CN111996236A

CN111996236A - 基于crispr技术进行靶核酸检测的方法

Info

Publication number: CN111996236A
Application number: CN202011079069.XA
Authority: CN
Inventors: 梁亚峰; 孙洁; 刘锐恒
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-10-10
Also published as: CN112391446B; WO2021238556A1; CN112391446A; CN111996236B

Abstract

本发明提供了基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法，具体地，提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有靶核酸的反应体系中加入gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器，所述单链核酸检测器可以为单链DNA、单链RNA或者单链DNA‑RNA杂交体。

Description

基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，涉及基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法，尤其涉及基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性(SNPs,singlenucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs的检测与分析技术的发展尤为重要。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

尽管现有核酸检测技术众多，如何更加快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向。因此，开发新型检测体系和检测方法在核酸检测领域仍具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物，所述系统或组合物包括V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

另一方面，本发明还提供了上述系统或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。

另一方面，本发明还提供了V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在检测样品中靶核酸中的应用。

如上所述的应用，所述V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在与样品中的靶核酸结合或杂交后，可以切割体系中的单链核酸检测器。

另一方面，本发明还提供了V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在制备检测样品中靶核酸的试剂中的应用。

进一步的，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体，所述VI型CRISPR/CAS效应蛋白包括Cas13家族蛋白或其突变体。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述Cas12a选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种或任意几种；所述Cas12a优选为LbCas12a，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，或者，将SEQ ID No.5所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在其他的实施方式中，所述Cas12b的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，或者，将SEQID No.6所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas13家族蛋白包括Cas13a、Cas13b，优选的，所述Cas13a选自Lshcas13a，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，或者，将SEQ ID No.7所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，所述Cas12i蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)SEQ ID NO：2所示的蛋白；

(2)将SEQ ID NO：2所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

所述Cas12j蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)SEQ ID NO：4所示的蛋白；

(2)将SEQ ID NO：4所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白突变体包括氨基酸取代、缺失或替换，且所述突变体至少保留其trans切割活性。优选地，所述突变体具有Cis和trans切割活性。

本发明中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，包括单链核酸、双链核酸，例如单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA。

本发明中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器包括单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体的任意两种或三种的混合物，例如，单链DNA和单链RNA的组合物、单链DNA和单链DNA-RNA杂交体的组合物、单链RNA和单链DNA-RNA的组合物。

在优选的实施方式中，所述单链核酸检测器为单链寡核酸检测器。

所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。

在一个具体的实施方式中，所述Cas蛋白为Cas12i，所述靶核酸为单链核酸和/或双链核酸，优选，单链DNA和/或双链DNA，所述单链核酸检测器选自单链DNA、和/或单链RNA、和/或单链DNA-RNA杂交体。

在一个具体的实施方式中，所述Cas蛋白为Cas12j，所述靶核酸为单链核酸和/或双链核酸，优选，单链DNA和/或双链DNA，所述单链核酸检测器选自单链DNA、和/或单链RNA、和/或单链DNA-RNA杂交体。

在一个具体的实施方式中，所述Cas蛋白为Cas12a(或者，称之为cpf1)，所述靶核酸为单链核酸和/或双链核酸，优选，单链DNA和/或双链DNA，所述单链核酸检测器选自单链DNA、和/或单链RNA、和/或单链DNA-RNA杂交体。

在一个具体的实施方式中，所述Cas蛋白为Cas12b(或者，称之为C2c1)，所述靶核酸为单链核酸和/或双链核酸，优选，单链DNA和/或双链DNA，所述单链核酸检测器选自单链DNA、和/或单链RNA、和/或单链DNA-RNA杂交体。

在一个具体的实施方式中，所述Cas蛋白为Cas13a，所述靶核酸为RNA，优选，所述单链核酸检测器选自单链DNA、和/或单链RNA、和/或单链DNA-RNA杂交体。

本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

在一些实施方式中，本发明的方法还包括测量CRISPR/CAS效应蛋白(Cas蛋白)产生的可检测信号的步骤。所述Cas蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发单链核酸的切割活性，从而切割所述单链核酸检测器进而产生可检测信号。

本发明中，所述可检测信号可以是当切割单链核酸检测器时产生的任何信号。例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化)，基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。

在优选的实施方式中，所述可检测信号通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的报告信号；例如，单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。

在一个实施方式中，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在其他的实施方式中，所述可检测信号还可以通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式检测反应信号。

在一个实施方式中，所述的靶核酸包括DNA、RNA，优选为单链核酸或双链核酸或核酸修饰物。

在一个实施方式中，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的，所述靶核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM等方法富集或扩增的产物。

在一个实施方式中，所述方法还包括从样品中获得靶核酸的步骤。

在一个实施方式中，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸，如特定的突变位点或SNP位点或与对照有差异的核酸；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒，例如，乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒，冠状病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，优选地，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。

在一些实施方式中，所述靶核酸来源于细胞，例如，来源于细胞裂解液。

在一些实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定量的，在其他的实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定性的。

优选的，所述单链核酸检测器在被所述Cas蛋白切割之前产生第一可检测信号，并且在被切割之后产生不同于第一可检测信号的第二可检测信号。

在其他的实施方式中，单链核酸检测器包括一个或多个的修饰，例如碱基修饰，骨架修饰，糖修饰等，以向核酸提供新的或增强的特征(例如改进的稳定性)。合适修饰的例子包括修饰的核酸骨架和非天然核苷间连接，具有修饰主链的核酸包括那些在主链中保留磷原子的核酸和那些在主链中不具有磷原子的核酸。合适的其中含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基膦酸酯。在一些实施方式中，单链核酸检测器包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷键。在其他的实施方式中，所述单链核酸检测器可以是核酸模拟物；在某些实施方式中，所述核酸模拟物为肽核酸(PNA)，另一类核酸模拟物是基于具有连接到吗啉环上的杂环碱基的连接吗啉基单元(吗啉基核酸)，其他的核酸模拟物还包括环己烯基核酸(CENA)，还包括核糖或者脱氧核糖链。

另一方面，本发明提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸中是否存在待检测的特征序列的方法，所述方法包括：

(1)提供靶核酸、gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器；

(2)所述gRNA能够靶向待检测的特征序列，所述Cas蛋白在所述gRNA的作用下识别所述待检测的特征序列，所述Cas蛋白识别所述待检测的特征序列后激发单链核酸切割活性；

(3)所述Cas蛋白通过单链核酸切割活性切割所述单链核酸检测器，所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割后与所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前相比表现出可检测的区别；

(4)测试是否能够检测出步骤(3)所述的可检测的区别；如果能够检测出步骤(3)所述的可检测的区别，则反映靶核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测出步骤(3)所述的可检测的区别，则反映靶核酸中不含有待检测的特征序列。

在一个实施方式中，所述步骤(3)和(4)可以通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的报告信号，通过报告信号的有无反映靶核酸中是否含有待检测的特征序列；能够检测到报告信号，则反映靶核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测到报告信号，则反映靶核酸中不含有待检测的特征序列。例如，单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号，通过荧光信号的有无反映靶核酸中是否含有待检测的特征序列；能够检测到荧光信号，则反映靶核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检测到荧光信号，则反映靶核酸中不含有待检测的特征序列。

在一个实施方式中，所述步骤(3)和(4)还可以通过其他的方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式，检测所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后的胶体金测试结果以反映靶核酸中是否含有待检测的特征序列；所述单链核酸检测器被Cas蛋白切割前和被Cas蛋白切割后在胶体金的检测线和质控线上将表现出不同的显色结果。

另一方面，本发明还提供了一种基于CRISPR技术检测靶核酸中是否存在待检测的特征序列的系统，所述系统包括：gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器。

另一方面，本发明还提供了一种基于CRISPR技术的用于检测靶核酸中是否存在待检测的特征序列的试剂盒，所述试剂盒包括：gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器。

进一步的，所述试剂盒还包括用于扩增得到靶核酸的引物。

另一方面，本发明还提供了上述系统或者上述试剂盒在诊断待测样品中是否存在待检测的特征序列中的用途。

进一步的，所述用途包括从待测样品中获得靶核酸，进一步检测靶核酸中是否存在待检测的特征序列。

优选的，可以通过基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)、PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)从待测样品中获得靶核酸。

在优选的实施方式中，所述待检测的特征序列为病毒特异的序列、细菌特异的序列、与疾病相关的特征序列、特定的突变位点或SNP位点；优选的，所述病毒为植物病毒或动物病毒；优选的，所述病毒为冠状病毒，优选，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。如果靶核酸中存在上述待检测的特征序列，则可以反映出靶核酸来源的样品为某种病毒、细菌，或者是感染了某种病毒、细菌、疾病，或者是具有特定的突变位点或SNP位点。

所述Cas蛋白优选V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白，例如，选自Cas12、Cas13、Cas14家族蛋白或其突变体。

在一个实施方式中，所述Cas12a选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种或任意几种；所述的Cas12a优选为LbCas12a，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，或者，将SEQ ID No.5所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas13家族蛋白包括Cas13a、Cas13b，优选的，所述Cas13a选自Lshcas13a，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示或者，将SEQ ID No.7所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

(1)SEQ ID NO：2所示的蛋白；

所述Cas12j蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)SEQ ID NO：4所示的蛋白；

在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白。

本发明中，所述gRNA包括靶向所述待检测特征序列的序列(导向序列)和识别Cas蛋白的序列(同向重复序列或其部分)。

本发明中，所述的导向序列包括10-40bp；优选地，12-25bp；优选地，15-23bp；优选地，16-18bp。

本发明中，所述gRNA与待检测特征序列至少有50％的匹配度，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％。

在一个实施方式中，当所述的特征序列含有一个或多个特征位点(如特定的突变位点或SNP)时，所述的特征位点与gRNA完全匹配。

在一个实施方式中，所述检测方法中可以包含一种或多种导向序列互不相同的gRNA，其靶向不同的特征序列。

在一个实施方式中，所述的识别所述待检测的特征序列包括结合和/或切割待检测特征序列。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白与gRNA的用量摩尔比为(0.8-1.2)：1。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述gRNA的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述靶核酸的用量终浓度为5-100nM，优选，10-50nM。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器的用量终浓度为100-1000nM，优选，150-800nM，优选，200-800nM，优选，200-500nM，优选，200-300nM。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器具有2-300个核苷酸，优选，3-200个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器为单链DNA分子、单链RNA分子或单链DNA-RNA杂交体。

在一个实施方式中，所述方法可用于待检测特征序列的定量检测。

术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸(例如RNA、DNA)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)与另一核酸形成碱基对和/或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多(例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多)。

应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100％。

本发明发现V型或VI型CRISPR/CAS蛋白(包括Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b、Cas13a)一旦通过检测靶核酸而被激活，就可以混杂地切割非靶向单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)或者单链DNA-RNA杂交体。因此，当靶核酸存在于样品中时，可以利用所述CRISPR/CAS蛋白切割单链核酸检测器(包括，单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体)，通过单链核酸检测器所表现出的检测信号来进行检测。

一般定义：

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“寡核苷酸”是指含有3-100个核苷酸的序列，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444，Thompson etal.,1994,Nucleic AcidsRes 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA，Genetics Computer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。

如本文所用，所述“CRISPR”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。

如本文所用，“生物素(biotin)”也称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子维生素。“亲和素(avidin)”，又称抗生物素，是一种碱性糖蛋白，具有4个同生物素亲和例极高的结合位点，常用亲和素有链霉亲合素。生物素与亲和素的极强亲和力可用于在检测体系中放大或增强检测信号。如生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合，而结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。

特征序列

如本文所用，所述“特征序列”或“待检测特征序列”或“待检测的特征序列”可以互换使用，均指表征生物体特异性或某些特有特征的核酸序列，所述特征序列与gRNA导向序列杂交促进CRISPR复合物的形成。所述的特征序列为DNA多核苷酸，其数量可以包含与gRNA导向序列互补的部分，也可以等同于或略少于gRNA导向序列互补的部分。在某些实施方式中所述的生物体包括动物、植物和微生物。所述微生物包括细菌、真菌、酵母、原生动物、寄生虫或病毒。例如，所述的特征序列可以是表征病毒特性的核酸序列(如果病毒为RNA序列，也包括通过逆转录形成的DNA序列)；例如，所述的特征序列可以是含有特异性突变位点的序列，例如动物细胞中诱发肿瘤的基因突变位点，或者在植物中改变植物性状的某些基因突变位点(如赋予ALS蛋白除草剂抗性的特异性突变位点)。

在某些实施方式中，所述病毒包括双链RNA病毒、正义RNA病毒、负义RNA病毒、逆转录病毒或其组合引起，或者病毒感染由冠状病毒科(Coronaviridae)病毒、小核糖核酸科(Picornaviridae)病毒、杯状病毒科(Caliciviridae)病毒、黄病毒科(Flaviviridae)病毒、披膜病毒科(Togaviridae)病毒、丝状病毒科(Filoviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒科(Pneumoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)或Delta virus引起，或者病毒感染由冠状病毒(Corona virus)、SARS、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、甲型肝炎(Hepatitis A)、诺沃克病毒(Norwalkvirus)、黄热病病毒(Yellow fever virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、丙型肝炎毒(HepatitisC virus)、登革热病毒(Dengue fever virus)、寨卡病毒(Zika virus)、风疹病毒(Rubellavirus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、辛德毕斯病毒(Sind bisvirus)、基孔肯亚病毒(Chikungunya virus)、博尔纳病病毒(Borna disease virus)、埃博拉病毒(Ebolavirus)、新型冠状病毒(2019-nCoV)、马尔堡病毒(Marburg virus)、麻疹病毒(Measlesvirus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、亨德拉病毒(Hendravirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、人呼吸道合胞病毒(Human respiratorysyncytialvirus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)、流感(Influenza)或丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus)引起。

在某些示例性实施方式中，病毒可以是选自以下的植物病毒：烟草花叶病毒(TMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、RT病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)、梅花痘病毒(PPV)、雀麦花叶病毒(BMV)、马铃薯病毒X(PVX)、柑橘衰退病毒(CTV)、大麦黄矮病毒(BYDV)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)、番茄丛生特技病毒(TBSV)、水稻球茎病毒(RTSV)、水稻黄色斑驳病毒(RYMV)、水稻灰白色病毒(RHBV)、玉米雷亚朵菲纳病毒(MRFV)、玉米矮花叶病毒(MDMV)、甘蔗花叶病毒(SCMV)、甘薯羽毛斑驳病毒(SPFMV)、甘薯沉降脉状线虫病毒(SPSVV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)、葡萄病毒A(GVA)、葡萄病毒B(GVB)、葡萄斑点病毒(GFkV)、葡萄卷叶病毒相关病毒-1、-2和-3、(GLRaV-1、-2和-3)、南芥菜花叶病毒(ArMV)、或落叶松茎麻点相关病毒(RSPaV)。

在某些实施方式中，细菌的实例包括但不限于以下的一种或多种(或其组合)：放线杆菌属(Actinobacil lus)种、放线菌纲(Actinomycetes)种、放线菌属(Actinomyces)种(例如Actinomyces israelii和Actinomyces naeslundii)、气单胞菌属(Aeromonas)种(例如Aeromonas hydrophila、Aeromonas veronii biovar sobria(Aeromonas sobria)和Aeromonas caviae)、Anaplasma phagocytophilum、Anaplasma marginale Alcaligenesxylosoxidans、Acinetobacter baumanii、Actinobacillus actinomycetemcomitans、芽孢杆菌属(Bacillus)种(例如Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus subtilis、Bacillus thuringiensis和Bacillus stearothermophilus)、拟杆菌属(Bacteriodes)、肠杆菌属(Enterobacter)种(例如Enterobacter aerogenes、Enterobacter agglomerans、Enterobacter cloacae和大肠杆菌，包括机会性大肠杆菌，例如enterotoxigenic E.coli、enteroinvasive E.coli、enteropathogenic E.coli、enterohemorrhagic E.coli、enteroaggregative E.coli和uropathogenic E.coli)、肠球菌属(Enterococcus)种(例如Enterococcus faecalis和Enterococcus faecium)、埃立克体属(Ehrlichia)种(例如Ehrlichia chafeensia和Ehrlichia canis)、Epidermophyton floccosum、Erysipelothrix rhusiopathiae、真细菌属(Eubacterium)种、Francisella tularensis、Fusobacterium nucleatum、Gardnerella vaginalis、Gemella morbillorum、嗜血杆菌属(Haemophilus)种(例如Haemophilus influenzae、Haemophilusducreyi、Haemophilusaegyptius、Haemo p hilus parainfluenza、Haemophilus haemolyticus和Haemophilus parahaemolyticus、螺杆菌属(Helicobacter)种(例如Helicobacterpylori、Helicobacter cinaedi和Helicobacter fennelliae)、Kingella kingii、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)种、乳酸菌属(Lactobacillus)种、Listeria monocytogenes、Leptospira interrogans、Legionella pneumophila、Leptospira interrogans、消化链球菌属(Peptostreptococcus)种、Mannheimia hemolytica、Microsporum canis、Moraxellacatarrhalis、摩根氏菌属(Morganell)种、动弯杆菌属(Mobiluncus)种、微球菌属(Micrococcus)种、分支杆菌属(Mycobacterium)种(例如Mycobacterium leprae、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium paratuberculosis、Mycobacteriumintracellulare、Mycobacteriumavium、Mycobacterium bovis、和Mycobacteriummarinum)、支原体属(Mycoplasm)种(例如Mycoplasma pneumoniae、Mycoplasma hominis、和Mycoplasma genitalium)、诺卡氏菌属(Nocardia)种(例如Nocardia asteroides、Nocardia cyriacigeorgica和Nocardia brasiliensis)、奈瑟氏菌属(Neisseria)种(例如Neisseria gonorrhoeae和Neisseria meningitidis)、Pasteurella multocida、Pityrosporum orbiculare(Malassezia furfur)、普罗维登斯菌属(Providencia)种(例如Providencia alcalifaciens、Providencia rettgeri和Providencia stuartii)、铜绿假单胞菌、Propionibacterium acnes、Rhodococcus equi、Rickettsia sp.、沙门氏菌属(Salmonella)种(例如Salmonella enterica、Salmonella typhi、Salmonella pa ratyphi、Salmonella enteritidis、Salmonella cholerasuis和Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)种(例如Serratia marcesans和Serratia liquifaciens)、志贺氏菌属(Shigella)种(例如Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella boydii和Shigella sonnei)、葡萄球菌属(Staphylococcus)种、链球菌属(Streptococcus)种(例如肺炎链球菌(例如氯霉素抗性血清型4肺炎链球菌、奇放线菌素抗性血清型6B肺炎链球菌、链霉素抗性血清型9V肺炎链球菌、红霉素抗性血清型14肺炎链球菌、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌、四环素抗性血清型19F肺炎链球菌、青霉素抗性血清型19F肺炎链球菌、和甲氧苄氨嘧啶抗性血清型23F肺炎链球菌、氯霉素抗性血清型4肺炎链球菌、奇放线菌素抗性血清型6B肺炎链球菌、链霉素抗性血清型9V肺炎链球菌、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌、青霉素抗性血清型1 9F肺炎链球菌、或甲氧苄氨嘧啶抗性血清型23F肺炎链球菌)、耶尔森氏鼠疫杆菌属(Yersinia)种(例如Yersinia enterocolitica、Yersinia pestis、和Yersiniapseudotuberculosis)和Xanthomonas maltophilia等。

靶核酸

如本文所用，所述“靶核酸”是指从生物样品(待测样品)中提取的多核苷酸分子。所述生物样品是从任何生物体获得、排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，包括来自健康或表面健康的人类受试者或受待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品，例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。例如，生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的液体)中获得的生物液体或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎)获得的液体，或皮肤或粘膜表面的拭子。样品也可以是从任何器官或组织获得的样品(包括活组织检查或尸体解剖标本，例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、精液等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。

在其他实施方式中，生物样品可以是植物细胞、愈伤、组织或器官(如根、茎、叶、花、种子、果实)等。

本发明中，所述的靶核酸还包括通过逆转录RNA形成的DNA分子，进一步地，所述的靶核酸可以采用本领域公知的技术对其进行扩增，所述的扩增技术等温扩增技术和非等温扩增技术，等温扩增可以是基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)。在某些示例性实施方式中，可以使用非等温扩增方法，其包括但不限于PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)。

进一步的，本发明所述的检测方法还一步包括对靶核酸扩增的步骤；所述的检测系统，还进一步包括对靶核酸进行扩增的试剂。所述扩增的试剂包括下组中的一种或多种：DNA聚合酶、链置换酶、解旋酶、重组酶、单链结合蛋白等。

Cas蛋白

本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，优选来自V型或VI型CRISPR/CAS蛋白，其一旦与待检测特征序列(靶序列)结合(即形成Cas蛋白-gRNA-靶序列的三元复合物)，就可以诱发其trans活性，即随机切割非靶向单链核苷酸(即本文所述单链核酸检测器，优选单链DNA(ssDNA)、单链DNA-RNA杂交体、单链RNA)。当Cas蛋白与特征序列结合后，其切割或不切割特征序列，均可以诱发其trans活性；优选地，其通过切割特征序列诱发其trans活性；更优选地，其通过切割单链特征序列诱发其trans活性。所述Cas蛋白通过识别与特征序列临近的PAM(protospacer adjacent motif)识别特征序列。

本发明所述的Cas蛋白为至少具有trans切割活性的蛋白，优选地，所述的Cas蛋白为具有Cis和trans切割活性的蛋白。所述的Cis活性是指Cas蛋白可在gRNA的作用下识别PAM位点并特异性切割靶序列的活性。

本发明所述的Cas蛋白包括V型和VI型CRISPR/CAS效应蛋白，包括Cas12、Cas13、Cas14等蛋白家族。优选地，例如Cas12蛋白，例如Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j；优选地，所述Cas蛋白为Cas12a、Cas12b、Cas12i、Cas12j。Cas13蛋白家族包括Cas13a、Cas13b等。

在实施方式中，本文所称的Cas蛋白，如Cas12，也涵盖Cas的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。

在一个实施方式中，编码Cas蛋白，如Cas12，的一种或多种核酸分子或其直系同源物或同源物可以被密码子优化用于在真核细胞中表达。真核生物可如本文所述。一种或多种核酸分子可以是工程化的或非天然存在的。

在一个实施方式中，Cas12蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。

在一个实施方式中，Cas蛋白可以来自：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。

在一个实施方式中，Cas蛋白选自如下序列组成的蛋白：

(1)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4-7所示的蛋白；

(2)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4-7所示氨基酸序或其活性片段列经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白还包括与上述序列具有50％，优选55％，优选60％，优选65％，优选70％，优选75％，优选80％，优选85％，优选90％，优选95％，序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。

所述的Cas蛋白可以通过重组表达载体技术获得，即将编码该蛋白的核酸分子构建到合适的载体上，再转化到宿主细胞中，使得所述的编码核酸分子在细胞中表达，从而获得相应的蛋白。所述的蛋白可以被细胞分泌出来，或者破解细胞通过常规的提取技术获得该蛋白。所述的编码核酸分子可以整合至宿主细胞的基因组中进行表达，也可以不整合到宿主细胞中进行表达。所述的载体还进一步包括有利于序列整合，或进行自我复制的调节元件。所述的载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，优选地，本发明中的表达载体是质粒。所述的载体进一步包括一种或多种调控元件，选自启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。

宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

gRNA

如本文所用，所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，导向RNA可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guidesequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与特征序列(靶序列)100％互补。所述的导向序列不与单链核酸检测器互补。

在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应靶序列之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

本发明所述的gRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。

单链核酸检测器

本发明所述的单链核酸检测器是指含有2-200个核苷酸的序列，优选，具有2-150个核苷酸，优选，3-100个核苷酸，优选，3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。优选为单链DNA分子、单链RNA分子或单链DNA-RNA杂交体。

所述的单链核酸检测器在检测方法或系统中用以报告是否含有特征序列。所述的单链核酸检测器两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态(即未被切割状态时)不呈现报告信号，当该单链核酸检测器被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。在本发明中，如果能够检测出可检测的区别，则反映靶核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检检测出所述的可检测的区别，则反映靶核酸中不含有待检测的特征序列。

在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述的单链核酸检测器具有连接至5’端第一分子(如FAM或FITC)和连接至3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测特征序列(优选，胶体金检测方式)。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端(胶体金)设有结合第一分子的抗体(即第一分子抗体)，在第一线(control line)处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线(test line)处含有与第二分子结合的第二分子的抗体(即第二分子抗体，如亲和素)。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。

本发明所述的检测方法，可用于待检测特征序列的定量检测。所述的定量检测指标可以根据报告基团的信号强弱进行定量，如根据荧光基团的发光强度，或根据显色条带的宽度等。

附图说明

图1.采用单链DNA作为单链核酸检测器验证Cas12i的检测结果。

图2.采用单链DNA作为单链核酸检测器验证Cas12j的检测结果。

图3.采用不同的单链DNA作为单链核酸检测器验证Cas12i的检测结果。

图4.采用不同的单链DNA作为单链核酸检测器验证Cas12j的检测结果。

图5.采用单链RNA作为单链核酸检测器验证Cas12i和Cas12j的检测结果。

图6.采用胶体金试纸条检测Cas12i切割单链核酸检测器的结果。

图7.利用双链DNA作为靶核酸，采用单链RNA作为单链核酸检测器验证Cas12i的检测结果。

图8.利用双链DNA作为靶核酸，采用单链RNA作为单链核酸检测器验证Cas12j的检测结果。

图9.利用单链DNA作为靶核酸，采用单链RNA作为单链核酸检测器验证Cas12a的检测结果。

图10.利用单链DNA作为靶核酸，采用单链RNA作为单链核酸检测器验证Cas12b的检测结果。

图11.以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用5’6-FAM-UUUUU-3’BHQ1作为单链核酸检测器验证Cas12i、Cas12j、Cas12a和Cas12b的检测结果。

图12.以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用5’-/56-FAM/rA rA rA rA rA/3Bio/-3’(rA表示碱基为腺嘌呤的RNA)作为单链核酸检测器验证Cas12i、Cas12j、Cas12a和Cas12b的检测结果。

图13.以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用5’-/56-FAM/rC rC rC rC rC/3Bio/-3’(rC表示碱基为胞嘧啶的RNA))作为单链核酸检测器验证Cas12i、Cas12j、Cas12a和Cas12b的检测结果。

图14.以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用FAM/TUTUT/3Bio/-3’(其中，T为DNA，U为RNA)作为单链核酸检测器验证Cas12i、Cas12j、Cas12a和Cas12b的检测结果。

图15.以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用FAM/UTUTU/3Bio/-3’(其中，T为DNA，U为RNA)作为单链核酸检测器验证Cas12i、Cas12j、Cas12a和Cas12b的检测结果。

图16.以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用FAM/ArA A rA A/3Bio/-3’(A表示碱基为腺嘌呤的DNA，rA表示碱基为腺嘌呤的RNA))作为单链核酸检测器验证Cas12i、Cas12j、Cas12a和Cas12b的检测结果。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明技术方案基于如下原理，获得待测样品的核酸，比如，可以通过扩增的方法得到靶核酸，利用可以与靶核酸配对的gRNA引导Cas蛋白识别并结合在靶核酸上；随后，Cas蛋白激发单链DNA、单链RNA或单链DNA-RNA杂交体的切割活性，从而切割体系里的单链核酸检测器；单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，如果单链核酸检测器被切割，则会激发荧光；在其他的实施方式中，单链核酸检测器的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。

实施例1、利用Cas12i采用单链DNA作为单链核酸检测器

PCR扩增水稻Os06g0623700基因,引物设计如下：

TGW6-i3g2-F3:CCAGACCGAGAGCAAATG(SEQ ID NO.18)；

WSDT18-R:AGCTTCCCACCAGCACTAAC(SEQ ID NO.19)；

PCR产物纯化回收，作为靶核酸序列，扩增得到的靶核酸序列如SEQ ID No.1所示；

利用Cas12i蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

针对上述靶核酸序列寻找gRNA的靶序列，所设计的gRNA序列如SEQ ID No.3所示；

采用单链DNA作为Reporter(单链核酸检测器)，其序列为：5’6-FAM-TTTTT-3’BHQ1，通过荧光报告的方式进行检测。

本实施方式中，所述体系中Cas12i终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，dsDNA(靶核酸)浓度为14.8nM,Reporter终浓度200nM。

如图1所示，采用单链DNA作为Reporter，Cas12i能够表现出针对Reporter的切割活性，与不加靶核酸的对照相比，可以快速的报告出荧光。图1中，①为添加靶核酸的实验结果，②为不添加靶核酸的对照组。

实施例2、利用Cas12j采用单链DNA作为单链核酸检测器

采用实施例1的靶核酸、gRNA、Reporter，利用Cas12j蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示；Cas12j、靶核酸、gRNA、Reporter的用量浓度分别为50nM、14.8nM、50nM和200nM。

结果如图2所示，采用单链DNA作为Reporter，Cas12j能够表现出针对Reporter的切割活性，与不加靶核酸的对照相比，可以快速的报告出荧光。图2中，①为添加靶核酸的实验结果，②为不添加靶核酸的对照组。

实施例3、利用Cas12i和Cas12j采用不同的单链DNA作为单链核酸检测器

本实施例中采用单链DNA作为靶核酸，同时采用单链DNA作为单链核酸检测器。

其中，针对Cas12i的靶核酸单链DNA序列为TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ IDNo.8)；针对Cas12i的gRNA序列为DRi3-gOsTGW6-2(SEQ ID No.9)。

针对Cas12j的靶核酸单链DNA序列为Cas12j19-g3-ATG-R(SEQ ID No.10)；针对Cas12j的gRNA序列为DR12j19gOsTGW6-3(SEQ ID No.11)。

所设计的单链DNA检测器序列如下(5’-3’)：

Reporter-A：5’6-FAM-AAAAA-3’BHQ1；

Reporter-T：5’6-FAM-TTTTT-3’BHQ1；

Reporter-C：5’6-FAM-CCCCC-3’BHQ1；

Reporter-FB：5'6-FAM/TTATT/3'BHQ1。

体系中，Cas12i或者Cas12j的终浓度为250nM，靶核酸的用量终浓度为25nM，gRNA的用量终浓度为25nM，单链DNA检测器的用量终浓度为200nM。

如图3所示，采用不同的单链DNA作为检测器，Cas12i均能够表现出针对Reporter的切割活性，与不加靶核酸的对照相比，可以快速的报告出荧光。

图3中：

①、Cas12i+Reporter-A+靶核酸

②、Cas12i+Reporter-T+靶核酸

③、Cas12i+Reporter-C+靶核酸

④、Cas12i+Reporter-FB+靶核酸

⑤、Cas12i+H₂O对照组

如图4所示，采用不同的单链DNA作为检测器，Cas12j均能够表现出针对Reporter的切割活性，与不加靶核酸的对照相比，可以快速的报告出荧光。

图4中：

①、Cas12j+Reporter-A+靶核酸

②、Cas12j+Reporter-T+靶核酸

③、Cas12j+Reporter-C+靶核酸

④、Cas12j+Reporter-FB+靶核酸

⑤、Cas12j+H₂O对照组

实施例4、利用Cas12i和Cas12j采用单链RNA作为单链核酸检测器

采用单链DNA(ssDNA)作为靶核酸，利用单链RNA作为单链核酸检测器，验证Cas12i和Cas12j的活性。

靶核酸ssDNA的终浓度为5nM，Cas12i和Cas12j的终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，Reporter-FQ-U浓度200nM条件下，验证Cas12i和Cas12j在以单链RNA作为单链核酸检测器的试验。

Reporter-FQ-U序列为5’6-FAM-UUUUU-3’BHQ1；

针对Cas12i的gRNA为DRi3-gOsTGW6-2(SEQ ID No.9)；

针对Cas12j的gRNA为DR12j19-gOsTGW6-3(SEQ ID No.11)；

针对Cas12i的靶核酸ssDNA为：Cas12i3-g2-ssDNA0(SEQ ID No.12)：

针对Cas12j的靶核酸ssDNA为：Cas12j19-g3-ssDNA0(SEQ ID No.13)：

如图5所示，利用单链RNA作为检测器，Cas12i和Cas12j能够表现出针对Reporter的切割活性，与不加靶核酸的对照相比，可以快速的报告出荧光。

图5中，不同的线条代表的结果如下：

①、Cas12i不加Reporter-FQ-U对照组

②、Cas12i+H₂O+Reporter-FQ-U(不加靶核酸)

③、Cas12i+Cas12i3-g2-ssDNA0+Reporter-FQ-U

④、Cas12j不加Reporter-FQ-U对照组

⑤、Cas12j+H₂O+Reporter-FQ-U(不加靶核酸)

⑥、Cas12j+Cas12j19-g3-ssDNA0+Reporter-FQ-U

实施例5、采用侧向流试纸条检测SARS-CoV-2

利用LAMP扩增SARS-CoV-2的orf1ab基因片段，其中，LAMP引物设计如下：

orf1ab-A-B3:agtctgaacaactggtgtaag(SEQ ID NO.20)；

orf1ab-A-BIP:tcaacctgaagaagagcaagaactgattgtcctcactgcc(SEQ ID NO.21)；

orf1ab-A-F3:tccagatgaggatgaagaaga(SEQ ID NO.22)；

orf1ab-A-FIP:agagcagcagaagtggcacaggtgattgtgaagaagaagag(SEQ ID NO.23)；

orf1ab-A-LB:acaaactgttggtcaacaagac(SEQ ID NO.24)；

orf1ab-A-LF:ctcatattgagttgatggctca(SEQ ID NO.25)；

以LAMP产物作为靶核酸，用实施例1的Cas12i蛋白，gRNA:AGAGAAUGUGUGCAUAGUCACACCCAAGGUAAACCUUUGGAAUUUGG(SEQ ID NO.26)；采用单链核酸检测器5’-/56-FAM/TTTTT/3Bio/-3’作为Reporter，通过侧向流试纸条的方式检测。所述试纸条的检测线标记有可以结合Bio的链霉亲和素，控制线上标记有可以结合胶体金金标抗体的抗体，所述金标抗体可以结合FAM。

所用反应体系中：Cas12i终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，LAMP产物1ul,Reporter浓度500nM。

结果如图6所示，采用试纸条检测，当Cas12i靶向靶核酸之后，切割Reporter，控制线的着色与对照组相比更加明显。

图6的试纸条从左至右1-2所检测的反应体系中的样品如下表所示：

编号	1	2
			Cas12i	+	+
靶核酸	-	+
			Reporter	+	+

实施例6、Cas12i可以利用双链靶核酸切割单链RNA

本实施例中，采用双链DNA(dsDNA)作为靶核酸，利用单链RNA作为单链核酸检测器，验证Cas12i的检测活性。

orf1ab-A-B3:agtctgaacaactggtgtaag(SEQ ID NO.27)；

orf1ab-A-BIP:tcaacctgaagaagagcaagaactgattgtcctcactgcc(SEQ ID NO.28)；

orf1ab-A-F3:tccagatgaggatgaagaaga(SEQ ID NO.29)；

orf1ab-A-FIP:agagcagcagaagtggcacaggtgattgtgaagaagaagag(SEQ ID NO.30)；

orf1ab-A-LB:acaaactgttggtcaacaagac(SEQ ID NO.31)；

orf1ab-A-LF:ctcatattgagttgatggctca(SEQ ID NO.32)；

以LAMP产物作为靶核酸，gRNA序列如下:

AGAGAAUGUGUGCAUAGUCACACCCAAGGUAAACCUUUGGAAUUUGG(SEQ ID NO.33)；

Reporter-FQ-U序列为5’6-FAM-UUUUU-3’BHQ1；

Cas12i的终浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，Reporter-FQ-U终浓度为200nM；如图7所示，利用双链DNA作为靶核酸，采用Cas12i利用单链RNA可以快速的报告出荧光。图7中，①为Cas12i+H₂O+Reporter-FQ-U，②为Cas12i+LAMP+Reporter-FQ-U。

实施例7、Cas12j可以利用双链靶核酸切割单链RNA

利用针对OsTGW6的PCR产物，gRNA(SEQ ID No.11所示)终浓度50nM，Cas12j浓度为50nM，gRNA终浓度为50nM，Reporter-FB-U(5’6-FAM-UUUUU-3’BHQ1)终浓度为200nM条件下，验证Cas12j的检测活性。

如图8所示，利用双链DNA作为靶核酸，采用Cas12j利用单链RNA可以快速的报告出荧光。图8中，①为Cas12j+H₂O+Reporter-FB-U，②为Cas12j+靶核酸+Reporter-FB-U。

实施例8、采用其他Cas蛋白利用不同靶核酸切割不同单链核酸检测器的结果

本发明中，还验证了Cas12i、Cas12j利用不同的单链核酸或双链核酸作为靶核酸时，采用不同的单链RNA检测器(比如，5’-/56-FAM/rA rA rA rA rA/3Bio/-3’(rA表示碱基为腺嘌呤的RNA),5’-/56-FAM/rC rC rC rC rC/3Bio/-3’(rC表示碱基为胞嘧啶的RNA))，或者单链DNA-RNA杂交体检测器(比如，FAM/TUTUT/3Bio/-3’(其中，T为DNA，U为RNA),FAM/UTUTU/3Bio/-3’(其中，T为DNA，U为RNA),FAM/A rA A rA A/3Bio/-3’(A表示碱基为腺嘌呤的DNA，rA表示碱基为腺嘌呤的RNA))时，与对照组相比，Cas12i和Cas12j在利用不同的单链RNA检测器，或者单链DNA-RNA杂交体检测器，可以快速的报告出荧光。

除此之外，本发明还针对Cas12a、Cas12b以及Cas13a在靶向不同的靶核酸时采用不同的单链核酸检测器进行了效果验证，其中，Cas12a氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，Cas12b氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，Cas13a氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，所采用的试验设计如下：

上述TGW6-i3g2-100bp-TTA1的序列如SEQ ID No.8所示；

上述Cas12i3-g2-ssDNA0的序列如SEQ ID No.12所示；

上述OsTGW6的序列如SEQ ID No.1所示；

上述LbCas12a-TGW6-g1的序列如下(SEQ ID No.14)：

UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUUUCACCGACAGCAGCAUGA；

上述AaCas12b-TGW6-g1的序列如下(SEQ ID No.15)：

GUCUAAAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAACUUCAAGCGAAGUGGCACUUUCACCGACAGCAGCAUGA；

上述RNA(TGW6-100bp-TTA1)的序列如下(SEQ ID No.16)：

CGUGACUUGCUCGUGCUGAGAUCGUUGGUAGUUCAUGCUGCUGUCGGUGAAAUAAACAUCUCCGGUAACCUGAUCAAUGUCCACCCCAUUGGUGAAGCGA；

上述Cas13a-gRNA的序列如下(SEQ ID No.17)：

CCACCCCAAUAUCGAAGGGGACUAAAACUUAUUUCACCGACAGCAGCAUGAACUAC；

上述单链RNA检测器包括5’-/56-FAM/UUUUU/3Bio/-3’，5’-/56-FAM/rArArArArA/3Bio/-3’(rA表示碱基为腺嘌呤的RNA),5’-/56-FAM/rCrCrCrC rC/3Bio/-3’(rC表示碱基为胞嘧啶的RNA)；

上述单链DNA-RNA杂交体检测器包括FAM/TUTUT/3Bio/-3’(其中，T为DNA，U为RNA),FAM/UTUTU/3Bio/-3’(其中，T为DNA，U为RNA),FAM/A rA A rA A/3Bio/-3’(A表示碱基为腺嘌呤的DNA，rA表示碱基为腺嘌呤的RNA)；

上述单链DNA检测器包括Reporter-A：5’6-FAM-AAAAA-3’BHQ1；Reporter-T：5’6-FAM-TTTTT-3’BHQ1；Reporter-C：5’6-FAM-CCCCC-3’BHQ1；Reporter-FB：5'6-FAM/TTATT/3'BHQ1。

采用Cas12a，以单链DNA Cas12i3-g2-ssDNA0作为靶核酸，以LbCas12a-TGW6-g1作为gRNA，选择单链RNA检测器5’-/56-FAM/UUUUU/3Bio/-3’；如图9所示，与对照组相比，Cas12a针对单链RNA检测器可以快速的报告出荧光；图9中，①为Cas12a+H₂O+Reporter，②为Cas12a+靶核酸+Reporter。

采用Cas12b，以单链DNA Cas12i3-g2-ssDNA0作为靶核酸，以AaCas12b-TGW6-g1作为gRNA，选择单链RNA检测器5’-/56-FAM/UUUUU/3Bio/-3’；如图10所示，与对照组相比，Cas12b针对单链RNA检测器可以快速的报告出荧光；图10中，①为Cas12b+H₂O+Reporter，②为Cas12b+靶核酸+Reporter。

如图11所示，以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用5’6-FAM-UUUUU-3’BHQ1作为单链核酸检测器，①Cas12i、②Cas12j、③Cas12a和④Cas12b均可以快速的报告出荧光，⑤-⑧为空白对照。

如图12所示，以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用5’-/56-FAM/rA rA rA rA rA/3Bio/-3’(rA表示碱基为腺嘌呤的RNA)作为单链核酸检测器，①Cas12i、②Cas12j、③Cas12a和④Cas12b均可以快速的报告出荧光，⑤-⑧为空白对照。

如图13所示，以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用5’-/56-FAM/rC rC rC rC rC/3Bio/-3’(rC表示碱基为胞嘧啶的RNA))作为单链核酸检测器，①Cas12i、②Cas12j、③Cas12a和④Cas12b均可以快速的报告出荧光，⑤-⑧为空白对照。

如图14所示，以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用FAM/TUTUT/3Bio/-3’(其中，T为DNA，U为RNA)作为单链核酸检测器，①Cas12i、②Cas12j、③Cas12a和④Cas12b均可以快速的报告出荧光，⑤-⑧为空白对照。

如图15所示，以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用FAM/UTUTU/3Bio/-3’(其中，T为DNA，U为RNA)作为单链核酸检测器，①Cas12i、②Cas12j、③Cas12a和④Cas12b均可以快速的报告出荧光，⑤-⑧为空白对照。

如图16所示，以单链DNA TGW6-i3g2-100bp-TTA1(SEQ ID No.8)作为靶核酸，采用FAM/A rA A rA A/3Bio/-3’(A表示碱基为腺嘌呤的DNA，rA表示碱基为腺嘌呤的RNA))作为单链核酸检测器，①Cas12i、②Cas12j、③Cas12a和④Cas12b均可以快速的报告出荧光，⑤-⑧为空白对照。

此外，Cas12a和Cas12b在利用其他的单链核酸或双链核酸作为靶核酸时，针对不同的单链RNA检测器或者单链DNA-RNA杂交体检测器，都可以快速的报告出荧光。Cas13a利用RNA作为靶核酸时，针对不同的单链DNA检测器或者单链DNA-RNA杂交体检测器，可以报告出荧光。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 基于CRISPR技术进行靶核酸检测的方法

<130> P2020-1822

<150> CN202010478129.9

<151> 2020-05-29

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

ccagaccgag agcaaatgcg gccgcccgtt aggcctacgg tttcactaca aaaccggcaa 60

cctgtacatc gccgacgcct acatgggatt gatgcgagtt ggtccaaaag gcggggaggc 120

aaccgtgcta gccatgaagg ctgatggcgt gccacttcgc ttcaccaatg gggtggacat 180

tgatcaggtt accggagatg tttatttcac cgacagcagc atgaactacc aacgatctca 240

gcacgagcaa gtcacggcga ccaaggattc gaccggacgg ctcatgaagt atgacccacg 300

aactaaccaa gtcaccgttc ttcaatccaa cataacctac ccgaacggtg tcgccatgag 360

cgctgaccga acacatctga tcgttgcatt gaccgggcca tgtaagttga tgaggcattg 420

gatccgaggc ccgaagactg gcaaatctga accatttgtt gacctgccag gctatcctga 480

taatgtgagg cctgatggaa aaggtggtta ttggatagcg cttcatcgcg agaagtatga 540

gcttcccttt ggtccggata gtcacttggt tgctatgagg gttagtgctg gtgggaagct 600

<210> 2

<211> 1045

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Lys Lys Val Glu Val Ser Arg Pro Tyr Gln Ser Leu Leu Leu Pro

1 5 10 15

Asn His Arg Lys Phe Lys Tyr Leu Asp Glu Thr Trp Asn Ala Tyr Lys

20 25 30

Ser Val Lys Ser Leu Leu His Arg Phe Leu Val Cys Ala Tyr Gly Ala

35 40 45

Val Pro Phe Asn Lys Phe Val Glu Val Val Glu Lys Val Asp Asn Asp

50 55 60

Gln Leu Val Leu Ala Phe Ala Val Arg Leu Phe Arg Leu Val Pro Val

65 70 75 80

Glu Ser Thr Ser Phe Ala Lys Val Asp Lys Ala Asn Leu Ala Lys Ser

85 90 95

Leu Ala Asn His Leu Pro Val Gly Thr Ala Ile Pro Ala Asn Val Gln

100 105 110

Ser Tyr Phe Asp Ser Asn Phe Asp Pro Lys Lys Tyr Met Trp Ile Asp

115 120 125

Cys Ala Trp Glu Ala Asp Arg Leu Ala Arg Glu Met Gly Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Gln Phe Ser Glu Tyr Ala Thr Thr Met Leu Trp Glu Asp Trp Leu

145 150 155 160

Pro Leu Asn Lys Asp Asp Val Asn Gly Trp Gly Ser Val Ser Gly Leu

165 170 175

Phe Gly Glu Gly Lys Lys Glu Asp Arg Gln Gln Lys Val Lys Met Leu

180 185 190

Asn Asn Leu Leu Asn Gly Ile Lys Lys Asn Pro Pro Lys Asp Tyr Thr

195 200 205

Gln Tyr Leu Lys Ile Leu Leu Asn Ala Phe Asp Ala Lys Ser His Lys

210 215 220

Glu Ala Val Lys Asn Tyr Lys Gly Asp Ser Thr Gly Arg Thr Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Leu Ser Glu Lys Ser Gly Glu Ile Thr Glu Leu Met Leu Glu Gln

245 250 255

Leu Met Ser Asn Ile Gln Arg Asp Ile Gly Asp Lys Gln Lys Glu Ile

260 265 270

Ser Leu Pro Lys Lys Asp Val Val Lys Lys Tyr Leu Glu Ser Glu Ser

275 280 285

Gly Val Pro Tyr Asp Gln Asn Leu Trp Ser Gln Ala Tyr Arg Asn Ala

290 295 300

Ala Ser Ser Ile Lys Lys Thr Asp Thr Arg Asn Phe Asn Ser Thr Leu

305 310 315 320

Glu Lys Phe Lys Asn Glu Val Glu Leu Arg Gly Leu Leu Ser Glu Gly

325 330 335

Asp Asp Val Glu Ile Leu Arg Ser Lys Phe Phe Ser Ser Glu Phe His

340 345 350

Lys Thr Pro Asp Lys Phe Val Ile Lys Pro Glu His Ile Gly Phe Asn

355 360 365

Asn Lys Tyr Asn Val Val Ala Glu Leu Tyr Lys Leu Lys Ala Glu Ala

370 375 380

Thr Asp Phe Glu Ser Ala Phe Ala Thr Val Lys Asp Glu Phe Glu Glu

385 390 395 400

Lys Gly Ile Lys His Pro Ile Lys Asn Ile Leu Glu Tyr Ile Trp Asn

405 410 415

Asn Glu Val Pro Val Glu Lys Trp Gly Arg Val Ala Arg Phe Asn Gln

420 425 430

Ser Glu Glu Lys Leu Leu Arg Ile Lys Ala Asn Pro Thr Val Glu Cys

435 440 445

Asn Gln Gly Met Thr Phe Gly Asn Ser Ala Met Val Gly Glu Val Leu

450 455 460

Arg Ser Asn Tyr Val Ser Lys Lys Gly Ala Leu Val Ser Gly Glu His

465 470 475 480

Gly Gly Arg Leu Ile Gly Gln Asn Asn Met Ile Trp Leu Glu Met Arg

485 490 495

Leu Leu Asn Lys Gly Lys Trp Glu Thr His His Val Pro Thr His Asn

500 505 510

Met Lys Phe Phe Glu Glu Val His Ala Tyr Asn Pro Ser Leu Ala Asp

515 520 525

Ser Val Asn Val Arg Asn Arg Leu Tyr Arg Ser Glu Asp Tyr Thr Gln

530 535 540

Leu Pro Ser Ser Ile Thr Asp Gly Leu Lys Gly Asn Pro Lys Ala Lys

545 550 555 560

Leu Leu Lys Arg Gln His Cys Ala Leu Asn Asn Met Thr Ala Asn Val

565 570 575

Leu Asn Pro Lys Leu Ser Phe Thr Ile Asn Lys Lys Asn Asp Asp Tyr

580 585 590

Thr Val Ile Ile Val His Ser Val Glu Val Ser Lys Pro Arg Arg Glu

595 600 605

Val Leu Val Gly Asp Tyr Leu Val Gly Met Asp Gln Asn Gln Thr Ala

610 615 620

Ser Asn Thr Tyr Ala Val Met Gln Val Val Lys Pro Lys Ser Thr Asp

625 630 635 640

Ala Ile Pro Phe Arg Asn Met Trp Val Arg Phe Val Glu Ser Gly Ser

645 650 655

Ile Glu Ser Arg Thr Leu Asn Ser Arg Gly Glu Tyr Val Asp Gln Leu

660 665 670

Asn His Asp Gly Val Asp Leu Phe Glu Ile Gly Asp Thr Glu Trp Val

675 680 685

Asp Ser Ala Arg Lys Phe Phe Asn Lys Leu Gly Val Lys His Lys Asp

690 695 700

Gly Thr Leu Val Asp Leu Ser Thr Ala Pro Arg Lys Ala Tyr Ala Phe

705 710 715 720

Asn Asn Phe Tyr Phe Lys Thr Met Leu Asn His Leu Arg Ser Asn Glu

725 730 735

Val Asp Leu Thr Leu Leu Arg Asn Glu Ile Leu Arg Val Ala Asn Gly

740 745 750

Arg Phe Ser Pro Met Arg Leu Gly Ser Leu Ser Trp Thr Thr Leu Lys

755 760 765

Ala Leu Gly Ser Phe Lys Ser Leu Val Leu Ser Tyr Phe Asp Arg Leu

770 775 780

Gly Ala Lys Glu Met Val Asp Lys Glu Ala Lys Asp Lys Ser Leu Phe

785 790 795 800

Asp Leu Leu Val Ala Ile Asn Asn Lys Arg Ser Asn Lys Arg Glu Glu

805 810 815

Arg Thr Ser Arg Ile Ala Ser Ser Leu Met Thr Val Ala Gln Lys Tyr

820 825 830

Lys Val Asp Asn Ala Val Val His Val Val Val Glu Gly Asn Leu Ser

835 840 845

Ser Thr Asp Arg Ser Ala Ser Lys Ala His Asn Arg Asn Thr Met Asp

850 855 860

Trp Cys Ser Arg Ala Val Val Lys Lys Leu Glu Asp Met Cys Asn Leu

865 870 875 880

Tyr Gly Phe Asn Ile Lys Gly Val Pro Ala Phe Tyr Thr Ser His Gln

885 890 895

Asp Pro Leu Val His Arg Ala Asp Tyr Asp Asp Pro Lys Pro Ala Leu

900 905 910

Arg Cys Arg Tyr Ser Ser Tyr Ser Arg Ala Asp Phe Ser Lys Trp Gly

915 920 925

Gln Asn Ala Leu Ala Ala Val Val Arg Trp Ala Ser Asn Lys Lys Ser

930 935 940

Asn Thr Cys Tyr Lys Val Gly Ala Val Glu Phe Leu Lys Gln His Gly

945 950 955 960

Leu Phe Ala Asp Lys Lys Leu Thr Val Glu Gln Phe Leu Ser Lys Val

965 970 975

Lys Asp Glu Glu Ile Leu Ile Pro Arg Arg Gly Gly Arg Val Phe Leu

980 985 990

Thr Thr His Arg Leu Leu Ala Glu Ser Thr Phe Val Tyr Leu Asn Gly

995 1000 1005

Val Lys Tyr His Ser Cys Asn Ala Asp Glu Val Ala Ala Val Asn Ile

1010 1015 1020

Cys Leu Asn Asp Trp Val Ile Pro Cys Lys Lys Lys Met Lys Glu Glu

1025 1030 1035 1040

Ser Ser Ala Ser Gly

1045

<210> 3

<211> 46

<212> RNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

agagaaugug ugcauaguca cacuuucacc gacagcagca ugaacu 46

<210> 4

<211> 908

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Met Pro Ser Tyr Lys Ser Ser Arg Val Leu Val Arg Asp Val Pro Glu

1 5 10 15

Glu Leu Val Asp His Tyr Glu Arg Ser His Arg Val Ala Ala Phe Phe

20 25 30

Met Arg Leu Leu Leu Ala Met Arg Arg Glu Pro Tyr Ser Leu Arg Met

35 40 45

Arg Asp Gly Thr Glu Arg Glu Val Asp Leu Asp Glu Thr Asp Asp Phe

50 55 60

Leu Arg Ser Ala Gly Cys Glu Glu Pro Asp Ala Val Ser Asp Asp Leu

65 70 75 80

Arg Ser Phe Ala Leu Ala Val Leu His Gln Asp Asn Pro Lys Lys Arg

85 90 95

Ala Phe Leu Glu Ser Glu Asn Cys Val Ser Ile Leu Cys Leu Glu Lys

100 105 110

Ser Ala Ser Gly Thr Arg Tyr Tyr Lys Arg Pro Gly Tyr Gln Leu Leu

115 120 125

Lys Lys Ala Ile Glu Glu Glu Trp Gly Trp Asp Lys Phe Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Leu Asp Glu Arg Thr Gly Glu Val Ala Glu Lys Phe Ala Ala Leu

145 150 155 160

Ser Met Glu Asp Trp Arg Arg Phe Phe Ala Ala Arg Asp Pro Asp Asp

165 170 175

Leu Gly Arg Glu Leu Leu Lys Thr Asp Thr Arg Glu Gly Met Ala Ala

180 185 190

Ala Leu Arg Leu Arg Glu Arg Gly Val Phe Pro Val Ser Val Pro Glu

195 200 205

His Leu Asp Leu Asp Ser Leu Lys Ala Ala Met Ala Ser Ala Ala Glu

210 215 220

Arg Leu Lys Ser Trp Leu Ala Cys Asn Gln Arg Ala Val Asp Glu Lys

225 230 235 240

Ser Glu Leu Arg Lys Arg Phe Glu Glu Ala Leu Asp Gly Val Asp Pro

245 250 255

Glu Lys Tyr Ala Leu Phe Glu Lys Phe Ala Ala Glu Leu Gln Gln Ala

260 265 270

Asp Tyr Asn Val Thr Lys Lys Leu Val Leu Ala Val Ser Ala Lys Phe

275 280 285

Pro Ala Thr Glu Pro Ser Glu Phe Lys Arg Gly Val Glu Ile Leu Lys

290 295 300

Glu Asp Gly Tyr Lys Pro Leu Trp Glu Asp Phe Arg Glu Leu Gly Phe

305 310 315 320

Val Tyr Leu Ala Glu Arg Lys Trp Glu Arg Arg Arg Gly Gly Ala Ala

325 330 335

Val Thr Leu Cys Asp Ala Asp Asp Ser Pro Ile Lys Val Arg Phe Gly

340 345 350

Leu Thr Gly Arg Gly Arg Lys Phe Val Leu Ser Ala Ala Gly Ser Arg

355 360 365

Phe Leu Ile Thr Val Lys Leu Pro Cys Gly Asp Val Gly Leu Thr Ala

370 375 380

Val Pro Ser Arg Tyr Phe Trp Asn Pro Ser Val Gly Arg Thr Thr Ser

385 390 395 400

Asn Ser Phe Arg Ile Glu Phe Thr Lys Arg Thr Thr Glu Asn Arg Arg

405 410 415

Tyr Val Gly Glu Val Lys Glu Ile Gly Leu Val Arg Gln Arg Gly Arg

420 425 430

Tyr Tyr Phe Phe Ile Asp Tyr Asn Phe Asp Pro Glu Glu Val Ser Asp

435 440 445

Glu Thr Lys Val Gly Arg Ala Phe Phe Arg Ala Pro Leu Asn Glu Ser

450 455 460

Arg Pro Lys Pro Lys Asp Lys Leu Thr Val Met Gly Ile Asp Leu Gly

465 470 475 480

Ile Asn Pro Ala Phe Ala Phe Ala Val Cys Thr Leu Gly Glu Cys Gln

485 490 495

Asp Gly Ile Arg Ser Pro Val Ala Lys Met Glu Asp Val Ser Phe Asp

500 505 510

Ser Thr Gly Leu Arg Gly Gly Ile Gly Ser Gln Lys Leu His Arg Glu

515 520 525

Met His Asn Leu Ser Asp Arg Cys Phe Tyr Gly Ala Arg Tyr Ile Arg

530 535 540

Leu Ser Lys Lys Leu Arg Asp Arg Gly Ala Leu Asn Asp Ile Glu Ala

545 550 555 560

Arg Leu Leu Glu Glu Lys Tyr Ile Pro Gly Phe Arg Ile Val His Ile

565 570 575

Glu Asp Ala Asp Glu Arg Arg Arg Thr Val Gly Arg Thr Val Lys Glu

580 585 590

Ile Lys Gln Glu Tyr Lys Arg Ile Arg His Gln Phe Tyr Leu Arg Tyr

595 600 605

His Thr Ser Lys Arg Asp Arg Thr Glu Leu Ile Ser Ala Glu Tyr Phe

610 615 620

Arg Met Leu Phe Leu Val Lys Asn Leu Arg Asn Leu Leu Lys Ser Trp

625 630 635 640

Asn Arg Tyr His Trp Thr Thr Gly Asp Arg Glu Arg Arg Gly Gly Asn

645 650 655

Pro Asp Glu Leu Lys Ser Tyr Val Arg Tyr Tyr Asn Asn Leu Arg Met

660 665 670

Asp Thr Leu Lys Lys Leu Thr Cys Ala Ile Val Arg Thr Ala Lys Glu

675 680 685

His Gly Ala Thr Leu Val Ala Met Glu Asn Ile Gln Arg Val Asp Arg

690 695 700

Asp Asp Glu Val Lys Arg Arg Lys Glu Asn Ser Leu Leu Ser Leu Trp

705 710 715 720

Ala Pro Gly Met Val Leu Glu Arg Val Glu Gln Glu Leu Lys Asn Glu

725 730 735

Gly Ile Leu Ala Trp Glu Val Asp Pro Arg His Thr Ser Gln Thr Ser

740 745 750

Cys Ile Thr Asp Glu Phe Gly Tyr Arg Ser Leu Val Ala Lys Asp Thr

755 760 765

Phe Tyr Phe Glu Gln Asp Arg Lys Ile His Arg Ile Asp Ala Asp Val

770 775 780

Asn Ala Ala Ile Asn Ile Ala Arg Arg Phe Leu Thr Arg Tyr Arg Ser

785 790 795 800

Leu Thr Gln Leu Trp Ala Ser Leu Leu Asp Asp Gly Arg Tyr Leu Val

805 810 815

Asn Val Thr Arg Gln His Glu Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Gln Thr Gly

820 825 830

Ala Pro Ala Ala Thr Leu Asn Pro Thr Ala Glu Ala Ser Tyr Glu Leu

835 840 845

Val Gly Leu Ser Pro Glu Glu Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Lys

850 855 860

Arg Lys Lys Arg Glu Pro Phe Tyr Arg His Glu Gly Val Trp Leu Thr

865 870 875 880

Arg Glu Lys His Arg Glu Gln Val His Glu Leu Arg Asn Gln Val Leu

885 890 895

Ala Leu Gly Asn Ala Lys Ile Pro Glu Ile Arg Thr

900 905

<210> 5

<211> 1228

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp

20 25 30

Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys

35 40 45

Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp

50 55 60

Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu

65 70 75 80

Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

85 90 95

Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn

100 105 110

Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu

115 120 125

Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe

130 135 140

Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn

145 150 155 160

Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile

165 170 175

Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys

180 185 190

Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys

195 200 205

Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe

210 215 220

Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile

225 230 235 240

Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn

245 250 255

Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys

260 265 270

Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser

275 280 285

Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe

290 295 300

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys

305 310 315 320

Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe

340 345 350

Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp

355 360 365

Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp

370 375 380

Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu

405 410 415

Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser

420 425 430

Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys

435 440 445

Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys

450 455 460

Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr

465 470 475 480

Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile

485 490 495

Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr

500 505 510

Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro

515 520 525

Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala

530 535 540

Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys

545 550 555 560

Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly

565 570 575

Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met

580 585 590

Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro

595 600 605

Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly

610 615 620

Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys

625 630 635 640

Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn

645 650 655

Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu

660 665 670

Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys

675 680 685

Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile

690 695 700

Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His

705 710 715 720

Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile

725 730 735

Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys

740 745 750

Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys

755 760 765

Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr

770 775 780

Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile

785 790 795 800

Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val

805 810 815

Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp

820 825 830

Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly

835 840 845

Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn

850 855 860

Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu

865 870 875 880

Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile

885 890 895

Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys

900 905 910

Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn

915 920 925

Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

930 935 940

Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys

945 950 955 960

Lys Ser Asn Pro Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Lys Gly Tyr Gln Ile

965 970 975

Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe

980 985 990

Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr

995 1000 1005

Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp Ser

1010 1015 1020

Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro Glu Glu

1025 1030 1035 1040

Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser Arg Thr Asp

1045 1050 1055

Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr Gly Asn Arg Ile

1060 1065 1070

Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val Phe Asp Trp Glu Glu

1075 1080 1085

Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu Phe Asn Lys Tyr Gly Ile

1090 1095 1100

Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp

1105 1110 1115 1120

Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln

1125 1130 1135

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1140 1145 1150

Pro Val Lys Asn Ser Asp Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu

1155 1160 1165

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1170 1175 1180

Tyr Asn Ile Ala Arg Lys Val Leu Trp Ala Ile Gly Gln Phe Lys Lys

1185 1190 1195 1200

Ala Glu Asp Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys

1205 1210 1215

Glu Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His

1220 1225

<210> 6

<211> 1129

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<220>

Claims

1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型或VI型Cas蛋白(CRISPR/CAS效应蛋白)、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述V型或VI型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由V型或VI型Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器选自单链DNA、单链RNA或单链DNA-RNA杂交体的任意一种或任意几种组合，所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交；

所述V型Cas蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白的任意一种或任意几种组合；优选的，所述Cas12家族蛋白选自Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h中的一种或任意几种组合；更优选的，所述Cas12家族蛋白为Cas12i、Cas12j、Cas12a、Cas12b中的一种或任意几种组合物；所述VI型Cas蛋白选自Cas13家族蛋白，优选的，所述Cas13家族蛋白包括Cas13a、Cas13b。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas蛋白为Cas12i和/或Cas12j。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸；优选的，包括单链核酸、双链核酸，例如，单链DNA、双链DNA、单链RNA。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的报告信号；或者，所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式检测反应信号。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM等方法富集或扩增的产物。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸或与对照有差异的特异核酸，优选地，疾病相关的特异核酸为特定的突变位点或SNP位点；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒，例如，乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒，冠状病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，例如，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。

9.一种用于检测样品中靶核酸的系统或组合物或试剂盒，所述系统或组合物包括权利要求1-8任一权利要求中所述的V型或VI型Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器。

10.权利要求9所述的系统或组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸的应用。