CN113913497B

CN113913497B - 利用碱基修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法

Info

Publication number: CN113913497B
Application number: CN202110146567.XA
Authority: CN
Inventors: 梁亚峰
Original assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shandong Shunfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN113913497A

Abstract

本发明提供了一种利用修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒，所述的检测方法包括向含有靶核酸的反应体系中加入gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器，所述单链核酸检测器存在碱基修饰。

Description

利用碱基修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及利用修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。

背景技术

特异性检测核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的应用价值，例如病原体的检测，遗传病检测等。在病原体检测方面，由于每种病原体微生物都有其独一无二的特征核酸分子序列，因此可以开发出针对特定物种的核酸分子检测，也称为核酸诊断(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品安全、环境微生物污染检测，人体病原菌感染等领域具有重要义。另一个方面是对人或其他物种的单核苷酸多态性 (SNPs,singlenucleotide polymorphisms)的检测。在基因组水平上去理解遗传变异和生物学功能之间的关系为现代分子生物学提供了新视角，而其中SNPs对生物学的功能、进化和疾病等密切相关，因此SNPs 的检测与分析技术的发展尤为重要。

目前建立的特异性核酸分子检测通常需要分为两步，第一步是目的核酸的扩增，第二步是目的核酸检测。现有检测技术包括限制性核酸内切酶方法、Southern、Northern、斑点杂交、荧光PCR检测技术、 LAMP环介导等温扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等方法。2012年之后，CRISPR基因编辑技术兴起，张锋团队基于RPA技术开发了一种以Cas13为核心的靶向RNA的新核酸诊断技术(SHERLOCK 技术)，Doudna团队开发了一种以Cas12酶为核心的诊断技术(DETECTR技术),中国科学院上海植物生理生态研究所王金博士等也开发了一种基于Cas12的新型核酸检测技术(HOLMES技术)。基于CRISPR 技术开发的核酸检测技术正在日益发挥重要作用。

在基于CRISPR的核酸检测技术中，核酸探针或者核酸检测器是上述检测技术的关键元件，本发明对核酸探针进行了改进，从而扩展了该技术的应用范围。

发明内容

本发明提供了利用碱基修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法、系统和试剂盒。

方法

一方面，本发明提供了一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与V型CRISPR/CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由CRISPR/CAS效应蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸。

所述单链核酸检测器含有修饰的核酸，所述修饰的核酸为碱基修饰的核酸，所述碱基修饰的核酸包括以下一种或任意几种：2’-Deoxynebularine，或Etheno-dA。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器包含2-30个碱基修饰的核酸，优选，所述单链核酸检测器包含3-15个碱基修饰的核酸，优选，所述单链核酸检测器包含5-10个碱基修饰的核酸，优选，5、6、7、 8、9、10个碱基修饰的核酸。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器的核酸由2-30个碱基修饰的核酸构成，优选的，所述单链核酸检测器的核酸由5-15个碱基修饰的核酸构成，优选的，所述单链核酸检测器的核酸由5-10个碱基修饰的核酸构成，优选，5、6、7、8、9、10个碱基修饰的核酸。

另一方面，本发明还提供了一种切割碱基修饰的核酸的方法，所述方法包括，使碱基修饰的核酸与靶核酸、V型CRISPR/CAS效应蛋白和gRNA(指导RNA)接触，gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述gRNA不与所述碱基修饰的核酸杂交。

在一个实施方式中，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白切割所述碱基修饰的核酸，

在一个实施方式中，所述接触可以是在体外、离体或体内的细胞内部。

在一个实施方式中，所述切割为非特异性的切割(trans切割)。

试剂、试剂盒、系统或组合物

另一方面，本发明还提供了一种用于检测样品中靶核酸的试剂、试剂盒、系统或组合物，所述试剂、试剂盒、系统或组合物包括V型CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和单链核酸检测器，所述gRNA 包括与所述CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

进一步的，所述试剂、试剂盒、系统或组合物还包括用于扩增或转录得到靶核酸的引物。

另一方面，本发明还提供了一种用于切割碱基修饰的核酸的试剂、试剂盒、系统或组合物，所述试剂、试剂盒、系统或组合物包括V型CAS效应蛋白、gRNA(指导RNA)和靶核酸，所述gRNA包括与所述CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

在一个实施方式中，优选的，所述碱基修饰的核酸是含有碱基修饰的核苷酸，优选的，所述切割是非特异性切割。

应用

另一方面，本发明还提供了上述试剂、试剂盒、系统或组合物在检测样品中靶核酸的应用。

另一方面，本发明还提供了上述试剂、试剂盒、系统或组合物在切割含有碱基修饰的单链核酸中的应用。优选的，所述切割含有碱基修饰的单链核酸为非特异性的切割。

另一方面，本发明还提供了V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在切割碱基修饰的核酸中的应用。

如上所述的应用，所述V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在与样品中的靶核酸结合或杂交后，激活旁路激活(trans活性)，可以切割体系中的碱基修饰的核酸。

另一方面，本发明还提供了V型或VI型CRISPR/CAS效应蛋白在制备切割碱基修饰的核酸的试剂、试剂盒、系统或组合物中的应用。

另一方面，本发明还提供了上述V型Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器在检测样品中靶核酸中的应用；或者，在制备用于检测样品中靶核酸的试剂、系统、组合物或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明还提供了上述试剂、系统、组合物或试剂盒在检测样品中靶核酸中的应用。

单链核酸检测器

本发明中，所述单链核酸检测器包括DNA、RNA、核酸类似物和核酸修饰物中的一种或多种的组合。

如本领域所知，核苷是碱基-糖基的组合，所述碱基通常是杂环碱基，最常见的是嘌呤和嘧啶，嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)通常被称为天然的核碱基。

所述单链核酸检测器中一种或多种修饰，所述修饰包括碱基修饰(杂环碱基的修饰)，糖修饰(糖基修饰)，骨架修饰(核苷间连接键的修饰)等。

本文所述碱基修饰是指对杂环碱基进行改造。所述经过修饰的碱基可以与脱氧核糖或核糖连接，经过修饰的碱基与脱氧核糖连接构成的是脱氧核苷，可以构成DNA；经过修饰的碱基与核糖连接构成的是核苷，可以构成RNA。

在一种实施方式中，所述单链核酸检测器的核酸是经过碱基修饰的核酸，所述碱基修饰的核酸包括以下一种或任意几种：结构为nebularine的核酸、结构为2’-Deoxynebularine的核酸、结构为Etheno-dA 的核酸、碱基为5-Nitroindole的核糖核苷酸或碱基为5-Nitroindole的脱氧核糖核苷酸；

优选的，所述单链核酸检测器是经过碱基修饰的核酸，所述碱基修饰的核酸包括以下一种或任意几种：结构为2’-Deoxynebularine的核酸、结构为Etheno-dA的核酸。

所述nebularine，又称水粉蕈素,烟云杯伞素，其结构示意如下：

所述2’-Deoxynebularine结构示意如下：

所述Etheno-dA结构如下所示：

所述5-Nitroindole(5-硝基吲哚)可以作为一种杂环碱基构成核苷，其结构示意如下：

构成完整的脱氧核糖核苷酸的结构如下：

所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交。

CRISPR/CAS效应蛋白

进一步的，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白选自Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体；在一个实施方式中，所述Cas蛋白优选为Cas12家族，包括但不限于Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、 Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述Cas12a选自FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、 OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a中一种或任意几种；所述Cas12a优选为LbCas12a，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者，将SEQ ID No.1所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如 2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在其他的实施方式中，所述Cas12b的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或者，将SEQID No.2所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个) 氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在优选的实施方式中，所述Cas12i蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)SEQ ID No.3所示的蛋白；

(2)将SEQ ID No.3所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个， 7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

所述Cas12j蛋白的氨基酸序列选自下组：

(1)SEQ ID No.4所示的蛋白；

(2)将SEQ ID No.4所示氨基酸序或其活性片段经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个， 7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白突变体包括氨基酸取代、缺失或替换，且所述突变体至少保留其 trans切割活性。优选地，所述突变体具有Cis和trans切割活性。

本领域技人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代, 这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在Cas酶的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

表1

本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从本发明的Cas蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR 而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。

应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备Cas蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。

本领域技术人员能够理解，本发明Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变) 或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。

本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定Cas蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。

靶核酸

本发明中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，包括单链核酸、双链核酸，例如单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA。

在一个实施方式中，所述靶核酸来源于病毒、细菌、微生物、土壤、水源、人体、动物、植物等样品。优选的，所述靶核酸为PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM等方法富集或扩增的产物。

在一个实施方式中，所述方法还包括从样品中获得靶核酸的步骤。

在一个实施方式中，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸、与疾病相关的特异核酸，如特定的突变位点或SNP位点或与对照有差异的核酸；优选地，所述病毒为植物病毒或动物病毒，例如，乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒，冠状病毒；优选地，所述病毒为冠状病毒，优选地，SARS、SARS-CoV2(COVID-19)、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、Mers-Cov。

在一些实施方式中，所述靶核酸来源于细胞，例如，来源于细胞裂解液。

在一个实施方式中，所述的靶核酸包括DNA、RNA，优选为单链核酸或双链核酸或核酸修饰物。

可检测信号

本发明中，所述可检测信号通过以下方式实现：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。

在一些实施方式中，本发明的方法还包括测量CRISPR/CAS效应蛋白(Cas蛋白)产生的可检测信号的步骤。所述Cas蛋白识别所述靶核酸或与所述靶核酸杂交之后可以激发单链核酸的切割活性，从而切割所述单链核酸检测器进而产生可检测信号。

本发明中，所述可检测信号可以是当切割单链核酸检测器时产生的任何信号。例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，荧光检测，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化)，基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。

在优选的实施方式中，所述可检测信号通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的报告基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的报告信号；例如，单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，当所述单链核酸检测器被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。

在一个实施方式中，所述荧光基团选自FAM、FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red 或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在其他的实施方式中，所述可检测信号还可以通过以下方式实现：所述单链核酸检测器的5’端和3’端分别设置不同的标记分子，通过胶体金检测的方式检测反应信号。

在一些实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定量的，在其他的实施方式中，所述可检测信号的测量可以是定性的。

优选的，所述单链核酸检测器在被所述Cas蛋白切割之前产生第一可检测信号，并且在被切割之后产生不同于第一可检测信号的第二可检测信号。

gRNA

本发明中，所述gRNA包括靶向所述待检测特征序列的序列(导向序列)和识别Cas蛋白的序列(同向重复序列或其部分)。

本发明中，所述的导向序列包括10-40bp；优选地，12-25bp；优选地，15-23bp；优选地，16-18bp。

本发明中，所述gRNA与待检测特征序列至少有50％的匹配度，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％。

在一个实施方式中，当所述的特征序列含有一个或多个特征位点(如特定的突变位点或SNP)时，所述的特征位点与gRNA完全匹配。

在一个实施方式中，所述检测方法中可以包含一种或多种导向序列互不相同的gRNA，其靶向不同的特征序列。

在一个实施方式中，所述的识别所述待检测的特征序列包括结合和/或切割待检测特征序列。

比例

在一个实施方式中，所述Cas蛋白与gRNA的用量摩尔比为(0.8-1.2)：1。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述gRNA的用量终浓度为20-200nM，优选，30-100nM，更优选，40-80nM，更优选，50nM。

在一个实施方式中，所述靶核酸的用量终浓度为5-100nM，优选，10-50nM。

在一个实施方式中，所述单链核酸检测器的用量终浓度为100-1000nM，优选，150-800nM，优选， 200-800nM，优选，200-500nM，优选，200-300nM。

术语“杂交”或“互补的”或“基本上互补的”是指核酸(例如RNA、DNA)包含使其能够非共价结合的核苷酸序列，即以序列特异性，反平行的方式(即核酸特异性结合互补核酸)与另一核酸形成碱基对和/ 或G/U碱基对，“退火”或“杂交”。杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间可能存在错配。两个核酸之间杂交的合适条件取决于核酸的长度和互补程度，这是本领域公知的变量。典型地，可杂交核酸的长度为8个核苷酸或更多(例如，10个核苷酸或更多，12个核苷酸或更多，15个核苷酸或更多，20 个核苷酸或更多，22个核苷酸或更多，25个核苷酸或更多，或30个核苷酸或更多)。

应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以特异性杂交。多核苷酸可包含60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高， 98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，或与其杂交的靶核酸序列中的靶区域的序列互补性为100％。

序列表

seq ID	内容	类型
			1	Cas12a	protein
2	Cas12b	protein
			3	Cas12i	protein
4	Cas12j	protein

一般定义

除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。

术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA 或者其杂交体，可以是双链或单链的。

术语“寡核苷酸”是指含有3-100个核苷酸的序列，优选，具有3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。

术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，氨基酸序列的同一性可以通过常规方法，参考例如Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482Pearson&Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444， Thompson etal.,1994,Nucleic AcidsRes 22:467380等的教导，通过计算机化运行运算法则(Wisconsin Genetics软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA,和TFASTA，Genetics Computer Group)来确定。也可使用可从美国国立生物技术信息中心(NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得的BLAST运算法则，使用默认参数确定。

如本文所用，所述“CRISPR”是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。

如本文所用，“生物素(biotin)”也称维生素H，是一种分子量为244Da的小分子维生素。“亲和素 (avidin)”，又称抗生物素，是一种碱性糖蛋白，具有4个同生物素亲和例极高的结合位点，常用亲和素有链霉亲合素。生物素与亲和素的极强亲和力可用于在检测体系中放大或增强检测信号。如生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合，而结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。

靶核酸

如本文所用，所述“靶核酸”是指从生物样品(待测样品)中提取的多核苷酸分子。所述生物样品是从任何生物体获得、排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物，例如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物(例如植物或动物，包括来自健康或表面健康的人类受试者或受待诊断或调查的病症或疾病影响的人类患者的样品，例如病原微生物例如病原细菌或病毒的感染)。例如，生物样品可以是从例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、粘液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、渗出液、渗出液(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的液体)中获得的生物液体或从关节(例如，正常关节或受疾病影响的关节，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎)获得的液体，或皮肤或粘膜表面的拭子。样品也可以是从任何器官或组织获得的样品(包括活组织检查或尸体解剖标本，例如肿瘤活检)或者可以包含细胞(原代细胞或培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。示例性的样品包括但不限于，细胞、细胞裂解物、血涂片、细胞离心制剂、细胞学涂片、体液(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、尿、支气管肺泡灌洗、精液等)、组织活检(例如肿瘤活组织检查)、细针抽吸物和/或组织切片(例如低温恒温器组织切片和/或石蜡包埋的组织切片)。

在其他实施方式中，生物样品可以是植物细胞、愈伤、组织或器官(如根、茎、叶、花、种子、果实)等。

本发明中，所述的靶核酸还包括通过逆转录RNA形成的DNA分子，进一步地，所述的靶核酸可以采用本领域公知的技术对其进行扩增，所述的扩增技术等温扩增技术和非等温扩增技术，等温扩增可以是基于核酸测序的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增 (SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、或切口酶扩增反应(NEAR)。在某些示例性实施方式中，可以使用非等温扩增方法，其包括但不限于PCR、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、或衍生物扩增方法(RAM)。

进一步的，本发明所述的检测方法还一步包括对靶核酸扩增的步骤；所述的检测系统，还进一步包括对靶核酸进行扩增的试剂。所述扩增的试剂包括下组中的一种或多种：DNA聚合酶、链置换酶、解旋酶、重组酶、单链结合蛋白等。

Cas蛋白

本文所述“Cas蛋白”是指CRISPR-associated蛋白，优选来自V型或VI型CRISPR/CAS蛋白，其一旦与待检测特征序列(靶序列)结合(即形成Cas蛋白-gRNA-靶序列的三元复合物)，就可以诱发其trans 活性，即随机切割非靶向单链核苷酸(即本文所述单链核酸检测器，优选单链DNA(ssDNA)、单链 DNA-RNA杂交体、单链RNA)。当Cas蛋白与特征序列结合后，其切割或不切割特征序列，均可以诱发其trans活性；优选地，其通过切割特征序列诱发其trans活性；更优选地，其通过切割单链特征序列诱发其trans活性。所述Cas蛋白通过识别与特征序列临近的PAM(protospacer adjacent motif)识别特征序列。

本发明所述的Cas蛋白为至少具有trans切割活性的蛋白，优选地，所述的Cas蛋白为具有Cis和trans 切割活性的蛋白。所述的Cis活性是指Cas蛋白可在gRNA的作用下识别PAM位点并特异性切割靶序列的活性。

本发明所述的Cas蛋白包括V型和VI型CRISPR/CAS效应蛋白，包括Cas12、Cas13、Cas14等蛋白家族。优选地，例如Cas12蛋白，例如Cas12a、Cas1 2b、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12g、Cas12h、 Cas12i、Cas12j；优选地，所述Cas蛋白为Cas12a、Cas12b、Cas12i、Cas12j。Cas13蛋白家族包括Cas13a、 Cas13b等。

在实施方式中，本文所称的Cas蛋白，如Cas12，也涵盖Cas的功能变体或其同源物或直系同源物。如本文所用的蛋白的“功能变体”是指至少部分保留该蛋白的活性的这样的蛋白的变体。功能变体可以包括突变体(其可以是插入、缺失或替换突变体)，包括多晶型物等。功能变体中还包括这样的蛋白与另一种通常不相关的核酸、蛋白质、多肽或肽的融合产物。功能变体可以是天然存在的或可以是人造的。有利的实施方式可以涉及工程化或非天然存在的V型DNA靶向效应蛋白。

在一个实施方式中，编码Cas蛋白，如Cas12，的一种或多种核酸分子或其直系同源物或同源物可以被密码子优化用于在真核细胞中表达。真核生物可如本文所述。一种或多种核酸分子可以是工程化的或非天然存在的。

在一个实施方式中，Cas12蛋白或其直系同源物或同源物可以包含一个或多个突变(并且因此编码其的核酸分子可以具有一个或多个突变。突变可以是人工引入的突变并且可以包括但不限于催化结构域中的一个或多个突变。

在一个实施方式中，Cas蛋白可以来自：纤毛菌属、李斯特菌属、棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真细菌属、链球菌属、乳酸菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、固氮螺菌属、Sphaerochaeta、葡糖醋杆菌属、奈瑟氏菌属、罗氏菌属、Parvibaculum、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属、弯曲杆菌属和毛螺菌属。

在一个实施方式中，Cas蛋白选自如下序列组成的蛋白：

(1)SEQ ID No.1-4所示的蛋白；

(2)将SEQ ID No.1-4所示氨基酸序或其活性片段列经过一个或多个(如2个、3个、4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有基本相同功能的衍生蛋白。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白还包括与上述序列具有50％，优选55％，优选60％，优选65％，优选70％，优选75％，优选80％，优选85％，优选90％，优选95％，序列同一性的，且具有trans活性的蛋白。

所述的Cas蛋白可以通过重组表达载体技术获得，即将编码该蛋白的核酸分子构建到合适的载体上，再转化到宿主细胞中，使得所述的编码核酸分子在细胞中表达，从而获得相应的蛋白。所述的蛋白可以被细胞分泌出来，或者破解细胞通过常规的提取技术获得该蛋白。所述的编码核酸分子可以整合至宿主细胞的基因组中进行表达，也可以不整合到宿主细胞中进行表达。所述的载体还进一步包括有利于序列整合，或进行自我复制的调节元件。所述的载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，优选地，本发明中的表达载体是质粒。所述的载体进一步包括一种或多种调控元件，选自启动子、增强子、翻译起始的核糖体结合位点、终止子、多聚腺苷酸序列、筛选标记基因。

宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。

gRNA

如本文所用，所述的“gRNA”又称为guide RNA或导向RNA，并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，导向RNA可以包含同向(direct)重复序列和导向序列(guidesequence)，或者基本上由或由同向重复序列和导向序列(在内源性CRISPR系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。gRNA在不同的CRISPR系统中，依据其所依赖的Cas蛋白的不同，可以包括crRNA和tracrRNA，也可以只含有 crRNA。crRNA和tracrRNA可以经过人工改造融合形成single guide RNA(sgRNA)。在某些情况下，导向序列是与靶序列(本发明中所述特征序列)具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导 CRISPR/Cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列，通常具有12-25nt的序列长度。所述的同向重复序列可折叠形成特定结构(如茎环结构)供Cas蛋白识别，以形成复合物。所述的导向序列不需要与特征序列(靶序列)100％互补。所述的导向序列不与单链核酸检测器互补。

在某些实施方案中，当最佳比对时，导向序列与其相应靶序列之间的互补程度(匹配度)为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。

本发明所述的gRNA可以是天然的，也可以是经过人工改造或设计合成的。

单链核酸检测器

本发明所述的单链核酸检测器是指含有2-200个核苷酸的序列，优选，具有2-150个核苷酸，优选， 3-100个核苷酸，优选，3-30个核苷酸，优选，4-20个核苷酸，更优选，5-15个核苷酸。优选为单链DNA 分子、单链RNA分子或单链DNA-RNA杂交体。

本发明中，对单链核酸检测器的碱基进行了修饰，从而使得原本无法用于核酸检测的poly G，经过修饰后可以高效的用于核酸检测。

所述的单链核酸检测器在检测方法或系统中用以报告是否含有特征序列。所述的单链核酸检测器两端包括不同的报告基团或标记分子，当其处于初始状态(即未被切割状态时)不呈现报告信号，当该单链核酸检测器被切割后，呈现出可检测的信号，即切割后与切割前表现出可检测的区别。在本发明中，如果能够检测出可检测的区别，则反映靶核酸中含有待检测的特征序列；或者，如果无法检检测出所述的可检测的区别，则反映靶核酸中不含有待检测的特征序列。

在一个实施方式中，所述的报告基团或标记分子包括荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、 FITC、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种或任意几种。

在一个实施方式中，所述的单链核酸检测器具有连接至5’端第一分子(如FAM或FITC)和连接至 3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有单链核酸检测器的反应体系与流动条配合用以检测特征序列(优选，胶体金检测方式)。所述的流动条被设计为具有两条捕获线，在样品接触端(胶体金)设有结合第一分子的抗体(即第一分子抗体)，在第一线(control line)处含有结合第一分子抗体的抗体，在第二线(test line)处含有与第二分子结合的第二分子的抗体(即第二分子抗体，如亲和素)。当反应沿着条带流动时，第一分子抗体与第一分子结合携带切割或未切割的寡核苷酸至捕获线，切割的报告子将在第一个捕获线处结合第一分子抗体的抗体，而未切割的报告子将在第二捕获线处结合第二分子抗体。报告基团在各条线的结合将导致强读出/信号(例如颜色)。随着更多的报告子被切割，更多的信号将在第一捕获线处累积，并且在第二线处将出现更少的信号。在某些方面，本发明涉及如本文所述的流动条用于检测核酸的用途。在某些方面，本发明涉及用本文定义的流动条检测核酸的方法，例如(侧)流测试或(侧)流免疫色谱测定。在某些方面，所述单链核酸检测器中的分子可相互替换，或改变分子的位置，只要其报告原理与本发明相同或相近，所改进的方式也均包含在本发明中。

本发明所述的检测方法，可用于待检测特征序列的定量检测。所述的定量检测指标可以根据报告基团的信号强弱进行定量，如根据荧光基团的发光强度，或根据显色条带的宽度等。

附图说明

图1、5个2’-Deoxynebularine相连接的单链核酸，在5’端连接有荧光基团FAM和3’端连接有淬灭集团BHQ1作为单链核酸检测器时的检测结果。

图2、5个Etheno-dA相连接的单链核酸，在5’端连接有荧光基团FAM和3’端连接有淬灭集团BHQ1 作为单链核酸检测器时的检测结果。

图3、5个碱基为5-Nitroindole的脱氧核糖核苷酸，在5’端连接有荧光基团FAM和3’端连接有淬灭基团BHQ1作为单链核酸检测器时的检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本发明技术方案基于如下原理，获得待测样品的核酸，比如，可以通过扩增的方法得到靶核酸，利用可以与靶核酸配对的gRNA引导Cas蛋白识别并结合在靶核酸上；随后，Cas蛋白激发单链核酸切割活性，从而切割体系里的单链核酸检测器；单链核酸检测器的两端分别设置荧光基团和淬灭基团，如果单链核酸检测器被切割，则会激发荧光；如果单链核酸无法被切割，则不会激发荧光；在其他的实施方式中，单链核酸检测器的两端还可以设置成能够被胶体金检测的标记。

实施例1、碱基修饰的单链核酸检测器的检测效果

本实施方式中，利用结构为5个2’-Deoxynebularine相连接的核酸、5个Etheno-dA相连接的核酸、 5个碱基为5-Nitroindole的核苷相连接的核酸作为单链核酸检测器，同时在单链核酸检测器的5’端连接有荧光基团FAM且3’端连接有淬灭基团BHQ1。

申请人对Cas12a(SEQ ID No.1)、Cas12b(SEQ ID No.2)、Cas12i(SEQ ID No.3)和Cas12j(SEQ ID No.4)，在利用上述含有单链核酸检测器时的检测效果进行了验证，试验设计如下：

上述Cas12i3-g2-ssDNA0的序列：

gatcgttggtagttcatgctgctgtcggtgaaataaacatctccggtaac

上述Cas12j19-g3-ssDNA0的序列：

ccccgccttt tggaccaact cgcatcaatc ccatgtaggc gtcggcgatg

上述LbCas12a-TGW6-g1的序列：

uaauuucuacuaaguguagauuuucaccgacagcagcauga

上述AaCas12b-TGW6-g1的序列：

gucuaaaggacagaauuuuucaacgggugugccaauggccacuuuccagguggcaaagcccguugaacuucaagcgaaguggcacuuuca ccgacagcagcauga

上述dri3-gostgw6-2的序列：

agagaaugugugcauagucacacuuucaccgacagcagcaugaacu

上述Cas12j19-TGW6-g3的序列：

gugcugcugucucccagacgggaggcagaacugcacggauugaugcgaguugguccaaaa

配制20微升反应体系，体系内各成分的含量如下：

组分	20ul体系使用量	终浓度
			缓冲液	2ul	1×
2uM的Cas12	0.5ul	50nM
			1uM的gRNA	1ul	50nM
100nM的ssDNA	1ul	5nM
			10uM的单链核酸检测器	0.4ul	200nM
H₂O	Up to 20ul

结果如图1-3所示，当单链核酸检测器是由碱基修饰的核酸构成时，具体的，结构为 2’-Deoxynebularine的核酸、结构为Etheno-dA的核酸为单链核酸检测器时，利用Cas12a(SEQ ID No.1)、Cas12b(SEQ ID No.2)、Cas12i(SEQ ID No.3)和Cas12j(SEQ IDNo.4)皆可以进行核酸检测；尤其是，Cas12a、Cas12b和Cas12i利用结构为2’-Deoxynebularine的单链核酸检测器，与对照相比，可以快速的表现出荧光；Cas12a和Cas12i利用结构为Etheno-dA的单链核酸检测器，与对照相比，可以快速的表现出荧光。但是，利用碱基为5-Nitroindole的脱氧核糖核苷酸作为单链核酸检测器时，整体检测效果不好。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东舜丰生物科技有限公司

<120> 利用碱基修饰的单链核酸进行靶核酸检测的方法

<130> JH-CNP210171DJ

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1228

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LbCas12a

<400> 1

Met Ser Lys Leu Glu Lys Phe Thr Asn Cys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr

1 5 10 15

Leu Arg Phe Lys Ala Ile Pro Val Gly Lys Thr Gln Glu Asn Ile Asp

20 25 30

Asn Lys Arg Leu Leu Val Glu Asp Glu Lys Arg Ala Glu Asp Tyr Lys

35 40 45

Gly Val Lys Lys Leu Leu Asp Arg Tyr Tyr Leu Ser Phe Ile Asn Asp

50 55 60

Val Leu His Ser Ile Lys Leu Lys Asn Leu Asn Asn Tyr Ile Ser Leu

65 70 75 80

Phe Arg Lys Lys Thr Arg Thr Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

85 90 95

Leu Glu Ile Asn Leu Arg Lys Glu Ile Ala Lys Ala Phe Lys Gly Asn

100 105 110

Glu Gly Tyr Lys Ser Leu Phe Lys Lys Asp Ile Ile Glu Thr Ile Leu

115 120 125

Pro Glu Phe Leu Asp Asp Lys Asp Glu Ile Ala Leu Val Asn Ser Phe

130 135 140

Asn Gly Phe Thr Thr Ala Phe Thr Gly Phe Phe Asp Asn Arg Glu Asn

145 150 155 160

Met Phe Ser Glu Glu Ala Lys Ser Thr Ser Ile Ala Phe Arg Cys Ile

165 170 175

Asn Glu Asn Leu Thr Arg Tyr Ile Ser Asn Met Asp Ile Phe Glu Lys

180 185 190

Val Asp Ala Ile Phe Asp Lys His Glu Val Gln Glu Ile Lys Glu Lys

195 200 205

Ile Leu Asn Ser Asp Tyr Asp Val Glu Asp Phe Phe Glu Gly Glu Phe

210 215 220

Phe Asn Phe Val Leu Thr Gln Glu Gly Ile Asp Val Tyr Asn Ala Ile

225 230 235 240

Ile Gly Gly Phe Val Thr Glu Ser Gly Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn

245 250 255

Glu Tyr Ile Asn Leu Tyr Asn Gln Lys Thr Lys Gln Lys Leu Pro Lys

260 265 270

Phe Lys Pro Leu Tyr Lys Gln Val Leu Ser Asp Arg Glu Ser Leu Ser

275 280 285

Phe Tyr Gly Glu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Phe

290 295 300

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Asn Ser Glu Ile Phe Ser Ser Ile Lys Lys

305 310 315 320

Leu Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile

325 330 335

Phe Val Lys Asn Gly Pro Ala Ile Ser Thr Ile Ser Lys Asp Ile Phe

340 345 350

Gly Glu Trp Asn Val Ile Arg Asp Lys Trp Asn Ala Glu Tyr Asp Asp

355 360 365

Ile His Leu Lys Lys Lys Ala Val Val Thr Glu Lys Tyr Glu Asp Asp

370 375 380

Arg Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Gly Ser Phe Ser Leu Glu Gln Leu

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Ala Asp Ala Asp Leu Ser Val Val Glu Lys Leu Lys Glu

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Ile Ile Ile Gln Lys Val Asp Glu Ile Tyr Lys Val Tyr Gly Ser Ser

420 425 430

Glu Lys Leu Phe Asp Ala Asp Phe Val Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys

435 440 445

Asn Asp Ala Val Val Ala Ile Met Lys Asp Leu Leu Asp Ser Val Lys

450 455 460

Ser Phe Glu Asn Tyr Ile Lys Ala Phe Phe Gly Glu Gly Lys Glu Thr

465 470 475 480

Asn Arg Asp Glu Ser Phe Tyr Gly Asp Phe Val Leu Ala Tyr Asp Ile

485 490 495

Leu Leu Lys Val Asp His Ile Tyr Asp Ala Ile Arg Asn Tyr Val Thr

500 505 510

Gln Lys Pro Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Lys Leu Tyr Phe Gln Asn Pro

515 520 525

Gln Phe Met Gly Gly Trp Asp Lys Asp Lys Glu Thr Asp Tyr Arg Ala

530 535 540

Thr Ile Leu Arg Tyr Gly Ser Lys Tyr Tyr Leu Ala Ile Met Asp Lys

545 550 555 560

Lys Tyr Ala Lys Cys Leu Gln Lys Ile Asp Lys Asp Asp Val Asn Gly

565 570 575

Asn Tyr Glu Lys Ile Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met

580 585 590

Leu Pro Lys Val Phe Phe Ser Lys Lys Trp Met Ala Tyr Tyr Asn Pro

595 600 605

Ser Glu Asp Ile Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Gly Thr Phe Lys Lys Gly

610 615 620

Asp Met Phe Asn Leu Asn Asp Cys His Lys Leu Ile Asp Phe Phe Lys

625 630 635 640

Asp Ser Ile Ser Arg Tyr Pro Lys Trp Ser Asn Ala Tyr Asp Phe Asn

645 650 655

Phe Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Lys Asp Ile Ala Gly Phe Tyr Arg Glu

660 665 670

Val Glu Glu Gln Gly Tyr Lys Val Ser Phe Glu Ser Ala Ser Lys Lys

675 680 685

Glu Val Asp Lys Leu Val Glu Glu Gly Lys Leu Tyr Met Phe Gln Ile

690 695 700

Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Asp Lys Ser His Gly Thr Pro Asn Leu His

705 710 715 720

Thr Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile

725 730 735

Arg Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys

740 745 750

Lys Glu Glu Leu Val Val His Pro Ala Asn Ser Pro Ile Ala Asn Lys

755 760 765

Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr

770 775 780

Lys Asp Lys Arg Phe Ser Glu Asp Gln Tyr Glu Leu His Ile Pro Ile

785 790 795 800

Ala Ile Asn Lys Cys Pro Lys Asn Ile Phe Lys Ile Asn Thr Glu Val

805 810 815

Arg Val Leu Leu Lys His Asp Asp Asn Pro Tyr Val Ile Gly Ile Asp

820 825 830

Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Ile Val Val Val Asp Gly Lys Gly

835 840 845

Asn Ile Val Glu Gln Tyr Ser Leu Asn Glu Ile Ile Asn Asn Phe Asn

850 855 860

Gly Ile Arg Ile Lys Thr Asp Tyr His Ser Leu Leu Asp Lys Lys Glu

865 870 875 880

Lys Glu Arg Phe Glu Ala Arg Gln Asn Trp Thr Ser Ile Glu Asn Ile

885 890 895

Lys Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Ile Ser Gln Val Val His Lys Ile Cys

900 905 910

Glu Leu Val Glu Lys Tyr Asp Ala Val Ile Ala Leu Glu Asp Leu Asn

915 920 925

Ser Gly Phe Lys Asn Ser Arg Val Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln

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Lys Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Met Val Asp Lys

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965 970 975

Thr Asn Lys Phe Glu Ser Phe Lys Ser Met Ser Thr Gln Asn Gly Phe

980 985 990

Ile Phe Tyr Ile Pro Ala Trp Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Ser Thr

995 1000 1005

Gly Phe Val Asn Leu Leu Lys Thr Lys Tyr Thr Ser Ile Ala Asp

1010 1015 1020

Ser Lys Lys Phe Ile Ser Ser Phe Asp Arg Ile Met Tyr Val Pro

1025 1030 1035

Glu Glu Asp Leu Phe Glu Phe Ala Leu Asp Tyr Lys Asn Phe Ser

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Arg Thr Asp Ala Asp Tyr Ile Lys Lys Trp Lys Leu Tyr Ser Tyr

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Gly Asn Arg Ile Arg Ile Phe Arg Asn Pro Lys Lys Asn Asn Val

1070 1075 1080

Phe Asp Trp Glu Glu Val Cys Leu Thr Ser Ala Tyr Lys Glu Leu

1085 1090 1095

Phe Asn Lys Tyr Gly Ile Asn Tyr Gln Gln Gly Asp Ile Arg Ala

1100 1105 1110

Leu Leu Cys Glu Gln Ser Asp Lys Ala Phe Tyr Ser Ser Phe Met

1115 1120 1125

Ala Leu Met Ser Leu Met Leu Gln Met Arg Asn Ser Ile Thr Gly

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Arg Thr Asp Val Asp Phe Leu Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser Asp

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Gly Ile Phe Tyr Asp Ser Arg Asn Tyr Glu Ala Gln Glu Asn Ala

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Glu Lys Leu Asp Lys Val Lys Ile Ala Ile Ser Asn Lys Glu Trp

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Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ser Val Lys His

1220 1225

<210> 2

<211> 1129

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Cas12b

<400> 2

Met Ala Val Lys Ser Ile Lys Val Lys Leu Arg Leu Asp Asp Met Pro

1 5 10 15

Glu Ile Arg Ala Gly Leu Trp Lys Leu His Lys Glu Val Asn Ala Gly

20 25 30

Val Arg Tyr Tyr Thr Glu Trp Leu Ser Leu Leu Arg Gln Glu Asn Leu

35 40 45

Tyr Arg Arg Ser Pro Asn Gly Asp Gly Glu Gln Glu Cys Asp Lys Thr

50 55 60

Ala Glu Glu Cys Lys Ala Glu Leu Leu Glu Arg Leu Arg Ala Arg Gln

65 70 75 80

Val Glu Asn Gly His Arg Gly Pro Ala Gly Ser Asp Asp Glu Leu Leu

85 90 95

Gln Leu Ala Arg Gln Leu Tyr Glu Leu Leu Val Pro Gln Ala Ile Gly

100 105 110

Ala Lys Gly Asp Ala Gln Gln Ile Ala Arg Lys Phe Leu Ser Pro Leu

115 120 125

Ala Asp Lys Asp Ala Val Gly Gly Leu Gly Ile Ala Lys Ala Gly Asn

130 135 140

Lys Pro Arg Trp Val Arg Met Arg Glu Ala Gly Glu Pro Gly Trp Glu

145 150 155 160

Glu Glu Lys Glu Lys Ala Glu Thr Arg Lys Ser Ala Asp Arg Thr Ala

165 170 175

Asp Val Leu Arg Ala Leu Ala Asp Phe Gly Leu Lys Pro Leu Met Arg

180 185 190

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195 200 205

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Glu Tyr Ala Lys Leu Val Glu Gln Lys Asn Arg Phe Glu Gln Lys Asn

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275 280 285

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Lys Trp Gly Lys Leu Ala Pro Asp Ala Pro Phe Asp Leu Tyr Asp Ala

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Glu Ile Lys Asn Val Gln Arg Arg Asn Thr Arg Arg Phe Gly Ser His

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Asp Leu Phe Ala Lys Leu Ala Glu Pro Glu Tyr Gln Ala Leu Trp Arg

340 345 350

Glu Asp Ala Ser Phe Leu Thr Arg Tyr Ala Val Tyr Asn Ser Ile Leu

355 360 365

Arg Lys Leu Asn His Ala Lys Met Phe Ala Thr Phe Thr Leu Pro Asp

370 375 380

Ala Thr Ala His Pro Ile Trp Thr Arg Phe Asp Lys Leu Gly Gly Asn

385 390 395 400

Leu His Gln Tyr Thr Phe Leu Phe Asn Glu Phe Gly Glu Arg Arg His

405 410 415

Ala Ile Arg Phe His Lys Leu Leu Lys Val Glu Asn Gly Val Ala Arg

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485 490 495

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Leu Ser Gly Leu Arg Val Met Ser Val Asp Leu Gly Leu Arg Thr Ser

565 570 575

Ala Ser Ile Ser Val Phe Arg Val Ala Arg Lys Asp Glu Leu Lys Pro

580 585 590

Asn Ser Lys Gly Arg Val Pro Phe Phe Phe Pro Ile Lys Gly Asn Asp

595 600 605

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850 855 860

Asn Gln Leu Met Gln Trp Ser His Arg Gly Val Phe Gln Glu Leu Ile

865 870 875 880

Asn Gln Ala Gln Val His Asp Leu Leu Val Gly Thr Met Tyr Ala Ala

885 890 895

Phe Ser Ser Arg Phe Asp Ala Arg Thr Gly Ala Pro Gly Ile Arg Cys

900 905 910

Arg Arg Val Pro Ala Arg Cys Thr Gln Glu His Asn Pro Glu Pro Phe

915 920 925

Pro Trp Trp Leu Asn Lys Phe Val Val Glu His Thr Leu Asp Ala Cys

930 935 940

Pro Leu Arg Ala Asp Asp Leu Ile Pro Thr Gly Glu Gly Glu Ile Phe

945 950 955 960

Val Ser Pro Phe Ser Ala Glu Glu Gly Asp Phe His Gln Ile His Ala

965 970 975

Asp Leu Asn Ala Ala Gln Asn Leu Gln Gln Arg Leu Trp Ser Asp Phe

980 985 990

Asp Ile Ser Gln Ile Arg Leu Arg Cys Asp Trp Gly Glu Val Asp Gly

995 1000 1005

Glu Leu Val Leu Ile Pro Arg Leu Thr Gly Lys Arg Thr Ala Asp

1010 1015 1020

Ser Tyr Ser Asn Lys Val Phe Tyr Thr Asn Thr Gly Val Thr Tyr

1025 1030 1035

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Glu Lys Leu Ser Glu Glu Glu Ala Glu Leu Leu Val Glu Ala Asp

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Ser Arg Val Pro Leu Gln Asp Ser Ala Cys Glu Asn Thr Gly Asp

1115 1120 1125

Ile

<210> 3

<211> 1045

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 3

Met Lys Lys Val Glu Val Ser Arg Pro Tyr Gln Ser Leu Leu Leu Pro

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Asn His Arg Lys Phe Lys Tyr Leu Asp Glu Thr Trp Asn Ala Tyr Lys

20 25 30

Ser Val Lys Ser Leu Leu His Arg Phe Leu Val Cys Ala Tyr Gly Ala

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Val Pro Phe Asn Lys Phe Val Glu Val Val Glu Lys Val Asp Asn Asp

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Gln Leu Val Leu Ala Phe Ala Val Arg Leu Phe Arg Leu Val Pro Val

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Glu Ser Thr Ser Phe Ala Lys Val Asp Lys Ala Asn Leu Ala Lys Ser

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Leu Ala Asn His Leu Pro Val Gly Thr Ala Ile Pro Ala Asn Val Gln

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Ser Tyr Phe Asp Ser Asn Phe Asp Pro Lys Lys Tyr Met Trp Ile Asp

115 120 125

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210 215 220

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340 345 350

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Asn Lys Tyr Asn Val Val Ala Glu Leu Tyr Lys Leu Lys Ala Glu Ala

370 375 380

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450 455 460

Arg Ser Asn Tyr Val Ser Lys Lys Gly Ala Leu Val Ser Gly Glu His

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Gly Gly Arg Leu Ile Gly Gln Asn Asn Met Ile Trp Leu Glu Met Arg

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Leu Asn Pro Lys Leu Ser Phe Thr Ile Asn Lys Lys Asn Asp Asp Tyr

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645 650 655

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Trp Cys Ser Arg Ala Val Val Lys Lys Leu Glu Asp Met Cys Asn Leu

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Asn Thr Cys Tyr Lys Val Gly Ala Val Glu Phe Leu Lys Gln His Gly

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Leu Phe Ala Asp Lys Lys Leu Thr Val Glu Gln Phe Leu Ser Lys Val

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<211> 908

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<223> Cas12j

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Leu Arg Ser Ala Gly Cys Glu Glu Pro Asp Ala Val Ser Asp Asp Leu

65 70 75 80

Arg Ser Phe Ala Leu Ala Val Leu His Gln Asp Asn Pro Lys Lys Arg

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Ser Met Glu Asp Trp Arg Arg Phe Phe Ala Ala Arg Asp Pro Asp Asp

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Leu Gly Arg Glu Leu Leu Lys Thr Asp Thr Arg Glu Gly Met Ala Ala

180 185 190

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850 855 860

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865 870 875 880

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885 890 895

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900 905

Claims

1.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法，所述方法包括将样品与V型Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器接触，所述gRNA包括与所述V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；检测由V型Cas蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述单链核酸检测器不与所述gRNA杂交；

所述单链核酸检测器由碱基修饰的脱氧核糖核苷酸组成的核酸和设置于所述核酸5’端和3’端的不同报告基团或标记分子组成；

所述碱基修饰的脱氧核糖核苷酸为2’-Deoxynebularine或Etheno-dA，

当所述碱基修饰的脱氧核糖核苷酸为2’-Deoxynebularine时，

所述V型Cas蛋白选自Cas12i、Cas12j、Cas12a或Cas12b中的一种或任意几种组合；

当所述碱基修饰的脱氧核糖核苷酸为Etheno-dA时，所述V型Cas蛋白选自Cas12a和/或Cas12b。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链核酸检测器的核酸由2-30个碱基修饰的脱氧核糖核苷酸构成。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于传感器的检测。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于颜色或胶体相变/分散的检测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于金纳米颗粒的检测或基于半导体的检测。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过以下方式进行检测：荧光检测、胶体金检测或电化学检测。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可检测信号通过荧光偏振进行检测。

9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述靶核酸包括单链核酸、双链核酸，所述单链核酸包括单链DNA、单链RNA，所述双链核酸包括双链DNA。

11.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述靶核酸来源于微生物、土壤、水源、动物、植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述靶核酸来源于病毒、细菌、人体。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述靶核酸为病毒核酸、细菌核酸或与对照有差异的特异核酸。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述病毒为乳头瘤病毒，肝DNA病毒，疱疹病毒，腺病毒，痘病毒，细小病毒或冠状病毒。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒为冠状病毒，所述冠状病毒为SARS、SARS-CoV2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1或Mers-Cov。

16.一种切割碱基修饰的单链核酸的方法，所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法，其特征在于，所述碱基修饰的单链核酸由碱基修饰的脱氧核糖核苷酸组成，使用所述碱基修饰的单链核酸与靶核酸、V型CRISPR/CAS蛋白和gRNA接触，gRNA包括与所述CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述V型CRISPR/CAS效应蛋白切割所述碱基修饰的单链核酸，所述gRNA不与所述碱基修饰的单链核酸杂交，

当所述碱基修饰的脱氧核糖核苷酸为2’-Deoxynebularine时，

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述单链核酸检测器的核酸由2-30个碱基修饰的脱氧核糖核苷酸构成。

18.一种用于检测样品中靶核酸的组合物，其特征在于，所述组合物包括

V型Cas蛋白、gRNA和单链核酸检测器，

所述gRNA包括与所述V型Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列；

当所述碱基修饰的脱氧核糖核苷酸为2’-Deoxynebularine时，

19.权利要求18所述的组合物在制备用于检测样品中靶核酸的试剂盒中的应用。