时归因于合成错配而导致单个气泡形成。然而，当合成错配间隔区与脱靶株系呈双链体时，归因于合成错配和SNP错配而形成两个气泡。合成错配crRNA以显著高于脱靶株系的信号检测其相应株系，从而允许稳固的株系区别(图37B、37D)。归因于株系之间的显著序列相似性，不可能发现在两个基因组之间仅具有单核苷酸差异的28nt连续段以展示真正的单核苷酸株系区别。然而，预测较短crRNA将仍然是功能性的，这是因为其与LshC2c2一起(Abudayyeh等,2016)，并且因此设计针对两个寨卡株系中的标靶的较短23-nt crRNA，所述株系包括间隔区序列中的合成错配和靶序列中的仅一个错配。这些crRNA仍然能够在高灵敏度下区分寨卡的非洲和美洲株系(图36C)。
使用从唾液纯化的DNA的快速基因分型
从人唾液的快速基因分型可以适用于急诊药物基因组学情况或用于家庭诊断。为展示本文所公开的实施方案用于基因分型的潜力，选择五个基因座以使用23andMe基因分型数据作为黄金标准为C2c2检测定基准(Eriksson等,2010)(图38A)。五个基因座横跨大范围的功能性关联，包括对例如抑制素(statin)或醋氨酚(acetaminophen)的药物的敏感度、诺如病毒易感性以及心脏病风险(表15)。
表15：所测试的SNP变体
ID 基因 类别
rs5082 APOA2 饱和脂肪消耗和体重增加
rs1467558 CD44 醋氨酚代谢
rs2952768 附近的CREB1 吗啡依赖性
rs4363657 SLCO1B1 抑制素使用者的肌病风险4.5x增加
rs601338 FUT2 对诺如病毒的抗性
从四名人受试者收集唾液，并且使用简单的商业试剂盒在小于一小时内纯化基因组DNA。四名受试者具有跨越五个基因座的一组多样的基因型，对此提供了足够宽的取样空间以为用于基因分型的测定定基准。对于五个SNP基因座中的每一个，使用RPA用适当引物扩增受试者的基因组DNA，继而用LwC2c2检测，并且设计crRNA对以特异性地检测两个可能等位基因之一(图38B)。测定特定地足以在高显著性下区分等位基因并且推断纯合与杂合基因型。因为在检测之前对唾液进行DNA提取方案，所以测试测定以确定是否可以更适用于通过使用加热至95℃持续5分钟的唾液而无需任何进一步提取的POC基因分型。测定能够对唾液仅经受加热持续5分钟，然后进行后续扩增和C2c2检测的两名患者正确地进行基因分型(图40B)。
在低等位基因分数下cfDNA中的癌性突变的检测
因为测定对标靶中的单核苷酸差异具有高度特异性，所以设计测试以确定测定是否足够灵敏来检测无细胞DNA(cfDNA)中的癌症突变。cfDNA片段是小百分比(0.1％至5％)的野生型cfDNA片段(Bettegowda等,2014；Newman等,2014；Olmedillas Lopez等,2016；Qin等,2016)。在cfDNA领域中的重大挑战是检测这些突变，这是因为在给出血液的背景中所发现的高水平的非突变DNA下通常难以发现这些突变(Bettegowda等,2014；Newman等,2014；Qin等,2016)。POC cfDNA癌症测试还将适用于癌症存在的定期筛选，尤其对于处于缓解期的风险下患者。
通过在crRNA靶位点中具有单突变的ssDNA1的背景中稀释dsDNA标靶1来确定测定用以检测野生型背景中的突变体DNA的能力(图41A-B)。LwC2c2能够传感dsDNA 1达到低至背景dsDNA的0.1％和dsDNA 1的渺摩尔浓度内的水平。这个结果显示，背景突变体dsDNA 1的LwC2c2裂解足够低以允许在0.1％等位基因分数下稳固检测中靶dsDNA。在低于0.1％的水平下，背景活性可能成问题，这阻止正确标靶的任何进一步显著检测。
因为测定可以在临床相关范围内的等分基因分数下传感合成标靶，所以评估测定是否能够检测cfDNA中的癌症突变。设计针对两种不同癌症突变EGFR L858R和BRAF V600E的RPA引物，并且在类似于实际人cfDNA样品的5％、1％和0.1％的等位基因分数下使用商业cfDNA标准以供测试。使用一对可以区分突变体等位基因与野生型等位基因的crRNA(图38C)，达成对两种突变体基因座的0.1％等位基因分数的检测(图39A-B)。
论述
通过组合C2c2的天然特性与等温扩增和淬灭的荧光探针，本文所公开的测定和系统已经展示为通用的稳固方法来检测RNA和DNA，并且适合于多种快速诊断，包括传染病应用和快速基因分型。本文所公开的测定和系统的主要优点是在数天之内花费低至0.6美元/测试可以重新设计并合成新的POC测试。
因为许多人疾病应用需要检测单错配的能力，所以开发合理的方法以通过将合成错配引入crRNA的间隔区序列中使crRNA工程改造成对靶序列中的单错配具有高度特异性。用CRISPR效应物达成特异性的其它方法依靠在许多向导设计上基于筛选的方法(Chavez等,2016)。使用设计的错配crRNA，展示因单错配而不同的位点中的寨卡和登革病毒株的辨别、来自人唾液gDNA的SNP的快速基因分型以及cfDNA样品中的癌症突变的检测。
测定平台的低成本和适应性适用于其它应用，包括(i)代替特异性qPCR测定，例如Taqman的一般RNA/DNA定量经验，(ii)类似于微阵列的快速、多元化RNA表达检测，以及(iii)其它灵敏检测应用，例如来自食物中的其它来源的核酸污染的检测。另外，C2c2可以潜在地用于生物设置内，例如细胞中的转录物的检测，并且在给出C2c2检测的高度特异性性质下，有可能追踪活细胞中的转录物或疾病相关突变的等位基因特异性表达。在适体的广泛可用性下，还有可能通过将适体对蛋白质的检测与揭露RPA的隐蔽扩增位点继之以C2c2检测相结合来传感蛋白质。
使用CRISPR-Cas13a/C2c2的核酸检测：渺摩尔灵敏度和单核苷酸特异性
为达成稳固的信号检测，我们从韦德纤毛菌(LwCas13a)鉴别Cas13a的直系同源物，其相对于沙氏纤毛菌Cas13a(LshCas13a)展现较高的RNA导向的RNA酶活性(10)(图2，还参见上文“LwCas13a裂解需求的表征”)。与ssRNA标靶1(ssRNA 1)、crRNA和报告子(淬灭的荧光RNA)一起孵育的LwCas13a(图18)(13)得到约50fM的检测灵敏度(图51、15)，这对于许多诊断应用不够灵敏(12、14-16)。我们因此探索了将基于Cas13a的检测与不同等温扩增步骤组合(图10、11、53、16)(17、18)。在探索的方法当中，重组酶聚合酶扩增(RPA)(18)得到最高灵敏度并且可以与T7转录相结合以使扩增的DNA转变成RNA用于由LwCas13a进行后续检测(还参见上文“重组酶聚合酶扩增(RPA)和其它等温扩增策略的论述”)。我们涉及了通过RPA扩增、扩增的DNA至RNA的T7 RNA聚合酶转录和通过Cas13a附带RNA裂解介导的报告子信号作为SHERLOCK释放对靶RNA检测的这种组合。
我们首先确定SHERLOCK用于检测RNA(当与逆转录相结合时)或DNA标靶的灵敏度。如通过数字微滴PCR(ddPCR)验证，我们达成了RNA与DNA的单分子灵敏度(图27、51、54A、B)。当我们在单个反应中组合所有SHERLOCK组分时维持渺摩尔灵敏度，从而展示这个平台作为定点护理(POC)诊断的可行性(图54C)。SHERLOCK具有与两种已确立的灵敏核酸检测方法ddPCR和定量PCR(qPCR)类似水平的灵敏度，而单独的RPA对于检测低水平的标靶不够灵敏(图55A-D)。此外，如由跨越重复的变异系数来测量，SHERLOCK相比ddPCR、qPCR和RPA显示较小的变异(图55E-F)。
我们接下来检查SHERLOCK是否将在需要高灵敏度的传染病应用中有效。我们产生了带有寨卡病毒(ZIKV)或相关黄病毒登革(DENV)的基因组片段的慢病毒(19)(图31A)。SHERLOCK检测低至2aM的病毒颗粒并且可以辨别ZIKV与DENV(图31B)。为了探索SHERLOCK在实地中的潜在用途，我们首先展示了冻干并随后再水合的Cas13acrRNA复合物(20)可以检测20fM非扩增的ssRNA 1(图33A)并且标靶检测也可能在玻璃纤维纸上进行(图33B)。SHERLOCK的其它组分也适用于冷冻干燥：RPA在环境温度下作为冻干的试剂提供，并且我们先前展示了T7聚合酶耐受冷冻干燥(2)。以组合形式，对Cas13a检测反应进行冷冻干燥和纸上点斑促成与水性反应可比水平的ssRNA 1的灵敏检测(图33C-E)。尽管纸上点斑和冻干略微降低读出的绝对信号，但SHERLOCK(图31C)在低至20aM的浓度下可以容易地检测仿制ZIKV病毒(图31D)。SHERLOCK还能够检测临床分离株(血清、尿液或唾液)中的ZIKV，其中滴度可以低至2x103个拷贝/毫升(3.2aM)(21)。如通过qPCR验证(图32F和52B)，从患者血清或尿液样品中提取并逆转录成cDNA的ZIKV RNA(图32E和52A)可以在低至1.25x103个拷贝/毫升(2.1aM)的浓度下检测。此外，来自患者样品的信号预测ZIKV RNA拷贝数并且可以用于预测病毒负荷(图33F)。为模拟样品检测而无需核酸纯化，我们测量了外加至人血清中的ssRNA 1的检测，并且发现Cas13a可以检测含有至多2％血清的反应中的RNA(图33G)。CRISPR-dx的另一个重要的流行病学应用是细菌病原体的鉴别和特异性细菌基因的检测。我们靶向16S rRNA基因V3区，其中保守侧接区允许跨越细菌种类使用通用RPA引物，并且可变内区允许区别种类。在用于不同病原性株系以及从大肠杆菌和绿脓假单胞菌分离的gDNA的一组五个可能的靶向crRNA中(图34A)，SHERLOCK对株系正确地进行基因分型并且显示低交叉反应性(图34B)。另外，我们能够使用SHERLOCK区分具有以下两种不同抗性基因的肺炎克雷伯菌的临床分离株：肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金属-β-内酰胺酶1(NDM-1)(22)(图56)。
为增加SHERLOCK的特异性，我们将合成错配引入crRNA:标靶双链体中，这使得LwCas13a能够辨别因单碱基错配而不同的标靶(图36A、B；还参见上文“工程改造的错配的设计”)。我们设计了在间隔区序列中具有合成错配的多个crRNA以检测ZIKV的非洲或美洲株系(图37A)和DENV的株系1或3(图37C)。合成错配crRNA以显著高于脱靶株系的信号(双尾司徒登t检验；p<0.01)检测其相应株系，从而允许基于单错配的稳固的株系辨别(图37B、D，36C)。进一步表征揭示，当突变在间隔区的位置3处并且合成错配在位置5处时，Cas13a检测达成最大特异性同时维持中靶灵敏度(图57和58)。检测单碱基差异的能力开辟了使用SHERLOCK用于快速人基因分型的机会。我们选择横跨一系列健康相关的单核苷酸多态性(SNP)(表1)的五个基因座并且在这些SNP处使用23andMe基因分型数据作为黄金标准为SHERLOCK检测定基准(23)(图38A)。我们从跨越所关注的基因座具有多样化基因型的四名人受试者收集唾液，并且经由商业柱纯化或直接加热五分钟来提取基因组DNA(20)。SHERLOCK以高显著性和足够的特异性区分等位基因来推断纯合与杂合基因型(图38B、40、59、60；还参见上文“通过SHERLOCK使用合成标准的基因分型”)。最后，我们试图确定SHERLOCK是否可以检测无细胞(cf)DNA片段中的低频癌症突变，这由于患者血液中高水平的野生型DNA而有挑战性(24-26)。我们首先发现SHERLOCK可以检测在基因组DNA的背景中稀释的渺摩尔浓度的ssDNA 1(图61)。接下来，我们发现SHERLOCK还能够在低至背景DNA的0.1％的水平下检测含单核苷酸多态性(SNP)的等位基因(图41A、B)，所述水平处于临床相关范围内。我们然后展示SHERLOCK可以检测具有低至0.1％的等位基因分数的仿制cfDNA样品中的两种不同癌症突变EGFR L858R和BRAF V600E(图38、39)(20)。
SHERLOCK平台适用于其它应用，包括(i)代替特异性qPCR测定，例如TaqMan的一般RNA/DNA定量，(ii)快速、多元化RNA表达检测，以及(iii)其它灵敏检测应用，例如核酸污染的检测。另外，Cas13a可以潜在地检测生物设置内的转录物并且追踪活细胞中转录物或疾病相关突变的等位基因特异性表达。我们已经显示，SHERLOCK是用以检测RNA和DNA的通用的稳固方法，其适合于包括传染病应用和灵敏基因分型的快速诊断。很有信心在数天之内花费低至0.61美元/测试可以重新设计并合成SHERLOCK纸测试(还参见上文“SHERLOCK是可负担的、可适应的CRISPR-Dx平台”)，这是因为所测试的几乎每个crRNA促成高灵敏度和特异性。这些质量突出了CRISPR-Dx的能力并且开辟了生物分子的快速、稳固和灵敏检测的新途径。
表16：所使用的RPA引物
Figure BDA0002275597970002051
Figure BDA0002275597970002061
Figure BDA0002275597970002071
表17：所使用的crRNA序列
Figure BDA0002275597970002072
Figure BDA0002275597970002081
Figure BDA0002275597970002091
Figure BDA0002275597970002101
Figure BDA0002275597970002111
表18：本实施例中所使用的RNA和DNA标靶
名称 序列 第一个图
ssRNA 1(C PFS) g(SEQ.I.D.No.288) 图2F
ssRNA 1(G PFS) (SEQ.I.D.No.289) 图2F
ssRNA 1(A PFS) (SEQ.I.D.No.290) 图2F
ssRNA 1(U PFS) (SEQ.I.D.No.291) 图2F
ssDNA 1 (SEQ.I.D.No.292) 图27
DNA 2 (SEQ.I.D.No.293) 图54B
慢病毒中的ZIKV (SEQ.I.D.No.294) 图31B
慢病毒中的DENV (SEQ.I.D.No.295) 图31B
合成ZIKV标靶 (SEQ.I.D.No.296) 图33D
合成非洲ZIKV标靶 (SEQ.I.D.No.297) 图37A
合成美洲ZIKV标靶 (SEQ.I.D.No.298) 图37A
合成登革株系1标靶 (SEQ.I.D.No.299) 图37C
合成登革株系3标靶 (SEQ.I.D.No.300) 图37C
ssRNA 2 (SEQ.I.D.No.301) 图36A
ssRNA 3 (SEQ.I.D.No.302) 图36A
表19：本实施例中所使用的质粒
Figure BDA0002275597970002112
Figure BDA0002275597970002121
实施例3-C2c2预防感染并且减少淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCMV)的复制
如图67中所指示和下表20中所列，向导RNA被设计成结合至LCMV基因组的各个区域。
表20
gRNA标注 gRNA序列 SEQ ID NO
L1 ctcacgaagaaagttgtgcaaccaaaca 624
L2 tcttcaatctggttggtaatggatattt 625
L3 gccaatttgttagtgtcctctataaatt 626
L4 tatctcacagaccctatttgattttgcc 627
L5 aaattcttcattaaattcaccatttttg 628
L6 tatagtttaaacataactctctcaattc 629
S1 atccaaaaagcctaggatccccggtgcg 630
S2 agaatgtcaagttgtattggatggttat 631
S3 aaagcagccttgttgtagtcaattagtc 632
S4 tgatctctttcttctttttgtcccttac 633
S5 tctctttcttctttttgtcccttactat 634
S6 caatcaaatgcctaggatccactgtgcg 635
使用脂质转染胺2000(Lipofectamine 2000)将表达融合至具有核输出信号的msfGFP的韦德纤毛菌(Lw)C2c2/Cas13a的质粒和表达向导RNA的质粒转染至293FT细胞中。在脂质转染胺-质粒混合物添加的同时将293FT细胞涂板。24小时后，用阿姆斯特朗型(armstrong)LCMV(MOI 5，1小时)感染经过转染的293FT细胞(通过使用Vero细胞的病灶形成单位测定来确定病毒滴度)。感染1小时后，用柠檬酸盐缓冲液洗涤细胞以破坏感染培养基中残余的不感染细胞的病毒。感染后48小时，移出含病毒上清液并且在不含核酸酶的水中以1:10稀释，然后用作使用针对LCMV GP的引物的RT-qPCR的输入。结果在图68中示出。
在LCMV感染前1天将293FT细胞涂板，以使得在约80-85％汇合度下进行感染。涂板后24小时，用阿姆斯特朗型LCMV(MOI 5，1小时)感染293FT细胞(通过使用Vero细胞的病灶形成单位测定来确定病毒滴度)。感染1小时后，用柠檬酸盐缓冲液洗涤细胞以破坏感染培养基中残余的不感染细胞的病毒。24小时后，使用脂质转染胺2000将表达融合至具有核输出信号的msfGFP的Lw C2c2/Cas13a的质粒和表达向导RNA的质粒转染至293FT细胞中。感染后48小时，移出含病毒上清液并且在不含核酸酶的水中以1:10稀释，然后用作使用针对LCMV GP的引物的RT-qPCR的输入。结果在图69中示出。
使用脂质转染胺2000将表达融合至具有核输出信号的msfGFP的Lw C2c2/Cas13a的质粒和表达一个或多个向导RNA的单个质粒或多个质粒转染至293FT细胞中。在脂质转染胺-质粒混合物添加的同时将293FT细胞涂板。用1至4个不同向导RNA转染细胞。24小时后，用阿姆斯特朗型LCMV(MOI 5，1小时)感染细胞(通过使用Vero细胞的病灶形成单位测定来确定病毒滴度)。感染1小时后，用柠檬酸盐缓冲液洗涤细胞以破坏感染培养基中残余的不感染细胞的病毒。感染后48小时，移出含病毒上清液并且在不含核酸酶的水中以1:10稀释，然后用作使用针对LCMV GP的引物的RT-qPCR的输入。结果在图70中示出。
从图68-70显而易见，被设计成靶向病毒RNA的CRISPR系统可以减少病毒复制并且因此减少病毒负荷，这在使用多个向导RNA时甚至更加明显。
实施例4用于Cas13靶向向导的LCMV的全基因组筛选
进行广基因组筛选以鉴别最有效的向导RNA。跨越LCMV基因组拼贴283个向导RNA：在编码链上每50nt(207个向导)和非编码链上每150nt(76个向导)。
LCMV筛选设计和方法：为进行减少LCMV复制的向导的全基因组筛选，跨越LCMV基因组的S与L区段拼贴向导。对于编码区，沿着编码区每50nt设计28nt向导。对于非编码区，每150nt设计向导。对于四种蛋白质(GPC、NP(或dN)、Z和L)存在LCMV的4个编码区，并且这4种蛋白质中的每一种具有其自身的非编码区。使用这种策略，总共测试283个向导：GPC：非编码区中的11个向导和编码区中的32个向导；NP：非编码区中的12个向导和编码区中的35个向导；Z：非编码区中的4个向导和编码区中的7个向导；L：非编码区中的49个向导和编码区中的133个向导。相应gRNA的间隔区序列以及其在LCMV基因组和LMCV基因内的相对位置在下表21中提供。
表21
Figure BDA0002275597970002141
Figure BDA0002275597970002151
Figure BDA0002275597970002161
Figure BDA0002275597970002171
Figure BDA0002275597970002181
Figure BDA0002275597970002191
Figure BDA0002275597970002201
为进行筛选，使用脂质转染胺2000用编码具有BFP荧光的Cas13a的质粒和编码单向导的质粒反向转染HEK293FT细胞。还反向转染三个对照向导：1个空载体和2个脱靶向导。转染后24小时，在MOI 1下用GFP表达LCMV感染细胞1小时。然后在感染后48小时(反向转染后72小时)测量如由GFP荧光测量的病毒复制。减少病毒复制的向导的分数在图71和下表22中提供。如由GFP荧光的倍数变化测量的病毒减少的量在图72中提供。图73提供了图解GFP减少的代表性图像。从图74显而易见，靶向向导沿着LCMV基因组成簇。
表22
Figure BDA0002275597970002211
表23
T7启动子 (SEQ.ID.No.919)
ZikvBrazil_301-700 (SEQ.ID.No.920)
ZikvBrazil_301-700_N139S (SEQ.ID.No.921)
T7prom_ZikvBrazil_301-700 (SEQ.ID.No.922)
T7prom_ZikvBrazil_301-700_N139S (SEQ.ID.No.923)
实施例5-寨卡cDNA、RNA和病毒颗粒的检测限的确定
使用SHERLOCK方法用寨卡病毒特异性RPA引物和寨卡病毒特异性crRNA确定寨卡病毒cDNA、RNA和病毒颗粒的检测限。
为检测cDNA，将来源于病毒种子储备液的寨卡病毒cDNA稀释至水或尿液中。进行热灭活以模拟临床样品中的病毒颗粒的热灭活处理以及灭活人尿液中所存在的RNA酶。进行RPA持续20分钟，继之以Cas13a检测，其中条形图中所示的荧光是在1小时处测量的荧光(图77A)。
为检测RNA，将来源于病毒种子储备液的寨卡病毒RNA稀释至水、尿液或先前经过热和RNA酶灭活的尿液中。为对健康尿液进行热和RNA酶灭活，在热处理之前添加TCEP/EDTA。这种处理显示出RNA酶灭活对防止RNA降解的重要性。进行RT-RPA持续20分钟，继之以Cas13a检测，其中条形图中所示的荧光是在1小时处测量的荧光(图77B)。
为检测病毒颗粒，将来自细胞培养上清液的寨卡病毒颗粒稀释至PBS或尿液中。然后用TCEP/EDTA和25分钟热处理(55℃下20分钟、95℃下5分钟)对样品进行热和RNA酶灭活。这种两步热处理允许灭活尿液中的RNA酶，随后从病毒颗粒(寨卡病毒颗粒在低于65℃的温度下稳定)释放RNA。95℃步骤在RNA酶灭活后从病毒颗粒释放RNA。进行RT-RPA持续20分钟，继之以Cas13a检测，其中条形图中所示的荧光是在1小时处测量的荧光(图77C)。
如下检测病毒样品中的单核苷酸变体。用靶向突变体序列的crRNA与靶向野生型序列的crRNA测试样品，并且相对荧光用于确定所存在的等位基因(图78A)。
图78B展示通过SHERLOCK方法测试的3种SNP的基因组位置。简化树展示SNP之间的关系和在2015年寨卡病毒爆发期间出现SNP的地方。
图78C示出了对应于在2015年寨卡病毒爆发期间出现的不同SNP与出现SNP的位置的图。每个条形表示具有对应于突变型变体或野生型变体的序列的合成gBlock、来源于具有祖先型序列(即，无突变型变体)的种子储备液的cDNA或无输入(水)。通过20分钟RPA扩增每个样品并且条形表示在检测反应1小时处的荧光。较深色阴影的条形表示当突变体crRNA用于检测反应中时测量的荧光，并且较浅色的条形表示当使用野生型crRNA时测量的荧光。
cDNA来源于三个临床样品。将2015年寨卡爆发的每个场所联系起来，并且来源于具有祖先型序列(无突变型变体)的种子储备液的cDNA与突变体crRNA和野生型crRNA一起测试。图78D中所示的图表示在1小时时间点处突变体cRNA与野生型cRNA之间的荧光比。比率大于1指示突变体crRNA具有大于野生型crRNA的荧光并且因此指示所测试的样品中突变型变体的存在。紫色是DOMUSA SNP，橙色是USA SNP，并且绿色是HND SNP。
图78E中的热图展示了对于针对每个crRNA的每个样品经过log2变换的图78D中所示的荧光比。值大于0指示突变型变体的存在。
S139N是最近鉴别的在新近寨卡爆发期间观测到的小头畸形表型中起作用的变体(Yuan,L.2017.Science)。图78F中的每个条形表示具有对应于S139N变体或N139S变体的序列的合成gBlock、来源于具有S139N变体的种子储备液的cDNA或无输入(水)。通过20分钟RPA扩增每个样品并且条形表示在检测反应1小时处的荧光。深色阴影的条形表示当S139N靶向crRNA用于检测反应中时测量的荧光，并且较浅色的条形表示当使用N139S靶向crRNA时测量的荧光。我们能够设计RPA引物和向导并且在公布一周内对其进行测试，从而将这种变体与小头畸形相关联-突出了这种方法的速度/实时性质。
实施例6-用于登革病毒的SHERLOCK板块
多血清型登革SHERLOCK板块在图79A中图解。在RPA期间使用一组登革特异性RPA引物。然后将RPA反应分成4个反应，其中血清型特异性向导在每个反应中以允许区分登革病毒的4种血清型。在图79B中，x轴上的每个记号表示用作SHERLOCK反应的输入的gblock模板。用单组RPA引物扩增每个模板，然后针对每个crRNA(DENV1 crRNA、DENV2 crRNA、DENV3crRNA和DENV4 crRNA)测试每个RPA反应。进行RPA反应持续20分钟，并且条形图中所示的荧光是在3小时处测量的荧光。每个紫色阴影指定血清型特异性crRNA。这个条形图的替代性表示在图79C中以log10标度的荧光示出。
实施例7-用于各种黄病毒的SHERLOCK板块
图80A图解了黄病毒SHERLOCK板块如何工作。在RPA中使用一组可以扩增4种不同相关黄病毒的RPA引物。然后将RPA反应分成4个反应，其中病毒特异性向导在每个反应中以允许区分寨卡病毒、西尼罗河病毒、登革病毒和黄热病病毒的存在。在图80B中，x轴上的每个记号表示用作SHERLOCK反应的输入的gblock模板。用单组RPA引物扩增每个模板，然后针对每个crRNA(ZIKV crRNA、WNV crRNA、DENV crRNA和YFV crRNA)测试每个RPA反应。进行RPA反应持续20分钟，并且条形图中所示的荧光是在3小时处测量的荧光。每种颜色指定病毒特异性crRNA。在图80C中，x轴上的每个记号表示用作SHERLOCK反应的输入的两个gblock模板以模拟SHERLOCK检测共感染的能力。用单组RPA引物扩增每个反应，然后针对每个crRNA(ZIKV crRNA、WNV crRNA、DENV crRNA和YFV crRNA)测试每个RPA反应。进行RPA反应持续20分钟，并且条形图中所示的荧光是在3小时处测量的荧光。每种颜色指定病毒特异性crRNA。在每个交替的白色和灰色区块内，每个条形表示由按每个区块中保留的ZIKVcrRNA、WNV crRNA、DENV crRNA和YFV crRNA的次序测试的向导产生的荧光。在图80B和80C中以条形图表示的所测量的荧光的替代性表示分别在图81A和81B中示出。
实施例8-使用CRISPR-Cas13a的病毒诊断
申请者使用CRISPR-Cas13检测平台SHERLOCK以直接检测来自尿液的寨卡病毒，区分多种病原性病毒，并且鉴别临床相关的适应性突变。
新近病毒爆发已经突出了尤其在远离临床实验室的偏远地区诊断病毒感染的重大挑战。病毒诊断在2016年ZIKV爆发期间尤为困难，一部分是由于ZIKV在人样本中维持低滴度并且是短暂感染。由于现有诊断技术的限制，在临床上确认首例病例之前病毒流通数月(Metsky等2017)。举例来说，核酸检测是极灵敏的并且快速适应，但需要大量的样品操作和昂贵的机器。相比之下，基于抗原和基于抗体的测试更快并且需要最少设备，但具有降低的灵敏度和特异性并且可能耗时数月来开发。理想诊断将组合核酸诊断的灵敏度、特异性和灵活性与基于抗原的测试的低成本和速度。此种诊断可以面对新兴的病毒爆发快速地开发和部署并且将适合于实地的疾病监视。
此处，申请者开发了使用基于Cas13的核酸检测平台SHERLOCK(特异性高灵敏度酶促报告子解锁)的病毒诊断(图82A)。RNA导向的核糖核酸酶Cas13可以经由附带裂解使信号扩增>1,000倍，并且基于crRNA:标靶配对提供增强的特异性。Cas13还允许高度适应的病毒诊断平台，这是因为新的病毒病原体或突变可以通过仅仅改变crRNA序列来靶向。使用重组酶聚合酶扩增(RPA)将Cas13a与上游等温扩增配对进一步增加其灵敏度而不需要昂贵的机器。使用这个SHERLOCK平台，申请者检测直接来自体液的病毒，建立病毒板块以区分多个病毒种类和株系，并且开发诊断以鉴别临床相关突变。
申请者首先检查SHERLOCK测定对ZIKV的灵敏度(Gootenberg等2017)，并且确定其对ZIKV cDNA具有单拷贝(1cp)灵敏度(图86)。申请者评估了SHERLOCK对来源于来自2016年ZIKV爆发的样品的一组40个cDNA的性能(图82B、图87)。这包括来自具有ZIKV的患者的37个样品(13个血浆样品、13个血清样品和11个尿液样品)和来自蚊库的3个样品。申请者能够检测来自37个临床样品中的25个(68％)和3个蚊库中的3个(100％)的cDNA中的ZIKV。申请者将用于这40个cDNA样品的SHERLOCK检测与使用含有35个靶位点的两个不同PCR引物库拼贴和扩增整个ZIKV cDNA的复杂得多的扩增子PCR方法相比较(Quick等2017)(图82C)。申请者使用Agilent电泳工作平台定量这些扩增子PCR产物，并且选择临界值用于确定ZIKV的存在或不存在(红色虚线)以使如由基因组序列覆盖率测量的准确度达到最大(图88，关于细节参见方法)。在使用至少一种方法呈阳性的32个样品当中，25个对两种方法呈阳性，符合率78％(参见维恩图)。尽管通过扩增子PCR拼贴全基因组，而且使用相比SHERLOCK(1μl)更大的输入体积用于扩增子PCR(2.5μl)，但两种方法具有同等性能。这些结果展示了SHERLOCK的灵敏度和其成功应用于临床样品。
核酸提取是费时的，需要专业知识，并且常常在实地不可行。申请者因此开发了可以无需提取而从尿液扩增和检测核酸的SHERLOCK方案。申请者使用热和化学还原的组合以使病毒颗粒溶解并灭活在尿液中以≌1μg/ml存在的RNA酶(图89)(Weickmann和Glitz1982)。申请者无需稀释即直接使用这种处理的尿液作为RPA的输入。这种方法能够达成在尿液中稀释的ZIKV cDNA的单拷贝检测(图83A)。如果将ZIKV RNA在非处理的尿液中稀释，那么灵敏度降至3.6fM(1,800cp/μl)，据推测这是归因于RNA酶降解(图83B)。将ZIKV RNA在处理的尿液中稀释允许与水(36aM或18cp/μl，图90)相比同样灵敏的检测。天然地，ZIKVRNA囊封于病毒颗粒中，这保护RNA免于降解。申请者开发了两步热灭活方案，其中首先在低于ZIKV颗粒的熔融温度下加热样品以灭活RNA酶，然后在95℃下加热5分钟以使病毒颗粒溶解并灭活(图91)(Müller等2016)。这能够达成在<2小时内来自20aM(10cp/μl)的感染性颗粒的ZIKV的灵敏检测(图83C)。为在尿液中达到6aM(3cp/μl)的灵敏度，申请者使用3小时检测步骤，总周转时间<4小时(图83C插图)。
许多遗传上和抗原上类似的黄病毒在美洲和非洲内共同流通；因此，申请者通过开发诊断板块以检测相关病毒种类并区别病毒血清型来扩展SHERLOCK。使用实验室中开发的探针设计算法，申请者能看快速鉴别ZIKV、登革病毒(DENV)、西尼罗河病毒(WNV)和黄热病病毒(YFV)内足够保守以充当通用黄病毒RPA引物区的区域。以这种方式，单个RPA引物对可以扩增四种病毒中的任一种，然后种类特异性crRNA可以检测给定的样品中存在哪种或哪些病毒(图84A)。申请者发现通用黄病毒RPA引物和病毒特异性crRNA能够以高度特异性方式以<0.22％的交叉反应性检测合成ZIKV、DENV、WNV和YFV DNA标靶的存在(图84B、图92)。这种测定还可以检测黄病毒的所有成对组合的存在，展示了其检测仿制共感染的能力(图84C、图93)。除了特异性地检测相关病毒以外，申请者设计SHERLOCK板块以使用DENV特异性RPA引物和血清型特异性crRNA区分不同DENV血清型(图84D)。申请者能够以<3.2％的交叉反应性区分DENV血清型1-4(图84E、图94)。SHERLOCK因此可以延伸至检测和区别相关病毒或血清型而无需病毒或血清型特异性RPA引物。
SHERLOCK独特地备用于可实地部署的变体鉴别。单核苷酸多态性(SNP)鉴别通常涉及使用需要大量样品加工并且难以实地部署的测序技术。SHERLOCK通过将SNP置于crRNA的第三个位置处并且将合成错配置于crRNA的第五个位置处可以用于SNP鉴别(图85A)(Gootenberg等2017)。申请者设计SHERLOCK诊断用于来自2016年ZIKV爆发的3种区域特异性SNP(图85B)。申请者验证了这些测定中的每一个对合成标靶和祖先型病毒种子储备液的性能(图85C)。为对样品进行基因分型，申请者采用衍生型crRNA(图85A，深色条形)的荧光与祖先型crRNA(图85A，浅色条形)的荧光的比率。这个比率对于含有SNP的样品应大于1，并且对于不含SNP的样品小于1。申请者对来自洪都拉斯和多米尼加共和国的患者的cDNA样品和来自美国的蚊库测试SNP测定(图85D)。申请者观测到如条形图(图85D)和热图(图85E)中所示的预期荧光比。这些结果突出了SHERLOCK的单核苷酸特异性。
最后，申请者展示SHERLOCK可以快速适应于鉴别新兴的功能性突变。在描述prM(S139N)中造成胎儿小头畸形的ZIKV点突变的报道公布1周内(Yuan等2017)(图95)，申请者设计、预定并成功测试可以区分具有或不具有S139N突变的核酸序列的SHERLOCK诊断(图85F)。申请者测试了替代性crRNA设计(在位置7处无合成错配和SNP)，其也可以区分139S和139N等位基因(图96)。为进一步说明开发新的SHERLOCK诊断用于临床相关突变的简易性，申请者在1周内开发用于HIV逆转录酶中的六个最常观测到的抗药性突变的测定(图97)。这些开发强调了SHERLOCK平台的适应性和特异性。
申请者已经展示病毒SHERLOCK诊断的多种有用特征，包括灵敏度、速度、使用者友好性以及多元化病毒诊断板块的能力和对临床相关SNP进行基因分型的能力。快速周转时间和对样品加工的低需求应能够在不久的将来实现SHERLOCK的实地测试。另外，SHERLOCK诊断应易于开发用于多种病毒性疾病，包括出血热、性传播感染和呼吸道疾患，以及新兴的病毒病原体。
实施例8-方法
临床样品/道德声明.用于本研究的临床样品是来自综合医院dela Plaza de laSalud(圣多明哥，多米尼加共和国)、佛罗里达州卫生部(Florida Department of Health)(塔拉哈西，佛罗里达州)和洪都拉斯国立自治大学(Universidad Nacional Autonoma deHonduras)(特古西加尔巴，洪都拉斯)的机构审查委员会(Institutional Review Board)/伦理审查委员会(Ethics Review Committee)评估和批准的临床研究。麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology，MIT)机构审查委员会/伦理审查委员会和博德研究所的研究课题规划办公室(Office of Research Subject Projection)提供了使用由先前所列机构收集的样品的批准。
LwCas13a和crRNA的产生.如(Gootenberg等2017)所描述纯化LwCas13a。将crRNADNA模板在1x Taq反应缓冲液(NEB)中以10μM的最终浓度粘接至T7启动子寡核苷酸。这涉及在95℃下变性5分钟，继而以每分钟5℃降至4℃进行粘接。使用HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒(NEB)体外转录crRNA。对于短RNA转录物根据制造商的说明书进行转录，其中体积按比例调整至30μl。在37℃下孵育反应物过夜。使用RNAClean XP珠粒(Beckman Coulter)以珠粒与反应物体积的2x比率并且额外补充1.8x异丙醇来纯化转录物。
样品制备.根据制造商的说明书使用具有载体RNA的QIAamp病毒RNA小型试剂盒(QIAGEN)从140μl输入物质中提取病毒RNA。在60μl中洗脱样品，并且储存于-80C下。
为产生cDNA，使用先前公布的方法(Matranga等2014)将5uL提取的RNA转变成单链cDNA。简单地说，用SuperScript III和随机六聚体引物对RNA进行逆转录。然后用RNA酶H使RNA-DNA双链体降解。
单个培养的分离株ZIKV Pernambuco(分离株PE243，KX197192.1)在ZIKV检测实验中用作阳性对照或用作祖先型序列的对照。从种子储备液样品中提取病毒RNA。
通过添加TCEP/EDTA并加热样品进行尿液样品的RNA酶灭活。将TCEP和EDTA分别以100mM和1mM的最终浓度添加至尿液样品中。使用两种方案：在95℃下10分钟的一步灭活，或在50℃下20分钟继之以95℃下5分钟的两步灭活。使用热循环仪(EppendorfMasterCycler)或干热块进行灭活。
RPA反应和引物设计.对于RPA反应，根据制造商的说明书使用Twist-Dx RT-RPA试剂盒。引物浓度是480nM。对于涉及RNA的扩增反应，以每微升2个单位的最终浓度使用鼠类RNA酶抑制剂(NEB M3014L)。
对于ZIKV检测，使用来自新近公布(Gootenberg等2017)的RPA引物RP819/RP821。对于黄病毒板块，使用RPA引物FLAVI-NS5fwd-1/FLAVI-NS5rev-1。对于登革病毒板块，使用RPA引物DENV-3UTRfwd-1/DENV-3UTRrev-1。对于区域特异性寨卡SNP检测，使用RPA引物DOMUSA-5249-fwd/DOMUSA-5249-rev(DOMUSA5249 SNP)、USA-935-fwd/USA-935-rev(USA935 SNP)和HND-2788-fwd/HND-2788-rev(HND2788 SNP)。为检测与小头畸形相关联的寨卡SNP，使用RPA引物ZIKV-mcep-fwd和ZIKV-mcep-rev。为检测HIV逆转录酶中的抗药性SNP，使用RPA引物HIVRT-149F/HIVRT-348R(K65R、K103N和V106M SNP)和HIV-462F/HIVRT-601R(Y181C、M184V和G190A SNP)。
Cas13a检测反应和crRNA设计.如(Gootenberg等2017)所描述进行检测反应，不同之处是使用25ng背景RNA而非100ng。这在不引入报告子寡核苷酸的任何伪裂解的情况下增加反应速率。除非另有指示，否则RNase Alert v2(Thermo)用作报告子。Biotek微板读取器(Synergy H4、Neo2和Cytation 5)用于测量检测反应的荧光。使用单色器以485nm下激发和520nm下发射来监测荧光动力学，每5分钟读取直至3小时。申请者未观测到不同机器之间灵敏度的显著差异。
对于ZIKV检测，使用来自新近公布(Gootenberg等2017)的crRNA“寨卡靶向crRNA2”。对于黄病毒板块，使用crRNA ZIKV-NS5at9227(ZIKV)、DENV-NS5at9127(DENV)、WNV-NS5at9243(WNV)和YFV-NS5at9122(YFV)。对于登革病毒板块，使用crRNA D1-3UTRat10457(DENV1)、D2-3UTRat10433(DENV2)、D3-3UTRat10419(DENV3)和D4-3UTRat10366(DENV4)。对于区域特异性寨卡SNP检测，使用crRNA DOMUSA-5249-祖先型/DOMUSA-5249-衍生型(DOMUSA5249 SNP)、USA-935-祖先型/USA-935-衍生型(USA935 SNP)和HND-2788-祖先型/HND-2788-衍生型(HND2788 SNP)。为检测与小头畸形相关联的寨卡SNP，使用crRNA ZIKV-mcep-snp3syn5-祖先型/ZIKV-mcep-snp3syn5-衍生型(图85F中所示的设计)和crRNAZIKV-mcep-snp7-祖先型/ZIKV-mcep-snp7-衍生型(图96中所示的设计)。为检测HIV逆转录酶中的抗药性SNP，使用crRNA HIVRT-K65R-祖先型/HIVRT-K65R-衍生型(K65R SNP)、crRNAHIVRT-K103N-祖先型/HIVRT-K103N-衍生型(K103N SNP)、crRNA HIVRT-V016M-祖先型/HIVRT-V106M-衍生型(V106M SNP)、crRNA HIVRT-Y181C-祖先型/HIVRT-Y181C-衍生型(Y181C SNP)、crRNA HIVRT-M184V-祖先型/HIVRT-M184V-衍生型(M184V SNP)和crRNAHIVRT-G190A-祖先型/HIVRT-G190A-衍生型(G190A SNP)。
数据分析.通过扣除10分钟(图82-84)或20分钟(图85)后的荧光值进行背景校正，此时观测到最小荧光。对于黄病毒板块与登革病毒板块，将背景校正荧光标准化为标靶特异性荧光。标靶特异性荧光是在每个时间点处将具有给定crRNA的无输入(水)对照的平均背景校正荧光从具有相同crRNA的给定DNA标靶的背景校正荧光扣除。
对于来自2016年爆发的ZIKV样品的分析(图82)，临界值用于确定ZIKV的存在或不存在。使用来自以下5个样品的背景扣除荧光确定SHERLOCK荧光临界值：4个单供体健康人尿液样品和1个无输入水对照。也就是说，对于这5个中的每个样品s，申请者采用跨越3个技术性重复的荧光的平均值ms和标准偏差σs。将临界值设定为5个值的中值{ms+3σs}。使用来自基因组组装的信息确定关于扩增子PCR产量的临界值。首先，通过采用来自两个扩增子PCR库中的每一个的最小浓度对每个样品计算扩增子PCR产量(图87A)。然后目标是确定最佳预测样品中是否存在基因组的特定靶向部分r的产量(在这种情况下，对于RPA扩增子，申请者用SHERLOCK进行检测)。样品s中存在r的概率Prs(r)可以估算为从s的cDNA测序和组装的ZIKV基因组的分数。(计算跨基因组的概率优选地简化了查看在基因组中r处是否存在覆盖，这是因为覆盖的缺乏不一定指示r不存在。)这个分析的数据是来自ZIKV爆发的新近基因组测序研究的个别技术性重复(Metsky等2017)。扩增子PCR产量对所覆盖的基因组分数的图在图87B中示出。值Prs(r)可以用于估算对于临界值选择的精确率和召回率。特别地，不具有r的样品数的估算是跨越所有样品的Prs(r)的和。类似地，在扩增子PCR产量超过给定临界值的样品P当中，正确标记为r存在的数目被估算为跨越P中的样品的Prs(r)的和。图87C示出了对于临界值的每个选择的精确率和召回率，以及F0.5得分，这是考虑到临界值将样品准确归类为具有ZIKV的靶向部分的能力的复合度量。设定扩增子PCR产量临界值以使F0.5得分达到最大。
对于SNP鉴别，使用祖先型靶向和衍生型靶向crRNA计算背景扣除荧光值。申请者采用衍生型背景扣除荧光与祖先型背景扣除荧光的比率以确定SNP的存在或不存在。对于HIV SNP(图97)，申请者计算SNP鉴别指数，这是衍生型等位基因的荧光比除以祖先型等位基因的荧光比的比率。如果两个等位基因之间不存在辨别能力，那么SNP鉴别指数等于1，并且随着两个等位基因之间的荧光比分歧而增加。
ZIKV检测实验.以6.8x104cp/ul的储备液浓度使用PE243种子储备液cDNA。将cDNA在超纯水(Life Technologies)或健康尿液(Lee Biosolutions)中以1:10连续稀释。使4-8μl每个样品灭活，并且1-2μl用作RPA反应的输入。以2.72x105cp/ul使用PE243种子储备液RNA。将RNA在超纯水(Life Technologies)或健康尿液(Lee Biosolutions)中以1:10连续稀释。使4-8μl每个样品灭活，并且1-2μl用作RPA反应的输入。
培养的分离株，株系PRVABC59(KU501215)，用于病毒颗粒实验。在昆虫和非人灵长类动物细胞系中培养PRVABC59，并且原始储备液购自ATCC(ATCC VR-1843)。
病毒板块实验.对于黄病毒板块与登革病毒板块，合成衍生的DNA模板以104个拷贝/微升的浓度用作输入。无输入(水)对照用作所测试的每个crRNA的阴性对照。在所有实验中，RPA反应中的MgAc浓度增至20mM并且使用三个技术性重复。
对于黄病毒板块，ZIKV模板序列来源于(KX197192)、DENV(NC_001477.1)、WNV(NC_09942.1)和YFV(AY968065.1)。RPA反应扩增这些黄病毒的NS5的一部分。
对于登革病毒板块，DENV1模板序列来源于(KM204119.1)、DENV2(KM204118.1)、DENV3(KU050695.1)、DENV4(JQ822247.1)。RPA反应扩增DENV1-4的3'UTR区的一部分。
SNP鉴别实验.对于区域特异性SNP鉴别，含有具有祖先型或衍生型等位基因的ZIKV基因组的400-nt片段的合成模板用于验证SNP鉴别测定的性能。另外，来自3个国家(美国、洪都拉斯和多米尼加共和国)的ZIKV cDNA样品用于确认对蚊库和临床样品的性能。PE243种子储备液cDNA(KX197192.1)以300cp/μl用作组外对照。另外，使用无输入(水)对照。对于小头畸形相关的SNP鉴别实验，以104cp/μl使用含有具有祖先型或衍生型等位基因的ZIKV基因组的400-nt片段的合成模板，并且以300cp/μl使用PE243种子储备液cDNA。对于HIV抗药性SNP鉴别实验，以104cp/μl使用含有具有祖先型或衍生型等位基因的HIV基因组的468-nt片段的合成模板。在所有SNP鉴别实验中，使用3个技术性重复。
实施例9-可编程的基于Cas13的抗病毒治疗剂和伴随诊断
传染病威胁我们的健康和安全，而黄金标准诊断和治疗具有有限的有效性并且基于几十年历史的科学和系统。绝大多数传染病得不到诊断和治疗，并且爆发耗时过长来诊断。已经批准基于核酸的诊断用于仅十一种病毒，并且只有九种病毒性疾病可以用FDA批准的抗病毒疗法来解决(De Clercq和Li,2016)。这意味着我们可以诊断和治疗少于10％的已知感染人的病毒病原体(Hulo等,2011)。此外，病毒可以快速演变出对疗法的抗性，限制了我们的现有抗病毒储库的功效。迫切需要开发可以在全世界任何地方快速和准确诊断感染性疾患，鉴别和追踪已知的与新的感染性威胁，并且开发可以通过诊断而告知的抗病毒治疗的新工具。
申请者最近发现了CRISPR-Cas13系统，其可以支持特异性RNA序列检测和裂解，并且已经展示其用于传染病的潜在应用(Abudayyeh等,2016；Gootenberg等,2017)。Cas13是RNA导向的RNA靶向CRISPR效应物，其对RNA标靶识别，例如病原体核酸展现核糖核酸酶活性。通过对直接靶向病毒RNA的CRISPR-Cas13系统进行编程，申请者可以开发高度多元化抗病毒疗法以及病毒诊断。CRISPR-Cas13系统因此准备应用于RNA病毒并且可以是qPCR诊断和shRNA治疗的更有特异性的替代品。
此处，申请者提供了新的方法来解决诊断和治疗具有病毒感染的患者中所描述的不足。申请者将使用基于Cas13的系统以开发可编程的疗法来抗衡病毒威胁并防止抗药性的演变。另外，申请者将建立快速、灵敏和低成本的伴随诊断以鉴别特异性病原体序列，包括特异性多态性(例如抗药性突变)。这将展示强有力的适应性策略来抑制病毒复制并且将突出Cas13对于开发新的诊断和治疗应用的重要性。更广泛地，类似方法可以将基于Cas13的系统定位成新的前线工具以快速鉴别鉴别感染剂并治疗患者。
不存在用于最新兴病毒的抗病毒药物，并且包括小分子、短干扰RNA和抗体的可用的直接作用抗病毒剂通常靶向少数可高度突变的病毒蛋白质或RNA。这是成问题的，因为RNA病毒快速演变，并且可以容易地获得对现有治疗剂的抗性。基于Cas13的系统提供高度多元化、可编程的抗病毒疗法，其直接靶向病毒RNA，并且可以灵活适应于靶向新颖病毒或新兴爆发的病原体。在现有抗病毒化合物存在的情况下，基于Cas13的疗法可以与此类化合物组合用于病毒，从而降低特异性抗药性突变的流行率。可能最重要地，如果病毒演变出对特异性Cas13向导RNA序列的抗性，那么容易转换成不同向导RNA序列，或设计新向导序列以靶向新突变。此类方法应防止对基于Cas13的疗法的抗性广泛发展并且解决当前抗病毒疗法所面临的共同挑战。
当前黄金标准病原体诊断常常是昂贵的、缓慢的，并且缺乏足以检测病毒感染的灵敏度。标准分子扩增方法，例如RT-qPCR，通常需要核酸提取和昂贵的热循环机器。免疫测定，例如ELISA，仅可以检测单个标靶，与抗原上类似的标靶相互作用，并且无法快速开发或更新以处理新的或演变中的威胁。新颖的基于CRISPR的平台(SHERLOCK)可以转换具有单分子检测灵敏度和单核苷酸多态性特异性的病毒性疾病的诊断(Gootenberg等,2017)。申请者可以使SHERLOCK适应于用作伴随诊断以告知基于Cas13的疗法。为此，申请者可以通过使技术适应于直接代替纯化的核酸使用临床样品作为输入在高性能下使周转时间减至<1小时。此外，申请者将开发特异性的基于Cas13的诊断，其将鉴别已知或预测的疗法抗性突变。这些特征将允许基于Cas13的诊断来补充治疗性用途。
用于开发治疗剂的基于Cas13的系统可能出现如对于Cas9已经注意到的潜在脱靶效应的问题。Cas9的许多应用涉及其在DNA中作出编辑，然后编码永久性和遗传性变化的能力。相比之下，Cas13由于其靶向RNA而具有不同应用，并且向导引导的变化不是遗传性的。即使Cas13引导的变化不是遗传性的，Cas13仍然可以用于调控、检测细胞内部或外部的RNA分子或使所述分子成像，展现了其作为用于研究病毒性疾病的工具的实力。
申请者将开发一组Cas13直系同源物和相应的向导RNA序列，其有效抑制以下两种哺乳动物病毒的复制：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和流感。另外，申请者将进行中试实验以测试用于Cas13的递送方法，筛选Cas13的脱靶活性，并且研究对Cas13疗法作出反应的病毒演变和向导抗性。申请者将开发改善的用于快速周转时间的诊断方案，用于检测流感和区别甲型、乙型和丙型流感的测定设计，以及用于无仪器诊断的侧流测定。
SHERLOCK诊断平台具有将传染病测试革新为快速、广谱、可实地部署的诊断的潜力。其技术进步和商业化潜力的评估将框定在现有的常用诊断方法，例如免疫测定和核酸扩增策略的情形内。因此，在开发阶段，我们将评估其性能度量，包括灵敏度和特异性、得出结果的时间、每个反应的成本、温度稳定性、外源设备需求以及使用和解释的简易性。初步结果表明SHERLOCK与现有FDA批准的病原体诊断方法相比是有利的。
存在五个与这种方法相关的关键技术挑战：个别向导RNA的功效、向导抗性的演变、脱靶核酸酶活性、靶向流感复制的简易性和基于Cas13的伴随诊断的灵敏度。
第一个技术挑战是确保由个别向导RNA靶向病毒基因组的高功效。不同于以由启动子强度确定的特定速率从基因组产生的信使RNA，病毒基因组以指数方式复制。为适当抑制病毒复制，Cas13介导的裂解活性必须超过新的病毒基因组的合成速率。申请者可以应用以下两种方法以减轻这种风险并且确保高度有效的基因组裂解：筛选Cas13直系同源物以发现具有较高核酸酶活性的直系同源物，和筛选病毒基因组以发现最佳向导序列。这些结果可以组合得到甚至更高的靶向效率。通过优化Cas13直系同源物的核酸酶活性和筛选最佳向导序列，申请者计划达成至少10倍的病毒复制降低。通过同时组合多个向导，申请者计划达成至少20倍的病毒复制降低。
第二个技术挑战是病毒可能演变出对向导靶向的抗性。这可能通过靶位点中的直接突变或经由基因组的其它部分中补偿标靶裂解效应的突变而发生。RNA病毒已知具有每代每个碱基约10-4个取代的相对高的突变率(Sanjuan等,2010)。在给出向导RNA通常靶向病毒基因组的28个核苷酸的区域下，这意味着标靶区中单突变的概率为约3x10-3。申请者从Cas13的先前表征获知需要标靶区中的两个突变以防止标靶裂解(Abudayyeh等,2016)。假设两个突变独立地发生，那么在单个区域中出现的向导抗性的概率为约10-5。这些计算说明了向导汇集的重要性，这是因为向导库应以乘法方式进一步降低抗性演变的概率(例如对于2个向导：10-10，对于3个向导：10-15)。除了向导汇集以外，申请者将通过在基于Cas13的疗法之前和之后对病毒群体进行测序以绘制疗法抗性的演变(如果存在的话)来专门解决这一挑战。
第三个技术挑战是由Cas13引起的脱靶核酸酶活性。脱靶核酸酶活性是成问题的，这是因为其可能在动物模型中或患者中诱发副作用。然而，重要的是区分由Cas13和Cas9引起的脱靶裂解的相对效应。因为Cas9靶向DNA，所以任何脱靶裂解事件将导致受影响细胞的基因组的永久改变。然而，Cas13靶向RNA并且因此脱靶裂解将对基因表达仅具有短暂效应，这是因为信使RNA的半衰期趋向于小于24小时(Yang等,2003)。尽管在Cas13与Cas9之间有这种对比，申请者可以在存在和不存在Cas13裂解的情况下对细胞的转录组进行测序以测量Cas13的任何脱靶裂解活性。具体地说，申请者将通过测序来比较Cas13向导与靶向荧光素酶转录物的siRNA之间的脱靶效应。如果脱靶效应是向导特异性的，那么申请者还将评价最佳靶向向导的脱靶效应。申请者预期Cas13具有比siRNA至少低2倍的脱靶裂解活性。
第四个技术挑战是靶向甲型流感的能力。与LCMV成对比，甲型流感在受感染细胞的细胞核中复制其基因组，并且基因组与甲型流感蛋白复合形成核糖核蛋白(RNP)(Knipe和Howley,2007)。申请者可以经由使用来源于先前公布的shRNA的数个向导的中试实验来优化甲型流感的靶向(Wang等,2017；Huang等,2017；Stoppani等,2015；Xu等,2015；Wang等,2016；McMillen等,2016)，随后继续进行综合全基因组筛选。具体地说，申请者可以优化Cas13的定位(细胞核对细胞溶质)并且辨别设计向导以靶向正义mRNA是否是更有效的策略，因为这种RNA种类不含RNP并且可能因此更易于靶向。如果那些策略未达成目标靶向效率，那么申请者可以将Cas13与另一种蛋白质融合以使这些RNP不稳定，这类似于经由形成融合蛋白改变Cas9功能的策略(Dominguez等,2016)。当前用于流感的核酸靶向策略已经包括siRNA，这据报道在细胞培养模型中展现流感复制的80％-95％降低或至少5倍减少(Huang等,2017；Xu等,2015)。申请者使用靶向流感的单向导或多向导可以达成类似或增加水平的病毒复制减少，具体地>5倍。
最后的技术挑战是基于Cas13的伴随诊断的灵敏度。这对于确保病毒在患者中变得普遍存在之前可以检测到这种病毒是重要的。这在疗法抗性突变的情形中尤其相关，所述突变最初在低频率下难以检测，但在高频率下检测容易得多。不幸的是，直到疗法抗性突变在患者中达到高频率的时间，已经造成损伤。更灵敏的、快速的基于Cas13的诊断将能够实现更快检测。出于这些原因，申请者对于基于Cas13的流感诊断已经设定了极其严格的临界值50aM(每微升25个拷贝)。这个临界值远低于鼻拭子中的中值甲型流感滴度，其为每微升104个RNA拷贝(Ngaosuwankul等，2010)。
参考文献
Abudayyeh，O.O.，Gootenberg，J.S.，Konermann，S.，Joung，J.，Slaymaker，I.M.，Cox，D.B.T.，Shmakov，S.，Makarova，K.S.，Semenova，E.，Minakhin，L.，et al.(2016).C2c2is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPReffector.Science 353，aaf5573.
Andersen，K.G.，Shapiro，B.J.，Matranga，C.B.，Sealfon，R.，Lin，A.E.，Moses，L.M.，Folarin，O.A.，Goba，A.，Odia，I.，Ehiane，P.E.，et al.(2015).ClinicalSequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus.Cell 162，738-750.
Cong，L.，Ran，F.A.，Cox，D.，Lin，S.，Barretto，R.，Habib，N.，Hsu，P.D.，Wu，X.，Jiang，W.，Marraffini，L.A.，et al.(2013).Multiplex genome engineering usingCRISPR/Cas systems.Science 339，819-823.
De Clercq，E.，and Li，G.(2016).Approved Antiviral Drugs over the Past50 Years.Clin.Microbiol.Rev.29，695-747.
Dominguez，A.A.，Lim，W.A.，and Qi，L.S.(2016).Beyond editing：repurposingCRISPR-Cas9 for precision genome regulation andinterrogation.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.17，5-15.
Gire，S.K.，Goba，A.，Andersen，K.G.，Sealfon，R.S.G.，Park，D.J.，Kanneh，L.，Jalloh，S.，Momoh，M.，Fullah，M.，Dudas，G.，et al.(2014).Genomic surveillanceelucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014outbreak.Science 345，1369-1372.
Gootenberg，J.S.，Abudayyeh，O.O.，Lee，J.W.，Essletzbichler，P.，Dy，A.J.，Joung，J.，Verdine，V.，Donghia，N.，Daringer，N.M.，Freije，C.A.，et al.(2017).Nucleicacid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.Science 356，438-442.
Huang，D.T.-N.，Lu，C.-Y.，Shao，P.-L.，Chang，L.-Y.，Wang，J.-Y.，Chang，Y.-H.，Lai，M.-J.，Chi，Y.-H.，and Huang，L.-M.(2017).In vivo inhibition of influenza Avirus replication by RNA interference targeting the PB2 subunit viaintratracheal delivery.PLoS One 12，e0174523.
Hulo，C.，de Castro，E.，Masson，P.，Bougueleret，L.，Bairoch，A.，Xenarios，I.，and Le Mercier，P.(2011).ViralZone：a knowledge resource to understand virusdiversity.Nucleic Acids Res.39，D576-D582.
Knipe，D.M.，and Howley，P.M.(2007).Fields’Virology(Lippincott Williams&Wilkins).
McMillen，C.M.，Beezhold，D.H.，Blachere，F.M.，Othumpangat，S.，Kashon，M.L.，and Noti，J.D.(2016)，Inhibition of influenza A virus matrix and nonstructuralgene expression using RNA interference.Virology 497，171-184.
Metsky，H.C.，Matranga，C.B.，Wohl，S.，Schaffner，S.F.，Freije，C.A.，Winnicki，S.M.，West，K.，Qu，J.，Baniecki，M.L.，Gladden-Young，A.，et al.(2017).Zikavirus evolution and spread in the Americas，Nature 546，411-415.
Ngaosuwankul，N.，Noisumdaeng，P.，Komolsiri，P.，Pooruk，P.，Chokephaibulkit，K.，Chotpitayasunondh，T.，Sangsajja，C.，Chuchottaworn，C.，Farrar，J.，and Puthavathana，P.(2010).Influenza A viral loads in respiratory samplescollected from patients infected with pandemic H1N1，seasonal H1N1 and H3N2viruses.Virol.J.7，75.
Ngo，N.，Cubitt，B.，Iwasaki，M.，and de la Torre，J.C.(2015).Identificationand Mechanism of Action of a Novel Small-Molecule Inhibitor of ArensvirusMultiplication.J.Virol.89，10924-10933.
Park，D.J.，Dudas，G.，Wohl，S.，Goba，A.，Whitmer，S.L.M.，Andersen，K.G.，Sealfon，R.S.，Ladner，J.T.，Kugelman，J.R.，Matranga，C.B.，et al.(2015).Ebola VirusEpidemiology，Transmission，and Evolution during Seven Months in SierraLeone.Cell 161，1516-1526.
Sanjuan，R.，Nebot，M.R.，Chirico，N.，Mansky，L.M.，and Belshaw，R.(2010).Viral Mutation Rates.J.Virol.84，9733-9748.
Stoppani，E.，Bassi，I.，Dotti，S.，Lizier，M.，Ferrari，M.，and Lucchini，F.(2015).Expression of a single siRNA against a conserved region of NP genestrongly inhibits in vitro replication of different Influenza A virus strainsof avian and swine origin.Antiviral Res.120，16-22.
Sullivan，B.M.，Emonet，S.F.，Welch，M.J.，Lee，A.M.，Campbell，K.P.，de laTorre，J.C.，and Oldstone，M.B.(2011).Point mutation in the glycoprotein oflymphocytic choriomeningitis virus is necessary for receptor binding，dendritic cell infection，and long-term persistence.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1008，2969-2974.
Wang，R.，Zhang，Y.-Y.，Lu，J.-S.，Xia，B.-H.，Yang，Z.-X.，Zhu，X.-D.，Zhou，X.-W.，and Huang，P.-T.(2017).The highly pathogenic H5N1 influenza A virus down-regulated several cellular MicroRNAs which target viralgenome.J.Cell.Mol.Med.
Wang，S.，Chen，C.，Yang，Z.，Chi，X.，Zhang，J.，and Chen，J.-L.(2016).Targeteddisruption of influenza A virus hemagglutinin in genetically modified micereduces viral replication and improves disease outcome.Sci.Rep.6，23746.
Xu，F.，Zhou，Y.，Liu，Q.，and Liu，G.(2015).RNA interference of influenza Avirus replication by microRNA-adapted lentiviral loop short hairpinRNA.J.Gen.Virol.96，2971-2981.
Yang，E.，van Nimwegen，E.，Zavolan，M.，Rajewsky，N.，Schroeder，M.，Magnasco，M.，and Darnell，J.E.，Jr(2003).Decay rates of human mRNAs：correlation withfunctional characteristics and sequence attributes.Genome Res.13，1863-1872.
实施例10-改善的用于病毒性腹泻疾患的Cas13a/C2c2诊断
腹泻病造成每年超过五十万例死亡，大多数是发展中国家的儿童(Walker CL,Rudan I,Liu L等,Global burden of childhood pneumonia and diarrhoea.Lancet2013；381:1405-16)。在这些疾病当中，轮状病毒是死亡率的主要原因，并且如诺如病毒的其它病毒引起全世界的严重爆发。这些感染常常得不到诊断，或误诊为细菌，导致用抗生素不当治疗，使患者症状恶化并且促进抗生素抗性。为解决这个可怕的公共卫生挑战，极大地需要快速、便宜和灵敏的测试用于病毒性腹泻病的诊断。
申请者可以使用最近发现的RNA导向的RNA靶向核酸酶Cas13a/C2c2以建立腹泻疾患诊断。诊断是治疗患者至关重要的第一步，这是因为其允许医师区分细菌感染与病毒感染，从而影响治疗方案。CRISPR-Dx平台，称为SHERLOCK(特异性高灵敏度酶促报告子解锁)是不依赖于冷链和便携的用于核酸检测的灵敏和特异性工具。
使用病毒性腹泻疾患作为模型，申请者可以基于SHERLOCK技术建立快速、可实地应用的诊断方法。在许多临床设置中，其耗时超过48小时来诊断病毒性疾病-如果诊断甚至是可能的话。在对SHERLOCK有少许关键技术性增强的情况下，包括使总测定时间缩短至一小时并且从基于荧光的读出转移至比色输出，申请者可以建立可以使用简单的热块运作并且由临床工作者视觉上分析的测试。这将避免了将样品运送至集中测试实验室的需要，这是昂贵的、耗时的并且可以导致样品降解。此类延迟在地方性或季节性疾病爆发期间是尤其危急的，在此期间快速公共卫生反应可以防止新兴感染剂进一步扩散。
存在约22种感染人并引起疾病的已知病毒科，并且这个数目归因于持续人口扩张而日益增加(Woolhouse ME,Howey R,Gaunt E,Reilly L,Chase-Topping M,SavillN.Temporal trends in the discovery of human viruses.Proc Biol Sci 2008；275:2111-5)。许多这些疾病缺乏足够的诊断，这是患者治疗至关重要的第一步。如RT-qPC R和ELISA的当前黄金标准诊断需要专用设备、冷链、耗时，并且具有高额开销。基于抗原的快速诊断已经证实对于开发来说具有挑战性。归因于这些限制，极大需要可以用于在低收入设置中和爆发期间用于检测特异性病毒病原体的快速、便宜和灵敏的诊断工具。申请者可以开发并改善用于腹泻病的病毒诊断，所述腹泻病是儿童死亡率的主要原因之一。新的CRISPR-Cas13a/C2c2系统具有快速识别并裂解来源于DNA或RNA的特异性RNA序列的能力(Abudayyeh OO,Gootenberg JS,Konermann S等,C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.Science 2016；353:aaf5573)，使其成为用于病毒诊断的最佳系统。此外，其特别适用于爆发，这是因为可以在数天之内设计和部署新的测试。
在给出SHERLOCK的高灵敏度和成功应用于其它传染病下，这个检测平台是用于改善定点护理诊断并开发用于腹泻病毒病原体的快速、可实地部署和多元化测试的理想候选物。这种方法将改善严重疾病的诊断，改善患者护理，并且减少抗生素的不当使用。
现有诊断方法的主要限制因素之一是患者检查与实验室结果之间的滞后时间。对于如轮状病毒和诺如病毒的病毒，此类延迟可以具有致命影响。通过增加Cas13a/C2c2检测反应的速率并开发不需要核酸提取的检测方案，可以达成“实时”诊断。申请者从样品收集至得出结果的周转时间可以小于一小时。
通常所用的核酸检测测试，如RT-qPCR，归因于宿主材料(血清、尿液、粪便)中的PCR抑制剂需要在扩增之前提取。这是重大的限制，因为提取是耗时的并且需要专业技术人员。因此，样品通常在集中的实验室中处理，并且不会立即加工。由SHERLOCK使用的等温扩增方法不受宿主材料抑制，从而允许样品制备方案直接从尿液和粪便扩增用于实地快速病毒检测。
申请者将经由序列设计并且通过改变检测反应的组成来优化扩增速度。先前的工作已经展示等温扩增引物具有不同性能，因此申请者将筛选至少十种引物对以鉴别具有改善性能的那些。申请者将以类似方式优化向导序列，这是因为已经显示Cas13a/C2c2优先裂解特定序列基序。申请者还将优化T7聚合酶浓度、rNTP浓度、背景RNA浓度和镁浓度以进一步提高检测速度。检测反应的当前迭代通常耗时超过2小时来达成灵敏核酸检测，但在优化下可以减至小于一小时并且可能低至三十分钟。
开发用于目视病原体检测的比色读出
对临床诊断的最大限制因素之一是在全世界许多临床设置中稳固的基础设施的缺乏。当前诊断常常需要昂贵的机器和高水平的技术培训，而在许多诊所中基本的基础设施(如电力)都成问题。通过将当前Cas13a/C2c2检测从荧光输出转移至目视颜色变化，申请者可以建立使用者友好的诊断，其可以由任何卫生保健工作者进行而不需要昂贵和耗能的机器。
申请者可以使用以下两种不同方法用于比色检测：从无色底物产生有色产物的酶促报告子(例如lacZ、过氧化物酶、β葡糖苷酸酶)；以及由单链RNA连接的金纳米颗粒簇，这可以通过使纳米颗粒群体解聚并且当纳米颗粒溶解于溶液中时引起颜色偏移来使核酸酶活性直接转变成颜色变化。申请者将仔细评估这两种方法的性能，尤其作为纸上的读出，这是因为其在确定颜色变化的速度和简易性方面有所权衡。表现最佳的方法将使用临床样品测试以进一步验证其报告特异性核酸序列存在的能力。
开发用于腹泻疾患的病毒病原体多元诊断
引起腹泻的病毒，包括轮状病毒、诺如病毒、诺瓦克病毒、巨细胞病毒和病毒性肝炎，常常得不到诊断。这些病毒感染导致高死亡率和发病率并且常常因药物，例如抗生素而加重。申请者可以开发多元诊断，其可以确定腹泻感染是否是病毒性的以帮助告知患者护理，快速检测病毒爆发，并且减少不需要的抗生素使用。
来自粪便、尿液和血液以及病毒种子储备液的临床样品将用于针对每种病原体开发SHERLOCK。申请者将使用多个序列比对以说明结合区内的核苷酸多样性来设计引物对和向导。病毒RNA将经历重组酶聚合酶扩增(RPA)反应，将添加T7 RNA聚合酶以使扩增的DNA转录成RNA，并且申请者将所得RNA添加至由Cas13a和淬灭的荧光报告子组成的新反应混合物中并且添加基于比色的系统用于评估。
实施例11-使用HUDSON方案用于直接来自体液的病毒检测
为使SHERLOCK在任何情形中都擅长于病毒检测，其应与在目视读出下能够从患者样品直接检测的方法配对。我们测试了用于ZIKV和DENV检测的SHERLOCK对患者样品的性能并且开发HUDSON(对未提取的诊断样品进行加热来消除核酸酶(Heating UnextractedDiagnostic Samples to Obliterate Nucleases))，一种能够在比色读出下对直接来自体液的ZIKV和DENV进行快速灵敏检测的方法，最近作为SHERLOCKv2的一部分示出(Gootenberg等Science doi:10.1126/science.aaq0179；2018)。另外，我们设计了SHERLOCK测定以区分多个病毒种类和株系并且鉴别临床相关突变。
患者样品中ZIKV和DENV的检测提供了SHERLOCK的灵敏度和其对病毒多样性的耐受性的严格测试。我们的ZIKV SHERLOCK测定当对种子储备液cDNA进行测试时具有单拷贝(1cp/μl)灵敏度(图98)。我们对来源于在2015-2016年ZIKV流行期间收集的样品的40个cDNA评估其性能：37个来自疑似具有ZIKV感染的患者样品并且3个来自蚊库(图87、99B和表24)。对于来自这些患者的16个样品，我们通过将SHERLOCK的灵敏度和特异性与包括可商购的Altona Realstar寨卡病毒RT-PCR测定的其它核酸扩增测试相比较来为SHERLOCK定基准(图82C、88A-C、99C、100、101、表25，并且参见论述)。在通过Altona测定测试呈阳性的10个样品当中，全部10个都通过SHERLOCK检测(100％灵敏度)；其它6个样品通过两种测定呈阴性(100％特异性、100％符合率)。我们的ZIKV测定当对健康尿液和水进行测试时不具有假阳性(图99B)。我们然后验证了SHERLOCK检测DENV的能力，所述DENV是具有与ZIKV感染类似的症状的相关但更多样性的黄病毒。所有24个RT-PCR阳性DENV RNA样品在检测1小时后都确认DENV阳性(图99D、102、103和表26)。SHERLOCK灵敏地和特异性地检测从ZIKV和DENV患者样品中提取的病毒核酸。
表24
Figure BDA0002275597970002451
Figure BDA0002275597970002461
Figure BDA0002275597970002471
Figure BDA0002275597970002481
表25
Figure BDA0002275597970002491
表26
Figure BDA0002275597970002501
Figure BDA0002275597970002511
Figure BDA0002275597970002521
尽管SHERLOCK擅长于检测经过提取的核酸，但可实地部署的快速诊断测试不应需要提取步骤来检测体液中的病毒核酸。许多病毒从尿液或唾液中脱出，包括ZIKV和DENV，并且取样不是侵入性的(Paz-Bailey等N.Engl.J.Med doi:10.1056/NEJMoa1613108(2017)；Andries等PLoS Negl.Trop.Dis.9,e0004100(2015))。为经由SHERLOCK检测直接来自体液的病毒核酸，我们开发了HUDSON，一种使用热和化学还原使病毒颗粒溶解并灭活在体液中发现的高水平的RNA酶的方法(图104A和89)(Weickmann等J.Biol.Chem.257:8705-8710(1982))。可以将HUDSON处理的尿液或唾液在无需稀释或纯化下直接添加至RPA反应中(将血液产物以1:3稀释以避免在加热期间凝固)，而不会抑制后续扩增或检测。HUDSON和SHERLOCK能够达成外加至尿液、全血、血浆、血清或唾液中的游离ZIKV核酸的灵敏检测(图83A、83B、90A、105和106)。为模拟临床感染，在病毒核酸囊封于感染性颗粒的情况下，我们将感染性ZIKV颗粒外加至体液中。HUDSON与SHERLOCK组合(图91和107)允许来自全血(图108)或血清(图104B)中90aM(45cp/μl)、唾液(图104C)中0.9aM(约1cp/μl)和尿液中20aM(10cp/μl)的感染性颗粒的ZIKV RNA的灵敏检测。在荧光和比色读出下(图104D和114)，总周转时间<2小时。HUDSON和SHERLOCK的灵敏度与患者样品中所观测的在1-1,000cp/μl范围内的ZIKV RNA浓度是可比的(Faye等J.Clin.Virol.43:96-101(2008)；Paz-Bailey等N.Engl.J.Med.Doi:10.1056/NEJMoa1613108(2017))。HUDSON与泛DENV SHERLOCK测定配对，检测全血、血清和唾液中的DENV(图109和110)。直接从8个患者血清样品中的8个(图104E)和所测试的3个患者唾液样品中的3个(图104F)检测DENV，唾液的总周转时间<1小时，但病毒滴度低于血清(Andries等PLoS Negl.Trop.Dis.9,e0004100(2015))。我们在比色读出下使用侧流条带直接检测DENV(图104G)，展现了可以使用最少设备检测直接来自体液的ZIKV或DENV的HUDSON至SHERLOCK的流水线。
因为许多遗传上和抗原上类似的黄病毒共同流通并且具有类似症状，所以我们开发了诊断板块以区分相关病毒种类和血清型。我们鉴别ZIKV、DENV、西尼罗河病毒(WNV)和黄热病病毒(YFV)基因组内的保守区并且设计了使用可以扩增4种病毒中的任一种的通用黄病毒RPA引物和种类特异性crRNA的黄病毒板块(图84A)。这个板块在<0.22％脱靶荧光下检测合成ZIKV、DENV、WNV和YFV DNA标靶(图84B、92，并且参见方法)，并且鉴别这4种病毒的所有成对组合的存在，展示了检测仿制共感染的能力(图84B、84C和93)。我们还设计了使用DENV特异性RPA引物和血清型特异性crRNA的板块(图84D)，其可以在<3.2％脱靶荧光下区分DENV血清型1-4(图84D、79C和94)。这种低水平的脱靶荧光允许以100％特异性区别血清型，提供了当前血清型鉴别方法的替代品(Waggoner等J.Clin.Microbiol.51:3418-3420(2013))。DENV板块确认12个RT-PCR血清分型的患者样品或临床分离株的血清型(图84D和111)，并且鉴别2个具有混合感染的临床分离株，混合感染是通常观测到的现象(Requena-Castro等Mem.Inst.Oswaldo Cruz.112:520-522(2017))。SHERLOCK因此可以延伸至使用单个扩增反应区别相关病毒或血清型。
SHERLOCK独特地备用于可实地部署的变体鉴别，这将允许实时追踪微生物威胁。单核苷酸多态性(SNP)的基因分型通常涉及PCR和基于荧光或基于质谱法的检测，这需要大量的样品加工、昂贵的设备并且限制可实地部署性(Kim等Annu.Rev.Biomed.Eng.9:289-320(2007))。SHERLOCK可以通过将合成错配置于crRNA中的SNP附近，用祖先型特异性和衍生型特异性crRNA测试每个标靶来鉴别SNP(图112A)(Gootenberg等Science 356:438-442(2017))。我们设计了用于来自2015-2016年ZIKV流行的3种区域特异性SNP的诊断(图112B)并且鉴别来自洪都拉斯、多米尼加共和国和美国的合成标靶、病毒种子储备液和cDNA样品中的这些SNP(图112C-E)。这些结果展示SHERLOCK可以鉴别来自ZIKV流行的样品中的SNP并且突出了SHERLOCK的单核苷酸特异性。
对于例如ZIKV和HIV的病毒的新兴抗药性和其它临床相关突变的快速鉴别将具有极大效用。最近与胎儿小头畸形相关联的在PrM区域中的ZIKV点突变(S139N)用作测试案例以用于快速开发变体鉴别的测定(Yuan等Science eaam7120(2017))。在报告公布一周内(图112F和113)，我们开发了多个用于S139N突变的SHERLOCK测定(图96和112G)，并且可以在目视读出下鉴别来自2015-2016年ZIKV流行的患者样品中的突变(图112H)。为进一步说明开发用于许多临床相关突变的SHERLOCK诊断的简易性，我们在1周内设计并测试用于HIV逆转录酶中六个最常观测到的抗药性突变的测定(Rhee等Nucleic Acids Res.31:298-303(2003))(图97)。这些实施例强调了SHERLOCK可以用于近实时地监测临床相关变体。
将HUDSON与SHERLOCK组合，我们已经建立了具有高性能和最小设备或样品加工需求的可实地部署的病毒诊断平台。这个平台与基于扩增的核酸诊断的灵敏度和特异性一样(Piepenburg等PLoS Biol.4,e204(2006))；Yu等Angew.Chem.Int.Ed Engl.56,992-996(2017)；Eboigbodin等Diagn.Microbiol.Infect.Dis.86:369-371(2016)；Pardee等Cell165:1255-1266(2016)；Chotiwan等Sci.Tra nsl.Med.9(2017)doi:10.1126/scitranslmed.aag0538；Van Ness等P NAS 100:4504-4509(2003))，与快速抗原测试具有类似的速度和设备需求(Bosch等Sci.Transl.Med 9(2017),doi:10.1126/scitrtanslmed.a an1589；Balmaseda等PNAS USA 114:8384-8389(2017)；Priyamva da等PNAS USA 113:7852-7857(2016))。此外，这种方法可以容易地适应于检测体液中存在的几乎任何病毒，按比例调整以能够达成多元化检测(Gootenberg等Science doi:10.1126/science.aaq0179(2018))，并且为了不依赖于冷链可以冻干试剂(Gootenberg等Science356:438-442(2017))。基于Cas13的检测是有前景的下一代诊断策略，其具有在全世界几乎任何地方实施的潜力以能够达成病毒感染的有效快速诊断。
材料和方法
临床样品/道德声明.用于本研究的临床样品是来自综合医院de la Plaza de laSalud(圣多明哥，多米尼加共和国)、佛罗里达州卫生部(塔拉哈西，佛罗里达州)和洪都拉斯国立自治大学(特古西加尔巴，洪都拉斯)的机构审查委员会/伦理审查委员会评估和批准的临床研究。麻省理工学院(MIT)机构审查委员会/伦理审查委员会和博德研究所的研究课题规划办公室提供了使用由先前所列机构收集的样品的批准。对于登革病毒临床样品，博德研究所机构审查委员会/伦理审查委员会提供了使用样品的批准。
在2015-2016年寨卡流行期间收集寨卡病毒(ZIKV)临床样品，并且在协作场所用Hologic Aptima ZIKV测定，或取决于协作场所用所公布的ZIKV RT-PCR或RT-qPCR测定进行测试。核酸测试和结果在表24中报告。从这些收集的临床样品中提取的RNA准备用于宏基因组和靶向测序，并且先前所公布的基因组(Metsky等Nature 546:411-415(2017))和来自这40个制剂的cDNA用作输入以用于比较SHERLOCK与扩增子PCR性能。还使用AltonaRealStar寨卡病毒RT-PCR试剂盒测试从这些样品中的16个提取的RNA，测定的细节见于下文并且所测试的样品和其结果在表25中报告。
确认的阳性登革病毒(DENV)患者血清样品根据DENV的比较基因组学是过量的用于博德研究所病毒基因组学计划(Viral Genomics Initiative)。另外，四个确认的DENV阳性患者血清样品和三个匹配的唾液样品获自Boca Biolistics。从DENV RT-PCR阳性人血清样品中提取的RNA和临床分离株根据DENV的比较基因组学是过量的用于博德研究所病毒基因组学计划。通过在C6/36细胞上培养人血清并且用下文所概述的RNA提取方案从细胞上清液收集RNA来制备临床分离株。
LwCas13a和crRNA的产生.如(Gootenberg等Science 356:438-442(2017))自身所描述或通过Genscript纯化LwCas13a。将crRNA DNA模板在1x Taq反应缓冲液(NEB)中以10μM的最终浓度粘接至T7启动子寡核苷酸。这涉及在95℃下变性5分钟，继而以每分钟5℃降至4℃进行粘接。使用HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒(NEB)体外转录crRNA。对于短RNA转录物根据制造商的说明书进行转录，其中体积按比例调整至30μl。在37℃下孵育反应物过夜。使用RNAClean XP珠粒(Beckman Coulter)以珠粒与反应物体积的2x比率并且额外补充1.8x异丙醇来纯化转录物。由Integrated DNA Technologies(IDT)合成一些crRNA。
样品制备.根据制造商的说明书使用具有载体RNA的QIAamp病毒RNA小型试剂盒(QIAGEN)从140μl输入物质中提取病毒RNA。在60μl不含核酸酶的水中洗脱样品，并且储存于-80℃下直至使用。
为产生cDNA，使用先前公布的方法(Matranga等Genome Biol.15:519(2014))将5μl提取的RNA转变成单链cDNA。简单地说，用SuperScript III(Invitrogen)和随机六聚体引物对RNA进行逆转录。然后用RNA酶H使RNA-DNA双链体降解。将cDNA储存于-20℃下直至使用。在一些实验中(图99C和100)，使用SuperScript IV在55℃下进行逆转录20分钟，而无需RNA酶H处理。
单个培养的分离株ZIKV Pernambuco(分离株PE243，KX197192.1)在ZIKV检测实验中用作阳性对照或用作祖先型序列的对照。使用上文所描述的RNA提取方法从140μl种子储备液样品中提取病毒RNA。
通过添加TCEP/EDTA并加热样品进行尿液样品的RNA酶灭活。将TCEP和EDTA分别以100mM和1mM的最终浓度添加至尿液样品中。使用两种方案：在95℃下10分钟的一步灭活，或在50℃下20分钟继之以95℃下5分钟的两步灭活。使用热循环仪或干热块进行灭活。
通过添加TCEP/EDTA并加热样品进行全血、血浆、血清和唾液样品中寨卡病毒的RNA酶灭活。将TCEP和EDTA分别以100mM和1mM的最终浓度添加至尿液样品中。使用在50℃下5分钟继之以64℃下5分钟(血液产物或唾液)，或在50℃下20分钟继之以95℃下5分钟(尿液)的两步灭活。使用热循环仪或干热块进行灭活。
通过添加TCEP/EDTA并加热样品进行全血、血清和唾液样品中DENV的RNA酶灭活。将TCEP和EDTA分别以100mM和1mM的最终浓度添加至尿液样品中。使用在42℃(或在一些实验中，37℃)下20分钟继之以64℃下5分钟的两步灭活。使用热循环仪进行灭活。
RPA反应和引物设计.对于RPA反应，根据制造商的说明书使用Twist-Dx RT-RPA试剂盒。引物浓度是480nM。对于涉及RNA的扩增反应，以每微升2个单位的最终浓度使用鼠类RNA酶抑制剂(NEB M3014L)。除非另有规定，否则所有RPA反应都是20分钟。
对于ZIKV检测，使用来自新近公布的RPA引物RP819/RP821(Gootenberg等Science356:438-442(2017))。对于泛DENV检测，不考虑血清型，使用所公布的RPA引物DENV1-3-RPA-RP4/DENV1-3-RPA-FP13和DENV4-RPA-RP2/DENV4-RPA-FP3的等量混合物(A bd ElWahed等PLoS One 10,e0129682(2015))。对于黄病毒板块，使用RPA引物FLAVI-NS5fwd-1/FLAVI-NS5rev-1。对于用以区别血清型的DENV板块，使用RPA引物DENV-3UTRfwd-1/DENV-3UTR rev-1。对于区域特异性寨卡SNP检测，使用RPA引物DOMUSA-5249-fwd/DOMUSA-5249-rev(DOMUSA5249 SNP)、USA-935-fwd/USA-935-rev(USA935 SNP)和HND-2788-fwd/HND-2788-rev(HND2788SNP)。为检测与小头畸形相关联的寨卡SNP，使用RPA引物ZIKV-mcep-fwd和ZIKV-mcep-rev。为检测HIV逆转录酶中的抗药性SNP，使用RPA引物HIVRT-149F/HIVRT-348R(K65R、K103N和V106M SNP)和HIV-462F/HIVRT-601R(Y181C、M184V和G190A SNP)。对于RPA引物名称和序列的完整清单，参见表28。
表27.DENV患者样品和临床分离株的元数据
我们示出了24个DENV RNA样品、8个血清患者样品、3个唾液样品的多种信息，包括来源国、样品类型和其中所用图式。
Figure BDA0002275597970002591
Figure BDA0002275597970002601
Figure BDA0002275597970002611
表28.本研究中所用的RPA引物序列的清单
正向引物在其5'端含有T7启动子序列引物(gaaatTAATACGACTCACTATAggg)。
Figure BDA0002275597970002612
Figure BDA0002275597970002621
Cas13检测反应和crRNA设计.如(Gootenberg等Science 356:438-442(2017))所描述进行检测反应，不同之处是每个反应的背景RNA输入从100ng减至0-25ng。这在不引入报告子寡核苷酸的任何伪裂解的情况下增加反应速率。除非另有指示，否则RNase Alertv2(Thermo)用作报告子。Biotek微板读取器(Synergy H4、Neo2和Cytation 5)用于测量检测反应的荧光。使用单色器以485nm下激发和520nm下发射来监测荧光动力学，每5分钟读取直至3小时。我们未观测到不同机器之间灵敏度的显著差异；因此可互换地利用机器。所报告的荧光值是背景扣除值或模板特定值。所报告的时间点在图注中注释。
对于ZIKV检测，使用来自新近公布的crRNA“寨卡靶向crRNA 2”(Gootenberg等Science 356:438-442(2017))。对于泛DENV检测，不考虑血清型，使用3个crRNA和D1-3UTRat10660、D2/3-3UTrat10635、D4-3UTRat10620的等量混合物。对于黄病毒板块，使用crRNA ZIKV-NS5at9227(ZIKV)、DENV-NS5at9127(DENV)、WNV-NS5at9243(WNV)和YFV-NS5at9122(YFV)。对于用以区别血清型的DENV板块，使用crRNA D1-3UTRat10457(DENV1)、D2-3UTRat10433(DENV2)、D3-3UTRat10419(DENV3)和D4-3UTRat10366(DENV4)。对于区域特异性寨卡SNP检测，使用crRNA DOMUSA-5249-祖先型/DOMUSA-5249-衍生型(DOMUSA5249SNP)、USA-935-祖先型/USA-935-衍生型(USA935 SNP)和HND-2788-祖先型/HND-2788-衍生型(HND2788 SNP)。为检测与小头畸形相关联的寨卡SNP，使用crRNA ZIKV-mcep-snp3syn5-祖先型/ZIKV-mcep-snp3syn5-衍生型(图112F中所示的设计)和crRNA ZIKV-mcep-snp7-祖先型/ZIKV-mcep-snp7-衍生型(图105中所示的设计)。为检测HIV逆转录酶中的抗药性SNP，使用crRNA HIVRT-K65R-祖先型/HIVRT-K65R-衍生型(K65R SNP)、HIVRT-K103N-祖先型/HIVRT-K103N-衍生型(K103N SNP)、HIVRT-V016M-祖先型/HIVRT-V106M-衍生型(V106MSNP)、HIVRT-Y181C-祖先型/HIVRT-Y181C-衍生型(Y181C SNP)、HIVRT-M184V-祖先型/HIVRT-M184V-衍生型(M184V SNP)和HIVRT-G190A-祖先型/HIVRT-G190A-衍生型(G190ASNP)。对于crRNA名称和间隔区序列的完整清单，参见表29。对于crRNA序列和二级结构对活性的影响的额外论述，参见论述。
表29.本研究中所用的crRNA间隔区序列的清单
本研究中所用的所有crRNA含有相同正向重复序列(GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC)。在T7体外转录期间用于增加产量的5'GGG在T7启动子序列引物(gaaatTAATACGACTCACTATAggg)中编码。
Figure BDA0002275597970002641
Figure BDA0002275597970002651
侧流检测反应.使用定制探针寡核苷酸(LF-polyU，序列参见表30)用可商购的检测条带(Milenia Hybridetect 1,TwistDx,Cambridge,UK)达成侧流检测。将Cas13检测反应物在Hybridetect测定缓冲液中以1:5稀释，然后插入条带并且在室温下孵育5分钟。然后移出条带并且使用智能手机相机照相。
表30.本研究中所用的合成靶序列和RNA报告子的清单
将所有合成标靶预定为来自IDT的gBlock，并且在其5'端含有25个核苷酸的T7启动子序列引物序列(gaaatTAATACGACTCACTATAggg)。这允许在RPA扩增之前或之后进行gBlock的体外转录。将荧光报告子预定为来自IDT的HPLC纯化的RNA寡核苷酸。
Figure BDA0002275597970002661
Figure BDA0002275597970002671
RT-PCR实验.在Lightcycler 96RT-PCR机器(Roche)上根据制造商的说明书使用Altona RealStar寨卡病毒RT-PCR试剂盒(RUO型式)进行ZIKV检测的RT-PCR。从患者样品中提取的10μl ZIKV RNA用作RT-PCR的输入。1μl内部对照(IC)用于每个样品。
数据分析.通过扣除0分钟(图98、99D、102、103)、10分钟(图84、99B-C和104)或20分钟(图112)后的荧光值进行背景扣除，此时观测到最小荧光。对于黄病毒板块与DENV板块，将背景扣除荧光标准化为标靶特异性荧光。标靶特异性荧光是在每个时间点处将具有给定crRNA的无输入(水)对照的平均背景扣除荧光从具有相同crRNA的给定DNA标靶的背景扣除荧光扣除。
对于来自2015-2016年流行的ZIKV样品的分析(图99B)，临界值用于确定ZIKV的存在或不存在。使用来自以下5个阴性对照样品的背景扣除荧光确定ZIKV SHERLOCK荧光临界值：4个单供体健康人尿液样品和1个无输入水对照。也就是说，对于这5个中的每个样品s，我们采用跨越3个技术性重复的荧光的平均值ms和标准偏差σs。将临界值设定为5个值的中值{ms+3σs}。对于图1C，使用1个无输入对照进行相同计算{ms+3σs}以确定临界值。使用来自基因组组装的信息确定关于扩增子PCR产量的临界值。首先，通过采用来自两个扩增子PCR库中的每一个的最小浓度对每个样品计算扩增子PCR产量(图87A)。然后目标是确定最佳预测样品中是否存在基因组的特定靶向部分r的产量(在这种情况下，对于RPA扩增子，我们用SHERLOCK进行检测)。样品s中存在r的概率Prs(r)可以估算为从s的cDNA测序和组装的ZIKV基因组的分数。(计算跨基因组的概率优选地简化了查看在基因组中r处是否存在覆盖，这是因为覆盖的缺乏不一定指示r不存在。)这个分析的数据是来自ZIKV流行的新近基因组测序研究的个别技术性重复(Metsky等Nature 546:411-415(2017))。扩增子PCR产量对所覆盖的基因组分数的图在图88B中示出。值Prs(r)可以用于估算对于临界值选择的精确率和召回率。特别地，不具有r的样品数的估算是跨越所有样品的Prs(r)的和。类似地，在扩增子PCR产量超过给定临界值的样品P当中，正确标记为r存在的数目被估算为跨越P中的样品的Prs(r)的和。图87C示出了对于临界值的每个选择的精确率和召回率，以及F0.5得分，这是考虑到临界值将样品准确归类为具有ZIKV的靶向部分的能力的复合度量。设定扩增子PCR产量临界值以使F0.5得分达到最大。对于SHERLOCK与扩增子PCR和其它方法相比的灵敏度和特异性的额外论述，参见论述。
类似于上文关于ZIKV测定所描述来计算DENV SHERLOCK荧光临界值。来自8个无输入阴性对照的背景扣除荧光用于确定临界值。对于这8个的每个无输入对照s，我们采用跨越3个技术性重复的荧光的平均值ms和标准偏差σs并且将临界值设定为8个值的中值{ms+_3σs}。
对于多病毒或血清型板块，我们计算板块中针对其它crRNA的每个标靶的脱靶荧光。这是通过在3小时检测时间点处(此时观测到最大荧光或信号已经饱和)计算未匹配标靶:crRNA对的标靶特异性荧光相对于匹配标靶:crRNA对所观测的标靶特异性荧光的百分比来进行。在正文中所报告的脱靶荧光是对于给定板块中的4个标靶所观测的最大值。
对于SNP鉴别，使用祖先型靶向和衍生型靶向crRNA计算背景扣除荧光值。我们采用衍生型背景扣除荧光与祖先型背景扣除荧光的比率以确定SNP的存在或不存在。对于HIVSNP(图106)，我们计算SNP鉴别指数，这是衍生型等位基因的荧光比除以祖先型等位基因的荧光比的比率。如果两个等位基因之间不存在辨别能力，那么SNP鉴别指数等于1，并且随着两个等位基因之间的荧光比分歧而增加。对于影响使用SHERLOCK区别个别SNP的简易性的因素的额外论述，参见论述。
ZIKV和DENV检测实验.以6.8x104cp/μl的储备液浓度使用PE243(MF352141.1)种子储备液cDNA。将cDNA在超纯水(Life Technologies)或健康尿液(Lee Biosolutions)中以1:10连续稀释。使4-8μl每个样品灭活，并且1-2μl用作RPA反应的输入。以2.72x105cp/μl使用PE243种子储备液RNA。最初在2015年5月13日从具有皮疹的发热患者分离病毒，并且在2016年在巴西的FIOCRUZ Pernambuco实验室(E.Marques)以及在MIT Gehrke实验室完成Vero细胞传代。PE243是来自巴西寨卡流行的首批分离株之一(Donald等PLoSNegl.Trop.Dis.10,e0005048(2016))。将RNA在超纯水(Life Technologies)或健康尿液(Lee Biosolutions)中以1:10连续稀释。使4-8μl每个样品灭活，并且1-2μl用作RPA反应的输入。我们使用14mM MgAc用于DENV检测和17mM MgAc用于ZIKV检测。
经BEI仓库以美国目录号ATCC VR-1843获得培养的分离株，来自波多黎各的ZIKV株系PRVABC59(KU501215)(Donald等PLoS Negl.Trop.Dis.10,e0005048(2016)；Lanciotti等Emerg.Infect.Dis.22:933-935(2016))并且用于添加病毒至健康尿液、唾液、全血和血清样品中。在昆虫和非人灵长类动物细胞系中培养PRVABC59。HuH-7人肝癌细胞用于如(Lambeth等J.Clin.Microbiol.43:3267-3272(2005))所描述在病毒储备液中衍生出感染性颗粒。培养的分离株，DENV2株系New Guinea C(NGC)，用于稀释健康唾液(LeeBiosolutions)、全血(Research Blood Components)和血清(Millipore Sigma)中的病毒。
病毒板块实验.为说明黄病毒科的4种不同病毒(ZIKV、DENV、WNV和YFV)之间的序列多样性，我们应用方法CATCH(用于全面杂交的标靶的紧凑聚集(Compact Aggregationof Targets for Comprehensive Hybridization))以搜索将适用于泛黄病毒RPA引物对的保守区。这种方法的实施在MIT许可(https://github.com/broadinstitute/catch)下在GitHub上可用。这种方法允许我们缩小对NS5的保守区内的引物对的搜索。
对于黄病毒板块和DENV板块的初始测试，合成衍生的DNA模板以104个拷贝/微升的浓度用作输入。无输入(水)对照用作所测试的每个crRNA的阴性对照。在所有板块实验中，使用三个技术性重复。在所有黄病毒板块实验中，RPA反应中的MgAc浓度是20mM，而在所有DENV板块实验中，RPA中的MgAc浓度是14mM。
对于黄病毒板块的初始测试，ZIKV模板序列来源于(KX197192)、DENV(NC_001477.1)、WNV(NC_09942.1)和YFV(AY968065.1)。RPA反应扩增这些黄病毒的NS5的一部分。
对于DENV板块的初始测试，DENV1合成模板序列来源于(KM204119.1)、DENV2(KM204118.1)、DENV3(KU050695.1)、DENV4(JQ822247.1)。RPA反应扩增DENV 1-4的3'UTR区的一部分。另外，对从临床样品和种子储备液中提取的RNA测试DENV板块。
SNP鉴别实验.对于区域特异性SNP鉴别，含有具有祖先型或衍生型等位基因的ZIKV基因组的400-nt片段的合成模板用于验证SNP鉴别测定的性能。另外，来自3个国家(美国、洪都拉斯和多米尼加共和国)的ZIKV cDNA样品用于确认对蚊库和临床样品的性能。关于这些cDNA样品的额外信息参见表24。PE243种子储备液cDNA(KX197192.1)以300cp/μl用作组外对照。另外，使用无输入(水)对照。对于小头畸形相关SNP鉴别实验，以104cp/μl使用含有具有祖先型或衍生型等位基因的ZIKV基因组的400-nt片段的合成模板，并且以300cp/μl使用PE243种子储备液cDNA。对于HIV抗药性SNP鉴别实验，以104cp/μl使用含有具有祖先型或衍生型等位基因的HIV基因组的468-nt片段的合成模板。对于合成模板名称和序列的完整清单，参见表30。在所有SNP鉴别实验中，使用3个技术性重复。
论述
SHERLOCK对于ZIKV检测的灵敏度和特异性的论述.我们已经显示，SHERLOCK是用于核酸检测的极灵敏和特异性的方法。ZIKV检测是SHERLOCK的灵敏度的关键测试，这在很大程度上是因为ZIKV归因于低病毒滴度和样品降解对于检测来说极具挑战性(Paz-Bailey等N.Engl.J.Med.Doi:10.1056NEJMoa1613108(2017))。我们测试了来自2015-16年ZIKV流行的一组37个疑似阳性患者样品和3个蚊库，使用SHERLOCK与扩增子PCR来确定给定样品中ZIKV核酸的存在或不存在。对于来自这些患者的16个样品，我们能够比较SHERLOCK与以下两种FDA-EUA批准的ZIKV诊断：1)Hologic Aptima ZIKV测定，和2)Altona RealStar寨卡病毒RT-PCR测定。
为比较SHERLOCK与Altona RealStar寨卡病毒RT-PCR测定，我们对一组16个患者样品比较两种测定。我们进行这两种测定以使得逆转录条件和输入体积是等效的：20分钟逆转录和10μl输入。归因于逆转录反应条件将cDNA从RNA输入以1:4稀释，因此我们用于SHERLOCK的RNA的量是Altona试剂盒所用量的1/4。我们观测到两种方法之间的同等灵敏度，其中16个样品中的10个通过每种方法呈阳性并且总体上符合率100％(图99C和100)。
我们然后比较SHERLOCK和Altona测定与使用大得多的输入体积(>500μl)的Hologic Aptima寨卡病毒测定。通过Altona测定与SHERLOCK呈阳性的所有10个样品通过Hologic测定呈阳性(表25)。三个样品通过Hologic测定呈阳性，但通过其它两种测定不呈阳性，这可能归因于>50x的较大样品输入体积用于Hologic测定。总之，SHERLOCK对于ZIKV检测具有与RT-PCR测定等效的灵敏度，并且其灵敏度相对于Hologic测定受输入体积限制。
我们包括扩增子PCR数据的理由是基于在ZIKV流行期间进行大规模基因组测序(Metsky等Nature 546:411-415(2017))时我们观测到部分基因组是很常见的。这表明广基因组比较仪将提供比例如RT-PCR的单扩增子方法更高的灵敏度。使用扩增子PCR方法，我们使用Agilent电泳工作平台定量扩增子PCR产物并且选择2ng/μl的临界值用于确定ZIKV的存在或不存在，这使如由扩增子PCR产物的基因组序列覆盖率测量的准确度达到最大(图100，关于细节参见方法)。尽管两种方法靶向的ZIKV基因组的区域之间有差异，但在这两种方法之间存在高符合率(82.5％)(图84C和88A-C)。扩增子PCR方法拼贴整个ZIKV基因组，而SHERLOCK仅使用一个长128nt的扩增子，比长300-400nt的PCR扩增子更短(图101)。因此，有可能通过SHERLOCK比通过扩增子PCR更容易地检测高度降解的样品(具有短RNA片段)。相反地，如果SHERLOCK扩增子本身已经降解，，但基因组的其它部分未降解，那么扩增子PCR将检测样品中所存在的基因组的剩余部分。
SHERLOCK的这种灵敏度与高特异性配对。我们已经使用各种SHERLOCK测定显示SNP灵敏度、血清型鉴别和种级特异性。我们还已经测试了众多阴性对照，包括健康体液、水以及在一些情况下来自其它病毒的核酸。基于这些结果，我们不会预期使用SHERLOCK观测到许多假阳性(如果有的话)。
SHERLOCK性能可变性的原因.如原始SHERLOCK论文的补充文本中所论述，RPA性能是高度可变的并且取决于模板序列、扩增子长度和其它因素(Gootenberg等Science 356:438-442(2017))。Cas13检测步骤使荧光信号扩增100至1,000倍或更多倍，这取决于RPA扩增子的输入浓度。因此，SHERLOCK对于RPA扩增或Cas13检测中的变异是相当稳固的，除非这种变异的量值极大。
为设计多病毒和多血清型板块，我们使用简并RPA引物以捕获相关RNA病毒的显著序列多样性。在一些情况下，引物简并可以引起不同标靶的可变扩增效率。一般来说，这可以通过优化RPA反应(调整引物和镁浓度等)来管理。
除RPA变异以外，我们已经观测到SHERLOCK的Cas13检测步骤中的一些变异，这归因于间隔区GC含量、多段polyU和二级结构对crRNA性能的影响。一些crRNA相比其它更有活性，并且一些crRNA在不存在标靶的情况下(即，无输入对照)显示更有活性。我们还已经观测到在体外转录之后一些crRNA相比其它纯度更低。然而，在纯化之后，几乎所有crRNA都是高度活性的(有几个例外是归因于间隔区的不合需要的二级结构，例如当大部分间隔区可以自身配对时)。
黄病毒板块中的较低ZIKV荧光(图84B)可能归因于上文所论述的因素的组合(同样对于本研究中所用的其它crRNA)。
影响通过SHERLOCK的SNP辨别的因素.观测到不同间隔区RNA序列在SHERLOCK的检测步骤中具有不同水平的性能。上文论述了引起这些性能差异的因素，但还暗示与SNP检测有关。
SNP检测依赖于因一个或两个核苷酸而与靶序列不同的一对crRNA，并且因此对序列依赖性的靶分子具有差异活性。当crRNA与靶RNA之间第二个错配的存在引起附带裂解中可观测到的差异时，SNP辨别是成功的。因此，以下可能限制SNP辨别的成功：
·_高度活性crRNA中的单个额外错配可能不会使活性降至足够用于强辨别并且对于一些crRNA已经观测到。可能的解决方案包括1)在添加至检测反应中之前稀释RPA产物，或2)使用较低crRNA浓度。
·_如果在RPA期间一个等位基因优先扩增成另一个(归因于模板的二级结构的变化)，这可能使SHERLOCK的输出有偏差。我们尚未观测到这种情况，但这是可能的。
·_在不存在沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对的情况下RNA的摆动配对将允许一些crRNA弱结合。对于我们的A>G或G>A突变中的一些(例如USA935)已经观测到这种情况。crRNA中的“U”可以结合至衍生型或祖先型核苷酸。然而，甚至在这种情况下，容易区分两个等位基因，这是因为G靶向crRNA将含有C核苷酸，其不会与A配对。
在给出这些限制下，具有较低活性(这可以通过缩短间隔区来达成)的crRNA可以更好地适于SNP检测，并且尽管摆动碱基配对可能对SHERLOCK的信号有影响，但其不会完全消除SNP鉴别。
***
本发明所描述的方法、药物组合物和试剂盒的各种修改和变更在不偏离本发明的范围和精神的情况下将为本领域技术人员显而易见。尽管已经结合特定实施方案描述本发明，但将了解，本发明能够进行进一步修改并且所要求的发明内容不应过度地限于此类特定实施方案。确实，本领域技术人员显而易见的对所描述的本发明实施方式的各种修改意图处于本发明的范围内。本申请意图涵盖本发明的任何变更、用途或改编，其一般遵循本发明的原理并且包括偏离本公开的内容，所述内容处于本发明所属领域内的已知惯例的范围内并且可以应用于本文之前所陈述的基本特征。

Claims (44)

1.一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括：
CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA；以及
基于RNA的掩蔽构建体；
其中所述靶分子包括一种或多种病毒靶分子。
2.一种多肽检测系统，所述多肽检测系统包括：
CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至触发RNA的向导RNA；
基于RNA的掩蔽构建体；以及
一种或多种检测适体，所述一种或多种检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点。
3.一种用于检测样品中的病毒的方法，所述方法包括：
将样品或样品组分配至一个或多个个别离散容积中，所述个别离散容积包含如权利要求1或2所述的CRISPR系统；
在足以允许所述一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子的条件下孵育所述样品或样品组；
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种靶分子来活化所述CRISPR效应蛋白，其中活化所述CRISPR效应蛋白得以修饰所述基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中一种或多种病毒的存在。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述样品包含两种或更多种病毒，并且其中所述方法区分所述两种或更多种病毒。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述向导RNA检测所述一种或多种病毒的单核苷酸变体。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述向导RNA还包含一个或多个合成错配。
7.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CRISPR系统的所述向导RNA包含检测一组病毒中的每种病毒和/或病毒株的泛病毒向导RNA组。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述向导RNA是使用组覆盖方法得到。
9.一种用于检测病毒的方法，所述方法包括：
使如权利要求1或2中任一项所述的CRISPR系统暴露于样品；
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种微生物特异性靶RNA或所述一种或多种触发RNA来活化所述RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中一种或多种病毒的存在。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述CRISPR系统在衬底上，并且其中使所述衬底暴露于所述样品。
11.如权利要求10所述的方法，其中将相同或不同CRISPR系统施加至所述衬底上的多个离散位置。
12.如权利要求11所述的方法，其中将相同或不同CRISPR系统施加至所述衬底上的多个离散位置。
13.如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述衬底是柔性材料衬底。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述柔性材料衬底是纸衬底、织物衬底或基于柔性聚合物的衬底。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述不同CRISPR系统检测每个位置处的不同微生物。
16.如权利要求13所述的方法，其中通过将所述衬底短暂浸入有待取样的流体中，通过将有待测试的流体施加至所述衬底，或通过使有待测试的表面与所述衬底接触，使所述衬底被动暴露于所述样品。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述样品是生物或环境样品。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述环境样品获自食物样品、饮料样品、纸表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于大气或其它气体样品，或其组合。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品获自组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰液、粘液、淋巴、滑液、脑脊髓液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓液，或皮肤或粘膜表面的拭子。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述环境样品或生物样品是粗样品和/或其中在应用所述方法之前所述一种或多种靶分子未从所述样品纯化或扩增。
21.一种用于监测病毒性疾病爆发和/或演变的方法，所述方法包括：
使如权利要求1或2所述的CRISPR系统暴露于样品；
经由所述一种或多种向导RNA结合至一种或多种包含非同义病毒突变的靶序列来活化所述RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中存在的病毒株的类型。
22.如权利要求21所述的方法，其中暴露所述CRISPR系统包括使一种或多种CRISPR系统定位于一个或多个个别离散容积内以及将样品或样品等分试样添加至所述一个或多个个别离散容积中。
23.一种用于针对病毒抗原和/或病毒特异性抗体筛选样品的方法，所述方法包括：
使如权利要求2所述的CRISPR系统暴露于样品，其中所述一种或多种适体结合至一种或多种病毒抗原或一种或多种病毒特异性抗体，并且其中所述适体编码鉴别所述一种或多种适体所结合的所述一种或多种病毒抗原或所述一种或多种病毒特异性抗体的条形码，并且其中所述向导RNA被设计成检测所述条形码；
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种微生物特异性靶RNA或所述一种或多种触发RNA来活化所述RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中一种或多种病毒抗原或一种/或多种病毒特异性抗体的存在。
24.如权利要求3至23中任一项所述的方法，其中所述病毒是DNA病毒。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述DNA病毒是肌病毒科、短尾病毒科、长尾病毒科、异疱疹病毒科、疱疹病毒科(包括人疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒)、马洛疱疹病毒科、脂毛病毒科、小杆状病毒科、腺病毒科、瓶状病毒科、囊泡病毒科、非洲猪瘟病毒科(包括非洲猪瘟病毒)、杆状病毒科、西坎达病毒科、棒状病毒科、覆盖噬菌体科、微小纺锤形病毒科、球状病毒科、滴状病毒科、肥大唾腺炎病毒科、虹彩病毒科、马赛病毒科、拟菌病毒科、裸病毒科、线形病毒科、潘多拉病毒科、乳头瘤病毒科、藻类DNA病毒科、原质病毒科、多DNA病毒、多瘤病毒科(包括猿猴病毒40、JC病毒、BK病毒)、痘病毒科(包括牛痘和天花)、球脂状病毒科、复层病毒科、图里病毒科、地诺DNA病毒、盐末端蛋白病毒、瑞兹病毒，或其组合。
26.如权利要求3至23中任一项所述的方法，其中病毒感染是由双链RNA病毒、正义RNA病毒、反义RNA病毒、逆转录病毒或其组合引起。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒科病毒、小RNA病毒科病毒、杯状病毒科病毒、黄病毒科病毒、披膜病毒科病毒、玻那病毒科、丝状病毒科、副粘病毒科、肺泡病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科、布尼亚病毒科、正粘病毒科或丁型病毒。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒、SARS、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、甲型肝炎、诺瓦克病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、风疹病毒、罗斯河病毒、辛德毕斯病毒、基孔肯雅病毒、博尔纳病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、新城疫病毒、人呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、拉沙病毒、汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、流感或丁型肝炎病毒。
29.一种用于检测样品中的一种或多种微生物的方法，所述方法包括：
使样品与如权利要求1或2中任一项所述的核酸检测系统接触；以及
将所述经过接触的样品应用于侧流免疫色谱测定。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述核酸检测系统包括包含第一分子和第二分子的基于RNA的掩蔽构建体，并且其中所述侧流免疫色谱测定包括优选地在侧流条带上的离散检测位点处，检测所述第一分子和第二分子。
31.如权利要求30所述的方法，所述第一分子和所述第二分子是通过结合至识别所述第一分子或第二分子的抗体以及优选地用夹心抗体检测所述结合的分子来检测。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述侧流条带包括针对所述第一分子的上游第一抗体和针对所述第二分子的下游第二抗体，并且其中如果所述样品中不存在所述靶核酸，那么未裂解的基于RNA的掩蔽构建体由所述第一抗体结合，并且其中如果所述样品中存在所述靶核酸，那么裂解的基于RNA的掩蔽构建体由所述第一抗体与所述第二抗体结合。
33.一种检测病毒的方法，所述方法包括：
从受试者获得样品，其中所述样品是尿液、血清、血液或唾液；
扩增所述样品的RNA；
将所述样品与效应蛋白、一种或多种被设计成结合至相应病毒特异性靶分子的向导RNA和基于RNA的掩蔽构建体组合，
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种病毒特异性靶RNA来活化所述RNA效应蛋白，其中活化所述CRISPR效应蛋白得以修饰所述基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述信号，其中检测到所述信号指示所述病毒的存在；并且
其中所述方法不包括从所述样品中提取RNA的步骤。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述扩增步骤的持续时间选自由以下组成的组：2小时、1小时、30分钟、20分钟和10分钟。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述检测步骤的持续时间选自由以下组成的组：3小时、2小时、1小时、30分钟、20分钟和10分钟。
36.如权利要求33所述的方法，其中检测所需的样品体积是100μl至1μl。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述病毒是寨卡病毒。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述样品包含两种或更多种病毒，并且其中所述方法区分所述两种或更多种病毒。
39.如权利要求33所述的方法，其中所述基于RNA的掩蔽构建体包含可检测配体和掩蔽组分所附接的RNA寡核苷酸。
40.如权利要求33所述的方法，其中所述方法还包括在扩增所述样品的RNA之前的核酸酶灭活步骤和病毒灭活步骤。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述核酸酶灭活步骤在37℃至50℃的范围内的温度下进行。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述核酸酶灭活步骤的持续时间选自5分钟、10分钟、15分钟和20分钟。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述病毒灭活步骤在64℃至95℃的范围内的温度下进行。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述病毒灭活步骤持续5分钟。
CN201880032672.7A 2017-03-15 2018-03-15 用于病毒检测的基于crispr效应系统的诊断 Pending CN111108220A (zh)

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762471931P 2017-03-15 2017-03-15
US62/471,931 2017-03-15
US201762484857P 2017-04-12 2017-04-12
US62/484,857 2017-04-12
US201762530086P 2017-07-07 2017-07-07
US62/530,086 2017-07-07
US201762568315P 2017-10-05 2017-10-05
US62/568,315 2017-10-05
US201762588138P 2017-11-17 2017-11-17
US62/588,138 2017-11-17
US201762596735P 2017-12-08 2017-12-08
US62/596,735 2017-12-08
PCT/US2018/022764 WO2018170340A1 (en) 2017-03-15 2018-03-15 Crispr effector system based diagnostics for virus detection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111108220A true CN111108220A (zh) 2020-05-05

Family

ID=63522599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880032672.7A Pending CN111108220A (zh) 2017-03-15 2018-03-15 用于病毒检测的基于crispr效应系统的诊断

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20200181720A1 (zh)
EP (1) EP3596218B1 (zh)
JP (2) JP2020513815A (zh)
KR (1) KR20190140918A (zh)
CN (1) CN111108220A (zh)
AU (1) AU2018234832A1 (zh)
BR (1) BR112019019087A2 (zh)
CA (1) CA3056411A1 (zh)
IL (1) IL269330A (zh)
SA (1) SA519410124B1 (zh)
WO (1) WO2018170340A1 (zh)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111548918A (zh) * 2020-05-14 2020-08-18 上海交通大学 一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管
CN111653312A (zh) * 2020-05-28 2020-09-11 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种利用基因组数据探究疾病亚型亲缘性的方法
CN111733294A (zh) * 2020-07-27 2020-10-02 广州动物园 鹦鹉博尔纳病毒4型的鉴定引物、鉴定方法和试剂盒
CN111733287A (zh) * 2020-06-22 2020-10-02 天津大学 检测发热伴血小板减少综合征病原体核酸的试剂盒
CN111996291A (zh) * 2020-08-21 2020-11-27 深圳海关动植物检验检疫技术中心 用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用
CN112501256A (zh) * 2020-12-03 2021-03-16 台州市中心医院（台州学院附属医院） 一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法
CN112575059A (zh) * 2020-12-08 2021-03-30 天津大学 核酸检测试剂及检测方法
CN112609010A (zh) * 2020-12-09 2021-04-06 四川大学 一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒
CN112646932A (zh) * 2021-01-08 2021-04-13 湖南超亟检测技术有限责任公司 一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒
CN112813179A (zh) * 2020-12-09 2021-05-18 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院） 一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒及其使用方法
CN112904002A (zh) * 2021-02-01 2021-06-04 广西大学 一种基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法
CN113504274A (zh) * 2021-07-20 2021-10-15 郑州轻工业大学 一种共价有机骨架材料及其制备方法和应用，适配体传感器及其制备方法
CN113791207A (zh) * 2021-08-06 2021-12-14 南方科技大学 高灵敏度的免疫检测方法及其应用
CN114703324A (zh) * 2022-03-29 2022-07-05 广西壮族自治区兽医研究所 检测禽偏肺炎病毒的试剂及方法
CN114854862A (zh) * 2022-05-31 2022-08-05 重庆大学 一种检测融合基因及其变体的系统以及方法和应用
CN115011713A (zh) * 2022-06-15 2022-09-06 湖南工程学院 基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法
CN115820939A (zh) * 2022-12-18 2023-03-21 厦门大学 用于猴痘病毒检测的crRNA、核酸分子组合物、检测体系及应用
CN115961088A (zh) * 2021-10-11 2023-04-14 首都医科大学附属北京佑安医院 检测hiv k103n突变的成套试剂与试剂盒
CN116904662A (zh) * 2023-01-10 2023-10-20 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法
CN117646089A (zh) * 2024-01-22 2024-03-05 烟台海关技术中心 YHV-1检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
IL294014B2 (en) 2015-10-23 2024-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
IL308426A (en) 2016-08-03 2024-01-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
JP7191388B2 (ja) 2017-03-23 2022-12-19 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸によってプログラム可能なｄｎａ結合蛋白質を含む核酸塩基編集因子
US11618928B2 (en) * 2017-04-12 2023-04-04 The Broad Institute, Inc. CRISPR effector system based diagnostics for malaria detection
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
RU2020115264A (ru) * 2017-10-04 2021-11-08 Зе Броад Институт, Инк. Диагностика на основе эффекторной системы crispr
CN111757937A (zh) 2017-10-16 2020-10-09 布罗德研究所股份有限公司 腺苷碱基编辑器的用途
US20210269866A1 (en) 2018-06-26 2021-09-02 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics
SG11202012785VA (en) 2018-06-26 2021-01-28 Broad Inst Inc Crispr double nickase based amplification compositions, systems, and methods
WO2020006049A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 The Broad Institute, Inc. Crispr/cas and transposase based amplification compositions, systems and methods
EP4442836A2 (en) 2018-08-01 2024-10-09 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
WO2020072816A1 (en) * 2018-10-03 2020-04-09 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based diagnostics for hemorrhagic fever detection
EP3650553B1 (en) * 2018-11-07 2023-07-12 Siemens Healthcare GmbH Method for detection of specific nucleic acids
CA3119971A1 (en) * 2018-11-14 2020-05-22 Pardis SABETI Multiplexing highly evolving viral variants with sherlock
WO2020124050A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 The Broad Institute, Inc. Tiled assays using crispr-cas based detection
JP7333171B2 (ja) * 2018-12-18 2023-08-24 栄研化学株式会社 Ｒｎａ検出方法、ｒｎａ検出用核酸及びｒｎａ検出用キット
RU192778U1 (ru) * 2018-12-26 2019-10-01 Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) Устройство для иммунохроматографической экспрессной внелабораторной диагностики заболевания винограда, вызываемого вирусом скручивания листьев
EP3931313A2 (en) 2019-01-04 2022-01-05 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
WO2020186223A1 (en) * 2019-03-14 2020-09-17 The Broad Institute, Inc. Sherlock assays for tick-borne diseases
US20220154258A1 (en) 2019-03-14 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based multiplex diagnostics
WO2020191243A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
CN110396557B (zh) * 2019-04-30 2023-06-02 广州普世利华科技有限公司 一种基于CRISPR/Cas12a的特异性HPV核酸检测方法
WO2021026227A1 (en) * 2019-08-05 2021-02-11 Massachusetts Institute Of Technology Transplant diagnostics using crispr-based technology
GB2628935A (en) 2019-09-03 2024-10-09 Myeloid Therapeutics Inc Methods and compositions for genomic integration
US20220333208A1 (en) 2019-09-03 2022-10-20 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based multiplex cancer diagnostics
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
CN111118212B (zh) * 2020-01-07 2023-11-14 河北农业大学 检测新城疫病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法
WO2021142109A1 (en) * 2020-01-07 2021-07-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Transposition-based diagnostics methods and devices
CN111118218B (zh) * 2020-01-20 2024-01-23 杭州奥盛仪器有限公司 对虾虹彩病毒的CRISPR-Cas12a蛋白酶等温检测引物组、试剂盒及其检测方法
EP3875602A1 (en) 2020-03-05 2021-09-08 Nederlandse Organisatie voor toegepast- natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO Nucleic acid fluorescence detection
CN111235313A (zh) * 2020-03-08 2020-06-05 深圳市创新医学科技有限公司 一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法
US11732315B2 (en) 2020-03-12 2023-08-22 New England Biolabs, Inc. Rapid diagnostic test for lamp
US10968493B1 (en) 2020-03-12 2021-04-06 New England Biolabs, Inc. Rapid diagnostic test using colorimetric LAMP
US11345970B2 (en) 2020-03-12 2022-05-31 New England Biolabs, Inc. Rapid diagnostic test for LAMP
WO2021183921A1 (en) * 2020-03-12 2021-09-16 New England Biolabs, Inc. A rapid diagnostic test for lamp
WO2021188734A1 (en) * 2020-03-17 2021-09-23 The Broad Institute, Inc. Crispr system high throughput diagnostic systems and methods
CN111334610B (zh) * 2020-03-20 2023-11-14 广东省妇幼保健院 一种登革病毒通用型rt-raa-lfd扩增引物及检测方法
US11453907B2 (en) 2020-03-23 2022-09-27 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based coronavirus diagnostics
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
WO2022016187A1 (en) * 2020-07-14 2022-01-20 Northwestern University Virofind: a novel platform for detection and discovery of the entire virogenome in clinical samples
KR102630635B1 (ko) * 2020-08-04 2024-01-29 한국생명공학연구원 dCas9/gRNA 복합체 기반의 표적 RNA 검출 방법
CN111961705A (zh) * 2020-08-11 2020-11-20 佛山科学技术学院 一种沙门氏菌的检测方法
WO2022040443A2 (en) * 2020-08-21 2022-02-24 New England Biolabs, Inc. A rapid diagnostic test for lamp
WO2022051667A1 (en) * 2020-09-03 2022-03-10 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based diagnostics for virus detection
GB2600103B (en) * 2020-10-19 2024-01-10 Quantumdx Group Ltd Integrated thermal conditioning and PCR in a molecular POC diagnostic system
KR20220059418A (ko) * 2020-11-02 2022-05-10 주식회사 이지다이아텍 다중 진단을 위한 핵산 분리 및 검출용 미세입자 프로브
CN112359146A (zh) * 2020-11-30 2021-02-12 浙江大学 一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法
US20230014132A1 (en) * 2021-01-15 2023-01-19 Purdue Research Foundation Loop-mediated isothermal amplification (lamp) analysis for pathogenic targets
US20220235408A1 (en) * 2021-01-15 2022-07-28 Purdue Research Foundation Loop-mediated isothermal amplification (lamp) on a solid-phase medium
US20240093190A1 (en) * 2021-01-19 2024-03-21 President And Fellows Of Harvard College Engineered nucleic acids targeting long noncoding rna involved in pathogenic infection
CN113046357B (zh) * 2021-01-25 2023-05-16 柳州市柳铁中心医院 一种乐伐替尼耐药基因dusp9、其筛选方法及应用
CN112779358B (zh) * 2021-01-27 2023-06-09 重庆威斯腾前沿生物研究院有限责任公司 一种非诊断目的的dcas9介导检测HPV16型E6基因的免疫层析方法
CN114847562A (zh) * 2021-02-05 2022-08-05 深圳华大智造科技股份有限公司 口罩
KR102555480B1 (ko) * 2021-02-22 2023-07-13 가천대학교 산학협력단 유전자가위 기반 인플루엔자 바이러스 타입의 신속 검출
CN112725539B (zh) * 2021-02-24 2023-05-23 遵义医科大学珠海校区 一种呼吸合胞病毒的RPA/Cas12a/IF试剂盒及其检测方法
CN112899356B (zh) * 2021-03-03 2022-12-13 广西扬翔股份有限公司 一种快速鉴定猪早期胚胎性别的引物组、试剂盒及其应用
CN112795702A (zh) * 2021-03-07 2021-05-14 珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司 虾血细胞虹彩病毒lamp检测引物组、试剂盒及方法
CN113005230B (zh) * 2021-04-28 2024-02-20 南通海关综合技术中心(江苏国际旅行卫生保健中心南通分中心、南通海关口岸门诊部) 亚洲型寨卡病毒RT-RPA/CRISPR-Cas12a检测试剂盒及其检测方法
CN113340648B (zh) * 2021-06-04 2023-01-06 深圳市悦诚达信息技术股份有限公司 一种冷链物流用病毒检验设备
CN113552103B (zh) * 2021-07-20 2022-12-30 济南大学 一种基于CRISPR-Cas系统的检测外泌体的荧光生物传感器
EP4373963A2 (en) 2021-07-21 2024-05-29 Montana State University Nucleic acid detection using type iii crispr complex
CN113755560A (zh) * 2021-10-15 2021-12-07 宁夏农林科学院动物科学研究所(宁夏草畜工程技术研究中心) 一种蓝氏贾第虫lamp快速检测方法
KR20230062112A (ko) * 2021-10-29 2023-05-09 가천대학교 산학협력단 유전자가위 기반 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 신속 검출
CN114807334A (zh) * 2022-05-31 2022-07-29 深圳联合医学科技有限公司 目标基因的检测方法、引物组、试剂盒及应用
WO2024064136A1 (en) * 2022-09-19 2024-03-28 Domus Diagnostics, Inc. Rapid molecular diagnostics with unified-one-pot sample processing, nucleic acid amplification, and result readout
KR102576803B1 (ko) * 2022-10-14 2023-09-12 주식회사 풀무원 CRISPR-Cas 기반의 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 조성물 및 이를 이용한 리스테리아 모노사이토제네스 검출방법
US20240254571A1 (en) * 2023-01-26 2024-08-01 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy Degenerate CRISPR Cas13a crRNAs for Detection of Highly Variable RNA Sequences

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160161413A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 Bubble Technology Industries Inc. System and method for detection of contaminants
US20160175462A1 (en) * 2013-06-17 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
CN110506128A (zh) * 2016-12-09 2019-11-26 博德研究所 基于crispr效应系统的诊断

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2044616A1 (en) 1989-10-26 1991-04-27 Roger Y. Tsien Dna sequencing
ATE341621T1 (de) 1997-10-24 2006-10-15 Invitrogen Corp Rekombinatorisches klonieren unter verwendung von nukleinsaüren mit rekombinationsstellen
US6465177B1 (en) 1998-10-26 2002-10-15 John Wayne Cancer Institute Detection of loss of heterozygosity in tumor and serum of melanoma patients
AU3811101A (en) * 2000-02-11 2001-08-20 Lawrence Blatt Method and reagent for the modulation and diagnosis of cd20 and nogo gene expression
US6699722B2 (en) * 2000-04-14 2004-03-02 A-Fem Medical Corporation Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes
EP1356094B1 (en) * 2000-06-26 2010-01-13 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US20030064366A1 (en) 2000-07-07 2003-04-03 Susan Hardin Real-time sequence determination
WO2002044425A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
CA2476835A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 University Of Virginia Patent Foundation A non-invasive diagnostic test utilizing histone modification markers
SI3363809T1 (sl) 2002-08-23 2020-08-31 Illumina Cambridge Limited Modificirani nukleotidi za polinukleotidno sekvenciranje
CA2554007C (en) 2004-01-27 2013-03-26 Altivera L.L.C. Diagnostic radio frequency identification sensors and applications thereof
WO2006044078A2 (en) 2004-09-17 2006-04-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for analysis of molecules
WO2006042112A2 (en) * 2004-10-05 2006-04-20 California Institute Of Technology Aptamer regulated nucleic acids and uses thereof
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
WO2007052765A1 (ja) * 2005-11-02 2007-05-10 Shimadzu Corporation Rnaの抽出方法及びrnaの検出方法
CA2648149A1 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Solexa, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
WO2007121276A2 (en) 2006-04-12 2007-10-25 Biocept, Inc. Enrichment of circulating fetal dna
AU2007309504B2 (en) 2006-10-23 2012-09-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
WO2008149176A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Cellectis Meganuclease variants cleaving a dna target sequence from the mouse rosa26 locus and uses thereof
US8921118B2 (en) 2008-03-27 2014-12-30 President And Fellows Of Harvard College Paper-based microfluidic systems
US20100240054A1 (en) 2008-09-22 2010-09-23 Biocept, Inc. Identification and isolation of fetal cells and nucleic acid
CN102666872A (zh) * 2009-09-25 2012-09-12 艾利尔圣迭戈公司 粗基质中的核酸的检测
AU2011220736C1 (en) 2010-02-24 2014-12-18 The Broad Institute, Inc Methods of diagnosing infectious disease pathogens and their drug sensitivity
CN102884170A (zh) 2010-03-04 2013-01-16 新加坡国立大学 检测和分离细胞的微流体分选器
US8771985B2 (en) 2010-04-26 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using zinc-finger nucleases
WO2012125781A2 (en) 2011-03-15 2012-09-20 Colorado State University Research Foundation Rapid detection of pathogens using paper devices
US9464331B2 (en) * 2011-07-06 2016-10-11 Quest Diagnostics Investments Incorporated Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens
GB201115098D0 (en) 2011-09-01 2011-10-19 Belgian Volition Sa Method for detecting nucleosomes containing histone variants
US20140295472A1 (en) 2011-11-10 2014-10-02 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Paper Based Diagnostic Test
WO2013188638A2 (en) * 2012-06-15 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Endoribonucleases and methods of use thereof
WO2014047561A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for labeling of agents
SG11201504523UA (en) 2012-12-12 2015-07-30 Broad Inst Inc Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
US11441196B2 (en) 2013-03-15 2022-09-13 The Broad Institute, Inc. Ribosomal ribonucleic acid hybridization for organism identification
US9873907B2 (en) 2013-05-29 2018-01-23 Agilent Technologies, Inc. Method for fragmenting genomic DNA using CAS9
US20150065821A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 Google Inc. Nanoparticle Phoresis
US10196684B2 (en) * 2013-10-18 2019-02-05 California Institute Of Technology Enhanced nucleic acid identification and detection
JP6387606B2 (ja) * 2013-11-27 2018-09-12 東ソー株式会社 核酸の検出方法
US10253353B2 (en) 2013-12-06 2019-04-09 The Broad Institute, Inc. Enhanced methods of ribonucleic acid hybridization
US9737251B2 (en) 2014-05-28 2017-08-22 Verily Life Sciences Llc Needle-free blood draw
CN107208137A (zh) * 2014-10-20 2017-09-26 龙公司 检测rna病毒的组合物和方法
WO2016100975A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Massachsetts Institute Ot Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
EP3250689B1 (en) * 2015-01-28 2020-11-04 The Regents of The University of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
WO2016172598A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 The Broad Institute Inc. Exosomes and uses thereof
EP3297660A2 (en) 2015-05-20 2018-03-28 The Broad Institute Inc. Shared neoantigens
EP3314020A1 (en) 2015-06-29 2018-05-02 The Broad Institute Inc. Tumor and microenvironment gene expression, compositions of matter and methods of use thereof
US11332783B2 (en) 2015-08-28 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Sample analysis, presence determination of a target sequence
WO2017070605A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 The Broad Institute Inc. Type vi-b crispr enzymes and systems
WO2017205668A1 (en) * 2016-05-25 2017-11-30 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Portable, low-cost pathogen detection and strain identification platform
US10337051B2 (en) * 2016-06-16 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for detecting a target RNA
WO2018100431A1 (en) * 2016-11-29 2018-06-07 Genomic Vision Method for designing a set of polynucleotide sequences for analysis of specific events in a genetic region of interest
US11584955B2 (en) * 2017-07-14 2023-02-21 Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited Application of Cas protein, method for detecting target nucleic acid molecule and kit
CN107939288B (zh) 2017-11-14 2019-04-02 中国科学院地质与地球物理研究所 一种非旋转套的防转装置以及旋转导向装置
WO2020186223A1 (en) * 2019-03-14 2020-09-17 The Broad Institute, Inc. Sherlock assays for tick-borne diseases
US11453907B2 (en) * 2020-03-23 2022-09-27 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based coronavirus diagnostics

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160175462A1 (en) * 2013-06-17 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using viral components
US20160161413A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 Bubble Technology Industries Inc. System and method for detection of contaminants
CN110506128A (zh) * 2016-12-09 2019-11-26 博德研究所 基于crispr效应系统的诊断

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EAST-SELETSKY ET AL.: "\"Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection\"", 《NATURE》, vol. 538, pages 272 *
MAX J KELLNER ET AL.: ""SHERLOCK: Nucleic acid detection with CRISPR nucleases"", 《SHERLOCK: NUCLEIC ACID DETECTION WITH CRISPR NUCLEASES》, vol. 14, no. 10, pages 1 - 42 *

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111548918A (zh) * 2020-05-14 2020-08-18 上海交通大学 一种能实现多体系兼容的全封闭一体式反应管
CN111653312B (zh) * 2020-05-28 2021-04-16 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种利用基因组数据探究疾病亚型亲缘性的方法
CN111653312A (zh) * 2020-05-28 2020-09-11 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种利用基因组数据探究疾病亚型亲缘性的方法
CN111733287A (zh) * 2020-06-22 2020-10-02 天津大学 检测发热伴血小板减少综合征病原体核酸的试剂盒
CN111733287B (zh) * 2020-06-22 2022-10-11 天津大学 检测发热伴血小板减少综合征病原体核酸的试剂盒
CN111733294A (zh) * 2020-07-27 2020-10-02 广州动物园 鹦鹉博尔纳病毒4型的鉴定引物、鉴定方法和试剂盒
CN111996291A (zh) * 2020-08-21 2020-11-27 深圳海关动植物检验检疫技术中心 用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用
CN112501256A (zh) * 2020-12-03 2021-03-16 台州市中心医院（台州学院附属医院） 一种CRSPR-cas13a驱动的基于双酶信号扩增策略的RNA快速检测方法
CN112575059A (zh) * 2020-12-08 2021-03-30 天津大学 核酸检测试剂及检测方法
CN112609010B (zh) * 2020-12-09 2023-03-10 四川大学 一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒
CN112609010A (zh) * 2020-12-09 2021-04-06 四川大学 一种基于点亮型RNA适体的CRISPR-Cas13核酸检测试剂盒
CN112813179A (zh) * 2020-12-09 2021-05-18 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院） 一种用于尿路感染病原菌检测的试剂盒及其使用方法
CN112646932A (zh) * 2021-01-08 2021-04-13 湖南超亟检测技术有限责任公司 一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒
CN112904002A (zh) * 2021-02-01 2021-06-04 广西大学 一种基于stern-volmer原理检测甘蔗中高粱花叶病毒的方法
CN113504274A (zh) * 2021-07-20 2021-10-15 郑州轻工业大学 一种共价有机骨架材料及其制备方法和应用，适配体传感器及其制备方法
CN113504274B (zh) * 2021-07-20 2023-11-21 郑州轻工业大学 一种共价有机骨架材料及其制备方法和应用，适配体传感器及其制备方法
CN113791207A (zh) * 2021-08-06 2021-12-14 南方科技大学 高灵敏度的免疫检测方法及其应用
CN115961088A (zh) * 2021-10-11 2023-04-14 首都医科大学附属北京佑安医院 检测hiv k103n突变的成套试剂与试剂盒
CN114703324A (zh) * 2022-03-29 2022-07-05 广西壮族自治区兽医研究所 检测禽偏肺炎病毒的试剂及方法
CN114854862A (zh) * 2022-05-31 2022-08-05 重庆大学 一种检测融合基因及其变体的系统以及方法和应用
CN115011713A (zh) * 2022-06-15 2022-09-06 湖南工程学院 基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法
CN115011713B (zh) * 2022-06-15 2023-09-26 湖南工程学院 基于DNAzyme双循环体系的牛结核分枝杆菌检测探针组及其检测方法
CN115820939A (zh) * 2022-12-18 2023-03-21 厦门大学 用于猴痘病毒检测的crRNA、核酸分子组合物、检测体系及应用
CN115820939B (zh) * 2022-12-18 2024-09-13 厦门大学 用于猴痘病毒检测的crRNA、核酸分子组合物、检测体系及应用
CN116904662A (zh) * 2023-01-10 2023-10-20 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法
CN117646089A (zh) * 2024-01-22 2024-03-05 烟台海关技术中心 YHV-1检测引物、crRNA、CRISPR组合物、试剂盒及应用

Also Published As

Publication number Publication date
IL269330A (en) 2019-11-28
KR20190140918A (ko) 2019-12-20
AU2018234832A1 (en) 2019-10-10
EP3596218A1 (en) 2020-01-22
US20200181720A1 (en) 2020-06-11
EP3596218B1 (en) 2023-08-23
EP3596218A4 (en) 2020-12-30
JP2020513815A (ja) 2020-05-21
CA3056411A1 (en) 2018-09-20
SA519410124B1 (ar) 2023-03-12
BR112019019087A2 (pt) 2020-05-12
JP2023052052A (ja) 2023-04-11
WO2018170340A1 (en) 2018-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7527961B2 (ja) Ｃｒｉｓｐｒエフェクター系に基づく診断
JP7228514B2 (ja) Ｃｒｉｓｐｒエフェクターシステムベースの診断法
CN111108220A (zh) 用于病毒检测的基于crispr效应系统的诊断
US20220090178A1 (en) Devices for crispr effector system based diagnostics
US11104937B2 (en) CRISPR effector system based diagnostics
CN111836903A (zh) 基于crispr效应系统的多重诊断
US20180298445A1 (en) Crispr effector system based diagnostics
CN111630162A (zh) 基于crispr效应系统的诊断
AU2018329947A1 (en) Multi-effector CRISPR based diagnostic systems
WO2022051667A1 (en) Crispr effector system based diagnostics for virus detection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination