CN112575059A - 核酸检测试剂及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及核酸检测试剂及检测方法。本发明提供的核酸检测试剂中，包括I)、Cas13d蛋白；II)、crRNA或其转录模板；III)、ssRNA reporter。利用该试剂对RNA进行检测，不需要将RNA反转录为DNA，节省了时间和步骤；因此ssRNA reporter的设计更加方便多样；能针对任何核酸可能的序列和突变进行检测，反应所需的时间更短。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，尤其涉及核酸检测试剂及检测方法。
背景技术
今天，在人类基因分型和病原体检测等领域，对快速和成本低、效益高的核酸检测方法的开发需求仍在增长。目前，已经开发了许多用于快速核酸检测的方法，然而，它们可能无法同时满足特异性、敏感性、速度、成本和简单性。CRISPR/Cas系统最初作为微生物抵御外来核酸入侵的生化特性被科学家发现认识，随着对该系统研究的深入，截止到目前已经有多种CRISPR/Cas系统被开发成快速、高灵敏的核酸检测工具，并且由于其高度的灵活性、高度敏感性和特异性，正在快速的发展。
2017年，张锋课题组建立了一种非常高效的基于CRISPR-Cas13a蛋白的核酸诊断技术命名为“SHERLOCK”。它是基于RNA引导的靶向RNA的CRISPR效应器Cas13a的顺式和反式切割RNA的原理开发的核酸检测技术。只有当Cas13a-crRNA复合体与靶RNA结合后，才会对设计的短的单链RNA reporter(5’端带有FAM基团，3’端带有荧光淬灭基团)进行切割，产生荧光信号，从而完成检测。“SHERLOCK”技术具有较高的灵敏度(aM)和特异性，对靶RNA的检测非常方便，能够特异性检测寨卡病毒、登革热病毒以及新冠肺炎病毒等。2018年，张锋课题组使用多种蛋白，利用相同的原理开发了“SHERLOCKv2”技术，该技术能够同时快速、较高灵敏的进行多种核酸的检测。
2018年，Jennifer A.Doudna等，应用CRISPR-Cas12a蛋白具有顺式和反式切割ssDNA的特性，开发了“DETECTR”核酸检测技术。同年，中科院课题组应用CRISPR-Cas12a蛋白具有顺式和反式切割ssDNA的特性，开发了“HOLMES”核酸检测技术。应用CRISPR-Cas12a蛋白开发的检测技术同样具有快速和高灵敏度。和“SHERLOCK”技术不同的是，“DETECTR”和“HOLMES”的靶标和reporter都为DNA，因此检测RNA时需要将RNA反转录为DNA才能进行检测，操作步骤繁琐。
可见，现有技术中无论是应用CRISPR-Cas13a蛋白还是CRISPR-Cas12a蛋白进行核酸检测，都需要Cas蛋白首先与靶核酸结合，并能够激活这种蛋白的附加切割其他核酸的功能才能够实现检测功能。并且，Cas13a蛋白分子量大；对ssRNA反式切割有碱基偏好性，因此RNA reporter的设计需要考虑碱基偏好性，限制了RNA reporter的种类；而Cas12a蛋白分子量也很大；靶标为DNA，因此检测RNA需要将RNA反转录为DNA才能进行检测，操作过程繁琐，导致对RNA的检测需要的要求较高。因此，本领域仍在寻找更简单快捷准确的核酸检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供核酸检测试剂及其应用，该试剂可以直接对RNA进行检测，且能够快速高效的切割ssRNA，进而快速、准确的检测核酸。
本发明提供的核酸检测试剂，包括：
I)、Cas13d蛋白；
II)、crRNA或其转录模板；
III)、ssRNA reporter。
在本发明中，所述Cas13d蛋白为Es Cas13d或Rsp Cas13d。
所述crRNA的序列中包括：靶向识别序列和Cas13d识别序列。
在本发明中，所述crRNA的序列中，5’端至3’端依次为Cas13d识别序列和靶向识别序列。其中，识别Es Cas13d的序列如SEQ ID NO:1所示；识别Rsp Cas13d的序列如SEQ IDNO:2所示。
所述crRNA转录模板的序列中，5’端至3’端依次为T7 promoter序列、Cas13d识别序列和靶向识别序列。其中，识别Es Cas13d的序列如SEQ ID NO:3所示；识别Rsp Cas13d的序列如SEQ ID NO:4所示。
所述靶向识别序列长度为19～36bp且与待测核酸反向互补。
一些实施例中，所述T7 promoter序列如SEQ ID NO:5所示。
一些具体实施例中，待测RNA的序列如SEQ ID NO:7所示，当以EsCas13d作为蛋白时，检测该待测RNA的试剂中，crRNA的序列如SEQ ID NO:11所示。该crRNA的转录模板的序列如SEQ ID NO:10所示。
一些具体实施例中，待测RNA的序列如SEQ ID NO:7所示，当以RspCas13d作为蛋白时，检测该待测RNA的试剂中，crRNA的序列如SEQ ID NO:13所示。该crRNA的转录模板的序列如SEQ ID NO:12所示。
一些具体实施例中，待测RNA的序列如SEQ ID NO:9所示，当以EsCas13d作为蛋白时，检测该待测RNA的试剂中，crRNA的序列如SEQ ID NO:15所示。该crRNA的转录模板的序列如SEQ ID NO:14所示。
一些具体实施例中，待测RNA的序列如SEQ ID NO:9所示，当以RspCas13d作为蛋白时，检测该待测RNA的试剂中，crRNA的序列如SEQ ID NO:17所示。该crRNA的转录模板的序列如SEQ ID NO:16所示。
本发明中，所述ssRNA reporter包括顺序连接的荧光基团、短核苷酸和淬灭基团，所述短核苷酸的序列中至少包括2个相连的核糖核苷酸残基。
本发明中，所述短核苷酸的序列由核糖核酸组成，或者由核糖核酸和脱氧核糖核酸组成。其中包括至少2个相连的核糖核酸残基。作为优选，所述短核苷酸序列由核糖核酸组成。所述短核苷酸的长度为4bp～30bp。本发明中，所述短核苷酸的长度为6bp。一些具体实施例中，所述短核苷酸的序列为UUUUUU。
一些实施例中，所述ssRNA reporter的结构为5’-3’端依次为FAM基团-UUUUUU-淬灭基团。
本发明所述的待测核酸为RNA，特别是短单链RNA。对于DNA的检测，可以通过将DNA分子转录为RNA来实现。例如，本发明所述的检测试剂可以对siRNA、miRNA进行检测，也可将单链DNA或双链DNA分子转录为RNA后进行检测。也可以用带有T7 Promter的引物将DNA进行pcr，让目标DNA带有T7Promter，在检测系统中加入T7转录酶和带有T7promter的DNA，可以直接检测DNA。
在本发明所述的核酸检测试剂，还包括反应缓冲液；所述反应缓冲液中包括Hepes-KOH、MgCl2和盐；所述盐选自NaCl或KCl。
一些实施例中，所述核酸检测试剂的反应缓冲液中包括Hepes-KOH 20mmol/L、MgCl2 10mmol/L、NaCl 60mmol/L。
一些实施例中，所述核酸检测试剂的反应缓冲液中包括Hepes-KOH 20mmol/L、MgCl2 10mmol/L、KCl 150mmol/L。
一些实施例中，所述核酸检测试剂的反应缓冲液中包括Hepes-KOH 20mmol/L、MgCl2 10mmol/L、KCl 50mmol/L。
本发明提供的一种核酸检测试剂，其包括：Es Cas13d蛋白、crRNA或其转录模板、ssRNA reporter、buffer、RNA酶抑制剂和Rnase free H2O；
其中，所述crRNA中5’端至3’端依次包括：如SEQ ID NO:1所示序列和靶向识别序列；所述crRNA的转录模板中5’端至3’端依次包括：T7 promoter序列、如SEQ ID NO:3所示序列和靶向识别序列；所述靶向识别序列长度为19～36bp且与待测核酸反向互补。
所述ssRNA reporter的5’端至3’端依次包括顺序连接的FAM荧光基团、短核苷酸和淬灭基团，所述短核苷酸的序列为UUUUUU；
所述buffer中包括：20mmol/L Hepes-KOH、60mmol/L NaCl、10mmol/L MgCl2。
本发明提供的另一种核酸检测试剂，其包括：Rsp Cas13d蛋白、crRNA或其转录模板、ssRNA reporter、buffer、RNA酶抑制剂和Rnase free H2O；
其中，所述crRNA中5’端至3’端依次包括：如SEQ ID NO:2所示序列和靶向识别序列；所述crRNA的转录模板中5’端至3’端依次包括：T7 promoter序列、如SEQ ID NO:4所示序列和靶向识别序列；所述靶向识别序列长度为19～36bp且与待测核酸反向互补
所述ssRNA reporter的5’端至3’端依次包括顺序连接的FAM荧光基团、短核苷酸和淬灭基团，所述短核苷酸的序列为UUUUUU；
所述buffer中包括：20mmol/L Hepes-KOH、50mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2。
本发明还提供了一种核酸的检测方法，其采用本发明所述的核酸检测试剂对待测样品进行检测，检测步骤包括：
制备Cas13d蛋白与crRNA的复合物Cas13d-crRNA；
将Cas13d-crRNA、待测样品和ssRNAreporter混合，经孵育后，根据荧光信号判断是否存在待测核酸。
所述Cas13d-crRNA的制备方法包括：将Cas13d蛋白与crRNA混合，在buffer和RNA酶抑制剂存在条件下，37℃反应，获得Cas13d-crRNA。所述Cas13d-crRNA的制备中37℃反应20min。
本发明所述检测方法中，检测反应的体系包括：Buffer1 1.8μL(Buffer3 1.6μL)、Rnase free H2O 12.2μL、cRNA(10ng/μL)1μL、Cas13d蛋白(63.3μg/mL)2μL、Murine RNaseinhibitor(40U/μL)1μL、待测样本1μL、ssRNA repoter(10μM)1μL。
将Cas13d-crRNA、待测样品和ssRNA reporter混合后，所述孵育的温度为37℃，时间为1～5h。优选的，孵育的时间为3h。
所述荧光信号的检测采用本领域常用的方法即可。在本发明实施例中，采用实时荧光PCR仪对反应产生的荧光信号进行检测。
本发明提供的核酸检测试剂中，包括I)、Cas13d蛋白；II)、crRNA或其转录模板；III)、ssRNA reporter。利用该试剂对RNA进行检测，至少包括如下优势：1，在RNA检测中，不需要将RNA反转录为DNA，节省了时间和步骤；2，EsCas13d和RspCas13d蛋白对ssRNA反式切割碱基偏好性相对低，因此ssRNA reporter的设计更加方便多样；3，EsCas13d和RspCas13d蛋白对其靶标RNA没有PFS偏好性，应用于核酸检测，能针对任何核酸可能的序列和突变进行检测；4，EsCas13d和RspCas13d蛋白能够快速、高效的切割短ssRNA reporter，进而快速检测核酸。总之，本发明能够更加快速、高效、低成本的进行特定核酸检测以及应用于其他小分子的检测。
附图说明
图1示本发明的检测原理示意图；
图2示尿素变性胶验证蛋白活性及Buffer选择；
图3示本发明的检测实验结果，其中2-a示对TargetRNA-1的检测结果，2-b示对TargetRNA-2的检测结果；
图4示反应30min以及180min后荧光报告情况。
具体实施方式
本发明提供了核酸检测试剂及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
EsCas13d蛋白和RspCas13d蛋白具有和CRISPR-Cas13a蛋白相似的特性，能够顺式和反式切割ssRNA。CRISPR-Cas13d蛋白比Cas13a和Cas12a蛋白分子量小约20％核苷酸，且相对于Cas13a蛋白而言，Cas13d蛋白对ssRNA reporter的切割碱基偏好性低，因此能够多样设计RNA reporter。
本发明中，所述Es Cas13d或Rsp Cas13d通过表达商业化质粒制备，所述质粒经大肠杆菌表达系统表达后，菌液离心弃去上清，重悬破碎再离心后，用AKTA分别过Ni柱和脱盐柱进行纯化。
在本发明的试剂中，Cas13d蛋白与其他组分相互独立存在，或者Cas13d蛋白与其他组分混合存在。其可为粉末也可以为溶液形式，本发明对此不做限定。
在本发明所述的crRNA的序列中，靶向识别序列能够识别待测样品中的靶标RNA分子，其中的Cas13d识别序列能够使crRNA与Cas13d蛋白结合形成复合物Cas13d-crRNA。当检测的反应体系中含有Target RNA时，Cas13d-crRNA与Target RNA结合，会激活Cas13d蛋白反式切割ssRNA reporter中短核苷酸的活性，使荧光基团与淬灭基团分离从而产生荧光。反之，若检测的反应体系中不含有Target RNA，则Cas13d-crRNA复合物不能与Target RNA没有结合，则不能切割ssRNA reporter，也不能产生荧光。本发明应用这一原理(图1)，可以快速高效的进行特定核酸检测。
在本发明中，所述crRNA在试剂盒中可以RNA的形式存在，基于稳定保存的考虑，也可以以其转录模板的形式存在，即以DNA形式存在。
在本发明中，所述ssRNA reporter中，包括顺序连接的荧光基团、短核苷酸和淬灭基团。其中荧光基团位于ssRNA reporter的5’端，或者ssRNA reporter的3’端。即，所述ssRNA reporter的5’-3’端依次为荧光基团、短核苷酸和淬灭基团，或者所述ssRNAreporter的5’-3’端依次为淬灭基团、短核苷酸和荧光基团。
本发明中，所述ssRNA reporter中的短核苷酸为短单链核苷酸，优选为短单链核糖核酸。所述短核苷酸中可以含有脱氧核糖核酸，当短核苷酸中含有脱氧核糖核酸时，其中至少包括2个相连的核糖核苷酸残基。在本发明的一个具体实施例中，所述短核苷酸的序列为UUUUUU。所述ssRNA reporter的结构为5’-3’端依次为FAM基团-UUUUUU-淬灭基团。本发明所述ssRNA reporter的制备采用人工合成的方式。
实施例中涉及核酸序列如表1所示：
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例
一、检测试剂制备
1.EsCas13d或RspCas13d蛋白的表达及纯化；
表达EsCas13d蛋白的质粒(pET28a-MH6-EsCas13d)和表达RspCas13d蛋白的质粒(pET28a-MH6-RspCas13d_RspCasWYL1)均从Addgene购买，将两种质粒化分别转入BL21(DE3)中，分别进行蛋白的表达和纯化，获得EsCas13d蛋白和RspCas13d蛋白。
2、Target-RNA制备
将SEQ ID NO:7、9所示核酸序列的RNA分子作为检测目标，其制备方法为：
以SEQ ID NO:6所示的DNA为模板转录获得SEQ ID NO:7所示的Target-RNA-1；
以SEQ ID NO:8所示的DNA为模板转录获得SEQ ID NO:9所示的Target-RNA-2。
3、crRNA制备
制备识别Target-RNA且与Cas13d蛋白结合的crRNA：
以SEQ ID NO:10所示的DNA为模板转录获得SEQ ID NO:11所示的EsCas13dcrRNA1；
以SEQ ID NO:12所示的DNA为模板转录获得SEQ ID NO:13所示的RspCas13dcrRNA1；
以SEQ ID NO:14所示的DNA为模板转录获得SEQ ID NO:15所示的EsCas13dcrRNA2；
以SEQ ID NO:16所示的DNA为模板转录获得SEQ ID NO:17所示的RspCas13dcrRNA2；
将转录获得的crRNA经纯化(EasyPure RNA Purificaton Kit)，用于此后的实验。
4、反应buffer的配制
三种反应buffer如表2所示，配制buffer的各组分母液浓度均为1mol/L，不足部分以Rnase free H2O补足。
表2三种Reaction Buffer
| 组分 | Buffer1 | Buffer2 | Buffer3 |
| Hepes-KOH | 20mM | 20mM | 20mM |
| NaCl | 60mM | - | - |
| MgCl<sub>2</sub> | 10mM | 10mM | 10mM |
| KCl | - | 150mM | 50mM |
| KOH调节pH＝6.8 | KOH调节pH＝7.6 | KOH调节pH＝7.1 |
5、ssRNA reporter于华大基因公司合成
ssRNA reporter结构5’至3端为：FAM/rUrUrUrUrUrU/3IABkFQ。
6、另外准备Rnase free H2O、Murine RNase inhibitor(40U/μL)、2×RNALoading Buffer作为检测试剂中的组分。
二、纯化蛋白的活性验证及反应Buffer的选择
采用步骤一中制备的试剂，按照表2设计进行实验：
表2纯化蛋白的活性验证及反应Buffer的选择
按照表2分组，配制反应体系后，于37℃反应20min，然后各组反应体系加入Target-RNA-1，37℃继续反应3h后，加入20μL的2×RNA Loading Buffer,70℃加热10min，立即置于冰上。跑10％的TAE尿素变性胶，得到图2。因反应体系中没有添加割ssRNArepoter，电泳中条带是由没有被切开的Target-RNA与Loading Buffer中染料结合后产生的。因此，条带亮度越低说明切割反应进行的越完全。如图2所示，EsCas13d蛋白反应最佳Buffer为Buffer1，RspCas13d蛋白最佳反应Buffer为Buffer3。
三、EsCas13d和RspCas13d蛋白切割ssRNA reporter的验证
按照表3配制反应体系，其中Target-RNA为步骤一中合成的Target-RNA-1或Target-RNA-2，以不添加Target-RNA的体系作为对照组：
表3 EsCas13d和RspCas13d蛋白切割ssRNA repoter反应体系
将上述反应体系配好后，用实时荧光PCR(Thermo Fisher Scientific)检测荧光信号：4℃反应5min后，37℃反应3h，每隔1min中读取一次荧光数据，得到图3的结果。从图3可以看到，当Cas13d-crRNA复合物与Target RNA结合后，会切割ssRNA reporter，从而产生荧光，而Cas13d-crRNA复合物不与RNA结合，则不会切割ssRNA reporter，看不到荧光。并且，我们可以在短时间内明显的看到荧光上升，说明检测系统的高效性。
四、检测灵敏度验证
分别对Target-RNA-1和Target-RNA-2进行梯度稀释获得浓度依次为230nM、115nM、11.5nM、1.15nM、115pM的样本溶液。以表3记载的反应体系进行检测，以实时荧光PCR仪检测荧光信号，分别于反应30min以及3h检测荧光强度，各组荧光强度如图4。结果表明，反应30min已经能够检测到荧光信号，且荧光强度与模板浓度呈正相关。反应180min后，荧光强度相对于反应30min增强，在低模板浓度范围内，荧光强度仍与模板浓度呈正相关。而随着模板浓度的提高，荧光强度过强，提示可以对模板稀释后再进行检测。根据图4结果，本发明提供方法的检测限度达到了pM级，说明检测系统的灵敏性、高效性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 核酸检测试剂及检测方法
<130> MP2028659
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaacuacacc cgugcaaaau ugcagggguc uaaaac 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaactacacc cgtgcaaaat tgcaggggtc taaaac 36
<210> 3
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cuacuacacu ggugcaaauu ugcacuaguc uaaaac 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctactacact ggtgcaaatt tgcactagtc taaaac 36
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaattaata cgactcacta taggg 25
<210> 6
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga acagcaatct 60
actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgttta 120
tc 122
<210> 7
<211> 103
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gauccucuag aaauauggau uacuugguag aacagcaauc uacucgaccu gcaggcaugc 60
aagcuuggcg uaaucauggu cauagcuguu uccuguguuu auc 103
<210> 8
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taatacgact cactataggg atacgctgtg gttcgccaag tcccaatggc atcgtaaaga 60
acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga 120
ta 122
<210> 9
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
auacgcugug guucgccaag ucccaauggc aucguaaaga acauuuugag gcauuucagu 60
caguugcuca auguaccuau aaccagaccg uucagcugga ua 102
<210> 10
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaattaata cgactcacta taggggaact acacccgtgc aaaattgcag gggtctaaaa 60
ccgccaagct tgcatgcctg caggtcgag 89
<210> 11
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaacuacacc cgugcaaaau ugcagggguc uaaaaccgcc aagcuugcau gccugcaggu 60
cgag 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaattaata cgactcacta tagggctact acactggtgc aaatttgcac tagtctaaaa 60
ccgccaagct tgcatgcctg caggtcgag 89
<210> 13
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cuacuacacu ggugcaaauu ugcacuaguc uaaaaccgcc aagcuugcau gccugcaggu 60
cgag 64
<210> 14
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaattaata cgactcacta taggggaact acacccgtgc aaaattgcag gggtctaaaa 60
cgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatg 89
<210> 15
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaacuacacc cgugcaaaau ugcagggguc uaaaacgagc aacugacuga aaugccucaa 60
aaug 64
<210> 16
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaattaata cgactcacta tagggctact acactggtgc aaatttgcac tagtctaaaa 60
cgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatg 89
<210> 17
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cuacuacacu ggugcaaauu ugcacuaguc uaaaacgagc aacugacuga aaugccucaa 60
aaug 64
Claims (10)
1.核酸检测试剂，包括：
I)、Cas13d蛋白；
II)、crRNA或其转录模板；
III)、ssRNA reporter；
所述crRNA的序列中包括：靶向识别序列和Cas13d识别序列；
所述ssRNA reporter包括顺序连接的荧光基团、短核苷酸和淬灭基团，所述短核苷酸中至少包括2个相连的核糖核苷酸残基。
2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂，其特征在于，所述Cas13d蛋白为Es Cas13d或Rsp Cas13d。
3.根据权利要求1或2所述的核酸检测试剂，其特征在于，
所述crRNA的序列中，5’端至3’端依次为Cas13d识别序列和靶向识别序列；其中，识别Es Cas13d的序列如SEQ ID NO:1所示；识别Rsp Cas13d的序列如SEQ ID NO:2所示；
所述crRNA转录模板的序列中，5’端至3’端依次为T7 promoter序列、Cas13d识别序列和靶向识别序列；其中，识别Es Cas13d的序列如SEQ ID NO:3所示；识别Rsp Cas13d的序列如SEQ ID NO:4所示；
所述靶向识别序列长度为19bp～36bp且与待测核酸反向互补。
4.根据权利要求1所述的核酸检测试剂，其特征在于，所述ssRNA reporter中短核苷酸的序列为UUUUUU。
5.根据权利要求1～4任一项所述的核酸检测试剂，其特征在于，还包括反应缓冲液；所述反应缓冲液中包括Hepes-KOH、MgCl2和盐；所述盐选自NaCl或KCl。
6.一种核酸检测试剂，其特征在于，包括：Es Cas13d蛋白、crRNA或其转录模板、ssRNAreporter、buffer、RNA酶抑制剂和Rnase free H2O；
其中，所述crRNA中5’端至3’端依次包括：如SEQ ID NO:1所示序列和靶向识别序列；所述crRNA的转录模板中5’端至3’端依次包括：T7 promoter序列、如SEQ ID NO:3所示序列和靶向识别序列；所述靶向识别序列长度为19～36bp且与待测核酸反向互补
所述ssRNA reporter的5’端至3’端依次包括顺序连接的FAM荧光基团、短核苷酸和淬灭基团，所述短核苷酸的序列为UUUUUU；
所述buffer中包括：20mmol/L Hepes-KOH、60mmol/LNaCl、10mmol/L MgCl2。
7.一种核酸检测试剂，其特征在于，包括：Rsp Cas13d蛋白、crRNA或其转录模板、ssRNAreporter、buffer、RNA酶抑制剂和Rnase free H2O；
其中，所述crRNA中5’端至3’端依次包括：如SEQ ID NO:2所示序列和靶向识别序列；所述crRNA的转录模板中5’端至3’端依次包括：T7 promoter序列、如SEQ ID NO:4所示序列和靶向识别序列；所述靶向识别序列长度为19～36bp且与待测核酸反向互补
所述ssRNA reporter的5’端至3’端依次包括顺序连接的FAM荧光基团、短核苷酸和淬灭基团，所述短核苷酸的序列为UUUUUU；
所述buffer中包括：20mmol/L Hepes-KOH、50mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2。
8.一种核酸的检测方法，其特征在于，采用权利要求1～7任一项所述的核酸检测试剂对待测样品进行检测，检测步骤包括：
制备Cas13d蛋白与crRNA的复合物Cas13d-crRNA；
将Cas13d-crRNA、待测样品和ssRNA reporter混合，经孵育后，根据荧光信号判断是否存在待测核酸。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述Cas13d-crRNA的制备方法包括：将Cas13d蛋白与crRNA混合，在buffer和RNA酶抑制剂存在条件下，37℃反应，获得Cas13d-crRNA。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为37℃，时间为1～5h。
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